(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高い非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を持つとして被検体を同定する方法であって、
被検体からのＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含む試料を抗ＡＬＫ抗体と接触させること；
該試料中でＡＬＫタンパク質の発現を検出すること；
ＡＬＫタンパク質の発現の検出が、試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色の検出を含む場合に、該試料をＡＬＫに対して陽性としてスコア化すること；又は
ＡＬＫタンパク質の発現の検出が、試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色の検出を含まない場合に、該試料をＡＬＫに対して陰性としてスコア化すること；及び
試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に被検体をＡＬＫ阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣを持つと同定するか又は、試料がＡＬＫに対して陰性としてスコア化された場合に被検体がＡＬＫ阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が低いＮＳＣＬＣを持つと同定すること
を含む方法。
【請求項２】
試料をＡＬＫに対して陽性又は陰性としてスコア化することが、試料中の正常な細胞若しくは要素又は腫瘍壊死領域におけるＡＬＫタンパク質の発現を検出することを排除することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の正常細胞が、非腫瘍細胞、神経由来の細胞、肺胞のマクロファージ、腺上皮細胞、若しくはリンパ球を含むか、又は正常な要素がムチンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料が組織生検、細針吸引物、気管支肺胞洗浄液、胸水、又は痰を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
組織生検が、組織切片を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料が固定されるものである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
試料が、試料採集の約６時間以内に、中性緩衝化ホルマリン又は亜鉛ホルマリン中で少なくとも約６時間固定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗ＡＬＫ抗体が、ウサギ抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料中のＡＬＫタンパク質の発現を検出することが、抗ＡＬＫ抗体の試料への結合の直接的又は間接的検出を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
シグナル増幅工程をさらに含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試料を抗ＡＬＫ抗体に接触させること及び該試料中でＡＬＫタンパク質の発現を検出することが、自動化組織ステイナーで行われる、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料をＡＬＫに対して陽性又は陰性としてスコア化することが、目視検査を含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
目視検査が、光学顕微鏡を使用して行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料をＡＬＫに対して陽性又は陰性としてスコア化することを検出することが、少なくとも一の視野の目視検査を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高い非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を持つとして被検体を同定する方法であって、
（ａ）被検体からのＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含む試料をウサギ抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３抗体に接触させる工程、
（ｂ）該試料中でＡＬＫタンパク質の発現を検出する工程、ここで、
（ｉ）試料を抗ＡＬＫ抗体に結合する３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸にコンジュゲートされた二次抗体と接触させ、
（ｉｉ）試料を３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた三次抗体と接触させ、
（ｉｉｉ）試料を過酸化水素及び３,３'-ジアミノベンジディンテトラヒドロクロリドと接触させ、及び
（ｉｖ）光学顕微鏡を使用してＤＡＢ沈着物を検出すること、を含み、
（ｃ）試料をＡＬＫに対して陽性又は陰性としてスコア化する工程、ここで、
（ｉ）試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色が存在する場合に、該試料がＡＬＫに対して陽性であるとしてスコア化すること、又は
（ｉｉ）試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色が存在しない場合に、該試料がＡＬＫに対して陰性であるとしてスコア化すること、を含み、
（ｄ）試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に被検体をクリゾチニブでの治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣを持つと同定するか又は、試料がＡＬＫに対して陰性としてスコア化された場合に被検体がクリゾチニブでの治療に応答する可能性が低いＮＳＣＬＣを持つと同定する工程
を含む方法。
【請求項１６】
試料中でＡＬＫタンパク質の発現を検出することが、工程（ｂ）（ｉｉ）後に、
試料を３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸がＡＬＫタンパク質又はその近傍に沈着するのに十分な条件下で、過酸化水素及びチラミドにコンジュゲートされた３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸と接触させること、及び
試料を３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸に結合する三次抗体と接触させること
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高い非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を持つとして被検体を同定するためのキットであって、抗ＡＬＫ抗体を含み、ここで、
被検体からのＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含む試料が該抗ＡＬＫ抗体と接触させられ、
該試料中のＡＬＫタンパク質の発現が検出され、
ＡＬＫタンパク質の発現の検出が、試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色の検出を含む場合に、該試料はＡＬＫに対して陽性としてスコア化され；又は
ＡＬＫタンパク質の発現の検出が、試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色の検出を含まない場合に、該試料はＡＬＫに対して陰性としてスコア化され；及び
試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に被検体はＡＬＫ阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣを持つと同定されるか又は、試料がＡＬＫに対して陰性としてスコア化された場合に被検体はＡＬＫ阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が低いＮＳＣＬＣを持つと同定される、キット。
【請求項１８】
被検体からの試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に、該被検体がＡＬＫ阻害剤クリゾチニブを用いた治療のために選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
選択された被検体に治療的有効量のＡＬＫ阻害剤クリゾチニブがさらに投与される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤クリゾチニブでの治療に応答する可能性が高い非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を持つとして被検体を同定するためのキットであって、ウサギ抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３抗体を含み、ここで、
（ａ）被検体からのＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含む試料が該ウサギ抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３抗体と接触させられ、
（ｂ）該試料中でＡＬＫタンパク質の発現が検出され、ここで検出は、
（ｉ）試料を抗ＡＬＫ抗体に結合する３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸にコンジュゲートされた二次抗体と接触させ、
（ｉｉ）試料を３-ヒドロキシキノキサリン-２-カルボン酸に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた三次抗体と接触させ、
（ｉｉｉ）試料を過酸化水素及び３,３'-ジアミノベンジディンテトラヒドロクロリドと接触させ、及び
（ｉｖ）光学顕微鏡を使用してＤＡＢ沈着物を検出すること、を含み、
（ｃ）試料がＡＬＫに対して陽性又は陰性としてスコア化され、ここでスコア化は、
（ｉ）試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色が存在する場合に、該試料がＡＬＫに対して陽性であるとしてスコア化すること、又は
（ｉｉ）試料中の一又は複数の腫瘍細胞に顆粒状の強い細胞質染色が存在しない場合に、該試料がＡＬＫに対して陰性であるとしてスコア化すること、を含み、
