(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法であって、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体を、２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体が、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と結合可能な条件で、接触させる工程、
ここで第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７１〜８３番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的であり、第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７９〜８８番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的であり、並びに
（ｂ）２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片との結合を検出する工程、を含む。
【請求項２】
アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法であって、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とが複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
（ｂ）前記試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体との三元複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
ここで第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７１〜８３番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的であり、第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７９〜８８番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的であり、並びに
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、別個の、重複していない複数のエピトープに特異的であり、および、
（ｃ）前記三元複合体を検出する工程、を含む。
【請求項３】
前記エピトープ間がアミノ酸６個分より多く離れていない、請求項１または２に記載の免疫学的検定法。
【請求項４】
前記エピトープ間がアミノ酸３個分より多く離れていない、請求項３に記載の免疫学的検定法。
【請求項５】
前記抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体が、ポリクロ−ナル抗体、モノクローナル抗体または遺伝子操作されたモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫学的検定法。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫学的検定法。
【請求項７】
前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、または、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項６に記載の免疫学的検定法。
【請求項８】
前記第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０、から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項６に記載の免疫学的検定法。
【請求項９】
前記試料が、対象の体液または組織に由来するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫学的検定法。
【請求項１０】
アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するためのキットであって、
（ｉ）配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７１〜８３番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および
（ｉｉ）配列番号１に記載のプレアウグリンのアミノ酸７９〜８８番目にまたがる配列に含まれる一つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、
を含んでいるキット。
【請求項１１】
（ｉ）前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、または、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９によって産生されるものであり、および、
（ｉｉ）前記第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体が、ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０によって生成されるものである、
請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
抗アウグリン抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体であって、抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体が、プレアウグリン配列の６アミノ酸ＷＤＲＴＲＰ（配列番号１３）を含む一つのエピトープに特異的であるか、またはプレアウグリン配列の６アミノ酸ＱＷＹＱＱＦ（配列番号１４）もしくは５アミノ酸ＷＹＱＱＦ（配列番号１５）を含む一つのエピトープに特異的である、抗アウグリン抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体。
【請求項１３】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９、から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１３の抗体と同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１５】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、またはＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９、から選択されるハイブリドーマ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的検定の分野に入るものである。本発明は具体的には、対象の体液または組織に由来する試料中に含まれるアウグリン(augurin)またはその前駆体もしくは断片のレベルを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年同定された分泌ペプチドであるアウグリンは、食道がん関連遺伝子４（ＥＣＲＧ４）によってコードされており、脊椎動物で保存されている（ミラビュー（Ｍｉｒａｂｅａｕ）ら、２００７、ゲノム研究（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１７：３２０〜３２７）。ヒトＥＣＲＧ４は１４８アミノ酸のタンパク質をコードしており、そのうち、１〜３０番目の残基はリーダーペプチドである。ＥＣＲＧ４によってコードされているこのタンパク質のプロセシングされた一形態はアウグリン（残基３１〜１４８）と呼ばれているが、６８〜７１番目の残基の位置にホルモン前駆体切断部位が１箇所あるため、１つの推定ホルモン前駆体から、ＥＣＲＧ４のＥＣ部分に続くエシリン（残基３１〜７０）と、ＥＣＲＧ４のＲＧ部分に続くアルジリン（７１〜１４８）と呼ばれる断片の、２つの推定ペプチドホルモンが生成される（ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、２０１１、中枢神経系の分泌液と障壁（Ｆｌｕｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＮＳ）８：６）。トロンビンと一緒にインキュベートすると、保存されている第二推定タンパク質切断部位がトロンビンによって切断され、Ｃ末端Δ１６配列（１３４〜１４８番目のアミノ酸残基）が生じる。加えて、２量体アウグリンについても記載されている（ゴンザレスら、２０１１、中枢神経系の分泌液と障壁  ８：６）。
【０００３】
マウス下垂体腺腫とヒト結腸悪性腫瘍細胞を使ったアウグリンの翻訳後修飾に関する試験から、アウグリンが酵素であるフリンによって切断され、構成的分泌経路を通じて分泌されることが明らかにされた（オザワ（Ｏｚａｗａ）ら、２０１１、分子内分泌学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）２５（５）、７７６−７８４）。加えて、アウグリンが輸送中に硫酸化されること、およびアウグリンの翻訳後修飾に必須のタンパク質切断（Ｒ41Ｅ42  および／またはＲ70Ｑ71での切断）が細胞増殖を抑制することが明らかになっている。
【０００４】
ダング（Ｄａｎｇ）らは２０１２年、ＥＣＲＧ４がヒト細胞の上皮表面に局在することを発見し（ダングら、２０１２．  細胞組織研究（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ）３４８（３）：  ５０５−５１４）、ＥＣＲＧ４の放出は細胞特異的であり、種々の組織におけるそれぞれのＥＣＲＧ４活性が組織特異的な過程によって制御されている可能性があると推測した。
【０００５】
ＥＣＲＧ４はヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓において組織特異的な発現を示し、心臓と肝臓での発現が最も高かった（ステック（Ｓｔｅｃｋ）ら、２００２、生化学と生物物理研究速報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）２９９：１０９〜１１５）。脳領域では、ＥＣＧＲ４は主に視床下部と脈絡膜叢上皮細胞で見いだされた（タッドロス（Ｔａｄｒｏｓｓ）ら、２０１０、英国薬理学誌（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）１５９：  １６６３〜１６７１；  ドナフエ（Ｄｏｎａｈｕｅ）ら、２０１０．  脳脊髄分泌液研究（Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）７（紀要１）：Ｓ３２；ゴンザレスら、２０１１、中枢神経系の分泌液と障壁  ８：６）。ラットの中枢神経系（ＣＮＳ）が損傷を受けると、脈絡膜叢上皮においてアウグリンとＥＣＲＧ４遺伝子の発現が急速に低下することが検出された。同時に、アウグリンはＣＮＳ負傷直後に動態化され、脳脊髄液（ＣＳＦ）に放出されたと推測された（ポドビン（Ｐｏｄｖｉｎ）ら、２０１１、プロスワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）６（９）：  ｅ２４６０９）。ヒトのＣＳＦでは、アウグリン前駆体は内因性ペプチドとして同定された（ホエルタエ（Ｈｏｅｌｔｔａｅ）ら、２０１２、プロスワン７（８）：ｅ４２５５５）。
