(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンシフェル・アダエレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来の、配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピメラーゼであって、マンガンイオンの存在下で測定したとき、５５℃で酵素活性に最適な温度を有し、そして、５５℃で、２２時間の半減期を有する、プシコースエピメラーゼ。
【請求項２】
請求項１のプシコースエピメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項５】
請求項４の組み換えベクターを含む組み換え菌株。
【請求項６】
請求項１に記載のプシコースエピメラーゼ、プシコースエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む（carrying）組み換えベクターを含む（harboring）組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含む、プシコース製造用組成物。
【請求項７】
銅イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを追加的に含む、請求項６に記載のプシコース製造用組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のプシコースエピメラーゼ、当該プシコースエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む（carrying）組み換えベクターを含む（harboring）組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を果糖と反応させることを含む、プシコース生産方法。
【請求項９】
前記反応に使用される果糖の濃度は５５〜７５％（ｗ／ｗ）である、請求項８に記載のプシコース生産方法。
【請求項１０】
前記反応はｐＨ７〜１０の条件下で行われる、請求項８に記載のプシコース生産方法。
【請求項１１】
前記反応は４０〜７０℃の条件下で行われる、請求項８に記載のプシコース生産方法。
【請求項１２】
銅イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを添加する段階を追加的に含む、請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載のプシコース生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株、およびこれらプシコース製造における用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プシコースは、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番炭素のエピマーであって、果糖の７０％に該当する甘味度を有している。しかし、果糖と異なり、体内で吸収時、ほとんど代謝されず、血糖調節、虫歯予防および肝での脂肪合成を阻害する機能性糖として多様な機能性食品などに使用することができる。
砂糖代替甘味料として多く使用されている糖アルコール類は、一定量以上摂取時、下痢を誘発するなどの副作用があるが、プシコースは知られた副作用がない。
したがってプシコースの甘味料としての関心が高まっているが、自然系に極めて珍しく存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、プシコースを効率的に生産する技術の開発が必要である。
【０００３】
従来のプシコース生産は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いて果糖からプシコースを生産する化学的方法があり、最近知られた最も効率的な方法としては、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプシコースエピメラーゼによるプシコースを生産するような生物学的方法による生産方法に分かれる。化学的方法によるプシコース生産は糖蜜処理過程または葡萄糖異性化反応中にプシコースが非常に少量存在し、費用が多く消耗され、副産物が発生することが問題となっており、生物学的方法も収率が低く生産費用が高いという問題点がある。
したがって、副産物を生成せず、産業化に適した温度およびｐＨ条件を示し高い収率でプシコースを生産できる方法が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の一例は、果糖をプシコースに転換する酵素のアミノ酸配列を提供する。
他の例は、前記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供する。
他の例は、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株を提供する。
他の例は、前記酵素、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、および前記組み換えベクターを含む組み換え菌株からなる群より選択された１種以上を含むプシコース製造用組成物を提供する。
他の例は、前記酵素、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、および前記組み換えベクターを含む組み換え菌株からなる群より選択された１種以上を使用するプシコース製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、果糖をプシコースに転換する活性の高い新規なエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株を土壌から分離および同定した（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ  ＳＹＧ２９；寄託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ）。エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）が有している全体遺伝子の中の果糖をプシコースに転換することができる酵素をコードするポリヌクレオチドを明らかにするために研究を行って、その塩基配列を最初に明らかにした。
【０００６】
また、これにより確保したポリヌクレオチドを組み換えベクターに挿入し発現させて果糖からプシコースを生成する活性を有する酵素を確保することによって本発明を完成するようになった。
即ち、本発明は、機能が明らかになっていない蛋白質のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩基配列を確認し、前記蛋白質がＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有し高収率でプシコースを製造することができるのを確認して完成されたものであって、前記遺伝子および蛋白質プシコース生産における用途および前記蛋白質のＤ−プシコース３−エピメラーゼとしての用途を提供する。
【０００７】
本発明の一例は、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白質を提供する。前記蛋白質は、果糖をプシコースに転換させる活性を有する蛋白質であり得る。したがって、他の例は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、果糖をプシコースに転換させる活性を有するプシコースエピメラーゼを提供する。前記酵素は、Ｄ−プシコース３−エピマー化活性を有する酵素であり得る。例えば、前記蛋白質または酵素は、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に由来したものであり得るが、これに制限されるのではない。
