(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１０１】
0006302909.tif 000075
の化合物、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
Ｒ１は、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
各Ｒ２Ｏは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
各Ｒ２Ｎは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
各Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
各Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、そしてＹは、−Ｌ−Ｚであるか、または
Ｒ４は、−Ｌ−Ｚであり、そしてＹは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
各Ｌは独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
各ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、
各Ｚは、さらなるライゲーションのための官能基である）。
【請求項２】
Ｚが、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、
各ＲＮが独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
各ＲＯが独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
各ＲＳが独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ−ａ）：
【化１０３】
0006302909.tif 000076
の請求項１に記載の化合物、またはその塩
（式中、Ｒ３ｃは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基である）。
【請求項４】
式（ＩＩ−ｂ）：
【化１０４】
0006302909.tif 000077
の請求項３に記載の化合物、またはその塩。
【請求項５】
式（ＩＩ−ｂ１）：
【化１０５】
0006302909.tif 000078
を有する、請求項４に記載の化合物、またはその塩。
【請求項６】
式（ＩＩ−ｂ２）：
【化１０６】
0006302909.tif 000079
（式中、Ｒｙ１は、水素、ハロゲン、または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）および
式（ＩＩ−ｂ３）：
【化１０７】
0006302909.tif 000080
から選択される式を有する、請求項５に記載の化合物、またはその塩。
【請求項７】
式（ＩＩ−ｃ）：
【化１０８】
0006302909.tif 000081
の請求項１に記載の化合物、またはその塩。
【請求項８】
式（ＩＩ−ｃ１）：
【化１０９】
0006302909.tif 000082
、式（ＩＩ−ｃ２）：
【化１１０】
0006302909.tif 000083
（式中、Ｒｙ２は、水素または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）および
式（ＩＩ−ｃ３）：
【化１１１】
0006302909.tif 000084
から選択される式を有する、請求項７に記載の化合物、またはその塩。
【請求項９】
Ｒ４が−Ｌ−Ｚであり、そしてＹが任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４が−Ｌ−Ｚであり、そしてＹがメチルまたはＣＦ３である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１がＨまたはメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記Ｃ３位の前記Ｆ原子がアキシャルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記Ｃ３位の前記Ｆ原子がエクアトリアルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３ａが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、Ｒ３ｒが任意選択で置換されたアルキルまたは任意選択で置換されたアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ３ａが任意選択で置換されたベンゾイルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ３ａが、ＣＨ３ＣＯ−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ−、Ｃ３Ｈ７ＣＯ−、ｔ−ＢｕＣＯ−、ＣＦ３ＣＯ−、ＰｈＣＨ２ＣＯ−、またはＣ６Ｈ５ＣＯ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が以下の式：
【化１１２】
0006302909.tif 000085
の１つである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物を含むシアリダーゼタンパク質付加体であって、シアリダーゼタンパク質が該化合物に共有結合的にコンジュゲートされている、シアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項１９】
式
【化１１３】
0006302909.tif 000086
を有する、請求項１８に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２０】
前記シアリダーゼが、ヒト、ウイルス、または細菌シアリダーゼである、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２１】
前記シアリダーゼが、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、およびｎａｎＨからなる群から選択される細菌シアリダーゼである、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２２】
前記化合物がＤＦＳＡ−５−インまたはＤＦＳＡ−７−インである、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２３】
前記化合物が、配列番号１〜６の任意のペプチド内の１つまたは複数のチロシン残基と共有結合的に連結しており、該ペプチドが、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、またはｎａｎＨのフラグメントである、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２４】
前記シアリダーゼが、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２５】
前記シアリダーゼが、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４からなる群から選択されるヒトシアリダーゼである、請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物を含む検出可能なコンジュゲートであって、該化合物が検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１９に記載のシアリダーゼタンパク質付加体を含む検出可能なシアリダーゼタンパク質コンジュゲートであって、該シアリダーゼタンパク質付加体が、検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なシアリダーゼタンパク質コンジュゲート。
【請求項２８】
前記タグ付け部分が標識を含む、請求項２６に記載の検出可能なコンジュゲート、または請求項２７に記載の検出可能なシアリダーゼコンジュゲート。
【請求項２９】
以下の式：
【化１１４】
0006302909.tif 000087
から選択される式を有する、請求項２８に記載の検出可能なコンジュゲートもしくは検出可能なシアリダーゼコンジュゲート、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
ＲＫは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、またはタンパク質であり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
各Ｒ２Ｏは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
各Ｒ２Ｎは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、
各Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
各Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４ａは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または任意選択で置換されたアシルであり、
Ｙａは、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
各Ｌは、独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
各ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、
各ＲｐおよびＲｑは独立に、水素、任意選択で置換された脂肪族；任意選択で置換されたヘテロ脂肪族；置換または非置換アリール；任意選択で置換されたヘテロアリール；任意選択で置換されたアシル；樹脂；タンパク質；レポーター；リンカーＬａによって任意選択で接合された標識（該リンカーＬａは任意選択で置換されたアルキレンである）；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである）。
【請求項３０】
前記標識がフルオロフォアである、請求項２８に記載の検出可能なコンジュゲートまたは検出可能なシアリダーゼコンジュゲート。
【請求項３１】
前記標識が、
【化１１６】
0006302909.tif 000088
である、請求項２８に記載の検出可能なコンジュゲートまたは検出可能なシアリダーゼコンジュゲート。
【請求項３２】
シアリダーゼの存在を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）シアリダーゼを含む疑いのある試料を請求項１に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、該試料中の該シアリダーゼの存在を示す、方法。
【請求項３３】
前記シアリダーゼが細胞内にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物が、ＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）またはＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）：
【化１１７】
0006302909.tif 000089
である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、哺乳動物、家禽、または魚由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、病原体を含有する疑いがある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記病原体が、細菌、ウイルス、原生動物、または真菌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞中のシアリダーゼの位置を画像化するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）細胞をＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）、ＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）の化合物、またはその誘導体もしくはエステルと接触させるステップと、
（ｂ）細胞内エステラーゼに前記化合物をそれぞれＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）に変換させるステップと、
（ｃ）ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）を前記細胞中の細胞内位置で１つまたは複数のシアリダーゼに共有結合的にコンジュゲートさせるステップと、
（ｄ）レポーターを添加するステップと、
（ｅ）細胞内シアリダーゼ分布の画像を得るステップと
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
インフルエンザウイルスによる感染を決定する方法における使用のための、請求項１に記載の化合物を含む組成物であって、該方法は、
（ａ）インフルエンザウイルス感染の疑いのある対象からの検査試料を該組成物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、インフルエンザウイルスによる感染の可能性を示す、組成物。
【請求項４２】
前記化合物が、ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）
【化１】
0006302909.tif 000090
もしくはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）
【化２】
0006302909.tif 000091
、またはそのエステルである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに耐性でない、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに感受性である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに耐性である、請求項４１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、シアリダーゼの診断および画像化の分野に関する。具体的には、本発明は、ウイルス、細菌、および哺乳動物シアリダーゼに不可逆的に結合する標的特異的化合物に関する。より具体的には、本発明は、シアリダーゼの活性部位に共有結合的に結合し、診断および治療機能に有用である化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
シアリダーゼは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）とも呼ばれ、複合糖質のオリゴサッカライド由来の末端シアル酸残基の加水分解を触媒するエキソグリコシダーゼである。シアリダーゼは、様々な機能に関して広く発現される（Ｒ．  Ｋ．  Ｙ．  Ｍ．  Ｓａｉｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）。多くの病原体、例えば、ウイルス、細菌、および原生動物などが、浸潤、栄養、脱離、および免疫回避のためにシアリダーゼを産生する（Ｅ．  Ｓｅｖｅｒｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、１５３巻、２８１７頁）。
【０００３】
哺乳動物シアリダーゼも、細胞増殖／分化の制御、細胞接着、代謝、および免疫学的機能の調節を含めた多くの生物学的プロセスにおいて関係付けられている（Ｔ．  ＡｎｇａｔａおよびＡ．  Ｖａｒｋｉ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、２００２年、１０２巻、４３９頁。Ａ．  Ｖａｒｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４６巻、１０２３頁）。４つのタイプのシアリダーゼが哺乳動物において同定され、特徴付けられている。これらのシアリダーゼは、異なる遺伝子によってコードされ、リソソーム（Ｎｅｕ１）、細胞質ゾル（Ｎｅｕ２）、原形質膜（Ｎｅｕ３）、およびミトコンドリア／リソソーム（Ｎｅｕ４）の酵素として異なる細胞内位置で発現される。これらの酵素は、一般的な作用機序を共有するが、これらは、細胞下の分布、最適なｐＨ、速度論的性質、および基質特異性の差異におそらく起因して、ほとんど重なった機能を有さない（Ｔ．  ＭｉｙａｇｉおよびＫ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、２２巻、８８０頁）。これらの酵素の制御機能および詳細な機能は、大部分は確定していない（Ｅ．  Ｍｏｎｔｉら、Ａｄｖ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１０年、６４巻、４０３頁）。
【０００４】
シアリダーゼ活性の変化は、様々な疾患において関係付けられている。例えば、シアリダーゼ活性の上昇が、ＢＨＫ形質転換細胞、およびヒト乳がん／大腸がん組織において報告されている（Ｃ．  Ｌ．  Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９７２年、２４７巻、２７４２頁。Ｈ．  Ｂ．  ＢｏｓｍａｎｎおよびＴ．  Ｃ．  Ｈａｌｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９７４年、７１巻、１８３３頁）。動物試験でも、腫瘍原性形質転換および腫瘍浸潤におけるシアリダーゼの役割が示唆されている。哺乳動物シアリダーゼの生化学的特徴付けにより、Ｎｅｕ３の増加は、大腸、腎臓、および前立腺のがんに関与していることが示唆されている。Ｎｅｕ３遺伝子をがん細胞にトランスフェクトすると、Ｂｃｌ−２発現の増大およびカスパーゼ−３／−９の活性の減少によってアポトーシスに対する保護がもたらされる（Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｊｐｎ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｒ．  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．、２００８年、８４巻、４０７頁）。
【０００５】
さらに、Ｎｅｕ３過剰発現は、ＥＧＦ受容体リン酸化およびＲａｓ活性化の調節によって細胞運動性および浸潤を増大させる（Ｔ．  Ｗａｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６巻、２４８３頁。Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００８年、１４４巻、２７９頁）。がん進行における明らかなＮｅｕ３のプロモーションと対照的に、他のシアリダーゼは、細胞アポトーシスの加速、分化、および細胞浸潤の抑制によってがん低減において役割を果たす（Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．、２００４年、２０巻、１８９頁）。
【０００６】
他の側面では、リソソームシアリダーゼ（Ｎｅｕ１）の欠損は、シアリドーシスの主な原因として考えられており、シアリドーシスは、シアリル複合糖質の過剰な蓄積および進行性ニューロソマティック症状の発生をもたらす、遺伝性リソソーム蓄積症である（Ｇ．  Ｈ．  Ｔｈｏｍａｓ、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：  α−Ｍａｎｎｏｓｉｄｏｓｉｓ，  β−Ｍａｎｎｏｓｉｄｏｓｉｓ，  Ｆｕｃｏｓｉｄｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ、８版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年）。
【０００７】
活性ベースタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）は、特定の酵素の化学プローブを使用する機能的なプロテオミクス技術である（Ｍ．  Ｊ．  ＥｖａｎｓおよびＢ．  Ｆ．  Ｃｒａｖａｔｔ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、２００６年、１０６巻、３２７９頁）。ＡＢＰＰプローブは一般に、２つの要素：反応基およびタグから構成される。反応基は、標的酵素の触媒機構に基づいて設計され、これは通常、酵素活性部位中の求核残基に共有結合的に連結し得る求電子体を含有する。タグは、フルオロフォアなどのレポーター、またはビオチンなどのアフィニティー標識であり得る。タグは、レポーターを導入するためのＣｕ（Ｉ）触媒アジド−アルキン［３＋２］環付加（Ｃｕ（Ｉ）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ［３＋２］  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＣｕＡＡＣ）による後続の修飾のためにアルキンまたはアジド部分を組み込むことができる（Ｖ．  Ｖ．  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００２年、４１巻、２５９６頁。Ｈ．  Ｃ．  ＫｏｌｂおよびＫ．  Ｂ．  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、２００３年、８巻、１１２８頁）。
【０００８】
ＡＢＰＰプローブは、がん状態などのある特定の生物学的状態、および刺激剤に対する応答と関連して特定の酵素変化を監視する有用なツールであり得る。ＡＢＰＰプローブは、多くの酵素クラスのために開発されており、これらのクラスには、セリン加水分解酵素（Ｙ．  Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、１４６９４頁。Ｄ．  Ｋｉｄｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４０巻、４００５頁）、システインプロテアーゼ（Ｄ．  Ｇｒｅｅｎｂａｕｍら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００２年、１巻、６０頁）、タンパク質ホスファターゼ（Ｃ．  Ｗａｌｌｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２００９年、５１９巻、４１７頁。Ｋ．  Ａ．  Ｋａｌｅｓｈら、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年、４６巻、５８９頁）、酸化還元酵素（Ｇ．  Ｃ．  Ａｄａｍら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、２０巻、８０５頁）、ヒストン脱アセチル化酵素（Ｃ．  Ｍ．  ＳａｌｉｓｂｕｒｙおよびＢ．  Ｆ．  Ｃｒａｖａｔｔ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２００７年、１０４巻、１１７１頁）、キナーゼ（Ｍ．  Ｐ．  Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７年、４６巻、３５０頁）、メタロプロテアーゼ（Ｓ．  Ａ．  Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００６年、２巻、２７４頁）、ならびにグリコシダーゼ（Ｃ．  Ｓ．  Ｔｓａｉら、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．、２００２年、４巻、３６０７頁。Ｄ．  Ｊ．  ＶｏｃａｄｌｏおよびＣ．  Ｒ．  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００４年、４３巻、５３３８頁。Ｋ．  Ａ．  Ｓｔｕｂｂｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００８年、１３０巻、３２７頁。Ｍ．  Ｄ．  Ｗｉｔｔｅら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２０１０年、６巻、９０７頁）が含まれる。
【０００９】
２つのタイプのシアリダーゼＡＢＰＰプローブ、キノンメチドおよび光親和性標識プローブが報告されている（Ｇ．  Ｔ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２６５巻、１０８０１頁。Ｃ．  Ｐ．  Ｌｕら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００５年、４４巻、６８８８頁。Ｒ．  Ｋａｎｎａｐｐａｎら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、２００８年、３１巻、３５２頁）。これらのプローブは、細胞可溶化物などの複合タンパク質試料中で使用される場合、非特異的標識において問題を有することが多い。さらに、これらのプローブは、細胞膜に不透過性であるため、ｉｎ  ｓｉｔｕ標識実験に適用することができない。
【００１０】
生理的条件下でのシアリダーゼプロファイリングに関して、標的特異的および細胞透過性ＡＢＰＰプローブが、生細胞中のシアリダーゼ変化を試験するのに必要とされている。最近、Ｗｉｔｈｅｒｓおよび共同研究者らは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉトランスシアリダーゼ（ＴｃＴｓ）に対する有効な阻害剤として３−フルオロシアリルフルオリドを使用した（Ａ．  Ｇ．  Ｗａｔｔｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００３年、１２５巻、７５３２頁。Ｓ．  Ｂｕｃｈｉｎｉら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００８年、４７巻、２７００頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒ．  Ｋ．  Ｙ．  Ｍ．  Ｓａｉｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年。
【非特許文献２】Ｅ．  Ｓｅｖｅｒｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、１５３巻、２８１７頁。
【非特許文献３】Ｔ．  ＡｎｇａｔａおよびＡ．  Ｖａｒｋｉ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、２００２年、１０２巻、４３９頁。
【非特許文献４】Ａ．  Ｖａｒｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４６巻、１０２３頁。
【非特許文献５】Ｔ．  ＭｉｙａｇｉおよびＫ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、２２巻、８８０頁。
【非特許文献６】Ｅ．  Ｍｏｎｔｉら、Ａｄｖ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１０年、６４巻、４０３頁。
【非特許文献７】Ｃ．  Ｌ．  Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９７２年、２４７巻、２７４２頁。
【非特許文献８】Ｈ．  Ｂ．  ＢｏｓｍａｎｎおよびＴ．  Ｃ．  Ｈａｌｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９７４年、７１巻、１８３３頁。
【非特許文献９】Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｊｐｎ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｒ．  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．、２００８年、８４巻、４０７頁。
【非特許文献１０】Ｔ．  Ｗａｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６巻、２４８３頁。
【非特許文献１１】Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００８年、１４４巻、２７９頁。
【非特許文献１２】Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．、２００４年、２０巻、１８９頁。
【非特許文献１３】Ｇ．  Ｈ．  Ｔｈｏｍａｓ、Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：  α−Ｍａｎｎｏｓｉｄｏｓｉｓ，  β−Ｍａｎｎｏｓｉｄｏｓｉｓ，  Ｆｕｃｏｓｉｄｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ、８版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年。
【非特許文献１４】Ｍ．  Ｊ．  ＥｖａｎｓおよびＢ．  Ｆ．  Ｃｒａｖａｔｔ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、２００６年、１０６巻、３２７９頁。
【非特許文献１５】Ｖ．  Ｖ．  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００２年、４１巻、２５９６頁。
【非特許文献１６】Ｈ．  Ｃ．  ＫｏｌｂおよびＫ．  Ｂ．  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、２００３年、８巻、１１２８頁。
【非特許文献１７】Ｙ．  Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、１４６９４頁。
【非特許文献１８】Ｄ．  Ｋｉｄｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４０巻、４００５頁。
【非特許文献１９】Ｄ．  Ｇｒｅｅｎｂａｕｍら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００２年、１巻、６０頁。
【非特許文献２０】Ｃ．  Ｗａｌｌｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２００９年、５１９巻、４１７頁。
【非特許文献２１】Ｋ．  Ａ．  Ｋａｌｅｓｈら、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１０年、４６巻、５８９頁。
