(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）アルコール脱水素酵素であって、配列番号３６で表されるアミノ酸配列において
Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換；
Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換；
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９ＶａｌおよびＰｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせ；
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせ；
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせ；
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌの組み合わせ；
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｇｌｙの組み合わせ；または
置換Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｓｅｒの組み合わせ
を有する前記アルコール脱水素酵素。
【請求項２】
アルコール脱水素酵素が、補因子としてＮＡＤＨを使用する、またはＮＡＤＰＨ補因子と比較してＮＡＤＨ補因子に対する特異性が増加している、請求項１に記載のアルコール脱水素酵素。
【請求項３】
アルコール脱水素酵素が、少なくとも１つの第二の基質と比較して、少なくとも１つの第一の基質に対する特異性が増加しており、前記少なくとも１つの第一の基質と少なくとも１つの第二の基質が以下：
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がＭＥＫである；
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がアセトインである；
第一の基質がＭＥＫであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がＭＥＫであり、第二の基質がアセトインである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がアセトンである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がＭＥＫである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がアセトンである；
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がアセトインである；および
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がＭＥＫである
からなる群から選択される、請求項１または２に記載のアルコール脱水素酵素。
【請求項４】
配列番号３８、配列番号４２、配列番号４８、配列番号５０、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルコール脱水素酵素。
【請求項５】
請求項１に記載のアルコール脱水素酵素をコードする核酸。
【請求項６】
配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４９、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０の配列を含む、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項８】
請求項５または７に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項９】
発酵によって、イソプロパノール；２，３−ブタンジオール；エタノール；２−ブタノールから選ばれる１つまたはそれ以上の生成物；および場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産することができる、請求項５または７に記載の１つまたはそれ以上の核酸を含む組換え微生物。
【請求項１０】
発酵によって、アセトイン；ＭＥＫ；アセトアルデヒド；アセトンから選ばれる１つまたはそれ以上の生成物；および場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産することができる、請求項５または７に記載の１つまたはそれ以上の核酸を含む組換え微生物。
【請求項１１】
細菌、古細菌および真菌を含む群から選ばれる、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、クロストリジウム・コスカチイ（Clostridium coskatii）、クロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、ブチリバクテリウム・リモサム（Butyribacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチィ（Alkalibaculum bacchii）、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（Moorella thermautotrophica）、オキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）およびサーモアナエロバクター・キウヴィ（Thermoanaerobacter kiuvi）を含む群から選択されるカルボキシド栄養性アセトゲンである、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutylicum）、およびクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）を含む群から選択されるＡＢＥ発酵微生物である、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含む群から選択される、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか１項に記載の微生物を用いた基質の微生物発酵によって、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノール、２−ブタノール、アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトンの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するための方法。
【請求項１６】
少なくとも、
（ａ）本発明の１つまたはそれ以上の微生物の培養物を含有するバイオリアクタに基質を供給する工程；および
（ｂ）１つまたはそれ以上の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で培養物を発酵させる工程
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
基質が、ＣＯ、ＣＯ2およびＨ2の１つもしくはそれ以上を含む基質、ならびに／または１つもしくはそれ以上の炭水化物を含む基質から選ばれる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
基質がＣＯを含む基質を含み、方法が
（ａ）ガスが大気中に放出される前に、産業プロセスの結果として生産されるＣＯ含有ガスを捕捉する工程；
（ｂ）培養物によって１つまたはそれ以上の生成物を生産するために、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵を行う工程であって、培養物が、１つまたはそれ以上のカルボキシド栄養性アセトゲン微生物を含む工程
を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型アルコール脱水素酵素、該酵素を含む微生物、および微生物発酵によって１つまたはそれ以上の生成物を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた発酵によるエタノールまたはブタノールなどのアルコール類の生産は周知であり、工業的に何世紀にもわたって使用されてきた。歴史的には、エタノール発酵が最も大きいプロセスである。アセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵は、２番目に大きい発酵プロセスとして考えられ［Duerre P: Production of solvents. In: Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005: 671-696］、中国のような国々の現在の生産能力は百万トンを超えている［Ni Y and Sun Z: Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium acetobutylicum in China. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 83: 415-423］。ブタノールは、通常、溶媒またはバイオ燃料として使用され、一方、アセトンは、望ましくない副生成物として考えられている［Duerre P: Production of solvents. In: Handbook on Clostridia, CRC Press, 2005: 671-696］。クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）の少数の単離株は、第二級アルコール脱水素酵素により、アセトンの代わりにイソプロパノールを生産することが知られている［George HA, Johnson JL, Moore WEC, Holdeman LV, Chen JS: Acetone, isopropanol, and butanol production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl Environ Microbiol 45: 1160-1163］。イソプロパノールはブタノールと類似した特性を有し、アセトンよりも有益である。しかしながら、還元はあまり効率的ではなく、それぞれのクロストリジウム・ベイジェリンキ株は良好な力価を生じさせず、有用な生産株として考えられていない。
【０００３】
昨今、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来の第二級アルコール脱水素酵素を用いたイソプロパノール生産のために代謝的に遺伝子操作されている［Lee et al, 2012: Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 78: 1416-1423］が、高効率のアルコール脱水素酵素が、このプロセスを最適化するために必要とされる。
【０００４】
ＡＢＥ発酵の挑戦は、すべての既知の生物が糖またはデンプンベースの基質に依存しているということである。アセトンおよびイソプロパノール（isoproanol）などの化学製品の生産に適した多くの炭水化物供給原料のコストは、ヒトの食品または動物飼料としての原料の価値によって影響を受け、このような生産のためのデンプンまたはスクロースを生産する作物の栽培は、すべての地理において経済的に持続可能とは限らない。したがって、より低コストおよび／またはより豊富な炭素資源を、アセトンおよびイソプロパノールなどの有用な化学製品に変換するための技術を開発することは興味深い。
【０００５】
ＣＯは、石炭またはオイルなどの有機材料、およびオイル由来の製品の不完全燃焼の主要な自由エネルギーが豊富な副生成物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼業界は、年間５０万トンを超えるＣＯを生産し、大気中に放出することが報告されている。密接に関連する微生物であるクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）などのアセトゲン生物は、唯一のエネルギーおよび炭素源としてＣＯまたはＣＯ２／Ｈ２含有ガス上で化学独立栄養的に増殖し得て、酢酸塩、エタノールまたは２，３−ブタンジオールなどの生成物を合成するが、アセトンおよびイソプロパノールは合成しない［Munasinghe PC, Khanal SK: Biomass-derived syngas fermentation into biofuels: Opportunities and challenges. Bioresource Technol 2010, 5013-22］。
【０００６】
最近、イソプロパノールの生産は、スイッチグラス由来の合成ガスからの１００Ｌのパイロットスケールの発酵装置中のクロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）（クロストリジウム属（Clostridium）株のＰ１１）に関する研究において報告された［Kundiyana DK, Huhnke RL, Wilkins MR: Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor: Design and process considerations. J Biosci Bioeng 2010, 109: 492-498］。しかしながら、同じ研究室の関連研究は、これは、使用される合成ガス中の汚染に起因するものであり、その理由は２０％のアセトンを含有するガス浄化混合物を通過させたためであることを示した［Ramachandriya KD: Effect of biomass generated producer gas, methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain P11. Masters thesis, Oklahoma State University 2009; Ramachandriya KD, Wilkins MR, Delorme MJM, Zhu X, Kundiyana DK, Atiyeh HK, Huhnke RL: Reduction of acetone to isopropanol using producer gas fermenting microbes. Biofuels Environ Biotechnol, 2011, epub］。しかしながら、著者は、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）（クロストリジウム属（Clostridium）株のＰ１１）によるアセトンからイソプロパノールへの還元を確認し、第二級アルコール脱水素酵素の存在を推測したが、いずれの証拠も見出されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術の欠点の１つもしくはそれ以上を克服すること、または少なくとも、有用な選択肢を公衆に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、イソプロパノールおよび／もしくはＣＯからの１つもしくはそれ以上の他の生成物の生産、またはアセトン−ブタノール−エタノール（ＡＢＥ）発酵からイソプロパノール−ブタノール−エタノール（ＩＢＥ）発酵への改良、または例えば２−ブタノールへのＭＥＫの変換に使用することができるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）における新規な第一級：第二級アルコール脱水素酵素を同定し、特異的突然変異誘発によって、基質および／または補因子特異性などの酵素の特性を最適化した。
【０００９】
本発明の一態様において、少なくとも１つの第二の基質と比較して、少なくとも１つの第一の基質に対する特異性が増加しているアルコール脱水素酵素が提供され、ここで、少なくとも１つの第一の基質と少なくとも１つの第二の基質が以下：
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がＭＥＫである；
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がアセトンであり、第二の基質がアセトインである；
第一の基質がＭＥＫであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がＭＥＫであり、第二の基質がアセトインである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がアセトンである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がＭＥＫである；
第一の基質がアセトインであり、第二の基質がアセトアルデヒドである；
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がアセトンである；
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がアセトインである；および
第一の基質がアセトアルデヒドであり、第二の基質がＭＥＫである
からなる群から選択され；
ここで、アルコール脱水素酵素は、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、少なくとも１つまたはそれ以上の変異を含む。
【００１０】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、２つまたは３つの第二の基質と比較して、１つ、２つまたは３つの第一の基質に対する特異性が増加している。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、１つ、２つまたは３つの第二の基質と比較して、２つまたは３つの第一の基質に対する特異性が増加している。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＮＡＤＰＨ補因子と比較してＮＡＤＨ補因子に対する特異性が増加しているアルコール脱水素酵素であって、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、少なくとも１つまたはそれ以上の変異を含むアルコール脱水素酵素を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、補因子としてＮＡＤＨを使用するアルコール脱水素酵素であって、補因子としてＮＡＤＰＨを使用する、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、少なくとも１つまたはそれ以上の変異を含むアルコール脱水素酵素を提供する。
【００１３】
特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよび／またはアセトアルデヒドおよび／またはアセトインと比較してアセトンに対する特異性が増加している。
【００１４】
特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、アセトンおよび／またはアセトアルデヒドおよび／またはアセトインと比較してＭＥＫに対する特異性が増加している。
【００１５】
特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、アセトンおよび／またはＭＥＫおよび／またはアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する特異性が増加している。
【００１６】
特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、アセトンおよび／またはＭＥＫおよび／またはアセトアルデヒドと比較してアセトインに対する特異性が増加している。
【００１７】
特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、基質としてアセトインを使用する能力が実質的にない。特定の一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、基質としてアセトインを使用する能力が実質的にないが、基質として、アセトン、ＭＥＫおよび／またはアセトアルデヒドを使用することができる。
【００１８】
一実施形態において、少なくとも１つの変異は、配列番号３６のアルコール脱水素酵素配列の位置Ｇｌｙ１９８、Ｓｅｒ１９９、Ａｒｇ２００、Ｐｒｏ２０１およびＴｙｒ２１８に対応するアミノ酸のうちの１つまたは組み合わせでのアミノ酸置換である。
【００１９】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、以下の変異：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１９８Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１９８Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１９８Ｖａｌ、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１９９Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ａｒｇ２００Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２０１Ａｓｐ、Ｐｒｏ２０１Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２１８ＡｌａおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの１つまたはそれ以上を含む。
【００２０】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、以下の変異：Ｔｙｒ２１８Ｇｌｙ、Ｔｙｒ２１８ＳｅｒまたはＴｙｒ２１８Ｖａｌの１つを含む。
【００２１】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含む。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含む。
【００２２】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含む。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９ＬｅｕおよびＰｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｇｌｙの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｓｅｒの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌの組み合わせを含む。
【００２３】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含み、１）ＭＥＫおよび／またはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含み、ＭＥＫおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。
【００２４】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。
【００２５】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９ＶａｌおよびＰｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含み、１）ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）ＭＥＫ、アセトンおよび／もしくはアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトンおよび／もしくはＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトンおよびアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトンおよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）ＭＥＫおよびアセトンおよびアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトンおよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。
【００２６】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。
【００２７】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、基質としてアセトインを使用する能力が実質的にない。
【００２８】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含み、補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、これらの置換のすべてを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加し；ならびに４）補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。
【００２９】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含み、補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、これらの置換のすべてを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに４）補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。
【００３０】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号３８に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４２に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５０に示される配列を有する。
