(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の対をなす免疫受容体鎖を決定する方法：
(ａ) 試料を複数のサブセットに分割する工程であって、該試料が、免疫受容体鎖の対を発現するリンパ球を含む、工程；
(ｂ) 各サブセットに存在するヌクレオチド配列のリストを、サブセットごとに決定する工程であって、各サブセットの前記リストに免疫受容体の第１鎖をコードする第1ヌクレオチド配列が出現するかまたは出現せず、各サブセットの前記リストに免疫受容体の第２鎖をコードする第２ヌクレオチド配列が出現するかまたは出現しない、工程；
(ｃ) (ｉ) 各サブセットにおいてそろって出現するかまたは出現しないかのいずれかである、前記第１鎖と前記第２鎖をコードする前記第１ヌクレオチド配列と前記第２ヌクレオチド配列、および (ｉｉ) 少なくとも1つのサブセットにおいてそろって出現しかつ少なくとも1つのサブセットにおいて出現しない前記第１鎖と前記第２鎖をコードする前記第１ヌクレオチド配列と前記第２ヌクレオチド配列を、対をなす免疫受容体鎖として同定する工程。
【請求項２】
望ましい数の対をなす免疫受容体が得られるまで、前回の複数のどのサブセットとも異なる別の複数のサブセットに対して工程(ａ)〜(ｃ)を繰り返す工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
免疫受容体鎖がＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫受容体鎖がＢ細胞受容体重鎖可変領域およびＢ細胞受容体軽鎖可変領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料が、免疫受容体鎖の対を発現するリンパ球の集団を含み、かつ該集団がサイズを有し、かつ該集団の異なるリンパ球が各々、該集団内での頻度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数のサブセットの数が、集団のサイズ、および対をなす免疫受容体鎖が決定されるリンパ球の頻度に依存する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料のサイズおよび複数のサブセットの数が、該試料のリンパ球が２項モデルに従って該サブセットに分配されるように選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2012年3月5日に出願された米国仮特許出願第61/606,617号の優先権を主張し、この出願は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの重要な免疫機能はT細胞受容体 (TCR) によって媒介され、TCRは、抗原ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子とからなる複合体に共に結合するαサブユニットおよびβサブユニットを含む。いくつかの重要な疾患は異常なT細胞機能によって生じると考えられている：例えば、癌は、免疫監視、すなわち形質転換細胞のクローンをそれらが腫瘍に成長する前に検出し破壊するT細胞機能、の不全によって生じると考えられており；自己免疫疾患は、自己抗原に対するT細胞の過活動性のまたは異常な応答によって生じると考えられている；Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, Fourth Edition (W.B. Saunders Company, 2000)（非特許文献1）。したがって、癌および自己免疫疾患の両方を治療するためのいくつかの治療アプローチでは、T細胞機能を利用することに関心が寄せられている；例えば、Molloy et al, Current Opinion in Pharmacology, 5: 438-443 (2005)（非特許文献2）；Morgan et al, Science, 314: 126-129 (2006)（非特許文献3）；Turcotte and Rosenberg, Adv. Surg., 45: 341-360 (2011)（非特許文献4）。このようなアプローチにおける共通の課題は、関心対象の標的へと特異的に結合できる受容体全体を形成するように相伴うTCRαサブユニットおよびTCRβサブユニットを同定し単離することである。典型的には、関心対象のT細胞を同定し、各サブユニットをコードする核酸を単離し解析できるようにクローン的に増殖させる。しかしながら、TCRが、メラノーマにおけるMART-1などの共通の疾患抗原に特異的でない限り、単一細胞解析、クローニング、および受容体単離の過程を、それぞれの患者について繰り返さなくてはならない。
【０００３】
最近、DNA配列決定の塩基当たりのコストが下がり、また配列決定技法がより簡便になったために、大規模DNA配列決定を使用する診断および予後予測適用が提唱されている；例えば、Welch et al, Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 2011: 30-35（非特許文献5）；Cronin et al, Biomark Med., 5: 293-305 (2011)（非特許文献6）；Palomaki et al, Genetics in Medicine (online publication 2 February 2012)（非特許文献7）。特に、T細胞受容体もしくはB細胞受容体またはそれらの成分などの免疫分子をコードする核酸のプロファイルは、生物の健康または疾患の状態に関する豊富な情報を含み、その結果、そのようなプロファイルの使用に基づいた診断および予後予測の指標が、幅広い状態に関して開発されつつある；Faham and Willis、米国特許出願公開第2010/0151471号（特許文献1）；Freeman et al, Genome Research, 19: 1817-1824 (2009)（非特許文献8）；Boyd et al, Sci. Transl. Med., 1(12): 12ra23 (2009)（非特許文献9）；He et al, Oncotarget (March 8, 2011)（非特許文献10）。免疫レパートリーの現在の配列ベースのプロファイルは、単一の受容体鎖のみをコードする核酸からなり；したがって、正確に対をなすTCRα鎖とTCRβ鎖または免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖からの潜在的に有用な情報は得られない。
【０００４】
上記の点から、別々に抽出され配列決定されたサブユニットをコードする核酸から機能的免疫受容体を決定するための、利用可能な簡便な方法が存在するのであれば、癌および自己免疫疾患の治療に非常に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第2010/0151471号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, Fourth Edition (W.B. Saunders Company, 2000)
【非特許文献２】Molloy et al, Current Opinion in Pharmacology, 5: 438-443 (2005)
【非特許文献３】Morgan et al, Science, 314: 126-129 (2006)
【非特許文献４】Turcotte and Rosenberg, Adv. Surg., 45: 341-360 (2011)
【非特許文献５】Welch et al, Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 2011: 30-35
【非特許文献６】Cronin et al, Biomark Med., 5: 293-305 (2011)
【非特許文献７】Palomaki et al, Genetics in Medicine (online publication 2 February 2012)
【非特許文献８】Freeman et al, Genome Research, 19: 1817-1824 (2009)
【非特許文献９】Boyd et al, Sci. Transl. Med., 1(12): 12ra23 (2009)
【非特許文献１０】He et al, Oncotarget (March 8, 2011)
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、別々のライブラリーから選択されたサブユニットから、T細胞受容体またはB細胞受容体などの機能的免疫受容体を決定するための方法に関する。本発明は多くの実行および適用において例証されるが、そのうちのいくつかを以下におよび本明細書を通して要約する。
【０００８】
1つの局面において、本発明は、以下の工程を含む、試料中の所定数の対をなす免疫受容体鎖を決定する方法に関する：(a) 試料を複数のサブセットに分割する工程であって、該試料が、免疫受容体鎖の対を発現するリンパ球を含む、工程；(b) 複数のサブセットの一部分において、そのような対を有するリンパ球の免疫受容体鎖の各対の第1鎖のヌクレオチド配列を決定する工程；(c) 複数のサブセットの同じ一部分において、そのような対を有するリンパ球の免疫受容体鎖の各対の第2鎖のヌクレオチド配列を決定する工程；(d) (i) 該一部分のどのサブセットに関しても、そろって出現するかまたは出現しないかのいずれかである第1鎖と第2鎖の対、および (ii) 該一部分の少なくとも1つのサブセットにおいてそろって出現しかつ該一部分の少なくとも1つのサブセットにおいて出現しない第1鎖と第2鎖の対を、対をなす免疫受容体鎖として同定する工程；(e) 所定数の対をなす免疫受容体が得られるまで、前回の複数のどのサブセットとも異なる別の複数のサブセットに対して工程(a)〜(d)を繰り返す工程。
【０００９】
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、試料中のT細胞の対をなすT細胞受容体鎖を決定する方法に関する：(a) T細胞を含む試料を得る工程であって、各T細胞が第1免疫受容体鎖および第2免疫受容体鎖を発現する、工程；(b) 該試料のT細胞の第1免疫受容体鎖のヌクレオチド配列を決定する工程であって、各第1免疫受容体鎖が該試料中での出現の頻度を有する、工程；(c) 該試料のT細胞の第2免疫受容体鎖のヌクレオチド配列を決定する工程であって、各第2免疫受容体鎖が該試料中での出現の頻度を有する、工程；および (d) 対をなす第1免疫受容体鎖と第2免疫受容体鎖を、該試料内で同じ頻度を有するものとして同定する工程。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、対をなす免疫受容体鎖に基づいた新規クロノタイププロファイルに関する。このようなプロファイルを生成する方法は、(a) T細胞またはB細胞を含む試料を得る工程；(b) 該試料のT細胞またはB細胞の第1免疫受容体鎖のヌクレオチド配列を決定する工程；(c) 該試料のT細胞またはB細胞の第2免疫受容体鎖のヌクレオチド配列を決定する工程；および (d) 対をなす免疫受容体鎖のプロファイルを形成するために、同じT細胞またはB細胞において発現された第1免疫受容体鎖をコードするヌクレオチド配列と第2免疫受容体鎖をコードするヌクレオチド配列とを対にする工程を含む。
【００１１】
本発明の、上記で特徴づけられたこれらの局面およびその他の局面は、説明がなされる多くの実行および適用において例証されるが、そのうちのいくつかを図面で示し、添付の特許請求の範囲において特徴づける。しかしながら、上記の概要は、本発明のそれぞれ説明がなされる態様またはすべての実行を記載することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な態様を記載している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【００１３】
【図１Ａ】別々に配列決定された分子からTCRα鎖とTCRβ鎖を合致させるための本発明の1つの態様の工程を図式的に示す。
【図１Ｂ】同じT細胞に由来するTCRα鎖およびTCRβ鎖、または同じB細胞に由来する重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンを決定するための本発明の別の態様の工程を図式的に示す。
【図２】図2A〜2Cは、TCRβ遺伝子を増幅するための二段階PCRスキームを示す。
【図３】図3Aは、図2CのPCR産物のヌクレオチド配列を決定する詳細を図示する。図3Bは、図2CのPCR産物のヌクレオチド配列を決定する別の態様の詳細を図示する。
【図４】図4Aは、単一反応においてIgH鎖から3つの配列決定鋳型を生成するためのPCRスキームを図示する。図4B〜4Cは、3つの別々の反応においてIgH鎖から3つの配列決定鋳型を生成し、その後、得られたアンプリコンを混合して、P5プライマー結合部位およびP7プライマー結合部位を付加するための二次PCRを行うためのPCRスキームを図示する。図4Dは、IgH鎖について生成された配列リードの位置を図示する。図4Eは、NDN領域における塩基コールを改善するための、V領域およびJ領域のコドン構造の使用を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、特記されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え技法を含む）、バイオインフォマティクス、細胞生物学、および生化学の従来の技法および説明を使用することができる。このような従来の技法には、血液細胞のサンプリングおよび解析、核酸の配列決定および解析などが含まれるが、これらに限定されない。適切な技法の具体的な例は、本明細書における以下の実施例を参照することによって知ることができる。しかしながら、その他の同等な従来の手順もまた、当然ながら用いることができる。このような従来の技法および説明は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)；PCR Primer: A Laboratory Manual；およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual（いずれもCold Spring Harbor Laboratory Pressによる）などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【００１５】
