(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩であって、前記塩を形成する酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシルエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、セバシン酸、オクタデカン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびウンデシレン酸からなる群より選ばれる、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩であって、前記塩は、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硝酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二燐酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酢酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ベンゼンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二フマル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二マレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ニコチン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二オレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二シュウ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二プロピオン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二サリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(４−アミノサリチル酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドジアセチルサリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酒石酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ｐ−トルエンスルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二クエン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二リンゴ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ナフタレン−１，５−二スルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二セバシン酸塩、および
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(L−アスパラギン酸)塩からなる群より選ばれる、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩、および薬物許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、
薬物組成物。
【請求項５】
式（Ｉ）で表わされる化合物：
【化１】
0006342001.tif 000051
と式（ＩＩ）で表わされる化合物：
【化２】
0006342001.tif 000052
とを反応させて、
化合物Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを得る工程を含む、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項６】
式（Ｉ）で表わされる前記化合物を活性化エステル、酸塩化物、アシル化イミダゾールまたは混合酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる前記化合物と反応させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
触媒として、第３級アミンを加える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第３級アミンが、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリメチルアミン、ピリジンまたは置換されたピリジンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）で表わされる化合物を酸塩化物に変換する際に、塩素化剤として、塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ塩化リン、塩化オキサリル、又は三塩化シアヌルを用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）で表わされる前記化合物を酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる化合物と反応させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
触媒として、ピリジン又は置換されたピリジンを加える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記置換されたピリジンがＤＭＡＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを、さらにその薬学的に許容される酸と反応させてその対応する薬学的に許容される塩を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質キナーゼ関連疾患の治療または予防のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記疾患が癌である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記癌は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、および前立腺癌からなる群により選ばれる、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記治療または予防の対象となる個体は哺乳動物である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記治療または予防の有効量は、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇである、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常の治療または予防のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記生理異常は、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ−２の過剰発現により引き起こされたものである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記生理異常は癌である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記癌は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、および前立腺癌からなる群により選ばれる、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２５】
前記治療または予防の有効量は、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇである、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の化合物。 
【請求項２６】
タンパク質キナーゼ関連疾患の治療または予防のために用いられる、請求項４に記載の薬物組成物。
【請求項２７】
前記疾患が癌である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項２８】
前記癌は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、および前立腺癌からなる群により選ばれる、請求項２７に記載の薬物組成物。
【請求項２９】
前記治療または予防の対象となる個体は哺乳動物である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項３０】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２９に記載の薬物組成物。
【請求項３１】
前記治療または予防の有効量は、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項３２】
哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常の治療または予防のために用いられる、請求項４に記載の薬物組成物。
【請求項３３】
前記生理異常は、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ−２の過剰発現により引き起こされたものである、請求項３２に記載の薬物組成物。
【請求項３４】
前記生理異常は癌である、請求項３３に記載の薬物組成物。
【請求項３５】
前記癌は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、および前立腺癌からなる群により選ばれる、請求項３４に記載の薬物組成物。
【請求項３６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項３２に記載の薬物組成物。
【請求項３７】
前記治療または予防の有効量は、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇである、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）  本願は、２０１３年１２月１２日付で中国国家知識産権局に提出された出願番号が第２０１３１０７０６０５８．３号であり、発明の名称が「抗腫瘍作用を有するキナゾリン誘導体およびその製造、ならびに応用」である中国特許出願に基づく優先権および関連権益を主張し、当該出願の内容の全ては、援用によりここに組み込まれるものとする。
（技術分野）
本発明は、医薬品化学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲは、上皮成長因子受容体（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＨＥＲ）糖タンパク質ファミリーのメンバーの一員であり、また、その他のメンバーとしては、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ−３）、ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ−４）を含み、その細胞内に位置するチロシンキナーゼは、各種の基質タンパク質をリン酸化させて触媒することができ、腫瘍細胞のシグナル伝達経路において非常に重要な地位を占めている。ＥＧＦＲは、細胞外シグナルの刺激下でその細胞内におけるチロシンキナーゼを活性化させ、細胞外におけるシグナルを細胞内に伝達して増幅することによって、細胞の増殖、分化、血管形成、およびアポトーシス抑制を調整することができる。ＥＧＦＲの過剰発現、または突然変異に起因するシグナル経路の伝達異常は、悪性腫瘍の増殖、侵襲および転移との関係が密接である。ＥＧＦＲは、正常組織、前癌病変および癌組織における発現が段階的に向上され、且つ、ＥＧＦＲの発現レベルと腫瘍患者の予後とが密接に関連している。一部の合成薬物は、ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝導を遮断することができるため、腫瘍細胞の成長を抑制し、腫瘍による周辺組織への浸潤を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する。したがって、ＥＧＦＲに対する標的治療は、現時点の研究のホットスポットの１つである。ＥＧＦＲを標的とする分子標的治療は、選択的な患者に対して比較的よい治療効果を持っている。
【０００３】
現在、市場においてＥＧＦＲを標的とする薬物は、主に、ＥＧＦＲ細胞外領域に作用するモノクローナル抗体、およびＥＧＦＲ細胞内のチロシンキナーゼ結合領域に作用する小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）の２種類に大きく分けられるが、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ系薬物は、薬物とＥＧＦＲチロシンキナーゼとの結合形態の違いによって、可逆的阻害剤および不可逆的阻害剤の２種類に分けられる。不可逆的阻害剤は、不可逆的にタンパク質チロシンキナーゼに永久に結合されることができ、新たなタンパク質チロシンキナーゼが生成しない限り、タンパク質チロシンキナーゼを持続的に低減させることができる。不可逆的阻害剤薬効は、薬効を発揮する時間がさらに長くなる。しかしながら、ＦＤＡの報告書のデータによると、従来の臨床開発薬物のアファチニブの生物学的利用率は、１１．１７５％のみであり、ヌードマウスのＡ４３１ヒト上皮癌異種移植モデル実験では、アファチニブの投与量１０ｍｇ／ｋｇ群における薬効がなかった。ただし、アファチニブのＭＴＤは、３０ｍｇ／ｋｇであり（非特許文献１を参照）、これにより、アファチニブの治療域は、非常に狭いことが認められた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｉ  Ｄ，  Ａｍｂｒｏｇｉｏ  Ｌ，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．ＢＩＢＷ２９９２，  ａｎ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２００８，  ２７（３４）：  ４７０２−４７１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【０００６】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩に関し、その中で、前記塩を形成する酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシルエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、セバシン酸、オクタデカン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびウンデシレン酸からなる群により選ばれる。
【０００７】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩に関し、その中で、前記塩は、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硝酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二燐酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酢酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ベンゼンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二フマル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二マレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ニコチン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二オレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二シュウ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二プロピオン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二サリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(４−アミノサリチル酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドジアセチルサリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酒石酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ｐ−トルエンスルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二クエン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二リンゴ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ナフタレン−１，５−二スルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二セバシン酸塩、および
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(L−アスパラギン酸)塩からなる群により選ばれる。
【０００８】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬物許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む薬物組成物に関する。
【０００９】
また、本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学許容される塩の製造方法に関する。当該製造方法は、
【００１０】
【化１】
0006342001.tif 000002
【００１１】
