(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ｃ）このタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とをこの特定の順序で含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するキメラワクチン抗原。
【請求項２】
キメラワクチン抗原のアミノ酸配列が、配列番号１０（Ｅｑ１抗原）及び配列番号１６（Ｅｑ１ｂ抗原）からなる群より選択される、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項３】
前記配列内に追加で、Ｔヘルパーリンパ球に特異的なエピトープを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項４】
Ｔヘルパーリンパ球に特異的な前記エピトープが、ＨＣＶ非構造タンパク質のエピトープである、請求項３に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項５】
前記非構造タンパク質がＮＳ３である、請求項４に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項６】
キメラワクチン抗原のアミノ酸配列が、配列番号１４（ＥｑＮＳ３抗原）であることを特徴とする、請求項５に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項７】
Ｔヘルパーリンパ球に特異的な前記エピトープが人工エピトープである、請求項３に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項８】
前記人工エピトープが、エピトープＰ１Ｍ（配列番号１７）及びエピトープＰ２Ｂ（配列番号１８）からなる群より選択される、請求項７に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項９】
キメラワクチン抗原のアミノ酸配列が、配列番号１２（ＮＳＥｑ２抗原）、配列番号１３（ＥｑＮＳｂ抗原）及び配列番号１５（ＥｑＰ１抗原）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項１０】
ａ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とをこの特定の順序で含むＨＣＶに対するキメラワクチン抗原；並びに薬学的に許容できる賦形剤及び／又はアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項１１】
キメラワクチン抗原が、請求項２から９までのいずれか一項に記載のキメラワクチン抗原である、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
ＨＣＶ構造抗原又はＨＣＶ  ＮＳ３抗原の組換えタンパク質変異体を更に含む、請求項１０又は１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記ＨＣＶ構造抗原を発現するＤＮＡ免疫化用のプラスミドを更に含む、請求項１０又は１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記ＨＣＶ構造抗原及びＨＣＶの組換えカプシドタンパク質を発現するＤＮＡ免疫化用のプラスミドを更に含む、請求項１０又は１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
ＤＮＡ免疫化用のプラスミド、ＨＣＶ構造抗原の組換えタンパク質、又は両方の混合物をベースとする製剤と一緒に初回／追加免疫スケジュールで投与できる、請求項１０又は１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
ＨＣＶに特異的な免疫反応を誘導するワクチンを生成するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載のキメラワクチン抗原の使用。
【請求項１７】
前記ワクチンが、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで防御能を有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ワクチンが、健常人又はＨＣＶ感染患者において免疫反応を誘導する能力がある、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記ワクチンが、ＤＮＡ免疫化用のプラスミド、ＨＣＶ構造抗原の組換えタンパク質又は両方の混合物をベースとする製剤と一緒に初回／追加免疫スケジュールで投与される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野及び製薬業界に関し、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するキメラ抗原及びそれを含むワクチン組成物の開発に関する。本発明において、ＨＣＶ抗原の特異的な領域の正確な選択及びＣＤ４＋Ｔリンパ球に特異的な人工エピトープの包含により、キメラ抗原はＨＣＶに対して強力且つ広い免疫反応を誘導することが可能になるので、最小数の構成要素が使用される。
【背景技術】
【０００２】
世界人口のおよそ３％がＨＣＶに感染している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００６年；４４：５２１〜５２６頁）。感染者の殆どは慢性化する（Ａｍｏｒｏｓｏ  Ｐ，ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９８年；２８：９３９〜９４４頁）。Ｃ型肝炎感染症は、慢性肝障害、肝硬変、肝不全及び肝癌の主因の１つである（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ  ＪＨ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００２年；３６（５補足１）：Ｓ２１〜Ｓ２９頁）。現在では、ＨＣＶ感染症は、先進国における肝移植の主因である。加えて、ＨＣＶ感染症はとりわけ、ＩＩ型クリオグロブリン血症、膜性増殖性糸球体腎炎、晩発性皮膚ポルフィリン症として肝外徴候と関連付けられている。現在、このウイルスに対する予防ワクチンは存在せず、ペグ化インターフェロン（ＩＦＮ）＋リバビリンの併用に基づいて使用される従前通りの抗ウイルス治療は、症例の５０％未満にしか有効でない。更に、上述した治療は多重有害事象の原因になる（Ｇｈａｎｙ  ＭＧ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００９年；４９（４）：１３３５〜７４頁）。
【０００３】
ＨＣＶは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のヘパシウイルス属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）に属する。ＨＣＶはエンベロープを持ったウイルスであり、ウイルス粒子は直径およそ５０〜７０ｎｍであり、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と会合している（Ｐｏｐｅｓｃｕ  ＣＩ  ｙ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００９年；１０２（１）：６３〜７４頁）。ウイルスゲノムは、およそ９．６ｋｂのプラス鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。ゲノムは、少なくとも１０種のウイルスタンパク質：コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７（構造タンパク質）及び非構造タンパク質：ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂへと共及び翻訳後プロセスされるウイルスポリタンパク質をコードしている（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｒ  ｙ  Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖ．、２０００年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、８１：１６３１〜４８頁）。
【０００４】
ＨＣＶに有効なワクチンの開発にはいくつか重大な障害がある。この病原体は、宿主環境に適応して速やかに突然変異することができるＲＮＡウイルスである。このことが、世界中で同定されている複数のウイルス分離株の多様性の高さに関与している。６つの主要なＨＣＶ遺伝子型が同定されており、ヌクレオチド配列で最大で３０％異なることがある（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  Ｐ．、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９９年；３１補足１：５４〜６０頁）。ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の超可変領域に最も大きい異種性が観察され、その領域に中和抗体によって潜在的に標的されるエピトープが見いだされる。実際のところ、ＨＣＶは、ウイルス分子の不均一集団として体内を循環しており、この現象は多種性として公知である（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ  Ｐ．、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、２００４年；８５（Ｐｔ１１）：３１７３〜８８頁）。突然変異が、宿主によって発揮される特異的な体液性及び細胞性免疫反応に対するウイルス回避の方法を構成していることが実証された。
【０００５】
