(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に標的配列（T）を含む核酸の存在を検出するin vitro方法であって、該方法が、
a）Tの両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b）前記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c）対照配列1（S1）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d）前記工程c）のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e）対照配列2（S2）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f）前記工程e）のプラスミドを前記バイアルV1及びV2に移す工程と、
g）前記バイアルV1及びV2において核酸を抽出する工程と、
h）プライマーFOR及びプライマーREVを使用して前記バイアルV1及びV2においてPCR反応を行う工程と、
i）前記バイアルV1及びV2において増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在を生じる場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在を生じる場合、バイアルV1におけるTの存在が前記サンプルにおけるTを含む前記核酸の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記サンプルが臨床サンプルである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記臨床サンプルが、ヒト対象に由来する組織サンプル又は体液サンプルである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
Tを含む前記核酸が微生物又はウイルスに由来する核酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、細菌、古細菌、原生生物及び真菌からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
Tを含む前記核酸が癌遺伝子若しくはヒト癌遺伝子である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の標的配列（T）を含む核酸の検出に対するキットであって、前記キットが、
（a）FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
（b）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1（S1）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
（c）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2（S2）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とS2とが同一ではない、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽性及び陰性の対照（control）、並びに抽出対照としてそれぞれ役割を果たすことができる、シークエンシングアッセイに対するユニバーサルコントロール（universal controls）に関する。本出願は、本発明の対照を使用する、対応するプラスミド、キット、それらの使用、及び特定の核酸を検出する方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
核酸シークエンシングの使用は、現代医学の多くの診断領域において不可欠なツールとなりつつある。かかる領域の一例は腫瘍学であり、例えば催腫瘍性突然変異が遺伝子内に存在するか、又は発癌性の及び／又は指標となる転座がゲノム内に存在するかを同定するために核酸シークエンシングが用いられる。さらに、核酸シークエンシングは、病原性微生物（例えば細菌又はウイルス等）がヒト患者に由来する臨床サンプル、例えば組織サンプル又は血液サンプル等の中に存在するかを検出するために用いられる。後者の方法では、ヒト対象に見られず、微生物にのみ見られる核酸配列を検出する。
【０００３】
通例、実際のシークエンシング工程の前に、シークエンシングすべき核酸を増幅するために増幅反応が行われる。かかる増幅反応は通常PCR反応によって行われる。このため、増幅すべき配列の上流及び下流の配列にハイブリダイズする特定のプライマーをPCR反応に使用する（すなわち、増幅すべき配列にプライマーが隣接する）。
【０００４】
過去数十年に亘る進歩により、診断法の多くの工程が自動化されている。かかる工程の例は、臨床サンプルからの核酸の抽出である。したがって、現在は多かれ少なかれ患者から「採取されたまま」の状態の臨床サンプルを提供し、特に、完全に自動化された方式で抽出工程を行うことができる。
【０００５】
上記のことから、典型的な診断アッセイは、ヒト被験体に由来する臨床サンプル、例えば気道に由来するサンプルに特定の病原体が存在するかどうかという疑問に答えることを対象とする場合がある。この目的のため、臨床サンプルをヒト被験体（例えば、痰等）から採取し、この工程を可能な限り無菌の条件下で行う。その後、通例、例えば36バイアルサンプルリング等のマルチバイアルシステムの一部である反応バイアルに上記サンプルを移す。もちろん、他の患者に由来する更なる臨床サンプルを並行して分析してもよい。その後、特にこれらのサンプルに由来する核酸を自動化方式で抽出する。次の自動化工程では、上記バイアルにおいて、特異的なプライマーを使用するPCR反応を行い、病原体にのみ見られ、検出される特定の病原体に特徴的な標的配列の増幅をもたらす。次の工程では、その後標的配列を同定するため、増幅された核酸のシークエンシングを行う。
【０００６】
上記アッセイは、結果として、標的配列を同定して臨床サンプル中の病原体の存在を示し得るか、又は標的配列を検出せず臨床サンプル中の病原体の不在を示し得るかのいずれかをもたらすことができる。
【０００７】
しかしながら、上に記載されるアッセイにおいて、該アッセイの幾つかの工程が適切に行われないことを除外することができない。
【０００８】
適切に行われなかったアッセイの典型的な例は、抽出工程が適切に行われなかったことにより標的配列が検出されないことである。したがって、実際にはサンプルに病原体が存在している可能性があっても結果は陰性である（「偽陰性」結果）。不適切な抽出工程を除外するため、通例抽出対照を行い、抽出対照は通常、検出される配列とは異なる配列を有する核酸に対応する。この核酸は、通例自動化抽出工程の開始前に（通常、抽出の間使用される溶解バッファーに該核酸を添加することにより）サンプルに添加される（「スパイクされる（spiked）」）。この核酸の配列が検出される配列と異なることから、抽出対照の配列を増幅するために増幅反応の間第2のプライマー対を使用する。アッセイ完了後の抽出対照の配列の存在は、その抽出工程が実際に適切に行われたことを示す。
【０００９】
したがって、標的の増幅に使用されるプライマーとの交差反応性のリスクを伴う抽出対照には追加のプライマー対が必要であり、費用が増加する。
【００１０】
標的配列を増幅するPCR反応が適用される条件下で作動することを更に保証しなくてはならない。この目的のため、陽性対照を適用する。陽性対照は通常、サンプル増幅反応に対して使用されるプライマーがハイブリダイズする配列と同一の、この配列に隣接する領域を含む、増幅されるウイルス配列を正確に保有するプラスミドからなる。上記サンプルに対して使用される試薬及び条件を使用してこの陽性対照において上記配列を検出することができる場合、その増幅反応は実際に適切に動作した。しかしながら、陽性対照又は病原体を含む全てのサンプルに汚染がなかったことを保証するため、陰性対照を行う必要がある。
【００１１】
陰性対照反応は、通例別々のバイアルで行われ、この特定のバイアルに対してサンプルに代えてバッファーのみが添加される。陰性対照における標的配列の存在は、サンプルが汚染されたことを示す。
