(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を支持体に固定化するための方法であって、
ａ）下記の化合物またはその塩を用意する：
親水性ドメインに結合した１以上の疎水性ドメインを含みまたはそれらからなり、
該１以上の疎水性ドメインは該親水性ドメインに共有結合しており、
該１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む
化合物であって、該化合物は連結基を含む；そして、
該親水性ドメインは式（Ｉ）の化合物を含み：
Ｘ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１−Ｚ−［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２  （Ｉ）
｛式中：
Ｚは、１〜１００、１〜５０、または４〜３０の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分を含む線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、ここで、該ポリエチレングリコール部分は２つの−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分を連結する１以上のスペーサー部分ＳＰを含んでもよく、そして該線状ＰＥＧ部分は一端または両端にリンカー部分Ｌ３を含んでもよく、
各Ｌ１は、互いに独立して選択されるリンカー部分であり、
各ｎは、０または１のいずれかであり、互いに独立して選択され、
Ａ１およびＡ２は、互いに独立して選択される２官能性または３官能性の部分であり、
ただし、少なくとも１つのＡ１またはＡ２は３官能性であり、
ｋ１およびｋ２は、０〜１０の整数であり、互いに独立して選択される、ただし、ｋ１およびｋ２のうち少なくとも１つは０ではなく、
Ｘ１およびＸ２は、独立して水素または保護基から選択され、
Ｌ３は、独立して、１〜１０個のＣ原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは（ｉ）１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子により中断されていてもよく、および／または（ｉｉ）１〜４個のヒドロキシル、カルボニル、アミノまたはチオール基により置換されていてもよい｝、
該１以上の疎水性ドメインは、該親水性ドメインに３官能性ドメインを介して共有結合し、
ｂ）該化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞を該化合物と接触させ、それにより該連結基を該細胞の表面に固定化する；そして
ｃ）細胞に固定化された該連結基を、該連結基を結合できる支持体と接触させ、それにより該細胞を支持体に固定化する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
式（Ｉ）中のＺは、下記の構造：
−（Ｌ３）ｎ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−（ＳＰ）ｎ１］ｍ−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ１−（Ｌ３）ｎ２
｛式中：
ＳＰは、スペーサー部分であり、
各スペーサー部分ＳＰは互いに独立して選択され、
各ｎ１は、０または１のいずれかであり、ｍ個の部分それぞれについて独立して選択され、
各ｎ２は、０または１のいずれかであり、互いに独立して選択され、
ｍは、１から１００、１から５０、または４から３０の整数であり、
ｙは、１から１００、１から５０、または４から３０の整数であり、
ｙ１は、０から３０、０から１０、または０から４の整数であり、
ただし、ｙ＊ｍ＋ｙ１≦１００であり、
Ｌ３は、独立して、１〜１０個のＣ原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは（ｉ）１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子により中断されていてもよく、および／または（ｉｉ）１〜４個のヒドロキシル、カルボニルまたはチオール基により置換されていてもよい｝
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ｎ１はｍ個の部分−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−（ＳＰ）ｎ１］−について同一である、および／または
（ｂ）ｙ１は０である、および／または
（ｃ）ｙは４、５または６であり、ｎ１は１である、または
（ｄ）ｙは４、５または６であり、ｎ１は１である、および／または
（ｅ）スペーサー部分ＳＰは、互いに独立して、ホスフェートおよび２官能性部分からなる群から選択される、および／または
（ｆ）ｎ２は両方とも０である、または
（ｇ）一方または両方のｎ２＝１であり、Ｌ３は１〜１０個のＣ原子をもつアルキル基であり、それはアミド基、カルボニル基、カルバメートおよび／またはＮＨ基を含んでもよい、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）Ｘ１またはＸ２は疎水性ドメインにより置き換えられている、および／または
（ｂ）連結基はビオチンである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記線状脂質は、
（ａ）飽和または不飽和脂肪酸である、および／または
（ｂ）８から２６個のＣ原子または１２から２２個のＣ原子を有する脂肪酸であり、または
（ｃ）オレイン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸およびベヘン酸からなる群から選択される、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）前記ステロイドはステロールである、または
（ｂ）前記ステロイドは、コレステロール；ステロイドホルモン、アンドロゲン、同化ステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、テストステロン、エストロゲン、エストラジオール、エストリオール、またはエストロン；黄体ホルモン物質、プロゲステロン、プロゲスチン、コルチコステロイド、グルココルチコイド、またはミネラルコルチコイド；エクジステロイド、またはエクジステロン；フィトステロール；ブラシノステロイド；ホパノイド；およびエルゴステロールからなる群から選択され、または
（ｃ）前記疎水性ビタミンはα−トコフェロールである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）１、２、３または４つの疎水性ドメインが親水性ドメインに共有結合しており、および／または
（ｂ）親水性ドメインに共有結合している２以上の疎水性ドメインが異なるかまたは同一である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記疎水性ドメインは
（ａ）線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンからなる、または
（ｂ）３官能性部分Ａ１にリンカー部分Ｌ２を介して共有結合した線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、該Ｌ２は下記のものを含み、またはそれからなる：ホスフェート基、部分
−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］−
｛式中：
ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、ｙ２は１から３０または３から１０の整数であり、ｍ１は１から１０の整数である｝、グリセロール部分、カルバメート基、アミド基、１〜１０個のＣ原子を有する線状アルキル基：そのアルキル鎖は末端Ｃ原子に官能基を含み、それは１、２、３、４または５つの部分Ｒ１により置換されていてもよく、ここで、Ｒ１は独立してＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ４アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ４シアノアルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノまたはカルボニル部分である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ２は、ホスフェート、アミド、カルバメート、エステル基、および部分
−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］ｍ１−
｛式中：
ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、
ｙ２は、１から３０または３から１０の整数であり、
ｍ１は、１から１０または１から３の整数である｝
からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンは、リンカー部分テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）またはホスフェートを介して３官能性部分Ａ１に結合している、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）ｋ１は、１、２、３、４または５である、および／または
（ｂ）前記疎水性ドメインは、３官能性部分Ａ１のみを介して親水性ドメインに共有結合している、および／または
（ｃ）ｋ２は、１、２、３、４、５または６である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）化合物はさらに標識部分を含み、および／または
１以上の部分Ａ２は標識部分であり、および／または
（ｂ）連結基は３官能性部分Ａ２を介して共有結合している、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）リンカーＬ１は、独立してホスフェート、アミド、カルバメートおよびエステル基からなる群から選択される、および／または
（ｂ）部分Ａ１およびＡ２は、独立して、下記のものから選択される：ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、ｄＴ、および１〜１０個のＣ原子を有する線状アルキル基であって末端Ｃ−原子に官能基を含むアルキル鎖からなる群から選択される２官能性基；ならびに１〜１０個のＣ原子を有し、少なくとも１つの−ＯＨ、−ＳＨ、および／または少なくとも１つの−ＮＨ２基を含む３官能性部分、および／または
（ｃ）リンカーＬ２は、独立してホスフェート、アミド、カルバメート、エステル基、
および部分
−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］ｍ１−
｛式中：
ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、
ｙ２は、１から３０の整数であり、
ｍ１は、１から１０の整数である｝
からなる群から選択される、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物またはその塩の１種類以上を含む組成物を用意する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
目的細胞を含む細胞集団を支持体に固定化する方法であって、
ａ）請求項１〜１３のいずれか１項において定義される化合物を用意する；
ｂ）該化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞集団を該化合物と接触させ、それにより該細胞の表面に連結基を固定化する；
ｃ）細胞に固定化された該連結基を、該連結基を結合できる支持体と接触させ、それにより該細胞を該支持体に固定化し、そして該支持体に固定化された目的細胞を所望により検出する
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記細胞が懸濁状態の細胞であり、および／または該細胞が動物もしくはヒトの細胞、脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を支持体に固定化するための方法に関するものであって、その方法は、ａ）化合物またはその塩を用意する、該化合物またはその塩は親水性ドメインに結合した１以上の疎水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、１以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、連結基を含む；ｂ）化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその化合物と接触させ、それにより連結基を細胞の表面に固定化する；そしてｃ）細胞に固定化された連結基を、連結基が結合できる支持体と接触させ、それにより細胞を支持体に固定化することを含む。
【発明の概要】
【０００２】
US2005/0208644A1では、細胞を固定化するために２種類の化合物を使用する系を用いている。そこに開示されるのは、細胞に対する親和性をもつ化学物質の使用により細胞を希望するパターンで固相表面に固定化するための方法である。より容易に固相表面に固定化されるもうひとつの第２化学物質の使用によって、第１化合物は第２化合物に結合する。第１化学物質は、膜に対する生体適合性アンカー(biocompatible anchor for membrane)（ＢＡＭ）であると記載されている。このアンカーは脂肪族基をもち、それが細胞膜に挿入されるのに伴なって結合し、細胞に損傷を与えることなく非共有結合により固定化できる。Kato K. et al., Biotechnol. Prog. 2004, 20, 897-904には、いわゆるＢＡＭ類（ＢＡＭ９０：１つのオレイル鎖；ＤＯＰＥ−ＢＡＭ８０：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）が、高い水溶性、タンパク質を細胞膜の外葉(outside leaflet)に迅速にアンカリングする能力、細胞膜における高い保持率、および細胞溶解活性の欠如の結果として、タンパク質を細胞膜にアンカリングする試薬として有用であり、これはこのアンカリング技術が細胞表面工学に有望であることを示唆すると記載されている。”Kato K. Et al. BioTechniques 2003 35:1014-1021には、生体適合性アンカー分子、すなわちオレイル−Ｏ−オイル（エチレングリコール）−スクシニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−エステルによる懸濁細胞付着が記載されている。
【０００３】
しかし、先行技術の化合物は幾つかの欠点をもつ。そのような化合物を用いる細胞固定化は定量的ではなく、細胞タイプ−非依存性でもない。また、種々の細胞タイプの混合物、たとえば血液試料において自然に生じるものを、定量的にかつ細胞表現型に依存せずに表面に付着させることはできない。さらに、表面への細胞の結合は後続処理工程、たとえば免疫化学的染色および洗浄に十分なほど堅牢ではない。現状水準の技術の他の欠点は、記載されたリンカー分子が細胞によりインターナリゼーションされるかまたは細胞により拒絶されて、最終的に細胞の解離および／または喪失を生じる可能性があることである。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、生存性に影響を及ぼすことなく細胞を固定化するための新規方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の方法はこの課題を解決し、先行技術の欠点を克服する。ＰＥＧ−ベースの化合物を用いる本発明方法によれば、懸濁細胞および接着性細胞を含めて、すべてのタイプの細胞を捕獲することができる。
【０００６】
１態様において、本発明は、細胞を支持体に固定化するための方法に関するものであって、その方法は、
ａ）下記の化合物またはその塩を用意する：
親水性ドメインに結合した１以上の疎水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、
１以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、
１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む
化合物であって、連結基を含む化合物；
ｂ）化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞をその化合物と接触させ、それにより連結基を細胞の表面に固定化する；そして
ｃ）細胞に固定化された連結基を、その連結基を結合できる支持体と接触させ、それにより細胞を支持体に固定化する
ことを含む。
【０００７】
意外にも、細胞を支持体に固定化する前に細胞を前記に定めた化合物で処理した場合、そのような化合物を表面に固定化した後にそれに細胞を固定化するのと比較して細胞の固定化はより効果的であることが見出された（たとえば、実施例３〜５を参照）。
【０００８】
本発明の方法は細胞を支持体に固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１：実施例６の実験に用いたプレート：ストレプトアビジン処理ＭＴＰ（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ），１２ウェル，ＮＵＮＣ，ＭＣ  ＩＤ：６０４  １７６，ロット番号：１６６５  Ｃ２。
