(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（２）の高解像度スキャニング顕微鏡法のための顕微鏡であって、
試料（２）を照明するための照明装置（３）と、
試料（２）にわたって少なくとも１つの点スポットまたは線スポット（１４）をスキャンするため、および点スポットまたは線スポット（１４）を検出平面（１８）において静止した回折限界個別画像（１７）へと結像するための結像装置（４）と、
結像縮尺を考慮した上で少なくとも１つの広がり／面積に関して回折限界個別画像（１７）の半値幅の少なくとも２倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について検出平面（１８）における個別画像（１７）を検出するための検出器装置（１９）と、
前記検出器装置（１９）のデータからスキャン位置について個別画像（１７）の回折構造を評価するため、および回折限界を超えて引き上げられた解像度を有する試料（１７）の画像を生成するための評価装置（Ｃ）とを有しており、
前記検出器装置（１９）は、
ピクセル（２５）を有する、個別画像（１７）よりも大きい検出器アレイ（２４）と、
前記検出器アレイ（２４）に前置され、検出平面（１８）からの放射を非結像式に前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へ分配する非結像式の再分配部材（２０〜２１；３０〜３４；３０〜３５）とを有しており、
当該顕微鏡はさらに、
‐  前記再分配部材はファイバ端部が前記検出器アレイのピクセルのところで終わる複数のファイババンドルを有し、光方向で見て前記ファイババンドルの前にカラースプリッタが設けられ、異なるファイババンドルの少なくとも２つのファイバが前記検出器アレイの１つのピクセルで終わるか、および／または、
‐  前記再分配部材はファイババンドルであり、光方向で見て前記ファイババンドルの個別のファイバの後かつ前記検出器アレイの個別のピクセルの前に、それぞれカラースプリッタおよびミラーが、異なる検出ピクセルが少なくとも部分的に異なる波長で照射されるように設けられる、顕微鏡。
【請求項２】
前記再分配部材は、検出平面（１８）に配置された入力部（２２）および出力部（２３）を有し、前記出力部において光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）の幾何学配置とは相違する幾何学配置で前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）のところで終わる、前記光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記光ファイバはマルチモード光ファイバであることを特徴とする、請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記光ファイバ（２１）は、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部（２２）から前記出力部（２３）へ延びていることを特徴とする、請求項２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記再分配部材は、検出平面（１８）からの放射を前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へと導く、それぞれ別様に傾いたミラー部材（３１）を備えるミラー（３０）を含んでおり、前記検出器アレイのピクセル（２５）は前記ミラー部材（３１）の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記結像装置（４）は前記検出器装置（１９）に合わせて個別画像（１７）のサイズを適合化するために結像方向で見て検出平面（１８）に前置されたズーム光学系（２７）を有していることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記照明装置（３）と前記結像装置（４）は１つのスキャン装置（１０）を分かち合っており、それにより前記照明装置（３）は前記結像装置により結像されるスポット（１４）と一致する回折限界点スポットまたは線スポットで試料（２）を照明し、前記ズーム光学系（２７）は前記照明装置（３）の構成要素でもあるように配置されることを特徴とする、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記検出器アレイ（２４）は検出器ラインであることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記検出器ラインはＡＰＤラインまたはＰＭＴラインであることを特徴とする、請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
試料（２）の高解像度のスキャニング顕微鏡法のための方法であって、
試料（２）が照明され、
試料（２）にわたってスキャンをしながら導かれる少なくとも１つの点スポットまたは線スポット（１４）が個別画像（１７）へと結像され、前記スポット（１４）は回折限界で個別画像（１７）へと結像され、個別画像（１７）は静止するように検出平面（１８）に位置しており、
結像縮尺を考慮した上で少なくとも１つの広がり／面積に関して回折限界個別画像（１７）の半値幅の少なくとも２倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について個別画像（１７）が検出され、
各々のスキャン位置について個別画像（１７）の回折構造が評価され、回折限界を超えて引き上げられた解像度を有する試料（２）の画像が生成され、
ピクセル（２５）を有する、個別画像（１７）よりも大きい検出器アレイ（２４）が提供され、
検出平面（１８）からの個別画像の放射が非結像式に前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へ再分配され、
‐  前記再分配部材はファイバ端部が前記検出器アレイのピクセルのところで終わる複数のファイババンドルを有し、光方向で見て前記ファイババンドルの前にカラースプリッタが設けられ、異なるファイババンドルの少なくとも２つのファイバが前記検出器アレイの１つのピクセルで終わるか、および／または、
‐  前記再分配部材はファイババンドルであり、光方向で見て前記ファイババンドルの個別のファイバの後かつ前記検出器アレイの個別のピクセルの前に、それぞれカラースプリッタおよびミラーが、異なる検出ピクセルが少なくとも部分的に異なる波長で照射されるように設けられる、方法。
【請求項１１】
個別画像（１７）の放射は、検出平面（１８）に配置された入力部（２２）および出力部（２３）を有し、前記出力部において光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）の幾何学配置とは相違する幾何学配置で前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）のところで終わる、前記光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）によって再分配されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光ファイバはマルチモード光ファイバであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光ファイバ（２１）は、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部（２２）から前記出力部（２３）へ導かれることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
各々の光ファイバ（２１）が個別に放射により照射され、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）に付属するピクセル（２５）の妨害信号が検出され、キャリブレーションマトリクスが作製され、これを用いて試料（２）の顕微鏡法において相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークが修正されることによって、前記光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）と前記検出器アレイ（２４）がキャリブレーションされることを特徴とする、請求項１０，１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
