(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キスペプチン−５４、キスペプチン−５３、キスペプチン−５２、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、キスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）、およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの生体試料中の量を、質量分析により決定する方法であって、
（ａ）質量分析により検出可能な１種または複数の多価キスペプチン−５４由来ペプチドイオンを生成するのに適した条件下で、試料をイオン化に供することと、
（ｂ）前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドのそれぞれに由来する、４＋、５＋、６＋、および７＋からなる電荷を有するイオンの群から選択される１種または複数の多価イオンの量を質量分析により決定することと、
（ｃ）決定されたイオンの量を用いて、生体試料中の対応する１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量を決定することと、
（ｄ）生体試料中のキスペプチン−５４由来ペプチドの決定量を合計して、キスペプチン−５４が生体試料中で分解される前の、生体試料中のキスペプチン−５４の合計量を決定すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記生体試料が、前記群から選択される２種以上のキスペプチン−５４由来ペプチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の前に、キスペプチン−５４のＮ末端部分に特異的な抗体を用いて、１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの濃度を高めることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４を含んでなり、
ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１７２．４±０．５、９７７．２±０．５、および８３７．７±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）を含んでなり、かつ、
ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１４５０．５±０．５、１１６０．６±０．５、および９６７．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５３を含んでなり、かつ、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１４３．２±０．５、９５２．７±０．５、および８１６．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５２を含んでなり、かつ、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１１２．０±０．５、および９２６．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記質量分析がタンデム質量分析であり、かつ、ステップ（ａ）において生成した前記１種または複数の多価イオンが、キスペプチン−５４由来ペプチド断片イオンに断片化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、９７７．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０８３．６±０．５および９０３．１±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、８３７．７±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、９７７．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１６０．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０７１．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、９６７．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０７１．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５３を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１４３．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０５３．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５３を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、９５２．７±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０５４．１±０．５および８７８．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５３を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、８１６．７±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、８７８．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５２を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、１１１２．０±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１２７８．２±０．５および１０２２．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、キスペプチン−５２を含んでなり、ステップ（ａ）において生成した前記多価イオンが、９２６．８±０．５のｍ／ｚを有するイオンを含んでなり、かつ、前記断片イオンが、１０２２．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）におけるイオン化の前に、１種または複数の同位体標識キスペプチン−５４由来ペプチドを前記生体試料に添加することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の前に前記生体試料を酸性化に供することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の前に、前記生体試料をメタノールによる沈殿に供することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料を固相抽出（ＳＰＥ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が血漿または血清を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
患者由来の生体液試料におけるキスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）の分解を測定する方法であって、
（ａ）キスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）と、キスペプチン−５３およびキスペプチン−５２またはキスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来生成物とから、質量分析により検出可能な、４＋、５＋、６＋、および７＋からなる電荷を有するイオンの群から選択される１種または複数の多価イオンを生成するのに適した条件下で、前記生体液試料をイオン化に供することと、
（ｂ）キスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）と、キスペプチン−５３およびキスペプチン−５２またはキスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来生成物の１種または複数のイオンの量を質量分析により決定することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定されたイオンの量を用いて、生体液試料中のキスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）の分解を決定することと
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月２３日に出願された米国仮出願第６１／５６３，４３５号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本開示に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、キスペプチン−５４およびキスペプチン−５４由来ペプチドの定量的測定に関する。特定の態様において、本発明は、ＨＰＬＣ−タンデム質量分析によるキスペプチン−５４およびキスペプチン−５４由来ペプチドの定量的測定のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景技術の以下の記載は、単に本発明の理解を助けるものとして提供されるものであって、本発明に対する先行技術を記載または構成することを認めるものではない。
【０００４】
キスペプチン−５４ペプチドは有性生殖に不可欠であり、および癌転移を抑制する。該ペプチドは、メタスチン、キスペプチン１−５４、ＫＰ−５４、およびＫｉＳＳ−１（６８〜１２１）としても知られている。キスペプチン−５４は、タンパク質ＫｉＳＳ−１の残基６８〜１２１のカルボキサミド断片であり、タンパク質ＫｉＳＳ−１はＫｉＳＳ−１遺伝子によりコードされる。キスペプチン−５４は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のシグナル分泌に対してＧタンパク質共役受容体５４（ＧＰＲ５４）を強力におよび選択的に刺激する。ＧｎＲＨの律動的分泌は、思春期を開始させ、排卵を調整し、生殖機能全般を維持する。キスペプチン−５４は、メラノーマおよび乳癌の進行を抑制することが知られている。キスペプチン−５４は、癌細胞の走化性および浸潤を阻害して転移を抑制すると仮定されている。
【０００５】
ヒトキスペプチン−５４（ＣＡＳ番号［３７４６８３−２４−６］）は、約５８５７．５ｇ／モルの分子量および約５８５４．０ｇ／モルのモノアイソトピック質量を有する５４個のアミノ酸からなる。ヒトキスペプチン−５４は、１３８個のアミノ酸のＫｉＳＳ−１タンパク質の６８〜１２１番目のアミノ酸残基を含有するペプチドアミド切断産物である。ＫｉＳＳ−１切断から生じる他の生物活性ペプチドは、キスペプチン−１４（ＫＰ−１４、４１〜５４）、キスペプチン−１３（ＫＰ−１３、残基４２〜５４）、およびキスペプチン−１０（ＫＰ−１０；残基４５〜５４）である。
【０００６】
キスペプチン−５４は、タンデム質量分析を用いて同定されている。例えば、Ｋｏｔａｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１、２７６（３７）、３４６３１〜６頁（単離）；Ｄｈｉｌｌｏ，Ｗ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２００５、９０（１２）、６６０９〜１５頁（合成）を参照のこと。キスペプチン−５４は、免疫アッセイを用いて定量されている。例えば、Ｊａｙａｓｅｎａら、Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２００９、９４（１１）、４３１５〜２３頁（抗体とキスペプチン−５４と免疫反応性を測定した）を参照のこと。キスペプチンペプチドのうち、キスペプチン−１０のみが、精製されて定量的質量分析に供さられたことが報告されている。Ｃｈａｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．、２０１１、９６（６）、Ｅ９０８〜１５頁。
【発明の概要】
【０００７】
