(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミセルと前記ミセル内部に封止された薬物とから構成されるミセルナノ錯体であって、前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、前記ポリマーは前記フラボノイドのＢ環と結合している、ミセルナノ錯体。
【請求項２】
請求項１に記載のミセルナノ錯体であって、一個以上のフラボノイドが前記ポリマーに結合されている、ミセルナノ錯体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のミセルナノ錯体であって、前記ポリマーは架橋剤によって前記フラボノイドと結合されている、ミセルナノ錯体。
【請求項４】
請求項３に記載のミセルナノ錯体であって、前記架橋剤はチオエーテル、イミン、アミン、アゾ、1,2,3トリアゾル群から成る群から選択される、ミセルナノ錯体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記フラボノイドはフラボノイド単量体またはフラボノイド二量体である、ミセルナノ錯体。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、二個以上のフラボノイドが前記共役結合体の中に存在する場合、一個以上の前記フラボノイドがＢ環を介して前記ポリマーと結合している、ミセルナノ錯体。
【請求項７】
請求項６に記載のミセルナノ錯体であって、Ｂ環を介して前記ポリマーと結合していない前記フラボノイドは、Ａ環を介して前記ポリマーと結合している、ミセルナノ錯体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記ポリマーは親水性ポリマーである、ミセルナノ錯体。
【請求項９】
請求項８に記載のミセルナノ錯体であって、前記親水性ポリマーは、アクリルアミド、アルキル、オキサゾリン、アルケニル、イミン、アクリル酸、メタクリル酸、ジオール、オキシラン、アルコール、アミン、無水物、エステル、ラクトン、炭酸塩、カルボン酸、アクリレート、水酸基、リン酸塩、テレフタル酸エステル、アミド、エーテルから成る群から選択されるモノマーから構成される、ミセルナノ錯体。
【請求項１０】
請求項８に記載のミセルナノ錯体であって、前記親水性ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(オキサゾリン)、ポリエチレンイミン、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリル酸、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエーテル、ポリ(アリルアミン)、ポリ酸無水物、ポリ(β-アミノエステル)、ポリ(ブチレンサクシネート)、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリ(グリセロール)、ポリグリコール酸、ポリ(3-ヒドロキシプロピオン酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリル酸)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸co-グリコール酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(2-オキサゾリン)、ポリ(セバシン酸)、ポリ(テレフタル酸エステル-co-リン酸塩)、これらの共重合体から成る群から選択される、ミセルナノ錯体。
【請求項１１】
請求項８に記載のミセルナノ錯体であって、前記親水性ポリマーは多糖である、ミセルナノ錯体。
【請求項１２】
請求項８に記載のミセルナノ錯体であって、前記親水性ポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、キトサン、セルロース、アミロース、でんぷん、ゼラチン、カラギナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコル、ゲル化剤、グァーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン、キシログルカン、アルギン酸塩から成る群から選択される多糖である、ミセルナノ錯体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記フラボノイドはフラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジン、アントシアニジンから成る群から選択される、ミセルナノ錯体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のミセルナノ錯体であって、前記フラバンは、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール、ロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラヴィン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシンおよびこれらの混合物から成る群から選択される、ミセルナノ錯体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記薬物は治療薬である、ミセルナノ錯体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記治療薬は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格かく乱化学物質、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ I 阻害剤、トポイソメラーゼ II 阻害剤、キナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、抗体薬物共役結合体、ヌクレオチド類似体、前駆体類似体、ペプチド抗生物質、プラチナ系薬物、レチノイド、ビンカ・アルカロイド、サイトカイン、代謝拮抗物質、ビンカ・アルカロイド誘導体、およびその他の細胞毒素から成る群から選択される化学療法剤である、ミセルナノ錯体。
【請求項１７】
請求項１６に記載のミセルナノ錯体であって、前記化学療法剤は、アクチノマイシン、アファチニブ、オールトランス型レチノイン酸、アキシチニブ、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボスチニブ、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロランブシル、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロンA (C26H39NO6S)、エポチロンB (C27H41NO6S)、エポチロンC (C26H39NO5S)、エポチロンD (C27H41NO5S)、エポチロンE (C26H39NO7S)、エポチロンF (C27H41NO7S)、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、ラパチニブ、レンバチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ペメトレキセド、ラニビズマブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラスツズマブ、テニポシド、チオグアニン、トファシチニブ、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンから成る群から選択される、ミセルナノ錯体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記ミセルナノ錯体はサイズ範囲が30〜300 nm、50〜300 nm、100〜300 nm、30〜50 nm、30〜100 nm、30〜150 nm、150〜300 nm、200〜300 nm、250〜300 nm、100〜150 nm、100〜200 nm、100〜250 nm、130〜180 nm、130〜250 nmのいずれかである、ミセルナノ錯体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記ミセル内における前記薬物の負荷効率は、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上または80%以上である、ミセルナノ錯体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のミセルナノ錯体であって、前記ミセル内における前記薬物の負荷量は、1〜10 w/w%、5〜25 w/w%、20〜45 w/w%、30〜50 w/w%、35〜50 w/w%、40〜50 w/w%、45〜50 w/w%、30〜35 w/w%、30〜40 w/w%または30〜45 w/w%の範囲である、ミセルナノ錯体。
【請求項２１】
ミセルと前記ミセルに封止される薬物とから構成されるミセルナノ錯体の形成方法であって、前記方法は以下のステップから構成される：
a.前記薬物を適切な溶媒に溶かしてポリマーフラボノイド共役結合体に添加する。ここで、前記ポリマーは前記フラボノイドのＢ環と結合している。
b.前記ポリマーフラボノイド共役結合体と前記ミセル内の前記薬物の封止とから構成されるミセルの自己集合により、前記ミセルナノ錯体を調製する、
方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ステップ(a)は、さらに次のステップから構成される:
a.前記溶媒を除去して、前記薬物と前記ポリマーフラボノイド共役結合体との乾燥フィルムを形成し、さらに、
b.前記乾燥フィルムを水性溶媒中で水和させる、
方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法であって、生成されたミセルナノ錯体をろ過して分離するステップをさらに含む、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、ステップ(a)は、前記薬物を適切な溶媒の中で透析するステップをさらに含む、方法。
【請求項２５】
フラボノイドのＢ環に結合されたポリマーから成る、ポリマーフラボノイド共役結合体であって、前記ポリマーは、多糖類、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(オキサゾリン)、ポリエチレンイミン、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリル酸、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエーテル、ポリ(アリルアミン)、ポリ酸無水物、ポリ(β-アミノエステル)、ポリ(ブチレンサクシネート)、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリ(グリセロール)、ポリグリコール酸、ポリ(3-ヒドロキシプロピオン酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリル酸)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸co-グリコール酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(2-オキサゾリン)、ポリ(セバシン酸)、ポリ(テレフタル酸エステル-co-リン酸塩)、これらの共重合体から成る群から選択される、ポリマーフラボノイド共役結合体。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリマーフラボノイド共役結合体であって、前記フラボノイドは、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール、ロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラヴィン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシンおよびこれらの混合物から成る群から選択される、ポリマーフラボノイド共役結合体。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のポリマーフラボノイド共役結合体であって、前記ポリマーは、チオエーテル、イミン、アミン、アゾ、1,2,3トリアゾル群から成る群から選択される架橋剤によってフラボノイドと共役結合されている、ポリマーフラボノイド共役結合体。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のポリマーフラボノイド共役結合体であって、前記ポリマーはポリ(エチレングリコール)であり、前記フラボノイドはエピガロカテキン-3-ガレートであり、前記架橋剤はチオエーテルである、ポリマーフラボノイド共役結合体。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリマーフラボノイド共役結合体であって、前記共役結合体は次式で表され、
