(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメソテリンに特異的に結合する単離ヒト可変重鎖（ＶＨ）単一ドメインモノクローナル抗体であって、前記抗体は、以下：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、５１〜５８、および９７〜１０３；または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５１〜６６、および９９〜１０２；
としてそれぞれ示される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項４】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号２を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項５】
前記抗体がキメラ抗体または合成抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項６】
前記抗体が標識されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項７】
前記標識が、蛍光標識、酵素標識、または放射性標識である、請求項６に記載の単離モノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体およびエフェクター分子を含む単離免疫抱合体。
【請求項９】
前記エフェクター分子が毒素である、請求項８に記載の単離免疫抱合体。
【請求項１０】
前記毒素がシュードモナス外毒素またはそのバリアントである、請求項９に記載の単離免疫抱合体。
【請求項１１】
前記シュードモナス外毒素またはそのバリアントが、配列番号３〜８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離免疫抱合体。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体および異種タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
前記異種タンパク質がヒトＦｃである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む二重特異性抗体。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および治療薬を含む単離免疫抱合体。
【請求項１７】
前記治療薬が薬物を含む、請求項１６に記載の単離免疫抱合体。
【請求項１８】
薬学的に許容され得るキャリア中に治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体とＦｃ領域を含む融合タンパク質、請求項８〜１１および１６〜１７のいずれか１項に記載の免疫抱合体、または請求項１３に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項１９】
被験体におけるメソテリン発現癌を処置するための組成物であって、治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体とＦｃ領域を含む融合タンパク質、請求項８〜１１および１６〜１７のいずれか１項に記載の免疫抱合体、請求項１３に記載の融合タンパク質、または請求項１８に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項２０】
被験体におけるメソテリン発現腫瘍の成長または転移を阻害するための組成物であって、治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体とＦｃ領域を含む融合タンパク質、請求項８〜１１および１６〜１７のいずれか１項に記載の免疫抱合体、請求項１３に記載の融合タンパク質、または請求項１８に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項２１】
被験体が癌を有するかどうかを決定するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物であって、
前記被験体由来のサンプルが請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触され、
前記サンプルへの前記抗体の結合が検出され、
ここで、コントロールサンプルへの前記抗体の結合と比較した場合の前記サンプルへの前記抗体の結合の増大により、前記被験体が癌を有すると同定されることを特徴とする、組成物。
【請求項２２】
被験体における癌の診断を確認するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物であって、
癌と診断された前記被験体由来のサンプルが請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触され、
前記サンプルへの前記抗体の結合が検出され、
ここで、コントロールサンプルへの前記抗体の結合と比較した場合の前記サンプルへの前記抗体の結合の増大により、前記被験体における癌の診断が確認されることを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
前記癌または腫瘍が、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または卵巣癌である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の免疫抱合体、または請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質をコードする、単離核酸分子。
【請求項２５】
前記モノクローナル抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列が配列番号１を含む、請求項２４に記載の単離核酸分子。
【請求項２６】
プロモーターに作動可能に連結された請求項２４または請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターで形質転換された単離宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年９月２７日に出願された米国仮出願第６１／７０６，３９６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、メソテリンに特異的な単一ドメインモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体に関する。本開示は、さらに、癌の検出および処置などのためのかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
メソテリンは、悪性中皮腫（Ｃｈａｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１８１−１８６，１９９２；Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１３６−１４０，１９９６）および他の固形腫瘍（胃癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、胆管癌、乳癌、および卵巣癌（Ｈａｓｓａｎら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：３９３７−３９４２，２００４；ＭｃＧｕｉｒｅら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１−６，１９９６；Ａｒｇａｎｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：３８６２−３８６８，２００１；Ｈａｓｓａｎら，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１３：２４３−２４７，２００５；Ｌｉら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７：２８６−２９６，２００８；Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１７４９，２０１０；Ｔｃｈｏｕら，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  １３３（２）：７９９−８０４，２０１２；米国特許第７，０８１，５１８号）など）で高発現するので、治療標的として提案されている。
【０００４】
メソテリン（ＭＳＬＮ）遺伝子は、約３０ｋＤａのＮ末端タンパク質および約４０ｋＤａのＣ末端膜結合成熟メソテリンにプロセシングされる約７０ｋＤａの前駆体タンパク質をコードする（Ｈａｓｓａｎ  ａｎｄ  Ｈｏ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４：４６−５３，２００８）。ここ２０年で、多数の抗メソテリンモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（ＳＳ１Ｐ免疫毒素およびＭＯＲＡｂ−００９（アマツキシマブとしても公知）が含まれる）が開発されており、これらは現在中皮腫および他の癌の臨床試験で評価されている（Ｈａｓｓａｎ  ａｎｄ  Ｈｏ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４：４６−５３，２００８；Ｈｏ，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  ２５：２７５−２８４，２０１１）。ＳＳ１Ｐは、細胞死滅を媒介する短縮シュードモナス外毒素に融合したマウス抗メソテリンＦｖからなる組換え免疫毒素である（Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｈａｓｓａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−５６５，２００６）。化学療法と組み合わせたＳＳ１Ｐの臨床試験が現在進行中である。ＭＯＲＡｂ−００９（マウスＳＳ１Ｆｖをベースとしたキメラ（マウス／ヒト）抗体）は、メソテリン保有腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）。
【０００５】
米国国立がん研究所（ＮＣＩ）において、最近、メソテリンを認識する２つの完全なヒトｍＡｂ（ｍ９１２およびＨＮ１）が生成された（Ｆｅｎｇら，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ８：１１１３−１１１８，２００９；Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，２０１１）。ＨＮ１ヒトＦｖは、ファージディスプレイライブラリーから単離され、完全ヒトＩｇＧが生成された。ＨＮ１免疫毒素は、短縮シュードモナス外毒素ＡへのＨＮ１Ｆｖの融合によっても生成された（ＰＥ３８）（Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，２０１１）。ＨＮ１ＩｇＧは、細胞表面会合メソテリンに結合し、非常に強力なＡＤＣＣで癌細胞を死滅させる。ＨＮ１ヒト抗体は、メソテリン中のＳＳ１部位と重複する高次構造エピトープを認識する。これは、ＨＮ１をＳＳ１ベースのｍＡｂの完全ヒトバージョン（ＭＯＲＡｂ−００９など）として開発することができることを示している。いくつかの公知のメソテリンｍＡｂが利用可能であるにもかかわらず、腫瘍細胞に対して補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を示すものは存在しなかった。したがって、現在のメソテリン標的療法は、強いＣＤＣを有する抗メソテリンｍＡｂの欠如が足かせとなっている。
【０００６】
ＣＤＣは、治療抗体の重要な細胞死滅機構である（Ｗｅｉｎｅｒら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：３１７−３２７，２０１０）。癌治療のための第１の承認ｍＡｂ（リツキシマブ）は、その抗腫瘍活性がＣＤＣに一部依存する。前臨床研究では、その抗腫瘍活性は、Ｃ１ｑ欠損マウスにおいて完全に破壊された（Ｄｉ  Ｇａｅｔａｎｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：１５８１−１５８７，２００３）。補体の枯渇はまた、Ｂ細胞リンパ腫の異種移植片モデルにおいてその活性を減少させた（Ｃｒａｇｇ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３，２００４）。抗体結合部位が細胞膜に近い場合にＣＤＣが起こり得ることが示唆されている（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，２００９）。これの証拠として、リツキシマブよりも細胞膜の遙か近くに結合するオファツムマブはＣＤＣ活性もはるかに高い（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，２００９）。ほとんどすべての既存のメソテリンｍＡｂおよび免疫毒素（ＨＮ１およびＳＳ１Ｐ／ＭＯＲＡｂ−００９が含まれる）は、領域Ｉ（細胞膜から離れて存在すると推定される細胞表面メソテリンのＮ末端）を認識する（Ｋａｎｅｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３７３９−３７４９，２００９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，０８１，５１８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９２）５２：１８１〜１８６
【非特許文献２】Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：１３６〜１４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
概要
メソテリン特異的ヒト単一ドメイン（ＶＨ）抗体（ＳＤ１およびＳＤ２という）を本明細書中に開示する。ＳＤ１抗体は、ヒトメソテリンのＣ末端で高次構造エピトープに結合し、メソテリン発現腫瘍細胞に対してＡＤＣＣだけでなく強いＣＤＣ活性も示す。ＳＤ２は、全長ヒトメソテリンに特異的であるが、メソテリンのＣ末端メソテリンペプチドに結合しない。
【００１０】
ＳＤ１またはＳＤ２の１つ以上の（３つ全てなどの）ＣＤＲを含むモノクローナル抗体を本明細書中に提供する。本明細書中に提供した抗体には、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ抗体など）ならびに抗体フラグメントおよび単一ドメイン（ＶＨ）抗体が含まれる。例えばメソテリンに特異的に結合する抗体、これらの抗体をコードする核酸分子、核酸分子を含む発現ベクター、および核酸分子を発現する単離宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。本明細書中に開示の抗体およびエフェクター分子（毒素など）を含む免疫抱合体も提供する。抗体を含む融合タンパク質（ヒトＦｃを含む融合タンパク質など）も提供する。
【００１１】
本明細書中に提供した抗体および組成物を、種々の目的（メソテリンを発現する癌（例えば、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌）の診断の確認のためなど）のために使用することができる。したがって、癌と診断された被験体由来のサンプルをメソテリンに結合するモノクローナル抗体と接触させること、およびサンプルへの抗体の結合を検出することによる被験体における癌診断の確認方法を本明細書中に提供する。コントロールサンプルへの抗体の結合と比較したサンプルへの抗体の結合の増大により、癌診断が確認される。いくつかの実施形態では、本方法は、メソテリン特異的抗体を特異的に認識する第２の抗体をサンプルと接触させる工程、および第２の抗体の結合を検出する工程をさらに含む。
【００１２】
同様に、被験体におけるメソテリンを発現する癌の検出方法を本明細書中に提供する。本方法は、被験体由来のサンプルを本明細書中に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程、およびサンプルへの抗体の結合を検出する工程を含む。コントロールサンプルと比較したサンプルへの抗体の結合の増大により、被験体における癌が検出される。いくつかの実施形態では、本方法は、メソテリン特異的抗体を特異的に認識する第２の抗体をサンプルと接触させる工程、および第２の抗体の結合を検出する工程をさらに含む。
【００１３】
メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および治療有効量のメソテリンに特異的なモノクローナル抗体、または免疫抱合体、融合タンパク質、もしくは抗体を含む組成物を被験体に投与することによる、メソテリン発現癌（例えば、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌）を有する被験体の処置方法をさらに提供する。
【００１４】
メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および治療有効量の本明細書中に開示の抗体、免疫抱合体、融合タンパク質、または組成物を被験体に投与することによる、被験体におけるメソテリン発現癌の腫瘍の成長または転移を阻害する方法も提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトメソテリンに特異的に結合する単離モノクローナル抗体であって、前記抗体のＶＨドメインは、以下：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、５１〜５８、および９７〜１０３；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５１〜６６、および９９〜１０２；
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜５７、および９６〜１１１；または
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５、および９９〜１０６
を含む、単離モノクローナル抗体。
（項目２）
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２または配列番号１５と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、項目１に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目３）
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号２または配列番号１５を含む、項目１に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目４）
前記抗体が単一ドメイン抗体である、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目５）
前記抗体が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド安定化可変フラグメント（ｄｓＦｖ）である、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目６）
前記抗体がＩｇＧである、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目７）
前記抗体がキメラ抗体または合成抗体である、項目１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目８）
前記抗体が標識されている、項目１〜７のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目９）
前記標識が、蛍光標識、酵素標識、または放射性標識である、項目８に記載の単離モノクローナル抗体。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体およびエフェクター分子を含む単離免疫抱合体。
（項目１１）
前記エフェクター分子が毒素である、項目１０に記載の単離免疫抱合体。
（項目１２）
前記毒素がシュードモナス外毒素またはそのバリアントである、項目１１に記載の単離免疫抱合体。
（項目１３）
前記シュードモナス外毒素またはそのバリアントが、配列番号３〜８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の単離免疫抱合体。
（項目１４）
項目１〜９のいずれか１項に記載の抗体および異種タンパク質を含む、融合タンパク質。
（項目１５）
前記異種タンパク質がヒトＦｃである、項目１４に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
薬学的に許容され得るキャリア中に治療有効量の項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、項目１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫抱合体、または項目１４もしくは項目１５に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
（項目１７）
被験体におけるメソテリン発現癌を処置する方法であって、メソテリン発現癌を有する被験体を選択する工程、および治療有効量の項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、項目１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫抱合体、項目１４もしくは項目１５に記載の融合タンパク質、または項目１６に記載の組成物を前記被験体に投与し、それにより、前記メソテリン発現癌を処置する工程を含む、方法。
（項目１８）
被験体におけるメソテリン発現腫瘍の成長または転移を阻害する方法であって、メソテリン発現腫瘍を有する被験体を選択する工程、および治療有効量の項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、項目１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫抱合体、項目１４もしくは項目１５に記載の融合タンパク質、または項目１６に記載の組成物を前記被験体に投与し、それにより、腫瘍の成長または転移を阻害する工程を含む、方法。
（項目１９）
被験体が癌を有するかどうかを決定する方法であって、
前記被験体由来のサンプルを項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；および
前記サンプルへの前記抗体の結合を検出する工程
を含み、
ここで、コントロールサンプルへの前記抗体の結合と比較した場合の前記サンプルへの前記抗体の結合の増大により、前記被験体が癌を有すると同定される、方法。
（項目２０）
被験体における癌の診断を確認する方法であって、
癌と診断された被験体由来のサンプルを項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；および
前記サンプルへの前記抗体の結合を検出する工程
を含み、
ここで、コントロールサンプルへの前記抗体の結合と比較した場合の前記サンプルへの前記抗体の結合の増大により、前記被験体における癌の診断が確認される、方法。
（項目２１）
前記癌が、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または卵巣癌である、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
