(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むボツリヌス毒素の製造方法であって：
（ａ）ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理して、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；
（ｂ）前記沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および核酸分解酵素を処理してボツリヌス毒素を抽出する工程；
（ｃ）前記抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程
前記（ｃ）工程での酸沈殿は、ｐＨが２．５〜４．５になるように硫酸または塩酸を添加することによって行うことを特徴とする、ボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項２】
ボツリヌス毒素生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項３】
精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項４】
前記（ａ）工程での酸沈殿は、ｐＨが３．０〜４．５になるように硫酸または塩酸を添加することによって行うことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項５】
前記（ｂ）工程でのプロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ベンザミジン塩酸（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項６】
前記（ｂ）工程での核酸分解酵素は、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅであることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項７】
前記（ｂ）工程でのボツリヌス毒素抽出は、ｐＨ４．５〜６．５で行うことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項８】
前記（ｃ）工程での緩衝溶液は、リン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項９】
前記（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ３．５〜７．５および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１０】
前記（ｄ）工程以後に、
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画を硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）で処理して沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および
（ｆ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１１】
前記（ｅ）工程での硫酸アンモニウムは、濃度が１０〜５０％（ｗ／ｖ）になるように添加されることを特徴とする請求項１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１２】
前記（ｅ）工程での緩衝溶液は、リン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項１３】
前記（ｅ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ３．５〜７．５および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス毒素の製造方法に関し、より詳しくは（ａ）ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；（ｂ）前記沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および核酸分解酵素を処理してボツリヌス毒素を抽出する工程；（ｃ）前記抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程を含むボツリヌス毒素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経毒性を持つ毒素を分泌する種々のクロストリジウム属菌株が１８９０年代から今まで発見されて、過去７０年間これらの菌株が分泌する毒素に対する特性解明がなされてきた（Ｓｃｈａｎｔ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：８０，１９９２）。
【０００３】
前記クロストリジウム属菌株から由来した神経毒性を持つ毒素、すなわちボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ）は、その血清学的特徴によりＡ〜Ｇ型の七つの型に区分される。各毒素は、約１５０ＫＤａ程度の毒素タンパク質を有しているが、自然的には種々の非毒性タンパク質と結合されている複合体からなっている。中間（Ｍｅｄｉｕｍ）複合体（３００ｋＤａ）は、毒素タンパク質と非毒性−非ヘマグルチニンタンパク質からなり、大きい（Ｌａｒｇｅ；４５０ｋＤａ）複合体および巨大（Ｌａｒｇｅ−Ｌａｒｇｅ；９００ｋＤａ）複合体は、中間複合体がヘマグルチニンと結合されている形態を有している（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４：４１９，１９８０）。このような非毒性非ヘマグルチニンタンパク質は腸内で低いｐＨと各種タンパク質加水分解酵素から毒素を保護する機能をすると知られている。
【０００４】
前記毒素は、細胞内で分子量が約１５０ｋＤａである一つのポリペプチドで合成された後、細胞内タンパク質分解酵素の作用やトリプシンのような人為的な酵素処理によってＮ末端から１／３になる位置で切断されて、二つ単位体である軽鎖（Ｌ：ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）（分子量；５０ｋＤａ）および重鎖（Ｈ：ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）（分子量；１００ｋＤａ）に分けられる。このように分けられた毒素は、単一ポリペプチドである時に比べてその毒性が大きく増加する。二つの単位体は、二硫化結合によって連結されていて、それぞれは異なる機能を有する。重鎖は目標物（ｔａｒｇｅｔ）になる細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して（Ｐａｒｋ．Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７２：２４３，１９９０）、低いｐＨ（ｐＨ４）で生体膜と反応してチャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）を形成する機能を有して（Ｍａｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ．，１８：３２４，１９９３）、軽鎖は薬理活性を持っていて洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を使って細胞に透過性を与えたり、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）等で細胞内投入された時神経伝達物質の分泌を妨げる（Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：４０９０，１９８８）。
【０００５】
前記毒素は、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のコリン性前シナプス（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）でアセチルコリンのエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）を阻害して無力症を引き起こす。極微量の毒素を処理しても毒性が現れることからこの毒素は何らかの酵素活性を持つと考えられられてきた（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２６：４２７，１９８６）。
【０００６】
