(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0006302490.tif 000053
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、非置換または置換脂環式、非置換または置換ヘテロ脂環式、非置換または置換アリールアルキル、あるいは非置換または置換アルキルアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２Ｏ（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換（ＣＨ２）１−２ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルケニル）、非置換または置換Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ２−Ｃ１０アルキニル）、非置換または置換脂環式、非置換または置換ヘテロ脂環式、非置換または置換アリールアルキル、非置換または置換アルキルアリール、あるいは
【化２】
0006302490.tif 000054
（ここで、Ｒ２ａは、独立して、Ｈ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｃｌ、Ｆ、Ｍｅ、ＥｔまたはＣＮである）であり；
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２（Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ５またはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；
Ｒ4は、
【化３】
0006302490.tif 000055
（ここで、Ｒ４ａは、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ３アルキルであり；Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＯ２またはＮＨ２である）であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ５アルキル）、ＣＯ（Ｃ２−Ｃ５アルケニル）またはＣＯ（Ｃ２−Ｃ５アルキニル）であり；
Ｗは、ＯまたはＳであり；ならびに
ｎは、０、１または２である］
により示される構造を有する化合物、あるいはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
式（Ｉａ）
【化４】
0006302490.tif 000056
（式中、Ｙは、Ｈであるか、またはＮＯ２であり；Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔである）
により示される構造を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉｂ）
【化５】
0006302490.tif 000057
（式中、Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅおよびＥｔであり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ５アルキルまたは（ＣＨ２）１−２Ｃ６Ｈ５である）
により示される構造を有する、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
式（Ｉｂ'）
【化６】
0006302490.tif 000058
（式中、Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり、かつＲ６はＭｅまたはｎ−Ｐｒである）
により示される構造を有する、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
特異的または優先的に腫瘍関連抗原に結合する標的部分に共有結合された請求項１記載の化合物を含む、コンジュゲート。
【請求項６】
式（ＩＩ−１'）
【化７】
0006302490.tif 000059
（式中、Ｒ６は、Ｍｅまたはｎ−Ｐｒｏであり、Ａｂは抗体である）
により示される構造を有する、請求項５記載のコンジュゲート。
【請求項７】
Ａｂで示される抗体が、抗ＣＤ７０抗体、抗メソテリン抗体または抗グリピカン３抗体である、請求項６記載のコンジュゲート。
【請求項８】
式（ＩＩ）
［Ｄ（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ］ｍＺ            （ＩＩ）
［式中、Ｚは標的部分であり；
ＸＤは、第１のスペーサー部分であり；
ＸＺは、第２のスペーサー部分であり；
Ｃは、切断可能な基であり；
下付き文字ａおよびｂは、独立して、０または１であり；
下付き文字ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；ならびに
Ｄは、式（Ｄ−ａ）
【化８】
0006302490.tif 000060
または
式（Ｄ−ｂ）
【化９】
0006302490.tif 000061
（ここで、ＹはＨであるか、またはＮＯ２であり；Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ６はＣ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ５アルキルまたは（ＣＨ２）１−２Ｃ６Ｈ５である）
あるいはその医薬的に許容される塩である］
により示される構造を有する、請求項５記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｚで示される標的部分が抗体である、請求項８記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）
Ｄ−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−Ｒ３１            （ＩＩＩ）
［式中、
Ｒ３１は、反応性官能基であり；
ＸＤは、第１のスペーサー部分であり；
ＸＺは、第２のスペーサー部分であり；
Ｃは、切断可能な基であり；
下付き文字ａおよびｂは、独立して、０または１であり；
下付き文字ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；ならびに
Ｄは、
式（Ｄ−ａ）
【化１０】
0006302490.tif 000062
または
式（Ｄ−ｂ）
【化１１】
0006302490.tif 000063
（ここで、Ｙは、Ｈであるか、またはＮＯ２であり；Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ５アルキルまたは（ＣＨ２）１−２Ｃ６Ｈ５である）、
あるいはその医薬的に許容される塩である］
の構造を有する、薬剤−リンカー化合物。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ−ａ）：
0006302490.tif 000064
［式中、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；
Ｒ６は、Ｍｅ、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒであり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択され；
ｐは、１、２、３または４であり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは、１、２、３、４または５であり；
ｓは、０または１であり；ならびに
Ｒ３１は、
【化１２】
0006302490.tif 000065
からなる群から選択される］
により示される構造を有する、請求項１０記載の薬剤−リンカー化合物。
【請求項１２】
式（ＩＩＩ−ｂ）：
【化１３】
0006302490.tif 000066
［式中、
Ｒ６は、Ｍｅまたはｎ−Ｐｒであり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｒは、１、２、３、４または５であり；
ｓは、０または１であり；ならびに
Ｒ３１は、
【化１４】
0006302490.tif 000067
からなる群から選択される］
により示される構造を有する、請求項１０記載の薬剤−リンカー化合物。
【請求項１３】
癌に罹患している患者における癌治療用の医薬の製造のための、請求項１記載の化合物または請求項１記載の化合物と標的部分とのコンジュゲートの使用。
【請求項１４】
化合物が、癌により過剰発現されるか、または特異的に発現される抗原に結合する抗体である標的部分とコンジュゲートされている、請求項１３の使用。
【請求項１５】
癌が、腎臓、肺、胃および卵巣癌からなる群から選択される、請求項１３の使用。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物または請求項１に記載の化合物と標的部分とのコンジュゲート、および医薬的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の化合物が、抗体である標的部分に結合されている、請求項１６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
本発明は、ツブリシンと構造的に類似する化合物、リガンドとのそのコンジュゲート、かかる化合物およびコンジュゲートを製造および使用するための方法、ならびにかかる化合物およびコンジュゲートを含む組成物に関する。
【０００２】
ツブリシンは、元々は粘液細菌であるArchangium gephyraまたはAngiococcus disciformisの培養物から単離された細胞毒素であり、各生物は異なるツブリシン混合物を産生する(Sasse et al. 2000; Reichenbach et al. 1998)。その結晶構造および生合成経路は解明されており(Steinmetz et al. 2004)、その生合成遺伝子は配列決定されている(Hoefle et al. 2006b)。ツブリシンの生合成前駆体であるプレツブリシンは、ある程度の活性を有することも示されている(Ullrich et al. 2009)(第１著者または発明者および年により本明細書に引用した全ての引用文献についての完全な引用は、本明細書末部に列挙される)。
【０００３】
ツブリシンは、天然に存在する抗有糸分裂性のポリペプチドおよびデプシペプチドの一群に属しており、これはホモプシン、ドラスタチンおよびクリプトフィシンを包含する(Hamel 2002)。ポリペプチドまたはデプシペプチド以外の抗有糸分裂剤には、例えばパクリタキセル、メイタンシンおよびエポシロンなども存在する。有糸分裂中に、細胞の微小管は再構成して紡錘体を形成するが、その際のプロセスは、微小管構成成分であるタンパク質のαおよびβ-チューブリンの迅速な組立ておよび分解を必要とする。抗有糸分裂剤は、前記プロセスを阻止して、細胞が有糸分裂することを防止する。分子レベルでは、正確な妨害メカニズムは、ある１つの抗有糸分裂剤と別の抗有糸分裂剤とでは異なることもあり得る。ツブリシンは、チューブリンの微小管への組立てを防止することにより、影響を受けた細胞をＧ２/Ｍ期において蓄積させて、アポトーシスを引き起こす(Khalil et al. 2006)。逆に、パクリタキセルは、微小管に結合すること、かつその分解を防止することにより、同じ最終結果をもたらす。
【０００４】
ツブリシンは、式(Ａ)に示されるような、１つのタンパク質形成アミノ酸サブユニットおよび３つの非タンパク質形成アミノ酸サブユニットから構成されたテトラペプチジル骨格を有する：Ｎ−メチルピペコリン酸(Ｍｅｐ)、イソロイシン(Ｉｌｅ)、ツブバリン(Ｔｕｖ)およびツブフェニルアラニン(Ｔｕｐ、Ｒ'はＨに等しい)またはツブチロシン(Ｔｕｔ、Ｒ'はＯＨに等しい)。十分に知られた天然ツブリシンの中で(Ａ、Ｂなどと表される)、構造的変異部位は、表１に示されるような式(Ａ)のＲ'、Ｒ''およびＲ'''残基にある：
【表１】
0006302490.tif 000002
【０００５】
加えて、その他の天然ツブリシンが同定されている(Chai et al. 2010)。
【０００６】
Kaurら(2006)は、ツブリシンＡの抗増殖特性を試験し、他の抗有糸分裂剤、例えばパクリタキセルおよびビンブラスチンよりも効力が高く、ツブリシンＡが異種移植片アッセイにおいて様々な癌細胞株に対して活性であることを見出した。更に、ツブリシンＡは、癌細胞ではアポトーシスを誘導したが、正常細胞では誘発せず、インビトロアッセイにおいては極めて強力な抗血管形成特性を示した。その他のツブリシンの抗有糸分裂特性もまた評価されており、一般的に、非ツブリシン抗有糸分裂剤の抗有糸分裂特性と比較して有望であることが見出されている(例えば、Balasubramanian et al. 2009; Steinmetz et al. 2004; Wipf et al. 2004を参照されたい)。これらの理由から、ツブリシンは、抗癌剤としての多大な関心が寄せられている(例えば、Domling et al. 2005c;Hamel 2002を参照されたい)。
【０００７】
多くの文献は、ツブリシンの合成を目的とした取り組みを記述しており、例えば、Balasubramanian et al. 2009; Domling et al. 2006; Hoefle et al. 2003; Neri et al. 2006; Peltier et al. 2006; Sani et al. 2007; Sasse et al. 2007; Shankar et al. 2009; Shibue et al. 2009 and 2010；および Wipf et al. 2004が挙げられる。その他の文献は、ツブリシンアナログまたは誘導体の製造および評価により、構造活性相関(ＳＡＲ)試験を記載している：Balasubramanian et al. 2008 and 2009; Chai et al. 2011; Domling 2006; Domling et al. 2005a; Ellman et al. 2013; Hoefle et al. 2001 & 2006a; Pando et al. 2011; Patterson et al. 2007 & 2008; Richter 2012a, 2012b, and 2012c; Shankar et al. 2013; Shibue et al. 2011; Sreejith et al. 2011; Vlahov et al. 2010a; Wang et al. 2007; Wipf et al. 2007 and 2010；および Zanda et al. 2013。ＳＡＲ研究は、Ｍｅｐ環、Ｔｕｖサブユニットの残基Ｒ''およびＲ'''ならびにＴｕｐ／Ｔｕｔサブユニットの芳香環または脂肪族炭素鎖における構造多様性を主に探索する。
【０００８】
Domlingら(2005)は、ポリマーまたは生体分子として一般的に記述されるパートナー分子とツブリシンとのコンジュゲートを開示しているが、実施例ではパートナー分子としてのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)に限定されている。Chengら(2011)は、コンジュゲートに使用するために適合されたツブリシンアナログも開示している。ツブリシンのコンジュゲートを開示するその他の書類は、Boyd et al. 2008 and 2010; Jackson et al. 2013; Vlahov et al. 2008a, 2008b and 2010b; Leamon et al. 2008 and 2010; Reddy et al. 2009; および Low et al. 2010である。Leungら(2002)は、薬剤(ツブリシンを含む)と結合して、薬剤の生物活性と水溶解度を改良することができるポリアニオンポリペプチドを開示している。
【０００９】
Davisら(2008)およびSchluepら(2009)は、ツブリシンがＴｕｐ／Ｔｕｔカルボキシル基に結合したヒドラジド−ジスルフィドリンカー部分を介してシクロデキストリンに共有結合しているシクロデキストリンに基づいた製剤を開示する。
【００１０】
Ｔｕｖサブユニットの脱アセチル化により［即ち、式(Ａ)中のＲ''は、アセチルの代わりに水酸基である］、生物学的活性が失われることが報告された(Domling et al. 2006)。ツブリシンＵおよびＶの研究において(前者はアセチル化されており、後者は脱アセチル化されている点で異なる)、ツブリシンＶは、アッセイに応じて約２００Ｘ〜６００Ｘで作用が弱いことが報告された(Balasubramanian et al. 2009)。アセテート基が加水分解を受け易いため、Ｒ''位置での脱アセチル化は、活性を失わせる強力な不安定性中心として、医薬適用のためのツブリシンアナログ開発するために関心が寄せられている。
【００１１】
(本発明の簡単な説明)
我々は、Ｒ''位置にて、アセテート基をカルバメート基に置き換えることにより、上記にて議論した脱アセチル化に関連した生物学的活性の喪失を保護することができることを見出した。本明細書に記述したカルバメート基は、生物学的活性についての有意な失活をもたらさず、依然として安定性が高い。
【００１２】
従って、一態様において、本発明は、式(Ｉ)：
【化１】
0006302490.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、非置換または置換脂環式、非置換または置換ヘテロ脂環式、非置換または置換アリールアルキル、または非置換または置換アルキルアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、非置換または置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２Ｏ(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換(ＣＨ２)１−２ＯＣ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ１−Ｃ１０アルキル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルケニル)、非置換または置換Ｃ(＝Ｏ)(Ｃ２−Ｃ１０アルキニル)、非置換または置換脂環式、非置換または置換ヘテロ脂環式、非置換または置換アリールアルキル、非置換または置換アルキルアリール、または
【化２】
0006302490.tif 000004
(式中、各Ｒ２ａは、独立して、Ｈ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｃｌ、Ｆ、Ｍｅ、ＥｔまたはＣＮである)であり；
；
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２(Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル)、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ６Ｈ５、またはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；
Ｒ４は、
【化３】
0006302490.tif 000005
(式中、Ｒ４ａは、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ３アルキルであり；およびＹは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、Ｍｅ、Ｅｔ、ＮＯ２またはＮＨ２である)であり；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｃ２−Ｃ５アルキニル、ＣＯ(Ｃ１−Ｃ５アルキル)、ＣＯ(Ｃ２−Ｃ５アルケニル)、またはＣＯ(Ｃ２−Ｃ５アルキニル)であり；
Ｗは、ＯまたはＳ(好ましくはＯ)であり；ならびに
ｎは、０、１または２である］
により示される構造を有する化合物、またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、標的細胞上の化学部分に特異的または優先的に結合する標的部分と共有結合された、式(I)の化合物を含むコンジュゲートを提供するものであり、この標的細胞は好ましくは癌細胞である。好ましくは、この標的部分は、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、さらにより好ましくはヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、この化学部分とは腫瘍関連抗原である。腫瘍関連抗原は、癌細胞の表面上に提示されるものであるか、または癌細胞により細胞外空間周辺に分泌されるものであってもよい。
【００１４】
別の実施態様において、本発明の化合物および反応性官能基を有するリンカー部分を含む標的部分にコンジュゲートするのに適切な物質の組成物を提供する。
【００１５】
別の実施態様において、癌に罹患している患者における癌の治療方法を提供するものであって、治療上有効量の本発明の化合物またはその化合物と標的部分(特に、抗体)とのコンジュゲートを前記患者に投与することを特徴とする方法を提供する。別の実施態様において、癌に罹患している患者における癌の治療のための医薬製造のために、本発明の化合物またはその化合物と標的部分(特に抗体)とのコンジュゲートの使用を提供する。該癌は、腎臓癌、胃癌、肺癌または卵巣癌であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１、図２ａ−２ｂおよび図３は、組み合わせて化合物(ＩＩＩ−１)の合成のためのスキームを示す。
【図２】図１、図２ａ−２ｂおよび図３は、組み合わせて化合物(ＩＩＩ−１)の合成のためのスキームを示す。
【図３】図１、図２ａ−２ｂおよび図３は、組み合わせて化合物(ＩＩＩ−１)の合成のためのスキームを示す。
【００１７】
【図４】図４は、化合物(ＩＩＩ−２)の合成のためのスキームを示す。
【００１８】
【図５】図５は、化合物(Ｉ−２)および(Ｉ−３)の合成のためのスキームを示す。
【００１９】
【図６】図６ａ−６ｃは、組み合わせて化合物(ＩＩＩ−４)および(ＩＩＩ−５)の合成のためのスキームを示す。
【００２０】
【図７】図７は、化合物(Ｉ−１)の合成のためのスキームを示す。
【００２１】
【図８】図８は、化合物(Ｉ−４)の合成のためのスキームを示す。
【００２２】
【図９】図９ａおよび９ｂは、化合物(ＩＩＩ−６)の合成のためのスキームを合わせて示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、本発明の化合物を製造するために有用な中間体の合成のためのスキームを示す。
【図１１】図１１は、本発明の化合物を製造するために有用な中間体の合成のためのスキームを示す。
【００２４】
【図１２】図１２は、本発明の別の化合物の合成のためのスキームを示す。
【００２５】
【図１３】図１３ａ−１３ｄは、本発明の化合物の生物学的活性を示す。
【００２６】
【図１４】図１４は、本発明のコンジュゲートのインビトロ活性を示す。
【００２７】
【図１５】図１５は、本発明のコンジュゲートのインビボ活性を示す。
【００２８】
【図１６】図１６ａおよび１６ｂは、本発明のコンジュゲートの活性に対するインビボの追加データを示す。
【図１７】図１７ａおよび１７ｂは、本発明のコンジュゲートの活性に対するインビボの追加データを示す。
【図１８】図１８ａおよび１８ｂは、本発明のコンジュゲートの活性に対するインビボの追加データを示す。
【図１９】図１９ａおよび１９ｂは、本発明のコンジュゲートの活性に対するインビボの追加データを示す。
【図２０】図２０は、本発明のコンジュゲートの活性に対するインビボの追加データを示す。
【００２９】
【図２１】図２１は、カルバメート基での構造多様性を示す本発明の別の化合物の合成についてのスキームを示す。
【図２２】図２２は、カルバメート基での構造多様性を示す本発明の別の化合物の合成についてのスキームを示す。
【００３０】
【図２３】図２３は、「クリック」ケミストリーによるコンジュゲーションに適切な本発明の化合物の合成についてのスキームを示す。
【００３１】
【図２４】図２４は、脂肪族アミン基を介するコンジュゲーションに適切な本発明の化合物の合成についてのスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
(本発明の詳細な説明)
定義
「抗体」は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント(即ち、「抗原結合部分」)またはその１つの単一鎖変異体を意味する。抗体全体は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重鎖(Ｈ)および２つの軽鎖(Ｌ)を含むタンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(ＶＨ)および３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(ＶＬまたはＶｋ)および１つのシングルドメインであるＣＬを含む軽鎖定常領域を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性領域、その間に散在したより保存性が高いフレームワーク領域(ＦＲ)へと更に細分化され得る。ＶＨおよびＶＬ各々は、アミノ末端からカルボキシ末端へと下記の順序で配置されている３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。定常領域は、抗体と、宿主の組織または因子、例えば様々な免疫系細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第１成分(Ｃｌｑ)との結合を媒介することができる。抗体が抗原Ｘに対して、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは６×１０−９Ｍ以下、より好ましくは３×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは２×１０−９Ｍ以下のＫＤにて結合する場合に、その抗体は、抗原Ｘに「特異的に結合」すると言える。抗体は、キメラであるか、ヒト化されているか、あるいは、好ましくはヒトであってよい。重鎖定常領域は、グリコシル化のタイプまたは程度に影響を及ぼすか、抗体半減期を延長させるか、エフェクター細胞または補体系との相互作用を増強または減少させるか、または他の特性を調節するように構築され得る。この構築は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失によって、またはあるドメインを、別の免疫グロブリンタイプ由来のドメインと置き換えることによって、または前記の組合せによって達成することができる。
【００３３】
抗体の「抗原結合フラグメント」および「抗原結合部分」(または、単に「抗体部分」または「抗体フラグメント」)とは、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメント、例えば、(ｉ)Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；(ｉｉ)Ｆ(ａｂ')２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；(ｉｉｉ)主にＦａｂとヒンジ領域の一部を有するＦａｂ'フラグメント(例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007を参照されたい)；(ｉｖ)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(ｖ)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖｉ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；(ｖｉｉ)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)；ならびに(ｖｉｉｉ)ナノボディ、すなわち、単一の可変領域および２つの定常領域を含有する重鎖可変領域などによって行うことができることが示されている。好ましい抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、ＦｖおよびＦｄフラグメントである。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらをＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖(単一鎖ＦｖまたはｓｃＦｖとして公知)として調製できる合成リンカーによる組換え方法を使用してこれらを結合させることができる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)を参照されたい。そのような単一鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される。
