(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号１もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、または
（ｉｖ）（ｉ）で示される単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含み、
ネオキサンチンシンターゼの発現が調節されていない対照植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現が増大された、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の植物細胞を含む、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物。
【請求項３】
タバコ植物のカロテノイド含量を調節するための方法であって、
（ａ）以下を含む、前記植物におけるネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、
（ｉ）ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号１もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量を測定するステップと、
（ｃ）ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のカロテノイド含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項４】
リコペンβシクラーゼまたは９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはこれらの組合せの発現または活性もまた、前記植物において調節される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リコペンβシクラーゼが配列番号８で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によりコードされ、または配列番号９で示されるポリペプチド配列もしくはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、及び９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが配列番号１３で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によりコードされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タバコ植物中のβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、
（ａ）以下を含む、前記植物におけるネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、
（ｉ）ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号１もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、もしくは本質的にそれからなるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
（ｉｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むネオキサンチンシンターゼ、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部もしくはそのエアロゾル中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、
（ｃ）ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、β−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって入手されまたは入手可能である、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物、またはそれから誘導されもしくは誘導可能であるタバコ植物材料。
【請求項８】
ネオキサンチンシンターゼの発現が調節されていない対照植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせたルテインおよびβ−カロテンの含量が、前記対照植物より高く、乾燥処理植物材料のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が前記対照植物由来のエアロゾルより少なくとも１０％高く、（ｉ）植物の緑葉ルテイン含量が少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉ）植物のβ−カロテン含量が少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉｉ）加熱時のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が少なくとも約１ｎｇ／ｍｇである、突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物。
【請求項９】
請求項２、７または８に記載のタバコ植物由来のバイオマス、種子または葉を含む植物材料。
【請求項１０】
請求項１に記載の植物細胞、請求項２、７または８のいずれか１項に記載の植物の少なくとも一部、または請求項９に記載の植物材料を含むタバコ製品。
【請求項１１】
β−ダマセノンを生成するための方法であって、
（ａ）請求項２、７または８のいずれか１項に記載のタバコ植物の少なくとも一部、請求項９に記載の植物材料、または請求項１０に記載のタバコ製品を提供するステップと、
（ｂ）それを加熱してβ−ダマセノンを含むエアロゾルを生成するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号６と少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項１４】
ネオキサンチンシンターゼ活性を有し、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来のネオキサンチンシンターゼ、リコペンβシクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼのポリヌクレオチド配列、ならびにそれらの変異体、ホモログおよび断片を開示する。特に、タバコの新たな香味プロファイルをもたらす加熱したタバコのエアロゾル中で検出可能なβ−ダマセノンの量を調節するための、ネオキサンチンシンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性の修飾を記載する。
【背景技術】
【０００２】
β−ダマセノンは、乾燥処理タバコの乾留エアロゾル中の芳香性因子である。それは典型的なフルーティーで調理したリンゴ香を有し、天然にはロサ・ダマスケナ・ミル（Rosa damascena Mill）（ダマスクローズ）においても見ることができ、したがって数種の植物でその合成につながる酵素経路の存在を示す。ロサ・ダマスケナの花はその素晴らしい香りが有名であり、香料に使用するためのバラ油およびバラ水を生成するため市販品用に採取される。花弁も、食品または飲料を香味付けるため時折直接使用され、人間が消費するのに安全であると考えられる。
【０００３】
カロテノイドは、β−ダマセノン生成の考えられる前駆体である。ネオキサンチンの加熱酸化は、β−ダマセノンの形成をもたらす。ネオキサンチンは、キサントフィルのクラスに属する酸素化カロテノイド誘導体であり、８個のイソプレノイド単位からなる。成熟した葉および乾燥処理した葉では、遊離ネオキサンチンは存在しないか、または非常に低いレベルでのみ検出される。葉緑体などの色素体に存在する植物カロテノイド経路内では、ネオキサンチンを形成することが知られている酵素はネオキサンチンシンターゼのクラスに属する。ネオキサンチンシンターゼはビオラキサンチンからのネオキサンチンの形成を触媒し、ＡＢＡ４ポリヌクレオチドによってコードされる。リコペンβシクラーゼもビオラキサンチンからのネオキサンチンの形成を触媒し、ＮｅＳｙポリヌクレオチドによってコードされる。９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（複数可）はＣ25−アレン−アポ−アルデヒドおよびキサノチンにおけるシス−ネオキサンチンの切断を触媒し、ＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドによってコードされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
香味プロファイルが修飾されたタバコなどの植物材料が、当技術分野で引き続き必要とされている。本発明の目的は、この必要性を満たすことである。
対応するＡＢＡ４、ＮｅＳｙおよびＮＣＥＤ２遺伝子はニコチアナ・タバカムからクローニングおよび配列決定されており、これら遺伝子の発現調節の影響が調べられている。ＮｅＳｙおよびＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドによってコードされる酵素はカロテノイド生合成経路の成分であると考えられ、植物中のＮｅＳｙポリヌクレオチドの発現の上方制御、およびＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの発現の下方制御は、カロテノイド含量を増大することが分かっている。しかしながら、改変されたβ−ダマセノンの生成は検出されなかった。驚くことに本発明者らは、ＡＢＡ４ポリヌクレオチドの発現の増大はカロテノイド含量を増大しただけでなく、タバコ植物から調製した乾燥処理タバコの点火後に形成されたエアロゾル中の、β−ダマセノン含量も有意に増大したことを発見した。ＮｅＳｙポリヌクレオチドは、ＡＢＡ４ポリヌクレオチドとカロテノイド生合成経路中の同地点で作用する酵素をコードするので、この発見はより一層驚くべきものであったが、ＮｅＳｙポリヌクレオチドはβ−ダマセノンレベルに対して有意な影響がないことが分かった。如何なる特定の理論によっても縛られることを望むものではないが、この発見は、ＡＢＡ４ポリヌクレオチドによってコードされるネオキサンチンシンターゼは、ニコチアナ・タバカムでのβ−ダマセノン合成において中心的役割を果たすことを示唆する。これによって、β−ダマセノンレベルが調節され、したがって改変された香味プロファイルを有する植物を生成することができる。カロテノイド含量が調節された植物を工学的に作製することができる。このような植物は、消費者に対する栄養学的利点を有し得る。さらに、植物のカロテノイド含量の調節を使用して、カロテノイド生合成を阻害する除草剤に耐性がある植物を作製することができ、これによって現在これらの化合物に敏感である穀物用の除草剤としてのカロテノイド阻害剤の用途が広がり得る。有利なことにこれらの変化が、業界による容認および植物収率最大化などに関する重要な基準である、植物の外観を実質的に変えることはない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様および実施形態は、添付の特許請求の範囲に示されている。
一態様では、ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号１または配列番号６と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、ポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを提供する。
別の態様では、配列番号２と少なくとも６６％の配列同一性または配列番号７と少なくとも６０％の配列同一性を有する単離ポリペプチドを提供する。
【０００６】
別の態様では、単離ポリヌクレオチド（複数可）を含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを提供する。
別の態様では、本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド（複数可）、ポリペプチドまたは構築物、ベクターまたは発現ベクターを含み、対照または野生型植物と比較して、ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節された、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物細胞を提供する。
一実施形態では、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物は植物細胞を含む。
【０００７】
別の態様では、植物のカロテノイド含量を調節するための方法であって、（ｉ）植物におけるネオキサンチンシンターゼ、好ましくは本明細書で示されているポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のカロテノイド含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法を提供する。
一実施形態では、リコペンβシクラーゼまたは９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはこれらの組合せの発現または活性も、植物において調節される。
【０００８】
一実施形態では、リコペンβシクラーゼは配列番号８で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、またはポリペプチド配列は配列番号９で示される配列もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼは配列番号１３で示されるポリヌクレオチド配列もしくはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。
別の態様では、植物中のβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、（ｉ）植物におけるネオキサンチンシンターゼ、好ましくは本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むネオキサンチンシンターゼの発現または活性を調節するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、β−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本明細書に記載される方法（複数可）によって入手されまたは入手可能である、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物、またはそこから誘導されもしくは誘導可能である植物材料を提供する。
別の態様では、ネオキサンチンシンターゼの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせたルテインおよびβ−カロテンの含量が、ネオキサンチンシンターゼの発現または活性が増大していない対照植物より高く、乾燥処理植物材料のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が対照植物由来のエアロゾルより少なくとも１０％高く、好ましくは（ｉ）植物の緑葉ルテイン含量が少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉ）植物のβ−カロテン含量が少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉｉ）植物由来の葉バイオマスの加熱時のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量が少なくとも約１ｎｇ／ｍｇである、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を提供する。
【００１０】
別の態様では、本明細書に記載される植物由来のバイオマス、種子または葉を含む植物材料を提供する。
別の態様では、本明細書に記載される植物細胞、植物の少なくとも一部、または植物材料を含むタバコ製品を提供する。
別の態様では、β−ダマセノンを生成するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の植物、植物材料、またはタバコ製品の少なくとも一部を提供するステップと、（ｂ）それを加熱してβ−ダマセノンを含むエアロゾルを生成するステップとを含む方法を提供する。
さらなる態様は以下のものを含む。
１つ以上の制御配列に作動可能に連結した、１つ以上の本明細書に記載される単離ポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
【００１１】
１つ以上の本明細書に記載される単離ポリヌクレオチドを含み、少なくとも１５〜３０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、１００〜１５０ヌクレオチド、１５０〜２００ヌクレオチド、２００〜３００ヌクレオチド、３００〜４００ヌクレオチド、４００〜５００ヌクレオチド、５００〜６００ヌクレオチドまたは６００〜７００ヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド構築物。
本明細書に記載される植物材料、バイオマス、種子もしくは葉を取り込んだ、またはこれらを利用した消耗品。
本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖ＲＮＡ、コンジュゲートまたは発現ベクターなどを含む細胞株。細胞内での本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドの発現、またはそれによってコードされる１つ以上のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、本明細書に記載されるキメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖ＲＮＡ、コンジュゲートまたは発現ベクターを投与するステップを含む方法。
【００１２】
本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドを検出、単離、増幅または分析するための方法であって、ポリヌクレオチドを含む試料を提供するステップと、単離ヌクレオチド配列由来の少なくとも１０個の隣接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子と、前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズするステップとを含む方法。
対照植物と比較した植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量とβ−ダマセノン含量、またはカロテノイド含量もしくはβ−ダマセノン含量を調節するための方法であって、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する作用物質の使用を含む方法。
【００１３】
対照植物と比較した植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量とβ−ダマセノン含量、またはカロテノイド含量もしくはβ−ダマセノン含量を調節するための、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する作用物質の使用。
【００１４】
一実施形態では、作用物質は、キメラポリヌクレオチド遺伝子、１つ以上のポリヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド構築物、１つ以上のポリヌクレオチドまたはそれと共有結合した少なくとも１個の非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド成分を含むコンジュゲート、リボザイム、突然変異原、ジンクフィンガー、小分子もしくはメガヌクレアーゼであるか、またはこれらに由来する。
【００１５】
別の実施形態では、ポリヌクレオチド断片（複数可）は、アンチセンス核酸、リボザイム、スプライスゾーム仲介トランススプライシングに影響を与えるＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、または他の非翻訳ＲＮＡなどをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド断片（複数可）は干渉ＲＮＡをコードする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】植物におけるカロテノイド経路の簡略型の図である。ネオキサンチンとルテインは、葉におけるβ−ダマセノンの形成に貢献する前駆体候補である。追加的な、ただしこれまで特徴付けられていないステップは、それぞれ乾燥処理中のグリコシド形成および細菌分解を含む。
【図２】（Ａ）３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４植物を工学的に作製するために使用したＫ３２６から増幅したＮｔＡＢＡ４のｃＤＮＡ配列の図である。（Ｂ）ＮｔＡＢＡ４翻訳配列の図である。（Ｃ）ＮｔＡＢＡ４配列を増幅するために使用したフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）プライマー。Ｆプライマー中の５’ｃａｃｃ配列は、ｐＥＮＴＥＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクターへのクローニングに必要とされる。
【図３】ＮｔＡＢＡ４遺伝子のコピーに対応するＨｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ由来のタバコゲノム配列のクローニングおよび配列決定の図である。（Ａ）５エクソンおよび４イントロンを含むこのゲノム配列は合計１８０８ｂｐ（１７９２＋１６ｂｐイントロンボーダー）に及ぶ。（Ｂ）ＮｔＡＢＡ４のｃＤＮＡ（Ｔ）とクローニングゲノムＮ１ＡＢＡ４のアイソフォーム（ＣＱ）は同一ではない。（Ｃ）ゲノム配列（Ｓｂｊｃｔ）から推測した予想７８６ｂｐ長ＮＩＡＢＡ４コピーは、ゲノムコピーに存在しない葉緑体トランジットペプチドにおける位置９での１セリンを含めて、クローニングＮ１ＡＢＡ４ｃＤＮＡ（クエリ）と７アミノ酸異なる。
【図４】（Ａ）３５Ｓ：：ＮｔＮｅＳｙ植物を工学的に作製するために使用したＫ３２６から増幅したＮｔＮｅＳｙのｃＤＮＡ配列の図である。（Ｂ）ＮｔＮｅＳｙ翻訳配列の図である。（Ｃ）ＮｔＮｅＳｙ配列を増幅するために使用したフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）プライマー。Ｆプライマー中の５’ｃａｃｃ配列は、ｐＥＮＴＥＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクターへのクローニングに必要とされる。
【図５】（Ａ）ＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ植物を工学的に作製するために使用したＮｔＮＣＥＤ２の部分的ｃＤＮＡ配列の図である。（Ｂ）ＮｔＮＣＥＤ２の部分的配列を増幅するために使用したフォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）プライマーの図である。Ｆプライマー中の５’ｃａｃｃ配列は、ｐＥＮＴＥＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクターへのクローニングに必要とされる。
【図６】ＴＮ９０−４、３５Ｓ：：ＮｔＮｅＳｙ−１＿２（ＮｅＳｙ１−２）、３５Ｓ：：ＮｌＡＢＡ４−２＿２（ＡＢＡ４−２＿２）およびＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ−１＿４（ＣＥＤ２−１＿４）選択株の「グリーン」試料（葉プール）における、ルテイン、β−カロテン濃度、およびネオキサンチンの半定量化の図である。
【図７】株ＴＮ９０−４（ＴＮ９０対照）、３５Ｓ：：ＮｔＮｅＳｙ−１＿２（ＮｅＳｙ１−２）、３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４−２＿２（ＡＢＡ４−２−２）およびＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ−１＿４（ＣＥＤ２−１＿４）のエアロゾル（Ａｅｒｏｓｏｌ）、乾燥処理タバコ（Ｔｏｂａｃｃｏ）およびエアロゾル形成後の固形タバコ（Ｐｌｕｇ）におけるβ−ダマセノン含量の図である。β−ダマセノンの定量化は、スモークシミュレーター、エアロゾル捕捉およびβ−ダマセノン定量化を含めて三連で実施する。Ｔ検定解析は、株ＮｔＡＢＡ４−２＿２のエアロゾル中のβ−ダマセノン含量はＴＮ９０−４と統計学的に異なること（Ｐ＜０．０１）、および株ＮｔＡＢＡ４−２＿２の固形タバコ中のβ−ダマセノン含量はＴＮ９０−４と統計学的に異なること（Ｐ＜０．０５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本出願の範囲内で使用する技術用語および表現は、植物および分子生物学の関連分野においてそれらに通常施用する意味を一般に示す。全ての以下の用語の定義は、本出願の全容に適用する。語句「含む」は他のエレメントまたはステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数形を除外するものではない。１つのステップが、特許請求の範囲に列挙する数個の特徴の機能を果たすことができる。所与の数値または範囲の文脈での用語「約」、「本質的に」および「およそ」は、所与の数値または範囲の２０％以内、１０％以内、または５％、４％、３％、２％もしくは１％以内にある数値または範囲を指す。
用語「単離」はその本来の環境から得られた任意の実体を指すが、この用語は如何なる精製度も意味しない。
【００１８】
「ベクター」は、核酸の輸送を可能にする核酸成分の組合せを含む核酸媒体、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどを指す。適切なベクターには、環状、二本鎖核酸プラスミドなどの染色体外複製が可能であるエピソーム、直鎖状二本鎖核酸プラスミド、および任意の起源の他のベクターなどがある。
「発現ベクター」は、核酸の発現を可能にする核酸成分の組合せを含む核酸媒体、例えばＡＢＡ４ポリヌクレオチド、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどである。適切な発現ベクターには、環状、二本鎖核酸プラスミドなどの染色体外複製が可能であるエピソーム、直鎖状二本鎖核酸プラスミド、および任意の起源の機能上同等な他の発現ベクターなどがある。発現ベクターは、以下に定義するような、上流に位置し核酸に作動可能に連結した少なくとも１個のプロモーター、核酸構築物または核酸コンジュゲートを含む。
【００１９】
用語「構築物」は、１つ以上のポリヌクレオチドを含む二本鎖、組換え核酸断片を指す。構築物は、相補的「センスもしくはコード鎖」と塩基対形成する「鋳型鎖」を含む。２つの考えられる方向、発現ベクターなどのベクター内に位置するプロモーターの方向に対して同一（またはセンス）方向または逆（またはアンチセンス）方向のいずれかで、ベクターに所与の構築物を挿入することができる。
「プロモーター」は、典型的には上流に位置し二本鎖ＤＮＡ断片に作動可能に連結した核酸エレメント／配列を指す。プロモーターは対象の固有遺伝子と隣接した領域に完全に由来してよく、または異なる固有プロモーター由来の異なるエレメントまたは合成ＤＮＡセグメントで構成され得る。
【００２０】
用語「相同性、同一性または類似性」は、配列アラインメントにより比較した、２ポリペプチド間または２核酸分子間の配列類似性の程度を指す。比較する２つの別個の核酸配列の間の相同性の程度は、比較可能な位置における同一もしくは一致ヌクレオチドの数の関数である。同一率は、目視および数学的計算により決定することができる。あるいは、２核酸配列の同一率は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータプログラムを使用して、配列情報の比較により決定することができる。
【００２１】
用語「植物」は、その任意の生活環または発生段階の任意の植物、およびその子孫を指す。一実施形態では、植物は「タバコ植物」であり、タバコ属に属する植物を指す。タバコ植物の好ましい種は本明細書に記載される。
「植物細胞」は、植物の構造および生理的単位を指す。植物細胞は、細胞壁がないプロトプラスト、単離単細胞もしくは培養細胞、または植物組織、植物器官、もしくは完全体植物などだけには限られないが、これらを含めた高度に編成された単位の一部の形であってよい。
用語「植物材料」は、バイオマス、葉、茎、根、花もしくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、断片、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分もしくは産物を含めた、植物から入手可能な任意の固体、液体または気体組成物、またはこれらの組合せを指す。一実施形態では、植物材料は、バイオマス、種子または葉を含むか、またはこれらからなる。別の実施形態では、植物材料は葉を含むか、または葉からなる。
【００２２】
用語「品種」は、同種の他の植物とそれらを区別する一定の特徴を共有する、植物の集団を指す。１つ以上の特有の形質を有しているので、その品種内の個体間のごくわずかな全体の違いによって、品種はさらに特徴付けされる。品種は市販されていることが多い。
本明細書で使用する用語「株」または「品種改良株」は、植物品種改良中に使用される植物群を示す。１つ以上の対象の形質に関して個体間でほとんど違いを示さないので、株と品種は区別可能であるが、他の形質に関しては個体間である程度の違いが存在し得る。
用語「調節」は、ポリペプチドの発現または活性の低減、阻害、増大、または他の場合それに影響を与えることを指すことができる。この用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性の低減、阻害、増大、または他の場合それに影響を与えることも指すことができ、転写活性の調節だけには限られないが、それを含むことができる。
【００２３】
本明細書で使用する用語「低減」または「低減された」は、ポリペプチド活性、転写活性およびタンパク質発現などに限られないが、これらの量または活性の約１０％〜約９９％の低減、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の低減を指す。
本明細書で使用する用語「阻害」または「阻害された」は、ポリペプチド活性、転写活性およびタンパク質発現などに限られないが、これらの量または活性の約９８％〜約１００％の低減、または少なくとも９８％、少なくとも９９％、ただし特に１００％の低減を指す。
本明細書で使用する用語「増大」または「増大した」は、ポリペプチド活性、転写活性およびタンパク質発現などに限られないが、これらの量または活性の約５％〜約９９％の増大、または少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％以上の増大を指す。
【００２４】
対照植物の文脈における用語「対照」は、酵素の発現または活性が修飾（例えば、増大または低減）しておらず、したがって酵素の発現または活性が修飾されている植物と比較することができる、植物または植物細胞を意味する。対照植物は空ベクターを含むことができる。対照植物は野生型植物に相当し得る。