１つの態様において、本発明は、キスペプチン−５４、キスペプチン−５３、キスペプチン−５２、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、キスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）、およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの試料中の量を、質量分析により決定する方法を提供する。これらの方法は、質量分析により検出可能な１種または複数の多価キスペプチン−５４由来ペプチドイオンを生成するのに適した条件下で、試料をイオン化に供することと；１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドのそれぞれに由来する１種または複数のイオンの量を質量分析により決定することと；決定されたイオンの量を用いて、試料中の対応する１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量を決定することとを含む。
【０００８】
１つの態様において、方法は、イオン化の前に、キスペプチン−５４Ｎ末端部分に特異的な抗体を用いてキスペプチン−５４由来ペプチドの濃度を高めることをさらに含む。加えてまたは代わりに、方法は、キスペプチン−５４由来ペプチドの濃度を高めるために、試料から１種または複数の成分を沈殿させるのに十分な量でメタノールなどの有機溶媒を前記試料に添加することをさらに含む。
【０００９】
幾つかの実施形態において、イオンは、キスペプチン−５４、キスペプチン−５３、およびキスペプチン−５２から決定される。幾つかの実施形態において、イオンは、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、キスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）、およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）から決定される。
【００１０】
幾つかの実施形態において、試料由来のキスペプチン−５４由来ペプチドは、イオン化の前に化学的に修飾される。
【００１１】
幾つかの実施形態において、キスペプチン−５４由来ペプチドから生成する多価イオンの少なくとも１つは、４＋、５＋、６＋、または７＋からなる電荷を有するイオンの群から選択される。
【００１２】
幾つかの実施形態において、決定されたキスペプチン−５４由来ペプチドは、キスペプチン−５４、キスペプチン−５３、キスペプチン−５２からなる群から選択される。
【００１３】
１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドがキスペプチン−５４を含む実施形態において、多価キスペプチン−５４イオンは、１１７２．４±０．５、９７７．２±０．５、および８３７．７±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択され得る。
【００１４】
１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドがキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）を含む実施形態において、多価キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）イオンは、１４５０．５±０．５、１１６０．６±０．５、および９６７．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択され得る。
【００１５】
１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドがキスペプチン−５３を含む実施形態において、多価キスペプチン−５３イオンは、１１４３．２±０．５、９５２．７±０．５、および８１６．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択され得る。
【００１６】
１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドがキスペプチン−５２を含む実施形態において、多価キスペプチン−５２イオンは、１１１２．０±０．５、および９２６．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択され得る。
【００１７】
幾つかの実施形態において、質量分析はタンデム質量分析である。タンデム質量分析を利用する実施形態は、１種または複数の多価キスペプチン−５４由来ペプチドイオンをキスペプチン−５４由来ペプチド断片イオンに断片化することを含む。
【００１８】
キスペプチン−５４がタンデム質量分析に供される実施形態において、９７７．２±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５４イオンは、１０８３．６±０．５および９０３．１±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンに断片化され得；８３７．７±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５４イオンは、９７７．２±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得る。
【００１９】
キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）がタンデム質量分析に供される実施形態において、１１６０．６±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）イオンは、１０７１．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得；９６７．３±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）イオンは、１０７１．６±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得る。
【００２０】
キスペプチン−５３がタンデム質量分析に供される実施形態において、１１４３．２±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５３イオンは、１０５３．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得；９５２．７±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５３イオンは、１０５４．１±０．５および８７８．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンの群から選択される１種または複数のイオンに断片化され得；ならびに８１６．７±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５３イオンは、８７８．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得る。
【００２１】
キスペプチン−５２がタンデム質量分析に供される実施形態において、１１１２．０±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５２イオンは、１２７８．２±０．５および１０２２．９のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される１種または複数のイオンに断片化され得；９２６．８±０．５のｍ／ｚを有する多価キスペプチン−５２イオンは、１０２２．９±０．５のｍ／ｚを有するイオンに断片化され得る。
【００２２】
幾つかの実施形態において、試料は、イオン化の前に１つまたは複数の処理ステップに供される。幾つかの実施形態において、処理ステップは、１つまたは複数の精製ステップを含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは、水性ギ酸を試料に添加することを含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは、試料から１種または複数の成分を沈殿させるのに十分な量でメタノールなどの有機溶媒を前記試料に添加することと；試料由来のキスペプチン−５４由来ペプチドの一部が上清に残っている有機溶媒−試料混合物を遠心分離することと；さらなる処理またはイオン化のために上清を回収することとを含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは、キスペプチン−５４由来ペプチドをカラムに保持するのに適した条件下で、陰イオンまたは陽イオン交換カラムに試料を適用することと；カラムからキスペプチン−５４由来ペプチドを溶出することと；さらなる処理またはイオン化のために、溶出されたキスペプチン−５４由来ペプチドを回収することとを含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは免疫精製を含む。幾つかの関連する実施形態において、免疫精製は、キスペプチン−５４のＮ末端に特異的な抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体を用いた、１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの捕捉および抽出を含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは固相抽出（ＳＰＥ）を含む。幾つかの実施形態において、処理ステップは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、患者由来の体液試料におけるキスペプチン−５４由来ペプチドの分解を低減する方法を提供する。これらの方法は、体液試料を酸性化すること、若しくは前記体液試料からタンパク質を沈殿させるのに十分な条件下で薬剤により体液試料を処理すること、または両方を含む。幾つかの実施形態において、前記体液試料を酸性化することは、水性ギ酸により酸性化することを含んでなる。幾つかの実施形態において、タンパク質沈殿剤は、メタノールなどの有機溶媒を含んでなる。幾つかの関連する実施形態において、有機溶媒の体積と生体試料の体積の比は約３：１である。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、患者由来の生体液試料におけるキスペプチン−５４の分解を測定する方法を提供する。これらの方法は、キスペプチン−５４、ならびにキスペプチン−５３およびキスペプチン−５２からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来生成物から、質量分析により検出可能な１種または複数の多価イオンを生成するのに適した条件下で、患者由来の体液試料をイオン化に供することと；キスペプチン−５４、ならびにキスペプチン−５３およびキスペプチン−５２からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来生成物の１種または複数のイオンの量を質量分析により決定することと；ステップｂにおいて決定されたイオンの量を用いて、試料中のキスペプチン−５４およびキスペプチン−５４由来生成物の量を決定することとを含む。
【００２５】
患者由来の生体液試料におけるキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）の分解を測定する類似の方法が提供される。これらの方法は、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、ならびにキスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）由来生成物から、質量分析により検出可能な１種または複数の多価イオンを生成するのに適した条件下で、患者由来の生体液試料をイオン化に供することと；キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、ならびにキスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）由来生成物の１種または複数のイオンの量を質量分析により決定することと；ステップｂにおいて決定されたイオンの量を用いて、試料中のキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）およびキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）由来生成物の量を決定することとを含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、妊娠高血圧腎症を発症するリスクを診断または予測する方法を提供する。これらの方法は、患者から得られた体液または組織試料を提供することと；体液または組織試料を１つまたは複数の処理ステップに供して、キスペプチン−５４、キスペプチン−５３、キスペプチン−５２、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）、キスペプチン−５３（Ｒ１４Ｐ）、およびキスペプチン−５２（Ｒ１４Ｐ）からなる群から選択される１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドを含んでなる処理された試料を生成することと；質量分析により検出可能な１種または複数の多価イオンを生成するのに適した条件下で、処理された試料をイオン化に供することと；１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドに由来の１種または複数のイオンの量を質量分析により決定することと；決定されたイオン量を用いて、試料中のキスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）の量を決定することとを含んでなる。これらの方法では、正常と比べて上昇した試料中のキスペプチン−５４またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）レベルは、妊娠高血圧腎症の存在または妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示す。