能動免疫反応が起こるにもかかわらず、ＨＣＶが免疫能力のある個体に持続感染を引き起こすことは重視すべきである（Ｌｅｃｈｍａｎｎら、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、２０００年、２０、２１１〜２２６頁）。これまで、無関係な免疫反応を助長し有効な免疫反応を妨害することによって感染の持続性に関与するいくつかのウイルス効果が説明されてきた。これらの効果は、先天的及び後天的免疫の両方で検出されている（Ｇｒａｋｏｕｉ  Ａ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、３０２（５６４５）：６５９〜６２頁）。ＨＣＶに効果がない免疫反応は、この病原体を除去できないだけでなく、肝障害にも関与することを裏付ける証拠がある。
【０００６】
これまで、ＨＣＶに対する防御及び浄化と相関する免疫学的指標は、完全には定義されていなかった。しかしながら、様々なＨＣＶ抗原に対する強力で持続的な細胞性免疫反応の誘導が特に関係すると考えられている（Ｌｅｃｈｍａｎｎら、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、２０００年、２０、２１１〜２２６頁）。ＨＣＶに慢性的に感染した患者において、特異的Ｔリンパ球反応の機能障害が特に有意である。いくつかの機序がこの効果に関与していると思われ、その１つは、制御性Ｔ細胞の作用である。
【０００７】
殆ど全ての免疫化戦略は、ＨＣＶに対するワクチンを開発することを試みることであった。それら戦略のいくつかには、組換えタンパク質、合成ペプチド、ウイルス様粒子、裸のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び組換えウイルスがある。ウイルス抗原の全てが、ＨＣＶに対するワクチン候補の標的として評価されてきた。ワクチン候補の殆どは、動物モデルでの免疫原性研究の段階にある。にもかかわらず、現在のところ、一部の候補は、臨床評価に達しており、安全で免疫原性であることが実証されたが、明白な臨床的影響はまだ実証されていない（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ．、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年；３１（３）：２２３〜４２頁）。
【０００８】
サブユニットタンパク質ワクチン候補の開発は、ＨＣＶワクチンを得るために評価された最初の戦略の１つであった。構造抗原をベースとするそれら候補のいくつかは、動物モデルにおけるウイルス攻撃に対して限定的な防御を達成した。Ｅ１及びＥ２オリゴマーで免疫化したチンパンジーの症例がそれに相当する。７匹のチンパンジーを免疫化し、そのうちの５匹は防御され、２匹は感染したが慢性化せずにウイルスが除去された（Ｃｈｏｏ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９４年、９１、１２９４〜１２９８頁）。この防御は、Ｅ２タンパク質とヒト細胞との相互作用を阻害できる抗体の存在と相関している（Ｒｏｓａ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年、９３、１７５９〜１７６３頁）。
【０００９】
１ｂ遺伝子型分離株由来の組換えＥ１タンパク質が、ホモ二量体として精製された（Ｍａｅｒｔｅｎｓ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ａｃｔａ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｂｅｌｇ、２０００年、６３、２０３頁）。ＨＣＶに慢性的に感染した２匹のチンパンジーが、この組換えＥ１タンパク質５０μｇの投薬を９回受けた。ワクチン接種は、肝臓組織像を改善し、肝臓からウイルス抗原を除去し、アラニンアミノトランスフェラーゼレベルを減少させた。しかしながら、治療中に血清ＲＮＡレベルは変化せず、治療終結後に肝臓の炎症及びウイルス抗原が再び現れた。高い抗Ｅ１抗体レベルと肝障害の減少との関連が観察された（Ｍａｅｒｔｅｎｓら、Ａｃｔａ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｂｅｌｇ、２０００年、６３、２０３頁）。ミョウバン中に配合したＥ１タンパク質変異体がヒトにおいて評価された。この候補は、安全で免疫原性であり、特異的な抗体及びリンパ増殖反応を誘導した（Ｎｅｖｅｎｓ  Ｆ、ｙ  ｃｏｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．、２００３年；３８（５）：１２８９〜９６頁）。しかしながら、患者はウイルスを除去せず、肝臓の組織学的改善が観察されなかったので、この候補の投与はＨＣＶ感染症の臨床経過に影響を及ぼさなかった。場合によっては、タンパク質サブユニット手法は、不都合なことに強い細胞性免疫反応を誘導しなかった。この手法は、別の弱点、すなわち病原体によって異なるレベルで誘導される、ＨＣＶ特異的な免疫反応機能障害の異なる機序に関係する領域の挿入を有する可能性がある（Ｇｒａｋｏｕｉ  Ａ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、３０２（５６４５）：６５９〜６２頁）。
【００１０】
Ｔリンパ球エピトープを含む合成ペプチドの混合物をベースとする２つのワクチン候補も、臨床試験に達した（Ｙｕｔａｎｉ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２００９年、１００（１０）：１９３５〜４２頁、Ｋｌａｄｅ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００８年．１３４（５）：１３８５〜９５頁）。これまで行われたフェーズＩ及びＩＩ臨床試験において、両方の候補は特異的な免疫反応を誘導し、ＨＣＶに慢性的に感染した患者に低い反応原性を有した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ．、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年；３１（３）：２２３〜４２頁）。にもかかわらず、これらのワクチン候補は、ウイルス負荷に対して有意な効果を示さなかったか、又は一時的な効果しかなかった。これらの候補が肝臓組織像になんら改善を誘導しなかったことを考慮すると、臨床的な影響はまだ実証されていない。ウイルス排除に重要な可能性があるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対する様々なエピトープが、ＨＣＶポリタンパク質の全体で同定された。これらの知見は、合成ペプチドをベースとするワクチンの戦略を裏付ける。マウスにおいて、コア、ＮＳ４及びＮＳ５エピトープを含めた様々なペプチドは、単独で又は脂質部分と共に強いＴ細胞障害性反応を誘導した（Ｓｈｉｒａｉら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１９９６年、１７３、２４〜３１頁；Ｈｉｒａｎｕｍａら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、１９９９年、８０、１８７〜１９３頁；Ｏｓｅｒｏｆｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８年、１６、８２３〜８３３頁）。この手法の主要な短所は、Ｔヘルパー機能がないそれらペプチドが、弱い免疫原にしかなり得ないということである。加えて、ワクチンの有効性は、いくつかの抗原に対する多価性及び広範囲の免疫反応の誘導によって決まることが多い。ワクチンに含まれるペプチドの数が増加するにつれて、処方の複雑さは全ての点で高まる。これらの制限がこの手法の弱点である。
【００１１】
他方で、ＨＣＶに対するワクチン候補として様々な組換えウイルスベクターが評価された。欠損組換えアデノウイルスは、その肝臓向性、体液性及び細胞性免疫反応を誘導する能力並びに経口及び非経口ルートでの投与可能性のため、魅力的な候補となる。ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えアデノウイルスは、これらのタンパク質それぞれに対する抗体反応を誘導する（Ｍａｋｉｍｕｒａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９６年、１４、２８〜３６頁）。また、コア及びＥ１組換えアデノウイルスでマウスを免疫化した後に、これらの抗原に対する特異的Ｔ細胞障害性免疫反応が検出される（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９７年、２５、４７０〜４７７頁）。これらは有望な結果だが、遺伝子治療における組換えアデノウイルスの使用に関連するいくつかの問題は、ヒトにおいてその安全性に疑念が生じたことである。現在のところ、臨床試験においてＨＣＶ組換えアデノウイルスをベースとするワクチン候補は、免疫原性に関する結果は良好であるが臨床的な影響の証拠はないと評価されている（Ｂａｒｎｅｓ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．、２０１２年；４（１１５）：１１５頁）。様々なＨＣＶ遺伝子を含有する牛痘、鶏痘並びにカナリア痘など他の組換えウイルスベクターの使用は、マウスにおいて強いＴ細胞毒及びヘルパー反応を誘導した（Ｓｈｉｒａｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９４年、６８、３３３４〜３３４２頁；Ｌａｒｇｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年、１６２、９３１〜９３８頁）。特に、ＨＣＶ非構造抗原ＮＳ３〜ＮＳ５の組換え型である修飾牛痘ウイルスアンカラが、ヒトにおける臨床試験で評価された（Ｆｏｕｒｎｉｌｌｉｅｒ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７年；２５（４２）：７３３９〜５３頁）。ＨＣＶに慢性的に感染している患者のフェーズＩ臨床試験においてこの候補は免疫原性であり、忍容性は良好であった。ペプチド手法と同様に、ウイルス負荷に対する効果は一過性であり、ワクチン接種を受けた人の一部にだけ観察された。従って、臨床的な影響はまだ実証されていない。一般に、組換えウイルスをベースとするワクチン候補は、その適用に関連する安全性及び規制の問題が障害となっている。