1つの局面において、本発明は、配列決定されたコード核酸の集団から免疫受容体鎖の対を合致させるための方法を提供する。本発明の1つの態様に従って、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のレパートリーをコードする核酸集団を配列決定して、各リストのメンバー間にいかなる対応もない2つの別々の配列リストを形成する。これは、各鎖について別々の配列決定操作もしくはランを実施することによって達成することができ、またはこれは、それがコードする鎖の種類の同一性に従ってタグ付けされた核酸を用いて単一の配列ランを実施することによって成し遂げることができる。本発明の別の態様に従って、T細胞受容体α (TCRα) 鎖およびT細胞受容体β (TCRβ) 鎖のレパートリーをコードする核酸集団を配列決定して、各リストのメンバー間にいかなる対応もない2つの別々の配列リストを形成する。本発明の別の態様に従って、T細胞受容体γ (TCRγ) 鎖およびT細胞受容体δ (TCRδ) 鎖のレパートリーをコードする核酸集団を配列決定して、各リストのメンバー間にいかなる対応もない2つの別々の配列リストを形成する。上記のように、これは、各鎖について別々の配列決定ランを実施することによって達成することができ、またはこれは、それがコードする鎖の種類（すなわち、それぞれTCRαおよびTCRβまたはTCRγおよびTCRδのいずれか）の同一性に従ってタグ付けされた核酸を用いて単一の配列ランを実施することによって成し遂げることができる。後者の態様では、例えば、TCRα鎖とTCRβ鎖（またはTCRγ鎖とTCRδ鎖）が同じT細胞に由来するという理由で、それらを機能的な鎖になるように合致させるかまたは対にするには、2つのアプローチに従うことができる。第1のアプローチでは、各コード核酸の頻度を決定し、コードヌクレオチド配列が同じ頻度を有するTCRα鎖とTCRβ鎖を対にして、機能的なまたは再構成されたTCRを形成させる。TCRγ鎖とTCRδ鎖も同じ過程によって合致させることができる。全3種類の免疫受容体対を合致させるために適用できる第2のアプローチでは、リンパ球集団を複数のサブセットに繰り返し分割する。サブセットの一部分または亜集団から、2つの異なる免疫受容体鎖をコードする核酸を抽出し配列決定して、各リストのメンバー間にいかなる対応もない2つの別々の配列リストを形成する。上記のように、これは、各鎖について別々の配列決定ランを実施することによって達成することができ、またはこれは、それがコードする鎖の種類の同一性に従ってタグ付けされた核酸を用いて単一の配列ランを実施することによって成し遂げることができる。一例を挙げて説明すると、T細胞またはB細胞を含む試料を100個のサブ試料に等分した場合、平均すると各分割量は、元の試料中のT細胞またはB細胞の総数の約1/100からなるサブセットを含むが、次に20個のそのようなサブセットをサブセットの総数の一部分としてランダムに選択する。（そのような一部分は1よりも大きくかつ100よりも小さい任意の数であってよいが、以下により詳細に記載されるように、10〜20の範囲の数が、必要とされる配列決定の量と関心対象の頻度で存在する受容体対を同定する可能性との間の良好なトレードオフである）。1つの態様において、複数のサブセットは20〜2000の範囲であり、そのサブセットの一部分は10〜50の範囲である。別の態様において、サブセットの一部分は10〜20の範囲である。上記態様の例を図1Aおよび1Bに図示する。
【００１６】
図1Aに図示されるように、T細胞を含む試料 (100) から核酸（DNAまたはRNAであってよい）を抽出した後、別々の反応量中で、例えばFaham and Willis（上記）によって開示されたような二段階ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって各核酸集団が増幅され得る条件下で、TCRα（またはその一部）をコードする核酸に特異的なプライマー (102) およびTCRβ（またはその一部）をコードする核酸に特異的なプライマー (104) を混合する。そのようなプライマーを選択し、そのような反応を実施するための手引きおよび開示は、分子免疫学の文献および以下に（TCRβおよびIgHに関して）、ならびにYao et al, Cellular and Molecular Immunology, 4: 215-220 (2007) などの参考文献に（TCRαに関して）詳しく記載されており、後者の参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。1つの態様において、二段階PCRによって作製されたアンプリコン (106) および (108) は、MiSeq Personal Sequencer（Illumina、San Diego, CA）などの市販の次世代シーケンサーを用いた配列解析の準備ができた状態である。ヌクレオチド配列が決定された (107) および (109) 後、データベースまたは表（それぞれ110および112）が得られる。類似の配列を計数することができ、頻度対配列プロット（114および116）を構築する。同一頻度を有するか、または同じ順位序列を有する頻度を有するTCRαとTCRβとを合致させることにより (118)、再構成されたTCRを決定することができる。明らかに、本方法のこの態様は、実験誤差を考慮に入れても、異なるTCRαの頻度同士および異なるTCRβの頻度同士が近すぎない、すなわち異なる場合に、最も効率的に働く。
【００１７】
等しい（または等しく順位づけされた）頻度を有するクロノタイプ配列の対が同定されたならば、遺伝子操作および発現のための従来の技法を用いて、各鎖をコードする全長配列を公知の定常領域および可変領域から再構築することができる；例えば、Walchli et al, PLosOne, 6(11): e27930 (2011)など。
【００１８】
上記態様の変化形において、受容体鎖頻度を決定する際により高い精度を得ることができ、これはTCRβをコードするRNAを二段階PCRで増幅する図2Aおよび2Bを参照して理解することができる。以下により詳細に記載されるように、第1段階増幅においてプライマー (202) およびプライマーセット (212) を用いて、TCRβをコードするすべての核酸に対して共通プライマー結合部位 (214) を付着させる。図2Bは、さらなる材料を生成するための、ならびにSolexaベースの配列決定プロトコールでの（ブリッジPCRを介した）クラスター形成において用いられるプライマー結合部位P5 (222) およびP7 (220) を付着させるための第2段階増幅の成分を図示する。プライマーP7 (220) はまた、同じランにおける同時配列決定用に96個までの試料を多重化するための試料タグ (221) を含み得る；例えば、Illumina application note 770-2008-011 (2008)。同じプライマー中の異なる種類のタグを用いて、受容体鎖頻度の決定の精度を高めることができる。この態様では、プライマーP7は多様性の高いタグセットを含むように改良され、結果として、96種のタグの代わりに、プライマーP7は10,000種またはそれ以上の別個のタグを有するように操作される。言い換えると、プライマーP7は、それぞれが同一の鋳型結合領域、別個のタグ配列、および同一の5'尾部部分（例えば、図2B中の (223)）を有する、10,000種またはそれ以上の別個のオリゴヌクレオチドの混合物である。この配置のおかげで、同じ受容体鎖をコードする核酸のいかなるサブセットも（例えば、100個未満）、高い確率で異なるタグを受け取る。核酸の小規模セットのメンバーを、計数、標識、選別目的で、タグのはるかにより大規模のセットと組み合わせるこのような過程は周知であり、参照により組み入れられる以下の参考文献において様々な形態で開示されている、Brenner、米国特許第6,172,214号；Brenner et al、米国特許第7,537,897号；およびMacevicz、国際特許出願公開第WO US2005/111242号；Brenner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000)；Casbon et al, Nucleic Acids Research, 39(12): e81 (2011)；Fu et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 108: 9026-9031 (2011)。最小限にクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドタグ、または他の有用な特性を有するタグのセットの構築は、参照により組み入れられる以下の例示的な参考文献に開示されている：Brenner、米国特許第6,172,214号；Morris et al、米国特許出願公開第2004/0146901号；Mao et al、米国特許出願公開第2005/0260570号など。好ましくは、すべての核酸が高い確率で特有のタグを受け取るようにする場合には、タグセットは、標識される核酸のセットのサイズの少なくとも100倍（またはそれ以上）であるべきである。免疫受容体鎖に関して、1つの態様において、別個のタグの数は10,000〜100,000の範囲であり；別の態様において、別個のタグの数は10,000〜50,000の範囲であり；および別の態様において、別個のタグの数は10,000〜20,000の範囲である。Brenner、米国特許第6,172,214号に開示されているように、オリゴヌクレオチドタグのこのような大規模混合物は、コンビナトリアル方法によって合成することができる；あるいは、Cleary et al, Nature Methods, 1: 241-248 (2004)；York et al, Nucleic Acids Research, 40(1): e4 (2012)；LeProust et al, Nucleic Acids Research, 38(8): 2522-2540 (2010)などによって開示されているような非コンビナトリアル方法によって、特有のタグを含���プライマーを個々に合成することもできる。
【００１９】
1つの局面において、上記態様は、以下の工程により実施することができる：(a) T細胞を含む試料を得る工程；(b) 該試料からT細胞のTCRα鎖のヌクレオチド配列を決定する工程であって、各TCRα鎖が該試料中での出現の頻度を有する、工程；(c) 該試料からT細胞のTCRβ鎖のヌクレオチド配列を決定する工程であって、各TCRβ鎖が該試料中での出現の頻度を有する、工程；および (d) 対をなすTCRα鎖とTCRβ鎖を、該試料内で同じ頻度を有するものとして同定する工程。各TCRα鎖およびTCRβ鎖の頻度は、コード核酸またはクロノタイプの作表から決定することができる。あるいは、各TCRα鎖およびTCRβ鎖の頻度は、クロノタイプによってコードされるポリペプチドの作表から決定することもできる。上記のように、クロノタイプ頻度は、上記の通りにタグ付けスキームを使用して、クロノタイプを直接または間接的に計数することにより決定することができる。
【００２０】
図1Bは、TCRまたはBCRのいずれかに適用することができ、また実験誤差のためであるかまたはそうでないかにかかわらず、サブユニット鎖間の受容体頻度が近いかまたは識別できない場合でさえも使用することができる、合致する受容体サブユニットを同定するための別の態様を図示する。T細胞またはB細胞のいずれかであってよいリンパ球を含む試料 (149) から開始して、試料を1からKまで（図中）の複数のサブセット (152) に分離または分割することにより、サブセットを形成する。いくつかの態様では、K個のサブセットのうちの一部分のみを解析する；したがって、K個のサブセットすべてを実際に形成する必要はない。実際に解析する一部分のみのサブセットを形成してもよい。例えば、試料が100μLの量を有し、K = 100であるが、20個のサブセットからなる一部分のみを解析する場合には、1μLサブセットを20個のみ形成する必要がある。各サブセット (152) から、異なる各免疫受容体鎖（サブセット1において示されるTCRαおよびTCRβ）をコードする核酸を配列決定し、それによってリストの対、例えばサブセット1、2 ... K-1、Kそれぞれについての (162)、(164)、(166)、および (168) を形成する。このようなリストの各対は、第1免疫受容体鎖のヌクレオチド配列の第1リスト、例えばサブセット1のTCRαに関するリスト (154)、および第2免疫受容体鎖のヌクレオチド配列の第2リスト、例えば、サブセット1のTCRβに関するリスト (156) を含む。1つの態様において、サブセットの数、Kは5〜500の範囲の数である；別の態様において、Kは10〜100の範囲の数である；別の態様において、Kは20〜50の範囲の数である。いくつかの態様において、解析されるサブセットの一部分は10個以下のサブセットである；他の態様において、解析されるサブセットの一部分は20個以下のサブセットである；他の態様において、解析されるサブセットの一部分は、サブセットの少なくとも5パーセントである；他の態様において、解析されるサブセットの一部分は、サブセットの少なくとも10パーセントである；他の態様において、解析されるサブセットの一部分は、サブセットの少なくとも20パーセントである。
【００２１】