式（Ｉ）で表わされる化合物と式（ＩＩ）で表わされる化合物とを反応させて化合物Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを得る工程を含み、
好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を活性化エステル、酸塩化物、アシル化イミダゾールまたは混合酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる化合物と反応させることであり、さらに好ましくは、第３級アミン、例えばトリエチレンジアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリメチルアミン、ピリジンまたは置換されたピリジンを加えて触媒とすることであり、
好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を酸塩化物に変換する際に、塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ塩化リン、塩化オキサリル、三塩化シアヌルを用いて塩素化剤とすることであり、
あるいは、好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる化合物と反応させることであり、さらに好ましくは、ピリジン、置換されたピリジン、例えばＤＭＡＰを加えて触媒とすることであり、
必要に応じて、化合物Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを、その薬学的に許容される酸と反応させてその対応する薬学的に許容される塩を生成する。
【００１２】
本発明の他の一態様によれば、タンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法に関し、前記方法は、それを必要となる個体へ、治療または予防の有効量のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【００１３】
また、本発明の他の一態様によれば、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する方法に関し、前記方法は、それを必要となる哺乳動物へ、治療または予防の有効量のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【００１４】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩がタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用に関し、好ましくは、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物の製造における使用に関する。
【００１５】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩の薬物組成物がタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用、好ましくは、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物の製造における使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、それぞれの開示された実施形態に対して完全な理解を提供するために、何らかの具体的な詳細を含んで説明する。しかしながら、関連分野の当業者にとっては、これらの具体的な詳細の一部を用いなくても、他の方法、構成成分（部品）、材料などを用いる場合、前記実施形態を実現することができると、認識し得るものである。
【００１７】
本出願で別途に要求されない限り、本明細書全体、およびかかる特許請求の範囲において、「備える」、「含む」、「含有」、「含まれる」などのような単語は、オープンエンド的な意味、包括的な意味、すなわち「…を含むがこれらに限定されるものではない」として解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書全体における「一実施形態」、または「実施形態（実施案）」、または「別の一実施形態において」、または「いくつかの実施形態において」のような記載とは、少なくとも１つの実施形態において、当該実施形態の記載に関連する要素、構造や特徴を含んでいることを意味する。このため、明細書全体にわたって異なる部分に記載された「一実施形態において」、または「実施形態において」、または「別の一実施形態において」、または「いくつかの実施形態において」のような連語（語句）とは、全て同じ実施形態を指す必要はない。また、具体的な要素、構造や特徴は、任意の適切な形態で１つ以上の実施形態の中に組み合わせることができる。
【００１９】
定義
「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、アメリカ食品医薬品局に既に認可されたヒトまたは動物に投与可能な任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防食剤、染料／着色剤、香味補強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張圧剤、溶剤または乳化剤等の薬物組成物の構成に副作用無しの各形態の担体を含むが、これらに限らない。
【００２０】
「薬学的に許容される塩」とは、遊離アルカリの生物学的効率および性質を維持するそれらの塩を指し、このような塩は、生物学的または他の態様に適合され且つ無機酸または有機酸で形成されたものである。前記無機酸は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられるが、これらに限定されることではない。前記有機酸は、例えば、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシルエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、セバシン酸、オクタデカン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などが挙げられるが、これらに限定されることではない。
【００２１】
「薬物組成物」とは、本発明に係る化合物と、当該技術分野に一般的に許容されている、生体活性化化合物をヒトおよび他の哺乳動物へ輸送する媒体とが形成した製剤を指す。このような媒体は、全ての薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【００２２】
「治療有効量」とは、本願に係る化合物を用いて哺乳動物、例えば、ヒトに投与した際に、哺乳動物、例えばヒトのタンパク質チロシンホスホリラーゼ媒介性疾患または疾患状態を十分に治療するための（次の通りに定義される）量を指す。化合物、疾患状態およびその重症度、並びに被治療哺乳動物の年齢に応じて、「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量が異なっているが、当業者にとっては、自身の知識および本発明に基づき、慣例に応じて本発明の化合物の量を決定することができる。
【００２３】
本明細書で使用される「治療を行う」または「治療（する）」は、関連疾患また病症を患った哺乳動物（例えば、ヒト）の疾患または疾患状態に対する治療を包括し、且つ、
（ｉ）哺乳動物における疾患または疾患状態の発生（特に、当該哺乳動物が前記疾患状態にかかりやくいが、まだこのような疾患状態を患ったと診断されていない際）を予防すること、
（ｉｉ）疾患または疾患状態を抑制し、即ち、その発生を阻害すること、あるいは、
（ｉｉｉ）疾患または疾患状態を緩和し、即ち、疾患または疾患状態を消退させることを含む。
【００２４】
本明細書で表現するように、「疾患」および「疾患状態」のような用語は、互いに交換して使用してもよく、または、異なっていてもよく、特殊な疾患または疾患状態は、既知の病原因子をまだ有していない可能性がある（したがって、病因学によって説明することができない）ため、疾患として公認されないが、望ましくない疾患状態または病症として考えられ、その中で、特定の一連の症状が既に臨床医によって多かれ少なかれ同定された。
【００２５】
本発明の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩に関する。
【００２６】
【化２】
0006342001.tif 000003
【００２７】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキ
シエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド
【００２８】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩に関し、その中で、前記塩を形成する酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシルエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、セバシン酸、オクタデカン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびウンデシレン酸からなる群により選ばれる。
【００２９】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびはその薬学的に許容される塩に関し、その中で、前記塩は、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硝酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二燐酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酢酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ベンゼンスルホン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二フマル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二マレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ニコチン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二オレイン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二シュウ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二プロピオン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二サリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(４−アミノサリチル酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドジアセチルサリチル酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酒石酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ｐ−トルエンスルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二クエン酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二リンゴ酸塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ナフタレン−１，５−二スルホン酸)塩、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二セバシン酸塩、および
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(L−アスパラギン酸)塩からなる群により選ばれる。
【００３０】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩、および薬物許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む薬物組成物に関する。
【００３１】
本発明の薬物組成物に用いられる可能な薬物許容される担体の具体例は、アメリカ食品医薬品局に既に認可されたヒトや動物に投与可能な任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防食剤、染料／着色剤、香味補強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張圧剤、溶剤または乳化剤等の薬物組成物に副作用無しの各形態の担体を含むが、これらに限らない。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明の薬物組成物は、腸管外、経皮、経粘膜、経鼻、経頬、経舌下、または経口で用いられた錠剤、ディップ剤、顆粒剤、貼付剤、ペースト、カプセル剤、エアゾール剤または坐剤に製造されることができる。本発明の薬物組成物は、口腔内投与、口含、静脈射出、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、点鼻、点眼、吸入、肛門内投与、膣投与、または表皮投与などにより投与する。
【００３３】
また、本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学許容される塩の製造方法に関する。当該製造方法は、
【００３４】
【化３】
0006342001.tif 000004
【００３５】
【化４】
0006342001.tif 000005
【００３６】
式（Ｉ）で表わされる化合物と式（ＩＩ）で表わされる化合物とを反応させて化合物Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを得る工程を含み、
好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を活性化エステル、酸塩化物、アシル化イミダゾールまたは混合酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる化合物と反応させることであり、さらに好ましくは、第３級アミン、例えばトリエチレンジアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリメチルアミン、ピリジンまたは置換されたピリジンを加えて触媒とすることであり、
好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を酸塩化物に変換する際に、塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、オキシ塩化リン、塩化オキサリル、三塩化シアヌルを用いて塩素化剤とすることであり、
【００３７】
あるいは、好ましくは、式（Ｉ）で表わされる化合物を酸無水物に変換した後、さらに式（ＩＩ）で表わされる化合物と反応させることであり、さらに好ましくは、ピリジン、置換されたピリジン、例えばＤＭＡＰを加えて触媒とすることであり、
必要に応じて、化合物のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを、その薬学的に許容される酸と反応させてその対応する薬学的に許容される塩を生成する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、米国特許公開ＵＳ  ２００２／０７７３３０Ａ１号に記載の方法により、式（ＩＩ）で表わされる化合物を製造する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）で表わされる化合物を、次の通りに製造する。
【００４０】
２−ブロモエチルメチルエーテル１０８４．２ｇ（７．８ｍｏｌ）、４−ピペリドン一水和物塩酸塩９２１．０ｇ（６ｍｏｌ）、無水炭酸カリウム３３１２．０ｇ（２４ｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド３．７５Ｌを、２０Ｌの反応釜に入れ、室温で２４時間撹拌した。釜内における反応液は、合計で約４．４Ｌである。その２．２Ｌ排出しておき、釜内に、撹拌しながら水１３Ｌを加え、塩化メチレン４Ｌを加え、１０分間撹拌し、静置して分液し、塩化メチレン層を排出した。水層を、さらに塩化メチレンで３回抽出し、毎回塩化メチレン３Ｌを用いた。水層を捨てた。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウム１．３ｋｇを加え、０．５時間乾燥させ、吸引ろ過し、塩化メチレン１Ｌでろ過ケークを洗い流した。ろ過ケーキを吸引乾燥して捨てた。また、他の反応液２．２Ｌを上記の同様に処理して、ろ過液を合わせ、ろ過液を回転蒸発で濃縮した。濃縮液を合わせて油状物が得られた。
【００４１】
前記油状物を減圧蒸留し、２ｍｍＨｇで８２〜８８℃の留分を収集し、無色透明液体である１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−オン５８２．７ｇが得られた。
【００４２】
水素化ナトリウム１７４．１ｇ（４．３５４ｍｏｌ、含有量６０％）、および塩化メチレン５．０８Ｌを、２０Ｌの反応釜に加え、撹拌して０℃まで冷却した。ホスホノ酢酸トリメチル６６０．４ｇ（３．６２８ｍｏｌ）を、ゆっくりと滴下し、滴下の過程で釜内に０℃以下（≦０℃）に安定して維持し、滴下過程で多量のガスが発生し、反応液が灰色から白色になった。滴下終了後、ガスを発生しなくなり、反応液が白色のスラリー状であった。反応液を０℃以下に維持て低温で１時間撹拌した。１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−オン５７７．７ｇ（３．６２８ｍｏｌ）を、釜にゆっくりと滴下した。滴下過程において釜内を２℃以下に維持した。滴下終了後、０℃の低温に維持させて１５時間撹拌した。
【００４３】