【非特許文献２２】Ｇ．  Ｃ．  Ａｄａｍら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、２０巻、８０５頁。
【非特許文献２３】Ｃ．  Ｍ．  ＳａｌｉｓｂｕｒｙおよびＢ．  Ｆ．  Ｃｒａｖａｔｔ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２００７年、１０４巻、１１７１頁。
【非特許文献２４】Ｍ．  Ｐ．  Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７年、４６巻、３５０頁。
【非特許文献２５】Ｓ．  Ａ．  Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００６年、２巻、２７４頁。
【非特許文献２６】Ｃ．  Ｓ．  Ｔｓａｉら、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．、２００２年、４巻、３６０７頁。
【非特許文献２７】Ｄ．  Ｊ．  ＶｏｃａｄｌｏおよびＣ．  Ｒ．  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００４年、４３巻、５３３８頁。
【非特許文献２８】Ｋ．  Ａ．  Ｓｔｕｂｂｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００８年、１３０巻、３２７頁。
【非特許文献２９】Ｍ．  Ｄ．  Ｗｉｔｔｅら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２０１０年、６巻、９０７頁。
【非特許文献３０】Ｇ．  Ｔ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９０年、２６５巻、１０８０１頁。
【非特許文献３１】Ｃ．  Ｐ．  Ｌｕら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００５年、４４巻、６８８８頁。
【非特許文献３２】Ｒ．  Ｋａｎｎａｐｐａｎら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、２００８年、３１巻、３５２頁。
【非特許文献３３】Ａ．  Ｇ．  Ｗａｔｔｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００３年、１２５巻、７５３２頁。
【非特許文献３４】Ｓ．  Ｂｕｃｈｉｎｉら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００８年、４７巻、２７００頁。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
３−フルオロシアリル−酵素中間体（レポーター−阻害剤−酵素コンジュゲート）を捕捉することによって機能するメカニズムベース不可逆的シアリダーゼ阻害剤（ＤＦＳＡなどのアルキンヒンジ付き３−フルオロシアリルフルオリド化合物）が本明細書に開示される。これらのシアリダーゼ阻害剤は、シアリダーゼを単離および同定するために検出可能なタグ付け部分とコンジュゲートすることができる。生理的条件下でのシアリダーゼ活性のｉｎ  ｓｉｔｕでの細胞取込み、同定、および画像化を可能にするシアリダーゼ阻害剤の細胞透過性前駆体として有用なシアリダーゼ阻害剤のエステルで保護されたバージョン（ＰＤＦＳＡなど）も提供される。
【００１３】
一態様では、本開示は、式（Ｉ）：
【化１】
0006302909.tif 000002
の新規不可逆的シアリダーゼ阻害剤、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
Ｒ１は、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
Ｒ２Ｏの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
Ｒ２Ｎの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの各事例は独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
Ｒ３ｒの各事例は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または−Ｌ−Ｚであり、
Ｙは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルまたは−Ｌ−Ｚであり、
Ｌの各事例は独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、
Ｚの各事例は、さらなるライゲーションのための官能基であり、
ただし、化合物は、式
【化２】
0006302909.tif 000003
のものではない）
を提供する。
【００１４】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｚは、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、ＲＮの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、ＲＯの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、ＲＳの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ａ）：
【化３】
0006302909.tif 000004
のもの、またはその塩
（式中、Ｒ３ｃは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基である）である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ）：
【化４】
0006302909.tif 000005
のもの、またはその塩である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ１）：
【化５】
0006302909.tif 000006
のもの、またはその塩である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ２）：
【化６】
0006302909.tif 000007
のもの、またはその塩
（式中、Ｒｙ１は、水素または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ３）：
【化７】
0006302909.tif 000008
のもの、またはその塩である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ）：
【化８】
0006302909.tif 000009
のもの、またはその塩である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ１）：
【化９】
0006302909.tif 000010
のもの、またはその塩である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ２）：
【化１０】
0006302909.tif 000011
のもの、またはその塩
（式中、Ｒｙ２は、水素または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ３）：
【化１１】
0006302909.tif 000012
のもの、またはその塩である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化１２】
0006302909.tif 000013
（式中、Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアル方向で位置することができ；Ｒ１は、直鎖または分枝鎖アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）を含み；Ｒ３の各事例は、Ｈ、ならびにアセチル（ＣＨ３ＣＯ）、プロパノイル（Ｃ２Ｈ５ＣＯ）、ブタノイル（Ｃ３Ｈ７ＣＯ）、ピバロイル（ｔ−ＢｕＣＯ）、トリフルオロアセチル（ＣＦ３ＣＯ）、フェニルアセチル（ＰｈＣＨ２ＣＯ）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）、および（置換）ベンゾイルを含むアシル基からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ３、ＣＦ３、および部分Ｌ−Ｚ（式中、Ｌは、リンカーであり、Ｚは、さらなるライゲーションのための末端官能基である）からなる群から選択され；Ｌは、１〜１２個の炭素原子ならびに／またはＮ、Ｏ、およびＳから選択される０〜５個のヘテロ原子を含む連結基であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎＮＨ、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され；ｎは、１〜８の整数であり；Ｚは、さらなるライゲーションのための任意の官能基を表す）のものである。ある特定の実施形態では、Ｚは、アルキン（ＨＣ≡Ｃ）、アルケン（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ）、ハロ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アジド（Ｎ３）、アミン（ＮＨ２）、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）、およびカルボキシル（ＣＯ２Ｈ）基からなる群から選択され、ただし、Ｒ１におけるＨ、Ｒ３におけるＨ、およびＹにおけるＣＨ３は、式（ＩＩ）の化合物中に同時に存在しない。
【００２５】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化１３】
0006302909.tif 000014
（式中、Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアル方向で位置することができ；Ｒ１は、直鎖または分枝鎖アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）を含み；Ｒ３は、Ｈ、ならびにアセチル（ＣＨ３ＣＯ）、プロパノイル（Ｃ２Ｈ５ＣＯ）、ブタノイル（Ｃ３Ｈ７ＣＯ）、ピバロイル（ｔ−ＢｕＣＯ）、トリフルオロアセチル（ＣＦ３ＣＯ）、フェニルアセチル（ＰｈＣＨ２ＣＯ）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ）、および（置換）ベンゾイルを含むアシル基からなる群から選択され；Ｘは、−Ｏ、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）、−ＮＨ、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨからなる群から選択され；Ｒ４は、Ｈ、アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）、および部分Ｌ−Ｚ（式中、Ｌは、リンカーであり、Ｚは、さらなるライゲーションのための末端官能基である）からなる群から選択され；Ｌは、１〜１２個の炭素原子ならびに／またはＮ、Ｏ、およびＳから選択される０〜５個のヘテロ原子を含む連結基であり、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎＮＨ、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され；ｎは、１〜８の整数であり；Ｚは、さらなるライゲーションのための任意の官能基を表す）の化合物である。ある特定の実施形態では、Ｚは、アルキン（ＨＣ≡Ｃ）、アルケン（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ）、ハロ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アジド（Ｎ３）、アミン（ＮＨ２）、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）、およびカルボキシル（ＣＯ２Ｈ）基からなる群から選択され、ただし、Ｒ１におけるＨ、Ｒ３におけるＨ、ＸにおけるＯ、およびＲ４におけるＨは、式（Ｖ）の化合物中に同時に存在しない。
【００２６】
例示的なシアリダーゼ阻害剤は、以下の式：
【化１４】
0006302909.tif 000015
のものである。
【００２７】
本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ１）、（ＩＩ−ｂ２）、（ＩＩ−ｂ３）、（ＩＩ−ｃ）、（ＩＩ−ｃ１）、（ＩＩ−ｃ２）、（ＩＩ−ｃ３）、または（ＩＩ）〜（ＩＸ）の化合物を含む検出可能なコンジュゲートに関し、化合物は、検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態では、検出可能なタグ付け部分は、レポーター基または標識を含む。ある特定の実施形態では、標識は、アジド付属ビオチン（ａｚｉｄｏ−ａｎｎｅｘｅｄ  ｂｉｏｔｉｎ）（アジド−ビオチン）である。
【００２８】
本開示は、式（Ｉ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ１）、（ＩＩ−ｂ２）、（ＩＩ−ｂ３）、（ＩＩ−ｃ）、（ＩＩ−ｃ１）、（ＩＩ−ｃ２）、（ＩＩ−ｃ３）、もしくは（ＩＩ）〜（ＩＸ）の化合物、または検出可能なコンジュゲートを含むシアリダーゼタンパク質付加体に関する。提供されるシアリダーゼタンパク質付加体のある特定の実施形態では、シアリダーゼタンパク質は、化合物または検出可能なコンジュゲートに共有結合的にコンジュゲートされている。
【００２９】
本開示は、ウイルス、細菌、およびヒトシアリダーゼと共有結合性付加体を形成する合成シアリダーゼ阻害剤に関する。
【００３０】
本発明は、フルオロシアリル−酵素付加体の検出および画像化に関する。一例として、末端アルキン基を持つＤＦＳＡ−５−インは、Ｃｕ（Ｉ）−触媒［３＋２］環付加（クリック反応）によってアジド−ビオチンとコンジュゲートされており、ストレプトアビジン特異的報告シグナル（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）によって検出される。
【化１５】
0006302909.tif 000016
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＤＦＳＡ−５−インまたはＤＦＳＡ−７−インは、インフルエンザノイラミニダーゼに競合的に結合することによって、インフルエンザ感染におけるオセルタミビル感受性を診断するのに使用される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＰＤＦＳＡ−５−インまたはＰＤＦＳＡ−７−インは、生細胞内のシアリダーゼ活性の変化のｉｎ  ｓｉｔｕでの画像化のために使用される。
【００３３】
これらおよび他の態様は、以下の図面と併せて採用される以下の好適な実施形態の説明から明らかとなるが、これらにおける変形および改変は、本開示の新規概念の趣旨および範囲から逸脱することなく影響され得る。
【００３４】
定義
特定の官能基および化学用語の定義を以下により詳細に説明する。化学元素は、ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、７５版、内表紙に従って識別され、特定の官能基は一般に、その中に記載されているように定義される。さらに、有機化学の一般的原理、ならびに特定の機能性部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９年；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年；ならびにＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７年に記載されている。
【００３５】
本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、したがって、様々な立体異性体、例えば、鏡像異性体および／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマー、もしくは幾何異性体の形態であり得、またはラセミ混合物および１種または複数の立体異性体に富む混合物を含めた、立体異性体の混合物の形態であり得る。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにキラル塩の形成および結晶化を含めた当業者に公知の方法によって混合物から単離することができ、または好適な異性体を不斉合成によって調製することができる。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）；Ｗｉｌｅｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３３巻：２７２５頁（１９７７年）；Ｅｌｉｅｌ，  Ｅ．Ｌ．、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＮＹ、１９６２年）；およびＷｉｌｅｎ，  Ｓ．Ｈ．、Ｔａｂｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、２６８頁（Ｅ．Ｌ．  Ｅｌｉｅｌ編、Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ、ＩＮ、１９７２年）を参照。本発明は、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体としての化合物、および代わりに、様々な異性体の混合物としての化合物をさらに包含する。
【００３６】
値の範囲が列挙されている場合、これは、その範囲内の各値およびサブ範囲を包含するように意図されている。例えば、「Ｃ１〜６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１〜６、Ｃ１〜５、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜６、Ｃ２〜５、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３、Ｃ３〜６、Ｃ３〜５、Ｃ３〜４、Ｃ４〜６、Ｃ４〜５、およびＣ５〜６アルキルを包含するように意図されている。
【００３７】
用語「脂肪族」は、本明細書において使用される場合、アルキル、アルケニル、アルキニル、および炭素環基を指す。同様に、用語「ヘテロ脂肪族」は、本明細書において使用される場合、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、および複素環基を指す。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖飽和炭化水素基のラジカル（「Ｃ１〜１０アルキル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜２個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキル」）。Ｃ１〜６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、ｉｓｏ−ブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（Ｃ５）、３−ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３−メチル−２−ブタニル（Ｃ５）、３級アミル（Ｃ５）、およびｎ−ヘキシル（Ｃ６）がある。アルキル基の追加の例としては、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、ｎ−オクチル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルキル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換アルキル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１〜１０アルキル（例えば、−ＣＨ３）である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１〜１０アルキルである。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアルキル」は、親鎖内に（すなわち、親鎖の隣接する炭素原子間に挿入された）、かつ／または親鎖の１つもしくは複数の末端位置に配置された、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１、２、３、または４個のヘテロ原子）をさらに含む、本明細書に定義されたアルキル基を指す。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜１０個の炭素原子および１個または複数のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜１０アルキル」）を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜９個の炭素原子および１個または複数のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜９アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜８個の炭素原子および１個または複数のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜８アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜７個の炭素原子および１個または複数のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜７アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜６個の炭素原子および１個または複数のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜６アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜５個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜５アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜４個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜４アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜３個の炭素原子および１個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜３アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１〜２個の炭素原子および１個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１〜２アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、１個の炭素原子および１個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ１アルキル」）である。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に２〜６個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子を有する飽和基（「ヘテロＣ２〜６アルキル」）である。別段の指定のない限り、ヘテロアルキル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換ヘテロアルキル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換ヘテロアルキル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、非置換ヘテロＣ１〜１０アルキルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、置換ヘテロＣ１〜１０アルキルである。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「アルケニル」は、２〜１０個の炭素原子および１つまたは複数の炭素間二重結合（例えば、１、２、３、または４つの二重結合）を有する直鎖または分岐鎖炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１つまたは複数の炭素間二重結合は、内部（２−ブテニル中など）または末端（１−ブテニル中など）であり得る。Ｃ２〜４アルケニル基の例としては、エテニル（Ｃ２）、１−プロペニル（Ｃ３）、２−プロペニル（Ｃ３）、１−ブテニル（Ｃ４）、２−ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などがある。Ｃ２〜６アルケニル基の例としては、上述のＣ２〜４アルケニル基、およびペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などがある。アルケニルの追加の例としては、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルケニル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換アルケニル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換アルケニル」）。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、非置換Ｃ２〜１０アルケニルである。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、置換Ｃ２〜１０アルケニルである。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアルケニル」は、親鎖内に（すなわち、親鎖の隣接する炭素原子間に挿入された）、かつ／または親鎖の１つもしくは複数の末端位置に配置された、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１、２、３、または４個のヘテロ原子）をさらに含む、本明細書に定義されたアルケニル基を指す。ある特定の実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜１０個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する基（「ヘテロＣ２〜１０アルケニル」）を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜９個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜８個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜７個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜６個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜５個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜４個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜３個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基は、親鎖内に２〜６個の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルケニル」）。別段の指定のない限り、ヘテロアルケニル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換ヘテロアルケニル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換ヘテロアルケニル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロアルケニル基は、非置換ヘテロＣ２〜１０アルケニルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルケニル基は、置換ヘテロＣ２〜１０アルケニルである。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「アルキニル」は、２〜１０個の炭素原子、および１つまたは複数の炭素間三重結合（例えば、１、２、３、または４つの三重結合）を有する直鎖または分岐鎖炭化水素基のラジカル（「Ｃ２〜１０アルキニル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つまたは複数の炭素間三重結合は、内部（２−ブチニル中など）または末端（１−ブチニル中など）にあり得る。Ｃ２〜４アルキニル基の例としては、限定することなく、エチニル（Ｃ２）、１−プロピニル（Ｃ３）、２−プロピニル（Ｃ３）、１−ブチニル（Ｃ４）、２−ブチニル（Ｃ４）などがある。Ｃ２〜６アルケニル基の例としては、上述のＣ２〜４アルキニル基、およびペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）などがある。アルキニルの追加の例としては、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルキニル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換アルキニル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換アルキニル」）。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、非置換Ｃ２〜１０アルキニルである。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、置換Ｃ２〜１０アルキニルである。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアルキニル」は、親鎖内に（すなわち、親鎖の隣接する炭素原子間に挿入された）、かつ／または親鎖の１つもしくは複数の末端位置に配置された、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１、２、３、または４個のヘテロ原子）をさらに含む、本明細書に定義されたアルキニル基を指す。