【００２７】
別の態様において、本発明は、配列番号２および配列番号３として特定された配列からなるアミノ酸配列を有する１種もしくは複数の実質的に単離されたポリペプチド、またはこのプロリンバリアントを提供する。
【００２８】
タンデム質量分析を利用する本明細書に提供された方法のいずれにおいても、タンデム質量分析は、例えば、多重反応モニタリング、前駆イオンスキャン、またはプロダクトイオンスキャンを含む当技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。
【００２９】
抽出カラム、分析カラム、およびイオン源の２つ以上を利用する本明細書に提供された方法のいずれにおいても、これらの構成要素の２つ以上は、自動試料処理および分析を可能にするようにオンライン方式で接続することができる。
【００３０】
キスペプチン−５４由来ペプチドのイオン化を必要とする本明細書に提供された方法のいずれにおいても、質量分析は好ましくは正イオンモードで行われる。あるいは、質量分析は陰イオンモードで行われる。例えば大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、および加熱ＥＳＩなどのさまざまなイオン源が、本発明の実施形態において使用されてもよい。特定の好ましい実施形態において、キスペプチン−５４由来ペプチドは、正イオンモードで加熱ＥＳＩを用いてイオン化される。
【００３１】
試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量を決定する本明細書に示された方法の好ましい実施形態において、個別に検出可能な内部標準が試料中に提供され、この量も試料中で決定される。これらの実施形態において、目的とする分析物（複数可）および試料中に存在する内部標準の両方の全部または一部がイオン化されて、質量分析計で検出可能な複数のイオンを生成し、それぞれから生成された１種または複数のイオンは質量分析により検出される。これらの実施形態において、目的とする分析物から生成したイオンの存在または量は、試料中の目的とする分析物の量または存在に関係し得る。
【００３２】
他の実施形態において、試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量は、１種または複数の外部参照標準に対する比較により決定することができる。例示的な外部参照標準としては、キスペプチン−５４由来ペプチドまたはこの同位体標識バリアント（同位体標識キスペプチン−５４および同位体標識キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）など）でスパイクされたブランク血漿または血清が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、特に記載のない限り、単数形「１つ（種）の（ａ）」、「１つ（種）の（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数の言及を含む。故に、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「キスペプチン−５４由来ペプチド」は、インタクトなキスペプチン−５４、およびアミノ酸配列がキスペプチン−５４のアミノ酸配列内に見出されるペプチド断片、ならびにこの全ての多形を指す。キスペプチン−５４の１つの公知の多形には、１４位のアルギニンに対するプロリン置換が含まれる。この多形は、キスペプチン−５４（プロリンバリアント）またはキスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）として本明細書に記載されている。キスペプチン−５４由来ペプチドは、１つまたは複数の以下の特質、すなわち自然発生、化学的合成、同位体標識、および化学的修飾を有し得る。同位体標識および／または化学的修飾は、当業者により公知の幾つかの手法のいずれかにより実施することができる。他の例示的なキスペプチン−５４由来ペプチドとしては、キスペプチン−５３、キスペプチン−５２、およびこれらのタンパク質バリアントが挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「キスペプチン−５４」は、図１Ａに配列番号１として示された配列を有する５４個のアミノ酸のペプチドを指す。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「キスペプチン−５３」は、図１Ｂに配列番号２として示された配列を有する５３個のアミノ酸のペプチドを指す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「キスペプチン−５２」は、図１Ｃに配列番号３として示された配列を有する５２個のアミノ酸ペプチドを指す。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドに適用される用語「単離された」は、ポリペプチドを天然に伴う成分から分離されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、これが天然に関連するタンパク質および自然発生の有機分子から少なくとも６０重量％遊離している場合、実質的に単離されている。該定義は、隣接するアミノ酸から分離されたポリペプチドにも及ぶ（例えば、アミノ酸配列に関して、「単離された」は、ポリペプチドにおいて天然に関連する隣接するアミノ酸が存在しない配列を指す）。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％（重量で）単離される。単離されたポリペプチドは、標準的手法、例えば、天然源からの抽出（例えば、細胞または体液からの精製）、該ペプチドまたはこの融合タンパク質をコードする組換え核酸の発現、該ポリペプチドの化学的合成により得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「精製」または「精製すること」は、目的とする分析物以外の全ての材料を試料から除去することを指すわけではない。そうではなく、精製は、目的とする分析物の検出を妨げ得る試料中の他の成分と比べて、１種または複数の目的とする分析物の量を高める手順を指す。さまざまな手段による試料の精製は、１種または複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択された親または娘イオンの検出を妨げ得るまたは妨げ得ない１種または複数の物質の相対的減少を可能にし得る。この用語が使用されるとき、相対的減少は、精製される材料中に目的とする分析物と共に存在するいずれかの物質が、精製により完全に除去されることを必要としない。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫精製」または「免疫精製する」は、１種または複数の目的とする分析物を濃縮するために、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などの抗体を利用する精製手順を指す。免疫精製は、当技術分野で周知である免疫精製方法のいずれかを用いて行うことができる。多くの場合、免疫精製手順は、固体担体、例えばカラム、ウェル、チューブ、ゲル、カプセル、粒子等に結合、コンジュゲート、またはさもなければ付着した抗体を利用する。本明細書で使用される免疫精製としては、特に限定されないが、当技術分野でしばしば免疫沈降と呼ばれる手順のほか、当技術分野でしばしば親和性クロマトグラフィーと呼ばれる手順が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫粒子（ｉｍｍｕｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、表面（粒子上および／または粒子中のどちらか）に抗体が結合され、コンジュゲートされ、またはさもなければ付着しているカプセル、ビーズ、ゲル粒子等を指す。特定の好ましい実施形態において、免疫粒子は、セファロースまたはアガロースビーズである。代替の好ましい実施形態において、免疫粒子は、ガラス、プラスチックもしくはシリカビーズ、またはシリカゲルである。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体」は、キスペプチン−５４由来ペプチドに対して親和性を有する任意のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を指す。さまざまな実施形態において、キスペプチン−５４由来ペプチド以外の化学種に対するキスペプチン−５４由来ペプチド抗体の特異性は異なる可能性があり、例えば特定の好ましい実施形態において、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体は、キスペプチン−５４由来ペプチドに特異的であり、故にキスペプチン−５４由来ペプチド以外の化学種に対する親和性がほとんどない、またはないのに対し、他の好ましい実施形態において、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体は非特異的であり、故にキスペプチン−５４由来ペプチド以外の特定の化学種を結合する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、目的とする分析物を含有し得る任意の試料を指す。本明細書で使用されるとき、用語「体液」は、個体の身体から単離することができるいずれかの液体を意味する。例えば、「体液」としては、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等が挙げられ得る。幾つかの好ましい実施形態において、試料としては、体液試料、好ましくは患者由来の血漿または血清が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「固相抽出」または「ＳＰＥ」は、溶液がその中または周囲を通過する固体（すなわち、固相）に対する、溶液（すなわち、移動相）に溶解または懸濁された成分の親和性の結果として、化学的混合物が成分に分離されるプロセスを指す。幾つかの例において、移動相が固相の中または周囲を通過するとき、移動相の望ましくない成分が固相により保持され得、移動相における分析物の精製をもたらす。他の例において、分析物が固相により保持され得、移動相の望ましくない成分が固相の中または周囲を通過させる。これらの例において、さらなる処理または分析のため、第２の移動相が、固相の保持された分析物を流出するのに次いで使用される。ＴＦＬＣなどのＳＰＥは、単一または混合モードメカニズムにより作動することができる。混合モードメカニズムは、同じカラム中でのイオン交換および疎水性保持を利用する。例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強陰イオン交換および疎水性保持を示し得、または強陽イオン交換および疎水性保持を示し得る。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「クロマトグラフィー」は、固定相液体または固定相固体の周囲または上を流れるときの化学物質の特異的分布の結果として、液体またはガスにより運ばれる化学的混合物が成分に分離されるプロセスを指す。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」は、流体が微粉物質のカラムまたはキャピラリー通路を均一にしみ通るときの、流体溶液の１種または複数の成分の選択的遅延のプロセスを意味する。