(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異OCH1タンパク質をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含む、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) の操作された安定した株であって、該変異OCH1タンパク質が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸45〜404と少なくとも95％同一である触媒ドメインを含み、かつSEQ ID NO: 2を含む野生型OCH1タンパク質の触媒活性を実質的に保持し、該変異OCH1タンパク質が、変異OCH1タンパク質をゴルジ体へ標的化するためのN末端配列を欠き、かつN末端領域において膜アンカードメインを欠き、かつ該株が実質的に均一なN-グリカンを生成し、該変異OCH1対立遺伝子が、染色体上に存在し、かつOCH1遺伝子座において野生型OCH1対立遺伝子と置き換わる、前記株。
【請求項２】
変異OCH1タンパク質における膜アンカードメインの欠如が、OCH1野生型タンパク質のN末端部分の欠失の結果であり、該欠失部分が、野生型OCH1タンパク質の膜アンカードメインを含む、請求項1に記載の株。
【請求項３】
欠失部分が、野生型OCH1タンパク質の細胞質尾部の1つまたは複数のアミノ酸をさらに含む、請求項2に記載の株。
【請求項４】
変異OCH1タンパク質が、SEQ ID NO: 3に記載される配列を含む、請求項1に記載の株。
【請求項５】
Man8GlcNAc2が主なN-グリカン型である、実質的に均一なN-グリカンを生成する、請求項1に記載の株。
【請求項６】
α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現する核酸をさらに含む、請求項1に記載の株。
【請求項７】
α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現する核酸が、前記株のOCH1遺伝子座において組み込まれている、請求項6に記載の株。
【請求項８】
OCH1遺伝子座が、SEQ ID NO: 1に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項7に記載の株。
【請求項９】
Man5GlcNAc2が主なN-グリカン型である、実質的に均一なN-グリカンを生成する、請求項6に記載の株。
【請求項１０】
異種タンパク質をコードし発現する核酸をさらに含む、請求項1または請求項6に記載の株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年10月23日に出願された米国仮特許出願第61/717,423号の優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ピキア・パストリス (Pichia pastoris) は、多種多様な組換えタンパク質の生産系として大きな成功を収めている。これが急速に受け入れられたのには、以下のものを含むいくつかの要因が寄与している：(1) 外来遺伝子の制御発現に比類なく適している、P. パストリスのアルコールオキシダーゼ I (AOX1) 遺伝子由来のプロモーター；(2) P. パストリスの分子遺伝子操作に必要な技法が、サッカロミセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) のものと類似していること、および (3) P. パストリスが、呼吸増殖、すなわち発酵酵母に対して高い細胞密度での培養を容易にする生理的特徴を強く好むこと。
【０００３】
酵母として、P. パストリスは、操作および培養が容易である単細胞微生物である。しかしながら、これは真核生物でもあり、タンパク質プロセシング、折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、およびグリコシル化などの、高等真核細胞によって行われる翻訳後修飾の多くを行うことができる。したがって、細菌系では不活性な封入体となる多くのタンパク質が、P. パストリスでは生物活性のある分子として産生される。P. パストリス系はまた、昆虫培養細胞系および哺乳動物組織培養細胞系などの高等真核生物に由来する発現系よりも、使用するのに迅速で、容易で、かつ安価であると一般的に見なされており、通常、より高い発現レベルをもたらす。
【０００４】
P. パストリスは、典型的に高等真核生物に関連する翻訳後修飾の多くを行う可能性を有する。これには、シグナル配列（プレ型およびプレプロ型の両方）のプロセシング、折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、ならびにO結合型およびN結合型グリコシル化の両方が含まれる。P. パストリスおよび他の真菌による、分泌された外来（高等）真核生物タンパク質のグリコシル化には、問題がある場合がある。哺乳動物では、O結合型オリゴ糖は、N-アセチルガラクトサミン、ガラクロトース、およびシアル酸を含む種々の糖から構成される。対照的に、P. パストリスを含む下等真核生物は、単にマンノース (Man) 残基から構成されるOオリゴ糖を付加し得る。
【０００５】
P. パストリスにおけるN-グリコシル化もまた、高等真核生物のものとは異なる。すべての真核生物において、これはER内で、脂質結合オリゴ糖単位であるGlc3Man9GlcNAc2（Glc = グルコース；GlcNAc = N-アセチルグルコサミン）の、認識配列Asn-X-Ser/Thrのアスパラギンへの移行から始まる。このオリゴ糖コア単位はその後、トリミングされてMan8GlcNAc2になる。この時点で、下等真核生物と高等真核生物のグリコシル化パターンが異なり始める。哺乳動物のゴルジ体は、Man5-6GlcNAc2（高マンノース型）、いくつかの異なる糖の混合物（複合型）、または両方の組み合わせ（ハイブリッド型）のいずれかから構成されるオリゴ糖を生成する一連のトリミングおよび付加反応を行う。P. パストリスによって分泌される外来タンパク質では、N-グリコシル化の2つの異なるパターンが観察されている。いくつかのタンパク質は、サイズおよび構造がコア単位 (Man8-11GlcNAc2) と類似している糖鎖構造を有して分泌される。P. パストリスから分泌される他の外来タンパク質は、はるかにより多くの糖鎖を受け取り、高度にグリコシル化されているように見える。
【０００６】
酵母によってタンパク質に付加されたN結合型高マンノースオリゴ糖は、製薬産業による外来分泌タンパク質の使用において問題を示す。例えば、それらは哺乳動物に静脈内より導入された場合、抗原性が非常に高くなる可能性があり、さらに肝臓による血液からの該タンパク質の迅速なクリアランスを引き起こし得る。
【０００７】
ピキア・パストリスのN-グリコシル化経路を改変する試みにおいて、Jacobs et al., 2009, Nature Protocols 4:58-70（非特許文献1）に記載されているように、株（以下「M5-Blast」と称する）が作製された。M5-BlastはP. パストリスGS115株の改変物であり、内因性マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子OCH1が、α-1,2マンノシダーゼ遺伝子を含むカセットの導入によって破壊されている。しかしながら、M5-Blast株は、凍結および融解のラウンド、様々な温度および条件下での増殖の後、ならびに外因性遺伝子を導入するために他のプラスミドをその後形質転換してから、内因性OCH1遺伝子を再生し、平行してα-1,2マンノシダーゼ遺伝子を除去するゲノム再編成を受けやすい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Jacobs et al., 2009, Nature Protocols 4:58-70
【発明の概要】
【０００９】
開示の概要
実質的に均一なN-グリカンを有する外因性タンパク質を発現させるための新規ピキア・パストリス株を、本明細書において開示する。より具体的には、この株は、変異OCH1遺伝子産物（すなわち、α-1,6-マンノシルトランスフェラーゼまたは「OCH1タンパク質」）をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含むように遺伝子操作されている。変異OCH1タンパク質は、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインを含むが、OCH1タンパク質のゴルジ体へのまたはゴルジ体中の局在性を変更するN末端配列を有する。この株は、機能的OCH1タンパク質をコードするmRNAを産生するいかなる他のOCH1対立遺伝子も含まない。このような株は頑強であり、安定しており、かつ形質転換可能であり、変異OCH1対立遺伝子および関連する表現型（すなわち、実質的に均一なN-グリカンを生成する能力）は、凍結および融解のラウンド後、ならびにその後の形質転換後に、何世代にもわたって維持される。
【００１０】
本開示はまた、前記株を構築する方法、および該株によってタンパク質を発現させる方法を特徴とする。
【００１１】
[本発明1001]
野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインと、野生型OCH1タンパク質と比較して変異OCH1タンパク質のゴルジ局在性を変更するN末端配列とを含む変異OCH1タンパク質をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子
を含む、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) の操作された安定した株であって、実質的に均一なN-グリカンを生成する、株。
[本発明1002]
触媒ドメインを含む変異OCH1タンパク質のC末端断片が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸45〜404と少なくとも95％同一である、本発明1001の株。
[本発明1003]
変異OCH1タンパク質が、変異OCH1タンパク質をゴルジ体へ標的化するためのN末端配列を欠いている、本発明1001の株。
[本発明1004]
変異OCH1タンパク質が、N末端領域において膜アンカードメインを欠いている、本発明1003の株。
[本発明1005]
変異OCH1タンパク質における膜アンカードメインの欠如が、OCH1野生型タンパク質のN末端部分の欠失の結果であり、該欠失部分が、野生型OCH1タンパク質の膜アンカードメインの1つまたは複数のアミノ酸を含む、本発明1001の株。
[本発明1006]
欠失部分が、野生型OCH1タンパク質の細胞質尾部の1つまたは複数のアミノ酸をさらに含む、本発明1005の株。
[本発明1007]
変異OCH1タンパク質が、SEQ ID NO: 3に記載される配列を含む、本発明1001の株。
[本発明1008]
変異OCH1対立遺伝子が染色体上に存在する、本発明1001の株。
[本発明1009]
変異OCH1対立遺伝子が、OCH1遺伝子座において野生型OCH1対立遺伝子と置き換わる、本発明1008の株。
[本発明1010]
変異OCH1対立遺伝子がプラスミド上で維持され、かつ染色体上の野生型OCH1対立遺伝子が破壊されている、本発明1001の株。
[本発明1011]
Man8GlcNAc2が主なN-グリカン型である、実質的に均一なN-グリカンを生成する、本発明1001の株。
[本発明1012]
α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現する核酸をさらに含む、本発明1001の株。
[本発明1013]
α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現する核酸が、前記株のOCH1遺伝子座において組み込まれている、本発明1012の株。
[本発明1014]
OCH1遺伝子座が、SEQ ID NO: 1に記載されるヌクレオチド配列を含む、本発明1013の株。
[本発明1015]