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜１０個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する基（「ヘテロＣ２〜１０アルキニル」）を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜９個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜８個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜７個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜６個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または複数のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜５個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜４個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜３個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基は、親鎖内に２〜６個の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１個または２個のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルキニル」）。別段の指定のない限り、ヘテロアルキニル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換ヘテロアルキニル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換ヘテロアルキニル」。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキニル基は、非置換ヘテロＣ２〜１０アルキニルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキニル基は、置換ヘテロＣ２〜１０アルキニルである。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「カルボシクリル」または「炭素環式」は、非芳香族環系内に３〜１０個の環炭素原子（「Ｃ３〜１０カルボシクリル」）およびゼロ個のヘテロ原子を有する非芳香族環式炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜８カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜７個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜７カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、３〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、４〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、５〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基は、５〜１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜１０カルボシクリル」）。例示的なＣ３〜６カルボシクリル基としては、限定することなく、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）などがある。例示的なＣ３〜８カルボシクリル基としては、限定することなく、上述のＣ３〜６カルボシクリル基、およびシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）などがある。例示的なＣ３〜１０カルボシクリル基としては、限定することなく、上述のＣ３〜８カルボシクリル基、およびシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ−１Ｈ−インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などがある。前述の例が例示するように、ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、単環式（「単環式カルボシクリル」）または多環式（例えば、縮合環系、架橋環系、もしくはスピロ環系、例えば、二環系（「二環式カルボシクリル」）もしくは三環系（「三環式カルボシクリル」）などを含有する）であり、飽和していることができ、または１つもしくは複数の炭素間二重もしくは三重結合を含有し得る。「カルボシクリル」は、上記に定義したカルボシクリル環が１つまたは複数のアリールまたはヘテロアリール基と縮合しており、付着点がカルボシクリル環上にある環系も含み、このような事例では、炭素の番号は、炭素環式環系内の炭素の数を指定するように続く。別段の指定のない限り、カルボシクリル基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換カルボシクリル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換カルボシクリル」）。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、非置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子、ならびに各ヘテロ原子が独立に、窒素、酸素、および硫黄から選択される、１〜４個の環ヘテロ原子を有する３〜１４員非芳香族環系のラジカル（「３〜１４員ヘテロシクリル」）を指す。１つまたは複数の窒素原子を含有するヘテロシクリル基では、付着点は、結合価が許容する場合、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または多環式（例えば、縮合環系、架橋環系、もしくはスピロ環系、例えば、二環系（「二環式ヘテロシクリル」）もしくは三環系（「三環式ヘテロシクリル」）など）であり、飽和していることができ、または１つもしくは複数の炭素間二重もしくは三重結合を含有し得る。ヘテロシクリル多環式環系は、一方または両方の環内に１個または複数のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロシクリル」は、上記に定義したヘテロシクリル環が１つもしくは複数のカルボシクリル基と縮合しており、付着点がカルボシクリルもしくはヘテロシクリル環上にある環系、または上記に定義したヘテロシクリル環が１つもしくは複数のアリールもしくはヘテロアリール基と縮合しており、付着点がヘテロシクリル環上にある環系も含み、このような事例では、環員の番号は、ヘテロシクリル環系内の環員の数を指定するように続く。別段の指定のない限り、ヘテロシクリルの各事例は独立に、非置換であり（「非置換ヘテロシクリル」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、非置換３〜１４員ヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、置換３〜１４員ヘテロシクリルである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「アリール」は、６〜１４個の環炭素原子を有し、芳香族環系内に供給されるヘテロ原子がゼロである単環式または多環式（例えば、二環式もしくは三環式）４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環アレイ内に６、１０、または１４個のπ電子が共有された）のラジカル（「Ｃ６〜１４アリール」）を指す。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１−ナフチルおよび２−ナフチルなどのナフチル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」は、上記に定義したアリール環が１つもしくは複数のカルボシクリルもしくはヘテロシクリル基と縮合されており、ラジカルもしくは付着点がアリール環上にある環系も含み、このような事例では、炭素原子の番号は、アリール環系の炭素原子の数を指定するように続く。別段の指定のない限り、アリール基の各事例は独立に、非置換であり（「非置換アリール」）、または１つもしくは複数の置換基と置換されている（「置換アリール」）。ある特定の実施形態では、アリール基は、非置換Ｃ６〜１４アリールである。ある特定の実施形態では、アリール基は、置換Ｃ６〜１４アリールである。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアリール」は、環炭素原子、ならびに各ヘテロ原子が独立に、窒素、酸素、および硫黄から選択される、芳香族環系内に供給される１〜４個の環ヘテロ原子を有する５〜１４員の単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環アレイ内に共有された６、１０、または１４個のπ電子を有する）のラジカル（「５〜１４員ヘテロアリール」）を指す。１つまたは複数の窒素原子を含有するヘテロアリール基では、付着点は、結合価が許容する場合、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロアリール多環式環系は、一方または両方の環内に１個または複数のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアリール」は、上記に定義したヘテロアリール環が１つまたは複数のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合しており、付着点がヘテロアリール環上にある環系を含み、このような事例では、環員の番号は、ヘテロアリール環系内の環員の数を指定するように続く。「ヘテロアリール」は、上記に定義したヘテロアリール環が１つまたは複数のアリール基と縮合しており、付着点がアリールまたはヘテロアリール環上のいずれかにある環系も含み、このような事例では、環員の番号は、縮合多環式（アリール／ヘテロアリール）環系内の環員の数を指定する。１つの環がヘテロ原子を含有しない多環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）、付着点は、いずれかの環、すなわち、ヘテロ原子を持つ環（例えば、２−インドリル）またはヘテロ原子を含有しない環（例えば、５−インドリル）上のいずれかにあり得る。
【００４８】
基に接尾辞「−エン」を付けることは、基が二価部分であることを示し、例えば、アルキレンは、アルキルの二価部分であり、アルケニレンは、アルケニルの二価部分であり、アルキニレンは、アルキニルの二価部分であり、ヘテロアルキレンは、ヘテロアルキルの二価部分であり、ヘテロアルケニレンは、ヘテロアルケニルの二価部分であり、ヘテロアルキニレンは、ヘテロアルキニルの二価部分であり、カルボシクリレンは、カルボシクリルの二価部分であり、ヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルの二価部分であり、アリーレンは、アリールの二価部分であり、ヘテロアリーレンは、ヘテロアリールの二価部分である。
【００４９】
上記から理解されるように、本明細書に定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、ある特定の実施形態では、任意選択で置換されている。任意選択で置換されたとは、置換または非置換であり得る基（例えば、「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルケニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキニル、「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリール、または「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）を指す。一般に、用語「置換された」は、基に存在する少なくとも１個の水素が、許容できる置換基、例えば、置換すると安定化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応などによる変換を自発的に起こさない化合物をもたらす置換基と置き換えられていることを意味する。別段の指定のない限り、「置換された」基は、その基の１つまたは複数の置換可能な位置で置換基を有し、任意の所与の構造中で１つを超える位置が置換されている場合、置換基は、各位置で同じであり、または異なっている。用語「置換された」は、有機化合物のすべての許容できる置換基、安定化合物の形成をもたらす本明細書に記載の置換基のいずれかとの置換を含むように企図されている。本発明は、安定化合物に到達するための任意かつすべてのこのような組合せを企図する。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たし、安定部分の形成をもたらす本明細書に記載の任意の適当な置換基を有し得る。
【００５０】
例示的な炭素原子置換基としては、それだけに限らないが、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−ＯＮ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、−ＳＨ、−ＳＲａａ、−ＳＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨＯ、−Ｃ（ＯＲｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２ＯＲａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−ＯＳｉ（Ｒａａ）３  −Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−Ｂ（Ｒａａ）２、−Ｂ（ＯＲｃｃ）２、−ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１４カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールがあり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基と置換されており；
あるいは炭素原子上の２個のジェミナル水素は、基＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂ、または＝ＮＯＲｃｃで置き換えられており、
Ｒａａの各事例は独立に、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択され、または２個のＲａａ基は、接合されて３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｄｄ基と置換されており、
Ｒｂｂの各事例は独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択され、または２個のＲｂｂ基は、接合されて３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｄｄ基と置換されており、
Ｒｃｃの各事例は独立に、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択され、または２個のＲｃｃ基は、接合されて３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｄｄ基と置換されており、
Ｒｄｄの各事例は独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲｅｅ、−ＯＮ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、−ＳＨ、−ＳＲｅｅ、−ＳＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＯＣＯ２Ｒｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２ＯＲｅｅ、−ＯＳＯ２Ｒｅｅ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、−ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリールから選択され、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｇｇ基と置換されており、または２個のジェミナルＲｄｄ置換基は、接合されて＝Ｏもしくは＝Ｓを形成することができ、
Ｒｅｅの各事例は独立に、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、および３〜１０員ヘテロアリールから選択され、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｇｇ基と置換されており、
Ｒｆｆの各事例は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、または２個のＲｆｆ基は、接合されて３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｇｇ基と置換されており、
Ｒｇｇの各事例は独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＮ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）３＋Ｘ−、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）２＋Ｘ−、−ＮＨ２（Ｃ１〜６アルキル）＋Ｘ−、−ＮＨ３＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＣ１〜６アルキル）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（ＯＨ）、−ＳＨ、−ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＳ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１〜６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯＣ１〜６アルキル、−Ｓｉ（Ｃ１〜６アルキル）３、−ＯＳｉ（Ｃ１〜６アルキル）３−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−Ｐ（＝Ｏ）２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１〜６アルキル）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ２〜６ヘテロアルケニル、Ｃ２〜６ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、５〜１０員ヘテロアリールから選択され、または２個のジェミナルＲｇｇ置換基は、接合されて＝Ｏもしくは＝Ｓを形成することができ、Ｘ−は、対イオンである。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、−Ｉ）を指す。
【００５２】
ある特定の実施形態では、窒素原子上に存在する置換基は、窒素保護基（「アミノ保護基」とも本明細書で呼ばれる）である。窒素保護基としては、それだけに限らないが、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、Ｃ１〜１０アルキル（例えば、アラルキル、ヘテロアラルキル）、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ２〜１０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜１０ヘテロアルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリール基があり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基と置換されており、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ、およびＲｄｄは、本明細書で定義した通りである。窒素保護基は、当技術分野で周知であり、参照により本明細書に組み込まれているＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年に詳細に記載されたものを含む。
【００５３】
例えば、アミド基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）などの窒素保護基としては、それだけに限らないが、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシアシルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンアミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミドおよびｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミドがある。
【００５４】
カルバメート基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）などの窒素保護基としては、それだけに限らないが、メチルカルバメート、エチルカルバメート（ｃａｒｂａｍａｎｔｅ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジル（ｎｉｔｏｂｅｎｚｙｌ）カルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシアシルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（ｉｓｏｂｏｒｙｎｌ）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、および２，４，６−トリメチルベンジルカルバメートがある。
【００５５】
スルホンアミド基（例えば、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）などの窒素保護基としては、それだけに限らないが、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナシルスルホンアミドがある。
【００５６】
他の窒素保護基としては、それだけに限らないが、フェノチアジニル−（１０）−アシル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノアシル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオアシル誘導体、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加体（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロオリン（ｐｙｒｏｏｌｉｎ）−３−イル）アミン、四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタアシルクロム（ｐｅｎｔａａｃｙｌｃｈｒｏｍｉｕｍ）−またはタングステン）アシル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホラミデート、ジベンジルホスホラミデート、ジフェニルホスホラミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、および３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）がある。
【００５７】
ある特定の実施形態では、酸素原子上に存在する置換基は、酸素保護基（「ヒドロキシル保護基」とも本明細書で呼ばれる）である。酸素保護基としては、それだけに限らないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２があり、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書で定義した通りである。酸素保護基は、当技術分野で周知であり、参照により本明細書に組み込まれているＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年に詳細に記載されたものを含む。
【００５８】
例示的な酸素保護基としては、それだけに限らないが、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコルメチル（ｇｕａｉａｃｏｌｍｅｔｈｙｌ）（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（Ｄ���ＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、炭酸メチル、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、炭酸エチル、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、炭酸イソブチル、炭酸ビニル、炭酸アリル、ｔ−ブチルカーボネート（ＢＯＣ）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、炭酸ベンジル、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチル（ｎａｐｔｈｔｈｙｌ）カーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシアシル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）がある。
【００５９】
ある特定の実施形態では、硫黄原子上に存在する置換基は、硫黄保護基（「チオール保護基」とも呼ばれる）である。硫黄保護基としては、それだけに限らないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２があり、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書で定義した通りである。硫黄保護基は、当技術分野で周知であり、参照により本明細書に組み込まれているＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ、３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年に詳細に記載されたものを含む。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わないでヒトおよび下等動物の組織と接触して使用するのに適した、適切な医学的判断の範囲内の塩を指し、かつ妥当な利益／リスク比に見合っている薬学的に許容される塩を含めた任意のおよびすべての塩を指す（Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７年）６６巻：１〜１９頁で詳細に薬学的に許容される塩を記載するＢｅｒｇｅらを参照）。薬学的に許容される無毒性の酸性塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などを用いて、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などと用いて、あるいはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがある。適切な塩基に由来する薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４の塩がある。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどがある。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切な場合、無毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、ならびに対イオンを使用して形成されるアミン陽イオン、例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などがある。
【００６１】
本明細書において使用される場合、化合物の「誘導体」は、化合物の溶媒和物、水和物、多形、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、プロドラッグを指す。
【００６２】
用語「多形」は、化合物（またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物）が、そのすべてが同じ元素組成を有する異なる結晶充填配置で結晶化することができる結晶構造を意味する。異なる結晶形は通常、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的および電気的性質、安定性、ならびに溶解度を有する。再結晶溶媒、結晶化速度、貯蔵温度、および他の要因が、１つの結晶形を支配させることができる。化合物の結晶多形は、異なる条件下での結晶化によって調製され得る。
【００６３】
用語「共結晶」は、少なくとも２つのコンポーネントから構成される結晶構造を指し、コンポーネントは、原子、イオン、または分子であり得る。一般に、コンポーネントは、イオン性、またはより一般には、非イオン性相互作用によって互いに相互作用して結晶構造を形成する。特定の共結晶形態については、すべてのそのコンポーネントを単結晶格子（単位胞）内に見つけることができ、通常、明確な化学量論比内にある。共結晶のコンポーネントは、その純粋な形態にあるとき、固体であっても、液体であってもよい。結晶性塩、結晶性水和物、および結晶性溶媒和物も、共結晶の意味の範囲内にある。
【００６４】
「溶媒和物」は、通常、加溶媒分解反応によって溶媒または水（「水和物」とも呼ばれる）と付随した化合物の形態を指す。この物理的会合は、水素結合を含む。慣例的な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテルなどがある。本発明の化合物は、例えば、結晶形で調製することができ、溶媒和または水和されている場合がある。適当な溶媒和物には、水和物などの薬学的に許容される溶媒和物が含まれ、化学量論的溶媒和物および非化学量論的溶媒和物の両方がさらに含まれる。ある特定の事例では、溶媒和物は、例えば、１つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子内に組み込まれているとき、単離することができる。「溶媒和物」は、溶液相および単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート、およびメタノレートがある。
