(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＩｇＡを結合させる条件下で陰イオン交換体上に組成物をロードする工程、
（ｂ）少なくとも２つのカルボキシル基を有する多価カルボン酸または多価ヒドロキシ−カルボン酸またはそれらの塩から選択される、２つ以上の酸基を有する物質を含むアルカリ性溶出溶液をアプライする工程、
（ｃ）場合により、陰イオン交換体の強力な競合体を含む酸性溶出溶液をアプライする工程を含み、
工程（ｂ）中に溶出したタンパク質は単量体ＩｇＡが富化されている、ＩｇＡを含む組成物からＩｇＡを富化する方法。
【請求項２】
工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、低導電率溶液を陰イオン交換体にアプライすることにより前溶出工程（ａ１）を実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ１）を弱酸性／中性のｐＨで行なう、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
物質は、ジヒドロキシ−ジカルボン酸および／もしくはジカルボン酸またはそれらの塩、ならびに／またはヒドロキシ−トリカルボン酸もしくはその塩から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ジカルボン酸もしくはジヒドロキシ−ジカルボン酸またはそれらの塩は、酒石酸／酒石酸塩、シュウ酸／シュウ酸塩、マロン酸／マロン酸塩およびマレイン酸／マレイン酸塩から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ジヒドロキシ−ジカルボン酸もしくはその塩は、酒石酸／酒石酸塩であるか、またはジカルボン酸もしくはその塩は、シュウ酸／シュウ酸塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）中に回収した溶出物は本質的にＩｇＭを含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）中に溶出したタンパク質は二量体ＩｇＡが富化されている、請求項６に記載
の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）での陰イオン交換体の強力な競合体は、クエン酸／その塩、ベンゼンスルホン酸／その塩、安息香酸／その塩、および硫酸水素イオンの塩またはそれらの混合物から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換体の強力な競合体はクエン酸塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換体は強陰イオン交換体または弱陰イオン交換体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
陰イオン交換体は、第四級アンモニウム、第四級アミノエチル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルおよびジメチルアミノエチルから選択される陰イオン交換リガンドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩｇＡを含む組成物は血液、血清、血漿または他の体液である、またはこれらに由来する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＩｇＡを含む組成物は、血漿分画の中間沈殿物の溶液、または血漿からのＩｇＧの精製中に得られる副画分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩｇＡを含む組成物はＩｇＧ精製プロセスでの中間体であり、請求項１に記載の方法の工程（ａ）および工程（ｂ）をＩｇＧ生産プロセスの一部である陰イオン交換体上で行なう、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＩｇＡを含む組成物を沈殿物の可溶化により得る、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
沈殿物はＩｇＧ精製中に得られるオクタン酸沈殿物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
可溶化工程はＩｇＡおよびＩｇＧを選択的に溶液にする、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
可溶化を、１〜１５ｍＳ／ｃｍの導電率および３．５〜６または７〜９．５のｐＨを有する溶液を使用して実行する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
可溶化を、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液および／またはこれらの緩衝液の内の２つもしくはそれ以上の組み合わせにより実行する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
緩衝液は、ｐＨ４．８である、０．２２Ｍの酢酸塩緩衝液または０．１５Ｍのリン酸塩緩衝液から選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＡを含む材料からのＩｇＡ（およびＩｇＭ）の富化プロセスに関する。詳細には、本発明は、単量体ＩｇＡおよび二量体ＩｇＡの有利な富化および分離をもたらす陰イオン交換体の連続溶出プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
公知であるように、免疫グロブリンは、感染と戦っている哺乳類の免疫系において重要な役割を果たす。免疫グロブリン（Ｉｇ）は、Ｂリンパ球で合成されて全ての脊椎動物の血漿、リンパ液および他の身体の分泌物中に見出される特異的免疫タンパク質である。免疫グロブリンは、ヒトにおいては血漿タンパク質の約２０％を占める。
【０００３】
全ての免疫グロブリンは、それらの特異性とは無関係に、４本のポリペプチド鎖：即ち、共有的に付着したオリゴ糖基をそれぞれ有する２本の同一の重（Ｈ）鎖と、２本の同一の通常はグリコシル化されていない軽（Ｌ）鎖とを備える共通の構造を有し、各鎖はジスルフィド結合により共有的に連結される。４本全てのポリペプチド鎖は定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含有し、各領域はそれぞれカルボキシル末端およびアミノ末端に見出される。重鎖および軽鎖は単一のＶ領域を有するが、軽鎖は単一のＣ領域を持ち、重鎖は３つのＣ領域を含有する。重鎖および軽鎖両方のＶ領域が組み合わさって２つの同一の抗原結合部位（抗体の抗原に結合する部分）が形成される。免疫グロブリンのＦｃ領域内における構造決定因子は、胎盤輸送または抗原依存性の細胞毒性等のエフェクタ機能を媒介する。
【０００４】
免疫グロブリンは、そのＨ鎖の構成要素に従って、生化学的特性および生理学的特性が異なる５つの主要なクラス：即ちＩｇＧ（γ重鎖）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）およびＩｇＥ（ε）に分けられる。軽鎖には２つのタイプ、即ちκおよびλがある。個々の分子はκ鎖またはλ鎖を含有し得るが両方を含有しない。ヒトでは、κ軽鎖を含有する免疫グロブリンとλ軽鎖を含有する免疫グロブリンとの比は約６０：４０である。
【０００５】
有効性および応用範囲に起因して、免疫グロブリンの３つのクラスＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭは他に比べて重要である。ヒトＩｇＧは血漿中において最も豊富な免疫グロブリンに相当するが、ＩｇＡは、唾液、涙液ならびに気道および腸管の粘液等の外分泌物における主要な抗体クラスに相当する。ＩｇＡは、細菌性病原体およびウイルス性病原体に対する第一次防御ラインの内の１つを形成する。ＩｇＭはヒト循環系において群を抜いて物理的に最大の抗体であり、感染の経過の初期に現れ、通常は更なる曝露後により少ない程度で再度現れる。
【０００６】
ＩｇＡの純粋な単量体型は２本の軽（Ｌ）鎖および２本の重（Ｈ）鎖から成り；真の二量体型では、２つのそのような単量体が、いわゆるＪ鎖（接続鎖）により連結されている。血漿では、非共有的に会合したＩｇＡ二量体との平衡状態でＩｇＡ単量体が存在するが；Ｊ鎖含有ＩｇＡ二量体も存在する。全二量体ＩｇＡ（即ち、Ｊ鎖を含有する真の二量体および非共有的に会合したＩｇＡ二量体）は全ＩｇＡの約１０〜２５％を占める。粘膜および粘液腺の分泌物では、更なる分泌成分（ＳＣ）を有するＪ鎖含有ＩｇＡ二量体が優勢である。ＩｇＡには、通常は約８０〜９０重量％対１０〜２０重量％の相対割合でヒト血清中に存在する２つのサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２がある。この相関はＩｇＡの単離中に変更され得る。免疫グロブリン製剤におけるκ軽鎖対λ軽鎖の天然比は約１：１になる。ＩｇＡは、正常なヒト血清の全タンパク質の約３〜４％に相当するにすぎない。
