(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料におけるＨＩＶ中和抗体をインビトロで判定する方法であって、
（ｉ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記試料と、さらに融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させ、
（ｉｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合が前記試料の存在下で阻害される場合に、前記試料中にＨＩＶ中和抗体が存在すると判定することを特徴とする、方法。
【請求項２】
ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質が、ＣＤ４またその機能的に同等の変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ４の機能的に同等の変異体が、少なくとも前記ＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域を含んでなるＣＤ４断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定が、前記融合タンパク質に結合しているリポーターを用いることを含んでなるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記測定が、フローサイトメトリーにより前記細胞を分析することを含んでなるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リポーターが、検出可能部分に結合するＦｃ特異的二次抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がＨＩＶ感染細胞であり、前記ＨＩＶ感染細胞が好ましくは慢性的に感染しているものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）より前に、未結合融合タンパク質を除去する少なくとも一つの洗浄工程をおこなう、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記測定が、定量的なものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、血漿試料である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と、(ii)マウスＩｇＧのＦｃ領域とを含んでなることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質が、ＣＤ４またはその機能的に同等の変異体である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＣＤ４の機能的に同等の変異体が、少なくとも前記ＣＤ４のＤ１−Ｄ２  Ｎ末端領域を含んでなるその断片である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記マウスＩｇＧが、マウスＩｇＧ１またはその機能的に同等の変異体である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質をコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現カセット、ベクターもしくは遺伝子導入細胞。
【請求項１６】
ＨＩＶ中和抗体を発現する抗体産生細胞をインビトロで同定する方法であって、
（ｉ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記抗体産生細胞の培養液の上清と、さらに融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させて、
（ｉｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合が前記上清の存在下で阻害される場合、前記抗体産生細胞がＨＩＶ中和抗体を発現するものとして判定することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記中和抗体を発現する細胞をクローニングすることをさらに含んでなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ中和抗体の産生方法であって、
（ｉ）請求項１６〜１８のいずれかの方法にしたがって単離した抗体産生細胞を培養し、
（ｉｉ）前記抗体産生細胞により発現された前記抗体を単離することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＨＩＶ中和抗体のインビトロ同定方法に関する。また、本発明は、前記方法に使用される融合タンパク質および前記融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染過程中、生物は、異なる病原性抗原に対して広範な体液性応答を示し、先天的Ｔ細胞応答とともに、感染を制御し、生物の一体性を保持する。ＨＩＶ−１感染の状態において、この体液性応答は感染中の初期に検出されることがあるが、効果がない。この理由は、主にほとんどの患者により産生される抗体が、ウイルスの複製サイクルを妨げることができないウイルス性エピトープを認識するからである。Ｔｏｍａｒａｓ  Ｇ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：１２４４９−１２４６３参照。実際に、自己ウイルスを中和する能力を有する抗体は、一部の患者において数カ月後にしか同定することができず、広域中和抗体（ｂｎＡｂｓ）を生じさせるためには数年を必要とする。Ｍａｓｃｏｌａ  Ｊ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；２８：４１３−４４４参照。今まで、数種の広域中和抗体が同定され、それらの全てが、ウイルス適応性において重要な役割を有するエンベロープタンパク質において一連の保存エピトープを認識する。これらの抗体には、抗ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）抗体（ＩｇＧｂ１２およびＶＣＲ０１）、抗ＣＤ４誘発エピトープ抗体（Ｘ５）、抗ｇｐ４１抗体（２Ｆ５および４Ｅ１０）、抗炭水化物（２Ｇ１２）、抗グリコシル化第四エピトープ（ＰＧ９およびＰＧ１６）およびコア抗体などが挙げられる。Ｂａｒｂａｓ  Ｃ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１９９２；８９：９３３９−９３４３、Ｗｕ  Ｘ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；３２９：８５６−８６１、Ｍｏｕｌａｒｄ  Ｍ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：６９１３−６９１８、Ｍｕｓｔｅｒ  Ｔ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３；６７：６６４２−６６４７、Ｚｗｉｃｋ  Ｍ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５：１０８９２−１０９０５、Ｓｃａｎｌａｎ  Ｃ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：７３０６−７３２１、Ｗａｌｋｅｒ  Ｌ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；３２６：２８５−２８９およびＰｉｅｔｚｓｃｈ  Ｊ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１０；２０７：１９９５−２００２参照。それらのうち、抗ＣＤ４ｂｓ抗体などのｇｐ１２０／ＣＤ４の相互作用を遮断することができる抗体は、いくつかの理由で注目されている：１）ｇｐ１２０の保存領域を認識する、２）多数のウイルス単離株を中和でき、３）ＨＩＶ−１感染の動物モデルにおいて示されたように、感染を予防または抑制することができる。Ｈｅｓｓｅｌｌ  Ａ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９；１５：９５１−９５４、  Ｈｅｓｓｅｌｌ  Ａ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４９：１０１−１０４およびＶｅａｚｅｙ  Ｒ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３；９：３４３−３４６参照。したがって、この種のｂｎＡｂｓの誘発は、ワクチン接種指針について興味深い目標である。しかしながら、これらの抗体の検討における主要な障害の一つは、それらの同定にある。一般的に、広域中和抗体および特にＣＤ４ｂｓ抗体は、インビトロで再現することが困難である立体構造エピトープを認識する。今まで、これらの抗体により異なって認識される組み換えタンパク質と突然変異体を使用することを含む、いくかの方法にしたがってＣＤ４ｂｓ抗体の検討がおこなわれた。Ｌｉ  Ｙ等、Ｎａｔ��Ｍｅｄ．２００７；１３：１０３２−１０３４およびＬｙｎｃｈ  Ｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６（４）：７５８８−７５９５および上記Ｗｕ、２０１０参照。さらに、細胞間ウイルス転移アッセイが最近開発された。このアッセイでは、血漿試料中のＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の存在を検出することができる。このアッセイは、ＣＤ４ｂｓまたは抗ＣＤ４抗体のようなｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用を遮断する抗体の存在下で完全に阻害されるウイルス進入プロセスに基づいている。定義によれば、ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との間の相互作用を遮断することができるいずれの抗体も、中和抗体であろう。さらに、この手法では、ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の存在と血漿の中和能との間に強い相関関係が示された。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐａｌｏｍｉｎｏ  Ｓ等、Ｖａｃｃｉｎｅ２０１１；２９：５２５０−５２５９参照。より最近では、ＨＩＶ−１感染患者の８０％超がＣＤ４ｂｓ抗体を生じることから、この反応性は上記したよりも反応頻度が高いであろうことが示された。上記Ｌｙｎｃｈ、２０１２参照。
【０００３】
しかしながら、この場合において、これらの抗体の存在と血漿試料の中和能との間には明確な相関がない。これらの矛盾から、ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の分析を計画する前に考慮すべき重要な問題が方法にあることが明らかである。ＨＩＶ中和抗体を同定するためにより迅速で信頼性のある方法が当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
第一の態様によれば、本発明は、試料におけるＨＩＶ中和抗体をインビトロで判定する方法であって、
（ｉ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記試料と、そして融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させ、
（ｉｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合が前記試料の存在下で阻害される場合に、試料中にＨＩＶ中和抗体が存在すると判定することを特徴とする方法に関する。
【０００５】
第二の態様によれば、本発明は、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【０００６】
第三の態様によれば、本発明は、前記第二の態様の融合タンパク質をコードする核酸、および前記核酸を含んでなる発現カセットまたはベクターに関する。
【０００７】