（ｄ）試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に被検体はクリゾチニブでの治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣを持つと同定されるか又は、試料がＡＬＫに対して陰性としてスコア化された場合に被検体はクリゾチニブでの治療に応答する可能性が低いＮＳＣＬＣを持つと同定される、キット。
【請求項２１】
被検体からの試料がＡＬＫに対して陽性としてスコア化された場合に、該被検体がクリゾチニブを用いた治療のために選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
選択された被検体に治療的有効量のクリゾチニブがさらに投与される、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１２年９月２４日に出願された、米国仮特許出願第61/704,960号に対する優先権を主張し、その内容はその全体がここに参照により援用される。
分野
本出願は、非小細胞肺癌の診断法に関し、特に、非小細胞肺癌が未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤に応答すると予測されるか否かを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質は、インスリンレセプターサブファミリーのレセプターチロシンキナーゼのメンバーである。ＡＬＫは、通常は神経系のみに発現する、Ｉ型膜糖タンパク質である。染色体２ｐ内の反転は、棘皮動物微小管関連タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子とＡＬＫ遺伝子の融合遺伝子産物の形成をもたらし、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株及び保存臨床材料中で発見された(Soda et al., Nature 448561-566, 2007)。ＡＬＫは現在ＮＳＣＬＣでの重要なプレイヤーとして認識されており、ＥＭＬ４が優性な融合パートナーではあるが、他の融合パートナー遺伝子も同定されている。ＡＬＫ遺伝子転位の頻度は２〜７％の範囲であるようであり、米国で年間約６０００のＡＬＫ陽性患者に、全世界で年間約４００００のＡＬＫ患者に翻訳されている。重要なことに、ＡＬＫ遺伝子転位はめったにＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＫＲＡＳ変異と一致して起こることがなく、ＡＬＫ陽性であることは区別される疾患サブタイプであることを実証している。
クリゾチニブ（XALKORI, Pfizer）は、ＡＬＫを阻害する強力なチロシンキナーゼ阻害剤である。２つの臨床試験において、クリゾチニブで治療された、局所的にＡＬＫ陽性の進行性又は転移性ＮＳＣＬＣ患者は、全体的な応答率５０％（N=136; 95% CI 42%, 59%）及び６１％（N=119; 95% CI 52%, 70%）をそれぞれ示した。このように、ＮＳＣＬＣ患者におけるＡＬＫの状態の決定は、患者のケアを指向するのに重要である。しかしながら、クリゾチニブ治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣ患者を迅速且つ正確に同定する、特定の、高感度で標準化されたＡＬＫの状態に対するアッセイの需要が残存している。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書は、ALK阻害剤、例えばクリゾチニブ、を用いる治療に応答すると予測されるＮＳＣＬＣを持つとして被検体を同定する方法の実施態様を開示する。該実施態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いてＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含有する試料をＡＬＫ陽性と又はＡＬＫ陰性と同定すること及び本明細書に開示の方法をスコア化することを含む。試料がＡＬＫ陽性と同定された場合に被検体がＡＬＫ阻害剤での治療に応答する可能性が高いＮＳＣＬＣを持つと同定され、試料がＡＬＫ陰性と同定された場合に被検体がＡＬＫ阻害剤での治療に応答する可能性が低いＮＳＣＬＣを持つと同定される。幾つかの例において、試料は抗ＡＬＫ抗体で標識され、顆粒状の強い細胞質染色を有する少なくとも一の腫瘍細胞が試料に存在する場合に、該試料がＡＬＫに対して陽性であると同定される。
開示される方法の幾つかの実施態様はまた、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療のためのＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する被検体を選択することを含む。開示される方法の追加の実施態様はまた、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する被検体にＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ等）を単独で、又は他の既知の又は将来開発される治療との併用で投与すること等の治療に応答すると予測されるＮＳＣＬＣを有すると同定された被検体を治療することを含む。
開示の上記および他の特徴は、添付図面を参照して進み、以下の詳細な説明から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１Ａと１Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）染色（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ染色（右パネル）での均一なＡＬＫ ＩＨＣ発現を示す２つの例示的ＡＬＫ陽性症例のデジタル画像である。
【図２】図２Ａ−Ｃは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）染色（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ染色（右パネル）での不均一なＡＬＫ ＩＨＣ発現を示す３つの例示的ＡＬＫ陽性症例のデジタル画像である。抗ＡＬＫ染色された試料において強い細胞質染色が存在するが、強度は様々である。
【図３】抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における腺上皮細胞の点状の顆粒状染色を示すデジタル画像である（左パネル）。対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおいては、腺上皮細胞の染色が明確でない（右パネル）。腺上皮細胞の染色は正常組織要素には存在したが、癌細胞には存在しなかったため、スライドの解釈からは排除した。
【図４】図４Ａは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における外見上の神経組織要素の染色を示すデジタル画像（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける染色の欠失を示すデジタル画像（右パネル）である。図４Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける（右パネル）神経組織の染色を示すデジタル画像である。該染色は、正常組織要素又は細胞に存在していたため、スライドの解釈では排除された。
【図５】図５は、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における肺胞のマクロファージに存在する顆粒状点刻を示すデジタル画像（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける染色の欠失を示すデジタル画像（右パネル）である。この染色は、正常細胞に存在していたが、腫瘍細胞には存在していなかったため、スライドの解釈では排除された。
【図６】図６Ａは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける（右パネル）ムチンの染色を示すデジタル画像である。正常組織及び腫瘍細胞に染色がなかったため、この試料はＡＬＫ陰性であると解釈された。図６Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける（右パネル）ムチンの染色を示すデジタル画像である。正常組織は陰性であったが腫瘍細胞は染色されたため、この試料はＡＬＫ陽性であると解釈された。
【図７】図７Ａと７Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける（右パネル）幾つかのリンパ球の染色を示すデジタル画像である。この染色は、正常細胞に存在していたため、スライドの解釈では排除された。
【図８】図８Ａと８Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）染色（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ染色（右パネル）での腫瘍細胞におけるＡＬＫ ＩＨＣ発現の不在を示す２つの例示的ＡＬＫ陰性症例のデジタル画像である。
【図９】図９Ａと９Ｂは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）染色（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ染色（右パネル）の両方での弱い顆粒状細胞質染色を示す例示的ＡＬＫ陰性症例のデジタル画像である。
【図１０】図１０Ａ−Ｄは、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）染色（左パネル）での、対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ染色（右パネル）より顕著な細胞質染色を示す例示的ＡＬＫ陰性症例のデジタル画像である。これら症例は、強い細胞質染色の欠如のため、ＡＬＫ陰性であると解釈された。
【図１１】図１１は、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色された試料における（左パネル）及び対応するウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇスライドにおける（右パネル）膜／細胞質染色を示すデジタル画像である。染色は、ネガティブコントロールよりも抗ＡＬＫ抗体を用いて染色されたスライド上で高頻度にみられたが、強い顆粒状細胞質染色ではなかったため、この結果はＡＬＫ陰性であると解釈された。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
Ｉ．略語
ALK    未分化リンパ腫キナーゼ
DAB    3,3'-ジアミノベンジディンテトラヒドロクロリド
FISH    蛍光インサイツハイブリダイゼーション
H&E    ヘマトキシリン及びエオジン
HQ    3-ヒドロキシキノキサリン-2-カルボン酸
HRP    西洋ワサビペルオキシダーゼ
IHC    免疫組織化学
NSCLC    非小細胞肺癌