【化３】
0006307631.tif 000004
ここで、nは20〜910の範囲である、ポリマーフラボノイド共役結合体。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のポリマーフラボノイド共役結合体の形成方法であって、前記フラボノイドと前記ポリマーとを基本的条件下で求核付加によって結合させるステップから構成され、前記ポリマーは脱離求核群を有する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記結合反応は１〜２４時間の反応時間で実行される、方法。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の方法であって、前記フラボノイドの凝集を実質的に阻止する溶媒の中で前記結合させるステップを行うステップをさらに含む、方法。
【請求項３３】
請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法であって、前記求核群のH2O2媒介酸化を阻止し、これにより前記結合させるステップを効率化する除去薬物を添加するステップをさらに含む、方法。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法であって、前記基本的条件は、ｐＨ範囲７〜１０である、方法。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法であって、前記求核群は、チオール、アミン、ジアゾアルカン、アジドから成る群から選択される、方法。
【請求項３６】
製薬工業において薬物投与担体を製造するためのミセルナノ錯体の使用であって、前記ミセルナノ錯体は、ミセルと、前記ミセル内部に封止された薬物とを含み、前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、前記ポリマーは前記フラボノイドのＢ環と結合している、使用。
【請求項３７】
請求項３６に記載の使用であって、前記ミセルナノ錯体は、前記封止された薬物を生体内の標的腫瘍部位に放出する、使用。
【請求項３８】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の前記ミセルナノ錯体の使用であって、腫瘍治療薬製造のための使用。
【請求項３９】
請求項３８に記載の使用であって、前記ミセルナノ錯体は、吸入スプレーによって非経口的に、局部的に、直腸経由で、鼻腔経由で、口腔から、膣から、インプラントリザーバーにより、注射により、皮下的に、腹腔内に、経粘膜的に、経口または眼科用剤により投与される、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の使用であって、前記非経口的投与は、皮下注射により、皮内に、静脈内に、筋肉注射で、関節内に、動脈内に、滑液嚢内に、胸骨内に、くも膜下に、病巣内に、頭蓋内注射により、または点滴によるものから構成される、方法。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の使用であって、前記ミセルナノ錯体内に貯留された前記薬物が一日当たり用量1〜80 mg/kg投与される、方法。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の使用であって、前記がん患者は、副腎皮質がん、AIDS関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、グレード1(未分化)星状細胞腫、グレード2星状細胞腫、グレード3星状細胞腫、グレード4星状細胞腫、中枢神経系非定型奇形腫様腫瘍/桿状腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、気管支がん、気管支肺胞上皮がん、バーキットリンパ腫、子宮頚がん、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞性リンパ腫、子宮内膜がん、子宮内膜子宮がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌、肝門部胆管癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭がん、口唇がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、内分泌腺腫瘍、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成、骨髄異形成性/骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣明細胞癌、上皮性卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、松果体実質細胞腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、第15染色体異常による気道癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、頸部扁平上皮がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、喉頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂がん、尿道癌、子宮肉腫、膣がん、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、腎芽細胞腫から成る群から選択されるがんに患っている、方法。
【請求項４３】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の前記ミセルナノ錯体であって、腫瘍処置用である、ミセルナノ錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に薬物投与用のミセルナノ錯体およびその製法に関する。本発明はまた、フラボノイドのB環に結合されるポリマーから構成されるポリマーフラボノイド共役結合体およびその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も普及しているがん治療法である化学療法は細胞毒性のある薬物を経口および非経口投与により使用する。投与従来の抗がん剤における主な課題は体内で非固有的な分散が行われることにあり、このため重篤な副作用のある体内での毒性に繋がることにある。さらに経口薬物の治療効果は、薬物が消化管を通過せざるをえないため、生体適合度が低いという制約を受ける。過去数十年の間に研究者らは従来型の薬物投与による制約を薬物の動態と体内拡散の改善によって克服するための薬物投与システム開発に焦点を当ててきた。
【０００３】
近年においては緑茶のカテキンが心臓血管系の疾患やガン予防を含むその健康上のメリットにより広範に研究されてきた。お茶のカテキンの中でも、(-)-エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は最も豊富に存在し、緑茶の有利な効果のために主な役割を演じているものと見られてきた。多くの研究によって、EGCGに抗酸化性、抗糖尿病、抗菌、抗炎症、コレステロール削減の効果があることが証明されてきた。さらにがん細胞生存のために欠かせない複数のシグナル伝達経路に照準を当てることにより腫瘍の拡大や転移を効果的に阻止することも証明された。
【０００４】
これらの望ましい動作にも拘わらず、安定性に乏しいことおよび経口での生体吸収性が低いことからEGCGの臨床への応用は限られてきた。例えば、EGCGは不安定であり生理的環境の下で分解され易い。EGCGは0.05 M リン酸塩緩衝食塩水(PBS) (pH 7.4)中で37°Cの温度で30分以内と半減期が短い。さらに、体内に吸収されたEGCGの大半は胃液により、さらに小腸では新陳代謝による分解によって大部分が加水分解される。その結果、所望の治療効果を得るために必要なEGCGの血漿濃度は経口投与後に達成されない。
従って、前述の不利な点の一つまたは複数を克服するか少なくとも改善しうる薬物投与システムを提供する必要性が存在する。薬物投与システムの調製方法を提供する必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００５】
第一の局面に従い、ミセルと前記ミセル内部に封止された薬物から構成されるミセルナノ錯体を提供する。前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、ここに前記のポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。
【０００６】
有利な点として、ミセルナノ錯体を薬物投与システムとして利用することができる。ミセルナノ錯体はサイズが小さく、 高い薬物負荷容量があり、腫瘍を照準とした薬物投与のために有利である。さらに有利な点として、生理的環境内でミセルナノ錯体を使用することによって薬物の持続的分散を実現することができる。さらに有利な点として、ナノ錯体は非水溶性の各種抗がん剤の投与手段として大きく期待しうる。さらに有利な点として、ミセルナノ錯体は薬物投与に関連した生体毒性が削減され、腫瘍の成長を大幅に抑止しうる。さらに有利な点として、ミセルナノ錯体は薬物投与システムまたはミセル担体と薬物による治療上の相乗効果がある固有であり効果的な薬物投与システムになりうる。 
【０００７】
薬物はドキソルビシンであってよい。有利な点として、ドキソルビシンを封止したミセルナノ錯体は持続的に薬物を拡散できる。この持続的薬物放出はミセルナノ錯体内でのEGCGとドキソルビシンの間の強い相互作用によるものと考えられる。さらに有利な点として、いくつかの実施例においては、初期段階にのみ僅かな突発的放出が観察されたにとどまり、ドキソルビシン分子がミセルナノ錯体の内部に安定的に封止されていたことを示唆する。こうした低率の薬物漏えいは、副作用が最小限で治療効果は最大限に得られるために不可欠であり、ナノ錯体に封止された分子は血流中を循環する間に早期に漏れ出す可能性が低いと見られる。以上に加えさらに有利な点として、ミセルナノ錯体はがん治療のためにドキソルビシンを全身投与するために応用しうる。 
【０００８】
薬物はスニチニブ(SU)であってよく、フラボノイドはエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)であってよい。有利な点として、ミセルナノ錯体はSUを持続的に放出することができる。さらに有利な点として、いくつかの実施例においては、突発的な薬物の放出はほとんど観察されず、SU分子がミセルナノ錯体の内部に安定的に封止されていたことを示唆する。
【０００９】