第四の態様によれば、本発明はキットに関し、当該キットは、（ｉ）前記第二の態様の融合タンパク質、前記第三の態様の核酸、ベクターまたは遺伝子導入細胞と、（ｉｉ）前記融合タンパク質に結合できるリポーターとを含んでなる。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は、抗体産生細胞発現ＨＩＶ中和抗体をインビトロで同定する方法であって、
（ｉ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記抗体産生細胞の培養液の上清と、さらに融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させ、
（ｉｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合が前記上清の存在下で阻害される場合、前記抗体産生細胞がＨＩＶ中和抗体を発現するものと判定することを特徴とする方法に関する。
【０００９】
さらに別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ中和抗体の産生方法であって、
（ｉ）本発明の方法にしたがって単離した抗体産生細胞を培養し、
（ｉｉ）前記抗体産生細胞により発現された前記抗体を単離すること
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１０】
さらに別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ感染と関連した疾病の治療または予防に使用するための、本発明による方法を用いて産生されたＨＩＶ中和抗体、または本発明にる方法により同定された細胞により産生されたＨＩＶ中和抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１の図である。選択可能なマーカーとオープンリーディングフレームなどのプラスミドの主要特性を示す。図面を描くのに、ＰｌａｓＭａｐｐｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｉｓｈａｒｔ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕａｌｂｅｒｔａ．ｃａ／ＰｌａｓＭａｐｐｅｒ／Ａｕｇｕｓｔ  ２０１２）を使用した。
【図１−２】図１−１参照
【図２】ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１融合タンパク質を含有するＨＥＫ２９３上清の滴定。Ａ）プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１を導入したＨＥＫ２９３細胞株の上清を使用して、慢性的に感染したＭＯＬＴ細胞株におけるＮＬ４．３を染色した。細胞表面上でｇｐ１２０に結合したｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１タンパク質を、ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９複合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて同定した。非感染ＭＯＬＴ細胞株を、陰性対照として使用した。Ｂ）ＮＬ４．３ＭＯＬＴ細胞株を染色するのに使用した上清の滴定。
【図３】ＣＤ４ｂｓ−ｂＮＡｂＩｇＧｂ１２のＣＤ４／ｇｐ１２０遮断活性。４８μｇ／ｍＬで開始してＩｇＧｂ１２抗体のＣＤ４／ｇｐ１２０遮断活性を滴定により求めた。ＣＤ４とｇｐ１２０との間の相互作用を遮断するＩｇＧｂ１２の作用の機構の概略図である。
【図４】抗体の特異性とＣＤ４−ｇｐ１２０遮断活性との間の関係。ＣＤ４−ｇｐ１２０遮断活性に関与する特異性を、Ｅｎｖ糖タンパク質における既知の一連のエピトースを認識した数種の抗体を利用することによりアッセイした。ｇｐ１２０（ＩｇＧｂ１２、ＶＲＣ０１およびＶＲＣ０３）またはＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）におけるｇｐ１２０ｂｓにおけるｄｅＣＤ４ｂｓを認識した抗体のみが、ｇｐ１２０とＣＤ４との間の相互作用を遮断し、アッセイはこの種の反応性に非常に特異的であった。
【図５】血漿試料におけるｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の定量化。血漿試料におけるＩｇＧｂ１２などのＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の存在を確認するために、ＣＤ４／ｇｐ１２０遮断活性をフローサイトメトリーにより求めた。ＩｇＧｂ１２を用いた標準曲線を用いて存在するＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体を定量化した。広範な中和血漿（ｂＮ血漿）が、非ｂＮ血漿よりも、ＣＤ４−ｇｐ１２０遮断抗体が多く存在した。
【図６】ＡＲＴナイーブＨＩＶ−１感染患者（ＨＩＶ−１）および非感染対照個体（ＨＣ）の血漿試料におけるＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の定量化。ＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の存在について、ＨＩＶ−１感染患者（赤丸）から得た７２個の血漿試料および１０個の非感染対照（青四角）で試験した。データは、ＣＤ４／ｇｐ１２０阻害率（％）を示す。陽性カットオフとして、非感染対照個体の中央値＋２倍標準偏差を固定した。この陽性基準（破線）に準じて、ＨＩＶ−１試料の４３％（７２個のうち３１個）および非感染対照の１０％（１０個のうち１個）が、陽性として考えられた（ｐ＝０．００３４、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。
【図７】ＨＩＶ−１分離株ＢａＬを用いたＡＲＴナイーブＨＩＶ−１感染患者（ＨＩＶ−１）および非感染対照個体（ＨＣ）の血漿試料におけるＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の定量化。７．Ａ）ＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の存在について、ＨＩＶ−１感染患者から得た７２個の血漿試料（赤丸）および９個の非感染対照（青四角）で試験した。データは、ＣＤ４／ｇｐ１２０阻害率（％）を示す。陽性カットオフとして、非感染対照個体の中央値＋２倍標準偏差を固定した。この陽性基準（破線）に準じて、ＨＩＶ−１試料の９７％（７２個のうち７０個）および非感染対照の０％が、陽性として考えられた（ｐ＝０．００３４、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。７．Ｂ）各血漿試料について得られたＮＬ４−３とＢａＬ分離株の両方に対するｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１の結合の阻害率（％）は、強い相関関係を示した（ｐ＜０．０００１、Ｐｅａｒｓｏｎ相関試験）。
【００１２】
微生物の寄託
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１は、２０１２年７月２５日に、ドイツ連邦共和国にあるＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７  Ｂ、  Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに、受託番号ＤＳＭ２６２１５のもと寄託された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、試料中のＨＩＶ中和抗体の同定および半定量化のためのアッセイに関する。この試験は、その詳細が本明細書に記載されている種々の設定で同等に実施することができるが、ｈｕＣＤ４／マウスＩｇＧ１融合タンパク質によりＨＩＶ感染細胞の表面上のＥｎｖ糖タンパク質の認識に基づいている。感染細胞の表面上でｈｕＣＤ４／ＩｇＧ１融合タンパク質がｇｐ１２０に結合するのを妨げる場合に、抗体は中和されていると考える。この新規な手法にはいくつかの利点がある：すなわち、１）ＨＩＶ感染細胞は、それらの表面上で、機能的且つ天然の配座を有するＥｎｖ糖タンパク質を発現し、２）ｈｕＣＤ４／マウスＩｇＧ１融合タンパク質を使用すると、ｇｐ１２０とＣＤ４との間の自然の相互作用に似た作用を示し、３）サイトメトリー様式により、このアッセイが再現可能且つ時間がかからなくなり、４）半定量的であり且つ非常に特異的である。
【００１４】
１．一般用語および表現の定義
本明細書において使用される用語「抗体産生細胞」は、抗体またはその機能的同等物を産生または分泌することができる細胞、または抗体またはその機能的同等物を産生または分泌できる細胞になることができるものを指す。本明細書による抗体産生細胞は、好ましくは商業的な抗体産生に適応する産生細胞である。より好ましくは、前記産生細胞は、ヒトに使用される抗体を産生するのに好適である。
【００１５】
本明細書において使用される用語「Ｂ細胞」は、液性免疫応答において大きな役割を果たす（Ｔ細胞により支配されている細胞介在免疫応答とは異なり）一種のリンパ球を指す。Ｂ細胞の主要機能は、抗原に対して抗体を作り、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割を果たし、抗原相互作用による活性化後に最終的に記憶Ｂ細胞となることである。Ｂ細胞は、適応免疫系の必須成分である。
【００１６】
本明細書において使用される用語「結合効力（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）」は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する化合物、好ましくは抗体の親和性を指す。「親和性」は、前記化合物がｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する強さを意味する。親和性は、アミノ酸の反対電荷の引力のようなイオン性相互作用、水素結合または疎水性相互作用のような非共有相互作用により求めることができる。本明細書において使用される用語「結合」または「特異的結合」は、結合対（例えば、二種のタンパク質または化合物、好ましくはｇｐ１２０およびＣＤ４のＣＤ４結合領域または化合物、好ましくはこの結合部位に特異的な抗体）間の相互作用を指す。ある実施態様によれば、相互作用の親和定数は、最大で１０−６モル／リットル、最大で１０−７モル／リットルまたは最大で１０−８モル／リットルである。一般的に、表現「結合」または「特異的結合」は、一つの化合物の別の化合物に対する特異的結合であって、標準的アッセイにより測定した結合レベルが、アッセイのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高いものを指す。
【００１７】
本明細書において使用される用語「ＣＤ４」は、分化クラスター４、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹枝状細胞の表面上に発現された糖タンパク質を指す。ＣＤ４は、抗原提示細胞でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を支援する共受容体である。Ｔ細胞内部にあるその部分を用いて、ＣＤ４は、活性化Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードに関与する数多くの分子を活性化するのに必須であるチロシンキナーゼｌｃｋとして知られている、酵素を採用することによりＴＣＲにより生成されるシグナルを増幅する。ヒトＣＤ４の完全タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１７３０（２０１２年６月１８日）で寄託されている。
【００１８】