【００１２】
ＤＮＡ免疫化が、ＨＣＶワクチン開発の戦略として大規模に研究されてきた。動物モデルにおける研究は、殆ど全てのＨＣＶ抗原に対して細胞性及び体液性免疫反応を誘導するこれら候補の能力を示した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ、２００９年；５（８）：５６８〜７１頁）。ＨＣＶ抗原をコードしている配列を含有するＤＮＡ免疫化プラスミドを含む２つのワクチン候補がヒトにおいて臨床試験中である（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ｄｕｅｂａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年；３１（３）：２２３〜４２頁）。一例では、それは、ＮＳ３〜ＮＳ５タンパク質を発現しており、エレクトロポレーションによって投与されるＤＮＡワクチンである（Ｓａｌｌｂｅｒｇ  Ｍ、ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２００９年；９（７）：８０５〜１５頁）。他の例として、それは、組換えコアタンパク質とＨＣＶ構造抗原を発現するＤＮＡプラスミドとの混合物をベースとするワクチン組成物がある（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  Ｍ、ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、２０１０年；１２（１）：１０７〜１６頁）。両方の候補は、安全であり忍容性が良好であることが実証され、免疫化した対象において特異的な免疫反応を誘導した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  Ｌ、Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  Ｓ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年；３１（３）：２２３〜４２頁）。これら２つの例のいずれにおいても、ＨＣＶ感染過程又は持続的組織学的改善に対する効果は実証されなかった。ＤＮＡワクチンは、その単純性及び安定性に関連する潜在的な利点があるにもかかわらず、重大な規制上の課題に直面している。それらの主要な制限は、これまで、完全には理解されていない現象であり動物モデルにおいて得られた結果と大きく異なる、ヒトにおいて不十分な免疫原性に関係すると思われる。
【００１３】
上述した要素により、ＨＣＶに対する予防又は治療ワクチンの開発は、未解決の問題である。本発明は、明確にこの目標に向けて行われる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は上述した問題を解決し、ａ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）に対応する第１の部分と、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）に対応する第２の部分と、ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）に対応する第３の部分とをこの順序で含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するキメラワクチン抗原を提供する。
【００１５】
本発明の新規性は、エピトープの特異的選択及び生成されるタンパク質変異体上に配置されるそれらの順序にある。このワクチン抗原の設計により、様々なＨＣＶ抗原に対する免疫反応の範囲を広げ、強化するのに必要な構成要素の数を減らすことが可能になる。本発明は、単一のキメラ抗原中にＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）に対応するＨＣＶポリタンパク質領域を特にこの順序で含む融合タンパク質について初めて記述する。得られる免疫反応は適切であり、従って、広範囲のウイルス抗原に対して向けられる。
【００１６】
ＨＣＶの特異的な領域の選択は、ウイルスタンパク質由来の、免疫抑制効果を及ぼす可能性がある領域の使用を防ぐ。同様に、その選択は、本発明において選択される領域に対して免疫優性になる可能性があり、設計した抗原に含まれる場合には、本発明において選択される領域に特異的な免疫反応の誘導を制限する可能性がある他の領域の使用を防ぐ。他方で、選択される領域が人工タンパク質抗原中に配置される順序が、免疫系へのエピトープの暴露及びプロセッシング／提示の違いによりＨＣＶに対する免疫反応の誘導に有意に影響するという事実を考慮して、本発明はこのような要素を含む。実際のところ、本発明のキメラ抗原において、コア、Ｅ１及びＥ２タンパク質の領域は、天然のウイルスポリタンパク質の順序に対して逆に配置されている。
【００１７】
本発明の具現化において、キメラワクチン抗原の配列は、配列番号１０（Ｅｑ１抗原）及び配列番号１６（Ｅｑ１ｂ抗原）からなる群より選択される。
【００１８】
本発明のキメラ抗原は、その配列中に少なくとも１つのＴヘルパーリンパ球特異的エピトープを追加で含むことができる。本発明の具体化において、キメラ抗原に含まれるＴヘルパーリンパ球特異的エピトープは、ＨＣＶ非構造タンパク質由来の１つのエピトープである。特定の具現化において、非構造タンパク質は、ＮＳ３である。より具体的には、本発明は、配列番号１４（ＥｑＮＳ３抗原）として識別されるアミノ酸配列を特徴とするキメラワクチン抗原を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様において、キメラ抗原に含まれるＴヘルパーリンパ球特異的エピトープは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球人工エピトープである。本発明の文脈において、人工エピトープという用語は、アミノ酸配列が天然の形態で存在せず、その代わりにバイオインフォマティクスによって設計されるエピトープを定義する。Ｔヘルパーリンパ球によって認識される人工エピトープの選択及び包含は、キメラ抗原性変異体に含まれるＨＣＶエピトープに特異的な免疫反応の誘導に関与する。本発明は、Ｔヘルパーリンパ球エピトープＰ１Ｍ（配列番号１７）及びＰ２Ｂ（配列番号１８）の人工エピトープについて初めて記述する。これらのエピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１１結合目標を含有するように設計された。従って、本発明は、アミノ酸配列が配列番号１７又は配列番号１８として識別されるアミノ酸配列に対応するＴヘルパーリンパ球特異的エピトープを提供する。
【００２０】
本発明の具体化において、キメラ抗原は、配列番号１２（ＮＳＥｑ２抗原）、配列番号１３（ＥｑＮＳｂ抗原）及び配列番号１５（ＥｑＰ１抗原）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有し、その抗原は、これらＴヘルパーリンパ球特異的エピトープの少なくとも１つを含有する。
【００２１】
以下のキメラ抗原は、下に要約する特徴を有する：キメラ抗原Ｅｑ１（配列番号１０）は、ＨＣＶポリタンパク質の領域Ｅ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）をその特定の順序で含む。キメラ抗原ＮＳＥｑ２（配列番号１２）は、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたエピトープＰ２Ｂ及びＰ１Ｍをこの順序で含む。キメラ抗原ＥｑＮＳｂ（配列番号１３）は、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＰ２Ｂエピトープを含む。キメラ抗原ＥｑＮＳ３（配列番号１４）は、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸領域１２４２〜１４１５を含む。キメラ抗原ＥｑＰ１（配列番号１５）は、Ｅｑ１内でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＰ１Ｍエピトープを含む。キメラ抗原Ｅｑ１ｂ（配列番号１６）は、ＨＣＶポリタンパク質のＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）領域をその特定の順序で含むが、その場合に、アミノ酸配列がＨＣＶ遺伝子型１ａＨ７７変異体（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００４１０２．１）に対応する。
【００２２】
本発明の具体化において、キメラ抗原は、組換えＤＮＡ技術によって、実施例１に記述されるプラスミドで形質転換された細菌から得られた。それでもなお、この技術の専門家は、そのような抗原を他の宿主から得ることもでき、周知の手順によって精製して、免疫化に使用できることを知っている。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ａ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とからこの順序で構成される、ＨＣＶに対するキメラワクチン抗原；並びに薬学的に許容できる賦形剤及び／又はアジュバントを含むワクチン組成物を提供する。
【００２４】
本発明の具体化において、ワクチン組成物は、配列番号１０（Ｅｑ１抗原）、配列番号１６（Ｅｑ１ｂ抗原）、配列番号１４（ＥｑＮＳ３抗原）、配列番号１２（ＮＳＥｑ２抗原）、配列番号１３（ＥｑＮＳｂ抗原）又は配列番号１５（ＥｑＰ１抗原）と識別される抗原を含む。
【００２５】
本発明の目的の場合、市販の又は開発段階にある多様な薬学的に許容できるアジュバントを使用して、本発明の目的のワクチン組成物に含有されるキメラ抗原に対する免疫反応を強化することができる。
【００２６】
