(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体装置であって、
ｉ）少なくとも１つの注入口；
ｉｉ）径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺によって規定される台形断面を有し、該断面は、この曲線マイクロ流路に沿って一定の幅を有しており、前記径方向内側の辺が、前記径方向外側の辺よりも低くなっており、前記底辺が直線状である、曲線マイクロ流路；および
ｉｉｉ）少なくとも１つの排出口
を備える、マイクロ流体装置。
【請求項２】
前記台形断面は、直角台形の断面である、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
前記台形断面の上辺は、湾曲している、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
前記台形断面の上辺は、凸状である、請求項３に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
前記台形断面の上辺は、凹状である、請求項３に記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
前記台形断面の径方向内側の辺の高さは、約２０〜約２００ミクロンの範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
前記台形断面の径方向外側の辺の高さは、約２０〜約２００ミクロンの範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
前記台形断面の底辺の幅は、約１００〜約２０００ミクロンの範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
前記台形断面の上辺の幅は、約１００〜約２０００ミクロンの範囲である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
前記曲線マイクロ流路は、渦巻き状マイクロ流路である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記曲線マイクロ流路は、蛇行状マイクロ流路である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
前記曲線マイクロ流路の曲率半径は、約２．５〜約２５ｍｍの範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１３】
前記曲線マイクロ流路の長さは、約４〜約１００ｃｍの範囲である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの注入口は、単一の注入口である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの排出口は、２つの排出口である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府による支援
本発明は、アメリカ海軍宇宙海事システム司令所より授与された補助金第Ｎ６６００１−１１−１−４１８２号により政府の支援を受けてなされたものであり、政府はその権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１２年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７０４，１２８号の利益を主張する。この出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
従来の大規模細胞分離法には、膜系のフィルターを用いた物理的な濾過、ならびに細胞のサイズ、変形性、および密度の違いを利用して目的細胞を濾別する密度勾配遠心法がある。これらの技術は、多大な労働力を要し、人為的影響を生じ得る、または所望の細胞を損失し得る多段階の試料調製を必要とする。膜濾過法は、また、容易に詰まりの影響を受け、頻繁に洗浄する必要がある。また、濾過および遠心分離技術に供した目的細胞の本来の表現型が、機械的ストレスに誘導されて変化することの証拠が報告されてもいる。最近では、フィルターを用いないサイズ別細胞分画法として、慣性マイクロ流体装置が研究されていた。ディ・カルロ・Ｄ．（Di Carlo D.）「慣性マイクロ流体技術 (Inertial microfluidics)」『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a chip）』２００９年；９巻；２１号：３０３８〜３０４６頁、クンタゴウダナハリ ＳＳ（Kuntaegowdanahalli SS）ら『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a chip）』２００９年；９巻；２０号：２９７３〜２９８０頁、およびバガット ＡＡＳ（Bhagat AAS）ら『バイオメディカル・マイクロデバイシズ（Biomedical Microdevices）』２０１０年；１２巻；２号：１８７〜１９５頁を参照のこと。
【０００４】
しかしながら、細胞の損失を最小限とし、続く解析のために目的細胞の本来の表現型を維持することが可能な、より簡易で効率的な血液試料処理方法の開発が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一般に、断面が長方形でない湾曲したマイクロ流路を有する、粒子の集束および混合のためのマイクロ流体装置である。特定の一態様において、本発明は、少なくとも１つの注入口、ならびに径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺によって規定される台形断面を有し、該断面は、この曲線マイクロ流路に沿って一定の幅を有しており、前記径方向内側の辺が、前記径方向外側の辺よりも低くなっており、前記底辺が直線状である、曲線マイクロ流路、を備える、マイクロ流体装置である。上記マイクロ流体装置は、さらに、少なくとも１つの排出口を備える。ある態様において、上記マイクロ流体装置は、排出口を２つ備える。ある態様において、上記マイクロ流体装置は、注入口を１つ備える。
【０００６】
ある態様において、上記台形断面は、直角台形であり得る。ある態様において、上記台形断面の上辺は、凸状または凹状となることができる曲率で、湾曲させることができる。
【０００７】
他の態様において、上記台形断面の径方向内側の辺および径方向外側の辺は、高さが約２０〜約２００μｍの範囲であり得る。ある態様において、上記台形断面の上辺および底辺は、幅が約１００〜約２０００μｍの範囲であり得る。
【０００８】
一態様において、上記曲線マイクロ流路は、渦巻き状のマイクロ流路であり得る。他の態様において、上記曲線マイクロ流路は、蛇行状のマイクロ流路であり得る。上記曲線マイクロ流路は、曲率半径が約２．５〜約２５ｍｍ、長さが約４〜約１００ｃｍの範囲であり得る。
【００１６】
本発明は、現在のマイクロ流体装置を用いて得られる分離能よりも高い分離能での分離など、多くの利点を有する。流路の寸法は、通常、粒径の３倍より大きく、これにより装置に詰まりの問題がなくなりハイスループットとなるだけでなく、製造コストが減少する。これらの利点によって、湾曲マイクロ流体装置の将来における幅広い応用が示唆される。また、本明細書に記載の発明は、流路の形状を変更することにより、従来の長方形湾曲マイクロ流路よりも多くの異なる利点を提供する。特に、粒子の高分離能な分離に応用する場合、粒子は、その粒径と流速に従って、内側および外側に沿う２つの主流に分離される。この種の装置によって、従来の長方形の流路では不可能な、高分離能かつハイスループットな分離が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
上述の事項は、添付の図面に記されるように、本発明の実施形態の例のより具体的な以下の説明により、明らかになるであろう。なお、異なる図全般を通して、同じ箇所に同様の参照符号を付している。図面は、必ずしも一定の縮尺に従ってはおらず、代わりに本発明の実施形態の説明に重点を置いている。
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、２つの典型的な曲線マイクロ流路の上面図を示す概略図である（図１Ａ：渦巻き状、図１Ｂ：蛇行状）。渦巻き状マイクロ流路の切取図を左に示す。典型的には、流路の幅は、深さよりも大きい。長方形の断面を有する流路内のディーン（Dean）流れは、上壁および底壁に平行でありつつ、内側から外側への主流を有する。ディーン流れおよび慣性揚力の影響を受けて、粒子は、ディーン流れが弱い流路の内側半分に集束する。粒子の位置は、流路の寸法、縦横比、曲率半径、粒径、および流速などのパラメータによって制御される。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、異なる断面を有する湾曲流路の概略図である。図２Ａは、内側（曲率中心付近）が深く、外側が浅い湾曲マイクロ流路を示す。２つのディーン渦核は内側に偏っており、内部に粒子を捕捉している。この種のマイクロ流路は、粒子の濃縮および濾別に応用される。図２Ｂは、内側が浅く、外側が深い湾曲マイクロ流路を示す。２つのディーン渦核は外側に偏っており、内部にいくらか小さい半径を有する粒子を閉じ込める能力を有していて、サイズ別の分離に用いることができる。図２Ｃは、段状の断面を有する湾曲流路を示し、粒子は段の角に捕捉される。図２Ｄでは、内に浅い領域を挟んだ湾曲マイクロ流路が、複雑なディーン流れおよび慣性揚力の分布を形成し、粒子の集束または捕捉を防ぐ。このような流路は、ミキサーとして用いることができる。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、注入口を１つと排出管を２つ有する、実際の台形断面渦巻き状マイクロ流体装置を示す写真である。図３Ａに示す流路は、視覚化のために染料で満たされている。装置は、プラズマによって接着された２層のＰＤＭＳ層からなる。渦巻き型である層の一方は、切削されたマイクロＰＭＭＡ型で鋳造される。流路の断面図を図３Ｂに示す。流路の幅は６００μｍ、内側の高さ（下部）は８０μｍ、外側の高さ（上部）は１４０μｍである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｈは、排出口における蛍光ビーズの分布を比較する上面図で、図４Ａ〜図４Ｄは高さが８０μｍ、幅が６００μｍの長方形断面、図４Ｅ〜図４Ｈは台形断面を有する図１Ａで述べたような渦巻き状マイクロ流路を示しており、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ（左）から７．５ｍＬ／ｍｉｎ（右）へと増加している。図に示すビーズの粒径は、図４Ａおよび図４Ｅでは５．７８μｍ、図４Ｂおよび図４Ｆでは９．７７μｍ、図４Ｃおよび図４Ｇでは１５．５μｍ、図４Ｄおよび図４Ｈでは２６．２５μｍである。
【図５】図５は、台形断面渦巻き状流路を横切るディーン流れ場の計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーション結果を、渦巻き状流路の断面において力が平衡となる粒子の位置を示す実験結果と比較して示す図である。矢印は、ディーン流れの方向および大きさを示し、分布図は、ディーン流れの大きさを示す。点は、実験結果から得られた２６．２５μｍビーズの位置である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、台形断面を有する渦巻き状流路を用いて新鮮なヒト血液から好中球を分離した結果および写真を示す。図６Ａは、モノ・ポリ分離溶液（Mono-Poly Resolving Medium）（カタログ番号１６９８０４９、ＭＰバイオメディカル（MP Biomedicals））を用いて新鮮なヒト血液から単離した、主に好中球である多形核白血球（ＰＮＬ）、および１×ＰＢＳで希釈した０．１％ヘマトクリット血液試料を用いて、様々な流速下で、流路内における各細胞の位置を明らかにした図である。ここに示す上面視の画像は、ファントムｖ９．１（Phantom v9.1）高速カメラによって記録された一連の明視野画像の標準偏差を求めて得られたものである。この実験に用いられた流路の断面は、幅が５００μｍ、内壁および外壁の深さがそれぞれ９０μｍおよび１２０μｍの台形であった。上部の破線は内側流路壁を示し、下部の破線は外側流路壁を示す。図６Ｂでは、ヘマトクリットが異なる血液試料に単離したＰＮＬを加え、ＡＰＣ結合抗ＣＤ４５抗体を用いて染色し、０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で渦巻き状流路に投入する試料として用いた。内側排出口から排出される画分中に回収されたＰＮＬおよびＲＢＣ細胞数を、それぞれフローサイトメトリー解析および血球計算器で求めた。図６Ｃは、０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速において投入試料として０．１％ヘマトクリットの新鮮な血液試料を用いた際の、内側排出口の排出画分のギムザ染色を示す。細胞のほとんどが好中球であった。図６Ｄは、ヒト血液の１％ヘマトクリットバッフィーコートを０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速において渦巻きを通して処理し、１μＭ ＰＭＡを用いる条件または用いない条件で、投入される細胞と排出される細胞の両方にニトロブルー−テトラゾリウム（ＮＢＴ）試験を行った図である。画像は、外部由来のＰＭＡが存在する条件下でのみ細胞が青くなっていることを示し、これにより、装置は試料中の好中球を活性化せず、排出された好中球は生きたままであり、インビトロの刺激によって活性化できることが示された。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、内側が８０μｍ、外側が１３０μｍ、幅が６００μｍの台形断面を有する渦巻き状装置を用いて分離した後、２つの排出口から回収したＭＳＣのサイズの分布を示すグラフであり、各排出口から回収した細胞を１００個、手作業で測定している。図７Ａでは、試料は２．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入されている。図７Ｂでは、試料は３．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入されている。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、２．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、内側が８０μｍ、外側が１３０μｍ、幅が６００μｍの台形断面を有する渦巻き状装置の内側排出口（図８Ｂ）および外側排出口（図８Ａ）から回収されたＭＳＣの顕微鏡画像である。
【図９】図９Ａは、ディーン渦内部に粒子を集束および捕捉する原理を説明する、台形断面流路の概略図である。図９Ｂは、２つの排出管を除いた実際のＰＤＭＳ鋳造台形断面渦巻き状マイクロ流体装置の写真を示す。断面の切取図を左に示す。渦巻き状曲線の半径は、７．５ｍｍから１２．５ｍｍまで変化させた。流路断面の内側および外側の高さは、それぞれ８０μｍおよび１３０μｍである。流路の幅は、６００μｍである。
【図１０】図１０Ａは、０．５ｍＬ／ｍｉｎから７．５ｍＬ／ｍｉｎの流速範囲で、内側／外側の深さが８０／１３０μｍの台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路、および高さが８０μｍの長方形流路の、排出口における蛍光ビーズの分布を比較した上面視の画像である。図１０Ｂは、力が平衡となる粒子の位置を示す、上面視および側面視による２６．２５μｍ蛍光ビーズの分布と組み合わせた、ディーン流れ場のＣＦＤシミュレーション（内側／外側の深さ：８０／１４０μｍ、幅：６００μｍ、流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ、流路半径：７．５ｍｍ）である。黒い円錐体は、ディーン流れの方向および大きさを示す。灰色の円は、実験結果から得られた、典型的な流速における２６．２５μｍビーズの位置である。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、内側／外側の深さが８０／１３０μｍ、幅が６００μｍの台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路を用い、３．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で粒子を分離したＦＡＣＳの結果を表すグラフであり、図１１Ａは、０．６６５％体積／体積濃度の１６．６８μｍおよび２６．９μｍ粒子（約２．６×１０６／ｍＬ）を含む投入分、図１１Ｂは内側の排出分、図１２Ｂは外側の排出分を示す。
【図１２】図１２は、異なる位置にある粒子にかかる力の方向を説明する概略図である。黒丸は、平衡が不安定な点を示す。白丸は、力の平衡が安定している点を示す。白い円錐体は、ディーン速度の方向および対数的大きさを示す。
【図１３】図１３は、幅が５００μｍ、深さが７０μｍ（内側）および１００μｍ（外側）である台形断面を有する渦巻き状流路の概略図（一定の縮尺には従っていない）であり、操作の原理を示している。排出口において、大きい白血球（ＷＢＣ）は、慣性揚力（ＦＬ）およびディーン抗力（ＦＤ）の組み合わせによって内壁近くに集束し、一方、小さい赤血球（ＲＢＣ）は、ディーン渦核に捕捉されて、外壁近くで広い帯状となる。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、１０μｍ（白）および６μｍ（灰色）ビーズの慣性集束を示す概略図（一定の縮尺には従っていない）および平均合成蛍光画像である。図１４Ａは、最適な流速として１ｍｌ／ｍｉｎ（Ｄｅ＝４．３１）の流速で、５００μｍ×９０μｍ（Ｗ × Ｈ）の長方形断面を有する渦巻き状流路を用いたものであり、図１４Ｂは、最適な流速として２ｍｌ／ｍｉｎ（Ｄｅ＝８．６３）の流速で、５００μｍ×１２０μｍの長方形断面を有する渦巻き状流路を用いたものであり、図１４Ｃは、最適な流速として０．８ｍｌ／ｍｉｎ（Ｄｅ＝４．２２）の流速で、幅が５００μｍ、深さが７０μｍ（内側）および１００μｍ（外側）の台形断面を有する渦巻き状流路を用いたものである。図１４Ｄは、最適な流速として０．８ｍｌ／ｍｉｎ（Ｄｅ＝４．３２）の流速で、幅が５００μｍ、深さが９０μｍ（内側）および１２０μｍ（外側）の台形断面を有する渦巻き状流路を用いたものである。水平な破線は、流路壁の位置を示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、幅が５００μｍ、深さが７０μｍ（内側）および１００μｍ（外側）の台形断面を有する渦巻き状流路内の流速（Ｑ）の関数として、蛍光粒子が集束する挙動を示す上面視の画像である。図１５Ａでは、１５．５μｍ粒子を用い、ａｐ／Ｄｈ＝０．１０４、ａｐ／Ｄｉｎｎｅｒ＝０．２１３であり、図１５Ｂでは、１０μｍ粒子を用い、ａｐ／Ｄｈ＝０．０６７、ａｐ／Ｄｉｎｎｅｒ＝０．１３７であり、図１５Ｃでは、６μｍ粒子を用い、ａｐ／Ｄｈ＝０．０４０、ａｐ／Ｄｉｎｎｅｒ＝０．０８２である。水平な破線は、流路壁の位置を示し、内側流路壁が画像の上側に示される。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、ＷＢＣおよび異なるヘマトクリット（０．１％、０．５％）の、ＲＢＣの流路幅方向における分布を示す正規化強度線走査を示す。図１６Ａは、最適な流速（１ｍｌ／ｍｉｎ）で、長方形断面（５００μｍ×９０μｍ）を有する渦巻き状流路を用いたものであり、図１６Ｂは、最適な流速（０．８ｍｌ／ｍｉｎ）で、台形断面（５００μｍ×７０／１００μｍ）を有する渦巻き状流路を用いたものである。内側の流路壁は、ｘ＝０で表され、外側の流路壁は、ｘ＝５００で表されている。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、台形断面を有する渦巻き状流路における血液細胞の特徴付けを示す。図１７Ａは、０．８ｍｌ／ｍｉｎでの多形核白血球（ＰＭＬ）、単核白血球（ＭＮＬ）およびＲＢＣ（０．１％ヘマトクリット）の流路幅方向における分布を示す正規化強度線走査である。内側の流路壁は、ｘ＝０で表され、外側の流路壁は、ｘ＝５００で表されている。図１７Ｂは、異なるヘマトクリットにおける全ＷＢＣ、ＰＭＮ、ＭＮＬおよびＲＢＣの単回回収率を示す。図１７Ｃおよび図１７Ｄは、台形断面渦巻きによる処理後、２段階カスケードの様式で回収した際の１％ヘマトクリット投入試料の回収率（図１７Ｃ）および１．５％ヘマトクリット投入試料の回収率（図１７Ｄ）を示す。ＲＢＣ量はコールター計数器で測定し、ＷＢＣ、ＰＭＮおよびＭＮＬ量は、個別に、ヘキスト陽性細胞、ＣＤ６６ｂ陽性細胞、ヘキスト陽性だがＣＤ６６ｂは陰性である細胞のＦＡＣＳ解析に基づいて求めた。エラーバーは、３回の試験結果の標準偏差を示す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、分画遠心分離を経て得られたバッフィーコートの渦巻き処理の図である。図１８Ａは、モノ・ポリ分離溶液（Mono-Poly Resolving Medium）を用いた遠心分離後の健康な血液試料の写真である。第１層（ＦＲ１）はＭＮＬからなり、一方、第２層（ＦＲ２）は、ＰＭＮの大部分およびＲＢＣの残りいくらかを含んでいた。この２層の細胞を、元々の全血試料と同じ体積に再懸濁し、台形断面を有する渦巻き状のマイクロ流路でさらに処理した。図１８Ｂは、台形断面渦巻き状マイクロ流路の投入試料および排出試料中の細胞サイズの分布を示す。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、渦巻きおよび他の赤血球除去法によるＰＭＮ活性化を比較した図である。図１９Ａは、１μＭ ＰＭＡを用いる条件または用いない条件で、分画遠心分離法（ＭＰＲＭ）または渦巻き処理によって単離されたＷＢＣに、ニトロブルー−テトラゾリウム（ＮＢＴ）試験を行った図である。スケールバーは１０μｍである。図１９Ｂは、異なるＲＢＣ除去法で処理した試料中の活性化ＰＭＮを、ＣＤ６６ｂ＋ ＣＤ１８＋細胞のＦＡＣＳ解析に基づいて比較した図である。エラーバーは、３回の試験結果の標準偏差を表す。
【図２０】図２０は、長方形断面渦巻き状マイクロ流路における粒子の平衡を示す図である。流路断面の黒い円錐体は、半径７．５ｍｍの流路において、流速が３．５ｍＬ／ｍｉｎのときのディーン流れ場のＣＦＤシミュレーションの結果である。ディーン抗力は、ディーン速度に比例するので、同図は、粒子にかかるディーン抗力のベクトルプロットも示す。上面視および側面視による１５．５μｍ蛍光ビーズ分布の実験画像は、シミュレーション図の下側および左側に並べられている。上面視および側面視による観察の組み合せにより、典型的な流速における１５．５μｍビーズの位置が、流路断面中に灰色の円として描かれている。
【図２１】図２１は、内側／外側の深さが８０／１４０μｍで、幅が６００μｍである台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路における、粒子の平衡を示す図である。流路断面の黒い円錐体は、半径７．５ｍｍの流路において流速が３．５ｍＬ／ｍｉｎのときのディーン流れ速度（ディーン抗力でもある）のＣＦＤシミュレーションの結果である。上面視および側面視による２６．２５μｍ蛍光ビーズ分布の実験画像は、シミュレーションの下側および左側に並べられている。上面視および側面視による観察の組み合せにより、典型的な流速における２６．２５μｍビーズの位置が、流路断面中に灰色の円として描かれている。
【図２２】図２２は、流路深さが異なる長方形断面渦巻き状マイクロ流路、および台形断面渦巻き状マイクロ流路の排出口において、流速を上げていった場合に、蛍光ラベルされた微粒子を上面視により実験的に観察した図である。
【図２３】図２３は、流速（ｍＬ／ｍｉｎ）の関数として内側排出口からの回収率（％）を示すグラフであり、台形断面渦巻き状マイクロ流路（内側の深さが８０μｍ、外側の深さが１３０μｍ、幅が６００μｍ）の内側排出口からの、異なる流速における様々な粒径の粒子の回収率を示している。
【図２４】図２４Ａは、フローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、米国）を用いて取得した散布図を示し、内側の深さが８０μｍ、外側の深さが１３０μｍ、幅が６００μｍの台形断面を有する流路における粒子混合物の分離結果を示している。図２４Ｂは、排出口の分岐点において取得した高速顕微鏡画像（ファントムＶ９．１（Phantom V9.1）、ヴィジョン・リサーチ社（Vision Research Inc.）、米国、露光時間＝４μｓ）であり、流速３．４ｍＬ／ｍｉｎにおいて１８．６８μｍ粒子および２６．９μｍ粒子の分離をはっきりと示している。
【図２５】図２５は、台形断面マイクロ流路において、典型的ないくつかの位置の粒子に作用する力を示す概略図である。位置ａの粒子に作用する力は、高流速での、内側における不均衡を示す。位置ｂ、ｃ、ｄおよびｅの粒子に作用する力は、異なる位置に中心を持つディーン渦付近に粒子が捕捉される傾向にあることを示す。白い円錐体は、シミュレートされたディーン速度ならびにディーン抗力の方向および対数的大きさを示す。