遅延は、バルク流体（すなわち、移動相）が固定相に対して移動するとき、１つまたは複数の固定相とこの流体の間の混合物成分の分布によって生じる。「液体クロマトグラフィー」の例としては、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、および乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）またはハイスループット液体クロマトグラフィーとして知られることもある）が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」（「高圧液体クロマトグラフィー」として知られることもある）は、固定相、典型的には高密度充填カラムに加圧下で移動相を通過させることにより分離度が向上する液体クロマトグラフィーを指す。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「超高速液体クロマトグラフィー」または「ＵＨＰＬＣ」（「超高圧液体クロマトグラフィー」として知られることもある）は、固定相、典型的には、２μｍ以の平均径を有する充填粒子を含んでなる固定相を有する高密度充填カラムに高圧下で移動相を通過させることにより分離度が向上する液体クロマトグラフィーを指す。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「乱流液体クロマトグラフィー」または「ＴＦＬＣ」（高乱流液体クロマトグラフィーまたはハイスループット液体クロマトグラフィーとして知られることもある）は、分離を行うための土台として、カラム充填を通じてアッセイされる材料の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を指す。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前の、２種の不特定の薬物を含有する試料の調製において適用されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８５４：２３〜３５頁（１９９９）を参照のこと；ＴＦＬＣをさらに説明している米国特許第５，９６８，３６７号、第５，９１９，３６８号、第５，７９５，４６９号、および第５，７７２，８７４号も参照のこと。当業者は、「乱流」を理解する。流体がゆっくりおよび滑らかに流れる場合、該流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムの中を通って低い流速で移動する流体は層流である。層流では、流体の粒子の動きは秩序正しく、粒子は概ね直線で移動する。より速い速度では、水の慣性は流体摩擦力に打ち勝ち、乱流が生じる。不規則境界と接していない流体は、摩擦により遅くなった、または不均一な表面により歪められた流体を「追い越す」。流体が乱れて流れているとき、流体は、流れが層流である場合より多くの「抗力」により渦巻いて（ｅｄｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｈｉｒｌｓ）（すなわち渦で）流れる。流体流がいつ層流または乱流となるかの決定に役立つ多くの参考文献が利用可能である（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．  Ｂｅｒｎａｒｄ  ＆  Ｊ．Ｍ．  Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００）；Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ  Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ  Ｍａｔｈｉｅｕ  ＆  Ｊｕｌｉａｎ  Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「ガスクロマトグラフィー」または「ＧＣ」は、試料混合物が気化され、液体または粒子状固体からなる固定相を含有するカラムの中を通って移動するキャリアガス（窒素またはヘリウムとして）の流れに注入され、固定相に対する化合物の親和性に従って該混合物の成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを指す。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「大粒子カラム」または「抽出カラム」は、約５０μｍより大きい平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを指す。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、±１０％を意味する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「分析カラム」は、分析物の存在または量の決定を可能にするのに十分なカラムから溶出する試料中の材料の分離を達成するのに十分なクロマトグラフィー段数を有するクロマトグラフィーカラムを指す。このようなカラムは、さらなる分析用の精製試料を得るために、保持されていない材料から保持された材料を分離または抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」とは区別される場合が多い。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、±１０％を意味する。好ましい実施形態において分析カラムは、直径約５μｍの粒子を含有する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「オンライン」および「インライン」は、例えば「オンライン自動方式」または「オンライン抽出」で使用されるとき、オペレーターの介入を必要とせずに行われる手順を指す。対照的に、用語「オフライン」は本明細書で使用されるとき、オペレーターの手動介入を必要とする手順を指す。故に、試料が沈殿に供せられ、上清が次いでオートサンプラーに手動で充填される場合、沈殿および充填ステップは、この後のステップからオフラインである。方法のさまざまな実施形態において、１つまたは複数のステップは、オンライン自動方式で行うことができる。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「質量分析」または「ＭＳ」は、化合物をこの質量により同定するための分析技術を指す。ＭＳは、イオンをそれらの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づき濾過し、検出し、および測定する方法を指す。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算することを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出することができる。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。例えば、「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆｒｏｍ  Ｓｕｒｆａｃｅｓｓ」と題された米国特許第６，２０４，５００号；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された米国特許第６，１０７，６２３号；「ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された米国特許第６，２６８，１４４号；「Ｓｕｒｆａｃｅ-Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ」と題された米国特許第６，１２４，１３７号；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９９９、２：２６４〜７６頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０００、２１：１１６４〜６７頁を参照のこと。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「負イオンモードで作動」は、負イオンが発生され検出されるような質量分析方法を指す。用語「正イオンモードで作動」は本明細書で使用されるとき、正イオンが発生され検出されるような質量分析方法を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「イオン化」または「イオン化すること」は、１つまたは複数の電子単位と等しい正味電荷を有する分析物イオンを発生させるプロセスを指す。負イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味負電荷を有するものであり、一方正イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味正電荷を有するものである。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「電子イオン化」または「ＥＩ」は、気相または蒸気相中の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を指す。電子と分析物との衝突は分析物イオンを生成し、これが次いで質量分析技術に供され得る。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「化学イオン化」または「ＣＩ」は、試薬ガス（例えばアンモニア）が電子衝突に供され、分析物イオンが試薬ガスイオンおよび分析物分子の相互作用により形成される方法を指す。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「高速原子衝撃」または「ＦＡＢ」は、高エネルギー原子のビーム（多くの場合ＸｅまたはＡｒ）が非揮発性試料に衝突し、試料に含まれる分子を脱離させイオン化する方法を指す。試験試料は、グリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの粘性の液体マトリックスに溶解される。化合物または試料に対する適切なマトリックスの選択は、経験的プロセスである。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」または「ＭＡＬＤＩ」は、非揮発性試料がレーザー照射に曝され、これが試料中の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊などのさまざまなイオン化経路により脱離させイオン化する方法を指す。ＭＡＬＤＩに関して、試料は、分析物分子の脱離を促進するエネルギー吸収マトリックスと混合される。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」は、非揮発性試料がレーザー照射に曝され、これが試料中の分析物を、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、およびクラスター崩壊などのさまざまなイオン化経路により脱離させイオン化する別の方法を指す。ＳＥＬＤＩに関して、試料は典型的には、１種または複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に結合される。ＭＡＬＤＩと同様に、このプロセスも、イオン化を促進するためのエネルギー吸収材料を使用することができる。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、溶液が短い長さのキャピラリー管に沿って流され、該管の末端に高い正電位または負電位が印加される方法を指す。該管の末端に達する溶液は、溶媒蒸気中の極めて小さい溶液滴のジェットまたはスプレーに気化（噴霧）される。液滴のこのミストは、蒸発室を通って流れる。液滴が小さくなるにつれて、電気の表面電荷密度は、同じ電荷間の天然の反発力がイオンおよび中性分子を放出させるような時点まで増加する。加熱ＥＳＩは類似するが、キャピラリー管中にある間に試料を加熱するための熱源を含む。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩと類似する質量分析方法を指す。しかし、ＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生じるイオン−分子反応によりイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極の間の放電により維持される。次いでイオンは、典型的には一連の差動的に排気されるスキマーステージを用いて質量分析器に抽出される。乾燥および予熱Ｎ2ガスの対向流が、溶媒の除去を改善するために用いられてもよい。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、より低い極性種を分析するのにＥＳＩより有効であり得る。