【００１２】
したがって、材料及び空間を必要とする追加の対照反応を、陰性対照として行う必要がある。
【００１３】
上を要約すると、現在検出アッセイにおいて使用される対照は、追加の空間及び材料を必要とし、交差反応の可能性を高める。したがって、診断用シークエンシングアッセイに使用される実験対照を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明は、サンプル中の標的配列を含む核酸の存在を検出する新たな方法、サンプル中の標的配列を含む核酸の検出に対するプラスミド、該プラスミドの使用、及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第1の態様では、本発明は、サンプル中に標的配列（T）を含む核酸の存在を検出するin vitro方法であって、該方法が、
a）Tの両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b）前記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c）対照配列1（S1）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d）前記工程c）のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e）対照配列2（S2）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f）前記工程e）のプラスミドを前記バイアルに移す工程と、
g）前記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h）プライマーFOR及びプライマーREVを使用して前記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i）前記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在を生じる場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在を生じる場合、バイアルV1におけるTの存在が前記サンプルにおけるTを含む前記核酸の存在を示す、方法に関する。
【００１６】
上のシークエンシングの結果は、排他的な方式、すなわち、更なる配列が同定されないことを意味し、したがって、上の経過を、バイアルV2におけるシークエンシングが結果として2つの配列、すなわちS1及びS2のみの存在をもたらす場合、並びにバイアルV1におけるシークエンシングが結果として2つの配列、すなわちT及びS2のみの存在をもたらす場合、バイアルV1におけるTの存在が上記サンプル中のTを含む上記核酸の存在を示すと定式化してもよいことを理解する必要がある。核酸中に幾つかの標的配列が検出されれば、バイアルV1におけるシークエンシングは結果としてこれらの幾つかの標的配列及びS2の存在をもたらすはずである。
【００１７】
好ましい実施の形態では、上記サンプルは臨床サンプルであり、上記臨床サンプルはヒト対象に由来することが好ましい。上記臨床サンプルは組織サンプル又は体液サンプルであることが好ましい場合がある。上記サンプルは、例えば気道、消化管から得られた、又は移植後に移植物から得られた組織サンプルであってもよい。さらに、上記サンプルは、特に血液、血漿、血清、リンパ液及び唾液からなる群から選択される体液サンプルであってもよい。
【００１８】
別の好ましい実施の形態では、Tを含む上記核酸は微生物に由来する核酸である。上記微生物は、細菌、古細菌、原生生物、真菌、及びウイルスからなる群から選択されることが好ましい。特に好ましい実施の形態では、上記微生物は、A群レンサ球菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis：ヒト型結核菌）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacteriumbovis：ウシ型結核菌）、マイコバクテリウム・カネッティ（Mycobacterium canetti）及びマイコバクテリウム・ミクロティ（Mycobacterium microti）を含む結核菌群の成員、サルモネラ・エンテリカ属の一種（Salmonella enterica spp.）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridiumdifficile）、バンコマイシン耐性腸球菌及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus：黄色ブドウ球菌）からなる群から選択される細菌である。別の特に好ましい実施の形態では、上記細菌は、アデノウイルス、鳥インフルエンザA（H7N9）ウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ノロウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、特にHIV-1、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、デング熱ウイルス及びチクングニヤウイルスからなる群から選択されるウイルスである。最も好ましい実施の形態では、上記微生物はHIV（特にHIV-1）、HBV及びHCVからなる群から選択されるウイルスである。
【００１９】
特定の種の中で、異なる遺伝子型の微生物、例えば、ノロウイルスのGI及びGII遺伝子型、HIVのサブタイプA〜K、A〜H遺伝子型のHBV、及び1〜4遺伝子型のHCV等を選択し、検出してもよい。
【００２０】
特に好ましい実施の形態では、標的配列（T）を含む上記核酸は二本鎖DNAである。
【００２１】
したがって、特に好ましい実施の形態では、本発明の方法は、サンプル中の微生物、特に上に提示される微生物の存在を検出するため使用され得る。
【００２２】
更に別の好ましい実施の形態では、Tを含む上記核酸は癌遺伝子、好ましくはヒト癌遺伝子である。上記ヒト癌遺伝子は、BCR-ABL major、BCR-ABL minor、BCR-AML1 ETO、PML-RARA、BRAF V600変異体、KRAS変異体及びNRAS変異体からなる群から選択されることが好ましい。
【００２３】
したがって、特に好ましい実施では、本発明の方法は、サンプル中の癌遺伝子、特に上に提示される癌遺伝子の存在を検出するため使用され得る。
【００２４】
更に別の好ましい実施の形態では、S1及びS2はTに対して相同性を有さず、Tの増幅に対する試薬及び条件を使用して増幅されるように選択される（これは、例えばS1及びS2のG/C含有量に適用される）。S1及びS2は、例えば植物、特にタバコモザイクウイルス（TMV）のゲノムに由来してもよい。しかしながら、S1及びS2は天然起源ではない人工配列であってもよい。
【００２５】
T、S1及びS2は約2000塩基以下の長さを有することが特に好ましい場合がある。約1000塩基以下、好ましくは約600塩基又は約400塩基の長さであることが特に好ましい。
【００２６】
第1の態様に関連する別の実施の形態では、工程c）及び工程e）の上記プラスミドは原核生物又は真核生物のプラスミドである。原核生物のプラスミド、特に一般的に使用される大腸菌（E. coli）プラスミドを使用することが特に好ましい場合がある。
【００２７】
別の好ましい実施の形態では、工程e）の上記プラスミドを、全てのバイアルにおいて核酸の抽出の間使用される溶解バッファーに上記プラスミドを添加し、その後、上記プラスミドを含む上記溶解バッファーを抽出工程に添加することによって上記バイアルに移す。
【００２８】
更に別の好ましい実施の形態では、工程h）で行われる上記PCR反応はRT-PCR反応である。これは、もちろん標的配列（T）を含む核酸が一本鎖又は二本鎖のRNAである場合に特に適用される。
【００２９】
別の好ましい実施の形態では、上記抽出工程g）、工程h）の上記PCR反応、及び工程i）の上記シークエンシングは、任意に、完全に自動化された方式で行われる。以下のデバイス、すなわち工程g）に対してSentosa SX101デバイス（Vela Diagnostics）又はepMotion System（Eppendorf）、工程h）においてRotor-Gene Q（Qiagen）デバイス、及び工程i）においてIon Torrent Semiconductor Sequencingデバイス（life technologies）を使用することが特に好ましい場合がある。