個別画像（１７）の放射はそれぞれ別様に傾いたミラー部材（３１）を備えるミラー（３０）によって再分配され、前記ミラー（３０）によって検出平面（１８）からの放射が前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へと導かれ、前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）は前記ミラー部材（３１）の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
検出器アレイ（２４）として検出器ラインが使用されることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記検出器ラインはＡＰＤラインまたはＰＭＴラインであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出器アレイ（２４）の個々のピクセル（２５）の信号が相互相関により評価されることによって、点スポットまたは線スポット（１４）のスキャンの運動方向が判定されることを特徴とする、請求項１０乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
試料（２）で静止している点スポットまたは線スポット（１４）で回折限界個別画像（１７）の時間的変化が判定されて評価されることによって、試料（２）における変化が検出されることを特徴とする、請求項１０乃至１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を照明するための照明装置と、試料にわたって点スポットまたは線スポットをスキャンするため、および点スポットまたは線スポットを検出平面へ結像縮尺のもとで静止した回折限界個別画像へと結像するための結像装置と、結像縮尺を考慮した上で回折限界個別画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの位置解像度でさまざまなスキャン位置について検出平面で個別画像を検出するための検出器装置と、検出器装置のデータからスキャン位置について個別画像の回折構造を評価するため、および回折限界を超えて高められた解像度を有する試料の画像を生成するための評価装置とを有する、試料の高解像度スキャニング顕微鏡法のための顕微鏡に関する。さらに本発明は、試料が照明され、試料にわたってスキャンをしながら導かれる点スポットまたは線スポットが個別画像へと結像される、試料の高解像度のスキャニング顕微鏡法のための方法に関するものであり、スポットは結像縮尺のもとで回折限界で個別画像へと結像され、個別画像は静止するように検出平面に位置しており、結像縮尺を考慮した上で回折限界個別画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの位置解像度でさまざまなスキャン位置について個別画像が検出され、それにより個別画像の回折構造が検出され、各々のスキャン位置について個別画像の回折構造が評価され、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料の画像が生成される。
【背景技術】
【０００２】
このような顕微鏡ないし顕微鏡法は、たとえば非特許文献１や特許文献１から知られており、これらの文献は従来技術に関わるその他の検証についても記載している。
【０００３】
このような手法は、スポットが回折限界のもとで検出平面へと結像されることによって、解像度向上を実現する。回折限界の結像は点スポットをエアリーディスクとして結像する。このような回折ディスクは検出平面において、その構造を解像することができるように検出される。このように、顕微鏡の結像性能に関して検出器側でオーバーサンプリングが行われる。点スポットの結像の場合、エアリーディスクの形状が解像される。前掲の文献に記載され、それに関する開示内容が全面的に本明細書に取り入れられている回折構造の適切な評価によって、回折限界を２倍上回る解像度向上を達成することができる。
【０００４】
しかしその際に検出側では、そのような仕方により試料上で走査される各々の点について、従来式のレーザスキャニング顕微鏡（以下においてＬＳＭとも略称する）と比較したとき、１つの個別画像を何倍もの画像情報で記録せざるを得ないことを回避できない。たとえばスポットの個別画像の構造を１６のピクセルで検出するとき、１つのスポットごとに１６倍のデータ量が生じるばかりでなく、通常のピンホール検出の場合にＬＳＭの検出器へ入射することになる放射強度の平均１／１６しか、単一のピクセルが含んでいないことになる。放射強度は個別画像の構造、たとえばエアリーディスクにわたって、当然ながら均一に分布しているわけではないので、実際にはこのような構造の縁部では、ｎ個のピクセルのときの１／ｎの平均値よりもさらに大幅に低い放射強度しか生じない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｕｎｄ  Ｊ．Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０４，１９８１０１（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
すなわち、検出器側で放射量を高解像度で検出できるようにすることが課題となる。顕微鏡法で通常使用されている従来のＣＣＤアレイは十分な信号／雑音比を実現するものではないため、それ自体すでにこの用途において不都合であるが、画像記録時間を延長したとしても、改良の助けにはならない。ＡＰＤアレイには高すぎる暗雑音もつきまとうので、測定時間を延長しても不十分な信号／雑音比に帰結することになる。同様のことはＣＭＯＳ検出器にも当てはまり、しかも、検出器部材サイズに関して不都合である。スポットの回折限界個別画像が、少なすぎるピクセルに割り当てられることになるからである。ＰＭＴアレイもこれに類似する設計スペース問題をもたらすものであり、同じくピクセルが大きすぎる。したがって設計スペース問題は、特に、高解像度のための顕微鏡の具体化が、開発コストや機器の普及の面からして、既存のＬＳＭ設計への統合が可能である場合にしか実現可能でないという点にある。しかしながら、ここでは個別画像の特定のサイズが与えられている。面積的に比較的大きい検出器を組み込むことができるのは、画像をいっそう有意に、すなわち数オーダーだけ拡大する光学系が、追加的に設けられる場合に限られる。そのような光学系は、それ以上の結像収差なしに回折限界構造を得ようとするならば、非常に高いコストがかかる。
【０００８】
従来技術では、高解像度における上述した検出側の問題を回避する別の方法も知られている。たとえば欧州特許第１１５７２９７Ｂ１号明細書には、構造化された照明によって非線形プロセスが活用される方法が記載されている。構造化された照明は、試料上の複数の回転・位置姿勢にわたって変位し、試料はこれらの様々な状態で、上述した制約が存在しない広視野検出器に結像される。
【０００９】
上述した検出器制約なしに、同じく高解像度（すなわち試料画像の解像度が回折限界を超えている）が実現される方法が、国際公開第２００６１２７６９２号パンフレットおよびＤＥ１０２００６０２１３１７から公知である。ＰＡＬＭと略称されるこの方法は、光学的な活性化信号によって活性化することができるマーキング物質を利用する。マーキング物質は活性化した状態のときにのみ、励起放射で励起して特定の蛍光放射を放出させることができる。活性化していない分子は、励起放射の入射後にも蛍光放射を発しない。つまり活性化放射は、蛍光を出すように励起可能な状態へと活性化物質を切換える。したがって、一般に切換信号という用語が使われる。そして切換信号は、少なくともある程度の割合の活性化したマーキング分子が、同じく活性化した隣接するマーキング分子から隔てられていて、活性化したそれぞれのマーキング分子が顕微鏡法の光学的な解像度で計測したときに離間しているように、もしくは事後的に離間可能であるように印加される。これは活性化した分子の隔絶と呼ばれる。このような隔絶された各分子について、解像限界のもとで惹起されるそれぞれの放射分布の中心を判定し、そのようにして各分子の位置をコンピュータによって、光学的な結像が本来可能にするよりも高い精度で決定することは容易である。ＰＡＬＭ法は試料全体を結像するために、マーキング分子が切換信号によって切換信号の所与の強度のときに活性化される確率が、すべてのマーキング分子について等しいという事実を利用する。すなわち切換信号の強度は、所望の隔絶が行われるように印加される。この工程は、可能な限りすべてのマーキング分子が、励起されて蛍光を出す部分集合に含まれるようになるまで繰り返される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の枠内では、試料上で走査されるスポットは静止するように検出平面へと結像される。そして検出平面からの放射が非結像式に再分配されて、検出器アレイへと導かれる。ここで「非結像式に」という概念は、検出平面に存在する個別画像に関わるものである。それにもかかわらず、このような個別画像の個々の面領域は、当然ながら結像原理に基づいて結像することができる。その意味で、検出器アレイと再分配部材との間には完全に結像をする光学系が位置していてもよい。しかしながら検出平面に存在する個別画像は、再分配のときにそれ自体としては維持されない。
