(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患の治療に使用するための、配列番号３からなるペプチドもしくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選択される配列を含むその断片、または配列番号８からなるペプチドもしくは配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択される配列を含むその断片を含む医薬組成物であって、前記心血管疾患は、心筋または脳梗塞、急性心筋梗塞、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、脳卒中、動脈瘤、安定または労作性狭心症、心筋症、高血圧性心疾患、慢性心不全、急性心不全、肺性心、不整脈、心内膜炎、心筋炎などの炎症性心疾患、末梢動脈疾患、ＳＩＲＳによる心筋および血管機能不全、およびアテローム性動脈硬化症から選択される、医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記心血管疾患が心筋梗塞である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記心血管疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物は、それを必要とする対象に注射される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、１つまたは複数の別の抗心血管疾患化合物と組み合わせて投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記１つまたは複数の別の抗心血管疾患化合物は、スタチン化合物、抗凝固剤法、抗アルドステロン化合物、ＡＣＥ阻害剤、およびベータ遮断剤から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体に関する。本発明はこのほか、心血管疾患の治療に使用するための配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の疾患の顕著な特徴である心血管疾患は世界で主要な死の過程である。
【０００３】
心筋梗塞または脳梗塞は、有害で損傷性の持続性または一過性心筋虚血に起因する複雑な臨床症候群の例である。これは通常、冠動脈／脳動脈閉塞によって引き起こされ、酸素の供給と需要との間に不均衡を生じる。
【０００４】
組織の損傷は虚血の持続時間に左右される。５分程度の短時間の虚血であれば、虚血組織は最終的に再灌流後に回復し、梗塞症状または致死的結果に至ることはない。しかし、虚血の持続時間が著しく長いと梗塞および炎症性反応を起こす。実際、梗塞と炎症性反応との間には関連があり、治癒および瘢痕形成の必要条件となっている［Ｅｎｔｍａｎ  Ｍ．Ｌ．ら，１９９４およびＭｅｈｔａ  Ｊ．Ｌ．ら，１９９９］。この応答は、虚血組織が再灌流された場合に程度および持続時間が増幅される。
【０００５】
この応答は多相性であり、最初の虚血が、ＴＮＦ−アルファ放出によって開始される壊死、フリーラジカル酸素種の形成、補体活性化およびサイトカインカスケードを誘導する。梗塞部の再灌流相が、虚血部位における白血球動員に関与する炎症性反応を増大および促進させる。動員された白血球はほかにも、ｉｎ  ｓｉｔｕおよび全身の炎症性メディエーター放出に関与し、最終的には、梗塞の病態生理学的結果の原因となる過剰に活性化した炎症状態をもたらす。
【０００６】
いずれの炎症性メディエーターについても作用に見解の一致をみていない。実際、梗塞の生理病理学では有益な作用と有害な作用との間で均衡が保たれている。例えば、ＴＮＦ−アルファは、その発現および放出の時間、持続時間およびレベルに応じて、心筋虚血時に細胞保護作用だけでなく有害な作用を示す［Ｈａｒｊｏｔ  Ｋ  Ｓａｉｎｉ．ら，２００５］。これにより、このような炎症性メディエーターの遮断を主体とする治療法の複雑さが説明され得る。
【０００７】
動脈閉塞によって引き起こされる初期の損傷事象から虚血後の組織修復の基礎となる後期段階の再生過程に及ぶ虚血カスケードの全段階において、炎症のメディエーター（サイトカイン、ケモカイン、ＲＯＳなど）の放出および広範囲の白血球動員が重要な役割を果たしている。この炎症性応答を標的とした多数の治療戦略が何らかの効果を示すことができなかった。現在、個々の虚血誘導性炎症性メディエーターではなく増幅ループに影響を及ぼす試みに価値があることは明らかであると思われる。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症では、動脈での病巣形成および管腔狭窄が徐々に進行することによって脳血管疾患および冠動脈疾患をきたす。プラーク破裂および血栓症が起こると、これらの最もよくみられる形態の心血管疾患が急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、心筋梗塞または脳卒中として発症する。ヒトおよび動物を対象にした研究では、アテローム性動脈硬化症が、主として内因的に修飾された構造体、具体的には自然免疫応答および適応免疫応答の両方を刺激する酸化リポタンパク質に応答して開始される動脈壁内での慢性炎症過程によって引き起こされることが確認されている。血管細胞および単球／マクロファージの両方の活性化によって自然応答が引き起こされ、次いで、抗原提示細胞によってエフェクターＴリンパ球に提示された多数の抗原候補に対して適応免疫応答が発現する［Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ  Ｈら，２０１１］。遺伝子改変マウスモデルにより、循環単球がケモカインによって血管壁内に動員された後、マクロファージおよび脂質を含有する細胞になることが明らかにされている。内膜マクロファージがサイトカイン放出によるプラーク発生、炎症増幅ならびにプロテアーゼ産生およびアポトーシス蓄積によるプラーク不安定化を促進する［Ｌｉｂｂｙ  Ｐ．２００２］。
【０００９】
ＰＲＲｓ（病原体認識受容体（Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の略）と相互作用するＰＡＭＰｓ（病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ａａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ）の略）と呼ばれる複数のメディエーターによって単球／マクロファージが刺激される。アテローム性動脈硬化症の生理病理には複数のＰＲＲｓが関与する。例えば、ヒトおよび動物のアテローム性動脈硬化病巣にはＴｏｌｌ様受容体が発現する。マウスではＴＬＲを阻害するとアテローム性動脈硬化症の発現が減少し、このような経路を標的とすることによってアテローム形成が抑制される可能性が示唆される［Ｂｊｏｒｋｂａｃｋａ  Ｈら，２００４］。
【００１０】
近年、骨髄細胞に発現する新たな受容体のファミリー、すなわち骨髄細胞に発現する誘発性受容体（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ）（ＴＲＥＭｓ）が新たに記載された。このファミリーのうちＴＲＥＭ−１が単球／マクロファージおよび好中球に発現する。ＴＲＥＭ−１の活性化により、サイトカインおよびケモカインの産生（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１および−３、ＭＩＰ−１αなど）とともに急速な好中球脱顆粒および酸化バーストが引き起こされる［Ｒａｄｓａｋ  ＭＰら，２００４およびＨａｒａ  Ｈら，２００９］。
【００１１】
ＴＲＥＭ−１の機能は、盛んな免疫応答を誘発するためにＴＬＲを合成することによって炎症を活性化／惹起するのではなく、これを調節／増幅することである。最初、感染時にＴＲＥＭ−１の病態生理的役割が特定された。ＴＲＥＭ−１は急性（腸間膜虚血−再灌流、出血性ショック、膵炎など）および慢性（炎症性腸疾患、リウマチ性疾患など）の両方の無菌性炎症時に極めて重要な役割を果たすことが知られている。
【００１２】
ＴＬＴ−１（Ｔｒｅｍ様転写産物−１（Ｔｒｅｍ−Ｌｉｋｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１））はＴＲＥＭファミリーのメンバーであるが、巨核球および血小板のみにみられるものである。ＴＬＴ−１は最初、血小板凝集時にフィブリノーゲンを結合し血小板凝集体を安定化することによって何らかの役割を果たすことが確認された。しかし、本発明者らのＴＬＴ−１、可溶性ＴＬＴ−１およびｓＴＬＴ−１由来ポリペプチドに関する研究室で得られた新たな観察結果から、ＴＬＴ−１が炎症時にＴＲＥＭ−１を特異的に阻害することによって何らかの役割を果たすことが明らかになった［Ｄｅｒｉｖｅ  Ｍら，２０１２，国際公開第２０１０／１２４６８５号］。
【００１３】
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎらは、ＴＬＴ−１が炎症時に血管損傷部位での血小板凝集を促進することによって保護的役割を果たすことを記載している（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９）。
【００１４】
血小板凝集が心血管疾患（例えば、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症）時に最悪の転帰をもたらすことが知られているため、ＴＬＴ−１由来ペプチドが心血管疾患に対して治療効果を示すことがわかったのは驚くべきことであった。
【００１５】
本発明者らは本明細書に、１）ＴＲＥＭ−１が大動脈、腸間膜動脈および微小血管の細胞の内皮細胞によって発現されること、２）ＴＲＥＭ−１が心筋組織によって発現され、その発現が心筋虚血（持続性心筋虚血および一過性心筋虚血）後の梗塞部においてアップレギュレートされること、３）ＴＲＥＭ−１がアテローム斑内に動員されたマクロファージによって発現されることを記載する。
【００１６】
本発明者らはこのほか、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドがともにＴＲＥＭ−１を特異的に阻害し、心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症におけるＴＲＥＭ−１による炎症性応答を低下させることが可能であることを示す。
【００１７】
その結果、心筋虚血（持続性虚血および一過性虚血）の２つの異なるモデルの急性期にこれらのペプチドを投与することによってｓｉｔｕの炎症性応答およびこれに続く白血球輸送が調節され、これにより虚血後の心リモデリングおよび疾患進行の後期段階が抑制された。実際、持続性虚血および一過性虚血（虚血−再灌流）事象の６週間後に心機能の劇的な改善が認められた。これは生存率の上昇につながるものであると考えられた。
【００１８】
本発明者らは最後に、ＴＲＥＭ−１を特異的に阻害することによってアテローム斑形成の拡大を抑制することにおけるＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの役割を示す。
【００１９】
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列および機能保存的変異体から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドに関する。
【００２０】
本発明はさらに、心血管疾患の治療に使用するための配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体または本発明による単離核酸、発現ベクター、宿主細胞に関する。
【発明の概要】
【００２１】
本発明の１つの目的は、心血管疾患の治療に使用するための配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体である。
【００２２】
一実施形態では、前記ペプチドは、心血管疾患の治療に使用するための配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなる群より選択される６個の連続するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
一実施形態では、心血管疾患は心筋梗塞である。
【００２４】
別の実施形態では、心血管疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【００２５】
本発明の別の目的は、配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体である。
【００２６】
一実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなる群より選択される６個の連続するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
別の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号８または配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる。
【００２９】
本発明の別の目的は、上記ペプチドをコードする単離核酸配列である。
【００３０】
本発明の別の目的は、上記核酸配列を含む発現ベクターである。
【００３１】
本発明の別の目的は、上記発現ベクターを含む宿主細胞である。
【００３２】
本発明の別の目的は、治療有効量の少なくとも１つの上記ペプチド、上記核酸、上記発現ベクターまたは上記宿主細胞を少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とともに含む、医薬組成物である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本明細書全体を通じていくつかの用語が使用され、以下の段落ではこれを定義する。
【００３４】
本明細書で使用される「ＴＬＴ−１」または「ＴＲＥＭ様転写産物１」という用語は、ＴＲＥＭファミリーのメンバーを表す。Ｍｃｖｉｃａｒのグループによる初期の研究［Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ａ．Ｖ．ら，２００４］よって、ＴＬＴ−１が血小板および巨核球系に特異的に豊富に存在し、血小板α顆粒中の閉じ込められていることが示された。トロンビンまたはＬＰＳによって血小板が活性化すると、ＴＬＴ−１が血小板表面に移動する。ＴＬＴ−１にはｖセットＩｇ様細胞外ドメイン、膜貫通領域および免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）とポリプロリンリッチドメインとを含む細胞質側末端が含まれている。ＴＲＥＭファミリーの他のメンバーとは異なり、ＴＬＴ−１はＤＡＰ１２活性化連鎖と共役しないが、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞のＣａ＋＋シグナル伝達を増強することが示されており、これはＴＬＴ−１が共活性化受容体であることを示唆するものである。ＴＬＴ−１のアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列として記載されている。
【００３５】
本明細書で使用される「骨髄細胞に発現する誘発性受容体（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  １）」に対する「ＴＲＥＭ−１」という用語は、ヒトおよびマウスの多形核好中球および成熟単球の両方で同定されている細胞表面分子を表す。この分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＤＡＰ１２と呼ばれるアダプタータンパク質の助けを借りて下流のシグナル伝達経路を活性化する。細胞培養でも感染症の患者の組織試料中でも、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）や黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などの細菌の存在するとき、ＴＲＥＭ−１の発現が細好中球および単球で大幅にアップレギュレートされる。これとは著しく対照的に、免疫複合体によって引き起こされる乾癬、潰瘍性大腸炎または血管炎などの非感染性の炎症性疾患の患者の試料ではＴＲＥＭ−１はアップレギュレートされない。さらに、ＴＲＥＭ−１がそのリガンドと結合すると、ＩＬ−１０産生の阻害とともにＬＰＳの相乗作用およびＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカイン合成の増幅が観察される。ＴＲＥＭ−１のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列として記載されている。
【００３６】
ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドとも呼ばれる本発明のペプチドを下の表１に記載する。
【００３７】
【表１】
0006307080.tif 000002
【００３８】
本明細書で使用される「機能保存的変異体」という用語は、特に限定されないが、あるアミノ酸をこれとほぼ同じ特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸に置き換えることを含め、ペプチドの全体的なコンホメーションおよび機能を変化させずにタンパク質または酵素内の所与のアミノ酸残基が改変した、本発明のペプチドに由来するペプチドを表す。タンパク質内で保存されているとされるアミノ酸以外のアミノ酸が異なっていてもよく、この場合、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質の間でのタンパク質またはアミノ酸配列類似性のパーセントは異なるものであり得、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法などのアライメント方法による決定で、例えば７０％〜９９％であり得る。「機能保存的変異体」にはこのほか、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによる決定でアミノ酸同一性が少なくとも２０％、好ましくは４０％、より好ましくは６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％であり、比較する元のタンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的にほぼ同じ特性または機能を有するペプチドが含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのコンホメーション、活性、特異性、効果または安定性を修正するために別の方法で修飾された、すなわち、任意の種類の分子とペプチドとを共有結合させることによって、配列のアミノ酸のいずれかに化合物を付加することによって修飾された、本発明のペプチドまたはその機能保存的変異体のバリエーションを指す。
【００４０】
本明細書で使用される「治療すること」または「治療」という用語は、このような用途が適用される障害もしくは病態またはこのような障害もしくは病態の１つもしくは複数の症状を元の状態に戻す、軽減する、その進行を抑制するまたはこれを予防することを表す。
【００４１】
本発明によれば、「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、必要に応じて哺乳動物、特にヒトに投与したときに有害反応、アレルギー反応をはじめとする望ましくない反応を引き起こさない実体および組成物を表す。薬学的に許容される担体または添加剤は、無毒性の固体、半固体または液体である任意の種類の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を指す。
【００４２】
本発明によれば、治療する「患者」または「個体」という用語は、炎症性障害に罹患しているか、これに罹患する可能性のあるヒトまたは非ヒト哺乳動物（げっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌまたは霊長類など）を対象とする。好ましくは、対象はヒトである。
【００４３】
本発明のペプチド
本発明の第一の態様は、配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体に関する。
【００４４】
本発明の別の態様は、配列番号１のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体に関する。
【００４５】
一実施形態では、前記ペプチドは配列番号１ではない。
【００４６】
一実施形態では、前記ペプチドは配列番号２ではない。
【００４７】
一実施形態では、ペプチドは長さが５０アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２５アミノ酸未満、２０アミノ酸未満である。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは長さが６〜２０アミノ酸、１０〜２０アミノ酸、１２〜１８アミノ酸または１４〜１６アミノ酸である。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは長さが３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸または２０アミノ酸である。
【００５０】
別の実施形態では、本発明によるペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２からなる群より選択される６個の連続するアミノ酸配列を含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、配列番号３または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、配列番号４または配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる。
【００５４】
別の実施形態では、本発明によるペプチドはＤ−またはＬ−立体配置を有し得る。
【００５５】
別の実施形態では、本発明によるペプチドのアミノ末端のアミノ酸はアセチル化された末端アミノ基を有し、カルボキシル末端のアミノ酸はアミド化された末端カルボキシ基を有する。したがって、本発明はほかにも、アミノ末端がアセチル化されているか、カルボキシ末端がアミド化されている、本発明のペプチドの誘導体を含む。
【００５６】
さらに、本発明によるペプチドの生物学的利用能（安定性および脂溶性を含む）ならびに本発明によるペプチドが血液脳関門および上皮組織を通過する能力を増大させるために、これに可逆的化学修飾を施し得る。このような可逆的化学修飾の例としては、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシ基とアルコールとのエステル化によってアミノ酸の負電荷を除去し、その疎水性を増大させることが挙げられる。このエステル化は、形成されるエステル結合がこれを加水分解する細胞内エステラーゼによって認識されてアスパラギン酸およびグルタミン酸残基の電荷が元に戻るため、可逆的なものである。その正味の効果は、内部に取り込まれ脱エステル化されたペプチドが細胞膜を通過することができないことから、細胞内ペプチドの蓄積となる。
【００５７】
このような可逆的化学修飾の別の例としては、膜透過性の増大を可能にするＴＡＴペプチドまたはペネトラチンペプチドなどのペプチド配列をさらに付加することが挙げられる（Ｃｈａｒｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｏｊａｎ．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｏｊａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  １５  Ｐｏｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８７，Ｉｓｓｕｅ  １，１  Ｊｕｌｙ  ２００４，Ｐａｇｅｓ  ３３２−３４３を参照されたい）。
【００５８】
Ｆｍｏｃおよび／またはＢｏｃベースの２０法論に従って、従来の固相化学ペプチド合成法により本発明によるペプチドを入手し得る（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｎ．（１９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａを参照されたい）。
【００５９】
あるいは、組換えＤＮＡ技術に基づく従来の方法によって、例えば、簡潔に述べると、本発明のペプチドをコードする核酸配列をしかるべきプラスミドまたはベクターに挿入し、前記プラスミドまたはベクターにコンピテントな細胞を形質転換し、本発明のペプチドの発現が可能な条件下で前記細胞を培養し、必要に応じて、このような事柄の専門家に知られている従来の手段により本発明のペプチドを単離および（任意選択で）精製することを含む方法によって、本発明によるペプチドを入手してもよい。本発明のペプチドをコードする核酸配列は、アミノ酸と、このようなアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンとの間に存在する対応から容易に推定され得る。この場合、本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドをコードする単離核酸配列である。ある特定の実施形態では、前記核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡから選択される。本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドをコードする前記核酸配列を含むプラスミドおよび発現ベクターならびに本発明のペプチドを発現する原核細胞または真核細胞である。組換えＤＮＡ技術の原理の概説については、例えば、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社が出版する「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  ５  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」と題するテキスト（Ｒ．Ｗ．ＯｌｄおよびＳ．Ｂ．，第４版（１９８９））にみることができる。
【００６０】
記載される通り、本発明はほかにも、本発明のペプチドと機能的に同等なペプチドまたは「機能保存的変異体」を含む。この説明で使用される意味において、「機能的に同等な」という表現は、問題のペプチドが、例えば炎症を軽減する能力などの本発明のペプチドの生物活性を少なくとも１つ有することを意味する。
【００６１】
本発明のペプチドの効果は、ペプチドにより心血管疾患の炎症が軽減したことを評価する簡単な試験を実施することによって、当業者に明らかになるであろう。例えば、単離したヒト好中球、マクロファージまたは内皮細胞５×１０５個を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳおよび／または１０μｇ／ｍＬの抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂの存在下、２０μｇ／ｍＬのポリペプチドを加えて、または加えずに、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。次いで、上清を収集し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡによって測定する。被験ペプチドがＴＲＥＭ−１を阻害すれば、サイトカイン濃度がペプチドを加えない条件に比して最大３０％低下するはずである。
【００６２】
本発明の核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明の第二の態様は、本発明によるペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００６３】
好ましい実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を有するペプチドをコードする核酸分子。
【００６４】
「コード配列」またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列とは、発現するとＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列のことである、すなわち、このヌクレオチド配列はタンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードするものである。タンパク質のコード配列は開始コドン（通常、ＡＴＧ）および停止コドンを含み得る。
【００６５】
このような核酸分子は、当業者に周知の従来の方法によって、特に天然のタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的変異誘発によって入手し得る。通常、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、これをプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの適切なベクターに含ませ得る。
【００６６】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子が転写を制御する適切なエレメント（特にプロモーター、エンハンサーおよび任意選択でターミネーター）および任意選択で翻訳と関連付けられたベクターおよび発現カセットのほか、本発明による核酸分子が挿入された組換えベクターに関する。このような組換えベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。
【００６７】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞内に導入して宿主を形質転換し、導入した配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進させ得る運搬体を意味する。
【００６８】
本発明のペプチドまたはキメラ誘導体をコードする遺伝子を挿入し発現させることができる限り、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用し得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１ベータｄ２−４などが挙げられる。
【００６９】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミドまたは例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。
【００７０】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当該技術分野で公知の技術、例えば、パッケージング細胞にトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくは３０ウイルスによる一過性トランスフェクションなどによって作製し得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコルについては、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、同第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、同第６，０１３，５１６号、同第４，８６１，７１９号、同第５，２７８，０５６号および国際公開第９４／１９４７８号にみることができる。
【００７１】
動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔ．ら，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ  Ｙら，１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ  ＪＯら，１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤら，１９８３）などが挙げられる。
【００７２】
本発明にはほかにも、ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療に使用することができる、本発明の核酸分子を含む遺伝子送達システムが含まれる。これには、例えば、従来の方法で遺伝子治療に使用される、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスに由来するベクターなどのウイルス転移ベクターが含まれる。これにはほかにも、本発明の核酸分子と非ウイルス遺伝子送達ビヒクルとを含む遺伝子送達システムが含まれる。非ウイルス遺伝子送達ビヒクルの例としては、リポソームおよびポリエチレンイミン、シクロデキストリン、ヒスチジン／リジン（ＨＫ）ポリマーなどのポリマーが挙げられる。
【００７３】
本発明の別の目的にはほかにも、少なくとも１つの本発明による核酸分子により遺伝的に形質転換した原核または真核宿主細胞がある。
【００７４】