【００３１】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４６に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４８に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５２に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６３に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６５に示される配列を有する。
【００３２】
第二の態様において、本発明は、本発明の第一の態様のアルコール脱水素酵素をコードする核酸を提供する。
【００３３】
ある種の実施形態において、核酸は、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４９、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０の配列を有する。他の実施形態において、核酸は、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号５１または配列番号５３の配列を有する。
【００３４】
第三の態様において、本発明は、本発明の第一の態様のアルコール脱水素酵素をコードする核酸を含む核酸ベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。一実施形態において、第一の態様のアルコール脱水素酵素をコードする核酸は、第二の態様の核酸である。
【００３５】
第四の態様において、本発明は、本発明の第二または第三の態様の核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００３６】
第五の態様において、本発明は、本発明の第二または第三の態様の１つまたはそれ以上の核酸を含む組換え微生物を提供する。
【００３７】
一実施形態において、微生物は、発酵によって、
イソプロパノール；
２，３−ブタンジオール；
エタノール；および
２−ブタノール
から選ばれる１つまたはそれ以上の生成物；
ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物
を生産することができる。
【００３８】
一実施形態において、微生物は、発酵によって、
アセトイン；
アセトアルデヒド；
ＭＥＫ；および
アセトン
から選ばれる１つまたはそれ以上の生成物；
ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物
を生産することができる。
【００３９】
一実施形態において、組換え微生物は、細菌、古細菌および真菌を含む微生物の群から選ばれる。
【００４０】
一実施形態において、組換え微生物は、クロストリジウム属（Clostridium）、アセトバクテリウム属（Acetobacterium）、ムーレラ属（Moorella）、ブチリバクテリウム属（Butyribacterium）、ブラウティア属（Blautia）、オキソバクター属（Oxobacter）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ザイモモナス属（Zymomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、リポミセス属（Lipomyces）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、エクソフィラ属（Exophila）、ムコール属（Mucor）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、クラディオフィラロフォラ属（Cladiophilalophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、オフィストマ属（Ophistoma）、バチルス属（Bacillus）、オリゴトロファ属（Oligotropha）、シュードモナス属（Pseudomonas）、カルボフィラス属（Carbophilus）、ヒドロゲノファーガ属（Hydrogenophaga）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ザバルジニア属（Zavarzinia）、カプラビダス属（Cupravidus）、セネコシスティス属（Senechocystis）、クロロフレクサス属（Chloroflexus）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロコッカス属（Methylococcus）、メチロミクロビウム属（Methylomicrobium）、メチロスフェラ属（Methylosphera）、メチロカルダム属（Methylocaldum）、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロサイナス属（Methylosinus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノゲニウム属（Methanogenium）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、メタノシェラ属（Methanoshera）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）、メタノトリックス属（Methanotrix）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノミセス属（Actinomyces）、バクテリオデス属（Bacteriodes）、バークホルデリア属（Burkholderia）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ピロコッカス属（Pyrococcus）、ゲオバクター属（Geobacter）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、サーマトガ属（Thermatoga）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ベイヨネラ属（Veillonella）、アクインコラ属（Aquincola）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、モラクセラ属（Moraxella）およびサイクロバクター属（Psychrobacter）から選ばれる。
【００４１】
一実施形態において、生物は、カルボキシド栄養性アセトゲン微生物の群、ＡＢＥ微生物の群、腸内細菌の群、ラクトバチルスの群、真菌および酵母の群、好気性カルボキシドトローフ（carboxydotroph）の群、好気性ＣＯ２固定生物の群、メチロトローフの群およびメタノゲンの群から選ばれる。
【００４２】
一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、クロストリジウム・コスカチイ（Clostridium coskatii）、クロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、ブチリバクテリウム・リモサム（Butyribacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチィ（Alkalibaculum bacchii）、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（Moorella thermautotrophica）、オキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）およびサーモアナエロバクター・キウヴィ（Thermoanaerobacter kiuvi）を含む群から選択されるカルボキシド栄養性アセトゲンである。一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）またはクロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）である。特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１またはＤＳＭ２３６９３である。特定の別の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００４３】
一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutylicum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）を含む群から選択されるＡＢＥ微生物である。一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）またはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）である。特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４（またはＤＳＭ７９２）である。特定の別の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２（ＡＴＣＣ５１７４３）である。
【００４４】
一実施形態において、微生物は、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ザイモモナス属（Zymomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）を含む群から選択される腸内細菌である。一実施形態において、微生物は、大腸菌（Eschericia coli）、ザイモノナス・モビリス（Zymononas mobilis）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、クレブシエラ・オクストカ（Klebsiella oxtoca）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）またはセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）である。
【００４５】
一実施形態において、微生物は、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）を含む群から選択されるラクトバチルスである。一実施形態において、微生物は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である。
【００４６】
一実施形態において、微生物は、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、リポミセス属（Lipomyces）を含む群から、およびアスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、エクソフィラ属（Exophila）、ムコール属（Mucor）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、クラディオフィラロフォラ属（Cladiophilalophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、オフィストマ属（Ophistoma）を含む群から選択される真菌または酵母である。一実施形態において、微生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジジア・トロピカリス（Candidia tropicalis）、カンジジア・アルビカンス（Candidia albicans）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である。一実施形態において、微生物は、アスパルギルス・ニガー（Aspargillus niger）またはトリクデルマ・レゼイ（Trichderma resei）である。
【００４７】
一実施形態において、微生物は、バチルス属（Bacillus）、オリゴトロファ属（Oligotropha）、シュードモナス属（Pseudomonas）、カルボフィラス属（Carbophilus）、ヒドロゲノファーガ属（Hydrogenophaga）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ザバルジニア属（Zavarzinia）を含む群から選択される好気性カルボキシドトローフである。一実施形態において、微生物は、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxydovorans）、カルボフィラス・カルボキシダス（Carbophilus carboxidus）、ヒドロゲノファーガ・シュードフラバ（Hydrogenophaga pseudoflava）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium sp.）、シュードモナス・カルボキシドヒドロゲナ（Pseudomonas carboxydohydrogena）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、ザバルジニア・コンプランソリス（Zavarzinia compransoris）またはバチルス・シュレゲリ（Bacillus schlegelii）である。
【００４８】
一実施形態において、微生物は、カプラビダス属（Cupravidus）、セネコシスティス属（Senechocystis）、クロロフレクサス属（Chloroflexus）を含む群から選択される好気性ＣＯ２固定生物である。一実施形態において、微生物は、カプラビダス・ネカトール（Cupravidus necator）、セネコシスティス属種（Senechocystis sp.）またはクロロフレクサス・アウランチカス（Chloroflexus auranticus）である。
【００４９】
一実施形態において、微生物は、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロコッカス属（Methylococcus）、メチロミクロビウム属（Methylomicrobium）、メチロスフェラ属（Methylosphera）、メチロカルダム属（Methylocaldum）、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロサイナス属（Methylosinus）を含む群から選択されるメチロトローフである。一実施形態において、微生物は、メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）またはメチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）である。
【００５０】
一実施形態において、微生物は、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノゲニウム属（Methanogenium）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、メタノシェラ属（Methanoshera）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）、メタノトリックス属（Methanotrix）を含む群から選択されるメタノゲンである。一実施形態において、微生物は、メタノサーモバクター・マルブルゲンシス（Methanothermobacter marburgensis）またはメタノサルシナ・バケリ（Methanosarcina bakeri）である。
【００５１】
第六の態様において、本発明は、本発明の第五の態様の微生物を用いた基質の微生物発酵によって、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するための方法を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、アセトイン、ＭＥＫ、アセトンおよびアセトアルデヒドの１つまたはそれ以上を生産するための方法を提供する。
【００５３】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）本発明の１つまたはそれ以上の微生物の培養物を含有するバイオリアクタに基質を供給する工程；および
（ｂ）イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で培養物を発酵させる工程
を含む。
【００５４】
一実施形態において、基質は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含む基質である。別の実施形態において、基質は、１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質である。
【００５５】
別の実施形態において、２つまたはそれ以上の異なる基質の組み合わせを使用してもよい。一実施形態において、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含む基質、ならびに１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質の組み合わせが使用される。
【００５６】
一実施形態において、基質はＣＯを含む基質であり、方法は、
（ａ）ガスが大気中に放出される前に、産業プロセスの結果として生産されるＣＯ含有ガスを捕捉する工程；
（ｂ）本発明の１つまたはそれ以上のカルボキシド栄養性アセトゲン微生物を含有する培養物によって、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵を行う工程
を含む。
【００５７】
本発明はまた、概して、本明細書において個々にまたは集合的に言及されたまたは指示された部分、要素および特徴、該部分、要素または特徴の２つまたはそれ以上のいずれかの組み合わせまたはすべての組み合わせにもあると言うことができ、本発明が関係する技術分野における既知の同等物を有する具体的な整数が本明細書に記述される場合、このような既知の同等物は、個々に明示されたかのように本明細書に組み込まれるとみなされる。
【００５８】
本発明のこれらの態様および他の態様は、すべてのその新規な態様で考察されるべきであり、以下の説明から明白となり、これは、添付する図面を参照して単なる一例として与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】野生型タンパク質は、大腸菌（E. coli）で発現させたとき、非常に可溶性であり、容易に精製することができたことを示す図である。試料（左から右）：総細胞抽出物；可溶性溶解物；分子量ラダー；カラム溶出画分１〜７。
【図２】Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ（左パネル）とＡｒｇ２００Ｇｌｎ（右パネル）変異タンパク質は非常に可溶性であったことを示す図である。Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ試料（左から右）：総細胞抽出物；ラダー；カラム洗浄物１；カラム洗浄物２；溶出画分１〜５。Ａｒｇ２００Ｇｌｎ試料（左から右）：総細胞抽出物；カラム洗浄物１；カラム洗浄物２；ラダー；溶出画分１〜５。
【図３】野生型タンパク質とＳｅｒ１９９Ａｓｐ変異体の活性を示す図である。Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ変異体は、アセトンを用いた野生型とほぼ同じ活性であった。
【図４】Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ変異体の相対的活性を示す図である。
【図５】変異体２（パネルＡ）、変異体７（パネルＢ）、変異体１０（パネルＣ）、変異体１１（パネルＤ）および変異体１３（パネルＥ）は可溶性であったことを示す図である。変異体２の試料（左から右）：総細胞抽出物、可溶性溶解物、カラム洗浄画分（１〜６）、分子量ラダー、カラム溶出画分（１〜６）。変異体７の試料（左から右）：総細胞抽出物、可溶性溶解物、カラム洗浄画分（１〜５）、分子量ラダー、カラム溶出画分（１〜７）。変異体１０の試料（左から右）：総細胞抽出物、可溶性溶解物、カラム洗浄画分（１）、分子量ラダー、カラム洗浄画分（２〜４）、カラム溶出画分（１〜５）。変異体１１の試料（左から右）：総細胞抽出物、可溶性溶解物、カラム洗浄画分（１〜３）、分子量ラダー、カラム溶出画分（１〜５）。変異体１３の試料（左から右）：総細胞抽出物、可溶性溶解物、カラム洗浄画分（１）、分子量ラダー、カラム洗浄画分（２〜３）、カラム溶出画分（１〜５）、分子量ラダー。
【図６】補因子としてＮＡＤＨおよび基質としてアセトンを用いた、野生型タンパク質ならびに変異体２、７、１０、１１および１３の活性を示す図である。変異体１１だけは、補因子としてＮＡＤＨを使用して、いずれかの有意な活性を有する。
【図７】アセトン（アセトンセット＝１）に標準化された様々な基質を用いた、野生型および変異型ＡＤＨ酵素の比活性を示す図である。各々の酵素について、好ましい補因子を用いた（すなわち、野生型ＡＤＨ、変異体２と変異体７についてはＮＡＤＰＨ；変異体１０と変異体１１についてはＮＡＤＨ）。
【図８】ＭＥＫ（２−ブタノン）（ＭＥＫセット＝１）に標準化された様々な基質を用いた、野生型および変異型ＡＤＨ酵素の比活性を示す図である。各々の酵素について、好ましい補因子を用いた（すなわち、野生型ＡＤＨ、変異体２と変異体７についてはＮＡＤＰＨ；変異体１０と変異体１１についてはＮＡＤＨ）。
【図９】アセトアルデヒド（アセトアルデヒドセット＝１）に標準化された様々な基質を用いた、野生型および変異型ＡＤＨ酵素の比活性を示す図である。各々の酵素について、好ましい補因子を用いた（すなわち、野生型ＡＤＨ、変異体２と変異体７についてはＮＡＤＰＨ；変異体１０と変異体１１についてはＮＡＤＨ）。
【図１０】アセトイン（アセトインセット＝１）に標準化された様々な基質を用いた、野生型および変異型ＡＤＨ酵素の比活性を示す図である。各々の酵素について、好ましい補因子を用いた（すなわち、野生型ＡＤＨ、変異体２と変異体７についてはＮＡＤＰＨ；変異体１０と変異体１１についてはＮＡＤＨ）。
【図１１】補因子としてＮＡＤＨとＮＡＤＰＨ、および対照（ＣＮＴＬ）を含む基質としてアセトンを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１野生型酵素の活性試験を示す図である。
【図１２】様々な基質を用いた、野生型Ａｄｈ酵素について測定された動力学、ＫＭ値および活性を示す図である。
【図１３】ｐＭＴＬ８５１４７−ＴｈｌＡ−ＣｔｆＡＢ−Ａｄｃ−Ａｄｈのプラスミドマップを示す図である。
【図１４】イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノールとエタノールへの発酵経路、およびアルコール脱水素酵素（ａｄｈ）の役割を示す図である。他の反応（ｒｅａｔｉｏｎ）：アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓ）、アセト乳酸脱炭酸酵素（ａｌｄｃ）、ジオール脱水酵素（ｐｄｄ）、アルデヒド脱水素酵素（ａｌｄ）、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ａｏｒ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）、チオラーゼ（ｔｈｌＡ）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下は、本発明の説明であり、一般論として示されたそれらの好ましい実施形態を含む。本発明はさらに、本発明を支持する実験データ、本発明の様々な態様の具体例および本発明を実施するための手段を提供している、本明細書において後述する「実施例」なる見出しに示されている開示によって明らかにされる。
【００６１】
本発明者（単数または複数）は、カルボキシド栄養性アセトゲン微生物由来のアルコール脱水素酵素の変異が、互いと比較して、基質アセトイン、メチルエチルケトン（ＭＥＫまたは２−ブタノン）、アセトンおよびアセトアルデヒドの１つまたはそれ以上に対するその特異性を増加することを予期せずに見出した。
【００６２】
さらに、本発明者らは、ＮＡＤＰＨに代えてまたはＮＡＤＰＨに加えて、補因子としてＮＡＤＨを受け入れることができる変異体を同定した。したがって、それは、これらの補因子の１つだけの利用可能性によって限定されず、生産形成の全体的な効率を高めるためのより豊富な細胞内ＮＡＤＨプールを用いることができる。
【００６３】