【図２６】図２６は、台形断面マイクロ流路において、典型的ないくつかの位置の粒子に作用する力を示す概略図である。位置ａの粒子に作用する力は、高流速での、内側における不均衡を示す。位置ｂ、ｃ、ｄおよびｅの粒子に作用する力は、異なる位置に中心を持つディーン渦付近に粒子が捕捉される傾向にあることを示す。白い円錐体は、シミュレートされたディーン速度ならびにディーン抗力の方向および対数的大きさを示す。
【図２７】図２７Ａは、ディーン渦内での粒子の集束および捕捉の原理を説明する、台形断面渦巻き状マイクロ流路の概略図である。図２７Ｂは、側面視における集束位置計測を説明する、実際の渦巻き状マイクロ流体装置を示す図である。マイクロ流体流路は、可視化のために染料で満たされている。試料は、計測のために、中央のループから外側のループに流される。
【図２８】図２８Ａは、湾曲流路の上面視による、粒子周囲の相対流速の概略図である。図２８Ｂは、長方形流路でのシミュレーションに従って、ディーン速度ＵＤがＲｅに伴って増加することを示す、流速（ｍＬ／ｍｉｎ）の関数としてのディーン速度のグラフである。上の曲線におけるＵＤの値は、流路深さの２２％（集束位置）におけるディーン速度の大きさであり、一方下の曲線のＵＤは、流路中央におけるディーン速度の大きさである。図２８Ｃは、流路幅の中央線における異なる流速でのｙ軸沿いのディーン速度の大きさを示す、ディーン速度（ｍ／ｓ）の関数としての流路深さ（μｍ）のグラフである。
【図２９】図２９は、１５．５μｍ粒子にかかる３つの主要な力の大きさを示す、流速（ｍＬ／ｍｉｎ）の関数としての力（Ｎ）のグラフである。ＦＤＤおよびＦＡＢＣは、長方形断面流路のシミュレーションに基づいて計算され、粒子は、平衡位置（流路深さの２２％）に位置している。ＦＬは、ヤン（Yang）のシミュレーションに従って計算され、その方向は、円筒管の軸方向に沿っている。
【図３０】図３０は、台形断面渦巻き状マイクロ流体流路内で集束する粒子に与える、傾斜角の効果を説明する図である。画像中の白い帯は、１５．５μｍ蛍光ビーズが集束した帯を上面視で示す。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｃは、１５．５μｍ蛍光粒子が集束した帯の、異なる形状の流路断面における流速に伴う移動を示す、上面視の顕微鏡画像である。流路の幅は、５００μｍである。内側の深さは、７５μｍである。流路の断面積は、３つの流路全てにおいて等しく５．０×１０−２ｍｍ２となるように設計される。線は流路壁を示す。図３１Ａは、凸状台形断面である。図３１Ｂは、直角台形断面である。図３１Ｃは、凹状台形断面である。
【図３２】図３２Ａは、台形断面（内側／外側流路高さが８０／１３０μｍ）を有する渦巻き状流路によるＣＴＣ濃縮の操作原理を説明する図である。ＣＴＣは、慣性揚力およびディーン抗力の組み合わせによって、排出口において内壁付近に集束し、一方白血球（ＷＢＣ）および血小板は、外壁近くに形成されるディーン渦核に捕捉される。図３２Ｂは、ＣＴＣ分離のためのワークステーションの構成を示す写真である。溶血された血液は、シリンジポンプを用いて渦巻き状チップを通して送り込まれ、そこでＣＴＣは他の血液成分から素早く効率的に分離される。
【図３３】図３３は、コントロールの（選別されていない）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、および渦巻き状チップによって濃縮された細胞の培養の位相差顕微鏡写真である。画像は、細胞間で形態および増殖速度に大きな違いがないことを示しており、高い生存率および無菌状態が示唆される。スケールバーは２００μｍである。
【図３４】図３４Ａは、台形渦巻き状バイオチップの性能および最終的な純度に与えるＷＢＣ濃度の効果を示す、濃縮係数の関数としての１ｍＬあたりのＷＢＣ数のグラフである。図３４Ｂは、検査された異なるがん細胞株が、約８５％という高い効率で分離されたことを示すヒストグラムプロットである。図３４Ｃは、トリパンブルー色素を用いて染色されたコントロール（選別されていない）および選別されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の高い細胞生存率を示す位相差顕微鏡写真、および試料の処理中に細胞にかかる剪断力が生存率を下げておらず、９０％より多い生存細胞が得られていることを立証する棒グラフの結果を示す。
【図３５】図３５は、台形断面チップによって捕捉されたＣＴＣの生存率を示す写真である。捕捉された細胞は、２Ｄポリリジンコート基板上で平板培養し、一晩放置する。インビトロで、ＣＴＣによる血小板のクラスター化を観察可能である。ＣＴＣの生存率は、ＰＩ染色によって確認された。
【図３６】図３６Ａ〜図３６Ｄは、渦巻き状チップを用いて処理された、健康な提供者（ｎ＝５）ならびに転移性乳癌および肺癌患者（ｎ＝１０）の血液の写真である。図３６Ａは、単離されたＣＴＣの蛍光免疫染色を示す。ＣＴＣは、次のような基準：ヘキスト陽性、パン−サイトケラチン陽性およびＣＤ４５陰性、で分類される。図３６Ｂは、健康な提供者、乳癌患者、および肺癌患者のＣＴＣを計数しプロットしたものを示す。図３６Ｃは、乳癌試料中のがん幹細胞（ＣＳＣ）の、基準マーカーを用いた分類を示す。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋は検出されなかった。ＣＤ４４＋細胞は、ＣＤ２４＋細胞よりも大きいことがわかった。図３６Ｄは、アポトーシス細胞の染色を示す。単離されたＣＴＣには切断型カスパーゼ−３は存在しない。切断型カスパーゼ−３を発現する細胞の大多数（＞９５％）は、ＣＤ４５＋である。
【図３７】図３７は、細胞のサイズおよび細胞間の核の不均一性を示す、ＣＴＣ画像ライブラリの写真である。スケールバーは１０μｍである。
【図３８】図３８は、単離されたＣＴＣの、切断型カスパーゼ−３についてのフローサイトメトリー解析を示す、ＦＬＡ−１の関数としてのＦＬＡ−４のグラフである。細胞のうちの９．９％のみが切断型カスパーゼ−３陽性であり、マイクロ流体チップにおける高流速は、細胞の生存率および完全性に影響しないことが確認された。
【図３９】図３９は、濃縮されたＣＴＣの１７番染色体のセントロメア（Ｃｅｎ−１７）およびＨＥＲ２の検出を示す写真である。ＨＥＲ２／Ｃｅｎ１７比が２より大きい場合、細胞はＨＥＲ２が増幅されている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫＢＲ３乳癌株をコントロールとして用いた。合成された画像（ＤＡＰＩ、スペクトル：ＨＥＲ２シグナル、スペクトル：Ｃｅｎ−１７）の倍率は２０倍である。スケールバーは１０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明の実施形態の例を説明する。
【００１９】
マイクロ流体装置において、曲線流路を流れる粒子は、慣性移動および二次ディーン流れの両方に影響される。ディーン流れおよび慣性揚力の組合せによって、濃縮および分離用途に適した異なる位置に、粒子が集束、位置することとなる。
【００２０】
マイクロ流体装置に導入されて、粒子が集束する位置を新しく生じるような、ディーン渦の形状および位置の変化をもたらす非長方形断面を有する湾曲マイクロ流路一式が、本明細書に述べられている。例えば、本明細書に示すように、内側（曲率中心沿い）が深く、外側が浅い湾曲マイクロ流路は、内壁付近に強いディーン渦核を２つ生じ、サイズに関わりなく、その渦内に全ての粒子を捕捉する。このような流路は、超ハイスループットな水の濾過および精製など、粒子および細胞の濃縮用途において、その用途が多く見出される。
【００２１】
超ハイスループットとは、約０．５ｍＬ／ｍｉｎ〜約１Ｌ／ｍｉｎの範囲の流速である。様々な組み合せで複数の流路を組み合わせることで、超ハイスループットを実現することができる。ある態様において、単一のマイクロ流体装置に、複数の流路を組み合わせることができる。他の態様において、多重化マイクロ流体装置に複数の流路を組み合わせることができる。これにより、超ハイスループットの流速を、約０．５ｍＬ／ｍｉｎ、約５ｍＬ／ｍｉｎ、約１０ｍＬ／ｍｉｎ、約２０ｍＬ／ｍｉｎ、約４０ｍＬ／ｍｉｎ、約５０ｍＬ／ｍｉｎ、約１００ｍＬ／ｍｉｎ、約２００ｍＬ／ｍｉｎ、約３００ｍＬ／ｍｉｎ、約４００ｍＬ／ｍｉｎ、約５００ｍＬ／ｍｉｎ、約６００ｍＬ／ｍｉｎ、約７００ｍＬ／ｍｉｎ、約８００ｍＬ／ｍｉｎ、約９００ｍＬ／ｍｉｎ、または約１Ｌ／ｍｉｎとすることができる。
【００２２】
また、本明細書に示すように、湾曲マイクロ流路の内側が浅く外側が深い場合、外側の外壁付近に渦の中心が偏り、渦内に粒子および細胞を閉じ込める。しかしながら、慣性力が優勢となる大きい粒子は、長方形断面流路と同様に、内側の流路壁付近に集束する。このように、流路パラメータを適切に設計することにより、小さい粒子／細胞は、外側の渦に捕捉され、一方、比較的大きい粒子は、内側のマイクロ流路壁に沿って集束することが、本明細書に示される。粒子／細胞が、ディーン渦に捕捉されるのか、内側の流路壁に向かって収束するのかを決定する直径の閾値は、流速に依存する。このことにより、このような装置が、広範囲の粒径を有する混合物の間で、良好な分離分解能を実現することが可能となる。回収に２つの排出口のみを用いる態様において、粒子が、流路の内側付近に集束し、内側に位置する排出口の回収分岐に向かう長方形断面流路よりも、スループットは一層高い。これにより、分離分解能は低くなり、流路が詰まる可能性は高くなる。本明細書に示すように、台形断面によると、より高濃度の粒子／細胞を、これらの間の相互作用を最小化しつつ処理して、超ハイスループットを実現することができる。
【００２３】
本明細書で述べる装置により、多核白血球（ＰＮＬ）（直径約１０〜約１５μｍ）の赤血球（ＲＢＣ）（直径約７〜８μｍ）からの分離、および小さい間充織幹細胞（ＭＳＣ）（直径約１４〜約２０μｍ）の大きいＭＳＣ（直径が約２０μｍより大きい）からの分離が実証され、この装置が、例えば臨床分析や細胞研究などで使用される良好な分離分解能およびハイスループットを実現したことが示されている。また、本明細書に示すように、段状の断面を有し、内に浅い領域を挟んだ流路は、粒子の捕捉および混合に用いることができる。
【００２４】
最近、数種の湾曲流路（渦巻き状、蛇行状、弧状）が、マイクロ流体技術に導入されている。実験によって、湾曲流路を流れる粒子は、慣性力およびディーン流れの両方に影響を受けることが示されている。これら２つの効果のバランスによって、粒子の精密な集束および位置取りが可能となる。この現象は、粒子の濃縮またはサイズ選択的な分離、あるいは液体の濾過などの多くの用途で用いることができる。
【００２５】
層状の輪郭を有する流路を流れる流体は、流路の断面の重心付近に最大速度成分を有し、壁の表面付近ではゼロまで減少する。湾曲流路において、流体は、径方向外側に向かう遠心加速度を受ける。加速度の大きさは二次速度に比例するので、流路断面の重心における遠心力は、流路壁における遠心力よりも高くなる。均一でない遠心力によって、ディーン渦として知られる、反対方向に回転する２つの渦が、流路の上半分および下半分に形成され、これらは、図１Ａに示されるように、中央では径方向外側に向かう流れを有し、流路壁付近では２つの内向きの流れを有する。これにより、曲線流路を流れる粒子は、これら横向きのディーン流れが存在することによって、抗力を受ける。ストークスの法則のもとで、抗力は、その時点におけるディーン速度に比例し、粒子の直径に比例する。他の優勢な力が存在しない場合、ディーン抗力によって、粒子が渦内の流れの方向に沿って移動し、核内に閉じ込められる。縦横比が高い長方形断面流路において、上面または底面から視覚化した場合、下流方向へ向かいつつ、内壁と外壁との間の流路幅に沿って前後に動く粒子を観察することで、このような動きを観察することができる。
【００２６】
マイクロ流路の寸法に匹敵する直径を有する大型の細胞は、ディーン抗力以外に、慣性揚力もかなり受けることになり、その結果、流路壁に沿って集束して平衡状態となる。曲線形状を有するマイクロ流路において、慣性揚力およびディーン抗力の相互作用によって、低流速では、平衡位置が内側流路壁付近の２箇所のみに減少し、流速が上がるにつれて外側に移動し、それぞれ上側ディーン渦および下側ディーン渦内に入る。２箇所の平衡位置は、マイクロ流路の高さに沿ってお互いに重なり合い、所定の細胞サイズに対してマイクロ流路の内壁から同じ距離に位置する、すなわち、マイクロ流路の幅方向において１箇所と見なされる。
【００２７】
本明細書で述べるように、台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路が研究されている。このような流路は、最大速度が流路断面に沿って非対称であり、これにより、流路の深い方に偏ったより強いディーン渦が形成されるという点で、長方形断面とは異なる。この渦核は、その内側に粒子を閉じ込める可能性が高い。本明細書に示すように、台形断面を有する渦巻き状流路において、粒子が集束する挙動は、長方形流路における挙動とは異なる。台形流路において、図２１に示すように、粒子は、低流速では、内側流路壁付近に集束し（長方形断面を有する流路と同様）、一方、ある流速閾値を超えると、外側半分に位置する平衡位置に移行する。上面視および側面視で集束位置を精査することにより、流路の外側半分に形成される２つのディーン渦の中心に、粒子が捕捉されることが明らかになった。
【００２８】
実験的測定によると、粒子は、流速が約０．５〜３．０ｍＬ／ｍｉｎのときに、流路深さの約２５．５〜２７．１％の間に深さ方向に沿って集束する。この結果は、台形流路における集束した粒子と流路壁との間の深さ方向の距離が、長方形流路における距離よりも大きいことを示している。
【００２９】
流路の内壁が深い場合、これらの強いディーン渦は内側に現れる、すなわち、高流速であっても、粒子は内壁付近に捕捉されることになる。このような断面を有する湾曲流路を用いて、排出口の内側において広いサイズの粒子を回収し、排出口の外側において粒子を含まない濾別された液体を回収することができ、例えば、水の濾過において多くの応用が見出される。一方、流路の外壁が深い場合、ディーン渦は外側に偏る。内側において、ディーン流れ場は、長方形流路のディーン流れ場によく似ている。ある流速において、より大きい粒子は、ディーン流れおよび慣性揚力の両方に影響を受けて内壁に沿って集束することができ、一方、より小さい粒子は、外側の渦の中心に捕捉される傾向がある。直径に対応した粒子の異なる位置取り（内側又は外側）により、新しいサイズ選択的な分離処理が提供される。
【００３０】
図５は、計算流体力学（ＣＦＤ）のソフトウェアを用いてディーン流れ場をシミュレートし、上面視および側面視から粒子の位置を観察することでその現象を説明する図である。粒子が、ディーン流れが低い領域に沿って流れていることがわかる。流速が約３ｍｌ／ｍｉｎより遅い場合、長方形流路と同様、粒子は内側に集束し、流速が約４ｍｌ／ｍｉｎを越えるまで速くなると、粒子はディーン渦に捕捉されて外側流路壁に向かって移動する。
【００３１】
図４Ａ〜４Ｈは、流速を上げていった場合に、上面視で見た際の、異なるサイズを有する粒子の断面中の位置を示す。この装置においては、粒子サイズに基づいて集束する典型的な状況が２つ、つまり、慣性が優勢な状況とディーンが優勢な状況とがあった。小さい粒子（例えば、５．７８μｍ粒子）では、大きい流路寸法によって粒子が集束することが妨げられ、これら粒子は、低流速であってもディーン渦に捕捉された。より大きい粒子（例えば、約９．７７μｍ粒子）も、内壁に集束できなかったが、流速が約１ｍｌ／ｍｉｎ以上のときにディーン渦内に捕捉された。１５．５μｍ粒子は、約１．５ｍｌ／ｍｉｎ以下の低流速で内壁に集束したが、約２ｍｌ／ｍｉｎで慣性が優勢な状況からディーンが優勢な状況へ移行した。同じマイクロ流路において、２６．２５μｍ粒子は、約３ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速で、慣性状況からディーン状況へ移行した。これらの結果から、内側排出口および外側排出口から別々に回収することによって、約１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約１５．５μｍよりも大きい粒子をより小さい粒子から分離することができる。同様に、約２．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約２６．２５μｍの粒子および約１５．５μｍの粒子の混合物から、約２６．２５μｍの粒子を分離することができる。ある態様において、低流速とは、約０．５〜約２ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。このように、低流速とは、約０．５ｍＬ／ｍｉｎ、約０．６ｍＬ／ｍｉｎ、約０．７ｍＬ／ｍｉｎ、約０．８ｍＬ／ｍｉｎ、約０．９ｍＬ／ｍｉｎ、約１．０ｍＬ／ｍｉｎ、約１．１ｍＬ／ｍｉｎ、約１．２ｍＬ／ｍｉｎ、約１．３ｍＬ／ｍｉｎ、約１．４ｍＬ／ｍｉｎ、約１．５ｍＬ／ｍｉｎ、約１．６ｍＬ／ｍｉｎ、約１．７ｍＬ／ｍｉｎ、約１．８ｍＬ／ｍｉｎ、約１．９ｍＬ／ｍｉｎ、または約２．０ｍＬ／ｍｉｎの流速であり得る。ある態様において、高流速とは、約６〜約１０ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。このように、高流速とは、約６ｍＬ／ｍｉｎ、約６．５ｍＬ／ｍｉｎ、約７．０ｍＬ／ｍｉｎ、約７．５ｍＬ／ｍｉｎ、約８．０ｍＬ／ｍｉｎ、約８．５ｍＬ／ｍｉｎ、約９．０ｍＬ／ｍｉｎ、約９．５ｍＬ／ｍｉｎ、または約１０．０ｍＬ／ｍｉｎの流速であり得る。
【００３２】
したがって、ある態様において、本発明は、粒子の集束、分離、および混合に関するマイクロ流体技術分野で様々な用途に用いられる、特有なディーン渦を引き起こす非長方形断面を有する湾曲マイクロ流路一式に関する。特定の態様において、本発明は、少なくとも１つの注入口、ならびに径方向内側の辺、径方向外側の辺、底辺、および上辺で規定される台形断面を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置であって、その断面は、ａ）高さが等しくない径方向内側の辺および径方向外側の辺、またはｂ）径方向外側の辺と高さが等しい径方向内側の辺を有しており、上辺は、それぞれ幅が底辺と等しくない少なくとも２つの連続した直線部を有している、マイクロ流体装置である。上記装置は、さらに、排出口を少なくとも１つ備える。ある態様において、浅い内側および深い外壁からなる台形断面を有する渦巻き状流路が、粒子サイズ別高分離能粒子分離機として用いられる。
【００３３】
ある態様において、マイクロ流体装置は、注入口を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個以上備える。
【００３４】
一態様において、曲線マイクロ流路１２０は、図１Ａに示すような渦巻き状マイクロ流路であり得る。他の態様において、曲線マイクロ流路１２０は、図１Ｂに示すような蛇行状マイクロ流路であり得る。曲線マイクロ流路１２０は、曲率半径が約２．５〜約２５ｍｍの範囲であり得る。曲線マイクロ流路は、例えば、曲率半径が約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１０ｍｍ、約１１ｍｍ、約１２ｍｍ、約１３ｍｍ、約１４ｍｍ、約１５ｍｍ、約１６ｍｍ、約１７ｍｍ、約１８ｍｍ、約１９ｍｍ、約２０ｍｍ、約２１ｍｍ、約２２ｍｍ、約２３ｍｍ、約２４ｍｍ、または約２５ｍｍであり得る。曲線マイクロ流路１２０は、また、長さが約４〜約１００ｃｍの範囲であり得る。曲線マイクロ流路は、例えば、長さが約５ｃｍ、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、約４５ｍｍ、約５０ｍｍ、約５５ｍｍ、約６０ｍｍ、約６５ｍｍ、約７０ｍｍ、約７５ｍｍ、約８０ｍｍ、約８５ｍｍ、約９０ｍｍ、約９５ｍｍ、または約１００ｃｍであり得る。
【００３５】
マイクロ流体装置は、さらに、少なくとも１つの排出口を備える。ある態様において、マイクロ流体装置は、排出口を２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個以上備える。特定の態様において、マイクロ流体装置は、廃棄用および粒子の回収用に、排出口を２つ有する。他の態様において、マイクロ流体装置は、注入口を１つと排出口を２つのみ有する。
【００３６】
台形断面渦巻き状マイクロ流路では、マイクロ流路の幅、マイクロ流路断面の内側および外側の深さ、渦巻きの曲率半径、および傾きの角度など、集束位置および分離効率に影響を与える要因がいくつかある。幅は、約１００〜約２０００μｍの範囲であり得、例えば、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、約１０００μｍ、約１１００μｍ、約１２００μｍ、約１３００μｍ、約１４００μｍ、約１５００μｍ、約１６００μｍ、約１７００μｍ、約１８００μｍ、または約１９００μｍなどであり得る。
【００３７】
外側の深さは、約２０〜約２００μｍの範囲であり得、例えば、約４０μｍ、約６０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１６０μｍ、または約１８０μｍの外側の深さであり得る。内側の深さは、約２０〜約２００μｍの範囲であり得、例えば、約４０μｍ、約６０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１６０μｍ、または約１８０μｍの内側の深さなどであり得る。曲率半径は、約２．５〜２５ｍｍの範囲であり得、例えば、約５ｍｍ、約７．５ｍｍ、約１０ｍｍ、約１２．５ｍｍ、約１５ｍｍ、約１７．５ｍｍ、約２０ｍｍ、または約２２．５ｍｍの半径などであり得る。
【００３８】
傾きの角度は、流路の上部と底部との間の角度である。傾きの角度は、約２〜約６０度の範囲であり得る。このように、傾きの角度は、約２度、約４度、約６度、約８度、約１０度、約１２度、約１４度、約１６度、約１８度、約２０度、約２２度、約２４度、約２６度、約２８度、約３０度、約３２度、約３４度、約３６度、約３８度、約４０度、約４２度、約４２度、約４６度、約４８度、約５０度、約５２度、約５４度、約５６度、約５８度、または約６０度であり得る。流路の傾きの角度は、集束の挙動に２通りの影響を与える。すなわち、（ｉ）ディーン渦に粒子を捕捉するのに必要な、粒子サイズの関数としての流速の閾値、および（ｉｉ）ディーン渦核の位置、である。大きい傾きの角度（すなわち、約１０〜約６０度の範囲）によって、外側に強いディーンが形成され、粒子捕捉能が増大することになる。また、大きい傾きの角度は、所定のサイズの粒子をディーン渦に捕捉するのに必要な流速の閾値を低下させる。
【００３９】
特定の態様において、本発明は、少なくとも１つの注入口１１０、ならびに径方向内側の辺２１０、径方向外側の辺２２０、底辺２３０、および上辺２４０で規定される、図２Ａに示すような台形断面２０１または図２Ｂに示すような台形断面２０２を有する曲線マイクロ流路１２０を備える、図１Ａに示すようなマイクロ流体装置１００であって、その断面は、ａ）高さが等しくない径方向内側の辺２１０および径方向外側の辺２２０、またはｂ）図２Ｄに示すような、径方向外側の辺２２０と高さが等しい径方向内側の辺２１０を有しており、上辺２４０は、それぞれ幅が底辺２３０と等しくない少なくとも２つの連続した直線部２４０ａおよび２４０ｂを有している、マイクロ流体装置１００である。マイクロ流体装置は、さらに、少なくとも１つの排出口１３０を備える。
【００４０】
ある態様において、マイクロ流体装置の断面２０１は、図２Ａに示すように、径方向内側の辺２１０の高さを、径方向外側の辺２２０よりも高くすることができる。他の態様において、図２Ｂに示すように、径方向内側の辺２１０の高さを、径方向外側の辺２２０よりも低くすることができる。さらに他の態様において、上辺２４０は、図２Ｃに示すような段状の断面２０３を形成する、少なくとも１つの段（２４１、２４２、２４３など）を含むことができる。この特定の態様において、径方向内側の辺２１０を、径方向外側の辺２２０の高さよりも高くまたは低くすることができる。さらに他の態様において、上辺２４０は、図２Ｄに示すように、径方向内側の辺２１０と径方向外側の辺２２０との間に少なくとも１つの浅い領域２４０ｃを含むことができる。台形断面は、図３１Ｂに示すように、直角台形の断面であり得る。ある態様において、台形断面の上辺および／または底辺は、図３１Ａに示すように凸状であり得る曲率または図３１Ｃに示すように凹状であり得る曲率を有して湾曲させることができる。
【００４１】
他の態様において、台形断面の径方向内側の辺２１０および径方向外側の辺２２０は、高さが約２０ミクロン（μｍ）〜約２００μｍの範囲であり得る。このように、径方向内側の辺２１０の高さは、約２０μｍ、約４０μｍ、約６０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１６０μｍ、約１８０μｍ、または約２００μｍであり得、径方向外側の辺２２０の高さは、約２０μｍ、約４０μｍ、約６０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１２０μｍ、約１４０μｍ、約１６０μｍ、約１８０μｍ、または約２００μｍであり得る。ある態様において、径方向内側の辺２１０の高さは、約７０μｍ、または約８０μｍ、または９０μｍであり得、径方向外側の辺２２０の高さは、約１００μｍ、または約１２０μｍ、または約１３０μｍ、または約１４０μｍであり得る。
