(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の一部を同定する方法であって、下記を含む前記方法：
第１の期間の間に、一対の電極に第１の電圧信号を印加することにより、脂質二重層に挿入されたナノポアに核酸分子を引き入れることであって、ここで第１の電圧信号が、ナノポアを介して第１のイオン電流を生じさせ、それはナノポアに近接する核酸分子の一部の特性を示す；
第２の期間の間に、一対の電極に第２の電圧信号を印加することにより、ナノポアから核酸分子を放出することであって、ここで第２の電圧信号が、ナノポアを介して第２のイオン電流を生じさせる；および
第１のイオン電流および第２のイオン電流を含むナノポアを介した正味のイオン電流に少なくとも部分的に基づいて、第１の期間および第２の期間を決定すること。
【請求項２】
正味のイオン電流に少なくとも部分的に基づく第１の期間および第２の期間の決定が、正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定が、第２の電圧信号をオフに設定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定が、第２の電圧信号を第１の電圧信号と反対の極性を有する信号に設定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第１の期間の間の第１の電圧信号および第２の期間の間の第２の電圧信号が、ＡＣ信号を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルをナノポアに対応する整流特性に少なくとも部分的に基づいて設定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルを、第１の期間および第２の期間を含む組み合わせられた期間にわたる第１のイオン電流に対応する電荷および第２のイオン電流に対応する電荷の和に少なくとも部分的に基づいて設定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルを、核酸分子をナノポアに引き入れるために十分な電圧の大きさに少なくとも部分的に基づいて設定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
電極の一方が非ファラデー性伝導を促進する特性を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
電極の一方が貴金属を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電極の一方が電極の一方の表面積を増大させる構造を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
電極の一方が二重層の静電容量を増大させる構造を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
電極の一方が海綿状構造を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
海綿状構造が、白金を界面活性剤の存在下で白金電極上に電気メッキすることにより形成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の期間および第２の期間が、核酸分子の一部の特性が時間の経過にわたってどれだけ速く変化するかに少なくとも部分的に基づいて決定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子の一部を同定するためのシステムであって、下記を含む前記システム：
電圧源を制御する電圧制御ユニット；
電圧源に連結された一対の電極；および
測定回路；
ここで、電圧制御ユニットは、下記のように構成されており：
電圧源を制御して第１の期間の間に第１の電圧信号を一対の電極に印加することにより、脂質二重層に挿入されたナノポアに核酸分子を引き入れ、ここで、第１の電圧信号が、ナノポアを介して第１のイオン電流を生じさせ、それはナノポアに近接する核酸分子の一部の特性を示す；
電圧源を制御して第２の期間の間に一対の電極に第２の電圧信号を印加することにより、ナノポアから核酸分子を放出し、ここで第２の電圧信号が、ナノポアを介して第２のイオン電流を生じさせる；および
第１のイオン電流および第２のイオン電流を含むナノポアを介した正味のイオン電流に少なくとも部分的に基づいて、第１の期間および第２の期間を決定する；
かつここで、該測定回路は、第１のイオン電流を測定するように構成されている。
【請求項１７】
正味のイオン電流に少なくとも部分的に基づく第１の期間および第２の期間の決定が、正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定が、第２の電圧信号をオフに設定することを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
正味のイオン電流を低減する第１の期間および第２の期間の決定が、第２の電圧信号を第１の電圧信号と反対の極性を有する信号に設定することを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
第１の期間の間の第１の電圧信号および第２の期間の間の第２の電圧信号が、ＡＣ信号を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
電圧制御ユニットが、さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルをナノポアに対応する整流特性に少なくとも部分的に基づいて設定するように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
