(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素含有化合物を分析するための方法における使用のためのニンヒドリン試薬であって、
ニンヒドリンと、
４．５〜５．５の間の値にｐＨを維持する水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、該第２の温度が該第１の温度より高く、該第１の温度が０℃〜３０℃であり、該第２の温度が少なくとも１００℃である、温度依存性還元剤と
を含み、
該試薬がヒドリンダンチンを実質的に含まない、
ニンヒドリン試薬。
【請求項２】
前記第１の温度が５℃〜２５℃である、請求項１に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３】
前記第１の温度が１０℃〜２０℃である、請求項２に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項４】
前記温度依存性還元剤が、３カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項１〜３のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項５】
前記温度依存性還元剤が、６カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項４に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項６】
前記温度依存性還元剤が、１２カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項５に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項７】
前記温度依存性還元剤が、２４カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、請求項６に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項８】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の糖を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項９】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単糖を含む、請求項８に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１０】
前記温度依存性還元剤が、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、またはこれらの混合物を含む、請求項９に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１１】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の二糖を含む、請求項８から１０のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１２】
前記温度依存性還元剤が、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、キシロビオースまたはこれらの混合物を含む、請求項１１に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１３】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のより長鎖の多糖を含む、請求項８から１２のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１４】
前記温度依存性還元剤が、スタキオース、デキストリン、マルトデキストリン、またはこれらの混合物を含む、請求項１３に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１５】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のカルボン酸および／またはその塩を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１６】
前記温度依存性還元剤が、カルボン酸のＩ族またはＩＩ族の金属塩を含む、請求項１５に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１７】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単官能性カルボン酸またはその塩を含む、請求項１５または１６に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１８】
前記カルボン酸がギ酸またはその塩である、請求項１７に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項１９】
前記温度依存性還元剤が、少なくとも１種の追加の還元基を含む１種または複数のカルボン酸を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２０】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のアルデヒド基および／またはケトン基を有する１種または複数の化合物を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２１】
前記温度依存性還元剤がアセトンを含む、請求項２０に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２２】
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の無機化合物を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２３】
前記温度依存性還元剤が、低い酸化状態の硫黄の無機化合物または低い酸化状態のリン酸素酸を含む、請求項２２に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２４】
前記温度依存性還元剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩および／または次亜リン酸塩を含む、請求項２３に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２５】
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項１〜２４のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２６】
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項２５に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２７】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が０．５〜３％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項２６に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２８】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が１〜２．５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項２７に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項２９】
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が約２％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、請求項２８に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３０】
前記緩衝液が水性緩衝液である、請求項１〜２９のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３１】
前記緩衝液が弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種を含む、請求項３０に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３２】
前記緩衝液が有機酸を含む、請求項３１に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３３】
前記緩衝液が酢酸、エタン酸またはプロパン酸を含む、請求項３２に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３４】
前記緩衝液が約５．２の値にｐＨを維持する、請求項１〜３３のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３５】
１種または複数の有機溶媒をさらに含む、請求項１〜３４のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３６】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、メチルセロソルブおよびメタノールから選択される、請求項３５に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３７】
有機溶媒の濃度が１０％〜７５％ｖ／ｖである、請求項３５または３６のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３８】
有機溶媒の濃度が２５％〜６５％ｖ／ｖである、請求項３７に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項３９】
有機溶媒の濃度が、３５％〜５５％ｖ／ｖである、請求項３８に記載のニンヒドリン試薬。
【請求項４０】
窒素含有化合物を分析するための方法における、請求項１〜３９のいずれかに記載のニンヒドリン試薬の使用。
【請求項４１】
前記窒素含有化合物がアミノ酸である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
窒素含有化合物を分析する方法であって、
ｉ）請求項１から３９のいずれかに記載のニンヒドリン試薬を提供するステップと、
ｉｉ）該ニンヒドリン試薬を少なくとも前記第２の温度に加熱することによって、ヒドリンダンチン含有混合物を形成するステップと、
ｉｉＩ）該ヒドリンダンチン含有混合物を該窒素含有化合物と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項４３】
