(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
適応光学を使用する誘導放出抑制顕微鏡検査の方法であって、
（ａ）励起光路と抑制光路中の第１の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
（ｂ）前記蛍光画像の画像輝度の尺度と画像鮮鋭度の尺度とを組み合わせる測定基準を計算することとを含み、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小され、
（ｃ）前記第１の光変調器上のパターンを調整することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し且つ／又は前記抑制光路を前記励起光路と位置合わせするために（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を繰り返すこととをさらに含み、
前記第１の光変調器は、空間光変調器又は変形可能ミラーである、誘導放出抑制顕微鏡検査の方法。
【請求項２】
（ａ）前記蛍光画像を取得することは、
同期化された抑制ビーム及び励起ビームであって、前記抑制ビームが前記励起ビームよりも長い波長を有する、同期化された抑制ビーム及び励起ビームを形成することと、
前記励起ビームを前記励起光路に沿って対物レンズを通して試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
前記抑制ビームを前記抑制光路に沿って抑制光変調器上に向け、前記抑制光変調器からの前記抑制ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、中心から離れた前記蛍光を脱励起するように前記中心で最小値を有する点広がり関数を有する抑制ビームを形成することと、
前記中心からの前記蛍光を取得することと、
前記試料に対する前記中心を複数の位置に移動させて、前記蛍光画像を構築することと、を含む請求項１に記載の誘導放出抑制顕微鏡検査の方法。
【請求項３】
前記方法は更に、
前記励起ビームを励起光変調器上に向け、前記励起光変調器からの前記励起ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
第２の測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記励起光変調器上のパターンを適応させることとを含み、
前記第２の測定基準は、画像輝度の尺度Ｂである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料から検出器までの経路は放出光路であり、前記方法は更に、
前記試料からの前記光を前記対物レンズを通して第２の光変調器上に、次いで前記検出器上に向けることと、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第２の光変調器上のパターンを適応させることとを含み、
前記更なる測定基準は、画像輝度の尺度Ｂ、画像鮮鋭度の尺度Ｓ、又は両者を組み合わせる測定基準である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の光変調器もまた、前記励起光路中にあり、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第２の光変調器上の前記パターンを適応させることは、前記励起光路及び前記放出光路の両方での光学収差を低減するために前記第２の光変調器上の前記パターンを適応させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の光変調器は、前記放出光路及び前記励起光路に加え前記抑制光路中にあり、
更なる測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記第２の光変調器上の前記パターンを適応させることは、前記抑制光路、前記励起光路、及び前記放出光路の各々での光学収差を低減するために前記第２の光変調器上の前記パターンを適応させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数の光学収差モードを補正することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抑制光変調器上の前記パターンは、点広がり関数を有する前記抑制ビームとして非ゼロ次の回折ピークを試料上に向けるように構成されたパターンである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記測定基準Ｍは、
【数１】
0006444869.tif 000007
により定義され、ただしＭは、前記測定基準であり、Ｓは、画像鮮鋭度尺度であり、Ｂは、画像輝度尺度であり、σは、補正される収差モードが最大輝度を生成するか最小輝度を生成するかに応じて値−１又は１を有する定数であり、βは、定数であり、ｆ（Ｓ）は、閾値ＳＴを上回るＳの値についてはより大きい絶対値を有し前記閾値ＳＴを下回るＳの値についてはより小さい絶対値を有するＳの関数である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定基準Ｍは、
【数２】
0006444869.tif 000008
により定義され、ただしｋは、比例定数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
画像輝度の前記尺度は、画像での画素値の合計として計算される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
画像鮮鋭度の前記尺度は、画像フーリエ変換（ＦＴ）の二次モーメントとして定義され、
【数３】
0006444869.tif 000009
