(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソニックヘッジホッグポリペプチドを含む、心筋梗塞を経験した被験体における不整脈及びＱＴ間隔を減少させるための医薬組成物。
【請求項２】
ヘッジホッグタンパク質のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
可溶性ポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ソニックヘッジホッグポリペプチドが、配列番号１の１位のアミノ酸残基から１９７位のアミノ酸残基に及ぶ配列、又は前記配列と少なくとも９０％の同一性を有するその機能保存変異体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ソニックヘッジホッグポリペプチドが抗体のＦｃ部分に融合されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
微粒子によって運搬される、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、心筋梗塞を経験した被験体の心臓保護のための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
心臓発作として一般的に公知の心筋梗塞は、心臓部への血液供給が中断されると発生し、一部の心臓細胞を死に至らしめる。これは、脆弱性アテローム動脈硬化性プラークの破裂後の冠状動脈閉塞が最も一般的な原因である。その結果生じる虚血及び酸素不足は、相当の期間にわたって治療せずに放置された場合、心筋組織の損傷及び又は死を引き起こし得る。したがって、心筋梗塞の臨床状況では、当面の目標は、可能な限り迅速に患者への血流を回復させることである。血流が適切な時間内に回復した場合、組織損傷を回避し得る。しかしながら、血流の回復がかなり遅れると、虚血再灌流傷害として公知の二次症状に至り、これは虚血事象後に徐々に進行し得、不可逆的な組織損傷を引き起こし得る。臨床例としては、心筋梗塞後の心臓収縮機能不全、不整脈及び不可逆的な筋細胞損傷（心臓細胞死）が挙げられる。したがって、心筋梗塞後の心臓保護のためのいくつかの方法が検討されている。例えば、収縮機能の改善を目的とした現在の治療は、多くの場合、強心剤（例えば、カルシウム、ドーパミン、エピネフリン、エフェドリン、フェニレフリン、ドブタミン）の使用を含む。しかしながら、報告によれば、強心薬は、細胞内カルシウム濃度及び心拍数の増加に関連しており、特に、エネルギーバランスが損なわれた心臓では潜在的に有害であり得る。したがって、心臓保護の限定的な成功は、治療ターゲットの数が比較的少ないことによって制限されている。本発明は、心筋梗塞後の心臓保護のための新たな治療ターゲットを提供することによって、この必要性を満たす。
【０００３】
発明の概要：
本発明は、心筋梗塞を経験した被験体の心臓保護に使用するための、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達経路のリガンドに関する。
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、生理的な状況において（成体心筋細胞において）、リガンド又は送達微粒子のいずれかを使用するソニックヘッジホッグが、区分化された一酸化窒素（ＮＯ）産生と、それに続くグリベンクラミド感受性内向き整流カリウムチャネル（すなわち、ＡＴＰ依存性カリウム電流（ＩＫＡＴＰ））の活性化を誘導して、活動電位持続時間、Ｃａ２＋トランジェントの振幅及び細胞収縮の減少をもたらし得ることを示した。これらの効果は、Ｐａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ複合体、ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ、ＮＯシンターゼの活性化及びｃＧＭＰの蓄積を介して媒介される。これらの効果は、リンパ球由来のシェッドメンブレン（shed membrane）微粒子によって運搬されるソニックヘッジホッグによって模倣されるが、これは、微粒子が、生物学的メッセージのベクターとしてインビボで作用し得ることを示唆している。本発明者らによって得られたインビボの結果は、ＥＣＧのＱＴ間隔の減少が、心室のソニックヘッジホッグによって誘導されるＩＫＡＴＰに直接関連していたことを示している。虚血／再灌流の動物モデルでは、再灌流前のソニックヘッジホッグの投与は、ＱＴ間隔の延長を防止する。ＱＴ延長は、心室性不整脈及び心臓突然死と相関する。さらに、再灌流時のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化は、心筋に対する直接的な作用によって、再灌流２４時間後の再灌流障害を防止する。結論として、血管新生及び内皮機能不全の両方に対するその効果に加えて、本発明者らは、心筋細胞に対して直接作用するＳｈｈの新規な心臓保護効果を本明細書で実証する。本研究は、急性心筋梗塞後の再灌流傷害を予防するために、潜在的な治療ターゲットとしてのＳｈｈ経路の多面的効果を強調している。
【０００５】
したがって、本発明は、心筋梗塞を経験した被験体の心臓保護に使用するための、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドに関する。
【０００６】
本明細書で使用される「心臓保護」という用語は、心筋梗塞後、虚血再灌流後、虚血再灌流中又は虚血再灌流前の心筋損傷の保護又は軽減を意味する。特に、虚血再灌流との関連では、心臓保護としては、梗塞サイズの減少、再灌流傷害の軽減、ＱＴ延長の防止（すなわち、ＱＴ間隔の減少）、不整脈（例えば、心室性不整脈）の軽減、及び心室再分極の改善が挙げられる。したがって、本発明は、急性心筋梗塞後の心臓突然死リスクを減少させるのに特に適切である。
【０００７】
本明細書で使用される「ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路」という用語は、細胞内、特に心筋細胞内のソニックヘッジホッグによって媒介される一連の事象を指す。ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路は、ソニックヘッジホッグタンパク質の非存在下であっても、下流の構成要素を活性化することによって活性化され得る。
【０００８】
したがって、「ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路（signalling pathway）のリガンド」という用語は、成体心筋細胞におけるソニックヘッジホッグタンパク質の効果を模倣することができる任意の天然又は非天然化合物を指す。好ましくは、該リガンドは、成体心筋細胞におけるＰａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈ複合体を活性化することができるか、又は成体心筋細胞におけるＩＫＡＴＰを活性化することができる化合物である。典型的には、該リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー又は有機小分子である。
【０００９】
特定の実施態様では、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドは、ソニックヘッジホッグポリペプチドである。
【００１０】
「ソニックヘッジホッグ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ソニックヘッジホッグタンパク質を指す。該タンパク質は、自己触媒的に切断される前駆体として作られ；Ｎ末端部分は可溶性であり、シグナル伝達活性を含有するが、Ｃ末端部分は前駆体のプロセシングに関与する。より重要なことに、Ｃ末端産物は、コレステロール部分をＮ末端産物に共有結合して、Ｎ末端産物が細胞表面に向かうのを制限する。「ソニックヘッジホッグ」という用語は、天然に存在するソニックヘッジホッグ並びにその機能保存変異体及び改変型を含む。ソニックヘッジホッグは任意の供給源に由来し得るが、典型的には、哺乳動物（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類）ソニックヘッジホッグ、より具体的にはヒトソニックヘッジホッグである。ソニックヘッジホッグタンパク質及びこのようなタンパク質をコードする核酸の配列は、当業者に周知である。例えば、Genbankアクセッション番号ＡＡＡ６２１７９（配列番号１）は、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）ソニックヘッジホッグの完全アミノ酸配列を提供する。しかしながら、当業者であればこれらの分子の配列を認識しており、ソニックヘッジホッグの特性を有する限り、任意のソニックヘッジホッグタンパク質又は遺伝子配列変異体を使用し得ると理解すべきである。
【００１１】
「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能の変更を伴わずに、タンパク質又は酵素の所定のアミノ酸残基が変化しているものであり、限定されないが、あるアミノ酸の類似特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するものによる置換が挙げられる。タンパク質において、保存的と示されているもの以外のアミノ酸は異なっていてもよく、類似機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性の割合は様々であり得、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ法（この場合、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）などのアライメントスキームにしたがって決定した場合に７０％〜９９％であり得る。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定した場合に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、それが比較されるネイティブなタンパク質又は親タンパク質と同じか又は実質的に類似の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。
【００１２】
本発明によれば、「ソニックヘッジホッグポリペプチド」という用語は、ソニックヘッジホッグタンパク質のシグナル伝達ドメインを含む任意のポリペプチドを指す。したがって、該用語は、ソニックヘッジホッグそれ自体、又はヘッジホッグタンパク質のシグナル伝達ドメインを含むそのフラグメントを包含する。好ましくは、ソニックヘッジホッグポリペプチドは可溶性ポリペプチドであり、Ｃアミノ末端ドメインを含まない。ヘッジホッグタンパク質のシグナル伝達ドメインは、アミノ末端ドメインである。本明細書で使用される「アミノ末端ドメイン」は、ソニックヘッジホッグタンパク質のアミノ末端アミノ酸由来のアミノ酸配列であって、ネイティブなソニックヘッジホッグポリペプチドのカルボキシ末端フラグメントのタンパク質分解活性によって特異的に認識されるグリシン−システイン−フェニルアラニン（ＧｌｙＣｙｓ−Ｐｈｅ）切断部位をそのカルボキシ末端に有するアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、ソニックヘッジホッグポリペプチドは、配列番号１の１位のアミノ酸残基から１９７位のアミノ酸残基に及ぶ配列、又は前記配列の機能保存変異体（例えば、配列番号１の１位のアミノ酸残基から１９７位のアミノ酸残基に及ぶ配列と少なくとも９０％（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％）の同一性を有する配列）を含む。