「形質転換」という用語は、「外来性」（すなわち、外因性または細胞外）の遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞が導入遺伝子または配列を発現して所望の物質、通常、導入遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生させることを意味する。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は「形質転換された」ことになる。
【００７５】
ペプチド、特に本発明によるペプチドの発現および産生には、真核細胞、特に哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞を選択するのが好ましい。
【００７６】
通常、誘導体の適切な翻訳後修飾にプロセシングする能力があることから、ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、ＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３  ２５などの細胞系を使用し得る。
【００７７】
本発明による発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換は従来の分子生物学技術を用いて実施することができる。本発明のＶ−ＡＴＰアーゼｃ−サブユニット誘導体は、例えば、本発明による遺伝的に形質転換した細胞を培養し、前記細胞によって発現された誘導体を培養物から回収することによって得られる３０であり得る。次いで、これらを必要に応じて、それ自体が当業者に公知の従来の方法、例えば、分画沈殿法、特に硫酸アンモニウム沈殿法、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどによって精製し得る。
【００７８】
特に、本発明によるタンパク質の作製には、組換えタンパク質を調製および精製するための従来の方法を用い得る。
【００７９】
治療法、使用および医薬組成物
本発明の第三の目的は、心血管疾患の治療に使用するための本発明によるペプチドに関する。
【００８０】
本発明の１つの目的は治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であり、この方法は対象に治療有効量の上記ペプチドを投与することを含む。一実施形態では、前記方法は上記ペプチドを投与することを含み、前記ペプチドはＴＲＥＭ−１を阻害する。
【００８１】
特に限定されないが、心筋および脳梗塞、急性心筋梗塞、虚血、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、脳卒中、動脈瘤、安定または労作性狭心症、心筋症、高血圧性心疾患、心不全（慢性および急性）、肺性心、不整脈、心内膜炎、心筋炎などの炎症性心疾患、末梢動脈疾患、ＳＩＲＳによる心筋および血管機能不全、アテローム性動脈硬化症を含めた、本発明による心血管疾患。
【００８２】
一実施形態では、心血管疾患病態は心筋梗塞である。
【００８３】
別の実施形態では、心血管疾患病態はアテローム性動脈硬化症である。
【００８４】
別の実施形態では、心血管疾患病態はＳＩＲＳによる心筋および血管機能不全である。
【００８５】
一実施形態では、心血管疾患は腸間膜虚血再灌流ではない。
【００８６】
別の実施形態では、心血管疾患は複数菌敗血症時の心血管保護を含まない。
【００８７】
一実施形態では、本発明のペプチドを敗血症の治療に使用しない。
【００８８】
一実施形態では、本発明のペプチドを虚血および再灌流症候群の治療に使用しない。
【００８９】
一実施形態では、本発明のペプチドを凝固亢進状態の患者の治療に使用しない。
【００９０】
一実施形態では、本発明のペプチドを炎症による出血の治療に使用しない。
【００９１】
一実施形態では、本発明のペプチドを急性ウイルス性心筋炎の治療に使用しない。
【００９２】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドを心筋および脳梗塞、心筋虚血、冠動脈心疾患、脳卒中、動脈瘤、安定または労作性狭心症、心筋症、高血圧性心疾患、心不全（慢性および急性）、肺性心、不整脈、心内膜炎、心筋炎などの炎症性心疾患、末梢動脈疾患、ＳＩＲＳによる心筋および血管機能不全ならびにアテローム性動脈硬化症からなる群で選択される心血管疾患の治療に使用する。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療に使用するための配列番号２のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体または配列番号１のアミノ酸配列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含むペプチドおよび機能保存的変異体に関する。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明は、心血管疾患の治療に使用するための配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列のペプチドに関する。
【００９５】
一実施形態では、本発明はほかにも、心血管疾患の治療に使用するための本発明による単離核酸、本発明によるプラスミド、本発明による発現ベクターまたは本発明による宿主細胞に関する。
【００９６】
本発明によるペプチドは、そのデコイ受容体の特性により炎症性病態を治療することができる。
【００９７】
「デコイ受容体」は、ポリ本発明によるペプチド（ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチド）がＴＲＥＭ−１リガンドを捕捉し、そのＴＲＥＭ−１に対する生理学的作用を妨げることを意味する。
【００９８】
したがって、本発明によるペプチドは、より効果的に心血管疾患を阻止する目的で併用療法（複数の治療標的を対象とする）の一部を形成し得る。
【００９９】
本発明のさらなる目的は、治療有効量の少なくとも１つの本発明によるペプチドを少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とともに含む医薬組成物である。ある特定の実施形態では、前記医薬組成物はほかにも、１つまたは複数の（ＣＯＯＨ）ペプチドを含有する。あるいは、本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む治療有効量のベクターを、少なくとも１つの補助剤および／または薬学的に許容される添加剤とともに含有し得る。前記ベクターは遺伝子治療に使用され得る。
【０１００】
「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で心血管疾患を治療するのに十分な量の本発明のキメラ誘導体を意味する。
【０１０１】
本発明の化合物および組成物の総１日量は、主治医によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量レベルは、治療する障害およびその障害の重症度；使用する具体的な化合物の活性；使用する具体的な組成物、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事；投与のタイミング、投与経路、使用する具体的な化合物の排泄速度；治療の継続期間；使用する具体的なペプチドと併用して、または同時に使用する薬物；ならびに医学分野で周知の同様の因子を含めた様々な因子によって決まる。例えば、所望の治療効果を得るのに必要な用量よりも低いレベルの化合物の用量から開始し、所望の効果が得られるまで用量を漸増させることは、十分当業者の技能範囲内にある。しかし、生成物の１日量は、成人１日当たり０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲にわたって変化し得る。組成物は、治療する患者に対する用量を対症的に調節するために、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇおよび５００ｍｇの有効成分を含有するのが好ましい。薬剤は通常、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分、好ましくは１ｍｇ〜約１００ｍｇの有効成分を含有する。有効量の薬物は通常、体重１ｋｇに対して１日当たり０．０００２ｍｇ〜約２０ｍｇ、特に体重１ｋｇに対して１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇの用量レベルで供給される。
【０１０２】
本発明の活性な産物（ペプチド、核酸、ラスミド、発現ベクターまたは宿主細胞）を心血管疾患の治療に使用するために投与し得る。投与するべき本発明の活性な産物［ペプチドまたはベクター（構築物）］の治療有効量ならび本発明のペプチドおよび／または医薬組成物で病的状態を治療するための用量は、患者の年齢および状態、障害または疾患の重症度、投与の方法および頻度ならびに使用する具体的なペプチドを含めた多数の因子によって左右される。
【０１０３】
本発明のペプチドまたはベクター（構築物）を含有する医薬組成物の提供形態は、投与に適した任意の形態、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤または液剤などの固体、液体または半固体であってよく、これらの組成物は、任意の適切な手段によって、例えば、経口的に、非経口的に、吸入により、または局所的に投与し得るため、所望の投与形態を形成するのに必要な薬学的に許容される添加剤を含む。医薬品を投与するための様々な医薬形態およびそれを得るのに必要な添加剤に関する概説が、例えば、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌ  ｎｉｃａ」（製剤学に関する論文），Ｃ．Ｆａｕｌ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１９９３，Ｌｕｚ  ｎ  ５，Ｓ．Ａ．Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，Ｍａｄｒｉｄにみられる。
【０１０４】
経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与、経肺投与または経直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分を単独で、または別の有効成分と組み合わせて、従来の製薬補助剤との混合物として単位投与形態で動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態には、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤もしくは液剤などの経口経路形態、舌下およびバッカル投与形態、エアゾール剤、埋植物、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内および鼻腔内投与形態ならびに経直腸投与形態が含まれる。
【０１０５】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容される賦形剤を含有する。これらは具体的には、等張で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）または場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水の添加によって注射用液剤を構成することが可能な乾燥組成物、特に凍結乾燥であり得る。
【０１０６】
注射用途に適した医薬形態としては、無菌水溶液剤または分散液剤；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射用液剤または分散液剤の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。いずれの場合にも、その形態は無菌状態であり、かつ容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。それは製造および保管条件下で安定であり、かつ細菌および真菌などの微生物による汚染作用から保護されなければならない。
【０１０７】
本発明の化合物を遊離塩基または薬学的に許容される塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。このほか分散液剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油で著精することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を抑えるために保存剤を含有する。
【０１０８】
本発明によるペプチドは、中性または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基との間で形成される）が挙げられ、これは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸との間で形成される。遊離カルボキシル基との間で形成される塩はこのほか、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものであり得る。
【０１０９】
このほか担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物および植物性油を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒子径を維持することによって、また界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、微生物の活動を抑制することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。組成物中に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０１１０】
必要な量の活性なペプチドを必要に応じて上記の他の成分とともにしかるべき溶媒に組み込んだ後、ろ過滅菌することによって、無菌注射用液剤を調製する。一般に、基礎となる分散媒と、上に挙げた他の成分のうち必要な成分とを含有する無菌賦形剤に、滅菌した様々な有効成分を組み込むことによって分散液剤を調製する。無菌注射用液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過した有効成分と任意の追加の所望成分との溶液からその粉末を得ることができる、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１１１】
製剤化すると、投与剤形に適合した方法で、治療効果の得られる量で液剤が投与される。製剤は上記注射用液剤のタイプのような様々な剤形で容易に投与されるが、ほかにも薬物放出カプセル剤などを用いることができる。水溶液での非経口投与には、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、最初に液体希釈剤を十分な量の生理食塩水またはグルコースで等張にするべきである。このような特定の水溶液は、特に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適している。これに関連して、本開示を踏まえれば、当業者には使用し得る無菌水性媒質がわかるであろう。例えば、１回量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶かし、これを皮下注入液１０００ｍｌに加えるか、注入しようとする部位に注射し得る。治療する対象の状態に応じて、必然的に用量の多少の変更が生じる。いずれの場合にも、投与に関与する者が個々の対象に適した用量を決定する。
【０１１２】
本発明のペプチドは、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム、約０．００１〜０．１ミリグラムまたは約０．１〜１．０ミリグラム、場合によっては約１０ミリグラムなどを含む治療用混合物として製剤化され得る。ほかにも、複数の用量を投与し得る。
【０１１３】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態としては、例えば、錠剤をはじめとする経口投与用固形物；リポソーム製剤；持効性カプセル剤；および現在用いられている他の任意の形態が挙げられる。
【０１１４】
既に述べた通り、本発明によるペプチドは、より効果的に心血管疾患を阻止する目的で併用療法の一部を形成し得る。この場合、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを１つまたは複数の別の抗心血管疾患化合物、例えば、スタチン化合物、抗凝固剤法、抗アルドステロン化合物、ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン変換酵素阻害薬）およびベータ遮断剤とともに含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