として計算され、ただしＩ＾ｎ，ｍは、画像の離散ＦＴであり、ｎ’＝ｎ−（Ｎ−１）／２、ｍ’＝ｍ−（Ｍ−１）／２であり、ｎ及びｍは、０からＮ−１又はＭ−１にそれぞれ及ぶ座標であり、前記関数μｎ，ｍは、
【数４】
0006444869.tif 000010
により定義される円形マスクである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）蛍光画像を前記誘導放出抑制顕微鏡から取得するステップと、
（ｅ）前記蛍光画像の画像輝度、画像鮮鋭度、又は両方を測定する測定基準を計算するステップと、
（ｆ）前記光変調器上のパターンを調整するステップと、
を繰り返すことにより前記抑制光ビーム路、前記励起光ビーム路、及び前記放出ビーム路の１つ以上の精細な位置合わせを提供するように精細な位置合わせ手順を実行することを更に含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記光変調器は、変形可能ミラーである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）励起路に沿った励起ビームと、抑制ビームの抑制光路内の空間光変調器と、を有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得し、
（ｂ）前記蛍光画像の画像輝度の尺度と画像鮮鋭度の尺度とを組み合わせる測定基準を計算し、
（ｃ）前記空間光変調器上のパターンを調整し、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し又は前記抑制ビームと前記励起ビームとを位置合わせするために（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を繰り返し、前記測定基準は、画像鮮鋭度の尺度を画像輝度の尺度と組み合わせ、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小される、
ように構成されたコンピュータプログラム製品。
【請求項１６】
前記取得される画像を前記誘導放出抑制顕微鏡から取得するように構成され、前記顕微鏡が更に第２の空間光変調器を備え、
前記コンピュータプログラム製品は、前記第１及び前記第２の両方の空間光変調器上のパターンを調整するように構成されている、請求項１５に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１７】
前記測定基準Ｍは、
【数５】
0006444869.tif 000011
により定義され、ただしＭは、前記測定基準であり、Ｓは、画像鮮鋭度尺度であり、Ｂは、画像輝度尺度であり、σは、補正される収差モードが最大輝度を生成するか最小輝度を生成するかに応じて値−１又は１を有する定数であり、βは、定数であり、ｆ（Ｓ）は、閾値ＳＴを上回るＳの値についてはより大きい絶対値を有し前記閾値ＳＴを下回るＳの値についてはより小さい絶対値を有するＳの関数である、請求項１５又は１６に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１８】
画像鮮鋭度の前記尺度Ｓは、画像フーリエ変換（ＦＴ）の二次モーメントとして定義され、
【数６】
0006444869.tif 000012
として計算され、ただしＩ＾ｎ，ｍは、画像の離散ＦＴであり、ｎ’＝ｎ−（Ｎ−１）／２、ｍ’＝ｍ−（Ｍ−１）／２であり、ｎ及びｍは、０からＮ−１又はＭ−１にそれぞれ及ぶ座標であり、前記関数μｎ，ｍは、
【数７】
0006444869.tif 000013
により定義される円形マスクである、請求項１７に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１９】
光源と、
前記光源からの光を抑制光路及び励起光路中に分割する分割器と、
前記励起光路を通過する前記光を対象上に向ける対物レンズと、
前記抑制光路を通って進む光の周波数をより低い周波数にシフトさせる音響光学変調器と、
前記抑制光路を通って進む前記光を前記対物レンズを通して前記試料上に、中心から離れた蛍光を脱励起するように前記中心で最小値を有する点広がり関数と共に向けるように構成された光変調器と、
前記中心からの蛍光光を取得するセンサと、
複数の中心で検知される光から前記試料の蛍光画像を構築し、画像輝度の尺度及び画像鮮鋭度の尺度を含む測定基準を測定し、前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し又は前記抑制光路と前記励起光路とを位置合わせするために前記光変調器上のパターンを適応させ、前記測定基準は、画像鮮鋭度の尺度を画像輝度の尺度と組み合わせ、前記画像輝度の尺度は、前記画像鮮鋭度の尺度がより低いときに縮小される、コントローラと、
を備える誘導放出抑制顕微鏡。
【請求項２０】
前記励起光路中に第２の光変調器を更に備える、請求項１９に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
【請求項２１】
前記第２の光変調器は、前記抑制光路、前記励起光路、及び放出光路の各々での変形可能ミラーであり、前記放出光路は、前記試料と前記センサとの間の光路である、請求項２０に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
【請求項２２】
前記第１の光変調器は、非ゼロ次の回折ピークを前記試料上に点広がり関数と共に向ける回折パターンを表示するように構成されている、請求項１９、２０、又は２１に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
【請求項２３】
前記測定基準Ｍは、
【数８】
0006444869.tif 000014