【００３０】
更に別の好ましい実施の形態では、工程i）の上記シークエンシングは、単分子リアルタイムシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、パイロシークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、及びチェーンターミネーションシークエンシングによって行われる。イオン半導体シークエンシングが特に好ましい。
【００３１】
本発明の第1の態様の更に別の好ましい実施の形態では、標的配列（T）を含む核酸の存在を少なくとも2つのサンプルにおいて並行して検出する。そのため、本発明は、少なくとも2つのサンプルSA1及びサンプルSA2における標的配列（T）を含む核酸の存在を検出するin vitro方法であって、該方法が、
a）Tの両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列がある、Tを含む核酸を含む可能性のあるサンプルSA1及びサンプルSA2を準備する工程と、
b）SA1をバイアルV1に移し、SA2をバイアルV3に移す工程と、
c）対照配列1（S1）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とが同一ではない、S1を含むプラスミドを準備する工程と、
d）上記工程c）のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e）対照配列2（S2）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f）上記工程e）のプラスミドを上記バイアルに移す工程と、
g）上記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h）上記プライマーFOR及びプライマーREVを使用して上記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i）上記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2のシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在をもたらす場合、かつバイアルV1及びバイアルV3におけるシークエンシングが結果としてT及びS2の存在をもたらす場合、バイアルV1及びバイアルV3におけるTの存在がサンプルSA1及びサンプルSA2中のTを含む上記核酸の存在を示す、方法にも関する。
【００３２】
したがって、サンプルを並行して、好ましくは最大15個のサンプル（7個又は15個のサンプルを並行して分析することが特に好ましい）を分析するため、上に記載のセットアップを使用してもよく、これはマルチプレックス法と呼ばれることもある。Tを含む核酸が癌遺伝子である場合、並行して7個のサンプル（更に追加の対照サンプル8）の分析を行うことが好ましい場合があり、Tを含む核酸が微生物に由来する核酸である場合、平行して15個のサンプル（更に追加の対照サンプル16）の分析を行うことが特に好ましい場合がある。一般に、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1及びS2の存在をもたらす場合、かつバイアルにおける対応するサンプルのシークエンシングが結果としてT及びS2の存在をもたらす場合、Tを含む核酸がサンプル中に存在する。
【００３３】
本発明の幾つかの実施の形態では、核酸に含まれた少なくとも2つの標的配列を分析することを理解する必要がある。したがって、本発明は、サンプル中に少なくとも2つの標的配列（T1及びT2）を含む核酸の存在を検出するin vitro方法であって、該方法が、
a）T1の両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列があり、T2の両側にフォワードプライマー（FOR1）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV1）にハイブリダイズする配列があり、T1とT2とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、T1及びT2を含む核酸を含む可能性のあるサンプルを準備する工程と、
b）上記サンプルをバイアルV1に移す工程と、
c）対照配列1（S1）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、対照配列3（S3）の両側にFOR1にハイブリダイズする配列及びREV1にハイブリダイズする配列があり、T1とT2とS1とS3とが同一ではない、S1及びS3を含むプラスミドを準備する工程と、
d）上記工程c）のプラスミドをバイアルV2に移す工程と、
e）対照配列2（S2）の両側にFORにハイブリダイズする配列及びREVにハイブリダイズする配列があり、TとS1とS2とが同一ではない、S2を含むプラスミドを準備する工程と、
f）上記工程e）のプラスミドを上記バイアルに移す工程と、
g）上記バイアルにおいて核酸を抽出する工程と、
h）上記プライマーFOR、REV、FOR1及びREV1を使用して上記バイアルにおいてPCR反応を行う工程と、
i）上記バイアルにおいて増幅された核酸をシークエンシングする工程と、
を含み、バイアルV2におけるシークエンシングが結果としてS1、S2及びS3の存在をもたらす場合、かつバイアルV1におけるシークエンシングが結果としてT1、T2及びS2の存在をもたらす場合、バイアルV1におけるT1及びT2の存在が上記サンプル中のT1及びT2を含む上記核酸の存在を示す、方法にも関する。
【００３４】
したがって、上記核酸中の少なくとも2つの標的配列の存在を検出することによって特定の核酸を特性評価するため、上に記載されるセットアップを使用してもよい。特に、このセットアップを上記方法の特異性を増すため使用してもよい。
【００３５】
第2の態様では、本発明は、対照配列（S）を含むプラスミドであって、
Sの両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列があり、
FOR及びREVにハイブリダイズする前記配列が、FORにハイブリダイズする前記配列、その後に続く標的配列（T）、その後に続くREVにハイブリダイズする前記配列を含む核酸に由来する配列であり、SとTとが同一ではない、プラスミドに関する。
【００３６】
好ましい実施の形態では、増幅反応中のFOR及びREVの上記プラスミドへのハイブリダイゼーションは、結果としてSの増幅をもたらす。
【００３７】
好ましい実施の形態では、FORにハイブリダイズする前記配列、その後にT、その後にREVにハイブリダイズする前記配列を含む前記核酸が、微生物由来の核酸である。
【００３８】
上記微生物は、細菌、古細菌、原生生物、真菌、及びウイルスからなる群から選択されることが好ましい。特に好ましい実施の形態では、上記微生物は、A群レンサ球菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacteriumbovis）、マイコバクテリウム・カネッティ（Mycobacterium canetti）及びマイコバクテリウム・ミクロティ（Mycobacterium microti）を含む結核菌群の成員、サルモネラ・エンテリカ属の一種（Salmonella enterica spp.）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridiumdifficile）、バンコマイシン耐性腸球菌及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus）からなる群から選択される細菌である。別の特に好ましい実施の形態では、上記微生物は、アデノウイルス、鳥インフルエンザA（H7N9）ウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ノロウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、特にHIV-1、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、デング熱ウイルス及びチクングニヤウイルスからなる群から選択されるウイルスである。最も好ましい実施の形態では、上記微生物はHIV（特にHIV-1）、HBV及びHCVからなる群から選択されるウイルスである。