【０００６】
ＩＩ．用語
用語と方法の以下の説明は、本開示をより良く説明し、本開示を実施するために当業者を指導するために与えられる。単数形「a」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に特記する場合を除き、一又は一以上を指す。例えば、用語「抗体を含む」とは単数又は複数の抗体を包含し、「少なくとも一つの抗体を含む」のフレーズと等価であるとみなされる。用語「又は（ｏｒ）」は、文脈が明確に特記する場合を除き、記述された別の要素の単一要素、又は２つ以上の要素の組合わせを言う。本明細書で使用される場合、「包含する（comprises）」とは「含む（includes）」を意味する。従って、「Ａ又はＢを包含する」とは付加的要素を除外することなく、「Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含む」を意味する。本明細書で参照するＧＥＮＢＡＮＫ受入番号の日付は、少なくとも２０１２年９月２４日以前に利用可能となった配列のものである。
特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を持つ。本明細書に記載されるものと類似又は同等な方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用可能であるが、適切な方法及び材料は以下に記載される。材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定されるものとして意図されない。
本開示の様々な実施態様の総括を容易にするため、以下の特定用語の説明が与えられる。
【０００７】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）：  インスリンレセプターサブファミリーのレセプターチロシンキナーゼのメンバー。ＡＬＫは、細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを包含する。ＡＬＫ融合遺伝子をもたらす染色体再配置は、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞種、及び非小細胞肺癌を含む複数の腫瘍型に見出される。ALK/EMLは最も一般的なＡＬＫ遺伝子融合体であり、追加のＡＬＫ融合体には、ALK/RANBP2、ALK/ATIC、 ALK/TFG、 ALK/NPM1、 ALK/SQSTM1、 ALK/KIF5B、 ALK/CLTC、ALK/TPM4、及びALK/MSNが含まれる。
ＡＬＫ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベース（例えば、受入番号NP_004295 (タンパク質)、及び NM_004304 (核酸））から公的に入手可能である。当業者は、ＡＬＫ変異体及び／又はＡＬＫ遺伝子融合体を含む、追加のＡＬＫ核酸配列及びタンパク質配列を同定することができる。
【０００８】
ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性等のＡＬＫ活性を阻害又は低減する分子である。幾つかの実施態様において、ＡＬＫ阻害剤は、低分子、タンパク質（抗体等）、又は核酸（アンチセンス分子）であり得る。ＡＬＫ阻害剤は、リガンド（プレイオトロフィン等）のＡＬＫへの結合を阻害又は低減して、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を低減してもよい。ＡＬＫ阻害剤はまた、直接的にＡＬＫチロシンキナーゼ活性を阻害又は低減してもよく、例えば、ＡＴＰ競合性阻害剤（クリゾチニブ等）。アンチセンス分子等のＡＬＫ発現を阻害又は低減する分子もまたＡＬＫ阻害剤である。幾つかの実施態様において、ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫ遺伝子融合体（ＡＬＫ／ＥＭＬ４遺伝子融合体を含むがこれに限定されない）等の遺伝子改変のＡＬＫの活性を阻害又は低減する。ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害してもよく、又はＡＬＫチロシンキナーゼ活性の阻害に加えて、他のレセプターチロシンキナーゼ活性（ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦＲ等）を阻害してもよい。
【０００９】
抗体：  免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原（ＡＬＫ等）と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子。例示的抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びヒト化抗体を含む。
天然に生じる抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ等）は、ジスルフィド結合で相互に繋がった２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む。本明細書で使用される用語抗体はまた、一又は複数の抗体鎖をコードする核酸を細胞中で発現させることにより産生された組換え抗体を含む（例えば、米国特許第4,745,055号、米国特許第4,444,487号、国際出願第88/03565号、欧州出願第256,654号、欧州出願第120,694号、欧州出願第125,023号、Faoulkner et al., Nature 298286, 1982; Morrison, J. Immunol.123793, 1979; Morrison et al., Ann Rev. Immunol.  2239, 1984を参照されたい)。
用語抗体はまた、天然に生じる抗体又は組換え抗体の抗原結合断片を含む。用語抗体に包含される結合断片の具体的、非限定的例は、Fab、 （Fab’）２、Fv、及び単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。Ｆａｂは、抗体全体を酵素パパインで消化することにより、完全な軽鎖及び１つの重鎖の部分として得られて産生されるか又は遺伝子操作により等価的に産生される一価の抗原結合抗体分子断片である。Fab’は、抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元により得られる抗体分子断片であり、完全な軽鎖及び重鎖の部分として得られ、抗体分子あたり２つのFab’断片が得られる。(Fab’)2は、抗体全体を、続く還元をしないで酵素ペプシンで処理して得られるか又は遺伝子操作により等価的に得られる抗体断片である。F（Ａb’)2は、ジスルフィド結合により一緒に保持された２つのFＡb’のダイマーである。Ｆｖは、２本鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作断片である。一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む、遺伝子的に融合された単一鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された遺伝子操作分子である。これらの断片の作製法は当該分野でルーチンである。
【００１０】
色素原：  ピグメント又は色素等の着色産物へ変換可能な物質である。特定の色素原は電子供与体であり、酸化されると着色産物になる。着色産物の産生と、酸化等の化学変換で不溶性になるという性質は、色素原をＩＨＣに対して有用なものにする。発色化合物の特定の例としては、限定するものではないが、3,3'-ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、ファストレッド（ｆａｓｔ ｒｅｄ）、ファストブルー（ｆａｓｔ ｂｌｕｅ）、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２,２'-アジノ-ジ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４ークロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーＤ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレッドを包含する。
【００１１】
接触：  一つの薬剤をもう一つの薬剤の近傍に置くことにより、薬剤が相互作用することを可能にすることである。例えば、抗体を、生物学的試料を含有する顕微鏡スライド又は他の表面に適用することにより、該抗体により特異的に認識される試料中のタンパク質を検出することを可能にすることができる。 
【００１２】
クリゾチニブ：  ＡＬＫを強力に阻害するレセプターチロシンキナーゼ阻害剤である。クリゾチニブ（PF-02341066又はXALKORI, Pfizerとしても知られる）は、経口利用可能な、ＡＬＫ及びｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦＲチロシンキナーゼ及びそれらの発癌性変異体のＡＴＰ競合性低分子阻害剤である。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組込まれる、米国特許第7,230,098号、米国特許第7,825,137号、米国特許第7,858,643号、及び米国特許第8,217,057号を参照されたい。クリゾチニブは、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを持つ患者の治療に使用することができる。
【００１３】
検出：  媒介物（agent）の存在又は不在を決定することである。幾つかの実施態様において、これは定量をさらに含むことができる。例えば、特定のタンパク質（ＡＬＫ等）に対して特異的な抗体は、ＮＳＣＬＣ組織を含有する試料等の、試料中のタンパク質を検出可能にする。特定の実施態様において、検出可能な標識（標的が存在する場合のシグナルの増加等）からの放出シグナルが検出される。検出はバルクでも可能で、巨視的数の分子が同時に観察され得る。検出はまた、顕微鏡及び背景ノイズを低減させる全反射照明といった技術を用いた単一分子からのシグナルの同定を含むことができる。
【００１４】
標識：  例えば、分光光度法、フローサイトメトリー、又は顕微鏡（光学顕微鏡等）によって検出可能な試薬である。例えば、一又は複数の標識を抗体に付着させて、それにより標的タンパク質の検出を可能にすることができる。例示的標識は、放射性同位元素、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、ハプテン、酵素、及びそれらの組み合わせを含む。
