(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されているヌクレオチド配列を有する遺伝子、又は該遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アントシアニン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ若しくは３’，５’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコード化する遺伝子、又は
アントシアニン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ若しくは３’，５’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されているアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質をコードする遺伝子が対象の植物に人工的に導入されたトランスジェニック植物を得る方法であって、該トランスジェニック植物におけるピオニジン３−Ｏ−ルチノシドの量が遺伝子導入前の元の植物におけるピオニジン３−Ｏ−ルチノシドの量よりも増加し、これによって該トランスジェニック植物の花の色が元の植物の花の色に比べて紫がかった色になることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記トランスジェニック植物がトランスジェニックタバコであることを特徴とする、請
求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されているヌクレオチド配列を有する遺伝子、又は該遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アントシアニン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ若しくは３’，５’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコード化する遺伝子、又は
アントシアニン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ若しくは３’，５’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されているアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質をコードする遺伝子が対象の植物に人工的に導入されたトランスジェニック植物。
【請求項４】
単一のアミノ酸−Ｌ８７Ｒの突然変異がなされることを特徴とする、形質転換された遺伝子から発現された、アントシアニン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ又は３’，５’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されているアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質の活性を操作する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なタンパク質及び遺伝子並びにそれらの使用に関する。より詳しくは、本発明はフラボノイドO−メチルトランスフェラーゼ（FOMT）に係るタンパク質、及びこれらのタンパク質をコード化する遺伝子、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチルトランスフェラーゼ（EC2.1）は、最も一般的なメチルドナー分子であるS−アデノシルメチオニン（SAM又はAdoMet）からの活性化メチル基を、DNA、RNA、タンパク質、多糖類、脂質、及び様々な小分子中のN−, C−, O−, S−求核部分へと移動させるアルキル化反応の触媒として機能する（ジー．エル．・カントーニ（Cantoni, G.L.）著、「生物学的メチル化−選択された様相（Biological Methylation − Selected Aspects）」、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annual Review of Biochemistry）、1975年、第44巻、p.435−451）。メチルトランスフェラーゼは求核部分のタイプによって分類される。即ち、O−メチルトランスフェラーゼとC−メチルトランスフェラーゼである。さらに、メチル化されている基質によっても分類することができる。多くの重要な生物学的プロセスにおいて、メチル化は重要な役割を果たしている。DNAのメチル化は遺伝子の発現を規制し、リン脂質のメチル化は膜流体を保持し、ホルモン、神経伝達物質及びポリフェノール等のメチル化はシグナル伝達及び自己防衛の制御に極めて重要である（エム．フォントケイブ（Fontecave, M.）、エム．アッタ（M. Atta）及びイー．マリーズ（E. Mulliez）著、「S−アデノシルメチオニン：何も無駄にならない（S−adenosylmethionine: nothing goes to waste.）」、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス（Trends in Biochemical Sciences）、2004年、第29巻、第5号、p.243−249）。メチル化の広範囲に亘る機能にも拘わらず、メチルトランスフェラーゼの活性は、その様々な機能に関して特定の方法で作用する（エス．クリマソースカス（Klimasauskas, S.）及びイー．ウエインホールド（E. Weinhold）著、「バイオテクノロジーの新しい道具：AdoMet依存メチルトランスフェラーゼ（A new tool for biotechnology: AdoMet−dependent methyltransferases）」、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology）、2007年、第25巻、第3号、p.99−104）。
【０００３】
植物には様々なSAM−O−メチルトランスフェラーゼ（OMT）があり、これらはメチル受容体分子（例えば、フェニルプロパノイド類、フラボノイド類、及びベンジルイソキノリンアルカロイド類）の立体化学に関する選択性が相違しており、2つの型に分類される。Ｉ型は低分子量（23〜27kD）でカチオン依存性のOMT類を含む。これらの大部分は、フェニルプロパノイド類のカフェオイルコエンザイムＡエステル（CCoAOMT）に特異的なメチル化であることを示しており、裸子植物及び被子植物のリグニンの前駆体であるモノリグノールの生合成において鍵となる酵素であることを示唆している（ゼット．エイチ．イェ（Ye, Z.H.）ら著、「ヒャクニチソウのリグニンの生合成における別のメチル化経路（An alternative methylation pathway in lignin biosynthesis in Zinnia.）」、プラント・セル（Plant Cell）、1994年、第6巻、第8号、p.1427−1439）。II型はより分子量が大きく（38〜43ｋD）、カチオン非依存性ホモ二量体OMT類を含み、これは、コーヒー酸、フラボン類、イソフラボン、クマリン、及びアルカロイドOMT類を含む大きな科に属する物質をメチル化する（エス．フリック（Frick, S.）及びティー．エム．カッチャン（T.M. Kuchan）著、「イソキノリンアルカロイド及びフェニルプロパノイドの生合成に共通するO−メチルトランスフェラーゼの分子クローニングと機能的発現（Molecular cloning and functional expression of O−methyltransferases common to isoquinoline alkaloid and phenylpropanoid biosynthesis）」、プラント・ジャーナル（Plant Journal）、1999年、第17巻、第4号、p.329−39；アール．ケイ．イブラヒム（Ibrahim, R.K.）、エイ．ブルヌー（A. Bruneau）、及びビー．バンティグニーズ（B. Bantignies）著、「植物のO−メチルトランスフェラーゼ：分子分析、共通するサイン及び分類（Plant O−methyltransferases: molecular analysis, common signature and classification）」、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant Molecular Biology）、1998年、第36巻、第１号、p.1−10；エム．イブダ（Ibdah, M.）ら著、「アイスプラントのフェニルプロパノイド代謝における新しいMg2+依存O−メチルトランスフェラーゼ（A novel Mg2+−dependent O−methyltransferase in the phenylpropanoid metabolism of Mesembryanthemum crystallinum）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、2003年、第278巻、第45号、p. 43961−43972；ピー．ヒュグエニー（Hugueney, P.）ら著、「ブドウの蔓のアントシアニンメチル化に関わる新しいカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（A novel cation−dependent O−methyltransferase involved in anthocyanin methylation in grapevine）」、プラント・フィジオロジー（Plant Physiology）、2009年、第150巻、第４号、p. 2057−2070）。
【０００４】
しかしながら、2003年にイブダら（Ibdah）らは、分子量が26.6kDでＩ型のOMT類への高い類似性を有する、アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）から得られた新しいMg2+依存PFOMTがフラボノールとカフェオイルCoAとに特異的であることを報告した（エム．イブダ（Ibdah, M.）ら著、「アイスプラントのフェニルプロパノイド代謝における新しいMg2+依存O−メチルトランスフェラーゼ（A novel Mg2+−dependent O−methyltransferase in the phenylpropanoid metabolism of Mesembryanthemum crystallinum）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、2003年、第278巻、第45号、p. 43961−43972）。したがって、Ｉ型のOMT類内でのリグニンの合成のみに限定されない様々な基質を有する新しい亜綱が提案された。フロリゲン（Florigen）の特許（2003年）は、ペチュニア、トレニア、又はフクシアから得られるフラボノイドメチルトランスフェラーゼ（FMT）活性を有するＩ型状のポリペプチドをコード化する遺伝子配列を明らかにし（エフ．ブルグリーラ（Brugliera, F.）ら著、「メチルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子配列とその使用（Genetic sequences having methyltransferase activity and uses therefor）」、2003年、国際公開第2003/062428号パンフレット）、そして、粗タンパク分析によると、アントシアニン（デルフィニジン、シアニジン誘導体）を基質として使用することができた。リー（Lee）らは、2008年に、トリセチン、ルテオリン、ミリスチン、及びカフェオイル−CoAに特異的な基質を有する低分子OMT類をコード化する２つの遺伝子ROMT15及びRONT17をクローンとして発生させた（ワイ．ジェイ．リー（Lee, Y.J.）ら著、「米から得られるカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（Cation dependent O−methyltransferases from rice）」、プランタ（Planta）、2008年、第227巻、第３号、p.641−7）。異なるブドウの蔓の栽培変種から得られた２つの遺伝子（VνAOMT及びFAOMT）が、アントシアニンOMT類をコード化することが実証され（ピー．ヒュグエニー（Hugueney, P.）ら著、「ブドウの蔓のアントシアニンメチル化に関わる新しいカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（A novel cation−dependent O−methyltransferase involved in anthocyanin methylation in grapevine）」、プラント・フィジオロジー（Plant Physiology）、2009年、第150巻、第４号、p.2057−2070；ジェイ．ラッカー（Lucker, J.）、エス．マーテンズ（S. Martens）、及びエス．ティー．ランド（S.T. Lund）著、「アントシアニン及びグリコシル化フラボノールへの強い選択性を示すカベルネ・ソービニオンの3’，5’−O−メチルトランスフェラーゼに変換し得るブドウのキャラクタリゼーション（Characterization of a Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 3’,5’−O−methyltransferase showing strong preference for anthocyanins and glycosylated flavonols）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、2010年、第71巻、第13号、p. 1474−1484）、その酵素活性を、シアニジン 3−O−グルコシド、デルフィニン 3−O−グルコシド、及びケルセチン 3−O−グルコシドを選択して、イン・ビトロ又はイン・ビーボで試験した。メチル化位置は、アントシアニジンのＢ環の3’−OH又は3’−及び5’−O−であり、このタンパク質がA3’5’OMTとして作用することを示している。コヴィニク（Kovinich）は2011年に、トランスクリプトーム分析によって黒大豆からOMT5の遺伝子を単離し、これは、イン・ビトロ��アントシアニン 3’−O−メチルトランスフェラーゼであることが確認された（エヌ．コヴィニク（Kovinich, N.）ら著、「トランスクリプトームと代謝物質との複合解析によって、準同質遺伝性である黒大豆種皮と茶大豆種皮（共にダイズ）との大きな相違がわかり、同質遺伝子色素の同定を可能にした。（Combined analysis of transcriptome and metabolite data reveals extensive differences between black and brown nearly−isogenic soybean (Glycine max) seed coats enabling the identification of pigment isogenes.）」、ビーエムシー・ゲノミクス（BMC Genomics）、2011年、12号）。アキタ（Akita）らは、2011年に、花色が紫色の芳香シクラメンからの遺伝子（CkmOMT2）を明らかにし、イン・ビトロでの酵素分析により、このCkmOMT2によってアントシアニン基質の3’−OH又は3’,5’−O−のメチル化が起こることを実証した（ワイ．アキタ（Akita, Y.）ら著、「花の色に係る芳香シクラメンのO−メチルトランスフェラーゼの単離とキャラクタリゼーション（Isolation and characterization of the fragrant cyclamen O−methyltransferase involved in flower coloration）」、プランタ（Planta）、2011年、第234巻、第6号、p. 1127−1136）。したがって、Ｉ型OMTにおける亜綱は、フラボノイド選択性のカチオン依存性小分子OMTであることが、上記研究によって証明された。
