(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種の立体特異的ジオールデヒドラターゼを含む組換え微生物であって、前記立体特異的ジオールデヒドラターゼが配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換え微生物。
【請求項２】
異種アクチバーゼをさらに含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉと比較して立体特異的ジオールデヒドラターゼを過発現するように遺伝子改変された、組換えＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ微生物であって、前記立体特異的ジオールデヒドラターゼが配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換え微生物。
【請求項４】
アクチバーゼをさらに含む、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
アクチバーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２または４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナールおよびプロパン−１−オールの１以上を生成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
内因性または外因性アルコール脱水素酵素をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
発現が減衰またはノックアウトされているアルコール脱水素酵素をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
アルコール脱水素酵素が第２級アルコール脱水素酵素である、請求項７または８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む立体特異的ジオールデヒドラターゼを含む微生物を含む、プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナールおよびプロパン−１−オールの１以上を製造するための培養物。
【請求項１１】
プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナールおよびプロパン−１−オールの１以上の製造方法であって、基質およびプロパン−１，２−ジオールの存在下で配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む立体特異的ジオールデヒドラターゼを含む微生物を培養することを含む、製造方法。
【請求項１２】
プロパン−１，２−ジオールが、（Ｒ）プロパン−１，２−ジオールおよび（Ｓ）プロパン−１，２−ジオールのいずれか１つまたは両者である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質が、糖、デンプン、セルロース、バイオマス、加水分解物、グリセロール、合成ガス、産業廃ガス、製鋼所の廃ガス、およびＣＯ−含有ガスからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質の微生物発酵により、プロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オンおよびプロパナールに変換する酵素反応、ならびにプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを含む生成物を生成するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在まで、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オール、プロピレン、またはイソブチレンなどの大半の化学物質は、石油化学源から得られている。原油の世界的埋蔵量の減少と、途上国の需要の増加により、石油の需要と供給との圧力が高まり、代替のバイオベース化学物質が開発されている。食品または非食品作物のいずれかを使用して、糖またはセルロース系の原料を生成する現在の生化学物質の生成は、土地利用、食料安全保障、および供給の不安定さならびに環境問題において欠点を有し得る。
【０００３】
プロパン−２−オンは、米国における年間需要が２００万メートルトンに上る重要な溶剤である。プロパン−２−オールは、１年あたり３００万メートルトンの容量で、コーティングまたは工業プロセスのための溶剤として使用されている。１−プロパノールは、医薬品および化粧品の生成に重要であり、燃料の代替品として考えられている。イソブチレンは、多数の化学物質の化学的構成要素および重要な前駆体である。イソブチレンに対する世界的な需要は、１年あたり１０万メートルトンを超えると推定されており、その市場価値は２５０億米ドルである。
【０００４】
触媒プロセスを用いることで、主としてＣＯおよび／またはＣＯと水素（Ｈ２）とからなるガスを様々な燃料および化学物質に変換することができる。しかし、微生物を用いることによっても、これらのガスを燃料および化学物質に変換することができる。このような生物学的プロセスは、一般的に化学反応よりも遅いが、より高い特異性、より高い収率、より低いエネルギーコストおよびより高い毒に対する耐性など、触媒プロセスよりも優れたいくつかの利点を有する。
【０００５】
ＣＯは、石炭または石油および石油由来の生成物などの有機材料の不完全燃焼の自由エネルギーに富む主要副産物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼業界は、年間５０万トンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出していると報告されている。
【０００６】
微生物が、唯一の炭素源としてＣＯで増殖できる能力は、独立栄養成長のアセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）生化学的経路（Ｗｏｏｄｓ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路としても知られている）を使用する生物の性質である。カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）生物、光合成生物、メタン生成生物および酢酸生成生物を含む大多数の嫌気性生物は、ＣＯを様々な最終生成物、すなわち、ＣＯ２、Ｈ２、メタン、ｎ−ブタノール、アセテートおよびエタノールに代謝することが示されている。唯一の炭素源としてＣＯを使用する場合は、全てのそのような生物は、これらの最終生成物の少なくとも２種類を生成する。
【０００７】
クロストリジウム・アセトブチリカムまたはクロストリジウム・ベイジェリンキなどの一部の微生物は、ブタノール発酵（ＡＢＥまたはＩＢＥ発酵）中に主要副産物としてプロパン−２−オンまたはプロパン−２−オールを生成することが知られている（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）が、プロパン−１−オールは、出芽酵母による発酵の副産物である（Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。しかし、これらのすべての生物は、糖またはデンプン系の基質に依存している。密接に関連する微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉなどの酢酸生成生物は、唯一のエネルギー源および炭素源としてＣＯまたはＣＯ２／Ｈ２含有ガス上で化学独立栄養成長することができ、酢酸塩、エタノール、ブタノールまたは２，３−ブタンジオールなどの生成物を合成するが、プロパン−２−オンもプロパン−２−オールも合成しない（ＭｕｎａｓｉｎｇｈｅおよびＫｈａｎａｌ ２０１０）。プロパン−２−オンからプロパン−２−オールへの還元は、酢酸生成種で示されているが、基本原理は不明である（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オール、あるいはそれらの前駆体の生成法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、とりわけ、（特に、ＣＯ含有基質の）微生物発酵によってプロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オンおよびプロパナールに変換する酵素反応、ならびにプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オンを生成するための方法、ならびにこのような方法に使用する組換え微生物を提供する。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、ジオールデヒドラターゼ酵素の一種によって触媒され、プロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オンおよびプロパナールに変換する酵素反応を提供する。
【００１１】
特定の一実施形態において、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの生成法であって、微生物の存在下でプロパン−１，２−ジオールを含む基質を発酵することを含む方法を提供する。
【００１２】
特定の一実施形態において、この微生物は、１以上の他の生成物を生成する。一実施形態において、１以上の他の生成物は、エタノール、ブタノールおよび／またはブタンジオールである。
【００１３】
一実施形態において、この微生物はカルボキシド栄養性微生物である。
【００１４】
特定の一実施形態において、このカルボキシド栄養性微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉである。
【００１５】
一実施形態において、この微生物は、下記に定義するような組換え微生物である。
【００１６】
一実施形態において、この微生物は、大腸菌属、サッカロミセス属、クロストリジウム属、バチルス属、ラクトコッカス属、ザイモモナス属、コリネバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、アセトバクテリウム属、ラルストニア属、カプリアビダス属、サルモネラ属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、シュードモナス属、乳酸菌属、ロドコッカス属、エンテロコッカス属、アルカリゲネス属、ブレビバクテリウム属、メチロバクテリウム属、メチロコッカス属、メチロモナス属、メチロシスチス属、メチロサイナス属から選択される。
【００１７】
特定の一実施形態において、この微生物は、大腸菌、出芽酵母、クロストリジウム・アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、酪酸菌、Ｃ．ジオリス（Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ）、Ｃ．クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．パステリアニウム（Ｃ．ｐａｓｔｅｒｉａｎｉｕｍ）、Ｃ．ノビ（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、Ｃ．セルロリチカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、Ｃ．フィトフェルメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトコッカス・ラクティス、枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、ザイモモナスモビリス、クレブシエラ・オキシトカ、肺炎桿菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、トリコデルマ・リーゼイ、ラルストニア・ユートロファ、カプリアビダス・ネカトール、シュードモナスプチダ、ラクトバチルス・プランタラム、メチロバクテリウム・エキストロクエンスからなる群から選択される。
【００１８】
一実施形態において、この方法は、
ａ．１以上の微生物の培養物を含む基質を含むバイオリアクターに、糖、デンプン、セルロース、バイオマス加水分解物、合成ガスおよび／またはグリセロールを含む基質を提供する好気性または嫌気性発酵のステップと、
ｂ．この基質にプロパン−１，２−ジオールを提供するステップと、
ｃ．プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するために、バイオリアクター内で培養物を嫌気性発酵させるステップとを含む。
【００１９】
特定の一実施形態において、この方法は、
ａ．１以上のカルボキシド栄養性微生物の培養物を含む基質を含むバイオリアクターに、ＣＯ含有基質を提供するステップと、
ｂ．この基質にプロパン−１，２−ジオールを提供するステップと、
ｃ．プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するために、バイオリアクター内で培養物を嫌気性発酵させるステップとを含む。
【００２０】
特定の一実施形態において、この方法は、
ａ．工業プロセスの結果として生成されるＣＯ含有ガスを捕捉するステップと、
ｂ．１以上カルボキシド栄養性微生物およびプロパン−１，２−ジオールを含む基質中でプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するために、ＣＯ含有ガスを嫌気性発酵させるステップとを含む。
【００２１】
一実施形態において、この方法は、
ａ．１以上の微生物の培養物を含む基質を含むバイオリアクターに、糖、デンプン、セルロース、バイオマス加水分解物、合成ガスおよび／またはグリセロールを含む基質を提供する好気性または嫌気性発酵のステップと、
ｂ．１以上の微生物がプロパン−１，２−ジオールを生成するステップと、
ｃ．１以上の微生物が、プロパン−１，２−ジオールを変換し、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するステップとを含む。
【００２２】
方法の態様の特定の実施形態において、発酵は水性培地中で起こる。
【００２３】
一実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールであり、生成物はプロパン−２−オンおよび／またはプロパン−２−オールである。
【００２４】
一実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールであり、生成物はプロパナールおよび／またはプロパン−１−オールである。
【００２５】
好ましくは、この基質はＣＯを含む。好ましくは、この基質は、ＣＯ含有ガス状基質である。一実施形態において、この基質は、工業廃ガスを含む。特定の実施形態において、このガスは製鋼所の廃ガスまたは合成ガスである。
【００２６】
一実施形態において、この基質は、典型的には、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、４０体積％〜５５体積％のＣＯなどの主要な割合のＣＯを含む。特定の実施形態において、この基質は、約２５体積％、約３０体積％、約３５体積％、約４０体積％、約４５体積％、約５０体積％、約５５体積％、または約６０体積％のＣＯを含む。
【００２７】
一実施形態において、この方法は、さらに、発酵ブロスからプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オール、ならびに必要に応じて、１以上の他の生成物を回収するステップを含む。
【００２８】
一実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは、基質へ微生物を導入する前、導入と同時に、または導入後に発酵基質に添加される。
【００２９】
一実施形態において、発酵ブロスのＣＯおよび／または他の成分は、プロパン−１，２−ジオールの導入前、導入と同時に、または導入後に基質に添加されてもよい。
【００３０】
一実施形態において、基質内に存在するプロパン−１，２−ジオールは、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するカルボキシド栄養性微生物によって生成される。一実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは、同じバイオリアクター内で生成されても、または異なるバイオリアクター内で生成されてもよい。
【００３１】
さらなる実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは、同じバイオリアクターまたは異なるバイオリアクター内で異なる微生物によって生成される。
【００３２】
組換え微生物
第２の態様において、本発明は、親微生物内に存在しない（本明細書で外因性酵素と呼ばれ得る）１以上の外因性ジオールデヒドラターゼ酵素を発現するように改変された組換え微生物を提供する。
【００３３】