【００１５】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）：  小細胞肺癌以外の任意のタイプの肺癌である。ＮＳＣＬＣは、扁平上皮細胞癌（ＳＱＣＣ）、腺癌（ＡＤＣ）、及び大細胞癌を含む。ＡＤＣと大細胞癌の両方が、非扁平上皮細胞タイプの癌として分類されている。ＡＤＣがは、腺房癌、乳頭癌、気管支肺胞癌（ＢＡＣ）、固形癌、及び混合亜型を含むサブクラスへグループ化できる(2004 World Health Organization classification of lung tumors, Beasley et al., Semin.Roentgenol.4090-97, 2004)。ＡＤＣは、全肺癌の約４０％に及び、喫煙したことのない個人の間で最も一般的な形態の肺癌である。ＡＤＣは、非扁平上皮タイプのＮＳＣＬＣとして分類されている。組織学的には、ＡＤＣは腺形成、乳頭構造、又はムチン産生を伴う固形成長を示す。大細胞癌は、巨細胞腫瘍、明細胞癌、腺扁平上皮癌、及び未分化癌を含む。
【００１６】
正常細胞又は組織：  非腫瘍、非悪性細胞及び組織である。 
【００１７】
試料：  被験者から得た、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、又はそれらの組合わせを含む生物学的標本である。例としては、例えば、組織又は腫瘍生検、細針吸引物、気管支肺胞洗浄液、胸水、痰、手術標本、リンパ節、ＮＳＣＬＣ転移、末梢血、又は剖検材料等の少なくとも１個のＮＳＣＬＣ細胞（「ＮＳＣＬＣ試料」）を含有する標本が含まれる。他の例において、試料は非ＮＳＣＬＣ細胞又は組織等の対照試料を含む。
【００１８】
感度及び特異性：  ２値分類試験のパフォーマンスの統計的測定である。感度は、正確に同定された現実の陽性の比率（ＦＩＳＨ等の別の方法によりＡＬＫ陽性と同定されるＡＬＫ陽性であると同定されるべきＮＳＣＬＣ腫瘍の百分率等）を測定する。特異性は、陰性の比率（ＦＩＳＨ等の別の方法によりＡＬＫ陰性と同定されるＡＬＫ陰性であると同定されるＮＳＣＬＣ腫瘍の百分率等）を測定する。
【００１９】
被検体：  ヒト及び獣医学的被検体等の非ヒトほ乳類を含むカテゴリーの、多細胞脊椎生物である。特定の例において、被検体は、ＮＳＣＬＣ等の、肺癌を持つか又は肺癌を持つと推測される者である。
【００２０】
治療的有効量：  進行の抑制、増悪の遅延、又は疾患の減弱、又は例えば肺癌（ＮＳＣＬＣ等）等の癌等の疾患により引き起こされる症状の低減に十分な用量である。
〜に十分な条件下：  所望の活性を許容する任意の環境を記載するのに用いられる語句である。例には、試料中の一又は複数の標的分子（ＡＬＫ等）の検出を可能にするのに十分に抗体をＮＳＣＬＣ試料と接触させることが含まれる。
【００２１】
ＩＩＩ．  ＡＬＫ阻害剤に応答する可能性が高い腫瘍を持つとして被検体を同定する方法
本明細書は、ＡＬＫ阻害剤、例えばクリゾチニブ、を用いる治療に応答すると予測されるＮＳＣＬＣを持つとして被検体を同定する方法の実施態様を開示する。実施態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いてＮＳＣＬＣ腫瘍細胞をＡＬＫ陽性と又はＡＬＫ陰性と同定すること及び本明細書に開示の方法をスコア化することを含む。ＮＳＣＬＣ腫瘍がＡＬＫ陽性と同定された場合に、被検体がＡＬＫ阻害剤での治療に応答する可能性が高いか又は応答すると予測されるＮＳＣＬＣを持つと同定され、ＮＳＣＬＣ腫瘍がＡＬＫ陰性と同定された場合に、被検体がＡＬＫ阻害剤での治療に応答する可能性が低いか又は応答しないと予測されるＮＳＣＬＣを持つと同定される。
ＡＬＫ阻害剤を用いた治療のためのＮＳＣＬＣを持つ被検体を選択するための現在の方法は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを利用して被検体の腫瘍がＡＬＫ陽性であるか否かを決定することに基づいている。しかしながら、ＦＩＳＨは、本明細書に開示の方法と比較して幾つかの不利点を提示する。ＦＩＳＨアッセイは、より時間がかかり、より高価で且つ、本明細書に開示の方法等、ＩＨＣ法よりも結果の解釈に実質的により専門的な専門性を要する。加えて、本明細書に開示の方法は、ＮＳＣＬＣ腫瘍を高感度及び高特異性で、ＡＬＫ陽性又はＡＬＫ陰性と同定する「２値」スコア化法を提供する。
【００２２】
ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの迅速且つ正確な同定（例えば、腫瘍中にＡＬＫ遺伝子再配置を持つ、及び／又はＡＬＫを発現する）は、患者のケアを先導するのに重要である。ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ）を用いて治療された、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを持つ被検体は、５０％より高い全体的応答率を示した (e.g., Kwak et al., N. Engl. J. Med.3631693-1703, 2010; Shaw et al., Lancet Oncol.121004-1012, 2011)。ＮＳＣＬＣにおけるＡＬＫ遺伝子再配置は、約２−７％の頻度を有すると推定されている。従って、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの正確な同定は、ＡＬＫ阻害剤治療から利益を受ける可能性が高い被検体を選択するのに必要である。しかしながら、現在使用されているＦＩＳＨ「ブレーク・アパート」アッセイは、試料解釈において、顕著なチャレンジを提示する。例えば、染色体内遺伝子再配置は、潜在的に偽陰性の結果を導く、不安定な、検出困難な、分割したシグナルを産生する。加えて、ＦＩＳＨアッセイは、５０個の核に対するシグナルパターンの列挙を要求する。５０細胞中５を下回る細胞が陽性である場合、試料はＡＬＫ陰性であるとみなされ、５０細胞中２５を超える細胞が陽性である場合、試料はＡＬＫ陽性であるとみなされる。しかしながら、５−２５の陽性細胞が存在する場合、試料は多義的であり、第２の読み取り者が要求される；次いで、平均パーセント細胞が１５％以上の場合、試料はＡＬＫ陽性であるとみなされる。このように、ＦＩＳＨアッセイは、時間がかかり費用追加的な試験を必要とさせる、相当数の「多義的」結果を産生することがある。さらに、最小腫瘍含量要求を満たさない場合、試料はＦＩＳＨにより試験されないため、細針吸引物又はＦＦＰＥ組織学的試料等の多くの症例標本はＦＩＳＨにより試験されることはない。最後に、ＦＩＳＨは、約１０−３０％の不成功率を有し、多くの標本がＡＬＫ結果を持つことがなく、ＡＬＫ陽性被検体が見過ごされ、最適な治療を得ることがない。
【００２３】
対照的に、開示された実施態様は、ＡＬＫのＩＨＣ検出を利用する。ＩＨＣ法は、迅速で、解剖学的病理学研究室においてルーチンであり、光学顕微鏡を利用し（専用の暗視野蛍光顕微鏡を要するＦＩＳＨと比較して）、ＦＩＳＨより安価であり、解釈に専用の専門性を要求しない。加えて、開示された実施態様は自動化することができ、これは標準化された染色を提供し、アッセイの感度と特異性をさらに改善させる。開示されたＩＨＣ法のもう一つの利点は、事前に特定された腫瘍細胞含量要求がない（一方、ＦＩＳＨアッセイは少なくとも５０の腫瘍細胞を要求する）ことである。加えて、開示されたＩＨＣ法は、病理学者又は読み取り者に（ＦＩＳＨ法と対照的に）組織試料全体を評価することを可能にする。ＦＩＳＨに関しては、腫瘍を含有すると同定された試料の部分だけがＦＩＳＨ試薬と接触させられる。従って、ＡＬＫが組織上の異なる腫瘍領域に存在する場合、これは同定されないであろう。対照的に、開示された方法は、組織試料全体の文脈において、読み取り者にスライド上の腫瘍全体をみることを可能にする。最後に、本明細書に開示のスコア化法は、「２値」（陽性又は陰性）であり、従って明確な結果を提供する。ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ腫瘍検出のための以前のＩＨＣ法ですら、追加の試験を要求する不明確な結果を頻繁に生じさせ (例えば、Yi et al., J. Thorac.Oncol.6459-465, 2011)、又は半定量的なグレードの染色強度と免疫反応性腫瘍細胞の百分率の推定 を利用している(例えば、Mino-Kenudson et al., Clin.Cancer Res.161561-1571, 2010)。しかしながら、開示されたＩＨＣ法とスコア化法は、少しの腫瘍細胞（又は１つの腫瘍細胞のみでさえ）がＡＬＫ抗体で強い顆粒状の細胞質染色を示す場合でさえ、ＮＳＣＬＣ腫瘍の高感受性且つ特異的同定を提供する。
【００２４】
Ａ．  ＡＬＫの検出
特定の例において、被検体から得た試料は分析され、一又は複数の腫瘍細胞における検出可能なレベルのＡＬＫタンパク質等、これがＡＬＫタンパク質を含有するか否かが決定される。このように、試料は試料中のＡＬＫタンパク質の存在を検出又は測定、例えば、定量的又は半定量的測定されることができる。特定の例において、開示された方法は、試料中の腫瘍細胞におけるＡＬＫタンパク質の存在の定量的測定を利用する。
開示された実施態様は、ＩＨＣを利用して、被検体からの試料中のＡＬＫタンパク質を検出する。ＩＨＣは、抗原と抗体等の特異的結合薬剤との相互作用を検出することにより、試料（例えば、ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞又は組織を含む組織の部分又は切片等のＮＳＣＬＣ試料等）における抗原（タンパク質等）の存在又は分布を決定する方法である。抗原（標的抗原等）を含有する試料は、抗体−抗原結合を許容する条件下抗体とインキュベートされる。抗体−抗原結合は、抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識によって（直接的検出）又は、１次抗体に対して生じさせた２次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識によって（間接的検出等）検出することができる。間接的検出の他の例において、抗体−抗原結合は、２次抗体に結合可能な３次抗体（２次抗体に対して生じさせた、又はハプテン等の２次抗体にコンジュゲートされた分子に対して生じさせた）にコンジュゲートされた検出可能な標識によって検出される。ＩＨＣに使用することができる例示的な検出可能な標識は、限定されないが、放射性同位元素、蛍光色素（フルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、及びローダミン等）、ハプテン、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼ等）及び色素原（3,3'-ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又はファストレッド等）を含む。幾つかの例において、抗体−抗原結合はまた、シグナル増幅（チラミドシグナル増幅又は関連法）を含む。シグナル増幅法は、米国特許公開第2012/0171668号に記載の方法を含んでもよく、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【００２５】