【００３９】
別の好ましい実施の形態では、Tを含む上記核酸は癌遺伝子、好ましくはヒト癌遺伝子である。上記ヒト癌遺伝子は、BCR-ABL major、BCR-ABL minor、BCR-AML1 ETO、PML-RARA、BRAF V600変異体、KRAS変異体、及びNRAS変異体からなる群から選択されることが好ましい。
【００４０】
更に別の好ましい実施の形態では、SはTに対して相同性を有さず、その配列がTの増幅に対する試薬及び条件を使用して増幅されるように選択される（これは、例えばSのG/C含有量に適用される）。Sは、例えば植物ウイルス、特にタバコモザイクウイルス（TMV）のゲノムに由来してもよい。しかしながら、Sは天然起源ではない人工配列であってもよい。
【００４１】
T及びSが約2000塩基以下の長さを有することが特に好ましい場合がある。約1000塩基以下、好ましくは約600塩基又は約400塩基の長さが特に好ましい。
【００４２】
別の実施の形態では、上記プラスミドは原核生物又は真核生物のプラスミドである。原核生物のプラスミド、特に一般的に使用される大腸菌プラスミドを使用することが特に好ましい場合がある。
【００４３】
別の実施の形態では、前記プラスミドが本発明の第1の態様による方法の工程c）で使用され、陽性及び陰性の対照としての役割を果たす。
【００４４】
更に別の実施の形態では、前記プラスミドが本発明の第1の態様による方法の工程e）で使用され、抽出対照としての役割を果たす。
【００４５】
本発明は、サンプル反応（SR）においてサンプル中のTの存在を検出するように設計されたシークエンシングアッセイにおける本発明の第2の態様によるプラスミドの使用であって、前記プラスミドを対照反応（CR）において使用し、CR及びSRが別々の反応である、本発明の第2の態様によるプラスミドの使用に関する。
【００４６】
さらに、本発明は、サンプル反応（SR）においてサンプル中のTの存在を検出するように設計されたシークエンシングアッセイにおける本発明の第2の態様によるプラスミドの使用であって、前記プラスミドを、それに由来する核酸の抽出の前に前記SRに添加する、本発明の第2の態様によるプラスミドの使用に関する。
【００４７】
また、第2の態様における本発明は、対照配列1（S1）の両側にフォワードプライマー（FOR）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV）にハイブリダイズする配列があるS1と、対照配列2（S2）の両側にフォワードプライマー（FOR1）にハイブリダイズする配列及びリバースプライマー（REV1）にハイブリダイズする配列があるS2とを含み、FOR、FOR1、REV及びREV1にハイブリダイズする上記配列が、FORにハイブリダイズする上記配列、その後に続く標的配列1（T1）、その後に続くREVにハイブリダイズする上記配列、及びFOR1にハイブリダイズする上記配列、その後に続く標的配列2（T2）、その後に続くREV1にハイブリダイズする上記配列を含む核酸に由来する配列であり、S1とS2とT1とT2は同一ではない、プラスミドに関する。上記プラスミドは、陽性及び陰性の対照の両方としての役割を果たすことが好ましい。
【００４８】
第3の態様では、本発明は、サンプル中の標的配列（T）を含む核酸の検出に対するキットであって、該キットが、
（a）FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
（b）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1（S1）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
（c）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2（S2）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とS2とが同一ではない、キットに関する。
【００４９】
その実施の形態では、本発明は、サンプル中に標的配列1及び標的配列2（T1及びT2）を含む核酸の検出に対するキットであって、該キットが、
（a）FOR及びREVがT1に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
（b）FOR1及びREV1がT2に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR1及びプライマーREV1と、
（c）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1（S1）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列、及びFOR1にハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列3（S3）、その後に続くREV1にハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
（d）FORハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2（S2）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、T1とT2とS1とS2とS3とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、キットに関する。
【００５０】
本発明は、サンプル中に標的配列（T）を含む核酸の検出に対するキットであって、該キットが、
（a）FOR及びREVがTに隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
（b）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1（S1）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、TとS1とが同一ではない、キットも開示する。
【００５１】
その実施の形態では、本発明は、サンプル中に標的配列1及び標的配列2（T1及びT2）を含む核酸の検出に対するキットであって、該キットが、
（a）FOR及びREVがT1に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR及びプライマーREVと、
（b）FOR1及びREV1がT2に隣接する配列にハイブリダイズする、プライマーFOR1及びプライマーREV1と、
（c）FORにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列1（S1）、その後に続くREVにハイブリダイズする配列、及びFOR1にハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列2（S2）、その後に続くREV1にハイブリダイズする配列を含むプラスミドと、
を含み、T1とT2とS1とS2とが同一ではなく、FORとFOR1とが同一ではなく、REVとREV1とが同一ではない、キットに関する。
【００５２】
好ましい実施の形態では、上に言及されるキットは使用に関する指示書を含む。
【００５３】