項目１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、項目１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫抱合体、または項目１４もしくは項目１５に記載の融合タンパク質をコードする、単離核酸分子。
（項目２３）
前記モノクローナル抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号１４を含む、項目２２に記載の単離核酸分子。
（項目２４）
プロモーターに作動可能に連結された項目２２または項目２３に記載の単離核酸分子。
（項目２５）
項目２２〜２４のいずれか１項に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
（項目２６）
項目２２〜２５のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターで形質転換された単離宿主細胞。
【００１５】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄ：メソテリンのＣ末端に対するヒト単一ドメイン抗体の生成。（図１Ａ）ファージディスプレイテクノロジーによるヒト抗体のスクリーニングのために使用したペプチドのデザイン。膜結合メソテリン中の３つの機能的領域を以下に提案する：（配列番号９の）領域Ｉ：２９６〜３９０；領域ＩＩ：３９１〜４８６；領域ＩＩＩ：４８７〜５９８。細胞表面メソテリン上の３つの推定Ｎ連結グリカン（Ａｓｎ３８８、Ａｓｎ４８８、およびＡｓｎ５１５）を示す。本研究で使用したペプチドは、メソテリンのＣ末端の５０残基（配列番号９の残基５３９〜５８８）を含む。（図１Ｂ）操作したヒト抗体ドメイン（ＶＨ）ファージディスプレイライブラリーを、Ｃ末端メソテリンペプチド（残基５３９〜５８８）に対する４ラウンドのファージパニングのために使用した。（図１Ｃ）モノクローナルファージＥＬＩＳＡ実験を、４ラウンドのパニングの終了時に行った。ＳＤ１ファージクローン（クローン１）は強いシグナルを伴って全長メソテリンおよびＣ末端ペプチドの両方に結合するので、これをさらなる分析のために選択した。（図１Ｄ）モノクローナルファージＥＬＩＳＡ実験を、２つの選択された抗体ファージクローン（ＳＤ１およびＳＤ２）を使用して行った。ＳＤ１クローンは、全長ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）およびメソテリンペプチドの両方に結合する。ＳＤ２は、ＭＳＬＮのみに結合し、ペプチドには結合しない。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄ：メソテリンのＣ末端に対するヒト単一ドメイン抗体の生成。（図１Ａ）ファージディスプレイテクノロジーによるヒト抗体のスクリーニングのために使用したペプチドのデザイン。膜結合メソテリン中の３つの機能的領域を以下に提案する：（配列番号９の）領域Ｉ：２９６〜３９０；領域ＩＩ：３９１〜４８６；領域ＩＩＩ：４８７〜５９８。細胞表面メソテリン上の３つの推定Ｎ連結グリカン（Ａｓｎ３８８、Ａｓｎ４８８、およびＡｓｎ５１５）を示す。本研究で使用したペプチドは、メソテリンのＣ末端の５０残基（配列番号９の残基５３９〜５８８）を含む。（図１Ｂ）操作したヒト抗体ドメイン（ＶＨ）ファージディスプレイライブラリーを、Ｃ末端メソテリンペプチド（残基５３９〜５８８）に対する４ラウンドのファージパニングのために使用した。（図１Ｃ）モノクローナルファージＥＬＩＳＡ実験を、４ラウンドのパニングの終了時に行った。ＳＤ１ファージクローン（クローン１）は強いシグナルを伴って全長メソテリンおよびＣ末端ペプチドの両方に結合するので、これをさらなる分析のために選択した。（図１Ｄ）モノクローナルファージＥＬＩＳＡ実験を、２つの選択された抗体ファージクローン（ＳＤ１およびＳＤ２）を使用して行った。ＳＤ１クローンは、全長ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）およびメソテリンペプチドの両方に結合する。ＳＤ２は、ＭＳＬＮのみに結合し、ペプチドには結合しない。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ：ＳＤ１ヒトＦｃ融合タンパク質の産生および分析。（図２Ａ）非還元条件下および還元条件下での精製ＳＤ１−ｈＦｃ（４μｇのタンパク質／レーン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質の純度は、９５％を超えていた。ＮＲ：非還元；Ｒ：還元。（図２Ｂ）Ａ４３１／Ｈ９（類上皮癌Ａ４３１細胞株中のメソテリンの強制発現）（Ｈｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３８１４−３８２０，２００５）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（中皮腫）、およびＫＭＢＣ（胆管癌）の各細胞抽出物中の内因性メソテリンタンパク質の免疫沈降。ＳＤ１を使用して、細胞ライセート中の内因性メソテリンタンパク質を免疫沈降させた。Ｃ：無関係のＶＨ単一ドメインヒトＦｃ融合物；ＩＰ：免疫沈降；インプット：免疫沈降前の全細胞ライセートに対するウェスタンブロット。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄ：ＳＤ１−ｈＦｃの結合特性。（図３Ａ）直接ＥＬＩＳＡ。ＳＤ１−ｈＦｃは、全長ヒトメソテリンタンパク質（ＭＳＬＮ）およびペプチドの両方に結合したが、マウスメソテリン（ｍＭＳＬＮ）やＢＳＡに結合しなかった。（図３Ｂ）競合ＥＬＩＳＡ。メソテリンペプチドは、ＳＤ１−ｈＦｃのヒトメソテリンタンパク質への結合を競合したが、ＳＳ１Ｐ、ＨＮ１、または５０残基を含む無関係のペプチドは競合しなかった。（図３Ｃ）ヒトメソテリンタンパク質に対するＳＤ１−ｈＦｃの解離平衡ＫＤは、１３．５８ｎＭであり、（図３Ｄ）ペプチドについては１６．０８ｎＭであった。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄ：ＳＤ１−ｈＦｃの結合特性。（図３Ａ）直接ＥＬＩＳＡ。ＳＤ１−ｈＦｃは、全長ヒトメソテリンタンパク質（ＭＳＬＮ）およびペプチドの両方に結合したが、マウスメソテリン（ｍＭＳＬＮ）やＢＳＡに結合しなかった。（図３Ｂ）競合ＥＬＩＳＡ。メソテリンペプチドは、ＳＤ１−ｈＦｃのヒトメソテリンタンパク質への結合を競合したが、ＳＳ１Ｐ、ＨＮ１、または５０残基を含む無関係のペプチドは競合しなかった。（図３Ｃ）ヒトメソテリンタンパク質に対するＳＤ１−ｈＦｃの解離平衡ＫＤは、１３．５８ｎＭであり、（図３Ｄ）ペプチドについては１６．０８ｎＭであった。
【図４】図４：メソテリン発現癌細胞およびコントロール癌細胞に関するＳＤ１−ｈＦｃタンパク質のフローサイトメトリー分析。ＳＤ１−ｈＦｃは、安定なメソテリンｃＤＮＡでトランスフェクトしたＡ４３１／Ｈ９細胞株に結合したが、Ａ４３１細胞株には結合しなかった。抗体はまた、本研究で試験した４つのヒト癌細胞株のうちの３つに結合した。ＯＶＣＡＲ８：卵巣癌；ＮＣＩ−Ｈ２２６：中皮腫；ＥＫＶＸおよびＬ５５：ＮＳＣＬＣ；ＫＭＢＣ、Ｍｚ−ＣｈＡ−１、およびＨｕＣＣＴ１：胆管癌。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｈ：ＳＤ１−ｈＦｃは、メソテリン発現癌細胞に対してＣＤＣおよびＡＤＣＣを引き起こした。（図５Ａ、５Ｂ）ＣＤＣアッセイ。Ａ４３１／Ｈ９細胞（図５Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ２２６（図５Ｂ）細胞を、補体供給源としての正常ヒト血清（ＮＨＳ、２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）の存在下で、漸増濃度のＳＤ１−ｈＦｃと共にインキュベートした。補体タンパク質Ｃ１ｑは、ＳＤ１−ｈＦｃの存在下でＨ９細胞（図５Ｃ）およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（図５Ｄ）に結合したが、ＨＮ１やコントロールｈＦｃ融合タンパク質の存在下では結合しなかった。（図５Ｅ〜５Ｈ）ＡＤＣＣアッセイ。新たに単離したＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＤ１−ｈＦｃの存在下で標的細胞であるＡ４３１／Ｈ９細胞（図５Ｅ）またはＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（図５Ｆ）と５０：１の比率でインキュベートした。精製ヒトＮＫ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で標的細胞であるＡ４３１／Ｈ９（図５Ｇ）またはＮＣＩ−Ｈ２２６（図５Ｈ）と共に５０μｇ／ｍｌのＳＤ１−ｈＦｃを使用してインキュベートした。ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を、ＬＤＨアッセイによって決定した（＊：ｐ＜０．０５）。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｈ：ＳＤ１−ｈＦｃは、メソテリン発現癌細胞に対してＣＤＣおよびＡＤＣＣを引き起こした。（図５Ａ、５Ｂ）ＣＤＣアッセイ。Ａ４３１／Ｈ９細胞（図５Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ２２６（図５Ｂ）細胞を、補体供給源としての正常ヒト血清（ＮＨＳ、２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）の存在下で、漸増濃度のＳＤ１−ｈＦｃと共にインキュベートした。補体タンパク質Ｃ１ｑは、ＳＤ１−ｈＦｃの存在下でＨ９細胞（図５Ｃ）およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（図５Ｄ）に結合したが、ＨＮ１やコントロールｈＦｃ融合タンパク質の存在下では結合しなかった。（図５Ｅ〜５Ｈ）ＡＤＣＣアッセイ。新たに単離したＰＢＭＣを、漸増濃度のＳＤ１−ｈＦｃの存在下で標的細胞であるＡ４３１／Ｈ９細胞（図５Ｅ）またはＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（図５Ｆ）と５０：１の比率でインキュベートした。精製ヒトＮＫ細胞を、異なるＥ：Ｔ比で標的細胞であるＡ４３１／Ｈ９（図５Ｇ）またはＮＣＩ−Ｈ２２６（図５Ｈ）と共に５０μｇ／ｍｌのＳＤ１−ｈＦｃを使用してインキュベートした。ＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を、ＬＤＨアッセイによって決定した（＊：ｐ＜０．０５）。
【図６】図６Ａ〜６Ｄ：腫瘍成長に及ぼすＳＤ１−ｈＦｃの強力な抗腫瘍効果。（図６Ａ）Ａ４３１／Ｈ９細胞を、サイズがおよそ７０ｍｍ３の腫瘍を樹立するためにヌードマウスの側腹部に接種した。７日目から、マウスをＳＤ１−ｈＦｃ（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで１日おきに処置した。下向き矢印は、注射日を示す。各処置群の平均腫瘍サイズを、７〜２０日目に計算した（＊：ｐ＜０．０５）。（図６Ｂ）Ａ４３１／Ｈ９細胞を、マウス補体供給源としてのマウス正常血清（３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）の存在下で１００μｇ／ｍＬのＳＤ１−ｈＦｃとインキュベートした。ＣＤＣ活性を、ＬＤＨアッセイによって測定した（＊：ｐ＜０．０５）。（図６Ｃ）Ａ４３１／Ｈ９細胞を、マウスエフェクター細胞の供給源としての精製マウスＮＫ細胞の存在下で１００μｇ／ｍＬのＳＤ１−ｈＦｃとインキュベートした。マウスＡＤＣＣ活性を、ＬＤＨアッセイによって測定した（＊：ｐ＜０．０５）。（図６Ｄ）マウスＮＫ細胞の純度。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂ：ＳＤ１ベースの組換え免疫毒素の産生および分析。（図７Ａ）非還元条件下での精製ＳＤ１−ＰＥ３８（４μｇのタンパク質／レーン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＳＤ１−ＰＥ３８の純度は、９５％超であった。ＩＴ：免疫毒素。（図７Ｂ）ＳＤ１−ＰＥ３８免疫毒素で処置したＡ４３１／Ｈ９細胞、Ａ４３１細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、およびＫＭＢＣ細胞に対するＷＳＴ−８アッセイ。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂ：ＳＤ１ベースの組換え免疫毒素の産生および分析。（図７Ａ）非還元条件下での精製ＳＤ１−ＰＥ３８（４μｇのタンパク質／レーン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＳＤ１−ＰＥ３８の純度は、９５％超であった。ＩＴ：免疫毒素。（図７Ｂ）ＳＤ１−ＰＥ３８免疫毒素で処置したＡ４３１／Ｈ９細胞、Ａ４３１細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、およびＫＭＢＣ細胞に対するＷＳＴ−８アッセイ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
配列表
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、連邦規則法典第３７巻第１．８２２条に定義のヌクレオチド塩基の標準的な略称およびアミノ酸の三文字表記を使用して示す。各核酸配列について１つの鎖のみを示すが、表示の鎖のいずれかを参照することによって相補鎖が含まれることが理解される。配列表を、２０１３年９月１１日に作成したＡＳＣＩＩテキストファイル（２６．７ＫＢ）として提出し、このファイルは、本明細書中で参考として援用される。添付の配列表中、
配列番号１は、ＳＤ１単一ドメイン抗体のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号２は、ＳＤ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号３は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号４は、ＰＥ３８のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号５は、ＰＥ−ＬＲのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号６は、ＰＥ−ＬＲ／６Ｘのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号７は、免疫原性を減少させたＰＥのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号８は、ＰＥ−ＬＲ／８Ｍのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号９は、ヒトメソテリンのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１０〜１３は、プライマー配列である。
【００２７】
配列番号１４は、ＳＤ２単一ドメイン抗体のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１５は、ＳＤ２単一ドメイン抗体のアミノ酸配列である。
【００２９】
詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＤＣＣ    抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＣＡＲ    キメラ抗原受容体
ＣＤＣ    補体依存性細胞傷害性
ｃＤＮＡ    相補ＤＮＡ
ＣＤＲ    相補性決定領域
ＣＴＬ    細胞傷害性Ｔリンパ球
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＭ    エフェクター分子
ＦＡＣＳ    蛍光標示式細胞分取
ＧＰＩ    グリコシルホスファチジルイノシトール
ｈＦｃ    ヒトＦｃ
ＨＲＰ    セイヨウワサビペルオキシダーゼ
Ｉｇ    免疫グロブリン
ｉ．ｖ．    静脈内
ＫＤ    解離定数
ＬＤＨ    乳酸デヒドロゲナーゼ
ｍＡｂ    モノクローナル抗体
ＭＡＣ    膜侵襲複合体
ｍＭＳＬＮ  マウスメソテリン
ＭＳＬＮ    メソテリン
ＮＨＳ    正常ヒト血清
ＰＢＭＣ    末梢血単核球
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ    シュードモナス外毒素
ＰＥ    フィコエリトリン
ｐｆｕ    プラーク形成単位
ＲＩＰＡ    放射性免疫沈降アッセイ
ＶＨ    可変重鎖
ＶＬ    可変軽鎖  。
【００３０】
ＩＩ．用語と方法
別途記載がない限り、従来の用法にしたがって技術用語を使用する。分子生物学における共通の用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．発行，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．発行，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００３１】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、特定の用語について以下に説明する。
【００３２】
抗体：抗原（メソテリンなど）のエピトープまたはそのフラグメントを認識して結合する（特異的に認識して特異的に結合するなど）少なくとも１つの軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。免疫グロブリン分子は、重鎖および軽鎖から構成され、そのそれぞれが重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。全体として、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識された抗原の結合を担う。
【００３３】
抗体には、インタクトな免疫グロブリンならびに当該分野で周知の抗体のバリアントおよび一部（単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメイン抗体）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖドメイン（「ｄｓＦｖ」）など）が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合した融合タンパク質である一方で、ｄｓＦｖでは、鎖の会合を安定化するためにジスルフィド結合が導入されるように鎖が変異されている。用語「抗体」には、遺伝子操作された形態（キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ抱合体抗体（二重特異性抗体など）など）も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。
【００３４】
典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互連結された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２つの軽鎖型（ラムダ（λ）およびカッパ（κ））が存在する。抗体分子の機能的活性を決定づける５つの主な重鎖クラス（すなわち、アイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。
【００３５】
各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（これらの領域は、「ドメイン」としても公知である）を含む。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、共同して、抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって分断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：２０７−９，２００１を参照のこと）にしたがって定義されている。ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベースは、オンラインで利用可能である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種（ヒトなど）内で比較的保存されている。構成成分の軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組み合わせである抗体のフレームワーク領域は、三次元空間中にＣＤＲを位置づけ、そして整列させる働きをする。
【００３６】
ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲを、典型的には、Ｎ末端から順に番号をつけてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３といい、これらはしばしば特定のＣＤＲが存在する鎖によって同定される。したがって、ＶＨＣＤＲ３（またはＨ−ＣＤＲ３）は、これが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン中に存在するのに対して、ＶＬＣＤＲ１（またはＬ−ＣＤＲ１）は、これが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。メソテリンに結合する抗体は、例えば、特異的なＶＨ領域の配列およびＶＬ領域の配列、したがって、特異的ＣＤＲ配列を有するであろう。異なる特異性（すなわち、異なる抗原のための異なる組み合わせ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲというのは抗体ごとに異なるものであるにもかかわらず、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸の位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置を、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。
【００３７】
「ＶＨ」または「ＶＨ」という言及は、免疫グロブリン重鎖の可変領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの重鎖の可変領域が含まれる）をいう。「ＶＬ」または「ＶＬ」という言及は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖の可変領域が含まれる）をいう。
【００３８】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および／または重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞によって産生された抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法（例えば、骨髄腫細胞の免疫脾臓細胞との融合からのハイブリッド抗体形成細胞の作製）によって産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００３９】
「キメラ抗体」は、しばしば異なる動物種由来の２つ以上の異なる抗体分子由来の構造エレメントを含む。例えば、キメラ抗体は、ある種（ヒトなど）由来のフレームワーク残基および別の種（メソテリンに特異的に結合するマウス抗体など）由来のＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有することができる。
【００４０】