本発明のワクチン組成物は同様に、ＨＣＶ構造又はＮＳ３抗原の組換えタンパク質変異体を含むこともできる。本発明のワクチン組成物は、ＨＣＶ構造抗原を発現するＤＮＡ免疫化用のプラスミドを更に含むことができる。本発明の別の具現化において、キメラ抗原はＤＮＡ免疫化用のプラスミドと一緒に配合されてもよく、そのプラスミドはＨＣＶ構造抗原及びＨＣＶ組換えカプシドタンパク質を同時に発現する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ａ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ｂ）ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ｃ）ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とをこの順序で含むＨＣＶに対するキメラワクチン抗原を含むワクチン組成物が、ＤＮＡ免疫化用のプラスミド、ＨＣＶ構造タンパク質の組換え変異体又は両方の混合物をベースとする製剤と一緒に初回／追加免疫スケジュールで投与され得ることを含む。
【００２８】
本発明の目的であるワクチン組成物には、いくつかのＨＣＶ抗原に対して体液性と細胞性両方の免疫反応を誘導するという長所があり、従って、広範囲のウイルス分離株に対して活性があり、代用ウイルス攻撃モデルにおいて防御を誘導する能力がある。
【００２９】
本発明において、ワクチン組成物は、筋肉内、皮内、腹膜内、皮下、粘膜内、静脈若しくは舌下経路、又はその分野の専門家に公知の他のあらゆる経路によって投与されてもよい。他方で、投与は注射器、スプレー又は他の投与装置によってなされてもよい。
【００３０】
ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とからこの順序で構成されるキメラワクチンの抗原を使用して、ＨＣＶに対する免疫反応を誘導するワクチンを製造することも本発明の目的である。本発明の具体化において、上述したワクチンは、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで防御を誘導する能力がある。他方で、本発明のワクチンは、健常人又はＨＣＶ感染患者において反応を誘導する能力がある。従って、ＨＣＶに対する免疫反応の誘導方法を提供することも本発明の態様である。この方法は、ＨＣＶポリタンパク質のＥ２領域（アミノ酸４０８〜５４０）からなる第１の部分と、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域（アミノ酸１９０〜２２２）からなる第２の部分と、ＨＣＶポリタンパク質のコア領域（アミノ酸１〜５０）からなる第３の部分とからこの順序で構成されるキメラ抗原又は上述した抗原を含有するワクチン組成物を、健常人又はＨＣＶ感染者に投与することを特徴とする。
【００３１】
本発明は、上述した方法において、キメラワクチン抗原又はそれを含有するワクチン組成物が、ＤＮＡ免疫化用のプラスミド、ＨＣＶ構造抗原の組換え変異体又は両方の混合物をベースとする製剤と一緒に初回／追加免疫スケジュールで投与されることも含む。
【００３２】
ＨＣＶ感染患者の治療の場合、本発明の抗原又はそれを含有するワクチン組成物は、この種の患者に対する標準的な治療に含まれる薬剤と同時に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】様々なキメラ抗原をコードする配列を含有するプラスミドのマップである。  図１Ａは、ｐＩＭＣｏ６４Ｋ、Ｃｏｑ１抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｂは、ｐＩＭＥ６４Ｋ、Ｅｑ１抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｃは、ｐＩＭＥ１６４Ｋ、Ｅ１ｑ１抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｄは、ｐＩＮＳＥ６４Ｋ、ＮＳＥｑ２抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｅは、ｐＩＥＮＳｂ、ＥｑＮＳｂ抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｆは、ｐＩＥＮＳ３、ＥｑＮＳ３抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｇは、ｐＩＭＰ１Ｅ６４Ｋ、ＥｑＰ１抗原を発現するためのプラスミドの図である。  図１Ｈは、ｐＩＭＥ６４Ｋｂ、Ｅｑ１ｂ抗原を発現するためのプラスミドの図である。
【図２】様々なキメラ抗原の略図である。  図２Ａは、ＨＣＶポリタンパク質のコア（アミノ酸１〜５０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）領域を含むＣｏｑ１抗原の図である。  図２Ｂは、ＨＣＶポリタンパク質のＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）を含むＥｑ１抗原の図である。  図２Ｃは、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）、Ｅ２（アミノ酸４０８〜５４０）及びコア（アミノ酸１〜５０）を含むＥ１ｑ１抗原の図である。  図２Ｄは、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＰ２Ｂ及びＰ１Ｍエピトープを含む、ＮＳＥｑ２抗原の図である。  図２Ｅは、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＰ２Ｂエピトープを含む、ＥｑＮＳｂ抗原の図である。  図２Ｆは、Ｅｑ１上のＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入された、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸領域１２４２〜１４１５を含む、ＥｑＮＳ３抗原の図である。  図２Ｇは、Ｅｑ１上でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたＰ１Ｍエピトープを含む、ＥｑＰ１抗原の図である。  図２Ｈは、ＨＣＶポリタンパク質の遺伝子型１ａＨ７７変異体のＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）領域を含む、Ｅｑ１ｂ抗原の図である。
【図３】様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は抗体価の逆数としてＹ軸に示され、血清が、ＥＬＩＳＡによって決定される陰性対照群血清の４９２ｎｍでの平均光学密度より少なくとも２倍大きい光学密度を示す最大希釈と定義される。Ｘ軸に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与された様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図４】様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、刺激有りで増殖する細胞と刺激なしで増殖する細胞との比と定義され、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数としてＹ軸に示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。Ｘ軸に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与された様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図５】様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対するＩＦＮγ分泌の反応を示す図である。Ｙ軸は、細胞１００万個当たりの正味のスポットの数を表し、刺激した条件で検出されたスポットの数から刺激なし条件で検出されたスポットの数を引いた値と定義され、ＩＦＮγ分泌ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定される。Ｘ軸に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与された様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図６】様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果はウイルス価の対数としてＹ軸に示され、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位数の対数と定義され、ウイルス攻撃後に雌マウスの卵巣中で検出される。ウイルス攻撃に使用したワクシニアウイルスは、コア、Ｅ１及びＥ２抗原（ＨＣＶポリタンパク質の１〜６５０アミノ酸領域）を発現しているワクシニアウイルスであるｖｖＲＥウイルス並びにＨＣＶ抗原を発現しないＷＲワクシニアウイルスであった。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【図７】ＮＳ３と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は、ＥＬＩＳＡによって決定される抗体価の逆数としてＹ軸に示される。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）、Ｅ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、反応を評価した。
【図８】ＮＳ３と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数としてＹ軸に示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、反応を評価した。