本明細書において使用される用語「コドンの最適化」は、ＤＮＡによりコードされているポリペプチドを変更することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映して発現を向上させるための、核酸分子におけるコドンの変更を指す。コドンの最適化について、当該技術分野において知られているいくつかの方法およびソフトウエアツールがある。Ｎａｒｕｍ  Ｄ等、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９（１２）：７２５０−７２５３）、Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  Ｎ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２；  ２４（１）：１８−２４、Ｆｅｎｇ  Ｌ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０００；３９（５０）：１５３９９−１５４０９およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓ  Ｄ等、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．２０００；２０（２）：２５２−２６４参照。
【００１９】
本明細書において使用される用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、一般的に受けいれられている特許実務にしたがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」も含む。
【００２０】
本明細書において使用されている用語「ＦＡＣＳ」または「蛍光活性化セルソーティング」は、各細胞の特異的光散乱および蛍光特性に基づいて、細胞の不均一混合物を、一度に一つずつ、一つ以上の容器にソートする方法を指す。
【００２１】
本明細書において使用される用語「断片結晶性領域」または「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ受容体と称される細胞表面受容体および補体系のタンパク質の一部と相互作用する抗体のテール領域を指す。
【００２２】
本明細書において使用される用語「融合タンパク質」は、種々のタンパク質に由来する２つ以上の機能ドメインからなる遺伝子技術により生成されるタンパク質を指す。融合タンパク質は、従来の手段（例えば、好適な細胞における前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現）により得られることができる。
【００２３】
本明細書において使用される用語「ｇｐ１２０」は、抗原特異性またはＨＩＶの外エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）の生物学的機能を有する糖タンパク質を指す。「ｇｐ１２０タンパク質」は、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域由来の分子である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは、それらの一次配列に約５００のアミノ酸を有している。Ｇｐ１２０は、高Ｎ−グリコシル化されていて、見掛け分子量が１２０ｋＤである。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、約５１１アミノ酸である。Ｇｐｌ２０は、５つの可変領域（Ｖｌ−Ｖ５）が組み入れられている５つの相対的に保存された領域（Ｃ１−Ｃ５）を含む。可変領域は、広範囲なアミノ酸置換、挿入および欠失を含んでいる。「ｇｐｌ２０ポリペプチド」は、単一サブユニットとマルチマーの両方を含む。ｇｐ４１部はビリオンの膜二重層に固定され（および広がっており）、一方、ｇｐｌ２０セグメントは、包囲環境に突き出ている。ｇｐ１２０の受容体結合領域は、タンパク質のＮ−末端半分に局在化されている。このあとには、ヒンジとしてか、融合機構へのコミュニケート受容体結合の引き金として作用すると思われるプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）が続いている。ｇｐ１２０のＣ末端は高度に保存され、ｇｐ４１と相互作用する。ｗｔｇｐ１６０ポリペプチドの典型的な配列が得られる。ＧｅｎＢａｎｋの受入番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２参照。好ましくは、ｇｐ１２０ポリペプチドはＨＩＶＥｎｖ由来である。
【００２４】
さらに、本明細書において定義される「ｇｐ１２０ポリペプチド」は、本明細書において記載される正確な配列を有するポリペプチドには限定されない。実際に、ＨＩＶゲノムは、つねに変化しており、分離株間の比較的高度の可変性を示すいくつかの可変ドメインを含む。これらの用語は、同定されたＨＩＶ分離株、さらに新たに同定された分離株ならびにこれらの分離株のサブタイプのいずれかからのｇｐ１２０ポリペプチドを含むことがすぐにわかる。構造的な特徴は、ＨＸＢ−２を引用することにより本明細書において説明する。ここでの開示および技術の教示を考慮して当業者は、他のＨＩＶ変異株（例えば、分離株ＨＩＶＩｌＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、多様なサブタイプからの他のＨＩＶ株（例えば、サブタイプＡ〜ＧおよびＯ）、ＨＩＶ−２株および多様なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）における対応する領域を決定することができる。Ｊｏｋｌｉｋ  Ｗ、Ｅｄ．「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳ、１９８８）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ、等、Ｅｄｓ．、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９５）、およびＫｎｉｐｅ  Ｄ等、Ｅｄｓ．、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、  ５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、２００６）参照。配列比較プログラム（例えば、本明細書において説明されているＢＬＡＳＴ等）または構造特性プログラムの同定およびアライメント（βシート領域を同定するための「ＡＬＢ」プログラム等）は、未変性および変性Ｅｎｖポリペプチド配列の配列を比較するのに使用することができる。変性Ｅｎｖポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、いずれかのＨＩＶ変異株に基づくものであることができる。さらに、用語ｇｐ１２０ポリペプチドは、さらなる内部欠失、付加および置換などの未変性配列に対するさらなる変性を含むタンパク質を含む。これらの変性は、部位特異的突然変異誘発法のように意図的であってもよいし、または自然発生突然変異事象を介するように偶然であってもよい。
【００２５】
本明細書において使用される用語「ＨＩＶ」は、ヒト免疫不全ウイルスを指す。これには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶを含み、好ましくはＨＩＶ−１および/またはＨＩＶ−２に関する。「ＨＩＶ−１」は、ヒト免疫不全ウイルス（１型）を意味する。ＨＩＶ−１は、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の形態を含むが、これらには限定されない。ＨＩＶ−１ウイルスは、既知の主要なサブタイプ（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）または実験室株および一次分離株を含む範囲外のサブタイプ（グループＯ）を表す。「ＨＩＶ−２」は、ヒト免疫不全ウイルス（２型）を意味する。ＨＩＶ−２は、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の形態を含むが、これらには限定されない。用語「ＳＩＶ」は、サル、チンパンジーおよび他の非ヒト霊長類を感染するＨＩＶ様ウイルスであるサル免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶは、細胞外ウイルス粒子およびＳＩＶ感染細胞に関連するＳＩＶの形態を含むが、これらには限定されない。
【００２６】
２つ以上の核酸またはポリペプチドに関連して用語「同一の」またはパーセント「一致度」は、配列一致度の一部分としてのいずれの保存アミノ酸配列置換を考慮せず、最大一致について、比較し整列（必要に応じてギャップを導入する）したときに、同じであるか、または同じである特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。一致度％は、配列比較ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いるか、または目視検査により測定できる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の整列を得るのに使用することができる種々のアルゴリズムとソフトウエアは、当該技術分野において知られている。配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＢＬＡＳＴ  ２．０、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、およびＡＬＩＧＮ−２  アルゴリズムなどがあげられるが、これらには限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９７７；２５：３３８９−３４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６；２６６：４６０−４８０、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０；８７：２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３；９０：５８７３−５８７７、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／、Ａｕｇｕｓｔ  ２０１２参照。比較のための配列整列方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ局部相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ類似性サーチ法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行、または手動整列および目視検査によりおこなうことができる。Ｓｍｉｔｈ  Ｔ等、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２−４８９、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３−４５３、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ等、Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラム、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ等、Ｅｄｓ、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」,５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ,ＮＹ,ＵＳ,２００２）参照。
【００２７】
本明細書において使用される用語「ハイブリドーマ」は、２つの細胞、Ｂ細胞などの免疫系からの抗体分泌細胞、および骨髄腫などの不死化細胞を単一膜内で融合することにより作成される細胞を指す。
【００２８】
本明細書において使用される用語「キット」は、輸送および貯蔵できるようにパックした本発明の方法を実施するのに必要な種々の試薬を含む製品を指す。キットのコンポーネントをパックするのに好適な材料は、結晶、プラスチック(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート)、瓶、バイアル、紙または封筒などがある。本発明のキットは、さらにそこに含まれているコンポーネントを使用するための取扱い説明書を含む。
【００２９】