【０００６】
アウグリンは視床下部ＣＲＦの放出によってＡＣＴＨの放出を刺激し、視床下部下垂体を制御するための治療用標的となり得ることが示されている（タッドロスら、２０１０、英国薬理学誌  １５９：１６６３〜１６７１）。さらにＥＣＲＧ４は特に軟骨細胞と軟骨において発現量が多く、発現量は軟骨細胞が分化している最中に劇的に増加し、骨関節炎を起こしている軟骨では低下した。このことから、ＥＣＲＧ４が分化している関節軟骨細胞と軟骨破壊のマーカーとなることが示唆されている（フー（Ｈｕｈ）ら、２００９、遺伝子（Ｇｅｎｅ）４４８：７〜１５）。
【０００７】
成体マウスの脳では、ＥＣＲＧ４は神経細胞の老化や加齢に関与していると考えられている（クジロ（Ｋｕｊｕｒｏ）ら、２０１０、ＰＮＡＳ  １０７（１８）：８２５９〜８２６４）。
【０００８】
ＥＣＲＧ４遺伝子は種々の癌（たとえば、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、前立腺癌、結腸直腸癌、悪性神経膠腫、胃癌）では過剰メチル化を介して下方制御されている。このことは、エピジェネティックな制御が正常な細胞から癌細胞への転換に関与していることを示唆している（ユエ（Ｙｕｅ）ら、２００３、世界消化器病学誌（Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）９（６）：１１７４−１１７８；バナジャ（Ｖａｎａｊａ）ら、２００９、癌調査（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）２７（５）：５４９〜５６０；  ゴエズ（Ｇｏｅｔｚｅ）ら、２００９、ＢＭＣキャンサー（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ）９：４４７；ワング（Ｗａｎｇ）ら、２０１２、肝消化器病学（Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）５９（１１８）：１６９６〜１６９８）。ＥＣＲＧ４遺伝子の過剰メチル化は前立腺癌の再発予測と関連づけられており（バナジャら、２００９、癌調査２７（５）：５４９〜５６０）、初期胃癌のモニタリングおよび病気の重症度（ステージ）の予測に利用できる可能性がある（ワングら、２０１２、肝消化器病学５９（１１８）：１６９６〜１６９８）。さらに、ＥＣＲＧ４のｍＲＮＡの発現レベルが限局的な侵襲性、病気のステージ、および予後と関連しているので、ＥＳＣＣ患者用の独立した予後因子の候補となり得ることが示されている（モリ（Ｍｏｒｉ）ら、腫瘍学レポート（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）１８：９８１〜９８５；リー（Ｌｉ）ら、２００９、国際対がん連合雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）：１２５、１５０５〜１５１３）。モリと共同研究者らはさらに、手術の恩恵を受けられる患者だけを手術に選択することも重要であるだろうと仮定した。ＥＣＲＧ４のｍＲＮＡの発現は、侵襲的な乳癌試料では減少しており、このことは癌のステージおよびサイズと関連があった（サバティエ（Ｓａｂａｔｉｅｒ）ら、２０１１、プロスワン６（１１）：  ｅ２７６５６）。さらに、ＥＣＲＧ４のｍＲＮＡの発現は、無病生存率および乳癌患者の全生存率と関連があったため、癌の予後因子であると示唆されている。
【０００９】
ＥＣＲＧ４のｍＲＮＡはヒト末梢血液細胞内でも上昇していたが、リポ多糖（ＬＰＳ）と共にインキュベートすると、多型核細胞と単球の細胞表面におけるＥＣＲＧ４は顕著に減少した（バイラード（Ｂａｉｒｄ）ら、２０１２、白血球生物学雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）９１（５）：７７３〜７８１）。ＬＰＳを処理した白血球の馴化培地から、１４ＫＤａと８ＫＤａの（ＥＣＲＧ４の７１〜１４８に相当する）ＥＣＲＧ４が検出された（バイラードら、２０１２、白血球生物学誌９１（５）：７７３〜７８１）。白血球におけるＥＣＲＧ４の比較的低い発現レベルは、ＴＢＳＡやけどを負った患者の外傷、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）や損傷を負った鈍的外傷患者に関連している可能性があり、このことは、傷害の生物学にＥＣＲＧ４が臨床的に関連していること、およびＥＣＲＧ４が炎症反応に関与していることを示唆している。しかしながら、ＥＣＲＧ４の発現は血中では検出されていない（バイラ−ドら、２０１２、白血球生物学誌９１（５）：７７３〜７８１）。さらに、ラットの実験中耳炎では、ラットの粘膜組織に感染させた後３〜４８時間の間に、ＥＣＲＧ４の発現が急激に減少したことが示されている（クラビ（Ｋｕｒａｂｉ）ら、２０１３、プロスワン８（４）：ｅ６１３９４）。
【００１０】
ヒトのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）を検出する競合酵素免疫学的検定がフェニックス・ファーマシューティカルズ社（バーリンゲム、カリフォルニア、米国）から入手可能である。しかしながら、アウグリンならびにその断片および前駆体を検出するための、高感度かつ高選択性で、同時に再現性が高く、検定間でのばらつきが小さい改良された検定が必要とされている。本発明は、例えば、低濃度のアウグリンを高い選択性で検出するための研究用ツールとして使用することができる、そのような測定法を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の対象は、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法である。一側面においてこの方法は、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体が、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と結合可能な条件であり、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片との三元複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
ここで前記第１と第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、別個の重複していない複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、および、
（ｂ）２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片との結合を検出する工程、を含む。
【００１２】
本発明はまた、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法に関し、この方法は、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とが複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
（ｂ）前記試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体とが三元複合体を形成可能な条件で接触させる工程、
ここで、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、別個の、重複していない複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、および、
（ｃ）前記三元複合体を検出する工程、を含む。
【００１３】
本発明はまた、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するためのキットに関し、このキットは、
（ｉ）配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目、より好ましくは７１〜８３番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープ(an epitope)に特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、
（ｉｉ）配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目、より好ましくは７９〜８８番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープ(an epitope)に特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、
を含んでいる。
【００１４】
本発明はさらに、抗アウグリン抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体を対象とし、ここで、抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目、より好ましくは７１〜８３番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープ(an epitope)に特異的であるか、または配列番号１のプレアウグリンの７９〜８８番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープ(an epitope)に特異的である。
【００１５】
本発明はさらに、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９、から選択されるハイブリドーマ細胞株に関する。
【００１６】
好ましい方法の変異形態を従属請求項に記載している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プレアウグリンと、プロセシングを受けて生成され得るペプチドの構造。
【図２】ペプチドＰＱＷ１４（配列番号９）を免疫化して得られたモノクローナル抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４およびＡＫ４３９／Ｈ１０のエピトープマッピングの結果。
【図３】ペプチドＡＵＧ−ＥＬ１０（配列番号１０）を免疫化して得られたモノクローナル抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７、ＡＫ４８２／Ｈ２、ＡＫ４８２／Ｇ９およびＡＫ４８２／Ｈ１０のエピトープマッピングの結果。
【図４】分析物の安定性。表示された期間、２２℃で保存した後の、各材料に由来する１０試料の平均値（ＳＥＭ）。モノクローナル免疫学的検定によって測定し、保存しなかった試料と比較した平均値（回復率、％）を示している。
【図５】モノクローナル免疫学的検定によって測定した組換えプレアウグリンの用量反応曲線。
【図６】モノクローナル免疫学的検定によって測定した、健常者集団（ｎ＝１００）におけるアウグリン免疫活性の度数分布。
【図７Ａ】種々の標準物質の測定。フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）競合酵素免疫学的検定による測定。
【図７Ｂ】種々の標準物質の測定。ポリクロ−ナル抗体を用いた参照サンドイッチ式免疫学的検定による測定。
【図７Ｃ】種々の標準物質の測定。モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ式免疫学的検定による測定。