【００６５】
「互変異性体」は、特定の化合物構造の互換性形態であり、水素原子および電子の変位の点で異なる化合物を指す。したがって、２つの構造は、π電子および原子（通常Ｈ）の移動によって平衡状態にあり得る。例えば、エノールおよびケトンは、酸または塩基での処理によって急速に相互転換されるので、互変異生体である。互変異性の別の例は、酸または塩基での処理によって同様に形成される、フェニルニトロメタンのａｃｉ型およびニトロ型である。
【００６６】
互変異性型は、対象の化合物の最適な化学反応性および生物活性の達成に関連している場合がある。
【００６７】
本明細書において使用される場合、化合物の「同位体標識誘導体」は、化合物の少なくとも１種の原子が、自然において見出される原子の最も豊富な同位体より分子量において高いまたは低い同位体について富化された化合物の誘導体を指す。
【００６８】
「プロドラッグ」は、切断可能な基を有し、加溶媒分解によって、または生理的条件下で、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬学的に活性である本発明の化合物になる本発明の化合物の誘導体を含めた化合物を指す。このような例としては、それだけに限らないが、コリンエステル誘導体などＮ−アルキルモルホリンエステルなどがある。本発明の化合物の他の誘導体も、これらの酸形態および酸誘導体形態の両方で活性を有するが、酸感受性形態では、哺乳動物生物における溶解度、組織適合性、または遅延放出という利点をもたらすことが多い（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，  Ｈ．、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、７〜９頁、２１〜２４頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５年を参照）。プロドラッグには、当技術分野の専門家に周知の酸誘導体、例えば、親酸の適当なアルコールとの反応によって調製されるエステル、または親酸性化合物の置換もしくは非置換アミンとの反応によって調製されるアミド、または酸無水物、または混合無水物などが含まれる。本発明の化合物に懸垂している酸性基に由来する単純な脂肪族または芳香族エステル、アミド、および無水物は、特定のプロドラッグである。いくつかの場合では、二重エステル型プロドラッグ、例えば、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルなどを調製することが望ましい。特に、本発明の化合物のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、アリール、Ｃ７〜Ｃ１２置換アリール、およびＣ７〜Ｃ１２アリールアルキルエステル。
【００６９】
本明細書において使用される場合、２つの実体が互いに「コンジュゲート」または「ライゲーション」されているとき、これらは、直接的または間接的な共有結合性または非共有結合性相互作用によって連結している。ある特定の実施形態では、会合は、共有結合性である。他の実施形態では、会合は、非共有結合性である。非共有結合性相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などがある。間接的な共有結合性相互作用は、２つの実体が任意選択でリンカー基によって共有結合的に接続されているときである。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「標識」は、部分であって、標識が付着されている実体の検出を可能にする、この部分内に組み込まれた少なくとも１種の元素、同位体、または官能基を有する、部分を指す。標識は、直接付着させることができ（すなわち結合によって）、あるいはリンカー（例えば、環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換アルキレン；環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換アルケニレン；環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換アルキニレン；環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン；環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換ヘテロアルケニレン；環式もしくは非環式、分岐状もしくは非分岐状、置換もしくは非置換ヘテロアルキニレン；置換もしくは非置換アリーレン；置換もしくは非置換ヘテロアリーレン；または置換もしくは非置換アシレン（ａｃｙｌｅｎｅ）、またはリンカーを構成し得るこれらの任意の組合せなど）によって付着させることができる。標識は、検出されている実体の生物活性または特徴を妨害しない任意の位置で本発明の実体に付着させることができることが理解されるであろう。
【００７１】
一般に、標識は、以下の５つのクラスのいずれか１つ（またはそれより多い）に分類され得る：ａ）それだけに限らないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅを含めた放射性同位体または重同位体であり得る同位体部分を含有する標識、ｂ）酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に結合され得る抗体または抗原であり得る免疫性部分を含有する標識、ｃ）着色部分、ルミネセンス部分、リン光部分、または蛍光部分である標識（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣなど）、ｄ）１つまたは複数の光親和性部分を有する標識、ならびにｅ）１つまたは複数の公知の結合パートナーを有するリガンド部分を有する標識（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）。
【００７２】
ある特定の実施形態では、生物学的標的の同定などにおいて、標識は、放射性同位体、好ましくはβ粒子などの検出可能な粒子を放出する同位体を含む。ある特定の実施形態では、標識は、生物系における分子間相互作用の直接解明のための１つまたは複数の光親和性部分を含む。様々な公知の発光器を使用することができ、ジアゾ化合物、アジド、またはジアジリンのナイトレンまたはカルベンへの光変換を最も利用する（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．、Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３年）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照）。本発明のある特定の実施形態では、光親和性標識は、それだけに限らないが、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸を含めた、１つまたは複数のハロゲン部分と置換されたｏ−、ｍ−、およびｐ−アジドベンゾイルである。
【００７３】
ある特定の実施形態では、標識は、１つまたは複数の蛍光部分を含む。ある特定の実施形態では、標識は、蛍光標識ＦＩＴＣである。ある特定の実施形態では、標識は、１つまたは複数の公知の結合パートナーを有するリガンド部分を含む。ある特定の実施形態では、標識は、リガンド部分ビオチンを含む。
【００７４】
投与が企図される「対象」としては、それだけに限らないが、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児対象（例えば、乳児、子供、青年）、または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、もしくは高齢成人））ならびに／あるいは他の非ヒト動物、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）、商業的に関連した哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／またはイヌなど）、ならびにトリ（例えば、商業的に関連したトリ、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなど）がある。ある特定の実施形態では、動物は、哺乳動物である。動物は、雄であっても雌であってもよく、発達の任意の段階におけるものであり得る。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってもよい。
【００７５】
「フルオロフォア」（または発色団と同様の蛍光色素）は、光励起されると光を再放出することができる蛍光化学化合物である。フルオロフォアは一般に、いくつかのπ結合を有するいくつかの組み合わされた芳香族基、または平面分子もしくは環状分子を含有する。
【００７６】
本明細書において使用される場合、用語「試料」、「検査試料」、「生体試料」は、互換的に使用される。用語の試料は、限定することなく、細胞培養物またはその抽出物、動物（例えば、哺乳動物）から得られる生検材料またはその抽出物、および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙、もしくは他の体液またはこれらの抽出物を含む。例えば、用語「試料」は、単細胞微生物（細菌および酵母など）、ならびに多細胞生物（植物および動物など、例えば、脊椎動物または哺乳動物、特に、診断または調査されるべき健康もしくは見かけ上健康なヒト対象または状態もしくは疾患に影響されたヒト患者）を含めた任意の生体から得られる、それによって排泄される、またはそれによって分泌される任意の固体もしくは流体試料を指す。試料は、固体材料、例えば、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、細胞ホモジネート、もしくは細胞画分など、または生検、または生体液を含めた任意の形態であり得る。生体液は、任意の部位から得ることができる（例えば、血液、唾液（または頬細胞を含有する洗口液）、涙、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、羊膜液、腹膜液、および胸膜液、またはこれらからの細胞、房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌液）、漏出液、浸出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）、あるいは関節（例えば、正常な関節、または疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、痛風、もしくは敗血症性関節炎などに影響された関節）から得られる流体）。試料は、任意の器官または組織（生検または剖検標本を含む）から得ることができ、あるいは細胞（初代細胞であっても、培養細胞であっても）、または任意の細胞、組織、もしくは器官によってコンディショニングされた媒体を含み得る。生体試料として、組織学的目的で採取された凍結切片などの組織の切片も挙げることができる。生体試料には、細胞または組織ホモジネートの部分的または完全な分画によって生成されるタンパク質、脂質、炭水化物、および核酸を含む生体分子の混合物も含まれる。試料は、好ましくはヒト対象から採取されるが、生体試料は、任意の動物、植物、細菌、ウイルス、酵母などからのものであり得る。用語の動物は、本明細書において使用される場合、発達の任意の段階におけるヒトおよび非ヒト動物を指し、例えば、哺乳動物、トリ、爬虫類、両生類、魚、虫、および単細胞を含む。細胞培養物および生組織試料は、多数の動物であると見なされる。ある特定の例示的な実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。動物は、トランスジェニック動物またはヒトクローンであってもよい。必要に応じて、生体試料は、予備分離技法を含めた予備処理に付すことができる。
【００７７】
本明細書において使用される場合「阻害」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、および「阻害剤」などは、化合物の、ビヒクルと比べて細胞内でＲａｓが関与する特定の生物学的プロセスの活性を低減し、遅延させ、停止し、または防止する能力を指す。
【００７８】
本明細書において使用される場合、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ用途との関連で用語「細胞」は、任意の属または種の真核生物細胞および原核生物細胞を包含することを意味し、哺乳動物細胞が特に対象のものである。「細胞」はまた、正常細胞および疾患細胞、例えば、がん性細胞の両方を包含することも意味する。多くの実施形態では、細胞は生細胞である。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
式（Ｉ）：
【化１０１】
0006302909.tif 000017
の化合物、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
Ｒ１は、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
Ｒ２Ｏの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
Ｒ２Ｎの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの各事例は独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
Ｒ３ｒの各事例は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または−Ｌ−Ｚであり、
Ｙは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルまたは−Ｌ−Ｚであり、
Ｌの各事例は独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、
Ｚの各事例は、さらなるライゲーションのための官能基であり、
ただし、該化合物は、式
【化１０２】
0006302909.tif 000018
のものではない）。
（項目２）
Ｚが、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、
ＲＮの各事例が独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
ＲＯの各事例が独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
ＲＳの各事例が独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
式（ＩＩ−ａ）：
【化１０３】
0006302909.tif 000019
の項目１に記載の化合物、またはその塩
（式中、Ｒ３ｃは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基である）。
（項目４）
式（ＩＩ−ｂ）：
【化１０４】
0006302909.tif 000020
の項目３に記載の化合物、またはその塩。
（項目５）
式（ＩＩ−ｂ１）：
【化１０５】
0006302909.tif 000021
の項目３に記載の化合物、またはその塩。
（項目６）
式（ＩＩ−ｂ２）：
【化１０６】
0006302909.tif 000022
の項目３に記載の化合物、またはその塩
（式中、Ｒｙ１は、水素、ハロゲン、または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）。
（項目７）
式（ＩＩ−ｂ３）：
【化１０７】
0006302909.tif 000023
の項目３に記載の化合物、またはその塩。
（項目８）
式（ＩＩ−ｃ）：
【化１０８】
0006302909.tif 000024
の項目１に記載の化合物、またはその塩。
（項目９）
式（ＩＩ−ｃ１）：
【化１０９】
0006302909.tif 000025
の項目８に記載の化合物、またはその塩。
（項目１０）
式（ＩＩ−ｃ２）：
【化１１０】
0006302909.tif 000026
の項目８に記載の化合物、またはその塩
（式中、Ｒｙ２は、水素または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）。
（項目１１）
式（ＩＩ−ｃ３）：
【化１１１】
0006302909.tif 000027
の項目８に記載の化合物、またはその塩。
（項目１２）
Ｙが任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである、項目８から１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１３）
Ｙがメチルである、項目１１に記載の化合物。
（項目１４）
ＹがＣＦ３である、項目１１に記載の化合物。
（項目１５）
Ｒ１がＨまたはメチルである、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１６）
前記Ｃ３位の前記Ｆ原子がアキシャルである、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１７）
前記Ｃ３位の前記Ｆ原子がエクアトリアルである、項目１から１５のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１８）
Ｒ３ａが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、Ｒ３ｒが任意選択でアルキルアリールである、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１９）
Ｒ３ａが任意選択で置換されたベンゾイルである、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２０）
Ｒ３ａが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、Ｒ３ｒが任意選択で置換されたアリールである、項目１から１８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２１）
Ｒ３ａが−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐｈである、項目２０に記載の化合物。
（項目２２）
Ｒ３ａが、ＣＨ３ＣＯ−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ−、Ｃ３Ｈ７ＣＯ−、ｔ−ＢｕＣＯ−、ＣＦ３ＣＯ−、ＰｈＣＨ２ＣＯ−、またはＣ６Ｈ５ＣＯ−である、項目１から１８に記載の化合物。
（項目２３）
前記化合物が以下の式：
【化１１２】
0006302909.tif 000028
の１つである、項目１に記載の化合物。
（項目２４）
項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物を含むシアリダーゼタンパク質付加体であって、前記シアリダーゼタンパク質が前記化合物に共有結合的にコンジュゲートされている、シアリダーゼタンパク質付加体。
（項目２５）
式
【化１１３】
0006302909.tif 000029
の項目２４に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目２６）
前記シアリダーゼが、ヒト、ウイルス、または細菌シアリダーゼである、項目２５に記載のシアリダーゼタンパク質付加体
（項目２７）
前記シアリダーゼが、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、およびｎａｎＨからなる群から選択される細菌シアリダーゼである、項目２６に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目２８）
前記化合物がＤＦＳＡ−５−インまたはＤＦＳＡ−７−インである、項目２４から２７のいずれか一項に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目２９）
前記化合物が、配列番号１〜６の任意のペプチド内の１つまたは複数のチロシン（Ｙ）残基と共有結合的に連結しており、前記ペプチドが、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、またはｎａｎＨのフラグメントである、項目２４から２８のいずれか一項に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目３０）
前記シアリダーゼが、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、項目２６に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目３１）
前記シアリダーゼが、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４からなる群から選択されるヒトシアリダーゼである、項目２６に記載のシアリダーゼタンパク質付加体。
（項目３２）
前記項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物を含む検出可能なコンジュゲートであって、前記化合物が検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なコンジュゲート。
（項目３３）
項目２４から３０のいずれか一項に記載のシアリダーゼタンパク質付加体を含む検出可能なシアリダーゼタンパク質コンジュゲートであって、前記シアリダーゼタンパク質付加体が、検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なシアリダーゼタンパク質コンジュゲート。
（項目３４）
前記タグ付け部分が標識を含む、項目３２に記載の検出可能なコンジュゲート、または項目３３に記載の検出可能なシアリダーゼコンジュゲート。
（項目３５）
以下の式：
【化１１４】
0006302909.tif 000030
【化１１５】
0006302909.tif 000031
のいずれか１つの項目３４に記載の検出可能なコンジュゲートもしくは検出可能なシアリダーゼコンジュゲート、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
ＲＫは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、またはシアリダーゼタンパク質であり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
Ｒ２Ｏの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
Ｒ２Ｎの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの各事例は独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
Ｒ３ｒの各事例は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４ａは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または任意選択で置換されたアシルであり、
Ｙａは、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｌの各事例は独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、
ＲｐおよびＲｑの各事例は独立に、水素、任意選択で置換された脂肪族；任意選択で置換されたヘテロ脂肪族；置換または非置換アリール；任意選択で置換されたヘテロアリール；任意選択で置換されたアシル；樹脂；タンパク質；レポーター；リンカーＬａによって任意選択で接合された標識（該リンカーＬａは任意選択で置換されたアルキレンである）；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである）。
（項目３６）
前記標識がフルオロフォアである、項目３４から３５のいずれか一項に記載の検出可能なコンジュゲートまたは検出可能なタンパク質コンジュゲート。
（項目３７）
前記標識が、
【化１１６】
0006302909.tif 000032
である、項目３４から３５のいずれか一項に記載の検出可能なコンジュゲートまたは検出可能なタンパク質コンジュゲート。
（項目３８）
シアリダーゼの存在を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）シアリダーゼを含む疑いのある試料を項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、前記試料中の前記シアリダーゼの存在を示す、方法。
（項目３９）
前記シアリダーゼが細胞内にある、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記化合物が、ＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）もしくはＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）：
【化１１７】
0006302909.tif 000033
またはその誘導体、コンジュゲート、もしくはエステルである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記試料が、哺乳動物、家禽、または魚由来である、項目３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記哺乳動物がヒトである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記試料が、病原体を含有する疑いがある、項目３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記病原体が、細菌、ウイルス、原生動物、または真菌である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
細胞中のシアリダーゼの細胞内位置を画像化するステップをさらに含む、項目３８から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
シアリダーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）シアリダーゼを含む疑いのある試料を項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、前記試料中の前記シアリダーゼの存在を示す、方法。
（項目４７）
前記シアリダーゼが細胞外にある、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記検出可能なコンジュゲートが、ＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）もしくはＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）：
【化１１８】
0006302909.tif 000034
、またはその誘導体、コンジュゲート、もしくはエステルを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記試料が、哺乳動物、家禽、または魚由来である、項目４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記哺乳動物がヒトである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記試料が、病原体を含有する疑いがある、項目４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記病原体が、細菌、ウイルス、原生動物、または真菌である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
細胞中のシアリダーゼの細胞内位置を画像化するステップをさらに含む、項目４６から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
（ｄ）細胞をＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）、ＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）の化合物、またはその誘導体もしくはエステルと接触させるステップと、
（ｅ）細胞内エステラーゼに前記化合物をそれぞれＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）に変換させるステップと、
（ｆ）ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）を前記細胞中の細胞内位置で１つまたは複数のシアリダーゼに共有結合的にコンジュゲートさせるステップと、
（ｇ）レポーターを添加するステップと、
（ｈ）細胞内シアリダーゼ分布の画像を得るステップと
をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目５５）
シアリドーシスを診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）シアリドーシスの疑いのある対象からの検査試料を項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと、
（ｄ）前記シグナルを健康な対象からのシグナルと比較するステップと
を含み、前記検査試料中のシグナルの相対的な低減は、シアリドーシスを示す、方法。
（項目５６）
シアリドーシスを診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）シアリドーシスの疑いのある対象からの検査試料を項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）シグナルを検出するステップと、
（ｃ）前記シグナルを健康な対象からのシグナルと比較するステップと
を含み、前記検査試料中のシグナルの相対的な低減の存在は、シアリドーシスを示す、方法。
（項目５７）
前記検査試料が線維芽細胞を含有する、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
インフルエンザウイルスによる感染を診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）インフルエンザウイルス感染の疑いのある対象からの検査試料を項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、インフルエンザウイルスによる感染の可能性を示す、方法。
（項目５９）