変異体（単数または複数）は、本発明の酵素が、別のものと比較して、１つの発酵最終生成物を優先的に生産するように適合され、ＮＡＤＰＨプール（Bennett & San, 2009）と比較して典型的には非常により大きなＮＡＤＨプールを利用可能にすることを意味する。ＡＢＥ発酵において、エタノールとアセトンの両方が生産され、ＩＢＥ発酵において、イソプロパノールが生産される（Kopke & Durre, 2011）。本発明は、アセトンのイソプロパノールへの還元を増加させることができ、またはアセトアルデヒドからエタノールへ、もしくはその反対と比較して、この反応を優先的に触媒させることができる。例えば、本発明は、すべての株が厳密にＮＡＤＰＨ依存性であり、アセトアルデヒドに対して高いバックグラウンド活性を有する、未修飾のアルコール脱水素酵素に依存するため、イソプロパノール生産の制限を克服するのを助けることができる。イソプロパノール生産のために遺伝子操作された大腸菌（E. coli）株は、同じ欠点と低収率を被り、この理由は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来の同じＮＡＤＰＨ依存性アルコール脱水素酵素が代替物なしに使用されるためである［Hanai T et al (2007) Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology 73:7814-8; Inokuma K et al (2010) Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. Journal of bioscience and bioengineering 110:696-701; Jojima T et al (2008) Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology 77:1219-24］。同様に、本発明は、従前は実行可能なレベルのイソプロパノールを生産することができないカルボキシド栄養性アセトゲン微生物によって一酸化炭素を含む基質からイソプロパノールを生産するための手段を提供する。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）またはＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）としてのいくつかのカルボキシド栄養性生物は、エタノールと２，３−ブタンジオールの両方を形成することができる（Kopke et al., 2011）。本発明はまた、アセトインの２，３−ブタンジオールへの還元を増加させることができ、またはアセトアルデヒドからエタノールへ、もしくはその反対と比較して、この反応を優先的に触媒させることができる。２，３−ブタンジオールは、ジオール脱水酵素によってＭＥＫに変換することができる（Toraya et al, 1976, Substrate specificity of coenzyme B12-dependent diol dehydrase - glycerol as both a good substrate and a potent inactivator. Biochem. Biophys. Res. Commun., 69: 475-80）。本発明は、ＭＥＫの２−ブタノールへの効果的な変換を可能にする。したがって、本発明はまた、より高い特異性でアセトインから２，３−ブタンジオールおよびＭＥＫから２−ブタノールを生産するための解決手段を提供する。
【００６４】
したがって、本発明は、とりわけ、アセトイン、メチルエチルケトン（ＭＥＫもしくは２−ブタノン）および／もしくはアセトアルデヒド基質のような他の基質と比較してアセトン基質に対する特異性が増加し、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトイン基質と比較してＭＥＫ基質に対する特異性が増加し、ＭＥＫ、アセトインおよび／もしくはアセトン基質と比較してアセトアルデヒド基質に対する特異性が増加し、ならびに／またはアセトン、ＭＥＫおよび／もしくはアセトアルデヒド基質と比較してアセトイン基質に対する特異性が増加しているアルコール脱水素酵素であって、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、少なくとも１つまたはそれ以上の変異を含むアルコール脱水素酵素、該アルコール脱水素酵素をコードする核酸、該核酸を含む核酸ベクター、基質の発酵によって、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、および場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産することができ、本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の核酸を含む微生物、ならびにイソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、および場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するための方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、基質としてアセトインを使用する能力が実質的にないアルコール脱水素酵素、このようなアルコール脱水素酵素をコードする核酸および核酸ベクター、該核酸または核酸ベクターを含む微生物、ならびにこのようなアルコール脱水素酵素を使用する方法を提供する。
【００６６】
語句「ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含む基質」は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上が、例えば、増殖および／または発酵のために微生物の１つまたはそれ以上の株に利用可能である任意の基質を含むものと理解されるべきである。基質は、１００％のＣＯ、ＣＯ２もしくはＨ２または他のガスと比較して大部分のＣＯ、ＣＯ２もしくはＨ２を含んでもよく、または２つもしくはそれ以上の該ガスの任意の比率で組み合わせられてもよいことが認識されるべきである。特定の実施形態において、基質は、ＣＯおよびＣＯ２の組み合わせを含む。別の実施形態において、基質は、ＣＯおよびＨ２の組み合わせを含む。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２およびＨ２の組み合わせを含む。別の実施形態において、基質は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の組み合わせを含む。
【００６７】
ある種の実施形態において、基質はＣＯ２を含み、任意の培養、増殖または発酵は、光（光合成）および／または電気（電気合成）の存在下で実施されてもよい。ある種の実施形態において、ＣＯ２はＯ２と組み合わせられる。
【００６８】
一実施形態において、「ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む基質」とは、「一酸化炭素を含む基質」である。「ＣＯを含む基質」および類似の用語は、一酸化炭素が、例えば、増殖および／または発酵のために微生物の１つまたはそれ以上の株に利用可能である任意の基質を含むものと理解されるべきである。
【００６９】
語句「一酸化炭素を含むガス状基質」ならびに類似の語句および用語は、あるレベルの一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。ある種の実施形態において、基質は、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％〜７０体積％のＣＯ、３０体積％〜６０体積％のＣＯ、および４０体積％〜５５体積％のＣＯを含有する。特定の実施形態において、基質は、約２５体積％、または約３０体積％、または約３５体積％、または約４０体積％、または約４５体積％、または約５０体積％のＣＯ、または約５５体積％のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。
【００７０】
ＣＯを含む基質は任意の水素を含有する必要がないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従う生成物形成に有害であるべきではない。特定の実施形態において、水素の存在は、アルコール生産の改善された全体的な効率をもたらす。例えば、特定の実施形態において、基質は、約２：１または１：１または１：２の比率のＨ２：ＣＯを含んでもよい。一実施形態において、基質は、約３０体積％以下のＨ２、２０体積％以下のＨ２、約１５体積％以下のＨ２または約１０体積％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質流は、低濃度のＨ２、例えば、５％未満、もしくは４％未満、もしくは３％未満、もしくは２％未満、もしくは１％未満を含み、または実質的に水素を含まない。基質はまた、幾分かのＣＯ２、例えば、約１体積％〜約８０体積％のＣＯ２、または１体積％〜約３０体積％のＣＯ２を含有してもよい。一実施形態において、基質は、約２０体積％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、基質は、約１５体積％以下のＣＯ２、約１０体積％以下のＣＯ２、約５体積％以下のＣＯ２を含み、またはＣＯ２を実質的に含まない。
【００７１】
本発明の特定の実施形態において、ＣＯ含有ガス状基質は、産業排ガスまたは産業廃棄ガスである。「産業廃棄ガスまたは産業排ガス」は、概して、産業プロセスによって生産されるＣＯを含む任意のガスを含み、鉄金属生成物製造、非鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生産およびコークス製造の結果として生産されるガスを含むと解釈されるべきである。さらなる例は、本明細書の他の箇所に示され得る。
【００７２】
一実施形態において、「ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む基質」とは、「ＣＯ２およびＨ２を含む基質」である。「ＣＯ２およびＨ２を含む基質」および類似の用語は、二酸化炭素および水素が、例えば、増殖および／または発酵のために微生物の１つまたはそれ以上の株に利用可能である任意の基質を含むものと理解されるべきである。
【００７３】
ＣＯ２およびＨ２を含有する基質は、典型的には、大部分を占めるＨ２を含有し、例えば、少なくとも約３０体積％のＨ２、または少なくとも４０体積％のＨ２、または少なくとも５０体積％のＨ２、または少なくとも６０体積％のＨ２、または少なくとも７０体積％のＨ２、または少なくとも８０体積％のＨ２、または少なくとも８５体積％のＨ２を含有する。
【００７４】
ガス状基質は、典型的には、少なくとも約１０体積％のＣＯ２、または少なくとも１５体積％のＣＯ２、または少なくとも２０体積％のＣＯ２、または少なくとも２５体積％のＣＯ２、または少なくとも３０体積％のＣＯ２、または少なくとも４０体積％のＣＯ２を含有する。
【００７５】
ある種の実施形態において、Ｈ２：ＣＯ２の比率は、約１：１または約２：１または約３：１である。
【００７６】
ある種の実施形態において、ＣＯ２およびＨ２を含む基質は、産業プロセスの副生成物として、またはいくつかの他の供給源から得られる廃棄ガスである。ＣＯ２排出量の最大の供給源は、世界的に、発電所、産業施設および他の供給源における石炭、オイルおよびガスなどの化石燃料の燃焼に由来する。
【００７７】
ガス状基質は、産業プロセスの副生成物として、または自動車の排出ガスなどのいくつかの別の供給源から得られるＣＯ２およびＨ２を含有する廃棄ガスであってもよい。ある種の実施形態において、産業プロセスは、水素製造、アンモニア製造、燃料の燃焼、石炭のガス化、ならびに石灰石およびセメントの生産からなる群から選択される。ガス状基質は、混和流を与えるために、１つまたはそれ以上のガス状基質を混和した結果であってもよい。Ｈ２またはＣＯ２に富んだ廃棄ガス流は、Ｈ２とＣＯ２の両方に富んだ廃棄ガス流よりも豊富であることは当業者に理解される。当業者は、ＣＯ２およびＨ２の所望の成分の１つを含む１つまたはそれ以上のガス流を混和することは、本発明の範囲内にあることを理解する。
【００７８】
水素に富んだガス流は、炭化水素の蒸気改良、具体的には、天然ガスの蒸気改良を含む様々なプロセスによって生産される。石炭または炭化水素の部分酸化もまた、水素に富んだガスの供給源である。水素に富んだガスの他の供給源は、水の電気分解、塩素を生産するために使用される電解セル、ならびに様々な精製装置および化学流からの副生成物を含む。
【００７９】
典型的に二酸化炭素に富んだガス流は、天然ガスまたはオイルなどの炭化水素の燃焼からの排出ガスを含む。二酸化炭素はまた、アンモニア、石灰またはリン酸塩の生産からの副生成物として生産される。
【００８０】
以下の説明において、本発明の実施形態は、「ＣＯを含有するガス状基質」または「ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含むガス状基質」の送達および発酵に関して説明されている。しかしながら、ガス状基質は、代替的形態で提供されてもよいことが認識されるべきである。例えば、ガス状基質は、液体中に溶解して提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素、二酸化炭素および／または水素を含有するガスで飽和され、次に、その液体をバイオリアクタに添加する。これは、標準的な方法を用いて達成されてもよい。例として、マイクロバブル分散発生装置（Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002）を用いることができる。さらなる例として、ＣＯを含有するガス状基質は、固体支持体に吸着されてもよい。このような代替的方法は、用語「ＣＯを含有する基質」、「ＣＯ２およびＨ２を含む基質」および「ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含む基質」ならびに類似の語句の使用によって包含される。
【００８１】
語句「１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質」および類似の用語は、１つまたはそれ以上の炭水化物が、例えば、増殖および／または発酵のために微生物の１つまたはそれ以上の株に利用可能である任意の基質を含むものと理解されるべきである。「炭水化物」は、概して、単糖、二糖、オリゴ糖および多糖、単炭水化物および複合炭水化物、例えばグルコース、フルクトース、糖蜜およびデンプンを含むと解釈されるべきである。
【００８２】
一実施形態において、「１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質」は、バイオマスから供給されてもよい。バイオマスは、いかなる性質のものであってもよく、例えば、森林または他の市販の作物（例えば、樹木、枝、切り株、木材チップ、おがくず、刈り取った草）、都市固形廃棄物、および微生物発酵による１つまたはそれ以上の生成物を生産するための原料を提供するように生長される作物、例えば、ススキ、スイッチグラス、麻、トウモロコシ、ポプラ、ヤナギ、ソルガム、サトウキビおよび竹などからの残留物を含む。
【００８３】
文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、本明細書中で使用される語句「発酵」、「発酵プロセス」または「発酵反応」などは、プロセスの増殖期と生成物生合成期の両方を包含することが意図される。本明細書においてさらに説明するように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第一の増殖リアクタと第二の発酵リアクタを含んでもよい。このようにして、発酵反応への金属または組成物の添加は、これらのリアクタのいずれかまたは両方への添加を含むものと理解されるべきである。
【００８４】
用語「バイオリアクタ」は、１つまたはそれ以上の容器および／もしくはタワーまたは配管からなる発酵デバイスを含み、連続撹拌槽型リアクタ（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクタ（ＩＣＲ）、トリクルベッドリアクタ（ＴＢＲ）、気泡カラム、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサーまたは気−液接触に適した他の容器もしくは他のデバイスが挙げられる。いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第一の増殖リアクタと第二の発酵リアクタを含んでもよい。このようにして、バイオリアクタまたは発酵反応への基質の添加について言及する際、必要に応じて、これらのリアクタのいずれかまたは両方への添加を含むものと理解されるべきである。
【００８５】
核酸「構築物」または「ベクター」という用語および類似の用語は、概して、遺伝物質を細胞に移入する媒体として使用するのに適したいずれもの核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を含むと解釈されるべきである。これらの用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターとしては、１つまたはそれ以上の調節因子、複製起点、マルチクローニング部位および／または選択マーカーが挙げられる。特定の一実施形態において、構築物またはベクターは、該構築物またはベクターによってコードされた１つまたはそれ以上の遺伝子を発現させるように適合されている。核酸構築物またはベクターは、裸の核酸を含み、ならびに細胞への送達を容易にするために１つまたはそれ以上の薬剤と調合された核酸（例えば、リポソームにコンジュゲートした核酸、核酸が含有される生物）も含む。ベクターは、核酸のクローニングまたは発現、および組換え微生物を生産するために微生物の形質転換に使用されてもよい。ベクターは、本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の核酸を含んでもよい。
【００８６】
「外因性核酸」は、それらが導入される微生物の外部を起源とする核酸である。外因性核酸は、いずれもの適切な供給源から得ることが可能であり、限定されないが、それらを導入しようとする微生物、それらを導入しようとする生物とは異なる微生物株もしくは種が挙げられ、またはそれらは、人工的に作出されたものでもよくまたは組換えによって作出されたものでもよい。別の実施形態において、外因性核酸は、それらを導入しようとする微生物中に天然には存在しない核酸配列を表し、微生物中に天然には存在しない生成物の発現を可能にする。外因性核酸は、それを導入しようとする微生物のゲノムに組み込まれるように適合されていてもよく、または染色体外の状態のままにするように適合されていてもよい。
【００８７】
「親微生物」は、本発明の微生物を作製するために用いられる微生物である。親微生物は、天然に存在している微生物（すなわち野生型微生物）、またはこれまでに修飾されているが、本発明の主題の１つもしくはそれ以上の酵素を発現もしくは過剰発現しない微生物であってよい。したがって、本発明の微生物は、親微生物において本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素を発現するように修飾されている。
【００８８】
本発明のアルコール脱水素酵素は、本明細書において、別の基質と比較して１つの基質に対する「特異性が増加」していると言及される。これは、アルコール脱水素酵素が、野生型アルコール脱水素酵素と比較して、別の基質と比べて１つの基質に対する特異性が増加していることを意味することが意図される。これはいくつかの実施形態において当てはまる場合もあるが、本発明のアルコール脱水素酵素が、野生型アルコール脱水素酵素と比較して特定の基質に対するより高い特異性を有することを必然的に推定するものと解釈されるべきではない。さらに、これはいくつかの実施形態において当てはまる場合もあるが、この用語は、本発明のアルコール脱水素酵素が、別の基質と比較して特定の基質に対する絶対的な特異性を有し、別の基質と比較して特定の基質に対して少なくとも優先性を含むことを意味すると解釈されるべきではない。
【００８９】
「特異性の増加」、「よい高い特異性」または類似の用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ補因子に関連して使用するとき、反応中に補因子がアルコール脱水素酵素に結合する親和性の程度を指す。これは当てはまる場合もあるが、アルコール脱水素酵素および補因子が、絶対的な特異性を有し、特定のアルコール脱水素酵素と別の補因子と比較した１つの補因子の間の結合に対する少なくとも優先性を含むことを意味すると解釈されるべきではない。
【００９０】
本明細書において、「イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールを含む１つまたはそれを超える生成物」の生産について言及される。しかしながら、追加の生成物もまた作製されてもよいことは認識されるべきである。
【００９１】
また、本明細書において、「アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトンを含む１つまたはそれ以上の生成物」の生産について言及され得る。本発明の変異型アルコール脱水素酵素の特異性が別の基質と比較して特定の基質に対して低減される場合のある種の実施形態において、これらの生成物はまた、本明細書において「基質」と呼ばれるが、一方、それは減少したレベルで下流生成物に変換され、または実質的に変換がおこらず、増加したレベルのアセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／またはアセトンが蓄積されるのを可能にする。例として、一実施形態において、本発明のアルコール脱水素酵素は、基質としてアセトインを使用する能力が実質的になく、そのため、アセトインは蓄積されてもよい。
【００９２】
さらに、いくつかの実施形態において、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上を含む、本明細書において言及される１つまたはそれ以上の生成物は、同じ発酵反応において、別々の発酵反応において、または化学合成によって、下流生成物にさらに変換される中間体または前駆体として使用されてもよいことは認識されるべきである。この場合において、特定の微生物における１つもしくはそれ以上の生成物の生産を検出できない場合があり、または小さなレベルの生産だけを検出することができる場合がある。しかしながら、１つまたはそれ以上の生成物の生産は、１つまたはそれ以上の下流生成物の生産に基づいて推定することができる。
【００９３】
本発明のある種の実施形態において、本発明のアルコール脱水素酵素は、「基質としてアセトインを使用する能力が実質的にない」。このことは、これが好ましい場合もあるが、酵素が、基質としてアセトインを使用する能力が絶対的にないことを必ずしも含意しない。一実施形態において、この語句は、約１％以下の野生型酵素の活性の寛容、または０．１秒−１ｍＭ−１未満のｋｃａｔ／ＫＭの酵素効率を含むと解釈されるべきである。
【００９４】
酵素
本発明者らは、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）由来のアルコール脱水素酵素（配列番号３６）の変異が、他の基質と比較して様々な基質に対する特異性を増加することを実証し、ある種の実施形態において、補因子特異性が改変または最適化され得ることを実証しているが、一方、本発明者らは、本発明が、他の生物由来の他のアルコール脱水素酵素に幅広く適用可能であり；具体的には、第一級または第二級アルコールに対する活性を有し、基質としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（ＥＣ１．１．１．１またはＥＣ１．１．１．２）を使用する任意のアルコール脱水素酵素に幅広く適用可能であることを企図している。
【００９５】
典型的には、本発明が適用可能であるアルコール脱水素酵素の群は、配列番号３６のアルコール脱水素酵素に対して少なくとも約６５％の配列同一性を有し、より具体的には少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する。
【００９６】
例として、本発明は、以下のアルコール脱水素酵素：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の第一級：第二級アルコール脱水素酵素（配列番号３６）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）の第一級：第二級アルコール脱水素酵素（ＹＰ＿００３７８０６４６．１）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）の第一級：第二級アルコール脱水素酵素（Ｐ２５９８４．２）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）の第一級：第二級アルコール脱水素酵素（ＡＢＣ５００９０．１）またはサーモアナエロビウム・ブロッキ（Thermoanaerobium brockii）の第一級：第二級アルコール脱水素酵素（Ｐ１４９４１．１）に適用することができる。
【００９７】
本発明のアルコール脱水素酵素は、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、少なくとも１つの変異を含む。一実施形態において、少なくとも１つの変異は、配列番号３６のアルコール脱水素酵素配列の位置Ｇｌｙ１９８、Ｓｅｒ１９９、Ａｒｇ２００、Ｐｒｏ２０１およびＴｙｒ２１８に対応するアミノ酸のうちの１つまたは組み合わせでのアミノ酸置換である。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号３６のアルコール脱水素酵素配列の位置Ｓｅｒ１９９に対応する位置でのアミノ酸置換である、少なくとも１つの変異を含む。当業者は、代替のアルコール脱水素酵素における関連する位置（配列番号３６のＡＤＨの位置１９８、１９９、２０１および２１８に対応する）を、当該技術分野において公知の標準的な手法に従って、その配列を配列番号３６のアルコール脱水素酵素の配列と整列させることによって、容易に認識する。
【００９８】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、以下の変異：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｇｌｙ１９８Ｉｌｅ、Ｇｌｙ１９８Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１９８Ｖａｌ、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１９９Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ａｒｇ２００Ｇｌｕ、Ｐｒｏ２０１Ａｓｐ、Ｐｒｏ２０１Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２１８ＡｌａおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの１つまたはそれ以上を含む。
【００９９】
本発明者らはまた、対応する野生型アルコール脱水素酵素と比較して、以下の変異：Ｔｙｒ２１８Ｇｌｙ、Ｔｙｒ２１８ＳｅｒおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌの１つを含む、本発明のアルコール脱水素酵素を想定する。これらの変異は、本明細書において後述する実施例の部に例示されたＴｙｒ２１８ＡｌａおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅ置換にサイズにおいてすべて近い置換を表す。
【０１００】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含む。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含む。