【図８】分析物検出の精度に関して生じ得る差に関する試験結果。８つの混合試料を、実施例２および３で説明したポリクロ−ナル抗体およびモノクローナル抗体を使った免疫学的検定、ならびにフェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）検定を使用して測定。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明はアウグリンタンパク質またはその前駆体ペプチドもしくはペプチド断片を検出するための免疫学的検定に関する。特にこの免疫学的検定では、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目のアミノ酸、好ましくは７１〜８８番目のアミノ酸を含んでいる複数のエピトープ(epitopes)を検出する。したがって、本発明で提供する免疫学的検定では、プレアウグリンの７１〜１０７番目のアミノ酸、好ましくは７１〜８８番目のアミノ酸を包含しているアウグリンの断片および前駆体を検出することができる。これらの断片には以下に概要を示すように、アルジリン、Δ１６−アウグリン、およびΔ１６−アルジリンが含まれる（例えば図１を参照のこと）。本発明の免疫学的検定法は、プレアウグリンの７１〜１０７番目にわたるアミノ酸配列中の複数のエピトープ(epitopes)に特異的に結合することが可能な２つの抗アウグリン抗体を組み合わせると、アウグリン（または、複数のエピトープ(epitopes)を含んでいるその断片もしくは前駆体）の検出能力が向上するという驚くべき結果に基づくものである。本発明の免疫学的検定法では、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは、７１〜８８番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的に結合することが可能な２つの別個の抗アウグリン抗体を用いる。本発明の免疫学的検定によると、２つの抗体が、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に結合することで、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を定性的におよび／または定量的に検出することができる。両方の抗体がアウグリンまたはその前駆体もしくは断片に結合すれば、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片が存在するとして検出される。言い換えると、本発明は、試料中のアウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定に関し、この方法は、前記試料を、第１の抗アウグリン抗体（またはその抗原結合断片もしくは誘導体）および第２の抗アウグリン抗体（またはその抗原結合断片もしくは誘導体）と接触させる工程、および、前記抗体とアウグリンまたはその前駆体もしくは断片との三元免疫複合体の有無を検出する工程を含む。免疫複合体は前記抗体と前記試料との間の免疫反応が可能な条件で形成される。
【００１９】
一側面において本発明は、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定に関し、この方法は、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体が、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と結合可能な条件であり、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片との三元複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
ここで前記第１と第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、別個の重複していない複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、および、
（ｂ）２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片との結合を検出する工程、を含む。２つの抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体の特異的な結合が、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片が存在することの指標となる。
【００２０】
本発明はまた、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法にも関し、この方法は、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とが複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
（ｂ）前記試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体とが三元複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
ここで、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目にかけてのアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、別個の、重複していない複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、および、
（ｃ）前記三元複合体を検出する工程、を含む。試料中に三元複合体が含まれていると検出されることが、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片が存在することの指標となる。
【００２１】
本発明による免疫学的検定法では、第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜９５番目、より好ましくは７１〜９０番目、最も好ましくは７１〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的である。２つの抗体のエピトープは重複している複数のエピトープ(epitopes)であってもよく、または重複していない複数のエピトープ(epitopes)であってもよい。たとえば、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間は好ましくはアミノ酸６個分以上離れていない。つまり、アウグリン配列内の２つのエピトープの間には、アミノ酸残基が６個以上は存在しない。このエピトープ間は、アミノ酸残基６個分以上、または、５個分以上、４個分以上、３個分以上、２個分以上、もしくは１個分以上離れていない。２つのエピトープは、互いが直接隣接していても、つまり、２つのエピトープの間にアミノ酸残基が全くなくてもよい。
【００２２】
場合によっては、第１および第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、７１〜１０７番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、かつ、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間はアミノ酸６、５、４、３、２、１または０個分以上離れていない。第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体はまた、７１〜１００番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であってもよく、かつ、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間はアミノ酸６、５、４、３、２、１または０個分以上離れていない。第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体はまた、７１〜９５番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であってもよく、かつ、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間はアミノ酸６、５、４、３、２、１または０個分以上離れていない。第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体はまた、７１〜９０番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であってもよく、かつ、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間はアミノ酸６、５、４、３、２、１または０個分以上離れていない。第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体はまた、７１〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であってもよく、かつ、２つの抗体の前記複数のエピトープ(epitopes)間はアミノ酸６、５、４、３、２、１または０個分以上離れていない。
【００２３】
前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１の７１〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる複数のエピトープ(epitopes)に特異的であり、かつ、前記複数のエピトープ(epitopes)がアミノ酸３個分以上離れていないことが特に好ましい。たとえば、第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７１〜８３番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的であり、２番目の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、配列番号１のプレアウグリンの７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的である。
【００２４】
本明細書の以降でより詳細に議論するように、本明細書に記載の免疫学的検定法の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、例えば、ポリクロ−ナル抗体、モノクローナル抗体または遺伝子操作されたモノクローナル抗体であってよい。両方の抗体がモノクローナル抗体であることが好ましい。例えば、第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として寄託されている細胞株４８２／Ｈ２、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として寄託されている細胞株４８２／Ｈ１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として寄託されている細胞株４８２／Ｈ７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として寄託されている細胞株４８２／Ｇ９から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される。第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、例えば、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として寄託されている細胞株４３９／Ｆ４、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として寄託されている細胞株４３９／Ｈ１０から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される。本明細書の免疫学的検定法や本発明を使用したキットの本要件では、好ましくは、第１の抗体はハイブリドーマ細胞株４８２／Ｈ７によって生成された抗体であり、第２の抗体はハイブリドーマ細胞株４３９／Ｆ４によって生成された抗体である。