前記窒素含有化合物がアミノ酸である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｉｉｉ）の生成物の色を分析するステップをさらに含む、請求項４２または４３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアミノ酸などの窒素含有化合物を分析するための新規の試薬、およびこれを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質形成の元となる成分であり、ひいては多くの生物学的過程において主要な役割を果たしている。ある場合には、個体内にある特定のアミノ酸が存在することまたは存在しないことによって、個体の健康に著しく影響を及ぼす可能性がある。例えば、遺伝性の代謝障害であるフェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｅａ）に罹患した個体は、フェニルアラニンを代謝することができず、このフェニルアラニンの蓄積は個体の脳の発達に深刻な影響を及ぼす。したがって、遊離アミノ酸を検出するため、またはタンパク質のアミノ酸組成を決定するための方法は疾患の適切な診断および管理のために極めて重要である。同様に、このような方法は、市販の薬物、食品および食材の分析、ならびにタンパク質および酵素の研究および開発のために重要である。より一般的には、窒素含有化合物の検出および同定は、農業科学、生化学、臨床学、環境学、食品科学、法医学、組織化学、微生物学、医学、栄養学、植物科学およびタンパク質科学を含めた広範囲な研究分野の全域にわたり用途を見出している。
【０００３】
現在では、遊離アミノ酸または加水分解により放出されたアミノ酸はアミノ酸自動分析計を使用して通常検出している。１９５０年代には、最初の自動化されたアミノ酸分析法は、Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎ（Ｓｐａｃｋｍａｎ  ＤＨ、Ｓｔｅｉｎ  ＷＨ、およびＭｏｏｒｅ  Ｓ．  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９５８年、３０巻：１１９０〜１２０６頁）により開発された。この多段階法は、イオン交換液体クロマトグラフィーでアミノ酸を分離することを含む。ニンヒドリン試薬を試薬リザーバーからポンプで送り込み、イオン交換カラムからの溶離液と混合し、スチールまたはプラスチック反応コイルに通し、反応のために必要とされる温度まで加熱する。ニンヒドリンは、すべてのアミノ酸および関連するアミン化合物と反応して、濃い色の反応生成物を形成する。ルーエマンパープルが第一級アミンおよび第一級アミノ酸により形成され、５７０ｎｍの波長の光の吸光度により測定することができる。他の有色の反応生成物、特に黄色の反応生成物が、第二級アミンおよびいくつかの第二級アミノ酸により形成される。これらの反応生成物は、４４０ｎｍの波長の光のその吸光度により測定することができる。有色の反応生成物は、アミノ酸濃度により強度が異なる。
【０００４】
色素複合体により吸収された光が適切な波長、特に５７０ｎｍおよび４４０ｎｍにおいて検出される光度計にアミノ酸反応生成物を通す。異なるアミノ酸の存在はクロマトグラフィーにより決定することができる。各アミノ酸の識別情報は、その移動の特徴、したがってクロマトグラム上のその位置に基づき確立される。アミノ酸の濃度は、特定された波長での吸光度として光度計において検出される有色生成物の強度により決定する。したがって、本方法を使用して、どのアミノ酸が試験試料中に存在するか、ならびにそれぞれの相対濃度を定性的および定量的に決定することができる。
【０００５】
ニンヒドリンとアミノ酸またはアミンとの間の発色反応は、室温では極めて遅い。高温ではかなり速いが、それでも、１３０℃以上の温度でさえ何分もかかる。良好なクロマトグラフィー性能を維持するために、発色反応は、およそ１分間以下の時間枠内で行なう必要がある。これを達成するためには、ニンヒドリン試薬が有効となるように、および許容される反応速度が得られるように、ニンヒドリンの還元型形態であるヒドリンダンチンが必要なことが判明した。高温で有色の生成物の形成をスピードアップするヒドリンダンチンの能力を説明するためのいくつかの理由またはメカニズムが示唆されてきた。１つの示唆は、ヒドリンダンチンが反応中間体のうちの１種に対して安定剤として作用することである。よってヒドリンダンチンは、触媒ではなく促進剤とみなされる。
【０００６】
「ニンヒドリン試薬」という用語は、アミノ酸分析器での使用のために必要な構成成分のすべてを含有する１つまたは複数の溶液を指す。したがって、ニンヒドリン試薬は、ヒドリンダンチン、ニンヒドリンならびに必要な緩衝液および溶媒を含む。ニンヒドリン試薬は、ニンヒドリン溶液に、ヒドリンダンチンの別の溶液を添加することによって形成することができる。アミノ酸分析に必要な構成成分のすべてを含む１つの溶液を提供することが好ましいが、結果として、ニンヒドリン試薬は受け入れ難いほど短い貯蔵寿命を有することになる。代わりに、ヒドリンダンチンは、ニンヒドリン溶液に還元剤を添加し、これによって、ニンヒドリンの一部分をヒドリンダンチン還元することで、インサイチュで生成することができる。ヒドリンダンチンのインサイチュでの形成は、強い還元剤の存在下、幾分瞬時に生じる。しかしこれらの両方法では、ユーザーがニンヒドリンの別の溶液を、ヒドリンダンチンまたは適切な還元剤の別の溶液と混合して始めて、アミノ酸分析への使用のためのニンヒドリン試薬が準備されることになる。
【０００７】
最近では、２本のビンを提供することが製造業者にとって好ましい慣習となっており、一方は有機溶媒中のヒドリンダンチン溶液を含み、他方はニンヒドリン溶液、水性緩衝液および追加の有機溶媒を含み、両方のビンとも不活性ガス雰囲気下でしっかりと密封されている。次いで、アミノ酸分析器を使用する少し前または直前にビンの内容物を混合して、ニンヒドリン試薬を形成する。
【０００８】
残念なことに、ヒドリンダンチンは取扱いが極めて困難な試薬である。ヒドリンダンチンは、空気の存在下では特に不安定であり、酸素はヒドリンダンチンを急速に酸化させてニンヒドリンに戻す。ヒドリンダンチンを著しく消耗させるために、比較的少量の空気しか必要とせず、したがって色生成の感度を実質的に減少させる。空気が試薬からしっかりと排除されていない場合、ヒドリンダンチン濃度は、クロマトグラフィー分析の時間枠内で発色反応が起こらなくなるまで、ゆっくりと低下する。
【０００９】
したがって、ほんの微量の酸素の曝露でもヒドリンダンチン活性の確実な損失を引き起こすことになるので、ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬の周囲空気への曝露は絶対最小値に保持しなければならない。普通窒素である不活性雰囲気を、ニンヒドリン試薬の調製において、およびそれの使用中の両方に使用することができる。理解され得るように、このような必要条件により、その使用前および／または使用中、ヒドリンダンチン活性を許容できない速度で劣化させないことを確実にするためには、複雑な装置および取扱い手順が結果として必要となる。これらの予防手段が使用されているにもかかわらず、ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬は通常１カ月以下の貯蔵寿命しかない。
【００１０】
加えて、ヒドリンダンチンは、完全な水性媒体には不溶性である。しかし、ヒドリンダンチンはいくつかの有機溶媒には可溶性である。したがって、有機溶媒は一般的に比較的高い割合で試薬に加えることによって、貯蔵中および使用中のヒドリンダンチンの沈殿の可能性を減少させる。実際に、有機溶媒は、７５体積％まで高い含有量が通常使用される。溶媒はまた、ヒドリンダンチンの十分な溶解を確実にするため２種以上の異なる種類の溶媒の組合せを含んでもよい。この目的のために使用される有機溶媒として、通常、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルセロソルブ、エチレングリコールおよびスルホランが挙げられる。しかしそれでも、不十分な有機溶媒が使用されるか、またはヒドリンダンチン濃度が高すぎる場合には、沈殿が静置状態で生じるか、または、クロマトグラフィー機器内に蓄積することもあり、管類を遮断する。
【００１１】
ヒドリンダンチン（ｈｙｒｄｒｉｎｄａｎｔｉｎ）の使用に関連する上述の問題を考慮して、典型的なニンヒドリン試薬を使用するアミノ酸分析のための代替の技法および装置が提案されてきた。例えば、ＵＳ３，６３２，４９６は、一方の端に試薬受け入れ用の入口を含み、他方の端に活性化した試薬の放出用の出口を含むチャネルを有する、細長い筺体から形成される試薬生成器を開示している。チャネルは、ニンヒドリンを還元して活性化した試薬を形成するための、触媒として活性のある金属材料の表面により画定されている。このようにニンヒドリンは、その安定した状態で１つのベシクル内に貯蔵し、活性化させることができる。
【００１２】
ＵＳ４，３５９，３２３は、アミンのための液体クロマトグラフ分析システムに関する。このシステムは、クロマトグラフィーカラム、反応カラムおよび再利用のための移動相を再循環させるループからなる。このシステムの主要なおよび最も重大な特色は、液体移動相が、溶離液と、アミンと反応して測光法で検出可能な化合物を生じる物質との組合せで構成されていることである。したがって、この方法は、全部の作業のためにたった１つのポンプしか必要としない。ポンプシステムの複雑さは低下したものの、混合物中のヒドリンダンチンの存在は、現在市販の試薬のものと同様の不安定さおよび空気感度の問題を依然としてもたらす。
【００１３】
上記に加えて、いくつかの還元剤が、アミノ酸分析に必要な試薬における使用に対するこれらの適性について評価されてきた。ニンヒドリンのための還元剤は、試薬溶液に極めて可溶性であり、ニンヒドリンに対して優れた還元特性を有し、有色の副生成物を形成せず、装置に対して化学作用を起こさず、安定しており、取扱いが容易なことが好ましい。しかし、以下にさらに詳細に考察されているように、現存する還元剤はこれらの特徴のすべてを示さず、したがって１種または複数の面でアミノ酸分析の感度および精度をかなりの程度まで妨害する。
【００１４】
ニンヒドリン試薬を継続して開発している間、インサイチュでヒドリンダンチンを生成する強い還元剤の使用に多くの注目が集まった。Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎによる元の方法は、還元剤として塩化第１スズを利用した。しかし、適度に速い反応に対して十分なヒドリンダンチンを生成するのに必要とされる塩化第１スズの量は、水酸化スズ化合物の最終的な沈殿を引き起こし、ひいてはこれが流管をふさぎ、遮断した。したがって、塩化第１スズの使用はすぐに破棄され、シアン化物、チタン塩、ボロハイドライドおよびアスコルビン酸などの他の還元剤が調査された。シアン化物は、毒性の問題のために商業的に使用することができず、必要な安定性を欠いていた。さらに本格的な研究が水素化ホウ素ナトリウムおよびアスコルビン酸還元剤について行われた。
【００１５】
例えば、ＵＳ３，７７８，２３０は、液体クロマトグラフィーによるアミノ酸自動分析に使用するための発色液であって、アスコルビン酸が還元剤として使用されている発色液を開示している。記載されている方法では、メチルセロソルブの存在下でアスコルビン酸をニンヒドリンと反応させることによって、ヒドリンダンチンを形成する。アスコルビン酸は、高い溶解性、強力な還元特性および着色感度など、いくつかの利点を有することが判明した。加えて、アスコルビン酸は、塩化第１スズなどの従来の還元剤と比較して、劣化後容易に再生される。
【００１６】