第３の態様において、本発明は、親微生物内に存在する（本明細書で内因性酵素と呼ばれ得る）１以上の内因性ジオールデヒドラターゼ酵素を過剰発現するように改変された微生物を提供する。
【００３４】
第４の態様において、本発明は、親微生物内に存在する（本明細書で内因性酵素と呼ばれ得る）１以上の内因性ジオールデヒドラターゼ酵素の変異型を発現するように改変された微生物を提供する。
【００３５】
第２、第３または第４の態様の実施形態において、この微生物は、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの収率が、親微生物によって生成される場合よりも高くなり得るように適合される。
【００３６】
第２、第３または第４の態様の実施形態において、この微生物は、親微生物によって生成される場合よりも速い速度でプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するように適合される。
【００３７】
第２の態様の一実施形態において、ジオールデヒドラターゼ酵素。
【００３８】
特定の実施形態において、このジオールデヒドラターゼ酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍもしくはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＥＣ ４．１.２．２８）のジオールデヒドラターゼ、またはその機能的に等価な変異型の特定の特性を有する。
【００３９】
特定の実施形態において、このジオールデヒドラターゼ酵素は、クレブシエラ・オキシトカもしくは肺炎桿菌（ＥＣ ４．１.２．３０）のプロパンジオールデヒドラターゼ、またはその機能的に等価な変異型の特定の特性を有する。
【００４０】
第２の態様の一実施形態において、この新規のジオールデヒドラターゼ酵素およびその活性化酵素は、配列番号１および２（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの酵素）ならびにＹＰ＿００３７７９３５３およびＹＰ＿００３７７９３５４（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの酵素）に定義されるとおりであるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【００４１】
第２の態様の一実施形態において、この新規のジオールデヒドラターゼ酵素およびその活性化酵素は、配列番号３および４（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの遺伝子）ならびにＣＬＪＵ＿ｃ１１８３０；９４４４８００およびＣＬＪＵ＿ｃ１１８３１；９４４４８０１（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの遺伝子）に定義される核酸配列によってコードされるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【００４２】
第３の態様の一実施形態において、クレブシエラ属の３つのサブユニットを含むジオールデヒドラターゼ酵素は、ＹＰ＿００２２３６７８０、ＹＰ＿００２２３６７８１、ＹＰ＿００２２３６７８２（肺炎桿菌）および１ＤＩＯ＿Ａ、１ＤＩＯ＿Ｂ、１ＤＩＯ＿Ｃ（Ｋ．オキシトカ）に定義されるとおりであるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【００４３】
第３の態様の一実施形態において、クレブシエラ属のジオールデヒドラターゼ酵素の３つのサブユニットは、ＧＩ：２０６５７５７４８、ＧＩ：２０６５７５７４９、ＧＩ：２０６５７５７５０（肺炎桿菌）およびＧＩ：８６８００６、ＧＩ：８６８００７、ＧＩ：８６８００８（Ｋ．オキシトカ）に定義される核酸によってコードされるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【００４４】
第２または第３の態様の特定の実施形態において、この組換え微生物は、親微生物の同じ酵素の発現と比較して、内因性酵素の発現が減衰するか、またはノックアウトされるように改変される。
【００４５】
一実施形態において、発現が減衰するかまたはノックアウトされている酵素は、アルコール脱水素酵素である。特定の実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素は、配列番号５（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）およびＡＤＫ１５５４４.１（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）に定義されるか、またはその機能的に等価な変異型である。さらなる実施形態において、第２級アルコール脱水素酵素は、配列番号６（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）およびＣＬＪＵ＿ｃ２４８６０；ＧＩ：３００４３５７７７（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）に定義される核酸によってコードされる。
【００４６】
さらなる実施形態において、この組換え生物は、プロパン−１−オールおよび／もしくはプロパン−２−オールに加えて、またはプロパン−１−オールおよび／もしくはプロパン−２−オールの代わりに、プロパナールおよび／またはプロパン−２−オンを生成する。
【００４７】
一実施形態において、この微生物は、１以上の内因性核酸の発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸を含み、１以上の内因性核酸は、前述のジオールデヒドラターゼをコードしている。
【００４８】
一実施形態において、発現が増加するように適合された１以上の外因性核酸は調節エレメントである。一実施形態において、この調節エレメントはプロモーターである。一実施形態において、このプロモーターは構成的プロモーターである。一実施形態において、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターおよびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
【００４９】
一実施形態において、この組換え微生物は、メチルグリオキサール合成酵素（ｍｇｓＡ）；メチルグリオキサール還元酵素（ｙｄｊＧ）；第２級アルコール脱水素酵素（ｇｌｄＡ／ｂｕｄＣ）；ラクトアルデヒド還元酵素／第１級アルコール脱水素酵素（ｆｕｃＯ）をさらに含むがこれらに限定されない、プロパン−１，２−ジオールを生成するための１以上の外因性酵素を発現するように適合される。さらなる態様において、この微生物は、プロパン−１，２−ジオール生合成経路の１以上の内因性酵素を過剰発現するように適合される。
【００５０】
一実施形態において、この１以上の外因性核酸は、前述のジオールデヒドラターゼ酵素をコードする核酸構築物またはベクターであり、特定の一実施形態において、プラスミドである。
【００５１】
一実施形態において、この外因性核酸は発現プラスミドである。
【００５２】
特定の一実施形態において、この親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含むカルボキシド栄養性細菌の群から選択される。
【００５３】
一実施形態において、この親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。特定の一実施形態において、この微生物は、株ＤＳＭ１００６１から派生したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態において、この微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００５４】
一実施形態において、この親微生物は、大腸菌またはラクトコッカス・ラクティスである。
【００５５】
（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉから）単離された核酸
第４の態様において、本発明は、カルボキシド栄養性微生物から単離され、ジオールデヒドラターゼをコードする核酸を提供する。
【００５６】
第４の態様のさらなる実施形態において、このカルボキシド栄養性微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。特定の一実施形態において、この微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの株ＤＳＭ１００６１から派生したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍＤＳＭ２３６９３である。
【００５７】
第４の態様のさらなる実施形態において、微生物内で発現させる場合、ジオールデヒドラターゼをコードする核酸は、ＣＯおよびプロパン−１，２−ジオールを含む基質の発酵によって、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの生成の収率ならびに／あるいは速度の増加を促進する。
【００５８】
第４の態様の一実施形態において、ジオールデヒドラターゼをコードする核酸は、配列番号１および２であるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【００５９】
一実施形態において、この核酸は、微生物内で発現させる場合に、ＣＯおよびプロパン−１，２−ジオールを含む基質の発酵によって、微生物がプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成することを可能にする、前述の本発明の酵素のうちの１以上をコードする配列を含む。特定の一実施形態において、本発明は、微生物内で発現させる場合に、ＣＯ含有基質の発酵によって、微生物がプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成することを可能にする２つの酵素をコードする核酸を提供する。
【００６０】
一実施形態において、本発明の核酸はさらにプロモーターを含む。一実施形態において、このプロモーターは、その制御下の遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態において、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターが使用される。他の特定の実施形態において、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターが使用される。特定の一実施形態において、このプロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のものである。
【００６１】
第５の態様において、本発明は、第４の態様の１以上の核酸を含む核酸構築物またはベクターを提供する。
【００６２】
特定の一実施形態において、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターである。特定の一実施形態において、発現構築物またはベクターは、プラスミドである。
【００６３】
第６の態様において、本発明は、第４の態様の核酸または第５の態様のベクターもしくは構築物のいずれか１以上を含む宿主生物を提供する。
【００６４】
第７の態様において、本発明は、本発明の第４の態様において言及した発現構築物もしくはベクターまたはメチル化構築物もしくはベクターを含む組成物を提供する。
【００６５】
好ましくは、この組成物は、本発明の第２の態様による組換え微生物を生成することができる。
【００６６】
特定の一実施形態において、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターは、プラスミドである。
【００６７】
第８の態様において、第１の態様の方法によって生成される場合に、本発明は、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、プロパナールおよび／またはプロパン−２−オンを提供する。
【００６８】
別の態様において、本発明は、本発明の第２または第３の態様の微生物を生成するための方法であって、微生物が、ＣＯおよびプロパン−１，２−ジオールを含む基質の発酵によって、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するか、または親微生物と比較して増加した量のプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オール、必要に応じて、１以上の他の生成物を生成することができるように、１以上の核酸を導入することによってカルボキシド栄養性酢酸生成親微生物を形質転換することを含む方法を提供し、その際、親微生物は、ＣＯ含有基質の発酵によって、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成することができないか、または組換え微生物よりも低いレベルでプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成する。
【００６９】
特定の一実施形態において、親微生物は、メチルグリオキサール合成酵素（ｍｇｓＡ）；メチルグリオキサール還元酵素（ｙｄｊＧ）；第２級アルコール脱水素酵素（ｇｌｄＡ／ｂｕｄＣ）；ラクトアルデヒド還元酵素／第１級アルコール脱水素酵素（ｆｕｃＯ）を含むがこれらに限定されない、プロパン−１，２−ジオールの生合成のための１以上の酵素を発現するように適合された１以上の外因性核酸を導入することによって形質転換される。さらなる実施形態において、親微生物はさらに、プロパン−１，２−ジオールの生合成経路の１以上の酵素を発現するように適合された１以上の外因性核酸を導入することによって形質転換される。さらなる実施形態において、親微生物はさらに、プロパン−１，２−ジオールの生合成経路の１以上の酵素を発現するように適合された１以上の内因性核酸を発現または過剰発現することによって形質転換される。一実施形態において、親微生物は、親微生物内に天然に存在するプロパン−１，２−ジオール経路内の１以上の内因性酵素を過剰発現するように適合された１以上の核酸で形質転換される。
【００７０】
特定の実施形態において、この１以上の酵素は前述のとおりである。
【００７１】
本発明は、本願明細書で言及されるかまたは示される部分、要素および特徴に個々に存在するか、または前記部分、要素もしくは特徴の２以上の任意の組み合わせまたは全ての組み合わせで集合的に存在すると広く言うこともでき、本発明が関連する技術分野で公知の均等物を有する特定の整数が本明細書に記載される場合には、このような公知の均等物は個々に記載されたものとして本明細書に援用されるとみなされる。
【００７２】
本発明のこれらのおよび他の態様は、その全ての態様において考慮されるべきであり、添付の図面を参照することで、例示としてのみ記載される以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】プロパン−１，２−ジオールからのプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの立体特異的生成を示す反応経路の図である。
【図２】Ａ−プロパン−１，２−ジオール、Ｂ−（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールおよびＣ−（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールからの生成物プロパナール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オールおよびエタノールの生成を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。プロパン−２−オンは、ＡおよびＣの副産物であるが、プロパン−２−オールピークにより隠されている。さらなる分析では、異なるガスクロマトグラフィー法を用いて、プロパン−２−オンを別々に溶出した。
【図３】プロパン−２−オンおよびプロパン−２−オールの保持時間が強調されている、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養物上のヘッドスペースのガスクロマトグラムである。プロパン−１，２−ジオールを添加していない培養物、Ａ；（Ｒ）−プロパン−２−オールを添加した培養物、Ｂ。
【図４】Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロパン−１，２−ジオールを添加していない培養物Ａは、プロパン−１−オール、またはプロパン−２−オールを示さない。（Ｒ）−プロパン−２−オールを添加した培養物Ｂは、プロパン−１−オールおよびプロパン−２−オールの生成を示す。
【図５】Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉの培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロパン−１，２−ジオールを添加していない培養物Ａおよび（Ｒ）−プロパン−２−オールを添加した培養物Ｂは、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−１−オールまたはプロパン−２−オールへの変換を示さない。