【００２５】
これまでに概要を述べたように、本発明の免疫学的検定では、プレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目のアミノ酸残基を包含するアウグリンの断片および前駆体を検出することが可能である。従って本発明は、アルジリンを検出するための免疫学的検定法、Δ１６−アウグリンを検出するため免疫学的検定法、およびΔ１６−アルジリンを検出するための免疫学的検定法を提供する。
【００２６】
抗体とアウグリン（またはその前駆体もしくは断片）との結合は適切な条件（つまり、免疫反応を起こすこと、すなわち、免疫複合体を形成する上での抗体とアウグリンとの結合を起こすことが可能である条件）で行われる。そのような条件は当業者に知られており、また、以下に記載するような免疫学的検定に関する標準的な形式を使用することができる。そのような条件とは、好ましくは、生理学的な温度、ｐＨ、およびイオン強度のもとでということであり、培地、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行ってもよい。
【００２７】
好ましい検出法としては、例えば、放射標識免疫測定（ＲＩＡ）、化学発光免疫学的検定および蛍光免疫法、酵素免疫学的検定（ＥＬＩＳＡ）、ルミネクス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）に基づくビーズ測定法、タンパク質マイクロアレイ測定法のような様々な形式の免疫学的検定、ならびに、例えば、免疫クロマトグラフストリップ試験のような迅速な試験形式が挙げられる。
【００２８】
検定は、均一なまたは不均一な検定、競合的なおよび非競合的な検定である可能性がある。特に好ましい態様において検定は、非競合的な免疫学的検定であるサンドイッチ式検定の形式であり、この方法では、第１の抗体および第２の抗体に結合している分析物が検出および／または定量される。例えば、第１の抗体は固相（例えば、ビーズ、ウェルもしくは他の容器の表面、チップまたはストリップ）に結合させたものであってもよく、第２の抗体は標識した抗体、例えば色素、放射性同位体、または反応性もしくは触媒活性をもつ部分で標識した抗体である。次いで適した方法によって、分析物に結合した、標識されている抗体の量を測定する。「サンドイッチ式検定」に関連する一般的な組成や手順は確立されており、当業者に知られている。（免疫学的検定ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、デビッド・ワイルド編、エルゼビア有限責任会社、オックスフォード、第３版（２００５年５月）、ＩＳＢＮ−１３：  ９７８〜００８０４４５２６７；ハルツチグ（Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ）Ｃら、化学生物学最新見解（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．）２００６年２月；１０（１）：４〜１０。ＰＭＩＤ：１６３７６１３４。参照することにより本明細書に組み入れられる）。サンドイッチ式免疫学的検定は、例えば、１段階測定、または２段階測定として設計することができる。
【００２９】
特に好ましい態様においてこの検定は、２つの抗体分子（つまり、抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体）、好ましくは抗体を含み、この２つの抗体分子はいずれも液体反応混合液中に分散して存在し、ここで、第１の標識成分が第１の抗体に結合しており、前記第１の標識成分は蛍光または化学発光の消光または増幅に基づく標識システムの一部であり、かつ、前記標識システムの第２の標識成分は第２の抗体分子に結合しており、よって、両方の抗体分子が分析物に結合すると測定可能なシグナルが生じ、試料を含んでいる溶液中に形成されたサンドイッチ複合体の検出が可能となる。
【００３０】
さらにより好ましくは、前記標識システムは、希土クリプテートまたは希土キレートと蛍光色素または化学発光色素（特にシアニン型の色素）との組み合わせを含む。本発明では、蛍光に基づく測定方法では色素を使用し、色素は例えば、ＦＡＭ（５−もしくは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素（例えばＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５、ＣＹ３．５、ＣＹ７）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４’，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ，６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｒ５）、６−カルボキシルローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）色素（例えばボディピーＴＭＲ）、オレゴングリーン、クマリン（例えばウンベリフェロン）、ベンズイミド（Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅｓ）（例えばヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８）、フェナントリジン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅｓ）（例えばテキサス・レッド、ヤキマ・イエロー、アレクサフルオロ）、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などからなる群から選択され得る。
【００３１】
本発明において化学発光に基づく検定では、カーク−オスマー著、化学工学の百科事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第４版、編集局長クロスウィッツ；編集ハウ−グラント、ジョン・ウィリーアンドサンズ、１９９３年、１５巻、５１８〜５６２頁で記載されている化学発光物質についての物理的原理に基づいて、色素を使用する。この文献は、５５１〜５６２頁に記載の引用文献と共に、参照することにより本明細書に組み入れられる。好ましい化学発光色素はアクリジニウムエステルである。
【００３２】
本明細書中で言及している通り、「検定」は免疫学的検定の分野で使用されているどのような種類の検定であってもよい。そのような検定は、特定の親和性にのっとった、検出される分析物と１つまたは複数の補足プローブ（ここでは、抗体分子、つまり、抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体）との結合に基づくものであってよい。抗体分子と標的分子または目的の分子（つまりアウグリンやその前駆体もしくは断片）との間での相互作用を考慮すると、その親和定数は１０8〜１０11／Ｍの範囲であり、好ましくは１０9／Ｍより高い値である。
【００３３】
検定の「感度」とは、実際に陽性であるもののうち、正しく陽性と同定されたものの割合、つまり、陽性の結果を同定する能力（実際に陽性の結果／陽性の数）に関する。したがって、検定によって検出できる分析物の濃度が低ければ低いほど、その検定の感度は高い。検定の「特異性」とは、実際に陰性であるもののうち、正しく陰性と同定されたものの割合、つまり、陰性の結果を同定する能力（実際の陰性／陰性の数）に関する。抗体の「特異性」は、個々の抗原結合部位がたった１つの抗原エピトープと反応する能力として定義される。抗体の結合挙動は、その親和性（アフィニティ）とその結合活性（アビディディ）で表すことができる。抗体の「親和性」とは、単一の抗原エピトープと単一の抗原結合部位との間の反応強度の尺度である。抗体の「結合活性」とは、多くのエピトープを有する抗原と多価抗体との間の、総体的なの強度の尺度である。
【００３４】
本発明において抗体分子（本明細書では「補足分子」とも呼ばれる）は、試料に由来する標的分子および／または目的の分子、つまり分析物（すなわち本発明ではアウグリン）またはその前駆体もしくは断片に結合させるのに使用することができる分子である。したがって補足分子は、標的分子および／または目的の分子に特異的に結合するように、空間的な特徴と表面の特徴との両面において適切な形状でなければならず、そのような特徴には、表面の電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体または受容体の有無などがある。そのため結合は、補足分子と標的分子または目的の分子との間の、例えば、イオン結合、ファン・デル・ワールス結合、パイ−パイ結合、シグマ−パイ結合、疎水結合もしくは水素結合による相互作用で、または２つ以上の前述の相互作用の組み合わせによるものであり得る。本発明では、補足分子は抗体分子である。好ましくは、抗体分子は、標的または目的の分子に対して十分な親和性のある抗体断片を含む抗体であり、組換え抗体または組換え抗体断片、ならびに前記抗体を化学的におよび／または生化学的に改変した誘導体、あるいはそれらの少なくとも１２個分の長さのアミノ酸を有する変異鎖に由来する断片を含む。
【００３５】
本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、そうでないことが記載されていない限り、広く、抗体分子および様々な抗体由来の分子の両方を指す。そのような抗体由来の分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖もしくは軽鎖可変領域のいずれか）、ならびに個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子との間のキメラ融合体などを含む。本発明による機能的な免疫グロブリン断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合しているＦｖ、ＦａｂとＦ（ａｂ’）２である可能性がある。本発明の抗体またはその断片は、アウグリンおよびその断片を検出するための免疫学的検定法を確立するために使用することができる。抗体は、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＧであってよく、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり、最も好ましくはＩｇＧ１抗体である。「抗体」という用語はさらに、ポリクロ−ナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、好ましくはＩｇＧ１抗体；キメラモノクローナル抗体；ヒト化抗体、遺伝子操作されたモノクローナル抗体も包含する。
【００３６】