【図２】図２：実施例６の実験のデザインを示す。４×判定。横列Ａ：２００μｌのＰＢＳを導入し、１ｎｍｏｌの化合物をそれにそれぞれ添加し、混合し、約３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、８００μｌのＰＢＳを導入し、３００．０００のＷＢＣ（非処理）を添加した。横列Ｂ：８００μｌのＰＢＳを導入し、３００．０００のＷＢＣ（非処理）を添加した。横列Ｃ：１ｍｌ中１０×１０＾６のＷＢＣを１０ｎｍｏｌの本発明化合物と共に１０分間インキュベートし、８００μｌのＰＢＳ／ウェルを導入し、３００．０００の処理済みＷＢＣをそれぞれ添加した。第１  ＭＴＰプレートを３０分後にＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔを積層し、１５分間インキュベートした。＞  Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ（Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｓ９ｓ５）測定した。第２プレートを９０分後に測定した。第３プレートを１５０分後に測定した。
【図３】図３：３０、９０または１２０分間のインキュベーション後の実施例６の結果を示す。
【図４】図４：３０、９０または１２０分間のインキュベーション後の実施例６の結果をグラフとして示す。
【図５】図５：３０、９０または１５０分間のインキュベーション後の実施例６のプレートを示す。
【図６−１】図６：Ａ：本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造。Ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成および合成副産物。
【図６−２】図６：Ａ：本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造。Ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成および合成副産物。
【図６−３】図６：Ａ：本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造。Ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成および合成副産物。
【図６−４】図６：Ａ：本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造。Ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成および合成副産物。
【図６−５】図６：Ａ：本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造。Ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成および合成副産物。
【図７−１】図７：Ａ）社内参照番号２９．８９１１８０をもつコレステリル含有化合物、Ｂ）社内参照番号２９．８９１１８０をもつミリスチン酸含有化合物による、細胞の染色を示す。Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８の染色。Ｄ）およびＥ）：模式的に示す本発明方法に有用な異なる化合物による異なる曝露時間の細胞染色。実施例３による例示的写真。
【図７−２】図７：Ａ）社内参照番号２９．８９１１８０をもつコレステリル含有化合物、Ｂ）社内参照番号２９．８９１１８０をもつミリスチン酸含有化合物による、細胞の染色を示す。Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８の染色。Ｄ）およびＥ）：模式的に示す本発明方法に有用な異なる化合物による異なる曝露時間の細胞染色。実施例３による例示的写真。
【図８−１】図８：Ａ）およびＢ）は、実施例３によるジャーカット細胞(Jurkat cell)を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ実験の結果を示す。Ｂ）：１：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー；２：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；３：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；４：ＰＢＳ  ｗ／ｏ(含まない)  ビオチンリンカー；５：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；６：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；７：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー  ｗ／ｏ  ＳＡ；８：ＰＢＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー  ｗ／ｏ  ＳＡ。
【図８−２】図８：Ａ）およびＢ）は、実施例３によるジャーカット細胞(Jurkat cell)を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ実験の結果を示す。Ｂ）：１：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー；２：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；３：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；４：ＰＢＳ  ｗ／ｏ(含まない)  ビオチンリンカー；５：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；６：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；７：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー  ｗ／ｏ  ＳＡ；８：ＰＢＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー  ｗ／ｏ  ＳＡ。
【図９−１】図９：実施例３によるＷＢＣ細胞を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ実験の結果を示す。Ｂ）：１：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー；２：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；３：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；４：ＰＢＳ  ｗ／ｏ(含まない)  ビオチンリンカー；５：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；６：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー。
【図９−２】図９：実施例３によるＷＢＣ細胞を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ実験の結果を示す。Ｂ）：１：ＰＢＳ＋ビオチンリンカー；２：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；３：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ＋ビオチンリンカー；４：ＰＢＳ  ｗ／ｏ(含まない)  ビオチンリンカー；５：ＰＢＳ＋１０％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー；６：ＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ  ｗ／ｏ  ビオチンリンカー。
【図１０】図１０：実施例３による固定化細胞の染色を示す。左縦列：ＤＡ−ＭＢ４６８−抗体：Ｋ５／８。中縦列：ＭＤＡ−ＭＢ４６８−抗体：ＥｐＣＡＭ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＦＩＴＣ。右縦列：ＭＤＡ−ＭＢ４６８−抗体：ＥＧＦＲ。
【図１１】図１１：実施例３による固定化細胞の染色を示す。左縦列：ＭＤＡ−ＭＢ４６８−抗体：ＥｐＣＡＭ  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ。中縦列：ＭＤＡ−ＭＢ４６８−抗体：ＥｐＣＡＭ  Ｍｉｌｔｅｎｙｓ  ＡＰＣ。右縦列：ＷＢＣ−抗体：ＣＤ４５  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ。
【図１２−１】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１２−２】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１２−３】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１２−４】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１２−５】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１２−６】図１２：本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を示す。
【図１３】図１３：異なる分子を用いた遠心分離および細胞固定化の後のＷＢＣ回収率を示す。分子プローブＨＨ１７４９＊、ＨＨ１７５０＊およびＨＨ１７５５＊（＊  ビオチン−ＰＥＧ−リジン−（Ｃ１８）２）は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す：分子の濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率はより高い。遠心分離特性：１０分，３００×ｇ。
【図１４】図１４：異なる分子を用いた遠心分離および細胞固定化の後のＷＢＣ回収率を示す。分子プローブＨＨ１７４９＊、ＨＨ１７５０＊およびＨＨ１７５５＊は異なる濃度で細胞固定化率に関して異なる性能を示す：リンカー濃度が高いほど、細胞固定化率はより高い。
【図１５】図１５：本発明方法に有用な異なる化合物を用いた異なる時点での遠心分離後のＷＢＣ回収率を示す。分子ＡおよびＢ（Ａ：コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ；Ｂ：ビオチン−ＰＥＧ−リジン−（Ｃ１８）２）は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す。それぞれの左カラム：本発明化合物を含まない；それぞれ左から２つ目のカラム：０，３５ｎｍｏｌの分子Ａ；それぞれ左から３つ目のカラム：１００ｎｍｏｌの分子Ｂ；それぞれの右カラム：０，５ｎｍｏｌの分子Ｂ。分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率はより高い。分子Ｂは３．５時間以内は細胞を固定化できる。遠心分離特性：１０分，３００×ｇ。
【図１６】図１６：異なる実験者による遠心分離後のＷＢＣ回収率を示す。各アッセイの左、中および右カラムはそれぞれ異なる実験者１、２および３を表わす。分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率はより高い。さらに、細胞安定化は実験者とは無関係である。遠心分離特性：１０分，３００×ｇ。分子：コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ。
【図１７】図１７：異なる時点および遠心分離設定における遠心分離後のＷＢＣ回収率を示す。下記の分子を試験した：１２３４：５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’；１２４８：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２５４：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２５５：３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ。すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる。ＰＢＳ中のＷＢＣは３００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける。分子１２３４は最良の性能を示し、化合物１２５５および１２５４がそれに続く。遠心分離特性：２０分，３００×ｇ。それぞれの左カラム：分子と共に１０分間のインキュベーション。それぞれの中カラム：分子と共に１時間  分間のインキュベーション。それぞれの右カラム：分子と共に２時間のインキュベーション。
【図１８】図１８：異なる時点および遠心分離設定における遠心分離後のＷＢＣ回収率を示す。下記の分子を試験した：１２５５：３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２３４：５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’；１２４８：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２５４：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ。すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる。ＰＢＳ中のＷＢＣは５００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける。分子１２３４は最良の性能を示し、化合物１２５５および１２５４がそれに続く。遠心分離特性：２０分，５００×ｇ。それぞれの左カラム：分子と共に１０分間のインキュベーション。それぞれの中カラム：分子と共に１時間  分間のインキュベーション。それぞれの右カラム：分子と共に３時間のインキュベーション。
【図１９】図１９：異なる時点および遠心分離設定における遠心分離後のＷＢＣ回収率を示す。下記の分子を試験した：１２５５：３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２３４：５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’；１２４８：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２５４：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ。すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる。ＰＢＳ中のＷＢＣは１０００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける。遠心分離特性：２０分，１０００×ｇ。それぞれの左カラム：分子と共に１０分間のインキュベーション。それぞれの中カラム：分子と共に１時間  分間のインキュベーション。それぞれの右カラム：分子と共に２時間のインキュベーション。
【図２０】図２０：異なる時点での遠心分離後のジャーカット細胞回収率を示す。それぞれのカラムは左から：１：分子と共に１０分間のインキュベーション。２：分子と共に１時間のインキュベーション。３：分子と共に３，５時間のインキュベーション。４：分子と共に５，５時間  分間のインキュベーション。下記の分子を試験した：１２５５：３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ．１２３４：５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’；１２４８：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ；１２５４：３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ。ジャーカット培養細胞は、ＰＢＳ中、および異なる分子を用いた遠心分離プロセスに際して５．５時間以内は安定である。遠心分離特性：２０分間，５００×ｇ。
【図２１−１】図２１：３官能性リンカー部分が細胞生存性に影響を及ぼさないことを示す。３官能性リンカー部分が異なる、本発明方法に有用な異なる化合物を用いて、ＷＳＴ−１増殖キット（ＲＡＳ）を用いる細胞生存性試験を実施した。これらの異なるリンカーは４時間のリンカーインキュベーション時間中、細胞生存性に影響を及ぼさないと思われる。Ａ）２時間後およびＢ）４時間後の生存性試験。
【図２１−２】図２１：３官能性リンカー部分が細胞生存性に影響を及ぼさないことを示す。３官能性リンカー部分が異なる、本発明方法に有用な異なる化合物を用いて、ＷＳＴ−１増殖キット（ＲＡＳ）を用いる細胞生存性試験を実施した。これらの異なるリンカーは４時間のリンカーインキュベーション時間中、細胞生存性に影響を及ぼさないと思われる。Ａ）２時間後およびＢ）４時間後の生存性試験。
【図２２−１】図２２：３官能性リンカー部分が細胞生存性に影響を及ぼさないことを示す。本発明方法に有用な被験化合物、すなわちＡ）：コレステロール部分を含む化合物としてのＮｏ．１２４４、およびＢ）：ステアリン酸部分を含む化合物としての１２７４は、４．５時間のリンカーインキュベーション時間中、細胞形態に影響を及ぼさないことが分かった。左の写真：１時間のインキュベーション。中の写真：２，５時間のインキュベーション。右の写真：４，５時間のインキュベーション。上の写真：明視野。下の写真：ＤＡＰＩ。
【図２２−２】図２２：３官能性リンカー部分が細胞生存性に影響を及ぼさないことを示す。本発明方法に有用な被験化合物、すなわちＡ）：コレステロール部分を含む化合物としてのＮｏ．１２４４、およびＢ）：ステアリン酸部分を含む化合物としての１２７４は、４．５時間のリンカーインキュベーション時間中、細胞形態に影響を及ぼさないことが分かった。左の写真：１時間のインキュベーション。中の写真：２，５時間のインキュベーション。右の写真：４，５時間のインキュベーション。上の写真：明視野。下の写真：ＤＡＰＩ。