【０００８】
前記蛋白質または酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有するものであり得るが、果糖をプシコースに転換する活性（例えば、Ｄ−プシコース３−エピマー化活性）が維持される限り、これに限定されず、配列番号１のアミノ酸の中の一部が置換、挿入および／または欠失された場合などを全て含むことができる。例えば、前記蛋白質または酵素は、果糖をプシコースに転換する活性を維持し、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
【０００９】
前記配列番号１のアミノ酸配列または少なくとも７０％以上の相同性のあるアミノ酸配列を有する蛋白質または酵素は、ソジウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定された単量体の分子量が２７〜３３ｋＤａ、例えば、２９〜３１ｋＤａであり得る。
【００１０】
他の例は、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の例は、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供する。また他の例は、前記組み換えベクターを含む、即ち、前記組み換えベクターに形質転換された、組み換え菌株を提供する。前記組み換え菌株は、前記蛋白質を発現することができるのを特徴とする。
前記蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基配列、または前記塩基配列に対して実質的同一性を有する配列を含むものであり得る。前記の実質的な同一性は、配列番号２の塩基配列と任意の他の配列を最大限に対応するように整列し、その配列を分析して、前記任意の他の配列が配列番号２の塩基配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、これからコードされた蛋白質が果糖をプシコースに転換する活性を維持することを意味する。
【００１１】
当該分野の通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知された遺伝子組み換え技術などを用いて前記ポリヌクレオチドの塩基配列の中の一つまたはそれ以上の塩基を置換、付加または欠失させることによって、前記実質的相同性を有する範囲で同一の活性を有する酵素蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することができるのを容易に理解することができる。このような相同性の比較は、市販されるコンピュータプログラムを用いて２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算して行うことができる。
【００１２】
前記ポリヌクレオチドは、それ自体で、または前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターの形態で使用できる。前記組み換えベクターとは、作動可能なように連結された目的ポリヌクレオチドを伝達することができる組み換え核酸分子を意味し、前記目的ポリヌクレオチドはプロモーターおよび転写終結因子などからなる一つ以上の転写調節要素と作動可能に連結されているものであり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、例えば、化学物質誘導性要素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）および温度敏感性要素（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）などと作動可能に連結されてものであり得る。前記化学物質誘導性要素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、ｌａｃオペロン、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーターなどからなる群より選択されるものであり得る。前記Ｔ７プロモーターは、ウイルスであるＴ７ファージに由来したものであって、プロモーターと共にＴ７ターミネーターを含む。
【００１３】
前記組み換えベクターは、当業界に広く知られた方法を通じてクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。前記組み換えベクターは、遺伝子組み換えに使用されてきたベクターであれば全て使用に適し、例えば、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）およびこれらと同等な機能を遂行できるウイルスベクターなどからなる群より選択されたものであり得るが、これらに限定されるのではない。例えば、前記組み換えベクターは、大腸菌内発現に適したｐＥＴ、ｐＢＲ、ｐＴｒｃ、ｐＬｅｘ、ｐＵＣベクターなどからなる群より選択されたものから製作されたものであり得る。
【００１４】
前記組み換えベクターで形質転換させることができる宿主細胞は、前記蛋白質を発現（過発現）させることができる発現システムを有する全ての微生物の中から選択されたものであり、例えば、大腸菌であり得る。前記大腸菌としてＢＬ２１、ＪＭ１０９、Ｋ−１２、ＬＥ３９２、ＲＲ１、ＤＨ５αまたはＷ３１１０などを例示することができ、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を使用することができるが、これに制限されるのではない。この他にも、前記宿主細胞としてバチルスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、コリネバクテリウムグルタミクムのようなコリネバクテリア属菌株、サルモネラチフィムリウムなどのサルモネラ属菌株、その他セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス属菌株のような腸内菌と菌株などからなる群より選択された菌株を使用してもよい。
【００１５】
前記組み換えベクターで宿主細胞を形質転換させる方法は、当業界に公知された全ての形質転換方法を特別な制限なく選択して使用することができ、例えば、細菌原形質体の融合、電気穿孔法、推進体砲撃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターを用いた感染などからなる群より選択されたものであり得る。
前述のように、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質は、果糖をプシコースに転換させるプシコース転換能に優れた酵素蛋白質である。したがって、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質またはこれを発現する組み換え菌株は、プシコース製造に有用に適用できる。
【００１６】
したがって、本発明の他の例は、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含む、プシコース製造用組成物を提供する。前記プシコース製造用組成物は、果糖を基質にして果糖からプシコースを製造するものであり得る。前記培養物は、前記組み換え菌株から生産された酵素蛋白質を含むものであって、前記組み換え菌株を含むか、菌株を含まない無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）形態であり得る。前記破砕物は、前記組み換え菌株を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液を意味するものであって、前記組み換え菌株から生産された酵素蛋白質を含むものである。本明細書において、別途の言及がない限り、プシコースの製造に使用される組み換え菌株は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。