【図９】ＮＳ３と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対するＩＦＮγ分泌の反応を示す図である。Ｙ軸は、ＩＦＮγ分泌ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した細胞１００万個当たりの正味のスポットの数を表す。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、反応を評価した。
【図１０】ＮＳ３と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果は、ウイルス価の対数としてＹ軸に示される。ウイルス攻撃に使用したワクシニアウイルスは、ｖｖＲＥ及びＷＲであった。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【図１１】ＤＮＡ免疫化用のプラスミドと組み合わせたＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は、ＥＬＩＳＡによって決定される抗体価の逆数としてＹ軸に示される。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、反応を評価した。
【図１２】ＤＮＡ免疫化用のプラスミドと組み合わせたＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数としてＹ軸に示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図１３】ＤＮＡ免疫化用のプラスミドと組み合わせたＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対するＩＦＮγ分泌の反応を示す図である。Ｙ軸は、ＩＦＮγ分泌ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した細胞１００万個当たりの正味のスポットの数を表す。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、反応を評価した。
【図１４】ＤＮＡ免疫化用のプラスミドと組み合わせたＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果は、ウイルス攻撃後に雌マウスの卵巣中で検出したウイルス価の対数としてＹ軸に示される。ウイルス攻撃には、ｖｖＲＥ及びＷＲウイルスを使用した。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【図１５】ＨＣＶ構造タンパク質の組換え変異体と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は、ＥＬＩＳＡによって決定される抗体価の逆数としてＹ軸に示される。Ｘ軸は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原を示す。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コアタンパク質（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質の１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、反応を評価した。
【図１６】ＨＣＶ構造タンパク質の組換え変異体と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数として示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図１７】ＨＣＶ構造タンパク質の組換え変異体と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対するＩＦＮγ分泌の反応を示す図である。結果は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイで決定した細胞１００万個当たりの正味のスポットとして示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図１８】ＨＣＶ構造タンパク質の組換え変異体と混合したＥｑ１による免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果は、ウイルス攻撃後に雌マウスの卵巣中で検出したウイルス価の対数として示される。ワクシニアウイルスｖｖＲＥ及びＷＲを使用して、ウイルス攻撃した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【図１９】人工エピトープ及びＮＳ３タンパク質のエピトープを含む様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は、ＥＬＩＳＡによって決定される平均抗体価の逆数として示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図２０】人工エピトープ及びＮＳ３タンパク質のエピトープを含む様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数として示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図２１】人工エピトープ及びＮＳ３タンパク質のエピトープを含む様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対するＩＦＮγ分泌の反応を示す図である。結果は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイで決定した細胞１００万個当たりの正味のスポットとして示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図２２】人工エピトープ及びＮＳ３タンパク質のエピトープを含む様々なキメラ抗原による免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果は、ウイルス攻撃後に雌マウスの卵巣中で検出したウイルス価の対数として示される。ワクシニアウイルスｖｖＲＥ及びＷＲを使用して、ウイルス攻撃した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【図２３】キメラ抗原Ｅｑ１及びＥｑ１ｂによる免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する抗体産生反応を示す図である。結果は、ＥＬＩＳＡによって決定される平均抗体価の逆数として示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡのコーティング抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図２４】キメラ抗原Ｅｑ１及びＥｑ１ｂによる免疫化スケジュールにおける、ＨＣＶタンパク質に対する増殖反応を示す図である。結果は、ＣＦＳＥ染色による細胞数測定アッセイで決定される刺激指数として示される。２より大きい刺激指数を陽性とみなす。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。コア（カプシドタンパク質のアミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体を細胞刺激抗原として使用して、免疫反応を評価した。
【図２５】キメラ抗原Ｅｑ１及びＥｑ１ｂによる免疫化スケジュールにおける、ウイルス攻撃に対する反応を示す図である。結果は、ウイルス攻撃後に雌マウスの卵巣中で検出したウイルス価の対数として示される。ワクシニアウイルスｖｖＲＥ及びＷＲを使用して、ウイルス攻撃した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した様々な免疫原が示される。エラーバーは、各群の平均値の標準偏差を示す。
【実施例】
【００３４】
（例１）ＨＣＶエピトープを含む様々なキメラ抗原の生成
図１で示すように、プラスミドｐＩＭＣｏ６４Ｋ（配列番号１）、ｐＩＭＥ６４Ｋ（配列番号２）、ｐＩＭＥ１６４Ｋ（配列番号３）、ｐＩＮＳＥ６４Ｋ（配列番号４）、ｐＩＥＮＳｂ（配列番号５）、ｐＩＥＮＳ３（配列番号６）、ｐＩＭＰ１Ｅ６４Ｋ（配列番号７）、ｐＩＭＥ６４Ｋｂ（配列番号８）を入手した。これらのプラスミドはそれぞれ、図２に表されるキメラ抗原Ｃｏｑ１（配列番号９）、Ｅｑ１（配列番号１０）、Ｅ１ｑ１（配列番号１１）、ＮＳＥｑ２（配列番号１２）、ＥｑＮＳｂ（配列番号１３）、ＥｑＮＳ３（配列番号１４）、ＥｑＰ１（配列番号１５）及びＥｑ１ｂ（配列番号１６）の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現を可能にする。全ての場合において、抗原Ｅｑ１ｂ（ＨＣＶ株Ｈ７７、遺伝子型１ａに由来する配列）を除いて、アミノ酸配列はＨＣＶ遺伝子型１ｂ分離株に由来する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｈｏｒｔａ  ＥＥ、Ｅｕｒ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．、２０１１年；１５（１１）：１３２０〜７頁）。
【００３５】