【図２３】図２３：リンカーインキュベーションを行なわない場合の異なる時点での細胞形態を示す。本発明方法に有用な分子を添加しない場合、細胞は４．５時間のインキュベーション時間中に離散する。左の細胞ではインキュベーション時間中に細胞形態が影響を受けていない。左の写真：１時間のインキュベーション。中の写真：２，５時間のインキュベーション。右の写真：４，５時間のインキュベーション。上の写真：明視野。下の写真：ＤＡＰＩ。
【図２４】図２４：異なる時点での遠心分離後のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞回収率を示す。それぞれのカラムは左から：１：分子と共に１０分間のインキュベーション。２：分子と共に１時間のインキュベーション。３：分子と共に３時間のインキュベーション。４：分子と共に５時間  分間のインキュベーション。本発明方法に有用な下記の化合物を試験した：１２３４：５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’；１２５５：３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ。ＭＤＡ−ＭＢ４６８培養細胞は、ＰＢＳ中、および本発明方法に有用な異なる化合物を用いた遠心分離プロセスに際して、５時間以内は安定である。遠心分離特性：２０分間，５００×ｇ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
用語“支持体”または“表面”は、液相中の試薬と不均一反応により相互作用する材料を表わす。好ましくは、支持体は固体支持体である。
用語“固体支持体”は、液相中の試薬と不均一反応により相互作用する固相材料を表わす。固体支持体の使用は化学、生化学、医薬および分子生物学の分野で周知である。解決すべき技術的課題に応じて多数のタイプの固体支持体が開発されている。本発明に関してこれらのいずれかを使用できる。たとえば、本発明方法に使用する固体支持体は、シリカ、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、もしくはポリフッ化ビニリデン、またはその組合わせの成分を含むことができる。さらなる適切な固体支持体にはコントロールドポアガラス、ガラスプレートまたはスライドガラス、ポリスチレン、および活性デキストランが含まれるが、これらに限定されない。他の観点において、合成有機ポリマー、たとえばポリアクリルアミド、ポリメタクリレートおよびポリスチレンも例示的な支持体表面である。さらに、多糖類、たとえばセルロースおよびデキストランは支持体表面のさらなる例示である。他の支持体表面、たとえば繊維も作動可能である。
【００１１】
固体支持体を容器に収容することができ、その際、容器はチューブ、たとえば遠心チューブもしくはスピンチューブ、注射器、カートリッジ、チャンバー、マルチウェルプレート、もしくは試験管、またはその組合わせである。細胞の固定化を可能にするために、固体支持体を前処理または官能化することができる。たとえば、実施例に示すように、ウェル−プレートをストレプトアビジンで前処理することができる。１態様において、通常は適切な接触が可能になるように固体支持体は繊維状または粒状であってもよい。使用するのに適した固体支持体のサイズは変更できる。細胞を１つの固体支持体（たとえば、１つの容器またはマルチウェルプレート）のみに結合させることができ、あるいは多数の固体支持体（たとえば、ビーズ）に結合させることができる。使用するのに適した固体支持体の形状は、たとえばシート、プレカットしたディスク、シリンダー、単繊維、または粒状物から構成される固体支持体であってもよい。好ましい１態様において、固体支持体は平坦であり、あるいは実質的に平坦であってキャビティーを備えている。１態様において、固体支持体は繊維状または粒状であってもよい。固体支持体のサイズは変更でき、実施すべき方法または適用に応じて選択できる。
【００１２】
ある態様において、固相は試験片、チップ、特にマイクロアレイチップもしくはナノアレイチップ、マイクロタイター-プレート、またはマイクロ粒子である。
本発明方法に使用できる化合物の細胞固定化の基本原理は、本発明方法に使用できる化合物の末端疎水性部分が目的細胞膜の脂質二重層内へ固着(anchor)することであると仮定される。次いで細胞を、たとえばその後、特異的に修飾された表面に付着させ、所望により視覚化および／または検出のために標識することができる。疎水性部分に応じて、特定の細胞への優先的または排他的な結合を達成することもできる。
【００１３】
さらに、固定化方法には、実施例に詳細に示すように、細胞に対する有利な安定化効果をさらに示す化合物を用いる。これは、固定化された細胞の細胞生存性および／または細胞生理が目的かつ重要である場合に特に重要である。
【００１４】
特に、疎水性部分としてコレステロール部分を含む化合物が殊に好ましい。
安定化効果、特に剪断保護効果は、特に本発明方法に使用できる化合物の疎水性部分としてのコレステロール、ミリスチン酸およびステアリン酸について証明される（参照：実施例５）。
【００１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分は、少なくとも１つの−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分、好ましく１〜５０、より好ましくは４〜３０の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分を含む、線状または分岐状、好ましくは線状の部分であると理解される。
【００１６】
安定化−固定化を得るのに加えて−の基本原理は、結合分子の末端疎水性部分が細胞膜の脂質二重層内へ固着することであると仮定される。この疎水性分子の固定化により原形質膜流動性が低減し、したがって細胞が安定化される。
【００１７】
本発明方法に使用する化合物は連結基を含む。
連結基は、化合物を表面または支持体、特に固体支持体に可逆的もしくは不可逆的に、および／または共有結合もしくは非共有結合により固定化するのに適した部分である。好ましい態様において、連結基は抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメント、受容体もしくはその結合部位、受容体に対するリガンド、酵素もしくはその結合部位、酵素に対する基質、タグ結合部位、タグ、または官能基である。
【００１８】
官能基はたとえばチオール基であってもよく、それを金コートした基材表面に共有結合性の不可逆的な-Ｓ−Ｓ−結合の形成により結合させることができる。
ストレプトアビジンへのビオチンの結合、または抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメントの結合は、非共有結合性かつ可逆的である。固体支持体への非共有結合を用いるそのような連結基は、細胞をさらに使用するために、たとえば動物モデルに投与するために、再び離脱させることを意図する場合に好ましい。
【００１９】
好ましい態様において、連結基は、たとえばストレプトアビジンコートした表面または支持体に非共有結合できるビオチン部分、または固体支持体としての金コートした基材表面に結合できるチオール基であってもよい。
【００２０】
本発明による特に好ましい連結基はビオチンである。実施例に示すように、連結基としてビオチンを含む化合物は細胞を固定化するために特に有用であることが見出された。
脂質は、脂肪、ろう、ステロール、脂溶性疎水性ビタミン、たとえばビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ、脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ならびにリン脂質から選択される疎水性小分子である。
【００２１】
疎水性ビタミンは、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫからなる群から選択される小分子である。より好ましい態様において、疎水性ビタミンはα−トコフェロールである。
本発明方法に使用できる化合物は、１以上の疎水性ドメイン、親水性ドメイン、および連結基を含み、好ましくはそれらからなる。
【００２２】
好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の疎水性ドメインが親水性ドメインに共有結合している。
実施例に示すように、本発明方法に使用する化合物を細胞と接触させる。固定化は好ましくは生細胞または生存可能性のある細胞について行なわれるので、細胞は一般に、好ましくは緩衝化されたおよび／または栄養素を含有する水溶液中に存在し、たとえば細胞はＰＢＳまたは培地に懸濁されている。本発明方法に使用する化合物を、たとえば溶液の形で、たとえば水溶液として、ピペッティングなど当技術分野で既知の方法により細胞に添加することができる。
【００２３】
一般に、化合物をたとえば水溶液の形で目的とする細胞懸濁液に添加する。一般に、細胞の生存性を維持するために、混合は穏やかに行なわれる。
一般に、接触は約１℃〜４５℃、好ましくは１０℃〜３０℃、より好ましくは２２℃〜３８℃の温度で行なわれる。好ましくは、細胞の生存性に影響を及ぼさない温度が選択される。
【００２４】
同様に、細胞生存性を維持するために、接触は一般に約９００〜１１００ｍｂａｒの圧力で行なわれる。
同様に、細胞を化合物と共に、結合させるのに十分な時間、インキュベートすることが好ましい。一般に、細胞を化合物と共に、１分〜３日間、好ましくは５分〜２４時間、よりいっそう好ましくは１０分〜８時間、インキュベートすることが好ましい。
【００２５】
さらに、水溶液は一般に細胞の統合性および／または生存性に影響を及ぼさないように選択される。
そのような条件により化合物は細胞の膜と相互作用することができる。それにより、連結基が細胞に固定化される。
【００２６】
本発明方法の工程ｃ）は、細胞に固定化された連結基を、連結基を結合できる支持体と接触させ、それにより細胞を支持体に固定化することに関する。そのような接触は、工程ｂ）で得られた細胞を適切な支持体に添加することにより、たとえば工程ｂ）で得られた細胞を適切な支持体にピペッティングすることにより実施できる。この態様において、工程ｂ）の細胞と支持体は工程ｃ）以前には空間的に分離されている。たとえば、本明細書に開示するビオチン部分を含む化合物を細胞に固定化することができる。インキュベーション後に、それにより得られた細胞を、ストレプトアビジンでコートされたアレイまたはウェル−プレートへピペッティングその他の方式で移すことができる。ビオチン部分とストレプトアビジン部分は結合し、それにより細胞は表面に固定化される。
【００２７】
あるいは、工程ｂ）で得られた細胞は支持体から空間的に分離されてはいない。そのような態様において、細胞は既にたとえばウェル−プレート内にあり、連結基を含む本発明方法に使用できる化合物が懸濁状態の細胞に添加されるか、あるいは連結基を含む本発明方法に使用できる化合物がたとえばウェル内に存在し、適切な緩衝液に懸濁された細胞がそれに添加される。この態様において、連結基は特定の条件下でのみ結合できる部分であり、それにより分子スイッチとなる。たとえば、連結基は、補因子もしくは反応体を添加した場合にのみ連結基を結合できる支持体と反応する官能基であるか、あるいは結合のために補因子を必要とするバイオアファイン（生物親和性）(bioaffine)結合対のメンバーであってもよく、それにより細胞を支持体に固定化する。
【００２８】
好ましくは、化合物を工程ｂ）で、支持体または表面から空間的に分離されている細胞と接触させる。実施例に示すように、ビオチンとストレプトアビジンを結合対として使用できる。実施例においては、ビオチンを化合物の連結基として用い、この連結基を結合できる支持体はストレプトアビジンでコートされた支持体である。
【００２９】
連結基を結合できる支持体は、チオール基と反応できる金表面の場合のように支持体自体が連結基を結合できるならば処理されていない支持体であるか、あるいは適切な結合対のメンバーまたは連結基と反応する官能基を含むように前処理できる支持体である。前処理の性質は、支持体および連結基を結合するために支持体に付着させる部分の化学的性質に依存する。好ましい態様において、連結基を結合できる支持体は、前処理され、バイオアファイン結合対の一方のメンバーを含む；特に、支持体は、それに結合した、好ましくはそれに共有結合した、抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメント、受容体もしくはその結合部位、受容体に対するリガンド、酵素もしくはその結合部位、酵素に対する基質、タグ結合部位、タグ、または官能基を含む。
【００３０】
連結基を結合できる支持体を得るために、前処理された支持体上の部分を連結基に対応して選択することは理解される。
好ましい態様において、本発明は、化合物が下記の化合物またはその塩である本発明方法に関する：
１以上の疎水性ドメインおよび親水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、
１以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、
１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、
親水性ドメインは式（Ｉ）の化合物を含み：
Ｘ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１−Ｚ−［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２  （Ｉ）
｛式中：
Ｚは、１〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは４〜３０の−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分を含む線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、その際、ポリエチレングリコール部分は２つの−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−部分を連結する１以上のスペーサー部分ＳＰを含んでもよく、線状ＰＥＧ部分は一端または両端にリンカー部分Ｌ３を含んでもよく、
各Ｌ１は、互いに独立して選択されるリンカー部分であり、
各ｎは、０または１のいずれかであり、互いに独立して選択され、
Ａ１およびＡ２は、互いに独立して選択される２官能性または３官能性の部分であり、ただし、少なくとも１つのＡ１またはＡ２は３官能性であり、
ｋ１およびｋ２は、０〜１０の整数であり、互いに独立して選択され、ただし、ｋ１およびｋ２のうち少なくとも１つは０ではなく、
Ｘ１およびＸ２は、独立して水素または保護基から選択され、
Ｌ３は、独立して、１〜１０個のＣ原子を含む線状アルキルまたはアルケニル鎖から選択され、それは（ｉ）１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子により中断されていてもよく、および／または（ｉｉ）１〜４個のヒドロキシル、カルボニル、アミノまたはチオール基により置換されていてもよい｝、
１以上の疎水性ドメインは、親水性ドメインに３官能性ドメインを介して共有結合しており、
化合物はさらに連結基を含む。
【００３１】
安定化効果を得るためには、本発明方法に使用する化合物は２または３以上、より好ましくは２または３つの疎水性ドメインを含むのが有利であることが見出された。特に有利には、特定の態様において、少なくとも１つの脂質疎水性ドメインがステロイドを含む。
【００３２】
本発明の好ましい１態様において、２または３以上、より好ましくは２または３つの疎水性部分である疎水性ドメインが、親水性ドメインに共有結合している。
本明細書における一般的理解のために、“疎水性部分”は“疎水性ドメイン”に含まれ、それの主要部を形成し、よってその疎水性を決定する。
【００３３】
２以上の疎水性部分を含む化合物についての疎水性部分は同一であってもよく、あるいは異なってもよい。たとえば、２つの疎水性ドメインを含む本発明方法に使用する化合物は、２つのミリスチン酸部分、またはミリスチン酸部分とコレステリル部分を含むことができる。
【００３４】
疎水性ドメインは、それぞれ線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、好ましくはそれからなる。
線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンは、３官能性部分に直接に、またはリンカーＬ２を介して結合していてもよい。線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンが３官能性部分に直接結合している化合物の例は、化合物ミリスチン酸−ミリスチン酸−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧである。線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンがリンカーＬ２を介して３官能性部分に結合している化合物の例は、化合物コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧである。この後者の例においてＴＥＧ（テトラエチレングリコール）がリンカーＬ２である。
【００３５】
好ましい１態様において、疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンからなる。この事象において、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンは疎水性、より好ましくは親油性であるので、疎水性ドメインが疎水性、より好ましくは親油性であるのは明らかである。
【００３６】
疎水性部分は、ある質量の水から忌避される部分であると理解される。好ましくは、その部分は親油性である；すなわち、それは脂肪または脂肪酸のような他の非極性親油性物質に溶解する傾向をもつ。
【００３７】
他の好ましい態様において、疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミン、および１以上のさらなる部分を含む。この態様において、疎水性部分は全体として疎水性、より好ましくは親油性である。
【００３８】