【００１７】
他の例は、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、前記蛋白質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む組み換え菌株、前記組み換え菌株の培養物、および前記組み換え菌株の破砕物（以下、‘酵素蛋白質など’）からなる群より選択された１種以上を使用するプシコース生産方法が提供される。前記プシコース生産方法は、前記酵素蛋白質などを果糖と反応させる段階を含む。一具体例で、前記酵素蛋白質などを果糖と反応させる段階は、前記蛋白質を果糖と接触させる段階によって遂行できる。一具体例で、前記酵素蛋白質などを果糖と接触させる段階は、例えば、前記酵素蛋白質などを果糖と混合する段階または前記酵素蛋白質などが固定化された担体に果糖を接触させる段階によって遂行できる。また他の例で、前記酵素蛋白質などを果糖と反応させる段階は前記組み換え菌株の菌体を果糖が含まれている培養培地で培養する段階によって遂行できる。このように前記酵素蛋白質などを果糖と反応させることによって果糖をプシコースに転換して果糖からプシコースを生産することができる。
【００１８】
前記プシコース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、使用される蛋白質の量は、全体反応物基準に０．００１ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌ、０．００３ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌ、０．００３ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌ、または０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌであり得る。酵素の使用量が前記濃度より低ければプシコース転換効率が低くなることがあり、前記濃度より高ければ産業での経済性が低くなるので、前記範囲が適当である。
【００１９】
前記プシコース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、基質として使用される果糖の濃度は全体反応物基準に４０〜８０％（ｗ／ｖ）、例えば、５５〜７５％（ｗ／ｖ）であり得る。果糖の濃度が前記範囲より低ければ経済性が低くなり、前記範囲より高ければ果糖がよく溶解されないので、果糖の濃度は前記範囲にすることがよい。前記果糖は緩衝溶液または水（例えば、蒸留水）に溶解された溶液状態で使用することができる。
【００２０】
前記酵素蛋白質は、アルカリ条件に行くほど活性が増加し、約ｐＨ７以上、または約ｐＨ７．５以上、例えば、ｐＨ７．５〜１０の範囲で９０％以上の活性を維持する（図５参照）。このような酵素蛋白質の最適条件を考慮する時、前記反応はｐＨ７以上またはｐＨ７．５以上、例えば、ｐＨ７〜１１、ｐＨ７〜１０、ｐＨ７〜９、ｐＨ７．５〜１１、ｐＨ７．５〜１０、またはｐＨ７．５〜９の条件下で遂行できる。また、前記反応は、３０℃以上、例えば、４０℃以上の温度条件下で遂行できる。温度が７０℃以上になれば、基質である果糖の褐変現象が起こることがあるので、前記反応は４０〜７０℃、例えば、４２〜６５℃、４５〜６２℃、５０〜６０℃、または５２〜５７℃の条件下で遂行できる。また、前記反応時間が長いほどプシコース転換率が高くなる。例えば、前記反応時間は１時間以上、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上とすることがよい。反応時間が４８時間を超過すればプシコース転換率の増加率が微小であるか、むしろ減少するので、反応時間は４８時間を超過しないのがよい。したがって、前記反応時間は１〜４８時間、２〜４８時間、３〜４８時間、４〜４８時間、５〜４８時間、または６〜４８時間とすることができ、産業的および経済的側面を考慮して、１〜４８時間、２〜３６時間、３〜２４時間、３〜１２時間、または３〜６時間程度にすることができるが、これに制限されるのではない。前記条件は、果糖からプシコースへの転換効率が最大化される条件として選定されたものである。
【００２１】
また、前記プシコース生産方法において、組み換え菌株を使用する場合、使用される菌株の菌体濃度は全体反応物を基準に５ｍｇ（ｄｃｗ：乾燥細胞重量）／ｍｌ以上、例えば、５〜１００ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、または４５〜５５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであり得る。菌体濃度が前記範囲未満である場合にはプシコース転換活性が低いか殆どなく、前記範囲を超過すれば菌体が過度に多くなってプシコース転換反応の全体的な効率が低くなるので、菌体濃度は前記範囲にすることがよい。
【００２２】
前記プシコース転換酵素活性を有する酵素蛋白質は、金属イオンによって活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）特性を有するものであり得る。前記酵素蛋白質による反応を金属イオン存在下で行うことによって、プシコースの生産収率を増進させることができる。プシコース生産収率に寄与することができる金属イオンは、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、カルシウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であり、例えば、マンガンイオン、マグネシウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であり得る。前記金属イオンの添加量が０．１ｍＭ未満である場合にはプシコース生産収率増進効果が微小であるので、前記金属イオンの添加量は０．１ｍＭ以上にすることができる。一方、前記金属イオンの添加量が５ｍＭを超過すればその超過量に比べて効果が微小であるため、前記金属イオンの添加量は５ｍＭ以下にすることができる。例えば、前記金属イオンの添加量は０．１ｍＭ〜５ｍＭ、例えば、０．１〜２ｍＭ、または０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ範囲にすることができる。
【００２３】
したがって、前記プシコース製造用組成物は前記金属イオンを追加的に含むことができ、金属イオンの種類と含量は前記のとおりである。また、前記プシコース生産方法は金属イオンを添加する段階を追加的に含むことができ、金属イオンの種類と添加量は前記のとおりである。一実施形態で、前記金属イオンは、基質である果糖に添加されるか、前記酵素蛋白質などと果糖との混合物に添加することができる。また他の実施形態で、前記金属イオンは、前記酵素蛋白質などが固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記酵素蛋白質などが固定化された担体と果糖との混合物に添加されるか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態でまたはそれぞれ添加することができる。組み換え菌株を使用する場合、前記金属イオンが培養物に添加されるか、金属イオンが添加された培養培地で培養が遂行できる。
【００２４】