【００３４】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する(例えば、抗原Ｘに特異的に結合する単離された抗体は、抗原Ｘ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、抗原Ｘに特異的に結合する単離された抗体は、他の種からの抗原Ｘ分子などの他の抗原に対する交差反応性を有することもある。ある実施形態では、単離された抗体は、ヒト抗原Ｘに特異的に結合し、他の(非ヒト)抗原Ｘ抗原とは交差反応しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。
【００３５】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を示す単一の分子組成の抗体分子の製剤を意味する。
【００３６】
「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方(存在する場合には、定常領域)が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する抗体を意味する。ヒト抗体は、天然または合成修飾を包含する後の修飾を包含していてもよい。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を包含していてもよい(例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異)。しかしながら、「ヒト抗体」には、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系から得られるＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列上に移入されている抗体は含まれない。
【００３７】
「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を意味する。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合しているヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物(例えば、トランスジェニックマウス)から得られるＢ細胞を包含するハイブリドーマによって産生される。
【００３８】
「脂肪族」は、規定された数の炭素原子(例えば、「Ｃ３脂肪族」、「Ｃ１−Ｃ５脂肪族」または「Ｃ１からＣ５脂肪族」などであり、後者２つの用語は、１〜５個の炭素原子を有する脂肪族部分について同意語である)を有するか、または炭素原子の数が明確に規定されていない場合、１〜４個の炭素原子(不飽和脂肪族部分の例では２〜４個の炭素)を有する直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和、非芳香族の炭化水素部分を意味する。
【００３９】
「アルキル」は、飽和脂肪族部分を意味し、その際、炭素原子数の表記に関しては同じ規定を適用することができる。一例として、Ｃ１−Ｃ４アルキル部分には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｔ−ブチル、１−ブチル、２−ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「アルキレン」は、アルキル基の二価の対応物、例えば、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を意味する。
【００４０】
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する脂肪族部分を意味し、その際、炭素原子数の表記に関しては同じ規定を適用することができる。一例として、Ｃ２−Ｃ４アルケニル部分には、エテニル(ビニル)、２−プロペニル(アリルまたはプロパ−２−エニル)、ｃｉｓ−１−プロペニル、トランス−１−プロペニル、Ｅ−(またはＺ−)２−ブテニル、３−ブテニル、１,３−ブタジエニル(ブタ−１,３−ジエニル)などが挙げられるが、これらに限られない。
【００４１】
「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する脂肪族部分を意味し、その際、炭素原子数の表記に関しては同じ規定を適用することができる。一例として、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基には、エチニル(アセチルエニル)、プロパルギル(プロパ−２−イニル)、１−プロピニル、ブタ−２−イニルなどが包含される。
【００４２】
「脂環式」は、１〜３個の環を有し、それぞれの環が３〜８個(好ましくは３〜６個の)炭素原子を有する飽和または不飽和、非芳香族の炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和である脂環式部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも１個の環が少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する脂環式部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも１個の環が少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する脂環式部分を意味する。例として、脂環式部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチルおよびアダマンチルが挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましい脂環式部分は、シクロアルキルのもの、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。「シクロアルキレン」は、シクロアルキル基の二価の対応物を意味する。
【００４３】
「ヘテロ脂環式」は、少なくとも１個のその環において、３個まで(好ましくは１〜２個)の炭素が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子で置き換えられており、前記ＮおよびＳは所望により酸化されていてよく、かつ前記Ｎは所望により、四級化されていてもよい脂環式部分を意味する。同様に「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」および「ヘテロシクロアルキニル」は、それぞれ少なくとも１個のその環において、そのように修飾されているシクロアルキル、シクロアルケニルまたはシクロアルキニル部分を意味する。例示的なヘテロ脂環式部分には、アジリジニル、アゼチジニル、１,３−ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、１,３−ジオキソラニル、テトラヒドロ−１,１−ジオキソチエニル、１,４−ジオキサニル、チエタニルなどが包含される。「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキル基の二価の対応物を意味する。
【００４４】
「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」および「アリールチオ」は、それぞれ−Ｏ(アルキル)、−Ｏ(アリール)、−Ｓ(アルキル)および−Ｓ(アリール)を意味する。例としては、それぞれ、メトキシ、フェノキシ、メチルチオおよびフェニルチオである。
【００４５】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００４６】
「アリール」は、環が夫々３〜７個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１個の環が芳香族である単環式、二環式または三環式環系を有する炭化水素部分を意味する。環系中の環は、相互に縮合しているか(ナフチルのように)、または相互に結合していてもよく(ビフェニルのように)、かつ非芳香環に縮合または結合していてもよい(インダニルまたはシクロヘキシルフェニルのように)。さらなる例では、アリール部分には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニルおよびアセナフチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「アリーレン」は、アリール基の二価の対応物、例えば、１,２-フェニレン、１,３-フェニレンまたは１,４-フェニレンを意味する。
【００４７】
「ヘテロアリール」は、環がそれぞれ３〜７個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１個の環が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する芳香環であり、前記ＮおよびＳは所望により酸化されていてもよく、かつ前記Ｎは所望により四級化されていてもよい、単環式、二環式または三環式環系を有する炭化水素部分を意味する。そのような少なくとも１個のヘテロ原子を含有する芳香環は、他のタイプの環に縮合していてよいか(ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルのように)、または他の種類の環に直接結合していてもよい(フェニルピリジルまたは２−シクロペンチルピリジルのように)。さらなる例では、ヘテロアリール部分には、ピロリル、フラニル、チオフェニル(チエニル)、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、Ｎ−オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シノリニル、キノザリニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニルなどが挙げらる。「ヘテロアリーレン」は、アリール基の二価の対応物を意味する。
【００４８】
「非置換または置換Ｃ１−Ｃ５アルキル」または「所望により置換されていてもよいヘテロアリール」などとして「非置換または置換」または「所望により置換」の語句を使用することによって、ある部分が置換されていてもよいと示されている場合、そのような部分は、好ましくは１〜５個の数、より好ましくは１〜２個の数の１つまたはそれ以上の独立して選択される置換基を有していてもよい。置換基および置換パターンは、当業者であれば選択することができるが、その際、置換基が結合される部分について考慮して、化学的に安定であり、当分野で公知の技術、さらには本明細書に記載の方法によって合成することができる化合物が提供される。
【００４９】
「アリールアルキル」、「(ヘテロ脂環式)アルキル」、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」などは、場合によってはアリール、ヘテロ脂環式、ビアリールなどの部分で置換されており、また場合によってはアルキル、アルケニルまたはアルキニル部分の開環(不飽和)価、例えば、ベンジル、フェネチル、Ｎ−イミダゾイルエチル、Ｎ−モルホリノエチルなどで置換されているアルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を意味する。反対に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」などは、場合によってはアルキル、アルケニルなどの部分で置換されており、また場合によっては、例えば、メチルフェニル(トリル)またはアリルシクロヘキシルなどで置換されているアリール、シクロアルキルなどの部分を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」などは、場合によっては１つまたはそれ以上の特定の置換基(場合によっては、ヒドロキシル、ハロなど)で置換されたアルキルアリールなどの部分を意味する。
【００５０】
例えば、許容可能な置換基には、アルキル(特に、メチルまたはエチル)、アルケニル(特に、アリル)、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、脂環式、ヘテロ脂環式、ハロ(特に、フルオロ)、ハロアルキル(特に、トリフルオロメチル)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル(特に、ヒドロキシエチル)、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｏ(ハロアルキル)(特に、−ＯＣＦ３)、−Ｏ(シクロアルキル)、−Ｏ(ヘテロシクロアルキル)、−Ｏ(アリール)、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ(アルキル)、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＯＨ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＯＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ(アルキル)、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ(アリール)、−ＮＨ(ヒドロキシアルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｈ、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２、−ＯＳＯ２(アルキル)、−ＳＨ、−Ｓ(アルキル)、−Ｓ(アリール)、−Ｓ(シクロアルキル)、−Ｓ(＝Ｏ)アルキル、−ＳＯ２(アルキル)、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ(アルキル)、−ＳＯ２Ｎ(アルキル)２などが挙げられる。
【００５１】
置換される部分が脂肪族部分である場合、好ましい置換基は、アリール、ヘテロアリール、脂環式、ヘテロ脂環式、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｏ(ハロアルキル)、−Ｏ(シクロアルキル)、−Ｏ(ヘテロシクロアルキル)、−Ｏ(アリール)、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ(アルキル)、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ(アルキル)、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＯＨ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＯＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ(アルキル)、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ(アリール)、−ＮＨ(ヒドロキシアルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｈ、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２、−ＯＳＯ２(アルキル)、−ＳＨ、−Ｓ(アルキル)、−Ｓ(アリール)、−Ｓ(＝Ｏ)アルキル、−Ｓ(シクロアルキル)、−ＳＯ２(アルキル)、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ(アルキル)および−ＳＯ２Ｎ(アルキル)２である。より好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ(アリール)、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ(アルキル)、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ(アリール)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｈ、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、および−ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２である。特に好ましくは、フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルキルオキシ、Ｏ(Ｃ２−Ｃ４アルキレン)ＯＨおよびＯ(Ｃ２−Ｃ４アルキレン)ハロである。
【００５２】
置換される部分が、脂環式、ヘテロ脂環式、アリールまたはヘテロアリール部分である場合、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｏ(ハロアルキル)、−Ｏ(アリール)、−Ｏ(シクロアルキル)、−Ｏ(ヘテロシクロアルキル)、アルキルチオ、アリールチオ、−Ｃ(＝Ｏ)(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＯＨ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＯＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ(アルキル)、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ(アリール)、−ＮＨ(ヒドロキシアルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｈ、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２、−ＯＳＯ２(アルキル)、−ＳＨ、−Ｓ(アルキル)、−Ｓ(アリール)、−Ｓ(シクロアルキル)、−Ｓ(＝Ｏ)アルキル、−ＳＯ２(アルキル)、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ(アルキル)および−ＳＯ２Ｎ(アルキル)２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨＯＨ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−Ｃ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＯＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｏ(ヒドロキシアルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＯＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ２、−ＮＨ(アルキル)、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ(アリール)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｈ、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ２、−ＮＨＣ(＝Ｏ)ＮＨ(アルキル)、−ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｎ(アルキル)２および−ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２である。特に好ましい置換基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロおよびＣ１−Ｃ４アルコキシである。
【００５３】
「Ｃ１−Ｃ５アルキル」または「５〜１０％」のように範囲が示されている場合、かかる範囲には、最初の例におけるＣ１およびＣ５、２番目の例での５％および１０％のような範囲のエンドポイントが含まれる。
【００５４】
特定の立体異性体が具体的に示されていなければ(例えば、構造式中の関連する立体中心で太字または斜体の結合によって、構造式中でＥまたはＺ配置を有するような二重結合の描写によって、あるいは立体化学命名法の使用によって)、純粋な化合物ならびにその混合物として、全ての立体異性体が本発明の範囲に含まれる。特に断りがなければ、各エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにその組み合わせおよび混合物は、全て本発明に包含される。
【００５５】
当業者は、化合物が、本明細書で用いられる構造式中に示されているものと等価である互変異性体型(例えば、ケトおよびエノール型)、共鳴型および双性型を有していてもよく、この構造式には、このような互変異性体型、共鳴型または双性型が包含されることを認識するであろう。
【００５６】
「医薬的に許容されるエステル」は、インビボ(例えば、ヒトの体内)で加水分解して親化合物またはその塩を生じるか、あるいはそれ自体が親化合物と同様の活性を有するエステルを意味する。適当なエステルには、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニルまたはＣ２−Ｃ５アルキニルエステル、特に、メチル、エチルまたはｎ−プロピルが含まれる。
【００５７】
「医薬的に許容される塩」は、医薬製剤に適した化合物の塩を意味する。化合物が１つまたはそれ以上の塩基性基を有する場合、その塩は、酸付加塩、例えば、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩(エンボン酸塩)、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシル酸塩などであり得る。化合物が１つまたはそれ以上の酸性基を有する場合、その塩は、塩、例えば、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などでありうる。多形結晶形態および溶媒和物はまた、本発明の範囲内に包含される。
【００５８】
組成物
式(Ｉ)において、便宜上下記に繰り返すが、
【化４】
0006302490.tif 000006
基Ｒ１は、好ましくはＭｅ、Ｅｔ、ｎ−Ｐｒ、ｉ−Ｐｒ、または
【化５】
0006302490.tif 000007
であり、より好ましくは後者である。
【００５９】
また式(Ｉ)において、基Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルケニル、Ｃ１−Ｃ５アルキニル、ＣＨ２ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ１−Ｃ５アルケニル、ＣＨ２ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ１−Ｃ５アルキニル、
【化６】
0006302490.tif 000008
が好ましい。
【００６０】
また式(Ｉ)において、好ましい基Ｎ(Ｒ３ａ)(Ｒ３ｂ)は、下記：
【化７】
0006302490.tif 000009
のものであり、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの１つがＨであり、かつもう一方がＭｅであることが特に好ましい。
【００６１】
別の好ましい実施態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは双方Ｈであるか、または双方Ｍｅであるか、あるいはＲ３ａおよびＲ３ｂの１つがＨであり、かつもう一方がＣ６Ｈ５である。
【００６２】
別の好ましい実施態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２(Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル)、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５またはＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。
【００６３】
式(Ｉ)中のＲ１およびＲ２の定義において、基が非置換または置換として規定される場合、それは非置換であるのが好ましい。
【００６４】
本明細書の式において、フェニル環の２個の炭素間にてフェニル環を横ぎる結合は、前記結合に連結された基は、フェニル環のオルト、メタまたはパラ位置のいずれかに位置されてもよい。説明により、式：
【化８】
0006302490.tif 000010
は、
【化９】
0006302490.tif 000011
を示す。
【００６５】
ツブリシンＴｕｖおよびＴｕｐのサブユニット(様々なＲ２およびＲ４基を有する)の対応物の合成は、Chengら(2011)により教示されており、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
式(Ｉ)の化合物の好ましい実施態様において、
Ｒ１は、
【化１０】
0006302490.tif 000012
であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ５アルキル(特に、Ｍｅまたはｎ−Ｐｒ)または
【化１１】
0006302490.tif 000013
であり；
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの１つはＨであり、もう一方はＭｅであり；
Ｒ４は、
【化１２】
0006302490.tif 000014
(式中、ＹはＨまたはＮＯ２であり、Ｒ４ａはＨ、ＭｅまたはＥｔである)である；
Ｒ５はＭｅであり；
ＷはＯであり、ｎが１である。
【００６７】
式(Ｉ)の化合物の別の好ましい実施態様において、ｎは１であり、ＷはＯであり、Ｒ４中のＹはＨであるか、またはＮＯ２(好ましくはＨ)であり、そしてＲ２は
【化１３】
0006302490.tif 000015
であり、より好ましくは
【化１４】
0006302490.tif 000016
である。
【００６８】
この好ましい実施態様の化合物は、式(Ｉａ)：
【化１５】
0006302490.tif 000017
(式中、ＹはＨであるか、またはＮＯ２であり；Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；ならびに、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ６Ｈ５、ＭｅまたはＥｔである)
により示される化合物、またはその医薬的に許容される塩である。
【００６９】
さらにより好ましくは、化合物は、式(Ｉａ')：
【化１６】
0006302490.tif 000018
(式中、Ｒ４ａはＨ、ＭｅまたはＥｔであり；ならびに、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ６Ｈ５、ＭｅまたはＥｔである)により示される構造を有する化合物、またはその医薬的に許容される塩である。
【００７０】
また別の好ましい実施態様において、ＷはＯであり、ＹはＮＨ２であり、ｎは１であり、Ｒ２中の両方のＲ２ａ基はＮＨ２以外の基である。この実施態様の化合物は、式(Ｉｂ)：
0006302490.tif 000019
(式中、Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ６Ｈ５、ＭｅおよびＥｔであり；ならびに、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ１−Ｃ５アルキルまたは(ＣＨ２)１−２Ｃ６Ｈ５である)により示される化合物、またはその医薬的に許容される塩である。
【００７１】
また別の好ましい実施態様において、化合物は、式(Ｉｂ')：
【化１７】
0006302490.tif 000020
(式中、Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔ(好ましくはＨ)であり、Ｒ６は、Ｍｅまたはｎ−Ｐｒである)
により示される構造を有する化合物、あるいはその医薬的に許容される塩である。
【００７２】
好ましくは、式(Ｉａ)、(Ｉａ')および(Ｉｂ)において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの１つは、Ｈであり、一方はＭｅである。他の好ましい実施態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、双方Ｈであるか、または双方Ｍｅであるか、またはＲ３ａおよびＲ３ｂの１つがＨであり、かつ他方がＣ６Ｈ５である。また別の好ましい実施態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔである。
【００７３】
本発明の化合物の特別な例は、この下に示される化合物と共にその医薬的に許容される塩を含む：
【化１８】
0006302490.tif 000021
【化１９】
0006302490.tif 000022
【化２０】
0006302490.tif 000023
【化２１】
0006302490.tif 000024
。
【００７４】
化合物(Ｉ−２)、(Ｉ−７)、(Ｉ−８)および(Ｉ−９)が好ましい。
【００７５】
コンジュゲート
適宜、本発明の化合物は、特異的または優先的に癌細胞の化学部分に結合する標的部分とコンジュゲートされてもよい。好ましくは、この標的部分とは、抗体またはその抗原結合部分であり、この化学部分とは、腫瘍関連抗原である。好ましくは、このコンジュゲーションは、ＴｕｖまたはＴｕｐサブユニット中の官能基(例えば、アミノ基)との化学結合により達成される。
【００７６】
別の実施態様において、式(ＩＩ)：
［Ｄ(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ］ｍＺ        (ＩＩ)