試料中の各種類のリンパ球、例えばリンパ球 (150) は、特定の頻度で試料中に存在する。サブセットへのリンパ球の分配は、2項モデルによって容易に近似される；したがって、特定のクロノタイプを有する任意のリンパ球（例えば (150)）に関して、(a) 試料中でのその頻度、(b) 試料中のリンパ球の総数、および (c) サブセットの数は、所定の割合のサブセット中に特定のリンパ球の少なくとも1つを見出す期待値と関連し得る。この関係は以下のように表すことができる：r = (1-f)(N/K)、式中、rは特定のリンパ球の少なくとも1つを含むサブセットの割合であり、fは試料中の特定のリンパ球の頻度であり、Nは試料中のリンパ球の総数であり、Kはサブセットの数である。したがって、r = 1/2と設定し、Nを定数とした場合、異なる頻度のリンパ球がサブセットの約半数中に存在するように、Kの連続値を選択することができる。rの他の値を選択することもできるが、r = 1/2は、最も高い統計的検出力を結果にもたらし、よってrは約1/2という値が好ましい。このようなリストが得られたならば、それらを調べて、サブセット中にそろって出現するかまたは全く出現しない第1ヌクレオチド配列と第2ヌクレオチド配列の対を同定する。例として、対 (158) のメンバーはサブセット2のリスト (164) およびサブセットK-1のリスト (166) 中に現れるが、その対のどちらのメンバーも、サブセット1およびKのリスト (162) または (168) 中に単独でまたはそろって現れない。これは当然ながら、リンパ球 (150) のような、サブセット2およびK-1中に存在するが、サブセット1およびKには存在しない特定のリンパ球の有無を反映している。このようなパターンによって、対 (158) のメンバーが相伴い、機能的免疫受容体の鎖に相当することが確認される。リンパ球 (153) などの試料 (149) 中の他のリンパ球も、ほぼ同じ頻度で存在し得る。しかしながら、特に、rがおよそ2分の1であり、かつ解析されるK個のサブセットのうちの一部分が10〜20またはそれ以上の範囲である場合、リンパ球 (153) の少なくとも1つがリンパ球 (150) と全く同じサブセット中に出現する確率は極めて低い。
【００２２】
本発明の1つの局面において、一連の頻度クラスに由来するリンパ球の合致する第1鎖と第2鎖は、Kの異なる値について上記過程を繰り返して実施することによって決定することができる。例えば、正常個体の末梢血の1 mL試料は約1〜4.8×106個のリンパ球を含み、そのうちの約10〜15パーセントがB細胞であり、約70〜85パーセントがT細胞であり、および約10パーセントがNK細胞である；したがって、1 mL試料は約7×105個〜約4×106個のT細胞を含み得る。1 mL試料中のTリンパ球の数がN = 106個である場合には、以下の頻度のT細胞の合致するTCR鎖は、サブセットの50パーセント中にそろって現れ、かつサブセットの他方の50パーセント中には全く現れないTCR鎖を同定することによって合致させる：
0006302847.tif 000002
上記の通り、特定の頻度におけるサブセットすべてを解析する必要はない。例えばf = 0.001といった選択された頻度であるかまたはそれに近い頻度を有するリンパ球が多数存在する場合には、サブセットの50パーセントにおいてそろって現れるすべての対が、同じ頻度の他のどの対とも識別され得るまで、サブセットの総数に占めるより大きな部分を用いることによって、それらすべてを分離することができる。これは、50パーセントの全く同じサブセット中に2つの異なるリンパ球が出現する確率は、サブセットの一部分が増加するにつれて無限小となるためである。
【００２３】
再構成されたTCRの用途
再構成されたT細胞受容体には、個々におよび一群として種々の用途があり、これには、免疫療法のための結合化合物として、養子免疫療法のためのトランスフェクトT細胞の成分として、ワクチン中の抗原供給源として、および免疫状態の指標としての用途が含まれるが、これらに限定されない。可溶型の合致したTCR鎖は、例えば、Jakobsen et al、米国特許第7,329,731号および第7,666,604号によって教示されるような、特有の抗癌療法のためのT細胞捕捉剤に連結される高親和性結合成分として使用することができる；上記特許は参照により本明細書に組み入れられる。合致したTCR鎖を用いてベクターを構築することができ、次いでこれを、患者の養子免疫療法のための自己T細胞へのトランスフェクションに用いることができる。この適用の1つの態様では、患者を癌抗原で免疫する前および免疫した後に、TCRを解析する試料を取得すことができ、その結果、増大した抗癌TCR鎖を容易に合致させ、これを選択する。このような適用を開示している参考文献には、Turcotte et al, Adv. Surg., 45: 341-360 (2011)；Morgan et al, Science, 314: 126-129 (2006)；Walchli et al, PlosOne, 6: e27930 (2011)；Robbins et al、米国特許出願公開第2010/0034834号などが含まれる。
【００２４】
試料由来の合致したまたは再構成されたTCRの集団は、個体の免疫系の特有のプロファイルを含み、これは単一配列クロノタイプのプロファイルよりもはるかにより多くの情報を含む。すなわち、合致したTCR鎖または合致した重鎖免疫グロブリンと軽鎖免疫グロブリンの集団は、クロノタイプが、同じT細胞で発現されるTCR鎖の対または同じB細胞で発現される重鎖免疫グロブリンと軽鎖免疫グロブリンの対をコードするヌクレオチド配列の対である、クロノタイププロファイルを含む。いずれの場合においても、そのような対は、例えばMHC四量体-ペプチド複合体のセットとの相互作用によってT細胞機能に、例えば、Palmowski et al, Immunol. Rev., 188: 155-163 (2002)；Hadrup et al, Nature Methods, 6: 520-526 (2009)、または例えばELISAによってB細胞機能に、例えば、Reddy et al, Nature Biotechnology, 28(9): 965-969 (2010)、直接関連し得る。1つの態様において、合致した免疫受容体鎖のクロノタイププロファイルは少なくとも100種のクロノタイプ対を含み、ここで、該対の各クロノタイプは30〜300ヌクレオチドの配列を含む。別の態様において、合致した免疫受容体鎖のクロノタイププロファイルは少なくとも500種のクロノタイプ対を含み、ここで、該対の各クロノタイプは30〜300ヌクレオチドの配列を含む。別の態様において、合致した免疫受容体鎖のクロノタイププロファイルは少なくとも1000種のクロノタイプ対を含み、ここで、該対の各クロノタイプは30〜300ヌクレオチドの配列を含む。さらに別の態様において、合致した免疫受容体鎖のこのようなクロノタイププロファイルは、TCRαクロノタイプとTCRβクロノタイプの対を含む。別の態様において、合致した免疫受容体鎖のこのようなクロノタイププロファイルは、TCRγクロノタイプとTCRδクロノタイプの対を含む。
【００２５】
試料
クロノタイププロファイルは、免疫細胞の試料から得られ得る。例えば、免疫細胞には、T細胞および／またはB細胞が含まれ得る。T細胞（Tリンパ球）には、例えばT細胞受容体を発現する細胞が含まれる。T細胞には、ヘルパーT細胞（エフェクターT細胞またはTh細胞）、細胞傷害性T細胞 (CTL)、記憶T細胞、および調節性T細胞が含まれる。1つの局面において、T細胞の試料は少なくとも1,000個のT細胞を含む；しかしより典型的には、試料は少なくとも10,000個のT細胞を含み、およびより典型的には少なくとも100,000個のT細胞を含む。別の局面において、試料は、細胞1000〜1,000,000個の範囲の数のT細胞を含む。免疫細胞の試料はまたB細胞を含み得る。B細胞には、例えば、形質B細胞、記憶B細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁帯B細胞、および濾胞性B細胞が含まれる。B細胞は免疫グロブリン（抗体、B細胞受容体）を発現し得る。上記のように、1つの局面において、B細胞の試料は少なくとも1,000個のB細胞を含む；しかしより典型的には、試料は少なくとも10,000個のB細胞を含み、およびより典型的には少なくとも100,000個のB細胞を含む。別の局面において、試料は、B細胞1000〜1,000,000個の範囲の数のB細胞を含む。
【００２６】
本発明の方法において用いられる試料は、例えば、腫瘍組織、血液および血漿、リンパ液、脳および脊髄を取り囲む脳脊髄液、骨関節を取り囲む滑液などを含む種々の組織に由来し得る。1つの態様において、試料は血液試料である。血液試料は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0 mLであってよい。試料は腫瘍生検材料であってよい。生検材料は、例えば、脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄の腫瘍に由来し得る。対象から試料を単離するために、当業者によって用いられる任意の生検技法を用いることができる。例えば、生検は、全身麻酔を用いた開放生検であってよい。生検は、開放生検よりも小さな切開を行う閉鎖生検であってよい。生検は、組織の一部分を取り出すコア生検または切開生検であってよい。生検は、病変全体を取り出すことを試みる切除生検であってよい。生検は、針を用いて組織または液体の試料を取り出す細針吸引生検であってよい。
【００２７】
試料は、例えば皮膚生検材料といった生検材料であってよい。生検材料は、例えば、脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄に由来し得る。対象から試料を単離するために、当業者によって用いられる任意の生検技法を用いることができる。例えば、生検は、全身麻酔を用いた開放生検であってよい。生検は、開放生検よりも小さな切開を行う閉鎖生検であってよい。生検は、組織の一部分を取り出すコア生検または切開生検であってよい。生検は、病変全体を取り出すことを試みる切除生検であってよい。生検は、針を用いて組織または液体の試料を取り出す細針吸引生検であってよい。
【００２８】
試料は、対象が残した身体物質から得ることができる。そのような廃棄された物質は、ヒトの排泄物を含み得る。廃棄された物質はまた、脱落した皮膚細胞、血液、歯、または毛髪を含み得る。
【００２９】
試料は、例えばDNA（例えば、ゲノムDNA）またはRNA（例えば、メッセンジャーRNA）といった核酸を含み得る。核酸は、例えば循環系から抽出された無細胞DNAまたはRNAであってよい；Vlassov et al, Curr. Mol. Med., 10: 142-165 (2010)；Swarup et al, FEBS Lett., 581: 795-799 (2007)。提供する本発明の方法において、解析され得る対象由来のRNAまたはDNAの量は、例えば、いくつかの適用（例えば、較正試験）においては単一細胞程度を含み、また6 pg〜60 ugのDNAおよびおよそ1 pg〜10 ugのRNAの範囲に換算される1千万個ほどの細胞またはそれ以上を含む。
【００３０】
以下（定義）でより十分な議論がなされているように、リンパ球の試料は、別個のクロノタイプを有する実質的にすべてのT細胞またはB細胞がその中で表現（represent）され、それによって（この用語の本明細書における意味での）レパートリーが形成されるように、十分に多量である。1つの態様においては、ある集団の、0.001パーセントまたはそれ以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを、99パーセントの確率で含む試料が取得される。別の態様においては、ある集団の、0.0001パーセントまたはそれ以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを、99パーセントの確率で含む試料が取得される。１つの態様において、B細胞またはT細胞の試料は少なくとも50万個の細胞を含み、別の態様においてはそのような試料は少なくとも100万個の細胞を含む。
【００３１】
試料が取得される供給源物質が十分でない場合、例えば臨床研究試料等の場合、その物質からDNAが、バイアスのない技法、例えば総ゲノム増幅（WGA）、多置換増幅（MDA）；または同様の技法、例えばHawkins et al, Curr. Opin. Biotech., 13: 65-67 (2002); Dean et al, Genome Research, 11: 1095-1099 (2001); Wang et al, Nucleic Acids Research, 32: e76 (2004); Hosono et al, Genome Research, 13: 954-964 (2003)の技法等により増幅され得る。
【００３２】
血液試料は、特に注目されており、従来の技法、例えばInnis et al 編, PCR Protocols（Academic Press, 1990）等の技法を用いて得られ得る。例えば、白血球は、従来の技法、例えばRosetteSepキット（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada）を用いて血液試料から分離され得る。血液試料は、100μLから10 mLの範囲の容量であり得；1つの局面において、血液試料の容量は、200 100μLから2 mLの範囲である。DNAおよび／またはRNAは、その後、本発明の方法において使用するために、そのような血液試料から、従来の技法、例えば、DNeasy Blood & Tissueキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出され得る。任意で、白血球のサブセット、例えばリンパ球がさらに、従来の技法、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）（Becton Dickinson, San Jose, CA）、磁気活性化細胞ソーティング（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）等を用いて単離され得る。
【００３３】
識別性のある組換えは各個体の適応免疫細胞のDNAおよびそれらに関連するRNA転写物に存在するので、RNAまたはDNAのいずれかが、提供される発明の方法において配列決定され得る。T細胞受容体もしくは免疫グロブリン分子またはそれらの一部分をコードするT細胞またはB細胞由来の組換え配列は、クロノタイプと称される。DNAまたはRNAは、T細胞受容体（TCR）遺伝子または抗体をコードする免疫グロブリン（Ig）遺伝子由来の配列に対応するものであり得る。例えば、DNAおよびRNAは、TCRのα、β、γまたはδ鎖をコードする配列に対応するものであり得る。多数派のT細胞では、TCRは、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体である。TCRα鎖は、VJ組換えにより生じ、β鎖受容体はV(D)J組換えにより生じる。TCRβ鎖に関して、ヒトには48種のVセグメント、2種のDセグメントおよび13種のJセグメントが存在する。2つの接合部の各々ではいくつかの塩基が欠失または付加され得る（NおよびPヌクレオチドと呼ばれる）。少数派のT細胞では、TCRは、γおよびδデルタ鎖からなる。TCRγ鎖は、VJ組換えにより生じ、TCRδ鎖はV(D)J組換えにより生じる（Kenneth Murphy, Paul Travers, and Mark Walport, Janeway's Immunology 7th edition, Garland Science, 2007, その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３４】