一つの実施形態においてフラボノイドはフラボノイド単量体とすることができる。別の実施形態においてフラボノイドはフラボノイド二量体とすることができる。有利な点として、フラボノイド単量体から構成されるミセルナノ錯体はフラボノイド二量体を含むミセルナノ錯体より速くかつより多くのSUを放出することができる。有利な点として、SUとフラボノイド二量体の間には強い相互作用がある可能性がある。 
【００１０】
有利な点として、ミセルナノ錯体は内部に薬物を安定的に封止し照準部位へ投与されることによりSUなどの薬物が持つ重篤な副作用を最小限にしうる。従って、ミセルナノ錯体はSUとEGCGの間の有益な相乗効果を提供しうる。
【００１１】
さらに有利な点として、SUから成るミセルナノ錯体は脱離SUより腫瘍に対する効果が生体において強化されている。さらに有利な点として、SUから構成されるミセルナノ錯体はSU非含有のものより重篤な副作用が生体内で少ない可能性がある。さらに有利な点として、同じ効果を得るために脱離SUと比べ、SUと結合したミセルナノ錯体は少量で済む。さらに有利な点として、SUを含むミセルナノ錯体の阻止効果は治療を停止した後もかなりの期間維持されうる。
【００１２】
さらに有利な点として、SUを含むミセルナノ錯体は血漿中の脱離SU濃度を低下させ、SUの重篤な副作用を軽減する可能性がある。さらに有利な点として、血漿中の脱離SU濃度低下はフラボノイドとSUの相互作用およびミセルナノ粒子による浸透率と保持率(EPR)上昇効果によるものであると考えられる。 
【００１３】
第二の局面に従い、ミセルおよび前記ミセルに封止される薬物から構成されるミセルナノ錯体の調製方法を提供する。(a) 前記薬物を適切な溶媒に溶かしてポリマーフラボノイド共役結合体に添加する。ここに、前記ポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。(b)前記ポリマーフラボノイド共役結合体と前記ミセル内の前記薬物封止から構成するミセルの自己集合により前記ミセルナノ錯体を調製する。
【００１４】
有利な点として、ナノ錯体はポリマーフラボノイド共役結合体と薬物の存在下では自己集合される。さらに有利な点として、ナノ錯体の調製はフラボノイドと薬物の結合特性を利用することによって実現された。
【００１５】
第三の局面に従い、フラボノイドのB環と結合されたポリマーから成るポリマーフラボノイド共役結合体を提供する。
【００１６】
有利な点として、フラボノイドはポリマーと共役結合されている。一つの実施形態においてポリマーはポリエチレングリコール(PEG)とすることができる。有利な点として、ポリマー系ナノ粒子は細胞内皮系システム (RES)による腎クリアランスと腎エントラップメントを両方とも回避し、EPR効果によって腫瘍組織内に蓄積される。さらに有利な点として、PEG安定化ミセルは、PEG表面鎖が体内のRESによる検出とクリアランスを防止するので、無修正ミセルより血漿の半減期が長くなる。さらに有利な点として、 PEGはミセルポリマーとナノ粒子の表面を改質して劣化しない表面を形成するために利用できる。
【００１７】
第四の局面に従い、上記のように定義されたポリマーフラボノイド共役結合体の調製方法であって、前記フラボノイドと前記ポリマーを基本的条件下で求核付加によって結合させる手順から構成され、前記ポリマーには脱離求核群が存在する。
【００１８】
有利な点として、ポリマーフラボノイド共役結合体は求核付加によってアルカリpHで合成しうる。有利な点として、この結合はpH制御条件下におけるフラボノイドB環のC2’位置で PEGなどのポリマーチオール群などの求核群を求核付加することによって達成しうる。
【００１９】
一つの実施形態においてポリマーはポリエチレングリコール(PEG)であり、脱離求核群はチオールである。有利な点として、EGCGなどフラボノイドの電子不足オルトキノンはチオール群などの求核群と反応する。チオール群はシステイン、グルタチオン、プロテインなど多種多様な生分子中に存在する。EGCGはヒト赤血球膜たんぱく質とグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)中のシステイン残留物と共有結合する。さらにシステインとグルタチオンの存在下において酸化されると、EGCGの共有結合付加体が生成される。さらに有利な点として、生成されたEGCGシステイン共役結合体は成長阻害および抗炎症効能を保持すると同時に、EGCGより高い酸化促進作用がある。さらに有利な点として、N-アセチルシステイン結合EGCGはネズミとヒトの肺がん細胞に対して成長阻害およびEGCGのアポトーシス誘導活性を助長する。
【００２０】
第五の局面に従い、ミセルと前記ミセル内部に封止された薬物から構成されるミセルナノ錯体の使用を提供する。前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、ここに前記のポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。
【００２１】
第六の局面に従い、上記に定義されたミセルナノ錯体を抗がん剤に適用する手順から成る腫瘍の処置方法を提供する。
【００２２】
有利な点として、ミセルナノ錯体には脱離薬物より優れる抗がん効果がある。さらに有利な点として、ミセルナノ錯体は内部に薬物を安定的に封止し照準部位へ投与されることによりSUなどの薬物が持つ重篤な副作用を最小限にしうる。こうした投与システムは有益な相乗効果も提供する。
【００２３】
第七の局面に従い、上記に定義された腫瘍処置のためのミセルナノ錯体を提供する。
【００２４】
第八の局面に従い、腫瘍処置用医薬製造への上記に定義されたミセルナノ錯体の応用を提供する。
【００２５】
用語の定義
本明細書に使用される以下の語や用語は次の定義による意味を持つ。
フラボノイド「B環」とは二環構造(6角環(C)で凝縮されたベンゼン環(A)から構成される二環構造)と結合された選択的な置換フェニル基を意味する。選択的な置換フェニル基はC環の2位に結合している。本発明の目的のために、各環を以下のように名づける:
【００２６】
【化１】
0006307631.tif 000002
【００２７】
用語「エピガロカテキンガレート」はエピガロカテキンと没食子酸のエステルを意味し、「エピガロカテキン-3-ガレート」またはEGCGと同義である。
【００２８】
本特許出願の目的のために、「PEG-EGCG共役結合体」という句は特定されない限りPEG-mEGCG共役結合体(EGCG単量体)とPEG-dEGCG (EGCG二量体)共役結合体の両方を意味する。
【００２９】
「大部分が」という語は「全く」を排除せず、例えば、Yから「大部分が脱離」した組成はYから全く脱離している場合を含む。必要に応じて「大部分が」という語は発明の定義から省略される場合がある。  
【００３０】
別段に特定されない限り、「から構成される」や「から成る」という用語及びこれらの文法上の別表現は、記載されている要素を含むが追加的な記載されていない要素も含む場合があることを意味する「開かれた」または「包含的」な語を意味する。 
【００３１】
本明細書に使用される「に関する」や「についての」という用語は調製剤の成分濃度について言う限り、通常の場合は表記値の+/- 5%、より典型的に表記値の+/- 4%、さらに典型的に表記値の+/- 3%、さらに典型的に表記値の+/- 2%、さらに典型的に表記値の+/- 1%、さらに典型的に表記値の+/- 0.5%を意味する。
【００３２】
本明細書を通して特定の実施形態は範囲形式によって開示される場合がある。範囲形式での記述は利便性および簡潔性のためのみであって、開示された範囲の規定的制限として解釈されてはならない。従って、範囲の記述はその範囲内の個々の数値をはじめすべての可能な副範囲を特定して開示したものととらえられるべきである。例えば、1から6までなどの範囲による記述は、その範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、6ばかりではなく、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの副範囲を特定して開示したものと解釈されるべきである。このことは範囲の幅に関わらず適用される。
【００３３】
本明細書においては一部の実施例は広範かつ派生的に記述されることもありうる。派生的開示の範囲に含まれるより狭義の各品種や下位の各派生的群も開示の一部を成す。これには、削除された材料がこの明細書において特定して記載されているか否かに関わらず、属から主題を除いて、条件付きまたは否定的制限付き実施例の派生的記述を含む。
【００３４】
実施例の詳細な説明
ミセルナノ錯体の例示的であって制限的ではない実施例を以下では開示する。 
【００３５】
ミセルナノ錯体はミセルと前記ミセル内部に封止された薬物から構成され、前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、ここに前記のポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。 
【００３６】
一つ以上のフラボノイドが前記ポリマーに結合していてもよい。二つ以上のフラボノイドが前記ポリマーに結合していてもよい。
【００３７】
ポリマーは架橋剤によって前記フラボノイドと結合していてもよい。架橋剤はポリマーとフラボノイドを架橋しうる任意の薬品群であってよい。架橋剤はチオエーテル、イミン、アミン、アゾ、1,2,3トリアゾル群から成る群から選択することができる。架橋剤はアルカン群であってよい。架橋剤はポリマーの任意の部分とフラボノイドの任意の部分の間に存在していてよい。架橋剤はポリマーの終端とフラボノイドの任意の部分の間に存在していてよい。
【００３８】
フラボノイドはフラボノイド単量体またはフラボノイド二量体から成る群から選択することができる。フラボノイド単量体はフラボノイド分子一個から構成されることができる。フラボノイド二量体は架橋剤で架橋された二個のフラボノイド分子から構成されることができる。フラボノイド二量体のうち一個のフラボノイド分子はポリマーと架橋されることができる。フラボノイド二量体の両方のフラボノイド分子は独立的にポリマーと架橋されることができる。一個のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドはB環を介して前記ポリマーと結合されている。一個のフラボノイドが前記共役結合体と結合されている場合、フラボノイドはD環を介して前記ポリマーと結合されている。
【００３９】
二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がB環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はA環を介して前記ポリマーと結合されている。二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がB環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はB環を介して前記ポリマーと結合されている。二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がB環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はD環を介して前記ポリマーと結合されている。
【００４０】
二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がD環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はA環を介して前記ポリマーと結合されている。二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がD環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はB環を介して前記ポリマーと結合されている。二個以上のフラボノイドが前記共役結合体に存在する場合、フラボノイドのうち一個以上がD環を介して前記ポリマーと結合されている。前記の一個以上のフラボノイドのうち片方はD環を介して前記ポリマーと結合されている。