最近明らかになったところによると、毒素はメタロペプチダーゼ活性（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持っていて、その基質は、エキソサイトーシス装置複合体（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）をなす単位タンパク質であるシナプトブレビン（Ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ）、シンタキシン（Ｓｙｎｔａｘｉｎ）、２５ＫＤａのシナプトソーム関連タンパク質（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ２５ＫＤａ）（ＳＮＡＰ２５）等である。各型の毒素は、この三つのタンパク質中一つを基質としているが、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトブレビンを、ＡとＥ型はＳＮＡＰ２５を、Ｃ型はシンタキシンを特定部位で切断すると知られている（Ｂｉｎｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：９１５３，１９９４）。
【０００７】
特に、ボツリヌス毒素Ａ型は、ｐＨ４．０〜６．８の薄い水溶液に溶解性であると知られている。約７以上のｐＨで安定化非−毒素タンパク質が神経毒素から分離されて、その結果毒性が徐々に失われるが、特にｐＨおよび温度が上昇するにつれ毒性が減少すると知られている。
【０００８】
前記ボツリヌス毒素は、少量で体に致命的で大量生産が容易であるため、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）と共に４大生物テロ武器で使われることができる毒素である。しかし、前記ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｏｘｉｎ）中Ａ型毒素の場合には、全身的には体に影響を及ぼさない容量以下で注射すると、前記注射部位の局所筋肉を麻痺させることができると明らかになり、このような特性を利用してシワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療剤などで広範囲に使用することができるので、需要が急増していて需要に合わせてボツリヌス毒素の生産方法に対する研究が盛んに行われている。
【０００９】
現在代表的に商用化されている製品は、米国アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）（ボツリヌス毒素Ａ型精製された神経毒素複合体）で、それぞれのＢＯＴＯＸ（登録商標）の１００ユニットバイアルは、約５ｎｇの精製されたボツリヌス毒素Ａ型複合体、０．５ｍｇヒト血清アルブミン、および０．９ｍｇ塩化ナトリウムで構成されて、真空−乾燥形態で提供されて、保存剤なしに（０．９％塩化ナトリウム注入）滅菌生理食塩水を利用して復元させる。他の商用化された製品は、英国Ｉｐｓｅｎ社のＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）（ボツリヌス毒素薬剤学的組成物中ラクトースおよびヒト血清アルブミンを有するクロストリジウムボツリヌスＡ型毒素ヘマグルチニン複合体、使用前に０．９％塩化ナトリウムを利用して復元される）およびＳｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭｙｏＢｌｏｃＴＭ（ボツリヌス毒素Ｂ型、ヒト血清アルブミン、コハク酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを含む薬ｐＨ５．６注射溶液）等がある。
【００１０】
従来のボツリヌス毒素の製造のためには、酸沈殿法、塩による析出法およびクロマトグラフィー法などが利用された。
【００１１】
例えば、日本公開特許第１９９４−１９２２９６号にはクロストリジウムボツリヌス細菌を培養した後、酸沈殿、抽出、核酸分解制添加および結晶化工程を経て結晶型（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）のボツリヌスＡ型毒素を製造する方法が開示されている。また、米国登録特許第５６９６０７７号にはクロストリジウムボツリヌス細菌を培養して、これを酸沈殿、抽出、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび結晶化工程を経てボツリヌスＢ型毒素を製造する方法が開示されている。
【００１２】
一方、Ｓｉｍｐｓｏｎ等は、重力流クロマトグラフィーを使用したボツリヌス神経毒素の精製、ＨＰＬＣ、親和性樹脂を使用した捕獲工程、サイズ排除クロマトグラフィー、および二つの異なるイオン交換カラムの使用を含むイオン（陰イオンおよび陽イオン）交換クロマトグラフィーを使用してボツリヌスＡ型毒素を製造して（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６５：７６，１９８８）、Ｗａｎｇ等は、ボツリヌス毒素Ａ型を精製するための沈殿とイオンクロマトグラフィー法を使用した（Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｌａｓ  Ｆａｃｉ  Ｃｏｓｍ  Ｓｕｒｇ．，２００２：５８，２００２）。
【００１３】
また、米国登録特許第６８１８４０９号にはボツリヌス毒素を精製するためのイオン交換およびラクトースカラムの使用が開示されていて、米国登録特許第７４５２６９７号にはイオン交換クロマトグラフィーおよび疏水性クロマトグラフィーを使用してボツリヌスＡ型毒素を製造する方法が開示されている。大韓民国公開特許第２００９−００９１５０１号には酸沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィー法を利用して、ボツリヌス毒素を精製する方法が、米国公開特許第２０１３−０１５６７５６号は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー法を利用したボツリヌス毒素の精製方法が開示されている。
【００１４】
しかしながら、既存方法での陰イオン交換クロマトグラフィーの使用は、ボツリヌス毒素のゲルバンドパターン（ｇｅｌ  ｂａｎｄｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）に有害な影響を及ぼして（米国登録特許第７４５２６９７号）、精製期間が長く商業的に適用するなどの問題点が残っていて、ボツリヌス毒素生産菌株であるクロストリジウムボツリヌスは、嫌気性細菌であるため、発酵を嫌気性施設内で行わなければならないため、大量生産が難しい問題点があり、前記精製方法によって精製された有効性分である前記ボツリヌス毒素が明確に分離同定されなく不純物が含まれる問題点があった。また、従来のボツリヌス毒素の製造方法は、高純度のボツリヌス毒素を精製するためにろ過または透析工程などが必須的に含まれて精製過程が複雑かつ困難な問題がある。
【００１５】
そこで、本発明者等は、前記のような既存の問題を解決するために努力した結果、ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、形成された沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すると、ろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）およびエタノール沈殿（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）工程の省略が可能で、ボツリヌス毒素の製造過程が非常に容易である点を確認して、
【００１６】
前記の製造方法で純度９８％以上のボツリヌス毒素が生産できることを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開１９９４−１９２２９６号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０１５６７５６号明細書
【特許文献３】米国特許第７４５２６９７号明細書
【特許文献４】米国特許第６８１８４０９号明細書
【特許文献５】韓国公開特許第２００９−００９１５０１号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３−０１５６７５６号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４：４１９，１９８０
【非特許文献２】Ｐａｒｋ．Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７２：２４３，１９９０
【非特許文献３】Ｍａｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ．，１８：３２４，１９９３
【非特許文献４】Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：４０９０，１９８８
【非特許文献５】Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２６：４２７，１９８６
【非特許文献６】Ｂｉｎｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：９１５３，１９９４
