(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソブタノール生合成経路と、
ａ．以下のアミノ酸配列のうちの一つからなるケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチド：配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号２０２、配列番号２２７、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号３５４、配列番号３７１、又は配列番号３７４
又はその活性断片、又は
ｂ．ａの前記異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと
を含む組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）のメンバーである、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記イソブタノール生成経路が、以下の基質から生成物への変換を含み：
ａ．ピルベートからアセトラクテート
ｂ．アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート
ｃ．２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレート
ｄ．２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、及び
ｅ．イソブチルアルデヒドからイソブタノール
前記基質から生成物への変換の２つ以上が、前記宿主細胞にとって異種の酵素によって触媒される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記基質から生成物への変換の全てが、前記宿主細胞にとって異種の酵素によって触媒される、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換が、ＮＡＤＨを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される、請求項５又は６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、低下又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が、低下又は消失したアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、低下又は消失したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記基質から生成物への変換が、実質的にサイトゾルに局在する酵素によって触媒される、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
イソブタノールの生成方法であって、
ａ．請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．イソブタノールが生成される条件下で前記ａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記接触させるステップの少なくとも一部が嫌気条件下で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
グリセロールに対するイソブタノールのモル比が１より大きい、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
イソブタノールと、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞とを含む組成物。
【請求項１６】
配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号２０２、配列番号２２７、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号３５４、配列番号３７１、又は配列番号３７４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
又はその活性断片であって、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１７】
アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換方法であって、
ａ．請求項１６に記載のポリペプチドを提供するステップと、
ｂ．２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成される条件下で前記ａ）のポリペプチドをアセトラクテートに接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の異種ポリペプチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号７２０、７２３、７２７、７５２、７５９〜７６２、７６６〜７６８、又は８３１のいずれか一つからなり、かつケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２１】
１つ以上のプロモーターに作動可能に連結された、請求項１９又は２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
１つ以上の終結領域に作動可能に連結された、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載の１つ以上のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２４または２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
前記酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母である、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／７０５９７７号明細書に関連し、且つその優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願の全体は、本明細書において参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出する配列表に関する記載
本願と共に提出するＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２０１３０９２６＿ＣＬ５８６２ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、サイズ：１，２３６，８２１バイト、及び作成日：２０１３年９月２６日）において電子的に提出する配列表の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、イソブタノール生成経路で機能するのに適したケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、バリン及びイソロイシンの生物学的生産に関与する。ＫＡＲＩ酵素はまた、操作された微生物を用いるイソブタノール生成経路に有用であることも示されている（特許文献１及び２）。かかる微生物を使用して、植物由来の基質からイソブタノールを生成することができる。
【０００５】
イソブタノールの化学的合成方法は公知であるが（オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）及びメタノールとｎ−プロパノールとのゲルベ縮合（非特許文献２）、これらの手法は石油化学品に由来する出発物質を使用し、概して高価である。さらに、イソブタノールの化学合成は、温室効果ガスの排出を最小限に抑えるなどの、環境上の利点をもたらす見込みがない。植物由来原材料からのイソブタノールの生成は、当該技術分野の進歩に相当し得る。
【０００６】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を利用することのできるＫＡＲＩ酵素は、既存の解糖経路及び一般的に用いられる微生物細胞の他の代謝経路によって生成されるＮＡＤＨを生かすことができ、イソブタノール生成の向上をもたらし得る。特許文献３及び特許文献４及び２０１２年３月２３日に出願された特許文献５（特許文献６として公開されている）（この各々が参照により本明細書に援用される）が、様々な補因子（ＮＡＤＨ）利用能を有するＫＡＲＩ酵素の作成について記載している。しかしながら、当該技術分野では、イソブタノール生合成経路などの生成経路に好適なＫＡＲＩ活性を有する代替的ポリペプチドが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，８５１，１８８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９９３，８８９号明細書
【特許文献３】米国特許第８，１２９，１６２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９Ａ１号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１３／４２８５８５号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３００７１８９８Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，独国，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書には、組換え宿主細胞のイソブタノール生成を増加させる方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞（例えば、イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む）を提供するステップを含む。実施形態では、この方法は、（ｉ）リジンでない配列番号９３の９０位に対応するアミノ酸残基、（ｉｉ）スレオニンでない配列番号９３の９３位に対応するアミノ酸残基；及び（ｉｉｉ）メチオニンでない配列番号９３の９４位に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む異種ポリペプチド又はその断片を含む。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明の別の異種ポリペプチド又はその断片が使用される。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明のポリペプチド又はその断片をコードする本発明のポリヌクレオチド又はその断片が使用される。実施形態では、この方法は、イソブタノールが生成される条件下で組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップをさらに含む。この方法の実施形態では、この組換え宿主細胞によって生成されるイソブタノールは、異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞によって生成されるイソブタノールより多い。
【００１０】
本明細書には、組換え宿主細胞のＮＡＤＨ利用を増加させる方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞（例えば、イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む）を提供するステップを含む。実施形態では、この方法は、（ｉ）リジンでない配列番号９３の９０位に対応するアミノ酸残基、（ｉｉ）スレオニンでない配列番号９３の９３位に対応するアミノ酸残基；及び（ｉｉｉ）メチオニンでない配列番号９３の９４位に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む異種ポリペプチド又はその断片を含む。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明の別の異種ポリペプチド又はその断片が使用される。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明のポリペプチド又はその断片をコードする本発明のポリヌクレオチド又はその断片が使用される。実施形態では、この方法は、イソブタノールが生成される条件下で組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップを含む。実施形態では、この組換え宿主細胞のＮＡＤＨ利用は、異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞のＮＡＤＨ利用より高い。この方法の実施形態では、ＮＡＤＨ利用の増加は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ比の増加である。
【００１１】
本明細書には、組換え宿主細胞の成長速度を増加させる方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明の組換え宿主細胞（例えば、イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む）を提供するステップを含む。実施形態では、この方法は、（ｉ）リジンでない配列番号９３の９０位に対応するアミノ酸残基、（ｉｉ）スレオニンでない配列番号９３の９３位に対応するアミノ酸残基；及び（ｉｉｉ）メチオニンでない配列番号９３の９４位に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む異種ポリペプチド又はその断片を含む。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明の別の異種ポリペプチド又はその断片が使用される。他の実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本発明のポリペプチド又はその断片をコードする本発明のポリヌクレオチド又はその断片が使用される。実施形態では、この方法は、イソブタノールが生成される条件下で宿主細胞を炭素基質と接触させるステップを含む。実施形態では、この組換え宿主細胞の成長速度は、異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞の成長速度より高い。
【００１２】
本発明の方法の実施形態では、組換えポリペプチド又はその断片は、（ｉ）チロシン又はアラニンである配列番号９３の９０位に対応するアミノ酸残基；（ｉｉ）バリン、アラニン、又はロイシンである配列番号９３の９３位に対応するアミノ酸残基；及び（ｉｉｉ）ロイシンである配列番号９３の９４位に対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む。本発明の方法の実施形態では、組換え宿主細胞は酵母宿主細胞である。本発明の方法の実施形態では、酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母である。本発明の方法の実施形態では、酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。本発明の方法の実施形態では、異種ポリペプチド又は断片は、配列番号７６１、７５２、７５９又は７６０と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の同一性を有する配列によりコードされる。本発明の方法の実施形態では、異種ポリペプチド又は断片は、配列番号２３７、２２７、２３３又は２３４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の同一性を有する配列を含む。
【００１３】
本明細書には、イソブタノール生合成経路と、ａ）以下のうちの一つと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の同一性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチド：Ｋ９ＪＭ２（配列番号１９３）、Ｋ９ＪＭ３（配列番号１９４）、Ｋ９ＪＭ４（配列番号１９５）、Ｋ９ＪＭ５（配列番号１９６）、Ｋ９ＪＭ６（配列番号１９７）、Ｋ９ＪＭ７（配列番号１９８）、Ｋ９ＪＭ８（配列番号１９９）、Ｋ９ＪＭ９（配列番号２００）、Ｋ９ＪＭ１０（配列番号２０１）、Ｋ９ＪＭ１１（配列番号２０２）、Ｋ９ＪＭ１２（配列番号２０３）、Ｋ９ＪＭ１３（配列番号２０４）、Ｋ９ＪＭ１４（配列番号２０５）、Ｋ９ＪＭ１５（配列番号２０６）、Ｋ９ＪＭ１６（配列番号２０７）、Ｋ９ＪＭ１７（配列番号２０８）、Ｋ９ＪＭ１８（配列番号２０９）、Ｋ９ＪＭ１９（配列番号２１０）、Ｋ９ＪＭ２０（配列番号２１１）、Ｋ９ＪＭ２１（配列番号２１２）、Ｋ９ＪＭ２２（配列番号２１３）、Ｋ９ＪＭ２３（配列番号２１４）、Ｋ９ＪＭ２４（配列番号２１５）、Ｋ９ＪＭ２５（配列番号２１６）、Ｋ９ＪＭ２６（配列番号２１７）、Ｋ９ＪＭ２７（配列番号２１８）、Ｋ９ＪＭ２８（配列番号２１９）、Ｋ９ＪＭ２９（配列番号２２０）、Ｋ９ＪＭ３０（配列番号２２１）、Ｋ９ＪＭ３１（配列番号２２２）、ＪＭ３２（配列番号２２３）、ＪＭ３３（配列番号２２４）、ＪＭ３４（配列番号２２５）、ＪＭ３５（配列番号２２６）、ＪＭ３６（配列番号２２７）、ＪＭ３７（配列番号２２８）、ＪＭ３８（配列番号２２９）、ＪＭ３９（配列番号２３０）、ＪＭ４０（配列番号２３１）、ＪＭ４２（配列番号２３２）、ＪＭ４３（配列番号２３３）、ＪＭ４４（配列番号２３４）、Ｋ９＿ＤＡＶＩＤ＿ＳＨ（配列番号２３６）、Ｋ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）、Ｋ９＿ＵＲＳＡＬＡ（Ｋ９ＳＢ２＋Ａ５６Ｖ）（配列番号２３９）、ＪＭ４１（配列番号２４０）、Ｋ９ＡＬＬ１４８（配列番号２４１）、Ｋ９ＪＭ１４８（配列番号２４２）、Ｋ９ＡＬＬ１５６（配列番号２４３）、Ｋ９ＪＭ１５６（配列番号２４４）、Ｋ９ＡＬＬ１９１（配列番号２４５）、Ｋ９ＪＭ１９１（配列番号２４６）、Ｋ９ＡＬＬ２５４（配列番号２４７）、Ｋ９ＡＬＬ２７８（配列番号２４８）、Ｋ９ＡＬＬ３７（配列番号２４９）、Ｋ９ＪＭ３７Ｓ（配列番号２５０）、Ｋ９ＡＬＬ６６（配列番号６６）、Ｋ９ＪＭ６６（配列番号２５２）、Ｋ９ＡＬＬ８Ｑ（配列番号２５３）、Ｋ９ＪＭ８Ｑ（配列番号２５４）、Ｋ９ＡＬＬ４５（配列番号２５５）、Ｋ９＿ＬＵＣＹ（配列番号３００）、Ｋ９＿ＩＬＹＡ（配列番号３０１）、Ｋ９ＡＬＬ２５８（配列番号３０２）、Ｋ９ＹＷ２５−Ｔ１９１Ｓ（配列番号３０３）、ＰＬＨ６８９：：ＡＬＬ３（配列番号３０４）、Ｆ５３Ｌ（配列番号３０７）、Ｆ５３Ｉ（配列番号３０８）、Ｆ５３Ｍ（配列番号３０９）、Ｆ５３Ｖ（配列番号３１０）、Ｆ５３Ｐ（配列番号３１１）、Ｆ５３Ｓ（配列番号３１２）、Ｆ５３Ａ（配列番号３１３）、Ｆ５３Ｅ（配列番号３１４）、Ｆ５３Ｑ（配列番号３１５）、Ｔ１１−１（配列番号３１６）、Ｔ１１−２（配列番号３１７）、Ｔ１１−３（配列番号３１８）、Ｔ１１−４（配列番号３１９）、Ｔ１１−５（配列番号３２０）、Ｔ１１−６（配列番号３２１）、Ｔ１１−７（配列番号３２２）、Ｔ１１−１０（配列番号３２３）、Ｔ１１−１２（配列番号３２４）、Ｔ１１−１３（配列番号３２５）、Ｔ１１−１４（配列番号３２６）、Ｔ１１−１５（配列番号３２７）、Ｔ１１−１６（配列番号３２８）、Ｔ１１−１８（配列番号３２９）、Ｔ１１−１９（配列番号３３０）、Ｔ１１−２１（配列番号３３１）、Ｔ１１−２２（配列番号３３２）、Ｔ１１−２５（配列番号３３３）、Ｔ１１−２７（配列番号３３４）、Ｔ１１−２８（配列番号３３５）、Ｔ１１−２９（配列番号３３６）、Ｔ１１−３０（配列番号３３７）、Ｔ１１−３２（配列番号３３８）、Ｔ１１−３３（配列番号３３９）、Ｔ１１−３５（配列番号３４０）、Ｔ１１−３６（配列番号３４１）、Ｔ１１−３７（配列番号３４２）、Ｔ１１−３８（配列番号３４３）、Ｔ１１−３９（配列番号３４４）、Ｔ１１−４２（配列番号３４５）、Ｔ１１−４３（配列番号３４６）、Ｔ１１−４４（配列番号３４７）、Ｔ１１−４５（配列番号３４８）、Ｔ１１−４６（配列番号３４９）、Ｔ１１−４７（配列番号３５０）、Ｔ１１−４９（配列番号３５１）、Ｔ１１−５０（配列番号３５２）、Ｔ１１−５２（配列番号３５３）、Ｔ１１−５４（配列番号３５４）、Ｔ１１−５５（配列番号３５５）、Ｔ１１−５６（配列番号３５６）、Ｔ１１−５７（配列番号３５７）、Ｔ１１−５８（配列番号３５８）、Ｔ１１−５９（配列番号３５９）、Ｔ１１−６０（配列番号３６０）、Ｔ１１−６１（配列番号３６１）、Ｔ１１−６２（配列番号３６２）、Ｔ１１−６４（配列番号３６３）、Ｔ１１−６６（配列番号３６４）、Ｔ１１−６７（配列番号３６５）、Ｔ１１−６９（配列番号３６６）、Ｔ１１−７０（配列番号３６７）、Ｔ１１−７２（配列番号３６８）、Ｔ１１−７４（配列番号３６９）、Ｔ１１−７５（配列番号３７０）、Ｔ１１−７６（配列番号３７１）、Ｔ１１−７９（配列番号３７２）、Ｔ１１−８０（配列番号３７３）、Ｔ１１−８１（配列番号３７４）、Ｔ１１−８３（配列番号３７５）、Ｔ１１−８４（配列番号３７６）、Ｔ１１−８５（配列番号３７７）、Ｔ１１−８６（配列番号３７８）、Ｔ１１−８７（配列番号３７９）、Ｔ１１−８８（配列番号３８０）、Ｔ１１−９１（配列番号３８１）、Ｔ１１−９４（配列番号３８２）、Ｔ１１−９５（配列番号３８３）、Ｔ１１−９６（配列番号３８４）、Ｔ１１−９７（配列番号３８５）、Ｔ１１−９９（配列番号３８６）、Ｔ１１−１０３（配列番号３８７）、Ｔ１１−１０４（配列番号３８８）、Ｔ１１−１０９（配列番号３８９）、Ｔ１１−１１０（配列番号３９０）、Ｔ１１−１１１（配列番号３９１）、Ｔ１１−１１４（配列番号３９２）、Ｔ１１−１１６（配列番号３９３）、Ｔ１１−１１７（配列番号３９４）、Ｔ１１−１１９（配列番号３９５）、Ｔ１１−１２１（配列番号３９６）、Ｔ１１−１２２（配列番号３９７）、Ｔ１１−１２４（配列番号３９８）、Ｔ１１−１２５（配列番号３９９）、Ｔ１１−１２８（配列番号４００）、Ｔ１１−１３０（配列番号４０１）、Ｔ１１−１３１（配列番号４０２）、Ｔ１１−１３４（配列番号４０３）、Ｅ１４７Ｖ（配列番号５５２）、Ｇ１６４Ｄ（配列番号４０４）、Ｇ３０４Ｖ（配列番号４０５）、Ｎ２５８Ｓ（配列番号４０６）、Ｔ７１Ｓ（配列番号４０７）、Ｖ１８４Ｉ（配列番号４０８）、Ａ２７９Ｄ（配列番号４０９）、Ｄ９８Ｖ（配列番号４１０）、Ｍ１６９Ｆ（配列番号４１１）、Ｍ１６９Ｋ（配列番号４１２）、Ｍ１６９Ｌ（配列番号４１３）、Ｅ１００Ｑ＿Ｍ３１２Ｋ（配列番号４１４）、ＥＣＢ１１（配列番号５３４）、ＥＣ２Ａ２（配列番号５３５）、ＥＣ２Ｂ１２（配列番号５３６）、ＥＧＣ１０（配列番号５３７）、ＥＧＤ９（配列番号５３８）、ＥＧＧ８（配列番号５３９）、ＥＨＧ１（配列番号５４０）、ＥＨＧ２（配列番号５４１）、ＥＨＨ６（配列番号５２０）、ＥＨＨ９（配列番号５２１）、ＥＨＨ１０（配列番号５２２）、ＥＨＨ１２（配列番号５２３）、ＥＫＣ５（配列番号５４６）、ＥＫＧ４（配列番号５４７）、ＥＪＦ５（配列番号５４８）、ＥＪＢ８（配列番号５４９）、ＥＪＡ１（配列番号５５０）、ＥＪＢ１０（配列番号５５１）、Ｋ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ（配列番号５５３）、又はＫ９ＪＭ１（配列番号１９２）又はその活性断片；又はｂ）ａ）の異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞が提供される。
【００１４】
また、本明細書には、イソブタノール生合成経路と、ａ）Ｋ９ＪＭ２（配列番号１９３）、Ｋ９ＪＭ３（配列番号１９４）、Ｋ９ＪＭ４（配列番号１９５）、Ｋ９ＪＭ５（配列番号１９６）、Ｋ９ＪＭ６（配列番号１９７）、Ｋ９ＪＭ７（配列番号１９８）、Ｋ９ＪＭ８（配列番号１９９）、Ｋ９ＪＭ９（配列番号２００）、Ｋ９ＪＭ１０（配列番号２０１）、Ｋ９ＪＭ１１（配列番号２０２）、Ｋ９ＪＭ１２（配列番号２０３）、Ｋ９ＪＭ１３（配列番号２０４）、Ｋ９ＪＭ１４（配列番号２０５）、Ｋ９ＪＭ１５（配列番号２０６）、Ｋ９ＪＭ１６（配列番号２０７）、Ｋ９ＪＭ１７（配列番号２０８）、Ｋ９ＪＭ１８（配列番号２０９）、Ｋ９ＪＭ１９（配列番号２１０）、Ｋ９ＪＭ２０（配列番号２１１）、Ｋ９ＪＭ２１（配列番号２１２）、Ｋ９ＪＭ２２（配列番号２１３）、Ｋ９ＪＭ２３（配列番号２１４）、Ｋ９ＪＭ２４（配列番号２１５）、Ｋ９ＪＭ２５（配列番号２１６）、Ｋ９ＪＭ２６（配列番号２１７）、Ｋ９ＪＭ２７（配列番号２１８）、Ｋ９ＪＭ２８（配列番号２１９）、Ｋ９ＪＭ２９（配列番号２２０）、Ｋ９ＪＭ３０（配列番号２２１）、Ｋ９ＪＭ３１（配列番号２２２）、ＪＭ３２（配列番号２２３）、ＪＭ３３（配列番号２２４）、ＪＭ３４（配列番号２２５）、ＪＭ３５（配列番号２２６）、ＪＭ３６（配列番号２２７）、ＪＭ３７（配列番号２２８）、ＪＭ３８（配列番号２２９）、ＪＭ３９（配列番号２３０）、ＪＭ４０（配列番号２３１）、ＪＭ４２（配列番号２３２）、ＪＭ４３（配列番号２３３）、ＪＭ４４（配列番号２３４）、Ｋ９＿ＤＡＶＩＤ＿ＳＨ（配列番号２３６）、Ｋ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）、Ｋ９＿ＵＲＳＡＬＡ（Ｋ９ＳＢ２＋Ａ５６Ｖ）（配列番号２３９）、ＪＭ４１（配列番号２４０）、Ｋ９ＡＬＬ１４８（配列番号２４１）、Ｋ９ＪＭ１４８（配列番号２４２）、Ｋ９ＡＬＬ１５６（配列番号２４３）、Ｋ９ＪＭ１５６（配列番号２４４）、Ｋ９ＡＬＬ１９１（配列番号２４５）、Ｋ９ＪＭ１９１（配列番号２４６）、Ｋ９ＡＬＬ２５４（配列番号２４７）、Ｋ９ＡＬＬ２７８（配列番号２４８）、Ｋ９ＡＬＬ３７（配列番号２４９）、Ｋ９ＪＭ３７Ｓ（配列番号２５０）、Ｋ９ＡＬＬ６６（配列番号６６）、Ｋ９ＪＭ６６（配列番号２５２）、Ｋ９ＡＬＬ８Ｑ（配列番号２５３）、Ｋ９ＪＭ８Ｑ（配列番号２５４）、Ｋ９ＡＬＬ４５（配列番号２５５）、Ｋ９＿ＬＵＣＹ（配列番号３００）、Ｋ９＿ＩＬＹＡ（配列番号３０１）、Ｋ９ＡＬＬ２５８（配列番号３０２）、Ｋ９ＹＷ２５−Ｔ１９１Ｓ（配列番号３０３）、ＰＬＨ６８９：：ＡＬＬ３（配列番号３０４）、Ｆ５３Ｌ（配列番号３０７）、Ｆ５３Ｉ（配列番号３０８）、Ｆ５３Ｍ（配列番号３０９）、Ｆ５３Ｖ（配列番号３１０）、Ｆ５３Ｐ（配列番号３１１）、Ｆ５３Ｓ（配列番号３１２）、Ｆ５３Ａ（配列番号３１３）、Ｆ５３Ｅ（配列番号３１４）、Ｆ５３Ｑ（配列番号３１５）、Ｔ１１−１（配列番号３１６）、Ｔ１１−２（配列番号３１７）、Ｔ１１−３（配列番号３１８）、Ｔ１１−４（配列番号３１９）、Ｔ１１−５（配列番号３２０）、Ｔ１１−６（配列番号３２１）、Ｔ１１−７（配列番号３２２）、Ｔ１１−１０（配列番号３２３）、Ｔ１１−１２（配列番号３２４）、Ｔ１１−１３（配列番号３２５）、Ｔ１１−１４（配列番号３２６）、Ｔ１１−１５（配列番号３２７）、Ｔ１１−１６（配列番号３２８）、Ｔ１１−１８（配列番号３２９）、Ｔ１１−１９（配列番号３３０）、Ｔ１１−２１（配列番号３３１）、Ｔ１１−２２（配列番号３３２）、Ｔ１１−２５（配列番号３３３）、Ｔ１１−２７（配列番号３３４）、Ｔ１１−２８（配列番号３３５）、Ｔ１１−２９（配列番号３３６）、Ｔ１１−３０（配列番号３３７）、Ｔ１１−３２（配列番号３３８）、Ｔ１１−３３（配列番号３３９）、Ｔ１１−３５（配列番号３４０）、Ｔ１１−３６（配列番号３４１）、Ｔ１１−３７（配列番号３４２）、Ｔ１１−３８（配列番号３４３）、Ｔ１１−３９（配列番号３４４）、Ｔ１１−４２（配列番号３４５）、Ｔ１１−４３（配列番号３４６）、Ｔ１１−４４（配列番号３４７）、Ｔ１１−４５（配列番号３４８）、Ｔ１１−４６（配列番号３４９）、Ｔ１１−４７（配列番号３５０）、Ｔ１１−４９（配列番号３５１）、Ｔ１１−５０（配列番号３５２）、Ｔ１１−５２（配列番号３５３）、Ｔ１１−５４（配列番号３５４）、Ｔ１１−５５（配列番号３５５）、Ｔ１１−５６（配列番号３５６）、Ｔ１１−５７（配列番号３５７）、Ｔ１１−５８（配列番号３５８）、Ｔ１１−５９（配列番号３５９）、Ｔ１１−６０（配列番号３６０）、Ｔ１１−６１（配列番号３６１）、Ｔ１１−６２（配列番号３６２）、Ｔ１１−６４（配列番号３６３）、Ｔ１１−６６（配列番号３６４）、Ｔ１１−６７（配列番号３６５）、Ｔ１１−６９（配列番号３６６）、Ｔ１１−７０（配列番号３６７）、Ｔ１１−７２（配列番号３６８）、Ｔ１１−７４（配列番号３６９）、Ｔ１１−７５（配列番号３７０）、Ｔ１１−７６（配列番号３７１）、Ｔ１１−７９（配列番号３７２）、Ｔ１１−８０（配列番号３７３）、Ｔ１１−８１（配列番号３７４）、Ｔ１１−８３（配列番号３７５）、Ｔ１１−８４（配列番号３７６）、Ｔ１１−８５（配列番号３７７）、Ｔ１１−８６（配列番号３７８）、Ｔ１１−８７（配列番号３７９）、Ｔ１１−８８（配列番号３８０）、Ｔ１１−９１（配列番号３８１）、Ｔ１１−９４（配列番号３８２）、Ｔ１１−９５（配列番号３８３）、Ｔ１１−９６（配列番号３８４）、Ｔ１１−９７（配列番号３８５）、Ｔ１１−９９（配列番号３８６）、Ｔ１１−１０３（配列番号３８７）、Ｔ１１−１０４（配列番号３８８）、Ｔ１１−１０９（配列番号３８９）、Ｔ１１−１１０（配列番号３９０）、Ｔ１１−１１１（配列番号３９１）、Ｔ１１−１１４（配列番号３９２）、Ｔ１１−１１６（配列番号３９３）、Ｔ１１−１１７（配列番号３９４）、Ｔ１１−１１９（配列番号３９５）、Ｔ１１−１２１（配列番号３９６）、Ｔ１１−１２２（配列番号３９７）、Ｔ１１−１２４（配列番号３９８）、Ｔ１１−１２５（配列番号３９９）、Ｔ１１−１２８（配列番号４００）、Ｔ１１−１３０（配列番号４０１）、Ｔ１１−１３１（配列番号４０２）、Ｔ１１−１３４（配列番号４０３）、Ｅ１４７Ｖ（配列番号５５２）、Ｇ１６４Ｄ（配列番号４０４）、Ｇ３０４Ｖ（配列番号４０５）、Ｎ２５８Ｓ（配列番号４０６）、Ｔ７１Ｓ（配列番号４０７）、Ｖ１８４Ｉ（配列番号４０８）、Ａ２７９Ｄ（配列番号４０９）、Ｄ９８Ｖ（配列番号４１０）、Ｍ１６９Ｆ（配列番号４１１）、Ｍ１６９Ｋ（配列番号４１２）、Ｍ１６９Ｌ（配列番号４１３）、Ｅ１００Ｑ＿Ｍ３１２Ｋ（配列番号４１４）、ＥＣＢ１１（配列番号５３４）、ＥＣ２Ａ２（配列番号５３５）、ＥＣ２Ｂ１２（配列番号５３６）、ＥＧＣ１０（配列番号５３７）、ＥＧＤ９（配列番号５３８）、ＥＧＧ８（配列番号５３９）、ＥＨＧ１（配列番号５４０）、ＥＨＧ２（配列番号５４１）、ＥＨＨ６（配列番号５２０）、ＥＨＨ９（配列番号５２１）、ＥＨＨ１０（配列番号５２２）、ＥＨＨ１２（配列番号５２３）、ＥＫＣ５（配列番号５４６）、ＥＫＧ４（配列番号５４７）、ＥＪＦ５（配列番号５４８）、ＥＪＢ８（配列番号５４９）、ＥＪＡ１（配列番号５５０）、ＥＪＢ１０（配列番号５５１）、Ｋ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ（配列番号５５３）、又はＫ９ＪＭ１（配列番号１９２）と少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％の同一性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチド、又はその活性断片；又はｂ）ａ）のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞も提供され；ここでケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチドは、ＮＡＤＨに対するＫＭが約５０未満である。
【００１５】
実施形態では、宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択され、酵母細胞はそのメンバーである。実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００１６】
実施形態では、宿主細胞はイソブタノール生成経路を含む。実施形態では、イソブタノール生成経路は、ピルベートからアセトラクテート；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレート；２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；及び；イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を含み；これらの基質から生成物への変換の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は全てが、宿主細胞にとって異種である酵素によって触媒される。実施形態では、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換は、ＮＡＤＨを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される。実施形態では、宿主細胞は、低下又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性を有する。実施形態では、宿主細胞は、低下又は消失したアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する。実施形態では、宿主細胞は酵母であり、且つ低下又は消失したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。実施形態では、基質から生成物への変換は、実質的にサイトゾルに局在する酵素によって触媒される。
【００１７】
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、表Ｚに提供されるＫＡＲＩプロファイルＨＭＭと比較したとき＜１０−３のＥ値を有する。
【００１８】
本明細書には、イソブタノールの生成方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に提供される組換え宿主細胞を提供するステップと；ｂ）イソブタノールが生成される条件下でａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態では、接触させるステップの少なくとも一部は嫌気条件下で行われる。実施形態では、グリセロールに対するイソブタノールのモル比は１より大きい。
【００１９】
また、ａ）イソブタノールを生成する組換え宿主細胞を提供するステップと；ｂ）イソブタノールが生成される条件下でａ）の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含むイソブタノールの生成方法も提供され；ここで接触させるステップの少なくとも一部は嫌気条件下で行われ；及び生成されるグリセロールに対するイソブタノールの比は１より大きい。
【００２０】
イソブタノールと本明細書に開示される組換え宿主細胞とを含む組成物が提供される。
【００２１】
本明細書には、Ｋ９ＪＭ２（配列番号１９３）、Ｋ９ＪＭ３（配列番号１９４）、Ｋ９ＪＭ４（配列番号１９５）、Ｋ９ＪＭ５（配列番号１９６）、Ｋ９ＪＭ６（配列番号１９７）、Ｋ９ＪＭ７（配列番号１９８）、Ｋ９ＪＭ８（配列番号１９９）、Ｋ９ＪＭ９（配列番号２００）、Ｋ９ＪＭ１０（配列番号２０１）、Ｋ９ＪＭ１１（配列番号２０２）、Ｋ９ＪＭ１２（配列番号２０３）、Ｋ９ＪＭ１３（配列番号２０４）、Ｋ９ＪＭ１４（配列番号２０５）、Ｋ９ＪＭ１５（配列番号２０６）、Ｋ９ＪＭ１６（配列番号２０７）、Ｋ９ＪＭ１７（配列番号２０８）、Ｋ９ＪＭ１８（配列番号２０９）、Ｋ９ＪＭ１９（配列番号２１０）、Ｋ９ＪＭ２０（配列番号２１１）、Ｋ９ＪＭ２１（配列番号２１２）、Ｋ９ＪＭ２２（配列番号２１３）、Ｋ９ＪＭ２３（配列番号２１４）、Ｋ９ＪＭ２４（配列番号２１５）、Ｋ９ＪＭ２５（配列番号２１６）、Ｋ９ＪＭ２６（配列番号２１７）、Ｋ９ＪＭ２７（配列番号２１８）、Ｋ９ＪＭ２８（配列番号２１９）、Ｋ９ＪＭ２９（配列番号２２０）、Ｋ９ＪＭ３０（配列番号２２１）、Ｋ９ＪＭ３１（配列番号２２２）、ＪＭ３２（配列番号２２３）、ＪＭ３３（配列番号２２４）、ＪＭ３４（配列番号２２５）、ＪＭ３５（配列番号２２６）、ＪＭ３６（配列番号２２７）、ＪＭ３７（配列番号２２８）、ＪＭ３８（配列番号２２９）、ＪＭ３９（配列番号２３０）、ＪＭ４０（配列番号２３１）、ＪＭ４２（配列番号２３２）、ＪＭ４３（配列番号２３３）、ＪＭ４４（配列番号２３４）、Ｋ９＿ＤＡＶＩＤ＿ＳＨ（配列番号２３６）、Ｋ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）、Ｋ９＿ＵＲＳＡＬＡ（Ｋ９ＳＢ２＋Ａ５６Ｖ）（配列番号２３９）、ＪＭ４１（配列番号２４０）、Ｋ９ＡＬＬ１４８（配列番号２４１）、Ｋ９ＪＭ１４８（配列番号２４２）、Ｋ９ＡＬＬ１５６（配列番号２４３）、Ｋ９ＪＭ１５６（配列番号２４４）、Ｋ９ＡＬＬ１９１（配列番号２４５）、Ｋ９ＪＭ１９１（配列番号２４６）、Ｋ９ＡＬＬ２５４（配列番号２４７）、Ｋ９ＡＬＬ２７８（配列番号２４８）、Ｋ９ＡＬＬ３７（配列番号２４９）、Ｋ９ＪＭ３７Ｓ（配列番号２５０）、Ｋ９ＡＬＬ６６（配列番号６６）、Ｋ９ＪＭ６６（配列番号２５２）、Ｋ９ＡＬＬ８Ｑ（配列番号２５３）、Ｋ９ＪＭ８Ｑ（配列番号２５４）、Ｋ９ＡＬＬ４５（配列番号２５５）、Ｋ９＿ＬＵＣＹ（配列番号３００）、Ｋ９＿ＩＬＹＡ（配列番号３０１）、Ｋ９ＡＬＬ２５８（配列番号３０２）、Ｋ９ＹＷ２５−Ｔ１９１Ｓ（配列番号３０３）、ＰＬＨ６８９：：ＡＬＬ３（配列番号３０４）、Ｆ５３Ｌ（配列番号３０７）、Ｆ５３Ｉ（配列番号３０８）、Ｆ５３Ｍ（配列番号３０９）、Ｆ５３Ｖ（配列番号３１０）、Ｆ５３Ｐ（配列番号３１１）、Ｆ５３Ｓ（配列番号３１２）、Ｆ５３Ａ（配列番号３１３）、Ｆ５３Ｅ（配列番号３１４）、Ｆ５３Ｑ（配列番号３１５）、Ｔ１１−１（配列番号３１６）、Ｔ１１−２（配列番号３１７）、Ｔ１１−３（配列番号３１８）、Ｔ１１−４（配列番号３１９）、Ｔ１１−５（配列番号３２０）、Ｔ１１−６（配列番号３２１）、Ｔ１１−７（配列番号３２２）、Ｔ１１−１０（配列番号３２３）、Ｔ１１−１２（配列番号３２４）、Ｔ１１−１３（配列番号３２５）、Ｔ１１−１４（配列番号３２６）、Ｔ１１−１５（配列番号３２７）、Ｔ１１−１６（配列番号３２８）、Ｔ１１−１８（配列番号３２９）、Ｔ１１−１９（配列番号３３０）、Ｔ１１−２１（配列番号３３１）、Ｔ１１−２２（配列番号３３２）、Ｔ１１−２５（配列番号３３３）、Ｔ１１−２７（配列番号３３４）、Ｔ１１−２８（配列番号３３５）、Ｔ１１−２９（配列番号３３６）、Ｔ１１−３０（配列番号３３７）、Ｔ１１−３２（配列番号３３８）、Ｔ１１−３３（配列番号３３９）、Ｔ１１−３５（配列番号３４０）、Ｔ１１−３６（配列番号３４１）、Ｔ１１−３７（配列番号３４２）、Ｔ１１−３８（配列番号３４３）、Ｔ１１−３９（配列番号３４４）、Ｔ１１−４２（配列番号３４５）、Ｔ１１−４３（配列番号３４６）、Ｔ１１−４４（配列番号３４７）、Ｔ１１−４５（配列番号３４８）、Ｔ１１−４６（配列番号３４９）、Ｔ１１−４７（配列番号３５０）、Ｔ１１−４９（配列番号３５１）、Ｔ１１−５０（配列番号３５２）、Ｔ１１−５２（配列番号３５３）、Ｔ１１−５４（配列番号３５４）、Ｔ１１−５５（配列番号３５５）、Ｔ１１−５６（配列番号３５６）、Ｔ１１−５７（配列番号３５７）、Ｔ１１−５８（配列番号３５８）、Ｔ１１−５９（配列番号３５９）、Ｔ１１−６０（配列番号３６０）、Ｔ１１−６１（配列番号３６１）、Ｔ１１−６２（配列番号３６２）、Ｔ１１−６４（配列番号３６３）、Ｔ１１−６６（配列番号３６４）、Ｔ１１−６７（配列番号３６５）、Ｔ１１−６９（配列番号３６６）、Ｔ１１−７０（配列番号３６７）、Ｔ１１−７２（配列番号３６８）、Ｔ１１−７４（配列番号３６９）、Ｔ１１−７５（配列番号３７０）、Ｔ１１−７６（配列番号３７１）、Ｔ１１−７９（配列番号３７２）、Ｔ１１−８０（配列番号３７３）、Ｔ１１−８１（配列番号３７４）、Ｔ１１−８３（配列番号３７５）、Ｔ１１−８４（配列番号３７６）、Ｔ１１−８５（配列番号３７７）、Ｔ１１−８６（配列番号３７８）、Ｔ１１−８７（配列番号３７９）、Ｔ１１−８８（配列番号３８０）、Ｔ１１−９１（配列番号３８１）、Ｔ１１−９４（配列番号３８２）、Ｔ１１−９５（配列番号３８３）、Ｔ１１−９６（配列番号３８４）、Ｔ１１−９７（配列番号３８５）、Ｔ１１−９９（配列番号３８６）、Ｔ１１−１０３（配列番号３８７）、Ｔ１１−１０４（配列番号３８８）、Ｔ１１−１０９（配列番号３８９）、Ｔ１１−１１０（配列番号３９０）、Ｔ１１−１１１（配列番号３９１）、Ｔ１１−１１４（配列番号３９２）、Ｔ１１−１１６（配列番号３９３）、Ｔ１１−１１７（配列番号３９４）、Ｔ１１−１１９（配列番号３９５）、Ｔ１１−１２１（配列番号３９６）、Ｔ１１−１２２（配列番号３９７）、Ｔ１１−１２４（配列番号３９８）、Ｔ１１−１２５（配列番号３９９）、Ｔ１１−１２８（配列番号４００）、Ｔ１１−１３０（配列番号４０１）、Ｔ１１−１３１（配列番号４０２）、Ｔ１１−１３４（配列番号４０３）、Ｅ１４７Ｖ（配列番号５５２）、Ｇ１６４Ｄ（配列番号４０４）、Ｇ３０４Ｖ（配列番号４０５）、Ｎ２５８Ｓ（配列番号４０６）、Ｔ７１Ｓ（配列番号４０７）、Ｖ１８４Ｉ（配列番号４０８）、Ａ２７９Ｄ（配列番号４０９）、Ｄ９８Ｖ（配列番号４１０）、Ｍ１６９Ｆ（配列番号４１１）、Ｍ１６９Ｋ（配列番号４１２）、Ｍ１６９Ｌ（配列番号４１３）、Ｅ１００Ｑ＿Ｍ３１２Ｋ（配列番号４１４）、ＥＣＢ１１（配列番号５３４）、ＥＣ２Ａ２（配列番号５３５）、ＥＣ２Ｂ１２（配列番号５３６）、ＥＧＣ１０（配列番号５３７）、ＥＧＤ９（配列番号５３８）、ＥＧＧ８（配列番号５３９）、ＥＨＧ１（配列番号５４０）、ＥＨＧ２（配列番号５４１）、ＥＨＨ６（配列番号５２０）、ＥＨＨ９（配列番号５２１）、ＥＨＨ１０（配列番号５２２）、ＥＨＨ１２（配列番号５２３）、ＥＫＣ５（配列番号５４６）、ＥＫＧ４（配列番号５４７）、ＥＪＦ５（配列番号５４８）、ＥＪＢ８（配列番号５４９）、ＥＪＡ１（配列番号５５０）、ＥＪＢ１０（配列番号５５１）、Ｋ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ（配列番号５５３）、又はＫ９ＪＭ１（配列番号１９２）と少なくとも約９０％の同一性又は少なくとも約９５％の同一性又は少なくとも約９９％の同一性を含むポリペプチド、又はその活性断片が提供され、前記ポリペプチドはケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する。また、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。従って、かかるポリペプチドを含む組換え宿主細胞及びかかるポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供される。実施形態では、組換え宿主細胞はイソブタノール生合成経路をさらに含む。実施形態では、かかる組換え宿主細胞がイソブタノールの生成方法で用いられる。
【００２２】
アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に開示されるポリペプチドを提供するステップと；ｂ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートが生成される条件下でａ）のポリペプチドをアセトラクテートに接触させるステップとを含む。
【００２３】
また、本明細書には、提供されるポリペプチドを含む、アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレートへの変換方法も提供される。また、アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレートへの変換方法も提供され、この方法は、提供されるポリペプチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップと；ポリペプチドをアセトラクテートと接触させるステップとを含み、ここではジヒドロキシイソバレレートが生成される。また、イソブタノール、パントテネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、３，３−ジメチルマレート、及び２−メチル−１−ブタノールからなる群から選択される生成物の生成方法も提供され、この方法は、本明細書に提供される組換え宿主細胞を提供するステップであって、組換え宿主細胞が生成物生合成経路を含むステップと；生成物が生成される条件下で微生物宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態では、接触させるステップの少なくとも一部が嫌気条件下で行われる。
【００２４】
本発明の１つ以上のＫＡＲＩポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列番号６９２〜８０６のいずれか、又は本明細書に記載される任意の他の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の同一性を有する核酸配列を含む。実施形態では、ポリヌクレオチドは１つ以上のプロモーターに作動可能に連結される。実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の終結領域に作動可能に連結される。実施形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。実施形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供される。実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む組換え宿主細胞が提供される。実施形態では、この組換え宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態では、酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、又はピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母である。実施形態では、酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００２５】
図面の簡単な説明及び配列説明
本発明は、本願の一部をなす以下の詳細な説明、図、及び添付の配列説明からさらに完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」及び「ｋ」と表示されるステップが、以下に記載する基質から生成物への変換を表す。
【図２】指示される変異体により生成されたイソブタノール（ｍＭ）の箱ひげ図を示す（実施例５を参照）。
【図３】ＫＡＲＩ変異体を有する株による発酵からのグリセロール（図３Ａ）及びイソブタノール（図３Ｂ）のモル収率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
表Ｚ−表Ａに掲載され、且つ米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書及び同第２００９０１６３３７６号明細書に記載されるとおりの、実験的に検証されたＫＡＲＩ酵素のプロファイルＨＭＭの表である。
【００２８】
【表１】
0006407869.tif 000002
【００２９】
アラインメントにおける列に相当するプロファイルＨＭＭの１１個の位置は、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ−５  ＫＡＲＩにおける１１個の補因子スイッチング位置に対応するもので、位置２４、３３、４７、５０、５２、５３、６１、８０、１１５、１５６、及び１７０として同定される。表Ｚは、本明細書と共に電子的に提出され、参照により本明細書に援用される。
【００３０】
本明細書と共に電子的に提出する配列表に提供する配列は、参照により本明細書に援用される。標準に準拠して、配列表及び本明細書の配列の表に提供される特定のプライマーはＮを使用してヌクレオチドａ又はｇ又はｃ又はｔが表され；Ｋを使用してｇ又はｔが表され；Ｍを使用してａ又はｃが表され得る。
【００３１】
本発明の詳細な説明
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、それらの定義を含む本願が優先するものとする。また、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び他の参考文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
【００３２】
本明細書に開示されるポリペプチドに関連して「〜に由来する」には、指示される生物中に存在するＫＡＲＩのアミノ酸配列に基づき合成される配列、並びにそうした生物の遺伝物質から直接クローニングされる配列が包含されることは理解されるであろう。
【００３３】
「操作されたポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、合成の、即ち天然で見られるポリペプチドと何らかの形で異なるポリペプチドを指す。
【００３４】