により定義され、ただしＭは、前記測定基準であり、Ｓは、画像鮮鋭度尺度であり、Ｂは、画像輝度尺度であり、σは、補正される収差モードが最大輝度を生成するか最小輝度を生成するかに応じて値−１又は１を有する定数であり、βは、定数であり、ｆ（Ｓ）は、閾値ＳＴを上回るＳの値についてはより大きい絶対値を有し前記閾値ＳＴを下回るＳの値についてはより小さい絶対値を有するＳの関数である、請求項１９、２０、２１、又は２２に記載の誘導放出抑制顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導放出抑制顕微鏡検査（stimulated emission depletion microscopy）の方法、そのような方法のためのコンピュータプログラムコード、及び誘導放出抑制顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡検査は、単細胞などの薄い試料だけでなく、組織切片、線虫、又は生きてさえいるネズミなどの厚い試料もまた撮像するために使用される。本技法は、蛍光顕微鏡検査技法である。
【０００３】
ＳＴＥＤ顕微鏡検査は、従来の励起焦点を、蛍光スペクトルのピークに関してレッドシフトされ且つ中心強度最小（理想的には強度ゼロ）を特徴とする高強度の第２のレーザ焦点−抑制焦点−と重ね合わせることにより回折限界を克服する。抑制レーザは、励起されたフルオロフォア（fluorophore）を誘導放出により基底状態に押し戻し、それにより励起焦点の周辺での蛍光を抑制し、撮像すべき非常に小さい中心強度最小点での蛍光だけを残す。抑制ビームの強度を増加させることは、有効点広がり関数（ＰＳＦ：point spread function）を原理上は回折制限されないサイズまで低減する。
【０００４】
実際には、ＳＴＥＤ顕微鏡検査で得られる分解能は、抑制焦点の中心での強度最小の品質に強く依存し、無視できない最小強度については、蛍光はまた、焦点の中心でも抑制され、分解能の改善は、無効にされる。抑制レーザビームのシステム誘起及び試料誘起の両方の収差（aberration）は、ビーム品質を劇的に低下させ、無視できない最小強度を作成することもある。従って、収差の著しい試料でのＳＴＥＤ顕微鏡検査は、決してささいなことではない。
【０００５】
らせん状位相マスクにより作成される、最も一般に使用される抑制プロファイルは、ビーム収差に対して強い抵抗力があり、従ってらせん状位相マスクは、特に厚い試料では、ＳＴＥＤで広く使用されている。しかしながら、否定的側面では、らせん状位相マスクは、ドーナツ形の抑制焦点を作成し、それは、横（ｘｙ）平面に閉じ込められるがしかしなお軸（ｚ）方向では回折制限される、著しく異方的な有効ＰＳＦをもたらす。その結果、これらのＳＴＥＤ画像は、横方向では超解像されるが、しかし光学軸に沿ってはそうでない。組織の固有の三次元構成を最高に詳細に撮像するためには、ＳＴＥＤ顕微鏡検査は、三次元分解能の向上を示さなければならない。
【０００６】
薄い試料については、２つの三次元ＳＴＥＤ法が、これまでに実証されている。最高分解能は、厚い試料形状と両立できない、２つの対向する対物レンズを利用する複雑なセットアップで達成されている。別法として、単一の対物レンズを使用して、πラジアン（λ／２）の位相ステップを有する中心円を特徴とする環状位相フィルタが、適用されている。この位相マスクは、中心最小点の上下に追加の高強度突出部を有する輪状焦点を作成し、それにより中心の周りのすべての方向で蛍光放出の抑制を可能にする。残念ながら、この手法は、らせん状位相マスクの手法よりも収差の影響をはるかに多く受けやすく、当然のことながら、三次元ＳＴＥＤ撮像は、今まで厚い試料で実証されていない。
【０００７】
収差を避けるための１つの手法は、試料、例えば組織を屈折率整合媒体に埋め込むことであるが、しかし生きている標本と両立できない。
【０００８】
ＳＴＥＤ撮像のための１つの知られている手法は、E. Auksorius, B. R. Boruah, C. Dunsby, P. M. Lanigan, G. Kennedy, M. A. Neil, and P. M. French, "Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging," Opt. Lett. 33, 113-115 (2008)で提案される手法である。この文書では、空間光変調器（ＳＬＭ）が、ＳＴＥＤビームの位相を変調するために使用される。ホログラムが、＋１回折次数での位相分布を生成するためにＳＬＭに書き込まれ、ＳＬＭの柔軟性が、Ｉ型らせん状位相分布か又はπだけシフトされた中心円板位相を有するＩＩ型分布の生成を可能にする。
【０００９】
この文書は、収差補正が、プログラム可能なＳＬＭを使用して可能なこともあることを示唆するけれども、使用される方法は、焦点の直接測定、即ちＳＴＥＤビーム焦点の直接画像を含む論文を引用する。これは、実際の試料について実行不可能であり、生体試料を含む多くの試料については収差は複雑であり、これは、そのような収差の補正について困難を生み出す。
【００１０】
共焦点又は二光子顕微鏡などの、他の種類の以前に公開されたセンサレス適応光学（ＡＯ：adaptive optics）顕微鏡は、全画像輝度（画素値の合計）などの、簡単な画像品質測定基準を使用している。適切に選択された収差モードに対するこれらの測定基準の応答は、明確に定義された最大値を提供し、それは、典型的には二次であり、それ故に最適化が、簡単なアルゴリズムを使用して容易に行われることもあった。
【００１１】
しかしながら、ＳＴＥＤ顕微鏡では、これらの簡単な測定基準は、あまり役に立たない。収差の著しいＳＴＥＤ顕微鏡は、蛍光を狭い領域に効果的に閉じ込めず、より大きい容積にわたるフルオロフォアからの放出を可能にする。もしこの状態から、収差が補正されるならば、抑制が、より有効になり、有効ＰＳＦが、より少ないフルオロフォアを包含するので、全画像強度の固有の低下がある。言い換えれば、最適補正は、画像輝度などの簡単な測定基準による目標とされるはずがない。
【００１２】