電圧制御ユニットが、さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルを、第１の期間および第２の期間を含む組み合わせられた期間にわたる第１のイオン電流に対応する電荷および第２のイオン電流に対応する電荷の和に少なくとも部分的に基づいて設定するように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
電圧制御ユニットが、さらに、ＡＣ信号のデューティーサイクルを、核酸分子をナノポアに引き入れるために十分な電圧の大きさに少なくとも部分的に基づいて設定するように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２４】
電極の一方が非ファラデー性伝導を促進する特性を含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
電極の一方が貴金属を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
電極の一方が電極の一方の表面積を増大させる構造を含む、請求項２４又は２５に記載のシステム。
【請求項２７】
電極の一方が二重層の静電容量を増大させる構造を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２８】
電極の一方が海綿状構造を含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２９】
海綿状構造が、白金を界面活性剤の存在下で白金電極上に電気メッキすることにより形成される、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
第１の期間および第２の期間が、核酸分子の一部の特性が時間の経過にわたってどれだけ速く変化するかに少なくとも部分的に基づいて決定される、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３１】
核酸分子が、ポリメラーゼと会合したタグ付けされたヌクレオチドを含み、ここで、第１の期間および第２の期間が、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼと会合している期間に少なくとも部分的に基づいて決定される、請求項１６〜３０のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
[0001]  近年の半導体産業内の超小型化における進歩は、バイオテクノロジストが伝統的に嵩高な感知ツールをますます小さいフォームファクター中に、いわゆるバイオチップ上に詰め込み始めることを可能にしてきた。バイオチップに関する、それらをより堅牢、効率的、かつ対費用効果が高くする技法を開発することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００３】
[0002]  本発明の様々な態様が、以下の詳細な記載および添付の図面において開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】[0003]  図１は、ナノポアベースの配列決定チップ中のセルの一態様を図説する。脂質二重層１０２がセルの表面上に形成されている。
【図２】[0004]  図２は、ナノ−ＳＢＳ技法を用いてヌクレオチド配列決定を実施しているセル２００の一態様を図説する。
【図３】[0005]  図３は、予め装填される（ｐｒｅ−ｌｏａｄｅｄ）タグを用いたヌクレオチド配列決定を実施しているセルの一態様を図説する。
【図４】[0006]  図４は、“予め装填される”タグを用いた核酸配列決定に関するプロセス４００の一態様を図説する。
【図５】[0007]図５Ａは、ファラデー伝導の間の小信号回路モデルの一態様を図説する。[0008]図５Ｂは、ファラデー性伝導によるＰＮＴＭＣの異なる状態を図説する。
【図６】[0009]  図６は、非ファラデー性容量結合測定のために構成されたナノポアベースの配列決定チップ中のセルの一態様を図説する。
【図７】[0010]  図７は、非ファラデー性伝導に関する小信号回路モデルの一態様を図説する。
【図８Ａ】[0011]  図８Ａは、二重層の容量応答の一態様を図説する。
【図８Ｂ】[0011]  図８Ｂは、二重層の容量応答の一態様を図説する。
【図９Ａ】[0012]  図９Ａは、正極性を有する２００ｍＶがナノポアに印加された際の開始時の過渡状態（ｓｔａｒｔｕｐ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）を示す。
【図９Ｂ】[0013]  図９Ｂは、二重層コンデンサー上の電圧の減衰率を図説する。
【図１０】[0014]  図１０は、定常状態におけるピーク正電流が、デューティーサイクル（ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ）および印加された電圧の関数として変動することを図説する。
【図１１】[0015]  図１１は、図１０のデータに合わせられたシミュレーションモデルの一態様を図説する。
【図１２Ａ】[0016]  図１２Ａは、印加された信号が５０％デューティーサイクルを有する場合のシミュレーションの結果を図説する。
【図１２Ｂ】[0016]  図１２Ｂは、印加された信号が５０％デューティーサイクルを有する場合のシミュレーションの結果を図説する。
【図１３Ａ】[0017]  図１３Ａは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合の測定電流を図説する。
【図１３Ｂ】[0018]  図１３Ｂは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合のシミュレーションされた電流を図説する。