前記担体は、固定された菌株、または前記菌株から生産される酵素の活性が長期間維持される環境を造成することができるものであって、酵素固定化用途として使用できる公知された全ての担体であり得る。例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を使用することができる。アルギン酸ナトリウムは海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であって、マンヌロン酸（β−Ｄ−ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とグルロン酸（α−Ｌ−ｇｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が造成されており、含量面では無作為にベータ−１，４結合をなして形成され、菌株または酵素が安定的に固定されて優れたプシコース収率を示すのに有利であり得る。一具体例で、プシコースの収率をより増進させるために、１．５〜４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、例えば、約２．５％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を菌株の固定化に使用することができる。例えば、菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養液、または前記菌株の破砕物の１〜２体積倍のアルギン酸ナトリウム水溶液に前記菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を添加して混合した後、前記得られた混合液を注射器ポンプと真空ポンプを用いて約０．２Ｍカルシウムイオン溶液に落としてビーズが生成されるようにすることによって、アルギン酸ナトリウム担体に菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物が固定化させることができる。前記酵素は、前記菌株、菌株培養物または前記菌株の破砕物から通常の方法、例えば透析、沈殿、吸着、電気泳動、親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法によって精製されたものであり得る。
【００２５】
一実施形態において、前記プシコースの生産方法は、配列番号１のアミノ酸配列、または前記配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むプシコースエピメラーゼ蛋白質を準備および精製する段階；および前記蛋白質を果糖と反応させる段階を含むものであり得る。
好ましい他の実施形態において、前記プシコースの生産方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する組み換え菌株を培養および回収する段階；および前記組み換え菌株または前記組み換え菌株から分離された酵素蛋白質を果糖と反応させる段階を含むものであり得る。
前記組み換え菌株の培養段階は、使用される菌株（宿主細胞）の特性により関連技術分野の当業者によって容易に選択される培地および培養条件下で遂行することができる。例えば、前記培養は連続、半連続、または回分式培養であり得るが、この方法に限定されたのではない。前記培地としては、大腸菌をはじめとする任意の宿主細胞、および細胞内容物を支持するかまたは含有することができる任意の培養培地、溶液、固体、半固体または剛性支持体を含み、例えば、２ＹＴ培地、ＬＢ培地、ＳＯＢ培地、ＴＢ培地などからなる群より選択されたものであり得る。
【００２６】
前記組み換え菌株の培養物は、一般に宿主細胞（例えば、大腸菌）を培養することに適した条件を用いて得られる。例えば、前記組み換え菌株を３５℃〜３７℃および１５０〜２５０ｒｐｍ条件下で振とう培養して培養物を得ることができる。また、前記酵素蛋白質の過発現を誘導するために当業界で通常使用する誘導物質を添加することができる。例えば、前記誘導要素がｌａｃオペロンまたはｔｒｃプロモーターである場合、ＬａｃｔｏｓｅまたはＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）であり得、前記誘導時期は当業者によって培養の適切な時期に行うことができる。
【００２７】
前記組み換え菌株は前記得られた培養物を遠心分離および／またはろ過などを行って得ることができ、また前記得られた菌株を均質化させ遠心分離して得られた上澄み液または前記上澄み液を分画化するか、クロマトグラフィーなどを通じて精製して酵素蛋白質を得ることができる。例えば、回収された菌株を５０ｍＭリン酸緩衝溶液で懸濁した後、破砕して遠心分離した後、上澄み液のみニッケル−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で吸着させた後、２０ｍＭ、２５０ｍＭイミダゾールの濃度で酵素蛋白質を回収することができる。
【００２８】
前記果糖と反応させる段階は、前記酵素蛋白質の最適活性化条件下に遂行することができる。例えば、ｐＨ７以上またはｐＨ７．５以上、例えば、ｐＨ７〜１１、ｐＨ７〜１０、ｐＨ７〜９、ｐＨ７．５〜１１、ｐＨ７．５〜１０、またはｐＨ７．５〜９、および／または４０〜７０℃、例えば、４２〜６５℃、４５〜６２℃、５０〜６０℃、または５２〜５７℃の温度条件下に遂行することができる。前記果糖は全体反応物基準に４０〜７５％（ｗ／ｖ）、例えば５０〜７５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用できる。前記範囲で果糖を使用することによってより経済的で効率的にプシコースを生産することができる。
また、組み換え菌株を使用する場合、好ましくは果糖と反応させる前に前記回収された菌体を、例えば、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌなどを用いて２回以上洗浄して使用することができる。
【００２９】
また好ましくは、前記果糖と反応させる段階は、マンガンおよびマグネシウムからなる群より選択された１種以上の金属のイオンをさらに添加して遂行することができる。前記金属イオンは、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、例えば、０．１〜２ｍＭ、または０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ範囲で添加することができる。前記範囲に未達する場合、活性増加効果を十分に得ることができず、前記範囲を超過する場合、使用される量に比べて得るようになる活性増大効果が微小であるため好ましくない。
【００３０】
本発明の方法によって果糖から得られたプシコースは通常の方法によって精製することができ、このような方法は当業者に通常の技術に属する。例えば、遠心分離、ろ過、結晶化、イオン交換クロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせからなる群より選択された一つ以上の方法によって行われ得る。
［発明の効果］
【００３１】
本発明による新規なプシコースエピメラーゼ蛋白質はプシコースを生産する活性を有している酵素であって、産業的に適用可能な条件で熱安定性が非常に優れていて半減期が長く高い収率で果糖からプシコースの大量生産が可能である。従って、本発明のＤ−プシコース  ３−エピメラーゼとこれを用いたプシコースの生産方法は、多様な食品、医薬および化粧品用素材産業で有用に使用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、一実施形態の精製過程を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ図面である（ｌａｎｅ１：粗酵素、ｌａｎｅ２：硫酸アンモニウム、ｌａｎｅ３：熱処理、ｌａｎｅ４：Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｑ、ｌａｎｅ５、６：ヒドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）、ｌａｎｅ７、８、９、１０：Ｈｉ−ｔｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ）。