［式中、Ｚは、リガンドであり；Ｄは、本発明の細胞毒性化合物、例えば式(Ｉ)、(Ｉａ)、(Ｉａ')または(Ｉｂ)の化合物であり；ならびに、−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−とは、ＺおよびＤを連結するための「リンカー部分」または「リンカー」として総括的に示される］により示される、本発明の細胞毒性化合物およびリガンドを含むコンジュゲートが提供される。リンカーのなかで、Ｃは、目的とする化合物Ｄの生物学的作用部位または部位付近で切断されるように設計された切断可能な基である；ＸＤおよびＸＺは、これらはＤおよびＣおよびＺの間を各々空けるため、スペーサー部分(または「スペーサー」)と総称され；下付き文字のａおよびｂは、独立して、０または１である(即ち、ＸＤおよび／またはＸＺの存在は任意である)；ならびに下付き文字のｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０(好ましくは、１、２、３または４)である。Ｄ、ＸＤ、Ｃ、ＸＺおよびＺは、さらに完全に以下の本明細書に記述される。
【００７７】
リガンドＺ−例えば抗体−は、標的化機能の役割を果たす。その抗原または受容体が存在する標的組織または細胞に結合することにより、リガンドＺは、そのコンジュゲートを標的へ方向付ける。好ましくは、標的組織または細胞は、癌様組織または細胞であり、抗原または受容体とは、腫瘍関連抗原、すなわち癌様細胞によって特異に発現されるか、あるいは非癌細胞と比較して癌細胞によって過剰に発現される抗原である。標的組織または細胞にて基Ｃが切断されることにより、化合物Ｄが放出され、局所的にその細胞毒性作用が発揮される。ある場合において、このコンジュゲートは、エンドサイトーシスによって標的細胞中に内部移行され、切断が標的細胞内で起こる。このようにして、化合物Ｄの正確な送達が、目的とする作用部位で達成され、その結果、必要な投薬が低減される。また、化合物Ｄは、通常、そのコンジュゲートされた状態で生物学的に不活性(または、顕著に低い活性)であり、これにより標的ではない組織または細胞に対して望ましくない毒性が減少される。抗癌薬は、一般に細胞に対して高い毒性を有することが多いので、これは重要な問題である。
【００７８】
下付文字ｍによって表されるように、リガンドＺの各分子は、コンジュゲートのために利用できる部位Ｄの数および用いられる実験条件に応じて、１以上の化合物Ｄとコンジュゲートできる。当業者は、リガンドＺの個々の分子それぞれが整数個の化合物Ｄとコンジュゲートされる一方で、コンジュゲートの製造は、統計平均を反映して、化合物ＤのリガンドＺに対する非整数比に関して分析されうることを理解するであろう。この割合は、置換割合(ＳＲ)として、あるいは抗体薬物コンジュゲートの場合には、薬物抗体比(ＤＡＲ)として示される。
【００７９】
リガンドＺおよびそのコンジュゲーション
好ましくは、リガンドＺは抗体である。利便性と簡略化のためであって、限定するものではないが、リガンドＺのコンジュゲーションについて本明細書中に詳述されている後記記載は、それが抗体であるという文脈で記載されているが、当業者であれば、他のタイプのリガンドＺが、必要な変更を加えてコンジュゲートできることを理解するであろう。例えば、リガンドとしての葉酸とのコンジュゲートは、その表面上に葉酸受容体を有する細胞を標的とし得る(Vlahov et al. 2008; Leamon et al. 2008)。同じ理由で、下記の詳細な説明は、主に抗体Ｚの化合物Ｄに対する１：１比率に関して記載されている。
【００８０】
好ましくは、リガンドＺは、腫瘍関連抗原に対する抗体であり、そのようなリガンドＺを含むコンジュゲートは、癌細胞を選択的に標的とすることが可能である。このような抗原の例には、メソテリン、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ４(Ｏ８Ｅとしても知られる)、タンパク質チロシンキナーゼ７(ＰＴＫ７)、グリピカン(glypican)-３、ＲＧ１、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４４が挙げられる。抗体は、動物(例えば、マウス)、キメラであるか、ヒト化されていてもよく、または好ましくはヒトであってよい。抗体は、好ましくは、モノクローナル、特にモノクローナルヒト抗体である。前記抗原のうちの一部に対するヒトモノクローナル抗体の調製は、Korman et al., US 2009/0074660 A1 (B7H4); Rao-Naik et al., 8,097,703 B2 (CD19); King et al., US 2010/0143368 A1 (CD22); Keler et al., US 7,387,776 B2 (2008) (CD30); Terrett et al., US 8,124,738 B2 (CD70); Korman et al., US 6,984,720 B1 (2006) (CTLA-4); Korman et al., US 8,008,449 B2 (2011) (PD-1); Huang et al., US 2009/0297438 A1 および Cardarelli et al., US 7,875,278 B2 (PSMA); Terrett et al., US 2010/0034826 A1 (PTK7); Terrett et al., US 2010/0209432 (A1) (glypican-3); Harkins et al., US 7,335,748 B2(2008) (RG1); Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012) (mesothelin)；および Xu et al., US 2010/0092484 A1(CD44)に開示されており；それらの開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８１】
リガンドＺは、アフィボディ、ドメイン抗体(ｄＡｂ)、ナノボディ、ユニボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、ヴァーサボディ、デュオカリン、リポカリンまたはアヴィマー(avimer)などの抗体フラグメントまたは抗体模倣物質であってもよい。
【００８２】
リガンドＺ上のいくつかの異なる反応性基のうちのいずれか１つがコンジュゲーション部位でありうるが、これにはリシン残基中のε−アミノ基、ペンダント型炭水化物部分、カルボン酸基、ジスルフィド基およびチオール基が挙げられる。反応性基の各タイプは、いくつかの利点と欠点を有するトレードオフを示す。コンジュゲートに適した抗体反応性基に関する総説については、例えば、Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216およびDubowchikおよびWalker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123を参照されたい。これらは、出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００８３】
一実施形態では、リガンドＺは、リシンε−アミノ基を介してコンジュゲートされる。ほとんどの抗体は、複数の露出したリシンε−アミノ基を有し、(下記の本明細書でさらに記載されているように)ヘテロ二官能性薬剤を用いた修飾を包含する当分野で公知の技術を用いて、アミド、尿素、チオ尿素またはカルバメート結合を介してコンジュゲートされうる。しかしながら、多くのε−アミノ基のうちのどの基を反応させ、どのような方法で反応させるかを制御することは困難であり、コンジュゲートの調製時にバッチ間で異なる可能性が存在する。また、コンジュゲーションは、抗体の元々の立体構造を維持するために重要なプロトン化ε−アミノ基の中和を引き起こし得るか、あるいは抗原結合部位の付近またはその部位のリシンで起こり得るが、いずれも望ましくない。
【００８４】
他の実施態様では、リガンドＺは、多くの抗体がグリコシル化されているように、炭水化物側鎖を介してコンジュゲートされうる。この炭水化物側鎖は、過ヨウ素酸塩で酸化されてアルデヒド基を発生し、次いでアミンと反応して、セミカルバゾン、オキシムまたはヒドラゾンにおいてイミン基を形成しうる。所望であれば、このイミン基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって、より安定なアミン基に変換することができる。炭水化物側鎖を介したコンジュゲーションについてのさらなる開示においては、例えば、Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986) を参照されたい；これは出典明示により本明細書に組み込まれる。リシンε−アミノ基を用いる場合と同様に、コンジュゲーション部位の位置および化学量論の再現性に関して懸念がある。
【００８５】
さらなる別の実施態様では、リガンドＺは、カルボン酸基を介してコンジュゲートされうる。一実施形態では、末端カルボン酸基は官能化されてカルボヒドラジドを生じ、次いでアルデヒドを担持するコンジュゲーション部分と反応される。Fisch et al., Bioconjugation Chemistry 1992, 3, 147-153を参照されたい。
【００８６】
なお別の実施態様では、抗体Ｚは、抗体Ｚ上のシステイン残基およびコンジュゲートの他の部分上の硫黄を架橋するジスルフィド基を介してコンジュゲートされうる。いくつかの抗体は、遊離のチオール(スルフヒドリル)基を欠如しているが、例えば、ヒンジ領域にジスルフィド基を有する。このような場合、遊離チオール基は、元々のジスルフィド基を還元させることによって生成させることができる。次いで、このようにして調製されたチオール基は、コンジュゲートするために用いることができる。例えば、Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994);およびDoronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)を参照されたい；これらは出典明示により本明細書に組み込まれる。この場合も、コンジュゲート部位の位置および化学量論、ならびに抗体の元々の構造に起こり得る破壊に関する懸念が存在する。
【００８７】
多くの方法は、元々のジスルフィド結合を壊すことなく、遊離チオール基を抗体に導入するために知られており、これらの方法は、本発明のリガンドＺを用いて実施することができる。用いられる方法に応じて、予測可能な数の遊離スルフヒドリルを所定の位置に導入することが可能である。ある手法では、システインが別のアミノ酸に置換されている変異抗体が調製される。例えば、EigenbrotらのUS 7,521,541 B2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4,698,420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7,311,902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995) を参照されたい。他の手法では、さらなるシステインがＣ末端に加えられる。例えば、Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al,  Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003)；および Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17. 21-27(2004)を参照されたい。遊離システインを導入するための好ましい方法は、LiuらのWO 2009/026274 A1が教示するものであり、この方法では、システインを有するアミノ酸配列が抗体の重鎖のＣ末端に加えられる。この方法は、既知の数のシステイン残基(重鎖１つ当たり１個)を、抗原結合部位から離れた既知の位置に導入するものである。この段落で引用されている文献の開示は、全て出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００８８】
さらなる別の実施態様では、リシンε−アミノ基は、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)−プロピオネート(ＳＰＤＰ)などのヘテロ二官能性試薬を用いて改変されて、ε−アミノ基をチオールまたはジスルフィド基に変換して、いわばシステイン代替物が調製されうる。しかしながら、この方法は、適切なε−アミノ基に関連した同じコンジュゲーション位置および化学量論の制限を受ける。
【００８９】
さらなる別の好ましい実施形態では、リガンドＺは、チオール基の求核性付加生成物を介して受容部分にコンジュゲートされる。好ましい受容部分は、マレイミド基であり、その抗体のチオール基との反応は、一般的に下記に図示される。このチオール基は、元々のものであるか、または上記のように導入されたものであってよい。
【化２２】
0006302490.tif 000025
【００９０】
リガンドＺは、以下に論じたとおり「クリック」ケミストリーに従って使用するために適合した官能基によりコンジュゲートされ得る。
リンカー−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−
【００９１】
上記のように、本発明のコンジュゲートのリンカー部分は、３つまでのエレメント、すなわち切断可能な基Ｃ、ならびに任意のスペーサーＸＺおよびＸＤを含む。
【００９２】
切断可能な基Ｃは、生理学的条件下で切断可能な基であり、好ましくは、コンジュゲートが血漿中で全身に循環している間は比較的安定であるが、コンジュゲートがその目的の作用部位、すなわち、標的細胞付近、その位置またはその中に達すると容易に切断されるように選択される。好ましくは、前記コンジュゲートは、抗体Ｚが標的細胞の表面上に提示される抗原に結合すると、標的細胞によるエンドサイトーシスによって内部移行される。その後、基Ｃの切断は、標的細胞の小胞体(初期エンドソーム、後期エンドソームまたは特にリソソーム)で起こる。
【００９３】
一実施形態では、基Ｃは、ｐＨ感受性の基である。血漿中のｐＨは中性よりもやや高いが、リソソーム内部のｐＨは約５の酸性である。よって、その切断が酸で触媒される基Ｃは、血漿中の速度よりもリソソーム内部では数桁も速い速度で切断される。適切な酸感受性の基の例には、ShenらのUS 4,631,190 (1986)；Shenらの US 5,144,011 (1992)；Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054(1981)およびYang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA). 85, 1189-1193(1988)(これらは出典明示により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、ｃｉｓ−アコニチルアミドおよびヒドラゾンが挙げられる。
【００９４】
別の実施態様において、基Ｃは、ジスルフィドである。ジスルフィドは、周囲チオール濃度に依存した速度でチオール−ジスルフィド交換メカニズムによって切断され得る。グルタチオンおよび他のチオールの細胞内濃度がそれらの血清濃度よりも高いため、ジスルフィドの切断速度は細胞内でより高い。さらに、チオール−ジスルフィド交換の速度は、ジスルフィドの立体化学的および電子的特性を調節し(例えば、アルキル−アリールジスルフィド対アルキル−アルキルジスルフィド；アリール環上での置換など)、増強された血清安定性または特定の切断速度を有するジスルフィド結合を設計することによって改変することができる。コンジュゲートにおけるジスルフィド切断可能な基に関するさらなる開示については、例えば、Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; および Sufi et al., US 2010/0145036 A1を参照されたい、これらは出典明示により本明細書に取り込まれる。
【００９５】
好ましい基Ｃは、血清中のプロテアーゼによる切断とは対照的に、目的とする作用部位でプロテアーゼによって優先的に切断されるペプチド結合を含む。典型的には、基Ｃは、１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜６個のアミノ酸、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、天然および／または非天然α−アミノ酸でありうる。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるものか、さらに、それらから得られるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、シトルリンおよびＯ−ホスホセリンである。用語アミノ酸には、アミノ酸類似体および模倣物も包含される。類似体は、天然アミノ酸と同じ一般的なＨ２Ｎ(Ｒ)ＣＨＣＯ２Ｈ構造を有する化合物であるが、但し、Ｒ基が天然アミノ酸の中では見出されないものは除く。類似体の例には、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン−スルホキシドおよびメチオニンメチルスルホニウムが包含される。アミノ酸模倣物質は、α−アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、それと同様に機能する化合物である。用語「非天然アミノ酸」は、「Ｄ」立体化学的形態を表すことが意図されており、天然アミノ酸は「Ｌ」形態である。
【００９６】
好ましくは、基Ｃは、プロテアーゼのための切断認識配列であるアミノ酸配列を含有する。多くの切断認識配列は当分野で公知である。例えば、Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); よび Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)を参照されたい；その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９７】
細胞によって内部移行されることが意図されていないコンジュゲートにおいては、基Ｃは、標的組織付近の細胞外マトリックスに存在するプロテアーゼ、例えば、付近の死滅細胞から放出されるプロテアーゼまたは腫瘍関連プロテアーゼによって切断されるように選択することができる。典型的な細胞外腫瘍関連プロテアーゼとしては、マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)、チメットオリゴペプチダーゼ(ＴＯＰ)およびＣＤ１０である。
【００９８】
細胞によって内部移行されるように設計されるコンジュゲートにおいては、基Ｃは、好ましくは、エンドソームまたはリソソームプロテアーゼ、特にリソソームプロテアーゼによる切断について選択されたアミノ酸配列を含む。このようなプロテアーゼの非限定的な例には、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳ、特にカテプシンＢが挙げられる。カテプシンＢは、配列−ＡＡ２−ＡＡ１−(式中、ＡＡ１は塩基性または強水素結合性アミノ酸(リシン、アルギニンまたはシトルリンなど)であり、ＡＡ２は疎水性アミノ酸(フェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンなど)である)、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ(ここで、Ｃｉｔはシトルリンを示す)またはＶａｌ−Ｌｙｓでペプチドを優先的に切断する。(この場合、文脈に特段の記載がない限り、アミノ酸配列は、Ｈ２Ｎ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＣＯ２Ｈのように、Ｎ−から−Ｃ方向に記されている)。カテプシン−切断基に関するさらなる情報については、Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346(1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352(1998);およびDubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869(2002)を参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる。ペプチジルリンカーの切断に利用できる別の酵素としては、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎにて優先的に切断するリソソームシステインプロテアーゼであるレグマインである。
【００９９】
一実施形態において、基Ｃは、２つのアミノ酸配列−ＡＡ２−ＡＡ１(ここで、ＡＡ１はリシン、アルギニンまたはシトルリンであり、ＡＡ２は、フェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンである)を含むペプチドである。別の実施態様において、Ｃは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、およびＧｌｕからなる群から選択される１〜５個のアミノ酸からなる配列からなる。
【０１００】
単一のアミノ酸からなる切断可能な基Ｃの調製および設計は、ChenらのUS2010/0113476 A1に開示されており、この開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
基Ｃは、光切断可能なもの、例えば、光への曝露時に切断されるニトロベンジルエーテルであってもよい。
【０１０２】
基Ｃは、抗体Ｚまたは化合物Ｄに直接結合することもできる。すなわち、場合によっては、スペーサーＸＺおよびＸＤは存在していても、存在していなくてもよい。例えば、基Ｃがジスルフィドである場合、２個の硫黄のうちの１個は、抗体Ｚ上のシステイン残基またはその代替物であってよい。あるいは、基Ｃは、抗体の炭水化物側鎖上のアルデヒドに結合しているヒドラゾンであってもよい。あるいは、基Ｃは、抗体Ｚのリシンε−アミノ基と一緒に形成されたペプチド結合であってよい。好ましい実施形態において、化合物Ｄは、化合物Ｄにおけるカルボキシルまたはアミン基へのペプチジル結合を介して基Ｃに直接結合されている。
【０１０３】
スペーサーＸＺは、存在する場合、基Ｃが抗体Ｚの抗原結合を立体的に障害しないように、または抗体Ｚが基Ｃの切断を立体的に障害しないように、基Ｃと抗体Ｚとの間に空間的な分離を提供する。さらに、スペーサーＸＺは、高い溶解性または低い凝集特性をコンジュゲートに付与するために用いることができる。スペーサーＸＺは、あらゆる組み合わせで組み立てることができる１つまたはそれ以上のモジュラーセグメントを含んでよい。スペーサーＸＺに適切なセグメントの例としては、下記：
【化２３】
0006302490.tif 000026
(式中、下付き文字ｑは０または１であり、下付き文字ｒは１〜２４、好ましくは２〜４である)
ならびに、その組合せである。これらのセグメントを、例えば、下記：
【化２４】
0006302490.tif 000027
に示したように組合せることもできる。
【０１０４】
スペーサーＸＤは、存在する場合、化合物Ｄが基Ｃの切断を立体的にまたは電子的に障害しないように、基Ｃと化合物Ｄとの間に空間的な分離を提供する。スペーサーＸＤは、さらなる分子量および化学官能性をコンジュゲートに導入するために用いられ得る。一般に、さらなる質量および官能性は、コンジュゲートの血清半減期および他の特性に影響を及ぼすはずである。したがって、スペーサー基の賢明な選択により、コンジュゲートの血清半減期を調節することができる。スペーサーＸＺについて上記したように、スペーサーＸＤは、モジュラーセグメントから組み立てることもできる。
【０１０５】
スペーサーＸＺおよび／またはＸＤは、存在する場合には、Ｚ〜ＣまたはＤ〜Ｃ各々の間に、好ましくは４〜２５個の原子、より好ましくは４〜２０個の原子の直線状の分離を提供する。
【０１０６】
スペーサーＸＺもしくはＸＤのいずれかまたは両方は、自己犠牲部分を含んでよい。自己犠牲部分とは、(１)基Ｃと抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄのいずれかに結合し、かつ(２)基Ｃからの切断が、反応順序を開始し、場合によっては、抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄから自己犠牲部分自体の脱離を生じるような構造を有する部分である。言い換えると、抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄから離れた部位での反応(基Ｃからの切断)が、ＸＺ−ＺまたはＸＤ−Ｄ結合の分裂を引き起こす。自己犠牲部分は、スペーサーＸＤの場合に存在することが望ましい。なぜなら、コンジュゲートからの切断後、スペーサーＸＤまたはその部分が細胞毒素Ｄに結合したままであると、抗体Ｚの生物学的活性が損なわれることがあるためである。自己犠牲部分の使用は、切断可能な基Ｃがポリペプチドである場合には特に望ましい。
【０１０７】
パートナー分子Ｄ上のヒドロキシルまたはアミノ基に結合する典型的な自己犠牲部分(ｉ)〜(ｖ)は、下記：
【化２５】
0006302490.tif 000028
に示されている。
【０１０８】
自己犠牲部分は、点線ａおよびｂの間の構造であり、内容を示すために示されている隣接する構造特徴を有している。自己犠牲部分(ｉ)および(ｖ)は、化合物Ｄ−ＮＨ２に結合しており(すなわち、化合物Ｄはアミノ基を介してコンジュゲートされている)、一方で自己犠牲部分(ｉｉ)、(ｉｉｉ)および(ｉｖ)は、化合物Ｄ−ＯＨに結合している(すなわち、化合物Ｄは、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を介してコンジュゲートされている)。点線ｂでアミド結合が切断されると、アミド窒素がアミン窒素として放出され、一連の反応が開始されて点線ａで結合の切断が生じ、場合によっては、結果としてＤ−ＯＨまたはＤ−ＮＨ２の放出が生じうる。自己犠牲部分に関するさらなる開示については、例えば、Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6,214,345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7,375,078 B2; and Senter et al., US 2003/0096743 A1を参照されたい；これらは出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
別の実施態様において、抗体の標的部分および細胞毒性化合物Ｄは、切断可能でないリンカーにより連結される。抗体の分解により、最終的には、細胞毒性化合物Ｄの生物学的活性とは干渉しない低分子付加部分へと縮小される。
【０１１０】
化合物Ｄ−リンカー組成物
本発明のコンジュゲートは、好ましくは、化合物Ｄおよびリンカー(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ(式中、ＸＤ、Ｃ、ＸＺ、ａおよびｂは、式(ＩＩ)について規定されたとおりである)を最初に結合させて、式(ＩＩＩ)：
Ｄ−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−Ｒ３１      (III)
(式中、Ｒ３１は、抗体Ｚ上の官能基と反応させてコンジュゲートを形成するのに適した官能基である)
により示される薬物リンカー組成物を形成させることによって製造される。適当な基Ｒ３１の例には、アミノ、アジド、シクロオクチン、
【化２６】
0006302490.tif 000029
(式中、Ｒ３２は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、メシレートまたはトシレートであり、Ｒ３３は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｏ−(４−ニトロフェニル)、−Ｏ−ペンタフルオロフェニルまたは−Ｏ−テトラフルオロフェニルである)
が挙げられる。適切な部分Ｄ−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−Ｒ３１を製造するために一般的に使用できる化学文献は、Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al., US 7,517,903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 A1；および Chen et al., US 2010/0113476 A1に開示されており；この開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
好ましい反応性官能基−Ｒ３１は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＨ、マレイミド、シクロオクチン、アジド(−Ｎ３)、ヒドロキシルアミノ(−ＯＮＨ２)またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。特に好ましい官能基−Ｒ３１は、
【化２７】
0006302490.tif 000030
からなる群から選択される。
【０１１２】