【００６４】
用語「大気圧光イオン化」または「ＡＰＰＩ」は本明細書で使用されるとき、分子Ｍの光イオン化の機構が、分子イオンＭ＋を形成するための光子吸収および電子放出である質量分析の形態を指す。光子エネルギーは、典型的にはイオン化電位をわずかに上回るのみであるため、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせずに試料を分析することが可能であり得、故に時間および費用を大幅に節約する。水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下、分子イオンはＨを抽出してＭＨ＋を形成し得る。これは、Ｍが高いプロトン親和性を有する場合に生じる傾向がある。これは、Ｍ＋およびＭＨ＋の和は一定であるため、定量精度に影響を与えない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常、ＭＨ＋として観察されるのに対し、ナフタレンまたはテストステロンなどの非極性化合物は、通常、Ｍ＋を形成する。例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０００、７２（１５）：３６５３〜３６５９頁を参照のこと。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「誘導結合プラズマ」または「ＩＣＰ」は、ほとんどの要素が崩壊しおよびイオン化されるように十分に高温で、試料が部分的イオン化ガスと相互作用する方法を指す。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「電界脱離」は、非揮発性試験試料がイオン化表面に置かれ、強電界を用いて分析物イオンを発生させる方法を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「脱離」は、表面からの分析物の除去および／または気相への分析物の進入を指す。レーザー脱離熱脱離は、分析物を含有する試料がレーザーパルスにより気相に熱的に脱離される手法である。レーザーは、金属床を備える特別に作製された９６ウェルプレートの背部に衝突する。レーザーパルスは金属床を加熱し、熱は試料を気相に移動させる。気相試料は、次いで質量分析計に引き込まれる。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「選択的イオンモニタリング」は、比較的狭い質量範囲内（典型的には約１質量単位）のイオンのみが検出される質量分析機器のための検出モードである。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「選択反応モニタリング」として知られることもある「多重反応モード」は、前駆イオンおよび１種または複数の断片イオンが選択的に検出される質量分析機器のための検出モードである。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、用語「定量化下限（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「定量下限（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）」または「ＬＬＯＱ」は、測定が定量的に意味を持つようになるポイントを指す。このＬＯＱでの分析物反応は、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）および８５％〜１１５％の精度で同定可能であり、分散しておりおよび再現可能である。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「検出限界」または「ＬＯＤ」は、測定値がこれに伴う不確実性より大きいポイントである。ＬＯＤは、値がこの測定に伴う不確実性を超えているポイントであり、ゼロ濃度での平均のＲＳＤの３倍として定義される。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、体液試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出可能な分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。
【００７３】
用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／-０．５原子質量単位を指す。
【００７４】
上記の本発明の概要は、非限定的であり、本発明の他の特徴および利点は、本発明の以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、それぞれのプロリンバリアント（すなわち、それぞれがＲ１４Ｐ置換を有する）を含む、それぞれキスペプチン−５４（配列番号１）、キスペプチン−５３（配列番号２）、およびキスペプチン−５２（配列番号３）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、キスペプチン−５４のフルスキャンスペクトルを示す図である。スペクトルは、それぞれ８３７．５±０．５および９７７．０±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４［Ｍ＋７Ｈ］＋７および［Ｍ＋６Ｈ］＋６のイオンの発生を示している。詳細は実施例３で論じられている。
【図３】図３は、９７７．０±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４［Ｍ＋６Ｈ］＋６イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１０８３．６±０．５および９０３．１±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図４】図４は、８３７．７±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４［Ｍ＋７Ｈ］＋７イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、９０２．８±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図５】図５は、キスペプチン−５４（Ｒ１４Ｐ）のフルスキャンスペクトルを示す図である。このスペクトルは、それぞれ９６７．３±０．５、１１６０．６±０．５、および１４５０．５±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４（Ｒ１４Ｐ）［Ｍ＋６Ｈ］＋６、［Ｍ＋５Ｈ］＋５、および［Ｍ＋４Ｈ］＋４イオンの発生を示している。詳細は実施例３で論じられている。
【図６】図６は、１１６０．６±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４（Ｒ１４Ｐ）［Ｍ＋５Ｈ］＋イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１０７１．６±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図７】図７は、９６７．３±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４（Ｒ１４Ｐ）［Ｍ＋６Ｈ］＋６イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１０７１．６±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図８】図８は、キスペプチン−５３のフルスキャンスペクトルを示す図である。このスペクトルは、それぞれ８１６．９±０．５、９５２．７±０．５、および１１４３．２±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５３［Ｍ＋７Ｈ］＋７、［Ｍ＋６Ｈ］＋６、および［Ｍ＋５Ｈ］＋５イオンの発生を示している。詳細は実施例３で論じられている。
【図９】図９は、１１４３．２±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５３［Ｍ＋５Ｈ］＋５イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１０５３．９±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図１０】図１０は、９５２．７±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５３［Ｍ＋６Ｈ］＋６イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１０５４．１±０．５および８７８．３±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図１１】図１１は、８１６．７±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５３［Ｍ＋７Ｈ］＋７イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、８７８．３±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図１２】図１２は、キスペプチン−５２のフルスキャンスペクトルを示す図である。このスペクトルは、それぞれ９２６．６±０．５、１１１２．０±０．５、および１３８９．５±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５２［Ｍ＋６Ｈ］＋６、［Ｍ＋５Ｈ］＋５、および［Ｍ＋４Ｈ］＋４イオンの発生を示している。詳細は実施例３で論じられている。
【図１３】図１３は、１１１１．９±０．５±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５２［Ｍ＋５Ｈ］＋５イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは、１２７８．２±０．５および１０２２．９±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図１４】図１４は、９２６．８±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５２［Ｍ＋６Ｈ］＋６イオンの例示的な断片化スペクトルを示す図である。例示的な断片イオンは１０２２．９±０．５のｍ／ｚで観察される。詳細は実施例３で論じられている。
【図１５】図１５は、妊婦＃１（２８歳、妊娠２５週）由来の血清におけるＫＰ−５２、ＫＰ−５３、ＫＰ−５４、およびＫＰ−５４（ＩＳ）の検出を示す図である。詳細は実施例４で論じられている。
【図１６】図１６は、妊婦＃１（２８歳、妊娠２５週）由来のＥＤＴＡ血漿におけるＫＰ−５２、ＫＰ−５３、ＫＰ−５４、およびＫＰ−５４（ＩＳ）の検出を示す図である。詳細は実施例４で論じられている。
【図１７】図１７は、妊婦＃２（２１歳、妊娠２８週）由来の血清におけるＫＰ−５２、ＫＰ−５３、ＫＰ−５４、およびＫＰ−５４（ＩＳ）の検出を示す図である。詳細は実施例４で論じられている。
【図１８】図１８は、妊婦＃２（２１歳、妊娠２８週）由来のＥＤＴＡ血漿におけるＫＰ−５２、ＫＰ−５３、ＫＰ−５４、およびＫＰ−５４（ＩＳ）の検出を示す図である。詳細は実施例４で論じられている。
【発明の詳細な説明】
【００７６】
試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量を測定する方法が記載される。より詳細には、試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドを検出および定量化する質量分析方法が記載される。方法は、質量分析（ＭＳ）の方法と組み合わされた、選択された分析物の精製を行うための固相抽出および／または液体クロマトグラフィーを利用し得、これにより試料中のキスペプチン−５４由来ペプチドを検出および定量化するためのハイスループットアッセイシステムを提供し得る。好ましい実施形態は、自動化されたキスペプチン−５４由来ペプチド定量化アッセイのための大規模臨床検査室での適用に特によく適している。
【００７７】