本発明をさらに定義するため、以下の用語及び定義が本明細書に提供される。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」又は「〜を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はこれらの任意の他の変化形は、挙げられる完全体又は完全体群の包含を意味するが、しかし任意の他の完全体又は完全体群の排除を意味するものではないことが理解される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限られず、明示的には列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を包含し得る。さらに、反する旨が明記されない限り、「又は」は包含的な「又は」を指し、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢでは、以下のいずれか一つが満たされる：Ａが真であり（又は存在し）且つＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）且つＢが真である（又は存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して用いられるとおりの用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」若しくは「〜からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変化形は、任意の記載される完全体又は完全体群の包含を示し、しかし特定される方法、構造、又は組成物にさらなる完全体又は完全体群を加えることはできないことを示す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して用いられるとおりの用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」若しくは「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変化形は、任意の記載される完全体又は完全体群の包含、及び特定される方法、構造又は組成物の基本的な又は新規の特性を実質的に変化させることのない任意の記載される完全体又は完全体群の任意の包含を示す。特許審査便覧（Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．）第２１１１．０３章を参照のこと。
【００３８】
また、本発明のエレメント又は構成要素に先行する不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、インスタンスの数に関して、すなわちエレメント又は構成要素の出現に関して、非制限的なものであることが意図される。従って「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は少なくとも１つを含むものとして読まれなければならず、単数形の語形のエレメント又は構成要素はまた、数値が明らかに単数であることを意味しない限り、その複数形も含む。
【００３９】
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、非制限的な用語であり、特定の発明のいかなる単一の実施形態も参照することを意図せず、しかし、本明細書に記載されるとおりの、あらゆる可能な実施形態を包含する。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用いられる本発明の成分又は反応物の量を修飾する用語「約」は、例えば、現実の世界で濃縮物の作製又は溶液のために用いられる典型的な計測及び液体操作の手順；それらの手順における不注意による誤り；組成物の作製又は方法の実行のために用いられる成分の製造、供給源、又は純度の違いなどを通じて生じ得る数量のばらつきを指す。用語「約」はまた、特定の初期混合物によってもたらされる組成物の平衡条件の違いに起因して異なる量も包含する。用語「約」によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はそれらの量と等価な量を含む。一実施形態において、用語「約」は、報告される数値の１０％以内、好ましくは報告される数値の５％以内を意味する。
【００４１】
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、提示されるとおりの、又は後に補正及び補足されるとおりの特許請求の範囲に記載され、又は本明細書に記載されるとおりの、本発明の全ての実施形態に概して適用されることが意図される。
【００４２】
用語「イソブタノール生合成経路」は、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。特定のイソブタノール生合成経路が図１に示され、本明細書に記載される。時に「イソブタノール生合成経路」は「イソブタノール生成経路」と同義語として用いられる。
【００４３】
「操作されたアルコール生成経路」（操作されたブタノール又はイソブタノール生成経路など）を含む組換え宿主細胞とは、その宿主細胞に通常存在するものとは違う方法でアルコールを生成する修飾された経路を含む宿主細胞を指す。かかる違いには、その宿主細胞による生成が典型的でないアルコールの生成、又は増加した若しくはより効率的な生成が含まれる。
【００４４】
用語「有効イソブタノール生成能力」は、本明細書で使用されるとき、細胞１グラムあたりに生成されるイソブタノールのグラム単位での総量を指す。
【００４５】
用語「有効力価」は、本明細書で使用されるとき、発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノールの総量を指す。ブタノールの総量には、以下が含まれる：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；及び（ｉｉｉ）ガスストリッピングが用いられる場合には、気相から回収されるブタノールの量。
【００４６】
用語「有効速度」は、本明細書で使用されるとき、発酵１時間につき発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノールの総量を指す。
【００４７】
用語「有効収率」は、本明細書で使用されるとき、生物触媒によって消費される発酵性炭素基質１単位あたりに生成されるブタノールの量を指す。
【００４８】
用語「ＮＡＤＰＨ消費アッセイ」は、ＫＡＲＩ酵素の比活性を決定するための酵素アッセイを指し、酵素反応からのＫＡＲＩ補因子ＮＡＤＰＨの消失を計測することが関わる。
【００４９】
「ＫＡＲＩ」は、酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼの略称である。
【００５０】
ＮＡＤＰＨのアデノシル２’−リン酸に対するＫＡＲＩ酵素の様々なアミノ酸残基の位置を参照するときの用語「近接性」は、その酵素の構造の三次元モデルにおいて、酵素に結合したＮＡＤＰＨのアデノシル２’−リン酸のリン原子の約４．５Å以内にあるアミノ酸を意味する。
【００５１】
用語「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（略称「ＫＡＲＩ」）、及び「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」は、同義的に使用され、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に分類される（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応の触媒能を有する酵素を指す。本明細書で使用されるとき、用語「クラスＩケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素」は、典型的には３３０〜３４０アミノ酸残基を有する短い形態を意味し、クラスＩＩと称される典型的に約４９０残基を有する長い形態とは異なる。
【００５２】
用語「ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性」及び「ＫＡＲＩ活性」は、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒する能力を指す。
【００５３】
用語「アセト乳酸シンターゼ」（「ＡＬＳ」）は、ピルベートからアセトラクテート及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。アセトラクテートは２つの立体異性体（（Ｒ）及び（Ｓ））を有する；この酵素は、生物系によって作られる（Ｓ）−異性体を選好する。例示的なアセト乳酸シンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）により知られる。これらの酵素は、限定はされないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＢ１５６１８、Ｚ９９１２２、それぞれ、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＡ２５０７９、Ｍ７３８４２及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＡ２５１６１、Ｌ１６９７５）を含めた数多くの供給源から入手可能である。
【００５４】
用語「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」又は「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指す。例示的なアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼはＥＣ番号４．２．１．９により知られる。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＹＰ＿０２６２４８、ＮＣ＿０００９１３、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ＿００１１４２）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）を含めた無数の微生物から入手可能である。好適なＤＨＡＤ配列は当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に提供される。
【００５５】
用語「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」（本明細書では「ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」又は「ｋｉｖＤ」とも称される）は、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。例示的な分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼはＥＣ番号４．１．１．７２により知られ、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６、ＡＪ７４６３６４、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ−４６１３４６、ＮＣ−００３１９７）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ−１４９１８９、ＮＣ−００１９８８）を含めた数多くの供給源から入手可能である。
【００５６】
用語「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（本明細書では「アルコールデヒドロゲナーゼ」又は「ＡＤＨ」とも称される）は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。例示的な分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５により知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ１．１．１．１又は１．１．１．２）に分類されることもある。これらの酵素はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを電子供与体として利用し、限定はされないが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ−０１０６５６、ＮＣ−００１１３６；ＮＰ−０１４０５１、ＮＣ−００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ−４１７４８４、及びＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ−３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）を含めた数多くの供給源から入手可能である。
【００５７】
用語「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」は、α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル補因子Ａ）への変換を触媒する酵素を指す。かかる酵素はＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子受容体として使用し得る。例示的な分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．２．４．４により知られる。これらの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットを含み、いずれのサブユニットからの配列も、限定はされないが、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６；及びＣＡＢ１４３３７、Ｚ９９１１６）及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３；及びＡＡＡ６５６１８、Ｍ５７６１３）を含めた無数の微生物から入手可能である。
【００５８】
用語「炭素基質」又は「発酵性炭素基質」は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及び一炭素基質からなる群から選択される炭素源又はこれらの混合物を指す。
【００５９】
用語「比活性」は、本明細書で使用されるとき、所与の量のタンパク質における活性の単位として定義される。従って、比活性は直接計測されるのではなく、１）酵素試料の活性（単位／ｍｌ）を、２）当該の試料中のタンパク質濃度で除すことにより計算され、そのため比活性は単位／ｍｇで表される。純粋な、完全に活性の酵素の試料の比活性は、当該の酵素に固有である。タンパク質の混合物の試料の比活性は、目的の活性酵素で構成される当該の試料中におけるタンパク質の相対的な割合の尺度である。
【００６０】
用語「ｋｃａｔ」及び「ＫＭ」は当業者に公知であり、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｆｅｒｓｔ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８５；ｐｐ  ９８−１２０）に記載されている。ミカエリス定数ＫＭは、最大速度の半値を与える基質の濃度である。多くの場合に「ターンオーバー数」と称される用語「ｋｃａｔ」は、活性部位毎の単位時間あたりに生成物に変換される基質分子の最大数、又は単位時間あたりに酵素が代謝回転する回数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］、式中、［Ｅ］は酵素濃度である（Ｆｅｒｓｔ，前掲）。用語「総代謝回転」及び「総ターンオーバー数」は、本明細書では、ＫＡＲＩ酵素と基質との反応によって形成される生成物の量を指して使用される。
【００６１】
用語「触媒効率」は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭとして定義される。触媒効率を使用することにより、基質に対する酵素の特異性が定量化される。
【００６２】
用語「単離核酸分子」、「単離核酸断片」及び「遺伝子コンストラクト」は、同義的に使用することができ、場合により合成の、非天然の又は改変されたヌクレオチド塩基を含む一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを意味し得る。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
【００６３】
用語「アミノ酸」は、タンパク質又はポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を識別するため以下の略号を用いる。
【００６４】
【表２】
0006407869.tif 000003
【００６５】
用語「遺伝子」は、特定のタンパク質として発現することが可能な核酸断片を指し、場合によりコード配列の前にある（５’非コード配列）及びその後ろに続く（３’非コード配列）調節配列を含む。「天然遺伝子」は、天然でそれ自体の調節配列を伴い見出されるとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指し、天然で一緒に見出されることのない調節配列及びコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然で見出されるものとは異なる形で並んだ調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、微生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、通常はその宿主微生物に見出されないが、遺伝子導入によって宿主微生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然微生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中、又は下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列であって、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすものを指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造が含まれ得る。
【００６７】
用語「内因性」は、ポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドに関連して使用されるとき、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然ポリヌクレオチド又は遺伝子を指し、又は天然ポリペプチドについては、ゲノムにおけるこの位置から転写及び翻訳されるものを指す。
【００６８】
用語「異種」は、ポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドに関連して使用されるとき、通常その宿主生物に見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドを指す。「異種」はまた、対応する天然遺伝子と異なる形で、例えば生物のゲノムにおけるその天然の位置以外で供給源生物に再導入される天然コード領域、又はその一部分も含む。異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は宿主生物に、例えば遺伝子導入によって導入することができる。異種遺伝子は、天然宿主に再導入される非天然調節領域を伴う天然コード領域を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００６９】
用語「組換え遺伝子発現エレメント」は、タンパク質コード配列の前（５’非コード配列）及びその後（３’終結配列）の調節配列を含む、１つ以上の特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。キメラ遺伝子は、組換え遺伝子発現エレメントである。オペロンのコード領域は、作動可能に連結されたプロモーター及び終結領域と共に、組換え遺伝子発現エレメントを形成することができる。
【００７０】
「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造が含まれ得る。
【００７１】
用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御する能力を有する核酸配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは全体として天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成核酸セグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが遺伝子の発現を、異なる組織又は細胞型で、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件若しくは生理学的条件に応答して誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。他方で「誘導性プロモーター」は、そのプロモーターがプロモーター特異的シグナル又は分子により誘導又は惹起されると、遺伝子の発現を生じさせる。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＦＢＡ１プロモーター」は、ＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域に由来する断片を指して使用され得ることは理解されるであろう。
【００７２】
用語「ターミネーター」は、本明細書で使用されるとき、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に作用することによって特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼし得る。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じターミネーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＣＹＣ１ターミネーター」は、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指して使用され得ることは理解されるであろう。
【００７３】
用語「作動可能に連結された」は、単一の核酸断片上の核酸配列が、一方の機能が他方によって影響を受けるように関係付けられていることを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現が生じることが可能な場合、当該のコード配列と作動可能に連結されている（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結される。
【００７４】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」は、核酸断片の宿主微生物のゲノムへの導入を指し、これにより遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主微生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」微生物と称される。
【００７６】
用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運び、且つ通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの、線状又は環状の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であって、多数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられることにより、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入する能力を有する固有の構築物となった配列であり得る。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、外来宿主における当該遺伝子の発現の亢進を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００７７】
用語「部位飽和ライブラリ」は、一度に全２０個の可能なアミノ酸による特定のアミノ酸位置におけるランダム置換を含むライブラリを指す。
【００７８】
用語「エラープローンＰＣＲ」は、不完全な又は「ずさんな（ｓｌｏｐｐｙ）」ＰＣＲ反応条件を課してランダムなコピーエラーを加えることを指し、これにより特定のヌクレオチド配列における突然変異のランダム化ライブラリが生じる。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチド中のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を改良するために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
【００８０】
用語「コドンが最適化された」は、それが様々な宿主を形質転換するための核酸分子の遺伝子又はコード領域に関連するとき、そのＤＮＡによりコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映させるための、核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの改変を指す。かかる最適化は、コドンのうちの少なくとも１つ、又は２つ以上、又は多数を、当該生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つ又は複数のコドンに置き換えることを含む。
【００８１】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列の逸脱により、遺伝子をコードする配列の変化が可能となる。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、且つＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定の塩基に限られるため、ヌクレオチドには６４通りの可能な組み合わせがあり、そのうちの６１通りがアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終結させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」を、本明細書では表１Ａに再掲する。結果として、多くのアミノ酸が２つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニン及びプロリンは４つ、セリン及びアルギニンは６つのトリプレットによりコードされるが、一方トリプトファン及びメチオニンはただ１つのトリプレットによりコードされる。この縮重により、ＤＮＡベースの組成が、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、広い範囲にわたって変化を有することが可能となる。
【００８２】
【表３】
0006407869.tif 000004
【００８３】
多くの生物が、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドン使用に偏りを示す。コドン選択、又はコドンバイアスは、生物間でのコドン使用の違いであり、遺伝子コードの縮重により得られるもので、多くの生物間で十分に裏付けられている。コドンバイアスは、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、この効率が次には、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存するものと考えられる。細胞において選択的ｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンの反映である。従って遺伝子は、コドン最適化に基づき、所与の生物において最適な遺伝子発現となるよう適合させることができる。
【００８４】
幅広い動物種、植物種及び微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列を所与として、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日アクセス）で利用可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で応用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ  リリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算した酵母についてのコドン使用頻度表を、以下に表１Ｂとして再掲する。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、従ってこの表では、ＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）を使用する。表１Ｂは、全６４個のコドンについてではなく、各アミノ酸についての頻度を計算するように編集している。
【００８５】
【表４】
0006407869.tif 000005
【００８６】
【表５】
0006407869.tif 000006
【００８７】
【表６】
0006407869.tif 000007
【００８８】
この又は同様の表を利用することにより、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列にこれらの頻度を適用して、ポリペプチドをコードしながらも所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を作製することができる。
【００８９】
所与のポリペプチド配列をコードするための最適化された頻度でのコドンのランダムな割り当ては、アミノ酸毎にコドン頻度を計算し、次にポリペプチド配列にコドンをランダムに割り当てることにより、手動で行うことができる。加えて、様々なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが、当業者には容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージの「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩスイートのバックトランスレーション機能、及びＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの「バックトランスレート」機能。加えて、コード領域配列のコドン最適化のために様々なリソース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日アクセス）の「バックトランスレーション」機能及びｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（２００２年７月９日アクセス）で利用可能な「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能が、公的に利用可能である。所与の頻度に基づきコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムの構築は、当業者により基礎的な数学関数を用いて容易に達成することもできる。
【００９０】
コドン最適化コード領域は、「合成遺伝子デザイナー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｂｉｏｓｃｉ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）、２０１２年３月１９日アクセス）などのソフトウェアパッケージを含め、当業者に公知の様々な方法により設計することができる。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。従って、２つ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖を指して用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、及び用語「ポリペプチド」を、これらの用語のいずれかの代わりに、又はそのいずれかと同義的に使用することができる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来しても、又は組換え技術によって生成されてもよいが、必ずしも示される核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成によることを含め、任意の方法で生成することができる。
【００９２】
「単離されている」ポリペプチド又はその断片、変異体、若しくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルが必要とされるものではない。例えば、単離されているポリペプチドは、その天然の又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的上、任意の好適な技法によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」及び「突然変異体」は同義語であり、具体的に記載されるポリペプチドと、例えば突然変異生成などの組換えＤＮＡ技法を用いて作られた１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、及び置換だけ異なるポリペプチドを指す。目的の活性を失うことなしにどのアミノ酸残基を置換、付加、又は欠失させることができるかを決定する際の指針は、特定のポリペプチドの配列を、例えば酵母又は細菌の、相同ポリペプチド配列と比較し、高度な相同性の領域（保存領域）に生じるアミノ酸配列変化の数を最小限とすることによるか、又はアミノ酸をコンセンサス配列に置き換えることにより、見出すことができる。
【００９４】
「操作されたポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、合成の、すなわち自然の中に見られるポリペプチドと何らかの形で異なるポリペプチドを指す。
【００９５】
或いは、これらの同じ又は同様のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体を、遺伝子コードの「冗長性」を利用して合成又は選択することができる。様々な制限部位を作り出すサイレントな変化など、様々なコドン置換を導入して、発現用のプラスミド又はウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異をポリペプチド又はそのポリペプチドに加えられる他のペプチドのドメインに反映させて、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。例えば突然変異は、標的タンパク質の発現を低下又は消失させるために用いることができ、限定はされないが、遺伝子全体又は遺伝子の一部分の欠失、タンパク質を発現させないか、又はより低度に発現させるための遺伝子への（プロモーター又はコード領域のいずれかにおける）ＤＮＡ断片の挿入、機能タンパク質を発現させないための、終止コドン又はフレームシフトを加える突然変異のコード領域への導入、及び非機能性の又は酵素活性がより低いタンパク質が発現するようにアミノ酸を改変する１つ以上の突然変異のコード領域への導入が挙げられる。
【００９６】
アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えた結果、すなわち保存的アミノ酸置換であってもよく、又はアミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有するアミノ酸に置き換えた結果、すなわち非保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、又は両親媒性の性質の類似性に基づき作ることができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ；正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ；及び負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。或いは、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、又は両親媒性の性質の違いを選択して、「非保存的」アミノ酸置換を作ることができる。「挿入」又は「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的又は機能的に許容されるものとしての変化の範囲内であり得る。許容される変化は、組換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチド分子にアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に生じさせ、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることにより、実験的に決定することができる。
【００９７】
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者が配列を手作業で評価することによるか、或いはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いた、コンピュータによって自動化された配列比較及び同定より、ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列が含まれる部分である。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定的に同定するには、１０個以上の連続したアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、配列依存的な遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離方法（例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドがＰＣＲの増幅プライマーとして使用され得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定及び／又は単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。ここで当業者は、本明細書に報告されるとおりの配列の有益性により、開示される配列の全て又は実質的な部分を当業者に公知の目的のために使用し得る。従って、本発明は、添付の配列表に報告されるとおりの完全な配列、並びに上記に定義するとおりのそれらの配列の実質的な部分を含む。
【００９８】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的であり、及びＲＮＡに関して、アデニンはウラシルと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【００９９】
用語「同一性パーセント」は、当該技術分野において公知のとおり、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間における、それらの配列を比較して決定されるとおりの関係である。当該技術分野では、「同一性」はまた、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間における、場合によってはかかる配列のストリング間のマッチにより決定されるとおりの、配列の関連性の程度も意味する。「同一性」及び「類似度」は、限定はされないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含め、公知の方法によって容易に計算することができる。
【０１００】
同一性の好ましい方法は、試験する配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性及び類似度の決定方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコードとして体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて実行されてもよい。配列の多重アラインメントは、数種類のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実行され、そのアルゴリズムには、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖという名称のアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１，（１９９２）により記載される）に対応し、且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムに含まれるＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」が含まれる。多重アラインメントについて、デフォルト値はギャップペナルティ＝１０及びギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセント計算のためのデフォルトパラメータは、Ｋタプル＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナル・セーブド＝５である。核酸についてのこれらのパラメータは、Ｋタプル＝２、ギャップペナルティ＝５、ウィンドウ＝４及びダイアゴナル・セーブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。加えて、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」が利用可能であり、これはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗという名称のアラインメント方法に対応し（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）により記載される）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムに含まれる。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【０１０１】
当業者には、他の種由来などの、ポリペプチド（かかるポリペプチドは同じ又は同様の機能又は活性を有する）の同定、又は対応するポリヌクレオチドの記載において、多くの配列同一性レベルが有用であることが十分に理解される。パーセント同一性の有用な例としては、限定はされないが、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が挙げられ、又は本発明の記載においては５５％〜１００％の任意の整数百分率、例えば、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が有用であり得る。好適なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するのみならず、典型的には少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、又は少なくとも２５０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する好適なポリヌクレオチド断片は、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０２】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが：１．）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び５．）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、分析に配列分析ソフトウェアが使用される場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき「デフォルト値」は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味するものとする。
【０１０３】
標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）により；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，刊行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により記載されている。さらなる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。他の分子ツール及び技法が当該技術分野において公知であり、それには、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子座における突然変異のポジティブ選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６；Ｍ  Ａ  Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｊａｎｕａｒｙ  １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系並びに突然変異体ｌｏｘ部位及びＦＬＰ基質突然変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｐａｇｅｓ  ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｉｓｓｕｅ  ４，６４９−６５９頁）、「シームレス」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、及びギャップ修復方法論（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８：２０１−２１６；１９８１）が含まれる。
【０１０４】
本明細書に提供される組換え宿主細胞及び方法は、ＫＡＲＩ酵素が不可欠な役割を果たす微生物イソブタノール生成において生じる必要性に対処する。図１に示されるイソブタノール生合成経路では、アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレート（ＤＨＩＶ）への基質から生成物への変換がＫＡＲＩ酵素によって触媒される。
【０１０５】
イソブタノールの生成は、典型的には宿主微生物に存在する解糖経路を利用する。解糖中にグルコースから２つのピルベート分子が生成される間、正味として、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ反応によりＮＡＤ＋から２つのＮＡＤＨ分子が生成される。さらに、２つのピルベート分子から１つのイソブタノール分子が生成される間、正味として、ＫＡＲＩ反応により１つＮＡＤ（Ｐ）Ｈ分子が消費され、及びイソブタノールデヒドロゲナーゼ反応により１つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ分子が消費される。ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの相互変換は、概して酵母においては低速で非効率である；従って、消費されるＮＡＤＰＨは代謝により（例えば、ペントースリン酸経路により）生成され、この過程で基質が消費される。その間、細胞はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の恒常性を維持しようと努めるため、イソブタノール生成において生成される過剰なＮＡＤＨが他の代謝中間体の無駄な還元において；例えばピルベートからのラクテートの生成により消費される。このように、イソブタノール経路による生成されるＮＡＤＨと消費されるＮＡＤＰＨとの不均衡は、グルコースから生成されるイソブタノールのモル収率の低下を２つの形で引き起こし得る：１）ＮＡＤＰＨを生成するための不必要な代謝作業、及び２）ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ恒常性を維持するための代謝中間体の無駄な反応。
【０１０６】
生合成経路に適したＫＡＲＩ活性を有するポリペプチド
本明細書には、アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）由来のＫＡＲＩ酵素の変異体が開示される。かかる変異体は、イソブタノール生合成経路などのＫＡＲＩを利用する生合成経路の効率を特定の生成条件に対して最適化するための代替法を提供する。実施例に、アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）に由来するＫ９  ＫＡＲＩ酵素の変異体を用いるイソブタノール生成を実証する。従って、当業者はこの開示を与えられることによって、様々な生成条件に適した開示されるＫＡＲＩ酵素又はその変異体若しくは活性断片を含む組換え宿主細胞を生成することが可能である。このように、本明細書に提供される変異体はまた、ＫＡＲＩ活性によって触媒される基質から生成物への変換を含む他の生合成経路においても有用であり得る。
【０１０７】
実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号９３のＳ５６及びＳ５８に対応するアミノ酸の置換を含む。実施形態では、ＫＡＲＩ活性を有する本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号９３のＹ５３に対応するアミノ酸の置換を含む。一部の実施形態では、Ｓ５６に対応する位置のアミノ酸はＡである。一部の実施形態では、Ｓ５８に対応する位置のアミノ酸はＤ又はＥである。一部の実施形態では、Ｙ５３に対応する位置のアミノ酸は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、又はＡである。一部の実施形態では、Ｓ５６に対応する位置のアミノ酸はＶ又はＤである。一部の実施形態では、Ｓ５８に対応する位置のアミノ酸はＤ又はＱである。