図２で示すように、キメラ抗原Ｃｏｑ１（配列番号９）は、この特定の順序で位置するＨＣＶポリタンパク質のコア（アミノ酸１〜５０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）領域を含む。キメラ抗原Ｅｑ１（配列番号１０）は、ＨＣＶポリタンパク質のＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）領域を等しく含むが、他の特定の順序である。キメラ抗原Ｅ１ｑ１（配列番号１１）は同じ領域を含むが、以下の順序である：ＨＣＶポリタンパク質のＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）、Ｅ２（アミノ酸４０８〜５４０）及びコア（アミノ酸１〜５０）。キメラ抗原ＮＳＥｑ２（配列番号１２）は、Ｅｑ１内でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたエピトープＰ２Ｂ及びＰ１Ｍをこの順序で含む。他方で、キメラ抗原ＥｑＮＳｂ（配列番号１３）は、Ｅｑ１内でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたエピトープＰ２Ｂを含む。キメラ抗原ＥｑＮＳ３（配列番号１４）は、キメラ抗原Ｅｑ１のＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入された、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１２４２〜１４１５の領域を含む。キメラ抗原ＥｑＰ１（配列番号１５）は、Ｅｑ１内でＥ１（アミノ酸１９０〜２２２）とコア（アミノ酸１〜５０）領域の間に挿入されたエピトープＰ１Ｍを含む。キメラ抗原Ｅｑ１ｂ（配列番号１６）は、ＨＣＶポリタンパク質のＥ２（アミノ酸４０８〜５４０）、Ｅ１（アミノ酸１９０〜２２２）及びコア（アミノ酸１〜５０）領域をこの特定の順序で含むが、この場合、アミノ酸配列はＨＣＶ株Ｈ７７、遺伝子型１ａ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００４１０２．１））に対応する。
【００３６】
キメラ抗原のいくつかに含まれる人工エピトープＰ１Ｍ及びＰ２Ｂを、ヒトＴヘルパーリンパ球に認識されるようにバイオインフォマティクスによって設計した。プログラムＲａｎｋｐｅｐ、ＳＹＦＰＥＴＨＩ及びＰｒｏＰｒｅｄを使用して、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１１に対する結合モチーフを研究し、出現頻度に照らして人工エピトープ中の位置ごとのアミノ酸変異を計画した。Ｔヘルパーリンパ球に特異的な人工エピトープとして、配列がＬＰＥＹＶＩＭＶＫＬＰＳＲＡ（配列番号１７）である１４アミノ酸のＰ１Ｍ；及び配列がＧＹＫＶＩＶＬＮＰＲＶＡＳＴＬ（配列番号１８）である１５アミノ酸のＰ２Ｂについて記述される。
【００３７】
組換えタンパク質抗原の発現の場合、大腸菌株ＧＣ−３６６のコンピテント細胞をそれぞれのプラスミドで形質転換した。組換えタンパク質の発現は、細胞培養最少培地を利用して摂氏３７℃で１２時間発現させた。全てのタンパク質抗原は、タンパク質発現用としてナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４Ｋタンパク質由来断片をＮ末端に含み、この機能については以前から知られている（Ｙｅｒｏ  Ｄ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年；４４（Ｐｔ１）：２７〜３４頁）。他方で、タンパク質変異体は、タンパク質精製を容易にする目的で６−ヒスチジンタグをＣ末端に含む。実際に、タンパク質を、細胞破砕によって得られた不溶性画分を炭酸−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６、８Ｍ尿素による可溶化及びその後の金属キレート親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【００３８】
（例２）マウスにおけるＨＣＶエピトープを含む様々なキメラ抗原の免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合したキメラ抗原Ｃｏｑ１；群２、ミョウバン中に配合した抗原Ｅ１ｑ１；群３、ミョウバン中に配合した抗原Ｅｑ１；群４、ミョウバン（対照群）。全ての場合において、組換え抗原２０μｇを投与した。０、２及び４週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００３９】
０及び６週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、６週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を試験した。加えて、６週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、２００７年；２４（３〜４）：２４６〜２５３頁）及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００８年；５１（Ｐｔ２）：９７〜１０５頁）。
【００４０】
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応を、図３〜５に示す。評価した反応は、コアタンパク質（アミノ酸１〜１２０、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｏｂｒｅｇｏｎ  ＪＣ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００１年；１９：３９４０〜３９４６頁）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０、Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＬＪ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００年；３２（２）：１３７〜１４３頁）、及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｄｏｎａｔｏ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年；３５（３）：２２５〜３６頁）の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として利用して検出した。図３で示すように、ＨＣＶ構造タンパク質に対する抗体産生反応は、評価した全ての抗原に対してよりもＥｑ１で免疫化した群において一層高かった（ｐ＜０．０００１；クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。類似の挙動が、増殖反応（図４）及びＩＦＮγ分泌（図５）それぞれについて観察された。加えて、図６で示すように、代用攻撃モデルにおいて、タンパク質Ｅｑ１で免疫化した群は、（ｖｖＲＥでの攻撃後に）特異的なウイルス血症を有意に抑制することができる唯一の群であった（ｐ＝０．００６９、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。
【００４１】
代用攻撃モデルにおいて、キメラ抗原Ｅｑ１は防御を誘発することができるので、これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能活性を有し、いくつかのＨＣＶ抗原に対して体液性と細胞性両方の特異的な免疫反応を誘導するキメラ抗原Ｅｑ１の能力が証明された。加えて、変異体Ｃｏｑ１及びＥ１ｑ１はこの種の免疫反応を誘導することができなかったので、キメラ抗原内でＨＣＶ構造タンパク質の選択した領域が位置する順序は、特異的な免疫反応の誘導並びに攻撃モデルにおける機能的な防御免疫反応の発現に重要であることが証明される。従って、抗原内にエピトープがあることは十分でなく、正しい前後関係にあることが十分である。
【００４２】
（例３）マウスにおけるＮＳ３と混合したＥｑ１抗原の免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合した抗原Ｅｑ１；群２、ミョウバン中に配合した、組換えタンパク質ＮＳ３と混合した抗原Ｅｑ１（Ｐａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｄら、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、２００６年；２３：９４〜９８頁）；群３、ミョウバン中に配合した組換えタンパク質ＮＳ３；群４、ミョウバン（対照群）。全ての場合において、組換え抗原Ｅｑ１  ２０μｇ及びＮＳ３タンパク質１０μｇを対応する群に投与した。０、２及び４週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００４３】
０及び６週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、６週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を試験した。加えて、６週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、２００７年；２４（３〜４）：２４６〜２５３頁）及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した。
【００４４】
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応を、図７〜９に示す。評価した免疫反応は、コアタンパク質（アミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）、Ｅ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質中のアミノ酸１１９２〜１４５７）の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として利用して検出した。図７で示すように、Ｅｑ１を単独で又はＮＳ３と混合して免疫化した群において、抗体産生反応は、それらの間で統計的有意差なしにＨＣＶ構造抗原に対して誘導される。しかしながら、ＮＳ３に対する抗体産生反応は、ＮＳ３とＥｑ１の混合物群において有意に高かった（ｐ＝０．０００１、マンホイットニー検定）。
【００４５】
他方で、図８に表される増殖反応の分析から、個別の攻撃に対しＥｑ１とＮＳ３の混合物を投与した群において、コア、Ｅ２及びＮＳ３抗原に対する反応が有意に高いことが証明された（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。Ｅ１に対する反応に関しては、Ｅｑ１を単独で又はＮＳ３と混合して免疫化した群間に統計的有意差は観察されなかった。
【００４６】
