(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエントの血液試料におけるドナー核酸の割合を決定することにより固形臓器の移植片拒絶または固形臓器の傷害を判定する方法であって、下記：
（ａ）レシピエントの血液試料において、少なくとも１つの遺伝子座における少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の存在を検査すること；および、
（ｂ）ドナーＨＬＡ対立遺伝子が検出されれば、移植片拒絶または傷害と判定されること、
を含み、
ここで、レシピエントの血液試料における、少なくとも１つのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子が、ＤＰＢ１，エキソン２の配列を含むものである、
前記方法。
【請求項２】
さらに、ドナーＨＬＡ対立遺伝子の割合を決定し、その割合が前決定した閾値を超えれば移植片拒絶または傷害と判定されることを含み、
ここで、前記閾値が、移植に成功したレシピエントに由来する試料の解析により決定されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記決定工程が、試料中に検出された同一遺伝子座におけるすべてのＨＬＡ対立遺伝子の量の和に対する少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の量の比を計算することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ＨＬＡ対立遺伝子についての検査が配列決定を含み、さらに配列決定の前にターゲット濃縮工程を含む、前記方法。
【請求項５】
前記配列決定がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて実施されるクローン増幅工程を含み、各プライマーがアダプター配列およびＨＬＡハイブリダイゼーション配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＬＡ対立遺伝子についての検査が下記の工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法：
（１）フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅させて、ＨＬＡアンプリコンを得る工程；
（２）クローン配列決定を実施して、工程（１）で得たＨＬＡアンプリコンの配列を決定する工程；
（３）前記工程（２）で決定した配列のうち、同一遺伝子座における少なくとも１つのレシピエントＨＬＡ対立遺伝子および少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程；および、
（４）前記工程（３）で同定したレシピエントＨＬＡ配列とドナーＨＬＡ配列の数を比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定する工程。
【請求項７】
前記工程（１）における少なくとも１つのプライマーが、ＳＥＱ  ＩＤｓ：１〜１０および１２から選択されるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（３）における同定が下記のコンピューター処理工程を含む、請求項６または７に記載の方法：
（ｉ）ＨＬＡ遺伝子座における配列をＨＬＡ配列データベースと比較する工程；
（ｉｉ）既知のＨＬＡ対立遺伝子に対応する複数のビン内に配列を選別する工程；
（ｉｉｉ）１または２つの多数配列をレシピエント対立遺伝子として同定する工程；および、
（ｉｖ）１または２つの少数配列をドナー対立遺伝子として同定する工程。
【請求項９】
前記工程（１）において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
２、３またはより多数の遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を、同一反応液でマルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＬＡ対立遺伝子を、下記を含む方法により定量的に検出する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法：
（Ｉ）試料を、それぞれ０〜５コピーのターゲットＨＬＡ対立遺伝子を含む複数の反応溶液に分割すること；
（ＩＩ）それぞれの反応溶液をターゲットＨＬＡ対立遺伝子の存在についてアッセイすること；および、
（ＩＩＩ）同一遺伝子座において、ドナーＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数を、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数と比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定すること。
【請求項１２】
さらに、独立して、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントについての遺伝子型情報を得ることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
レシピエントの血液中のドナーＤＮＡの濃度が閾値レベルを超えているかどうかを決定することにより、移植片レシピエントが移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があるかを判定する方法であって、ドナーＤＮＡの濃度が下記：
（ａ）レシピエントの血液試料溶液中の少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を定量的に検出すること；
（ｂ）ドナーＤＮＡの濃度を測定すること；および、
（ｃ）ドナーＤＮＡの濃度を閾値と比較すること、ここで閾値に達しているかまたはそれを超えていればレシピエントは移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性がある、
を含む方法により決定され、
ここで、少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子が、ＤＰＢ１，エキソン２の配列を含むものである、
前記方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
固形臓器の移植片拒絶または移植片傷害の早期検出は重要なアンメット・クリニカル・ニーズである。生検ベースの方法は感度が低く、重篤な合併症のリスクが高い。したがって、特に魅力的なのは、移植した臓器の生検を必要としない非侵襲的検査である。現在は、血清クレアチニンの検出が移植片拒絶または傷害の非侵襲的検査である。しかし、この検査はきわめて特異的というわけではない。さらに、このマーカーの検出可能な上昇は移植片拒絶の経過に際してかなり後期に起き、その時点では臓器を救済するには遅すぎることが多い。
【０００２】
移植片拒絶を検出するための核酸ベースの非侵襲的方法を開発する試みが幾つかあった。幾つかの方法は移植片拒絶のシグナル、たとえば特定の拒絶関連遺伝子の発現に依存していた。たとえばHartono et al., (2011) Non-invasive Diagnosis of Acute Rejection
of Renal Allografts. Curr Opin Organ Transplant 15:35を参照。レシピエントの血液中のドナー特異的核酸を調べる試みもあった。それらは最初は、雌性レシピエントにおいて検出される雄性ドナー提供臓器のＹ染色体遺伝子に限られていた。Morelra et al., (2009) Cell-free DNA as non-invasive acute rejection marker in renal transplantation. Clin. Chem. 55:11; Snyder et al., (2011) Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. PNAS 108:6229。レシピエントの血漿中のドナー特
異的ＨＬＡ配列を検出する初期の試みもあった。Gadi et al., (2006) Soluble donor DNA concentrations in recipient’s serum correlate with pancreas-kidney rejection.
Clin. Chem. 52:3。しかし、これらの試みは失敗であるとして広く酷評された：各グル
ープの患者内で信号に著しい変動があったので、検査の予測価値が乏しかった(Baxter-Lowe, L., and Busch, M., (2006) Tracking Microchimeric DNA in Plasma to Diagnose and Manage Organ Transplant Rejection Clin Chem 52:4に概説されている)。現在のところ、移植片拒絶の早期検出のための信頼できる非侵襲的検査法はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hartono et al., (2011) Non-invasive Diagnosis of Acute Rejection of Renal Allografts. Curr Opin Organ Transplant 15:35
【非特許文献２】Morelra et al., (2009) Cell-free DNA as non-invasive acute rejection marker in renal transplantation. Clin. Chem. 55:11
【非特許文献３】Snyder et al., (2011) Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. PNAS 108:6229
【非特許文献４】Gadi et al., (2006) Soluble donor DNA concentrations in recipient’s serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clin. Chem. 52:3
【非特許文献５】Baxter-Lowe, L., and Busch, M., (2006) Tracking Microchimeric DNA in Plasma to Diagnose and Manage Organ Transplant Rejection Clin Chem 52:4
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本発明は、レシピエントの血液試料におけるドナー核酸の割合を決定することにより固形臓器の移植片拒絶または傷害を判定する方法であり、この方法は下記を含む：レシピエントから血液試料を得る；少なくとも１つの遺伝子座における少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の存在について試料を検査する；そしてドナーＨＬＡ対立遺伝子が検出されれば、移植片拒絶または傷害と診断する。この態様の変法において、この方法はさらに、ドナーＨＬＡ対立遺伝子の割合を決定し、その割合が前決定した閾値