これらの利点があるにもかかわらず、ＵＳ３，７７８，２３０において開示された、還元剤としてアスコルビン酸を含むニンヒドリン試薬は酸化の影響を受けやすい。ニンヒドリン試薬は通常、周囲温度で、不活性な容器内で最初に調製しなければならない。その結果、ヒドリンダンチンの酸化リスクを最小限に抑えるために、入念なおよび時間のかかる手順が必要となる。加えて、この方法では、分離したアミノ酸がニンヒドリン試薬に導入される間、加熱した反応コイルに到達する前までにかなりの時間が経過し、したがってクロマトグラムにおいて記録された結果がゆがめられる。加えて、この間に、ニンヒドリン試薬は、分析装置内に拡散した酸素に曝露され得る。実際にＵＳ３，７７８，２３０は、アスコルビン酸を含むニンヒドリン試薬の劣化特徴は、塩化第１スズを含むＭｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎのものと同じにすぎなかったことを認めている（すなわち１５日間）。空気酸化による劣化後の着色能力の回復は、アスコルビン酸の再添加を必要とする。塩化第１スズの溶解性が低いことから、従来のＭｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎ法を使用した類似の手法は可能ではなかった。
【００１７】
おそらくアスコルビン酸を還元剤として使用することに対する最も注目すべき不都合の１つは、単独で加熱した際に、茶色の色の分解物質を形成することが公知であることである。ＵＳ３，７７８，２３０は、アスコルビン酸をニンヒドリンと反応させた還元生成物は、茶色の色ではないことを示唆している。しかし、アスコルビン酸を還元剤として使用すると、アスコルビン酸の熱分解の結果、有色の副生成物の形成が生じ、これによって、クロマトグラムによって記録された結果の精度に悪影響を及ぼすリスクが高い。
【００１８】
さらなる例において、ＵＳ４，２７４，８３３は、還元剤（水素化ホウ素ナトリウムまたは塩化第１スズ）またはヒドリンダンチンそれ自体、ならびにスルホラン水の混和性有機溶媒を含むニンヒドリン試薬を開示している。可溶化剤としてのスルホランの利用は、多くの利点を有することが示唆されている。特に、スルホランは、ヒドリンダンチンおよびニンヒドリンを極めてよく可溶化し、溶液成分のいずれとも反応しない。したがって、この試薬は、フローラインの目詰まりをもたらすことが公知である沈殿を起こさずに、長い期間の間安定している。ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬の寿命は、少なくとも３カ月であると主張されている。しかし、ＵＳ３，７７８，２３０の場合のように、ニンヒドリン試薬は通常、周囲温度において不活性な容器内で最初に調製しなければならない。上で論じたように、これは、ヒドリンダンチンの酸化のリスクを最小限に抑えるために入念なおよび時間のかかる手順を必要とする。
【００１９】
Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎが、ヒドリンダンチンを必要とするニンヒドリンベースの分析を発見してからこの６０年間でわずかな変化しか起こらなかった。むしろ、この方法は、依然として現在最も一般的に使用されている技法である。その後、この方法は、異なる還元剤および／または溶媒を使用することによって修正されてきたが、上記で強調されたように、酸化の影響を受けやすいことおよび水溶液中での溶解性が低いことが依然として欠点として挙げられる。
【００２０】
代替の還元剤を発見することに関してかなりの研究が行われてきたが、製造業者は一般的にヒドリンダンチンおよびニンヒドリンの別の溶液を提供することに逆戻りしている。通常、製造業者は２本のビンを提供し、第１のビンは、有機溶媒中にヒドリンダンチン溶液を含み、第２のビンは、ニンヒドリン溶液、水性緩衝液および追加の有機溶媒を含む。両方のビンは、不活性ガス雰囲気下でしっかりと密封されている。次いで、アミノ酸分析器において使用する前に、これらのビンを混合してニンヒドリン試薬を形成する。
【００２１】
大部分の製造業者は、混合前は約１２カ月、混合後は２〜３カ月の最大貯蔵寿命を主張している。しかし、混合した試薬の寿命は、一度分析機器に取り付けるとさらに低くなり、有意に１カ月未満となり得る。
【００２２】
Ｈｉｔａｃｈｉは、ヒドリンダンチンを生成するための還元剤、特に水素化ホウ素ナトリウムを提供する唯一のメジャーな製造業者であるようだ。水素化ホウ素ナトリウムは、取扱いが容易ではなく、特に安定した還元剤でもない。妥当な安定性は、非水性溶媒中に保持した場合のみに達成される。還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを使用する主な利点は、望ましくない有色の生成物または沈殿物が生成されないことである。製造中に２本のビンは依然として必要だが、組成および混合手段は、上に記載されている方法とはむしろ異なる。一方のビンは、水素化ホウ素ナトリウム、ニンヒドリンおよび非水性溶媒を含有する。他方のビンは、水性緩衝液および追加の非水性の溶媒を含有する。ボロハイドライドは、水性試薬と混合するまでニンヒドリンと反応しないことが想定できる。
【００２３】
Ｍｏｏｒｅ、ＳｔｅｉｎおよびＳｐａｃｋｍａｎの方法とは異なり、水素化ホウ素ナトリウムおよびニンヒドリンは、分析器の加熱した反応チャンバーの前に、ラインで一緒に混合する。したがって、Ｈｉｔａｃｈｉ試薬は、標準的な１カ月ではなく、密封された試薬容器の開封から最大１２カ月の間まで使用することができると断言されている。しかし、ボロハイドライドは依然として完全に安定ではなく、微量の金属の存在がその劣化を促進させることが公知である。その結果、１年が終わるまでにかなりの量のボロハイドライドが通常喪失される。しかし、使用時には、ヒドリンダンチンはラインで生成され、追加のポンプシステムまたはラインが水素化ホウ素ナトリウムを分析装置に導入するために必要となる。これは、システムの複雑さおよび費用を増加させ、Ｈｉｔａｃｈｉ試薬は、これらにこのような追加のポンプシステムおよび供給ラインを取り付けない限り、すべての機器上で使用可能でないこともある。さらに、ヒドリンダンチンは、使用時に、加熱した反応チャンバー内で溶出したアミノ酸に接触させる前に、ニンヒドリンから形成される。
ＧＢ１３４９９４１は、特定のアリールアルキルアルデヒドを、ニンヒドリンと組み合わせて利用することによって、高い蛍光を示す複合体が得られる第一級アミノ基の蛍光分析アッセイのための初期の方法に関する。
さらに最近では、工業用の循環水中の従属栄養性細菌を検出するための方法がＣＮ  １０２６１８６２１Ａにおいて記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第３，６３２，４９６号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３５９，３２３号明細書
【特許文献３】米国特許第３，７７８，２３０号明細書
【特許文献４】米国特許第４，２７４，８３３号明細書
【特許文献５】英国特許第１３４９９４１号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｓｐａｃｋｍａｎ  ＤＨ、Ｓｔｅｉｎ  ＷＨ、およびＭｏｏｒｅ  Ｓ．  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９５８年、３０巻：１１９０〜１２０６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
酸化の影響を受けにくく、したがって使用前および使用中の取扱いがさらに簡単であり、より長い貯蔵寿命が得られる、改善されたニンヒドリン試薬に対する必要性が依然として存在することは明白である。
【００２７】
したがって、最初の態様では、本発明は、窒素含有化合物を可視化するための方法における使用のためのニンヒドリン試薬であって、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、この第２の温度が第１の温度より高い、温度依存性還元剤とを含む、ニンヒドリン試薬を提供する。
【００２８】
上述のように、本発明は、これに限定されないが、アミノ酸を含む窒素含有化合物を可視化するためのニンヒドリン試薬を提供する。ニンヒドリン試薬は、以下にさらに詳細に考察されているような、特定のセットの特性を有する温度依存性還元剤を含む。この結果、公知のおよび／または市販のニンヒドリン試薬とは異なり、本発明のニンヒドリン試薬の成分は、別々に貯蔵することも、使用直前にプレミックスすることも必要なく、したがって１本のビンで貯蔵し、ユーザーに提供することができる。これを考慮すると、本発明のニンヒドリン試薬の使用は、現在市販されているものよりも、複雑ではなく、高価ではない。
【００２９】
本発明のニンヒドリン試薬は、ヒドリンダンチンを含む必要がなく、ヒドリンダンチンを実質的に含まないことが好ましい。これは、本発明の試薬の有利な態様である。
【００３０】
試薬の成分は、第１の、より低い温度で安定しており、この温度で、これらの成分を輸送および貯蔵することができる。ニンヒドリン試薬の成分が第２の温度に加熱され、この温度で還元剤が、ニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において活性となり、このときにヒドリンダンチンが形成される。したがって、ニンヒドリン試薬は、アミノ酸分析装置の使用前および使用中の両方において簡単に取り扱われ、制御される。実際に、本発明のニンヒドリン試薬は、空気の存在下でかなりの期間の間、極めて簡単におよび効率的に貯蔵および使用することができる。本発明のニンヒドリン試薬は、２年を優に超える貯蔵寿命を有し得ることが判明している。
【００３１】
上記を考慮して、本発明のニンヒドリン試薬は、アミノ酸分析器機器を使用して、アミノ酸分析以外の用途のために使用することができる。その安定性の増加により、このニンヒドリン試薬は、一般的に可視化剤として使用することができるが、ただし、試験試料は、１種または複数の有機の窒素含有化合物を含むものとする。市販のニンヒドリン試薬は、イオン交換分離法を使用して、アミノ酸分析器上でアミノ酸を検出すること以外の目的に使用することができるが、その一方で上述の特徴を有する改善されたニンヒドリン試薬は、窒素含有有機化合物を検出するための広範囲な他の分析法にさらに容易に適用することができる。
【００３２】
本発明の試薬の使用は、十分に確立されたアミノ酸およびニンヒドリン反応に基づく。したがって、有色の反応生成物には、公知の方式で測光を施すことができる。特に、最も一般的な２つの波長、５７０ｎｍおよび４４０ｎｍにおいて得られる相対的吸光度感度は、本発明を使用した場合、市販の試薬を使用してアミノ酸分析器において現在達成されているものと同様である。多くの用途に対して、第一級および第二級アミノ酸を決定するために、１つのモニタリング波長だけが必要となり得る。
【００３３】
上述のように、本発明の試薬は、温度依存性還元剤を含む。第１の温度でのニンヒドリンの還元において不活性な一連の温度依存性還元剤は、第１の温度より高い第２の温度でニンヒドリンを還元してヒドリンダンチンを形成することが可能であることが判明した。
【００３４】
したがって、市販のニンヒドリン試薬とは異なり、本発明の温度依存性還元剤は、酸素の存在下、第１の温度で極めて安定している。したがって、使用前の試薬の劣化を回避するための入念なおよび時間のかかる手順を必要としない。さらに、ニンヒドリンからのヒドリンダンチンの形成および形成速度は、温度を変化させることによって制御することができる。このように、ヒドリンダンチンは、必要なときにだけ生成され、使用中のニンヒドリン試薬の寿命は増加し、費用が削減される。