【００４１】
ポリマーは親水性ポリマーであってよい。親水性ポリマーは、アクリルアミド、アルキル、オキサゾリン、アルケニル、イミン、アクリル酸、メタクリル酸、ジオール、オキシラン、アルコール、アミン、無水物、エステル、ラクトン、炭酸塩、カルボン酸、アクリレート、水酸基、リン酸塩、テレフタル酸エステル、アミド、エーテルから成る群から選択されるモノマーから構成することができる。
【００４２】
親水性ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(オキサゾリン)、ポリエチレンイミン、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリル酸、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエーテル、ポリ(アリルアミン)、ポリ酸無水物、ポリ(β-アミノエステル)、ポリ(ブチレンサクシネート)、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリ(グリセロール)、ポリグリコール酸、ポリ(3-ヒドロキシプロピオン酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリル酸)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸co-グリコール酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(2-オキサゾリン)、ポリ(セバシン酸)、ポリ(テレフタル酸エステル-co-リン酸塩)、これらの共重合体から成る群から選択することができる。
【００４３】
親水性ポリマーは多糖であってよい。ポリマーは、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、キトサン、セルロース、アミロース、でんぷん、ゼラチン、カラギナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコル、ゲル化剤、グァーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン、キシログルカン、アルギン酸塩から成る群から選択される多糖であってよい。
【００４４】
親水性ポリマーはポリエチレングリコール(PEG)であってよい。PEGは親水性、柔軟性、生体適合性があるので生物医学用途に使用されてきた合成ポリマーである。具体的には、PEGはミセルポリマーとナノ粒子の表面を改質して劣化しない表面を形成するために利用されてきた。
【００４５】
有利な点として、フラボノイドと共役結合させるポリマーとしてポリエチレングリコール(PEG)が選択された。この共役結合は、pH制御条件下におけるフラボノイドB環のC2’位にPEGのチオール群を求核付加することによって実現された。
【００４６】
フラボノイドはフラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジン、アントシアニジンから成る群から選択することができる。
【００４７】
フラボンは、アピゲニン、ルテオリン、タンゲリチン、クリシン、6-ヒドロキシフラボン、バイカレイン、スクテラリン、ヴォゴニン、ジオスミン、フラボキセイト、7,8-ジヒドロキシフラボンから成る群から選択することができる。
【００４８】
イソフラボンは、ゲニステイン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、ダイジン、グリシチン、アセチルゲニスチン、アセチルダイジン、アセチルグリシチン、マロニル ゲニスチン、マロニルダイジン、マロニルグリシチンから成る群から選択することができる。
【００４９】
フラバンは、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール、ロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラヴィン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシンおよびこれらの混合物から成る群から選択することができる。
【００５０】
アントシアニジンは、オーランチニジン、カペンシニジン、シアニジン、デルフィニジン、ユーロピニジン、ヒルスチジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、プルチェリジン、ロシニジンから成る群から選択することができる。
【００５１】
薬物は治療薬であってよい。治療薬は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格かく乱化学物質、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ I 阻害剤、トポイソメラーゼ II 阻害剤、キナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、抗体薬物共役結合体、ヌクレオチド類似体、前駆体類似体、ペプチド抗生物質、プラチナ系薬物、レチノイド、ビンカ・アルカロイド、サイトカイン、代謝拮抗物質、ビンカ・アルカロイド誘導体、およびその他の細胞毒素から成る群から選択される化学療法剤であってよい。
【００５２】
化学療法剤は、アクチノマイシン、アファチニブ、オールトランス型レチノイン酸、アキシチニブ、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ボスチニブ、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロランブシル、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロンA (C26H39NO6S)、エポチロンB (C27H41NO6S)、エポチロンC (C26H39NO5S)、エポチロンD (C27H41NO5S)、エポチロンE (C26H39NO7S)、エポチロンF (C27H41NO7S)、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、ラパチニブ、レンバチニブ、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ペメトレキセド、ラニビズマブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラスツズマブ、テニポシド、チオグアニン、トファシチニブ、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンから成る群から選択することができる。
【００５３】
化学療法薬はドキソルビシンであってよい。
【００５４】
化学療法剤はスニチニブ(SU)であってよい。SUは、マルチターゲット型チロシン・キナーゼ阻害剤であり、腎明細胞癌 (ccRCC)の第一線治療である。具体的には、SUは腫瘍血管新生と拡散に寄与している血管内皮増殖因子 (VEGF)と血小板由来増殖因子(PDGF)受容体を標的として、ガン細胞を消滅するだけではなく腫瘍血管新生をも削減する。これは後期腎細胞ガン、消化管間質腫瘍 (GIST)、膵神経内分泌腫瘍 (pNET)への使用については認可済みである。また、転移性乳癌、後期非小細胞肺がん、進行（した）肝細胞がん、神経内分泌腫瘍、白血病を治癒する潜在力があることも証明された。しかし、肝臓、心臓や消化管に対する毒性、高血圧、皮膚障害、手足症候群などの重篤な副作用を発生する場合がある。
【００５５】
ミセルナノ錯体はサイズ範囲が30〜300 nm、50〜300 nm、100〜300 nm、30〜50 nm、30〜100 nm、30〜150 nm、150〜300 nm、200〜300 nm、250〜300 nm、100〜150 nm、100〜200 nm、100〜250 nm、130〜180 nm、130〜250 nmのいずれかであってよい。
【００５６】
ミセルナノ錯体は、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上または80%以上で前記ミセル内に存在する前記薬物の添加効率を持つことができる。
【００５７】
ミセルナノ錯体は、1〜10 w/w%、5〜25 w/w%、20〜45 w/w%、 30〜50 w/w%、35〜50 w/w%、40〜50 w/w%、45〜50 w/w%、30〜35 w/w%、30〜40 w/w%または30〜45 w/w%の範囲の前記ミセル内部に存在する前記薬物の負荷量を持つことができる。
【００５８】
ミセルナノ錯体の調製方法はミセルおよび前記ミセルに封止される薬物から構成されることができ、この方法は以下の手順から成る：
a.前記薬物を適切な溶媒に溶かしてポリマーフラボノイド共役結合体に添加する。ここに、前記ポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。
b.前記ポリマーフラボノイド共役結合体と前記ミセル内の前記薬物封止から構成するミセルの自己集合により前記ミセルナノ錯体を調製する。
【００５９】
ステップ(a)はさらに以下のステップから成りうる：
a.前記溶媒を除去して前記薬物と前記ポリマーフラボノイド共役結合体の乾燥フィルムを形成し、さらに、
b.前記乾燥フィルムを水性溶媒中で水和させる。
【００６０】
この方法はさらに、形成されたミセルナノ錯体をろ過または適正な溶媒中で透析して分離するステップから構成されてもよい。
ポリマーフラボノイド共役結合体はフラボノイドのB環と結合されたポリマーから成っていてよい。
【００６１】
ポリマーフラボノイドポリマーは、多糖類、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(オキサゾリン)、ポリエチレンイミン、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリル酸、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリエーテル、ポリ(アリルアミン)、ポリ酸無水物、ポリ(β-アミノエステル)、ポリ(ブチレンサクシネート)、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリ(グリセロール)、ポリグリコール酸、ポリ(3-ヒドロキシプロピオン酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリル酸)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸co-グリコール酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(2-オキサゾリン)、ポリ(セバシン酸)、ポリ(テレフタル酸エステル-co-リン酸塩)、これらの共重合体から成る群から選択することができる。
【００６２】
ポリマーフラボノイド共役結合体のフラボノイドは、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール、ロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラヴィン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシンおよびこれらの混合物から成る群から選択することができる。 
【００６３】
ポリマーはチオエーテル、イミン、アミン、アゾ、1,2,3トリアゾル群から成る群から選択される架橋剤によってポリマーフラボノイド共役結合体中のフラボノイドと共役結合されることができる。架橋剤はアルカン群であってよい。架橋剤はポリマーの任意の部分とフラボノイドの任意の部分の間に存在していてよい。架橋剤はポリマーの終端とフラボノイドの任意の部分の間に存在していてよい。
【００６４】