【非特許文献７】Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｌａｓ  Ｆａｃｉ  Ｃｏｓｍ  Ｓｕｒｇ．，２００２：５８，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、簡単な工程で高純度のボツリヌス毒素を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理して、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；（ｂ）前記沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および核酸分解酵素を処理してボツリヌス毒素を抽出する工程；（ｃ）前記抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程；を含むボツリヌス毒素の製造方法を提供する。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
下記の工程を含むボツリヌス毒素の製造方法：
（ａ）ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理して、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；
（ｂ）前記沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および核酸分解酵素を処理してボツリヌス毒素を抽出する工程；
（ｃ）前記抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、
沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程。
（項目２）
ボツリヌス毒素生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。（項目３）
精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目４）
前記（ａ）工程での酸沈殿は、ｐＨが３．０〜４．５になるように硫酸または塩酸を添加することによって行うことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目５）
前記（ｂ）工程でのプロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ベンザミジン塩酸（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目６）
前記（ｂ）工程での核酸分解酵素は、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅであることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目７）
前記（ｂ）工程でのボツリヌス毒素抽出は、ｐＨ４．５〜６．５で行うことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目８）
前記（ｃ）工程での酸沈殿は、ｐＨが２．５〜４．５になるように硫酸または塩酸を添加することによって行うことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目９）
前記（ｃ）工程での緩衝溶液は、リン酸ナトリウムであることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目１０）
前記（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ３．５〜７．５および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目１１）
前記（ｄ）工程以後に、
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画を硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）で処理して沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および
（ｆ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程をさらに含むことを特徴とする項目１〜１０のいずれかに記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目１２）
前記（ｅ）工程での硫酸アンモニウムは、濃度が１０〜５０％（ｗ／ｖ）になるように添加されることを特徴とする項目１１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目１３）
前記（ｅ）工程での緩衝溶液は、リン酸ナトリウムであることを特徴とする項目１１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
（項目１４）
前記（ｅ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ３．５〜７．５および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るボツリヌス毒素の製造過程を示した模式図。
【図２】一次陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後、ボツリヌス毒素の純度を測定した結果。
【図３】二次陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後、ボツリヌス毒素の純度を測定した結果。
【図４】本発明に係る製造方法で製造されたボツリヌス毒素とアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸＲ処理による複合筋活動電位振幅の増減程度を測定した結果。（Ｎ：ｎｏ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｓ：ｓａｌｉｎｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｂ２：ＢＴＸ−Ａ−１，ｔｗｏ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ２：ＢＴＸ−Ａ−２，ｔｗｏ  ｕｎｉｔｓ；Ｂ４：ＢＴＸ−Ａ−１，ｆｏｕｒ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ４：ＢＴＸ−Ａ−２，ｆｏｕｒ  ｕｎｉｔｓ；Ｂ８：ＢＴＸ−Ａ−１，ｅｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ８：ＢＴＸ−Ａ−２，ｅｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）。
【図５】本発明に係る製造方法で製造されたボツリヌス毒素とアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸＲ処理による伝導速度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ）を測定した結果。（Ｎ：ｎｏ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｓ：ｓａｌｉｎｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｂ２：ＢＴＸ−Ａ−１，ｔｗｏ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ２：ＢＴＸ−Ａ−２，ｔｗｏ  ｕｎｉｔｓ；Ｂ４：ＢＴＸ−Ａ−１，ｆｏｕｒ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ４：ＢＴＸ−Ａ−２，ｆｏｕｒ  ｕｎｉｔｓ；Ｂ８：ＢＴＸ−Ａ−１，ｅｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ；Ｄ８：ＢＴＸ−Ａ−２，ｅｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２３】
一観点において、本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素生産菌株培養液を酸で処理して、ボツリヌス毒素を酸沈殿させる工程；（ｂ）前記沈殿したボツリヌス毒素に緩衝溶液を添加した後、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および核酸分解酵素を処理してボツリヌス毒素を抽出する工程；（ｃ）前記抽出されたボツリヌス毒素を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程；を含むボツリヌス毒素の製造方法に関する（図１）。
【００２４】
前記方法を介して最終的に製造されたボツリヌス毒素は、冷凍保管および凍結乾燥保管など様々な方法により保管が可能である。
【００２５】
本発明において、前記（ｄ）工程を終えた後、（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画を硫酸アンモニウムで処理して沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および（ｆ）陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程をさらに含んでもよい。
【００２６】