さらに、本発明は、哺乳動物の心血管疾患を治療する方法を提供し、この方法は、前記心血管疾患に罹患している前記哺乳動物に、治療有効量の少なくとも１つの本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むベクターを、好ましくはそれを含有する医薬組成物の形態で投与することからなる。本発明の１つの特定の実施形態では、前記医薬組成物は、１つまたは複数の本発明のペプチドに加えて、１つまたは複数の（ＣＯＯＨ）ペプチドを含有する。
【０１１６】
一実施形態では、特に限定されないが、心筋および脳梗塞、急性心筋梗塞、虚血、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、脳卒中、動脈瘤、安定または労作性狭心症、心筋症、高血圧性心疾患、心不全（慢性および急性）、肺性心、不整脈、心内膜炎、心筋炎などの炎症性心疾患、末梢動脈疾患、ＳＩＲＳによる心筋および血管機能不全、アテローム性動脈硬化症を含めた、本発明による心血管疾患。
【０１１７】
本発明を以下の図面および実施例によってさらに説明する。しかし、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節が、αＴＲＥＭ−１およびＬＰＳによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発した血管機能不全に対して有益であることを示す図である。大動脈リングのフェニレフリン（ＡおよびＢ）およびアセチルコリン（Ｃ）に対する濃度−応答曲線。健常ラットから大動脈を採取し、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドまたはＬＲ１２スクランブルペプチドを加え、または加えずに、αＴＲＥＭ−１（５μｇ／ｍＬ）およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。Ｂ：一部の大動脈から内皮を剥離した（−Ｅ）。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものであり、ｐ値：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意差無し。
【図２】ＴＲＥＭ−１が伝導動脈および抵抗動脈由来の内皮細胞に発現することを示す図である。図示されるようにＬＰＳを加えて、または加えずにマウス大動脈（伝導動脈）（Ａ）およびラット腸間膜動脈（抵抗動脈）（Ｂ）を刺激した。ｑＲＴ−ＰＣＲによりＴｒｅｍ−１発現を測定した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものであり、ｐ値：＊＊＊ｐ値＜０．００１。ｎｓ（有意差無し）。
【図３】ＴＲＥＭ−１が微小血管内皮細胞に構成的に発現し誘導性であることを示す図である。マウス肺および肝臓から単離したＣＤ１４６＋／ＶＥＧＦＲ２＋細胞（ＬｕＭＥＣおよびＬｉＭＥＣ）をフローサイトメトリーによりＴＲＥＭ−１発現について分析した。ＴＲＥＭ−１はＬｉ／ＬｕＭＥＣに構成的に発現する（Ａ）。ＴＲＥＭ−１発現は実験的敗血症時（Ａ）にｉｎ  ｖｉｖｏで誘導性であり、またＬＰＳによる１時間の刺激時（Ｂ）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導性である。このほか、ＦＡＣＳによりＴＲＥＭ−１およびＶＥＧＦＲ２発現の動態を解析した（Ｃ）。ＬＰＳにより時間依存性のＴＲＥＭ−１およびＶＥＧＦＲ２発現のアップレギュレーションが誘導され、これはＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって阻害された。データは少なくとも１０の異なる実験の代表的なものであり、ｐ値：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】ＬＰＳ刺激時のＴＲＥＭ−１発現の動態を示す図である。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬｕＭＥＣ（ＣＤ１４６＋、ＶＥＧＦＲ２＋）をＬＰＳで４時間および１２時間刺激し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより（Ａ）Ｔｒｅｍ−１、Ｔｎｆ−α（Ｂ）およびＩｌ−６（Ｃ）の発現について解析した。データは少なくとも１０の異なる実験の代表的なものである。
【図５】ＬＰＳで２４時間刺激したＬｕＭＥＣによるサイトカイン産生に対するＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの効果を示す図である。（Ａ）ＬＰＳで２４時間刺激したＬｕＭＥＣの上清中のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＬＰＳで２４時間刺激したＬｕＭＥＣにおけるサイトカイン／ケモカイン測定。データは対照細胞とＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置した細胞との間の比で表されている（比が１を上回れば、処置細胞よりも対照細胞の方が濃度が高いことを表す）。データは少なくとも１０の異なる実験の代表的なものである。
【図６】敗血症時にｉｎ  ｖｉｖｏで阻害された血管細胞内シグナル伝達経路が、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節によって回復することを示す図である。ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドは、Ａｋｔ経路およびＣｏｘ−１発現の阻害を正常に戻すことに加えて、Ｃｏｘ−２およびｉＮＯＳを例とする誘導性経路のアップレギュレーションを回復させることができる。この効果は大動脈（Ａ）および腸間膜動脈（Ｂ）で測定された。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものであり、ｐ値：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節が敗血症性心機能不全に対して有益であることを示す図である。敗血症性心機能不全のラットモデルにＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドを投与すると、Ｍｉｌｌａｒカテーテルによって測定される固有の心機能（ＦＥＶＧ、ＥＳＰＶＲ、ｄｐｄｔｍａｘ／Ｖｅｄ、ＰＲＳＷ）が増大する。データは少なくとも１０の異なる実験の代表的なものである。
【図８】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節が敗血症による低血圧および心機能不全に対して有益であることを示す図である。（Ａ）敗血症性心機能不全のミニブタモデルにＴＬＴ−１由来ペプチドおよびＴＲＥＭ−１由来ペプチドを投与すると、安定な平均動脈圧（８５ｍｍＨｇ）の維持に必要なノルエピネフリン注入量が減少する。実際、対照個体よりもＴＬＴ−１由来ペプチドおよびＴＲＥＭ−１由来ペプチドで処置した個体の方が常にＭＡＰが高く、ノルエピネフリン投与量が少なかった。（Ｂ）心係数、心拍出力係数、ＳｖＯ２および酸素運搬量の評価。これらのパラメータはすべて、ＴＬＴ−１由来ペプチドおよびＴＲＥＭ−１由来ペプチドで処置個体の方が対照個体よりも高い値を示した。（Ｃ）ＬＲ１２によりアシドーシスおよび高乳酸塩血症の発現が減弱された。ＬＲ１２群はｎ＝６、ＬＲ１２スクランブル群はｎ＝５である。
【図９】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節が敗血症による拡張期、収縮期および平均動脈圧の変化に対して有益であることを示す図である。敗血症性心機能不全（内毒血症）のサルモデルにＴＬＴ−１由来ペプチドおよびＴＲＥＭ−１由来ペプチドを投与すると、内毒素による一過性の血圧低下が完全に予防された（平均血圧（Ａ）、収縮期血圧（Ｂ）および拡張期血圧（Ｃ））（ｐ＜０．００１、対照ペプチド対ＬＲ１２）。平均±ＳＤ。Ｎ＝６／グループ。
【図１０】ＴＲＥＭ−１が心筋組織に発現し、虚血時にアップレギュレートされることを示す図である。（Ａ）ベースライン時の心筋ならびに心筋梗塞の６時間後、１２時間後および２４時間後の梗塞領域におけるＴｒｅｍ−１  ｍＲＮＡのｑ−ＰＣＲによる定量化。（Ｂ）心筋梗塞の２４時間後におけるＴＲＥＭ−１タンパク質の定量化。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊ｐ＜０．００１［健常領域と梗塞領域との比較］である。
【図１１】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を調節することによって、梗塞を起こした心筋における白血球動員および遠隔区画からの白血球動員を制御することを示す図である。（Ａ）ＴＬＴ−１由来ペプチドおよびＴＲＥＭ−１由来ペプチドまたは対照ペプチド（ＬＲ１２−ｓｃｒ）で処置したマウスにおける様々な時点での梗塞を起こした心筋への白血球浸潤のフローサイトメトリーによる定量化；１グループ当たりおよび１時点当たりのマウスはｎ＝５；ＬＲ１２−ｓｃｒとの比較で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、偽手術との比較で≠ｐ＜０．０５、≠≠ｐ＜０．０１である。（Ｂ）ＭＩ後の様々な時点における骨髄、血液および脾臓中の白血球のサブタイプのフローサイトメトリーによる定量化；各時点においてｎ＝６〜７；ＬＲ１２−ｓｃｒ処置マウスとの比較で＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５；偽手術マウスとの比較で≠≠ｐ＜０．０１、≠ｐ＜０．０５である。（Ｃ）ＭＩ後のＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３の血漿中濃度；マウスはｎ＝５；ＬＲ１２−ｓｃｒ処置個体との比較で＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１２】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、マウスの虚血時に心筋炎症性反応を調節することを示す図である。この実験には、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドまたは対照ＬＲ１２スクランブルペプチド（「対照」）で処置したマウスから心筋梗塞誘発の２４時間後に心筋溶解物を得た。２つの領域、すなわち対照個体の梗塞を起こした区域から遠位にある部分から採取した健常領域および梗塞領域を検討した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊ｐ＜０．００１［ＬＲ１２と対照との比較］である。ホスホ（ｐ）−ｐ３８、（ｐ）−ＥＲＫ１／２、ｉＮＯＳ、Ｃｏｘ２、（ｐ）−Ａｋｔ、（ｐ）−ＧＳＫ３β、Ｓｏｃｓ３に対する抗体で分析した心筋組織溶解物のウエスタンブロット。
【図１３】マウスの虚血時の心筋組織によるサイトカイン産生に対するＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの効果を示す図である。この実験には、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドまたは対照ＬＲ１２スクランブルペプチド（「対照」）で処置したマウスから心筋梗塞誘発の６時間後、２４時間後および／または９６時間後に心筋溶解物を得た。梗塞領域をサイトカイン／ケモカイン産生について分析した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。ｐ値は＊ｐ＜０．００１［ＬＲ１２と対照との比較］である。（Ａ）梗塞を起こした心筋組織における心筋梗塞２４時間後のサイトカイン／ケモカイン測定。データは対照個体とＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したマウスとの間の比で表されている（比が１を上回れば、処置マウスよりも対照マウスの方が濃度が高いことを表す）。（Ｂ）サイトカインの発現：梗塞を起こした心筋組織における心筋梗塞６時間後、２４時間後および９６時間後のＴｎｆ−α、Ｉｌ−６およびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベル。
【図１４】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、心筋梗塞領域のプロテアーゼ活性を低下させることを示す図である。この実験には、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドまたは対照ＬＲ１２スクランブルペプチド（「対照」）で処置したマウスから心筋梗塞誘発の６時間後、２４時間後および９６時間後に心筋溶解物を得た。梗塞領域を分析した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。（Ａ）Ｑ−ＰＣＲによるＭｍｐ９  ｍＲＮＡの定量化；（Ｂ）Ｔｉｍｐ−１；ならびに（Ｃ）ベースライン時、心筋梗塞の１２時間後、２４時間後および９６時間後のＭｍｐ−９ゼラチナーゼ活性を示す代表的なゲル内酵素電気泳動。上：対照ペプチドで処置した個体；下：ＬＲ１２で処置した個体。
【図１５】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、マウスの心筋梗塞後の生存率を改善することを示す図である。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）に心筋虚血操作を加え、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドを反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中１００μｇを１日１回で５日間）グループ、スクランブルＬＲ１２を反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中１００μｇを１日１回で５日間）グループまたは０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中１０μｇの抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂを腹腔内注射するグループに無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝１０〜１５）。生存率を１週間モニターし、ログランク検定により解析した（第５日以降、死亡個体はみられなかった）。データは少なくとも１５の異なる実験の代表的なものである。
【図１６】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、ラットの心筋虚血−再灌流後の心機能を改善することを示す図である。成体雄Ｗｉｓｔａｒラットに心筋虚血−再灌流操作を加え、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドを反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回で５日間）グループまたはスクランブルＬＲ１２を反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回で５日間）グループに無作為に割り付けた（ｎ＝１０）。心筋損傷の６週間後、麻酔下でコンダクタンスカテーテルを用いて心機能を検討した。ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したラットの方が対照ラットよりもＥｍａｘ、ＥＳＰＶＲおよびＰＲＳＷが高い値を示した。いずれもｐ＜０．０２［対照とＬＲ１２との比較］である。
【図１７】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、ラットの心筋梗塞後の収縮期および拡張期機能を改善することを示す図である。成体雄Ｗｉｓｔａｒラットに心筋虚血操作を加え、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドを反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回で５日間）グループまたはスクランブルＬＲ１２を反復投与する（０．９％ＮａＣｌ  ０．２ｍＬ中、３ｍｇ／ｋｇ、１日１回で５日間）グループに無作為に割り付けた（ｎ＝２０）。心筋損傷の６週間後、麻酔下でコンダクタンスカテーテルを用いて心機能を検討した。検討したいずれのパラメータも、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したラットの方が対照ラットよりも良好な値を示した（いずれもｐ＜０．０１［対照とＬＲ１２との比較］である）。