【０００７】
ＩｇＭは、複数の単量体がジスルフィド結合により、ほとんどが五量体としてだが六量体としても互いに共有的に連結されている高分子を形成する。五量体ＩｇＭ中にはＪ鎖が見出されるが六量体型中には見出されず、これはおそらく六量体の複合体中における空間の制約に起因する。五量体ＩｇＭを、Ｊ鎖を欠いた状態で形成することもできる。現時点では正常な五量体のどの部分がＪ鎖を含有するか依然として不明確であり、この点でＪ鎖含有五量体が１本またはそれ以上のＪ鎖を含有するかどうかも不明確である（非特許文献１）。ＩｇＭは巨大分子であることからＩｇＭは良好に拡散することができず、非常に低い量で間質中にのみ見出される。ＩｇＭは主に血清中に見出されるが、Ｊ鎖の存在により、分泌性免疫グロブリンとしても重要である。ＩｇＭの重合特性に起因して、ＩｇＭは高い結合活性を持ち、補体活性化に特に有効である。
【０００８】
前世紀中に、免疫グロブリン製剤の様々な感染症の予防および治療への使用に成功した。伝統的に、免疫グロブリン製剤は全身投与用に開発され、大部分がＩｇＧで構成されていた。しかしながら、乳児下痢症の予防および治療への母乳の使用の成功により、血漿および粘膜（分泌型）のＩｇＡの潜在的有効性が注目された（非特許文献２）。
【０００９】
Ｅｉｂｌらにより実施された臨床試験（非特許文献３）は、血漿由来のＩｇＡリッチ免疫グロブリン製剤（ＩｇＡｂｕｌｉｎ、７３％ＩｇＡおよび２６％ＩｇＧ）の経口供給により、壊死性腸炎の進行を阻止し得ることを示す。他の適応症、例えば粘膜感染等の適応症もＩｇＡによる治療の恩恵を受けることができる。しかしながら、ＩｇＡｂｕｌｉｎはもはや入手不可能であり、現在、入手可能なＩｇＡ製品はない。
【００１０】
免疫グロブリンの既知で一般的な単離および精製の方法は、大部分がこの群に属する分子の物理化学的特性および生物学的特性の差異、例えば免疫グロブリンの分子量、等電点、様々な条件下での溶解性の差異に基づいており；加えて、いくつかの物質（例えば細菌性のＡタンパク質およびＧタンパク質）に対する免疫グロブリンの親和性を考慮する必要がある。ゲルクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、透析、塩および有機溶媒による沈殿は、免疫グロブリン分子の様々な特性に基づいている。文献に記載されている、最も広く使用されているプロトコルは、いくつかのアプローチを併用する。
【００１１】
血漿プールからの免疫グロブリンの商業的な単離プロセスは通常、例えばＣｏｈｎにより開発されているエタノール分画から始まる（非特許文献４、非特許文献５）。オリジナルのＣｏｈｎのプロセスの多くの改変が記載されている。
【００１２】
エタノール沈殿に対する代替アプローチがＳｔｅｉｎｂｕｃｈらにより記載されている（非特許文献６）このアプローチは、上清中に免疫グロブリンを残す沈殿用にオクタン酸を使用する。免疫グロブリンは、陰イオン交換体であるＤＥＡＥ−セルロースを使用する吸着（「バッチ式」）により更に精製される。
【００１３】
ＩＶＩＧ製品用に免疫グロブリンリッチ血漿画分からＩｇＧを精製するためのクロマトグラフィー法の使用が既に検討されている。具体的には、別々の工程でのまたは連続した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーが、血漿またはその画分からのＩｇＧの特許取得済みの精製方法で述べられている。特許取得済みの方法の大部分では、陰イオン交換クロマトグラフィーがネガティブモード、即ち夾雑タンパク質、例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、フィブリノゲン、トランスフェリンの結合を可能にするために使用される条件で使用されるが、ＩｇＧは非吸着物中にある。ＩｇＡおよびＩｇＭは、例えばイオン強度を高めることにより陰イオン交換カラムから溶出され得る。
【００１４】
加えて、製品の純度を高めるために様々なクロマトグラフィー分離プロセスが開発されている。最高の成績をもたらすもの（具体的には特許文献１、特許文献２）は、一方が陰イオン交換を使用し他方が陽イオン交換を使用する２つ以上の連続クロマトグラフィー工程を含む。これらのプロセスの特異性は、従来の実施条件下ではＩｇＧを吸着しないが前精製工程中に共精製される他のタンパク質の大部分に結合するという陰イオン交換体の特性によりもたらされる。
【００１５】
血漿またはその画分、例えばＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩからのＩｇＧの精製に関する特許文献３では、カプリル酸による前処理後に２つのクロマトグラフィー工程がある。第１の工程ではＩｇＡに結合するために強陰イオン交換体が使用され、第２の工程ではＩｇＭに結合するために弱陰イオン交換体が使用される。発明者らは、高塩濃度でによりＩｇＡおよびＩｇＭをそれぞれ溶出することができたと主張する。
【００１６】
多くのＩｇＡ分画方法が文献に記載されているが、製薬業界で販売されているＩｇＡ免疫療法製品は驚くほどわずかである。免疫療法上での使用に関するＩｇＡの有効性は技術的制約により制限されていると思われる。ＩｇＡの大規模分画方法は高純度製剤（即ち９０％超）の調製に失敗しており、小規模精製法（例えば抗ＩｇＡ親和性カラム）は商業的に実現可能な製品を提供することができない。従って、免疫療法上での使用に適した高純度ＩｇＡ製剤を調製するＩｇＡの大規模精製方法が望ましい。特に、ＩｇＧはＩｇＡの抗炎症特性に悪影響を及ぼす可能性があるという事実に起因して、ＩｇＧフリーのＩｇＡが非常に望ましい。
【００１７】
ＩｇＡは、硫酸アンモニウム、エタノール、カプリル酸、ポリエチレングリコール等の沈殿とクロマトグラフィー技法との様々な組み合わせを使用して、血漿または他の体液から分画され得る。ＩｇＡの単離に使用されるクロマトグラフィー樹脂として、ＤＥＡＥセルロース、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０、抗ＩｇＧ免疫吸着剤および抗ＩｇＭ免疫吸着剤による親和性クロマトグラフィー、Ｊａｃａｌｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆａｓｔｆｌｏｗ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６、チオール基吸着（thiophilic adsorption）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂにコンジュゲートされた抗ＩｇＡ抗体、プロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィー（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）が挙げられる。しかしながら、これらの技法のいずれによっても、血漿または他のＩｇＡを含む材料からのＩｇＡの精製が商業的に実行可能になる大規模精製プロセスがこれまで実現されていない。
【００１８】
特許文献４には、免疫グロブリン含有出発材料中の免疫グロブリンＩｇＧおよびＩｇＡを互いに、ならびにそれらの高分子凝集体からも、ならびに出発材料中に既に存在していた、またはヒドロキシアパタイト、特にセラミックヒドロキシアパタイトを使用する精製工程中におよび更なる精製工程中に生じた他の高分子夾雑物質からも分離する方法が記載されている。この特許出願に記載されたプロセスはＩｇＡを含む溶液の大規模生産に適しているが、改善されたプロセスを開発することが望ましくなるいくつかの欠点を有する。例えば、出発材料として使用する材料は画分ＩＩ＋ＩＩＩから得られたＣｏｈｎ画分ＩＩＩであり、このことは、この画分を次いでＩｇＧ生産に使用することができなかったことを意味しており、商業的な魅力が弱くなる。加えて、得られるＩｇＡ溶液は、許容される純度の製剤を得るためにいくつかの更なる精製工程（クロマトグラフィー）を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】ＥＰ０７０３９２２
【特許文献２】ＷＯ９９／６４４６２
【特許文献３】米国特許第６，３０７，０２８号
【特許文献４】ＷＯ９７／２５３５２
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｅｒｉｋ  Ｊ．Ｗｉｅｒｓｍａら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５９７９〜５９８９頁