ポリマーフラボノイド共役結合体のポリマーはポリ(エチレングリコール)であってよく、ポリマーフラボノイド共役結合体の前記フラボノイドはエピガロカテキン-3-ガレート、ポリマーフラボノイド共役結合体の前記架橋剤はチオエーテルであってよい。
【００６５】
ポリマーフラボノイドは次の化学式で表される
【００６６】
【化２】
0006307631.tif 000003
【００６７】
ここに、nは20〜910の範囲である。
【００６８】
ポリマーフラボノイド共役結合体の調製方法は、前記フラボノイドと前記ポリマーを基本的条件下で求核付加によって結合させる手順から構成され、ここに前記ポリマーには脱離求核群が存在する。
【００６９】
求核群はスルフヒドリル、アミン、カルボニル、カルボン酸、アジド、ハロゲン、アルキン、アルケンから成る群から選択することができる。求核群チオール、アミン、ジアゾアルカン、アジドから成る群から選択することができる。
【００７０】
求核群ハチオールであってよい。EGCGは酸素の存在下で酸化され、セミキノン・ラジカルおよび反応性酸素種が関与する経路を経由してオルトキノンを生成する。EGCGの電子不足オルトキノン はシステイン、グルタチオン、たんぱく質など多種多様な生分子中に存在する求核チオール群と反応する。EGCGはヒト赤血球膜たんぱく質とグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)中のシステイン残留物と共有結合する。システインとグルタチオンの存在下において酸化されると、EGCGの共有結合付加体が生成される。その結果生成されるEGCGのシステイン共役結合体は、成長阻害および抗炎症活性を保持しつつ、EGCGより高い酸化促進作用がある。さらに、Nアセチルシステイン結合EGCGはネズミとヒトの肺がん細胞に対して成長阻害およびEGCGのアポトーシス誘導活性を助長する。
【００７１】
結合反応は、反応時間範囲1〜24時間、約1〜時間、約1〜4時間、約1〜8時間、約1〜12時間、約2時間〜4時間、約2時間〜8時間、約2時間〜12時間、約2時間〜24時間、約4時間〜8時間、約4時間〜12時間、約4時間〜24時間、約8時間〜12時間、約8時間〜24時間または約12時間〜24時間で行われることができる。
【００７２】
この方法はさらに、前記フラボノイドの集積を大きく阻止する溶媒の中で結合反応させるステップから成っていてもよい。
【００７３】
この方法はさらに、前記求核群のH2O2媒介酸化を阻止し、そうすることによって前記結合反応を効率化する除去薬物を添加するステップから成っていてもよい。
【００７４】
基本条件はpH範囲7以上10以下、8以上10以下、9以上10以下、7以上11以下、8以上11以下、9以上11以下、10以上11以下、7以上、8以上、9以上、10以上または11以上とすることができる。
【００７５】
ミセルナノ錯体の使用には、ミセルと前記ミセル内部に封止された、薬物投与担体としての薬剤を含むことができ、ここに、前記ミセルはポリマーフラボノイド共役結合体から構成され、さらにここにおいて前記のポリマーは前記フラボノイドのB環と結合している。
ミセルナノ錯体は封止された薬物を生体内標的の腫瘍に投与されることができる。
【００７６】
一つのガン治療方法はミセルナノ錯体をガン患者に投与するステップから構成されることができる。一つの腫瘍治療方法はミセルナノ錯体をガン患者に投与するステップから構成されることができる。
【００７７】
ミセルナノ錯体は、吸入スプレーによって非経口的に、局部的に、直腸経由で、鼻腔経由で、口腔から、膣から、インプラントリザーバーにより、注射により、皮下的に、腹腔内に、経粘膜的に、経口または眼科用剤により投与することができる。
【００７８】
非経口的投与は、皮下注射により、皮内に、静脈内に、筋肉注射で、関節内に、動脈内に、滑液嚢内に、胸骨内に、くも膜下に、病巣内に、頭蓋内注射により、または点滴によるものから構成されることができる。
【００７９】
前記ミセルナノ錯体内に存在する薬物は一日当たり約1〜約80 mg/kg、一日当たり約1〜約2 mg/kg、一日当たり約1〜約5 mg/kg、一日当たり約1〜約10 mg/kg、一日当たり約1〜約20 mg/kg、一日当たり約1〜約50 mg/kg、一日当たり約2〜約5 mg/kg、一日当たり約2〜約10 mg/kg、一日当たり約2〜約20 mg/kg、一日当たり約2〜約50 mg/kg、一日当たり約2〜約80 mg/kg、一日当たり約5〜約10 mg/kg、一日当たり約5〜約20 mg/kg、一日当たり約5〜約50 mg/kg、一日当たり約5〜約80 mg/kg、一日当たり約10〜約20 mg/kg、一日当たり約10〜約50 mg/kg、一日当たり約10〜約80 mg/kg、一日当たり約20〜約50 mg/kg、一日当たり約20〜約80 mg/kgまたは一日当たり約50〜約80 mg/kgの用量で投与することができる。
【００８０】
がん患者は、副腎皮質がん、AIDS関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、グレード1(未分化)星状細胞腫、グレード2星状細胞腫、グレード3星状細胞腫、グレード4星状細胞腫、中枢神経系非定型奇形腫様腫瘍/桿状腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、気管支がん、気管支肺胞上皮がん、バーキットリンパ腫、子宮頚がん、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞性リンパ腫、子宮内膜がん、子宮内膜子宮がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌、肝門部胆管癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭がん、口唇がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、内分泌腺腫瘍、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成、骨髄異形成性/骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣明細胞癌、上皮性卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、松果体実質細胞腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、第15染色体異常による気道癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、頸部扁平上皮がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、喉頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂がん、尿道癌、子宮肉腫、膣がん、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、腎芽細胞腫から成る群から選択されるがんに患っていることがある。
【００８１】
腫瘍患者は、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、グレード1(未分化) 星状細胞腫、グレード2星状細胞腫、グレード3星状細胞腫、グレード4星状細胞腫、中枢神経系非定型奇形腫様腫瘍/桿状腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、気管支がん、子宮頚がん、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、子宮内膜がん、子宮内膜子宮がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌、肝門部胆管癌、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭がん、口唇がん、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、髄様上皮腫、内分泌腺腫瘍、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成、骨髄異形成性/骨髄増殖性腫瘍、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣明細胞癌、上皮性卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、松果体実質細胞腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、第15染色体異常による気道癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、頸部扁平上皮がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、喉頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂がん、尿道癌、子宮肉腫、膣がん、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、腎芽細胞腫から成る群から選択されるがんに患っていることがある。
【００８２】
ミセルナノ錯体はがん治療に使用しうる。ミセルナノ錯体は腫瘍治療に使用しうる。
【００８３】
ミセルナノ錯体はがん治療薬製造に使用することができる。ミセルナノ錯体は腫瘍治療薬製造に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
付帯図面は開示された実施形態を図解するものであり、開示された実施形態をの原理を説明するためのものである。しかし、図面は図解のためにのみ意図されており、発明を制限する規定として解釈されてはならない。
【図１】PEG-mEGCG共役結合体 (108)の合成スキーマである。チオール官能化PEG (PEG-SH) (102)はアルカリpH (106)であるDMSOと水の1:3 (v/v)混合液の中でEGCG (104)共役結合された。
【図２】DI水に濃度0.5 mg mL-1で溶解させたPEG-EGCG共役結合体 (202)とPEG (204)のUV-Visスペクトルである。
【図３】EGCG (302)とPEG-mEGCG共役結合体 (304)のHPLCクロマトグラムである。矢印は280 nmでモニタリングを行った試料のピークを指す。
【図４】反応時間の関数として表したPEG-mEGCG共役結合体結合の度合いである。
【図５】D2O.に溶解させたPEG-mEGCG共役結合体の1H NMRスペクトルである。
【図６】ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の組成を示す概念図である。
【図７】異なるPEG-mEGCG:ドキソルビシン重量比で調製されたドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の(A)サイズと(B)ゼータ電位を表すグラフを示す。調製されたままのナノ錯体(黒線、702)のサイズとゼータ電位を 再構成ナノ錯体(×印で示す線、704)のものと比較した。
【図８】異なるPEG-mEGCG:ドキソルビシン重量比で調製したドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の(A)薬物負荷効率と(B)負荷量を表すグラフを示す。
【図９】37oCにおけるPBS (pH 7.3)でのドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の試験管内薬物投与特性を示す。PEG-mEGCG:ドキソルビシン重量比 = 1:1。
【図１０】SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体形成の概念図である。