よりいっそう好ましい態様において、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含む本発明方法に使用できる化合物の疎水性ドメインは、細胞膜に挿入できる。これは、当技術分野で既知の方法により判定できる。
【００３９】
好ましい１態様において、本発明方法に使用できる化合物の２または３つの疎水性部分は異なる疎水性ドメインであり、あるいは３つの疎水性部分の場合、２つは第３のものと異なり、または３つすべてが互いに異なる。
【００４０】
本発明のこの好ましい態様において、第１疎水性ドメインは飽和脂肪酸、殊にミリスチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸、特にミリスチン酸を含み、好ましくはそれからなり、および／または第２疎水性ドメインはコレステロールを含み、好ましくはそれからなる。第３疎水性ドメインの場合、このドメインは好ましくはコレステロールまたは飽和脂肪酸、殊にミリスチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸、特にミリスチン酸を含み、好ましくはそれからなり、および／または第１または第２疎水性ドメインと同一である。
【００４１】
このコンホメーションは、一価分子、すなわち、本発明の疎水性部分を１つ含む分子と比較して、細胞に対してより高い結合親和性をもつことが示された。したがって、本発明方法に有用な化合物の剪断保護効果を達成するのに必要な濃度は、一価分子と比較してより低い。
【００４２】
分子の親水性部分は本発明方法に有用な化合物のインターナリゼーションを阻害し、疎水性部分を外側原形質膜内へ取り込むことにより剪断保護効果が誘導される。本発明方法に有用な標識された化合物を用いた実験により、化合物は細胞内部に影響を及ぼすことなく外側原形質膜に取り込まれるだけであることが確認された。
【００４３】
固定化に関して、疎水性部分をもつ化合物は、すべての細胞タイプのターゲティングおよび緊密な保持を示すことが実施例において見出された（特に実施例２を参照）。特に、コレステロール、ミリスチン酸、ステアリン酸およびベヘン酸部分は、本発明方法に使用するための化合物において特に有用であることが見出された。
【００４４】
１、２または３つの疎水性部分を含む化合物を用いる方法は定量的な細胞固定化のために有利であることもことも見出された。
本発明によれば、“コレステロール−二重リンカー分子”は、２つの疎水性部分を含み、それらが両方ともコレステロールである、本発明方法に有用な化合物であると理解される。したがって、“ミリスチン酸−三重リンカー分子”は、３つの疎水性部分を含み、それらがすべてミリスチン酸である化合物であると理解される。
【００４５】
本発明によれば、“非対称二重リンカー分子”は、２つの疎水性部分を含み、それら２つの疎水性部分が互いに異なる化合物であると理解される。
本発明方法に使用する化合物は、例において大部分がこのモジュール型の模式的様式で記載される。
【００４６】
本発明によれば、図６Ａ）に示す化合物“コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ”は、疎水性部分としての２つのコレステロール部分がＴＥＧ（テトラエチレングリコール）を介して３官能性部分に結合している化合物であると理解される。
【００４７】
化学式と並行して化合物のモジュール型記述を示す図６によれば、“（スペーサーＣ１８）”はスペーサー部分として長さ１８原子のＰＥＧ部分にホスフェート部分が続くものであると理解される。したがって、−（スペーサーＣ１８）７−は７つの“（スペーサーＣ１８）”部分からなる部分であると理解される。
【００４８】
本発明によれば、“Ｆｌｕｏｓ”は３官能性部分Ａ２に直接結合したフルオレセイン部分であると理解される。
本発明によれば、“ビオチン−ＴＥＧ”はリンカーＴＥＧを介して３官能性部分Ａ２に結合したビオチン部分であると理解される。
【００４９】
この模式的様式で開示した、本発明方法に使用する化合物の場合、３官能性部分Ａ１はＴＥＧ結合−疎水性部分については一般にグリセロールである（参照：図６Ａ）。さらに、３官能性部分としてのグリセロールに代わるセリノールまたは６−［（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−１−ヘキサノールを含む態様を同様に開示する。そのような３官能性部分に代わる他のものは当業者が入手できる。
【００５０】
図６Ａの化合物について３官能性部分Ａ１はセリノールであり、その際、疎水性部分は３官能性部分Ａ１に直接結合している。
よりいっそう模式的様式で、“コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ”は構造“５’−ＸＸＹＹＹＹＹＹＹＦＺ−３’”のものであると記載することができ、その際、ＹはＰＥＧ＋スペーサー部分であり、Ｘは３官能性リンカーを介して親水性部分に結合した疎水性部分であり、Ｆは蛍光標識フルオレセインであり、Ｚは連結基（ビオチン）である。５’および３’は、ヌクレオチドと同様に、実施例に示す自動合成による合成の方向を示す。
【００５１】
同様に、−ＰＥＧ２０００−はＰＥＧ２０００部分；すなわち、４５のＣ２Ｈ６Ｏ２サブユニットからなるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であると理解される。
実験の部に記載する本発明方法に使用する化合物において、そうではないと明確に指摘しなければ、Ｌ１が存在し（ｎ＝１）、それはホスフェートである。
【００５２】
実施例に具体的に開示した本発明方法に使用する化合物に関して“スペーサー”は、ホスフェート部分を含むＰＥＧ部分であると理解される。ＰＥＧ部分の長さは、たとえばＣ９またはＣ１２により決定され、それはＰＥＧ部分がそれぞれ９または１２原子の長さをもつことを示す。
【００５３】
“ｄＴ”は、図６Ｂ）に例示されるチミジンであると理解される。この部分ｄＴは吸光により化合物の濃度を決定するために使用でき、本発明による２官能性部分である。
特に、コレステロール−二重リンカー分子、ミリスチン酸−二重または三重リンカー分子、およびステアリン酸−二重リンカー分子は、白血球および種々の培養細胞系を用いる定量的細胞固定化を達成するのに適切であることが見出された。さらに、コレステロール−二重リンカーとミリスチン酸−二重リンカー分子の組合わせは、単一の二重リンカー分子と比較してある細胞タイプの弱い固定化率増大を示す。
【００５４】
コレステロール部分とミリスチン酸部分の両方を含む非対称二重リンカーは定量的な細胞固定化も示すことも示された。
さらに、親水性ドメインに共有結合した２または３つの疎水性分子を含む本発明方法に有用な化合物は、細胞への緊密な結合を示し、それはおそらく協同結合効果の利用によるものであろう。細胞へのそのような分子の結合は、疎水性分子を１つだけ含む化合物を用いる結合または固定化と比較して１００〜１０００倍強い。
【００５５】
さらに、１態様において、２または３つの疎水性部分は、リンカー部分Ｌ１の使用により空間的に分離されていることが好ましい。これは細胞の定量的固定化のために特に有用である。適切なリンカーを用いると、本発明方法において血液からのすべての種類の希少細胞および普通細胞を固定化するために理想的に適したテイラード結合分子が得られる。
【００５６】
そのような好ましい態様において、ｎ＝１であり、したがってＬ１が存在する。
本発明方法に有用な化合物の親水性ドメインはＰＥＧ部分を含み、したがってフレキシブルである。
【００５７】
本発明方法に有用な化合物の末端疎水性部分（単数または複数）に続いて長いフレキシブル親水性ドメインがある。
この親水性ドメインは、目的細胞の周囲で細胞を安全に包埋するのに必要なフレキシブルフォールディングを行なうことができ、それにより細胞の形態および機能を存続させるために重要な細胞フレンドリーなヒドロゲル様環境を生成する。
【００５８】
フレキシブル親水性ドメインを得るために、長さの異なる、および／またはＰＥＧ部分間のホスフェートのような構成スペーサー部分の異なる、種々の線状ＰＥＧ部分を使用できる。たとえば、４５のＣ２Ｈ６Ｏ２サブユニットを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（ＰＥＧ２０００）（参照：実施例６Ｂ））または前記の−（スペーサーＣ１８）７−のようなホスフェートスペーサーを含むＰＥＧ部分を使用できる。
【００５９】
適切な保護基は当技術分野で知られている。ホスホルアミダイト化学に適切な保護基は、たとえば（４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、およびフルオレノメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）である。特に好ましい保護基はＤＭＴ（４，４’−ジメトキシトリチル）である。
【００６０】
本発明方法に使用する化合物の多様な塩類、たとえば図１に示すように本発明方法に有用な化合物のＮａ＋および／またはＴＥＡ＋塩類を使用できる。
他の塩類も可能であり、当業者に知られている。 好ましくは、細胞の生存性または機能に全くまたは実質的に影響を及ぼさない塩類を使用する。
【００６１】
本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）中の部分Ｚは下記の構造をもつ：
−（Ｌ３）ｎ２−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−（ＳＰ）ｎ１］ｍ−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ１−（Ｌ３）ｎ２−
式中：
ＳＰは、スペーサー部分であり、
各スペーサー部分ＳＰは互いに独立して選択され、
各ｎ１は、０または１のいずれかであり、ｍ個の部分それぞれについて独立して選択され、
各ｎ２は、０または１のいずれかであり、互いに独立して選択され、
ｍは、１から１００、好ましくは１から５０、より好ましくは４から３０の整数であり、
ｙは、１から１００、好ましくは１から５０、より好ましくは４から３０の整数であり、
ｙ１は、０から３０、好ましくは０から１０、より好ましくは０から４の整数であり、
ただし、ｙ＊ｍ＋ｙ１≦１００であり、
Ｌ３は、前記に定めたものである。
【００６２】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｎ１はｍ個の部分−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−（ＳＰ）ｎ１］−について同一である。
例から分かるように、ｎ１は一般に、本発明方法に有用な化合物において常に０であり、あるいは本発明方法に有用な化合物において常に１である。
【００６３】
ｎ１＝１の例示的化合物は、コレステリル−ＴＥＧ−スペーサーＣ１２−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧである。
ｎ１＝０の例示的化合物は、コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧである。
【００６４】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｙ１は０である。
ｙ１＝０の例示的化合物は、コレステリル−ＴＥＧ−スペーサーＣ１２−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧである。
【００６５】
本発明のさらなる態様において、ｙ１は１である。
ｙ１＝１の例示的化合物は、５’−コレステリルＴＥＧ−コレステリルＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−スペーサーＣ３−ｄＴ−ビオチンＴＥＧ−３’である。
【００６６】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｙは３、４、５または６であり、ｎ１は１である。よりいっそう好ましくは、ｍは３、４、５、６、７、８、９または１０である。
本発明のさらなる好ましい態様において、スペーサー部分ＳＰは互いに独立してホスフェートおよび２官能性部分からなる群から選択される。
【００６７】
すべてのスペーサー部分ＳＰが同一であることが好ましい。よりいっそう好ましくは、すべての部分ＳＰがホスフェートである。
本発明による２官能性部分は本発明方法に使用する化合物の合成前に２つの官能基を含む部分であると理解される。したがって、そのような２官能性部分は線状化合物の合成に適切である。適切な２官能性基は、好ましくは下記のものからなる群から選択される：ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、よりいっそう好ましくはｄＴ、および１〜１０個のＣ原子、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の原子を含む線状アルキル基であって、末端Ｃ原子に、特に、独立してアミン、カルボニル、ヒドロキシル、チオール、炭酸基から選択される官能基を含むアルキル鎖。末端官能基をもつ適切な線状アルキル基の例は、ジアミノアルキル部分、たとえばＨ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＮＨ２またはヒドロキシル−カルボニル部分、たとえば−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−Ｏ−である。
【００６８】
本発明による３官能性部分は、本発明方法に使用する化合物の合成前に３つの官能基を含む部分であると理解される。したがって、そのような３官能性部分は分岐化合物の合成に適切である。適切な３官能性部分は、好ましくは１〜１０個のＣ原子、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＣ原子をもち、かつ少なくとも１つの−ＯＨ、−ＳＨおよび／または少なくとも１つの−ＮＨ２基をもつ３官能性部分から選択され、より好ましくはアミノ酸、たとえばリジンまたはセリン、セリノール、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ２）４−ＮＨ２）−ＣＨ２−、グリセロール、および１，３  ジアミノグリセロール部分から選択される。
【００６９】
本発明のさらなる好ましい態様において、Ｘ１および／またはＸ２、好ましくはＸ１またはＸ２は、疎水性ドメインにより置き換えられている。Ｘ１が疎水性ドメインにより置き換えられている例示的化合物は、実施例に示すビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２である。
【００７０】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｎ２は両方とも０である。そのような態様において、中心の線状ＰＥＧ部分は部分Ｘ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１および［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に直接結合している。
【００７１】
本発明のさらなる好ましい態様において、一方または両方のｎ２が１であり、Ｌ３は１〜１０個のＣ原子をもつアルキル基であり、それはアミド基、カルボニル基、カルバメート、および／またはＮＨ基を含んでいてもよい。本発明のさらなる好ましい態様において、Ｌ３は１〜１０個のＣ原子をもつアルキル基であり、それはアミド基、カルボニル基、カルバメート、および／またはＮＨ基を含んでいてもよい。たとえば、本発明の化合物ビオチン−ＰＥＧ２０００−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の場合のように、１つのＬ３は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−であってもよい。
【００７２】
本発明のさらなる好ましい態様において、線状脂質は
（ａ）飽和もしくは不飽和脂肪酸、および／または
（ｂ）８から２６個のＣ原子、好ましくは１２から２２個のＣ原子、より好ましくは１４から１８個のＣ原子をもつ脂肪酸
である。
【００７３】
脂肪酸は、飽和または不飽和のいずれかの長い脂肪族テイル（鎖）をもつカルボン酸である。大部分の天然脂肪酸は４から２８の偶数の炭素原子の鎖をもつ。
飽和脂肪酸の例は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸である。
【００７４】
適切な不飽和脂肪酸の例は下記のものである。
【００７５】
【表１】
0006302560.tif 000002
【００７６】
よりいっそう好ましい態様において、線状脂質はオレイン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸およびベヘン酸からなる群から選択され、より好ましくはミリスチン酸およびオレイン酸から選択される。
【００７７】
さらなる好ましい態様において、ステロイドを疎水性部分として使用できる。
ステロイドは、互いに連結した特徴的配列の４つのシクロアルカン環を含むタイプの有機化合物である。ステロイドのコアは１７個の炭素原子からなり、それらが互いに結合して４つの縮合環の形をとる：３つのシクロヘキサン環（環Ａ、ＢおよびＣと表記する）および１つのシクロペンタン環（Ｄ環）。ステロイドは、この４環コアに結合する官能基およびそれらの環の酸化状態により変異する。ステロールは特殊な形のステロイドであり、位置３のヒドロキシル基およびコレスタンから誘導された骨格をもつ。
【００７８】
本発明のさらなる好ましい態様において、
（ａ）ステロイドはステロールである、または
（ｂ）ステロイドは、コレステロール；ステロイドホルモン、好ましくは生殖腺ステロイド、より好ましくはアンドロゲン、たとえば同化ステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、またはテストステロン、エストロゲン、たとえばエストラジオール、エストリオール、またはエストロン；黄体ホルモン物質、たとえばプロゲステロンまたはプロゲスチン、コルチコステロイド、特にグルココルチコイドまたはミネラルコルチコイド；エクジステロイド(ecdysteroid)、たとえばエクジステロン(ecdysterone)；フィトステロール；ブラシノステロイド(brassinosteroid)；ホパノイド(hopanoid)；およびエルゴステロールからなる群から選択される、