本発明において、ボツリヌス毒素生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）であることが好ましいが、これに限定されるのではなく、ボツリヌス毒素生産が可能ないずれの菌株でも使用可能であることは通常の技術者には自明である。
【００２７】
本発明の「ボツリヌス毒素」とは、クロストリジウムボツリヌス菌株によって生成された神経毒素だけでなく、変形、組換え、ハイブリッドおよびキメラボツリヌス毒素を意味する。組換えボツリヌス毒素は、非−クロストリジウム種によって組換えで製造された軽鎖および／または重鎖を有することができる。また、本発明の「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを包括して、ボツリヌス毒素複合体（すなわち３００、６００および９００ｋＤａ複合体）だけでなく、純粋ボツリヌス毒素（すなわち約１５０ｋＤａ神経毒性分子）の二つ共を包括して、これらはいずれも本発明の実施において有用である。
【００２８】
本発明の「製造されたボツリヌス毒素」とは、ボツリヌス毒素が培養または発酵工程から収得される時、ボツリヌス毒素に同伴できる他のタンパク質および不純物から分離されるか実質的に分離された純粋ボツリヌス毒素またはボツリヌス毒素複合体を意味する。従って、製造されたボツリヌス毒素は少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の純度を有して、特に好ましくは本発明において、製造されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする。
【００２９】
ボツリヌス毒素を製造するためのクロストリジウムボツリヌス菌株の培養は、当業界に公示された通常の方法を用いてなり、培養のために用いることができる通常の培地を利用して培養可能である。
【００３０】
非制限的な例として、クロストリジウムボツリヌス菌株の培養のための培地には、カゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）等が含まれ、２５〜４０℃の温度で９０〜１８０時間、好ましくは１００〜１５０時間培養する。
【００３１】
前記（ａ）工程での酸沈殿工程は、培養を終了した後ｐＨセンサーを利用してｐＨが３．０〜４．５、好ましくは３．３〜４．０、最も好ましくは３．４〜３．６になるように、酸、好ましくは硫酸または塩酸を添加することによって行うことができる。  
【００３２】
（ａ）工程における酸沈殿工程は、ボツリヌス菌を培養した後、残っている菌を全部死滅させて多くの種類のタンパク質溶液に酸を加えることによってｐＨを低下させて、タンパク質が等電点に達することになって沈殿する原理を利用したものである。広い意味で結晶化も含まれて、純粋に精製するのに重点を置いた結晶化に比べて沈殿法は混合された状態で目的物を粗く分離する方法である。通常沈殿法は、目的物質と構造的に類似の不純物が共に沈殿される。この時、ｐＨを約３．０〜４．５に調節して、前記ボツリヌス毒素の回収率は、ｐＨが低いほど高くなるが、ｐＨが３．０以下になる場合、前記ボツリヌス毒素自体に影響を及ぼして、ｐＨが４．５以上になる場合、前記ボツリヌス毒素の回収率が低くなるため、前記範囲内で行われることが好ましい。
【００３３】
特に、ｐＨが３．４〜３．６である時、前記ボツリヌス毒素の回収率が最も高いので最も好ましい。ボツリヌス菌培養液に酸を徐々に加えた後、ｐＨが適合した範囲に到達すればそれ以上ｐＨ変化を示さない時まで添加した後、常温で１５時間〜３０時間放置した後、上澄み液を除去する。
【００３４】
前記（ｂ）工程におけるボツリヌス毒素抽出工程は、（ａ）工程で得た毒素をリン酸緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を加えて溶解して沈殿を除去する工程を含むが、この時、リン酸緩衝液のｐＨは約４．０〜約７．０が好ましく、塩基、好ましく水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加して最終ｐＨを４．５〜６．５、好ましくは５．０〜６．０に調節して、毒素抽出を前記ｐＨ範囲で行うことができる。
【００３５】
また、前記（ｂ）工程での核酸分解酵素は、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅであることを特徴とし、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、ベンザミジン塩酸（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）を用いることが好ましいが、これに限定されず当業界に公示されたタンパク質分解酵素活性を抑制できるいずれの物質でも使用可能である。
【００３６】
（ｂ）工程ににおけるボツリヌス毒素抽出工程での核酸分解酵素処理を介して（ａ）工程で酸によって沈殿された沈殿物に含まれたＤＮＡ、ＲＮＡなどの不純物分解が可能である。酵素処理工程は、１．５時間以下にすると、ＤＮＡ、ＲＮＡの分解が不充分に起きることがあるので、１．５〜７時間、好ましくは３〜６時間行うことが好ましく、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは、０．０５〜１．０ｇ／ｌ、好ましくは０．１〜０．５ｇ／ｌの濃度で添加されることが好ましい。
【００３７】
前記酵素処理を介した収得された抽出液には、ボツリヌス毒素と前記ボツリヌス毒素と類似の極性を有するタンパク質が含まれているので、前記タンパク質を塩酸で沈殿させる塩酸沈殿工程を経なければならない。具体的には、前記（ｃ）工程における塩酸沈殿工程は、酵素処理された抽出液を遠心分離して収得した上澄み液に塩酸（ＨＣｌ）を添加してｐＨ２．５〜４．５、好ましくはｐＨ３．０〜４．０になるように調節した後、４℃の低温冷蔵庫で塩酸沈殿過程を行うることが好ましい。特に、前記塩酸沈殿工程でのｐＨは、毒素の活性と回収率を高く維持するために、ｐＨを３．３〜３．８に調節することが最も好ましいが、前記ｐＨ範囲内で塩酸沈殿工程が行われる場合、ボツリヌス毒素が９０％以上で力価が高く、タンパク質の凝固現象が顕著に減る効果がある。以後、前記塩酸沈殿物を緩衝溶液に溶解させて、次の工程を行うことができる。
【００３８】
最も重要な工程である前記（ｄ）工程は、塩酸沈殿過程完了後、ボツリヌス毒素Ａ型を除いた多くの主な不純物を除去するために、陰イオン交換樹脂を利用してクロマトグラフィーを行うもので、陰イオン交換樹脂としてはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）または第四級アムモニウム（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ，Ｑ）基で置換されたものなどを用いることができるが、これに制限されない。例えば、米国特許第５，６９６，０７７号、国際特許公開第ＷＯ９６／０５２２２および米国特許第５，８４６，９２９号に記載されたようなＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いることができる。好ましくは、強塩基性の第四級アムモニウム基を有するグループやまたは弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）グループを有する陰イオン交換樹脂のうちいずれか一つを選択して用いる。
【００３９】
例えば、強塩基性の陰イオン交換グループでは、  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ，  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ，  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ，  Ｍｏｎｏ  Ｑ，  Ｍｉｎｉ  Ｑ，  Ｃａｐｔｏ  Ｑ，  Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ，  Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ，  Ｑ  Ｃｅｒｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ，  Ｎｕｖｉａ  Ｑ，  ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ，  Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ，  Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ２５  Ｑ，  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｓ），  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  Ｈｉｃａｐ  （Ｍ），  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  （Ｍ），  Ｅｓｈｍｏｎｏ  Ｑ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ−５５０Ｃ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｃ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑ−６００Ｃ  ＡＲ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ，  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ，  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ  （３０），  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ  （２０），  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷなどを用いることができるが、これに限定ず当業界に公示された陰イオン交換樹脂を用いることができる。