【非特許文献２】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｌ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１３９：４３〜７０頁
【非特許文献３】Ｅｉｂｌ，Ｍ．ら（１９８８）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１９：１〜７頁
【非特許文献４】Ｃｏｈｎら（１９４６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８、４５９頁
【非特許文献５】Ｏｎｃｌｅｙら（１９４９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１、５４１頁
【非特許文献６】Ｒｅｖ．Ｆｒａｎｃ．Ｅｔ．Ｃｌｉｎ．ｅｔ  Ｂｉｏｌ．１９６９、ＸＩＶ、１０５４頁
【非特許文献７】Ｃｒｉｐｐｓ，Ａ．Ｗ．ら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５７：１９７〜２０４頁
【非特許文献８】Ｄｏｅｌｌｇａｓｔ，Ｄ．Ｊ．ら（１９７６）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１３：１３５〜１３９頁
【非特許文献９】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．ら（１９８７）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１６Ｂ：１１９３〜１１９７頁
【非特許文献１０】Ｌｅｉｂｌ，Ｈ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６：４０８〜４１０頁
【非特許文献１１】Ｐｅｊａｕｄｉｅｒ，Ｌ．ら（１９７２）Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．２３：１６５〜１７５頁
【非特許文献１２】Ｒｏｑｕｅ−Ｂａｒｒｉｅｒａ，Ｍ．ら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１７４０〜１７４３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
従って、本出願人は、ＩｇＡを含む組成物および／または免疫グロブリン含有材料からの免疫グロブリンＡおよび免疫グロブリンＭの製剤用の新規のクロマトグラフィープロセスを開発した。有利なことに、ＩｇＧの精製および単離のプロセス中に得られる副画分および／または廃棄物をＩｇＡ（およびＩｇＭ）の単離および精製に使用することができる。
【００２２】
新規な方法には、文献に記載された他の方法に比べていくつかの利点がある。本方法は、塩勾配を有さない単純な連続的および選択的溶出を特徴とする。弱酸性からわずかにアルカリ性の条件でのジカルボン酸ならびに／またはジヒドロキシ−ジカルボン酸およびヒドロキシ−トリカルボン酸（またはそれらの塩）の使用により、陰イオン交換樹脂の荷電表面に対する高い競合作用が可能になる。加えて、各ピーク画分の溶出中にｐＨは一定のままである。加えて、溶出緩衝液のｐＨは一定である。
【００２３】
本プロセスにより免疫グロブリンをサブ画分中に分離することができ、該サブ画分は、高純度のＩｇＡ濃縮物およびＩｇＭ濃縮物を生産するための出発材料としての役割を果たすことができる。加えて、本プロセスにより、分離サブ画分中に富化された単量体免疫グロブリンおよび二量体／多量体免疫グロブリンが得られる。本方法により、単一のイオン交換クロマトグラフィー工程によって免疫グロブリンのいくつかの有用な濃縮物を生産することができ、該濃縮物は次いで、所望の単量体ＩｇＡまたは二量体ＩｇＡが富化されている組成物を得るために更に処理され得る。有利なことに、記載した方法により、現在の最先端の高純度ＩｇＡ製剤の精製方法技術に比べて著しい改善がもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
従って、本発明の一態様は、
（ａ）ＩｇＡを結合させる条件下で陰イオン交換体上に組成物をロードする工程、
（ｂ）２つ以上の酸基を有する物質を含むアルカリ性溶出溶液をアプライする工程を含み、
工程（ｂ）中に溶出したタンパク質は単量体ＩｇＡが富化されている、ＩｇＡを含む組成物からＩｇＡを富化する方法である。
【００２５】
好ましくは、低導電率溶液を陰イオン交換体にアプライすることにより、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に前溶出工程（ａ１）を実行する。好ましくは、この工程（ａ１）を弱酸性から中性のｐＨで行なう。
【００２６】
好ましくは、工程（ｂ）での物質は、多価カルボン酸もしくは多価ヒドロキシ−カルボン酸またはそれらの塩および／またはリン酸塩から選択され、より好ましくは、物質は、酒石酸／酒石酸塩、シュウ酸／シュウ酸塩、マロン酸／マロン酸塩、マレイン酸／マレイン酸塩等のジヒドロキシ−ジカルボン酸および／もしくはジカルボン酸またはそれらの塩、クエン酸／クエン酸塩等のヒドロキシ−トリカルボン酸もしくはその塩、および／またはリン酸塩から選択される。ジヒドロキシ−ジカルボン酸またはその塩は、好ましくは酒石酸／酒石酸塩、シュウ酸／シュウ酸塩、マロン酸／マロン酸塩およびマレイン酸／マレイン酸塩から選択される。より好ましくは、ジヒドロキシ−ジカルボン酸またはその塩は、酒石酸／酒石酸塩またはシュウ酸／シュウ酸塩である。好ましい実施形態では、工程（ｂ）でのアルカリ性溶液のｐＨは、追加の緩衝成分を、好ましくはｐＨ７．６±０．４でＴｒｉｓ緩衝液を、１〜２０ｍＭの、好ましくは２〜１５ｍＭの、より好ましくは５〜１０ｍＭの最終濃度まで添加することにより安定化されている。
【００２７】
好ましくは、工程（ｂ）中に回収した溶出物は本質的にＩｇＭを含まない。
【００２８】
本発明の別の態様は、陰イオン交換体の強力な競合体を含む酸性溶出溶液をアプライすることにより実行する更なる溶出工程である追加の（任意選択の）工程（ｃ）を有する、前述した方法である。好ましくは、工程ｃ中に溶出したタンパク質は二量体
ＩｇＡが富化されている。
【００２９】
好ましくは、工程（ｃ）での陰イオン交換体の強力な競合体は、クエン酸／その塩、ベンゼンスルホン酸／その塩、安息香酸／その塩、および硫酸水素イオンの塩またはそれらの混合物から選択される。より好ましくは、陰イオン交換体の強力な競合体はクエン酸塩である。
【００３０】
本発明の方法で使用する陰イオン交換体は、強陰イオン交換体または弱陰イオン交換体であり得る。好ましくは、陰イオン交換体は、陰イオン交換リガンド、例えば第四級アンモニウム、第四級アミノエチル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルまたはジメチルアミノエチルを含む。より好ましくは、陰イオン交換体は、ＭＰＨＱ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＰおよびＦＦ）、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（低置換型および高置換型）、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＸＰ、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ  ＡＮＸ、Ｍａｃｒｏ  Ｃａｐ  Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  Ｑおよび１５  Ｑ、Ｑ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌ、Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｑ  ６５０Ｍ、ＱＡＥ  ５５０  Ｃ、ＤＥＡＥ  Ｂｉｏｇｅｌ  Ａ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥ、Ｆｒａｇｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥならびにＦｒａｇｔｏｇｅｌ  ＤＭＡＥから選択される。
【００３１】
好ましくは、ＩｇＡを含む組成物は血液、血清、血漿もしくは他の体液である、またはこれらに由来する。より好ましくは、ＩｇＡを含む組成物は、血漿分画中にまたは血漿からのＩｇＧの精製中に得られる中間体または副画分である。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、ＩｇＡを含む組成物はＩｇＧ精製プロセスの中間体であり、本発明の方法で使用する陰イオン交換体はＩｇＧ生産プロセスの一部である。ＩｇＧを陰イオン交換体の通過画分中に主に見出すことができ、ＩｇＡを前述した方法に従って溶出させる。