より好ましくは、ステロイドはコレステロールである、または
（ｃ）疎水性ビタミンはα−トコフェロールである。
【００７９】
本発明のさらなる好ましい態様において、１、２、３または４、好ましくは１、２または３つの疎水性ドメインが親水性ドメインに共有結合している。
本発明のさらなる好ましい態様において、親水性ドメインに共有結合している２以上の疎水性ドメインは異なるかまたは同一である。
【００８０】
本発明のさらなる好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンからなる。
本発明のさらなる好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は３官能性部分Ａ１にリンカー部分Ｌ２を介して共有結合した線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、好ましくはそれからなる。
【００８１】
疎水性部分を直接またはリンカーＬ２を介して結合させるために、そのような２官能性および３官能性の部分を本発明方法に使用する化合物中に用いるのに成功した。
リンカーＬ２は、独立して、疎水性部分を親水性部分に共有結合させるのに適したいずれかのリンカー部分であり、そのリンカーは疎水性部分とそれぞれＡ１またはＡ２との間に５０、３０もしくは２０原子またはそれ未満の長さをもつ。
【００８２】
好ましい１態様において、リンカーＬ２は下記のものを含み、好ましくはそれからなる；ホスフェート基、部分−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］ｍ１−｛式中：ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、好ましくはｎ＝０であり、ｙ２は１から３０、好ましくは３から１０の整数であり、ｍ１は１から１０、好ましくは１から３の整数である｝、グリセロール部分、カルバメート基、アミド基、１〜１０個のＣ原子、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の原子を有する線状アルキル基：そのアルキル鎖は末端Ｃ原子に、特に、独立してアミン、カルボニル、ヒドロキシル、チオール、炭酸基から選択される官能基を含み、それは１、２、３、４または５つの部分Ｒ１により置換されていてもよく、その際、Ｒ１は独立してＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ４アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ４シアノアルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノまたはカルボニル部分を含む。末端官能基を含む適切な線状アルキル基の例は、ジアミノアルキル部分、たとえばＨ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＮＨ２またはヒドロキシル−カルボニル部分、たとえば−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−Ｏ−である。好ましくは、線状アルキル基は置換されていない。よりいっそう好ましくは、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンは３官能性部分Ａ１に、リンカー部分−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｊ−｛式中、ｊは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択され、好ましくはｊは３である｝、特にテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ホスフェート部分、またはＴＥＧ、グリセロールおよびホスフェート部分を含む部分、または−ＴＥＧ−グリセリル−ホスフェート−Ｏ−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）−を含むかもしくはそれからなる部分を介して結合している。
【００８３】
本発明方法のより好ましい態様において、化合物は３官能性部分Ａ１にリンカー部分Ｌ２を介して共有結合した線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、好ましくはその際、Ｌ２は、ホスフェート、アミド、カルバメート、エステル基、および部分
−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］ｍ１−
｛式中：
ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、好ましくはｎ＝０であり、
ｙ２は、１から３０、好ましくは３から１０の整数であり、
ｍ１は、１から１０、好ましくは１から３の整数である｝
からなる群から選択され、
より好ましくは、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンはリンカー部分テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）またはホスフェートを介して３官能性部分Ａ１に結合している。
【００８４】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｋ１は１、２、３、４または５、好ましくは１、２または３である。
本発明の特に好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は、３官能性部分（単数または複数）Ａ１のみを介して、または前記のドメインＸ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１を介して、その親水性ドメインに共有結合している。そのような態様に、本発明方法に使用する化合物のさらなる好ましい態様も適用される。そのような化合物において、疎水性ドメインは専ら分子の一方の末端部に位置し、これに対し、さらなる基、たとえば連結基（単数または複数）、および所望により標識部分（単数または複数）は、そこから空間的に離れた他方の末端部に位置する。
【００８５】
本発明のさらなる好ましい態様において、ｋ２は１、２、３、４、５または６、好ましくは１、２または３である。
本発明方法に使用する化合物がｄＴ部分を２官能性部分Ａ２として含む場合、ｋ２は好ましくは３、４、５または６である。
【００８６】
本発明の他の好ましい態様において、ｋ１は０であり、Ｘ１は疎水性ドメインにより置き換えられており、それは好ましくはステロイド、より好ましくはコレステロールを含む。特に好ましい態様において、Ｚは部分−（Ｌ３）ｎ２−ＴＥＧ（Ｌ３）ｎ２−であり、式中のｎ２は独立して０または１である。本発明のよりいっそう好ましい態様において、ｋ２は１、２、３、４、５または６、好ましくは３、４、５または６である。よりいっそう好ましくは、１以上、特に１つの、さらなる疎水性部分（単数または複数）が部分−［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に結合し、その際、さらなる疎水性部分（単数または複数）はステロイド、より好ましくはコレステロールを含む。よりいっそう好ましくは、Ｌ２はリンカー部分テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ホスフェート、またはＴＥＧ、グリセロールおよびホスフェート部分を含む部分、または−ＴＥＧ−グリセリル−ホスフェート−Ｏ−（ＣＨ２）４−Ｃ（Ｏ）−を含むかもしくはそれからなる部分である。本発明方法に使用する例示的化合物は、図１２に示すＣｈｏｌ−ＴＥＧ−Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ−Ｄｏｕｂｌｅｒ−ビオチン−ｄＴである。
【００８７】
本発明方法に使用する化合物がｄＴ部分を２官能性部分Ａ２として含む場合、ｋ２は好ましくは３、４、５または６である。
本発明方法のさらなる好ましい態様において、工程ａ）の化合物はさらに標識部分を含む。したがって、本発明のさらなる好ましい態様において、化合物は標識部分および連結基を含む。
【００８８】
そのような化合物は、細胞の固定化と検出の両方を達成すべき場合に、たとえば固定化された細胞の位置確認(localization)または細胞の定量のために、特に適切である。そのような化合物の例は５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン＿ＴＥＧ−３’であり、これを本発明の方法に用いて、ストレプトアビジン−コートしたプレートに細胞を固定化し、そしてこれらの細胞を検出するのに成功した。
【００８９】
適切な標識部分は in vitro 検出に適した部分であり、当業者に知られている。検出は、発光、特に蛍光の場合のように直接的であってもよく、あるいは酵素またはその基質の場合のように間接的であってもよい。よって、直接検出または間接検出に適した標識部分を両方とも使用できる。
【００９０】
本明細書中で用いる“標識”または“標識部分”は、直接検出または間接検出のための信号を発生できるいずれかの物質を表わす。よって、標識部分を直接または間接的に検出できる。直接検出のために、本発明に使用するのに適した標識部分をいずれか既知の検出可能なマーカーグループ、たとえば色原体、化学発光性グループ（たとえば、アクリジニウムエステルまたはジオキセタン）、電気化学発光性化合物、色素、または蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびその誘導体）、発光性金属錯体、たとえばルテニウムまたはユーロピウムの錯体、および放射性同位体から選択できる。
【００９１】
間接検出系において、バイオアファイン結合対の第１パートナーは本発明方法に使用する化合物の標識部分である；すなわち、第１パートナーは本発明に使用する化合物に共有結合しており、その一部である。適切な結合対の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはビオチンアナログ、たとえばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、および受容体／リガンド、たとえばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい第１結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。同様に好ましいものは、ハプテン、タグ、ジゴキシンおよびビオチン、ならびにそのアナログである。そのような結合対の第２パートナー、たとえば抗体、ストレプトアビジンなどは、通常は直接検出できるように、たとえば前記の標識部分により標識される。
【００９２】
したがって、好ましい態様において、標識部分は直接標識化または間接標識化のための標識部分である。
好ましい１態様において、標識部分は下記のものから選択される：（ａ）色原体、化学発光性グループ（たとえば、アクリジニウムエステルまたはジオキセタン）、電気化学発光性化合物、色素、蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびその誘導体）、発光性金属錯体、たとえばルテニウムまたはユーロピウムの錯体、および放射性同位体からなる群から選択される直接標識化部分；（ｂ）あるいは間接検出系の一方のパートナー、好ましくは標識部分が下記のものからなる群から選択される結合対のメンバーのうちの一方であるもの：（ｉ）ハプテンまたは抗原／抗体、（ｉｉ）ビオチンまたはビオチンアナログ、たとえばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、（ｉｉｉ）糖／レクチン、（ｉｖ）核酸または核酸アナログ／相補的核酸、および（ｖ）受容体または受容体フラグメント／リガンド、たとえばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモン。
【００９３】
間接検出に適した標識部分として好ましい第１結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。同様に好ましいものは、ハプテン、ジゴキシンおよびビオチンならびにそのアナログである。そのような結合対の第２パートナー、たとえば抗体、ストレプトアビジンなどは、一般に直接検出できるように、たとえば前記の直接標識部分により標識される；しかし、本発明方法に使用する化合物中に抗体を用い、標識された抗原またはハプテンを検出のために用いることもできる。
【００９４】
上記の結合対メンバーの記載において、抗体という用語は抗体およびその抗原結合性フラグメントの両方を包含すると理解される。
好ましい態様において、標識部分は直接標識化のための標識部分であり、よりいっそう好ましくは標識部分は蛍光性部分または色素である。
【００９５】
適切な蛍光性部分（または色素）は当技術分野で知られており、下記のものを含む：フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、キサンテン誘導体、たとえばローダミン、オレゴングリーン(Oregon green)、エオシン、またはテキサスレッド(Texas red)、シアニン誘導体、たとえばシアニン、インドカルボシアニン(indocarbocyanine)、オキサカルボシアニン(oxacarbocyanine)、チアカルボシアニン(thiacarbocyanine)、およびメロシアニン(merocyanine)、ナフタレン誘導体、たとえばダンシル(dansyl)およびプロダン(prodan)誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、たとえばピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、たとえばカスケードブルー(cascade blue)、オキサジン誘導体、たとえばナイルレッド(Nile red)、ナイルブルー(Nile blue)、クレシルバイオレット(cresyl violet)、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、たとえばプロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、たとえばオーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、たとえばポルフィン、フタロシアニンおよびビリルビン。
【００９６】
実施例において、フルオレセインを例示的な標識として用いた。これによって高感度の標識検出が可能になり、標識の位置確認および／または定量が共に可能になる。蛍光標識は本発明の特に好ましい標識部分である。
【００９７】
標識化に適した放射性同位体(radioactive isotopeまたはradioisotope)、および本発明方法に使用する化合物をそのような放射性標識で標識するための方法は、当業者に知られている。たとえば、下記の同位体のうちの１つを使用できる：１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉ。
【００９８】
抗体または抗原結合性フラグメントを間接系である抗体／抗原またはハプテンのメンバーとして用いる場合、エピトープまたはハプテンに対して特異的な抗体または抗原結合性フラグメントが本発明方法に使用する化合物の一部であってもよく、あるいはエピトープまたはハプテンが本発明方法に有用な化合物の一部であってもよい。したがって、後続検出のために、それぞれ他方のメンバーを、たとえば蛍光標識で直接標識することができる。適切な抗体または抗原結合性フラグメントを後記にさらに詳細に記載する。
【００９９】
本発明の好ましい態様において、連結基および所望により標識部分を部分［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に結合させる。
本発明の特に好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は親水性ドメインに３官能性部分（単数または複数）Ａ１のみを介して（または前記のドメインＸ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１を介して）共有結合しており、連結基および所望により標識部分は部分［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に結合している。これにより、細胞膜内への挿入のための疎水性ドメインと固定化および所望により標識化のための部分との空間的分離が確実になる。
【０１００】
本発明のより好ましい態様において、化合物はさらに標識部分を含み、その際、標識部分は３官能性部分Ａ２を介して共有結合している。たとえば、そのような標識部分は蛍光色素である。
【０１０１】
そのような化合物は、固定化に加えて標識化および検出するための本発明方法に使用するのに特に適切である。
本発明の他の好ましい態様において、１以上の部分（単数または複数）Ａ２は標識部分であり、より好ましくは部分Ａ２は核酸塩基を含む部分であり、よりいっそう好ましくは実施例に記載する特定の化合物の場合のように、部分Ａ２はｄＴである。
【０１０２】
本発明の他の好ましい態様において、化合物はさらに標識部分を含み、その際、標識部分は３官能性部分Ａ２を介して共有結合している。たとえば、そのような標識部分は蛍光色素であり、１以上の部分（単数または複数）Ａ２は標識部分であり、より好ましくは部分Ａ２は核酸塩基を含む部分であり、よりいっそう好ましくは部分Ａ２はｄＴである。
【０１０３】
ｄＴを含むそのような化合物を実施例において化合物の濃度を決定するために用いた。
そのような態様において、本発明方法に使用する化合物はフルオレセインおよびｄＴを含むことができる。
【０１０４】
さらなる好ましい態様において、連結基は３官能性部分Ａ２を介して共有結合し、たとえば連結基はビオチンである。
よりいっそう好ましい態様において、連結基は３官能性部分Ａ２を介して共有結合しており、標識部分は３官能性部分Ａ２を介して共有結合している。