【０００５】
フラボノイド類は、アントシアニン、フラボン、フラボノール、フラバン、フラバノール及びイソフラボン等を含む植物の二次代謝産物の一大グループであり、色素形成、アントシアニン及び助色素としての他のフラボノイドによるＵＶ光損傷に対する保護、重合性リグニンによる構造的支持、並びに分類された抗菌性のフィトアレキシンを提供する。これらの化合物は、フェニルアラニンの一次代謝産物から得られる。フラボノイド生合成のエントリー・ポイントは桂皮酸であり、この桂皮酸は、フェニルアラニンのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL, 図１）との最初の反応で生成される。次いで、桂皮酸 4−ヒドロキシラーゼ（C4H）によって触媒されて、桂皮酸のフェニル環のパラ位に水酸基が導入され、p−クマル酸を生成する。そして、CoAとのチオエステル結合の形成によってp−クマル酸のカルボキシル基が活性化され、これがp−クマロイルCoAリガーゼ（4CL）によって触媒されるプロセスである。カルコンシンターゼ（CHS）触媒の存在下で１つのp−クマル酸CoAの末端に３つのマロニル−CoAが相互作用可能に濃縮され、カルコンが生成する。カルコンイソメラーゼ（CHI）は、カルコンの自発的で追加的な環化を立体的に誘導して大きく加速して、ナリンゲニンを形成する。フラバノン3−ヒドロキシラーゼ（F3H）、フラバノン3’−ヒドロキシラーゼ（F3’H）、及びフラバノン3’,5’−ヒドロキシラーゼ（F3’5’H）が、次いで、ナリンゲニンを３位、3’位、及び3’,5’位で水酸化し、ジヒドロフラボノールを生成する（それぞれDHK、DHQ、DHM）（ティー．ヴォクト（(Vogt, T.）著、「フェニルプロパノイドの生合成（Phenylpropanoid biosynthesis）」、モレキュラー・プラント（Molecular Plant）、2010年、第３巻、第１号、p. 2−20）。ジヒドロフラボノール4−レダクターゼ（DFR）は、中央の環のケトン基を還元することによってジヒドロフラボノール類をフラバンジオール類（ロイコアントシアニジン）に変換する。ロイコアントシアニジン類は、アントシアニジンシンターゼ（ANS）／ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（LDOX）の作用によって、対応する３つのアントシアニジン（ぺラルゴニジン、シアニジン、及びデルフィニジン）に変換される。これら３つの主要なアントシアニジン以外に、15以上のアントシアニジンが記載されている（イー．グロートウォルド（Grotewold, E.）著、「花の色素の遺伝子と生化学（The genetics and biochemistry of floral pigments）」、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・バイオロジー（Annual Review of Plant Biology）、2006年、第57巻、p. 761−780）。何千ものアントシアニン類が報告されているが、これらの大部分が６つの普通のアントシアニジンから得られている。６つの普通のアントシアニジンとは、ペラルゴニジン（Pg）、シアニジン（Cy）、デルフィニジン（Dp）、ペオニジン（Pn）、及びマルヴィジン（Mv）である。生合成の経路という点では、ペオニジンがＢ環の3’位でシアニジンをモノメチル化し、ペチュニジンとマルヴィジンは、両方とも、Ｂ環の3’位及び3’5’位に１つ又は２つのメチル基を有するデルフィニジンから得られる。グリコシル化、メチル化及びアシル化によって変性した前記６つのアントシアニジンから数多くのアントシアニンが得られる。
【０００６】
アントシアニンの発色団は主としてアグリコンであり、デルフィニジン及びその誘導体は青色を有する傾向があり、ペラルゴニジン誘導体は非常に濃い赤色を呈する。3’位又は5’位の水酸基のメチル化はわずかな赤色化をもたらす（ワイ．タナカ（Tanaka, Y.）、エフ．ブルグリーラ（F. Brugliera）、及びエス．チャンドラー（S. Chandler）著、「バイオテクノロジーによる花の色の変更についての最近の進歩（Recent progress of flower colour modification by biotechnology）」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・サイエンス（International Journal of Molecular Sciences）、2009年、第10巻、第12号、p. 5350−5369）。グリコシル化及びアシル化は吸収波長を変えないが、安定化を容易にし、赤いアントシアニンをアシル化パッケージによって青にさえする（エム．シオノ（Shiono, M.）、エヌ．マツガキ（N. Matsugaki）及びケイ．タケダ（K. Takeda）著、「ヤグルマギクの色素の構造−赤いバラのアントシアニンを他の花における「超色素」の一部としてパッケージすることで艶やかな青色に変える。（Structure of the blue cornflower pigment −packaging red−rose anthocyanin as part of a ‘superpigment’ in another flower turns it brilliant blue.）」、ネイチャー（Nature）、2005年、第436巻、第7052号、p. 791−791）。
【０００７】
フラボン、フラボノール、イソフラボン等の他のフラボノイドは、フラボンシンターザゼ（FNS）、フラボノールシンターゼ（FLS）、及びイソフラボンシンターゼ（IFS）によってそれぞれ合成される。特に、フラボノイド類における水酸基のO−メチル化は、その反応性を低下させて抗微生物活性を増加させる（アール．ケイ．イブラヒム（R.K. Ibrahim）ら著、「ネコノメソウにおけるポリメチル化フラボノールグリコシドの酵素学と区画化（Enzymology and compartmentation of polymethylated flavonol glucosides in Chrysosplenium−Americanum）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、1987年、第26巻、第5号、p.1237−1245）。
【０００８】
花の色の形成は、化学的に異なる３つの種類の色素による。その３つとは、フラボノイド類、ベタレイン類、及びカロテノイド類であり、これらの中でも、被子植物に広く含まれていることから、フラボノイド類が最もよく研究されてきている。花の色に主要な貢献をしているフラボノイド分子はアントシアニンであり、花の橙色、赤色、紫色及び青色の多くの元となっている。アントシアニン以外のフラボノイド類、例えば、フラボン及びフラボノールなどは花の着色に影響する発色補助因子として機能することがある（ピー．フィグエイレド（Figueiredo, P.）ら著、「アントシアニン錯形成反応の新しい相。失色の手段としての分子内発色補助作用か？（New aspects of anthocyanin complexation. Intramolecular copigmentation as a means for colour loss?）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、1996年、第41巻、第1号、p.301−308）。さらに、何か他の要素も花の色に影響を与えている。例えば、液胞のｐＨも、花弁の表皮細胞の液胞中にあるアントシアニンの色に重要な役割を果たしている（エス．フクダ−タナカ（Fukuda−Tanaka, S.）ら著、「青い花弁中の色を高めるタンパク質−華やかなアサガオの花は舞台裏でのプロトン交換輸送体に依存している。（Colour−enhancing protein in blue petals − Spectacular morning glory blooms rely on a behind−the−scenes proton exchanger.）」、ネイチャー（Nature）、2000年、第407巻、第6804号、p.581−581）。ｐＨに加えて、金属イオン（ティー．コンドウ（Kondo, T.）ら著、「ツユクサの花弁における青色発生の構造的要因（Structural basis of blue−color development in flower petals from Commelina communis）」、ネイチャー（Nature）、1992年、第358巻、第6386号、p.515−518）、アントシアニン類の構造（アントシアニン液胞含有物（anthocyanic valuolar inclusion, AVI））（エル．ポアセル（Pourcel, L.）ら著、「シロイヌナズナにおけるアントシアニン液胞含有物の形成とアントシアニン色素の隔離との関係（The formation of anthocyanic vacuolar inclusions in Arabidopsis thaliana and implications for the sequestration of anthocyanin pigments）」、モレキュラー・プラント（Molecular Plant）、2010年、第3巻、第1号、p.78−90）、及び細胞の形状（ケイ．ノダ（Noda, K.）ら著、「花の色の強度は、MYBに関連する転写因子によって制御される特定の細胞形態に依存する（Flower color intensity depends on specialized cell−shape controlled by a MYB−related transcription factor.）。」、ネイチャー（Nature）、1994年、第369巻、第6482号、p.661−664）も色の変化に劇的な影響を与える。
【０００９】
装飾用植物は、幅広い色彩を与えることによって人間生活の装飾において重要な美的役割を果たしている。収穫後の寿命を長くし、匂いを変え、花の形状を変更することは追求すべき目的であるが、新しい色の装飾用植物を作るために特定の色形質を変えることが品種改良の主要なゴールである（ワイ．タナカ（Tanaka, Y.）ら著、「草花栽培における遺伝子工学（Genetic engineering in floriculture）」、プラント・セル・ティシュー・アンド・オルガン・カルチャー（Plant Cell Tissue and Organ Culture）、2005年、第80巻、第1号、p.1−24）。特にアントシアニンは、新しい色素化合物を作る、又は現存の色素化合物の性質を変えるという目的を持った、数多くのバイオテクノロジー的努力の対象であった（イー．グロートウォルド（Grotewold, E.）著、「花の色素の遺伝子と生化学（The genetics and biochemistry of floral pigments）」、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・バイオロジー（Annual Review of Plant Biology）、 2006年、第57巻、 p. 761−780）。これら３つの重要なアントシアニジン（Pg, Cy及びDp）の合成は図１に示されているが、他の３つの普通のアントシアニジン（Pn, Pt, Mv）がどのようにして合成されるかは重要であり、不明瞭である。1977年以来のメチル化アントシアニンの形成についての研究において、ウィアリング（Wiering）とデヴラミング（Devlaming）とは、ペチュニアのアントシアニンのメチル化を制御する２対の二対同義遺伝子があることを示し（エイチ．ウィアリング（Wiering, H.）及びピー．デヴラミング（P. Devlaming）著、「ツクバネアサガオにおけるアントシアニンのグリコシル化及びメチル化パターン。２．遺伝子Mf1とMf2。（Glycosylation and methylation patterns of anthocyanins in Petunia−hybrida .2. Genes Mf1 and Mf2）」、ツァイトシュリフト・フュア・プフランツェンツヒトゥング−ジャーナル・オブ・プラント・ブリーディング（Zeitschrift Fur Pflanzenzuchtung−Journal of Plant Breeding）、1977年、第78巻、第２号、p. 113−123）、イン・ビトロでの、シアニジン 3−(p−クマロイル)−ルチノシド−5−グルコシド、デルフィニジン 3−(p−クマロイル)−ルチノシド−5−グルコシドに対する活性を示した（エル．エム．ヴイ．ジョンソン（Jonsson, L.M.V.）ら著、「ツクバネアサガオの花におけるアントシアニンのメチル化に係る4−メチルトランスフェラーゼの特性と遺伝子制御（Properties and genetic−control of 4 methyltransferases involved in methylation of anthocyanins in flowers of petunia−hybrida）」、プランタ（Planta）、1984年、第160巻、第２号、p.174−179）が、現在に至るまでペチュニアのコード化した遺伝子のクローンは作られていない。