【００３３】
本発明の別の好ましい態様では、ＩｇＡを含む組成物は、沈殿物の可溶化により得られる。好ましくは、沈殿物は、ＩｇＧ精製中に得られるオクタン酸沈殿物である。オクタン酸沈殿の上清は通常、更に処理されてＩｇＧが精製される。好ましくは、可溶化工程は、ＩｇＡおよびＩｇＧを選択的に溶液にする。好ましくは、可溶化を、１〜１５ｍＳ／ｃｍの導電率および３．５〜６または７〜９．５のｐＨを有する溶液を使用して実行する。より好ましくは、可溶化を、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液および／またはこれらの緩衝液の内の２つもしくはそれ以上の組み合わせにより実行する。更により好ましくは、緩衝液は、ｐＨ４．８である、０．２２Ｍの酢酸塩緩衝液または０．１５Ｍのリン酸塩緩衝液から選択される。
【００３４】
好ましくは、緩衝液と中間沈殿物とを１：５〜１：１２の比で使用する。
【００３５】
本発明の別の態様は、連続溶出により単量体ＩｇＡと二量体ＩｇＡとを分離するための陰イオン交換クロマトグラフィーの使用である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、ＩｇＡを含む組成物からのＩｇＡ富化画分の改善した調製方法に関する。本発明の方法により得られる画分から、高純度のＩｇＡ濃縮物を治療用途のために生産することができる。本方法は、微酸性から中性のｐＨで行なう単一の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含み、それにより、ＩｇＡをクロマトグラフィー固定相上に保持することができるがＩｇＧの大部分は比較的純粋な形で通過画分中に回収される。その後、保持したＩｇＡおよび他の夾雑物を、微酸性からアルカリ性のｐＨにおいて連続的で選択的な溶出を使用して分画する。本発明はまた、単量体ＩｇＡと二量体ＩｇＡとを分離するためのクロマトグラフィープロセスに関する。
【００３７】
ＩｇＡを含む組成物は、ＩｇＡを含有する任意の材料であってよく、好ましくは体液であってもよい。好ましくは、ＩｇＡを含む組成物は血液、血漿もしくは血清であり、またはこれらに由来する。ＩｇＡを含む組成物は、例えばＣｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙ（Ｃｏｈｎら（１９４６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８、４５９頁；Ｏｎｃｌｅｙら（１９４９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１、５４１頁）に記載されている、低温エタノール分画プロセスによるペーストもしくは沈殿物の溶液であってよく、好ましくは画分（ＦＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）、（ＦＩＩ＋ＩＩＩ）もしくはＦＩＩＩの溶液であってもよく、またはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｃｈｍａｎプロセス（Ｈ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎら（１９５４）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７、８６６〜７３頁）もしくはその修正に記載されている沈殿物Ａ、沈殿物Ｂおよび沈殿物Ｇの溶液であってもよい。
【００３８】
ＩｇＡを含む組成物は、好ましくは、血漿からのオクタン酸沈殿、ポリエチレングリコール沈殿および／もしくは硫酸アンモニウム沈殿を使用するＩｇＧの精製中に得られる中間沈殿物の溶液または中間溶液もしくは廃棄物画分、または任意のＩｇＡを含む中間体もしくは廃棄物画分である。しかしながら、他のＩｇＡ含有出発材料を使用する方法も本発明に含むように意図される。例えば、本発明の方法を使用して、ＩｇＡを他の体液、例えば母乳または唾液から富化してもよい。
【００３９】
好ましくは、出発材料は、前述した血漿または血漿画分からのＩｇＧの精製プロセス中に陰イオン交換体へアプライするために調製された、上流処理工程により免疫グロブリンが既に富化されている中間溶液である。好ましくは、ＩｇＧの大部分は陰イオン交換体に結合せず、ＩｇＧを精製するために更に直接処理され得る。中間溶液に含有されているＩｇＡの大部分を含む、結合した材料を、次いで本発明の方法に従って溶出させてもよい。
【００４０】
出発材料として沈殿物を使用する場合、数時間にわたって緩衝液中に沈殿物を再懸濁させることにより、ＩｇＡを沈殿物（処理画分または副／廃棄物画分）から抽出することができる。好ましくは、再懸濁工程中にＩｇＡおよびＩｇＧを選択的に可溶化させることができる。好ましくは、１〜１５ｍＳ／ｃｍの、より好ましくは５〜１５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶液を使用して可溶化を実行する。ｐＨは３．５〜６または７〜９．５のいずれかである。酸性のｐＨを選択する場合、ｐＨは好ましくは４〜５．５であり、より好ましくは４．５〜５．２であり、最も好ましくは約４．８である。アルカリ性のｐＨを選択する場合、ｐＨは好ましくは７〜９であり、より好ましくは７．５〜８．５である。好ましくは、約４．８のｐＨでリン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液を使用し、これらの緩衝液の内の２つまたはそれ以上の組み合わせも使用することができる。より好ましくは、ｐＨ４．８で０．１〜０．２Ｍの、好ましくは０．１５Ｍのリン酸塩緩衝液または０．１〜０．３Ｍの、好ましくは０．２Ｍの酢酸塩緩衝液により可溶化を実行する。しかしながら、当業者は、更に適した緩衝液を見出すことができるであろう。緩衝液と沈殿物との比は約１：５〜１：１２であり、好ましくは１：５、１：７、１：１０または１：１２であるが、他の比も使用することができる。可溶化を、適切な混合器（例えば、例えばＧｒａｂｅｒのＶｉｂｒｏ混合器または例えばＥｋａｔｏのＶｉｓｃｏｐｒｏｐ）を使用する強振とう下で、２時間以上にわたって、好ましくは４時間以上にわたって、更により好ましくは終夜にわたって実行する。
【００４１】
場合により、可溶化後に、例えば深層ろ過により清澄化工程を実行してもよい。
【００４２】
本発明の方法に係る第１の工程は、ＩｇＡを含む組成物を陰イオン交換体上にロードすることである。陰イオン交換体をカラム、膜、任意の種類のマトリクス、樹脂または他の基材として設けることができ、該陰イオン交換体は陰イオン交換リガンドを含む。ロード段階中にＩｇＡを陰イオン交換体上に保持することができる条件下で実行する限り、本発明の方法は、任意の種類の陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陰イオン交換体または混合モードの陰イオン交換体上で実行することができ、一方でＩｇＧが比較的純粋な形で通過画分中に回収される。
【００４３】
陰イオン交換リガンドは正に帯電した基である。例えば、陰イオン交換体はリガンドとして、第四級アンモニウム、第四級アミノエチル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルまたはジメチルアミノエチル等の基を含むことができる。適切な陰イオン交換体の例として、ＭＰＨＱ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＰおよびＦＦ）、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（低置換型および高置型）、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＸＰ、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ  ＡＮＸ、Ｍａｃｒｏ  Ｃａｐ  Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０  Ｑおよび１５  Ｑ、Ｑ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃｅｌ、Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｑ  ６５０Ｍ、ＱＡＥ  ５５０  Ｃ、ＤＥＡＥ  Ｂｉｏｇｅｌ  Ａ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥならびにＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＭＡＥが挙げられる。最も好ましい陰イオン交換体は、ＭＰＨＱまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ＭＤである。