【０１０５】
本発明のさらなる特に好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は親水性ドメインに３官能性部分（単数または複数）Ａ１のみを介して（または前記のドメインＸ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１を介して）共有結合しており、連結基および標識部分が部分［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に結合している。
【０１０６】
そのような化合物により、固定化と、標識化、検出および定量との両方が可能になる。
本発明のいっそうさらなる特に好ましい態様において、疎水性ドメイン（単数または複数）は親水性ドメインに３官能性部分（単数または複数）Ａ１のみを介して（または前記のドメインＸ１−［Ａ１−（Ｌ１）ｎ］ｋ１を介して）共有結合しており、連結基が部分［Ａ２−（Ｌ１）ｎ］ｋ２−Ｘ２に結合しているが、標識部分は結合していない。
【０１０７】
そのような化合物は、結合した細胞の固定化のみを意図する場合に使用できる。
本発明のよりいっそう好ましい態様において、本発明方法に使用する化合物は標識部分および連結基を含み、その際、標識部分は蛍光標識であり、および／または連結基はビオチンである。
【０１０８】
本発明の他の好ましい態様において、化合物がさらに標識部分を含むことはない。例示的化合物は５’−コレステリルＴＥＧ−コレステリルＴＥＧ−ＰＥＧ２０００−ビオチンＴＥＧ−３である。
【０１０９】
本発明のさらなる好ましい態様において、リンカーＬ１は、独立してホスフェート、アミド、カルバメート、およびエステル基からなる群から選択される。
本発明のさらなる好ましい態様において、部分Ａ１およびＡ２は、独立して、下記のものから選択される：ホスフェート基、カルバメート基、アミド基、核酸塩基を含む部分、よりいっそう好ましくはｄＴ、および１〜１０個のＣ原子を有する線状アルキル基であって末端Ｃ−原子に、特に、独立してアミン、カルボニル、ヒドロキシル、チオール、炭酸基から選択される官能基を含むアルキル鎖からなる群から選択される２官能性基；ならびに１〜１０個のＣ原子を有し、少なくとも１つの−ＯＨ、−ＳＨ、および／または少なくとも１つの−ＮＨ２基を含み、好ましくはリジン、セリン、セリノール、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ２）４−ＮＨ２）−ＣＨ２−、グリセロール、および１，３  ジアミノグリセロール部分から選択される３官能性部分。
【０１１０】
本発明のさらなるより好ましい態様において、リンカーＬ２は、独立してホスフェート、アミド、カルバメート、エステル基、および部分
−［Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ２−（ＳＰ）ｎ］ｍ１−
｛式中：
ＳＰおよびｎは前記に定めたものであり、好ましくはｎ＝０であり、
ｙ２は、１から３０、好ましくは３から１０の整数であり、
ｍ１は、１から１０、好ましくは１から３の整数である｝
からなる群から選択される。
【０１１１】
ＰＥＧ−ベースのリンカー、すなわちＴＥＧ−リンカーは、本発明方法に有用な例示的化合物に有用であることが示された。例示的化合物は５’−コレステリルＴＥＧ−コレステリルＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチンＴＥＧ−３’である。
【０１１２】
本発明方法に有用な化合物およびその中間体は、当業者に知られている方法により製造できる。本発明方法に有用な化合物の例示的な合成を図６Ｃに示す。本発明方法に有用な化合物の合成に用いた中間体も図１２に示す。さらに、合成の一般的概念を実施例１にそれらの化合物について簡単に記載する。それらの化合物は、ホスホルアミダイト−ベースのヌクレオチド合成と同様に固相で製造できる。それらの化合物は、実施例に記載するように、ＣＰＧのような固体支持体上での合成により合成できる。特に、それらの化合物は、当業者に知られている条件下での後続カップリング工程、および固体支持体（実施例において：ＣＰＧ(controlled pore glass)（コントロールドポアガラス）)からの開裂により合成できる。他の固体支持体、たとえばマクロ多孔質ポリスチレンも合成に使用できる。合成は保護基を保持することにより、または保護基を開裂させることにより実施できる。特に、それらの化合物は、ＤＭＴオン（保有）またはＤＭＴオフ（離脱）のいずれかの方式で、３’末端と表示する分子末端にＤＭＴ分子を残して、またはＤＭＴ基を開裂除去することにより合成できる。それらの化合物を、たとえば透析によってさらに精製してもよい。
【０１１３】
ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成を図６Ｃ）に詳細に示す。
本発明方法に有用な他の化合物を当技術分野で知られている方法に従って同様に製造できる。
【０１１４】
前記に説明したように、本発明方法に用いる化合物を工程ｂ）で組成物として、たとえば水溶液として接触させることができる。
好ましい１態様において、１種類より多い前記化合物を含む組成物を使用できる。
【０１１５】
より好ましい態様において、化合物またはその塩は１種類以上の前記化合物を含む組成物中にある。
したがって、１態様において、本発明は、細胞を支持体に固定化するための方法に関するものであって、その方法は、
ａ）下記の化合物またはその塩を含む組成物を用意する：
親水性ドメインに結合した１以上の疎水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、
１以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、
１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む
化合物であって、連結基を含む化合物；
ｂ）化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で、前記化合物を含む組成物と細胞を接触させ、それにより連結基を細胞の表面に固定化する；そして
ｃ）細胞に固定化された連結基を、その機能性ドメインを結合できる表面と接触させ、それにより細胞を表面に固定化する
ことを含む。
【０１１６】
よりいっそう好ましい態様において、組成物は少なくとも３種類の異なる前記化合物を含み、
（ｉ）異なる化合物は少なくともそれらの疎水性ドメインにおいて異なり、
（ｉｉ）異なる化合物は標識部分を含む。
【０１１７】
よりいっそう好ましい態様において、組成物は少なくとも４、５、６、７、８、９または１０種類の異なる前記化合物を含む。
本発明はさらに、本発明方法に有用な少なくとも１種類の化合物が少なくとも１つの細胞、好ましくは生細胞に結合したものを含む組成物に関する。そのような組成物は、それぞれ細胞の固定化および所望により検出に有用である。
【０１１８】
好ましい１態様において、そのような組成物はさらに固体支持体を含み、本発明方法に有用な少なくとも１種類の化合物が連結基を介してそれに結合している。そのような態様において、少なくとも１つの細胞が本発明方法に有用な化合物を介して固体支持体に固定化されている。化合物がさらに標識部分を含む場合、細胞（単数または複数）の位置確認、検出および定量が可能である。
【０１１９】
他の好ましい態様において、少なくとも１つの細胞に結合した本発明方法に有用な少なくとも１種類の化合物を含む組成物は水性緩衝液を含み、本発明方法に有用な少なくとも１種類の化合物が結合した少なくとも１つの細胞は該緩衝液に懸濁されている。そのような組成物は、その中の細胞を、たとえば固定化工程の前、または固定化工程の後の、たとえばＦＡＣＳまたは遠心分離に際して、およびその後の離脱に際して、適切に安定化するのに適している。
【０１２０】
本発明方法に有用な化合物は、脂質二重層を含むいずれかの細胞に結合するのに適切である。好ましくは、細胞は真核細胞、より好ましくは動物細胞、よりいっそう好ましくは脊椎動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【０１２１】
好ましい態様において、細胞は懸濁状態の細胞であり、および／または細胞は動物細胞またはヒト細胞、特に脊椎動物細胞、殊に哺乳動物細胞である。よりいっそう好ましくは、細胞は懸濁状態の細胞であり、動物細胞またはヒト細胞、特に脊椎動物細胞、殊に哺乳動物細胞である。
【０１２２】
たとえば、細胞は白血球、希少細胞、腫瘍細胞、または変異細胞、より好ましくは脊椎動物またはヒトの白血球、希少細胞、腫瘍細胞、または変異細胞である。
さらなる態様において、本発明は、本発明方法に有用な１種類またはそれ以上の化合物を含む組成物を使用する本発明方法に関する。
【０１２３】
本発明方法に有用な２種類以上の異なる化合物を含むある組成物は、細胞タイプ−非依存性の固定化および標識化のために特に有用であることを示すことができた。
したがって、他の態様において、本発明は、本発明方法に有用な少なくとも３種類の異なる化合物を含む組成物を使用する本発明方法に関するものであり、その際、異なる化合物は少なくともそれらの疎水性ドメインにおいて異なり、異なる化合物は標識部分を含む。
【０１２４】
少なくとも２種類はそれらの疎水性ドメイン（単数または複数）において異なる、本発明方法に有用な多様な化合物の使用により、すべての細胞タイプを結合する組成物を得ることができ、それにより細胞タイプ−非依存性の固定化が提供される。
【０１２５】
よりいっそう好ましい態様において、よって組成物は本発明方法に有用な少なくとも４、５、６、７、８、９または１０種類の異なる化合物を含む。よりいっそう好ましい態様において、 そのような組成物の２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはすべての化合物が少なくともそれらの疎水性ドメインにおいて異なる。
【０１２６】
適切な好ましい疎水性ドメインは、前記に定めたものである。
より好ましい態様において、少なくとも１種類の化合物の疎水性ドメインが飽和脂肪酸、殊にミリスチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸、特にミリスチン酸を含み、好ましくはそれからなり、および／または少なくとも１種類の化合物の疎水性ドメインがステロイド、特にコレステロール、または疎水性ビタミン、特にα−トコフェロールを含み、好ましくはそれからなる。
【０１２７】
好ましい態様において、本発明は、本発明方法に有用な１種類またはそれ以上の化合物を含む水溶液を使用する本発明方法に関する。
本発明方法に使用する水溶液は、好ましくは緩衝化されている。たとえば、溶液はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス、および／またはＨｅｐｅｓ緩衝液であってもよい。
【０１２８】
本発明方法に有用な溶液のｐＨは、好ましくは約５，５〜８，５、より好ましくは６，５〜７，５である。
なおさらなる態様において、本発明は、細胞を固定化するための、前記に開示した少なくとも１種類の化合物または組成物を含むキットの使用に関する。
【０１２９】
キットはさらに、個別に、たとえば容器または注射器に保存された、本発明方法に使用するための２種類以上の化合物を含むことができる。それらは乾燥形態、たとえば凍結乾燥もしくは乾燥した状態で、または溶液として、または凍結形態で、たとえば凍結溶液として保存できる。
【０１３０】
１態様において、本発明の方法は、希少細胞の固定化、ならびに所望により検出および／または特性分析のために、好ましくは１つの希少細胞の特性分析のために使用できる。
したがって、他の態様において、本発明は目的細胞を含む細胞集団を支持体に固定化する方法に関するものであって、その方法は、
ａ）下記の化合物またはその塩を含む組成物を用意する：
親水性ドメインに結合した１以上の疎水性ドメインを含み、好ましくはそれらからなり、
１以上の疎水性ドメインは親水性ドメインに共有結合しており、
１以上の疎水性ドメインはそれぞれ、線状脂質、ステロイドまたは疎水性ビタミンを含み、親水性ドメインはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む
化合物であって、連結基を含む化合物；
ｂ）化合物が細胞の膜と相互作用できる条件下で細胞集団をその化合物と接触させ、それにより細胞の表面に連結基を固定化する；
ｃ）細胞に固定化された連結基を、その連結基を結合できる表面と接触させ、それにより細胞をその表面に固定化する；そして
ｄ）表面に固定化された目的細胞を所望により検出する
ことを含む。
【０１３１】
細胞の集団は少なくとも２種類の細胞を含む組成物であり、それは少なくとも２種類の異なる細胞を含有し、あるいは含有すると推定される。そのような異なる細胞は、たとえばそれぞれＴ細胞とＢ細胞、異なるＴ細胞のサブセット、または腫瘍細胞と非腫瘍細胞、または内皮細胞と上皮細胞であってもよい。
【０１３２】
本発明による“細胞の膜”は原形質膜であると理解される。
この本発明方法には、細胞を表面に固定化するための前記の本発明方法のものと同じ態様が適用される。したがって、適切な化合物を含む組成物も前記のように使用できる。
【０１３３】
特に好ましい態様において、目的細胞は白血球、特に希少細胞、たとえば循環型の腫瘍細胞、内皮細胞または上皮細胞である
よりいっそう好ましくは、細胞は懸濁状態の細胞であり、および／または細胞は動物細胞またはヒト細胞、特に脊椎動物細胞、殊に哺乳動物細胞である。
【０１３４】
表面に固定化された目的細胞の検出は、そのような目的細胞に特異的な検出剤の使用により実施できる：たとえば、特異的細胞表面マーカーを認識する抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または複数の特異的細胞表面マーカーを認識する複数の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、たとえば特定のＴ細胞サブセット集団を検出するためのもの、または特定の腫瘍細胞タイプを検出するための特異的な腫瘍マーカー（単数または複数）を認識するもの。前記のように、また当業者に知られているように、抗体またはその抗原結合性フラグメントのような検出剤を、次いで直接または間接的に検出できる。直接検出の場合は、検出剤自体が直接検出可能な標識、たとえば蛍光色素で標識されている。あるいは、間接検出可能な標識を使用でき、たとえば標識部分、たとえば蛍光性部分を備えた二次抗体を検出することができる。その際、蛍光を検出できる。
【０１３５】
目的細胞を検出するための検出可能な標識は、目的細胞の特異的検出を可能にするために、本発明の工程ａ）およびｂ）に用いる化合物の標識部分と異なることが好ましい。蛍光色素を用いる場合、それぞれの色素は好ましくは別個の励起および／または発光スペクトルを示す。
【０１３６】
目的細胞を固定化するそのような態様において、たとえば全血から単離した有核細胞を、本発明方法の実施により規定の支持体または表面に、特にアレイ状に、より好ましくはマイクロアレイまたはナノアレイ状に固定化することができる。この有核細胞集団内の、たとえば白血球（ＷＢＣ）集団内の希少細胞、たとえば循環型の腫瘍細胞、内皮細胞または上皮細胞をこの表面または支持体に定量的に結合させ、その希少細胞集団に特異的な抗原または生化学的特性に対する抗体または特異的結合分子により同定することができる。これにより、必要であればさらなる特性分析工程のための厳密な位置確認および再−位置確認が可能になる。
【０１３７】
したがって、本発明の好ましい態様において、表面に固定化された目的細胞を検出する工程ｄ）を実施する。
本発明のさらなる態様において、さらに標識部分を含む本発明方法に有用な化合物を用いる。これにより細胞集団自体の検出が可能になり、その細胞集団と比較した目的細胞についての情報を得ることが可能になる。
【０１３８】
したがって、本発明はまた、１つの希少細胞の特性分析のための、本発明方法の使用に関する。
したがって、本発明のさらなる態様において、１つの希少細胞の特性分析はさらなる工程ｅ）として、たとえば細胞表面マーカーの検出により実施される。
【０１３９】
さらなる態様において、本発明の方法は、特に抗体スクリーニングのようなスクリーニング目的で懸濁細胞を固定化するために使用できる。たとえば、抗体または抗原結合性フラグメントを表面に提示している固定化細胞を、当技術分野で既知の方法により、抗原への結合についてスクリーニングすることができる。
【０１４０】
培養細胞系における抗体またはその抗原結合性フラグメントのスクリーニングは、抗体開発に一般に適用される。１適用は、抗体を細胞表面の特異的受容体分子に結合させることを含む。二次抗体（サンドイッチ効果）を用いて一次抗体の結合特性を調べることができる。懸濁細胞を用いてそのような実験を行なうのは困難である。本発明の方法は、細胞の生理学的特性をいずれも喪失することなく懸濁細胞を慎重に固定化でき、したがってそのようなスクリーニングアッセイを実施するために使用できる。
【０１４１】
同様に、本発明の方法を用いて懸濁細胞を細胞の機能アッセイのために固定化することができる。細胞の機能を in vitro または in vivo で調べるためのアッセイは重要である：細胞の機能アッセイは、医薬、農業およびバイオテクノロジーの研究および開発において、小分子化合物または生体物質を調べるために、あるいは小分子のクラスをハイスループットスクリーニングで同定するために、一般に用いられる。ある機能アッセイは表面依存アッセイを基礎とし、したがって一般に接着性細胞について実施される。本発明の方法を懸濁細胞の固定化のために実施して、そのような機能アッセイを後続工程として適用することができる。
【０１４２】
したがって、本発明のさらなる態様において、本方法は、工程ｅ）固定化された細胞のスクリーニング、たとえば固定化された細胞の抗体スクリーニングを含む。
本発明のなおさらなる態様において、本方法は、工程ｅ）固定化された細胞を用いる細胞の機能アッセイの実施をさらに含む。
【０１４３】
したがって、本発明はまた、懸濁細胞の固定化のための、好ましくはスクリーニングのための、よりいっそう好ましくは抗体もしくは抗原結合性抗体フラグメントまたは他の方式の結合分子についてのスクリーニングのための、本発明方法の使用に関する。
【０１４４】