【図２】図２は、一実施形態のＤ−プシコース３−エピメラーゼ蛋白質を発現するための組み換えベクターの切断地図（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｍａｐ）である。
【図３】図３は、一実施形態のＤ−プシコース３−エピメラーゼの活性を添加された金属イオンの種類によって示すグラフである。
【図４】図４は、一実施形態のＤ−プシコース３−エピメラーゼの温度による活性を示すグラフである。
【図５】図５は、一実施形態のＤ−プシコース３−エピメラーゼのｐＨによる活性を示すグラフである（■：Ｍｃｉｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ、●：Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ）。
【図６】図６は、一実施形態の５５℃および６０℃での一実施形態のＤ−プシコース  ３−エピメラーゼの活性を時間別に示すグラフである。
【図７】図７は、一実施形態のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ二重逆数作図を示すグラフである。
【図８】図８は、一実施形態のＤ−プシコース  ３−エピメラーゼを用いた高濃度果糖からのプシコース生産効率（プシコース転換率）を示すグラフである。
【図９】図９は、一実施形態のＤ−プシコース  ３−エピメラーゼを用いた高濃度果糖からのプシコース生産性をＨＰＬＣによって測定した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例１で使用された菌株が高濃度果糖からプシコースが生産されたのをＨＰＬＣ分析で確認した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、寄託菌株ＫＣＣＭ１１４０５Ｐの１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列（５’→３’）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を具体的な実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、本発明は下記の実施例に限定されたものでなく、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であるのは、この分野で当業者に明白なことである。したがって、添付された請求項は広く本発明の思想と範囲に符合するように解釈されなければならない。
【実施例】
【００３４】
実施例１．果糖をプシコースに転換する活性を有する土壌由来微生物エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）の培養
エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ  ＳＹＧ２９；寄託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ）を１％プシコースが添加された最小培地（ＫＨ２ＰＯ４２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２・ＳＯ４２．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、酵母エキス（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）１ｇ／Ｌ）を用いて３０℃で２４時間振盪培養した。前記得られた培養物を４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、菌体のみ回収した。
【００３５】
前記菌株は、次のような過程で選別されたプシコース生産菌株である：
根圏土壌１ｇを０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ１０ｍＬに懸濁し、１００μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）を取って寒天培地に塗抹した後、３０℃で培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状と大きさが異なるコロニーを選別した後、最小培地（ＫＨ２ＰＯ４２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２・ＳＯ４２．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、酵母エキス（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）１ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００μｌに入れて浮遊させ、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。前記破砕液を１２，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を回収して酵素液（ｃｒｕｄｅ  ｅｎｚｙｍｅ）として使用し、前記酵素液を１０ｍＭプシコースを基質にして３０℃で８時間反応させた。
【００３６】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を通じて前記反応液でプシコースが果糖への転換が行われたのか確認した。前記薄層クロマトグラフィー分析は、横２０ｃｍ、縦５ｃｍのシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ））固定相とアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水を８５：１５条件で混合した移動相展開溶媒を用いて３分３０秒間２回ずつ展開して行った。前記液体クロマトグラフィー分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＲＩＤ）行った。移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎにした。
【００３７】
前記ＴＬＣ分析を通じてプシコースから果糖への転換が確認された菌株を選別して１％（ｗ／ｖ）果糖と０．０５％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された最小培地に接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、菌体濃度４０ｍｇ−ｄｃｗ／ｍｌ条件で４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を入れて浮遊させ、７０℃で６時間菌体と果糖との反応を実施した。前記反応結果物を１００℃で５分間加熱して反応を停止させ、ＨＰＬＣを通じてプシコース生産を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＲＩＤ）前述の条件（溶媒は：水、温度：８０℃、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ）で行った。前記得られた結果を図１０に示した。図１０で確認されたように、ＨＰＬＣ分析を通じて果糖からプシコースを最も多く生産した菌株１種を最終選定した。
【００３８】
前記菌株は、２０１３年３月２９日付で韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１４０５Ｐを付与された。前記菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列（５’→３’）は図１１に示した。
【００３９】