【００４２】
ある態様において、台形断面の上辺２４０および底辺２３０は、幅が、約１００〜２０００μｍの範囲であり得、例えば、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、約１０００μｍ、約１１００μｍ、約１２００μｍ、約１３００μｍ、約１４００μｍ、約１５００μｍ、約１６００μｍ、約１７００μｍ、約１８００μｍの幅、または約１９００μｍの幅などであり得る。
【００４３】
図２４Ａは、渦巻き状マイクロ流路における粒子の立体的集束を立証する実験結果を示す。その結果により、粒子が、渦巻き状流路における揚力ゼロ平面とディーン渦の中心との間で、深さに沿って対称的に２つの帯を形成することが示されている。特定の態様において、多重ループマイクロ流路を用いて、約０．５〜約７．５ｍＬ／ｍｉｎの範囲の流速で、直径が約５．７８μｍ、約９．７７μｍ、約１５．５μｍ、および約２６．２５μｍである異なるサイズの標準微粒子の集束を検量した。
【００４４】
このように、本明細書で述べる通り、渦巻き状マイクロ流路は、１以上のループを備えることができる。ある態様において、多重ループマイクロ流路は、２ループマイクロ流路、３ループマイクロ流路、４ループマイクロ流路、５ループマイクロ流路、６ループマイクロ流路、７ループマイクロ流路、８ループマイクロ流路、９ループマイクロ流路、１０ループマイクロ流路などであり得る。図９Ｂに示すように、特定の態様において、多重ループマイクロ流路は、８ループマイクロ流路であり得る。８ループマイクロ流路の特定の一態様において、装置は、注入口を１つと排出口を２つ有し、効率的な細胞の移動および集束のために、曲率半径が、注入口における約２４ｍｍから、２つの排出口における約８ｍｍまで減少する、８ループマイクロ流路であり得る。台形断面の場合、流路断面の幅は、約６００μｍであり得、内側／外側の高さは、それぞれ約８０μｍおよび約１３０μｍであり得る。他の態様において、図１Ａに示すように、多重ループマイクロ流路は、４ループマイクロ流路であり得る。
【００４５】
実験結果によって、低流速下で粒子を導入すると、粒子は、内側のマイクロ流路壁付近の平衡位置を占めることが示されている。しかしながら、流速の閾値（粒子サイズに依存する）を超えると、平衡位置は、外側のマイクロ流路壁に移動し、これによりディーン渦による捕捉が示唆された。この急な移行を利用して、台形断面渦巻き状マイクロ流路は、従来の長方形断面渦巻きよりも高分離能で粒子を分離した。この装置によって、約１．６１×１０７／ｍｉｎという超ハイスループットかつ９２％を超える効率で、１５．５μｍビーズおよび１８．６８μｍビーズの分離が実現された。超ハイスループットとは、粒子約１〜約１×１０９個／ｍｉｎの範囲のスループットであり得る。
【００４６】
当業者に理解される通り、用途によっては、１台以上のマイクロ流体装置を連結し、それによって多重化装置を作成することができる。例えば、１台のマイクロ流体装置の排出口を、１台以上のマイクロ流体装置の注入口に接続することができる。あるいは、またはそれに加えて、複数の流路をマイクロ流体装置に組み込むことができる。多重化することができる流路および／またはマイクロ流体装置に組み込むことができる流路の数は、約２から約５００の範囲であり得る。このように、流路の数は、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００であり得る。
【００４７】
また、当業者に理解される通り、マイクロ流体装置は、さらに、前段、後段、または（例えば、多重化された）装置内に、他の構成要素を備えることができる。例えば、１台以上のマイクロ流体装置は、例えば前段または後段の解析（例えば、免疫染色、逆ＰＣＲや定量ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））、蛍光（例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、シークエンシングなどのために、１つ以上の回収装置（例えば、貯留槽）、流動装置（例えば、シリンジポンプ、圧力計、温度計）、解析装置（例えば、９６穴マイクロタイタープレート、顕微鏡）、濾過装置（例えば、膜）を、さらに備えることができる。単離処理をリアルタイムに視覚化することを可能にする、かつ／または単離された細胞をリアルタイムに計数することを可能にするために、装置に撮像システムを接続して、装置から画像を取り込む、かつ／または装置から撮像システムが受光してもよい。一例において、撮像システムは、装置が顕微鏡のスライドに積載される場合は、顕微鏡から得られた画像を表示し、かつ／またはデジタル化してもよい。撮像システムは、例えば、顕微鏡ならびに観察モニタおよびコンピュータ処理装置に連結された、デジタル化装置および／またはカメラを含んでもよい。
【００４８】
本明細書で述べるマイクロ流体装置は、様々な目的に使用することができる。一態様において、図９Ａに示すように、本発明は、粒子の混合物から１つ以上の粒子をサイズ別に分離する方法である。この方法は、径方向内側の辺９１０、径方向外側の辺９２０、底辺９３０、および上辺９４０で規定され、径方向内側の辺９１０の高さが径方向外側の辺９２０よりも低く、これにより傾きの角度９４５が規定される台形断面を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置９００の、図示しない少なくとも１つの注入口に、マイクロ流路の断面の一部に沿って粒子サイズに基づいて粒子を単離する流速で、混合物を導入する工程を含み、大きい粒子９７０がマイクロ流路の径方向内側の辺９１０に沿って第１（内側）排出口９５０まで流れ、小さい粒子９８０がマイクロ流路の別の部分に沿って少なくとも１つの他の（外側）排出口９６０まで流れ、これによって混合物から粒子をサイズ別に分離する。上記方法は、サイズ別に分離された粒子を、第１排出口９５０から回収する工程を含むことができる。
【００４９】
様々な混合物中に存在する粒子を、装置に導入することができる。混合物としては、体液（例えば、血液、リンパ、尿などの生体試料）、液体（例えば、水）、培地、乳濁液、下水などが挙げられる。生体試料が全血である態様において、血液は、混ぜ物をしないで、または混ぜ物をして（例えば、溶血させる、希釈する）、導入することができる。血液を溶血させる方法は、当該技術分野において公知である。ある態様において、他の細胞と比較した粒子の体積／体積濃度は、約５％未満であり得る。このように、体積／体積濃度は、約４％、約３％、または約２％であり得る。ある態様において、ヘマトクリットが約０．５〜約２％の範囲になるまで、血液試料を希釈することができる。このように、希釈された血液試料のヘマトクリットは、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、または約２％であり得る。
【００５０】
さらに他の態様において、本発明は、混合物から細胞を濃縮する方法である。この方法は、径方向内側の辺２１０、径方向外側の辺２２０、底辺２３０、および上辺２４０で規定され、径方向内側の辺２１０の高さが径方向外側の辺２２０よりも高い、図２Ａに示すような台形断面２０１を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口に、マイクロ流路の断面の径方向内側の辺に沿って細胞を単離して、図示しない第１排出口へ導く流速で、混合物を導入する工程を含み、これによって混合物から細胞を濃縮する。上記方法は、濃縮された細胞を、第１排出口から回収する工程を含むことができる。特定の態様において、流速は、約０．５〜約１０ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。
【００５１】
さらに他の態様において、本発明は、混合物（例えば、水）から微粒子を濾別する方法である。微粒子には、細菌、菌類、寄生虫、綿状凝集物、または水中に存在する他の沈降物の凝集体を含むことができる。この方法は、径方向内側の辺２１０、径方向外側の辺２２０、底辺２３０、および上辺２４０で規定され、径方向内側の辺２１０の高さが径方向外側の辺２２０よりも高い、図２Ａに示すような台形断面２０１を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口に、マイクロ流路の断面の径方向内側の辺２１０に沿って微粒子を単離して、図示しない第１排出口へ導く流速で、微粒子を含む水を導入する工程を含み、これによって水から微粒子を濾別する。上記方法は、微粒子を、第１排出口から回収する工程を含むことができる。特定の態様において、流速は、約０．５〜約１０ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。
【００５２】
他の態様において、本発明は、混合物に細胞を分散させる方法である。この方法は、径方向内側の辺２１０、径方向外側の辺２２０、底辺２３０、および上辺２４０で規定され、段状の断面を形成する少なくとも１つの段（２４１、２４２、２４３など）を含む上辺２４０を有する、図２Ｃに示すような台形断面２０３を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口に、段状断面の部分に沿って細胞を分散させる流速で、混合物を導入する工程を含み、細胞は、図示しない別々の排出口への分散前、分散途中、または分散後に、辺に衝突せず、これによって細胞を混合物中に分散する。上記方法は、分散された細胞を、別々の排出口から回収する工程を含むことができる。特定の態様において、流速は、約２〜約１０ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。
【００５３】
さらに他の態様において、細胞を液体に混合する方法は、径方向内側の辺２１０、径方向外側の辺２２０、底辺２３０、および上辺２４０で規定され、径方向内側の辺２１０および径方向外側の辺２２０の間に少なくとも１つの浅い領域２４０ｃを含む上辺２４０を有する、図２Ｄに示すような台形断面２０４を有する曲線マイクロ流路を備えるマイクロ流体装置の少なくとも１つの注入口に、マイクロ流路に沿って細胞を混合して、混合物を図示しない第１排出口に導く流速で、液体および細胞を導入する工程を含む。上記方法は、混合物を、第１排出口から回収する工程を含むことができる。特定の態様において、流速は、約０．１〜約２ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得る。
【００５４】
本明細書で述べる方法においては、様々な方法で、流体をマイクロ流体装置に導入することができる。一態様において、シリンジポンプを用いて流体をマイクロ流体装置に導入することができる。他の態様において、ピストンポンプ、ギアポンプ、蠕動ポンプ、圧電性マイクロポンプ、または可変式の圧力調節器を用いて、流体をマイクロ流体装置に導入することができる。マイクロ流体装置における流体の流速は、用途によって変更することがある。ある態様において、流速は、約０．５〜約１０ｍＬ／ｍｉｎの範囲であり得、例えば、約１ｍＬ／ｍｉｎ、約２ｍＬ／ｍｉｎ、約３ｍＬ／ｍｉｎ、約４ｍＬ／ｍｉｎ、約５ｍＬ／ｍｉｎ、約６ｍＬ／ｍｉｎ、約７ｍＬ／ｍｉｎ、約８ｍＬ／ｍｉｎ、または約９ｍＬ／ｍｉｎの流速などであり得る。
【００５５】
様々な粒子を、マイクロ流体装置を用いて分離することができる。特定の態様において、大きい粒子を小さい粒子から分離することができる。大きい粒子の直径は、約１８〜約５０μｍであり得る。大きい粒子の直径は、例えば、約１９μｍ、約２０μｍ、約２１μｍ、約２２μｍ、約２３μｍ、約２４μｍ、約２５μｍ、約２６μｍ、約２７μｍ、約２８μｍ、約２９μｍ、約３０μｍ、約３１μｍ、約３２μｍ、約３３μｍ、約３４μｍ、約３５μｍ、約３６μｍ、約３７μｍ、約３８μｍ、約３９μｍ、約４０μｍ、約４１μｍ、約４２μｍ、約４３μｍ、約４４μｍ、約４５μｍ、約４６μｍ、約４７μｍ、約４８μｍ、約４９μｍ、または約５０μｍであり得る。小さい粒子の直径は、約２〜約１４μｍであり得る。小さい粒子の直径は、例えば、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、または約１４μｍであり得る。特定の態様において、流速は約２．５ｍＬ／ｍｉｎ、大きい粒子の直径は約１８〜約４０μｍの範囲、小さい粒子の直径は約１０〜約２０μｍの範囲であり得る。他の特定の態様において、流速は約１．５ｍＬ／ｍｉｎ、大きい粒子の直径は約１５〜約２５μｍの範囲、小さい粒子の直径は約５〜約１０μｍの範囲であり得る。さらに他の特定の態様において、流速は約２．５〜約３．０ｍＬ／ｍｉｎの範囲、大きい粒子の直径は約２５〜約４０μｍの範囲、小さい粒子の直径は約５〜約１５μｍの範囲であり得る。
【００５６】
ある態様において、粒子は、幹細胞などの細胞であり得る。他の態様において、細胞は体液（例えば、血液、尿、リンパ、髄液など）中に存在し得る。特定の態様において、細胞は、血液試料中に存在し得、大型の細胞は循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）、小型の細胞は血液細胞であり得る。ある態様において、ＣＴＣは、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、肝細胞癌、上咽頭癌および他の種類の癌（のうち１つ以上）の癌細胞（例えば、転移性癌細胞）であり得る。この手法は、最初に細胞表面バイオマーカーを選択する必要がないので、上皮由来および非上皮由来の異なる癌の両方に用いるのに適している。
【００５７】
本明細書で述べる方法は、分離された粒子（例えば、細胞）を回収、単離する工程をさらに含むことができる。ある態様において、上記方法は、免疫染色、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨおよびシークエンシングなどの後段の解析をさらに含むことができる。特定の態様において、上記方法は、不均一性を検討する工程をさらに含むことができる。
【００５８】
本明細書で述べる方法において、他に言及しない限り、粒子（例えばＣＴＣ）の捕捉効率は、約６０〜約１００％の範囲であり得、例えば、約６２%、約６４%、約６６%、約６８%、約７０%、約７２%、約７４%、約７６%、約７８%、約８０%、約８２%、約８４%、約８６%、約８８%、約９０%、約９２%、約９４%、約９６%、約９８%、および約９９%などであり得る。特定の態様において、捕捉効率は、８０％または８５％または８７％の平均回収率であり得る。他の特定の態様において、ＣＴＣにおけるＨＥＲ２増幅を検出することで、ＨＥＲ２に関連した治療方法の利益を得るであろうハイリスクの乳癌患者を識別することができる。
【００５９】
本明細書で述べるマイクロ流体装置は、ミリリットル単位の血液などの流体を、数分で処理することができる。特定の態様において、台形断面を有するマイクロ流体装置は、約８分間で７．５ｍＬの血液（例えば、溶血した赤血球）を処理可能で、これによって生存ＣＴＣを濃縮することができ、また、より少ない量の血液、例えば４ｍＬを約５分間で処理することができ、また、より量の多い血液、例えば約２０ｍＬを約１５分間、または４０ｍＬを約３０分間、または６０ｍＬを約４５分間、または８０ｍＬを約６０分間、またはより多い量を１時間より長い時間で処理することができる。
【００６０】
さらに他の態様において、大型の細胞は白血球、小型の細胞は血液細胞であり得る。さらに他の態様において、混合物は骨髄試料であり得、幹細胞を血液細胞から分離することができる。
【００６１】
サイズ別の細胞の分離は、細胞研究において、細胞混合物からある種類の細胞を単離するために必要な、難易度の高い要件である。例えば、腫瘍発生の致命的な結果である癌の転移が、すべての癌関連死の約９０％を占める。転移の間、腫瘍由来の生存上皮細胞（循環性腫瘍細胞、すなわちＣＴＣ）は、腫瘍発生の初期段階で、転移性癌を患う患者の末梢血中に剥離し、おそらく、離れた臓器における溢出の原因となり、新しい転移部を形成する。ＣＴＣを検出することで、病期および癌の進行に関する貴重な洞察を得られることが、臨床報告によって示されている。典型的には直径約２０μｍであるＣＴＣと、他の血液細胞（ＲＢＣは約８μｍ、白血球は約１０〜１５μｍ）とのサイズの違いに基づく分離は、ごく少数のＣＴＣを血液細胞から分離する良い方法であろう。
【００６２】
他の例としては、好中球が挙げられ、これは、細菌感染に対する先天的な免疫応答の重要なエフェクターであるが、過剰な応答によって、全身性炎症および敗血症での臓器不全を引き起こし得る。したがって、好中球自体が、敗血症の制御における標的候補として認識されてきた。敗血症の動物モデルにおいて、好中球を欠乏させる、またはその活性を相殺することが、臓器機能を維持するのに役立つことが研究によって示された。敗血症患者の血液中の循環性好中球の除去が、炎症を制御するのに役立つと仮定することは魅力的であり、仮説を実証するためには、連続的な血液分離技術が必要となる。様々な細胞種を含む血液細胞は、例えば、細胞径が約１０〜約１５μｍの範囲である多形核白血球（ＰＮＬ）、細胞径が約７〜約８μｍの単球およびリンパ球、盤径が約６〜約８μｍの範囲である赤血球など、細胞のサイズが異なっており、サイズに基づく分離技術は、血液を異なる血液成分に分画するのに役立つであろう。
【００６３】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、多数の非造血細胞系統に分化することができる、骨髄由来の成体幹細胞である。以前の論文には、骨髄間質細胞の単一細胞由来のコロニーが、形態学的に区別されるいくつかの細胞種を含むことが報告されている。初期のコロニーでは、ごく小さい円形細胞が、大型の細胞に比べて、素早く自己再生している。小型の細胞に富む試料は、大型の細胞に富む試料よりも強い多能性分化能を有していた。サイズ別の高分離能の分離は、この種の用途においても必要とされている。
【００６４】
図６Ａ〜図６Ｄは、新鮮なヒト血液からＰＮＬを分離する例示的な装置の性能を示す。幅が５００μｍ、内壁または外壁の深さがそれぞれ９０μｍおよび１２０μｍである台形断面を有する渦巻き状流路は、ＰＤＭＳポリマー中に製造された。上記装置は、連続的かつハイスループットの様式で、２％ヘマトクリット血液試料においてＰＮＬを９０％より多く回収し、一方、ＲＢＣの除去は７５％以下に維持した。これによって、上記装置を連結した場合、好中球欠乏血液を選択的に輸血することができる。排出された試料をギムザ染色することによって、単離されたＰＮＬの９８％が好中球であることが、さらに確認された。機械的ストレスによって好中球が活性化され得ることが知られているが、注入された試料および排出された試料の両方にＮＢＴ試験を行うことで、単離された好中球はこの装置で処理された後で生存しており活性化されていないことが実証された。したがって、単離された好中球に対して続いて行われる臨床検査および分子診断によって、注入された試料の初期状態が明らかになるはずである。
【００６５】
ＭＳＣ分離を実証するものとして、継代初期のＭＳＣ細胞株を約１００００個／ｍｌに希釈し、内側の高さが８０μｍ、外側の高さが１３０μｍ、幅が６００μｍである８ループの渦巻きで検討した。実験後、各排出口から任意の１００個の細胞を手作業で測定した。サイズ分布の結果を図７Ａ〜図７Ｂおよび図８Ａ〜図８Ｂに示す。想定通り、細胞は、そのサイズに応じて２つの小グループに分離する。流速２．２ｍＬ／ｍｉｎのとき、内側排出口で回収される細胞の大多数は、１８〜３０μｍの細胞であり（検討したＭＳＣの約３０％）、一方、外側排出口における細胞は、１５〜１９μｍの範囲である（検討したＭＳＣの約７０％）。流速を３ｍＬ／ｍｉｎに上げた場合、２０μｍの細胞が外側により多くなり、内側で回収される２２μｍ以下の細胞はより少なくなる。このように、分離の閾値が変化する。この結果により、長方形断面流路では報告されたことがない高分離能の分離が、台形断面によって可能となることが示される。
【００６６】
図２Ｃに示すような段状断面を有する渦巻き状流路の場合、段付近のディーン流れが段に妨げられて、局所的なディーン渦を作り出す。最初の結果によって、これらの渦がその内側に粒子を捕捉する能力を有することが示されている。この種類の流路の潜在的用途は、高流速で細胞を送達するための分配器としてであり得る。細胞は異なる位置で捕捉され、複数の小分岐に分離される際に、流路壁にぶつかって損傷することが防がれる。
【００６７】
２つの深い領域に浅い領域が挟まれている渦巻き状のマイクロ流路では、図２Ｄに示すように、ディーン流れおよび慣性揚力の分布がより一層複雑になる。０．３ｍｍと０．４５ｍｍとの間で高さが切り替わる二核渦巻き流路は、どの位置においても粒子を集束または捕捉することができないことを示す。この結果によって、ミキサーとしてこのような形状を用いることが可能であると示される。この種類のミキサーの利点は、試料が二次流れにしたがって混合されることによって、柱状のミキサーよりも混合工程が穏やかになることである。
【００６８】
例示
（実施例１）
台形断面渦巻き状マイクロ流路を有する高分離能サイズ別微粒子／細胞分離機
台形断面を有する渦巻き状マイクロ流体流路における粒子集束の挙動を、以下に説明する。側面視および上面視の両方から粒子の流れる位置を観察し、ディーン流れ場の数値シミュレーションと組み合わせることで、これら流路内の力平衡状態が、渦巻き状慣性マイクロ流体流路における粒子集束機構のよりよい理解のために研究される。渦巻き状慣性マイクロ流体流路においては、流路断面を変更することで、ディーン流れ場を移動させることができ、粒子集束の挙動に大きな影響を与える。この機構に基づき、高分解能およびハイスループットの両方を兼ね備える粒子の分離が実現される。
【００６９】
理論
長方形断面渦巻き状流路において、ディーン渦は、幅方向において対称であり、粒子は、主として湾曲流路の内側に集束する。直径／高さの比が０．０７以上である粒子は、通常、流路の上半分および下半分にある２つのディーン渦内の流れに集束する。流速が上がるにつれ、粒子集束位置は、初めは、慣性揚力の増加のために内側流路壁の近くに移動するが、流速がより速くなると遠心力が優勢になり始め、粒子の位置を内壁から離して外壁に向けて押し動かす（図１０Ａ）。異なるサイズの粒子の集束位置が互いに近くなるので、この現象によって、粒子／細胞分離のスループットおよび分離能は限定される。クンタゴウダナハリ（Kuntaegowdanahalli）らを参照のこと。外壁よりも内壁が浅い台形断面渦巻き状流路において、「慣性優勢」な状況から「ディーン優勢」な状況への移行は急であり、したがって、集束位置は流路の内側半分から外側半分へと直ちに移動する。これは、マイクロ流路の外側半分（図９Ａにおける深い領域）に偏った強いディーン渦核の発達によるものであり、ディーン力場は非線形となる。慣性揚力は、高度にサイズ依存的であるので、サイズの異なる粒子／細胞は、異なる流速において、慣性優勢な状況からディーン優勢な状況へと移る。この原理を利用して、従来の長方形断面マイクロ流路よりも高い空間分解能で、サイズの異なる粒子／細胞を分離することができる。
【００７０】
実験
マイクロ流体流路は、精密切削工程によって製造されたポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）型（ホィッツ・テクノロジー社（Whits Technologies）、シンガポール）で鋳造された。その構成は、複数ループを有し曲率半径が約１０ｍｍである、注入口が１つで排出口が２つの渦巻き状流路からなる。その形状は、硬化剤を１０：１の比で混合したシルガード（Sylgard）１８４シリコーンエラストマー（ＰＤＭＳ）プレポリマーを用いて鋳造された。硬化後、形状を有するＰＤＭＳ鋳物は、はぎ取られ、３ｍｍ厚の別のＰＤＭＳ層にプラズマ接着された。注入用の穴および排出用の穴は、接着する前に開けておいた。側面から粒子の位置を観察するために、装置を、流路の排出部分に沿って約２ｍｍ切断し、装置を扁平瓶容器に対して垂直に維持することで、第２の鋳造を行った。ＰＤＭＳミキサーが流路に流れ込むのを防ぐために、第２の鋳造前に、管を穴に接続しておいた。
【００７１】
試験の間、倒立顕微鏡下（オリンパスＸ７１）にマイクロ流体装置を置き、流路の末端付近で、ファントムＶ９．１（Phantom V9.1）カメラ（ヴィジョン・リサーチ社（Vision Research Inc.）、米国）を用いて蛍光画像を記録した。注入試料は、サイズの異なる固体蛍光粒子（バングズ・ラボラトリー社（Bangs Laboratories, Inc.）、米国）１％をＤＩ水で希釈することで作製され、ＮＥ−１０００シリンジポンプ（ニュー・エラ・ポンプ・システム社（New Era Pump Systems, Inc.）、米国）を用いて異なる流速で流路に送り込まれて、集束位置を観察した。装置の分離品質を評価するために、２種の異なるサイズの高濃度粒子を混合した。
【００７２】
結果および考察