「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）は、ヒトフレームワーク領域およびヒト免疫グロブリン由来の全ＣＤＲを含む抗体である。一例を挙げれば、フレームワークおよびＣＤＲは、同一起源のヒト重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に由来する。しかし、あるヒト抗体由来のフレームワークを、異なるヒト抗体由来のＣＤＲを含むように操作することができる。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と名付けられ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と名付けられる。１つの実施形態では、全ＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合、定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならない（すなわち、少なくとも約８５〜９０％（約９５％以上など）同一）。それ故、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、おそらくＣＤＲを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一の抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得たアミノ酸と限定数の置換を行うことができる。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさないさらなる保存的アミノ酸置換を有することができる。ヒト化免疫グロブリンを、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【００４１】
結合親和性：抗原に対する抗体の親和性。１つの実施形態では、親和性を、Ｆｒａｎｋｅｌら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１−１０６，１９７９）によって記載のスキャッチャード法の修正形態によって計算する。別の実施形態では、結合親和性を、抗原／抗体解離速度によって測定する。別の実施形態では、高結合親和性を、競合放射免疫アッセイによって測定する。別の実施形態では、結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定する。抗原（メソテリンなど）に「特異的に結合する」抗体は、抗原に高親和性で結合し、他の無関係の抗原に有意には結合しない抗体である。
【００４２】
乳癌：乳房組織（通常、管路（乳頭に乳を運搬する管）および小葉（乳を作製する腺））中に形成される癌の型。トリプルネガティブ乳癌は、癌細胞がエストロゲン受容体や、プロゲステロン受容体や、有意なレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現しない乳癌型をいう。トリプルネガティブ乳癌はまた、ＥＲ陰性ＰＲ陰性ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性乳癌とも呼ばれる。
【００４３】
化学療法薬：異常細胞の成長によって特徴付けられる疾患の処置で治療有用性を有する任意の化学薬品。かかる疾患には、腫瘍、新生物、癌、ならびに乾癬などの過形成性成長によって特徴付けられる疾患が含まれる。１つの実施形態では、化学療法薬は、中皮腫または別の腫瘍（胃癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌など）の処置で用いる薬剤である。１つの実施形態では、化学療法薬は、放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法薬を容易に同定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙら，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第２版，著作権  ２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｅｒｙ，Ｒ．（ｅｄｓ．）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，第２版  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｎｏｂｆ，Ｍ．Ｆ．，Ｄｕｒｉｖａｇｅ，Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第４版  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。併用化学療法は、１種を超える癌処置剤の投与である。一例は、放射性化合物または化合物と組み合わせて使用したメソテリンに結合する抗体（または免疫抱合体）の投与である。
【００４４】
胆管癌：肝臓内の胆管に裏打ちされた細胞中に発症する癌の型である。
【００４５】
保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、タンパク質の親和性（メソテリンに対する抗体など）に実質的に影響を及ぼしたり親和性を減少させたりしない置換である。例えば、メソテリンに特異的に結合するモノクローナル抗体は、せいぜい約１、せいぜい約２、せいぜい約５、せいぜい約１０、またはせいぜい約１５の保存的置換を含むことができ、メソテリンポリペプチドに特異的に結合することができる。用語「保存的バリアント」はまた、抗体がメソテリンに特異的に結合するという条件での非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含む。非保存的置換は、メソテリンの活性またはメソテリンへの結合を減少させる置換である。
【００４６】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表は、当業者に周知である。以下の６群は、相互に保存的置換されると見なされるアミノ酸の例である。
【００４７】
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：全体で天然のＩｇ結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列。Ｉｇの軽鎖および重鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを有し、これらのＣＤＲはそれぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３ならびにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名されている。
【００４９】
接触：直接的に物理的に関連した位置であり、固体形態および液体形態の両方が含まれる。
【００５０】
細胞傷害性：生物の残りの細胞との対語としての標的にされることが意図された細胞に対する生物の分子の毒性（免疫毒素など）。１つの実施形態では、対照的に、用語「毒性」は、免疫毒素のターゲティング部分によって標的にされることが意図される細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性をいい、用語「動物毒性」は、免疫毒素によって標的にされることが意図される細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性による動物に対する免疫毒素の毒性をいう。
【００５１】
縮重バリアント：本開示の文脈では、「縮重バリアント」は、遺伝暗号の結果として縮重する配列を含むメソテリンポリペプチドまたはメソテリンに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドをいう。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどが１つを超えるコドンによって特定される。したがって、メソテリンポリペプチドまたはヌクレオチド配列によってコードされるメソテリンに結合する抗体のアミノ酸配列が不変である限り、全縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【００５２】
診断：病態（癌などであるが、これに限定されない）の存在または性質の同定。診断法は、感度および特異性で異なる。診断アッセイの「感度」は、試験で陽性の罹患個体の百分率（真陽性の百分率）である。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率（ここで、偽陽性率は試験で陽性の罹患していない個体の割合と定義する）である。特定の診断方法では病態の確定診断ができないが、この診断方法が診断に役立つ陽性の表示を提供すればそれで十分である。「予後」は、病態（癌または転移など）の発症（例えば、重症度）の可能性である。
【００５３】
エフェクター分子：キメラ分子が標的にする細胞に所望の影響を及ぼすことが意図されるキメラ分子の部分。エフェクター分子は、エフェクター部分（ＥＭ）、治療薬、もしくは診断薬、または類似の用語としても公知である。
【００５４】
治療薬には、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスなどの化合物が含まれる。核酸治療部分および核酸診断部分には、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡと共有結合性に架橋結合するための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。あるいは、抗メソテリン抗体などのターゲティング部分に連結した分子は、薬物、核酸（アンチセンス核酸など）、または循環系への直接曝露から保護することができる別の治療部分などの治療組成物を含むカプセル封入系（リポソームまたはミセルなど）であり得る。抗体に付着したリポソームの調製手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒら，Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ  ２８：３４１−３６５，１９８５を参照のこと）。診断薬または診断部分は、放射性同位体および他の検出可能な標識を含む。かかる目的に有用な検出可能な標識も当該分野で周知であり、放射性同位体（３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、および１２５Ｉなど）、フルオロフォア、化学発光剤、および酵素が含まれる。
【００５５】
エピトープ：抗原決定基。抗原性を示す（すなわち、特異的免疫応答を誘発する）特定の化学基またはペプチド配列が分子上に存在する。抗体は、ポリペプチド（メソテリンなど）上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。
【００５６】
フレームワーク領域：ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列。フレームワーク領域には、可変軽鎖フレームワーク領域および可変重鎖フレームワーク領域が含まれる。フレームワーク領域は、抗原結合に適切な方向にＣＤＲを保持する働きをする。
【００５７】
宿主細胞：ベクターが増殖することができ、そのＤＮＡが発現される細胞。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。本用語には、対象とされる宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に変異が生じ得るので、全子孫が親細胞と同一でなくて良いと理解される。しかし、かかる子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合に含まれる。
【００５８】
ハイブリドーマ：モノクローナル抗体産生のためのハイブリッド細胞。ハイブリドーマは、抗体産生細胞（免疫化動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）から得られるＢ細胞など）と骨髄腫細胞との融合によって産生される。
【００５９】
免疫応答：免疫系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球など）の刺激に対する応答。１つの実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。１つの実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答など）である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、この応答により特異的抗体が産生される。
【００６０】
免疫抱合体：抗体またはその機能的フラグメントへのエフェクター分子の供給結合性の連結。エフェクター分子は、検出可能な標識または免疫毒素であり得る。毒素の非限定的な具体例には、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ（ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０など））、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、またはその改変毒素、または直接もしくは間接的に細胞成長を阻害するか細胞を死滅させる他の毒物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的に肝臓毒性によって死亡させる高度に有毒な化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴを、毒素の未変性のターゲティング成分（ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖など）の除去および抗体などの異なるターゲティング部分との置換によって免疫毒素用の形態に改変することができる。「キメラ分子」は、エフェクター分子に抱合（カップリング）したターゲティング部分（リガンドまたは抗体など）である。用語「抱合した」または「連結した」は、２つのポリペプチドから１つの連続するポリペプチド分子を作製することをいう。１つの実施形態では、抗体をエフェクター分子に連結する。別の実施形態では、エフェクター分子に連結した抗体を、体内でのその半減期を増大させるために、脂質または他の分子、タンパク質またはペプチドにさらに連結する。化学的手段または組換え手段のいずれかによって連結することができる。１つの実施形態では、連結は化学的連結であり、抗体部分とエフェクター分子との間の反応によって２分子間に共有結合が形成されて１つの分子が形成される。抗体とエフェクター分子との間にペプチドリンカー（短いペプチド配列）を任意選択的に含めることができる。最初に個別の機能性を有する２分子（抗体およびエフェクター分子など）から免疫抱合体が調製されたので、これらの免疫抱合体を時折「キメラ分子」ともいう。したがって、用語「キメラ分子」は、本明細書中で使用する場合、エフェクター分子に抱合（カップリング）したターゲティング部分（リガンドまたは抗体など）をいう。
【００６１】
単離された：「単離された」生物学的構成要素（核酸、タンパク質（抗体が含まれる）、またはオルガネラなど）は、構成要素が天然に存在する環境（細胞など）中の他の生物学的構成要素（すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質およびオルガネラ）から実質的に分離または精製されている。「単離されている」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。本用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸を含む。
【００６２】
標識：分子の検出を容易にするために抗体またはタンパク質などの別の分子に直接または間接的に抱合した検出可能な化合物または組成物。標識の非限定的な具体例には、蛍光タグ、酵素結合、および放射性同位体が含まれる。１つの例では、「標識された抗体」は、抗体中への別の分子の組み込みをいう。例えば、標識は、検出可能なマーカー（放射性標識されたアミノ酸の組み込みまたはマークされたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着など）である。ポリペプチドおよび糖タンパク質の種々の標識方法は当該分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドのための標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、および１２５Ｉなど）、蛍光標識（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン光体など）、酵素標識（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーター（ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ、または磁性薬剤（ガドリニウムキレートなど）。いくつかの実施形態では、標識を、潜在的な立体障害を軽減するために種々の長さのスペーサーアームに付着させる。
【００６３】
リンカー：いくつかの場合、リンカーは、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合させる働きをする抗体結合フラグメント（Ｆｖフラグメントなど）内のペプチドである。「リンカー」はまた、エフェクター分子（細胞毒素または検出可能な標識など）にターゲティング部分（抗体など）を連結するように働くペプチドをいうことができる。
【００６４】
用語「抱合」、「接合」、「結合」、または「連結」は、２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子にすることまたは放射性核種もしくは他の分子をポリペプチド（ｓｃＦｖなど）に共有結合性に付着させることをいう。特定の文脈では、本用語には、エフェクター分子へのリガンド（抗体部分など）の接合への言及が含まれる。化学的手段または組換え手段のいずれかによって連結することができる。「化学的手段」は、抗体部分とエフェクター分子との間の反応であって、２分子間に共有結合が形成されて１つの分子が形成されるような反応をいう。
【００６５】
肺癌：肺組織内、通常は気道の管壁細胞内に形成される癌。２つの主な型は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。これらの型を、顕微鏡下での細胞の外観に基づいて診断する。
【００６６】
哺乳動物：本用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒト被験体および獣医学的被験体の両方が含まれる。
【００６７】
メソテリン：４０ｋＤａ細胞表面グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結糖タンパク質。ヒトメソテリンタンパク質を、７０ｋＤの前駆体として合成し、次いで、タンパク質分解性にプロセシングする。メソテリンの３０ｋＤアミノ末端が分泌され、これを巨核球増強因子という（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８０５  ８０８，１９９４）。４０ｋＤカルボキシル末端は、成熟メソテリンとして膜に結合したままである（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３６  １４０，１９９６）。例示的なメソテリンの核酸およびアミノ酸配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２５，０６８号；米国特許第６，０８３，５０２号；Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：９０，１９９４；Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１３６，１９９６；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：６３８，１９９７；およびＣｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９，１９９７に記載されている。ヒトメソテリンのアミノ酸配列を、配列番号９として本明細書中に記載する。メソテリンはまた、細胞内に残存するメソテリンタンパク質またはポリペプチドならびに分泌型および／または単離された細胞外のメソテリンタンパク質をいう。
【００６８】
中皮腫：内蔵を覆う厚膜として成長する胸膜および腹膜の管壁細胞に由来し、立方細胞によって裏打ちされた腺様腔を包囲することができる紡錘細胞または線維組織から構成される新生物型。中皮腫は、しばしば、肺、心臓、または腹部を裏打ちする組織に由来する。いくつかの場合、中皮腫は、アスベストへの曝露に起因する。
【００６９】
ＭＯＲＡｂ−００９：メソテリンに対して高い親和性および特異性を有するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナルＩｇＧ／κ。マウス抗メソテリンｓｃＦｖのＶＨ領域およびＶＬ領域を、メソテリン陽性細胞に関するメソテリンｃＤＮＡで免疫化したマウスの脾臓ｍＲＮＡから作製したファージディスプレイライブラリーのパニングによって得た。ＶＨ領域およびＶＬ領域を、ヒトＩｇＧ１およびκ定常領域を用いてインフレームでグラフティングした（Ｈａｓｓａｎ  ａｎｄ  Ｈｏ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４４（１）：４６−５３，２００８）。
【００７０】
新形成、悪性疾患、癌、または腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物性成長は腫瘍を生成し得る。個体内の腫瘍量は、腫瘍の数、容積、または重量として測定することができる「全身腫瘍組織量」である。転移しない腫瘍は、「良性」といわれる。周囲組織に侵入し、そして／または転移することができる腫瘍は、「悪性」といわれる。血液学的腫瘍の例には、白血病（急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）が含まれる）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度形態および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病、および脊髄形成異常が含まれる。
【００７１】
固形腫瘍（肉腫および癌腫など）の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、胆管癌、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、クロム親和性細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）が含まれる。
【００７２】
いくつかの例では、癌は、中皮腫、胃癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、胆管癌、乳癌、または卵巣癌である。
【００７３】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続し、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、同一の読み枠内に存在する。
【００７４】
卵巣癌：卵巣組織（卵子（すなわち、卵）が形成される女性生殖腺対のうちの１つ）中に形成される癌。ほとんどの卵巣癌は、卵巣上皮癌（卵巣表面上の細胞内に始まる癌）または悪性胚細胞腫瘍（卵細胞内に始まる癌）のいずれかである。
【００７５】
膵臓癌：悪性（癌）細胞が膵臓組織内に見いだされる疾患。外分泌癌とも呼ばれる。
【００７６】
医薬品：被験体または細胞に適切に投与した場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化合物または組成物。