【００４０】
カラム緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液を用いることができる。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液を用いる。カラム緩衝液の濃度は、３０ｍＭ〜７０ｍＭに調節し、好ましくは約４０〜６０ｍＭに調節する。カラム緩衝液のｐＨは、約３．５〜７．５になるように調節して、移動相の流速は、０．５ｍｌ／分〜５．０ｍｌ／分に調節して、好ましくは、１．０〜３．０ｍｌ／分に調節する。この時、緩衝液の伝導度は３〜３０ｍＳ／ｃｍに合わせてカラムの平衡化が終わると試料を注入する。毒素は、Ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈで湧出されて、多くの主な不純物は吸着される。すなわち、前記（ｄ）工程における陰イオン交換クロマトグラフィーを利用した精製工程で、ボツリヌス毒素Ａ型タンパク質は、陰イオン交換樹脂に吸着されず多くの主な不純物は吸着されて除去される。
【００４１】
本発明において、前記（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ３．５〜７．５、好ましくはｐＨ４．５〜７．０、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は、３〜３０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは５〜２０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることが好ましい。
【００４２】
以後、（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィー過程で完全に除去されず残っている余分の不純物を除去するために、必要な場合（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画を硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）で処理して沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させる工程；および（ｆ）二次陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製する工程をさらに含ませてボツリヌス毒素を製造することができる。
【００４３】
前記（ｅ）工程でボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画を硫酸アンモニウムで処理して沈殿させた後、沈殿物を緩衝溶液に溶解させた。前記硫酸アンモニウム沈殿工程は、塩析過程に該当するもので、前記塩析は水によく溶解する塩（硫酸アンモニウムなど）をタンパク質混合液に加えてイオン強度を増加させてタンパク質を沈殿させるものである。もし目的とするタンパク質が硫酸アンモニウム３０％（ｗ／ｖ）飽和時主に沈殿するのを知ると、予め３０％（ｗ／ｖ）飽和以下の硫酸アンモニウム濃度で目的以外のタンパク質を沈殿させて除去して、次に３０％（ｗ／ｖ）飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて目的とするタンパク質を沈殿させてこれを遠心分離で集めることができる。塩析操作は、精製の初期手段としてよく利用される。この時用いられる硫酸アンモニウム溶液は、１０〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｖ）濃度の溶液を用いることができる。
【００４４】
以後、前記（ｆ）工程で陰イオン交換クロマトグラフィーを利用してボツリヌス毒素を精製することができる。本発明に係る高純度のボツリヌス毒素の精製は、（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィー（一次陰イオン交換クロマトグラフィー）でほとんど行われ、（ｆ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィー（二次陰イオン交換クロマトグラフィー）は完全に除去されず残っている余分の不純物を除去するために実施するもので、（ｆ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーは、（ｄ）工程の陰イオン交換クロマトグラフィーと同じ方法で行われる。
【００４５】
前記精製方法を介して得られたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質が含まれている最終分画を除菌ろ過して原液を製造することができる。製造された原液は、使用時まで凍結保管することができる。
【００４６】
他の観点において、本発明は、本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素に関する。ＨＰＬＣを利用した精製されたボツリヌス毒素の純度を確認した結果、一次陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後のボツリヌス毒素の純度は９８．３８％で（図２）、一次陰イオン交換クロマトグラフィー工程でほとんどの毒素が除去されてアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）（純度約９５％）より純度が高いことを確認できて、二次陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後のボツリヌス毒素の純度は９８．９９％であることを確認した（図３）。
【００４７】
また、本発明のボツリヌス毒素の製造方法は、ろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）およびエタノール沈殿（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）工程の省略が可能で、ボツリヌス毒素の製造過程が容易で簡単である長所があって、特に、アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）（米国公開特許第２０１２−０１５６７５６号；Ｎｏｎ−ＡＰＦ方式）に比べて２度のろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程およびエタノール沈殿（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）工程の省略により精製工程が縮小されて（５工程−＞３工程）、ボツリヌス毒素原液生産期間（４週−＞２週）を短縮させることができる長所を持つ。
【００４８】
本発明のさらに他の実施例で本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質（ＤＷＰ４５０）の安全性を確認するために、アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）と安全性を比較する実験を行った結果、本発明の方法によって製造されたボツリヌス毒素（ＤＷＰ４５０）は雌に対して６０Ｕ／ｋｇのＮＯＡＥＬ値を示してアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のボトックス３０Ｕ／ｋｇに比べて２倍以上安全なことが明らかになって、これは本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素の場合、純度が高く局所作用力が増大して副作用として示されるボツリヌス毒素の全身循環性が低くなって安全性が２倍高く示されたと見ることができる。
【００４９】
本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素は、薬学的組成物の有効性分となる。前記ボツリヌス毒素は、活動亢進性骨格筋を特徴とする神経筋肉障害の治療のために使用されてもよい。また、頭痛、偏頭痛、緊張性頭痛、副鼻腔頭痛、頚椎性頭痛、発汗障害、脇多汗症、手多汗症、足多汗症、フレイ症候群、過運動性皮膚シワ（ｈｙｐｅｒｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｋｉｎ  ｌｉｎｅ）、顔面シワ、眉間シワ、目じりシワ、口元シワ、鼻唇シワ、皮膚障害、弛緩不能症、斜視、慢性裂肛、眼瞼痙攣、筋骨格痛、線維筋痛症、すい臓炎、頻脈、前立腺肥大、前立腺炎、尿閉、尿失禁、過敏性膀胱、片側顔面痙攣、震え、筋痙攣、胃腸管障害、糖尿病、唾液過多症、排尿筋−括約筋協調不全、脳卒中後硬直、傷回復、小児脳性麻痺、平滑筋痙攣、再狭窄、局所筋緊張異常、てんかん、頸部筋緊張異常症、甲状腺障害、高カルシウム血症、強迫障害、関節炎痛み、レイノー症候群、皮膚伸展線条、腹膜癒着、血管痙攣、鼻水、筋肉痙縮、負傷筋柔、喉頭筋緊張異常、書痙および手根管症候群など多様に使用できる。