【図１４Ａ】[0019]  図１４Ａは、印加された信号が５０％デューティーサイクルを有する場合の時間に対するナノポアに印加された電圧を図説する。
【図１４Ｂ】[0019]  図１４Ｂは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合の時間に対するナノポアに印加された電圧を図説する。
【図１５】[0020]  図１５は、分子を同定するためのプロセスの一態様を図説する。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
[0021]  本発明は、プロセス；装置；システム；組成物；コンピューターで読み取り可能な記憶媒体上に具体化されたコンピュータープログラム製品；および／またはプロセッサー、例えばプロセッサーに接続されたメモリー上に記憶された、および／またはそれにより提供される命令を実行するように構成されたプロセッサーとしてを含む、数多くの方法で実施されることができる。本明細書において、これらの実施、または本発明がとり得るあらゆる他の形態は、技法と呼ばれることができる。一般に、開示されたプロセスの工程の順序は、本発明の範囲内で変更されることができる。別途記載されない限り、タスクを実施するように構成されていると記載されたプロセッサーまたはメモリーのような構成要素は、そのタスクを所与の時点において実施するように一時的に構成されている一般的な構成要素またはそのタスクを実施するように製造されている特定の構成要素として実施されることができる。本明細書で用いられる際、用語‘プロセッサー’は、データ、例えばコンピュータープログラム命令を処理するように構成された１以上の装置、回路、および／または処理コアを指す。
【０００６】
[0022]  本発明の一以上の態様の詳細な記載が、下記で本発明の原理を図説する添付の図と共に提供されている。本発明は、そのような態様と関連して記載されているが、本発明がいずれかの態様に限定されることは一切ない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は、数多くの代替物、修正および均等物を包含する。数多くの具体的な詳細が、以下の記載において、本発明の完全な理解を提供するために述べられている。これらの詳細は、例のために提供されており、本発明は、これらの具体的な詳細の一部または全部を用いずに特許請求の範囲に従って実施されることができる。明確さのため、本発明に関連する技術分野において既知である技術資料は、本発明が不必要に不明瞭にならないように、詳細には記載されていない。
【０００７】
[0023]  内径約１ナノメートルの孔径を有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において有望性を示してきた。電位が導電性流体中に浸されたナノポアを横切って印加された際、ナノポアを横切るイオンの伝導に帰せられる小さいイオン電流が観察され得る。電流の大きさは、孔径に感受性である。分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子が部分的または完全にナノポアを塞いだ場合、ナノポアを介する電流の大きさが変化する。イオン電流の遮断は、そのＤＮＡまたはＲＮＡ分子の塩基対配列と相関し得ることが示されている。
【０００８】
[0024]  ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定のために用いられることができる。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成された多数の自律的に作動するセンサーセルを組み込む。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含むことができる。
【０００９】
[0025]  図１は、ナノポアベースの配列決定チップ中のセルの一態様を図説する。脂質二重層１０２が、セルの表面上に形成されている。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含有するバルク電解質１１４が、セルの表面上に直接置かれる。単一のＰＮＴＭＣ１０４が、脂質二重層１０２中に、電気穿孔法により挿入される。アレイ中の個々の脂質二重層は、化学的または電気的のどちらにおいても互いに接続されていない。従って、アレイ中のそれぞれのセルは、そのＰＮＴＭＣと会合した単一のポリマー分子に独特のデータを生成する独立した配列決定機械である。ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物上で作動し、そうでなければ不透過性の二重層を介するイオン電流を変調する。そのイオン電流は、各セル中のアナログ測定回路１１２により読み取られ、デジタル情報に変換され、セルから外に伝達される。一部の態様において、伝達データ速度は、１秒あたり約数ギガビットである。一部の態様において、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が、伝達されたデータを受け取り、そのデータを処理し、そのデータをコンピューターに送る。
【００１０】
[0026]  続けて図１を参照して、アナログ測定回路１１２は、電解質の薄膜１０８により覆われた金属電極１１０に接続されている。電解質の薄膜１０８は、イオン不透過性脂質二重層１０２によりバルク電解質１１４から分離されている。ＰＮＴＭＣ１０４は、脂質二重層１０２を横切り、イオン電流がバルク液体から金属電極１１０へと流れるための唯一の経路を提供する。金属電極１１０は、作用電極（ＷＥ）とも呼ばれる。セルは、対／参照電極（ＣＥ／ＲＥ）１１６も含み、それは電気化学的電位センサーである。
【００１１】