図１０Ａは、流速を上げていった際の、異なるサイズの粒子が集束した帯を上面視で示している。この結果によって、異なる流速において、サイズが異なる粒子の流れが、内壁（慣性状況）から外壁（ディーン状況）へ移動するという分離の原理が、はっきりと示されている。例えば、台形断面であると、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎのとき、内側排出口および外側排出口から回収することで、直径が１５．５μｍよりも大きい粒子を、それよりも小さい粒子から分離することができる。同じ流路において、流速を２．５ｍＬ／ｍｉｎに上げると、直径が２６．２５μｍよりも大きい粒子を、それよりも小さい粒子から分離することができる。それに比べて、長方形流路においては、ある流速において、サイズの異なる粒子は流路内の異なる位置に集束する傾向があるが、粒子間の距離はごく小さく、粒子／細胞濃度が高い場合は不鮮明になり得、高ヘマトクリット細胞試料を処理する能力は制限される。図１１Ａ〜図１１Ｃは、流速が最適化された３．４ｍＬ／ｍｉｎのときの、異なる２つのサイズの粒子（１６．６８μｍおよび２６．９μｍ）の分離効率を示す。両方の排出口における回収純度は９６％を超えており、一方、スループットは８．８５×１０６／ｍｉｎまで達することができ、これは１．３３％体積／体積濃度（血液試料中のヘマトクリット数と同等）である。
【００７３】
流路断面の中央領域において、ディーン抗力（
【００７４】
【数１】
0006265508.tif 000002
【００７５】
ここでＵｆは平均流速である）および慣性力（
【００７６】
【数２】
0006265508.tif 000003
【００７７】
）が優勢であり、一方、遠心力（
【００７８】
【数３】
0006265508.tif 000004
【００７９】
）は無視されるので、粒子は、渦巻き状慣性マイクロ流体流路において、流路深さの中央に集束すると、以前は考えられていた。しかし、図１０Ｂに示す実験結果によると、粒子は異なる２つの深さに集束している。異なる流速において、ディーン流れ場の分布には小さい変化しか起こらず、最大ディーン流れ速度は常に深さ方向の中央に見出されることが、数値シミュレーションによって示されている。粒子が集束する位置（実験的にゼロディーン線とゼロ揚力線との間に見出される）において、ＦＤは、主に内壁に向いており、また、最大ディーン力よりもかなり小さい。このような条件では、ＦＣを無視することはできない。
【００８０】
図１２は、流路断面において、異なる位置にある粒子に作用する力を説明する図である。位置＃２では、すべての力が流路の幅方向を向いているが、流路の深さ方向に沿ったわずかな乱れによって、ＦＬの方向が変化して大きさが増大し、このため、この点は、平衡が不安定な点となる。位置＃３は、低流速（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）において、力の平衡が安定な点である。流速が上がるにつれて、ＦＬはＦＤよりも速く増大し、粒子の平衡点は上壁または底壁に向かって移動しなくてはならなくなり、これによってＦＤの成分が増大して、増大したＦＣを打ち消す（位置＃１）。流速が上がり続けると、ＦＣが優勢となり、それ以外の力は、ＦＣを横向きに打ち消すことができないので、粒子は外側に移動し、ついには、そこにある強いディーン流れによって、中心渦の１つ（位置＃４）に捕捉される。すべての力は粒子サイズに関連するので、粒子を位置＃１から位置＃４に移動させる流速はサイズ依存的であり、これによってサイズ別の分離が可能となる。
【００８１】
結論
台形断面渦巻き状マイクロ流体流路が、粒子のサイズ別の分離のために開発された。実験結果によって、上記流路により高分離能かつハイスループットな細胞の分離を実現可能であることが示される。１６．６８μｍ粒子と２６．９μｍ粒子との間で、１．３３％の濃度、３．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で、９６％を超える効率で粒子を分離することに成功し、これは、これまでのマイクロ流体法の中で最も高いスループットおよび効率である。ディーン流れ場の数値シミュレーションを行うとともに、力が平衡となる粒子の流れの位置を観察することによって、粒子が集束する機構を検討した。解析によって、粒子は、慣性揚力およびディーン抗力が優勢でない場所に集束し、粒子の力の平衡を説明するのに遠心力を考慮すべきであることが示されている。
【００８２】
（実施例２）
台形断面を有する渦巻き状流路を用いた、血液からの白血球の分離
慣性マイクロ流体技術は、最近、効率的でハイスループットなマイクロ流体細胞分離方法として、広く注目を集めている。しかしながら、実現された分離分解能およびスループット、ならびに細胞−細胞間相互作用による細胞の分散にともなう問題は、この技術の、血液および他の体液などの現実の試料への適用における制限因子であったようである。本明細書では、分離分解能が向上した新規デザインの渦巻き状慣性マイクロ流体（台形断面）選別機を示し、希釈したヒト血液（１〜２％ヘマトクリット）から、多形核白血球（ＰＭＮ）および単核白血球（ＭＮＬ）を高効率（＞８０％）で分離／回収する能力を実証する。この方法で濃縮したＰＭＮも、元々の注入試料と比べて無視できる程度しか活性化しておらず、一方、従来のＲＢＣ溶血法では、感受性ＰＭＮは、人為的な活性化が明らかに誘導されていた。したがって、この技術は、治療または診断用途のために、感受性血液細胞を濃縮／分離するための有望な代替法となるであろう。
【００８３】
赤血球（ＲＢＣ）は、血液（赤血球が体積の約４５％を占める）、骨髄穿刺液、および腹腔穿刺液などの多くの体液中に、最も豊富に存在する細胞成分である。混入したＲＢＣをそれらの試料から除くことは、様々な理由によって、科学的試験、臨床試験、および診断試験のいずれに用いる前でも欠かすことのできない試料調製工程であることが多い（グーデル Ｗ．Ｇ．（Guder W.G.）ら、第１版；１９９６年；ダルムシュタット、ドイツ：ＧＩＴ出版を参照）。例えば、ＲＢＣの不用意な溶血によってヘモグロビンが放出されると、化学的干渉が引き起こされ、ＰＣＲに基づく試験の性能が低下する（アル−サウド，Ｗ．Ａ．（Al-Soud, W.A.）およびＰ．ラドストロム（P. Radstrom）『ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology）』２００１年；３９巻；２号：４８５〜４９３頁を参照）。ヒト細胞の初代細胞培養におけるＲＢＣの抗増殖性役割およびアポトーシス促進性役割を支持する報告もまた発表されている（フレドリクソン，Ｋ．（Fredriksson, K.）ら『スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Scandinavian Journal of Immunology）』２００４年；５９巻；６号：５５９〜５６５頁、およびアトキン，Ｓ．Ｌ．（Atkin, S.L.）ら『イン・ビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル（In Vitro Cell Dev Biol Anim）』１９９５年；３１巻；９号：６５７〜６５８頁を参照）。必要とされるＲＢＣの除去の程度は、後段における用途によって大きく異なるが、選別された細胞の表現型の人為的な変化を回避することは、すべての研究にとって重要な基準である。これは、ヒト血液からＲＢＣを除去して、様々な病原体に対して免疫応答を実行し仲介する重要な役割を担う白血球（ＷＢＣ）を単離する場合に、特に重要である。単離された白血球から得た情報は、白血球の本来の状態の重要な特徴が、試料調製時の人為的影響によって隠されていない場合にのみ、病気の予後診断を容易にするのに有効であろう。
【００８４】
大規模に血液細胞を分離するための従来の方法論には、分画遠心分離および選択的なＲＢＣの溶血がある。分画遠心分離の性能は、特に、反復感染などの患者から得た血液の場合に、血液の供給源に影響を受け（ニーダム，Ｐ．Ｌ．（Needham, P.L.）『ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッド（Journal of Immunological Methods）』１９８６年；９９巻：２８３〜２８４頁を参照）、一方、ＲＢＣを完全に除去するために、通常、遠心分離と組み合わせて用いられるＲＢＣ溶血法は、細胞を低張環境にさらして、細胞種に特異的な様式で細胞代謝を変化させる（セルツナ−，Ｎ．（Selzner, N.）ら『セル・デス・アンド・ディファレンシエーション（Cell Death and Differentiation）』２００４年；１１巻：Ｓ１７２〜Ｓ１８０頁を参照）。また、それらの試料調製手順によって、単離された白血球の免疫表現型が変化し得る、または生存率が悪化し得るということを示す事例が、いくつか報告されている。また、大規模な試料の取り扱いが、不正確な制御および不均一な条件による、分離および後段における用途の変動を招き、そのため、異なる研究室およびプラットフォームを横断した類似した結果の比較が、簡単でなくなる（コンソ−シアム，Ｍ．ｏ．ｔ．Ｔ．Ｒ．（Consortium, M.o.t.T.R.）『ネイチャー・メソッド（Nature Methods）』２００５年；２巻；５号：３５１〜３５６頁を参照）。
【００８５】
サイズ依存的な流体力学効果を利用した、高分離能な連続的マイクロ流体分離技術（ハウ，Ｈ．Ｗ．（Hou, H.W.）ら『マイクロマシーン（Micromachines）』２０１１年；２巻；３号：３１９〜３４３頁、トナー，Ｍ．（Toner, M.）およびＤ．イリミア（D. Irimia）「ブラッド−オン−ア−チップ（Blood-on-a-chip）」『アニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング（Annual Review of Biomedical Engineering）』２００５年；アニュアル・レビューズ、パロ・アルト：７７〜１０３頁、フアン，Ｌ．Ｒ．（Huang, L.R.）ら『サイエンス（Science）』２００４年；３０４巻；５６７３号：９８７〜９９０頁、ならびにヤマダ，Ｍ．（Yamada, M.）、Ｍ．ナカシマ（M. Nakashima）、およびＭ．セキ（M. Seki）『アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）』２００４年；７６巻；１８号：５４６５〜５４７１頁を参照）のいくつかは、数マイクロメーターの粒子サイズの違いを区別することを実現したと報告されており、この違いは血液細胞間で観察される本来のサイズの違いと同等である（ＲＢＣ：６〜８μｍの円板状；単核白血球（ＭＮＬ）：７〜１０μｍの球体；多形核白血球（ＰＭＮ）１０〜１２μｍの球体；白血球はＭＮＬおよびＰＭＮの両方を含む）（ダウニー，Ｇ．Ｐ．（Downey, G.P.）ら『ジャーナル・オブ・アプライド・フィジオロジー（Journal of Applied Physiology）』１９９０年；６９巻；５号：１７６７〜１７７８頁、およびダニエルズ，Ｖ．Ｇ．（Daniels, V.G.）、Ｐ．Ｒ．フィーター（P.R. Wheater）、ならびにＨ．Ｇ．バーキット（H.G. Burkitt）『ファンクショナル・ヒストロジー：テキスト・アンド・カラー・アトラス（Functional histology:  A text and colour atlas）』１９７９年；エジンバラ：チャーチル・リビングストンを参照）。これらの手法は、上述した大規模な血液細胞の分離方法に関する問題を回避する有望な代替法と見なされ、標識を用いない連続的な様式で試料を処理することが可能である。サイズ別マイクロ流体分離技術は、溶血剤の添加または事前の細胞標識処理は必要とせず、血液試料を取り扱っている間の、微環境のより良い制御を可能とする。細胞の分離は、個々の細胞を、細胞サイズ依存的な様式で流路幅方向において異なる位置に細胞を並べるように、よく設計された形状を有するマイクロ流路に一様に流すことによって実施され、その後、異なる排出口において、連続的に試料が回収される。流路の設計は、分離分解能およびスループットの両方のために極めて重要であり、サイズ別の正確な流体力学効果の作用原理が異なるように、様々である。一例において、微小支柱のアレイを含む「決定論的横変異（ＤＬＤ）」マイクロ流路は、微小支柱の周囲の層流の非対称な分岐の結果、粒子の臨界流体力学径より大きいまたは小さい差動横変異を引き起こす（フアン，Ｌ．Ｒ．（Huang, L.R.）ら『サイエンス（Science）』２００４年；３０４巻；５６７３号：９８７〜９９０頁を参照）。他の種類のマイクロ流体装置である、収縮−拡大部分を有して作られた「ピンチド・フロー・フラクショネーション（ＰＦＦ）」（ヤマダ，Ｍ．（Yamada, M.）、Ｍ．ナカシマ（M. Nakashima）、およびＭ．セキ（M. Seki）『アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）』２００４年；７６巻；１８号：５４６５〜５４７１頁を参照）��おいて、収縮領域内の層流の放物線速度分布によって、サイズ別に流路の側壁付近に粒子が並び、その結果、収縮領域の流路幅に匹敵する直径を有する大きい粒子は、中央の流線近くに留まるが、小さい粒子は、その中心を流路の側壁に近づける。サイズが様々な粒子の、横方向の位置のこのような違いは、拡大領域に入るとさらに増幅され、その結果、効果的に分離が行われる。この技術はどちらも、ＲＢＣを他の細胞種から分離するのに必要な高分離能を有しているが、処理のスループットが低いために、実用化は、臨床試料に極度に限定されている。一方、長方形断面を有する曲線マイクロ流路においてディーン流れを用いる、慣性マイクロ流体技術に基づく技術は、ハイスループットな粒子のサイズ別分離を実現したと報告されている（ディ・カルロ，Ｄ．（Di Carlo, D.）ら、『プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）』２００７年；１０４巻；４８号：１８８９２〜１８８９７頁（以下「ディ・カルロら、２００７年」とする）、バガット，Ａ．Ａ．Ｓ．（Bhagat, A.A.S.）、Ｓ．Ｓ．クンタゴウダナハリ（S.S. Kuntaegowdanahalli）、およびＩ．パパウトスキ（I. Papautsky）『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００８年；８巻；１１号：１９０６〜１９１４頁、ディ・カルロ，Ｄ．（Di Carlo, D.）ら、『アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）』２００８年；８０巻；６号：２２０４〜２２１１頁、クンタゴウダナハリ，Ｓ．Ｓ．（Kuntaegowdanahalli, S.S.）ら『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００９年；９巻；２０号：２９７３〜２９８０頁、ならびにセオ，Ｊ．（Seo, J.）、Ｍ．Ｈ．リーン（M.H. Lean）、およびＡ．コール（A. Kole）『アプライド・フィジクス・レター（Applied Physics Letters）』２００７年；９１巻；３号：０３３９０１〜０３３９０３頁を参照）。
【００８６】
以下に述べるように、流路の断面を長方形の代わりに台形へと変更することによって、ハイスループットという特徴を維持しつつ、曲線マイクロ流路の分離分解能は改善され、その流路の、ＰＭＮの免疫表現型に無視できる程度の影響しか与えずに、ヒト血液試料からＲＢＣを効率的に除去する能力を、以下に説明する。また、マイクロリットルスケールからミリリットルスケールの体積範囲で試料を処理する必要性に合わせるために、現在の設計では、血液試料の体積がマイクロリットルオーダーである（例えば、指先採血）際に、希釈した全血試料を直接処理することができ、また、ＲＢＣ溶血法の代わりとして、分画遠心分離と組み合わせて用いて、試料の体積がより大きい（例えば、約１ｍＬ）場合に、選別された細胞の活性化状態に変化の兆候が見られない、純粋なＷＢＣを得ることもできる。本明細書で述べる台形断面渦巻き状マイクロ流路を、骨髄穿刺液から間充織幹細胞（ＭＳＣ）を採取するなど、他の体液からＲＢＣを除去して標的細胞を濃縮する、一般的でハイスループットな方法として用いることができる。
【００８７】
材料および方法
マイクロ流路の製造
台形断面渦巻き状流路は、標準的なソフトリソグラフィ技術を用いて、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）のマスターテンプレートから、ポリジメチルシロキサンポリマー（ＰＤＭＳ、サイラード（Sylard）１８４シリコーンエラストマーキット、ダウ・コーニング社、米国）を用いて製造した。ＰＭＭＡのテンプレートマスターは、切削処理によって製造され（ホィッツ・テクノロジー社（Whits Technologies）、シンガポール）、断面形状に対する特殊な要求を満たした。使用できる切削機の性能を考えると、テンプレートとなる鋳型の実際の形状は、仮想の設計と比較して±１０μｍの公差を有し、表面粗さはＲａ＝０．８μｍであった。その次に、１０：１（ｗ／ｗ）の比で硬化剤と混合したＰＤＭＳプレポリマーを、ＰＭＭＡのテンプレートマスターで鋳造し、８０℃で２時間硬化させて、マイクロ流路の特徴を複製した。硬化したＰＤＭＳ鋳造物をＰＭＭＡマスターからはぎ取り、１．５ｍｍ径の生検用穴あけ器を用いて、注入貯留槽用および排出貯留槽用の穴を開けた。最後に、ＰＤＭＳ鋳造物は、平坦な０．５ｃｍ厚の別のＰＤＭＳ板に、不可逆的に接着され、その後、酸素プラズマ処理を行った（ハリックプラズマクリーナー／滅菌装置、ハリックプラズマ社（Harrick Plasma, Inc）、米国）。得られたＰＤＭＳ装置は異なる４箇所で切断され、断面を顕微鏡で測定して、装置の正確な寸法を求めた。長方形断面渦巻き状流路も、ＰＤＭＳポリマーで製造したが、エッチングしたシリコンウエハーマスターから、二重鋳造工程によって製造した（バガット，Ａ．Ａ．Ｓ．（Bhagat, A.A.S.）ら『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２０１１年；１１巻；１１号：１８７０〜１８７８頁を参照）。簡潔に言えば、まず、ポジティブＡＺ４６２０フォトレジストを６インチシリコンウエハー上でパターン化し、マイクロ流路の特徴を規定した。その後、パターン化されたウエハーを、深堀りイオンエッチング（ＤＲＩＥ）を用いて所望の深さにエッチングし、残ったフォトレジストを酸素プラズマ処理によって除去した。次に、ＰＤＭＳ鋳造物の取り外しを援助するために、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクチル）シラン（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、米国）を用いて、エッチングしたウエハーを１．５時間コーティングした。その後、プレポリマー５部および硬化剤１部を混合したＰＤＭＳ液体混合物をシリコンウエハー上に注ぎ、８０℃で２時間硬化させた。得られたＰＤＭＳ鋳造物は、表面から突出した流路の特徴を有し、次のＰＤＭＳ鋳造のマスターとした。このＰＤＭＳマスターを用いて、シラン処理およびＰＤＭＳの硬化を繰り返し、ネガティブレプリカを得た。最後の工程として、注入貯留槽および排出口貯留槽の穴を開けたネガティブレプリカを、標準的なプラズマ補助下接着によって、別のＰＤＭＳ基板に接着した。
【００８８】
試料調製
ビーズ実験のために、直径６μｍ（５．５１８μｍ±０．１２２μｍ）、１０μｍ（１０．３μｍ±０．４μｍ）（ポリサイエンス社（Polysciences, Inc.）、米国）、または１５．５μｍ（１５．５μｍ±１．５２μｍ、バングス・ラボラトリー社（Bangs Laboratories, Inc.））の蛍光ポリスチレン粒子（１ｗｔ％固形分）を、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧプルロニック（Pluronic）（登録商標）Ｆ−１０８（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、米国）を含む脱イオン水（０．１％体積分率）でそれぞれ希釈し、注入試料とした。ＰＥＧ−ＰＥＧ−ＰＥＧプルロニック（Pluronic）（登録商標）Ｆ−１０８を少量添加しても、流体の粘度および密度を変化させるほどではなかったが、粒子の流路壁への非特異的な接着を最小限度に押さえた（イングリス，Ｄ．Ｗ．（Inglis, D.W.）ら『アプライド・フィジクス・レター（Applied Physics Letters）』２００４年；８５巻；２１号：５０９３〜５０９５頁を参照）。
【００８９】
血液試料を用いた実験のために、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを加えた、健康な提供者からの新鮮なヒト全血を、リサーチ・ブラッド・コンポーネント社（Research Blood Component, LLC）（ボストン、マサチューセッツ州、米国）から購入し、ＰＭＮの生存性を確保するために、採血後６時間以内に処理した。ＰＭＮおよびＭＮＬは、モノ・ポリ分離溶液（Mono-Poly Resolving Medium）(ＭＰ−ＲＭ；ＭＰバイオメディカル社（MP Biomedicals, LLC）、米国）を用いて単離された。簡潔に言えば、３ｍＬのＭＰ−ＲＭ層の上に重ねた３．５ｍＬの全血層を含む１５ｍＬ遠心管を、制動装置をオフにして３００ｇで３０分間遠心分離した。ＭＮＬおよびＰＭＮを含む細胞の帯を、それぞれ別々の試験管に回収し、サンプルバッファー（０．５％ＢＳＡを加えた１×ＰＢＳ）で洗浄、再懸濁した。単離されたＭＮＬおよびＰＭＮは、一緒に混合し、分画遠心分離によって単離される代表的なＷＢＣ試料とすることもできる。選択的ＲＢＣ溶血法を用いて単離されたＷＢＣは、全血をＲＢＣ溶血バッファー（ｅバイオサイエンス社（eBioscience Inc.）、米国）（１：１０）を用いて１０分間処理することによって得られ、その後、サンプルバッファーで洗浄、再懸濁した。最後に、血液試料の場合、制動装置をオフにして４００ｇで１０分間、全血を遠心沈殿させて、細胞画分および血漿画分を得た。その後、細胞画分をサンプルバッファーに再懸濁し、様々なヘマトクリット（０．５〜２％ヘマトクリット）に調製して、様々な試料を構成した。
【００９０】
装置の特徴付け
上記装置を、１２ビットＣＣＤカメラ（Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧ、浜松ホトニクス株式会社（Hamamatsu Photonics K.K.）、日本）を備えた、位相差／落射蛍光倒立顕微鏡（オリンパスＩＸ７１、オリンパス社（Olympus Inc.）、米国）に設置した。サンプルをシリンジに入れ、シリンジポンプ（ハーバード・アパラタスＰＨＤ２０００、ハーバード・アパラタス社（Harvard Apparatus Inc.）、米国）を用いて、様々な流速でマイクロ流路に送り込んだ。粒子／細胞の沈殿を防ぐため、シリンジの内部に置いた小型の磁気攪拌棒を、試料を処理する間攪拌させた。イメージＪ（ImageJ）（登録商標）ソフトウェアを用いて、一連の画像の蛍光強度の平均をとることによって、流路断面内の蛍光粒子の位置を求めた。細胞の場合、高速カメラであるファントムｖ９．１（Phantom v9.1）（ヴィジョンリサーチ社（Vision Research Inc.）、米国）を用いて位相差で記録した高速ビデオを解析して、細胞の位置を求めた。高速ビデオの光強度の標準偏差を計算し、高速移動する細胞の位置を視覚化した。
【００９１】
ＦＡＣＳ解析
ＢＤファーミンジェン（商標）（BD PharmingenTM）（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、米国）から、すべての抗体を購入した。分離効率を求めるために、０．１ｍｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（Hoechst 33342）（インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）およびＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ６６ｂモノクローナル抗体（１：２５ｖ／ｖ）を用いて、４℃で３０分間、暗所で全血を染色した。その後、染色した血液細胞画分を遠心分離によって回収し、注入試料として所望のヘマトクリットになるように、サンプルバッファーに再懸濁した。注入試料および２つの排出口からの排出試料を回収し、ＢＤ（商標） ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）、米国）で解析して、各試料中のＷＢＣ（ヘキスト陽性細胞）およびＰＭＮ（ＣＤ６６ｂ陽性細胞）を求めた。ＭＮＬが様々な種類の細胞を含み、ＭＮＬの総量を求めるのに利用できる便利な表面マーカーがないことを考え、ＭＮＬの数は、ヘキスト陽性だがＣＤ６６ｂ陰性である細胞の数に基づいて計数した。それに加えて、ＲＢＣ濃度を、Ｚ２コールター計数器（ベックマン・コールター社（Beckman Coulter Inc）、米国）によってさらに測定した。同様に、バッフィーコート試料に対する装置性能を評価するために、ＭＰ−ＲＭを用いた遠心分離によって単離されたＷＢＣの表面マーカー、ＣＤ６６ｂ、および核を染色した。その後、染色されたＷＢＣを、最初の全血体積と同じ体積のサンプルバッファーに再懸濁し、装置で処理した。次に、試料中の細胞のサイズ分布をＺ２コールター計数器によって測定し、フローサイトメーターを用いて試料の組成を解析した。