【００４４】
ロードを、ＩｇＡを陰イオン交換体に結合させる条件下で行なう（工程（ａ））。典型的には、多くの場合には２つの緩衝系（平衡緩衝液１および２）により使用前に陰イオン交換体を平衡化し、平衡緩衝液２をロード前に使用する。通常、ＩｇＡを含む溶液を、平衡緩衝液（２つの緩衝系を使用する場合には平衡緩衝液２）と同様なｐＨおよび導電率を有すように調整する。平衡緩衝液は、使用する陰イオン交換体に適している一般的な緩衝系である。平衡緩衝液１の導電率は５〜５０ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは５〜４５ｍＳ／ｃｍである。ｐＨは３〜８である。適切な緩衝液の例として、リン酸塩緩衝液もしくは酢酸塩緩衝液またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、緩衝液はｐＨ３〜５の酢酸塩緩衝液またはｐＨ７〜８のリン酸塩緩衝液である。平衡緩衝液１の最も好ましい選択は、ｐＨ３．５〜４．５および約８ｍＳ／ｃｍの導電率の約０．８Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ７〜８および約４０ｍＳ／ｃｍの導電率の約０．５Ｍのリン酸塩緩衝液、またはｐＨ７〜８および約１０ｍＳ／ｃｍの導電率の約０．１Ｍのリン酸塩緩衝液である。平衡緩衝液２の導電率は０．５〜１．５ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．７〜１．３ｍＳ／ｃｍである。ｐＨは５〜８．５である。平衡緩衝液２の適切な選択の例として、リン酸塩、酢酸塩およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、緩衝液はｐＨ６〜７の酢酸塩緩衝液またはｐＨ７〜８のリン酸塩／酢酸塩緩衝液である。平衡緩衝液２に関する最も好ましい緩衝液は、ｐＨ６〜６．６および約１ｍＳ／ｃｍの導電率の約１０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ６〜６．６および約１ｍＳ／ｃｍの導電率の約７．５ｍＭのリン酸塩および２．５ｍＭの酢酸塩緩衝液、またはｐＨ６〜６．６および約１ｍＳ／ｃｍの導電率の約５ｍＭのリン酸塩および１０ｍＭの酢酸塩緩衝液である。
【００４５】
陰イオン交換体へのロード後に該イオン交換体を概して平衡緩衝液２で洗浄し、任意の結合していない材料を除去する。
【００４６】
場合により、前溶出工程を行なって緩く結合した材料を除去してもよい。これを、リン酸塩、酢酸塩およびそれらの組み合わせを含有する緩衝液により行なってもよい。本発明において、好ましくは前溶出を低導電率溶液により、好ましくは弱酸性または中性のｐＨで実行する。より好ましくは、好ましくは約５〜１５ｍＭのリン酸塩および１５〜４５ｍＭの酢酸塩の濃度で、より好ましくは約１０ｍＭのリン酸塩および３０ｍＭの酢酸塩で、リン酸塩／酢酸塩緩衝液を使用する。前溶出緩衝液のｐＨは約６．０〜６．８であり、好ましくは６．０のｐＨを使用するが、当業者は他の適切な緩衝液を選択することができるであろう。本発明では、前溶出画分（単数または複数）は主にＩｇＧを含有し、ＩｇＡを含む組成物がＩｇＡの量に比べて大量のＩｇＧを含有する場合に前溶出を好ましくは使用する。
【００４７】
任意選択の前溶出工程後に、緩衝液を第１の溶出緩衝液に変更する（工程（ｂ））。本発明者らは、多価カルボン酸もしくは多価ヒドロキシカルボン酸またはそれらの塩を使用することにより、好ましくはジヒドロキシ−ジカルボン酸もしくはヒドロキシ−トリカルボン酸またはそれらの塩を使用することにより、第１の溶出中に回収した材料の、概して画分（単数または複数）中のＩｇＡが、主に単量体ＩｇＡが良好に富化されるという利点を発見した。あるいは、リン酸塩緩衝液をこの溶出工程に使用してもよい。好ましくは、第１の溶出中に回収した材料は本質的にＩｇＭを含まない。好ましくは、アルカリ性ｐＨ、例えばｐＨ７．２〜９．０の、より好ましくは７．４〜７．８の、最も好ましくは約７．６のｐＨを使用する。好ましくは、ジヒドロキシ−ジカルボン酸もしくはヒドロキシ−トリカルボン酸またはそれらの塩は、酒石酸／酒石酸塩、シュウ酸／シュウ酸塩、マロン酸／マロン酸塩、マレイン酸／マレイン酸塩またはクエン酸／クエン酸塩から選択される。好ましくは、第１の溶出緩衝液は、多価カルボン酸もしくは多価ヒドロキシ−ジカルボン酸またはそれらの塩を５〜１００ｍＭの、より好ましくは２０〜８０ｍＭの、更により好ましくは２５〜６５ｍＭの、最も好ましくは約５５ｍＭの濃度で含有する。加えて、第１の溶出緩衝液は、他の緩衝物質、例えば酢酸ナトリウムを含有してもよい。例えば、第１の溶出緩衝液は、１〜２０ｍＭの酢酸ナトリウムを、好ましくは１〜１０ｍＭの酢酸ナトリウムを、最も好ましくは５ｍＭの酢酸ナトリウムを含有してもよい。好ましくは、第１の溶出溶液は、追加の緩衝成分をｐＨ７．６±０．４で、好ましくはＴｒｉｓを、１〜２０ｍＭの、好ましくは２〜１５ｍＭの、より好ましくは５〜１０ｍＭの最終濃度まで含むことができる。当業者は、第１の溶出溶液の所望のｐＨおよび導電率を達成するのに適した他の物質およびその適切な濃度を選択することができるであろう。
【００４８】
より好ましくは、第１の溶出溶液中のジヒドロキシ−ジカルボン酸またはその塩は酒石酸塩またはシュウ酸塩であり、最も好ましくは酒石酸塩である。
【００４９】
好ましくは、第１の溶出中に回収した材料は単量体ＩｇＡが富化されており、および本質的にＩｇＭを含まず、即ちＩｇＭが枯渇している。
【００５０】
本発明のより好ましい実施形態では、第２の溶出工程である追加の工程（ｃ）を実行する。工程（ｃ）で溶出した材料、概して画分（単数または複数）は、Ｊ鎖含有ＩｇＡ等の二量体ＩｇＡが富化されている。ＩｇＡを含む組成物中にＩｇＭが存在する場合、この工程でＩｇＭも溶出される可能性がある。
【００５１】
第２の溶出工程が望まれる場合、緩衝液を次いで第２の溶出緩衝液に変更してもよい。好ましくは、第２の溶出緩衝液は、陰イオン交換体から結合したタンパク質を置き換えるために、陰イオン交換体の強力な競合体を含有してもよい。そのような強力な競合体の例として、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、および硫酸水素塩の塩またはそれらの混合物が挙げられる。最も好ましい競合体はクエン酸塩である。好ましくは、第２の溶出緩衝液のｐＨは約３．０〜６．０であってもよく、より好ましくは約４．５〜５．５であってもよく、最も好ましくはｐＨは５．０である。好ましくは、第２の溶出緩衝液中のクエン酸の濃度は１〜１００ｍＭであり、より好ましくは１〜５０ｍＭであり、更により好ましくは約２５ｍＭである。加えて、第２の溶出緩衝液は他の緩衝物質、例えばリン酸塩を含有してもよく、好ましい濃度は４０〜５０ｍＭである。最も好ましくは、第２の溶出緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび２５ｍＭのクエン酸塩を５．０のｐＨで含有してもよい。
【００５２】
ＩｇＡが富化されているまたは単量体ＩｇＡもしくは必要に応じて二量体ＩｇＡが富化されている材料または画分を次いで必要に応じて貯蔵し、場合により更に処理する。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを実行して例えば二量体ＩｇＡをＩｇＭおよび単量体ＩｇＡから分離してもよく、親和性クロマトグラフィーを使用して（例えばプロテインＡ親和性クロマトグラフィーであるＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＭにより）残余のＩｇＧおよび／もしくはＩｇＭを除去してもよく、ならびに／または第２のイオン交換クロマトグラフィーを使用して不純物（例えば陰イオン交換体、主に好ましくはモノリスエチレンジアミン（ＥＤＡ））を分離してもよい。所望の純度を引き出すために当業者により他の工程が考案され得る。
【００５３】
加えて、任意の病原体、例えばウイルスまたはプリオンタンパク質を除去するための工程を任意の商業的プロセスに含めることができる。そのような処理工程は当業者に公知であり、例えばナノろ過、溶媒／界面活性剤処理、低温殺菌等の方法から選択され得る。
【００５４】