インフルエンザウイルスによる感染を診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）インフルエンザウイルス感染の疑いのある対象からの検査試料を項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、インフルエンザウイルスによる感染の可能性を示す、方法。
（項目６０）
前記インフルエンザウイルスが細胞外にある、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記化合物が、ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩ）もしくはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）、またはその誘導体もしくはエステルである、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記検出可能なコンジュゲートが、ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩ）もしくはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）、またはその誘導体もしくはエステルを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記インフルエンザウイルスが細胞内にある、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６４）
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに耐性でない、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６５）
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに感受性である、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６６）
前記インフルエンザウイルスが、オセルタミビルに耐性である、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６７）
前記オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１である、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６８）
前記インフルエンザウイルスが、１０４または１０４より大きい力価で存在する、項目５８から６７のいずれかに記載の方法。
（項目６９）
シアリダーゼ含有ウイルスを伴った感染を診断するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７０）
哺乳動物、家禽、または魚由来の生物中のシアリダーゼを検出するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７１）
前記生物がヒト由来である、化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７２）
前記生物が病原体を含有する、前記化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７３）
生細胞内のシアリダーゼ活性を画像化するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７４）
前記画像化するステップが、細胞内シアリダーゼをプロファイリングすることをさらに含む、化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７５）
シアリドーシスを診断、予防、または処置するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲートの使用。
（項目７６）
シアリダーゼ含有ウイルスを伴った感染を診断するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物、または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲート。
（項目７７）
哺乳動物、家禽、または魚由来の生物中のシアリダーゼを検出するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物、または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲート。
（項目７８）
生細胞内のシアリダーゼ活性を画像化するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物、または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲート。
（項目７９）
シアリドーシスを診断、予防、または処置するための、項目１から２３のいずれか一項に記載の化合物、または項目３２に記載の検出可能なコンジュゲート。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】活性ベースシアリダーゼプローブを使用するシアリダーゼ活性変化の同定および画像化。（１Ａ）ＤＦＳＡ、ＰＤＦＳＡ、およびアジド−ビオチンの構造。（１Ｂ）これらの活性ベースシアリダーゼプローブを使用する活性変化を有するシアリダーゼの同定および画像化。
【００８０】
【図２】ＤＦＳＡ−５−イン付加体形成によるシアリダーゼの同定。ＤＦＳＡ付加体形成によるシアリダーゼの同定。（２Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えシアリダーゼをＤＦＳＡで短時間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クリック反応試薬アジド−ビオチンと反応させてビオチン部分を酵素コンジュゲートのアルキン基にライゲーションしたＰＶＤＦ膜に移した（左および中央のパネル）。洗浄した膜中に存在するビオチン修飾シアリダーゼをストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ報告システムによって検出した。これらのシアリダーゼ付加体を、クマシーブルー染色によっても示した（右パネル）。（２Ｂ）インフルエンザＮＡの検出は、活性部位への結合をＤＦＳＡと競合するように特異的阻害剤オセルタミビル酸（ＯＳ）を添加して、または添加しないで、ＤＦＳＡともにインフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３／Ｈ１Ｎ１）試料をインキュベートした後、行った（左パネル）。これらの総溶解産物をクマシーブルー染色によっても示した（右パネル）。（２Ｃ）２９３Ｔトランスフェクト細胞または非トランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）の溶解産物中に存在するヒトシアリダーゼ試料を、ＤＦＳＡを用いて、または用いずに処理した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。シアリダーゼを、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４中で提示されるｆｌａｇエピトープの免疫ブロット分析によっても検出した。（２Ｄ）ヒトシアリダーゼの標識を、シアリダーゼ発現２９３Ｔ細胞とともにＰＤＦＳＡをインキュベートすることによっても行い、同様に付加体検出のために処理した。シアリダーゼを、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４中で提示されるｆｌａｇエピトープの免疫ブロット分析によっても検出した。（２Ｅ）ＤＦＳＡ−ｎａｎＨ付加体形成は、使用したｎａｎＨに比例していることが示された。
【００８１】
【図３】細胞可溶化物中のヒトシアリダーゼのｐＨ依存標識。組換えシアリダーゼ発現細胞の溶解産物を異なる緩衝液（ｐＨ７．０または９．０）中で収集し、ＤＦＳＡ（１００μΜ）とともにインキュベートしてシアリダーゼを標識した。
【００８２】
【図４】ＤＦＳＡ標識を使用するインフルエンザ感染細胞の可視化。３０μΜ  ＤＦＳＡで処理され、ビオチンタグ付けされ、ＦＩＴＣタグ付きストレプトアビジンで染色されたインフルエンザ感染細胞の蛍光画像。インフルエンザノイラミニダーゼは、緑色で示され、抗核タンパク質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＰ）モノクローナル抗体染色後のインフルエンザＮＰは、赤色で示されている。細胞核は、ＤＡＰＩ染色によって青色で示されている。スケールバー：２０μｍ。Ｍｏｃｋ：非感染細胞。ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【００８３】
【図５】ＰＤＦＳＡによって標識されたシアリダーゼ発現２９３Ｔ細胞の画像化分析。生きたシアリダーゼ発現２９３Ｔ細胞を、０．２ｍＭのＰＤＦＳＡで１５時間処理した。共焦点顕微鏡法分析のために細胞を固定し、透過させ、ビオチンでタグ付けした。ＰＤＦＳＡ媒介シアリダーゼ標識は、緑色で示され、ｆｌａｇ標識は、赤色で示されている。スケールバー：１０ｍｍ。
【００８４】
【図６】シアリドーシス患者の線維芽細胞中のシアリダーゼ変化のプロファイリング。（６Ａ）正常（Ｄ５５１）またはシアリドーシス患者（ＧＭ０２９２１＆ＧＭ０２９２２）に由来する線維芽細胞を、ＰＤＦＳＡ（１０μΜ）でのｉｎ  ｓｉｔｕシアリダーゼ標識のために培養した。関連したシアリダーゼ標識シグナルは、星印でマークされている（左パネル）。これらの総溶解産物は、ＤＢ７１染色によっても示した（右パネル）。（６Ｂ）正常（Ｄ５５１）またはシアリドーシス患者（ＧＭ０２９２１＆ＧＭ０２９２２）に由来する線維芽細胞を抗Ｎｅｕ１抗体によって分析した。（６Ｃ）細胞シアリダーゼ活性を、基質としてＭＵＮＡＮＡを使用して測定し、ＰＤＦＳＡともに事前にインキュベートして、またはしないで培養された細胞の抽出物中のシアリダーゼ活性と比較した。値は、３つの独立した実験の平均±標準誤差である。
【００８５】
【図７】ＰＶＤＦ膜上のＤＦＳＡを用いたインフルエンザウイルスの検出。（Ａ）ＤＦＳＡ標識によるインフルエンザウイルスの検出限界。（Ｂ）競合ＯＳ（オセルタミビル（ｏｓｌｅｔａｍｉｖｉｒ））の存在下でのＤＦＳＡ染色によるオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｖｉｍｉｒ）感受性（ＷＳＮ２７４Ｈ）およびオセルタミビル耐性（ＷＳＮ２７４Ｙ）インフルエンザウイルスの区別。ＰＶＤＦ：フッ化ポリビニリデン。
【００８６】
【図８】ＰＤＦＳＡおよびＤＦＳＡを合成するための方法の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明は、シアリダーゼの不可逆的阻害剤に関する。提供される不可逆的阻害剤は、シアリダーゼと共有結合を形成し、３−フルオロシアリル−酵素中間体を捕捉する。フルオロシアリル−酵素付加体は、シアリダーゼを単離および同定するために、ＣｕＡＡＣによってアジド付属ビオチン（アジド−ビオチン）などの検出可能なタグ付け部分とライゲーションすることができる。
【００８８】
本発明は、細胞取込みを改善するための膜透過性前駆体としてのエステルで保護されたシアリダーゼ阻害剤をさらに提供する（Ａ．  Ｋ．  Ｓａｒｋａｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９５年、９２巻、３３２３頁。Ｃ．  Ｌ．  Ｊａｃｏｂｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０００年、３２７巻、２６０頁）。細胞透過性シアリダーゼ阻害剤は、生理的条件下でのシアリダーゼ活性の変化の同定およびｉｎ  ｓｉｔｕ画像化を初めて可能にした。
【００８９】
一態様では、本開示は、式（Ｉ）：
【化１６】
0006302909.tif 000035
の新規不可逆的シアリダーゼ阻害剤、またはその塩
（式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
Ｒ１は、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンであり、
Ｒ２Ｏの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、
Ｒ２Ｎの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基であり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの各事例は独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基であり、
Ｒ３ｒの各事例は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または−Ｌ−Ｚであり、
Ｙは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルまたは−Ｌ−Ｚであり、
Ｌの各事例は独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、
ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、
Ｚの各事例は、さらなるライゲーションのための官能基であり、
ただし、化合物は、式
【化１７】
0006302909.tif 000036
のものではない）
を提供する。
【００９０】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ１は、Ｈ、または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。
【００９１】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏ、Ｎ３、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２、またはグアニジンである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏであり、式中、Ｒ２Ｏは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏであり、式中、Ｒ２Ｏは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＣＨ３またはＯＣ２Ｈ５である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏであり、式中、Ｒ２Ｏは、任意選択で置換されたアシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏであり、式中、Ｒ２Ｏは、アセチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＯＲ２Ｏであり、式中、Ｒ２Ｏは、酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｎ（Ｒ２Ｎ）２であり、式中、Ｒ２Ｎの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＮＨ（Ｒ２Ｎ）であり、式中、Ｒ２Ｎは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ＮＨ２である。
【００９２】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ３ａは独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、メチルまたはエチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、フェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたアルキルアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたベンゾイルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ａは、ＣＨ３ＣＯ−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ−、Ｃ３Ｈ７ＣＯ−、ｔ−ＢｕＣＯ−、ＣＦ３ＣＯ−、ＰｈＣＨ２ＣＯ−、またはＣ６Ｈ５ＣＯ−である。
【００９３】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ３ｂは独立に、水素、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒ、または酸素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、任意選択で置換された複素環、任意選択で置換されたアルキルアリール、任意選択で置換されたアルキルヘテロアリール、または任意選択で置換されたアルキル複素環である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、メチルまたはエチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、フェニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたアルキルアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ３ｒであり、式中、Ｒ３ｒは、任意選択で置換されたベンゾイルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｂは、ＣＨ３ＣＯ−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ−、Ｃ３Ｈ７ＣＯ−、ｔ−ＢｕＣＯ−、ＣＦ３ＣＯ−、ＰｈＣＨ２ＣＯ−、またはＣ６Ｈ５ＣＯ−である。
【００９４】
本明細書で一般に定義されるように、リンカーＸは、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘは、−Ｏ−である。ある特定の実施形態では、Ｘは、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−である。ある特定の実施形態では、Ｘは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−である。ある特定の実施形態では、Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−である。ある特定の実施形態では、Ｘは、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−である。
【００９５】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または−Ｌ−Ｚである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、−Ｌ−Ｚであり、式中、Ｌは独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、さらなるライゲーションのための官能基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、式中、ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、さらなるライゲーションのための官能基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、式中、ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、式中、ＲＮの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、ＲＯの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、ＲＳの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である。
【００９６】
本明細書で一般に定義されるように、Ｙは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルまたは−Ｌ−Ｚである。ある特定の実施形態では、Ｙは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、置換Ｃ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、ＣＦ３である。ある特定の実施形態では、Ｙは、非置換Ｃ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、−Ｌ−Ｚであり、式中、Ｌは独立に、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ＝Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＳＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−からなる群から選択され、ｎの各事例は、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、さらなるライゲーションのための官能基である。ある特定の実施形態では、Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、式中、ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、さらなるライゲーションのための官能基である。ある特定の実施形態では、Ｙは、−（ＣＨ２）ｎ−Ｚであり、式中、ｎは、１〜８の整数であり、両端を含み、Ｚは、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、ＲＮの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、ＲＯの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、ＲＳの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である。
【００９７】
式（Ｉ）の化合物についての一実施形態では、Ｚは、任意選択で置換されたアルキン、任意選択で置換されたアルケン、ハロゲン、−Ｎ３、Ｎ（ＲＮ）２、ＯＲＯ、ＳＲＳ、またはＣＯ２ＲＯであり、式中、ＲＮの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または窒素保護基であり、ＲＯの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基であり、ＲＳの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または硫黄保護基である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ａ）：
【化１８】
0006302909.tif 000037
のもの、またはその塩
（式中、Ｒ３ｃは独立に、水素、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアシル、または酸素保護基である）である。
【００９９】
ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、メチルまたはエチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、任意選択で置換されたアシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、アセチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３ｃは、酸素保護基である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ）：
【化１９】
0006302909.tif 000038
のもの、またはその塩である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ１）：
【化２０】
0006302909.tif 000039
のもの、またはその塩である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ２）：
【化２１】
0006302909.tif 000040
のもの、またはその塩
（式中、Ｒｙ１は、水素、ハロゲンまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）である。
【０１０３】
本明細書で定義されるように、Ｒｙ１は、水素、ハロゲン、または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒｙ１は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒｙ１は、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｒｙ１は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒｙ１は、メチルまたはエチルである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｂ３）：
【化２２】
0006302909.tif 000041
のもの、またはその塩である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ）：
【化２３】
0006302909.tif 000042
のもの、またはその塩である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ１）：
【化２４】
0006302909.tif 000043
のもの、またはその塩である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ２）：
【化２５】
0006302909.tif 000044
のもの、またはその塩
（式中、Ｒｙ２は、水素、ハロゲンまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである）である。
【０１０８】
本明細書で定義されるように、Ｒｙ２は、水素、ハロゲン、または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒｙ２は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒｙ２は、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒｙ２は、メチルまたはエチルである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ−ｃ３）：
【化２６】
0006302909.tif 000045
のもの、またはその塩である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、提供される化合物は、Ｃ３アキシャル位でＦ原子を有する。いくつかの実施形態では、提供される化合物は、Ｃ３エクアトリアル位でＦ原子を有する。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される化合物を含むシアリダーゼタンパク質付加体を提供する。ある特定の実施形態では、シアリダーゼタンパク質は、化合物に共有結合的にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態では、タンパク質付加体は、式
【化２７】
0006302909.tif 000046
のものであり、式中、Ｙ、Ｘ、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４は、本明細書で定義した通りである。ある特定の実施形態では、化合物は、ＤＦＳＡ−５−インまたはＤＦＳＡ−７−インである。ある特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜６の任意のペプチド内の１つまたは複数のチロシン（Ｙ）残基と共有結合的に連結しており、ペプチドは、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、またはｎａｎＨのフラグメントである。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の化合物を含む検出可能なコンジュゲートであって、化合物は、検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なコンジュゲートを提供する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のシアリダーゼタンパク質付加体を含む検出可能なシアリダーゼコンジュゲートであって、シアリダーゼタンパク質付加体は、検出可能なタグ付け部分に共有結合的にコンジュゲートされている、検出可能なシアリダーゼコンジュゲートを提供する。
【０１１４】
検出可能なタグ付け部分は、それがコンジュゲートされている実体の検出を可能にする官能基である。提供される検出可能なコンジュゲートは、本明細書に記載の化合物またはシアリダーゼコンジュゲートに共有結合的にコンジュゲートされた検出可能なタグ付け部分を有する。提供される検出可能なコンジュゲートは、検出可能なタグ付け部分から生成されるシグナルを検出することによってこれらの現存および存在について確認することができる。シグナルの検出は、シグナルの画像化または記録などの化学的または物理的手段のいずれかによって行うことができる。ある特定の実施形態では、シグナルは、ストレプトアビジン特異的報告シグナルによって検出される。
【０１１５】
例示的な検出可能なタグ付け部分としては、必ずしもそれだけに限らないが、蛍光性分子（例えば、自家蛍光分子、試薬と接触すると蛍光を発する分子など）、放射性標識（例えば、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１２Ｂ、９０Ｙ、１８６Ｒｈなど）；ビオチン（例えば、ビオチンとアビジンの反応によって検出される）；蛍光タグ；画像化試薬（例えば、米国特許第４，７４１，９００号および米国特許第５，３２６，８５６号に記載されているもの）などがある。検出可能な標識には、抗体結合によって、例えば、検出可能に標識された抗体の結合によって、またはサンドイッチ型アッセイによる結合抗体の検出によって検出され得るペプチドまたはポリペプチドも含まれる。やはり使用に適しているのは、量子ドット（例えば、検出可能に標識された半導体ナノ結晶、例えば、蛍光標識量子ドット、抗体コンジュゲート量子ドットなど）である。例えば、Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻：７５９〜１７６２頁；Ｃｈａｎら、（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻：２０１６〜２０１８頁；米国特許第６，８５５，５５１号；Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻：２０１３〜２０１６頁を参照。
