(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｉｓ−タグに対する親和性を有し、配列番号１および配列番号２から選択されるヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子に対する親和性を有する分子を調製するための、請求項１に記載の配列の１つを含むオリゴヌクレオチドの使用であって、特に、
Ｈｉｓ−タグに対する抗体のアゴニストとしての使用、
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子の検出、
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子の精製、
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子の結合、
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子の濃度の決定、
のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下に記載する本発明は、ヒスチジンタグを結合する一本鎖ＤＮＡアプタマーの独特なヌクレオチド配列およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
原核細胞および真核細胞は、組換えタンパク質の生成の効果的な発現系として使用されることがある。高い純度および品質のタンパク質を得るために、アフィニティークロマトグラフィー法が非常によく採用される。そのようなクロマトグラフィーの例として、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）がある。この技術を使用するには、通常ヒスチジン残基の６つの連続した繰り返しから構成される短いヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）を、標的タンパク質と融合しなければならない。Ｈｉｓ−タグは、特定の金属イオン（例えば、コバルト、銅、ニッケル、および亜鉛）と可逆的に結合することができる。それらイオンのうち１つを含む適切なキャリアを使用して、Ｈｉｓ−タグタンパク質の精製または固定化が可能である。組換えタンパク質に付けたＨｉｓ−タグは、タグに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット技術により検出するために使用することができる。当該タンパク質検出システムは、プルダウン法、共免疫沈降法、またはファーウエスタンブロット法など、タンパク質間の相互作用を研究するために使用される他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術で使用することができる。
【０００３】
ＤＮＡアプタマーは、約４０〜１００ヌクレオチドの長さであり、高い特異性と親和性とを有するリガンドと結合することができる一本鎖デオキシリボ核酸として定義される。アプタマーの２次構造および３次構造が多く存在するということは、選択したアプタマーの標的分子との適合が最適であることを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特に、ヒスチジンタグを含む標的分子またはヒスチジンヘキサマーを含む任意の分子（例えば、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ誘導体）に対する親和性が高い、新規の分子の供給を通して、ヒスチジンタグを含む分子を特定するための新規な方法を提供することを目的とする。
【０００５】
上述の技術的目的は、本発明に従って実施することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｈｉｓ−タグに対する親和性を有し、以下の配列番号１
【化１】
0006302542.tif 000002
のヌクレオチド配列（以下、「アプタマーＡ１」という。）
または以下の配列番号２
【化２】
0006302542.tif 000003
のヌクレオチド配列（以下、「アプタマーＢ１」という）を有するＤＮＡアプタマーを対象とする。
【０００７】
本発明は、Ｈｉｓ−タグを含むペプチドまたはタンパク質に対する親和性が保たれている場合、ＤＮＡ配列を一部変更することを可能にし、複数種のタンパク質の混合物からＨｉｓ−タグタンパク質の選択的な精製を可能にする。特に、本発明の範囲は、少なくとも１つのプリン塩基またはピリミジン塩基が異なる上記配列の変異体を包含する。
【０００８】
本発明は、Ｈｉｓ−タグを含む、標的分子に対する親和性を有する分子を調製するための、上記配列のうち１つを有するオリゴヌクレオチドの使用を別の対象とする。
【０００９】
使用は、
・Ｈｉｓタグに対する抗体のアゴニストとしての使用のため、
・Ｈｉｓタグを含む標的分子を検出するため、
・Ｈｉｓタグを含む標的分子を精製するため、
・Ｈｉｓタグを含む標的分子を結合するため、
・Ｈｉｓタグを含む標的分子の濃度を分析するため、
であってもよい。
【００１０】
特に、当該オリゴヌクレオチドは、タグ（例えば、Ｈｉｓ−タグを所有する標的分子を標識する蛍光タグ）を付けた分子の形態で使用されてもよい。
【００１１】
そのような種類の分子は、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）またはＢｉＦＣ（２分子蛍光相補）などの専門家にとって公知の分析技術を使用して、タンパク質間の相互作用を監視するために使用することができる。
【００１２】
本発明の特徴は、以下でさらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒスチジンタグを含むタンパク質とアプタマーとの間の結合を示す図である。レーン：１）タンパク質マーカー、２）Ｂ１アプタマーでインキュベートしたＨｉｓ−ＰＣＮＡタンパク質、３）Ｂ１アプタマーでインキュベートしたＰＣＮＡタンパク質、４）基準となるアプタマーでインキュベートしたＨｉｓ−ＰＣＮＡタンパク質、５）基準となるアプタマーでインキュベートしたＰＣＮＡタンパク質。試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、次いで、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０）で染色した。
【図２】大腸菌タンパク質抽出物からの、Ｈｉｓ−タグタンパク質の精製を示す図である。レーン：１）タンパク質マーカー、２）４０ｍｇの大腸菌タンパク質抽出物、３）Ｂ１アプタマーの使用により精製されたＨｉｓ−ＰＣＮＡタンパク質。試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し次いで、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。
【図３】図３は、Ｈｉｓ−タグを含む組換えタンパク質の検出をＢ１アプタマーを使用して行った場合のＥＬＩＳＡ検査の結果を表す。データは、３つの独立した実験からの平均化された結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、以下に引用する実施例により補足される。これらは、本発明の範囲全体を示すものではない。
【００１５】
実施例１  Ｈｉｓ−タグに対する親和性を有するＤＮＡアプタマーの開発
Ｈｉｓ−タグを含む標的分子に対する親和性を有するＤＮＡ分子の研究開発は、以下の配列
【化３】
0006302542.tif 000004
の一方を含むＤＮＡアプタマーが強い親和性を有することを示した。
【００１６】
本発明により、専門家にとって公知の通常用いられる任意なＤＮＡ合成法により、ＤＮＡ分子を得ることが可能となる。
【００１７】