【０１０１】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含む。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９ＬｅｕおよびＰｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｇｌｙの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｓｅｒの組み合わせを含む。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌの組み合わせを含む。
【０１０２】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含み、１）ＭＥＫおよび／またはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ置換を含み、ＭＥＫおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。
【０１０３】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ置換を含み、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。
【０１０４】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９ＶａｌおよびＰｒｏ２０１Ｇｌｕの組み合わせを含み、１）ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）ＭＥＫ、アセトンおよび／もしくはアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトンおよび／もしくはＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトンおよびアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトンおよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）ＭＥＫおよびアセトンおよびアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトンおよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。
【０１０５】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／または２）アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。
【０１０６】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに／またはアセトアルデヒドおよび／もしくはアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに／または３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、ＭＥＫおよびアセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。別の実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。一実施形態において、置換のこの組み合わせを含むアルコール脱水素酵素は、基質としてアセトインを使用する能力が実質的にない。
【０１０７】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ａｌａの組み合わせを含み、補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、これらの置換のすべてを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加し；ならびに４）補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。
【０１０８】
別の実施形態において、アルコール脱水素酵素は、以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｐｈｅの組み合わせを含み、補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、これらの置換のすべてを含み、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し；ならびに２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し；ならびに３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し；ならびに５）補因子としてＮＡＤＨを使用することができる。
【０１０９】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号３８に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４２に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５０に示される配列を有する。
【０１１０】
一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４６に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号４８に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５２に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号５４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６３に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６４に示される配列を有する。一実施形態において、アルコール脱水素酵素は、配列番号６５に示される配列を有する。
【０１１１】
本発明のアルコール脱水素酵素は、当該技術分野において公知の任意の適切な手段、例えば、本明細書において後述する、部位特異的突然変異誘発技法、ランダム突然変異誘発技法、組換え法および化学合成などによって作製されてもよい。
【０１１２】
いくつかの場合において、本発明の変異型アルコール脱水素酵素は、自然には不溶性であってもよい。これらの酵素は、標準的な技法を用いて可溶性にすることができる。例として、１つまたはそれ以上のシャペロンの共発現を伴う技法を使用してもよい。特定の一実施形態において、ＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳのシャペロンの共発現が用いられる。特定の一実施形態において、プラスミドｐＧｒｏ７（Takara Bio, Inc; clontech.com/takara/NZ/Products/Protein_Research/Protein_Folding_and_Expression/Chaperone_Plasmid_Set）を使用することができる。このプラスミドは、ＧｒｏＥＬ／ＥＳシャペロンタンパク質のアラビノース誘導性発現を容易にする。例示的な技法はまた、本明細書において後述する実施例２に提供される。
【０１１３】
本発明のアルコール脱水素酵素（dehyrogenase）が適切な機能を有するかどうかは、あらゆる公知の方法を用いて評価することができる。しかしながら、例として、本明細書において後述する実施例に概説されている方法を用いてもよい。あるいは、Ismailら［Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J Bacteriol 1993, 175: 5097-5105］またはKhorkinら［NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases: crystal structure, cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs of Clostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii. J Mol Biol. 1998, 22: 278(5): 967-981］において概説されている方法は、酵素活性を評価するために使用されてもよい。
【０１１４】
補因子特異性は、標準的な方法を用いて評価することができる。しかしながら、例として、本明細書において後述する「実施例」の部に記載されている方法を用いてもよい。
【０１１５】
核酸
本発明が新規なアルコール脱水素酵素に関する限りにおいて、本発明はまた、アルコール脱水素酵素をコードする核酸およびこのような核酸を含む核酸ベクターを提供する。
【０１１６】
当業者は、酵素のアミノ酸配列および遺伝子コードの縮重を考慮して、本発明のアルコール脱水素酵素をコードする核酸の配列を容易に認識する。しかしながら、単なる一例として、一実施形態において、核酸は、配列番号３７の配列を有する。他の実施形態において、核酸は、配列番号４１または配列番号４９の配列を有する。さらに他の実施形態において、核酸は、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０の配列を有する。
【０１１７】
本発明のアルコール脱水素酵素をコードする核酸は、任意の特定の微生物について最適化されたコドンであってもよいことが認識されるべきである。
【０１１８】
本発明の核酸、アルコール脱水素酵素および微生物が、組換え技術を用いて作製され、使用されることができる程度に、本発明はまた、本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の核酸を含む核酸ベクターを提供する。
【０１１９】
本発明の核酸は、微生物の形質転換の際に染色体外のままでもよく、または微生物のゲノムへの組み込みのために適合されてもよい。したがって、本発明の核酸は、染色体外構築物の組み込み（例えば、宿主ゲノムへの相同組換えおよび標的化組み込みを可能にする領域）または染色体外構築物の安定な発現および複製（例えば、複製起点、プロモータおよび他の調節配列）を支援するよう適合された追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする核酸は、該核酸によってコードされた１つまたはそれ以上の酵素の発現を促進するように適合されたプロモータを含む。一実施形態において、プロモータは、好ましくは、適切な発酵条件下で非常に活性である構成的プロモータである。誘導性プロモータを使用することもできる。好ましい実施形態において、プロモータは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスタまたはアラビノース誘導性ｐＢＡＤプロモータを含む群から選択される。適切な発酵条件下での発現、好ましくは高レベルの発現を導くことができる他のプロモータは、例示された実施形態の代用として効果的であることは当業者に認識される。
【０１２１】
本発明の発現構築物／ベクターを含む核酸および核酸構築物は、当該技術分野において標準的なあらゆる技法を用いて構築することができる。例えば、化学合成、部位特異的突然変異誘発または組換え技法を用いてもよい。このような技法は、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に記載されている。さらなる例示的な技法は、本明細書において後述する実施例の部に記載されている。本質的に、個々の遺伝子および調節因子は、該遺伝子が発現し、所望のタンパク質を形成することができるように互いに作動可能に連結される。本発明における使用に適したベクターは、当業者に認識される。しかしながら、例として、以下のベクター：ｐＢＡＤまたはｐＭＴＬ８００００ベクター、および本明細書において後述する実施例の部において例示されるプラスミドが、好適であり得る。
【０１２２】
本発明はまた、本明細書に記載されている核酸のいずれか１つまたはそれ以上を含む、宿主生物、特に微生物を提供し、例えば、ウイルス、細菌および酵母が挙げられる。
【０１２３】
微生物
本発明はまた、基質の発酵によって、イソプロパノール、ＭＥＫ、２，３−ブタンジオールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産することができ、本発明の少なくとも１つの核酸を含む微生物を提供する。
【０１２４】
本発明の微生物は、親微生物に由来するアルコール脱水素酵素遺伝子に所望の変異（単数または複数）を導入するために、当該技術分野において公知のあらゆる技法、例えば、部位特異的突然変異誘発技法などを用いて、または親微生物に本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の核酸を導入するために、他の組換え技術を用いて、親微生物から調製されてもよい。
【０１２５】
一実施形態において、１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の外因性核酸が親微生物に導入され、親微生物に由来する１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素遺伝子を置換する。別の実施形態において、本発明の１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の外因性核酸が親微生物に導入され、親微生物に由来するアルコール脱水素酵素遺伝子に補足的である。他の実施形態において、１つまたはそれ以上の外因性核酸が親微生物に導入され、親微生物に由来する１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素遺伝子に１つまたはそれ以上の所望の変異を導入する。別の実施形態において、１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素をコードする１つまたはそれ以上の外因性核酸が親微生物に導入され、１つまたはそれ以上の変異が親微生物に由来する１つまたはそれ以上のアルコール脱水素酵素遺伝子に導入され、その発現および活性を低減させまたはノックアウトする。
【０１２６】
一実施形態において、本発明の微生物は、組換え技術を用いて親微生物から調製される。例えば、親微生物は、本発明のアルコール脱水素酵素をコードする１つもしくはそれ以上の外因性核酸、または親微生物における天然のアルコール脱水素酵素遺伝子に所望の変異を導入するように適合された１つもしくはそれ以上の核酸を用いて形質転換される。外因性核酸は、親微生物の形質転換の際に染色体外のままでもよく、または親微生物のゲノムに組み込まれてもよい（一実施形態において、天然のアルコール脱水素酵素遺伝子を置換し、または変異を天然のアルコール脱水素酵素遺伝子に導入する）。したがって、それらは、本明細書において上述されるように、染色体外構築物の組み込み（例えば、宿主ゲノムへの相同組換えおよび標的化組み込みを可能にする領域）または染色体外構築物の発現および複製（例えば、複製起点、プロモータおよび他の調節因子または配列）を支援するよう適合された追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２７】
単なる一例として、微生物の形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコールを媒介した形質転換、化学的または天然のコンピーテンスまたはコンジュゲーションによって達成することができる。好適な形質転換技法は、例えば、Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989に記載されている。
【０１２８】
１つまたはそれ以上の外因性核酸は、裸の核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換プロセスを容易にするために１つまたはそれ以上の薬剤と調合されてもよい（例えば、リポソームにコンジュゲートした核酸、核酸が含有される生物）。適切であるように、１つまたはそれ以上の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。制限阻害剤は、ある種の実施形態において使用することができる；例えば、Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412を参照されたい。）
【０１２９】
一実施形態において、親微生物は、細菌、古細菌および真菌である。
【０１３０】
一実施形態において、親微生物は、クロストリジウム属（Clostridium）、アセトバクテリウム属（Acetobacterium）、ムーレラ属（Moorella）、ブチリバクテリウム属（Butyribacterium）、ブラウティア属（Blautia）、オキソバクター属（Oxobacter）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ザイモモナス属（Zymomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、リポミセス属（Lipomyces）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、エクソフィラ属（Exophila）、ムコール属（Mucor）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、クラディオフィラロフォラ属（Cladiophilalophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、オフィストマ属（Ophistoma）、バチルス属（Bacillus）、オリゴトロファ属（Oligotropha）、シュードモナス属（Pseudomonas）、カルボフィラス属（Carbophilus）、ヒドロゲノファーガ属（Hydrogenophaga）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ザバルジニア属（Zavarzinia）、カプラビダス属（Cupravidus）、セネコシスティス属（Senechocystis）、クロロフレクサス属（Chloroflexus）、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロコッカス属（Methylococcus）、メチロミクロビウム属（Methylomicrobium）、メチロスフェラ属（Methylosphera）、メチロカルダム属（Methylocaldum）、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロサイナス属（Methylosinus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノゲニウム属（Methanogenium）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、メタノシェラ属（Methanoshera）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）、メタノトリックス属（Methanotrix）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノミセス属（Actinomyces）、バクテリオデス属（Bacteriodes）、バークホルデリア属（Burkholderia）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ピロコッカス属（Pyrococcus）、ゲオバクター属（Geobacter）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、パエニバチルス属（Paenibacillus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、サーマトガ属（Thermatoga）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ベイヨネラ属（Veillonella）、アクインコラ属（Aquincola）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、モラクセラ属（Moraxella）およびサイクロバクター属（Psychrobacter）から選ばれる。
【０１３１】
一実施形態において、親微生物は、カルボキシド栄養性アセトゲン微生物の群、ＡＢＥ微生物の群、腸内細菌の群、ラクトバチルスの群、真菌および酵母の群、好気性カルボキシドトローフの群、好気性ＣＯ２固定生物の群、メチロトローフの群およびメタノゲンの群から選ばれる。
【０１３２】
一実施形態において、親微生物は、カルボキシド栄養性アセトゲン細菌の群から選択される。ある種の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、クロストリジウム・コスカチイ（Clostridium coskatii）、クロストリジウム・アセチカム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、ブチリバクテリウム・リモサム（Butyribacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチィ（Alkalibaculum bacchii）、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（Moorella thermautotrophica）、オキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）およびサーモアナエロバクター・キウヴィ（Thermoanaerobacter kiuvi）を含む群から選択される。
【０１３３】
これらのカルボキシド栄養性アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ、酢酸塩および他の生成物を形成する嫌気的条件下で、エネルギー源として一酸化炭素（ＣＯ）および／または水素（Ｈ２）とともに、一酸化炭素（ＣＯ）および二酸化炭素（ＣＯ２）などのガス状一炭素（Ｃ１）供給源を利用し、化学独立栄養的に増殖するそれらの能力によって定義される。カルボキシド栄養性アセトゲンは、同じモードの発酵であるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌまたは還元アセチル−ＣｏＡ経路を共有し、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸脱水素酵素、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸還元酵素および一酸化炭素脱水素酵素／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）からなる酵素セットの存在によって定義され、これらの組み合わせは、特徴的であり、この種の細菌に固有である（Drake, Kusel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006）。基質をバイオマス、二次代謝物およびピルビン酸塩に変換し、それらから生成物が（アセチル−ＣｏＡを介してまたは直接的に）形成される糖発酵細菌の化学従属栄養的増殖とは対照的に、アセトゲンにおいて基質は、アセチル−ＣｏＡに直接的に導かれ、それから生成物、バイオマスおよび二次代謝物が形成される。
【０１３４】
一実施形態において、微生物は、種Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）および「Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）」ならびに関連する単離株を含むカルボキシド栄養性クロストリジウムのクラスタから選択される。これらには、限定されないが、株Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Abrini, Naveau, & Nyns, 1994）、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４２００）、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）（Tanner, Miller, & Yang, 1993）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）０−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）または「Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）Ｐ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）（ＷＯ２００８／０２８０５５）および関連する単離株、例えば、「Ｃ．コスカチイ（C. coskatii）（米国特許出願公開第２０１１／０２２９９４７号）、「クロストリジウム属種（Clostridium sp.）ＭＴ３５１」（Tyurin & Kiriukhin, 2012）およびその変異株、例えば、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）ＯＴＡ−１（Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010）または「クロストリジウム属種（Clostridium sp.）ＭＴ８９６」（Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012）が含まれる。
【０１３５】
これらの株は、クロストリジウムのｒＲＮＡクラスタＩ（Collins et al., 1994）内のサブクラスタを形成し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子レベルについて少なくとも９９％の同一性を有するが、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリント実験によって決定された異なる種である（ＷＯ２００８／０２８０５５、米国特許出願公開第２０１１／０２２９９４７号）。
【０１３６】