[0027]  一部の態様において、ナノポアアレイは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技法を用いる並行配列決定を可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技法を用いてヌクレオチド配列決定を実施しているセル２００の一態様を図説する。ナノ−ＳＢＳ技法において、配列決定されるべき鋳型２０２およびプライマーが、セル２００に導入される。この鋳型−プライマー複合体に、４種類の異なるようにタグ付けされたヌクレオチド２０８が、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼ２０４と複合体形成し、そのタグの尾部は、ナノポア２０６の入口（ｖｅｓｔｉｂｕｌｅ）中に位置している。そのタグの尾部は、ナノポア２０６の入口中のアミノ酸残基との強い親和性を有するように修飾されることができる。正しいヌクレオチドのポリメラーゼに触媒される組み込みの後、タグが取り付けられたポリホスフェートが放出され、ナノポア２０６を通過して独特のイオン電流遮断信号２１０を生成し、それにより、付加された塩基を、そのタグの異なる化学構造により電子的に同定する。
【００１２】
[0028]  図３は、予め装填されるタグを用いたヌクレオチド配列決定を実施しているセルの一態様を図説する。ナノポア３０１が、膜３０２中に形成されている。酵素３０３（例えばポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ）が、ナノポアと会合している。一部の場合において、ポリメラーゼ３０３は、ナノポア３０１に共有結合している。ポリメラーゼ３０３は、配列決定されるべき一本鎖核酸分子３０４と会合している。一部の態様において、一本鎖核酸分子３０４は、環状である。一部の場合において、核酸分子３０４は、線状である。一部の態様において、核酸プライマー３０５が、核酸分子３０４の一部にハイブリダイズしている。ポリメラーゼ３０３は、ヌクレオチド３０６のプライマー３０５上への、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として用いる組み込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、タグ種（“タグ”）３０７を含む。
【００１３】
[0029]  図４は、“予め装填される”タグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一態様を図説する。段階Ａは、図３において記載されているような構成要素を図説する。段階Ｃは、ナノポア中に装填されたタグを示す。“装填される”タグは、認識可能な長さの時間、例えば０．１ミリ秒（ｍｓ）〜１０００ｍｓの間ナノポア中に位置している、および／またはナノポアの中もしくは近くに留まっているタグであることができる。一部の場合において、“予め装填される”タグは、ヌクレオチドから放出される前にナノポア中に装填される。一部の場合において、タグは、タグがヌクレオチド組み込み事象の際に放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適切に高い、例えば９０％〜９９％である場合に、予め装填される。
【００１４】
[0030]  段階Ａにおいて、タグ付けされたヌクレオチド（４種類の異なるタイプ：Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの１つ）は、ポリメラーゼと会合していない。段階Ｂにおいて、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと会合している。ポリメラーゼをナノポアに引き寄せるために、電圧（例えばＤＣまたはＡＣ電圧）が、ナノポアまたはナノポアが存在する膜に印加されることができる。段階Ｃにおいて、ポリメラーゼがナノポアにドッキングする。タグは、ドッキングの間に電気的な力、例えば膜および／またはナノポアを横切って印加された電圧により生成される電場の存在下で生成される力によりナノポア中に引き込まれる。
【００１５】
[0031]  会合したタグ付けされたヌクレオチドの一部は、一本鎖核酸分子と（例えばＡはＴと、ＧはＣと）塩基対合する。しかし、会合したタグ付けされたヌクレオチドの一部は、一本鎖核酸分子と塩基対合しない。これらの塩基対合しなかったヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと会合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼにより拒絶される。対合しなかったヌクレオチドは、一過性にのみポリメラーゼと会合するため、図４において示されているようなプロセス４００は、典型的には段階Ｄを越えて進行しない。例えば、対合しなかったヌクレオチドは、段階Ｂにおいて、またはプロセスが段階Ｃに入った少し後に、ポリメラーゼにより拒絶される。
【００１６】
[0032]  ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアを通過する電流は約３０ピコアンペア（ｐＡ）である。段階Ｃにおいて、ナノポアを介して流れる電流は、約６ｐＡ、８ｐＡ、１０ｐＡ、または１２ｐＡであり、それぞれのアンペア数は、タグ付けされたヌクレオチドの４タイプの１つに対応している。ポリメラーゼは、異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子中に組み込み、タグ分子を放出する。段階Ｄにおいて、放出されたタグは、ナノポアを通過する。タグは、ナノポアにより検出される。特に、タグがナノポアを通過する際、タグの異なる化学構造により、独特のイオン電流遮断信号（例えば図２中の信号２１０を参照）が生成され、それにより付加された塩基を電子的に同定する。そのサイクル（すなわち段階Ａ〜Ｅまたは段階Ａ〜Ｆ）の繰り返しは、核酸分子の配列決定を可能にする。
【００１７】