SAM及びMg2＋依存性シアニジン 3−グルコシド 3’−O−メチルトランスフェラーゼ（CGMT）を、ヨーロッパブドウのアントシアニン・プロモーター細胞の懸濁液から部分的に精製したところ（シー．ベイリー（Bailly, C.）、エフ．コーミアー（F. Cormier）及びシー．ビー．ドゥ（C.B. Do）著、「ヨーロッパブドウの細胞懸濁培養液におけるアントシアニン集積に関するS−アデノシル−L−メチオニン、即ちシアニジン 3−グルコシド 3’−O−メチルトランスフェラーゼ、のキャラクタリゼーションと活性（Characterization and activities of S−adenosyl−L−methionine:cyanidin 3−glucoside 3’−O−methyltransferase in relation to anthocyanin accumulation in Vitis vinifera cell suspension cultures）」、プラント・サイエンス（Plant Science）、1997年、第122巻、第１号、p. 81−89）、基質としてシアニジンを用いたCGMTの活性は13％であり、アシル化の前にメチル化が起こったことを示唆するシアニジン 3−p−クマロイルグルコシドについての活性は見られず、また、ブドウのアントシアニン合成に２以上のOMTが関わっていることを示すデルフィニジンについての活性も見られなかった。ヒュグエニー（Hugueney）らはブドウの蔓中のアントシアニン O−メチルトランスフェラーゼ（AOMT）をコード化する新しいcDNAを単離し、イン・ビトロ及びイン・プランタでその3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼ活性を確認した（ピー．ヒュグエニー（Hugueney, P.）ら著、「ブドウの蔓のアントシアニンメチル化に関わる新しいカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（A novel cation−dependent O−methyltransferase involved in anthocyanin methylation in grapevine）」、プラント・フィジオロジー（Plant Physiology）、2009年、第150巻、第４号、p.2057−2070）。VνAOMTについて同じオープンリーディングフレームを有する他の栽培品種のブドウの蔓から得た遺伝子もラッカー（Lucker）らによって分析され、イン・ビトロでアントシアニン類とグリコシル化フラボノール類に対して強い選択性を有する3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼを示した（ジェイ．ラッカー（Lucker, J.）、エス．マーテンズ（S. Martens）、及びエス．ティー．ランド（S.T. Lund）著、「アントシアニン及びグリコシル化フラボノールへの強い選択性を示すカベルネ・ソービニオンの3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼに変換し得るブドウのキャラクタリゼーション（Characterization of a Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 3’,5’−O−methyltransferase showing strong preference for anthocyanins and glycosylated flavonols）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、2010年、第71巻、第13号、p. 1474−1484）。ブルグリーラ（Brugliera）らは、ペチュニア（FMT）とトレニア（TFMT）に由来する２つのフラボノイドメチルトランスフェラーゼ遺伝子を示し、それらがE. Coliで発現した粗タンパク質がデルフィニジン 3−ルチノシドとデルフィニジン 3−グルコシドとが対応するペチュニジン又はマルヴィジン誘導体に変化する際の触媒として機能することができることを示した。ペチュニア植物におけるFMTのアンチセンス発現によって、花弁の色が対照実験における紫から、別の遺伝子形質変換ペチュニアの花におけるダークピンク又は赤味がかった紫に変化したことを示した（エフ．ブルグリーラ（Brugliera, F.）ら著、「メチルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子配列とその使用（Genetic sequences having methyltransferase activity and uses therefor）」、2003年、国際公開第2003/062428号パンフレット）。紫色の花が咲く芳香シクラメン「香りの舞（ＫＭ）」から得た遺伝子CkmOMT2と、イン・ビトロでの酵素分析により、このCkmOMT2によってアントシアニン基質の3’−OH又は3’,5’−O−のメチル化が起こることが実証された。イオンビーム照射によってゲノム上のCkmOMT2を削除することにより、赤みがかった紫色の花が咲く芳香シクラメン（KMrp）が誘導された（ワイ．アキタ（Akita, Y.）ら著、「花の色に係る芳香シクラメンのO−メチルトランスフェラーゼの単離とキャラクタリゼーション（Isolation and characterization of the fragrant cyclamen O−methyltransferase involved in flower coloration）」、プランタ（Planta）、2011年、第234巻、第6号、p. 1127−1136）。このことは、アントシアニンのメチル化が花色の変化に貢献することを示した。
【００１０】
アントシアニン メチルトランスフェラーゼの活性を制御することによって、花の色を操作する手段が得られ、したがって、単一の種又は栽培品種がより広い範囲の花弁の色を有するようにすることができる。このような制御は、生来の酵素の発現レベル若しくは活性を制御することによって、又は生来のものではない酵素を導入することによって達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2003/062428号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ジー．エル．・カントーニ（Cantoni, G.L.）著、「生物学的メチル化−選択された様相（Biological Methylation − Selected Aspects）」、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annual Review of Biochemistry）、1975年、第44巻、p.435−451
【非特許文献２】エム．フォントケイブ（Fontecave, M.）、エム．アッタ（M. Atta）及びイー．マリーズ（E. Mulliez）著、「S−アデノシルメチオニン：何も無駄にならない（S−adenosylmethionine: nothing goes to waste.）」、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス（Trends in Biochemical Sciences）、2004年、第29巻、第5号、p.243−249
【非特許文献３】エス．クリマソースカス（Klimasauskas, S.）及びイー．ウエインホールド（E. Weinhold）著、「バイオテクノロジーの新しい道具：AdoMet依存メチルトランスフェラーゼ（A new tool for biotechnology: AdoMet−dependent methyltransferases）」、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology）、2007年、第25巻、第3号、p.99−104
【非特許文献４】ゼット．エイチ．イェ（Ye, Z.H.）ら著、「ヒャクニチソウのリグニンの生合成における別のメチル化経路（An alternative methylation pathway in lignin biosynthesis in Zinnia.）」、プラント・セル（Plant Cell）、1994年、第6巻、第8号、p.1427−1439
【非特許文献５】エス．フリック（Frick, S.）及びティー．エム．カッチャン（T.M. Kuchan）著、「イソキノリンアルカロイド及びフェニルプロパノイドの生合成に共通するO−メチルトランスフェラーゼの分子クローニングと機能的発現（Molecular cloning and functional expression of O−methyltransferases common to isoquinoline alkaloid and phenylpropanoid biosynthesis）」、プラント・ジャーナル（Plant Journal）、1999年、第17巻、第4号、p.329−39
【非特許文献６】アール．ケイ．イブラヒム（Ibrahim, R.K.）、エイ．ブルヌー（A. Bruneau）、及びビー．バンティグニーズ（B. Bantignies）著、「植物のO−メチルトランスフェラーゼ：分子分析、共通するサイン及び分類（Plant O−methyltransferases: molecular analysis, common signature and classification）」、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant Molecular Biology）、1998年、第36巻、第１号、p.1−10
【非特許文献７】エム．イブダ（Ibdah, M.）ら著、「アイスプラントのフェニルプロパノイド代謝における新しいMg2＋依存O−メチルトランスフェラーゼ（A novel Mg2＋−dependent O−methyltransferase in the phenylpropanoid metabolism of Mesembryanthemum crystallinum）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、2003年、第278巻、第45号、p. 43961−43972
【非特許文献８】ピー．ヒュグエニー（Hugueney, P.）ら著、「ブドウの蔓のアントシアニンメチル化に関わる新しいカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（A novel cation−dependent O−methyltransferase involved in anthocyanin methylation in grapevine）」、プラント・フィジオロジー（Plant Physiology）、2009年、第150巻、第４号、p. 2057−2070
【非特許文献９】ワイ．ジェイ．リー（Lee, Y.J.）ら著、「米から得られるカチオン依存性O−メチルトランスフェラーゼ（Cation dependent O−methyltransferases from rice）」、プランタ（Planta）、2008年、第227巻、第３号、p.641−7
【非特許文献１０】ジェイ．ラッカー（Lucker, J.）、エス．マーテンズ（S. Martens）、及びエス．ティー．ランド（S.T. Lund）著、「アントシアニン及びグリコシル化フラボノールへの強い選択性を示すカベルネ・ソービニオンの3’，5’−O−メチルトランスフェラーゼに変換し得るブドウのキャラクタリゼーション（Characterization of a Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon 3’,5’−O−methyltransferase showing strong preference for anthocyanins and glycosylated flavonols）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、2010年、第71巻、第13号、p. 1474−1484
【非特許文献１１】エヌ．コヴィニク（Kovinich, N.）ら著、「トランスクリプトームと代謝物質との複合解析によって、準同質遺伝性である黒大豆種皮と茶大豆種皮（共にダイズ）との大きな相違がわかり、同質遺伝子色素の同定を可能にした。（Combined analysis of transcriptome and metabolite data reveals extensive differences between black and brown nearly−isogenic soybean (Glycine max) seed coats enabling the identification of pigment isogenes.）」、ビーエムシー・ゲノミクス（BMC Genomics）、2011年、12号
【非特許文献１２】ワイ．アキタ（Akita, Y.）ら著、「花の色に係る芳香シクラメンのO−メチルトランスフェラーゼの単離とキャラクタリゼーション（Isolation and characterization of the fragrant cyclamen O−methyltransferase involved in flower coloration）」、プランタ（Planta）、2011年、第234巻、第6号、p. 1127−1136
【非特許文献１３】ティー．ヴォクト（(Vogt, T.）著、「フェニルプロパノイドの生合成（Phenylpropanoid biosynthesis）」、モレキュラー・プラント（Molecular Plant）、2010年、第３巻、第１号、p. 2−20
【非特許文献１４】イー．グロートウォルド（Grotewold, E.）著、「花の色素の遺伝子と生化学（The genetics and biochemistry of floral pigments）」、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・バイオロジー（Annual Review of Plant Biology）、2006年、第57巻、p. 761−780
【非特許文献１５】ワイ．タナカ（Tanaka, Y.）、エフ．ブルグリーラ（F. Brugliera）、及びエス．チャンドラー（S. Chandler）著、「バイオテクノロジーによる花の色の変更についての最近の進歩（Recent progress of flower colour modification by biotechnology）」、インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・サイエンス（International Journal of Molecular Sciences）、2009年、第10巻、第12号、p. 5350−5369