【００１１】
「回折限界」という概念は、アッベの理論に基づく回折限界だけに限定されるのではなく、実際上の不十分さや制約に基づいて理論上の最大値に２０％だけ不足するケースも含むものとする。その場合にも個別画像は、ここでは回折構造と呼ぶ構造を有している。この構造がオーバーサンプリングされる。
【００１２】
このような原理は、サイズに関して個別画像に適合していない検出器アレイを使用することを可能にする。検出器アレイの少なくとも１つの広がり（または面積）は、検出されるべき個別画像よりも大きいか、または小さいことが好ましい。様々な幾何学的な構成という概念には、検出器アレイの相違する広がりだけでなく、検出平面における個別画像の広がりの高さと幅に関して相違するアスペクト比での配置も該当する。検出器アレイのピクセルは、追加的に、必要な解像度に対して大すぎていてよい。また、検出器アレイのピクセル配置の輪郭が、検出平面で個別画像が有している輪郭と根本的に異なっていることも許容される。最終的に検出器アレイは、本発明によると、検出平面の個別画像とは異なるサイズを有している。本方法における再分配、ないし顕微鏡における再分配部材は、個別画像とそのサイズによる寸法制約やピクセルサイズ制約を顧慮することなしに、検出器アレイを選択することを可能にする。特に、検出器アレイとして検出器ラインを利用することができる。
【００１３】
試料の画像は、ＬＳＭで普通であるようにスポットでの試料の走査によって、それぞれ異なる走査空間すなわち異なるスキャン位置に割り当てられた多数の個別画像から生じる。
【００１４】
本発明のコンセプトは、レーザスキャニング顕微鏡法について知られているように、複数のスポットについて並列化された形態で同時に実施することもできる。そうすると、複数のスポットが試料上で走査され、複数のスポットの個別画像が静止するように検出平面に相並んで位置する。そしてこれらが面積的に呼応するサイズの共通の再分配部材によって、または複数の個々の再分配部材によって再分配されてから、対応するサイズの単一の検出器アレイへ、または複数の個々の検出器アレイへ導かれる。
【００１５】
以下の記述は、一例として単一の点スポットでの走査だけに話を絞る。しかし、このことは限定として理解されるべきではなく、説明する構成要件や原則は、複数の点スポットの並列走査にも線スポットの採用にも意味的に当てはまる。後者は当然、線の延びる方向に対して横向きにのみ回折限界であるので、この点に関わる本明細書の構成要件は１つの方向（線の延びる方向に対して横向き）にのみ妥当する。
【００１６】
本発明の方式により、ＩＳＭ法を満足のいく速度と是認できる装置コストとで実施することができる。本発明は高解像度の顕微鏡法原理について、これまで与えられていなかった幅広い適用分野を開くものである。
【００１７】
再分配または再分配部材を具体化する１つの選択肢は、光ファイバからなるバンドルを使用することにある。これらの光ファイバはマルチモード光ファイバとして製作することができるのが好ましい。バンドルは、検出平面に配置され、その輪郭に関して検出平面における回折限界個別画像の広がりを満たす入力部を有している。それに対して光ファイバは出力部では、検出器アレイによって設定され、入力部の配置とは相違する幾何学的な配置で配置される。このとき光ファイバの出力側の端部は、検出器アレイのピクセルまで直接的に導くことができる。バンドルの出力部が、たとえばＡＰＤラインやＰＭＴラインのような検出器ラインへ楽に差し込むことができるコネクタにまとめられていると、特別に好ましい。
【００１８】
本発明の理解のために重要なのは、検出器アレイのピクセルと、個別画像が検出平面で解像される画像ピクセルとを区別することである。各々の画像ピクセルは、通常、検出器アレイのちょうど１つのピクセルに割り当てられる。しかしそれぞれの配置に関して、両者は相違している。本発明について特徴的なのは、特に、そのサイズと配置に関して個別画像のオーバーサンプリングを惹起する画像ピクセルでの放射が検出平面で記録されることである。このようにして、回折限界個別画像の生成に基づいて回折構造である個別画像の構造が解像される。再分配部材は、当該画像ピクセルが設けられた入力側を有している。入力側は検出平面に位置している。再分配部材は各々の画像ピクセルでの放射を、検出器アレイのピクセルのうちの１つへと導く。検出器アレイのピクセルへの画像ピクセルの割り当ては画像構造を維持せず、したがって再分配は個別画像に関して非結像式である。すなわち本発明はまた、当分野に属する顕微鏡において、検出器装置が、放射が画像ピクセルで記録される検出平面に位置する入力側を有する非結像式の再分配部材を有していることも特徴としている。さらに再分配部材は、画像ピクセルで記録された放射が検出器アレイのピクセルに供給される出力側を有しており、この放射は入力側から出力側へと個別画像に関して非結像式に再分配される。これに準じて本発明による方法は、当分野の方法において、放射が検出平面において画像ピクセルで記録され、これらの画像ピクセルが個別画像に関して非結像式に検出器アレイのピクセルへ再分配されることによって特徴づけることができる。検出器アレイは、そのピクセルの配置および／またはサイズに関して、検出平面における画像ピクセルの配置および／またはサイズと相違している。さらに検出平面の画像ピクセルは、再分配部材により、回折限界に関して個別画像の回折構造がオーバーサンプリングされるように設けられる。
【００１９】
高感度の検出器アレイでは、放射強度の差が大きいときに、隣接するピクセルがクロストークによる障害を示すことが知られている。これを回避するために、好ましい発展例では、出力部で隣接する光ファイバが入力部でも隣接するように光ファイバが入力部から出力部へと導かれる。回折限界個別画像は急激な放射強度変化を示さないので、このような再分配部材の構成は、検出器アレイの相並んで位置するピクセルが可能な限り少ない放射強度差を得ることを自動的に保証し、それによりクロストークを最低限に抑える。
【００２０】
光ファイバに依拠する再分配に代えて、別様に傾いたミラー部材を有するミラーを再分配部材に装備することも可能である。このようなミラーはたとえばファセットミラー、ＤＭＤ、またはアダプティブミラーとして構成することができ、後者２態様では、相応の調整または制御によってミラー部材の傾斜が確保される。ミラー部材は放射を検出平面から、幾何学構成がミラー部材の幾何学構成と相違する検出器アレイのピクセルへと導く。
【００２１】
ミラー部材は、光ファイババンドルの入力部の光ファイバ端部と同じく、個別画像の回折構造の解像度に関して画像ピクセルを構成している。（もはや）検出器アレイのピクセルサイズではなく、ミラー部材のサイズがオーバーサンプリングにとって決定的に重要である。その意味で、この場合、複数の個別検出器からなるグループも検出器アレイとして理解される。これらはその配置に関して、検出平面における画像ピクセルとは常に異なっている（すなわち大きい）からである。
【００２２】
ＬＳＭでは、所望の解像度に応じて様々な対物レンズが使用される。対物レンズの交換は、検出平面における個別画像の広がりを変化させる。したがって、個別画像のサイズを検出器装置のサイズに合わせて適合化するためのズーム光学系を、結像方向で見て検出平面に前置するのが好ましい。このようなズーム光学系は１００％を明らかに下回るパーセント範囲で個別画像のサイズを変化させ、すなわち、冒頭で不都合であると述べた個別画像のサイズの数倍化よりもはるかに簡素に実現される。
【００２３】