【００９２】
異なるＲＢＣ除去技術を比較するために、全血（染色せず）を１％ヘマトクリットになるまでサンプルバッファーで希釈し、マイクロ流路装置で処理した。その次に、装置の注入試料および排出試料、ならびにＭＰ−ＲＭを用いた分画遠心分離によって単離されたＷＢＣまたは１０分間の低張ＲＢＣ溶血（上記試料調製の段落に記載の方法）によって単離されたＷＢＣを、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ６６ｂモノクローナル抗体（１：２５ｖ／ｖ）およびＡＰＣ結合マウス抗ヒトＣＤ１８モノクローナル抗体（１：２５ｖ／ｖ）を用いて、４℃で３０分間、暗所で染色した。染色後、試料をサンプルバッファーで洗浄し、フローサイトメーターで解析した。活性化ＰＭＮ（すなわち、ＣＤ１８陽性ＰＭＮ）のゲートは、３７℃以下で３０分間、１μＭのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、米国）で処理し（完全な活性が得られた）、その後、免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ解析をおこなったＰＭＮに基づいて描かれた。
【００９３】
ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）試験
ＭＰ−ＲＭを用いた分画遠心分離によって単離されたＷＢＣおよび１％ヘマトクリット注入試料を用いて渦巻き処理によって単離されたＷＢＣを、細胞の最終濃度が約１００万個／ｍＬとなるようにサンプルバッファーに再懸濁した。各細胞試料４０μＬを、ポリ−Ｌ−リジンコートされたガラススライド（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、米国）上にそれぞれ置き、試料の領域はハイドロフォビック・バリアー・ペン（Hydrophobic Barrier Pen）（イムエッジ（商標）ペン（ImmEdgeTMPen）、ベクター・ラボラトリー社（Vector Laboratories, Inc.）、米国）を用いて、円形とした。その後、スライド上の試料を３７℃で１０分間インキュベートし、細胞を付着させた。ＮＢＴ試験のアッセイバッファーは、新しく調整され、１×Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＤＰＢＳバッファー（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水；インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）および０．２５％（ｗ／ｗ）ＮＢＴ（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、米国）で構成した。ＰＭＡ刺激の条件では、アッセイバッファーは１μＭのＰＭＡも含んでいた。インキュベーション後、４０μＬのアッセイバッファーをスライド上に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。最後に、細胞試料を位相差顕微鏡（オリンパスＣＫＸ４１、オリンパス社（Olympus Inc.）、米国）で観察し、ＮＤＰＬ−１（２×）接続レンズ（ヴィヴィタール（登録商標）サカール・インターナショナル社（Vivitar(R) Sakar International, Inc.）、米国）を用いて、顕微鏡下６０倍の対物レンズで、ＤＳＬＲカメラ（キヤノンＥＯＳ５００Ｄ、キヤノン（Canon）、米国）によって、カラー画像を撮影した。
【００９４】
結果および考察
設計原理
マイクロ流路を流れるとき、流体中に懸濁された粒子は、慣性揚力および粘性抗力を受けていた。慣性揚力は、制限された流路における流れの放物線速度分布によって起こる剪断誘発性揚力（ディ・カルロ（Di Carlo）ら、２００７年を参照）および壁に近づいたときに粒子の周囲の回転乱流から起きる壁面誘発性揚力（ゼン，Ｌ．（Zeng, L.）、Ｓ．バラチャンダー（S. Balachandar）、およびＰ．フィッシャー（P. Fischer）『ジャーナル・オブ・フルイド・メカニクス（Journal of Fluid Mechanics）』２００５年；５３６巻：１〜２５頁を参照）を含む。粒子が、ａｐ／Ｄｈ≧０．０７（ここでａｐは粒径を表し、
【００９５】
【数４】
0006265508.tif 000005
【００９６】
はマイクロ流路の水力直径であって、ＡおよびＰは、それぞれ流路断面の面積および周囲長である）を満たす場合、剪断誘発性揚力と壁面誘発性揚力との間の相互作用によって、最初無作為に分布していた粒子が、マイクロ流路外縁周辺の安定した平衡位置まで横方向に移動する。（ディ・カルロ，Ｄ（Di Carlo, D）ら、２００７年、バガット，Ａ．Ａ．Ｓ．（Bhagat, A.A.S.）、Ｓ．Ｓ．クンタゴウダナハリ（S.S. Kuntaegowdanahalli）、およびＩ．パパウトスキ（I. Papautsky）『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００８年；８巻；１１号：１９０６〜１９１４頁、ならびにディ・カルロ，Ｄ．（Di Carlo, D.）ら、『アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）』２００８年；８０巻；６号：２２０４〜２２１１頁を参照）。多くの研究によって、粒子に作用する正味の慣性揚力（ＦＬ）は、粒子サイズ（
【００９７】
【数５】
0006265508.tif 000006
【００９８】
）および流体の剪断速度（
【００９９】
【数６】
0006265508.tif 000007
【０１００】
）に高度に依存していることが明らかになっている。得られた平衡位置は、これら以外に、流路断面の形状にも影響を受ける。正方形断面直線状マイクロ流路内では、粒子は、低レイノルズ数流れ（Ｒｅｃ＜１００、ここで
【０１０１】
【数７】
0006265508.tif 000008
【０１０２】
であり、ρ、Ｕｆ、μは、別個に流体溶媒の密度、速度および粘度を表す）では８箇所の平衡位置に集束するが、レイノルズ数が高い場合（Ｒｅｃ≧５００）、流路の角付近の４箇所の平衡位置に集束する（チュン，Ｂ．（Chun, B.）およびＡ．Ｊ．Ｃ．ラッド（A.J.C. Ladd）、『フィジクス・オブ・フルイド（Physics of Fluids）』２００６年；１８巻；３号：０３１７０４頁を参照）。縦横比が高い長方形断面マイクロ流路における剪断速度の非対称な性質によって、粒子は、優先的に流路の長手寸法に沿って集束する（バガット，Ａ．Ａ．Ｓ．（Bhagat, A.A.S.）、Ｓ．Ｓ．クンタゴウダナハリ（S.S. Kuntaegowdanahalli）、およびＩ．パパウトスキ（I. Papautsky）『マイクロフルイディクス・アンド・ナノフルイディクス（Microfluidics and Nanofluidics）』２００９年；７巻；２号：２１７〜２２５頁を参照）。流路の曲率を組み込むことによって、粒子に二次流れの粘性抗力を加えて、平衡位置をさらに変更し得る。渦巻き状流路などの湾曲マイクロ流路を通過する流体は、流路断面にわたり、反対方向に回転する２つの渦（ディーン渦）からなる二次流れを発生する遠心加速度を受ける（ディーン，Ｗ．Ｒ．（Dean, W.R.）『フィロソフィカル・マガジン（Philosophical Magazine）』第７集、１９２７年；４巻；２０号：２０８〜２２３および２２９頁、およびディーン，Ｗ．Ｒ．（Dean, W.R.）『フィロソフィカル・マガジン（Philosophical Magazine）』第７集、１９２８年；５巻；３０号：６７３〜６９５頁を参照）。渦流れの大きさは、無次元のディーン数（Ｄｅ）、および粒子が受け、ディーン抗力（ＦＤ）として知られる粘性力を用いて表すことができ、ストークスの抗力を想定することで定量化することが出来る。
【０１０３】
【数８】
0006265508.tif 000009
【０１０４】
【数９】
0006265508.tif 000010
【０１０５】
ここで、ＵＤはディーン流れの平均速度を表し、
【０１０６】
【数１０】
0006265508.tif 000011
【０１０７】
で与えられる。特に、ディーン抗力の式では、はっきりと示されていないが、ディーン渦の異なる位置において、二次流れの速度が変化し、渦核ではほぼゼロとなるため、ディーン抗力の大きさおよび方向は、流路断面内で変化する（オオカワラ，Ｓ．（Ookawara, S.）ら『ケミカル・エンジニアリング・サイエンス（Chemical Engineering Science）』２００７年；６２巻；９号；２４５４〜２４６５頁を参照）。慣性揚力は、最初、粒子の集束を規定し、渦巻き状流路内でのディーン抗力および慣性揚力の組合せ効果により、複数の粒子の平衡位置は、内側流路壁からの横方向距離が同じで、縦方向に重なる二つの位置まで減少する（ラッサム，Ａ．（Russom, A.）ら「ニュー・ジャーナル・オブ・フィジックス（New Journal of Physics）』２００９年；１１巻：０７５０２５頁を参照）。さらに、両方の力（
【０１０８】
【数１１】
0006265508.tif 000012
【０１０９】
【数１２】
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【０１１０】
）がサイズ依存的である結果、様々な直径の粒子が、所与の流速で同じ渦巻き状流路を流れるときに、内側流路壁付近の横方向の異なる位置を占め、異なる度合いで集束する。このように、渦巻き状マイクロ流路を、適切なサイズ別粒子／細胞分離装置として用いることができる。
【０１１１】
血液細胞の分離に渦巻き状マイクロ流路を用いる際の主な問題の１つは、分離分解能が限られていること、および分離効率に影響を与えずに膨大な数のＲＢＣを保持する収容力が限られていることにある。ある最近の研究によって、直径がそれぞれ７．３２μｍ、９．９２μｍ、１５．０２μｍおよび２０．６６μｍであるポリスチレン粒子は、とても低い濃度（０．００５％体積率の粒子溶液）で、Ｄｅ＝１６．３のときに、５００μｍ×１００μｍ（Ｗ × Ｈ）の長方形断面渦巻き状マイクロ流路において、４つの別個の帯に集束できることが示された（チャタージー，Ａ．（Chatterjee, A.）、Ｓ．Ｓ．クンタゴウダナハリ（S.S. Kuntaegowdanahalli）、およびＩ．パパウトスキ（I. Papautsky）『プロシーディング・オブ・ザ・ＳＰＩＥ（Proceedings of the SPIE）』２０１１年；７９２９巻：７９２９０７頁を参照）。しかしながら、膨大な数のＲＢＣが、細胞−細胞相互作用によってＲＢＣの流れ幅を著しく広げて、他の細胞の集束に影響を与える血液試料に、このような設計を直接適用することはできない。より高いヘマトクリットの試料を収容するためには、平衡位置間の間隔を増大することが必要である。本明細書に示す手法では、図１３に示すように、渦巻き状マイクロ流路の断面を、外側流路壁においてより流路が深い台形に変更している。台形断面の非対称性によって、速度場の形状が変化し、比較的遅い流速であったとしても、より流路が深くなっている外壁側に偏った強いディーン渦核が形成される。したがって、図１４Ａ〜図１４Ｄに示すように、長方形断面を有する渦巻きにおいて、慣性揚力とディーン抗力との間の相互作用によって、大きい粒子が内壁付近に集積し、小さい粒子が流路幅の中央に位置するディーン渦の核に捕捉されるのに対し、台形断面を有する渦巻きにおける速度場の変化によって、大きい粒子の集束位置に影響を与えずに小さい粒子が外壁に向かって大きく移動し、これによって、平衡位置が大きく変化して、分離分解能がより高くなる。
【０１１２】
台形断面は、粒子が集束する際のサイズ依存性および流速依存性にも影響を与える。長方形断面の渦巻きにおいて、ａｐ／Ｄｈ≧０．０７である粒子は、最初、低いＲｅｃにおいて内側流路壁付近に集束し、その後、Ｒｅｃが増大するにつれ外壁に向かって移動する。Ｒｅｃが十分に高い場合、ディーン抗力が粒子の挙動を支配し、粒子は集束しない。それどころか、本明細書に示す結果は、Ｄｈの代わりに、内壁における流路深さ（Ｄｉｎｎｅｒ）が、より優れた、重大な流路寸法となって、ある直径の粒子が内壁付近で集束流を形成することができるかどうかを決定する。このことは、図１５Ａ〜図１５Ｃに示すような、Ｄｏｕｔｅｒ／Ｄｉｎｎｅｒ≦１．５の基準を満たす台形流路を用いて確認された。興味深いことに、台形断面渦巻きの粒子の挙動は、集束／非集束のＲｅｃへの同様な依存性を示し、Ｒｅｃがさらに増大した際に、流路断面の外側半分に粒子を捕捉することで特徴付けられる追加的な状況が観察される。また、粒子を捕捉するのに必要となる流速は、粒子サイズにともなって大きくなり、特定のサイズ範囲にある粒子の分離を実現可能とする。Ｒｅｃが高い状況で粒子が捕捉される正確な機構は、よくわからないままである。以前の研究によって、粒子の集束流れの位置は、粒子に作用するＦＤの方向および大きさの両方に著しく影響を受ける（オオカワラ，Ｓ．（Ookawara, S.）ら『ケミカル・エンジニアリング・ジャーナル（Chemical Engineering Journal）』２００４年；１０１巻；１〜３号；１７１〜１７８頁を参照）が、一方、ＦＬは、Ｒｅｃが低い流れにおいて粒子の集束を規定する主な力であった（ラッサム，Ａ．（Russom, A.）ら「ニュー・ジャーナル・オブ・フィジックス（New Journal of Physics）』２００９年；１１巻：０７５０２５頁を参照）ことが明らかになっている。台形断面渦巻き内の速度場の変化によって、ディーン渦の分布が偏り、渦の核において粒子トラップとして働くのかもしれない。その結果、低いＲｅｃにおいて、大きい粒子は、小さいＦＤを受けてディーン渦核から逃れることができ、ＦＬの空間分布によって最初に決定される横方向の平衡位置を見出すことができる。この仮説を実証するために、台形断面渦巻きの慣性集束についてさらに検討することが必要である。
【０１１３】
ヒト血液試料に対する装置の性能
本明細書で開発された、ＲＢＣの除去に最適化されたＰＤＭＳ装置は、注入口を１つと排出口を２つ有し、幅が５００μｍ（４８５．００μｍ±２．３１μｍ）で深さが７０μｍ（内壁、７２．８４μｍ±１．１６μｍ）および１００μｍ（外壁、１０２．６５μｍ±３．５５μｍ）の台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路からなる。排出口領域付近では、幅４８５μｍの流路は、流路幅の比が３：７（内：外）である２つの排出口流路に分割され、その２つの流路の長さは、お互いに等しくなるように調整された。内側排出口は、ＲＢＣが除去された試料のＷＢＣ排出口（すなわち、ＰＭＮ／ＭＮＬ）であると定義され、外側排出口は、不要なＲＢＣ排出口であると定義された。最適な流速は、実験的に０．８ｍＬ／ｍｉｎと求められた（Ｒｅｃ＝４６．５２；Ｄｅ＝４．２２）。ＭＰ−ＲＭを用いた遠心分離によって単離されたＰＭＮおよびＭＮＬを、装置に別々に注入し、図１７Ａに示す、流路内における平衡位置を求めた。最適な流速においては、ＰＭＮは、上面視で、内側流路壁から約７５μｍ離れたところに集束流れを形成し、ＭＮＬは、同様の横方向の位置を占めたが、おそらくより小型の細胞サイズのために、流れがわずかに広かった。これに対し、さらに細胞サイズが小さいＲＢＣは、外側流路壁付近に広がった流れとして示され、これによって、装置の排出口において、ＲＢＣからＰＭＮ／ＭＮＬを単離することが可能となった。０．１％以上のヘマトクリットの注入試料の場合に、図１６Ａに示す、ＷＢＣの分布がＲＢＣの分布と著しく重なる従来の長方形断面渦巻き状マイクロ流路と比較して、開発された台形断面渦巻きは、図１６Ｂに示すように、ＷＢＣとＲＢＣとの間に、より大きい間隔を実現し、それによって、単離されたＷＢＣの純度と回収を損なうことなく、ヘマトクリットがより高い注入試料を処理することを可能にした。図１７Ｂは、１回通した後の、本装置のＷＢＣ排出口からの血液成分の回収を示し、ここでは０．５％ヘマトクリット血液試料において、ＲＢＣの約９５％が除去され、全ＷＢＣの９８．４％が回収され（ＰＭＮは９９．４％、ＭＮＬは９２．４％回収された）、最適な性能が実現された。この条件下において、装置のスループットは、１分あたり全血（４５％ヘマトクリット）約１０μＬということになり、これは、１０倍希釈した血液の場合に２０μＬ／ｍｉｎでＷＢＣを約２９倍濃縮する「流体力学的濾過」（ヤマダ，Ｍ．（Yamada, M.）およびＭ．セキ（M. Seki）『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００５年；５巻；１１号：１２３３〜１２３９頁を参照）、５０μＬ／ｈｒでＷＢＣを９２％回収する誘電泳動（ＤＥＰ）マイクロ分離機（ハン，Ｋ．Ｈ．（Han, K.-H.）およびＡ．Ｂ．フレイジャー（A.B. Frazier）『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００８年；８巻；７号：１０７９〜１０８６頁を参照）、および２．５〜２０μＬ／ｈｒでＷＢＣを９７％回収する磁気泳動マイクロ分離機（ハン，Ｋ．Ｈ．（Han, K.-H.）およびＡ．Ｂ．フレイジャー（A.B. Frazier）『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２００６年；６巻；２号：２６５〜２７３頁を参照）などの他のマイクロ流体白血球単離装置よりも著しく高い。注入試料のヘマトクリットがさらに高くなると��流路の幅にわたってＲＢＣの分布が広がることになり、ＲＢＣの除去は減少するが、全ＷＢＣおよびＰＭＮの回収は比較的一定のままであった。１．５％ヘマトクリットまでは、依然としてＲＢＣの８６．８％を除去することができ、全ＷＢＣの９６．２％を回収することができる。図１７Ｃおよび図１７Ｄに示すように、第１装置のＷＢＣ排出口からの排出試料を希釈することなく第２装置の注入試料として用いる２段階処理によって、１〜１．５％ヘマトクリット試料の場合に、良好なＷＢＣの回収を維持しつつ、高いＲＢＣ除去を実現できた。第１装置から回収されたＷＢＣは約６倍濃縮されたので、２段階処理によって、２５分よりも短い時間で、５００μＬの全血を容易に処理することができ、これは、セス（Sethu）らが報告したマイクロ流体ＲＢＣ溶血装置に匹敵する（セス，Ｐ．（Sethu, P.）ら『アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）』２００６年；７８巻；１５号：５４５３〜５４６１頁を参照）。
【０１１４】
血液の供給源の違いにその性能が影響を受け、異なる細胞層を異なる試験管へ手動で移動させる分画遠心分離の第２段階として、上記装置を用いることもできる。最初の３０分の遠心分離後、単離されたＷＢＣにＲＢＣがいくらか残っている場合が多く、さらなるＲＢＣの除去には、低速遠心分離による追加の洗浄工程またはＲＢＣの溶血工程が必要となる。ここで、この装置のＲＢＣ除去能は、遠心分離によって顕著な量のＲＢＣがＷＢＣと一緒に単離された場合のバッフィーコート処理において実証された（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。細胞試料のサイズ分布に基づいて、全集団のうちのＷＢＣの割合（細胞径：６．６〜１５μｍ）は、この装置による処理後、３０％から９１％に増加したことが観察された。
【０１１５】
ＰＭＮの免疫表現型に対するＲＢＣ除去技術の影響
ＲＢＣの、試料からの穏やかな除去は、残りの細胞の後段の解析にとって非常に重大である。最近の研究で、癌細胞であるＭＣＦ７において、Ｒｅｃ＝２１での慣性分離後に、全体的な遺伝子発現プロファイルおよび細胞の生存率が測定され、選別されていない対照試料と比較して、分離工程に起因する顕著な影響は観察されなかった（ハー，Ｓ．Ｃ．（Hur, S.C.）ら『ラボ・オン・ア・チップ（Lab on a Chip）』２０１１年；１１巻；５号：９１２〜９２０頁を参照）。このことは、細胞を短時間、一時的に剪断条件にさらしても、細胞機能を変化させるのに十分でないであろうことを示している。本明細書で述べる渦巻き状装置の場合、単離されたＷＢＣの生存率は、９８．２２％±０．８３％（トリパンブルー染色；注入試料：９８．０５％±１．０８％）であることがわかり、インビトロの刺激（ＰＭＡ）に応答して活性酸素種を生じる能力を、ＮＢＴ試験によって測定した。図１９Ａに示すように、渦巻き処理および分画遠心分離の両方によって単離されたＰＭＮは、不活性なままであったが、１μＭのＰＭＡが存在すると、ＮＢＴを減少させることができた。外部刺激に対する白血球の高い感受性を考え、発明者らは、異なるＲＢＣ除去技術が、ＰＭＮに対する伝統的な活性化マーカーである細胞表面マーカー（図１９Ｂ）、ＣＤ１８の発現レベルに与える影響を比較した。渦巻き処理およびＭＰ−ＲＭを用いた遠心分離の両方においては、ＰＭＮ活性化に対する影響は無視できる程度であったが、一方、ＲＢＣ溶血法においては、活性化したＰＭＮの割合は著しく増加し、表現型および遺伝子発現プロファイルに対し潜在的に影響を与える可能性があった。
【０１１６】
結論
台形渦巻き状流路内における非対称な速度場が、慣性集束現象に影響を与えるという実験的な証明によって示されるように、同様の寸法の長方形断面と比較して分離能が高い分離を提供する台形断面渦巻きを用いて、新規の、ハイスループットなＲＢＣ除去技術が開発され、曲線慣性マイクロ流体選別機を最適化するためのパラメータとして、（幅および深さ以外に）流路断面の形状を用いることの可能性が示された。このサイズ別分離技術によって、血液細胞を非生理学的条件に長時間さらす必要がなくなり、これによって、分離中の細胞の表現型の人為的な変化が最小限になる。詰まりおよび低スループットが、たいていの、膜を利用する（ブルイル，Ａ．（Bruil, A.）ら『ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ（Journal of Biomedical Materials Research）』１９９１年；２５巻；１２号：１４５９〜１４８０頁を参照）、またはミクロンサイズの支柱を利用する（パナロ，Ｎ．Ｊ．（Panaro, N.J.）ら『バイオモレキュラー・エンジニアリング（Biomolecular Engineering）』２００５年；２１巻；６号：１５７〜１６２頁を参照）サイズ別マイクロ流体分離方法の主な短所であるが、上述の装置の比較的大きい寸法によって、詰まりの問題もなく大量の試料を処理することが可能になる。上述の渦巻き状マイクロ流路は、ＤＬＤ技術およびＰＦＦ技術などの他の種類の連続的細胞分離方法と比較して、豊富なＲＢＣ（約２％ＨＣＴまで）を収容する大きい流路寸法を有して、速い操作流速（ｍＬ／ｍｉｎの範囲）で機能し、これによって、ハイスループットとなり、血液試料を処理するのに適している。再現性高く、全細胞数の９０％より多くなるようにＷＢＣを濃縮する性能および能力もまた、単独または分画遠心分離と組み合わせて用いるときに、様々な体液からＲＢＣを完全に除去するためのよい選択となる。流路断面および他の構造的特徴をさらに最適化することによって、この技術を、他の多くの主要な細胞分離の問題に適用することができる。
【０１１７】
（実施例３）
長方形断面および台形断面を有するサイズ別粒子分離用渦巻き状マイクロ流路
渦巻き状慣性マイクロ流体システムにおいて、流路断面の深さおよび幅の両方に沿った粒子の集束流れの位置を三次元的に観察する方法を、以下に説明する。その結果によって、粒子が、マイクロ流路断面の上壁および底壁付近に集束することが確認され、集束機構および分離機構についての明確な見識が明らかになる。力の平衡についてのこのような詳細な理解に基づいて、流路の外側半分により強いディーン渦を生じる、台形断面を有する新規の渦巻き状マイクロ流路が導入される。このような装置で集束する粒子は、粒子サイズおよび流速に影響を受けやすく、サイズ依存的な臨界流速において、内側半分から外側半分の平衡位置に急激に移行することが、実験によって示される。粒子の平衡位置は、異なる集束機構に基づいてよく分離されているので、長方形断面を有する渦巻き状マイクロ流路にわたって、より高い分離分解能が実現される。
【０１１８】
長方形断面および台形断面渦巻き状流路における粒子の集束位置
図２０は、８０μｍ×６００μｍ（Ｈ×Ｗ）の長方形断面を有する渦巻き状流路における、１５．５μｍ粒子の集束位置を、上面視および側面視によって示す。上面視において、粒子の集束位置は、流れが増大するにつれて、内壁から外壁に向かって徐々に移動する。側面視において、深さ方向に沿って２つの明確な帯が観察され、これによって、上壁および底壁付近に２つの異なる集束位置が示される。幅方向に沿った集束位置の段階的な変化とは対照的に、深さ方向に沿った集束位置は、おおむね流速に依存せず、流速が０．５〜７．５ｍＬ／ｍｉｎの範囲の場合に、上壁および底壁から２２．０％±１．１％の流路深さに固定されたままとなる。この結果は、直線状長方形断面流路または直線状円形断面流路における、以前のシミュレーションおよび実験研究に一致する。ディーン流れ分布のシミュレーションから、ディーン流れは、その方向を２８±０．５％変化させることがわかり、これによって、集束位置（深さ）におけるディーン抗力は、常に内壁に向いていることが示される。これらの結果によって、渦巻き状流路を移動する粒子の集束機構に対する重要な見識が得られる。力の平衡について詳細を以下に論じる。