【０１１６】
適当な蛍光性分子（フルオロフォア）としては、それだけに限らないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオレセインのスクシンイミジルエステル、フルオレセインジクロロトリアジンの５−異性体、ケージドカルボキシフルオレセイン−アラニン−カルボキサミド、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４；ルシファーイエロー、アクリジンオレンジ、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ヨウ化プロピジウム、ＪＣ−１（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾイルカルボシアニンヨージド）、テトラブロモローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミン−、メチルエステル）、ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミン、エチルエステル）、テトラメチルロサミン、ローダミンＢ、ならびに４−ジメチルアミノテトラメチルロサミン、緑色蛍光タンパク質、青色シフト緑色蛍光タンパク質、シアンシフト緑色蛍光タンパク質、赤色シフト緑色蛍光タンパク質、黄色シフト緑色蛍光タンパク質、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフト−アルイミド（ａｌｉｍｉｄｅ）−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−５−インダセン−３−プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｃ  ａｃｉｄ）ＢＯＤＩＰＹ；カスケードブルー；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ（ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａａｍｉｎｅ）ペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２−，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ，  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ−フルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’ジ��トキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリ−フェロネオルト（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉ−ｆｅｒｏｎｅｏｒｔｈｏ）クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミン（ｈｏｄａｍｉｎｅ）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ロソール酸；ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ５６０；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラホーヤブルー；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニン、クマリンおよび関連色素、ロドールなどのキサンテン色素、レゾルフィン、ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールなどのアミノフタルヒドラジド、ならびにイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、ならびに蛍光性ユウロピウムおよびテルビウム複合体などがある。対象のフルオロフォアは、ＷＯ０１／４２５０５およびＷＯ０１／８６００１にさらに記載されている。
【０１１７】
適当な蛍光タンパク質および発色性タンパク質としては、それだけに限らないが、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から市販されている増強型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのＡｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａに由来するＧＦＰまたはその誘導体、例えば、「ヒト化」誘導体；例えば、ＷＯ９９／４９０１９、およびＰｅｅｌｌｅら（２００１年）、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．、２０巻：５０７〜５１９頁に記載されている、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ、またはＰｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ  ｇｕｅｒｎｙｉなどの別の種由来のＧＦＰ；「ヒト化」組換えＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含めたＧＦＰ；例えば、Ｍａｔｚら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻：９６９〜９７３頁に記載されているＡｎｔｈｏｚｏａｎ種由来の様々な蛍光タンパク質および着色タンパク質のいずれかなどがある。
【０１１８】
適当なエピトープタグとしては、それだけに限らないが、赤血球凝集素；ＦＬＡＧ；ＦＬＡＧ−Ｃ；ポリヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ６）などの金属イオン親和性タグなどがある。
【０１１９】
適当な画像化剤としては、ポジティブ造影剤およびネガティブ造影剤がある。適当なポジティブ造影剤としては、それだけに限らないが、ガドリニウムテトラアザシクロドデカン四酢酸（Ｇｄ−ＤＯＴＡ）；ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）；ガドリニウム−１、４，７−トリス（カルボニルメチル）−１０−（２’−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ）；マンガン（ＩＩ）−ジピリドキサールジホスフェート（Ｍｎ−ＤＰＤＰ）；Ｇｄ−ジエチレントリアミンペンタアセテート−ビス（メチルアミド）（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）などがある。適当なネガティブ造影剤としては、それだけに限らないが、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）画像化剤；およびペルフルオロカーボンがあり、適当なペルフルオロカーボンとしては、それだけに限らないが、フルオロヘプタン、フルオロシクロヘプタン、フルオロメチルシクロヘプタン、フルオロヘキサン、フルオロシクロヘキサン、フルオロペンタン、フルオロシクロペンタン、フルオロメチルシクロペンタン、フルオロジメチルシクロペンタン、フルオロメチルシクロブタン、フルオロジメチルシクロブタン、フルオロトリメチルシクロブタン、フルオロブタン、フルオロシクロブタン（ｆｌｕｏｒｏｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｓｅ）、フルオロプロパン、フルオロエーテル、フルオロポリエーテル、フルオロトリエチルアミン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロプロパン、六フッ化硫黄などがある。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、検出可能なタグ付け部分は、標識を含む。ある特定の実施形態では、標識は、フルオロフォアである。ある特定の実施形態では、標識は、式
【化２８】
0006302909.tif 000047
のものであり、式中、Ｌａは、任意選択で置換されたアルキレン；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、標識は、式
【化２９】
0006302909.tif 000048
のものであり、式中、
Ｌａは、本明細書で定義されており、
Ｒｔの各事例は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環である。
【０１２２】
本明細書で一般に定義されるように、Ｌａは、任意選択で置換されたアルキレン；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである。ある特定の実施形態では、Ｌａは、任意選択で置換されたアルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌａは、非置換アルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｌａは、−ＣＨ２−である。ある特定の実施形態では、Ｌａは、−（ＣＨ２）２−である。ある特定の実施形態では、Ｌａは、−（ＣＨ２）３−である。ある特定の実施形態では、Ｌａは、−（ＣＨ２）４−である。ある特定の実施形態では、Ｌａは、−（ＣＨ２）５−である。
【０１２３】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒｔは、水素、ハロゲン、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換された複素環である。ある特定の実施形態では、Ｒｔは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒｓは、ハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｒｔは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒｔは、メチルまたはエチルである。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、提供される検出可能なコンジュゲートは、式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸＩ−ｂ）：
【化３０】
0006302909.tif 000049
のもの、またはその塩であり、
式中、
Ｃ３位のＦ原子は、アキシャルまたはエクアトリアルであり、
ＲＫは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、またはシアリダーゼタンパク質であり、
Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、およびＸは、本明細書で定義した通りであり、
Ｒ４ａは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または任意選択で置換されたアシルであり、
Ｙａは、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルであり、
ＲｐおよびＲｑの各事例は独立に、水素、任意選択で置換された脂肪族；任意選択で置換されたヘテロ脂肪族；置換または非置換アリール；任意選択で置換されたヘテロアリール；任意選択で置換されたアシル；樹脂；タンパク質；レポーター；任意選択で置換されたアルキレンであるリンカーＬａによって任意選択で接合された標識；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである。
【０１２５】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒ４ａは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または任意選択で置換されたアシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４ａは、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｒ４ａは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４ａは、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４ａは、任意選択で置換されたアシルである。ある特定の実施形態では、Ｒ４ａは、任意選択で置換されたアセチルである。
【０１２６】
式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキル、または任意選択で置換されたアシルである。式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、Ｈである。式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、メチルまたはエチルである。式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、任意選択で置換されたアシルである。式（Ｘ−ａ）、（Ｘ−ｂ）、（ＸΙ−ａ）、または（ＸΙ−ｂ）のある特定の実施形態では、Ｘは、Ｏであり、Ｒ４ａは、アセチルである。
【０１２７】
本明細書で一般に定義されるように、Ｙａは、Ｈまたは任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙａは、Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｙａは、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙａは、メチル、エチル、またはｎ−プロピルである。
【０１２８】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒｐは独立に、水素、任意選択で置換された脂肪族；任意選択で置換されたヘテロ脂肪族；置換または非置換アリール；任意選択で置換されたヘテロアリール；任意選択で置換されたアシル；樹脂；タンパク質；レポーター；任意選択で置換されたアルキレンであるリンカーＬａによって任意選択で接合された標識；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである。ある特定の実施形態では、Ｒｐは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒｐは、レポーターである。ある特定の実施形態では、Ｒｐは、リンカーＬａによって接合されたレポーターであり、Ｌａは、本明細書で定義されている。ある特定の実施形態では、Ｒｐは、標識である。ある特定の実施形態では、Ｒｐは、リンカーＬａによって接合された標識であり、Ｌａは、本明細書で定義されている。
【０１２９】
本明細書で一般に定義されるように、Ｒｑは独立に、水素、任意選択で置換された脂肪族；任意選択で置換されたヘテロ脂肪族；置換または非置換アリール；任意選択で置換されたヘテロアリール；任意選択で置換されたアシル；樹脂；タンパク質；レポーター；任意選択で置換されたアルキレンであるリンカーＬａによって任意選択で接合された標識；任意選択で置換されたアルケニレン；任意選択で置換されたアルキニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキレン；任意選択で置換されたヘテロアルケニレン；任意選択で置換されたヘテロアルキニレン；任意選択で置換されたアリーレン；任意選択で置換されたヘテロアリーレン；または任意選択で置換されたアシレンである。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、レポーターである。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、リンカーＬａによって接合されたレポーターであり、Ｌａは、本明細書で定義されている。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、標識である。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、リンカーＬａによって接合された標識であり、Ｌａは、本明細書で定義されている。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、Ｒｐは、水素であり、Ｒｑは、リンカーＬａによって任意選択で接合されたレポーターまたは標識である。ある特定の実施形態では、Ｒｑは、水素であり、Ｒｐは、リンカーＬａによって任意選択で接合されたレポーターまたは標識である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、提供される検出可能なコンジュゲートは、式：
【化３１】
0006302909.tif 000050
の１つのものである。
【０１３２】
別の態様では、本発明は、シアリダーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）シアリダーゼを含む疑いのある試料を本明細書に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、試料中のシアリダーゼの存在を示す、方法を提供する。
【０１３３】
別の態様では、シアリダーゼの存在を検出するための方法であって、
（ａ）シアリダーゼを含む疑いのある試料を検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、試料中のシアリダーゼの存在を示す、方法を提供する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、細胞内にある。ある特定の実施形態では、検出可能なコンジュゲートは、ＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）もしくはＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）：
【化３２】
0006302909.tif 000051
、またはその誘導体、コンジュゲート、もしくはエステルを含む。ある特定の実施形態では、試料は、哺乳動物、家禽、または魚由来である。ある特定の実施形態では、試料は、ヒト由来である。ある特定の実施形態では、試料は、病原体を含有する疑いがある。ある特定の実施形態では、試料は、細菌、ウイルス、原生動物、または真菌を含有する。
【０１３５】
本明細書で一般に使用する場合、シアリダーゼは、ヒト、ウイルス、または細菌シアリダーゼである。ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼである。ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４からなる群から選択されるヒトシアリダーゼである。ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、およびｎａｎＨからなる群から選択される細菌シアリダーゼである。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本方法は、細胞中のシアリダーゼの細胞内位置を画像化するステップをさらに含む。
【０１３７】
本明細書で一般に使用する場合、レポーターは、標的分子、付加体、またはコンジュゲートと検出可能なタグ付け部分を形成することができる化学実体を指す。いくつかの実施形態では、標的分子は、任意の本明細書に記載の化合物、または任意のシアリダーゼ−化合物コンジュゲートであり得る。ある特定の実施形態では、レポーターは、クリック反応によって化合物またはシアリダーゼ−化合物コンジュゲートと反応して化合物またはシアリダーゼ−化合物コンジュゲートに検出可能なタグ付け部分を導入する。
【０１３８】
クリックケミストリーは、２００１年にＳｈａｒｐｌｅｓｓによって導入された化学的手法であり、小単位を一緒に接合することによって迅速かつ確実に物質を生成するように適応された化学を記述する。例えば、Ｋｏｌｂ、ＦｉｎｎおよびＳｈａｒｐｌｅｓｓ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１年）４０巻：２００４〜２０２１頁；Ｅｖａｎｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７年）６０巻：３８４〜３９５頁を参照。例示的なカップリング反応（これらのいくつかは、「クリックケミストリー」として分類され得る）としては、それだけに限らないが、活性化酸またはハロゲン化アシルからのエステル、チオエステル、アミド（例えば、ペプチドカップリングなど）の形成；求核置換反応（例えば、ハロゲン化物の求核置換またはひずんだ環の系（ｓｔｒａｉｎｅｄ  ｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）の開環など）；アジド−アルキンヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｏｎ）環付加；チオール−イン付加；イミン形成；およびマイケル付加（例えば、マレイミド付加）がある。ある特定の実施形態では、クリック反応は、銅の存在下で実施される（Ｋｏｌｂら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００１年、４０巻、２００４頁；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００２年、４１巻、２５９６頁；Ｗｕら、Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２００７年、４０巻、７頁）。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、レポーターは、アジド基を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、末端アルキンを含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、アジド−ビオチンである。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本方法は、
（ｄ）細胞をＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）、ＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）の化合物、またはその誘導体もしくはエステルと接触させるステップと、
（ｅ）細胞内エステラーゼにこの化合物をそれぞれＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）に変換させるステップと、
（ｆ）ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩＩ）またはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）を細胞中の細胞内位置で１つまたは複数のシアリダーゼに共有結合的にコンジュゲートさせるステップと、
（ｇ）レポーターを添加するステップと、
（ｈ）細胞内シアリダーゼ分布の画像を得るステップと
をさらに含む。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、シアリドーシスを診断するための方法であって、
（ａ）シアリドーシスの疑いのある対象からの検査試料を本明細書に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと、
（ｄ）このシグナルを健康な対象からのシグナルと比較するステップと
を含み、検査試料中のシグナルの相対的な低減は、シアリドーシスを示す、方法を提供する。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、シアリドーシスを診断するための方法であって、
（ａ）シアリドーシスの疑いのある対象からの検査試料を本明細書に記載の検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）シグナルを検出するステップと、
（ｄ）このシグナルを健康な対象からのシグナルと比較するステップと、
を含み、検査試料中のシグナルの相対的な低減は、シアリドーシスを示す、方法を提供する。
【０１４３】
診断法のいくつかの実施形態では、検査試料は、線維芽細胞を含有する。診断法のいくつかの実施形態では、検出可能なコンジュゲートは、ＰＤＦＳＡ−５−イン（ＩＶ）、ＰＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩＩ）、またはこれらの誘導体、コンジュゲート、もしくはエステルを含む。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスによる感染を診断するための方法であって、
（ａ）インフルエンザウイルス感染の疑いのある対象からの検査試料を請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、
（ｂ）レポーターを添加するステップと、
（ｃ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、インフルエンザウイルスによる感染の可能性を示す、方法を提供する。
【０１４５】
別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスによる感染を診断するための方法であって、
（ａ）インフルエンザウイルス感染の疑いのある対象からの検査試料を請求項３２に記載の検出可能なコンジュゲートと接触させるステップと、
（ｂ）シグナルを検出するステップと
を含み、シグナルの存在は、インフルエンザウイルスによる感染の可能性を示す、方法を提供する。
【０１４６】
診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、細胞外にある。診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、細胞内にある。診断法のある特定の実施形態では、検出可能なコンジュゲートは、ＤＦＳＡ−５−イン（ＩＩ）もしくはＤＦＳＡ−７−イン（ＶＩ）、またはその誘導体、コンジュゲート、もしくはエステルを含む。診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、オセルタミビル（ＯＳ）に耐性でない。診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、オセルタミビル（ＯＳ）に感受性である。診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、オセルタミビル（ＯＳ）に耐性である。ある特定の実施形態では、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９である。ある特定の実施形態では、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１である。診断法のある特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、１０４以上の力価で存在する。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、生細胞中のシアリダーゼを画像化するための方法であって、
シアリダーゼを含有する生細胞を本明細書に記載の任意の化合物とともに、化合物をシアリダーゼにコンジュゲートさせる条件下でインキュベートするステップと、
シアリダーゼ−化合物コンジュゲートをレポーターと、レポーターの化合物へのコンジュゲーションを可能にする条件下で接触させるステップと、
化合物にコンジュゲートされているレポーターから放出されるシグナルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０１４８】
提供される方法のいずれかのある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、検出可能なコンジュゲートの標識によって生成される。提供される方法のある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、化合物とコンジュゲートされたレポーターから放出される。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、化合物−シアリダーゼ付加体とコンジュゲートされたレポーターから放出される。ある特定の実施形態では、レポーターは、標識を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、アジド部分および標識を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、アルキン部分および標識を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、ビオチン部分およびアルキン部分を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、ビオチン部分およびアジド部分を含む。ある特定の実施形態では、レポーターは、式
【化３３】
0006302909.tif 000052
のものである。
【０１４９】
別の態様では、ＤＦＳＡ−５−インおよびＰＤＦＳＡ−５−インなどの提供される化合物の例示的な合成は、
（ａ）Ｎ−（ペンタ−４−イノイル）−マンノサミン（１）（Ｔ．  Ｌ．  Ｈｓｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２００７年、１０４巻、２６１４頁）を、３−フルオロピルビン酸（ナトリウム塩として）と、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎｅｕ５Ａｃアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．３）の触媒作用によって反応させて付加体２を得るステップと、
【化３４】
0006302909.tif 000053
（ｂ）ＩＲ−１２０樹脂（酸形態）の存在下でメタノール中で付加体２をエステル化して化合物３を得るステップと、
【化３５】
0006302909.tif 000054
（ｃ）化合物３をアセチル化し、その後クロマトグラフィー単離して過アセチル化エステル４を得るステップと、
【化３６】
0006302909.tif 000055
（ｄ）ヒドラジン酢酸塩を使用することによって化合物４のアノマー位で選択的に脱アセチル化して化合物５を得るステップと、
【化３７】
0006302909.tif 000056