【００１３】
特定の実施態様では、本発明の治療方法に使用されるソニックヘッジホッグポリペプチドは、それらの治療有効性を改善するために改変され得ることが意図される。治療化合物のこのような改変は、毒性を低減するために、循環時間を増加させるために、又は生体分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、生体分布を改変する様々な薬物担体ビヒクルとの組み合わせによって有意に低減され得る。
【００１４】
薬物の持続性を改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、生体分布を改変し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的障壁を通る透過性を変化させ；体からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性及び改変容易性を考慮して、薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームへの結合は、滞留時間を改善し、毒性を低減することが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端のヒドロキシル基を通じて、及び他の化学的方法を介して活性剤にカップリングされ得るが；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２つの活性剤に限定される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合性を保持するが、１分子当たりの付着点が多い（より大きな薬物ローディングを提供する）というさらなる利点を有し、様々な用途に適するように合成設計され得る新規生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーを検討した。
【００１６】
当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を認識している。例えば、ＰＥＧと、リジンなどの三官能性モノマーとの交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を介してリシンのａ−及びｅ−アミノ基に連結される。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密にコントロールされた所定の間隔で反応性ペンダント基（リシンのカルボン酸基）を提供しつつ、ＰＥＧの望ましい特性を保持する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋又は他の分子とのコンジュゲーションに使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な結合を変化させることによって、安定な長期循環プロドラッグを生産するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、及びコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量に影響を与える（より小さなＰＥＧセグメントは、より大きな薬物ローディングを提供する）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体的な分子量を増加させることにより、コンジュゲートの循環半減期が増加するであろう。それにもかかわらず、コンジュゲートは、易分解性でなければならないか、又は糸球体ろ過限界値未満の分子量（例えば、４５kDa未満）を有しなければならない。
【００１７】
また、循環半減期及び生体分布を維持するのに重要なポリマー骨格に対して、リンカーを使用して、特定のトリガー（典型的には、ターゲット組織における酵素活性）によって骨格ポリマーから放出されるまで、治療剤をプロドラッグ形態に維持し得る。例えば、生体分布の特定部位への送達が必要であり、治療剤が病変部位で又はその近くで放出される場合に、この種類の組織活性化薬物送達は特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者に公知であり、酵素反応速度、活性酵素の普及率、及び選択された疾患特異的な酵素の切断特異性に基づくものであり得る（例えば、VectraMed, Plainsboro, N.J.によって確立された技術を参照のこと）。このようなリンカーは、治療送達のために、本明細書に記載されるソニックヘッジホッグポリペプチドを改変するのに使用され得る。
【００１８】
特定の実施態様では、ソニックヘッジホッグポリペプチドは、抗体のＦｃ部分に融合される。本明細書で使用される「Ｆｃ部分」は、定常領域のフラグメント、類似体、変異体、突然変異体又は誘導体を含む、免疫グロブリン（好ましくは、ヒト免疫グロブリン）の定常領域由来のドメインを包含する。適切な免疫グロブリンとしては、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及び他のクラスが挙げられる。
【００１９】
本発明によれば、ソニックヘッジホッグポリペプチドは、従来の自動化ペプチド合成法によって、又はリコンビナント発現によって生産され得る。タンパク質を設計及び作製するための一般的な原理は、当業者に周知である。
【００２０】
本発明のソニックヘッジホッグポリペプチドは、従来の技術にしたがって溶液中又は固体支持体上で合成され得る。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールにしたがって使用され得る。本発明のソニックヘッジホッグポリペプチドはまた、例示的なペプチド合成装置、例えばApplied Biosystems IncのModel 433Aを用いる固相技術によって合成され得る。自動ペプチド合成によって、又はリコンビナント法によって作製された任意の所定のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的な信頼性は、当業者に周知の任意の方法によって立証され得る。
【００２１】
自動ペプチド合成の代替手段としては、リコンビナントＤＮＡ技術が用いられ得、この場合、本明細書で以下に記載されるように、選択のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞にトランスフォーメーション又はトランスフェクションし、発現に適切な条件下で培養する。リコンビナント法は、より長いポリペプチドを生産するのに特に好ましい。
【００２２】
ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含有及び発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系が利用され得る。これらとしては、限定されないが、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフォーメーションした細菌などの微生物；酵母発現ベクターでトランスフォーメーションした酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションしたか、又は細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）でトランスフォーメーションした植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられる。当業者であれば、タンパク質の哺乳動物発現を最適化するための様々な技術を認識している。リコンビナントタンパク質の生産に有用な哺乳動物細胞としては、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞及び２９３細胞が挙げられる。細菌、酵母及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドのリコンビナント発現用の例示的なプロトコールは当業者に公知であり、本明細書で以下に簡単に説明する。リコンビナントタンパク質発現のための哺乳動物宿主系も当業者に周知である。発現タンパク質をプロセシングするか、又はタンパク質活性の提供に有用な特定の翻訳後修飾を生じさせる特定の能力について、宿主細胞株を選択し得る。ポリペプチドのこのような修飾としては、限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加及びアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」形態を開裂する翻訳後プロセシングも、正確な挿入、フォールディング及び／又は機能に重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの様々な宿主細胞は、このような翻訳後活性に関して特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするように選択され得る。
【００２３】
本発明のソニックヘッジホッグポリペプチドのリコンビナント生産では、ソニックヘッジホッグ由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを用いることが必要であろう。このようなベクターを調製するための方法、及びこのようなベクターでトランスフォーメーションされた宿主細胞を生産するための方法は、当業者に周知である。このような試みに使用されるポリヌクレオチド分子は、宿主内における増殖のために、選択可能なマーカー及び複製起点を一般的に含むベクターに結合され得る。発現構築物のこれらの要素は当業者に周知である。一般的に、発現ベクターとしては、所定のタンパク質をコードするＤＮＡであって、適切な転写調節配列又は翻訳調節配列、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子由来のものなどに作動可能に連結されたＤＮＡが挙げられる。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳をコントロールする適切な配列が挙げられる。「発現ベクター」、「発現構築物」又は「発現カセット」という用語は本明細書を通して互換的に使用され、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物であって、該核酸のコード配列の一部又は全部が転写され得る核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を含むことを意味する。当然のことながら、本発明のペプチド又はポリペプチドを発現させるための適切な発現ベクターの選択は、使用すべき特定の宿主細胞に依存し、当業者の技術の範囲内にある。一般に、本発明に有用なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ポリペプチド配列の挿入又は組み込みによって操作されたウイルス源又は細菌源由来の他のビヒクルが挙げられる。
【００２４】