本明細書において使用される用語「既知のＨＩＶ中和抗体」は、当該技術分野において知られているＨＩＶ中和抗体を指す。好ましくは、既知のＨＩＶ中和抗体は、ＩｇＧｂ１２、ＶＲＣ０１、ＶＲＣ０３、ＶＲＣ−ＰＧ０４、３ＢＮＣ６０、ＨＪ１６、３ＢＮＣ１１７、ＮＩＨ４５−４６、８ＡＮＣ１３１および１２Ａ１２からなる群から選択されたものである。Ｗａｋｅｒ  Ｌ等、Ｎａｔｕｒｅ２０１１；４７７（７３６５）：４６６−４７０およびＳｃｈｅｉｄ  Ｊ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１１；３３（６０４９）：１６３３−１６３７参照。他のＨＩＶ中和抗体として、２Ｆ５、４Ｅ１０、ＰＧ９、ＰＧ１６  および２Ｇ１２などが挙げられるが、これらには限定されるものではない。
【００３０】
本明細書において使用される用語「中和抗体」は、病原体に結合し、病原体が対象において細胞を感染するか、または疾病を生じる能力を妨害する、抗体またはその抗原結合断片である。典型的には、本発明の方法において使用される中和抗体は、病原体の表面に結合し、病原体による感染を、前記抗体の不存在下または陰性対照の存在下での病原体による感染に対して、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、  ４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１０％阻害または減少することができる。抗体がｎＡｂであるかどうかを確認する方法は、当該技術分野において説明されてきた。Ｌｉ  Ｍ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：１０１０８−１０１２５、Ｗｅｉ  Ｘ等、Ｎａｔｕｒｅ２００３；４２２：３０７−３１２およびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  Ｄ、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；Ｊａｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ１２：Ｕｎｉｔ１２．１１参照。これらの方法は、レポーター遺伝子をコードするウイルスを用いた受容細胞株を用いた一回のウイルス感染後のレポーター遺伝子の発現の減少の測定に基づいている。本発明に関連して、この抗原は、好ましくはｇｐ１２０であり、この感染体は好ましくはＨＩＶである。特に、用語「ＨＩＶ中和抗体」は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する親和性を有する抗体を指す。用語「中和抗体」は、サブクラスのｂｎＡｂを含む。本明細書において使用される用語「広域中和抗体」または「ｂｎＡｂ」は、有効投与量で供給されたとき、７を超えるＨＩＶ株、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のＨＩＶ株に対するＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防または治療のための治療剤として使用できるいずれかの方法により得られる抗体として理解される。抗体の中和能は、ＩＣ５０（すなわち、標的細胞の感染が５０％減少する抗体濃度）により特徴付けられる。好ましくは、本明細書において使用される中和抗体は、ＩＣ５０が２μｇ／ｍｌ以下（０．１５μｇ／ｍＬ未満、０．１２５μｇ／ｍＬ未満、０．１０μｇ／ｍＬ未満、０．０７５μｇ／ｍＬ未満、０．０５μｇ／ｍＬ未満、０．０２５μｇ／ｍＬ未満、０．０２μｇ／ｍＬ未満、０．０１５μｇ／ｍＬ未満、０．０１２５μｇ／ｍＬ未満、０．０１μｇ／ｍＬ未満、０．００７５μｇ／ｍＬ未満、０．００５μｇ／ｍＬ未満または０．００４μｇ／ｍＬ未満（抗体濃度１０−８以下、好ましくは１０−９Ｍ以下、好ましくは１０−１０Ｍ以下、すなわち、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下）である。このことは、インビトロでＨＩＶの臨床分離株の５０％を中和するには極低抗体濃度しか必要されないことを意味する。効力は、当該技術分野において説明されている標準中和アッセイを用いて測定でききる。
【００３１】
本明細書において使用される用語「動作可能に連結された」は、意図するヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に連結されている（例えば、インビトロ転写系においてか、またはベクターを宿主細胞に導入するときには宿主細胞に）を意味する。Ａｕｅｒ  Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；２４：４１−４３参照。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、いずれかの長さであり、そしてリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドにより形成される、高分子形態のヌクレオチドを指す。この用語は、一本鎖と二本鎖の両方のポリヌクレオチド、および修飾ポリヌクレオチド（例えば、メチル化、保護など）を含む。
【００３３】
本明細書において使用される用語「予防する」、「予防をする」および「予防」は、対象における疾病の開始の阻害または発生を減少させることを指す。予防は、完全であってもよく（例えば、対象において病的細胞が全く存在しない）、または部分的であってもよい。また、予防は、病態に対する感受性の減少を指す。
【００３４】
本明細書において使用される用語「一次抗体」および「二次抗体」は、一般的に、意図する標的を直接対象とするか、または別の（一次）抗体を対象とし続いて意図する標的に結合するかに基づく２つの抗体群を指す。本発明に関連して、一次抗体は、Ｆｃ領域のみが使用されるので標的を対象とせず、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質に融合する。二次抗体は、Ｆｃ領域を対象とする。
【００３５】
本明細書において使用される用語「試料」は、いずれかの試料、好ましくは抗体を含むことができる生物試料を指す。例えば、細胞培養（例えば、Ｂ細胞、特にＢ細胞ハイブリドーマの培養）の上清であることができる。また、対象から採取された試料であることができる。本発明で使用するための対象から採取される好適な試料としては、いずれかの生体液、特に血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、抹消血細胞または組織細胞血清、唾液、精液、痰、頭脊柱液（ＣＲＬ）、涙、粘液、汗、ミルクまたは脳抽出物などがある。身体組織は、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄または扁桃組織を含んでなる。好ましい試料は、血漿または血清である。用語「対照試料」は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合するいずれの化合物も含んでいない試料を指す。
【００３６】
本明細書において使用される用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、動物、特にヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）などの脊椎動物；鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ネズミおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物を指す。この用語は、特定の年齢や性別を意味しない。用語「対象」は、胚および胎児を含む。
【００３７】
本明細書において使用される用語「表面」は、細胞の外膜を指し、「その表面上」は、表面または膜に組み込まれるかまたは付着していることを意味することがある。いずれの場合においても、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位は細胞の外側であり、結合が生じるように暴露している。
【００３８】
本明細書において使用される用語「治療する」または「治療」は、臨床症状があらわれた後の疾病の進行を抑制するために、本発明の化合物またはそれを含有する組成物もしくは薬剤を投与することを指す。疾病の進行の抑制は、症状の減少、疾病期間の減少、病的状態の安定化（具体的には、さらなる悪化の回避）、疾病の進行の遅延、病的状態の改善および寛解（部分的および全体）を含むがこれらには限定されない有益なまたは所望の臨床結果を意味する。また、疾病の進行の抑制は、治療がおこなわれなった場合の予測生存率と比較して、生存が延長されることも含む。
【００３９】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、意図する宿主細胞における自己複製を提供するさらなるセグメントに動作可能に連結した意図する核酸に準じるか、または意図する発現カセットに準じるセグメントを含んでなる、直鎖または環状核酸分子を指す。
【００４０】
２．試料中のＨＩＶ中和抗体を測定する方法
第一の態様によれば、本発明は、試料におけるＨＩＶ中和抗体をインビトロで判定する方法であって、
ａ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記試料と、そして融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させ、
ｂ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合効力がいずれかの中和抗体の不存在下で測定される結合効力よりも低い場合に、前記試料中にＨＩＶ中和抗体が存在すると判定することを特徴とする方法である。
【００４１】
第一工程において、試料におけるＨＩＶ中和抗体を測定する方法は、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞と、前記試料および(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質とを接触させることを含んでなる。
【００４２】
好ましい実施態様によれば、試料は、細胞培養、例えば、Ｂ細胞、特にＢ細胞ハイブリドーマの培養の上清であることができる。また、対象から採取された試料であることができる。より好ましい実施態様によれば、試料は、血漿試料または血清試料である。
【００４３】
接触は、少なくとも細胞、試料および融合タンパク質を暴露することにより実施される。好ましい実施態様によれば、暴露は長時間（すなわち、細胞が生存するため、およびｇｐ１２０のＣＤ４結合部位および本発明の融合タンパク質の特異的結合に好適な条件下でのインキュベーション）であることができる。接触工程中の条件は、当業者が通常適宜決定できる。接触工程で使用できる好適な緩衝剤には、おこなうアッセイを妨害しない生理緩衝剤などがある。例えば、トリスまたはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝剤を用いることができる。緩衝剤（および緩衝液などの得られる溶解試薬）のｐＨは、約２．０〜約１０．０、必要に応じて約４．０〜約９．０、好ましくは約７．０〜約８．５、さらにより好ましくは約７．５〜約８．０、または約７．０、約７．５、約８．０または約８．５であることができる。典型的な「接触」条件は、１５分〜４時間（４℃、３７℃または室温で１時間）のインキュベーションを含んでなることができる。しかしながら、これらは、例えば、相互作用結合パートナーの性質に応じて適切に変更してもよい。試料は、必要に応じて穏やかな揺動、混合または回転をしてもよい。さらに、非特異的結合を減少させるための遮断薬などの他の適当な試薬を添加してもよい。例えば、１〜４％のＢＳＡまたは他の好適な遮断薬（例えば、ミルク）を使用してもよい。接触条件は、スクリーニング法の目的に応じて変更および適合させることができる。例えば、インキュベーション温度が、例えば、室温または３７℃である場合には、これらの条件下で安定であるバインダーを特定できる可能性が高まる（例えば、３７℃でのインキュベーションの場合、人体にみられる条件下で安定であるバインダー）。このような性質は、結合パートナーの一方または両方がある種の治療用途に使用できる候補である場合（例えば、抗体）には極めて有利なことがある。
【００４４】