Man5GlcNAc2が主なN-グリカン型である、実質的に均一なN-グリカンを生成する、本発明1012の株。
[本発明1016]
異種タンパク質をコードし発現する核酸をさらに含む、本発明1001または本発明1012の株。
本明細書に記載されるいかなる特徴または特徴の組み合わせも、任意のそのような組み合わせに含まれる特徴が、内容、本明細書、および当業者の知識から明らかなように相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。本発明の付加的な利点および局面は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】M5-BlastピキアゲノムからOCH1 N末端断片相同性を除去するための欠失戦略の図を示す。OCH1 N末端断片に隣接している相同アームを用いて、lox71-lox66組換え部位を含む二重交差構築物を作製する。この介入配列は、cre媒介組換えによって除去することができる。
【図２】M5-BlastゲノムDNAから二重交差構築物の隣接アームを増幅するためのPCRプライマーを示す。
【図３】相同アームの末端にlox部位を付加するためのPCR反応を示す。
【図４】既存のlox71-MazF-NatR-lox66カセット上へのM5-BlastゲノムDNA伸長物の付加を示す。
【図５】M5-Blastピキア形質転換用の二重交差断片を作製するための最終配列の重複アセンブリおよび増幅を示す。この最終構築物は、選択／対抗選択カセットに隣接する>500 bpの相同アームを有する。
【図６】二重交差組換え事象のためのDNA断片を作製するために用いられたPCRプライマー対を示す。
【図７】二重交差組換え事象後のM5-BlastゲノムのLEU5‐マンノシダーゼHDEL領域の理論的な配置を示す。
【図８】cre組換え後のLEU5とマンノシダーゼHDLEとの間のゲノムDNAの理論的な配置を示す。
【図９】M5-Blast株に形質転換されたPCR産物に由来したはずである領域のDNA配列を検証するために用いられたPCRプライマー81487118‐80765854を示す。
【図１０】様々なP. パストリス株において発現された組換えタンパク質のN-グリカン解析を示す。
【図１１】実施例6に記載される試験1で得られたトラスツズマブのN-グリカン解析を示す。
【図１２】ELISAによる、Man5型トラスツズマブ（試験1）と市販のハーセプチンのHer2結合親和性の比較を示す。
【図１３】「Trans」株由来の培地タンパク質における全N-グリカンプールのDSA-FACE解析を示す。A. マルト-デキストロース参照の結果。パネルB〜Fは、以下のようなN-グリカンの結果を示す：B. 微小規模におけるGS Trans株；C. 微小規模におけるM5 Trans株；D. バイオリアクターにおけるGS Trans株；E. バイオリアクターにおけるM5 Trans株；F. ウシRNase B由来の参照N-グリカン。
【図１４】「CalB」株由来の培地タンパク質における全N-グリカンプールのDSA-FACE解析を示す。A. マルト-デキストロース参照の結果。パネルB〜Fは、以下のようなN-グリカンの結果を示す：B. 微小規模におけるGS CalB株；C. 微小規模におけるM5 CalB株；D. バイオリアクターにおけるGS CalB株；E. バイオリアクターにおけるM5 CalB株；F. ウシRNase B由来の参照N-グリカン。
【図１５】「CalA」株由来の培地タンパク質における全N-グリカンプールのDSA-FACE解析を示す。A. マルト-デキストロース参照の結果。パネルB〜Fは、以下のようなN-グリカンの結果を示す：B. 微小規模におけるGS CalA株；C. 微小規模におけるM5 CalA株；D. バイオリアクターにおけるGS CalA株；E. バイオリアクターにおけるM5 CalA株；F. ウシRNase B由来の参照N-グリカン。
【００１３】
表1〜6は36〜49ページに記載される。表7〜8は32ページ（実施例7）に記載される。
【００１４】
表1は、実施例1に記載されるSuperM5株におけるOCH1遺伝子座のDNA配列 (SEQ ID NO: 1) を記載する。
【００１５】
表2は、ピキア・パストリスにおける野生型OCH1のアミノ酸配列 (SEQ ID NO: 2) を記載する。
【００１６】
表3は、上流OCH1セグメントから欠失され得るヌクレオチドを記載する。
【００１７】
表4は、M5-Blastピキア・パストリス株のOCH1遺伝子座 (+/- 2 kb) のDNA配列を記載する。
【００１８】
表5は、上流OCH1セグメントのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を記載する。
【００１９】
表6は、下流OCH1セグメントのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を記載する。
【００２０】
表7。試験2から得られたトラスツズマブのN-グリカン解析（実施例6）。
【００２１】
表8。BIAcoreで解析されたトラスツズマブの動力学的パラメータ（実施例6）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
遺伝子操作されたピキア・パストリス株
本開示は、頑強であり、安定しており、かつ形質転換可能である遺伝子操作された新規ピキア・パストリス株であって、実質的に均一なN-グリカン構造を生成するピキア・パストリス株を特徴とする。
【００２３】
本明細書においてさらに記載されるように、前記株は、変異OCH1遺伝子産物（すなわち、α-1,6-マンノシルトランスフェラーゼまたは「OCH1タンパク質」）をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含むように遺伝子操作されている。変異OCH1タンパク質は、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインを含むが、OCH1タンパク質のゴルジ体へのまたはゴルジ体中の局在性を変更するN末端配列を有する。この株は、機能的OCH1タンパク質をコードするmRNAを産生するいかなる他のOCH1対立遺伝子も含まない。
【００２４】
前記株は、M8 N-グリカン、Man8GlcNAc2をM5 N-グリカン、Man5GlcNAc2に変換するα-1,2-マンノシダーゼをコードし発現する核酸を含むように、付加的に遺伝子操作され得る。
【００２５】
遺伝子改変の結果として、本明細書で開示される株は、実質的に均一なN-グリカンを生成する。
【００２６】
「実質的に均一な」N-グリカンとは、関心対象の特定の糖タンパク質の集団を含む調製物を考えた場合に、集団内のタンパク質分子上のN-グリカンの少なくとも50％、60％、75％、80％、85％、90％、またはさらには95％が同じであることを意味する。
【００２７】
「主なN-グリカン構造」または「主なグリコフォーム」とは、タンパク質の（すなわち、タンパク質に付着している）特定のN-グリカン構造またはグリコフォームが、該タンパク質のすべてのN-グリカン構造またはグリコフォームのうちの最大の割合を構成することを意味する。ある特定の具体的な態様において、主なグリコフォームは、タンパク質の全グリコフォームの集団の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、もしくは95％、またはそれ以上を占める。望ましいN-グリカン構造の例には、例えば、Man8GlcNAc2（もしくは「M8」)またはMan5GlcNAc2(「M5」)が含まれる。望ましい付加的なN-グリカン構造には、GnM5 (GlcNAcMan5GlcNAc2)、GalGnM5 (GalGlcNAcMan5GlcNAc2)、GalGnM3 (GalGlcNAcMan3GlcNAc2)、GnM3 (GlcNAcMan3GlcNAc2)、Gn2M3 (GlcNAc2Man3GlcNAc2)、およびGal2Gn2M3 (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2) が含まれる。これらのN-グリカンの構造は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるJacobs et al., 2009, Nature Protocols 4:58-70に記載されている。
【００２８】
具体的な態様において、本発明の株は、変異OCH1対立遺伝子、およびα-1,2-マンノシダーゼをコードし発現する核酸の両方を含み、その結果としてこの株は、M5が主なグリコフォームである均一なN-グリカンを生成する。これらの株はまた、本明細書においてSuperM5株またはSuperMan5株と称される。SuperM5株の一例は、以下の実施例の項において記載される。
【００２９】
本発明の株は「頑強」であり、これはこの株（栄養要求体または欠損株、例えば、プロテアーゼ欠損、AOX1変異体等として別段記述されてない限り）が、株GS115などの改変されていないピキア・パストリス株とおよそ同じ増殖速度および同じ増殖条件を有することを意味する。例えば、本発明の株は、高温（例えば、30℃、37℃、またはさらには42℃）で増殖することができ、温度感受性ではない。例えば、本明細書で開示されるSuperM5株は、頑強であり、温度感受性ではない。
【００３０】
本発明の株はまた安定しており、これは遺伝子改変または遺伝子改変の結果としての表現型（すなわち、均一なN-グリカンを生成する）が、凍結および融解のラウンド後、ならびにその後の形質転換後に、例えば少なくとも10、20、30、40、または50世代（細胞分裂）といった何世代にもわたって維持されることを意味する。例えば、本明細書で開示されるSuperM5株は、何世代にもわたって変異OCH1対立遺伝子を維持し、復帰変異することなく実質的に均一なM8（または他の下流N-グリカンを）を作製し続けることができる。
【００３１】
遺伝子操作‐変異OCH1対立遺伝子
本発明の株は、変異OCH1遺伝子産物（すなわち、α-1,6-マンノシルトランスフェラーゼまたは「OCH1タンパク質」）をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含むように遺伝子操作されている。変異OCH1タンパク質は、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインを含むが、OCH1タンパク質のゴルジ体へのまたはゴルジ体中の局在性を変更するN末端配列を有する。
【００３２】
ピキア・パストリスの野生型OCH1遺伝子は、404アミノ酸 (SEQ ID NO: 2) のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する。他の真菌ゴルジグリコシルトランスフェラーゼと同様に、ピキア・パストリスOCH1タンパク質はII型膜タンパク質であり、短い細胞質尾部（Met1〜Tyr21 (SEQ ID NO: 25)、またはAla2〜Tyr21）、膜アンカードメイン（Phe22〜Ser44、すなわち
0006407872.tif 000002
）、ステム領域、および触媒ドメインを含む大きなC末端領域を有する。例えば、Kim et al., J. Biol. Chem. 281:6261-6272 (2006)；Nakayama et al., EMBO 11(7): 2511-2519 (1992)；およびTu et al., Cell. Mol. Life Sci 67:29-41 (2010) を参照されたい。
【００３３】
野生型OCH1タンパク質は一般的にシスゴルジ中に局在する。野生型OCH1タンパク質のゴルジ局在性は、細胞質尾部、膜アンカードメイン、およびステム領域からなるN末端領域によって決定づけられると考えられている。特に、そのアミノ酸の構成要素および長さを含めた膜アンカードメインが、タンパク質のゴルジ標的化において重要な役割を果たす。例えば、Tu et al.（前記）を参照されたい。
【００３４】