ソニックヘッジホッグのリガンドを生産するための別の戦略は、シェッドメンブレン微粒子の使用である。細胞は、微粒子の放出を介して他の細胞と情報伝達し得る。微粒子は、刺激及び／又はアポトーシス細胞から放出された小さな小胞である。それらは、元の親細胞に特徴的な膜タンパク質と、細胞シグナル伝達に関与する細胞内成分とを保有する。微粒子は、細胞機能障害を維持及び／又は開始する細胞シグナル伝達のバイオマーカー及びエフェクターの両方であると考えられる。いくつかの種類の微粒子は、細胞プロセス及びセクレトーム（細胞によって分泌される分子）のモデュレーションを介し、続いて、ターゲット細胞の再プログラミング後に組織修復を誘導することによる治療能力を有する。微小粒子産生細胞においてソニックヘッジホッグなどの関連の合成を駆動することによって、様々なタンパク質を過剰発現するように微粒子（Micorparticles）を操作し得る。
【００２５】
したがって、特定の実施態様では、本発明は、心筋梗塞を経験した被験体の心臓保護のための、ソニックヘッジホッグを有する微粒子の使用に関する。薬物を送達するための担体として、微粒子は、固有の利点を有する：第１に、微粒子は細胞膜から形成されるので、非常に安全で自己にとって都合がよい；第２に、ソニックヘッジホッグを有する微粒子の操作は簡単で容易に取り扱え、一般的なプロセスであり、薬物の物理化学的特性によって制限されない。微粒子の使用は、ソニックヘッジホッグの簡単で有効な担体及び無害な治療的介入を保証する。
【００２６】
さらなる目的では、本発明は、それを必要とする患者における心筋梗塞を治療するための方法であって、
−ｉ）心臓虚血組織における血液供給を回復させること
−ｉｉ）治療有効量の本発明のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンド（例えば、微粒子によって運搬されるソニックヘッジホッグポリペプチド又はソニックヘッジホッグ）を前記患者に投与することによって、心臓保護を誘導すること
からなる工程を含む方法に関する。
【００２７】
「治療有効量」は、任意の医療処置に適用可能な妥当なリスク対効果比で心臓保護を誘導するのに十分な本発明のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドの量を意味する。本発明の化合物及び組成物の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解されよう。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量のレベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般健康、性別及び食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路及び排泄速度；治療期間；用いられるリガンドと組み合わせて、又は同時に用いられる薬物；並びに医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまでその投与量を徐々に増加させることは、当技術分野の技術の範囲内で周知ある。
【００２８】
特定の実施態様では、上記工程ｉ）及びｉｉ）を逐次に又は同時に実施し得る。したがって、本発明の方法は、再潅流傷害前及び／又は再潅流傷害時に、治療有効量の本発明のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドを被験体に投与する工程を含む。典型的には、血流への注入によって、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドを投与する。第２の投与は、再灌流後短時間（すなわち、２４時間）であると考えられ得る。
【００２９】
ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドを、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて、治療組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与した場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤化助剤を指す。
【００３０】
好ましくは、注射可能な製剤の場合、医薬組成物は、薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性、無菌性の生理食塩水（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）であり得るか、又は場合により、滅菌水若しくは生理食塩水の添加によって注射液剤を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【００３１】
注射使用に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液剤又は分散剤；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液剤又は分散剤の即時調製用の滅菌散剤が挙げられる。全ての場合において、この形態は無菌でなければならず、注射容易性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００３２】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製され得る。通常の貯蔵及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含有する。
【００３３】
ソニックヘッジホッグポリペプチドは、中性の形態又は塩の形態で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）酸付加塩が挙げられ、これらは、例えば、塩酸、リン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形成される。遊離カルボキシル基によって形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【００３４】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物並びに植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、並びに界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【００３５】
滅菌注射液剤は、必要量の活性ポリペプチドを、必要な場合には上記他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒体と、上記のものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ベヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液剤を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、先に滅菌ろ過したその溶液からの活性成分と、任意の所望のさらなる成分の粉末が生成される。
【００３６】
本発明はまた、血管内人工器官、例えば、ステント、バイパスグラフト、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、血管カフ及び血管形成用カテーテルの中から選択される生体物質又は医療用送達デバイスを調製するための、本発明のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドの使用に関する。
【００３７】
これに関して、本発明はより具体的には、上に定義したソニックヘッジホッグポリペプチド（又は、ソニックヘッジホッグポリペプチドをコードする核酸、若しくはソニックヘッジホッグポリペプチドをコードする核酸を含むベクター）の発現及び／又は活性でコーティングされた上記生体物質又は医療用送達デバイスであって、血管内人工器官、例えば、ステント、バイパスグラフト、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、血管カフ及び血管形成用カテーテルの中から選択される生体物質又は医療用送達デバイスに関する。このような局所的生体物質又は医療用送達デバイスは、冠状動脈、頸動脈、腎動脈、末梢動脈、脳動脈又は任意の他の動脈若しくは静脈位置を含む任意の血管位置で実施する血行再建、バイパス又は移植手術の補助物として血管狭窄を減少させるために、動静脈透析アクセスの場合などで、ポリテトラフルオロ−エチレン移植の有無にかかわらず、及びステント術の有無にかかわらず吻合性狭窄を減少させるために、あるいは任意の他の心臓手術若しくは移植手術、又は先天的血管インターベンションと併せて使用され得る。
【００３８】
例示目的のために、このような血管内人工器官及びそれらにソニックヘッジホッグポリペプチドをコーティングするための方法は、より具体的には、国際公開第２００５０９４９１６号に記載されているか、又は当技術分野で最近使用されているものである。人工器官のコーティングに使用される化合物は、前記阻害剤の制御放出を優先的に可能にするはずである。前記化合物は、ポリマー（例えば、縫合糸、ポリカーボネート、Hydron及びElvax）、生体ポリマー／生体基質（例えば、アルギン酸塩、フカン、コラーゲンをベースにした基質、ヘパラン硫酸）又は合成ヘパラン硫酸様分子などの合成化合物又はそれらの組み合わせであり得る。ポリマー材料の他の例としては、生体適合性で分解可能な材料、例えば、ラクトンをベースにしたポリエステル又はコポリエステル、例えば、ポリラクチド、ポリラクチド−グリコリド、ポリカプロラクトン−グリコリド、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリアミノ酸、多糖、ポリホスファゼン、ポリ（エーテル−エステル）コポリマー、例えば、PEO-PLLA又はそれらの混合物、及び生体適合性で非分解性の材料、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、アクリレートをベースにしたポリマー又はコポリマー、例えば、ポリブチルメタクリレート、ポリ（ヒドロキシエチルメチル−メタクリレート）、ポリビニルピロリジノン、ポリテトラフルオエチレンなどのフッ素化ポリマー、セルロースエステルが挙げられ得る。ポリマーマトリックスを使用する場合、それは、２層（例えば、前記阻害剤が組み込まれた基層、例えば、エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル及びポリブチルメタクリレート、並びに前記阻害剤の拡散コントロールとして作用する保護膜、例えば、ポリブチルメタクリレート）を含み得る。あるいは、前記阻害剤は基層に含まれていてもよく、補助物は外層に組み込まれていてもよく、その逆も同様である。
【００３９】
このような生体物質又は医療用送達デバイスは生体分解可能でもよいし、又は永久使用を目的とする場合には金属若しくは合金、例えば、Ｎｉ及びＴｉ若しくは他の安定物質製であり得る。本発明の阻害剤はまた、ミクロポア又はチャネルを含有するように改変されたステント又は移植体の金属に封入され得る。また、本発明の阻害剤を含有する上で開示したポリマー若しくは他の生体適合材料製の血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、又は血管カフも局所送達に使用され得る。
【００４０】