【００５０】
本発明の「薬学的組成物」とは、ボツリヌス毒素を有効性分として含む製剤を意味して、「製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」とは、薬学的組成物にボツリヌス神経毒素活性成分以外に少なくとも一つ以上の追加的な成分（賦形剤）が含まれることができる。前記追加的な成分は、アルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、ゼラチン、スクロース、トレハロース、ヒドロキシエチル澱粉、コラーゲン、ラクトース、スクロース塩化ナトリウム、ポリサッカライド、カプリル酸、ポリビニルピロリドンおよびナトリウムからなる群で選択されるが、これに限定されない。また、ボツリヌス毒素を有効性分として含む薬学的製剤は、追加的な成分（賦形剤）と組合わせる工程を含み、組合せ合工程は、フリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および真空乾燥（ｖａｃｕｕｍ  ｄｒｙｉｎｇ）からなる工程の群で選択されることを特徴とする。
【００５１】
従って、薬学的組成物はヒト患者のような対象に診断、治療または美容のために（例えば、筋肉内または皮下注射によって、または、デポ（ｄｅｐｏｔ）またはインプラントの挿入によって）投与するのに適する製剤である。薬学的組成物は、例えば凍結乾燥されたり真空乾燥された状態、凍結乾燥されたり真空乾燥された薬剤学的組成物を食塩水または水で復元した後、形成された溶液または；復元を要しない溶液であってもよい。活性成分は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧの中一つまたはクロストリジウムバクテリアによって天然で製造されることができるいずれのボツリヌス毒素であってもよい。先述の通り、薬剤学的組成物は液体または固体であってもよく、例えば真空−乾燥されることができる。ボツリヌス毒素活性成分薬学的組成物を製剤化するための代表的な方法は、２００２年１１月５日に公開された米国特許公開公報第２００３−０１１８５９８号に開示されている。
【００５２】
本発明のさらに他の実施例では、本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質（ＤＷＰ４５０）の効能を確認するために、複合筋活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＣＭＡＰ）振幅および伝導速度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ；ｔＣ）を測定した。二つのそれぞれ異なるボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であるＢＴＸ−Ａ−１（ＢＯＴＯＸ（登録商標），Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））と実施例２で製造されたＢＴＸ−Ａ−２（ＤＷＰ４５０）を用いて四つのグループに分けて実験を行った。グループ１は、０．０８ｍｌの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＮａＣｌ）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には何も投与せず、グループ２は、０．０２ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（二つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０２ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（二つのユニット）を投与した。グループ３は、０．０４ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（四つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０４ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（四つのユニット）を投与して、グループ４は、０．０８ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（八つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０８ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（八つのユニット）を投与した。
【００５３】
ボツリヌス毒素の１ユニット（ｕｎｉｔ）は、それぞれ約１８〜２０ｇで計量される雌スイスウェブスターマウスに腹腔内注射時のＬＤ５０で定義されて、ボツリヌス毒素の１ユニットは、雌スイスウェブスターマウスグループの５０％を殺すボツリヌス毒素の量である。
【００５４】
ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２の投与による複合筋活動電位を測定した結果、２Ｈｚの遅い刺激速度で、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループは、投与３日、１週、２週、３週および４週後にＴＡ筋肉（ｄＹ）の麻痺効果を観察し（図４Ａ）、２０Ｈｚの速い刺激速度でもＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループ全部において、投与３日、１週、２週、３週および４週後にＴＡ筋肉（ｄＹ）の麻痺効果を観察した（図４Ｂ）。２Ｈｚの遅い刺激速度および２０Ｈｚの速い刺激速度でＢＴＸ−Ａ−１とＢＴＸ−Ａ−２との間に有意差（ｐ＜０．０５）がないことを確認して、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２投与群全部においてＴＡ筋肉に麻痺効果は、投与したボツリヌス毒素の容量と関連があることを確認した。
【００５５】
ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２の投与による伝導速度（ｔＣ）を測定した結果、ＢＴＸ−Ａ−１とＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループ全部において、２Ｈｚの遅い刺激速度および２０Ｈｚのはやい刺激速度で伝導速度の遅延を誘発させないことを確認した（図５）。
【００５６】
すなわち、本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素はすでに商業的に販売されているアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）と似た効果を有していて、純度が高くてボツリヌス毒素の全身循環性が低くなって安全性が２倍高いので、神経筋肉障害の治療、シワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療剤など多様に利用されることができるのを確認した。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５８】
実施例１：クロストリジウムボツリヌス菌株の培養
１−１：培養に用いた培地の組成
ボツリヌス毒素の生産のためのクロストリジウムボツリヌス菌株の種培養および本培養は、２％カゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、１％酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、１％グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）および０．５％チオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）の組成を有する培地を用いた。
【００５９】
１−２：クロストリジウムボツリヌス菌株の種培養（ｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）
実施例１−１の培地組成を有する１０ｍｌの滅菌された培地が入っているｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｕｂｅに２０ｕｌのクロストリジウムボツリヌス（疾病管理本部管理番号：４−０２９−ＣＢＢ−ＩＳ−００１）を接種して３５℃で嫌気的条件で（２２〜３０時間）一次種培養（静置培養）した。一次種培養で菌株の成長が確認されると同じ培地組成を有する８００ｍｌの滅菌された培地が入っている１リットルｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｏｔｔｌｅに８ｍｌの一次種培養液を接種して３５℃で嫌気的条件で（８〜１５時間）二次種培養（静置培養）した。