【００７７】
薬学的に許容され得るキャリア：有用な薬学的に許容され得るキャリアは従来のキャリアである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版，１９７５は、本明細書中に開示の抗体の薬学的送達に適切な組成物および処方物を記載している。
【００７８】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口処方物は、通常、薬学的におよび生理学的に許容され得る流動物（水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（散剤、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態など）について、従来の非毒性固体キャリアには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中立のキャリアに加えて、投与すべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助剤（湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラート）など）を含むことができる。
【００７９】
疾患の防止、処置、または回復：疾患の「防止」は、疾患の完全な発症の抑制をいう。「処置」は、発症し始めた後の疾患または病的状態の兆候または症状を回復する治療的介入（全身腫瘍組織量の減少または転移の数またはサイズの減少など）をいう。「回復」は、癌などの疾患の兆候または症状の数または重症度の減少をいう。
【００８０】
前立腺癌：前立腺（膀胱下部および直腸前部に見いだされる男性生殖系中の腺）の組織内に形成される癌。前立腺癌は、通常、高齢男性で起こる。
【００８１】
精製：用語「精製」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製ペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が細胞内の天然の環境に存在するペプチドまたはタンパク質より豊富である調製物である。１つの実施形態では、タンパク質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％を示すように調製物を精製する。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を示す。実質的に精製されたタンパク質の純度は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％である。したがって、１つの非限定的な具体例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞成分を９０％含まない。
【００８２】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、２つの別の分離した配列セグメントの人為的組み合わせによって作製された配列を有する核酸である。この人為的組み合わせを、しばしば、化学合成または例えば遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの人為的操作によって行う。
【００８３】
組換え毒素：細胞ターゲティング部分が毒素に融合されたキメラタンパク質（Ｐａｓｔａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１１７３−１１７７，１９９１）。細胞ターゲティング部分が抗体のＦｖ部分である場合、分子を組換え免疫毒素と名付ける（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：３９４−３９７，１９８９）。毒素部分を、一般に、ほとんどの正常細胞上に存在する毒素受容体に結合できないように変更する。組換え免疫毒素は、抗原結合ドメインによって認識される細胞を選択的に死滅させる。これらの組換え毒素および免疫毒素を使用して、癌（例えば、メソテリンが発現される癌）を処置することができる。
【００８４】
サンプル（または生物サンプル）：被験体から得たゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡが含まれる）、タンパク質、またはその組み合わせを含む生物標本。例には、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織生検、穿刺吸引物、外科標本、および剖検材料が含まれるが、これらに限定されない。１つの例では、サンプルには、腫瘍生検（腫瘍生検など）が含まれる。
【００８５】
配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列の間の類似性を、配列間の類似性に関して示し、そうでなければ、配列同一性という。配列同一性は、頻繁に、同一率（または類似性または相同性）に関して測定され、百分率が高いほど２つの配列はより類似する。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインメントした場合に比較的高い配列同一度を有するであろう。
【００８６】
比較のための配列のアラインメント方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列アラインメント法および相同性計算について詳細に考察している。
【００８７】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、いくつかの供給元（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上が含まれる）から利用可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと組わせて使用する。このプログラムを使用した配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイト上で利用可能である。
【００８８】
メソテリンまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体のＶＬまたはＶＨのホモログおよびバリアントを、典型的には、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、デフォルトパラメーターに設定したギャップを考慮したｂｌａｓｔｐを使用した抗体のアミノ酸配列と全長アラインメントにわたってカウントした少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性によって特徴付けられる。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト１１および残基ごとのギャップコスト１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用したＢｌａｓｔ２配列関数を使用する。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、アラインメントを、デフォルトパラメーター（ギャップ開始ペナルティ９、ギャップ伸長ペナルティ１）に設定したＰＡＭ３０行列を使用したＢｌａｓｔ２配列関数を使用して行うべきである。基準配列に対してなお一層高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合に同一率が増加するであろう（少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性など）。全配列未満が配列同一性について比較される場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％配列同一性を有し、基準配列とのその類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。かかる短いウィンドウにわたる配列同一性の決定方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲がガイダンスのみを目的として提供され、この範囲外で非常に有意なホモログを得ることが完全に可能であると認識するであろう。
【００８９】
扁平上皮癌：重層扁平上皮に由来し、腺上皮または円柱上皮が通常存在する気管支粘膜などの部位内にも生じ得る悪性新生物。扁平上皮癌は、最も一般的な皮膚癌型である。
【００９０】
ＳＳ１Ｐ：細胞死滅を媒介する短縮シュードモナス外毒素に連結した抗メソテリンＦｖ（ＭＯＲＡｂ−００９と同一のＦｖ）からなる組換え免疫毒素（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：５６８−５７２，１９９９；Ｐａｓｔａｎら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：５５９−５６５，２００６）。ＣＡＴ−５００１としても公知のＳＳ１Ｐは、メソテリンを発現する細胞株に対して細胞傷害性を示し、ヌードマウスにおいてメソテリン発現腫瘍異種移植片を完全に後退させ、ヒト癌患者から得た細胞に対して細胞傷害性を示す（Ｈａｓｓａｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：３９３７−３９４２，２００１；Ｈａｓｓａｎら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：３５２０−３５２６，２００２）。
【００９１】
胃癌：胃を裏打ちする組織内に形成される癌。胃がんとも呼ばれる。
【００９２】
被験体：生きている多細胞脊椎動物（ヒトおよび獣医学的被験体（ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる）が含まれるカテゴリー）。
【００９３】
合成：実験室における人為的手段による産生物（例えば、ハイブリドーマテクノロジーによる産生されたかｃＤＮＡ構築物から発現したモノクローナル抗体）。
【００９４】
治療有効量：処置される被験体で所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量。例えば、これは、腫瘍成長の阻害または抑制に必要な量であり得る。１つの実施形態では、治療有効量は、腫瘍を排除するか、腫瘍のサイズを減少させるか、腫瘍の転移を防止するのに必要な量である。被験体に投与した場合、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の効果が達成された標的組織濃度（例えば、腫瘍内）を達成するであろう投薬量を使用するであろう。
【００９５】
毒素：細胞に細胞傷害性を示す分子。毒素には、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシン、ゲロニン、またはその改変毒素が含まれる。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的には肝臓毒性によって死に至る高度に有毒な化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴを、毒素の未変性のターゲティング成分（ＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖など）の除去および異なるターゲティング部分（抗体など）とのその置換によって免疫毒素として使用するための形態に改変することができる。
【００９６】
ベクター：宿主細胞に導入され、それにより、形質転換された宿主細胞が産生される核酸分子。ベクターは、宿主細胞内で複製される核酸配列（複製起点など）を含むことができる。ベクターはまた、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝子エレメントを含むことができる。
【００９７】
別の説明がない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者によって一般に理解される意味を有する。文脈上他の意味を明確に示さない限り、単数を示す用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数形が含まれる。「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢまたはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供しているとさらに理解すべきである。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な方法および材料を本開示の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中に言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書を優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００９８】
ＩＩＩ．緒言
メソテリンに対するモノクローナル抗体は、現在、中皮腫および他の複数の癌形態の処置について評価中であり、固形癌の臨床開発で非常に有望である。メソテリンに対する抗体は、腫瘍成長の免疫毒素ベースの阻害および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の誘導を介して作用することが示されている。しかし、腫瘍に対する治療抗体の最も重要な細胞死滅機構の１つと考えられている補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、かかる抗体について不活性である。ＳＤ１（メソテリンに対するヒト単一ドメイン抗体）を同定するためのファージディスプレイ抗体工学技術および合成ペプチドスクリーニングの使用を本明細書中に開示する。ＳＤ１は、細胞表面に近いメソテリンのＣ末端（配列番号９の残基５３９〜５８８）で高次構造エピトープを認識する。ＳＤ２（全長メソテリンを認識する単一ドメイン抗体）も同定した。潜在的な治療薬としてＳＤ１を調査するために、組換えヒトＦｃ（ＳＤ１−ｈＦｃ）融合タンパク質を生成した。ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、メソテリン発現腫瘍細胞に対して、ＡＤＣＣに加えて、強いＣＤＣ活性を示す。さらに、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片の腫瘍成長を有意に阻害する。ＳＤ１は、メソテリン発現腫瘍を標的にする第１のヒト単一ドメイン抗体である。本明細書中に開示の結果は、ＳＤ１が癌治療薬として使用することができ、且つメソテリン発現腫瘍を標的にする現在の抗体療法を超える有意な利点を示すことを証明している。
【００９９】
ＩＶ．メソテリン特異的モノクローナル抗体
ＳＤ１およびＳＤ２（メソテリンに特異的なヒト単一ドメイン抗体）を本明細書中に開示する。前述のメソテリン特異的治療抗体と対照的に、ＳＤ１は、メソテリンのＣ末端で高次構造エピトープを認識する。ヒトＦｃに融合する場合、ＳＤ１はメソテリン発現腫瘍細胞に対して強力なＣＤＣおよびＡＤＣＣを誘発する。メソテリン発現癌のマウス異種移植片モデルにおいてＳＤ１−ｈＦｃがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を有意に阻害することも本明細書中で証明する。ＳＤ２は、全長メソテリンを認識するが、メソテリンＣ末端フラグメントに結合しない。ＳＤ１およびＳＤ２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【０１００】
【化１】
0006307085.tif 000002
【０１０１】
メソテリン（細胞表面メソテリンまたは可溶性メソテリンなど）に結合する（例えば、特異的に結合する）単離モノクローナル抗体を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、抗体のＶＨドメインは、本明細書中に配列番号２または配列番号１５として記載のアミノ酸配列の少なくとも一部（ＩＭＧＴによって決定された配列番号２または配列番号１５由来の１つ以上の（３つ全てなどの）ＣＤＲ配列など）を含む。他の実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔ法を使用して決定した配列番号２または配列番号１５由来の１つ以上の（３つ全てなどの）ＣＤＲ配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、抗体のＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、５１〜５８、および９７〜１０３を含む。他の実施形態では、抗体のＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５、５１〜６６、および９９〜１０２を含む。いくつかの例では、抗体のＶＨドメインは、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の例では、抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２を含むか配列番号２からなる。
【０１０３】
他の実施形態では、抗体のＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸残基２６〜３３、５１〜５７、および９６〜１１１を含む。他の実施形態では、抗体のＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５、および９９〜１０６を含む。いくつかの例では、抗体のＶＨドメインは、配列番号１５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の例では、抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５を含むか配列番号１５からなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、メソテリンに結合する（特異的に結合するなど）モノクローナル抗体は単一ドメイン抗体である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、メソテリンに結合する（特異的に結合するなど）モノクローナル抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはジスルフィド安定化可変フラグメント（ｄｓＦｖ）である。他の実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子である。特定の例では、抗体はＩｇＧである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体または合成抗体である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、開示の抗体は、メソテリン（可溶性メソテリンまたは細胞表面メソテリン）に、約２０ｎＭ以下（約１８ｎＭ以下、１６ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下など）の解離定数（Ｋｄ）で結合する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、メソテリンに、約２０ｎＭ、約１９ｎＭ、約１７ｎＭ、約１６ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、または約１０ｎＭの結合親和性で結合する。
【０１０８】
本明細書中に開示のモノクローナル抗体を、蛍光標識、酵素標識、または放射性標識などで標識することができる。
【０１０９】
本明細書中に開示のモノクローナル抗体およびエフェクター分子を含む免疫抱合体も提供する。エフェクター分子は、例えば、毒素または検出可能な標識であり得る。いくつかの実施形態では、免疫抱合体は、本明細書中に開示のＶＨドメイン（ＳＤ１またはＳＤ２のＣＤＲ配列を含むか、配列番号２または配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインなど）および毒素（ＰＥまたはそのバリアント（したがって、ＰＥ３８など）など）を含む。特定の例では、免疫抱合体は、ＰＥ３８に融合したＳＤ１またはＳＤ２のＶＨを含む。いくつかの例では、毒素は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＰＥ３８である。免疫抱合体の例は、以下の第ＶＩ節でより詳細に考察している。
【０１１０】
本明細書中に開示の抗体および異種タンパク質を含む融合タンパク質も提供する。いくつかの例では、異種タンパク質はＦｃタンパク質である。１つの非限定的な例では、Ｆｃタンパク質はヒトＦｃタンパク質（ヒトＩｇＧγ１Ｆｃなど）である。
【０１１１】
治療有効量の開示の抗体、免疫抱合体、または融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を本明細書中にさらに提供する。
【０１１２】
開示のモノクローナル抗体、免疫抱合体、および融合タンパク質をコードする単離核酸分子も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１の少なくとも一部（抗体の１つ以上のＣＤＲをコードする部分など）を含む。いくつかの例では、モノクローナル抗体のＶＨドメインは、配列番号１を含む配列によってコードされる。他の実施形態では、モノクローナル抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４の少なくとも一部（抗体の１つ以上のＣＤＲをコードする部分など）を含む。いくつかの例では、モノクローナル抗体のＶＨドメインは、配列番号１４を含む配列によってコードされる。
【０１１３】
いくつかの例では、単離核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【０１１４】
本明細書中に開示の単離核酸分子を含む発現ベクターも提供する。核酸分子またはベクターを含む単離宿主細胞も本明細書中に提供する。いくつかの例では、宿主細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）など）である。
【０１１５】
Ｖ．抗体および抗体フラグメント
本明細書中に開示のモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであり得る。モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２など）であり得る。メソテリンに特異的に結合する抗体クラスを、周知の手順にしたがって、別の抗体クラスにスイッチングすることができる（例えば、ＩｇＧをＩｇＭにスイッチングすることができる）。クラススイッチを使用して、一方のＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することもできる（ＩｇＧ１からＩｇＧ２への変換など）。
【０１１６】
抗体フラグメントも本開示に含まれる（単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメイン抗体）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）。これらの抗体フラグメントは、抗原への選択的な結合能力を保持している。これらのフラグメントには、以下が含まれる：
（１）Ｆａｂ（抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含むフラグメントであって、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生成するための酵素パパインでの全抗体の消化によって産生することができる）；