本開示の変異OCH1タンパク質は、野生型OCH1タンパク質と比較して変異OCH1タンパク質のゴルジ局在性を変更するN末端配列を有する。この変化したN末端配列の結果として、変異OCH1タンパク質は、適切にゴルジ体へ標的化されないもしくはゴルジ体内に保持されないか、または適切にゴルジ内の正しい区画へ標的化されないもしくはゴルジ内の正しい区画内に保持されない。「標的化」という用語は、タンパク質が細胞内または細胞外の適切な目的地に輸送される生物学的機構を意味する。具体的な態様において、本開示の変異OCH1タンパク質は、変異OCH1タンパク質のゴルジ標的化を可能にするN末端配列を欠いており、その結果として変異OCH1タンパク質はゴルジ体へ標的化されず、別の細胞位置に輸送されるか、または細胞外に分泌される。
【００３５】
いくつかの態様において、N末端配列の変化は、OCH1タンパク質の膜アンカードメイン中の1つまたは複数のアミノ酸の変異、すなわち、付加、欠失、または置換の結果である。具体的な態様では、膜アンカードメイン中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている。特定の態様において、膜アンカードメインの、連続しているかまたはそうではない少なくとも2、3、4、5、6、7個、またはそれ以上のアミノ酸が欠失されている。例えば、膜アンカードメインの最初の5アミノ酸（FYMAI、SEQ ID NO: 90）のうちのいくつかまたはすべてが欠失される。
【００３６】
他の態様において、N末端配列の変化は、OCH1タンパク質の細胞質尾部中の1つまたは複数のアミノ酸の変異、すなわち、付加、欠失、または置換の結果である。具体的な態様では、細胞質尾部中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている；例えば、細胞質尾部の、連続しているかまたはそうではない少なくとも2、3、4、5、6、7個、またはそれ以上のアミノ酸が欠失されている。細胞質尾部における欠失の例は表3に見出される。他の態様において、1つまたは複数のアミノ酸の欠失は、細胞質尾部における1つまたは複数のアミノ酸の付加と組み合わされる。
【００３７】
さらなる他の態様において、N末端配列の変化は、OCH1タンパク質のステム領域中の1つまたは複数のアミノ酸の変異；例えば、膜アンカードメインの直後の最初の10、20、30、40、50、または60アミノ酸中の1つまたは複数のアミノ酸の欠失の結果である。
【００３８】
ある特定の態様において、N末端配列の変化は、OCH1タンパク質の細胞質尾部、膜アンカードメイン、および／またはステム領域における変異の組み合わせの結果である。
【００３９】
具体的な態様において、N末端配列の変化は、細胞質尾部と膜アンカードメインにおける変異の組み合わせの結果である。例えば、細胞質尾部中の1つまたは複数のアミノ酸および膜アンカードメイン中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失されている。OCH1タンパク質のN末端領域における欠失の例を、表3に記載する。
【００４０】
他の態様において、結果として得られる変異N末端配列が、ゴルジ中にOCH1タンパク質を適切に標的化するまたは局在化させることがなおできない限り、1つまたは複数のドメインにおける欠失に加えて、1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質のN末端に付加される。例えば、結果として得られる変異N末端配列はなお、機能的な膜アンカードメインを欠いている。変異配列が膜アンカードメインを含むかどうかは、アミノ酸の組成および長さに基づいて容易に判定され得る。ゴルジグリコシルトランスフェラーゼの膜アンカードメインは典型的に、疎水性であり多くの場合に芳香族アミノ酸を含む16〜20アミノ酸からなり、膜スパンの両端のすぐ外側に正電荷アミノ酸を有する場合が多い。例えば、Nakayama et al. (1992)、前記を参照されたい。変異OCH1タンパク質の一例はSEQ ID NO: 3に記載され、これは野生型OCH1タンパク質の最初の26アミノ酸の代わりにその最初の10アミノ酸を有する。
【００４１】
本明細書で開示される変異OCH1タンパク質は、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインを含む。
【００４２】
野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインは、360アミノ酸（すなわち、SEQ ID NO: 2のアミノ酸45〜404内）のC末端断片内に位置する。いくつかの態様において、変異OCH1タンパク質は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸45〜404、55〜404、65〜404、75〜404、85〜404、95〜404、または105〜404と実質的に同一であるC末端断片を含む。「実質的に同一」とは、配列が、それらの全長において整列させた場合に、少なくとも90％、95％、98％、99％、またはそれ以上同一であることを意味する。大部分の態様において、変異OCH1タンパク質の触媒ドメインは、10アミノ酸、8アミノ酸、5アミノ酸、3アミノ酸、または2アミノ酸を超えて、野生型ドメインとは異ならない。具体的な態様において、変異OCH1タンパク質の触媒ドメインは、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと同一である。1つまたは複数のアミノ酸が異なる場合、その違いは保存的アミノ酸置換を示すことが好ましい。保存的置換の例には、I、V、L、もしくはMなどの非極性（疎水性）残基の互いの置換；Kに対するR、Nに対するQ、Sに対するG、もしくはその逆などの1つの極性（親水性）残基の別の極性残基に対する置換；およびK、R、もしくはHなどの塩基性残基の互いの置換、またはDもしくはEなどの1つの酸性残基の互いの置換が含まれる。
【００４３】
変異OCH1タンパク質はまた、野生型OCH1タンパク質の触媒活性、すなわち野生型OCH1タンパク質のα-1,6-マンノシルトランスフェラーゼ活性の少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上を実質的に保持する。特定のOCH1変異タンパク質の活性もまた、当技術分野で公知のインビトロアッセイ法またはインビボアッセイ法を用いて容易に決定され得る。例えば、Nakayama (1992)、前記を参照されたい。
【００４４】
上記のように、本発明の株は、変異OCH1タンパク質をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含み、機能的OCH1タンパク質をコードするmRNAを産生するいかなる他のOCH1対立遺伝子も含まない。このような株は、種々の手段によって操作され得る。
【００４５】
いくつかの態様において、ピキア・パストリス株の染色体上のOCH1遺伝子座における野生型OCH1対立遺伝子は、変異OCH1対立遺伝子を提供するように改変もしくは変異されているか（以下の実施例において説明される通り）、または変異OCH1対立遺伝子によって置換されている（例えば、相同組換えによる）。改変は、結果として得られる株が、変異OCH1対立遺伝子に関して安定しているようなものでなければならない。すなわち、変異対立遺伝子は、機能的OCH1タンパク質をコードするOCH1対立遺伝子に復帰することなく、小容量フラスコ培養および工業サイズのバイオリアクター培養の両方に適した何世代（例えば、少なくとも10、20、30、40、50回、またはそれ以上の細胞分裂）にもわたって、該株において維持される。
【００４６】
他の態様において、変異OCH1対立遺伝子は、1つまたは複数の野生型OCH1対立遺伝子（一倍体であれば1つの野生型OCH1「対立遺伝子」、または二倍体であれば複数の野生型OCH1「対立遺伝子」）が既に破壊されており、したがって機能的OCH1タンパク質が天然OCH1対立遺伝子または天然OCH1遺伝子座から産生されないピキア・パストリス株に、発現ベクターを介して導入される。発現ベクターは、変異OCH1対立遺伝子を宿主ゲノムに組み込むように設計された組込みベクターであってよく；または染色体と独立して該株において複製する複製ベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。
【００４７】
変異OCH1対立遺伝子が、野生型OCH1対立遺伝子を変異させるもしくは置換することにより天然OCH1遺伝子座においてもたらされるか、または1つもしくは複数の野生型OCH1対立遺伝子（一倍体であれば1つの野生型OCH1「対立遺伝子」、もしくは二倍体であれば複数の野生型OCH1「対立遺伝子」）が既に破壊されている株において、発現ベクターを介して提供されるかにかかわらず、結果として得られる変異株が、何世代（例えば、少なくとも10、20、30、40、50回、またはそれ以上の細胞分裂）にもわたって機能的OCH1タンパク質を産生しないことが重要である。「機能的OCH1タンパク質」とは、野生型OCH1タンパク質または野生型OCH1タンパク質の機能的同等物、すなわちゴルジへ標的化され、野生型OCH1タンパク質の触媒活性（すなわち、野生型OCH1タンパク質のα-1,6-マンノシルトランスフェラーゼ活性の少なくとも約80％、85％、90％、95％、またはそれ以上）を実質的に保持するタンパク質を意味する。復帰変異を回避するためには、野生型OCH1対立遺伝子を生じる相同組換えを回避するように、該株における相同配列が除去されるべきである。
【００４８】
変異OCH1対立遺伝子は、宿主染色体上に存在するかまたは染色体外ベクター上に存在するかにかかわらず、mRNAへと転写される。言い換えれば、この株は、変異OCH1対立遺伝子のコード配列がプロモーターに機能的に連結されて、転写をもたらすように操作されている。プロモーターは、内因性OCH1プロモーター、OCH1対立遺伝子とは異種のプロモーター（例えば、AOX1プロモーター、GAPプロモーター）等などの内因性プロモーターであってよく；またはピキア・パストリスにおいて機能的な外因性プロモーターであってもよい。転写のレベルは、改変されていないピキア・パストリス株（GS115など）における野生型OCH1対立遺伝子の転写のレベルと同じ、それよりも高い、またはそれよりも低くてよい。
【００４９】
上記のOCH1対立遺伝子に対する遺伝子改変を有するピキア・パストリス株は、一倍体株および二倍体株の両方を含む。OCH1変異対立遺伝子が宿主染色体中に組み込まれている二倍体株に関して、この株はOCH1変異対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であってよい。
【００５０】
上記のOCH1対立遺伝子に対する遺伝子改変を有するピキア・パストリス株は、頑強で安定しており、かつMan8GlcNAc2が主なN-グリカンである実質的に均一なN-グリカン構造を有するタンパク質を産生する。
【００５１】
遺伝子操作‐α-1,2-マンノシダーゼをコードし発現する核酸
上記のOCH1対立遺伝子に対する遺伝子改変に加えて、前記株は、Man8GlcNAc2をMan5GlcNAc2に変換するα-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現し得る核酸分子を含むように操作することができ、それによって主なN-グリカン型としてMan5GlcNAc2を提供する。
【００５２】