幾つかの例において、特異的結合剤は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、又はその断片等の抗体である。幾つかの例において、抗体はヒト化抗体である。幾つかの例において、抗体はキメラ抗体である。所望の場合、抗体は、標的タンパク質／抗体複合体の検出を許容する、及び幾つかのケースにおいては標的タンパク質／抗体複合体の定量を許容する検出可能な標識を含有することができる。他の例において、抗体は適切に標識された２次抗体を用いて検体される。追加の例において、抗体は適切に標識された３次抗体を用いて検体される。
【００２６】
幾つかの例において、ＡＬＫに対する抗体は、Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson, AZ)から得られる。特定の例において、抗体は、抗ＡＬＫ D5F3ウサギモノクローナル抗体（Ventana、カタログ番号790-4794）である。しかしながら、当業者は、限定されないが、抗ALK 5A4抗体(Abcam, Cambridge, MA; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、抗ALK ALK1抗体(Dako, Carpinteria, CA)、及び抗ALK D9E抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)を含む、他の供給源から、本明細書に提供される方法に使用することができる他の抗体が商業的に利用可能であることを理解する。当業者は、現在利用可能であるか又は将来開発されるものを含む、本開示の方法に使用することができる追加の抗ＡＬＫ抗体を選択することができる。
幾つかの例において、肺癌試料（ＮＳＣＬＣ腫瘍組織を含む試料等）が得られ、ＩＨＣのために処理される。例えば、試料は固定され、例えば、ホルマリン及びパラフィンで包埋される。試料は次いで、顕微鏡ガラススライド等の支持体上にマウントされる。例えば、試料は連続の薄い切片にスライスされ（例えば、マイクロトームを使用して）、切片は顕微鏡スライドにマウントされる。幾つかの例において、単一のスライドは同じ肺癌試料からの多数の組織切片を含むか、又は同じ肺癌試料からの切片は異なるスライド上に置かれることができる。肺癌（ＮＳＣＬＣ腫瘍等）試料の異なる切片は次いで、個々に異なる抗体、例えば、抗ＡＬＫ抗体とネガティブコントロール抗体（例えば、試料中の内在的抗原に特異的に結合しない抗体）を用いて標識されることができる。つまり、１つの切片が抗ＡＬＫ抗体を用いて標識され、もう１つの切片がネガティブコントロール抗体（試料中に内在的に生じることのない標的に結合する抗体等）を用いて標識されることができる。幾つかの例において、抗ＡＬＫ抗体（又はネガティブコントロール抗体）を用いて標識されたスライドはまた、（例えば、試料中の細胞タイプを区別する等の形態学的又は組織学的情報を提供するのに）ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色される。他の例において、同じ被検体からの別のスライドは、Ｈ＆Ｅを用いて標識される（同じＮＳＣＬＣ試料からの連続切片等）。幾つかの例において、さらなる抗体（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＲＡＳ抗体、及び／又は抗ＨＥＲ２抗体）を用いて標識することにより、同一の又は追加の組織試料において、追加の対象タンパク質が検出され得る。幾つかの例において、自動化スライドステイナー（例えば、BENCHMARK XT又はBENCHMARK GX装置等の、Ventana Medical Systemsから入手するBENCHMARK装置等）を使用して、スライドを染色し処理することができる。
【００２７】
幾つかの例において、試料においてＡＬＫタンパク質を検出することは、抗ＡＬＫ抗体の試料への結合の間接的検出を含む（例えば、抗ＡＬＫ（１次）抗体は検出可能に標識されていない）。例えば、試料は、抗ＡＬＫ抗体（抗ＡＬＫ D5F3抗体等）と、抗ＡＬＫ抗体が試料中のＡＬＫタンパク質に結合するために十分な条件下、接触させられる。試料は次いで、抗ＡＬＫ抗体と特異的に結合することができる２次抗体（抗ＡＬＫ抗体がウサギ抗体である場合、抗ウサギ抗体等）と、２次抗体が抗ＡＬＫ抗体に結合するのに十分な条件下、接触させられる。２次抗体は検出可能に標識されることができる。検出可能な標識は、２次抗体にコンジュゲートされることができる。幾つかの例において、２次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識は、直接的に検出される（蛍光標識、又は、適切な基質の存在において検出可能な反応産物を産生することができる酵素等）。他の実施態様において、２次抗体は、一又は複数のハプテン（フルオレセイン、ジニトロフェニル、ビオチン、又は3-ヒドロキシキノキサリン-2-カルボン酸（ＨＱ）等）とコンジュゲートされる。試料は次いで、ハプテンでコンジュゲートされた２次抗体と特異的に結合することができる３次抗体（例えば、抗ＨＱ抗体等の抗ハプテン抗体）と、３次抗体がハプテンに結合するのに十分な条件下、接触させられる。幾つかの例において、３次抗体は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、又はアルカリフォスファターゼ（ＡＰ））等の検出可能な標識にコンジュゲートされる。試料は次いで、酵素存在下で検出可能な反応産物を産生する一又は複数の試薬と接触させられる。幾つかの例において、試料は、ＨＲＰ基質（過酸化水素等）及びＨＲＰ存在下で視覚的に検出可能な産物を産生する色素原（ＤＡＢ等）と接触させられる。幾つかの例において、試料中のＡＬＫタンパク質の検出は、OPTIVIEW DAB IHC検出キット(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, カタログ番号760-700)を使用して行われる。
【００２８】
さらなる例において、試料中のＡＬＫタンパク質の検出は、シグナル増幅を含む間接的検出を含む。幾つかの例において、シグナル増幅は、シグナル増幅なしでは弱い染色しか示さないＡＬＫ陽性標本の明確な検出を可能にする。ＩＨＣのためのシグナル増幅法は、当業者に既知である。幾つかの例において、シグナル増幅は、Tyramide Signal Amplification (TSA（商標）)としても知られる、CAtalyzed Reporter Deposition (CARD)を含む。この方法の一変法において、酵素でコンジュゲートされた２次抗体（ＨＲＰがコンジュゲートされた２次抗体等）が１次抗体に結合する。次いで、ビオチン化チラミドの基質（チラミンは4 - （2 - アミノエチル）フェノールである）が使用され、それはＨＲＰ酵素と相互作用すると、恐らくフリーラジカルになる。フェノール性ラジカルは次いで迅速に周辺の物質と反応し、従って、近傍にビオチンを沈着させるか又は固定する。このプロセスはさらに基質（ビオチン化チラミド）を与え、さらに局所性ビオチンを増大させることにより繰り返される。最後に、「増幅された」ビオチン沈着物が蛍光性分子へ結合したストレプトアビジンで検出される。あるいは、増幅されたビオチン沈着物は、アビジン-ペルオキシダーゼ複合体で検出することができ、その後ＤＡＢと接触させられ茶色を生成する。
【００２９】
他の例において、シグナル増幅は、試料をＨＲＰでコンジュゲートされた３次抗体と接触させた後に、１次抗体が試料に結合した部位又はその近傍にＨＱが沈着するのに十分な条件下、試料を過酸化水素及びチラミド−ＨＱコンジュゲートと接触させることを含む。試料は次いで、ＨＱに特異的に結合する、酵素でコンジュゲートされた抗体（ＨＲＰ又はＡＰでコンジュゲートされた抗体等）と接触させられる。幾つかの例において、この酵素でコンジュゲートされた抗体は、ＨＲＰでコンジュゲートされた３次抗体と同一である。他の例において、酵素でコンジュゲートされた抗体は、ＨＲＰでコンジュゲートされた３次抗体とは異なる抗体である。試料は次いで、酵素存在下で検出可能な反応産物を産生する一又は複数の試薬と接触させられる。幾つかの例において、試料は、ＨＲＰ基質（過酸化水素等）及びＨＲＰ存在下で視覚的に検出可能な産物を産生する色素原（ＤＡＢ等）と接触させられる。幾つかの例において、シグナル増幅は、OPTIVIEW Amplification Kit (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, カタログ番号760-099)を使用して行われる。
【００３０】
Ｂ．  ＡＬＫ陽性又はＡＬＫ陰性としての試料のスコア化
ＡＬＫ陽性又はＡＬＫ陰性としての試料のスコア化には、検出可能に標識されたＡＬＫを有するＮＳＣＬＣ試料（例えば、一又は複数のスライド、１、２、３、４、又は５スライド等）が使用される。幾つかの例において、ＮＳＣＬＣ試料は、ＡＬＫに対して特異的な抗体及び適切に標識された２次及び／又は３次抗体を用いて、例えば、上記セクションＡに記載されたように、標識されることができる。非限定的一例において、OPTIVIEW DAB IHC Detection Kit 及びOPTIVIEW Amplification Kit が、製造元の指示書に従って使用される(Ventana Medical Systems, Inc., それぞれ、カタログ番号760-700及び760-099)。
【００３１】
抗ＡＬＫ標識ＮＳＣＬＣ試料（又はそのデジタル画像）は、（例えば、光学顕微鏡を用いて又は用いずに）、例えば、病理学者により、視覚的に検査される。幾つかの例において、試料全体（組織切片全体等）が、例えば、光学顕微鏡を使用して、例えば、約２ｘ〜２０ｘ倍率で、視覚的に検査される。他の例において、少なくとも１つの視野（少なくとも２、３、４、又は５つの異なる視野等）が、視覚的に検査される。視野は、切片全体又は切片のデジタル画像よりも小さい、顕微鏡により分析されるべき試料（例えば、組織切片）の領域である。幾つかの例において、２ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、又は６０ｘ倍率（２ｘ〜２０ｘ倍率等）で視認可能な試料の領域である。
【００３２】
開示された方法は、腫瘍をＡＬＫ陽性又はＡＬＫ陰性であるとして同定（例えば、スコア化）して、例えば、ＡＬＫ阻害剤に対するＮＳＣＬＣの応答可能性等の、予後情報を提供するのに使用することができる。腫瘍（例えば、腫瘍性）細胞は、腫瘍細胞におけるＡＬＫタンパク質の発現を示す、検出可能な標識（染色）の存在を評価される。腫瘍細胞における（腫瘍細胞の任意の百分率）強い顆粒性染色の存在を有する試料は、ＡＬＫ陰性であると同定又はスコア化される。抗ＡＬＫ抗体を用いて標識された試料中の少なくとも１つの腫瘍細胞（2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、又はより多くの腫瘍細胞等）における強い顆粒性細胞質染色は、ＡＬＫ陽性試料としてスコア化される。例えば、抗ＡＬＫ抗体を用いて標識された試料中の約1-100,000細胞（10-100,000細胞、1000-100,000細胞、1000-50,000細胞、10,000-50,000細胞、10-50,000細胞、500-50,000細胞、又は約1000-10,000細胞等）における強い顆粒性染色は、ＡＬＫ陽性試料としてスコア化される。幾つかの例において、強い顆粒性細胞質染色は、腫瘍の腫瘍性部分にわたって均一に分布する。他の例において、強い顆粒性細胞質染色は、腫瘍の腫瘍性部分にわたって不均一に分布する。いずれかの例において、腫瘍の腫瘍性部分における（少なくとも一又は複数の腫瘍細胞における等）強い顆粒性細胞質染色は、ＡＬＫ陽性としてスコア化される。