試料の照明は、通常のＬＳＭと同じくスキャンをするように行われるのが好ましく、それが絶対に必要というわけではないが、その場合に最大の解像度向上が実現される。試料をスキャンするように照明するとき、照明装置と結像装置は、共通のスキャン装置を有しているのが好都合である。このスキャン装置は、照明スポットを試料にわたって導くと同時に、試料が結像される、照明スポットと一致するスポットを検出器に関して再びスキャンし、それにより個別画像を検出平面で静止するようにする。このような構造では、ズーム光学系を照明装置と結像装置の共通の部分にセットすることができる。その場合、ズーム光学系は、検出平面における検出器のサイズに合わせた個別画像の適合化を可能にするばかりでなく、これに加えて、対物レンズの選択とともに変わる可能性がある対物レンズひとみへ、利用可能な照明放射を周縁損失なく全面的に入力結合することも可能にする。
【００２４】
検出器アレイの相並んで位置するピクセルの間の放射強度依存的なクロストークは、すでに冒頭で述べたとおり、光ファイババンドルを用いた再分配の場合、バンドル内での光ファイバの適切な配置によって低減することができる。その追加または代替として、キャリブレーションを実行することも可能である。そのために各々の光ファイバに順次放射をあてて、隣接するピクセルの干渉信号を検出する。このようにしてキャリブレーションマトリクスが作製され、これを用いて以後の試料の顕微鏡法のときに、相並んで位置するピクセルの放射強度依存的なクロストークが修正される。
【００２５】
個別画像の回折構造の解像は、試料の走査中に変位するスポットの移動方向を判定することを追加的に可能にする。このような移動方向は基本的にはスキャナのメカニズム（たとえばスキャンミラーや可動の試料テーブル）から既知であるものの、これには機械的に生じる残留不正確性がある。検出器アレイの個々のピクセルの信号を相互相関により評価することによって、こうした残留不正確性を除去することができる。その際、相並んで位置する画像ピクセルは、試料においてスポットの回折限界の結像に基づきある程度だけ重なり合い、それぞれの中心部は相並んで位置することが利用できる。このような画像ピクセルの信号を相互相関させれば、スキャンメカニズムの不可避的な許容差に基づいて残る残留不正確性を低減、または全面的に除去することができる。
【００２６】
向上した解像度に加えて、個々の検出器部材の（検出平面の画像ピクセルが割り当てられた）測定系列に由来する信号の空間的および時間的な相関関係を通じて、スポットで検出される検出容積における蛍光の時間的な変化を検出することができ、たとえば時間的な相関関係から、蛍光相関分光法におけるように拡散係数を決定することもでき、また、それぞれの画像ピクセルの間の空間的な相関関係を含めることによって指向性拡散や拡散バリアを視覚化することもできる。これに加えて蛍光分子の移動経過は、トラッキング用途のために多大な関心が寄せられており、それは、照明スポットが蛍光分子の運動に追随するはずだからである。ここで説明している構造は、運動方向をすでにピクセル露光時間内で高精度に判定することを可能にする。したがって発展形として、試料で静止している点スポットまたは線スポットで回折限界個別画像の時間的変化が判定されて評価されることによって、試料における変化が検出されるのが好ましい。
【００２７】
さらに本発明による方式は、スキャンされる照明において、たとえば位相フィルタによって照明分布を変調することを可能にする。それにより、たとえばＧｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔ．Ｌｅｔ．，３４，３５０８（２００９）に記載されているように、非常に簡単にこの方法を具体化することができる。
【００２８】
ここで方法について説明している限りにおいて、制御装置が、これらの工程を顕微鏡の作動時に実行する。
【００２９】
当然のことながら、以上に挙げた構成要件および以下にこれから説明する構成要件は、記載されている組合せとしてだけでなく、それ以外の組合せや単独でも、本発明の枠内から外れることなく適用可能である。
【００３０】
次に、本発明の要部をなす構成要件を開示する添付の図面を参照しながら、本発明を一例としてさらに詳しく説明する。図面は次のものを示している：
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】高解像度の顕微鏡法のためのレーザスキャニング顕微鏡を示す模式図である。
【図２】図１の顕微鏡の検出器装置を示す拡大図である。
【図３】検出平面における検出器装置１９のあり得る実施形態を示す上面図である。
【図４】検出平面における検出器装置１９のあり得る実施形態を示す上面図である。
【図５】検出器フィールドのサイズの適合化のためのズーム光学系による図１の顕微鏡の発展例である。
【図６】ズーム光学系に関わる、ならびに多色結像のための発展例に関わる、図５の顕微鏡の変形例である。
【図７】検出器装置を対象とした、図１の顕微鏡の変形例である。
【図８】図７の検出器装置１９の変形例である。
【図９】検出器とファイババンドルの２倍化を利用して、２つの異なる波長領域で試料を高解像度に観察するためのレーザスキャニング顕微鏡構造を示す図である。
【図１０】２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットにより取得することができるレーザスキャニング顕微鏡を模式的に示す図である。
【図１１】２つの波長領域の光を共通の検出器へと導くファイバ構造の一例を模式的に示す図である。
【図１２】検出されるべき２つの波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するための第１の解決法を示す図である。
【図１３】検出されるべき２つの波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するための第２の解決法を示す図である。
【図１４】検出されるべき２つの波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するための別の解決法を示す図である。
【図１５】２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットによりファイババンドルを通じて取得することができる、また別案によれば、１つの波長での測定をファイババンドルを通じて実行することができる、レーザスキャニング顕微鏡の変形例を示す図である。
【図１６】図１５に関して、２つの波長領域について高い解像度の画像を同時に記録するための、ならびに、ファイバ入力部におけるエアリーディスクのサイズに応じて、エアリーディスクのいっそう細かいサンプリングもしくは改善された信号対雑音比で試料を観察する追加の代替的な選択肢のためのファイバ構造の略図である。
【図１７】２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットにより取得することができ、また別案によれば、１つの波長での測定を実行することができる、レーザスキャニング顕微鏡の別の態様を示す図である。
【図１８】２つの波長領域について高い解像度で画像を同時に記録するための、ならびに、エアリーディスクのいっそう細かいサンプリングで試料を観察する追加の代替的な選択肢のためのファイバ構造を示す図である。
【図１９】２つのカラーチャネルについて高解像度の画像を検出するための検出ユニットの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
図１は、試料２の顕微鏡法のために構成されたレーザスキャニング顕微鏡１を模式的に示している。レーザスキャニング顕微鏡（以下、ＬＳＭと略称する）１は制御装置Ｃによって制御され、照明光路３と結像光路４とを含んでいる。照明光路は試料２のスポットを照明し、結像光路４はこのスポットを検出のために回折限界で結像する。照明光路３と結像光路４は多数の部材を共有している。しかしこのことは、試料２のスキャンによるスポット照明と同様に、さほど強制的なことではない。試料を広視野照明することもできよう。
【００３３】
ＬＳＭ１では、試料２の照明は、機能的には他に必要のない方向転換ミラー６およびレンズ７を介してミラー８上に入力結合されるレーザビーム５によって行われる。ミラー８は、レーザビーム５が反射角のもとでエミッションフィルタ９にあたるように作用する。図面を見やすくするため、レーザビーム５についてはその主軸だけが図示されている。
【００３４】