（２）Ｆａｂ’（抗体分子のフラグメントを、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生成するための全抗体のペプシンでの処理およびその後の還元によって得ることができる。抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる）；
（３）（Ｆａｂ’）２（その後の還元を行わない酵素ペプシンでの全抗体の処置によって得ることができる抗体のフラグメント。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって共に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である）；
（４）Ｆｖ（２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント）；
（５）単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）（遺伝子融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子）；
（６）単鎖抗体の二量体（ｓｃＦＶ２）（ｓｃＦＶの二量体（「ミニ抗体」としても公知）として定義される）；および
（７）ＶＨ単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメインからなる抗体フラグメント）。
【０１１７】
これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。
【０１１８】
いくつかの場合、抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解性加水分解または宿主細胞（大腸菌など）内でのフラグメントをコードするＤＮＡの発現によって調製することができる。抗体フラグメントを、従来の方法による全抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、ペプシンでの抗体の酵素切断によって産生することができ、それにより、Ｆ（ａｂ’）２と命名された５Ｓフラグメントを得ることができる。このフラグメントを、チオール還元剤および任意選択的にジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のブロッキング基を使用してさらに切断して、１価の３．５Ｓ  Ｆａｂ’フラグメントを産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、２つの１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接産生される（米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号を参照のこと）。
【０１１９】
フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための抗体の他の切断方法（重鎖の分離）、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素技術、化学的技術、または遺伝学的技術も使用することができる。
【０１２０】
当業者は、抗体の保存的バリアントを産生することができると理解するであろう。抗体フラグメント（ｄｓＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントなど）において使用されるかかる保存的バリアントは、ＶＨ領域とＶＬ領域との間の正確な折り畳みおよび安定化に必要な重要なアミノ酸残基を保持し、分子の低ｐＩおよび低毒性を保存するための残基の電荷特性を保持するであろう。収率を増大させるために、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域内でアミノ酸置換（せいぜい１個、せいぜい２個、せいぜい３個、せいぜい４個、またはせいぜい５個のアミノ酸置換など）を行うことができる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６群は、相互に保存的置換されると見なされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１２１】
ＶＩ．免疫抱合体および融合タンパク質
メソテリンに特異的な開示のモノクローナル抗体を、治療薬またはエフェクター分子に抱合することができる。免疫抱合体には、抗体への治療薬の共有結合性の連結が存在する分子が含まれるが、これらに限定されない。治療薬は、特定の標的分子または標的分子を保有する細胞に施工する特定の生物学的活性を有する薬剤である。当業者は、治療薬には、種々の薬物（ビンブラスチンおよびダウノマイシンなど）、細胞毒素（未変性または改変されたシュードモナス外毒素またはジフテリア毒素など）、封入剤自体が薬理学的組成物を含む封入剤（リポソームなど）、放射性薬剤（１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、および３５Ｓなど）、ならびに他の標識、標的部分、およびリガンドが含まれ得ると認識するであろう。
【０１２２】
特定の治療薬の選択は、特定の標的分子または標的細胞および所望の生物学的影響に依存する。したがって、例えば、治療薬は、特定の標的細胞（腫瘍細胞など）を死滅させるために使用される細胞毒素であり得る。逆に、非致死性の生物学的応答を生じさせることを望む場合、治療薬を、非致死性の薬理学的物質または非致死性の薬理学的物質を含むリポソームに抱合することができる。
【０１２３】
本明細書中に記載の治療薬および抗体を使用して、当業者は、機能的に等価な核酸（配列が異なるが、同一のエフェクター部分または抗体配列をコードする核酸など）を含む種々のクローンを容易に構築することができる。したがって、本開示は、抗体ならびにその抱合体および融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１２４】
当業者に公知の多数の手段を使用して、エフェクター分子を目的の抗体に連結することができる。共有結合性および非共有結合性の付着手段の両方を使用することができる。エフェクター分子を抗体に付着させる手順は、エフェクターの化学構造によって異なる。ポリペプチドは、典型的には、エフェクター分子を結合させるための抗体上の適切な官能基との反応に利用可能な種々の官能基（カルボン酸基（ＣＯＯＨ）、遊離アミン基（−ＮＨ２）、またはスルフヒドリル基（−ＳＨ）など）を含む。あるいは、抗体を、さらなる反応性官能基に曝露または付着するように誘導体化する。誘導体化は、いくつかの公知のリンカー分子のうちのいずれかの付着を含み得る。リンカーは、抗体をエフェクター分子に接合するために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体およびエフェクター分子の両方への共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーを、その側鎖基を介して構成アミノ酸に接合することができる（ジスルフィド結合によるシステインへの接合など）か、末端アミノ酸のα炭素アミノ基およびカルボキシル基に接合することができる。
【０１２５】
いくつかの状況下では、免疫抱合体がその標的部位に到達した時にエフェクター分子を抗体から遊離させることが望ましい。したがって、これらの状況下では、免疫抱合体は、標的部位付近で切断可能な連結を含むであろう。抗体からエフェクター分子を放出させるためのリンカーの切断を、標的細胞の内側または標的部位付近のいずれかに免疫抱合体が供される酵素活性または酵素条件によって促進することができる。
【０１２６】
種々の放射線診断化合物、放射線治療化合物、標識（酵素または蛍光分子など）薬物、毒素、および他の薬物の抗体への付着について報告されている多数の方法を考慮して、当業者は、抗体または他のポリペプチドへの所与の薬剤の適切な付着方法を決定することができるであろう。
【０１２７】
本明細書中に開示の抗体または抗体フラグメントを誘導体化するか、別の分子（別のペプチドまたはタンパク質など）に連結することができる。いくつかの場合、抗体または抗体フラグメント（ＶＨドメインなど）を、異種タンパク質（例えば、Ｆｃタンパク質）に融合する。
【０１２８】
一般に、誘導体化または標識によって標的抗原への結合が悪影響を受けないように抗体またはその一部を誘導体化する。例えば、抗体を、（化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合的会合などによって）抗体または抗体部分の別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができる１つ以上の他の分子的実体（別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体）、検出剤、医薬品、および／またはタンパク質またはペプチドなど）に機能的に連結することができる。
【０１２９】
１つの誘導体化抗体型を、（同型または二重特異性抗体の作製などのための異なる型の）２つ以上の抗体の架橋によって産生する。適切な架橋剤には、適切なスペーサー（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）によって分離された２つの反応性が異なる基を有するヘテロ二官能性またはホモ二官能性（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）である架橋剤が含まれる。かかるリンカーは市販されている。
【０１３０】
メソテリンまたはそのフラグメントに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体を、検出可能な部分で標識することができる。有用な検出剤には、蛍光化合物（フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）スルホニルクロリド、フィコエリトリン、およびランタニドリン光体などが含まれる）が含まれる。生物発光マーカー（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）など）も有用である。抗体を、検出に有用な酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼなど）で標識することもできる。抗体を検出可能な酵素で標識する場合、抗体を、識別することができる反応生成物を産生するために酵素を使用するさらなる試薬の添加によって検出することができる。例えば、薬剤セイヨウワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、視覚的に検出可能な有色反応生成物が得られる。抗体を、ビオチンで標識し、アビジン結合またはストレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出することもできる。アビジン自体を酵素または蛍光標識で標識することができることに留意すべきである。
【０１３１】
抗体を、磁性薬剤（ガドリニウムなど）で標識することができる。抗体を、ランタニド（ユウロピウムおよびジスプロシウムなど）およびマンガンで標識することもできる。常磁性粒子（超常磁性酸化鉄など）も標識として有用である。抗体を、二次レポーター（ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施形態では、標識を、潜在的な立体障害を軽減するために種々の長さのスペーサーアームによって付着させる。
【０１３２】
抗体を、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。放射性標識を、診断目的および治療目的の両方のために使用することができる。例えば、放射性標識を使用して、Ｘ線、発光スペクトル、または他の診断技術によってメソテリンを検出することができる。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
【０１３３】
抗体を、化学基（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基またはエチル基、または炭水化物基など）で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴の改善（血清半減期の増加または組織結合の増大など）に有用であり得る。
【０１３４】
毒素を、本明細書中に記載のモノクローナル抗体と共に使用して免疫毒素を産生することができる。例示的な毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが含まれる。これらの毒素は、商業的供給元（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から容易に利用可能である。意図する毒素には、本明細書中に記載の毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６８９，４０１号を参照のこと）。１つの実施形態では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である（米国特許第５，６０２，０９５号）。本明細書中で使用する場合、「シュードモナス外毒素」は、全長未変性（天然に存在する）ＰＥまたは改変されたＰＥをいう。かかる改変には、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩ、およびＩＩＩ内の種々のアミノ酸の欠失、単一のアミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端での１つ以上の配列の付加が含まれ得るが、これらに限定されない（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１，１９８９を参照のこと）。
【０１３５】
本明細書中に記載のモノクローナル抗体と共に使用されるＰＥには、未変性配列、未変性配列の細胞傷害性フラグメント、ならびに未変性ＰＥの保存的に改変されたバリアントおよびその細胞傷害性フラグメントが含まれ得る。ＰＥの細胞傷害性フラグメントには、標的細胞内でのその後のタンパク質分解性プロセシングまたは他のプロセシングを行うか行わずに細胞傷害性を示すフラグメントが含まれる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントには、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５が含まれる。ＰＥおよびそのバリアントのさらなる説明については、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；同第５，５１２，６５８号；同第５，６０２，０９５号；同第５，６０８，０３９号；同第５，８２１，２３８号；および同第５，８５４，０４４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５１６４３号；Ｐａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３５８−３３６２，１９９１；Ｋｏｎｄｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５，１９８８；Ｐａｓｔａｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３３３：Ｃ１−Ｃ６，１９９７を参照のこと。
【０１３６】
全長ＰＥ配列を、本明細書中で配列番号３として記載する。
ＡＥＥＡＦＤＬＷＮＥＣＡＫＡＣＶＬＤＬＫＤＧＶＲＳＳＲＭＳＶＤＰＡＩＡＤＴＮＧＱＧＶＬＨＹＳＭＶＬＥＧＧＮＤＡＬＫＬＡＩＤＮＡＬＳＩＴＳＤＧＬＴＩＲＬＥＧＧＶＥＰＮＫＰＶＲＹＳＹＴＲＱＡＲＧＳＷＳＬＮＷＬＶＰＩＧＨＥＫＰＳＮＩＫＶＦＩＨＥＬＮＡＧＮＱＬＳＨＭＳＰＩＹＴＩＥＭＧＤＥＬＬＡＫＬＡＲＤＡＴＦＦＶＲＡＨＥＳＮＥＭＱＰＴＬＡＩＳＨＡＧＶＳＶＶＭＡＱＴＱＰＲＲＥＫＲＷＳＥＷＡＳＧＫＶＬＣＬＬＤＰＬＤＧＶＹＮＹＬＡＱＱＲＣＮＬＤＤＴＷＥＧＫＩＹＲＶＬＡＧＮＰＡＫＨＤＬＤＩＫＰＴＶＩＳＨＲＬＨＦＰＥＧＧＳＬＡＡＬＴＡＨＱＡＣＨＬＰＬＥＴＦＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷＮＱＶＤＱＶＩＲＮＡＬＡＳＰＧＳＧＧＤＬＧＥＡＩＲＥＱＰＥＱＡＲＬＡＬＴＬＡＡＡＥＳＥＲＦＶＲＱＧＴＧＮＤＥＡＧＡＡＮＡＤＶＶＳＬＴＣＰＶＡＡＧＥＣＡＧＰＡＤＳＧＤＡＬＬＥＲＮＹＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＲＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＲＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＲＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＲＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＫＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ  。
【０１３７】
いくつかの例では、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を含むＰＥ３８である。
ＧＧＳＬＡＡＬＴＡＨＱＡＣＨＬＰＬＥＴＦＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷＮＱＶＤＱＶＩＲＮＡＬＡＳＰＧＳＧＧＤＬＧＥＡＩＲＥＱＰＥＱＡＲＬＡＬＴＬＡＡＡＥＳＥＲＦＶＲＱＧＴＧＮＤＥＡＧＡＡＮＧＰＡＤＳＧＤＡＬＬＥＲＮＹＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＲＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＲＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＲＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＲＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＫＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ（配列番号４）  。
【０１３８】
プロテアーゼ耐性ＰＥバリアントおよび免疫原性が減少したＰＥバリアント（ＰＥ−ＬＲ、ＰＥ−６Ｘ、ＰＥ−８Ｘ、ＰＥ−ＬＲ／６Ｘ、およびＰＥ−ＬＲ／８Ｘなどであるが、これらに限定されない）も本明細書中で意図する（例えば、Ｗｅｌｄｏｎら，Ｂｌｏｏｄ  １１３（１６）：３７９２−３８００，２００９；Ｏｎｄａら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５（３２）：１１３１１−１１３１６，２００８；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０１６１５０号，ＷＯ２００９／０３２９５４号、およびＷＯ２０１１／０３２０２２号を参照のこと）。
【０１３９】
いくつかの例では、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するリソソーム分解耐性を示すバリアント（ＰＥ−ＬＲなど）である（Ｗｅｌｄｏｎら，Ｂｌｏｏｄ  １１３（１６）：３７９２−３８００，２００９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０３２９５４号）。
ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＲＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＲＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＲＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＲＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＫＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ（配列番号５）  。
【０１４０】
他の例では、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するＰＥ−ＬＲ／６Ｘと命名されたバリアントである（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０３２０２２）。
ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＧＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＡＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＡＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＡＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＳＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＳＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ（配列番号６）  。
【０１４１】
他の例では、ＰＥバリアントは、免疫原性が減少したＰＥ（以下の配列を有するＰＥなど）である
ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＸＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＸＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＸＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＸＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＸＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＸＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＸＥＸＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ  （Ｘ＝Ｇ、Ａ、またはＳ；配列番号７）  。
【０１４２】
他の例では、ＰＥは、以下のアミノ酸配列を有するＰＥ−ＬＲ／８Ｍと命名されたバリアントである（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０３２０２２号）。
ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＡＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＧＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＡＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＡＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＡＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＳＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＳＥＡＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ（配列番号８）  。
【０１４３】