代替手法は、対物レンズ補正環の調整などの、比較的簡単な調整を使用する。そのような比較的簡単な静的方法は、ＳＴＥＤ顕微鏡検査で実際に遭遇される複雑な収差を補正することができない。
【００１３】
更なる必要性は、ＳＴＥＤ顕微鏡で励起及び抑制ビームを位置合わせすることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様によると、
（ａ）励起光路（excitation light path）と抑制光路中の第１の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
（ｂ）前記蛍光画像の画像輝度（image brightness）の尺度と画像鮮鋭度（image sharpness）の尺度とを組み合わせる測定基準（metric）を計算することと、
（ｃ）前記第１の光変調器上のパターンを調整することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減し且つ／又は前記抑制光路を前記励起光路と位置合わせするために（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を繰り返すこととを含み、
前記光変調器は、空間光変調器又は変形可能ミラー（deformable mirror）である、誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
【００１５】
この態様による方法は、新規の画像品質フィードバック測定基準を使用し、組織などの光学収差のある標本を通って撮像するとき、三次元のすべてで回折限界を十分に下回る分解能を実証する。
【００１６】
別の態様では、
同期化された抑制ビーム及び励起ビームであって、前記抑制ビームが前記励起ビームよりも長い波長を有する、同期化された抑制ビーム及び励起ビームを形成することと、
前記励起ビームを前記励起光路に沿って対物レンズ（objective）を通して試料上に向けて、蛍光を発生させることと、
前記抑制ビームを抑制光変調器上に向け、前記抑制光変調器からの前記抑制ビームを前記対物レンズを通して前記試料上に向けて、中心から離れた前記蛍光を脱励起（de-excite）するように前記中心で最小値を有する点広がり関数を有する抑制ビームを形成することと、
前記中心からの前記蛍光を取得することと、
前記試料に対する前記中心を複数の位置に移動させて、蛍光画像を構築することと、
画像輝度の尺度及び画像鮮鋭度の尺度を含む前記蛍光画像の測定基準を決定することと、
前記測定基準を最大化又は最小化することにより光学収差を低減するために前記抑制光変調器上のパターンを調整することと、
を含む誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
【００１７】
別の態様では、
（ａ）励起光路と抑制光路中の第１の光変調器とを有する誘導放出抑制顕微鏡から蛍光画像を取得することと、
（ｂ）異なる増強効果を有するように前記第１の光変調器上の異なるパターンを使用して（ａ）を繰り返すことと、
前記蛍光画像を組み合わせることと、
を含む誘導放出抑制顕微鏡検査の方法が提供される。
【００１８】
本発明の実施形態は、純粋に例として添付の図面を参照して、開示されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態の概略図を示す。
【図２】本発明の実施形態を使用して補正される画像を示す。
【図３】本発明の実施形態を使用して補正される画像を示す。
【図４】本発明の実施形態の適応光学手法を用いた改善を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、概略図であり、一定の縮尺でない。
【００２１】
図１は、例となる実施形態で使用されるＡＯ  ＳＴＥＤセットアップを例示する。８０ＭＨｚモード同期Ｔｉ：サファイアレーザ２からの出力は、グランレーザ偏光子８により２つのビーム路（beam path）１０、１２に分割される前にファラデーアイソレータ４及び半波長板６に通された。透過ビーム１０は、ＳＴＥＤ照明に、即ち抑制に使用され、それ故に対応する光路は、抑制パルスビーム路１０と呼ばれることになる。このビームは、１００ｍ長の偏光保持単一モードファイバ２０中に結合される前に１９ｃｍ長のガラスブロック１４、パルス遅延調整のための遅延ステージ１６、及びレーザパワー調整のための音響光学変調器１８に通された。ガラスブロック及び単一モードファイバは、パルスを数百ピコ秒に引き伸ばすのに役立った。
【００２２】
同期化励起パルスを発生させるために、グランレーザ偏光子で反射された励起ビーム路１２に沿った励起ビームは、フォトニック結晶ファイバ２６（SCG-800, Newport - RTM）中に焦点を合わされた。このファイバ２６から出力された白色光スペクトルは、波長選択及びパワー制御のための音響光学波長可変フィルタ２８に結合され、次いで第２の偏光保持単一モードファイバ３０中に結合された。
【００２３】
各単一モードファイバ２０、３０の出力において、ビーム１０、１２は、平行にされ、対物レンズの瞳に共役な平面に置かれたそれぞれの液晶空間光変調器２２、３２（ＳＬＭ）から反射された。
【００２４】
各ビーム路での半波長板４０、４２及び共通ビーム路での１／４波長板４４は、各ビームの円偏光を試料中に生成するために使用された。加えて、偏光ビーム分割器キューブ４６は、ビーム偏光をきれいにするために抑制ビーム路で使用された。
【００２５】