【図６】Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロパン−１，２−ジオールを添加していない培養物Ａは、プロパン−１−オールまたはプロパン−２−オールを示さず、（Ｒ）−プロパン−２−オールを添加した培養物Ｂは、残留プロパン−１，２−ジオールを示さず、プロパン−２−オールではなくプロパン−１−オールのみの生成を示す。
【図７】ｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣを有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（濃い方の棒グラフ）および野生型のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（薄い方の棒グラフ）におけるプロパン−１，２−ジオールからのプロパノール生成を示すグラフである。エラーバーは、３回の反復の標準偏差を表す。
【図８】Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼとＢＬＡＳＴ検索からの最も関連する酵素とのアラインメントの概要である。灰色のバーは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ参照配列との同一性を表し、黒い領域はミスマッチを表し、白い領域はギャップを表す。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉにのみ存在するドメインがボックス内で強調されている。
【図９】酪酸菌の培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。接種時の培養物Ａは、グリセロールおよびプロパン−１，２−ジオールを示す。増殖４８時間後の培養物Ｂは、幾分かの残留プロパン−１，２−ジオールおよび生成されたプロパン−１−オールを示す。
【図１０】プライマーＯｇ８４ｆおよびＯｇ８５ｒを使用した、ジオールデヒドラターゼ遺伝子内のグループＩＩイントロン挿入のＰＣＲによる確認の写真である。クラリスロマイシン選択後の８個のクローンを無作為にスクリーニングした。
【図１１】ジオールデヒドラターゼが不活性化されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体の、増殖１週間後の培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。プロパン−１，２−ジオールを添加していない培養物Ａおよび（Ｒ）−プロパン−２−オールを添加した培養物Ｂは、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−１−オールまたはプロパン−２−オールへの変換を示さない。
【図１２】ｐＴｒｃ−ｄｈａＢ１Ｂ２（Ａ）およびｐＴｒｃ９９Ａ（Ｂ）を有する大腸菌の、４ｇ／Ｌのプロパン−１，２−ジオールの存在下での増殖４８時間後の培養物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
プロパン−２−オンおよびプロパン−２−オールの全ての公知の生合成経路は、アセチル−ＣｏＡを起点とし、アセトアセチル−ＣｏＡおよびアセト酢酸の中間体を経由する。本明細書で、グリセルアルデヒド−３−リン酸またはピルビン酸からラクトアルデヒドおよびプロパン−１，２−ジオールを経由して（Ｂｅｒｒｉｏｓ−Ｒｉｖｅｒａ、Ｓａｎ、およびＢｅｎｎｅｔｔ２００３；ＪａｉｎおよびＹａｎ２０１１）、プロパン−２−オンおよびプロパン−２−オールへの代替ルートを提示する。プロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オンおよびプロパナールに立体特異的に変換することができる酵素について説明する。その後、これらの生成物は、プロパン−２−オールおよびプロパン−１−オールにさらに変換することができる。しかし、プロパン−１，２−ジオールのプロパナールへの変換については、プロパン−１，２−ジオールをプロパナールおよびプロパン−２−オンの両方に変換することができない肺炎桿菌の別の酵素によって説明されている（ＪａｉｎおよびＹａｎ２０１１）。本明細書では、この酵素を天然に含み得る酢酸生成細胞、全ての天然のプロパン−１，２−ジオール生成宿主生物、または大腸菌もしくは出芽酵母について示されているようなプロパン−１，２−ジオール生成のために改変された工学処理細胞のいずれかにおける、プロパン−２−オン／プロパン−２−オールおよび／またはプロパナール／プロパン−１−オールの選択的生成のための酵素ならびにプロセスについて説明する（Ｂｅｒｒｉｏｓ−Ｒｉｖｅｒａ、Ｓａｎ、およびＢｅｎｎｅｔｔ２００３；ＪａｉｎおよびＹａｎ２０１１）。この反応は、前駆体プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナール、プロパン−１−オールからの他の物質、例えば、プロパン−２−オンから生成することができるイソブチレンの生成も可能にする（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）（国際公開第２０１１０３２９３４号）。新規のジオールデヒドラターゼを用いる本発明の別の利点は、酵素機構の性質にある。生成物を再利用することができないように、ジオールデヒドラターゼが不可逆反応を触媒し、したがって、速度制御要素は効率的な生成が可能になることは、合成経路を設計する際に、重要な留意事項である。（Ｂａｒ−Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｂｏｎｄ−Ｗａｔｔｓ、Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、およびＣｈａｎｇ  ２０１１）。
【００７５】
以下に、好ましい実施形態を含み、一般用語で与えられる本発明を説明する。本発明はさらに、本発明を支持する実験データ、本発明の様々な態様の具体例、および本発明を実施する手段を提供する下記の見出し「実施例」の下に与えられる開示から明らかにされる。
【００７６】
定義
本明細書で言及する「発酵ブロス」とは、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培地である。
【００７７】
本明細書で言及する「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素を発現する微生物であり、目的微生物とは区別される。
【００７８】
本明細書で言及する「目的微生物」は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現する微生物であり、シャトル微生物とは区別される。
【００７９】
「効率の増加」および「増加した効率」などの用語は、発酵プロセスに関連して使用される場合に、発酵を触媒する微生物の増殖速度、生成物の高い濃度での増殖速度および／または生成物の生成速度、消費される基質の体積当たりの生成される所望の生成物の体積、所望の生成物の生成速度または生成レベル、ならびに発酵の他の副産物と比較した所望の生成物の相対的割合のうちの１以上の増加を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
「一酸化炭素を含む基質」という語句および類似する用語は、任意の基質を含むと理解されるべきであり、例えば、その中の一酸化炭素は、増殖および／または発酵のための１以上の細菌株に利用できる。
【００８１】
「一酸化炭素を含むガス状基質」という語句ならびに類似の語句および用語は、ある程度の一酸化炭素を含む全てのガスを含む。特定の実施形態において、この基質は、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％、２０体積％〜約７０体積％、３０体積％〜約６０体積％、および４５体積％〜約５５体積％のＣＯを含む。特定の実施形態において、この基質は、約２５体積％、約３０体積％、約３５体積％、約４０体積％、約４５体積％、約５０体積％、約５５体積％、または約６０体積％のＣＯを含む。
【００８２】
「単離された」という語句および類似する用語は、集団の他のメンバーから除去された集団のメンバーを指す。一般的に、この集団は混合集団であり、単離されたメンバーは、シングルトンまたは均質集団のメンバーのいずれかである。この用語は、微生物、タンパク質、および核酸などを説明するために使用することができる。
【００８３】
「組換え体」という語句および類似する用語は、異なる個体、異なる種、または共に結合された異なる属の一部を含む核酸、タンパク質または微生物を指す。一般的に、組換え体は、複合核酸が形成されるように、組換えＤＮＡ技術を用いて行われる。例えば、複合核酸を用いて、複合タンパク質を作製することができる。組換え体を用いて、融合タンパク質を作製することができる。組換え体を用いて、複合核酸を維持および複製し、必要に応じてタンパク質、必要に応じて複合タンパク質を発現する微生物を形質転換することができる。
【００８４】
「立体特異的」などの用語は、差次的に鏡像異性体を認識し、鏡像異性体との異なる反応を触媒する酵素を指す。したがって、一方の鏡像異性体のみが反応するか、またはそれぞれの鏡像異性体が別個の生成物を生み出してもよい。
【００８５】
基質にとって水素を含有することは必要ではないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法による生成物形成に有害であってはならない。特定の実施形態において、水素の存在は、全体的な効率が改善されたアルコール生成をもたらす。例えば、特定の実施形態において、基質のＨ２：ＣＯの比は、約２：１、１：１または１：２であり得る。一実施形態において、基質は、約３０体積％以下、２０体積％以下、約１５体積％以下、または約１０体積％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質流は、低濃度、例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＨ２を含むか、または実質的に水素を含まない。この基質は、約１体積％〜約８０体積％、または１体積％〜約３０体積％などの少しのＣＯ２も含んでいてもよい。一実施形態において、この基質は、約２０体積％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、この基質は、約１５体積％以下、約１０体積％以下、約５体積％以下のＣＯ２を含むか、または実質的にＣＯ２を含まない。
【００８６】
以下の説明において、本発明の実施形態を、「ＣＯ含有ガス状基質」の送達および発酵の観点から説明する。しかし、このガス状基質は、代替的な形態で提供されてもよいことが理解されるべきである。例えば、ＣＯ含有ガス状基質は、液体中に溶解されて提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素含有ガスで飽和され、その後、その液体がバイオリアクターに添加される。これは、標準的な方法を用いて達成することができる。一例として、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ. ａｌ.Ｓｃａｌｅ−ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０１巻、Ｎｏ．３／１０月、２００２）を使用することができる。さらなる例として、ＣＯ含有ガス状基質は、固体支持体上に吸着させてもよい。このような代替方法は、「ＣＯ含有基質」などの用語の使用によって包含される。
【００８７】
本発明の特定の実施形態において、ＣＯ含有ガス状基質は、工業オフガスまたは廃ガスである。「工業廃ガスまたはオフガス」は、工業プロセスによって生成されるＣＯを含む任意のガスを含み、鉄金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生成、およびコークス製造の結果として生成されるガスを含むと広く理解されるべきである。さらなる例を、本明細書の他の箇所に提供することができる。
【００８８】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書で使用する「発酵」、「発酵プロセス」または「発酵反応」などの語句は、プロセスの増殖相および生成物生合成相の両方を包含することが意図される。本明細書でさらに説明するように、いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらの反応器のいずれかまたは両方に添加することを含むと理解されるべきである。
【００８９】
「バイオリアクター」という用語は、連続攪拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、または気液接触に適する他の容器もしくは他の装置を含む１以上の容器および／またはタワーあるいは配管からなる発酵装置を含む。いくつかの実施形態において、このバイオリアクターは、第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、バイオリアクターまたは発酵反応への基質の添加に言及する場合には、必要に応じて、これらの反応器のいずれかまたは両方に添加することを含むと理解されるべきである。
【００９０】
「外因性核酸」は、それらが導入される微生物の外に由来する核酸である。外因性核酸は、導入される微生物（例えば、組換え微生物が由来する親微生物）、導入される生物とは異なる微生物の株もしくは種を含むがこれらに限定されない任意の適切な供給源に由来し得るか、または人工的にまたは組換えによって作製することができる。核酸が、異なる種の微生物に由来し、異なる配列を有する場合は、それらは異種である。一実施形態において、外因性核酸は、導入されるべき微生物内に天然に存在する核酸配列を表し、（例えば、配列（例えば、遺伝子）のコピー数を増加させるか、または発現を増加させるために強力なプロモーターもしくは構成的プロモーターを導入することによって）特定の遺伝子の発現を増加させるかまたは過剰発現させるために導入される。別の実施形態において、外因性核酸は、導入される微生物内に天然に存在しない核酸配列を表し、（例えば、プロモーターなどの調節エレメントを導入する場合に）微生物内に天然に存在しない生成物の発現もしくは微生物にとって天然の遺伝子の発現の増加を可能にする。外因性核酸は、導入される微生物のゲノム中に組み込まれるか、または染色体外状態のままでいるように適合されてもよい。
【００９１】
「外因性」は、タンパク質を指すために使用することもできる。これは、組換え微生物が由来する親微生物に存在しないタンパク質を指す。
【００９２】
組換え微生物および核酸またはタンパク質に関連して本明細書で使用する「内因性」という用語は、組換え微生物が由来する親微生物に存在する任意の核酸またはタンパク質を指す。
【００９３】
特段の断りのない限り、本明細書で言及する「プロパン−１，２−ジオール」は、２つの鏡像異性体（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールおよび（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールのラセミ混合物を指す。特段の断りのない限り、本明細書で言及する「プロパノール」は、２つの異性体プロパン−１−オールおよびプロパン−２−オールの混合物を指す。本明細書で言及する反応生成物が、プロパン−１−オールまたはプロパン−２−オールを含む場合、対応する中間体プロパナールおよびプロパン−２−オンが追加的または代替的に生成され得ることは、当業者であれば理解するであろう。場合によって、単体生成物としての中間体アルデヒドまたはケトン化合物の単離が望ましいことがあり、必要に応じて、このようなアルデヒドおよびケトン生成物は、本発明の範囲内に含まれると意図される。
【００９４】
本発明は、配列が本明細書に具体的に例示される配列とは異なるが、実質的に同じ機能を実行する核酸を用いて実施することができると理解されたい。このことは、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列にとって、コードされるタンパク質またはペプチドが実質的に同じ機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配列にとって、変異型の配列は、１以上の遺伝子の発現を促進する能力を有する。このような核酸は、本明細書で「機能的に等価な変異」と言及され得る。一例として、核酸の機能的に等価な変異型は、対立遺伝子変異型、遺伝子の断片、変異（欠失、挿入、およびヌクレオチド置換など）ならびに／あるいは多型などを含む遺伝子を含む。他の微生物由来の相同遺伝子も、本明細書に具体的に例示する配列の機能的に等価な変異型の例として見なされ得る。これらには、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉなどの種の相同遺伝子が含まれ、これらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公的に利用可能である。「機能的に等価な変異型」という語句も、配列が特定の生物のコドン最適化の結果として変化する核酸を含むと解釈されるべきである。核酸の「機能的に等価な変異型」は、本明細書において、好ましくは、同定された核酸と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上の核酸配列同一性を有する。