一実施形態では、配列表中に示す任意のポリヌクレオチドを含めた、本明細書に記載される任意の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、それと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
【００２５】
別の実施形態では、ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
【００２６】
別の実施形態では、リコペンβシクラーゼをコードし配列番号８と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、配列番号８と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
【００２７】
別の実施形態では、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼをコードし配列番号１３と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドは、配列番号１３と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、非修飾または修飾デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であってよい、ヌクレオチドのポリマーを指す。したがってポリヌクレオチドは、非制限的に、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡまたはこれらの断片（複数可）であってよい。さらにポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物とのハイブリッド分子、またはこれらの断片（複数可）であってよい。さらにポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは両方、またはこれらの断片（複数可）を含む三本鎖領域で構成されてよい。ポリヌクレオチドはホスホチオエートなどの１つ以上の修飾塩基を含有することができ、ペプチド核酸であってよい。一般にポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、または前述の組合せの単離またはクローニング断片から構築することができる。本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列として示すが、配列は、それらの対応するＲＮＡ配列、およびそれらの逆相補体を含めた、それらの相補的（例えば、完全に相補的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
【００２９】
用語「ＮｔＡＢＡ４ポリヌクレオチド」は、ニコチアナ・タバカム由来のネオキサンチンシンターゼをコードするポリヌクレオチドに関するものであり、配列番号１もしくは配列番号６と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号１もしくは配列番号６の配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体、配列番号１もしくは配列番号６の断片を含めたＮｔＡＢＡ４ポリヌクレオチドの断片、配列番号１もしくは配列番号６の対応する断片と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する断片と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有する配列番号１もしくは配列番号６の断片を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリヌクレオチドを含む。ＮｔＡＢＡ４ポリヌクレオチドは、ネオキサンチンシンターゼとして機能するポリペプチドをコードするため、配列番号１もしくは配列番号６と十分もしくは相当な程度の同一性または類似性を含む配列も含む。一実施形態では、用語「ＮｔＡＢＡ４ポリヌクレオチド」は、配列番号１または配列番号６として本明細書で指定するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるヌクレオチドのポリマーを指す。
【００３０】
用語「ＮｔＮｅＳｙポリヌクレオチド」は、ニコチアナ・タバカム由来のリコペンβシクラーゼをコードするポリヌクレオチドに関するものであり、配列番号８と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号８の断片を含めたＮｔＮｅＳｙポリヌクレオチドの断片、配列番号８の配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体、配列番号８の対応する断片と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する断片と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有する配列番号８の断片、および配列番号８の対応する断片と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する断片と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有する配列番号８の断片を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリヌクレオチドを含む。ＮｔＮｅＳｙポリヌクレオチドは、リコペンβシクラーゼとして機能するポリペプチドをコードするため、配列番号８と十分もしくは相当な程度の同一性または類似性を含む配列も含む。一実施形態では、用語「ＮｔＮｅＳｙポリヌクレオチド」は、それと１００％の配列同一性を有する配列番号８として本明細書で指定するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるヌクレオチドのポリマーを指す。
【００３１】
用語「ＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド」は、ニコチアナ・タバカム由来の９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに関するものであり、配列番号１３と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号１３と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体、配列番号１３の断片を含めたＮｔＮｅＳｙポリヌクレオチドの断片、配列番号１３の対応する断片と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する断片と実質的相同性（すなわち、配列類似性）または実質的同一性を有する配列番号１３の断片を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリヌクレオチドを含む。ＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドは、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするため、配列番号１３と十分もしくは相当な程度の同一性または類似性を含む配列も含む。一実施形態では、用語「ＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド」は、それと１００％の配列同一性を有する配列番号１３として本明細書で指定するポリヌクレオチドを含む、それからなる、または本質的にそれからなるヌクレオチドのポリマーを指す。
【００３２】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドはホスホジエステル結合を一般に含有するが、いくつかの場合、例えばホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ−メチルホホロアミデート結合、およびペプチドポリヌクレオチド骨格および結合を含めた別の骨格を有し得る、ポリヌクレオチドアナログが含まれる。他のアナログポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するポリヌクレオチドがある。リボースリン酸骨格の修飾は、様々な理由で、例えば生理的環境内もしくはバイオチップ上のプローブとしてのこのような分子の安定性および半減期を増大するために行うことができる。天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作製することができ、あるいは、異なるポリヌクレオチドアナログの混合物、および天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作製することができる。
【００３３】
例えばホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホホロアミデート結合、およびペプチドポリヌクレオチド骨格および結合を含めた、様々なポリヌクレオチドアナログが知られている。他のアナログポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するポリヌクレオチドがある。１つ以上のカルボキシル糖を含有するポリヌクレオチドも含まれる。
【００３４】
他のアナログには、ペプチドポリヌクレオチドアナログであるペプチドポリヌクレオチドがある。天然に存在するポリヌクレオチドの強く帯電したホスホジエステル骨格とは対照的に、これらの骨格は中性条件下で実質的に非イオン性である。これによって利点をもたらすことができる。第一に、ペプチドポリヌクレオチド骨格は改善されたハイブリダイゼーション動態を示し得る。ペプチドポリヌクレオチドには、ミスマッチ対完全一致の塩基対に関する溶解温度の大きな変化がある。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部ミスマッチに関して溶解温度の２〜４℃の低下を典型的に示す。非イオン性ペプチドポリヌクレオチド骨格に関して、低下は７〜９℃に近い。同様に、それらの非イオン性のため、これらの骨格と結合した塩基のハイブリダイゼーションは塩濃度に対して比較的鈍感である。さらにペプチドポリヌクレオチドは、細胞酵素によって分解しない、またはあまり分解しない可能性があり、したがってより安定状態であり得る。
【００３５】
特に開示するポリヌクレオチド、およびその断片の組合せの使用には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブ、または核酸増幅アッセイで使用するためのプライマーとしての断片の使用がある。一般にこのような断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個以上の隣接ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０個以上の隣接ヌクレオチドを含む。したがって一態様では、プローブまたはプライマーまたは両方の使用を含む、ＡＢＡ４ポリヌクレオチドを検出するための方法も提供する。例示的なプライマーは配列番号３〜５で示される。別の態様では、プローブまたはプライマーまたは両方の使用を含む、ＮｅＳｙポリヌクレオチドを検出するための方法も提供する。例示的なプライマーは配列番号１０〜１２で示される。別の態様では、プローブまたはプライマーまたは両方の使用を含む、ＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを検出するための方法も提供する。例示的なプライマーは配列番号１４〜１６で示される。
【００３６】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基礎パラメータおよび適切な条件を考案するためのガイダンスは、Sambrook, J.,E.F.Fritsch, and T.Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)によって記載されている。本明細書に記載されるアミノ酸配列と組み合わせた遺伝子コードの知識を使用して、縮重オリゴヌクレオチドのセットを調製することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離および増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の実施形態では、縮重プライマーを、遺伝子ライブラリー用のプローブとして使用することができる。このようなライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびさらに電子発現配列タグまたはＤＮＡライブラリーだけには限られないが、これらが含まれる。この方法によって同定した相同配列は、次いで、本明細書で同定した配列のホモログを同定するプローブとして使用される。低ストリンジェンシー条件、典型的には適度にストリンジェントな条件、および一般に非常にストリンジェントな条件下で本明細書に記載されるポリヌクレオチド（複数可）とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）の使用も考えられる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基礎パラメータおよび適切な条件を考案するためのガイダンスは、Sambrook,J.,E.F.Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)によって言及されており、例えばポリヌクレオチドの長さまたは塩基組成に基づいて、当業者により容易に決定することができる。
【００３７】
適度にストリンジェントな条件を得るための一つの方法は、５×標準クエン酸ナトリウム、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム、１．０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）を含有する事前洗浄液、約５０％のホルムアミド、６×標準クエン酸ナトリウムのハイブリダイゼーションバッファー、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または他の類似したハイブリダイゼーション溶液、約５０％のホルムアミドを含有する溶液など、および約４２℃のハイブリダイゼーション温度）、および約６０℃、０．５×標準クエン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム中の洗浄条件の使用を含む。一般に、非常にストリンジェントな条件は前述のようなハイブリダイゼーション条件として、ただし約６８℃、０．２×標準クエン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムでの洗浄で定義される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４である）は、標準クエン酸ナトリウム（１×標準クエン酸ナトリウムは０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいて代用することができ、ハイブリダイゼーション終了後、洗浄を１５分間実施する。当業者に知られており以下でさらに記載するような、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖の安定性を支配する基本原則を適用することにより、洗浄温度および洗浄塩濃度を必要に応じて調節し、望ましい程度のストリンジェンシーを得ることができることは理解されるはずである（例えば、Sambrook,J.,E.F. Fritsch, and T.Maniatis(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y参照)。未知の配列の標的ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドがハイブリダイズするとき、ハイブリッド長はハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであると考えられる。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズするとき、ポリヌクレオチドの配列を一直線に並べ、最適配列相補性の１つ以上の領域を確認することによって、ハイブリッド長を決定することができる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの溶解温度より５〜１０℃低いはずであり、この場合溶解温度は以下の等式に従い決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドに関して、溶解温度（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長を超えるハイブリッドに関して、溶解温度（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、前式でＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×標準クエン酸ナトリウムに関する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。典型的には、各々のこのようなハイブリダイズポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（一般には少なくとも５０％、６０％、または７０％、および最も一般には少なくとも８０％）である長さを有し、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドと少なくとも６０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の配列同一性を有する。
【００３８】
当業者によって理解されるように、直鎖状ＤＮＡには２つの考えられる向き、５’から３’方向と３’から５’方向がある。例えば、同一ポリヌクレオチド分子／鎖内で、参照配列が５’から３’方向に位置する場合、および第二配列が５’から３’方向に位置する場合、したがって参照配列と第二配列は同一方向を向いている、または同じ向きを有する。典型的には、プロモーター配列と所与のプロモーターの制御下の対象遺伝子は、同じ向きに位置する。しかしながら、５’から３’方向に位置する参照配列に対して、第二配列が同一ポリヌクレオチド分子／鎖内の３’から５’方向に位置する場合、したがって参照配列と第二配列はアンチセンス方向を向いている、またはアンチセンスの向きを有する。互いに対してアンチセンスの向きを有する２配列は、参照配列（５’→３’方向）と参照配列（５’から３’に位置する参照配列）の逆相補配列が同一ポリヌクレオチド分子／鎖内に位置する場合、同じ向きを有するとして或いは記載することができる。本明細書で示される配列は５’から３’方向に示す。本明細書で提供する組換え構築物を使用して植物または植物細胞を形質転換し、タンパク質の発現または活性レベルを調節することができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、植物または植物細胞内でのポリペプチドの発現に適した制御領域に作動可能に連結した、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。したがってポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするコード配列を含むことができる。タンパク質の発現または活性レベルが調節される植物は、突然変異植物、非天然型植物、トランスジェニック植物、人造植物または遺伝子操作植物を含むことができる。トランスジェニック植物は、組換えＤＮＡの安定的組み込みにより改変されたゲノムを含むことが適切である。組換えＤＮＡは遺伝子操作され細胞外で構築されたＤＮＡを含み、天然に存在するＤＮＡまたはｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含有するＤＮＡを含む。トランスジェニック植物は、原型形質転換植物細胞から再生する植物、および後世もしくは雑種の形質転換植物からの子孫トランスジェニック植物を含むことができる。
【００３９】
組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは天然ポリペプチドであってよく、または細胞と異種であってよい。いくつかの場合、組換え構築物は、制御領域に作動可能に連結した、発現を調節するポリヌクレオチドを含有する。適切な制御領域の例は本明細書に記載される。
【００４０】
本明細書に記載されるベクターなどの、組換えポリヌクレオチド構築物を含有するベクターも提供する。適切なベクター骨格には、例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体などの、当技術分野で通常使用されるベクター骨格がある。適切な発現ベクターには、非制限的に、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルス由来の、プラスミドおよびウイルスベクターがある。多数のベクターおよび発現系が市販されている。
【００４１】
ベクターは、例えば複製起点、足場結合領域またはマーカーも含むことができる。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型を植物細胞にもたらすことができる。例えばマーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ベロマイシン、またはヒグロマイシン）、または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロンまたはホスフィノスリシン）に対する耐性などの、殺生物剤耐性をもたらすことができる。さらに発現ベクターは、発現ポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または位置特定）を容易にするように設計されたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃまたはヘマグルチニン配列などのタグ配列は、コードポリペプチドとの融合体として典型的に発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含めて、ポリペプチド内の任意の場所に挿入することができる。
【００４２】
組換えポリヌクレオチドをそのゲノムに組み込んで安定形質転換状態にすることによって、植物または植物細胞を形質転換することができる。したがって本明細書に記載される植物または植物細胞は、安定的に形質転換することができる。典型的には、安定的に形質転換された細胞は、各細胞分裂で導入ポリヌクレオチドを保持する。植物または植物細胞は、組換えポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれないように、一過的に形質転換することもできる。典型的には、一過的に形質転換された細胞は、各細胞分裂で導入組換えポリヌクレオチドの全部または一部を失い、したがって十分な回数の細胞分裂後、娘細胞において導入組換えポリヌクレオチドを検出することはできない。
【００４３】
バイオリスティック、遺伝子銃技法、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換およびエレクトロポレーションを含めた、いずれも本明細書に包含される、植物細胞を形質転換するためのいくつかの方法が当技術分野で利用されている。植物染色体に外来ＤＮＡを組み込むためのアグロバクテリウム系は植物の遺伝子操作に関して広く研究、修飾、および利用されている。センスもしくはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結した対象精製タバコタンパク質に対応するＤＮＡ配列を含む、裸状態の組換えＤＮＡ分子を、従来の方法により適切なＴ−ＤＮＡ配列と接合させる。これらは、いずれも標準的であるポリエチレングリコール技法またはエレクトロポレーション技法によって、タバコプロトプラストに導入される。あるいは、対象精製タバコタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含むこのようなベクターを生きたアグロバクテリウム細胞に導入し、次いでＤＮＡをタバコ植物細胞に移す。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸状態ＤＮＡによる形質転換は、タバコプロトプラストとＤＮＡ含有リポソームの融合によって、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。Ｔ−ＤＮＡベクター配列を伴わない裸状態ＤＮＡを使用して、不活性高速マイクロプロジェクタイルを介してタバコ細胞を形質転換することもできる。
【００４４】
細胞または培養組織を形質転換のレシピエント組織として使用する場合、望む場合当業者に知られる技法により、形質転換培養物から植物を再生することができる。組換え構築物中に含める制御領域の選択は、有効性、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞または組織優先的発現だけには限られないが、これらを含めたいくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者には通常のことである。ポリヌクレオチドの転写を同様の形式で調節することができる。特定細胞型では、いくつかの適切な制御領域は転写のみを開始する、または主に転写を開始する。植物ゲノムＤＮＡ中の制御領域を同定および特徴付けするための方法は、当技術分野で知られている。
【００４５】
適切なプロモーターには、異なる組織または細胞型で存在する（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）、または異なる発生段階中に存在する、または異なる環境条件に応じて存在する組織特異的因子によって認識される、組織特異的プロモーターがある。適切なプロモーターには、特異的誘導物質を必要とせずに大部分の細胞型で活性化し得る、構成的プロモーターがある。ＲＮＡｉポリペプチド生成を制御するのに適したプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチン−もしくはファセオリン−プロモーターがある。当業者は、組換えプロモーターの多数の変形を作製することができる。
【００４６】
組織特異的プロモーターは、生長組織または再生組織中などの植物発生中の特異的時間で、特定細胞または組織でのみ活性がある転写制御エレメントである。例えば特定組織中でのポリヌクレオチドの発現が好ましいとき、組織特異的発現は有利であり得る。発生制御下での組織特異的プロモーターの例には、特定組織、例えば根もしくは葉などの生長組織、または果実、胚珠、種子、花粉、めしべ、花部などの再生組織、または任意の胚組織中でのみ（または主にそこでのみ）転写を開始することができるプロモーターがある。再生組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、内乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、がく片特異的、またはこれらの組合せであってよい。
【００４７】
適切な葉特異的プロモーターには、Ｃ４植物（トウモロコシ）由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ−ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）ｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リボース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーターがある（例えば、葉および光成長型苗木において発現されるトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、発達段階のトマト果実において発現されるＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２、または大部分が葉板および葉鞘中の葉肉細胞においてのみ高レベルで発現されるリボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター）。
【００４８】
適切な老年期特異的プロモーターには、果実成熟中、葉の老年期および切断時に活性があるトマトにおけるプロモーター、トウモロコシにおけるシステインプロテアーゼをコードする遺伝子のプロモーターがある。適切な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者に知られている、適切な根優先的プロモーターを選択することができる。適切な種子優先的プロモーターには、種子特異的プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーターなどの種子発達中に活性があるプロモーター）と、種子発芽プロモーター（種子発芽中に活性があるプロモーター）の両方がある。このような種子優先的プロモーターには、Ｃｉｍ１（シトキニン誘導型メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−ホスフェートシンターゼ）、Ｚｍ−４０としても知られるｍＺＥ４０−２、ｎｕｃｌｃ、およびｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）があるが、これらだけには限られない。γ−ゼインは内乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ−１は胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターには、マメβ−ファセオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどがあるが、これらだけには限られない。単子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターには、トウモロコシ１５ｋＤａゼインプロモーター、２２ｋＤａゼインプロモーター、２７ｋＤａゼインプロモーター、ｇ−ゼインプロモーター、２７ｋＤａγ−ゼインプロモーター（ｇｚｗ６４Ａプロモーターなど、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｓ７８７８０参照）、ワクシープロモーター（ｗａｘｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、シュルンケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１プロモーター、シュルンケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ２２３４４参照）、Ｉｔｐ２プロモーター、ｃｉｍ１プロモーター、トウモロコシｅｎｄ１およびｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１およびｅｅｐ２、ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター、ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター、およびシュルンケン２プロモーターがあるが、これらだけには限られない。