本発明の方法において解析されるDNAおよびRNAは、定常領域（α、δ、ε、γまたはμ）を有する重鎖免疫グロブリン（IgH）または定常領域λまたはκを有する軽鎖免疫グロブリン（IgKまたはIgL）をコードする配列に対応するものであり得る。各抗体は、2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖を有する。各鎖は、定常（C）領域および可変領域から構成される。重鎖に関して、可変領域は、可変（V）、多様（D）および結合（J）セグメントから構成される。これらのセグメントの各タイプをコードするいくつかの別個の配列がゲノム中に存在する。B細胞の発達の間に特定のVDJ組換えイベントが起こり、これはその細胞が特定の重鎖を生成することを示すものである。軽鎖における多様性は、D領域がなくVJ組換えのみがある点を除いて、同様の様式で生じる。組換え部位の付近では体細胞変異がしばしば起こり、それによっていくつかのヌクレオチドが付加または欠失し、これがB細胞によって生成される重鎖および軽鎖の多様性をさらに増大させる。B細胞により生成される抗体で生じ得る多様性は、異なる重鎖と軽鎖の掛け算である。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位を形成するのに寄与する。この多様性には、あるエピトープに対して特異的な応答が惹起された後に起こり得る体細胞超変異が加わる。
【００３５】
上記の通り、本発明に従って、プライマーは、リンパ球から抽出された組換え核酸のサブセットのアンプリコンを生成するよう選択することができる。そのようなサブセットは、本明細書において「体細胞再編成領域」と称され得る。体細胞再編成領域は、発達段階のまたは十分に発達したリンパ球に由来する核酸を含んでよく、ここで発達段階のリンパ球とは、免疫遺伝子の再編成が完了しておらず、完全なV(D)J領域を有する分子が形成されていない細胞である。例示的な不完全な体細胞再編成領域には、不完全なIgH分子（D-J領域のみを含む分子など）、不完全なTCRδ分子（D-J領域のみを含む分子など）、および不活性IgK（例えば、Kde-V領域を含む）が含まれる。
【００３６】
「クロノタイプ」および「レパートリー」の定義において以下にさらに記載されるように、細胞の十分なサンプリングは、レパートリーデータを解釈する重要な局面である。例えば、細胞1,000個からの開始は、どのくらいの配列リードが得られるかにかかわらず、アッセイが検知できる最低限の頻度をもたらす。したがって、本発明の1つの局面は、免疫受容体分子の投入数を定量する方法の開発である。これは、TCRβ配列およびIgH配列に関して実行された。いずれの場合にも、すべての異なる配列を増幅することができる同じプライマーセットが用いられる。コピーの絶対数を得るために、多重のプライマーを用いるリアルタイムPCRが、既知数の免疫受容体コピーを有する標準と共に実施される。このリアルタイムPCR測定は、後に配列決定される増幅反応物において実施することができ、または同じ試料の別の分割量に対して行うこともできる。DNAの場合、再編成された免疫受容体分子の絶対数は、細胞数に容易に変換することができる（2倍以内、いくつかの細胞は、評価される特定の免疫受容体の再編成コピーを2つ有し、その他は1つ有するため）。cDNAの場合、リアルタイム試料において測定される再編成分子の総数は、同じ試料の別の増幅反応において用いられるこれらの分子の総数を定義するために推定され得る。加えて、本方法は、RNAの単位量（およそ1μg）中の再編成免疫受容体分子の数を定義するために、RNAの総量を決定する方法と組み合わされ、それによってcDNA合成の比効率 (specific efficiency) が推測され得る。cDNAの総量が測定される場合、cDNA合成の効率を考慮する必要はない。細胞数も既知である場合には、細胞当たりの再編成免疫受容体コピー数を算出することができる。細胞数が既知でない場合には、特定型の細胞は通常同程度の量のRNAを生成することを踏まえて、それを総RNAから概算することができる。したがって、1μg当たりの再編成免疫受容体分子のコピーから、細胞当たりのこれらの分子の数を概算することができる。
【００３７】
配列決定用に処理される反応とは別個にリアルタイムPCRを行う1つの欠点は、異なる酵素、投入DNA、およびその他の条件が利用され得るため、リアルタイムPCRにおいて他の反応と異なる阻害効果が生じ得ることである。リアルタイムPCRの産物を配列決定用に処理することで、この問題は改善される。しかしながら、リアルタイムPCRを使用しての低コピー数は、コピー数の少なさもしくは阻害効果、またはその反応におけるその他の最適でない条件のいずれかに起因し得る。
【００３８】
利用できる別のアプローチは、未知量の試料由来のcDNAまたはゲノムDNAに、既知量の既知配列を有する特有の免疫受容体再編成分子、すなわち既知量の1つまたは複数の内部標準を添加することである。添加された既知配列について得られる分子の、同じ試料の残りの配列について得られる分子に対する相対数を計数することによって、初期cDNA試料中の再編成免疫受容体分子の数を概算することができる。（分子計数のためのそのような技法は周知である；例えば、参照により本明細書に組み入れられるBrenner et al、米国特許第7,537,897号）。添加した特有の配列の配列決定から得られるデータは、同時にリアルタイムPCR較正も使用される場合、異なる可能性を識別するのに使用することができる。DNA（またはcDNA）中の再編成免疫受容体のコピー数が低いと、残りの試料配列についての分子数に対する、添加された配列についての分子数の比が高くなる。一方、リアルタイムPCRにより測定される低コピー数が反応の非効率性に起因する場合、その比は高くならない。
【００３９】
核酸集団の増幅
標的核酸集団のアンプリコンは、様々な増幅技法により生成され得る。本発明の1つの局面においては、マルチプレックスPCRが、核酸の混合物、特に組換え免疫分子、例えばT細胞受容体またはそれらの一部分を含む混合物のメンバーを増幅するのに使用される。そのような免疫分子のマルチプレックスPCRを実施するための手引きは、参照により組み入れられる以下の参考文献において見出される：Morley、米国特許第5,296,351号；Gorski、米国特許第5,837,447号；Dau、米国特許第6,087,096号；Von Dongen et al、米国特許出願公開第2006/0234234号；欧州特許公報EP 1544308B1等。
【００４０】
ゲノムからのDNA増幅（またはRNAの逆転写によるcDNA形式での核酸増幅）の後、個々の核酸分子は、単離され、任意で再増幅され、次いで個別に配列決定され得る。例示的な増幅プロトコールは、参照により組み入れられるvan Dongen et al, Leukemia, 17: 2257-2317 (2003)またはvan Dongen et al、米国特許出願公開第2006/0234234号に見出され得る。簡潔に説明すると、例示的なプロトコールは以下のようなものである：反応緩衝液： ABI Buffer IIまたはABI Gold Buffer（Life Technologies, San Diego, CA）；50μLの最終反応容量；100 ngの試料DNA；10 pmolの各プライマー（以下に記載されるように増幅のバランスをとるために調整される）；終濃度200μMのdNTP；終濃度1.5 mMのMgCl2（標的配列およびポリメラーゼに依存して最適化される）；Taqポリメラーゼ（1〜2U/チューブ）；サイクル条件：95℃での予備活性化7分間；60℃でのアニール；サイクル時間：30秒間の変性；30秒間のアニール；30秒間の伸長。本発明の方法における増幅に使用することができるポリメラーゼは市販されており、例えば、Taqポリメラーゼ、AccuPrimeポリメラーゼまたはPfuを含む。使用するポリメラーゼの選択は、忠実性と効率性のどちらが好ましいかに基づくものであり得る。
【００４１】
リアルタイムPCR、ピコグリーン染色、ナノ流体電気泳動（例えば、LabChip）またはUV吸収測定は、初期工程において、増幅可能な物質の関数的な量を判断するのに使用することができる。
【００４２】
1つの局面において、マルチプレックス増幅は、出発集団における配列の相対量が増幅集団またはアンプリコンにおけるそれと実質的に同じになるように実行される。すなわち、マルチプレックス増幅は、試料集団のメンバー配列間の増幅バイアスが最小となるように実行される。1つの態様において、そのような相対量は、アンプリコンにおける各相対量が出発試料におけるその値の5倍以内である場合、実質的に同じとされる。別の態様において、そのような相対量は、アンプリコンにおける各相対量が出発試料におけるその値の2倍以内である場合、実質的に同じとされる。以下でより十分な議論がなされているように、PCRにおける増幅バイアスは、任意の試料においてバイアスのない増幅を提供するPCRプライマーセットが既定のレパートリーのために選択され得る従来の技法を用いて、検出および補正され得る。
【００４３】
TCRまたはBCR配列に基づく多くのレパートリーに関して、マルチプレックス増幅は、任意で、すべてのVセグメントを使用する。その反応は、異なるVセグメントプライマーにより増幅される配列の相対存在量を維持する増幅となるよう最適化される。プライマーのいくつかは関連するものであり、したがってプライマーの多くは「クロストーク」し、それと完全には一致しない鋳型を増幅し得る。その条件は、どのプライマーがそれを増幅するかによらず各鋳型が同様の様式で増幅され得るように最適化される。換言すると、2つの鋳型が存在する場合、1,000倍増幅後には両方の鋳型がおよそ1,000倍増幅され得るが、鋳型の一方において増幅産物の半分がクロストークのために異なるプライマーを保持していることは問題とならない。その後の配列決定データの解析において、プライマー配列は解析から除外され、したがって鋳型が均等に増幅されている限りどのプライマーが増幅に使用されたかは問題とならない。
【００４４】
1つの態様において、増幅のバイアスは、標的配列と非相補的な尾部を有するプライマーを用いて第1または一次段階において少数の増幅サイクルを実施する二段階増幅（上記で引用したFaham and Willis に記載されている）を実施することによって回避され得る。この尾部は、一次アンプリコンの配列の末端に付加されるプライマー結合部位を含み、そのような部位は、1つのみの順方向プライマーおよび1つのみの逆方向プライマーを用いる第2段階の増幅において使用され、それによって増幅のバイアスの主たる原因が除かれる。好ましくは、一次PCRは、異なるプライマーによる差次的増幅を最小限にするよう十分少ないサイクル数（例えば、5〜10）を有する。二次増幅は一対のプライマーを用いて実行され、したがって差次的増幅の問題は非常に小さい。一次PCRの1パーセントが二次PCRに直接利用される。2つの増幅間で使用される35サイクル（100倍希釈工程のない場合の約28サイクルに相当）は、サイクルの内訳によらずに、一次で1サイクル、二次で34サイクルであろうが、一次で25サイクル、二次で10サイクルであろうが、堅調な増幅を示すのに十分であった。理論的には一次PCRにおいて1サイクルのみ実施すれば増幅のバイアスが小さくなる可能性があるが、それ以外にも考慮すべきことがある。この1つの局面は、表現である。これは、出発投入量が最終的に得られるリード数に対して過剰でない場合に影響力がある。例えば、1,000,000のリードが得られ、1,000,000の投入分子で開始する場合、100,000の分子からの表現のみを二次増幅に移すのでは、当初試料中の異なる種の相対存在量の概算の精度が下がる。2つの工程の間での100倍の希釈は、一次PCR増幅が100より有意に多い分子を生成していない限り、その表現が縮小することを意味する。これは、最小で8サイクル（256倍）であるが余裕をもって10サイクル（約1,000倍）が使用され得ることを示している。その代案は、一次PCRの1%超を二次に利用することであるが、一次PCRにおいて使用されるプライマー濃度は高いため、これらのプライマーが増幅において干渉し配列間の増幅バイアスを悪化させないことを確実にするために、大きな希釈係数が使用され得る。別の代案は、精製または酵素処理工程を追加して一次PCR由来のプライマーを排除し、その希釈率を小さくすることである。この実施例では、一次PCRは10サイクル、二次は25サイクルであった。
【００４５】
クロノタイプのための配列リードの生成