したがって、本発明はまた、細胞の機能アッセイの実施のための、本発明方法の使用に関する。
好ましい１態様において、本発明の方法は in vitro 法である。
【０１４５】
さらに、本発明の方法に続いて、細胞を離脱させる後続工程を行なうことができる。たとえば、生細胞を固体支持体または表面に固定化するために本発明の方法を実施し、続いて支持体または表面から離脱させてマウスモデルに移植することができる。これらの種類の機能アッセイは、たとえば循環型異常細胞の腫瘍誘発ポテンシャルを調べるためにきわめて重要である。
【０１４６】
この態様において、離脱は、本発明の工程ｃ）：細胞に固定化された連結基を、その連結基を結合できる表面と接触させ、それにより細胞をその表面に固定化した後；または工程ｄ）：表面に固定化された目的細胞を検出した後、好ましくは工程ｄ）：表面に固定化された目的細胞を検出した後に実施できる。
【０１４７】
さらなる好ましい態様において、スクリーニング工程、および／または希少細胞の特性分析工程、および／または細胞の機能アッセイ工程は、細胞を離脱させる前に実施される。
【０１４８】
したがって、本発明のさらなる態様において、本方法はその後の固定化細胞の離脱に関係する工程をさらに含む。
本発明の方法はラボ・オン・チップ(lab on a chip)として実施できる：２〜５０個のような少数の細胞または単一細胞の細胞形態または細胞機能を調べるために、本発明方法に有用な化合物を支持体または表面に選択的かつ系統的にスポットすることができる。このスポッティングによって少数の細胞または単一細胞をそのようなスポット上にターゲティッド固定化することができる。これよりその支持体または表面（チップ）で直接に分子分析できる。
【０１４９】
したがって、１態様において、２、３、４またはそれ以上の本発明方法を並行して、特に固体支持体、たとえばチップ上で実施する。チップはアレイ、特にマイクロアレイまたはナノアレイであってもよい。たとえば、５０、１０００または１００００の固定化法を並行して実施する。
【０１５０】
そのような固体基材は、粒子、たとえばナノ粒子、特に磁性ナノ粒子、カラム、または平坦な基材、アレイまたはウェルプレート、特にオリゴウェルまたはマルチウェル−プレートであってもよい。好ましい態様において、アレイはマイクロアレイまたはナノアレイである。
【０１５１】
本発明方法に使用する化合物は、たとえば剪断応力を示す条件に際しての細胞の安定化にも有用である。
したがって、本発明はまた、本発明方法の固定化に際して、または工程ａ）以前の培養に際して、少なくとも１つの細胞を安定化するための、本発明方法の使用に関する。
【０１５２】
本発明方法に有用な化合物は、さらに、バイオテクノロジーにおける、たとえば大規模な動物細胞培養における、細胞安定化のために有用である：哺乳動物細胞の剪断感受性は大規模な動物細胞培養の開発を複雑にする可能性のある関連問題となる可能性があると発表された。本化合物はこれらの問題を軽減する。
【０１５３】
本発明方法に有用な化合物は、さらにフローサイトメトリーおよび／または蛍光活性化セルソーティングにおける細胞安定化のために有用である：
フローサイトメトリーは特定の細胞集団を分離するためにごく一般的に用いられる方法である。このプロセスに際して、細胞は流速に応じた高い剪断応力を受ける。本発明方法に有用な化合物はこの剪断応力を低減する。
【０１５４】
本発明方法に有用な化合物は、さらにビーズ−ベースの細胞分離プロセスにおける細胞安定化のために有用である：
異なる表現型をもつ細胞集団を、磁性ビーズに結合した特異的抗体により分離することができる。このプロセスに際して、細胞はビーズのサイズに応じた高い剪断応力を受ける。本発明方法に有用な化合物はこの剪断応力を低減する。
【０１５５】
抗体および抗原結合性抗体フラグメントに関して、当業者にはそのような分子が分かっている：天然抗体は、基本構造を共有する免疫グロブリンとしても知られる球形血漿タンパク質（約１５０ｋＤａ(http://en.wikipedia.org/wiki/Dalton_unit))である。それらはアミノ酸残基に付加した糖鎖をもつので、それらは糖タンパク質である。それぞれの抗体の基本的な機能単位は免疫グロブリン（Ｉｇ）モノマー（１つのＩｇ単位のみを含む）である；分泌型抗体は、ＩｇＡのように２つのＩｇ単位を含むダイマー型、真骨魚類(teleost fish)ＩｇＭのように４つのＩｇ単位を含むテトラマー型、または哺乳動物ＩｇＭのように５つのＩｇ単位を含むペンタマー型の場合もある。本発明において、適切なフォーマットの例にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして知られる抗体アイソタイプを含む天然抗体のフォーマットが含まれる。
【０１５６】
天然抗体のほかに、抗体フラグメントを含む人工抗体フォーマットが開発された。それらのうち幾つかを以下に記載する。
すべての抗体の一般構造がきわめて類似するが、特定抗体の固有の特性は前記に詳述したように可変（Ｖ）領域により決定される。より具体的には、それぞれ軽鎖（ＶＬ）上に３つ、重鎖（ＶＨ）上に３つの可変ループが、抗原への結合、すなわちそれの抗原特異性に関与する。これらのループは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＶＨとＶＬの両ドメインからのＣＤＲが抗原−結合部位に寄与するので、最終的な抗原特異性を決定するのは重鎖と軽鎖の組合わせであって、いずれか単独ではない。
【０１５７】
したがって、本明細書中で用いる用語“抗体”は、天然抗体に対する構造類似性をもち、かつ各ターゲットに特異的に結合できる、いずれかのポリペプチドを意味し、その際、結合特異性はＣＤＲにより決定される。よって、“抗体”は各ターゲットに結合する免疫グロブリン由来の構造体に関係するものとし、下記のものを含むが、それらに限定されない：全長抗体もしくは全抗体、抗原結合性フラグメント（理学的または概念的に抗体構造体から誘導されたフラグメント）、以上のいずれかの誘導体、キメラ分子、以上のいずれかと他のポリペプチドとの融合体、またはいずれか別の構造体／組成物であって各ターゲットに選択的に結合するもの。抗体またはその機能活性部分は、少なくとも１つの抗原結合性フラグメントを含むいずれかのポリペプチドであってもよい。抗原結合性フラグメントは、少なくとも重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインからなり、それらの両ドメインが一緒に特定の抗原に結合できるように配置されている。
【０１５８】
“全長”または“完全”抗体は、ジスルフィド結合により相互に結合した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を表わし、それらは下記のものを含む：（１）重鎖に関しては、可変領域、ならびに３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域；ならびに（２）軽鎖に関しては、軽鎖可変領域、および１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常領域。
【０１５９】
“抗原結合性抗体フラグメント”または“その抗原結合性フラグメント”も、少なくとも１つの前記に定めた抗原結合性フラグメントを含み、その機能活性部分（またはフラグメント）が由来する完全抗体と本質的に同じ機能および結合特異性を示す。パパインによる限定的なタンパク質分解消化は、Ｉｇプロトタイプを３つのフラグメントに開裂する。それぞれ１つの全Ｌ鎖および約半分のＨ鎖を含む２つの同一アミノ末端フラグメントは、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）である。サイズは類似するが両重鎖のカルボキシル末端側半分をそれらの鎖間ジスルフィド結合と共に含む第３フラグメントは、結晶性フラグメント（Ｆｃ）である。Ｆｃは炭水化物、補体結合部位およびＦｃＲ−結合部位を含む。限定的なペプシン消化により、両Ｆａｂ片、およびＨ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合を含めたヒンジ領域を含む、単一のＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合について二価である。Ｆａｂ’を得るために、Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合を開裂させることができる。さらに、重鎖および軽鎖の可変領域を互いに融合させて一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を形成することができる。
【０１６０】
可変ドメイン（Ｆｖ）は、１つのＶＬおよび１つのＶＨからなる無傷の抗原結合性ドメインを含む最小フラグメントである。結合ドメインのみを含むそのようなフラグメントは、酵素法により、またはたとえば細菌細胞および真核細胞における関連遺伝子フラグメントの発現により作製できる。種々の方法を使用できる：たとえば、Ｆｖフラグメントのみ、またはＦｖと第１定常ドメインを含めた“Ｙ”の上側アームのうちの１つを含む‘Ｆａｂ’−フラグメント。これらのフラグメントは、通常は２つの鎖間にポリペプチドリンクを導入することによって安定化され、その結果、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が生成する。あるいは、ジスルフィド連結したＦｖ（ｄｓＦｖ）フラグメントを使用できる。結合ドメインのフラグメントは、全長抗体を作製するためにいずれかの定常ドメインと組み合わせることができ、あるいは他のタンパク質およびポリペプチドと融合させることができる。
【０１６１】
ある組換え抗体フラグメントは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。ｓｃＦｖの開裂によりモノマーｓｃＦｖが生成し、それを複合体化してダイマー（ダイアボディ(diabody)）、トリマー（トリアボディ(triabody)）、またはより大きな凝集体、たとえばＴａｎｄＡｂおよび（フレキシボディ（Flexibody））にすることができる。
【０１６２】
２つの結合ドメインをもつ抗体は、２つのｓｃＦｖを単純なポリペプチドリンクで結合させることにより（ｓｃＦｖ）２、または２つのモノマーのダイマー化により（ダイアボディ）作製できる。最も簡単なデザインは２つの機能性抗原結合性ドメインをもつダイアボディであり、それらのドメインは同一、類似である（二価ダイアボディ）か、あるいは別個の抗原に対する特異性をもつことができる（二重特異性ダイアボディ）。
【０１６３】
重鎖の４つの可変ドメインおよび軽鎖の４つの可変ドメインを含む抗体フォーマットも開発された。これらの例には、四価二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂおよびフレキシボディ，Ａｆｆｉｍｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ，ドイツ、ハイデルベルク）が含まれる。フレキシボディはｓｃＦｖとダイアボディマルチマーモチーフを組み合わせて、細胞表面の互いにかなり離れた２つの分子を連結させるために高度のフレキシビリティーを備えた多価分子にしたものである。２より多い機能性抗原結合性ドメインが存在し、それらが別個の抗原に対する特異性をもつならば、その抗体は多重特異性である。
【０１６４】
まとめると、抗体またはその抗原結合性フラグメントである特異的免疫グロブリンタイプには下記の抗体が含まれるが、それらに限定されない：Ｆａｂ（可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨｌ）ドメインをもつ一価フラグメント）、Ｆ（ａｂ’）２（２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントがヒンジ領域においてジスルフィド橋または別のものにより連結したもの）、Ｆｖ（ＶＬおよびＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬとＶＨがリンカー、たとえばペプチドリンカーにより連結した一本鎖Ｆｖ）、二重特異性抗体分子（本明細書に記載する特異性を備えた抗体分子が、その抗体とは異なる結合特異性をもつ第２の機能性部分（限定ではなく、他のペプチドもしくはタンパク質、たとえば抗体、または受容体リガンドを含む）に連結したもの）、二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ｓｃＦｖがＣＨ３に連結したもの）。
【０１６５】
抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
タグは、バイオテクノロジーにおける認識のために用いられるペプチドモチーフである。周知のタグは、Ｎｉ２＋−カラムに結合させることができるＨｉｓ−タグ（６×ヒスチジン）である。
【０１６６】
核酸または核酸アナログ／相補的核酸を結合対として用いる場合、いずれかの核酸配列とそれの相補的配列を使用できる。
レクチンは、糖部分に対して高特異的な炭水化物結合性タンパク質である。適切なレクチンとして、コンカナバリンＡを使用でき、これはα−Ｄ−マンノシルおよびα−Ｄ−グルコシル残基、分岐α−マンノシド型(mannosidic)構造体（高α−マンノースタイプ、またはハイブリッドタイプ、および二アンテナ型複合体(biantennary complex)タイプのＮ−グリカンに結合する。
【０１６７】
受容体／リガンド結合対としては、たとえばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンを使用できる。たとえば、エストロゲンをステロイドとして使用し、その受容体をそれぞれの結合パートナーとして使用できる。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：本発明方法に有用な化合物の合成
本発明方法に有用な下記の化合物を合成した：
【０１６９】
【表２−１】
0006302560.tif 000003
【０１７０】
【表２−２】
0006302560.tif 000004
【０１７１】
【表２−３】
0006302560.tif 000005
【０１７２】
【表２−４】
0006302560.tif 000006
【０１７３】
【表２−５】
0006302560.tif 000007
【０１７４】
【表２−６】
0006302560.tif 000008
【０１７５】
【表２−７】
0006302560.tif 000009
【０１７６】
【表２−８】
0006302560.tif 000010
【０１７７】
【表３】
0006302560.tif 000011
【０１７８】
【表４−１】
0006302560.tif 000012
【０１７９】
【表４−２】
0006302560.tif 000013
【０１８０】
【表４−３】
0006302560.tif 000014
【０１８１】
【表５−１】
0006302560.tif 000015
【０１８２】
【表５−２】
0006302560.tif 000016
【０１８３】
Ｄ）本発明方法に有用な例示的化合物および副産物の化学構造
本発明方法に有用な例示的化合物および合成副産物の化学構造を図６ＡおよびＢに示す。
【０１８４】
Ｅ）ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成
本発明のビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−（Ｃ１８）２の合成を図６Ｃに示す。
Ｆ）本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびにその中間体の構造
本発明方法に有用な化合物および参照化合物の合成のために下記の中間体を用いた：
コレステリル−ＴＥＧ−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１９７５），
ミリスチン酸−ＣＥ−ＰＡ（社内製造），
ビオチン−ＴＥＧ−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１９５５），
ビオチン−ｄＴ−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１０３８），
ｄＴ−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１０３０），
対称ｄｏｕｂｌｅｒ−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１９２０），
ＰＥＧ−２００−ＣＥＤ−ＰＡ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  ＣＬＰ−２１１９），
６−フルオレセイン−ＣＥ−ＰＡ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ  １０−１９６４）および
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ＣＰＧ（Ｐｒｏｌｉｇｏ  １０００Ａ  Ｍ４０１０１０）
本発明方法に有用なさらなる化合物および参照化合物ならびに中間体の構造を図１２に示す。
【０１８５】
２．本発明方法に有用な化合物を用いる細胞標識化
【０１８６】
【表６−１】
0006302560.tif 000017
【０１８７】
【表６−２】
0006302560.tif 000018
【０１８８】
【表７−１】
0006302560.tif 000019
【０１８９】
【表７−２】
0006302560.tif 000020
【０１９０】
実施例３：細胞の固定化に関する実験の結果
下記を以下の化合物のモジュール型記載に適用する：
Ｘ＝疎水性部分，Ｙ＝ＰＥＧ２０００，Ｚ＝ビオチン−ＴＥＧ，Ｆ＝Ｆｌｕｏｓ＝フルオレセイン
下記の実験において細胞の回収率を決定した。
【０１９１】
【表８−１】
0006302560.tif 000021
【０１９２】
【表８−２】
0006302560.tif 000022
【０１９３】
【表８−３】
0006302560.tif 000023
【０１９４】
【表８−４】
0006302560.tif 000024
【０１９５】
【表８−５】
0006302560.tif 000025