【００４９】
誘導性プロモーターの例には、病原体による攻撃、嫌気性条件、高温、光、渇水、低温、または高塩濃度に応答性があるプロモーターがある。病原体誘導性プロモーターには、病原体による感染後に誘導される病原体関連タンパク質（ＰＲタンパク質）がある（例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼ）。
【００５０】
植物プロモーター以外に、他の適切なプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびＴｉプラスミド由来の他のプロモーターは細菌起源に由来する可能性があり、またはウイルスプロモーターに由来する可能性がある（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）。用語「ＮｔＡＢＡ４ポリペプチド」は、いわゆるニコチアナ・タバカム由来の「ネオキサンチンシンターゼ」をコードするポリペプチドを指し、配列番号１と少なくとも約６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体、または配列番号６と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体、配列番号２と少なくとも約６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチド変異体、または配列番号７と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチド変異体、配列番号２もしくは配列番号７のＮｔＡＢＡ４ポリペプチドの断片、およびそれぞれ配列番号２もしくは配列番号７の対応する断片と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列番号２もしくは配列番号７の断片によってコードされるアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリペプチド変異体を含む。ＮｔＡＢＡ４ポリペプチド（複数可）は、ネオキサンチンシンターゼとして機能するため、配列番号２もしくは配列番号７と十分もしくは相当な程度の同一性または類似性を含む配列も含む。ＮｔＡＢＡ４ポリペプチドの断片は、ネオキサンチンシンターゼ活性を典型的に保持する。ＮｔＡＢＡ４ポリペプチドは、それらが依然ネオキサンチンシンターゼとして機能する条件で、任意の型の改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、リフォールディングもしくは異性体化、三次元構造、もしくは自己会合状態に影響を与える変化）の導入によって生じる突然変異体も含み、ポリペプチドは故意に工学的に作製すること���でき、または天然で単離することができる。ＮｔＡＢＡ４ポリペプチドは直線形であってよく、または知られている方法を使用して環化することができる。用語「ＮｔＡＢＡ４ポリペプチド」は、それと１００％の配列同一性を有する配列番号１もしくは配列番号６によってコードされるポリペプチド、またはそれと１００％の配列同一性を有する配列番号２もしくは配列番号７で示される配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドを指すこともできる。
【００５１】
用語「ＮｔＮｅＳｙポリペプチド」は、ニコチアナ・タバカム由来のリコペンβシクラーゼをコードするポリペプチドを指し、配列番号９と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号９と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド変異体、配列番号９のＮｔＮｅＳｙポリペプチドの断片、および配列番号９の対応する断片と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列番号９の断片によってコードされるアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリペプチド変異体を含む。ＮｔＮｅＳｙポリペプチドは、リコペンβシクラーゼとして機能するため、配列番号９と十分もしくは相当な程度の同一性または類似性を含む配列も含む。ＮｔＮｅＳｙポリペプチドの断片は、リコペンβシクラーゼ活性を典型的に保持する。ＮｔＮｅＳｙポリペプチドは、それらが依然リコペンβシクラーゼとして機能する条件で、任意の型の改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、リフォールディングもしくは異性体化、三次元構造、もしくは自己会合状態に影響を与える変化）の導入によって生じる変異体および突然変異体も含み、ポリペプチドは故意に工学的に作製することができ、または天然で単離することができる。ＮｔＮｅＳｙポリペプチドは直線形であってよく、または知られている方法を使用して環化することができる。用語「ＮｔＮｅＳｙポリペプチド」は、それと１００％の配列同一性を有する配列番号９で示される配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチドを指すこともできる。
【００５２】
用語「ＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチド」は、ニコチアナ・タバカム由来の９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼをコードするポリペプチドを指し、配列番号１３と１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または配列番号１３と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるポリペプチド変異体によってコードされるアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる他のポリペプチドを含む。９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ活性を典型的に保持する、ＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドの断片も包含される。ＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドは、それらが依然９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼとして機能する条件で、任意の型の改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、リフォールディングもしくは異性体化、三次元構造、もしくは自己会合状態に影響を与える変化）の導入によって生じる変異体および突然変異体も含み、ポリペプチドは故意に工学的に作製することができ、または天然で単離することができる。ＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドは直線形であってよく、または知られている方法を使用して環化することができる。
【００５３】
別の態様では、配列表中に示す任意のポリペプチドを含めた、本明細書に記載される任意の配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ポリペプチドを提供する。単離ポリペプチドは、それと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなることが適切である。
【００５４】
ポリペプチドは、任意の型の改変（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、リフォールディングもしくは異性体化、三次元構造、もしくは自己会合状態に影響を与える変化）の導入によって生じた変異体を含み、ポリペプチドは故意に工学的に作製することができ、または天然で単離することができる。変異体は、サイレント変化をもたらし機能上同等なタンパク質を生成する改変を有し得る。物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および両親媒性の類似性に基づいて、故意のアミノ酸置換を施すことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリシンとアルギニンがあり、類似した親水性値を有する非帯電極性頭部基があるアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンがある。保存的置換は、例えば以下の表に従い施すことができる。第二縦列中の同ブロック、および好ましくは第三縦列中の同ラインのアミノ酸を互いに置換することができる。
【００５５】
【表１】
0006302407.tif 000002
ポリペプチドは、成熟タンパク質、または未熟タンパク質、または未熟タンパク質由来のタンパク質であってよい。ポリペプチドは直線形であってよく、または知られている方法を使用して環化することができる。典型的にはポリペプチドは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の隣接アミノ酸を含む。
【００５６】
一実施形態では、ネオキサンチンシンターゼをコードし配列番号２と少なくとも約６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性、または配列番号７と約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ＮｔＡＢＡ４ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、リコペンβシクラーゼをコードし配列番号９と少なくとも約８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる単離ＮｔＮｅＳｙポリペプチドを提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドによってコードされる単離ＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドを提供する。
ポリペプチド配列の断片も本明細書で開示し、このような断片は、完全長配列の活性を適切に保持している。
【００５８】
突然変異ポリペプチド変異体を使用して、１つ以上の突然変異ポリペプチド変異体を含む、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物（例えば、突然変異、非天然型またはトランスジェニック、人造または遺伝子操作植物）を作製することができる。突然変異ポリペプチド変異体は、非突然変異ポリペプチドの活性を保持することが適切である。突然変異ポリペプチド変異体の活性は、非突然変異ポリペプチドより高い、低い、またはそれとほぼ同じである可能性がある。
【００５９】
本明細書に記載されるヌクレオチド配列およびポリペプチドの突然変異は、人造突然変異、または合成突然変異、または遺伝子操作突然変異を含むことができる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列およびポリペプチドの突然変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ操作ステップを含む方法によって入手されまたは入手可能である突然変異であってよい。本明細書に記載されるヌクレオチド配列およびポリペプチドの突然変異は、人間による介入を含む方法によって入手されまたは入手可能である突然変異であってよい。例として、方法は、遺伝子物質にランダムな突然変異をもたらす、突然変異誘発、催奇性、または発癌性有機化合物、例えばエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの、外から加える化学物質を使用する突然変異誘発を含むことができる。さらなる例として、方法は、１つ以上の遺伝子操作ステップ、例えば本明細書に記載される１つ以上の遺伝子操作ステップ、またはこれらの組合せなどを含むことができる。さらなる例として、方法は、１つ以上の植物交配ステップを含むことができる。
本明細書で使用する用語「非天然型」は、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは植物などの実体が自然界で見られないことを意味し、したがって自然界に存在する実体は明らかに除外する。このような非天然型実体は、人間によって構造的に修飾、合成または操作することができる。特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子またはタンパク質などのヌクレオチド配列またはポリペプチドに本来存在する天然突然変異ではない。
【００６０】
ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で形質転換または組換え宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを調製することができる。生成した発現ポリペプチドは、知られている精製法を使用して、このような培養物から次いで精製することができる。ポリペプチドの精製は、ポリペプチドと結合する作用物質を含有するアフィニティーカラム、このようなアフィニティー樹脂での１回以上のカラムステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する１回以上のステップ、またはイムノアフィニティークロマトグラフィーを含むことができる。あるいは、精製を容易にする形でポリペプチドを発現させることも可能である。例えばそれは、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオン−５−トランスフェラーゼまたはチオレドキシンの融合ポリペプチドなどの、融合ポリペプチドとして発現させることが可能である。融合ポリペプチドの発現および精製用のキットは市販されている。ポリペプチドはエピトープでタグ化することができ、このようなエピトープを対象とする特異的抗体の使用により後に精製することができる。逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの、１回以上の液体クロマトグラフィーステップを利用して、ポリペプチドをさらに精製することができる。前述の精製ステップの一部または全部を、様々な組合せで利用して、実質的に相同的な組換えポリペプチドを提供することができる。このように精製したポリペプチドは他のポリペプチドを実質的に含まない可能性があり、本明細書では「実質的に精製されたポリペプチド」として定義し、このような精製ポリペプチドは、ポリペプチド、断片、変異体などを含む。ポリペプチドおよび断片の発現、単離、および精製は、本明細書に記載される方法だけには限られないが、これらを含めた、任意の適切な技法により実施することができる。
【００６１】
ポリペプチドに対して作製したモノクローナル抗体などのアフィニティーカラムを利用して、発現したポリペプチドをアフィニティー精製することもできる。これらのポリペプチドは、従来の技法を使用して、例えば高塩溶出バッファー中で、アフィニティーカラムから除去することができ、使用する低塩バッファーに次いで透析することができ、または利用するアフィニティーマトリックスに応じてｐＨもしくは他の成分を変更することにより除去することができ、またはアフィニティー成分の天然基質を使用して競合的に除去することができる。
【００６２】
ポリペプチドは、知られている従来の化学合成により生成することもできる。合成手段によりポリペプチドまたはその断片を構築するための方法は、当業者には知られている。天然ポリペプチドとの一次、二次もしくは三次構造または立体配座特性の共有により合成的に構築したポリペプチド配列は、生物活性を含む、共通した生物学的性質を有し得る。
【００６３】
本明細書で使用する用語「非天然型」は、自然に形成されないまたは自然界に存在しない、実体（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子突然変異体、ポリペプチド、植物、植物細胞および植物材料）を記載する。このような非天然型実体または人工実体は、本明細書に記載される方法または当技術分野で知られている方法によって、作製、合成、初期化、修飾、介入、または操作することができる。したがって例として、非天然型植物、非天然型植物細胞または非天然型植物材料は、戻し交配などの従来の植物交配技法を使用して、または例えばアンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼなどの遺伝子操作技術によって作製することができる。さらなる例として、非天然型植物、非天然型植物細胞または非天然型植物材料は、生成する植物、その植物細胞または植物材料または子孫が、自然に形成されないまたは自然界に存在しない遺伝子構成物（例えばゲノム、染色体またはそのセグメント）を含むように、第一植物または植物細胞から（それ自体は天然に存在し得る）第二植物または植物細胞への、遺伝子移入または１つ以上の遺伝子突然変異（例えば、１つ以上の多型）の移動によって作製することができる。したがって、生成する植物、植物細胞または植物材料は人工的または非天然型である。したがって、人工的または非天然型植物または植物細胞は、生成する遺伝子配列が、第一植物または植物細胞と異なる遺伝的背景を含む第二植物または植物細胞に本来存在する場合でさえ、第一の天然植物または植物細胞における遺伝子配列の修飾によって作製することができる。遺伝的背景の違いは、表現型の違いによって、または核酸配列決定、遺伝子マーカー（例えば、マイクロサテライトＲＮＡマーカー）の有無などの、当技術分野で知られている分子生物学的技法によって検出することができる。
【００６４】
本明細書に記載されるＮｔＡＢＡ４またはＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドと免疫反応性がある抗体も提供する。本明細書で示されるポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、これらと免疫反応性がある抗体を産生する際に「免疫原」として利用することができる。このような抗体は、抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドと特異的に結合することができる。特異的に結合する抗体は、他の分子ではなくポリペプチド、ホモログ、および変異体を特異的に認識し結合する抗体である。一実施形態では、抗体は本明細書で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドと交差反応しない。
【００６５】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、抗体の形成を誘導する抗原決定基またはエピトープを含有する。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖状または立体配座（不連続）のいずれかであり得る。直鎖状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一セクションで構成され、一方立体配座または不連続エピトープは、ポリペプチドフォールディング時に非常に接近するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸セクションで構成される。当技術分野で知られる任意の方法によって、エピトープを同定することができる。さらに、ポリペプチド由来のエピトープはアッセイにおいて研究試薬として使用し、培養ハイブリドーマ由来のポリクローナル血清または上清などの物質から、特異的結合抗体を精製することができる。このようなエピトープまたはそれらの変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的もしくは酵素による切断などの当技術分野で知られる技法を使用して、または組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる。
【００６６】
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を、従来の技法によって調製することができる。ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も、本明細書において企図される。このようなハイブリドーマは、従来の技法によって産生し同定することができる。抗体を産生するため、様々な宿主動物を、ポリペプチド、その断片、変異体、または突然変異体を用いた注射によって免疫処置することができる。このような宿主動物は、数例挙げると、ウサギ、マウス、およびラットだけには限られないが、これらを含むことができる。様々なアジュバントを使用して免疫応答を高めることができる。宿主の種類に応じて、このようなアジュバントは、（完全および不完全）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性化物質、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのおそらく有用なヒト用アジュバントだけには限られないが、これらを含む。モノクローナル抗体は従来の技法によって回収することができる。このようなモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含めた任意の免疫グロブリンクラス、およびそれらの任意のサブクラスであってよい。
抗体をアッセイ中で使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、ポリペプチドまたは断片の存在を検出することもできる。イムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドまたは断片を精製する際に、抗体を利用することもできる。
【００６７】
ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２（またはこれらの２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）の発現または活性を調節（例えば増大）することができる組成物は、１つ以上の内在性遺伝子（複数可）の転写に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド、ＲＮＡ転写産物（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド、１つ以上のタンパク質の安定性に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド、基質もしくは制御タンパク質に関する１つ以上のタンパク質の酵素活性または１つ以上のタンパク質の結合活性に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド、１つ以上のタンパク質に対して特異性を示す抗体、１つ以上のタンパク質の安定性または１つ以上のタンパク質の酵素活性または１つ以上のタンパク質の結合活性に干渉することができる低分子化合物、１つ以上のポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガータンパク質、および１つ以上のポリヌクレオチドに対して活性を有するメガヌクレアーゼだけには限られないが、これらを含む。遺伝子編集技術、遺伝的編集技術およびゲノム編集技術は、当技術分野でよく知られている。
【００６８】
アンチセンス技術は、ポリペプチドの発現を調節するために使用することができる、１つのよく知られている方法である。抑制する遺伝子のポリヌクレオチドをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、制御領域および転写終結配列に作動可能に連結させる。次いで組換え構築物を植物に形質転換し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。ポリヌクレオチドが抑制する遺伝子の完全配列である必要はないが、典型的には抑制する遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部と実質的に相補的である。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、リボザイム、またはｍＲＮＡの発現に影響を与える触媒ＲＮＡに転写され得る。事実上任意の標的ＲＮＡと特異的に対形成し特異的位置でホスホジエステル骨格を切断し、それによって標的ＲＮＡを機能上不活性化するように、リボザイムを設計することができる。異種ポリヌクレオチドは、特定ｍＲＮＡ転写産物を切断し、それによってポリペプチドの発現を妨げるように設計されたリボザイムをコードすることができる。ハンマーヘッド型リボザイムは特定ｍＲＮＡを破壊するのに有用であるが、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断する様々なリボザイムを使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ＲＮＡが５’−ＵＧ−３’ヌクレオチド配列を含有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当技術分野で知られている。ハンマーヘッド型リボザイム配列を転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定ＲＮＡに埋め込んで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの切断効率を高めることができる。
【００７０】
一実施形態では、ＲＮＡ転写産物（複数可）の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチドは干渉ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉またはＲＮＡサイレンシングは、それによって酵素分解の特異的ｍＲＮＡを標的化することができる、進化上保存されたプロセスである。二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）が細胞により導入または生成され（例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス、または干渉ＲＮＡポリヌクレオチド）、干渉ＲＮＡ経路が始まる。二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅｓＩＩＩによって、２１〜２３ｂｐ長の多数の低分子干渉ＲＮＡ二重鎖に転換され得る。ＡＴＰ依存的プロセスを介して低分子干渉ＲＮＡの巻き戻しを促進するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体によって、低分子干渉ＲＮＡは後に認識され得る。低分子干渉ＲＮＡの巻き戻しアンチセンス鎖は、低分子干渉ＲＮＡアンチセンス鎖と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡに、活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を誘導する。標的ｍＲＮＡとアンチセンス鎖はＡ型ヘリックスを形成することができ、Ａ型ヘリックスの主要溝は活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体によって認識され得る。低分子干渉ＲＮＡ鎖の５’末端の結合部位によって画定する一部位で、活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体により標的ｍＲＮＡが切断され得る。活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体をリサイクルして、別の切断事象を触媒することができる。
【００７１】
干渉ＲＮＡ発現ベクターは、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、または関連ＲＮＡ変異体の発現レベルの低減によりＲＮＡ干渉活性を示す干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、干渉ＲＮＡ構築物を含むことができる。発現ベクターは、本明細書でさらに記載するように、上流に位置し干渉ＲＮＡ構築物に作動可能に連結したプロモーターを含むことができる。干渉ＲＮＡ発現ベクターは、適切な最小コアプロモーター、対象の干渉ＲＮＡ構築物、転写終結およびポリアデニル化シグナルを含めた、上流（５’）制御領域、下流（３’）制御領域、および様々な選択マーカーなどの当業者に知られている他の配列を含むことができる。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、二本鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖と相補的センス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子）、二本鎖ヘアピン様構造、または一本鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖のみを含むｓｓＲＮＡ分子）などを含めた様々な形で生成し得る。構造は、自己相補的センス鎖とアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を含むことができる。二本鎖干渉ＲＮＡは、酵素により二本鎖低分子ＲＮＡに転換され得る。低分子干渉ＲＮＡ二重鎖の鎖の一方は、標的ｍＲＮＡおよび関連ＲＮＡ変異体内の相補的配列とアニーリングすることができる。低分子干渉ＲＮＡ／ｍＲＮＡ二重鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体によって認識され、それは配列依存形式に多数の部位でＲＮＡを切断し、標的ｍＲＮＡおよび関連ＲＮＡ変異体の分解をもたらすことができる。
【００７３】
二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ分子の自己相補的センス領域とアンチセンス領域がポリヌクレオチドベースまたは非ポリヌクレオチドベースリンカー（複数可）によって連結した、ステム−ループ構造で単一オリゴヌクレオチドから構築される低分子干渉ＲＮＡ分子、ならびに環状ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングしてＲＮＡ干渉を仲介することができる活性低分子干渉ＲＮＡ分子を作製することができる、自己相補的センス鎖とアンチセンス鎖を含む２つ以上のループ構造およびステムを有する環状一本鎖ＲＮＡを含むことができる。
【００７４】
低分子ヘアピンＲＮＡ分子の使用も企図される。それらは、逆相補（センス）配列以外に、典型的にはスペーサーまたはループ配列により隔てられる、特異的アンチセンス配列を含む。スペーサーまたはループの切断は一本鎖ＲＮＡ分子とその逆相補体をもたらし、したがって（場合によっては、片方または両方の鎖の３’末端もしくは５’末端から１、２、３個もしくはそれより多くのヌクレオチドの付加または除去をもたらし得る他のプロセシングステップで）、それらはアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。スペーサーは、スペーサーの切断（および場合によっては、片方または両方の鎖の３’末端もしくは５’末端から１、２、３、４個もしくはそれより多くのヌクレオチドの付加または除去をもたらし得る後のプロセシングステップ）前に、アンチセンス配列とセンス配列をアニーリングさせ二本鎖構造（またはステム）を形成することができるほど十分な長さであってよい。典型的にはスペーサー配列は、２個の相補的ヌクレオチド配列領域間に位置し、二本鎖ポリヌクレオチドへのアニーリング時に低分子ヘアピンＲＮＡを含む無関連ヌクレオチド配列である。一般にスペーサー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む。