【０１０８】
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号９３の９０位又は９３位又はその両方のアミノ酸に対応するアミノ酸に置換を含む。実施形態では、９０位のアミノ酸は、Ｍ、Ｌ、Ｙ、又はＡである。実施形態では、９３位のアミノ酸は、Ｉ、Ａ、Ｖ、Ｌ、又はＴである。実施形態では、両方の位置が置換される。置換の例示的な組み合わせを表３に示す。実施形態では、かかるポリペプチドはＫＡＲＩ活性を有する。
【０１０９】
他の実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号９３の９０位又は９３位又は９４位又はそれらの組み合わせのアミノ酸に対応するアミノ酸に置換を含む。実施形態では、９０位のアミノ酸は、Ｋ、Ｍ、又はＹである。実施形態では、９３位のアミノ酸は、Ａ、Ｉ、Ｔ又はＶである。実施形態では、９４位のアミノ酸は、Ｉ、Ｌ、Ｍ、又はＦである。実施形態では、これらの位置の組み合わせ又は全てが置換される。置換の例示的な組み合わせを表５及び表６に示す。実施形態では、かかるポリペプチドはＫＡＲＩ活性を有する。
【０１１０】
他の実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号２３９のＡ７３、Ｌ１６７、Ｔ１９１、Ｓ３２、Ｖ２２０、Ｌ２４３、Ｃ４６、Ｅ２００、Ｅ６８、Ｄ１４、Ｉ２３４、Ａ３１１、Ｆ１８９、Ｋ４２、Ｖ１５８、Ｇ４５、Ｐ１２４、Ｋ４２、Ｄ１９６、Ｌ２８４、Ｐ１０１、Ｍ１３２、Ｋ２７０、Ｋ７７、Ｐ１２５、Ｋ１３６、Ａ１６２、Ｄ２４２、Ｆ１１５、Ｑ２１３、Ｙ２６２、Ｆ２９２、Ｋ２３８、Ｉ２５６、Ｃ１５６、Ｍ９４、Ｆ５３、Ｃ２０９、Ｓ３３０、Ｑ９１、Ａ２１０、Ａ１５７、Ｎ１０７、Ｋ２９４、Ｖ５６、Ｉ２５、Ｈ２３５、Ｉ８４、Ｆ１８９、Ｙ２５４、Ｖ５６、Ｇ１１４、Ｅ１９４、Ｌ２１１、Ｄ２２５、Ａ１６６、Ｌ１７１、Ｔ２１８、Ｇ２４８、Ｋ９６、Ｖ１２３、Ｆ５３、Ｍ１０８、Ｅ１８６、Ｄ３０２、Ｅ５８、Ｇ２２３、Ｔ９３、Ｇ１１４、Ｇ１５１、Ｄ３０２、Ｋ４２、Ｋ２８２、Ｉ２８３、Ｇ１２０、Ｔ１９１、Ｙ２５４、Ｖ１２３、Ｋ１２６、Ｋ２８１、Ａ１７４、Ｖ１４２、Ｄ１６８、Ｅ２６１、Ａ９２、Ｍ１６９、Ｅ２７４、Ａ１７６、Ａ２１４、Ｉ９９、Ａ２１０、Ｔ１９１、Ｔ１８７、Ｌ２１９、Ｔ１８７、Ｌ２１９、Ｔ１９１、Ｇ３０４、Ａ１０５、Ｃ２０９、Ｐ１０１、Ａ２７９、Ｇ１２０、Ａ３０３、Ｋ３１４、Ｉ２７２、Ｒ１８１、Ｅ１４５、Ａ２１４、Ｔ９３、Ｄ１２７、Ｎ４０、Ｇ２０７、Ｅ３２６、Ｄ２９５、Ｅ１４７、Ｇ１４９、Ｖ２９８、Ｔ２７３、Ｔ１３１、Ｉ１２２、Ｄ２６４、Ｈ１１８、Ｒ１９０、Ｌ３１５、Ｄ２４２、Ｍ３１２、Ｓ２８５、Ｉ２３４、Ｌ８５、Ｈ１４０、又はＭ２３７に対応する少なくとも１つの位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、これらの位置の少なくとも２つ、これらの位置の少なくとも３つ、又はこれらの位置の少なくとも４つに置換を含む。かかる置換の組み合わせの例を、かかる位置での置換に好適なアミノ酸の例と共に表１１に提供する。
【０１１１】
実施形態では、ポリペプチドは、以下の置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つを含む：Ｔ１９１Ｎ、Ｔ１９１Ｓ、Ｅ５８Ｄ、Ｅ２７４Ｋ、Ｔ１８７Ｓ、Ｋ４２Ｎ、Ａ１０５Ｔ、Ａ７３Ｔ、Ａ９２Ｄ、Ａ２７９Ｔ、Ａ１７６Ｔ、Ｇ１２０Ｓ、Ｍ１６９Ｋ、Ｒ１８１Ｋ、又はＡ２１４Ｖ。
【０１１２】
実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９３の５３位に対応する位置に、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ａ、Ｅ、又はＱから選択される置換を含む。実施形態では、５３位のアミノ酸はＦである。
【０１１３】
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、以下の置換のうちの１つ又はそれらの組み合わせを含む：Ｙ５３Ｆ、Ｓ５６Ａ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ、Ｋ９０Ａ／Ｙ、Ｔ９３Ｌ、Ｍ９４Ｌ、Ｅ１４８Ｑ、Ｈ３７Ｎ、Ｇ４５Ｃ、Ｇ６６Ａ、Ｅ１４８Ｇ、Ｅ１４８Ｑ、Ｖ１５６Ａ、Ｔ１９１Ｓ、Ｙ２５４Ｆ、又はＫ２７８Ｍ。実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、配列番号９３の５３位、５６位、５７位、５８位、８７位、及び９０位に対応する位置の各々に置換を含む。実施形態では、これらの位置のアミノ酸は、５３Ｆ、５６Ａ、５７Ｅ、５８Ｅ、８７Ｐ、９０Ａ／Ｙである。実施形態では、かかるポリペプチドは、９３又は９４又はその両方に対応する位置に置換をさらに含む。実施形態では、これらの位置のアミノ酸は９３Ｌ又は９４Ｌである。かかる置換の組み合わせの例として、限定はされないが、以下を挙げることができる。
【０１１４】
【表７】
0006407869.tif 000008
【０１１５】
かかる置換の組み合わせの例として、限定はされないが、以下を挙げることができる。
【０１１６】
【表８】
0006407869.tif 000009
【０１１７】
実施形態では、ポリペプチドは、１５８位、６７位、１６２位、３１２位、１６９位、又はそれらの組み合わせに対応する位置のアミノ酸に置換を含む。実施形態では、１５８位のアミノ酸は、Ｔ、Ｋ、又はＷである。実施形態では、６７位のアミノ酸は、Ｌ、Ｍ、又はＱである。実施形態では、１６２位のアミノ酸は、Ｑ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｃ、Ｎである。実施形態では、１６９位のアミノ酸は、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｅ、又はＭである。実施形態では、３１２位のアミノ酸は、Ｃ又はＬである。
【０１１８】
実施形態では、ポリペプチドは、５３位、５６位、５７位、５８位、８７位、又はそれらの組み合わせに対応する位置のアミノ酸に置換を含む。実施形態では、ポリペプチドは、８７位、１４７位、１６４位、３０４位、２５８位、７１位、１８４位、７９位、９８位、１６９位、１００位、３１２位、又はそれらの組み合わせに置換をさらに含む。かかる置換の組み合わせの例として、限定はされないが、以下を挙げることができる。
【０１１９】
【表９】
0006407869.tif 000010
【０１２０】
かかる置換の組み合わせの例として、限定はされないが、以下を挙げることができる。
【０１２１】
【表１０】
0006407869.tif 000011
【０１２２】
実施形態では、配列番号２３９を有するＫＡＲＩ変異体は、以下から選択される１つ又は複数の置換をさらに含む：Ａ７３Ｔ；Ｌ１６７Ｍ及びＴ１９１Ｓ；Ｓ３２Ｙ及びＶ２２０Ｉ；Ｌ２４３Ｓ；Ｃ４６Ｓ及びＥ２００Ｅ；Ｅ６８Ｇ；Ｄ１４Ｎ、Ｉ２３４Ｎ及びＡ３１１Ｖ；Ｆ１８９Ｌ；Ｋ４２Ｍ及びＶ１５８Ｄ；Ｇ４５Ｄ；Ｐ１２４Ｓ；Ｋ４２Ｎ、Ｄ１９６Ｖ及びＬ２８４Ｃ；Ｐ１０１Ｓ、Ｍ１３２Ｖ及びＫ２７０Ｎ；Ｋ７７Ｍ；Ｐ１２５Ｓ；Ｋ１３６Ｅ、Ａ１６２Ｔ及びＤ２４２Ｖ；Ｆ１１５Ｉ、Ｑ２１３Ｈ及びＹ２６２Ｎ；Ｆ２９２Ｉ；Ｋ２３８Ｍ；Ｉ２５６Ｔ及びＣ１５６Ｖ；Ｍ９４Ｌ；Ｆ５３Ｌ、Ｃ２０９Ｓ及びＳ３３０Ｙ；Ｑ９１Ｒ及びＡ２１０Ｄ；Ａ１５７Ｓ；Ｎ１０７Ｓ；Ｆ５３Ｉ及びＫ２９４Ｍ；Ｖ５６Ａ；Ｉ２５Ｎ及びＨ２３５Ｙ；Ｉ８４Ｎ及びＦ１８９Ｙ；Ｙ２５４Ｈ、Ｖ５６Ａ；Ｇ１１４Ｃ、Ｅ１９４Ｄ、Ｌ２１１Ｓ及びＤ２２５Ｅ；Ａ１６６Ｔ、Ｌ１７１Ｓ、Ｔ２１８Ｉ及びＧ２４８Ｃ；Ｋ９６Ｅ及びＶ１２３Ａ；Ｋ９６Ｅ及びＶ１２３Ａ；Ｆ５３Ｉ及びＭ１０８Ｌ；Ｅ１８６Ｄ；Ｆ５３Ｉ；Ｄ３０２Ｅ；Ｅ５８Ｄ；Ｇ２２３Ｄ；Ｔ９３Ａ、Ｇ１１４Ｄ及びＧ１５１Ｓ；Ｄ３０２Ｅ；Ｋ４２Ｎ、Ｋ２８２Ｎ及びＩ２８３Ｆ；Ｇ１２０Ｓ；Ｔ１９１Ｎ及びＹ２５４Ｈ；Ｖ１２３Ａ及びＫ１２６Ｍ；Ｋ２８１Ｍ；Ａ１７４Ｄ；Ｖ１４２Ｆ、Ｄ１６８Ｅ及びＥ２６１Ｅ；Ａ９２Ｄ；Ｍ１６９Ｋ；Ｅ２７４Ｋ；Ａ１７６Ｔ；Ａ２１４Ｖ；Ｉ９９Ｖ及びＡ２１０Ｔ；Ｔ１９１Ｓ；Ｔ１８７Ｓ；Ｌ２１９Ｗ；Ｇ３０４Ｃ；Ａ１０５Ｔ；Ｃ２０９Ｒ；Ｐ１０１Ｓ；Ａ２７９Ｔ；Ｇ１２０Ｓ、Ａ３０３Ｔ及びＫ３１４Ｍ；Ｉ２７２Ｎ；Ｒ１８１Ｋ；Ｅ１４５Ｖ及びＡ２１４Ｔ；Ｔ９３Ｉ；Ｄ１２７Ｅ；Ｎ４０Ｄ及びＴ１９１Ｓ；Ｇ２０７Ｓ及びＥ３２６Ｋ；Ｄ２９５Ｅ；Ｅ１４７Ｄ；Ｇ１４９Ｃ及びＶ２９８Ａ；Ｔ２７３Ｓ；Ｔ１３１Ａ；Ｉ１２２Ｆ；Ｄ２６４Ｖ；Ｈ１１８Ｙ及びＲ１９０Ｇ；Ｌ３１５Ｍ；Ｄ２６４Ｖ；Ｄ２４２Ｎ；Ｍ３１２Ｉ；Ｓ２８５Ｙ；Ｉ２３４Ｍ；Ｌ８５Ｍ、Ｈ１４０Ｙ及びＭ２３７Ｌ；及びそれらの組み合わせ。
【０１２３】
実施形態では、配列番号２３９を有するＫＡＲＩ変異体は、以下から選択される１つ又は複数の置換をさらに含む：Ｆ５３Ｌ；Ｆ５３Ｉ；Ｆ５３Ｍ；Ｆ５３Ｖ；Ｆ５３Ｐ；Ｆ５３Ｓ；Ｆ５３Ａ；Ｆ５３Ｅ；Ｆ５３Ｑ；Ｙ５３Ｆ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ及びＮ８７Ｐ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ及びＮ８７Ｐ；Ｙ５３Ｉ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ及びＮ８７Ｐ；及びそれらの組み合わせ。
【０１２４】
実施形態では、配列番号２３９を有するＫＡＲＩ変異体は、以下から選択される１つ又は複数の置換をさらに含む：Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ及びＮ８７Ｐ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＥ１４７Ｖ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＧ１６４Ｄ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ、及びＧ３０４Ｖ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＮ２５８Ｓ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＴ７１Ｓ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＶ１８４Ｉ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＡ７９Ｄ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＤ９８Ｖ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＭ１６９Ｆ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＭ１６９Ｋ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ及びＭ１６９Ｌ；Ｙ５３Ｌ、Ｓ５６Ｖ、Ｋ５７Ｅ、Ｓ５８Ｅ、Ｎ８７Ｐ、Ｅ１００Ｑ及びＭ３１２Ｋ；及びそれらの組み合わせ。
【０１２５】
実施形態では、配列番号２３９を有するＫＡＲＩ変異体は、ＥＣＢ１１、ＥＣ２Ａ２、ＥＣ２Ｂ１２、Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ、ＥＧＣ１０、ＥＧＧ８、ＥＧＤ９、ＥＨＧ１、ＥＨＧ２、ＥＨＨ１２、ＥＨＨ１０、ＥＨＨ６、ＥＨＨ９、ＥＫＣ５、ＥＫＧ４、ＥＪＦ５、ＥＪＡ１、ＥＪＢ８、ＥＪＢ１０；及びそれらの組み合わせの置換から選択される１つ又は複数の置換をさらに含む。
【０１２６】
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、Ｋ９ＪＭ２、Ｋ９ＪＭ３、Ｋ９ＪＭ４、Ｋ９ＪＭ５、Ｋ９ＪＭ６、Ｋ９ＪＭ７、Ｋ９ＪＭ８、Ｋ９ＪＭ９、Ｋ９ＪＭ１０、Ｋ９ＪＭ１１、Ｋ９ＪＭ１２、Ｋ９ＪＭ１３、Ｋ９ＪＭ１４、Ｋ９ＪＭ１５、Ｋ９ＪＭ１６、Ｋ９ＪＭ１７、Ｋ９ＪＭ１８、Ｋ９ＪＭ１９、Ｋ９ＪＭ２０、Ｋ９ＪＭ２１、Ｋ９ＪＭ２２、Ｋ９ＪＭ２３、Ｋ９ＪＭ２４、Ｋ９ＪＭ２５、Ｋ９ＪＭ２６、Ｋ９ＪＭ２７、Ｋ９ＪＭ２８、Ｋ９ＪＭ２９、Ｋ９ＪＭ３０、Ｋ９ＪＭ３１、ＪＭ３２、ＪＭ３３、ＪＭ３４、ＪＭ３５、ＪＭ３６、ＪＭ３７、ＪＭ３８、ＪＭ３９、ＪＭ４０、ＪＭ４２、ＪＭ４３、ＪＭ４４、Ｋ９ＳＢ２、Ｋ９＿ＤＡＶＩＤ＿ＳＨ、Ｋ９ＡＬＬ３、Ｋ９＿ＵＲＳＡＬＡ（Ｋ９ＳＢ２＋Ａ５６Ｖ）、ＪＭ４１、Ｋ９ＡＬＬ１４８、Ｋ９ＪＭ１４８、Ｋ９ＡＬＬ１５６、Ｋ９ＪＭ１５６、Ｋ９ＡＬＬ１９１、Ｋ９ＪＭ１９１、Ｋ９ＡＬＬ２５４、Ｋ９ＡＬＬ２７８、Ｋ９ＡＬＬ３７、Ｋ９ＪＭ３７Ｓ、Ｋ９ＡＬＬ６６、Ｋ９ＪＭ６６、Ｋ９ＡＬＬ８Ｑ、Ｋ９ＪＭ８Ｑ、Ｋ９ＡＬＬ４５、Ｋ９＿ＬＵＣＹ、Ｋ９＿ＩＬＹＡ、Ｋ９ＡＬＬ２５８、Ｋ９ＹＷ２５−Ｔ１９１Ｓ、ＰＬＨ６８９：：ＡＬＬ３、Ｆ５３Ｌ、Ｆ５３Ｉ、Ｆ５３Ｍ、Ｆ５３Ｖ、Ｆ５３Ｐ、Ｆ５３Ｓ、Ｆ５３Ａ、Ｆ５３Ｅ、Ｆ５３Ｑ、Ｔ１１−１、Ｔ１１−２、Ｔ１１−３、Ｔ１１−４、Ｔ１１−５、Ｔ１１−６、Ｔ１１−７、Ｔ１１−１０、Ｔ１１−１２、Ｔ１１−１３、Ｔ１１−１４、Ｔ１１−１５、Ｔ１１−１６、Ｔ１１−１８、Ｔ１１−１９、Ｔ１１−２１、Ｔ１１−２２、Ｔ１１−２５、Ｔ１１−２７、Ｔ１１−２８、Ｔ１１−２９、Ｔ１１−３０、Ｔ１１−３２、Ｔ１１−３３、Ｔ１１−３５、Ｔ１１−３６、Ｔ１１−３７、Ｔ１１−３８、Ｔ１１−３９、Ｔ１１−４２、Ｔ１１−４３、Ｔ１１−４４、Ｔ１１−４５、Ｔ１１−４６、Ｔ１１−４７、Ｔ１１−４９、Ｔ１１−５０、Ｔ１１−５２、Ｔ１１−５４、Ｔ１１−５５、Ｔ１１−５６、Ｔ１１−５７、Ｔ１１−５８、Ｔ１１−５９、Ｔ１１−６０、Ｔ１１−６１、Ｔ１１−６２、Ｔ１１−６４、Ｔ１１−６６、Ｔ１１−６７、Ｔ１１−６９、Ｔ１１−７０、Ｔ１１−７２、Ｔ１１−７４、Ｔ１１−７５、Ｔ１１−７６、Ｔ１１−７９、Ｔ１１−８０、Ｔ１１−８１、Ｔ１１−８３、Ｔ１１−８４、Ｔ１１−８５、Ｔ１１−８６、Ｔ１１−８７、Ｔ１１−８８、Ｔ１１−９１、Ｔ１１−９４、Ｔ１１−９５、Ｔ１１−９６、Ｔ１１−９７、Ｔ１１−９９、Ｔ１１−１０３、Ｔ１１−１０４、Ｔ１１−１０９、Ｔ１１−１１０、Ｔ１１−１１１、Ｔ１１−１１４、Ｔ１１−１１６、Ｔ１１−１１７、Ｔ１１−１１９、Ｔ１１−１２１、Ｔ１１−１２２、Ｔ１１−１２４、Ｔ１１−１２５、Ｔ１１−１２８、Ｔ１１−１３０、Ｔ１１−１３１、Ｔ１１−１３４、Ｅ１４７Ｖ、Ｇ１６４Ｄ、Ｇ３０４Ｖ、Ｎ２５８Ｓ、Ｔ７１Ｓ、Ｖ１８４Ｉ、Ａ２７９Ｄ、Ｄ９８Ｖ、Ｍ１６９Ｆ、Ｍ１６９Ｋ、Ｍ１６９Ｌ、Ｅ１００Ｑ＿Ｍ３１２Ｋ、ＥＣＢ１１、ＥＣ２Ａ２、ＥＣ２Ｂ１２、ＥＧＣ１０、ＥＧＤ９、ＥＧＧ８、ＥＨＧ１、ＥＨＧ２、ＥＨＨ６、ＥＨＨ９、ＥＨＨ１０、ＥＨＨ１２、ＥＫＣ５、ＥＫＧ４、ＥＪＦ５、ＥＪＢ８、ＥＪＡ１、ＥＪＢ１０、Ｋ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ、又はＫ９ＪＭ１の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列又はその活性断片を含む。従って、実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、Ｋ９ＪＭ３６（配列番号２２７）、Ｋ９ＪＭ４３（配列番号２３３）、Ｋ９ＪＭ４４（配列番号２３４）、又はＫ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列、又はその活性断片を含む。実施形態では、ポリペプチドは、Ｋ９ＪＭ３６（配列番号２２７）、Ｋ９ＪＭ４３（配列番号２３３）、Ｋ９ＪＭ４４（配列番号２３４）、又はＫ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）の配列、又はその活性断片を含む。
【０１２７】
実施形態では、アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）に由来するものなどのＫＡＲＩ酵素における置換は、ＮＡＤＨに対するＫＭを低下させる。
【０１２８】
実施形態では、ポリペプチドは、１０、１５、又は２０個未満の置換を含む。実施形態では、ポリペプチドは、実験的に検証されたＫＡＲＩに基づく、且つ＜１０−３未満のＥ値で表Ｚに提供されるプロファイルＨＭＭにマッチする。配列は、ｈｍｍｓｅａｒｃｈ（Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡから入手可能なＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ）を使用して、表Ｚに提供されるプロファイルＨＭＭと比較することができる。
【０１２９】
また、本明細書には、本明細書に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、配列番号６９２〜８０６のいずれか一つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の同一性を有する配列を含む。また、本明細書には、かかるポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞及びかかる組換え宿主細胞を含む方法も提供される。
【０１３０】
分子技法
本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技法は、当該技術分野において周知されており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，発行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により記載されている。
【０１３１】
ＫＡＲＩ活性を有するさらなるポリペプチドの同定
この開示を与えられることにより、当業者は、ＫＡＲＩ活性を有するさらなる好適なポリペプチドを同定することが容易に可能となる。文献及び当業者に周知されているバイオインフォマティクスデータベースにおいて、本明細書に開示される配列及び当該技術分野で利用可能な配列を使用して、他のポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドの配列を同定することができる。例えば、かかる配列は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列による公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索により同定することができる。かかる方法では、同一性は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき得る。
【０１３２】
加えて、本明細書に開示されるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を使用して、自然中の他のＫＡＲＩ相同体を同定することができる。例えば、本明細書に開示されるＫＡＲＩをコードする核酸断片の各々を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当該技術分野において公知である。配列依存性プロトコルの例としては、限定はされないが、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）核酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）；又は鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２（１９９２）］の様々な使用によって例示されるとおりの、ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅の方法；及び（３）ライブラリ構築及び相補性によるスクリーニングの方法が挙げられる。
【０１３３】
当業者は、この開示を与えられることによって、例えば、Ｎ末端における配列アラインメントに基づき本明細書に提供されるポリペプチドをトランケートしてＫＡＲＩ活性を確認することにより、本明細書に提供されるポリペプチドの活性断片を作成し得ることが理解されるであろう。実施形態では、本明細書に提供されるアナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ及びその変異体は、野生型配列と比べてＮ末端でトランケートされる（配列番号９３）。
【０１３４】
変異体の作成
本明細書に記載される変異体は、当該技術分野において公知の任意の方法によって作成され得る。当該技術分野において公知の部位特異的突然変異誘発方法には、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＣｈａｎｇｅ−ＩＴ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＵＳＢ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が含まれる。当該技術分野において公知のランダム点突然変異誘発方法には、例えば、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２００７，５：２９，ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４１−７００７−５−２９．）又はＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、化学的突然変異原（例えばエチルメタンスルホン酸）又は紫外線への曝露、ＰＣＲにおける修飾ヌクレオチドの使用（例えば、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４，３２：３，ｅ２６．）、及び特異的ミューテーター株の使用が含まれる。当該技術分野において公知のＤＮＡ組換え又は「シャッフリング」方法には、例えば、ランダム断片化及び再構築（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２，１０７４７−１０７５１．）、ヘテロ二重鎖修復（例えば、Ｖｏｌｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９  ２７：１８，ｅ１８．）、付着伸長（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１６：３，２５８−２６１．）、アンペアードプライマーシャッフリング（例えば、Ｍｉｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，８７９，５８２号明細書）、部位特異的組換え（例えば、Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３３０：２，２８７−２９６．）、及び合成シャッフリング（例えば、Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，１２５１−１２５５．）が含まれる。他のタンパク質変異体ライブラリ構築方法には、例えば、循環置換（例えば、Ｇｕｎｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２，７（４）：ｅ３５９９８）、及び化学的ＤＮＡ合成が含まれる。当業者はこの開示を与えられることによって、本明細書に提供される変異体並びにそれと（上記に記載したとおり）同一性が１００％未満の変異体を容易に作製及び使用することができる。
【０１３５】
本明細書に記載及び実証される方法を用いて、ＫＡＲＩ活性を有するさらなるポリペプチドを得ることができる。例えば、ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドは、本明細書に記載されるとおりの部位飽和遺伝子ライブラリの構築に使用することができる。かかる遺伝子ライブラリの構築用キットが（例えば、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，＃７８４８０から）市販されている。部位特異的突然変異誘発もまた、市販のキットを使用して実施することができる（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット、カタログ番号２００５２４、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。突然変異誘発の標的部位のプライマー設計は当該技術分野で周知されており、標的部位を同定する多重配列アラインメントも同様に周知されている。
【０１３６】
補因子特異性
補因子特異性を決定するため、飽和アセトラクテートにおける各補因子のＶｍａｘ／ＫＭ比を計算し得る；ＮＡＤＨについて高い比を有する変異体ほど、等モル濃度の２つの補因子及び飽和アセトラクテートの条件下でＮＡＤＰＨと比べてＮＡＤＨでの反応速度が高くなる。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに対するＶｍａｘ値及びＫＭ値は、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に提供される方法を用いて決定することができる。例えば、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに対するＶｍａｘ値及びＫＭ値を決定するため、部分的に精製したタンパク質を様々な濃度のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨでアッセイしてもよい。
【０１３７】
ＫＡＲＩ構造
ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドの同定及び修飾において有用な構造情報は、当該技術分野において、例えばここに記載する文献、並びに本明細書と共に表Ｚに提供されるプロファイルＨＭＭ、及び米国特許出願公開第２０１００１９７５１９号明細書及び同第２００９０１６３３７６号明細書に提供されている。
【０１３８】
ＮＡＤＰＨのリン酸ｐ２’酸素原子がホウレンソウＫＡＲＩのＡｒｇ１６２、Ｓｅｒ１６５及びＳｅｒ１６７の側鎖と水素結合を形成することが報告された（Ｂｉｏｕ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：３４０５−３４１５，１９９７）。Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２８：５０５−５１５，２００３）による研究は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡＯ−ＫＡＲＩ）について、その構造をホウレンソウＫＡＲＩの構造と比較した後に、３つのＮＡＤＰＨリン酸結合部位（Ａｒｇ４７、Ｓｅｒ５０及びＴｈｒ５２）を同定している。ＮＡＤＰＨ、アセトラクテート及びマグネシウムイオンが結合したＰＦ５−ＫＡＲＩの構造を、ＰＦ５  ＫＡＲＩと９２％のアミノ酸配列相同性を有するＰ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１−ＫＡＲＩ（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＮＰ３，Ａｈｎ  Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２８：５０５−５１５，２００３）の結晶構造に基づき構築した。ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの構造はホモ十二量体であり、各十二量体は、広範囲の二量体界面を有する６つのホモ二量体からなる。ＫＡＲＩの活性部位はこの二量体界面に位置する。この生物学的構築物は、四面体の辺に位置する６つのホモ二量によって形成され、２３点群対称の高度に対称な十二量体をもたらす。
【０１３９】
ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの単量体Ａ及び単量体Ｂの座標並びにＰＦ５−ＫＡＲＩの配列に基づき、ＤｅｅｐＶｉｅｗ／Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒを用いてＰＦ５−ＫＡＲＩ二量体のモデルを構築した（Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：２７１４−２７２３，１９９７）。次にこのモデルを、さらなる改良のため、Ｓｉｌｉｃｏｎ  ＧｒａｐｈｉｃｓシステムのプログラムＯにインポートした（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ  ４７：１１０−１１９，１９９１）。
【０１４０】
ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの構造は、活性部位にＮＡＤＰＨ、基質若しくは阻害剤又はマグネシウムを有しない。従って、アセトラクテート（ａｃｅｔｏｌａｃａｔｅ）結合部位にマグネシウムイオン、ＮＡＤＰＨ及び阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート）を有するホウレンソウＫＡＲＩ構造（ＰＤＢ  ＩＤ  １ｙｖｅ，Ｂｉｏｕ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：３４０５−３４１５，１９９７）を使用して、活性部位におけるこれらの分子をモデル化した。植物ＫＡＲＩは、ＰＦ５−ＫＡＲＩとも、又はＰＡＯ１  ＫＡＲＩとも、ほとんど配列相同性を有しない（＜２０％アミノ酸同一性）が、しかしながらこれらの２つのＫＡＲＩ酵素の活性部位領域における構造は、極めて類似している。これらの２つのＫＡＲＩ構造の活性部位を重ね合わせるため、プログラムＯのコマンドＬＳＱ＿ｅｘｔ、ＬＳＱ＿ｉｍｐｒｏｖｅ、ＬＳＱ＿ｍｏｌを使用して、ホウレンソウＫＡＲＩの単量体Ａの活性部位をＰＦ５  ＫＡＲＩモデルの単量体Ａと整列させた。ホウレンソウＫＡＲＩの活性部位において結合するＮＡＤＰＨ、２個のマグネシウムイオン及び阻害剤の座標を抽出し、ＰＦ５  ＫＡＲＩの分子Ａに組み込んだ。プログラムによって計算される単量体Ａから単量体Ｂへの変換演算子を適用することにより、ＰＦ５  ＫＡＲＩの単量体Ｂ用のこれらの分子の座標セットを作成した。
【０１４１】
ＰＡＯ１  ＫＡＲＩ結晶構造の活性部位にはＮＡＤＰＨがないため、ＮＡＤＰＨ結合部位におけるリン酸結合ループ領域（ＰＡＯ１  ＫＡＲＩの残基４４〜４５、ホウレンソウＫＡＲＩの１５７〜１７０）の構造は、両者間で極めて異なる。ＮＡＤＰＨ結合形態をモデル化するため、ＰＦ５−ＫＡＲＩリン酸結合ループ（４４〜５５）のモデルを１ｙｖｅ（１５７〜１７０）のモデルに置き換えた。これら両者間における側鎖の不一致は全て、プログラムＯのｍｕｔａｔｅ＿ｒｅｐｌａｃｅコマンドを使用してＰＦ５−ＫＡＲＩ配列の側鎖に変換し、置き換えられた側鎖の立体配座は手動で調整した。ＮＡＤＰＨ／Ｍｇ／阻害剤が結合した二量体ＰＦ５−ＫＡＲＩモデルの全体を、プログラムＣＮＸ（ＡＣＣＥＬＲＹＳ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ，Ｂｕｒｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ａｎｄ  Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｄ  ５４：９０５−９２１，１９９８）を使用して１ラウンドのエネルギー最小化にかけ、その後、モデルにおいて、阻害剤を基質のアセトラクテート（ＡＬ）に置き換えた。
【０１４２】
ＫＡＲＩ活性
本明細書に記載されるポリペプチドは、ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドを含む。ＫＡＲＩ活性は、当該技術分野において（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第８，１２９，１６２号明細書に）記載される方法を用いて、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素変換をアッセイすることにより確認することができる。例えば、この変換は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．のものなど）を使用して３４０ｎｍで反応からの補因子ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの消失を計測することにより追跡し得る。
【０１４３】
ＫＡＲＩ活性はまた、図１のステップａ、ｃ、ｄ、及びｅに提供される基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞において所与のＫＡＲＩを発現させて、本明細書に記載し及び実証するとおり（実施例を参照）、イソブタノールの生成を計測することによっても確認できる。或いは、ＫＡＲＩ活性は、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換の下流の生合成経路における中間生成物の生成を計測することによっても確認し得る。同様に、他の生合成経路についての基質から生成物への変換を含む宿主細胞もまた、同様の戦略を用いた、且つＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換の生合成経路生成物又は下流の中間生成物の生成を確認するＫＡＲＩ活性の確認に使用することができる。
【０１４４】
変異体が作成されると、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨでのＫＡＲＩ活性を、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に開示される方法を用いて容易に評価することができる。例えば、ＫＡＲＩ活性は、３４０ｎｍで反応からのＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの消失を計測することによるか、又はＨＰＬＣ／ＭＳを用いた２，３−ジヒドロキシイソバレレートの形成の計測によってミカエリス定数を求めることにより決定し得る。
【０１４５】
イソブタノール生成の確認
培養培地中のイソブタノールの存在及び／又は濃度は、当該技術分野で公知の多くの方法によって決定することができる（例えば、参照によって援用される米国特許第７，８５１，１８８号明細書を参照のこと）。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１カラムをＳｈｏｄｅｘ  ＳＨＧガードカラムと共に（いずれもＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）から購入し得る）を利用し、屈折率（ＲＩ）検出を伴う。クロマトグラフ分離は、０．５ｍＬ／分の流量及び５０℃のカラム温度で０．０１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として使用して達成される。用いられる条件下で、イソブタノールの保持時間は４６．６分である。
【０１４６】
或いは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法を利用することができる。例えば、特定のＧＣ方法は、ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ内径，１μｍ膜厚，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）と共に利用する。キャリアガスは、ヘッド圧力を一定として１５０℃で計測して４．５ｍＬ／分の流量のヘリウムである；注入器スプリットは２００℃で１：２５である；オーブン温度は４５℃で１分、４５から２２０℃まで１０℃／分、及び２２０℃で５分である；及び２４０℃で２６ｍＬ／分のヘリウムメークアップガスによるＦＩＤ検出が用いられる。イソブタノールの保持時間は４．５分である。
【０１４７】
ＤＨＭＢの低減
イソブタノール生合成経路を含む宿主細胞におけるＤＨＭＢの生成は、経路基質の全てが所望の生成物に変換されていないことを示している。従って、収率は低くなる。加えて、ＤＨＭＢは生成物の生成に対して阻害効果を有し得る。例えば、ＤＨＭＢは生合成経路における酵素の活性を減少させ、又は発酵中の酵母の成長及び／又は生成能力に対して他の阻害効果を有し得る。従って、本明細書に記載される方法は、発酵中におけるＤＨＭＢの低減方法を提供する。このような方法には、ＤＨＭＢの生成を減少させる方法及び発酵組成物からＤＨＭＢを除去する方法の双方が含まれる。
【０１４８】
ＤＨＭＢ生成を減少させる
本明細書に記載される一部の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する能力の低下又は消失を含むことができる。アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する宿主細胞の能力は、例えば、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは遺伝子の修飾若しくは破壊、又はアセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの修飾若しくは破壊により、低下又は消失させることができる。他の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド若しくは遺伝子に、又はアセト乳酸レダクターゼを有する内因性ポリペプチドに、欠失、突然変異、及び／又は置換を含むことができる。かかる修飾、破壊、欠失、突然変異、及び／又は置換により、低下した、実質的に消失した、又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性がもたらされ得る。本発明の一部の実施形態では、生合成経路の生成物は、アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する能力の低下又は消失を含まない組換え宿主細胞における同じ生成物の生成と比較してより高収率で又はより多量に生成される。一部の実施形態では、組換え宿主細胞におけるアセトラクテートからＤＨＭＢへの変換が低下し、実質的に消失し、又は消失する。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、以下からなる群から選択される：ＹＭＲ２２６Ｃ、ＹＥＲ０８１Ｗ、ＹＩＬ０７４Ｃ、ＹＢＲ００６Ｗ、ＹＰＬ２７５Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＲ０３６Ｃ、ＹＰＬ０６１Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＣＲ１０５Ｗ、ＹＯＲ３７５Ｃ、及びＹＤＲ５４１Ｃ。
【０１４９】
従って、生成物は、ＤＨＭＢを実質的に含まない、又はそれを含まないイソブタノールを含む組成物であってもよい。一部の実施形態では、ブタノールを含む組成物は、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．３ｍＭ以下のＤＨＭＢ、又は約０．２ｍＭのＤＨＭＢを含有する。
【０１５０】
アセト乳酸レダクターゼ活性の記載される修飾を有する本明細書に開示される組換え宿主細胞においては、アセトラクテートからＤＨＭＢ以外の基質への変換が関与する生合成経路の任意の生成物がより高い有効性で生成され得る。かかる生成物としては、限定はされないが、ブタノール、例えば、イソブタノール、２−ブタノール、及びＢＤＯ、並びに分枝鎖アミノ酸が挙げられる。
【０１５１】
一部の実施形態では、宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性ポリヌクレオチドに、少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも２つの内因性ポリヌクレオチドの各々に、少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換を触媒することができる。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、アセトラクテートから２Ｓ，３Ｓ−ＤＨＭＢ（ファストＤＨＭＢ）及び／又は２Ｓ，３Ｒ−ＤＨＭＢ（スローＤＨＭＢ）への還元の触媒能を有する。
【０１５３】
ＤＨＭＢの除去
他の実施形態において、発酵からＤＨＭＢを除去することにより、ＤＨＭＢの低減を実現することができる。従って、ＤＨＭＢ濃度が低下した発酵もまた、本明細書に記載される。ＤＨＭＢの除去により、例えば、より高純度の生成物、又は所望の純度を達成するのに必要な処理がより少ない生成物を得ることができる。従って、高い純度を有するエタノール又はブタノールなどの生合成経路の生成物を含む組成物もまた、提供される。
【０１５４】
ＤＨＭＢは、発酵プロセスの最中又はその後に除去することができ、当該技術分野において公知の任意の手段により除去することができる。ＤＨＭＢは、例えば、有機相中への抽出又は反応抽出により除去することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、発酵ブロスは、約０．５ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、又は約５０時間の発酵後に約１．０ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、又は約５０時間の発酵後に約５．０ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。
【０１５６】
生合成経路
本明細書に提供されるＫＡＲＩ変異体はイソブタノールの生成に好適であるが（実施例を参照のこと）、本明細書に開示されるＫＡＲＩが、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート又は２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートから２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートなどの、ＫＡＲＩ活性によって触媒される基質から生成物への変換を用いる任意の生合成経路で有用となり得ることが想定される。かかる経路としては、限定はされないが、パントテン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン又は３，３−ジメチルマレートの生成経路が挙げられる。
【０１５７】
一実施形態では、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むパントテン酸生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから２−デヒドロパントエートへの変換、これは例えば３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ；これはＥＣ２．１．２．１１に分類され得る）によって触媒され得る；
−２−デヒドロパントエートから（Ｒ）−パントエートへの変換、これは例えば２−デヒドロパントエート２−レダクターゼ（ｐａｎＥ；これはＥＣ１．１．１．１６９に分類され得る）によって触媒され得る
−（Ｒ）−パントエートから（Ｒ）−パントテネートへの変換。これは例えばパントエート−β−アラニンリガーゼ（ｐａｎＣ；これはＥＣ６．３．２．１に分類され得る）によって触媒され得る。
【０１５８】
別の実施形態では、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むバリン生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ２．６．１．４２に分類され得る）によって触媒され得る。
【０１５９】
別の実施形態では、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むイソロイシン生合成経路である：
−ピルベート及びα−ケトブチレートから２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る；
−２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートから２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートへの変換、これは例えばＫＡＲＩによって触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートから３−メチル−２−オキソ−ペンタノエートへの変換、これは例えばＤＨＡＤによって触媒され得る；
−３−メチル−２−オキソ−ペンタノエートからイソロイシンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ２．６．１．４２に分類され得る）によって触媒され得る。
【０１６０】
別の実施形態では、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むロイシン生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから２−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば２−イソプロピルマレートシンターゼ（ｌｅｕＡ、これはＥＣ２．３．３．１３に分類され得る）によって触媒され得る；
−２−イソプロピルマレートから２−イソプロピルマレエートへの変換、これは例えば３−イソプロピルマレートデヒドラターゼ（ｌｅｕ１；これはＥＣ４．２．１．３３に分類され得る）によって触媒され得る；
−２−イソプロピルマレエートから３−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば３−イソプロピルマレートデヒドラターゼ（ｌｅｕ１；これはＥＣ４．２．１．３３に分類され得る）によって触媒され得る；
−３−イソプロピルマレートから２−イソプロピル−３−オキソスクシネートへの変換、これは例えば３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ；これはＥＣ１．１．１．８５に分類され得る）によって触媒され得る；
−２−イソプロピル−３−オキソスクシネートから４−メチル−２−オキソペンタノエートへの変換（自発的反応）；及び
−４−メチル−２−オキソペンタノエートからロイシンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ２．６．１．４２に分類され得る）によって触媒され得る。
【０１６１】
別の実施形態では、ＫＡＲＩによって触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含む３，３−ジメチルマレート生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから（Ｒ）−３，３ジメチルマレートへの変換、これは例えばジメチルマレートデヒドロゲナーゼ（ＤＭＭＤ；これは１．１．１．８４に分類され得る）によって触媒され得る。
【０１６２】
イソブタノール生合成経路
特定の好適なイソブタノール生合成経路が、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書（参照により本明細書に援用される）に開示される。この開示されているイソブタノール生合成経路の図を、図１に提供する。米国特許出願公開第２００７００９２９５７  Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、例示的なイソブタノール生合成経路のステップには、以下の変換が含まれる：
−例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換（図１を参照、その中の経路ステップａ）、
−例えばＫＡＲＩにより触媒されるとおりの、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（図１を参照、その中の経路ステップｂ）；
−例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）とも称されるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換（図１を参照、その中の経路ステップｃ）；
−例えばケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（「ｋｉｖＤ」）とも称される分枝鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりの、２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換（図１を参照、その中の経路ステップｄ）；及び
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図１を参照、その中の経路ステップｅ）。
【０１６３】
別の例示的なイソブタノール生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる：
ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（経路ステップａ）
ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（経路ステップｂ）