[0033]  一部の場合において、図４の段階Ｆにおいて示されているように、成長している核酸分子中に組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過するであろう。その組み込まれなかったヌクレオチドは、一部の場合においてナノポアにより検出され得るが、その方法は、組み込まれたヌクレオチドおよび組み込まれなかったヌクレオチドを、ヌクレオチドがナノポアにおいて検出されている時間に少なくとも部分的に基づいて識別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアを急速に通過し、短い期間（例えば１０ｍｓ未満）の間検出され、一方で組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、長い期間（例えば少なくとも１０ｍｓ）の間ナノポア中に装填されて検出される。
【００１８】
[0034]  ２タイプのイオンの流れが、ＰＮＴＭＣ−ファラデー性伝導および非ファラデー性伝導により駆動され得る。ファラデー性伝導では、化学反応が、金属電極の表面において起こる。ファラデー性電流は、電極における何らかの化学物質の還元または酸化により生成される電流である。非ファラデー性伝導では、金属の表面において化学反応が起きない。金属電極および電解質の薄膜の間の二重層キャパシタンス(ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ)における変化する電位が、イオンの流れを駆動する。
【００１９】
[0035]  ファラデー性伝導によるイオンの流れは、いくつかの欠点を有する。電極の作動寿命は、下記でより詳細に記載されるであろうように、イオン電流がＰＮＴＭＣを介して流れるにつれて電極中の金属が消費され、消耗するため、限られている。
【００２０】
[0036]  図５Ａは、ファラデー性伝導の間の小信号回路モデルの一態様を図説する。ＰＮＴＭＣおよびＷＥは、小信号回路モデルにおいて単純な抵抗器として表されている。図５Ｂは、ファラデー性伝導によるＰＮＴＭＣの異なる状態を図説している。イオン電流の流れｉ（ｔ）は、５つの状態：開いたナノポアチャンネルによる最高電流状態（示されていない）およびＰＮＴＭＣの活性部位に結合した４種類の異なるタイプのヌクレオチドのそれぞれに対応する４つのより低い電流状態を有する。正の電流の流れｉ（ｔ）は、ＶＣＥ，ＲＥ節に入り、ＶＷＥ節を出る電子を記載している。陰イオン（例えばＣｌ−）は、ＣＥを出て、バルク電解質を介して流れ、脂質二重層をＰＮＴＭＣを介して横切り、電解質の薄膜を介して続き（ｃｏｎｔｉｎｕｅ）、ＷＥの金属と化合する。
【００２１】
[0037]  例えば、銀金属（Ａｇ）を有する電極に関して、化学反応は次のものである：
Ａｇ（固体）  ＋  Ｃｌ−（水性）  →  ＡｇＣｌ（固体）  ＋  電子（アナログ回路中を流れる）  式１
[0038]  上記の式１において示されているように、金属銀の原子は、ＰＮＴＭＣを通過するそれぞれの塩化物陰イオン（Ｃｌ−）に関して、不溶性の塩である塩化銀（ＡｇＣｌ）に変換される。一部の場合において、銀は、数分の操作の内に消耗する。
【００２２】
[0039]  金属電極の消耗を避けるため、イオン電流の流れの方向は、類似の期間の間負の電圧を印加することにより逆転し、銀金属に戻る塩化銀（ＡｇＣｌ）の変換を引き起こすことができる。しかし、この方式での再装填（ｒｅｃｈａｒｇｉｎｇ）または再生は、銀を毛髪様の特徴として金属電極の表面上に再析出させ、それは、特により小さいセルの幾可学的形状、従ってより小さい電極を有するチップにおいて、全体的な性能に影響を及ぼす可能性がある。
【００２３】
[0040]  別の方法は、電圧を印加してポリメラーゼをナノポアに引き寄せ、タグを検出のためにナノポアを通して、またはその近くまで引き、次いである期間の間電圧をオフにし、それによってタグをナノポアから放出させることにより、金属電極の消耗を遅らせることである。電圧がオフになっている間は電流が存在しないため、より少ない銀原子が変換され、金属電極の寿命が延長される。しかし、検出時間は相応に低減する。
【００２４】
[0041]  金属電極の消耗に加えて、ファラデー性伝導は、時間の経過にわたるセル内のバルク電解質の濃度における不均衡も引き起こす。例えば、一方の電極においてＫＣｌ分子の正味の増加があるが、反対側の電極においてＫＣｌ分子の正味の喪失がある。この一方の電極における塩濃度の増大および反対側の電極上での塩の消耗は、セル内に望ましくない浸透圧を作り出す。
【００２５】
[0042]  ＰＮＴＭＣを介する代わりのタイプのイオンの流れは、非ファラデー性伝導によるものである。非ファラデー性伝導では、化学反応（化学物質の還元または酸化）が金属の表面において起こらない。金属電極および電解質の薄膜の間の二重層キャパシタンスを横切る電位の変化が、イオンの流れを駆動する。
【００２６】
[0043]  非ファラデー性伝導に関して、金属電極は、腐食および酸化に耐性である金属で作られていることができる。例えば、貴金属、例えば白金または金は酸化しづらく、たとえそれらが酸化した場合でも、そのプロセスは容易に逆行可能である。小さい電位（例えば、ＶＣＥと比較して＋／−１Ｖ未満）が電極中の白金／金に印加された場合、初期の容量性の過渡状態（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）は別として、イオン電流は流れない。これは、金属から電解質中に混合されたレドックス（還元−酸化）活性種中への電子トンネル効果の測定を可能にする。レドックス活性種（例えばフェリシアン化物またはフェロシアン化物）が電解質中にない場合、定常状態イオン（または電子もしくは正孔）電流が金属−液体界面を横切って流れない。白金／金および電解質の間の化学的（すなわち結合）相互作用がないにもかかわらず、印加された電位に応答した金属−液体界面におけるイオン消耗領域の成長および縮小からの電解質中のイオンの一過性の物理的置換が存在する。このイオン消耗領域は、電気化学の用語で“二重層”と呼ばれる。電気工学モデルを用いて、平行板コンデンサーが成立し、ここで、金属は一方の板であり、消耗領域は誘電体であり、液体中のイオンの拡散分布は他方の板である。