エミッションフィルタ９で反射された後、レーザビーム５はスキャナ１０により２軸偏向され、レンズ１１および１２により対物レンズ１３を通って試料２のスポット１４へ集束される。ここで、スポットは図１の図面では点状であるが、線状のスポットも可能である。スポット１４で励起された蛍光放射は対物レンズ１３、レンズ１１および１２を介して再びスキャナ１０へと到達し、その前に結像方向で再び静止する光線が存在している。この光線は、スポット１４の蛍光放射をその波長に関して選別し、特に、たとえば励起放射として利用できるレーザビーム５の照明放射から蛍光放射を分離する機能を有するエミッションフィルタ９および１５を通過する。レンズ１６は、全体としてスポット１４が、検出平面１８に位置する回折限界画像１７へと結像されるように作用する。検出平面１８は、スポット１４が試料２に位置している平面と共役の平面である。スポット１４の画像１７は検出平面１８で、以下で図２から図４を参照して詳しく説明する検出器装置１９により記録される。ここで重要なのは、検出器装置１９がスポット１４の回折限界画像１７を検出平面１８で空間的に解像することである。
【００３５】
１８の検出断面上のスポットの強度分布（ガウス分布）は、１８ａとしてその下に図１に示されている。
【００３６】
制御装置ＣはＬＳＭ１のすべてのコンポーネントを制御し、特に、スキャナ１０や検出器装置１９を制御する。制御装置はさまざまなスキャン位置についてそれぞれ個々の画像１７のデータを記録し、その回折構造を分析して、試料２の高解像度の全体画像を生成する。
【００３７】
図１のＬＳＭ１は一例として、試料上で走査される単一のスポットについて示されている。しかしながら同時に、たとえば図１の紙面に対して垂直に延びる線スポットに基づく走査のためにこれを利用することもできる。また、相並んで位置する複数の点スポットが試料で走査されるように、図１のＬＳＭ１を製作することも可能である。その場合、それぞれに対応する個別画像１７が検出平面１８で同じく相並んで位置する。そして検出器装置１９は、相並んで位置する個別画像１７を検出平面１８で検出するために、相応に構成される。
【００３８】
検出器装置１９が図２に拡大して示されている。この検出器装置は、検出器アレイ２４に供給をする光ファイババンドル２０で構成されている。光ファイババンドル２０は個別光ファイバ２１から構成されている。光ファイバ２１の端部は、検出平面１８に位置する光ファイババンドル入力部２２を形成する。したがって、光ファイバ２１の個々の端部が、スポット１４の回折限界画像１７が記録されるピクセルとなる。スポット１４は、図１の実施形態では一例として点スポットであるので、画像１７はエアリーディスクであり、その広がりは図１および２で検出平面１８を表す円の内部に位置している。つまり光ファイババンドル入力部２２の広がりは、それによってエアリーディスクの広がりがカバーされる程度の大きさとなっている。光ファイババンドル２０の個々の光ファイバ２１は、それぞれの出力部のところで、光ファイババンドル入力部２２とは別の幾何学的な配置へと移っており、すなわち、光ファイバ２１の出力側の端部が相並んで位置する長尺状のコネクタ２３の形状へと移っている。コネクタ２３は検出器ライン２４の幾何学的な配置に適合するように構成されており、すなわち、光ファイバ２１の各々の出力側の端部が、検出器ライン２４のピクセル２５のちょうど前に位置している。
【００３９】
再分配部材の幾何学的な広がりはきわめて基本的に、すなわち図４ではファイババンドルによって行われているその具体化の如何に関わりなく、入力側で個別画像の（あるいは複数の点スポットの場合には相並んで位置する個別画像の）の広がりに適合化されている。再分配部材は、個別画像１７の強度分布が走査理論に照らして、回折限界に関してオーバーサンプリングされるように放射を検出平面１８から受け取る機能を有している。すなわち再分配部材は、検出平面１８での結像縮尺を考慮した上で回折限界から生じる最小の解像可能な構造より少なくとも２分の１倍小さいピクセルであって、検出平面１８に位置するピクセル（図３の設計形態では光ファイバの入力端部によって形成される）を有している。
【００４０】
当然ながらコネクタ２３の利用は、光ファイバ２１の出力側の端部をピクセル２５の前に配置するための数多くの選択肢のうちの１つにすぎない。これ以外の接続部を使用することも同様に可能である。個々のピクセル２５を光ファイバ２１と直接的に融合させることもできる。検出器ライン２４の使用さえ必須ではない。その代わりに、各々のピクセル２５について単一の検出器を使用することができる。
【００４１】
図３および４は、光ファイババンドル入力部２２の考えられる実施形態を示している。光ファイバ２１は、光ファイババンドル入力部２２で相互に融着されている。それによっていっそう高い充填係数が実現され、すなわち、個々の光ファイバ２１の間の隙間が光ファイババンドル入力部２２のところで最低限に抑えられる。その一方で融着は、隣接する光ファイバの間のある程度のクロストークをもたらす。これを回避したければ、光ファイバを接着すればよい。図４に示すように、光ファイバ２１の端部を正方形に配置することも可能である。
【００４２】
個々の光ファイバ２１は、光ファイババンドル入力部２２のところで相並んで位置する光ファイバ２１が検出器アレイ２４のところでも相並んで位置するように、検出器アレイ２４の個々のピクセル２５に割り当てられるのが好ましい。このような手法により、たとえば散乱放射によって、あるいは個々のピクセル２５の信号処理で発生し得る、隣接するピクセル２５の間のクロストークが最低限に抑えられる。検出器アレイ２４がラインであるとき、検出器ラインにおける個別光ファイバの順序が、検出平面１８の上面から見て個別光ファイバを順次接続する螺旋により規定されることによって、相応の配置を実現することができる。
【００４３】
図３は、さらに、光ファイバ２１の配置の各コーナーで光ファイババンドル入力部２２に位置するブラインドファイバ２６を示している。これらのブラインドファイバは、検出器アレイのピクセル２５へは通じていない。ブラインドファイバの位置では、信号の評価にとって必要な信号強度が存在しないことになる。それにより、検出器ライン２４または検出器アレイにおける光ファイバ２１の本数、およびこれに伴うピクセル２５の個数を、たとえば３２個のピクセルで処理が行えるように減らすことができる。このような検出器ライン２４は、すでに別の形でレーザスキャニング顕微鏡において採用されており、これによる利点は、信号評価エレクトロニクスをこのようなレーザスキャニング顕微鏡へいったん装備するだけでよく、既存の検出器ライン２４と、検出器装置１９により追加されるべきその他の検出器ライン２４との間で切換が行われることである。
【００４４】
図４では、正方形の基本形状をもつ光ファイバがバンドルに使用される。これらも同じく高いカバー率を検出平面で有しており、すなわち放射を効率的に集める。
【００４５】
図５は、図１のＬＳＭ１の発展例を示しており、検出平面１８にズーム光学系２７が前置されている。図１の設計形態では検出平面１８が配置されていた共役平面は、ここでは中間画像平面２８を形成しており、ここからズーム光学系２７が放射を受け取って検出平面１８へと導く。ズーム光学系２７は、検出器装置１９の入力部の広がりに合わせて画像１７を最善に適合させることができる。
【００４６】
図６は、図１のレーザスキャニング顕微鏡１のさらに別の変形例を示している。まず、ここではズーム光学系はズーム光学系２９として、照明光路３も結像光路４も通過する光路の部分に位置するように配置されている。それにより、検出器装置１９の入力側での画像１７のサイズを適合化できるばかりでなく、結像光路４に関して対物レンズ１３のひとみ充填およびこれに伴うレーザビーム５の活用も適合化できるという利点が得られる。
【００４７】
これに追加して図６では、放射を２つの分離した色チャネルに分割するビームスプリッタがエミッションフィルタ９に後置されることにより、ＬＳＭ１がさらに２チャネルで構成されている。色チャネルの相応の部材は、図１のＬＳＭ１において結像方向でエミッションフィルタ９に後置されている部材にそれぞれ対応する。色チャネルは図６の図面では符号の末尾の”ａ”または”ｂ”によって区別されている。
【００４８】
もちろん、２つの色チャネルを用いての具体化する方式は、ズーム光学系２９の使用に依存するものではない。しかしながらこの組合せは、両方の色チャネルでそれぞれ独立して設ける必要があったなら、２倍になるはずだったズーム光学系２７が、１つしか必要ないという利点がある。しかしながら、ズーム光学系２７を図１に示す設計形態で適用することもできるのは言うまでもなく、図６のＬＳＭ１をズーム光学系２９なしで具体化することもできる。
【００４９】
図７は、検出器装置１９に関わる図１のＬＳＭ１の変形例を示している。
【００５０】