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（経路ステップｃ）
ｉｖ）α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、（経路ステップｆ）
ｖ）イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、（経路ステップｇ）、及び
ｖｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換；（経路ステップｅ）
【０１６４】
別の例示的なイソブタノール生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる：
ｉ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（経路ステップａ）
ｉｉ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（経路ステップｂ）
ｉｉｉ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、（経路ステップｃ）
ｉｖ）α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、（経路ステップｈ）
ｖ）バリンからイソブチルアミンへの変換、（経路ステップｉ）
ｖｉ）イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、（経路ステップｊ）、及び
ｖｉｉ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換：（経路ステップｅ）
【０１６５】
ステップｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、及びｋに関して代替的な経路の基質から生成物への変換が、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７  Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載される。上記に記載される基質から生成物への変換並びにさらなるイソブタノール経路のものに用い得る遺伝子及びポリペプチドが、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書及び国際公開第２０１１／０１９８９４号パンフレット（双方とも参照によって本明細書に援用される）に記載される。米国特許出願公開第２０１１／０１９８９４号明細書、同第２００７００９２９５７号明細書、同第２０１０００８１１５４号明細書は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のものを含めたジヒドロキシ酸デヒドラターゼについて記載している。また、本明細書には、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ「Ｌ２Ｖ４」（アミノ酸配列番号８２２）も提供される。ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼには、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、マクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号５４２）及びリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）（配列番号５４３）に由来するものが含まれる。米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書及び米国特許出願公開第２０１１０２６９１９９号明細書（参照によって援用される）は、アルコールデヒドロゲナーゼについて記載している。アルコールデヒドロゲナーゼには、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のＳａｄＢが含まれる。さらなるアルコールデヒドロゲナーゼには、ウマ肝臓ＡＤＨ及びベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ、及びＮＡＤＨを補因子として利用するものが含まれる。一実施形態では、ブタノール生合成経路は、ａ）約３００μＭ未満、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約２０μＭ未満又は約１０μＭ未満のＮＡＤＨに対するＫＭを有するケトール酸レダクトイソメラーゼ；ｂ）ＮＡＤＨを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ；又はｃ）ａ）及びｂ）の両方を含む。
【０１６６】
さらに、米国特許出願公開第２００７００９２９５７  Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）には、キメラ遺伝子の構築並びに開示される生合成経路を使用するイソブタノール生成のための細菌及び酵母の遺伝子操作が記載される。
【０１６７】
修飾
ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の機能欠失を用いることで、生合成生成物経路に利用されるピルベートの利用可能性が高められている。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１９５０  Ａ１号明細書は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の破壊及びＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を含む酵母株を開示し、この酵母株はＤ−乳酸の生成に用いられる。米国特許出願公開第２００５／００５９１３６  Ａ１号明細書は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないグルコース耐性二炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を開示し、この酵母株は外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有し得る。Ｎｅｖｏｉｇｔ  ａｎｄ  Ｓｔａｈｌ（Ｙｅａｓｔ  １２：１３３１−１３３７（１９９６））は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの減少及びＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの増加がグリセロール収率に及ぼす影響について記載している。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書は、サイトゾルに局在するアセト乳酸シンターゼが発現し、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的に消失するように酵母を操作することによるピルベートからアセトラクテートへの変換の増加を開示している。
【０１６８】
本明細書に提供される細胞において有用であり得るさらなる修飾の例には、米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の破壊若しくはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも１つの遺伝子の破壊、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、エントナー−ドウドロフ経路を介した炭素フラックスの増加又は還元当量バランスを提供する宿主細胞に対する修飾が含まれる。他の修飾には、ピルベート利用生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが含まれる。他の修飾には、参照により本明細書に援用される２０１２年３月２３日に出願された米国特許出願第１３／４２８５８５号明細書に記載されるとおりの、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換が含まれる。実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃ又はその相同体である。さらなる修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び／又はアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの欠失、突然変異、及び／又は置換が含まれる、参照により本明細書に援用される２０１２年３月２３日に出願された米国特許出願第１３／４２８５８５号明細書。実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＬＤ６又はその相同体である。酵母生成宿主細胞がｐｄｃ−であるグルコース抑制の低減効果を有する遺伝子修飾が、米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される。
【０１６９】
国際公開第２００１／１０３３００号パンフレットは、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；及び（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換；及び／又は（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を開示している。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、又はＣＣＣ１によってコードされる。実施形態では、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、構成的突然変異体ＡＦＴ１  Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１  Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１  Ｃ２９１Ｆ、又はＡＦＴ１  Ｃ２９３Ｆである。
【０１７０】
加えて、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド及び／又はホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み得る。
【０１７１】
イソブタノール生成用の微生物宿主
イソブタノール生成用の微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母から選択され得る。イソブタノール生成に用いられる微生物宿主は、収率がブタノール毒性によって制限されることのないように、イソブタノールに耐性を有しなければならない。高力価のイソブタノールレベルで代謝的に活性な微生物は、当該技術分野において周知されている。ブタノール生成に用いられる微生物宿主は、収率がブタノール毒性によって制限されることのないように、イソブタノールに耐性を有しなければならない。ブタノール耐性突然変異体がソルベント生成クロストリジウムから単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関しては、利用可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する研究の多くが、ブタノールの毒性がエタノールより高いことを示唆しており（ｄｅ  Ｃａｖａｌｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，６４：２１５−２２，２００４）及び（Ｋａｂｅｌｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２０：２２３−２２７，２００３、Ｔｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８６：２００６−２０１８，２００４）は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵中の１−ブタノールの収率が１−ブタノールの毒性によって制限され得ることを報告している。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの一次的な効果は、膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：１２３８−１２４３，１９８５）。
【０１７２】
イソブタノールの生成用に選択する微生物宿主は、イソブタノールに耐性を有しなければならず、且つ炭水化物をイソブタノールに変換する能力を有しなければならない。好適な微生物宿主の選択基準としては、以下が挙げられる：イソブタノールに対する固有の耐性、高いグルコース利用率、遺伝子操作用の遺伝学的ツールの利用可能性、及び安定な染色体改変を生じる能力。
【０１７３】
イソブタノール耐性を有する好適な宿主株は、株の固有の耐性に基づきスクリーニングすることによって同定することができる。イソブタノールに対する微生物の固有の耐性は、最少培地で成長させたとき成長速度の５０％の阻害をもたらすイソブタノールの濃度（ＩＣ５０）を決定することによって計測できる。ＩＣ５０値は、当該技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。例えば、目的の微生物を様々な量のイソブタノールの存在下で成長させ、６００ナノメートルでの光学濃度を計測して成長速度をモニタしてもよい。成長曲線の対数期部分から倍加時間を計算し、それを成長速度の尺度として用いることができる。イソブタノール濃度に対する成長阻害率のグラフから、５０％の成長阻害を生じるイソブタノールの濃度を決定することができる。好ましくは、宿主株は約０．５％より高いイソブタノールに対するＩＣ５０を有するべきである。
【０１７４】
イソブタノール生成用の微生物宿主はまた、グルコースを高率で利用しなければならない。多くの微生物が炭水化物の代謝能を有する。しかしながら、特定の環境微生物は炭水化物を高い効率まで代謝することができず、従って好適な宿主ではない。
【０１７５】
宿主を遺伝子修飾する能力は、任意の組換え微生物の産生に必須である。遺伝子移入技術の方式は、電気穿孔、接合、形質導入又は自然形質転換によってもよい。広範な宿主接合性プラスミド及び薬剤耐性マーカーが利用可能である。クローニングベクターは、宿主微生物に対して、当該の宿主で機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づき適合される。
【０１７６】
微生物宿主はまた、炭素フローが競合する経路を不活性化するために、様々な遺伝子を欠失させて操作される必要がある。これには、不活性化を誘導するためのトランスポゾン又は染色体組込みベクターのいずれかを利用可能であることが必要である。加えて、生成宿主は、固有のイソブタノール耐性を改良する突然変異を達成することができるように、化学的突然変異生成を起こし易いものでなければならない。
【０１７７】
上記に記載される基準に基づけば、イソブタノールの生成に好適な微生物宿主としては、限定はされないが、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。好適な宿主としては、以下が挙げられる：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。一部の実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は、当該技術分野において周知されており、限定はされないが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、及びＬａｌｌｅｍａｎｄを含む様々なソースから利用可能である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、及びＣＢＳ７９６１が挙げられる。
【０１７８】
生成宿主の構築
発酵性炭素基質をイソブタノールに変換する酵素経路をコードし得る必要な遺伝子を含む組換え微生物を、当該技術分野において公知の技法を用いて構築することができる。本発明では、本発明のイソブタノール生合成経路の一つの酵素、例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、及び分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、上記に記載したとおり、様々な供給源から単離することができる。
【０１７９】
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学分野において一般的で、周知されている。例えば、遺伝子の配列が分かっている場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により好適なゲノムライブラリを作成することができ、所望の遺伝子配列と相補的なプローブでスクリーニングすることができる。配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの標準的なプライマー誘導増幅法を用いてＤＮＡを増幅することにより、適切なベクターを使用する形質転換に好適な量のＤＮＡを得ることができる。異種宿主における発現のためのコドン最適化ツールは、容易に利用可能である。一部のコドン最適化ツールは、宿主微生物のＧＣ含量に基づき利用可能である。
【０１８０】
関連する経路遺伝子が同定され、単離された後、それらの遺伝子は、当該技術分野において公知の手段によって好適な発現宿主に形質転換することができる。様々な宿主細胞の形質転換に有用なベクター又はカセットは一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの会社から市販されている。典型的にはベクター又はカセットは、関連する遺伝子の転写及び翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、及び自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列を含む。好適なベクターは、転写開始制御を含む遺伝子の領域５’及び転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含む。いずれの制御領域も形質転換宿主細胞と相同の遺伝子に由来し得るが、かかる制御領域はまた、生成宿主として選択される特定の種にとって天然でない遺伝子に由来してもよいことが理解されるべきである。
【０１８１】
所望の宿主細胞において関連する経路コード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域又はプロモーターは多数あり、当業者は精通している。事実上、これらの遺伝エレメントを駆動することが可能な任意のプロモーターが、本実施例で用いるものを含め、本発明に好適であり、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；及びｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）における発現に有用）並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター及び様々なファージプロモーターが挙げられる。酵母組換え宿主細胞には、遺伝子用の発現カセットの構築に数多くのプロモーターを使用することができ、限定はされないが、酵母における使用に好適な以下の構成的プロモーター：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３（ＧＰＤ）、ＡＤＨ１、ＩＬＶ５、及びＧＰＭ１；及び酵母における使用に好適な以下の誘導性プロモーター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＯＬＥ１、及びＣＵＰ１が挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ、及びＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐが挙げられ、参照により本明細書に援用される２０１２年３月２３日に出願された米国特許出願第１３／４２８５８５号明細書に記載されている。
【０１８２】
終結制御領域もまた、好ましい宿主にとって天然の様々な遺伝子に由来し得る。場合により、終結部位は不要であることもあり、しかしながら含まれる場合には最も好ましい。
【０１８３】
特定のベクターは、広範な宿主細菌における複製能を有し、且つ接合によって移すことができる。ｐＲＫ４０４の完全なアノテートされた配列並びに３つの関連するベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、及びｐＲＫ４４２（Ｈ）が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性菌における遺伝子操作に有益なツールであることが分かっている（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，５０：７４−７９，２００３）。広宿主域のＩｎｃ  Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体もまた、様々なグラム陰性菌において機能し得るプロモーターを伴い利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６及びｐＡＹＣ３７は、グラム陰性菌における異種遺伝子発現を可能にする多重クローニング部位と共に活性プロモーターを有する。
【０１８４】
染色体遺伝子置換ツールもまた広く利用可能である。例えば、広宿主域レプリコンｐＷＶ１０１の温度感受性変異体を修飾することによりプラスミドｐＶＥ６００２が構築されており、これを用いると、様々なグラム陽性菌に遺伝子置換を生じさせることができる（Ｍａｇｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：５６３３−５６３８，１９９２）。加えて、インビトロのトランスポソーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ）が、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給元から様々なゲノムにおけるランダム突然変異の作成に利用可能である。
【０１８５】
様々な微生物宿主におけるイソブタノール生合成経路の発現を、以下にさらに詳細に記載する。
【０１８６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に有用なベクター又はカセットは一般的であり、上記に列挙した会社から市販されている。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子は、様々な供給源から単離し、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換することができる。
【０１８７】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
一連の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターが、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における発現に利用可能であり、限定はされないが、ｐＲｈＢＲ１７及びｐＤＡ７１（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６２：６１−６８，２００３）が挙げられる。加えて、一連のプロモーターが、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における異種遺伝子発現に利用可能である（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７０：５５５７−５５６８，２００４及びＴａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６８：３４６−３５４，２００５）。Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における染色体遺伝子の標的遺伝子破壊を、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，、前掲、及びＢｒａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：２０２９−２０３６，２０００）により記載される方法を用いて作成することができる。
【０１８８】
上記に記載したとおりの、イソブタノールの生成に必要な異種遺伝子を、最初にｐＤＡ７１又はｐＲｈＢＲ７１にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換することができる。次にこのベクターを、Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．，、前掲により記載されるとおり、電気穿孔によってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に形質転換することができる。組換え体を、グルコースを含有する合成培地で成長させることができ、当該技術分野において公知の方法を用いてイソブタノールの生成を追跡することができる。
【０１８９】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法もまた、当該技術分野において公知である。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子を様々な供給源から単離し、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローニングして、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換することができる。加えて、イソブタノール生合成経路の５つの遺伝子を、発現用に２つのオペロンに分割することができる。経路の３つの遺伝子（ｂｕｂＢ、ｉｌｖＤ、及びｋｉｖＤ）は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込むことができる（Ｐａｙｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，２２７８−２２８２，１９９１）。残りの２つの遺伝子（ｉｌｖＣ及びｂｄｈＢ）は発現ベクターにクローニングして、組み込まれたイソブタノール遺伝子を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換することができる。
【０１９０】
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で複製するプラスミド及びシャトルベクターの多くは、プロトプラスト形質転換又は電気穿孔のいずれかによるＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の形質転換に用いることができる。イソブタノールの生成に必要な遺伝子を、プラスミドｐＢＥ２０又はｐＢＥ６０誘導体にクローニングすることができる（Ｎａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１１４：１２１−１２６，１９９２）。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換する方法は、当該技術分野において公知である（Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１：３７７５−３７８０，１９９５）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現用に構築されたプラスミドをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
【０１９１】
パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現について上記に記載したとおりプラスミドを構築し、それを使用してプロトプラスト形質転換によりパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）を形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
【０１９２】
アルカリゲネス（ラルストニア）・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法は、当該技術分野において公知である（Ｔａｇｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：３５８５−３５９１，１９９４）。イソブタノール生合成経路の遺伝子を上記に記載される広宿主域ベクターのいずれかにクローニングし、電気穿孔により、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）におけるポリ（ヒドロキシブチレート）経路については詳細な記載がなされており、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを修飾する様々な遺伝学的技法が公知であり、それらのツールをイソブタノール生合成経路の操作に適用することができる。
【０１９３】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，５８６，２２９号明細書（これは参照により本明細書に援用される）を参照）。ブタノール経路遺伝子をｐＰＣＵ１８に挿入することができ、このライゲートされたＤＮＡをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１  Ｃ５ａＡＲ１細胞に電気穿孔することにより、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。
【０１９４】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。酵母における遺伝子の発現には、典型的にはプロモーターが必要であり、続いて目的の遺伝子、及び転写ターミネーターが必要である。本明細書の実施例で使用されるものを含めて、数多くの酵母プロモーターを、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子用の発現カセットの構築に使用することができ、限定はされないが、構成的プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１、及びＧＰＭ、並びに誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、及びＣＵＰ１が挙げられる。好適な転写ターミネーターとしては、限定はされないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、及びＡＤＨ１が挙げられる。例えば、イソブタノール生合成経路の好適なプロモーター、転写ターミネーター、及び遺伝子を、米国特許出願公開第２０１００１２９８８６号明細書に記載されるとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及び酵母株のいずれにおける株増殖も可能にする。典型的には、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主における自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。酵母で典型的に用いられるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、及びｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、及び栄養選択用マーカーを含む。これらの４つのベクターの選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）及びＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における標準的な分子クローニング技術によるか、或いは酵母におけるギャップ修復組換え法により行うことができる。
【０１９５】
ギャップ修復クローニング手法は、酵母における高度に効率的な相同組換えを利用する。典型的には、酵母ベクターＤＮＡが消化され（例えばその多重クローニング部位において）、その配列に「ギャップ」が作り出される。目的のインサートＤＮＡが複数産生され、これらのインサートＤＮＡは、５’末端及び３’末端の両方に、互いに及びベクターＤＮＡの５’末端及び３’末端と連続的に重複する≧２１ｂｐ配列を含む。例えば、「遺伝子Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するには、発現カセット用に酵母プロモーター及び酵母ターミネーターが選択される。このプロモーター及びターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、及び遺伝子Ｘは、その供給源生物からＰＣＲ増幅されるか、或いは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られるかのいずれかである。直鎖化されたベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、及びターミネーターと直鎖化されたベクターの３’末端との間に、少なくとも２１ｂｐの重複配列が存在する。次に「ギャップ含有（ｇａｐｐｅｄ）」ベクター及びインサートＤＮＡが酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を許容する適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。正しいインサートの組み合わせの存在は、ＰＣＲマッピングにより、選択した細胞から調製されたプラスミドＤＮＡを用いて確認することができる。次に、酵母から単離されたプラスミドＤＮＡ（通常は濃度が低い）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換し、続いてミニプレップ及び制限マッピングによってプラスミドコンストラクトをさらに確認することができる。最後にコンストラクトを配列分析によって確認することができる。
【０１９６】
ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノムへの組込みもまた、酵母の相同組換えシステムを利用する。典型的には、コード領域と、さらに制御エレメント（プロモーター及びターミネーター）及び栄養要求マーカーを含むカセットが、カセットとハイブリダイズし、且つ挿入が所望されるゲノム範囲の５’側及び３’側領域と配列相同性を有する４０〜７０塩基対を含むプライマーを使用して、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅される。次にＰＣＲ産物が酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むため、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーターコンストラクトがプラスミドＤＮＡコンストラクトからＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ  ＰＣＲによるか、或いは一般的な制限消化及びクローニングによって、独立栄養マーカー（ＵＲＡ３など）とつなぎ合わされる。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含む完全なカセットが、酵母染色体上の位置「Ｙ」の５’側及び３’側領域と相同性を有する４０〜７０ｂｐを含むプライマー配列と共にＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシル不含の成長培地で選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲによるか、或いは染色体ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによって確認することができる。
【０１９７】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）におけるイソブタノール生合成経路の発現
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のファミリーに属し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターをラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、ｐＡＭβ１及びその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８３：１７５−１８２，１９９６）；及び（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３７：２２７−２３１，１９９３）；ｐＭＢＢ１、及びｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＨＷ８００（Ｗｙｃｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：１４８１−１４８６，１９９６）；接合性プラスミドであるｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：５８００−５８０４，２００２）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５８１−４５８４，１９９７）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：１２６２−１２６７，２００１）；及びｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３８：１８９９−１９０３，１９９４）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のいくつかのプラスミドもまた報告されている（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１：１２２３−１２３０，２００５）。
【０１９８】
様々なエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種（Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、及びＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））におけるイソブタノール生合成経路の発現
エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のファミリーに属し、乳酸菌種、桿菌種及びレンサ球菌種の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターを、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、ｐＡＭβ１及びその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８３：１７５−１８２，１９９６）；及び（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３７：２２７−２３１，１９９３）；ｐＭＢＢ１、及びｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＨＷ８００（Ｗｙｃｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：１４８１−１４８６，１９９６）；接合性プラスミドであるｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：５８００−５８０４，２００２）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５８１−４５８４，１９９７）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：１２６２−１２６７，２００１）；及びｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３８：，１８９９−１９０３，１９９４）が挙げられる。ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡ遺伝子を使用するＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の発現ベクターもまた、使用することができる（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：２７６３−２７６９，１９９８）。加えて、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）染色体における遺伝子置換用のベクターを使用することができる（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２：３３４−３４５，２００６）。
【０１９９】
発酵培地
本発明における発酵培地は、好適な炭素基質を含有しなければならない。好適な基質としては、限定はされないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース、又はスクロースなどのオリゴ糖類、デンプン又はセルロースなどの多糖類又はこれらの混合物、並びにチーズホエー透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの未精製混合物を挙げることができる。さらに、炭素基質はまた、二酸化炭素、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの、一炭素基質であってもよい。一炭素及び二炭素基質に加え、メチロトローフ微生物はまた、メチルアミン、グルコサミン及び様々なアミノ酸などの数多くの他の炭素含有化合物を代謝活性に利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２．（ｅｄｓ）：  Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，英国）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニン又はオレイン酸を代謝し得る（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−４８９，１９９０）。従って、本発明において利用される炭素供給源は多種多様な炭素含有基質を包含し、微生物の選択によってのみ制限されることが企図される。
【０２００】
上述の炭素基質及びそれらの混合物は全て、本発明において好適であると考えられるが、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、及びスクロースである。
【０２０１】
適切な炭素源に加え、発酵培地は好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤並びに当業者に公知の、培養物の増殖及びイソブタノール生成に必要な酵素経路の促進に好適な他の構成成分を含有しなければならない。
【０２０２】
培養条件
典型的には細胞は、適切な培地において約２５℃〜約４０℃の範囲の温度で成長させる。本発明における好適な成長培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス又は酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な市販の調製培地である。他の限定又は合成成長培地もまた使用することができ、特定の微生物の成長に適切な培地は微生物学又は発酵科学分野の当業者に周知されている。カタボライト抑制を直接的又は間接的に調節することが知られる薬剤、例えば、環状アデノシン２’，３’−一リン酸（ｃＡＭＰ）の使用もまた、発酵培地に取り入れることができる。
【０２０３】
発酵に好適なｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。
【０２０４】
発酵は好気条件下又は嫌気条件下で実施することができ、嫌気条件又は微好気条件が好ましい。
【０２０５】
工業用バッチ及び連続発酵
本方法は、バッチ発酵方法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵開始時に設定され、発酵中に人為的な改変を受けない閉鎖系である。従って、発酵開始時、培地に所望の１つ又は複数の微生物を接種し、その系に何も加えることなく発酵を生じさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合にｐＨ及び酸素濃度などの要素の制御が試みられる。バッチ系では、その系の代謝産物及びバイオマス組成物が、発酵の停止時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静止遅滞期を通じて調節され、高成長の対数期に至り、最終的に定常期に至って、そこで成長速度が低下し又は停止する。処理されない場合、定常期の細胞は最終的には死滅し得る。対数期の細胞は、概して最終生成物又は中間体の生成のバルクに関与する。
【０２０６】
標準的なバッチ系の変種がフェドバッチ系である。フェドバッチ発酵プロセスもまた本発明に好適であり、発酵の進行に伴い基質が徐々に添加される点を除いては、典型的なバッチ系を含む。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、及び培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の計測は困難であり、従ってｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの廃ガスの分圧など、計測可能な因子の変化に基づき推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野において公知であり、参照により本明細書に援用されるＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、又はＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，１９９２）に例を見ることができる。
【０２０７】
本発明はバッチ式で実施されるが、本方法を連続発酵法に適合させ得ることが企図される。連続発酵は開放系であり、ここでは限定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等量の馴化培地が処理のため取り除かれる。概して連続発酵は培養物を、細胞が主に対数期で成長している一定の高密度に維持する。
【０２０８】
連続発酵により、細胞成長又は最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの要因又は任意の数の要因を調節することが可能となる。例えば、一つの方法では、炭素源又は窒素レベルなどの制限栄養素が一定の率に維持され、且つ他のパラメータは全て調節可能とされる。他の系では、培地の濁度により計測される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼす多数の要因を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の成長条件の維持を図り、従って培地の抜き取りによる細胞損失が、発酵における細胞成長速度と釣り合わなければならない。連続発酵プロセスの栄養素及び成長因子を調節する方法、並びに生成物形成速度を最大化する技法は、工業微生物学の技術分野において公知であり、様々な方法が、Ｂｒｏｃｋ，前掲により詳述されている。
【０２０９】
本発明は、バッチ、フェドバッチ又は連続プロセスのいずれを用いても実施することができ、任意の公知の発酵方式が好適であり得ることが企図される。加えて、細胞が全細胞触媒として基板上に固定化され、イソブタノール生成用の発酵条件に供され得ることが企図される。
【０２１０】
発酵培地からのイソブタノール単離方法
生物学的に生成されたイソブタノールは、ＡＢＥ発酵の技術分野において公知の方法を用いて発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、及びこれらの中の参考文献を参照）。例えば、発酵培地から遠心、ろ過、デカンテーションなどによって固形物を取り除くことができる。次に、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、又はパーベーパレイションなどの方法を用いて、イソブタノールを発酵培地から単離することができる。
【０２１１】
イソブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を形成するため、蒸留を用いて、当該の混合物をその共沸組成まで分離し得る。蒸留を別の分離方法と組み合わせて用いると、共沸近傍の分離を達成することができる。イソブタノールの単離及び精製のために蒸留と組み合わせて用いることのできる方法としては、限定はされないが、デカンテーション、液液抽出、吸着、及び膜ベースの技法が挙げられる。加えて、イソブタノールは、共留剤を使用する共沸蒸留を用いて単離することができる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。
【０２１２】
イソブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するため、蒸留をデカンテーションと組み合わせて用いることで、イソブタノールを単離及び精製することができる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスが、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物が凝縮され、イソブタノールがデカンテーションによって発酵培地から分離される。デカントされた水相は、還流として最初の蒸留カラムに戻されてもよい。デカントされたイソブタノールリッチな有機相は、第２の蒸留カラムで蒸留によりさらに精製され得る。
【０２１３】
イソブタノールはまた、液液抽出を蒸留との組み合わせで用いても、発酵培地から単離することができる。この方法では、イソブタノールは、好適な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次にイソブタノール含有有機相を蒸留して、溶媒からブタノールが分離される。
【０２１４】
また、蒸留を吸着と組み合わせて用いてもまた、発酵培地からイソブタノールを単離することができる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に分子篩などの吸着剤を使用することにより、残りの水が除去される（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０２１５】
加えて、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて用いて、イソブタノールなどの生成物を発酵培地から単離及び精製することができる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性の膜によるパーベーパレイションにより、残りの水が除去される（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５：１９９−２１０（２００４））。
【０２１６】
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも称される）を用いてブタノール（又は他の発酵アルコール）を、それが生成される発酵槽から除去することができ、これにより微生物は、ブタノールを高収率で生成することが可能となる。当該技術分野で記載がなされている、発酵アルコールを除去するための一つのＩＳＰＲ方法は、液液抽出である。一般にブタノール発酵に関しては、例えば、ブタノール濃度が毒性レベルに達するより前の時点で、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤と接触させる。有機抽出剤及び発酵培地は二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相の濃度が低下するため、阻害性のブタノールに対する微生物の曝露が制限される。
【０２１７】
液液抽出は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書（この開示は全体として本明細書により援用される）に記載される方法に従い実施することができる。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書は、液液抽出を用いた発酵ブロスからのブタノールの生成及び回収方法について記載し、これらの方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させて、水相と有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含む。典型的には、抽出剤は、飽和、一不飽和、多価不飽和（及びこれらの混合の）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、及びこれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ用の１つ又は複数の抽出剤は、非アルコール抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、及びこれらの混合物などの外因性の有機抽出剤であってもよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、アルコールは、発酵培地中のアルコールを、有機酸（例えば脂肪酸）及びアルコールを有機酸とエステル化させる能力を有する触媒と接触させることにより形成することができる。かかる実施形態において、有機酸はＩＳＰＲ抽出剤として働くことができ、そこにアルコールエステルが分配される。有機酸は発酵槽に供給されてもよく、及び／又は発酵槽に送り込まれるバイオマスが供給する発酵性炭素に由来してもよい。供給原料中に存在する脂質は有機酸に触媒的に加水分解されることができ、同じ触媒（例えば酵素）が有機酸をアルコールとエステル化することができる。触媒は発酵前に供給原料に供給してもよく、又は供給原料の供給前若しくはその供給と同時に発酵槽に供給してもよい。触媒が発酵槽に供給されると、脂質の有機酸への加水分解及び実質的に同時の、有機酸と発酵槽に存在するブタノールとのエステル化により、アルコールエステルが得られ得る。供給原料に由来しない有機酸及び／又は天然の油もまた発酵槽に送り込むことができ、天然の油は有機酸に加水分解される。アルコールとエステル化されない有機酸は全て、ＩＳＰＲ抽出剤の一部として働き得る。アルコールエステルを含有する抽出剤は、発酵培地から分離することができ、その抽出剤からアルコールを回収することができる。抽出剤は発酵槽に再循環され得る。従って、ブタノール生成の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換は、発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下させ、増加するブタノール濃度の毒性作用から微生物を遮蔽する。加えて、脂質は有機酸に触媒的に加水分解され、それによりＩＳＰＲ抽出剤における脂質の蓄積速度を減少させることができるため、未分画の穀粒を、その脂質を分離することなしに供給原料として使用することができる。
【０２１９】
原位置生成物除去は、バッチ式又は連続式で実行することができる。連続式の原位置生成物除去では、生成物は反応器から連続的に除去される。バッチ式の原位置生成物除去では、ある容積の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、その抽出剤はプロセス中には除去されない。原位置生成物除去について、有機抽出剤は発酵の開始時に発酵培地と接触させることで、二相性発酵培地が形成される。或いは、有機抽出剤は、微生物が所望の量の成長（これは培養物の光学濃度を計測して決定することができる）を達成した後に、発酵培地に接触させることができる。さらに、有機抽出剤は、発酵培地の生成物アルコールレベルが所定レベルに達した時点で、発酵培地に接触させることができる。本発明の一部の実施形態に係るブタノール生成の場合、ブタノール濃度が毒性レベルに達するより前の時点で有機酸抽出剤を発酵培地に接触させることができ、それによりブタノールを有機酸とエステル化させてブタノールエステルを生成し、結果的に発酵槽のブタノール濃度を低下させてもよい。次に、所望の有効ブタノールエステル力価に達した後、エステル含有有機相を発酵槽から除去する（及び水相を構成する発酵ブロスから分離する）ことができる。一部の実施形態では、発酵槽中の利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後、エステル含有有機相が水相から分離される。
【０２２０】
イソブタノール生成
本明細書に記載し及び実証するとおり、本出願者らは、イソブタノール生成経路での使用に適したＫＡＲＩ酵素変異体を発見した。
【０２２１】
実施形態では、かかる変異体を用いるイソブタノール生成は、グリセロール蓄積の低下をもたらし得る。実施形態では、ＮＡＤＨに対するＫＭが非置換ポリペプチドより低い、上記に記載するＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドの変異体は、グリセロールに対するイソブタノールのモル比が増加する。実施形態では、グリセロールに対するイソブタノールのモル比は１より大きい。実施形態では、グリセロールに対するイソブタノールのモル比は２より大きい。実施形態では、モル比は３より大きい。実施形態では、モル比は４より大きく、５より大きく、６より大きく、７より大きく、８より大きく、９より大きく、１０より大きく、１２より大きく、又は１４より大きい。実施形態では、モル比は、約１〜５、約１〜１０、約２〜８、約５〜１０、約５〜１５、約１０〜１５又は約１２〜１５の範囲である。
【実施例】
【０２２２】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示として提供されるに過ぎないことが理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を把握することができ、及びその趣旨及び精神から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適合させるため本発明の様々な変更及び改良を行うことができる。
【０２２３】
一般的方法：
細菌培養物の維持及び成長に好適な材料及び方法もまた、当該技術分野において周知されている。以下の実施例での使用に好適な技法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４、又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．ＢｒｏｃｋによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９を参照することができる。細菌細胞の成長及び維持に用いる全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２２４】
用いられる略語の意味は、以下のとおりである：「Å」はオングストロームを意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｎｇ／μｌ」はナノグラム毎マイクロリットルを意味し、「ｐｍｏｌ／μｌ」はピコモル毎マイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｇ／Ｌ」はグラム毎リットルを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｌ／分」はミリリットル毎分を意味し、「ｗ／ｖ」は体積あたり重量を意味し、「ｖ／ｖ」は体積あたり体積を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＭＳ」は質量分析法を意味し、「ＨＰＬＣ／ＭＳ」は高速液体クロマトグラフィー／質量分析法を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ｄＮＴＰ」はデオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、「℃」はセルシウス度を意味し、及び「Ｖ」はボルト数を意味する。
【０２２５】
実施例に提供される置換の位置の付番は、完全長アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）に基づく。
【０２２６】
実施例で使用されるＰＮＹ２０６８株及びＰＮＹ２１１５株の構築：
ＰＮＹ２０６８及びＰＮＹ２１１５に関するさらなる遺伝子操作の宿主細胞として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＮＹ０８２７株を使用する。ＰＮＹ０８２７は、ブダペスト条約に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９にて２０１１年９月２２日にＡＴＣＣに寄託された特許寄託番号ＰＴＡ−１２１０５を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する株を参照する。
【０２２７】
ＵＲＡ３の欠失及び半数体への胞子形成
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くＫＡＮＭＸ４マーカーの除去を可能にするためｌｏｘＰ部位が隣接するＰＴＥＦ１−ｋａｎＭＸ４−ＴＥＦ１ｔカセットを含むｐＬＡ５４（配列番号１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）並びにプライマーＢＫ５０５（配列番号２）及びＢＫ５０６（配列番号３）を使用することにより行った。各プライマーのＵＲＡ３部分をＵＲＡ３  ＡＴＧの１８０ｂｐ上流の５’領域及びコード領域の７８ｂｐ下流の３’領域から得て、ｋａｎＭＸ４カセットの組込みによりＵＲＡ３コード領域の置換が生じるようにした。ＰＣＲ産物を、標準的な遺伝学的技法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＮＹ０８２７に形質転換し、３０℃の２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌジェネティシン添加ＹＥＰ培地で形質転換体を選択した。プライマーＬＡ４６８（配列番号４）及びＬＡ４９２（配列番号５）によるコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みカセットの存在を確認した。遺伝子型ＭＡＴａ／α  ＵＲＡ３／ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有するヘテロ接合二倍体：ＮＹＬＡ９８が得られた。半数体を得るため、標準方法（Ｃｏｄｏｎ  ＡＣ，Ｇａｓｅｎｔ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＭ，Ｂｅｎｉｔｅｚ  Ｔ．「パン酵母サッカロミセス・セレビシエにおける胞子形成及び四分子形成の頻度に影響を及ぼす因子（Ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂａｋｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ）」、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５  ＰＭＩＤ：７５７４６０１）を用いてＮＹＬＡ９８を胞子形成させた。マイクロマニピュレータを使用して四分子を切断し、２％グルコース添加富栄養ＹＰＥ培地で成長させた。４つの生存胞子を含む四分子をウラシル不含２％グルコース添加合成完全培地にパッチし、プライマーＡＫ１０９−１（配列番号６）、ＡＫ１０９−２（配列番号７）、及びＡＫ１０９−３（配列番号８）を使用した多重コロニーＰＣＲによって交配型を確認した。得られた同定半数体株は、ＮＹＬＡ１０３（これは遺伝子型：ＭＡＴα  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する）、及びＮＹＬＡ１０６（これは遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する）と命名した。
【０２２８】
Ｈｉｓ３の欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるため、スカーレス欠失カセットを使用した。スカーレスなＨＩＳ３欠失用のＰＣＲカセットの４つの断片を、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及び鋳型として、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製したＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ＨＩＳ３断片Ａは、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９）、及びＨＩＳ３断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１０）で増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂは、ＨＩＳ３断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１１）、及びＨＩＳ３断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１２）で増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕは、ＨＩＳ３断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１３）、及びＨＩＳ３断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１４）で増幅した。ＨＩＳ３断片Ｃは、ＨＩＳ３断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ４５８（配列番号１５）、及びプライマーｏＢＰ４５９（配列番号１６）で増幅した。ＰＣＲ産物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＡとＨＩＳ３断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９）及びｏＢＰ４５５（配列番号１２）で増幅して、ＨＩＳ３断片ＡＢを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＵとＨＩＳ３断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１３）及びｏＢＰ４５９（配列番号１６）で増幅して、ＨＩＳ３断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルと、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＨＩＳ３断片ＡＢとＨＩＳ３断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号９）及びｏＢＰ４５９（配列番号１６）で増幅して、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＮＹＬＡ１０６のコンピテント細胞をＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換し、３０℃のウラシル不含２％グルコース添加合成完全培地に播いた。３０℃のヒスチジン不含２％グルコース添加合成完全培地におけるレプリカ平板法により形質転換体をスクリーニングして、組込みが正しいことを確認した。ゲノムＤＮＡ調製を行い、５’末端用のプライマーｏＢＰ４６０（配列番号１７）及びＬＡ１３５（配列番号１８）及び３’末端用のプライマーｏＢＰ４６１（配列番号１９）及びＬＡ９２（配列番号２０）を使用するＰＣＲによって組込みを確認した。ＵＲＡ３マーカーは、標準プロトコルに従い３０℃の２％グルコース及び５−ＦＯＡ添加合成完全培地に播くことにより再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをＳＤ  −ＵＲＡ培地にパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２００３と命名される得られた同定株は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δを有する。
【０２２９】
ＰＤＣ１の欠失
内因性ＰＤＣ１コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーを含むｐＬＡ５９（配列番号２１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）並びにプライマーＬＡ６７８（配列番号２２）及びＬＡ６７９（配列番号２３）を使用することにより行った。各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＰＤＣ１開始コドンの５０ｂｐ下流の５’領域及び終止コドンの５０ｂｐ上流の３’領域から得て、ＵＲＡ３カセットの組込みによりＰＤＣ１コード領域の置換が生じ、しかしコード領域の最初の５０ｂｐ及び最後の５０ｂｐは残るようにした。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２００３に形質転換し、３０℃のウラシル不含２％グルコース添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ３３７（配列番号２４）及びＵＲＡ３の内部プライマーであるＬＡ１３５（配列番号１８）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、ＰＤＣ１コード領域の内部のプライマーＬＡ６９２（配列番号２５）及びＬＡ６９３（配列番号２６）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含２％グルコース添加合成完全培地に播いた。形質転換体を０．５％ガラクトース添加富栄養培地に播き、リコンビナーゼを誘導した。コロニーをウラシル不含２％グルコース添加合成完全培地にパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２００８と命名される得られた同定株は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２３０】
ＰＤＣ５の欠失
内因性ＰＤＣ５コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーを含むｐＬＡ５９（配列番号２１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）並びにプライマーＬＡ７２２（配列番号２８）及びＬＡ７３３（配列番号２９）を使用することにより行った。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ＰＤＣ５開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域及び終止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から得て、ＵＲＡ３カセットの組込みによりＰＤＣ５コード領域全体の置換が生じるようにした。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２００８に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ４５３（配列番号３０）及びＵＲＡ３の内部プライマーＬＡ１３５（配列番号１８）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、ＰＤＣ５コード領域の内部のプライマーＬＡ６９４（配列番号３１）及びＬＡ６９５（配列番号３２）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。形質転換体を１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養ＹＥＰ培地に播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２００９と命名される得られた同定株は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２３１】
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２欠失は、コード配列の３’末端から２５０ヌクレオチドを欠失させ、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３ヌクレオチドをインタクトなまま残すように設計した。欠失の７ヌクレオチド下流にインフレームの終止コドンが存在した。スカーレスなＦＲＡ２欠失用のＰＣＲカセットの４つの断片を、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、及び鋳型として、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製したＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ＦＲＡ２断片Ａは、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号３３）及びＦＲＡ２断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９５（配列番号３４）で増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂは、ＦＲＡ２断片Ａの３’末端と相同性を有する５’’テールを含むプライマーｏＢＰ５９６（配列番号３５）及びＦＲＡ２断片Ｕの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９７（配列番号３６）で増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕは、ＦＲＡ２断片Ｂの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９８（配列番号３７）及びＦＲＡ２断片Ｃの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５９９（配列番号３８）で増幅した。ＦＲＡ２断片Ｃは、ＦＲＡ２断片Ｕの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ６００（配列番号３９）、及びプライマーｏＢＰ６０１（配列番号４０）で増幅した。ＰＣＲ産物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＡとＦＲＡ２断片Ｂとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号３３）及びｏＢＰ５９７（配列番号３６）で増幅して、ＦＲＡ２断片ＡＢを作成した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＵとＦＲＡ２断片Ｃとを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号３７）及びｏＢＰ６０１（配列番号４０）で増幅して、ＦＲＡ２断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物はアガロースゲルと、続いてゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＦＲＡ２断片ＡＢとＦＲＡ２断片ＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号３３）及びｏＢＰ６０１（配列番号４０）で増幅して、ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２３２】
内因性ＦＲＡ２コード領域を欠失させるため、上記で得られたスカーレス欠失カセットを標準的な技法を用いてＰＮＹ２００９に形質転換し、ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。ゲノムＤＮＡ調製を行い、５’末端用のプライマーｏＢＰ６０２（配列番号４１）及びＬＡ１３５（配列番号１８）、並びに全遺伝子座を増幅するためプライマーｏＢＰ６０２（配列番号４１）及びｏＢＰ６０３（配列番号４２）を使用するＰＣＲによって組込みを確認した。ＵＲＡ３マーカーは、標準プロトコルに従い３０℃の１％エタノール及び５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）添加合成完全培地に播くことにより再利用した。５−ＦＯＡプレートからのコロニーをウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株、ＰＮＹ２０３７は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δを有する。
【０２３３】
天然２ミクロンプラスミドの付加
ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６マーカーを、ｐＬＡ５９（配列番号２９）からＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してＰＣＲ増幅し、３０℃のＳＥ  −ＵＲＡプレートにおいてＬＡ８１１×８１７（配列番号４３、４４）及びＬＡ８１２×８１８（配列番号４５、４６）２ミクロンプラスミド断片（ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ；Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ由来の天然２ミクロンプラスミドから増幅した）と共に株ＰＮＹ２０３７に形質転換した。得られた株ＰＮＹ２０３７  ２μ：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６をｐＬＡ３４（ｐＲＳ４２３：：ｃｒｅ）（ｐＬＡ３４とも称される）（配列番号２７）で形質転換し、３０℃のＳＥ  −ＨＩＳ  −ＵＲＡプレートで選択した。形質転換体をＹＰ−１％ガラクトースプレートにパッチし、３０℃で４８時間成長させることにより、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を誘導した。次に個々のコロニーをＳＥ  −ＵＲＡ、ＳＥ  −ＨＩＳ、及びＹＰＥプレートにパッチし、ＵＲＡ３マーカーの除去を確認した。得られた同定株ＰＮＹ２０５０は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンを有する。
【０２３４】
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２０６８の構築
ＰＮＹ２０６８［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ１Δ：：ＰＰＤＣ１−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６］を、ＰＮＹ２０５０から以下のとおり構築した。
【０２３５】
ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーを含むｐＬＡ５９（配列番号２１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）並びにプライマーＬＡ５１２（配列番号４７）及びＬＡ５１３（配列番号４８）を使用することにより行った。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域及び終止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から得て、ＵＲＡ３カセットの組込みによりＧＰＤ２コード領域全体の置換が生じるようにした。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０５０に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号４９）及びＵＲＡ３の内部のＬＡ１３５（配列番号１８）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域の内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号５０）及びＬＡ５１５（配列番号５１）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株ＰＮＹ２０５６は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δを有する。
【０２３６】
ＹＭＲ２２６の欠失及びＡｌｓＳの組込み
内因性ＹＭＲ２２６Ｃコード領域を欠失させるため、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種由来の遺伝子アセト乳酸シンターゼを、ＦＢＡ１プロモーター及びＣＹＣ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ７１（配列番号５２）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマーＬＡ８２９（配列番号５３）及びＬＡ８３４（配列番号５４）を使用することにより行った。各プライマーのＹＭＲ２２６Ｃ部分は、コード配列の最初の６０ｂｐ及び終止コドンの４０９ｂｐ上流の６５ｂｐから得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０５６に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＮ１２５７（配列番号５５）及びＦＢＡ１プロモーターの内部のＬＡ７４０（配列番号６１）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、ＹＭＲ２２６Ｃコード領域の内部のプライマーＮ１２５７（配列番号５５）及びＬＡ８３０（配列番号５６）、及び３’コード領域の外部のプライマーＬＡ８３０（配列番号５６）、及びＵＲＡ３マーカーの内部のＬＡ９２（配列番号２０）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株ＰＮＹ２０６１は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２３７】
ＡＬＤ６の欠失及びＫｉｖＤの組込み
内因性ＡＬＤ６コード領域を欠失させるため、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種由来のｋｉｖＤ遺伝子を、ハイブリッドＦＢＡ１プロモーター及びＴＤＨ３ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ７８（配列番号５７）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマーＬＡ８５０（配列番号５８）及びＬＡ８５１（配列番号５９）を使用することにより行った。各プライマーのＡＬＤ６部分は、コード配列の最初の６５ｂｐ及びコード領域の最後の６３ｂｐから得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０６１に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＮ１２６２（配列番号６０）及びＦＢＡ１プロモーターの内部のＬＡ７４０（配列番号６１）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、３’コード領域の外部のプライマーＮ１２６３（配列番号６２）及びＵＲＡ３マーカーの内部のＬＡ９２（配列番号２０）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株ＰＮＹ２０６５は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１を有する。
【０２３８】
ＡＤＨ１の欠失及びＡＤＨの組込み
ＡＤＨ１は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に存在する内因性アルコールデヒドロゲナーゼである。以下に記載するとおり、内因性ＡＤＨ１をベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＡＤＨ）に置換した。内因性ＡＤＨ１コード領域を欠失させるため、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ＩＬＶ５プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ６５（配列番号６３）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマーＬＡ８５５（配列番号６４）及びＬＡ８５６（配列番号６５）を使用することにより行った。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域及びコード領域の最後の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０６５に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ４１４（配列番号６６）及びＩＬＶ５プロモーターの内部のＬＡ７４９（配列番号６７）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、３’コード領域の外部のプライマーＬＡ４１３（配列番号６８）及びＵＲＡ３マーカーの内部のＬＡ９２（配列番号２０）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２０６６と命名される得られた同定株は、遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２３９】
ｐｄｃ１Δ遺伝子座へのＡＤＨの組込み
ＡＤＨのさらなるコピーをｐｄｃ１Δ領域に組み込むため、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ＡＤＨ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ６５（配列番号６３）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマーＬＡ８６０（配列番号６９）及びＬＡ６７９（配列番号２３）を使用することにより行った。各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＰＤＣ１開始コドンの６０ｂｐ上流の５’領域及び終止コドンの１０３ｂｐ上流の５０ｂｐから得た。内因性ＰＤＣ１プロモーターを使用した。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０６６に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ３３７（配列番号２４）及びＢｉＡＤＨ遺伝子の内部のＮ１０９３（配列番号７０）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、３’コード領域の外部のプライマーＬＡ６８１（配列番号７１）及びＵＲＡ３マーカーの内部のＬＡ９２（配列番号２０）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株をＰＮＹ２０６８と命名し、これは遺伝子型：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｇｐｄ２Δ  ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＰＦＢＡ１−ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｌｄ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−ＰＦＢＡ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：ＰＩＬＶ５−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ１Δ：：ＰＰＤＣ１−ＡＤＨ＿Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４０】
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５の構築
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６］の構築は、以下のとおりであった。
【０２４１】
ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内因性ＰＤＣ１プロモーターを使用してＰＮＹ２０５０のｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１遺伝子座にａｌｓＳを組み込むため、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種由来の遺伝子アセト乳酸シンターゼを、ＦＢＡ１プロモーター及びＣＹＣ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ７１（配列番号５２）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマー８９５（配列番号７２）及び６７９（配列番号７３）を使用することにより行った。各プライマーのＰＤＣ１部分は、コード配列の上流の６０ｂｐ及び終止コドンの５３ｂｐ上流の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０５０に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。３’コード領域の外部のプライマー６８１（配列番号７４）及びＵＲＡ３遺伝子の内部の９２（配列番号７５）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に陽性形質転換体をゲノムＤＮＡ用に調製し、プライマーＮ２４５（配列番号７６）及びＮ２４６（配列番号７７）を使用するＰＣＲによりスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２０９０と命名される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δ、ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６，ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４２】
ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内因性ＰＤＣ６コード領域を欠失させるため、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種由来のｋｉｖＤ遺伝子を、ハイブリッドＦＢＡ１プロモーター及びＴＤＨ３ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ７８（配列番号５７）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマー８９６（配列番号７８）及び８９７（配列番号７９）を使用することにより行った。各プライマーのＰＤＣ６部分は、コード配列の６０ｂｐ上流及びコード領域の５９ｂｐ下流から得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０９０に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。ＰＤＣ６遺伝子の内部プライマーであるプライマー３６５（配列番号８０）及び３６６（配列番号８１）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に産物が存在しない形質転換体を、コロニーＰＣＲ、遺伝子の５’末端の外部のＮ６３８（配列番号８２）及びＦＢＡ１プロモーターの内部の７４０（配列番号８３）によってスクリーニングした。次に陽性形質転換体をゲノムＤＮＡ用に調製し、ＰＤＣ６コード配列に対する２つの外部プライマーによるＰＣＲによってスクリーニングした。陽性の組込み体は４７２０ｂｐの産物を産生し得る一方、ＰＤＣ６野生型形質転換体は２１３０ｂｐの産物を産生し得る。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株はＰＮＹ２０９３と命名され、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４３】
ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内因性ＡＤＨ１コード領域を欠失させ、内因性ＡＤＨ１プロモーターを使用してＢｉＡＤＨを組み込むため、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）属の種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ＩＬＶ５プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ６５（配列番号６３）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマー８５６（配列番号８４）及び８５７（配列番号８５）を使用することにより行った。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域及びコード領域の最後の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２０９３に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＢＫ４１５（配列番号８６）及びＢｉＡＤＨ遺伝子の内部のＮ１０９２（配列番号８７）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、３’コード領域の外部のプライマー４１３（配列番号８８）及びＵＲＡ３マーカーの内部の９２（配列番号７５）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２１０１と命名される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４４】
ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
ＰＮＹ２１０１のｆｒａ２Δ遺伝子座にＢｉＡＤＨを組み込むため、ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ＩＬＶ５プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーと共に含むｐＬＡ６５（配列番号６３）から、組込みカセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマー９０６（配列番号８９）及び９０７（配列番号９０）を使用することにより行った。各プライマーのＦＲＡ２部分は、ＡＴＧを始端とするコード配列の最初の６０ｂｐ及び終止コドンの５６ｂｐ下流から得た。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２１０１に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマー６６７（配列番号９１）及びＩＬＶ５プロモーターの内部の７４９（配列番号９２）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２１１０と命名される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ２ミクロン  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４５】
ＧＰＤ２欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くＵＲＡ３マーカーの除去を可能にするため変性ｌｏｘＰ部位が隣接するＵＲＡ３マーカーを含むｐＬＡ５９（配列番号２１）から、欠失カセットをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ並びにプライマーＬＡ５１２（配列番号４７）及びＬＡ５１３（配列番号４８）を使用することにより行った。各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２開始コドンの５０ｂｐ上流の５’領域及び終止コドンの５０ｂｐ下流の３’領域から得て、ＵＲＡ３カセットの組込みによりＧＰＤ２コード領域全体の置換が生じるようにした。ＰＣＲ産物を標準的な遺伝学的技法を用いてＰＮＹ２１１０に形質転換し、３０℃のウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。５’コード領域の外部のプライマーＬＡ５１６（配列番号４９）及びＵＲＡ３の内部のＬＡ１３５（配列番号１８）を使用するコロニーＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、ＧＰＤ２コード領域の内部のプライマーＬＡ５１４（配列番号５０）及びＬＡ５１５（配列番号５１）を使用するコロニーＰＣＲによって陽性形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーター下にあるＣＲＥリコンビナーゼを含むｐＬＡ３４（配列番号２７）で形質転換することにより再利用し、３０℃のヒスチジン不含１％エタノール添加合成完全培地に播いた。１％エタノール及び０．５％ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含１％エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。ＰＮＹ２１１５と命名される得られた同定株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロン  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有する。