【００７５】
対象の任意のＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘアピン二重鎖を生成するのに適した配列組成、ループサイズ、およびステム長を選択することにより生成することができる。ヘアピン二重鎖のステム長を設計するのに適した範囲は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド、約１４〜３０ヌクレオチド、約３０〜５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド、約１００〜１５０ヌクレオチド、約１５０〜２００ヌクレオチド、約２００〜３００ヌクレオチド、約３００〜４００ヌクレオチド、約４００〜５００ヌクレオチド、約５００〜６００ヌクレオチド、および約６００〜７００ヌクレオチドなどのステム長を含む。ヘアピン二重鎖のループ長を設計するのに適した範囲は、約４〜２５ヌクレオチド、約２５〜５０ヌクレオチド、またはヘアピン二重鎖のステム長が十分である場合それより長いループ長を含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子は約１５ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長の間である。別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、約１５ヌクレオチド長と約３５ヌクレオチド長の間の二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、約１７ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長の間の二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド長と約２５ヌクレオチド長の間の二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、約２１ヌクレオチド長と約２３ヌクレオチド長の間の二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。特定の実施形態では、２１ヌクレオチドより長い二重鎖領域を有するヘアピン構造は、ループの配列および長さと無関係に、有効な低分子干渉ＲＮＡ誘導サイレンシングを促進することができる。
【００７６】
典型的には標的ｍＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長の間である。したがって標的ｍＲＮＡは、１つ以上の標的配列に関する以下の基準、約２：１と約１：２の間のＡ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比、標的配列の５’末端のＡＡジヌクレオチドもしくはＣＡジヌクレオチド、標的ｍＲＮＡに特有の少なくとも１０連続ヌクレオチドの配列（すなわち、同一植物由来の他のｍＲＮＡ配列中にその配列は存在しない）、および３個を超える連続グアニン（Ｇ）ヌクレオチドもしくは３個を超える連続シトシン（Ｃ）ヌクレオチドの「ラン」の不在に好ましく適合する、約１４ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長の間の領域に関して調べることができる。これらの基準は当技術分野で知られる様々な技法を使用して評価することができ、例えばＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用して、公的に利用可能なデータベースを検索し、選択した標的配列が標的ｍＲＮＡに特有であるかどうか決定することができる。あるいは、市販のコンピュータソフトウェア（例えば、市販されているＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒおよび低分子干渉ＲＮＡ設計ツール）を使用して、標的配列を選択することができる（および低分子干渉ＲＮＡ配列を設計することができる）。
【００７７】
一実施形態では、約１４ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長の間であり、１つ以上の前述の基準に見合う標的ｍＲＮＡ配列を選択する。別の実施形態では、約１６ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長の間であり、１つ以上の前述の基準に見合う標的配列を選択する。さらなる実施形態では、約１９ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長の間であり、１つ以上の前述の基準に見合う標的配列を選択する。別の実施形態では、約１９ヌクレオチド長と約２５ヌクレオチド長の間であり、１つ以上の前述の基準に見合う標的配列を選択する。
例示的な実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列の、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれより多くの隣接ヌクレオチドと相補的な特異的アンチセンス配列を含む。
【００７８】
低分子干渉ＲＮＡ分子によって含まれる特異的アンチセンス配列は、標的配列の相補配列と同一、または実質的に同一であってよい。一実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子によって含まれる特異的アンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡ配列の相補配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。配列同一性を決定するための方法は当技術分野で知られており、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウエアのＢＬＡＳＴＮプログラムを使用することにより決定することができ、またはＮＣＢＩウエブサイトで提供され得る。
【００７９】
低分子干渉ＲＮＡ分子の特異的アンチセンス配列は、（例えば、転位または転換を含めたヌクレオチド置換による）標的ｍＲＮＡの配列との１、２、３、４個またはそれより多くのヌクレオチドでの変異により変動性を示す可能性がある。このようなヌクレオチド置換が二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖中に存在するとき、典型的に置換ヌクレオチドと水素結合塩基対を形成するセンス鎖中の相補的ヌクレオチドは、相応じて置換することができる、または置換することができない。１つ以上のヌクレオチド置換がアンチセンス鎖中ではなく、センス配列中に存在する二本鎖ＲＮＡ分子も企図する。前に記載したように、低分子干渉ＲＮＡ分子のアンチセンス配列が、低分子干渉ＲＮＡのヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列の間に１つ以上のミスマッチを含むとき、ミスマッチはアンチセンス配列の３’末端、５’末端、または中心部分で見ることができる。別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ分子は、ストリンジェントな条件下で天然標的遺伝子もしくは標的ｍＲＮＡの一部と選択的にハイブリダイズすることができる、特異的アンチセンス配列を含む。当業者に知られるように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変更は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップに使用する時間、溶液の温度または濃度を変えることにより実施することができる。適切な条件は、使用する個々のヌクレオチド配列、例えば標的ｍＲＮＡまたは遺伝子の配列にも一部依存し得る。
【００８０】
植物において二本鎖ＲＮＡサイレンシングを誘導するための一つの方法は、ヘアピンＲＮＡを生成する遺伝子構築物を用いた形質転換である（Smith et al.(2000)Nature, 407, 319-320参照）。このような構築物は、適切なスペーサーにより隔てられた標的遺伝子配列の逆領域を含む。スペーサー断片としての機能性植物イントロン領域の挿入は、イントロンスプライシングヘアピンＲＮＡの作製によって、遺伝子サイレンシング誘導の有効性をさらに増大する（Wesley et al.(2001)Plant J., 27, 581-590）。ステム長は、約５０ヌクレオチド長〜約１キロベース長であることが適切である。イントロンスプライシングヘアピンＲＮＡを生成するための方法は、当技術分野で十分記載されている（例えば、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008)72, 2, 615-617参照）。
【００８１】
二重鎖または二本鎖構造、例えば二本鎖ＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡを有する干渉ＲＮＡ分子は、平滑末端を有する可能性があり、または３’もしくは５’オーバーハングを有する可能性がある。本明細書で使用する「オーバーハング」は、一本のＲＮＡ鎖の３’末端が他の鎖の５’末端を越えて延長する、（３’オーバーハング）、またはその逆（５’オーバーハング）のとき、二重鎖構造から突出した非対合ヌクレオチドまたはヌクレオチドを指す。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾型であってよい。一実施形態では、干渉ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖が、約１ヌクレオチド長〜約６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する。他の実施形態では、３’オーバーハングは約１ヌクレオチド長〜約５ヌクレオチド長、約１ヌクレオチド長〜約３ヌクレオチド長、および約２ヌクレオチド長〜約４ヌクレオチド長である。
【００８２】
干渉ＲＮＡ分子が分子の一末端に３’オーバーハングを含むとき、他の末端は平滑末端であってよく、またはさらにオーバーハング（５’もしくは３’）を有してよい。干渉ＲＮＡ分子が分子の両末端にオーバーハングを含むとき、オーバーハングの長さは同じであるかまたは異なってよい。一実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両末端に約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。さらなる実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両末端に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡである。さらに別の実施形態では、干渉ＲＮＡのオーバーハングを含むヌクレオチドは、ＴＴジヌクレオチドまたはＵＵジヌクレオチドである。
標的ｍＲＮＡ配列と、１つ以上のオーバーハングを含む干渉ＲＮＡ分子の同一率を決定するとき、オーバーハング（複数可）を考慮することができる、またはできない。例えば、３’オーバーハング由来のヌクレオチドおよび二本鎖の５’または３’末端由来の最大２ヌクレオチドを、低分子干渉ＲＮＡ分子の実質的な活性消失なしで修飾することができる。
干渉ＲＮＡ分子は、１つ以上の５’または３’キャップ構造を含むことができる。干渉ＲＮＡ分子は、干渉ＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端に、または干渉ＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の５’末端にキャップ構造を含むことができる。あるいは干渉ＲＮＡ分子は、干渉ＲＮＡ分子の３’末端と５’末端の両方にキャップ構造を含むことができる。用語「キャップ構造」は、エクソヌクレアーゼ分解から分子を保護し、細胞内での送達または局在化も容易にすることができる、オリゴヌクレオチドの一末端に組み込まれた化学的修飾を指す。
【００８３】
干渉ＲＮＡ分子に適用可能な別の修飾は、干渉ＲＮＡ分子の活性、細胞分布、細胞内取り込み、バイオアベイラビリティもしくは安定性を高める１つ以上の成分またはコンジュゲートの干渉ＲＮＡ分子との化学結合である。ポリヌクレオチドは、当技術分野で十分確立された方法によって、合成または修飾することができる。化学修飾は、２’修飾、非天然型塩基の導入、リガンドとの共有結合、およびチオホスフェート結合とホスフェート結合の置換だけには限られないが、これらを含むことができる。この実施形態では、二重鎖構造の完全性を少なくとも１個、および典型的には２個の化学結合によって強化する。化学結合は、様々なよく知られている技法のいずれかによって、例えば共有、イオンもしくは水素結合の導入によって、疎水性相互作用、ファンデルワールスもしくはスタッキング相互作用によって、金属イオン配位結合によって、またはプリンアナログの使用によって行うことができる。
【００８４】
２本の一本鎖の一方または両方におけるヌクレオチドを修飾して、例えば非制限的に特定ヌクレアーゼなどの、細胞酵素の活性化を調節することができる。２’−アミノ修飾、２’−フルオロ修飾、２’−アルキル修飾、非帯電骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、およびホスホラミデート修飾だけには限られないが、これらを含めた、細胞酵素の活性化を低減または阻害するための技法は、当技術分野で知られている。したがって、二本鎖ＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１個の２’−ヒドロキシル基は化学基によって置換される。さらに、少なくとも１個のヌクレオチドを修飾して、ロック型ヌクレオチドを形成することができる。このようなロック型ヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素を結び付ける、メチレンまたはエチレン架橋を含有する。オリゴヌクレオチドにロック型ヌクレオチドを導入することによって、相補的配列に対するアフィニティーを改善し、溶解温度が数℃増大する。
【００８５】
リガンドを例えば干渉ＲＮＡ分子と結合させて、その細胞内吸収を高めることが可能である。特定の実施形態では、疎水性リガンドを分子と結合させて、細胞膜の直接的浸透を容易にする。これらの手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内浸透を容易にするために使用されている。いくつかの場合、カチオン性リガンドとオリゴヌクレオチドの結合は、ヌクレアーゼに対する耐性の改善をしばしばもたらす。カチオン性リガンドの代表例には、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムがある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドがオリゴヌクレオチド中に分散するとき、ｍＲＮＡに対するそれらの高い結合アフィニティーを保持することができる。
【００８６】
本明細書に記載される分子およびポリヌクレオチドは、よく知られている固相合成の技法を使用して調製することができる。当技術分野で知られる任意の他のこのような合成手段を、追加的または代替的に利用することができる。
様々な実施形態が、１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または１つ以上のポリヌクレオチドを含む干渉ＲＮＡ構築物を対象とする。
様々な実施形態が、１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または１つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を対象とする。
【００８７】
様々な実施形態が、１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または自己アニーリングしてヘアピン構造を形成することができる１つ以上の干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする１つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を対象とし、その中で構築物は、（ａ）１つ以上の本明細書に記載されるポリヌクレオチド、（ｂ）ヘアピン構造のループを形成するスペーサーエレメントをコードする第二配列、および（ｃ）第一配列と同じ方向に位置する、第一配列の逆相補配列を含む第三配列を含み、第二配列は第一配列と第三配列の間に位置し、かつ第二配列は第一配列と第三配列に作動可能に連結する。
【００８８】
ヘアピン構造を形成しない様々なＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを構築するため、開示する配列を利用することができる。例えば二本鎖ＲＮＡは、（１）第一プロモーターとの作動可能な連結によるＤＮＡの第一鎖の転写、および（２）第二プロモーターとの作動可能な連結によるＤＮＡ断片の第一鎖の逆相補配列の転写によって形成することができる。ポリヌクレオチドの各々の鎖は、同じ発現ベクターから、または異なる発現ベクターから転写することができる。ＲＮＡ干渉活性を有するＲＮＡ二重鎖を、酵素により低分子干渉ＲＮＡに転換してＲＮＡレベルを調節することができる。
したがって様々な実施形態が、１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または自己アニーリングすることができる干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする干渉ＲＮＡ構築物を対象とし、その中で構築物は、（ａ）１つ以上の本明細書に記載されるポリヌクレオチド、および（ｂ）第一配列と同じ方向に位置する、第一配列の相補（例えば逆相補）配列を含む第二配列を含む。
【００８９】
遺伝子発現の同時抑制を促進することによって、１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）の内在性発現レベルを調節するための、様々な組成物および方法を提供する。同時抑制の現象は、植物細胞宿主への多数の導入遺伝子コピーの導入の結果として起こる。多数の導入遺伝子コピーの組み込みは、導入遺伝子および標的内在性遺伝子の発現の調節をもたらすことができる。同時抑制の程度は、導入遺伝子と標的内在性遺伝子の間の、配列同一性の程度に依存する。内在性遺伝子と導入遺伝子の両方のサイレンシングは、転写を妨害し得るサイレンシング遺伝子座（すなわち、対象の内在性プロモーターおよび内在性遺伝子）の広範囲のメチル化によって起こり得る。あるいはいくつかの場合、内在性遺伝子と導入遺伝子の同時抑制は、転写産物が生成され得るが高い分解率が転写産物の蓄積を妨げる、転写後遺伝子サイレンシングによって起こり得る。転写後遺伝子サイレンシングによる同時抑制に関するメカニズムは、ＲＮＡがこれらのプロセスにおける主要イニシエーターと標的の両方であると思われる点でＲＮＡ干渉と類似し、おそらくｍＲＮＡのＲＮＡ誘導型分解による同じ分子機構によって、少なくとも部分的に仲介することができると考えられる。
【００９０】
核酸の同時抑制は、導入遺伝子としての、多数の核酸もしくはその断片のコピーの、対象植物のゲノムへの組み込みにより実施することができる。核酸もしくはその断片に作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを用いて、宿主植物を形質転換することができる。様々な実施形態が、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含み内在性遺伝子の同時抑制を促進するための発現ベクターを対象とする。
様々な実施形態が、多数のポリヌクレオチド（複数可）コピーの（タバコ）植物ゲノムへの組み込みによりＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（複数可）（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）の発現レベルを調節するための方法であって、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターで植物細胞宿主を形質転換することを含む方法を対象とする。
【００９１】
ｍＲＮＡの翻訳を調節することにより内在性遺伝子発現レベルを調節するための、様々な組成物および方法を提供する。宿主（タバコ）植物細胞は、ｍＲＮＡの一部と相補的な配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドの発現を可能にするプロモーターに対してアンチセンス方向に位置する、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターで形質転換することができる。
ｍＲＮＡの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、配列がプロモーターに対してアンチセンス方向に位置する、ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含むことができる。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの長さは変わる可能性があり、約１５〜２０ヌクレオチド、約２０〜３０ヌクレオチド、約３０〜５０ヌクレオチド、約５０〜７５ヌクレオチド、約７５〜１００ヌクレオチド、約１００〜１５０ヌクレオチド、約１５０〜２００ヌクレオチド、および約２００〜３００ヌクレオチドであってよい。
【００９２】
突然変異ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得るための方法も提供する。植物細胞または植物材料を含めた対象の任意の植物を、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、化学的誘導性突然変異誘発、照射誘導性突然変異誘発、修飾塩基を利用する突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用する突然変異誘発、二本鎖破壊突然変異誘発、修復欠陥宿主系統を利用する突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングおよび他の同等の方法を含めた、突然変異誘発を誘導することが知られる様々な方法によって、遺伝子修飾することができる。
【００９３】
あるいは、対象植物のゲノムにトランスポゾン（例えば、ＩＳエレメント）を導入することにより、不活性化に関して遺伝子を標的化することができる。これらの可動性遺伝子エレメントは有性生殖交配−受精によって導入することができ、挿入突然変異体はタンパク質活性の消失に関してスクリーニングすることができる。親植物において破壊された遺伝子は、例えば有性生殖交配−受精によって、トランスポゾン誘導性突然変異誘発を受けていない植物と親植物を交配することにより、他の植物に導入することができる。当業者に知られる、任意の標準的な品種改良技法を利用することができる。一実施形態では、１つ以上の遺伝子を、１つ以上のトランスポゾンの挿入によって不活性化することができる。突然変異は、１つ以上の遺伝子の同系破壊、１つ以上の遺伝子の異系破壊、または２つ以上の遺伝子が破壊される場合は同系破壊と異系破壊の両方の組合せをもたらす可能性がある。適切なトランスポゾンエレメントには、レトロトランスポゾン、レトロポゾン、およびＳＩＮＥ様エレメントがある。このような方法は当業者には知られている。
【００９４】
あるいは、植物内で自己切断および複製可能ないくつかの低分子環状ＲＮＡ由来のリボザイムを導入することにより、不活性化に関して遺伝子を標的化することができる。これらのＲＮＡは単独（ウイロイドＲＮＡ）で、またはヘルパーウイルスと共に複製することができる（サテライトＲＮＡ）。適切なＲＮＡの例には、タバコリングスポットウイルス由来のアボカドサンブロッチウイロイドおよびサテライトＲＮＡ、ルセルントランジェントストリークウイルス（ｌｕｃｅｒｎｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）、ビロードタバコモットルウイルス（ｖｅｌｖｅｔ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ナス属ノジフロラムモットルウイルス（ｎｏｄｉｆｌｏｒｕｍ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、および地中クローバーモットルウイルス（ｃｌｏｖｅｒ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）由来のＲＮＡがある。様々な標的ＲＮＡ特異的リボザイムが当業者に知られている。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドの発現を、遺伝子での突然変異の作製などの、非トランスジェニック手段によって調節する。遺伝子配列中にランダムに突然変異を導入する方法は、化学的突然変異誘発、ＥＭＳ突然変異誘発および放射線突然変異誘発を含むことができる。細胞中に１つ以上の標的突然変異を導入する方法は、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、タイリング（ｔｉｌｌｉｎｇ）（ゲノムにおいて誘導される局部損傷の標的化）、相同的組換え、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発を含むが、これらだけには限られない。
【００９６】
突然変異のいくつかの非制限的な例は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、挿入およびミスセンス突然変異、単一ヌクレオチド多型および単純配列反復である。突然変異後、スクリーニングを実施して、時期尚早停止コドンまたは他の場合非機能性遺伝子をもたらす突然変異を同定することができる。突然変異後、スクリーニングを実施して、高レベルで発現され得る機能性遺伝子をもたらす突然変異を同定することができる。突然変異体のスクリーニングは配列決定により、または遺伝子またはタンパク質に特異的な１つ以上のプローブまたはプライマーの使用により実施することができる。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはタンパク質の安定性の調節をもたらす可能性がある、ポリヌクレオチドにおける特異的突然変異を作製することもできる。このような植物は、本明細書では「非天然型」または「突然変異」植物と呼ぶ。典型的には、突然変異または非天然型植物は、遺伝子操作する前にその植物中に存在しなかった、外来または合成または人造核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部を含む。外来核酸は、単一ヌクレオチド、２つ以上のヌクレオチド、２つ以上の隣接ヌクレオチドまたは２つ以上の非隣接ヌクレオチド、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００個もしくはそれより多くの隣接または非隣接ヌクレオチドなどであってよい。
【００９７】
突然変異または非天然型植物は、調節されたタンパク質レベルをもたらす、１つ以上の突然変異の任意の組合せを有し得る。例えば、突然変異または非天然型植物は、単一遺伝子中に単一突然変異、単一遺伝子中に多数の突然変異、２つ以上もしくは３つ以上の遺伝子中に単一突然変異、または２つ以上もしくは３つ以上の遺伝子中に多数の突然変異を有し得る。さらなる例として、突然変異または非天然型植物は、遺伝子（複数可）の特異的部分、タンパク質もしくはその一部の活性部位をコードする遺伝子の領域などに、１つ以上の突然変異を有し得る。さらなる例として、突然変異または非天然型植物は、１つ以上の遺伝子（複数可）の外側領域、それらが遺伝子（複数可）の活性もしくは発現を調節する条件で、制御する遺伝子の上流領域もしくは下流領域などに、１つ以上の突然変異を有し得る。上流エレメントは、プロモーター、エンハンサーまたは転写因子を含むことができる。エンハンサーなどのいくつかのエレメントは、それが制御する遺伝子の上流または下流に位置する可能性がある。エレメント（複数可）は、それが制御する遺伝子の近くに位置する必要はない。いくつかのエレメントは、それが制御する遺伝子の数百数千塩基対上流または下流に位置することが分かっているからである。突然変異または非天然型植物は、遺伝子（複数可）の最初の１００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の２００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の３００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の４００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の５００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の６００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の７００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の８００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の９００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の１０００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の１１００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の１２００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の１３００ヌクレオチド以内、遺伝子（複数可）の最初の１４００ヌクレオチド以内、または遺伝子（複数可）の最初の１５００ヌクレオチド以内に位置する、１つ以上の突然変異を有し得る。突然変異または非天然型植物は、遺伝子（複数可）の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４または第１５組の１００ヌクレオチド以内に位置する１つ以上の突然変異、またはこれらの組合せを有し得る。突然変異ポリペプチド変異体を含む、突然変異または非天然型植物（例えば、本明細書に記載される突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物など）を開示する。
【００９８】