前記生体物質又は医療用送達デバイスは、阻害剤が前記生体物質又は医療用送達デバイスから経時的に放出して、周囲組織に入るのを可能にする。前記放出は、１カ月間〜１年間にわたって起こり得る。本発明の局所送達は、疾患部位では本発明の阻害剤が高濃度であり、循環する化合物は低濃度であることを可能にする。このような局所送達適用に使用される前記阻害剤の量は、使用される化合物、治療すべき症状及び所望の効果に応じて変化するであろう。本発明の目的のために、治療有効量が投与されるであろう。
【００４１】
前記生体物質又は医療用送達デバイスの局所投与は、好ましくは、血管病変部位で又はその近くで行う。投与は、以下の経路の１つ以上によるものであり得る：カテーテル又は他の血管内送達系、鼻腔内、気管支内、腹腔内又は食道。ステントは、一般的に、閉塞を軽減するために管の管腔内に放置するチューブ構造として使用される。血管の壁成分と結合した障害物を剪断破壊して管腔を拡張するためには、それらを非拡張形態で管腔内に挿入し、次いで、自発的に拡張するか（自己拡張ステント）、又はインサイツで第２のデバイス（例えば、狭窄血管又は体内経路内で膨張するカテーテルマウント血管形成バルーン）を用いて拡張することができる。
【００４２】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）レセプター複合体は、心室心筋細胞におけるＮＯ産生を媒介する。Ａ）ラット心室心筋細胞におけるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）及びＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）及び参照グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡの発現を実証する代表的なＰＣＲゲル。Ｂ）心筋細胞及び参照組織として使用した精巣におけるＳｍｏ及びＰｔｃタンパク質の発現を実証する代表的なウエスタンブロット（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）。Ｃ）心筋細胞をリコンビナントＳｈｈタンパク質（Ｎ−Ｓｈｈ）、又はＳｈｈタンパク質保有微粒子（ＭＰＳｈｈ＋）と共に４時間インキュベーションした後のＮＯ産生の増加を実証する代表的な共焦点画像（上のパネル）。コントロール（ｎ＝細胞８９５個）において、Ｎ−Ｓｈｈ（ｎ＝細胞３６５個）とのインキュベーション後において、及びホスホイノシチド−３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＬＹ、２５μM、ｎ＝細胞９８個）、ＮＯＳ阻害剤Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ、１００μM、ｎ＝細胞９８個）とのコインキュベーション後において、ＤＡＦ蛍光レベル（下のパネル）を定量した。ＭＰＳｈｈ＋（ｎ＝細胞３８２個）とのインキュベーション後において、及びＳｈｈ経路阻害剤シクロパミン（ＭＰＳｈｈ＋−Ｃｃｌ、３０μM、ｎ＝細胞１３７個）とのコインキュベーション後においても、ＤＡＦ蛍光レベルを定量した。ＰＴＣ／Ｓｍｏ阻害剤シクロパミン（Ｃｃｌ、３０μM、ｎ＝細胞６８個）は単独で、基本ＮＯレベルに対していかなる効果も及ぼさなかった。Ｓｈｈを有さないＭＰ（ＭＰＳｈｈ−）とのインキュベーションは、ＮＯ形成を増強しなかった（ｎ＝細胞２３個）。データは、平均±ＳＥＭである；＊、ｐ＜０．０５対コントロール。
【図２】Ｓｈｈシグナル経路は、心室心筋細胞の興奮収縮連関を阻害する。Ａ）コントロール、Ｎ−Ｓｈｈ処理及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞のサルコメア長の代表的な経時変化。Ｂ）コントロール、Ｎ−Ｓｈｈ処理及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞における休止サルコメア長。Ｃ）コントロール心筋細胞、及びリコンビナントＳｈｈ（Ｎ−Ｓｈｈ）又はＳｈｈ保有ＭＰ（ＭＰＳｈｈ＋）と共に４時間インキュベーションした心筋細胞のＣａ２＋トランジェント（４０５／４８０nmインド−１蛍光）の代表的な経時変化。Ｄ）コントロール、Ｎ−Ｓｈｈ処理及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞における拡張期Ｃａ２＋レベル。ホスホイノシチド−３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＬＹ、２５μM、ｎ＝１９）、ＮＯＳ阻害剤Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ、１００μM、ｎ＝１９）及びＳｈｈ経路阻害剤シクロパミン（Ｃｃｌ、３０μM、ｎ＝１７（Ｎ−Ｓｈｈ）及びｎ＝７５（ＭＰＳｈｈ＋））と共にインキュベーションした後の、コントロール（ｎ＝２５３）、Ｎ−Ｓｈｈ処理（ｎ＝８２）及びＭＰＳｈｈ＋処理（ｎ＝２１８）心筋細胞において、短縮（休止サルコメア長に対する％）（Ｅ）及びＣａ２＋トランジェントの振幅（Ｆ）を測定した。Ｓｈｈタンパク質を有さないＭＰ（ＭＰＳｈｈ−、ｎ＝２５）とのインキュベーションは、短縮又はＣａ２＋トランジェントを改変しなかった。データは、平均±ＳＥＭである；＊、ｐ＜０．０５対コントロール。
【図３】心臓の興奮収縮連関のＳｈｈシグナル経路。Ａ）コントロール（黒色の線）心室心筋細胞、並びにリコンビナントＳｈｈ（Ｎ−Ｓｈｈ）で４時間処理した心筋細胞（破線）、及びＳｈｈ保有ＭＰ（ＭＰＳｈｈ＋）で４時間処理した心筋細胞（灰色の線）におけるフィールド刺激前後の［Ｃａ２＋］ｉと短縮との間の関係の代表的なトレース。Ｂ）様々な外部［Ｃａ２＋］（四角：０．３、円：０．５、三角：１、逆三角：１．８mM）によってＣａ２＋トランジェントをモデュレーションした後の、コントロール及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞におけるサルコメアの短縮（休止時の長さに対する％）対Ｃａ２＋トランジェント。等尺性除膜コントロール及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞のＣ）張力及びＤ）相対張力（各条件においてｎ＝１２）。コントロール（ｎ＝７）、リコンビナントＳｈｈ（Ｎ−Ｓｈｈ）で４時間処理した心筋細胞（Ｎ−Ｓｈｈ、ｎ＝８）（Ｅ）及びＳｈｈ保有ＭＰ（ＭＰＳｈｈ＋）で４時間処理した心筋細胞（ｎ＝８）（Ｆ）において電圧クランプで記録した膜電位に応じたＬ型Ｃａ２＋電流密度（ＩＣａＬ、ｐＡ／ｐＦ単位）。データは、平均±ＳＥＭである；＊、ｐ＜０．０５対コントロール。
【図４】Ｓｈｈは、活動電位持続時間を減少させ、内向き整流カリウム電流を活性化する。Ａ）コントロール及びＳｈｈ処理後において記録した活動電位の代表的なトレース（左パネル、黒色及び赤灰色）。ＩＫＡＴＰ阻害剤グリベンクラミド（１μM）の存在下で、同じ実験を繰り返した（黒色コントロール、灰色Ｓｈｈ、右パネル）。コントロール（ｎ＝７）、Ｓｈｈ（ｎ＝８）、コントロール＋グリベンクラミド（ｎ＝７）、Ｓｈｈ＋グリベンクラミド（ｎ＝８）、Ｓｈｈ＋Ｌ−ＮＮＡ（ｎ＝７）、Ｓｈｈ＋Ｌ−ＮＮＡ＋グリベンクラミド（ｎ＝７）、Ｓｈｈ＋ＯＤＱ（ｎ＝７）、Ｓｈｈ＋ＯＤＱ＋グリベンクラミド（ｎ＝７）における９５％再分極（ＡＰＤ９５、Ｂ）時の活動電位持続時間の平均値。Ｃ）Ｓｈｈの非存在下（黒色のトレース）又は存在下（灰色のトレース）における−１２０mV〜０mVの、グリベンクラミドの適用前後に測定した電流差のファミリー。電流密度として表した平均定常状態電流を（Ｄ）に示す（コントロール及びＳｈｈにおいてｎ＝８及び８）。ＯＤＱ（ｎ＝６）及びＬ−ＮＮＡ（ｎ＝６）の存在下においても、同様の実験を実施した。−１２０及び−６０mVにおける平均電流密度をそれぞれ（Ｅ）及び（Ｆ）に示す。データは、平均±ＳＥＭとして表す。＊及び＃、それぞれｐ＜０．０５対コントロール及びＳｈｈ。
【図５】さらなる内向き整流Ｋ＋電流の有無の場合における活動電位、ＩＣａＬ及びＣａ２＋トランジェントの数値シミュレーション。Ｓｈｈによって誘発される内向き整流電流のマッチング式を実験的に構築し、このモデルに追加した（CellMLからのBondarenko et al. (2004)のオンラインモデル）。Ａ）シミュレーションした電流の電流−電圧関係。電気刺激後の活動電位（ＡＰ）の経時変化（Ｂ）、並びにこのカリウム電流の存在下（黒色の線）及び非存在下（破線）におけるＡＰ中の経時変化ＩＣａＬ（Ｂ）。Ｓｈｈ処理中のより短いＡＰは、より高いがより短いＣａ２＋電流を誘発して、より少ない正味Ｃａ２＋流入をもたらし（カリウム電流の非存在下及び存在下におけるＣａ２＋イオンはそれぞれ４．３８Ｅ１０対３．９７Ｅ１０）、より小さいＣａ２＋トランジェントを生じたことに注目すべきである（Ｄ）。
【図６】Ｓｈｈは、静脈内（ＩＶ）注射６時間後のＥＣＧのＱＴｃ間隔を短縮する。Ｓｈｈ、Ｓｈｈ及びヘキサメトニウム、ＭＰ、Ｓｈｈ及びシクロパミン、Ｓｈｈ及びグリベンクラミドの静脈内（ｉ．ｖ．）注射前及びその６時間後に、ラットにおいて遠隔測定ＥＣＧを記録した。心拍数に対してＱＴ間隔を補正し（方法を参照のこと）、３０分間の期間全体で平均化した。＊ｐ＜０．０５、静脈内（ＩＶ）注射６時間後対注射前。
【図７】虚血再灌流後のＱＴｃ間隔の経時変化。虚血前及び再灌流の最初の２４時間にわたって、ラットにおいてＥＣＧを記録した。冠状動脈を３０分間閉塞した。再灌流１５分前に、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ及びシクロパミン又はビヒクルをラットに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。心拍数に対してＱＴ間隔を補正し（方法を参照のこと）、３０分間の期間全体で平均化した。（＊Ｐ＜０．０５対コントロール）。
【図８】再灌流２４時間後の左室リモデリング。マッソントリクロームで染色した心臓切片から、線維形成の大幅な増加が明らかになったが、これは、再灌流１５分前にＳｈｈを動物に静脈内（ｉ．ｖ．）注射すると抑制された。この抑制は、シクロパミンによって無効化された（＊Ｐ＜０．０５  Ｓｈｈ対ビヒクル、＃Ｐ＜０．０５  Ｓｈｈ対Ｓｈｈ＋シクロパミン）。
【図９】Ｓｈｈ経路の活性化は、虚血再灌流のラットモデルにおける梗塞サイズを減少させる。Ａ）ＴＴＣ染色した心臓の代表的な切片（上）。Ｂ）リスク領域（ＡＡＲ）に対して梗塞領域（ＩＡ）を正規化することによって、定量を行った。Ｎ−Ｓｈｈによる処理は再灌流２４時間後の梗塞サイズを減少させ、この心臓保護効果はシクロパミンによって抑制された。群間において、総ＡＡＲの有意差は観察されなかった（Ｃ）。データは、平均±ＳＥＭとして表す（コントロールｎ＝６、Ｎ−Ｓｈｈ  ｎ＝５、Ｎ−Ｓｈｈ＋Ｃｃｌ  ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５対コントロール）。