抗体は、例えば、試料から得られた目的の分子に特異的に結合するファージディスプレイなどの技術によって選択される。本明細書において「特異的結合」という用語は、目的の分子またはその断片に対して作成された抗体を指す。抗体は、その目的の分子またはその前述したような断片に対する親和性が、目的の分子を含んでいる試料中に存在する他の分子に対する親和性よりも、少なくとも好ましくは５０倍を上回る、より好ましくは１００倍を上回る、最も好ましくはすなくとも１０００を上回る場合に、特異的であると見なされる。抗体の作成方法および所与の親和性を所有する抗体の選択方法は当該分野においてはよく知られている。本発明の抗体／抗体分子は、組換え的に容易に構築・発現させることができる。十分量の本発明の抗体分子は、とりわけ当該分野で知られている組換え法によって容易に産生できる。例えば、ベントリイ、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）１７、１９９８年、５５９〜５６７：ラシェール（Ｒａｃｈｅｒ）、応用微生物および生物学（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）４０（１９９４）、８５１〜８５６；サミュエルソン（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ）、欧州免疫学雑誌（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２６（１９９６）、３０２９〜３０３４）を参照のこと。
【００３７】
本明細書において抗体分子は、好ましくは、完全な抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン）、Ｆ（ａｂ）−、Ｆａｂｃ−、Ｆｖ−、Ｆａｂ’−、Ｆ（ａｂ’）2−断片、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ接木抗体、２価の抗体構築物、抗体融合タンパク質または合成タンパク質である。モノクローナル抗体が好ましい。
【００３８】
本発明はまた、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するためのキットに関し、このキットは、
（ｉ）配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目、より好ましくは、７１〜８３番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および
（ｉｉ）配列番号１のプレアウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜８８番目、より好ましくは、７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、を含む。このキットは、好ましくは、
（ｉ）配列番号１のプレアウグリンの７１〜８３番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、および
（ｉｉ）配列番号１のプレアウグリンの７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体、を含む。抗体は好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００３９】
本発明はさらに、体液由来の生体試料に含まれているアウグリンまたはその断片を検出および／または定量するためのサンドイッチ形式の免疫学的検定における本発明のキットの使用に関する。そのような断片は、２つの抗体が標的とする、少なくとも２つのエピトープにわたる配列を含む。例えばこのキットを使用して、アウグリン、アルジリン、Δ１６−アウグリンおよびΔ１６−アルジリンを検出および／または定量することができる。
【００４０】
本明細書で言及しているように、「断片」という用語はより大きなタンパク質またはペプチドから誘導可能なより小さいタンパク質またはペプチドを指す。従って「断片」は、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を含む。前記断片は、より大きなタンパク質またはペプチドから、それらの１つまたは複数のペプチド結合を鹸化することで誘導できる。
【００４１】
「試料」という用語は、好ましくは、生体試料である。本明細書で使用する場合、「試料」とは、診断、予後または評価の目的で目的の対象から、例えば患者から、得た体液または組織の試料を指す。本発明の目的に関する「患者」または「対象」には、ヒトおよび他の動物（特に哺乳動物）の両方、ならびに他の生物が含まれる。従って本方法は、ヒトの診断および獣医学的な使用に応用することが可能である。好ましい態様では、患者は哺乳動物であり、最も好ましい態様では、患者または対象はヒトである。
【００４２】
好ましい被験試料としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、ならびに胸水が上げられる。加えて当業者であれば、被験試料によっては、分取または精製の手順を追うことで、例えば、全血を血清または血漿成分に分離することで、より迅速に分析できることが理解できるだろう。
【００４３】
従って本発明の好ましい態様では、試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、唾液試料および尿試料または前述したすべての試料の抽出物を含む群から選択される。試料は、好ましくは血液試料であり、より好ましくは血清試料または血漿試料である。
【００４４】
血清または血漿試料は、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含む可能性がある血液細胞を、定量的に血清または血漿から分離するという手段によって得ておくことが好ましい。このことは例えば、血液試料を少なくとも２０００〜３０００ｇで少なくとも１５分間遠心分離することによって、達成することができる。
【００４５】
本発明で使用する前に試料を、必要に応じて、均質化するか、または溶媒を使って抽出して液体試料とする必要がある場合がある。そのため液体試料は、溶液または懸濁液であり得る。本発明で使用する前に、液体試料を１つ以上の前処理にかけてもよい。そのような前処理には、これらに限定されるものではないが、希釈、ろ過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿、透析が挙げられる。前処理は、化学的または生化学的な物質、例えば酸、塩基、緩衝剤、塩、溶媒、反応性色素、界面活性剤、乳化剤、キレート剤を溶液に加えることを含んでいてもよい。
【００４６】
本発明における「血漿」とは、遠心分離後に得られる、抗凝血剤を含むが細胞を実質的に含んでいない、血液の上清のことである。抗凝血剤の例としては、ＥＤＴＡまたはクエン酸などのカルシウムイオン結合化合物、およびヘパリナート（ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ）またはヒルジンなどのトロンビン阻害剤が挙げられる。細胞を含まない血漿は、抗凝血剤処置した血液（例えば、クエン酸、ＥＤＴＡ化またはヘパリンで処置した血液）を少なくとも１５分間、２０００〜３０００ｇで遠心分離することによって、得ることができる。
【００４７】
これまでに概要を述べたように、本発明はまた、プレアウグリン（配列番号１）の７１〜１０７番目、好ましくは７１〜１００番目、より好ましくは７１〜９５番目、さらに好ましくは７１〜９０番目、さらにより好ましくは７１〜８８番目、最も好ましくは７１〜８３番目および７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープを標的とする抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体に関する。好ましい抗体は本明細書で後述する。本発明はさらに、体液由来の生体試料に含まれているアウグリンまたはその断片を検出および／または定量するためのサンドイッチ形式の免疫学的検定における、本明細書で記載の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体の使用に関する。そのような断片は、２つの抗体が標的とする、少なくとも２つのエピトープにわたる配列を含む。例えばこのキットを使用して、アウグリン、アルジリン、Δ１６−アウグリンおよびΔ１６−アルジリンを検出および／または定量することができる。
【００４８】
本発明の抗体、キットおよび免疫学的検定において、プレアウグリン（配列番号１）の７１〜１０７番目、好ましくは７１〜１００番目、より好ましくは７１〜９５番目、さらにより好ましくは７１〜９０番目、さらにより好ましくは７１〜８８番目、最も好ましくは７１〜８３番目および７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープを標的とする抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または遺伝子操作されたモノクローナル抗体である。抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４９】
アウグリンの７１〜１０７番目、好ましくは７１〜１００番目、より好ましくは７１〜９５番目、さらにより好ましくは７１〜９０番目、さらにより好ましくは７１〜８８番目、最も好ましくは７１〜８３番目および７９〜８８番目にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープを標的とする抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、ＩｇＧであるか、またはＩｇＧから誘導されることが好ましい。
【００５０】
本発明によるモノクローナル抗体は、好ましくは、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０またはＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１にてＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞株から産生したものであってもよい。これらの細胞株は、本発明のプレアウグリンの７１〜８８番目の残基にわたるアミノ酸配列に含まれる1つのエピトープを標的とする特定のモノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｈ７を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｈ２を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｇ９を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｈ１０を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。モノクローナル抗体ＡＫ４３９／Ｆ４を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。モノクローナル抗体ＡＫ４３９／Ｈ１０を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１３年７月３日、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７として、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託された。全てのハイブリドーマ細胞株は、本明細書で前述し、実施例１で詳細を記載する原則に従って作成した。
【００５１】
最後に、本発明はまた、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０６、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０８、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２１０およびＤＳＭ  ＡＣＣ３２１１としてＤＳＭＺに寄託したハイブリドーマ細胞株にも関する。これらのハイブリドーマ細胞株は、プレアウグリンの７１〜８８番目のアミノ酸、特にプレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸および７９〜８８番目のアミノ酸を標的とする、本発明の好ましい抗体を産生する。