【０２４６】
実施例１．９０位及び９３位でのＫ９ＳＢ２＿ＳＨのコンビナトリアル突然変異誘発によるＫ９ＹＷライブラリの作成
アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ（配列番号９４）のコンビナトリアル突然変異誘発に、９０位及び９３位（付番はアナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）由来の完全長ＫＡＲＩ酵素；配列番号９３に基づく）を選択した。これらの位置における置換は、以前、Ｋ９ＳＢ２  ｅＰＣＲライブラリのスクリーニングで観察された。９０位のＬｙｓ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒと９３位のＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＡｌａとの可能な組み合わせの各々を含む一組の変異体を作成した。Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤ（配列番号９５）を初期鋳型とする９０位及び９３位での逐次的な突然変異誘発によって２５個の変異体を調製した。いずれの突然変異誘発手順も、突然変異誘発プライマーの混合物によるＰＣＲステップによって開始し、続いてそのＰＣＲ産物をメガプライマーとして用いる第２の反応を行った。
【０２４７】
９０位における突然変異誘発のためのＰＣＲ反応は、ＰＦＵｕｌｔｒａポリメラーゼ（カタログ番号６００３８０；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で実施した。混合物中のプライマー（表１；９０位）及びプライマーＳＢ２＿ｒ１（ＴＧＧ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ；配列番号９６）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）により商業的に合成された。ＰＣＲ反応は、１μｌのＫ９ＳＢ２＿ＳＨ−ＤＨＡＤ（配列番号９５）（５０ｎｇ／μｌ）、４μｌの９０混合物（１０ｕＭ）、４ｕｌ  ＳＢ２＿ｒ１（１０ｕＭ）、１０ｕｌの１０×ＰＦＵｕｌｔｒａ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μｌのＰＦＵｕｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び３４μｌのｄｄＨ２Ｏからなった。ＰＣＲ反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で２．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０．０分間６８℃に保ち、次に試料回収まで４℃に保持した。アガロースゲル電気泳動（１％アガロース、１×ＴＢＥ緩衝液）によって反応生成物を鋳型から分離し、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ及びゲルバンド精製キット（カタログ番号２８−９０３４−７０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を製造者の推奨どおり使用して回収した。
【０２４８】
【表１１】
0006407869.tif 000012
【０２４９】
単離した反応産物をメガプライマーとして用いることにより、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５２３；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて一組の９０位変異体を作成した。プライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏを除き、ここで使用した全ての試薬がこのキットに含まれたものであった。反応混合物には、１μｌ  Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤ（５０ｎｇ／μｌ）、４μｌのＫ９０メガプライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５ｕｌ  ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ、１ｕｌ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素、及び３７．５μｌのｄｄＨ２Ｏが含まれた。反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて１８回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で１４分からなった。温度サイクルの完了時点で試料を６８℃で７分間インキュベートし、次に試料回収まで４℃に保持した。２μｌのＤｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を各反応に添加し、混合物を３７℃で５分間インキュベートした。
【０２５０】
４μｌの各突然変異誘発反応物を、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（カタログ番号Ｌ１００４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）においてＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４００３）に形質転換し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プライマーｐＨＲ８１−Ｆ（ＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣ；配列番号１０７）及びｐＨＲ８１−Ｒｅｖ（ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  Ｇ；配列番号１０８）を用いたＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ベースのＤＮＡ配列決定用に複数の形質転換体を選択した。ＫＡＲＩ配列が確認された形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７０６；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、製造者により提供されるプロトコルに従い細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。クローンをＫ９０プラスミド混合物中に加え合わせた。
【０２５１】
９３位における突然変異誘発のためのＰＣＲ反応を、上記に変更を加えて実施した。９３混合物中のプライマー（表１）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）により商業的に合成された。ＰＣＲ反応は、１μｌのＫ９ＳＢ２＿ＳＨ−ＤＨＡＤ（配列番号９５）（５０ｎｇ／μｌ）、４μｌの９３混合物（１０ｕＭ）、４ｕｌ  ＳＢ２＿ｒ１、１０ｕｌの１０×ＰＦＵ  ｕｌｔｒａ反応緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μｌのＰＦＵｕｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び３４μｌのｄｄＨ２Ｏからなった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キットを用いる続く反応を、上記に変更を加えて実施した。反応混合物には、１μｌ  Ｋ９０  プラスミド混合物（５０ｎｇ／μｌ）、４μｌのＫ９０メガプライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５ｕｌ  ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ、１ｕｌ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素、及び３７．５μｌのｄｄＨ２Ｏが含まれた。
【０２５２】
２つの突然変異誘発ステップ及びｔｅｍｐｌｉｐｈｉベースのＤＮＡ配列決定により、２５個の変異体のプラスミドが単離され、ＤＮＡ配列を再確認した。変異体のアミノ酸置換を表２に提供する。
【０２５３】
【表１２】
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【０２５４】
実施例２．Ｋ９ＹＷ変異体の酵母イソブタノール生成
９０位及び９３位におけるコンビナトリアル突然変異誘発から得られた２５個のプラスミドを用いて、４８ウェルプレートにおいて嫌気条件下で成長する酵母のイソブタノール生成を評価した。イソブタノール生成株は、宿主ＰＮＹ２２５９（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ６Δ  ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ  ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ  ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ  ｙｍｒ２２６ｃΔ  ａｌｄ６Δ：：ｌｏｘＰ）において、ＫＡＲＩ変異体のコード配列を含むプラスミドを形質転換してウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播くことにより作成した。３０℃で３〜５日間インキュベートした後、ＳＥ−Ｕｒａプレート上に形質転換からの酵母コロニーが現れた。各変異体から少なくとも３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａプレートにパッチし、３０℃でインキュベートした。
【０２５５】
酵母培養条件：
好気培養培地：２ｇ／ｌエタノール含有ＳＥ  −Ｕｒａ培地。
嫌気培養培地：１０ｍｇ／ｌエルゴステロール、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、３０ｍｇ／ｌチアミン、及び３０ｍｇ／ｌニコチン酸を添加した３０ｇ／ｌグルコース及び１ｇ／ｌエタノール含有ＳＥＧ  −Ｕｒａ。
４８ウェルプレート：Ａｘｙｇｅｎ  カタログ番号Ｐ−５ＭＬ−４８−Ｃ−Ｓ、５ｍｌ／ウェル総容積、１．５ｍｌ／ウェルの培養容積。
【０２５６】
好気培養は、プレートを透過性粘着フィルム（ＶＷＲ；カタログ番号６０９４１−０８６）で覆った。プレートは３０℃で２２５ｒｐｍで振盪した。嫌気培養は、透過性フィルムで覆った接種したばかりのプレートから、嫌気チャンバで２時間平衡させて酸素をパージした。次にプレートカバーを粘着性アルミニウムカバー（ＶＷＲ；カタログ番号８９０４９−０３４）に交換し、各プレートを気密性プラスチックボックス（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；カタログ５０−２５）の中に、新鮮な脱酸素剤パック（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｇａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；カタログ１０−０１）と一緒に置いた。集合体全体（密閉された気密性プラスチックボックスの中にある１つ又は複数のプレート及び脱酸素剤パック）を嫌気チャンバから取り出し、３０℃で２２５ｒｐｍで振盪した。
【０２５７】
実験プロトコル
ＳＥ  −Ｕｒａ寒天プレート上の単一の酵母コロニーを新鮮なＳＥ  −Ｕｒａ寒天プレートにストリークし、高密度の細胞パッチが成長するまで３０℃でインキュベートした。最初の好気培養のため、４８ウェルプレートにある液体前培養物にこれらの細胞のループを接種した。一晩振盪した後、各ウェルの０．１５ｍｌを平底９６ウェルプレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）プレートリーダーで各ウェルの６００ｎｍの吸光度を計測することにより、各培養ウェルのＯＤ６００を計測した。実験的に決定された検量線に基づく線形変換をこれらのプレートリーダーの計測による光学濃度に当てはめることにより、それらの光学濃度をキュベットベースの分光光度計に相当する吸光度の値に変換した。
【０２５８】
各好気前培養ウェルの計算した部分量を、１．５ｍｌのＳＥＧ  −Ｕｒａ培地が入った新鮮な４８ウェルプレートの対応するウェルに、０．２の初期ＯＤ６００（キュベット分光光度計吸光度単位で）に達するように接種した。新鮮なプレートの接種過程で好気前培養プレートを遠心し、各ウェルから上清を除去し、各ウェルの細胞を新鮮なＳＥＧ  −Ｕｒａ培地に再懸濁した。この嫌気培養プレートを２日間振盪した。培養上清中のイソブタノール濃度をＨＰＬＣによって計測した（表３）。
【０２５９】
【表１３】
0006407869.tif 000014
【０２６０】
実施例３．９０位、９３位、及び９４位におけるＫ９ＳＢ２＿ＳＨのコンビナトリアル突然変異誘発によるＫ９ＪＭライブラリの作成
９０位、９３位、及び９３位におけるコンビナトリアル突然変異誘発に基づきＫ９ＳＢ２＿ＳＨのさらなる誘導体を調製した（付番は完全長アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩに基づく）。作成した変異体は、９０位にＬｙｓ、Ｍｅｔ、又はＴｙｒを含み、９３位にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、又はＶａｌを含み、及び９４位にＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、又はＰｈｅを含んだ。突然変異誘発は、最初に突然変異誘発プライマーの混合物によるＰＣＲステップ、続いてそのＰＣＲ産物をメガプライマーとして用いる一連の反応を行うことにより実施した。表４に掲載する突然変異誘発プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）により商業的に合成された。
【０２６１】
【表１４】
0006407869.tif 000015
【０２６２】
【表１５】
0006407869.tif 000016
【０２６３】
突然変異誘発プライマーによるＰＣＲ
プライマーを６つのグループに組み合わせた。グループ１：プライマー１〜１０；グループ２：プライマー１１〜２０；グループ３：プライマー２１〜３０；グループ４：プライマー３１〜４０；グループ５：プライマー４１〜５０；グループ６：プライマー５１〜５８。各プライマーの１０μＬのアリコートを滅菌１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。次にプライマー混合物を分子生物学級の水で、最終的な総濃度が１０μＭとなるように１０倍希釈した。リバースプライマーは、最終濃度が１０μＭとなるように１０倍希釈した。
【０２６４】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してＰＣＲを実施した；プライマー、ＤＮＡ鋳型及び分子生物学級の水を除く全ての試薬は、このポリメラーゼと共に供給されたものであった。使用したＤＮＡ鋳型はプラスミドＫ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤ（配列番号９５）であった。ＰＣＲ反応には、１０μＬ  ５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、２μＬ  ５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μＬの１０μＭフォワードプライマー混合物、２．５μＬの１０μＭリバースプライマー、２μＬ  ５０ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ、０．５μＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ及び３０．５μＬ分子生物学級の水が含まれた。全ての反応に、以下の条件を用いた：開始温度は９８℃で３０秒、続いて３０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９８℃で１０秒、５８℃で１５秒、及び７２℃で２．０分からなった。温度サイクルの完了時点で最後の７２℃ステップを５．０分間実行し、試料は試料回収が行われるまで４℃に保持した。
【０２６５】
ゲル電気泳動を用いて所望のＰＣＲ産物を分離した。５．５μＬ  １０×ローディングダイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０８１６−０１５）を各試料に加えた。２０μＬの各試料を１％アガロースゲルのレーンにロードし、ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液中１４０Ｖで３０分間泳動させることによりＤＮＡサイズを分離した。予想された断片サイズは約３５００ｂｐであり、このサイズのバンドをゲルから切り出し、予め秤量してある滅菌エッペンドルフチューブに入れた。これらのチューブを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（カタログ番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、以下の変更を加えた製造者のプロトコルに従いゲルから精製した。フィルタユニットは７５０μＬ  ＰＥ緩衝液で３回洗浄した。次に、回収されたＰＣＲ産物を、このプロセスにおける次のステップのプライマーとして使用した。
【０２６６】
メガプライマーによる酵母発現プラスミドの増幅
ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２１０５１８；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いることにより、プラスミドを増幅して突然変異を導入するＰＣＲステップを実施した。反応は、２５０ｎｇの精製メガプライマーＰＣＲ産物、１００ｎｇ  Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤ鋳型ＤＮＡ（配列番号９５）、５μＬ  １０×反応緩衝液、１．５μＬ  Ｑｕｉｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１μＬ  ｄＮＴＰ混合物及び総反応容積を５０μＬにするための所定量の分子生物学級の水からなった。プライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏを除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示するキットに含まれたものであった。両方の反応に、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で３０秒、続いて１６回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６．０分からなった。温度サイクルの完了時点で、試料を試料回収まで４℃に保持した。１μｌのＤｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を各反応に添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【０２６７】
２μｌの各突然変異誘発反応物を、製造者の指示に従いＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４００３）に形質転換した。この形質転換体を、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（カタログ番号Ｌ１００４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プライマーｐＨＲ８１−Ｆ（ＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣ；配列番号１０７）及びｐＨＲ８１−Ｒｅｖ（ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  Ｇ；配列番号１０８）を用いたＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ベースのＤＮＡ配列決定用に複数の形質転換体を選択した。ＫＡＲＩ配列が確認された形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７０６；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、製造者により提供されるプロトコルに従い細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。ＫＡＲＩ  ＪＭ１〜ＪＭ３１が同定され（表５）、イソブタノール生成を分析した（実施例４）。
【０２６８】
【表１６】
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【０２６９】
２順目の突然変異誘発を実施して、さらなる変異体を作成した。
【０２７０】
メガプライマー作成ＰＣＲ
表４のプライマーの一部を３つのグループに組み合わせた。グループＳ−１：プライマー３１、４４、４５、４８、５５、５６及び５８；グループＳ−２：プライマー２２、２５、２８及び４１；グループＳ−３：プライマー２４、３７、４０、４３及び５２。各プライマーの１０μＬのアリコートを滅菌１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。次にプライマー混合物を分子生物学級の水で、最終的な総濃度が１０μＭとなるように１０倍希釈した。リバースプライマーは、最終濃度が１０μＭとなるように１０倍希釈した。
【０２７１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  英国  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してＰＣＲを実施した；プライマー、ＤＮＡ鋳型及び分子生物学級の水を除く全ての試薬は、このポリメラーゼと共に供給されたものであった。グループＳ−１、Ｓ−２及びＳ−３のＤＮＡ鋳型は、それぞれＪＭ３１（配列番号２２２）、ＪＭ２９（配列番号２２０）及びＪＭ１６（配列番号２０７）であった。メガプライマーＰＣＲ反応は、１０μＬ  ５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１μＬ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μＬの１０μＭフォワードプライマー混合物、２．５μＬの１０μＭリバースプライマー、２．５μＬ  １ｎｇ／μＬ鋳型ＤＮＡ、０．５μＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ及び１μＬ  ５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び３２．５μＬ分子生物学級の水からなった。全ての反応に、以下の条件を用いた：開始温度は９８℃で３０秒、続いて３０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、及び７２℃で２分２０秒からなった。温度サイクルの完了時点で最後の７２℃ステップを５．０分間実行し、試料は試料回収が行われるまで４℃に保持した。
【０２７２】
ゲル電気泳動を用いて所望のＰＣＲ産物を分離した。５．５μＬ  １０×ローディングダイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０８１６−０１５）を各試料に加えた。２０μＬの各試料を１％アガロースゲルのレーンにロードし、ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液中１４０Ｖで３０分間泳動させることにより、ＤＮＡサイズを分離した。予想された断片サイズは約３５００ｂｐであり、このサイズのバンドをゲルから切り出し、予め秤量してある滅菌エッペンドルフチューブに入れた。これらのチューブを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（カタログ番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、以下の変更を加えた製造者のプロトコルに従いゲルから精製した。フィルタユニットは７５０μＬ  ＰＥ緩衝液で３回洗浄した。次に、回収されたＰＣＲ産物を、このプロセスにおける次のステップのプライマーとして使用した。
【０２７３】
メガプライマーによる酵母発現プラスミドの増幅
ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２１０５１８；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いることにより、プラスミドを増幅して突然変異を導入するＰＣＲステップを実施した。反応は、２５０ｎｇの精製メガプライマーＰＣＲ産物、１００ｎｇ  Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤ鋳型ＤＮＡ（配列番号９５）、５μＬ  １０×反応緩衝液、１．５μＬ  Ｑｕｉｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１μＬ  ｄＮＴＰ混合物及び総反応容積を５０μＬにするための所定量の分子生物学級の水からなった。プライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏを除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示するキットに含まれたものであった。両方の反応に、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で３０秒、続いて１６回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で６．０分からなった。温度サイクルの完了時点で、試料を試料回収まで４℃に保持した。１μｌのＤｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を各反応に添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【０２７４】
２μｌの各突然変異誘発反応物を、製造者の指示に従いＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４００３）に形質転換した。この形質転換体を、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（カタログ番号Ｌ１００４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プライマー、プライマーｐＨＲ８１−Ｆ（ＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣ；配列番号１０７）及びｐＨＲ８１−Ｒｅｖ（ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  Ｇ；配列番号１０８）を用いたＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ベースのＤＮＡ配列決定用に複数の形質転換体を選択した。ＫＡＲＩ配列が確認された形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７０６；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、製造者により提供されるプロトコルに従い細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。ＫＡＲＩ  ＪＭ３２〜ＪＭ４４が同定され（表６を参照）、イソブタノール生成を分析した（実施例５）。
【０２７５】
【表１７】
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【０２７６】
実施例４．ＰＮＹ２２５９におけるＪＭ変異体のイソブタノール生成
成長培地
酵母株を成長させる手順の中では、３種類の培地を使用した：ＳＥ−ｕｒａ回収プレート、好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２７７】
酵母形質転換回収プレート（ＳＥ−ｕｒａ）：５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．０１％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０２７８】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．１％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０２７９】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．１％ヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌチアミン及び１０ｍｇ／Ｌエルゴステロール。
【０２８０】
ディープウェルプレート成長手順
好気前培養培地の１．５ｍＬアリコートをＡｘｙｇｅｎ  ４８ディープウェルプレート（＃Ｐ−５ｍＬ−４８−Ｃ−Ｓ，Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の各ウェルに分注し、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ寒天プレートで成長した細胞を接種した。滅菌通気性カバー（＃６０９４１−０８６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を使用して培養プレートを密閉した。プレートを３０℃のインキュベーターに置き、振盪しながら２４時間成長させて、このとき１．５〜２．０の目標ＯＤ６００値に達した（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ３８４  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって決定するとき）。ＯＤ６００値を記録した。プレートにおいて、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ１Ｒ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＭ−２０プレートロータ（＃４１１０２７４２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した遠心によって細胞をペレット化し、生じた上清は廃棄した。細胞ペレットをＣｏｙ嫌気バッグ（Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に移し、そこでペレットを、嫌気条件に少なくとも２４時間平衡させた０．１ｍＬの嫌気成長培地（上記に記載される）に再懸濁した。ペレット／培地懸濁液を使用して、Ａｘｙｇｅｎ  ４８ディープウェルプレート（＃Ｐ−５ｍＬ−４８−Ｃ−Ｓ，Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中の１．５ｍＬアリコートの嫌気培養培地を、０．２の初期目標ＯＤ６００値となるように接種した。次にプレートを滅菌フォイルシール（６０９４１−０７６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）で密閉し、脱酸素パックと共にＭＧＣ  ２．５Ｌ嫌気ジャー（＃５０−２５、＃１０−０１、三菱ガス化学株式会社アネロパックシステム（ＭＧＣ  ＡｎａｅｒｏＰａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）、日本）に入れ、次にこれを密閉した。嫌気ジャーをＣｏｙ嫌気バッグから取り出し、３０℃のインキュベーターに置き、振盪しながら６９時間成長させた。最初の嫌気継代培養が終了した時点で細胞を遠心し、ＨＰＬＣ分析用に上清の試料を保存した。実験により決められるとおりペレットを使用して次の嫌気継代培養物を接種した；次の継代培養物は２４〜７２時間成長させた。各変異体につき３つの形質転換体を評価した（結果は表７に提供する）。選択の変異体を血清バイアル試験で分析した（結果は表８に提供する）。
【０２８１】
血清バイアル成長手順
フィルタ付き蓋を有する１２５ｍＬフラスコ中の好気前培養培地の１０ｍＬアリコートに、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ寒天プレートで成長した細胞を接種した。好気前培養物を、約１．５〜２の目標ＯＤ６００値に達するまで、振盪しながら３０℃で約２４時間好気的に成長させた。ＯＤ６００値はＣａｒｙ  ３００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｅｍｅｔｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して決定し、値を記録した。培養物を５０ｍＬチューブ（＃８９０３９−６６６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に移し、遠心によって細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットをＣｏｙ嫌気バッグ（Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に移し、そこでペレットを１．０ｍＬ嫌気成長培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）に再懸濁した。再懸濁した細胞ペレットを使用して、０．２の目標初期ＯＤ６００値になるように５０ｍＬ血清ボトル（Ｗｈｅａｔｏｎ，２２３７４８，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）中の３０ｍＬ  ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ培地を接種した。全ての嫌気培地、血清バイアル、栓及びクリンプを、接種前に嫌気バッグにおいて少なくとも２４時間脱気させた。血清ボトルに栓をしてクリンプし、嫌気バッグから出して、２４０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で成長させた。嫌気培養物を、少なくとも１．２の目標ＯＤ６００値になるように２４〜７２時間成長させた。さらなる嫌気成長ステップでは、前の嫌気培養ステップからの細胞を接種材料として使用し、ＨＰＬＣ分析用に上清のアリコートを保存した。各変異体につき３つの形質転換体を評価した（結果は表８に提供する）。
【０２８２】
ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析用に、嫌気成長期間が終了した時点のＯＤ６００値を得るため試料を取った。Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５分離ユニット、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、及び２４１４屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−Ｇプレカラム及びＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１分離カラム（Ｓｈｏｄｅｘ，ＪＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と共に使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。０．５ｍＬ／分の流量で０．０１Ｎ硫酸の均一濃度溶離によって化合物を分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してクロマトグラムを解析した。
【０２８３】
【表１８】
0006407869.tif 000019
【０２８４】
【表１９】
0006407869.tif 000020
【０２８５】
実施例５．ＰＮＹ２１１５におけるＫ９ＪＭ変異体及び誘導体のイソブタノール生成
実施例３及び実施例１１で調製した変異体を、酵母株ＰＮＹ２１１５（ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６）におけるイソブタノール生成について分析した。
【０２８６】
成長培地
酵母株を成長させる手順の中では、４種類の培地を使用した：ＳＥ−ｕｒａ寒天プレート、ＳＡＧ−２−ｕｒａ寒天プレート、好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２８７】
酵母形質転換回収プレート（ＳＥ−ｕｒａ）：５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．０１％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０２８８】
グルコース適応プレート（ＳＡＧ−２−Ｕｒａ）：５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、３ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２％ｗ／ｖグルコース、０．０１％ロイシン、０．０１％ヒスチジン、０．００２％トリプトファン。
【０２８９】
好気前培養培地（ＳＡＧ−０．２−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、３ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．０１％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０２９０】
嫌気培養培地（ＳＡＧ−３−Ｕｒａ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、３ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３％ｗ／ｖグルコース、０．０１％ロイシン、０．０１％ヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０２９１】
形質転換及びグルコース適応
ＰＮＹ２１１５のコンピテント細胞を作成し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して１μＬの精製プラスミド（約０．４〜０．８μｇ総ＤＮＡ）で形質転換した。形質転換混合物をＳＥ−ｕｒａプレートに播き、３０℃で４日間インキュベートした。各形質転換体につき３つのコロニーを選択し、ＳＥ−ｕｒａプレートにパッチし、３０℃で２日間インキュベートした。Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ、Ｋ９ＡＬＬ３（配列番号２３７）、及びＫ９ＪＭ１１に６つの形質転換体を用いた。次に、ＳＡＧ−２−Ｕｒａプレートにパッチし、３０℃で２日間成長させることにより、変異体がグルコース適応を起こした。
【０２９２】
好気前培養培地の１．５ｍＬアリコートを、ＶＷＲ  ４８ディープウェルプレート（＃８２００４−６７４、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）の各ウェルに分注し、上記に記載したとおり、ＳＡＧ−２−Ｕｒａ寒天プレートで成長した細胞を接種した。滅菌通気性カバー（＃６０９４１−０８６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を使用して培養プレートを密閉した。プレートを３０℃のインキュベーターに置き、振盪しながら２４時間成長させて、このとき１．５〜２．０の目標ＯＤ６００値に達した（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ３８４  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって決定するとき）。ＯＤ６００値を記録した。プレートにおいて、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ１Ｒ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＭ−２０プレートロータ（＃４１１０２７４２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の遠心によって細胞をペレット化し、生じた上清は廃棄した。細胞ペレットをＣｏｙ嫌気バッグ（Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に移し、そこでペレットを、嫌気条件に少なくとも２４時間平衡させた０．１ｍＬの嫌気成長培地（上記に記載される）に再懸濁した。ペレット／培地懸濁液を使用して、０．２の初期目標ＯＤ６００値になるようにＶＷＲ  ４８ディープウェルプレート（＃８２００４−６７４、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）中の嫌気培養培地の１．５ｍＬアリコートを接種した。次にプレートを滅菌フォイルシール（６０９４１−０７６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡで密閉し、脱酸素パックと共にＭＧＣ  ２．５Ｌ嫌気ジャー（＃５０−２５、＃１０−０１、三菱ガス化学株式会社アネロパックシステム（ＭＧＣ  ＡｎａｅｒｏＰａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）、日本）に入れ、次にこれを密閉した。この嫌気系をＣｏｙ嫌気バッグから取り出して３０℃のインキュベーターに置き、振盪しながら６９時間成長させた。最初の嫌気継代培養が終了した時点で細胞を遠心し、ＨＰＬＣ分析用に上清の試料を保存した。実験により決められるとおりペレットを使用して次の嫌気継代培養物を接種した；次の継代培養物は２４〜７２時間成長させた。各変異体につき３つの形質転換体を評価した。選択の変異体を血清バイアル試験で分析した。
【０２９３】
血清バイアル成長手順
フィルタ付き蓋を有する１２５ｍＬフラスコ中の好気前培養培地の１０ｍＬアリコートに、２０μＬ  ３Ｍ滅菌酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を塗ったＣＭ＋グルコース寒天プレート（＃Ｃ３０８０，Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）で成長させた細胞を接種した。好気前培養物は、約１．５〜２の目標ＯＤ６００値に達するまで、振盪しながら３０℃で約２４時間好気的に成長させた。ＯＤ６００値はＣａｒｙ  ３００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｅｍｅｔｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して決定し、値を記録した。培養物を５０ｍＬチューブ（＃８９０３９−６６６、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に移し、遠心によって細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットをＣｏｙ嫌気バッグ（Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に移し、そこでペレットを１．０ｍＬ嫌気成長培地（ＳＡＧ−Ｕｒａ）に再懸濁した。再懸濁した細胞ペレットを使用して、０．２の目標初期ＯＤ６００値になるように５０ｍＬ血清ボトル（Ｗｈｅａｔｏｎ，２２３７４８，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）中の３０ｍＬ  ＳＡＧ−Ｕｒａ培地を接種した。全ての嫌気培地、血清バイアル、栓及びクリンプを、接種前に嫌気バッグにおいて少なくとも２４時間脱気させた。血清ボトルに栓をしてクリンプし、嫌気バッグから出して、２４０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で成長させた。嫌気培養物を、少なくとも１．２の目標ＯＤ６００値になるように２４〜７２時間成長させた。さらなる嫌気成長ステップでは、ＨＰＬＣ分析用に上清のアリコートを保存した前の嫌気培養ステップからの細胞を接種材料として使用した。各変異体につき３つの形質転換体を評価した。
【０２９４】
ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析用に試料を取り、嫌気成長期間が終了した時点でＯＤ６００値を得た。Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５分離ユニット、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、及び２４１４屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−Ｇプレカラム及びＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１分離カラム（Ｓｈｏｄｅｘ，ＪＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と共に使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。０．５ｍＬ／分の流量で０．０１Ｎ硫酸の均一濃度溶離によって化合物を分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してクロマトグラムを解析した。
【０２９５】
【表２０】
0006407869.tif 000021
【０２９６】
【表２１】
0006407869.tif 000022
【０２９７】
実施例６．Ｋ９ＪＭ及びＫ９ＹＷ変異体の動態特性
特性決定のため、ＫＡＲＩ変異体の遺伝子を、ＰｍｅＩ及びＳｆｉＩでの消化並びにＪＥＡ１．ＰＳ．ｐＢＡＤプラスミド（配列番号２３８）の対応する部位へのライゲーションによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミドにサブクローニングした。得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドを、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）（全体として参照により本明細書に援用される米国特許第８，１２９，１６２号明細書に記載される）に形質転換した。形質転換クローンを、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（＃１０１３２０−１５４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。各株につき１つの形質転換体を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレートにストリークした。これらのプレートの各々からの単一コロニーを使用して、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び０．０２５％（ｗ／ｖ）アラビノース含有３ｍＬ  ＬＢブロスを接種し、２２５ｒｐｍで振盪しながら一晩成長させた。４０００×ｇで５分間遠心することにより培養物を回収した。細胞を３００ｕｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）マスターミックス（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７１４５６−４）に再懸濁した。混合物を１６，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を収集した。