【非特許文献１６】エム．シオノ（Shiono, M.）、エヌ．マツガキ（N. Matsugaki）及びケイ．タケダ（K. Takeda）著、「ヤグルマギクの色素の構造−赤いバラのアントシアニンを他の花における「超色素」の一部としてパッケージすることで艶やかな青色に変える。（Structure of the blue cornflower pigment− packaging red−rose anthocyanin as part of a ‘superpigment’ in another flower turns it brilliant blue．）」、ネイチャー（Nature）、2005年、第436巻、第7052号、p. 791−791
【非特許文献１７】アール．ケイ．イブラヒム（R.K. Ibrahim）ら著、「ネコノメソウにおけるポリメチル化フラボノールグリコシドの酵素学と区画化（Enzymology and compartmentation of polymethylated flavonol glucosides in Chrysosplenium−Americanum）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、1987年、第26巻、第5号、p.1237−1245
【非特許文献１８】ピー．フィグエイレド（Figueiredo, P.）ら著、「アントシアニン錯形成反応の新しい相。失色の手段としての分子内発色補助作用か？（New aspects of anthocyanin complexation. Intramolecular copigmentation as a means for colour loss?）」、フィトケミストリー（Phytochemistry）、1996年、第41巻、第1号、p.301−308
【非特許文献１９】エス．フクダ−タナカ（Fukuda−Tanaka, S.）ら著、「青い花弁中の色を高めるタンパク質−華やかなアサガオの花は舞台裏でのプロトン交換輸送体に依存している。（Colour−enhancing protein in blue petals − Spectacular morning glory blooms rely on a behind−the−scenes proton exchanger.）」、ネイチャー（Nature）、2000年、第407巻、第6804号、p.581−581
【非特許文献２０】ティー．コンドウ（Kondo, T.）ら著、「ツユクサの花弁における青色発生の構造的要因（Structural basis of blue−color development in flower petals from Commelina communis）」、ネイチャー（Nature）、1992年、第358巻、第6386号、p.515−518
【非特許文献２１】エル．ポアセル（Pourcel, L.）ら著、「シロイヌナズナにおけるアントシアニン液胞含有物の形成とアントシアニン色素の隔離との関係（The formation of anthocyanic vacuolar inclusions in Arabidopsis thaliana and implications for the sequestration of anthocyanin pigments）」、モレキュラー・プラント（Molecular Plant）、2010年、第3巻、第1号、p.78−90
【非特許文献２２】ケイ．ノダ（Noda, K.）ら著、「花の色の強度は、MYBに関連する転写因子によって制御される特定の細胞形態に依存する（Flower color intensity depends on specialized cell−shape controlled by a MYB−related transcription factor.）。」、ネイチャー（Nature）、1994年、第369巻、第6482号、p.661−664
【非特許文献２３】ワイ．タナカ（Tanaka, Y.）ら著、「草花栽培における遺伝子工学（Genetic engineering in floriculture）」、プラント・セル・ティシュー・アンド・オルガン・カルチャー（Plant Cell Tissue and Organ Culture）、2005年、第80巻、第1号、p.1−24
【非特許文献２４】エイチ．ウィアリング（Wiering, H.）及びピー．デヴラミング（P. Devlaming）著、「ツクバネアサガオにおけるアントシアニンのグリコシル化及びメチル化パターン。２．遺伝子Mf1とMf2。（Glycosylation and methylation patterns of anthocyanins in Petunia−hybrida .2. Genes Mf1 and Mf2）」、ツァイトシュリフト・フュア・プフランツェンツヒトゥング−ジャーナル・オブ・プラント・ブリーディング（Zeitschrift Fur Pflanzenzuchtung−Journal of Plant Breeding）、1977年、第78巻、第２号、p. 113−123
【非特許文献２５】エル．エム．ヴイ．ジョンソン（Jonsson, L.M.V.）ら著、「ツクバネアサガオの花におけるアントシアニンのメチル化に係る4−メチルトランスフェラーゼの特性と遺伝子制御（Properties and genetic−control of 4 methyltransferases involved in methylation of anthocyanins in flowers of petunia−hybrida）」、プランタ（Planta）、1984年、第160巻、第２号、p.174−179
【非特許文献２６】シー．ベイリー（Bailly, C.）、エフ．コーミアー（F. Cormier）及びシー．ビー．ドゥ（C.B. Do）著、「ヨーロッパブドウの細胞懸濁培養液におけるアントシアニン集積に関するS−アデノシル−L−メチオニン、即ちシアニジン 3−グルコシド 3’−O−メチルトランスフェラーゼ、のキャラクタリゼーションと活性（Characterization and activities of S−adenosyl−L−methionine:cyanidin 3−glucoside 3’−O−methyltransferase in relation to anthocyanin accumulation in Vitis vinifera cell suspension cultures）」、プラント・サイエンス（Plant Science）、1997年、第122巻、第１号、p. 81−89
【発明の概要】
【００１３】
本発明は以下のものを与える。
(1) SEQ ID NO: 3に示されているアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸を削除、置換、又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質。
(2) アントシアニン 3’−O−メチルトランスフェラーゼ又は 3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする、前記タンパク質。
(3) SEQ ID NO: 1に示されているヌクレオチド配列を有する遺伝子、又は該遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アントシアニン 3’−O−メチルトランスフェラーゼ又は 3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコード化する遺伝子。
(4) 前記タンパク質をコード化する遺伝子。
(5) 前記遺伝子を有する発現ベクター。
(6) 前記発現ベクターによって転換された形質転換体。
(7) 前記タンパク質の部分ペプチド。
(8) 前記遺伝子が使用されていることを特徴とする、トランスジェニック生物を得る方法。
(9) 前記遺伝子が対象生物に人工的に導入されたトランスジェニック生物。
(10) 触媒反応に必須である単一のアミノ酸の突然変異がなされることを特徴とする、前記タンパク質の活性を操作する方法。
【００１４】
本発明は、牡丹から得られたフラボノイド O−メチルトランスフェラーゼ（PsFOMT）をコード化する遺伝子配列、及び触媒反応に必須の単一のアミノ酸を置換することによってPsFOMTの活性を調節する方法に関する。中国においては、牡丹（Paeonia属; 中国牡丹）は「花の王」と称され、幸運と幸せとをもたらすとされている。ワンらは、中原の130の栽培品種の牡丹と、大根島の37の栽培品種の牡丹とを分析し、６種類のアントシアニンがあることを見出した。それらのアントシアニンは、Pn3G5G, Pn3G, Cy3G5G, Cy3G, Pg3G5G及びPg3Gであり（エル．エス．ワン（Wang, L.S.）ら著、「中原（中国産）牡丹品種及び大根島（日本産）牡丹品種の花の色を研究するための花弁のアントシアニン類の分析（Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan (Chinese) and Daikon Island (Japanese) tree peony cultivars）」、ジャーナル・オブ・プラント・リサーチ（Journal of Plant Research）、2001年、第114巻、第1113号、p. 33−43）、全系統種が主要なアントシアニンとしてPn3G5Gを含有していた（エル．エス．ワン（Wang, L.S.）ら著、「花の色素のクラスター分析による、中国産の牡丹種における発現（Phenetics in tree peony species from China by flower pigment cluster analysis）」、ジャーナル・オブ・プラント・リサーチ（Journal of Plant Research）、2001年、第114巻、第1115号、p. 213−221）。驚くべきことに、発明者たちは、数百もの牡丹が紫又は紫がかった花の色を有しており、しかも、それらの栽培種における主なアントシアニン類がPn3G5Gであり、これがb*の値（CIELAB色空間、国際照明委員会）の減少に貢献していることに気付いた。Pn3G5G量の増加中に、花弁の色が紫になることが示されている。色の形成メカニズムを説明するために、発明者たちは牡丹の栽培種を研究し、同類の植物である、花弁が鮮やかな赤であり、主要なアントシアニン組成物がCy3Gである、花色の異なる細葉芍薬（学名：Paeonia tenuifolia）を対照に用いた（図２）。分子の小さいＩ型のO−メチルトランスフェラーゼ遺伝子（PsFOMT）が、日本産の牡丹種（Paeonia suffruticosa, cv. 郡芳殿）から単離され、フラボノイド、特にアントシアニン類に効率的に作用する酵素がF3’OMT及びF3’5’OMTであることが判明した。対する細葉芍薬から、類似の遺伝子PtFOMTをクローン技術により作成した。この遺伝子は、PsFOMTとは異なる４つのヌクレオチドを有しており、そのコード化酵素は活性が著しく低下している。４つの異なるヌクレオチドは４つの様々なアミノ酸残基に対応した。各残基の役割を部位特異的突然変異誘発によって確認したところ、１つの残基のみが触媒活性に関わることが分かり、この残基を植物におけるメチル化を調節する際の対象とすることができる。本発明は、アントシアニンOMTと、OMTの活性を低下させる方法とを含み、花の色、果実の色、葉の色、種の色等の植物の特徴を変更するための任意のアプローチを提供し、色の変化という特徴を有する新種を開発し、特定の機能を有するバクテリアを作る。本発明は他の面においても用いることができ、例えば、FOMT変換植物の新しい抽出物は、ヘルスケア添加物、又は飲料、ジュース、食品の着色料として使用することができる。飲料は、ワイン、茶、コーヒー、ミルク、及び乳製品を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】フラボノイドの生合成の経路の略図である。化合物の名称と構造とが示されている。酵素の名前は、PALがフェニラニンアンモニアリアーゼ（phenylanine ammonialyase）、C4Hが桂皮酸−4−ヒドロキシラーゼ、4CHが4−クマル酸CoAリガーゼ、CHSがカルコンシンターゼ、CHIがカルコンイソメラーゼ、F3Hがフラバノン 3−ヒドロキシラーゼ、F3’Hがフラバノン 3’−ヒドロキシラーゼ、F3’5’Hがフラバノン 3’,5’−ヒドロキシラーゼ、DFRがジヒドロフラボノール 4−レダクターゼ、ANSがアントシアニジンシンターゼ、FNSがフラボンズシンターゼ、FLSがフラボノールシンターゼ、LARがロイコアントシアニジンレダクターゼ、ANRがアントシアニジンレダクターゼ、OMTがO−メチルトランスフェラーゼ、UGTがUDT−グルコース フラボノイドグルコシルトランスフェラーゼ、ATがアシルトランスフェラーゼである。ヴァーチャル・テイルの矢印の部分（virtual tail arrow part）は生成と確認が必要である。
【図２】花の画像とアントシアニンのグラフである。Ａは紫色を有する牡丹 Paeonia suffruticosa, cv. 郡芳殿であり、Ｂは鮮明な赤色を有する細葉芍薬 Paeonia tenuifoliaである。
【図３】E. Coliにおける発現プラスミド（pMAL−PsFOMT, pMAL−PtFOMT）と、アグロバクテリウム媒介形質転換用のバイナリープラスミド（pBI121−PAP1、及びpBI121−PsFOMT, pBI121−PtFOMT）との線図である。
【図４】PsFOMTペプチドとPtFOMTペプチドとの比較と、４つのアミノ酸突然変異（13, 85, 87,及び205の位置）を示している。
【図５】PsFOMTのアミノ酸配列をVvAOMT（ブドウの蔓）、GmAOMT（黒大豆）、及びMsPFOMT（アイスプラント）と並べ、LOOPPプログラムパッケージによって3C3Y_Aと比較した二次構造が予測されている。