を超えれば移植片拒絶または傷害と診断することを含む。この態様のさらなる変法において、決定工程は、試料中に検出された同一遺伝子座におけるすべてのＨＬＡ対立遺伝子の量の和に対する少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の量の比を計算することを含む。この態様のさらにさらなる変法において、ドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子は、互いに連鎖不平衡(linkage disequilibrium)状態にある少なくとも２つの遺伝子座において検出される。この態様のさらにさらなる変法において、ドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子は、互いに連鎖不平衡状態にはない少なくとも２つの遺伝子座において検出される。この態様のさらにさらなる変法において、少なくとも１つの遺伝子座は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１から選択される。この態様のさらなる変法において、少なくとも１つのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子は、ＤＱＡ１，エキソン２；ＤＱＢ１，エキソン２および３；ＤＰＡ１，エキソン２；ＤＰＢ１，エキソン２；ＤＲＢ１，エキソン２；ＤＲＢ３，エキソン２；ＤＲＢ４，エキソン２；ならびにＤＲＢ５，エキソン２、またはそれらのＨＬＡ遺伝子に由来するイントロン配列、もしくはそれらの遺伝子に由来するエキソン配列とイントロン配列の組合わせから選択される配列を含む。この態様のさらなる変法において、ＨＬＡ対立遺伝子について検査する工程は配列決定、特にクローン配列決定を含む。この態様のさらなる変法において、検査は表１に開示するオリゴヌクレオチドを用いる増幅または検出を含む。この態様のさらなる変法において、前記方法はさらに配列決定の前にターゲット濃縮(target enrichment)工程を含む
。ターゲット濃縮工程は、少なくとも１ラウンドのゲノムＤＮＡ増幅またはターゲット捕獲を含むことができる。クローン配列決定は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて実施されるクローン増幅工程を含むことができ、各プライマーはアダプター配列およびＨＬＡハイブリダイゼーション配列を含む。この態様のさらなる変法において、ＨＬＡ対立遺伝子についての検査は下記の工程を含む：フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅させて、ＨＬＡアンプリコンを得る工程；クローン配列決定を実施して、ＨＬＡアンプリコンの配列を決定する工程；上記で決定した配列のうち、同一遺伝子座における少なくとも１つのレシピエントＨＬＡ対立遺伝子および少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程；上記で同定したレシピエントＨＬＡ配列とドナーＨＬＡ配列の数を比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定する工程。上記方法における少なくとも１つのプライマーは表１から選択できる。この態様のさらなる変法において、同定工程は下記のコンピューター処理工程を含む：ＨＬＡ遺伝子座における配列をＨＬＡ配列データベースと比較する工程；既知のＨＬＡ対立遺伝子に対応する複数のビン(bin)内に配列を選別する工程；１または２つの多数(majority)配列をレ
シピエント対立遺伝子として同定する工程；１または２つの最も代表的な少数(minority)配列をドナー対立遺伝子として同定する工程。この態様のさらにさらなる変法において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する。それらの３以上の遺伝子座は、遺伝子ＤＰＢ１、ＤＱＢ１およびＤＲＢ１に由来する配列を含むことができる。この態様のさらなる変法において、２、３またはより多数の遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を、同一反応溶液(reaction volume)でマルチプレックスＰＣＲによって同時
に増幅する。この態様のさらなる変法において、ＨＬＡ対立遺伝子を、下記を含む方法により定量的に検出する：試料を、それぞれ０〜約５コピーのターゲットＨＬＡ対立遺伝子を含む複数の反応溶液に分割する；それぞれの反応溶液をターゲットＨＬＡ対立遺伝子の存在についてアッセイする；同一遺伝子座において、ドナーＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数を、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数と比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定する。この態様の変法において、アッセイ操作は、その少なくとも１つが表１から選択されるオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。この態様のさらなる変法において、この方法はさらに、独立して、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントについての遺伝子型情報を得ることを含む。
【０００５】
他の態様において、本発明は、レシピエントの血液中のドナーＤＮＡの濃度が閾値レベルを超えているかどうかを決定することにより、移植片レシピエントが移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があるかを判定する方法であり、ドナーＤＮＡの濃度は下記を含む方法により決定される：レシピエントから血液試料溶液を得る；その試料溶液中の少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を定量的に検出する；ドナーＤＮＡの濃度を測定する；そしてそれを閾値と比較し、その際、閾値に達しているかまたはそれを超えていればレシピエントは移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性がある。この態様の変法において、少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１対立遺伝子から選択される。この態様のさらなる変法において、少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子は、ＤＱＡ１，エキソン２；ＤＱＢ１，エキソン２および３；ＤＰＡ１，エキソン２；ＤＰＢ１，エキソン２；ＤＲＢ１，エキソン２；ＤＲＢ３，エキソン２；ＤＲＢ４，エキソン２；ならびにＤＲＢ５，エキソン２、またはそれらの遺伝子に由来するエキソン配列とイントロン配列の組合わせから選択される。この態様のさらにさらなる変法において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する。それらの３以上の遺伝子座は、遺伝子ＤＰＢ１、ＤＱＢ１およびＤＲＢ１に由来する配列を含むことができる。
【０００６】
他の態様において、本発明は、レシピエントの血液中のドナーＨＬＡ対立遺伝子の割合を定期的に決定することにより、移植片レシピエントを移植片拒絶の発症についてモニタリングし、ドナーＤＮＡの割合の増大が検出されればその患者は移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があると診断する方法である。
【０００７】
さらに他の態様において、本発明は、ＳＣＩＤ小児の血液中の母性細胞を定量的に検出する方法であって、下記を含む方法である：小児から血液試料を得る；少なくとも１つの遺伝子座における少なくとも１つの非遺伝性の母性ＨＬＡ対立遺伝子(non-transmitted maternal HLA allele)の存在について試料を検査する；検査工程で検出した母性対立遺伝
子を定量し、それにより母性細胞を定量的に検出する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
用語“対立遺伝子”は、遺伝子の配列バリアントを表わす。遺伝子の１以上の相異が対立遺伝子を構成する可能性がある。ＨＬＡ対立遺伝子については、一般に遺伝子の複数の相異が対立遺伝子を構成する（すなわち、大部分の対立遺伝子は互いに１より多い塩基が異なる）。本明細書中で用いるレシピエントの対立遺伝子は、レシピエントに存在する２つの対立遺伝子のうちの１つ（またはホモ接合個体に存在する単一の対立遺伝子）である。情報価値のあるドナー対立遺伝子は、ドナーに存在するがレシピエントには存在しない対立遺伝子である。
【０００９】
“クローン解析(clonal analysis)”という文脈中の用語“クローン”は、すべて単一
分子から誘導された分子の凝集体または集団を個別に解析することを表わす。たとえば、“クローン配列決定(clonal sequencing)”は、同一分子から誘導された各アンプリコン
を個別に配列決定することを表わす。
【００１０】
用語“ディープシーケンシング(deep sequencing)”は、ターゲット配列を単一検査に
おいて多数回読み取る配列決定方法を表わす。単一のディープシーケンシング工程は同一ターゲット配列について行なわれる多数の配列決定反応からなり、それぞれが独立した配列読出しを生じる。
【００１１】
“デジタル解析(digital analysis)”または“デジタル希釈(digital dilution)”という文脈中の用語“デジタル”は、試料中に存在する複数の個々の分子それぞれの解析を表わす。デジタル希釈は試料を複数の反応溶液に分布させることを表わし、その際、平均して１個以下の分子が各反応溶液中に存在する。ある例では、デジタル希釈により、デジタル読出し、たとえば個々の分子それぞれからイエス／ノーの結果を求めることができ、そしてクローン配列の数を計数することにより分子集団から得られたデジタル結果を表にまとめることができる。多数の個別反応溶液の場合、反応溶液当たり１個より多い分子を含むデジタル希釈は実際に定量の最大の正確度(accuracy)および精度(precision)をもたら
すことができる。
【００１２】
用語“ドナーＨＬＡ”配列および“ドナーのＨＬＡ配列”は、臓器ドナーに存在するＨＬＡ配列を表わすために互換性をもって用いられる。本発明の状況においては、臓器ドナーに存在するが臓器レシピエントには存在しないドナー配列を使用する。
【００１３】
用語“レシピエントＨＬＡ”配列および“レシピエントのＨＬＡ配列”は、臓器レシピエントに存在するＨＬＡ配列を表わすために互換性をもって用いられる。本発明の状況においては、臓器レシピエントに存在するが臓器ドナーには存在しないレシピエント配列を使用する。
【００１４】
用語“多型”は、ある集団にゲノム配列またはコードされるアミノ酸配列の２以上のバリアントがみられる状態を表わす。“一塩基多型”（ＳＮＰ）は、配列のバリエーションがゲノム配列中の１つの多型ヌクレオチド位置からなる多型である。
【００１５】
用語“遺伝子型”は、ある個体またはその個体に由来する試料に含まれる１以上の遺伝子の１以上の対立遺伝子の組合わせを表わす。
用語“ハプロタイプ”は、ある個体の同一染色体上に存在する１以上の遺伝子の１以上の対立遺伝子の組合わせを表わす。
【００１６】
用語“ＨＬＡ遺伝子の遺伝子型を決定する”は、ある対象におけるＨＬＡ対立遺伝子の選択された組合わせを決定することを表わす。たとえば、本発明において、“ＨＬＡ−Ａ遺伝子の遺伝子型を決定する”は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の１以上のエキソン、たとえばエキソン２、３および４中に存在する少なくとも１つの多型残基（対立遺伝子決定基）を同定することを表わす。同様にして、遺伝子ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＰＢ１、ＤＰＡ１、ＤＱＡ１およびＤＱＢ１の遺伝子型を決定できる。
【００１７】
用語“デジタルドロップレットＰＣＲ(digital droplet PCR)”または“ｄｄＰＣＲ”
は、試料のデジタル希釈から得られる複数の反応溶液(ドロップレット“droplet”)で実
施されるＰＣＲを表わす。
【００１８】
用語“ターゲット領域”は、核酸配列の解析すべき領域を表わす。