【図１０Ａ】Ｓｈｈシグナル伝達の活性化は、虚血再灌流後の心室再分極を改善する。ビヒクル、リコンビナントＮ−Ｓｈｈ又はＮ−Ｓｈｈ＋シクロパミン（Ｃｃｌ）のいずれかで処理（再灌流１５分前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）した動物において、３０分間の虚血後の２４時間の再灌流にわたって、ＥＣＧを取得した。（Ａ）再灌流６時間後の典型的なＥＣＧは、心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）の延長を示した。３つの異なる実験条件におけるＱＴｃ変動の経時変化を（Ｂ）にまとめる。Ｃ）には、再灌流後２時間にわたって記録した不整脈の回数がまとめられており、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化すると、心室性不整脈が軽減することが示されている。Ｄ）ビヒクルのみ（コントロール）で処理した動物において、再灌流後に記録した心室性不整脈（矢印によって示される）の３つの代表的なパターン。（コントロールｎ＝６、Ｎ−ＳＨＨ  ｎ＝５、Ｎ−ＳＨＨ＋Ｃｃｌ  ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図１０Ｂ】Ｓｈｈシグナル伝達の活性化は、虚血再灌流後の心室再分極を改善する。ビヒクル、リコンビナントＮ−Ｓｈｈ又はＮ−Ｓｈｈ＋シクロパミン（Ｃｃｌ）のいずれかで処理（再灌流１５分前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）した動物において、３０分間の虚血後の２４時間の再灌流にわたって、ＥＣＧを取得した。（Ａ）再灌流６時間後の典型的なＥＣＧは、心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）の延長を示した。３つの異なる実験条件におけるＱＴｃ変動の経時変化を（Ｂ）にまとめる。Ｃ）には、再灌流後２時間にわたって記録した不整脈の回数がまとめられており、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化すると、心室性不整脈が軽減することが示されている。Ｄ）ビヒクルのみ（コントロール）で処理した動物において、再灌流後に記録した心室性不整脈（矢印によって示される）の３つの代表的なパターン。（コントロールｎ＝６、Ｎ−ＳＨＨ  ｎ＝５、Ｎ−ＳＨＨ＋Ｃｃｌ  ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図１０Ｃ】Ｓｈｈシグナル伝達の活性化は、虚血再灌流後の心室再分極を改善する。ビヒクル、リコンビナントＮ−Ｓｈｈ又はＮ−Ｓｈｈ＋シクロパミン（Ｃｃｌ）のいずれかで処理（再灌流１５分前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）した動物において、３０分間の虚血後の２４時間の再灌流にわたって、ＥＣＧを取得した。（Ａ）再灌流６時間後の典型的なＥＣＧは、心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）の延長を示した。３つの異なる実験条件におけるＱＴｃ変動の経時変化を（Ｂ）にまとめる。Ｃ）には、再灌流後２時間にわたって記録した不整脈の回数がまとめられており、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化すると、心室性不整脈が軽減することが示されている。Ｄ）ビヒクルのみ（コントロール）で処理した動物において、再灌流後に記録した心室性不整脈（矢印によって示される）の３つの代表的なパターン。（コントロールｎ＝６、Ｎ−ＳＨＨ  ｎ＝５、Ｎ−ＳＨＨ＋Ｃｃｌ  ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【図１０Ｄ】Ｓｈｈシグナル伝達の活性化は、虚血再灌流後の心室再分極を改善する。ビヒクル、リコンビナントＮ−Ｓｈｈ又はＮ−Ｓｈｈ＋シクロパミン（Ｃｃｌ）のいずれかで処理（再灌流１５分前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射）した動物において、３０分間の虚血後の２４時間の再灌流にわたって、ＥＣＧを取得した。（Ａ）再灌流６時間後の典型的なＥＣＧは、心拍数について補正したＱＴ間隔（ＱＴｃ）の延長を示した。３つの異なる実験条件におけるＱＴｃ変動の経時変化を（Ｂ）にまとめる。Ｃ）には、再灌流後２時間にわたって記録した不整脈の回数がまとめられており、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化すると、心室性不整脈が軽減することが示されている。Ｄ）ビヒクルのみ（コントロール）で処理した動物において、再灌流後に記録した心室性不整脈（矢印によって示される）の３つの代表的なパターン。（コントロールｎ＝６、Ｎ−ＳＨＨ  ｎ＝５、Ｎ−ＳＨＨ＋Ｃｃｌ  ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５）。
【００４４】
実施例１：ソニックヘッジホッグシグナル伝達は、成体心室筋細胞における興奮収縮連関をモデュレーションする
材料と方法
倫理に関する声明
実験は、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Pub. No. 85-23, Revised 1996)を順守しており、全ての手順は、European Parliament Directive 2010/63/EU and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals"を順守していた。
【００４５】
単離された細胞の調製
以前に記載されているように１、２００〜２５０ｇの雄性成体ウィスターラットから、心室心筋細胞を単離した。ヘパリン（１００Ｕ）と共にペントバルビタールナトリウム（１００mg/kg）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって、ラットを麻酔した。心臓を迅速に摘出し、氷冷ハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液（mM単位：ＮａＣｌ  １１７、ＫＣｌ  ５．７、ＮａＨＣＯ３４．４、ＫＨ２ＰＯ４１．５、ＭｇＣｌ２１．７、ＨＥＰＥＳ  ２１、グルコース１１．７、タウリン２０、ｐＨ７．１５）で洗浄し、Langendorff灌流システムにマウントし、最初にハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液で５分間灌流（３ml／分、３７℃）して血液から除去し、次いで、１．２mg/mlコラゲナーゼ４型（Worthington, Lakewood, NJ, USA）を補充した緩衝液で１３〜１８分間灌流した。１mg/ml ２，３−ブタンジオンモノオキシム（ＢＤＭ）及び１mg/ml ＢＳＡを補充したハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液に、心臓を入れた。同じ培地中で、ハサミ及びピペットを用いて心房を取り出し、心室を慎重に分離した。懸濁液をナイロンメッシュ（２００μm）に通してろ過し、細胞のデカンテーションのために１０分間にわたって４回インキュベーションした。上清の各デカンテーション後、筋細胞を、０mmol/L Ｃａ２＋（＋１mg/ml  ＢＤＭ及び１mg/ml  ＢＳＡ）を含有するハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、０．３mmol/L Ｃａ２＋（＋０．６mg/ml  ＢＤＭ及び１mg/ml  ＢＳＡ）を含有するハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液に２回再懸濁し、そして最後に、１mmol/L Ｃａ２＋（＋１mg/ml  ＢＳＡのみ）を含有するハンクス−ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。
【００４６】
Ｓｈｈタンパク質又は微粒子とのインキュベーション
細胞を計数し、細胞１５０．１０３個／mlまで播種し、続いて、穏やかに振盪しながら、０．４μg/mlリコンビナントヒト担体結合Ｓｈｈ（Ｃ２４ＩＩ）タンパク質（N-Shh, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）又は１０μg/ml微粒子（ＭＰ）と共に２２℃で４時間インキュベーションした。予備実験（０時間、２時間、４時間及び６時間のインキュベーションを試験したところ、カルシウムトランジェント及び短縮に対する効果は、４時間後に最も顕著であった）にしたがって、インキュベーション時間を決定した。
【００４７】
微粒子の調製
ヒトリンパＣＥＭ  Ｔ細胞株（ATCC, Manassas, VA, USA）から、微粒子（ＭＰ）を得た。細胞を細胞１０６個／mlで播種し、無血清X-VIVO 15培地（Lonza, Walkersville, MD, USA）中で培養し、次いで、フィトヘマグルチニン（５μg/ml）で７２時間、ホルボール−１２−ミリスタート−１３（２０ng/ml）及びアクチノマイシンＤ（０．５μg/ml）で２４時間（ＭＰＳｈｈ＋）、又はアクチノマイシンＤ（０．５μg/ml）のみで２４時間処理した（ＭＰＳｈｈ−）。２回の遠心分離工程（７５０ｇで１５分間及び１５００ｇで５分間）で上清を得て、細胞及び大きな残屑を除去した。残ったＭＰ含有上清を１４，０００ｇに４５分間供して、ＭＰをペレット化した。ＭＰペレットを２回の遠心分離（１４，０００ｇ、４５分間）に供した。最後に、ＭＰペレットを滅菌ＮａＣｌ（０．９％w/v）２４００μlで戻した。１ml当たりタンパク質１０μgを含有するように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準に対して決定したタンパク質含有量に対して、ＭＰ含有量を調整した。
【００４８】
阻害剤及び化学物質
また上記と同じ条件下で、コントロール細胞及びＭＰロード細胞を様々な阻害剤：シクロパミン（Ｃｃｌ、３０μM、Ｓｈｈ経路阻害剤）、ＬＹ２９４００２（ＬＹ、２５μM、ＰＩ３−Ｋ阻害剤）、Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ、１００μM、ＮＯＳ阻害剤、１Ｈ−［１．２．４］オキサジアゾロ［４．３−ａ］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ、１０μM、可溶性グアニル酸シクラーゼ、ｓＧＣ、阻害剤）、グリベンクラミド（Ｇｌｉｂ、１μM、ＫＡＴＰチャネル阻害剤）と共にインキュベーションした。特に指定がない限り、Sigma (St. Louis, MO, USA)から全ての化学物質を入手した。
【００４９】
Ｃａ２＋トランジェント及び細胞短縮
単離された心室心筋細胞に、インド−１ＡＭ（１０μM、Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を室温で３０分間ロードし、次いで、１．８mmol/L Ｃａ２＋を含有するＨＥＰＥＳフリー緩衝液（１１７mmol/L ＮａＣｌ、５．７mmol/L ＫＣｌ、４．４mmol/L ＮａＨＣＯ３、１．５mmol/L ＫＨ２ＰＯ４、１．７mmol/L ＭｇＣｌ２、２１mmol/L ＨＥＰＥＳ、１１mmol/Lグルコース、２０mmol/Lタウリン、ｐＨ７．２）で洗浄した。フィールド刺激（１Hz、２２℃、１．８mmol/L外部Ｃａ２＋）を使用して、アンロード細胞の短縮及びカルシウム濃度［Ｃａ２＋］（インド−１色素）を研究した。サルコメア長（ＳＬ）及び蛍光（４０５及び４８０nm）を同時に記録した（IonOptix Myocyte Calcium and Contractility Recording System, Dublin, Ireland）３。様々な［Ｃａ２＋］ｏｕｔ（mmol/L単位：０．３、０．５、１、１．８、２．５、３．５、５）におけるカルシウムトランジェント及び短縮を評価するために、ラミニンでプレコーティングしたカバースリップ上に心筋細胞を配置し、５００μl／分の一定流量で灌流した。５mlシリンジに接続されたマイクロキャピラリーにカップリングした円錐形の先端を細胞の近くに配置することによって、灌流を達成した。
【００５０】