【００２７】
[0044]  図６は、非ファラデー性容量結合測定のために構成されたナノポアベースの配列決定チップ中のセルの一態様を図説する。脂質二重層６０２が、セルの表面上に形成されている。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含有する電解質６１４が、セルの表面上に直接置かれる。単一のＰＮＴＭＣ６０４が、脂質二重層６０２中に、電気穿孔法により挿入される。アレイ中の個々の脂質二重層は、化学的または電気的のどちらにおいても互いに接続されていない。従って、アレイ中のそれぞれのセルは、そのＰＮＴＭＣと会合した単一のポリマー分子に独特のデータを生成する独立した配列決定機械である。セルは、非ファラデー性容量結合測定を行うためのアナログ測定回路６１２を含む。測定は、デジタル情報に変換され、セルから外に伝達される。一部の態様において、伝達データ速度は、１秒あたり約数ギガビットである。一部の態様において、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が、伝達されたデータを受け取り、そのデータを処理し、そのデータをコンピューターに送る。
【００２８】
[0045]  続けて図６を参照して、アナログ測定回路６１２は、電解質の薄膜６０８により覆われた金属電極６１０に接続されている。電解質の薄膜６０８は、イオン不透過性脂質二重層６０２によりバルク電解質６１４から分離されている。ＰＮＴＭＣ６０４は、脂質二重層６０２を横切り、バルク液体から金属電極６１０へのイオンの流れのための唯一の経路を提供する。金属電極６１０は、作用電極（ＷＥ）とも呼ばれる。非ファラデー性伝導に関して、金属電極６１０は、腐食および酸化に耐性である金属、例えば、白金、金、および黒鉛で作られていることができる。金属電極６１０は、下記でより詳細に記載されるであろうように、海綿状電極であることができる。セルは、対／参照電極（ＣＥ／ＲＥ）６１６も含み、それは電気化学的電位センサーである。
【００２９】
[0046]  図７は、非ファラデー性伝導に関する小信号回路モデルの一態様を図説する。ＰＮＴＭＣは、小信号回路モデルにおいて単純な抵抗器７０２として表されている。二重層キャパシタンスは、小信号回路モデルにおいてコンデンサー７０４として表されている。一部の態様において、図７中のＶ１は、接地からの電圧増分、例えば５００ｍＶであるように設定されており、一方でＶ２は、Ｖ１プラス印加された信号、例えば１０Ｈｚ〜１ｋＨｚの印加されたＡＣ信号であるように設定されている。
【００３０】
[0047]  一部の態様において、印加された信号はＡＣ信号である。一方の極性において、印加されたＡＣ信号は、ポリメラーゼをナノポアに引き寄せ、タグを検出のためにナノポアを通して引き入れ、またはその付近まで引き寄せる。印加されたＡＣ信号の極性が逆転した際に、タグがナノポアから放出され、電気化学的変化が金属電極に起こらないように、電極が再装填／再生される。ＡＣ信号は繰り返し極性を変化させるため、タグ付けされたヌクレオチドと会合したタグの一部が、複数回、ナノポア中へと方向付けられ、ナノポアから出るように方向付けられる。この反復性の信号タグの装填および排出は、タグが多数回読まれることを可能にする。多数回の読み取りは、エラー、例えばタグがナノポアを通って(ｔｈｒｅａｄｉｎｇ)入る、および／またはナノポアから出ることと関係するエラーの修正を可能にすることができる。
【００３１】
[0048]  一部の態様において、ＡＣ信号の周波数は、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼと会合している期間に少なくとも部分的に基づいて選択される。ＡＣ信号の周波数は、ポリメラーゼと会合したタグ付けされたヌクレオチドが、タグが検出され得るように、十分な長さの時間の間、少なくとも１回ナノポア中に引き入れられて装填されることを可能にするべきであり；そうでなければ、ポリメラーゼと会合しているタグの一部が、システムにより検出されることができない。換言すると、サンプリングは、事象が見逃されないように、事象の連続が起こっている速度より速い速度であるべきである。
【００３２】
[0049]  続けて図６を参照して、脂質二重層６０２が形成される前に、バルク電解質６１４は、作用電極６１０と直接接触しており、そうして電解質および作用電極の間で短絡回路を作り出している。図８Ａおよび図８Ｂは、二重層の容量応答の一態様を図説している。その図は、電解質および作用電極の間に短絡回路を有する二重層の特性を図説している。この実施例において、電解質は、０．５Ｍ酢酸カリウムおよび１０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。対電極６１６は、ＡｇＣｌを含む。作用電極６１０は、電気メッキされた白金を有する白金電極である。水の粘性が、印加された場に反応したイオンの容易な流れを妨げ；これは、二重層の容量応答における直列抵抗として現れる。この抵抗は、図８Ａにおいて示されているように、ピーク電流を制限する。ＲＣの電気化学的接続の直列の性質は、反応の減衰において見られることができ、それはＲＣ時間定数により特性付けられる。図８Ｂにおいて、電流は、系の検出限界未満であるｅｘｐ（−２５）＝１３．８ｐＡまで低下することが示されている。これは、（電気的観点からの）シャント抵抗および（電気化学的観点からの）ファラデー性電流の両方の欠如を実証している。
【００３３】