【０１１９】
台形断面を有する渦巻き状流路において、粒子が集束する挙動は、長方形流路における挙動と異なる。台形流路においては、図２１に示すように、粒子は、低流速では内側流路壁付近に集束し（長方形断面を有する流路同様）、一方、ある流速の閾値を超えると、外側半分に位置する平衡位置に急激に移行する。上面視および側面視で集束位置を精査することにより、流路の外側半分に形成される２つのディーン渦の中心に、正確に粒子が捕捉されることが明らかになる。
【０１２０】
上面視による集束の比較
図２２は、長方形断面および台形断面を有する渦巻き状流路における、蛍光粒子の集束位置の流速依存性を示す。粒子径は、それぞれ５．７８μｍ、９．７７μｍ、１５．５μｍ、および２６．２５μｍであった。長方形流路の断面は、それぞれ８０μｍ×６００μｍ（Ｈ×Ｗ）および１２０μｍ×６００μｍ（Ｈ×Ｗ）であった。台形流路の幅は、６００μｍに固定し、流路の内側および外側の深さは、それぞれ８０μｍおよび１３０μｍである。図２２に示す結果によって、長方形流路においては、粒子は、低流速では内側流路壁付近に集束し、その後、集束位置は、流速が上がるにつれて外壁に向かって徐々に移動することが示される。所与の流速において、様々なサイズの粒子は、流路断面内の異なる位置を占めていた。クンタゴウダナハリは、この現象を利用して、流路の末端において複数の排出口を有する分岐によって、サイズ別の分離を実証した。しかしながら、粒子間の集束位置の違いは大きくないので、濃縮懸濁液の分離における分離能およびスループットは制限される。
【０１２１】
台形流路における、異なるサイズを有する粒子の集束位置の測定では、はっきりと異なる特性が示される。図２２に示すように、すべての粒子において、流速を上げる際に流路の内側から外側へ「移行する」狭い流速の範囲、すなわち閾値が存在した。流速が閾値以下では、粒子は内壁付近に集束し、一方、閾値より大きいと、流路の外側付近に集束した。この流速の閾値は、粒子サイズの関数であることに注意することが重要である。特に、より小さい５．７８μｍ粒子および９．７７μｍ粒子は、非常に遅い流速（≦１ｍｌ／ｍｉｎ）で流路の外側半分に移動し、一方、１５．５μｍ粒子および２６．２５μｍ粒子は、このような低流速では内壁付近に集束したままであった。小さい粒子（５．７８μｍおよび９．７７μｍ）がいったん外側に集束すると、流速を上げても影響はなかった。一方、１５．５μｍ粒子は、２．０ｍＬ／ｍｉｎを越えると外側で平衡となり、また、２６．２５μｍ粒子は、３．５ｍＬ／ｍｉｎを越える流速で移動した。
【０１２２】
分離分解能およびスループット
異なる２つのサイズの粒子を分離する場合、理想的な筋書きは、異なるサイズの粒子が、互いにできる限り離れた位置に集束することである。これによって、分離分解能が増大するだけでなく、異なるサイズの粒子間の相互作用を最小化することによって、粒子濃度が高い試料（例えば、血液分離の場合、ヘマトクリットが高い細胞溶液）を処理することが可能になる。図２２の結果によって、台形断面流路は、これらの要件を満たしていることが示される。次に、様々なサイズの粒子の実際の分離を示す試験を行った。
【０１２３】
図２３は、１ｍＬあたり１５００００〜３５００００個に希釈されて、台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路に送り込まれる、国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の追跡可能な異なる標準的粒子（公称径１５μｍ、２０μｍ、および２５μｍ、平均直径１５．６１μｍ、２０．８５μｍ、および２５．６３μｍ、バングス・ラボラトリー社（Bangs Laboratories, Inc.）、米国）の回収を示す。排出試料を回収し、粒子の回収を解析した。内側排出口および外側排出口における回収体積の比は、１：４であった。結果によって、粒子が内側から外側半分に完全に移動するのに適した流速範囲は、１５μｍビーズの場合は２．０〜２．６ｍＬ／ｍｉｎの間、２０μｍビーズの場合は２．６〜３．４ｍＬ／ｍｉｎの間、２５μｍビーズの場合は３．４〜４．８ｍＬ／ｍｉｎの間で有ることが示された。これらのデータは、流速の閾値が、これら３つの粒子集団を高分離分解能で分離するのに十分であったことを示している。
【０１２４】
台形流路のハイスループットな分離性能が、異なる平均直径を有する蛍光ラベル化粒子を用いて、図２４Ａ〜図２４Ｂに示される。図２４Ａの散布図は、２つの粒子集団およびその分離効率を示す。１．６１×１０７／ｍｉｎ（１．８７％体積率で、血液分離における「ヘマトクリット数」に等しい）のスループットでの１５．５μｍビーズおよび１８．６８μｍビーズの分離結果は、９２％を越える分離効率を示す。最適化された３．４ｍＬ／ｍｉｎの流速での１８．６８μｍビーズおよび２６．９μｍビーズの分離結果によって、両方の排出口において、全スループットは、１．３３％体積率である８．８５×１０６／ｍｉｎで、純度は９６％を越えている。図２４Ｂは、１８．６８μｍ粒子と２６．９μｍ粒子との分離を示す顕微鏡画像を示す。高速画像は、排出口において対向する流路壁付近の、分離された粒子の流れを示している。
【０１２５】
細胞は、変形性および形状の点で、硬い粒子とは異なる。ハー（Hur）らは、慣性マイクロ流体技術では、粒子の形状は集束位置に明確な影響は及ぼさないが、粒子の水力直径は重要な因子であり、一方、変形性は粒子／細胞の集束位置に明確な影響を与え、これにより、同じサイズの硬いビーズと比較して、粒子／細胞が集束した帯は、流路壁からわずかに移行することを報告した。装置を細胞の分離に用いる場合、細胞の変形性のばらつきは、分離効率に影響を与える場合がある。しかし、上記実施例２に示すように、台形渦巻きは、おそらく内側の集束位置と外側の捕捉位置との間の大きい距離が助けとなって、変形可能な白血球と赤血球とを、遜色なく分離可能である。
【０１２６】
長方形断面流路における力の平衡の解析および集束機構
湾曲マイクロ流路において粒子にかかる力を解析するために、図２０および図２１に示すように、座標系（ｘ、ｙ、ｚ）を規定する。流路曲線に沿った方向（主流の方向）は、ｘ軸に沿っている。流路深さに沿った方向は、ｙ軸であり、流路に沿った半径方向（幅方向）は、ｚ軸である。
【０１２７】
断面に沿って、ディーン誘導抗力ＦＤＤおよび慣性揚力ＦＬは、渦巻き状流路に懸濁された粒子にかかるすべての力の中で、優勢である（力の解析の詳細は以下で述べる）。粒子の平衡位置は、このように、これら２つの力の間の平衡に依存している。
【０１２８】
流路断面のある位置で平衡となる粒子の場合、ｙ−ｚ平面に沿った粒子速度およびその近傍におけるディーン流れ速度の違いによって、図２０および図２１に示すような、ストークスの法則に従う抗力（すなわち、抗力はディーン速度に比例する）が粒子に生じる。この抗力ＦＤＤは、ディーン流れ場に完全に依存する。シミュレーションモデルにおいて、流速が１．０ｍＬ／ｍｉｎから８．０ｍＬ／ｍｉｎへと増加する場合、ディーン流れの分布は、顕著には変化しない。流路幅（ｚ軸）に沿った流路断面の中央部分において、ディーン流れ速度は、常にｚ軸に平行であり、上壁および底壁に近づくにつれて、流路深さ（ｙ軸）に沿ってその方向を変化させる。このように、内壁／外壁領域以外では、ＦＤＤが、主にｚ軸に平行に作用している。流路の２８±０．５％の深さと７２±０．５％の深さとの間の領域においては、ＦＤＤは、ｚ軸の負の方向に向いており、一方、上壁／底壁付近の領域においては、ｚ軸の正の方向に沿っている。
【０１２９】
剪断場における小さい粒子は、粒子周囲の粘性流れにおける慣性効果の結果、流れの方向に垂直な揚力ＦＬを受ける。上記設計のマイクロ流体流路の場合、ＦＤＤに比べて、「最小揚力」領域以外のたいていの位置で、ＦＬが優勢である。これまで、縦横比が低い長方形流路におけるＦＬの分布についてのシミュレーション結果がないが、流路断面の中央領域において、ＦＬは、常に流路の上壁または底壁に向いている。
【０１３０】
流路壁付近では、以前の研究において、直線状流路における揚力の平衡が数値的にシミュレーションされ、実験的に観察されている。チョイ（Choi）による正方形流路の断面における集束位置の直接的な観察によって、粒子は、４つの流路壁の近くで平衡となることが示され、これらは「最小揚力平面」と呼ばれる。バガット（Bhagat）らは、上面視および側面視の両方で蛍光粒子の分布を観察し、長方形直線状流路の場合に、４つの最小揚力平面が、長い側壁に沿った２つの最小揚力平面に減少することを示した。長方形断面湾曲流路において、流路の２２％の深さおよび７８％の深さで、流路の上壁および底壁に沿って粒子が集束するという意味で、他の結果は、湾曲流路における彼らの観察に一致する。さらに、彼らの実験データによると、粒子は、低流速では最小揚力平面に沿って分散したままであり、流速が上がるにつれて最小揚力平面の中央に集束する。直線状長方形流路におけるこのような実験的挙動と数値計算を組み合わせることによって、最小揚力平面内のＦＬが、真の平衡（平面の中央）に向かって、粒子をさらに押していることが明らかになる。低流速でこの力が弱い間、その力によって、粒子は、上記平面に沿って分散する。より速い流速では、ＦＬは、より急速に増加して（ＦＬ〜Ｕｍ２、ここでＵｍは主流の平均速度である）、顕著になり、これによって、粒子は、最小揚力平面の中央に集束する。
【０１３１】
湾曲長方形流路における粒子の挙動についても、同様に説明することができる。側壁領域付近以外には、ｙ方向のＦＤＤが存在しないので、ｙ軸に沿ったすべての粒子の集束位置は、直線状長方形流路同様に、流路の２２％の深さおよび７８％の深さに粒子を集束させる、ＦＬによって決まる。これらの最小揚力平面（２２％および７８％）において、ディーン流れは、（内壁から幅方向１０％周辺での縁効果によって）粒子が弱いＦＤＤを受け、最小揚力平面内で弱いＦＬによって平衡となるまで、粒子を内壁に向かって押す。（ｙ軸における）いかなる逸脱もより強いＦＬを生じ、粒子は強制的に最小揚力平面に戻る（図２５の位置ｂおよび位置ｃ）ので、この場合（図２５の位置ａ）の平衡は安定している。ここでの集束位置は、主にＦＤＤ（〜ｒ）の観点から、粒子のサイズに依存することになり、大きい粒子は、小さい粒子に比べてさらに内壁へと押される。このような状況（図２３における約３ｍＬ／ｍｉｎより遅い状況）において、ＦＤＤが大きくなる（〜Ｕｍ２）ことにより、速い流速で、粒子はさらに壁に向かって押されることになる。
【０１３２】
流速が上がる（図２３における約３ｍＬ／ｍｉｎより速くなる）と、ｚ軸に沿ったＦＬ（〜Ｕｍ２）は、ＦＤＤ（〜Ｕｍ１．６３またはＵｍ１．８）よりも速く大きくなり、粒子の集束位置は、外壁に向かって動き始める（図２２）。サイズが異なる粒子の場合、大きい粒子では、ＦＬの大きさ（ＦＬ〜ｒ３）は、流速とともに、ＦＤＤよりも速く大きくなる。これが、流路の内側から外側への（約３ｍＬ／ｍｉｎより速い）集束位置の二次移行の原因となる機構である。このような状況において、大きい粒子は、図２２に見られるように、小さい粒子よりも急にこの移行（ＦＬのより急な増加）を行うことになる。単に、大きい粒子の流れが、より急に外側へと移動して小さい粒子の流れと重なるために、大きい粒子と小さい粒子との物理的な離隔距離が小さくなるということは、重要な意味を持つ。その結果、長方形断面を有する渦巻き状慣性選別機の分離分解能は、ある流速において最適化することができ、単に流速を変化させるだけでは、さらに向上させることはできない。
【０１３３】
一方、中央線における粒子（図２５の粒子ｄ）も、流路の内側半分で平衡となることができ、ここで、ＦＬ（内側に向いている）およびＦＤＤ（外側に向いている）は、方向が反対である。しかしながら、中央線から少しずれることによって、粒子位置は、近くの最小揚力平面に向かって大きく偏向するため（図２５の粒子ｅ）、この平衡は、もしも存在するのであれば、安定ではない。流路の外側半分においては、通常、ＦＬおよびＦＤＤは、同じ方向であり、そのため、力の平衡を保つことはできない（粒子ｆおよび粒子ｇ）。
【０１３４】
なお、上記解析は、粒子と流れ場との間の相互作用を考慮していない。実際は、粒子の存在によって、主流の分布が劇的に変化し、さらに横方向の流れを誘発することが提唱されている。主流の変化は、ＦＬおよびＦＤＤに直接影響を与え得る。ディーン流れは、主流の不均一性によって生じるので、ディーン流れの分布はまた、主流の変化および粒子に誘発された横方向の流れの両方によって変化し、ひいてはＦＤＤの大きさを変化させる。このため、直線状流路におけるＦＬのシミュレーションデータが利用できる場合であっても、これらの力について数値解析を行うのは難しくなる。しかしながら、この単純化した力の解析に基づいて、揚力が主に抗力と平衡となっている渦巻き状慣性マイクロ流体流路内で、力の平衡をさらに数値的に理解することができる。
【０１３５】
台形流路における集束機構
長方形断面流路において、ＦＤＤとＦＬとの平衡の結果、粒子は、特定の位置（典型的には、湾曲流路の内側）に集束する。いずれかの力が変化すると、平衡は崩れ、粒子は、断面における新しい集束位置に移行することとなる。集束位置の変化は、流路断面の形状を変化させることによって容易に実現させることができる。例えば、内側が浅く外側が深い断面を有する台形流路は、主流を流路断面の外側に向けて移行させる。これによって、外側により強いディーン流れが生じ、内側により弱いディーン流れが生じる（図２６）。長方形断面流路および台形断面流路の内側半分におけるディーン流れ場には、大きな違いが存在し、後者では、ディーン流れ速度がｙ軸に沿って大きい成分を有する（すなわち、長方形流路の場合のように、最小揚力平面およびディーン流れ場は、互いに平行でない）。このことは、台形断面流路において、対応する最小揚力平面に粒子が位置する場合、粒子が、ｙ軸方向に沿って流路の中央に向くＦＤＤの成分の影響を受けることを意味する。このように、粒子は、台形流路において、最小揚力平面からさらに離れて（中央に向かって）平衡となる。このことは、０．５〜３．０ｍＬ／ｍｉｎの範囲の流速で、長方形流路における「ゼロディーン流れ平面」に実に近い流路の２５．５〜２７．１％の局部的な深さに、粒子が集束することを示す実験データによって支持される。実際は、台形流路においては、流路の外側のディーン渦核以外に、真の「ゼロディーン流れ平面」はない。
【０１３６】
台形断面の内側半分において、ディーン流れの分布は、ディーン渦の中心が内壁から離れているため、大きさが小さいにもかかわらず、長方形断面流路におけるディーン流れの分布と同様である。粒子を押して内壁から離すには揚力が十分でない低流速では、長方形流路の場合と同様、大きい粒子は、内側流路壁付近に集束したままになる。流速が上がるにつれて、粒子は、ｚ軸に沿ったＦＬが大きくなるために、外壁に向かって動き始める。ここで、ＦＤＤは、ｙ軸に沿って「ゼロディーン流れ平面」付近の流路断面の中央に向かう、ＦＤｙと称する成分、およびＦＤｚと称するｚ軸に沿った対応する成分の２つの成分を有する。図２６から、「ゼロディーン流れ平面」でも、ＦＤｙはゼロではないままであり、その大きさは、内側から外側へ大きくなっていることがわかる。通常、これによって、ＦＤＤとＦＬとの平衡は、特に高流速において、より不安定になる。より具体的には、位置ａの粒子が示すように、より速い流速は、集束位置を流路の中央、ディーン流れがより強いところに向かって押す傾向があり、そのため、粒子を、揚力によって捕捉されることから引き離すことができた。
【０１３７】
粒子が、流路の外側半分、渦の中心の１つの近くにいったん移動すると、結果として生じる力ＦＤＤおよびＦＬは、渦の中心に近い平衡位置へ、粒子を押すことになる。渦の中心付近の粒子に作用する力を、図２６に示す。捕捉は、流路の傾き、流速、および粒径などの多くのパラメータに依存する、これら２つの力の動的平衡によって起こる。例えば、結果として生じる力ＦＤＤおよびＦＬを受けて、位置ｂの粒子は、最小揚力平面を横切って、位置ｃに向かって移動する傾向があり、そこで、強いＦＤＤは、粒子を位置ｄに向かって押し得る。質的には、ディーン核付近において、最小揚力平面上（位置ｂ、位置ｅ）の粒子は、粒子をディーン核に向かって押すＦＤＤを受け、一方、ディーン核（またはゼロＦＤｚ線、位置ｃ、位置ｄ）付近に捕捉された粒子は、粒子を最小揚力平面に戻すＦＤＤおよびＦＬの両方を受ける。
【０１３８】
外壁と比較して内壁が深くなっている台形断面では、内側に強い渦が形成され、その結果、粒子サイズおよび流速にかかわらず、粒子が捕捉される。このような形状はサイズ別の分離には適用されない。また、凹状、凸状または普通に傾斜した上壁を有するマイクロ流路も製造し、それらが粒子の集束および捕捉に与える影響を検討した。これら３つの様式の実験比較を、以下に論じる。
【０１３９】
台形断面渦巻き状マイクロ流路の場合、流路断面の内側深さおよび外側深さ、幅、渦巻きの曲率半径、ならびに傾斜角など、集束位置および分離効率に影響を与える因子がいくつかある。上記で解析したように、流路の傾斜は、（ｉ）ディーン渦に粒子を捕捉するのに必要な、粒子サイズの関数としての流速の閾値、および（ｉｉ）ディーン渦核の位置、の２つの点で集束の挙動に影響を与える。傾斜角が大きいと、外側のディーンが強くなり、粒子の捕捉能が増大することになる。また、傾斜角が大きいと、あるサイズの粒子をディーン渦内に捕捉するのに必要な流速の閾値が減少する。この理解は、異なる傾斜角および異なる３つの流路断面形状を有する流路内の粒子の帯を観察することによって、さらに実証された（データと考察は以下に含まれる）。
【０１４０】
渦巻き状マイクロ流路における立体的な粒子の集束を確認する実験結果が、本明細書で示される。この結果によって、渦巻き状流路においてゼロ揚力平面とディーン渦の中心との間に、深さに沿って、対称的に２つの帯を粒子が形成することが示される。ディーン流れの分布についての実験的証明および数値シミュレーションに基づいて、粒子に作用する様々な力を考慮して、集束機構についての詳細な説明を示す。粒子集束機構についてのこの理解により、粒子分離用の台形断面渦巻き状マイクロ流路を開発し、解析した。多重ループマイクロ流路を用いて、０．５〜７．５ｍＬ／ｍｉｎの流速範囲で、直径が５．７８μｍ、９．７７μｍ、１５．５μｍ、および２６．２５μｍの、サイズが異なる標準微粒子の集束を検量した。実験結果は、粒子が低流速下で投入されると、内側マイクロ流路壁付近の平衡位置を占めることを示している。しかしながら、流速の閾値（サイズ依存的である）を越えると、平衡位置は、外側マイクロ流路壁に向かって移動し、これがディーン渦への捕捉であることが示唆される。この急な移行を利用して、台形断面渦巻き状マイクロ流路は、従来の長方形断面渦巻きよりも分離能が高い分離を可能にする。約１．６１×１０７／ｍｉｎの超ハイスループットで、効率が９２％を越える１５．５μｍビーズおよび１８．６８μｍビーズの分離が、この装置を用いて実現された。
【０１４１】
方法
装置の設計および製造
圧力によって長方形流路を通る流れは、流路断面の重心において速度が最大で、壁表面において速度がゼロである双曲線状となる。このような不均一な流れ場に懸濁された粒子は、慣性揚力をかなり受けて、マイクロ流路断面内の特定の位置に集束する。湾曲流路において、流体は、半径方向外向きの遠心加速度をうけて、流路の上半分および下半分に、ディーン渦として知られる、反対方向に回転する２つの渦で特徴付けられる横断流れを生じる（図２７Ａを参照）。
【０１４２】
直線状流路内の慣性集束は、４ｃｍしか必要としないと報告されているが、曲線マイクロ流路に生じるディーン渦は、粒子に付加的な力を加えて、懸濁された粒子が平衡位置に移動するのには、より長い流路長さを必要とする。このことを考慮して、これらの実験に用いたマイクロ流体流路はすべて、半径が８ｍｍから２４ｍｍへと大きくなる、注入口が１つで排出口が２つの８ループ渦巻きとして設計され、粒子の移動に十分な長さとされた。流路の寸法は、ミリメーター以下の範囲であるので、続くポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）鋳造用の、特定の流路断面を有するマスター鋳型は、メタクリル酸ポリメチル（ＰＭＭＡ）で切削された。切削工具の制限のため、形状の公差は、表面粗さＲａが約０．８μｍで、ｘ−ｙ方向で１０μｍ以内、ｚ方向で２μｍ以内に制御される。鋳型は、慎重に点検され、使用前に、その寸法を正確に測定した。その後、硬化剤を１０：１の比で混合したシルガード（Sylgard）１８４シリコーンエラストマー（ＰＤＭＳ）プレポリマーを鋳造することによって、マイクロ流路を製造した。硬化後、ＰＤＭＳは、鋳型からはぎ取られ、３ｍｍ厚の平坦なＰＤＭＳ層にプラズマ接着された。注入用の穴および排出用の穴は、接着する前に開けておいた。
【０１４３】
縦方向の集束位置を測定するために、流路とＰＤＭＳ部の縁との間で約２ｍｍの間隔を空けて、渦巻き状流路の外周に沿って装置を切断した。マイクロ流路の形状を有するＰＤＭＳ鋳型は、その後、底が平坦なペトリディッシュに垂直に置かれ、ＰＤＭＳの第２の型を鋳込んで、チップを垂直に保持した（図２７Ｂ）。ＰＤＭＳが流路に流れ込むのを防ぐために、第２の鋳造前に、タイゴンチューブを穴に接続しておいた。実験の間、倒立顕微鏡下に装置を置き、蛍光粒子を用いて直線状部分の画像を記録した。ＰＤＭＳは、弾性材料であるので、流路の断面は、高い駆動圧のために、圧力によって変形する。流路の圧力が大気圧に近く、流路を膨張させる影響が最小となる外側貯留槽付近で、高速画像を撮影する。図２７Ｂに示す装置は、サイズ別の粒子分離にも用いられる。分離実験には、第２の鋳造は必要としなかった。
【０１４４】
流体の調製
側面視による粒子集束の観察のために、縦横比が低い長方形断面を有する渦巻き状流路を製造した。マイクロ流路は、幅が６００μｍで深さが８０μｍであり、縦横比は７．５（幅／深さ）であった。流体とＰＤＭＳ流路との間の屈折率の違いが大きい場合、界面における屈折が大きいために、ＰＤＭＳの厚い部分を通る流路内の蛍光粒子の撮像は困難である。これを克服するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１：１の体積比でエタノールと混合し、２９８．１５Ｋで屈折率が１．４２、密度が０．９８０５ｇ／ｍｌ、かつ粘度が０．９７８ｍＰａ・sである混合物を生成した。混合物の屈折率は、ＰＤＭＳの屈折率（１．４３）と同様であり、屈折に基づく散乱を除去することによって、撮像を向上させる。溶液は、１週間の長期の浸漬後、ポリスチレン（ＰＳ）粒子（バングス・ラボラトリー社（Bangs Laboratories, Inc.）、米国）およびタイゴンチューブを溶解することが示された。しかしながら、短期間の実験の場合、流体の混合物は、粒子およびチューブに何ら影響を与えず、実験における理想的な水の代替となる。
【０１４５】
数値シミュレーション
湾曲流路における流体のディーン流れ場を、市販の計算流体力学（ＣＦＤ）ソフトウェアであるコムソル（COMSOL）４．２ａ（バーリントン、マサチューセッツ州）を用いてシミュレートした。異なる断面形状を有する湾曲マイクロ流路部を、半径７．５ｍｍの１２０°の円弧としてモデル化した。流路部における流体の密度および動粘性係数のパラメータは、水と同様に設定した。このシミュレーションで用いた層流の式は、
【０１４６】
【数１３】
0006265508.tif 000014
【０１４７】
および
【０１４８】
【数１４】
0006265508.tif 000015
【０１４９】
で与えられ、式中、記号は、コムソルにおける規定の定義に従う。物理モデルは、非圧縮かつ非乱流となるように設定した。注入口の境界は、特定の流速となるように条件設定し、一方、排出口は、粘性応力のない条件で圧力がゼロとなるように設定した。流路壁においては、滑り境界のない条件を用いた。１．０〜８．０ｍＬ／ｍｉｎの典型的な流速をシミュレートして、定常状態の流体流れについて十分な解を得た。断面内の流速の成分、すなわち、二次ディーン流れを、円弧の中央で抽出した。
【０１５０】
考察
湾曲流路における粒子の力の平衡の解析
周囲の流体とともに流れる粒子は、以下の公知の力：抗力ＦＤ、遠心力ＦＣ、浮揚力すなわち圧力傾度力ＦＢ、相対速度の変化による２つの非定常力である付加的な質量力または仮想の質量力ＦＡおよびバセット履歴力ＦＨ、重力ＦＧ、ならびに慣性揚力ＦＬの影響を受ける。各力については、慣性流れの状況にある、懸濁された粒子にかかっているものとして論じる。
【０１５１】
（ｉ）抗力ＦＤ−粒子にかかる抗力は、粒子に対して、相対流速Ｕｒの方向である。ＦＤの大きさは
【０１５２】
【数１５】
0006265508.tif 000016
【０１５３】
で与えられ、ここでＣＤは抗力係数、ρｆは流体の密度、ｒは粒子の半径である。二次流れをともなう湾曲流路において、Ｕｒは、ｘ軸に沿った粒子と流体との間の速度の違いである、主流に沿った滑り速度Ｕｓ、および流路断面の平衡点に集束する粒子のディ−ン速度ＵＤという、２つの直角に交わる相対流速の組み合わせである。このように、図２８Ａに示すような
【０１５４】
【数１６】
0006265508.tif 000017
【０１５５】
を得る。