完全に反応した後、水１Ｌを徐々に加えて反応を停止した。冷却を停止した。撹拌しながら水４．０８Ｌを加え、１０分間撹拌し、静置して分液した。塩化メチレン層を排出し、水層を塩化メチレン１．７Ｌで抽出した。水層を捨て、有機層を合わせ、水５．０８Ｌで１回洗浄し、１Ｎ塩酸で２回（３．６Ｌ＋１．５Ｌ）抽出し、塩化メチレン層を捨て、塩酸層を合わせた。塩酸層を０℃程度に冷却させ、撹拌しながら１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を、ｐＨ９まで徐々に加え、冷却を停止し、室温まで昇温した。塩化メチレン５．０８Ｌを加えて抽出し、水層を捨て、有機層を水５．０８Ｌで１回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液５．０８Ｌで１回洗浄し、無水硫酸マグネシウム５００ｇを加え、０．５時間乾燥させ、吸引ろ過し、ろ過ケークを塩化ナトリウム０．５Ｌで洗い流し、濾液を回転乾燥させた後、油ポンプを用いて減圧吸引乾燥した後、ブリリアントイエロー色の油状物である２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］メチルアセテート６２６．０ｇが得られた。
【００４４】
２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］メチルアセテート６２１．０ｇ（２．９１５ｍｏｌ）、エタノール２．９１５Ｌを、反応釜２０Ｌに入れて撹拌し、０℃まで冷却した。水酸化ナトリウム２９１．５ｇ（７．２８９ｍｏｌ）を、水０．７２９Ｌに溶解した後、１０℃まで冷却し、低温に維持し、反応釜を徐々に加え、滴下終了後、２５℃まで昇温し、撹拌を７時間続けた。完全に反応した後、反応液を０℃まで冷却し、一晩撹拌した。
【００４５】
０℃程度に維持し、ｐＨ値が２になるまで濃塩酸を徐々に滴下し、冷却を停止し、室温で撹拌を３０分間続け、吸引ろ過し、無水エタノール５００ｍＬでろ過ケーキを洗い流した後、吸引乾燥して別途で保存した。ろ液を、５０℃の水浴で液体が蒸発しなくなるまで回転蒸発・濃縮させ、黄色油状物を得たと共に、多量の白色結晶が析出した。無水エタノール１．４６Ｌを加え、室温で１５分間撹拌し、吸引ろ過し、無水エタ５００ｍＬでろ過ケークを洗い流した後、吸引乾燥して別途で保存した。ろ液を５０℃で液体が蒸発しなくなるまで回転蒸発・濃縮させ、淡黄色の濃い粥状物が得られた。
【００４６】
粥状物の再結晶：イソプロピルアルコール１．４６Ｌを添加し、８５℃の水浴で撹拌・還流・溶解して清澄化させ、熱いうちに吸引ろ過して少量の不溶性残留物を除去し、３Ｌの三ツ口フラスコに移し、８５℃の水浴に入れ、加熱を停止して自然冷却させ、一晩撹拌した。
【００４７】
氷浴で撹拌を２時間続け、吸引ろ過し、イソプロパノール１００ｍＬ／回でろ過ケークを５回洗い流し、ろ過ケーキを室温で空気中に２時間放置し、４５℃で真空乾燥させて、２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］酢酸塩酸塩２５４．５ｇが得られた。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドは、酸とを反応し、相応する薬学的に許容される塩が得られた。
【００４９】
本発明のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドの薬学的に許容される塩の製造に用いられる酸の例示的な具体例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシルエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、セバシン酸、オクタデカン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびウンデシレン酸を含むが、これらに限らない。
【００５０】
本発明の他の一態様によれば、タンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法に関し、前記方法は、それを必要となる個体へ、治療または予防の有効量のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、前記疾患は癌である。
【００５２】
本発明の方法で癌を治療または予防することができる例示的な具体例は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌および前立腺癌を含むが、これらに限らない。
【００５３】
いくつかの実施形態において、個体は哺乳動物である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを治療または予防の有効量としてタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量１ｍｇ〜１０００ｍｇを治療または予防の有効量としてタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量１０ｍｇ〜５００ｍｇを治療または予防の有効量としてタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する。
【００５８】
また、本発明の他の一態様によれば、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する方法に関し、前記方法は、それを必要となる哺乳動物へ、治療または予防の有効量のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ−２の過剰発現により生理異常を引き起こす。
【００６０】
いくつかの実施形態において、生理異常は癌である。
【００６１】
本発明の方法で癌を治療または予防することができる例示的な具体例は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌および前立腺癌を含むが、これらに限らない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを治療または予防の有効量として哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量１ｍｇ〜１０００ｍｇを治療または予防の有効量として哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、単位投与量１０ｍｇ〜５００ｍｇを治療または予防の有効量として哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する。
【００６６】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩がタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用に関し、好ましくは、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物の製造における使用に関する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩は、哺乳動物体内におけるＥＧＦＲおよび／またはＨｅｒ−２の過剰発現により引き起こされた前記生理異常を治療または予防するために用いられる。いくつかの実施形態において、前記生理異常は特にＥＧＦＲの過剰発現により引き起こされた生理異常である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、タンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常、およびタンパク質チロシンホスホリラーゼの活性を抑制する方法で有効となる疾患は、癌である。
【００６９】
本発明のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩を使用して癌を治療または予防することができる例示的な具体例は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、皮膚癌、腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、口腔癌、喉頭癌、子宮頸癌、肝臓癌、および前立腺癌を含むが、これらに限らない。
【００７０】
いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、単位投与量が約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇであるＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患、好ましくは哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物として用いられる。本出願に記載の単位投与量は、特別な説明しない場合、いずれも、患者に投与され且つ操作・包装されやすいユニット、即ち1回服用量を意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、単位投与量が約１ｍｇ〜約１０００ｍｇであるＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患、好ましくは哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物における使用を提供する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、単位投与量が約１０ｍｇ〜約５００ｍｇであるＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患、好ましくは哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療する薬物の製造における使用を提供する。
【００７４】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩がタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用、好ましくは哺乳動物体内タンパク質チロシンホスホリラーゼ活性を抑制するための薬物における使用に関する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００７６】
本発明の他の一態様によれば、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩の薬物組成物がタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用、好ましくは、哺乳動物体内におけるタンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常を治療または予防する薬物の製造における使用に関する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩の薬物組成物は、哺乳動物体内におけるＥＧＦＲおよび／またはＨｅｒ−２の過剰発現により引き起こされた前記生理異常を治療または予防する薬物の製造における使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記生理異常は特にＥＧＦＲの過剰発現により引き起こされた生理異常である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、タンパク質チロシンホスホリラーゼの過剰発現に起因した生理異常、およびタンパク質チロシンホスホリラーゼの活性を抑制する方法で有効となる疾患は、癌である。
【００７９】
本発明のＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩の薬物組成物を使用して癌を治療または予防することができる例示的な具体例は、乳癌、頭頸部癌、肺癌（非肺小細胞癌、肺小細胞癌を含み）、結腸癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、皮膚癌、腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、口腔癌、喉頭癌、子宮頸癌、肝臓癌、および前立腺癌を含むが、これらに限らない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００８１】
いくつかの実施形態において、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を単位投与量として含有する薬物組成物を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用、好ましくは哺乳動物体内のタンパク質チロシンホスホリラーゼ活性を抑制する薬物の製造における使用を提供する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を単位投与として含有する薬物組成物を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物における使用、好ましくは哺乳動物体内のタンパク質チロシンホスホリラーゼ活性を抑制する薬物における使用を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇのＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドまたはその薬学的に許容される塩を単位投与量として含有する薬物組成物を投与してタンパク質キナーゼ関連疾患を治療または予防する薬物の製造における使用、好ましくは哺乳動物体内のタンパク質チロシンホスホリラーゼ活性を抑制する薬物の製造における使用を提供する。
【００８４】
以下、本発明の各態様およびその利点をよりよく理解するために、下記の実施例により本発明を詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、非限定的なものであり、本発明のいくつかの実施形態を説明するためのものだけとして理解されるべきである。
【００８５】
実施例
実施例１
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド
２０Ｌの反応釜へアルゴンガスの送入を維持する。２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］アセテート酸塩２５０．０ｇ（１．０６２ｍｏｌ）、再蒸留したテトラハイドロフラン１．４６Ｌ、およびクロマトグラフ的に純粋なＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．４６ｍＬを反応釜に加えて撹拌し、０℃に冷却し、塩化オキサリル１２８．１ｇ（１．００９ｍｏｌ、８６．７ｍｌ）をゆっくりと滴下し、滴下過程において反応釜内に３℃以下に安定して維持した。滴下終了後、冷却を停止させ、アルゴンガスの送入を停止させ、２５℃で３時間撹拌し、２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］アセチルクロリド塩酸塩のテトラハイドロフラン溶液が得られた。
【００８６】
２−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イリデン］アセチルクロリド塩酸塩のテトラハイドロフラン溶液を有する反応釜にアルゴンガスの送入を維持して撹拌し、０℃以下に冷却する。Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４，６−ジアミン２５６．７ｇ（０．７０８ｍｏｌ）を、Ｎ−メチルピロリドン１．４６Ｌに溶解し、濾液を反応釜にゆっくりと滴下し、反応釜内に０℃以下に安定して維持する。滴下終了後、撹拌を１時間続け、冷却を停止させて２５℃まで自然に上昇させて一晩撹拌した。
【００８７】
ＴＬＣは、反応が完全に反応したか否かを監視する。完全に反応した後、反応液を０℃の程度に冷却し、水２．９Ｌをゆっくりと滴下し、反応釜内に溶液が透明になった。反応液を吸引ろ過して残留物を除去した後、１０Ｌの丸底フラスコに移し、４０℃で水浴し、機械的に撹拌した。ｐＨ値を約１０にしたまで、５Ｎ  水酸性化ナトリウム溶液を滴下し，すぐに固形物が析出して急速に増加し、適量な水を加えて反応系を正常に撹拌させ、水浴を撤去し、室温で２時間撹拌し、吸引ろ過し、ろ過ケークを蒸留水で滴下液体のｐＨ値が約７になるまで洗い流し、ベーキング乾燥して淡いピンク色の固形物である、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドの粗製品が得られた。
【００８８】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド粗製品２０ｇ、およびイソプロパノール２５０ｍＬを、１Ｌの反応釜に加えて混合し、機械的に撹拌し、８８℃で加熱しながら３時間還流し、加熱を停止させ、一晩撹拌するように維持した。吸引ろ過し、ろ過ケークをイソプロパノールで毎回２５０ｍＬ、４回洗い流し、乾燥までに吸引して乾かし、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドの製品が得られた。
【００８９】
質量スペクトル（ＭＳ）検出機器（型番：６４１０Ｂ  ＬＣ−ＭＳ、アジレント）、ＭＳ：５４４．２［Ｍ＋Ｈ］＋ピーク。
【００９０】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル検出機器（型番：ＶＡＲＩＡＮ  ＩＮＯＶＡ  ５００ＭＨｚ、測定条件：溶剤ＤＭＳＯ）により、下記のような結果が得られ、
【００９１】
【化５】
0006342001.tif 000006
【００９２】
【表１】
0006342001.tif 000007
【００９３】
カーボン核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル検出機器（型番：ＶＡＲＩＡＮ  ＩＮＯＶＡ  ５００ＭＨｚ、測定条件：溶剤ＤＭＳＯ）により、下記のような結果が得られ、
【００９４】
【化６】
0006342001.tif 000008
【００９５】
【表２】
0006342001.tif 000009
【００９６】
実施例２
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド２９０．０ｇ、およびイソプロパノール４．５Ｌを、２０Ｌの反応釜に加えて４０℃で加熱しながら撹拌した。
【００９７】
蒸留水１３５ｍＬおよびメタンスルホン酸１２８．１ｇの混合液を、釜にゆっくりと滴下し、釜内を清澄させ、滴下終了後、さらに５分間撹拌し、撹拌を停止して反応液を排出してろ過し、水：イソプロパノール＝３：１００（体積比）の混合液１５０ｍＬを取って釜を洗浄した後、反応液とを混入し、吸引ろ過して残留物を除去し、濾液を１０Ｌの丸底フラスコに移し、さらに水：イソプロパノール＝３：１００（体積比）の混合液１５０ｍＬを取ってろ過フラスコを洗浄し、且つ丸底フラスコにも入れて合併し、室温で一晩撹拌した。固形物を析出して吸引ろ過し、ろ過ケークに対し、イソプロパノールを用いて毎回２５０ｍＬで４回洗い流し、吸引乾燥し、３５℃で２４時間真空乾燥させ、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩３５６．１ｇ（収率９０．７％）が得られた。