本発明の方法では、任意のハイスループット核酸配列決定技法を使用することができる。好ましくは、このような技法は、そこから少なくとも1000種のクロノタイプが決定され得る、および好ましくはそこから少なくとも10,000〜1,000,000種のクロノタイプが決定され得る大量の配列データを、費用に対して効果の高い方法で生成する能力を有する。DNA配列決定技法は、標識されたターミネーターまたはプライマーおよびスラブまたはキャピラリー中でのゲル分離を用いるジデオキシ配列決定反応（サンガー法）、可逆的に停止される標識ヌクレオチドを用いる合成による配列決定、パイロシークエンシング、454配列決定、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーに対するアレル特異的ハイブリダイゼーションおよびその後のライゲーションを用いる合成による配列決定、重合工程中における標識ヌクレオチドの組み込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシークエンシング、ならびにSOLiD配列決定を含む。分離された分子の配列決定は、最近になって、ポリメラーゼまたはリガーゼを用いる連続的または単回の伸長反応によって、およびプローブのライブラリーを用いる単回または連続的なディファレンシャルハイブリダイゼーションによって実証されている。これらの反応は、多くのクローン配列に対して並列で実施され、現在の商業利用においては1億超の配列の並列化が実現している。したがってこれらの配列決定アプローチは、T細胞受容体（TCR）および／またはB細胞受容体（BCR）のレパートリーの研究に使用することができる。本発明の1つの局面においては、個々の分子を固相表面上で空間的に単離し、その表面上で配列決定を並列で行う工程を含むハイスループットの配列決定法が使用される。そのような固相表面は、非多孔性表面（例えば、Solexa配列決定におけるようなもの、例えばBentley et al, Nature,456: 53-59 (2008)、またはComplete Genomics配列決定、例えばDrmanac et al, Science, 327: 78-81 (2010)）、ビーズまたは粒子に結合された鋳型を含み得るウェルのアレイ（例えば、454と共に用いるもの、例えばMargulies et al, Nature, 437: 376-380 (2005)、またはIon Torrent配列決定、米国特許出願公開第2010/0137143号もしくは第2010/0304982号）、微細加工膜（例えば、SMRT配列決定と共に用いるもの、例えばEid et al, Science, 323: 133-138 (2009)）、またはビーズアレイ（SOLiD配列決定またはポロニーシークエンシングと共に用いるもの、例えばKim et al, Science, 316: 1481-1414 (2007)）を含み得る。別の局面において、そのような方法は、単離された分子を、それらを固相表面上で空間的に単離する前または後のいずれかにおいて増幅する工程を含む。先行増幅は、エマルジョンベースの増幅、例えばエマルジョンPCR、またはローリングサークル増幅を含み得る。特に関心対象となるものは、参照により組み入れられる、Bentley et al（上記で引用）および製造元の説明書（例えば、TruSeq（商標）Sample Preparation Kit and Data Sheet, Illumina, Inc., San Diego, CA, 2010）；さらに以下の参考文献、米国特許第6,090,592号；同第6,300,070号；同第7,115,400号；およびEP0972081B1に記載されるような、個々の鋳型分子を固相表面上で空間的に単離し、その後にそれらをブリッジPCRにより並列で増幅して個別のクローン集団ま��はクラスターを形成し、次いで配列決定する、Solexaベースの配列決定である。1つの態様において、固相表面上に配置され増幅される個々の分子は、1 cm2あたり少なくとも105クラスターの密度；または1 cm2あたり少なくとも5×105の密度；または1 cm2あたり少なくとも106クラスターの密度のクラスターを形成する。1つの態様においては、比較的高いエラー率を有する配列決定化学が使用される。そのような態様において、そのような化学によりもたらされる平均品質スコアは、配列リード長の単調に下降する関数である。1つの態様において、そのような下降は、配列リードの0.5パーセントが1〜75位に少なくとも1つのエラーを有する；配列リードの1パーセントが76〜100位に少なくとも1つのエラーを有する；および配列リードの2パーセントが101〜125位に少なくとも1つのエラーを有することに相当する。
【００４６】
1つの局面において、個体の配列ベースのクロノタイププロファイルは、以下の工程を用いて得られる：（a）個体のT細胞および／またはB細胞から核酸試料を得る工程；（b）そのような核酸試料に由来する個々の分子を空間的に単離する工程であって、個々の分子が、該試料中の核酸から生成されかつ体細胞再編成領域またはその一部分を含む少なくとも1つの鋳型を含み、個々の分子が各々、少なくとも1つの配列リードを作成することができる、工程；（c）空間的に単離された個々の分子を配列決定する工程；ならびに（d）クロノタイププロファイルを生成するために、該核酸試料に由来する核酸分子の異なる配列の存在量を決定する工程。1つの態様において、体細胞再編成領域の各々は、V領域およびJ領域を含む。別の態様において、配列決定する工程は、前記空間的に単離された個々の分子の各々を双方向に配列決定して、少なくとも1つの順方向配列リードおよび少なくとも1つの逆方向配列リードを作成することを含む。後者の態様に関してさらに、順方向配列リードの少なくとも1つと逆方向配列リードの少なくとも1つとが重複領域を有し、そのような配列リード間の逆相補関係によってそのような重複領域の塩基が決定されるようにする。さらに別の態様において、体細胞再編成領域の各々は、V領域およびJ領域を含み、配列決定する工程はさらに、その順方向配列リードの1つまたは複数と、J領域内のある位置から始まりそれと連結したV領域の方向へと延びる少なくとも1つの逆方向配列リードとから、個々の核酸分子の各々の配列を決定することを含む。別の態様において、個々の分子は、完全IgH分子、不完全IgH分子、完全IgK完全、IgK不活性分子、TCRβ分子、TCRγ分子、完全TCRδ分子および不完全TCRδ分子からなる群より選択される核酸を含む。別の態様において、配列決定する工程は、単調に下降する品質スコアを有する配列リードを生成することを含む。後者の態様に関してさらに、単調に下降する品質スコアは、その配列リードが下記以上のエラー率を有するものである：配列リードの0.2パーセントが、塩基1〜50位において少なくとも1つのエラーを含み、配列リードの0.2から1.0パーセントが、51〜75位において少なくとも1つのエラーを含み、配列リードの0.5から1.5パーセントが、76〜100位において少なくとも1つのエラーを含む。別の態様において、上記方法は以下の工程を含む：(a) 個体のT細胞および／またはB細胞から核酸試料を得る工程；(b) そのような核酸試料に由来する個々の分子を空間的に単離する工程であって、個々の分子が、該試料中の核酸から各々生成されかつ体細胞再編成領域またはその一部分を各々含む鋳型の入れ子セットを含み、各入れ子セットが、同じ方向に各々延びかつ該入れ子セットが生成された核酸上の異なる位置から各々始まる複数の配列リードを作成することができる、工程；(c) 空間的に単離された個々の分子を配列決定する工程；ならびに (d) クロノタイププロファイルを生成するために、該核酸試料に由来する核酸分子の異なる配列の存在量を決定する工程。1つの態様において、配列決定する工程は、入れ子セットの各々について複数の配列リードを作成することを含む。別の態様において、体細胞再編成領域の各々はV領域およびJ領域を含み、かつ複数の配列リードの各々は��V領域内の異なる位置から始まりそれと連結したJ領域の方向へと延びる。
【００４７】
1つの局面において、個体由来の試料ごとに、本発明の方法において使用される配列決定技法は、1回のランあたり少なくとも1000種のクロノタイプの配列を生成し；別の局面において、そのような技法は、1回のランあたり少なくとも10,000種のクロノタイプの配列を生成し；別の局面において、そのような技法は、1回のランあたり少なくとも100,000種のクロノタイプの配列を生成し；別の局面において、そのような技法は、1回のランあたり少なくとも500,000種のクロノタイプの配列を生成し；そして別の局面において、そのような技法は、1回のランあたり少なくとも1,000,000種のクロノタイプの配列を生成する。さらに別の局面において、そのような技法は、個々の試料につき、1回のランあたり100,000から1,000,000種の間のクロノタイプの配列を生成する。
【００４８】
提供される発明の方法において使用される配列決定技法は、1リードあたり約30 bp、約40 bp、約50 bp、約60 bp、約70 bp、約80 bp、約90 bp、約100 bp、約110 bp、約120 bp、1リードあたり約150 bp、約200 bp、約250 bp、約300 bp、約350 bp、約400 bp、約450 bp、約500 bp、約550 bpまたは約600 bpを生成することができる。
【００４９】
配列データからのクロノタイプの決定
配列リードデータからのクロノタイプの構築は、一部、そのようなデータを生成するのに使用された配列決定法に依存しており、これは、方法が異なると、予想リード長およびデータ品質が異なるためである。1つのアプローチにおいて、解析用の配列リードデータの生成にSolexaシーケンサーが使用される。1つの態様において、少なくとも100万の鋳型分子をもたらすための少なくとも0.5〜1.0×106個のリンパ球を提供する試料が得られ、鋳型分子は、任意の増幅後に、対応する100万またはそれ以上の鋳型分子クローン集団（またはクラスター）をもたらし得る。Solexaアプローチを含む最もハイスループットな配列決定アプローチについては、配列決定の精度を増大させるべく高い冗長度で各鋳型配列が決定されるように、そのようなクラスターレベルでの過剰サンプリングが望ましい。Solexaベースでの実施について、好ましくは、各々独立した鋳型の配列は10回またはそれ以上決定される。予想リード長およびデータ品質が異なる他の配列決定アプローチについては、同等の配列決定精度のために異なる冗長度レベルが使用され得る。当業者は、上記のパラメータ、例えば試料サイズ、冗長度等が、特定の用途に関連する設計上の選択事項であることを認識している。
【００５０】
本発明の1つの局面において、クロノタイプの配列（IgH、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、および／またはIgLκ（IgK）由来のものを含むがこれらに限定されない）は、1つまたは複数の配列リードからの情報を、例えば選択された鎖のV(D)J領域に沿って組み合わせることにより決定され得る。別の局面において、クロノタイプの配列は、複数の配列リードからの情報を組み合わせることにより決定される。このような複数の配列リードは、センス鎖に沿う1つまたは複数の配列リード（すなわち、「順方向」配列リード）およびその相補鎖に沿う1つまたは複数の配列リード（すなわち、「逆方向」配列リード）を含み得る。同じ鎖に沿って複数の配列リードを生成する場合は、最初に、該配列リードの異なる位置に対して選択されたプライマーを用いて試料分子を増幅することにより、別々の鋳型が生成される。このコンセプトは、図4Aに図示されており、そこではプライマー（404、406および408）が、1回の反応でアンプリコン（それぞれ410、412および414）を生成するのに使用されている。このような増幅は、同じ反応において実施してもよく、または別々の反応において実施してもよい。1つの局面において、PCRが使用される場合は、別々の鋳型を生成するために別々の増幅反応が使用され、これらはその後組み合わされ、同じ鎖に沿う複数の配列リードを生成するのに使用される。この後者のアプローチは、複数の鋳型の均等増幅を実現するためにプライマー濃度（および／またはその他の反応パラメータ）のバランスをとる必要がない点で好ましい（本明細書において、「バランスのとれた増幅」または「非バイアス増幅」と称されることがある）。別々の反応による鋳型の生成については、図4B〜4Cに図示されている。その中で、IgHを含む試料（400）が3等分され（472、474、および476）、これらがJ領域プライマー（401）およびV領域プライマー（それぞれ404、406および408）を用いる別々のPCRに添加され、アンプリコン（それぞれ420、422および424）が作製されている。後者のアンプリコンはその後、P5およびP7プライマーを用いる二次PCR（480）において組み合わされ（478）、ブリッジPCRおよびIllumina GAシーケンサーまたは同等の機器における配列決定のための鋳型（482）が調製される。
【００５１】
本発明の配列リードは、様々な長さを有するものであり、それは一部、使用される配列決定技法に依存する。例えば、いくつかの技法では、その実施の中でいくつかのトレードオフ、例えば、（i）鋳型あたりの配列リードの数と長さおよび（ii）配列決定作業の費用と時間、が発生し得る。1つの態様において、配列リードは、20から400ヌクレオチドの範囲であり；別の態様において、配列リードは、30から200ヌクレオチドの範囲であり；さらに別の態様において、配列リードは、30から120ヌクレオチドの範囲である。1つの態様においては、1つから4つの配列リードが、各クロノタイプの配列の決定のために生成され；別の態様においては、2つから4つの配列リードが、各クロノタイプの配列の決定のために生成され；そして別の態様においては、2つから3つの配列リードが、各クロノタイプの配列の決定のために生成される。上記の態様において、示されている数は、異なる個体由来の試料を同定するのに使用される配列リードを除いたものである。以下に記載される態様において使用される様々な配列リードの長さもまた、そのリードによって取り込むことが求められる情報により変化し得；例えば、配列リードの出発位置および長さは、NDN領域の長さおよびそのヌクレオチド配列を提供するよう設計され得；したがって全NDN領域に及ぶ配列リードが選択される。他の局面においては、Dおよび／またはNDN領域を組み合わせて（しかし別々にではなく）含む1つまたは複数の配列リードで十分である。
【００５２】
本発明の別の局面において、クロノタイプの配列は、一部には、配列リードを1つまたは複数のV領域参照配列および1つまたは複数のJ領域参照配列とアラインすることにより、および、一部には、例えば、高可変性のNDN領域に関しては、参照配列とのアラインメントを用いない塩基決定により、決定される。様々なアラインメントアルゴリズムが、配列リードおよび参照配列に適用され得る。例えば、アラインメント法を選択する手引きは、参照により組み入れられるBatzoglou, Briefings in Bioinformatics, 6: 6-22 (2005)において利用可能である。1つの局面において、（上述のように）VリードまたはCリードがVおよびJ領域参照配列に対してアラインされる場合、ツリー検索アルゴリズムが使用される；例えば、Gusfield（上記で引用）およびCormen et al, Introduction to Algorithms, Third Edition (The MIT Press, 2009)に概説されている。
【００５３】