（ｅ）化合物５をジエチルアミノサルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）で処理してＰＤＦＳＡ−５−イン（α−アノマー、６０％）およびそのβ−アノマー（３０％）を得るステップと、
（ｆ）アルカリ性条件下でＰＤＦＳＡ−５−インを脱保護し、その後、逆相カラムで精製してＤＦＳＡ−５−インを得るステップと
を含む。
【０１５０】
別の態様では、ＤＦＳＡ−７−インおよびＰＤＦＳＡ−７−インなどの提供される化合物の例示的な合成は、
（ｇ）Ｄ−マンノサミンを３−フルオロピルビン酸（ナトリウム塩として）と、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎｅｕ５Ａｃアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．３）の触媒作用によって反応させて付加体６を得るステップと、
【化３８】
0006302909.tif 000057
（ｈ）ＩＲ−１２０樹脂（酸形態）の存在下でメタノール中で付加体６をエステル化して化合物７を得るステップと、
【化３９】
0006302909.tif 000058
（ｉ）化合物７をアセチル化し、その後クロマトグラフィー単離して過アセチル化エステル８を得るステップと、
【化４０】
0006302909.tif 000059
（ｊ）ヒドラジン酢酸塩を使用することによって化合物８のアノマー位で選択的に脱アセチル化して化合物９を得るステップと、
【化４１】
0006302909.tif 000060
（ｋ）化合物９をジエチルアミノサルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）で処理して化合物１０を得るステップと、
【化４２】
0006302909.tif 000061
（ｌ）メタノール中で化合物１０をメタンスルホン酸で処理して化合物１１を得るステップと、
【化４３】
0006302909.tif 000062
（ｍ）化合物１１を炭酸水素ナトリウムの存在下で４−ニトロフェニルクロロホルメートで処理して化合物１２を得るステップと、
【化４４】
0006302909.tif 000063
（ｎ）化合物１２を２，２’−ジメトキシプロパンで酸触媒作用によって処理し、その後、ピリジン中で４−ニトロフェニルクロロホルメートで処理して化合物１３を得るステップと、
【化４５】
0006302909.tif 000064
（ｏ）化合物１３をピリジン中でプロパルギルアミンで処理して化合物１４を得るステップと、
【化４６】
0006302909.tif 000065
（ｐ）化合物１４をトリフルオロ酢酸で処理して化合物１５を得るステップと、
【化４７】
0006302909.tif 000066
（ｑ）化合物１５をピリジン中で無水酢酸で処理して化合物１６を得るステップと、
【化４８】
0006302909.tif 000067
（ｒ）化合物１６をジイソプロピルエチルアミン中で塩化アセチルで処理してＰＤＦＳＡ−７−インを得るステップと、
【化４９】
0006302909.tif 000068
（ｓ）ＰＤＦＳＡ−７−インをけん化してＤＦＳＡ−７−インを得るステップと
をさらに含む。
【０１５１】
活性ベースプローブとしてのＤＦＳＡ−５−インの実現可能性を検査するために、ＤＦＳＡ−５−インによる様々なシアリダーゼの阻害を、基質として２−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）を使用して評価した。本試験で使用されるシアリダーゼは、インフルエンザウイルス（ＮＡ）、細菌（ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、ｎａｎＣ、ｎａｎＪ、ｎａｎＩ、およびｎａｎＨ）、ならびにヒト（Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３、およびＮｅｕ４）シアリダーゼを含めて、様々な種に由来する。
【０１５２】
すべての試験したシアリダーゼは、マイクロモルからマイクロモル以下の半最大阻害濃度を伴ってＤＦＳＡ−５−インに対して感受性であり（表１）、ＤＦＳＡは、これらの酵素の強力な活性ベースプローブであり得ることを示した。ＤＦＳＡによる感受性阻害と対照的に、エステルで保護された類似体ＰＤＦＳＡ−５−インは、これらのシアリダーゼを阻害せず（データを示さず）、ＰＤＦＳＡ中のヒドロキシ基およびカルボキシ基をエステル化するとシアリダーゼ活性部位への結合が防止されることを示唆した。
【表１】
0006302909.tif 000069
【０１５３】
ＤＦＳＡ−５−インによるシアリダーゼ標識をバリデートするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるフルオロシアロシル−酵素付加体の形成を検査した。すべての細菌シアリダーゼは、ＤＦＳＡ付加体を形成し、これらは、アジド−ビオチンによって捕捉され、ストレプトアビジン特異的報告シグナルによって検出された（図２Ａ）。
【０１５４】
インフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３／Ｈ１Ｎ１）の表面に位置したインフルエンザノイラミニダーゼも、ノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビル酸（ＯＳ）によって競合で排除され得るＤＦＳＡ付加体を形成し、ＤＦＳＡは、活性部位のノイラミニダーゼと相互作用することを示唆した（図２Ｂ）。
【０１５５】
ＤＦＳＡ−５−インによるインフルエンザノイラミニダーゼの標識と同様に、特定のＤＦＳＡ標識が、トランスフェクト２９３Ｔ細胞の粗抽出物中の４つのヒトシアリダーゼによって同定された（図２Ｃ）。
【０１５６】
本開示により、ヒトシアリダーゼのＤＦＳＡ標識は、ｐＨ条件に感受性であったことが明らかになる。Ｎｅｕ１およびＮｅｕ３は、ｐＨ９で不十分に標識された。Ｎｅｕ３については、弱い標識がｐＨ７でさえ観察された（図３）。
【０１５７】
一例として細菌ｎａｎＨを使用すると、ＤＦＳＡ標識生成物は、シアリダーゼの量におおよそ比例した（図２Ｅ）。
【０１５８】
本開示は、相互作用するアミノ酸を同定するためのＤＦＳＡ標識シアリダーゼのトリプシンペプチドフラグメントに対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を提供する。６つすべての細菌シアリダーゼペプチドは、チロシン残基において３−フルオロシアリル部分によって標識されることが判明した（表２）。
【表２】
0006302909.tif 000070
【０１５９】
細胞内シアリダーゼのプロファイリングのために、プローブは、細胞透過性である必要がある。しかし、親水性化合物であるために、ＤＦＳＡ−５−インは、細胞に対して不十分に透過性である。細胞取込みを増強するために、エステルで保護されたプローブ、ＰＤＦＳＡ−５−インを使用して、２９３Ｔ細胞内で発現される細胞内シアリダーゼの標識を試験した。ＤＦＳＡ−５−インでの細胞抽出物のシアリダーゼ標識と比較して（図２Ｃ）、ＰＤＦＳＡ−５−インとともに生細胞をインキュベートした後、シアリダーゼ標識の同様の結果が観察された（図２Ｄ）。
【０１６０】
ＰＤＦＳＡ−５−インを使用するシアリダーゼ標識の成功により、ＰＤＦＳＡとともに生細胞をインキュベートし、固定および透過された細胞中のシアリダーゼ付加体の細胞位置を検査することによって、発現されたシアリダーゼ活性の細胞局在を判定することが促された（図５）。シアリダーゼ活性は、ＰＤＦＳＡ媒介シアリダーゼ標識を通じた緑色シグナルとして検出され、シアリダーゼタンパク質は、抗ｆｌａｇ抗体での染色によって赤色シグナルとして検出された。
【０１６１】
図５は、シアリダーゼシグナルは、Ｎｅｕ１／Ｎｅｕ４発現細胞についてはリソソーム内、Ｎｅｕ２発現細胞については細胞質ゾル内、およびＮｅｕ３発現細胞については原形質膜内に位置し、以前の報告と一致することを示す。（Ｔ．  ＭｉｙａｇｉおよびＫ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、２２巻、８８０頁。Ｔ．  Ｍｉｙａｇｉら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．、２００４年、２０巻、１８９頁）。
【０１６２】
発現細胞中のシアリダーゼ活性およびＮｅｕ１の分析は、約８５％での高い共局在を示した。同様の高い共局在がＮｅｕ２およびＮｅｕ３発現細胞内で見出され、観察されたシアリダーゼ活性プロファイリングは、酵素分布と相関していることを示唆した。
【０１６３】
Ｎｅｕ４発現細胞の活性および共局在は、わずか６８％でより低い。可能な説明は、Ｎｅｕ４が、Ｎ末端における１２アミノ酸の配列の存在および非存在で異なる長いおよび短いアイソフォーム内で発現されることである（Ｖ．  Ｓｅｙｒａｎｔｅｐｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００４年、２７９巻、３７０２頁。Ｋ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２００５年、３９０巻、８５頁。Ａ．  Ｂｉｇｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、２０巻、１４８頁）。長いＮｅｕ４は、ミトコンドリア内に主に位置し、Ｎ末端ｆｌａｇタグを有し、一方、短いＮｅｕ４は、膜を標的にし、ｆｌａｇタグを有さない。これらの２つの発現されるＮｅｕ４シアリダーゼ形態が細胞局在およびｆｌａｇ抗原発現において異なるという事実は、見かけ上の低い共局在の観察結果を説明することができる。
【０１６４】
したがって、４つのシアリダーゼにおけるシアリダーゼ活性のプロファイリングの結果は、ＰＤＦＳＡが生細胞の有用なプローブであることを示唆する。
【０１６５】
シアリドーシスは、通常、Ｎｅｕ１欠損に起因する遺伝性リソソーム蓄積症である。正常およびシアリドーシス（ｓｉａｌｙｄｏｓｉｓ）患者の線維芽細胞中のＮｅｕ１活性の差異は、ＰＤＦＳＡ−５−インを使用して生細胞標識によって検査された。シアリダーゼ標識は、より軽度のシアリドーシス（ＧＭ０２９２２）細胞より、より重度のシアリドーシス（ＧＭ０２９２１）線維芽細胞において著しく低減された（図６Ａ）。（Ａ．  Ｖ．  ＰｓｈｅｚｈｅｔｓｋｙおよびＭ．  Ｐｏｔｉｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１巻、２８３５９頁）。
【０１６６】
ＰＤＦＳＡ標識によって観察されるシアリダーゼ活性の差異の結果は、基質としてＭＵＮＡＮＡを使用する細胞抽出物の慣例的な活性測定と一致する（図６Ｃ）。ＰＤＦＳＡ−５−イン処理による付加体形成および細胞可溶化物を使用するＭＵＮＡＮＡ処理によって判定された同様のシアリダーゼ活性は、細胞内シアリダーゼが付加体形成によって有効に修飾されたことを示唆する。
【０１６７】
ＤＦＳＡは、ＤＦＳＡ標識にアクセス可能な細胞表面でノイラミニダーゼを発現するインフルエンザウイルス感染細胞を画像化するのにも順調に使用された（図４）。
【０１６８】
ＤＦＳＡを使用するインフルエンザ検出の感度を判定するために、様々な量のインフルエンザウイルスを伴うＤＦＳＡ−５−インをインキュベートし、次いで膜にウイルス試料を固定化し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用される同様の検出手順を行った。この手順により、１０４以上の力価で存在するインフルエンザウイルスの検出が可能になった（図７Ａ）。
【０１６９】
ＤＦＳＡ−５−インは、インフルエンザノイラミニダーゼの活性部位で結合することが示され、この結合は、ＯＳによって競合的に阻害され得る（図７Ｂ）。ＯＳは、ＤＦＳＡがオセルタミビル感受性（ＯＳｓ）ウイルスに標識するのを競合的に阻害することができ、その理由は、両化合物がノイラミニダーゼの活性部位に結合するためであることが予期された。しかし、２００８年以来、Ｈ１Ｎ１の主流となっている臨床分離株であるオセルタミビル耐性（ＯＳｒ）インフルエンザウイルスについては（Ｔ．  Ｇ．  Ｓｈｅｕら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００８年、５２巻、３２８４頁）、ＯＳは、突然変異体ノイラミニダーゼの活性部位に結合することができず、ＤＦＳＡがインフルエンザに結合するのを阻害しないはずである。実際に、ＯＳｓおよびＯＳｒＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスはともに、ＯＳの非存在下でＤＦＳＡによって標識されたが、ＯＳｒウイルスのみが、競合するＯＳの存在下でＤＦＳＡ標識によって検出可能であり、薬物耐性インフルエンザ系統を検出するためにＤＦＳＡプローブを使用する可能性を示唆した。
【０１７０】
本開示は、メカニズムベース阻害剤として３−フルオロシアリルフルオリドを使用することによる、かつレポーターをライゲーションするためにアルキン基を組み込むことによる活性ペースシアリダーゼプローブＤＦＳＡ−５−インを提供する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるＤＦＳＡ不活化シアリダーゼの生化学分析は、酵素活性部位中のチロシン残基がＤＦＳＡによって特異的に標識されることを示した。ＤＦＳＡ−５−インのウイルス、細菌、およびヒト酵素由来のすべてのシアリダーゼを標識する能力は、ＤＦＳＡ−５−インが様々な用途に対する一般的なシアリダーゼプローブとして使用され得ることを示唆する。
【０１７１】
ＤＦＳＡ−５−インは、そのサイズが小さいので、一般的なＡＢＰＰとして有利である。エステルで保護されたＰＤＦＳＡ−５−インを導入すると、細胞透過性が増強され、細胞内シアリダーゼのプロファイリングが可能になる。ＰＤＦＳＡ−５−インの生細胞を使用して細胞内シアリダーゼをプローブする能力は、特に不安定なシアリダーゼに関して、細胞可溶化物を使用する標識に対して追加の利点を有する。シアリダーゼは、様々な疾患に関与していることが公知であるので、これらのプローブは、シアリダーゼベース診断を開発するのに有用となり得る。
【実施例】
【０１７２】
本発明の範囲を限定することを意図することなく、本発明の実施形態による例示的な計測器、装置、方法、およびこれらの関連した結果を以下に示す。表題または副題が読者の便宜のために実施例において使用されている場合があり、これらは、本発明の範囲を決して限定しないはずであることに留意されたい。さらに、ある特定の理論が本明細書に提案および開示されているが、これらが正しくても、間違っていても、本発明が作用のいずれの特定の理論またはスキームを考慮することなく本発明によって実行される限り、これらは決して、本発明の範囲を限定しないはずである。
（実施例１）
方法および材料。
【０１７３】
別段の注記のない限り、すべての化合物および試薬は、ＡｃｒｏｓまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。すべての化学物質は、試薬グレードとして購入し、さらに精製することなく使用した。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼは、ＴｏＹｏＢｏ  ＳＴＣから購入した。反応は、ＥＭシリカゲル６０  Ｆ２５４プレートで分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて監視し、ＵＶ（２５４ｎｍ）および／または酸性モリブデン酸アンモニウムセリウムまたはニンヒドリンを用いた染色下で可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０  Ｇｅｄｕｒａｎ（３５〜７５μｍ、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で実施した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、２０℃でＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−４００（４００ＭＨｚ）分光計で記録した。化学シフトは、ＣＨＣｌ３（δ＝７．２４ｐｐｍ）によって割り当てた。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−４００（１００ＭＨｚ）分光計でアタッチドプロトンテスト（ＡＰＴ）を使用して得、較正用のＣＤＣｌ３（δ＝７７．０ｐｐｍの中心線）のシグナルを使用して報告した。質量スペクトルは、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥＳＩ−ＴＯＦ）およびＴｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ａｃａｄｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ）（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ  ＥＴＤ）の分析サービスによって得た。蛍光スペクトルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５分光計で得た。プロテアーゼ阻害剤は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＰＶＤＦ膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｎｉゲル（４〜１２％）、ＰＢＳ、および細胞培養培地、および試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によって測定した。ＧＭ０２９２１およびＧＭ０２９２２は、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得た。タンパク質ブロットに対する化学発光は、ＦＵＪＩ  ＬＡＳ３０００画像化システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用して可視化および定量化した。シアリダーゼ発現２９３Ｔ細胞の共焦点顕微鏡法は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤを使用して得た。
（実施例２）
メチル５−（ペンタ−４−インアミド）−２，４，７，８，９−ペンタ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロ−α−Ｌ−マンノ−ノナ−２−ウロピラノソネート（ｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｏｎａｔｅ）（４）。
【０１７４】
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、２５．０ｍＬ）中のＮ−４−ペンチノイルマンノサミン（４６０．０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）（Ｚ．  ＺｈｏｕおよびＣ．  Ｊ．  Ｆａｈｒｎｉ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、８８６２頁）、３−フルオロピルビン酸（ナトリウム塩として、４５８．２ｍｇ、３．５６ｍｍｏｌ）、ＮａＮ３（１％、５００μＬ）、およびＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（２００Ｕ）の混合物を室温で３日間インキュベートした。この混合物を濃縮した。残留物をＤｏｗｅｘ（登録商標）カラム（１×２，２００メッシュ）に施し、水およびギ酸（０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ）で順次溶出した。所望の生成物２を含有する画分をプールし、減圧下で濃縮した。ジアステレオマー比（アキシャル／エクアトリアル＝７：１）２は、ＮＭＲ分析によって判定した。
【０１７５】
粗生成物２にＭｅＯＨ（３０ｍＬ）およびイオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０−Ｈ（５００ｍｇ）を添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌し、セライトのパッドに通して濾過し、エステル３を得た。ＭｅＯＨを除去し、残留物をピリジン（２５ｍＬ）、ＤＭＡＰ（１０．０ｍｇ）、およびＡｃ２Ｏ（１０ｍＬ）で処理した。この混合物を室温で１２時間撹拌した。その後、ピリジンを真空下で最初に除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に吸収させ、５％クエン酸（×３）、１０％  ＮａＨＣＯ３（×３）、およびブラインで洗浄した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。単一ジアステレオマー４（３６６．６ｍｇ、３５％の全収率）を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出したシリカゲルカラムクロマトグラフィー後に白色泡状物として得た。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３：１）  Ｒｆ＝０．３１。1H-NMR  (CDCl3,  400MHz)  δ  5.66  (d,  J=9.0Hz,  1H),  5.55  (d,  J=2.4,  10.9,  27.7Hz,  1H),  5.34  (dd,  J=1.9,  5.3Hz,  1H),  5.11  (m,  1H),  4.92  (dd,  J=2.4,  49.1Hz,  1H),  4.51  (dd,  J=2.4,  12.5Hz,  1H),  4.25  (dd,  J=1.3,  10.6Hz,  1H),  4.17  (dd,  J=6.4,  12.5Hz,  1H),  4.13  (m,  1H),  2.53-2.39  (m,  2H),  2.37-2.26  (m,  2H),  2.16  (s,  3H),  2.13  (s,  3H),  2.07  (s,  3H),  2.01  (s,  3H),  1.99  (s,  3H),  1.97  (t,  J=2.5Hz,  1H).    13C-NMR  (CDCl3,  100MHz)  δ  171.2,  170.6,  170.5,  170.3,  170.2,  167.1,  165.1,  95.1  (d,  J=29.0Hz),  86.9  (d,  J=184.0Hz),  82.7,  71.6,  71.1,  69.6,  68.2,  68.1,  68.0,  62.1,  53.5,  45.7,  35.4,  0.8  (2×),  20.7,  20.5,  14.6.    19F-NMR:    (CDCl3,  282.4MHz)  δ  -209.1  (dd,  J=28.0,  52.0Hz)  ＨＲ−ＥＳＩ  ＭＳ  Ｃ２５Ｈ３３ＮＯ１４［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：５４８．１７７４；実測値：５４８．１７７０。
（実施例３）
メチル５−（ペンタ−４−インアミド）−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロ−α−Ｌ−マンノ−２−ノナ−２−ウロピラノソネート（５）。
【０１７６】
ＣＨ２Ｃｌ２  １０ｍＬ中の化合物４（１６５．０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ  ２．０ｍＬ中のヒドラジン酢酸塩（１１６．０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で８時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。生成物５（１１０．０ｍｇ、７２％）を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出したシリカゲルカラムクロマトグラフィー後に油状物として得た。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３：１）  Ｒｆ＝０．３１。1H-NMR  (400MHz,  CDCl3  +  CD3OD)  δ  5.46  (dd,  J=2.4,  4.4Hz,  1H),  5.39-5.26  (m,  2H),  4.97  (dd,  J=2.4,  50Hz,  1H),  4.76  (m,  1H),  4.46-4.34  (m,  2H),  4.20  (dd,  J=7.4,  12.4Hz,  1H),  3.85  (s,  3H),  2.54-2.40  (m,  2H),  2.36-2.30  (m,  2H),  2.17  (s,  3H),  2.11  (s,  3H),  2.09  (s,  3H),  2.07-2.05  (m,  4H).    13C-NMR  (100Hz,  CDCl3  +  CD3OD)  δ  173.7,  172.4,  171.9,  171.7,  171.6,  168.7,  95.5  (d,  J=20.0Hz),  88.5  (d,  J=146.0Hz),  83.5,  72.6,  71.2,  71.1,  71.0,  70.0,  69.3,  63.6,  53.4,  45.4,  36.1,  21.1  (2×),  21.0,  15.4.    19F-NMR  (CDCl3,  282.4MHz)  δ  -205.3  (dd,  J=28.0,  52.0Hz).  ＨＲ−ＥＳＩ  ＭＳ  Ｃ２３Ｈ３１ＦＮＯ１３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：５２２．１６１８；実測値：５２２．１２１１。
（実施例４）
メチル５−（ペンタ−４−インアミド）−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロ−β−Ｌ−マンノ−ノナ−２−ウロピラノシルオネート（ｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｎａｔｅ）フルオリド（ＰＤＦＳＡ−５−イン）。
【０１７７】
ＣＨ２Ｃｌ２  ５ｍＬ中の化合物５（７５．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、−３０℃でＤＡＳＴ  １９μＬ（０．１９ｍｍｏｌ）を添加し、５時間撹拌した。反応を、少量のシリカゲルおよびＭｅＯＨ  １．５ｍＬを添加することによってクエンチした。この混合物を減圧下で濃縮した。ＰＤＦＳＡ−５−イン（α−アノマー、４６．０ｍｇ、６０％）およびβ−アノマー（２３．０ｍｇ、３０％）を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（５：１）で溶出したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１７８】
ＰＤＦＳＡ−５−イン（α−アノマー）：ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３：１）  Ｒｆ＝０．３３。1H-NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  5.79  (d,  J=8.9Hz,  1H),  5.46  (dd,  J=10.7,  25.6Hz,  1H),  5.36-5.28  (m,  1H),  5.10  (ddd,  J=2.6,  2.7,  50.7,  1H),  4.34  (d,  J=10.9Hz,  1H),  4.29  (dd,  J=1.7,  12.4Hz,  1H),  4.16  (dd,  J=4.2,  12.4Hz,  1H),  4.08  (m,  1H),  3.87  (s,  3H),  2.52-2.37  (m,  2H),  2.36-2.23  (m,  2H),  2.12  (s,  3H),  2.08  (s,  3H),  2.06  (s,  3H),  1.99  (s,  3H),  1.97  (t,  J=2.5Hz,  1H).    13C-NMR  (100Hz,  CDCl3)  δ  171.3,  170.5  (2×),  170.4,  170.2,  164.3  (d,  J=20.0Hz),  104.5  (dd,  J=13.0,  179.0Hz),  85.4  (dd,  J=16.0,  154.0Hz),  82.7,  72.5,  69.6,  69.0,  68.3  (d,  J=5.0Hz),  67.0,  61.8,  53.7,  45.5  (d,  J=3.0Hz),  35.4,  20.7,  20.6  (2×),  20.5,  14.6.    19F-NMR:    (CDCl3,  282.4MHz)  δ  -123.3  (d,  J=12.0Hz),  -217.1  (ddd,  J=12.0,  24.0,  52.0Hz).  ＨＲ−ＥＳＩ  ＭＳ  Ｃ２３Ｈ３０Ｆ２ＮＯ１２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：５５０．１７３０；実測値：５５０．１７３６。
【０１７９】
ＰＤＦＳＡ−５−イン（β−アノマー）：ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３：１）  Ｒｆ＝０．３７。1H-NMR  (400MHz,  CDCl3)  δ  5.68  (d,  J=9.7Hz,  1H),  5.42  (dd,  J=2.1,  6.3Hz,  1H),  5.38  (m,  1H),  5.25  (m,  1H),  5.10  (dd,  J=2.3,  48.6Hz,  1H),  4.48  (dd,  J=2.6,  12.6Hz,  1H),  4.43  (dd,  J=10.5,  20.8Hz,  1H),  4.32  (d,  J=10.7Hz,  1H),  4.11  (dd,  J=10.5,  20.8Hz,  1H),  3.86  (s,  3H),  2.38-2.53  (m,  2H),  2.23-2.37  (m,  2H),  2.13  (s,  3H),  2.09  (s,  3H),  2.04  (s,  3H),  2.03  (s,  3H),  1.99  (t,  J=2.6Hz,  1H).    13C-NMR  (100Hz,  CDCl3)  δ  171.1,  170.6,  170.5,  170.2,  169.9,  162.6  (d,  J=21.0Hz),  105.0  (dd,  J=23.0,  183.0Hz),  84.6  (dd,  J=35.0,  147.0Hz),  82.84,  72.7  (d,  J=2.0  HZ),  72.3  (d,  J=2.0Hz),  69.6,  68.4  (d,  J=14.0Hz),  67.1,  62.1,  53.7,  44.5,  35.4,  20.7  (3×),  20.6,  14.6.    19F-NMR:    (CDCl3,  282.4MHz)  δ  -122.4  (d,  J=20.0Hz),  -207.2  (d,  J=16.0Hz).