【０２９８】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７）を使用して細胞溶解物のタンパク質濃度を計測した。０．２〜１．０マイクログラムの粗抽出タンパク質を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ＫＯＨ、ｐＨ６．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  グルコース−６−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２単位のロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び様々な濃度のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨからなる反応緩衝液に、９０μＬの容積となるように添加した。反応は、１０μＬの［Ｒ／Ｓ］−アセトラクテートを５ｍＭの最終濃度及び１００μＬの最終容積となるまで添加することにより開始させた。３０℃で１０分間インキュベートした後、５０μＬの反応混合物を抜き取り、それを１５０μＬの０．１％ギ酸に加えることにより、反応をクエンチした。ＮＡＤＨによる反応の動態パラメータを計測するため使用した補因子濃度は、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３及び１ｍＭであった。ＮＡＤＰＨによる反応に用いた補因子濃度は、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３及び１ｍＭであった。
【０２９９】
２，３−ジヒドロキシイソバレレートについて分析するため、ギ酸でクエンチした反応混合物２μＬを、Ｗａｔｅｒｓ  ＳＱＤ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣに注入した。クロマトグラフィー条件は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム（２．１ｍｍ直径、１００ｍｍ長さ）で流量（０．５ｍｌ／分）であった。緩衝液Ａは水中０．１％（ｖ／ｖ）からなり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。試料は、１％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中にある）で１分間、続いて１分の１％緩衝液Ｂから１．５分の７５％緩衝液Ｂまでの直線勾配を使用して分析した。エレクトロスプレーイオン化法−３０Ｖコーン電圧を用いるｍ／ｚ＝１３３でのイオン化法によって反応生成物２，３−ジヒドロキシイソバレレートを検出した。生成物２，３−ジヒドロキシイソバレレートの量を、真正な標準物質と比較することにより計算した。
【０３００】
Ｖｍａｘ値及び補因子ＫＭ値を計算するため、ＤＨＩＶ形成の速度データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬの最小二乗回帰を使用して単一基質のミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）式に当てはめた。ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨによる反応の動態パラメータを表１０に提供する。Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ誘導体は、１．７〜３．２倍増加したＮＡＤＰＨに対するＫＭを呈し、ＮＡＤＨに対するＫＭの変化は１．７倍未満である。
【０３０１】
【表２２】
0006407869.tif 000023
【０３０２】
実施例７．Ｋ９＿ＵｒｓｕｌａのエラープローンＰＣＲ
Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ（Ｋ９ＳＢ２＋Ａ５６Ｖ）（配列番号２３９）のエラープローンＰＣＲを実施して、ＮＡＤＨに対するＫＭ値が低下した変異体をスクリーニングすることのできるライブラリを作成した。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ  ＥＺＣｌｏｎｅドメイン突然変異誘発キット（カタログ番号２００５５２；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で突然変異誘発ＰＣＲを実施した。プライマーＫ９Ｇ９＿ＥＺ＿Ｆ１（ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ；配列番号２５６）及びＫ９Ｇ９＿ＥＺ＿Ｒ１（ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  Ｇ；配列番号２５７）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）により商業的に合成された。プライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏ以外は、ここで使用した試薬は、上記に指示するキットに含まれたものであった。突然変異誘発ＰＣＲ混合物は、６μｌのｐＢＡＤ．ＫＡＲＩベクター（配列番号２５８）（２４３ｎｇ／μｌ）中Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ、１．２５μｌの各プライマー（１００ｎｇ／μｌストック）、５μｌの１０×Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ反応緩衝液、１μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＭｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び３４μｌのｄｄＨ２Ｏからなった。ＰＣＲ反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で２．０分間、続いて３０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、及び７２℃で２．０分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０．０分間７２℃に保ち、次に試料回収まで４℃に保持した。アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｌｏｒｅｓｉｓ）（１％アガロース、１×ＴＢＥ緩衝液）によって反応生成物を鋳型から分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（カタログ番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の推奨どおり使用して回収した。
【０３０３】
単離した反応産物をメガプライマーとして用いることにより、上記に指示するキットの「ＥＺＣｌｏｎｅ反応」で遺伝子ライブラリを作成した。メガプライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏ以外は、ここで使用した試薬は、上記に指示するキットに含まれたものであった。反応は、２５μｌの２×ＥＺＣｌｏｎｅ酵素混合物、６μｌのメガプライマー（９９ｎｇ／μｌ）、２μｌのｐＢＡＤ．ＫＡＲＩベクター（配列番号２５８）（２４ｎｇ／μｌ）中Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ、３μｌのＥＺＣｌｏｎｅ溶液、及び１４μｌのｄｄＨ２Ｏからなった。反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、及び６８℃で１０．０分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０．０分間７２℃に保ち、次に試料回収まで４℃に保持した。１μｌのＤｐｎ  Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を添加し、混合物を３７℃で２．５時間インキュベートした。ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（カタログ番号Ｄ４００４、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）で混合物を８ｕｌに濃縮した。
【０３０４】
次に、４μｌのＤｐｎ  Ｉ消化及び濃縮した「ＥＺＣｌｏｎｅ反応」生成物を、５０μｌ  ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ  ＥＺＣｌｏｎｅドメイン突然変異誘発キットに提供される）に製造者の推奨どおり形質転換した。この形質転換体を、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（カタログ番号Ｌ１００４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７で一晩インキュベートした。ＸＬ−Ｇｏｌｄ中の得られたライブラリを、Ｍ９塩を含有する溶液で寒天プレートから掻き取り、加え合わせ、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する培地に希釈し、３７℃で一晩インキュベートした。ライブラリＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７０６；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、製造者により提供されるプロトコルに従い細胞から単離した。次に増幅したライブラリを使用することにより、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を形質転換した。形質転換クローンを、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（＃１０１３２０−１５４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。クローンは、実施例８に記載されるとおりのハイスループットスクリーニングに用いた。
【０３０５】
実施例８．Ｋｍ  ＮＡＤＨが低下した変異体に関するＫ９−Ｕｒｓｕｌａ  ｅＰＣＲライブラリのスクリーニング
Ｋ９−Ｕｒｓｕｌａ  ｅＰＣＲライブラリのハイスループットスクリーニングアッセイ
突然変異体ＫＡＲＩ酵素の遺伝子ライブラリのハイスループットスクリーニングを、本明細書に記載されるとおり実施した：５５４．４ｇ／Ｌ  グリセロール、６８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１７ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１３２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４を含有する１０×凍結用培地を、分子的に純粋な水で調製し、ろ過滅菌した。１０×凍結用培地をＬＢ培地で希釈することにより、凍結用培地を調製した。９６ウェルアーカイブプレート（カタログ番号３３７０、Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに、１×凍結用培地のアリコート（２００μＬ）を使用した。
【０３０６】
ＬＢ寒天プレートからクローンを選択して、凍結用培地が入った９６ウェルアーカイブプレートに接種し、振盪なしに３７℃で一晩成長させた。次にアーカイブプレートを−８０℃で保存した。陰性対照として、ｐＢＡＤ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換した、米国特許第８，１２９，１６２号明細書に記載されるとおりの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を常に使用した。ライブラリの陽性対照は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）におけるｐＢＡＤ．ＫＡＲＩベクター（配列番号２５８）中のＫ９＿Ｕｒｓｕｌａであった。
【０３０７】
アーカイブプレートからのクローンを９６ディープウェルプレートに接種した。各ウェルは、解凍したアーカイブプレートからの細胞３．０μｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．０２％（ｗ／ｖ）アラビノースを誘導物質として含有するＬＢ培地２００μｌを含んだ。細胞を、振盪（９００ｒｐｍ）しながら３７℃、８０％湿度で一晩成長させ、遠心（３７５０ｒｐｍ、２５℃で５分）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）により回収し、後の分析のため細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０３０８】
アッセイ基質（Ｒ，Ｓ）−アセトラクテートを、Ａｕｌａｂａｕｇｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｏｓｓ（Ａｕｌａｂａｕｇｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：２８２４−２８３０，１９９０）により記載されるとおり合成した。このアッセイで使用した他の化学物質は全て、Ｓｉｇｍａから購入した。ＫＡＲＩによるアセトラクテートからα，β−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素変換を、プレートリーダー（Ｓａｐｈｉｒｅ  ２，Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，スイス）を使用して３４０ｎｍで反応からの補因子ＮＡＤＨの酸化を計測することにより追跡した。活性は、６２２０Ｍ−１ｃｍ−１  ＮＡＤＨのモル吸光係数を使用して計算した。
【０３０９】
ディープウェルプレート中の凍結細胞ペレット及びＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ  ７１４５６、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，独国）を、同時に室温で３０分間加温した。３０分間加温した後、７５μｌの５０％ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（水中ｖ／ｖ）を各ウェルに添加し、プレートシェーカーを使用して細胞を懸濁した。細胞ペレット／５０％Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ懸濁液が入ったプレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞溶解物を７５μＬ  ｄ．ｄ水で希釈し、０．５×溶解物を得た。希釈した無細胞抽出物のアッセイを、２．４ｍＭ（Ｒ／Ｓ）−アセトラクテート、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５又は２００μＭ  ＮＡＤＨ及び６．２５又は１２．５μＬの０．５×細胞溶解物を含有する緩衝液中、３０℃で実施した。
【０３１０】
Ｋ９−Ｕｒｕｓｌａ変異体の同定：一次スクリーニング
細胞溶解物の所定容積毎に、７５μＭ  ＮＡＤＨで計測されたＮＡＤＨ酸化速度と２００μＭ  ＮＡＤＨで計測されたＮＡＤＨ酸化速度との比を、各変異体及び陽性対照ウェル（１プレートにつき２個）について計算した。陽性対照ウェル（細胞溶解物あたり１０４個）に関する比の平均値及び標準偏差を計算した。
【０３１１】
変異体ウェルは、速度比が両方ともに０．７８５（陽性対照平均値より３標準偏差高い）より大きく、且つ１より小さい場合に初期ヒットを含むと見なした。２つの細胞溶解物容積間で、５４０４個の潜在的な変異体のプールから合計６３０ヒットが同定された。これらの初期ヒットを統合し、後の分析のためのより小さいライブラリＣＬ１を形成した。
【０３１２】
Ｋ９−Ｕｒｓｕｌａ変異体の同定：二次スクリーニング
複数の手法を用いて統合ライブラリからの変異体を評価した。一つの手法では、一次スクリーニングと同様の方法に変更を加えて二次スクリーニングを実施した。統合ヒットライブラリ（ＣＬ１）を生物学的トリプリケートで成長させ、無細胞抽出物を調製し、上記に記載したとおりアッセイした。速度データを収集し、以下に記載するとおり分析した。ＣＬ１ライブラリの細胞溶解物の容積毎に、７５μＭ  ＮＡＤＨで計測されたＮＡＤＨ酸化速度と、２００μＭ  ＮＡＤＨで計測されたＮＡＤＨ酸化速度との比を、各変異体及び陽性対照ウェル（１プレートにつき２個）について計算した。これらの比を使用することにより、以下の式を用いてＫｍ  ＮＡＤＨを計算した（これは、２つの基質濃度に関するミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈｅａｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）式の比から求めることができる）：
「ＨＴＳ」Ｋｍ＝７５（１−Ｒ）／（Ｒ−７５／２００）、式中、Ｒ＝速度比
【０３１３】
変異体ウェルは、Ｋｍが１２５μＭ未満であり、且つ２００μＭ  ＮＡＤＨでの速度が０．８より大きかった場合に初期ヒットを含むと見なした。ヒットはまた、２００μＭ  ＮＡＤＨでの速度に関わらず、０．６１７より大きい速度比を呈した変異体からも収集した。これらの変異体の比及び「ＨＴＳ」Ｋｍ値を表１１に提供する。
【０３１４】
別の手法では、統合ライブラリの変異体のＮＡＤＨ  ＫＭ値を、手動でプレートリーダーによって実施した酵素アッセイで計測した。ＣＬ１アーカイブプレートのクローンを９６ディープウェルプレートに接種した。各ウェルは、解凍したアーカイブプレートからの３．０μｌの細胞、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．０２％（ｗ／ｖ）アラビノースを誘導物質として含有する２００μｌのＬＢ培地を含んだ。細胞を、振盪（９００ｒｐｍ）しながら３７℃、８０％湿度で一晩成長させ、遠心（３７５０ｒｐｍ、２５℃で５分）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）により回収し、後の分析のため細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０３１５】
細胞ペレットを解凍し、２０μＬ  Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒマスターミックス（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＃）に懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。１４０μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）を各ウェルに添加した。プレートを４℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心した。１２０μＬの上清（ＣＦＥ）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３３７０）に移した。
【０３１６】
ＮＡＤＨに対する「プレート」ＫＭを決定するため、様々な濃度のＮＡＤＨ（５０、１００、２００及び４００μＭ）でＣＦＥをアッセイした。アッセイは、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５．２ｍＭ（Ｒ／Ｓ）−アセトラクテート及び所定濃度のＮＡＤＨを含有する緩衝液中、３０℃で行った。緩衝液の１８０μＬアリコートを９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３３７０）の各ウェルに添加し、２０μＬのＣＦＥを各ウェルに添加して反応を開始させた。Ｓ−アセトラクテートからＤＨＩＶへの変換速度を、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＮＡＤ＋に対するＮＡＤＨの酸化速度を３４０ｎｍで計測することにより決定した。総アッセイ時間は２分間であり、１５秒毎に各ウェルを読み取った。補因子濃度に対して比活性（Ｕ／ｍｇ）をプロットすることによりＫＭ値を計算し、データをミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）式に当てはめた。上記に記載するＨＴＳスクリーニングによって同定されたヒットの「プレート」ＫＭ値を、表１１に掲載する。
【０３１７】
Ｋ９−Ｕｒｓｕｌａ変異体の配列分析
二次ＨＴＳスクリーニングで同定された変異体のＤＮＡ配列決定を、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることにより、プライマーｐＢＡＤ−Ｆｏｒ（ＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ；配列番号２６０）及びｐＢＡＤ−Ｒｅｖ（ＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴ；配列番号２６１）で達成した。配列を表１１に示す。
【０３１８】
【表２３】
0006407869.tif 000024
【０３１９】
【表２４】
0006407869.tif 000025
【０３２０】
【表２５】
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【０３２１】
【表２６】
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【０３２２】
実施例９．Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ誘導体の動態特性
実施例８からのいくつかのＫ９＿Ｕｒｓｕｌａ誘導体を動態特性用に選択した。変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて、実施例６に記載するとおり分析した。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを補因子としたＫＡＲＩ反応の動態パラメータを表１２に提供する。同じＴ１９１Ｓのアミノ酸置換を含む２つの独立したクローン（＃１及び＃２）を分析した。５８位及び１９１位におけるアミノ酸置換がＮＡＤＨのＫＭを低下させることが観察された。
【０３２３】
【表２７】
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【０３２４】
実施例１０．５３位に置換を有するＫ９＿Ｕｒｓｕｌａ誘導体の調製及び特性決定
Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａにおける５３位変異体の作成
５３位のアミノ酸置換を部位特異的突然変異誘発によって個々にＫ９＿Ｕｒｓｕｌａに導入し、得られた変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて特徴付けた。Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａの部位特異的突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２１０５１８；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で実施した。表１３に掲載するプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡ）により商業的に合成された。プライマーは、表１３に示すとおり（「混合物」と表示される列）、４つの混合物に組み合わせた。
【０３２５】
【表２８】
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【０３２６】
プライマー、鋳型、及びｄｄＨ２Ｏを除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示したキットに含まれたものであった。突然変異誘発反応混合物には、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩ（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ、１μｌの各プライマー混合物（１１．５ｕＭの総プライマー濃度）、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏが含まれた。反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて１８回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で４．０分からなった。温度サイクルの完了時点で試料を６８℃で５．０分間インキュベートし、次に試料回収まで４℃に保持した。２μｌのＤｐｎ  Ｉを各反応に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０３２７】
２μｌの各突然変異誘発反応物を、製造者の指示に従いＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４００３）に形質転換した。この形質転換体を、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（カタログ番号Ｌ１００４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。次に、プライマーｐＢＡＤ−Ｆｏｒ（ＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ；配列番号２６０）及びｐＢＡＤ−Ｒｅｖ（ＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴ；配列番号２６１）を用いたＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ベースのＤＮＡ配列決定用に複数の形質転換体を選択した。ＫＡＲＩ配列が確認された形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７０６；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって、製造者により提供されるプロトコルに従い細胞からプラスミドＤＮＡを単離した。
【０３２８】
５３位変異体の特性決定
Ｋ９＿Ｕｒｓｕｌａ及び５３位に置換を含む誘導体のサブセットを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）で発現させ、実施例６に記載するとおり特徴付けた。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨによる反応の動態パラメータを表１４に提供する。置換Ｆ５３Ｌ及びＦ５３Ｉを含むＫ９＿Ｕｒｓｕｌａ誘導体を、それぞれＫ９＿Ｌｕｃｙ（配列番号３００）及びＫ９＿Ｉｌｙａ（配列番号３０１）と命名した（表１４）。
【０３２９】
【表２９】
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【０３３０】
【表３０】
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【０３３１】
Ｋ９＿Ｌｕｃｙ及びＫ９＿Ｉｌｙａの精製及び動態解析
発現及び特性決定のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド（ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩ）を使用することにより、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を形質転換した。形質転換クローンを、ＬＢ培地及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天プレート（＃１０１３２０−１５４、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。各株につき１つの形質転換体を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレートにストリークした。これらのプレートの各々からの単一コロニーを使用して、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有１０ｍＬ  ＬＢブロスを接種した。これらの培養物を、ベント付きフィルタ付きの蓋を有する１２５ｍＬバッフル付きフラスコにおいて振盪しながら３７℃で８時間成長させた。この培養物２００μＬを使用して、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び０．２％（ｗ／ｖ）アラビノース含有ＬＢブロスが入った、フィルタ付きベント付きの蓋を有する５００ｍＬバッフル付きフラスコ２つを接種した。発現培養物を振盪しながら３７℃で１６〜１８時間成長させた。細胞を遠心によって４０ｍＬアリコートに回収した；上清を廃棄し、精製まで細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０３３２】
Ｋ９＿Ｌｕｃｙ及びＫ９＿Ｉｌｙａ変異体を、同じ方法を用いて精製した。各４０ｍＬ細胞培養物アリコートに相当する２つの細胞ペレットを４ｍＬ  Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒマスターミックス（Ｎｏｖａｇｅｎ  ７１４５６，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，独国）に再懸濁し、室温で１５分間、続いて６０℃で１５分間インキュベートした。変性タンパク質及び細胞残屑を、７，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心することによりペレット化した。上清をデカントし、溜めて、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ０．２μｍシリンジフィルタ（ＰＮ４１９２，Ｐａｌｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）でろ過した。ろ過して熱処理した無細胞抽出物から、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラム（１７−１０７１−０１、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）を使用してＫ９＿Ｌｕｃｙ及びＫ９＿Ｉｌｙａを精製した。カラムは、タンパク質をロードする前に、流量２．０ｍＬ／分の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）５ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液により０．２ＣＶの平衡で予め平衡化させた。Ｋ９＿Ｌｕｃｙ及びＫ９＿Ｉｌｙａを、流量２．０ｍＬ／分の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液からなる１．５ＣＶの均一濃度ステップで溶出した。Ｆｒａｃ−９５０フラクションコレクター（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）をサーペンタインパターンで使用して画分２．５ｍＬ容積を収集した。変異体は全て、画分Ｄ５〜Ｅ５又はＤ６〜Ｅ４の間に溶出した。１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＹＭ−３０スピンフィルタ（ＵＦＣ９０３００８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｃｉａ，ＭＡ）を使用して画分をプールし、１０ｍＬ  １００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液で洗浄した。ろ液を廃棄し、精製したタンパク質を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する１ｍＬ緩衝液を使用して膜から溶出させた。精製したタンパク質（表１５）の動態パラメータを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）粗抽出物に関する実施例６の記載と同じ方法で決定した。
【０３３３】
【表３１】
0006407869.tif 000032
【０３３４】
実施例１１．Ｋ９ＹＷ及びＫ９ＪＭ変異体及び誘導体の部位特異的突然変異誘発
Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨ誘導体の部位特異的突然変異誘発を実施して、さらなるアミノ酸置換を組み込んだ。実施例１０の記載に変更を加えて突然変異誘発を実施した。酵母シャトルプラスミド中の変異体で突然変異誘発反応を実施するため、温度サイクルの間の６８℃ステップを４．０分から１０分に増加させた。
【０３３５】
Ｋ９ＹＷ２５から変異体Ｋ９ＡＬＬ３（酵母シャトルプラスミド中にある）を、プライマーＡｌａＬＬ１（ＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＣ；配列番号８０７）及びＡｌａＬＬ１ｒｅｖ（ＧＧＴ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧ；配列番号８０８）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  Ｋ９ＹＷ２５＿ＤＨＡＤ（実施例１におけるＫ９ＳＢ２＿ＳＨ＿ＤＨＡＤの突然変異誘発によって作成した）（５０ｎｇ／μｌ）、プライマーＡＬＬ１及びＡＬＬ１ｒｅｖ（各１０ｕＭ）の１ｕｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用に、Ｋ９ＡＬＬ３の遺伝子をＪＥＡ１．ＰＳ．ｐＢＡＤプラスミド（配列番号２３８）のＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ部位にサブクローニングした。
【０３３６】
Ｋ９ＡＬＬ３から変異体Ｋ９ＡＬＬ１９１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にある）を、プライマーＴ１９１Ｓ（ＣＴＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣ；配列番号８０９）及びＴ１９１Ｓｒｅｖ（ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  Ｇ；配列番号８１０）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩ（配列番号５３０）プラスミド（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９ＡＬＬ３、プライマー（各１０ｕＭ）の１μｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。
【０３３７】
Ｋ９ＡＬＬ３から変異体Ｋ９ＡＬＬ２５４（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にある）を、プライマーＹ２５４Ｆ（ＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＴＡＴＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧ；配列番号８１１）及びＹ２５４Ｆｒｅｖ（ＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣ；配列番号８１２）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩプラスミド（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９ＡＬＬ３、上記のプライマー（各１０ｕＭ）の１μｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。
【０３３８】
Ｋ９ＡＬＬ３から変異体Ｋ９ＡＬＬ２７８（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にある）を、プライマーＫ２７８Ｍ（ＣＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣ；配列番号８１３）及びＫ２７８Ｍｒｅｖ（ＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡＴＧ；配列番号８１４）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩプラスミド（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９ＡＬＬ３、上記のプライマー（各１０ｕＭ）の１μｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。
【０３３９】
Ｋ９ＪＭ１１から変異体Ｋ９ＪＭ１９１（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にある）を、プライマーＴ１９１Ｓ（ＣＴＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣ；配列番号８１５）及びＴ１９１Ｓｒｅｖ（ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  Ｇ；配列番号８１６）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩ（配列番号２５９）（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９ＪＭ１１、プライマー（各１０ｕＭ）の１μｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。酵母試験のため、Ｋ９ＪＭ１９１をＫ９＿Ｄａｖｉｄ＿ＤＨＡＤのＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ部位にサブクローニングした。
【０３４０】
Ｋ９ＹＷ２５から変異体Ｋ９ＹＷ２５−Ｔ１９１Ｓ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラスミド中にある）を、プライマーＴ１９１Ｓ（ＣＴＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣ；配列番号８１７）及びＴ１９１Ｓｒｅｖ（ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  Ｇ；配列番号８１８）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＢＡＤ．ＫＡＲＩ（５０ｎｇ／μｌ）中Ｋ９ＹＷ２５、Ｔ１９１Ｓ及びＴ１９１Ｓｒｅｖ（各１０ｕＭ）の１μｌの混合物、２．５μｌの１０×反応緩衝液、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物、０．７５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、０．５μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び１９．２５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。反応には、以下の条件を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて１８回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で３．０分からなった。温度サイクルの完了時点で試料を６８℃で５．０分間インキュベートし、次に試料回収まで４℃に保持した。
【０３４１】
Ｋ９ＡＬＬ３から変異体Ｋ９ＡＬＬ２５８（酵母シャトルプラスミド中にある）を、プライマー２５８−１（ＧＧＴＡＴＧＣＧＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＴＡＣ；配列番号８１９）及び２５８−１ｒ（ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＡＣＣ；配列番号８２０）を用いて誘導した。突然変異誘発反応は、１μｌ  ｐＬＨ６８９：：ＡＬＬ３（配列番号３０４）（５０ｎｇ／μｌ）、プライマー２５８−１及び２５８−１ｒ（各１０ｕＭ）の１ｕｌの混合物、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。
【０３４２】
酵母シャトルプラスミドにおけるさらなる変異体を、Ｋ９ＡＬＬ３及びＫ９ＪＭ１１の鋳型混合物を含む突然変異誘発反応で用いて調製した。各反応は、０．５μｌ  Ｋ９ＪＭ１１＿ＤＨＡＤ（５０ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ  Ｋ９ＡＬＬ３＿ＤＨＡＤ（配列番号５３３）（５０ｎｇ／μｌ）、表に掲載される１μｌのプライマー混合物（各プライマー１０ｕＭ）、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ試薬、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素及び３９．５μｌのｄｄＨ２Ｏを含んだ。
【０３４３】
【表３２】
0006407869.tif 000033
【０３４４】
調製した変異体のアミノ酸置換を表に提供する。
【０３４５】
【表３３】
0006407869.tif 000034
【０３４６】
実施例１２．部位特異的Ｋ９変異体の動態特性
実施例１１で調製した変異体のサブセットを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、実施例６に記載するとおり分析した。実施例３に記載される３つのさらなる変異体（Ｋ９ＪＭ３６、Ｋ９ＪＭ４３、Ｋ９ＪＭ４４）をＪＥＡ１．ＰＳ．ｐＢＡＤプラスミド（配列番号２３８）のＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ部位にサブクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて、同様に分析した。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを補因子とするＫＡＲＩ反応の動態パラメータを表１８に提供する。
【０３４７】
【表３４】
0006407869.tif 000035
【０３４８】
実施例１３
１５８位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びＰＮＹ２０６８における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）の１５８位に対応するアミノ酸における１９個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物（この例ではＫ９＿１５８ｆと称される）（表１９）及びリバースプライマーＫ９＿３０９Ｔ＿１１１７１１ｒ：ＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＣ（配列番号４１５；この例ではＫ９＿３０９Ｔｒと称される）を用いて、Ｋ９  ＫＡＲＩの位置１５８を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨを含むプラスミド（プラスミドＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１；配列番号５３２）を鋳型として使用した。
【０３４９】
簡潔に言えば、レギュラーＰＣＲによってメガプライマーを調製した。メガプライマーＰＣＲ混合物は、４５μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃１０５７２０６３）、２．０μｌ  Ｋ９＿１５８ｆ（２０μＭ）、２．０μｌ  Ｋ９＿３０９Ｔｒ（２０μＭ）及び１．０μｌ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）からなった。メガプライマーの作製用ＰＣＲプログラムは以下である：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１．０分からなった。次にメガプライマーを使用することにより、実施例５（参照により本明細書に援用される２０１２年３月２３日に出願された米国特許出願第１３／４２８５８５号明細書）に示されるものと同じ手順を用いてＫ９ＳＢ２＿ＳＨに突然変異を導入した。ＰＣＲ産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０３５０】
ユニーク配列を有する得られた変異体をＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１と共に、酵母株ＰＮＹ２０６８におけるイソブタノール生成について（各突然変異体につき三重で）分析した。Ｋ９  ＫＡＲＩ変異体を有するプラスミド及びプラスミドｐＹＺ０６７ΔＡＤＨΔＫｉｖＤを酵母株ＰＮＹ２０６８に形質転換した。形質転換細胞をヒスチジン及びウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播いた。３つの形質転換体を同じ培地の新鮮なプレートに移した。形質転換体を、４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カタログ番号３９１−０５−０６１）における嫌気条件下のイソブタノール生成について試験した。有望な形質転換体を、１５ｍｌ血清バイアルにおける嫌気条件下のイソブタノール生成についてさらに試験した。
【０３５１】
５〜７日後、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレート上の形質転換からの酵母コロニーが出現した。各変異体からのこれらの３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレートにパッチし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０３５２】
成長培地及び手順
酵母株を成長させる手順の中では、２種類の培地を使用した：好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０３５３】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０３５４】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０３５５】
パッチした細胞を４８ウェルプレートに接種した。各ウェルは１．５ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各ウェルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１．５ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１．５ｍｌ細胞懸濁液を調製して各ウェルに加えた。４８ウェルプレートの酸素を、嫌気チャンバを使用して製造者のプロトコル（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に従い除去した。次に細胞を３０℃で振盪しながら２日間成長させた。嫌気成長の２日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３５６】
４８ウェルプレートデータに基づき上位の成績のものを選択してパッチした。パッチした細胞を２４ウェルプレートに接種した。各ウェルは３．０ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各バイアルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１０ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１０ｍｌ細胞懸濁液を調製して各バイアルに加えた。各バイアルにキャップをして、次に細胞を３０℃で振盪しながら２日間成長させた。嫌気成長の２日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３５７】
Ｋ９  ＫＡＲＩ突然変異体を有する酵母株のＬＣ／ＭＳ分析
嫌気成長期間が終了した時点で、ＬＣ／ＭＳ分析用に試料を取った。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ分離ユニット及びＡｃＱｕｉｔｙ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）をＷａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３分離カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用して実施した。化合物は、９９％水相から始まり９９％有機相で終わる水（＋０．１％ギ酸）及びアセトニトリル（＋０．１％ギ酸）の逆相勾配を使用して、０．５ｍＬ／分の流量で分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してクロマトグラムを分析した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