【図１８】４週間にわたってＰＢＳ（左）またはＬＲ１２（右）の連日腹腔内注射によって処置したａｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞のアテローム性動脈硬化プラークを示す図である。ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置すると、Ｒｅｄ  Ｏｉｌ染色を用いて評価される大動脈洞内のアテローム性動脈硬化症の発現が減少する：ＬＲ１２処置では１０３３１８μｍ２であるのに対して賦形剤投与では１４６７３６μｍ２、Ｐ＝０．０２である。データは少なくとも１５の異なる実験の代表的なものである。
【図１９】アテローム性動脈硬化プラークにおけるマクロファージ染色（抗ＭＯＭＡ２、赤色）を示す図である。ａｐｏＥ−／−マウスをＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置すると、免疫蛍光染色法および免疫組織化学法（抗ＭＯＭＡ２）による定量化でアテローム性動脈硬化プラークにおけるマクロファージ浸潤が対照個体よりも２７％減少する（ｐ＝０．００４）。
【図２０】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、第７日における循環血中の非古典的単球集団の減少を引き起こすことを示す図である。アテローム硬化症マウスモデルの第７日、循環血中のＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｌｏｗおよびＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｈｉｇｈ単球を染色後にフローサイトメトリーにより計数した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。（Ｐ＜０．０５）。
【図２１】：ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが、ＴＲＥＭ−１を阻害することによって、第２８日における白血球増加を軽減することを示す図である。アテローム硬化症マウスモデルの第２８日、循環血中のＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｌｏｗおよびＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｈｉｇｈ単球を染色後にフローサイトメトリーにより計数した。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。
【図２２】ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置すると、病変内の単球浸潤が減少することを示す図である。無菌ＰＢＳで１：４に希釈した１μｍのＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅグリーン蛍光プレーンマイクロスフェアを後眼窩静脈内に注射することにより、単球をｉｎ  ｖｉｖｏで標識した。病巣内の蛍光ビーズの数が単球動員を反映する。データは少なくとも５つの異なる実験の代表的なものである。Ｐ＜０．０５。
【実施例】
【０１１９】
材料および方法
ペプチド
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（アクセッション番号ＡＹ０７８５０２、ＡＦ５３４８２２、ＡＦ２４１２１９およびＡＦ２８７００８）のＴＬＴ−１およびＴＲＥＭ−１の配列に基づいて、ＴＲＥＭ−１ペプチドおよびＴＬＴ−１ペプチドをその細胞外ドメインの様々な部分（ＴＲＥＭ１−ＬＰ１７、ＴＲＥＭ１−ＬＰ１２、ＴＲＥＭ１−ＬＰ６−１、ＴＲＥＭ１−ＬＰ６−２、ＴＲＥＭ１−ＬＰ６−３、ＴＬＴ１−ＬＲ１７、ＴＬＴ１−ＬＲ１２、ＴＬＴ１−ＬＲ６−１、ＴＬＴ１−ＬＲ６−２およびＴＬＴ１−ＬＲ６−３）を模倣して設計した。これらはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ用にＣ末端アミド化ペプチドとして化学合成したものである（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ  ＢＶ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）。分取精製後、質量分析および分析逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、正確なペプチドが９９％超の収率で得られ、均一であった。これらのペプチドには内毒素が含まれていなかった。対応するスクランブルペプチドを同様に合成し、対照ペプチドとして用いた。
【０１２０】
動物
実験方法はすべて、実験動物の管理および使用に関する地方委員会による承認を受け、動物実験に関する国際ガイドラインに従って実施したものである。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）からマウスおよびラットを入手した。
【０１２１】
マウス胸部大動脈およびラット腸間膜動脈の分離
ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により動物を麻酔した正中腹部切開を実施し、胸郭を開いて胸部大動脈または腸間膜動脈（ラット）を露出させた。
【０１２２】
血管から血液を除去し、１０％ウシ胎仔血清と抗生物質を添加したＲＰＭＩ培地で２０時間インキュベートした。以下のように様々な条件を無作為に適用した：１）対照血管、２）ＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）とｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした血管、３）ＬＰＳおよびペプチドによる処置、４）アゴニストのαＴＲＥＭ−１（５μｇ／ｍＬ）、５）ＬＰＳとインキュベートし処置した内皮剥離血管。
【０１２３】
一部の実験では、刺激後、血管から全ＲＮＡおよびタンパク質を抽出した。
【０１２４】
血管反応性
ワイヤーミオグラフ（ＥＭＫＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で大動脈の血管反応性を検討した。この実験は以下の組成の生理食塩水（ＰＳＳ）中、３７℃で常時９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気しながら実施した：１１９ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、４．７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１４．９ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３−、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４２−、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１．１８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４−および５．５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース。至適な受動張力下で平衡化（少なくとも２０分間）した後、ＫＣｌ脱分極（１００ｍＭ）と１０μＭフェニレフリン（Ｐｈｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）の組合せに応答した２回の連続した収縮を用いて、血管の最大収縮能を試験した。２０分のウォッシュアウト時間の後、この血管収縮薬アゴニストの累積投与（１ｎＭ〜１００μＭ）により、ＰＥに対する濃度−応答曲線を求めた。新たな洗浄時間の後、１μＭのフェニレフリン（Ｐｈｅ）で予備収縮させてからアセチルコリン（ＡＣｈ）（１ｎＭ〜１００μＭ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の弛緩効果を試験することにより、内皮依存性の弛緩を評価した。５０％を超える弛緩を引き起こすアセチルコリン（１μＭ）により、機能的な内皮の存在を確認した。
【０１２５】
肺および肝臓微小血管内皮細胞（ＬｕＭＥＣおよびＬｉＭＥＣ）の分離
深麻酔（ペントバルビタール）下でマウスを屠殺し、肺および肝臓を採取した。一部修正を加えた既に記載されているプロトコル［Ｄａｑｉｎｇら，１９９８］に従って、マウス肺および肝臓の微小血管内皮細胞の分離を実施した。簡潔に述べると、臓器を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで洗浄し、１〜２ｍｍ四方に細切し、Ｉ型コラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ）で３７℃にて１時間、時折攪拌しながら消化した。細胞消化物を７０μｍのセルストレーナーでろ過し、１，５００ｒｐｍで遠心分離し、２０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌ  ＥＣＧＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）を含むゼラチンコートディッシュに細胞を播いた。第１日、浮遊細胞を除去し、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を加えた。５日後、ＣＤ１４６  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔを用いて、これらの細胞の１回目の精製を実施した。トリプシン処理後、細胞を成長培地に再懸濁させ、次いで新鮮なゼラチンコートディッシュに播いた。１５日後、同じ手順に従って細胞に２回目の精製を実施した。純度（８５％超）および内皮細胞の生存率のを確認した。さらに、ＦＡＣＳ解析を用いて、フローサイトメトリーによりＶＥＧＦＲ２およびＣＤ１４６発現を判定し細胞の表現型を評価した。
【０１２６】
ミニブタの調製ならびに敗血症による低血圧および敗血症性心機能不全のモニタリング
生体雄ミニブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、ベトナムダルマミニブタ、３０〜４０ｋｇ）をＥｌｅｖａｇｅ  Ｆｅｒｒｙ社（Ｖｏｓｇｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。手術前、ミニブタに水を自由摂取させて一晩絶食させた。ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびミダゾラム（０．１ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内投与により前麻酔を実施した。静脈内ペントバルビタール（１０ｍｇ／ｋｇの初期ボーラス投与および６〜８ｍｇ／（ｋｇ・時）の持続投与）により麻酔を誘導および維持し、必要に応じてスフェンタニル（１０μｇ）およびパンクロニウム（４ｍｇ）を間欠的に用いた。ミニブタに機械的換気を施行した（炭酸正常状態が維持されるよう１回換気量８ｍｌ／ｋｇ、ＰＥＥＰ  ５ｃｍ  Ｈ２Ｏ、ＦｉＯ２  ０．２１、呼吸数１４〜１６回／分に調節した）。左頸静脈を露出させ、トリプルルーメンラインを挿入した。右頸静脈にもカテーテルを挿入し、心拍出量、ＳｖＯ２、右心房圧および肺動脈圧が連続的に記録できるようＳｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテルを配置した。動脈圧の連続測定のために右頸動脈カテーテルを挿入した。膀胱内のカテーテルにより尿の採取を可能にした。
【０１２７】
計測後、正中開腹術を施行して左結腸から糞便を採取し、１．５ｇ／ｋｇを０．９％ＮａＣｌ  ２００ｍＬに懸濁させ、３８℃で２時間インキュベートした。手術後、腹膜炎誘発および腹水ドレナージを実施するためチューブを留置した。
【０１２８】
手術後、ミニブタを２時間回復させた後、ベースライン測定を実施した（「Ｈ０」と定義される）。試験全体を通じて通常の生理食塩水を常時投与した（１０ｍＬ／（ｋｇ・時））。加温パッドまたは冷却を用いて体温を一定（±１℃）に維持した。
【０１２９】
ベースラインデータ収集（Ｈ０）後、腹部チューブから自己糞便を投与して腹膜炎を誘発した後、鉗子で留めておいた。２時間後（Ｈ２）、ミニブタを無作為化により、ＬＲ１２を投与するグループ（ＬＲ１２群、ｎ＝６）または賦形剤（通常の生理食塩水）単独を投与するグループ（対照群、ｎ＝５）に割り付けた。５ｍｇ／ｋｇ（６０ｍＬ中）のボーラス投与を３０分間、静脈内実施した後、１ｍｇ／（ｋｇ・ｈ）（１５ｍＬ／時）の注入を開始し、試験期間を通じて継続した。
【０１３０】
次いで、試験期間を通じて、経験豊富な徹底した医師が以下の指針に厳密に従って動物を管理した：
ｉ）血行動態に関する目標：主な目的は平均動脈圧（ＭＡＰ）を８５ｍｍＨｇ超に維持することとした。この目的を達成するため、０．９％ＮａＣｌの維持投与（７ｍＬ／（ｋｇ・時））に加えて、中心静脈圧（ＣＶＰ）および肺動脈楔入圧（ＰＡＯＰ）が１８ｍｍＨｇ未満の場合に限りヒドロキシエチルデンプン（試験期間全体で最大２０ｍＬ／ｋｇ）（ＨＥＳ１３０／０．４、Ｖｏｌｕｖｅｎ（登録商標）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）の投与を認めた。ヒドロキシエチルデンプンが最大体積に達した場合、最大１０μｇ／（ｋｇ・分）のノルエピネフリンの持続注入を開始した。
ｉｉ）呼吸に関する目標：主な目的はＰａＯ２／ＦｉＯ２比を３００超、動脈ＰａＣＯ２を３５〜４５ｍｍＨｇに維持することとした。したがって、吸気／呼気の比を１：１付近、ＰＥＥＰを最大１５ｃｍＨ２Ｏ、呼吸数を最大３０回／分に増大させることによって、人工呼吸器の設定を修正できるようにした。
ｉｉｉ）加温パッドまたは冷却を用いて体温を一定（±１℃）に維持するものとした。
ｉｖ）血糖を５〜７ｍｍｏｌ／Ｌに維持する必要がある場合、静脈内グルコース注入を実施するものとした。
ＭＡＰ、平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ）、右心房圧（ＲＡＰ）、心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）およびＳｖＯ２を含めた血行動態パラメータを常時モニターした。Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚのモニタリングにより全身酸素運搬量（ＤＯ２）および全身酸素消費量（ＶＯ２）を計算した。心拍出力係数（Ｗ／ｍ２）をＭＡＰ×ＣＩ／４５１として計算した（２４）。
【０１３１】
サルの調製ならびに敗血症による低血圧および敗血症性心機能不全のモニタリング
雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（２．８〜３．５ｋｇ、２４か月齢、Ｌｅ  Ｔａｍａｒｉｎｉｅｒ、Ｌａ  Ｒｏｕｔｅ  Ｒｏｙａｌｅ、Ｔａｍａｒｉｎ、Ｍａｕｒｉｔｉｕｓ）を用いた。ＬＰＳ抗原投与前日にカニクイザルを絶食させたが、水は常時摂取とした。ＣＩＴｏｘＬＡＢフランス倫理委員会（ＣＩＴｏｘＬＡＢ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＣＥＣ）が全試験計画を審査し承認した（Ｎｒ  ＣＥＣ：０２２２１）。
【０１３２】
薬物投与およびｉｎ  ｖｉｖｏのＬＰＳ抗原投与。
【０１３３】
ＬＰＳ抗原投与の前日、バイタルサインおよび体重を記録した。翌朝、ベースラインの臨床検査室試料を採取し、ベースラインとなる一連のバイタルサインを記録した。テフロン（登録商標）カテーテルから橈側皮静脈または伏在静脈内に薬物を投与した。ＬＰＳ投与には反対側の静脈を用いた。
【０１３４】
サルを無作為化により、ＬＲ１２を投与するグループまたはプラセボを投与するグループ（１グループ当たりｎ＝６）に割り付けた。賦形剤（０．９％ＮａＣｌ）のみを注入する４匹からなるグループを追加で設け、対照群とした。
【０１３５】
時間０の時点で、１５分間のＬＲ１２またはプラセボ溶液の静脈内注入を開始し、較正済みのシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）により１２ｍＬ／時の速度で送達した（５ｍｇ／ｋｇ、１０分間、２ｍＬ）。次いで、持続注入を２ｍＬ／時の速度でさらに８時間実施した（１ｍｇ／（ｋｇ・時）、８時間、１６ｍＬ）。処置注入の直前、反対側のカテーテルから１０分間にわたってＬＰＳ（１０μｇ／ｋｇ）の静脈内ボーラス投与を実施した。全試験期間中、サルを拘束椅子に立位で固定して覚醒した状態に保ち、絶食を継続させた。
【０１３６】
脈拍数および血圧について、１５分毎のモニタリングを１時間、次いで３０分毎のモニタリングを７時間実施した。
【０１３７】
心筋梗塞のマウスモデル