−ＯＨ基は、抗体上のカルボキシ基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖)にてエステル化され得る。
【０１１３】
−ＣＯ２Ｈ基は、抗体上の−ＯＨ基によりエステル化されるか、またはアミノ基(例えば、リシン側鎖)によりアミド化される。
【０１１４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基は、官能性上は活性化カルボキシル基であり、アミノ基(例えば、リシンから)との反応により便宜的にアミド化され得る。
【０１１５】
マレイミド基は、マイケル付加反応において、抗体上の−ＳＨ基(例えば、抗体のシステインまたはスルフヒドリル官能性を導入するための化学修飾由来の)とコンジュゲートされ得る。
【０１１６】
上記した「鏡像」であるマイケル付加反応において、マレイミド基を抗体に導入するために、抗体が修飾される場合に、−ＳＨ基はコンジュゲーションにとって特に有用である。抗体は、マレイミド基を持つように、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)−シクロヘキサンカルボキシレート(ＳＭＣＣ)またはそのスルホン化変異体のスルホ−ＳＭＣＣを用いて修飾され得る；双方の試薬は、Sigma-Aldrichから購入できる。
【０１１７】
アジドおよびシクロオクチンは、いわゆる銅不含の「クリックケミストリー」を介してコンジュゲーションを実施できる相補的官能基であり、ここでアジド付加は、シクロオクチンの拘束性アルキン結合を超えて１,２,３−トリアゾール環を形成する。例えば、Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584を参照されたい。このアジドは、式(ＩＩＩ)中の反応性の官能基Ｒ３１であってもよく、シクロオクチンは、抗体またはその抗原結合部分に位置するか、または位置していなくともよい。シクロオクチン基は、ＤＩＢＯ試薬(Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregonから入手可能)により得ることができる。
【０１１８】
非天然アミノ酸を、抗体に導入するための技術は、反応性官能基とのコンジュゲーションのために提供する非天然アミノ酸を含む官能基を提供できる。例えば、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを、Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008)に教示されるとおりに、抗体または他のポリペプチドに導入できる。ｐ−アセチルフェニルアラニン中のケトン基は、ヒドロキシルアミノ反応性の官能基とオキシムを形成することによりコンジュゲーション部位となり得る。別法として、非天然アミノ酸のｐ−アジドフェニルアラニンを、抗体に導入して、クリックケミストリーによるコンジュゲーションのためのアジド官能基を提供することができる。非天然アミノ酸を、Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010)および Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416に教示されるとおり、細胞不含方法を用いて抗体または他のポリペプチドにも導入できる。
【０１１９】
アミン(ＮＨ２)基を、Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997に教示されるとおり、トランスグルタミナーゼ酵素を用いてコンジュゲーションに使用できる。
【０１２０】
コンジュゲーションは、Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342；Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010)；および Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005)に教示されるとおり、酵素ソルターゼ(Sortase)Ａを用いても行ない得る。このソルターゼＡの認識モチーフ(典型的にはＬＰＸＴＧ、ここでＸはあらゆる天然アミノ酸である)は、リガンドＺ上に位置してもよく、また求核アクセプターモチーフ(典型的には、ＧＧＧ)は、式(ＩＩＩ)中の基Ｒ３１であってもよく、また基Ｒ３１であってなくてもよい。
【０１２１】
式［Ｄ(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ］ｍＺおよびＤ−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−Ｒ３１中の基Ｄは、好ましくは、
式(Ｄ−ａ)
【化２８】
0006302490.tif 000031
または
式(Ｄ−ｂ)
【化２９】
0006302490.tif 000032
(式中、Ｙは、Ｈであるか、またはＮＯ２であり；Ｒ４ａは、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；およびＲ６はＣ１−Ｃ５アルキル、ＣＨ２ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ１−Ｃ５アルキルまたは(ＣＨ２)１−２Ｃ６Ｈ５である)の構造を有する。
【０１２２】
かかる基Ｄの例示には、次のものが挙げられる：
【化３０】
0006302490.tif 000033
(式中、Ｒ７はＨ、ＭｅまたはＥｔである)。
【０１２３】
式：Ｄ−(ＸＤ)ａＣ(ＸＺ)ｂ−Ｒ３１の組成物の例示には、下記に示すもの、ならびにそれらの医薬的に許容される塩が挙げられる：
【化３１】
0006302490.tif 000034
【化３２】
0006302490.tif 000035
【化３３】
0006302490.tif 000036
【化３４】
0006302490.tif 000037
。
【０１２４】
好ましい薬剤−リンカー化合物は、式(ＩＩＩ−ａ)：
【化３５】
0006302490.tif 000038
[式中、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、Ｈ、ＭｅまたはＥｔであり；
Ｒ６は、Ｍｅ、Ｅｔまたはｎ−Ｐｒであり；
ＡＡａおよび各ＡＡｂは、独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択され；
ｐは、１、２、３または４であり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり(好ましくは２、３、または４)；
ｒは、１、２、３、４または５であり；
ｓは、０または１であり；ならびに
Ｒ３１は、
【化３６】
0006302490.tif 000039
からなる群から選択される］
により示される構造またはその医薬的に許容される塩を有する。
【０１２５】
式(ＩＩＩ−ａ)中の、−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、ポリペプチドを示す。このポリペプチドの長さは、ｐ値により決定される(例えば、ｐが１であるならばジペプチド、ｐが３であるならばテトラペプチドなど)。ＡＡａは、ポリペプチドのカルボキシ末端であり、そのカルボキシル基は、薬剤のアニリノ窒素とのペプチド(アミド)結合を形成する。逆に、最後のＡＡｂは、ポリペプチドのアミノ末端であり、そのα-アミノ基は、ｓが１であるならば、
【化３７】
0006302490.tif 000040
とのペプチド結合を形成し、ｓが０であるならば、
【化３８】
0006302490.tif 000041
とのペプチド結合を形成する。
【０１２６】
より好ましい薬剤-リンカー化合物は、式(ＩＩＩ−ｂ)：
【化３９】
0006302490.tif 000042
［式中、
Ｒ６は、Ｍｅまたはｎ−Ｐｒであり；
ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０(好ましくは２、３、または４)であり；
ｒは、１、２、３、４または５であり；
ｓは、０または１であり；ならびに
Ｒ３１は、
【化４０】
0006302490.tif 000043
からなる群から選択される］
により示される構造、またはその医薬的に許容される塩を有する。
【０１２７】
コンジュゲートの製造
下記は、リシンε−アミノ基を２−イミノチオランと反応させ、その後上記のようなマレイミド含有薬物−リンカー部分と反応させることによって、遊離チオール基を抗体に導入することに基づく代表的な手順である。最初に、抗体は、５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)を含有する０.１Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)に緩衝液を交換され、５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮される。チオール化は、前記抗体に２−イミノチオランを加えることにより達成される。加えられる２−イミノチオランの量は、予備実験によって決定することができ、抗体ごとに変動する。予備実験において、２−イミノチオランの増加量の滴定液が抗体に加えられ、その後抗体と室温(室温、約２５℃)で１時間インキュベートされ、抗体は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ(商標)Ｇ−２５カラムを用いて５０ｍＭのｐＨ６.０ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で脱塩され、導入されたチオール基の数は、ジチオジピリジン(ＤＴＤＰ)と反応させることによって迅速に決定される。チオール基とＤＴＤＰとの反応により、チオピリジンが遊離され、これを３２４ｎｍで分光学的にモニターしうる。０.５〜１.０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の試料が典型的に用いられる。２８０ｎｍでの吸光度は、試料中のタンパク質の濃度を正確に決定するために用いることができ、次いで各試料のアリコート(０.９ｍＬ)は、０.１ｍＬのＤＴＤＰ(エタノール中で５ｍＭのストック溶液)と室温で１０分間インキュベートされる。緩衝液のみとＤＴＤＰとの盲験試料もまた、平行してインキュベートされる。１０分後、３２４ｎｍでの吸光度で測定され、チオール基の数は、１９,８００Ｍ−１のチオピリジンの吸光係数を用いて定量される。
【０１２８】
典型的には、抗体１個当たり約３個のチオール基のチオール化レベルが望ましい。例えば、ある抗体を用いると、これは１５倍モル過剰量の２−イミノチオランを加えて、その後室温で１時間インキュベーションすることによって達成することができる。次いで、この抗体は、２−イミノチオランと所望のモル比でインキュベートされ、次いでコンジュゲート緩衝液(５ｍＭのグリシンおよび２ｍＭのＤＴＰＡを含有する５０ｍＭのｐＨ６.０ ＨＥＰＥＳ緩衝液)中で脱塩される。チオール化物質は氷上で維持され、その間に導入されたチオールの数が上記のように定量される。
【０１２９】
導入されたチオールの数が確認された後、薬物−リンカー部分がチオール１個当たり３倍モル過剰量で加えられる。コンジュゲーション反応は、５％ ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)の最終濃度または類似した別の溶媒を含有するコンジュゲーション用緩衝液中で進められる。一般に、薬物−リンカーストック溶液は、１００％ ＤＭＳＯ中に溶解される。ストック溶液は、チオール化抗体に直接加えられ、十分量のＤＭＳＯを加えて１０％の最終濃度にするか、または１０％ ＤＭＳＯの最終濃度を含有するコンジュゲーション用緩衝液中で予め希釈し、その後同等体積のチオール化抗体に加えられる。
【０１３０】
コンジュゲーション反応混合物は、撹拌しながら室温で２時間インキュベートされる。インキュベーション後、コンジュゲーション反応混合物は、遠心分離され、０.２μｍフィルターで濾過される。コンジュゲートの精製は、多くの方法を用いてクロマトグラフィーによって達成することができる。ある方法において、コンジュゲートは、５ｍＭのグリシンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する１５０ｍＭのｐＨ７.２ ＨＥＰＥＳ緩衝液で予め平衡にしたＳＥＰＨＡＣＲＹＬ(商標)Ｓ２００カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製される。クロマトグラフィーは、２８ｃｍ／ｈの線流速で行われる。コンジュゲートを含有するフラクションが収集され、プールされて、濃縮される。別の方法において、精製は、イオン交換クロマトグラフィーに通して達成することができる。条件は、抗体ごとに変動し、各場合で最適化されるべきである。例えば、抗体−薬物コンジュゲート反応混合物は、５ｍＭのグリシンを含有する５０ｍＭのｐＨ５.５ ＨＥＰＥＳ中で予め平衡化されたＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(商標)カラムに適用される。抗体コンジュゲートは、平衡緩衝液中(ｐＨ５.５)で０〜１ＭのＮａＣｌグラジエントを用いて溶出される。コンジュゲートを含有する該当フラクションはプールされ、製剤用緩衝液(５ｍＭのグリシンおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのｐＨ７.２ ＨＥＰＥＳ緩衝液)に対して透析される。
【０１３１】
当業者は、上記の条件および方法が例示であって、限定するものではなく、コンジュゲーションのためのその他の手法も当該技術分野で知られており、本発明で使用可能であることが理解されよう。
【０１３２】
上記の方法により製造されたコンジュゲートは、式(ＩＩ−１)により示される。それは、化合物(ＩＩＩ−１)と抗中皮抗体６Ａ４(Terrett et al. 2012)とのコンジュゲート:
【化４１】
0006302490.tif 000044
である。
【０１３３】
当業者には、かかるコンジュゲートの製造は、種々の置換比率、典型的には通常１〜５の範囲の部分を有してもよく、かかる製造は、式(ＩＩ−１')：
【化４２】
0006302490.tif 000045
(式中、Ｒ６はＭｅであるか、またはｎ−Ｐｒであり、Ａｂは抗体である)
により示され得ることが理解されるであろう。抗体は、抗ＣＤ７０、抗メソテリンまたは抗グリピカン−３抗体であるのが好ましい。
【０１３４】
医薬組成物
別の態様において、本開示内容は、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化された本発明の化合物またはそのコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。これは所望により、抗体または他の薬物などの１つまたはそれ以上の別の医薬的に活性な成分を含有していてもよい。前記医薬組成物は、他の治療剤、特に他の抗癌薬との併用療法にて投与することができる。
【０１３５】
医薬組成物は、１つまたはそれ以上の賦形剤を含んでいてもよい。使用することができる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤または乳濁剤、固体結合剤、分散剤または懸濁助剤、溶解補助剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、保存剤、等張化剤およびこれらの組合せが挙げられる。適切な賦形剤の選択および使用は、出典明示により本明細書に取り込まれるGennaro, ed., Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)に教示されている。
【０１３６】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与(例えば、注射または点滴による)に適している。投与経路に応じて、活性化合物は、酸の作用およびそれを不活性化させ得るその他の自然条件から保護するための材料でコーティングすることができる。「非経口投与」という語句は、通常、注射による腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射ならびに点滴が挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、医薬組成物は、非経口経路、例えば、投与の局所、表皮または粘膜経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所などを介して投与されうる。
【０１３７】
医薬組成物は、無菌水溶液または分散液の形態であってもよい。それらはまた、マイクロエマルション、リポソームまたは高い薬物濃度を達成するのに適したその他の規則構造中に製剤化されうる。該組成物は、投与前に水中で再構成するための凍結乾燥物の形態でも提供され得る。
【０１３８】
担体物質を組み合わせて単一の投薬形態を製造することができる有効成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に応じて変動し、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、１００パーセント以外で、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせて有効成分が約０.０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは、有効成分が約０.１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセントから約３０パーセントの範囲である。
【０１３９】
投与計画は、治療効果を生じるように調整される。例えば、単一のボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割投薬量が時間をかけて投与されてもよく、あるいは、投薬量がその状況の緊急性に示されるように比例して減少され、もしくは増加されうる。投与を容易にし、投薬を均一にするための投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。「投薬単位形態」は、治療されるべき対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は、所望される治療効果を生じるように算出された予め決定された量の活性化合物を、必要とされる医薬担体と共に含有する。
【０１４０】
投薬量は、宿主体重当たり、約０.０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０.０１から５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、０.３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重でありうるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。典型的な治療計画としては、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与である。好ましい投与計画には、下記の投与スケジュール：(ｉ)４週間ごとに６回の投与、次いで３ヶ月ごと；(ｉｉ)３週間ごと；(ｉｉｉ)３ｍｇ／ｋｇ体重で１回、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間ごと、のうちの１つを用いて、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を挙げられる。ある方法において、投薬量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度が達成されるように調節され、ある方法では約２５〜３００μｇ／ｍＬである。
【０１４１】
本発明の化合物の「治療上有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状から開放されている期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の苦痛による機能欠陥もしくは機能障害の予防を生じる。例えば、腫瘍を有する対象の治療においては、「治療上有効量」は、好ましくは、治療されていない対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％まで腫瘍の増殖を阻害する。治療上有効量の治療化合物は、対象において(典型的にヒトであるが、別の哺乳動物であってもよい)、腫瘍サイズを減少させるか、あるいは症状を軽減させることができる。
【０１４２】
医薬組成物は、放出制御または徐放性製剤であってもよく、これには、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーが用いられ得る。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１４３】
治療組成物は、(１)無針皮下注射デバイス(例えば、US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824;および 4,596,556)；(２)微小注入ポンプ(US 4,487,603);(３)経皮デバイス(US 4,486,194)；(４)点滴装置(US 4,447,233 および4,447,224);ならびに(５)浸透デバイス(US 4,439,196 および 4,475,196)などの医療機器によって投与されうる；これらの開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
ある実施形態において、医薬組成物は、インビボで適正な分布を確保するよう製剤することができる。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を確実に通過できるようにそれらをリポソーム中に製剤化でき、これは特定の細胞または臓器への選択的な輸送を高めるための標的部分をさらに含むことができる。例えば US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016;および 5,399,331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273を参照されたい。
【０１４５】
用途
本発明の化合物またはそのコンジュゲートは、過剰増殖性疾患などの疾患を治療するために使用することができ、過剰増殖性疾患には、頭部、頚部、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺および傍神経節腫の腫瘍を包含する頭頚部の癌；肝臓および胆道系の癌、特に肝細胞癌腫；腸管癌、特に結腸直腸癌；卵巣癌；小細胞および非小細胞肺癌(ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ)；線維肉腫、悪性線維性組織球腫、胎児性横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、神経線維肉腫、骨肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫および胞状軟部肉腫などの乳癌肉腫；急性前骨髄球性白血病(ＡＰＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)などの白血病；中枢神経系の腫瘍、特に脳癌；多発性骨髄腫(ＭＭ)、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞性大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫およびＴ細胞未分化大細胞リンパ腫などが挙げられるが、これらに限定するものではない。臨床的には、本明細書に記載の方法の実施および組成物の使用は、癌の増殖のサイズもしくは数の減少および／または付随する症状(適用可能な場合には)の低減を生じる。病理学的には、本明細書に記載の方法の実施および組成物の使用は、癌細胞の増殖の阻害、癌または腫瘍のサイズの減少、さらなる腫瘍転移の予防、および腫瘍血管形成の阻害などの病理学的に関連する応答を生じる。このような疾患を治療する方法は、治療上有効量の本発明の組み合わせを対象に投与することを特徴とする。前記方法は、必要であれば繰り返されてもよい。特に、癌は、腎臓癌、肺癌、胃癌または卵巣癌でありうる。
【０１４６】
本発明の化合物またはそれらのコンジュゲートは、その他の治療剤、例えば抗体、アルキル化剤、血管形成阻害剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ開裂剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ小溝結合剤、エンジイン、熱ショックタンパク質９０阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、免疫調節剤、微小管安定化剤、ヌクレオシド(プリンまたはピリミジン)類似体、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ(ＩまたはＩＩ)阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤などと組み合わせて投与することができる。具体的な治療剤には、アダリムマブ、アンサマイトシンＰ３、オーリスタチン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カリスタチンＡ、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、シタラビン、クリプトフィシン、ダカルバジン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ダイネミシンＡ、エポシロン、エトポシド、フロキシウリシン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、イピリムマブ、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、インフリキシマブ、インターフェロン、インターロイキン、β−ラパコン、レナリドミド、イリノテカン、メイタンシン、メクロレスアミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(ＳＡＨＡ)、６−チオグアニジン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、トラスツズマブ、トリコスタチンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンデシンが挙げられる。
【実施例】
【０１４７】
本発明の実施は、下記の実施例を参照してさらに理解することができ、これらは例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【０１４８】
実施例１−化合物(ＩＩＩ−１)
この実施例は、化合物(ＩＩＩ−１)の合成を記述したものであり、この対応するスキームは、図１、２ａ−２ｂおよび３と組合せて示される。
【０１４９】
化合物２
トルエン(150 mL)中の化合物１(6 g, 16.6 mmol；Peltierら(2006)に従って製造した)およびパラホルムアルデヒド(9.94 g, 331 mmol)の混合物を、７０℃で２４時間、密閉容器内で加熱した。薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)により、反応が完了したことが示された。反応混合液を、ＣＥＬＩＴＥ(登録商標)フィルター媒体に通して濾過して、フィルターケーキを、トルエンを用いて完全に洗浄した。溶媒の蒸発後に、粗生成物を、０〜７０％の酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)/ジクロロメタン(ＤＣＭ)のグラジエントを用いるシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２(4.76 g)を淡黄色油状物として得た。MS：(+) m/z 375.2 (M+1).
【０１５０】
化合物３
塩酸(1,4-ジオキサン中で4.0 M, 12.24 mL, 50.8 mmol)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(ＭＰ−ＢＨ３ＣＮ)が結合した支持体樹脂(4.85 g, 12.7 mmol)の存在下で、アセトニトリル(62 mL)およびメタノール(6.8 mL)中の化合物２(4.76 g, 12.7 mmol)の溶液に滴加した。反応混合液を、室温(ＲＴ)で３時間攪拌した。ＬＣＭＳは、この反応が完了したことを示した。樹脂を、濾去して、アセトニトリル−メタノールの混合液で洗浄した。溶媒の蒸発後に、粗生成物を、０〜１０％メタノール／ＤＣＭ(１％ＮＨ４ＯＨを含有)のグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、粗製化合物３を得た。
【０１５１】
生成物のフラクションを濃縮して、ＥｔＯＡｃで希釈して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄して、過剰アンモニウム塩を除去した。水性フラクションを、ＥｔＯＡｃで１回逆抽出した。有機相を合わせて、乾燥させて、濃縮して、泡沫状固体として化合物３(2.82 g)を得た。MS: (+) m/z 273.2 (M+1).