用語“核酸”は、天然および非天然の両方のヌクレオチド（たとえば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを表わす。この用語は、ポリマーの長さ（たとえば、モノマー数）により限定されることはない。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、一般に５’−３’  ホスホジエエステル結合を含むであろう；ただし、ある場合にはヌクレオチドアナログは他の結合をもつ可能性がある。核酸は天然塩基（アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）および非天然塩基を含むことができる。用語“非天然核酸”または“非天然ヌクレオチド”は、修飾された窒素塩基、糖またはホスフェート基を含むかあるいは非天然部分をその構造に取り込んだヌクレオチドを表
わす。非天然ヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、ビオチニル化、アミノ化、脱アミノ、アルキル化、ベンジル化および蛍光体標識ヌクレオチドが含まれる。
【００１９】
用語“プライマー”は、一般に適宜な緩衝液、核酸前駆体の存在および１以上の任意選択的補因子ならびに適切な温度を含めた適切な条件下で、核酸ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の開始点として作用する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を表わす。プライマーは一般に、ターゲット配列に対して少なくとも実質的に相補的である少なくとも１つのターゲットハイブリダイゼーション領域を含む。この領域は一般に約１５〜約４０ヌクレオチドの長さのものである。
【００２０】
プライマーの“アダプター領域”または“アダプター”という用語は、一般にプライマーのターゲットハイブリダイゼーション領域の５’側に位置する領域を表わす。一般にアダプターは後続の解析工程で機能を果たす。たとえば、アダプターは、増幅、たとえばエマルジョンＰＣＲに用いる微粒子または他の固体表面にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。アダプターは後続工程に用いるプライマー、たとえば配列決定用プライマーの結合部位としても作用できる。アダプター領域は一般に１５から３０までのヌクレオチド長さである。
【００２１】
用語“個別識別子タグ(individual identifier tag)”、“識別タグ(identification tag)”、“多重識別タグ(multiplex identification tag)”または“ＭＩＤ”は、本明細
書中で互換性をもって用いられ、特定の試料に由来するＤＮＡのマーカーとして作用するプライマー領域を表わす。
【００２２】
用語“増幅条件”は、核酸増幅反応（たとえば、ＰＣＲ増幅）においてプライマーのハイブリダイゼーションおよび鋳型依存性伸長を可能にする条件を表わす。用語“アンプリコン”は、ターゲット核酸配列の全部または一部を含み、いずれか適切な増幅方法によるインビトロ増幅の生成物として形成された核酸分子を表わす。多様なＰＣＲ条件が、PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990)に記載されている。
【００２３】
用語“熱安定核酸ポリメラーゼ”または“熱安定ポリメラーゼ”は、たとえば大腸菌(E. coli)由来のポリメラーゼと比較して高い温度で比較的安定であるポリメラーゼ酵素を
表わす。熱安定ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）に典型的な温度循環条件下で用いるのに適している。代表的な熱安定ポリメラーゼには下記に由来するものが含まれる：テルムス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、テルムス・カルドフィルス(Thermus caldophilus)、テルムス属種Ｚ０５(たとえば、U.S. Patent No. 5,674,738を参照)およびテルムス属種Ｚ０５変異株のポリメラーゼ、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、テルムス・フラブス(Thermus flavus)、テルムス・フィリホルミス(Thermus filiformis)、テルムス属種ｓｐｓ１７、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、ホットスプリング科(Hot Spring family)  Ｂ／クローン７、
バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・カルド
テナックス(Bacillus caldotenax)、テルモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)、テルモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)、テルモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)。
【００２４】
用語“試料”は、個体に由来する核酸を含有するかあるいは含有すると推定されるいずれかの組成物を表わす。本発明の状況において、その中のドナーＤＮＡを検出する試料はレシピエントの血液およびそれに由来する画分、たとえば血漿である。本明細書に開示す
る解析は血液から単離した血漿試料について実施されると理解される；すなわち、用語“患者の血液中に検出された”と“患者の血漿中に検出された”は互換性をもって用いられ、その血液が患者から得られ、それに由来する血漿を解析に用いることを意味する。たとえばドナーおよびレシピエントの遺伝子型を決定するための本発明の特定の観点について、他のいずれかのタイプの体液を使用でき、それには限定ではなく皮膚、血漿、血清、全血および血液成分、唾液、尿、涙液、精液、膣液、ならびに他の体液および組織（パラフィン包埋された組織を含む）が含まれる。試料は、個体から得られた細胞のインビトロ培養の構成要素および成分を含有する可能性もある。
【００２５】
核酸配列決定に関連して、用語“有効な読み(valid read)”は、特定のゲノム配列への割当てに成功した（エラーの補正ありまたは補正なしで）配列の読みを表わす。ＨＬＡ対立遺伝子に関して、有効な読みは、その試料中に存在すると予想されるＨＬＡ対立遺伝子の１つへの割当てに成功した（エラーの補正ありまたは補正なしで）配列の読みである。その試料中に存在すると予想されるいずれの対立遺伝子にも割り当てられなかった読みは無効な読みである。
【００２６】
本発明は、移植片拒絶または傷害の非侵襲的早期検出を実施するための、核酸のクローン解析、たとえばクローン配列決定法（次世代シーケンシング(Next Generation Sequencing)（ＮＧＳ）または大量並列シーケンシング(Massively Parallel Sequencing)（ＭＰ
Ｓ）)またはデジタルドロップレットＰＣＲ(digital droplet PCR)（ｄｄＰＣＲ）、あるいは入手できるようになるであろう他の手法であってデジタル読出しまたはクローン解析を含む手法の使用である。移植された固形臓器の拒絶またはそれに対する傷害が起きた場合、ドナー組織からのＤＮＡをレシピエントの血漿中に見出すことができると報告されている。本発明は、移植片レシピエントの血漿におけるドナー特異的ＤＮＡ配列の量および比率を正確に定量することを含む。移植片拒絶のためドナーＤＮＡのレベルが上昇した場合ですら、総血漿ＤＮＡのうち小割合（数パーセント以下）が移植片に由来するにすぎないと予想されるので、信頼性のある検査法は血漿ＤＮＡのデジタル解析を必要とする。ドナーＤＮＡは情報価値のある遺伝子マーカー、すなわちドナーとレシピエントの間で多型性であるマーカーの存在により同定される。たとえば、本発明は、多型遺伝子系、たとえばＨＬＡをターゲティングすることにより実施できる。
【００２７】
本発明は、固形臓器移植片拒絶の発症または進行を検出またはモニタリングする方法であって、移植片レシピエントの血液または血漿をドナー由来のＨＬＡ核酸配列について検査し、ドナー由来の配列が見出されれば移植片拒絶と診断することを含む。本発明は、場合により、レシピエントの血液または血漿中のドナーＨＬＡ核酸配列の量および割合を定量し、その割合が移植に成功したレシピエントに由来する試料の解析により決定した閾値より高ければ移植片拒絶と診断することを含む。本発明はさらに、移植片レシピエントの血液または血漿をドナー由来のＨＬＡ核酸配列について反復検査することにより移植片拒絶の発症または進行について患者をモニタリングし、ドナー由来配列の量または割合が増大していれば移植片拒絶と診断することを含む。
【００２８】
本発明は、ヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen)（ＨＬＡ）遺伝子座のユニーク
な特性を利用することにより固形臓器の移植片拒絶または傷害を早期検出する方法を提供する。ＨＬＡ遺伝子座の遺伝子（ＨＬＡ遺伝子）はヒトゲノムにおいて最も多型性のものである。ＨＬＡ遺伝子座は、染色体６の短腕上の約３５００万塩基対の範囲に及ぶ。主領域はクラスＩおよびクラスＩＩ領域である。クラスＩ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃであり、主要クラスＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲである。タンパク質レベルで発現する多型性はＨＬＡ抗原のアミノ酸配列に反映され、したがって移植のための組織型判定にとって大きな関心がある。これらの多型は主に、クラスＩＩ遺伝子についてはエキソン２に、クラスＩ遺伝子についてはエキソン２お
よび３に局在する。可能であれば一般に特定のＨＬＡ遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＤＲ）は移植の前にドナーとレシピエントの間でマッチさせるので、本発明の状況では有用ではない可能性がある。他のＨＬＡ遺伝子座、たとえばＤＰ遺伝子座は一般にマッチングに含まれず、したがって特定のドナー−レシピエント対について情報価値をもつ可能性がある。本発明は、情報価値がある少なくとも１つの遺伝子座を大部分のドナー−レシピエント対に見出すことができるように、複数のＨＬＡ遺伝子座の利用を可能にする。
【００２９】
検出すべきターゲットドナー配列としてのＨＬＡ遺伝子座の選択は、既存の文献に記載されたターゲットよりはるかに優れている。たとえば、Ｙ染色体配列を検出する方法は同性ドナーおよびすべての雄性レシピエントを除外する。これと対照的に、ＨＬＡ遺伝子は常染色体（染色体６）にあるので、すべての組合わせの性において検出できる。さらに、ＨＬＡベースの方法は個別の一ヌクレオチド相異（ＳＮＰ）をターゲティングする方法より優れている。大部分の増幅および配列決定技術はエラープローン（エラー誘発型）であるので、検知された一ヌクレオチド変異は時にはアーチファクトであって真のＳＮＰではないことがある。これと対照的に、ＨＬＡ対立遺伝子は互いに多数のヌクレオチドが相異する。したがって、ＨＬＡ遺伝子座内の対立遺伝子の検出を含む方法は、非ＨＬＡ遺伝子座をターゲティングする方法と比較してエラーを生じにくい。現在入手できるＨＬＡ遺伝子型判定方法、たとえばクローン配列決定を用いるものは、エキソン内の多重連鎖多型(multiple linked polymorphism)のフェーズを設定でき、各ＨＬＡ対立遺伝子の明瞭な配列決定が可能になる。この特徴がドナーＤＮＡをレシピエントＤＮＡから区別する正確度をさらに付加し、ドナーＤＮＡの量が正確に定量される。
【００３０】