[0050]  作用電極６１０は、所与の体積に関してその表面積を最大化するように構成されている。表面積が増大するにつれて、二重層の静電容量が増大し、コンデンサーが荷電された状態になる前に、より大きい量のイオンが、同じ印加された電位により置換され得る。図７を参照して、Ｃ二重層のインピーダンス＝１／（ｊ＊２＊ｐｉ＊ｆ＊Ｃ）であり、式中、ｆ＝周波数であり、Ｃ＝Ｃ二重層である。ｆ、Ｃ、またはｆおよびＣの両方をより大きくすることにより、コンデンサーのインピーダンスはＲＰＮＴＭＣと比較して非常に小さくなり、測定される電流はより大きくなる。小信号モデルのインピーダンスは、ＲＰＮＴＭＣにより支配され、測定される電流は、５つの状態：開いたナノポアチャンネルによる最高の電流の状態およびＰＮＴＭＣの活性部位中に結合した４種類の異なるタイプのヌクレオチドのそれぞれに対応する４つのより低い電流状態をよりよく識別することができる。
【００３４】
[0051]  例えば、作用電極の表面積は、電極を“海綿状”にすることにより増大し得る。一部の態様において、二重層のバルク液体に対する静電容量は、白金金属を直径５ミクロンの平滑白金電極上に界面活性剤の存在下で電気メッキすることにより高められ得る。界面活性剤は、ナノスケールの間隙空間を白金金属中に作り出し、それを“海綿状”にする。その白金海綿体は、電解質を吸い込み、大きい有効表面積（例えば、電極の下向きの領域の１平方ミクロンあたり３３ｐＦ）を作り出す。二重層の表面積を最大化することは、“ＤＣブロック”コンデンサーを作り出し、それにより二重層上の電圧は平常状態に達し、操作の間ほとんど変化しない。直列ＰＮＴＭＣ抵抗（図７中のＲＰＮＴＭＣ）および二重層のキャパシタンス（図７中のＣ二重層）は、低周波数ゼロを形成し、それはハイパスフィルターの役目を果たす。一例において、約１０ギガオームのＲＰＮＴＭＣ、約８００ｐＦのＣ二重層は、結果として約１０ギガオーム＊約８００ｐＦ＝約８秒の時間定数をもたらす。次いで、測定を１００Ｈｚで切ることは、ＤＣドリフトを拒絶し、測定されたタグにおける低周波数情報量を１０００分の１に減じる。
【００３５】
[0052]  一切のタグが存在しない場合、ＰＮＴＭＣは、アルファ溶血素タンパク質ナノポアと類似して振舞う。溶血素ナノポアは、そのバイアスを方形波駆動のデューティーサイクルに応じて変化させる整流特性を有する。ファラデー性伝導の場合とは異なり、電極に印加される絶対電圧は、ナノポアに印加される電圧と同じではない：二重層上の電圧は、ナノポアに印加される電位にバイアスをかけ、このバイアスはデューティーサイクルにより変化する。
【００３６】
[0053]  図９Ａおよび９Ｂは、非ファラデー性ＡＣ変調を有するナノポア電流を図説する。この実施例では、印加される信号は５Ｈｚにおける５０％デューティーサイクルを有する２００ｍＶピークトゥピーク方形波である。電解質は、０．５Ｍ酢酸カリウムおよび１０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。対電極６１６は、ＡｇＣｌを含む。作用電極６１０は、電気メッキされた白金を有する白金電極である。
【００３７】
[0054]  図９Ａは、正極性を有する２００ｍＶがナノポアに印加された際の開始時の過渡状態を示し、これは直接印加された２００ｍＶによる開放チャンネル電流がおおよそ７０ｐＡであることを示している。図９Ａは、約２０秒後に定常状態に達することを示している。図９Ｂにおいて、二重層コンデンサー上の電圧の減衰率が、観察されることができる。減衰率は、二重層キャパシタンスの大きさおよびナノポア負荷抵抗により決定される。
【００３８】
[0055]  図１０は、定常状態におけるピーク正電流がデューティーサイクルおよび印加された電圧の関数として変動することを図説している。プロット１０１０は、印加された電圧が２００ｍＶのピークトゥピーク方形波である場合の、異なるデューティーサイクルに対してプロットされたアンペア（Ａ）での定常状態ピーク電流を示す。プロット１０２０は、印加された電圧が１００ｍＶのピークトゥピーク方形波である場合の、異なるデューティーサイクルに対してプロットされた（Ａでの）定常状態ピーク電流を示す。この実施例では、電解質は、０．５Ｍ酢酸カリウムおよび１０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。対電極６１６は、ＡｇＣｌを含む。作用電極６１０は、電気メッキされた白金を有する白金電極である。溶血素ナノポアは整流特性を有する（または非オーム性である）ため、正極性電圧が印加される場合よりも大きい大きさの負極性電圧が、同じ大きさの電流を通すために必要とされる。ピーク正電流は、デューティーサイクルが増大するにつれて低下する。デューティーサイクルがより低い程、二重層キャパシタンスを介してナノポアに印加される正電圧はより高い。
【００３９】
[0056]  図１１は、図１０のデータにマッチしたシミュレーションモデルの一態様を図説する。そのシミュレーションは、ナノポア上の実際の電圧を見積もるように構成されており、それは、ナノポアと直列で接続された二重層コンデンサーのため、作用電極に印加された電圧と同じではない。この電圧は、非ファラデー性の場合は直接測定されることができない。酢酸カリウムにおける非線形性は、１Ｍ塩化カリウムの非線形性に正比例すると仮定された。図１２Ａおよび１２Ｂは、印加される信号が５０％デューティーサイクルを有する場合のシミュレーションの結果を図説する。図１２Ｂにおいて、減衰の傾きは、溶血素ナノポアの整流特性のため、正電流に関して負電流よりも急勾配であり、それは、図１１において多項式Ｂ１およびＢ２によりモデル化されている（ｍｏｄｅｌｅｄ）。
【００４０】