α-1,2-マンノシダーゼ (MS-I) は十分に特徴づけられた酵素のファミリーである。大部分のMS-I酵素は、ゴルジ中または小胞体中に局在することが知られているが、いくつかは分泌され、細胞外活性を有する。Gonzalez et al., Mol Biol Evolution 17:292-300 (2000) を参照されたい。ERおよびゴルジに局在するこのような酵素のトポロジーは一般的に、管腔触媒ドメインおよびN末端膜貫通領域を有する。Herscovics, Biochimie 8: 757-62 (2001) を参照されたい。N末端領域は、ステム領域（管腔触媒ドメインに最も近い）、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部から構成される。分泌型MS-I酵素では、酵素の分泌のためのシグナルとして働くリーダー配列として、触媒外の膜貫通領域もまた知られている。様々なα-1,2-マンノシダーゼの詳細な特徴づけは、マウスおよびS. セレビシエ由来のMS-I酵素ならびにそれらの触媒ドメインを研究したBecker et al. (European J. Cell Biol 79: 986-992 (2000))；マウスMS-Iおよびその触媒ドメインの触媒活性を特徴づけたSchneikert and Herscovics (Glycobiology 4: 445-450 (1994))；線虫 (C. elegans) 由来の2種類の酵素、ヒトMS-I、およびS. セレビシエMS-I（ER由来）を含むいくつかのMS-I酵素の活性およびドメインを調べたGonzalez et al. (J. Biol Chem 274: 21375-86 (1999))；ならびにT. リーゼイ (T. reesei) α-1,2-マンノシダーゼを、触媒ドメインおよびN末端リーダー配列から構成される分泌性MS-Iのカテゴリーに属すると特徴づけたMaras et al. (J. Biotechnology 77:255-263 (2000)) に見出すことができる。
【００５３】
α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードする核酸分子は、本発明における使用に関して任意の種に由来してよく、これには、例えば、マウスα-1,2-マンノシダーゼ (Herscovics et al. J. Biol. Chem. 269: 9864-9871, 1994)、ウサギα-1,2-マンノシダーゼ (Lai et al. J. Biol. Chem. 269: 9872-9881, 1994)、またはヒトα-1,2-マンノシダーゼ (Tremblay et al. Glycobiology 8: 585-595, 1998) をコードする哺乳動物遺伝子、例えば、アスペルギルス (Aspergillus) α-1,2-マンノシダーゼ（msdS遺伝子）、トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) α-1,2-マンノシダーゼ (Maras et al., J. Biotechnol. 77: 255-263, 2000)、またはサッカロミセス・セレビシエα-1,2-マンノシダーゼをコードする真菌遺伝子、ならびに線虫（GenBankアクセッション番号CAA98114およびCAB01415）およびキイロショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)（GenBankアクセッション番号AAF46570) に由来する遺伝子などの他の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Nett et al., Yeast 28:237-252, 2011）を参照されたい。
【００５４】
α-1,2-マンノシダーゼの「機能的部分」または「酵素活性断片」とは、全長タンパク質の酵素活性を実質的に保持する天然または野生型α-1,2-マンノシダーゼのポリペプチド断片を意味する。この文脈における「実質的な」とは、全長タンパク質の酵素活性の少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上が保持されることを意味する。例えば、いかなるN末端膜貫通配列またはシグナル配列も存在しないα-1,2-マンノシダーゼの触媒ドメインは、α-1,2-マンノシダーゼの「機能的断片」を構成する。当業者は、当技術分野で利用可能な情報、および当技術分野で公知の技法の組み合わせに基づいて、α-1,2-マンノシダーゼの機能的断片を容易に同定し作製することができる。特定のポリペプチド断片の活性もまた、当技術分野で公知のインビトロアッセイ法またはインビボアッセイ法を用いて検証することができる。
【００５５】
いくつかの態様において、α-1,2-マンノシダーゼまたは機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、トリコデルマ・リーゼイα-1,2-マンノシダーゼコード配列に由来する。具体的な態様において、このヌクレオチド配列は、Maras et al. J. Biotechnol. 77: 255-63 (2000) に記載されているトリコデルマ・リーゼイα-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片（全長タンパク質のC末端触媒ドメインなど）をコードする。
【００５６】
大部分の態様において、前記株は、α-1,2-マンノシダーゼまたは機能的断片がERへ標的化されるように操作される。具体的な態様において、ER標的化は、α-1,2-マンノシダーゼまたは機能的断片中にER標的化配列を含めることによって達成される。ER標的化配列、すなわちタンパク質がER中に局在するかまたは保持されるように該タンパク質をERへ標的化する配列には、S. セレビシエSEC12のN末端断片、GLS1によってコードされるS. セレビシエα-グルコシダーゼIのN末端、およびMNS1によってコードされるS. セレビシエα-1,2-マンノシダーゼのN末端断片が含まれる。Nett et al. (2011) もまた参照されたい。具体的な態様において、α-1,2-マンノシダーゼまたは機能的断片は、α-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片のC末端においてER保持シグナル、HDEL (SEQ ID NO: 91) を含めることによってERへ標的化される。
【００５７】
α-1,2-マンノシダーゼまたは機能的断片をコードする核酸は、発現ベクターを介してピキア・パストリ株に導入することができる。発現ベクターは、α-1,2-マンノシダーゼコード配列を宿主ゲノムに組み込むように設計された組込みベクターであってよく；または染色体と独立して該株において複製する複製ベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。組込みベクターである場合、ベクターは、野生型OCH1遺伝子への核酸の組込み（例えば、一重または二重交差相同組換えによる）および野生型OCH1対立遺伝子の同時破壊を達成するように設計され得る。
【００５８】
SuperM5株
本開示は、頑強であり、安定しており、かつ形質転換可能であり、実質的に均一なMan5GlcNAc2 N-グリカンを生成するピキア・パストリス株を提供する。これらの株はまた、本明細書においてSuperM5株またはSuperMan5株と称される。
【００５９】
SuperM5株は、野生型OCH1タンパク質の触媒ドメインと実質的に同一である触媒ドメインを含むが、OCH1タンパク質をゴルジ体へ標的化するのに必要なN末端配列を欠く変異OCH1タンパク質をコードするmRNAへと転写される変異OCH1対立遺伝子を含むように遺伝子操作される。この株は、機能的OCH1タンパク質をコードするmRNAを産生するいかなる他のOCH1対立遺伝子も含まない。この株は、ERへ標的化され、Man8GlcNAc2をMan5GlcNAc2に変換するα-1,2-マンノシダーゼまたはその機能的断片をコードし発現する核酸を含むように、付加的に遺伝子操作される。
【００６０】
SuperM5株の一例は、実施例1において記載される。この株のOCH1遺伝子座のヌクレオチド配列は、表1およびSEQ ID NO: 1に記載される。Jacobs et al. (2009) に記載されるM5-Blast株を用いて構築した場合、SuperM5株は、頑強な増殖、安定性、および生成されるM5グリカンの均一性の点でM5-Blastよりも優れている。
【００６１】
遺伝子操作‐付加的な酵素の導入
前記株は、ハイブリッド型および複合型N-グリカンの生成に向けたグリコシル化経路における他の下流酵素（またはその機能的断片）を発現するように付加的に改変され得る。このような付加的な酵素には、例えば、とりわけ、GlcNAcトランスフェラーゼI (GnT-I)、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1 (GalT)、マンノシダーゼII (Man-II)、およびGnT-IIのうちの1つまたは複数が含まれる。Jacobs et al. (2009)；Gerngrossに対する米国特許第7,029,872号を参照されたい。
【００６２】
GnT-Iは、Man5GlcNAc2におけるトリマンノシルコアのα-1,3-マンノースへのβ-1,2結合GlcNAc残基の付加を触媒する。GnT-I活性の導入は、本発明における使用に関して、GlcNAcトランスフェラーゼI (GnT-I) をコードする核酸配列を含むベクターによる形質転換によって達成され得る。このような核酸配列は、任意の種、例えば、ウサギ、ラット、ヒト、植物、昆虫、線形動物、およびリーシュマニア・タレントラエ (Leishmania tarentolae) などの原虫に由来し得る。具体的な態様において、ヌクレオチド配列はヒトGnT-Iをコードする。GnT-Iまたはその機能的部分はゴルジ体へ標的化され、これはGnT-Iタンパク質またはその機能的部分中に酵母ゴルジ局在化シグナルを含めることによって達成され得る。ある特定の態様において、ヒトGnT-Iの触媒ドメインは、公知のシス／メディアルゴルジ局在性を有するグリコシルトランスフェラーゼであるS. セレビシKre2pのN末端ドメインに融合される。
【００６３】
GalTは、ドナー基質としてUDP-Galを用いる、β-1,4結合におけるガラクトース残基のβ-1,2-GlcNAcへの付加を触媒する。GalT活性の導入は、ヒト、植物（例えば、シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)）、昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ）に由来し得る、GalTまたはその機能的断片をコードする核酸配列を含むベクターによる形質転換によって達成され得る。GalTまたはその機能的部分は、ゴルジ保持シグナルを含むように遺伝子操作され、ゴルジ体へ標的化される。例示的なゴルジ保持シグナルは、サッカロミセス・セレビシエKre2タンパク質の最初の100アミノ酸から構成される。
【００６４】
Man-IIは、GlcNAcMan5GlcNAc2 N-グリカンから末端のα-1,3-マンノースおよびα-1,6-マンノースの両方を除去するように作用する。α-1,3アーム上の末端β-1,2結合GlcNAc残基の存在が、この活性に必須である。Man-II活性の導入は、ゴルジ局在化シグナルを含むように操作された、Man-IIタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸ベクターで株を形質転換することによって達成され得る。一例として、適切な核酸は、S. セレビシエMnn2pのゴルジ局在化ドメインにインフレームで融合されたキイロショウジョウバエMan-IIの触媒ドメインをコードし得る。
【００６５】
GnT-IIは、トリマンノシルコアの遊離α-1,6-マンノースへの第2のβ-1,2結合GlcNAc残基の付加を触媒する。GnT-II活性の導入は、GnT-IIタンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクターによる形質転換によって達成され得る。GnT-II遺伝子は、哺乳動物種を含むいくつかの種からクローニングされており、本発明において使用することができる。一例として、適切なヌクレオチド配列は、S. セレビシエMnn2pのN末端部分に融合されたラットGnT-IIの触媒ドメインコードする。
【００６６】
株に対する他の操作
本明細書で開示される株は、例えば、クローニングおよび選択を容易にするための変異栄養要求性遺伝子（例えば、his-）を有すること、産物の分解を限定するためのプロテアーゼ欠損（例えば、pep4-、prbl-、および／またはsub2-）を有すること、緩徐なメタノール使用表現型（例えば、mutS）を有することを含む、様々な適切な操作（交差または組換え操作など）によって達成される付加的な特徴を含み得る。
【００６７】
具体的な態様において、本開示は以下の株を提供する：