本発明の方法での使用に適した試験試料には、目的とする分析物を含有し得るいずれの試験試料も含まれる。幾つかの好ましい実施形態において、試料は生体試料、すなわち、動物、細胞培養物、生物培養物等などの生物源から得られた試料である。特定の好ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等などの哺乳動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性または女性のヒトである。好ましい試料としては、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、または組織試料などの体液、好ましくは血漿および血清が挙げられる。このような試料は、例えば、患者、すなわち、妊娠高血圧腎症などの疾患または状態の診断、予後、または治療のために臨床の場に現れる、生きた人間（男性または女性）から得ることができる。試料が生体試料を含む実施形態において、試料が生物源から得られた場合、該方法は、試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドの量（すなわち、１つまたは複数の試料中の内因性キスペプチン−５４由来ペプチドの量）を決定するのに使用することができる。
【００７８】
キスペプチン−５４由来ペプチドは、妊娠高血圧腎症を発症するリスクを診断または予測するために、妊娠女性被験者由来の患者試料において定量されてもよい。妊娠高血圧腎症のリスクの診断または予測において、患者試料由来のキスペプチン−５４由来ペプチドのレベルは、妊娠女性試料における正常レベルと比較される。正常レベルと比べて患者試料中のキスペプチン−５４由来ペプチドの上昇したレベルは、妊娠高血圧腎症の存在また妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示している。
【００７９】
本発明はまた、キスペプチン−５４由来ペプチド定量アッセイのためのキットも企図する。キスペプチン−５４由来ペプチド定量アッセイのためのキットは、本明細書に提供された組成物を含むキットを含み得る。例えば、キットは、少なくとも１つのアッセイに対して十分な量で包装材料および測定された量の同位体標識内部標準を含み得る。典型的には、キットは、キスペプチン−５４由来ペプチド定量アッセイで使用するための包装された試薬を使用するための、有形形態で記録された（例えば、紙または電子媒体上に含まれた）指示書も含むであろう。
【００８０】
本発明の実施形態において使用するための校正およびＱＣプールは、キスペプチン−５４由来ペプチドが本質的に非存在であることを条件として、意図された試料マトリックスと類似したマトリックスを用いて好ましくは調製される。
【００８１】
質量分光分析のための試料調製
幾つかの実施形態において、試料は分析の前に酸性化される。内部標準は、酸性化の前または後で試料に添加されてもよい。
【００８２】
質量分光分析のための調製において、キスペプチン−５４由来ペプチドは、例えば、液体クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動などの電気泳動、免疫親和性分離などの親和性分離、酢酸エチルまたはメタノール抽出などの抽出方法、およびカオトロピック剤または上記の任意の組み合わせ等の使用などの当技術分野で公知のさまざまな方法により、試料中の１種または複数の他の成分（例えばタンパク質）と比べて濃縮することができる。
【００８３】
タンパク質沈殿は、試験試料、特に、血清または血漿などの生物学的試験試料を調製する１つの方法である。タンパク質精製方法は、ウェル当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ２００３、７８５：２６３〜２７５頁は、本発明の方法での使用に適したタンパク質沈殿法を記載している。タンパク質沈殿は、上清中にキスペプチン−５４由来ペプチドを残しながら、試料から大部分のタンパク質を除去するのに使用することができる。試料は、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠心分離されてもよく、あるいは試料は、沈殿したタンパク質を除去するために濾過されてもよい。得られた上清または濾液は、次いで質量分光分析に直接適用されてもよいし、またはあるいは、液体クロマトグラフィーなどのさらなる精製ステップ、およびこの後の質量分光分析に適用されてもよい。特定の実施形態において、例えば、ギ酸タンパク質沈殿などのタンパク質沈殿の使用は、ＴＦＬＣもしくは質量分析の前の他のオンライン抽出、またはＨＰＬＣおよび質量分析の必要性を不要にすることができる。
【００８４】
質量分析の前に使用することができる試料精製の別の方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的緩徐な層流技術に依存している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラムの中を通る試料の層流が、試料から目的とする分析物を分離するための土台となるカラム充填に依存する。当業者は、このようなカラムでの分離は分配プロセスであり、キスペプチン−５４由来ペプチドと共に使用するのに適したＨＰＬＣを含むＬＣ、機器およびカラムを選択できることを理解するであろう。クロマトグラフィーカラムは、典型的には、化学部分の分離（すなわち、分画）を促進するための媒体（すなわち、充填材料）を含む。媒体は、微細粒子を含み得る。粒子は、典型的には、化学部分の分離を促進するためにさまざまな化学部分と相互作用する結合表面を含む。１つの適切な結合表面は、アルキル結合表面またはシアノ結合表面などの疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、またはＣ−１８結合アルキル基を含み得る。好ましい実施形態において、カラムはＣ−１８カラムである。クロマトグラフィーカラムは、試料を受け取るための入口、および分画試料を含む流出物を排出するための出口を含む。試料は、入口に直接供給されてもよく、またはオンライン抽出カラムもしくはＴＦＬＣカラムなどのＳＰＥカラムから供給されてもよい。幾つかの実施形態において、試料がＳＰＥおよび／またはＨＰＬＣに到達する前に試料中の微粒子およびリン脂質を除去するために、オンラインフィルターがＳＰＥカラムおよびまたはＨＰＬＣカラムの前に使用されてもよい。好ましい実施形態において、０．２μｍまたは０．４５μｍマイクロスピン酢酸セルロース脱脂フィルター（ｍｉｃｒｏ−ｓｐｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ  ｄｅｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）が、このようなオフラインフィルターとして使用される。
【００８５】
１つの実施形態において、試料は、入口でＬＣカラムに適用され、溶媒または溶媒混合物と共に溶出され、および出口で排出されてもよい。種々の溶媒モードが、目的とする分析物（複数可）を溶出するために選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、または多型（すなわち混合）モードを用いて行うことができる。クロマトグラフィー中、材料の分離は、溶離液（「移動相」としても知られる）、溶出モード、勾配条件、温度等の選択などの変数により影響される。
【００８６】
特定の実施形態において、分析物は、目的とする分析物はカラム充填材料により可逆的に保持されるが、１種または複数の他の材料は保持されない条件下で、カラムに試料を適用して精製されてもよい。これらの実施形態において、目的とする分析物がカラムにより保持される第１の移動相条件が使用され得、および保持されない材料がひとたび洗い流されたら、保持された材料をカラムから除去するための第２の移動相条件が、この後に使用され得る。あるいは、分析物は、１種または複数の他の材料と比較して、目的とする分析物が差動速度で溶出する移動相条件下で、カラムに試料を適用して精製されてもよい。このような手順は、試料の１種または複数の他の成分と比べて、１種または複数の目的とする分析物の量を増大させることができる。
【００８７】
１つの好ましい実施形態において、ＨＰＬＣは、極性埋め込み型分析カラムクロマトグラフィーシステムを用いて実施される。特定の好ましい実施形態において、Ｃ−１８  ＢＥＨ（エチレン架橋ハイブリッド）分析カラム（例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．社製のＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ＢＥＨ分析カラム（２．５×５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）、または同等物）が使用される。特定の好ましい実施形態において、ＨＰＬＣは、ＨＰＬＣグレード０．２％水性ギ酸を溶媒Ａとして、およびアセトニトリル中０．２％ギ酸を溶媒Ｂとして用いて行われる。
【００８８】
バルブおよびコネクター配管の慎重な選択により、２つ以上のクロマトグラフィーカラムは、いずれの手動ステップも必要とすることなく材料が次から次へと通過するように、必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態において、バルブおよび配管の選択は、必要なステップを実行するように予めプログラムされたコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた、このようなオンライン方式で検出システム、例えば、ＭＳシステムにも接続される。故に、オペレーターは、試料のトレーをオートサンプラーに入れることができ、残りのオペレーションはコンピュータ制御下で行われ、選択された全ての試料の精製および分析をもたらす。
【００８９】
幾つかの実施形態において、ＴＦＬＣは、質量分析の前にキスペプチン−５４由来ペプチドを精製するのに使用することができる。このような実施形態において、試料は、分析物を捕捉するＴＦＬＣカラムを用いて抽出することができる。分析物は、次いで溶出され、分析ＨＰＬＣカラムにオンラインで移される。例えば、試料抽出は、ＴＦＬＣ抽出カートリッジを用いて達成されてもよく、大きい粒子サイズ（例えば、２５μｍ以上、例えば、５０μｍの粒子サイズ）充填カラムを用いて達成されてもよい。このカラムから溶出される試料は、次いで、質量分析の前のさらなる精製のために、ＨＰＬＣ分析カラムにオンラインで移される。これらのクロマトグラフィー手順に関わるステップは自動方式で連結することができるため、分析物の精製中にオペレーターが関与する必要は最小化され得る。この特徴は、時間および費用の節約をもたらし得、オペレーターの誤る機会を排除し得る。
【００９０】
幾つかの実施形態において、方法は、分析の前にキスペプチン−５４由来ペプチドを免疫精製するステップを含む。免疫精製ステップは、当技術分野で周知の免疫精製方法のいずれかを用いて行うことができる。多くの場合、免疫精製手順は、固体担体、例えばカラム、ウェル、チューブ、カプセル、粒子等に結合され、コンジュゲートされ、固定化されまたはさもなければ付着した抗体を利用する。一般には、免疫精製方法は、（１）目的とする分析物を含有する試料を、分析物が抗体に結合するように抗体と共にインキュベートすることと、（２）１つまたは複数の洗浄ステップを行うことと、（３）抗体から分析物を溶出することを含む。
【００９１】
特定の実施形態において免疫精製のインキュベーションステップは、溶液中で抗体なしで行われ、抗体はこの後、洗浄ステップの前に固体表面に結合または付着させる。特定の実施形態においてこれは、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体である１次抗体、および１次抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体に対する親和性を有する、固体表面に付着した２次抗体を用いて達成することができる。代替の実施形態において１次抗体は、インキュベーションステップの前に固体表面に結合される。
【００９２】
適切な固体担体としては、チューブ、スライド、カラム、ビーズ、カプセル、粒子、ゲル等が挙げられるがこれらに限定されない。幾つかの好ましい実施形態において、固体担体は、例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート等などのマルチウェルプレートである。特定の好ましい実施形態において固体担体は、セファロースまたはアガロースビーズもしくはゲルである。抗体（例えば、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体または２次抗体）が固体担体に結合させ、付着させ、固定化され、連結され得る、当技術分野で周知の多くの方法、例えば、共有または非共有結合吸着、親和性結合、イオン結合等がある。幾つかの実施形態において抗体は、ＣＮＢｒを用いて連結され、例えば抗体は、ＣＮＢｒ活性化セファロースに連結されてもよい。他の実施形態において、抗体は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌなどの抗体結合タンパク質を通じて固体担体に付着させる。
【００９３】