最後に、第4の態様では、本発明は、サンプル中にそれぞれ標的配列（T）を含む核酸又は標的配列1及び標的配列2（T1及びT2）を含む核酸の検出に対する方法における本発明の第3の態様によるキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１A：5'→3'方向の本発明によるプラスミドに含まれる配列、すなわち、フォワードプライマーにハイブリダイズする配列、その後に続く対照配列、その後に続くリバースプライマーにハイブリダイズする領域の模式図を示す。図１Ｂ：ここでも5'→3'方向の本発明による陽性及び陰性の対照として使用されるプラスミドに含まれる2つの対照配列の模式図を示す。具体的な例は、HCV核酸、すなわちNS3領域及びNS5B領域に含まれる2つの遺伝子、すなわち、NS3フォワードプライマー（サンプルにおいてNS3の増幅に使用される）にハイブリダイズする配列、対照配列S1、その後に続くNS3リバースプライマー（サンプルにおいてNS3の増幅に使用される）にハイブリダイズする配列、その後に続くNS5Bフォワードプライマー（サンプルにおいてNS5Bの増幅に使用される）にハイブリダイズする配列、対照配列S2、その後に続くNS5Bリバースプライマー（サンプルにおいてNS5Bの増幅に使用される）にハイブリダイズする配列に関する。図１Ｃ：ここでも5'→3'方向の本発明による抽出対照として使用されるプラスミドに含まれる配列の模式図を示す。具体的な例は、HCV核酸、すなわちNS5B領域に含まれる遺伝子、すなわち、NS5Bフォワードプライマー（サンプルにおいてNS5Bの増幅に使用される）にハイブリダイズする配列、対照配列S3、その後に続くNS5Bリバースプライマー（サンプルにおいてNS5Bの増幅に使用される）にハイブリダイズする配列に関する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明の発明者らは、特に、陽性及び陰性の、また抽出の対照としてシークエンシングアッセイにおいて使用され得るユニバーサルシークエンシングコントロールの提供に成功した。
【００５６】
本発明の幾つかの実施の形態をより詳細に説明する前に、以下の定義を紹介する。
【００５７】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（the singular forms of "a" and "an"）は文脈により特に明確に指定のない限り、対応する複数形も包含する。
【００５８】
本発明に関連して「約」という用語は、対象となる特徴の技術的効果が依然保証されると当業者が理解する精度間隔を指す。「通例」という用語は±10%、好ましくは±5 %の指定数値からの偏差を示す。
【００５９】
「含む（comprising）」という用語は限定するものではないことを理解する必要がある。本発明の目的上、「からなる（consisting of）」という用語は「含む」という用語の好ましい実施の形態であるとみなされる。以下で或る群が少なくとも或る特定数の実施の形態を含むと規定されている場合、これは好ましくはこれらの実施の形態のみからなる群も包含することを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される「存在を検出する」という用語は、「有無を検出する」という意味で理解される。本願において特許請求される方法で言及されるように、分析対象のサンプルは潜在的に標的配列を含む核酸を含む。したがって、例えば患者がC型肝炎ウイルスに感染しているという兆候が存在する場合があると、HCVの核酸を含む可能性のある対応する血液サンプルを本発明による方法によって分析する。そのアッセイが適切に行われたことを全ての対照が示すならば、結果は標的配列（複数の場合もあり）（したがってウイルス）が存在するか又は不在であるかのいずれかであり、それに応じて上記サンプル中の標的配列の有無が検出される。
【００６１】
本発明に関連して、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の自然発生的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。核酸は特に、二本鎖DNA及び一本鎖RNAとすることができる。
【００６２】
「配列」という用語は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーにおける塩基の連続発生（sequential occurrence）を指し、デオキシリボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、T、G及びCからなる群から選択され、リボヌクレオチドポリマーに見られる塩基は、A、U、G及びCからなる群から選択される。そのため、デオキシリボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAGCAAGCCT（配列番号14）であり得る一方、リボヌクレオチドポリマーにおける塩基配列は例えば、GGAAUCGAUAU（配列番号15）であり得る。
【００６３】
本明細書で言及される「標的配列」は、その存在が本発明による方法において検出される核酸中の配列である。「標的配列」は、その存在が検出される特定の核酸に特徴的である。例えば、HCVの核酸が検出される場合、標的配列は、例えばHCVのNS3及び／又はNS5A及び／又はNS5Bの遺伝子を含む場合がある（実施例1及び実施例2も参照されたい）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、標的配列を含む核酸の存在について試験することができる任意のヒト又は動物（veterinary）対象由来の任意の生物学的サンプルを指す。サンプルとしては、例えば肺組織等の任意の器官から得られる組織、並びに例えば血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、羊膜帯血、涙液、唾液及び鼻咽頭洗浄液等の任意の器官から得られる体液が挙げられ得る。上記で挙げられたように、サンプルは身体の特定の領域、例えば気道由来のものであってもよく、気道由来のサンプルとしては、咽頭ぬぐい液、咽頭洗浄液、鼻腔ぬぐい液及び下気道由来の検体が挙げられる。
【００６５】
サンプルは、特にヒト又は動物対象由来のものとすることができる。したがって、「患者」はヒト又は動物対象とすることができる。「臨床サンプル」に言及する場合、サンプルが標的配列を含む核酸を保有することが疑われる患者に由来することを示す。
【００６６】
配列と関連して本明細書で使用される「隣接する」という用語は、特定の配列に隣接すると記載される2つの配列（例えば、フォワードプライマーにハイブリダイズする配列及びリバースプライマーにハイブリダイズする配列）が上記特定の配列の上流及び下流に含まれることを意味する。これに関連してフォワードプライマーにハイブリダイズする配列を参照すると、この領域は上流、すなわち上記配列の5'末端にある。標的配列に続いて、その後、すなわち上記配列の下流又は3'末端に、リバースプライマーにハイブリダイズする配列が存在する。このセットアップも図1Aに由来し得る。
【００６７】
「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の5'→3'への合成に対する開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマー伸長産物は、適切なバッファー中、適した温度において、適切なヌクレオチド及びDNAポリメラーゼ等の重合用物質の存在下で合成される。例えばOLIGO（コロラド州カスケードのMolecular Biology Insights）等のコンピュータープログラムを使用してプライマーを設計することができる。プライマー設計の際の重要な特徴として、検出を容易にするための適切な、好ましくは上に提示される範囲の増幅産物のサイズ、プライマー対の成員に対する類似の融点、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは配列特異性を伴ってアニールし、合成を開始するのに十分な長さを必要とするが、オリゴヌクレオチド合成中にその適合度が低下するほど長くはない）が挙げられる。通例、プライマーは15〜30のヌクレオチド長である。
【００６８】
特定配列の上流領域にハイブリダイズする「フォワードプライマー」及び特定の配列の下流領域にハイブリダイズする「リバースプライマー」は、上記特定の配列がPCR増幅反応中に増幅されるようにハイブリダイズする。二本鎖DNA又はcDNAがそのサンプルに存在する場合、フォワードプライマーは、その3'末端が増幅される配列の方を向くように上流領域にハイブリダイズし、リバースプライマーの3'末端も増幅される配列に向く。PCRの全工程で見られるように、フォワードプライマーは非コーディング鎖にハイブリダイズするのに対し、リバースプライマーはコーディング鎖にハイブリダイズし、プライマーは異なる鎖にそのようにハイブリダイズする。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「増幅」という用語は核酸標的のコピーを数十億生成することが可能な酵素媒介性の手法を指す。当該技術分野において既知の酵素媒介性の標的増幅手法の例としてはPCRが挙げられる。