【００３３】
抗ＡＬＫ抗体を用いて標識された試料における少なくとも１つの腫瘍細胞に強い顆粒性細胞質染色が存在しない場合、試料はＡＬＫ陰性試料としてスコア化される。幾つかの例において、試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する腫瘍細胞がない限り、腫瘍細胞において、細胞質染色を有さない（例えば、バックグラウンド又はネガティブコントロールのレベルを超える染色がない）、弱い細胞質染色を有する、及び／又は中間的細胞質染色を有するＮＳＣＬＣ試料は、ＡＬＫ陰性試料としてスコア化される。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在する（この場合、試料はＡＬＫ陽性としてスコア化される）のでなければ、弱い細胞質染色及び／又は中間的細胞質染色を任意の数の腫瘍細胞に有するＮＳＣＬＣ試料は、ＡＬＫ陰性としてスコア化される。
【００３４】
染色強度（例えば、半定量的ＩＨＣ法）の決定法は、当業者に知られている。幾つかの例において、強い顆粒性細胞質染色は、当業者により「３＋」強度の染色として同定される一又は複数の腫瘍細胞の染色を含む（例えば、バックグラウンドを超える染色がない場合に０の、弱い強度の染色に１＋の、中間的強度の染色に２＋の、強い強度の染色に３＋のスケールを利用して）。従って、幾つかの例において、３＋（強い染色等）の細胞質染色強度を有する少なくとも１つの細胞の存在は、ＡＬＫ陽性試料であるとみなされる。幾つかの例において、試料中に強い顆粒性細胞質染色（３＋染色強度等）を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、任意の数の腫瘍細胞での、当業者によって１＋（弱い染色等）又は２＋（中間的染色等）として同定される細胞質染色の試料における存在は、ＡＬＫ陰性試料としてスコア化される。
当業者は、例えば、形態学的及び／又は組織学的特徴に基づいて、腫瘍性である（腫瘍細胞）試料の部分及び正常組織又は細胞である試料の部分を同定することができる。幾つかの例において、試料（例えば、抗ＡＬＫ抗体を用いて標識された同一の試料又は近接の組織切片）は、Ｈ＆Ｅを用いて染色され、組織及び細胞の形態を同定することを支援する。
【００３５】
開示された方法の幾つかの例において、一又は複数の壊死腫瘍領域が標識された試料に存在し得る。抗ＡＬＫ抗体を用いた壊死腫瘍領域又は壊死腫瘍細胞（例えば、保存された細胞の輪郭の有無にかかわらず、核の欠失及び炎症性浸潤を伴う腫瘍領域）の染色は、腫瘍細胞の陽性染色であるとはみなされず、腫瘍細胞の強い顆粒性細胞質染色の評価から排除される。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、壊死腫瘍細胞又は領域の如何なる強度の染色（強い強度の染色を含む）を有する試料もＡＬＫ陰性であるとみなされる。
【００３６】
開示された方法の他の例において、非腫瘍細胞又は細胞要素の染色は、たとえ強い顆粒性細胞質染色であっても陽性染色であるとはみなされず、試料の評価から排除される。例えば、神経由来の細胞（神経細胞及び／又は神経節細胞等）は、ＡＬＫを発現することが知られている（例えば、Iwahara et al., Oncogene 14439-449, 10997）。従って、神経又は神経節（又は神経由来の他の細胞）の染色は、試料の評価には含まれない。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、神経由来の細胞の如何なる強度の染色を有する試料もＡＬＫ陰性であるとみなされる。
【００３７】
追加の例において、正常粘膜又は腺上皮細胞の染色（たとえ強い顆粒性細胞質染色であっても）は、ＡＬＫ陽性染色であるとはみなされず、試料の評価から排除される。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、正常粘膜又は腺上皮細胞の如何なる強度の染色を有する試料もＡＬＫ陰性であるとみなされる。同様に、肺胞のマクロファージの抗ＡＬＫ染色（例えば、薄い顆粒状細胞質点刻）又は浸潤リンパ球の抗ＡＬＫ染色は、ＡＬＫ陽性染色であるとはみなされず、試料の評価から排除される。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、肺胞のマクロファージ又は浸潤リンパ球の如何なる強度の染色を有する試料もＡＬＫ陰性であるとみなされる。
【００３８】
さらなる例において、ムチンは抗ＡＬＫ抗体により染色されるが、ＡＬＫ陽性染色であるとはみなされず、試料の評価から排除される。試料中に強い顆粒性細胞質染色を有する少なくとも１つの腫瘍細胞が存在しない限り、ムチンの如何なる強度の染色を有する試料もＡＬＫ陰性であるとみなされる。
【００３９】
幾つかの例において、スコア化法は、抗ＡＬＫ標識ＮＳＣＬＣ試料を抗ＡＬＫ抗体で標識された一又は複数のコントロール（例えば、ＮＳＣＬＣ試料として同じＩＨＣ施行でアッセイされたコントロール）と比較することを含む。幾つかの例において、コントロールは、ＡＬＫ陽性であることが知られている細胞（例えば、Ｈ２２８細胞）を含有する試料等、陽性コントロールを含む。他の例において、コントロールは、ＡＬＫ陰性であることが知られている細胞（例えば、Ｃａｌｕ−３細胞）を含有する試料等、陰性コントロールを含む。幾つかの例において、陽性及び／又は陰性コントロール試料は、アッセイ試薬及び装置の適切な機能を確保するためのシステムレベルのコントロールである。一例において、コントロールは、陽性及び陰性コントロールの両方を含む（例えば、ALK 2 in 1 Control Slides, Ventana Medical Systems, Inc., カタログ番号781-4796）。
【００４０】
他の例において、陰性コントロールは、陰性コントロール抗体を用いて染色されたＮＳＣＬＣ試料を含む。幾つかの例において、陰性コントロール抗体は、ＮＳＣＬＣ試料には内在的に存在しない標的抗原に特異的に結合する抗体である。幾つかの例において、陰性コントロール抗体は、モノクローナル抗体等の免疫グロブリンである。陰性コントロール抗体を用いた染色は、被検体からの試料におけるバックグラウンド染色のレベルを評価するのに使用することができる。幾つかの例において、陰性コントロール抗体を用いて染色されたＮＳＣＬＣ試料は、抗ＡＬＫ抗体を用いて染色された試料と同一の被検体から得たＮＳＣＬＣ試料（該試料の近接又は連続切片等）である。他の例において、陰性コントロール抗体を用いて染色されたＮＳＣＬＣ試料は、抗ＡＬＫ抗体を用いて染色された試料とは異なる被検体からのものである。
【００４１】
Ｃ．  試料
被検体から生物学的試料を取得する方法は、当業者に知られている。例えば、肺組織又は肺細胞を取得する方法は、ルーチンである。例えば、細胞材料を含有する肺腫瘍からの試料は、全腫瘍又は腫瘍の一部の外科的切除により、腫瘍から細針吸引物を収集することにより、並びに当該分野で既知の他の方法により取得することができる。幾つかの例において、試料はＮＳＣＬＣを持つか又は持つことが疑われる被検体から取得することができる。特定の例において、被検体から取得した試料は、少なくともＮＳＣＬＣ腫瘍部分等のＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を含む。幾つかの例において、被検体からの試料はまた、正常（非腫瘍等）組織又は細胞を含む。 
試料は収集後固定により処理され、幾つかの例においてはワックス（パラフィン等）で包埋される。マウントされた細胞及び組織調整物のための固定液は当該分野でよく知られており、限定されないが、以下を含む：  ホルマリン固定液、９５％アルコール性Bouin’s固定液、９５％アルコール固定液、Ｂ５固定液、Bouin’s固定液、Karnovsky’s固定液（グルタルアルデヒド）、Hartman’s固定液、Hollande’s固定液、Orth’s溶液（ジクロメート固定液）、及びZenker’s固定液（Carson, Histotechology A Self-Instructional Text, ChicagoASCP Press, 1997等を参照されたい）。ＡＬＫ染色強度は、特定の固定液（９５％アルコール、ＡＦＡ，Ｂ５、又はＰｒｅｆｅｒ等）が使用された場合に減少する。ＡＬＫ染色はまた、組織試料が収集の短時間以内に固定されなかった場合又は十分な時間で固定されなかった場合にも減少し得る。特定の例において、試料は中性平衡化ホルマリン（１０％中性平衡化ホルマリン等）又は亜鉛ホルマリン中で固定される。幾つかの例において、試料は少なくとも約６時間（例えば、約６〜４８時間、１２〜２４時間又は約６、１２、１６、１８、２４、３６、又は４８時間）固定される。追加の例において、試料は、収集の６時間以内（例えば、約１５分、３０分、１、２、３、４、５、又は６時間以内）に固定液に置かれる。
【００４２】
幾つかの例において、試料は、ＮＳＣＬＣ腫瘍を含む固定され、ワックスで包埋された肺組織試料等の、固定され、ワックスで包埋された肺組織試料である。幾つかの例において、試料は、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色されたＮＳＣＬＣ腫瘍を含む肺組織切片である。幾つかの例において、試料は、直接的又は間接的（標識２次抗体等）に標識されてもよく、幾つかの例においてはさらにＨ＆Ｅで染色される、ＡＬＫに対して特異的な１次抗体で標識されたＮＳＣＬＣ腫瘍を含む肺組織切片である。
幾つかの例において、試料（又はその断片）は、固体支持体上に存在する。固体支持体は、生物学的試料を有し、試料中のコンポーネント（タンパク質等）の便利な検出を可能にする。例示的支持体又は物質は、スライド（ガラス顕微鏡スライド又はプラスチック顕微鏡スライド等）、カバースリップ（ガラスカバースリップ又はプラスチックカバースリップ等）、組織培養皿、マルチウェルプレート、膜（ニトロセルロース又はポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ））又はBIACORE（商標）チップを含む。
【００４３】
Ｄ．  治療法
開示された実施態様は、例えば、被検体からの試料がＡＬＫ陽性とスコア化された場合に、ＡＬＫ阻害剤で治療するための被検体を選択することをさらに含むことができる。加えて、開示された方法は、被検体からの試料がＡＬＫ陽性とスコア化された場合に、被検体にＡＬＫ阻害剤を投与することをさらに含むことができる。
【００４４】