【０１５２】
化合物４
ポリマーに結合したＮ−ベンジル−Ｎ−シクロヘキシルカルボジイミド(Aldrich, 4.5 g, 5.21 mmol)を、０℃で、ＤＣＭ(48 mL)中で化合物３(1.42 g, 5.21 mmol)、ｔ−ブタノール(0.72 g, 5.32 mmol)およびＢｏｃ保護されたイソロイシン３ａ(1.27 g, 5.47 mmol)の溶液に加えた。該反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した。樹脂を、濾去して、ＤＣＭで洗浄した。濾液を濃縮して、ＥｔＯＡｃで希釈して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄した。水溶液を、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜１０％メタノール／ＤＣＭ(１％ ＮＨ４ＯＨを含有)のグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、中間体生成物３ｂを含有するフラクションを得た。
【０１５３】
生成物を含有するフラクションを合わせて、濃縮して、ＥｔＯＡｃで希釈して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄して、過剰アンモニウム塩を除去した。水性フラクションを、ＥｔＯＡｃで１回逆抽出した。有機相を合わせて、乾燥させて、濃縮して、中間体生成物３ｂを、白色固体として得た。
【０１５４】
トルエン(50 mL)中の中間体生成物３ｂを、攪拌しながら密閉容器内で終夜９０℃に加熱した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。この溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜１００％ ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物４(1.3 g)を淡黄色固体として得た。MS：(+) m/z 486.3 (M+1).
【０１５５】
化合物５
トリフルオロ酢酸(TFA, 26 mL)を、ＤＣＭ(26 mL)中の化合物４の混合液に加えた。ＲＴで３０分間攪拌した後、ＬＣＭＳは、この反応が完了したことを示した。溶液を、濃縮して、ＥｔＯＡｃで希釈して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄した。水溶液をＥｔＯＡｃで２回逆抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮して、化合物５(1.03 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 386.3 (M+1).
【０１５６】
化合物６
ＤＣＣ(0.664 g, 3.22 mmol)を、０℃で、ＤＣＭ中の、化合物５(1.03 g, 2.68 mmol)、(Ｒ)−１−メチルピペリシン−２−カルボン酸５ａ(0.4 g, 2.81 mmol; Peltier et al. 2006に従って製造した)およびｔ−ブタノール(0.369 g, 2.73 mmol)の混合液に加えた。この反応混合液を、ＲＴまで昇温させて、ＲＴで終夜攪拌した。固体を、濾去して、濾液を濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃに溶解させて、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄した。水溶液を、ＥｔＯＡｃで２回逆抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜２０％メタノール／ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物６(1.23 g)を淡黄色固体として得た。MS:(+) m/z 511.4 (M+1).
【０１５７】
化合物７
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF, 10 mL)中の、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA, DIPEAとしても示される, 0.972 mL, 5.58 mmol)、ビス(４−ニトロフェニル)カーボネート(BNPC, 1.698 g, 5.58 mmol)および化合物６(0.57 g, 1.116 mmol)の混合液を、を、ＲＴで終夜攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜２０％メタノール／ＤＣＭのグラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７(0.68 g)を黄色油状物として得た。MS: (+) m/z 676.4 (M+1).
【０１５８】
化合物８
メチルアミン／メタノール(2.0 M, 0.089 mL, 0.178 mmol)を、メタノール(1 mL)中の化合物７(0.1 g, 0.148 mmol)に加えた。反応混合液をＲＴで１０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させて、化合物８(0.084 g)を得た。MS: (+) m/z 568.4 (M+1).
【０１５９】
化合物９
水酸化リチウム(7.09 mg, 0.296 mmol)/水(0.5 mL)を、ＲＴで化合物８(0.084 g, 0.148 mmol)/１,４−ジオキサン(0.5 mL)の溶液に加えた。反応混合液をＲＴで２時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３０％メタノール/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物９(0.075 g)を白色固体として得た。MS: (+) m/z 554.4 (M+1).
【０１６０】
化合物１０
トリエチルアミン(11.73 mL, 84 mmol)を、アセトニトリル(300 mL)中のジ-ｔ−ブチルジカーボネート(BOC2O, 10.57 mL, 46.0 mmol)および(Ｓ)−メチル ２−アミノ−３−(４−ニトロフェニル)プロピオン酸塩酸塩９ａ(10 g, 38.4 mmol)の混合液に、０℃で加えた。反応混合液を、ＲＴまで昇温させて、ＲＴで終夜攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。この反応混合液を濃縮して、生成物を、ジエチルエーテル(200 mL)に再度溶解した。固体を、濾去して、濾液を濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｂｏｃ保護された中間体(11.3 g)を白色固体として得た。
【０１６１】
Ｐｄ／Ｃ触媒(10 重量％, 0.85 g, 7.99 mmol)を、ＭｅＯＨ(200 mL)中のＢｏｃ保護された中間体(15 g, 46.2 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、水素雰囲気下で終夜攪拌した。Ｐｄ／Ｃ触媒を、濾過して、濾液を濃縮して、化合物１０(13.6 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 195.2 (M+1-Boc).
【０１６２】
化合物１１
ピリジン(5.77 mL, 71.3 mmol)を、０℃で、ＤＣＭ(185 mL)中のベンジルクロロホルメート(10.18 mL, 71.3 mmol)および化合物１０(17.5 g, 59.5 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴまで昇温させて、ＲＴで終夜攪拌した。この反応を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶を添加してクエンチして、塩水で洗浄した。有機層を乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１１(22.6 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 329.2 (M+1-Boc).
【０１６３】
化合物１２
ジイソブチル水素化アルミニウム(DIBAL-H)/ヘキサン(1M, 26.5 mL, 26.5 mmol)を、−７８℃で化合物１１(5.17 g, 12.07 mmol)/ＤＣＭ(39 mL)の溶液に加えた。この反応混合液を、−７８℃で２時間攪拌した。酢酸(24 mL)およびトルエン(36 mL)を、−７８℃で加えた。反応混合液を、ＲＴまで昇温させた。酒石酸(10% aq., 69 mL)を、反応混合液に加えた。水溶液を、ヘキサンおよびＥｔＯＡｃ(v/v 1:1)の混合液で抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１２(3.12 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 299.2 (M+1-Boc).
【０１６４】
化合物１３
ジブチル(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)ボラン(Bu2BOTf, DCM中で1M, 8.61 mL, 8.61 mmol)およびＤＩＥＡ(1.637 mL, 9.40 mmol)を、０℃で、ＤＣＭ(7.8 mL)中の(Ｓ)−４−イソプロピル−３−プロピオニルオキサゾリシン−２−オンである１２ａ(1.450 g, 7.83 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、０℃で４５分間攪拌した。ＤＣＭ(7.8 mL)中の化合物１２(3.12 g, 7.83 mmol)の溶液を、−７８℃で前記反応混合液に加えた。反応混合液を、終夜ＲＴまで昇温させた。リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7, 29 mL)を加えた。この水溶液を、ＤＣＭで抽出した。有機層を合わせて、塩水で洗浄して、乾燥させて、濾過して、濃縮した。
【０１６５】
残留物を、メタノール(130 mL)に再度溶解して、０℃に冷却した。Ｈ２Ｏ２水溶液(30%, 39.7 mL)を、０℃で反応混合液に加えた。反応混合液を、０℃で４時間攪拌した。水(39 mL)を加えた。ある量の溶媒(ＭｅＯＨ)を蒸発させた。水溶液を、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、５％ＮａＨＣＯ３溶液および塩水で洗浄して、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１３(4.23 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 484.3 (M+1-Boc).
【０１６６】
化合物１４
ジ(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)メタンチオン(1.5 g, 8.42 mmol)を、ＴＨＦ(20 mL)中の化合物１３(2.46 g, 4.21 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を終夜還流した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンのグラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１４(1.25 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 694.3 (M+1).
【０１６７】
化合物１５
(Ｅ)−２,２'−(ジアゼン−１,２−ジイル)ビス(２−メチルプロパンニトリル)(AIBN, 0.016 g, 0.095 mmol)を、化合物１４(1.78 g, 2.57 mmol)およびトリブチルスタンナン(Bu3SnH, 1.380 mL, 5.13 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、３０分間(１４２℃での油浴温度)還流した。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３３％ＥｔＯＡｃ/ヘキサン中のグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１５(0.84 g)を淡黄色油状物として得た。MS：(+) m/z 468.3 (M+1-Boc).
【０１６８】
化合物１６
ＬｉＯＨ(0.071 g, 2.96 mmol)/水(3.7 mL)を、化合物１５(0.84 g, 1.480 mmol)/テトラヒドロフラン(THF, 11.4 mL)の溶液に加えて、その後０℃で３０％のＨ２Ｏ２水溶液(0.271 mL, 8.88 mmol)を加えた。反応混合液を０℃で４時間攪拌した後に、１.３３ ＭＮａ２ＳＯ３水溶液(20 mL)を加えて、反応をクエンチした。塩酸(1 M)を加えて、ｐＨ２〜３に調整した。得られる水溶液を、ＤＣＭで抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜７５％ ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１６(0.53 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 357.3 (M+1-Boc).
【０１６９】
化合物１７
濃塩酸(4滴)を、メタノール(17.7 mL)中の２,２-ジメトキシプロパン(3.53 mL, 28.7 mmol)および化合物１６(0.53 g, 1.161 mmol)の溶液に加えた。この反応混液を、ＲＴで終夜攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。ＬＣＭＳは、ある程度脱保護された副生成物１６ａの形成も示した。溶媒を蒸発させた。
【０１７０】
トリエチルアミン(2.2 eq., 0.36 mL)を、ＲＴでアセトニトリル中の上記残留物およびＢＯＣ２Ｏ(1.2 eq., 304.3 mg)の溶液に加えて、副生成物１６ａを再度保護した。反応混合液を、ＲＴで２時間攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。水(７ｍＬ)を加えて、水溶液をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１７(0.3 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 371.3 (M+1-Boc).
【０１７１】
化合物１８
メタノール(6 mL)中の化合物１７(0.223 g, 0.474 mmol)および１０重量％Ｐｄ／Ｃ (20 mg, 0.474 mmol)の混合液を、Ｈ２下で終夜攪拌した。Ｐｄ／Ｃ触媒を、濾去して、濾液を濃縮した。粗生成物を、０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１８(0.112 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 237.2 (M+1-Boc).
【０１７２】
化合物１９
ＤＭＦ(12.4 mL)中の化合物１８(0.204 g, 0.606 mmol)、Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC, 0.174 g, 0.910 mmol)およびＦｍｏｃ保護されたシトルリン１８ａ(0.361 g, 0.910 mmol)の混合液を、ＲＴで終夜攪拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液(20 mL)を、加えて、反応をクエンチした。水溶液をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１９(0.25 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 716.4 (M+1).
【０１７３】
化合物２０
ピペリシン(0.5 mL, 5.06 mmol)を、ＤＭＦ(5 mL)中の化合物１９(0.25 g, 0.349 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、溶媒を蒸発させて、Ｆｍｏｃ脱保護された中間体を残留物として得た。
【０１７４】
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(２ｍＬ)中の(Ｓ)−２−((((９Ｈ−フルオレン−９−イル)メトキシ)カルボニル)−アミノ)−３−メチルブタン酸１９ａ(0.142 g, 0.418 mmol)およびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−Ｏ−(７−アザベンゾトリアゾール−１−イル)ウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HATU, 0.146 g, 0.383 mmol)の溶液に加えて、ｐＨ８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで５分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)中の上記残留物およびＤＩＥＡを、反応混合液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１５分間攪拌した後に、０.１％ＴＦＡ水溶液(8 mL)を含む水(20 mL)を加えた。水溶液をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜２０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０(0.24 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 815.4 (M+1).
【０１７５】
化合物２１
ピペリシン(0.3 mL)を、ＤＭＦ(3 mL)中の化合物２０の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した。ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。
【０１７６】
水(2 mL)中の水酸化リチウム(0.028 g, 1.176 mmol)を、ＴＨＦ(4 mL)中の上記残留物の溶液に加えた。反応混合液をＲＴで４時間攪拌した後に、ＨＣｌ水溶液(0.1N)を加えて、反応混合液を酸性とした(pH2〜3)。溶媒を部分的に蒸発させて、凍結乾燥して、化合物２１を白色固体として得た。MS：(+) m/z 579.4 (M+1).
【０１７７】
化合物２２
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(3 mL)中のε-マレイミドカプリン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル２１ａ(Tokyo Chemical Industry, 64.7 mg, 0.210 mmol)および化合物２１(81 mg, 0.14 mmol)の混合液に加えて、ｐＨ８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで２時間攪拌した後に、１:１(v/v)のアセトニトリルおよび水の混合液(10 mL)(0.1% TFAを含有する)を加えた。生成物２２を、分取高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により精製した。MS：(+) m/z 772.5 (M+1).
【０１７８】
化合物２３
２,２,２−トリフルオロ酢酸(0.7 mL, 0.013 mmol)を、ＤＣＭ(1 mL)中の化合物２２(30 mg, 0.039 mmol)の混合液にＲＴで加えた。反応混合液をＲＴで１０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させて、化合物２３を得た。MS：(+) m/z 672.4 (M+1).
【０１７９】
化合物(ＩＩＩ-１)
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物９(23.66 mg, 0.043 mmol)およびＨＡＴＵ(14.77 mg, 0.039 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物２３(26.1 mg, 0.039 mmol)およびＤＩＥＡを加えた。反応溶液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。この反応液に、１：１(v/v)の水およびアセトニトリルの混合液(10 mL)(0.1% TFAを含有する)を加えて、反応をクエンチした。生成化合物(ＩＩＩ-１)を、分取ＨＰＬＣにより精製した。MS：(+) m/z 1207.7 (M+1).
【０１８０】
マレイミド基を有する化合物、例えば(ＩＩＩ−１)を、抗体または他のリガンド上のスルフヒドリル基との反応によりコンジュゲートを製造するために使用できる。スルフヒドリル基は、システイン残基由来のものであるか、または２-イミノチオランを用いるリシン残基の誘導体化により得られるものであってもよい。
【０１８１】
実施例２−化合物(ＩＩＩ−２)
この実施例は、化合物(ＩＩＩ−２)の合成を記述しており、対応するスキームは図４に示される。
【０１８２】
化合物２４
Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン(0.556 mL, 3.19 mmol)を、ＲＴで、ＤＭＦ(5 mL)中のグリシン tert−ブチルエステル塩酸塩２３ａ(0.209 g, 1.596 mmol)、Ｆｍｏｃ-アミノオキシ酢酸２３ｂ(0.5g, 1.596 mmol)およびＨＡＴＵ(0.607 g, 1.596 mmol)の溶液に加えた。反応混合液をＲＴで１時間攪拌した後に、０.１％ ＴＦＡ水溶液(20 mL)を加えた。水溶液をＥｔＯＡｃで抽出して、有機層を合わせて、乾燥させて、濾過して、濃縮した。粗生成物を、０〜７０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４(0.45 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 449.2 (M+23).
【０１８３】
化合物２５
ＴＦＡ(3 mL, 1.437 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(0.5 mL)中の化合物２４(0.45 g, 1.055 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３０％ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２５(0.39 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 371.1 (M+1).
【０１８４】
化合物２６
Ｎ,Ｎ'−メタンジイリデンジシクロヘキサンアミン(DCC, 0.261 g, 1.267 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(6 mL)中の化合物２５および１−ヒドロキシピロリシン−２,５−ジオン(0.146 g, 1.267 mmol)の溶液に加えた。反応混合液をＲＴで終夜攪拌した後に、固体を濾去した。濾液を次いで濃縮した。粗生成物を、０〜１００％ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２６(0.43 g)を無色油状物として得た。
【０１８５】
化合物２７
ＤＩＥＡを、ＲＴで、ＤＭＦ中の化合物２１(50 mg, 0.086 mmol)および化合物２６(60.6 mg, 0.130 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで４時間攪拌した後に、反応を、１：１の０.１％ＴＦＡ水溶液およびアセトニトリル混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物２７(55 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 931.4 (M+1).
【０１８６】
化合物２８
ＴＦＡ(1 mL, 0.059 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(2 mL)中の化合物２７(55 mg, 0.059 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した。溶媒を蒸発させた。
【０１８７】
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物９(32.7 mg, 0.059 mmol)およびＨＡＴＵ(22.47 mg, 0.059 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(2 mL)およびＤＩＥＡを加えた。反応溶液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。この反応を、１:１(v/v)の水(0.1% TFAを含有する)およびアセトニトリルの混合液(20 mL)の添加によりクエンチした。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物２８(70 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 684.1 (M/2+1).
【０１８８】
化合物(ＩＩＩ−２)
ピペリシンを、ＤＭＦ(4 mL)中の化合物２８(70 mg, 0.051 mmol)の溶液に加えた。反応混合物を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、１：１のアセトニトリルおよび０.１％ＴＦＡ水溶液(40 mL)の混合液を加えた。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物(ＩＩＩ−２)(46 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1144.6 (M+1).
【０１８９】
ヒドロキシルアミン基を有する化合物、例えば(ＩＩＩ−２)を使用して、アルデヒドまたはケトン官能基を有する、抗体または他のリガンドとのコンジュゲートを(例えば、非天然アミノ酸の４−アセチルフェニルアラニンを組み込むことにより)形成させることができる。
【０１９０】
実施例３−化合物(Ｉ−２)および(Ｉ−３)
化合物(Ｉ−２)および(Ｉ−３)の合成は、概略的に図５に示される。
【０１９１】
化合物(Ｉ−３)
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(0.3 mL)中の化合物９(10 mg, 0.018 mmol)およびＨＡＴＵ(6.87 mg, 0.018 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(0.5 mL)およびＤＩＥＡ中の化合物２９(Cheng et al. 2011, 実施例１７に従って製造した；4.56 mg, 0.018 mmol)を加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、この反応を、１：１のアセトニトリルおよび０.１％ ＴＦＡ水溶液の混合液(4 mL)の添加によりクエンチした。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物(Ｉ−３)(Ｉ−２)(12 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 788.4 (M+1).
【０１９２】
化合物(Ｉ−２)
メタノール(0.5 mL)中の化合物(Ｉ−３)(12 mg, 0.015 mmol)および１０重量％Ｐｄ／Ｃ(4 mg, 0.015 mmol)の混合液を、Ｈ２雰囲気下で終夜攪拌した。触媒を、濾去して、濾液を濃縮した。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物(Ｉ−２)(8.1 mg)を白色固体として得た。MS:(+) m/z 758.4 (M+1).