【００９８】
質量スペクトル（ＭＳ）検出機器（型番：６４１０Ｂ  ＬＣ−ＭＳ、アジレント）ＭＳ：５４４．１において  ［Ｍ＋Ｈ］＋ピーク。
【００９９】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル検出機器（型番：ＶＡＲＩＡＮ  ＩＮＯＶＡ  ５００ＭＨｚ、測定条件：溶剤Ｄ２Ｏ）により、下記のような結果が得られ、
【０１００】
【化７】
0006342001.tif 000010
【０１０１】
【表３】
0006342001.tif 000011
【０１０２】
カーボン核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル検出機器（型番：ＶＡＲＩＡＮ  ＩＮＯＶＡ  ５００ＭＨｚ、測定条件：溶剤Ｄ２Ｏ）により、下記のような結果が得られ、
【０１０３】
【化８】
0006342001.tif 000012
【０１０４】
【表４】
0006342001.tif 000013
【０１０５】
実施例３
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド１０ｇ、およびイソプロパノール１５５ｍＬを、５００ｍＬのガラス瓶に加えて４０℃で加熱しながら撹拌した。
【０１０６】
蒸留水５ｍＬおよび濃硫酸３．３ｍＬの混合液を、ガラス瓶にゆっくりと滴下し、ガラス瓶内を清澄させ、滴下終了後、さらに５分間撹拌し、撹拌を停止して反応液を排出してろ過し、水：イソプロパノール＝３：１００（体積比）の混合液５ｍＬを取ってガラス瓶を洗浄した後、反応液を混入し、吸引ろ過して残留物を除去し、濾液を５００ｍＬのガラス瓶に移し、さらに水：イソプロパノール＝３：１００（体積比）の混合液５ｍＬを取ってろ過フラスコを洗浄し、且つ丸底フラスコにも入れて合併し、室温で一晩撹拌した。固形物を析出して吸引ろ過し、ろ過ケークに対し、イソプロパノールを用いて毎回１５５ｍＬで４回洗い流し、吸引乾燥し、３５℃で２４時間真空乾燥させ、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩が得られた。
【０１０７】
質量スペクトル（ＭＳ）検出機器（型番：６４１０Ｂ  ＬＣ−ＭＳ、アジレント）ＭＳ：５４４において［Ｍ＋Ｈ−１９６］＋ピーク。
【０１０８】
実施例４−２４
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドの他の酸との塩
実施例２の製造方法に従って、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドを、それぞれ塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、ニコチン酸、オレイン酸、シュウ酸、プロピオン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、アセチルサリチル酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、リンゴ酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、セバシン酸、Ｌ−アスパラギン酸に反応させて次のような産物が製作された。
【０１０９】
【表５】
0006342001.tif 000014
0006342001.tif 000015
【０１１０】
Ｄ２Ｏを溶剤とし、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ４００を用いて得られた化合物４〜化合物２５の１Ｈ  ＮＭＲデータは、次の通りであり、
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩
２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０２  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８１  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２０  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｔ，  １Ｈ），  ８．２７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３４  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１１】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩
２．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６３  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９０  （ｔ，  １Ｈ），  ３．００  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４９  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硝酸塩
２．４９  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６２  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９７  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９６  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３６  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１３】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二燐酸塩
２．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６６  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０２  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１４】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酢酸塩
２．０８  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６９  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９９  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２６  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３９  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１５】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ベンゼンスルホン酸塩
２．５１  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６０  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２７  （ｔ，  １Ｈ），  ７．３１−７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ７．５４−７．９３  （ｍ，  ８Ｈ），  ８．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１６】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二フマル酸塩
２．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６０  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ６．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．０４  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．２８  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１７】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二マレイン酸塩
２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０８  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２８  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．３０  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２６  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３９  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１１８】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ニコチン酸塩
２．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６２  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０６  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４０  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．１７  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．０４  （ｍ，  ２Ｈ）．
【０１１９】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二オレイン酸塩
０．９６  （ｔ，  ６Ｈ），  １．２７−１．３１  （ｍ，  ２８Ｈ），  １．３３−１．３５  （ｍ，  １２Ｈ），  １．５３−１．５８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．９４−１．９８  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．２３  （ｔ，  ４Ｈ），  ２．４９  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０１  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４５  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３７  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２０】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二シュウ酸塩
２．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６２  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９９  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２４  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２１】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二プロピオン酸塩
１．０９  （ｔ，  ６Ｈ），  ２．２７  （ｑ，  ４Ｈ），  ２．４５  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６５  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３７  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二サリチル酸塩
２．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５９  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６５  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ６．９５−７．０４  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４８−７．９６  （ｍ，  ４Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２３】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(４−アミノサリチル酸)塩
２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６６  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１１−６．２４  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．８８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｔ，  １Ｈ），  ７．６８−７．７４  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．３４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３６  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２４】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドジアセチルサリチル酸塩
２．１１  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．４９  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５１  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６５  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９２  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０３  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８９  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２７  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２１−７．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．４２  （ｔ，  １Ｈ），  ７．７８−８．０９  （ｍ，  ４Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３６  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２５】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二酒石酸塩
２．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．９１  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５１  （ｓ，  ４Ｈ），  ５．９９  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２６】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ｐ−トルエンスルホン酸)塩
２．３３  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９１  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．３１−７．４２  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．４５  （ｔ，  １Ｈ），  ７．７４−７．９３  （ｍ，  ４Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３７  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２７】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二クエン酸塩
２．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６０  （ｄ，  １Ｈ），  ２．６４  （ｓ，  ８Ｈ），  ２．９２  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７８  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１１  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９０  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２４  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４１  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２８】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二リンゴ酸塩