本発明はまた、第１の溶出工程で溶出される単量体ＩｇＡと第２の溶出工程で溶出される二量体ＩｇＡとを分離するための陰イオン交換クロマトグラフィーの使用も提供する。同じことを、適切な調整により、特に出発材料、即ち他の免疫グロブリンアイソタイプに対しても適用することができたことが予想される。工業的規模で実行することができるプロセスに単量体と二量体または多量体の免疫グロブリンとの分離を提供することは挑戦的であり、なぜならば、分離する必要があるタンパク質の特性が非常に類似しており、通常は工業的規模での使用に適しているプロセスによる分離に適応できないからである。
【００５５】
本発明の更なる態様は、本発明の方法により得ることができる組成物、およびそれから得られる製品である。そのような組成物を、例えば更なる精製工程によりおよび／または製剤化により、更に処理してもよい。例えば、薬学的に許容される賦形剤または担体を添加してもよく、必要な場合には安定剤を添加してもよく、必要に応じて増粘剤または粘度降下剤を添加してもよい。凍結乾燥も選択肢である。製品の所望の医学的用途に応じて適切な製剤を選択することができる。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、ＩｇＡは、ヒト血漿からのＩｇＧの精製プロセス中に得ることができる副画分および／または廃棄物から得られる。典型的には、複数のドナーからの血漿サンプルを貯蔵し、使用するまで凍結する。血漿を次いで融解させ、遠心分離し、および上清（脱クリオ血漿（cryo-poor plasma））に対してＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ  Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎまたはそれらの改変に従ってエタノール分画を行なう。一般に、ｐＨをある特定の範囲に調整し、エタノールをある特定の濃度まで添加し、概して４℃での数時間のインキュベーション中に沈殿物が生じ、沈殿物と可溶部とを分離して更なる処理に使用する。この工程は概して、所望の沈殿物および溶液が得られるまで、より高いエタノール濃度等を有する可溶部に対して繰り返される。
【００５７】
免疫グロブリン含有沈殿物を概して、終夜にわたって振とうしつつ、０．１〜０．３Ｍの、好ましくは０．２Ｍの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．８）を使用して可溶化する。次いで、オクタン酸沈殿を実行し、上清を更に処理してＩｇＧを精製する。沈殿物はＩｇＡを含有し、該沈殿物を可溶化することができ、次いで本発明の方法に従って更に処理してもよい。
【００５８】
前述したように、上清を使用して血漿ＩｇＧを更に精製してもよい。典型的には、緩衝液の変更を実行し、次いで材料を陰イオン交換クロマトグラフィーにアプライする。精製したＩｇＧを通過画分中に回収し、ＩｇＧの精製のみが所望される場合には、陰イオン交換体に結合したタンパク質を厳しい条件（例えば１ＭのＮａＣｌまたは１ＭのＮａＯＨ）の洗浄手順中に除去して廃棄する。
【００５９】
しかしながら、ＩｇＡの更なる精製が所望される場合には、次いで陰イオン交換体を前述したように溶出させ、単量体ＩｇＡおよび／または二量体ＩｇＡが富化された溶出物を得る。必要な場合には、ＩｇＭも回復させることができる。典型的には、適切な洗浄工程後に、ｐＨ６．０のリン酸塩／酢酸塩緩衝液を使用して前溶出を実行する。前溶出中に回収した材料をＦ３と称し、該材料は主にＩｇＧを含有する。
【００６０】
典型的には、次いでｐＨ７．３〜７．８の酒石酸塩／酢酸塩緩衝液を使用して第１の溶出を実行する。この工程中に材料Ｆ４が溶出され、該材料Ｆ４は単量体ＩｇＡが富化されているがＩｇＧも含有する。有利なことに、この材料中にはＩｇＭは見出されない。前記に開示したように、他の緩衝液の使用も本発明に含まれる。
【００６１】
必要な場合には、次いで約５のｐＨでクエン酸塩／リン酸塩緩衝液を使用して第２の溶出工程を実行する。この工程のために本発明に従って使用され得る他の緩衝液は前記に開示されている。第２の溶出により材料Ｆ５が提供され、該材料Ｆ５はＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを含有する。この材料では二量体ＩｇＡが富化されている。
【００６２】
病原体の不活性化および／または除去工程、例えばナノろ過を適切な段階でこれらのプロセスに組み入れ、生じる材料の安全性を確保することができる。病原体を不活性化するおよび除去するために多くの方法が説明されており、当業者は、そのような工程を過度な負担なしに本プロセスに組み入れることができるであろう。
【００６３】
前述したように、オクタン酸沈殿物も本発明の方法に適した出発材料である。発明者らは、３．５〜６または７〜９．５のｐＨで低導電率の溶液を用いる可溶化により、ＩｇＡおよびＩｇＧを優先的に溶液にするという利点を発見した。例えば、緩衝液は酢酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液であることができるが、他の緩衝液を使用することもできる。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態は、ＩｇＡを含む組成物および／または免疫グロブリン含有材料からのＩｇＡ（およびＩｇＭ）の分離方法であり、該方法は：
（ｉ）ＩｇＡを含む組成物をマクロ多孔質陰イオン交換樹脂にロードすること、
（ｉｉ）連続的で選択的な脱離／溶出後にＩｇＡを交換樹脂から単離すること、
（ｉｉｉ）以下から成る連続溶出
Ａ）ＩｇＧ画分が得られる弱酸性から中性のｐＨでの前溶出工程
Ｂ）微アルカリ性ｐＨでジカルボン酸もしくはジヒドロキシ−ジカルボン酸またはそれらの塩および／またはリン酸塩を使用し、単量体ＩｇＡ４０〜６０％以上および最大でＩｇＧ６０％までを含有する画分が得られる第１の溶出工程。この画分はＩｇＭが枯渇している。
Ｃ）酸性ｐＨでヒドロキシ−トリカルボン酸またはその塩、ベンゼンスルホン酸またはその塩、安息香酸またはその塩および硫酸水素イオンの塩またはそれらの混合物のいずれかを使用し、ＩｇＭ約４５％、ＩｇＡ２５％（大部分は二量体／多量体）、ＩｇＧ２５％および免疫グロブリン以外の夾雑物５％を含有する画分が得られる第２の溶出工程を特徴とする。
【００６５】
本方法を場合により、非常に直接的な方法で血漿分画の様々なプロセスに組み込むことができ、該方法は、常に同じ中間ＩｇＡ組成物をもたらす。
【００６６】
生じる画分から、高純度のＩｇＡ（およびＩｇＭ）濃縮物が可能な治療用途のために生産され得る。連続的で選択的な溶出がパイロットプラント規模で既に評価されている。
【００６７】
定義
用語「ＩｇＡを含む組成物」は、ＩｇＡを含有する任意の液体組成物に関する。具体的には、この組成物は、唾液、涙液または粘液等の体液、例えば治療目的のためのＩｇＧ等の血漿タンパク質を精製するための血漿の処理中に得ることができる任意の血漿画分または副／廃棄物画分であることができる。本用語はまた、インビトロで生産されたＩｇＡの組成物、例えばモノクローナルＩｇＡまたは組換え生産されたＩｇＡ、例えば細胞株から分泌されたＩｇＡも含む。
【００６８】
用語「富化する」または「富化」は本発明において、例えば精製工程後の、組成物中のタンパク質の総含有量に対する標的タンパク質の量の著しい増加に関する。標的タンパク質の純度が２０％以上、好ましくは３０％以上、更により好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％超で増加した場合に富化が達成されるであろう。
【００６９】
用語「純粋」は、本質的に標的タンパク質のみを含む組成物に関する。本発明において、溶液が９０％（ｗ／ｗ）超のＩｇＡを、好ましくは９５％超のＩｇＡを、より好ましくは９８％超のＩｇＡを含有する場合には、溶液は純粋なＩｇＡ溶液であろう。
【００７０】
用語「イオン交換クロマトグラフィー」は、イオンをその電荷に基づいて分離することが可能なプロセスに関する。本発明では陰イオン交換クロマトグラフィーを使用し、負に帯電した分子（例えば、負に帯電したドメインを示す、あるｐＨでの溶液中のタンパク質）は陽イオン基（陰イオン交換リガンド）により選択的に保持され、固体マトリクスに共有的に結合する。固体マトリクスは任意の適切な担持材料であることができ、およびビーズ、膜、または他の適切な固体支持構造体の形状であることができる。典型的には、固体マトリクスはビーズの形状であり、カラムとして使用されるであろう。しかしながら、陰イオン交換を行なう他の方法も本発明に含まれる。強陰イオン交換体が広範なｐＨ範囲にわたって帯電されるが、弱陰イオン交換体の帯電はｐＨにより変化するであろう。
【００７１】
「陰イオン交換体上にロードする」ことは、陰イオン交換クロマトグラフィーにかける溶液と、固体支持体上の陰イオン交換リガンドとを接触させることを意味する。典型的には本文脈において、本用語はクロマトグラフィー工程中におけるカラムへの供給を指すであろう。しかしながら、既に前述したように、本発明は、陰イオン交換体用のカラム構造体に限定されない。例えば、本発明をバッチ方式で実行することもできた。