ＰＥの置換を、本明細書中で配列番号３として記載した全長ＰＥのアミノ酸配列を参照して本明細書中に定義する。ＰＥの置換を、特定の位置に存在するアミノ酸残基、残基が特定の置換基で置換されたその後のアミノ酸を参照して本明細書中に記載する。これに関して、ＰＥの特定の実施形態のアミノ酸配列の位置を、本明細書中で、特定の実施形態のアミノ酸配列の位置または配列番号３によって定義した位置という。したがって、置換は、配列番号３の６１３−アミノ酸配列の表示の位置（各アミノ酸配列中の実際の位置は異なり得ると理解される）に対応するＰＥの特定の実施形態のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の置換をいう。２つ以上の位置での複数の置換事象では、２つ以上の置換は、同一でも異なっていてもよい−他で明確に示さない限り、置換される２つ以上のアミノ酸残基の各アミノ酸残基を、同一または異なるアミノ酸残基で置換することができる。
【０１４４】
ＰＥの改変は、任意の前述のバリアント（ＰＥの細胞傷害性フラグメント（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ−ＬＲ、およびＰＥ−ＬＲ／８Ｍ）が含まれる）中で生じ得る。改変されたＰＥは、上記のように、１つ以上のＰＥのＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基との任意の置換を含み得る。
【０１４５】
本明細書中に記載の抗体を使用して、多数の異なる診断化合物または治療化合物がその表面上にメソテリンを発現する細胞を標的にすることもできる。したがって、本開示の抗体を、細胞表面メソテリンを発現する細胞に直接送達させるべき薬物に直接またはリンカーを介して付着させることができる。治療目的、診断目的、または研究目的のためにこれを行うことができる。治療薬には、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスなどの化合物が含まれる。核酸治療部分および核酸診断部分には、アンチセンス核酸、単鎖または二重鎖のＤＮＡとの共有結合性の架橋のための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１４６】
あるいは、抗メソテリン抗体に連結した分子は、治療組成物（薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）など）または循環系への直接曝露から好ましく保護された別の治療部分含むリポソームまたはミセルなどのカプセル封入システムであり得る。抗体に付着したリポソームの調製方法は当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；Ｃｏｎｎｏｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５，１９８５を参照のこと）。
【０１４７】
本明細書中に記載の抗体を、検出可能な標識に共有結合的にまたは非共有結合的に連結することもできる。かかる用途に適切な検出可能な標識には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。有用な標識には、磁性ビーズ、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、テキサスレッド、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素など）、および比色分析標識（コロイド金または有色のガラスもしくはプラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックスなど）のビーズなど）が含まれる。
【０１４８】
かかる標識の検出手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識を、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーを、照度を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識を、典型的には、酵素への基質の提供および基質上の酵素作用によって生成される反応生成物の検出によって検出し、比色標識を、有色標識の簡潔な視覚化によって検出する。
【０１４９】
ＶＩＩ．組成物および使用方法
キャリア中のメソテリンに結合する（例えば、特異的に結合する）１つ以上の開示の抗体を含む組成物を提供する。融合タンパク質、免疫抱合体、または免疫毒素を含む組成物も提供する。組成物を、被験体への投与のための単位投薬形態に調製することができる。投与の量およびタイミングは、所望の結果を達成するために処置を担当する臨床医の裁量になる。抗体を、全身投与または局所投与（腫瘍内投与など）のために処方することができる。１つの例では、抗体を、非経口投与（静脈内投与など）のために処方する。
【０１５０】
投与のための組成物は、薬学的に許容され得るキャリア（水性キャリアなど）中に溶解した抗体溶液を含むことができる。種々の水性キャリア（例えば、緩衝化生理食塩水など）を使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容され得る補助剤（ｐＨ調整剤および緩衝剤など）および毒性調整剤（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなど）などを含むことができる。これらの処方物中での抗体濃度は、大きく異なり得、選択された特定の投与様式および被験体のニーズに従って、主に液量、粘度、および体重などに基づいて選択されるであろう。
【０１５１】
静脈内投与用の典型的な薬学的組成物は、約０．１〜１０ｍｇ／被験体／日の抗体を含む。特に循環系やリンパ系ではない隔離された部位（体腔内または器官の管腔内など）に薬剤を投与する場合、０．１ｍｇ／被験体／日から約１００ｍｇ／被験体／日までの投薬量を使用することができる。投与可能な組成物の実際の調製方法は、公知であるか当業者に明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）などの刊行物により詳細に記載されている。
【０１５２】
抗体を凍結乾燥形態で提供し、投与前に滅菌水で再水和することができるが、抗体を、公知の濃度の滅菌溶液中にも提供する。次いで、抗体溶液を、０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含む輸液バッグに添加し、いくつかの場合、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与する。１９９７年のリツキサン（登録商標）の承認以来、米国で市販されている抗体医薬の投与分野において多数の経験が利用可能である。抗体を、静注またはボーラスよりもむしろ低速注入によって投与することができる。１つの例では、より高い負荷量を投与後、より低いレベルの維持量を投与する。例えば、初期負荷量４ｍｇ／ｋｇをおよそ９０分間にわたって注入し、その後、以前の用量が十分に許容される場合に、２ｍｇ／ｋｇの維持量を４〜８週間にわたって毎週３０分間注入することができる。
【０１５３】
制御放出非経口処方物を、埋没物、油性注射液、または特定の系として作製することができる。タンパク質送達系の概要については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）を参照のこと。特定の系には、ミクロスフィア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして治療タンパク質（細胞毒素または薬物など）を含む。ミクロスフィアでは、治療薬を、粒子の至る所に分散させる。約１μｍ未満の粒子、ミクロスフィア、およびマイクロカプセルを、一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルという。ナノ粒子のみが静脈内投与されるような毛細管の直径はおよそ５μｍである。微粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；およびＴｉｃｅ  ＆  Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．  Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３１５−３３９，（１９９２）を参照のこと。
【０１５４】
ポリマーを、本明細書中に開示の抗体組成物のイオン制御放出のために使用することができる。制御薬物送達で用いる種々の分解性および非分解性のポリマーマトリックスは当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２，１９９３）。例えば、ブロックコポリマー（ポロクサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７）は、低温で粘調性を示すが流動性も示す液体として存在するが、体温で半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの処方および徐放に有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４，１９９２；およびＰｅｃら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８−６５，１９９０）。あるいは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４，１９９４）。さらに別の態様では、制御放出および脂質カプセル化薬の薬物ターゲティングのためにリポソームが使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｒｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９３））。多数のさらなる治療タンパク質の制御送達系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；同第米国特許第５，１８８，８３７号；同第米国特許第４，２３５，８７１号；同第米国特許第４，５０１，７２８号；同第米国特許第４，８３７，０２８号；同第米国特許第４，９５７，７３５号；同第米国特許第５，０１９，３６９号；同第米国特許第５，０５５，３０３号；同第米国特許第５，５１４，６７０号；同第米国特許第５，４１３，７９７号；同第米国特許第５，２６８，１６４号；同第米国特許第５，００４，６９７号；同第米国特許第４，９０２，５０５号；同第米国特許第５，５０６，２０６号；同第米国特許第５，２７１，９６１号；同第米国特許第５，２５４，３４２号、および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
【０１５５】
Ａ．治療方法
本明細書中に開示の抗体、組成物、融合タンパク質、および免疫抱合体を、腫瘍細胞（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌など）の成長を遅延または阻害するか、腫瘍細胞の転移を阻害するために投与することができる。これらの適用では、治療有効量の抗体を、癌細胞の成長、複製、または転移を阻害するか、癌の兆候または症状を阻害するのに十分な量で被験体に投与する。適切な被験体には、メソテリンを発現する癌（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ（ｔｒｉｐｌｅ  ｎａｔｉｖｅ）乳癌、または卵巣癌などであるが、これらに限定されない）と診断された被験体が含まれ得る。
【０１５６】
１つの非限定的な実施形態では、メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および本明細書中に開示の治療有効量の抗体、組成物、融合タンパク質、または免疫抱合体を被験体に投与することによる癌を有する被験体の処置方法を本明細書中に提供する。
【０１５７】
メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および治療有効量の本明細書中に開示の抗体、組成物、融合タンパク質、または免疫抱合体を被験体に投与することよる、腫瘍の成長または転移を阻害する方法も本明細書中に提供する。
【０１５８】
メソテリン特異的抗体、融合タンパク質、組成物、または免疫抱合体の治療有効量は、疾患の重症度および患者の一般的な健康状態に依存するであろう。抗体の治療有効量とは、臨床医または他の資格要件を満たした観察者が留意した場合に症状の主観的軽減または客観的に同定可能な改善のいずれかを提供する量である。
【０１５９】
本明細書中に開示の抗体、融合タンパク質、および免疫抱合体（またはその組成物）を、他の抗癌剤の投与または治療上の処置（腫瘍の外科的切除など）と併用することもできる。任意の適切な抗癌剤を、本明細書中に開示の抗体、組成物、融合タンパク質、および免疫抱合体と組み合わせて投与することができる。例示的な抗癌剤には、化学療法薬（例えば、分裂阻止因子、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、成長因子インヒビター、細胞周期インヒビター、酵素、トポイソメラーゼインヒビター、抗生存剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン（例えば、抗アンドロゲン）、および抗血管形成剤など）が含まれるが、これらに限定されない。他の抗癌処置には、放射線療法および癌細胞を特異的に標的にする他の抗体が含まれる。
【０１６０】
アルキル化剤の非限定的な例には、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が含まれる。
【０１６１】
代謝拮抗物質の非限定的な例には、葉酸アナログ（メトトレキサートなど）、ピリミジンアナログ（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリンアナログ（メルカプトプリンまたはチオグアニンなど）が含まれる。
【０１６２】
天然物の非限定的な例には、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が含まれる。
【０１６３】
混合型腫瘍薬の非限定的な例には、白金錯体（シスプラチンとしても公知のｃｉｓ−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ）抑制薬（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が含まれる。
【０１６４】
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例には、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）、およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロン（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロンなど）が含まれる。最も一般的に使用されている化学療法剤の例には、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イフォスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が含まれる一方で、いくつかのより新規の薬物には、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼヴァリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）、およびカルシトリオールが含まれる。
【０１６５】
使用することができる免疫調節薬の非限定的な例には、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、γインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、イムレグ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．のイムレグ由来）、ＳＫ＆Ｆ１０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。
【０１６６】
いくつかの癌型のための別の一般的な処置は、外科的処置（例えば、癌または癌の一部の外科的切除）である。別の処置例は、照射療法（例えば、腫瘍の根絶または外科的切除前の腫瘍の縮小を補助するための腫瘍への放射性物質またはエネルギーの投与（遠隔照射治療など））である。
【０１６７】
Ｂ．診断および検出方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのメソテリン発現の検出方法を本明細書中に提供する。いくつかの場合、生物サンプル中のメソテリン発現を検出する。サンプルは、任意のサンプル（生検、剖検、および病理標本由来の組織が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。生物サンプルには、組織切片、例えば、組織学的目的のために採取した凍結切片も含まれる。生物サンプルには、体液（血液、血清、血漿、痰、脊髄液、または尿など）がさらに含まれる。生物サンプルを、典型的には、哺乳動物（ヒトまたは非ヒト霊長類など）から得る。
【０１６８】
１つの実施形態では、被験体由来のサンプルを本明細書中に開示のモノクローナル抗体と接触させること、およびサンプルへの抗体の結合を検出することによって被験体が癌を有するかどうかを決定する方法を提供する。コントロールサンプルへの抗体の結合と比較した場合のサンプルへの抗体の結合の増大により、被験体が癌を有すると同定される。
【０１６９】
別の実施形態では、癌診断を受けた被験体由来のサンプルを本明細書中に開示のモノクローナル抗体と接触すること；およびサンプルへの抗体の結合を検出することによる、被験体における癌診断を確認する方法を提供する。コントロールサンプルへの抗体の結合と比較した場合のサンプルへの抗体の結合の増大により、被験体における癌診断が確認される。
【０１７０】
開示の方法のいくつかの例では、モノクローナル抗体を直接標識する。
【０１７１】
いくつかの例では、本方法は、モノクローナル抗体に特異的に結合する第２の抗体をサンプルと接触させる工程；および第２の抗体の結合を検出する工程をさらに含む。コントロールサンプルへの第２の抗体の結合と比較した場合のサンプルへの第２の抗体の結合の増大により、被験体における癌が検出されるか、被験体における癌診断が確認される。
【０１７２】
いくつかの場合、癌は、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、もしくは卵巣癌、またはメソテリンを発現する任意の他の癌型である。
【０１７３】
いくつかの例では、コントロールサンプルは、癌を持たない被験体由来のサンプルである。特定の例では、サンプルは、血液サンプルまたは組織サンプルである。
【０１７４】
いくつかの場合、メソテリンに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体を、検出可能な標識で直接標識する。別の実施形態では、メソテリン（第１の抗体）に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は標識されず、メソテリンに特異的に結合する抗体に結合することができる第２の抗体または他の分子を標識する。当業者に周知のように、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる第２の抗体を選択する。例えば、第１の抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は抗ヒトＩｇＧであり得る。抗体に結合することができる他の分子には、プロテインＡおよびプロテインＧが含まれるが、これらに限定されず、これらは共に市販されている。
【０１７５】
抗体または二次抗体に適切な標識は上に記載されており、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性薬剤、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の非限定的な例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の非限定的な例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の非限定的な例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の非限定的な例はルミノールであり、磁性薬剤の非限定的な例はガドリニウムであり、放射性標識の非限定的な例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが含まれる。
【０１７６】
別の実施形態では、生物サンプル中のメソテリンを、検出可能な物質で標識したメソテリン標準およびメソテリンに特異的に結合する非標識抗体を利用した競合免疫アッセイによってアッセイすることができる。このアッセイでは、生物サンプル、標識したメソテリン標準、およびメソテリンに特異的に結合する抗体を組み合わせ、非標識抗体への標識したメソテリン標準の結合量を決定する。生物サンプル中のメソテリン量は、メソテリンに特異的に結合する抗体への標識したメソテリン標準の結合量に反比例する。
【０１７７】
本明細書中に開示の免疫アッセイおよび方法を、多数の目的のために使用することができる。１つの実施形態では、メソテリンに特異的に結合する抗体を使用して、細胞培養物中の細胞内のメソテリンの産生を検出することができる。別の実施形態では、抗体を使用して、生物サンプル（組織サンプル、血液サンプル、または血清サンプルなど）中のメソテリン量を検出することができる。いくつかの例では、メソテリンは細胞表面メソテリンである。他の例では、メソテリンは可溶性メソテリン（例えば、細胞培養上清中のメソテリンまたは体液サンプル（血液サンプルまたは血清サンプルなど）中の可溶性メソテリン）である。
【０１７８】
１つの実施形態では、生物サンプル（血液サンプルまたは組織サンプルなど）中のメソテリンを検出するためのキットを提供する。例えば、被験体における癌診断を確認するために、生検を行って組織学的試験のための組織サンプルを得ることができる。あるいは、可溶性メソテリンタンパク質またはフラグメントの存在を検出するために血液サンプルを得ることができる。ポリペプチドの検出用キットは、典型的には、メソテリンに特異的に結合するモノクローナル抗体（本明細書中に開示の任意の抗体など）を含むであろう。いくつかの実施形態では、抗体フラグメント（ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメイン、またはＦａｂなど）がキットに含まれる。さらなる実施形態では、（例えば、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識を用いて）抗体を標識する。
【０１７９】
１つの実施形態では、キットは、メソテリンに結合する抗体の使用手段を開示する説明書を含む。説明書は、書面、電子的形態（コンピュータディスケットまたはコンパクトディスクなど）、または映像（ビデオファイルなど）であり得る。キットはまた、キットがデザインされた特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素を含むことができる。したがって、例えば、キットは、標識の検出手段（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、または適切な二次標識（二次抗体など）など）をさらに含むことができる。キットは、特定の方法の実施のために日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含むことができる。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【０１８０】