幾つかの例において、ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ(Pfizer, New York, NY)、AP26113 (Ariad Pharmaceuticals, Cambridge, MA)、 CH5424802 (Chugai Pharmaceutical, Tokyo, Japan)、 LDK378 (Novartis, Basel, Switzerland)、ASP3026 (Astellas Pharma, Northbrook, IL)、 X-396 (Xcovery, West Palm Beach, FL)、 又はレタスピマイシン（retaspimycin） (Infinity Pharmaceuticals, Cambridge, MA)等の低分子阻害剤である。追加のＡＬＫ阻害剤は、3-39 (Novartis),、GSK1838705A (GlaxoSmithKline, Boston, MA)、及びCEP-28122 (Cephalon, Frazer, PA)を含む。別の例において、ＡＬＫ阻害剤は、ヒト化抗ＡＬＫ抗体等の抗ＡＬＫ抗体である。
【００４５】
幾つかの例において、開示された方法は、被検体（ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣを持つ被検体等）に治療的有効量のＡＬＫ阻害剤を提供することを含む。係る薬剤及び治療の方法及び治療的用量は、当業者に知られており、例えば、熟練した臨床家によって決定されることができる。非限定的例において、治療的有効量のクリゾチニブは、ＡＬＫ陽性と同定されたＮＳＣＬＣ腫瘍を持つ被検体に投与される。幾つかの例において、クリゾチニブの治療的有効量は、約50-2000 mg/日（約50、100、150、200、250、300、400、500、600、700 ,800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000 mg/日）であることができ、１日あたり一又は二用量で経口的に投与される。幾つかの例において、方法は、被検体からの試料がＡＬＫ陽性とスコア化された場合に、２００ｍｇのクリゾチニブを１日あたり１又は２回被検体に経口的に投与することを含む。他の例において、方法は、被検体からの試料がＡＬＫ陽性とスコア化された場合に、２５０ｍｇのクリゾチニブを１日あたり１又は２回被検体に経口的に投与することを含む。被検体へのクリゾチニブの用量及び投与スケジュールは、腫瘍部位、腫瘍段階、腫瘍グレード、患者の治療履歴、患者行動及び栄養状態、随伴性の健康問題、社会的及びロジスティック因子、以前の原発腫瘍、及び患者の好み等の追加の因子を考慮して、熟練した臨床家により決定されることができる。クリゾチニブは、連続的投与スケジュールで又は一又は複数のサイクル（例えば、２１〜２８日の一又は複数のサイクル）で投与されてもよい。サイクルで投与される場合、治療は２１〜２８日ごとに反復されてもよい。
【００４６】
幾つかの実施態様において、被検体はまた、ＡＬＫ阻害剤と併用して一又は複数の追加の化学療法剤を投与される。追加の化学療法剤は以下を含むが、これらに限定されるものではない：ナイトロジェンマスタード類（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロフォスファミド、イフォスファミド及びメルファラン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン）、プラチナ化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン及びＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロルエタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、及びウラムスチン等のアルキル化剤；葉酸 (例えば、メトトレキセート、ペメトレキシド（pemetrexed）及びラルティトレキシド（raltitrexed）)、 プリン (例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン及びチオグアニン)、ピリミジン (例えば、カペシタビン)、シタラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビン等の代謝拮抗剤；ポドフィラム（podophyllum） (例えば、エトポシド及びテニポシド)、タキサン (例えば、ドセタキセル及びパクリタキセル)、ビンカ (例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン)等の植物アルカロイド；アンソラサイクリン（anthracycline）ファミリーメンバー (例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダルビシン、マイトキサントロン及びバルルビシン（valrubicin）)、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレア及び マイトマイシン等の細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質；トポテカン及びイリノテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤；アレムツズマブ（alemtuzumab）、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ及びトラスツズマブ等のモノクローナル抗体；アミノレブリン酸、メチルアミノレブリネート、ポルフィマーナトリウム及びベルテポルフィン等の光感受性物質；及びアリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、亜ヒ酸、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、 ボルテゾニブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペガスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフィニブ、バンデタニブ及びトレチノイン等の他の薬剤。係る薬剤の選択及び治療的用量は、当業者に知られており、熟練した臨床家によって決定されることができる。
【００４７】
他の例において、開示された方法は、手術、放射線治療、及び／又は化学療法剤をＡＬＫ阻害剤と組合わせ被検体に提供することを含む（例えば、連続的に、実質的に同時に、又は同時に）。係る薬剤と治療の方法及び治療的用量は、当業者に知られており、熟練した臨床家によって決定されることができる。
本開示は、以下の非限定的実施例により説明される。
【実施例】
【００４８】
実施例1
ＡＬＫ免疫組織化学プロトコル
この実施例は、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ試料の同定のためのＡＬＫ ＩＨＣ法を記載する。
ホルマリン固定パラフィン包埋ＮＳＣＬＣ組織切片が、抗ＡＬＫ D5F3ウサギモノクローナル抗体 (Ventana Medical Systems, カタログ番号790-4794)を用いて染色された。各ＮＳＣＬＣ試料からの別々の組織切片が、ウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇ(Ventana, カタログ番号790-4795)を用いて染色された。スライドは、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）でも染色され、形態を区別した。一コントロールスライド中のＡＬＫ ２（Ventanaカタログ番号781-4796）が、システムレベルの陽性及び陰性コントロールとして使用された。スライドは、表１に示す染色プロトコルを用いて、Ventana BENCHMARK XT自動化スライドステイナー及びOPTIVIEW DAB IHC Detection Kit (Ventana, カタログ番号760-700）及びOPTIVIEW Amplification Kit (Ventana カタログ番号760-099) を使用して染色された。同一のプロトコル及び試薬はまた、Ventana BENCHMARK GX 自動化スライドステイナーを使用しても試験された。
【００４９】
0006259828.tif 000002
【００５０】
実施例2
免疫組織化学結果の評価
この実施例は、ＡＬＫ ＩＨＣ結果を評価又はスコア化して、ＮＳＣＬＣ試料がＡＬＫに対して陽性であるか又は陰性であるかを決定する例示的方法を記載する。
ＡＬＫ ＩＨＣは、実施例１に記載されるように、抗ＡＬＫ D5F3抗体を用いて行われた。 ＡＬＫ ＩＨＣアッセイで標識された腫瘍性細胞が、ＤＡＢシグナルの存在又は不在について評価された。対応する陰性コントロールスライドを使用して、特定の組織要素（肺胞のマクロファージ、神経細胞、腺上皮細胞、リンパ球浸潤物中の細胞）に起因して起こることが知られている非特異的バックグラウンド染色及びバックグラウンド染色の程度を評価した。試料は、表２のスコア化アルゴリズムに基づいて、ＡＬＫに対して陽性又は陰性であると決定された。
【００５１】
0006259828.tif 000003
【００５２】
ＡＬＫに対して陽性：  実施例１に記載されたＩＨＣアッセイを用いて染色された陽性のケースは、典型的には、強い、顆粒状細胞質染色を示した。任意の数の腫瘍細胞において強い細胞質染色（従来のＩＨＣスコア化での３＋染色等）を有する試料は、陽性とスコア化される。大部分の陽性ケースにおいて、シグナルは、腫瘍の腫瘍性部分にわたり均一なレベルの強度を有して、均一に分布していた。幾つかの陽性ケースにおいて、シグナルは染色強度においてより不均一であった。均一なＡＬＫ ＩＨＣ発現の例が図１Ａ及びＢに示される。不均一なＡＬＫ ＩＨＣ発現の例が図２Ａ−Ｃに示される。
いくらかのバックグラウンド染色が、ＮＳＣＬＣ試料における正常粘膜内、並びに壊死腫瘍領域に観察された。この染色は、ＡＬＫ陽性染色とは評価されなかった。加えて、染色は、神経細胞（神経又は神経節細胞を含む）、腺上皮細胞、肺胞マクロファージ、及びリンパ球浸潤又はリンパ節への肺転移の細胞においてみとめられた。幾つかの試料において、ムチンの染色もみとめられた。これらの全てが、試料がＡＬＫ陽性であるか否かを決定する際に排除された。これら排除されるタイプのＡＬＫ染色の例が、図３（腺上皮細胞染色）、図４Ａ及びＢ（神経細胞染色）、図５（肺胞マクロファージ染色）、図６Ａ及びＢ（ムチン染色）、及び図７Ａ及びＢ（リンパ球染色）に示される。
【００５３】
ＡＬＫに対して陰性：  大部分のＡＬＫ陰性ケースは、対応する陰性コントロールスライドからのバックグラウンド染色を超えるＤＡＢシグナルの不在を示した（図８Ａ及びＢ）。しかしながら、少数のＡＬＫ陰性ケースは、対応する陰性コントロールスライドからのバックグラウンド染色を超えて検出された弱い、拡散した顆粒状細胞質パターンを示した（図９Ａ及びＢ）。これらのケースは、ＡＬＫ陰性ケースの約１〜２％を表すと推定され、確認的ＦＩＳＨ解析により陰性であった。
少数のケースにおいて、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）抗体を用いて染色されたスライド上の細胞質染色は、陰性コントロールスライド上におけるよりも顕著であった。しかしながら、これらのケースは強い細胞質染色を示さなかったため、ＡＬＫ陰性であると決定された（図１０Ａ−Ｄ）。別の例において、膜／細胞質染色が、抗ＡＬＫ抗体を用いて染色されたスライドにおいて観察された。この試料は、強い細胞質染色の欠如のため、ＡＬＫ陰性であると決定された。