【００３５】
化合物は、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対して適切であるが、ただし、この還元剤は、第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、この第２の温度は第１の温度より高いものとする。この点において、「不活性」という用語は、第１の温度でのニンヒドリンの還元に関して使用される場合、最大活性以下の活性を有する化合物を指す。同様に、「活性のある」という用語は、第２の温度でのニンヒドリンの還元に関して使用される場合、以下にさらに詳細に考察されているように、最小活性以上の活性を有する化合物を指す。
【００３６】
ニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤の形成において使用するための化合物は、公知の還元剤の速度と同等の速度でニンヒドリンを還元することが可能な還元活性を有し得る。しかし、ニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤は、あまり活性がなく、商業的に利用されている還元剤の速度より遅い速度でニンヒドリンを還元することが好ましい。これは、還元反応の制御がさらに容易であるという利点を有する。
【００３７】
ある特定の化合物が第２の温度でニンヒドリンの還元において十分な活性を有するかどうか評価するために、第１のプロトコルが考案された。その詳細を実施例１において提供する。プロトコル１の必要条件を満たす化合物は、高温または第２の温度でのニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において少なくとも最小活性を有するとみなされる。
【００３８】
プロトコル１の方法に従い、閾値温度（すなわち第２の温度）において、化合物が最小程度の活性を有する、すなわち、特定された期間で、所与の量のニンヒドリンを還元することができる場合、化合物はニンヒドリンの還元において十分に活性があるとみなされる。このプロトコルにおいて、閾値温度は１００℃である。
【００３９】
試験プロトコルに従い、ニンヒドリンおよびアミノ酸溶液を１００℃の閾値温度で選択された化合物の溶液と混合する。２０分後、（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの強度を、標準的な分光光度計を使用して、特定された波長５７０ｎｍでの溶液の吸収を測定することによって計算する。着色の強度が強いと、選択された化合物が閾値温度において高度の活性を有することを示している。より好ましくは、選択された化合物が本発明のニンヒドリン試薬の一部を形成するために必要とされる最小程度の活性を有するかどうか評価するという目的のためには、０．３の最小吸光度が必要とされる。第２の温度でのニンヒドリンの還元における化合物の最小活性は、上述の試験において少なくとも０．３の吸光度が得られる活性である。約０．３未満の吸光度は、化合物が、本発明のニンヒドリン試薬に使用するためのニンヒドリンの還元において、高温で十分に活性がないことを示す。より好ましくは、候補化合物により達成すべき最小吸光度は少なくとも０．４である。
【００４０】
上記に加えて、本発明のニンヒドリン試薬において温度依存性還元剤を形成するのに使用する化合物は、第１の温度でのニンヒドリンの還元において不活性でなければならない。
【００４１】
化合物が不活性である必要がある第１の温度は、第２の温度より低い。通常、第１の温度とは、アミノ酸分析器内での使用前または一般に窒素含有化合物を可視化するという目的のため、試薬が通常貯蔵され、および／または輸送される温度または温度の範囲である。現存するニンヒドリン試薬は通常室温以下で貯蔵される。したがって、第１の温度は好ましくは室温である。室温は通常外因により異なるので、第１の温度は好ましくは３０℃まで、さらにより好ましくは２５℃まで、さらにより好ましくは２０℃以下である。第１の温度は好ましくは０℃を超え、さらにより好ましくは５℃を超え、さらにより好ましくは１０℃を超える。一実施形態では、第１の温度は５℃〜２５℃である。さらにより好ましくは第１の温度は１０℃〜２０℃である。
【００４２】
第１の温度で不活性であると同定された化合物は、通常第１の温度では、いかなる有意な還元作用も有さないとみなされるが、第２の温度では十分に強い還元剤となり、ニンヒドリンと反応してヒドリンダンチンを形成する化合物を含む。加えて、第１の温度において不活性であると同定された温度依存性還元剤は、第１の温度では弱い還元活性（すなわち、上で定義された最大活性より低い活性）しか有さないことが公知であるが、第２の温度では十分に強い還元剤となり、ニンヒドリンと反応してヒドリンダンチンを形成する化合物を含む。
【００４３】
化合物が第１の温度で十分に不活性であるかどうか決定するために、第２のプロトコルが考案された。その詳細は実施例２において提供されている。プロトコル２は、実施例１に提供されているプロトコル１の前後に実施することができる。より好ましくは、プロトコル１の後に実施されるプロトコル２を使用して、選択された化合物が、閾値または第２の温度において、ニンヒドリンの還元のために必要とされる最小程度の活性を有することを確証する。
【００４４】
プロトコル２の方法に従い、選択された化合物を含むニンヒドリン試薬を調製し、空気の存在下、第１の温度で貯蔵する。設定された時間間隔で、試料をニンヒドリン試薬から採取し、アミノ酸溶液と混合し、第２の温度に加熱する。実施例１において提供されたプロトコル１に関する継続性という目的のため、第２の温度は、上で論じたように１００℃とする。（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの強度は、標準的分光光度計を使用して、溶液の吸収スペクトルを測定することによって計算する。連続する試料にわたり強度を測定すること、特に着色の強度のいかなる低減の速度も決定することは、選択された化合物の長期安定性が本発明のニンヒドリン試薬に使用される化合物に対して適切であるかどうかを示す。
【００４５】
プロトコル２に従い、修正された吸光度が１カ月後に５０％未満に低下した場合、選択された化合物は第１の温度で十分に安定しておらず、したがって本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して適切ではないとみなされる。すなわち、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤の形成における使用に対して適切な化合物は、１カ月後にこれらの初期活性の少なくとも５０％の活性を有する。より好ましくは、選択された化合物は、修正された吸光度が３カ月後に５０％以上である場合、さらにより好ましくは修正された吸光度が６カ月後に５０％以上である場合、本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して適切であるとみなされる。特に好ましい化合物とは、プロトコル２において修正された吸光度が１２カ月後に少なくとも５０％、さらにより好ましくは、修正された吸光度が２４カ月後に初期の吸光度の少なくとも５０％であるような化合物である。
【００４６】
上記に設定した特性を有し、実施例１のプロトコル１の必要条件を満たすことができ、実施例２のプロトコル２の必要条件を満たすまたは超える化合物が、ニンヒドリン試薬における使用に対して最も有利であることが判明した。上述のように、実施例１と２の両方に提供された方法を使用して、一連の化合物は、第１の温度で十分に安定しており、その一方で本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して第２の温度で必要とされる最小程度の活性も有することが判明した。これらの化合物は、第２の温度におけるこれらの活性の程度により異なり得るが、これらはすべて、本発明のニンヒドリン試薬における使用に対して必要とされる最小程度の活性を有する。
【００４７】
示されている通り、実施例１のプロトコル１および実施例２のプロトコル２を使用して、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対するこれらの適性について、一連の化合物をスクリーニングした。ニンヒドリン試薬は単一の温度依存性還元剤を含んでもよい。代わりに、試薬は、２種以上の温度依存性還元剤の組合せを含んでもよい。
【００４８】
本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対して適切な化合物は、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００４９】
一実施形態では、温度依存性還元剤は１種または複数の糖を含む。糖は、単糖、二糖および多糖に便利に分類することができる。
【００５０】
多くの糖は、軽度の還元特性を有し、時には還元糖と呼ばれる。還元糖は、その開環形態でアルデヒド基またはケトン基を生成する、その環状形態でヘミアセタール基またはヘミケタール基を含有するものとして定義することができる。すべての単糖および多くの二糖は還元糖である。
【００５１】
好ましい単糖として、グルコースおよびフルクトースが挙げられ、これらは、これらの環状形態において、ヘミアセタール基およびヘミケタール基をそれぞれ有する。グルコースおよびフルクトースは、上述のプロトコル１およびプロトコル２に曝された場合、両方とも第２の、閾値温度で十分な還元活性を有するが、その一方で空気の存在下、第１の温度で安定したままであることが判明した。
【００５２】
フルクトースは、室温で約３年の貯蔵寿命を有することが判明した。グルコースは、第２の温度でのニンヒドリンの還元においてあまり反応性はないが、室温で４年より長い貯蔵寿命を有し、フルクトースよりもさらに安定していることが判明した。したがって、より長い貯蔵寿命が必要とされる場合、本発明のニンヒドリン試薬は好ましくはグルコースを含む。
【００５３】
本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用のための他の単糖として、グリセルアルデヒドおよびガラクトースなどの化合物が挙げられ、これらは両方ともアルドースである。本発明の温度依存性還元剤を形成することが可能なことが判明した単糖の非網羅的リストには、アルドース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよびケトースジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトースおよびセドヘプツロース（Ｓｅｄｏｈｅｐｔａｌｏｓｅ）が挙げられる。アルドースはその直鎖の形態でアルデヒド基を有する単糖であり、ケトースはその直鎖の形態でケトン基を有する単糖である。
【００５４】
一般的に、いくつかの二糖および多糖は、試験プロトコルおよびバッチ安定性試験で定義されているような適切な温度依存性還元剤を形成するのに必要とされる特性を有さない。二糖については、これらは還元糖または非還元糖であることができる。例えばスクロースは非還元二糖であり、プロトコル１および２に従い評価した場合、ニンヒドリンからヒドリンダンチンへの還元において十分な活性がないことが判明した。しかし、これらの環状形態でヘミアセタール基またはヘミケタール基を含むかなりの数の二糖および多糖が存在する。これらの種類の糖は、プロトコル１および２で定義されているような温度依存性還元剤として作用することが可能である。二糖であるラクトースおよびマルトースは、このような２つの例である。