【００９５】
本発明は、配列が本明細書に具体的に例示されるアミノ酸配列とは異なるポリペプチドを用いて実施することができることも理解されたい。これらの変異体は、「機能的に等価な変異体」と本明細書で呼ばれることもある。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体は、同定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性を共有し、目的のペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ機能を有する。このような変異体は、それらの範囲内にタンパク質またはペプチドの断片を含み、その断片はポリペプチドの切断型を含み、欠失が１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個のアミノ酸であり得、ポリペプチドのいずれかの末端から１〜２５個の残基に及び得、欠失が領域内の任意の長さのものであり得るか、または特定の触媒機能および活性を付与するか、基質もしくは補因子の結合を付与するタンパク質の内部の位置もしくは特定のドメインに存在し得る。特定のポリペプチドの機能的に等価な変異体も、例えば、前の段落に例示したように、他の種の細菌内で相同遺伝子が発現するポリペプチドを含むと本明細書では解釈されるべきである。
【００９６】
本明細書で使用する「実質的に同じ機能」は、核酸またはポリペプチドが変異体の核酸またはポリペプチドの機能を実行することができることを意味すると意図される。例えば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同じ反応を触媒することができる。しかし、その変異体は、変異体のポリペプチドまたは核酸と同じレベルの活性を有することを意味すると解釈されるべきではない。
【００９７】
機能的に等価な変異型は、当業者に公知の方法を用いて、変異体の核酸またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有するか否かを評価することができる。しかし、一例として、ジオールデヒドラターゼ活性について試験するためのアッセイは、実施例の欄で説明されており、ＨＰＬＣ法を使用するかまたは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化することによって評価することができる（Ｔｏｒａｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９７７）。
【００９８】
本発明に関連して使用する「過剰発現する」および「過剰発現」ならびに類似する用語および語句は、同じ条件下で親微生物の（核酸を含む）タンパク質の発現レベルと比較して、（タンパク質をコードする１以上の核酸の発現を含む）１以上のタンパク質の発現増加を含むと広く解釈されるべきである。タンパク質（または核酸）が任意の特定のレベルで発現することを意味すると解釈されるべきではない。
【００９９】
本明細書で言及する「減衰した発現」は、親微生物における発現と比較して減少した核酸またはタンパク質の発現を指す。減衰した発現には、全く発現していない核酸またはタンパク質を指す「ゼロ」発現も含まれる。「ゼロ」発現は、ＲＮＡサイレンシング、発現プロセスの変更（例えば、プロモーター機能の破壊）、または酵素をコードする核酸のゲノムからの完全もしくは部分的な除去（すなわち、「ノックアウト」）を含む、当業者に公知の任意の方法によって達成することができる。
【０１００】
「親微生物」は、本発明の微生物が由来する微生物である。本発明の微生物は、人工もしくは自然選択、変異、または遺伝子組換えなどの任意の方法によって導出することができる。親微生物は、自然に発生するもの（すなわち、野生型微生物）、または事前に改変されるが、本発明の目的の酵素のうちの１以上を発現もしくは過剰発現しないものであり得る。したがって、本発明の組換え微生物は、親微生物内で発現または過剰発現しない１以上の酵素を発現または過剰発現するように改変されていてもよい。
【０１０１】
核酸「構築物」すなわち「ベクター」などの用語は、細胞内に遺伝物質を伝達する媒体として使用するのに適する（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）任意の核酸を含むと広く解釈されるべきである。これらの用語は、プラスミド、（バクテリオファージを含む）ウイルス、コスミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターは、１以上の調節エレメント、複製起点、マルチクローニングサイトおよび／または選択可能なマーカーを含んでもよい。特定の一実施形態において、構築物またはベクターは、構築物またはベクターがコードする１以上の遺伝子の発現を可能にするように適合される。核酸構築物またはベクターは、裸の核酸、ならびに細胞への送達を容易にするために１以上の薬剤で製剤化された核酸（例えば、リポソーム結合核酸、核酸が含まれている生物）を含む。
【０１０２】
開示
本発明者らは、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールが、ＣＯおよびプロパン１，２−ジオールを含む基質の存在下で、カルボキシド栄養性微生物により生成することができることを見出した。プロパン−１，２−ジオールのラセミ混合物からのプロパン−２−オンおよび／またはプロパン−１−オールならびに／あるいはプロパン−２−オールの微生物による生成は、これまで示されていない。さらなる実験の後、本発明者らは、（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールを含む基質の発酵が、プロパン−２−オンおよび／またはプロパン−２−オールを優先的に生成し、（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールを含む基質は、プロパナールおよび／またはプロパン−１−オールを優先的に生成することを示した。本発明者らは、プロパン−１，２−ジオールの立体特異的脱水を触媒して、（（Ｓ）鏡像異性体から）プロパナールまたは（（Ｒ）鏡像異性体から）プロパン−２−オンのいずれかを形成するカルボキシド栄養性微生物において、図１に示すように反応が進行すると考えている。この反応を触媒するジオールデヒドラターゼが同定され、単離されている。本発明者らは、これらの化合物が、その後、内因性アルコール脱水素酵素（複数可）の作用により、対応するアルコールプロパン−１−オールまたはプロパン−２−オールに変換されると考えている。第２級アルコール脱水素酵素を同定し、プロパン−２−オンをプロパン−２−オールに変換することが実証されている。同定された酵素は、生成物もしくは中間体としてプロパン−１，２−ジオールを生成する任意の組換え生物内でのプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの形成のために使用することができるか、またはそうするように遺伝子工学処理されている（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎ２０１１）。この反応は、例えば、前駆体プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナール、プロパン−１−オールから生成することができるイソブチレンなどの他のものの生成も可能にする。
【０１０３】
本発明は、微生物発酵によるプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オール、ならびに必要に応じて、１以上の他の生成物の生成法であって、本明細書で定義されるカルボキシド栄養性微生物を用いて、ＣＯおよびプロパン−１，２−ジオールを含む基質を発酵することを含む方法を提供する。本発明の方法を用いて、工業プロセスからの大気中の炭素の全排出量を削減することができる。
【０１０４】
本発明は、糖ベースの基質からのプロパノールなどのバイオ燃料の生成における利点を有し得、工業プロセスからの一酸化炭素を含む廃ガスを利用した、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよびプロパン−２−オールの生成のための代替手段を提供する。
【０１０５】
プロパン−１，２−ジオールは、当業者に公知の任意の方法によって発酵基質に添加してもよい。一例として、プロパン−１，２−ジオールは、基質への微生物の導入前、導入と同時、また導入後に添加してもよい。さらに、発酵ブロスのＣＯおよび／または他の成分は、プロパン−１，２−ジオールの導入前、導入と同時、また導入後に基質に添加してもよい。
【０１０６】
基質に存在するプロパン−１，２−ジオールは、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するカルボキシド栄養性微生物によって生成することができ、プロパン−１，２−ジオールの生成は、同じバイオリアクターまたは異なるバイオリアクター中であってよい。さらなる実施形態において、プロパン−１，２−ジオールは、同じバイオリアクターまたは異なるバイオリアクター中の異なる微生物によって生成される。
【０１０７】
特定の実施形態において、この微生物は、１以上の他の生成物、例えば、エタノール、ブタノールおよび／またはブタンジオールも生成する。プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの生成に加えて、エタノール共生成が観察されることは図２から分かる。
【０１０８】
好ましくは、発酵は、本明細書で定義した本発明の組換え微生物を用いて、少なくともプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成するために、バイオリアクター中で基質を嫌気性発酵させるステップを含む。
【０１０９】
組換え微生物
本発明者らは、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの生成のための組換え生物およびその使用法を開発した。組換えカルボキシド栄養性微生物は、外因性のジオールデヒドラターゼ酵素を発現し、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの収率が、親微生物によって生成される場合よりも高くすることができる。プロパン−１，２−ジオールから生成されるプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの比も、このように変更することができる。微生物は、親微生物によって生成される場合よりも速い速度でプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールも生成する。
【０１１０】
図１から分かるように、ジオールデヒドラターゼ酵素は、（Ｒ）および／または（Ｓ）プロパン−１，２−ジオールの対応するケトン／アルデヒド、すなわち、それぞれプロパン−２−オンまたはプロパナールへの反応を触媒する。プロパン−１，２−ジオールから生成されるプロパノールについて本明細書で言及され得るが、このような生成が、対応するアルデヒド／ケトン中間体を介している可能性があることは、当業者であれば理解するであろう。さらなる研究により、本発明者らは、これらのアルデヒドが、微生物が発現する１以上の内因性アルコール脱水素酵素によって対応するアルコールに還元されることを実証した。１以上のアルコール脱水素酵素を過剰発現させて、反応の速度および／またはプロパノール生成物の反応収率を増加させることができることが想定される。あるいは、１以上のアルコール脱水素酵素の発現は、アルコールの生成を減少させ、対応するアルデヒドの生成を増加させるために減衰させられ得る。
【０１１１】
本発明の微生物に使用する酵素および機能的変異型は、異なる属および種の細菌、または他の生物を含む任意の適切な供給源に由来し得る。しかし、一実施形態において、ジオールデヒドラターゼは、肺炎桿菌またはＫ．オキシトカ（ＥＣ ４.１.２.３０）に由来するものであるか、またはそれらの機能的に等価な変異型である。一実施形態において、ジオールデヒドラターゼ酵素（３つのサブユニット）は、ＹＰ＿００２２３６７８０、ＹＰ＿００２２３６７８１、ＹＰ＿００２２３６７８２に定義されるとおりであるか、またはその機能的に等価な変異型である。特定の一実施形態において、ジオールデヒドラターゼは、ジオールデヒドラターゼ遺伝子ＧＩ：２０６５７５７４８、ＧＩ：２０６５７５７４９、ＧＩ：２０６５７５７５０（肺炎桿菌）およびＧＩ：８６８００６、ＧＩ：８６８００７、ＧＩ：８６８００８（クレブシエラ・オキシトカ）によってコードされている。
【０１１２】
本発明者らは、カルボキシド栄養性微生物内で、これまで説明されていないジオールデヒドラターゼ酵素（配列番号３）を同定した。一実施形態において、本発明は、親微生物内に存在する１以上のジオールデヒドラターゼ酵素（例えば、配列番号３またはその機能的に等価な変異型）を過剰発現するように適合されたカルボキシド栄養性微生物を提供する。特定の一実施形態において、内因性のジオールデヒドラターゼ酵素は、配列番号４で定義される核酸によってコードされるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【０１１３】
一実施形態において、この組換え生物は、減衰した発現を示すか、またはノックアウトされている酵素を含む。特定の一実施形態において、この酵素はアルコール脱水素酵素であり、この組換え生物は、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールに加えて、またはプロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールの代わりにプロパナールおよび／またはプロパン−２−オンを生成する。特定の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５に定義されるか、またはその機能的に等価な変異型である。さらなる実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６に定義される核酸によってコードされている。
【０１１４】
一実施形態において、この微生物は、前述のジオールデヒドラターゼをコードする１以上の内因性核酸の発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸を含む。
【０１１５】
一実施形態において、この微生物はさらに、メチルグリオキサール合成酵素（ｍｇｓＡ）；メチルグリオキサール還元酵素（ｙｄｊＧ）；第２級アルコール脱水素酵素（ｇｌｄＡ／ｂｕｄＣ）；ラクトアルデヒド還元酵素／第１級アルコール脱水素酵素（ｆｕｃＯ）を含むがこれらに限定されないプロパン−１，２−ジオールの生合成に関与する１以上の外因性酵素を発現するように適合される。さらなる態様において、この微生物は、プロパン−１，２−ジオール生合成経路の１以上の内因性酵素を過剰発現するように適合される。
【０１１６】
本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける本発明の有効性を示してきたが、本明細書でさらに説明するように、本発明はカルボキシド栄養性酢酸生成微生物のより広いグループに適用可能であることが企図される。
【０１１７】
この微生物は、例えば、（例えば、遺伝子の発現を駆動する強力なプロモーターまたは構成的プロモーターを導入することによって）内因性遺伝子の発現を増加させること、酵素をコードし、発現するように適合された外因性核酸を導入することによって、または親微生物内に天然に存在しない酵素をコードし、発現するように適合された外因性核酸を導入することによって特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることを含む任意の数の組換え法によって１以上の酵素を発現または過剰発現するように適合され得る。
【０１１８】
一実施形態において、この微生物は、前述の酵素のうちの１以上をコードし、親微生物に由来する１以上の核酸の発現を増加させるように適合された１以上の外因性核酸を含む。一実施形態において、発現が増加するように適合された１以上の外因性核酸は、調節エレメントである。一実施形態において、調節エレメントはプロモーターである。一実施形態において、このプロモーターは、好ましくは、適切な発酵条件下で高活性である構成的プロモーターである。誘導性プロモーターも使用できる。好ましい実施形態において、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。発現、好ましくは、適切な発酵条件下での高レベルの発現を指示することができる他のプロモーターが、例示された実施形態の代替物として有効であることは当業者であれば理解するであろう。
【０１１９】
この微生物は、１以上の外因性核酸を含むことができる。（遺伝子または調節エレメント（例えば、プロモーター）などの）２以上の遺伝子エレメントで親微生物を形質転換することが望ましい場合には、それらは１以上の外因性核酸上に含まれてもよい。