一実施形態では、植物由来の種子を突然変異誘発して、次いで第一世代突然変異植物に成長させる。次いで第一世代植物は自家受粉させ、第一世代植物由来の種子は第二世代植物に成長させ、次いでそれらの遺伝子座の突然変異に関してスクリーニングする。突然変異誘発植物材料を突然変異に関してスクリーニングすることはできるが、第二世代植物をスクリーニングする利点は、全ての体細胞突然変異が生殖細胞系列突然変異に相当することである。当業者は、種子、花粉、植物組織または植物細胞だけには限られないが、これらを含めた様々な植物材料を突然変異誘発して、突然変異植物を創成することができることを理解するであろう。しかしながら、突然変異に関して植物核酸をスクリーニングするとき、突然変異誘発される植物材料の型が影響する可能性がある。例えば、非突然変異誘発植物の受粉前に花粉に突然変異誘発を施すとき、その受粉から生じる種子は第一世代植物に成長する。第一世代植物の各々の細胞は花粉で生じた突然変異を含有し、したがってこれらの第一世代植物は、第二世代まで待つ代わりに、突然変異に関して次いでスクリーニングすることができる。
【００９９】
化学的突然変異原または放射線を含めた、点突然変異、および短鎖欠失、挿入、転換、およびまたは転位を主にもたらす突然変異原を使用して、突然変異をもたらすことができる。突然変異原には、エチルメタンスルホネート、メチルメタンスルホネート、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ジエチルサルフェート、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソサミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ザ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタンなど）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジンジヒドロクロリドおよびホルムアルデヒドがあるが、これらだけには限られない。
【０１００】
突然変異原により直接引き起こされていない遺伝子座における自発的突然変異も、それらが所望の表現型をもたらすという条件で企図する。適切な突然変異作用物質は、例えばＸ線、ガンマ線、高速中性子照射およびＵＶ線などの電離放射線も含むことができる。当業者に知られる植物核酸調製の任意の方法を使用して、突然変異スクリーニング用の植物核酸を調製することができる。
個々の植物、植物細胞、または植物材料から調製した核酸を場合によってはプールして、突然変異誘発植物組織、細胞または材料由来の植物集団における突然変異のスクリーニングを促進することができる。１つ以上の次世代の植物、植物細胞または植物材料をスクリーニングすることができる。場合によってはプールする群のサイズは、使用するスクリーニング法の感度に依存する。
【０１０１】
核酸試料を場合によってはプールした後、ポリメラーゼ連鎖反応などのポリヌクレオチド特異的増幅技法に、それらを施すことができる。遺伝子または遺伝子の直ぐ隣の配列に特異的な任意の１つ以上のプライマーまたはプローブを利用して、場合によってはプールした核酸試料内の配列を増幅することができる。例示的なプライマーは、配列番号３〜５、１０〜１２および１４〜１６で示される。１つ以上のプライマーまたはプローブは遺伝子座の領域を増幅するように設計することが好ましく、この場合有用な突然変異が大抵生じ得る。プライマーは、ポリヌクレオチド領域内の突然変異を検出するように設計することが最も好ましい。さらに、プライマー（複数可）およびプローブ（複数可）は既知の多型部位を回避して、点突然変異のスクリーニングを容易にすることが好ましい。増幅産物の検出を容易にするため、任意の従来型標識法を使用して、１つ以上のプライマーまたはプローブを標識することができる。当技術分野で十分理解されている方法を使用し、本明細書に記載される配列に基づいて、プライマー（複数可）またはプローブ（複数可）を設計することができる。
【０１０２】
増幅産物の検出を容易にするため、任意の従来型標識法を使用して、プライマー（複数可）またはプローブ（複数可）を標識することができる。当技術分野で十分理解されている方法を使用し、本明細書に記載される配列に基づいて、これらを設計することができる。
多型は当技術分野で知られている手段によって同定することができ、いくつかは文献中に記載されている。
【０１０３】
さらなる態様では、突然変異植物を調製する方法を提供する。この方法は、機能性ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）をコードする遺伝子を含む植物の少なくとも一細胞を提供することを含む。次に、植物の少なくとも一細胞を、ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの活性を調節するのに有効な条件下で処理する。少なくとも１個の突然変異植物細胞を次いで突然変異植物に増殖させ、この場合突然変異植物は、対照植物のそれと比較して、調節されたレベルのＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）を有する。突然変異植物を作製するこの方法の一実施形態では、処理ステップは、少なくとも１個の突然変異植物細胞を生成するのに有効な条件下で、前に記載した化学的突然変異誘発剤に少なくとも１個の細胞を曝すことを含む。この方法の別の実施形態では、処理ステップは、少なくとも１個の突然変異植物細胞を生成するのに有効な条件下で、放射源に少なくとも１個の細胞を曝すことを含む。用語「突然変異植物」は、遺伝子操作または遺伝子修飾以外の手段により適切に、対照植物と比較して遺伝子型が修飾された突然変異植物を含む。
【０１０４】
特定の実施形態では、突然変異植物、突然変異植物細胞または突然変異植物材料は、別の植物、植物細胞または植物材料で本来生じた１つ以上の突然変異を含む可能性があり、望ましい形質を与える可能性がある。この突然変異を、別の植物、植物細胞または植物材料（例えば、突然変異を誘導した植物と異なる遺伝的背景を有する植物、植物細胞または植物材料）に組み込んで（例えば、遺伝子移入して）、それに形質を与えることができる。したがって例えば、第一植物で本来生じた突然変異を、第一植物と異なる遺伝的背景を有する第二植物などの、第二植物に導入することができる。したがって当業者は、望ましい形質を与える本明細書に記載の遺伝子の１つ以上の突然変異対立遺伝子をそのゲノム中に本来有する植物を、検索し同定することができる。本来生じる突然変異対立遺伝子（複数可）は、品種改良、戻し交配および遺伝子移入を含めた様々な方法により第二植物に移して、本明細書に記載される遺伝子の１つ以上の突然変異を有する株、品種またはハイブリッドを生成することができる。望ましい形質を示す植物は、突然変異植物のプールからスクリーニングすることができる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列の知識を利用して、選択を実施することが適切である。したがって、対照と比較して遺伝的形質をスクリーニングすることができる。このようなスクリーニング手法は、本明細書で論じる従来型核酸増幅および／またはハイブリダイゼーション技法の施用を含み得る。したがって、本発明のさらなる態様は、突然変異植物を同定するための方法であって、（ａ）植物由来のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドを含む試料を提供するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドの核酸配列を決定するステップとを含み、対照植物のポリヌクレオチド配列と比較したＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの配列の違いが、前記植物がＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２突然変異植物であることを示す方法に関する。別の態様では、対照植物と比較して高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積する突然変異植物を同定するための方法であって、（ａ）スクリーニングする植物由来の試料を提供するステップと、（ｂ）前記試料がＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上の突然変異を含むかどうか決定するステップと、（ｃ）前記植物の（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノン含量を決定するステップとを含み、前記試料が、対照植物と比較してコードタンパク質の発現または活性が調節されるＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上の突然変異を含む場合、タバコ植物の一部に、ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２の発現または活性が調節されていない対照タバコ植物と比較して、少なくとも５％の（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかの増大があれば、高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積する突然変異植物を示す方法を提供する。別の態様では、対照植物と比較して高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積する突然変異植物を調製するための方法であって、（ａ）第一植物由来の試料を提供するステップと、（ｂ）前記試料が、高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積をもたらすＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上の突然変異を含むかどうか決定するステップと、（ｃ）第二植物に１つ以上の突然変異を移行するステップとを含む方法を提供する。突然変異（複数可）は、例えば遺伝子処理、遺伝子操作、遺伝子移入、植物品種改良、戻し交配などによる、当技術分野で知られる様々な方法を使用して、第二植物に移行することができる。一実施形態では、第一植物は天然に存在する植物である。一実施形態では、第二植物は第一植物と異なる遺伝的背景を有する。別の態様では、対照植物と比較して高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積する突然変異植物を調製するための方法であって、（ａ）第一植物由来の試料を提供するステップと、（ｂ）前記試料が、高レベルの（ｉ）カロテノイドもしくはβ−ダマセノン、または（ｉｉ）カロテノイドおよびβ−ダマセノンのいずれかを蓄積をもたらすＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上の突然変異を含むかどうか決定するステップと、（ｃ）第一植物から第二植物に１つ以上の突然変異を遺伝子移入するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、遺伝子移入のステップは、戻し交配などを場合によっては含めた植物品種改良を含む。一実施形態では、第一植物は天然に存在する植物である。一実施形態では、第二植物は第一植物と異なる遺伝的背景を有する。一実施形態では、第一植物は栽培品種または優良栽培品種ではない。一実施形態では、第二植物は栽培品種または優良栽培品種である。さらなる態様は、本明細書に記載される方法によって入手されまたは入手可能である、（栽培品種または優良栽培品種突然変異植物を含めた）突然変異植物に関する。特定の実施形態では、「突然変異植物」は、ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（複数可）の配列内などの、植物の特異的領域にのみ局在する１つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同じであるか実質的に同じである。
【０１０５】
特定の実施形態では、突然変異植物は、ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの配列内などの植物の１つ以上の領域、およびゲノムの１つ以上のさらなる領域に局在する１つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同じでないか実質的に同じでない。特定の実施形態では、突然変異植物はＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のエクソン中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のイントロン中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドのプロモーター中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの３’非翻訳領域中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの５’非翻訳領域中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドのコード領域中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、またはＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの非コード領域中に１つ以上の突然変異を有していない可能性があり、その一部の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、もしくは６つ以上の任意の組合せである可能性がある。
【０１０６】
さらなる態様では、ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２をコードする遺伝子の突然変異を含む植物、植物細胞または植物材料を同定する方法であって、（ａ）植物、植物細胞または植物材料に突然変異誘発を施すステップと、（ｂ）前記植物、またはその植物細胞または植物材料または子孫から核酸試料を得るステップと、（ｃ）ＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２をコードする遺伝子またはその変異体もしくは断片の核酸配列を決定するステップを含み、前記配列の違いがその１つ以上の突然変異を示す方法を提供する。
【０１０７】
ジンクフィンガータンパク質を使用して、本明細書に記載される１つ以上のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの発現または活性を調節することができる。様々な実施形態で、ポリヌクレオチドのコード配列の一部または全部を含むゲノムＤＮＡ配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によって修飾する。ゲノムＤＮＡ配列は、ジンクフィンガータンパク質結合に特有な１部位に関して検索する。あるいは、ゲノムＤＮＡ配列は、ジンクフィンガータンパク質結合に特有な２部位に関して検索し、この場合２部位は対抗鎖上で一緒に密集して、例えば１、２、３、４、５、６個またはそれより多くの塩基対離れて存在する。したがって、ポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０１０８】
ジンクフィンガータンパク質を工学的に作製して、遺伝子中の選択標的部位を認識することができる。ジンクフィンガータンパク質は、ファージディスプレイ選択、細菌ツーハイブリッド選択または細菌ワンハイブリッド選択などだけには限られないが、これらを含めた選択法と結び付けた、切断または延長、または部位特異的突然変異誘発のプロセスにより、天然ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと非天然ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン由来の、モチーフの任意の組合せを含み得る。用語「非天然ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」は、標的核酸内の３塩基対配列と結合し修飾される核酸を含む細胞もしくは生物において存在しない、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを指す。標的遺伝子に特有な特異的ヌクレオチド配列と結合する、ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は、当技術分野で知られている。
【０１０９】
ポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドと、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼだけには限られないがこれらなどの非特異的エンドヌクレアーゼをコードする第二ポリヌクレオチドの融合体を作製することによって、ジンクフィンガーヌクレアーゼを構築することができる。ジンクフィンガータンパク質とヌクレアーゼの間の融合タンパク質は２塩基対からなるスペーサーを含む可能性があり、または代替的に、スペーサーは３、４、５、６、７個またはそれより多くの塩基対からなり得る。様々な実施形態で、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡ配列の制御領域、コード領域、または非コード領域において二本鎖切断を誘導し、ポリヌクレオチドの発現のレベルの低下、またはそれによってコードされるタンパク質の活性の低下をもたらす。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、非相同的末端接合によるＤＮＡ修復後、切断部位でＤＮＡの欠失をもたらすことが多い。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドの制御配列と結合する、ジンクフィンガータンパク質を選択することができる。より詳細には制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン−イントロンの境界、ターミネーター、または停止コドンを含むことができる。したがって本発明は、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドの近辺またはその中でジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発により生成される、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物もしくは植物細胞、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によりこのような植物もしくは植物細胞を作製する方法を提供する。タバコ植物にジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼを送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達に関して以下に記載する方法と類似している。
【０１１０】
別の態様では、Ｉ−ＣｒｅＩなどのメガヌクレアーゼを使用して、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物、または他の場合遺伝子修飾植物を生成するための方法を記載する。天然メガヌクレアーゼおよび組換えメガヌクレアーゼを使用して、植物のゲノムＤＮＡ中の一部位もしくは比較的少数の部位で二本鎖切断を特異的に引き起こし、本明細書に記載される１つ以上のポリヌクレオチドの破壊を可能にすることができる。メガヌクレアーゼは、ＤＮＡ認識性が改変された工学的作製メガヌクレアーゼであってよい。メガヌクレアーゼタンパク質は、当技術分野で知られる様々な異なるメカニズムによって、植物細胞に送達することができる。
【０１１１】
本発明は、植物細胞または植物中のＮｔＡＢＡ４もしくはＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（複数可）（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）を不活性化するための、メガヌクレアーゼの使用を包含する。特に本発明は、メガヌクレアーゼを使用して植物中のポリヌクレオチドを不活性化するための方法であって、ａ）本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供するステップと、（ｂ）前記植物細胞にメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を導入するステップと、（ｃ）メガヌクレアーゼにポリヌクレオチド（複数可）を実質的に不活性化させるステップを含む方法を提供する。メガヌクレアーゼを使用して、ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断することができる。このような切断は、非相同的末端接合による突然変異ＤＮＡ修復後、メガヌクレアーゼ認識部位でＤＮＡの欠失をもたらすことが多い。遺伝子コード配列中のこのような突然変異は、典型的には遺伝子を不活性化するのに十分である。植物細胞を修飾するためのこの方法は、適切な形質転換法を使用した、植物細胞へのメガヌクレアーゼ発現カセットの送達を最初に含む。最高有効性のため、メガヌクレアーゼ発現カセットと選択マーカーを関連付け、選択物質の存在下で首尾よく形質転換された細胞を選択することが望ましい。この手法は、ゲノムへのメガヌクレアーゼ発現カセットの組み込みをもたらすが、しかしながら植物が制御承認を必要とする可能性が高い場合、これは望ましくない可能性がある。このような場合、メガヌクレアーゼ発現カセット（および関連選択マーカー遺伝子）は、従来型品種改良技法を使用して、次世代植物で分離除去することができる。あるいは植物細胞は、選択マーカーを欠くメガヌクレアーゼ発現カセットを用いて初期に形質転換することができ、選択物質を欠く培地において増殖することができる。このような条件下では、処理細胞の分画はメガヌクレアーゼ発現カセットを得て、ゲノムにメガヌクレアーゼ発現カセットを組み込まずに、工学的作製メガヌクレアーゼを一過的に発現する。それは形質転換効率を考慮していないので、この後者の形質転換手順は、より多数の処理細胞をスクリーニングして望ましいゲノム修飾を得ることを必要とする。ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するとき、前述の手法を適用して植物細胞を修飾することもできる。
【０１１２】
メガヌクレアーゼ発現カセットの送達後、使用した個々の形質転換手順に典型的な条件下で、植物細胞を最初に増殖させる。これは、しばしば暗所中で２６℃未満の温度において、培地上で形質転換細胞を増殖することを意味し得る。このような標準条件を一定時間、好ましくは１〜４日間使用して、形質転換プロセスから植物細胞を回収することができる。この初期回収期後の任意の時点で、増殖温度を上昇させて工学的作製メガヌクレアーゼの活性を刺激し、メガヌクレアーゼ認識部位を切断し突然変異させることが可能である。
【０１１３】
特定の適用に対しては、植物のゲノムから正確にポリヌクレオチドを除去することが望ましい場合がある。一対の工学的作製メガヌクレアーゼを使用してそのような適用が可能になり、各ヌクレアーゼは目的とする欠失のいずれかの側でメガヌクレアーゼ認識部位を切断する。遺伝子を認識して結合し、ゲノムに二本鎖切断を導入することができるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も使用できる。したがって、別の態様において、本明細書に記載の通りＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを使用して、突然変異、非天然型もしくはトランスジェニックまたは別の遺伝子組換え植物を作製する方法が意図される。
【０１１４】
遺伝的修飾における使用に適する植物には、それだけには限らないが、単子葉および双子葉植物ならびにキツネノマゴ科、ネギ科、ユリズイセン科、ヒガンバナ科、キョウチクトウ科、ヤシ科、キク科、メギ科、ベニノキ科、アブラナ科、パイナップル科、アサ科、ナデシコ科、イヌガヤ科、アカザ科、イヌサフラン科、ウリ科、ヤマノイモ科、マオウ科、コカノキ科、トウダイグサ科、マメ科、シソ科、アマ科、ヒカゲノカズラ科、アオイ科、メランチウム科、バショウ科、フトモモ科、ヌマミズキ科、ケシ科、マツ科、オオバコ科、イネ科、バラ科、アカネ科、ヤナギ科、ムクロジ科、ナス科、イチイ科、ツバキ科またはブドウ科のうちの１つに由来する種を含む植物細胞系がある。
【０１１５】
適切な種は、トロロアオイ属、モミ属、カエデ属、ヌカボ属、ネギ属、ユリズイセン属、アナナス属、アンドログラフィス属、ウシクサ属、ヨモギ属、ダンチク属、オオカミナスビ属、メギ属、フダンソウ属、ベニノキ属、アブラナ属、キンセンカ属、ツバキ属、カンレンボク属、アサ属、トウガラシ属、ベニバナ属、ニチニチソウ属、イヌガヤ属、キク属、キナ属、スイカ属、コーヒー属、イヌサフラン属、コリウス属、キュウリ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、チョウセンアサガオ属、ナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、アブラヤシ属、麻黄属、エリアンサス属、コカ属、ユーカリ属、ウシノケグサ属、オランダイチゴ属、ガランサス属、ダイズ属、ワタ属、ヒマワリ属、パラゴムノキ属、オオムギ属、ヒヨス属、ナンヨウアブラギリ属、アキノノゲシ属、アマ属、ドクムギ属、ルピナス属、トマト属、ヒカゲノカズラ属、イモノキ属、ウマゴヤシ属、ハッカ属、ススキ属、バショウ属、タバコ属、イネ属、キビ属、ケシ属、パルテニウム属、チカラシバ属、ペチュニア属、クサヨシ属、アワガエリ属、マツ属、イチゴツナギ属、トウダイグサ属、ヤマナラシ属、ラウオルフィア属、トウゴマ属、バラ属、サトウキビ属、ヤナギ属、サンギナリア属、ハシリドコロ属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、スパルティナ属、ホウレンソウ属、ヨモギギク属、イチイ属、カカオ属、ライコムギ属、コムギ属、ウニオラ属、シュロソウ属、ツルニチニチソウ属、ブドウ属およびトウモロコシ属のメンバーを含むことができる。
【０１１６】
適切な種には、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ（オオウシクサ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（エレファントグラス）、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ）、Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコードグラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライ麦）、Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ（小麦ｘライ麦）、竹、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ナンヨウアブラギリ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマシ油）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓｙｃｌｉｓｅ  ａｌｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅ  ｙｃｌｉｓｅｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（辛唐辛子および甘唐辛子）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（セイヨウカボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（ニホンカボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ハウチワマメ）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（アスペン）、Ｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．（松）、Ａｂｉｅｓ  ｓｐｐ．（モミ）、Ａｃｅｒ  ｓｐｐ．（カエデ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．（ライグラス）およびＰｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ（チモシー）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス））Ｓｏｒｇｈｕ  ｙｃｌｉｓｅもしくは（モロコシ、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐ．（エナジーケーン）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（カノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（小麦）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（米）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）を含んでもよい。
【０１１７】
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節するように修飾された突然変異タバコ植物、非天然型タバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物を対象とし、それにより対照植物と比較して、対象の植物組織内でポリペプチドの発現レベルが調節される植物、例えばタバコ植物を作製する。開示される組成物および方法は、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍを含めたニコチアナ属の任意の種（例えば、ＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、ＴＩ  １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ  １０００−１およびＰｅｔｉｃｏ）に適用できる。
【０１１８】
他の種には、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｔａ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｔａ  ｖａｒ．  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｔａ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ  ｙｃｌｉｓｅ  ｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘ  ｓａｎｄｅｒａｅがある。
【０１１９】
本明細書において、タバコ栽培品種および優良タバコ栽培品種の使用も意図される。したがって、トランスジェニック、非天然型または突然変異植物は、１つ以上の導入遺伝子もしくは１つ以上の遺伝的突然変異またはその組合せを含むタバコ品種もしくは優良タバコ栽培品種であってよい。遺伝子突然変異（例えば、１つ以上の多型）は、個々のタバコ品種もしくはタバコ栽培品種（例えば、優良タバコ栽培品種）において天然には存在しない突然変異であることができ、または個々のタバコ品種もしくはタバコ栽培品種（例えば、優良タバコ栽培品種）において天然に起こる遺伝子突然変異であることができる、ただし突然変異は天然に起こらない。