ビームは、商用顕微鏡スタンド（IX71, Olympus）に取り付けられた１００×／１．４ＮＡ油浸対物レンズ５２（UPLSAPO 100XO/PSF, Olympus）により焦点を合わされる前にダイクロイックミラー（dichroic mirror）５０により共通路（common path）に併合された。試料５６は、走査のためにｘｙｚ圧電ステージ５４（PINano, Physik Instrumente）に取り付けられた。蛍光信号は、対物レンズにより集められ、ダイクロイックミラー４８、５０により入射ビーム路１０、１２から分離され、２つの帯域通過フィルタ６０によりフィルタ処理され、６２．５μｍコア径（約０．６４エアリーユニット）の５０：５０信号分割多モードファイバ６２中に焦点を合わされた。多モードファイバ６２の各出力は、単一光子計数アバランシェフォトダイオード６４、６６に付着された。画像収集及び計器制御は、ソフトウェア６８を使用する計器用ＰＣ７０を使用して達成された。
【００２６】
撮像のために、Ｔｉ：サファイアレーザ２は、抑制のための７７０ｎｍに同調され、６３３ｎｍでの励起線は、ＡＯＴＦ２８を使用してフォトニック結晶ファイバ２６の出力から選択された。対物レンズ背面開口で測定されたレーザパワーは、抑制及び励起についてそれぞれ８４〜１３２ｍＷ及び０．２〜２μＷであった。
【００２７】
画像（１２８×１２８画素）は、１００ライン／秒の走査速度、４０ｎｍの画素サイズ、及び１〜３フレーム蓄積（１．２８〜３．８４秒／画像に対応）で収集された。ラインは、正弦波速度プロファイルを使用して一方向に走査され、それは、走査中心で２１．５μｓ及び端でこの値の約二倍の画素滞留時間をもたらした。従って、記録された画素値は、中心画素が１で割られるように画素滞留時間に従って規格化された。ラインプロファイルのフィッティングは、ローレンツ関数（収差補正の後に取得された画像について）か又はガウス関数（収差補正なしで取得された画像についてであって、この場合には観測されたデータはローレンツプロファイルに適合しなかったから）を使用して行われた。
【００２８】
ＳＴＥＤ位相マスク並びに収差補正は、抑制ビーム路に置かれたＳＬＭ２２を使用して実現された。ＳＬＭ２２の８００×６００画素は、追加の表示デバイスとしてのＳＬＭを計器用ＰＣ７０に接続することにより個々にアドレスを指定された。
【００２９】
使用される波長での０から２πラジアン（及びそれ以上）までの位相変調は、ＳＬＭ２２に供給される位相画像のグレースケールを変えることにより達成される。２πラジアンよりも著しく大きい位相変調は、位相ラッピングを通じて作成されてもよく、それによりより大きい位相値は、範囲０から２πラジアンに変換される。収差は、照明、放出及び抑制ビーム路に影響を及ぼすけれども、達成可能な分解能は、抑制焦点の品質により支配される。
【００３０】
このため、抑制路１０でのＳＬＭ２２だけによる収差補正は、画像品質を大幅に改善するのに十分である。
【００３１】
しかしながら、照明及び放出路での収差は、蛍光励起（焦点での照明強度を低減することにより）、検出効率（共焦点ピンホール上の蛍光焦点をぼやけさせることにより）及び背景信号（抑制領域の外側での蛍光の励起及び検出を通じて）のレベルに影響を及ぼす。従って、第２のＳＬＭ３２は、励起ビーム路１２での追加の収差補正を行うために含められた。
【００３２】
代替実施形態では、更なる改善が、放出路での収差補正で同様に達成されることもある。
【００３３】
ＳＬＭ２２、３２での直接反射を使用する代わりに、軸外ホログラムが、使用され、それは、非ゼロ次の回折ビーム、ここでは一次ビームを前方へ対物レンズを通して向ける。そのような回折ビームの使用は、位相変調光を任意の直接反射された非変調光から分離するので、有益である。
【００３４】
述べられた配置では、能動的瞳が、そのような軸外ホログラム（図１差し込み図）−光を主反射軸から離れて一次回折次数に回折する円形外形のブレーズド格子−を作成することによりＳＬＭ２２上に定義され、回折光は、試料中に焦点を合わされた。入射光（並びに能動的瞳の外側の部分から反射された光）の残りの回折されないごく一部は、主反射軸に沿って単に反射され、第一焦点から約３μｍ離れ、抑制スポットよりもはるかに弱い第二焦点を試料中に形成した。この手法は、不完全な位相変調から生じるどんな残留光も、所望の抑制焦点を妨げ、その品質を悪化させることはあり得ないということを確実にした。
【００３５】
我々は、非回折光がまた、もし必要ならば中間の焦点面で遮られることもあり得るということに留意する。抑制焦点を作成するための位相マスクは、対応する関数をＳＬＭ位相パターンに追加することにより生成された。このようにして、位相マスクが追加され、かなり容易に変更され且つ交換され、製造された位相板が光路に物理的に置かれるシステムと比較されてもよい。
【００３６】
本顕微鏡は、開口数（ＮＡ）１．４の油浸レンズ５２を用いた。標本は、屈折率ｎ＝１．３４の水媒体（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）か又はグリセロール（ｎ＝１．４７）に封入（mount）された。水性封入剤については、限界システムＮＡは、集束ビームのより高い入射角での全内部反射に起因して封入剤の屈折率に制限される。従って、我々は、ＳＬＭ上で定義される能動的開口を１．３２５の対物レンズＮＡに対応するサイズに制限した。これは、我々が、市販の対物レンズよりも高いＮＡ＝１．３２５の水浸対物レンズの性能を事実上模倣することを可能にした。
【００３７】
ＳＬＭは、更なる位相関数のＳＬＭへの追加を通じて適応収差補正を可能にする。ここで述べられるシステムでは、我々は、システム及び標本により誘起される収差を決定するためにセンサレスＡＯ構成を用いた。センサレスＡＯでは、収差は、一連の所定のバイアス収差を使用して得られる一組の画像の分析を通じて推定される。このプロセスは、１）適切な組のモードを使用する収差の拡張、及び２）最適収差補正を見出すために最大化される画像品質測定基準の定義を必要とする。
【００３８】