【００５４】
実施例3
免疫組織化学結果のＦＩＳＨとの一致
この実施例は、実施例２に記載されるＡＬＫ ＩＨＣスコア化法と、ＮＳＣＬＣ試料のＡＬＫ状態の決定のためのＡＬＫブレーク・アパートＦＩＳＨとの一致を実証する。
３コホートが使用され、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体からの染色結果を、ＡＬＫの臨床的状態の面からＡＬＫ ＦＩＳＨと比較した。コホートは、切除物、針生検、気管支生検、及び細針吸引物からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞塊を含む、原発性及び転移性腫瘍からのヒトＮＳＣＬＣ組織試料の範囲を含んだ。ＩＨＣが実施例１に記載されるように実行された。全研究が、実施例２に記載のスコア化アルゴリズムを使用してスコア化された。ブレーク・アパートＦＩＳＨデータが、製造者のプロトコルに従い、VYSIS ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) を使用して得られた。
【００５５】
一致研究１
研究は、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体をレトロスペクティブなブレーク・アパートＦＩＳＨデータ(Cleveland Clinic Foundation)と比較して、外部研究室で行われた。外部サイトは、BenchMark XT装置上で、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体を使用して約１００のＮＳＣＬＣ症例を染色した。抗ＡＬＫ ＩＨＣアッセイは、このＮＳＣＬＣ試料コホートで、レトロスペクティブなＡＬＫブレーク・アパートＦＩＳＨデータと９８％を超える全体的パーセント一致を実証した。結果を表３及び４に詳述する。１００症例のうち、８６が、利用可能なＦＩＳＨデータを有し、ＡＬＫ ＩＨＣ結果と比較するのに十分な腫瘍の存在を有した。この研究の組織標本の調整は、固定条件（収集後の固定までの時間、固定時間）について確認されなかった。
【００５６】
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【００５７】
0006259828.tif 000005
【００５８】
一致研究2
研究は、７３のＮＳＣＬＣ症例（染色の１週間以内でカット）で、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体をブレーク・アパートＦＩＳＨデータと比較して、第２の外部研究室で行われた。外部サイトは、実施例１に記載されるように、BenchMark XT装置上で、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体を使用して症例を染色した。ＶＥＮＴＡＮＡ ＡＬＫ ＩＨＣアッセイは、このＮＳＣＬＣ試料コホートで、レトロスペクティブなALKブレーク・アパートＦＩＳＨデータと93%を超える全体的パーセント一致を実証した。結果を表5及び6に詳述する。
【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
４つの不一致（ＦＩＳＨ陰性、ＡＬＫ ＩＨＣ陽性）症例の追加の未染色スライドが、他のＡＬＫ ＩＨＣアッセイを用いて試験された（異なるクローン及び検出システム）。４症例のうち３症例が、検出されたＡＬＫ ＩＨＣ染色の点で、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）アッセイと一致した。
ＦＩＳＨ結果が未決定又は実施されなかった１０症例も存在した。これら症例のうち４つが、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ＩＨＣアッセイ及び他のＡＬＫクローンにより陽性であり、６つは、ＡＬＫ ＩＨＣにより陰性であった。ＦＩＳＨにより陽性であったが、ＩＨＣで染色するのに十分な試料が利用可能でなかった１症例が存在した。
【００６２】
一致研究3
この研究において、ＡＬＫブレーク・アパートＦＩＳＨプローブ研究に登録されたＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ患者の進行中のグローバル臨床研究からの約３００症例が、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル抗体アッセイを用いて染色された。約３００症例のうち、幾つかが、「ＦＩＳＨによる情報がない」又は「ＦＩＳＨアッセイ実施されず」と分類され、情報的目的のみのために染色されて評価された。試料のＦＩＳＨデータは、臨床研究に参加している中心的研究室から取得された。 
症例は、ＦＩＳＨ状態に対して盲検化され、無作為化され、及び染色結果を評価した２人の読み取り者に提供された。結果が、グローバル臨床研究から得られたＦＩＳＨ状態と比較された。ＡＬＫ ＩＨＣのＡＬＫブレーク・アパートＦＩＳＨとの比較結果が、表７に示される。この研究の組織標本の調整は、固定条件（収集後の固定までの時間、固定時間）について確認されなかった。
【００６３】
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【００６４】
ＡＬＫ ＩＨＣ陽性、ＡＬＫ ＦＩＳＨ陰性であった矛盾した症例
・４症例が、少なくとも１人の読み取り者により、ＡＬＫ ＩＨＣ陽性、ＦＩＳＨ陰性と評価された。コンセンサスレビューで、これらはＩＨＣ陰性と評価すべきであると決定された。これらの症例は、巣状の細胞質／膜染色を有しており、実施例２に記載されたように、陰性であるとみなされる。
・真の矛盾症例とみなされた９つのＡＬＫ ＩＨＣ陽性、ＡＬＫ ＦＩＳＨ陰性症例が存在した。
９つの不一致症例のうち、７つが追加のＡＬＫ診断試験（異なるクローン及び検出システムを使用した分子試験及びＩＨＣ試験）に利用可能な未染色スライドを有していた。これらの追加の試験結果は、矛盾症例の大部分が、ＡＬＫ ＦＩＳＨ陰性の場合に、ＡＬＫ状態に対して陽性ＩＨＣ評価への支持を表明したことを示した。ＩＨＣアッセイの感度を低減させ得る、染色前に３ヶ月を超えたこれら症例のスライドはカットされた。 
【００６５】
ＡＬＫ ＩＨＣ陰性、ＡＬＫ ＦＩＳＨ陽性であった矛盾した症例
・ＦＩＳＨにより陽性であったが、抗ＡＬＫ ＩＨＣアッセイにより陰性であった、１１症例が存在した。これら症例のうち１０症例が、分子技術とＩＨＣを用いた追加のＡＬＫ診断試験に利用可能な未染色スライドを有していた。これらの追加の試験結果は、抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３ ＩＨＣアッセイにより陰性であった症例の大部分がまた、別のＡＬＫ ＩＨＣシステムによっても陰性であったが、一又は複数の分子アッセイにより陽性であったことを示した。ＩＨＣアッセイの感度を低減させ得る、染色前に３ヶ月を超えたこれら症例のスライドはカットされた。
・このコホートには、ＦＩＳＨによる情報がない（結果が得られなかった）１４症例が存在した。これらのうち、３つが、ＡＬＫ ＩＨＣアッセイにより、両方の読み取り者によって、陽性と評価された。加えて、Ｈ＆Ｅスライドに基づいたＦＩＳＨアッセイが実行できなかった（通常、腫瘍含量が不十分であることにより）１９症例が存在した。両方の読み取り者が、これらのうち４症例において、ＡＬＫ ＩＨＣ染色結果を陽性と評価した。従って、ＦＩＳＨ結果が得られなかった平均２１％の症例が、抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ＩＨＣアッセイにより陽性ＡＬＫ状態を有していた。
【００６６】
抗ＡＬＫ ＩＨＣアッセイにより得られたＡＬＫ状態の再現性が決定された。約３００症例に対して各読み取り者により得られたＡＬＫ状態が比較された。結果は、表８に示されるように、抗ＡＬＫ ＩＨＣアッセイ及びスコア化アルゴリズムは、読み取り者間で高度に再現性があることを示す。
【００６７】
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結論
抗ＡＬＫ（Ｄ５Ｆ３）ウサギモノクローナル１次抗体を用いたＩＨＣは、BENCHMARK XT及びBENCHMARK GXプラットフォーム上での臨床的ＡＬＫ状態に対する染色結果において、再現性があった。２値スコア化アルゴリズムは、読み取り者にわたり高度に再現性があった。アッセイは、ＡＬＫ状態に対してＡＬＫブレーク・アパートＦＩＳＨ法と一致した。
【００６８】
実施例4
IHCアッセイでの組織処理条件の効果
この実施例は、ＩＨＣアッセイでの組織処理条件の変化の効果を記載する。
Ｈ２８８（ＡＬＫ陽性）細胞株を使用して、ＳＣＩＤマウスに異種移植腫瘍を生成させた。腫瘍が採取され、様々な時間、異なる固定液で固定され、実施例１に記載されたように抗ＡＬＫ Ｄ５Ｆ３抗体を用いて染色された。
１０％中性平衡化ホルマリンで少なくとも６時間固定された組織が、最適なＡＬＫ ＩＨＣ染色結果を与えた。少なくとも６時間での亜鉛ホルマリン固定もまた、許容可能なＡＬＫ ＩＨＣ染色結果を与えた。中性平衡化ホルマリン又は亜鉛ホルマリンでの６時間を下回る固定時間は、ＡＬＫに対する顕著に低減した染色強度をもたらした。追加の固定液（ＡＦＡ、Ｂ５、Ｐｒｅｆｅｒ、及び９５％エタノール）も試験されたが、全ての時間点で、顕著に低減したＡＬＫ染色強度をもたらした。
異種移植試料が採取され、３０分から２４時間の範囲の時間、未固定におかれ、次いで中性平衡化ホルマリン中で１２時間固定された。ＡＬＫ染色強度は、固定までの時間が６時間を超えて遅延した場合、低減した。
切り出されたが、様々な時間の間、染色されなかった切片もまた、ＡＬＫ ＩＨＣ染色に対して評価された。ＡＬＫ染色強度は、染色前の３ヶ月を超える時点で切り出され室温で貯蔵された切片において低減した。低減した染色強度にかかわらず、ＡＬＫ陽性症例はいずれもＡＬＫ陰性へ状態を変更することはなかった。
これらのデータに基づき、採取の約６時間以内に、１０％中性平衡化ホルマリン又は亜鉛ホルマリン中で少なくとも約６時間の試料の固定が、最適なＡＬＫ染色結果のために推奨される。加えて、室温で貯蔵された場合、切片が切り出しの約３ヶ月以内に染色されるならば、染色は最適である。
【００６９】
開示の原則が適用され得る多くの可能な実施形態の観点において、示された実施形態は単なる例であり、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではないことを認識すべきである。正しくは、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義される。従って、我々はこれらの特許請求の範囲及び精神内に入る全てを我々の発明として主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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