【０１５６】
ヤン（Yang）のシミュレーションによると、適度なレイノルズ数
【０１５７】
【数１７】
0006265508.tif 000018
【０１５８】
（ここでＵｍは流路内の主流の平均速度であり、Ｄはチューブの水力直径（ここでは流路の深さに等しい）であり、μは流体の動粘性係数である）のもとで、平衡位置にある半径ｒ＝０．０７５Ｄの自由回転粒子をともなうチューブのポワズイユの流れにおいて、粒子の流速Ｕｐは、周囲の流体の流速Ｕｆよりも小さい。滑り速度は、
【０１５９】
【数１８】
0006265508.tif 000019
【０１６０】
で与えられる。 
【０１６１】
所与の点において、ＵＤは、深さが８０μｍで幅が６００μｍの長方形断面流路におけるシミュレーション結果によると、通常、Ｒｅ２、すなわち
【０１６２】
【数１９】
0006265508.tif 000020
【０１６３】
の大きさに比例し、これはオオカワラ（Ookawara）の結果の
【０１６４】
【数２０】
0006265508.tif 000021
【０１６５】
と異なる。この不一致は、２つのモデル間の、構造パラメータの違いによるのかもしれない。図２８Ｂおよび図２８Ｃから、流速が３ｍＬ／ｍｉｎ未満のとき、流路の中央および２２％（粒子が集束する最小揚力平面付近（図２５を参照））において、ディーン流れ速度は、
【０１６６】
【数２１】
0006265508.tif 000022
【０１６７】
よりもわずかに速く大きくなることがわかる。一方、ＵＤは、流速が４．０ｍＬ／ｍｉｎより大きいとき
【０１６８】
【数２２】
0006265508.tif 000023
【０１６９】
（およそ
【０１７０】
【数２３】
0006265508.tif 000024
【０１７１】
）よりも遅れて大きくなる。このシステムで実現されるＵＤの最大の大きさは、０．０３７Ｕｍであり、これは流速が８．０ｍＬ／ｍｉｎ（Ｕｍ＝２．７７８ｍ／ｓ）のときである。
【０１７２】
このシステムにおいて、流速が１．０〜８．０ｍＬ／ｍｉｎの場合、上記Ｕｒの解析に基づいて計算された、粒子のレイノルズ数
【０１７３】
【数２４】
0006265508.tif 000025
【０１７４】
を得る。モルシ（Morsi）の解析／モデルに基づいて、０．１＜Ｒｅｐ＜１．０、および１．０＜Ｒｅｐ＜１０．０の場合のＣＤが、式
【０１７５】
【数２５】
0006265508.tif 000026
【０１７６】
および
【０１７７】
【数２６】
0006265508.tif 000027
【０１７８】
によって、それぞれ推定することができるであろう。ここで、解析を容易にするために、一次近似式
【０１７９】
【数２７】
0006265508.tif 000028
【０１８０】
をとり、これによって、算出したＦＤは、実際の値よりもわずかに小さくなる。抗力は、
【０１８１】
【数２８】
0006265508.tif 000029
【０１８２】
として、ストークスの法則に従う。これにより、流路断面におけるディーン流れによって誘発されるＦＤの成分は、
【０１８３】
【数２９】
0006265508.tif 000030
【０１８４】
で与えられる。
【０１８５】
ディーン流れには剪断が存在し、流路における主流の剪断およびディーン流れの剪断の両方によって、粒子は回転するが、クロセ（Kurose）は、ディーン流れによる剪断速度および回転速度は、上記範囲のＲｅｐでは、抗力の方向および大きさには大きく影響しないことを示した。このように、ディーン誘発性抗力ＦＤＤは、常にディーン方向に沿い、局所的なディーン速度ＵＤに比例する。
【０１８６】
（ｉｉ）揚力ＦＬ−湾曲流路において、ＵＤは、Ｕｍよりも大きさが２桁小さいので、ここでは、主流によって誘発される揚力のみを考慮する。揚力は、２つの別々の効果：サフマン（Saffman）によって初めて確認された、粒子の周囲の流体の滑り剪断、およびマグナス効果として知られる、流体中の粒子の滑り回転、によって生じる。正方形断面直線状流路におけるＦＬの分布は、他で研究されていたが、数学的計算は与えられていなかった。ここで、ＦＬと流速、および粒径との間の関係を示すために、ヤン（Yang）による、円筒状のチューブ内の定常流における、自由回転粒子の揚力の式を用いる。平衡位置付近の半径ｒ＝０．０７５Ｄの自由回転粒子をともなうチューブのポワズイユの流れにおいて、
【０１８７】
【数３０】
0006265508.tif 000031
【０１８８】
であり、ここで、Ｄはチューブの（水力）直径であり、ωｄおよびωｅは、それぞれチューブ断面の中央から相対距離ｄの位置にある粒子の滑り角速度、および平衡位置にある粒子の滑り角速度である。ωｄ／ωｅの項は、粒子の位置ｄおよびレイノルズ数Ｒｅの関数
【０１８９】
【数３１】
0006265508.tif 000032
【０１９０】
である。
【０１９１】
ＦＬは、壁からのＤが約２０％である平衡位置においてはゼロであり、粒子が平衡位置を横切って移動するときに、その方向を変化させる。平衡位置付近のＦＬの大きさは、上記式によると、
【０１９２】
【数３２】
0006265508.tif 000033
【０１９３】
にほぼ比例している。
【０１９４】
（ｉｉｉ）遠心力ＦＣ−曲率半径Ｒの湾曲流路を流れる粒子の場合、粒子にかかる遠心力は、ｚ軸に沿って流路の外側を向いており、
【０１９５】
【数３３】
0006265508.tif 000034
【０１９６】
に比例している：
【０１９７】
【数３４】
0006265508.tif 000035
【０１９８】
ここで、
【０１９９】
【数３５】
0006265508.tif 000036
【０２００】
は粒子の質量である。ρｐおよびＶｐは、それぞれ粒子の密度および体積を表す。
【０２０１】
（ｉｖ）浮揚力ＦＢ−圧力傾度が一定の流体において、粒子には、流路の曲率の中心に向いた、すなわちｚ軸に沿った浮揚力がかかり、
【０２０２】
【数３６】
0006265508.tif 000037
【０２０３】
であり、ここで
【０２０４】
【数３７】
0006265508.tif 000038
【０２０５】
は粒子の周囲の流体の向心加速度である。この力は、ＦＣに対向し、
【０２０６】
【数３８】
0006265508.tif 000039
【０２０７】
に比例する。
【０２０８】
（ｖ）付加的質量力ＦＡ− Ｕｆ≠Ｕｐの場合、物体と流体は同時に同じ物理的空間を占めることができないので、粒子の向心加速度または減速度は、粒子が流体中を移動するときは、周囲の流体をいくらか追い出さなくてはならない。このように、粒子は付加的な質量を有すると見なすことができる。粒子および周囲の流体は異なる遠心力下にあるので、この付加的な質量によって、粒子に付加的な力がかかる。この力は流路の外側を向いている、すなわちｚ軸に対向しており、
【０２０９】
【数３９】
0006265508.tif 000040
【０２１０】
で与えられる。
【０２１１】
（ｖｉ）バセット履歴力ＦＨ−バセット力は、流体中を移動する物体の相対速度（加速度）の変化をともなう、境界層発達の時間遅れに起因する力のことである。正確に計算することは難しく、通常、実用上の理由により無視される。
【０２１２】
（ｖｉｉ）重力ＦＧ−この場合、重力は、遠心力よりも少なくとも１桁小さい。ここでは、無視することができる。
【０２１３】
ｙｚ平面（流路の断面）にある粒子に作用する合力は、小さい項（ＦＧ、ＦＨ）を無視して、
【０２１４】
【数４０】
0006265508.tif 000041
【０２１５】
となる。
【０２１６】
ρｐ＝ρｆ＝ρを仮定すると、
【０２１７】
【数４１】
0006265508.tif 000042
【０２１８】
となる。
【０２１９】
合力ＦＡＢＣは、流路の曲率の中心を向いており、その大きさは、ＵｆＵｓに比例する、すなわち
【０２２０】
【数４２】
0006265508.tif 000043
【０２２１】
に比例する。図２９に示すように、ＦＡＢＣは、ＦＤＤよりも１桁または２桁小さい。このように、ＦＡＢＣの、集束位置に対する効果は、優勢ではない。
【０２２２】
流路断面形状の効果
外壁が高い台形流路の場合、流路断面の内側深さおよび外側深さ、幅、渦巻きの曲率半径、ならびに傾斜角など、集束位置および分離効率に影響を与える因子が多く存在する。上記で解析したように、流路の傾斜は、（ｉ）低い内側において、高流速のときは、流路深さの増大によって、揚力および抗力の平衡が崩れ、その結果粒子が外側に移動し渦核に捕捉される、すなわち流速の閾値を決定すること、および（ｉｉ）ディーン渦核の位置、の２つの点で集束の挙動に影響を与える。傾斜角が大きいと、外側のディーンが強くなり、粒子の捕捉能が増大することになる。また、傾斜角が大きいと、流速の閾値を減少させ、粒子を内側から引き出す。粒子は、傾斜角が大きい流路の場合、低流速で外側へと移行し、このことは、図３０に示す実験的観察や図２２に示す観察によって確認される。
【０２２３】
他にこの理解を確認するものとして、一定の傾斜角を有する直角台形断面、内側の傾斜角が大きく外側の傾斜角が小さくなっている上壁が凸状の断面、および外側半分のみ傾斜角が大きくなっている凹状断面の、異なる３つの流路断面形状を製造し、検討した（図３１Ａ〜図３１Ｃを参照）。
【０２２４】
凸状傾斜流路（図３１Ａに示す）の場合、深さの増大は、主に内側で起こっていた。集束した粒子の流れは、流速が上がるにつれて、徐々に外側へと移動した。２ｍＬ／ｍｉｎでは、小さな移行しか起こらず、傾斜角が減少する流路の中央で停止した。通常、凸状傾斜流路の性能は、長方形断面流路の性能に近く、分離に用いた場合、異なる粒子サイズの流れの間の離隔距離が物理的に狭いという同じ短所を共有している。
【０２２５】
凹状傾斜流路（図３１Ｃに示す）の場合、流路深さの増大は、主に外側で起こっていた。そのため、低流速であっても、強いディーン渦を生じた。これらの強いディーン渦は、通常の傾斜流路（図３１Ｂに示す）に比べて、より低流速でも粒子を捕捉することができた。一方、傾斜角が小さいので、粒子は内側に集束し続けたままとなり、１ｍＬ／ｍｉｎ付近の流速では、２つの半安定な集束位置を生じる。この場合、粒子は、流路の両側で２つの帯に分かれ、これも粒子の分離にとって望ましくない。凸状台形流路および凹状台形流路に加えて、図２Ｃに示すような段状断面、図２Ｄに示すような矩形波断面など、様々な上壁形状を有する渦巻き状流路についても検討した。
【０２２６】
（実施例４）
循環性腫瘍細胞を超高速に、かつ標識を用いずに分離する傾斜渦巻き状マイクロ流体技術
癌患者の末梢血中に見出される循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を計数し、特徴付けることによって、癌の診断および予後に利用可能な、潜在的情報源が提供される。本明細書では、臨床に関連する血液量から、ＣＴＣを、超高速に、かつ標識を用いずに濃縮する、台形断面を有する渦巻き状マイクロ流体装置について説明する。上記技術は、大きいＣＴＣを内壁に対して集束させる慣性揚力とともに、曲線マイクロ流路に定常流下で存在する、固有のディーン渦流れを利用する。従来の長方形断面に対して台形断面を用いると、ディーン渦核の位置が変化して、分離を実現することができる。小さい血液成分は、外側流路壁の方に偏ったディーン渦によって捕捉されて、最終的に外側排出口で除去され、一方、大きいＣＴＣは、内側流路壁付近で平衡となって、内側排出口から回収される。注入口を１つと排出口を２つ有する渦巻き状マイクロ流路を単独で用いると、７．５ｍＬの血液に加えた癌細胞株の細胞（ＭＣＦ−７、Ｔ２４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、８分以内で、８０％より多く、極めて高い純度で（ＷＢＣは４００〜６８０個／ｍＬ；ＷＢＣは対数減少値で約４ｌｏｇ減少した）単離、回収することができた。推定上のＣＴＣは、標準的なバイオマーカー（ＣＫ、ＣＤ４５およびＤＡＰＩ）を用いて、進行期の転移性乳癌および肺癌患者の試料（ｎ＝１０）の１００％から、ＣＴＣが３〜１２５個／ｍＬの範囲の頻度で、検出かつ単離された。この手法によって、親和性に基づく従来のＣＴＣ単離技術の欠点を克服することができ、また、ＣＴＣについての基礎研究によって、治療を進め、患者の看護を向上することが可能になる。
【０２２７】
別の注入口から始まるシースフローを用い、試料を流路幅の狭い領域に限定するために試料を注入口に閉じ込め、すべての細胞がほぼ同じ場所から移動を開始するようにし、それによって、粒子濃度が高いときに、流路内での粒子の分散を改善する。典型的な長方形断面流路とは対照的に、台形流路は、例えばシリンジポンプを１つ用いて試料を導入する試料用の注入口を１つ、ならびに、動作中に、廃棄および濃縮された細胞の回収にそれぞれ用いる排出口を２つ必要とするだけである。ある態様において、ピストンポンプ、ギアポンプ、蠕動ポンプ、圧電性マイクロポンプ、または可変式の圧力調節器を用いて、試料を導入することができる。このような新しく設計されたマイクロ流路を有するマイクロ流体装置を用いて、転移性乳癌および肺癌患者の末梢血から、多数のＣＴＣ（ＣＴＣを３〜１２５個／ｍＬ）を濃縮することが実証されている。この装置は、赤血球を溶血させた７．５ｍＬの血液を約８分で処理することができ、これによって、比較的高い純度および収率で、生存ＣＴＣを濃縮することができる。従来のマイクロ切削およびＰＤＭＳ鋳造を用いて、極めて低コストで高い分離能の台形渦巻き状流路を製造することができ、またシリンジポンプ１つを用いて台形渦巻き状流路を動作させることができ、これによって、自動化が容易となる。様々な詳細な分子解析を行い、かつ治療を受けている個々の患者の臨床モニタリングを行うのに十分な量までＣＴＣを濃縮するために、臨床試料の大規模な処理にこの方策を利用することができる。上記装置は、必要であれば、さらに大量の血液を処理するのによく適しており（約１５分で２０ｍＬ）、複数の後段の試験のために、大量のＣＴＣを得る必要性の増加にこたえる。
【０２２８】
材料および方法
装置の設計および製造
装置のデザインは、効率的な細胞の移動と集束のために、半径が８ｍｍから２４ｍｍへと大きくなる、注入口が１つで排出口が２つの８ループ渦巻き状マイクロ流路からなる。台形断面において、流路断面の幅は６００μｍであり、内側の高さおよび外側の高さは、それぞれ８０μｍおよび１３０μｍで最適化された。特定の流路寸法を有する鋳型は、ソリッドワークス（SolidWorks）ソフトウェアを用いて設計され、続くＰＤＭＳ鋳造のために、メタクリル酸ポリメチル（ＰＭＭＡ）シートで、従来のマイクロ切削技術（ホィッツ・テクノロジー社（Whits Technologies）、シンガポール）によって製造された。脱泡ＰＤＭＳ（基剤および硬化剤であるダウ・コーニング社（Dow Corning Inc.）のシルガード（Sylgard）１８４を、１０：１の比で混合）を鋳型で鋳造し、続いてオーブン内で、７０℃で２時間焼成することによって、マイクロ流体装置を製造した。硬化後、ＰＤＭＳを鋳型からはぎ取り、流体注入口および排出口用のアクセス孔（１．５ｍｍ）を、ユニ−コア（商標）パンチャー（Uni-CoreTM Puncher）（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Co. LLC.）、シンガポール）を用いて開け、酸素プラズマ装置（ハリック・プラズマ社（Harrick Plasma）、米国）を用いて、ＰＤＭＳ装置を硬化ＰＤＭＳの他の層に不可逆的に接着し、流路を完成させた。組み立てられた装置は、最終的に、７０℃のオーブン内に３０分間置かれ、さらに接着を強めた。
【０２２９】
細胞培養および試料調製
市販の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識された２つのヒト癌細胞株、すなわち乳腺癌（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、１つの膀胱癌細胞株（Ｔ２４；ＨＴＢ−４ ＡＴＣＣ、米国）および１つの肺癌細胞株（Ｈ１５９；ＨＴＢ−４ ＡＴＣＣ、米国）を用いて、ＣＴＣ分離を模した。濃縮されたＣＴＣにおけるＨＥＲ２のＤＮＡ ＦＩＳＨ解析のコントロールとして、ＳＫＢＲ３細胞株も用いた。上記の細胞の平均細胞径は、約１０〜約５０μｍの範囲である。細胞を、コーティングされたＴ２５フラスコ（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー社（Becton, Dickinson and Company）、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）を追加した高グルコースダルベッコ変形イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インビトロジェン社（Invitrogen）、米国）を用いて培養した。５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２を含む３７℃加湿雰囲気下で培養を続け、添加のために８０％コンフルエントの時点で採取した。コンフルエントでない単層を、０．０１％トリプシンおよび５．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ロンザ社（Lonza）、スイス）を用いて解離させた。他に言及しない限り、すべての実験において、健康な提供者から得た全血および患者の試料は、ＲＢＣ溶血バッファー（Ｇ−バイオサイエンス社（G-Bioscience）、米国）を用いて、室温で５分間、連続的に混合しながら溶血させた。ＰＢＳバッファーを用いて希釈することによって、溶解を停止させ、１０００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを、所望の濃度までＰＢＳを用いて再懸濁した。
【０２３０】
装置の特徴付け
すべての実験において、渦巻き状バイオチップを、最初に、高速ＣＣＤカメラ（ファントムｖ９（Phantom v9）、ヴィジョンリサーチ社（Vision Research Inc.）、米国）を備えた倒立位相差顕微鏡（オリンパスＩＸ７１（Olympus IX71）に載置した。シリンジポンプ（ＰＨＤ２０００、ハーバード・アパラタス社（Harvard Apparatus）、米国）を用い、流速２ｍＬ／ｍｉｎで約２分間、開始バッファー（０．５％ＢＳＡを追加した１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で、バイオチップを準備した。試験の間、癌細胞および血液試料を１０ｍＬシリンジに満たし、可撓性のあるタイゴン（登録商標）チューブを通してマイクロ流路と接続されたシリンジポンプを用いて、装置に送り込んだ。すべての実験において、流速を１７００μＬ／ｍｉｎに設定した。ファントム・カメラ・コントロール・ソフトウェアを用いて、流路の排出口で高速ビデオを撮影し、イメージＪ（登録商標）（ImageJ）ソフトウェアを用いて解析した。
【０２３１】
免疫蛍光染色
試料と選別されたＣＴＣとの分離効率および濃縮比を計算するために、ＢＤアキュリ（商標）（AccuriTM）Ｃ６フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーを、注入口およびＣＴＣ排出口の両方に用いた。癌細胞および白血球（ＷＢＣ）に一般的なマーカーに基づいた免疫蛍光染色を、区分および定量化に用いた。ＣＴＣ排出口からの濃縮された細胞を、フロオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合パン−サイトケラチン（ＣＫ）（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（MiltenyiBiotec Asia Pacific）、シンガポール）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＣＤ４５マーカー（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（MiltenyiBiotec Asia Pacific）、シンガポール）で３０分間染色し、癌細胞およびＷＢＣをそれぞれ識別した。臨床試料の場合は、ＦＩＴＣ結合パン−サイトケラチン（ＣＫ）（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（MiltenyiBiotec Asia Pacific）、シンガポール）で染色することによって、ＣＴＣを識別した。パン−ＣＫおよびヘキスト（核染色）陽性かつＣＤ４５陰性に染色され、癌細胞特有の形態を有する（すなわち、細胞質に対する核の比が高い）細胞は、ＣＴＣと識別される。ＣＤ４５およびヘキスト陽性かつパン−サイトケラチン陰性に染色される細胞は、白血球と識別される。
【０２３２】
細胞生存アッセイ（ＰＩ染色および培養を用いる）
健康な提供者からの血液と混合されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７のＧＦＰ標識細胞を、渦巻き状マイクロ流体技術で処理し、トリパンブルー（またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ））排除アッセイにより、長期間の再培養を通して評価した。単離されたＣＴＣは、ポリリジンコートされた２Ｄ細胞培養基板上に播種し、記載の通りに一晩培養した。その後、インサイチュで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって、細胞を染色した。細胞を撮像し、ＰＩ陽性に染色されたものを計数して、溶血および処理後の細胞の生存率を求めた。生存細胞数を、渦巻き状バイオチップ処理をしない、溶血後の細胞と比較した。
【０２３３】
臨床試料
ヒト全血試料を、健康な提供者および転移性肺癌および乳癌患者から得た。この試験は、施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって許可されたプロトコールに従い、施設内倫理委員会および地元の倫理委員会に承認された。健康な提供者からの合計１０血液試料をコントロールとして用い、肺癌および乳癌患者からの１０試料をＣＴＣの計数のために処理した。ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むヴァキュテーナーチューブ（ベクトン・ディッキンソン社（Becton−Dickinson）、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）に、血液試料を採取し、血液の凝固を防ぐために２〜４時間以内に処理した。すべての試料について、最初に、７．５ｍＬの全血を、ＲＢＣ溶血バッファーを用いて溶血し、チップで処理するのに先立ち、ＰＢＳに再懸濁した。チップで処理するのに先立ち、溶血させる代わりに、５〜１０倍の範囲で全血を因子によって希釈することもできる。
【０２３４】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
ＳＫＢＲ３細胞株（ＨＥＲ２シグナルが増幅されている）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ＨＥＲ２シグナルは増幅されていない）、ならびに単離されたＣＴＣについて、製造者のプロトコールにしたがって、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。サイトスピン（Cytospin）遠心分離機（サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）、米国）を用いて、６００ｒｐｍで６分間、細胞を遠心してスライド上に載せた。４％ＰＦＡ中、室温で１０分間スライドを固定し、エタノール系列（８０％、９０％、および１００％）で脱水した。ＦＩＳＨ解析のために、スライドを、３７℃で４０分間、ＲＮａｓｅ（４ｍｇ／ｍＬ）（シグマ社（Sigma）、米国）で処理し、１×ＰＢＳ／０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社（Sigma）、米国）で３回洗浄し、８０℃で１０分間、７０％ホルムアミド／２×ＳＣＣ（クエン酸緩衝液（saline sodium citrate）、パス・ヴィジョン（Path Vysion）、アボット社（Abbott）、米国）で変性させた。その後、氷冷エタノール系列で再び急冷脱水した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ（アボット・ラボラトリー社（Abbott Laboratories）、イリノイ州、米国）プローブを、４２℃に維持されたスライドに直接用いた。暗所、湿潤条件下、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを続けた。振盪させながら、４５℃で、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ、および２×ＳＳＣでスライドを洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）抗体で対比染色し、５０×５０ｍｍ２のカバーグラス（フィッシャー・サイエンティフィック社（Fisher Scientific）、米国）で封入した。
【０２３５】
アッセイを特徴付ける免疫蛍光