【００６０】
１−３：クロストリジウムボツリヌス菌株の本培養
クロストリジウムボツリヌス菌株を培養してボツリヌス毒素を生産するために本培養を実施して、実施例１−１の組成で培地９．３リットルを調製して、１０リットル培養器に入れた後、培地滅菌を実施した。嫌気的条件は、窒素を供給して作り、温度は３５℃、撹はん速度は５０ｒｐｍに設定して成長環境を維持させた。
【００６１】
実施例１−２で二次種培養を完了した１リットルｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｏｔｔｌｅを１０リットル培養器の接種ポットと連結された接種ライン（ｌｉｎｅ）を介して１０リットル培養器に接種した。１０リットル培養器でのクロストリジウムボツリヌス菌株は、３５℃、５０ｒｐｍ条件で培養されて、培養が進行される間培養設定条件に維持されるか確認して記録した。１００時間以上培養された時本培養を終了した。
【００６２】
実施例２：ボツリヌス毒素の製造
２−１：硫酸沈殿工程
硫酸沈殿工程は、ボツリヌス菌を培養した後、残っている菌を全部死滅させて、多くの種類のタンパク質が含まれた培養液に硫酸を添加することによってｐＨを低下させてタンパク質が等電点に達することになって、沈殿させるタンパク質を分離する方法で、実施例１−３の方法で本培養を実施して、培養が完了すると１０リットル培養器のｐＨセンサーを利用してｐＨ３．４〜３．６になるように５Ｎ硫酸を自動ポンプ（ｐｕｍｐ）で添加した後、培養器の収穫ライン（ｈａｒｖｅｓｔ  ｌｉｎｅ）を介して２０リットル容器（ＡＳ  ＯＮＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ  ＡＳ５．３７２．０６）も培養液を移動させて硫酸沈殿液が入っている２０リットル容器を直ちに生物安全作業対（ＢＳＣ）に移してＢＳＣ内で硫酸沈殿を実施した。
【００６３】
２−２：酵素処理および毒素抽出
前記硫酸沈殿物から上澄み液を除去してｐＨ５．３の１Ｍリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）バッファー７００ｍｌを添加した。その次、５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を利用してｐＨを５．０〜６．０に調節して、沈殿物に残っているＤＮＡおよびＲＮＡを除去するために、０．４Ｍベンザミジン塩酸（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）６０ｍｌ、ＤＮａｓｅ  １ｇ、ＲＮａｓｅ  １ｇを添加してボツリヌス毒素を抽出するために約５時間反応させた。
【００６４】
２−３：塩酸沈殿および毒素溶解
前記毒素抽出培養液を４℃、１２０００ｘｇで１５分間遠心分離してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）と上澄み液を分離して、分離した上澄み液を新しい１０リットルビン（ＡＳ  ＯＮＥ，Ｃａｔ．Ｎｏ  ＡＳ５．３７２．０４）に移した後、１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を添加してｐＨ３．４〜３．６になるように４℃低温冷蔵庫で塩酸沈殿過程を行った。塩酸沈殿液を４℃、１２０００ｘｇで１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、毒素沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）にｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）バッファー５０ｍｌを添加して毒素を溶解させた。
【００６５】
２−４：一次陰イオン交換クロマトグラフィー
沈殿過程完了後、ボツリヌス毒素Ａ型を除いた多くの主な不純物を除去するためにイオン交換樹脂を利用してクロマトグラフィーを行った。陰イオン交換樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐ／Ｎ  １７２２８）をカラムに充填した後、前記２−３工程で沈殿させた試料を注入して、５０ｍＭリン酸ナトリウム湧出緩衝溶液で毒素を湧出した。一次精製工程でボツリヌス毒素Ａ型タンパク質は、陰イオン交換樹脂に吸着せず多くの主な不純物は吸着されて除去されて、この時、高純度ボツリヌス毒素の精製のためにｐＨは４．５〜７．０、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は５〜２０ｍＳ／ｃｍが維持されるようにした。
【００６６】
２−５：硫酸アンモニウム沈殿
陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して精製されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質が含まれている分画を集めて２０〜４０％（ｗ／ｖ）で硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）を添加してボツリヌス毒素Ａ型タンパク質を再び沈殿させて、沈殿したボツリヌス毒素Ａ型タンパク質は、ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）バッファーに再溶解した。
【００６７】
２−６：二次陰イオン交換クロマトグラフィー
硫酸アンモニウム沈殿過程完了後、ボツリヌス毒素Ａ型を除いた少数の不純物を除去するために、イオン交換樹脂を利用したクロマトグラフィーを再度行った。陰イオン交換樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐ／Ｎ  １７２２８）をカラムに充填した後、前記２−５工程で再溶解した硫酸アンモニウム沈殿物を注入して、５０ｍＭリン酸ナトリウム湧出緩衝溶液で毒素を湧出した。この時、ボツリヌス毒素Ａ型タンパク質は吸着せず少数の不純物は吸着されて除去される。
【００６８】
高純度のボツリヌス毒素での精製は、精製一次陰イオン交換クロマトグラフィー工程でほとんどの行われ、二次陰イオン交換クロマトグラフィーを利用した精製工程は、残っている余分の不純物を除去するために実施するものである。この時、高純度ボツリヌス毒素の精製のためにｐＨは４．５〜７．０、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は５〜２０ｍＳ／ｃｍが維持されるようにした。
【００６９】
２−７：原液製造
前記２−６工程の陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して精製されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質が含まれている分画を集めて、０．２ｕｍ除菌ろ過して原液を製造して、製造された原液は−７０℃以下に保管した。製造されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質はＤＷＰ４５０と命名した。
【００７０】
実施例３：精製されたボツリヌス毒素の純度確認
ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社ｅ２６９５）は、ＳＥＣ（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法で行った。移動相はｐＨ６．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を用いて、Ｐ／Ｎ  ０８５４２に対するガードカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐ／Ｎ  ０８５４３）にＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐ／Ｎ  ０８５４２）カラムを連結してボツリヌスＡ型毒素タンパク質２０μｇをローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）して１ｍＬ／ｍｉｎで３０分間流した。その結果、一次陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後のボツリヌス毒素の純度は９８．３８％で（図２）、二次陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後のボツリヌス毒素の純度は９８．９９％であることを確認した（図３）。
【００７１】
実施例４：精製されたボツリヌス毒素の安全性確認
実施例２で精製されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質（ＤＷＰ４５０）の安全性を確認するために、アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）と安全性を比較する実験を行った。
【００７２】
ＳＤ（Ｓｐｒａｕｇｅ−Ｄａｗｌｅｙ）種ラットを利用して、群構成は、試験物質（ＤＷＰ４５０）３０、６０Ｕ／ｋｇおよび対照物質（アラガンサのＢＯＴＯＸ（登録商標））３０、６０Ｕ／ｋｇの四つの容量と対照群（生理食塩注射液）の五つの群にして、群当たり雄雌それぞれ１０匹ずつ、１回／１週、計５回、５週間筋肉投与した。試験物質（ＤＷＰ４５０）６０Ｕ／ｋｇおよび対照物質（ＢＯＴＯＸ（登録商標））６０Ｕ／ｋｇ投与群には雄雌各５匹ずつ追加して毒性の可逆性を評価するために１２週間の回復期間を置いて比較反復毒性試験を行った（表１）。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