【図６】選択されたOMTアミノ酸配列の系統樹が示されている。Ｉ型のOMTは上側のクレードにあり、シロイヌナズナから得たカフェオイル−CoA OMT（AtCCoAOMT、受け入れ番号 AAM64800）、ハコベの一種（Stellaria longipes）から得たカフェオイル−CoA OMT（SlCCoAOMT、受け入れ番号 L22203）、ムラサキウマゴヤシから得たカフェオイル−CoA OMT（MsCCoAOMT、受け入れ番号 AAC28973）、タバコから得たカフェオイル−CoA OMT（NtCCoAOMT、受け入れ番号 U38612）、ヨーロッパブドウから得たカフェオイル−CoA OMT（VvCCoAOMT、受け入れ番号 Z54233）、バルサムポプラ亜種から得たカフェオイル−CoA OMT（PtCCoAOMT、受け入れ番号 AJ224896）、及びトウモロコシから得たカフェオイル−CoA OMT（ZmCCoAOMT、受け入れ番号 AJ242980）、並びに人類から得たカテコールOMT（HOMT、受け入れ番号 A38459）、及びカラマツソウから得たカテコールOMT（TiOMT、受け入れ番号 AF064693）を含む。太字で示されているＩ型亜綱OMTは、アントシアニンに対するメチル化活性を有するとこれまでのところ報告されているものであり、ヨーロッパブドウから得たアントシアニンOMT（VvAOMT、受け入れ番号 BQ796057）、ダイズから得たアントシアニンOMT（GmAOMT、受け入れ番号 ADX43927.1）、芳香シクラメンから得たアントシアニンOMT（CkmOMT2、受け入れ番号 BAK74804.1）、フクシャから得たアントシアニンOMT（FMT、受け入れ番号 HB975539.1）、トレニアから得たアントシアニンOMT（TMT5、受け入れ番号 HB975529.1）、及びペチュニアから得たアントシアニンOMT（Petunia difE FMT、受け入れ番号 HB975519.1）を含む。II型は、黄色がかった花をつける水性草本（Chrysosplenium americanum）から得たコーヒー酸OMT（CaCOMT、受け入れ番号 AAA86982）、ムラサキウマゴヤシから得たコーヒー酸OMT（MsCOMT、受け入れ番号 M63853）、ヨーロッパブドウから得たコーヒー酸OMT（VvCOMT、受け入れ番号 AF239740）、及びタバコから得たコーヒー酸OMT（NtCOMT、受け入れ番号 AF484252）、並びにシロイヌナズナから得たフラボノイドOMT（AtFOMT、受け入れ番号 AY087244）、アイスプラントから得たフラボノイドOMT（McPFOMT、受け入れ番号 AY145521）、黄色がかった花をつける水性草本（Chrysosplenium americanum）から得たフラボノイドOMT（CaFOMT、受け入れ番号 U16794）、ニチニチソウから得たフラボノイドOMT（CrFOMT、受け入れ番号 AY127568）、及びイネから得たフラボノイドOMT（OsFOMT、受け入れ番号 DQ288259）、並びにムラサキウマゴヤシから得たイソフラボンOMT（MsIOMT、受け入れ番号 U97125）を含む。図において分岐点の横に記載の数値はブートストラップ値であり、Mega 5.0を用いた1000回の検証に基づいたものである。
【図７】緩衝溶液のｐＨ、培養温度、異なる二価のカチオンの存在、及びMg2+の濃度を含む様々に異なる反応系を有するイン・ビトロでのPsFOMTの活性を示している。結果は３回の実験の平均である。
【図８】基質としてのCy3Gと共にPsFOMTの存在下で、６分以内の製造物の増加を示している。製造物は、標準対照としてのPn3Gを用いて同定された。
【図９】植物におけるPsFOMTの活性のキャラクタリゼーション。Ａは対照である空のベクターを有する形質転換したタバコの花であり、ＢはPAP1の一過性発現と、PAP1とPsFOMTとの共発現とを有するイチゴの実である。
【図１０】空のベクター（ピンク色）を有する形質転換したタバコの花と35S::PsFOMTcDNAとをそれぞれ示している。
【図１１】牡丹種「郡芳殿」（Paeonia suffruticosa, cv.‘Gunpohden’）の成長している花におけるアントシアニン類の蓄積と、構成的に発現された遺伝子であるアクチン（Actin）を対象としたPsFOMTの発現グラフである。地平座標は試料を採取した日付を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下において、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、アントシアニンを最適な基質として使用するSAM依存性フラボノイドO−メチルトランスフェラーゼ（FOMT）と、触媒活性に極めて重要なコアアミノ酸の位置と、それらの使用及び／又は対応するポリペプチドとに関する。より具体的には、本発明はアントシアニン3’−O−メチルトランスフェラーゼ又は3’,5’−O−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。シアニジングリコシド、デルフィニジングリコシド、及びケラセチングリコシドを基質として使用することができる。FOMT遺伝子の機能は、イン・ビトロでの遺伝子組換えタンパク質の酵素分析法とイン・ビーボでの形質転換植物分析とによって確認された。さらに、このポリペプチドの活性を操作する方法が明らかになった。ポリペプチドへの活性を制御するのは単一のアミノ酸であり、これが、アントシアニンのメチル化を変更して制御する際の対象となる。本発明は、着色や抗酸化等のフラボノイドの要素に関連する植物の表現型を制御することへの道筋を提供する。本発明は、さらに、形質転換植物及びそれらの生殖組織と共に遺伝子の全体又への一部センス配列及びアンチセンス配列にも関する。
【実施例１】
【００１８】
（植物材料）
ボタン科、牡丹属の２つの受け入れ番号の植物（牡丹「郡芳殿」（Paeonia suffruticosa, cv.‘Gunpohden’）と細葉芍薬）が基質として用いられた。これらは、花の色の表現型が異なっており、それぞれ、紫と鮮明な赤である。様々な成長段階の花弁を集め、フラボノイドのグラフと、遺伝子のクローン作製と遺伝子発現解析とを行った。
【００１９】
（菌株）
DH5α, F− supE44, Δ(lacZYA−ArgF)U169,(Φ80lacZΔM15) hsdR17(rk−,mk+) recA1 endA1 gyrA96 relA1 deoR; BL21, F− dcm ompT hsdS(rB− mB−) gal araB::T7RNAP−tetAを使用した。アグロバクテリウム−ツメファシエンス株 EHA105 コンピテントセルを使用した（我々の研究室に保存されており、非特許文献である、ガオ・シウ（Gao Shiwu）ら著、「アグロバクテリウム−ツメファシエンス EHA105 コンピテントセル」の形質転換効率に影響する因子（Factors affecting transformation efficiency of Agrobacterium tumefaciens EHA105 competent cells）、ジャーナル・オブ・サウス・チャイナ・ユニバーシティ・オブ・トロピカル・アグリカルチャー（Journal of South China University of Tropical Agriculture）、2012年、第３巻、第１号）に開示されている。）。
【００２０】
（一般的方法）
一般に、ここで行われている方法は（シャンブルーク（Shambrook）ら著の「分子クローニング：実験室マニュアル（第３版）（Molecular Clonging: A laboratory manual. (3rd ed.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、米国、2001年）に記載されている。クローニング用ベクター pEASY−T3はトランスジェン・バイオテック（TransGen Biotech）から取得、細菌発現ベクター pMAL−c5X（NEBから購入）及び真核細胞発現ベクター pBI121（我々の研究室に保存）は大学から提供された。
【００２１】
（FOMTsのクローニング）
２つの受け入れ番号の花弁から全RNAが TIANGEN RNA Isolation Kit（TIANGEN, 中国、北京）を用いて単離された。夾雑するDNAを除去するために、全RNAを10単位のRNase−free DNasel（タカラバイオ、日本）を用いて37℃で30分間処理し、次いで、65℃の不活性化されたDNaselで10分間処理した。最終的に得られたRNAの濃度をNanodrop 2000（Thermo）を用いて測定した。M−MLV 逆転写酵素（プロメガ、米国）を用いてcDNAに変換した。候補遺伝子を同定するために、牡丹の花芽のESTデータベース（キュー．ワイ．シュー（Shu, Q.Y.）ら著、「牡丹の花芽の成長を制御する分子機構を理解する道具としての発現配列標識の機能予測（Functional annotation of expressed sequence tags as a tool to understand the molecular mechanism controlling flower bud development in tree peony）」、フィジオロジア・プランタールム（Physiologia Plantarum）、2009年、第135巻、第４号、p. 436−449）を検索した。オープンリーディングフレーム（ORF）を得るのに使用されるプライマーが表１に示されている。正確性の高いポリメラーゼ（high fidelity polymerase, タカラバイオ、日本）がPCRに使用され、プログラムは次のようであった。95℃で５分間、95℃で30秒間を30サイクル、55℃で30秒間、72℃で90秒間、そして、72℃で10分間の延長を行った。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動法で分離した。対象のDNA断片を、EasyPure Quick Gel Extraction Kit（トランスジェン（TransGen）、中国）を用いて、製造業者の指示に従って精製して回収した。次いで、配列決定のために対象のDNA断片をpEASY−T3ベクター（タカラバイオ、日本）に連結した。FOMTの等電点はExPASy（http://www.expasy.ch/tools/）から取得したCompute pI/MWによって予測した。配列からのFOMTタンパク質の第三及び第四構造はPyMOLソフトウェアによって予測した。
【００２２】
【表１】
0006296465.tif 000002
【００２３】
（花の成長過程におけるPsFOMT遺伝子発現の分析）
三日に一度、５つの成長段階（色のない段階から花が咲いた状態）で、RNAの抽出のために牡丹 Paeonia suffruticosa, cv. 郡芳殿の花弁を採集した。ｍRNA試料を生成してcDNAに変換した。半定量的RT−PCRをSEQ No. 21とSEQ No. 22のプライマーについて３回行った。94℃で30秒間の変性を25サイクル繰り返してPCRを行い、56℃で60秒間アニールし、72℃で60秒間延長した。PCR生成物をアガロースゲル上で分離した。構成的に発現されたアクティン遺伝子を遺伝子発現解析の対照として用いた。
【００２４】
（遺伝子組み換えFOMTの発現と精製）
完全な長さのFOMTがSEQ No.7とSEQ No.8のプライマーによって増幅され、これらのプライマーにおいては、制限酵素であるNdeIとBamHIサイトが5’−末端と3’−末端とにそれぞれ導入されていた。対象のDNA断片はpEASY−T3ベクターに連結され、得られた遺伝子組み換えプラスミドがDH5αに形質導入された。FONT cDNAの配列が決定され、突然変異が起こっていないことが確認された。遺伝子組み換えプラスミドは単離され、NdeIとBamHIとによって分解された。次いで、NdeIとBamHIとによって切断された、MBP標識を有する発現ベクターpMAL−c5XにDNA断片を連結して、pMAL−PsFOMTとpMAL−PtFOMTとを生成した（図３）。配列決定によって試験された正しい構成がE.coli BL21株に導入された。pMAL−PsFOMTとpMAL−PtFOMTとを有するE. coliは、グルコースを含有すると共にOD600が0.4〜0.5に達するまで100μg/mLのアンピシリンを補強した2 mLのLB液体培地で培養された。最終濃度が0.1 mMになるまでイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシドを添加した後、細胞を16℃でさらに20時間培養した。遠心分離によって細胞を集め、上澄み液を捨てた。集めた細胞をカラムバッファー（20 mM Tris−HCl, 200 mM NaCl 1mM EDTA, 10 mM β−メルカプトエタノール, pH 7.4）に再懸濁し、氷水浴中で音波照射によって破砕した（ティー．ラン（Lan, T.）ら著、「ポプラのグルタチオンS−トランスフェラーゼスーパー遺伝子ファミリーの大規模な機能的多角化（Extensive functional diversification of the Populus glutathione S−transferase supergene family）」、プラント・セル（Plant Cell）、2009年、第21巻、第12号、p. 3749−3766）。各場合において、次いで、破砕物を、10,000g、４℃で10分間の遠心分離に付した。その結果得られた粒子状物と少量の上澄み液とをSDS−PAGEで分析した。上澄み液の残りを、カラムバッファーで予め平衡状態にしておいたアミロース樹脂カラム（NEB）に通した。カラムに結合した過剰発現した融合タンパク質をカラムバッファー＋10 mMのマルトースによって溶出した。精製した溶融タンパク質の濃度を280 nmのUV吸光度によって検出した。対照として、空のpMAL−c5Xベクターで形質転換したBL21細胞を分析した。精製したタンパク質を、10％グリセロールと混合して−80℃で保存した。
【００２５】
（遺伝子組み換えFOMTの生化学的キャラクタリゼーション）
定量分析のために、反応条件を最適化した。FOMT活性のｐＨ依存性を、MES（4.5〜6.5）及びTris−HCl（7.5〜8.5）緩衝溶液を用いて評価した。二価のカチオンが酵素活性に与える効果は、反応混合物に10 mMのMgCl2, CaCl2, ZnCl2, MnCl2, CoCl2又はEDTAを含む溶液を添加することによって評価した。金属イオンの適正な濃度は、異なる様々な濃度のMgCl2（0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0及び10 mM）について試験して評価した。酵素活性への影響を調べるために、培養温度を25℃、30℃、35℃及び40℃にセットした。
【００２６】