【００７２】
用語「通過画分」は、クロマトグラフィー工程中に保持されない材料を指す。本発明において、通過画分は、結合していない、または陰イオン交換体に緩く結合しているだけの画分である。任意の所定の陰イオン交換体に関する通過画分は、使用する緩衝系に従って変化するであろう。
【００７３】
用語「溶出物」は、陰イオン交換体に結合したが、その後の条件の変更後に、即ち「溶出溶液」が陰イオン交換体にアプライされた後に、陰イオン交換体から放出される材料を指す。溶出物は概して、溶出溶液が陰イオン交換体にアプライされた後に画分中に回収される。
【００７４】
用語「中性ｐＨ」は約７のｐＨに関する。典型的には６．０〜７．５の範囲が中性であると見なされ、好ましくは６．５〜７．５の範囲が、より好ましくは６．８〜７．２の範囲が、最も好ましくは６．９〜７．１の範囲が中性であると見なされるであろう。
【００７５】
用語「弱酸性」は、約４．０〜６．５の範囲の、好ましくは５．０〜６．０の範囲の、より好ましくは５．５〜６．０の範囲のｐＨを指すであろう。
【００７６】
用語「低導電率」は、１５ｍＳ／ｃｍ未満の、好ましくは１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を指す。
【００７７】
用語「本質的にＩｇＭを含まない」は、存在する総タンパク質の１０％（ｗ／ｗ）未満のＩｇＭを、好ましくは５％未満を、更により好ましくは２％未満を、最も好ましくは１％未満のＩｇＭを指す。
【００７８】
用語「体液」は、母乳、唾液、粘液、涙液等の身体から排出されるまたは分泌される液体等の脊椎動物の体内由来の液体を含む。
【００７９】
用語「血漿」は、血液の液体成分（総血液量の約５５％）を指す。血漿は、アルブミン等の血漿タンパク質、免疫グロブリン（抗体）、凝固因子、ホルモン、およびグルコースまたはミネラルイオン等の他の成分を含有する。
【００８０】
用語「血清」は、フィブリノゲンおよび凝固因子が欠乏した血漿、即ち凝固が生じた後の液体画分に関する。
【００８１】
用語「血漿分画」は、血漿タンパク質の分離プロセスに関する。典型的には、血漿分画は、主なクラスの血漿タンパク質の最初の分離を可能にし、次いで更なる精製プロセスにかける血漿タンパク質の工業的規模の精製プロセスにおける最初の処理工程に関する。典型的には、Ｃｏｈｎ、ＯｎｃｌｅｙもしくはＫｉｓｔｌｅｒ  Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎまたはそれらの改変により説明されているように、分画をエタノールにより実行する。他の分画法は、オクタン酸、ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウム等の他の薬剤による沈殿に基づく。
【００８２】
用語「中間沈殿物」は、血漿タンパク質の下流精製プロセス中に実行することができる血漿分画または他の沈殿の結果として生じる沈殿物に関する。中間沈殿物は概して、様々な血漿タンパク質の混合物を含有する。
【００８３】
用語「沈殿物の可溶化」は、液体を、概して緩衝液を沈殿物に添加して該沈殿物に含有されるタンパク質を更なる精製工程用の溶液に戻すことに関する。
【００８４】
用語「副／廃棄物画分」は、通常は更に処理されない、即ち廃棄される、血漿分画または下流プロセスの中間体に関する。
【００８５】
以下の図を参照して、以下の非限定的な実施例により本発明をこれから説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】血漿分画の様々な中間沈殿物、または血漿からのＩｇＧの精製中に得られる副画分に基づくＩｇＡの富化プロセスを示すフロー図である。２つの出発材料を実証している（実施例１での方法１および実施例２での方法２）。
【図２】図１に示す方法１に従って陰イオン交換クロマトグラフィーにロードした材料（原料）の組成に関するＨＰＬＣ分析を示すグラフである。ｘ軸は溶出時間を示し、ｙ軸は２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡｕミリ吸光単位）を示す。
【図３】ｘ軸上にミリリットルで保持容量を示し、ｙ軸上に２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡｕ：ミリ吸光単位）を示す、陰イオン交換カラムの溶出プロファイルを示すグラフである。溶出溶液をプロファイルの上に示し、垂直線は、カラムにアプライする溶液の変更を示す。
【図４】方法１による画分Ｆ４Ａの組成に関するＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図５】親和性クロマトグラフィーによるＩｇＧ除去後のＦ４の組成に関するＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図６】親和性クロマトグラフィーによるＩｇＧおよびＩｇＭの画分Ｆ５の組成に関するＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図７−１】溶出緩衝液１として様々な緩衝液を使用する陰イオン交換カラムのプロセスに関する溶出プロファイルを示すグラフである。垂直の破線は、カラムにアプライする溶液の変更を示す。＊酢酸塩緩衝液による溶出に関してはロードを減少させた。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−２の続き。
【図８−１】ロードした総タンパク質と比較した、様々な溶出緩衝液により溶出１を実行した場合に得られた画分中のＩｇＡおよびＩｇＭの含有量の分析を示すグラフである。
【図８−２】図８−１の続き。
【図８−３】図８−２の続き。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は本発明を説明するのに役立つが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００８８】
以下の実施例では、血漿および／または血漿画分からのＩｇＧ精製プロセスを起源とする材料を本発明の出発材料として使用した。図１はＩｇＧ精製プロセスのフローチャートを示し、および本プロセスに本発明に係るＩｇＡ精製方法が導入され得る実施例を示す。
【００８９】
簡単に言うと、以下の工程を実行して血漿からＩｇＧを精製した：例えばＣｏｈｎまたはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎに従って、血漿または脱クリオ血漿を低温エタノール分画にかけ、免疫グロブリン含有画分を更に処理した。オクタン酸沈殿を実行し、次いで、大部分のＩｇＧを含有する懸濁液をろ過、ウイルス不活性化、および陰イオン交換（ＡＩＥＸ）クロマトグラフィーにかけた。大部分のＩｇＧをＡＩＥＸ通過画分中に回収し、最終製剤化および包装等の更なる処理にかけた。
【００９０】
図１に示すように、本発明に係るＩｇＡ精製方法は、低温エタノール分画から、例えばＦＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、ＦＩの上清、ＦＩＩ＋ＩＩＩ、沈殿物Ａまたはそれらのサブ画分に分岐され得た。しかしながら、好ましくは、オクタン酸沈殿物（オクタン酸ケーキ）から可溶化した材料を本発明の方法にかけて、または陰イオン交換カラムに結合した材料を本発明に係る連続溶出にかけて血漿ＩｇＡを得た。陰イオンカラムに結合した材料はこれまで廃棄されていたことから、該材料が好ましい。これらの材料からのＩｇＡ精製のプロセスの実行はＩｇＧプロセスを妨げず、その結果、ＩｇＧまたは他の血漿タンパク質の収率は全く減少せず、または決して損なわれない。それにも関わらず、本発明はこの出発材料に限定されない。
【００９１】
〔実施例１〕
溶出緩衝液１として酒石酸塩緩衝液を使用する、陰イオン交換（ＡＩＥＸ）カラムからのＩｇＡの連続溶出
血漿からのＩｇＧの精製プロセスを、基本的には図１に示すようにおよび簡単に前述したように実行した。ＩｇＧ精製プロセスでは、２種の緩衝液を使用して、即ち最初の２カラム容量（ＣＶ）では０．７８Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４．０±０．１、導電率８〜１０ｍＳ／ｃｍを使用し、続く８ＣＶでは１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ６．５±０．１、導電率０．８〜１．２ｍＳ／ｃｍを使用して、ＡＩＥＸカラム（ＭＰＨＱ）を平衡化した。図２はＡＩＥＸ原料組成物を示し、該ＡＩＥＸ原料組成物をＡＩＥＸカラムにロードし（樹脂１Ｌ当たりタンパク質約１８０ｇ）、その後、平衡化緩衝液２  ２ＣＶで洗浄した。この工程後、ＡＩＥＸカラムを連続溶出にかけた。