免疫精製方法の洗浄ステップは、一般には、１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドが、固体担体上の抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体に結合したままであるように、固体担体を洗浄するステップを含む。免疫精製の溶出ステップは、一般には抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体へのキスペプチン−５４由来ペプチドの結合を破壊する溶液の添加を含む。例示的な溶出溶液としては、有機溶液（エタノールなど）、食塩水、および高または低ｐＨ溶液が挙げられる。
【００９４】
幾つかの実施形態において、免疫精製は、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体を有する免疫粒子を用いて行われる。特定の好ましい実施形態において、１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドを含有する可能性がある試験試料および免疫粒子は、インキュベーション、および免疫粒子に付着した抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体へのキスペプチン−５４由来ペプチドの結合のためにチューブで混合され；チューブが、ペレットに免疫粒子を残しながら遠心分離され；上清が除去され；ペレットへの溶液の添加および再遠心分離により、免疫粒子が１回または複数回洗浄され；ならびに結合されたキスペプチン−５４由来ペプチドが、溶出溶液を免疫粒子に添加して溶出され、チューブが、ペレットに免疫粒子を残しながら遠心分離され；およびキスペプチン−５４由来ペプチドを含有する上清が回収される。関連する好ましい実施形態において、免疫精製は、抗キスペプチン−５４由来ペプチド抗体を有する免疫粒子を含有するカラムまたはカートリッジを用いて行われる。好ましくは、このようなカラムまたはカートリッジは、この中に免疫粒子を含有した状態で保ちながら、溶液が中を通って流れるような方法で構成および配置される。特定の好ましい実施形態において、溶液は、重力、遠心分離または圧力によりカラムまたはカートリッジを通って押し進められる。カラムの使用は、インキュベーション、洗浄および溶出ステップの行いやすさを向上させることができる。幾つかの実施形態において免疫精製は、親和性クロマトグラフィー、好ましくは自動化された親和性クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００９５】
患者試料（すなわち、血清または血漿）中のキスペプチン−５４は、Ｃ末端で分解してＫＰ−５３およびＫＰ−５２などのより短いキスペプチン−５４由来ペプチドを形成する可能性があることが見出された。この分解は、制御または説明されなければ、誤って低い分析結果をもたらし得る。例えば、ＫＰ−５４のＣ末端の結合に依存するラジオイムノアッセイは、もともとは患者試料中のＫＰ−５４のこの部分がＫＰ−５３またはＫＰ−５２に分解して以降、該部分を説明しないであろう。故に、本発明の１つの態様は、免疫精製および／または免疫アッセイに対して、キスペプチン−５４由来ペプチドのＮ末端に特異的な抗体を利用する。Ｎ末端特異的抗体を用いることにより、ＫＰ−５４およびこの分解生成物Ｋ−５３およびＫ−５２は、さらなる分析のために捕捉される。
【００９６】
代わりにまたは加えて、患者試料は、１種もしくは複数の薬剤で処理されてもよく、またはＫＰ−５４精製および分析の前にＫＰ−５４の分解を阻害もしくは防止する物理的条件に供されてもよい。例えば、患者血清または血漿試料は、分解を阻害または防止するためにギ酸などで酸性化されてもよい。あるいは、患者血清または血漿試料は、分解を阻害または防止するために、当技術分野で公知の任意のタンパク質沈殿法（メタノールを用いた処理など）に供されてもよい。
【００９７】
ＫＰ−５４分解を低減または阻害するために使用される精製方法および／または取られるステップにかかわらず、他のキスペプチン−５４由来ペプチドについて試料を同時に分析してＫＰ−５４分解を説明する、患者試料の分析方法が使用されてもよい。詳細には、患者試料は、ＫＰ−５４、ＫＰ−５３、およびＫＰ−５２（またはこれらのプロリンバリアント）について同時に分析することができる。ＫＰ−５４ならびにＫＰ−５３およびＫＰ−５２の１つまたは両方の総計量は、もともとは患者試料中に存在するＫＰ−５４のより診断的に有用な指標を提供することができる。
【００９８】
質量分析による検出および定量
さまざまな実施形態において、キスペプチン−５４由来ペプチドは、当業者に公知の任意の方法によりイオン化することができる。質量分析は、分画試料をイオン化し、およびさらなる分析のために荷電分子を作製するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。例えば試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）および粒子ビームイオン化により行うことができる。当業者は、イオン化方法の選択は、測定される分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、正対負モードの選択等に基づき決定し得ることを理解するであろう。
【００９９】
キスペプチン−５４由来ペプチドは、正または負モードでイオン化することができる。幾つかの実施形態において、キスペプチン−５４由来ペプチドは、正モードでＥＳＩ（加熱ＥＳＩなど）によりイオン化される。
【０１００】
質量分析法において一般には、試料がイオン化された後、これにより作製された正または負に荷電されたイオンが分析されて、質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定するための適切な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が含まれる。例示的なイオントラップ方法は、Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２０００、１４：９６７〜７３頁に記載されている。
【０１０１】
イオンは、幾つかの検出モードを用いて検出することができる。例えば、選択されたイオンが検出されてもよく（すなわち選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて）、またはあるいは、衝突誘起解離の結果生じる質量遷移（mass transition）もしくは中性損失がモニターされてもよい（例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ））。好ましくは、質量対電荷比が四重極分析器を用いて決定される。例えば、「四重極」または「四重極イオントラップ」機器において、振動無線周波数電磁界中のイオンは、電極間で印加されるＤＣ電位、ＲＦ信号の振幅、および質量／電荷比に比例した力を受ける。電圧および振幅は、特定の質量／電荷比を有するイオンのみが四重極の長さを移動し、全ての他のイオンは偏向されるように選択することができる。故に、四重極機器は、機器に注入されたイオンに対する「質量フィルター」および「質量検出器」の両方の機能を果たすことができる。
【０１０２】
「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」を使用して、ＭＳ法の解像度を高めることができる。この手法では、目的とする分子から発生した前駆イオン（親イオンとも呼ばれる）がＭＳ機器でフィルター処理され得、前駆イオンはこの後、断片化されて１種または複数の断片イオン（娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる）をもたらし、該イオンが次いで第２のＭＳ手順において分析される。前駆イオンの慎重な選択により、特定の分析物により生成されたイオンのみが断片化チャンバに移され、ここで不活性ガスの原子との衝突が断片イオンを生成する。前駆イオンおよび断片イオンは両方とも、イオン化／断片化条件の所定のセット下で再現可能な方法で生成されるため、ＭＳ／ＭＳ法は、極めて強力な分析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／断片化の組み合わせは、妨害物質を排除するのに使用することができ、生体試料などの複合試料において特に有用であり得る。
【０１０３】
タンデム質量分析機器を作動させる代替のモードとしては、プロダクトイオンスキャンおよび前駆イオンスキャンが含まれる。オペレーションのこれらのモードの記載については、例えば、Ｅ．  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ-Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ、第８章（Ａｍａｄｅｏ  Ｒ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ-Ａｌｂａ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２００５）（３８７頁）を参照のこと。
【０１０４】
分析物アッセイの結果は、当技術分野で公知の多くの方法により、原試料における分析物の量と関連づけることができる。例えば、サンプリングパラメータおよび分析パラメーターが慎重に制御されるという条件で、任意のイオンの相対存在量は、この相対存在量を原分子の絶対量に変換する表と比較することができる。あるいは、外部標準が試料と共に流されてもよく、標準曲線が、これらの標準から発生したイオンに基づき構築されてもよい。このような標準曲線を用いて、任意のイオンの相対存在量は、原分子の絶対量に変換することができる。特定の好ましい実施形態において、内部標準が、キスペプチン−５４由来ペプチドの量を計算するための標準曲線を生成するのに使用される。このような標準曲線を生成および使用する方法は、当技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することができる。例えば、好ましい実施形態において同位体標識キスペプチン−５４由来ペプチドの１つまたは複数の形態が、内部標準として使用され得る。イオンの量を原分子の量に関連づけるための多くの他の方法は、当業者に周知であろう。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、「同位体標識」は、質量分析法により分析される場合、非標識分子と比べて標識分子において質量シフトをもたらす。適切な標識の例としては、ジュウテリウム（2Ｈ）、13Ｃ、および15Ｎが挙げられる。１つまたは複数の同位体標識は、１つまたは複数の位置で分子に組み込むことができ、１つまたは複数の種類の同位体標識が、同じ同位体標識分子で使用され得る。
【０１０６】
方法の１つまたは複数のステップは、自動機械を用いて行うことができる。特定の実施形態において、１つまたは複数の精製ステップはオンラインで行われ、より好ましくは、精製および質量分析ステップの全てがオンライン方式で行われ得る。
【０１０７】
前駆イオンがさらなる断片化のために単離される、ＭＳ／ＭＳなどの特定の実施形態において、衝突活性化解離（ＣＡＤ）が、さらなる検出のための断片イオンを発生させるのに多くの場合使用される。ＣＡＤでは、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突を通じてエネルギーを得、この後、「単分子分解」と呼ばれるプロセスにより分解する。イオン内の特定の結合が、増加した振動エネルギーにより破られ得るように、十分なエネルギーを前駆イオン中に付加しなければならない。
【０１０８】
特に好ましい実施形態において、試料中の１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチドは、次のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出および／または定量化される。試料は、好ましくはＳＰＥに供され、次いで液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣに供され；クロマトグラフィーカラムからの液体溶媒の流れがＭＳ／ＭＳ分析器の加熱ネブライザーインターフェイスに入り；および溶媒／分析物混合物が、インターフェイスの加熱荷電管中で蒸気に変換される。これらのプロセス中に、１種または複数の分析物（すなわち、１種または複数のキスペプチン−５４由来ペプチド）が分析される。キスペプチン−５４由来ペプチドに由来のイオン、例えば前駆イオンは、機器の開口部を通過し、第一の四重極に入る。四重極１および３（Ｑ１およびＱ３）は、質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づきイオンの選択（すなわち、それぞれＱ１およびＱ３における「前駆」および「断片」イオンの選択）を可能にする質量フィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンが断片化される衝突セルである。質量分析計の第一の四重極（Ｑ１）は、キスペプチン−５４由来ペプチドの質量対電荷比により分子を選択する。正しい質量／電荷比を有する前駆イオンは衝突室（Ｑ２）に入ることができるが、任意の他の質量／電荷比を有する望ましくないイオンは、該四重極の側面と衝突し、排除される。Ｑ２に入る前駆イオンは、中性アルゴンガス分子と衝突し、断片になる。発生した断片イオンは四重極３（Ｑ３）に入り、キスペプチン−５４由来ペプチドの断片イオンが選択されるが、他のイオンは除去される。このプロセスは、必要なだけ頻繁に繰り返して、キスペプチン−５４由来ペプチドを所望するだけ何個でも分析することができる。