機械的記録及びＳＬ測定
以前に記載されているように３、単回透過処理筋細胞のＣａ２＋によって活性化された力を測定した。０．３%vol/vol  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びプロテアーゼ阻害剤（フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン及びtrans−エポキシスクシニル−１−ロイシン−グアニドブチルアミド（Ｅ−６４））を含有する弛緩溶液（pCa９；pCa＝−ｌｏｇ［Ｃａ２＋］、以下を参照のこと）中で、インタクトな単離された心室筋細胞を室温で６分間透過処理した。次いで、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない同じ溶液で細胞を２回洗浄し、４℃に維持した。
【００５１】
透過処理筋細胞をピエゾ抵抗ストレンゲージ（AE801センサー、Memscap；５００Hzアンロード共振周波数、ストレンゲージコンプライアンス：０．０３μm/μN）に、並びに薄いステンレス鋼針及び２分間のＵＶ照射によって重合したoptical glue (NOA 63, Norland Products)を備えるステッピングモータ駆動マイクロマニピュレーター（MP-285, Sutter Instrument Company）に付着させた。IonOptix収集ソフトウェアを使用して、高速フーリエ変換アルゴリズムを細胞のビデオ画像に適用することによって、実験中に、ＳＬをオンラインで決定した。撮像断面から測定した断面積に対して、力を正規化した。起点として機能するように、付着前にスラックＳＬを測定した。ＳＬ２．３μm、２２℃において、pCa−力の関係を確立した。全張力と弛緩張力との間の差によって、各pCaにおける活動張力を表した。最初の最大張力の８０％、又は目に見える横紋パターンを維持していなかった細胞を廃棄した。収縮中は細胞を等尺に維持したが、特に活性化が最大の場合に、サルコメアは通常、長さが変化した。十分に付着しており、ＳＬ変化が最小（＜０．１μm）の細胞のみを維持した。最大下活性化時の活動張力を、（pCa５で得られた）最大等尺性張力に対して正規化した。力測定結果を１００Hzで低域フィルタリングし、感熱紙レコーダ（Dash IV, Astro-Med）で記録した。pCa９〜pCa４．５のＣａ２＋濃度範囲の実験溶液（流速２００μl／分）を含有する５mLシリンジに接続された１０個のマイクロキャピラリーの出口を受け入れた円錐形のマイクロキャピラリーの先端に単一細胞を配置した。各細胞について、力とpCaとの間の関係を、力＝［Ｃａ２＋］ｎＨ／（Ｋ＋［Ｃａ２＋］ｎＨ）の方程式（式中、ｎＨは、ヒル係数であり、pCa５０は、−（ｌｏｇＫ）／ｎＨに対応する半最大活性化のpCaである）にフィッティングした。
【００５２】
弛緩ストック溶液（pCa９．０）及び最大活性化ストック溶液（pCa４．５）を混合することによって、Ｃａ２＋活性化溶液を毎日調製した。弛緩溶液及び活性化溶液は、１２mmol/Lクレアチンリン酸、３０mmol/Lイミダゾール、１mmol/L遊離Ｍｇ２＋、１０mmol/L ＥＧＴＡ、３．３mmol/L Ｎａ２ＡＴＰ及び０．３mmol/L ＤＴＴを含有しており、pCa９．０（弛緩溶液）又はpCa４．５（最大活性化溶液）のいずれかであり、ＫＯＨでｐＨ７．１に調整した。Ｋ−アセタートを用いて、イオン強度を１８０mmol/Lに調整した。
【００５３】
一酸化窒素（ＮＯ）の測定
ＮＯ感受性蛍光色素：ＤＡＦ−ＡＭ（２０μM、４−アミノ−５−メチルアミノ−２，７−ジフルオロフルオレセインジアセタート、３０分間、Invitrogen）を心筋細胞にロードした。次いで、細胞を２２℃のタイロード溶液（１．８mmol/L Ｃａ２＋）に再懸濁した。アルゴンイオンレーザーによる４８８nmの励起、及び５１０〜５３０nmの発光フィルタを用いて、ｘ−ｙモード（Zeiss LSM 510、２５×、ＮＡ＝０．８水浸、Le Pecq, France）で、ＤＡＦ蛍光の共焦点画像を取得した。細胞を含まない画像領域からのバックグラウンド蛍光（Ｆ−Ｆ０）について蛍光値を補正し、蛍光／バックグラウンド比（（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０）を計算した。Image J v 1.36bソフトウェア（National Institute of Health, USA）を使用して、全ての画像を処理及び分析した。
【００５４】
ウエスタンブロット
溶解緩衝液（１０mmol/L Ｔｒｉｓ−リンゴ酸、２０mmol/L β−グリセロールリン酸、５０mmol/L ＮａＦ、１０mmol/Lベンズアミジン、０．２mmol/L Ｎａ３ＶＯ４、４０μMロイペプチン、５００μM ＰＭＳＦ、１０μM Ｅ６４、２mmol/L ＥＤＴＡ、５mmol/L ＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ６．８、４℃）中でホモジナイズした心筋細胞ペレットから、タンパク質を抽出した。ホモジネートを１０，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。RC DCキット（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）によって、総タンパク質濃度を決定した。タンパク質抽出物をレムリ尿素緩衝液（１０mmol/L Ｔｒｉｓ−リンゴ酸、２０mmol/L β−グリセロールリン酸、５０mmol/L ＮａＦ、１０mmol/Lベンズアミジン、０．２mmol/L Ｎａ３ＶＯ４、４０μMロイペプチン、５００μM ＰＭＳＦ、１０μM Ｅ６４、１mmol/L ＥＤＴＡ、１mmol/L ＥＧＴＡ、８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３％ＳＤＳ、５mmol/L ＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ６．８、４℃）に可溶化し、９５℃で５分間煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）電気泳動を使用してタンパク質サンプル（５０μg）を分離し、半乾燥ウエスタンブロットプロトコールによってポリフッ化ビニリデン膜に転写し、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。Ｓｍｏに対するヤギ抗体（ａｂ５８５９１）（1:400, Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, UK）及びＰｔｃに対するヤギ抗体（ｓｃ−６１４７）（1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA）、並びにペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗ウサギ（１：３，０００）／抗ヤギ（１：１，００００）ＩｇＧ抗体（Pierce, Rockford, IL, USA）を用いて、膜を４℃で一晩染色した。化学発光（Super Signal West Pico, Pierce）を使用してバンドを同定し、デンシトメトリー法で評価し、任意単位（Ａ．Ｕ．）で表した。
【００５５】
ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
製造業者のプロトコール（Euromedex, Souffelweyersheim, France）にしたがってTRIzol試薬を使用して、心筋細胞ペレットからＲＮＡを抽出し、DNase I (Invitrogen)によって３７℃で３０分間処理した。superscript II逆転写酵素（Invitrogen）を４２℃で５０分間使用して、ｃＤＮＡを合成した。LightCycler rapid thermal cycler (Roche, Meylan, France)を使用して、定量ＰＣＲを実施した。反応混合物２０μlは、０．５μMプライマーミックスを補充したAbsolute QPCR SYBR Green Capillary mix (thermo stratＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ミックス、３mmol/L ＭｇＣｌ２、SYBR green I色素；Thermo Fischer Scientific, llkirch, France）１０μl及びｃＤＮＡ  ５μlを含有していた。データをＧＡＰＤＨに対して正規化した。増幅プログラムは、最初の変性工程（９５℃で１５分間）と、９５℃で１秒間の変性、６０℃で１０秒間のアニーリング及び７２℃で２０秒間の伸長の４０サイクルとを含んでいた。融解曲線を使用して、ＰＣＲ産物の特異性を決定した。
【００５６】
細胞電気生理学
Axopatch 200B (Axon instrument, Burlingham, CA, USA)を用いて、全細胞のパッチクランプ実験を室温（２２〜２４℃）で実施した。パッチピペットは、２MΩの抵抗を有していた。電流を細胞膜のキャパシタンスに対して正規化した（ｐＡ／ｐＦ）。記録前に、直列抵抗を補正した。
【００５７】
ＡＰを記録するために、ピペット溶液は、ＫＣｌ（１３０）、ＨＥＰＥＳ（２５）、ＡＴＰ（Ｍｇ）（３）、ＧＴＰ（Ｎａ）（０．４）、ＥＧＴＡ（０．５）；ｐＨ７．２（ＫＯＨ）を含有していた（mM単位）。バス溶液は、ＮａＣｌ（１３５）、ＭｇＣｌ２（１）、ＫＣｌ（４）、グルコース（１１）、ＨＥＰＥＳ（２）、ＣａＣｌ２（１．８）；ｐＨ７．４（ＮａＯＨ）を含有していた（mmol/L単位）。閾上強度の０．２ミリ秒の電流注入によって、ＡＰを誘発した。実験中、０．５Hzの刺激を３０回送ることによって、細胞を刺激した。
【００５８】
ＩＣａＬを記録するために、バス溶液は、ＣａＣｌ２（１．８）、ＴＥＡＣｌ（１４０）、ＭｇＣｌ２（２）、グルコース（１０）、ＨＥＰＥＳ（１０）、ｐＨ７．４（ＴＥＡＯＨ）を含有していた（mM単位）。ピペット溶液は、ＣｓＣｌ（１４０）、ＨＥＰＥＳ（１０）、ＥＧＴＡ（１０）、ＮａＧＴＰ（０．４）、ＭｇＡＴＰ（３）、ｐＨ７．２（ＣｓＯＨ）を含有していた（mmol/L単位）。０．１Hzにおいて−８０〜−１０mVの試験脱分極（１５０ミリ秒）によって、ＩＣａＬを誘発した。−８０〜＋５０mVの１０mV電圧工程を使用して、電流−電圧関係を決定した。その振幅を、パルスの終了時のピークＩＣａＬと電流レベルとの間の差と推定した。
【００５９】
１０μmol/Lテトロドトキシン（ＴＴＸ）及び２mMコバルト（Ｃｏ２＋）を外部媒体に追加して、それぞれＩＮａ及びＩＣａＬをブロックした以外は、ＡＰに使用した溶液を用いて、Ｋ＋電流を記録した。０．１Hzにおいて−１２０mV〜０mVの範囲の試験脱分極（１秒）によって、−８０mVの保持電位（ＨＰ）から、それらを誘発した。グリベンクラミドの適用前後に、電圧工程を各細胞に対して２回実施し、これを使用して電流のグリベンクラミド感受性要素を決定した。
【００６０】
数値シミュレーション
４によって記載されているマウス心内膜心室細胞モデルを使用して、数値シミュレーションを実施した。このモデルは、CellML repository (http://www.cellML.org)からオンラインで入手可能であり、Cellular Open Resource５によって開発された。負の傾きを有する瞬時内向き整流電流方程式から導かれる以下の方程式によって、Ｓｈｈによって活性化される電流をシミュレーションした：
【数１】
0006302936.tif 000002