【００７０】
本明細書で使用される「ハイブリダイズする」という用語は、一本鎖核酸の2以上の相補鎖間の非共有結合性の配列特異的な相互作用を確立することで、複合体、好ましくは本発明においては二重鎖にするプロセスを指す。
【００７１】
「バイアル」という用語は、通例診断アッセイに使用される反応バイアルを指す。バイアルは、マルチプレート、例えば96ウェルプレートに含まれてもよく、したがって「ウェル」とも呼ばれる場合があり、又はサンプルリング、例えば36バイアルサンプルリング上に含まれる場合がある。或る対象物がバイアルに「移される」場合、可能な限り無菌の条件をこの工程で使用することが好ましく、幾つかのセットアップでは、移す工程を、対象物をバイアルにピペッティングすることによって行ってもよく、これは自動化された方式で行われてもよい。本内容の典型的な「対象物」は臨床サンプル、バッファーに含まれるプラスミド、又はプラスミドを含む細胞である。また、プラスミドを含む細胞をバイアルに移す場合、上記細胞を抽出プロセス中に使用される特定のバッファー、例えば溶解バッファーに添加することによってこれを行ってもよい。
【００７２】
「プラスミド」という用語は、分子生物学におけるその標準的な意味により本明細書で使用される。任意の種類の原核生物又は真核生物のベクターを本発明の目的、すなわち、陽性及び陰性の対照、また抽出対照として使用されるプラスミドに対して使用してもよい。かかるプラスミドの例はTMVプラスミドである。
【００７３】
「同一ではない配列」と関連して本明細書で使用される「同一」という用語は、その配列が少なくとも1つの塩基において互いに異なることを意味する。しかしながら、上に指摘したように、少なくとも標的配列（複数の場合もあり）及び対照配列（複数の場合もあり）に関して、配列が全く相同性を示さないことが好ましい。異なる対照配列は一定の相同性を示す場合があるが、互いに明確に区別可能でなくてはならない。これは対照配列もまた少なくとも1塩基によって互いに異なることで達成される。したがって、好ましい実施形態では、TはS1及びS2に対して相同性を示さず、S1及びS2は幾らかの相同性を共有し得るが、少なくとも1塩基、好ましくは2以上の塩基で互いに異なる。
【００７４】
「核酸を抽出する」は、バイアルに存在する任意の核酸を任意の細胞性バックグラウンドから実質的に単離すること、特に無傷の細胞から単離することを意味する。また、核酸をその処理過程の間洗浄し、任意に濃縮することが好ましい。抽出に続き、バイアルに存在する実質的に全ての無傷の細胞を溶解し、核酸に無関係の実質的に全ての細胞破片を除去した。典型的な抽出方法は、低張性溶解バッファー、熱及び／又は洗浄剤の使用を含んでもよく、それらは当業者に知られている。本発明による特に好ましい抽出プロセスは以下の工程を含む：
−プロテイナーゼKを一般的に使用される溶解バッファーに添加し、後の工程が（RT-PCRにより）逆転写を行う工程を含む場合、キャリアRNAを溶解バッファーに添加してもよく、さらに、上に概説されるように、抽出対照プラスミドを該溶解バッファーに添加してもよい（「溶解バッファーにスパイクする」）、
−上に記載される溶解バッファーをサンプルに添加し、好ましくはサンプルを混合しながら、サンプルを60℃で10分間インキュベートする、
−（標準的なプロトコルに従って）サンプルから核酸を単離するため、核酸を捕捉するために一般的に使用される磁性ビーズを使用することが好ましく、したがって、次の工程は以下を含んでもよい：
○細胞の溶解後に結合バッファーをサンプルに添加する、
○核酸を捕捉するため磁性ビーズを添加する、
○磁性ビーズを磁石によって収集し、（好ましくは短いインキュベーションの後）上清を除去する、
○任意に幾つかの異なる（好ましくは2つの）洗浄バッファーをビーズに添加し、幾つかの（好ましくは2つの）洗浄工程を、ビーズを洗浄することによって順次行う（混合し、磁石によってビーズを収集し、上清を除去し、次の洗浄バッファーを添加する）、
○その後、通例ビーズを乾燥する、
○ビーズに溶離バッファーを添加し、好ましくは短いインキュベーションの後に、通例サンプルを混合する、
○磁性ビーズを磁石により収集し、溶離された核酸を含む上清を収集する、
−溶離された核酸（「抽出された核酸」に対応する）を含む上清を後の工程で使用する。
【００７５】
「PCR反応」は、米国特許第4,683,195号においてMullis et al.によって、また米国特許第4,683,202号においてMullisによってDNAの増幅に対して初めて記載され、当業者に既知のものである。PCR法では、DNAのサンプルを、DNA二重鎖の各鎖の3'端に相補的に調製された、モル過剰の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー（上記参照、フォワード及びリバースプライマー）と、モル過剰のヌクレオチド塩基（すなわちdNTP）と、オリゴヌクレオチドプライマー及びdNTPからのDNAの形成を触媒する熱安定性DNAポリメラーゼ（好ましくはTaqポリメラーゼ）とが入った溶液中で混合する。プライマーの内、少なくとも1つが変性DNA分析物の1つの鎖（上記定義ではナンセンス鎖）の3'端に5'→3'方向で結合するフォワードプライマーであり、それ以外が変性DNA分析物のもう一方の鎖（上記の定義ではセンス鎖）の5'端に3'→5'方向で結合するリバースプライマーである。この溶液を約94℃〜96℃に加熱することで、二本鎖DNAを一本鎖DNAへと変性させる。溶液を冷却し、いわゆるアニーリング温度に達すると、プライマーは分離した鎖と結合し、DNAポリメラーゼが、dNTPとプライマーとを結び付けることにより分析物の新たな鎖を触媒する。このプロセスを繰り返し、プライマーから合成された伸長産物をその相補配列から分離する場合、各伸長産物は他のプライマーから合成される相補伸長産物の鋳型として働く。各サイクルの後に配列は二倍に増幅することから、膨大な数のコピーの理論的な増幅を、数時間、このプロセスを繰り返すことで達成することができ、このようにして極めて僅かな量のDNAを、PCRを用いて比較的短期間にて増幅することができる。
【００７６】
PCR反応の出発材料がRNAである場合、逆転写を介してRNAから相補DNA（「cDNA」）を合成する。次いで得られたcDNAを、上記のPCRプロトコルを用いて増幅する。逆転写酵素は鋳型であるmRNA配列からDNAの相補的な一本鎖を合成することができるレトロウイルスにて見られる酵素として当業者に知られている。RNA産物を増幅するのに用いられるPCRは逆転写酵素PCR、すなわち「RT-PCR」と呼ばれる。
【００７７】
上の定義で使用される「相補的」及び「実質的に相補的」という用語は、例えばシークエンシングされる若しくは増幅される、二本鎖DNA分子の2本の鎖の間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間等のヌクレオチド又は核酸の間の塩基対合を指す。相補的なヌクレオチドは、一般的にはA及びT（又はA及びU）、並びにG及びCである。
【００７８】
本明細書の「シークエンシング」という用語は、分子生物学において一般的な意味で使用される。これにより、核酸配列における正確な塩基の連続発生が決定される。
【００７９】
本明細書で使用される「微生物」という用語は、その最も広い意味で使用される。このため、微生物は任意のタイプの細菌、古細菌、原生生物、真菌及びウイルスであり得る。ウイルスが本明細書で使用される「微生物」の定義に含まれることが明示的に述べられる。
【００８０】
「癌遺伝子」という用語は、本明細書では分子生物学及び腫瘍学のそれぞれにおいて一般的な意味で使用される。このため、例えば「正常又は野生型」遺伝子を催腫瘍性、すなわち発癌性に変える遺伝子において既知の突然変異が存在する。この点での例は、特定のシグナル（例えば成長誘導シグナル）が常に出され、対応するプロセスが開始されるようにキナーゼを構造上活性なものに変える突然変異である。本明細書で使用される「癌遺伝子」は、同様に発癌状況を生じる染色体内又は染色体間転座に関する場合もある。
【００８１】