収差は、変位（チップ（tip）、チルト（tilt）、焦点ずれ（defocus））モードにより導入される小さい画像シフトを除去するように変更されたゼルニケ（Zernike）多項式展開を使用して表された。表１は、この作業で収差補正に使用されるゼルニケモード（従来の番号付けに従う）を列挙する。ゼルニケ多項式モードは、適応光学で収差をモデル化するために広く使用されている。このことの１つの理由は、モード間の直交性であり、それは、焦点の変位（チップ、チルト及び焦点ずれモードによる）並びに焦点の歪み（非点収差、コマ収差及び球面収差などのより高次のモードを通じて）の分離などの、有用な実用的結果を有する。しかしながら、効果のこの分離は、厳密には近軸近似で且つ一様な瞳関数について当てはまるだけである。
【００３９】
当業者は、代替モードが、収差を表すために使用されてもよく、本方法が、そのような代替モードで正常に機能することになるということに気付くであろう。
【００４０】
ＳＴＥＤ顕微鏡検査で位相マスク及び高ＮＡレンズを使用するとき、これらの近似は、もはや妥当でない。我々は、抑制焦点のゼロ強度点が、例えばゼルニケコマ収差がＳＬＭを使用して適用されるときに横方向にシフトすることもあることを実験で観測した。同様の軸シフトは、ゼルニケ球面収差モードを適用するときに観測された。この挙動は、理論モデリングを通じて確認されている（データは示されない）。これらの変位効果を除去するために、我々は、金色ビーズの画像を使用して各ゼルニケモードについて誘起される焦点シフトを測定した。ゼロ点シフトの線形近似を使用して、チップ、チルト、又は焦点ずれモードの比例量（適切なように）が、強度ゼロ点が位置をシフトしないことを確実にするために、各適用ゼルニケモードに追加された。この手順は、その後の実験に使用された「変位のない」ゼルニケモードの変更された組を定義した。ゼルニケモードへのその後の言及は、今後は変位のないゼルニケモードを表すことになる。
【表１】
0006444869.tif 000002
【００４１】
本発明者らは、最適補正の近くで、ある収差モードの調整が、画像強度の減少を引き起こし、一方他のものは、増加につながったことを観測している（図２）。従って、輝度測定基準単独では、ＳＴＥＤ顕微鏡では不適切である。
【００４２】
画像鮮鋭度に関係する測定基準が、原理上はより適しているように見えることもあるが、しかし純粋にこれに基づく最適化は、測定基準が背景雑音により欺かれる（雑音は、撮像される標本よりも「より鮮鋭な」傾向がある）ので、ＳＴＥＤ焦点の劣化の影響を受けやすい。更に、いくつかの収差モードに対する鮮鋭度測定基準の応答は、最適補正の近くで非常に平坦であり、二次よりもむしろ四次に近い変化を示すことが見出された。
【００４３】
実際には、我々がＳＴＥＤ画像から望む特性は、高分解能と組み合わされる高輝度である。使用される測定基準は、画像輝度及び画像鮮鋭度の両方を組み合わせ手法で最適化しようとし、それは、どちらかの個別手法が失敗する可能性がある場合に成功する。
【００４４】
一実施形態では、組み合わせ測定基準は、
【数１】
0006444869.tif 000003
と定義され、ただしＢ及びＳは、それぞれ輝度及び鮮鋭度測定基準である。方程式１での括弧中の表式は、事実上、鮮鋭度測定基準Ｓが特定のしきいＳＴ（典型的にはピーク鮮鋭度の９０％に選択される）を上回るときにだけ輝度測定基準Ｂの寄与を導入するロジスティック関数である。パラメータβは、Ｓ及びＢからの寄与の平衡を保つように経験的に選択され、パラメータｋは、Ｓ≒ＳＴの領域でのロジスティック関数の遷移速度を調整するために使用された。定数σは、問題になっている収差モードが、ゼロの収差の大きさについてＢで最小を生成したか又は最大を生成したかに応じて＋１又は−１であった。
【００４５】
より一般的に言えば、測定基準Ｍは、鮮鋭度及び輝度を組み合わせる。実施形態では、測定基準Ｍは別法として、
【数２】
0006444869.tif 000004
と表されてもよく、ただしｆ（Ｓ）は、ＳＴを上回るＳについてはより高い絶対値及びＳＴを下回るＳについてはより低い絶対値を有するＳの関数である。
【００４６】
画像輝度測定基準Ｂは、共焦点又はＳＴＥＤ画像での画素値の合計として計算された。この画像輝度測定基準Ｂは、励起ビーム路１２の調整のための測定基準として、即ち励起ビーム路でＳＬＭ３２を使用する収差補正に使用される第２の測定基準Ｂとして単独で使用された。
【００４７】
鮮鋭度測定基準Ｓは、画像フーリエ変換（ＦＴ）の二次モーメントとして定義され、
【数３】
0006444869.tif 000005
として計算され、ただし、Ｉ＾ｎ，ｍは、画像の離散ＦＴであり、ｎ’＝ｎ−（Ｎ−１）／２、ｍ’＝ｍ−（Ｍ−１）／２であり、ｎ及びｍは、０からＮ−１又はＭ−１にそれぞれ及ぶ座標である。関数μｎ，ｍは、
【数４】
0006444869.tif 000006
により定義される円形マスクであり、ただしｗは、期待される分解能（例えば２００ｎｍ）への上限により割られた視野のサイズとして定義される半径（画像ＦＴの画素を単位にして）である。
【００４８】
このマスクは、さもなければＳを雑音により支配されるようにすることになる、より高い空間周波数を遮断するために使用される。測定基準のこの選択の動機は、画像特徴の幅と画像の対応する空間周波数スペクトルの幅との間の逆相関にあり、鮮鋭な画像は、広い画像ＦＴにつながる。方程式３の二次モーメント計算は、画像ＦＴの幅の尺度であるので、Ｓの大きい値は、狭いＰＳＦから生じる鮮鋭な画像に対応するという結果になる。Ｍの定義は、それが、回折限界よりも小さい構造を特徴とする任意の試料に容易に適用可能であることを意味するはずである。
【００４９】
中心がλ／２の位相マスクで撮像するとき、第２及び第３の球面収差モードは、画像輝度の減少につながり、一方第１の球面収差モードは、輝度増加につながることに留意することが重要である。これらの結果は、対物レンズ補正環が、これらの球面収差モードの組み合わせを調整するので、画像輝度を最大化するための対物レンズ補正環の手動調整が、必ずしも三次元ＳＴＥＤ顕微鏡検査に適用されなくてもよいことを示す。
【００５０】