別の局面において、少なくとも1つの順方向リードの末端および少なくとも1つの逆方向リードの末端は、重複領域（例えば、図3Bでは308）で重複しており、そのためそれらのリードの塩基は、相互に対して逆相補関係にある。したがって、例えば、重複領域における順方向リードが「5'-acgttgc」である場合、同じ重複領域内の、逆相補関係にある逆方向リードは「5'-gcaacgt」である。1つの局面において、そのような重複領域内の塩基は、少なくとも一部、そのような逆相補関係から決定される。すなわち、予想される重複領域における塩基コール（または関連する品質スコア）の確度は、もしそれが2つの配列リード間の逆相補関係を保存しているまたはそれと符合している場合、高くなるのである。1つの局面において、（図3Bに図示される）TCRβおよびIgH鎖のクロノタイプは、そのJ領域から始まりそれと連結したV領域の方向へと延びる少なくとも1つの配列リード（本明細書において「Cリード」（304）と称される）およびそのV領域から始まりそれと連結したJ領域の方向へと延びる少なくとも1つの配列リード（本明細書において「Vリード」（306）と称される）により決定される。重複領域（308）は、図3Bに示されるようにNDN領域（315）を含んでいる場合といない場合がある。重複領域（308）は、全体がJ領域内にある、全体がNDN領域内にある、全体がV領域内にある場合もあるし、または、それはJ領域-NDN領域の境界もしくはV領域-NDN領域の境界またはそのような境界の両方を含む場合がある（図3Bに図示されている）。典型的には、そのような配列リードは、合成による配列決定反応においてポリメラーゼにより配列決定プライマー、例えば図3Bの（302）および（310）を伸長することによって生成される；例えば、Metzger, Nature Reviews Genetics, 11: 31-46 (2010); Fuller et al, Nature Biotechnology, 27: 1013-1023 (2009)。プライマー（302）および（310）の結合部位は、それらが配列リードの初期のアラインメントおよび解析のための出発点または投錨点を提供することができるよう、予め決定されている。1つの態様において、Cリードは、例えば図3Bおよび3Cに図示されているように、それがTCRβまたはIgH鎖のDおよび／またはNDN領域を網羅し、かつ隣接するV領域の一部分を含むように位置決めされる。1つの局面において、V領域におけるVリードとCリードの重複は、これらのリードを互いにアラインするのに使用される。他の態様においては、そのような配列リードのアラインメントは必要ではなく、例えば、TCRβ鎖では、Vリードがクロノタイプの特定のV領域を同定するのに十分に長いというだけであり得る。この後者の局面は、図3Cに図示されている。配列リード（330）は、V領域を同定するのに使用され、これは別の配列リードと重複しているまたはしておらず、そして別の配列リード（332）は、NDN領域にかかるものであり、その配列を決定するのに使用される。配列リード（332）の、V領域へと延びる部分（334）は、配列リード（332）の配列情報を配列リード（330）のそれと関連付け、クロノタイプを決定するのに使用される。いくつかの配列決定法、例えばSolexa配列決定法のような塩基単位（base-by-base）のアプローチでは、解析における配列決定サイクルの数を最小限にすることによって、配列決定のラン時間および試薬の費用が削減される。任意で、図3Bに示されるように、アンプリコン（300）は、異なる生物学的試料、例えば異なる患者に由来するクロノタイプを区別するための試料タグ（312）を含むように作製される。試料タグ（312）は、プライマーをプライマー結合領域（316）にアニールさせ、それを伸長させて（314）、タグ（312）にかけて配列リードを作成し、そこから試料タグ（312）をデコードすることによって同定され得る。
【００５４】
IgH鎖は、少なくとも2つの要因から、TCRβ鎖よりも解析が難しい：i）体細胞変異の存在がマッピングまたはアラインメントをより困難にしている、およびii）NDN領域が大きいため、多くの場合CリードにVセグメントの一部分をマッピングすることができない。本発明の1つの局面において、この問題は、Vリードを生成するために、V領域に沿う異なる位置に配置される複数のプライマーセットを使用することによって、好ましくは、プライマー結合部位が重複せず間隔を空けて配置され、そして少なくとも1つのプライマー結合部位がNDN領域に隣接するように、例えば、1つの態様ではV-NDN接合部から5から50塩基、または別の態様ではV-NDN接合部から10から50塩基となるよう、複数のプライマーセットを使用することによって解消される。複数のプライマーセットの冗長度は、体細胞変異による影響を受ける結合部位を有する1つまたは2つのプライマーの不具合によるクロノタイプの検出の失敗の危険を最小限にする。さらに、NDN領域に隣接するプライマー結合部位が少なくとも1つ存在することにより、VリードがCリードと重複する可能性が高くなり、したがってCリードの長さが効果的に伸長される。これにより、すべてのサイズのNDN領域を網羅しかつVおよびJ領域の実質的に全体をそのNDN領域の両方の側にマッピングすることもできる連続配列を生成することが可能となる。そのようなスキームを実施する態様は、図4Aおよび4Dに図示されている。図4Aにおいて、IgH鎖を含む試料（400）は、単一セットのJ領域プライマー（401）および複数（示されているのは3）セットのV領域（402）プライマー（404、406、408）を用いて鎖を増幅し、すべてが同じNDN領域を含みかつV領域（402）の段階的に大きくなる部分（411、413、415）を含む異なる長さを有する複数の入れ子アンプリコン（例えば410、412、416）を作製することにより、各鎖につき複数のアンプリコンを生成することによって配列決定される。入れ子セットのメンバーは、それらのそれぞれのNDN、Jおよび／またはC領域の同一性（実質的同一性）を確認することにより、配列決定後にひとつにグループ化され得、それによって、リード長および／または配列決定品質が限定される他の配列決定プラットフォームの場合よりも長いV(D)Jセグメントの再構築が実現される。1つの態様において、複数のプライマーセットは、2から5の範囲の数であり得る。別の態様において、複数は2〜3であり；さらに別の態様では複数は3である。複数のプライマーの濃度および位置は、様々変化し得る。V領域プライマーの濃度は、同じである場合もそうでない場合もある。1つの態様において、NDN領域に最も近いプライマーは、例えばNDN領域を含むアンプリコンが、得られるアンプリコンにおいて表現されることを確実にするために、その複数の中の他のプライマーよりも高い濃度を有する。複数の3つのプライマーを使用する特定の態様において、60：20：20の濃度比が用いられる。NDN領域（444）に隣接する1つまたは複数のプライマー（例えば、図4Bでは435および437）は、J領域プライマー（432）によって生成される配列リード（442）と重複する1つまたは複数の配列リード（例えば、434および436）を生成するのに使用され得、それによって重複領域（440）における塩基コールの質が改善される。複数のプライマーからの配列リードは、隣接する下流のプライマー結合部位および／または隣接する下流の配列リードと重複している場合もそうでない場合もある。1つの態様においては、NDN領域に近接する配列リード（例えば、436および438）が、クロノタイプに関連する特定のV領域を同定するのに使用され得る。そのような複数のプライマーは、プライマー結合部位の1つが免疫グロブリンの発達時に超変異している場合に増幅が不完全または不成功となる可能性を低下させる。それはまた、V領域の超変異により導入された多様性がクロノタイプ配列に取り込まれる可能性を高める。二次PCRは、配列決定のための入れ子アンプリコンを調製するために、例えば図示されているようなP5（401）およびP7（404、406、408）プライマーを用いる増幅によりアンプリコン（420、422および424）を作製することによって実施され得、それらは固相表面上に単一分子として配分され得、さらにブリッジPCRまたは同様の技法により増幅される。
【００５５】
（特に、IgH鎖の）NDN領域における塩基コールは、図4Eに図示されているように、隣接するJおよびV領域のコドン構造を使用することによって改善することができる。（本明細書において使用される場合、「コドン構造」は、NDN領域の外側のTCRまたはBCR転写物または遺伝子のセグメント、例えばV領域、J領域等の天然のリーディングフレームのコドンを意味する。）図4Bのアンプリコンの拡大図であるアンプリコン（450）は、上側には、Cリード（442）および隣接するVリード（434）の相対位置が、下側には、V領域（430）およびJ領域（446）のそれぞれのコドン構造（452および454）が、示されている。本発明のこの局面によれば、コドン構造（452および454）が従来的なVおよびJ参照配列に対するアラインメントにより同定された後、NDN領域（456）の塩基は、配列リード（434）および（442）を用いて、1度に1塩基ずつ、J領域（446）からV領域（430）に向かっておよび反対のV領域（430）からJ領域（446）に向かって移動しつつコール（または同定）される。通常の生物学的条件下では、V領域からNDN領域を通ってJ領域までのインフレームコドンを有する組換えTCRまたはIgH配列のみがタンパク質として発現される。すなわち、体細胞により生成されるバリアントのうち、発現されるのは、そのJ領域およびV領域のコドンフレームが互いに対してインフレームでありかつNDN領域を通じてインフレームの状態にあるもののみである。（ここでは、VおよびJ領域の正確なフレームは、参照配列から決定される。）フレーム外（out-of-frame）配列が1つまたは複数の低品質の塩基コールに基づき同定される場合、その対応するクロノタイプは、再評価のためまたは潜在的な疾患関連異常としてフラグを立てられる。同定された配列がインフレームでありかつ高品質の塩基コールに基づいている場合、そこにはその対応するクロノタイプが正確にコールされている高い信頼性がある。したがって、1つの局面において、本発明は、双方向配列リードからV(D)Jベースのクロノタイプを決定する方法であって、（a）J領域から始まりNDN領域へと延びる少なくとも1つのJ領域配列リードおよびV領域から始まりNDN領域へと延びる少なくとも1つのV領域配列リードを、そのJ領域配列リードおよびV領域配列リードが重複領域で重複しておりかつJ領域およびV領域の各々がコドン構造を有するように、生成する工程；（b）NDN領域へと延びるJ領域のコドン構造がNDN領域へと延びるV領域のコドン構造に対してインフレームであるかどうかを判定する工程を含む前記方法を含む。さらなる態様において、生成する工程は、V領域から始まり、NDN領域を通ってJ領域まで延びる少なくとも1つのV領域配列リードを、J領域配列リードおよびV領域配列リードが重複領域で重複するように生成することを含む。
【００５６】
体細胞超変異
1つの態様において、体細胞超変異を起こしたIgHベースのクロノタイプは、以下のようにして決定される。体細胞変異は、（関連セグメントの、通常はV、JまたはCの）対応する参照配列の塩基と異なり、かつ統計的に有意な数のリードに存在する、配列決定された塩基と定義される。1つの態様においては、Cリードが、マッピングされたJセグメントに関する体細胞変異を発見するのに使用され得、同様に、Vセグメントに関してはVリードが使用され得る。JまたはVセグメントに直接マッピングされるかまたはNDN境界までのクロノタイプ伸長物の内側であるかのいずれかのCおよびVリードのみが使用される。このようにして、NDN領域は回避され、以前にクロノタイプの決定に使用された同じ「配列情報」が、変異の発見に使用されることはない（実際は異なる組換えNDN領域であるにすぎないのに誤って変異ヌクレオチドとして分類されるのを回避するため）。セグメントタイプごとに、マッピングされたセグメント（優性のアレル）がスキャホールドとして使用され、リードのマッピング段階でこのアレルにマッピングされたすべてのリードが考慮される。少なくとも1つのリードがマッピングされている参照配列の各位置が、体細胞変異について解析される。1つの態様において、非参照塩基を有効な変異として受諾する基準は、以下のものを含む：1）所定の変異塩基を有する少なくともN個のリード、2）少なくとも所定の分数N/Mのリード（Mはこの塩基位置にマッピングされたリードの総数である）；および3）2項分布、変異塩基におけるN個のリードの平均Qスコアおよび非変異塩基を有するリードの数（M-N）に基づく統計的な切り捨て。好ましくは、上記のパラメータは、クロノタイプ単位での変異の誤発見率が1000中1未満、より好ましくは10000中1未満となるように選択される。
【００５７】
TCRβレパートリー解析
この実施例では、TCRβ鎖を解析する。解析は、TCRβ配列の増幅、配列決定、および解析を含む。1つのプライマーは、Cβ1およびCβ2の共通配列に相補的であり、全48種のVセグメントを増幅することができる34種のVプライマーが存在する。Cβ1またはCβ2は、J/C結合部から10位および14位の位置で互いに異なっている。Cβ1またはCβ2のプライマーは16bpの位置で終了し、Cβ1またはCβ2に対する優先性はない。34種のVプライマーを、Van Dongen等の米国特許出願公開第2006/0234234号（参照により本明細書に組み入れられる）に開示の元のプライマーセットから改変する。改変されたプライマーは、参照により本明細書に組み入れられるFahamらの米国特許出願公開第2010/0151471号に開示されている。
【００５８】