図９に表される特異的なＩＦＮγ分泌反応については、その反応は、組換えタンパク質で免疫化した変異体の中でＥｑ１とＮＳ３との混合物で免疫化した群において有意に高い反応を示すＥ２抗原に関してだけ、統計的有意差を伴って誘導された（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００４７】
加えて、図１０で示すように、代用攻撃モデルにおいて、Ｅｑ１タンパク質を単独で又はＮＳ３と混合して免疫化した群の両方が、特異的なウイルス血症（ｖｖＲＥで攻撃）を有意に抑制した（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。
【００４８】
代用ウイルス攻撃モデルにおいて、抗原Ｅｑ１とＮＳ３との混合物をベースとする製剤は防御を得ることができるので、これらの結果から、その製剤はｉｎ  ｖｉｖｏで機能活性を持ち、ＨＣＶ構造抗原及びＮＳ３に対する体液性と細胞性両方の特異的な免疫反応の増大を誘導できることが証明された。
【００４９】
（例４）マウスにおけるＤＮＡ免疫化用のプラスミドと混合したキメラ抗原Ｅｑ１の免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合したＥｑ１抗原；群２、ＤＮＡ免疫化用のプラスミドｐＩＤＫＥ２と混合したＥｑ１抗原（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００４年；３９：２４９〜５５頁）の食塩溶液、；群３、ｐＩＤＫＥ２プラスミド及びＣｏ．１２０タンパク質と混合したＥｑ１抗原（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ、１９９９年；１６（４）、２２６〜２３１頁）の食塩溶液；群４、０及び３週目に、ｐＩＤＫＥ２プラスミドと混合したＣｏ．１２０タンパク質の食塩溶液、６週目に、ミョウバン中に配合したＥｑ１抗原の投薬；群５、０、３及び６週目に、ｐＩＤＫＥ２プラスミドの食塩溶液；群６、ミョウバン（対照）；群７、食塩溶液（対照）。対応する群において、マウスは、キメラＥｑ１抗原２０μｇ及びＣｏ．１２０組換えタンパク質１０μｇの投与を受けた。ｐＩＤＫＥ２プラスミドの場合、各投薬において１００μｇを投与した。０、３及び６週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００５０】
０及び８週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、８週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を調査した。加えて、８週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで、及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した。
【００５１】
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応を、図１１〜１３に示す。評価した反応は、コアタンパク質（アミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として利用して検出した。図１１で示すように、ＨＣＶ構造抗原に対する抗体産生反応は、対照を除く免疫化した全ての群において誘導される。ｐＩＤＫＥ２プラスミド単独で免疫化した群に対してＥｑ１タンパク質及びＣｏ．１２０とｐＩＤＫＥ２プラスミドとの混合物で免疫化した群において、Ｅ１及びＥ２に対して有意に高い抗体産生反応が検出された（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。同時に、コア、Ｅ１及びＥ２に対する増殖反応についてこれら２群間の統計的有意差を観察した（図１２）（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。実際のところ、Ｅｑ１タンパク質及びＣｏ．１２０とｐＩＤＫＥ２プラスミドとの混合物で免疫化した群は、Ｅ１及びＥ２抗原に対する増殖反応を誘導し、その誘導は、初回／追加免疫スケジュールで免疫化した群（群４）を除く残りの群において誘導されるそれよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００５２】
ＩＦＮγ分泌反応に関しては、全ての群（対照を除く）が、ＨＣＶ構造タンパク質に対して検出可能な反応を誘導した（図１３）。Ｅｑ１単独で免疫化した群（群１）でＥ２に対して誘導された反応に観察された優位性（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）を除けば、ｐＩＤＫＥ２プラスミドだけで免疫化した群（群５）に対し、免疫原性変異体でワクチン接種した群の間でＥ１及びＥ２に対する反応に統計的有意差は観察されなかった。しかしながら、初回／追加免疫スケジュールで免疫化した群（群４）を除く残りの群に関しては、コア抗原に対するＩＦＮγ分泌反応は、Ｅｑ１及びＣｏ．１２０タンパク質とｐＩＤＫＥ２プラスミドとの混合物で免疫化した群において有意に高かった（ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００５３】
加えて、代用攻撃モデルにおいて、キメラＥｑ１抗原の投与を含む全ての群（群１〜４）は、特異的なウイルス血症（ｖｖＲＥで攻撃）を有意に抑制できたが、残りの群はできなかった（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）（図１４）。
【００５４】
代用攻撃モデルにおいて、ｐＩＤＫＥ２プラスミド及びＣｏ．１２０タンパク質と混合したＥｑ１、又は初回／追加免疫スケジュールでの投与に基づくワクチン組成物は防御を誘導することができるので、その結果から、ワクチン組成物はｉｎ  ｖｉｖｏで機能活性を持ち、ＨＣＶ構造抗原に対する体液性と細胞性両方の特異的な免疫反応の増大を誘導できることが証明された。
【００５５】
（例５）マウスにおけるＨＣＶ構造タンパク質の組換えタンパク質変異体と混合したキメラ抗原Ｅｑ１の免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合したＥｑ１抗原；群２、０及び２週目に、ミョウバン中に配合したＣｏ．１２０と、Ｅ１．３４０（Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＬＪ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００年；３２（２）：１３７〜１４３頁）と、Ｅ２．６８０（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｄｏｎａｔｏ  ｙ  ｃｏｌｓ．、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年；３５（３）：２２５〜３６頁）タンパク質の混合物、４週目に、ミョウバン中に配合したキメラＥｑ１抗原の投薬；群３、０週目に、ミョウバン中に配合したキメラＥｑ１抗原、並びに２及び４週目に、ミョウバン中に配合したタンパク質Ｃｏ．１２０、Ｅ１．３４０及びＥ２．６８０の混合物の投薬；群４、ミョウバン中に配合したタンパク質Ｃｏ．１２０、Ｅ１．３４０、Ｅ２．６８０及びＥｑ１の混合物；群５、ミョウバン中に配合したタンパク質Ｃｏ．１２０、Ｅ１．３４０及びＥ２．６８０の混合物；群６、ミョウバン（対照）。対応する群において、マウスは、キメラＥｑ１抗原２０μｇ；Ｅ１及びＥ２タンパク質１６．７μｇ並びにＣｏ．１２０タンパク質０．１μｇの投与を受けた。０、２及び４週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００５６】
０及び６週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、６週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を調査した。加えて、８週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで、及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した。
【００５７】
ＨＣＶに対する特異的な免疫反応を、図１５〜１７に示す。評価した反応は、コアタンパク質（アミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として使用して検出した。図１５に観察されるように、対照を除く免疫化した全ての群は、ＨＣＶ構造抗原に特異的な抗体産生反応を誘導した。群の中でコアタンパク質に対する抗体産生反応に関して統計的有意差は観察されなかった。それに対し、構造タンパク質の混合物で免疫化した群（群５）並びに構造タンパク質＋Ｅｑ１の混合物で免疫化した群（群４）は、Ｅ１及びＥ２に対して、Ｅｑ１単独で免疫化した群よりも有意に高い抗体産生反応を有した（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）。
【００５８】
他方、図１６で観察されるように、ＨＣＶ抗原に対する増殖反応は、対照を除く全ての群において誘導された。Ｅ１及びＥ２に対する増殖反応に関しては、群の中で統計的有意差は観察されなかった。しかしながら、任意の組合せでキメラＥｑ１抗原の投与を受けた全ての群（群１〜４）は、コアに対して、ＨＣＶ構造タンパク質の混合物（群５）によって誘導されるより有意に高い増殖反応を誘導した（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００５９】
図１７で示すように、ＩＦＮγ分泌反応は、増殖反応で観察されたそれと類似の挙動を有した。この場合には、ＨＣＶ構造タンパク質の混合物で免疫化した群（群５）は、コアに対して、キメラＥｑ１抗原単独（群１）及びＥｑ１とＨＣＶ構造タンパク質の混合物（群４）で免疫化した群で誘導されるより有意に低いＩＦＮγ分泌反応を有した（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００６０】