SuperMan5、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI (=His+)；
SuperMan5 (his-)、P. パストリス、och1-、his4-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI；
SuperMan5 (mutS)、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI（緩徐なメタノール使用）；
SuperMan5 (pep4-)、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI（プロテアーゼ欠損）；
SuperMan5 (prb1-)、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI（プロテアーゼ欠損）；
SuperMan5 (pep4-、sub2-)、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI（プロテアーゼ欠損）；
SuperMan5 (pep4-、prb1-)、P. パストリス、och1-、ブラストサイジン耐性、T. リーゼイ由来マンノシダーゼI（プロテアーゼ欠損）。
【００６８】
株の使用
異種タンパク質をコードする発現ベクターで本発明の株を形質転換することにより、1つまたは複数のN-グリコシル化部位を有する異種タンパク質を本発明の株において発現させて、そのN-グリカン構造が実質的に均一である異種タンパク質の調製物を得ることができる。
【実施例】
【００６９】
実施例1‐SuperM5株の作製
本実施例は、Jacobs et al. (2009), Nature Protocols 4:58-70（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているM5-Blast株からのSuperM5株の作製を記載する。
【００７０】
M5-Blast株はP. パストリスGS115株の改変物であり、内因性マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子OCH1が、一重交差相同組換えにより、α-1,2マンノシダーゼ遺伝子を含むベクター（pGlycoSwitchM5-Blastベクター）の挿入によって破壊されている。一重交差相同組換えの結果として、組み込まれたマンノシダーゼ発現カセットには、OCH1 ORF由来のおよそ450 bpの相同配列が隣接している。このM5-Blast株のOCH1ゲノム遺伝子座の配列は、SEQ ID NO: 53に記載される。配列決定から、pGlycoSwitchM5-Blastベクター配列とOCH1 ORF 3'断片との間の接合部において10 bpが喪失しており、その結果、OCH1 C末端断片の上流にあるpGlycoSwitchM5-Blastベクター由来の3つの望ましい終止コドンのうちの1つが喪失し、第2および第3の終止コドンがその断片とは異なるリーディングフレームにフレームシフトしたことが明らかになった。結果として、実際のORFは、28 bp上流のベクター骨格中のインフレームのATGコドンまで伸長された。野生型タンパク質のPhe27は新たなORFのPhe11になり、新たな予測シグナル配列は、部分的に古いシグナルアンカーとベクター骨格由来の新たに融合された配列からなる。この新たなORFのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 3に記載される（予測される新たなシグナル配列である最初の25アミノ酸を伴う）。
【００７１】
一重交差相同組換え事象後のOCH1ゲノム遺伝子座のN末端領域を、二重交差相同組換えによりこのN末端領域を除去するために用いられる構築物と共に、図1に図示する。この構築物は、lox71-lox66対によって隣接された選択マーカーおよび対抗選択マーカーの両方を含み、これによってcre媒介組換えによる選択／対抗選択カセットのその後の除去が可能になる。相同アームを伴う二重交差選択／対抗選択カセットの配列はSEQ ID NO: 58に記載され、その作製は本実施例において以下に記載される。
【００７２】
交差構築物を作製する前に標的化領域の配列を確認するため、PCRプライマーを設計して、マンノシダーゼORFの上流の領域を包含する約1650 bpのDNAを増幅した。Phusionポリメラーゼ (NEB) を用いて、PCRプライマー80670918および80670919は、M5-BlastゲノムDNAから適切なサイズの断片を増幅した。PCR産物をTOPOクローニングし、配列を検証した。DNA配列から、マンノシダーゼ発現ベクターが、挿入のこの終了時にGS115ゲノムに正確に組み込まれたことが実証された。
【００７３】
隣接するPCRプライマーを設計して、M5-BlastゲノムDNAから、図1に示される相同領域を増幅した。これらのPCRプライマーのアラインメントを図2に示す。Phusionポリメラーゼを使用して、M5-BlastゲノムDNAからのPCR反応に成功した。
【００７４】
以下のプライマー対の組み合わせによるPCR産物をゲル単離し、lox71およびlox66組換え部位を付加するための鋳型として使用した：
80765855‐80765856（642 bp、図2A）
80765857‐80765858（658 bp、図2A）
80765852‐80765854（910bp、図2B）
80765853‐80765854（956 bp、図2B）
【００７５】
ミスマッチPCRプライマーを設計して、2つの相同アームの適切な末端においてlox部位を付加した。これらのミスマッチプライマーを図3に図示する。Phusionポリメラーゼを用いたPCR反応は、3つの反応の各々から正確なサイズのDNA産物を作製することに成功した：
80765855‐80984794（670 bp、図3A）
80765857‐80984794（681 bp、図3A）
80984795‐80765854（850 bp、図3B）
【００７６】
アームにlox部位を付加することに加えて、PCRプライマーを設計して、既存のlox71-MazF-NatR-lox66カセット上に適切なM5-BlastピキアゲノムDNA伸長物を付加した。再度、Phusionポリメラーゼを用いて、図4に示されるように正確なPCR産物を作製した。使用したプライマー対：
80984793‐80984796（2941 bp、図4）
【００７７】
選択／対抗選択カセットのPCR産物をゲル精製し、3断片重複PCRを行って、相同アームをこのカセットに付着させた。簡潔に説明すると、プライマーの非存在下で3断片を20回サイクリングして、断片の末端において重複部をアニールして伸長させた。次いでサイクリングした混合物を希釈し、図5に図示されるプライマーの存在下で35回サイクリングした。
【００７８】
PCR反応は、3分の伸長時間を使用してPhusionポリメラーゼで行った。プライマーを以下に詳述する：
80765855‐80765854（4311 bp、図5）
【００７９】
このPCR産物をゲル単離し、TOPOクローンニングした。選択カセットの包含を確実にするために、TOPOクローニングの選択をLB-Natプレート上で行った。複数の単離物においてDNA配列決定を行い、相同アーム配列を決定した。最終単離物は、機能的なNatR発現カセット、lox71およびlox66組換え部位、ならびに正確な相同アームを含んでいた。
【００８０】
図5に詳述されるクローニングされた断片の内部のPCRプライマーを用いて、ピキア・パストリス形質転換のための線状DNAを作製した。2つの独立したプライマーセットを設計した：
81364233‐81364234（4063 bp、図6）
81364235‐81364236（4060 bp、図6）
【００８１】
PCR反応は、Phusionポリメラーゼを用いて、100秒の伸長時間で行った。
【００８２】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、結合マトリックスから水で溶出した。標準的なDTT／ソルビトール処理を用いて、M5-Blastピキア・パストリス株をエレクトロポレーション受容性にした。エレクトロポレーションは、20μlコンピテント細胞および1〜2μlの精製線状DNAを含む1 mmキュベットを用いて行った。形質転換混合物をYPD-Nat寒天上にプレーティングした。
【００８３】
エレクトロポレーション後、細胞を30℃で3日間増殖させた。個々の形質転換体を、貯蔵および解析のためにYPD-Natにパッチした。図7は、M5-Blastゲノム中へのPCR産物の適切な二重交差組込み後のOCH1遺伝子座の理論的な配置を示す。PCRプライマー対を設計して、ノーセオスリシン耐性単離物が、PCR産物のゲノム中へのランダムな組込みではなく、相同組換えの結果であることをチェックしたこれらのPCRプライマー対を図7に図示する。
81487116‐81487117（895 bp、図7）
81487118‐81487119（937 bp、図7）
81487120‐81487121（656 bp、図7）
81487122‐81487123（756 bp、図7）
【００８４】
合計24個の独立した単離物をPCRによってスクリーニングし、正しいと考えられた単離物2つを、PCR産物のDNA配列決定によりさらに特徴づけた。2つの単離物を、単一コロニーになるようYPD培地上に塗布し、YPD-Nat上で再試験した。フェノール／クロロホルムガラスビーズ溶解を用いて、小規模のゲノムDNA調製物を作製した。これらのゲノム抽出物における81487116‐81487117、81487118‐81487119、81487120‐81487121、および81487122‐81487123プライマー対の配列決定結果に基づき、単離物は両方とも、M5-Blastゲノム中の適切な位置にlox71-lox66選択／対抗選択カセットを含んでいた。形質転換断片を生じるための最初のPCR反応によって導入された変異は存在せず、両末端における組換え接合部はM5-Blast「野生型」DNA配列と同一であり、かつlox71部位およびlox66部位は両方ともインタクトであった。二重交差組換え後のOCH1遺伝子座のDNA配列は、SEQ ID NO: 59に記載される。
【００８５】
2つの単離物（A1-2およびA4-3）を、creリコンビナーゼを構成的に発現するプラスミドで形質転換した。簡潔に説明すると、DTT／ソルビトール手順を用いて両株をエレクトコンピテントにし、これに環状プラスミドをエレクトロポレートし、YPD-G418上にプレーティングした。形質転換体を30℃で数日間増殖させ、コロニーを採取した。コロニーは、メタノールプレートに直接移して、MazF対抗選択を誘導するか、またはYPDにパッチして、MazF誘導の前にcre-ARSプラスミドの喪失を可能にした。メタノール誘導は、BMMY（1%メタノール）およびCSM（完全合成培地、0.5％メタノール）の両方で行った。反転したプレートの蓋に100μlメタノールを添加することによって、プレートに毎日メタノールを補充した。インキュベーションは30℃で行った。試験したすべての条件下で、有意なコロニー形成が認められた；メタノール上での増殖は、形質転換体がYPD-G418から直接生じたのであるか、またはG418なしのYPD上での中間パッチを経たかにかかわらないようであった。
【００８６】
Cre組換えは、lox71部位とlox66部位との間のDNA配列を除去し、ゲノムに欠損lox部位の傷跡のみを残すはずである。この組換え事象の理論的結果を図8に示す。PCRプライマーを設計して、欠損loxの傷跡を含む領域を増幅した。メタノール上で増殖した20個のコロニーをPCRによってスクリーニングして、選択／対抗選択カセットの喪失を判定した。使用したPCRプライマーは以下のものであった：
80670916‐80670917（680 bp、図8）
80670918‐80670919（782 bp、図8）
【００８７】