【０１９３】
化合物２９を、α−メチル位置で立体化学構造混在物を有する化合物に置き換えることにより、化合物(Ｉ−１)を同様に製造できる(Cheng et al. 2011)。
【０１９４】
実施例４−化合物(ＩＩＩ−４)
図６ａから６ｃの組み合わせにより、化合物(ＩＩＩ−４)の合成スキームを示す。
【０１９５】
化合物３２
化合物３０(Aldrich, 3.5g, 13.9 mmol)を、ＤＣＭ(50 mL)に溶解した。この溶液に、デスマーチン・ペルヨージナン(11.8 g, 27.9 mmol)を５℃で加えた。１０分間の後に、混合液をＲＴまで昇温させた。更に１時間後に、反応を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和ＮａＳ2Ｏ3水溶液でクエンチした。エーテルによる抽出後に、このエーテル抽出物を、ＮａＨＣＯ3水溶液、次いで塩水で洗浄して、乾燥させて、粘性油まで蒸発させた。油状物を、ＤＣＭ(50 mL)に溶解して、これに市販の化合物３１(5.05 g, 13.93 mmol)を加えた。１０分後に、反応混合液を、ＥｔＯＡｃにとり、ＮａＨＣＯ３水溶液、次いで塩水で洗浄して、乾燥させて、濾過し、溶媒を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(EtOAc:ヘキサン, 0〜20%グラジエント)の後に、化合物３２(2.3 g, 6.90 mmol, 49.5% 収率)を白色固体として得た。それは、文献に一致したＮＭＲスペクトルを示した(Wipf et al. 2004a)。
【０１９６】
化合物３３
塩酸(7.80 mL, 31.2 mmol，ジオキサン中で4M)を、５℃で、化合物３２(5.2 g, 15.60 mmol)のＤＣＭ溶液に加えた。脱保護反応が完了した後に、反応混合液を蒸発させて、化合物３３(4.21 g, 15.60 mmol, 100 % 収量, 塩酸塩)を白色固体として得て、これを更なる精製なしに次の工程に使用した。
【０１９７】
化合物３５
ＤＭＦ(20 mL)中の化合物３４(Sani et al. 2007, 4.00 g, 11.6 mmolに従って製造した)の溶液に、５℃で、ＨＡＴＵ(4.61 g, 12.12 mmol)およびＤＩＰＥＡ(6 ml, 34.4 mmol)を加えた。１０分間後に、化合物３３(2.71 g, 11.60 mmol)を加えた。更に３０分後に、混合液を、ＥｔＯＡｃにとり、これを１０％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および塩水で洗浄した。乾燥および濾過後に、有機相を蒸発させて、化合物３５(6.49 g, 11.60 mmol, 100%収率, [M+Na]+, 計算値582.3, 実測値582.3)を、油状物として得て、これを更なる精製なしに次工程に使用した。
【０１９８】
化合物３６
ＮａＢＨ４(4.66 g, 123 mmol)を、５℃で、化合物３５(6.49 g, 11.6 mmol)およびＮｉＳＯ4(Ｈ２Ｏ)6(6.48 g, 24.66 mmol)のメタノール溶液(100 mL)に数回に分けて加えた(注意：水素が発生した)。３０分後に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて、その後ＥｔＯＡｃを加えた。ＣＥＬＩＴＥ(登録商標)に通して濾過した後に、有機相を水相から分離して、塩水で洗浄して、乾燥させ、濾過して、蒸発させて、化合物３６(5.6 g, 9.97 mmol, 81 %収率, [M+1]+, 計算値562.3, 実測値562.4)を得て、これを更なる精製をせずに次工程に使用した。
【０１９９】
化合物３７
化合物３６(5.6 g, 9.97 mmol)を、５℃でピリジン(30 mL)に溶解した。酢酸無水物(4 g, 39.2 mmol)を、この溶液に加えた。１０分後に、混合液をＲＴまで昇温させた。約１時間後に、反応混合液を濃縮した。得られる残留物を、ＥｔＯＡＣにとり、有機相を、順次１０％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水により洗浄した。有機相を、乾燥させて、濾過して、濃縮して、化合物３７(5.8 g, 9.61 mmol, 100 %収率, [M+1]+, 計算値604.3, 実測値604.4)を得て、これを更なる精製をせずに次工程に使用した。
【０２００】
化合物３８ａおよび３８ｂ
化合物３７(0.8 g, 1.3 mmol)を、−７８℃でメタノール(5 mL)に溶解した。この溶液に、ＮａＯＭｅ(331 uL, 1.33 mmol, MeOH中で4M)を加えた。混合液を、１時間かけてＲＴまで昇温させた。混合液を、ＥｔＯＡｃに取り、１０％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を分離して、乾燥させて、濾過して、蒸発させて、エチルおよびメチルエステル(化合物３８ａおよび３８ｂ各々)の混合物を得た。このエステル混合物を、双方がカルボン酸へと後の工程で加水分解されるまで、その後の数工程中には分離しなかった。
【０２０１】
化合物４０ａおよび４０ｂ
上記反応からの化合物３８ａおよび３８ｂの混合液を、ＤＣＭ(20 mL)に溶解した。この溶液に、４-ニトロフェニルカルボノクロリデート３９(524 mg, 2.6 mmol)およびピリジン(210 μl, 2.6 mmol)を５℃で加えた。温度を、１時間後に室温まで昇温させて、メチルアミン(1.950 mL, 3.9 mmol, THF中で2M)を加えた。１０分後に、溶媒を蒸発させて、残留物をクロマトグラフィーカラムに通して濾過して、化合物４０ａおよび４０ｂ(各々エチルおよびメチルエステル；420 mg, HPLCから40a/40bの比率 3:1, 2工程に対して約53%収率, [M+1]+：40aに対して、計算値603.3, 実測値603.4； 40bに対して、計算値589.3, 実測値589.4)の混合液を得た。
【０２０２】
化合物４１ａおよび４１ｂ
化合物４０ａおよび４９ｂ(420 mg, 約0.68 mmol)の混合液を、ＤＣＭ(3 mL)に溶解して、これにＨＣｌ(4.8 mmol, 1.2 mL, ジオキサン中で4N)を加えた。５℃で１時間後に、溶媒を蒸発させて、化合物４１ａ(エチルエステル)および４１ｂ(メチルエステル)の混合液(約３：１の比率)を、更なる精製をせずに次工程に使用した。
【０２０３】
化合物４３ａおよび４３ｂ
化合物４１ａおよび４１ｂ(400 mg, 0.72 mmol)、化合物４２(Anichemから購入し得る, 170 mg, 0.721 mmol)および酢酸(0.041 mL, 0.721 mmol)の混合液を、５℃で、ＤＣＭ中で混合した。ナトリウムトリアセトキシホウ化水素(306 mg, 1.44 mmol)を加えた。混合液を、３０分後にＥｔＯＡｃにとった。７％Ｋ2ＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した後に、有機相を乾燥させて、濾過して、蒸発減量させて、残留物を得た。カラムクロマトグラフィー精製(MeOH:DCM, 0〜7%グラジエント)の後に、化合物４３ａ(エチルエステル)および４３ｂ(メチルエステル)を得た(310 mg, おおよそ0.42 mmol, おおよそ58.3 %収率, 43a:43bの割合は約3:1, [M+1]+, 43aに対して計算値738.4, 実測値738；43bに対して計算値724.4, 実測値724).
【０２０４】
化合物４５ａおよび４５ｂ
化合物４３ａおよび４３ｂ(310 mg, おおよそ0.42 mmol)の混合液を、ＲＴで、ＤＣＭ(5 mL)に溶解した。この溶液に、２,６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルピリジン(161 mg, 0.840 mmol)および化合物４４(Peltier et al. 2006に従い製造, 73.8 mg, 0.420 mmol)のＤＣＭ溶液(2 mL)に加えた。３０分後に、Ｅｔ３Ｎ(58.6 μl, 0.420 mmol)を加えた。混合液をＥｔＯＡｃにとり、これを１０％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を、乾燥させて、濾過して、蒸発減量させて、残留物とした。カラムクロマトグラフィー精製により、化合物４５ａおよび４５ｂ(294 mg, おおよそ0.334 mmol, 80 %収率, 45a:45bの割合は3:1, [M+1]+, 45aに対して計算値877.5, 実測値877;45bに対して計算値863.5, 実測値863)を粘性油として得た。
【０２０５】
化合物４６ａおよび４６ｂ
化合物４５ａおよび４５ｂ(100 mg, 約0.114 mmol)の混合液を、ＭｅＯＨ(20 mL)中のＰｄ／Ｃ(65 mg, 10%)の懸濁液に加えた。ＨＣｌ(28.5 μL, 0.114 mmol, ジオキサン中の4M)を加えた。フラスコをエバキュエートして、Ｈ２で再度充填して、この過程を３回反復した。２時間後に、懸濁液を、濾過して、溶媒を蒸発させて、残留物を得た。ＤＭＦ(500 uL)中の化合物５ａ(19.59 mg, 0.137 mmol)、ＨＡＴＵ(43.4 mg, 0.114 mmol)およびＤＩＰＥＡ(49.8 μl, 0.285 mmol)の懸濁液を、５℃で加えた。懸濁液が均一になった後に、上記残留物を、ＤＭＦ(1 mL)溶液として加えた。さらなるＤＩＰＥＡを加えて、ｐＨを約１２に調整した。１０分間後に、混合液をＥｔＯＡｃにとり、これを１０％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を分離して、乾燥させて、濾過して、蒸発させた。得られる残留物を、クロマトグラフィーカラムに通して、化合物４６ａおよび４６ｂ(各々エチルおよびメチルエステル, 80 mg,  約0.082 mmol, 71.9 %収率, 46a:46bの割合は3:1, [M+1]+, 46aに対して計算値976.5, 実測値976.5；46bに対して計算値962.5, 実測値962.5)の混合物を得た。
【０２０６】
化合物４７ａおよび４７ｂ
ＨＣｌ(256 μl, 1.024 mmol, ジオキサン中で4M)を、５℃で、化合物４６ａおよび４６ｂ(200 mg, 0.205 mmol)のＭｅＯＨ溶液(2 mL)に加えた。１時間後に、溶液を蒸発させて、高真空下で終夜乾燥させて、粘性油状物を得た。この油状物、即ちＦｍｏｃ保護されたシトルリン１８ａ(81 mg, 0.205 mmol)およびＤＩＰＥＡ(179 μl, 1.024 mmol)を、ＲＴで、ＤＭＦ(2 mL)に溶解した。プロピルホスホン酸無水物(T3P, 178 μL, 0.410 mmol, EtOAc中で2.3 M)を加えた。１時間後に、この反応混合液を、ＥｔＯＡｃ中にとり、これを飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。分離、乾燥および蒸発の後に、得られる残留物を、クロマトグラフィーカラム(MeOH:DCM, 0〜10% グラジエント)に通して、化合物４７ａおよび４７ｂ(各々エチルおよびメチルエステル, 150 mg, おおよそ0.119 mmol, 約58.3 %収率, 47a:47bの割合は3:1, [M+1]+, 47aに対して計算値1255.6, 実測値1255.6；47bに対して計算値1241.6, 実測値1241.6)の混合液を得た。
【０２０７】
化合物４９
化合物４７ａおよび４７ｂ(200 mg, 約 0.165 mmol)の混合液を、室温でＤＭＦ(5% ピペリシンを含む)(5 mL)に溶解した。溶液を、蒸発させて、３０分間後に乾燥させた。得られる残留物を、Ｂｏｃ保護されたバリン Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル４８(61.9 mg, 0.198 mmol)、ＤＭＦ(5 mL)およびＤＩＰＥＡ(87 μL, 0.496 mmol)と共に混合した。終夜反応させた後に、反応混合液を蒸発乾固させた。得られる混合液を、ＭｅＯＨ、ＴＨＦおよび水(1:1:1)の混合液(5 mL)に溶解した。ＮａＯＨを加えて、最終溶液のｐＨは１４であった。終夜ＲＴでこの反応を進めた後に、混合液を、ＨＣｌを用いて、ｐＨ３に酸性化して、高真空下で蒸発させた。得られる固体を、ＴＦＡで処理して、この混合液を１０分間蒸発させて、化合物４９(80 mg, 0.072 mmol, 43.8 %収率, [M+1]+, 計算値1104.6, 実測値1104.6)を、分取ＨＰＬＣ精製後に得た。
【０２０８】
化合物(ＩＩＩ-４)
化合物４９(80 mg, 0.072 mmol)、市販の化合物２１ａ(Aldrich, 26.6 mg, 0.087 mmol)およびＤＩＰＥＡ(38.0 μl, 0.217 mmol)を、ＤＭＦ(2 mL)に溶解した。反応を終夜まで進行させた後に、混合液を蒸発させて、残留物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、メジャーなアイソマー(15 mg, 16%収率, 1/2[M+2]2+, 計算値649.3, 実測値649.5)およびマイナーなアイソマー(3.7 mg, 4%収率, 1/2[M+2]2+, 計算値649.3, 実測値649.5)を得た。メジャーなアイソマーを、Ｔｕｐサブユニットのα−メチル位置にて天然ツブリシンの立体化学を有する(ＩＩＩ-４)として暫定的に割り当てて、マイナーなアイソマーを、それとは逆の立体化学を有する化合物(ＩＩＩ-５)と割り当てた。
【０２０９】
実施例５−化合物(Ｉ−５)、(Ｉ−６)および(Ｉ−７)
ＨＣｌによる化合物４６ａおよび４６ｂの処置に由来する少量の上記油状物を、化合物１８ａとカップリングしなかったが、しかしその代わりに、ＴＨＦ、ＭｅＯＨおよび水(1:1:1)の混合液に溶解した。反応混合液のｐＨを１４に調整した。反応を終夜続行させた後に、反応混合液の半量を蒸発させて、分取クロマトグラフィーにより精製して、化合物(Ｉ−５)(1 mg; M+1, 876.6)、(Ｉ−６)(1 mg; M+1, 862.5)および(Ｉ−７)(1 mg; M+1, 848.5)を得た。
【０２１０】
実施例６−化合物(Ｉ−１)
化合物(Ｉ−１)の合成スキームを図７に示した。
化合物５１
ＨＣｌ(6 N, 0.2 mL)を、ＭｅＯＨ(1 mL)中の化合物５０(Cheng et al. 2011; 50 mg, 0.198 mmol)および２,２-ジメトキシプロパン(0.244 mL, 1.982 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した後に、溶媒を蒸発させて、化合物５１(52.8 mg)を得た。MS：(+) m/z 267.2 (M+1).
【０２１１】
化合物５２
ＭｅＯＨ(1 mL)中の化合物５１(52.8 mg, 0.198 mmol)およびパラジウム炭素(10重量%, 8 mg)の混合液を、Ｈ２雰囲気下にて終夜攪拌した。次いで、触媒を濾去して、溶媒を蒸発させて、化合物５２(46.9 mg)を得た。MS：(+) m/z 237.3 (M+1).
【０２１２】
化合物(Ｉ−１)
ＤＣＭ(0.5 mL)中のペンタフルオロフェノール(2.493 mg, 0.014 mmol)、１,３-ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.049 mg, 9.93 μmol)および化合物９(5 mg, 9.03 μmol)の混合液を、ＲＴで終夜攪拌した。次いで、溶媒を蒸発させた。
【０２１３】
ＤＭＦ(0.2 mL)中の得られる残留物(6.50 mg, 9.03 μmol)および化合物５２(4.27 mg, 18.06 μmol)の溶液に、ＤＩＥＡ(1滴)を加えた。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、反応を、１:１のアセトニトリルおよび水(0.1% TFA(4 mL)を含有)の混合液の添加によりクエンチした。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物(Ｉ−１)(2.5 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 772.5 (M+1).
【０２１４】
実施例６−化合物(Ｉ−４)
図８は、化合物(Ｉ−４)の合成についてのスキームを示す。
【０２１５】
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(0.3 mL)中の化合物９(10.69 mg, 0.019 mmol)およびＨＡＴＵ(7.34 mg, 0.019 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物５３(4 mg, 0.019 mmol;Sani et al. 2007に従って製造した)およびＩＥＡを加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、反応を、１：１のアセトニトリル(0.1% TFA(4 mL)を含有)と水の混合液の添加によりクエンチした。分取ＨＰＬＣ精製により、化合物(Ｉ−４)(12.5 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 743.4 (M+1).
【０２１６】
実施例７−チオカルバメート
式(Ｉ)の化合物(式中、ＷはＳである(即ち、チオカルバメート))を、以下に図示したとおり、適切な前駆体、例えば化合物６(図１)を水素化ナトリウムで処理し、次いでチオイソシアネートで処理することにより製造した：
【化４３】
0006302490.tif 000046
【０２１７】
実施例８−化合物(ＩＩＩ−６)
化合物５６の合成のためのスキームを図９ａおよび９ｂに示した。
【０２１８】
化合物５６
１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 0.160 g, 0.778 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(5 mL)中のｔｅｒｔ−ブチル １−アミノ−３,６,９,１２−テトラオキサペンタデカン−１５−オエート５４(Quanta Biosciences, 0.25 g, 0.778 mmol)および２−(((((９Ｈ−フルオレン−９−イル)メトキシ)−カルボニル)アミノ)−オキシ)酢酸５５(Chem-Impex, 0.244 g, 0.778 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した後に、沈殿物を濾去した。次いで、濾液を濃縮した。粗生成物を、ＤＣＭ中の０〜１０％メタノールのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物５６(0.30 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 617.4 (M+1).
【０２１９】
化合物５７
ＴＦＡ(2 mL, 0.662 mmol)中の化合物５６(0.303 g, 0.491 mmol)の溶液を、ＲＴで２時間攪拌した。溶液を濃縮した後に、残留物を、ヘキサンで洗浄して、化合物５７(0.28 g)を得た。MS：(+) m/z 561.3 (M+1).
【０２２０】
化合物５８
ＤＣＣ(0.199 g, 0.963 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(5 mL)中の化合物５７(0.27 g, 0.482 mmol)および１-ヒドロキシピロリシン−２,５−ジオン[Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドまたはＮＨＳとしても知られる, 0.111 g, 0.963 mmol]の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した後に、固体を濾去した。次いで、濾液を濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の０〜１００％酢酸エチルのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物５８(0.12 g)を無色油状物として得た。MS:(+) m/z 658.3 (M+1).
【０２２１】
化合物５９
ＤＩＥＡ(2滴)を、ＲＴで、ＤＭＦ(2 mL)中の化合物５８(0.12 g, 0.182 mmol)および化合物２１(0.106 g, 0.182 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、この反応を、アセトニトリルおよび水(0.1％TFAを含有)の混合液の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物５９(0.12 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1121.6(M+1).
【０２２２】
化合物６０
ＴＦＡ(0.5 mL)を、ＤＣＭ(1 mL)中の化合物５９(20 mg, 0.018 mmol)の溶液に、ＲＴで加えた。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、溶液を濃縮して、化合物６０(18.2 mg)を得た。MS：(+) m/z 1021.6 (M+1).
【０２２３】
化合物６１
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(0.4 mL)中の化合物９(9.87 mg, 0.018 mmol)およびＨＡＴＵ(6.78 mg, 0.018 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物６０(18.2 mg, 0.018 mmol)およびＤＩＥＡを加えた。反応混合液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、この反応を、１：１(ｖ／ｖ)の水(０.１％ＴＦＡを含有する)およびアセトニトリルの混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物６１(25 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 779.0 (M/2+1).