使用される細胞は、真核細胞と原核細胞の両方を含むいずれの形態でもよい。好ましくは、細胞は、培養真核細胞、より好ましくは培養哺乳類細胞（例えば、培養ヒト細胞）である。好ましい哺乳類細胞は、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞、ＭＯＬＴ−３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ細胞および他の樹立細胞株の細胞である。さらに、細胞は、好ましくは、機能的および立体配座未変性状態において本発明の融合タンパク質を発現することができなければならない。一実施態様によれば、前記細胞は、ＨＩＶ感染細胞である。好ましくは、前記ＨＩＶ感染細胞は、慢性的に感染したものである。一つの具体的実施態様によれば、前記慢性的ＨＩＶ感染細胞は、ＮＬ４．３慢性的感染ＭＯＬＴ細胞、Ｈ９細胞およびＨｕＴ−７８細胞からなる群から選択されたものである。Ｂｌａｎｃｏ  Ｊ等、Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００４；７６（４）：８０４−８１１およびＢｌａｎｃｏ  Ｊ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００３；３０５（２）：３１８−３２９参照。
【００４５】
アッセイの種々の成分を接触させる順序は、特に限定されない。一つの実施態様によれば、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を、最初に融合タンパク質と接触させ、その後試料と接触させる。別の実施態様によれば、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を、最初に試料と接触させ、次に融合タンパク質と接触させる。さらに別の実施態様によれば、融合タンパク質と試料を混合し、その後この混合物を、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞に添加する。別の実施態様によれば、融合タンパク質、試料、および表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を同時に接触させる。
【００４６】
「ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位」を、配列およびｇｐ１２０の配座により決定する。ＣＤ４に対する結合に関与するｇｐ１２０の主要領域は、ＣＤ４結合ループ３６４−ＳＳＧＧＤＰＥＩＶＴＨ−３７４（ＨＸＢ２番号Ｐ０４５７８）であるけれども、ｇｐ１２０における配座ＣＤ４ｂｓは、このタンパク質の第四一定領域からの他の残基を含む。特に、Ｄ３６８（ＨＸＢ２番号）は、その突然変異がＣＤ４結合を無効にするので、極めて重要な残基である。ＣＤ４ｂｓの特徴付けがすでに公開されている。Ｓｔｅｒｊｏｖｓｋｉ  Ｊ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１１；４１０（２）：４１８−４２８参照。ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位は機能的且つ未変性な配座を有していることが好ましい。このようなＣＤ４結合部位を提供する一つの方法は、ｇｐ１２０タンパク質、Ｅｎｖタンパク質または前期結合部位を含んでなるその断片を使用することである。
【００４７】
好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質は、好ましくはＣＤ４またはその機能的に同等の変異体からなる群から選択されたものである。好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質はＣＤ４である。前記ＣＤ４は、好ましくは動物由来のもの、特にヒトなどの脊椎動物由来のもの（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース受託番号Ｐ０１７３０）、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）；鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ネズミおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物である。別の好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質は、ＣＤ４の機能的に同等の変異体である。
【００４８】
ＣＤ４の変異体は、天然および人工的なもののいずれであってもよい。表現「自然変異体」は、他の種において天然にあらわれる上記したヒトＣＤ４の全ての変異体（すなわち、ＣＤ４相同分子種）に関する。前記天然変異体は、ＣＤ４マウスまたはニワトリ相同分子種（ＮＣＢＩデータベース受託番号がそれぞれＮＰ＿０３８５１６．１およびＮＰ＿９８９９８０．１）などが挙げられるが、これらには限定されない。また、本発明に使用するのに好適なＣＤ４の自然変異体は、一つ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失による前記配列に由来するものでもよく、自然対立遺伝子、代替プロセシングから得られる変異体ならびに天然にあらわれる分泌および切断型などがある。
【００４９】
本発明において使用されるＣＤ４の機能的に同等の変異体は、一つ以上のアミノ酸の修飾、欠失または挿入から得られ、ＣＤ４の活性を実質的に保存するポリペプチドを指す。ポリペプチドがＣＤ４の機能的に同等の変異体としてみることができるかどうかを判定するのに適切なアッセイには、ポリペプチドが表面にｇｐ１２０を発現する細胞に結合する能力に基づく、本発明の実施例３に示すアッセイなどがある。アッセイは、ｇｐ１２０を発現する細胞を、抗体Ｆｃ断片と被検変異体とを含んでなる融合タンパク質と接触させることにより実施することができる。ポリペプチドは、上記したヒトＣＤ４の結合効力の少なくとも１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％またはそれ以下を示す場合には、ＣＤ４の機能的に同等の変異体としてみるとことができる。
【００５０】
本発明に関連して意図されるＣＤ４の機能的に同等の変異体は、上記した種々のＣＤ４の自然変異体との類似度または一致度が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％であるポリペプチドなどがある。２つの配列の間の一致度％は、比較される２つの配列を共有する同一のアミノ酸の割合を示し、一方、類似度％は類似アミノ酸の残基の割合（アルギニンとリジンなどのアミノ酸のまたはアスパラギン酸とグルタミン酸の残基の当量を考慮する）を示す。２つのアミノ酸配列の間の一致度％は、特定の領域に整列する２つの配列を比較し、一致する位置の数を得るために両方の配列における同一のアミノ酸がある位置の数を求め、前記位置数を、比較されているセグメントにおける総位置数により割り、得られた値に１００を掛けることにより計算する。２つのポリペプチドの間の一致度と類似度の程度は、コンピュータ実行アルゴリズムと、当該技術分野において広く知られている方法を用いて求める。アミノ酸の２つの配列の間の一致度と類似度は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて求める。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ等、「ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ」（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳ、２００１）参照。
【００５１】
別の実施態様によれば、ＣＤ４の機能的に同等の変異体は、少なくとも前記ＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域を含んでなるＣＤ４の断片である。ＣＤ４のＤ１ドメイン（Ｉｇ様Ｖ型としても知られている）は、ヒトＣＤ４の番号に準じたＣＤ４のアミノ酸２６−１２５を含んでなる（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース受託番号Ｐ０１７３０）。ＣＤ４のＤ２ドメイン（Ｉｇ様Ｃ２型１としても知られている）は、ヒトＣＤ４の番号に準じてＣＤ４のアミノ酸１２６−２０３を含んでなる。種々の実施態様によれば、ＣＤ４の大きな断片（Ｄ１−Ｄ４）を使用する。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ等、２０１１；８５（１８）：９３９５−９４０５参照。ＣＤ４のＤ２ドメインは、ＮｈｅＩ制限部位を含む。部位は、Ｃ末端（６０３−６０８ｂｐ）に位置している。別の実施態様によれば、代わりに、ＣＤ４断片に対する類似度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であって、ｇｐ１２０のＣＤ結合部位への結合能を有する、ＣＤ４断片の変異体が使用される。好ましくは、ＣＤ４断片は、配列番号８の配列を含んでなる。
【００５２】
一つの実施態様によれば、前記一次抗体は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）およびＩｇＭからなる群から選択されたものであり、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１である。前記一次抗体は、前記生物試料が由来する種とは異なる種由来のものであることが好ましい。前記一次抗体は、いずれかの脊椎動物抗体、好ましくはいずれかの哺乳動物抗体およびより好ましくはいずれかの非ヒト抗体（例えば、ウサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ヒツジ抗体またはロバ抗体）であることができる。一実施態様によれば、前記一次抗体は、マウスＩｇＧ、好ましくはマウスＩｇＧ１である。
【００５３】
別の実施態様によれば、Ｆｃ領域に対する類似度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であり、前記Ｆｃ領域の対応する二次抗体に結合することができる変異体を代わりに使用する。好ましくは、Ｆｃ領域は配列番号：９の配列を有している。
【００５４】
最も好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位への結合能を有する前記融合タンパク質は、ヒトＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域を含んでなるか、またはヒトＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域から構成されており、前記(ii)一次抗体のＦｃ領域はマウスＩｇＧ１のＦｃ領域である。より好ましい実施態様によれば、前記融合タンパク質は、配列番号：７によるアミノ酸配列を有するか、またはその配列に対する同一度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であり、好ましくは前記Ｆｃ領域の対応する二次抗体に結合することができる変異体を有する。「前記Ｆｃ領域の対応する二次抗体」は、二次抗体のＦａｂ断片は、一次抗体のＦｃ領域に結合する（すなわち、一次抗体の種に特異的である）。別の実施態様によれば、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合することができる融合タンパク質は、配列番号：１０によるポリヌクレオチドによりコードされている。
【００５５】