加えて、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、対照を除く全ての群は、特異的なウイルス血症（ｖｖＲＥで攻撃）を有意に抑制することができた（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）（図１８）。代用ウイルス攻撃モデルにおいて、ＨＣＶ構造抗原コア、Ｅ１及びＥ２の組換えタンパク質変異体を含む製剤と混合したキメラＥｑ１抗原の投与に基づくワクチン組成物は防御を得ることができるので、その結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能活性を持ち、ＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性と細胞性両方の特異的な免疫反応の増大を誘導できることが証明された。
【００６１】
（例６）マウスにおけるＨＣＶエピトープ及びＴヘルパーリンパ球に特異的な人工エピトープを含む様々なキメラ抗原の免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合したキメラＥｑ１抗原；群２、ミョウバン中に配合したキメラＮＳＥｑ２抗原；群３、ミョウバン中に配合したキメラＥｑＮＳｂ抗原；群４、ミョウバン中に配合したキメラＥｑＮＳ３抗原；群５、ミョウバン中に配合したキメラＥｑＰ１抗原；群６、ミョウバン（対照）。対応する群において、マウスは、組換えキメラ抗原２０μｇの投与を受けた。０、２及び４週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００６２】
０及び６週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、６週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を調査した。加えて、８週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで、及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した。
【００６３】
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応を、図１９〜２１に示す。評価した反応は、コア（アミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）、Ｅ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）及びＮＳ３（ＨＣＶポリタンパク質中のアミノ酸１１９２〜１４５７）タンパク質の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として利用して検出した。図１９で示すように、対照を除く全ての群において、特異的な抗体産生反応は、様々なキメラ抗原で免疫化した群の中で統計的有意差なしにＨＣＶ構造タンパク質に対して誘導された。ＨＣＶ  ＮＳ３の領域を含む群２、３及び４だけが、このウイルス抗原に対する抗体産生反応を誘導し、群２及び３に対し群４において有意に高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００６４】
図２０で示すように、対照を除く全ての群において、ＨＣＶ構造抗原に対する特異的な増殖反応が誘発された。この場合、コア及びＥ１抗原に対する増殖反応は、群１に対し群２、３及び５において有意に高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。Ｅ２に対する増殖反応に関しては、様々なキメラ抗原で免疫化した群の中で統計的有意差は検出されなかった。ＨＣＶ  ＮＳ３の領域を含む群２、３及び４だけが、このウイルス抗原に対する増殖反応を誘発し、群２及び３に対し群４において有意に高かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ及びニューマンコイルス多重比較検定）。
【００６５】
特異的なＩＦＮγ分泌反応の分析（図２１）から、対照を除く全ての群において、その中で統計的有意差がないＨＣＶ構造抗原に対する誘導が証明された。ＨＣＶ  ＮＳ３の領域を含む群２、３及び４だけが、その間で統計的有意差なしにこのウイルス抗原に対するＩＦＮγ分泌反応を誘導した。
【００６６】
加えて、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、対照を除く全ての群は、特異的なウイルス血症（ｖｖＲＥで攻撃）を有意に抑制することができた（ｐ＜０．０５、クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）（図２２）。結果から、Ｅｑ１配列中のエピトープ又はＨＣＶ  ＮＳ３の領域を挿入することにより、ＨＣＶ構造抗原に対して誘導される免疫反応に影響を及ぼすことなくこのウイルス抗原に特異的な免疫反応の誘導が可能になることが証明された。更に、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、Ｅｑ１タンパク質配列における人工エピトープＰ１Ｍ及びＰ２Ｂの包含は防御を得ることができるので、その包含により、これらの抗原若しくはＥ２に対して体液性又は細胞性の特異的な免疫反応を誘導する能力に影響を及ぼすことなく、またｉｎ  ｖｉｖｏで機能活性を保ちながら、コア及びＥ１抗原に対する増殖反応を有意に増大させることができる。
【００６７】
（例７）マウスにおけるキメラ抗原Ｅｑ１及びＥｑ１ｂの比較免疫原性試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、週齢８、体重１６〜１８ｇ、群当たり１７匹の動物を免疫化した。免疫化群は次の通りとした。群１、ミョウバン中に配合したキメラＥｑ１ｂ抗原；群２、ミョウバン中に配合したキメラＥｑ１抗原；群３、ミョウバン（対照）。対応する群において、マウスはキメラ抗原２０μｇの投与を受けた。０、２及び４週目に、筋肉注射により免疫化を実施した。
【００６８】
０及び６週目に採血を実施して、ＨＣＶ抗原に対する抗体産生反応を試験した。更に、６週目に群当たり５匹のマウスを屠殺して、特異的な細胞性反応を調査した。加えて、８週目に群当たり５匹の動物を、ＨＣＶ構造タンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥで、及び他の５匹の動物を対照ワクシニアウイルスＷＲで攻撃した。攻撃の５日後に、前述のとおりマウスを屠殺して、ウイルス価を卵巣において決定した。
【００６９】
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応を、図２３及び２４に示す。評価した反応は、コア（アミノ酸１〜１２０）、Ｅ１（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３４０）及びＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６８０）タンパク質の組換え変異体をＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原、又は細胞性免疫反応を決定するアッセイにおける刺激用の抗原として利用して検出した。上の図で示すように、対照ではなくタンパク質で免疫化した群において、ＨＣＶ構造抗原に特異的な抗体及び増殖反応が、組換えタンパク質で免疫化した群間での統計的有意差なしに誘導された。
【００７０】
他方で、代用ウイルス攻撃モデルにおいて、対照ではなくキメラ抗原で免疫化した群は、組換えタンパク質で免疫化した群間で差異なしに特異的なウイルス血症（ｖｖＲＥで攻撃）を有意に抑制することができた（ｐ＜０．０５；クラスカルワリス及びダンの多重比較検定）（図２５）。
【図１Ａ】
0006259831.tif 000002
【図１Ｂ】
0006259831.tif 000003
【図１Ｃ】
0006259831.tif 000004
【図１Ｄ】
0006259831.tif 000005
【図１Ｅ】
0006259831.tif 000006
【図１Ｆ】
0006259831.tif 000007
【図１Ｇ】
0006259831.tif 000008
【図１Ｈ】
0006259831.tif 000009
【図２Ａ】
0006259831.tif 000010
【図２Ｂ】
0006259831.tif 000011
【図２Ｃ】
0006259831.tif 000012
【図２Ｄ】
0006259831.tif 000013
【図２Ｅ】
0006259831.tif 000014
【図２Ｆ】
0006259831.tif 000015
【図２Ｇ】
0006259831.tif 000016
【図２Ｈ】
0006259831.tif 000017
【図３】
0006259831.tif 000018
【図４】
0006259831.tif 000019
【図５】
0006259831.tif 000020
【図６】
0006259831.tif 000021
【図７】
0006259831.tif 000022
【図８】
0006259831.tif 000023
【図９】
0006259831.tif 000024
【図１０】
0006259831.tif 000025
【図１１】
0006259831.tif 000026
【図１２】
0006259831.tif 000027
【図１３】
0006259831.tif 000028
【図１４】
0006259831.tif 000029
【図１５】
0006259831.tif 000030
【図１６】
0006259831.tif 000031
【図１７】
0006259831.tif 000032
【図１８】
0006259831.tif 000033
【図１９】
0006259831.tif 000034
【図２０】
0006259831.tif 000035
【図２１】
0006259831.tif 000036
【図２２】
0006259831.tif 000037
【図２３】
0006259831.tif 000038
【図２４】
0006259831.tif 000039
【図２５】
0006259831.tif 000040
【配列表】
0006259831000001.app