Illuminaゲノムアナライザーを使用して、上記プライマーにより作製されたアンプリコンを配列決定する。図2A〜2Bに記載のようにメッセンジャーRNA転写物（200）の二段階増幅を実施する。第1段階は上記プライマーを用い、第2段階にはブリッジ増幅および配列決定用の共通プライマーを加える。図2Aに示すように、3'末端がJ/C結合部（204）から16塩基であり、Cβ1（203）および2つのCβ2アレルに完全に相補的である20bpプライマー（202）を片側に使用して、一次PCRを実施する。RNA転写物（200)のV領域（206）において、異なるV領域配列に相補的なプライマー配列を含有するプライマーセット（212）が提供される（一態様においては34種）。プライマーセット（212）は、また、P7プライマー（220）に特異的なプライマー結合部位（218）を有するアンプリコン（216）を作製する非相補的テール（214）を含有する。従来のマルチプレックスPCRの後、二次増幅のためのmRNA転写物の多様なJ（D）V領域（206、208および210）および共通プライマー結合部位（203および218）を含有するアンプリコン（216）が形成され、ブリッジPCRによるクラスター形成のための試料タグ（221）およびプライマー（220および222）を加える。二次PCRにおいて、鋳型の同じ側で、J/C結合部に最も近い10塩基の配列をその3'末端に有し、J/C結合部から15〜31位の17bpの配列が続き、P5配列（224）がそれに続くプライマー（図2Bの222、本明細書において「C10-17-P5」と称される）を使用する。P5は、Solexa配列決定でのブリッジPCRによるクラスター形成において役割を果たす。（C10-17-P5プライマー（222）が第1PCRから作製された鋳型にアニーリングすると、J/C結合部に最も近い10塩基およびJ/C結合部から15〜31位の塩基の配列にプライマーがハイブリダイズするために、鋳型に4bpループ（11〜14位）が生じる。11〜14位のループ形成により、Cβ1またはCβ2を有する鋳型の差次的増幅が排除される。次に、J/C結合部に最も近い10塩基およびJ/C結合部から15〜31位の塩基の配列に相補的なプライマー(このプライマーをC'と呼ぶ)を用いて、配列決定を行う。すべての増幅された物質が、クラスター形成において効率的に使用することができるインタクトな末端を有するようにするために、C10-17-P5プライマーをHPLC精製することができる。）
【００５９】
図2Aにおいて、Vプライマー（212）のオーバーハングの長さは14bpが好ましい。一次PCRはより短いオーバーハング（214）により支援される。あるいは、二次PCRのためには、二次PCRがこの配列からプライミングされるので、一次PCRではVプライマーのオーバーハングはできるだけ長いものが使用される。効率的な二次PCRを支援するオーバーハング（214）の最小サイズを調査した。2bp刻みで10〜30のオーバーハングサイズを有するVプライマーを二系列（2つの異なるVセグメント用に）作製した。適切な合成配列を用いて、これらの系列における各プライマーにより第1PCRを実施し、増幅されたものすべてを示すためにゲル電気泳動を実施した。
【００６０】
図2Aに示されるように、一次PCRは、RNA鋳型（200）のV領域（206）にアニーリングし、共通の14bpのオーバーハングを5'テールに含有する34種の異なるVプライマー（212）を使用する。14bpは、Illumina配列プライマーの1つ（Read2プライマーと呼ぶ）の部分配列である。同じ側における二次増幅プライマー（220）は、P7配列、タグ（221）およびRead2プライマー配列（223）を含む（このプライマーはRead2_タグX_P7と呼ぶ）。P7配列はクラスター形成に使用される。Read2プライマーおよびその相補体は、それぞれVセグメントおよびタグの配列決定に用いられる。1〜96番のタグを有する96種のこれらのプライマーのセットを作製する（下記参照）。すべての増幅された物質が、クラスター形成で効率的に使用することができるインタクトな末端を有するようにするため、これらのプライマーはHPLC精製される。
【００６１】
上記のように、第2段階のプライマーであるC-10-17-P5（222、図2B）は第1段階のPCRで生成された鋳型に対して中断のある相同性を有する。このプライマーを用いた増幅の効率を検証した。CsegP5と呼ばれるC-10-17-P5の代わりのプライマーは、第1段階のCプライマーおよびP5を有する5'テールに完全な相同性を有する。第1段階のPCRの鋳型を増幅する場合のC-10-17-P5およびCsegP5を用いた効率は、リアルタイムPCRを実施することにより比較した。数回の繰り返しで、C-10-17-P5プライマーを用いたPCRは、CsegP5プライマーを用いたPCRと比較して効率にほとんど違いが認められなかった。
【００６２】
図2A〜2Cに示される二段階増幅から生じるアンプリコン (230) は、図2Cに示されるような、Illuminaシーケンサーで典型的に用いられる構造を有する。分子の最も外側の部分にアニールする2種のプライマー、IlluminaプライマーP5およびP7は、分子の固相増幅（クラスター形成）に用いられる。1分子当たり3件の配列リードを行う。100 bpの第1リードは、Illumina配列決定過程に適している融解温度を有するC'プライマーを用いて行う。第2リードは6 bp長のみであり、単に試料タグを同定するためのものである。これは、製造業者 (Illumina) によって提供されるタグプライマーを用いて生成される。最終リードは、やはり製造業者 (Illumina) によって提供されるRead 2プライマーである。このプライマーを用いて、第1PCR のVプライマー配列から開始する、Vセグメントにおける100 bpリードが生成される。
【００６３】
いくつかの特定の態様例を参照して本発明を説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらに対して多くの変更がなされ得ることを、当業者は認識するであろう。本発明は、上記のものに加えて、様々なセンサー実現およびその他の主題に適用可能である。
【００６４】
定義
本明細書において他に具体的に規定されない限り、本明細書で用いられる核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当分野における標準的な論文および教科書、例えば、Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992)；Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975)；Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999)；Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, 6th edition (Saunders, 2007)の用語および記号に従っている。
【００６５】
「アラインすること」とは、配列リードなどの試験配列を1つまたは複数の参照配列と比較して、どの参照配列が、または参照配列のどの部分が、何らかの配列距離尺度に基づいて最も近いかを判定する方法を意味する。ヌクレオチド配列をアラインする例示的な方法は、Smith Watermanアルゴリズムである。距離尺度には、ハミング距離、レーヴェンシュタイン距離などが含まれ得る。距離尺度は、比較される配列のヌクレオチドの品質値に関連した成分を含み得る。
【００６６】
「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物；すなわち、一本鎖または二本鎖であってよく、1つまたは複数の出発配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団を意味する。1つもしくは複数の出発配列は、同じ配列の1つもしくは複数のコピーであってもよいし、またはそれらは異なる配列の混合物であってもよい。好ましくは、アンプリコンは、単一の出発配列の増幅によって形成される。アンプリコンは、その反応産物が1つまたは複数の出発核酸または標的核酸の複製物を含む、様々な増幅反応によって作製され得る。1つの局面において、アンプリコンを作製する増幅反応は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかである反応物の塩基対形成が、反応産物の創出に必要な相補体を鋳型ポリヌクレオチドにおいて有するという点で、「鋳型駆動型」である。1つの局面において、鋳型駆動型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長、または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチド連結である。このような反応には、参照により本明細書に組み入れられる以下の参考文献、Mullis et al、米国特許第4,683,195号；第4,965,188号；第4,683,202号；第4,800,159号(PCR)；Gelfand et al、米国特許第5,210,015号(「taqman」プローブによるリアルタイムPCR)；Wittwer et al、米国特許第6,174,670号；Kacian et al、米国特許第5,399,491号(「NASBA」)；Lizardi、米国特許第5,854,033号；Aono et al、特開平4-262799(ローリングサークル増幅)などに開示されているポリメラーゼ鎖反応(PCR)、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、ローリングサークル増幅などが含まれるが、これらに限定されない。1つの局面において、本発明のアンプリコンはPCRによって作製される。増幅反応の進行に伴った反応産物の測定を可能にする検出化学が利用できるのであれば、増幅反応は「リアルタイム」増幅であってよく、例えば、以下に記載される「リアルタイムPCR」、またはLeon et al, Nucleic Acids Reseqrch, 26: 2150-2155 (1988)、および同様の参考文献に記載されているような「リアルタイムNASBA」であってよい。本明細書で用いられる「増幅すること」という用語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」とは、反応を行うために必要な反応物をすべて含む溶液を意味し、この反応物には、反応中にpHを選択されたレベルに維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなどが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６７】
「クロノタイプ」とは、免疫受容体またはその一部をコードするリンパ球の組換えヌクレオチド配列を意味する。より詳細には、クロノタイプとは、T細胞受容体 (TCR) もしくはB細胞受容体 (BCR) またはその一部をコードする、T細胞またはB細胞の組換えヌクレオチド配列を意味する。様々な態様において、クロノタイプは、IgHのVDJ再編成、IgHのDJ再編成、IgKのVJ再編成、IgLのVJ再編成、TCRβのVDJ再編成、TCRβのDJ再編成、TCRαのVJ再編成、TCRγのVJ再編成、TCRδのVDJ再編成、TCRδのVD再編成、Kde-V再編成などのすべてまたは一部をコードし得る。クロノタイプはまた、Bcl1-IgHまたはBcl1-IgHなどの、免疫受容体遺伝子を含む転座切断点領域をコードし得る。1つの局面において、クロノタイプは、それらが由来する免疫分子の多様性を表すまたは反映するのに十分長い配列を有する；その結果として、クロノタイプは長さが大きく異なり得る。いくつかの態様において、クロノタイプは25〜400ヌクレオチドの範囲の長さを有し；他の態様において、クロノタイプは25〜200ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００６８】
「クロノタイププロファイル」とは、リンパ球の集団に由来する別個のクロノタイプおよびそれらの相対存在量の一覧を意味する。典型的に、リンパ球の集団は組織試料から得られる。「クロノタイププロファイル」という用語は、以下のような参考文献に記載されているような免疫「レパートリー」の免疫学概念に関連するが、それよりも一般的である：Arstila et al, Science, 286: 958-961 (1999)；Yassai et al, Immunogenetics, 61: 493-502 (2009)；Kedzierska et al, Mol. Immunol, 45(3): 607-618 (2008)など。「クロノタイププロファイル」という用語は、リンパ球の選択されたサブセット（例えば、組織浸潤リンパ球、免疫表現型サブセットなど）に由来し得るか、または完全な免疫受容体と比較して多様性が低下した免疫受容体の一部をコードし得る、再編成免疫受容体コード核酸の多種多様なリストおよび存在量を含む。いくつかの態様において、クロノタイププロファイルは、少なくとも103種の別個のクロノタイプを含み得る；他の態様において、クロノタイププロファイルは、少なくとも104種の別個のクロノタイプを含み得る；他の態様において、クロノタイププロファイルは、少なくとも105種の別個のクロノタイプを含み得る；他の態様において、クロノタイププロファイルは、少なくとも106種の別個のクロノタイプを含み得る。そのような態様において、そのようなクロノタイププロファイルは、別個のクロノタイプのそれぞれの存在量または相対頻度をさらに含み得る。1つの局面において、クロノタイププロファイルとは、個体のリンパ球集団中の、T細胞受容体 (TCR) もしくはB細胞受容体 (BCR) またはその断片それぞれをコードする別個の組換えヌクレオチド配列（およびそれらの存在量）のセットであり、該セットのヌクレオチド配列は、該集団のリンパ球の実質的にすべてについて、別個のリンパ球またはそれらのクローン亜集団と1対1の対応を有する。1つの局面において、クロノタイプを規定する核酸セグメントは、それらの多様性（すなわち、セット中の別個の核酸配列の数）が十分に大きく、結果として個体中の実質的にすべてのT細胞もしくはB細胞またはそのクローンがそのようなレパートリーの特有の核酸配列を保有するように、選択される。すなわち、好ましくは、試料のそれぞれ異なるクローンは異なるクロノタイプを有する。本発明の他の局面において、レパートリーに相当するリンパ球集団は、循環B細胞であってよく、または循環T細胞であってよく、またはCD4+ T細胞、もしくはCD8+ T細胞、もしくは細胞表面マーカーによって規定されるその他の亜集団などを含むがこれらに限定されない、前述の集団のいずれかの亜集団であってよい。そのような亜集団は、特定の組織、例えば骨髄もしくはリンパ節などから試料を取得することによって、または1つもしくは複数の細胞表面マーカー、サイズ、形態などに基づいて試料（末梢血など）から細胞を選別もしくは濃縮することによって獲得され得る。さらなる他の局面において、レパートリーに相当するリンパ球集団は、腫瘍組織、感染組織などの罹患組織に由来し得る。1つの態様において、ヒトTCRβ鎖またはその断片を含むクロノタイププロファイルは、0.1×106〜1.8×106種の範囲、または0.5×106〜1.5×106種の範囲、または0.8×106〜1.2×106種の範囲の数の別個のヌクレオチド配列を含む��別の態様において、ヒトIgH鎖またはその断片を含むクロノタイププロファイルは、0.1×106〜1.8×106種の範囲、または0.5×106〜1.5×106種の範囲、または0.8×106〜1.2×106種の範囲の数の別個のヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、IgH鎖のV(D)J領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。