このクラスタの株は、共通の特徴によって定義され、類似した遺伝子型と表現型の両方を有し、それらはすべて、エネルギー保存および発酵代謝の同じモードを共有している。このクラスタの株はシトクロムを欠損し、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。
【０１３７】
このクラスタのすべての株は、約４．２Ｍｂｐ（Kopke et al., 2010）のゲノムサイズと約３２％モルのＧＣ組成（Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et al., 1993）（ＷＯ２００８／０２８０５５；米国特許出願公開第２０１１／０２２９９４７号）を有し、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素（一酸化炭素脱水素酵素、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸脱水素酵素、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸還元酵素および一酸化炭素脱水素酵素／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸塩：フェレドキシン酸化還元酵素、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（Kopke et al., 2010, 2011）をコードする本質的な主要な遺伝子オペロンを保存した。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の組織化および数は、ガス取り込みに関与し、核酸配列とアミノ酸配列における差異にもかかわらず、すべての種において同じであることが見出されている（Kopke et al., 2011）。
【０１３８】
株はすべて、類似した形態とサイズを有し（対数増殖細胞は０．５〜０．７×３〜５μｍの間である）、中等温度好性であり（最適な増殖温度は３０〜３７℃の間である）、厳密に嫌気性である（Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993）（ＷＯ２００８／０２８０５５）。さらに、それらはすべて、同じ主要な系統発生学的な形質を共有し、例えば、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適な初期ｐＨは５．５〜６である）、類似した増殖速度を有するＣＯ含有ガス上での強力な独立栄養的増殖、およびある種の条件下で形成される少量の２，３−ブタンジオールと乳酸を含む主な発酵最終生成物としてエタノールおよび酢酸を伴う代謝プロファイルが挙げられる（Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al., 1993）（ＷＯは、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用を弁別する）。これらの種のいくつかは、ある種のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して栄養要求性であり、一方、他はそうでないことが見出された。カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元は、これらの生物の範囲で示されている（Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012）。
【０１３９】
したがって、記載された形質は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）またはＣ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）のような１つの生物に特異的でないが、むしろ、カルボキシド栄養性のエタノール合成クロストリジウムに一般的な形質である。このようにして、本発明は、これらの株全体で作用することが期待され得るが、性能において相違する場合がある。
【０１４０】
一実施形態において、親株は、その単一炭素源およびエネルギー源としてＣＯを使用する。
【０１４１】
ある種の実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）およびクロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）を含む群から選択される。一実施形態において、群はまたクロストリジウム・コスカチイ（Clostridium coskatii）を含む。特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１またはＤＳＭ２３６９３である。特定の別の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【０１４２】
一実施形態において、親微生物は、ＡＢＥ発酵微生物である。「ＡＢＥ発酵微生物」または「ＡＢＥ微生物」は、溶媒であるブタノール、およびエタノール、およびアセトンまたはイソプロパノールを生産することができるグラム陽性クロストリジウム生物である。この群の属には、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutylicum）およびクロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）が含まれる。これらの生物は、すべて胞子形成し、グラム陽性であり、クロストリジウムのｒＲＮＡクラスタＩ内である。この群は、詳細には、Keisら（Keis, Shaheen, & Jones, 2001）によって記載されている。
【０１４３】
特定の一実施形態において、ＡＢＥ微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutylicum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）を含む群から選択される。
【０１４４】
一実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）またはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）である。特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４（ＤＳＭ７９２）またはＥＡ２０１８（ＣＣＴＣＣ  Ｍ９４０６１）である。特定の別の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２（ＡＴＣＣ５１７４３）およびＮＲＲＬ  Ｂ−５９３（ＤＳＭ６４２３）である。
【０１４５】
一実施形態において、親微生物は腸内細菌である。腸内細菌は、糖類を発酵させ、乳酸、および／またはエタノール、および／またはアセトイン、および／または２，３−ブタンジオール、および／または他の生成物を生産することができる腸内細菌科（Enterobacteriacea）の目に属する棒状のグラム陰性細菌である。
【０１４６】
特定の一実施形態において、腸内細菌は、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ザイモモナス属（Zymomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、大腸菌（Eschericia coli）、ザイモノナス・モビリス（Zymononas mobilis）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、クレブシエラ・オクストカ（Klebsiella oxtoca）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）またはセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）である。
【０１４７】
一実施形態において、親微生物はラクトバチルスである。ラクトバチルスは、糖類を発酵させ、乳酸、および／または２，３−ブタンジオール、および／またはＭＥＫ、および／または２−ブタノール、および／または他の生成物を生産することができるラクトバチルス（Lactobacillales）の目から選択されるグラム陽性乳酸細菌である。
【０１４８】
特定の一実施形態において、ラクトバチルスは、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である。
【０１４９】
一実施形態において、親微生物は、真菌または酵母である。真菌は真核微生物であり、酵母はその特定のサブセットであり、これらは、糖類を発酵させ、エタノールおよび／またはアセトイン、および／または他の生成物とすることができる。
【０１５０】
特定の一実施形態において、真菌は、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、エクソフィラ属（Exophila）、ムコール属（Mucor）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、クラディオフィラロフォラ属（Cladiophilalophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、オフィストマ属（Ophistoma）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、アスパルギルス・ニガー（Aspargillus niger）またはトリクデルマ・レゼイ（Trichderma resei）である。
【０１５１】
特定の一実施形態において、酵母は、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、リゾプス属（Rhizopus）、トリコスポロン属（Trichosporon）、リポミセス属（Lipomyces）を含む群から、およびアスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、エクソフィラ属（Exophila）、ムコール属（Mucor）、クラドスポリウム属（Cladosporium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、クラディオフィラロフォラ属（Cladiophilalophora）、ペシロミセス属（Paecilomyces）、スケドスポリウム属（Scedosporium）、オフィストマ属（Ophistoma）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジジア・トロピカリス（Candidia tropicalis）、カンジジア・アルビカンス（Candidia albicans）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である。一実施形態において、親微生物は、アスパルギルス・ニガー（Aspargillus niger）またはトリクデルマ・レゼイ（Trichderma resei）である。
【０１５２】
一実施形態において、親微生物は、好気性カルボキシドトローフである。好気性カルボキシドトローフは、天然において遍在することが見出され得る細菌であり、様々な環境、ならびにヒトから単離されている細菌である（King and Weber, 2007）。分類レベルでは、この生理学的な群は、非常に多様であり、α−プロテオバクテリア、ファーミキューテスまたは放線菌などの様々な門で構成されている（King and Weber, 2007）。すべてのこれらの生物は、空気の存在下においてＣＯレベル＞１％で増殖することが示された（King and Weber, 2007）。典型的なガス混合物は、５０％ＣＯおよび５０％空気からなる（Cypionka et al., 1980）。
【０１５３】
特定の実施形態において、親微生物は、バチルス属（Bacillus）、オリゴトロファ属（Oligotropha）、シュードモナス属（Pseudomonas）、カルボフィラス属（Carbophilus）、ヒドロゲノファーガ属（Hydrogenophaga）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ザバルジニア属（Zavarzinia）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Oligotropha carboxydovorans）、カルボフィラス・カルボキシダス（Carbophilus carboxidus）、ヒドロゲノファーガ・シュードフラバ（Hydrogenophaga pseudoflava）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium sp.）、シュードモナス・カルボキシドヒドロゲナ（Pseudomonas carboxydohydrogena）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、ザバルジニア・コンプランソリス（Zavarzinia compransoris）またはバチルス・シュレゲリ（Bacillus schlegelii）である。
【０１５４】
一実施形態において、親微生物は、好気性ＣＯ２固定生物である。好気性ＣＯ２固定微生物は、Ｈ２を用いてまたは酸素の存在下で光合成を介してＣＯ２を固定することができる細菌である。好気性ＣＯ２固定微生物は、カプラビダス属（Cupravidus）、セネコシスティス属（Senechocystis）、クロロフレクサス属（Chloroflexus）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、カプラビダス・ネカトール（Cupravidus necator）、セネコシスティス属種（Senechocystis sp.）またはクロロフレクサス・アウランチカス（Chloroflexus auranticus）である。
【０１５５】
一実施形態において、親微生物はメチロトローフである。メチロトローフ微生物は、メタンとして還元した一炭素基質または増殖のための炭素源としてメタノールを使用することができる。メチロトローフ（methylotrop）は、メチロモナス属（Methylomonas）、メチロバクター属（Methylobacter）、メチロコッカス属（Methylococcus）、メチロミクロビウム属（Methylomicrobium）、メチロスフェラ属（Methylosphera）、メチロカルダム属（Methylocaldum）、メチロシスティス属（Methylocystis）、メチロサイナス属（Methylosinus）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）またはメチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）である。
【０１５６】
一実施形態において、親微生物はメタノゲンである。メタノゲンは、ＣＯ２をメタンに還元することができる古細菌（Archeae）である。メタノゲンは、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノゲニウム属（Methanogenium）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、メタノシェラ属（Methanoshera）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）、メタノトリックス属（Methanotrix）を含む群から選択される。一実施形態において、親微生物は、メタノサーモバクター・マルブルゲンシス（Methanothermobacter marburgensis）またはメタノサルシナ・バケリ（Methanosarcina bakeri）である。
【０１５７】
方法
本発明は、本発明の組換え微生物を用いた基質の微生物発酵によって、イソプロパノール、エタノール、２，３−ブタンジオールおよび／または２−ブタノールならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するための方法を提供する。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明は、アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトンの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するための方法を提供する。
【０１５９】
一実施形態において、基質は、１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質である。別の実施形態において、基質は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたは組み合わせを含む基質である。ある種の実施形態において、１つまたはそれ以上の炭水化物と、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の１つまたはそれ以上を含む基質の両方を含む、混合された基質を用いてもよい。
【０１６０】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）本発明の１つまたはそれ以上の微生物の培養物を含有するバイオリアクタに基質を供給する工程；および
（ｂ）イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で培養物を発酵させる工程
を含む。
【０１６１】
好ましくは、１つまたはそれ以上の生成物はイソプロパノールを含む。
【０１６２】
一実施形態において、本方法は、
（ｃ）本発明の１つまたはそれ以上の微生物の培養物を含有するバイオリアクタに基質を供給する工程；および
（ｄ）アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトンの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で培養物を発酵させる工程
を含む。
【０１６３】
本方法は、１つまたはそれ以上の生成物を回収する工程をさらに含んでもよい。ある種の実施形態において、１つまたはそれ以上の生成物は、１つまたはそれ以上の下流生成物の生産における中間体である。この実施形態において、１つまたはそれ以上の生成物を回収することができ、次に、例えば、別個の発酵または化学合成反応において基質として使用することができる。別の実施形態において、１つまたはそれ以上の生成物は回収されず、同じ発酵プロセスにおいて１つまたはそれ以上の下流生成物に変換される。
【０１６４】
微生物の増殖および基質から１つまたはそれ以上の生成物（単数または複数）への変換が生じるためには、基質に加えて、好適な液体栄養培地がバイオリアクタに供給される必要があることは認識される。基質および培地は、連続的なバッチまたはバッチ供給方式でバイオリアクタに供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有する。発酵に適した培地は当該技術分野において公知である。しかしながら、例として、１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質の発酵のために、ルリアブロス（ＬＢ）、酵母エキスペプトンデキストロース（ＹＥＰＤ）または強化型クロストリジウム培地（ＲＣＭ）を使用することができる。さらに、ＣＯを用いた発酵に適した嫌気性培地は当該技術分野において公知であるが、例として、好適な培地は、Biebel (2001)によって記載されている。本発明の一実施形態において、培地は、本明細書において後述する実施例の部に記載されている通りである。
【０１６５】
発酵は、望ましくは、基質から１つまたはそれ以上の生成物（単数または複数）ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物（単数または複数）への発酵が生じるための適切な条件下で実施されるべきである。考慮すべき反応条件には、基質の制限にならないことを確実にするために、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型リアクタを使用する場合）、接種レベル、最大基質濃度、および生産阻害を避けるために最大生成物濃度が挙げられる。
【０１６６】
上述のように、発酵は、適切な培地および発酵条件を用いて行われる。一実施形態において、ガス状基質が使用される場合、最大ガス基質濃度は、液相中のＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）の制限にならないことを確実にするように考慮される。
【０１６７】
さらに、多くの場合、基質流（またはガス状基質中のＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）部分圧）のＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）濃度を増加させ、したがって、ＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）が基質である場合には発酵反応の効率を増加させることが望ましい。増加した圧力で動作することにより、気相から液相へのＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）移動速度の有意な増加が可能となり、この場合、それは、１つまたはそれ以上の生成物の生産のための炭素源として微生物によって取り込まれ得る。次に、これは、バイオリアクタが、大気圧というよりはむしろ高圧で維持されている場合、保持時間（流入するガス流量で割ったバイオリアクタ内の液体体積として定義される）が低下し得ることを意味する。最適な反応条件は、部分的には、使用される本発明の特定の微生物に依存する。しかしながら、一般的には、発酵は、周囲圧力よりも高い圧力で行うことが好ましい。また、所定のＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）から１つまたはそれ以上の生成物（単数または複数）への変換速度は、部分的には、基質の保持時間の関数であり、次に、所望の保持時間の到達が、バイオリアクタの必要体積を決定するため、加圧されたシステムの使用は、必要とされるバイオリアクタの体積を大いに減少させ、結果として、発酵装置の資本コストを減少させることができる。米国特許第５，５９３，８８６号に示されている例に従って、リアクタ体積は、リアクタ動作圧の増加に線形比例して減少し得て、すなわち、１０気圧で動作されるバイオリアクタは、１気圧で動作されるバイオリアクタの体積のわずかに１０分の１を必要とする。
【０１６８】
例として、高圧でガスからエタノールへの発酵を行う利益が記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で行われたガスからエタノールへの発酵について記載し、エタノール生産性はそれぞれ１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日であった。しかしながら、類似の培地を用いて行われた例示的な発酵および大気圧での流入ガス組成は、１０〜２０分の１のエタノール／リットル／日を生産することが見出された。
【０１６９】
また、ＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）を含有するガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）濃度の制限にならないことを確実にするようなものであることが望ましい。これは、ＣＯ（および／またはＣＯ２および／またはＨ２）を制限した条件の結果が、培養によって生成物（単数または複数）を消費することであり得るためである。
【０１７０】
発酵反応に供給するために使用されるガス流の組成は、その反応の効率および／またはコストに有意な影響を与えることができる。例えば、Ｏ２は、嫌気的発酵プロセスの効率を低下させ得る。発酵前または発酵後の発酵プロセスの段階における望ましくないまたは不必要なガスの処理は、このような段階に負担を増加させる可能性がある（例えば、ガス流をバイオリアクタに流入させる前に圧縮する場合、不必要なエネルギーが、発酵において必要とされないガスを圧縮するために使用され得る）。したがって、望ましくない成分を除去し、望ましい成分の濃度を増加させるために、基質流、特に、産業供給源に由来する基質流を処理することが望ましい場合がある。
【０１７１】
ある種の実施形態において、本発明の微生物の培養物は、水性培養培地中に維持される。好ましくは、水性培養培地は、最小の嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および第５，５９３，８８６号およびＷＯ０２／０８４３８に記載され、本明細書において後述する実施例の部に記載されている通りである。
【０１７２】
ＣＯを含む基質の発酵を含む本発明の実施形態において、発酵は、本発明の組換え微生物を用いて１つまたはそれ以上の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で基質を嫌気的に発酵させる工程を含む。
【０１７３】
この実施形態の方法は、産業プロセスから全大気中炭素排出量を減少させるために使用されてもよい。
【０１７４】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）本発明の１つまたはそれ以上の微生物の培養物を含有するバイオリアクタにＣＯを含む基質を供給する工程；および
（ｂ）イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、バイオリアクタ中で培養物を嫌気的に発酵させる工程
を含む。
【０１７５】
別の実施形態において、上記の工程（ｂ）における１つまたはそれ以上の生成物は、アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトン、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物である。
【０１７６】
一実施形態において、本方法は、
ガスが大気中に放出される前に、産業プロセスの結果として生産されるＣＯ含有ガスを捕捉する工程；