（式中、ＥＫは、Ｋ＋の平衡電位であり、Ｇｓｈｈは、Ｉｓｈｈコンダクタンスであり、Ｒは、気体定数であり、Ｔは、温度であり、Ｆは、ファラデー定数である）。
【００６１】
組織学。
ラット左心室から薄片（５μm）を調製し、光学顕微鏡検査（１０倍）のためにヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）及びマッソントリクローム（ＭＴ）で染色した。ＨＥ染色した心臓切片上で心筋の肥厚を推定し、ＭＴ染色した心室切片上でコラーゲンの存在を分析した。結果は、分析した心筋組織のコラーゲン含有量領域の割合として表した線維形成領域のパーセントを示している。
【００６２】
ＥＣＧの記録及び分析。
実験開始の１５日前に、DSI PhysioTel（商標）トランスミッタ（CTA-F40, Data Sciences International, Saint-Paul, Mn, USA）をマウスに埋め込んだ。回収後、データ収集システム（IOX2; EMKA Technologies）に接続されたシグナルトランスミッタレシーバ（RPC-1; DSI）を使用することによって、ＥＣＧを記録した。１，０００Hzのサンプリングレートでデータを連続的に収集した。このようにして、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ及びヘキサメトニウム、ＭＰ、Ｓｈｈ及びシクロパミン、Ｓｈｈ及びグリベンクラミドの静脈内（ｉ．ｖ．）注射前及びその６時間後に、ラットにおいてＥＣＧを記録した。また、虚血前の２４時間、虚血中及び再灌流後２４時間にわたって、ＥＣＧをモニタリングした。ソフトウェアECG-auto (ver 1.5.12.22, EMKA Technologies)を使用することによって、連続デジタル記録をオフラインで分析した。ＥＣＧシグナルを０．１〜１，０００Hzでデジタルフィルタリングした。心拍数及びＱＴ間隔を測定した。ＱＴ間隔は、心室再分極が元に戻るまでの等電ＰＲ間隔からの最初の偏差から、リードＩＩ  ＥＣＧからの等電ＴＰベースラインまでの時間と定義した。ＱＴ間隔は心拍数に依存するので、ＲＲ間隔の電位変化を考慮するようにＱＴ間隔を補正すべきである。バゼットの式：
【数２】
0006302936.tif 000003
（式中、ＱＴＢは、心拍数について補正したＱＴ間隔であり、ＲＲは、あるＱＲＳ群の発生から次のＱＲＳ群の発生までの間隔である）にしたがって、ＱＴ補正を実施した。
【００６３】
統計
示されている数値データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。ボンフェローニ事後検定による一元両側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、ｐ＜０．０５の場合に、結果を有意であるとみなした。
【００６４】
結果
Ｓｈｈ経路は、成体心筋細胞において機能的である
２つの膜貫通タンパク質Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃ）及びＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）は、ヘッジホッグレセプター複合体として同定された２４，２５。Ｐｔｃはヘッジホッグ結合タンパク質として機能し、Ｓｍｏはシグナル伝達に必要とされる。ヘッジホッグシグナルの非存在下では、ＰｔｃはＳｍｏの活性を阻害し、ヘッジホッグがＰｔｃと相互作用すると、Ｐｔｃがインターナリゼーションされ、Ｓｍｏ阻害が解除される２５。ＰＣＲ分析により、単離された成体ラット心室筋細胞には、Ｐｔｃ及びＳｍｏをコードするｍＲＮＡが存在することが同定されている（図１Ａ）。ウエスタンブロットによってこれをさらに確認して、Ｐｔｃ及びＳｍｏの存在が明らかになった（図１Ｂ）。次いで、ＮＯ蛍光プローブＤＡＦを心筋細胞にロードした（図１Ｃ）。最初の一連の実験では、細胞を、２０μmol/L Ｓｈｈホモログリガンドのリコンビナントタンパク質（Ｎ−Ｓｈｈ）と共に４時間インキュベーションした。コントロール細胞と比較すると、ＤＡＦ蛍光は、Ｎ−Ｓｈｈインキュベーション後に有意に増加していたが、これは、ＮＯの産生を示唆している。ＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＮＡの存在下では、この効果は抑制された。ＰＩ３Ｋは、潜在的な上流ＮＯＳモデュレータとして公知である１６。Ｓｈｈ誘導性のＮＯ産生は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４０２の存在下でも阻害された。また、心筋細胞をＳｈｈリガンド保有シェッドメンブレンＭＰ（ＭＰＳｈｈ＋、１８）と共に４時間インキュベーションすると、ＮＯ産生は有意に増加した。心筋細胞をＳｈｈ経路の特異的阻害剤シクロパミンと共にプレインキュベーションすると、この効果は抑制された。細胞を、Ｓｈｈリガンドを欠く様々なＭＰ（ＭＰＳｈｈ−、１８）と共にインキュベーションすると、ＤＡＦ蛍光はコントロールと同程度であった。まとめると、これらの実験は、成体ラット心筋細胞にはＳｈｈ経路が存在して機能しており、おそらくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ上流経路を介して、ＮＯＳ活性化及びＮＯ産生に関連していることを実証している。
【００６５】
Ｓｈｈ経路は、興奮収縮連関をモデュレーションする
単離された心筋細胞にインド−１（５μM、２０分間）をロードし、０．５Hzに置いた。サルコメア長の変動及び細胞質ゾルのＣａ２＋を同時に記録した。電気刺激によってトリガーされた細胞短縮は、Ｎ−Ｓｈｈ処理及びＭＰＳｈｈ＋処理の両方によって減少し（図２Ａ、Ｅ）、休止サルコメア長には影響がなかった（図２Ｂ）。Ｎ−Ｓｈｈ又はＭＰＳｈｈ＋はまた、Ｃａ２＋トランジェントの振幅を有意に減少させたが（図２Ｃ、Ｆ）、拡張期Ｃａ２＋は、わずかに減少したものの、統計的には依然として不変であった（図２Ｄ）。
【００６６】
実験を行って、心筋細胞における細胞短縮（図２Ｅ）及びＣａ２＋トランジェント（図２Ｆ）に対するＳｈｈ誘導性のＮＯ産生の影響を評価した。Ｎ−Ｓｈｈによって誘導される細胞短縮及びＣａ２＋トランジェントの振幅の減少は、Ｓｈｈ経路阻害剤シクロパミン、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２４９００２及び非選択的ＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＮＡの存在下では完全に無効化された。シェッドメンブレンＭＰＳｈｈ＋によって模倣されるＮ−Ｓｈｈの効果もシクロパミンによって遮断されたが、ＭＰＳｈｈ−はいかなる効果も及ぼさなかった。
【００６７】
この細胞短縮の減少は部分的には、Ｃａ２＋トランジェントの振幅の減少、及び／又は最終的には収縮機構レベルにおける直接作用のいずれかの結果であり得る。最初に、Ｃａ２＋トランジェントとサルコメア長細胞短縮との間の関係を位相面ループとして表した（図３Ａ、２６）。この種の表現は、Ｃａ２＋の変化に対する収縮機構の運動応答を反映する。これは、収縮反応をほとんど伴わずにＣａ２＋が急激に上昇する第１段階の後、細胞短縮がＣａ２＋トランジェントのピーク時に始まることを示す。Ｃａ２＋が低下しても収縮反応は継続し、最終的には、Ｃａ２＋及び収縮の両方が共に低下する。したがって、細胞短縮の減少は、Ｓｈｈの刺激後のＣａ２＋トランジェントの減少と相関する。Ｃａ２＋トランジェントの振幅及び筋フィラメントの応答をモデュレーションするために、０．３〜５mmol/Lの範囲の様々な［Ｃａ２＋］ｏｕｔに細胞を浸漬した（図３Ｂ）。各外部［Ｃａ２＋］について、ピークＣａ２＋トランジェントの振幅に対して、サルコメアの短縮をプロットした。しかしながら、コントロール及びＭＰＳｈｈ＋処理心筋細胞から得られた曲線を重ね合わせたところ、ＭＰＳｈｈ＋では、Ｃａ２＋トランジェント及び短縮が減少方向にシフトしていた。最後に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で除膜した心筋細胞において、筋フィラメントのＣａ２＋増感を評価した２１。図３Ｃ〜Ｄに示されているように、張力−pCaの関係から、筋フィラメントのＣａ２＋増感が類似することが実証された（コントロール及びＭＰＳｈｈ＋条件においてそれぞれpCa５０＝５．９１±０．０３及び５．８７±０．０３、ｎ＝細胞１２個／条件）。pCaが５．５超のＭＰＳｈｈ＋処理下では、最大活動張力のわずかな増加が観察された。まとめると、これらは、Ｎ−Ｓｈｈ及びＭＰＳｈｈ＋による細胞短縮の減少が、Ｃａ２＋シグナル伝達の減少の結果であるという仮説を裏付けている。
【００６８】
次いで、本発明者らは、ＮＯによってモデュレーションされることが公知２７の主な心臓Ｃａ２＋放出トリガー（すなわち、Ｌ型Ｃａ２＋電流（ＩＣａＬ、図３Ｅ、Ｆ））に対するＮ−Ｓｈｈ及びＭＰＳｈｈ＋の効果を評価した。Ｓｈｈ経路の活性化は、電圧クランプ条件下で測定したＩＣａＬに影響を与えなかった。最後に、コントロール細胞、及びＮ−Ｓｈｈ又はＭＰＳｈｈ＋のいずれかと共にインキュベーションした細胞では、１０mmol/Lカフェインを素早く適用した後に測定したピークＣａ２＋トランジェントとして測定した筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋放出が類似していたが（Ｆ４０５／Ｆ４８０比＝それぞれ０．３８±０．０２（ｎ＝６３）、０．３７±０．０２（ｎ＝２４）及び０．３６±０．０２（ｎ＝３６））、これは、Ｓｈｈ経路がＳＲ区画に直接干渉しない可能性を示唆している。
【００６９】
活動電位に対するＳｈｈ経路の効果
Ｃａ２＋トランジェントの振幅及び細胞収縮は、ＩＣａＬの変化の結果として活動電位波形によって直接モデュレーションされる２８。Ｎ−Ｓｈｈと共にプレインキュベーションした心筋細胞は、コントロール心筋細胞と比較して短い活動電位持続時間（ＡＰＤ）を示した（図４ＡＢ）。最近、ＮＯ／ｃＧＭＰ経路は、ＡＴＰ枯渇の非存在下で神経ＡＴＰ依存性カリウムチャネル（Ｋ−ＡＴＰ）を活性化すると記載されている２９〜３１。興味深いことに、Ｋ−ＡＴＰチャネルの選択的かつ特異的遮断薬であるグリベンクラミド３２の急性適用は、Ｎ−Ｓｈｈによって誘導されるＡＰＤ減少を抑制したが、Ｎ−Ｓｈｈ処理の非存在下ではいかなる効果も及ぼさなかった（図４Ｂ）。また、それぞれＬ−ＮＮＡ及びＯＤＱによるＮＯ／ｃＧＭＰ経路の遮断は、Ｎ−Ｓｈｈの効果を鈍化させた。電圧クランプ条件におけるグリベンクラミド感受性Ｋ＋電流を特性評価するために、さらなる電気生理学的実験を実施した。グリベンクラミド３２とのインキュベーション前後にＫ＋電流を記録し、Ｋ−ＡＴＰ電流（ＩＫＡＴＰ、図４Ｃ）を反映する電流差をパルス終了時に測定して、電流電圧関係を構築した（図４Ｄ）。この電流は、コントロール条件では存在しなかったが（図４Ｃ〜Ｅ）、Ｎ−Ｓｈｈの存在下では誘発され、Ｌ−ＮＮＡ及びＯＤＱの両方によって遮断された。これらの実験を裏付けるために、グリベンクラミドの適用前後に減算によって記録したＳｈｈ誘導性の電流の実験結果を最良に模倣するように経験的に調整したさらなるカリウム内向き整流電流（方法のセクションを参照のこと）の非存在下及び存在下で、数値シミュレーションを実施した（図５Ａ）。内向き整流Ｋ＋コンダクタンスを追加することにより、活動電位持続時間（図５Ｂ）及びＣａ２＋トランジェント（図５Ｄ）が、実験的に観察されたのと同程度まで減少した。これは、ＩＣａＬ振幅の増加を伴ったが（図５Ｃ）、以前に報告されているような２８、Ｃａ２＋電流がより短いために細胞に侵入して、Ｃａ２＋誘導性のＣａ２＋放出の減少をもたらすＣａ２＋の正味量の減少を伴わなかった（コントロール及びＳｈｈにおけるＣａ２＋イオンは、それぞれ４．３８Ｅ１０対３．９７Ｅ１０）。これは、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルに対する直接的効果がない場合にＳｈｈ経路によって誘発されるＣａ２＋トランジェントの減少が、ＩＫＡＴＰの活性化及びそれに続くＡＰＤの減少に起因することを実証している。