【００５５】
本発明の温度依存性還元剤を形成することが可能であることが判明した二糖の非網羅的リストには、トレハロース（Ｔｒｉｈａｌｏｓｅ）、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノースおよびキシロビオースが挙げられる。
【００５６】
より長鎖の多糖は、有効な温度依存性還元剤となり得る。テトラサッカロース、すなわちスタキオースは、このような一例である。かなり長鎖の多糖、例えば、デンプンは適切ではないが、その一方で部分的に加水分解したデンプン、例えば、デキストリンおよびマルトデキストリンは、有効な温度依存性還元剤となり得る。長鎖の多糖は適切な温度依存性還元剤となり得るが、その一方で、これらはより粘性の溶液を生じ、沈殿の可能性を増加させ得るので好ましくないことを理解されたい。
【００５７】
温度依存性還元剤はまた、１種もしくは複数のカルボン酸および／またはこれらの塩を含み得る。一般的に、単一のカルボン酸基だけで、他の官能基を含まない単純な単官能性カルボン酸は、プロトコル１および２により温度依存性還元剤として作用することが不可能なことが判明した。このような単官能性カルボン酸として、酢酸、プロピオン酸、および安息香酸が挙げられる。しかし、ギ酸およびその塩は、プロトコル１および２により温度依存性還元剤として作用することが可能であると判明した。
【００５８】
温度依存性還元剤における使用に対して適切なカルボン酸の塩として、金属塩、特にＩ族およびＩＩ族の金属塩、例えばカリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。ギ酸のナトリウム塩であるギ酸ナトリウム、は、プロトコル１およびプロトコル２にそれぞれ従い、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する十分な活性があり、第１の温度でニンヒドリンの還元において十分に不活性であることが判明した。特に、ギ酸ナトリウムは、グルコースとフルクトースとの間の還元活性を有することが判明した。さらに、貯蔵寿命は、４年を超える貯蔵寿命を有するグルコースの貯蔵寿命と同様であった。
【００５９】
本発明による温度依存性還元剤としての使用に対して適切な他のカルボン酸および／またはこれらの塩は、少なくとも１種の追加の還元基、例えば、ヒドロキシケトン基またはアルデヒド基のうちの１種または複数を含むものである。カルボン酸の適切な塩として、金属塩、例えば、周期表のＩ族またはＩＩ族の金属の塩が挙げられる。適切な塩の例として、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。
【００６０】
好ましいカルボン酸は、１〜２４個の炭素原子、より好ましくは１〜１８個の炭素原子、さらにより好ましくは１〜１２個を有し、Ｃ１〜Ｃ６アルデヒドおよびケトンがとりわけ好ましい。化合物は、直鎖、分枝または環状であってよい。
【００６１】
さらに、ヒドロキシル基（単純なアルデヒドおよびケトン自体を含む）の存在を有する、または有さない１種または複数のアルデヒド基およびケトン基を含む化合物は、プロトコル１および２の必要条件を満たすことが判明している。この種類の好ましい化合物は、１〜２４個の炭素原子、より好ましくは１〜１８個の炭素原子、さらにより好ましくは１〜１２個を有し、Ｃ１〜Ｃ６アルデヒドおよびケトンがとりわけ好ましい。化合物は直鎖、分枝または環状であってよい。適切なアルデヒドおよびケトンの例としてアセトンが挙げられる。
【００６２】
温度依存性還元剤はまた１種または複数の無機化合物を含んでもよいが、ただし、これらもまたプロトコル１および２の必要条件を満たすものとする。特に、低い酸化状態の硫黄を含む無機化合物、例えば、亜硫酸塩およびチオ硫酸塩、ならびに／または低い酸化状態のリン酸素酸を含む無機化合物、例えば、亜リン酸塩および次亜リン酸塩が特に適切となり得る。例えば、その亜リン酸塩、例えばリチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩、を含む亜リン酸は、フルクトースとギ酸ナトリウムの間の活性を有し、プロトコル１および２の両方をパスすることが判明した。
【００６３】
本発明のニンヒドリン試薬における使用のための温度依存性還元剤は一般的に当技術分野で公知であり、市販されているかまたは公知の合成経路と類似の方式で調製することができるかのいずれかである。
【００６４】
上記に同定されていない他の化合物または他のクラスの化合物は、本発明のニンヒドリン試薬の温度依存性還元剤としての使用に対して適切な成分となり得るが、ただし、実施例１のプロトコル１と実施例２のプロトコル２の両方の必要条件を満たすものとすることを理解されたい。一般的に、プロトコル１およびプロトコル２の必要条件を満たすことに加えて、温度依存性還元剤は、水に容易に可溶性または混和性であるべきであり、試薬の他の成分および／または分析方法において使用されたまたは生成された成分と合わせた場合に、沈殿を引き起こすべきではない。温度依存性還元剤が実質的に無毒性であることもまた有利である。
【００６５】
上記を考慮して、ニンヒドリン試薬は、任意の適切な濃度で温度依存性還元剤を含むことができる。これは、利用する温度依存性還元剤により、特に第２の温度における活性の程度などの要因により異なる。温度依存性還元剤の濃度は０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖであってよい。より好ましくは、温度依存性還元剤の濃度は０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである。２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖより高い濃度では、試薬の成分が溶液から沈殿するまたは溶液から他の成分の沈殿を引き起こす可能性がさらに高くなり、したがって２０％未満の濃度が好ましいことが判明した。
【００６６】
分析法における使用のためのニンヒドリン試薬を調製する場合、温度依存性還元剤の開始濃度は、この濃度が少なくとも０．３の実際の吸光度、より好ましくは０．３〜０．７の吸光度の提供に関与するので、実施例１により提供されるプロトコル１で同定された濃度と同様であることが好ましい。より好ましくは、毎回温度依存性還元剤のパーセンテージ濃度を増加させて、実施例１に従い試験プロトコルを数回繰り返した結果、溶液からの沈殿を起こさず、またはニンヒドリン試薬の他の成分に悪影響を及ぼすことのない、０．６〜０．７の間の最も高い吸光度を提供する濃度を開始濃度として使用する。
【００６７】
本発明のニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンおよび水性緩衝液をさらに含む。ニンヒドリンおよび適切な水性緩衝液は両方とも市販されており、現存するニンヒドリン試薬に使用されている。
【００６８】
本発明のニンヒドリン試薬は、ニンヒドリンを任意の適切な量で含んでもよい。好ましくは、試薬中のニンヒドリンの濃度は０．５〜３％ｗ／ｖである。より好ましくは、ニンヒドリンの濃度は１〜２．５％ｗ／ｖである。さらにより好ましくは、および実施例１によるプロトコル１として、試薬中のニンヒドリンの濃度は約２％ｗ／ｖである。
【００６９】
任意の適切な水性緩衝液をニンヒドリン試薬において使用することができる。適切な緩衝液は当技術分野で公知である。酸性緩衝液が好ましい。より好ましくは、弱酸性緩衝液は、ｐＨを３〜７、より好ましくは４〜６、さらにより好ましくは４．５〜５．５の間の値に維持するようにすることが好ましい。ある特定の適切なｐＨは約５．２である。
【００７０】
緩衝液は、任意の弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種から調製されてもよい。酸は、有機酸または無機酸であってよい。有機酸が好ましく、その例として、酢酸、エタン酸およびプロパン酸が挙げられる。１つの好ましい組合せは酢酸とその塩の１種である。酸性塩は、任意の適切な塩であってよい。塩は、任意の金属カチオンから形成することもできる。しかし、塩は、アルカリ金属、特にリチウム、ナトリウムまたはカリウムのうちのいずれか１種から形成されるのが好ましい。
【００７１】
上述のように、ヒドリンダンチンは完全な水性媒体に不溶性である。これを考慮すると、ヒドリンダンチンを含む市販のニンヒドリン試薬は、相当量の有機溶媒の存在なしには製造または使用することができない。しかし、ニンヒドリン試薬が有機溶媒または有機溶媒の混合物を含む必要がないことが本発明の利点である。その結果、製造費用は減少し、試薬は環境に対する悪影響が少なく、廃棄処理手順は単純化される。
【００７２】
ニンヒドリン試薬中の有機溶媒の存在は試薬の効力に影響を及ぼす可能性がある。有機溶媒を含まない本発明のいくつかの実施形態の試薬の感度は、有機溶媒または有機溶媒の混合物を含む市販の試薬より約３０％低いことが判明した。加えて、有機溶媒の不在下では、生成したヒドリンダンチンが沈殿するリスクがより高くなり得る。
【００７３】
上記にもかかわらず、本発明の試薬は、有機溶媒を含まずに製剤化された場合、アミノ酸分析のために使用された場合に少なくとも許容される結果が得られる。加えて、プロトコル１および２による温度依存性還元剤の濃度の最適化によって、沈殿のリスクは最小限に抑えられる。
【００７４】
代替のおよび好ましい実施形態では、本発明のニンヒドリン試薬は、有機溶媒または有機溶媒の混合物をさらに含む。市販の試薬に通常使用されている有機溶媒として、単独または混合物のいずれかでの、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、ヒドロキシエーテル、例えば、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、およびメチルセロソルブ、ならびに単純アルコール、例えば、メタノールが挙げられる。有機溶媒の添加は、本発明のニンヒドリン試薬の感度を増加させる。これは、以下においてさらに詳細に考察されているように、クロマトグラフィーシステム上で好ましいニンヒドリン試薬を使用する場合に考慮に入れるべきである。
【００７５】
使用される有機溶媒の総濃度は、有機溶媒の性質により異なる。特に、使用される有機溶媒の総濃度は１０％ｖ／ｖから７５％ｖ／ｖまで異なる。より好ましくは、使用される有機溶媒の総濃度は、２５％ｖ／ｖから６５％ｖ／ｖまで異なる。さらにより好ましくは、使用される有機溶媒の総濃度は、３５％ｖ／ｖから５５％ｖ／ｖまで異なる。上記の市販の有機溶媒のいずれも使用することができるが、以下に示すクロマトグラフィー実施例に従い、本発明の方法は、好ましくは４０％ｖ／ｖから５５％ｖ／ｖまでのエチレングリコールを利用する。
【００７６】
本発明のニンヒドリン試薬は、窒素含有化合物の検出のための公知のならびに標準的な手順および方法に従い使用することができる。このような方法に使用されるニンヒドリン試薬は、本発明の第１の態様において上で定義された試薬である。したがって、ニンヒドリン試薬は、実施例１および２でそれぞれ提供されたプロトコル１およびプロトコル２に従い、第１の温度で不活性であり、ニンヒドリンを還元してヒドリンダンチンを形成する第２の閾値温度で活性がある温度依存性還元剤を含む。