２．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５３  （ｑ，  ２Ｈ），  ２．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６３  （ｄ，  １Ｈ），  ２．７８  （ｑ，  ２Ｈ），  ２．９５  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４２  （ｑ，  ２Ｈ），  ５．９２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９２  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２２  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４３  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１２９】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ナフタレン−１，５−二スルホン酸)塩
２．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６２  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．００  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６６  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７９  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１０  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２４  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｔ，  １Ｈ），  ７．６３−７．９８  （ｍ，  １２Ｈ），  ８．３０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４０  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１３０】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二セバシン酸塩
１．２７−１．３１  （ｍ，  １６Ｈ），  １．５４−１．５８  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．２３  （ｔ，  ８Ｈ），  ２．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６５  （ｄ，  １Ｈ），  ２．９４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０２  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５３  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．８１  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１３  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９７  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２２  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１３１】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(L−アスパラギン酸)塩
２．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６０  （ｑ，  ２Ｈ），  ２．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ２．６７  （ｄ，  １Ｈ），  ２．８５  （ｑ，  ２Ｈ），  ２．９７  （ｔ，  １Ｈ），  ３．０４  （ｔ，  １Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．８２  （ｑ，  ２Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．９７  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２  （ｔ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｔ，  １Ｈ），  ８．３４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４７  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１３２】
実験のプロセスに用いられた化合物およびその略称は、次の通りであり、
化合物１：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、
化合物２：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩、
化合物３：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩、
化合物４：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩（その構造式は、次の通り、
【０１３３】
【化９】
0006342001.tif 000016
【０１３４】
化合物５：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硫酸塩、
化合物６：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二硝酸塩、
化合物７：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二燐酸塩、
化合物８：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二ベンゼンスルホン酸塩、
化合物９：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二フマル酸塩、
化合物１０：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二マレイン酸塩、
化合物１１：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドビス(ｐ−トルエンスルホン酸)塩、
化合物１２：Ｎ−［４−（３−エチニルフェニルアミノ−７−（２−エトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−メチルピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩（その構造式は、次の通り、
【０１３５】
【化１０】
0006342001.tif 000017
【０１３６】
生物学的実施例
生物学的実施例１
ラット生体内の生物学的利用率実験
実験１  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩によるラット生体内の生物学的利用率実験
【０１３７】
１．実験動物：
Ｗｉｓｔａｒラット１２匹、雄、体重２００〜２２０ｇであり、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された。許可証番号：ＳＣＸＫ（京）２００７−０００１。
【０１３８】
２．試験薬物の調製：
２．１  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩３０ｍｇを秤量し、超純水６ｍＬを加えて試料溶液５ｍｇ／ｍＬを調製し、静脈内投与のために使用される。
【０１３９】
２．２  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩３０ｍｇを秤量し、超純水１２ｍＬを加えて試料溶液２．５ｍｇ／ｍＬを調製し、胃内投与のために使用される。
３．実験方案
【０１４０】
【表６】
0006342001.tif 000018
【０１４１】
４．実験方法：
４．１  ＨＰＬＣ／ＭＳ条件：
４．１．１  ＨＰＬＣ条件：
クロマトグラフィーカラム：オクタデシル結合シリカゲルを充填剤とし（４．６ｍｍ×５０ｍｍ、１．８μｍ）、アジレント社製造、
移動相：  メタノール：５ｍＭ酢酸アンモニウム（ＰＨ４．０）（６０：４０）、
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃
４．１．２  ＭＳ条件：
ソースパラメータ
【０１４２】
【表７】
0006342001.tif 000019
【０１４３】
ＭＲＭモード検出  
イオン：５４４．３’４５７．１（Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩）
５５９．３’４４０．３（内部標準、アトルバスタチンヘミカルシウム塩）
滞留時間：８０、フラグメント電圧：１８０、衝突エネルギー：２５。
【０１４４】
４．２  標準曲線を構築する
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩を約１ｍｇ秤量し、１ｍｇ／ｍＬのメタノール溶液に調製し、段階的に５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの標準溶液に希釈させ、それぞれ１０μＬを吸引して１．５ｍＬの遠心管に入れ、内部標準（１μｇ／ｍＬのＬｉｐｉｔｏｒメタノール溶液）１０μＬを加え、ラット血漿１００μＬを加え、ボルテックスボルしてよく混合し、アセトニトリル２００μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、１分間ボルテックスした。１６０００ｒｐｍで８分間遠心し、上澄み液を吸引し、サンプル１０μＬを注入し測定した。
【０１４５】
４．３  血液サンプルの処理：
ラット１２匹を、群ごとに６匹で２つの群に無作為に分け、投与前に１２時間絶水しなく絶食し、それぞれ空試験用血約０．５ｍＬを取った後、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩（２０ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ胃内投与し、尾静脈注射により投与した後、異なる時間点で（尾静脈投与の方の採血時間点は、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、３０ｈであり、胃内投与の方の採血時間点は、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、３０ｈであり）、眼窩静脈叢から約０．５ｍＬを採血してヘパリン化遠心管に入れ、８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿１００μＬを吸引し、１．５ｍＬの遠心管に入れ、内部標準（１μｇ／ｍＬのアトルバスタチンヘミカルシウム塩のメタノール溶液）１０μＬを加え、ボルテックスしてよく混合し、アセトニトリル２００μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、１分間ボルテックスした。１６０００ｒｐｍで８分間遠心し、上澄み液を吸引し、サンプル１０μＬを注入し測定した。
【０１４６】
５．結果
５．１  サンプル濃度の自然対数を横軸とし、サンプルと内部標準とのピーク面積の比率の自然対数を縦軸として標準曲線を構築すると、ｙ＝１．００８ｘ−４．１４９、Ｒ２＝０．９９８になった。
【０１４７】
５．２  各時間点の血中薬物濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、下記表の通り、
５．２．１  静脈投与結果
【０１４８】
【表８】
0006342001.tif 000020
【０１４９】
５．２．２  胃内投与の結果：
【０１５０】
【表９】
0006342001.tif 000021
【０１５１】
５．２．３  結論
生物学的利用率の計算方法：  Ｆ＝（ＡＵＣｉｇ×Ｄｉｖ）／（ＡＵＣｉｖ×Ｄｉｇ）×１００％
式中、Ｄは投与量を表し、ＡＵＣは血中薬物濃度−時間曲線下面積を表し、ｉｇは胃内投与を表し、ｉｖは静脈注射投与を表す。
【０１５２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩の生物学的利用率は５６．８７％であり、且つ比較的良好な薬物動態学的特性を有している。
【０１５３】
実験２  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩によるラット生体内の生物学的利用率実験
１．実験動物：
Ｗｉｓｔａｒラット１２匹、雌と雄が半々であり、体重１６０〜１９０ｇであり、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入された。許可証番号：ＳＣＸＫ（京）２００７−０００１。
【０１５４】
２．投与計画：
【０１５５】
【表１０】
0006342001.tif 000022
【０１５６】
３．実験方法：
３．１  動物への投与、および血液サンプルの処理：
投与前に、ラット１２匹を１２時間絶水しなく絶食し、６匹毎に２つの群に無作為に分け、それぞれ下記投与計画で投与する前、および投与した後５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１０ｈ、２４ｈ、３０ｈの時間点で、眼窩静脈叢から約０．５ｍＬを採血してヘパリン化遠心管に入れて８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿１００μＬを吸引し、内部標準（１μｇ／ｍＬのアトルバスタチンヘミカルシウム塩のメタノール溶液）１０μＬを加え、ボルテックスしてよく混合し、アセトニトリル２００μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、２分間ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を吸引し、サンプル２０μＬを注入し測定した。
【０１５７】
３．２  標準曲線の構築：
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩の異なる濃度のメタノール溶液（５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０  ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１  μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）それぞれ１０μＬを吸引して１．５ｍＬの遠心管に入れ、いずれもラットの空試験用血漿１００μＬを加え、ボルテックスしてよく混合し、内部標準（１μｇ／ｍＬのアトルバスタチンヘミカルシウム塩のメタノール溶液）１０μＬを加え、アセトニトリル２００μＬを加えてタンパク質を沈殿させ、２分間ボルテックスして混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を吸引し、サンプル２０μＬを注入し測定した。サンプルと内部標準との血中薬物濃度の比率を横軸とし、サンプルと内部標準とのピーク面積の比率を縦軸として標準曲線を構築する。
【０１５８】
３．３  ＨＰＬＣ／ＭＳ条件は、実験一と同じである。
【０１５９】
４．結果：
ＤＡＳ２．０（統計モーメント）により主な薬物動態学的パラメータ、および経口投与の生物学的利用率を計算した結果
【０１６０】
【表１１】
0006342001.tif 000023
【０１６１】
５．結論
生物学的利用率の計算方法：Ｆ＝（ＡＵＣｉｇ×Ｄｉｖ）／（ＡＵＣｉｖ×Ｄｉｇ）×１００％
式中、Ｄは投与量を表し、ＡＵＣは血中薬物濃度−時間曲線下面積を表し、ｉｇは胃内投与を表し、ｉｖは静脈注射投与を表す。
【０１６２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二臭化水素酸塩の生物学的利用率は４２．７６％であり、且つ比較的良好な薬物動態学的特性を有している。
【０１６３】
実験３  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドによる生物学的利用率実験
１．実験動物：Ｗｉｓｔａｒラットが８匹、雄、体重１６０〜１９０ｇであり、中国人民解放軍軍事医学科学院実験動物センターから購入された。許可証番号：ＳＣＸＫ（軍）２０１２−０００４、合格証番号：００３７０７４。
【０１６４】
２．投与計画：
【０１６５】
【表１２】
0006342001.tif 000024
【０１６６】
予備製剤の製作：
１）ガラスチューブに化合物１０ｍＬを正確に秤量し、
２）総体積の２％のＤＭＳＯをピペットで吸引し、そしてピペットチップで遠心管の内壁に貼り付けてゆっくり回転しながら、数回でＤＭＳＯを徐々に注入し、遠心管の壁に吸着された化合物を溶解させ、化合物を完全に底部に移行した後、ボルテックスして溶解させ、８０℃の水浴中に入れ、
３）さらに、総体積６％のポリオキシエチレン３５ーヒマシ油を添加し、ボルテックスして混合し、
４）さらに、総体積９２％の０．９％塩化ナトリウム注射液を加え、ボルテックスしてよく混合し、澄み溶液を得て６０分以内に使用した。
【０１６７】
注：総体積とは、配合終了後に得られた溶液の体積を指す。
【０１６８】
３．実験方法：
３．１  動物への投与、および血液サンプルの処理：
投与前に、ラット８匹を１２時間絶水しなく絶食し、群毎に４匹で２つの群に無作為に分け、それぞれ下記投与計画で投与する前、および投与した後５ｍｉｎ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、および８ｈの時間点で眼窩静脈叢から約０．５ｍＬを採血し、ヘパリン化遠心管に入れて８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血漿１００μＬを吸引し、０．２％酢酸メタノール２００μＬ（２０ｎｇ／ｍＬ内部標準イルベサルタンを含み）を加えてタンパク質を沈殿させ、２分間ボルテックスして混合し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を吸引し、サンプル２０μＬを取って注入し測定した。