この実施形態のセンサレス適応光学構成では、画像（単一蓄積）は、所与モードＺ’ｉのバイアス収差ｂＺ’ｉを追加しながら共焦点（励起路補正について）か又はＳＴＥＤ（抑制路補正について）モードで収集され、ただしｂは、適切に選択されたバイアス振幅であった。典型的には、ｂは、各Ｚｉについて多数の画像を収集しながら−１から＋１ラジアンの範囲に及ぶように選択された。各画像について、適切な測定基準が計算され（励起路補正についてはＢ、抑制路補正についてはＭ）、次いでバイアス振幅ｂの関数としてプロットされた。補正収差ａｃｏｒｒが次いで、二次関数をデータにフィッティングすることにより計算された曲線のピークとして推定された。二次近似がデータを表さなかった場合には、ピークは、手動で識別されることもあった。
【００５１】
収差ａｃｏｒｒＺ’ｉが次いで、ＳＬＭ位相パターンに追加され、この測定及び補正のサイクルが次いで、関心のあるモードのそれぞれについて繰り返された。
【００５２】
コマ収差（coma）、非点収差（astigmatism）、及びトレフォイル収差（trefoil）に起因する収差は、我々の補正ルーチンの単一繰り返しを使用して評価されることもあった。球面収差モードは、典型的にはここで行われた実験での支配的な収差であり、典型的には最適値に収束するために１〜４回の補正繰り返しを必要とした。しかしながら、励起ビーム路を補正するための結果が、抑制ビーム路の補正のための出発点として使用されたときは、１〜２回の繰り返しが、典型的には球面収差を評価するのに十分であった。図示されるすべてのＡＯ  ＳＴＥＤ画像は、収差補正を行うために使用されるのと同じ視野である。
【００５３】
生物標本で遭遇される収差を使用する補正手順を検証するために、２００ｎｍの深紅色ビーズが、＃１．５カバーガラスに付着されたゼブラフィッシュ網膜切片の上面に追加され、次いで顕微鏡スライド上でＰＢＳ中に（生きた試料撮像の水性埋め込み条件を模倣するために）封入された。図２Ａ〜Ｌは、網膜切片を通って約１４μｍ又は約２５μｍに焦点を合わせた後の個々のビーズのｘｙ及びｘｚ画像を示す。
【００５４】
画像Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、及びＭは、共焦点画像、即ち抑制ビーム路をまったく使用しない場合を示す。画像Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、及びＮは、ＳＴＥＤを使用する分解能の改善、即ち抑制ビーム路を用いる場合を示す。画像Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、及びＯは、ＳＬＭ２２を使用する抑制ビーム路１０での収差補正を使用する改善を示す。
【００５５】
この例では、抑制ビーム路の補正が、励起路１０になされる補正の予備的知識なしに可能であることを実証するために、すべての収差補正は、抑制ビーム路１０上でのみ行われた。これらのデータはまた、抑制焦点の品質が、ＳＴＥＤ画像で回折以下（sub-diffraction）の分解能を達成する際の支配的要因であることも実証する。比較的少ない収差モードの補正が、約１４μｍ及び約２５μｍの深さを撮像するためのそれぞれ約２００ｎｍ及び約２５０ｎｍの軸方向分解能を得るのに十分であったが、我々は、より高次の収差を補正ルーチンに含ませることが、ＳＴＥＤ分解能を更に改善するはずであると期待する。図２Ｍ〜Ｏは、図２Ａ〜Ｆで描写されるデータの体積レンダリングを示し、散乱組織を通って記録された最初の三次元超解像ＳＴＥＤ画像を表す。
【００５６】
収差の強い試料により誘起される収差の補正を実証するために、両方のビーム路１０、１２を使用して、本発明者らはまた、グリセロール（ｎ＝１．４７）の層を通って蛍光ビーズも撮像した。蛍光ビーズを有する試料は、１００ｎｍの深紅色ビーズをポリエルリジンで被覆された顕微鏡スライドに付着することにより準備され、ビーズは、＃１．５カバーガラス及び包埋剤として使用された約５５μｍのグリセロールを通って撮像された。
【００５７】
図３は、通常の共焦点撮像モード及びＳＴＥＤ撮像モードでの収差補正の前及び後のビーズ画像を示す。図３では、画像Ａは、ＳＴＥＤのない共焦点モードでの画像を示し、画像Ｂは、ＳＬＭ３２及び第２の測定基準Ｂを使用する励起ビーム路１２だけでの試料誘起収差の補正があるが、ＳＴＥＤはまだない、画像Ａを示す。画像Ｃは、ＳＴＥＤを使用するが、しかしＳＬＭ３２を使用して励起ビーム路１２を補正するだけである画像、即ち画像Ｂと同様だが、しかしＳＴＥＤがある画像を示す。画像Ｄは、抑制ビーム路１０及び励起ビーム路１２の両方での収差を補正する結果を示す。
【００５８】
収差補正ルーチンは、共焦点撮像モードでの測定基準として画像輝度Ｂだけを使用し、ＳＬＭ３２を調整して励起ビーム路１２を補正することから始めた。
【００５９】
結果として生じる補正値は次いで、方程式１で定義された組み合わせ測定基準をＳＴＥＤ撮像モードで使用する抑制ビーム路１０の補正のための出発点として使用された。図３Ａ及びＢは、励起ビーム路での収差を補正するために第２のＳＬＭを使用する恩恵を例示する（共焦点撮像について）。図３Ｃで示されるように、無補正のＳＴＥＤ画像は、共焦点画像と比較して適度に改善された分解能を示すが、しかし非ゼロ中心強度が、蛍光を抑制するので、信号レベルの著しい減少を犠牲にしている。他方では、収差の補正は、ＳＴＥＤ画像の強度及び分解能を両方とも著しく向上させる（図３Ｄ）。
【００６０】
ＳＴＥＤ及びＡＯ  ＳＴＥＤ画像の軸方向プロファイルが、比較のためにプロットされ（図４）、その結果は、ピーク信号の約５倍の増加並びに分解能の約３．２倍の改善を示す。
【００６１】