ここでは検出器装置１９は、個々のファセット３１を担持するファセットミラー３０を有している。ファセット３１は、画像１７の解像度に関して、光ファイババンドル入力部２２における光ファイバ２１の端部に相当する。個々のファセット３１は、放射入射の光軸に対する傾きに関してそれぞれ異なっている。レンズ３２およびミニレンズアレイ３３ならびにビームの折り曲げのみに用いられる方向転換ミラー３４とともに、各々のファセット３１は、検出器アレイ２４のピクセル２５に個別画像１７の１つの面フィールドを結像する。この際、ファセット３１の向きに応じて、検出器アレイ２４は２Ｄアレイであるのが好ましいが、検出器ラインとすることも可能である。
【００５１】
図８は、放射を格別に良好に検出器ラインに分配する反射素子３５がレンズ３２にさらに前置された、図７の検出器装置１９の発展例を示している。
【００５２】
検出器アレイ２４は、すでに述べたとおり、その幾何学的形状に関して他の制約なしに選択することができる。その場合に当然ながら、検出器装置１９の再分配部材は対応する検出器アレイに適合化させなければならない。画像１７が解像される個々のピクセルは、究極的には、そのサイズに関してもはや検出器アレイ２４によって規定されるのではなく、検出平面１８からの放射の再分配を惹起する部材によって規定される。エアリーディスクの場合、ディスクの直径は回折限界結像において式「１．２２・λ／ＮＡ」に基づいて求められ、ここでλは結像される放射の平均波長であり、ＮＡは対物レンズ１３の開口数である。そして半値幅は０．１５・λ／ＮＡとなる。高解像度を実現するには、検出のときの位置解像度を半値幅の２倍の大きさに構成すれば足り、すなわち半値幅を２回走査すれば足りる。したがってファセット素子３１は、あるいは光ファイババンドル入力部２２の光ファイバ２１の端部は、回折限界個別画像の半値幅の、最大で半分の大きさであればよい。これは、もちろん、光学系が対物レンズ１３の後で惹起する結像縮尺を考慮した上で適用させる。つまりもっとも単純なケースでは、半値幅ごとに検出平面１８で４×４アレイのピクセルがあれば十分すぎるほどである。
【００５３】
図５および６を参照して説明したズーム光学系は、スポット１４の回折限界画像１７の回折分布が検出器装置１９の入力面を最善に充填するような適合化に加えて、さらに別の動作モードも可能にし、すなわちそれは、２つ以上のエアリーディスクが検出平面１８に結像される場合である。２つ以上のエアリーディスクが検出器装置１９へ結像される測定では、試料２の別の奥行き平面からの光が検出器装置１９の外側のピクセルで検出される。このとき画像が処理される過程で、ＬＳＭ１の奥行き解像度に悪影響を及ぼすことなく、追加の信号強度が得られる。このようにズーム光学系２７または２９は、画像の信号／雑音比と奥行き解像度との間の妥協を図ることを可能にする。
【００５４】
図１〜８で紹介している解決法は、１つの波長領域について高い空間解像度でデータを取得するのに適している。しかし多くの用途については、複数の波長でデータを得るのが望ましい。
【００５５】
その際にシーケンシャルなデータ記録は、一方では記録時間が２倍以上になるという欠点がある。画像の記録に追加して、フィルタの交換や、ファイババンドルへの結像の倍率の変更のための時間がさらに必要になるからである。
【００５６】
検出構造を２倍にするとともに、ダイクロイックビームスプリッタを用いて信号をスペクトル分割することで、２つの波長領域について時系列のデータを取得することが可能である（図９参照）。しかし、このような高感度の検出器は、その構成においてコストがかさむ。しかも追加の検出器に加えて、リアルタイムデータ記録のための計算ユニットも必要となる。最終的に、２つのリアルタイムシステムが同時に制御される。すなわち、このような検出ユニットの２倍化の取組みは著しい追加コストと結びついている。
【００５７】
図９は、検出器とファイババンドルの２倍化を利用して、２つの異なる波長領域で試料を高解像度に観察するためのレーザスキャニング顕微鏡構造を示している。
【００５８】
カラースプリッタ４０は、検出放射をそれぞれ異なる波長領域の２つの部分光路に分割する。
【００５９】
それぞれ調整可能な集束光学系４１，４２、ならびにファイババンドル４３，４４およびマルチチャネル検出器４５，４６が、すでに上で説明したように設けられている。
【００６０】
本発明の目的は上述した欠点の回避にある。
【００６１】
本発明は、独立請求項の構成要件によって特徴づけられる。
【００６２】
好ましい発展例は従属請求項の対象である。
【００６３】
以下において、特に図９〜１９の図面を参照しながら本発明を詳しく説明する。
【００６４】
図９〜１９の符号は次のものを意味している：
４０：カラースプリッタ
４１，４２：調整可能な集束光学系
４３，４４：ファイババンドル
４５，４６，４７：マルチチャネル検出器
４８，４９：ファイババンドル
５０，５１：検出器領域
５２：調整可能な集束光学系
５３，５４：位置調節可能な光学系
５５：内方旋回可能な方向転換ミラー
５６：ファイババンドル
５７，５８，５９：ファイババンドル
６０，６１，６２：検出器領域
６３：光バリア／カラーフィルタ
６４，６５：ファイババンドル
６６，６７，６８：検出器領域
６９：ファイババンドル
７０：マルチチャネル検出器
７１：カラースプリッタ
７２：ミラー
【００６５】
本発明の取組みは、ただ１つのマルチチャネル検出器によって２つの波長領域を検出できるようにすることに基づいており、これら両方の波長領域について、試料信号のサブエアリー走査を行うことができる。
【００６６】
たとえばドイツ特許出願公開第１０２０１２２０４１２８Ａ１号明細書に記載されている、このような構造での検出器として、たとえば３２の個別チャネルからなるＧａＡｓＰ検出器やマルチアルカリ検出器を適用することができる。Ｃｏｌｉｎ  Ｓｈｅｐｐａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｏｐｔｉｋ  ８０，Ｎｏ．２，５３（１９８２）の手法に基づく高解像度の画像の算定のためには、空間方向ごとにエアリーディスクの少なくとも２倍のオーバーサンプリングを行わなければならない。この理由により本発明では、たとえば検出器の３２のチャネルをそれぞれ１６のチャネルの２つのグループに分割することが提案される。それぞれ１６のチャネルが、試料信号をエアリーディスクの対応するオーバーサンプリングで検出する役目を果たす。１つの波長領域についてのそれぞれ１６のチャネル画像の相殺が、高解像度の画像をもたらす。
【００６７】
レーザスキャニング顕微鏡構造では、たとえばダイクロイックカラースプリッタによって、試料信号がスペクトル的に２つの光路に分割される（これに関しては図９参照）。
【００６８】
図１０は、２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットにより取得することができるレーザスキャニング顕微鏡を模式的に示している。そのために試料光がカラースプリッタ４０でスペクトル分割されて、信号のサブエアリー走査を可能にする２つのファイババンドル４３，４４へと導かれる。これら両方のファイババンドルは、引き続いて光を共通のマルチチャネル検出器４７へと導く。
【００６９】
そしてこのときに結像光学系を用いて、スペクトル領域の両方の光路について試料平面を、好ましくはそれぞれ１６のチャネルを備える両方のファイババンドルに結像することができる。
【００７０】
試料平面は、ファイババンドルの入射面の平面に対して光学的に共役に配置されている。そしてそれぞれのファイババンドルが、両方の波長領域の光を共通の検出器へと導く。このようなファイバ構造が一例として図１１に模式的に示されている。
【００７１】
この図面は、２つの波長領域について画像を高い解像度で同時に記録するためのファイバ構造を示している。ここでは第１のコネクタまたはファイババンドル４８（図面で左）のファイバ１から１６が、第１の波長領域に割り当てられている。ファイバ１７から３２は、第２のコネクタまたはファイババンドル４９で第２の波長領域に割り当てられている。両方のコネクタはピンホール平面に相当する画像面にある。
そして両方のコネクタのファイバは、検出器４７の領域５０および５１でそれぞれ一緒にされて（図面で右）、３２のチャネルを有する共通の検出器ライン４７へと両方の波長領域の光を導く。
【００７２】
１６の検出チャネルの２倍をベースとして高解像度の画像の安定した再構成を確保できるようにするために、一方では、個々のチャネルの間のクロストーク（光ファイバを通じて、および検出器の表面や内部でも）について修正を行うことが重要である。これは、たとえば所定の光量が各々のファイバへ順次投入されて、すべてのチャネルで信号が測定されるキャリブレーション測定を通じて可能となる。その結果として生じるマトリクスを反転させて、検出器で測定された信号にファイバでの強度分布を割り当てることができる。