【図１１】異なるPEG-EGCG:SU重量比でのSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の(A)サイズ、(B) PDI、(C) ゼータ電位を示すグラフである。
【図１２】異なるPEG-EGCG:SU重量比において調製したSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の(A)薬物負荷効率と(B)薬物負荷量を表すグラフを示す。
【図１３】37oCのPBS (pH 7.3)における異なるPEG-EGCG:SU重量比での(A) SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体と(B) SU/PEG-dEGCG ミセルナノ錯体の試験管内薬物投与特性を表すグラフである。
【図１４】SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体を投与されたマウスと(PEG-EGCG:SU重量比特定)と対照群と対比した、毎日経口SU処置(60 mg/kg)を受けたマウスの毎週体重測定値を表すグラフである。
【図１５】(A)腫瘍サイズ(光信号で数量化)と(B)SU/PEG-EGCGミセルナノ錯体(PEG-EGCG:SUの特定重量比)処置、経口SU処置、または未処置マウスの発光画像を示す画像である。
【図１６】SU/PEG-mEGCG 8:1 ミセルナノ錯体を用途されたマウスと対象群と対比した毎日経口SU処置(40 および15 mg/kg)を投与されたマウスの体重測定値を表すグラフである。
【図１７】経口SU/PEG-mEGCG 8:1ミセルナノ錯体処置、経口SU処置、または未処置のマウスにおける腫瘍サイズを表すグラフである。
【００８５】
例
具体的実施例を参照することによって本発明および比較例の非限定的例について詳細に説明する。これらの実施例はいかなる場合にも本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。
【００８６】
例1：材料と細胞培養
素材
チオール終端(PEG-SH、Mw = 5000 Da)を持つメトキシポリエチレングリコールをJenKem Technology (中国)から入手した。アルデヒド終端 (PEG-CHO、Mw = 5000 Da)を持つメトキシポリエチレングリコールを日本の日油株式会社から入手した。(-)-エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG、> 95% 純度)は栗田工業（日本、東京）から入手した。ピルビン酸ナトリウム溶液 (100 mM) はInvitrogen (シンガポール)から購入した。Ca2+ と Mg2+ (150 mM、pH 7.3)を含まないPBS生理食塩水はシンガポールBiopolisの媒質調製施設から供給を受けた。DMSOとトリエチルアミン (TEA) はSigma-Aldrich (シンガポール)から購入した。塩酸ドキソルビシン(DOX・HCl)はBoryung Pharm. Inc. (韓国)から購入した。SU (脱離基形態)はBioVision （米国）から購入した。その他すべての化学品は分析グレード品であった。
【００８７】
細胞培養
ヒト腎細胞がん細胞A498はAmerican Type Culture Collection (ATCC、Manassas、VA、USA)から入手し、DulbeccoのModified Eagle媒質に10% ウシ胎仔血清、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、2 mMのグルタミン、0.1 mMの非必須アミノ酸を添加した中で培養した。安定的A498 細胞クローンルシフェラーゼ遺伝子発現 (A498-luc) は既述に従って生成された。要約すると、A498細胞を濃度5x105細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種し、リポフェクタミン 2000 (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド)を使用してpRC-CMV2-lucプラスミドで移入した。1日後、移入細胞を100-mm 細胞培養トレイへ移し、1 mg ml-1 ジェネチシンを媒質に添加し、耐性細胞を選択した。選択から1週間後、耐性細胞を96ウェルプレートに密度1細胞/ウェルでコロニーから播種した。合計10コロニーを選択して増殖させ、ルシフェラーゼ活性をPromega Kit (米国ウィスコンシン州マディスン)を使用して単管照度計 (Berthold Lumat LB 9507、バート・ヴィルトバート、ドイツ)で測定した。ルシフェラーゼ活性が最も高いクローンを選んで500 mg  m1-1 ジェネチシンで維持した。
【００８８】
例2：PEG-EGCG共役結合体
この研究においては、二種類のPEG-EGCG共役結合体を使用してミセルナノ錯体、PEG-mEGCG、PEG-dEGCGを組成し、これらは各1個および2個のEGCG部分がPEG末端にある。
【００８９】
PEG-mEGCG共役結合体の合成
EGCGをチオール終端をもつPEGに共役結合させてPEG-mEGCG共役結合体を合成した。典型的に、EGCG (18.3 mg、40 μmol)を20 mLのPBSとDMSOを1:1 (v/v)で混ぜた混合液に溶解した。PEG-SH (Mw = 5000 Da、JenKem Technology、中国) (100 mg、20 μmol) を別個20 mLのPBSに溶解した。このPEG-SH溶液をEGCGの攪拌溶液に滴下して添加した。対照実験として、未修正PEG溶液を同濃度のEGCGの攪拌溶液に添加した。こうして得られた混合駅はpH 8.4である。この混合物を7時間25oCで攪拌した。この溶液に、1.6 mLの10%酢酸を添加しpHを4 にして反応を停止した。こうして得られた溶液を分画分子量(MWCO)が1,000 Daである透析管へ移した。この管をDI水で透析した。精製された溶液を凍結乾燥してPEG-mEGCG共役結合体を取得した。PEG-mEGCG共役結合体の組成は1H NMR分光分析によって確認された。乾燥PEG-mEGCG共役結合体をD2O に濃度20 mg mL-1 に溶解し、400 MHz Bruker AV-400 NMR分光計で解析した。歩留り：89%。1H NMR (D2O): δ 2.9 (t、H-α、 PEGから)、3.4 (s、H-γ、 PEGから)、3.5-3.8 (m、PEGのプロトン)、5.5 (s、C環のH-2)、5.85 (s、 C環のH-3)、6.15 (d、A環のH-6とH-8)、6.9 (s、B環のH-6’)、7.05 （s、D環のH-2” とH-6”）。
【００９０】
図 1はPEG-mEGCG共役結合体(108)の合成スキーマである。チオール官能化PEG (PEG-SH) (102)をモル過剰2倍としたEGCG (PEG-SH: EGCG = 1:2) (104)を用いてアルカリ性pH (106)の1:3 (v/v) のDMSOと水混合液中で培養した。pHがEGCGの自己酸化プロセスに決定的な影響を与えることが報告されている。アルカリpH 7〜9.5において、B環上のガロイル部分はD環上のガレート部分よりも自己酸化しやすい。その結果B環上のガロイル部分しかオルトキノンを形成しない。強アルカリ条件下(pH > 10)で、D環上のガレート部分も自己酸化してオルトキノンを形成する。本研究においては、反応はpH 8.4で行われ、EGCGのB環に オルトキノン のみを生成させられるようにした。オルトキノンへのその後のPEG-SH求核付加は共役チオエーテル結合によって結合されたPEG-mEGCG共役結合体を生成した。
【００９１】
結合反応がジメチル・スルホキシド (DMSO)の存在下において進行したことは注目に値する。EGCGは水性溶液中でPEGと接触すると凝集するので、EGCGをPEG-SHに共役結合させる間に凝集を回避するはずである。DMSOが効果的に凝集を阻止したことが発見された。この事実に基づいて、結合反応をDMSOと水の混合液中で行った。さらに、ピルビン酸ナトリウムを EGCGの自己酸化中に生成される H2O2 の排除剤として使用した。ピルビン酸ナトリウムは脱離チオール群をH2O2媒介酸化から保護し、EGCGとの結合反応に投入されるPEG-SH分子数を増加させる。取得されたPEG-mEGCG共役結合体を窒素雰囲気化で透析によって精製し、次に凍結乾燥したところ白粉を得た。
【００９２】
PEG-mEGCG共役結合体のUV-Vis 定性分析
PEG-mEGCG共役結合体は紫外可視(UV-Vis)分光分析 (図 2)による定性分析を行った。
【００９３】
PEG-mEGCG共役結合体のUV-VisスペクトルをHitachi U-2810分光光度計（日本）で測定したUV-Vis分光分析は、乾燥PEG-mEGCG共役結合体PEGをDI水に濃度0.5 mg mL-1で溶解させて行った。未操作PEG (204)とは異なって、PEG-mEGCG共役結合体 (202)は280 nmで強力なUV吸収ピークを示し、EGCGの結合に成功したことを意味する。さらに、EGCG二量体その他の酸化性物質に対応する425 nmでのUV吸収帯は観察されなかった。
【００９４】
PEG-mEGCG共役結合体のHPLC定性分析
PEG-mEGCG共役結合体は逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による評価も行った。逆相HPLCはWaters 2695 分離モジュールにSpirit(登録商標) C18有機カラム(5 μm、4.6 × 250 mm i.d.、AAPPTec)を搭載して行った。EGCG、PEG/EGCG混合液、PEG-mEGCG共役結合体をDI水に濃度1 mg mL-1.で溶解した。試料は、1%酢酸をアセトニトリルに、1%酢酸を水に25oCで流量1 mL/分において混ぜた混合溶媒に溶出した。流動相に関しては、アセトニトリル：水の容量比が0 分のとき3:7から10分後に4:6と逓増した。溶出試料を280 nmで観察した。EGCG結合の度合いは統合化ピーク領域を異なる濃度の EGCG 規定溶液から得られたピーク領域と比較して同定した。図 3に示されるように、EGCG (302)は 保持時間4.8分で溶出させたと同時に、PEG-mEGCG共役結合体 (304)は8分で溶出させた。この劇的な保持時間の変化は親水性PEG鎖がEGCGに付加されたことによって説明がつくようである。さらに、非EGCG ピークをPEG-mEGCG共役結合体のHPLCクロマトグラムで観察したところ、未反応EGCG分子は透析によって全て除去されていた。EGCG 結合の度合いは反応時間が6から7時間へ長くなるにつれて 63%から98%へ増加した(図 4)。しかし、反応時間が 8時間だったときには、この結合度は若干下がり、EGCG二量体その他酸化性物質が生成されはじめたことを示すようである。従って、最適な反応時間は7時間であった。
【００９５】
PEG-mEGCG共役結合体の1H NMR 定性分析
PEG-mEGCG共役結合体の組成を 1H 核磁気共鳴(NMR)分光分析によって同定した。図 5に示されるように、PEG-mEGCG共役結合体はA環(H-6、H-8 ＠δ = 6.15)、C環(H-2 ＠δ = 5.5 、H-3 ＠δ = 5.85)、D環(H-2’’、 H-6’’ ＠ δ = 7.1)でタンパク質信号を示した。A、C、D環から発生したタンパク質信号は未操作EGCGのものと同一であり、これらの部分が結合反応中変化しなかったことを示唆する。対照的に、B環のタンパク質信号は結合反応後に6.5から6.9 ppmへ変化した。タンパク質信号がこれ程大幅に変化したのはPEG-SHがB環のC2’位に付加されたことによるものと考えられる。さらに、B環のNMRピークはD環ピークの下領域の半分の領域を示したがこれは、B環上のプロトンが一個結合反応後になくなったことを示す。この観察された現象は以前のレポートと整合的であって、ここに2’システイニルEGCGの生成がB環からH-2’原子を消滅させたからである。上記の結果はPEG分子一個のみが 具体的にはEGCGのB環のC2’位に共役結合できたことを明らかに示す。