１つの実施形態では、診断キットは免疫アッセイを含む。免疫アッセイの詳細は使用した特定の形式によって異なり得るが、生物サンプル中のメソテリンの検出方法は、一般に、免疫学的反応条件下で生物サンプルをメソテリンポリペプチドに特異的に反応する抗体と接触させる工程を含む。免疫学的反応条件下で抗体を特異的に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体（結合抗体）の存在を、直接または間接的に検出する。
【０１８１】
細胞表面マーカーの有無の決定方法は、当該分野で周知である。例えば、抗体を、他の化合物（酵素、磁性ビーズ、コロイド性磁性ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物が含まれるが、これらに限定されない）に抱合することができる。抗体を、免疫アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学アッセイなどであるが、これらに限定されない）で利用することもできる。抗体を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のために使用することもできる。ＦＡＣＳは、細胞を分離または分取するための他のより高度なレベルの検出のうち、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを使用する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照のこと）。本明細書中に開示のメソテリンに結合する任意のモノクローナル抗体をこれらのアッセイで使用することができる。したがって、抗体を、従来の免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウェスタンブロット、または免疫沈降が含まれるが、これらに限定されない）で使用することができる。
【０１８２】
Ｃ．操作細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
開示のモノクローナル抗体を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ；キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても公知）を発現するように操作されたＣＴＬを産生することもできる。一般に、ＣＡＲは、結合部分、細胞外ヒンジおよびスペーサーエレメント、シグナル伝達で役割を果たす膜貫通領域および内部ドメインを含む（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０：９５６３０４，２０１０）。多数の例では、結合部分は、モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）である。ＣＡＲを生成するためにいくつかの異なる内部ドメインが使用されている。例えば、内部ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性モチーフ（ＩＴＡＭ）（ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなど）を有するシグナル伝達鎖からなり得る。いくつかの例では、内部ドメインは、少なくとも１つのさらなる同時刺激ドメイン（ＣＤ２８および／またはＣＤ１３７など）の細胞内部分をさらに含む。
【０１８３】
ＣＡＲを発現するＣＴＬを使用して、特定の細胞型（腫瘍細胞など）を標的にすることができる。したがって、本明細書中に開示のモノクローナル抗体を使用して、メソテリン特異的抗体の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを発現するＣＴＬを操作し、それにより、操作されたＣＴＬがメソテリン発現腫瘍細胞を標的にすることができる。操作されたＴ細胞は、以前にいくつかの癌型の養子療法のために使用されている（例えば、Ｐａｒｋら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（４）：８２５−８３３，２００７を参照のこと）。ＣＡＲを発現するＣＴＬがＨＬＡ非拘束性であり、したがって、標的抗原を発現した腫瘍を有する任意の患者のために使用することができるので、ＣＡＲを発現するＴ細胞の使用は、標準的なＣＴＬベースの免疫療法より普遍的である。
【０１８４】
したがって、メソテリン特異的抗体結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）を含むＣＡＲを本明細書中に提供する。ＣＡＲをコードする単離核酸分子およびベクターならびに核酸分子またはベクターを含む宿主細胞（ＣＴＬなど）も提供する。メソテリン特異的抗体結合フラグメントから構成されるＣＡＲを発現するＣＴＬを、メソテリンを発現する癌（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌など）の処置のために使用することができる。したがって、メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および治療有効量のメソテリンを標的にするＣＡＲを発現するＣＴＬを被験体に投与することによる、癌を有する被験体の処置方法を本明細書中に提供する。
【０１８５】
Ｄ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントから構成される組換えタンパク質である。したがって、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に結合する。二重特異性抗体を、ＣＴＬ（ＣＤ３などのＣＴＬ受容体成分など）および腫瘍抗原の両方を同時に標的にすることによる癌免疫療法のために使用することができる。本明細書中に開示のメソテリン特異的モノクローナル抗体を使用して、メソテリンおよびＣＴＬの療法を標的にする二重特異性抗体を生成し、それにより、メソテリン発現癌の処置手段を提供することができる。
【０１８６】
メソテリン特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性モノクローナル抗体を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性モノクローナル抗体は、Ｔ細胞受容体の成分（ＣＤ３など）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む。二重特異性抗体をコードする単離核酸分子およびベクターならびに核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。メソテリン特異的抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性抗体を、メソテリンを発現する癌（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌など）、または卵巣癌など）の処置のために使用することができる。したがって、メソテリンを発現する癌を有する被験体を選択すること、および治療有効量のメソテリンを標的にする二重特異性抗体を被験体に投与することによる、癌を有する被験体の処置方法を本明細書中に提供する。
【０１８７】
以下の実施例を、一定の特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供する。これらの実施例は、本開示を記載の特定の特徴や実施形態を制限すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１８８】
実施例１：材料と方法
本実施例は、実施例２に記載の研究のための実験手順を記載する。
【０１８９】
細胞培養
ヒト胆管癌（ＣＣＡ）株（ＫＭＢＣ、Ｍｚ−ＣｈＡ−１、およびＨｕＣＣＴ−１）、ならびにＡ４３１細胞（表皮癌）、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（中皮腫）、ＥＫＶＸ細胞（ヒト非小細胞肺癌、またはＮＳＣＬＣ）、ＯＶＣＡＲ−８細胞（卵巣癌）、およびＬ５５細胞（ＮＳＣＬＣ）を、記載のように成長させた（Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，２０１１；Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０）。Ａ４３１／Ｈ９は、ヒトメソテリンを安定に発現するトランスフェクトされたＡ４３１細胞株である（Ｈｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３８１４−３８２０，２００５）。ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。総継代数を１５回未満に減少させるために、細胞株の取得直後に生成した最初の凍結ストックの解凍後に全細胞株を数回しか継代しなかった（１ヶ月未満）。全細胞株を試験して形態および成長速度によって確認し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａは存在しなかった。
【０１９０】
操作したヒト抗体ドメインライブラリーのスクリーニング
ｍ８ｌと命名した操作したヒト（ＶＨ）抗体ドメインライブラリーの推定密度は２．５×１０１０であった（Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８２：７７９−７８９，２００８）。５０アミノ酸からなるＣ末端メソテリンペプチド（ＶＱＫＬＬＧＰＨＶＥＧＬＫＡＥＥＲＨＲＰＶＲＤＷＩＬＲＱＲＱＤＤＬＤＴＬＧＬＧＬＱＧＧＩＰＮＧＹＬＶ；配列番号９の残基５３９〜５８８）を合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。全長ヒトメソテリンタンパク質（ＭＳＬＮ）を、記載のように調製した（Ｋａｎｅｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３７３９−３７４９，２００９）。ファージライブラリーを、標準的な実験プロトコールにしたがってヒトメソテリンまたはＣ末端メソテリンペプチドに関する４ラウンドのパニングに供した（Ｈｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：６０７−６１７，２００５；Ｈｏ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：２９３−３０８，２００９）。各パニングラウンドの終了時に無作為に選別したクローンを、ファージ酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイによって抗原結合について分析した。
【０１９１】
ＳＤ１−ヒトＦｃ融合タンパク質の産生
ヒトＩｇＧγ１ＦｃおよびＦＬＡＧ／Ｈｉｓタグと融合したＳＤ１ヒト抗体ドメインをコードするＶＨ領域を、２つのプライマー（順方向：ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ ＡＴＡ ＴＣＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  Ａ；配列番号１０；逆方向：ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＴＧＧ；配列番号１１）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ベクターｐＶＲＣ８４００のＥｃｏＲＶ部位およびＢｓｐＥＩ部位（下線）に挿入した（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：８８２８−８８３４，２００５；Ｏｆｅｋら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４：２９５５−２９６２，２０１０）。最終プラスミド（ｐＭＨ１４８と命名）をＨＥＫ−２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、プロテインＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用してタンパク質を精製した。安定な細胞株を、ｐＭＨ１４８でのＨＥＫ−２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞のトランスフェクションによって樹立した。安定な株は、培養上清中に高レベルで（７０ｍｇ／Ｌ超）ＳＤ１−ｈＦｃ融合タンパク質を産生した。
【０１９２】
免疫沈降およびウェスタンブロット分析
細胞ライセート（１．５ｍｇ）を、５０μｇのＳＤ１または無関係のヒト単一ドメイン抗体と共に５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）中でインキュベートし、４℃で一晩回転させた。３０μｌのプロテインＡビーズを添加し（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、４℃で２時間回転させた。ビーズをスピンダウンし、ＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した。免疫複合体を、１００μｌの２×ローディング緩衝液中でのボイルの５分後にビーズから放出させた。標準的な実験プロトコール（Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０）にしたがって、ウェスタンブロット分析を行った。
【０１９３】
ＥＬＩＳＡ
直接的なＥＬＩＳＡおよび親和性測定−以前に記載の手順（Ｋａｎｅｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３７３９−３７４９，２００９）にしたがって、ＳＤ１−ｈＦｃの直接的な結合および親和性を、メソテリンペプチド、ヒトメソテリン、またはマウスメソテリン（ｍＭＳＬＮ）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で評価した。
【０１９４】
競合ＥＬＩＳＡ−種々の量のメソテリンペプチド、無関係の５０アミノ酸ペプチド、ＨＮ１ヒトｍＡｂまたはＳＳ１Ｐ免疫毒素を５μｇ／ｍｌのＳＤ１−ｈＦｃと混合し、室温で一晩インキュベートした。次いで、混合物を、５μｇ／ｍｌのヒトメソテリンタンパク質をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、上記手順にしたがって室温でさらに１時間インキュベートした。
【０１９５】
フローサイトメトリー
細胞表面会合メソテリンへのＳＤ１抗体の結合を決定するために、標準的なプロトコール（Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０）にしたがってフローサイトメトリー分析を行った。細胞あたりの平均メソテリン部位数を、ＢＤ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）ＰＥビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にて測定した。
【０１９６】
確立されたプロトコール（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，２００９；Ｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：２４００−２４０８，２００８）にしたがって、Ｃ１ｑおよび抗メソテリン結合アッセイを行った。簡潔に述べれば、Ａ４３１／Ｈ９細胞またはＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を１×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、異なる濃度のＳＤ１−ｈＦｃ、コントロールヒトＩｇＧ、またはＨＮ１ヒトＩｇＧと氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を、２０μｇ／ｍｌの精製Ｃ１ｑ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｙｌｅｒ，ＴＮ）と３７℃で０．５時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、次いで、ＦＩＴＣ標識ヒツジ抗ヒトＣ１ｑｍＡｂ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）と氷上で０．５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。
【０１９７】
ＡＤＣＣおよびＣＤＣ
標準的なプロトコール（Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，２０１１）にしたがって、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＡＤＣＣアッセイを行った。ＬＤＨ放出アッセイによってＳＤ１−ｈＦｃのＣＤＣ活性も測定した。簡潔に述べれば、細胞をＳＤ１−ｈＦｃと  ＤＭＥＭ培養培地中にて５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間インキュベートし、その後に補体供給源として正常ヒト血清（２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）または新たに採取したマウス血清（３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を添加した。ヒト正常血清は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から提供を受けた。３７℃で４時間のさらなるインキュベーション後、培養上清中へのＬＤＨの放出量の測定によって細胞溶解を決定した。最大ＬＤＨ放出を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中の溶解によって決定した。特異的溶解率を、以下の式にしたがって計算した：溶解率％＝［実験放出−自発的放出］／［最大放出−自発的放出］×１００。
【０１９８】
マウスにおける異種移植片抗腫瘍試験
十分に確立されたＮＣＩプロトコール（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）にしたがって、ヌードマウスにおいてＡ４３１／Ｈ９異種移植片を使用してＳＤ１−ｈＦｃを評価する腫瘍実験を行った。４〜６週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスを、実験中は小型隔離ケージに収容した。３００万個のＡ４３１／Ｈ９細胞を、マウスの右脇腹に皮下接種した。カリパスを使用して腫瘍寸法を決定し、以下の式によって腫瘍容積（ｍｍ３）を計算した：長さ×（幅）２×０．５。腫瘍サイズがおよそ７０ｍｍ３に到達した時に処置を開始した。異なる治療レジメンは以下を含んでいた：腫瘍接種の７、９、１１、１４、１７、２０日後のＰＢＳおよびＳＤ１−ｈＦｃ（５０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｖ．注射。腫瘍が１０００ｍｍ３超に到達した時にマウスを屠殺した。
【０１９９】
組換え免疫毒素の産生
選択されたファージミド由来のＳＤ１抗体ドメインを、ＮｄｅＩ制限部位およびＨｉｎｄ−ＩＩＩ制限部位（下線）を導入した２つのプライマー（順方向：ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＴ、配列番号１２；および逆方向：ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣ；配列番号１３）を使用してＰＣＲ増幅した。反応産物を、ｐＲＢ９８にクローン化した。以前に記載のように（Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｈｏ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，”  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第ＩＩ巻，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２０１０，１２７−１４６頁）、最終発現プラスミド（ｐＭＨ１４９と命名）を組換え免疫毒素の産生のために使用した。
【０２００】
細胞増殖阻害アッセイ
以前に記載のように（Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２３０２，２０１１；Ｈｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：６０７−６１７，２００５）、細胞成長阻害をＷＳＴ−８アッセイによって測定した。
【０２０１】
実施例２：ヒト単一ドメイン抗体は、癌細胞表面付近のメソテリン中のエピトープのターゲティングによって強力な抗腫瘍活性を誘発する
本実施例は、ヒトメソテリンのＣ末端エピトープに特異的なヒト単一ドメイン抗体の同定および特徴付けを記載する。
【０２０２】
ＳＤ１ヒト抗体の発見および産生
細胞表面付近の部位を標的にする新規の抗メソテリンｍＡｂを見出すために、Ｃ末端メソテリンペプチドを、小型結合剤（ＶＨ）のライブラリーをスクリーニングするためにデザインした。ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）遺伝子は、６２２アミノ酸の前駆体タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ７４３９２２）をコードする。小胞体への移行の際、Ｎ末端シグナルペプチド（残基：１〜３３）およびＣ末端ＧＰＩアンカー付加シグナル（推定切断部位：Ｓｅｒ５９８）を除去し、後者をＧＰＩアンカーと置換する。ｂｉｇ−ＰＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒプログラムを使用して、ＧＰＩ切断部位を、Ｓｅｒ５９８と予想した。最初に、推定Ｃ末端に対応する５０アミノ酸ペプチド（残基５４９〜５９８）の作製を試みたが、おそらくペプチドの疎水性に起因する凝集後に合成は失敗した。新規のペプチドを消化した（配列番号９の残基５３９〜５８８；ＶＱＫＬＬＧＰＨＶＥＧＬＫＡＥＥＲＨＲＰＶＲＤＷＩＬＲＱＲＱＤＤＬＤＴＬＧＬＧＬＱＧＧＩＰＮＧＹＬＶ）（メソテリンのＧＰＩ切断部位から１０アミノ酸離れている）（図１Ａ）。新規のペプチドを、操作したヒト抗体ドメインのファージディスプレイライブラリーを使用したファージパニングのために使用した（Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８２：７７９−７８９，２００８）（表１）。
【０２０３】
第４ラウンドのファージパニング後、ファージ力価は有意に増加し（図１Ｂ）、９５％超のクローンがペプチド結合剤であった。ペプチドだけでなく全長メソテリンにも結合したので、ファージクローンＳＤ１をさらなる分析のために選択した（図１Ｃ）。比較すると、同一の単一ドメイン抗体ファージライブラリーをヒトメソテリンについてスクリーニングしたが、クローンＳＤ２のみが富化し、全長ヒトメソテリンに特異的であったが、ペプチドには特異的でなかった（図１Ｄ）。ハイブリドーマ（Ｏｎｄａら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：５８４０−５８４６，２００５）またはファージディスプレイテクノロジーのいずれかによって全長タンパク質についてスクリーニングした場合に、メソテリンのＣ末端を認識するｍＡｂを得る可能性は低いようである。
【０２０４】
【表１】
0006307085.tif 000003
【０２０５】
各パニングラウンド後のファージ力価を、プラーク形成単位（ｐｆｕ）として示した。
【０２０６】