第1プライマー対を用いて、20個の単離物のうち17個が適切なPCR産物を生じた。17個のうちすべてではないが大部分は、第2プライマー対を用いて適切な産物を示した。17個の単離物の各々をYPD、YPD-Blast、YPD-Nat、およびYPD-G418にパッチして、薬物選択マーカーの有無について試験した。creプラスミドが選択／対抗選択カセットを適切に除去し、その後失われたのであれば、得られた株はブラストサイジン耐性であり、かつG418およびノーセオスリシンの両方に対して感受性であるはずである。単離物はすべてブラストサイジン耐性であり、かつノーセオスリシン感受性であった。いくつかはG418耐性を保持しており（おそらくは組み込まれたcreプラスミドをなお含んでいる）、これらは廃棄した。残りのうち4個を、LEU5‐マンノシダーゼHDEL遺伝子間領域のDNA配列決定のために採取した。
【００８８】
既存のPCRプライマーを用いて、LEU5およびマンノシダーゼHDEL ORFに及ぶゲノム領域を増幅した。
81487118‐80765854（1602 bp、図9）
【００８９】
フェノール／クロロホルムガラスビーズ抽出によって調製されたゲノムDNAにおいてPhusionポリメラーゼを用いて、PCR増幅を行った。複数の内部配列決定プライマーを用いて、1602 bp PCR 産物の全配列を検証した。配列決定された4個のPCR産物はいずれも正しく、LEU5遺伝子とマンノシダーゼHDEL ORFとの間の適切な位置に欠損lox部位を含んでいた。LEU5プロモーター、およびマンノシダーゼHDEL発現を駆動するGAPプロモーターはいずれもインタクトであり、出発M5-Blast株に存在するプロモーターと同一であった。二重交差組換えおよびcre組換え後のOCH1遺伝子座のDNA配列は、SEQ ID NO: 1に記載される。
【００９０】
単離物4個（およびcre組換えの前の親株2個）の各々のグリセロール貯蔵物を調製した。
bG酵母‐100015  A1-2（組換え前）
bG酵母‐100016  A4-3（組換え前）
bG酵母‐100017  単離物1（組換え後）
bG酵母‐100018  単離物2（組換え後）
bG酵母‐100019  単離物3（組換え後）
bG酵母‐100020  単離物4（組換え後）
【００９１】
各グリセロール貯蔵物を画線し、適切なマーカーについて再試験した：
bG酵母‐100015  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンR
bG酵母‐100016  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンR
bG酵母‐100017  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンS
bG酵母‐100018  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンS
bG酵母‐100019  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンS
bG酵母‐100020  his-、ブラストサイジンR、ノーセオスリシンS
【００９２】
試験したグリセロール貯蔵物はすべて、予測通りであった。
【００９３】
全6個の単離物のYPD穿刺物を作製し、糖鎖解析に供した。グリセロール貯蔵物bG酵母‐100017を用いて、ゲノム配列決定のための大きなゲノムDNAの調製物を作製した。加えて、野生型GS115およびM5-Blast株からも試料を調製した。簡潔に説明すると、100 ml酵母培養物（YPD、30℃増殖）からの細胞ペレットを1 Mソルビトール／100 mMクエン酸 (pH 6.0) に再懸濁し、RNaseを含むZymolyase (Zymo Research) で37℃にて2時間処理した。SDSを0.5％になるまで添加して、スフェロプラストを溶解した。次いでプロテイナーゼKを添加し、混合物を50℃で一晩インキュベートした。等量のフェノール／クロロホルムを添加し、混合物を30分間にわたり穏やかに揺り動かした。遠心分離後、上部水層を除去し、イソプロパノールでDNAを沈殿させた。糸状のDNAを溶液から巻き取り、TEに再懸濁した。DNAをエタノールで再度沈殿させた後、70％エタノールで洗浄し、風乾し、最後にTEに再懸濁した。
【００９４】
DNAを複数のチューブに分注した：
bG DNA‐100215  GS115ゲノムDNA
bG DNA‐100216  GS115ゲノムDNA
bG DNA‐100217  GS115ゲノムDNA
bG DNA‐100221  bG酵母‐100017ゲノムDNA
bG DNA‐100222  bG酵母‐100017ゲノムDNA
bG DNA‐100223  M5-BlastゲノムDNA
bG DNA‐100224  M5-BlastゲノムDNA
【００９５】
ゲノムDNA単離物を試験し、bG酵母‐10017株を作製する際に行われた操作がOCH1 ORFの変異型を変化させなかったことを検証するために、OCH1 ORFのN末端領域をbG DNA‐100221（新たな株）およびbG DNA‐100223（M5-Blast株）からPCRにより単離し、再度配列決定した。いずれのDNA調製物もOCH1 ORF遺伝子座において同一であり、上記のような10 bp欠失を含んでいた。
【００９６】
本実施例において用いられたプライマーを以下に記載する：
0006407872.tif 000003
【００９７】
実施例2‐貯蔵および取扱い
SuperM5を-80℃、-4℃、20℃、および室温の異なる条件で貯蔵した。株は、凍結グリセロール貯蔵物としておよび穿刺培養物として貯蔵した。異なる実験のため、および試験用に共同研究者に輸送するために、異なる培養物を貯蔵し、融解した。すべての場合において、この株は親ピキア・パストリスGS115株と同様に回収、プレーティング、および培養され、親株と同様に複合培地および規定培地の両方で増殖した。SuperM5株は親株と同様に形質転換され、タンパク質は、主なグリコフォームとしてまたは唯一のグリコフォームとしてマンノース-5グリコシル化を有して発現された。株は繰り返し貯蔵および再増殖されて、SuperM5株の頑強性を証明した。
【００９８】
実施例3‐P. パストリス株における試験タンパク質の解析
カンジダ・アンタルチカ (Candida antartica) リパーゼAおよびB、ヒトトランスフェリン、ならびにヒトのIgG由来CH2ドメインの遺伝子を、標準的な形質転換方法を用いてSuperM5ゲノムに組み込んだ。すべての場合において、有意な量のタンパク質が産生され、培地中に分泌された。形質転換された株およびタンパク質を含む培地を、以前に公表された方法を用いてグリカン解析について試験した。すべての場合において、試験タンパク質および株の糖タンパク質のグリカンプロファイルは、マンノース-5グリカン構造を実証し、用いた方法によって他のより高次のマンノース構造は検出されなかった。
【００９９】
実施例4‐P. パストリス株における細胞壁マンノプロテインの解析
12種類のピキア・パストリス株およびMan5-Blast株を、2 ml YPDを含む24ウェルプレート中で起こし、浸透 (250 rpm) させながら28℃で一晩増殖させた。増殖後、細胞を遠心分離（室温で3000 g、5分）によって回収し、Jacobs et al.（Jacobs et al., 2009, Nature Protocols 4(1):58-70を参照されたい）によるプロトコールに従って細胞壁マンノプロテインを抽出した。抽出されたマンノプロテイン（100μl ddH2O中）を、RCM緩衝液（8 M尿素、3.2 mM EDTA、360 mM Tris-HCL、PH 8.6）で300μlになるように希釈した。Laroy et al. (Laroy et al., 2006, Nature Protocols, 1: 397-405) によって公表された96ウェル膜上脱グリコシル手順に従って、これらの試料からN-グリカンを調製した。
【０１００】
乾燥N-グリカンを8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸2で標識した後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex G-10樹脂2）を用いて過剰な標識を除去した。試料を最終的に10μlの超純水中で再構成し、10倍希釈してから、ABI 3130 DNAシーケンサーのキャピラリー（e.l. 36 cm；i.d. 50μm）中に注入した（1.2 kVで80"）。以下の設定を適用した：オーブン温度：60℃ ラン電圧：15 kV；プレラン電圧：180" ラン時間：1000"；プレラン時間：15 kV。Genemapper v3.7を用いて、得られたデータを解析し、構造をピークに割り当てた（図10を参照されたい）。
【０１０１】
実施例5‐材料および方法
以下に、本発明に関する材料および方法の非限定的な例を記載する。
【０１０２】
プラスミドおよび株：
ピキア・パストリス発現ベクターpPICZαAは、Invitrogen Corporationから購入した；pUC19/GM-CSFプラスミド（GM-CSF遺伝子配列を含む）は、Shanghai Qing-Lan Biotech Co., Ltd.によって合成された；サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターpYES2、ピキア・パストリスX-33（野生型）、大腸菌 (E. coli) JM109は、本発明者らの研究室によるものであった。
【０１０３】
試薬および装置：
Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、制限酵素、T4リガーゼ、5-フルオロオロチン酸 (5-FOA) は、Shanghai Biological Engineering Technology Services Co., Ltd.から購入した；Zymolyaseは、Sigmag company (USA) から購入した；N-グリコシダーゼF (PNGase F) は、New England Biolabs, Inc. (USA) から購入した；ペプトン、酵母エキス、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース (YNB) は、BIO BASIC INC (Canada) から購入した。PCR装置 (PTC 100) は、MJ Research, Inc. (USA) によるものであった；電気泳動システム、ゲル画像化システムは、Bio-Rad (USA) によるものであった；AKTA精製システムは、GE (USA) から購入した。
【０１０４】
プライマー：
報告されたピキアURA3（オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ) 遺伝子配列（GenBank：AF321098）に基づき、相同断片に基づく2対の伸長増幅プライマーを設計した：URA5F、URA5R、およびURA3F、URA3R；サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターpYES2配列に基づき、プライマーpYES2FおよびpYES2Rを設計した；GenBank (E12456) の報告したピキアOCH1遺伝子配列に基づき、相同配列に基づく2対の増幅プライマーを設計した：OCH5F、OCH5R、およびOCH3F、OCH3R。内部同定プライマー (in ) 5F、(in ) 3Rも同様の配列に基づいた：ユニバーサルプライマー5' AOX1配列、3' AOX1配列は、参考文献に基づいた。プライマーは、Shanghai Biological Engineering Technology Services Co., Ltd.によって合成された。
【０１０５】
酵母細胞培養、ゲノム抽出、およびPCR条件は、公知のプロトコールに基づいて行った。
【０１０６】
URA3相同置換DNA配列の構築：
鋳型としてのX-33株ゲノム、ならびにプライマー対URA5F、URA5R、およびURA3F、URA3Rを用いて、URA3遺伝子の両側の相同断片、それぞれ700 bpおよび600 bpのURA5'およびURA3'をPCR増幅した。次に鋳型としてのURA5'およびURA3'、ならびにプライマー対としてのURA5FおよびURA3Rを用いて、URA3遺伝子の標的相同置換DNA断片であるURA5-3をPCR増幅したが、これは約1300 bpというサイズであった。