【０２２４】
化合物(ＩＩＩ−６)
ピペリシンの一滴を、ＲＴで、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物６１(25 mg, 0.016 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、この反応をアセトニトリルおよび水(0.1％TFAを含有する)の混合液の添加によりクエンチした。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物(ＩＩＩ−６)(20 mg)を白色固体として得た。MS:(+)m/z 668.0 (M/2+1)。化合物(ＩＩＩ−６)はヒドロキシルアミン基を有しており、これをオキシム形成(例えば、上記に議論されたような、タンパク質に組み込まれているｐ-アセチルフェニルアラニン残基のケトン基との)によるコンジュゲーションに使用できる。
【０２２５】
ｐ−アセチルフェニルアラニン残基を含有するように改変された、化合物(ＩＩＩ−６)と抗メソテリン抗体とのコンジュゲートは、３Ｈチミジン取り込みアッセイを用いた場合、Ｎ８７胃癌細胞に対して０.１４のＥＣ５０を示した。
【０２２６】
一実施態様において、本発明は、ケトン基を含有するように改変された化合物(ＩＩＩ−６)と抗メソテリン抗体とのコンジュゲートを提供する。好ましくは、この改変は、ｐ−アセチルフェニルアラニン残基を抗体ポリペプチド鎖に組み込むことによるものである。また好ましくは、そのように改変された抗体は６Ａ４である。
【０２２７】
実施例９−中間化合物６９
図１０は、化合物６９の合成のためのスキームを示し、これを本発明の化合物の合成のための中間体として使用できる。
【０２２８】
化合物６３
化合物６２(Chem-Impex, 5 g, 23.8 mmol)を、５℃でＭｅＯＨ(20 mL)中のＳＯＣｌ2(3.47 mL, 47.6 mmol)の溶液に加えた。反応を終夜進めた後に、反応混合液を、３０分間４５℃で加熱した。揮発性物質を蒸発させて、残留物をＤＣＭ(20 mL)に溶解した。Ｂｏｃ2Ｏ(7.8 g, 35.7 mmol)を加えた。Ｅｔ3Ｎを使用して、溶液のｐＨを９に調整した(含水ｐＨ紙を用いて試験した)。数時間後に、反応混合液をＥｔＯＡｃ中に移した。ＥｔＯＡｃ溶液を、１０％クエン酸溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を乾燥させて、分離して、蒸発させた。乾燥有機相の蒸発による最終残留物を、カラムに通過させて、化合物６３(5 g, 65%収率, [M+1-Boc]+, 計算値225.1, 実測値225.2)を得た。
【０２２９】
化合物６５
化合物６３(2 g, 6.2 mmol)のＤＣＭ溶液(20 mL)に、−７８℃で、ＤＩＢＡＬ-Ｈ(12.4 mL, 12.4 mmol, DCM中で1M)を加えた。３０分後に、ＭｅＯＨを使用して、反応をクエンチした。ＨＣｌを使用して、溶液のｐＨを約２に調整した。混合液をＥｔＯＡｃ中に移して、これを１０％クエン酸、塩水で洗浄して、乾燥させて、分離して、蒸発させた。この残留物を、ＤＣＭ(３０ｍＬ)に溶解した。化合物６４(2.4g, 6.2 mmol, US 4,894,386)を、０℃で加えた。混合液を１時間ＲＴで蒸発させて、残留物を、カラムに通過させて、化合物６５(2 g, 79%収率, [M+1-Boc]+, 計算値307.2, 実測値307.1)を得た。
【０２３０】
化合物６６
化合物６５(600 mg, 1.48 mmol)を、ＲＴでＥｔＯＡｃ(75 mL)に溶解した。この溶液を、Ｎ2およびＰｄ／Ｃ(600 mg, 10%)で充たしたフラスコに移し入れた。フラスコを、エバキュエートして、Ｈ２で再度充填した；このサイクルを３回反復した。１時間後に、溶液を、濾過して、蒸発させて、化合物６６(560 mg, 100%収率, [M+1]+, 計算値379.3, 実測値379.3)をエピマー混合液として得た。この混合液は、後になるまで分離されなかった。
【０２３１】
化合物６７
化合物６６(1.30 g, 3.43 mmol)、Ｆｍｏｃ保護されたシトルリン１８ａ(1.6 g, 4.12 mmol)および２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリン(EEDQ, 1.06 g, 4.3 mmol)を、ＤＣＭおよびＭｅＯＨ(22 mL, 10:1)の混合液に溶解した。この反応を終夜進めた後に、混合液を蒸発させて、残留物をカラムに通過させて(ＭｅＯＨ：ＤＣＭ，０〜５％グラジエント)、化合物６７([M+1]+, 7計算値758.4, 実測値758.4)をエピマー混合液(ＨＰＬＣ分析より約４：１)として得た。それを、更なる精製をせずに次工程に使用した。
【０２３２】
化合物６８ａ
上記反応由来の化合物６７の混合液を、ＲＴで、ＤＭＦ(５％ピペリシンを含む)(10 mL)に溶解した。３０分後に、混合液を蒸発させて、高真空吸引により終夜乾燥させた。残留物を、ＤＭＦ(5 mL)中の化合物４８(1.5 g, 3.45 mmol)と共に混合した。Ｅｔ３Ｎを使用して、溶液のｐＨを１２に調整した。１時間後に、反応混合液を、ＥｔＯＡｃ中に移して、これを１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を、乾燥させて、濾過して、蒸発乾固させた。残留物を、化合物６７の脱保護と同じ方法にて、ＤＭＦ中の５％ピペリシンを用いて脱保護した。この工程で得たアミンおよび化合物２１ａ(1 g, 3.27 mmol)を、ＤＭＦ(10 mL)中で混合した。Ｅｔ3Ｎを使用して、ＲＴで溶液のｐＨを１２に調整した。反応を終夜進めた後に、混合液を、ＥｔＯＡｃに移して、これを１０％クエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機相を、乾燥させて、濾過して、蒸発させて、残留物を得た。残留物を、一般のシリカカラムに通して、化合物６８ａおよび６８ｂ(1g, 化合物66から35%収率, [M+1]+, 計算値828.5, 実測値828.5)の混合液を得た。分取ＨＰＬＣカラムでの分離の後に、メジャーなエピマー(600 mg)を得た(構造は化合物６８ａとして暫定的に割り当てられ、化合物６８ｂはマイナーなものとして割り当てられた)。
【０２３３】
化合物６９
化合物６８ａ(600 mg, 0.72 mmol)を、ＤＣＭおよびＴＦＡ(１：１)の混合液(5 mL)に溶解した。２時間後に、反応混合液を蒸発させて、化合物６９(定量的収量, [M+1], 計算値672.4, 実測値672.4)を得た。
【０２３４】
実施例１０−中間化合物７５
図１１は、本発明の化合物合成のために使用できる中間化合物７５の合成についてのスキームを示す。
【０２３５】
化合物７１
化合物７０(Cheng et al. 2011, 25 mg, 0.044 mmol)、Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC, 0.014 mL, 0.088 mmol)、４-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP, 10.78 mg, 0.088 mmol)およびＭｅＯＨ(0.036 mL, 0.882 mmol)を、ＲＴで混合した。１時間後に、反応混合液を蒸発させて、カラムに通して、化合物７１(10 mg, 39%収率, M+1, 581.4)を得た。
【０２３６】
化合物７２
化合物７１(122 mg, 0.210 mmol, 別の合成バッチ由来)を、５℃でＭｅＯＨ(2 mL)に溶解した。ＮａＯＭｅ(0.441 mL, 0.221 mmol)を加えた。０.５時間の後に、混合液を、ＨＣｌ(ジオキサン中で４Ｍ)で中和して、蒸発させて、化合物７２(m+1, 539.4)を得て、これを更なる精製せずに次工程に使用した。
【０２３７】
化合物７３
化合物７２(60 mg, 0.111 mmol)を、５℃でＤＣＭ(1.5 mL)に溶解した。ＤＣＭ(0.5 mL)中のピリジン(0.045 mL, 0.557 mmol)、４-ニトロフェニルカルボノクロリデートである７２ａ(67.3 mg, 0.334 mmol, Aldrich)をゆっくりと加えた。反応を終夜進めた後に、混合液を蒸発させて、カラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７３(42 mg, 0.060 mmol, 53.6 %収率)(m+1, 704.4)を得た。
【０２３８】
化合物７４
化合物７３(42 mg, 0.060 mmol)を、５℃でｄＤＣＭ(1 mL)中に溶解した。メチルアミン(1.853 mg, 0.060 mmol)を加えた。０.５時間後に、混合液を蒸発させて、残留物を、クロマトグラフィーカラムに通して(MeOH:DCM, 0〜15% グラジエント, 生成物は7〜10%で溶出)、化合物７４(35 mg, 0.059 mmol, 98 %収率)(m+1, 596.4)を得た。
【０２３９】
化合物７５
化合物７４(93 mg, 0.156 mmol)を、５℃でＴＨＦ(1 mL)に溶解した。ＬｉＯＨ(7.47 mg, 0.94 mmol)/水(0.34 mL)を加えた。反応終了の後に、反応混合液を、ＨＣｌ(ジオキサン中で４Ｍ)により中和して、高真空で乾燥させて、化合物７５(m+1, 582.3)を得て、これを更なる精製をせずに次工程に使用した。
【０２４０】
実施例１１−化合物(ＩＩＩ−７)および(ＩＩＩ−８)
図１２は、化合物(ＩＩＩ−７)および(ＩＩＩ−８)の合成のためのスキームを示す。
【０２４１】
化合物(ＩＩＩ−７)
化合物７５(11 mg, 0.019 mmol)を、ＨＡＴＵ(6.83 mg, 0.018 mmol)およびＤＩＥＡ(14.86 μl, 0.085 mmol)を用いてＤＭＦ(0.5 mL)中で活性化させた。次いで、化合物６９(15.24 mg, 0.023 mmol)を加えた。１０分後に、反応混合液を、ＤＭＳＯに移して、分取クロマトグラフィーにより精製して、化合物(ＩＩＩ−７)(12 mg, 9.71 μmol, 51.4 %収率)(m+1, 1235.7)を得た。
【０２４２】
化合物(ＩＩＩ−８)
化合物７５(10 mg, 0.017 mmol)を、ＨＡＴＵ(6.21 mg, 0.016 mmol)およびＤＩＥＡ(0.014 mL, 0.077 mmol)を用いてＤＭＦ(0.5 mL)中で活性化した。次いで、化合物２３(13.86 mg, 0.021 mmol)を加えた。１０分後に、反応混合液を、ＤＭＳＯ中に移しとり、分取クロマトグラフィーにより精製して、化合物(ＩＩＩ−８)(13 mg, 10.52 μmol, 61.2 %収率)(m+1, 1235.7)を得た。
【０２４３】
実施例１２−化合物(Ｉ−８)および(Ｉ−９)
基本的には、プロテアーゼカテプシンＢを用いて、化合物(ＩＩＩ−７)および(ＩＩＩ−８)各々を処理して、化合物(Ｉ−８)および(Ｉ−９)を得ることができ、これについてはジペプチドＶａｌ−Ｃｉｔが基質モチーフである。化合物(ＩＩＩ−７)は、そのオルトアミノ基により、切断に対してさらなる立体障害に付される可能性がある。
【化４４】
0006302490.tif 000047
【０２４４】
実施例１３−化合物の生物学的活性
図１３ａおよび１３ｂは、ＡＴＰ発光アッセイを用いるＨ２２６肺癌および７８６−Ｏ腎臓癌細胞各々に対する本発明の化合物(Ｉ−４)および(Ｉ−２)の生物学的活性を示す。コントロールとして、ドキソルビシンおよびＴｕｖサブユニットにてカルバメート基の代わりにアセテート基を含有するツブリシンアナログ化合物Ａを使用した。化合物Ａを、Cheng et al. 2011の教示内容にしたがって製造できる。
【化４５】
0006302490.tif 000048
【０２４５】
Ｈ２２６細胞に対して、ＥＣ５０値は次のとおりであった：ドキソルビシン, １１５.４ｎＭ；化合物Ａ，２.４ｎＭ；および化合物(Ｉ−４)，１２.１ｎＭ。７８６−Ｏ細胞に対して、ＥＣ５０値は次のとおりであった：ドキソルビシン，６８.９ｎＭ；化合物Ａ，１.２ｎＭ，および化合物(Ｉ−４)，７.１ｎＭ。
【０２４６】
図１３ｃおよび１３ｄは、化合物(Ｉ−５)、(Ｉ−６)および(Ｉ−７)に対して類似のデータタイプを示す。比較化合物は、ドキソルビシンおよびツブリシンＤであった。Ｈ２２６細胞に対して、ＥＣ５０値は次のとおりであった：ドキソルビシン，１１５.４ｎＭ；ツブリシンＤ，０.０５ｎＭ；化合物(Ｉ−５)，１９.５ｎＭ；化合物(Ｉ−６)，９.９ｎＭ；および化合物(Ｉ−７)，１５.４ｎＭ。７８６−Ｏ細胞に対して、ＥＣ５０値は次のとおりであった：ドキソルビシン，６８.９ｎＭ；ツブリシンＤ，０.０２ｎＭ；化合物(Ｉ−５)，２２.９ｎＭ；化合物(Ｉ−６)，２２.８ｎＭ；および化合物(Ｉ−７)，１２.５ｎＭ。
【０２４７】
腫瘍細胞株を、アメリカンタイプ・カルチャーコレクション(ＡＴＣＣ)(P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)から入手して、ＡＴＣＣの指示書に従って培養した。細胞を、ＡＴＰアッセイのために、３時間、９６ウェルプレート中で１.０ｘ１０３細胞／ウェルにて播種した。化合物の１：３の連続希釈物を、ウェルに加えた。プレートを、２４〜７２時間インキュベートした。製造者のマニュアルに従って、CELLTITER-GLO(登録商標) 発光性細胞生存性キットを用いて、ＡＴＰプレート中のＡＴＰレベルを、GLOMAX(登録商標) 20/20 蛍光測定器(双方、Promega, Madison,WI, USA)により読み取った。ＥＣ５０値−即ち、細胞増殖を５０％まで阻害または減少させる濃度−を、PRISM(登録商標)software, version 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いて決定した。
【０２４８】
実施例１４−コンジュゲートのインビトロ活性
図１４は、Ｎ８７胃癌細胞(American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)に対するコンジュゲート(ＩＩ−１)のインビトロ活性を示す。
【０２４９】
細胞を、３Ｈ−チミジンアッセイのために、３時間、各９６−ウェルプレート中に各々１.０ｘ１０４細胞／ウェルにて播種した。コンジュゲート(ＩＩ−１)の連続希釈物(１：３)をウェルに加えた。プレートを、１２０時間インキュベートした。プレートを、全インキュベーション期間の最後の２４時間、１.０μＣｉの３Ｈ−チミジン／ウェルを用いてパルス化し、回収して、Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments, Meriden, CT)上で読み取った。ＥＣ５０値−即ち、細胞増殖を５０％まで阻害または減少させる濃度−を、PRISM(登録商標)software, version 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いて、０.２ｎＭであることを決定した。
【０２５０】
図１３ａ−１３ｄと図１４からのＥＣ５０値を比較することにより、２点が説明される。第１点は、コンジュゲートによる細胞毒素の標的化送達、その後のコンジュゲートの抗体成分とその抗原との結合により開始される能動的内在化メカニズムと関連がある効力の増強である(Schrama et al. 2006)。第２点は、コンジュゲートしていない毒素は比較的極性化合物であり、能動的な内在化メカニズムの非存在においては、細胞膜を横切り拡散することが困難であり、そのために高いＥＣ５０値(低い能力)が測定された。
【０２５１】
実施例１５−コンジュゲートのインビボ活性
この実施例において、コンジュゲート(ＩＩ−１)のインビボ活性を、Ｔｕｖサブユニットに存在するカルバメートの代わりにアセテートを有するということ以外、構造的には同一のコンジュゲート(ＩＩ−１)であるコンジュゲートＢの活性と比較した(Cheng et al. 2011)：
【化４６】
0006302490.tif 000049
【０２５２】
リン酸緩衝生理食塩水(「ＰＢＳ」)(０.１ｍＬ)＋マトリゲル(０.１ｍＬ)中に懸濁した５００万個のＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞を、ＳＣＩＤマウスの横腹にて皮下移植した。腫瘍測定を２８日後に開始し、マウスを、腫瘍のＬＷＨ／２により算出された６０ｍｍ３の平均腫瘍サイズにて各々７匹のグループへと無作為に分けた。腫瘍移殖２９日後、マウスに、試験化合物を個々に腹腔内投与した。図１５は、ＯＶＣＡＲ３異種移植について、コンジュゲート(ＩＩ−１)は、コンジュゲートＢ以上により効果的に腫瘍増殖を抑制したことを示す。この差異は、特に２０日後に顕著である。
【０２５３】
図１６ａ、１６ｂ、１７ａ、１７ｂ、１８ａ、１８ｂ、１９ａ、１９ｂおよび２０は、上記プロトコール(変更すべきところは変更して)毎に作成された本発明のコンジュゲートについてのインビボの追加の有効データを示す。
【０２５４】
図１６ａは、化合物(ＩＩＩ−１)と抗ＣＤ７０抗体 １Ｆ４または抗メソテリン抗体６Ａ４との一連のコンジュゲートについて、時間対ＯＶＣＡＲ３(卵巣癌)腫瘍容積についてのデータを示す。説明文は、順に、ＤＡＲ(例えば、「２.７」)および投薬量(μｍｏｌ／ｋｇ)(例えば、「０.１」)を示す。各例において、投与様式は、最後のデータセット(◆)を除いて単回用量(ＳＤ)での腹腔内投与であって、これについてはコンジュゲートをＱ７Ｄｘ３で投与した。図１６ｂは、同じ実験についての体重変化を示す。
【０２５５】
ヒトモノクローナル抗体６Ａ４の製造および特徴分析は、Terrettら(2012)に記述されており、この開示内容は出典明示により本明細書に組み込まれる。抗体６Ａ４についてのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、各々、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６に示される。抗体６Ａ４の可変領域ＶＨおよびＶＫの配列は、各々配列番号：７および配列番号：８に提供される。
【０２５６】
ヒトモノクローナル抗体１Ｆ４の製造および特徴分析は、Cocciaら(2010)に記述されており、この開示内容は出典明示により本明細書に組み込まれる。抗体１Ｆ４についてのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４に各々示される。抗体１Ｆ４の可変領域ＶＨおよびＶＫは、配列番号：１５および配列番号：１６各々に示される。
【０２５７】
図１７ａおよび１７ｂは、同様の実験についての結果を示すが、これは化合物(ＩＩＩ−８)および抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートを用いた。各例において、単回用量を腹腔内投与した。
【０２５８】
化合物(ＩＩＩ−１)と抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートのＨ２２６(肺癌)腫瘍についての効力を、図１８ａおよび１８ｂに示し、ＤＡＲおよび投薬の情報は図中の説明文にある。例えば、コンジュゲートを、単回用量にて腹腔内投与した。
【０２５９】
図１９ａおよび１９ｂは、化合物(ＩＩＩ−８)と抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートについてのＨ２２６データを示す。最初のデータセット(●)において、投与は単回用量であったが、一方で最後の２つのデータセット(▼および◆)に対する投与レジメンは、Ｑ７Ｄｘ３であった。
【０２６０】
図２０は、化合物(ＩＩＩ−１)と抗メソテリン抗体６Ａ４または抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４のコンジュゲートについてのＮ８７胃癌腫瘍に対する効力データを示す。
【０２６１】
抗体は、特にコンジュゲートに用いられる場合には、エフェクター機能、例えばＡＤＣＣを低減または排除するように設計された、天然の定常領域または遺伝子操作された(改変された)定常領域のいずれかであってもよい。かかる改変抗体の定常領域の例示は、配列番号：２５および配列番号：２６のポリペプチドにより提供される。配列番号：２５は、特定のアミノ酸置換基により改変されたＩｇＧ４アイソタイプの定常領域である。配列番号：２６は、ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４定常領域である。双方の配列番号：２５および配列番号：２６において、Ｃ末端リシンの存在は任意である。
【０２６２】
実施例１６−安定性試験
この実施例において、コンジュゲート(ＩＩ−１)およびコンジュゲートＢ(それら各々カルバメート基およびアセテート基を有する)のマウス血清安定性を比較した。
【０２６３】
コンジュゲートを、０.１μmol/kgの用量でマウスに注射した。コンジュゲート(ＩＩ−１)の場合には、投与濃度は３.４ｍｇ／ｍＬであり、コンジュゲートは４.２の置換比(ＳＲ)を有する。コンジュゲートＢの場合には、投与濃度は１.２ｍｇ／ｍＬであり、ＳＲは２.３であった。３匹の各動物からの血清(おおよそ１００ｕＬ)を、各時点で分析のために採取した。
【０２６４】
様々な動物由来の血清試料をプールして、各時点で２００〜３００ｕＬとした。プールした容量を、遠心分離して、固体を除去し、上清を分析のために使用した。コンジュゲートを、SEPHAROS(商標登録)ビーズに結合した抗イディオタイプのモノクローナル抗体を用いて、免疫親和性捕捉により血清から単離した。捕捉後に、コンジュゲートを、低ｐＨへと暴露して、その後トリス塩を用いて中和することにより溶出した。コンジュゲートに存在する細胞毒素は、活性型カテプシンＢを添加して、Ｃｉｔ−Ｖａｌペプチドリンカーを切断することにより放出される。カテプシンＢの消化を、３７℃で３時間行い、その後１容量の冷メタノールを添加した。溶媒抽出された細胞毒素を、ESI-TOF MS インラインを用いて、逆相クロマトグラフィー(Acquity HSS T3 2.1 X 50mm)を用いるＵＰＬＣによるＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０２６５】
コンジュゲート(ＩＩ−１)について、カルバメート基の加水分解に由来するヒドロキシル化合物の存在は、２４０時間までの経過時間全体を通じていずれの時点でも検知されなかった。カルバメート化合物のみを検出した。
【０２６６】
逆に、コンジュゲートＢについては、加水分解生成物を６時間後に検出でき、約５０％の加水分解が７２時間までに起きていた。以下の表２は、各二重荷電イオンに関する質量スペクトル強度に基づいたアセテートおよびヒドロキシル化合物の相対量を示したものである (M[H2+] 372.2 Da および 351.2 Da)：
【化４７】
0006302490.tif 000050
【表２】
0006302490.tif 000051
【０２６７】
これらの結果は、Ｔｕｖサブユニット中のアセテート基の置換により、更により安定な化合物となるが、実質的な生物学的活性も依然として保持していることを示している。
【０２６８】
実施例１７−化合物７２ａ、７２ｂおよび７２ｃ
この実施例は、カルバメート基の構造変化を有する本発明の化合物の製造および特性を記述している。合成スキームについては図２１を参照されたい。
【０２６９】
化合物７０ａ
ＭｅＯＨ(2M, 0.089 mL, 0.178 mmol)中のアンモニアを、ＭｅＯＨ(2 mL)中の化合物７(0.1 g, 0.148 mmol)に加えた。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことを示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７０ａ(55 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 554.3 (M+1).