【００５２】
前述のハイブリドーマ細胞株から産生された抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、本発明の免疫学的検定法の中で使用することが、または、本発明によるキットに含めることが可能である。
【００５３】
本発明の免疫学的検定またはキットの具体的な側面において、第１の抗体はプレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸を標的とするモノクローナル抗体であり、第２の抗体はプレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸を標的とするモノクローナル抗体である。例えば、抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７と抗ＰＱＷ１４抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４の組み合わせが好ましい。例えばサンドイッチ式ＥＬＩＳＡ測定法では、抗ＰＱＷ１４抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４をトレーサー抗体として、抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７を固相抗体として使用することができる。
【００５４】
ＰＱＷ１４ペプチド（配列番号９）（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸）を標的とするモノクローナル抗体には、本明細書で記載のＡＫ４３９／Ｆ４およびＡＫ４３９／Ｈ１０抗体が含まれる。ＡＵＧ−ＥＬ１０ペプチド（配列番号１０）（プレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸に対応）を標的とするモノクローナル抗体には、本明細書で記載のＡＫ４８２／Ｈ７、ＡＫ４８２／Ｈ２、ＡＫ４８２／Ｇ９および抗体ＡＫ４８２／Ｈ１０が含まれる。
【００５５】
具体的な態様において本発明は、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を検出するための免疫学的検定法に関し、この方法は、
（ａ）アウグリンまたはその前駆体もしくは断片を含むことが疑われる試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体を、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とが複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
（ｂ）前記試料と、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片に特異的な第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体とを、アウグリンまたはその前駆体もしくは断片と、前記第１および第２の抗体またはそれらの抗原結合断片もしくは誘導体とが三元複合体を形成可能な条件で、接触させる工程、
ここで、前記第１の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、プレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸を標的とするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体であり、第２の抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体は、プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸を標的とするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体であり、および
（Ｃ）三元複合体を検出する工程、を含む。この態様における免疫学的検定は、好ましくはサンドイッチ式ＥＬＩＳＡ測定法であり、より好ましくは、抗ＰＱＷ１４抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４をトレーサー抗体（「第２の抗体」）として、抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７を固相抗体（「第１の抗体」）として使用する。しかしながら、前述した抗体の他の組み合わせも用いることができる。例えば、抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７をトレーサー抗体として（「第２の抗体」）、かつ、抗ＰＱＷ１４抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４を固相抗体（「第１の抗体」）として使用することができる。
【００５６】
［配列］
アウグリンの前駆体ペプチド（プレアウグリン）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｎ端末シグナルペプチド（３０アミノ酸）が切断されると、アウグリンのプレアウグリン配列の３１〜１４８番目のアミノ酸残基に関する部分が放出される。アウグリンのアミノ酸配列を配列番号２に示す。エシリンはプレアウグリンの３１〜６８番目のアミノ酸残基に関する。エリシンのアミノ酸配列を配列番号３に示す。アルジリンはプレアウグリンの７１〜１４８番目のアミノ酸残基に関する。アルジリンのアミノ酸配列を配列番号４に示す。アウグリンはまた、切断されるとΔ１６（配列番号５）というＣ末端断片とΔ１６−アウグリン（配列番号６）を生成し、Δｌ６はプレアウグリンの１３４〜１４８番目のアミノ酸配列に関し、Δ１６−アウグリンはプレアウグリンの３１〜１３０番目のアミノ酸配列に関する。Δｌ６−アウグリンをさらにΔ１６−アルジリンへと切断することが可能であり、Δ１６−アルジリンはプレアウグリンの７１〜１３０番目のアミノ酸配列に関する（配列番号７）。
【００５７】
免疫ペプチドであるＰＫＥ１４の配列（プレアウグリンの４８〜６０番目のアミノ酸）を配列番号８にて提供する。免疫ペプチドＰＱＷ１４（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸）を配列番号９に示す。免疫ペプチドＡＵＧ−ＥＬ１０（プレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸）を配列番号９に示す。免疫ペプチドＰＧＹ１４（プレアウグリンの９１〜１０３番目のアミノ酸）を配列番号１１に示す。免疫ペプチドＰＤＩ１４（プレアウグリンの１１７〜１２９番目のアミノ酸）を配列番号１２に示す。モノクローナル抗体ＡＫ４３９／Ｆ４とＡＫ４３９／Ｈ１０の結合エピトープのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｈ７とＡＫ４８２／Ｈ２の結合エピトープのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。モノクローナル抗体ＡＫ４８２／Ｇ９とＡＫ４８２／Ｈ１０の結合エピトープのアミノ酸配列を配列番号１５に示す。合成ペプチドＰＱＰ−６１（プレアウグリンの７１〜１３１番目のアミノ酸を含む）ならびＡＵＧ−ＷＦ１５（プレアウグリンの７３〜８７番目のアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１６と１７に示す。
【００５８】
モノクローナル抗体（表１に記載の）のエピトープマッピングに使用したペプチドの配列を配列番号１８から配列番号３７に示す。
配列番号１（プレアウグリンのアミノ酸配列）：
ＭＡＡＳＰＡＲＰＡＶ  ＬＡＬＴＧＬＡＬＬＬ  ＬＬＣＷＧＰＧＧＩＳ  ＧＮＫＬＫＬＭＬＱＫ  ＲＥＡＰＶＰＴＫＴＫ  ＶＡＶＤＥＮＫＡＫＥ  ＦＬＧＳＬＫＲＱＫＲ  ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  ＰＲＳＰＹＧＦＲＨＧ  ＡＳＶＮＹＤＤＹ
配列番号２（アウグリンのアミノ酸配列）：
ＧＮＫＬＫＬＭＬＱＫ  ＲＥＡＰＶＰＴＫＴＫ  ＶＡＶＤＥＮＫＡＫＥ  ＦＬＧＳＬＫＲＱＫＲ  ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  ＰＲＳＰＹＧＦＲＨＧ  ＡＳＶＮＹＤＤＹ
配列番号３（エシリンのアミノ酸配列）：
ＧＮＫＬＫＬＭＬＱＫ  ＲＥＡＰＶＰＴＫＴＫ  ＶＡＶＤＥＮＫＡＫＥ  ＦＬＧＳＬＫＲＱ
配列番号４（アルジニンのアミノ酸配列）：
ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  ＰＲＳＰＹＧＦＲＨＧ  ＡＳＶＮＹＤＤＹ
配列番号５（Δ１６のアミノ酸配列）：
ＰＹＧＦＲＨＧＡＳＶ  ＮＹＤＤＹ
配列番号６（Δ１６−アウグリンのアミノ酸配列）：
ＧＮＫＬＫＬＭＬＱＫ  ＲＥＡＰＶＰＴＫＴＫ  ＶＡＶＤＥＮＫＡＫＥ  ＦＬＧＳＬＫＲＱＫＲ  ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  ＰＲＳ
配列番号７（Δ１６−アルジリンのアミノ酸配列）：
ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  ＰＲＳ
配列番号８（ＰＫＥ１４のアミノ酸配列）：
ＫＴＫＶＡＶＤＥＮＫ  ＡＫＥ
配列番号９（ＰＱＷ１４のアミノ酸配列）：
ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷ
配列番号１０（ＡＵＧ−ＥＬ１０のアミノ酸配列）：
ＥＶＱＱＷＹＱＱＦＬ
配列番号１１（ＰＧＹ１４のアミノ酸配列）：
ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹ
配列番号１２（ＰＤＩ１４のアミノ酸配列）：
ＤＹＹＱＲＨＹＤＥＤ  ＳＡＩ
配列番号１３（プレアウグリンの７３〜７８番目のアミノ酸配列）：
ＷＤＲＴＲＰ
配列番号１４（プレアウグリンの８２〜８７番目のアミノ酸配列）：
ＱＷＹＱＱＦ
配列番号１５（プレアウグリンの８３〜８７番目のアミノ酸配列）：
ＷＹＱＱＦ
配列番号１６（ＰＱＤ−６１のアミノ酸配列）：
ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  ＧＦＤＥＡＫＦＥＤＤ  ＩＴＹＷＬＮＲＤＲＮ  ＧＨＥＹＹＧＤＹＹＱ  ＲＨＹＤＥＤＳＡＩＧ  Ｐ
配列番号１７（ＡＵＧ−ＷＦ１５のアミノ酸配列）：
ＷＤＲＴＲＰＥＶＱＱ  ＷＹＱＱＦ
配列番号１８（プレアウグリンの７１〜８６番目）：
ＱＬＷＤＲＴＲＰＥＶ  ＱＱＷＹＱＱ
配列番号１９（プレアウグリンの７３〜８６番目のアミノ酸配列）：
ＷＤＲＴＲＰＥＶＱＱ  ＷＹＱＱ
配列番号２０（プレアウグリンの７４〜８６番目のアミノ酸配列）：
ＤＲＴＲＰＥＶＱＱＷ  ＹＱＱ
配列番号２１（プレアウグリンの７５〜８６番目のアミノ酸配列）：
ＲＴＲＰＥＶＱＱＷＹ  ＱＱ
配列番号２２（プレアウグリンの７６〜８６番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷＹＱ  Ｑ
配列番号２３（プレアウグリンの６８〜８２番目のアミノ酸配列）：
ＱＫＲＱＬＷＤＲＴＲ  ＰＥＶＱＱ
配列番号２４（プレアウグリンの６８〜８１番目のアミノ酸配列）：
ＱＫＲＱＬＷＤＲＴＲ  ＰＥＶＱ
配列番号２５（プレアウグリンの６８〜８０番目のアミノ酸配列）：
ＱＫＲＱＬＷＤＲＴＲ  ＰＥＶ
配列番号２６（プレアウグリンの６８〜７９番目のアミノ酸配列）：
ＱＫＲＱＬＷＤＲＴＲ  ＰＥ
配列番号２７（プレアウグリンの７６〜８８番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷＹＱ  ＱＦＬ