【０１６９】
３．２  ＬＣ−ＭＳ測定条件：
（１）クロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（１５０＊４．６ｍｍ，２．５μｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃
移動相：
Ａ相：５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液、
Ｂ相：メタノール、勾配が次の通りであり、
【０１７０】
【表１３】
0006342001.tif 000025
【０１７１】
（２）質量スペクトル条件：
ＡＰＩ３０００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ源、ＭＲＭ正イオン走査、パラメータは、次の通りであり、
【０１７２】
【表１４】
0006342001.tif 000026
【０１７３】
４．結果：
ＤＡＳ２．０（統計モーメント）により主な薬物動態学的パラメータ、および経口投与の生物学的利用率を計算した結果
【０１７４】
【表１５】
0006342001.tif 000027
【０１７５】
５．結論
生物学的利用率の計算方法：  Ｆ＝（ＡＵＣｉｇ×Ｄｉｖ）／（ＡＵＣｉｖ×Ｄｉｇ）×１００％
式中、Ｄは投与量を表し、ＡＵＣは血中薬物濃度−時間曲線下面積を表し、ｉｇは胃内投与を表し、ｉｖは静脈注射投与を表す。
【０１７６】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミドの生物学的利用率は２３．９％であり、且つ比較的良好な薬物動態学的特性を有している。
【０１７７】
実験４  Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩によるラット生体内の生物学的利用率実験
１．実験動物：ＳＤラット１２匹、雌と雄が半々であり、７〜１０週齢、体重２００〜３５０ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、太平路２７号院ＧＬＰセンター動物小屋に飼育された。北京維通利華実験動物技術有限公司の生産許可証番号は、ＳＣＸＫ（京）２００９−０００２である。
【０１７８】
２．投与計画
【０１７９】
【表１６】
0006342001.tif 000028
【０１８０】
３．実験方法：
３．１  動物への投与、および血液サンプルの処理：
投与計画によって各群動物に投与した後、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、および１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１２ｈ、２４ｈの時間点で、ガラス毛細管を用いて眼窩静脈から０．５ｍＬ程度をヘパリン管に採血し、上下に軽く振動し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。血漿を分離し、５０μＬを取って５ｍＬの遠心管に入れ、５０％メタノール水溶液５０μＬおよびチエノルフィンーＤ４同位体内部標準物質５０μＬを加え、均一に混合した後、メタノール：アセトニトリル＝１：３（体積比）の溶液を加え、ボルテックスで３０秒振動させ、十分に均一に混合し、３０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清５００μＬを取って、さらに２０％メタノール溶液５００μＬを加え、等倍希釈して、ボルテックスで３０秒振動させ、十分に均一に混合した後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、サンプル１０Ｌを取って注入し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０１８１】
３．２  ＬＣ−ＭＳ測定条件：
クロマトカラム：
Ａｇｅｌａ  Ｖｅｎｕｓｉｌ  ＡＱ−Ｃ１８、５μｍ  ２．１×５０ｍｍ、Ｓ／Ｎ：ＡＱ−２１０５０６００２９。
【０１８２】
液相条件：
Ａ：水溶液（５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム、０．２％のギ酸）、
Ｂ：メタノール、カラム温度２５℃、
サンプル注入量：１０Ｌ、
勾配溶出。
【０１８３】
勾配条件：
Ａ相：５ｍＭの酢酸アンモニウム（０．２％のギ酸を含み）、
Ｂ相：メタノール、
０〜０．５ｍｉｎ、Ａ相が０．２１ｍＬ／ｍｉｎで、Ｂ相が０．０９ｍＬ／ｍｉｎであり、
０．５〜１ｍｉｎ、Ａ相の流速を直線的に０ｍＬ／ｍｉｎまで低減させ、Ｂ相の流速を直線的に０．３ｍＬ／ｍｉｎまで向上させ、
１．０１ｍｉｎ、Ｂ相の流速を０．５ｍＬ／ｍｉｎまで向上させ、１ｍｉｎ維持し、
２．０１ｍｉｎ、Ａ相の流速を０．２１ｍＬ／ｍｉｎまで向上させ、Ｂ相の流速を０．０９ｍＬ／ｍｉｎまで低減させ、この割合を２ｍｉｎ維持し、初期流速の割合までバランスした。
【０１８４】
質量スペクトル条件：
イオン源：Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙ（ターボイオンスプレー）（ＥＳＩ＋）、
検出モード：ＭＲＭ、
電気的パラメータ：化合物１：  ｍ／ｚ  ５４４．２〜４５７．１、
ＣＥ（衝突エネルギー）：３６．５。
【０１８５】
４．結果：
ＤＡＳ２．０（統計モーメント）により主な薬物動態学的パラメータ、および経口投与の生物学的利用率を計算した結果
ラットに５．０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内注射する薬物動態統計学的モーメントパラメーター（ｎ＝６）
【０１８６】
【表１７】
0006342001.tif 000029
【０１８７】
【表１８】
0006342001.tif 000030
【０１８８】
５、結論
生物学的利用率の計算方法：Ｆ＝（ＡＵＣｉｇ×Ｄｉｖ）／（ＡＵＣｉｖ×Ｄｉｇ）×１００％
式中、Ｄは投与量を表し、ＡＵＣは血中薬物濃度−時間曲線下面積を表し、ｉｇは胃内投与を表し、ｉｖは静脈注射投与を表す。
【０１８９】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩の生物学的利用率は５６．９％であり、且つ比較的良好な薬物動態学的特性を有している。
【０１９０】
生物学的実施例２
マウスの１回胃内投与のＭＴＤ実験
１．実験動物：
雄性ＩＣＲマウス、体重１９〜２２ｇ、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、動物許可証番号は、ＳＣＸＫ（京）２００７−０００１である。
【０１９１】
２．実験方案：
マウス２１匹を取って９群に分け、第１、４、６群は１匹で、第２、５、８群は４匹で、第３、６、９群は２匹である。化合物４、化合物２、化合物１２を取って、注射用水に溶解した。第１〜第３群には、化合物４：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩を、それぞれドーズ量１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇで尾静脈に投与した。投与した後、動物の反応および体重変化を観察し、１４日後、動物を犠牲死させ、解剖して観察した。第４〜第６群には、化合物２：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩を、それぞれドーズ量１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇで尾静脈に投与した。投与した後、動物の反応および体重変化を観察し、１４日後、動物を犠牲死させ、解剖して観察した。第７〜第９群には、化合物１２：Ｎ−［４−（３−エチニルフェニルアミノ−７−（２−エトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−メチルピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩を、それぞれドーズ量１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇで尾静脈に投与した。投与した後、動物の反応および体重変化を観察し、１４日後、動物を犠牲死させ、解剖して観察した。
【０１９２】
３．実験結果：
【０１９３】
【表１９】
0006342001.tif 000031
【０１９４】
【表２０】
0006342001.tif 000032
【０１９５】
【表２１】
0006342001.tif 000033
【０１９６】
初歩的な薬物動態学的研究により、化合物４、および化合物１２が胃腸管に集まっており、経口投与の生物学的利用能が非常に低いことを見出した。
【０１９７】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二塩酸塩は、その耐性がよりよく、毒性がより低く、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０１９８】
生物学的実施例３
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性に対する阻害効果
１．主要な試薬材料
ＥＧＦＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号ＰＶ３８７２
ｐＧＴ（ポリグルタミン酸−チロシン）：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、製品番号Ｐ０２７５
ｐＹ−２０（マウス抗リン酸化チロシン抗体−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号０３−７７２０
ＴＭＢ（３，３‘，５，５‘−テトラメチルベンジジン、ＨＲＰ基質）：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、製品番号００−４２０１−５６
９６ウェルマイクロプレート、Ｎｕｎｃ社、製品番号４４２４０４
２．主要な計器機器
マイクロプレートリーダー：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、６８０型
９６ウェルプレートウォッシャー：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、１５７５型
【０１９９】
３．試験方法
３．１  基本的な方法
実験方法は、文献の「Ｊ．Ｍｏｙｅｒ，  Ｅ．Ｂａｒｂａｃｃｉ，  Ｋ．Ｉｗａｔａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ｂｙ  ＣＰ−３５８，７７４，  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９７，  ５７：  ４８３８−４８４８．」を参照し、且つ当該文献に基づいて調整された。実験方法について、次の通りに説明する。  
【０２００】
３．１．１  ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に０．２ｍｇ／ｍＬで溶解されたｐＧＴ（酵素の基質とし）で、９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、未結合のｐＧＴを洗浄液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗い流し、室温で２時間乾燥させた。
【０２０１】
３．１．２  酵素反応は、５０μＬの反応体系において行われ、室温で３０分間反応させ、その中で、当該反応体系は、５０ｍＭのＨＥＰＥｓ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．５、０．０１％のＢＲＩＪ−３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）からなり、且つ一定濃度のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）およびキナーゼを含み、キナーゼは、ＡＴＰ端末のリン酸基を触媒してｐＧＴのチロシン残基へ転移させてリン酸化させることができる。
【０２０２】
３．１．３  終濃度１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて反応を停止させ、ｐＹ−２０でリン酸化されたチロシン残基を識別して、当該抗体末端のＨＲＰがＴＭＢを発色させ、さらに同量の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加え、反応を停止し、４５０ｎｍでそのＯＤ値を測定し、ＯＤ値がｐＧＴチロシン残基のリン酸化程度に正相関する。
【０２０３】
３．２  キナーゼおよび基質ＡＴＰの濃度は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により開示された文献「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＥＧＦＲ  （ＥｒｂＢ１）」（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｏｏｌｓ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ＥＧＦＲ＿ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ＿ａｃｔｉｖｉｔｙ＿Ｅｕｒｏｐｉｕｍ．ｐｄｆ）を参照して決め、最終濃度の選択基準は、キナーゼ濃度が産物の生成量を検出システムの線形範囲内にするようになり、ＡＴＰ濃度がＫｍ（ミカエリス定数）値に近いことである。
【０２０４】
３．３  化合物の活性検出
３．３．１  適量の化合物を取ってＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解し、２ｍＭの原液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得、さらにＤＭＳＯで最高試験濃度５０倍の濃度の使用液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に希釈し、且つ４倍段階希釈し、合計７つの濃度にした。
【０２０５】
３．３．２  反応系（５０ｍＭのＨＥＰＥｓ、ｐＨ７．５、０．０１％  ＢＲＩＪ−３５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、４４．４ｎｇ／ｍＬのＥＧＦＲを含み、終濃度４０ｎｇ／ｍＬ）４４μＬに、５０倍濃度の化合物使用液１μＬを加え、均一に混合した。Ｈ２Ｏに溶解した１０倍濃度のＡＴＰ（当該ＡＴＰ濃度は、ＥＧＦＲ試験の中に１００μＭであり、Ｈｅｒ２試験の中に４００μＭであり）５μＬを加え、酵素反応を起動し、室温で３０分間反応させた。
【０２０６】
３．３．３  化合物を含まない陽性溶媒対照群（ＰＣ）と、ＡＴＰおよび化合物を含まない陰性溶媒対照群（ＮＣ）と同時に設定し、投与群ＯＤ値と溶媒対照群ＯＤ値とを比較して化合物の阻害率が得られた。計算方法は、以下の通りである。
【０２０７】
阻害率＝［１−（試験値−ＮＣ平均値）／（ＰＣ平均値−ＮＣ平均値］）×１００％、重複のウェルにより阻害率平均値およびＳＤ（標準偏差）を求め、化合物濃度を横軸とし、且つ対数分布し、阻害率平均値を縦軸としてプロットし、Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ４パラメータ方程式で曲線をフィッティングし、曲線における５０％阻害率に対応した化合物濃度は、ＩＣ５０値である。
【０２０８】
【表２２】
0006342001.tif 000034
【０２０９】
４．試験の結果
【０２１０】
【表２３】
0006342001.tif 000035
【０２１１】
生物学的実施例４
突然変異型ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ，Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）チロシンキナーゼ活性に対する阻害効果
１．主要な試薬材料
ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号ＰＲ７４４７Ａ
ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号ＰＲ８９１１Ａ
Ｐ２２（ポリペプチド基質）：ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌｔｄ．、製品番号１１２３９３
９６ウェルプレート：コーニング社、製品番号３３６５
３８４ウェルプレート：コーニング社、製品番号３５７３
２．主要な計器機器
Ｃａｌｉｐｅｒワークステーション
【０２１２】
３．試験方法
３．１  試験の基本的な条件
【０２１３】
【表２４】
0006342001.tif 000036
【０２１４】
３．２  キナーゼ緩衝液の調製：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．００１５％のＢｒｉｊ−３５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）
３．３  停止液の調製：１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．０１５％のＢｒｉｊ−３５、０．２％のＣｏａｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃３（コーティング試薬３、Ｃａｌｉｐｅｒワークステーションにより調製され）、５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）
【０２１５】
３．４  化合物の希釈：
３．４．１  ５０倍濃度の化合物の調製：例えば、化合物の検出用終濃度が１２．５ｎＭである場合、５０倍濃度に調製する濃度は、６２５ｎＭである。９６ウェルプレートにおいて、５０倍濃度の化合物使用液をＤＭＳＯで４倍希釈し、合計７つの濃度を希釈した。  
【０２１６】
３．４．２  ５倍濃度の化合物の反応プレートへの移し：前記９６ウェルプレートの各ウェルから１０  μｌを取り出し、別の９６ウェルプレートに移し、キナーゼ緩衝液９０μＬを加えた。前記９６ウェルプレートから５μＬを取り出し、３８４ウェル反応プレートに移した。したがって、３８４ウェル反応プレートにおいて、５μＬの１０％ＤＭＳＯで溶解した５倍濃度の化合物を備えた。陰性対照ウェルに、２５０ｍＭのＥＤＴＡ  ５μＬを加えた。
【０２１７】
３．５  キナーゼ反応
３．５．１  キナーゼ緩衝液を用いてキナーゼを２．５倍濃度の酵素溶液に調製した。
【０２１８】