【０１２０】
特に有用なニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）品種には、バーレー型、ダーク型、黄色型、オリエンタル型タバコがある。品種または栽培品種の非限定的な例は、以下の通りである：ＢＤ  ６４、ＣＣ  １０１、ＣＣ  ２００、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３０１、ＣＣ  ４００、ＣＣ  ５００、ＣＣ  ６００、ＣＣ  ７００、ＣＣ  ８００、ＣＣ  ９００、Ｃｏｋｅｒ  １７６、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ  ４８、ＣＤ  ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ  ５３８  ＬＣ  Ｇａｌｐａｏ  ｔｏｂａｃｃｏ、ＧＬ  ２６Ｈ、ＧＬ  ３５０、ＧＬ  ６００、ＧＬ  ７３７、ＧＬ  ９３９、ＧＬ  ９７３、ＨＢ  ０４Ｐ、ＨＢ  ０４Ｐ  ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ４０３ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ４０４ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ  ５０１  ＬＣ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＤＨ  ９５９、ＫＴ  ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ  １０、ＫＹ  １４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  １７１、ＫＹ  ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８  ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ｍｓＫＹ  １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ  ＬＣ、ＮＢＨ  ９８、Ｎ−１２６、Ｎ−７７７ＬＣ、Ｎ−７３７１ＬＣ、ＮＣ  １００、ＮＣ  １０２、ＮＣ  ２０００、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ６、ＮＣ７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８１０、ＮＣ  ＢＨ  １２９、ＮＣ  ２００２、Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ  ２０７、ＰＤ  ７３０２  ＬＣ、ＰＤ  ７３０９  ＬＣ、ＰＤ  ７３１２  ＬＣ’  ’Ｐｅｒｉｑ’ｅ’  ｔｏｂａｃｃｏ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７−１１、Ｒ  ７−１２、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ  ４、ＲＧＨ  ５１、ＲＳ  １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ−６、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ＮＦ３、ＴＩ  １４０６、ＴＩ  １２６９、ＴＮ  ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ  ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ  ３７−１、Ｂ  １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、Ｓａｍｓｕｎ  Ｈｏｌｍｅｓ  ＮＮ、ＫＴＲＤＣ  ｎｕｍｂｅｒ  ２  Ｈｙｂｒｉｄ  ４９、Ｂｕｒｌｅｙ  ２１、ＫＹ  ８９５９、ＫＹ  ９、ＭＤ  ６０９、ＰＧ  ０１、ＰＧ  ０４、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ  １１、ＲＧ  ８、ＶＡ  ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ  Ａ１、Ｂａｓｍａ  Ｄｒａｍａ  Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ  Ｉ  Ｚｉｃｈｎａ  ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ  Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ  ３４７、Ｃｒｉｏ���ｌｏ  Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ８１、ＤＶＨ  ４０５、Ｇａｌｐａｏ  Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ  Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ  Ｅ１、ＬＡ  ＢＵ  ２１、ＮＣ  ２３２６、ＮＣ  ２９７、ＰＶＨ  ２１１０、Ｒｅｄ  Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ  ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ  ＨＣ−７２、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ  ＰＢ  １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ１２−２／１、Ｙａｋａ  ＪＫ−４８、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ  ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ  ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ  ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ。本明細書において具体的に同定されていなくとも、上記のものより低変換亜変種も意図される。
【０１２１】
実施形態は、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）またはＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）の発現もしくは活性を調節するように修飾された突然変異植物、非天然型植物、雑種植物、またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法も対象とする。有利には、得られる突然変異植物、非天然型植物、雑種植物またはトランスジェニック植物は、全体の外観において対照植物と類似しているまたは実質的に同じであり得る。様々な表現型の特徴、例えば成熟度、植物当たりの葉の枚数、茎高、葉挿入角、葉サイズ（幅および長さ）、節間距離、および葉身−中肋比は、圃場観測によって評価できる。
【０１２２】
一態様は、本明細書に記載される突然変異植物、非天然型植物、雑種植物またはトランスジェニック植物の種子に関する。好ましくは、種子は、タバコ種子である。さらなる態様は、本明細書に記載されている突然変異植物、非天然型植物、雑種植物またはトランスジェニック植物の花粉もしくは胚珠に関する。加えて、雄性不稔を付与する核酸をさらに含む本明細書に記載の突然変異植物、非天然型植物、雑種植物またはトランスジェニック植物が提供される。
【０１２３】
本明細書に記載の突然変異植物、非天然型植物、雑種植物もしくはトランスジェニック植物またはその一部の再生可能な細胞の組織培養物も提供され、その培養物は、親の形態的および生理的特徴の全てを発現できる植物を再生する。再生可能な細胞には、それだけには限らないが、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその一部、胚珠、芽、幹、軸、髄およびさく果またはそこから得られるカルスもしくはプロトプラストの細胞がある。
【０１２４】
対照植物と比較して実質的に同じ外観を維持しているが、カロテノイドもしくはβ−ダマセノンレベルが調節されているまたはカロテノイドおよびβ−ダマセノンレベルが調節されている突然変異、トランスジェニックもしくは非天然型植物を提供することが目的の１つである。したがって、対照細胞または対照植物と比較して、調節されたレベルのカロテノイドもしくはβ−ダマセノンレベルまたは調節されたレベルのカロテノイドおよびβ−ダマセノンレベルを有する突然変異、トランスジェニックもしくは非天然型植物または植物細胞について、本明細書に記載されている。突然変異、トランスジェニックもしくは非天然型植物または植物細胞を修飾して、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列をコードする１つ以上のポリペプチドの発現を調節することによって、本明細書に記載される１つ以上の酵素の合成または活性を調節する。さらなる態様は、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物または細胞に関し、本明細書に記載される１つ以上の酵素の発現または活性が調節され、前記酵素の発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、植物の一部（例えば、葉）のカロテノイドレベルは少なくとも５％増減している。なおさらなる態様は、突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物または細胞に関し、ネオキサンチン合成酵素の発現またはそれにコードされるタンパク質の活性が調節され、対照植物由来のエアロゾルと比較して、エアロゾル中のβ−ダマセノンレベルが少なくとも５％増減されている。
【０１２５】
対照植物と比較したカロテノイド含量の変化は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の変化であってよい。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の変化は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の変化であってよい。
【０１２６】
適切には、植物の一部（例えば、葉）中のルテイン含量は、少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１８．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２０ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２５ｍｇ／１００ｇ以上である。
適切には、植物の一部（例えば、葉）中のβ−カロテン含量は、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも１４ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１４．５ｍｇ／１００ｇ、または適切には、少なくとも約１５ｍｇ／１００ｇ以上である。
【０１２７】
適切には、植物の一部（例えば、葉）中のルテイン含量は、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１８．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２０ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２５ｍｇ／１００ｇ以上であり、植物の一部（例えば、葉）中のβ−カロテン含量は、少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも１４ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１４．５ｍｇ／１００ｇ、または適切には、少なくとも約１５ｍｇ／１００ｇ以上である。
適切には、焼いたまたは加熱した葉のエアロゾル中のβ−ダマセノンレベルは、焼いたまたは収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．０５ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．１ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．１５ｎｇ／ｍｇ、または適切には、少なくとも約２ｎｇ／ｍｇ以上である。
【０１２８】
適切には、（ｉ）植物の一部（例えば、葉）中のルテイン含量は、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１８．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１９．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２０ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約２５ｍｇ／１００ｇ以上であり、適切には、（ｉｉ）植物の一部（例えば、葉）中のβ−カロテン含量は、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１２．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１３．５ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも１４ｍｇ／１００ｇ、適切には、少なくとも約１４．５ｍｇ／１００ｇ、または適切には、少なくとも約１５ｍｇ／１００ｇ以上であり；（ｉｉｉ）適切には、焼いたまたは加熱した葉のエアロゾル中のβ−ダマセノンレベルは、焼いたまたは収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．０５ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．１ｎｇ／ｍｇ、適切には、少なくとも約１．１５ｎｇ／ｍｇ、または適切には、少なくとも約２ｎｇ／ｍｇ以上である。
【０１２９】
植物を１００℃以上、例えば少なくとも１２５℃、少なくとも１５０℃、少なくとも１７５℃または少なくとも２００℃に加熱して、エアロゾルを放出させることができる。
【０１３０】
なおさらなる態様において、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物であって、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはその２つ以上もしく３つ以上の組合せ（前記組合せは、本明細書に開示されている）からなる群から選択される酵素の発現またはそれにコードされているタンパク質の活性が増加し、（ｉ）植物の一部（例えば、葉）中のルテイン含量が、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉ）植物の一部（例えば、葉）中のβ−カロテン含量が、収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇであり、（ｉｉｉ）焼いたまたは加熱した葉のエアロゾル中のβ−ダマセノンレベルが、焼いたまたは収穫した植物（例えば、葉）材料の少なくとも約１ｎｇ／ｍｇである植物が提供される。適切には、前記植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
【０１３１】
実施形態は、ネオキサンチン合成酵素の発現または活性、リコピンβ−シクラーゼの発現または活性、または９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現活性を調節するように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法も対象とし、それにより対照と比較してカロテノイド（例えば、それだけには限らないが、ルテインもしくはβ−カロテンまたは両方）のレベルが調節された植物または植物成分（例えば、葉、例えば緑葉または乾燥処理した葉）を得ることができる。実施形態は、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼのうち２つ以上もしくは３つ以上の組合せの発現または活性を調節するように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法も対象とする。したがって、一実施形態は、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性を調節することに関し、別の実施形態は、ネオキサンチン合成酵素およびリコピンβ−シクラーゼの発現もしくは活性を調節することに関し、別の実施形態は、ネオキサンチン合成酵素および９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性を調節することに関し、別の実施形態は、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはこれら２つ以上の配列の他の組合せの発現もしくは活性を調節することに関する。特に植物中のカロテノイドレベルが増加する場合、植物中のカロテノイドのレベルの調節は、消費者にとって栄養面で利点がある場合がある。特に植物中のカロテノイドレベルが増加する場合、植物中のカロテノイドレベルの調節を使用して、カロテノイド生合成を阻害する除草剤に対して耐性の植物を生成することができる。したがって、特定の一実施形態において、上述のポリヌクレオチドおよびその組合せの発現または活性を増加させるように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法が提供され、それにより栄養面での利益が改善されたまたは除草剤に対する耐性が増大した植物もしくは植物成分（例えば、葉、例えば緑葉または乾燥処理した葉）を得ることができる。実施形態は、ネオキサンチン合成酵素の発現もしくは活性を調節するように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法も対象とし、それにより対照と比較してβ−ダマセノンのレベルが調節されている植物または植物成分（例えば、加熱乾燥処理した葉）を得ることができる。したがって、さらなる実施形態において、ネオキサンチン合成酵素の発現もしくは活性を調節するように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法が提供され、それによりβ−ダマセノンのレベルが調節されている植物または植物材料、例えば加熱もしくは火熱乾燥されたタバコ葉を得ることができる。したがって、β−ダマセノン含量の増減により、香味プロファイルが変化した植物材料を得ることができる。特定の一実施形態において、ネオキサンチン合成酵素の発現もしくは活性が増加するように修飾された突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を作製するための組成物および方法が提供され、それによりβ−ダマセノンのレベルが増加している植物または植物材料、例えば加熱もしくは火熱乾燥処理されたタバコ葉を得ることができる。β−ダマセノン含量を増加させることにより、調理したリンゴ香の香味プロファイルを有する植物材料を得ることができる。β−ダマセノン含量の低下により香味プロファイルが変化した植物材料を得ることができる。特定の実施形態によると、本明細書においてβ−ダマセノンについての言及は、その前駆体も含むことができる。そのような修飾も、植物のカロテノイド含量を調節することができる。
【０１３２】
有利には、本明細書に記載される方法により得られる突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物は、外観において対照植物と類似しているまたは実質的に同じである。一実施形態において、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の茎高は、例えば、圃場移植の１、２もしくは３か月間以上後またはトッピング（topping）の１０、２０、３０もしくは３６日間以上後では対照植物と実質的に同じである。例えば、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の茎高は、対照植物の茎高以上である。別の実施形態において、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、対照植物と実質的に同じである。別の実施形態において、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の茎高は、対照植物と実質的に同じであり、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、対照植物と実質的に同じである。他の実施形態において、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の葉のサイズ、形態、枚数もしくは色彩は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
【０１３３】
別の態様において、植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を調節する方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ（前記組合せは上に開示されている）からなる群から選択される酵素の発現もしくは活性を調節し、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列または本明細書に記載されるポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）対照植物と比較してその中のカロテノイド含量が調節されている突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
【０１３４】
別の態様において、植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を増加させる方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ（前記組合せは上に開示されている）からなる群から選択される酵素の発現もしくは活性を増加させ、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列または本明細書に記載されるポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）対照植物と比較してその中のカロテノイド含量が増加している突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
【０１３５】
別の態様において、植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を低下させる方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼまたはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ（前記組合せは上に開示されている）からなる群から選択される酵素の発現もしくは活性を減少させ、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素、リコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列または本明細書に記載されるポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部（例えば、葉）中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）対照植物と比較してその中のカロテノイド含量が低下している突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。
【０１３６】
対照植物と比較した発現の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよく、その増加は、転写活性もしくはタンパク質発現または両方の増加を含む。
対照植物と比較した活性の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよい。
【０１３７】
対照植物と比較した発現の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であってよく、その減少は、転写活性もしくはタンパク質発現または両方の減少を含む。
対照植物と比較した活性の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であってよい。
【０１３８】
対照植物と比較したカロテノイド含量の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよい。
【０１３９】
対照植物と比較したカロテノイド含量の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％までの減少であってよい。
別の態様において、植物のβ−ダマセノン含量を調節する方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素の発現または活性を調節し、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部もしくはそのエアロゾル中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）ネオキサンチン合成酵素の発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のβ−ダマセノン含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。適切には、β−ダマセノン含量は、タバコの葉を加熱乾燥した後に形成されるエアロゾルにおいて測定される。
【０１４０】
別の態様において、植物のβ−ダマセノン含量を増加させる方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素の発現または活性を増加させ、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）ネオキサンチン合成酵素の発現または活性が増加していない対照植物と比較して、その中のβ−ダマセノン含量が増加している突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。適切には、β−ダマセノン含量は、タバコの葉を加熱乾燥処理した後に形成されるエアロゾルにおいて測定される。
【０１４１】
別の態様において、植物のβ−ダマセノン含量を減少させるまたは阻害する（例えば、実質的に阻害する）方法であって、（ｉ）植物中のネオキサンチン合成酵素の発現もしくは活性を減少または阻害し、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のβ−ダマセノン含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）ネオキサンチン合成酵素の発現もしくは活性が減少または阻害されていない対照植物と比較して、その中のβ−ダマセノン含量が減少しているもしくは阻害されている突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法が提供される。適切には、前記突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の外観は、対照植物と実質的に同じである。適切には、植物はタバコ植物である。適切には、β−ダマセノン含量は、タバコの葉を加熱乾燥処理した後に形成されるエアロゾルにおいて測定される。
【０１４２】
対照植物と比較したネオキサンチン合成酵素の発現の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよく、その増加は、転写活性もしくはタンパク質発現または両方の増加を含む。
【０１４３】
対照植物と比較したネオキサンチン合成酵素の活性の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよい。
対照植物と比較したネオキサンチン合成酵素の発現の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であってよく、その減少は、転写活性もしくはタンパク質発現または両方の減少を含む。
【０１４４】
対照植物と比較したネオキサンチン合成酵素の活性の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上の減少であってよい。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の増加は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％までまたはそれ以上、例えば２００％もしくは３００％以上の増加であってよい。
対照植物と比較したβ−ダマセノン含量の減少は、約５％〜約１００％、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％までの減少であってよい。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび組換え構築物を使用して、対象の植物種、適切にはタバコにおいて、本明細書に記載される酵素の発現を調節することができる。
【０１４５】
ポリヌクレオチドに基づいたいくつかの方法を使用して、植物において遺伝子発現を増加させることができる。例として、形質転換される植物と適合性がある構築物、ベクターまたは発現ベクターを調製することができ、それらは植物において遺伝子を過剰発現できる上流プロモーターと一緒に対象の遺伝子を含む。典型的なプロモーターについては、本明細書に記載されている。形質転換の後に適切な条件下で生長させた場合、植物において、またはその特定の組織においてそのプロモーターが発現を駆動して、この酵素のレベルを調節する（例えば、増加させる）ことができる。典型的な一実施形態において、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（または、本明細書に記載のそれらの任意の組合せ）を持つベクターを生成して、植物において遺伝子を過剰発現させる。ベクターは、植物の全組織において導入遺伝子の構成的発現を駆動する適切なプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターをその上流に持つ。ベクターは、形質転換されたカルスおよび細胞系を選抜するために、抗生物質耐性遺伝子も持っている。
【０１４６】