[0057]  図１３Ａは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合の測定電流を図説する。図１３Ｂは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合のシミュレーションされた電流を図説する。これらの図は、２５％というより低いデューティーサイクルでは、ナノポアを介する正電流の大きさ（４３ｐＡ）はナノポアを介する負電流の大きさ（−１３ｐＡ）よりもはるかに大きいことを図説している。定常状態においてシャント抵抗（非ファラデー性電流）を達成するためには、１回の振動の期間にかけて二重層を通る正および負電荷の和は、ゼロであるべきである。電流対時間のグラフにおいてｉ＝ｄＱ／ｄｔ（式中、ｉ＝電流およびＱ＝電荷である）であるため、電荷は、曲線下面積である。例えば、正極性の電流対時間プロットの曲線下面積（図１３Ｂの面積１３０２）が、負極性の電流対時間プロットの曲線下面積（図１３Ｂの面積１３０４）とおおよそ同じである場合、１回の振動の期間にかけて二重層を通る正および負電荷の和は、ゼロに近い。
【００４１】
[0058]  図１４Ａは、印加された信号が５０％デューティーサイクルを有する場合の時間に対するナノポアに印加された電圧を図説する。図１４Ｂは、印加された信号が２５％デューティーサイクルを有する場合の時間に対するナノポアに印加された電圧を図説する。図１４Ｂにおけるより低いデューティーサイクルでは、ナノポアに印加された電圧はより高く、それはポリメラーゼおよびタグをナノポアの方により大きい有効性で引き寄せる。図１４Ａにおけるより長いデューティーサイクルでは、ヌクレオチド特異的尾部が適切な位置にある間にタグを読み取る、および検出するのにより多くの時間が費やされる。
【００４２】
[0059]  図１５は、分子を同定するためのプロセスの一態様を図説する。１５０２において、分子は、第１の期間の間に一対の電極（例えば、作用電極およびおよび対／参照電極）に第１の電圧信号を印加することによりナノポアに引き寄せられ、ここで、その第１の電圧信号は、ナノポアを介して第１のイオン電流を生じさせ、それは、ナノポアに近接する分子（例えばタグ付けされたヌクレオチド）の一部の特性を示す。例えば、４タイプのタグ付けされたヌクレオチドは、異なる特性を有し、特定のタイプのタグ付けされたヌクレオチドがナノポア中に引き入れられた場合、その特性を示すイオン電流が、ナノポアを介して流れる。
【００４３】
[0060]  １５０４において、分子は、第２の期間の間に第２の電圧信号を電極の対に印加することにより、ナノポアから放出され、ここで、その第２の電圧信号は、ナノポアを介して第２のイオン電流を生じさせる。
【００４４】
[0061]  １５０６において、第１の期間および第２の期間は、第１のイオン電流および第２のイオン電流を含むナノポアを通る正味のイオン電流に少なくとも部分的に基づいて決定される。例えば、第１の期間および第２の期間は、正味のイオン電流が低減するように決定されることができる。一部の態様において、正味のイオン電流は、第２の電圧信号をオフに設定することにより低減する。第２の電圧信号がオフにされた場合、第２のイオン電流はゼロになり、上記で説明されたように金属電極の消耗が遅延する。一部の態様において、正味のイオン電流は、第２の電圧信号を、第１の電圧信号と反対の極性を有する信号に設定することにより低減する。例えば、第１の電圧信号および第２の電圧信号を交互にすることは、ＡＣ信号を作る。第２のイオン電流は、第１のイオン電流を相殺し、そうしてナノポアを介した正味のイオン電流を低減する。図１０において示されているように、電流は、デューティーサイクルおよび印加される電圧の関数として変動する。従って、デューティーサイクル（すなわち、第１の期間および第２の期間）は、１回の振動の期間（すなわち、第１の期間および第２の期間）にわたって二重層を通る正および負電荷の和がゼロに近いように、第１のイオン電流の曲線下面積が第２のイオン電流の曲線下面積と実質的に同じであるように調節されることができる。
【００４５】
[0062]  前記の態様は、理解の明確さの目的のためにいくらか詳細に記載されてきたが、本発明は、提供された詳細に限定されない。本発明を実施する多くの代替の方法が存在する。開示された態様は、説明的であり、限定的ではない。
【符号の説明】
【００４６】
１０２  脂質二重層
１０４  ＰＮＴＭＣ
１０６  酸化物
１０８  電解質の薄膜
１１０  金属電極
１１２  アナログ測定回路
１１４  バルク電解質
１１６  対／参照電極
２００  セル
２０２  鋳型
２０４  ポリメラーゼ
２０６  ナノポア
２０８  ４種類の異なるようにタグ付けされたヌクレオチド
２１０  イオン電流遮断信号
３０１  ナノポア
３０２  膜
３０３  酵素
３０４  一本鎖核酸分子
３０５  核酸プライマー
３０６  ヌクレオチド
３０７  タグ種
４００  プロセス
６０２  脂質二重層
６０４  ＰＮＴＭＣ
６０６  酸化物
６０８  電解質の薄膜
６１０  金属電極
６１２  アナログ測定回路
６１４  バルク電解質
６１６  対／参照電極
７０２  抵抗器
７０４  コンデンサー
１０１０  プロット
１０２０  プロット
１３０２  面積
１３０４  面積
１５０２  プロセス
１５０４  プロセス
１５０６  プロセス
【図１】
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【図２】
0006302547.tif 000003
【図３】
0006302547.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0006302547.tif 000010
【図９Ａ】
0006302547.tif 000011
【図９Ｂ】
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【図１０】
0006302547.tif 000013
【図１１】
0006302547.tif 000014
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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