例示的なオリゴヌクレオチドを提供するため、化学合成技術を使用して、固相で分子を得た（Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｖａｓｓｅｕｒ，Ｊ．−Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｖａｎ，Ｆ．  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ５′−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  ＲＮＡ，ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；５０：１．２８．１−１．２８．１６．）。
【００１８】
前述した配列で得られ、６０ヌクレオチドの長さ、およびそれぞれ６４１および６１２マイクログラムの量で合成されるアプタマーＡ１分子およびアプタマーＢ１分子をＨＰＬＣ法で検証した。
【００１９】
当該配列を有するＤＮＡ分子にさらなる変更を施してもよい。特に、それらは、既知の染料（例えば、蛍光性のもの）または他の分子（例えば、ビオチン）と結合されてもよい。
【００２０】
４７７および４５９マイクログラムの量の例示的なビオチン化アプタマーＡ１およびビオチン化アプタマーＢ１を５′末端におけるビオチン化オリゴヌクレオチドの自動化合成により得た（Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ａ  Ｌｏｎｇ  Ｃｈａｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ５′−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１；３２：１７１５−１７１８）。生成物をＨＰＬＣ法により検証した。
【００２１】
実施例２  アプタマー結合クロマトグラフ用樹脂とのＨｉｓ−タグタンパク質の結合
１０ｍＬの５０％アガロース結合ストレプトアビジンを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、蒸留水で洗浄した。次いで、ＢＷバッファ（１７．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸バッファ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。次に、２０ｍｇの５′末端をビオチン化した、Ｂ１または
【化４】
0006302542.tif 000005
配列を有する基準となるアプタマーのいずれかを含む３００μｌのＢＷバッファで、樹脂を懸濁した。試料を室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、樹脂をＢＷで３回洗浄し、続いて、ＡＳバッファ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。最後の洗浄後、アプタマーが結合した樹脂を３００μｌのＡＳバッファで懸濁し、ヒト組換えＰＣＮＡタンパク質を添加し、最終濃度を０．１３ｍｇ／ｍｌとした。本実験では、２種類のＰＣＮＡタンパク質：ａ）Ｈｉｓ−タグを有するもの、およびｂ）Ｈｉｓ−タグのないものを使用した。タンパク質を有する樹脂を室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、ＡＳバッファで４回洗浄し、ＧＬＢバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー２％（ｗ／ｖ）、１０％グリセロール、２００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）で懸濁し、９５℃で５分間インキュベートした。得られた試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）法）を施した。分離後、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０染料を使用して染色した。結果を図１に示す。
【００２２】
実施例３：細胞タンパク質抽出物からのＨｉｓ−タグタンパク質の精製
１０μｌの５０％アガロース結合ストレプトアビジンを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、蒸留水で洗浄した。次に、ＢＷバッファ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ  リン酸バッファ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。樹脂を２０ｍｇの５′末端をビオチン化したＢ１アプタマーを含む３００ｍｌのＢＷバッファで懸濁し、室温で１時間インキュベートし、続いて、ＢＷバッファで３回、ＡＳバッファ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。最後の洗浄後、アプタマーが結合した樹脂を３００μｌのＡＳバッファで懸濁した。次に、ヒト組換えＨｉｓ−ＰＣＮＡタンパク質を過剰発現させる大腸菌細胞から調製されたタンパク質抽出物全てを添加し、濃度を２．０ｍｇ／ｍｌとした。樹脂を室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、樹脂をＡＳバッファで４回洗浄した。Ｈｉｓ−ＰＣＮＡを溶出バッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を使用して溶出した。溶出したタンパク質をＧＬＢバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）  ブロモフェノールブルー  ２％（ｗ／ｖ）、１０％グリセロール、２００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。得られた試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レムリ法）を施した。分離後、タンパク質をクマシーブリリアントブルーＲ−２５０を使用して染色した。結果を図２に示す。
【００２３】
実施例４  ＥＬＩＳＡ法を使用したＨｉｓ−タグタンパク質検出
９６個のウェルのＥＬＩＳＡプレートに、ヒトＰＣＮＡタンパク質（０．５ｍｇタンパク質／ウェル）を塗布した。本実験では、２種のタンパク質ＰＣＮＡ：ａ）Ｈｉｓ−タグを有するもの、およびｂ）Ｈｉｓ−タグのないものを使用した。タンパク質を４℃で１６時間プレートに結合させた。次いで、プレートをＰＢＳＴ（０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＰＢＳ）バッファで３回洗浄した。次に、プレートを２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む１ｘ  ＰＢＳバッファで、室温で２時間保護した。以下の工程では、プレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、ＡＳバッファ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）で、５′末端をビオチン化したＢ１または基準となるアプタマーとともに室温で１時間インキュベートした。アプタマーの最終濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌであった。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、プレートをストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＢＳバッファ中、１：２００希釈）とともに室温で４０分間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質をウェルに添加した。青色が現れたとき、１ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、４５０ｎｍの波長で、吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【図１】
0006302542.tif 000006
【図２】
0006302542.tif 000007
【図３】
0006302542.tif 000008
【配列表】
0006302542000001.app