したがって、様々な実施形態は、植物ゲノムに複数コピーのポリヌクレオチドを組み込むことよってＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（または本明細書に記載のそれらの任意の組合せ）の発現レベルを調節する（例えば、増加させる）方法であって、植物細胞宿主をＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターで形質転換するステップを含む方法を対象とする。組換えポリヌクレオチドによってコードされるＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリペプチドは、天然のポリペプチドであることができ、または細胞に対して異種であることもできる。
【０１４７】
本発明によると、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２（または本明細書に記載のそれらの任意の組合せ）の突然変異対立遺伝子を持つタバコ植物を植物育種プログラムにおいて使用して、有用な系統、品種および雑種を作出することができる。特に、突然変異対立遺伝子は、上述の商業的に重要な品種に遺伝子移入される。したがって、本明細書に記載の突然変異植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物を異なる遺伝的同一性を含む植物と交配するステップを含む、植物を育種する方法が提供される。本方法は、後代植物を別の植物と交配するステップと、任意で、所望の遺伝形質または遺伝的背景を持つ後代が得られるまで交配を繰り返すステップとをさらに含むことができる。そのような育種方法によって果たされる目的の１つは、他品種、育種系統、雑種または栽培品種、特に商業的対象のもの、に所望の遺伝形質を導入することである。別の目的は、単一の植物品種、系統、雑種または栽培品種において、異なる遺伝子の遺伝的修飾の多重化（stacking）を容易にすることである。同一種内および異種間の交配が意図される。そのような交配から生じる後代植物（育種系統とも称される）は、本発明の非天然型植物の例である。
【０１４８】
一実施形態において、非天然型タバコ植物を作製する方法であって、（ａ）突然変異またはトランスジェニックタバコ植物を第２のタバコ植物と交配して、後代タバコ種子を産するステップと、（ｂ）植物生長条件下で後代タバコ種子を生長させて、非天然型タバコ植物を産するステップとを含む方法が提供される。本方法は、（ｃ）非天然型タバコ植物の前世代をそれ自身または別のタバコ植物と交配して、後代タバコ種子を産するステップと、（ｄ）植物生長条件下でステップ（ｃ）の後代タバコ種子を生長させて、さらなる非天然型タバコ植物を産するステップと、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交配および生長ステップを複数回繰り返して、非天然型タバコ植物のさらなる世代を生成するステップとをさらに含むことができる。本方法は、ステップ（ａ）の前に、親植物を提供するステップを任意に含むことができ、その親植物は特徴付けられており、突然変異またはトランスジェニック植物と同一でない遺伝的同一性を含む。いくつかの実施形態において、育種プログラムに応じて、交配および生長ステップを０〜２回、０〜３回、０〜４回、０〜５回、０〜６回、０〜７回、０〜８回、０〜９回または０〜１０回繰り返して、非天然型タバコ植物の世代を生成する。戻し交配はそのような方法の一例であり、後代をその両親の一方またはその親と遺伝的に類似した別の植物と交配して、次世代において両親の一方とより近い遺伝的同一性を有する後代植物を得る。植物育種、特にタバコ植物育種の技術は周知であり、本発明の方法において使用できる。本発明は、これらの方法によって作製された非天然型タバコ植物をさらに提供する。
【０１４９】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、育種および変異体遺伝子に対するスクリーニングから得られた系統は、標準的な圃場手順を使用して圃場で評価される。本来の突然変異のない親を含めた対照遺伝子型が含まれ、評価する植物は、ランダム化された完全なブロック設計または他の適切な圃場設計の圃場に配置される。タバコの場合、標準的な農業手段が使用され、例えば、タバコを収穫し、計量し、乾燥処理の前および間に化学的および他の一般的試験を行うために試料採取する。データの統計分析を実施して、選択した系統の親系統との類似性を確認する。選択した植物の細胞遺伝学的な分析を任意に実施して、染色体補体および染色体対合の関係を確認する。
【０１５０】
本明細書に記載の通り、マーカー利用選抜（ＭＡＳ）育種プログラムにおいてＤＮＡフィンガープリント法、単一ヌクレオチド多型、マイクロサテライトマーカーまたは類似の技術を使用して、遺伝子の突然変異対立遺伝子を他のタバコに移入するまたは育種することができる。例えば、育種家は、突然変異対立遺伝子を含有する遺伝子型と農学的に望ましい遺伝子型との雑種形成により分離集団を作出することができる。本明細書に掲げた技術の１つを使用して、Ｆ２または戻し交配世代における植物を、ゲノム配列またはその断片から開発したマーカーを使用してスクリーニングできる。突然変異対立遺伝子を持つと同定された植物を戻し交配または自家授粉して、スクリーニングすべき第２集団を作出することができる。期待される遺伝型または使用されるＭＡＳ技術に応じて、戻し交配の各サイクルの前に選択した植物を自家授粉して、望ましい個別植物の同定を補助することが必要になる場合がある。反復親の望ましい表現型が復帰するまで、戻し交配または他の育種手順を繰り返すことができる。
【０１５１】
本開示によると、育種プログラムにおいて、良好な交配は、稔性が有るＦ１植物を産する。選択したＦ１植物を両親の一方と交配することができ、戻し交配第１世代植物を自家授粉して、変異体遺伝子発現（例えば、ヌル型の遺伝子）に対して再びスクリーニングされる集団を作製する。最終的なスクリーニングで稔性があり反復親と相当に類似している植物が作製されるまで、戻し交配、自家受粉およびスクリーニングのプロセスを、例えば少なくとも４回繰り返す。この植物を、必要に応じて、自家授粉し、続けて、その後代を再びスクリーニングして、植物が変異体遺伝子の発現を表すことを確認する。いくつかの実施形態において、Ｆ２世代における植物集団を変異体遺伝子の発現に対してスクリーニングする、例えば、遺伝子の欠損によりポリペプチドを発現することができない植物を、標準的な方法、例えば、本明細書に記載の通りＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはそれらの任意の組合せ）を含めたポリヌクレオチドに対するヌクレオチド配列情報に基づいたプライマーを用いるＰＣＲ法を使用することにより同定する。
【０１５２】
雑種タバコ品種は、第１品種の雌親植物（すなわち、種子両親）の自家受粉を防止し、雌親植物に第２品種の雄親植物からの花粉を受け入れ、雌植物にＦ１雑種種子を形成させることよって作製できる。雌植物の自家受粉は、花の発生の初期段階で花を除雄することによって防止できる。別法として、雄性不稔の形態を使用して雌親植物における花粉形成を防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、または導入遺伝子が小胞子生成および／もしくは花粉形成を阻害するトランスジェニック雄性不稔、または自家不和合性によって作製できる。ＣＭＳを含有する雌親植物は特に有用である。雌親植物がＣＭＳである実施形態において、稔性がある雄植物から花粉が集められ、ＣＭＳ雌親植物の柱頭に手作業で塗布され、得られたＦ１種子が集められる。
【０１５３】
本明細書に記載される品種および系統を使用して、単交配タバコＦ１雑種を形成することができる。そのような実施形態において、親品種の植物を実質的に均質な近隣集団として生長させて、雄親植物から雌親植物への自然他花受粉を促進することができる。雌親植物上で形成されたＦ１種子を、通常の手法によって選択的に集める。２種類の親植物品種をまとめて生長させ、雌親において形成されるＦ１雑種種子と自家受粉の結果として雄親において形成される種子との混合物を集めることができる。別法として、三系交配を実施することができ、単交配Ｆ１雑種が雌親として使用され、異なる雄親と交配される。別の方法として、複交配雑種を作出することができ、２種類の異なる単交配のＦ１後代がそれら自身と交配される。
【０１５４】
突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の集団を、望ましい形質または表現型を有する集団のメンバーに対してスクリーニングし、選択することができる。例えば、単回の形質転換事象の後代の集団を、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２またはそれらにコードされているポリペプチドの発現もしくは活性が望ましいレベルである植物に対してスクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を使用して、発現または活性レベルを同定することができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅法；ＲＮＡ転写産物を検出するためのノーザンブロット法、Ｓ１  ＲＮａｓｅプロテクション法、プライマー伸長法またはＲＴ−ＰＣＲ増幅法；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素的アッセイ法；ポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法および酵素結合免疫アッセイ法がある。他の技術、例えばin situハイブリダイゼーション法、酵素染色法ならびに免疫染色法および酵素アッセイ法を使用して、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの存在もしくは発現または活性を検出することもできる。
【０１５５】
突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物細胞および植物が、本明細書に記載されており、１つ以上の組換えポリヌクレオチド、例えば１つ以上の単離ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）、１つ以上のポリヌクレオチド構築物、１つ以上の二本鎖ＲＮＡ、１つ以上のコンジュゲートまたは１つ以上のベクター／発現ベクターを含む。
【０１５６】
それだけには限らないが、本明細書に記載される植物は、本発明によって発現もしくは活性が調節される前または後のいずれかに、他の目的のために修飾してもよい。突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物には、次の遺伝的修飾が１つ以上存在できる。一実施形態において、重金属取り込みまたは重金属輸送に関与する１つ以上の遺伝子が修飾され、それにより修飾のない対照植物またはその部分よりも重金属含量が低い植物または植物の部分（葉など）が得られる。非限定的な例には、多剤耐性関連のタンパク質ファミリー、陽イオン拡散ファシリテータ（cation diffusion facilitators）（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ−、Ｉｒｔ−様タンパク質、（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅トランスポータ（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＨＭＡ、ＷＯ２００９０７４３２５に記載される）ファミリー、自然抵抗性関連マクロファージタンパク質（ＮＲＡＭＰ）のホモログファミリー、およびカドミウムなどの重金属の輸送に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータファミリーの遺伝子がある。本明細書では重金属という用語は、遷移金属を含む。別の実施形態において、窒素代謝中間体の変換に関与する１つ以上の遺伝子が修飾され、それにより、加熱した際に少なくとも１種のタバコ特異的ニトロソアミン（例えば、４−（メチルニトロサミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン、Ｎ−ニトロソノルニコチン、Ｎ−ニトロソアナタビン、およびＮ−ニトロソアナバシン）を対照植物またはその部分より低レベル産生する植物または植物の部分（葉など）が得られる。修飾できる遺伝子の非限定的な例には、ニコチン脱メチル化酵素、例えばニコチンのノルニコチンへの変換に関わるＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５およびＣＹＰ８２Ｅ１０、をコードしている遺伝子があり、ＷＯ２００６０９１１９４、ＷＯ２００８０７０２７４、ＷＯ２００９０６４７７１およびＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０２１０８８号に記載されている。
【０１５７】
他の修飾の例には除草剤耐性があり、例えば、グリフォセートは多くの広域スペクトル除草剤の有効成分である。ａｒｏＡ遺伝子（サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）および大腸菌（E.coli）由来グリフォセートＥＰＳＰ合成酵素）を移入することよって、グリフォセート耐性トランスジェニック植物が開発された。シロイヌナズナ由来突然変異ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子を形質転換することよって、スルホニルウレア耐性植物が作製された。突然変異アマランサス・ハイブリダス（Amaranthus hybridus）由来光化学系ＩＩのＯＢタンパク質を植物に移入して、アトラジン耐性トランスジェニック植物が作製され、細菌クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来ｂｘｎ遺伝子を組み込むことによって、ブロモキシニル耐性トランスジェニック植物が作製された。別の例示的な修飾により、昆虫に対して抵抗性の植物が得られる。ブロッコリにおいて最近例示された通り、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）毒素は、Ｂｔ耐性害虫の出現を遅らせる有効な方法を提供することができ、ピラミッド化したｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＣＢｔ遺伝子は、いずれか単一のタンパク質に対して耐性があるコナガを防除し、耐性昆虫の発生を著しく遅らせた。別の例示的な修飾により、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）よって引き起こされる病害に対して抵抗性の植物が得られる。Ｘａ２１遺伝子を発現している植物（斑点細菌病に対して抵抗性）が、Ｂｔ融合遺伝子とキチナーゼ遺伝子の両方を発現している植物（サンカメイチュウに対して抵抗性および鞘に耐性）と共に工学的に作製された。別の例示的な修飾により、生殖能力の変更（例えば雄性不稔）が得られる。別の例示的な修飾により、非生物的なストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に耐性のある植物が得られ、耐性のあるトランスジェニック植物は、シロイヌナズナ由来アシルグリセロールリン酸酵素を移入することよって作製され、マンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトールデヒドロゲナーゼおよびソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、耐乾燥性を改善する。別の例示的な修飾により、ヒトにおける使用に好ましい免疫特性を持ち得るタンパク質を産生する植物が得られる。例えば、Ｎ−グリカン中のα−１，３結合フコース残基、β−１，２結合キシロース残基または両方を実質的に欠いているタンパク質を産生できる植物が使用されるものであってよい。他の典型的な修飾により、貯蔵タンパク質および油が改善された植物、光合成の効率が増強された植物、貯蔵寿命が延長された植物、炭水化物含量が増強された植物、および真菌に対して抵抗性がある植物、アルカロイド生合成に関与する酵素をコードしている植物が得られる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）および／またはシスタチオニンガンマ−合成酵素（ＣＧＳ）の発現が調節されたトランスジェニック植物も意図される。
【０１５８】
１つ以上のそのような形質は、別のタバコ栽培品種から突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物に遺伝子移入されてもよく、または直接形質転換されてもよい。本発明の突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物への形質の遺伝子移入は、当技術分野において公知の任意の植物育種方法、例えば、血統育種、戻し交配、倍加半数体育種などによって達成されうる（Wemsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 ppを参照のこと）。上述の分子生物学に基づく技術、特にＲＦＬＰおよびマイクロサテライトマーカーをそのような戻し交配に使用して、反復親と最も高い遺伝的同一性を有する子孫を同定することができる。これにより、反復親と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の遺伝的同一性を有し、さらにより好ましくは反復親と遺伝的に同一であり、ドナー親から遺伝子移入した形質をさらに含むタバコ品種の作製を加速することができる。遺伝的同一性のそのような決定は、当技術分野において公知の分子マーカーに基づくことができる。
【０１５９】
最後の戻し交配世代を自家受粉させて、移入された核酸に関して純血な育種後代を得ることができる。一般に、得られた植物は、移入された形質（例えば、１つ以上の単一の遺伝子形質）に加えて、本発明の突然変異、非天然型またはトランスジェニックタバコ植物の形態的および生理的特徴の全てを本質的に有する。正確な戻し交配プロトコールは変更される形質によって決まり、適切な試験プロトコールが決定されることになる。移入される形質が優性対立遺伝子であるとき、戻し交配方法は簡略化されるが、劣性対立遺伝子が移入されてもよい。この実例において、後代の試験を導入して、望ましい形質が成功裏に移入されたかどうか決定することが必要な場合がある。
【０１６０】
様々な実施形態は、突然変異植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物およびバイオマスを提供し、それらにおいてＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはその任意の組合せ）の発現レベルが調節されて、その植物から調製される乾燥処理タバコを加熱した後に形成されるエアロゾル中のカロテノイド含量またはβ−ダマセノン含量が調節される。
【０１６１】
そのような植物、特にタバコ植物の部分、より具体的にはタバコ植物の葉身および中肋は、エアロゾル形成材料、エアロゾル形成用具、喫煙する物、喫煙可能な物、無煙製品およびタバコ製品を含むがこれに限らない様々な消耗品の生産に取り入れられるまたは使用することができる。エアロゾル形成材料の例には、それだけには限らないが、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、刻みタバコ、刻み充填材、乾燥処理タバコ、膨張タバコ（expanded tobacco）、均質化タバコ（homogenized tobacco）、再形成タバコ、およびパイプタバコがある。喫煙する物および喫煙可能な物とは、エアロゾル形成用具の型である。喫煙する物または喫煙可能な物の例には、それだけには限らないが、紙巻きタバコ、シガリロおよび葉巻がある。無煙製品の例には、噛みタバコおよび嗅ぎタバコがある。燃焼させるのではなく、特定のエアロゾル形成用具中で、１つ以上の電気的な加熱素子によってタバコ組成物または別のエアロゾル形成材料を加熱して、エアロゾルを生成する。別の型の加熱されたエアロゾル形成用具において、エアロゾルは、可燃性燃料成分または熱源から物理的に独立したエアロゾル形成材料への熱の移動によって生成され、その材料は熱源の内部、周辺または下流に位置していてもよい。無煙タバコ製品および様々なタバコに含有されるエアロゾル形成材料は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーを含めた任意の形態でタバコを含有することができ、薄片、薄膜、タブレット、発泡体もしくはビーズでなど任意の形式で他の成分上に堆積される、混合される、囲まれる、または別の方法で組み合わされる。本明細書では、用語「煙」を使用して、喫煙する物、例えば紙巻きタバコによって、またはエアロゾル形成材料を燃焼させることによって生成されるエアロゾルの型を記載する。
【０１６２】
一実施形態において、本明細書に記載される突然変異、トランスジェニックおよび非天然型タバコ植物の乾燥処理された材料も提供される。タバコ緑葉を乾燥処理するプロセスは当業者に公知であり、それだけには限らないが、空気乾燥処理、火熱乾燥処理、熱風乾燥お処理よび日干乾燥処理を含む。タバコ緑葉を乾燥処理するプロセスは、収穫したタバコの型によって決まる。例えば、バージニア熱風（ブライト）タバコは通常熱風乾燥処理され、バーレー種および特定のダーク株は通常空気乾燥処理され、パイプタバコ、噛みタバコおよび嗅ぎタバコは通常火熱乾燥処理される。
別の実施形態において、本明細書に記載される突然変異タバコ植物、トランスジェニックタバコ植物または非天然型タバコ植物の葉、好ましくは乾燥処理した葉を含むエアロゾル形成材料含有タバコを含めたタバコ製品について記載される。本明細書に記載されるタバコ製品は、無修飾タバコをさらに含むことができるブレンドタバコ製品であり得る。
【０１６３】
非突然変異、非天然型または非トランスジェニック対応物から得られる消耗品と比較した場合、これらの喫煙可能な物および無煙製品ならびにそのエアロゾル中の％カロテノイドもしくはβ−ダマセノンまたは％カロテノイドおよびβ−ダマセノンは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％以上、例えば２００％もしくは３００％、またはそれ以上であってよい。
【０１６４】
非突然変異、非天然型または非トランスジェニック対応物から得られる消耗品と比較した場合、これらの喫煙可能な物および無煙製品ならびにそのエアロゾル中の％カロテノイドもしくは％β−ダマセノンまたは％カロテノイドおよびβ−ダマセノンは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％未満であってよい。
【０１６５】
突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物は、例えば、農業において他の使用法があってもよい。例えば、本明細書に記載される突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を使用して、動物飼料およびヒト用食品を作ることができる。
本発明は、本明細書に記載される突然変異植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物を栽培するステップと、栽培した植物から種子を採取するステップとを含む、種子を作製する方法も提供する。本明細書に記載される植物由来種子を、当技術分野において公知の手法によって条件を整え包装材料に詰めて、製造物を形成することができる。包装材料、たとえば紙および布は、当技術分野で周知である。種子の包装は、ラベル、例えば、中にある種子の性質が記載されている、包装材料に固定されたタグまたはラベル、包装に印刷されたラベル、を有することができる。
【０１６６】
さらなる態様は、β−ダマセノンを生成するための方法であって（ａ）本明細書に記載の突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物、バイオマス、種子もしくは葉、またはタバコ製品の一部を提供するステップと、（ｂ）それを加熱するステップとを含む方法に関する。
【０１６７】
同定、選抜または育種のために植物を遺伝子型判定するための組成物、方法およびキットは、ポリヌクレオチド試料中のＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（または、その２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）の存在を検出する手法を含むことができる。したがって、１つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するための多くのプライマー（例えば、配列番号３〜５、１０〜１２もしくは１４〜１６で示される配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる１つ以上のプライマーもしくはプローブ）のうちの１つ、任意で１つ以上のプローブをおよび任意で増幅もしくは検出を実行するための１つ以上の試薬を含む組成物が記載される。
【０１６８】
したがって、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドに対応する約１０個以上の連続するポリヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが開示される。前記プライマーもしくはプローブは、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする（例えば、特異的にハイブリダイズする）約１５、２０、２５、３０、４０、４５または５０個以上の連続するポリヌクレオチドを含むまたはそれからなることができる。いくつかの実施形態において、プライマーもしくはプローブは、遺伝子の同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）もしくは単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのin situハイブリダイゼーション）または遺伝子検出（例えば、核酸増幅または検出における１つ以上の増幅プライマーとして）のための配列依存的方法に使用できる約１０〜５０個の連続するヌクレオチド、約１０〜４０個の連続するヌクレオチド、約１０〜３０個の連続するヌクレオチドまたは約１５〜３０個の連続するヌクレオチドを含むまたはそれからなることができる。１つ以上の特異的プライマーもしくはプローブを設計し、使用して、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチドの一部もしくは全体を増幅または検出することができる。具体的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコールに２種類のプライマーを使用して、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２核酸をコードしている核酸断片、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は、ＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２核酸配列から得られる１つのプライマーとＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２核酸配列の上流もしくは下流の配列、例えばＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙもしくはＮｔＮＣＥＤ２のプロモーター配列、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端またはベクターから得られる配列にハイブリダイズする第２プライマーとを使用して実施することもできる。ポリヌクレオチドのin vitro増幅に有用な熱的および等温技術の例は、当技術分野で周知である。試料は、植物、植物細胞もしくは植物材料または本明細書に記載の植物、植物細胞もしくは植物材料から作られるまたは得られるタバコ製品であることができるまたはそれから得ることができる。
【０１６９】
さらなる態様において、試料中のＮｔＡＢＡ４、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤ２ポリヌクレオチド（またはその２つ以上もしくは３つ以上の組合せ）を検出する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチドを含むまたは含む疑いがある試料を提供するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するために、前記試料を多くのプライマーのうちの１つまたは１つ以上のプローブと接触させるステップと、（ｃ）増幅産物の存在を検出するステップとを含み、増幅産物の存在が試料中のポリヌクレオチドの存在を表す方法も提供される。さらなる態様において、ポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための多くのプライマーのうちの１つまたはプローブの使用も提供される。ポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための多くのプライマーのうちの１つまたはプローブを含む、ポリヌクレオチドの少なくとも一部を検出するためのキットも提供される。キットは、ポリヌクレオチド増幅、例えばＰＣＲ用の試薬、またはプローブハイブリダイゼーション検出技術、例えばサザンブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションもしくはマイクロアレイ用の試薬を含むことができる。キットは、抗体結合検出技術、例えばウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＬＤＩ質量分析法または試験紙用の試薬を含むことができる。キットは、ＤＮＡ配列決定用の試薬を含むことができる。キットは、カロテノイド（例えば、ルテインもしくはβ−カロテン；またはルテインおよびβ−カロテン）およびβ−ダマセノン含量またはβ−ダマセノン含量を決定するための試薬および説明書を含むことができる。キットは、カロテノイド（例えば、ルテインもしくはβ−カロテン；またはルテインおよびβ−カロテン）およびβ−ダマセノン含量またはβ−ダマセノン含量を決定するための試薬および説明書を含むことができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、キットは、記載されている１つ以上の方法のための説明書を含むことができる。記載されているキットは、遺伝的同一性の決定、系統発生研究、遺伝子型判定、ハロタイプ判定、血統分析または植物育種に、特に共優性スコアリングと共に、有用になり得る。本発明は、本明細書に記載の、ポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞または植物材料を遺伝子型判定する方法も提供する。遺伝子型判定は、染色体対のホモログを区別する手法を提供し、これを使用して、植物集団中で分離された集団を識別することができる。分子マーカー法は、系統発生研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交配または体細胞雑種の同定、単一遺伝子形質に影響を及ぼす染色体部分の局在、マップベースクローニング、および量的遺伝の研究に使用できる。遺伝子型判定の特定の方法には、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含めた任意の数の分子マーカー分析技術を使用できる。ＡＦＬＰは、ヌクレオチド配列変化よって引き起こされる増幅断片間の対立遺伝子の差異の産物である。したがって、本発明は、ＡＦＬＰ分析のような技術を使用して、１つ以上の遺伝子または核酸、およびこれらの遺伝子または核酸と遺伝的に連鎖している染色体配列の分離を追跡する手法をさらに提供する。