全処置を６〜８週齢のマウス雄Ｃ５７ＢＬ／Ｃに実施した。キシラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、背臥位に固定した。気管に挿管して換気した（１回換気量を２００μｌ／２５ｇ、呼吸数を１２０回／分とした）。左側開胸術を施行後、左冠動脈を確認し、左心耳の先端から１．０ｍｍの遠位部を８−０プロレン縫合糸で結紮した。虚血領域（左心室）の心筋の色が赤色から白色に変化したことによりＬＡＤ梗塞を確認した。胸部を閉じ、６−０絹糸で皮膚を縫合した。マウスをケージに戻し、完全に回復するまで監視した。
【０１３８】
術後、死亡率についてマウスをモニターした。マウスを無作為化により、ペプチドを投与するグループ（連日腹腔内注射を５日間、５ｍｇ／ｋｇ）または投与しないグループに割り付け、生存をモニターした。あるいは、６時間後、２４時間後、９６時間後に、麻酔後にペントバルビタールナトリウムの過量投与によってマウスを屠殺した（１グループ当たりｎ＝６）。胸骨正中切開術を施行後、心臓を摘出し、虚血領域および非虚血領域を切離した。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ、ＷＢ、免疫組織化学およびＥＬＩＳＡ分析用にＡＲＮ抽出およびタンパク質抽出を実施した。
【０１３９】
フローサイトメトリー
健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび敗血症（ＣＬＰ）マウスの微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）を記載される通りに分離し、ＦＩＴＣおよびＰＥとコンジュゲートした抗マウスＶＥＧＦＲ２および抗ＴＲＥＭ−１と４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ホルムアルデヒドで固定した後、フローサイトメータで分析した。対照としてマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを同じ濃度で使用した。
【０１４０】
他の実験では、ＦＡＣＳ解析前にＭＥＣをＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）で２時間および６時間刺激するか、刺激しなかった。
【０１４１】
梗塞組織から単細胞懸濁液を調製するため、心臓を採取し、鋭利な鋏で細切し、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＸＩ、ＤＮアーゼＩおよびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のカクテルに入れ、３７℃で１時間振盪した。次いで、細胞を十分に破砕し、遠心分離した（１５分間、５００ｇ、４℃）。
【０１４２】
脾臓を摘出し、ＨＢＳＳ中、４℃にて３ｍｌシリンジの先端で破砕し、７０μｍナイロンフィルター（ＢＤ）でろ過した。細胞懸濁液を４℃で１０分間、３００ｇで遠心分離した。赤血球を溶解し（Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｌｙｓｉｓ溶液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、脾細胞をＨＢＳＳで洗浄し、０．２％（重量／体積）ＢＳＡを添加したＨＢＳＳに再懸濁させた。クエン酸塩を抗凝固剤として用いて心臓穿刺により末梢血を採血し、赤血球を溶解した。最後に、大腿骨をＨＢＳＳ  １ｍＬで洗い流し、７０μｍナイロンフィルターでろ過し、４℃で１０分間、３００ｇで遠心分離して骨髄単細胞懸濁液を得た。血球計算盤を用いてトリパンブルー（ＢｉｏＲａｄ）によりアリコートから総生存細胞数を求めた。
【０１４３】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４−またはＣＤ８−ＡＰＣ、ＣＤ３ε−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）、Ｂ細胞（ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）、顆粒球（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、Ｌｙ−６Ｇ−ＡＰＣ）、単球サブセット（ＣＤ１１５−ＰＥ、Ｌｙ−６Ｃ−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）に対するｍＡｂのカクテル（抗体はすべてＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）中で細胞懸濁液をインキュベートした。記録する細胞数を総生存細胞数（１ｍＬ当たりの総生存白血球数）と選択したゲート内にある細胞の百分率との積として計算し、組織（心臓）１ｍｇ当たり、器官（大腿骨および脾臓）当たりまたは１ｍＬ（血液）当たりで記録した。ＦＣ５００サイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）でデータを得た。
【０１４４】
ＲＮＡ抽出およびポリメラーゼ連鎖反応解析
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて細胞または虚血領域および非虚血領域から全ＲＮＡを抽出しＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した後、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてレトロ転写し、Ｑｉａｇｅｎ社から入手可能なプローブ（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、ｍＴＲＥＭ−１、ｍＴＮＦ−α、ｍＩＬ−６、ｍＭＭＰ−９、ｍＴＩＭＰ−１およびｍＡｃｔＢについて定量的ＰＣＲにより定量化した。あるいは、ＰＣＲアレイ（Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ／Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙｓ、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）用に全ＲＮＡをＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ−ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）でレトロ転写した。ＰＣＲはすべてＭｙｉＱ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒで実施し、ｉＱ５ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）により定量化した。遺伝子発現をＡｃｔＢで正規化した。
【０１４５】
タンパク質リン酸化解析
虚血領域および非虚血領域の組織またはＭＥＣをＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解し、４℃で５分間、１６，０００ｇで遠心分離し、上清を収集した。ブラッドフォード法（Ｐｉｅｒｃｅ）によりタンパク質濃度を求めた。次いで、溶解物をウエスタンブロット（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、４〜１２％、ＢｉｏＲａｄおよびＰＶＤＦ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析し、抗ホスホ−ｐ３８，抗−ｐＥＲＫ１／２，抗−ｐＡＫＴ，抗−ｐＧＳＫ３β，抗−ｉＮＯＳ，抗−ＣＯＸ２，抗−ＳＯＣＳ３，抗−ＴＲＥＭ−１および西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした対応する二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）ならびにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させた。抗ｐ３８，抗−ＥＲＫ１／２，抗−ＡＫＴ，抗−ＧＳＫ３βまたは抗−チューブリンを正規化に用いた。このほか、免疫ブロット（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｒｒａｙ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により複数のリン酸化タンパク質のパネルを検討した。ＬＡＳ−４０００イメージャーおよびＭｕｌｔｉ−Ｇａｕｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により捕捉および定量的シグナル密度分析を実施した。
【０１４６】
サイトカイン濃度測定
ＥＬＩＳＡ（Ｍｏｕｓｅ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびサイトカインパネルアッセイ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ、Ｐａｎｅｌ  Ａ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）により製造業者の推奨に従って、心筋溶解物（虚血領域および非虚血性領域）およびＭＥＣ上清中のサイトカインを測定した。
【０１４７】
酵素電気泳動
組織抽出物のＭＭＰ−９酵素活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥゼラチン酵素電気泳動により判定した。組織抽出物中に存在するＭＭＰ−９がゼラチン基質を分解し、ゲルをタンパク質について染色すると明瞭なバンドが残る。簡潔に述べると、ホモゲナイズし標準化した組織試料に還元剤を加えずに変性させ、ゼラチンを含有する７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動により分離した。次いで、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中、ゲルをＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（タンパク質を再生させる）の存在下、室温で２時間、次いで３７℃で一晩インキュベートした。その後、ゲルを０．２５％クーマシーブルーで染色した。デンシトメトリーによりバンドの分析および定量化を実施した。
【０１４８】
心筋永久虚血のラットモデル
成体雄Ｗｉｓｔａｒラット（３６０〜３８０ｇ）を用いた。全ラットをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）で麻酔し、機械的換気を施行した。左側開胸術を施行後、左冠動脈を確認し、８−０プロレン縫合糸で結紮した。虚血領域（左心室）の心筋の色が赤色から白色に変化したことによりＬＡＤ梗塞を確認した。胸部を閉じ、６−０絹糸で皮膚を縫合した。ラットをケージに戻し、完全に回復するまで監視した。全ラットの術後死亡率は２０％であった。
【０１４９】
外科的ＬＡＤ閉塞後、マイクロＴＥＰイメージングにより虚血領域の重要性を評価した。次いで、ラットを無作為化により、２４時間毎に５日間ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を投与するグループまたはプラセボ（賦形剤）を投与するグループに割り付けた。
【０１５０】
心筋リモデリングおよび心筋機能に対する治療効果を検討するため、６週間後にマイクロＴＥＰイメージングおよびコンダクタンスカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ）により、なおも評価を実施した。
【０１５１】
心筋虚血再灌流のラットモデル
虚血６０分後にＬＡＤ結紮を解除することにより虚血領域を再灌流したことを除いて、永久虚血の場合と同じ手術を施行した。次いで、上記プロトコルと同じプロトコルを適用した。
【０１５２】
マイクロＰＥＴイメージング
最初のＰＥＴ記録の６０分前、全個体に対し、約７０ＭＢｑの１８Ｆ−ＦＤＧ（体積０．３〜０．５ｍｌ）を静脈内注射し、短時間麻酔下（１．５〜２．５％のイソフルラン吸入）に置いた。イソフルランによる持続麻酔下、専用の小動物ＰＥＴシステム（Ｉｎｖｅｏｎ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ、ＵＳＡ）を用いてリストモードで記録を得た。ラットを腹臥位にして加温パッドの上に置き、体温を正常範囲内に維持した。四肢の内表面に装着した３つの電極により、ラットと標準的なＥＣＧモニターとを接続した。記録時間は１８Ｆ放射を２０分間、５７Ｃｏ透過を６分間とした。同時計数タイミングウィンドウを３．４ｎｓに設定し、エネルギーウィンドウを３５０〜６５０ｋｅＶに設定した。１６の心拍間隔で画像を再構築し、通常の心拍数値に対して１１〜１５ｍｓの時間分離能を得た。これらの条件下で軸空間分解能は１．５ｍｍ未満であった。さらに、ステレオリソグラフィー工程で得られたＬＶラットファントムでは、ＦＤＧ  ＰＥＴ画像により実際の内腔容積が高精度に決定され、成体のＬＶ収縮終期容積の下限に相当する１００μｌのレベルを上回るものであった。
【０１５３】
コンダクタンスカテーテルによる試験
ラットをイソフルランで麻酔し、２Ｆ高忠実度マイクロメートルカテーテル（ＳＰＲ−４０７、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を右頸動脈からＬＶ内に挿入した。Ｍｉｌｌａｒカテーテルと、ＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅ  ＩＩＩソフトウェア（ＡＣＱ３．２）を備えたＰＣと連動させたＨａｒｖａｒｄ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍとを連結した。
【０１５４】
マウスのアテローム性動脈硬化症
１２週齢の雄ＡｐｏＥ−／−マウスに脂肪食（脂質１５％、コレステロール１．２５％、コール酸無添加）の食餌を与え、ペプチド（１００μｇ／日）またはＰＢＳの連日腹腔内注射により処置した。脂肪食の４週間後、マウスを分析用に屠殺した。
【０１５５】
Ｒｅｄ  Ｏｉｌを用いて大動脈洞内のアテローム性動脈硬化プラークを染色し定量化した。本発明者らは、免疫蛍光染色法および免疫組織化学法を用いて、プラークの組成を分析した。最後に、本発明者らは、Ｐｏｔｔｅａｕｘらによって開発されたパルス染色法を用いて、アテローム性動脈硬化プラークへの単球動員に対するペプチド治療の効果を検討した。簡潔に述べると、無菌ＰＢＳで１：４に希釈した１μｍのＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅグリーン蛍光プレーンマイクロスフェアを後眼窩静脈内に注射することにより、単球をｉｎ  ｖｉｖｏで標識した［Ｐｏｔｔｅａｕｘら，２０１１］。病巣内の蛍光ビーズの数が単球動員を反映する。
【０１５６】
結果
１．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドは大動脈のＬＰＳ誘導性収縮および内皮機能不全を改善する：
ＴＲＥＭ−１調節が内皮血管運動に直接影響を及ぼし得るかどうかを検討するため、本発明者らは、正常ラットから切離した血管または内皮剥離血管をＬＰＳ、αＴＲＥＭ−１（ＴＲＥＭ−１のアゴニスト）、ＴＲＥＭ−１−およびＴＬＴ−１−由来ペプチドならびに対照ペプチドＬＲ１２スクランブルでｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した。最初に、ＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１が血管運動障害を誘発した（図１Ａおよび１Ｃ）。次いで、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドがＬＰＳによる血管運動障害を正常に戻した（図１Ｂおよび１Ｃ）。最後に、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはすべて、内皮を除去するとその有益な効果が消失した（図１Ｂ）。
【０１５７】
２．ＴＲＥＭ−１は大動脈および腸間膜動脈由来の内皮細胞に発現する：
ＴＲＥＭ−１がマウス大動脈およびラット腸間膜動脈由来の内皮細胞に発現するかどうかを明らかにするため、本発明者らは、血管（内皮を有するものまたは有さないもの）をＬＰＳで６時間刺激した（１００ｎｇ／ｍｌ）。マウス大動脈（図２Ａ）およびラット腸間膜動脈（図２Ｂ）とも、内皮が存在する場合のみＬＰＳ刺激によりＴｒｅｍ−１発現がアップレギュレートされた。
【０１５８】
したがって、本発明者らは、ＴＲＥＭ−１がマウス大動脈およびラット腸間膜動脈由来の内皮細胞に発現することを初めて示す。
【０１５９】
３．ＴＲＥＭ−１は肺および肝臓の微小血管内皮細胞（ＬｕＭＥＣおよびＬｉＭＥＣ）に発現する：
ＴＲＥＭ−１は肺および肝臓の微小血管内皮細胞に構成的に発現し、その発現は敗血症時およびＬＰＳ刺激によってアップレギュレートされる（図３）。これらの結果はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってさらに裏付けられた（図３Ｃ）。