【０３５８】
【表３５】
0006407869.tif 000036
【０３５９】
【表３６】
0006407869.tif 000037
【０３６０】
実施例１４
６７位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びＰＮＹ２１１５における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）の６７位に対応するアミノ酸における１９個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物（この例ではＫ９＿６７ｆと称される）（表２１）及びリバースプライマーＫ９＿３０９Ｔ＿１１１７１１ｒ：ＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＣ（配列番号４１５；この例ではＫ９＿３０９Ｔｒと称される）を用いて、Ｋ９  ＫＡＲＩの位置６７を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨを含むプラスミド（Ｋ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１；配列番号５３２）を鋳型として使用した。
【０３６１】
簡潔に言えば、レギュラーＰＣＲによってメガプライマーを調製した。メガプライマーＰＣＲ混合物は、４５μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃１０５７２０６３）、２．０μｌ  Ｋ９＿６７ｆ（２０μＭ）、２．０μｌ  Ｋ９＿３０９Ｔｒ（２０μＭ）及び１．０μｌ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）からなった。メガプライマーの作製用ＰＣＲプログラムは以下である：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１．０分からなった。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。
【０３６２】
次にメガプライマーを使用することにより、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２１０５１８、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を使用して遺伝子ライブラリを作成した。２５μｌ反応混合物には以下が含まれた：２．５μｌの１０×反応緩衝液、０．５μｌの５０ｎｇ／μｌ鋳型、２０．２５μｌのメガプライマー、０．５μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μｌ酵素混合物及び０．７５μｌ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ。メガプライマー及び鋳型を除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示したキットに含まれたものであった。この反応混合物を薄型ウェル２００μｌ容量ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲには以下の反応を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて２０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で５分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０分間６８℃に保ち、次に後の処理のため４℃に保持した。完成したＰＣＲ反応混合物に０．５μｌ  Ｄｐｎ  Ｉを添加し、次に３７℃で２時間インキュベートした。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。ＰＣＲ産物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０３６３】
ユニーク配列を有する得られた変異体をＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１と共に、酵母株ＰＮＹ２１１５におけるイソブタノール生成について（各突然変異体につき三重で）分析した。Ｋ９  ＫＡＲＩ変異体を有するプラスミド及びプラスミドｐＹＺ０６７ΔＡＤＨΔＫｉｖＤを酵母宿主ＰＮＹ２１１５に形質転換した。形質転換細胞をヒスチジン及びウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播いた。３つの形質転換体を同じ培地の新鮮なプレートに移した。形質転換体を、４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カタログ番号３９１−０５−０６１）における嫌気条件下のイソブタノール生成について試験した。有望な形質転換体を、１５ｍｌ血清バイアルにおける嫌気条件下のイソブタノール生成についてさらに試験した。
【０３６４】
５〜７日後、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレート上の形質転換からの酵母コロニーが出現した。各変異体からのこれらの３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレートにパッチし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０３６５】
成長培地及び手順
酵母株を成長させる手順の中では、２種類の培地を使用した：好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０３６６】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０３６７】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０３６８】
パッチした細胞を４８ウェルプレートに接種した。各ウェルは１．５ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各ウェルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１．５ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１．５ｍｌ細胞懸濁液を調製して各ウェルに加えた。４８ウェルプレートをアルミニウムフォイルで密閉した。次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３６９】
４８ウェルプレートデータに基づき上位の成績のものを選択してパッチした。パッチした細胞を２４ウェルプレートに接種した。各ウェルは３．０ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各バイアルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１０ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１０ｍｌ細胞懸濁液を調製して各バイアルに加えた。各バイアルにキャップをして、次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３７０】
Ｋ９  ＫＡＲＩ突然変異体を有する酵母株のＬＣ／ＭＳ分析
嫌気成長期間が終了した時点で、ＬＣ／ＭＳ分析用に試料を取った。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ分離ユニット及びＡｃＱｕｉｔｙ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）をＷａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３分離カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用して実施した。化合物は、９９％水相から始まり９９％有機相で終わる水（＋０．１％ギ酸）及びアセトニトリル（＋０．１％ギ酸）の逆相勾配を使用して、０．５ｍＬ／分の流量で分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してクロマトグラムを分析した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
【０３７１】
【表３７】
0006407869.tif 000038
【０３７２】
【表３８】
0006407869.tif 000039
【０３７３】
実施例１５
１６２位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びＰＮＹ２１１５における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）の１６２位に対応するアミノ酸における１９個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物（この例ではＫ９＿１６２ｆと称される）（表２４及びリバースプライマーＫ９＿３０９Ｔ＿１１１７１１ｒ：ＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＣ（配列番号４１５；この例ではＫ９＿３０９Ｔｒと称される）を用いて、Ｋ９  ＫＡＲＩの位置１６２を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨを含むプラスミド（又はＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１）を鋳型として使用した。
【０３７４】
簡潔に言えば、レギュラーＰＣＲによってメガプライマーを調製した。メガプライマーＰＣＲ混合物は、４５μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃１０５７２０６３）、２．０μｌ  Ｋ９＿１６２ｆ（２０μＭ）、２．０μｌ  Ｋ９＿３０９Ｔｒ（２０μＭ）及び１．０μｌ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）からなった。メガプライマーの作製用ＰＣＲプログラムは以下である：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１．０分からなった。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。
【０３７５】
次にメガプライマーを使用することにより、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２１０５１８、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を使用して遺伝子ライブラリを作成した。２５μｌ反応混合物には以下が含まれた：２．５μｌの１０×反応緩衝液、０．５μｌの５０ｎｇ／μｌ鋳型、２０．２５μｌのメガプライマー、０．５μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μｌ酵素混合物及び０．７５μｌ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ。メガプライマー及び鋳型を除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示したキットに含まれたものであった。この反応混合物を薄型ウェル２００μｌ容量ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲには以下の反応を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて２０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で５分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０分間６８℃に保ち、次に後の処理のため４℃に保持した。完成したＰＣＲ反応混合物に０．５μｌ  Ｄｐｎ  Ｉを添加し、次に３７℃で２時間インキュベートした。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。ＰＣＲ産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０３７６】
ユニーク配列を有する得られた変異体をＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１と共に、酵母株ＰＮＹ２１１５におけるイソブタノール生成について（各突然変異体につき三重で）分析した。Ｋ９  ＫＡＲＩ変異体を有するプラスミド及びプラスミドｐＹＺ０６７ΔＡＤＨΔＫｉｖＤを酵母宿主ＰＮＹ２１１５に形質転換した。形質転換細胞をヒスチジン及びウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播いた。３つの形質転換体を同じ培地の新鮮なプレートに移した。形質転換体を、４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カタログ番号３９１−０５−０６１）における嫌気条件下のイソブタノール生成について試験した。有望な形質転換体を、１５ｍｌ血清バイアルにおける嫌気条件下のイソブタノール生成についてさらに試験した。
【０３７７】
５〜７日後、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレート上の形質転換からの酵母コロニーが出現した。各変異体からのこれらの３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレートにパッチし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０３７８】
成長培地及び手順
酵母株を成長させる手順の中では、２種類の培地を使用した：好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０３７９】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０３８０】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０３８１】
パッチした細胞を４８ウェルプレートに接種した。各ウェルは１．５ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各ウェルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１．５ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１．５ｍｌ細胞懸濁液を調製して各ウェルに加えた。４８ウェルプレートをアルミニウムフォイルで密閉した。次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３８２】
４８ウェルプレートデータに基づき上位の成績のものを選択してパッチした。パッチした細胞を２４ウェルプレートに接種した。各ウェルは３．０ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各バイアルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１０ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１０ｍｌ細胞懸濁液を調製して各バイアルに加えた。各バイアルにキャップをして、次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３８３】
Ｋ９  ＫＡＲＩ突然変異体を有する酵母株のＬＣ／ＭＳ分析
嫌気成長期間が終了した時点で、ＬＣ／ＭＳ分析用に試料を取った。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ分離ユニット及びＡｃＱｕｉｔｙ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）をＷａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３分離カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用して実施した。化合物は、９９％水相から始まり９９％有機相で終わる水（＋０．１％ギ酸）及びアセトニトリル（＋０．１％ギ酸）の逆相勾配を使用して、０．５ｍＬ／分の流量で分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してクロマトグラムを分析した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
【０３８４】
【表３９】
0006407869.tif 000040
【０３８５】
【表４０】
0006407869.tif 000041
【０３８６】
実施例１６
３１２位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びＰＮＹ２１１５における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）の３１２位に対応するアミノ酸における１９個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物（この例ではＫ９＿３１２ｒと称される）（表２７）及びリバースプライマーＫ９＿２１９＿０３２２１２ｆ：ＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＣＡＴＣ（配列番号４７３；この例ではＫ９＿２１９ｆと称される）を用いて、Ｋ９  ＫＡＲＩの３１２の位置を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨを含むプラスミド（又はＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１）を鋳型として使用した。
【０３８７】
簡潔に言えば、レギュラーＰＣＲによってメガプライマーを調製した。メガプライマーＰＣＲ混合物は、４５μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃１０５７２０６３）、２．０μｌ  Ｋ９＿２１９ｆ（２０μＭ）、２．０μｌ  Ｋ９＿３１２ｒ（２０μＭ）及び１．０μｌ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）からなった。メガプライマーの作製用ＰＣＲプログラムは以下である：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１．０分からなった。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。
【０３８８】
次にメガプライマーを使用することにより、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２１０５１８、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を使用して遺伝子ライブラリを作成した。２５μｌ反応混合物には以下が含まれた：２．５μｌの１０×反応緩衝液、０．５μｌの５０ｎｇ／μｌ鋳型、２０．２５μｌのメガプライマー、０．５μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μｌ酵素混合物及び０．７５μｌ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ。メガプライマー及び鋳型を除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示したキットに含まれたものであった。この反応混合物を薄型ウェル２００μｌ容量ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲには以下の反応を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて２０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で５分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０分間６８℃に保ち、次に後の処理のため４℃に保持した。完成したＰＣＲ反応混合物に０．５μｌ  Ｄｐｎ  Ｉを添加し、次に３７℃で２時間インキュベートした。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。ＰＣＲ産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０３８９】
ユニーク配列を有する得られた変異体をＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１と共に、酵母株ＰＮＹ２１１５におけるイソブタノール生成について（各突然変異体につき三重で）分析した。Ｋ９  ＫＡＲＩ変異体を有するプラスミド及びプラスミドｐＹＺ０６７ΔＡＤＨΔＫｉｖＤを酵母宿主ＰＮＹ２１１５に形質転換した。形質転換細胞をヒスチジン及びウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播いた。３つの形質転換体を同じ培地の新鮮なプレートに移した。形質転換体を、４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カタログ番号３９１−０５−０６１）における嫌気条件下のイソブタノール生成について試験した。有望な形質転換体を、１５ｍｌ血清バイアルにおける嫌気条件下のイソブタノール生成についてさらに試験した。
【０３９０】
５〜７日後、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレート上の形質転換からの酵母コロニーが出現した。各変異体からのこれらの３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレートにパッチし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０３９１】
成長培地及び手順
酵母株を成長させる手順の中では、２種類の培地を使用した：好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０３９２】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０３９３】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０３９４】
パッチした細胞を４８ウェルプレートに接種した。各ウェルは１．５ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各ウェルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１．５ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１．５ｍｌ細胞懸濁液を調製して各ウェルに加えた。４８ウェルプレートをアルミニウムフォイルで密閉した。次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３９５】
４８ウェルプレートデータに基づき上位の成績のものを選択してパッチした。パッチした細胞を２４ウェルプレートに接種した。各ウェルは３．０ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各バイアルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１０ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１０ｍｌ細胞懸濁液を調製して各バイアルに加えた。各バイアルにキャップをして、次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０３９６】
Ｋ９  ＫＡＲＩ突然変異体を有する酵母株のＬＣ／ＭＳ分析
嫌気成長期間が終了した時点で、ＬＣ／ＭＳ分析用に試料を取った。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ分離ユニット及びＡｃＱｕｉｔｙ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）をＷａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３分離カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用して実施した。化合物は、９９％水相から始まり９９％有機相で終わる水（＋０．１％ギ酸）及びアセトニトリル（＋０．１％ギ酸）の逆相勾配を使用して、０．５ｍＬ／分の流量で分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してクロマトグラムを分析した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
【０３９７】
【表４１】
0006407869.tif 000042
【０３９８】
【表４２】
0006407869.tif 000043
【０３９９】
【表４３】
0006407869.tif 000044
【０４００】
実施例１７
１６９位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びＰＮＹ２１１５における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ配列（配列番号９３）の１６９位に対応するアミノ酸における１９個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物（この例ではＫ９＿１６９ｆと称される）（表３１）及びリバースプライマーＫ９＿３０９Ｔ＿１１１７１１ｒ：ＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＡＣ（配列番号４１５；この例ではＫ９＿３０９Ｔｒと称される）を用いて、Ｋ９  ＫＡＲＩの位置１６９を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体Ｋ９ＳＢ２＿ＳＨを含むプラスミド（又はＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１）を鋳型として使用した。
【０４０１】
簡潔に言えば、レギュラーＰＣＲによってメガプライマーを調製した。メガプライマーＰＣＲ混合物は、４５μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃１０５７２０６３）、２．０μｌ  Ｋ９＿１６９ｆ（２０μＭ）、２．０μｌ  Ｋ９＿３０９Ｔｒ（２０μＭ）及び１．０μｌ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）からなった。メガプライマーの作製用ＰＣＲプログラムは以下である：開始温度は９５℃で１．０分、続いて３５回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、及び７２℃で１．０分からなった。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。
【０４０２】
次にメガプライマーを使用することにより、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２１０５１８、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を使用して遺伝子ライブラリを作成した。２５μｌ反応混合物には以下が含まれた：２．５μｌの１０×反応緩衝液、０．５μｌの５０ｎｇ／μｌ鋳型、２０．２５μｌのメガプライマー、０．５μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μｌ酵素混合物及び０．７５μｌ  ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ。メガプライマー及び鋳型を除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示したキットに含まれたものであった。この反応混合物を薄型ウェル２００μｌ容量ＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲには以下の反応を用いた：開始温度は９５℃で２分、続いて２０回の加熱／冷却サイクルであった。各サイクルは、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒、及び６８℃で５分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに１０分間６８℃に保ち、次に後の処理のため４℃に保持した。完成したＰＣＲ反応混合物に０．５μｌ  Ｄｐｎ  Ｉを添加し、次に３７℃で２時間インキュベートした。製造者の推奨どおりＤＮＡクリーニングキット（カタログ番号Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物をクリーンアップした。ＰＣＲ産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０４０３】
ユニーク配列を有する得られた変異体をＫ８ＳＢ２＿ＳＨ＿８１と共に、酵母株ＰＮＹ２１１５におけるイソブタノール生成について（各突然変異体につき三重で）分析した。Ｋ９  ＫＡＲＩ変異体を有するプラスミド及びプラスミドｐＹＺ０６７ΔＡＤＨΔＫｉｖＤを酵母宿主ＰＮＹ２１１５に形質転換した。形質転換細胞をヒスチジン及びウラシル不含合成培地（炭素源として１％エタノール）に播いた。３つの形質転換体を同じ培地の新鮮なプレートに移した。形質転換体を、４８ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、カタログ番号３９１−０５−０６１）における嫌気条件下のイソブタノール生成について試験した。有望な形質転換体を、１５ｍｌ血清バイアルにおける嫌気条件下のイソブタノール生成についてさらに試験した。
【０４０４】
５〜７日後、ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレート上の形質転換からの酵母コロニーが出現した。各変異体からのこれらの３つのコロニーを新鮮なＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓプレートにパッチし、３０℃で３日間インキュベートした。
【０４０５】
成長培地及び手順
酵母株を成長させる手順の中では、２種類の培地を使用した：好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０４０６】
好気前培養培地（ＳＥ−Ｕｒａ）：６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％ｗ／ｖロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、及び０．００２％ｗ／ｖトリプトファン。
【０４０７】
嫌気培養培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０／５０ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に構成された５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５、６．７ｇ／Ｌ  アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ  ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％ｗ／ｖヒスチジン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌ  チアミン及び１０ｍｇ／Ｌ  エルゴステロール。
【０４０８】
パッチした細胞を４８ウェルプレートに接種した。各ウェルは１．５ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各ウェルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１．５ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１．５ｍｌ細胞懸濁液を調製して各ウェルに加えた。４８ウェルプレートをアルミニウムフォイルで密閉した。次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０４０９】
４８ウェルプレートデータに基づき上位の成績のものを選択してパッチした。パッチした細胞を２４ウェルプレートに接種した。各ウェルは３．０ｍｌ好気培地を含む。プレートを透過性フォイルで覆い、３０℃で振盪しながら一晩成長させた。次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。各バイアルにつき最終ＯＤ６００＝０．２の１０ｍｌの細胞懸濁液（嫌気培地中）を作る細胞の量を計算し、嫌気培地で１０ｍｌ細胞懸濁液を調製して各バイアルに加えた。各バイアルにキャップをして、次に細胞を３０℃で振盪しながら３日間成長させた。嫌気成長の３日後、次に細胞密度（ＯＤ６００）を計測した。細胞を４，０００ｇで５分間遠心し、ＬＣ／ＭＳを用いたイソブタノール計測用に上清を収集した。
【０４１０】
Ｋ９  ＫＡＲＩ突然変異体を有する酵母株のＬＣ／ＭＳ分析
嫌気成長期間が終了した時点で、ＬＣ／ＭＳ分析用に試料を取った。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ分離ユニット及びＡｃＱｕｉｔｙ  ＴＱＤトリプル四重極質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）をＷａｔｅｒｓ  ＡｃＱｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３分離カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と共に使用して実施した。化合物は、９９％水相から始まり９９％有機相で終わる水（＋０．１％ギ酸）及びアセトニトリル（＋０．１％ギ酸）の逆相勾配を使用して、０．５ｍＬ／分の流量で分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してクロマトグラムを分析した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｌｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
【０４１１】
【表４４】
0006407869.tif 000045
【０４１２】
【表４５】
0006407869.tif 000046
【０４１３】
実施例１８  Ｋ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ変異体
５個のＮ末端アミノ酸が欠失したトランケート形態のＫ９＿ＬｕｃｙであるＫ９＿Ｌｕｃｙ＿ＳＨ（核酸配列番号８０６）をベースとするさらなる変異体を調製し、酵母発現プラスミドｐＬＨ６８９（配列番号３０６）のＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ部位にサブクローニングした。プラスミドを株ＰＮＹ２１１５に形質転換し、実施例５に記載するとおりイソブタノール生成について分析した。
【０４１４】
【表４６】
0006407869.tif 000047
【０４１５】
実施例１９
ＫＡＲＩ変異体を有する株による発酵
イソブタノール生合成経路を含むＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の７つの株を表３３に掲載する。示される株は全て、親株ＰＮＹ２１４５（国際公開第２０１３／１０２１４７号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３０２５２２９６号明細書（両方とも参照によって援用される）に開示される）をベースとしたものであり、表中に指示されるＫＡＲＩ変異体を別にして、表３３の株は全て、イソブタノール生合成経路の基質から生成物への変換を触媒する以下の酵素を含む（「（ｙ）」によって指示される場合、酵母発現用にコドンが最適化された遺伝子によりコードされる）：アセト乳酸シンターゼ（「ＡｌｓＳ」；アミノ酸配列番号８２７及びコード配列番号８２６；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（「Ｌ２Ｖ４」；配列番号８２１及び８２２；ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（「ｋｉｖＤ＿Ｌｇ」；配列番号８２５及び５４３）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（「Ｂｉ」；配列番号８２３及び８２４）。参考として、指示する株で異種発現させたＫＡＲＩに関連するインビトロ動態計測値を提供する。
【０４１６】
同じプロトコルにより、但し並列で実行するのではなしに発酵を実施した。各株を調製し、グリセロールで凍結ストックとして保存した。各株のバイアルを解凍し、それを使用して、２Ｌバッフル付きフラスコに実験室培地（アミノ酸不含酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／Ｌ；ヒスチジン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地添加剤（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、３．７ｇ／Ｌ；チアミンＨＣｌ、２ｍｇ；ナイアシン、２ｍｇ；ＭＥＳ緩衝液、１００ｍＭ；ｐＨ５．５）中の接種材料を２００ｍＬの最終容積で作成し、６００ｎＭで計測して約１ＯＤの細胞密度になるまで３０℃及び２６０ｒｐｍで培養した。
【０４１７】
シード増殖及び生成の両方のための発酵を、以下に指示するとおりの添加剤を含むろ過滅菌したトウモロコシマッシュで行った。ろ過滅菌したトウモロコシマッシュは、温度制御及び撹拌機付きのホットプレート（ＶＷＲ，米国）を使用して開放容器中で液化させることにより調製した。５３５０ｇの水道水を約５０℃まで予熱した。液化用のＳｐｅｚｙｍｅ  ＦＲＥＤ−Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，米国）を４７ｇ／Ｌストック溶液として調製し、遠心してろ過滅菌した。この容器に１００ｍＬの酵素ストック溶液を添加した。約３０００ｇのトウモロコシ固形物を加えた。温度を５５℃に２０分間、混合しながら調節した。その後、温度を８５℃に上昇させた。温度を８５℃に９０分間、混合しながら調節した。この時点以降、ホットプレートの電源を切った。温度が５０℃に下がったところで、トウモロコシマッシュ及び容器を秤量し、蒸発で失われた水を補充した。容器の内容物を８つの１Ｌ遠心ボトルに分配し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ１２（米国）床置型遠心機において８０００ｒｐｍで４０分間遠心した。上清を４層のチーズクロスでろ過した。ろ液を６つの１Ｌガラスボトルに分配し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。ろ液を５０００ＲＰＭで９０分間さらに遠心した。遠心液を３５〜４０℃に加熱し、０．２２ミクロンフィルタフラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ）でろ過した。
【０４１８】
フラスコ培養物を使用して、増殖培地で調製した２Ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ発酵槽を接種した（接種後の最終濃度：ろ過滅菌したトウモロコシマッシュ、３５０ｍＬ；尿素、２ｇ／Ｌ；酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、２ｇ／Ｌ；ナイアシン、３０ｍｇ／Ｌ；チアミン、３０ｍｇ／Ｌ；脱イオン水、５６０ｍＬの最終培地容積になるまで）；５６０ｍＬの増殖培地で１４０ｍＬの培養物を使用した。発酵槽は、溶存酸素を５％に調節し、空気流量０．３ＳＬＰＭで、２Ｍ  ＫＯＨによりｐＨを５．２に調節し、且つ温度を３０℃に調節して実行した。Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ  Ｌ４００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ；ストック溶液として脱イオン水中１．２ｇ／８０ｍＬで調製し、０．２μｍフィルタでろ過した）を定期的に添加して、グルコースを過剰に保った。培養は、６００ｎＭで計測して約４〜５ＯＤの細胞密度に達するまで続けた。
【０４１９】
生成培地（ろ過滅菌したトウモロコシマッシュ、７９０ｍＬ；尿素、２ｇ／Ｌ；ナイアシン、３０ｍｇ／Ｌ；チアミン、３０ｍｇ／Ｌ）で調製し、且つ１１０ｍＬの増殖培養物を接種した２Ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ発酵槽において、生成発酵を実施した。生成発酵槽は、０．３ＳＬＰＭの窒素雰囲気下、ｐＨを２Ｍ  ＫＯＨで５．２に調節し、温度を３０℃に調節し、且つ撹拌速度を３００ｒｐｍに調節して実行した。Ｄｉｓｔｉｌｌａｓｅ  Ｌ−４００を定期的に添加して、グルコースを過剰に保った。発酵は４５〜５２時間実行した。試料を定期的に抜き取り、全ての経路中間体及び他の代謝産物、並びにＯＤ及び乾燥細胞重量を計測した。培養上清中のグルコース、イソブタノール、及び他の発酵副産物の計測を、ＨＰＬＣにより、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）を、屈折率（ＲＩ）及びダイオードアレイ（２１０ｎｍ）検出器を伴い、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，米国）と共に使用して実施した。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として使用し、０．６ｍＬ／分の流量及び４０℃のカラム温度で達成した。発酵槽からの排気をＮ２、Ｏ２、ＣＯ２について分析し、質量分析法（Ｔｈｅｒｍｏ）によりイソブタノールについて分析した。デンプンは、酵素アッセイにより、アミログルコシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してデンプンを加水分解し、続いて得られたグルコースのＨＰＬＣ分析を行うことにより分析した。
【０４２０】
各発酵の終了時点でグルコースからのグリセロール及びイソブタノールのモル収率を計測しており、図３に示す。各発酵の炭素収支を計算し、それを使用して発酵中のイソブタノール損失を補正した。Ｋ９ＪＢ４Ｐ  ＫＡＲＩ株は、グリセロールについて０．１７ｍｏｌ／ｍｏｌ及びイソブタノールについて０．７９ｍｏｌ／ｍｏｌのモル収率となった。ＫＡＲＩ  Ｋ９ＳＢ２又はＫ９ＳＢ２−ＳＨを含む株による発酵は一つにまとめ、グリセロールについて０．１３〜０．１５ｍｏｌ／ｍｏｌ及びイソブタノールについて０．８２〜０．８３ｍｏｌ／ｍｏｌのモル収率を有した。ＫＡＲＩ  Ｋ９ＡＬＬ３、Ｋ９ＪＭ３６、Ｋ９ＪＭ４３、又はＫ９ＪＭ４４を有する株による発酵は、グリセロールについて０．１２〜０．１３ｍｏｌ／ｍｏｌ及びイソブタノールについて０．８５〜０．８６ｍｏｌ／ｍｏｌのモル収率を有した。
【０４２１】
発酵実験で評価したＫＡＲＩのインビトロ動態特性は表１２に示され、以下の表３３に掲載する。当該技術分野に記載される方法（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３００７１８９８Ａ１号明細書、実施例１８を参照）によって収集されたＫ９ＪＢ４Ｐ及びＫ９ＳＢ２（参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３００７１８９８Ａ１号明細書に記載される変異体）精製タンパク質の特性もまた、この表に示す（Ｖｍａｘの単位はＵ／ｍｇ精製タンパク質）。図３Ａ〜図３Ｂは、各発酵のグリセロール（図３Ａ）及びイソブタノール（図３Ｂ）のモル収率を示す。各株について計算した嫌気生成段階における初期成長速度を、表３４に要約する。
【０４２２】
【表４７】
0006407869.tif 000048
【０４２３】
表３３の株の詳細は以下のとおりである：（１）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＬＨ６８９：Ｌ２Ｖ４）；（２）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ）；（３）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド  ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ）；（４）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４：：ＡＬＬ３＊、ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ）；（５）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４：：ＪＭ３６＊、ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ）；（６）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４：：ＪＭ４３＊、ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ）；及び（７）ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（プラスミド：ｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ＿Ｌｇ，ｐＬＨ６８９−Ｌ２Ｖ４：：ＪＭ４）。
【０４２４】
【表４８】
0006407869.tif 000049
【０４２５】
【表４９】
0006407869.tif 000050
【０４２６】
【表５０】
0006407869.tif 000051
【０４２７】
【表５１】
0006407869.tif 000052
【０４２８】
【表５２】
0006407869.tif 000053
【０４２９】
【表５３】
0006407869.tif 000054
【０４３０】
【表５４】
0006407869.tif 000055
【０４３１】
【表５５】
0006407869.tif 000056
【０４３２】
【表５６】
0006407869.tif 000057
【０４３３】
【表５７】
0006407869.tif 000058
【０４３４】
【表５８】
0006407869.tif 000059
【０４３５】
【表５９】
0006407869.tif 000060
【０４３６】
【表６０】
0006407869.tif 000061
【０４３７】
【表６１】
0006407869.tif 000062
【０４３８】
【表６２】
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【０４３９】
【表６３】
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【０４４０】
【表６４】
0006407869.tif 000065
【０４４１】
【表６５】
0006407869.tif 000066
【０４４２】
【表６６】
0006407869.tif 000067
【０４４３】
【表６７】
0006407869.tif 000068
【０４４４】
【表６８】
0006407869.tif 000069
【０４４５】
【表６９】
0006407869.tif 000070
【０４４６】
【表７０】
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【０４４７】
【表７１】
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【０４４８】
【表７２】
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【０４４９】
【表７３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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