潜在的治療薬としてＳＤ１を調査するために、ＳＤ１を臨床的に関連する分子（ヒトＦｃ（ｈＦｃ）融合タンパク質）に変換した（図２Ａ）。ＳＤ１−ｈＦｃヒトタンパク質を、ヒトＩｇＧ重鎖γ１の定常領域中のＣＨ２およびＣＨ３内にヒトＶＨを融合することによって生成した。ＳＤ１−ｈＦｃ融合タンパク質を大量産生するために、安定な細胞株を、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞の培養上清中にて高発現レベル（７０ｍｇ／Ｌ超）で樹立した。ＳＤ１−ｈＦｃは、抗体様二量体分子（軽鎖なし）であり、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによっておよそ１００ｋＤａと推定された。したがって、ＳＤ１ヒト抗体ドメインを、ファージディスプレイによってメソテリンのＣ末端に対して首尾よく単離し、ヒトＦｃ融合物（ＳＤ１−ｈＦｃ）を、潜在的臨床適用のためにＳＤ１ＶＨに基づいて産生した。
【０２０７】
ＳＤ１ヒト抗体は癌細胞表面会合メソテリンに結合する
癌細胞内のメソテリンタンパク質へのＳＤ１抗体の結合性を分析するために、ＳＤ１−ｈＦｃまたはコントロールとしての無関係のヒトＶＨ単一ドメインｈＦｃ融合タンパク質を使用して、癌細胞ライセートを使用したウェスタンブロットおよびプルダウンアッセイを行った。ＳＤ１−ｈＦｃを使用した種々の癌細胞ライセートの最初のウェスタンブロット分析は、高メソテリン発現細胞株（Ａ４３１／Ｈ９およびＮＣＩ−Ｈ２２６など）においてさえも還元条件下でメソテリンバンドを検出することができなかった。これは、ＳＤ１−ｈＦｃが変性メソテリンタンパク質を認識しないことを示していた。図２Ｂに示すように溶液中の内因性メソテリンタンパク質を検出するためのプルダウンアッセイの実施により、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、３つの異なる癌細胞株（Ａ４３１／Ｈ９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、およびＫＭＢＣ）から成熟メソテリンタンパク質を首尾よくプルダウンした。ＮＣＩ−Ｈ２２６およびＫＭＢＣは、未変性ヒト癌細胞株である。Ａ４３１／Ｈ９は、細胞表面上にメソテリンを過剰発現する操作されたＡ４３１株であった（Ｈｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３８１４−３８２０，２００５）。成熟メソテリンの分子量（約４０ｋＤａ）は、以前の研究と一致した（Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０；Ｈｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：１５７１−１５７５，２００７）。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は全長ヒトメソテリンタンパク質およびメソテリンペプチドの両方に結合し（図３Ａ）、全長マウスメソテリンタンパク質、ＢＳＡ、または他の無関係のタンパク質に結合しなかった。予想通り、ＳＳ１ＰおよびＨＮ１は、全長ヒトメソテリンのみに結合し、Ｃ末端ペプチドに結合しない。
【０２０８】
ＳＤ１−ｈＦｃがＣ末端を認識するかどうかを評価するために、本発明者らは、ＳＤ１−ｈＦｃ、ＨＮ１、またはＳＳ１Ｐをメソテリンペプチド（残基５３９〜５８８）とプレインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしたヒトメソテリンへの抗体−ペプチド混合物の結合を試験した。競合ＥＬＩＳＡ（図３Ｂ）は、Ｃ末端ペプチドは全長ヒトメソテリンへのＳＤ１−ｈＦｃの結合を遮断するが、ＳＳ１ＰやＨＮ１への結合を遮断せず、ＳＤ１−ｈＦｃがＣ末端配列に結合することを示すこと、および、メソテリンへのＳＤ１結合をＳＳ１ＰおよびＨＮ１が競合できないことを示していた。全長メソテリンタンパク質およびＣ末端ペプチドを使用してＳＤ１結合の動態も測定した。ＳＤ１−ｈＦｃは、ヒトメソテリンタンパク質に１３．５９ｎＭの解離平衡（ＫＤ）で結合し、ペプチドに１６．０８ｎＭのＫＤで結合する。平衡定数およびスキャッチャードプロットを、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ（３．０２バージョン）（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｋａｎｅｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３７３９−３７４９，２００９）の使用によって決定した。
【０２０９】
ＳＤ１が癌治療に適切であるかどうかを分析するために、ＳＤ１−ｈＦｃがヒト腫瘍細胞上の未変性メソテリン分子に結合するかどうかを決定した。フローサイトメトリー分析をメソテリン発現癌細胞パネルに対して行い、細胞あたりの平均メソテリン部位数を、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ蛍光定量システムを使用して実験的に測定した（表２）。ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、Ａ４３１／Ｈ９に結合するが、Ａ４３１に結合しなかった。これは、細胞表面会合メソテリン上のＳＤ１結合が高度に特異的であることを示している（図４）。未変性ヒト腫瘍細胞株パネル上のＳＤ１−ｈＦｃの結合も試験した。以前の研究では、悪性中皮腫、卵巣癌（Ｃｈａｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１８１−１８６，１９９２）、肺腺癌（Ｈｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：１５７１−１５７５，２００７）、および胆管癌（Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０）中でメソテリンが高度に発現されることを示していた。本研究では、ＳＤ１−ｈＦｃがヒト卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−８）、中皮腫（ＮＣＩ−Ｈ２２６）、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（ＥＫＶＸおよびＬ５５）、および胆管癌細胞株（ＫＭＢＣおよびＭｚ−ＣｈＡ−１）に強く結合し、メソテリン陰性株である胆管癌細胞（ＨｕＣＣＴ１）に結合しないことが見出された（Ｙｕら，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １：１４１−１４９，２０１０）。まとめると、これらの結果は、ＳＤ１ヒト抗体が癌細胞表面付近の未変性メソテリンの高次構造エピトープを認識し、細胞表面会合未変性メソテリンタンパク質に高親和性および優れた特異性で結合することを示す。
【０２１０】
【表２】
0006307085.tif 000004
【０２１１】
ＳＤ１−ｈＦｃの抗腫瘍活性：ＣＤＣおよびＡＤＣＣ
癌細胞に対するＳＤ１−ｈＦｃの抗腫瘍活性を評価するために、補体供給源としてのヒト血清の存在下でのＡ４３１／Ｈ９細胞モデルおよびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞モデルにおける細胞傷害活性を試験した。ＳＤ１−ｈＦｃは、４０％のＡ４３１／Ｈ９（図５Ａ）および３０％超のＮＣＩ−Ｈ２２６中皮腫細胞株（図５Ｂ）の死滅によって強力なＣＤＣ活性を発揮し、メソテリン陰性Ａ４３１細胞株に対する活性は示さなかった。無関係のコントロール抗体は、同一濃度で活性を示さなかった。ＭＯＲＡｂ−００９（現在臨床試験で評価中のキメラ抗体）が腫瘍細胞に対して有意なＣＤＣ活性を示さないので、これは重要な所見である（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）。メソテリン結合ＭＯＲＡｂ−００９は、補体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が有効性を示すには細胞表面からあまりに遠く離れている可能性があることが示唆される。細胞表面付近のメソテリンエピトープのターゲティングにより、メソテリン結合ＳＤ１−ｈＦｃは、癌細胞表面上に有効な補体ＭＡＣを生じ得る。
【０２１２】
ＳＤ１−ｈＦｃの抗腫瘍活性における補体の役割を分析するために、リツキシマブ、オファツムマブ、および他の抗ＣＤ２０治療ｍＡｂの特徴付けのための十分に確立されたプロトコール（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，２００９；Ｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：２４００−２４０８，２００８）にしたがって、フローサイトメトリーを使用して抗メソテリンヒトｍＡｂと反応した癌細胞へのＣ１ｑ結合を決定した。ＭＯＲＡｂ−００９と同様に、細胞表面メソテリンの領域Ｉ（細胞表面からかけ離れている）に特異的なＨＮ１ヒトｍＡｂはメソテリン発現癌細胞に対するいかなるＣＤＣ活性も示さないことが以前に示されている（Ｈｏら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，２０１１）。図５Ｃおよび５Ｄに示すように、Ｃ１ｑ補体は、ＳＤ１−ｈＦｃの存在下でＡ４３１／Ｈ９細胞またはＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に結合した。しかし、ＨＮ１やコントロールｈＦｃ融合タンパク質の存在下ではＣ１ｑ結合は見出されなかった。さらに、癌細胞へのＣ１ｑの結合は、用量−応答様式でのＳＤ１−ｈＦｃの細胞結合に関連している。これらの結果は、Ｃ末端結合物ＳＤ１−ｈＦｃはメソテリン発現癌細胞表面にＣ１ｑを動員することができるが、Ｎ末端結合物ＨＮ１ではできないことを証明している。
【０２１３】
ＣＤＣ活性に加えて、腫瘍細胞に対するＳＤ１−ｈＦｃのＡＤＣＣ活性を試験した。ＳＤ１−ｈＦｃをヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共に異なる濃度で使用して高レベルの細胞傷害性が見出された。ＳＤ１は、Ａ４３１／Ｈ９細胞（図５Ｅ）およびＮＣＩ−Ｈ２２６中皮腫細胞（図５Ｆ）の両方に対して有意なＡＤＣＣ活性を示した。メソテリン陰性Ａ４３１細胞に関して活性は見出されなかった。精製ヒトＮＫ細胞を使用した腫瘍細胞に対するＳＤ１−ｈＦｃのＡＤＣＣ活性も試験した。ヒトＮＫ細胞を、Ａ４３１／Ｈ９標的細胞またはＮＣＩ−Ｈ２２６標的細胞（Ｅ：Ｔ比５：１、１０：１、および２０：１で）および５０μｇ／ｍｌのＳＤ１−ｈＦｃとインキュベートした。また、ＳＤ１は、全てのＥ：Ｔ比でＡ４３１／Ｈ９細胞およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞の両方に対して有意なＡＤＣＣ活性を示した（図５Ｇ〜５Ｈ）。
【０２１４】
まとめると、これらの結果は、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでメソテリン発現腫瘍細胞に対して強力なＣＤＣ抗腫瘍活性およびＡＤＣＣ抗腫瘍活性を有することを示唆している。
【０２１５】
マウスにおける抗腫瘍活性
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＤ１−ｈＦｃの抗腫瘍活性を評価するために、前臨床研究においてＭＯＲＡｂ−００９を評価するために使用した確立されたプロトコール（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）にしたがって、腫瘍異種移植片を保有する免疫不全マウスを使用した。７日目から、Ａ４３１／Ｈ９腫瘍を保有する胸腺欠損ヌードマウスを、５０ｍｇ／ｋｇのＳＤ１−ｈＦｃで処置した（図６Ａ）。Ａ４３１／Ｈ９中のメソテリン部位数はメソテリンを内因性に発現する悪性中皮腫細胞の部位数に匹敵し、マウスへのその移植によって一貫して侵襲性に腫瘍成長する。腫瘍細胞接種の２０日後、ＳＤ１−ｈＦｃのみで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズは、コントロール群（平均１０００ｍｍ３）と比較して有意に減少した（平均３００ｍｍ３）。これらの結果は、ＳＤ１−ｈＦｃが単剤として非常に活性が高いことを証明している。同一のプロトコールを使用して、単剤としてのＭＯＲＡｂ−００９はマウスにおいて腫瘍成長阻害を中程度にしか誘導しなかった（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）。ＡＤＣＣおよびＣＤＣは、癌治療で使用した抗体によって媒介される重要な腫瘍細胞死滅機構である。ＳＤ１−ｈＦｃによって腫瘍細胞に対してＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方が生じるが、ＭＯＲＡｂ−００９はＡＤＣＣのみを誘導し、ＣＤＣを誘導しない。したがって、ＣＤＣはマウスにおけるその強力な腫瘍成長阻害で重要な役割を果たすと考えられる。
【０２１６】
マウスにおけるＳＤ１誘導性ＣＤＣを評価するために、マウス血清を使用してＣＤＣ活性を試験した。ＳＤ１−ｈＦｃは、ヌードマウスから新たに採取した３０％マウス血清の存在下で１１％のＡ４３１／Ｈ９細胞を死滅させ（図６Ｂ）、ＳＤ１−ｈＦｃに対するマウス補体の活性がヒト補体の活性の１／１０であることを示していた（図５）。これは、ヒトＦｃを有する抗体について、マウス補体がヒト補体より活性が低いことを示す以前の研究（Ｄｉ  Ｇａｅｔａｎｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：１５８１−１５８７，２００３）と一致する。ＨＮ１は有意なレベルのＣＤＣを誘導しなかった。ＳＤ１およびＨＮ１によって誘導されたＡＤＣＣも評価した。両抗体は、有意なレベルのＡＤＣＣを誘導することができた（図６Ｃ）。マウスＮＫ細胞の純度を図６Ｄに示す。
【０２１７】
結論として、ＳＤ１−ｈＦｃはマウスにおける強力な腫瘍成長阻害を誘導し、ＣＤＣは主な基本機構のようであるということが示された。
【０２１８】
考察
ＳＤ１（ファージディスプレイテクノロジーによってメソテリンのＣ末端でエピトープを認識する操作抗体ドメイン）の同定を本明細書中に開示する。このエピトープは、メソテリン標的療法の前臨床開発および臨床開発におけるいかなる現在の治療抗体（ＳＳ１Ｐ／ＭＯＲＡｂ−００９およびＨＮ１）のエピトープとも重複しない。ＳＤ１は、強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、メソテリン発現癌細胞に対して強力なＣＤＣ活性を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏマウス試験では、ＳＤ１−ｈＦｃタンパク質は、強力な腫瘍成長阻害を示す。本明細書中に開示の結果は、ＳＤ１が新規の抗メソテリンｍＡｂクラスを示し、メソテリン標的療法のための治療抗体として使用することができることを示す。
【０２１９】
ＳＤ１ドメインを、メソテリンのＣ末端５０残基ペプチドに関するファージパニングによって単離した。フローサイトメトリーおよびプルダウンアッセイによって抗体が癌細胞中の未変性メソテリンタンパク質に結合することが証明された。抗体はウェスタンブロットにおいて変性メソテリンタンパク質に結合せず、このことはＳＤ１ドメインが癌細胞表面付近のメソテリンの高次構造エピトープに結合することを示す。この領域は、いかなる公知の抗メソテリン抗体（ＳＳ１Ｐ／ＭＯＲＡｂ−００９およびＨＮ１が含まれる）によっても決してアクセスされていなかった。このことは、この領域を標的にする抗体を開発するための重要なストラテジーであると考えられる。ＣＤＣは、腫瘍に対する治療抗体の最も強力な細胞死滅機構の１つであるが、細胞膜に近い抗体結合部位が必要であり得る（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，２００９）。本データは、ＨＮ１（細胞表面からかけ離れたメソテリンのＮ末端（領域Ｉ）に特異的）がＣＤＣ活性を示さず、Ｃ１ｑを癌細胞に動員できないので、ＳＤ１−ｈＦｃによって誘発されるＣＤＣが特異的な新規のエピトープに依存することを証明している。さらに、ほとんど全ての既存のメソテリン抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００９／アマツキシマブ、ＳＳ１Ｐ、ＨＮ１）は領域Ｉを認識する。しかし、豊富なムチンＭＵＣ１６／ＣＡ１２５はまた癌細胞上のメソテリンの領域Ｉに結合することが以前に示されており（Ｋａｎｅｋｏら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：３７３９−３７４９，２００９）、抗体結合を競合し得る。ＳＤ１は、メソテリンとＭＵＣ１６／ＣＡ１２５結合を競合せず、したがって、腫瘍細胞へのＳＤ１の結合および活性はＭＵＣ１６／ＣＡ１２５によって中和される可能性が低い。
【０２２０】
ヌードマウスにおける異種移植腫瘍モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験は、ＳＤ１−ｈＦｃの強力な抗腫瘍活性を示した。類似のプロトコールを使用して、ＭＯＲＡｂ−００９マウス／ヒトキメラｍＡｂのみの抗腫瘍効果は中程度の抗腫瘍活性しか示さず、これはおそらくＭＯＲＡｂ−００９が腫瘍細胞に対して有意なＣＤＣ活性を生じないからである（Ｈａｓｓａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ７：２０，２００７）。腫瘍微小環境におけるＳＤ１−ｈＦｃをさらに評価するために、ヒト腫瘍異種移植片をマウス内に生成し、ＳＤ１−ｈＦｃが実際にｉｎ  ｖｉｖｏで非常に活性が高いことを示した。
【０２２１】
天然に存在する単一ドメイン抗体（ラクダＶＨＨおよびサメＶＮＡＲなど）は、癌免疫療法のための新規の治療薬クラスとして示唆されている。ヒトにおける免疫原性の可能性のために、これらの動物抗体を、いくつかの臨床適用のために直接使用することができない。したがって、ヒト単一ドメインＶＨは、癌治療の魅力的な候補である。しかし、ヒトＶＨは、典型的には、凝集する傾向がある（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５０２：３４１−３６４，２００９）。本研究では、ＳＤ１ＶＨをヒトＩｇＧγ１のＣＨ２およびＣＨ３に融合して、哺乳動物ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞中に二量体ＩｇＧ様タンパク質としてＳＤ１−ｈＦｃを産生した。用量依存様式でメソテリン陽性腫瘍細胞の増殖を阻害することができるＳＤ１に基づいた組換え免疫毒素も産生した（表２および図７Ａ〜７Ｂ）。全組換えタンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために適切に折り畳んだ。
【０２２２】
まとめると、メソテリン発現腫瘍に対する第１のヒト単一ドメイン抗体を生成し、ＣＤＣおよびＡＤＣＣによって癌細胞表面付近のエピトープを標的することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を有することが示された。かかる結合部位は、現在、前臨床研究および臨床研究において任意の公知の抗メソテリン抗体によってアクセスされていない。
【０２２３】
実施例３：被験体における癌の検出または被験体における癌の診断の確認のためのメソテリン特異的モノクローナル抗体
本実施例は、被験体における癌の検出のためのメソテリン特異的モノクローナル抗体（本明細書中に開示のモノクローナル抗体（例えば、ＳＤ１もしくはＳＤ２またはＳＤ１もしくはＳＤ２のＣＤＲ配列を含むモノクローナル抗体）など）の使用を記載する。本実施例は、被験体における癌診断の確認のためのこれらの抗体の使用をさらに記載する。
【０２２４】
血液サンプルを、メソテリン陽性癌（すなわち、メソテリンを過剰発現する癌（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または卵巣癌など））と診断されたか、前記癌を有すると疑われる患者から得る。癌をもたない患者から採取した血液サンプルを、コントロールとして使用することができる。血液サンプル中の可溶性メソテリンの存在を検出するためにＥＬＩＳＡを行う。当該分野で周知の方法（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：１６１２−１６１６，２００３を参照のこと）にしたがって、血液サンプル（患者サンプルおよびコントロールサンプル）中に存在するタンパク質を、固体支持体（９６ウェルプレートなど）に固定する。固定後、蛍光マーカーで直接標識したメソテリン特異的モノクローナル抗体を、タンパク質固定プレートに適用する。プレートを適切な緩衝液（ＰＢＳなど）で洗浄して任意の非結合抗体を除去し、抗体の非特異的結合を最小にする。標準的な方法にしたがって、蛍光分析プレートリーダーを使用して蛍光を検出することができる。コントロールサンプルと比較した患者サンプルの蛍光強度の増加は、抗メソテリン抗体が血液サンプル由来のタンパク質に特異的に結合したことを示し、したがって、サンプル中のメソテリンタンパク質の存在を示す。患者サンプル中のメソテリンタンパク質の検出は、患者がメソテリン陽性癌を有することを示すか、被験体中の癌診断が確認される。
【０２２５】
実施例４：癌処置のためのメソテリン特異的モノクローナル抗体
本実施例は、メソテリンの過剰発現を示す癌（本明細書中で「メソテリン陽性」癌という）（中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管癌、トリプルネガティブ乳癌、または卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない）の処置のためのメソテリン特異的モノクローナル抗体（本明細書中に開示のモノクローナル抗体（例えば、ＳＤ１もしくはＳＤ２またはＳＤ１もしくはＳＤ２のＣＤＲ配列を含むモノクローナル抗体）など）の使用を記載する。当該分野の標準的手順（例えば、Ｈａｓｓａｎら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：２９ａ，２００２；Ｋｒｅｉｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎｌ  Ｏｎｃｏｌ．２１：２２ｂ，２００２を参照のこと）にしたがって、メソテリン陽性癌と診断された患者を処置することができる。
【０２２６】
１つの例では、メソテリン陽性癌と診断された患者に、シュードモナス外毒素（ＰＥ）に連結したメソテリン特異的モノクローナル抗体を含む免疫抱合体を投与する。ＰＥ免疫抱合体の調製は記載されている（例えば、米国特許第７，０８１，５１８号および米国特許出願公開第２００５／０２１４３０４号を参照のこと）。別の例では、メソテリン陽性癌と診断された患者に、ＣＤＣおよびＡＤＣＣの両方を誘導することができ、それにより、毒素に連結することなく腫瘍細胞死滅を媒介することができるＳＤ１またはＳＤ１−ｈＦｃ融合タンパク質を投与する。
【０２２７】
いくつかの患者では、ＳＤ１、ＳＤ１−ｈＦｃ、または免疫抱合体を、静脈内ボーラス注射によって１日おきに全部で３〜６回投与する。他の患者では、ＳＤ１、ＳＤ１−ｈＦｃ、または免疫抱合体を、持続静脈内注入によって１０日間にわたって投与する。ＳＤ１、ＳＤ１−ｈＦｃ、または免疫抱合体の患者への投与用量は、患者の体重および性別ならびに投与の様式および時間経過に応じて変化する。処置後、患者を、癌の進行（腫瘍の成長および転移が含まれる）および疾患の他の臨床兆候について評価する。
【０２２８】
開示の発明の原理を適用することができる多数の可能な実施形態を考慮して、例示の実施形態が単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を制限すると解釈すべきでないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明が全てこれらの特許請求の範囲の範囲および精神の範疇であると主張する。
【図１−１】
0006307085.tif 000005
【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0006307085.tif 000015
【配列表】
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