【０１６０】
Ｔｒｅｍ−１の発現はＬＰＳによる４時間の刺激後に大幅に増大し、その後減少した。同様に、Ｔｎｆ−αおよびＩｌ−６も同じ動態を示した（図４）。
【０１６１】
予想された通り、細胞をＬＰＳで２４時間刺激したところ各種サイトカインが大量に産生され、その濃度はＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって低下した（図５）。
【０１６２】
したがって、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによる処置によって、内皮細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を減弱させることができた。
【０１６３】
４．ＴＲＥＭ−１調節が敗血症誘導性心血管機能不全を改善する：
マウスモデル：本発明者らは、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与がマウスの敗血症性ショック時に平均動脈圧を維持し、乳酸アシドーシスを抑制することを観察した。血管シグナル伝達の検討では、敗血症時にはＡｋｔ経路の阻害のほか、Ｃｏｘ−２およびｉＮＯＳのアップレギュレーションと同時にＣｏｘ−１の発現が示された。血管機能不全の証拠となるこれらの要素はＴＲＥＭ−１調節によって正常に戻る（図６）。
【０１６４】
ラットモデル：本発明者らはこのほか、固有の心機能（図７；表２）に焦点を絞り、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節によって、複数の心パラメータ：ＥＳＰＶＲ（収縮終期圧・容積関係）、ＰＲＳＷ（前負荷動員一回仕事量）、（ｄＰ／ｄｔ）ｍａｘ／Ｖｅｄ（左心室圧のマーカー）およびＬＶＥＦ（左心室駆出率）が改善することを示した。
【０１６５】
【表２】
0006307080.tif 000003
【０１６６】
ミニブタモデル：本発明者らは敗血症のミニブタモデルで、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与が心血管不全を軽減することを観察した。腹膜炎により、大量輸液（対照群に対して７７５０±５４０ｍＬ、ＬＲ１２群に対して６５００±８００ｍＬ、ｐ＝０．１３７）の甲斐なくＭＡＰの急速な低下が引き起こされた（図８Ａ）。したがって、ＭＡＰを８５ｍｍＨｇ超に維持するため、Ｈ１２までに対照個体およびＬＲ１２処置個体のそれぞれ４／５および１／６にノルエピネフリンを開始した。血圧の維持に必要なノルエピネフリン注入速度は、ＬＲ１２処置個体の方が対照個体よりも有意に遅いことがわかった（図８Ａ）。
【０１６７】
対照群では、低血圧に伴って心係数および心拍出力係数（心機能をより適切に表すと考えられている）がともに低下した。その結果、ＳｖＯ２およびＤＯ２が徐々に低下した（図８Ｂ）。この場合も同じく、ＬＲ１２は心不全の軽減に有意な有益な効果を示した。両群とも進行性の乳酸アシドーシスを発現したが（図８Ｃ）、そのほとんどがＬＲ１２によって軽減された（ｐ＝０．０００５）。
【０１６８】
サルモデル：本発明者らはサルの内毒素注入モデルで、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与が心血管不全を軽減することを観察した。ＬＰＳ注射後、心拍数が一時的に増加し、ＬＲ１２注入の効果はみられなかった（不掲載）。ＬＰＳ抗原刺激により、特にＨ１〜Ｈ２でわずかな体温上昇が引き起こされたが、プラセボ（ＬＲ１２ｓｃｒ）個体とＬＲ１２処置個体との間の差に有意性は認められなかった（不掲載）。
【０１６９】
プラセボ処置群では、用いたＬＰＳの投与量が少なくても一過性の低血圧が発現し、１８０分後に収縮期動脈圧が最大２５％、拡張期動脈圧が最大４０％低下した（ＬＲ１２または対照群との比較でｐ＜０．００１）。これとは極めて対照的に、ＬＲ１２処置個体には低血圧が全くみられず、その動脈圧は対照個体と差がなかった（図９）。
【０１７０】
５．ＴＲＥＭ−１は心筋組織に発現し、虚血時にアップレギュレートされる：
ＴＲＥＭ−１が心臓組織に発現するかどうかを明らかにするため、冠動脈結紮の前および心筋梗塞（ＭＩ）の６時間後、２４時間後および９６時間後に、マウスの健常領域および梗塞領域の両方から心筋を採取した。ベースライン時のｔｒｅｍ−１発現は極めて低かったのに対して、虚血によりその発現のアップレギュレーションが徐々に誘導され、ＭＩの２４時間後に最高レベルに達した（図１０Ａ）。ウエスタンブロットによりタンパク質レベルでも同じ動態が観察された（図１０Ｂ）。これに対して、非梗塞（「健常」）領域ではＴＲＥＭ−１発現は常に低い状態であった（データ不掲載）。
【０１７１】
６．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはマウスにおいてＭＩ時に白血球動員を調節し、遠隔区画からの白血球動員を制御する：
マウスには、またおそらくヒトにも、２つ異なる単球サブタイプが存在し、Ｌｙ−６Ｃｈｉｇｈ単球が強力な炎症性メディエーターであるのに対して、Ｌｙ−６Ｃｌｏｗ単球はその逆の作用を有する［ＮＡＨＲＥＮＤＯＲＦら，２００７］。ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴｒｅｍ−１調節によって、梗塞を起こした心筋へのＬｙ−６Ｃｈｉｇｈ単球の浸潤が完全に抑制されたのに対して、Ｌｙ−６Ｃｌｏｗ単球の動員は一時的に増大した。このほか、ＬＲ１２処置によってＰＭＮ浸潤がブロックされた（図１１Ａ）。ＴＲＥＭ−１はリンパ球によって発現されないが、Ｔｒｅｍ−１調節がＢ細胞およびＴ細胞の動員に影響を及ぼした。すなわち、ＬＲ１２処置マウスでＢリンパ球およびＣＤ８＋リンパ球の浸潤が減少したのに対して、ＣＤ４＋細胞の動員が増加した。
【０１７２】
Ｔｒｅｍ−１は、梗塞を起こした心筋への白血球動員の制御に重要であると思われるため、本発明者らは、遠隔区画からの細胞動員に対するＴｒｅｍ−１の効果を検討した。心筋梗塞発症後２４時間以内に単球が脾臓を出て心臓に浸潤する（ＳＷＩＲＳＫＩら）。この現象は今回、ＭＩ後最大１週間持続する脾臓単球含有量の急速な減少とともに観察された。同時に、７２時間後に循環血中の単球数の顕著な増加がみられるともに、骨髄（ＢＭ）内に徐々に蓄積した（図１１Ｂ）。Ｔｒｅｍ−１の除去または調節により、脾臓の単球枯渇および血中の単球増加がほぼ完全に抑制された。
【０１７３】
７２時間後に末梢血好中球数の増加がみられ、第７日までにベースラインに戻った。この好中球増加はＴｒｅｍ−１ノックアウトマウスにもＬＲ１２処置マウスにも観察されなかった。好中球の脾臓内含有量がほとんど変化しなかったことから、脾臓は好中球の産生／放出にあまり関与しないと思われた。このほか、ＢＭに徐々に中程度に蓄積するのが観察され、群間差は認められなかった（図１１Ｂ）。
【０１７４】
ＭＩの２４時間後、脾臓のＢリンパ球数、ＣＤ４＋リンパ球数、ＣＤ８＋リンパ球数が著しく減少し、同時にＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球の減少がみられた。次いで、７２時間後に循環血中のリンパ球数の増加がみられた後、ＭＩの７日後にベースラインに戻った。Ｔｒｅｍ−１をブロックすることにより、このリンパ球の動態パターンが妨げられた（図１１Ｂ）。
【０１７５】
単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１またはＣＣＬ２）、ＣＸ３ＣＬ１（またはフラクタルカイン）およびＭＣＰ−３（またはＣＣＬ７）は、それぞれ炎症性部位へのＬｙ−６Ｃｈｉｇｈ単球、Ｌｙ−６Ｃｌｏｗ単球およびリンパ球の動員に関与する重要なケモカインである。ＭＩの２４時間後、ＭＣＰ−１、ＣＸ３ＣＬ１およびＭＣＰ−３の血漿中濃度が増大した。処置マウスではＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３レベルが著明に低下した（図１１Ｃ）。
【０１７６】
７．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはマウスのＭＩ時に心筋炎症性反応を調節する：
本発明者らは次に、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによるＴＲＥＭ−１調節が浸潤性炎症性細胞の活性化を制御し得るかどうかを検討した。ＭＩ後迅速に心筋に侵入する炎症性細胞は、ｐ３８ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２のリン酸化ならびにｉＮＯＳおよびＣＯＸ２発現のアップレギュレーションにより活性化する。この活性化はＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって部分的に抑制される（図１２）。本発明者らがこれらのタンパク質のリン酸化／発現の動態を解析したところ、ペプチドのレベルは常に低下する（不掲載）。これに対して、生存に関与するタンパク質（ＡＫＴ）または拡張を抑制することが知られているタンパク質（ＳＯＣＳ３）のいくつかが、いずれのペプチドによってもアップレギュレートされた。例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３β）は炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの産生の制御に極めて重要な役割を果たす。自然免疫細胞では、ＧＳＫ３β不活性化（リン酸化を介するもの）がサイトカインの産生を抑制し、心筋細胞生存率を改善することが知られている。本発明者らは今回、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによってＧＳＫ３βのリン酸化が対照に比して増大することを観察した。
【０１７７】
ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって細胞の炎症誘発作用が調節されると思われたため、本発明者らは次に、それがサイトカイン／ケモカイン産生の減少につながるかどうかを検討した。
【０１７８】
本発明者らが次に検討した自然免疫または内皮機能に関与する１６８個の遺伝子のうち、冠動脈結紮後、ほとんどの場合、ＭＩの２４時間後に１５６個の発現が変化した。ＬＲ１２投与が心筋梗塞による遺伝子活性化を阻止した。
【０１７９】
予想された通り、ＭＩにより各種のサイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１３、ＩＬ１７、ＩＬ２７、ＩＦＮγ）およびケモカイン（ＭＩＰ２、ＪＥ）の産生が増大した。ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによりこれらのタンパク質の濃度が低下した（図１３Ａ）。定量的ＰＣＲにより、特にＭＩの６時間後にこれらの結果が遺伝子レベルで確認された（図１３Ｂ）。
【０１８０】
したがって、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与によって、梗塞領域のＭＩ炎症性反応を調節することができた。
【０１８１】
８．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドは心筋梗塞を起こした組織のプロテアーゼ活性を低下させる：
梗塞を起こした心筋では浸潤性の好中球およびマクロファージがマトリックスメタロプロテイナーゼ９（Ｍｍｐ−９）を発現する。Ｍｍｐ−９の活性は組織メタロプロテアーゼ阻害物質−１（Ｔｉｍｐ−１）によりバランスが保たれている。この２つのタンパク質の微妙なバランスを維持することが、心不全を引き起こす心室リモデリングの予防に極めて重要な役割を果たす。本発明者らは今回、対照マウスの梗塞領域でＭｍｐ−９およびＴｉｍｐ−１のｍＲＮＡ発現が増大することを観察した。これとは対照的に、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置した個体では、Ｍｍｐ−９発現が低い状態で維持されたのに対して、Ｔｉｍｐ−１が著しくアップレギュレートされた（図１４Ａ、Ｂ）。したがって、Ｍｍｐ−９／Ｔｉｍｐ−１比は対照マウスの方が常に高い値を示した。梗塞領域のＭｍｐ−９ゼラチナーゼ活性は、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したマウスよりも対照マウスの方が常に高い値を示した（図１４Ｃ）。
【０１８２】
以上の結果は、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドがＭＩ後の心構造の保護および心リモデリングの阻止に有益な役割を果たし得るという仮説を支持するものである。
【０１８３】
９．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはマウスのＭＩ後の生存率を改善する：
本発明者らは次に、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与がＭＩ時に何らかの保護効果をもたらし得るかどうかを明らかにしようと考えた。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内にＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドまたはＬＲ１２スクランブルの反復投与（連日１００μｇで５日間）を永久的な冠動脈結紮の６０分後から始めて無作為に実施した。ＬＲ１２処置した個体が１個体以外すべて生き延びた（図１５）のに対して、対照マウスの４０％が死亡した（ログランク検定；ｐ＜０．０１）。他のＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドでもほぼ同じ結果が得られた。
【０１８４】
持続的なＴＲＥＭ−１の関与がさらに有害であるかどうかを検討するため、本発明者らは、アゴニスト作用のある抗ＴＲＥＭ−１  ｍＡｂをマウスに投与した。この処置により死亡率が大幅に上昇し、生存率はわずか２０％であった。
【０１８５】
１０．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはラットの心筋虚血−再灌流後の心機能を改善する：
より重要なＭＩモデルにおけるＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの役割を検討するため、本発明者らは、ラットに一時的な冠動脈結紮（虚血−再灌流モデル：ＩＲ）を実施した。ラットを無作為に割り付けた後、麻酔下で撮像（マイクロＴＥＰ）し、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチド（連日３ｍｇ／ｋｇで５日間、腹腔内投与）またはＬＲ１２スクランブルペプチドを投与した。次いで、６週間後に再び撮像した後、コンダクタンスカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ）を用いて心機能を検討した。
【０１８６】
第１日、ＩＲ直後、両群に差はみられなかった。梗塞領域は中程度に重要であり、心機能はわずかに変化した。６週間後、全ラットに改善がみられ、梗塞がほぼ完全に治癒し、心室リモデリングは全く認められなかった（表３）。したがって、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはマイクロＴＥＰによって評価したパラメータには何ら効果を示さなかった。これに対して、コンダクタンスカテーテルにより心機能を検討したところ、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドがＥｍａｘまたはＰＲＳＷなどの極めて重要な収縮期パラメータを大幅に改善するのが観察された（図１６；表４）。
【０１８７】
【表３】
0006307080.tif 000004
【０１８８】
【表４】
0006307080.tif 000005
【０１８９】
したがって、この比較的軽症の心筋虚血モデルでも、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドの投与により収縮期の心機能を回復させることができた。
【０１９０】
１１．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはラットの心筋梗塞後の収縮期および拡張期機能を改善する：
本発明者らは最後に、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによってもたらされる炎症性応答の調節が、重症ＭＩ後の心機能改善につながり得るかどうかを検討した。本発明者らは、ラットに永久的な冠動脈結紮を実施した後、上記の通りに無作為に割り付けて撮像した。
【０１９１】