本発明の１つまたはそれ以上の微生物を含有する培養物によって、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノールおよび２−ブタノールの１つまたはそれ以上、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を生産するために、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵を行う工程
を含む。
【０１７７】
別の実施形態において、上記の工程（ｂ）における１つまたはそれ以上の生成物は、アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトン、ならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物である。
【０１７８】
本発明の一実施形態において、微生物によって発酵されたガス状基質は、ＣＯを含有するガス状基質である。ガス状基質は、産業プロセスの副生成物として、または自動車の排出ガスなどのいくつかの他の供給源から得られるＣＯを含有する廃棄ガスであってもよい。ある種の実施形態において、産業プロセスは、鉄金属生成物製造、例えば、製鋼、非鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、大気中に排出される前に、任意の便利な方法を用いて、産業プロセスから捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素と水素を含むガス）の成分であり得る。産業プロセスから生産されたＣＯは、通常、放出し燃焼させてＣＯ２を生産させ、したがって、本発明は、ＣＯ２温室ガス排出量の減少、およびバイオ燃料として使用するためのブタノールの生産において特に利用性を有する。また、ガス状のＣＯ含有基質の組成に依存して、発酵に導入する前に、ダスト粒子などのいずれもの望ましくない不純物を除去するために該基質を処理することが望ましい場合もある。例えば、ガス状基質は、公知の方法を用いてろ過または浄化されてもよい。
【０１７９】
当業者は、１つまたはそれ以上の炭水化物を含む基質を用いた発酵における使用の様々な方法を容易に認識する。しかしながら、例として、Vogel, H. C., & Todaro, C. C. (2007). Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, process design and equipment (ISBN: 0-8155-1407-7); Vogel, H. C., & Todaro, C. C. (1996). Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (ISBN: 978-0-8155-1407-7); Ezeji TC, Qureshi N, Blaschek HP (2005) Industrial relevant fermentations. in Handbook on Clostridia, ed Durre P (CRC Press, Boca Raton, FL), pp 799-814に記載されている方法を用いてもよい。
【０１８０】
生成物の回収
イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、エタノール、２−ブタノール、アセトイン、ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよび／もしくはアセトン、またはこれらの生成物のいずれか１つもしくはそれ以上およびアセトンならびに場合により１つまたはそれ以上の他の生成物を含有する混合された流れは、当該技術分野において公知の方法、例えば、分別蒸留または蒸発、パーベーパレーション、ガスストリッピングおよび抽出発酵、例えば、液−液抽出などによって、発酵ブロスから回収され得る。
【０１８１】
本発明のある種の好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上の生成物は、バイオリアクタからブロスの一部を連続的に取り出し、（好都合にはろ過によって）ブロスから微生物細胞を分離し、１つまたはそれ以上の生成物をブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールは、好都合には、例えば、蒸留によって回収することができる。アセトンは、例えば、蒸留によって回収することができる。生産される任意の酸は、例えば、活性炭上に吸着させることによって回収することができる。分離された微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクタに戻される。また、任意のアルコール（単数または複数）および酸（単数または複数）が除去された後に残っている無細胞透過物が、好ましくは発酵バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（例えば、ビタミンＢ群など）は、バイオリアクタに戻される前に、栄養培地を補充するために無細胞透過物に添加されてもよい。
【０１８２】
また、ブロスのｐＨが、活性炭への酢酸の吸着を増加させるために、上述されるように調整された場合、ｐＨは、バイオリアクタに戻される前に、発酵バイオリアクタ中のブロスと類似したｐＨに再調整すべきである。
実施例
【実施例１】
【０１８３】
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の野生型アルコール脱水素酵素の特徴付けと単一アミノ酸置換による基質特異性の範囲
Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）（Kopke, et al., 2010）を含むクロストリジウム属（Clostridium）のいくつかの種は、唯一の炭素源としてＣＯを利用することが示されており、最終生成物としてエタノールを伴う。細菌は、ＣＯを固定し、それをＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を介してアセチル−ＣｏＡに変換することができる。次に、アセチルＣｏＡのアセチル部分は、様々な代謝経路に使用され得る。ここで特に興味深いのは、カルボニル基が、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）酵素によって、その対応するアルコールに還元され得ることである（Kopke, et al., 2010）。これは、商業的に価値のあるバイオ燃料およびバイオケミカルにＣＯを変換するための経路を提供する。
【０１８４】
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１株のゲノム配列決定は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来の以前に特徴付けられた酵素に対して８６％同一であるＡＤＨを同定した。この株由来のＡＤＨは、その基質としてアセトアルデヒドを利用し、最終生成物としてエタノールを生産することができる。また、イソプロパノールへのアセトンの還元を触媒することができる。
【０１８５】
イソプロパノールは、脱水され、一般に使用されているプラスチックであるポリプロピレンに重合され得るプロピレンを形成し得るため、エタノールよりも経済的に価値のある最終生成物である（Inokuma et al., 2010）。また、プロピレンへの微生物ルートは、ほとんどのプロピレンが現在由来する石油の需要を減少させる。
【０１８６】
突然変異誘発研究は、ＡＤＨ酵素を介して、イソプロパノール生産の効率を改善する目的で完了した。５つの変異体を構築し、試験した：Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ、Ａｒｇ２００Ｇｌｎ、Ａｒｇ２００Ｇｌｕおよび二重変異体Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ／Ａｒｇ２００Ｇｌｎ。
【０１８７】
材料
微生物および増殖条件
大腸菌（E. coli）ＤＨ５α−ＥをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。この株の遺伝子型は、Ｆ−８０ΔｌａｃＺＭ１５（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，ｍｋ＋）ｇａｌ−ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１である。
【０１８８】
大腸菌（E. coli）ＬＭＧ１９４をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。この株の遺伝子型は、Ｆ−ΔｌａｃＸ７４  ｇａｌＥ  ｔｈｉ  ｒｐｓＬ  ΔｐｈｏＡ（ＰｖｕＩＩ）Δａｒａ７１４  ｌｅｕ：：Ｔｎ１０である。
【０１８９】
大腸菌（E. coli）ＭＣ１０６１をコリ・ジェネティック・ストック・センター（Coli Genetic Stock Centre）から入手した。この株の遺伝子型は、ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａＡ−ｌｅｕ）７６９７Δ（ｌａｃ）Ｘ７４  ｇａｌＫ１６  ｇａｌＥ１５（ＧａｌＳ）ラムダ−ｅｌ４−  ｍｃｒＡ０  ｒｅｌＡ１  ｒｐｓＬ１５０（ｓｔｒＲ）ｓｐｏＴ１  ｍｃｒＢ１  ｈｓｄＲ２である。
【０１９０】
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１をＤＳＭＺ（微生物および細胞培養物のドイツコレクション（The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７  Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１９１】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４およびＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２をＤａｖｉｄ  Ｊｏｎｅｓ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔａｇｏ）から入手し、さらに、それぞれＡＴＣＣ８２４／ＤＳＭ７９２およびＡＴＣＣ５１７４３の受託番号で公共株コレクションＤＳＭＺおよびＡＴＣＣから入手することができる。
【０１９２】
すべての大腸菌（E. coli）株は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）またはカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）のいずれかが補足されたＬｕｒｉａ  Ｂｕｒｔａｎｉ培地を用いて、好気的条件下で培養した。［０９８］固体培地は１．５％寒天を含有した。すべての株は、特に注記がない限り、３７℃にて増殖させた。
【０１９３】
ＳＯＣ培地（２０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌおよび２０ｍＭグルコース）をエレクトロポレーション後の大腸菌（E. coli）の回収に使用した。
【０１９４】
標準的な嫌気性技法を用いて、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）をｐＨ５．６のＰＥＴＣ培地（表１）中で増殖させ、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）およびＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）をＲＣＭ培地（表２）中で増殖させた［Hungate RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, in Norris JR and Ribbons DW (eds.), Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York, 1969: 117-132; Wolfe RS: Microbial formation of methane. Adv Microb Physiol 1971, 6: 107-146］。
【０１９５】
【表１】
0006407141.tif 000002
【０１９６】
【表２】
0006407141.tif 000003
【０１９７】
ＡＤＨ遺伝子およびタンパク質
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１の野生型ＡＤＨのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号３６および配列番号３５に示す。
【０１９８】
プライマー
【０１９９】
【表３】
0006407141.tif 000004
【０２００】
プラスミド
ｐＭＴＬ８５１４７−ＴｈｌＡ−ＣｔｆＡＢ−Ａｄｃ−Ａｄｈ（図８）をＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１  ＡＤＨ遺伝子の増幅のために使用した。
【０２０１】
プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ＴｈｌＡ−ＣｔｆＡＢ−Ａｄｃ−Ａｄｈは、標準的な組換えＤＮＡ技法および分子クローニング技法を用いて構築されている［Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987］。ＴｈｌＡ遺伝子（ＮＣ＿００３０３０．１；ＧＩ：１１１９０５６）は、Ｃ．アセトブイリカム（C. acetobuylicum）のゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子ａｄｃ−ｃｔｆＡＢ−ａｄｃ（ＮＣ＿００９６１７；領域：４，４００，５２４−４，４０２，６５６；ＧＩ：５２９４９９４、ＧＩ：５２９４９９５およびＧＩ：５２９４９９６を含む）は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）から増幅され、ａｄｈ遺伝子（図５）とＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌプロモータ領域（配列番号３９）は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１から増幅された。増幅のために使用したオリゴヌクレオチド配列を表４に示す。その後、増幅したすべての断片は、制限部位ＮｏｔＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩを用いて、プラスミドｐＭＴＬ８５１４１（ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）［Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85］にクローニングされた。最終のプラスミドを配列番号４０に示し、変異がないことを確実にするために配列決定された。
【０２０２】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＡＴＣＣ８２４、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）ＮＣＩＭＢ８０５２およびＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１からのゲノムＤＮＡは、BertramおよびDurre（Conjugal transfer and expression of streptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum. Arch Microbiol 1989, 151: 551-557）による変法を用いて単離された。１００ｍｌの一晩培養物を収集し（６，０００×ｇ、１５分間、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍｌ  ＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭスクロース、ｐＨ８．０）中に懸濁させた。３００μｌリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を添加し、混合物を３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて２８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を添加し、さらに１０分間インキュベートした。ＲＮＡは、２４０μｌ  ＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）および１０μｌ  ＲＮａｓｅＡを添加することによって、室温で消化された。次に、１００μｌ  プロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、１〜３時間、３７℃にてタンパク質分解を行った。最後に、６００μｌ過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加し、続いて、フェノール−クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡ量と質を分光光度的に調べた。
【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
発現ベクターｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＷｐｉＭｅｔＣをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。本研究で使用したプラスミドは、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグをコードする断片、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（所望により精製後、ＡＤＨからＨｉｓ６を除去するため）および無関係な細菌（ボルバキア・ピピエンティス（Wolbachia pipientis））由来のＭｅｔＣ酵素をコードする遺伝子を挿入することによって、予め修飾されている。
【０２０５】
方法
野生型ＡＤＨの増幅：
野生型ＡＤＨ  Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１は、プライマーＡＤＨ＿ＴＥＶ＿ＫｐｎＩ＿ｆｏｒおよびＡＤＨ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｒｅｖｅｒｓｅを用いて、プラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ＴｈｌＡ−ＣｔｆＡＢ−Ａｄｃ−Ａｄｈ（ＬＺ）の５０ｎｇ／μｌの作業ストックから増幅された。
【０２０６】
５０μＬのＰＣＲ混合物を以下のように作製した。
【０２０７】
【表５】
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【０２０８】
以下のサイクル条件を用いた。
【０２０９】
【表６】
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【０２１０】
生成物は、サイクルピュアキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）を用いてクリーンアップした。
【０２１１】
ベクターおよびインサートの消化：
ｐＢＡＤ骨格は、以下の処方により、酵素ＫｐｎＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＷｐｉＭｅｔＣを消化することによって調製した。
【０２１２】
【表７】
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【０２１３】
増幅されたＡＤＨ遺伝子を同じようにしてＫｐｎＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。
【０２１４】
【表８】
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【０２１５】
両方の消化を３７℃にて１６時間行った。消化された生成物は、ＳＹＢＲｓａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された１％アガロースゲル上で分離された。消化されたベクターおよびインサートに対応するバンドを切り出し、ＤＮＡをゲルクリーンアップキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）を用いて回収した。
【０２１６】
ｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨの構築
ＡＤＨおよびｐＢＡＤ消化物から精製されたＤＮＡは、以下の反応において、対照ライゲーションと一緒にライゲートされ、これは、ベクターと比較して３倍モル過剰のインサートを含有していた。
【０２１７】
【表９】
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【０２１８】
反応物は、１６℃にて２時間インキュベートした。ライゲーション混合物の２μＬアリコートを用いて、大腸菌（E. coli）ＭＣ１０６１細胞の５０μＬアリコートをエレクトロポレーションによって形質転換した。ＳＯＣ中で３７℃にて１時間の回復後、アリコートをＬＢ−アンピシリンプレート上に広げ、３７℃にて一晩インキュベートした。６コロニーを拾い上げ、ｐＢＡＤ＿ｆｏｒおよびＡＤＨ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿ｒｅｖプライマーを用いたＰＣＲによって、ＡＤＨインサートの存在についてスクリーニングした。フリーザーストックは成功したクローンで作製され、７００μｌの培養物と３００μｌの滅菌５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含んでいた。ＡＤＨ遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０２１９】
ＡＤＨの部位特異的突然変異誘発
重複伸長ＰＣＲによって５つすべての変異を構築するプロトコールは同じであったが、各々の変異はその対応する突然変異誘発プライマーを用いて構築したことを除く。したがって、１変異のみを生じさせるプロトコールが提供されている。
【０２２０】
Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ一次生成物の作製：
部位特異的突然変異誘発における最初の工程は、２つの重なった一次生成物の作製であった。これらのためのＰＣＲ反応は以下の通りである。
【０２２１】
一次生成物１．０：
【０２２２】
【表１０】
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【０２２３】
一次生成物１．１：
【０２２４】
【表１１】
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【０２２５】
サイクル条件は以下の通りであった。
【０２２６】
【表１２】
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【０２２７】
生成物は、Ｏｍｅｇａサイクルピュアキットを用いてクリーンアップした。
【０２２８】
Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ二次生成物の作製：
部位特異的突然変異誘発における次の工程は、外側プライマーを使用した重複伸長ＰＣＲ（Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 77, 51-59）を用いて、２つの一次生成物を、導入された変異を有する完全な遺伝子を含有した全長の二次生成物に再結合することであった。２つの一次生成物は、それらが等しいモル濃度であるように混合される。以下のＰＣＲ処方を用いた。
【０２２９】
【表１３】
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【０２３０】
サイクル条件は、野生型ＡＤＨの増幅と同じであった。
【０２３１】
ｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨ（Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ）の構築：
５つのＡＤＨ変異体（すなわち、変異：Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ；Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ；Ａｒｇ２００Ｇｌｎ；Ａｒｇ２００ＧｌｕおよびＳｅｒ１９９Ｇｌｕ／Ａｒｇ２００Ｇｌｎを有するもの）の各々をクローニングするための消化およびライゲーションプロトコールは、ｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨを構築するために使用したものと同じであった。各々の変異の存在をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２３２】
ＡＤＨ酵素の発現および精製
発現および精製プロトコールは、特に注記のない限り、すべての変異体および野生型で同じであった。野生型ＡＤＨの発現および精製のためのプロトコールを以下に示す。
【０２３３】
可溶性発現についての試験：
フリーザーストックからの５ｍＬのＬＢ−アンピシリン一晩培養物を３７℃にて増殖させ、翌朝、これを用いて、１００ｍＬのＬＢ−アンピシリンを接種した。培養物は、ＯＤ６００が０．８に到達するまで、３７℃にてインキュベートされた。この時点で、２０％アラビノースの１ｍＬを添加し、発現の残りについて、培養物を２８℃にてインキュベートした。５００μＬの試料をｔ＝０ｈ、２ｈ、４ｈおよび１６ｈ（すなわち、一晩）で採取した。各々の試料について、細胞をペレットにし、上清をデカントした。次に、ペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび０．２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、各々０．２μＬのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、２５単位／μＬ）とｒリゾチーム（Ｍｅｒｃｋ、３０ｋＵ／μＬ）を添加した。混合物を室温にて１５分間インキュベートし、次に、凍結（−８０℃にて）し、３回融解した。この時点で、「全タンパク質」試料として各々の混合物から１０μＬを採取した。残りの試料は、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、氷上に置いた。上清の１０μＬのアリコートを「可溶性タンパク質」試料として各々の混合物から採取した。各々１０μＬの全および可溶性タンパク質試料に、１０μＬのＳＤＳ緩衝液を添加し、全混合物を９８℃にて５分間加熱した。１５μＬの各々のアリコートは、１２％分離ゲルおよび４％スタッキングゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルを２００Ｖにて４０分間泳動した。ゲルを一晩クーマシーブルーを用いて染色し、次に、脱染色した。