３．５．２  キナーゼ緩衝液を用いてポリペプチドおよびＡＴＰを２．５倍濃度の基質溶液に調製した。
【０２１９】
３．５．３  ３８４ウェル反応プレートにおいて、５倍濃度の酵素溶液１０μＬを加え、室温で１０分間インキュベートした。
【０２２０】
３．５．４  ３８４ウェル反応プレートにおいて、２．５倍濃度の基質溶液１０μＬを加え、２８℃で１時間インキュベートした。
【０２２１】
３．５．５  停止液２５μＬを加え、反応を停止した。
【０２２２】
３．６  Ｃａｌｉｐｅｒで基質転化率のデータを読み出した。
【０２２３】
３．７  阻害率の計算：転化率を阻害率データとして変換した。
【０２２４】
阻害率（％）＝（ｍａｘ−転化率）／（ｍａｘ−ｍｉｎ）×１００％、その中、ｍａｘとはＤＭＳＯ対照の転化率を指し、ｍｉｎとは酵素無し対照の転化率を指す。阻害曲線によってＩＣ５０値を求めた。
【０２２５】
【表２５】
0006342001.tif 000037
【０２２６】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩は、選択性の高いチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤であり、特にＥＧＦＲに対する高い阻害活性を持ち、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０２２７】
生物学的実施例５
体外でヒト由来の腫瘍細胞に対する阻害効果
１．試験細胞および主要な試薬
ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１、ヒト非肺小細胞癌細胞系ＨＣＣ８２７、頭頸部癌細胞系Ｆａｄｕ、およびヒト膵臓癌細胞系ＡｓＰＣ−１：中国科学院細胞バンクから購入した。
【０２２８】
ＲＰＭＩ‐１６４０（培地名）：Ｇｉｂｃｏ社、製品番号３１８００−０２２。これは乾燥粉末であり、使用説明書によって液体培地に調製し、細胞培養の必要に応じて２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥｓを加えた。
【０２２９】
ＥＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｓａｌｔｓ）：Ｇｉｂｃｏ社、製品番号４１５００−０３４。これは乾燥粉末であり、使用説明書によって液体培地に調製し、細胞培養の必要に応じて２．２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥｓを加えた。
【０２３０】
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）：Ｇｉｂｃｏ社、製品番号１２８００−０１７。これは乾燥粉末であり、使用説明書によって液体培地に調製し、細胞培養の必要に応じて２．２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥｓを加えた。
【０２３１】
Ｆ−１２Ｋ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２  Ｈａｍ  Ｋａｉｇｈｎ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、製品番号Ｎ３５２０。これは乾燥粉末であり、使用説明書によって液体培地に調製し、細胞培養の必要に応じて１．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２．３８３ｇ／ＬのＨＥＰＥｓを加えた。
【０２３２】
Ｆ−１２（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）：Ｇｉｂｃｏ社、製品番号２１７００−０７５。これは乾燥粉末であり、使用説明書によって液体培地に調製し、細胞培養の必要に応じて１．７６ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２．３８３ｇ／ＬのＨＥＰＥｓを加えた。
【０２３３】
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）：Ｈｙｃｌｏｎｅ社、製品番号ＳＶ３００８７。
【０２３４】
ＭＴＴ（テトラゾリウム塩）：Ｓｉｇｍａ社、製品番号Ｍ５６５５。ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて５ｍｇ／ｍＬの原液に調製した。
【０２３５】
ＳＲＢ（スルホローダミン）：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、製品番号Ｓ９０１２。１％の酢酸を用いて０．４％（ｗ／ｖ）の使用液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に調製した。
【０２３６】
２．主要な計器機器
ＣＯ２細胞インキュベーター：Ｔｈｅｒｍｏ社、３１１型、３７１型。
【０２３７】
クリーンベンチ：ＤＬ−ＣＪ−２Ｎ型、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｄｏｎｇｌｉａｎ  Ｈａｒ  ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．。
【０２３８】
マイクロプレートリーダー：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、６８０型。
【０２３９】
９６ウェルプレートウォッシャー：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、１５７５型。
【０２４０】
３．試験方法
３．１  細胞培地処方（完全培地）は、一般的に、中国科学院細胞バックおよびＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）から提供された処方に基づき、基礎培地処方を結合し、添加物を調整した。
【０２４１】
３．２  細胞培養方法：完全培地、３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度で対数増殖期（付着細胞が通常完全に融合に近くなっている）まで細胞を培養し、細胞を収集し、後続試験（まず、付着細胞の付着を解消するためにトリプシン／ＥＤＴＡで消化し）を行った。
【０２４２】
３．３  一定量の細胞を９６ウェル細胞培養プレート（以下、単に９６ウェルプレートと称する）に接種し、異なる濃度の化合物を加え、一定時間（通常、３日間）共培養し、最後にＳＲＢ法でアッセイウェルにおける細胞タンパク質の全量を測定し、またはＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。
【０２４３】
３．３．１  細胞増殖曲線試験により細胞接種濃度を決めた。当該試験では、化合物の阻害試験過程を完全に模擬し、異なる濃度の細胞を９６ウェルプレートに接種し、適切な濃度は、化合物の干渉がない場合、試験期間にわたって対数増殖を維持する最大（または最大に近い）接種可能な濃度であるべきである。
【０２４４】
３．３．２  ＳＲＢ法による全細胞タンパク質の測定：ウェルにおける培地を吸い出し、１０％のトリクロロ酢酸を加えて細胞を１時間以上固定し、トリクロロ酢酸を除去し、Ｈ２Ｏで洗浄し、０．４％のＳＲＢを加え１５〜３０分間着色し、余剰のＳＲＢを除去し、１％の酢酸で洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）水溶液１００μＬを加え、タンパク質と結合されたＳＲＢを溶解させ、５７０ｎｍ波長で検出した。
【０２４５】
３．３．３  ＭＴＴ法による細胞生存率の測定：培地を吸い出し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ含有基礎培地（通常、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および他の添加物を含まない培地を指し）を１００μＬ／ウェルで加え、３時間培養し続け、ＭＴＴ含有基礎培地を吸い出し、ＤＭＳＯを１００μＬ／ウェルで加え、ホルマザンを溶解させ、４９０ｎｍ波長で検出した。
【０２４６】
３．３．４  ＳＲＢとＭＴＴとの２つの方法の選択：ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１実験、頭頸部癌細胞系Ｆａｄｕ実験、およびヒト膵臓癌細胞系ＡｓＰＣ−１実験はＭＴＴ法を用いたが、ヒト非肺小細胞癌細胞系ＨＣＣ８２７実験はＳＲＢ法を用いた。
【０２４７】
３．４  希釈および化合物の添加：ＤＭＳＯ耐性試験により、細胞のＤＭＳＯに対する耐性のあるＤＭＳＯ濃度を決定し、これによって化合物の希釈および添加方法を選択した。ＤＭＳＯ耐性試験により、異なる濃度のＤＭＳＯが細胞増殖への影響を測定した。耐性の定義は、細胞増殖に及ぼす影響が２０％を超えないことである。最終的に決定された２種類の方法は、下記の通りである。
【０２４８】
方法１：被験化合物１〜２ｍｇを秤量し、ＤＭＳＯで２ｍＭの原液に溶解させ、基礎培地で２０μＭに希釈し（または、試験の必要に応じて調整し）、且つ３倍段階希釈し、希釈過程においてＤＭＳＯ濃度を１％のままに維持し、８つの濃度群を得、アッセイウェルに完全培地８０μＬおよび１０倍濃度の化合物使用液２０μＬを加え、最終的に、各ウェルの容量が２００μＬで、ＤＭＳＯ濃度が０．１％である。関連する細胞系は、ＨＣＣ８２７がある。  
【０２４９】
方法２：被験化合物１〜２ｍｇを秤量し、ＤＭＳＯで２０ｍＭの原液に溶解させる。試験の必要に応じて初期濃度を調整し、さらにＤＭＳＯで３倍段階希釈し、合計８つの濃度である化合物溶液を得、各アッセイウェルに完全培地９９μＬおよび化合物溶液１μＬを加え、最終的に、各ウェルの体積が２００μＬで、ＤＭＳＯ濃度が０．５％である。関連する細胞系は、Ａ４３１、Ｆａｄｕ、ＡｓＰＣ−１がある。
【０２５０】
３．５  化合物阻害活性の計算：試験には、化合物試験群と、化合物を含まない陽性溶媒対照群（ＰＣ）と、細胞および化合物を含まない陰性溶媒対照群（ＮＣ）とを含み、阻害率＝［１−（試験値−ＮＣ平均値）／（ＰＣ平均値−ＮＣ平均値］）×１００％。重複のアッセイウェルにより、阻害率平均値およびＳＤを求め、化合物濃度を横軸とし、且つ対数分布し、阻害率平均値を縦軸としてプロットし、Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ４パラメータ方程式で曲線をフィッティングし、曲線における５０％阻害率に対応した化合物濃度はＩＣ５０値である。
【０２５１】
【表２６】
0006342001.tif 000038
【０２５２】
４．試験の結果
４．１  ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１に対する阻害効果
【０２５３】
【表２７】
0006342001.tif 000039
【０２５４】
４．２  ヒト非肺小細胞癌細胞系ＨＣＣ８２７に対する阻害効果
【０２５５】
【表２８】
0006342001.tif 000040
【０２５６】
４．３  ヒト頭頸部癌細胞系Ｆａｄｕに対する阻害効果
【０２５７】
【表２９】
0006342001.tif 000041
【０２５８】
４．４  ヒト膵臓癌細胞系ＡｓＰＣ−１に対する阻害効果
【０２５９】
【表３０】
0006342001.tif 000042
【０２６０】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、またはその薬学的に許容される塩は、選択性の高いチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤であり、特にＥＧＦＲに対する高い阻害活性を持っている。
【０２６１】
生物学的実施例６
Ａ４３１ヒト由来の表皮癌変異体移植モデルに対する薬力学的活性評価
１．試験方法
細胞培養：
１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータにおいて、腫瘍細胞を培養した。対数増殖期にある腫瘍細胞を収集し、細胞を適切な密度に調整し、ヌードマウスに０．２ｍL／匹で皮下注射し、腫瘍を形成した後、ヌードマウスの体内に３回以上継代した後、変異体移植モデルの確立に用いて始めることができる。  
【０２６２】
腫瘍の接種、および群分け：
前記担癌マウスを頚椎脱臼により犠牲死させ、無菌条件下で腫瘍塊を摘出し、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ程度の小さな断片に切断し、トラカールでヌードマウスに皮下接種した。担癌ヌードマウスの腫瘍体積が約１５０±５０ｍｍ３まで増殖した場合、実験動物を８匹／群で溶媒対照群、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および８０ｍｇ／ｋｇ投与量群、並びに陽性対照薬Ｔａｒｃｅｖａ  ５０ｍｇ／ｋｇ投与量群という５群にランダムに分けた。各群には、いずれも胃内投与であり、１日１回連続して１４日間投与し、群分けの当日は第０日とした。
【０２６３】
２．実験終点およびデータ処理
腫瘍体積の計算式は、体積＝０．５×長径×短径２である。測定した結果により、相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ：ＲＴＶ）を算出し、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、式中、Ｖ０は群分けで投与した時（ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは毎回測定した時の腫瘍体積である。相対腫瘍体積により相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃを算出し、Ｔは治療群の相対腫瘍体積の平均値で、Ｃは溶媒対照群の相対腫瘍体積の平均値である。計算式は、次の通り、
Ｔ／Ｃ＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（式中、ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：溶媒対照群ＲＴＶ）。腫瘍阻害率（％）＝（溶媒対照群腫瘍平均重量ー治療群平均腫瘍重量）／溶媒対照群平均腫瘍重量×１００％。体重変化率＝Ｗｎ／Ｗ０×１００％（式中、Ｗｎ：第ｎ日に各群の実験動物の平均体重、Ｗ０：第０日に各群の実験動物の平均体重）。
【０２６４】
３．統計学的解析
ＳＰＳＳ１３．０のアプリケーションによりＯｎｅ−Ｗａｙ  Ａｎｏｖａテストを実施し、群間の統計学的解析を行う。
【０２６５】
４．実験の結果
【０２６６】
【表３１】
0006342001.tif 000043
【０２６７】
【表３２】
0006342001.tif 000044
【０２６８】
５．実験の結論
化合物３の３つの投与量群は、いずれも、腫瘍増殖を抑制することができ、Ｔ／Ｃがそれぞれ３０．６％、３７．７％、および１９．１％であり、比較的良好な用量−効果関係を示し、陽性対照群のＴ／Ｃが４７．３％である。
【０２６９】
化合物３の３つの投与量群は、Ａ４３１ヒト由来の表皮癌変異体移植モデルに対する腫瘍阻害率が、それぞれ６８．６％、７３．２％、８５．６％であり、比較的良好な用量−効果関係を示し、陽性対照群腫瘍の阻害率が４７．３％である。
【０２７０】
化合物３の３つの投与量群は、実験動物の体重がいずれも著しく低下しなく、かつ実験動物に対する観察により、明らかな異常が認められず、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩の各投与量が実験動物に対して顕著な毒性を発生することができないことを示唆した。Ｔａｒｃｅｖａ投与量は、ＭＴＤである。
【０２７１】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩は、良好な抗腫瘍活性を持ち、治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）がより広く、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０２７２】
生物学的実施例７
ＦａＤｕヒト由来の頭頸部癌変異体移植モデルに対する薬力学的活性の評価
１．試験方法
細胞培養：
１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータにおいて、腫瘍細胞を培養した。対数増殖期にある腫瘍細胞を収集し、細胞を適切な密度に調整し、ヌードマウスに０．２ｍL／匹で皮下注射し、腫瘍を形成した後、ヌードマウスの体内に３回以上継代した後、変異体移植モデルの確立に用いて始めることができる。  
【０２７３】
腫瘍の接種、および群分け：
前記担癌マウスを頚椎脱臼により犠牲死させ、無菌条件下で腫瘍塊を摘出し、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ程度の小さな断片に切断し、トラカールでヌードマウスの右肩に皮下接種した。担癌ヌードマウスの腫瘍体積が約１２０±５０ｍｍ３まで増殖した場合、実験動物を８匹／群で溶媒対照群、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および８０ｍｇ／ｋｇ投与量群、並びに陽性対照薬Ｔａｒｃｅｖａ  ５０ｍｇ／ｋｇ投与量群という５群にランダムに分けた。各群には、いずれも胃内投与であり、１日１回連続して１４日間投与し、群分けの当日は第０日とした。
【０２７４】
２．実験終点およびデータ処理
腫瘍体積の計算式は、体積＝０．５×長径×短径２である。測定した結果により、相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ：ＲＴＶ）を算出し、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、式中、Ｖ０は群分けで投与した時（ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは毎回測定した時の腫瘍体積である。相対腫瘍体積により相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃを算出し、Ｔは治療群の相対腫瘍体積の平均値で、Ｃは溶媒対照群の相対腫瘍体積の平均値である。計算式は、次の通り、
Ｔ／Ｃ＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（式中、ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：溶媒対照群ＲＴＶ）。腫瘍阻害率（％）＝（溶媒対照群腫瘍平均重量ー治療群平均腫瘍重量）／溶媒対照群平均腫瘍重量×１００％。体重変化率＝Ｗｎ／Ｗ０×１００％（式中、Ｗｎ：第ｎ日に各群の実験動物の平均体重、Ｗ０：第０日に各群の実験動物の平均体重）。
【０２７５】
３．統計学的解析
ＳＰＳＳ１３．０のアプリケーションによりＯｎｅ−Ｗａｙ  Ａｎｏｖａテストを実施し、群間の統計学的解析を行う。