反応システムはヒュグエニー（Hugueny）らによるものに若干の変更を加えたものであった（A novel cation−dependent O−methyltransferase involved in anthocyanin methylation in grapevine）」、プラント・フィジオロジー（Plant Physiology）、2009年、第150巻、第４号、p. 2057−2070））。精製した遺伝子組み換えFOMT（2μg）を、200μMのSAM、1mMのMgCl2、14mMのβ−メルカプトエタノール、100 mMのTris, pH 7.5、及び20μMのフラボノイド基質を含み、最終的な体積を200 mLとして分析した。培養は35℃で行われ、２％のギ酸を含む200μLのメタノールで停止させた。酵素の反応速度の研究については、Kmの決定のために基質の濃度を５〜200μMに変化させた他は前記条件に基づいて、精製したFOMTを培養した。P680 HPLCポンプ、UltiMate 3000自動サンプル装置、TCC−100恒温カラムコンパートメント、及びDionex PDA100フォトダイオードアレイ検出器を備えた、Dionex HPLCシステム（Sunnyvale, CA）で反応生成物を分析した。分析カラムは、Ｃ18ガードカットリッジ（上海ANPELサイエンティフィック・インストゥルメント、上海）で保護されたODS 80Ts QA（150 mm x 4.6 mm, 5μm i.d.、東ソー、東京）のＣ18カラムであった。以下に示す溶剤と成分とを用いた。Ａ：10％ギ酸水溶液、Ｂ：メタノール、Ｂの濃度は10％から36％まで15分以内で一定に傾斜させ、３分で元の10%Ｂに戻した、流速は0.8 mL・分−1、カラム温度は35℃に維持、20μLの被検質を注入した。クロマトグラムは、525 nmでアントシアニン類、350 nmで他のフラボノイド類のピークが得られ、200〜800 nmでフォトダイオードアレイのスペクトルが記録された。Km値及びＶmax値はラインウィーバー・バークプロットから計算した。
【００２７】
（結果）
＜PsFOMTとPtFOMTとの配列分析＞
cDNA ORF配列と、PsFOMT及びPtFOMTの翻訳されたアミノ酸推定配列（SEQ1〜SEQ4）が表１に示されている。cDNA配列の長さは708 bpであり、アミノ酸の推定配列は235 aaである。PsFOMTとPtFOMTとの理論pIは、それぞれ5.25と5.36であり、両方のMwは26.4 kDであった。２つのアミノ酸配列の比較分析が行われ（図４）、13, 85, 87及び105の位置で相違があった。PsFOMTのアミノ酸配列をVvAOMT（ブドウの蔓）、GmAOMT（黒大豆）及びMsPFOMT（アイスプラント）と並置比較した。PsFOMTは、VaAOMTと72％の同一性を、MsPFOMTと69％の同一性を示した。PsFOMTの二次構造は、LOOPPプログラムパッケージによって3C3Y_Aと比較して予測し、これは保存ドメイン（Pfam01596）と８個のα−へリックスと７個のβ−シートとを有していた（図５）。
【００２８】
＜植物OMTの系統樹＞
様々な種から得た同族の遺伝子を、NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）のBLASTサーチを用いて比較した。核酸配列とアミノ酸配列とを、CLUSTAL X（ジェイ．ディー．トムソン（Thompson, J.D.）ら著、「CLUSTAL Xウィンドウズインターフェイス：品質分析ツールによって支援された、多重配列アラインメントのための柔軟な対策（The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）、1997年、第25巻、第24号、p. 4876−4882）を用いて並置比較し、人手によってより良いものにした。1000個のブートストラップ複製品を用い、MEGA 5.0ソフトウェアを使って、最尤法による系統樹を構築した（ケイ．タムラ（Tamura, K.）ら著、「MEGA5：最尤法、進化距離法、及び最大節減法を用いた分子進化遺伝的構成分析（MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods）」、モレキュラー・バイオロジー・アンド・エボリューション（Molecular Biology and Evolution）、2011年、第28巻、第10号、p. 2731−2739）。系統分析によると、PsFOMTはＩ型OMTのサブクレードに属し、ブドウの蔓から得たアントシアニン−OMT VvAOMT、ペチュニアdifE、トレニア及びフクシャ（不完全なORF）から得たフラボノイド−OMT、アイスプラントから得たPFOMT、並びにシロイヌナズナから得たAtCCoAOMTと近い関係にある（図６）。
【００２９】
＜遺伝子組み換えタンパク質のフラボノイド O−メチルトランスフェラーゼの活性＞
イン・ビトロでのPsFOMTのpH依存性は、6.5〜8.5の広い範囲内にあり、Qu3R基質上では7.5が最適である。培養温度が上がるにつれ（25〜40℃）、PsFOMTの活性は加速された。異なる二価のカチオンの影響が試験され、その結果によると、PsFOMTはMg2+の存在下で最も活性が高かった。Mg2+の最適濃度は1.0 mMであった。EDTAの存在下では、PsFOMTの活性は検出されなかった（図７）。PsFOMTはMg2+依存性の酵素であることが示され、Ｉ型OMTの予測と一致している。
【００３０】
生成された融合タンパク質（PsFOMT及びPtFOMT）の酵素活性を、イン・ビトロで、シアニジン、デルフィニジン、ケルセチン、ペラルゴニジン 3−O−グルコシド、シアニジン 3,5−ジ−O−グルコシド、シアニジン 3−O−グルコシド、シアニジン 3−O−ガラクトシド、デルフィニジン 3−O−グルコシド、ケルセチン 3−O−ルチノシド、コーヒー酸、ルテオリン、ケンペロール及びナリンゲニン、エピカテキンを含む基質を用いて、SAMの存在下で評価した。PsFOMT融合タンパク質は、シアニジン 3,5−ジ−O−グルコシド、シアニジン 3−O−グルコシドに対して特異的に高い触媒効率を有している。PsFOMT融合タンパク質は、デルフィニジン 3−O−グルコシドのＢ環で3’−及び5’−OHを配列的にメチル化することができる。シアニジン 3−O−ガラクトシド、ケルセチン 3−O−ルチノシド、及びケルセチンは異なるレベルでPsFOMTによってメチル化することができる（表２）。Cy3Gを基質としたPsFOMTの存在下で、反応生成物は６分以内に増加した（図８）。標準対照としてのPn3Gを用いて生成物を同定した。PsFOMTに非常に似ているPtFOMTタンパク質は、試験した基質に対して低いメチルトランスフェラーゼ活性を有していた（表３）。PsFOMTとPtFOMTとの酵素活性の不一致には４つの変異アミノ酸が関係していることが示唆される。
【００３１】
【表２】
0006296465.tif 000003
【００３２】
データは３回の分析の平均値（標準誤差）で示されている。
−は生成物が検出されなかったことを意味する。
【００３３】
【表３】
0006296465.tif 000004
【００３４】
データは３回の分析の平均値±標準誤差で示されている。
【実施例２】
【００３５】
（植物でのPsFOMT活性のキャラクタリゼーション）
完全な長さの遺伝子を SEQ No. 5及びNo. 6を用いてPCRによって5’−末端と3’−末端とにBamHIサイトとXhoIサイトと共に導入した。二重に分解された対象の断片と真核発現ベクターpBI121とを、BamHIサイトとXhoIとに連結した。次いで、エレクトロポーレーションによって、適切な構築物をアグロバクテリウムEHA105株に導入した。
【００３６】
（トランスジェニックタバコ）
タバコ cv.Nc89植物の葉（北京林業大学（Beijing Forestry University）のシラン・ダイ教授（Professor Silan Dai）より提供）を75％エタノールで30秒間消毒し、次いで２％次亜塩素酸ナトリウムで３分間処理し、そして滅菌水で３回洗浄した。葉を正方形（25 mm2）に切り分けた。pBI121−FOMT構築物を有するアグロバクテリウムEHA105株の単一コロニーが、50 mg mL−1のカナミシン及び25 mg mL−1のリファンピシンで補強された２mLのYFB培地（１Ｌにつき、５ｇの牛肉エキス、１ｇの酵母エキス、５ｇのショ糖、及び0.5 gのMgSO4・7H2O）に接種するのに使用された。この培地を、ＯＤ600 0.6〜0.8になるまで28℃で培養し、バクテリアを5000 rpmで５分間遠心分離することにより、丸くまとめた。得られた細胞をMS液体培地で洗浄し、適切な量のMS液体にペレットを再懸濁させた。正方形に切り分けたタバコの葉をバクテリア溶液に８分間浸し、2.0 mg L−1の6−ベンジルアミノプリン（6−BA）、0.2 mg L−1の1−ナフチル酢酸（NAA）、及び500 mg L−1のセフロミンを含むMS媒体で培養された。２週間後に外植片を選択された新しい培地に移した。再生小植物が２cmに成長した時点で、0.2 mg L−1のNAAを含むMS培地に移して根を誘発した。４週間後にトランスジェニックタバコ小植物を鉢に移して、花が咲くまで温室に入れておいた。正の遺伝子導入系がPCRによって選択され、空のプラスミドを有するトランスジェニック小植物が対照として使用された。トランスジェニック花弁中のアントシアニンがHPLCシステムで検出された。
【００３７】
（イチゴの果実における一過性発現による機能的キャラクタライゼーション）
赤くなりつつある果実を付けているイチゴの栽培品種、フラガリアxアナナッサ、品種名「ホンギャン（Hongyan）」（北京農業技術エクステンション・ステーション（The Beijing Agricultural Technology Extension Station））が被験種として選択された。ホフマン（Hoffmann）らに従って、pBI121−FOMT構築物を有するアグロバクテリウムEHA105株の単一コロニーが接種され、ペレットを遠心分離にかけてから、浸透性緩衝液（infiltration buffer：50 mM Mes、pH 5.6、2 mM Na3PO4, 0.5％グルコース（w/v）、及び100 mM アセトシリンゴン）で洗浄した（ティ．ホフマン（Hoffmann, T.）、ジー．カリノウスキー（G. Kalinowski）、及びダブリュ．シュワブ（W. Schwab）著、「アグロインフィルトレーションによるイチゴの果実（フラガリアxアナナッサ）における遺伝子発現のRNAi誘導抑制：遺伝子機能の高速分析（NAi−induced silencing of gene expression in strawberry fruit (Fragaria ｘ ananassa) by agroinfiltration：a rapid assay for gene function analysis）」、プラント・ジャーナル（Plant Journal）、2006年、第48巻、第5号、p. 818−826.）。
【００３８】
バクテリア懸濁液を浸透性緩衝液（infiltration buffer）で希釈して接種濃度をＯＤ600 0.1〜0.3に調節した。一過性形質転換のイチゴの果実を一過性形質転換するために浸透注射器を使用した。４日後に、以下に記載のアントシアニン量の分析のために接種したイチゴを収穫した。
【００３９】
（フラボノイドの抽出、準備及び分析）
適当な量の試料（花弁、花）をすり鉢とすりこ木で粉末にして、QL−861ボルテックスシェイカー（キリンベル・ラブ・インストゥルメント（Lylinbell Lab Instruments）、江蘇省、中国）でシェイクした、2 mL 2％(v/v)ギ酸のメタノール溶液で最初に抽出し、KQ−500DE型超音波洗浄機（ウルトラソニック・インストゥルメント、江蘇省昆山市、中国）を用いて20℃で20分間超音波処理し、SIGMA 3K30（SIGMA遠心分離機、ドイツ）（12,000 rpm, 10分間）遠心分離して上澄み液を集めた。さらに、2 mLと1 mLの抽出溶液を残渣に添加し、２回目・３回目の同じ操作を繰り返した。HPLC−DAD及びHPLC−ESI−MSn分析を行う前に、全抽出液を溜めて0.22μmの強化ナイロン膜フィルタ（上海 ANPEL、上海、中国）でろ過した。各試料について３つの試料が作られた。
【００４０】
HPLCシステムは反応生成物分析と同じであり、以下の溶剤と勾配とが用いられた。Ａ：10％ギ酸水溶液、Ｂ：アセトニトリルに溶解した0.1％ギ酸、Ｂの濃度は５％から40％Ｂまで25分以内で一定に傾斜させ、40％Ｂで５分間維持してから５分で元の５％Ｂに戻した、流速は0.8 mL・分−1、カラム温度は35℃に維持、10μLの被検質を注入した。クロマトグラムは、525 nmでアントシアニン類、350 nmで他のフラボノイド類のピークが得られた。
【００４１】
ESI源（アジリエント・テクノロジー、パロアルト、CA）を介してLC−MSD Trap VLイオントラップ質量分析計に連結したUV検出器を備えたアジリエント−1100−HPLCで、HPLC−ESI−MSn分析を行った。HPLC分離条件は先に記載したものと同じである。MS条件は次のようである。即ち、陰イオン（NI）モード、キャピラリー電圧 3.5 kV、噴霧圧力1 241.3kPa、ガス（N2）温度が350℃、流速 6.0 Lmin−1であった。キャピラリーのオフセット電圧は77.2であった。MSスペクトルは m/z 50〜1000からの範囲に亘って記録された。
【００４２】
（結果）
＜トランスジェニックタバコのフラボノイドO−メチルトランスフェラーゼの活性＞
発明者らは、イン・ビーボでのFOMTの機能を特徴付けるのにトランスジェニックタバコを用いた。ベクター35S::PsFOMTと35S::PtFOMTとを有するトランスジェニックタバコ系統の花弁におけるアントシアニンをHPLCシステムによって試験した。空のベクターを有し、主なアントシアニンがシアニジン 3−O−ルチノシド（Cy3R）である対照と比べて、35S::PsFOMTと35S::PtFOMTとを有するトランスジェニックタバコの花弁からは新しいアントシアニンが検出され、ポジティブモデルにおいて、その m/zは301と609であり、ピオニジンの分子量とそのルチノシドとを有していた（図９Ａ）。この結果は、PsFOMTとPtFOMTとがタバコの花弁においてメチルトランスフェラーゼとして機能していることを示していた。さらに、全アントシアニン（TA）中のピオニジン−3−O−ルチノシド（Pn3R）の量は、35S::PtFOMT系統よりも35S::PsFOMT系統においてはるかに高く（図９Ａ）、イン・ビーボでのPsFOMTの酵素はPtFOMTの酵素よりもより活性が高いことを示唆しており、遺伝子組み換えタンパク質の分析結果と一致している。35S::PsFOMT系統の花の色は対照の系統に比べて紫がかったものになる傾向があり（図１０）、一方、PtFOMTは花の色に関して明確な違いを示さない。このことは、メチル化が花の色を変化させることの一つの方法であることを示唆している。
【００４３】
＜一過性のイチゴ果実におけるフラボノイドO−メチルトランスフェラーゼの活性＞