結果的に本発明のボツリヌス毒素（ＤＷＰ４５０）は、雌に対して６０Ｕ／ｋｇのＮＯＡＥＬ値を示して、アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社ボトックス３０Ｕ／ｋｇに比べて２倍以上安全であることが明らかになり、これは本発明のボツリヌス毒素の場合、純度が高くて局所作用力が増大して副作用として現れるボツリヌス毒素の全身循環性が低くなって安全性が２倍高く示されることを確認することができた。
【００７５】
実施例５：精製されたボツリヌス毒素の効能確認
実施例２で精製されたボツリヌス毒素Ａ型タンパク質（ＤＷＰ４５０）の効能を確認するために、複合筋活動電位（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ＣＭＡＰ）振幅および伝導速度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ；ｔＣ）を測定した。
【００７６】
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）種ラット雄２４匹を任意に６匹ずつ四つの群に分けて実験を進めた。二つのそれぞれ異なるボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であるＢＴＸ−Ａ−１（ＢＯＴＯＸ（登録商標），Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））と実施例２で精製されたＢＴＸ−Ａ−２（ＤＷＰ４５０）を用いた。この二つの製剤は、表２に示したとおり特性が略同じで、すべての過程においてボツリヌス毒素は０．９％生理食塩水で希釈して用いた。ラット（ｒａｔ）に１０ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を腹腔注射（ｉ．ｐ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して麻酔させた後、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２をラットの前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒ；ＴＡ）筋肉に投与した。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
グループ１は、０．０８ｍｌの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＮａＣｌ）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には何も投与せず、グループ２は、０．０２ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（二つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０２ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（二つのユニット）を投与した。グループ３は、０．０４ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（四つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０４ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（四つのユニット）を投与して、グループ４は、０．０８ｍｌのＢＴＸ−Ａ−１（八つのユニット）を一つのＴＡ筋肉に投与し、他方のＴＡ筋肉には０．０８ｍｌのＢＴＸ−Ａ−２（八つのユニット）を投与した。
【００７９】
ＣＭＡＰおよび伝導速度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）の遅延程度は、ＣｙｂｅｒＡｍｐ３８０とＤｉｇｉｄａｔａ１３２０（（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．Ｉｎｃ，米国）を利用して測定して、用いられた電極はワニ口クリップ（ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ｃｌｉｐ）を利用して皮膚に付着させて、負極は膝窩（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ）筋に正極は恥骨後隙（ｒｅｔｒｏｐｕｂｉｃ  ｓｐａｃｅ）および大腿骨の大転子（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｒｏｃｈａｎｔｅｒ  ｏｆ  ｆｅｍｕｒ）に付着させた。記録電極は、前脛骨筋の筋腹（ｂｅｌｌｙ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｂｉａ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｍｕｓｃｌｅ）、レファレンス記録電極（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は、左踵骨腱（ｌｅｆｔ  ｈｉｎｄ  ｃａｌｃａｎｅａｌ  ｔｅｎｄｏｎ）および足の裏に付着した。
【００８０】
電気刺激は、１〜５ｍＡにして、２Ｈｚの遅い刺激速度および２０Ｈｚの速い刺激速度を適用した。ＴＡ筋肉の麻痺効果は、ＣＭＡＰｓ（ｄＹ）のピークツーピーク（ｐｅａｋ  ｔｏ  ｐｅａｋ）振幅を測定して決まられ、伝導速度（ｔＣ）の遅延は、刺激点とネガティブなピーク時点との間の時間間隔を測定して決めた。
【００８１】
前記電気刺激による分析は、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２の投与前と、投与３日、１週、２週、３週および４週後にそれぞれ測定して、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２投与によるＣＭＡＰおよび伝導速度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）は、ＳＡＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ９．２，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，米国）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。
【００８２】
その結果、２Ｈｚの遅い刺激速度で、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループは、投与３日、１週、２週、３週および４週後にＴＡ筋肉（ｄＹ）の麻痺効果を観察して（図４Ａ）、２０Ｈｚの速い刺激速度でもＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループ全部において投与３日、１週、２週、３週および４週後にＴＡ筋肉（ｄＹ）の麻痺効果を観察した（図４Ｂ）。
【００８３】
２Ｈｚの遅い刺激速度および２０Ｈｚの速い刺激速度でＢＴＸ−Ａ−１とＢＴＸ−Ａ−２との間に有意差（ｐ＜０．０５）がないことを確認して、ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２投与群全部においてＴＡ筋肉に麻痺効果は投与したボツリヌス毒素の容量と関連があることを確認した。
【００８４】
ＢＴＸ−Ａ−１およびＢＴＸ−Ａ−２の投与による伝導速度（ｔＣ）を測定した結果、ＢＴＸ−Ａ−１とＢＴＸ−Ａ−２を投与したグループ全部において、２Ｈｚの遅い刺激速度および２０Ｈｚの速い刺激速度で伝導速度の遅延を誘発させないことを確認した（図５）。
【００８５】
すなわち、本発明の方法により製造されたボツリヌス毒素は、すでに商業的に販売されているアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）と似た効果があることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明に係るボツリヌス毒素の製造方法を利用すると、簡単な工程で高純度のボツリヌス毒素を製造することができるので、非常に経済的かつ効率的で、本発明の方法で製造されたボツリヌス毒素は、既存の方法で生産されたボツリヌス毒素に比べて純度が高くて局所作用力が増加するので、副作用として現れるボツリヌス毒素の全身循環性が低くなって安全性が増加する長所があって、神経筋肉障害の治療、シワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療剤など多様に利用されることができる。
【００８７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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