実施例２．エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来のプシコース転換酵素の精製
前記実施例１で回収された菌体を１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に混濁させた後、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて４℃で４０分間破砕した。前記破砕液を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離し、上澄み液を回収して粗酵素として使用した。
【００４０】
粗酵素を５０−６０％飽和度の固体硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２・ＳＯ４］を添加して蛋白質を沈殿させ、４℃で１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して回収した後、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で１２時間透析して部分精製酵素を獲得した。
部分精製された酵素は６０℃で１０分間熱処理後、４℃で８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後に上澄み液を回収して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で平衡化させた後、Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｑ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実施した。結合蛋白質はＮａＣｌを用いて１．０Ｍまで濃度勾配を与えて溶出させた後、各分画の活性を測定し、活性の高い分画を集めて濃縮した。
【００４１】
Ｈｉ−ｔｒａｐ  Ｑによって分離した試料は１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ６．８）緩衝溶液に平衡化させた後、Ｂｉｏｇｅｌ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を実施した。前記結合された蛋白質を１０−１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ６．８）で濃度勾配を与えて溶出させた後、各分画の活性を測定し、活性の高い分画を集めて濃縮した。
【００４２】
Ｂｉｏｇｅｌ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｏｌｕｍｎによって分離した試料は１．５Ｍの硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．０）で平衡化した後、Ｈｉ−ｔｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に吸着させ、１．５−０Ｍの硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）濃度勾配法を適用して分画を獲得した。
【００４３】
前記方法でエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株から酵素を５段階手続によって均一に精製し、その結果を表１に要約した。
各精製段階別精製程度を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）を使用し、２０ｍＡを与えて実施した。前記得られた結果を図１に示した。図１で示されるように、精製された蛋白質が約３０ｋＤａの分子量を有することを確認した（図１）。前記精製された蛋白質を０．００４ｍｇ／ｍｌの濃度で果糖５０ｍＭと５５℃条件下で１０分間反応させた後、得られた結果物に対して実施例１に記載されたところと同様な方法でＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析結果（ＨＰＬＣ条件は実施例１と同一）、前記精製された蛋白質は果糖からプシコースを生産する活性を有することを確認することができる。したがって、前記精製された蛋白質が果糖からプシコースを生産するＤ−プシコースエピメラーゼ（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の活性を有することが分かる。
【００４４】
実施例３．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼのＮ−末端アミノ酸配列の決定
前記で精製された蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列は、イマス（Ｅ−Ｍａｓｓ。Ｃｏ）に依頼して分析した。Ｎ−末端の最初４４個のアミノ酸残基はＭＱＧＦＧＶＨＴＳＭＷＴＭＮＷＤＲＰＧＡＥＲＡＶＡＡＡＶＫＹＡＶＤＦＩＥＩＰＭＬＮＰＰＡであった。酵素のアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋに対するＢＬＡＳＴ調査（ＮＣＢＩ）を通じて分析した。その結果、前記精製された蛋白質はシノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ  ＮＧＲ２３４）のＤ−タガトースエピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；ＹＰ００２８２３３６３．１）と約８０％の高い相同性を示した。
【００４５】
実施例４．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの遺伝子分離
４−１．蛋白質をコードするＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの製造
プシコース転換酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーを製造するために次のような実験を行った。前記実施例３でのエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来プシコース転換酵素のＮ−末端アミノ酸配列のｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）分析結果を土台に８０％以上の相同性がある酵素（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．：ＹＰ００２８２３３６３．１、ＹＰ００６３９８４８０．１、ＹＰ００５１９２５９９．１、ＮＰ４３７０１０．１）を選別して該当酵素が５’および３’末端に隣接した部位にそれぞれシュガーＡＢＣトランスポーター（ｓｕｇａｒ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）および炭水化物キナーゼ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）をコーディングするＤＮＡ配列を共通的に有する構造であることを確認した。
【００４６】
これにより、本発明のＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする全体ＤＮＡ配列（ｆｕｌｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を探すために前記共通的に存在するシュガーＡＢＣトランスポーター（ｓｕｇａｒ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）および炭水化物キナーゼ（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）構造遺伝子を含むプシコース転換酵素の全体配列を確保し、該当プシコース転換酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを増幅させるために下記の配列番号４、５、６および７の塩基配列を有する混合プライマーを製作した。