イン・ビーボでのFOMTの機能を調べるのに、アグロバクテリウムが媒体となって一過性形質転換したイチゴの果実を用いた。この方法によると、時間のかかる異種遺伝子のトランスジェニック分析とその機能の解読を行わずに済んだ（ティ．ホフマン（Hoffmann, T.）、ジー．カリノウスキー（G. Kalinowski）、及びダブリュ．シュワブ（W. Schwab）著、「アグロインフィルトレーションによるイチゴの果実（フラガリアxアナナッサ）における遺伝子発現のRNAi誘導抑制：遺伝子機能の高速分析（NAi−induced silencing of gene expression in strawberry fruit (Fragaria ｘ ananassa) by agroinfiltration: a rapid assay for gene function analysis）」、プラント・ジャーナル（Plant Journal）、2006年、第48巻、第5号、p. 818−826.；エス．スポラオーレ（Spolaore, S.）、エル．トレイノッティ（L. Trainotti）及びジー．カサドーロ（G. Casadoro）著、「アグロバクテリウムが媒体となる熟した新鮮な果実における一過性遺伝子発現の単純な手順（A simple protocol for transient gene expression in ripe fleshy fruit mediated by Agrobacterium）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ボタニー（Journal of Experimental Botany）、2001年、第52巻、第357号、p. 845−850）。先の報告書とイチゴの果実中のアントシアニン類についての研究によると、フラガリアxアナナッサ、品種名「ホンギャン（Hongyan）」にはぺラルゴニジン誘導体のみがあり、これらは、イン・ビトロ分析に対するPsFOMTの基質ではない。Cy型のアントシアニン類の蓄積物を果実に導入するために、R2R3 MYB 転写因子PAP1（production of anthocyanin pigment 1）遺伝子（ジェイ．オー．ボレヴィッツ（Borevitz, J.O.）ら著、「フェニルプロパノイド生合成の保存されたMYB調節遺伝子を活性標識が同定する（Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis）」、プラント・セル（Plant Cell）、2000年、第12巻、第12号、p. 2383−2393）が、アグロフィルとレーションによってFOMTと共にイチゴの果実に一時的に導入された。シロイヌナズナ、タバコ及びトマトにおけるPAP1遺伝子の過剰発現はアントシアニン類蓄積物の機能を確認した（ジェイ．オー．ボレヴィッツ（Borevitz, J.O.）ら著、「フェニルプロパノイド生合成の保存されたMYB調節遺伝子を活性標識が同定する（Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid biosynthesis）」、プラント・セル（Plant Cell）、2000年、第12巻、第12号、p. 2383−2393；エル．エル．ゾウ（Zhou, L.L.）ら著、「シロイヌナズナ PAP1/MYB75転写因子を過剰発現するタバコカルス培養物の成長とアントシアニン生合成のキャラクタリゼーション（Development of tobacco callus cultures over expressing Arabidopsis PAP1/MYB75 transcription factor and characterization of anthocyanin biosynthesis） 」、プランタ（Planta）、2008年、第229巻、第1号、p. 37−51；ディ．エル．ズルアガ（Zuluaga, D.L.）ら著、「シロイヌナズナのMYB75/PAP1転写因子がトランスジェニックトマト植物においてアントシアニン生成を誘導する（Arabidopsis thaliana MYB75/PAP1 transcription factor induces anthocyanin production in transgenic tomato plants）」、ファンクショナル・プラント・バイオロジー（Functional Plant Biology）、2008年、第35巻、第7号、p. 606−618；ディ．ワイ．シエ（Xie, D.Y.）ら著、「アントシアニンレダクターゼとPAP1 MYB転写因子との共発現によるプロアントシアニジン類の代謝工学（Metabolic engineering of proanthocyanidins through co−expression of anthocyanidin reductase and the PAP1 MYB transcription factor）」、プラント・ジャーナル（Plant Journal）、2006年、第45巻、第6号、p. 895−907）。予想されたように、PAP1一過性発現果実は、Pgアントシアニン類に加えてCy 3−O−グルコシドとCy 3−O−マロニルグルコシドとを蓄積していた（図９Ｂ）。イチゴ果実中のアントシアニン類は表５に列記してあり、その各々を質量分析法と文献とによって同定した（エフ．エル．ダ・シルバ（da Silva, F.L.）ら著、「イチゴのアントシアニン色素（Anthocyanin pigments in strawberry）」、エル・ダブリュ・ティ−フードサイエンス・アンド・テクノロジー（LWT−Food Science and Technology）、2007年、第40巻、第2号、p. 374−382）。イチゴの果実におけるPAP1とFOMTとの共発現分析は、Cy 3−O−グルコシドとCy 3−O−マロニルグルコシドとの量が減少し、その一方で、対応するメチル化アントシアニンであるPn 3−O−グルコシドとPn 3−O−マロニルグルコシドとが増えていることを示した（図９Ｂ）。新しい化合物を質量分析と我々の研究室に保存されている信頼のおける参照文献とによって同定した。PsFOMTの転換効率とPtFOMTの転換効率とが相違していることに気が付いた。PsFOMT一過性発現果実における前駆体（Cy型）に対するメチル化生成物（Pn型）の割合は、PtFOMTのそれよりも大きく、イン・ビトロでの遺伝子組み換えタンパク質の結果と一致している。
【００４４】
【表４】
0006296465.tif 000005
【００４５】
＜PsFOMTの発現と被試験花の異なる成長相でのアントシアニンの蓄積＞
牡丹 Paeonia suffruticosa, cv. 郡芳殿における異なる成長段階でのPsFOMTの転写がRT−PCRによって分析された。この遺伝子は色のない蕾の段階で発現を開始し、その後発現が続いて、花弁が完全に色づいて咲き始めたときに最大になった。花が完全に開くと、PsFOMTの発現は殆ど認められなくなった。アントシアニンの蓄積についての調査も遺伝子発現の分析と同じ段階で行われた。花弁には、Cy3G、Cy3G5G、Pn3G、及びPn3G5Gを含む４つのアントシアニンがあった。主要なアントシアニンはPn3G5Gであり、次第に増加するPsFOMT発現と一致して顕著であった（図１１）。牡丹 Paeonia suffruticosa, cv. 郡芳殿の花においてはPsFOMTがPn3G5Gの蓄積と直接的に関係していることが示唆される。
【００４６】
＜部位特異的突然変異誘発と活性＞
活性に関わる鍵となるアミノ酸を確認するために、PCR法と迅速突然変異誘発システム（Fast Mutagenesis System）（TransGen）とを用いて部位特異的突然変異誘発を行った。使用されたプライマー配列は表１に示されている。PtFOMT−G13E、PtFOMT−T85A、PtFOMT−R87L、及びPtFOMT−T205Rという名称のPtFOMTのテンプレートとなる配列にしたがって、４つの構成を構築した。対応する遺伝子組み換えタンパク質を生成し、触媒活性を試験した。その結果、PtFOMT−R87Lの突然変異種がPsFOMTに匹敵する活性を回復した。他の突然変異種はPtFOMTに比べて大きく向上した活性を全く示さなかった。87位にあるロイシンはメチルトランスフェラーゼ活性に対して極めて重要な残基である。PsFOMT−L87RとPsFOMT−L87Aとの復帰突然変異は、PtFOMTに類似する低い酵素効率を有しており、これによって前記結論をさらに確認した。
【００４７】
【表５】
0006296465.tif 000006
【００４８】
活性％はPsFOMTと比べた遺伝子組み換えタンパク質の活性の割合。
SDは３回の繰り返しによる標準偏差。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<110>  INSTITUTE OF BOTANY, THE CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
<120>  Novel protein and gene related to flavonoid O−methyltransferase 
(FOMT) and their uses therefore
<140>  PCT/CN2013/074973
<141>  2013−04−28
<160>  22    
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  708
<212>  DNA
<213>  Paeonia suffruticosa cv. ‘Gunpohden’
<400>  1
atggccgagt cagataggaa gggtattctt aaaagtgaag cccttttgaa gtacatatta       60
gaaactagtg tctaccccag ggaacatgaa caactcaagc aactcagaca ggctaccgtc      120
gacaagtaca aatactggag tgtgatgaat gtgcctgctg atgaagggca gttcctctca      180
atgcttttga agattatgaa tgcaaagaag actatcgagg ttggagtctt tactggttat      240
tctcttctca ctgccgctct tgctctgcct accgatgcca aaataacagc aatcgatcca      300
gacggggaag cctacgagac tggacttcca tttattaaga aggctggagt ggagcataag      360
attaactaca ttcaagcaga tgcaatgtca gttttagatg atcttgtgac taatgggaag      420
gaagaaggga gctttgattt tgcatttgtg gatgcggaca aggaaaacta tgccaaatat      480
catgagccac tgatgaagtt ggttaaaatt ggtggaataa ttggctatga caatacattg      540
tggtttggtt cagttgcact ctcggacggt gatgagatga aggaatttca ggaaaagggc      600
aggcgcatct ttagagagtt caacactttc ttagctgctg atcctcgtat tgaattagct      660
cacatttcca ttggggacgg tctcgctctc tgtaggcgcc tctattag                   708
<210>  2
<211>  708
<212>  DNA
<213>  Paeonia tenuifolia
<400>  2
atggccgagt cagataggaa gggtattctt aaaagtggag cccttttgaa gtacatatta       60
gaaactagtg tctaccccag ggaacatgaa caactcaagc aactcagaca ggctaccgtc      120
gacaagtaca aatactggag tgtgatgaat gtgcctgctg atgaagggca gttcctctca      180
atgcttttga agattatgaa tgcaaaaaag actatcgagg ttggagtctt tactggttat      240
tctcttctca ctaccgctcg tgctctgcct accgatgcca aaataacagc aatcgatcca      300
gacggagaag cctacgagac tggacttcca tttattaaga aggctggagt ggagcataag      360
attaactaca ttcaagcaga tgcaatgtca gttttagatg atcttgtgac taatgggaag      420
gaagaaggga gctttgattt tgcatttgtg gatgctgaca aggaaaacta tgccaaatat      480
catgagccac tgatgaagct ggttaaaatt ggtggaataa ttggctatga caatacattg      540
tggtttggtt cagttgcact ctcggacggt gatgagatga aggaatttca ggaaaagggc      600
aggcgcatct ttacagagtt caacactttc ttagctgctg atcctcgtat tgaattagct      660
cacatttcca ttggggacgg cctcgccctc tgtaggcgcc tctattag                   708
<210>  3
<211>  235
<212>  PRT
<213>  Paeonia suffruticosa cv. ‘Gunpohden’
<400>  3
Met Ala Glu Ser Asp Arg Lys Gly Ile Leu Lys Ser Glu Ala Leu Leu 
1               5                   10                  15      
Lys Tyr Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr Pro Arg Glu His Glu Gln Leu 
20                  25                  30          
Lys Gln Leu Arg Gln Ala Thr Val Asp Lys Tyr Lys Tyr Trp Ser Val 
35                  40                  45              
Met Asn Val Pro Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Ser Met Leu Leu Lys 