【００７３】
他方では、両方のファイババンドル４８，４９におけるファイバの配置は、エアリーディスクのサブサンプリングが確保されるようになっていることが保証されなくてはならない。図１１に示す配置は、円形のファイバの６角形の配置を基本としている。水平方向については、ファイバ１３，２，１，５および１６でエアリーディスクを検出することができる。そのためにファイバ１４，３，１，６および１１は６０°をなしている。ファイバ１５，４，１，７および１２は１２０°をなしている。このようにして、上に挙げた走査基準が３つの向きについて実現される。追加のファイバ８，９および１０は、一方では集光効率およびこれに伴って信号対雑音比を改善し、他方では、その他の向きについてのサンプリングを改善する。
【００７４】
上述したファイバの配置は、円形の直径をもつファイバだけに限定されるものではない。６角形のファイバについても、そのような配置が同じく好適であろう。そのような配置が同じく可能である正方形のファイバのケースでは、４×４の要素の正方形のマトリクスにこれを配置するのが好適である。このケースでは、エアリーディスクのそれぞれ異なる方向について４つのファイバのサンプリングが実現される。
【００７５】
複数の波長で物体を顕微鏡観察するときには、エアリーディスクのサイズが波長依存的であることに留意する。エアリーディスクのサイズは波長に直接的に比例する。その帰結として、エアリーディスクの最善のサンプリングのためには、両方の波長領域についてファイバへの結像を適合化することが必要となる。そのために、本発明に基づく複数の解決法がある：両方の光路について、それぞれズーム系４１，４２が使用され、それによって両方の領域について最善のサンプリングを実現する（図１２も参照）。このような構造は最大のフレキシビリティによって特徴づけられる。
【００７６】
図１２は、検出されるべき両方の波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するための第１の解決法を示している。このケースでは、両方の検出チャネルがそれぞれ独自に調整可能な集束光学系４１，４２を有している。この解決法は最大のフレキシビリティを提供する。
【００７７】
別案として、ズーム系の一部を両方の波長領域について共同で利用することも可能である。その場合、ズーム系５２の共同利用される部分の後でビームが分割される（図１３も参照）。このような構造は第１の解決法に類似してフレキシブルである。ただし、いっそう低コストかつコンパクトである。
【００７８】
図１３は、検出されるべき両方の波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するための第２の解決法を示している。このケースでは、両方の検出チャネルは共通の調整可能な集束光学系５２を有している。そして分離された光路で、光学軸に沿ってスライド可能な光学素子５３，５４により、ひとみサイズに合わせた適合化が行われる。
【００７９】
この解決法は、上に図１２で説明した解決法に類似してフレキシブルである。
【００８０】
通常、同時に測定されるべき波長領域の典型的な組合せが存在する。このことは、生体試料の着色に用いられる染料の典型的な組合せから生じる。典型的な組合せについて中心の波長の比率に着目すると、
【数１】
0006444406.tif 000002
の値が得られる。この比率を光学システムのいっそうの簡素化のために活用することができる：
【００８１】
−  検出光の波長分割は、図１３に示すように、共同で利用されるズーム系５２の後で初めて行われる。引き続いて長波の検出チャネルの結像がたとえば約１．１５分の１に縮小され、それにより両方の波長領域について、両方のファイババンドルでのエアリーディスクのサイズが等しくなる（図１３も参照）。
【００８２】
−  別案として、両方のファイババンドルで、直径（およびそのバンドル直径）がたとえばちょうど１．１５の比率を有しているファイバが使用される（図１４参照）。このようにして、両方の検出チャネルのうちの一方で追加の光学系を省略することができる。
【００８３】
−  図１４は、検出されるべき両方の波長領域について、それぞれ異なるひとみサイズに合わせて光学系を適合化するためのこのような種類の解決法を示している。このケースでは、両方の検出チャネルは共通の調整可能な集束光学系５２を有している。ひとみサイズに合わせた適合化は、４３，４４のファイバ直径およびファイババンドル直径の変更によって行われる。これらは典型的な波長比率に準じて、相互に一定の比率となっている。
【００８４】
−  最後に、追加の光学系と異なるファイバ直径とをいずれも省略するという選択肢もある。このケースでは、一方の波長領域について最善のサンプリングを選択して、第２の波長領域については走査が劣ることをともに是認するか、または、一方のファイババンドルでのエアリーディスクが約７．５％だけ大きく、かつ第２のバンドルが小さくなるようにズームを調整することが推奨される。このような効果を考慮して再構成に取り入れることができるが、最善の解像度向上をもたらすわけではない。
【００８５】
−  別案として、調整可能な集束光学系は、エアリーディスクの拡大をちょうど補償する横色収差を有するように設計される。
【００８６】
上述したいずれの構造でも、両方の波長帯域の選択をフレキシブルに構成できるようにするために、カラースプリッタを対応する機構に交換することができる。
【００８７】
原則として、上記の構造や変形例を、２つを超える波長領域に拡張することもできる。そのために追加の色分離と検出器チャネルの分割とが必要である。
【００８８】
図１５は、２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットによりファイババンドル４３，４４を通じて取得することができるレーザスキャニング顕微鏡の変形例を示しており、また別案によれば、１つの波長での測定をファイババンドル５６を通じて実行することができる（可動の方向転換ミラー５５が光路にあるか否かに依存）、レーザスキャニング顕微鏡の変形例を示している。３つすべてのファイババンドルが、信号のサブエアリー走査を可能にする。信号は続いて共通のマルチチャネル検出器へと導かれる。
【００８９】
図１６は、図１５に関して、２つの波長領域について高い解像度の画像を同時に記録するための、そしてまた、ファイバ入力部におけるエアリーディスクのサイズに応じて、エアリーディスクのいっそう細かいサンプリングもしくは改善された信号対雑音比（ＳＮＲ）で試料を観察するための追加の代替的な選択肢となるファイバ構造の略図を示している。ここでは第１のコネクタまたはファイババンドル５７（図１５の４３）（図面の左）のファイバ１から１６が、検出器４７における第１の波長領域６０に割り当てられている。ファイバ１７から３２は、第２のコネクタまたはファイババンドル５９（図１５の４４）で、第２の波長領域に割り当てられている。ファイバ１’から３２’を有する第３のコネクタまたはファイババンドル５９（図１５の５６）は、検出器４７の検出面６２全体にわたって１つの波長で代替的に試料観察をする役目を果たす。
【００９０】
３つすべてのコネクタは画像平面に存在している。そして３つすべてのコネクタのファイバが統合されて（図面の右）、３２チャネルの共通の検出器ラインへと両方の波長領域の光を導く。このとき統合は、５７のファイバ１および５９のファイバ１’が第１の検出器チャネルに割り当てられ、ファイバ２および２’が第２のチャネルに割り当てられ、以下同様に構成される。このようにして、同一の検出器で選択的に２つの波長で測定を実施することができ、または、１つの波長でいっそう細かいサンプリングもしくは改善されたＳＮＲにより測定を実施することができる。
【００９１】
図１７は、２つの波長領域についてのデータを同時に単一の検出ユニットにより取得することができ、また別案によれば、１つの波長での測定を実行することができる（可動のカラースプリッタが光路にあるか否かに依存）、レーザスキャニング顕微鏡の別の態様を示している。２つすべてのファイババンドル４３，４４が、信号のサブエアリー走査を可能にする。信号は続いて共通のマルチチャネル検出器４７へと導かれる。１つの波長についてのみ検出を実行したいときは、内方旋回可能ないし内方スライド可能な光バリアまたはカラーフィルタ６３によって、ファイババンドル１からの光が検出器に当たるのを防ぐことができる。逆に光バリアまたは（異なる透過特性を有する）カラーフィルタ６３によって、２つの波長領域を観察するときに、ファイババンドル２からの光がファイババンドル１で照明される検出器チャネルへ入らないようにすることができる。