配列番号２８（プレアウグリンの７６〜８７番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷＹＱ  ＱＦ
配列番号２９（プレアウグリンの７６〜８５番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷＹＱ
配列番号３０（プレアウグリンの７６〜８４番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷＹ
配列番号３１（プレアウグリンの７６〜８３番目のアミノ酸配列）：
ＴＲＰＥＶＱＱＷ
配列番号３２（プレアウグリンの７９〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＥＶＱＱＷＹＱＱＦＬ  ＹＭＧ
配列番号３３（プレアウグリンの８０〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＶＱＱＷＹＱＱＦＬＹ  ＭＧ
配列番号３４（プレアウグリンの８１〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＱＱＷＹＱＱＦＬＹＭ  Ｇ
配列番号３５（プレアウグリンの８２〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＱＷＹＱＱＦＬＹＭＧ
配列番号３６（プレアウグリンの８３〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＷＹＱＱＦＬＹＭＧ
配列番号３７（プレアウグリンの８４〜９１番目のアミノ酸配列）：
ＹＱＱＦＬＹＭＧ
【実施例】
【００５９】
実施例１：抗体の生成
ペプチド
ヒトプレアウグリンの既知のアミノ酸配列（配列番号１を参照のこと）から、５つの領域を選択し、それらを標準的な手法によって化学合成した（ＪＰＴ有限責任会社、ベルリン、ドイツ）。これらのペプチドを、ＰＫＥ１４（プレアウグリンの４８〜６０番目のアミノ酸、配列番号８）、ＰＱＷ１４（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸、配列番号９）、ＡＵＧ−ＥＬ１０（プレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸、配列番号１０）、ＰＧＹ１４（プレアウグリンの９１〜１０３番目のアミノ酸、配列番号１１）、ＰＤＩ１４（合成されたプレアウグリンの１１７〜１２９番目のアミノ酸、配列番号１２）とした。
【００６０】
ポリクロ−ナル抗体の開発
ＰＫＥ１４（プレアウグリンの４８〜６０番目のアミノ酸、配列番号８）、ＰＱＷ１４（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸、配列番号９）、ＰＧＹ１４（プレアウグリンの９１〜１０３番目のアミノ酸、配列番号１１）、ＰＤＩ１４（プレアウグリンの１１７〜１２９番目のアミノ酸、配列番号１２）を標的とするポリクロ−ナル抗体を、標準手法によって生成した（欧州特許出願第１４８８２０９号Ａ１、欧州特許出願第１７３８１７８号Ａ１を参照のこと）。簡単に説明すると、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使って、ペプチドを担体タンパク質のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（ピアス、ロックフォード、イリノイ、米国）と連結させた。この抱合体を用い、以下の様式でヒツジを免疫化した：最初、ヒツジに１００μｇの抱合体（重量は抱合体のペプチド部分を指す）を接種し、その後、４週間ごとに２回、各回５０μｇずつの抱合体を用いて追加免疫した。初回接種から４か月後、ヒツジから３００ｍｌの抗血清を得た。それぞれの抗血清から、抗原特異的抗体を以下のように精製した：各ペプチド５ｍｇを５ｍＬのスルフォリンク（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ）−ゲル（ピアス、ロックフォード、イリノイ、米国）に結合させた。抗血清５０ｍＬはバッチ式ゲルと共に、室温で４時間培養した。これらの材料をカラム（空のＮＡＰ２５カラム、ファルマシア）に移した。素通り画分を捨て、ゲルを１００ｍｌの洗浄緩衝液（１００ｍＭ  リン酸カリウム、０．１％ツイーン２０、ｐＨ６．８）で洗浄し、特異的に結合した抗体を５０ｍＭのクエン酸（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出物を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＬ  塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で透析した。
【００６１】
モノクローナル抗体の開発
ＰＱＷ１４（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸、配列番号９）とＡＵＧ−ＥＬ１０（プレアウグリンの７９〜８８番目のアミノ酸、配列番号１０）を標的とするモノクローナル抗体を標準的な手法で生成した（ハーロウＥ、レーンＤ、抗体−研究室マニュアル。コールドスプリングハーバー、コールドスプリング研究室、１９８８、Ｌａｎｅ、１９８５、免疫学的手法雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８１：２２３−２２８）。簡単に説明すると、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）使って、ペプチドをＢＳＡに抱合させた。これらの抱合体でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、追加免疫を行い、膵臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞株を生成した。細胞株を、ポリスチレン固相の表面にコーティングしておいた免疫ペプチドと結合する抗体を分泌する能力を指標にスクリーニングした。この方法から、モノクローナル抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４およびＡＫ４３９／Ｈ１０（ＰＱＷ１４を標的とする抗体）、ＡＫ４８２／Ｈ７、ＡＫ４８２／Ｈ２、ＡＫ４８２／Ｇ９、ＡＫ４８２／Ｈ１０（ＡＵＧ−ＥＬ１０を標的とする抗体）を分泌する細胞株を生成した。さらなる実験用に、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィによって、モノクローナル抗体を培養上清から精製した。
【００６２】
抗体の標識化
抗体を標準的な手法に従って標識化した（欧州特許出願第１４８８２０９号Ａ１、欧州特許出願第１７３８１７８号Ａ１）。精製したそれぞれの抗体の濃度を１ｇ／Ｌに調整し、この抗体を１対５のモル比で化学発光標識であるＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；インベント有限責任会社，へニッヒスドルフ、ドイツ）と室温で２０分間培養することで標識化した。容積比で１０分の１量の５０ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンを室温で１０分間追加することで、反応を停止させた。ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア、フライブルク、ドイツ）とＢｉｏ−Ｓｉｌ（登録商標）ＳＥＣ−４００−５ＨＰＬＣカラム（バイオラッド）を用いたサイズ排除クロマトグラフィによって、標識化された抗体と結合していない標識を分離した。
【００６３】
抗体のコーティング
抗体を標準的な手法に従ってコーティングした（欧州特許出願第１４８８２０９号Ａ１、欧州特許出願第１７３８１７８号Ａ１）。ポリスチレン製のスターチューブ（グライナー）を２２℃で一晩かけて、精製した抗体でコーティングした（チューブ１本当たり、３００μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス、１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８に抗体２μｇを溶解したものを使用した）。次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（３０ｇ／ＬのカリオンＦＰ（メルク）、プロテアーゼを含んでいない５ｇ／Ｌの血清アルブミンを含む、ｐＨ６．５）でチューブをブロッキングし、凍結乾燥した。
【００６４】
実施例２：ポリクロ−ナル抗体を使用した基準となるアウグリンの検定
前述したポリクローナル成分を使用して、複数のサンドイッチ式免疫学的検定を準備した。抗ＰＫＥ１４抗体を用いたすべてのサンドイッチ式検定では、供血者の血漿プールでシグナルは認められなかったが、抗ＰＱＷ１４、抗ＰＧＹ１４および抗ＰＤＩ１４抗体を使ったサンドイッチ式検定ではシグナルが検出された。抗ＰＱＷ１４（プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸を標的とする、配列番号９）をトレーサー抗体とし、抗ＰＤＩ１４（プレアウグリンの１１７〜１２９番目のアミノ酸を標的とする、配列番号１２）を固相抗体として使用したときに最も高いシグナルが検出された。以降の実験は、これらポリクローナル抗体の組み合わせを使って実施した。
【００６５】
１００μＬの標準物質（１〜１４８番目のアミノ酸を含む組換えヒトプレアウグリン、配列番号１、インビボ・バイオテックサービス有限責任会社、ヘニヒスドルフ）または試料と、２００μＬのＭＡＣＮ標識化抗体を含む緩衝液を、ピペットを使い、コーティングしたチューブの中で混合した（３００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０９％のアジ化ナトリウム、０．１％のＢＳＡ、０．１％の非特異的ウシＩｇＧ、０．１％非特異的ヒツジＩｇＧ、０．０１％の非特異的マウスＩｇＧおよび２００μＬごとに０．５×１０6の相対発光量のＭＡＣＮ標識化抗体を含む）。そのチューブを室温で２０時間、撹拌しながら培養した。次にチューブを、１ｍＬのＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック、臨床検査製品部門、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ有限責任会社、ヘニヒスドルフ、ドイツ）を使って４回洗浄し、結合した化学発光物質をＬＢ９５２Ｔ（ベルトール）を使って、チューブ１本につき１秒間測定した。マルチカルク（ＭｕｌｔｉＣａｌｃ）ソフトウェア（スピリン・フィット）を使って、試料の濃度を計算した。
【００６６】
実施例３：モノクローナル抗体を使用したアウグリン検定の開発
前述したモノクローナル抗体を使って、複数のサンドイッチ式免疫学的検定を準備した。抗ＰＱＷ１４抗体および抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体、ならびに供血者の血漿プールを使用したすべてのサンドイッチ式検定でシグナルが得られた。抗ＰＱＷ１４抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４をトレーサー抗体として、抗ＡＵＧ−ＥＬ１０抗体であるＡＫ４８２／Ｈ７を固相抗体として使用したときに、よりも高いシグナルが得られた。以降の実験は、これらモノクローナル抗体の組み合わせを使って実施した。
【００６７】