本発明は、移植片レシピエントの血液または血漿中に存在する無細胞ＤＮＡ中の移植片ドナーＨＬＡ配列を検出および定量することにより、移植片拒絶または移植片傷害を診断する方法である。ある態様において、この方法はさらに、レシピエントの血液または血漿中のドナーＤＮＡの量または濃度をモニタリングし、増大が検出されればその移植片レシピエントは移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があると同定することを含む。ある態様において、本発明はさらに予備工程、すなわち１以上のＨＬＡ遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントのＨＬＡ遺伝子型の決定を含む。本発明のある態様、たとえばクローン配列決定において、この工程は任意選択的である；クローン配列決定方法は、ドナーとレシピエントの間でマッチングさせなかった多型ＨＬＡ遺伝子座について多数のＨＬＡ配列（レシピエントのもの）および存在すれば少数のＨＬＡ配列（ドナーのもの）を解明するからである。
【００３１】
情報価値があるＨＬＡ遺伝子座を確実に見出すために、ある態様において、本方法は、１より多いＨＬＡ遺伝子座、すなわち多型ＨＬＡ遺伝子座の組合わせを検査および検出することを含む。多型ＨＬＡ遺伝子または遺伝子座もしくは遺伝子座の組合わせをいずれも本発明の方法について使用できる。ある態様において、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子組合わせはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１から選択される。ある態様において、ＨＬＡ遺伝子の特定のエキソンまたはエキソンの一部（またはその組合わせ）をターゲティングする：たとえば、ＤＱＡ１：エキソン２；ＤＱＢ１：エキソン２および３；ＤＰＡ１：エキソン２；ＤＰＢ１：エキソン２；ＤＲＢ１：エキソン２、ＤＲＢ３：エキソン２；ＤＲＢ４：エキソン２；ならびにＤＲＢ５：エキソン２。他の態様において、多型ＨＬＡ遺伝子配列は、イントロン配列、またはエキソン配列とイントロン配列の組合わせを含む。
【００３２】
本発明は、移植片レシピエントの血漿中に存在するＤＮＡ中の多型ＨＬＡ遺伝子座の検出を含む。ヒト血漿中に存在するＤＮＡの多くはアポトーシスを受けている細胞に由来し
、１８０塩基対より短いかまたはそれに等しいと報告されている。このサイズは１つのヌクレオソームを囲むＤＮＡフラグメントに相当する；たとえばWO2013060762を参照：それには、ヒト血漿から単離されたＤＮＡのサイズが８５〜２３０塩基対の範囲であり、平均１４２塩基対であると報告されている。先行技術における知識および初期実験に基づいて、本発明者らは、移植片を拒絶している臓器移植片レシピエントの血漿中に存在するドナーＤＮＡも小さい可能性があると仮定した。本発明に用いる短いサイズの鋳型ＤＮＡは特別な問題を提起する。短いアンプリコンが得られるにすぎないので、検出できる多型の数が限られる。しかし、本発明者らは、適切なプライマー、たとえば表１に挙げるものを設計することにより、この問題を克服した。
【００３３】
ある態様において、複数のＨＬＡ遺伝子または遺伝子座を、遺伝子パネルの形の同一反応において解析する。１態様において、このパネルは、緊密に連鎖してはおらずかつ連鎖不平衡状態にはないＨＬＡ遺伝子配列を含む。この方法は、ドナーおよびレシピエントの厳密なＨＬＡ遺伝子型が決定されていない場合に特に有利である：幾つかの連鎖していない遺伝子座の採用は、少なくともある遺伝子座は情報価値があることを確実にする（すなわち、レシピエントに存在しない対立遺伝子がドナーに存在する状態での、ドナーとレシピエントの間の多型）。たとえば、この態様の変法において、遺伝子ＤＰＢ１、ＤＱＢ１およびＤＲＢ１由来の配列を同時に解析する。他の態様において、このパネルは、強い連鎖不平衡状態にある、緊密に連鎖した遺伝子配列から形成される。この方法は、実験エラー、たとえばレシピエントの配列にレシピエントの対立遺伝子とは異なる既知のＨＬＡ対立遺伝子に対応する配列を作り出す配列決定エラーを確実に認識して、“信号”ではなく“ノイズ”として廃棄する。たとえば、ＤＱＡ１遺伝子座からの配列の読みがレシピエントの対立遺伝子と１塩基異なれば、これらは原則として未知のドナー対立遺伝子を反映しているか、あるいはこれと対照的にレシピエントの対立遺伝子における配列決定エラーを反映している可能性がある。これらの非−レシピエントＤＱＡ１配列が実際にドナーＤＮＡ由来であれば、既知の連鎖不平衡パターンに基づいて、そのドナーは特定のＤＱＢ１またはＤＲＢ１対立遺伝子をもつと予想するであろう。非−レシピエントＤＱＡ１配列が実際には配列決定エラーであれば、レシピエントのＤＱＢ１またはＤＲＢ１配列における独立した配列決定エラーが予想のＤＱＢ１またはＤＲＢ１対立遺伝子を作り出す可能性はきわめて低い。これにより、ドナーおよびレシピエントの遺伝子型が未知であればドナー対立遺伝子を区別でき、エラーにより既知のＨＬＡ対立遺伝子に対応する配列が生じたのであればドナー対立遺伝子をレシピエントの対立遺伝子における配列決定エラーから区別できる。本発明の１態様は、互いに連鎖不平衡状態にある２以上の対立遺伝子および残りのものと連鎖不平衡状態にない少なくとも１つの対立遺伝子を含むＨＬＡ対立遺伝子の組合わせを検出することを含む。たとえば、この態様の変法において、遺伝子ＤＰＢ１、ＤＱＢ１およびＤＲＢ１由来の配列が同時に解析される。
【００３４】
複数の遺伝子座の同時解析は、並行反応において、または個別の反応を１つの多重反応、たとえば数種類の増幅プライマーが同一反応溶液中に存在するゲノムＰＣＲに組み合わせることにより、実施できる。ある態様において、本発明の方法は、試料中のレシピエントおよびドナーＨＬＡ対立遺伝子の定量検出を可能にする配列決定工程を含む。
【００３５】
この態様において、本方法はクローン解析によって可能となる精度を利用する；レシピエントの血漿または血液中の総ＤＮＡのうちわずかな割合（数パーセント）がドナーに由来するにすぎないと予想されるからである。適切な１方法はクローン配列決定による“ディープシーケンシング”であり、これは大量並列シーケンシング（ＭＰＳ）または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）としても知られている。次世代シーケンシング方法は数百の単一ＤＮＡ分子を並行してクローン増幅させる。各クローン集団を次いで個別に配列決定する。時にはＮＧＳ（ＭＰＳ）方法はクローン配列決定と呼ばれる。技術の進歩によって、はるかに長い、最大２５０以上のヌクレオチド、より最近では最大７００ヌクレオチドの
配列読取りが可能になった。しかし、健康な個体の血漿中の無細胞ＤＮＡは短いフラグメントで存在し、大部分は１５０塩基対を超えない長さである(参照：WO2013060762)。そのような短いターゲット配列については、既存の配列決定技術の粗雑な性能が確認される。
【００３６】
ある態様において、本発明方法のディープシーケンシング工程は任意選択的なターゲット濃縮工程を含む。ある態様において、ターゲット濃縮工程は増幅工程を含む。他の態様において、他のターゲット濃縮方法、たとえばライブラリーベースまたはプローブベースのターゲット濃縮方法を用いる；たとえば、U.S. Patent No. 7,867,703または8,383,338に記載。少なくとも１ラウンドの増幅、たとえば第１ラウンドは、当技術分野で既知のいずれかの方法により実施できる。ある態様において、１ラウンドより多い、たとえば２ラウンドの増幅を実施する。この態様の変法において、後続ラウンドの増幅、たとえばＰＣＲによる増幅は同一プライマーを用いて実施される。この態様の他の変法において、プライマーはＨＬＡ配列内へ３’方向にさらに伸びることによって（ネスティッドプライマー(nested primer)）、あるいは５’末端に追加配列、たとえば非ＨＬＡ配列をもつことに
よって異なる。
【００３７】
ある態様において、濃縮したターゲットを当技術分野で既知のいずれか適切な方法によりクローン増幅する。ある態様において、クローン増幅は、U.S. App. Ser. No. 12/245,666に詳細に記載されたエマルジョンＰＣＲを含む。簡単に述べると、エマルジョンＰＣ
Ｒに際して、前ラウンドの増幅からのアンプリコンを、そのアンプリコンにハイブリダイズする（たとえば、前ラウンドの増幅に用いたプライマーのアダプター領域にハイブリダイズすることにより）ことができるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした固相（たとえば、ビーズ）と接触させる。その結果、ビーズはビーズ上に存在するアダプター領域にハイブリダイズした状態でアニールしたアンプリコンを保有する。ビーズを次いで水溶液に懸濁し、油を添加してエマルジョンを調製する。各ビーズはクローンラウンドの増幅を実施するために必要なすべての試薬を収容した、油封入されたマイクロドロップレット中に懸濁した状態になる。各マイクロドロップレットは増幅反応のための反応チャンバーを内封している。この態様の変法において、２タイプのビーズを用いる：１タイプはアンプリコンの二本鎖のうちのひとつにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている；第２タイプはアンプリコンの他方の鎖にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている。他の態様において、クローン増幅は二次元表面ベースの（たとえば、スライドベースの）増幅を含む；たとえば、U.S.
Pat. No. 7,835,871、8,244,479、8,315,817および8,412,467に記載。一般に、入手可能なあるいは入手可能になるであろうクローン増幅方法はいずれも本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
ある態様において、レシピエントの血漿試料におけるドナーＤＮＡの存在および量を決定するために用いるクローン法はデジタルドロップレットＰＣＲである。デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、きわめて低い濃度ですら試料中のターゲット核酸の絶対測定を可能にする。ｄｄＰＣＲ法は、デジタル希釈またはドロップレット作製、ＰＣＲ増幅、検出、および（任意選択的に）解析の工程を含む。ドロップレット作製工程は、それぞれが核酸増幅の実施に必要な試薬を収容した複数の個別反応溶液（ドロップレット）の作製を含む。ＰＣＲ増幅工程は、ドロップレット（または、ドロップレットを沈着させた、より大きな反応溶液）に、核酸ターゲットを増幅してアンプリコンを作製するのに適したサーモサイクリング条件を施すことを含む。検出工程は、アンプリコンを含むかまたは含まないドロップレット（または、ドロップレットを沈着させた、より大きな反応溶液）の同定を含む。解析工程は、たとえば試料中のターゲット核酸の濃度、絶対量または相対量（他のターゲットに対比したもの）が得られる定量を含む。
【００３９】
ｄｄＰＣＲ工程は手動で（すなわち、一般的なデバイスを用いて）、あるいは専門化さ
れたデバイス、たとえばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ．（カリフォルニア州ハーキュリーズ）もしくはＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈ．（マサチュセッツ州ビレリカ）から入手できるｄｄＰＣＲデバイス、または入手できるかもしくは入手できるようになるであろう同様なデバイスを用いて実施できる。ある態様において、全ｄｄＰＣＲ工程を専門化されたデバイスで実施する。他の態様において、１以上の工程、たとえばデジタル希釈、サーモサイクリング、検出および解析を、たとえば手動または自動のジェネリックなピペッティングデバイス、サーモサイクラー、電気泳動デバイスなどから選択されるジェネリックなデバイスを用いて実施する。
【００４０】