また、融合タンパク質は、(i)前記ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質および(ii)前記一次抗体のＦｃ領域を連結するリンカーを含有してもいてもよい。このようなリンカーは、融合タンパク質の可変性を容易に高めることができ、また、２つの断片の間の立体障害を減少することもでき、適当な結合相互作用を可能とする。また、リンカーは、各断片の適切な折り畳みが生じるのを容易にすることもできる。リンカーは、タンパク質の２つのドメインの間にランダムコイルで存在するかを決定する配列などの天然のものであることができる。典型的なリンカー配列は、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＣ末端領域とＮ末端領域との間にみられるリンカーである。天然リンカーの他の例として、λｃＩおよびＬｅｘＡタンパク質にみられるリンカーなどが挙げられる。また、リンカーは、合成ものものであることができる。例えば、配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３は、合成未構造化リンカーとして使用されることができる。Ｈｕｓｔｏｎ  Ｊ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：４８７９−４８８７およびＨｕｓｔｏｎ  Ｊ等、ＵＳ５、０９１、５１３参照。別の典型的な実施態様には、ポリアラニン配列（例えば、（Ａｌａ）３）などがある。
【００５６】
別の実施態様によれば、融合タンパク質は、ジスルフィド連結ホモ二量体である。
【００５７】
第二工程において、本発明によるＨＩＶ中和抗体を測定する方法は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位への前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなる。
【００５８】
好ましくは、前記ＨＩＶ中和抗体は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞の表面に結合でき、本発明の融合タンパク質の結合を、陰性対照と比較して、好ましくは少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１０％減少することができる。より好ましくは、前記ＨＩＶ中和抗体は、少なくともＣＤ４と同じ程度に高いｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する親和性を有する抗体である。
【００５９】
適切な結合を検討する方法には、結合パートナーの性質に依存し、免疫学的検定（例えば、ＥＬＩＳＡ）、フィルタースクリーニングアッセイ、ＦＡＣＳ、もしくは免疫蛍光測定法、または結合定数を数値化する他の方法、染色組織スライドまたは細胞および他の免疫組織化学法などがあるが、これらには限定されない。このような方法は、当該技術分野において周知であり、前記結合効力を測定するのに使用することができる。
【００６０】
好ましくは、前記測定は、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）によりおこなわれる。本明細書において使用される用語「フローサイトメトリー」は、試料中の物質の割合を、その物質を標識（例えば、標識抗体をその物質に結合）し、その物質を含有する流体流が光線を通過し、試料から放出された光を一連のフィルターおよびミラーにより構成波長に分離し、その光を検出することにより測定するアッセイを指す。フローサイトメトリーは、検出感度が高く、相対サイズなどの単細胞の一部の特徴および内在性蛍光の数量化を迅速におこなうことができるとともに、蛍光で標識できる細胞状化合物の定量分析が可能でなる。Ｍｅｌａｍｅｄ  Ｍ等、「Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ(フローサイトメトリーおよび細胞選別)」、  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９０）参照。フローサイトメトリーの主要な利点の一つは、多数の粒子または細胞について検体の定量化を迅速にできることである。一般的に、検出可能なマーカーとして使用するのに選択される蛍光色素は、レーザーにより使用される波長を有する光により励起されたときに、蛍光色素が蛍光を発光する能力に基づき選択される。蛍光色素がレーザー光により励起されると、光を放出し、次にフローサイトメーターの光電子増倍管により評価される。この手法では、１〜２分間で、１００００細胞/粒子を分析することができる。フローサイトメーターは、異なる波長で発光する種々の蛍光色素からのエミッタンスを検出するフィルターを備えており、４種以上の異なる蛍光色素を検出可能なマーカーとして使用することができ、このことは、現在では少なくとも４種の異なる分子を同時に検出できることを意味している。細胞を分析するためのこれらの方法および装置は、市販されており、当該技術分野において周知である（例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；米国ニュージャージー州のＦｒａｎｋｌｉｎ  ＬａｋｅｓにあるＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。
【００６１】
一つの実施態様によれば、前記測定は、前記融合タンパク質、好ましくは前記融合タンパク質のＦｃ領域に結合できるリポーターを用いて前記細胞に結合する融合タンパク質を検出することを含んでなる。
【００６２】
好ましい実施態様によれば、前記測定は、前記細胞を、前記融合タンパク質、好ましくは前記融合タンパク質のＦｃ領域に結合できるリポーターを用いて、好ましくはフローサイトメトリーにより分析することを含んでなる。前記リポーターは、好ましくは検出可能部分を含んでなり、より好ましくは検出可能部分に結合したＦｃ特異的二次抗体である。
【００６３】
有用な検出可能な成分には、フルオロフォアなどがある。「フルオロフォア」（または「蛍光色素」もしくは「発色団」）は、光励起により光を再放出することができる蛍光化合物である。使用することができるフルオロフォアには、生物学的（例えば、タンパク質）および化学的フルオロフォアなどがある。典型的な生物学的フルオロフォアは、Ｔサファイア、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣＦＰｍ，ＣｙＰｅｔ，ＥＧＦＰ，ＰＡ−ＥＧＦＰ，Ｅｍｅｒａｌｄ，ＥＹＦＰ，Ｖｅｎｕｓ，ｍＣｉｔｒｉｎｅ，ｍＫＯ，ｍＯｒａｎｇｅ，ＤＳＲｅｄ，ＪＲｅｄ，ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ，ｍＣｈｅｒｒｙ，ＰＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ，ｍＲｕｂｙ，Ｔｏｍａｔｏ，ｍＰｌｕｍ，ｍＫａｔｅ，ｍＫａｔｕｓｈｋａ，Ｋａｅｄｅ，Ｈａｌｏｔａｇおよびスーパーエクリプティックフッ素を含んでなる。典型的な化学的フルオロフォアは、アレクサフルオル、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルローダミン、シアニン染料、フルオレセイン、量子ドット、ＩＲ染料、ＦＭ染料、ＡＴＴＯ染料を含んでなる。また、二次抗体は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはグルコースオキシダーゼなどの検出に有効である酵素で標識することができる。抗体が検出可能酵素で標識されるとき、酵素が使用して識別できる反応生成物を生成するさらなる試薬を添加することにより検出できる。例えば、薬剤ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素とジアミノベンジジンを添加することにより、視覚的に検出可能な着色反応生成物を生じる。また、抗体は、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合を間接的に測定して検出できる。
【００６４】
好ましくは、前記Ｆｃ特異的二次抗体は、前記一次抗体が由来する種に特異的である。一実施態様によれば、Ｆｃ特異的二次抗体は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）およびＩｇＭからなる群から選択されたものである。好ましくは、二次抗体は、ＩｇＧである。前記Ｆｃ特異的二次抗体は、いずれかの脊椎動物抗体、好ましくはいずれかの哺乳動物抗体、およびより好ましくはいずれかの非ヒト抗体（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジまたはロバ抗体）であることができる。
【００６５】
第一の態様の方法の別の実施態様によれば、工程（ｉ）に続き、未結合融合タンパク質を除去する一以上の洗浄工程をおこなう。洗浄工程は、細胞およびｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の結合パートナーに応じた適切な方法で実施できる。細胞は、いずれかの好適な培地、例えば、細胞培地、またはＰＢＳなどの緩衝剤で洗浄できる。培地は、Ｔｗｅｅｎ２０などの洗浄剤を含有してもよい。洗浄時間は、各洗浄ごとに、いずれかの好適な時間、例えば、１〜３０分間または３〜１０分間であることができる。洗浄は、前記細胞のキャリアを穏やかに震盪または揺動などでよい。洗浄温度は、細胞が生存でき、結合が妨害されない温度である。例えば、２０〜４５℃または３０℃〜４０℃であることができる。典型的には、約３７℃または室温である。融合タンパク質を洗浄するためのプロトコルは、当該技術分野において周知である。
【００６６】
表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞に対する融合タンパク質の結合効力を測定したら、前記結合が試料の存在下で阻害される場合、本発明の方法は試料におけるＨＩＶ中和抗体を測定することを含んでなる。
【００６７】
結合の阻害は、対照試料の存在下での結合に対して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である結合を指す。
【００６８】
好ましい実施態様によれば、結合の阻害は、上記した融合タンパク質の存在下における試料中、および融合タンパク質の不存在下およびｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する結合ができるいずれかの化合物の不存在下における並発反応ににおける結合効力を評価することにより測定される。この状況において、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する結合ができるいずれか他の化合物を含有しない試料の存在下における細胞に対する融合タンパク質の結合と比較して、細胞に対する融合タンパク質の結合が低い場合には、試料はｎＡｂを含有するものと判定する。本発明の方法を実施するのに使用できる好適な試料には、検討中の試料と同じ性質を有し、いずれのｎＡｂも含有しないことが知られている試料などがある。一実施態様によれば、分析されている試料が患者から得た試料であるときには、対照試料は、ＨＩＶ感染が知られていない患者か、あるいはＨＩＶに感染したがｎＡｂを生じなかった患者からの同じ性質の試料であることができる。別の実施態様によれば、分析されている試料が組織培養上清であるとき、対照試料は、ｎＡｂを産生しないことが知られている細胞、またはｇｐ１２０に対する親和性のないＡｂを発現する細胞からの培養上清であることができる。
【００６９】
第一の態様による方法は、試料にＨＩＶ中和抗体が存在するか存在しないかを判定することに用いられる。このために、標準となる値を得る。用語「標準値」は、中和抗体が存在するか、存在しないかを判定するのに使用される、閾値である。試料において測定される中和抗体の量が標準量を超える場合には中和抗体が存在し、試料において測定される中和抗体の量が標準量と同じか、あるいはそれ以下である場合には、中和抗体が存在しないとする。同様に、細胞に対する融合タンパク質の結合が標準量を超える場合には中和抗体が存在せず、細胞に対する融合タンパク質の結合が標準量と等しいか、あるいはそれよりも低い場合には中和抗体が存在するとする。標準値は、例えば、ＨＩＶ感染せず且つＨＩＶに対して免疫がない対象からの代表的な一連の試料における中和抗体の量を定量化し、標準量を測定するのに得られた結果を統計的に分析することにより確定できる。標準量は、好ましくはゼロまたはレポーター遺伝子活性を測定するのに使用されるアッセイの検出可能限界未満であることができる。したがって、標準量は、中和抗体を含んでいないことが知られている試料に接触させた上記した細胞から得ることができる。
【００７０】