【０２３４】
発現の終了時に、１００ｍＬの培養物の残りを５０ｍＬチューブ中でペレットにし、−８０℃にて凍結保存した。
【０２３５】
タンパク質精製：
野生型および変異型ＡＤＨ酵素はすべて、それらのＮ末端でＨｉｓ６タグを有するため、それらはすべて、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができた。上記の凍結細胞ペレット（１００ｍＬの培養物由来）は、０．５μｌ  ｒリゾチーム（３０ｋＵ／μｌ）、０．５μｌベンゾナーゼ（２５Ｕ／μｌ）および５０μｌプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む、１０ｍＬ氷冷分解（ｉｃｅ−ｃｏｌｄｌｙｓｉｓ）緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に再懸濁された。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を超音波処理によって溶解し、不溶性の残骸をペレットにし、上清を０．２ミクロンフィルタを用いて清澄化した。清澄化した上清は、溶解緩衝液で十分に洗浄したＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加された。５００μＬのベッド体積は、野生型ＡＤＨを精製するために使用し、２００μＬのベッド体積は、各々の変異体を精製するために使用された。タンパク質を１時間、４℃にてＴａｌｏｎ樹脂に結合させ、次に、溶解緩衝液で数回洗浄した。タンパク質は、１５０ｍＭのイミダゾールが補足された溶解緩衝液を用いてカラムから溶出し、溶出液を５００μＬ画分に集めた。精製プロセス中の様々な段階で採取されたアリコート、および全溶出画分をＳＤＳ  ｐａｇｅゲル上で泳動し、タンパク質の存在を確認し、精製の成功を決定した。タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、保存緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．０）に交換された。
【０２３６】
野生型タンパク質は、大腸菌（E. coli）で発現させたとき、非常に可溶性であり、容易に精製することができた（図１）。Ｓｅｒ１９９ＡｓｐおよびＡｒｇ２００Ｇｌｎ変異タンパク質もまた、非常に可溶性であった（図２）。他の２つの点変異体（Ｓｅｒ１９９ＧｌｕおよびＡｒｇ２００Ｇｌｕ）の溶解度は、より変動的であった（結果を示さず）。幾分驚くべきことに、二重変異体（Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ＋Ａｒｇ２００Ｇｌｎ）はＳｅｒ１９９Ｇｌｕより可溶性であった（結果を示さず）。
【０２３７】
Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ変異体の配列は配列番号３７（核酸）および配列番号３８（アミノ酸）に示されている。
【０２３８】
活性アッセイ
すべての活性アッセイは、石英キュベットを用いたＣａｒｙ１００  ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計を用いて行われた。アッセイに使用されたすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから調達された。
【０２３９】
特に注記がない限り、アッセイは、補因子（ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ）濃度が０．２ｍＭであり、基質（アセトアルデヒド、アセチル−ＣｏＡ、アセトン、ＤＬ−アセトイン、ＭＥＫ）濃度が３ｍＭであり、ＡＤＨ濃度が３０ｎＭであった。アッセイは、１ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で行われた。すべてのアッセイは、新たに調製した基質および補因子を用いて、３重にして行った。
【０２４０】
第一に、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の野生型酵素を測定し、酵素は、厳密にＮＡＤＰＨ依存性であり、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）のアルコール脱水素酵素について記載されているように（Ismaiel, Zhu, Colby, & Chen, 1993）、ＮＡＤＨ（図１１）を用いてほとんど何ら検出できる活性はなかったことが示された。
【０２４１】
その後、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１の精製された野生型酵素のための動力学（図１２）は、置換を有する変異型酵素を計測するためのベースラインとして決定された（図９）。活性は、いくつかの発酵経路において重要であるケトン類（アセトン、ＭＥＫ、アセトイン）およびアルデヒド類（アセトアルデヒド）を用いて検出することができた（図１４）。
【０２４２】
その後、作製された変異型アルコール脱水素酵素をアッセイし、野生型酵素と比較した。可溶性タンパク質が存在しなかったため、Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕ変異体をアッセイすることができなかった。粗細胞溶解物のアッセイはＡＤＨ活性を示さなかった。可溶性であるが、Ａｒｇ２００Ｇｌｎ変異体もまた、検出可能な活性を示さなかった。当然のことながら、これらの２つのＳｅｒ１９９Ｇｌｕ＋Ａｒｇ２００Ｇｌｎを組み合わせた変異体も不活性であった。残りの３つのタンパク質のうち、Ａｒｇ２００Ｇｌｕの活性は、基質濃度を５倍（１５ｍＭまで）増加させ、酵素濃度を６倍（１８０ｎＭまで）増加させた場合にのみ測定可能であった。
【０２４３】
一方、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ変異体は、アセトンを用いた野生型とほぼ同じ活性であった（図３）。最も興味深いことに、Ｓｅｒ１９９Ａｓｐ変異体は、アセトンに対してより特異的である（図４）。これは、野生型ＡＤＨをＳｅｒ１９９Ａｓｐ変異体で置換することは、イソプロパノール生産の増加をもたらす可能性があることを示す。実施例２に記載したように、この変異体は、さらなる置換のための基礎であった。
【実施例２】
【０２４４】
複数のアミノ酸置換による基質および補因子特異性の変化
実施例１からの結果に基づいて、本発明者らは、１〜４つのアミノ酸置換を有するさらに８つのアルコール脱水素酵素変異体を作製し、その活性を研究した。
【０２４５】
【表１４】
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【０２４６】
材料
プライマー
【０２４７】
【表１５】
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【０２４８】
プラスミド
変異体７に関する遺伝子配列をＤＮＡ２．０によって合成した。配列は、大腸菌（E. coli）におけるタンパク質の発現のためにコドン最適化された。合成された遺伝子はプラスミドｐＪ２０１に与えられた。この配列は、発現ベクターｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨに変異体７のＡＤＨ遺伝子をサブクローニングするためのＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含んだ。
【０２４９】
方法
変異体７のための発現プラスミドの構築
ｐＢＡＤ骨格は、制限酵素ＫｐｎＩ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦを用いてｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨを消化することによって調製された。
【０２５０】
変異体７の遺伝子は、同様に、制限酵素Ｋｐｎ−ＨＦおよびＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦを用いて、ｐＪ２０１ベクターから消化された。
【０２５１】
消化された生成物は、ＳＹＢＲｓａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された１％アガロースゲル上で分離された。消化されたベクターおよびインサートに対応するバンドを切り出し、ＤＮＡをゲルクリーンアップキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）を用いて回収した。
【０２５２】
精製されたインサートおよびベクターＤＮＡは、製造者の標準プロトコールに従って、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、３：１のモル比のインサート：ベクターでライゲートされた。
【０２５３】
ライゲーション混合物を用いて、エレクトロポレーションによって大腸菌（E. coli）ＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換された細胞のアリコートをＬＢ−アンピシリン上に広げ、３７℃にて一晩インキュベートした。単一コロニーを拾い上げた。得られた発現プラスミドを精製し、変異体７の遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。フリーザーストックは成功したクローンで作製された。
【０２５４】
ＡＤＨのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発
変異体８、９、１０、１１および１２を構築するために使用した鋳型ＤＮＡは、ｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−変異体７ＡＤＨであった。変異体１３を構築するために使用した鋳型ＤＮＡは、ｐＢＡＤ（ＫｐｎＩ）−ＡＤＨであった。異なる鋳型ＤＮＡおよび対応する突然変異誘発プライマーは別にして、変異体８〜１３を構築するためのプロトコールは同じであった。各々の変異体は、標準的な推奨されるプロトコールを用いて、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的突然変異誘発キットを用いて構築された。各々の変異体を構築するために使用されるフォワードおよびリバースプライマーを表５に列挙している。
【０２５５】
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発反応の生成物を用いて、熱ショックによって化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）ＸＬ１−ブルー細胞を形質転換した。単一のコロニーを拾い上げた。得られた発現プラスミドを精製し、各々の変異遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。フリーザーストックは各々の成功したクローンで作製された。
【０２５６】
タンパク質発現および精製
変異体２、７、１０、１１用の発現ベクターを用いて、プラスミドｐＧｒｏ７（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）で予め形質転換された大腸菌（E. coli）ＬＭＧ１９４を形質転換した。このプラスミドは、ＧｒｏＥＬ／ＥＳシャペロンタンパク質のアラビノース誘導性発現を容易にする。変異体１３用の発現ベクターを用いて、大腸菌（E. coli）ＬＭＧ１９４を形質転換した。
【０２５７】
各々のＡＤＨ変異体の発現は、０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度までＬ−アラビノースを添加することによって、中間対数期培養物（ＯＤ６００が約０．５である）において誘導された。培養物を２８℃にてさらに５時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、ペレットを−８０℃にて保存した。各々のペレットを１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（１５０μＬ）、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（３７．５Ｕ）およびリゾチーム（０．２ｍｇ．ｍＬ−１、最終濃度）を添加した。４℃にて２０分間のインキュベーション後、細胞を氷上で超音波処理によって溶解し、溶解物を遠心分離（２１，０００ｇ、４℃、３０分間）によって清澄化した。清澄化した溶解物は、５００μＬのＴａｌｏｎ金属アフィニティー樹脂（５０％ｗ／ｖのスラリー）とともに混合され、混合物を穏やかに４℃にて１時間撹拌し、Ｈｉｓ６タグ化されたＡＤＨタンパク質を樹脂に結合させた。重力流カラムに移す前に、樹脂を溶解緩衝液で複数回洗浄した。変異体７、８、９、１０および１２を精製するため、５ｍＭ  ＡＴＰ／ＭｇＣｌ２は、シャペロンタンパク質の除去を容易にするために、この洗浄工程に含まれた。５ｍＭイミダゾールおよび１０ｍＭイミダゾールをそれぞれ含有する、１０ベッド体積の溶解緩衝液でさらに洗浄後、各々の精製されたタンパク質は、５ベッド体積の溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて溶出された。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルタユニット（１０ｋＤａ分子量カットオフ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、精製されたタンパク質を保存緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）に交換した。凝集体は、無菌の０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過することによって除去された。各々のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９５％純度となるように判断された。ＡＤＨ濃度は、Ａ２８０（（Pace, Vajdos et al. 1995に従って計算される吸光係数を用いて）を測定することによって定量された。精製されたタンパク質のアリコートを−８０℃にて保存した。活性アッセイによって、これらの保存条件は、凍結／融解サイクルと組み合わせて、活性のいずれの喪失をももたらさなかったことを検証した。
【０２５８】
図５に示すように、変異体２、７および１１はすべて、ｐＧｒｏ７プラスミドを用いて大腸菌（E. coli）で発現させたとき、非常に可溶性であった。変異体１０に関する得られた可溶性タンパク質は、他のバリアントよりも低かった。変異体８、９および１２は、ｐＧｒｏ７と共発現された場合でさえ、完全に不溶性であった。変異体１３は非常に可溶性であり、野生型ＡＤＨタンパク質と同じ条件で、大量に生産することができた。
【０２５９】
活性アッセイ
野生型および変異型ＡＤＨ活性は、以前に記載された方法（Ismaiel, Zhu et al. 1993）に基づいて、分光光度アッセイを用いて測定された。活性は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの酸化に伴って、３４０ｎｍでの吸光度の減少を監視することによって定量された（ε３４０＝６，２２０Ｍ−１．ｃｍ−１）。定常状態の速度論的パラメータは、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御装置を備えたＣａｒｙ１００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて２５℃にて測定された。標準的なアッセイ混合物は、０．２ｍＭで存在する補因子（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）のいずれかとともに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５を含有した。初期反応速度は、５ｍＭの基質濃度を用いて測定された。測定は、３重にして行われ、バックグラウンドについて補正された。補因子ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨおよび基質アセトン、アセトイン、ＭＥＫは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから調達された。Ｄ−アセトインは、商業的供給源が存在しないため、以下に説明するように精製された。
【０２６０】
全体的に、変異体１１は、補因子としてＮＡＤＨを用いて、最も高い活性を有する（図６）。変異体１１の補因子の使用が、（野生型ＡＤＨと比較して）完全にスイッチした；変異体１１は、ＮＡＤＰＨを用いて、検出可能な活性を有していなかった。
【０２６１】
変異体１１は、４つの変異（Ｇ１９８Ｄ、Ｓ１９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅ、Ｙ２１８Ａ）を有している。４つすべての変異は、補因子の使用における観察されたスイッチに必要とされる。Ｙ２１８Ａ変異の追加は、ＮＡＤＨを用いた活性に必要であったが、この変異単独（すなわち、変異体１３）は補因子の優先性に影響を及ぼさなかった。これは、図１４に示されるように、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノールおよびエタノールへの発酵経路に重要な利点を有し得た。
【０２６２】
図７に示されるように、いくつかの変異体はまた、より大きな基質（アセトインおよびＭＥＫ）またはより小さな基質（アセトアルデヒド）のいずれかと比較してアセトンに対してより特異的である。すべての変異体（２、７、１０および１１）は、ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。変異体２、１０および１１は、アセトアルデヒドと比較しておよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加している。
【０２６３】
図８に示されるように、いくつかの変異体はまた、より大きな基質（アセトイン）またはより小さな基質（アセトアルデヒド）のいずれかと比較してＭＥＫに対してより特異的である。変異体２、１０および１１は、アセトアルデヒドと比較しておよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している。
【０２６４】
図９に示されるように、いくつかの変異体はまた、より大きな基質（アセトン、アセトインおよびＭＥＫ）と比較してアセトアルデヒドに対してより特異的である。変異体７は、アセトンと比較しておよびＭＥＫと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。変異体２、７および１０は、アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。
【０２６５】
図１０に示されるように、いくつかの変異体はまた、より小さな基質（アセトン、アセトインおよびＭＥＫ）と比較してアセトインに対してより特異的である。変異体７は、アセトンと比較しておよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。変異体７および１１は、アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している。変異体１０はアセトインを用いた活性を喪失したが、他の基質アセトン、ＭＥＫおよびアセトアルデヒドを用いた活性をなおも有していた。
【０２６６】
要約すると、結果は、図７〜１０に示されるように、以下を示す：
−変異体２は、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し、２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加している；
−変異体７は、１）ＭＥＫと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し、２）ＭＥＫ、アセトンおよびアセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加し、３）アセトンおよびＭＥＫと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している；
−変異体１１は、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し、２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し、３）アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が増加している；ならびに
−変異体１０は、１）ＭＥＫ、アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してアセトンに対する基質特異性が増加し、２）アセトアルデヒドおよびアセトインと比較してＭＥＫに対する基質特異性が増加し、３）アセトインと比較してアセトアルデヒドに対する基質特異性が増加している。これは、図１４に示される、イソプロパノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノールおよびエタノールへの発酵経路に重要な利点を有し得た。
【０２６７】
Ｄ−アセトインの精製
Ｄ−アセトイン（または（Ｓ）−アセトイン）のエナンチオ選択的合成：：Ｄ−アセトインは、Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールの位置選択的に制御されたモノ酸化を介して記載されるように（D'Accoloti et al. 1993 J. Org. Chem. 58: 3600-1）合成された。必要なジメチルジオキシラン（ＤＭＤＯ）−アセトン溶液は、以前に報告された手法の変法に従って新たに調製され、その後、ヨードメトリーによって滴定された。
【０２６８】
ＤＭＤＯ−アセトン溶液の作製：１０００ｍＬの三口丸底フラスコにガスアダプタおよび二重蒸留ヘッドを取り付け、そこに真空適合のレシーバを接続した。最終的な連結部を栓で止め、試薬の添加が意図された。丸底フラスコを受入端に固定し、アセトン−ドライアイス浴において−７８℃に冷却した。真空に直列に、塩分のある氷を用いて−２０℃に冷却したＢｕｃｈｉ（登録商標）コールドフィンガーコンデンサがあり、続いて、−１９６℃の液体窒素のコールドフィンガートラップに接続した。
【０２６９】
反応容器に、大きな楕円形撹拌棒、水（２２０ｍＬ）、アセトン（１６０ｍＬ）および炭酸水素ナトリウム（１２０．０６３ｇ）を充填した。激しい撹拌を０℃にて、窒素でパージしながら開始し、３分間の間隔で５回に分けて、固体オキソン（２５０．０４７ｇ）の添加中に継続した。強力な泡立ちが発生し、したがって、オキソンの添加速度を制御して、これを管理した。オキソンの第二の部分を添加した後、白色スラリー上の無色溶液がピンク色になった。オキソンの完全な添加の際に１５分間、撹拌を続けた。泡立ちの沈降時に、わずかな真空（９００ｍｂａｒ）を適用し、泡立ちを監視しながら、約４５０ｍｂａｒに徐々に増加させた。真空の漸進的適用中に、淡黄色の溶液を冷却したレシーバに集めた。約１００ｍＬのＤＭＤＯ−アセトン溶液を集めると、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液を用いて反応を停止させ、生成物を室温にした。
【０２７０】
ＤＭＤＯのヨウ素滴定：アセトン（１．００ｍＬ）中のＤＭＤＯの新たに蒸留した溶液を酢酸−アセトン溶液（２ｍＬ、３：２）にピペットで移した。次に、飽和した水性ヨウ化カリウム溶液（２．０ｍＬ）をドライアイスとともに添加し、溶液を脱気した。これを室温で１０分間、暗所にて保存しながら混合した。混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、終点指標として１％デンプン溶液を用いて、水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（０．０００９９モル／Ｌ）溶液に対して滴定し、２９．９ｍＭの濃度を得た。次に、フラスコを密封し、−１８℃にて保存した。
【０２７１】
（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオールのＤＭＤＯ酸化。Ｄ−（−）−２，３−ブタンジオールの（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノンへのモノ酸化は、文献（D'Accoloti et al. 1993 J. Org. Chem. 58: 3600-1）に報告された方法に従って行われた。
【実施例３】
【０２７２】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いたカルボキシドトローフにおけるエタノールと比較した２，３−ブタンジオールの優先的生産
カルボキシド栄養性生物であるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）は、ＣＯからエタノールと２，３−ブタンジオールの両方を生産することが示された（Kopke et al., 2011）（図１４）。実施例１において実証されているように、アルコール脱水素酵素は、エタノールと２，３−ブタンジオール経路、アセトアルデヒドのエタノールへの反応、それぞれアセトインの２，３−ブタンジオールへの反応、の両方における最終工程を触媒するＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）中に存在する（図１４）。アセトアルデヒドを用いたこの野生型酵素の活性は、アセトインとより高く（図１２）、これは、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ１００６１（Kopke et al., 2011）を用いた発酵における２，３−ブタンジオールと比較して支配的な生成物であるエタノールをもたらす。実施例２において、アミノ酸置換Ｇ１９８Ｅ、Ｓ１９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅを有するアルコール脱水素酵素変異体（変異体７）を作製し、これは、アセトアルデヒドと比較してアセトインに対する基質特異性が改善されている（図７）。野生型酵素と比較して、アセトアルデヒドと比べてアセトインを優先的に使用するこの酵素を用いて、野生型株と比較して、エタノール生産と比べて２，３−ブタンジオール生産を増加させることができる。