ｄｄＰＣＲ生成物の検出は、核酸を検出するためのいずれかのジェネリックまたは配列特異的な手段により実施できる。検出は反応溶液内で、または電気泳動もしくはクロマトグラフィーなどの追加工程の後に行なうことができる。検出は増幅中に（リアルタイムＰＣＲ）または増幅終了後に（エンドポイントＰＣＲ）行なうことができる。検出可能な標識をＰＣＲ試薬、たとえばプライマーまたはプローブにコンジュゲートさせることができる。用いる標識は、分光分析、光化学、生化学、免疫化学、化学その他の手法により検出できる。具体的には、有用な標識には下記のものが含まれる：放射性同位体、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡに一般に用いられるもの）、ハプテン、およびそれについて抗血清またはモノクローナル抗体が得られるタンパク質。標識されたＰＣＲ試薬の代わりとして、ＰＣＲ後に、別個の標識試薬、たとえば配列特異的標識プローブを用いて検出を実施できる。あるいは、非特異的的な核酸検出方法、たとえば電気泳動に続く染色を使用できる。
【００４１】
配列決定法とは異なり、本明細書に開示するｄｄＰＣＲベースの方法は、ドナーとレシピエントの間でＨＬＡ遺伝子座が情報価値をもつ（すなわち、多型性である）知識を利用する。ある態様において、本方法はドナーおよびレシピエントを遺伝子型判定して情報価値のあるＨＬＡ遺伝子座を同定する第１工程を含む。そのような情報を入手できれば、単一セットのＰＣＲ試薬を用いて、情報価値があると同定されたＨＬＡ遺伝子座をレシピエントの血漿試料においてターゲティングすることができる。あるいは、ドナーの情報なしに、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１から選択される１以上の遺伝子座を用いて、ドナーとレシピエントの間で少なくとも１つの遺伝子座が多型であってドナーＤＮＡが検出されることを期待して、レシピエントの試料をｄｄＰＣＲ解析することができる。
【００４２】
本発明の方法におけるクローン解析は、ＨＬＡ遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１の配列の一部をターゲティングする（すなわち、特異的にハイブリダイズして増幅することができる）プライマーの使用を含む。ある態様において、プライマーはＨＬＡ遺伝子の特定のエキソンまたはイントロンをターゲティングする：たとえば、ＤＱＡ１：エキソン２；ＤＱＢ１：エキソン２および３；ＤＰＡ１：エキソン２；ＤＰＢ１：エキソン２；ＤＲＢ１：エキソン２、ＤＲＢ３：エキソン２；ＤＲＢ４：エキソン２；ならびにＤＲＢ５：エキソン２。他の態様において、一対のプライマーがエキソン配列とイントロン配列の組合わせをターゲティングする。ある態様において、表１に挙げる１以上のプライマーを用いる。表１に示すように、あるプライマーは遺伝子特異的であり、すなわち１種類のＨＬＡ遺伝子のみから配列を増幅することができる。他のプライマーは一般的なものであり、すなわち１種類より多いＨＬＡ遺伝子から配列を増幅させることができる。
【００４３】
一般に、ＨＬＡプライマーはＨＬＡエキソン全体の配列を増幅および検出することを目標とする。ペプチド結合溝をコードするＨＬＡエキソンの平均サイズは、約２７０塩基対である。したがって、一般的なＨＬＡ遺伝子型判定アッセイは約２５０塩基対のアンプリコンを伴なう(Bentley, G., et al., (2009) High resolution, high throughput HLA ge
notyping by next-generation sequencing, Tissue Antigens, 74:393)。これと対照的に（血液または血漿中にみられるＤＮＡはフラグメント化しているという性質のため）、本発明におけるプライマーは１５０塩基対より長くないフラグメントの配列を増幅および検出することを目標とする。本発明に用いるプライマーは、短い無細胞ＤＮＡを増幅する能力と、ＨＬＡ遺伝子の情報価値のある（すなわち、最も多型性である）領域をターゲティングする能力を独特に兼ね備えている。ある態様において、本発明は、表１に挙げるＨＬＡハイブリダイゼーション領域をもつ少なくとも１つのプライマーを含むプライマーを用いて実施される。
【００４４】
【表１】
0006302048.tif 000002
【００４５】
＊  Ｓ＝ＣまたはＧ。プライマー試料は、指示した位置にＣまたはＧを含む等量のオリゴヌクレオチドの混合物を含有する
クローン配列決定のある態様において、アンプリコンを塩基挿入法(base-incorporation method)、たとえばパイロシーケンシング法(pyrosequencing method) (U.S. Pat. No. 6,274,320、6,258,568および6,210,891)；水素イオン検出法（ＩＳＦＥＴ）(たとえば、U.S. Pat. No. 8,262,900)、または色素−ターミネーター検出法(U.S. Pat. No. 7,835,87
1、8,244,479、8,315,817および8,412,467)により配列決定する。
【００４６】
本発明の方法により作製したＨＬＡ配列決定データは、個々のＤＮＡ分子のＨＬＡ配列を含む。本発明の方法に用いた一般的なＮＧＳ機器（たとえば、ＧＳファミリー，４５４
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州ブランフォード；ＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＮ（登録商標）およびＰＧＭ（商標），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド；ＨＩＳＥＱ（登録商標）およびＭＩＳＥＱ（登録商標），Ｉｌｌｕｍｉｎａ，カリフォルニア州サンディエゴ）は、試料中に存在する各配列、たとえば試料中に存在する同一遺伝子座における各ＨＬＡ対立遺伝子配列を定量および検出できるデータ解析モジュールを含む。ドナーおよびレシピエントの対立遺伝子配列に対応する読みの数を次いで計数して、試料中のドナー対立遺伝子の存在および量を決定し、それにより移植片拒絶または傷害を検出する。
【００４７】
コンピューター処理工程は一般に、ソフトウェアプログラムの機能を実行できるコンピューターにより実施される。本発明は、クローン配列決定により作製された個々の核酸配列の読みを解析するために入手できるかまたは入手できるようになるであろういずれか適切なソフトウェアを用いて実施できる。ソフトウェアは、ＨＬＡ配列の解析およびＨＬＡ遺伝子型の割当てに独特に適した特定の特徴をもつことができる。たとえば、ソフトウェアは試料から得られた配列の読みを既知のＨＬＡ対立遺伝子のデータベースと比較することができる。そのようなデータベースの一例は、European Molecular Biology Laboratory（ＥＭＢＬ）が管理しているＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースである；参照：Robinson et al. (2003) IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex, Nucleic Acids Research, 31:311。ＨＬＡ配列の読
みを解析するための一般的なソフトウェアは、試料中に存在する読みのうち多数グループを同定する。一般的なヒト試料には、検査した各ＨＬＡ配列につき４以下のグループの配列読み、すなわち同一遺伝子座の２つのＨＬＡ対立遺伝子それぞれについてフォワード読みおよびリバース読みが存在する（試料がホモ接合個体に由来するものであれば、２つの配列のみが存在するであろう）。本発明の状況において、ソフトウェア（プレプログラミングされたもの、またはユーザーインターフェースを通してユーザーが入力したもの）は、第３およびおそらく第４の対立遺伝子、すなわち試料中に存在する同一遺伝子座のドナーＨＬＡ対立遺伝子を同定する追加機能を行なう。ソフトウェア（プレプログラミングされたもの、またはユーザーインターフェースを通してユーザーが入力したもの）は、低濃度（一般に１％〜５％）で存在する少数のドナー対立遺伝子を、たとえばＰＣＲ誤取込み、配列決定エラー、関連の偽遺伝子、試料中の微量の混在ＤＮＡなどによるアーチファクトからユーザーが区別できるものでなければならない；これらは一般にドナー対立遺伝子より低い濃度、たとえば≪０．５％で存在する。
【００４８】
ある態様において、ソフトウェアは配列の読みをＨＬＡ配列データベースと比較し、２つ（または、ホモ接合レシピエントの場合は１つ）の最も多量に存在する配列を特定のＨＬＡ遺伝子座におけるレシピエントの対立遺伝子として同定する。本発明の範囲を限定するためではなく例示にすぎないが、Ｃｏｎｅｘｉｏ  ＨＬＡ遺伝子型判定ソフトウェア（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｔｄ．、オーストラリア、パース）は、アラインさせた連結配列(consolidated sequence)の読みを特定のアンプリコン（たとえば、ＤＱ
Ｂ１  エキソン２）についての基準配列と比較し、観測された配列の読みをＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースと比較する。そのアンプリコンに対応するすべての読みがＤＱＢ１
エキソン２“ビン(bin)”に選別され、そのソフトウェアはいずれの１つの試料につい
ても２つの対立遺伝子配列のみ（２つのフォワード読みおよび２つのリバース読み）があると仮定する。これらの配列を“マスターレイヤー(Master Layer)”に選別し、遺伝子型割当てに用いる。人工物または混在物に対応する他のすべての配列の読み（一般に真の対立遺伝子よりはるかに少量存在する）を、“フェイルドレイヤー(Failed Layer)”に選別
し、遺伝子型割当てには用いない。
【００４９】
本発明方法は、試料中に存在する１より多い遺伝子型、すなわち２より多い対立遺伝子を検出する必要がある。ある態様において、ソフトウェア（プレプログラミングされたもの、またはユーザーインターフェースを通してユーザーが入力したもの）は、多数成分および少数成分を同定して、あるアンプリコン、たとえばＤＱＢ１遺伝子座に対応する異なる対立遺伝子グループを表わす複数の“ビン”内へ選別する。たとえば、ＤＱＢ１  エキソン２について１つの“ビン”だけがあるのではなく、本方法はＤＱＢ１遺伝子座における複数の対立遺伝子について複数の“ビン”（たとえば、ＤＱＢ１＊０１：０１、＊０２：０１、＊０３：０１、など）を作成することを含む。ある態様において、２より多い、たとえば３、４、５、６つのビンを作成する。ＨＬＡタイプの少数成分に対応する配列は、適宜なビンに選別される。ノイズ（すなわち、ＰＣＲおよび配列決定のエラー、偽遺伝子など）は、やはり一般に各ビンについてフェイルドレイヤーに選別される。この工程は、対立遺伝子の多数成分（レシピエントの対立遺伝子）の迅速同定、および少数成分（ドナーの対立遺伝子）に対応する読みの同定を可能にする。特に、この方法はドナーおよびレシピエントの遺伝子型が未知である場合ですらドナー対立遺伝子の同定に適切である。ある態様において、ドナーおよびレシピエントの遺伝子型は既知である。そのような態様においては、特定のドナーおよびレシピエントの対立遺伝子を同定および計数し、それらとは異なるすべての読みを“フェイルド(failed)”読みとして廃棄するように、ソフトウェアを改変することができる。
【００５０】
クローン配列決定のある態様において、本方法は、たとえばＰＣＲ誤取込み、配列決定エラー、関連の偽遺伝子、試料中の微少な混在ＤＮＡなどによるアーチファクトから生じるエラーを最小限に抑える工程を含む。ＰＣＲまたは配列決定のエラーが対立遺伝子を他の既知のＨＬＡ対立遺伝子に“変換する”可能性がある。この事象は稀である、すなわちドナー対立遺伝子の頻度よりはるかに低い頻度であると予想されるが、ある態様において、本発明の方法はそのようなエラーを最小限に抑える工程を含む。たとえば本方法は、強い連鎖不平衡状態にある遺伝子、たとえばＤＱＡ１およびＤＱＢ１について、２つのアンプリコンの解析を含むことができる。エラーが多数の対立遺伝子をＤＱＢ１について既知の非レシピエント対立遺伝子に対応する配列に変換したとすれば、ランダムエラーが同様にレシピエントのＤＱＡ１対立遺伝子を人工的なＤＱＢ１対立遺伝子と連鎖不平衡状態にあるＤＱＡ１対立遺伝子に変換するという可能性はきわめて低い。