第一の態様の方法は、ＨＩＶ中和抗体の存在を判定することに使用できるだけでなく、ＨＩＶ中和抗体を定量化することにも使用できる。したがって、本発明は、前記判定が定量的である第一の態様の方法にも関する。用語「定量」は、半定量（すなわち、量の近似）を含んでなる。そのとき、第一の態様の方法において、前記少なくとも一つの対照は陽性対照であることが好ましい。好ましくは、少なくとも２種、３種、５種、１０種、１５種または２０種の陽性対照が使用される。各対照は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する固有量の化合物を含んでなる。換言すれば、陽性対照は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する化合物の種々の濃度における標準として使用される。得られる結合効力値は、標準曲線をひくのに使用でき、次に、それを使用して、定量的に求めるべきＨＩＶ中和抗体の量を導き出すのに使用できる。
【００７１】
好ましくは、本発明で言及する中和抗体の存在を判定することは、前記抗体の存在を判定すること、またはそれらの量または濃度を、好ましくは半定量的にまたは定量的に測定することに関する。最も好ましくは、その量は、力価（すなわち、所定の結合効力度にまだ影響する試料の最大希釈度）として測定される。好ましくは、測定は中和抗体の定量化のための正規化を含む。正規化、したがって、定量化は、所定量の特徴付けられた中和抗体を反応混合物に添加することによりおこなうことができる。好ましくは、前記特徴付けられた中和抗体は、一定レベルの中和とするために必要とする量が予め定められたものである抗体である。正規化は、同じレベルの中和（例えば、予め定めた量の特徴付けられた中和抗体による阻害と比較して結合の５０％の阻害）とするのに必要とされる試料の量または希釈度を求めることを原理とするものである。定量化について、中和は、特徴付けられた中和抗体を用いた標準曲線または当該技術分野において周知であるプロトコルに準じた他の好適な標準物質と比較することができる。定量法は、例えば、免疫学的検定（例えば、ＥＬＩＳＡ）、フィルタースクリーニングアッセイ、結合定数を定量化するＦＡＣＳまたは免疫蛍光測定法または結合定数を定量化する他の方法、染色組織スライドまたは細胞および他の免疫組織化学法などの上記した結合についての検討などがある。
【００７２】
３．本発明の融合タンパク質および核酸
別の態様によれば、本発明は、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００７３】
好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質は、ＣＤ４またはその機能的に同等の変異体である。より好ましい実施態様によれば、ＣＤ４の機能的に同等の変異体は、少なくとも前記ＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域を含んでなるＣＤ４の断片である。
【００７４】
別の実施態様によれば、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）およびＩｇＭからなる群から選択された一次抗体由来のものである。好ましくは、抗体はＩｇＧである。より好ましくは、抗体はＩｇＧ１である。前記一次抗体は、いずれかの脊椎動物抗体、好ましくはいずれかの哺乳動物抗体、より好ましくはいずれかの非ヒト抗体（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジまたはロバ抗体）であることができる。一実施態様によれば、前記一次抗体は、ネズミＩｇＧ、好ましくはマウスＩｇＧ１である。
【００７５】
また、前記融合タンパク質は、(i)前記ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と、(ii)一次抗体の前記Ｆｃ領域とを連結するリンカーを含有してもよい。このようなリンカーは、融合タンパク質の可変性を容易に高めることができ、また、２つの断片の間の立体障害を減少することもでき、適切な結合相互作用を可能とする。また、リンカーは、各断片の適切な折り畳みが生じるのを容易にすることもできる。リンカーは、タンパク質の２つのドメインの間にランダムコイルで存在すると判定された配列などの天然起源のものであることができる。典型的なリンカー配列は、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインとの間にみられるリンカーである。天然リンカーの他の例としては、λｃＩタンパク質およびＬｅｘＡタンパク質にみられるリンカーなどである。あるいは、リンカーは、合成のものであることができる。例えば、配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３は、合成非構造化リンカーとして使用することができる。Ｈｕｓｔｏｎ、１９８８、上記参照。別の典型的な実施態様には、ポリアラニン配列（例えば、（Ａｌａ）３）などがある。
【００７６】
別の態様によれば、本発明は、第二の態様の融合タンパク質をコードする核酸および発現カセット、または前記核酸を含んでなるベクターに関する。
【００７７】
好ましくは、前記核酸は、ポリヌクレオチドであり、ヌクレオチドモノマーの一本鎖または二本鎖ポリマー（核酸）を指し、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合連結により連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）などがあるがこれらには限定されない。
【００７８】
また、ＣＤ４の機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチドには、特異的配列により上記で定義したＣＤ４活性を有するポリペプチドの変異体をコードすることができるポリヌクレオチドなどがある。前記ポリヌクレオチドは、上記した配列に関しての一つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入、欠失または置換により上記で定義したポリヌクレオチドから生じる。好ましくは、ＣＤ４の機能的に同等の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列により、高度に制限的な条件において、上記したポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。高度に制限的なハイブリダイゼーションの典型的な条件には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および４０％ホルムアミド中、４２℃で１４時間インキュベーション後、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、６０℃で、１回または数回洗浄サイクルに附することなどがある。あるいは、高度に制限的な条件には、６×ＳＳＣにおいて約５０℃〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーションと、１〜３×ＳＳＣにおいて６８℃の温度での最終洗浄とを含んでなるものなどがある。中程度に制限的な条件は、０．２または０．３Ｍ  ＮａＣｌ中約６５℃まで、約５０℃の温度でハイブリダイゼーションした後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中、約５５℃まで約５０℃で洗浄することを含んでなる。一つのさらなる実施態様によれば、前記核酸は最適化されたコドンである。
【００７９】
別の実施態様によれば、代わりに、核酸に対する類似度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である核酸の変異体であって、本発明の融合タンパク質をコードする変異体を使用する。
【００８０】
第二の態様の核酸では、制限酵素で切断してベクターにライゲーションすることが必要である（すなわち、一部（例えば、１個、２個または３個）の末端ヌクレオチドを除去してもよい）。したがって、一実施態様によれば、本発明は、各末端を制限酵素で切断した前記核酸に関する。
【００８１】
別の実施態様によれば、本発明は、第二の態様の核酸と、プロモーター配列と、３’−ＵＴＲと、任意に選択マーカーとを含んでなる発現カセットに関する。さらに別の実施態様によれば、本発明は、第二の態様の核酸または発現カセットを含んでなる発現ベクターに関する。本発明による好適なベクターには、原核ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９およびブルースクリプトプラスミドならびにそれらの誘導体、例えば、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲｌおよびＲＰ４プラスミド；ファージおよびシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８ベクター；酵母における発現ベクター、例えば、２ミクロンプラスミド型ベクター；組み込みプラスミド；ＹＥＰベクター；セントロメアプラスミドおよび類似体；昆虫細胞における発現ベクター、例えば、ｐＡＣ系ベクターおよびｐＶＬ系ベクター；植物における発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系および類似体のベクター；ならびにウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルス）、ならびに非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ  ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌベクターに基づく、上位真核細胞における発現ベクターなどがある。一つの実施態様によれば、ベクターは、発現ベクターである。
【００８２】
別の実施態様によれば、本発明は、第二の態様の核酸、発現カセットまたは発現ベクターを含んでなる遺伝子導入細胞に関する。使用される遺伝子導入細胞は、真核細胞および原核細胞を含むいずれかの細胞型であることができ、好ましくは細胞として原核細胞、酵母細胞または哺乳類細胞が挙げられる。
【００８３】
４．本発明のキット
別の態様によれば、本発明は、（ｉ）第二の態様の融合タンパク質、第三の態様の核酸、ベクターまたは遺伝子導入細胞と、（ｉｉ）前記融合タンパク質に結合することができるリポーターとを含んでなるキットに関する。一つの実施態様によれば、前記キットは、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる少なくとも１種の細胞をさらに含んでなることができる。前記細胞は、第一の態様の方法で定義した細胞である。
【００８４】
５．ＨＩＶ中和抗体を発現するB細胞の同定方法
本発明のアッセイは、抗体−発現細胞の培養液の上清にアッセイを適用することにより中和抗体を発現できる抗体産生細胞を検出するのに使用することもできる。したがって、別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ中和抗体を発現する抗体産生細胞をインビトロで同定する方法であって、
（ｉ）表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記抗体産生細胞の培養液の上清と、さらに融合タンパク質であって、(i)ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と(ii)一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質と接触させ、
（ｉｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する前記融合タンパク質の結合効力を測定することを含んでなり、
前記結合能が少なくとも１種の対照の結合能とは異なる場合、前記抗体産生細胞がＨＩＶ中和抗体を発現するものとして判定することを特徴とする方法に関する。
【００８５】
第一工程において、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞を、前記抗体産生細胞の培養液の上清、および（ｉ）ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質と（ｉｉ）一次抗体のＦｃ領域とを含んでなる融合タンパク質に接触させる。接触工程の条件は、試料の接触について上記で実質的に説明した通りである。好ましい実施態様によれば、抗体産生細胞は、通常非不死であるＢ細胞である。別の実施態様によれば、抗体産生細胞は、通常不死である雑種細胞である。