【０１７１】
一実施形態において、本明細書に記載される突然変異、トランスジェニックおよび非天然型植物の乾燥処理された材料も提供される。例えば、タバコ緑葉を乾燥処理するプロセスは当業者に公知であり、それだけには限らないが、空気乾燥処理、火熱乾燥処理、熱風乾燥処理および日干乾燥処理を含む。タバコ緑葉を乾燥処理するプロセスは、収穫したタバコの型によって決まる。例えば、バージニア熱風（ブライト）タバコは通常熱風乾燥処理され、バーレー種および特定のダーク株は通常空気乾燥処理され、パイプタバコ、噛みタバコおよび嗅ぎタバコは通常火熱乾燥処理される。
【０１７２】
別の実施形態において、本明細書に記載される突然変異、トランスジェニックおよび非天然型植物の、または本明細書に記載される方法によって作製される葉、好ましくは乾燥処理した葉を含むタバコ製品を含めたタバコ製品について記載される。本明細書に記載されるタバコ製品は、無修飾タバコをさらに含むことができる。
【０１７３】
別の実施形態において、植物材料、好ましくは本明細書に記載される突然変異、トランスジェニックおよび非天然型植物由来の葉、例えば乾燥処理した葉を含むタバコ製品について記載される。例えば、植物材料をタバコ製品の内部または外部に添加することができ、燃焼させることにより望ましい芳香が放出される。この実施形態によるタバコ製品は、無修飾タバコまたは修飾したタバコであることができる。この実施形態によるタバコ製品は、本明細書に開示される遺伝子以外に１つ以上の遺伝子に修飾を有する突然変異、トランスジェニック、非天然型植物からさらに得られてもよい。
【０１７４】
さらなる態様は、リコピンβ−シクラーゼをコードしている配列を含み、それからなりまたは本質的にそれからなり、配列番号８と少なくとも６０％の配列同一性を有する、単離ポリヌクレオチドに関する。さらなる態様は、このポリヌクレオチドよってコードされる単離ポリペプチドに関する。さらなる態様は、配列番号９と少なくとも８７％の配列同一性を有する単離ポリペプチドに関する。さらなる態様は、単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターに関する。さらなる態様は、単離ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含む突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物細胞に関連し、対照または野生型植物と比較して、リコピンβ−シクラーゼの発現もしくは活性が調節されており、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素もしくは９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ；またはネオキサンチン合成酵素および９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性も調整されている。さらなる態様は、植物細胞を含む突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物に関する。さらなる態様は、植物のカロテノイド含量を調節する方法であって、（ｉ）植物中のリコピンβ−シクラーゼの発現または活性を調節し、好ましくは、リコピンβ−シクラーゼが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）リコピンβ−シクラーゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のカロテノイド含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法に関する。一実施形態において、リコピンβ−シクラーゼまたは９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ；ならびにリコピンβ−シクラーゼおよび９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性も調節される。さらなる態様は、この方法によって入手されまたは入手可能である、突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物、またはそれから誘導されもしくは誘導可能である植物材料に関する。さらなる態様は、リコピンβ−シクラーゼの発現またはそれにコードされているタンパク質の活性が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせた含量が、リコピンβ−シクラーゼの発現または活性が増大していない対照植物より高く、好ましくは、（ｉ）植物の緑葉ルテイン含量が、少なくとも約１７ｍｇ／１００ｇ（例えば、少なくとも約１７．５ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１８ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１８．５ｍｇ／１００ｇまたは少なくとも約１９ｍｇ／１００ｇ）であり、（ｉｉ）植物のβ−カロテン含量が、少なくとも約１０ｍｇ／１００ｇ（例えば、少なくとも約１０．５ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇまたは少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇ）である、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物に関する。さらなる態様は、植��由来細胞または組織を含む、バイオマス、種子もしくは葉を含めた植物材料に関する。
【０１７５】
さらなる態様は、植物細胞、植物の少なくとも一部または植物材料を含むタバコ製品に関する。さらなる態様は、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼをコードしている配列を含み、それからなりまたは本質的にそれからなり、配列番号１３と少なくとも６０％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチドに関する。さらなる態様は、このポリヌクレオチドよってコードされる単離ポリペプチドに関する。さらなる態様は、単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターに関する。さらなる態様は、単離ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは構築物、ベクターもしくは発現ベクターを含む突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物細胞に関連し、対照または野生型植物と比較して、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性が調節されており、好ましくは、ネオキサンチン合成酵素もしくはリコピンβ−シクラーゼ；またはネオキサンチン合成酵素およびリコピンβ−シクラーゼの発現もしくは活性も調節されている。さらなる態様は、植物細胞を含む突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物に関する。さらなる態様は、植物のカロテノイド含量を調節する方法であって、（ｉ）植物中の９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現または活性を調節し、好ましくは、９−シスエポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物の少なくとも一部中のカロテノイド含量を測定するステップと、（ｉｉｉ）９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、その中のカロテノイド含量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップとを含む方法に関する。一実施形態において、ネオキサンチン合成酵素またはリコピンβシクラーゼ；ならびにネオキサンチン合成酵素およびリコピンβシクラーゼの発現もしくは活性も調節される。さらなる態様は、この方法によって入手されまたは入手可能である、突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物、またはそれから誘導されもしくは誘導可能である植物材料に関する。さらなる態様は、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現またはそれにコードされているタンパク質の活性が増大しており、植物の緑葉ルテイン含量もしくはβ−カロテン含量または組み合わせた含量が、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの発現もしくは活性が増大していない対照植物より高く、好ましくは、（ｉ）植物の緑葉ルテイン含量が、少なくとも約１５ｍｇ／１００ｇ（例えば、少なくとも約１５．５ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１６ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１６．５ｍｇ／１００ｇまたは少なくとも約１７ｍｇ／１００ｇ）であり、（ｉｉ）植物のβ−カロテン含量が、少なくとも約１１ｍｇ／１００ｇ（例えば、少なくとも約１１．５ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１２ｍｇ／１００ｇ、少なくとも約１２．５ｍｇ／１００ｇまたは少なくとも約１３ｍｇ／１００ｇ）である、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物に関する。さらなる態様は、植物由来細胞または組織を含む、バイオマス、種子もしくは葉を含めた植物材料に関する。さらなる態様は、植物細胞、植物の少なくとも一部または植物材料を含むタバコ製品に関する。
【０１７６】
本発明は下の例においてさらに記載され、それらは本発明をさらに詳細に記述するために提供される。これらの例は、本発明を実施するために現在意図される好ましい様式を述べるものであり、本発明を例示することを目的とし、制限することを目的とするものではない。
【実施例】
【０１７７】
（例１）
ニコチアナ・タバカム由来ＡＢＡ４のクローニング
ＡＢＡ４に相同なニコチアナ・タバカムコード配列は、異所的に発現される。その遺伝子は、Ａ．サリアナＡＢＡ４との配列相同性に基づいてニコチアナ・タバカムＡＢＡ４（ＮｔＡＢＡ４）と呼ばれる。ＮｔＡＢＡ４は、ビオラキサンチンからトランス−ネオキサンチンの形成を触媒するネオキサンチン合成酵素の拡大「ファミリー」（extended "family"）に属する遺伝子である。遺伝子産物は、ＡｔＡＢＡ４との類似性により、およびＷｏＬＦＰＳＯＲＴ分析により、色素体に局在する可能性が極めて高い。６６３ｋｂの完全長コード配列を同定し、ＰＣＲ鋳型として葉Ｋ３２６  ｃＤＮＡを使用して増幅し、ｐＥＮＴＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定し、ｐＫ２ＷＧ７（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｔ、ベルギーから入手したＧａｔｅｗａｙベクター）に移入して、ニコチアナ・タバカムにおいて構成的に発現させる。ＮｔＡＢＡ４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２ならびに図２に説明される。ＮｔＡＢＡ４は、シロイヌナズナタンパク質ＡｔＡＢＡ４、Ａｔｌｇ６７０８０とアミノ酸レベルで６５％の同一性を示す。鋳型としてＨｉｃｋｓ  ＢｒｏａｄｌｅａｆのｇＤＮＡから開始するＰＣＲ増幅により、１８０８ｂｐのＮｔＡＢＡ４ホモログを同定することができた。ｃＤＮＡとｇＤＮＡ配列とを比較することにより遺伝子構造を推測して、ＮｔＡＢＡ４が４つのイントロンおよび５つのエクソンを持つことを実証した（図３Ａ）。Ｋ３２６およびＨｉｃｋｓ  ＢＬ  ＮｔＡＢＡ４アイソフォームの間で差異が存在する（図３Ｂ）。Ｈｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ由来ＮｔＡＢＡ４アミノ酸配列は、６アミノ酸の差異および９位におけるセリン１つの欠失により、Ｋ３２６配列と９７％の同一性を有する（図３Ｃ）。発現配列タグの比較によって示されるように、Ｎ末端に同一の特徴を有する発現配列タグ（ＡＭ８２４５６９）が、ＳＮＮタバコのＮＣＢＩ低温ストレス配列ライブラリー中に同定されたので、ＮｔＡＢＡ４ゲノム配列は偽遺伝子ではない。タバコの工学的作製では、ＮｔＡＢＡ４  Ｋ３２６  ｃＤＮＡ配列が使用され、ＴＮ９０において強力なウィルス性ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に発現される。
【０１７８】
（例２）
ニコチアナ・タバカム由来ネオキサンチン合成酵素（ＮｅＳｙ）のクローニング
ＮｅＳｙ（リコピンβ−シクラーゼ）は、ＡＢＡ４のように、ビオラキサンチンからのネオキサンチン（シス−ネオキサンチン）の形成を触媒する（図１を参照のこと）。この酵素は、色素体に局在している可能性が高い（アラビドプシス・サリアナＮｅＳｙに対する相同性に基づく）。ＴＧＩデータベースにある利用可能な配列から始めて、Ｋ３２６  ＲＮＡから１４８２ｋｂの完全長コード配列（図４を参照のこと）を増幅し、ｐＥＮＴＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定し、ＧａｔｅｗａｙベクターｐＫ２ＷＧ７（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｔ、ベルギーから入手した）にサブクローニングして過剰発現させる。ＢＡＣクローンが、同定される。このＢＡＣクローンに存在するゲノム配列は、ＮｔＮｅＳｙがゲノム構造内にイントロンを全く持たず、タバコにおいて、単一コピー遺伝子である可能性が極めて高いことを示している。３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４植物と比較するために、ＴＮ９０においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にＮｔＮｅＳｙ  Ｋ３２６  ｃＤＮＡを構成的に発現させる。
【０１７９】
（例３）
ニコチアナ・タバカム由来９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（ＣＥＤ２）のクローニング
ＣＥＤ２（９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ）は、シス−ネオキサンチンのＣ25−アレニック−アポ−アルデヒド（apo-aldehyde）およびキサントキシンへの切断を触媒する（図１を参照のこと）。ＮｔＣＥＤ２は、シロイヌナズナＡｔＮＣＥＤ４と高い相同性を共有し、これはプラスト顆粒に存在し、葉の葉緑体においてネオキサンチンを切断する可能性が高い。タバコｃＤＮＡ断片を、ＴＧＩデータベースで同定する。これから、部分配列（４０７ｂｐ）を、ｐＥＮＴＲ  Ｇａｔｅｗａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定し、Ｆｌａｎｄｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｔ、ベルギーから入手したＧａｔｅｗａｙベクターｐＫ７ＧＷＩＷＧ２（ＩＩ）にサブクローニングする。この場合、タバコ植物において、ＮｔＣＥＤ２断片はＲＮＡヘアピンとして発現され、対応する内在性ＮｔＣＥＤ２転写産物の遺伝子サイレンシングを誘導する（図５）。
【０１８０】
（例４）
ＮｔＡＢＡ４  ｃＤＮＡを用いるＴＮ９０バーレー種タバコの工学的作製
ＮｔＡＢＡ４コード配列（図２）を持つバイナリープラスミドｐＫ２ＷＧ７を生成して、ニコチアナ・タバカムにおいてこの遺伝子を過剰発現させる。このベクターは、植物の全組織において導入遺伝子の構成的発現を駆動するカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターをその上流に、および寒天プレートにおけるトランスジェニックニコチアナ・タバカム系統のカナマイシン（抗生物質）選抜（１００ｍｇ／ｍｌ）用のｋａｎ／ｎｐｔＩＩ遺伝子を含む。バーレー種タバコＴＮ９０を、古典的な葉ディスク手順を使用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介してこの構築物で形質転換する。カルスから、個々の系統を再生し、カナマイシンで選択する。次いで、３５Ｓプロモーター（５’−ＧＡＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣ）中のプライマー１つおよびＮｔＡＢＡ４コード配列内のプライマー１つを使用するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってＴ０過剰発現系統を観察し、特異的ＮｔＡＢＡ４プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、ＮｔＡＢＡ４のトランスジェニックコピーを特異的に検出する。Ｔ１種子を採取し、カナマイシン含有寒天プレート上で再生長させ、Ｔ０小植物に関して厳密に観察した。ＮｔＡＢＡ４  ｃＤＮＡを保有しているＴ−ＤＮＡが選択した系統のゲノムに挿入されたことをｇＤＮＡに対するＰＣＲは示しており、ＲＴ−ＰＣＲ分析によりその遺伝子を過剰発現している３系統を同定することができた。続いて、カナマイシン耐性植物を浮きトレイ中で生長させた後に、圃場で栽培する。ＮｔＡＢＡ４の３系統（ＮｔＡＢＡ４−１、ＮｔＡＢＡ−２およびＮｔＡＢＡ−３）、ベクター対照（ＶＣ、空のｐＫ７ＧＷＩＷＧ２（ＩＩ））およびＴＮ９０  ＵＳバックグラウンドタバコからなる２０個体の植物を、４個体ずつ複製した２０個体の植物で栽培する。圃場に移植してから３か月後（トッピングの３６日後）に、１つの実験的複製を代表する、小区分の２０個体の植物のうち１０個体の同一植物で、中央の着葉位の葉を１枚試料採取する。これらの葉（「緑葉」）を直ちにドライアイスに保存し、凍結乾燥する。圃場において２カ月後、３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４植物は、ＴＮ９０およびＶＣ植物と異なるどんな視覚的表現型も表さなかった。同様に、植物高さおよびクロロフィル含量分析からトランスジェニック３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４系統がＴＮ９０およびＶＣ対照に類似していることが実証され、ＮｔＡＢＡ４過剰発現が表現型特性に対して可視的影響を及ぼさないことが示唆される。小区分および系統当たり１０個体の選択した植物の残りの葉材料を試料採取し、バーレー種農作業にしたがって乾燥処理した。乾燥処理後に、中央の着葉位で葉を３枚試料採取する。トランスジェニック３系統（ＮｔＡＢＡ４−１、ＮｔＡＢＡ４−２およびＮｔＡＢＡ４−３）におけるＮｔＡＢＡ４発現の増大の作用を観察するために、「緑葉」および「乾燥処理した葉」を粉砕し、カロテノイド分析に供する。
【０１８１】
（例５）
３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４トランスジェニック系統の緑葉および乾燥処理した葉におけるカロテノイド分析
「緑葉」中のカロテノイドの定量分析は、技術的な制限により全てのキサントフィルに関して、特にネオキサンチン定量に関して（ニコチアナ・タバカムにおける低い濃度および低い分析分離により）不可能である。ネオキサンチンのプール（半定量分析に基づく、データ不掲載）は、ＴＮ９０、ＶＣ、ＮｔＡＢＡ４−１、ＮｔＡＢＡ４−２およびＮｔ−ＡＢＡ４−３におけるルテイン含量と（およびより小さい程度でβ−カロテンとも）類似の傾向を有すると仮定される。両方の後の色素は、緑葉中の他のカロテノイド（キサントフィル）濃度の代表的な尺度として使用される。対照的に、ネオキサンチンプールは速やかに、完全に分解することが公知なので、老化し乾燥処理した葉においてはそのような仮定は考えられない。カロテノイド分析は、古典的なＨＰＬＣ法および可視検出を使用して実施される。野生型およびベクター対照と比較したとき、ＮｔＡＢＡ４過剰発現系統においてＮｔＡＢＡ４−２およびＮｔＡＢＡ４−３系統においてルテインが著しく上昇していることが示される。ＴＮ９０およびベクター対照バックグラウンド系統と比較したとき、ＮｔＡＢＡ４の過剰発現により、ＮｔＡＢＡ４−２およびＮｔＡＢＡ４−３系統においてそれぞれ３０％および２６％の葉ルテインの増加が得られる。加えて、野生型ＴＮ９０と比較して、β−カロテンもＮｔＡＢＡ４系統において著しく高い（約１５％高い）。これらのデータは、ＮｔＡＢＡ４の過剰発現が、カロテノイド含量の全体的な増加に作用することを指し示している。トランスジェニック植物系統内のカロテノイドの増加は、有意である（Ｐ＜０．０５；Ｔ検定）。
【０１８２】
乾燥処理した葉中のカロテノイドの分析は、緑葉と比較してルテインおよびβ−カロテンプールの全般的な減少を示す。野生型、ベクター対照および３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４トランスジェニック系統の全てにおいて、緑色試料中に存在するルテインおよびβ−カロテンの８７〜９５％は乾燥処理の間に分解する。このことは、乾燥処理の間にこれらのカロテノイドが、活性酵素的または化学的修飾に供されることを示唆している。各乾燥処理試料群内にある大きな変動は、緑葉において、乾燥処理の間のカロテノイド異化が、カロテノイド合成ほど「制御」されておらず均質でないプロセスであることを示している。ＮｔＡＢＡ４−２が、ＴＮ９０（Ｐ＜０．００１）およびベクター対照（Ｐ＜０．０５）より高く、ベクター対照が、ＴＮ９０より高く（Ｐ＜０．０５）、ＮｔＡＢＡ４−１が、ＴＮ９０より高い（Ｐ＜０．０５）系統を比較するとき、Ｔ検定分析は、ルテイン含量が著しく異なることを示している。ＴＮ９０と比較したとき、β−カロテン含量は、ベクター対照（Ｐ＜０．０５）およびＮｔＡＢＡ４−１（Ｐ＜０．０１）においてより高い。
【０１８３】
（例６）
選択した３５Ｓ：ＮｅＳｙおよびＮｔＣＥＤ２干渉ＲＮＡ系統のカロテノイド分析
３５Ｓ：：ＮｔＡＢＡ４について記載した通り、３５Ｓ：ＮｔＮｅＳｙおよびＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ形質転換系統は、遺伝子型判定およびＲＴ−ＰＣＲに基づいて選択される。結果として、２個体の３５Ｓ：ＮｔＮｅＳｙおよび３個体のＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ系統が同定され、同じ圃場に、同時に４個体ずつ複製して植えられる。主要なカロテノイド（ルテインおよびβ−カロテン）の含量が、ＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡおよび３５Ｓ：ＮｔＮｅＳｙ系統において決定される。ＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡと３５Ｓ：ＮｔＮｅＳｙ両方の系統が、緑葉中の主なカロテノイドの増加を表すので、植物形質転換に対するこれら２つの遺伝子候補が、タバコ葉におけるカロテノイド代謝に影響を及ぼすことが確認される。しかし、選択したトランスジェニック系統全てを比較する場合、緑葉で全体的なカロテノイドの増加を達成するには、ＮｔＡＢＡ４の過剰発現が最も効率的であるように思われる。
【０１８４】
収穫した葉材料を空気乾燥処理して、観察されたカロテノイド変化によりそれぞれのエアロゾル中で生成されるβ−ダマセノン量が変わることを確認する。最も有望な乾燥処理試料を選択するために、緑葉中のルテイン、β−カロテンおよびネオキサンチン（半定量データ）において最も急激な変化を伴う試料／系統を選ぶ。これらの試料／系統は、それぞれ、ＮｔＮｅＳｙ−１＿２、ＮｔＡＢＡ４−２＿２およびＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ−１＿４であった（図６）。乾燥処理した葉において、ネオキサンチンまたは緑葉に蓄積する恐らく他のカロテノイドが、β−ダマセノン−グルコシドまたは他のβ−ダマセノン前駆体に変換され、その後の加熱によって放出されるとここで仮定される。
【０１８５】
（例７）
選択したトランスジェニック系統中のβ−ダマセノン分析
ＴＮ９０−４（対照）、ＮｔＮｅＳｙ−１＿２、ＮｔＡＢＡ４−２＿２およびＮｔＮＣＥＤ２干渉ＲＮＡ−１＿４試料系統の乾燥処理したタバコを加熱した後に形成されるエアロゾル中のβ−ダマセノンの含量を分析するために、含浸したタバコ刻み充填剤からエアロゾルを生成させる。使用した喫煙台は、２秒毎に１２回吹く方式を含むＮＨＳ熱源（５４Ｗ）を備える喫煙シミュレータである。喫煙前に、タバコ乾燥処理葉身を切断し、２０％グリセリンを含浸させた。含浸した乾燥処理タバコを加熱することによって生成したエアロゾル（１００ｍｇ、３回の完全な複製）を、ケンブリッジフィルターパッドに捕集する。ＰＡＤを、１０ｍＬ水／ＥｔＯＨ（９／１、体積／体積）を含有するバイアルに導入した。β−ダマセノンを、スターバー抽出法によって抽出した（Lancas et al. (2009) J. Sep. Sci. 32, 813-824に記載の通り）。この方法により、吸着相に対して親和性を表す化合物を抽出できる。攪拌子を、ＧＣ−ＭＳ注入器に加熱脱着させ、β−ダマセノンについて分析する。ＴＮ９０（対照）と比較して、ＮｔＡＢＡ４−２＿２試料は、エアロゾル中のβ−ダマセノンについて６８％の増加を示した（図７）。この差異は、統計学的に妥当である（Ｐ＜０．０１、Ｔ検定）。これらの結果は、乾燥処理した葉中のβ−ダマセノンに対する前駆体のプールが、ＮｔＡＢＡ４の異所的発現によって増強され、一方で他の２つの標的遺伝子、ＮｔＮｅＳｙ（過剰発現）およびＮｔＮＣＥＤ２（干渉ＲＮＡサイレンシング）の作用がＴＮ９０対照に似ていることを示唆している。したがって、タバコの葉において、ＮｔＮｅＳｙまたはＮｔＮＣＥＤを工学的に作製するのではなくＮｔＡＢＡ４を過剰発現させることによって、β−ダマセノン前駆体の産生を高められる可能性がある。
【０１８６】
本明細書において引用または記載されるいずれの出版物も、本出願の出願日の前に開示された関連情報を提供している。本明細書における記述は、本発明者にはそのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきでない。上の明細書に記載の出版物は全て、参照により本明細書に組み込む。本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者には明らかになる。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されるが、本発明は、請求されている通り、そのような特定の実施形態に過度に制限されるべきでないことは理解されよう。実際に、細胞、分子および植物生物学または関連する分野の当業者には明らかである本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、以下の請求の範囲内にあるものとする。
【０１８７】
配列
配列番号１（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＡＢＡ４のヌクレオチド配列）
配列番号２（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＡＢＡ４のアミノ酸配列）
配列番号３（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含む、ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｔＡＢＡ４の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号４（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含まない、ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｔＡＢＡ４の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号５（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｔＡＢＡ４の増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号６（ニコチアナ・タバカムＨｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ由来ＡＢＡ４のヌクレオチド配列）
配列番号７（ニコチアナ・タバカムＨｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ由来ＡＢＡ４のアミノ酸配列）
配列番号８（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｅＳｙのヌクレオチド配列）
配列番号９（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｅＳｙのアミノ酸配列）
配列番号１０（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含む、ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｅＳｙの増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号１１（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含まない、ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｅＳｙの増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号１２（ニコチアナ・タバカムＫ３２６由来ＮｅＳｙの増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号１３（ニコチアナ・タバカム由来ＮＣＥＤ２のヌクレオチド配列）
配列番号１４（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含む、ニコチアナ・タバカム由来ＮＣＥＤ２の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号１５（プライマー中にクローニング用のｃａｃｃ配列を含まない、ニコチアナ・タバカム由来ＮＣＥＤ２の増幅に使用したフォワードプライマーのヌクレオチド配列）
配列番号１６（ニコチアナ・タバカム由来ＮＣＥＤ２の増幅に使用したリバースプライマーのヌクレオチド配列）
【０１８８】
0006302407.tif 000003
0006302407.tif 000004
0006302407.tif 000005
0006302407.tif 000006
【図１】
0006302407.tif 000007
【図２】
0006302407.tif 000008
【図３−１】
0006302407.tif 000009
【図３−２】
0006302407.tif 000010
【図４】
0006302407.tif 000011
【図５】
0006302407.tif 000012
【図６】
0006302407.tif 000013
【図７】
0006302407.tif 000014
【配列表】
0006302407000001.xml