【００５１】
１態様において、本発明は、レシピエントの血液または血漿試料においてドナーＨＬＡ核酸を検出し、かつ場合により定量することにより、移植片拒絶または傷害を検出する方法である。本発明はさらに、レシピエントの血液または血漿試料においてドナーＨＬＡ核酸を定量または定量検出することにより、移植片拒絶をモニタリングし（すなわち、変化を検出し）、ドナー核酸の増加が検出されれば移植片拒絶の発症または進行と診断することを含む。本方法は、場合により、少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を定量検出し、同一遺伝子座における少なくとも１つのレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を定量検出し；ドナーおよびレシピエント対立遺伝子の量を用いて試料中のドナーＤＮＡの割合を決定し、あるいはドナーＤＮＡの割合が特定の閾値に達したかまたはそれを超えたかを判定し、それにより移植片拒絶を検出することを含む。閾値は、移植片拒絶を伴なう、および伴なわない、統計的に有意数の移植片レシピエントを探索し、移植片レシピエントの血液または血漿における移植成功と相関するドナー核酸の割合について最大値を決定することによって実験的に決定できる。ある態様において、少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１対立遺伝子から選択され、特に、ある態様において、対立遺伝子はＤＱＡ１：エキソン２；ＤＱＢ１：エキソン２および３；ＤＰＡ１：エキソン２；ＤＰＢ１：エキソン２；ＤＲＢ１：エキソン２、ＤＲＢ３：エキソン２；Ｄ
ＲＢ４：エキソン２；ならびにＤＲＢ５：エキソン２、またはこれらの遺伝子に由来するイントロン配列、もしくはエキソン配列とイントロン配列の組合わせから選択される配列を含む。ある態様において、定量検出はクローン配列決定を含む。ある態様において、本方法は配列決定の前にターゲット濃縮工程を含む。この態様の変法において、濃縮はＤＮＡ増幅により実施される。この態様の他の変法において、濃縮はターゲット捕獲により実施される。ｄｄＰＣＲを用いる場合、決定工程は、同一遺伝子座におけるレシピエントのＨＬＡ対立遺伝子（単数または複数）の濃度に対するドナーＨＬＡ対立遺伝子（単数または複数）の濃度の比を計算することを含む。
【００５２】
本発明を単一の技術または機器に限定するのではなく例示にすぎないが、本方法の態様は下記を含めたＧＳファミリーの配列決定機器を用いて後記のように実施できる：ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ＋（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）またはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州ブランフォード）。ドロップレットデジタルＰＣＲは、後記の実施例に記載するようにＱｕａｎｔａ  Ｌｉｆｅ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ．，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて実施できる。核酸のデジタル解析またはクローン解析のために入手できるかまたは入手できるようになるであろう他の機器およびシステムも、本発明において考慮される。
【００５３】
１態様において、ターゲット濃縮工程および配列決定工程は下記を含む：（ａ）第１増幅反応において、多型部位を含む１以上のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１遺伝子のエキソンまたはイントロンを、５’から３’プライム方向に挙げる下記を含む増幅プライマーを用いて増幅する：アプタマー配列、およびＨＬＡハイブリダイゼーション配列；（ｂ）第２増幅反応において、エマルジョンＰＣＲを実施する；（ｃ）工程（ｂ）で得られた各アンプリコンの配列を、パイロシーケンシング法を用いて決定する；（ｄ）工程（ｃ）で決定したＨＬＡアンプリコンの配列を既知のＨＬＡ配列と比較することにより、ＨＬＡ対立遺伝子をレシピエントまたはドナーに割り当てて、どのＨＬＡ対立遺伝子がレシピエントの血液または血漿中に存在するかを判定する；（ｅ）１以上のＨＬＡ対立遺伝子について、工程（ｃ）で得られた対立遺伝子それぞれに対応するドナーおよびレシピエントの配列決定の読みの数を定量する；そして（ｆ）工程（ｅ）で得られた量を用いて、レシピエントの読みに対する、または読みの総数からバックグラウンドを差し引いたものに対する、または読みの総数に対する、ドナーの読みの比を計算することにより、レシピエントの血液または血漿中に存在するドナーＤＮＡの割合を決定する。
【００５４】
この態様の変法において、本方法は工程（ａ）の後に多数の個体に由来するアンプリコンをプールし、そして配列決定工程（ｂ）〜（ｃ）を多数の個体に由来するアンプリコンのプールについて実施することを含む。この変法において、増幅プライマーはさらに個体識別タグを含み、これは多重識別(multiplex identification)（ＭＩＤ）タグとしても知られる。
【００５５】
他の態様において、工程（ｂ）〜（ｅ）またはそれらと均等な工程は、入手できるいずれかのディープシーケンシングの手法および機器（すなわち、デジタル配列読出しが可能な手法および機器）を用いて実施される。限定ではなく、機器の例には、ＧＳファミリーの機器（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州ブランフォード）；ＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＮ（登録商標）ならびにＰＧＭ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）；ＨＩＳＥＱ（登録商標）およびＭＩＳＥＱ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，カリフォルニア州サンディエゴ）、またはそれを改良および改変したものが含まれる。
【００５６】
ある態様において、移植片拒絶の発症または進行の検出は、ドナー核酸の割合を定量することを含む。割合の決定は、少なくとも１つのドナー対立遺伝子に対応する読みを、その試料から得られた同一遺伝子座におけるすべての読みの和と、または同一遺伝子座における少なくとも１つのレシピエントの対立遺伝子に対応する読みと、比較することを含む。理解しやすくするために、本明細書中で用いる用語“読み”は、レシピエントまたはドナーのＨＬＡ対立遺伝子が検出された配列決定の読みと他のいずれかのクローン法による読み（たとえば、デジタルドロップレットＰＣＲにおけるドロップレット）の両方を包含する。ある態様において、比較工程は、その試料から得られた同一遺伝子座におけるすべての読みの和に対する、単一のドナー対立遺伝子に対応する読みの比の２×を計算することを含む。他の態様において、比較工程は、その試料から得られた同一遺伝子座における単一のレシピエント対立遺伝子に対応する読みに対する、単一のドナー対立遺伝子に対応する読みの比を計算することである。１もしくは２つのドナー対立遺伝子、および１もしくは２つのレシピエント対立遺伝子、またはすべての対立遺伝子を用いる同様な比が、遺伝学技術分野の専門家に容易に認識されるであろう。たとえば、１態様において、（同一遺伝子座に４つの異なる対立遺伝子をもつヘテロ接合性のドナーおよびレシピエントを想定して）、レシピエント対立遺伝子の１つについての読みの数がＲであり、ドナー対立遺伝子の１つについての読みの数がＤであれば、ドナー割合(donor fraction)（ＤＦ）は式１に従って決定できる：
ＤＦ＝Ｄ／（Ｒ＋Ｄ）          式１
他の態様において、それぞれの対立遺伝子についての読みをフォワードとリバースの配列決定読みに分割することができる。その場合、ドナー割合（ＤＦ）をリバース割合とフォワード割合の平均として式２に従って決定することができる：
ＤＦＲ＝ＤＲ／（ＲＲ＋ＤＲ）          ＤＦＦ＝ＤＦ／（ＲＦ＋ＤＦ）
ＤＦ＝（ＤＦＲ＋ＤＦＦ）／２          式２
同一遺伝子座における１または２つのドナー対立遺伝子Ｄ（またはＤ１、Ｄ２）および１または２つのレシピエント対立遺伝子Ｒ（またはＲ１、Ｒ２）（または、ホモ接合性個体の場合は単一の対立遺伝子）を用いる同様な任意数の式を遺伝学の専門家は考案することができ、それらは本発明の範囲内である。
【００５７】
さらに他の態様において、幾つかのＨＬＡ遺伝子座を解析することができる。それぞれの遺伝子座からの読みを用いて、式１もしくは式２または類似の式に従ってドナーＤＮＡの割合を計算することができ、それぞれの遺伝子座について得られたドナー割合を平均してドナー割合の推定値を求めることができる。
【００５８】
他の態様において、本発明は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子座のハイスループット遺伝子型判定を用いて、重症複合型免疫不全(Severe Combined Immunodeficiency)（ＳＣＩＤ）小児の血液中の母性細胞の比率を推定する方法である。この態様の変法において、本方法は、大量並列シーケンシング（たとえば、下記を含むＧＳファミリーの配列決定機器を使用；ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ＋（登録商標）、ＧＳ  ＦＬＸ  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）またはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州ブランフォード））、ならびにＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子座の高分解ハイスループット遺伝子型判定に適したソフトウェア（たとえば、Ｃｏｎｅｘｉｏ）の使用を含む。この態様のさらなる変法において、非遺伝性の母性対立遺伝子に対応するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子配列の読みを計数することにより、ＳＣＩＤ小児の血液を解析して母性細胞の割合を推定する。
【実施例】
【００５９】
実施例１：次世代シーケンシングによるレシピエント血漿中のドナーＤＮＡの検出
試料採集およびＤＮＡ精製
腎移植片のヒトレシピエントから試料を採集した。ＤＮＡを下記に従って調製した。全
血を血漿調製チューブ（ＰＰＴ）に採集し、２時間以内に処理した。血漿の分離を、ＢＤ
Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＰＰＴ（商標）血漿調製チューブまたはＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州フランクリンレイクス）のいずれかについての製品添付文書に従ってクエン酸ナトリウムを用いて実施し、次いで凍結保存した。
【００６０】
８０００ｇで５分間の遠心により融解した後、血漿からＤＮＡを調製した。次いで上清を分離し、１６０００ｇでさらに５分間遠心した。２ｍＬの血漿からのＤＮＡ抽出を、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，インディアナ州インディアナポリス）を用いて実施した。ＤＮＡを約３４μｌの水で溶離し、Ｑｕｉｂｉｔ  ＨＳ  ＤＮＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーン）により定量した。
【００６１】