1つの局面において、本明細書で用いられる「実質的にすべての」とは、0.001パーセントもしくはそれ以上の相対存在量を有するすべてのセグメントを意味し；または別の局面において、本明細書で用いられる「実質的にすべての」とは、0.0001パーセントもしくはそれ以上の相対存在量を有するすべてのセグメントを意味する。別の特定の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、TCRβ鎖のV(D)J領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。別の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、25〜200ヌクレオチドの範囲の長さを有し、かつTCRβ鎖のV、D、およびJ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、25〜200ヌクレオチドの範囲の長さを有し、かつIgH鎖のV、D、およびJ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、別個のIgH鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等しい数の別個のヌクレオチド配列を含む。別の態様において、本発明のクロノタイププロファイルは、別個のTCRβ鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等しい数の別個のヌクレオチド配列を含む。さらなる別の態様において、「実質的に等しい」とは、クロノタイププロファイルが、個体の集団の、0.001パーセントまたはそれ以上の頻度のすべてのリンパ球によって保有または発現されるIgHもしくはTCRβまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を、99パーセントの確率で含むことを意味する。さらなる別の態様において、「実質的に等しい」とは、ヌクレオチド配列のレパートリーが、0.0001パーセントまたはそれ以上の頻度で存在するすべてのリンパ球によって保有または発現されるIgHもしくはTCRβまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を、99パーセントの確率で含むことを意味する。いくつかの態様において、クロノタイププロファイルは、105〜107個のリンパ球を含む試料に由来する。そのような数のリンパ球は、1〜10 mLの末梢血試料から得ることができる。
【００６９】
「相補性決定領域」(CDR)とは、免疫グロブリン(すなわち、抗体)またはT細胞受容体の領域を意味するものであり、この領域において分子は抗原の高次構造を補完し、それによって該分子の特異性を決定し、特定の抗原と接触する。T細胞受容体および免疫グロブリンはそれぞれ、3つのCDRを有する：CDR1およびCDR2は可変(V)ドメイン中に見出され、CDR3は、Vの一部、多様部(D)(重鎖のみ)および結合部(J)のすべて、ならびに定常(C)ドメインの一部を含む。
【００７０】
参照配列と別の配列(「比較配列」)との比較に関して用いられる「%相同」、「%同一」、または同様の用語は、この2つの配列の間の最適なアラインメントにおいて、比較配列が、示されるパーセンテージに等しいサブユニット位置の数において参照配列と同一であることを意味し、このサブユニットは、ポリヌクレオチド比較に関してはヌクレオチドであり、またはポリペプチド比較に関してはアミノ酸である。本明細書で用いられる、比較される配列の「最適なアラインメント」とは、サブユニット間の一致を最大にし、かつアラインメントの構築において使用されるギャップの数を最小にするアラインメントである。%同一性は、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)("GAP" program of Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI)などによって記載されているようなアルゴリズムの商用の実行によって決定され得る。アラインメントを構築し、同一性のパーセンテージまたは類似性の他の尺度を算出するための、当技術分野におけるその他のソフトウェアパッケージには、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981) (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI)のアルゴリズムに基づく「BestFit」プログラムが含まれる。言い換えれば、例えば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95パーセント同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの5パーセントまでが欠失されるか、もしくは別のヌクレオチドで置換されてよく、または参照配列中の全ヌクレオチド数の5パーセントまでのヌクレオチド数が参照配列中に挿入されてよい。
【００７１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長による、特定のDNA配列のインビトロ増幅のための反応を意味する。言い換えると、PCRは、プライマー結合部位によって挟まれた標的核酸の複数のコピーまたは複製物を作製するための反応であり、このような反応は以下の工程の1回または複数回の反復を含む：(i) 標的核酸を変性させる工程、(ii) プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせる工程、および(iii) ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させる工程。通常、反応は、サーマルサイクラー装置において、各工程に最適化された異なる温度の間で繰り返される。特定の温度、各工程における持続時間、および工程間の変化速度は、例えば参考文献、McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford、それぞれ1991および1995)によって例示される、当業者に周知の多くの要因に依存する。例えば、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来のPCRでは、＞90℃の温度で二本鎖標的核酸が変性され得、50〜75℃の範囲の温度でプライマーがアニーリングされ得、そして72〜78℃の範囲の温度でプライマーが伸長され得る。「PCR」という用語は、RT-PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量的PCR、マルチプレックスPCRなどを含むがこれらに限定されない、該反応の派生形態を含む。反応容量は、数百ナノリットル、例えば200 nL〜数百μL、例えば200μLの範囲である。「逆転写PCR」または「RT-PCR」とは、標的RNAを相補的な一本鎖DNAへと変換する逆転写反応が先行し、次いで増幅が行われるPCRを意味する；例えば、参照により本明細書に組み入れられるTecott et al、米国特許第5,168,038号。「リアルタイムPCR」とは、反応の進行と共に反応産物、すなわちアンプリコンの量がモニターされるPCRを意味する。リアルタイムPCRの多くの形態が存在し、主に反応産物のモニタリングに用いられる検出化学が異なる；例えば、参照により本明細書に組み入れられるGelfand et al、米国特許第5,210,015号(「taqman」)；Wittwer et al、米国特許第6,174,670号および第6,569,627号(インターカレート色素)；Tyagi et al、米国特許第5,925,517号(分子ビーコン)。リアルタイムPCRのための検出化学は、同様に参照により本明細書に組み入れられるMackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)において概説されている。「ネステッドPCR」とは、第1PCRのアンプリコンが、プライマーの新たなセットを用いる第2PCRのための試料となる二段階PCRを意味し、そのセットのうちの少なくとも一方は第1アンプリコンの内部の位置に結合する。ネステッド増幅反応に関する、本明細書で用いられる「初期プライマー」とは、第1アンプリコンを生成するために用いられるプライマーを意味し、「二次プライマー」とは、第2または入れ子アンプリコンを生成するために用いられる1つまたは複数のプライマーを意味する。「マルチプレックスPCR」とは、複数の標的配列(または単一の標的配列および1つまたは複数の参照配列)が同じ反応混合物中で同時に行われるPCRを意味する；例えば、Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999)(2色リアルタイムPCR)。通常、増幅される各配列について、プライマーの別個のセットが用いられる。典型的には、マルチプレックスPCRにおける標的配列の数は、2〜50、または2〜40、または2〜30の範囲である。「定量的PCR」とは、試料または標本中の1つまたは複数の特定の標的配列の存在量を測定するために設計されたPCRを意味する。定量的PCRは、このような標的配列の絶対的な定量および相対的な定量の両方を含む。定量的な測定は、標的配列と別々にまたは共にアッセイされ得る1つまたは複数の参照配列または内部標準を用いてなされる。参照配列は、試料または標本にとって内因性であっても外因性であってもよく、後者の場合には、1つまたは複数の競合鋳型を含み得る。典型的な内因性の参照配列には、以下の遺伝子の転写物のセグメントが含まれる：βアクチン、GAPDH、β2ミクログロブリン、リボソームRNAなど。定量的PCRのための技法は、参照により組み入れられる以下の参考文献において例証されるように、当業者に周知である：Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126 (1999)；Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989)；Zimmerman et al, Biotechniques, 21: 268-279 (1996)；Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020 (1992)；Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989)など。
【００７２】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型との二重鎖の形成に際して、核酸合成の開始点として働くことができ、伸長された二重鎖が形成されるように、鋳型に沿ってその3'末端から伸長され得る、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて行われる。伸長過程において付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはDNAポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、14〜40ヌクレオチドの範囲、または18〜36ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを用いる線状増幅反応、または2種もしくはそれ以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用に関してプライマーの長さおよび配列を選択するための指針は、参照により組み入れられる以下の参考文献によって明らかなように、当業者に周知である：Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)。
【００７３】
「品質スコア」とは、特定の配列位置における塩基の割り当てが正しいという確率についての尺度である。異なる配列決定化学、検出システム、塩基コールアルゴリズムなどの結果としてコールされる塩基に関するような特定の状況について、品質スコアを算出するための様々な方法が当業者に周知である。一般的に、品質スコア値は、正しい塩基コールの確率に単調に関連している。例えば、10という品質スコアまたはQは、塩基が正しくコールされる可能性が90パーセントあることを意味し得、20というQは、塩基が正しくコールされる可能性が99パーセントあることを意味し得るなどである。いくつかの配列決定プラットフォーム、特に合成による配列決定化学を用いる配列決定プラットフォームでは、平均品質スコアは配列リード長に応じて低下し、その結果、配列リードの始めの品質スコアは配列リードの終わりの品質スコアよりも高く、そのような低下は、不完全な伸長、繰り返し伸長、鋳型の減少、ポリメラーゼの減少、キャップ形成の障害、脱保護の障害などのような現象に起因する。
【００７４】
「配列リード」とは、配列決定技法によって生成された一連のデータまたはデータストリームから決定されたヌクレオチドの配列を意味し、この決定は、例えば、この技法と関連した塩基コーリングソフトウェア、例えばDNA配列決定プラットフォームの商業的供給業者からの塩基コーリングソフトウェアを用いてなされる。配列リードは通常、配列内の各ヌクレオチドに関する品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、例えばDNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼを用いて、鋳型核酸に沿ってプライマーを伸長させることによって作られる。データは、このような伸長に付随する光学的、化学的（例えば、pH変化）、または電気的シグナルなどのシグナルを記録することによって生成される。このような初期データが配列リードに変換される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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