この場合も同様に、第１日、両群とも全く同じであった。６週間後、重要な心室拡大のぞんざいによって評価される重要な心リモデリングが生じていた。この心リモデリングは、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって少なくとも部分的に変化した（表５）。心不全の間接的なマーカーとして、対照ラットには全ペプチドで処置したラットを上回る体重増加がみられた。
【０１９２】
【表５】
0006307080.tif 000006
【０１９３】
コンダクタンスカテーテルによって心機能を検討したところ、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドがＥｍａｘ、ＥＳＰＶＲ、ＰＲＳＷ、ｄＰ／ｄＴｍｉｎ、ｄＰ／ｄＴｍａｘおよびＶｅｄなどの極めて重要な収縮期および拡張期パラメータを改善するのが観察された（図１７）。
【０１９４】
まとめると、以上のデータは、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドが心筋梗塞後の心リモデリングおよび心不全の予防に保護的役割を果たすことを裏付けるものである。
【０１９５】
１２．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはマウスのアテローム性動脈硬化症の発現を予防する：
Ｒｅｄ  Ｏｉｌを用いて大動脈洞内のアテローム性動脈硬化プラークを染色し定量化した。興味深いことに、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによって処置すると、大動脈洞内の病巣の大きさが有意に３０％減少した（１４６７３６μｍ２に対して１０３３１８μｍ２、Ｐ＝０．０２）（図１８）。この結果は第二の一連の実験で確認された。
【０１９６】
１３．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはアテローム斑の細胞組成を変化させる：
本発明者らは、免疫蛍光染色および免疫組織化学法を用いて、プラーク組成を分析した。リンパ球浸潤（抗ＣＤ３抗体）およびコラーゲン蓄積（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）に群間差は観察されなかった。しかし、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したマウスのアテローム性動脈硬化病巣内のマクロファージ浸潤が有意に２７％減少していることがわかった（図１９）。
【０１９７】
１４．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはアテローム硬化症マウスの血中白血球集団を是正する：
本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて血中白血球集団を分析した。古典的単球はＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｈｉｇｈであり、非古典的単球はＣＤ１１５＋Ｇｒ１ｌｏｗであった。固形飼料で飼育したａｐｏＥ−／−マウスでは、非古典的単球のみがＴＲＥＭを発現した。興味深いことに、高脂肪食により非古典的単球でのＴＲＥＭ−１発現が増大した（データ不掲載）。
【０１９８】
次いで、本発明者らは、処置期間中に血中白血球集団を分析した。第７日、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したマウスの血液に非古典的単球の有意な減少が観察された（図２０）。第２８日、血液に古典的単球および非古典的単球の有意な減少が観察された（図２１）。
【０１９９】
１５．ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドはアテローム性動脈硬化プラークへの単球動員を減少させる：
最後に、本発明者らは、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドによる処置がアテローム性動脈硬化プラークへの単球動員に対する効果を検討した。本発明者らは、Ｐｏｔｔｅａｕｘらによって開発されたパルス染色法を用いた。簡潔に述べると、無菌ＰＢＳで１：４に希釈した１μｍのＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅグリーン蛍光プレーンマイクロスフェアを後眼窩静脈内に注射することにより、単球をｉｎ  ｖｉｖｏで標識した［Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ  Ｈ．ら，２０１１］。病巣内の蛍光ビーズの数が単球動員を反映する。ビーズを注射した２４時間後、処置ａｐｏＥ−／−マウスを屠殺した。興味深いことに、ＴＲＥＭ−１由来ペプチドおよびＴＬＴ−１由来ペプチドで処置したグループに対照群に比して単球浸潤の有意な減少がみられた（図２２）。
【０２００】
参考文献
本願全体を通じて、様々な文献に本発明と関連のある最新技術が記載されている。これらの文献の開示は参照により本開示に組み込まれる。
Ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｔｈｉｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｔｏ  ｗｈｉｃｈ  ｔｈｉｓ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｐｅｒｔａｉｎｓ．Ｔｈｅ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｒｅ  ｈｅｒｅｂｙ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ．
Ａｉｔ−Ｏｕｆｅｌｌａ  Ｈ，Ｔａｌｅｂ  Ｓ，Ｍａｌｌａｔ  Ｚ，Ｔｅｄｇｕｉ  Ａ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３１（５）：９６９−９７９（２０１１）．
Ｂｊｏｒｋｂａｃｋａ  Ｈ，Ｋｕｎｊａｔｈｏｏｒ  ＶＶ，Ｍｏｏｒｅ  ＫＪ，Ｋｏｅｈｎ  Ｓ，Ｏｒｄｉｊａ  ＣＭ，Ｌｅｅ  ＭＡ，Ｍｅａｎｓ  Ｔ，Ｈａｌｍｅｎ  Ｋ．，Ｌｕｓｔｅｒ  ＡＤ．，Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ  ＤＴ．，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＭＷ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ＭｙＤ８８−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｌｉｎｋｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０（４）：４１６−４２１（２００４）．
Ｄａｑｉｎｇ  Ｗ．Ｈａｒｔｗｅｌｌ．，Ｔａｎｙａ  Ｎ．Ｍａｙａｄａｓ．，Ｇａｅｔａｎ  Ｂｅｒｇｅｒ．（「ｅ」にウムラウト有り），Ｐａｕｌ  Ｓ．Ｆｒｅｎｅｔｔｅ．，Ｈｅｌｅｎ  Ｒａｙｂｕｒｎ．，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｏ．Ｈｙｎｅｓ．，Ｄｅｎｉｓａ  Ｄ．Ｗａｇｎｅｒ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；１４３  ４：１１２９  １１４１（１９９８）．
Ｄｅｒｉｖｅ  Ｍ，Ｂｏｕａｚｚａ  Ｙ，Ｓｅｎｎｏｕｎ  Ｎ，Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ  Ｓ，Ｑｕｉｇｌｅｙ  Ｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｖ，Ｍａｓｓｉｎ  Ｆ，Ｍａｘ  ＪＰ，Ｆｏｒｄ  Ｊ，Ａｌａｕｚｅｔ  Ｃ，Ｌｅｖｙ  Ｂ，ＭｃＶｉｃａｒ  ＤＷ，Ｇｉｂｏｔ  Ｓ．Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＲＥＭ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｅｐｓｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ  １；１８８（１１）：５５８５−９２．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｙ  ２．
Ｅｎｔｍａｎ  Ｍ．Ｌ．，Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ｗ．Ｐｏｓｔｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ９：１３０１−１３１１（１９９４）．
Ｈａｒａ  Ｈ，Ｓａｉｔｏ  Ｔ．ＣＡＲＤ９  ｖｅｒｓｕｓ  ＣＡＲＭＡ１  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；３０：２３４−２４２（２００９）．
Ｈａｒｊｏｔ  Ｋ  Ｓａｉｎｉ．，Ｙａｎ−Ｊｕｎ  Ｘｕ．，Ｍｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ．，Ｐｅｔｅｒ  Ｐ  Ｌｉｕ．，Ｌｏｒｒｉｅ  Ａ  Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ．，Ｎａｒａｎｊａｎ  ＳＤｈａｌｌａ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００５  Ｗｉｎｔｅｒ；１０（４）：２１３−２２２．
Ｌｉｂｂｙ  Ｐ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（６９１７）：８６８−８７４（２００２）．
Ｍｅｈｔａ  Ｊ．Ｌ．，Ｌｉ  Ｄ．Ｙ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｏｒ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｖｉｌｌａｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ；２：２９１−２９９（１９９９）．
Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ  Ｍ，Ｓｗｉｒｓｋｉ  ＦＫ，Ａｉｋａｗａ  Ｅ，Ｓｔａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｌ，Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ  Ｔ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＪＬ，Ｌｉｂｂｙ  Ｐ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ，Ｐｉｔｔｅｔ  ＭＪ．Ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｗｏ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４，３０３７−３０４７（２００７）．
Ｐｏｔｔｅａｕｘ  Ｓ，Ｇａｕｔｉｅｒ  ＥＬ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＳＢ，ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ  Ｎ，Ｒａｄｅｒ  ＤＪ，Ｔｈｏｍａｓ  ＭＪ，Ｓｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓ  ＭＧ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ  ＧＪ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｏｆ  Ａｐｏｅ−／−ｍｉｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１（５）：２０２５−２０３６（２０１１）．ｄｏｉ：４３８０２［ｐｉｉ］１０．１１７２／ＪＣＩ４３８０２．
Ｒａｄｓａｋ  ＭＰ，Ｓａｌｉｈ  ＨＲ，Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ，Ｓｃｈｉｌｄ  Ｈ．Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ−１  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；１７２：４９５６−４９６３（２００４）．
Ｓｗｉｒｓｋｉ  ＦＫ，Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ  Ｍ，Ｅｔｚｒｏｄｔ  Ｍ，Ｗｉｌｄｇｒｕｂｅｒ  Ｍ，Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  Ｖ，Ｐａｎｉｚｚｉ  Ｐ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＪＬ，Ｋｏｈｌｅｒ  ＲＨ，Ｃｈｕｄｎｏｖｓｋｉｙ  Ａ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ｐ，Ａｉｋａｗａ  Ｅ，Ｍｅｍｐｅｌ  ＴＲ，Ｌｉｂｂｙ  Ｐ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ，Ｐｉｔｔｅｔ  ＭＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ  ｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，６１２−６１６（２００９）．
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＡＶ，Ｇｉｂｏｔ  Ｓ，Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｉ，Ｇａｔｔｉｓ  Ｊ，Ｑｕｉｇｌｅｙ  Ｌ，Ｆｅｌｔｚ  Ｒ，Ｄｅ  Ｌａ  Ｍｏｔａ  Ａ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ＲＬ，Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｊ，Ｃｈｅｎｇ  Ｊ，Ｄｕｔｒａ  Ａ，Ｐａｋ  Ｅ，Ｃｈｅｒｔｏｖ  Ｏ，Ｒｉｖｅｒａ  Ｌ，Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｊ，Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｈｕｎｔｅｒ  Ｒ，Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ  ＰＬ，ＭｃＶｉｃａｒ  ＤＷ．ＴＲＥＭ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｂｙ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００９  Ｊｕｎ；１１９（６）：１４８９−５０１．
【図１】
0006307080.tif 000007
【図２】
0006307080.tif 000008
【図３】
0006307080.tif 000009
【図４】
0006307080.tif 000010
【図５】
0006307080.tif 000011
【図６】
0006307080.tif 000012
【図７】
0006307080.tif 000013
【図８】
0006307080.tif 000014
【図９】
0006307080.tif 000015
【図１０】
0006307080.tif 000016
【図１１−１】
0006307080.tif 000017
【図１１−２】
0006307080.tif 000018
【図１１−３】
0006307080.tif 000019
【図１１−４】
0006307080.tif 000020
【図１１−５】
0006307080.tif 000021
【図１２】
0006307080.tif 000022
【図１３】
0006307080.tif 000023
【図１４】
0006307080.tif 000024
【図１５】
0006307080.tif 000025
【図１６】
0006307080.tif 000026
【図１７】
0006307080.tif 000027
【図１８】
0006307080.tif 000028
【図１９】
0006307080.tif 000029
【図２０】
0006307080.tif 000030
【図２１】
0006307080.tif 000031
【図２２】
0006307080.tif 000032
【配列表】
0006307080000001.app