【００９２】
従って、リン酸塩酢酸塩緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩＋３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、導電率２〜７ｍＳ／ｃｍ）８ＣＶを使用して前溶出工程を実行した。図３に示すことができるように、前溶出工程中に画分Ｆ３が溶出し、該画分Ｆ３は主にＩｇＧを含有した。
【００９３】
この前溶出工程後、緩衝液を第１の溶出緩衝液（５〜８ＣＶ、５５ｍＭの酒石酸塩、５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ７．６±０．２、導電率５〜１５ｍＳ／ｃｍ）に変更した。酒石酸塩緩衝液への変更後に画分Ｆ４を回収し、該画分Ｆ４はＩｇＧとＩｇＡとを約６０：４０の比で含有し、本質的にＩｇＭを含まなかった。この画分に溶出したＩｇＡは主に単量体ＩｇＡであった。図３に示すことができるように、必要な場合には、いくつかのサブ画分（ピーク画分）をこの工程中に回収することができた。図４は、Ｆ４のサブ画分Ｆ４Ａの組成を示す。しかしながら、全てのサブ画分は、様々な比でＩｇＧおよび単量体ＩｇＡのみを含有した。
【００９４】
その後、５０ｍＭのリン酸塩および２５ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５．０、導電率５〜１５ｍＳ／ｃｍ）６ＣＶを第２の溶出緩衝液としてアプライした。第２の溶出緩衝液への変更後に画分Ｆ５が溶出し、該画分Ｆ５を、二量体ＩｇＡが富化されている２つのサブ画分（ピーク画分）で回収することができた（図３）。画分Ｆ５は、２０〜３０％のＩｇＡ（大部分は二量体／多量体）、３０〜５０％のＩｇＭおよび２０〜３５％のＩｇＧの比でＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧを含有した。
【００９５】
画分Ｆ４およびＦ５を親和性クロマトグラフィー（１工程または２工程）によりポリッシュしてＩｇＧおよびＩｇＭを選択的に除去した。ＨＰＬＣ分析により、画分Ｆ４から得られた生成物は高純度の単量体ＩｇＡである（図５）が、画分Ｆ５は二量体ＩｇＡが富化されている（図６）ことが明らかとなった。従って、この溶出方法により、画分Ｆ４中に単量体ＩｇＡが良好に富化され、画分Ｆ５中に二量体ＩｇＡが良好に富化された。
【００９６】
他のＡＩＥＸ材料（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、ＨｙｐｅｒＣｅｌ  Ｓｔａｒ  ＡＸ、Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）も試験し、同様の溶出プロファイルを得た。
【００９７】
〔実施例２〕
第１の溶出工程用の様々な緩衝液の試験
いくつかの異なる緩衝液を第１の溶出工程で評価し、酒石酸塩緩衝液の溶出プロファイルと比較した。
【００９８】
基本的には実施例１に記載したように実験を実行し、ＡＩＥＸ樹脂１Ｌ当たりタンパク質１００〜１８０ｇでタンパク質をロードした。しかしながら、第１の溶出に関しては、酒石酸塩緩衝液を、シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、酢酸塩緩衝液（５５ｍＭの各物質＋５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ７．６±０．２）に置き換えた。
【００９９】
得られた溶出プロファイルを図７に示す。２つ以上の酸基を有する物質を第１の溶出で使用する限りは、画分Ｆ４は全ての緩衝液に関して同じであるように見えたが、酢酸塩溶出プロファイルおよびリン酸塩溶出プロファイルは全く異なって見えた。しかしながら、第１の溶出もクエン酸塩緩衝液による第２の溶出に影響を及ぼした。シュウ酸塩緩衝液が同じようなＦ５ピークを生じることが分かった（図７）。マロン酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液では、第２の溶出中にＩｇＭが溶出しなかった。第１の溶出緩衝液として酢酸塩緩衝液では、ほとんど全てのＩｇＡとＩｇＭの全量とがＦ５中に溶出した。
【０１００】
ロードした総タンパク質に対するこれらの画分中のＩｇＡおよびＩｇＭの量を図８に示す。酒石酸塩およびシュウ酸塩では、単量体ＩｇＡがＦ４中に溶出するおよびＩｇＭと二量体ＩｇＡとがＦ５中に溶出するという好ましい溶出プロファイルが得られた。ヒドロキシジカルボン酸を使用する溶出のみが、全部で３つのＦ４サブ画分および単量体ＩｇＡの溶出をもたらした。リン酸塩緩衝液を使用する第１の溶出工程では、２つのみのサブ画分およびＩｇＡ溶出の軽減が示されたが、酢酸塩緩衝液では少量のＩｇＡを含むＦ４ピークが生じた。第１の溶出をマロン酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、またはリン酸塩緩衝液で行なった場合には、厳しい溶出条件を使用している（１ＭのＮａＣｌ）ストリップ画分（strip fraction）中に大きなピークが得られた。
【０１０１】
様々な画分中の免疫グロブリン含有量も表１に示す：
【表１】
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【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
有利なことに、我々は、そのような緩衝液のｐＨ、例えば酒石酸塩緩衝液のｐＨを、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．６±０．４を１〜２０ｍＭの、好ましくは２〜１５ｍＭの、より好ましくは５〜１０ｍＭの最終濃度まで添加することにより安定化させることができることを発見した。
【０１０４】
〔実施例３〕
オクタン酸沈殿物由来のＩｇＡの可溶化
図１に示すように、オクタン酸沈殿物（ＯＡケーキ）は、ＩｇＧ精製プロセス中に生じる別の廃棄物画分であった。この沈殿物は相当量のＩｇＡを含有することが分かっており、従って、ＩｇＡの精製用の良好な出発材料であった。
【０１０５】
ＯＡケーキとｐＨ４．８である０．１５Ｍのリン酸塩緩衝液とを１：６（ＯＡ沈殿物対緩衝液）の比で混合した。しかしながら、他の緩衝液を、例えばＴｒｉｓ緩衝液をＩｇＡの抽出に使用することもできた。可溶化した材料をろ過にかけ、次いでＡＩＥＸカラム（ＭＰＨＱ）にロードした。次いで、基本的には実施例１に記載したようにカラムを連続溶出させた。溶出プロファイルは基本的に図３に既に示したように見えた。
【０１０６】
ＡＩＥＸカラム用のＩｇＡを含む原料の組成は、実施例１での記載と比べてＩｇＧ対ＩｇＡの比が変化した。表２に示すように、画分Ｆ４におけるＩｇＧ対ＩｇＡの比はＩｇＡの方へのシフトした（１５％：８５％）。前溶出画分Ｆ３におけるＩｇＡの量も増加した。両方の画分ともＩｇＭを含まなかった。
【０１０７】
二量体化合物／多量体化合物の溶出は、出発材料の組成に起因して制限された。
【０１０８】
様々な画分中の免疫グロブリン含有量も表２に示す：
【表３】
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【０１０９】
更に他のＩｇＡを含む沈殿物による本調査を示すために、我々は他の沈殿物も試験した。またＩｇＡを２つの異なるエタノール沈殿物から可溶化してＡＩＥＸクロマトグラフィーにかけることができ、本発明の方法により非常に類似する溶出プロファイルが得られた。
【０１１０】
〔実施例４〕
単量体ＩｇＡのポリッシング
連続溶出により、夾雑物としてＩｇＧを含有する、単量体ＩｇＡが富化された画分（Ｆ４）が得られた。親和性クロマトグラフィー（Ｉｇ選択）によるＩｇＧの選択的除去によりポリッシング工程を実行した。
【０１１１】
画分Ｆ４を２つのサブ画分Ｆ４ＡおよびＦ４Ｂで回収した（図３）。しかしながら、得られたＦ４Ａ画分を限外ろ過／透析ろ過にかけてタンパク質を濃縮し、中性ｐＨである一般的な緩衝系に、好ましくはＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）に移した。このタンパク質溶液を親和性クロマトグラフィーの原料として使用した。ＩｇＡは親和性樹脂に結合せず、ＩｇＡを通過画分中に回収した。結合したＩｇＧをｐＨ３．０である０．１Ｍのグリシン緩衝液で溶出させた。最後に、ＩｇＡ生成物を安定した医薬組成物に製剤化することができた。図５は、ＩｇＧ（およびＩｇＭ）を含まない、ポリッシュしたＩｇＡ画分を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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