我々は、収差補正の前及び後の図２及び３で示されるＳＴＥＤ画像が、補正ルーチンが行われた同じビーズの画像であり、それ故に光退色がこれらの実験では重要でなかったことを実証しているということに留意する。生体撮像応用での標示付け条件は、光安定性の低いフルオロフォアを使用する可能性が高く、それは、場合によりは収差モード当たり５〜７のＳＴＥＤ画像の収集を可能にしないこともある。しかしながら、２Ｎ＋１の画像だけが、Ｎの収差モードを補正するために必要とされることは、実証されており、我々は、この手法がここで提示される方法と両立できると期待する。更に、さもなければ光退色により抑制される応用は、走査速度を増加させるか又はより低い繰り返し率のレーザを使用することによるＳＴＥＤ撮像中の三重項状態緩和の実施から恩恵を受けることもある。
【００６２】
提案されたセットアップはまた、自動位置合わせに使用されてもよい。特に、励起光路を抑制光路と位置合わせするために、抑制ビーム路光変調器上のパターンは、チップ又はチルトなどの、ある量のビームモードを光変調器に追加し、次いで画像を収集することにより調整される。適切な測定基準が、励起路及び抑制路を位置合わせするために計算され、最適化される。
【００６３】
収差補正に使用されるのと同じように、測定基準の正しい選択が、自動ビーム位置合わせの場合に重要である。最適位置合わせの近くでは、ＳＴＥＤ画像は、強度ゼロの位置が励起焦点のガウシアンフォーカスの中心に位置合わせされるときに最大限に明るいことになる。残念ながら、最適位置合わせから離れると、重ならないビームは、また高輝度でもある従来の共焦点画像をもたらす。それに応じて、輝度に基づく簡単な測定基準は、適切でない。
【００６４】
従って、ビームずれを補正するために、輝度及び鮮鋭度を組み合わせる測定基準Ｍが、粗い位置合わせ段階で使用される。この後に、輝度に関係する測定基準Ｂだけを使用する精細な位置合わせ段階が続く。
【００６５】
提案される手法の特定の恩恵は、光学収差の補正及び粗い位置合わせが両方とも、測定基準Ｍを使用することができ、それで単一操作として実行されてもよい、即ち単一最適化手法が、位置合わせすることも、収差を補正することもできることに留意されたい。
【００６６】
上で参照されたAuksoriusによる論文では、ＳＬＭは、抑制焦点の直接観測を通じて抑制ビーム路でのシステム収差を補正するために使用されると報告された。しかしながら、この方法は、人が通常蛍光画像にアクセスできるだけである、実際の標本の顕微鏡検査で導入される収差の補正にとって有用でない。本発明は、超解像画像それ自体を使用する収差補正を可能にし、それは、自動化ＡＯを生体超解像顕微鏡検査にとって有用にすることへの重要な一歩である。
【００６７】
ＳＬＭは、ＳＴＥＤ位相マスク及び適応収差補正を同じ顕微鏡で組み合わせるための便利な方法を提供する。
【００６８】
当業者は、変更が、上で述べられた実施形態になされてもよいことに気付くであろう。
【００６９】
上で述べられた実施形態は、抑制路及び励起路の両方でＳＬＭを使用する。いくつかの実施形態では、ＳＬＭは、抑制路でのみ提供される。他の実施形態では、光変調器は、試料と検出器との間の蛍光放出及び検出路で提供されてもよい。
【００７０】
光変調器としてのＳＬＭの使用に対する代替案がある。例えば、変形可能ミラーが、光変調器としてＳＬＭの代わりに使用されることもあり得る。変形可能ミラーを使用する代替手法は、３つ（抑制、励起、及び放出）のビーム路すべてを同じデバイスで補正することができるという利点を有することになる。しかしながら、ＳＬＭと異なり、ミラーデバイスの連続反射面は、不連続な位相跳躍を必要とするＳＴＥＤ位相マスクの生成を可能にしない。
【００７１】
更なる手法は、単一光変調器を使用して多重ビーム路が補正されることを可能にするために、ビーム路が一致する場所で光変調器を使用することである。
【００７２】
これらの選択肢を例示する代替実施形態は、図５である。この実施形態では、２つの光変調器がある。これらの１つは、抑制路だけに設置された抑制ビーム路ＳＬＭ２２であり、第２の光変調器は、３つのビーム路が一致するところに設置された組み合わせビーム路変形可能ミラー１０２である。図１での励起路におけるＳＬＭ３２は、単純なミラー１００に置き換えられることに留意されたい。
【００７３】
この手法では、抑制ビーム路ＳＬＭ２２は、抑制焦点を成形し且つ収差補正を提供するように位相パターンを補正するために使用される。第２の光変調器、即ち変形可能ミラー１０２は、抑制路、励起路及び放出路のそれぞれを補正するために使用される。
【００７４】
当業者は、光変調器が、抑制路、励起路及び放出路のそれぞれで提供されてもよく又は図５の実施形態でのように共有されてもよいことに気付くであろう。
【００７５】
代替試料取付け配置及び光をそれぞれのビーム路に沿って向けるために光学部品を配置する方法は、当技術分野で知られているように使用されてもよい。
【符号の説明】
【００７６】
２  Ｔｉ：サファイアレーザ
４  ファラデーアイソレータ
６  半波長板
８  グランレーザ偏光子
１０  透過ビーム、抑制ビーム路、抑制路
１２  励起ビーム路、励起路
１４  ガラスブロック
１６  遅延ステージ
１８  音響光学変調器
２０  偏光保持単一モードファイバ
２２  空間光変調器、ＳＬＭ
２６  フォトニック結晶ファイバ
２８  音響光学波長可変フィルタ、ＡＯＴＦ
３０  偏光保持単一モードファイバ
３２  空間光変調器、ＳＬＭ
４０  半波長板
４２  半波長板
４４  １／４波長板
４６  偏光ビーム分割器キューブ
４８  ダイクロイックミラー
５０  ダイクロイックミラー
５２  油浸対物レンズ
５４  圧電ステージ
５６  試料
６０  帯域通過フィルタ
６２  多モードファイバ
６４  アバランシェフォトダイオード
６６  アバランシェフォトダイオード
６８  ソフトウェア
７０  計器用ＰＣ
１００  単純なミラー
１０２  変形可能ミラー
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0006444869.tif 000019
【図３Ｄ】
0006444869.tif 000020
【図４】
0006444869.tif 000021
【図５】
0006444869.tif 000022