「マルチプレックス」という用語は、幾つかのサンプルにおける特定の核酸の存在の検出を指し、対応するアッセイを同時に行う、すなわち、本発明の方法の工程を一般的には並行して行う。
【００８２】
本明細書に記載の実施形態と併せて本発明を説明したが、上述の記載及び以下の実施例は説明を意図し、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点及び変更は本発明に関連する技術分野の当業者に明らかである。
【００８３】
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００８４】
以下の実施例は、当業者に本発明の組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を与えるために提示される。実施例は本発明の非限定的な例を意図するものである。量、温度等の変量に関して精度を保証するために尽力したが、実験誤差及び偏差を考慮するものとする。他に指定のない限り、部は重量部であり、温度はセルシウス度であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。全ての成分は他に指定のない限り、市販のものとした。
【実施例】
【００８５】
実施例1：陽性及び陰性の対照として使用されるプラスミド
本アッセイ（実施例3により詳細に記載される）の目標は、臨床サンプル中のC型肝炎ウイルス（HCV）の核酸の有無の検出である。HCV核酸には検出される2つの標的配列があり、これらの配列はHCVの遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bに含まれる。
【００８６】
陽性及び陰性の対照として使用されるプラスミドは、以下の配列を含む（5'→3'方向、図1Bも参照されたい）：
−NS3  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（薄い灰色で強調される）であって、NS3フォワードプライマーにハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする）；配列番号1
−HCV  NS3遺伝子に相同性を示さない、タバコモザイクウイルス（TMV）に由来する配列（以下S1と呼ぶ）；配列番号2
−NS3  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（薄い灰色で強調される）であって、NS3リバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする）；配列番号3
−NS5B  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（濃い灰色で強調される）であって、NS5Bフォワードプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする）；配列番号4
−HCVのNS5B遺伝子に対して相同性を示さず、S1と異なる、TMVに由来する第2の配列（S2）；配列番号5
−NS5B  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（濃い灰色で強調される）であって、NS5Bリバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする）；配列番号6。
【００８７】
上の要素を含む例示的配列は以下の通りである（配列番号7）：
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
ggaagcaagccgcggaaatgatcagaagacgtgcgaattcctcagggattattgtggcca
cgaaggataacgttaaaaccgttgattctttcatgatgaattttgggaaaagcacacgct
gtcagttcaagaggttattcattgatgaagggttgatgttgcatactggttgtgttaatt
ttcttgtggcgatgtcattgtgcgaaattgcatatgtttacggagacacacagcagattc
catacatcaatagagtttcaggattcccgtaccccgcccattttgccaaattggaggttg
acgaggtggagacacgcagaactactctccgttgtecagccgatgtcacacattatctga
acaggagatatgagggctttgtcatgagcacttcttcggttaaaaagtctgtttcgcagg
agatggtcggcggagccgccgtgatcaatccgatctcaaaacccttgcatggcaagatcc
tgacttttacccaatcggataaagaagctctgctttcaagagggtattcagatgttcaca
ctgtgcatgaagtgcaaggcgagacatactctgatgtttcactagttaggttaaccccta
CAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCAGGAGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT
TGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGTGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCCCCGGGGACCCCCCACAACC
gcatattggatatgtctaagtctgttgctgcgcctaaggatcaaatcaaaccactaatac
ctatggtacgaacggcggcagaaatgccaegecagactggactattggaaaatttagtgg
cgatgattaaaaggaactttaacgcacccgagttgtctggcatcattgatattgaaaata
ctgcatctttggttgtagataagttttttgatagttatttgcttaaagaaaaaagaaaac
caaataaaaatgtttctttgttcagtagagagtctctcaatagatggttagaaaagcagg
aacaggtaacaattggccagctcgcagattttgattttgtggatttgccagcagttgatc
agtacagacacatgattaaagcacaacccaagcaaaagttggacacttcaatccaaacgg
agtacccggctttgcagacgattgtgtaccattcaaaaaagatcaatgcaatattcggcc
cgttgtttagcgagcttactaggcaattactggacagtgttgattcgagcagatttttgt
ttttcacaagaaagacaccagcgcagattgaggatttcttcggagatctcgacagtcatg
GGCTGGACTTGTCCGGTTGGTTCACGGCTGGCTACAGCGGGGGAGACATTTATCACAGCGTGTCTCATGCCCGGCCCCGCTGGTTCTGGTTTTGCCTACTCCTGCTCGCTGCAGGGGTAGGCATCTACCTCCTCCCCAACCGATGA
【００８８】
実施例3に記載されるようにアッセイを行う。（上に示される配列を含むプラスミドを含む）対照バイアルにおける配列S1及び配列S2の検出の成功は、プライマー対NS3-for及びNS3-rev、並びにNS5B-for及びNS5B-revをそれぞれ使用するPCR反応が適切に作動した（陽性対照）ことを示す。S1及びS2が検出された場合、他にHCVの遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bの配列もこの対照（陰性対照）において検出され得たことから、そのサンプルが（例えば、ウイルスを含むサンプル又はウイルスそれ自体によって）汚染されたことを除外することができる。追加の陰性対照は必要ではない。実施例2で考察されるように、通常、抽出対照プラスミドもバイアルに添加する。
【００８９】
実施例2：抽出対照として使用されるプラスミド