【００４７】
配列番号４：５’  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＴＣ  ３’
配列番号５：５’  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＧＣ  ３’
配列番号６：５’  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡ  ３’
配列番号７：５’  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＧ  Ｃ  ３’
【００４８】
４−２．エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）を用いたＰＣＲによるプシコース転換酵素の一部を含有するＤＮＡ断片の取得
前記実施例１で準備された菌株の培養液５ｍｌを遠心分離して集菌しＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）を用いて、説明書方法に基づいて、菌体から染色体ＤＮＡを取得した。鋳型としてエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ  ＳＹＧ２９；寄託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ）由来染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）を使用し、それぞれ配列番号４と５、および６と７に記載された塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを使用して、ＰＣＲ技術で増幅を行った。増幅は、サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ）（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ．Ｃｏ．））を用いてそれぞれ９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分からなる３０回のサイクルで実施した。増幅生成物確認は、反応液２μｌを１％アガロース電気泳動で行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。
【００４９】
それぞれのＤＮＡ断片の配列分析を通じてプシコース転換酵素をコードするポリヌクレオチド部分を確認し、これを土台にＮｄｅＩとＸｈｏＩを含む合成プライマー（配列番号８：５’  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＣＣ  ３’；配列番号９：５’  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ３’）を製作して前記エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）に対してＰＣＲを行った。増幅生成物確認は、反応液２μｌを１％アガロース電気泳動で行った。その結果、約０．９ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認し、配列分析を通じて配列番号２に示した。
【００５０】
またＤＮＡ断片の配列分析を通じてプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と予想されるＤＮＡ配列を確保し、これを配列番号３に示した。
【００５１】
４−３．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ遺伝子のクローニング
ＰＣＲ増幅技術で確保したポリヌクレオチド（配列番号２）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｂａｇｅｎ）の同一な制限酵素部位に挿入し、組み換えベクターｐＥＴ２１ａ／プシコース３−エピメラーゼ（ｐＥＴ−ＥＤＰＥ）を製作した。（図２参照）。前記製作された組み換えベクターをヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換して組み換え菌株を製造した。
形質転換された組み換え菌株を５ｍｌＬＢ−アンピシリン（ＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地（Ｄｉｆｃｏ）に１０４ＣＦＵ／ｍｌの量で接種した後、６００ｎｍでの吸光度が１．５に到達するまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、これを再び２００ｍｌＬＢ−アンピシリン（ＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地に接種、３７℃の振とう培養機で培養した。この培養液の６００ｎｍで吸光度が０．５である時、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加して目的酵素の過発現を誘導した。この時、過発現誘導時点から培養条件は１６℃、１５０ｒｐｍに転換して１６時間維持した。
その後、遠心分離機４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体のみを回収した。回収した菌体は、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄後、酵素精製に使用した。
【００５２】
実施例５．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの精製および特性確認
５−１．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの精製
前記実施例４−３で回収された菌体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０、１０ｍＭイミダゾール）に混濁させた後、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて４℃で２０分間破砕した。破砕液を１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄み液のみを集めた後、予めｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に適用させた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ３００ｍｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０に２０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭイミダゾールが含まれている緩衝溶液を順次に流した。最後の過程である５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０、２５０ｍＭイミダゾールを流すことによって目的蛋白質を精製した。溶出された蛋白質は酵素活性測定用緩衝溶液（５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ７．０）で転換した後、実験に使用した。
【００５３】
５−２．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの金属イオン要求性分析
前記実施例５−１で得られたＤ−プシコースエピメラーゼの金属イオン要求性を確認するために金属イオンのＭｇＳＯ４またはＭｎＣｌ２をそれぞれ１ｍＭずつ処理して酵素活性を測定した。