ＣＴＣ培養の表現型の比を特徴付けるため、細胞を、フロオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合パン−サイトケラチン（ＣＫ）（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（Miltenyi Biotec Asia Pacific）、シンガポール）、フロオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＣＤ４４（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（Miltenyi Biotec Asia Pacific）、シンガポール）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＣＤ２４（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（Miltenyi Biotec Asia Pacific）、シンガポール）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＣＤ４５マーカー（１：１００、ミルテニーバイオテク・アジア・パシフィック社（Miltenyi Biotec Asia Pacific）、シンガポール）、およびヘキスト（インビトロジェン（Invitrogen）社、米国）などの、様々な抗体とともにインキュベートした。染色試薬を、アッセイに直接加えること、またはトリプシン処理後の細胞懸濁液に加えることのどちらかによって、染色を行うことができた。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（シグマ・アルドリッチ社（Sigma Aldrich）、米国）で固定した後、透過化処理（０．１％トリトン１００ｘ、サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）、米国）しながら、氷上で30分間、細胞をインキュベートした。
【０２３６】
結果および考察
設計原理
粒子が、渦巻き状マイクロ流路を流れるとき、層流速度分布が放物線状となる性質によって生じる、慣性揚力の影響下にある中立的浮揚粒子は、流れを横切って、流路の中央から流路壁の方に離れた平衡位置へと移動する。同時に、粒子は、曲線形状によって生じるディーン流れに沿ったディーン渦によって引き起こされる抗力も受ける。慣性力およびディーン力の組み合わせによって、流路幅内で、平衡位置が、内側マイクロ流路壁の一箇所に減少し、これによって、連続的な慣性集束を誘発する。どちらの力も粒子サイズの関数であるので、異なるサイズの粒子が、流路壁付近で、異なる横方向の位置を占め、また異なる集束程度を示し、これによって、サイズ別の分離が可能となる。長方形断面を有する渦巻き状マイクロ流路を利用することの主な課題の１つは、様々な粒径を有する粒子の平衡位置の間の空間が狭いということである。これは分離分解能に影響を与える。上記で論じたように、流路断面を台形形状に変更することで、分離分解能が大きく向上する。これは、主に、台形断面の非対称性が速度分布に影響を与え、図３２Ａに示すように、流路深さが深い外壁付近に、強いディーン渦が形成されることによる。そのため、慣性力と抗力が平衡を保つ状態で、流路幅の中央付近に小さい粒子が集束する長方形断面流路とは対照的に、変更された台形渦巻きの速度場によって、小さい粒子は、外壁付近の強いディーン渦核に捕捉される。内壁に大型の細胞が集束することによって、２つの細胞流れの間の空間が最大化され、ハイスループットかつ高分離能な選別を実現することができる。この独特な設計は、例えば、未処理の血液からの白血球の単離、または本明細書に示すような、血液からの超少量のＣＴＣの濃縮など、小さいが大量に存在するバックグラウンドの細胞混合物から、直径は大きいが少量しか存在しない対象細胞を濃縮するのに、理想的に適している。図３２Ｂは、試料を処理中の実験装置の写真を示す。ＣＴＣを連続的に回収することによって、免疫染色、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨおよびシークエンシングなどの、続く後段の解析に用いる、従来の９６穴プレートまたはメンブレンフィルターに、装置を連結することが容易になる。
【０２３７】
渦巻きの性能の特徴付け
ＣＴＣの単離に最適な技術は、最小の試料処理工程で、特定のマーカー（例えば、ＥｐＣＡＭ）に頼ることなく、許容できる程度の純度で（すなわち、後段の分子アッセイの汚染耐性に応じて）最大数の生細胞を単離することを目指さなければいけない。純度を上げ、かつ渦巻き状チップを通過する細胞成分を最小化するために、従来の化学的なＲＢＣ溶血手法を用いて、濃縮されたＣＴＣの数を最大化しつつ、システムのスループットを増大させた。ＲＢＣの溶血工程および密度勾配遠心工程によって、細胞の損失（１０〜３０％）を招き得ることが報告されているが、実験結果によって、工程全体において、細胞の損失は８％未満であることが示された。さらに、図３３に示すように、溶血バッファーにさらすことによっても、細胞の形態およびサイズは変化しなかった。広範囲な特徴付けを行い、ラテックス粒子および癌細胞株を加えた健康な血液試料の両方を用いて、流路の縦横比、流速、および試料濃度などの様々なパラメータの影響を検討することによって、最適な装置設計を見出した。溶血血液中のＷＢＣおよび血小板の濃度が比較的高いとき（＞３％）、これらを完全に除去することが、有効な濃縮を実現するのに重要である。注入試料の細胞濃度が排出純度に与える影響を調べるために、異なる有核細胞濃度で血液を処理した。健康な提供者から採取された最初７．５ｍＬの全血を、塩化アンモニウムを用いて化学的に溶血し、有核細胞画分を、処理用のＰＢＳバッファーを用いて１５ｍＬ（０．５倍濃度）、７．５ｍＬ（１倍濃度）および５ｍＬ（１．５倍濃度）となるように再懸濁した。回収した細胞をＤＡＰＩおよびＣＤ４５抗体を用いて染色して、混入したＷＢＣの数を定量化した。図３４Ａは、異なる試料濃度において、ＣＴＣ排出口から回収した細胞の合計数（ＤＡＰＩ＋／ＣＤ４５＋）を示す。このグラフは、最少のＷＢＣの混入を観察した（平均は、白血球が５００個／ｍＬ；範囲は、白血球が４００〜６８０個／ｍＬ）、細胞濃度が１倍以下（白血球が約３．５〜４×１０６／ｍＬ）のときに、この装置が最適に動作することを示す。したがって、臨床試料を処理するのに最適なものとして、７．５ｍＬの血液試料の合計処理時間が約８分となる、０．５倍濃度を選択した。現在のところ、これは、ＣＴＣ単離に用いるマイクロ流体プラットフォームによって実現された最も高いスループットであると考えられる。その上、バイオチップを多重化することによって、処理時間をさらに短くすることができる。
【０２３８】
癌細胞株を用いた単離効率および細胞生存率
ＣＴＣは、血流中に極めて少ないので、様々な後段のアッセイのために、血液試料中の標的細胞を最大数単離することが重要である。この目的のために、異なる３つの細胞株（すなわち、ＭＣＦ−７、Ｔ２４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をこの研究に用い、ＣＴＣの単離および回収における台形渦巻き状バイオチップの性能を定量化した。ＣＴＣ検出における本技術の汎用性を確認するために、これらの細胞株を選択した。上記の細胞の平均粒径は、約１０〜約５０μｍの範囲である。モデルシステムは、健康な提供者から得た７．５ｍＬの血液に、既知の数の細胞（約５００細胞）を加えることによって構築された。ＲＢＣを溶血し、最適化された濃度（約０．５倍）に再懸濁した後、加えた細胞の超高速濃縮のために、試料を渦巻き状チップに通した。濃縮後、免疫蛍光染色による、落射蛍光顕微鏡下での計数、または一般的な表面マーカー（ＣＫ＋／ＣＤ４５−）を用いたフローサイトメトリー解析のいずれかによって、癌細胞を識別した。図３４Ｂは、全血に加えた腫瘍細胞の捕捉効率の概要を示し、その平均回収率は、Ｔ２４細胞株で８０％、ＭＣＦ−７細胞株で８５％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株で８７％であった（ｎ＝３）。この装置を用いて捕捉された腫瘍細胞の生存率を確認するために、単離された細胞を、標準的な培養条件下で付着、増殖する２−Ｄ培養基で再培養した（図３５を参照）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／またはトリパンブルーによる染色などの機能アッセイを用いて、処理前後の細胞の生存率も確認した。この結果から、トリパンブルーによる染色が最低限であること（＜１０％）より、捕捉された細胞の生存率が高いことが示される（図３４Ｃを参照）。さらに癌細胞の形態を解析することによって、複数の処理工程中において、細胞は、比較的変化しないことも確認された（データは示していない）。
【０２３９】
臨床試料
台形渦巻き状バイオチップの臨床的有用性を確認するために、（ｉ）健常者５人（コントロール）、（ｉｉ）転移性乳癌（ＭＢＣ）患者５人、および（ｉｉｉ）非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者５人から、７．５ｍＬの血液試料を採取した（表１）。
【０２４０】
【表１】
0006265508.tif 000044
【０２４１】
ヘキスト（ＤＮＡ）、ＦＩＴＣ−パン−サイトケラチン（ＣＫ）抗体（癌／上皮のバイオマーカー）、およびＡＰＣ−抗ＣＤ４５抗体（血液バイオマーカー）を用いた免疫染色によって、単離されたＣＴＣの存在を確認した（図３６Ａ参照）。ヘキスト＋／パン−ＣＫ＋／ＣＤ４５−の細胞をＣＴＣとして記録した。表１に示すデータは、乳癌患者および肺癌患者の臨床病理的特徴、および渦巻き状バイオチップから得られたＣＴＣ数を示す。ＣＴＣは、１０個の患者試料のうち１０個から検出され（１００％検出）、その数はＭＢＣ患者の試料ではＣＴＣが６〜５７個／ｍＬの範囲、ＮＳＣＬＣ患者の試料ではＣＴＣが３〜１２５個／ｍＬの範囲であった（図３６Ｂ）。サイトケラチン陽性の上皮細胞は、健常被験者においても検出された（１ｍＬあたり１〜４個）が、患者試料の場合と比較して、明確な検出閾値を設定することができる。閾値解析によって、転移性疾患が予想される場合に、７．５ｍＬの血液試料あたり３〜４個のＣＴＣが、最適なカットオフ値として示された。
【０２４２】
濃縮されたＣＴＣは、様々な研究で以前から報告されているように、高度に不均一である（図３７を参照）。癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４およびＣＤ２４を染色することによって、大部分がＣＤ４４＋／ＣＤ２４−またはＣＤ４４−／ＣＤ２４＋のいずれかである異なるＣＴＣの集団が明らかになる（図３６Ｃ）。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞は、ＣＤ４４−／ＣＤ２４＋細胞よりも、明らかにサイズが大きい。なお、ＣＴＣの一部分は、おそらくアポトーシス性でもある。このことは、哺乳類細胞のアポトーシスプロセスにおいて不可欠な役割をはたす切断型カスパーゼ−３マーカーの染色によって実証される。解析結果によって、単離されたＣＴＣの１〜２％のみが切断型カスパーゼ−３陽性であることが示され、このことは、渦巻き状バイオチップで濃縮されたＣＴＣの大部分は、アポトーシスプロセスを反映する特徴を示さないことを示している。フローサイトメトリー解析によって、単離された細胞全体の９．９％のみが切断型カスパーゼ−３陽性であり、これらはＷＢＣである可能性が高いことも明らかになった（図３８）。これらの発見は、図３６Ｄに示すように、細胞を免疫蛍光染色することで確認され、以前の発見ともほぼ一致した。Ｔ．Ｊ．メツナー（T. J. Metzner）、Ｋ．ベセル（K. Bethel）、Ｅ．Ｈ．チョ（E. H. Cho）、Ｍ．Ｓ．ルトゲン（M. S. Luttgen）、Ｄ．Ｃ．レイザー（D. C. Lazar）、Ｍ．Ｌ．ユーソン（M. L. Uson）、Ｊ．Ｊ．ニーバ（J. J. Nieva）、Ｌ．バツェノバ（L. Bazhenova）、Ａ．コラトカー（A. Kolatkar）、およびＰ．クーン（P. Kuhn）『キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）』２０１２年；７２巻；補遺１を参照のこと。その上、単離されたＣＴＣにおいて、ＥｐＣＡＭ−／パン−ＣＫ＋細胞およびＥｐＣＡＭ＋／パン−ＣＫ＋細胞が検出された。ＥｐＣＡＭ−／パン−ＣＫ＋細胞の集団は、乳癌患者の試料と比べて、肺癌患者の試料ではかなり少なく、このことは、推定上のＣＴＣの正確な検出および濃縮には、ＥｐＣＡＭに基づいた手法はかなりの限界があることを示している。生存ＣＴＣの捕捉能は、単離細胞を一晩培養することによって実証される。この研究において、図３５に示す単離された細胞は、ポリリジンコートされたウェル培養プレートに、上記のような培養条件で一晩播種された。生細胞は、培養基上で広がることができ、染色した際に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に対して陰性であった。
【０２４３】
ＦＩＳＨ解析
多くの異なる点において、腫瘍細胞の不均一性は明らかであって、以前から数多く報告されている。Ａ．Ａ．パウエル（A. A. Powell）、Ａ．Ｈ．タラサズ（A. H. Talasaz）、Ｈ．ザング（H. Zhang）、Ｍ．Ａ．コラム（M. A. Coram）、Ａ．レディ（A. Reddy）、Ｇ．デング（G. Deng）、Ｍ．Ｌ．テリー（M. L. Telli）、Ｒ．Ｈ．アドバーニ（R. H. Advani）、Ｒ．Ｗ．カールソン（R. W. Carlson）、およびＪ．Ａ．モリック（J. A. Mollick）『 ＰＬｏＳ・ワン（PLoS One）』２０１２年；７巻；ｅ３３７８８頁を参照のこと。本明細書において、台形チップで単離されたＣＴＣで発現されるＨＥＲ２の変異が、ＨＥＲ２−腫瘍の患者の試料を用いて示された。パンテル（Pantel）らは、ＣＴＣにおけるＨＥＲ２の状態は、原発腫瘍と比較して変化していることを示した。Ｂ．Ｒ．ＢＡＳ ジェイガー（B. R. BAS Jaeger）、Ｕ アンデルガッセン（U Andergassen）、ＪＫ ノイゲバウアー（JK Neugebauer）、ＣＡ メルヒャー（CA Melcher）、Ｃ ショルツ（C Scholz）、Ｃ ハーゲンベック（C Hagenbeck）、Ｋ シュエラー（K Schueller）、Ｒ ローレンツ（R Lorenz）、Ｔ デッカー（T Decker）、Ｇ ハインリッヒ（G Heinrich）、Ｔ フェーム（T Fehm）、Ａ シュネーバイス（A Schneeweiss）、Ｗ リヒテネッガー（W Lichtenegger）、ＭＷ ベックマン（MW Beckmann）、Ｋ パンテル（K Pantel）、ＨＬ ソマー（HL Sommer）、Ｋフリーゼ（K Friese）、およびＷ ヤンニ（W Janni）、第３５回ＣＴＲＣ−ＡＡＣＲサンアントニオ乳癌シンポジウム年次大会にて一部発表；サンアントニオ、テキサス州、２０１２年を参照のこと。具体的には、ＨＥＲ２由来から得た試料の約３０％で、ＨＥＲ２＋ＣＴＣが観察される場合がある。ＤＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行って、単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ２の状態を評価した。単離されたＣＴＣにおけるＨＥＲ２シグナルを、図３９に示すように、コントロール乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＥＲ２シグナルは増幅されていない）およびＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２シグナルが増幅されている）と比較した。１つの核において、ＨＥＲ２／１７番染色体（Ｃｅｎ１７）セントロメアシグナルの比が２より大きいときに、増幅されたＨＥＲ２の発現を求めた。ＨＥＲ２／Ｃｅｎ−１７シグナルの範囲を観察した。ＨＥＲ２／Ｃｅｎ−１７比が１を示す細胞は、ＷＢＣまたはＨＥＲ２非増幅ＣＴＣであると思われ、さらなる免疫染色によって識別することができる。しかしながら、ＨＥＲ２シグナルが増幅された細胞も検出され、このことは、ＣＴＣが明確に存在することを示している。これは、原発腫瘍と比べて、ＣＴＣにおいてＨＥＲ２の状態が不均一であるという以前の発見と一致している。
【０２４４】
結論
癌医学の「理想」は、個別化治療の確立であり、個別化治療においては、治療は、固定化された状況から、患者個人個人の腫瘍の状態に合わせた治療へと移行する。循環性腫瘍細胞は、原発腫瘍の生検に代わる良い代替法であることが示されており、同等の遺伝子情報を伝達する。疾患ステージが異なる癌患者の末梢血においてＣＴＣを検出することは、治療の有効性および患者の生存における予後マーカーとしての将来性を示し、強い臨床的関連性を示している。しかしながら、後段のアッセイによる、インビトロのＣＴＣの系統立った特徴付けは、これらの細胞を検出しかつ濃縮する、信頼性が高く高感度な方法がないことによって遅れている。マイクロ流体技術の急速な発達にもかかわらず、ハイスループット、高純度、かつ高細胞生存性のＣＴＣ単離は、いまだ達成困難である。台形断面を有する渦巻き状マイクロ流路に慣性マイクロ流体技術を用いて、推定上のＣＴＣの超高速な濃縮に、新規のマイクロ流体技術プラットフォームを応用することが、本明細書に示されている。この改善された装置は、より大きい（血液）体積の処理を実現し、ＣＴＣの捕捉効率および収率を向上させた。１．７ｍＬ／ｍｉｎという速い血液処理スピードに加えて、簡易ながら効率的な台形渦巻き状流路は、スケールアップした装置の生産を非常に容易にし、これによって、より大きいスケールの臨床研究を可能にする。上記のように、台形渦巻き状バイオチップは、ステージが進んだ転移性乳癌および肺癌患者１０人のうち１０人から（１００％）ＣＴＣを単離することができ（ＣＴＣが３〜１２５個／ｍＬ）、免疫染色およびＤＮＡ ＦＩＳＨ解析によって、広範囲な不均一性の研究が可能となった。単離されたＣＴＣの生存率は、処理後も維持されており、これによって、培養が可能となり、かつ研究が広範囲となる。乳癌患者の末梢血から単離されたＣＴＣの大部分は生きているが、培養開始数日後に増殖しなくなり、このことは、不活動状態にある細胞を標的とする新しい治療手法が必要であることを示唆している。その上、ＣＴＣを連続的に回収することによって、免疫染色、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨおよびシークエンシングなどの、続く後段の解析に用いる、従来の９６穴プレートまたはメンブレンフィルターに、装置を連結することが容易になる。
【０２４５】
慣性マイクロ流体システムの、細胞添加レベルが低いときの精度および回収率は高かった。この手法は、最初に細胞表面バイオマーカーを選択する必要がないので、上皮由来および非上皮由来の異なる癌の両方に用いるのに適している。ＣＴＣは、多くのマイクロ流体装置において、ＣＴＣ濃縮に用いられるバイオマーカーである、ＥｐＣＡＭおよびサイトケラチンの発現において、高度に不均一かつ変異性であることが報告されている。細胞サイズの選択基準によって、この制限を克服し、より広い割合のＣＴＣを捕捉する。特定のサイトケラチンの発現が低い細胞は、パン−サイトケラチン抗体を用いた免疫染色によって、さらに識別される。上記システムの感度は、健常被験者から採取した血液に、血液７．５ｍＬあたり５００個の細胞濃度で加えられた、ＧＦＰ結合乳癌細胞株（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および膀胱癌細胞株（Ｔ２４）の回収率を求めることによって解析された。様々なモデルシステムの一般的な限界は、リン（Ring）らが述べるとおりである。Ａ．リン（A. Ring）、Ｉ．Ｅ．スミス（I. E. Smith）およびＭ．ドウセット（M. Dowsett）『ランセット・オンコロジー（Lancet Oncol）』２００４年；５巻：７９〜８８頁を参照のこと。癌細胞の捕捉効率は高く、８０〜９０％の範囲であった。この可変性は、癌の種類による細胞サイズの違いに部分的に起因し得る。それにもかかわらず、システムの柔軟性および簡易さによって、流路設計を適度に変化させて、異なる癌の種類で細胞の単離を最大限にすることができる。この結果によって、異なる癌の種類のＣＴＣを濃縮するシステムの汎用性が実証され、従って、ＣＴＣの連続的な評価、および患者のＣＴＣ数の信頼性の高い検出のための潜在的なツールとして働く。上記システムは、さらに、ステージが進行した転移性乳癌および肺癌の血液試料１０個に対する臨床試験によっても実証される。１０個の試料のうち１０個でＣＴＣが検出され、これによって、上記システムの感度が明確に示された。しかしながら、患者間で多様性が観察され、これは以前に報告されている傾向である。Ｍ．クリストファニリ（M. Cristofanilli）、Ｔ．バッド（T. Budd）、Ｍ．Ｊ．エリス（M. J. Ellis）、Ａ．ストペック（A. Stopeck）、Ｊ．マテラ（J. Matera）、Ｍ．Ｃ．ミラー（M. C. Miller）、Ｊ．Ｍ．ルーベン（J. M. Reuben）、Ｇ．Ｖ．ドイル（G. V. Doyle）、Ｊ．アラード（J. Allard）、Ｌ．Ｗ．Ｍ．Ｍ．タースタッペン（L. W. M. M. Terstappen）およびＤ．Ｆ．ヘイズ（D. F. Hayes）『ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N. Engl. J. Med.）』２００４年；３５１巻；７８１〜７９１頁、ならびにＷ．Ｊ．アラード（W. J. Allard）、Ｊ．マテラ（J. Matera）、Ｍ．Ｃ．ミラー（M. C. Miller）、Ｍ．レポレット（M. Repollet）、Ｍ．Ｃ．コネリー（M. C. Connelly,）、Ｃ．ラオ（C. Rao）、Ａ．Ｇ．Ｊ．ティッベ（A. G. J. Tibbe）、Ｊ．Ｗ．ウーア（J. W. Uhr）およびＬ．Ｗ．Ｍ．Ｍ．タースタッペン（L. W. M. M. Terstappen）『クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin. Cancer Res.）』２００４年；１０巻；６８９７頁を参照のこと。この多様性は、システムの解析性能を反映しておらず、むしろ血液中に存在するＣＴＣの数に影響を与える場合がある、病期および患者の状態などの様々な要因に依存す���。
【０２４６】
標準的な組織病理学および免疫染色法の応用は、癌の転移および潜在的薬物療法におけるＣＴＣの役割を理解するのに必須である。現在までのところ、市販のプラットフォームでは、単離されるＣＴＣ数は非常に少なく、後段の方法を制限していた。ＣＴＣの単離が改善されることによって、パパニコロウ（ＰＡＰ）染色およびＤＮＡ ＦＩＳＨによる細胞学的検査などの、標準化された特徴付けの方法を用いることが容易になる。台形渦巻き状バイオチップで単離されたＣＴＣをＰＡＰで処理すると、細胞質に対する核の比（Ｎ／Ｃ）が高いことが明らかになったが、これは、癌細胞の特徴である。個々のＤＮＡ ＦＩＳＨプローブで処理すると、ＨＥＲ２＋のＣＴＣもある。ＨＥＲ２＋のＣＴＣの存在は、試料の中でも様々であり、ＨＥＲ２−の腫瘍の患者由来の試料でも観察される（５個のうち２個）。このことは、ＨＥＲ２の状態の不均一性は、原発腫瘍と比べて、ＣＴＣにおいて明白であるという以前の発見を支持している。Ｓ．リースドルフ（S. Riethdorf）、Ｈ．フリッチェ（H. Fritsche）、Ｖ．ミュラー（V. Muller）、Ｔ．ラウ（T. Rau）、Ｃ．シンドルベック（C. Schindlbeck）、Ｗ．Ｊ．ブリジット・ラック（W. J. Brigitte Rack）、Ｃ．コイス（C. Coith）、Ｋ．ベック（K. Beck）、Ｆ．ヤニック（F. Janicke）、Ｓ．ジャクソン（S. Jackson）、Ｔ．ゴーネット（T. Gornet）、Ｍ．クリストファニリ（M. Cristofanilli）およびＫ．パンテル（K. Pantel）『クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin. Cancer Res.）』２００７年；１３巻：９２０頁を参照のこと。ＣＴＣにおけるＨＥＲ２増幅を検出することで、ＨＥＲ２に関連した治療方法の利益を得る、ハイリスクの乳癌患者を識別することができる。結論として、この研究によって、慣性マイクロ流体システムを用いた、血液試料のＣＴＣ検査が示される。
【０２４７】
本明細書で引用されたすべての特許、公開出願および文献の関連する教示は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２４８】
本発明は、その実施形態の例を参照して詳細に示され、かつ説明されたが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、形態および詳細を種々変更してもよいことは、当業者が理解するところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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