【００７７】
以前に考察されたように、本発明のニンヒドリン試薬は、第１の温度で不活性であり、ニンヒドリンを還元してヒドリンダンチンを形成する第２の温度で活性があるものでなければならず、この場合第２の温度は第１の温度より高い。そのより高い安定性のため、本発明のニンヒドリン試薬は、広範囲な窒素含有化合物を同定および／または定量化するための可視化剤として使用することができる。
【００７８】
しかし好ましい実施形態では、本発明のニンヒドリン試薬は、特に公知のおよび標準的なアミノ酸分析器を使用した、アミノ酸分析のために使用される。
【００７９】
したがって、本発明は、第２の態様において、窒素含有化合物、特にアミノ酸などを分析するための方法におけるニンヒドリン試薬の使用であって、このニンヒドリン試薬が、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、この第２の閾値温度が第１の温度より高い、温度依存性還元剤とを含む使用を提供する。
【００８０】
ニンヒドリン試薬は、１種または複数の窒素含有化合物を分析する、例えば、同定および／または定量化するための方法において使用することができる。この方法は、一連の窒素含有化合物を分析するのに適切である。実際に、上述のように、この方法は、有機および無機の両方の窒素含有化合物を分析するために使用することができる。
【００８１】
ニンヒドリン試薬は、１種または複数の窒素含有化合物を分析する、例えば、同定および／または定量化するための方法において使用することができる。この方法は、一連の窒素含有化合物を分析するのに適切である。実際に、上述のように、この方法は、有機および無機の両方の窒素含有化合物を分析するために使用することができる。
【００８２】
本発明の方法は、アミノ酸、およびタンパク質、ペプチドなどのアミノ酸から形成される化合物を分析するのに特に適切である。以下の記載は、アミノ酸の分析について記載している。他の上述の窒素含有化合物を類似の方式で処理することができることを理解されたい。
【００８３】
窒素含有化合物は、任意の液体媒体または液体流に存在し得る。本発明の方法は、イオン交換液体クロマトグラフィー手順において１種または複数のアミノ酸を含有するイオン交換カラムの出口からの溶離液の分析に対して特に適切である。
【００８４】
本発明の方法は、従来のアミノ酸自動分析計を使用して行ってもよい。上述のように、自動の分析器は通常、アミノ酸をこれらのそれぞれの成分に分離するための手段と、インプットシステムであって、ニンヒドリン試薬を該システムに導入し、分離したアミノ酸およびニンヒドリン試薬を高温で反応させて有色の物質を形成するためのインプットシステムと、特定された波長での有色の物質の吸光度を記録するための手段とを含む。このように、試験試料内に存在するアミノ酸およびそれぞれの相対濃度を決定することができる。
【００８５】
アミノ酸は通常、サイズ、溶解性、電荷および／または結合親和性に基づいて識別する技法を使用して分離する。現在では、アミノ酸を分離するために使用される最も一般的な技法は、実効電荷に基づいて識別するもので、したがってイオン交換クロマトグラフィーとして公知である。本発明は、イオン交換クロマトグラフィーならびに他の形態のクロマトグラフィーによる分離技法（カラムクロマトグラフィーおよび平面クロマトグラフィー）、例えば、これらに限定されないが、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーならびに順相、逆相および吸着分解メカニズムが関与する高圧または低圧液体クロマトグラフィーと共同して効果的に使用することができる方法を提供する。加えて、本発明は、非クロマトグラフィー分離技法、例えば、カラム電気泳動と共同して使用することができる方法を提供する。さらに、試薬は、必ずしもクロマトグラフィー分離が関与しない技法、例えば、フィンガープリント可視化および管または容器における発色のために効果的に使用することができる。
【００８６】
一実施形態では、本発明は、樹脂充填イオン交換カラムにアミノ酸含有溶液を通して、アミノ酸試料を、カラムを下るそれぞれのアミノ酸成分の移動速度の差異により、それぞれのアミノ酸成分に分離することを含むイオン交換クロマトグラフィー手順の一部として適用される。溶出したアミノ酸は、次いで、本発明の方法に従い発色液と自由に反応する。
【００８７】
上で論じたように、発色液は、ニンヒドリンと、第１の温度で不活性であり、ニンヒドリンを還元してヒドリンダンチンを形成する第２の閾値温度で活性のある温度依存性還元剤と、酢酸バッファと、好ましくは有機溶媒とで構成される。
【００８８】
上に記載のようなニンヒドリン試薬は、標準的なアミノ酸分析器における使用に対して適切である。上で論じたように、現存するアミノ酸分析器は、単一の加熱した反応チャンバーを含む。このチャンバーは、分離カラム流出液がニンヒドリン試薬と混合された後でルーエマンパープルが生成される場所であるため、色形成チャンバーとしても公知である。
【００８９】
色形成チャンバーの温度および／または温度依存性還元剤の濃度は、生成したヒドリンダンチンの沈殿を回避するよう選択されるのが好ましい。色形成チャンバー内の温度は、利用される温度依存性還元剤およびこの温度依存性還元剤がより高い温度でニンヒドリンを還元することが可能な範囲に従い変化させることができる。しかし一般的には、色形成チャンバーの温度は、好ましくは５０℃〜１５０℃、より好ましくは８０℃〜１５０℃の範囲である。さらにより好ましくは、色形成チャンバーの温度は、１２０℃〜１４０℃である。さらにより好ましくは、色形成チャンバーの温度は１２５℃〜１３５℃である。
【００９０】
ニンヒドリン試薬および溶出したアミノ酸は、加熱した反応チャンバー内で加熱し、十分な期間の間、例えば１５秒〜５分間反応させておく。より好ましくは、ニンヒドリン試薬および溶出したアミノ酸は、加熱した反応チャンバー内で、３０秒〜２分間、より好ましくは約１分間の期間反応させておく。この反応チャンバー内で必要とされる着色を生成するために必要とされる時間が短いことが本発明のニンヒドリン試薬の利点である。
【００９１】
上で論じたように、本発明のニンヒドリン試薬の成分は、ヒドリンダンチンを生成するために加熱に供された場合のみ反応し、このヒドリンダンチンをアミノ酸と接触させることによって、測光分析のための有色の生成物を生成することができる。本発明の方法において、ニンヒドリン試薬の成分は、通常はコイルである、加熱した色形成反応チャンバー内で加熱される。ヒドリンダンチンは、色形成反応コイルの最初の箇所で極めて低濃度で形成され、試薬が継続して高温に曝露される間、ヒドリンダンチン濃度は時間と共に増加する。このようにして、本発明のニンヒドリン試薬は、これらの構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｐａｒｔｓ）または作業方法を修正する必要なく、市販の分析器で使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
ニンヒドリン試薬の成分は、本明細書で以下に記載されているように、いくつかの異なる方式で色形成反応チャンバーに導入することができる。
【００９３】
第１の実施形態では、ニンヒドリン、上に記載のような温度依存性還元剤、および緩衝液、ならびに必要に応じて１種または複数の有機溶媒を予め混合して均一溶液を形成する。この均一溶液は、本発明の第１の態様のニンヒドリン試薬である。本発明の方法におけるその使用の相当前から混合物を形成することができるので、これは好ましい実施形態である。
【００９４】
より好ましくは、混合物は、１種または複数のポンプにより１種または複数の容器またはリザーバーから引き出され、アミノ酸分析手順中の任意の好都合な時点で共通ゾーンに送達される。このゾーンは、イオン交換カラムの下流であるが、色形成反応チャンバーの上流に位置する。市販の分析器は通常ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬をこのように送達するので、この配置は１つの好ましい実施形態である。したがって、本発明のニンヒドリン試薬は、これらの構成要素またはこれらの作業方法を修正する必要なしに標準的なアミノ酸分析器で使用することができる。
【００９５】
さらにより好ましくは、ゾーンは、色形成反応チャンバー内に位置する。このようにすれば、ヒドリンダンチンは、色形成反応チャンバー内で加熱により直ちに形成される。
【００９６】
代替の実施形態では、ニンヒドリン試薬の成分は、加熱およびアミノ酸との接触の直前まで分離したまま保持される。例えば、ニンヒドリンおよび温度依存性還元剤は、単一もしくは別々の容器またはリザーバーから２種以上のポンプにより引き出され、共通ラインまたは混合ゾーンに送達され、そこでそれらは合わせられて混合物を形成することができる。本実施形態では、緩衝液および任意選択の１種または複数の有機溶媒は、単一もしくは別々の容器またはリザーバーからそれぞれ引き出されて、ニンヒドリンおよび室温で不活性な化合物の混合物と合わせることができる。
【００９７】
同様に、共通ラインまたは混合ゾーンは通常、イオン交換カラムの下流であるが、色形成反応チャンバーの上流に位置する。市販の分析器は通常ヒドリンダンチンを含むニンヒドリン試薬をこのように送達するので、この配置は好ましい。したがって、本発明のニンヒドリン試薬は、これらの構成要素またはこれらの作業方法を修正する必要なしに標準的なアミノ酸分析器で使用することができる。
【００９８】
さらにより好ましくは、ゾーンは、色形成反応チャンバー内に位置する。このようにすれば、ヒドリンダンチンは、色形成反応チャンバー内で加熱により直ちに形成される。
【００９９】
アミノ酸流は、成分または成分の混合物と、手順の中の任意の好都合な時点において接触させることができる。例えば、アミノ酸は、混合物の形成および加熱前に、ニンヒドリンまたは温度依存性還元剤のうちの１つと合わせることができる。代替として、アミノ酸は、加熱前に、ニンヒドリンと温度依存性還元剤の混合物と合わせることもできる。さらなる代替として、アミノ酸は、混合および加熱が生じ、ヒドリンダンチンが形成された後で試薬の成分と合わせることもできる。
【０１００】
上述のように、一連の温度依存性還元剤が、プロトコル１および２を使用して、第１の温度で不活性であり、第２の閾値温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンに還元する活性のあるものとして同定された。プロトコル１、プロトコル２および本発明の実施形態が、ここで、以下の実施例において記載される。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１）
プロトコル１
本発明のプロトコル１は以下のステップで構成される；
１）以下の溶液を調製する：
ｉ）２％ニンヒドリンｗ／ｖおよび選ばれた開始濃度（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の化合物Ｘを含有する、ｐＨ５．２の、１Ｍの酢酸リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム／酢酸の水性緩衝液。０．０１％ｗ／ｖまたはｖ／ｖから開始して、ステージごとに濃度を徐々に増加させることが好ましい。高濃度の水溶性の固体または液体、特に約５０％およびそれ超のものは、調製後または分析システムで使用する場合、溶解性の問題または他の有害作用により評価するのが困難なこともある。