【０１２０】
一実施形態において、微生物が発現または過剰発現する１以上の外因性核酸は、任意の組み合わせで前述の酵素のうちの１以上をコードする核酸構築物またはベクターであり、特定の一実施形態において、プラスミドである。
【０１２１】
本発明の核酸は、親微生物の形質転換の際に染色体外に存在していてもよく、または親微生物のゲノムに組み込まれてもよい。したがって、本発明の核酸は、染色体外構築物の組込みを支援するように適合された追加のヌクレオチド配列（例えば、相同組換えおよび宿主ゲノムへの標的化組込みを可能にする領域）、または染色体外構築物の発現および複製を支援するように適合された追加のヌクレオチド配列（例えば、複製起点、プロモーターおよび他の調節エレメントもしくは配列）を含んでもよい。
【０１２２】
一実施形態において、前述の１以上の酵素をコードする外因性核酸は、さらに外因性の核酸がコードする１以上の酵素の発現を促進するように適合されたプロモーターを含む。一実施形態において、このプロモーターは、好ましくは、適切な発酵条件下で高活性である構成的プロモーターである。誘導性プロモーターも使用することができる。好ましい実施形態において、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。適切な発酵条件下での発現、好ましくは、高レベルの発現を指示することができる他のプロモーターが、例示された実施形態の代替物として有効であることは当業者であれば理解するであろう。
【０１２３】
一実施形態において、この外因性核酸は発現プラスミドである。
【０１２４】
特定の一実施形態において、この親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含むカルボキシド栄養性酢酸生成菌の群から選択される。
【０１２５】
特定の一実施形態において、この親微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉの種ならびに関連分離株を含むエタノール生成、酢酸生成クロストリジウムのクラスターから選択される。これらには、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ｎａｖｅａｕ、およびＮｙｎｓ１９９４）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際公開第／２００９／０６４２００号）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ、ＭｉｌｌｅｒおよびＹａｎ１９９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）（国際公開第２００８／０２８０５５号）の株、「Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ」（米国特許出願公開第２０１１０２２９９４７号）および「クロストリジウム種」などの関連分離株（Ｔｙｕｒｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ  ２０１２）、またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＯＴＡ−１などの変異株（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ.  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを用いた合成ガスからのバイオエタノール生成、博士論文、ノースカロライナ州立大学、２０１０）が含まれるが、これらに限定されない。これらの株は、クロストリジウムのｒＲＮＡクラスターＩ内にサブクラスターを形成し、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は９９％以上同一であり、ＧＣ含量が約３０％で同様に低い。しかし、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティング実験は、これらの株が異なる種に属することを示した（国際公開第２００８／０２８０５５号）。
【０１２６】
このクラスターの全ての種は、同様の形態およびサイズを有しており（対数増殖細胞は０.５〜０.７×３〜５μｍであり）、中温性（３０〜３７℃の最適増殖温度）で、絶対嫌気性菌である（Ａｂｒｉｎｉ，Ｎａｖｅａｕ，ａｎｄ  Ｎｙｎｓ １９９４；Ｔａｎｎｅｒ，Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｙａｎｇ  １９９３）（国際公開第２００８／０２８０５５号）。さらに、それらは全て、同様のｐＨ範囲（ｐＨ４〜７.５、最適な初期ｐＨ５.５〜６）などの同様の系統発生学的特色、同様の増殖率によるＣＯ含有ガス上での強力な独立栄養成長、ならびに主発酵最終生成物がエタノールおよび酢酸であり、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸が形成されるという類似の代謝プロファイルを共有する（Ａｂｒｉｎｉ，Ｎａｖｅａｕ，ａｎｄ  Ｎｙｎｓ １９９４；Ｋｏｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｔａｎｎｅｒ，Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｙａｎｇ  １９９３）（国際公開第２００８／０２８０５５号）。インドール生成も全３種で観察された。しかし、これらの種は、様々な糖類（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸類（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸類（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質類（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用に区別される。さらに、これらの種のいくつかは、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して栄養要求体であるが、他の種はそうではないことが判明した。ガス吸収に関与するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の機構および数は、核酸およびアミノ酸配列の違いにもかかわらず、全ての種で同一であることが判明している（Ｋｏｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０１２７】
一実施形態において、親株は、その唯一の炭素源およびエネルギー源としてＣＯを使用する。
【０１２８】
一実施形態において、この親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。特定の一実施形態において、この微生物は、株ＤＳＭ１００６１のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍから派生したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態において、この微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【０１２９】
核酸
（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉから同定された）単離核酸
本発明者らは、２種類のカルボキシド栄養性酢酸生成菌のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ内にジオールデヒドラターゼをコードする核酸を同定した。この核酸は、プロパン−１，２−ジオールのプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードしている。
【０１３０】
一実施形態において、ジオールデヒドラターゼをコードする核酸は、配列番号１−２（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）およびＣＬＪＵ＿ｃ１１８３０；９４４４８００ならびにＣＬＪＵ＿ｃ１１８３１；９４４４８０１（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）に定義されるか、またはその機能的に等価な変異型である。
【０１３１】
一実施形態において、本発明の核酸はさらにプロモーターを含む。一実施形態において、このプロモーターは、その制御下の遺伝子の構成的発現を可能にする。当業者は、容易に本発明で使用するプロモーターを理解するであろう。好ましくは、このプロモーターは、適切な発酵条件下で高レベルの発現を指示することができる。特定の実施形態において、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターが使用される。他の特定の実施形態において、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターが使用される。特定の一実施形態において、このプロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のものである。
【０１３２】
本発明は、本発明の組換え微生物を作製する際に使用する１以上の核酸または本発明の１以上の核酸を含む核酸構築物も提供する。
【０１３３】
一実施形態において、この核酸は、微生物内で発現させると、ＣＯ含有基質の発酵によって、微生物がプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成することを可能にする前述の本発明の酵素のうちの１以上をコードする配列を含む。特定の一実施形態において、本発明は、微生物内で発現させると、ＣＯ含有基質の発酵によって、微生物がプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールを生成することを可能にする２つの酵素をコードする核酸を提供する。特定の実施形態において、この２種類の酵素は、本明細書で定義するジオールデヒドラターゼおよびアルコール脱水素酵素である。
【０１３４】
本明細書に記載の酵素をコードする例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、本明細書に提供されるか、または前述のＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。しかし、当業者であれば、本明細書、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースに含まれる情報、ならびに遺伝コードを考慮して、酵素またはその機能的に等価な変異型をコードする別の核酸配列を容易に理解するであろう。
【０１３５】
本発明は、第１の態様の方法によって生成される場合に、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールも提供する。
【０１３６】
一実施形態において、この核酸は、核酸構築物またはベクターである。特定の一実施形態において、核酸構築物またはベクターは発現構築物またはベクターであるが、クローニングに使用されるものなどの他の構築物およびベクターは、本発明に包含される。特定の一実施形態において、この発現構築物またはベクターはプラスミドである。
【０１３７】
必要であれば、本発明の発現構築物／ベクターは、さらなるタンパク質の発現に適するプロモーターならびに追加の遺伝子に加えて、任意の数の調節エレメントを含んでもよいことが理解されるであろう。一実施形態において、この発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施形態において、この発現構築物／ベクターは、２以上のプロモーターを含む。特定の一実施形態において、発現構築物／ベクターは、発現される各遺伝子用の１つのプロモーターを含む。一実施形態において、この発現構築物／ベクターは、１以上のリボソーム結合部位、好ましくは、発現される各遺伝子用のリボソーム結合部位を含む。
【０１３８】
本明細書に記載の核酸配列および構築物／ベクター配列が、リボソーム結合部位および／または制限部位に必要とされるものなどの標準的なリンカーヌクレオチドを含んでもよいことは、当業者であれば理解するであろう。このようなリンカー配列は、必要とされるものとして解釈されるべきではなく、定義された配列に制限をもたらさない。
【０１３９】
本発明の発現構築物／ベクターを含む核酸および核酸構築物は、当技術分野における任意の数の標準的技術を用いて構築することができる。例えば、化学合成または組換え技術を使用することができる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に記載されている。さらなる例示的な技術は、下記の実施例の節に記載されている。本質的に、個々の遺伝子および調節エレメントは、遺伝子を発現させて、所望のタンパク質を形成することができるように互いに作動可能に連結される。本発明の使用に適するベクターは、当業者であれば理解するであろう。しかし、一例として、以下のベクターが適し得る：ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、ならびに下記の実施例の節に例示したプラスミド。
【０１４０】
本発明の核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態であってもよいことは理解されたい。
【０１４１】
本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれか１以上を含む宿主生物、特に、ウイルス、細菌、および酵母を含む微生物も提供する。
【０１４２】
微生物の生成法
１以上の外因性核酸は、裸の核酸として親微生物に送達され得るか、または形質転換プロセスを促進するために１以上の薬剤で製剤化され得る（例えば、リポソーム結合核酸、核酸が含まれる生物）。１以上の核酸は、適切には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。制限酵素阻害剤は、特定の実施形態で使用することができる。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６４，４１２．）を参照されたい。
【０１４３】
本発明の微生物は、組換え微生物を作製するための当技術分野で公知の任意の数の技術を用いて、親微生物および１以上の外因性核酸から調製することができる。ほんの一例として、（形質導入またはトランスフェクションを含む）形質転換は、エレクトロポレーション、超音波、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、化学物質または天然コンピテンス、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘導または接合によって達成することができる。適切な形質転換技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ：分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記載されている。
【０１４４】
エレクトロポレーションは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋｏｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；国際公開第２０１２／０５３９０５号）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；国際公開第２０１２／０５３９０５号）、Ｃ．ａｃｅｔｉｃｕｍ（Ｓｃｈｉｅｌ− Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｄｕｒｒｅ ２０１２）またはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ（Ｓｔｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）などのいくつかのカルボキシド栄養性酢酸生成菌について説明されており、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、１９０−１９５）、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｊｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：３０７１から３０８０）またはＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏn．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：８８３−８９０）などの多くのクロストリジウムで使用される標準的な方法である。プロファージ誘導は、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓの場合に、同様にカルボキシド栄養性酢酸生成菌について実証されており（Ｐｒａｓａｎｎａ Ｔａｍａｒａｐｕ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ、２０１０、変異型の作製のためのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７７５における遺伝子改変システムの開発、マスターズプロジェクトウェスタンケンタッキー大学）、接合は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２９：１０３−１１０）またはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：８１９−８２６）を含む多くのクロストリジウム用の選択法として説明されており、カルボキシド栄養性酢酸生成菌に対して同様の方法に使用することができる。