５０μＬの標準物質（１〜１４８番目のアミノ酸を含む組換えヒトプレアウグリン、配列番号１、インビボ・バイオテックサービス有限責任会社、ヘニヒスドルフ）または試料と、２００μＬのＭＡＣＮ標識化抗体を含む緩衝液を、ピペットを使い、コーティングしたチューブの中で混合した（３００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０９％のアジ化ナトリウム、０．１％のＢＳＡ、０．１％の非特異的ウシＩｇＧ、０．１％非特異的ヒツジＩｇＧ、０．０１％の非特異的マウスＩｇＧおよび２００μＬごとに０．５×１０6の相対発光量のＭＡＣＮ標識化抗体を含む）。そのチューブを室温で３時間、撹拌しながら培養した。次にチューブを、１ｍＬのＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック、臨床検査製品部門、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ有限責任会社、ヘニヒスドルフ、ドイツ）を使って４回洗浄し、結合した化学発光物質をＬＢ９５２Ｔ（ベルトール）を使って、チューブ１本につき１秒間測定した。マルチカルク（ＭｕｌｔｉＣａｌｃ）ソフトウェア（スピリン・フィット）を使って、試料の濃度を計算した。
【００６８】
実施例４：モノクローナル抗体のエピトープマッピング
６つのモノクローナル抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４、ＡＫ４３９／Ｈ１０、ＡＫ４８２／Ｈ７、ＡＫ４８２／Ｈ２、ＡＫ４８２／Ｇ９ならびにＡＫ４８２／Ｈ１０が標的とするプレアウグリンのエピトープの位置を、プレアウグリン配列中に含まれている種々のペプチドを使用して決定した。用いた種々のペプチドは、スペーサーを加え、Ｎ末端かＣ末端のいずれかをビオチン化して合成した。チューブ１本当たり２μｇのニュートラアビジン（ビオチン結合タンパク質：サーモサイエンティフィック、ピアスプロテインバイオロジー製品）を使い、前述したようにチューブをコーティングした。ピペットを使って、各ペプチド５０ｎｇを含む３００μＬのペプチド溶液をチューブに入れ、室温で撹拌しながら３時間培養した。その後、チューブを１ｍＬのＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ洗浄溶液で４回洗浄した。各抗体５０ｎｇを含む２００μＬの抗体溶液を、室温で撹拌しながら１６時間培養し、再度前述したように４回洗浄した。モノクローナル抗体と種々のペプチドとの結合能を検出するために、２００μＬのトレーサー溶液（化学発光物質であるＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステルを使用して前述したように標識化したヤギ抗マウス抗体を含む）をチューブに入れ、室温で撹拌しながら２時間培養した。その後、再び４回洗浄し、結合した化学発光物質をＬＢ９５２Ｔ照度計（ベルトール）を使用して、チューブ１本につき１秒間測定した。
【００６９】
表１にエピトープマッピングの結果を示す。図２から分かるように、モノクローナル抗体であるＡＫ４３９／Ｆ４とＡＫ４３９／Ｈ１０は、プレアウグリン配列の７３〜７８番目にある６つのアミノ酸からなる同じエピトープ（ＷＤＲＴＲＰ、配列番号１３）に結合する。図３からは、モノクローナル抗体のＡＫ４８２／Ｈ７およびＡＫ４８２／Ｈ２は、プレアウグリン配列の８２〜８７番目にある６つのアミノ酸からなる同じエピトープ（ＱＷＹＱＱＦ、配列番号１４）に結合するが、モノクローナル抗体のＡＫ４８２／Ｇ９およびＡＫ４８２／Ｈ１０は、プレアウグリン配列の８３〜８７番目の５つのアミノ酸からなる同じエピトープ（ＷＹＱＱＦ、配列番号１５）に結合することが分かる。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
実施例５：分析物の安定性
４種類の材料（血清、ＥＤＴＡ化血漿、クエン酸化血漿およびヘパリン化血漿）を１０の試料に分け、それぞれを２２℃で、様々な期間保存した。その後、モノクローナル抗体を使った免疫学的検定を使用してバッチごとに測定した。０時点、つまり２２℃で保存しなかった試料を、基準として１００％に設定した。図４に示すように、血清は室温で６時間安定しており、２３時間保存後には１０％減少し、３１．５時間保存した後には２０％減少している。ＥＤＴＡ化、クエン酸化およびヘパリン化した血漿中の分析物は、２２℃で少なくとも３１．５時間安定していた。
【００７２】
さらに、凍結融解を何回か繰り返し後の分析物の安定性も試験した。健康な供血者から得られた血漿をＥＤＴＡ化して１０試料に分け、これらを７回、凍結融解した。凍結融解を７回繰り返した後もＥＤＴＡ化血漿中に含まれていた分析物は非常に安定で、アウグリンを用いた免疫学的検定では、顕著な減少も増加も見られなかった。
【００７３】
実施例６：用量反応曲線
前述したモノクローナル免疫学的検定では、組換えプレアウグリン（配列番号１）を標準物質として使用することで用量反応曲線を作成することが可能である。典型的な用量反応曲線を図５に示す。
【００７４】
実施例７：健常人集団におけるアウグリンの免疫活性
健常人対象から得た１００のＥＤＴＡ化血漿試料を、モノクローナル免疫学的検定を使って測定した。これらの試料で見られたアウグリンの免疫活性の度数分布を図６に示す。アウグリンの免疫活性は全試料で測定可能で、中間値が１１１９ｐｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩが１０７１〜１１９５）、最小値が３８５ｐｍｏｌ／Ｌそして最大値が１８８０ｐｍｏｌ／Ｌであった。７５番目と９７．５番目の値はそれぞれ、１３３３と１７４４ｐｍｏｌ／Ｌであった。女性におけるアウグリンの免疫活性（ｎ＝６４；中間値１０７３ｐｍｏｌ／Ｌ）は、男性の免疫活性（ｎ＝３６；中間値１３２８ｐｍｏｌ／Ｌ）と比べて、有意に低かった（ｐ＜０．０１）。アウグリンの免疫活性と年齢との間に相関はなかった（スピアマンの相関係数、ｒ＝０．０７６、ｐ＞０．０５）。
実施例８：本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ式免疫学的検定およびフェニックスから購入したペプチド由来の競合的プレプロアウグリン（７１〜１０７番目）免疫学的検定、ならびに例２で示した基準となるサンドイッチ式免疫学的検定の比較。
【００７５】
複数の標準ペプチドを、実施例２および３のサンドイッチ式免疫学的検定ならびにフェニックス・ファーマシューティカルズ（バーリンゲム、米国）の競合的ヒトプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）免疫学的検定（ＥＫ−０１２−２２）を使用して測定した。以下の４種類の標準ペプチドを使用した：組換えヒトプレアウグリン（１〜１４８番目のアミノ酸、配列番号１）、フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリンペプチド（７１〜１０７番目）、合成ペプチドであるＰＱＰ−６１（プレアウグリンの７１〜１３１番目のアミノ酸を含む、配列番号１６）およびＡＵＧ−ＷＦ１５（プレアウグリンの７３〜８７番目のアミノ酸を含む、配列番号１７）。結果を図７Ａ、ＢおよびＣに示す。フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン競合的酵素免疫学的検定を使用した場合、標準ペプチドであるプリプロアウグリン（７１〜１０７番目）は検出されたが、組換えプレアウグリンやペプチドであるＰＱＰ−６１およびＡＵＧ−ＷＦ１５はいずれも検出されなかった（図７Ａ）。この検定はプレプロアウグリン（７１−１０７番目）検出用として開発されたものであるため、少なくとも組換えプレアウグリン（１〜１４８番目）とペプチドＰＱＰ−６１は、その両方が７１〜１０７番目のアミノ酸配列を含んでいるので検出されると予想していた。
【００７６】
組換えプレアウグリン（１〜１４８番目）とペプチドＰＱＰ−６１は、プレアウグリンの７１〜８３番目のアミノ酸および１１７〜１２９番目のアミノ酸のそれぞれを標的とする抗体の組み合わせを使用した、基準となるポリクロ−ナル抗体のサンドイッチ式免疫学的検定によって検出されたが（実施例２、図７Ｂ）、フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）とペプチドＡＵＧ−ＷＦ１５は検出されなかった。この免疫学的検定で使用した固相抗体は、プレアウグリンの１１７〜１２９番目のアミノ酸を標的とするペプチドＰＤＩ１４を標的とする抗体として産生されたもので、フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）およびＡＵＧ−ＷＦ１５はこのエピトープを含んでいない。したがって、このポリクロ−ナル免疫学的検定はこれら２つのペプチドを検出することができないと思われる。対照的に、組換えプレアウグリン（１〜１４８番目）とペプチドＰＱＰ−６１は、２つのポリクローナル抗体を産生するために使用された２つのペプチドＰＱＷ１４とＰＤＩ１４を標的とする両方のエピトープを含んでいるため、この検定によって検出可能であると考えられる。
【００７７】
４種類全ての標準ペプチドが、本出願に記載の２つのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ式免疫学的検定によって検出された（図７Ｃ、実施例３）。４種類全ての標準ペプチドがこの２つのモノクローナル抗体のエピトープを含んでいたので、この結果は予想通りであった。
【００７８】
分析物検出の精度に関して生じ得る差を、健康な供血者から得られたＥＤＴＡ化血漿試料を使用して試験した。１６のＥＤＴＡ化血漿試料を、それぞれ個別に、また、２つの試料を１対１の割合で混合して測定した。１６のＥＤＴＡ化血漿試料と８つの混合試料を、実施例２および３で説明したポリクロ−ナル抗体およびモノクローナル抗体を使った免疫学的検定、ならびにフェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）検定を使用して測定した。試料と混合試料の測定値および混合試料について計算した値、ならびに測定値と計算値との間の差を表２に示す。結果の差は図８にも示した。フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１〜１０７番目）検定では混合試料に関し、−８５．５から最大７３７．３％という偏差が見られた。８つの混合試料の内、計算値と測定値との間の偏差が２０％未満だったのは２試料だけであった。実施例２に記載した基準となる免疫学的検定を用いた場合、８つ全ての試料の値が、それぞれについて計算した値よりも顕著に低かった（６５．１〜１００．０％の範囲）。対照的に、本発明による実施例３のモノクローナル免疫学的検定では計算値と測定値との間の偏差が小さく（−１．０〜３５．８％の範囲）、偏差が２０％を上回ったのは１試料だけであった。
【００７９】
全ての試料（標準ペプチド試料、患者の試料、混合試料）を２つ組で測定し、その平均値を結果として示している。変動係数が１０％よりも大きかった試料は、実施例３のモノクローナル抗体免疫学的検定では１つもなく、実施例２のポリクロ−ナル抗体免疫学的検定を使用して測定した試料のうちの２０％のみであった。その一方で、フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１−１０７）検定で測定した２４の試料のうちの８０％が１０％より大きな変動係数を示した。従って、フェニックス・ファーマシューティカルズのプレプロアウグリン（７１−１０７）検定では、試料を正確に測定することができない。
【００８０】
これらの結果は全体として、プレアウグリンの７１〜１０７番目の残基にあるエプトープを標的とする２つの抗体を使用する本発明による免疫学的検定を用いることでのみ、アウグリンの免疫活性を正確に測定できることをはっきりと示している。
【００８１】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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