【０２７０】
化合物７１ａ
水(0.5 mL)中のＬｉＯＨ(4.41 mg, 0.184 mmol)を、ＲＴで、ＴＨＦ(1 mL)中の化合物７０ａ(51 mg, 0.092 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで２時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことを示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いるシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７１ａ(47 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 540.3 (M+1).
【０２７１】
化合物７２ａ
ＤＩＥＡ(6.45 μL, 0.037 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ａ(20 mg, 0.037 mmol)およびＨＡＴＵ(14.09 mg, 0.037 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)およびＤＩＥＡ(6.45 μL, 0.037 mmol)中の化合物２３(24.9 mg, 0.037 mmol)を加えた。反応溶液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴでさらに２０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことを示された。反応を、１：１(v/v)の水(０.１％ＴＦＡを含有する)およびアセトニトリル(0.1% ＴＦＡを含有する)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７２ａ(35.2 mg)を白色固体として得た。MS:(+) m/z 1193.6 (M+1). 化合物７２ａは、化合物(ＩＩＩ−９)としても本明細書の上記に示される。
【０２７２】
化合物７２ａおよび抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４のコンジュゲートは、７８６-Ｏ腎臓癌細胞に対して０.１９ｎＭのＥＣ５０を示した。化合物７２ａおよび抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートは、Ｎ８７胃癌細胞に対して０.１６ ｎＭのＥＣ５０を示した。両方の例において、３Ｈ-チミジン取り込みアッセイを使用した。
【０２７３】
化合物７０ｂ
化合物７(0.1 g, 0.148 mmol)およびアニリン(0.041 mL, 0.444 mmol)/ＤＭＦ(1.8 mL)の溶液を、５０℃で終夜加熱した。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜１５％ ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物５(58 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 630.4 (M+1).
【０２７４】
化合物７１ｂ
水(0.5 mL)中のＬｉＯＨ(4.03 mg, 0.168 mmol)を、ＴＨＦ(1 mL)中の化合物７０ｂ(53 mg, 0.084 mmol)の溶液に、ＲＴで加えた。反応混合液を、ＲＴで２時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７１ｂ(43 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 616.3 (M+1).
【０２７５】
化合物７２ｂ
ＤＩＥＡ(5.66 μL, 0.032 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ｂ(20 mg, 0.032 mmol)およびＨＡＴＵ(12.35 mg, 0.032 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)およびＤＩＥＡ(5.66 μL, 0.032 mmol)中の化合物２３(21.82 mg, 0.032 mmol)を加えた。反応溶液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで別の２０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。反応を、１：１(v/v)水(0.1％TFAを含有する)およびアセトニトリル(0.1％TFAを含有する)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７２ｂ(35 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1269.7 (M+1). 化合物７２ｂは化合物(ＩＩＩ−１０)としても上記本明細書に示した。
【０２７６】
化合物７２ｂおよび抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４のコンジュゲートは、７８６−Ｏ腎臓癌細胞に対して０.５８ｎＭのＥＣ５０を示した。化合物７２ｂおよび抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートは、Ｎ８７胃癌細胞に対して０.４７のＥＣ５０を示した。両方の例において、３Ｈチミジン組み込みアッセイを使用した。
【０２７７】
化合物７０ｃ
ＤＭＦ(1 mL, 0.148 mmol)中のジメチルアミンを、反応が完了するまで、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物７(0.1 g, 0.148 mmol)の溶液に滴加した。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜１５％ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７０ｃ(56 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 582.3 (M+1).
【０２７８】
化合物７１ｃ
水(0.5 mL)中のＬｉＯＨ(8.23 mg, 0.344 mmol)を、化合物７０ｃ(0.1 g, 0.172 mmol)/ＴＨＦ(1 mL)の溶液にＲＴで加えた。反応混合液を、ＲＴで２時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜３０％ ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７１ｃ(50.8 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 568.3 (M+1).
【０２７９】
化合物７２ｃ
ＤＩＥＡ(6.14 μL, 0.035 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ｃ(20 mg, 0.035 mmol)およびＨＡＴＵ(13.39 mg, 0.035 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを、８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物２３(23.67 mg, 0.035 mmol)およびＤＩＥＡ(6.14 μL, 0.035 mmol)を加えた。反応溶液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで更に２０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。反応を、１：１(v/v)の水(0.1％TFAを含有する)およびアセトニトリル(0.1％TFAを含有する)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７２ｃ(23.8 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1221.6 (M+1). 化合物７２ｃは化合物(ＩＩＩ−１１)としても上記本明細書において示される。
【０２８０】
化合物７２ｃおよび抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４のコンジュゲートは、７８６−Ｏ腎臓癌細胞に対して０.３２ ｎＭのＥＣ５０を示した。化合物７２ｃおよび抗メソテリン抗体６Ａ４のコンジュゲートは、Ｎ８７胃癌細胞に対して０.３４ｎＭのＥＣ５０を示した。両方の例において、３Ｈチミジン導入アッセイを使用した。
【０２８１】
実施例１８−化合物７５ａ、７５ｂおよび７５ｃ
この実施例は、前記実施例のツブリシンアナログ(但し、結合したリンカー部分を含まない)の製造を記述している。合成スキームについては、図２２を参照されたい。
【０２８２】
化合物７３
水(５ｍＬ)中のＬｉＯＨ(0.071 g, 2.97 mmol)を、ＲＴで、ＴＨＦ(5 mL)中の化合物１８(0.25 g, 0.743 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで２時間攪拌した後に、溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜２０％ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物７３(0.22 g)を白色固体として得た。MS:(+) m/z 223.3 (M+1-Boc).
【０２８３】
化合物７４
１,４-ジオキサン(4 mL, 0.620 mmol)中の化合物７３(0.2 g, 0.620 mmol)および４Ｎ ＨＣｌの混合液を、ＲＴで１時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。白色固体の化合物７４を、ヘキサンで２回洗浄した。MS：(+) m/z 223.3 (M+1).
【０２８４】
化合物７５ａ
ＤＩＥＡ(3.23 μL, 0.019 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ａ(10 mg, 0.019 mmol)およびＨＡＴＵ(7.05 mg, 0.019 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(0.5 mL)中のＤＩＥＡ(3.23 μL, 0.019 mmol)および化合物７４(5.35 mg, 0.024 mmol)を加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで１時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。反応を、１：１(v/v)のアセトニトリルおよび水(0.1％TFAを含有)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取HPLCにより精製して、化合物７５ａ(6.0 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 744.4 (M+1)．化合物７５ａは、化合物(Ｉ-１０)としても上記本明細書に示される。
【０２８５】
化合物７５ａは、ＡＴＰ発光アッセイを用いた場合、Ｎ８７胃癌細胞に対して７５.８ｎＭのＥＣ５０を示した。
【０２８６】
化合物７５ｂ
ＤＩＥＡ(2.83 μL, 0.016 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ｂ(10 mg, 0.016 mmol)およびＨＡＴＵ(6.17 mg, 0.016 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(0.5 mL)中のＤＩＥＡ(2.83 μL, 0.016 mmol)および化合物７４(4.69 mg, 0.021 mmol)を加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。反応を、１：１(v/v)のアセトニトリルおよび水(0.1％TFAを含有する)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７５ｂ(7.6 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 820.4 (M+1). 化合物７５ｂを、化合物(Ｉ-１１)としても上記本明細書に示した。
【０２８７】
化合物７５ｂは、ＡＴＰ発光アッセイを用いた場合、Ｎ８７胃癌細胞に対して０.３９ｎＭのＥＣ５０を示した。
【０２８８】
化合物７５ｃ
ＤＩＥＡ(3.07 μL, 0.018 mmol)を、ＤＭＦ(0.5 mL)中の化合物７１ｃ(10 mg, 0.018 mmol)およびＨＡＴＵ(6.70 mg, 0.018 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(0.5 mL)中のＤＩＥＡ(3.07 μL, 0.018 mmol)および化合物７４(5.09 mg, 0.023 mmol)を加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液をＲＴで１時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。この反応を、１：１(v/v)アセトニトリルおよび水(0.1％TFAを含有する)の混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７５ｃ(7.6 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 772.5 (M+1). 化合物７５ｃを、化合物(Ｉ-１２)としても上記本明細書に示した。
【０２８９】
化合物７５ｃは、ＡＴＰ発光アッセイを用いた場合、Ｎ８７胃癌細胞に対して５.４ｎＭのＥＣ５０を有する。
【０２９０】
実施例１９−化合物８０
この実施例は、パートナー分子中のアジド基と反応できるシクロオクチン基を有する「クリック」ケミストリーを介するコンジュゲーションに適切な化合物８０の合成を記述している。対応する合成スキームは、図２３に示される。
【０２９１】
化合物７７
ＤＣＣ(22.40 mg, 0.109 mmol)を、ＲＴでＤＣＭ(1 mL)中のＤＢＣＯ-ＰＥＧ４-酸の７６(50 mg, 0.090 mmol, Click Chemistry Tools, Scottsdale, AZから購入)およびＮ-ヒドロキシスクシンイミド(NHS, 20.83 mg, 0.181 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌した。固体を、濾去して、濾液を濃縮して、化合物７７を得た。MS：(+) m/z 650.3 (M+1). 
【０２９２】
化合物７８
ＤＩＥＡを、ＲＴでＤＭＦ(1 mL)中の化合物７７(58.8 mg, 0.091 mmol)および化合物２１(57.6 mg, 0.100 mmol)の溶液に加えて、ｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７８(20 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1113.6 (M+1). 
【０２９３】
化合物７９
ＴＦＡ(0.5 mL, 6.53 mmol)を、ＲＴでＤＣＭ(1 mL)中の化合物７８(17.2 mg, 0.015 mmol)の混合液に加えた。反応混合液をＲＴで１時間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。溶媒を蒸発させて化合物７９を得た。MS:(+) m/z 1013.5 (M+1).
【０２９４】
化合物８０
ＤＩＥＡ(2.96 μL, 0.017 mmol)を、ＤＭＦ(0.4 mL)中の化合物９(8.55 mg, 0.015 mmol)およびＨＡＴＵ(5.87 mg, 0.015 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)およびＤＩＥＡ(2.96 μL, 0.017 mmol)中の化合物７９(15.65 mg, 0.015 mmol)を加えた。反応混合液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで更に２０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応は完了したことが示された。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、ＤＭＳＯ(1 mL)に再溶解させて、分取ＨＰＬＣにより、化合物８０を白色固体として得た。MS：(+) m/z 775.0 (M/2+1). 化合物８０を、化合物(ＩＩＩ-１２)としても上記本明細書に示した。
【０２９５】
３Ｈチミジン導入アッセイを用いた場合に、化合物８０と種々の位置にてアジド基を有するように改変した抗グリピカン３抗体４Ａ６の７つの変異体とのコンジュゲートは、Ｎ８７胃癌細胞に対して、１.４、０.１７、０.１３、０.２２、０.１４、０.０６４および０.２５ｎＭのＥＣ５０を示した。
【０２９６】
抗体４Ａ６の製造および特性分析は、Terrette et al. 2010に記述されており、この開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。抗体４Ａ６についての、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびにＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２に各々示されている。可変領域ＶＨおよびＶＫは、配列番号：２３および配列番号：２４各々に提供される。
【０２９７】
一実施態様において、本発明は、化合物８０およびアジド基を含むように改変されたポリペプチド、好ましくは抗体のコンジュゲートを提供する。
【０２９８】
実施例２０−化合物８８
この実施例は、コンジュゲートに使用され得るアルキル第一級アミン官能基を有する化合物８８の合成を記述している。図２４の合成スキームを参照されたい。
【０２９９】
化合物８２
ＤＭＦ(3 mL)中のtert−ブチル １-アミノ-３,６,９,１２-テトラオキサペンタデカン-１５-オエート５４(0.285 g, 0.888 mmol, VWRから購入；実施例８を参照されたい)および２,５-ジオキソ-ピロリシン-１-イル ６-((((９Ｈ-フルオレン-９-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)ヘキサノエート ８１(0.4 g, 0.888 mmol, Chem-Impexから購入)の混合液を、ＲＴで２時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。粗生成物を、０〜１０％ＭｅＯＨ/ＤＣＭのグラジエントを用いて、シリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物８２(0.4 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 657.4 (M+1).
【０３００】
化合物８３
ＴＦＡ(2 mL, 0.393 mmol)中の化合物８２(0.258 g, 0.393 mmol)の混合液を、ＲＴで１時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。化合物８３(白色固体)を２回ヘキサンで洗浄して、更なる精製なしに次工程反応に使用した。
【０３０１】
化合物８４
ＤＣＣ(0.162 g, 0.786 mmol)を、ＲＴで、ＤＣＭ(5 mL)中の化合物８３(0.236 g, 0.393 mmol)およびＮＨＳ(0.090 g, 0.786 mmol)の混合液に加えた。反応混合液を、ＲＴで終夜攪拌して、固体を濾去して、濾液を濃縮した。粗生成物を、０〜１００％ ＥｔＯＡｃ/ヘキサンのグラジエントを用いてシリカゲルから溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物８４(0.195 g)を無色油状物として得た。MS：(+) m/z 698.3 (M+1).
【０３０２】
化合物８５
ＤＩＥＡを、ＲＴで、ＤＭＦ(1.5 mL)中の化合物２１(0.162 g, 0.279 mmol)および化合物８４(0.195 g, 0.279 mmol)の溶液に加えた。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、この反応を、１：１のアセトニトリルおよび水(０.１％ＴＦＡを含有する)の混合液(6 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物８５(0.292 g)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 1161.6 (M+1).
【０３０３】
化合物８６
ＴＦＡ(0.5 mL)を、ＲＴで、ＤＣＭ(1 mL)中の化合物８５(22.1 mg, 0.019 mmol)の混合液に加えた。反応混合液を、ＲＴで２０分間攪拌して、溶媒を蒸発させて、化合物８６を得た。MS：(+) m/z 1061.6 (M+1).
【０３０４】
化合物８７
ＤＩＥＡを、ＤＭＦ(0.4 mL)中の化合物９(10.53 mg, 0.019 mmol)およびＨＡＴＵ(7.23 mg, 0.019 mmol)の溶液に加えた。反応混合液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＤＭＦ(1 mL)中の化合物８６(20.19 mg, 0.019 mmol)およびＤＩＥＡを加えた。反応溶液のｐＨを８〜９に調整した。反応混合液を、ＲＴで１０分間攪拌した後に、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。反応を、１：１(v/v)の水(０.１％ＴＦＡ)およびアセトニトリルの混合液(10 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物８７(27.3 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 799.1 (M/2+1).
【０３０５】
化合物８８
ピペリシンを、ＤＭＦ(2 mL)中の化合物８７(27.3mg, 0.017 mmol)の溶液にＲＴで加えて、ｐＨを９〜１０に調整した。反応混合液を、ＲＴで１時間攪拌した後に、この反応を１：１のアセトニトリルおよび水(０.１％ＴＦＡを含有する)の混合液(6 mL)の添加によりクエンチした。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物８８(22.5 mg)を白色固体として得た。MS：(+) m/z 688.1 (M/2+1). 化合物８８は、化合物(ＩＩＩ-１３)としても本明細書上記に示される。
【０３０６】
一実施態様において、コンジュゲートを提供するものであって、このコンジュゲートにおいて化合物８８は、化合物８８のアルキル第１級アミンとポリペプチドのアミノ酸−好ましくはグルタミン酸−の側鎖残留物上のカルボキシル基の間のアミド形成により、ポリペプチド、好ましくは抗体とコンジュゲートされる。本発明は、酵素トランスグルタミナーゼの存在下で、化合物８８とポリペプチドとを組み合わせて含む前記コンジュゲートの製造方法も提供する。
【０３０７】
前記の発明の詳細な説明には、本発明の特定の部分または態様に主として、または単独で関連する一部が含まれる。それは、明確性および利便性のためであり、ある特定の特徴が開示されている単なる一部よりも大きく関連し、本明細書の開示では、異なる節で見出された情報の適当な組み合わせの全てが含まれることが理解されるべきである。同様に、本明細書に記載の様々な図面および記載は本発明の特定の具体例に関するものであるが、ある特定の特徴がある特定の図面または具体例の中で開示されている場合、かかる特徴もまた適当な範囲で、別の図面または具体例の中で、別の特徴との組み合わせにおいて、あるいは一般的な発明において用いることができることも理解されるべきである。
【０３０８】
さらに、本発明は、ある好ましい具体例について特に記載されているが、本発明をかかる好ましい具体例に限定するものではない。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。
【０３０９】
(文献)
下記の全ての引用文献は、筆頭著者(または発明者)によって省略した形で引用されており、本明細書より早い日付のものが下記に提供される。これらの文献の各々は、全ての目的のために出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書中の以下または別の箇所での文献の引用は、かかる文献が先行技術の材料であるということの承認ではない。
【０３１０】
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【０３１１】
(配列表)
明細書に開示された核酸および／またはアミノ酸を包含する配列番号：１〜配列番号：２６を含む「SEQT_12026WOPCT.txt,」名の配列表は、参照によりその全てを本明細書に組み込まれる。本明細書に添付した配列表は、ＡＳＣＩＩテキストフォーマットにて、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出され、紙およびそのコンピューター読取り可能なフォーマット双方により構成される。配列表は、PatentIn 3.5を用いて、2014年1月4日に作成されており、おおよそ15KBサイズである。
下記表３は、本出願に開示した配列の記述を要約する。
【表３】
0006302490.tif 000052
【０３１２】
【図１】
0006302490.tif 000068
【図２ａ】
0006302490.tif 000069
【図２ｂ】
0006302490.tif 000070
【図３】
0006302490.tif 000071
【図４】
0006302490.tif 000072
【図５】
0006302490.tif 000073
【図６ａ】
0006302490.tif 000074
【図６ｂ】
0006302490.tif 000075
【図６ｃ】
0006302490.tif 000076
【図７】
0006302490.tif 000077
【図８】
0006302490.tif 000078
【図９ａ】
0006302490.tif 000079
【図９ｂ】
0006302490.tif 000080
【図１０】
0006302490.tif 000081
【図１１】
0006302490.tif 000082
【図１２】
0006302490.tif 000083
【図１３ａ】
0006302490.tif 000084
【図１３ｂ】
0006302490.tif 000085
【図１３ｃ】
0006302490.tif 000086
【図１３ｄ】
0006302490.tif 000087
【図１４】
0006302490.tif 000088
【図１５】
0006302490.tif 000089
【図１６ａ】
0006302490.tif 000090
【図１６ｂ】
0006302490.tif 000091
【図１７ａ】
0006302490.tif 000092
【図１７ｂ】
0006302490.tif 000093
【図１８ａ】
0006302490.tif 000094
【図１８ｂ】
0006302490.tif 000095
【図１９ａ】
0006302490.tif 000096
【図１９ｂ】
0006302490.tif 000097
【図２０】
0006302490.tif 000098
【図２１】
0006302490.tif 000099
【図２２】
0006302490.tif 000100
【図２３】
0006302490.tif 000101
【図２４】
0006302490.tif 000102
【配列表】
0006302490000001.app