全体的なセットアップは、上に概説されるセットアップと同一である。したがって、該アッセイの目標は、臨床サンプルにおけるC型肝炎ウイルス（HCV）に由来する核酸の有無の検出であり、ここでHCVの遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bに含まれるHCV配列が検出される。
【００９０】
抽出対照として使用されるプラスミドは、以下の配列を含む（5'→3'方向、図1Cも参照されたい）：
−NS5B  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（薄い灰色で強調される）であって、NS5Bフォワードプライマーにハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：フォワードプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖の相補鎖にハイブリダイズする）；配列番号1
−HCV  NS5B遺伝子に相同性を示さず、S1及びS2と異なる、TMVに由来する第2の配列（S3）；配列番号8
−NS5B  HCV遺伝子に由来するプライマー領域（薄い灰色で強調される）であって、NS5Bリバースプライマーとハイブリダイズする配列に下線が引かれる（注：リバースプライマーは増幅反応中、以下に示される鎖にハイブリダイズする）；配列番号3。
【００９１】
例示的配列は以下の通りである（配列番号9）：
GCACAACGGCCTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTGGAACCAGTCGTCTTCTCCCGAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCCGTCTCTGCCCGTA
gcatctggtatcaaagaaagagcggggacgtcacgacgttcattggaaacactgtgatca
ttgctgcatgtttggcctcgatgcttccgatggagaaaataatcaaaggagccttttgtg
gtgacgatagtctgctgtactttccaaagggttgtgagtttccggatgtgcaacactccg
cgaatcttatgtggaattttgaagcaaaactgtttaaaaaacagtatggatacttttgcg
gaagatatgtaatacatcacgacagaggatgcattgtgtattacgatcccctaaagttga
tctcgaaacttggtgctaaacacatcaaggattgggaacacttggaggagttcagaaggt
ctctttgtgatgttgctgtttcgttgaacaattgtgcgtattacacacagttggacgacg
ctgtatgggaggttcataaaaccgcccctccaggttcgtttgtttataaaagtctggtga
agtatttgtctgataaagtt
CAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCAGGAGGTGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT
【００９２】
上記アッセイを実施例3に記載されるように行う。標準量の抽出対照プラスミドを、実施例2の対照を含む全てのサンプルの抽出工程において使用される溶解バッファーにスパイクする。
【００９３】
サンプルを含むバイアルにおけるHCV標的配列及び配列S3（及び上のプラスミド）の検出の成功は、少なくとも抽出工程が適切に作動したことを示す（抽出対照）。HCV標的配列のみが検出される場合、抽出工程は適切に行われず、逆に、かかる結果はウイルスDNAによるサンプルの汚染の指標である。抽出対照の細胞に含まれる配列の増幅反応には追加のプライマー対は必要ではない。
【００９４】
実施例3：実施例1及び実施例2のプラスミドを使用するアッセイ
ヒト対象に由来する血液等の臨床サンプル中にC型肝炎ウイルス（HCV）の核酸の有無を特定するため、以下に記載されるアッセイを行う。
【００９５】
アッセイをVela DiagnosticsによるSentosa SX101デバイス、QiagenによるRotor-Gene Qデバイス、及びlife technologiesによるIon Torrent Semiconductor Sequencingデバイスを使用して行う。
【００９６】
分析される臨床サンプルを適したバイアル又はウェルに供給し、更なるサンプルを同様に供給してもよく（もちろん異なるバイアルにおいて）、全てのサンプルを並行して分析することができる。実施例1のプラスミドを適切な濃度及び容量で別のバイアルに入れる。全てのバイアル／ウェルのサンプル（実施例1のプラスミドを含むバイアルを包含する）を第1の工程においてSentosa SX101デバイスの自動化された抽出手順に供する。この手順は溶解バッファーにおいて実施例2のプラスミドを使用するため、全てのバイアルにおいて、その後核酸が抽出される。
【００９７】
次の工程では、サンプルを自動的にサンプルリングに移す。かかるサンプルリングは、最大72のバイアルを含む場合があり、陽性対照（すなわち、実施例1のプラスミド）をバイアル1に移してもよく、サンプルをバイアル2〜バイアル72に移してもよい。
【００９８】
また、Sentosa SX101デバイスは、次の工程（HCVがRNAウイルスであることから本実施例では次の工程はRT-PCRである）で使用される成分と共にサンプルを自動的に充填することができる。したがって、最初のRT-PCRは検出されるNS3遺伝子及びNS5B遺伝子の領域において行われる必要がある。全てのバイアル、すなわちバイアル1〜バイアル72の抽出された核酸に対応する成分を添加する。該成分は逆転写酵素及びTaqポリメラーゼ酵素、また以下のプライマー：
NS3_fw: TGGGGGGCAGATACCGC（配列番号10）
NS3_rev: AGGAACTTGCCGTAGGTGGAGTA（配列番号11）
NS5B_fw: CCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTA（配列番号12）
NS5B_rev: TGAGACACGCTGTGATAAATGTC（配列番号13）
を含む。
【００９９】
その後、RT-PCRに必要な全ての成分と共に抽出した核酸を含むサンプルリングをRotor-Gene Qデバイスに移し、そこで標準的なプロトコルに従ってRT-PCR反応を行う。
【０１００】
その後、サンプルを個々のバイアルからIon Torrent Semiconductor Sequencingデバイスで使用されるマイクロウェルに移す。シークエンシング（任意に、増幅した核酸を断片化する必要な工程を含む）を標準的なプロトコルに従って行う。
【０１０１】
実施例1によるプラスミドはバイアル1に含まれ、上に指摘されるように、抽出工程もまたこのバイアルに対して行われたことから、実施例2のプラスミドを含む溶解バッファーをこのバイアルに添加した。配列S1及び配列S2の検出の成功は、PCR反応が適切に行われたことを示す。したがって、実施例1によるプラスミドはPCR反応に対する陽性対照としての役割を果たす。また、実施例2のプラスミドを添加したことから、配列S2も検出されるはずであり、S1、S2及びS3を除く更なる配列がバイアル1で検出されない場合は、サンプルの汚染を除外することができる。したがって、上記反応は陰性対照としての役割も果たす。上に指摘したように、実施例2によるプラスミドを全てのサンプルにおける核酸の抽出に使用される溶解バッファーに添加した。核酸抽出の成功は、全てのバイアルにおける配列S3の存在によって示される。
【０１０２】
HCVにおいて検出される配列、すなわち遺伝子NS3及び遺伝子NS5Bにおける領域も（配列S3に加えて）バイアル2（また、適用可能であれば、全ての更なるサンプルのバイアルにおいて）に存在する場合、HCVに由来する核酸が実際に存在した。これは、臨床サンプル（複数の場合もあり）におけるHCVの存在の指標である。
【０１０３】
配列S3のみがバイアル2で検出された場合、HCVに由来する核酸はサンプルには存在せず、したがって、HCV感染を除外することができる。
【図１】
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【配列表】
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