【０２７６】
４．実験の結果
【０２７７】
【表３３】
0006342001.tif 000045
【０２７８】
【表３４】
0006342001.tif 000046
【０２７９】
５．実験の結論
化合物３の各投与量群のＴ／Ｃは、それぞれ６１．４％、５４．７％、および３１．６％であり、各投与量群は、ＦａＤｕヒト由来の頭頸部癌変異体移植モデルに対していずれも比較的良好な阻害活性を持った。
【０２８０】
化合物３の各投与量群の腫瘍阻害率は、それぞれ３７．５％、５２．４％、および７６．２％であり、化合物３の各投与量群は、ＦａＤｕヒト由来の頭頸部癌変異体移植モデルに対していずれも比較的良好な阻害活性を持った。
【０２８１】
化合物３の各投与量群の実験動物の体重は、いずれも著しく低下しなく、かつ実験動物に対する観察により、明らかな異常が認められず、化合物３の各投与量群が実験動物に対して顕著な毒性を発生することができないことを示唆した。Ｔａｒｃｅｖａ投与量は、ＭＴＤである。
【０２８２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩は、良好な抗腫瘍活性を持ち、治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）がより広く、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０２８３】
生物学的実施例８
ＨＣＣ８２７ヒト由来の非肺小細胞癌変異体移植モデルに対する薬力学的評価
１．試験方法
細胞培養：
１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータにおいて、腫瘍細胞を培養した。対数増殖期にある腫瘍細胞を収集し、細胞を適切な密度に調整し、ヌードマウスに０．２ｍL／匹で皮下注射し、腫瘍を形成した後、ヌードマウスの体内に３回以上継代した後、変異体移植モデルの確立に用いて始めることができる。  
【０２８４】
腫瘍の接種、および群分け：
前記担癌マウスを頚椎脱臼により犠牲死させ、無菌条件下で腫瘍塊を摘出し、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ程度の小さな断片に切断し、トラカールでヌードマウスの右肩に皮下接種した。担癌ヌードマウスの腫瘍体積が約１５０±５０ｍｍ３まで増殖した場合、実験動物を８匹／群で溶媒対照群、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および８０ｍｇ／ｋｇ投与量群、並びに陽性対照薬Ｔａｒｃｅｖａ  ５０ｍｇ／ｋｇ投与量群という５群にランダムに分けた。各群には、いずれも胃内投与であり、１日１回連続して１４日間投与し、群分けの当日は第０日とした。
【０２８５】
２．実験終点およびデータ処理
腫瘍体積の計算式は、体積＝０．５×長径×短径２である。測定した結果により、相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ：ＲＴＶ）を算出し、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、式中、Ｖ０は群分けで投与した時（ｄ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは毎回測定した時の腫瘍体積である。相対腫瘍体積により相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃを算出し、Ｔは治療群の相対腫瘍体積の平均値で、Ｃは溶媒対照群の相対腫瘍体積の平均値である。計算式は、次の通り、
Ｔ／Ｃ＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（式中、ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：溶媒対照群ＲＴＶ）。腫瘍阻害率（％）＝（溶媒対照群腫瘍平均重量ー治療群平均腫瘍重量）／溶媒対照群平均腫瘍重量×１００％。体重変化率＝Ｗｎ／Ｗ０×１００％（式中、Ｗｎ：第ｎ日に各群の実験動物の平均体重、Ｗ０：第０日に各群の実験動物の平均体重）。
【０２８６】
３．統計学的解析
ＳＰＳＳ１３．０のアプリケーションによりＯｎｅ−Ｗａｙ  Ａｎｏｖａテストを実施し、群間の統計学的解析を行う。
【０２８７】
４．実験の結果
【０２８８】
【表３５】
0006342001.tif 000047
【０２８９】
【表３６】
0006342001.tif 000048
【０２９０】
５．実験の結論
化合物３の３つの投与量群のＴ／Ｃは、それぞれ５．０％、１．８％、および１．８％であり、比較的良好な用量−効果関係を示し、陽性対照群のＴ／Ｃが５．０％である。
【０２９１】
化合物３の３つの投与量群の腫瘍阻害率は、それぞれ９１．７％、９５．２％、および９７．４％である。  
【０２９２】
化合物３の各投与量群の実験動物の体重は、いずれも著しく低下しなく、かつ実験動物に対する観察により、明らかな異常が認められず、化合物３の各投与量群のいずれも、実験動物に対して顕著な毒性を発生することができないことを示唆した。Ｔａｒｃｅｖａ投与量は、ＭＴＤである。
【０２９３】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩は、良好な抗腫瘍活性を持ち、治療域がより広く、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０２９４】
生物学的実施例９
ネズミチフス菌に対する変異原性試験
１．材料および方法
化合物１：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド
化合物３：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩
直接変異原１：Ｄｅｘｏｎ（ＤＩＭＡ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＩＮＣ、ロット番号：４５６−２Ｄ）
直接変換剤２：アジ化ナトリウム、ＳＡ（ＡＭＲＥＳＣＯ  Ｉｎｃ．、ロット番号：０５８０ｃ５０９）
間接変異原：２−アミノアントラセン、２−ＡＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ  ＩＮＣ．、ロット番号：ＳＴＢＢ１９０１Ｖ）
菌株：ヒスチジン栄養要求性のネズミチフス菌変異株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１０２（中国医学科学院実験動物研究所、液体窒素で凍結保存される）。
【０２９５】
溶媒１：ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ（北京化工廠（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗｏｒｋｓ）、ロット番号：２０１１１２０９）
溶媒２：注射用滅菌水（天津薬業焦作有限公司、ロット番号：１１０８０１４２）
【０２９６】
２．菌株遺伝的特性の同定
菌株に対して、既に、自然復帰変異率の測定、ヒスチジン要求性試験、クリスタルバイオレット感度性試験、紫外線損傷による欠失変異の除去修復の同定試験、アンピシリン耐性試験、テトラサイクリン耐性試験を含む遺伝的特性を同定したところ、合格した。
【０２９７】
３．菌株の増菌培養
液体窒素で凍結保存された細菌菌液を、３７℃水浴で溶解した後、１００μＬを取って２０ｍＬの栄養ブイヨンに接種し、３７℃、遮光で１６時間静置培養した後、取り出して本変異原性試験に用いた。
【０２９８】
４．実験方法
【０２９９】
【表３７】
0006342001.tif 000049
【０３００】
４．２  試験試料の調製
化合物１を秤量し、終濃度が１５ｍｇ／ｍＬになるように一定量のＤＭＳＯに溶解させた。前記溶液を０．２２μｍのろ過膜でろ過し、ろ過時に最初のろ液１．０ｍＬを捨てた。最後、このようにろ過した試験試料（１５ｍｇ／ｍＬ）を濃度５、１．５、０．５、および０．１５ｍｇ／ｍＬの溶液にＤＭＳＯで段階希釈した。
【０３０１】
化合物３を秤量し、終濃度が１５ｍｇ／ｍＬになるように一定量の注射用滅菌水に溶解させた。前記溶液を０．２２μｍのろ過膜でろ過し、ろ過時に最初のろ液１．０ｍＬを捨てた。最後、このようにろ過した試験試料（１５ｍｇ／ｍＬ）を濃度５、１．５、０．５、および０．１５ｍｇ／ｍＬの溶液に注射用滅菌水で段階希釈した。
【０３０２】
４．３  試験試料の濃度分析
ろ過前に、１５ｍｇ／ｍＬの試験試料から、体積０．５ｍＬのサンプル２部を残した。試験試料を調製した後、ろ過した各濃度の試験試料から、体積０．５ｍＬでサンプル２部を残し、室温で保存し、ＨＰＬＣ法で濃度の精度を分析した。
【０３０３】
ＨＰＬＣ検出方法：オクタデシルシラン結合シリカゲルを充填剤（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）とし、０．３％の酢酸水溶液（ｖ／ｖ、アンモニア水でｐＨを８．１０±０．０５に調節し）−メタノール−アセトニトリル（１：７）＝４８：５２％（ｖ／ｖ）を移動相とし、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２５４ｎｍ、運転時間：３０分間で行った。
【０３０４】
４．４  試験試料調製溶液の保存および処分
試験試料を調製した後、投与する前に室温で保存した。投与して残った試験試料溶液を、投与終了後医療廃棄物として処理した。
【０３０５】
４．５  陽性対照薬の調製
Ｄｅｘｏｎ：適量のＤｅｘｏｎを秤量し、注射用滅菌水で溶解し、濃度２５０μｇ／ｍＬの溶液を得、０．２２μｍの除菌ろ過膜でろ過してから使用した。
【０３０６】
アジ化ナトリウム：適量のアジ化ナトリウムを秤量し、注射用滅菌水で溶解し、濃度６０μｇ／ｍＬの溶液を得、０．２２μｍの除菌ろ過膜でろ過してから使用した。
【０３０７】
２−アミノアントラセン：適量の２−アミノアントラセンを秤量し、ＤＭＳＯに溶解し、濃度３０μｇ／ｍＬの溶液が得られ、０．２２μｍの除菌ろ過膜を用いてろ過して使用した。
【０３０８】
４．６  Ｓ９混合液の製作および調製
本試験に用いられたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット肝臓Ｓ９のフラクション成分は、製造日が２０１２年５月１８日であり、ロット番号が２０１２０５１８である。液体窒素に保存され、タンパク質濃度が２０．４７７ｍｇ／ｍＬで、有効期限が２０１４年５月１７日までである。無菌試験および生物学的活性試験のいずれも試験要求を満たした。Ｓ９混合液は、下記表の組成比によって無菌条件下で調製された。
【０３０９】
使用する前に、Ｓ９混合液は無菌条件下で調製される。作業者は、本試験の必要に応じて調製の体積を決定した。他の溶媒は、本センターの標準操作手順に従って調製された。Ｓ９混合液の調製は、次の表を参照する。
【０３１０】
【表３８】
0006342001.tif 000050
【０３１１】
４．６  試験の操作
最上層培地を加熱熔融した後、４５℃で水浴を用いてバランスさせて用意した。
【０３１２】
対応した数量の１０ｍＬのガラス試験管を取って、順次に、試料または対照用薬液０．１ｍＬ、Ｓ９混合液またはｐＨ７．４のＰＢＳ  ０．５ｍＬ、最上層の培地（約０．０５ｍＭのヒスチジン、約０．０５ｍＭのビオチン、約０．６％の寒天、約０．５％のＮａＣｌを含み）２．０ｍＬを加え、最後に、細菌培養液０．１ｍＬを添加し、速やかにボルテックスシェイカーでよく混合して、下層培地の表面に注入し、軽く回転し、最上層培地を基礎培地の表面に均一に敷いた。
【０３１３】
プレートを平らな台の表面に置き、培地が凝固したら、プレートをフェイスダウンし、３７℃で４８時間培養した（特に、ＴＡ１０２菌株を７２時間培養した）。プレートを取り出し、各プレートに復帰変異コロニー数を目測でカウントした。サンプル添加時、および培養終了後、いずれも試験試料の沈殿現象を観察した。各群別は、それぞれ、活性化および非活性化の条件下で３つのプレートずつを作った。
【０３１４】
５．結果の判断
結果は、各プレートにおける復帰変異コロニー数として示され、各群の平均復帰変異コロニー数、および標準偏差を算出した。結果は、下記１つまたは２つの基準を満たした場合、陽性として判定されることができる。結果について判定する場合、まず試験結果の生物学的な意味を考え、同時に統計学的検定結果を参照した。
【０３１５】
１）少なくとも１つの菌株に、代謝活性化の有無の条件下で、復帰変異コロニー数が剤量依存性的に増加された。
【０３１６】
２）代謝活性化の有無の条件下で、１つ以上の投与量群の復帰変異コロニー数が著しく増加され、且つ繰り返すことができた。
【０３１７】
下記基準にしたがって、試験試料が菌株に対して抗菌毒性があるか否かを判断した。
【０３１８】
１）背景細菌叢が薄くなり、同時に復帰変異コロニー数が減少したことに伴った可能性がある。
【０３１９】
２）背景細菌叢が欠如し、即ち、細菌の増殖が完全に阻害された。
【０３２０】
３）針先状の非復帰変異の微細なコロニーを現した（通常、背景細菌叢の欠如に伴った）。
【０３２１】
６．データの処理方法
統計的解析は、両側検定を用い、統計的有意性水準がＰ≦０．０５を設定した。復帰変異コロニー数については、その平均数および標準偏差を統計した。
【０３２２】
データは、下記の過程で分析され、まず、Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ  Ｔｅｓｔでデータの均一（均質）性検定を行い、データが均一である（Ｐ＞０．０５）場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を行い、分散分析が有意である（Ｐ≦０．０５）場合、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定を行う。Ｌｅｖｅｎｅ’ｓＴｅｓｔの結果が有意である（Ｐ≦０．０５）場合、Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定を行う。Ｋｒｕｓｋａｌ−ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック検定の結果が用意である（Ｐ≦０．０５）場合、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を使用してさらに一対比較を行う。
【０３２３】
７．結果
７．１  試験試料の分析結果
化合物１の試験：分析の結果により分かるように、ろ過前の最高濃度、およびろ過後の各濃度の試験試料は、理論的濃度の１０１．７７％〜１０４．３１％の間にあり、且つ、ろ過膜は、９０％〜１１０％の許容可能な範囲内において、溶液濃度への大きく影響が認められなかった。
【０３２４】
化合物３の試験：分析の結果により分かるように、ろ過前の最高濃度、およびろ過後の各濃度の試験試料の精度は、理論的濃度９９．３９％〜１０２．８９％の間にあり、且つ、ろ過膜は、９０％〜１１０％の許容可能な範囲内において、溶液濃度への大きく影響が認められなかった。
【０３２５】
７．２  背景細菌叢およびコロニー形態の観察
代謝活性化（Ｓ９を添加し）条件下で、ＴＡ９７菌株は、１５００μｇ／プレートの用量下で抗菌毒性があり、背景細菌叢が針先のような微細なコロニーを現し、復帰変異コロニー数が顕著な低減される（Ｐ≦０．０５）ことが示された。
【０３２６】
代謝活性化または非代謝活性化（Ｓ９を添加しない）条件下で、ＴＡ１０２菌株は、１５００および５００μｇ／プレートの条件下で抗菌毒性があり、復帰変異コロニー数が顕著な低減される（Ｐ≦０．０５）ことが示された。
【０３２７】
その他の菌株は、各投与量の代謝活性化または非代謝活性化条件下で、いずれも顕著な抗菌毒性が認められなかった。
【０３２８】
７．３  沈殿現象の観察
各菌株は、非代謝活性化条件下の１５０〜１５００μｇ／プレートの投与量範囲内で、代謝活性化条件下の５００および１５００μｇ／プレート投与量である場合、体系内に試料溶液を加えた後、白濁を現し、最上層培地を添加した後、５００および１５００μｇ／プレートの投与量でも依然として混濁していた。これにより、これらの投与量での培養体系中に沈殿を析出し、その他の群に沈殿現象がなかったことが示された。培養終了時に、各投与量群は、いずれも沈殿現象がなかった。
【０３２９】
７．４  コロニー数
試験結果により、溶媒対照群が、代謝活性化または非代謝活性化の条件下で、各菌株の自然復帰変異コロニー数がいずれも本実験室の正常範囲内にあることが示された。Ｄｅｘｏｎおよびアジ化ナトリウムの陽性対照群の非代謝活性化条件下での、および、２−アミノアントラセン陽性対照群の代謝活性化条件下での復帰変異コロニー数は、いずれも有意に増加し（Ｐ≦０．０５）、明らかに溶媒対照群の復帰変異コロニー数の２倍以上を超え、所望の陽性結果が示された。
【０３３０】
ＴＡ１０２菌株の投与量１５〜１５０μｇ／プレートの間、ＴＡ９７菌株の投与量１５〜５００μｇ／プレートの間、および残りの菌株の投与量１５〜１５００μｇ／プレートの間には、いずれも試験試料に関連した復帰変異コロニー数の向上がなかった。各菌株は、相応の投与量範囲内における若干の微細であるが統計学的に有意差がある（Ｐ≦０．０５）復帰変異コロニー数の変化は、正常な範囲内にある正常な変動であると考えられる。試験結果により、試験試料が、それぞれ、投与量が１５０μｇ／プレート以下、５００μｇ／プレート以下、および１５００μｇ／プレート以下である場合、対応のＴＡ１０２菌株、ＴＡ９７菌株、および残りの菌株に対して変異原性がないことが示された。
【０３３１】
８．結論
本試験条件下で、化合物１、化合物３は、投与量が１５０μｇ／プレート以下である場合、ＴＡ１０２菌株に対して変異原性がなく、投与量が５００μｇ／プレート以下である場合、ＴＡ９７菌株に対して変異原性がなく、投与量が１５００μｇ／プレート以下である場合、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１５３５菌株に対して変異原性がなかった。化合物１、化合物３は、非抗菌毒性の投与量である場合、全ての菌株に対して変異原性がなかった。
【０３３２】
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド、およびＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−６−イル］−２−［１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イリデン］アセトアミド二メタンスルホン酸塩は、Ａｍｅｓ毒性がなく、臨床用薬のより好ましい選択である。
【０３３３】
前記により理解できるように、例示的な説明のために本発明の具体的な実施形態を説明したが、本発明の要旨および範囲を逸脱しない条件下で、当業者にとって様々な変更または改良を行うことができる。これらの変更または修正は、いずれも本願に添付の特許請求の範囲に入るものとされる。