【０２７３】
変異型アルコール脱水素酵素の遺伝子（配列番号４１）は、部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、フェレドキシンプロモータを有するｐＭＴＬ８５３５３シャトルベクター（Heap, Pennington, Cartman, & Minton, 2009）にクローニングされる。次に、構築物は、記載されているように（米国特許出願公開第２０１２／０２５２０８３号、ＷＯ／２０１２／１１５５２７）、メチル化され、エレクトロポレーションによってＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）に形質転換される。チアンフェニコール耐性コロニーを拾い上げ、５ｍＬの液体培地中で増殖させる。形質転換された培養物をＰＣＲによって検証し、発酵実験を行う。代謝最終産物とＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の野生型を比較すると、変異型アルコール脱水素酵素を有する株は、２，３−ブタンジオール：エタノール比が増加している。
【０２７４】
これと同様に、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）などの他のアセトゲン株は、同じプラスミドを用いて、アルコール脱水素酵素変異体で修飾することができる。エレクトロポレーションは、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）（Kopke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92;（Leang, Ueki, & Lovley, 2011）ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；ＷＯ２０１２／０５３９０５）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）（Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37）およびムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）（Kita et al., 2012）などのいくつかのカルボキシド栄養性アセトゲンについて記載されている。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）および他のアセトゲン株は、エタノールおよび２，３−ブタンジオールを生産することができる（Kopke et al., 2011）。変異型アルコール脱水素酵素を発現させることによって、この比率は、２，３−ブタンジオールを選択して改善させることができる。
【実施例４】
【０２７５】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いたカルボキシドトローフにおける２，３−ブタンジオールと比較したエタノールの優先的生産
実施例３に記載したように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）は、ＣＯからエタノールと２，３−ブタンジオールの両方を生産することができる（図１４）。しかしながら、いくつかのプロセスについて、プロセスのコスト（例えば、分離）を低く維持するために、単一生成物のみを生産することが有利であり得る。典型的には、これは、複数の経路のうちの１つの経路において、酵素を不活性化することによって達成することができる。しかしながら、複数の経路において反応を触媒する多機能酵素の場合には、この戦略を適用することができず、それは、アセトアルデヒドからエタノールへの還元とアセトインから２，３−ブタンジオールへの還元の両方を触媒するＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のアルコール脱水素酵素に関して当てはまる。本発明は、例えば、減少したレベルでまたは２，３−ブタンジオールなしに、エタノール生産を達成するための代替の手段を与える。実施例２において、アミノ酸置換Ｇ１９８Ｄ、Ｓ１９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅ、Ｙ２１８Ｆを有するアルコール脱水素酵素変異体（変異体１０）を作製し、これは、アセトインを減少させる能力を喪失したが、アセトアルデヒドを用いた活性をなおも有する（図７）。この変異型アルコール脱水素酵素の遺伝子（配列番号４７）は、二重相同クロスオーバー組み込み（野生型を変異型アルコール脱水素酵素で置換する）を可能にするために、アルコール脱水素酵素の隣接領域とともにベクターにクローニングされる。ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の１ｋｂの５’（配列番号５５）と３’（配列番号５６）相同性アームは、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅される。プライマーＳｅｃ５ｆ（attcatcctgcaggACAGTTAAAAAGCATATCTAACAGT（配列番号５７））／Ｓｅｃ５ｒ（gactgcggccgcTAAATATATAAGCAAATGTTGTGCC（配列番号５８））およびＳｅｃ３ｆ（atatgctagCGTATTTTTAATTGCGAACTTAAGA（配列番号５９））／Ｓｅｃ３ｒ（gactggcgcgcCAGTTAAAGTTAGACATCCGATTAT（配列番号６０））を用いて、それぞれ５’および３’相同性アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物は、ｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯを得るために、ＳｂｆＩ／ＮｏｔＩとＮｈｅＩ／ＡｓｃＩ部位の間で、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドにクローニングされる。ベクターは上記のように形質転換される。チアンフェニコールプレート上で選択後、形質転換体は、相同性アームに隣接するプライマーＳｅｃＯｆ（TTGGAATTTTAGCTGTAGATAACAA（配列番号６１））およびＳｅｃＯｒ（TAAGTGATTTTCAATGGACTTTACT（配列番号６２））を用いて、野生型アルコール脱水素酵素を変異型アルコール脱水素酵素にスワップアウトするためにスクリーニングされる。配列決定のコンホメーション後、発酵実験を行い、減少した２，３−ブタンジオール生産でまたは２，３−ブタンジオール生産なしでのエタノール生産を確認する。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）において、ある種の条件下で２，３−ブタンジオール生産の完全な除去についてノックアウトされ得る、ブタンジオールへの活性を有する第二の酵素が存在する。
【０２７６】
これと同様に、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）などの他のアセトゲン２，３−ブタンジオール生産株は、同じプラスミドを用いて、アルコール脱水素酵素変異体で修飾することができる。エレクトロポレーションおよび二重相同クロスオーバーのための方法は、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）について記載されている（Kopke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92;（Leang et al., 2011）。
【実施例５】
【０２７７】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いたカルボキシドトローフにおけるイソプロパノールの生産
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）は、野生型アルコール脱水素酵素に依存して、アセトン生合成遺伝子を導入することによって、ＣＯからのイソプロパノール生産のために修飾されている（米国特許出願公開第２０１２／０２５２０８３号、ＷＯ／２０１２／１１５５２７）。この生産を改善するために、実施例２において作製された、置換Ｇ１９８Ｄ、ＳＩ９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅ、Ｙ２１８Ａを有する非常にアセトンに特異的な変異型アルコール脱水素酵素（変異体１１）を導入することができる。変異型アルコール脱水素酵素遺伝子（配列番号５３）は、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ制限部位によって、アセトン生合成プラスミド（配列番号４０）にクローニングされる。次に、プラスミドは、上述されるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）に形質転換される。形質転換された培養物を用いた発酵実験は、すべてのアセトンをイソプロパノールに変換するイソプロパノール生産の増加を示す。アセトンに対する特異性の増加に加えて、生物は、イソプロパノール合成のためにＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを使用し、両方のプールにタッピングして入れておく。
【０２７８】
これと同様に、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）などの他のアセトゲン株は、同じプラスミドを用いて、アルコール脱水素酵素変異体で修飾することができる。エレクトロポレーションは、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）（Kopke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92;（Leang et al., 2011）ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；ＷＯ２０１２／０５３９０５）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）（Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37）またはムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）（Kita et al., 2012）などのいくつかのカルボキシド栄養性アセトゲンについて記載されている。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．ルジュングダーリイ（C. ljungdahlii）および他のアセトゲン株は、エタノールおよび２，３−ブタンジオールを生産することができる（Kopke et al., 2011）。変異型アルコール脱水素酵素を発現させることによって、この比率は、２，３−ブタンジオールを選択して改善させることができる。
【実施例６】
【０２７９】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いたＡＢＥ生物におけるイソプロパノールの生産
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来の第二級アルコール脱水素酵素を用いたイソプロパノール生産のために代謝的に遺伝子操作され得ることが示されているが、報告された結果は、イソプロパノールに至るまで変換しなかった残留アセトンを有する低イソプロパノールレベルのみを示す［Lee et al, 2012: Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for isopropanol-butanol-ethanol fermentation, Appl. Environ. Microbiol. 78: 1416-1423］。このプロセスを改善するために、最適化されたアルコール脱水素酵素は、この制限を克服するために必要とされる。
【０２８０】
実施例２において、アセトインに対して高い特異性を有し、ＮＡＤＨも使用することができる、置換Ｇ１９８Ｄ、Ｓ１９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅ、Ｙ２１８Ａを有する、最適化された変異型アルコール脱水素酵素（変異体１１）を作製し、これは、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）におけるＮＡＤＰＨよりも豊富である。変異型アルコール脱水素酵素遺伝子（配列番号５３）は、部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、強力なＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼプロモータを有するｐＭＴＬ８５３５４シャトルベクター（Heap et al., 2009）にクローニングされる。次に、プラスミドは、枯草菌（Bacillus subtilis）ファージメチルトランスフェラーゼを使用してインビボでメチル化され、記載されるように（Mermelstein & Papoutsakis, 1993）Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）に形質転換される。形質転換された培養物を用いて行った発酵において、すべてのアセトインは、高い特異性でイソプロパノールに変換される。
【実施例７】
【０２８１】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いた大腸菌（E.coli）におけるイソプロパノールの生産
大腸菌（E. coli）は、いくつかの研究においてイソプロパノール生産のための標的となっている［Hanai T et al (2007) Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology 73:7814-8; Inokuma K et al (2010) Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichia coli using gas stripping. Journal of bioscience and bioengineering 110:696-701; Jojima T et al (2008) Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Applied microbiology and biotechnology 77:1219-24］。しかしながら、すべての研究は、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来の全く同じ最適化されていないアルコール脱水素酵素を用い、酵素の低特異性およびＮＡＤＰＨ依存性に起因してイソプロパノール生産が制限される。これは、すべての研究において、イソプロパノールに十分に効果的に還元されないため、アセトンが副生成物として蓄積することから明らかになる。大腸菌（E. coli）において、ＮＡＤＨプールのプールは、ＮＡＤＰＨプールよりも数倍大きい（Bennett & San, 2009）。
【０２８２】
実施例２において、アセトインに対して高い特異性を有し、ＮＡＤＨも使用することができる、置換Ｇ１９８Ｄ、Ｓ１９９Ｖ、Ｐ２０１Ｅ、Ｙ２１８Ａを有する、最適化された変異型アルコール脱水素酵素（変異体１１）を作製した。大腸菌（E.coli）は、当該技術分野において使用される標準的な技法を用いて、この変異型アルコール脱水素酵素を含むように遺伝子操作することができる。組換え大腸菌（E.coli）は、野生型生物と比較してイソプロパノール生産が増加する。
【実施例８】
【０２８３】
最適化されたアルコール脱水素酵素を用いた酵母Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）における２−ブタノールの生産
酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のいくつかの株は、エタノールと並んで高レベルのアセトイン（Romano, Suzzi, Mortimer, & Polsinelli, 1995）を生産することができる。Ｄ−アセトイン（または（Ｓ）−アセトイン）は、実施例１に記載されているＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のアルコール脱水素酵素の作用によって、メソ−２，３−ブタンジオールに変換され得る。メソ−２，３−ブタンジオールのＭＥＫへの変換は、例えば、Ａ．アエロゲネス（A. aerogenes）（Toraya T, Shirakashi T, Kosuga T, 1976）またはクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）（Bachovchin, Eagar, Moore, & Richards, 1977）のジオール脱水酵素とともに記載されている。次に、ＭＥＫは、再度、実施例１に記載されているＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のアルコール脱水素酵素を用いて、２−ブタノールに変換され得る（図１４）。しかしながら、アルコール脱水素酵素はまたエタノールに対する活性を有するため、アセトアルデヒドからエタノールへのわずかに低い活性を有するが、アセトインから２，３−ブタンジオールおよびＭＥＫから２−ブタノールへの相対的に高い活性を有する酵素を有することが望ましい。実施例２の変異体１１は、正確にこれらの特性を有し、酵母において有利である補因子としてＮＡＤＨを使用する。
【０２８４】
変異体１１についてのコドン最適化遺伝子（配列番号５０）とクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）由来のジオール脱水酵素についてのコドン最適化遺伝子（ＹＰ＿００２２３６７８２；ＹＰ＿００２２３６７８３；ＹＰ＿００２２３６７８４）は、誘導性酵母プロモータＧＡＬ１／１０下で、記載されるように（Steen et al., 2008）適切なベクターにクローニングされる。すべてのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株の形質転換は、記載されるように（Gietz RW: RA Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. Part B. San Diego, CA: Academic Press Inc; 2002:87-96）酢酸リチウム法を用いて行われる。形質転換の成功と検証後、豊富なＹＰＤ培地における３０℃でのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）を用いた発酵が行われ、生成物として２−ブタノールと低レベルのエタノールを伴う。
【０２８５】
本発明は、本明細書において、読者が過度の実験を行うことなく本発明を実施できるように、ある種の好ましい実施形態を参照しながら説明されている。しかしながら、当業者であれば、構成要素およびパラメータの多くは、本発明の範囲から逸脱することなく、ある程度変更または改変してもよく、または公知の同等物に置換してもよいことは、容易に認識される。このような改変および同等物は、個々に明示されたかのように本明細書に組み込まれることは認識されるべきである。発明の名称、見出し等は、読者がこの文書を理解しやすくするために提供されたものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０２８６】
上記および下記で引用されたすべての出願、特許および刊行物の全開示は、存在する場合、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書におけるあらゆる出願、特許および刊行物への言及は、それらが有効な従来技術を構成するか、または世界中のどこの国でも共通する一般的な知見の一部を形成することへの承認、またはあらゆる形態の示唆ではなく、そのように解釈されるべきでもない。
【０２８７】
本明細書および以下に記載されるすべての請求項の全体において、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「を含む（comprise）」、「を含んでいる（comprising）」などの単語は、排他的な意味ではなく、包括的な意味で、すなわち、「に限定されないが含む」という意味で解釈されることとする。
（参考文献）
0006407141.tif 000017
0006407141.tif 000018
【配列表フリーテキスト】
【０２８８】
本明細書には配列表が添付され、配列表には以下の配列が列挙されている：
配列番号１〜３４：本明細書において、前述の表３、４および５に記載されている。
配列番号３５：本発明者らによって研究された野生型ＡＤＨの核酸配列。
配列番号３６：本発明者らによって研究された野生型ＡＤＨのアミノ酸配列。
配列番号３７：本発明者らによって作製された置換Ｓｅｒ１９９Ａｓｐを含む変異型ＡＤＨの核酸配列。
配列番号３８：本発明者らによって作製された置換Ｓｅｒ１９９Ａｓｐを含む変異型ＡＤＨのアミノ酸配列。
配列番号３９：Ｗｏｏｄ  Ｌｊｕｎｇｄａｈｌプロモータ領域の核酸配列。
配列番号４０：本明細書にさらに記載されるプラスミドｐＭＴＬ８５１４７−ＴｈｌＡ−ＣｔｆＡＢ−Ａｄｃ−Ａｄｈのヌクレオチド配列。
配列番号４１：本明細書においてさらに後述される変異体７の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号４２：本明細書においてさらに後述される変異体７のアミノ酸配列。
配列番号４３：本明細書においてさらに後述される変異体８の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号４４：本明細書においてさらに後述される変異体８のアミノ酸配列。
配列番号４５：本明細書においてさらに後述される変異体９の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号４６：本明細書においてさらに後述される変異体９のアミノ酸配列。
配列番号４７：本明細書においてさらに後述される変異体１０の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号４８：本明細書においてさらに後述される変異体１０のアミノ酸配列。
配列番号４９：本明細書においてさらに後述される変異体１１の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号５０：本明細書においてさらに後述される変異体１１のアミノ酸配列。
配列番号５１：本明細書においてさらに後述される変異体１２の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号５２：本明細書においてさらに後述される変異体１２のアミノ酸配列。
配列番号５３：本明細書においてさらに後述される変異体１３の核酸配列（コドン最適化されている）。
配列番号５４：本明細書においてさらに後述される変異体１３のアミノ酸配列。
配列番号５５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）アルコール脱水素酵素遺伝子の５’相同性アームのヌクレオチド配列。
配列番号５６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）アルコール脱水素酵素遺伝子の３’相同性アームのヌクレオチド配列。
配列番号５７：プライマーＳｅｃ５ｆ。
配列番号５８：プライマーＳｅｃ５ｒ。
配列番号５９：プライマーＳｅｃ３ｆ。
配列番号６０：プライマーＳｅｃ３ｒ。
配列番号６１：プライマーＳｅｃＯｆ。
配列番号６２：プライマーＳｅｃＯｒ。
配列番号６３：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｇｌｙを有するアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列。
配列番号６４：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｓｅｒを有するアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列。
配列番号６５：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌを有するアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列。
配列番号６６：以下の置換：Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕを有するアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列。
配列番号６７：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｇｌｙを有するアルコール脱水素酵素の核酸配列。
配列番号６８：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｓｅｒを有するアルコール脱水素酵素の核酸配列。
配列番号６９：以下の置換：Ｇｌｙ１９８Ａｓｐ、Ｓｅｒ１９９Ｖａｌ、Ｐｒｏ２０１ＧｌｕおよびＴｙｒ２１８Ｖａｌを有するアルコール脱水素酵素の核酸配列。
配列番号７０：以下の置換：Ｓｅｒ１９９Ｇｌｕを有するアルコール脱水素酵素の核酸配列（コドン最適化されている）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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