前記酵素活性測定は、前記金属イオン存在下で５０ｍＭ果糖と酵素０．５ｕｎｉｔ／ｍｌが５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝溶液（ｐＨ７．０）で５５℃で酵素と反応させて分当り１マイクロモルのプシコースを生産する量を１ｕｎｉｔと定義した。対照群（Ｎｏｎ）として金属イオンを処理していないものを使用した。
前記酵素活性は生産されたプシコース量（ｍＭ）を使用された酵素量と反応時間に分けて計算し、プシコース量はＨＰＬＣで分析した。前記ＨＰＬＣ分析は、８７Ｃ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）カラムを用いて８０℃で、移動相としては水１００％（ｖ／ｖ）を０．６ｍｌ／ｍｉｎ流速で流しながら行い、屈折率検出器（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＴＩＤ）でプシコースを検出してプシコース生産性を分析した。
前記測定された各金属イオンを処理した酵素活性を対照群の酵素活性と比較して図３に示した。図３に示されているように、実施例５−１の酵素はマンガン、マグネシウムイオンによって活性が増加することが明らかになって金属イオン要求性があることが分かる。
【００５４】
５−３．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの温度、ｐＨ変化による活性分析
ｐＨおよび温度変化によるプシコース３−エピメラーゼの活性を確認するために、多様なｐＨおよび温度で酵素と果糖基質を反応させて活性を確認した。
まず、ｐＨを７．０にし、温度を４０〜７０℃範囲で変化させて、酵素活性を測定した。前記酵素活性測定は、実施例５−２の過程を参照した。前記得られた結果を図４に示した。図４に示されているように、前記酵素は５０〜６０℃範囲で高い転換率を示し、特に５５℃で最大転換率を示すことが分かった。図４のＹ軸の相対的活性は、最もよく示された酵素活性を１００にした時の相対値を意味する。
【００５５】
また、ｐＨ変換による活性を確認してみるために、前記方法を参照して、５５℃でＭｃｉｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｕｅｒ  ｐＨ５．０−９．０、５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｐＨ９．０−１０．０の緩衝溶液をそれぞれ使用して酵素活性を測定した。前記得られた結果を図５に示した。図５に示されているように、前記酵素はアルカリ条件に行くほど高い活性を示し、ｐＨ７．５−１０．０の範囲で９０％以上の活性を維持した。この時、活性測定は５０ｍＭ果糖、酵素０．５ｕｎｉｔ／ｍｌでそれぞれのｐＨと温度範囲で１０分間反応し、１００℃で５分間加熱して反応を中止させた。
前記結果から分かるように、本発明によるプシコース３−エピメラーゼは比較的に広い温度およびｐＨ範囲で活性の変化が大きくないことが確認され、これは産業的に使用するに適した利点であって、プシコース産業化に有利に使用されることが期待される。
【００５６】
５−４．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの熱安定性分析
温度変化によるプシコース３−エピメラーゼの安定性を確認するために、前記実施例５−１で精製された酵素を５５℃および６０℃で一定時間（８時間）熱処理した後、５０ｍＭの果糖を基質にして１ｍＭ  ＭｎＣｌ２と酵素０．５ｕｎｉｔ／ｍｌが含まれている５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液でｐＨ７．０および５５℃条件下で１０分間反応させて酵素活性を測定した。酵素活性は１００℃で５分間加熱して中止させた。
前記熱処理時間によって得られた結果を図６に示した。図６のように、実施例５−１で精製された酵素の半減期は５５℃と６０℃それぞれ約２２時間、７時間に計算された。これは従来に報告された大部分のプシコース３−エピメラーゼに比べて非常に高い値であって、本発明によるプシコース３−エピメラーゼが産業的に反応の容易な温度で熱安定性が優れていることを確認することができる。
【００５７】
５−５．Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの反応速度（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）分析
実施例５−１で精製したエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来のプシコースエピメラーゼの酵素反応速度を確認してみるために動態パラメーター（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）分析を実施した。
基質である果糖の濃度を１０〜５０ｍＭ範囲で変化させながら、実施例５−１の酵素０．５ｕｎｉｔ／ｍｌおよび１ｍＭ  ＭｎＣｌ２が添加された５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液ｐＨ７．０および５５℃条件下で反応させて酵素活性を測定した。１００℃で５分間加熱して酵素活性を中止させた。
前記得られた結果を図７に示した。図７に示された結果で酵素反応速度を単量体で計算した場合、果糖のＫｍ値は１８．６ｍＭであり、ｋｃａｔは２５１１．２ｍｉｎ−１であった。前記酵素反応速度はミカエリスメンテン式（ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−ｍｅｎｔｅｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）に基づいて計算した。
本発明によるプシコース３−エピメラーゼの果糖に対する触媒効率（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は１３５であって、従来に発表されたアグロバクテリウムツメファシエンス由来のプシコース３−エピメラーゼの触媒効率である８５より高いことが明らかになった。
【００５８】
５−６．高濃度果糖からＤ−プシコース３−エピメラーゼによるプシコース生産
高濃度のプシコースを生産するために、実施例５−１で精製したＤ−プシコース３−エピメラーゼ０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で５５℃、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液ｐＨ７．０および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２の条件下で高濃度（４００ｇ／Ｌ）の果糖と反応させた。
前記実施例５−２と同様な方法で前記反応結果生産されたプシコース生産量を測定して果糖からプシコースへの転換率を測定した。使用された果糖が高濃度であるため、各時間別にサンプリングした溶液を２０倍に希釈してＨＰＬＣ分析を行った。
前記得られた結果を図８に示した。図８に示されているように、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でプシコース最終生産量が１１８．６ｇ／Ｌであり、プシコース転換率が約３０％程度である。
一方、前記のように高濃度果糖での生物転換によるプシコース生産性をＨＰＬＣで測定してその結果を図９に示した。
【受託番号】
【００５９】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ
受託日付：２０１３０３２９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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