【００９６】
PEG-dEGCG共役結合体の合成
PEG-dEGCG共役結合体はEGCGをアルデヒド末端群(PEG-CHO)を持つPEGに共役結合して合成した。PEG-CHO (Mw = 5000 Da、日本の日油株式会社) (1.75 g) とEGCG (3.25 g、7.09 mmol)を別個に酢酸、水、DMSO混合液に溶かした。反応はPEG-CHO溶液を滴下して添加することによって開始し、20oCで72時間に渡って行た。こうして得られる溶液をDI水で透析 (MWCO = 3500 Da)した。精製された溶液を凍結乾燥してPEG-dEGCG共役結合体を取得した。
【００９７】
例3：ドキソルビシン/PEG-mEGCG共役結合体
がん治療への応用のために、PEG-mEGCG共役結合体は大量の抗がん剤を内部に保持可能なミセルナノ錯体を生成させるために設計された。この研究においては、PEG-mEGCGミセルナノ錯体をドキソルビシンの投与担体として使用した。ドキソルビシンは最も普及している化学療法薬の中の一つであり、白血病、乳がん、卵巣がんや肺がんなど多くの種類のがんに対して強力な細胞毒性活性を示す。しかし、重篤な心臓毒性があり、鬱血性心不全、不整脈、高血圧その他の副作用がある。薬剤分子を内部に安定的に封止し持続的に放出できることから、PEG-mEGCG ミセルナノ錯体がこうした副作用を軽減できることは明らかである。
【００９８】
ドキソルビシン/PEG-mEGCGミセルナノ錯体の調製
ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体を透析によって調製した。要約すると、5 mgのDOX・HClを4.5 mL のジメチルフォルムアルデヒドに溶解した。この溶液に、TEAを TEA:DOX・HClモル比5:1で添加した。この混合液を 30 分間ボルテックスして脱プロトン化ドキソルビシン (DOX)を生成した。こうして得られるDOX溶液を0.5 mLのジメチルフォルムアルデヒドに異なるPEG-mEGCG/ DOX重量比で溶解したPEG-mEGCG共役結合体と混合した。この混合液を 90 分間ボルテックスし、MWCOが2,000 Daの透析管に移した。この管をDI水で24時間透析し、ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体を得た。
【００９９】
ドキソルビシン/PEG-mEGCGミセルナノ錯体の定性
ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の流体力学直径、多分散性指数、ゼータ電位を動的光散乱装置(Zetasizer Nano ZS、英国マルヴァーン)で評価した。測定は 25oCの水中で三回行った。ドキソルビシンの保持量を測定するため、水中に拡散した20 μLのナノ錯体を980 μLのジメチルフォルムアルデヒドと混ぜ、ドキソルビシンを抽出した。480 nmにおけるドキソルビシンの吸収量をHitachi U-2810分光光度計（日本）で測定した。薬剤負荷効率と負荷量は吸収量の値を、異なる濃度の各種ドキソルビシン規定溶液から得られたものと比較して同定した。
【０１００】
図 6はドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の調製を示す。PEG-mEGCG共役結合体 (602)とドキソルビシン (604) はジメチルフォルムアルデヒド (606)に併存して溶解していた。この混合液を蒸留水で(608)透析した。有機溶媒を透析管から除去するにともない、共役結合体の内疎水性EGCG 部分は相互に結合し始め、親水性PEG鎖 (610)の殻に囲まれたミセルコアを形成した。同時に、ドキソルビシン分子を疎水性ミセルコアの中に分割した。ドキソルビシン分子が、平面アントラサイクリン環間のπ-π相互作用によって水性溶液中では容易に積層されることも報告された。EGCGはπ-π積層化によってドキソルビシンと相互作用するポリフェノール構造をしているので、ミセルナノ錯体のコアに濃縮されたEGCGがドキソルビシンをこの中に把捉するために有利な環境を生む可能性があるものと推定した。さらに、表面が露出したPEG環はミセルナノ錯体の回りに保護殻を形成して細胞内皮系システムによる排除を免れる可能性があり、血中で長時間循環することが可能になる。
【０１０１】
ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体のサイズと表面電荷は動的光散乱(DLS)解析を用いて定性された。[図 7]はドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の(A)サイズと(B)ゼータ電位を表すグラフを示す。
【０１０２】
図 7AはPEG-mEGCG 対ドキソルビシンの異なる重量比で調製したミセルナノ錯体の流体力学直径を示す。注目される点として、ナノ錯体はサイズ 範囲が130〜180 nmで生成されたことである。これほどの小さいサイズは浸透性と貯留の強化(EPR)効果により血中で長時間循環し、腫瘍に照準を当てるために有利である。PEG-mEGCG:ドキソルビシン重量比0.5:1で組成されるミセルナノ錯体は1:1で組成されたものより直径が大きい。これより多いドキソルビシンの捕捉がより大きいミセルナノ錯体の組成に寄与している可能性が高い。ナノ錯体は極めて単分散性であって、このことは多分散指数(PDI)の値が0.1〜0.2の間で地位さことから明らかである。
【０１０３】
図 7Bに示されるように、ミセルナノ錯体は+15〜25 mVの範囲でプラスのゼータ電位を持つ。この陽イオンによる表面電荷はナノ錯体の中でプラスに帯電したドキソルビシン分子の封止によるものである。ミセルナノ錯体がフリーズドライ工程の間構造的一貫性を維持できるか否かについても発明者らは評価した。フリーズドライはコロイド状ナノ粒子の長期保存のために使用される最も普及している技術の中の一つである。ナノ錯体を凍結乾燥してから同濃度のDI水に再度分散させた。再構成ナノ錯体は、凍結乾燥保護剤を用いずとも、当初の粒子サイズと表面の電荷を維持することが判明した。このようにコロイド状態の程度が高い安定性は臨床用途とミセルナノ錯体の商品化にとって有利であると考えられる。
【０１０４】
図 8はドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の薬物負荷効率と負荷量を示す。薬物負荷効率は75%超であり、ドキソルビシンがPEG-mEGCG ナノ錯体に効率的に合体したことを示す。PEG-mEGCG:ドキソルビシン重量比が下がるに伴い、薬物負荷効率と負荷量とも増加した。観察された負荷量 (35-50 w/w%)は他のポリマーic ミセルシステムによって達成されたものよりはるかに高かった。EGCGとドキソルビシンのπ-π積層や疎水性相互作用がPEG-mEGCG ミセルナノ錯体の高い薬物負荷能力に重要な役割を持つものと思われる。
【０１０５】
ドキソルビシン放出研究
薬物放出の実験においては、0.5 mLのドキソルビシンで負荷されたナノ錯体(2 mg mL-1) をMWCO が2,000 Daの透析管に入れた。この管を25 mLのPBSに浸漬し、37oCでインキュベーターによって攪拌した。所定時点に、1 mLの放出された媒質を回収し、新鮮なPBS等量で置き換えた。媒質中に放出されたドキソルビシンの量はHitachi U-2810分光光度計（日本）を使用して480 nmにおけるドキソルビシンの吸光度を測定して同定した。
【０１０６】
ドキソルビシン/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の薬物放出特性は生理条件の温度とpHにおいても分析した。図 9に示されるように、ミセルナノ錯体はPBS中でドキソルビシンを持続的に放出した。およそ11%の負荷ドキソルビシンが7日以内に放出された。観察された放出率は先に報告された他のドキソルビシンデリバリシステムよりはるかに低い。この持続的薬物放出はミセルナノ錯体内でのEGCGとドキソルビシンの間の強い相互作用によるものと考えられる。さらに、初期段階にのみ僅かな突発的放出が観察されたにとどまり、ドキソルビシン分子がミセルナノ錯体の内部に安定的に封止されていたことを示唆する。こうした低率の薬物漏えいは、副作用は最小限であって治療効果は最大限に得られるために不可欠であり、ナノ錯体に封止された分子は血流中を循環する間に早期に漏れ出す可能性が低いものと考えられる。以上をまとめると、これらの結果はPEG-mEGCG ミセルナノ錯体はがん治療のためにドキソルビシンの全身投与に応用できる可能性があることを示す。
【０１０７】
例4：SU/PEG-EGCG共役結合体
SU/PEG-EGCGミセルナノ錯体の形成
図 10 は固体分散法によるSU/PEG-EGCGミセルナノ錯体の形成を図解したものである。要約すると、2 mgのSU (1006)を1 mL のクロロフォルムに溶解した。次に、SU溶液をガラスバイアル中で（PEG-mEGCG (1002)またはPEG-dEGCG (1004)）PEG-EGCG:SU重量比(1008)を変えて、PEG-EGCG 共役結合体に、添加した。この溶液のクロロフォルムを減圧(1010)下で揮発させた。こうして得られたPEG-EGCGの薄膜とSU混合液 (1012)の表面(1014)に2 mLの水を添加して水和化し、周囲温度下で24時間培養した。その結果えられた薄膜が水和化されるにともない、PEG-EGCGは自己凝集し、SUとEGCG 部分を水和化PEG鎖から分離することによってミセルナノ錯体を形成した。次にSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体溶液を0.8-μm フィルター (Sartorius Stedim Biotech GmbH、ドイツ)を通してろ過 (1016)し、残留脱離薬物を除去し、透明なSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体溶液 (1018)を得た。生体内の研究用に、SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体溶液をさらに0.2-μm フィルター (Sartorius Stedim Biotech GmbH、ドイツ)ろ過した。
【０１０８】
PEG-EGCG共役結合体が特定しない限りPEG-mEGCGとPEG-dEGCGの両方を指すことに注意しなければならない。
【０１０９】
EGCGは疎水性相互作用とπ-π積層化によってSUと相互作用するポリフェノール構造をしているので、ミセルナノ錯体のコアに濃縮されたEGCGがSUを把捉するために有利な環境を提供しうるものと推定した。さらに、表面が露出したPEG環はミセルナノ錯体の回りに高度に水和化された殻を形成してRES（細胞内皮系システム）による排除を免れる可能性があり、血中で長時間循環することおよび副作用の軽減が可能になる。
【０１１０】
SU/PEG-mEGCGミセルナノ錯体の定性
SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体の流体力学直径、サイズ分布、表面電荷を動的光散乱装置(DLS)(Zetasizer Nano ZS、英国マルヴァーン)で評価した。測定は 25oCの水中で三回行った。図 11Aは異なるPEG-EGCG:SU重量比において調製したミセルナノ錯体の流体力学直径を示す。注目される点として、ミセルナノ錯体はサイズ範囲130〜250 nmで生成されたことである。ナノメートルサイズは血中循環時間を延ばすために有利であって、EPR効果による腫瘍への照準を当てやすくなる。ミセルナノ錯体の特性はPEG-EGCG:SU重量比を変えて制御した。図 11BはPEG-EGCG:SU重量比 8 ：16で形成されたミセルナノ錯体が高度に単分散型であったことを示す。PEG-EGCG:SU重量比の増加に伴いミセルナノ錯体のプラス電荷は減少した(図 11C)。若干プラスに帯電した表面はプラスに帯電したSU分子の封止によるものであった。
【０１１１】