【０１４５】
特定の実施形態において、形質転換される微生物で活性のある制限システムにより、微生物に導入される核酸をメチル化することが必要である。これは、下記のものを含む様々な技術を使用して行うことができ、さらに下記の実施例の節に例示される。
【０１４６】
一例として、一実施形態において、本発明の組換え微生物は、以下のステップを含む方法によって生成される：
（ｉ）本明細書に記載の発現構築物／ベクターおよび（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入のステップ；
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のステップ；
シャトル微生物からの１以上の構築物／ベクターの単離のステップ；
１以上の構築物／ベクターの目的微生物への導入のステップ。
【０１４７】
一実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子を構成的に発現させる。別の実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導する。
【０１４８】
このシャトル微生物は、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を容易にする微生物、好ましくは、制限陰性微生物である。特定の実施形態において、このシャトル微生物は、制限陰性大腸菌、枯草菌、またはラクトコッカス・ラクティスである。
【０１４９】
このメチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
【０１５０】
発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に導入されると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。誘導は、任意の適切なプロモーター系によるものであってよいが、本発明の特定の一実施形態において、メチル化構築物／ベクターは、誘導性ｌａｃプロモーターを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくは、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導される。他の適切なプロモーターには、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７系が含まれる。本発明のさらなる実施形態において、メチル化構築物／ベクターのプロモーターは、構成的プロモーターである。
【０１５１】
特定の一実施形態において、このメチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル微生物内で発現するように、このメチル化構築物／ベクターは、シャトル微生物の素性に特異的な複製起点を有する。好ましくは、この発現構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子が目的微生物内で発現するように、この発現構築物／ベクターは、目的微生物の素性に特異的な複製起点を有する。
【０１５２】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、この発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。次いで、この発現構築物／ベクターは、いくつかの既知の方法のいずれか１つに従って、シャトル微生物から単離することができる。ほんの一例として、下記の実施例の節に記載の方法を用いて、発現構築物／ベクターを単離することができる。
【０１５３】
特定の一実施形態において、構築物／ベクターの両方が同時に単離される。
【０１５４】
この発現構築物／ベクターは、任意の数の公知の方法を用いて目的微生物に導入することができる。しかし、一例として、下記の実施例の節に記載の方法を用いてもよい。この発現構築物／ベクターはメチル化されるので、この発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は、目的微生物に組み込まれて、十分に発現することができる。
【０１５５】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物に導入されて、過剰発現してもよいことが想定される。したがって、一実施形態において、得られたメチルトランスフェラーゼ酵素を公知の方法を用いて収集し、発現プラスミドをメチル化するためにインビトロで使用してもよい。次いで、この発現構築物／ベクターは、発現のために目的微生物に導入することができる。別の実施形態において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子をシャトル微生物のゲノムに導入し、その後、発現構築物／ベクターをシャトル微生物に導入して、シャトル微生物から１以上の構築物／ベクターを単離し、次いで、発現構築物／ベクターを目的微生物に導入する。
【０１５６】
上記で定義した発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターを組み合わせて、重要な組成物を提供してもよいことが想定される。このような組成物は、本発明の組換え微生物を生成するために、制限バリア機構を回避するのに特に有用である。
【０１５７】
特定の一実施形態において、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターはプラスミドである。
【０１５８】
当業者であれば、本発明の微生物を生成する際に使用するいくつかの適切なメチルトランスフェラーゼを理解するであろう。しかし、一例として、枯草菌ファージΦΤ１メチルトランスフェラーゼおよび下記の実施例に記載のメチルトランスフェラーゼを使用してもよい。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を有するか、またはその機能的に等価な変異型である。適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、所望のメチルトランスフェラーゼの配列および遺伝コードを考慮して容易に理解されるであろう。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、下記の実施例に記載するもの（例えば、配列番号８の核酸、またはその機能的に等価な変異型）である。
【０１５９】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適合された任意の数の構築物／ベクターを用いて、メチル化構築物／ベクターを作製することができる。しかし、一例として、下記の実施例の節に記載のプラスミドを用いてもよい。
【０１６０】
生成法
本発明の一実施形態において、微生物が発酵するガス状基質は、ＣＯ含有ガス状基質である。ガス状基質は、工業プロセスの副産物として得られるか、または自動車の排気ガスなどのいくつかの他の供給源からのＣＯ含有廃ガスであり得る。特定の実施形態において、工業プロセスは、製鋼所などの鉄金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、任意の便利な方法を用いて、大気中に放出される前に、工業プロセスから捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素および水素を含むガス）の成分であってもよい。工業プロセスから生成されるＣＯは、通常燃やされて、ＣＯ２を生成するので、本発明は、ＣＯ２温室効果ガスの排出の減少およびバイオ燃料生成に特に有用である。ガス状ＣＯ含有基質の組成によっては、それを発酵に導入する前に、塵粒子などの望ましくない不純物を除去するために処理することも望ましい場合がある。例えば、ガス状基質は、公知の方法を用いて濾過または洗浄されてもよい。
【０１６１】
細菌の増殖および生じる生成物の生成のために、ＣＯ含有基質ガスに加えて、適切な液体栄養培地をバイオリアクターに供給する必要があることが理解されるであろう。
【０１６２】
本方法の態様の特定の実施形態において、発酵は水性培地中で生じる。本方法の態様の特定の実施形態において、基質の発酵はバイオリアクター内で行われる。
【０１６３】
基質および培地は、連続的に、バッチまたはバッチ供給方法でバイオリアクターに供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有する。ＣＯを用いる発酵に適する嫌気性培地は当技術分野で公知である。例えば、適切な培地はＢｉｅｂｅｌ（２００１）に記載されている。本発明の一実施形態において、培地は、下記の実施例の節に記載されているものである。
【０１６４】
発酵は、望ましくは、バイオ燃料の生成が生じる適切な発酵条件下で行われるべきである。圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが律速にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む反応条件が考慮されるべきである。
【０１６５】
さらに、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質中のＣＯ分圧）を増加させ、したがって、ＣＯが基質である発酵反応の効率を増加させることが望ましい場合が多い。圧力を高めて動作させると、発酵生成のための炭素源として微生物が取り込むことができるＣＯの気相から液相への移動速度を著しく増加させることができる。これは、ひいては、バイオリアクターが大気圧よりも高圧で維持される場合に、（入力ガス流量で割ったバイオリアクター中の液体体積として定義される）保持時間を低減することができることを意味する。最適な反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存するであろう。しかし、一般的には、発酵は周囲圧力より高い圧力で行うことが好ましい。また、所与のＣＯ変換速度は部分的に基質保持時間の関数であり、ひいては、所望の滞留時間の達成はバイオリアクターの必要容量を決定するので、加圧されたシステムを使用することでバイオリアクターの必要容量を大幅に減らすことができ、その結果、発酵装置の資本コストを大幅に減らすことができる。米国特許第５，５９３，８８６号に記載された例により、リアクターの容積は、リアクターの運転圧力の増加に比例して低減することができ、すなわち、圧力１０気圧で動作させたバイオリアクターは、圧力１気圧で動作させたバイオリアクターの容積のわずか１０分の１しか必要としない。
【０１６６】
一例として、高圧でガスからエタノールへの発酵を行うことの利点について説明されている。例えば、国際公開第０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で行われるガスからエタノールへの発酵について説明しており、それぞれのエタノール生産性は、１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日である。しかし、例えば、大気圧で同様の培地および流入ガス組成を用いて行われる発酵は、１日当たり１リットル当たり１０〜２０倍未満のエタノールを生成することが判明した。
【０１６７】
ＣＯ含有ガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯの濃度が律速にならないことを確実にするようなものであることも望ましい。１以上の生成物が培養により消費されるのは、ＣＯが制限された条件の結果であり得るからである。
【０１６８】
発酵反応に供給するために使用されるガス流の組成は、反応の効率および／またはコストに大きな影響を与え得る。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵プロセスの効率を低下させることができる。発酵前後の発酵プロセスの段階での望ましくないまたは不必要なガスの処理は、このようなステージの負荷を増加させ得る（例えば、ガス流がバイオリアクターに入る前に圧縮される場合に、不必要なエネルギーを用いて、発酵に必要ではないガスを圧縮することができる）。したがって、不要な成分を除去し、望ましい成分の濃度を増加させるために、基質流、特に、工業供給源由来の基質流を処理することが望ましい場合がある。
【０１６９】
特定の実施形態において、本発明の細菌の培養は水性培地中で維持されている。好ましくは、水性培地は嫌気性微生物増殖用の最少培地である。適切な培地は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号および国際公開第０２／０８４３８号に記載されており、下記の実施例のセクションに記載されるものである。
【０１７０】
プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／もしくはプロパン−２−オール、またはプロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／もしくはプロパン−２−オールならびに／または１以上の他の生成物を含む混合流は、分留または蒸発、パーベーパレーション、ガスストリッピングおよび、例えば、液−液抽出を含む抽出発酵などの当技術分野で公知の方法によって発酵ブロスから回収してもよい。生成物を、相分離によって抽出することができる培地に拡散または分泌させてもよい。
【０１７１】
本発明の特定の好ましい実施形態において、プロパナール、プロパン−２−オン、プロパン−１−オールおよび／またはプロパン−２−オールならびに１以上の生成物は、ブロスの一部をバイオリアクターから連続除去し、ブロスから微生物細胞を分離し（濾過が都合がよい）、ブロスから１以上の生成物を回収することによって発酵ブロスから回収される。アルコールは、例えば、蒸留によって都合よく回収することができる。プロパン−２−オンは、例えば、蒸留によって回収することができる。生成される全ての酸は、例えば、活性炭への吸着によって回収されてもよい。分離された微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻される。全てのアルコール（複数可）および酸（複数可）を除去した後に残っている無細胞透過物も、好ましくは発酵バイオリアクターに戻される。（ビタミンＢ類などの）追加の栄養素を無細胞透過物に加えて、バイオリアクターに戻される前に栄養培地を補充してもよい。
【０１７２】
活性炭への酢酸の吸着を高めるために、ブロスのｐＨを上記のように調整する場合にも、バイオリアクターに戻す前に、発酵バイオリアクターのブロスと同様のｐＨに、ｐＨを再調整すべきである。
【０１７３】
実施例
本発明を、これから、以下の非限定的な実施例を参照して、より詳細に説明する。
【０１７４】
微生物および増殖条件
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ１５２４３、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８、および酪酸菌のＤＳＭ １０７０２は、ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養物コレクション、ＩｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａＢｅ ７ Ｂ、３８１２４ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から供給された。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ １００６１から派生したものである。
【０１７５】
大腸菌を好気性および嫌気性の両方の条件下で培養したが、他の全ての株は、フルクトース（従属栄養増殖）またはヘッドスペース内に３０ｐｓｉのＣＯ含有製鋼所ガス（ニュージーランドグレンブルックのニュージーランドスチールサイトから収集した；組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を含む血清ボトル中５０ｍｌ容量の液体培地で絶対嫌気的に増殖させた。
【０１７６】