【０１０７】
pYXZプラスミドの構築：
鋳型としてのプラスミドpYES2、ならびにプライマー対pYES2FおよびpYES2Rを用いて、URA3遺伝子を含む配列をPCR増幅した。PCR産物を精製し、Sal Iで消化した後、ライゲーション反応を行った。自己連結したプラスミドpYXZを大腸菌JM109に形質転換し、陽性クローンを選択するためにアンピシリンを含むLBプレート上にプレーティングした。
【０１０８】
OCH1相同アームのクローニング：
鋳型としてのX-33株ゲノム、ならびにプライマー対OCH5F、OCH5R、およびOCH3F、OCH3Rを用いて、OCH1遺伝子相同アームの5'末端および3'末端、OCH5'およびOCH3'、ならびにその融合断片OCH3-5をPCR増幅した。用いた方法は、上記のものと同様であった。断片のサイズは、それぞれ1000 bp、700 bp、および1700 bpであった。
【０１０９】
ノックアウトプラスミドpYXZ-OCH1の構築：
本発明者らは、OCH1遺伝子5'および3'相同融合断片OCH3-5をNhe IおよびSal Iで消化し、この断片をSal IおよびNhe Iで消化したpYXZプラスミドにクローニングして、ノックアウトプラスミドpYXZ-OCH1を作製した。
【０１１０】
栄養要求性選択マーカーを構築するためのピキア・パストリスX-33由来のURA3遺伝子のノックアウト：
URA3遺伝子の両末端に対する相同配列を有する融合断片URA5-3アームを用いて、X-33コンピテント細胞をショックにより形質転換した；形質転換細胞を、5-FOAおよびウラシルを含むMD培地（YNB 1.34％、グルコース2％、寒天1.5％、ウラシル100μg/mL、5-FOA 1 mg/mL）上に広げ、30セ氏温度で3〜5日間インキュベートした。培地上で増殖した単一コロニーを選択し、爪楊枝でそれぞれMD培地（YNB 1.34％、グルコース2％、寒天1.5％）およびMDU培地（YNB 1.34％、グルコース2％、寒天1.5％、ウラシル100μg/mL）に播種し、30セ氏温度で3〜5日間インキュベートした。次いで、MDU培地上で良好に増殖したが、MD培地上では増殖できなかった株を選択した。選択工程を3ラウンド繰り返して、安定した形質を取得し、最終的な株を、プライマーとしてURA5F、URA3R、および鋳型としてゲノムDNAを用いて、PCRにより確認した。
【０１１１】
ピキア・パストリスX-33のOCH1遺伝子ノックアウト：
ノックアウトプラスミドpYXZ-OCH1を、2つの相同アームの間に位置するMlu I部位において線状化し、X-33 (ura3-) コンピテント細胞に電気ショックにより形質転換し、MD培地上に広げ、25セ氏温度で約1週間インキュベートした。単一コロニーを爪楊枝で採取し、YPD培地（ペプトン2％、酵母エキス1％、グルコース2％、寒天1.5％）を含む2枚のプレート上に同等になるよう播種し、それぞれ25セ氏温度および37セ氏温度で数日間インキュベートした。25セ氏温度で良好に増殖したが、37セ氏温度では増殖できなかったコロニーを抽出して、ゲノムDNAを採取した。PCR同定のために、OCH1遺伝子外部プライマーOCH5F、OCH3R、および内部プライマー (in) 5F、(in) 3Rを使用した。
【０１１２】
発現ベクターの構築：
本発明者ら自身の研究室によるプラスミドpUC19/GM-CSFを、EcoRIおよびNot Iで二重消化した。GM-CSF遺伝子断片を抽出し（6xHisタグ配列を導入した）、同じ制限酵素で消化したピキア・パストリス発現ベクターpPICZαAにクローニングして、発現ベクターpPICZαA/GM-CSFを作製した。陽性クローンを選択し、制限酵素消化および配列決定によって確認した。
【０１１３】
ピキア・パストリスX-33およびX-33 (och1-) におけるGM-CSFの発現および解析：
発現ベクターpPICZαA/GM-CSFを Sal Iで線状化し、このプラスミドをX-33および X-33 (och1-) コンピテント細胞に電気ショックにより形質転換した。ショックを与えた混合物を、YPDZ培地（それぞれ100 μg/mL、300 μg/mL、または500 μg/mL Zeocinを含む）でコーティングされた培養布に広げ、X-33形質転換体は30セ氏温度で3〜5日間増殖させ、X-33 (och1-) 形質転換体は25セ氏温度で約1週間培養した。良好に増殖した単一コロニーを採取して、ゲノムDNAを抽出し、プライマー5' AOX、3' AOX1を用いるPCR反応により同定して、陽性形質転換体を選択した。陽性X-33/PICZαA/GM-CSF細胞は、2 mLのYPD培地（2％ペプトン、1％酵母エキス、2％グルコース）に接種し、30セ氏温度で24時間インキュベートした。この培養物を用いて、10 mLのBMGY培地（2％ペプトン、酵母エキス1％、YNB 1.34%、グリセロール2％、100 mモル／Lリン酸緩衝液、pH 6.0）に接種した（5％接種比）。30セ氏温度での36時間のインキュベーション後、培養物を遠心分離して上清を除去し、ペレットを3 mLのBMMY培地（酵母エキス1％、YNB 1.34％、ペプトン2％、100 mモル／Lリン酸緩衝液、pH 6.0）に再懸濁し、2％メタノールを添加して、発現を誘導した：X-33 (och1-)/pPICZαA/GM-CSF陽性細胞は、YPD培地で25セ氏温度にて48時間、BMGYで25セ氏温度にて48時間培養し、25セ氏温度で発現を誘導した。発現誘導条件は、X-33細胞で使用された条件と同じであり、メタノールは24時間ごとに添加し、誘導は72時間行った。終了した時点で、細胞培養物を遠心分離し、タンパク質解析のために上清を収集した。
【０１１４】
実施例6‐M5-Blast株およびSuperM5株のトランスクリプトーム解析
RNA単離のための株の増殖
BG10株、GS115株、M5 Blast株、およびSuperM5株（実施例1に記載）を、パッチとしてYPD寒天プレート上で維持した。トランスクリプトーム解析のため、パッチから各株の50 ml培養液に接種し、BMGY中で30℃、200 rpmにておよそ16時間増殖させた。静止培養物を新鮮なBMGY培地中に100倍希釈し、30℃、200 rpmにて6時間増殖させた。この時点を、炭素源としてグリセロールを使用する指数増殖と見なした。一定分割量を15 mlチューブ中で遠心沈殿させ、上清を廃棄し、細胞ペレットを液体窒素中で急速に凍結した。細胞ペレットは、その後の全RNA単離のために-80℃で貯蔵した。
【０１１５】
全RNA単離
FastRNA SPINキット (MP Bio) を用いて、全RNAを単離した。細胞溶解は、BioSpec Mini-Beadbeater 96を用いて行った。全RNAをスピンカラムから15μlのRNase/DNaseフリー水中に溶出し、液体窒素中で凍結し、-80℃で貯蔵した。RNA試料は、Illumina HiSeq装置でのRNA-Seq解析のために、ドライアイス上で輸送した。RNA試料はAgilent Bio Analyzerで解析し、すべてがインタクトな酵母リボソームRNAピークを示した。
【０１１６】
RNAライブラリーの作製および配列決定
Illumina試薬を用いて、mRNAライブラリーを調製した。TruSeq RNA試料調製キットを用いて、ポリA RNAからバーコード化cDNAを選択的に作製した。バーコード化および増幅後、合計12の試料を解析のためにプールした（この研究に関して4つの試料）。50塩基のシングルエンド読み取りを行った。データは、標準的なFASTQ形式でBioGrammaticsに提供された。読み取りを不明瞭な塩基および品質スコアに基づいてトリミングし、次いでフィルターをかけて、40塩基未満の長さであるトリミング済みの全読み取りを排除した。およそ0.3％の読み取りが各データセットから除去された。
【０１１７】
CLC Genomics WorkbenchのRNA-Seqアルゴリズムを用いて、各データセットからの読み取りを、BG10野生型注釈付き配列にマッピングした。BG10ゲノムが、Man5株およびSuperM5株に存在するマンノシダーゼおよびブラストサイジン耐性遺伝子の発現カセットを含まないことに留意されたい。
【０１１８】
遺伝子発現プロファイリング
4つの株の各々の発現プロファイルをプロットし、クラスター化した。散布図（R値を伴う）を、全発現プロファイルの株間の比較について評価した。BG10株とGS115株は最も密接な相関関係を示し（R値 = 0.98）、Man5株とSuperM5株がこれに続いた（R値 = 0.95）。OCH1変異株 対 GS115株において、わずかな一般的上方制御が認められた（R値はMan5およびSuperM5それぞれについて0.92および0.84）。全体として、グリセロールにおいて増殖させた場合、遺伝子発現パターンは3株（GS115、M5、およびSuperM5）の中で同様である。
【０１１９】
BG10株に対するRNA-Seqデータセットマッピングの各々から、OCH1マッピングを抽出した。BG10株およびGS115株では、被覆スケールは0〜約75であった。OCH1の発現レベルはほぼ等しかった。配列読み取りは、オープングリーディングフレームにわたってほぼ等しく分布した。これらの2つの株におけるOCH1の発現レベルは、最も高く発現された遺伝子のおよそ0.2％であった。
【０１２０】
SuperM5株では、被覆スケールは0〜47であった。発現レベルは、BG10株およびGS115株のおよそ半分にまで低下した。また、オープンリーディングフレームのN末端の被覆は認められなかった。この被覆の欠如は、SuperM5株からこれらのDNA配列が完全に欠失している結果であった。
【０１２１】
Man5株では、被覆スケールは0〜502であった。オープンリーディングフレームのC末端部分よりもN末端部分の、有意により多くの被覆が認められた。この被覆の分離は、Man5株においてオープンリーディングフレームのN末端部分の大部分が重複している結果であった。ORFのN末端はマンノシダーゼORFの上流のDNAから発現され、ORFの変異型のC末端部分はマンノシダーゼORFおよびブラストサイジン耐性ORFの下流で発現された。読み取りの被覆に基づいて、ORFのC末端部分は、SuperM5よりもMan5においてわずかに少ないようである。
【０１２２】
Man5およびSuperM5データの変異型のOCH1 ORFへのマッピングから、両株における変異OCH1 ORFの完全な被覆が示され、遺伝子発現が示唆された。Man5株は、野生型OCH1 ORFマッピングについて上記したのと同じ理由で、ORFのN末端部分において余分な被覆を示す。
【０１２３】
Man5およびSuperM5データのマンノシダーゼORFへのマッピングから、2つの株における同様の発現レベルが示された。
【０１２４】
結論
GS115株、Man5株、およびSuperM5株において、トランスクリプトーム解析を行った。これらの株は、同様の全体的遺伝子発現パターンを示す。Man株およびSuperM5株では、変異型のOCH1 ORFが発現される（ポリアデニル化mRNAが存在する）。マンノシダーゼHDEL ORFは、両方の株においてほぼ同じレベルで発現される。
【０１２５】
実施例7‐M5-Blast様株およびSuperM5株におけるトラスツズマブ発現
試験1では、実施例1に記載されるSuperM5株を、エレクトロポレーションによって、トラスツズマブをコードする発現ベクターで形質転換した。AOX1プライマーおよびハーセプチン特異的プライマーを用いたゲノムPCRによって、Zeocin耐性コロニーをスクリーニングした。ゲノムPCRの陽性クローンを培養し、培養上清へのMan5型トラスツズマブ発現をSDS-PAGEによって評価した。
【０１２６】
試験2では、トラスツズマブをコードする発現ベクターで形質転換されたピキア株をスクリーニングして、高レベルのトラスツズマブを発現する株を選択した。選択された株を、エレクトロポレーションによって、GlycoSwitch（登録商標）プラスミド（pGlycoSwitch-M5/2 (GAP, BSD)、Gent Universityによって提供）で形質転換した。ブラストサイジンS耐性コロニーを、OCH1遺伝子座へのpGlycoSwitch-M5挿入およびMDS1遺伝子の存在を検出するために、ゲノムPCRによってスクリーニングした。ゲノムPCRの陽性クローンを培養し、培養上清へのMan5型トラスツズマブ発現をSDS-PAGEによって評価した。