４５４  ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）による血漿からの無細胞ＤＮＡのディープシーケンシング
個別の２５μｌ反応において、１〜１０ｎｇのＤＮＡ鋳型ならびに各１０ｐｍｏｌｅのフォワードおよびリバースプライマー（表１）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、各１５０μＭのｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＵＴＰ、グリセロール１０％  ｗ／ｖ、ならびにＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を実施した。サーマルサイクリング条件は下記のとおりであった：９５℃−１０分；３１サイクルの９５℃−１５秒，６０℃−４５秒，７２℃−１５秒；７２℃−５分；ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州フォスターシティー）。
【００６２】
ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）機器に用いたプライマーは５’−３’方向に下記の配置をもっていた：アダプター−キータグ−ＭＩＤ−ＨＬＡハイブリダイゼーション配列。アダプター、キータグおよびＭＩＤ配列は、製造業者の推奨に従って設計された。
【００６３】
アンプリコンのクリーンアップ、定量、希釈およびプーリングを下記に従って実施した。短い非特異的的生成物およびプライマー二量体人工生成物を、ＡＭＰＵＲＥ（登録商標）システム（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．，マサチュセッツ州ビバリー）により、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧＳ  ＧＴｙｐｅ  ＨＬＡ
ＭＲおよびＨＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナ州インディアナポリス）に記載されたクリーンアップのためのプロトコルに従って、アンプリコンから除去した。精製アンプリコンのアリコートを、９６ウェルＥ−ＧＥＬ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）における電気泳動によってさらに評価した。プライマー二量体がみられた場合、ＡＭＰｕｒｅ工程を反復し、生成物をＥ−ＧＥＬ（登録商標）により再評価した。精製アンプリコンを次いでＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）  ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）アッセイ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）により、マイクロプレート分光蛍光光度計で定量した。８つの標準品は０ｎｇ／μｌから５０ｎｇ／μｌまでの範囲のＤＮＡ濃度であった。ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（登録商標）により検出できなかったアンプリコンはいずれも０．１ｎｇ／μｌの濃度に割り当て（希釈計算の実施を可能にするために）、その後の工程を続けた。アンプリコンを１×１０６分子／μｌに希釈した。４５４  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（ＰＴＰ）の単一領域における配列決定のために予定したすべてのアンプリコンがプールされるようにアンプリコンのプールを作製した；各アンプリコンがほぼ目的とする読取り深さ（一般に、アンプリコン当たり４０，０００の読み）を与えるようにプールを作製した。
【００６４】
エマルジョンＰＣＲ、ビーズ回収およびパイロシーケンシングを下記に従って実施した。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）、ＤＮＡ含有ビーズの濃縮、およびパイロシーケンシングは、ＧＳ  ＦＬＸ（登録商標）機器（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州ブランフォード）で、ＧＳ  ＦＬＸ  ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ  ｍａｎｕａｌｓ：ｅｍＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  −  ＬｉｂＡ  ＭＶ（２０１０年１月）；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ（２０１０年５月）についての４領域ＰＴＰに基づいて、ただし下記の点を別として実施された：１）ｅｍＰＣＲに際して、アンプリコンプールをビーズ当たり０．４〜０．５コピーで用いた、２）ｅｍＰＣＲプライマーを指定の０．５倍の濃度で用いた、３）ＲＥＭｅモジュール（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナ州インディアナポリス）の使用によってＭｕｌｔｉＰｒｏｂｅ  ＨＴリキッドハンドラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，マサチュセッツ州ウォルサム）で、ビーズ濃縮を自動化した、および４）配列決定のために、推奨された濃縮ＤＮＡビーズ装填量の６０％をＰＴＰプレートに分配した。
【００６５】
４５４  ＡＶＡ（登録商標）ソフトウェアのコンセンサス機能を用いて配列を連結した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ベースのコンピューターにインストールしたＡＳＳＩＧＮ  ＡＴＦ（登録商標）４５４ソフトウェア（ｖ  ３４）（Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｌｔｄ．，オーストラリア、パース）を配列の解析に用いた。このソフトウェアは対立遺伝子をそれぞれの配列の読みに割り当て、各対立遺伝子に対応する配列の読みの数を計算した。結果を表２に示す。
【００６６】
ＭｉＳｅｑ（登録商標）機器を用いる血漿からの無細胞ＤＮＡのディープシーケンシング
ＭＩ−ＳＥＱ（登録商標）機器に用いたプライマーは５’−３’方向に下記の配置をもっていた：ＭｉＳｅｑタグ−４５４  ＭＩＤ配列−ＨＬＡハイブリダイゼーション配列（表１）。ＭｉＳｅｑ（登録商標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ）配列決定用のアンプリコン調製は、ＰＣＲ増幅の前に任意選択的に予備増幅操作を含む。任意選択的な予備増幅は下記に従って行なわれた：２５μｌの反応物は、１〜１０ｎｇのＤＮＡ鋳型および各１０ｐｍｏｌｅのフォワードおよびリバースプライマー、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、各１５０μＭのｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＵＴＰ、グリセロール１０％  ｗ／ｖ、ならびにＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。サーマルサイクリング条件は下記のとおりであった：９５℃−１０分；３１サイクルの９５℃−１５秒，６０℃−４５秒，７２℃−１５秒”；７２℃−５分；ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００。得られた予備増幅試料それぞれから４μｌアリコートをＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ増幅反応に導入した。条件はこのセクションの始めに記載したものと同じであった。
【００６７】
アンプリコンのクリーンアップおよび定量を製造業者の推奨に従って実施した。各アンプリコンを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０緩衝液で０．３ｎｇ／μｌの濃度に標準化した後、５’−３’方向にＭｉＳｅｑアダプター、ＭｉＳｅｑインデックスおよびＭｉＳｅｑタグを含むプライマーを用いて、限定ＰＣＲサイクル工程（９５℃−３０秒；１０サイクルの９５℃−１５秒，６３℃−３０秒，７２℃−４５秒；７２℃−５分）を行なって、Ｍｉｓｅｑインデックスおよび捕獲配列を加えた。２回目のアンプリコンクリーンアップ、定量および標準化（０．３ｎｇ／μｌ）を実施した後、ＭｉＳｅｑ（登録商標）機器にプーリングおよび装填した。得られた配列ファイルにおいて、自社開発したバイオインフォーマティクスツールを用いて読みの両端を配列から“トリミング”した。Ｃｏｎｅｘｉｏ  ＧｅｎｏｍｉｃｓからのＡＳＳＩＧＮ  ＡＴＦ（登録商標）４５４ソフトウェア（ｖ  ３４）を配列解析に用いた。
【００６８】
【表２】
0006302048.tif 000003
【００６９】
１  総配列読みは、同一遺伝子座におけるすべてのドナーおよびレシピエント対立遺伝子の和である
２  ２つの対立遺伝子のうち１つだけが検出されるので、ドナー％は実測値の２倍である
３  第２のドナー対立遺伝子はレシピエント対立遺伝子の１つと同一であるのでアッセイできなかった
４  第２のドナー対立遺伝子はサンプリング変動性のため検出できなかった
【００７０】
【表３】
0006302048.tif 000004
【００７１】
１  総配列読みは、同一遺伝子座におけるすべてのドナーおよびレシピエント対立遺伝子の和である
２  ２つの対立遺伝子のうち１つだけが検出されるので、ドナー％は実測値の２倍である
４  第２のドナー対立遺伝子はサンプリング変動性のため検出できなかった
【００７２】
【表４】
0006302048.tif 000005
【００７３】
１  総配列読みは、同一遺伝子座におけるすべてのドナーおよびレシピエント対立遺伝子の和である
３  第２のドナー対立遺伝子はレシピエント対立遺伝子の１つと同一であるのでアッセイできなかった
それぞれの場合、ＤＰＢ１遺伝子座はドナー−レシピエント対について情報価値があった。これらの結果は、急性または慢性の移植片拒絶を生じているレシピエントの血漿においてドナーＨＬＡ配列を検出できることを証明する。移植に成功したレシピエントの血漿にはドナーＤＮＡを検出できない。
【００７４】
実施例２：臨床試料を模倣した細胞系ブレンドにおける“ドナー”ＤＮＡのドロップレットデジタルＰＣＲによる検出
臨床試料に近似する試料は２種類の細胞系から単離した核酸のブレンドであり、それはレシピエントＤＮＡと少量（１％）のドナーＤＮＡの混合物を再現していた。“レシピエント”細胞系はＥＤＢＵであり、“ドナー”細胞系はＯＬＧＡであった。混合物は１％のＯＬＧＡ／９９％のＥＤＢＵを含有していた。これらの細胞系は後記の２種類のプローブにより区別できる異なるＤＰＢ１遺伝子型をもつ。実験条件下で各プローブはターゲット細胞系の両方の対立遺伝子に特異的にハイブリダイズし、他方の細胞系の対立遺伝子にはハイブリダイズしない。
【００７５】
ｄｄＰＣＲセットアップを、ＱＸ１００（商標）ドロップレット作製装置（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｓ．，カリフォルニア州ハーキュリーズ）についての製造業者の指示に従って行なった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６および８（表１）を用いてＤＰＢ１（検査試料中の情報価値のあるＨＬＡ遺伝子座）を増幅した。各試料を二重試験反応で操作した。９ｕＬの試料をＢｉｏＲａｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、２５０ｎＭの各プローブ、および９００ｎＭの各プライマー、および４単位のウラシル−Ｎ−グリコシレラーゼ（ＵＮＧ）と混和した；最終２０μＬのＰＣＲ体積。最終反応混合物をドロップレット作製装置チップの単一ウェル内へ、並行ウェル内の７０ｕＬのドロップレット作製用の油と一緒に移した。ドロップレット作製が完了すると、油に懸濁している生成ドロップレット４０ｕＬを９６ウェルプレートへ移した。次いでドロップレットを下記のサーマルサイクリングプロフィールで循環させた：５０℃で５分（ＵＮＧ工程）、続いて９５℃で１０分の熱活性化工程、そして４０サイクルの９４℃（３０秒）〜５７℃（１分）、そして９８℃に１０分間保持。各ドロップレットについてのエンドポイント蛍光を、ＢｉｏＲａｄ
ＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダーを用いてＦＡＭおよびＶＩＣの両チャンネルで読み取った。ＶＩＣプローブは両方の“ドナー”対立遺伝子を検出し、一方、ＦＡＭプローブは両方の“レシピエント”対立遺伝子を検出する。
【００７６】
ＶＩＣ陽性信号を総信号（ＶＩＣ陽性＋ＦＡＭ陽性）で割ることにより、ドナーＤＮＡのパーセントを決定した。レシピエントの試料におけるいずれかのドナー対立遺伝子の検出は、レシピエントの血流中の循環型ドナーＤＮＡの指標となる。表５のデータは、このｄｄＰＣＲアッセイがレシピエントＤＮＡのバックグラウンドにおいてドナー対立遺伝子を検出できること、および移植片レシピエントからの臨床血漿試料中のドナーＤＮＡの割合を決定できることを示す。観察された“ドナー”配列の割合は１．０４％であり、予測した１％という割合に近接していた。
【００７７】
【表５】
0006302048.tif 000006
【００７８】
実施例３：母性ＨＬＡ対立遺伝子の検出によるＳＣＩＤ小児の血液中の母性細胞の検出
４５４アンプリコン配列決定、ならびにＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子座の高分解ハイスループット遺伝子型判定のためのＣｏｎｅｘｉｏソフトウェアを用いる方法をによりＳＣＩＤ小児の血液を解析し、非遺伝性の母性対立遺伝子に対応するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子配列の読みの計数により母性細胞の比率を推定した。ここに本発明者らは、血漿中のＨＬＡ対立遺伝子混合物を定量できるシステムの開発を報告する。
【００７９】
血漿または考案した細胞系混合物に由来するＤＮＡを、ＨＬＡ  ＤＰＢ１またはＤＱＢ１  エキソン２の短い領域（約１５０ｂｐ；血漿中の小さなＤＮＡフラグメントを増幅）をターゲティングするプライマーを用いて増幅した。アンプリコンをエマルジョンＰＣＲによってさらに増幅し、４５４  ＧＳ  ＦＬＸまたはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒで配列決定した。改良型Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ａｓｓｉｇｎ  ＡＴＦ  ４５４ソフトウェアを用いて配列を調べた。このソフトウェアにより、ＤＰＢ１またはＤＱＢ１対立遺伝子それぞれの迅速デジタル解析が可能であった。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いて同様に混合物を解析した。
【００８０】
改良型Ｃｏｎｅｘｉｏソフトウェアを用いて、混合物中の少数のＨＬＡ対立遺伝子を容易に同定し、バックグラウント“ノイズ”、すなわちＰＣＲにより生成する配列または配列決定エラーから分離できた。２種類のヘテロ接合細胞系の混合物において、０．５％の少数の  ＨＬＡ対立遺伝子を１ｎｇ（約１４０の２倍体ゲノム）のＤＮＡ入力で検出できた。急性または慢性の拒絶を生じている腎移植片レシピエントからの３／３の血漿試料において、ドナーＨＬＡ対立遺伝子がドナー対立遺伝子＋レシピエント対立遺伝子全体のうち平均０．６％で検出された。
【００８１】
本発明を特定の例について詳細に記載したが、本発明の範囲内で多様な改変をなしうることは当業者に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は本明細書に記載した例によって限定されるべきではなく、提示する特許請求の範囲によって限定される。
なお、以下に出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
レシピエントの血液試料におけるドナー核酸の割合を決定することにより固形臓器の移植片拒絶または傷害を判定する方法であって、下記を含む方法：
（ａ）レシピエントから血液試料を得る；
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子座における少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の存在について試料を検査する；
（ｃ）ドナーＨＬＡ対立遺伝子が検出されれば、移植片拒絶または傷害と診断する。
［請求項２］
さらに、ドナーＨＬＡ対立遺伝子の割合を決定し、その割合が前決定した閾値を超えれば移植片拒絶または傷害と診断することを含む、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
決定工程が、試料中に検出された同一遺伝子座におけるすべてのＨＬＡ対立遺伝子の量の和に対する少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子の量の比を計算することを含む、請求項２に記載の方法。
［請求項４］
少なくとも１つのドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子が、ＤＱＡ１，エキソン２；ＤＱＢ１，エキソン２および３；ＤＰＡ１，エキソン２；ＤＰＢ１，エキソン２；ＤＲＢ１，エキソン２；ＤＲＢ３，エキソン２；ＤＲＢ４，エキソン２；ならびにＤＲＢ５，エキソン２、またはそれらのＨＬＡ遺伝子に由来するイントロン配列、もしくはそれらの遺伝子に由来するエキソン配列とイントロン配列の組合わせから選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ＨＬＡ対立遺伝子についての検査が配列決定を含み、さらに配列決定の前にターゲット濃縮工程を含む、前記方法。
［請求項６］
配列決定がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて実施されるクローン増幅工程を含み、各プライマーがアダプター配列およびＨＬＡハイブリダイゼーション配列を含む、請求項５に記載の方法。
［請求項７］
ＨＬＡ対立遺伝子についての検査が下記の工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅させて、ＨＬＡアンプリコンを得る工程；
（ｂ）クローン配列決定を実施して、工程（ａ）で得たＨＬＡアンプリコンの配列を決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した配列のうち、同一遺伝子座における少なくとも１つのレシピエントＨＬＡ対立遺伝子および少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を同定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で同定したレシピエントＨＬＡ配列とドナーＨＬＡ配列の数を比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定する工程。
［請求項８］
工程（ａ）または（ｂ）における少なくとも１つのプライマーが表１から選択される、請求項７に記載の方法。
［請求項９］
工程（ｃ）における同定が下記のコンピューター処理工程を含む、請求項７または８に記載の方法：
（ａ）ＨＬＡ遺伝子座における配列をＨＬＡ配列データベースと比較する工程；
（ｂ）既知のＨＬＡ対立遺伝子に対応する複数のビン内に配列を選別する工程；
（ｃ）１または２つの多数配列をレシピエント対立遺伝子として同定する工程；
（ｄ）１または２つの最も代表的な少数配列をドナー対立遺伝子として同定する工程。
［請求項１０］
工程（ａ）において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］
２、３またはより多数の遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を、同一反応液でマルチプレックスＰＣＲによって同時に増幅する、請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
ＨＬＡ対立遺伝子を、下記を含む方法により定量的に検出する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）試料を、それぞれ０〜約５コピーのターゲットＨＬＡ対立遺伝子を含む複数の反応溶液に分割する；
（ｂ）それぞれの反応溶液をターゲットＨＬＡ対立遺伝子の存在についてアッセイする；
（ｃ）同一遺伝子座において、ドナーＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数を、レシピエントＨＬＡ対立遺伝子を含有する反応溶液の数と比較し、それにより試料中のドナー核酸の割合を決定する。
［請求項１３］
さらに、独立して、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座におけるドナーおよびレシピエントについての遺伝子型情報を得ることを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１４］
レシピエントの血液中のドナーＤＮＡの濃度が閾値レベルを超えているかどうかを決定することにより、移植片レシピエントが移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があるかを判定する方法であって、ドナーＤＮＡの濃度が下記を含む方法により決定される方法：
（ａ）レシピエントから血液試料溶液を得る；
（ｂ）その試料溶液中の少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子を定量的に検出する；
（ｃ）ドナーＤＮＡの濃度を測定する；
（ｄ）ドナーＤＮＡの濃度を閾値と比較し、その際、閾値に達しているかまたはそれを超えていればレシピエントは移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性がある。
［請求項１５］
少なくとも１つのドナーＨＬＡ対立遺伝子が、ＤＱＡ１，エキソン２；ＤＱＢ１，エキソン２および３；ＤＰＡ１，エキソン２；ＤＰＢ１，エキソン２；ＤＲＢ１，エキソン２；ＤＲＢ３，エキソン２；ＤＲＢ４，エキソン２；ならびにＤＲＢ５，エキソン２、またはそれらの遺伝子に由来するエキソン配列とイントロン配列の組合わせから選択される、請求項１４に記載の方法。
［請求項１６］
工程（ａ）において、同一遺伝子座におけるドナーＨＬＡ対立遺伝子およびレシピエントＨＬＡ対立遺伝子を２、３またはより多数の遺伝子座で検出する、請求項１４または１５に記載の方法。
［請求項１７］
レシピエントの血液中のドナーＨＬＡ対立遺伝子の割合を定期的に決定することにより、移植片レシピエントを移植片拒絶の発症についてモニタリングし、ドナーＤＮＡの割合の増大が検出されればその患者は移植片拒絶を伴なっているかあるいはそれを発症する可能性があると診断する方法。
［請求項１８］
ＳＣＩＤ小児の血液中の母性細胞を定量的に検出する方法であって、下記を含む方法：
（ａ）小児から血液試料を得る；
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子座における少なくとも１つの非遺伝性の母性ＨＬＡ対立遺伝子の存在について試料を検査する；
（ｃ）工程（ｂ）で検出した母性対立遺伝子を定量し、それにより母性細胞を定量的に検出する。
【配列表】
0006302048000001.app