【０１９６】
【表８−６】
0006302560.tif 000026
【０１９７】
【表８−７】
0006302560.tif 000027
【０１９８】
【表８−８】
0006302560.tif 000028
【０１９９】
【表８−９】
0006302560.tif 000029
【０２００】
【表８−１０】
0006302560.tif 000030
【０２０１】
【表８−１１】
0006302560.tif 000031
【０２０２】
【表８−１２】
0006302560.tif 000032
【０２０３】
【表８−１３】
0006302560.tif 000033
【０２０４】
【表８−１４】
0006302560.tif 000034
【０２０５】
【表８−１５】
0006302560.tif 000035
【０２０６】
【表８−１６】
0006302560.tif 000036
【０２０７】
【表８−１７】
0006302560.tif 000037
【０２０８】
【表８−１８】
0006302560.tif 000038
【０２０９】
【表８−１９】
0006302560.tif 000039
【０２１０】
【表８−２０】
0006302560.tif 000040
【０２１１】
【表８−２１】
0006302560.tif 000041
【０２１２】
【表８−２２】
0006302560.tif 000042
【０２１３】
【表８−２３】
0006302560.tif 000043
【０２１４】
【表８−２４】
0006302560.tif 000044
【０２１５】
【表８−２５】
0006302560.tif 000045
【０２１６】
【表９−１】
0006302560.tif 000046
【０２１７】
【表９−２】
0006302560.tif 000047
【０２１８】
【表９−３】
0006302560.tif 000048
【０２１９】
【表９−４】
0006302560.tif 000049
【０２２０】
【表９−５】
0006302560.tif 000050
【０２２１】
Ｃ）プレートのウェルまたは細胞のいずれかを本発明方法に有用な分子で前処理した際に得られた結果の比較
下記に示すように、異なるインキュベーション時間、実験を実施した：
【０２２２】
【表１０−１】
0006302560.tif 000051
【０２２３】
【表１０−２】
0006302560.tif 000052
【０２２４】
【表１０−３】
0006302560.tif 000053
【０２２５】
【表１０−４】
0006302560.tif 000054
【０２２６】
【表１０−５】
0006302560.tif 000055
【０２２７】
Ｄ）例示的化合物ビオチン−ＰＥＧ−ｌｙｓ−（Ｃ１４）２についての回収率の決定：
化合物ビオチン−ＰＥＧ−ｌｙｓ−（Ｃ１４）２について下記の回収率が決定された：
Ｍ＝２７０８，９０ｇ／ｍｏｌ
５，４ｍｇ／１０ｍｌ  ＥｔＯＨ
ｃ＝ｎ／Ｖ＝ｍ／Ｍ＊Ｖ
ｃ＝５，４ｇ／（２７０８，９ｇ／ｍｏｌ＊１０  ｌ）＝１，９９  １０ｅ−４ｍｏｌ／ｌ
１，９９＊１０ｅ−４ｍｏｌ／ｌ＝７，９６ｎｍｏｌ／４μｌ
４μｌ＝４，５＊１０ｅ６細胞
→１，７７ｎｍｏｌ／１０ｅ６細胞
この実験における回収率：８５，７２％
実施例４：本発明方法に有用な１つの疎水性部分を含む化合物と２つの疎水性部分を含む化合物との比較
この実験の目的：ストレプトアビジン−コートした表面への本発明方法に有用な異なる分子を用いる白血球固定化の試験。特に、単一コレステロール−分子および異なる二重リンカー分子（すなわち、２つの疎水性部分を含むもの）の性能を試験した。詳細には、ストレプトアビジン−コートした表面への異なるリンカー分子を用いる白血球（ＷＢＣ）の固定化を、１２−ウェルプレートで試験した：３０００００  ＷＢＣ／ウェル。これに続いて、細胞の固定化および洗浄の後の細胞回収率をＣｅｌｌａｖｉｓｔａ計測器（１０ｘＮｕｃｌｅｉ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｓ９ｓ５）により測定した。
【０２２８】
【表１１−１】
0006302560.tif 000056
【０２２９】
【表１１−２】
0006302560.tif 000057
【０２３０】
【表１１−３】
0006302560.tif 000058
【０２３１】
【表１１−４】
0006302560.tif 000059
【０２３２】
【表１１−５】
0006302560.tif 000060
【０２３３】
実施例５：本発明方法に有用な化合物を用いる細胞安定化
本発明方法に有用な化合物が細胞の安定化および固定化に及ぼす効果を判定した。
Ａ）異なる分子を用いた遠心分離および細胞固定化の後のＷＢＣ回収率
図１４に示すように、分子プローブＨＨ１７４９＊、ＨＨ１７５０＊およびＨＨ１７５５＊（＊  ビオチン−ＰＥＧ−リジン−（Ｃ１８）２）は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す：分子の濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。遠心分離特性：１０分、３００×ｇ。図１５から分かるように、分子プローブＨＨ１７４９＊、ＨＨ１７５０＊およびＨＨ１７５５＊は、異なる濃度での細胞固定化率に関して異なる性能を示す。リンカー濃度が高いほど、細胞固定化率は高くなる。
【０２３４】
Ｂ）異なる化合物を用いた遠心分離後のＷＢＣ回収率−異なる時点
図１６から分かるように、分子ＡおよびＢ（Ａ：コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ；Ｂ：ビオチン−ＰＥＧ−リジン−（Ｃ１８）２）は遠心分離後の回収率に関して異なる性能を示す。分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。分子Ｂは３．５時間以内は細胞を固定化できる。遠心分離特性：１０分、３００×ｇ。Ａ：コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ。Ｂ：ビオチン−ＰＥＧ−リジン−（Ｃ１８）２。
【０２３５】
Ｃ）遠心分離後のＷＢＣ回収率−異なる実験者
図１７から分かるように、分子濃度が高いほど、遠心分離後の細胞回収率は高くなる。さらに、細胞安定化は実験者とは無関係である。遠心分離特性：１０分、３００×ｇ。分子：コレステリル−ＴＥＧ−コレステリル−ＴＥＧ−（スペーサーＣ１８）７−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ。
【０２３６】
Ｄ）遠心分離後のＷＢＣ回収率−異なる時点および遠心分離設定
第１実験の結果を図１８に示す。下記の分子を試験した：
・  １２３４：  ５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’
・  １２４８：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ  １２５４：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  １２５５：  ３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる
・  ＰＢＳ中におけるＷＢＣは３００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける
・  分子１２３４は最良の性能を示し、化合物１２５５および１２５４がそれに続く。
【０２３７】
遠心分離特性：２０分、３００×ｇ。
これに関する第２実験の結果を図１９に示す。下記の分子を試験した：
１２５５：  ３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ  １２３４：  ５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’
１２４８：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
１２５４：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
結果は下記のとおりである：
・  すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる
・  ＰＢＳ中におけるＷＢＣは５００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける
・  分子１２３４は最良の性能を示し、分子１２５５および１２５４がそれに続く。
【０２３８】
遠心分離特性：２０分、５００×ｇ。これに関する第３実験の結果を図２０に示す。下記の分子を試験した：
・  １２５５：  ３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  １２３４：  ５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’
・  １２４８：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  １２５４：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
結果は下記のとおりである：
・  すべての分子が２時間以内は細胞を固定化できる
・  ＰＢＳ中におけるＷＢＣは１０００×ｇで２０分間の遠心分離に際して損傷を受ける
遠心分離特性：２０分、５００×ｇ。
【０２３９】
Ｅ）遠心分離後のジャーカット回収率−異なる時点
この実験の結果を図２１に示す。下記の分子を試験した：
・  １２５５：  ３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  １２３４：  ５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’
・  １２４８：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
・  １２５４：  ３’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
結果は下記のとおりである：
・  ジャーカット培養細胞は、ＰＢＳ中および異なる分子を用いた遠心分離プロセスに際して５．５時間以内は安定である
遠心分離特性：２０分、５００×ｇ。
【０２４０】
Ｆ）３官能性リンカー部分は細胞生存性に影響を及ぼさない
これに関する第１実験の結果を図２２ＡおよびＢに示す。
３官能性リンカー部分が異なる、本発明方法に有用な異なる化合物を用いて、ＷＳＴ−１増殖キット（ＲＡＳ）を用いる細胞生存性試験を実施した。
【０２４１】
⇒図２２から分かるように、これらの異なるリンカーは４時間のリンカーインキュベーション時間中に細胞生存性に影響を及ぼさない。
これに関する第２実験の結果を図２３ＡおよびＢに示す。本発明方法に有用な被験分子（Ｎｏ．１２４４および１２７４）は、４．５時間のリンカーインキュベーション時間中に細胞形態に影響を及ぼさないことが見出された。
【０２４２】
Ｇ）本発明方法に有用な分子とのインキュベーションを行なわない場合の細胞形態−異なる時点
この実験の結果を図２４に示す。下記のことが見出された：
・  本発明方法に有用な分子を添加しない場合、細胞は４．５時間のインキュベーション時間中に離散する
・  インキュベーション時間中に残った細胞の細胞形態は影響を受けていない。
【０２４３】
Ｈ）遠心分離後のＭＤＡ−ＭＢ４６８回収率−異なる時点
この実験の結果を図２５に示す。本発明方法に有用な下記の分子を試験した：
・  １２３４：  ５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−スペーサーＣ１８−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−３’
・  １２５５：  ３’−（ミリスチン酸）２−ＰＥＧ２０００−ｄＴ−ビオチン−ＴＥＧ−５’  ＩＮＶＥＲＳ
下記のことが見出された：
・  ＭＤＡ−ＭＢ４６８培養細胞は、ＰＢＳ中における、および本発明方法に有用な異なる分子を用いた遠心分離プロセスに際して、５時間以内は安定である
遠心分離特性：２０分、５００×ｇ。
【０２４４】
実施例６：本発明方法に有用な化合物と共にインキュベートしたＳＡ−プレート（ストレプトアビジン−プレート）と本発明方法に有用な化合物と共にインキュベートしたＷＢＣ（白血球）との比較
出発物質として５’−（コレステリル−ＴＥＧ）２−ＰＥＧ２０００−Ｆｌｕｏｓ−ビオチン＿ＴＥＧ−３’  ＩＮＶＥＲＳ（１４５３０ｐｍｏｌ／μｌ）（社内参照Ｎｏ．：２９．８９１２５０）、およびストレプトアビジン処理したＭＴＰ（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ）、１２ウェルプレートを用いた。
【０２４５】
赤血球溶解を下記に従って実施した：
−ＥＤＴＡ−全血５９．４２３  ６．４００  ＷＢＣ／μｌ（Ａｍｂｕｌａｎｚ  Ｒｏｃｈｅ）
細胞溶解緩衝液：１００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ＋５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋０，５ｍＭ  ＫＨＣＯ３＋０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｋ
Ｃａ  １×８ｍｌの全血を細胞溶解緩衝液と共に５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに充填し、室温で１０分間インキュベートした。
【０２４６】
２５０ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを反復ピペッティングにより細胞溶解緩衝液に再懸濁した；５０ｍｌまで細胞溶解緩衝液を充填した。
２５０ｇで１５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳで再懸濁し、５０ｍｌまでＰＢＳを充填し、２５０ｇで１５分間遠心分離し、５０ｍｌまでＰＢＳを充填した。
【０２４７】
ＷＢＣをＳｙｓｍｅｘで測定した。
１：３７．１００のＷＢＣ／μｌ
−  プレート上での実験のデザインを以下に説明する（参照：図２）：
３×１２ウェル  ＭＴＰ：本発明方法に有用な化合物によるＷＢＣの処理：
４×判定：
横列Ａ：２００μｌのＰＢＳを導入し、それぞれ１ｎｍｏｌの化合物をそれに添加し、混合し、約３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、８００μｌのＰＢＳを導入し、３００．０００のＷＢＣ（非処理）を添加した；
横列Ｂ：８００μｌのＰＢＳを導入し、３００．０００のＷＢＣ（非処理）を添加した；
横列Ｃ：１ｍｌ中の１０×１０＾６のＷＢＣを１０ｎｍｏｌの本発明方法に有用な化合物と共に１０分間インキュベートし、それぞれ８００μｌのＰＢＳ／ウェル、３００．０００の処理済みＷＢＣを導入した。
【０２４８】
−第１  ＭＴＰプレートを３０分後にＰＢＳで２回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔを積層し、１５分間インキュベートした。＞  Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ（Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｓ９ｓ５）測定した。
【０２４９】
−第２プレートを９０分後に測定した。
−第３プレートを１５０分後に測定した。
計算した結果を図３に示す。これらの結果を表わすグラフを図４に示す。実験のプレートを図５に示す。
【０２５０】
本発明の方法は明らかに予想外に有利であることが分かった。
【図１】
0006302560.tif 000061
【図２】
0006302560.tif 000062
【図３】
0006302560.tif 000063
【図４】
0006302560.tif 000064
【図５】
0006302560.tif 000065
【図６−１】
0006302560.tif 000066
【図６−２】
0006302560.tif 000067
【図６−３】
0006302560.tif 000068
【図６−４】
0006302560.tif 000069
【図６−５】
0006302560.tif 000070
【図７−１】
0006302560.tif 000071
【図７−２】
0006302560.tif 000072
【図８−１】
0006302560.tif 000073
【図８−２】
0006302560.tif 000074
【図９−１】
0006302560.tif 000075
【図９−２】
0006302560.tif 000076
【図１０】
0006302560.tif 000077
【図１１】
0006302560.tif 000078
【図１２−１】
0006302560.tif 000079
【図１２−２】
0006302560.tif 000080
【図１２−３】
0006302560.tif 000081
【図１２−４】
0006302560.tif 000082
【図１２−５】
0006302560.tif 000083
【図１２−６】
0006302560.tif 000084
【図１３】
0006302560.tif 000085
【図１４】
0006302560.tif 000086
【図１５】
0006302560.tif 000087
【図１６】
0006302560.tif 000088
【図１７】
0006302560.tif 000089
【図１８】
0006302560.tif 000090
【図１９】
0006302560.tif 000091
【図２０】
0006302560.tif 000092
【図２１−１】
0006302560.tif 000093
【図２１−２】
0006302560.tif 000094
【図２２−１】
0006302560.tif 000095
【図２２−２】
0006302560.tif 000096
【図２３】
0006302560.tif 000097
【図２４】
0006302560.tif 000098