ｉｉ）純水中、１．０ｍＭ濃度のグリシンの標準液。以前に考察されたように、グリシンは標準的な基準アミノ酸として選ばれている。
２）長さがおよそ１５ｃｍ、外部直径が１．５ｃｍあるガラス試験管に、上記溶液ｉ）２．０ｍｌ、標準グリシン溶液ｉｉ）０．２０ｍｌ、純水２．８ｍｌを添加する。
３）試験管を１００℃の液体加熱槽に配置し、２０分間静かに放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。
４）冷却した溶液を１ｃｍキュベットに移し、標準的な分光光度計または比色計を使用して、純水に対して５７０ｎｍで吸光度を測定する。
５）活性について化合物を評価するのと同時に、試薬中にアミノ酸またはアミン不純物が存在する場合に備えて、ブランク試料も実施するべきである。手順は、グリシン標準物質を除外し、純水の量を３．０ｍｌに増加させること以外は上記の２）における手順と同一である。次いで吸光度を上記４）の通りに５７０ｎｍで測定する。
６）評価中の化合物により生成された実際の吸光度（これより以下、修正された吸光度と呼ぶ）は、グリシンの標準吸光度からブランク試料の吸光度を差し引くことによって得られる。
【０１０２】
化合物Ｘの活性の程度は不明なので、上記プロトコルの方法は、毎回化合物Ｘの濃度を徐々に増加させて、数回繰り返すことが好ましい。化合物Ｘの濃度は、修正された吸光度が０．６〜０．７の間に入るまで増加させるものとする。グリシンを対照として使用した場合、可能な限りの修正された最大吸光度は０．７５〜０．８０の間であり、よって、０．６〜０．７の修正された吸光度が達成された場合、化合物の濃度をそれ以上増加させても、必ずしもこのプロトコル評価において利点は得られない。
【０１０３】
修正された吸光度が決して０．３０を超えない場合、これは、化合物Ｘが本発明のニンヒドリン試薬における使用のために必要とされる活性の程度を有していないことを示す。
【０１０４】
修正された吸光度は０．３０未満に入るが、化合物Ｘの濃度の増加が溶液からの沈殿を引き起こす場合、またはいくつかの他の有害作用を引き起こす場合、これは、化合物Ｘが本発明のニンヒドリン試薬における使用のために必要とされる特性を有していないことを示す。
（実施例２）
プロトコル２
【０１０５】
化合物Ｘが、高温で、上記実施例１で設定されたプロトコル１の必要条件を満たすのに十分な活性があることを前提として、以下の試験を使用して、室温でおよび空気の存在下で、化合物Ｘを含むニンヒドリン試薬の長期安定性を評価することができる。
【０１０６】
ニンヒドリン試薬は、実施例１のプロトコル１と同様の方式で調製し、空気の存在下、室温で貯蔵する。設定された時間の間隔で、ニンヒドリン試薬から試料を採取し、アミノ酸溶液と混合し、設定された時間の間１００℃に加熱する。（もしある場合）生成されたルーエマンパープルの量を吸光度値として測定する。連続する試料における着色（吸光度）の強度が低減する率は、化合物Ｘの長期安定性が、本発明のニンヒドリン試薬の一部を形成するのに適当であるかどうかを示している。
【０１０７】
他のアミノ酸およびアミン化合物の相対的感度はどの試薬が使用されたとしても同様であるため、プロトコル１の通り、グリシンを標準アミノ酸として使用する。
【０１０８】
本発明のプロトコル２は、以下のステップで構成される；
１）第１日目に以下の溶液を調製する：
ｉ）グリシンの１．０ｍＭの水中標準溶液。
ｉｉ）２％ニンヒドリンｗ／ｖおよび選ばれた濃度（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の化合物Ｘを含有する、ｐＨ５．２の１Ｍの酢酸リチウム、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム／酢酸の水性緩衝液を含むニンヒドリン試薬。化合物Ｘの濃度は、０．４〜０．７の間の修正された吸光度が達成された濃度としてプロトコル１において同定された濃度と同様であるのが好ましい。２５０ｍｌの体積の試薬であれば、安定性の試験の全期間持続させるのに十分なはずである。
２）第１日目に、標準の試験管に、ニンヒドリン試薬（ｉｉ）２．０ｍｌ、グリシン標準物質（ｉ）０．２０ｍｌおよび純水２．８ｍｌを逐次的に添加する。混合し、１００℃の液体加熱槽内に試験管を配置し、３５分間静かに放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。１ｃｍの経路長を有するフローセルを使用して、純水に対して５７０ｎｍで、分光光度計内で試験管溶液の吸光度を測定する。
３）第１日目に、試薬（ｉｉ）２．０ｍｌおよび純水３．０ｍｌを含むブランク試験管試料を調製する。これは、試薬を構成するために使用される成分中に存在し得る任意のアミノ酸またはアミンタイプの不純物を考慮に入れたものである。混合し、ブランク試験管を１００℃の加熱槽内に配置し、静かに２０分間放置する。試験管を取り出し、室温まで急速に冷却する。１ｃｍの経路長を有するフローセルを使用して、純水に対して５７０ｎｍで、分光光度計内で試験管溶液の吸光度を測定する。
４）第１日目に、化合物Ｘにより生成された、修正された吸光度を計算する。これは、実施例１のプロトコル１に記載されているように、グリシン試料吸光度からブランク試料の吸光度を差し引くことによって得られる。
５）第１日目に、ステップ１〜４が完了した後、暗所で、２０℃で、栓をしたビンの中で試薬を貯蔵し、空気に曝露する。これは、ビンの中に試薬とほぼ同一の体積の大きな空隙を残すことで達成される。
６）２〜４週間ごとに、試薬の試料を取り出し、ステップ２および３を繰り返す。毎回、ステップ４の通りに５７０ｎｍでの修正された吸光度を計算し、これを、第１日目に測定したものと比較する。
（実施例３）
クロマトグラフィー実施例
【０１０９】
異なる温度依存性還元剤を含むいくつかのニンヒドリン試薬の相対的な感度を、標準的アミノ酸分析器を使用して評価した。試験プロトコルおよびバッチ安定性試験の通り、グリシンを基準アミノ酸として使用した。
【０１１０】
上で論じたように、本発明のニンヒドリン試薬は、有機溶媒または有機溶媒の混合物を必要に応じて含んでもよい。したがって、比較目的のため、これらのニンヒドリン試薬の相対的な感度を有機溶媒の存在下および不在下の両方で評価した。上述のように、有機溶媒が使用された場合、総濃度は好ましくは、使用される有機溶媒の性質に従い３５％から５５％まで異なる。これらの実験において、温度依存性還元剤は、すべて４０％エチレングリコールの存在下で評価した。
【０１１１】
クロマトグラフィー実験は、これらの感度が最適化されるまで、温度依存性還元剤のそれぞれに関して数回行った。これは、温度依存性還元剤の濃度および／または反応温度を変化させることによって達成した。
【０１１２】
開始濃度は、上に記載のような試験プロトコルの条件を満たすことが判明した濃度であった。上述のように、色形成チャンバー内の開始温度は利用する温度依存性還元剤に従い異なり得るが、１２５℃〜１３５℃の領域内が好ましい。
【０１１３】
ここに示されているクロマトグラフィー実施例に対して、異なる試薬組成物に対する相対的な感度を、グリシンに対するピークの高さの点からｍＡＵの単位で比較する。したがって、保持時間およびピーク幅のクロマトグラフィーの条件（すなわち、半値幅）は、すべての分析に対して一定とする（以下のクロマトグラフィーの条件を参照されたい）。
以下の機器条件を使用した：
クロマトグラフィーモード−均一濃度
カラム流量−０．４５ｍｌ／分
ニンヒドリン試薬の流量−０．３０ｍｌ／分
加熱した反応チャンバーの温度−１２５〜１３５℃の間で可変
反応時間−６０秒
注入量−２０μｌ
注入したグリシンの量−２ナノモル
保持時間−５．０分
半値幅−０．２６分
感度スケール−ｍＡＵ（１ｍＡＵは吸光度０．００１と同等である）
（実施例３．１）
フルクトース
【０１１４】
温度依存性還元剤として０．２０％ｗ／ｖのフルクトースを含むニンヒドリン試薬の感度を、上記に特定した条件下で標準的アミノ酸分析器を使用して評価した。
【０１１５】
４０％エチレングリコールの存在下、反応温度１３１℃においてピーク高さを１１２ｍＡＵとして同定した。
【０１１６】
エチレングリコールの不在下で、０．２０％ｗ／ｖのフルクトースを含むニンヒドリン試薬から、反応温度１３２℃においてピーク高さ８８ｍＡＵを得た。
（実施例３．２）
ギ酸ナトリウム
【０１１７】
温度依存性還元剤として１％ｗ／ｖギ酸ナトリウムを含むニンヒドリン試薬の感度を、上記に特定された条件下で標準的アミノ酸分析器を使用して評価した。
【０１１８】
４０％エチレングリコールの存在下、１％ギ酸ナトリウムを含むニンヒドリン試薬から、反応温度１３３℃においてピーク高さ１２６ｍＡＵを得た。
【０１１９】
エチレングリコール不在下、１％ギ酸ナトリウムを含むニンヒドリン試薬から、反応温度１３３℃においてピーク高さ１０７ｍＡＵを得た。
（実施例３．３）
グルコース
【０１２０】
温度依存性還元剤として２％ｗ／ｖグルコースを含むニンヒドリン試薬の感度を、上記に特定された条件下で標準的アミノ酸分析器を使用して評価した。
【０１２１】
４０％エチレングリコールの存在下、２％ｗ／ｖグルコースを含むニンヒドリン試薬から、反応温度１３１℃においてピーク高さ９７ｍＡＵを得た。
【０１２２】
エチレングリコールの不在下、２％ｗ／ｖグルコースを含むニンヒドリン試薬から、反応温度１３３℃においてピーク高さ７９ｍＡＵを得た。
【０１２３】
上記の結果は、同様の感度をそれぞれ達成するためにグルコースおよびフルクトースに対して必要とされる、２％から０．２％ｗ／ｖまで異なるパーセンテージ濃度により示されているように、グルコースから、ギ酸ナトリウムへの、フルクトースへの活性の大きな増加を示す。したがって、所望の感度を達成するために必要とされるパーセンテージ濃度は、温度依存性還元剤を形成するために使用される化合物（複数可）に応じて異なることが予想される。最適化の要因、例えば、標準的アミノ酸分析器で使用している間の、温度依存性還元剤のパーセンテージ濃度、（もしある場合）有機溶媒のパーセンテージ濃度、および反応チャンバーの温度により、プロトコル１および２をパスしたすべての化合物に対する最適なパーセンテージ濃度が同定される。
【０１２４】
さらに、この結果は、有機溶媒の不在下で、温度依存性還元剤の感度は低減することを示している。しかし、活性におけるこの低減は、分析法の感度に有意に影響を及ぼすことはないことがわかる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
窒素含有化合物を分析するための方法における使用のためのニンヒドリン試薬であって、
ニンヒドリンと、
水性緩衝液と、
第１の温度でニンヒドリンの還元において不活性であり、第２の温度でニンヒドリンをヒドリンダンチンへ還元する活性があり、該第２の温度が該第１の温度より高い、温度依存性還元剤と
を含むニンヒドリン試薬。
（項目２）
ヒドリンダンチンを実質的に含まない、項目１に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３）
前記第２の温度が少なくとも１００℃である、項目１または２のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
（項目４）
前記温度依存性還元剤が、実施例１のプロトコル１の前記第２の温度において、還元活性の基準を満たす化合物である、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目５）