50                  55                  60                  
Ile Met Asn Ala Lys Lys Thr Ile Glu Val Gly Val Phe Thr Gly Tyr 
65                  70                  75                  80  
Ser Leu Leu Thr Ala Ala Leu Ala Leu Pro Thr Asp Ala Lys Ile Thr 
85                  90                  95      
Ala Ile Asp Pro Asp Gly Glu Ala Tyr Glu Thr Gly Leu Pro Phe Ile 
100                 105                 110         
Lys Lys Ala Gly Val Glu His Lys Ile Asn Tyr Ile Gln Ala Asp Ala 
115                 120                 125             
Met Ser Val Leu Asp Asp Leu Val Thr Asn Gly Lys Glu Glu Gly Ser 
130                 135                 140                 
Phe Asp Phe Ala Phe Val Asp Ala Asp Lys Glu Asn Tyr Ala Lys Tyr 
145                 150                 155                 160 
His Glu Pro Leu Met Lys Leu Val Lys Ile Gly Gly Ile Ile Gly Tyr 
165                 170                 175     
Asp Asn Thr Leu Trp Phe Gly Ser Val Ala Leu Ser Asp Gly Asp Glu 
180                 185                 190         
Met Lys Glu Phe Gln Glu Lys Gly Arg Arg Ile Phe Arg Glu Phe Asn 
195                 200                 205             
Thr Phe Leu Ala Ala Asp Pro Arg Ile Glu Leu Ala His Ile Ser Ile 
210                 215                 220                 
Gly Asp Gly Leu Ala Leu Cys Arg Arg Leu Tyr 
225                 230                 235 
<210>  4
<211>  235
<212>  PRT
<213>  Paeonia tenuifolia
<400>  4
Met Ala Glu Ser Asp Arg Lys Gly Ile Leu Lys Ser Gly Ala Leu Leu 
1               5                   10                  15      
Lys Tyr Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr Pro Arg Glu His Glu Gln Leu 
20                  25                  30          
Lys Gln Leu Arg Gln Ala Thr Val Asp Lys Tyr Lys Tyr Trp Ser Val 
35                  40                  45              
Met Asn Val Pro Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Ser Met Leu Leu Lys 
50                  55                  60                  
Ile Met Asn Ala Lys Lys Thr Ile Glu Val Gly Val Phe Thr Gly Tyr 
65                  70                  75                  80  
Ser Leu Leu Thr Thr Ala Arg Ala Leu Pro Thr Asp Ala Lys Ile Thr 
85                  90                  95      
Ala Ile Asp Pro Asp Gly Glu Ala Tyr Glu Thr Gly Leu Pro Phe Ile 
100                 105                 110         
Lys Lys Ala Gly Val Glu His Lys Ile Asn Tyr Ile Gln Ala Asp Ala 
115                 120                 125             
Met Ser Val Leu Asp Asp Leu Val Thr Asn Gly Lys Glu Glu Gly Ser 
130                 135                 140                 
Phe Asp Phe Ala Phe Val Asp Ala Asp Lys Glu Asn Tyr Ala Lys Tyr 
145                 150                 155                 160 
His Glu Pro Leu Met Lys Leu Val Lys Ile Gly Gly Ile Ile Gly Tyr 
165                 170                 175     
Asp Asn Thr Leu Trp Phe Gly Ser Val Ala Leu Ser Asp Gly Asp Glu 
180                 185                 190         
Met Lys Glu Phe Gln Glu Lys Gly Arg Arg Ile Phe Thr Glu Phe Asn 
195                 200                 205             
Thr Phe Leu Ala Ala Asp Pro Arg Ile Glu Leu Ala His Ile Ser Ile 
210                 215                 220                 
Gly Asp Gly Leu Ala Leu Cys Arg Arg Leu Tyr 
225                 230                 235 
<210>  5
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   BamHI−forward
<400>  5
taggatccat ggccgagtca gataggaagg gta                                    33
<210>  6
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   XhoI−reverse
<400>  6
ttactcgagc atggctaata gaggcgccta caga                                   34
<210>  7
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  NdeI−forward
<400>  7
gggaattcca tatgatggcc gagtcagata ggaagggt                               38
<210>  8
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  BamHI−reverse
<400>  8
ttacgcggat cccatggcta atagaggcgc ctacaga                                37
<210>  9
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   PtFOMT G13E−forward
<400>  9
tattcttaaa agtgaagccc ttttg                                             25
<210>  10
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT G13E−reverse
<400>  10
tcacttttaa gaataccctt cctat                                             25
<210>  11
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT T85A−forward
<400>  11
ttattctctt ctcactgccg ctcgt                                             25
<210>  12
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT T85A−reverse
<400>  12
cagtgagaag agaataacca gtaaag                                            26
<210>  13
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   PtFOMT R87L−forward
<400>  13
tcactaccgc tcttgctctg cctac                                             25
<210>  14
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT R87L−reverse
<400>  14
agagcggtag tgagaagaga ataac                                             25
<210>  15
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT T205R−forward
<400>  15
ggcgcatctt tagagagttc aacac                                             25
<210>  16
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PtFOMT T205R−reverse
<400>  16
ctaaagatgc gcctgccctt ttcctg                                            26
<210>  17
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PsFOMT L87R−forward
<400>  17
cttctcactg ccgctcgtgc tctgc                                             25
<210>  18
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PsFOMT L87R −reverse
<400>  18
cgagcggcag tgagaagaga ataacc                                            26
<210>  19
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   PsFOMT L87A−forward
<400>  19
tctcactgcc gctgctgctc tgcct                                             25
<210>  20
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   PsFOMT L87A−reverse
<400>  20
gcagcggcag tgagaagaga ataacc                                            26
<210>  21
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PsFOMT−forward
<400>  21
atggccgagt cagataggaa gggt                                              24
<210>  22
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PsFOMT−reverse
<400>  22
taaaatgatc cttctgccat gct                                               23
【図１】
0006296465.tif 000007
【図２】
0006296465.tif 000008
【図３】
0006296465.tif 000009
【図４】
0006296465.tif 000010
【図５】
0006296465.tif 000011
【図６】
0006296465.tif 000012
【図７】
0006296465.tif 000013
【図８】
0006296465.tif 000014
【図９】
0006296465.tif 000015
【図１０】
0006296465.tif 000016
【図１１】
0006296465.tif 000017
【配列表】
0006296465000001.xml