【０１２７】
試験3では、試験1（クローン46）および試験2（クローン11）で得られた陽性クローンを、1 Lバッフル付きフラスコ中で培養した。メタノール含有培地と交換することにより、トラスツズマブ発現を誘導した。メタノール誘導の72時間後、トラスツズマブを、プロテインAアフィニティー樹脂を用いて培養上清から精製した。クローン46およびクローン11からのトラスツズマブの生産性は、それぞれ3 mg/L培養物および1.3 mg/L培養物であった。
【０１２８】
試験4では、クローン46（試験1）およびクローン11（試験2）において産生されたトラスツズマブのN-グリカン構造を解析した。一次解析では、N-グリカン構造の均一性を評価し、二次解析では、N-グリカンデータベースの検索および標準試料とのHPLC注入に従って、N-グリカン構造を同定した。これらの解析から、クローン46（試験1）から得られたトラスツズマブのN-グリカン構造は実質的に均一であり、主な（または本質的には唯一の）N-グリカンは、MALDI-TOF質量分析からMan5GlcNac2と推定された（図11）。クローン11（試験2）から得られたトラスツズマブのN-グリカン構造は、Man5GlcNAc2〜Man8GlcNAc2の混合物であることが判明した。
【０１２９】
（表７）試験2から得られたトラスツズマブのN-グリカン解析
0006407872.tif 000004
【０１３０】
クローン46から得られたMan5型トラスツズマブのHer2結合親和性を、ELISAアッセイおよびBIAcoreアッセイによって、市販のハーセプチンと平行して解析し、市販のハーセプチンと同様のHER2結合活性を有することが判明した。図12および表8を参照されたい。
【０１３１】
（表８）BIAcoreで解析されたトラスツズマブの動力学的パラメータ
0006407872.tif 000005
【０１３２】
実施例8‐M5-BlastおよびSuperM5において発現された付加的なグリコシル化タンパク質の解析
AOX1プロモーターによって駆動されるカンジダ・アンタルチカのリパーゼAおよびB（CalA、2 N-グリコシル化モチーフ、およびCalB、1 N-グリコシル化モチーフ）ならびにヒト血清トランスフェリン（2 N-グリコシル化モチーフ）の遺伝子を、AOX1遺伝子座における相同組換えにより、いずれも実施例1に記載されるM5-Blast株およびSuperM5株のゲノムに組み込んだ（Zeocinによる選択）。AOX1プロモーターによって駆動される天然ピキアPDIをコードする合成遺伝子に隣接したヒスチジン要求性の補完カセットを有するプラスミドを、同時形質転換した。選択は、Zeocinにより固体最少培地において行った。
【０１３３】
上記の各組み合わせの47個の形質転換体を培養し、microCE（キャピラリー電気泳動、GXII、CaliperLS）における分泌タンパク質の移動挙動の明白な変化に関して、タンパク質の存在量および品質を検査した。偽株の上清 (GS115) を陰性対照として適用した。
【０１３４】
SuperM5株から分泌された3つのタンパク質はすべて、M5-Blast株と比較して匹敵する発現レベルを示した。さらに、マイクロCEにおけるSuperM5上清からの標的タンパク質シグナルは、M5-Blast上清のものよりも少ない移動時間を示し、より低い見かけの分子量へと移行した。SuperM5からの分泌タンパク質のN-グリコシル化の変化は、微小規模においてより低い分子量をもたらすと考えられる。
【０１３５】
微小規模培養からの上清の試料およびバイオリアクターでの培養からの上清の試料を、そのN-グリカン組成について解析した。微小規模培養から得られた試料からは、0.5 mlの培地を2倍容量のRCM緩衝液（8 M尿素、3.2 mM EDTA、360 mM Tris-HCL、PH 8.6）で希釈した。バイオリアクター試料からは、0.2 ml培地を使用した。Laroy et al.（前記）によって公表された96ウェル膜上脱グリコシル手順に従って、これらの試料からN-グリカンを調製した。乾燥N-グリカンを8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸で標識した後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex G-10樹脂）を用いて過剰な標識を除去した。試料を最終的に10μlの超純水中で再構成し、10倍希釈してから、ABI 3730 DNAシーケンサーのキャピラリー（e.l. 36 cm；i.d. 50μm）中に注入した（1.2 kVで80"）。以下の設定を適用した：
オーブン温度：60℃  ラン電圧：15 kV
プレラン電圧：180"  ラン時間：1000"
プレラン時間：15 kV
【０１３６】
Genemapper v3.7を用いて、得られたデータを解析し、構造をピークに割り当てた。
【０１３７】
図13〜15に示されるように、SuperM5株から産生されたタンパク質のN-グリカンは実質的に均一であり、Man5GlcNAc2が主なN-グリカンであった。対照的に、M5-Blastから産生されたタンパク質のN-グリカンは、特にバイオリアクターでの培養からはかなり不均一であった。
【０１３８】
実施例9
本実施例では、実施例1に記載されるSuperM5株と、異なる遺伝的背景の野生型ピキア・パストリス株を接合させることにより、二倍体株を作製する。2つの遺伝的背景の組み合わせにより、OCH1破壊表現型の第2部位リプレッサーまたはエンハンサーがいずれかの株に存在するのかどうかを決定することが可能になる。二倍体は、各一倍体株の同一ゲノム位置における2つの優性選択マーカーを用いて「共に維持」される。二倍体OCH1遺伝子座において、この株は2つの異なるmRNAを転写する；一方は野生型Och1pをコードし（野生型一倍体ゲノムコピー由来）、他方は変異Och1pをコードする（SuperMan5一倍体ゲノムコピー由来）。
【０１３９】
Och1pの高度保存領域をV5エピトープタグと置換する、ハイグロマイシンB選択マーカーを含む二重交差ベクターを構築する。このベクターは、二倍体ゲノムへの組込みが、およそ50/50の分布で、野生型または変異型のOch1pのいずれかにおける高度保存ドメインと置き換わり、同様の出発遺伝的背景において両方のエピトープ挿入をもたらすように設計される。このベクターがOCH1のSuperM5ゲノムコピーに組み込まれた場合、ベクター上の薬物選択マーカーは、OCH1に隣接する既存のブラストサイジンマーカーと密接に連鎖する。ゲノムPCRおよびDNA配列決定を用いて、一方は野生型のOch1pがエピトープタグ化されており、およびもう一方は変異型のOch1pがエピトープタグ化されているという、2つの二倍体株の構築を検証することができる。
【０１４０】
二倍体に胞子を形成させ、ランダムな胞子を増殖させ、解析する。非選択培地上での増殖後、結果として得られた一倍体コロニーをハイグロマイシンB耐性についてスコア化する。ハイグロマイシンB耐性一倍体の分布および増殖特性は、エピトープ挿入によるOch1p不活化の致死性または増殖欠損を決定し得る。
【０１４１】
方法
prb1Δ遺伝子座にZeocin耐性マーカーを有する既存のSuperMan5株を、prb1Δ遺伝子座にノーセオスリシン耐性マーカーを有するBG10一倍体株と接合させて、出発二倍体株を作製する。BG10株は、prb1ΔノックアウトDNA構築物から作製される。
【０１４２】
Och1p配列中の14アミノ酸
0006407872.tif 000006
を14アミノ酸V5エピトープ
0006407872.tif 000007
と置換するためのハイグロマイシンBベクターを構築する。これは、ゲノムに組み込まれた場合、野生型および変異型のOch1pの両方の全長コード領域を保持する。
【０１４３】
ハイグロマイシンBベクターは、相同組換えによって二倍体ゲノムに組み込まれる。ゲノムDNAのPCRスクリーニングを用いて、相同組換えが起こった染色体（SuperMan5またはBG10のいずれか）および位置を検証することができる。陽性株からのPCR産物を配列決定して、Och1pからの14アミノ酸ドメインとV5タグとの置換を検証し、各ORFの長さが2つのコピーの各々において保持されることを確認する。
【０１４４】
2つの株を増殖させ、胞子を形成させ、結果として得られた一倍体を、prb1Δ遺伝子座における一方または他方の薬物マーカーに対する感受性によって検証する。一倍体はプレートレベルで増殖表現型について視覚的にスクリーニングすることができ、顕著な増殖分布が認められる場合、SuperMan5またはBG10 och1遺伝子座のいずれかまたは両方におけるV5タグ化構築物の存在についてスコア化される。すべての一倍体が同等に良好に増殖する場合、それらはハイグロマイシンBマーカーの存在についてスコア化され得る。胞子形成およびその後の発芽におけるハイグロマイシンBマーカーの喪失は、V5エピトープのOch1pタンパク質への挿入が、野生型および変異体の両方の場合において致死であることを示す。
【０１４５】
二倍体株、および生存可能であるならば得られた一倍体の両方の上清および抽出物における、ウェスタンブロットによるV5タグ化タンパク質の検出。付加的な実験法として、二倍体細胞において、Och1pの野生型および変異V5タグ化型の細胞内位置を免疫蛍光によって行うことができる。
【０１４６】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、参照数値のプラスまたはマイナス10％を指す。
【０１４７】
本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図される。本出願において引用された各参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４８】
本発明の好ましい態様を示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲を超えない修正をこれに対して加えることができることが当業者には容易に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１４９】
添付の特許請求の範囲において列挙される参照番号は、単に本特許出願の審査を容易にするためのものであり、例示的であって、特許請求の範囲の範囲を、図面中の対応する参照番号を有する特定の特徴に限定することは決して意図されていない。
【０１５０】
（表１）SEQ ID NO: 1
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0006407872.tif 000010
0006407872.tif 000011
【０１５１】
（表２）SEQ ID NO: 2
0006407872.tif 000012
【０１５２】
（表３）
0006407872.tif 000013
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【０１５３】
（表４）SEQ ID NO: 53
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0006407872.tif 000019
0006407872.tif 000020
【０１５４】
（表５）SEQ ID NO: 54（上部）およびSEQ ID NO: 55（下部）
0006407872.tif 000021
【０１５５】
（表６）SEQ ID NO: 56（上部）およびSEQ ID NO: 57（下部）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006407872.tif 000029
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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