薬物負荷効率と分量を測定するため、水中のミセルナノ錯体10 μLを990 μLのDMFに溶解し、431 nmでのSUの吸光度を Hitachi U-2810 紫外可視(UV-Vis)分光光度計（日本）を使用して測定した。SU規定溶液によって得られた較正曲線を使用し、負荷効率と負荷量を同定した。
【０１１２】
図 12はSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の薬物負荷効率と負荷量を示す。PEG-EGCG:SU重量比が1 から16へ増加するに伴い、薬物負荷効率は~ 30%から~ 80%へ増加した。SU/PEG-dEGCG ミセルナノ錯体の負荷効率はSU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体より高かったので、SUが、PEG-mEGCGとよりもPEG-dEGCGとのほうがよりよく相互作用することがここに示された。ミセルナノ錯体の負荷効率がろ過前の未負荷SU沈殿物量に関連していることも判明した。PEG-EGCG:SU重量比を 8へ増やすと、SU沈澱は発見されなかった。期待通りに、ミセルナノ錯体の負荷量はPEG-EGCG:SU重量比が増加するに伴い、ミセルナノ錯体内のPEG-EGCG濃度が高くなることによって増加した。
【０１１３】
SUの放出研究
SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の薬物放出特性を生理的条件(リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.3 ＠37oC)の中で分析した。SU放出の実験においては、0.5 mLのSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体 (0.4 mg mL-1)を透析管 (MWCO = 2,000 Da)に入れた。この管を25 mLのPBSに浸漬し、37oCでインキュベーターによって攪拌した。所定時点に、1 mLの放出された媒質を回収し、新鮮なPBS等量で置き換えた。媒質中に放出されたSU量はHitachi U-2810分光光度計（日本）を使用して431 nmにおける吸光度を測定して同定した。
【０１１４】
図 13に示されるように、ミセルナノ錯体はSUをPBS内に持続的に放出した、これはミセルナノ錯体内でのEGCG とSU間の協力な相互作用によるものであった。さらに、突発的な薬物の放出はほとんど観察されず、SU分子がミセルナノ錯体の内部に安定的に封止されていたことを示す。SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体は、SUとmEGCG部分の間の相互作用が弱いことによって、SU/PEG-dEGCG ミセルナノ錯体より速くより多くのSUを放出することが示された。放出率と放出量はPEG-EGCG:SU重量比に依存していた。SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体に関しては、PEG-EGCG:SU重量比の増加に伴い放出率と放出量ともに減少した。PEG-EGCG:SU重量比はSU/PEG-dEGCG ミセルナノ錯体内の放出率と放出量に大きく影響しなかった、但し、PEG-EGCG:SU重量比 8のときには放出率が下がり量も下がった点を除く。
【０１１５】
生体内の治療研究
毒性および治療効果を研究するため、ミセルナノ錯体の生体内研究を行った。皮下腎細胞がんモデルを作成した。成人メス Balb/c胸腺欠損、免疫不全ヌードマウス (平均体重= 19 g、年齢 = 6〜8週) を使用した。
【０１１６】
静脈注射によるSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の治療効果を研究するため、皮下注射により6x106 A498-luc細胞をマウスの左腿の付け根に接種することによって異種移植片腫瘍モデルを作成した。腫瘍接種から6日後に、ネズミを4群に分け、異なる溶液 (群当たり個体数n = 8) の尾静脈注射を週二回の割合で5週間行う一方、一つの群は毎日SUの経管栄養を60 mg/kgで受けた。尾静脈注射に関しては、容量200 lの試料溶液を使用した。
【０１１７】
A498-luc細胞から出る生物発光信号をモニターするため、イソフランガスで麻酔したネズミの腹腔内にPBSに溶解させた200 lのDルシフェリン(5 mg ml-1、Promega)注入し、CCDカメラを搭載したIVIS画像処理システム (Xenogen、Alameda、CA、米国)カメラボックスの中の温めた台(30oC)に乗せた。発光画像をルシフェリン注射の20 分後に30-s取得として取った。A498-luc細胞からの発光をデジタル化し、擬似カラーオーバーレーとしてネズミのグレースケールイメージの上に電子的に表示した。光信号の画像と測定値を取得し、Xenogen画像処理ソフトウェアv3.2で解析し、光子として計量した。腫瘍サイズと体重を週一回測定した。ネズミの取扱いと世話はすべて、シンガポールの国家実験動物研究顧問委員会により発行された化学的目的用動物の世話と使用に関するガイドラインに従って行った。
【０１１８】
すべてのデータを平均値± 平均標準誤差(SEM)として表した。平均値間の差の統計的有意性はスチューデントのt検定によって判定した。複数比較は、SigmaStat 3.5を使用してBonferroniの多数比較試験を応用して ANOVA で評価したP値< 0.05を統計的に有意であると判断した。
【０１１９】
SU/PEG-mECGCミセルナノ錯体（PEG-EGCG:SU重量比 8 ： 16）とSU/PEG-dEGCG ミセルナノ錯体（PEG-EGCG:SU重量比8）を、ミセルナノ錯体サイズ、サイズ分布、表面電荷に基づく生体内研究のために選択した。SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体を静脈内に週2回、5週間注入し、一群は毎日 60 mg/kgのSU経管栄養を受けた。一日当たり60 mg/kgの経口薬物投与は、SUの抗腫瘍効能が一日当たり40-80 mg/kgで最適な前臨床用量であることが実証されているこれまで報告されているところに基づいて選択した。発明者らの研究のために、他の研究においては一日当たり用量< 40 mg/kgでは効能を発揮しないこと、一日当たり用量120 mg/kgでは薬物の投与量をさらに高めた場合の効果をテストする量となることが示されたことに基づいて、一日当たり用量60 mg/kgは抗腫瘍用量として効果的であることが示された。
【０１２０】
図 14 は処置開始から一週間後に経口脱離SUを受けた群で大幅な減量があったことを示している。このことはSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体処置を投与された他の群では観察されなかった。抗腫瘍効果は、毎日 SU 経口治療よりSU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体を週二回投与したとき強化された (図 15)。SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体によるこの抗腫瘍効果は経口投与濃度の約1/10で得られた。5 週間後に治療は停止されたが、SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の阻害効果はかなりの期間継続した。腫瘍再発率は経口処置群ではミセルナノ錯体処置を受けた群よりはるかに高かった。
【０１２１】
経口投与によるSU/PEG-mEGCG MNCの治療効果を調査するため、100 μlのPBSと100 μl のMatrigel (BD Bioscience) に懸濁させた4x106 ACHN細胞を皮下注射によりマウスの右腿の付け根に接種することによって、異種移植片腫瘍モデルを作成した。腫瘍容積が200 mm3に達したとき、マウスを4群に分けて異なる溶液 （群当たり個体数n = 8）によって毎日5週間経口経管栄養を空建てた:対照群（クエン酸緩衝pH5）、SU/PEG-mEGCG 8:1 （SU ＠15 mg/kg）、SU ＠15、40 mg/kg。腫瘍はデジタルキャリパーを用いて週二回測定し、腫瘍の体積(mm3)は次の式によって計算した: 体積 = (長さ × 幅2)/2 (図16、17)。
【０１２２】
一日当たり経口SU用量60 mg/kgでは毒性が強すぎたことがすでに証明されていたので、この開示のためには一日当たり経口SU 用量を40 mg/kgとした。この一日当たり経口SU 用量を40 mg/kgは以前の報告に基づいてマウスにおいては抗腫瘍効果がある最適な前臨床用量(一日当たり40〜80 mg/kg)である。図 16は処置中に40 mg/kgのSUを受けた群では大幅な減量があったことを示す。このことはSU/PEG-mEGCG MNC 8:1とSU ＠ 15 mg/kgの処置を受けた他の群では観察されなかった。15 mg/kgの等量SU用量では、SU/PEG-mEGCG MNCはSUのみよりかなり高い治療効果を示した (図 17)。SU/PEG-mEGCG MNC によるこの抗腫瘍効果は最適経口SU用量40 mg/kg濃度の半分未満で達成できた。5 週間後に治療は停止されたが、SU/PEG-mEGCG MNCの阻害効果はかなりの期間継続した。
【０１２３】
EPR 効果は、腫瘍欠陥の解剖学的生理学的性質を検討し、腫瘍血管から選択的に漏れ出て腫瘍組織に蓄積する高分子の40 kDaを越す量の移送を容易にする。最も固形の腫瘍は欠陥のあるアーキテクチャを持つ血管を持ち、これが通常は大量の血管透過性に至る。このことは正常な組織では発生しない。本発明はccRCC 治療のために初めて、SU/PEG-mEGCG ミセルナノ錯体を血管内投与と経口投与の両方を可能な治療法として用いた。EGCGがSUと相互作用することが観察されたほか、ラットでの薬物動態分析ではEGCG投与がSUの血漿内濃度を顕著に削減したことが示された。緑茶とSUのすでに報告がある相互作用および多種多様な腫瘍に対するミセルナノ粒子のEPR 効果は、PEG-EGCGをSUデリバリ用ナノ粒子担体として使用できることを示唆している。極めて脈管原性の高い腫瘍である神経膠芽腫の場合、抗血管新生療法が高いと同時に一過性でもある効果があることを示した。このような腫瘍はVEGFによって促進されるプロセスによる血管新生を刺激するが、この結果生じる血管は構造的にも機能的にも異常である。SU/PEG-EGCG ミセルナノ錯体の使用はこれらのケースでは抗血管新生活性を潜在的に高める可能性がある。
【０１２４】
産業への応用可能性
ミセルナノ錯体はがん治療のためにドキソルビシンを全身投与するために応用しうる。
【０１２５】
ミセルナノ錯体はSUデリバリ用ナノ粒子担体として使用することができる。極めて脈管原性の高い腫瘍である神経膠芽腫の場合、抗血管新生療法が高いと同時に一過性でもある効果があることを示した。このような腫瘍はVEGFによって促進されるプロセスによる血管新生を刺激するが、この結果生じる血管は構造的にも機能的にも異常である。SUから成るミセルナノ錯体の使用はこれらのケースにおける抗血管新生活性を潜在的に強化することが考えられる。
ミセルナノ錯体は全身に投与された場合には治療薬の持続的放出のために、または標的部位への治療薬投与システムとして使用することができる。
【０１２６】
ミセルナノ錯体は、異なる種類のがん治療で用いられる多種多様な治療薬の封止用に使用することができる。
【０１２７】
ミセルナノ錯体は、がん以外の治療のための各種治療薬の封止用にも使用することができる。これには抗生物質その他医療用途用の小型分子を含むことができる。
本発明のその他各種の変更や適合が本発明の精神と範囲から乖離せずに可能であることは本開示を読了後には当分野における知識を有する者には自明であって、こうした変更や適合が添付された請求項の範囲の中で可能なことが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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