【００７０】
ＡＰＤのこのような減少は、インビボで記録されるＥＣＧ、より正確にはＱＴ間隔に影響を与えるはずである。実際、覚醒状態の非拘束動物において、Ｎ−Ｓｈｈ及びＭＰＳｈｈ＋ＥＣＧの注射後６時間にわたってＥＣＧを記録した。ＱＴｃ間隔の有意な減少は、注射６時間後に観察された（図６）。ヘキサメトニウム（交感神経及び副交感神経系の両方における前神経節部位のレセプターに対して作用するので、自律神経系による心臓のレギュレーションを阻害するニコチン性nAＣｈレセプターアンタゴニスト）で動物を前処理した場合、この効果は同一であった。しかしながら、グリベンクラミドを用いてＩＫＡＴＰ電流をインビボで遮断することによって、又はシクロパミンを用いてＳｈｈシグナル伝達経路を阻害することによって、ＱＴｃ間隔のこの減少は抑制された（図６）。ＱＴｃの延長は、インビボで心室性不整脈の発生と相関する。心筋再灌流後に、持続性心室頻拍及び突然死をトリガーし得るより高頻度の心室性不整脈を急速に示す病態生理学的な状況（例えば、虚血再灌流）において、これは起こる。この仮説を検証するために、本発明者らは、ラットを３０分間の虚血とそれに続く再灌流に供した。虚血前及び再灌流後２４時間にわたって、ＥＣＧを連続的に記録した（図７）。以前に報告されているように、ＱＴｃ間隔の延長が再灌流後に記録された。興味深いことに、再灌流前にＮ−Ｓｈｈで動物を処理すると、これは完全に無効化された。Ｎ−Ｓｈｈ処理の最大効果は、再灌流の１２時間後に観察されたことに注目すべきである。再灌流前にＮ−Ｓｈｈの単回注射を行うことを知ることにより、２４時間後に観察される効果の進行性喪失が、Ｓｈｈシグナル伝達経路の刺激の喪失に起因し得ることを予想し得る。Ｎ−Ｓｈｈに加えてシクロパミンを注射すると、ＱＴｃ間隔に対するＮ−Ｓｈｈの有益な効果は見られなかった（図７）。さらに、再灌流の２４時間後において、リスク領域に対する梗塞領域を測定することによって、再潅流障害を組織学的に評価した（図８）。これらの実験により、Ｎ−Ｓｈｈによる梗塞領域の明らかな減少が実証された。この心臓保護効果は、シクロパミンによって完全に無効化された。これらのインビボデータは、急性心筋梗塞後の再灌流傷害から心筋を保護するＳｈｈシグナル伝達経路の強力な役割を明らかに実証している。
【００７１】
実施例２：Ｓｈｈシグナル伝達経路の心臓保護効果
ラットを３０分間の虚血とそれに続く再灌流に供した。再灌流の２４時間後において、リスク領域に対する梗塞領域を測定することによって、再潅流傷害を組織学的に評価した（図９）。再潅流の１５分前に、リコンビナントＳｈｈホモログリガンド（Ｎ−ＳｈｈＨ、２５μg/kg）を第１のラット群に静脈内（intraveinous）（ｉｖ）注射し、Ｎ−Ｓｈｈ及びＳｈｈレセプター（ｐａｔｃｈ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）アンタゴニストのシクロパミン（Ｎ−Ｓｈｈ＋Ｃｃｌ、３０μmol/L）を第２の群に投与し、ビヒクル（コントロール）を第３の群に投与した。これらの実験により、Ｎ−Ｓｈｈ処理による梗塞領域の有意な減少が実証された。Ｎ−Ｓｈｈのこの心臓保護効果は、シクロパミンによって完全に抑制された。これらのインビボデータは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の再灌流傷害から心筋を保護するＳｈｈシグナル伝達経路の強力な役割を実証している。心臓保護効果は、再灌流後短時間内（すなわち、＜２４時間）に観察されることを考慮すると、血管新生及び／又は前駆細胞の動員によってそれが媒介される可能性は低い（Kusano KF, Pola R, Murayama T, Curry C, Kawamoto A, Iwakura A, Shintani S, Ii M, Asai J, Tkebuchava T, Thorne T, Takenaka H, Aikawa R, Goukassian D, von Samson P, Hamada H, Yoon YS, Silver M, Eaton E, Ma H, Heyd L, Kearney M, Munger W, Porter JA, Kishore R and Losordo DW. Sonic hedgehog myocardial gene therapy: tissue repair through transient reconstitution of embryonic signaling. Nat Med. 2005;11:1197-204. Pola R, Ling LE, Silver M, Corbley MJ, Kearney M, Blake Pepinsky R, Shapiro R, Taylor FR, Baker DP, Asahara T and Isner JM. The morphogen Sonic hedgehog is an indirect angiogenic agent upregulating two families of angiogenic growth factors. Nat Med. 2001;7:706-11.）。したがって、本発明者らは、心筋組織に対して直接作用するＳｈｈの別の多面的効果について仮説した。
【００７２】
本発明者らは、覚醒状態の動物において、虚血前及び再灌流後２４時間にわたって遠隔測定によって連続的に記録したＥＣＧを評価した（図１０）。再灌流後、ＱＴｃ間隔の延長が観察される。再灌流前にＮ−Ｓｈｈの単回注射によって処理した動物では、これは抑制され、洞調律に対する主な望ましくない心筋抑制効果はない。おそらくはペプチドの排出及びその効果の逆転が原因で、この効果の有意性は１２時間後に消失する傾向があることに注目すべきである（図１０Ａ、１０Ｂ）。Ｎ−Ｓｈｈ及びシクロパミンの両方（Ｎ−Ｓｈｈ＋Ｃｃｌ）で動物を同時に処理すると、ＱＴｃ間隔の延長の抑制は無効化された（図１０Ａ、１０Ｂ）。ＱＴ間隔の延長は、インビボで心室性不整脈の発生と相関するので、心室頻拍性不整脈の予測因子及び心臓突然死のリスク因子として一般的に使用されている（Antzelevitch C, Shimizu W, Yan GX and Sicouri S. Cellular basis for QT dispersion. Journal of electrocardiology. 1998;30 Suppl:168-75; Hlaing T, DiMino T, Kowey PR and Yan GX. ECG repolarization waves: their genesis and clinical implications. Annals of noninvasive electrocardiology: the official journal of the International Society for Holter and Noninvasive Electrocardiology, Inc. 2005;10:211-23.）。実際、Ｎ−Ｓｈｈによる処理は、再灌流時に測定した心室不整脈事象の頻度を有意に減少させた（図１０Ｃ〜Ｄ）。Ｓｈｈのこの有益な効果はやはり、シクロパミンによって無効化される。要するに、これらの実験は、電気生理学的なレギュレーションを介した、心筋に対するＳｈｈ経路の直接的な心臓保護効果を実証している。
【００７３】
第１に、本実施例は、虚血再灌流のラットインビボモデルにおける形態形成Ｓｈｈ経路の新規な心臓保護効果を実証するものである。第２に、本発明者らは、細胞及び分子レベルを調査し、機構的説明を提案した。Ｓｈｈシグナル伝達は、胚発生中の心筋形成において重要な役割を果たすと以前に報告された。心筋梗塞後の成体ラットにおいてこのシグナル伝達を回復させると、血管新生の増強、線維形成及び心臓アポトーシスの減少によって、心臓修復が改善された（Kusano KF, Pola R, Murayama T, Curry C, Kawamoto A, Iwakura A, Shintani S, Ii M, Asai J, Tkebuchava T, Thorne T, Takenaka H, Aikawa R, Goukassian D, von Samson P, Hamada H, Yoon YS, Silver M, Eaton E, Ma H, Heyd L, Kearney M, Munger W, Porter JA, Kishore R and Losordo DW. Sonic hedgehog myocardial gene therapy: tissue repair through transient reconstitution of embryonic signaling. Nat Med. 2005;11:1197-204.）。最近、心筋細胞の表面膜におけるＳｈｈの刺激は、心筋梗塞後の血管新生を媒介する血管新生サイトカインの発現を増加させることができたことが実証されている。本実施例は、Ｎ−Ｓｈｈ又はＭＰＳｈｈ＋のいずれかを単回注射することによって、再灌流前にＳｈｈ経路を活性化すると、ＱＴの延長の抑制によって、梗塞サイズ及び再灌流不整脈が減少することを実証するものである。いくつかの研究では、ＱＴ間隔の延長は、短期及び長期の両方において、患者における急性心筋梗塞後の心臓突然死のリスク増加に関連している。再灌流後におけるＱＴ間隔及びＱＴ間隔の可変性の減少は有益であり、最初の経皮的冠動脈形成術を受けた患者における再灌流成功の指標であることが現在ではよく認められている。結論として、本実施例は、心臓組織において、ＡＭＩに対するＳｈｈ経路の直接的な保護効果を初めて示すものである。まとめると、Ｓｈｈのこれらの多面的効果は、様々なターゲットに対して同時に作用することによって、心臓保護に関与している。
【００７４】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献には、本発明が属する分野の水準が記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表１】
0006302936.tif 000004
0006302936.tif 000005
0006302936.tif 000006
0006302936.tif 000007
【００７５】
補足参考文献：
【表２】
0006302936.tif 000008
【図１】
0006302936.tif 000009
【図２】
0006302936.tif 000010
【図３】
0006302936.tif 000011
【図４】
0006302936.tif 000012
【図５】
0006302936.tif 000013
【図６】
0006302936.tif 000014
【図７】
0006302936.tif 000015
【図８】
0006302936.tif 000016
【図９】
0006302936.tif 000017
【図１０Ａ】
0006302936.tif 000018
【図１０Ｂ】
0006302936.tif 000019
【図１０Ｃ】
0006302936.tif 000020
【図１０Ｄ】
0006302936.tif 000021
【配列表】
0006302936000001.app