（実施例５）
５−（ペンタ−４−インアミド）−２，３，５−トリデオキシ−３−フルオロ−Ｄ−エリスロ−β−Ｌ−マンノ−ノナ−２−ウロピラノシロニック（ｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｎｉｃ）フルオリド（ＤＦＳＡ−５−イン）。
【０１８０】
ＣＨ３ＯＨ  ５ｍＬ中のＰＤＦＳＡ−５−イン（４２．０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（３２．４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を室温で１時間にわたって添加した。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を添加し、この混合物を室温で２時間放置した。混合物をイオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０−Ｈによって中和し、セライトのパッドに通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、粗生成物をシリカゲル１００逆相Ｃ１８カラム（Ｈ２Ｏ〜１０％水性ＭｅＯＨ）でクロマトグラフィーにかけて生成物ＤＦＳＡ（２３．７ｍｇ、８５％）を白色泡状物として得た。1H-NMR  (400MHz,  D2O)  δ  5.24  (ddd,  J=2.5,  2.5,  51.3Hz,  1H),  4.12-4.37  (m,  2H),  3.82-3.93  (m,  3H),  3.61-3.72  (m,  2H),  2.51-2.60  (m,  4H),  2.42  (s,  1H).    13C-NMR  (150Hz,  D2O)  δ  175.6,  168.2  (d,  J=40.6Hz),  106.1  (dd,  J=15.5,  218.1Hz),  88.4  (dd,  J=18.0,  183.5Hz),  83.3,  72.7  (d,  J=3.3Hz),  70.3  (d,  J=5.6Hz),  68.6  (dd,  J=5.6,  17.8Hz),  67.8,  63.0,  48.8,  46.8  (d,  J=3.3Hz),  34.6  (d,  J=7.1Hz),  14.5.    19F-NMR  (CDCl3,  282.4MHz)  δ  -121.3  (d,  J=12.0Hz),  -218.0  (ddd,  J=12,  28,  52Hz).  ＨＲ−ＥＳＩ  ＭＳ  Ｃ１４Ｈ２０Ｆ２ＮＯ８［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３６８．１１５１；実測値：３６８．１１５２。
（実施例６）
細菌シアリダーゼのクローニング。
【０１８１】
シアリダーゼｎａｎＡ（ＳＰ１６９３）、ｎａｎＢ（ＳＰ１６８７）、およびｎａｎＣ（ＳＰ１３２６）のｃＤＮＡを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ＴＩＧＲ４ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３４）からＰＣＲによって増幅した。同様に、シアリダーゼｎａｎＨ（ＣＰＦ０９８５）、ｎａｎＩ（ＣＰＦ０７２１）、およびｎａｎＪ（ＣＰＦ０５３２）のｃＤＮＡを、特異的プライマーによってＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＮＣＴＣ８２３７ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  １３１２４Ｄ−５）から増幅した（表Ｓ３）。次いで得られたｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させるためにｐＥＴ４７ｂ＋の改変型（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローニングした。ＳｉｇｎａｌＩＰによってシグナルペプチドであると予測されたこれらのシアリダーゼのＮ末端の疎水性領域は、クローニング中のプライマーに含めなかった。すべてのこれらの細菌シアリダーゼを、Ｎ末端Ｈｉｓタグとともに発現させ、タンパク質精製および抗体同定を行った。
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉ内でのシアリダーゼの発現および組換えシアリダーゼの精製。
【０１８２】
すべてのシアリダーゼ遺伝子は、それぞれのプライマーによってゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって得た（表Ｓ３）。ＰＣＲ産物をｐＥＴ４７ｂベクターの改変型中にライゲーションし、ＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい配列を有するプラスミドを化学的形質転換法によってＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ／ＲＩＬコンピテント細胞に形質転換した。単一のコロニーを選択し、カナマイシンを含むＴＢ培地中で一晩培養した。新鮮なＴＢ培地中への細胞培養は、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導し、１６℃で２４時間増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を回収し、マイクロフルイダイザーによって５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、３００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液中で破壊し、遠心分離によって清澄化した。発現されたシアリダーゼをＮｉ−ＮＴＡアガロースによって精製した。タンパク質濃度をＱｕｂｉｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）によって判定し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
（実施例８）
ヒトシアリダーゼのクローニング。
【０１８３】
ヒトシアリダーゼ、Ｎｅｕ１、Ｎｅｕ２、およびＮｅｕ４のｃＤＮＡを、ＰＣＲによってＭＧＣクローン（クローンＩＤ：それぞれ４０００４６２０および４０１２５７６５）から増幅し、発現ベクターの改良型、Ｎ−末端ＦＬＡＧタグを有するｐＣＭＶ−タグ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中にサブクローニングし、一方、ＮおよびＣ末端内に両ＦＬＡＧタグを有するＮｅｕ１（クローンＩＤ：３５０６８２４）は、プライマーを追加することによって増幅した。Ｎｅｕ３  ｃＤＮＡは、その配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＣ１４４０５９．１）に従って合成し、他の３つのシアリダーゼと同様にクローニングした。すべてのクローンをＤＮＡ配列決定によって確認し、シアリダーゼ発現を、ＦＬＡＧ特異的抗体によって確認する。
（実施例９）
ＤＦＳＡおよびＰＤＦＳＡのＩＣ５０の判定
【０１８４】
シアリダーゼ阻害を、阻害剤およびノイラミニダーゼを室温で１０分間混合し、その後２００μΜの基質ＭＵＮＡＮＡを添加することによって判定した。阻害剤のＩＣ５０値を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を使用してＮＡ活性のパーセント阻害対阻害剤濃度をプロットすることによって用量−応答曲線から判定した。
（実施例１０）
膜クリック反応。
【０１８５】
ＰＶＤＦ膜を、それぞれブロッキング緩衝液  ５％  ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）およびストレプトアビジンブロッキング緩衝液  ０．０２％ストレプトアビジン／３％  ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で１時間ブロックした。膜をＰＢＳで５分間、２回洗浄した。ＰＶＤＦ膜のタンパク質側を裏向きにしてクリック反応混合物（０．１ｍＭアジド−ビオチン、０．１ｍＭトリス−トリアゾールリガンド、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム；ミニゲルサイズのブロットのために１ｍＬを用いて）中に浸漬し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで２回洗浄した後、ブロット上でビオチン標識に対してペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンを用いて膜をプローブした。シグナルをＥＣＬシステムによって検出した。
（実施例１１）
細菌シアリダーゼ、インフルエンザノイラミニダーゼ、および組換えヒトシアリダーゼの標識。
【０１８６】
精製細菌シアリダーゼ（１μｇ）をＤＦＳＡ（０．１ｍＭ）とともに室温で１時間インキュベートし、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。５×１０５個のインフルエンザウイルスをＤＦＳＡ（０．１ｍＭ）とともに室温で１時間インキュベートし、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。シアリダーゼトランスフェクタント２９３Ｔ細胞を、様々な溶解緩衝液：ｐＨ４．５（１％  ＮＰ−４０、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ４．５、１×Ｒｏｃｈｅ製ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）、ｐＨ７．４の緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、１×Ｒｏｃｈｅ製ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）、およびｐＨ９．０の緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ９．０、１×Ｒｏｃｈｅ製ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）によって溶解させた。溶解産物を収集し、ＤＦＳＡ（０．１ｍＭ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後、試料を清澄化し、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって判定した。各試料について、総溶解産物２０μｇを４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。電気泳動した後、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットした。クリック反応をＰＶＤＦ膜上で実施し、標識シグナルを化学発光検出器によって処理および分析した。
（実施例１２）
ＰＤＦＳＡを用いたシアリダーゼ発現細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ標識。
【０１８７】
シアリダーゼトランスフェクタント２９３Ｔ細胞、正常（Ｄ５５１）およびシアリドーシス線維芽細胞／（ＧＭ０２９２１およびＧＭ０２９２２）をＰＤＦＳＡ（０．２ｍＭ）とともに３７℃で１５時間インキュベートした。細胞を、溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、１×Ｒｏｃｈｅ製ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）によって溶解させ、次いで氷上で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、試料を１８，０００×ｇで１５分間回転させた。上清を収集し、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって判定した。各試料について、総溶解産物５０μｇを装填し、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した後、膜クリック反応を実施し、標識シグナルを化学発光検出器によって分析した。
【０１８８】
共焦点顕微鏡法分析のために、シアリダーゼトランスフェクタント２９３Ｔ細胞を４ウェルチャンバースライド上に播種し（１ウェル当たり３×１０５／ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン含有１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養した。増殖培地にＰＤＳＦＡ（０．２ｍＭ）を補充し、１５時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で室温で１０分間透過処理し、ＰＢＳ中で０．１ｍＭアジド−ビオチンプローブ／０．１ｍＭトリス−トリアゾールリガンド／１ｍＭ  ＣｕＳＯ４／２ｍＭアスコルビン酸ナトリウムからなるプローブ標識反応に室温で１時間付した。引き続いて、固定および標識された細胞をＰＢＳですすぎ、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８−コンジュゲートストレプトアビジン（０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍＬ）を用いて室温で３０分間染色した。組換えシアリダーゼを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４コンジュゲート抗ＦＬＡＧ抗体（０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）によって検出した。蛍光像は、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５−ＭＰ−ＳＭＤによって取り込んだ。
（実施例１３）
シアリダーゼ活性アッセイ。
【０１８９】
線維芽細胞（Ｄ５５１、ＧＭ０２９２１、およびＧＭ０２９２２由来）にＰＤＦＳＡ（０．２ｍＭ）を３７℃で１５時間供給した。線維芽細胞を、溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ４．５、１×Ｒｏｃｈｅ製ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）によって溶解させ、次いで氷上で１５分間インキュベートした。インキュベートした後、試料を１８，０００×ｇで１５分間回転させた。上清を収集した。０．１ｍＬの全体積中の総溶解産物１００μｇをＭＵＮＡＮＡ（０．１ｍＭ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。反応を０．８５Ｍグリシン−炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．３）０．１ｍＬで終わらせ、４℃で保持した後、蛍光を読み取った。蛍光は、３６５ｎｍの励起および４５０ｎｍの発光を用いて蛍光光度計で判定した。
（実施例１４）
ＤＦＳＡを使用するインフルエンザ感染細胞の可視化。
【０１９０】
ヒト腎細胞株、ＭＤＣＫを、ガラスカバースリップを含有する６ウェルプレート上に播種し（１ウェル当たり３×１０５／２ｍｌ）、２％  ＦＣＳ／ＤＭＥＭ、および１％  Ｐ／Ｓ抗生物質−抗真菌剤中で培養した。細胞に０．０３の感染の多重度（ＭＯＩ）のインフルエンザウイルスに３５℃で２０時間感染させ、３０μΜのＤＦＳＡを用いて３５℃で１時間処理した。カバースリップ上の細胞をメタノールで３分間固定し、次いでＰＢＳ中０．０５％  ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１分間透過処理した。細胞を室温で３０分間、プローブ標識反応（ＰＢＳ中の０．１ｍＭアジド−ビオチンプローブ、０．１ｍＭトリス−トリアゾールリガンド、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）に付した。引き続いて、固定および標識された細胞をＰＢＳですすぎ、抗ＮＰモノクローナル抗体（ＰＢＳ中５００倍希釈）、ストレプトアビジン−ＤｙＬｉｇｈｔ４８８（５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ）、および０．６μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０２０）を用いて室温で３０分間染色した。ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）を、核を染色するのに使用した。蛍光像をＬｅｉｃａ正立顕微鏡ＤＭ６０００Ｂによって取り込んだ。
（実施例１５）
膜上のインフルエンザウイルスのＯＳ感受性の迅速検出。
【０１９１】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦにマウントしたフッ化ポリビニリデン（polyvinylidene  fluoride、ＰＶＤＦ）膜をメタノールで湿らせた。３０μΜ  ＤＦＳＡまたは３０μΜ  ＤＦＳＡとＯＳで１時間、先に処理したインフルエンザウイルス試料を吸引によって隣接するスロットに導入した。３％  ＢＳＡを含むＰＢＳを使用して、次いで内因性ビオチンノイズを低下させるためにストレプトアビジン５μｇ／ｍＬを含むＰＢＳを使用して膜をブロットした。クリック反応の後、製造者の指示に従ってＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）製西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンとともにインキュベートした。０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを使用して追加の洗浄をした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質ＥＣＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を添加し、化学発光を展開させた。
（実施例１６）
ＤＦＳＡ標識シアリダーゼのトリプシンペプチドの質量分析。
【０１９２】
ＤＦＳＡ標識シアリダーゼ（５μｇ）を、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムおよび８ｍＭジチオトレイトール中に溶解させ、６５℃で１時間インキュベートした。このタンパク質溶液に、４０ｍＭヨードアセトアミド４μＬを添加し、暗所で、室温で１時間インキュベートした。タンパク質溶液に、４０ｍＭジチオトレイトール１μＬを室温で１時間にわたって添加した。シアリダーゼ試料を中性ｐＨで１７時間トリプシンで処理し、加熱してトリプシンを不活化し、乾燥させ、ＭＳ分析を行った。
【０１９３】
均等物および範囲
請求項において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などは、それとは反対に示されていない限り、または文脈から別段に明白でない限り、１つまたは１つを超えるを意味し得る。群の１つまたは複数の項の間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示されていない限り、または文脈から別段に明白でない限り、群の項の１つ、１つより多くのもの、またはすべてが、所与の生成物またはプロセス内に存在し、これらの中で使用され、またはこれらと別段に関連している場合、満たされていると見なされる。本発明は、群の正確に１つの項が所与の生成物またはプロセス内に存在し、これらの中で使用され、またはこれらと別段に関連している実施形態を含む。本発明は、群の項の１つ超またはすべてが所与の生成物またはプロセス内に存在し、これらの中で使用され、またはこれらと別段に関連している実施形態を含む。
【０１９４】
さらに、本発明は、列挙された請求項の１つまたは複数に由来する１つまたは複数の限定事項、要素、条項、および記述用語が別の請求項に導入されているすべての変形形態、組合せ、および順序を包含する。例えば、別の請求項に従属している任意の請求項を、同じ基本請求項に従属している任意の他の請求項に見出される１つまたは複数の限定事項を含むように改変することができる。要素がリストとして、例えば、マーカッシュ群形式で提示されている場合、要素の各亜群も開示されており、任意の要素（単数または複数）をその群から除くことができる。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素および／または特徴を含むように言及されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素および／または特徴からなり、または本質的になることが理解されるべきである。単純にする目的のために、このような実施形態は、本明細書にその通りの言葉で具体的に示されていない。用語「含む」および「含有する」は、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップを含むことを可能にすることも留意される。範囲が与えられている場合、終点は含まれる。さらに、別段の指定のない限り、または文脈および当業者の理解から別段に明白でない限り、範囲として表現されている値は、文脈により別段に明らかに要求されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において述べられた範囲内の任意の特定の値またはサブ範囲を想定することができる。
【０１９５】
本願は、様々な発行済み特許、公開済み特許出願、ジャーナル論文、および他の刊行物を参照し、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、明細書が支配するものとする。さらに、先行技術の中に入る本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１つまたは複数から明示的に除外され得る。そのような実施形態は、当業者に公知であると見なされるので、これらは、除外が本明細書で明示的に示されていなくても除外され得る。本発明の任意の特定の実施形態は、先行技術の存在に関連しているか否かにかかわらず、任意の理由で任意の請求項から除外することができる。
【０１９６】
当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または単なる規定の実験を使用して確認することができる。本明細書に記載の本実施形態の範囲は、上記記載に限定されるように意図されておらず、むしろ、添付の特許請求の範囲に示されている通りである。当業者は、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、本記載に対する様々な変更および改変を行うことができることを理解する。
（参考文献）
【数１】
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【数２】
0006302909.tif 000072
【数３】
0006302909.tif 000073
【数４】
0006302909.tif 000074
【０１９７】
本明細書で引用したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているように参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９８】
前述の発明を、理解を明確にする目的で例示および実施例によって幾分詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変を前述の発明に対して行われ得ることが、本発明の教示を踏まえると当業者に容易に明らかとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８】
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【配列表】
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