【００９２】
図１８は、２つの波長領域について高い解像度で画像を同時に記録するための、そしてまた、エアリーディスクのいっそう細かいサンプリングで試料を観察するための追加の代替的な選択肢となるファイバ構造を示している。ここでは第１のコネクタ６４（図面の左）のファイバ１７から３２が検出器４７での第１の波長領域６７に割り当てられている。ファイバ１から１６は、第２のコネクタ６５で、検出器４７における第２の波長領域６６に割り当てられている。別案として、試料光の全体をたとえば図１２のカラースプリッタの外方旋回により、第２のコネクタに向かってのみ導くこともできる。その場合にファイバ１’から３２’（検出器領域６８）は、１つの波長でのデータ記録の役目をする。両方のコネクタは画像平面において試料平面に対して光学的共役である。そして両方のコネクタのファイバが統合されて（図面の右）、両方の波長領域の光を３２のチャネルを備える共通の検出器ラインへと導く。このとき統合は、６４のファイバ１７および６５のファイバ１７’が１７番目の検出器チャネルに割り当てられ、ファイバ１８および１８’が１８番目のチャネルに割り当てられ、以下同様に構成される。１６の検出器チャネルの第１番目のチャネルは、ファイバ１’から１６’を通じてのみ信号を受ける。このようにして、同一の検出器により選択的に２つの波長で測定を実施することができ、または、１つの波長でいっそう細かいサンプリングもしくは改善されたＳＮＲにより測定を実施することができる。
【００９３】
図１９は、２つのカラーチャネルについて高解像度の画像を検出するための検出ユニットの略図を示している。色分割は、ここではファイババンドル６９の後で実行される。検出器マトリクスまたは検出器ライン７０の前に、それぞれ検出器部材に透過的に光をあてて負荷を与え、第２の検出器部材にスプリッタミラーおよび別のミラー７２での二重反射により光をあてて負荷を与える、小型化されたカラースプリッタ７１が装着されている。
【００９４】
カラースプリッタ７１およびミラー７２によって信号が２つのスペクトル成分へと分解され、マルチチャネル検出器７０のそれぞれ２つの検出器部材に分配される。この例では、たとえば奇数の検出器チャネルを用いて第１の波長領域について高解像度の画像が生成され、偶数のチャネルは第２の波長領域についての画像をもたらす。
【００９５】
変形例：
以下において、上に掲げた本発明の解決法のさまざまな変形例について説明する：
【００９６】
ａ）使用するマルチチャネル検出器の感度のある面が十分に広いときは、１つを超えるファイバが光を検出器部材へ導くようにファイババンドルを製作することが可能である。このようにして、利用者は、上に説明したような検出チャネルを２つの波長領域の同時の検出のために使用するか、またはその代替として、第２の検出チャネルで１つの波長での試料観察のためにすべての検出器チャネルを利用することができる（たとえば１つを超えるエアリーの観察に基づき、エアリーディスクのいっそう細かいサンプリングで、または改善された信号対雑音比で）。このような組合されたファイバコネクタ構造が図面に示されている。
【００９７】
ｂ）上に掲げた解決法の別案として、両方のファイババンドルのうちの一方で１６のファイバをまとめ、第２のバンドルには３２のファイバを含ませる。これに関する模式図を図１７に見ることができる。この場合にも、２つの波長領域での試料の観察を具体化することができる。第１の波長領域については、３２本のファイバをもつバンドルからファイバ１’から１６’が使用され、第２の波長領域については、１６本のファイバをもつバンドルからファイバ１６から３２が用いられる（図１７参照）。２つの波長領域でデータが検出されるべきときに、ファイバ１７’から３２’からの試料光が検出器へ当たらないようにするため、このケースでは光バリアがファイバ出力部１７’から３２’と検出器チャネル１７から３２との間で光路に挿入されるか、または、ファイバ端部１７，１７’，．．．３２，３２’とこれに対応する検出器チャネルとの間に、ファイバ１７から３２の波長領域の光だけを透過させ、ファイバ１７’から３２’からの光を遮断するカラーフィルタが挿入されなくてはならない。
【００９８】
ｃ）上に掲げた構造のさらに別の代替案は、単一のファイババンドルの使用に基づくものである。波長領域のスペクトル分割は、ファイバ出力部と検出器の間で初めて行われる。ここでは各々のファイバの後で、波長帯域に応じてビームが分割される。そして両方の波長帯域が２つの検出器部材に分配される。図面を図１９に見ることができる。付言しておくと、ここではファイババンドルの適合化は一方の波長についてのみ行うか、または両方の波長の間での妥協として行うことができる。別案として、調整可能な集束光学系が、エアリーディスクの倍率をちょうど補償する横色収差を有するように設計される。場合により、ファイバの光を検出器チャネルへ向けるために、追加の集束光学系が必要である。
【００９９】
ｄ）さらに別の代替的な構造では２つのファイババンドルが使用され、顕微鏡側のファイバコネクタが相並んで配置されている。集束光学系が、２つの波長帯域を相並んで配置する役割を果たす。この機能は、可変の軸上横色収差を有する光学素子によって生起される。たとえば、一例として図９では集束光学系４１の前に配置され、光学軸に対して垂直にスライド可能である、高分散のウェッジＫを通じて具体化することができる。このようにして、第１の波長領域の光がファイバ１から１６へ導かれ、その一方で、第２の波長領域の光は空間的にオフセットされてファイバ１７から３２に達する。波長領域の選択は、さまざまに異なるウェッジ角を通じて行うことができる（取替可能なウェッジ、または光路でスライドする、異なるウェッジ角をもつ「段差のある」ウェッジ）。
【０１００】
別案として、図９では一例として集束光学系４１の後に配置された、横方向へスライド可能なキット部材ＫＧを通じて可変の軸上横収差を実現することができ、その屈折率とアッベ数は、両方の波長領域が空間的に分割されるように選択されている。光路でウェッジをスライドさせることにより、波長領域を選択することが可能である。このような部材はドイツ特許出願公開第１９９５１４８２Ａ１号明細書から公知である。
【０１０１】
いずれのケースでも任意選択として、空間的に分離された両方の波長領域の光を両方のファイババンドルへ導くために、場合により、当業者に周知の追加のミラーが必要になる。
【符号の説明】
【０１０２】
４０    カラースプリッタ
４１，４２    調整可能な集束光学系
４３，４４    ファイババンドル
４５，４６，４７    マルチチャネル検出器
４８，４９    ファイババンドル
５０，５１    検出器領域
５２    調整可能な集束光学系
５３，５４    位置調節可能な光学系
５５    内方旋回可能な方向転換ミラー
５６    ファイババンドル
５７，５８，５９    ファイババンドル
６０，６１，６２    検出器領域
６３    光バリア／カラーフィルタ
６４，６５    ファイババンドル
６６，６７，６８    検出器領域
６９    ファイババンドル
７０    マルチチャネル検出器
７１    カラースプリッタ
７２    ミラー
【図１】
0006444406.tif 000003
【図２】
0006444406.tif 000004
【図３】
0006444406.tif 000005
【図４】
0006444406.tif 000006
【図５】
0006444406.tif 000007
【図６】
0006444406.tif 000008
【図７】
0006444406.tif 000009
【図８】
0006444406.tif 000010
【図９】
0006444406.tif 000011
【図１０】
0006444406.tif 000012
【図１１】
0006444406.tif 000013
【図１２】
0006444406.tif 000014
【図１３】
0006444406.tif 000015
【図１４】
0006444406.tif 000016
【図１５】
0006444406.tif 000017
【図１６】
0006444406.tif 000018
【図１７】
0006444406.tif 000019
【図１８】
0006444406.tif 000020
【図１９】
0006444406.tif 000021