【０１０９】
ウェル当技術分野で周知の標準的方法を用いて、当業者は、四重極３（Ｑ３）での選択に使用され得る、キスペプチン−５４由来ペプチドの特定の前駆イオンの１種または複数の断片イオンを同定することができる。
【０１１０】
イオンが検出器と衝突するとき、イオンは、電子のパルスを生成し、デジタル信号に変換される。得られたデータはコンピュータに送られ、コンピュータは回収されたイオンの数対時間をプロットする。得られた質量クロマトグラムは、伝統的なＨＰＬＣ−ＭＳ方法で生成されるクロマトグラムと類似する。特定のイオンに対応するピーク下の面積、すなわちこのようなピークの振幅が測定され得、目的とする分析物の量と関連づけられ得る。特定の実施形態において、断片イオンおよび／または前駆イオンの曲線下の面積、すなわちピークの振幅が、キスペプチン−５４由来ペプチドの量を決定するために測定される。上記のように、任意のイオンの相対存在量は、内部分子標準の１つまたは複数のイオンのピークに基づく校正標準曲線を用いて、原分析物の絶対量に変換することができる。
【０１１１】
以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。これらの実施例は、方法の範囲を制限することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：試料調製
１００μＬ血清またはＥＤＴＡ血漿患者試料を、内部標準として同位体標識キスペプチン−５４を含有する３００μＬのメタノールと混合した。タンパク質沈殿物を遠心分離により除去し、以下の実施例に記載されているように上清をＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。
【０１１３】
実施例２：液体クロマトグラフィーを用いた試料からのキスペプチン−５４由来ペプチドの抽出
マトリックス成分からのキスペプチン−５４および他のキスペプチン−５４由来ペプチドのオンラインクロマトグラフィー分離は、Ａｒｉａ  ＯＳ  Ｖ  １．５以降のソフトウェアを用いて、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｒｉａ  ＴＸ−４ハイスループット液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）システムにより行った。
【０１１４】
分析物および内部標準は、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＬＢ  Ｃ１８（２．１×２０ｍｍ、２５μｍ粒子サイズ）固相抽出カートリッジを用いて血清抽出物から単離した。抽出物の注入後、カートリッジを９０％溶媒Ａ（水＋０．２％ギ酸）および１０％溶媒Ｂ（アセトニトリル＋０．２％ギ酸）で洗浄した。抽出カートリッジはキスペプチン−５４を保持したが、イオンおよび強極性分子は流れた。
【０１１５】
分析物を、次いで４５％溶媒Ａ／５５％溶媒Ｂのパルスを用いて、分析カラムにわたって抽出カートリッジからバックフラッシュさせ、１００μＬの溶離液を分析的分離のためＨＰＬＣに供した。分析的分離は、溶媒Ａにおいて溶媒Ｂを増加させる急速な多相勾配（ｍｕｌｔｉｐｈａｓｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ＢＥＨ分析カラム（２．５×５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）により行った。ＨＰＬＣ勾配は、約１８０秒で３５％に勾配する５％有機調節剤により開始した。
【０１１６】
分離した分析物を、次いでキスペプチン−５４由来ペプチドの同定および定量のために、単一およびタンデム質量分析に供した。
【０１１７】
実施例３：ＭＳおよびＭＳ／ＭＳによるキスペプチン−５４由来ペプチドの検出
ＭＳは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａトリプル四重極を用いて行った。イオン化は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）プローブにより実施した。幾つかのキスペプチン−５４由来ペプチドの多価イオンを観察した。多価キスペプチン−５４関連ペプチドイオンを示す単一ＭＳスペクトルは、それぞれ図２（ＫＰ−５４）、図５（ＫＰ−５４（プロリンバリアント））、図８（ＫＰ−５３）、および図１２（ＫＰ−５２）に見られる。幾つかの主なイオン（この幾つかはこれらの図に見られる）が表１にまとめられている。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
上に列挙されたキスペプチン−５４由来ペプチドのそれぞれに由来するさまざまな多価前駆イオンを、さまざまな電荷状態で複数の断片イオンをもたらすＭＳ／ＭＳにさらに供した。ＫＰ−５４については、６＋および７＋前駆イオンを断片化し、例示的なＭＳ／ＭＳスペクトルは図３および４に見られる。ＫＰ−５４（プロリンバリアント）については、５＋および６＋前駆イオンを断片化し、例示的なＭＳ／ＭＳスペクトルは図６および７に見られる。ＫＰ−５３については、５＋、６＋、および７＋前駆イオンを断片化し、例示的なＭＳ／ＭＳスペクトルは図９、１０、および１１に見られる。ＫＰ−５２については、５＋および６＋前駆イオンを断片化し、例示的なＭＳ／ＭＳスペクトルは図１３および１４に見られる。さらに、同位体標識ＫＰ−５４を、上記のようにイオン化および断片化した（スペクトルは非掲載）。幾つかの観察された主な断片イオンのｍ／ｚ比が、表２にまとめられ列挙されている。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
実施例４：タンデムＭＳによるキスペプチン−５４由来ペプチドの検出および定量
ＭＳ／ＭＳは、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備えたＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａトリプル四重極ＭＳ／ＭＳシステムを用いて行った。以下のソフトウェアプログラム（全てＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ製）を、本明細書に記載された実施例において使用した：ＴＳＱ  Ｕｌｔｒａ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｖ  １．４．１以降、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｖ  ２．０以降、およびＬＣＱｕａｎ  Ｖ  ２．５以降。分析カラムから出る液体溶媒／分析物は、ＭＳ／ＭＳ分析器の加熱ネブライザーインターフェイスに流れた。溶媒／分析物混合物をインターフェイスの加熱管中で蒸気に変換した。分析物を、正極性でＨＥＳＩによりイオン化した。
【０１２２】
キスペプチン−５４由来ペプチドイオンが第一の四重極（Ｑ１）に移動し、四重極（Ｑ１）は９７７．０±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５４イオン、９５２．９±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５３イオン、９２６．９±０．５のｍ／ｚを有するＫＰ−５２イオン、または９８０．３±０．５のｍ／ｚを有する同位体標識ＫＰ−５４（ＩＳ）イオンを選択した。四重極２（Ｑ２）に入るイオンは、アルゴンガスと衝突して（２８Ｖの衝突室エネルギーで）イオン断片を発生させ、イオン断片はさらなる選択のために四重極３（Ｑ３）に移動させた。以下の質量移行は、正極性での検証中に検出および定量に使用した。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
表３に列挙された質量遷移は、例としてのみ提供される。追加の前駆／生成物イオンペアが、表３に示されたペアを置き換えるまたは増大させるために選択されてもよい（例えば図２〜１４に示されたイオンから）。
【０１２５】
２つの患者試料の分析からの、ＫＰ−５２、ＫＰ−５３、ＫＰ−５４、およびＫＰ−５４（ＩＳ）を同時定量するための例示的な質量クロマトグラムが、図１５（患者＃１〜２８歳、妊娠２５週、血清）および図１６（患者＃１〜２８歳、妊娠２５週、ＥＤＴＡ血漿）、図１７（患者＃２〜２１歳、妊娠２５週、血清）、および図１８（患者＃２〜２１歳、妊娠２５週、ＥＤＴＡ血漿）に示されている。血清からの質量クロマトグラム対ＥＤＴＡ血漿試料の比較は、血清試料が、キスペプチン−５４由来ペプチドのより短い形態をより形成しやすいことを示している。
【０１２６】
実施例５：免疫アッセイによるキスペプチン−５４由来ペプチドの濃縮
この実施例では、最初の患者試料を、キスペプチンのＮ末端部分に高度に特異的な抗体を用いたキスペプチン−５４由来ペプチドの捕捉および抽出により濃縮する。
【０１２７】
ＫＰ−５４は、Ｃ末端で試料中で分解し、故にＫＰ−５４、ＫＰ−５３、ＫＰ−５２などのキスペプチン−５４由来ペプチド、ならびにこの同位体バリアントおよび化学的に修飾されたバリアントを捕捉および濃縮するのに、Ｎ末端特異的抗体を使用できることが見出された。
【０１２８】
ひとたびＮ末端特異的抗体上で捕捉してから、残りの試料成分は洗浄し、および上記のような質量分光分析などの当技術分野で公知の任意の方法による後の分析のために、捕捉ペプチドを溶出した。
【０１２９】
本明細書に言及および引用された論文、特許、および特許出願、および全ての他の文書および電子的に利用可能な情報の内容は、個々の刊行物が、参照により組み込まれることを具体的および個別に示される場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願者らは、上記論文、特許、ならびに特許出願、または他の物理的および電子的文書からの全ての材料ならびに情報を、本出願に物理的に組み込む権利を保有する。
【０１３０】
本明細書に例証的に記載された方法は、本明細書に詳細には開示されていない任意の構成要素、制限の非存在下で適切に実行することができる。故に、例えば、用語「含んでなる」、「含む」、「含有する」等は、拡大的におよび限定することなく解釈されるべきである。さらに、本明細書に使用されている用語および発現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および発現の使用において、示され記載された特徴またはこの部分のいかなる同等物も排除する意図はない。特許請求された本発明の範囲内でさまざまな変更が可能であることが認識される。故に、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴により詳細に開示されているが、本明細書に開示された、これらに具体化された本発明の変更および変形形態が当業者により用いられ得ること、このような変更および変形形態は、本発明の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。
【０１３１】
本発明は、本明細書で広く包括的に記載されている。包括的開示に含まれるより狭義の種および亜属のグループのそれぞれも、本方法の一部を形成する。これは、削除された事項が本明細書に具体的に引用されているか否かに関わりなく、属から任意の発明の主題を取り除く但し書きまたは否定的限定を有する本方法の包括的記載を含む。
【０１３２】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。さらに、本方法の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は本発明がこれにより、該マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの構成事項の亜群に関しても記載されると認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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