表２〜４に記載の製剤に従って、標準的な嫌気性技術を用いて培地を調製した（Ｈｕｎｇａｔｅ ＲＥ：Ｎｏｒｒｉｓ ＪＲおよびＲｉｂｂｏｎｓ ＤＷ（編）、微生物学の方法、３Ｂ巻の中の絶対嫌気性菌の培養のためのロールチューブ法、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９：１１７−１３２；Ｗｏｌｆｅ ＲＳ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｅ．Ａｄｖ Ｍｉｃｒｏｂ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９７１，６：１０７−１４６）。固体培地には、１.２％バクト寒天（ＢＤ、米国ニュージャージー州フランクトンレイクス０７４１７）を添加した。
【０１７７】
全ての株を３７℃で増殖させた。
【０１７８】
【表１】
0006302471.tif 000002
【０１７９】
【表２】
0006302471.tif 000003
【０１８０】
【表３】
0006302471.tif 000004
【０１８１】
指定した場合、接種時にプロパン−１，２−ジオールを最終濃度５ｇ／Ｌまで添加し、４０時間培養した後、最終代謝産物分析を行った。
【０１８２】
代謝物の分析
タンパク質および他の細胞残渣を除去するために、サンプル４００μｌを２％（ｗ／ｖ）の５−スルホサリチル酸１００μｌと混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心分離して、沈殿した残渣を分離した。その後、分析のために、上清１０μｌをＨＰＬＣに注入した。３５℃で動作させるＲＩＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ社製１１００シリーズＨＰＬＣシステム（屈折率検出器）、および３５℃に保ったＡｍｉｎｅｘ社製ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００×７.８ｍｍ、粒径９μｍ）を用いて、２，３−ブタンジオール、２−ブタノールおよび他の代謝産物のＨＰＬＣ分析を行った。弱酸性水（０.００５ＭのＨ２ＳＯ４）を、０.６ｍｌ／分の流速で移動相として用いた。２，３−ブタンジオールの立体異性体の区別のために、３５℃で動作させるＲＩＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ社製１１００シリーズＨＰＬＣシステム（屈折率検出器）、および６０℃に保ったＡｌｌｔｅｃｈ社製ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６.５ｍｍ、粒径８μｍ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。弱酸性水（０.００５ＭのＨ２ＳＯ４）を、０.２５ｍｌ／分の流速で移動相として用いた。
【０１８３】
１ｃｍファイバーのＳｕｐｅｌｃｏ ＰＤＭＳ １００を備えたＡｇｉｌｅｎｔ社製６８９０ＮヘッドスペースＧＣ、Ａｌｌｔｅｃｈ社製ＥＣ−１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、および水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を用いて、プロパン−２−オン、プロパン−２−オールおよび他の代謝物のＧＣ分析を行った。試料５ｍｌをフンゲート（Ｈｕｎｇａｔｅ）管に移し、水浴中で４０℃まで加熱し、正確に５分間繊維に暴露した。インジェクターを２５０℃に維持し、１ｍｌ／分の一定流量でヘリウムをキャリアガスとして用いた。オーブンプログラムは、４０℃で５分間、その後、２００℃まで１０℃／分で上昇させるというものであった。その後、５０℃／分の速度で温度をさらに２２０℃まで上昇させ、その後、この温度で５分間保持し、５０℃／分の速度で４０℃まで低下させ、最後に１分間保持した。混合ガスとして４０ｍｌ／分の水素、４５０ｍｌ／分の空気および１５ｍｌ／分の窒素を含むＦＩＤを２５０℃に保った。
【０１８４】
プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナール、プロパン−１−オールへの反応の特定
プロパン−１，２−ジオール（ラセミ体）を、接種時にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの培養物に添加した。驚くべきことに、図２に見られるように、２日間増殖させた後、プロパン−１，２−ジオールは、プロパン−１−オールおよびプロパン−２−オールに変換されていることが判明した。（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールを培養物に添加した場合には、これはプロパン−１−オールに変換され、中間体プロパナールが見られ得る（図２）。（Ｒ）−プロパン−１，２-ジオールを培養物に添加した場合には、これはプロパン−２−オールに変換される（図２）。用いたＨＰＬＣ法は、プロパン−２−オールおよびプロパン−２−オンを分離することはできないが、ＧＣにより、中間体プロパン−２−オンの存在が見られ得る（図３）。
【０１８５】
プロパン−１，２−ジオールのプロパナールへの変換は、いくつかのジオールデヒドラターゼ酵素について説明されている。これまでに、例えば、肺炎桿菌またはＫ.オキシトカのＢ１２依存性（プロパン）ジオールデヒドラターゼのタイプ（ＥＣ ４.２.１.２８）（Ｔｏｒａｙａ Ｔ，Ｓｈｉｒａｋａｓｈｉ Ｔ，Ｋｏｓｕｇａ Ｔ １９７６）、ならびに例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍまたは酪酸菌のＢ１２非依存性グリセロール／ジオールデヒドラターゼのタイプ（ＥＣ ４.１.２.３０）（Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｈａｒｔｍａｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔａｄｔｍａｎ １９８６）の２つのタイプのジオールデヒドラターゼ酵素について説明されている（表１）。
【０１８６】
【表４】
0006302471.tif 000005
【０１８７】
しかし、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オンおよびプロパン−２−オールへの変換は観察されておらず、この反応を触媒する酵素はこれまで不明であった。プロパン−１，２−ジオールの立体特異的な変換も説明されていない。本発明者らは、図１に示すような、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オン＋プロパン−２−オールおよび／またはプロパナールならびにプロパン−１−オールへの立体特異的反応を特定した。この理論に拘束されることなく、本発明者らは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの新規ジオールデヒドラターゼが、立体特異的に（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オンに、（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールをプロパン−２−オールに変換すると考えている。
【０１８８】
次いで、プロパン−２−オールへのプロパン−２−オン変換は、米国特許出願第１３／４０３，９７２号および同第１３／４５９，２１１号、それ以前に記載の第１級：第２級アルコール脱水素酵素（配列番号５および６）によって触媒される。このような酵素の主な機能は、多くの他の第１級アルコール脱水素酵素および非特異的なエタノール脱水素酵素のように、プロパナールのプロパン−１−オールへの還元も触媒することできる（Ｉｓｍａｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０１８９】
ジオールデヒドラターゼ遺伝子の同定
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノム内検索により、酪酸菌（ＡＢＸ６５４４３およびＡＢＸ６５４４４）のＢ１２非依存性グリセロールデヒドラターゼとアミノ酸レベルで相同性の低い（それぞれ同一性＝５０３／８４４（５９％）、陽性＝６２６／８４４（７４％）、ギャップ＝６３／８４４（７％）、同一性＝１２５／２５７（４９％）、陽性＝１８１／２５７（７０％）、ギャップ＝０／２５７（０％））遺伝子（配列番号３および４）を特定した。
【０１９０】
この酵素を、ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムを用いてＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ内でノックアウトすると（Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．２００７）、プロパン−１，２−ジオールを利用して、プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、プロパナール、またはプロパン−１−オールの全てを形成することができない株をもたらしたので、この酵素が、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オンおよびプロパナールへの立体特異的変換に関与する新規ジオールデヒドラターゼであることを示す。
【０１９１】
ＣｌｏｓＴｒｏｎ社のＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いて、遺伝子のセンス鎖上の塩基２０５２と２０５３の間にグループＩＩイントロン標的部位を特定し、イントロン標的領域（配列番号１３）を設計し、これをｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクター中に化学的に合成した。最終ベクターのｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｐｆｌ−１１３６−２０５２！２０５３ｓは、標的部位への挿入時に、抗生物質クラリスロマイシンに対する耐性を付与するレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含む。
【０１９２】
上記のようにｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｐｆｌ−１１３６−２０５２！２０５３ｓプラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＰＥＴＣ−ＭＥＳ寒天上にシングルコロニーを順次ストリークし、標的遺伝子内のグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ８４ｆ（配列番号１４）およびＯｆ８５ｒ（配列番号１５）ならびにマキシムＰＣＲプレミックスキットを用いて、ＰＣＲにより８個のコロニーをグループＩＩイントロン挿入についてランダムにスクリーニングした。１６ｓ  ｒＤＮＡも、プライマーｆＤ１（配列番号１６）およびｒＰ２（配列番号１７）ならびにマキシムＰＣＲプレミックスキットを用いてＰＣＲ増幅した。３１６塩基対のＰＣＲ産物は、未修飾の野生型の遺伝子型を示し、約２ｋｂのＰＣＲ産物は、標的遺伝子にグループＩＩイントロンの挿入を示す。約２ｋｂのＰＣＲ産物の増幅によって見られるように、全８個のクローンは、遺伝子破壊について陽性に見える（図１０）。さらに、クローン４（配列番号１８および１９）ならびにクローン７（配列番号２０および２１）のＰＣＲ産物の配列決定により、ＰＣＲ産物がＲＡＭカセットを有するグループＩＩイントロン標的断片であることを確認した。クローン４（配列番号２２および２３）ならびにクローン７（配列番号２４および２５）の１６ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ産物も検証された配列であり、２つのクローンがＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであることが確認された。これらの結果から、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ内の推定ジオールデヒドラターゼ遺伝子の破壊が確認された。クローン４をプロパン−１，２−ジオールの存在下での増殖により試験し、この株は、プロパン−１，２−ジオールを利用して、プロパン−２−オン、プロパン−２−オール、またはプロパン−１−オールの全てを形成することができない（図１１）ので、この酵素が、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オンおよびプロパナールへの立体特異的変換に関与する新規ジオールデヒドラターゼであることを示す。
【０１９３】
同様の遺伝子（ＣＬＪＵ＿ｃ１１８３０；９４４４８００およびＣＬＪＵ＿ｃ１１８３１；９４４４８０１）ならびに酵素（ＹＰ＿００３７７９３５３およびＹＰ＿００３７７９３５４）は、それぞれ９９％（１つのミスマッチ）、および１００％の同一性でＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ内にのみ存在する。それぞれの遺伝子および酵素は、ジオールデヒドラターゼではなく、ピルビン酸・ギ酸リアーゼとして注釈されている。ジオールデヒドラターゼ酵素（配列番号１）のＢＬＡＳＴ結果を表２に示し、図８に概要を示す（黒棒は、参照Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼのアミノ酸配列に対するミスマッチであり、白い領域はギャップを表す）。この酵素の位置５９６および６５６（配列番号９）の間に特異的ドメインが存在することが分かり、これはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉにのみ存在するが、酪酸菌由来の公知のものなどの任意の他の酵素には存在せず、この酵素の残りの部分は良好な相同性を共有している。この理論に拘束されることなく、本発明者らは、このタンパク質ドメインが、プロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オンおよびプロパナールへの変換を可能にできると考えている。
【０１９４】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのジオールデヒドラターゼのみが、プロパン−１，２−ジオールからプロパン−２−オンおよびプロパナールへのこの新規反応を触媒することができるか否かを調べるために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉといくつかの特徴を共有し、密接に関連するＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉなどの他のカルボキシド栄養性生物（Ｋｏｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）（２００８／０２８０５５号）ならびに関連するジオールデヒドラターゼを有する酪酸菌などの生物を、５ｇ／Ｌのプロパン−１，２−ジオールのラセミ混合物の存在下で増殖させた（表３）。グリセロール／ジオールデヒドラターゼ遺伝子が発現することを確認するために、酪酸菌をグリセロールの存在下で増殖させた。
【０１９５】
【表５】
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【０１９６】
同じ酵素および第２級アルコール脱水素酵素も存在するので、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ細胞は、確かに、ラセミプロパン−１，２−ジオールをプロパン−１−オールおよびプロパン−２−オールに変換することができた（図４）。しかし、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｉｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉは、ラセミプロパン−１，２−ジオールの変換または消費を示さなかった（図５）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、ラセミプロパン−１，２−ジオールを全て消費したが、プロパン−１−オールのみを生成し、プロパン−２−オンまたはプロパン−２−オールは生成しなかった（図６）。酪酸菌も、ラセミプロパン−１，２−ジオールをプロパン−１−オールに変換し（図９）、文献（Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）に記載の結果が確認された。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓについては、プロパン−１，２−ジオールの変換はこれまで観察されていなかったが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、クレブシエラ・オキシトカのビタミンＢ−１２依存性酵素と相同性のあるデヒドラターゼの遺伝子を有する。
【０１９７】