前記温度依存性還元剤が、プロトコル１による前記第２の温度において還元活性の基準を満たす、最小吸光度０．４が観察されている化合物である、項目４に記載のニンヒドリン試薬。
（項目６）
前記第１の温度が０℃〜３０℃である、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目７）
前記第１の温度が５℃〜２５℃である、項目６に記載のニンヒドリン試薬。
（項目８）
前記第１の温度が１０℃〜２０℃である、項目７に記載のニンヒドリン試薬。
（項目９）
前記温度依存性還元剤が、実施例２のプロトコル２による前記第１の温度において還元活性の基準を満たす化合物である、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１０）
前記温度依存性還元剤が、３カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目９に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１１）
前記温度依存性還元剤が、６カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目１０に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１２）
前記温度依存性還元剤が、１２カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目１１に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１３）
前記温度依存性還元剤が、２４カ月後にその初期の活性の少なくとも５０％の活性を有する化合物である、項目１２に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１４）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の糖を含む、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１５）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単糖を含む、項目１４に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１６）
前記温度依存性還元剤が、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、リボース、キシロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アラビノース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、タロースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、またはこれらの混合物を含む、項目１５に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１７）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の二糖を含む、項目１４から１６のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
（項目１８）
前記温度依存性還元剤が、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、キシロビオースまたはこれらの混合物を含む、項目１７に記載のニンヒドリン試薬。
（項目１９）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のより長鎖の多糖を含む、項目１４から１８のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
（項目２０）
前記温度依存性還元剤が、スタキオース、デキストリン、マルトデキストリン、またはこれらの混合物を含む、項目１９に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２１）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のカルボン酸および／またはその塩を含む、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２２）
前記温度依存性還元剤が、カルボン酸のＩ族またはＩＩ族の金属塩を含む、項目２１に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２３）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の単官能性カルボン酸またはその塩を含む、項目２１または２２に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２４）
前記カルボン酸がギ酸またはその塩である、項目２３に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２５）
前記温度依存性還元剤が、少なくとも１種の追加の還元基を含む１種または複数のカルボン酸を含む、項目２１から２４のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
（項目２６）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数のアルデヒド基および／またはケトン基を有する１種または複数の化合物を含む、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２７）
前記温度依存性還元剤がアセトンを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記温度依存性還元剤が、１種または複数の無機化合物を含む、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目２９）
前記温度依存性還元剤が、低い酸化状態の硫黄の無機化合物または低い酸化状態のリン酸素酸を含む、項目２８に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３０）
前記温度依存性還元剤が、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩および／または次亜リン酸塩を含む、項目２９に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３１）
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３２）
前記温度依存性還元剤の濃度が０．０１％〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目３１に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３３）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が０．５〜３％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目３２に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３４）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が１〜２．５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目３３に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３５）
前記ニンヒドリン試薬中のニンヒドリンの濃度が約２％ｗ／ｖまたはｖ／ｖである、項目３４に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３６）
前記緩衝液が水性緩衝液である、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３７）
前記緩衝液が弱酸およびその共役塩基／塩のうちの１種を含む、項目３６に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３８）
前記緩衝液が有機酸を含む、項目３７に記載のニンヒドリン試薬。
（項目３９）
前記緩衝液が酢酸、エタン酸またはプロパン酸を含む、項目３８に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４０）
前記緩衝液が３〜７の間の値にｐＨを維持する、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４１）
前記緩衝液が４〜６の間の値にｐＨを維持する、項目４０に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４２）
前記緩衝液が４．５〜５．５の間の値にｐＨを維持する、項目４１に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４３）
前記緩衝液が約５．２の値にｐＨを維持する、項目４２に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４４）
１種または複数の有機溶媒をさらに含む、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４５）
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、スルホラン、カルビトール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、メチルセロソルブおよびメタノールから選択される、項目４４に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４６）
有機溶媒の濃度が１０％〜７５％ｖ／ｖである、項目４４または４５のいずれかに記載のニンヒドリン試薬。
（項目４７）
有機溶媒の濃度が２５％〜６５％ｖ／ｖである、項目４６に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４８）
有機溶媒の濃度が、３５％〜５５％ｖ／ｖである、項目４７に記載のニンヒドリン試薬。
（項目４９）
窒素含有化合物を分析するための方法における、任意の先行する項目に記載のニンヒドリン試薬の使用。
（項目５０）
前記窒素含有化合物がアミノ酸である、項目４８に記載の使用。
（項目５１）
窒素含有化合物を分析する方法であって、
ｉ）項目１から４８のいずれかに記載のニンヒドリン試薬を提供するステップと、
ｉｉ）該ニンヒドリン試薬を少なくとも前記第２の温度に加熱することによって、ヒドリンダンチン含有混合物を形成するステップと、
ｉｉＩ）該ヒドリンダンチン含有混合物を該窒素含有化合物と接触させるステップと
を含む方法。
（項目５２）
前記窒素含有化合物がアミノ酸である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
ステップ（ｉｉｉ）の生成物の色を分析するステップをさらに含む、項目５１または５２のいずれかに記載の方法。