前述のように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼ酵素は立体特異的であり、プロパン−１，２−ジオールの（Ｓ）体および（Ｒ）体を異なる生成物に変換する。酪酸菌の培養物を、プロパン−１，２−ジオールの異なる立体異性体と共に増殖させ、類似の立体特異性を有するか否かを決定した。プロパン−１，２−ジオールのラセミ体、（Ｒ）、または（Ｓ）を、接種時に１ｇ／Ｌ（１３ｍＭ）で添加した。４０時間後、（Ｓ）−プロパン−１，２−ジオールを有する培養物は、ジオールの全てをプロパン−１−オールに変換した。ラセミプロパン−１，２−ジオールを有する培養物は、約６４％をプロパン−１−オールに変換した（８.３ｍＭ）。（Ｒ）−プロパン−１，２−ジオールを有する培養物は、約１９％をプロパン−１−オールに変換した（２.５ｍＭ）（表４）。
【０１９８】
【表６】
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【０１９９】
酪酸菌におけるプロパン−１，２−ジオールの変換に関与する酵素は、（Ｒ）異性体よりも速い速度で（Ｓ）異性体を変換するように見えるが、両方の異性体は、プロパン−１−アールに変換され、プロパン−１−オールに還元される。これは、酪酸菌の酵素がＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの酵素と同属のジオールデヒドラターゼであり、立体特異的な変換ができないことを示す。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの培養物において観察されるように、いずれの異性体も、酪酸菌の酵素によってプロパン−２−オンに脱水されない。
【０２００】
変換率を増加させるためのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける異種ジオールデヒドラターゼの発現
ホスホトランスアセチラーゼ−アセテートキナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）のプロモーター領域を、プライマーのＰｐｔａ−ａｃｋ−Ｎｏｔ  Ｉ−Ｆ（配列番号１０：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）およびＰｐｔａ−ａｃｋ−Ｎｄｅ  Ｉ−Ｒ（配列番号１１：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）を用いて増幅し、Ｎｏｔ  ＩおよびＮｄｅ  Ｉ制限部位を用いて大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３１５１（ＦＪ７９７６４７．１）（Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．２００９）にクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８３１５５を作製した。クレブシエラ・オキシトカのジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子ｐｄｄＡＢＣを、コドン最適化して（配列番号１２）、合成した。次いで、合成したｐｄｄＡＢＣオペロンを、制限酵素Ｎｄｅ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩを用いてｐＭＴＬ８３１５５にサブクローニングした。
【０２０１】
プラスミドｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣを用いて、上記の方法を用いてＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを形質転換した。ＹＴＦ寒天上で増殖させ、細胞をプレートから掻き取り、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含むＹＴＦ寒天（８ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、２ｇ／ＬのＮａＣｌ、２.５ｇ／Ｌのフルクトース、および７.５ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ５.８）上に広げ、３０ ｐｓｉのＲｅａｌ Ｍｉｌｌ Ｇａｓ中３７℃でインキュベートした。シングルコロニーを、１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含むＰＥＴＣ−ＭＥＳ寒天上に再びストリークし、その後、１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールおよび０.５％フルクトースを含むＰＥＴＣ−ＭＥＳ寒天上に再びストリークした。複数のコロニーを、フルクトースを含むプレートからピックアップし、３０ ｐｓｉのＲｅａｌ Ｍｉｌｌ Ｇａｓを用いて、Ｂａｌｃｈ管中０.５％のフルクトースを含むＰＥＴＣ−ＭＥＳ ３ｍＬ中で増殖させた。プラスミドの存在をＰＣＲによって確認した。
【０２０２】
ｐＭＴＬ８３１５５−ｐｄｄＡＢＣを有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍをプロパン−１，２−ジオールの存在下で増殖させた場合に、プラスミドを含まないサンプル中よりも多くのプロパン−１−オールが生成された。トランスジェニック株は、野生型より少ないプロパン−２−オールも生成した（図７）。これらのデータは、トランスジェニック株が野生型のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍよりも速い速度でプロパン−１，２−ジオールをプロパン−１−オールに変換したことを示す。
【０２０３】
ジオールデヒドラターゼアクチベーター酵素
酪酸菌のジオールデヒドラターゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンの還元的切断によってラジカルを生成するためにアクチベーター酵素を必要とするグリシルラジカル酵素であると理解される（Ｒａｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ ２００３，Ｏ’ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ ２００４）。ピルビン酸・ギ酸リアーゼおよび嫌気性リボヌクレオチド還元酵素などの同様のグリシルラジカルの化学的性質を有する他の相同酵素は、同様の構造およびアクチベーター酵素を有する（Ａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。酪酸菌のジオールデヒドラターゼと５９％の同一性を有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼ（配列番号１）は、類似の構造を有し、プロパン−１，２−ジオールの脱水について同様の化学反応を行うと理解されている。酪酸菌および大腸菌のピルビン酸・ギ酸リアーゼの遺伝子において観察されるように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのアクチベーター酵素（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号４）は、ジオールデヒドラターゼのすぐ下流にある。
【０２０４】
大腸菌におけるジオールデヒドラターゼおよびアクチベーター酵素の機能的発現
活性に関与する新規の遺伝子の同定を確認し、その酵素が代替宿主において機能することを実証するために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼ（配列番号１）およびアクチベーター酵素（配列番号２）をコードする遺伝子を、大腸菌内で発現させ、機能することを実証した。遺伝子（配列番号３〜４）を合成し、大腸菌用にコドン最適化して（配列番号２６）、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上のオペロンで発現させた。大腸菌ＪＭ１０９を構築したプラスミド（ｐＴｒｃ−ｄｈａＢ１Ｂ２）で形質転換し、対照にはｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した。ＬＢ中で一晩増殖させた培養物を用いて、０.２ｍｇ／ｍＬの硫酸第二鉄アンモニウム十二水和物を補充し、６０ｍＭのプロパン−１，２−ジオール（Ｒ、Ｓ、またはラセミ）を含む２Ｘ−ＹＴに接種した。３７℃での好気性増殖の４時間後に、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを最終濃度が１ｍＭになるまで添加し、ジオールデヒドラターゼの発現を誘導し、チューブに蓋をした。次いで、培養物を３０℃で増殖させた。４８時間後に、プロパン−１，２−ジオールおよび生成物の濃度を、ＨＰＬＣにより測定した（表５）。ラセミプロパン−１，２−ジオールの場合には、基質の濃度を３４ｍＭまで減少させ、アセトン（プロパン−２−オン）およびプロパン−１−オールをそれぞれ９.２ｍＭおよび１４.７ｍＭ得た（図１２）。大腸菌は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで起こるようなプロパン−２−オンをプロパン−２−オールに還元するための第２級アルコール脱水素酵素を欠いている。プロパン−２−オールではないことを確認するために、用いたＨＰＬＣ法において類似の保持時間を有するＧＣによりプロパン−２−オンを確認した。
【０２０５】
【表７】
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【０２０６】
これは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの異種ジオールデヒドラターゼオペロンを発現する組換え大腸菌内でのプロパン−１，２−ジオールのプロパン−２−オンおよび１−プロパノールへの正常な変換を示している。
【０２０７】
大腸菌を用いたプロパン−１，２−ジオールの生成のための生成経路については、以前に説明されている（Ｊａｉｎ ａｎｄ Ｙａｎ ２０１１）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼオペロンと組み合わせてこの経路を発現させると、アセトンの生成が可能になる。（米国特許出願第１３／４０３，９７２号および同第１３／４５９，２１１号に記載の）第２級アルコール脱水素酵素遺伝子は、イソプロパノール生成のために共発現させることができるが、ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎら（２０１２）（国際公開第２０１１０３２９３４号）に記載の共発現遺伝子はイソブチレン生成を可能にする。
【０２０８】
読者が過度の実験をすることなく本発明を実施できるようにするために、特定の好ましい実施形態を参照して、本発明を本明細書で説明した。しかし、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、成分およびパラメータの多くをある程度まで変更もしくは改変できるか、または既知の同等物と置換できることを容易に認識するであろう。そのような改変および均等物は、個々に記載されたものとして本明細書に援用されることを理解されたい。タイトルまたは見出しなどは、この文書の読者の理解を高めるために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２０９】
上記および下記の全ての出願、特許および刊行物の全開示内容は、存在する場合には、参照により本明細書に援用される。しかし、本明細書中の全ての出願、特許および刊行物への言及は、それらが世界中の全ての国における共通の一般知識の有効な先行技術を構成するか、もしくは一部を形成するという承認または任意の形態の示唆として解釈されず、かつ解釈されるべきではない。
【０２１０】
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体において、特段の断りのない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、排他的な意味ではなく、包括的な意味、すなわち、「含むが、これに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
また、本発明は以下を提供する。
［１］  異種の立体特異的ジオールデヒドラターゼ酵素を含む単離された組換え微生物。
［２］  前記酵素がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼである、［１］に記載の単離された組換え微生物。
［３］  前記酵素がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのジオールデヒドラターゼである、［１］に記載の単離された組換え微生物。
［４］  前記酵素が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのジオールデヒドラターゼと少なくとも８０％同一である、［１］に記載の単離された組換え微生物。
［５］  プロパン−２−オンをプロパン−２−オールに変換しない、［１］または［４］に記載の単離された組換え微生物。
［６］  プロパナールをプロパン−１−オールに変換しない、［１］または［４］に記載の単離された組換え微生物。
［７］  カルボキシド栄養性酢酸生成菌である、［１］または［４］に記載の微生物。
［８］  野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉよりも前記酵素活性が高いものを発現するように遺伝子改変された立体特異的ジオールデヒドラターゼ酵素を含む単離微生物。
［９］  前記酵素をコードする遺伝子の野生型の平均コピー数よりも高い平均コピー数を有するように遺伝子改変された、［８］に記載の微生物。
［１０］  前記高い平均コピー数が２以上である、［９］に記載の微生物。
［１１］  前記高い平均コピー数が３以上である、［９］に記載の微生物。
［１２］  立体特異的ジオールデヒドラターゼ酵素アクチバーゼをコードする遺伝子の野生型の平均コピー数よりも高い平均コピー数を有するように遺伝子改変された、［８］に記載の微生物。
［１３］  プロパン−２−オンまたはプロパン−２−オールのうちの少なくとも１つを生成する方法であって、プロパン−１，２−ジオールを含む発酵ブロス中で第１の微生物を培養し、それによって、プロパン−２−オンまたはプロパン−２−オールのうちの少なくとも１つが生成されることを含む方法。
［１４］  前記プロパン−１，２−ジオールが、前記発酵ブロス中でその場で生成される、［１３］に記載の方法。
［１５］  前記プロパン−１，２−ジオールが前記第１の微生物によって生成される、［１４］に記載の方法。
［１６］  前記プロパン−１，２−ジオールが第２の微生物によって生成される、［１４］に記載の方法。
［１７］  前記第１の微生物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍｍである、［１３］に記載の方法。
［１８］  前記第１の微生物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである、［１３］に記載の方法。
［１９］  前記第１の微生物が大腸菌である、［１３］に記載の方法。
［２０］  前記第１の微生物がカルボキシド栄養性酢酸生成菌である、［１３］に記載の方法。
［２１］  前記発酵ブロスが一酸化炭素（ＣＯ）を含む、［１３］に記載の方法。
［２２］  前記発酵ブロスが、合成ガス、産業廃ガス、製鋼所の廃ガスからなる群から選択される少なくとも１つのエネルギー源を含む、［１３］に記載の方法。
［２３］  前記発酵ブロスが、糖、デンプン、セルロース、バイオマス加水分解物、およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つのエネルギー源を含む、［１３］に記載の方法。
［２４］  さらに、プロピオンアルデヒド、プロパン−２−オン、プロパン−１−オール、およびプロパン−２−オールからなる群から選択される少なくとも１種類の生成物を前記発酵ブロスから回収するステップを含む、［１３］に記載の方法。
［２５］  前記発酵ブロスが、プロパン−１，２−ジオールの（Ｒ）鏡像異性体を優勢的に含む、［１３］に記載の方法。
［２６］  前記発酵ブロスが、プロパン−１，２−ジオールの（Ｌ）鏡像異性体を優勢的に含む、［１３］に記載の方法。
［２７］  前記微生物が、プロパン−１−オールよりも、プロパン−２−オールを優勢的に生成する、［１３］に記載の方法。
［２８］  前記微生物が、プロパン−２−オールよりも、プロパン−１−オールを優勢的に生成する、［１３］に記載の方法。
［２９］  前記微生物が、プロパン−２−オンよりも、プロピオンアルデヒドを優勢的に生成する、［１３］に記載の方法。
［３０］  前記微生物が、プロピオンアルデヒドよりも、プロパン−２−オンを優勢的に生成する、［１３］に記載の方法。
［３１］  前記微生物が、プロパン−２−オンをプロパン−２−オールに変換しない、［１３］に記載の方法。
［３２］  前記微生物が、プロパン−２−オンをプロパン−２−オールに変換する、［１３］に記載の方法。
［３３］  前記発酵ブロスが、少なくとも１ｇ／Ｌのプロパン−１，２−ジオールを含む、［１３］に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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