【００８６】
好ましい実施態様によれば、ｇｐ１２０の前記ＣＤ４結合部位への結合能を有するタンパク質は、好ましくはＣＤ４またはその機能的に同等の変異体から選択されたものである。さらにより好ましい実施態様によれば、ＣＤ４の機能的等価物は、少なくとも前記ＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域を含んでなるＣＤ４断片である。別の実施態様によれば、ＣＤ４は、好ましくは動物由来、特に脊椎動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）、家畜（鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家畜哺乳類（例えばイヌおよびネコ）、ならびに実験動物（例えば、マウス、ネズミおよびモルモットなどの齧歯動物）由来のものである。別の実施態様によれば、一次抗体のＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域である。
【００８７】
アッセイの種々の成分を接触させる順序は特に限定されない。したがって、一実施態様によれば、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を融合タンパク質と最初に接触させ、後で培養上清と接触させる。別の実施態様によれば、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を最初に培養上清と接触させ、その後融合タンパク質と接触させる。さらに別の実施態様によれば、融合タンパク質と培養上清を混合した後、混合物を、表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞に添加する。別の実施態様によれば、融合タンパク質、培養上清および表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を発現する細胞を、同時に接触させる。
【００８８】
第二工程において、細胞におけるｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対する融合タンパク質の結合効力を判定する。ｇｐ１２０を発現する細胞に対する融合タンパク質の結合を判定するのに好適な方法は、試料中のＨＩＶ中和抗体を判定する方法に関連して上記で詳細に説明した。一実施態様によれば、前記測定は、前記融合タンパク質、好ましくは前記融合タンパク質のＦｃ領域に結合できるリポーターを用いて前記細胞に結合した融合タンパク質を検出することを含んでなる。好ましい実施態様によれば、前記測定は、前記融合タンパク質、好ましくは前記融合タンパク質のＦｃ領域に結合することができるリポーターを用いて、好ましくはフローサイトメトリーにより前記細胞を分析することを含んでなる。前記リポーターは、好ましくは検出可能な部分、より好ましくは検出可能部分に結合したＦｃ特異的二次抗体を含んでなる。
【００８９】
表面にｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を含んでなる細胞に対する融合タンパク質の結合効力を判定したら、前記結合が試料の存在下で阻害される場合には、本発明の方法は、抗体産生細胞を、ＨＩＶ中和抗体を産生するものとして判定することを含んでなる。結合の阻害は、対照試料の存在下での結合に対して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である結合を指す。
【００９０】
抗体産生細胞が不均質集団である場合、細胞をクローニングし、均質細胞集団を得るために中和抗体の産生に基づいてさらに選択することができる。クローンは、限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により成長させてよい。Ｇｏｄｉｎｇ  Ｊ、「Ｍｏｎｏｃｌａｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（モノクローナル抗体）：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（原理と実施）」、３ｒｄ  Ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ、１９９６）参照。このために好適な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地などがある。抗体産生細胞が雑種細胞である場合には、細胞を、動物における腹水腫瘍細胞として生体内で成長させてもよい。
【００９１】
６．中和抗体を得る方法
別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶ中和抗体を産生する方法であって、
ａ）中和抗体を発現するＢ細胞の単離方法にしたがって単離したＢ細胞を含んでなるハイブリドーマを培養し、
ｂ）前記ハイブリドーマにより発現されたＨＩＶ中和抗体を単離することを含んでなる方法に関する。
【００９２】
上記した方法にしたがって選択した中和抗体を発現する抗体産生細胞を、好ましくは未融合親骨髄腫の成長または生存を阻害する一種以上の物質を含有する好適な培地に播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培地には、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を防止するヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）などがある。
【００９３】
抗体は細胞から単離することができ、または好適な細胞において抗原特異性に関与する細胞の免疫グロブリン遺伝子の関連領域を発現することにより、組み換え手段により得ることもできる。
【００９４】
抗体は、当該技術分野において既知の方法、例えば、アニオン／カチオン交換、サイズ排除／ゲル濾過、沈殿および特異的アフィニティーリガンドの使用により、抗体産生細胞の培養上清から精製できる。一般的に使用されるアフィニティーリガンドは、４つのサブクラスのヒトまたはヒト化ＩｇＧの一つ以上を結合する、バクテリア由来プロテインＡおよびプロテインＧ、モノクローナル抗体ならびにラクダ科動物の抗体またはそれ由来の結合断片である。
【００９５】
抗体が組み換え手段により産生される場合、免疫グロブリン分子の関連領域をコードするポリヌクレオチドを単離する。抗体核酸の一つのソースは、意図する抗原で免疫した動物からＢ細胞を得て、それを不死化細胞に融合することにより産生したハイブリドーマである。別法として、核酸を、免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離できる。抗体をコードする核酸のさらに別のソースは、例えば、ファージ提示技術を介して精製したそのような核酸のライブラリーである。意図するペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド）は、当該技術分野において既知の標準法（例えば、パンニング）により同定できる。
【００９６】
意図する免疫グロブリンまたはポリペプチドからの関連アミノ酸配列を、直接タンパク質配列決定法により決定し、好適なコード化ヌクレオチド配列は、普遍遺伝暗号表にしたがって設計することができる。別法として、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡは、従来法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を用いてこのような抗体を産生する細胞から単離し、配列決定することができる。Ｂｒｏｗｎ  Ｔ、「Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＧＢ、１９９５）；Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ等「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９２）；Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ、等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ」（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、２００８）；Ｉｎｎｉｓ  Ｍ等、Ｅｄｓ、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳ、１９９０）；Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ、Ｅｄ．、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳ、１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐ  Ｔ等、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＧＢ、１９８７）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ、Ｅｄ．、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ、ＵＳ、１９８７）；Ｄａｖｉｓ  Ｌ等、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９８６）、Ｓｃｈｌｅｅｆ  Ｍ、Ｅｄ．、「Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ＤＥ、２００１）参照。
【００９７】
免疫グロブリンポリペプチドの全体の可変領域をコードする配列を決定してもよい；しかしながら、可変領域、例えば、ＣＤＲコード部分の一部分のみの配列決定するのが適切なことがある。配列決定を、標準法を用いて実施する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、上記参照およびＳａｎｇｅｒ  Ｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９７７；７４：５４６３−５４６７参照。クローン核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公表された配列とを比較することにより、当業者は、配列決定する領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列セグメント使用法および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞突然変異過程から得られる配列を含む重鎖および軽鎖可変領域の配列を決定することが容易にできるであろう。免疫グロブリン遺伝子配列情報の一つのソースは、米国メリーランド州ベテスダにある国立衛生研究所、国立医学図書館、全米バイオテクノロジー情報センターである。
【００９８】
７．治療法
別の態様によれば、本発明は、必要とする対象におけるＨＩＶまたはＡＩＤＳの治療または予防方法であって、本発明の第五の態様の方法により単離した中和抗体を前記対象に投与することを含んでなる、方法に関する。
【００９９】
ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの症状における中和抗体ＨＩＶの有益な治療または予防効果には、例えば、ＨＩＶに暴露する個体の初期感染を予防または遅延すること；ＨＩＶに感染した個体におけるウイルス負荷を減少させること；ＨＩＶ感染の無症状期を長くすること；ウイルスレベルが抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）を介して低下したＨＩＶ患者における低ウイルス負荷を維持すること；薬品未投与の患者およびＡＲＴで治療した患者において、ＨＩＶ−１特異的および非特異的の両方のＣＤ４Ｔ細胞レベルを増加またはＣＤ４Ｔ細胞の減少を低下させて、ＡＩＤＳを患う個人における健康全般または生活の質を増加させること；およびＡＩＤＳを患う個人の平均余命を延ばすことなどがある。臨床医は、治療の効果を、治療前の患者の状態、または未治療患者の予測される状態と比較して、治療がＡＩＤＳを阻害するのに有効かどうかを判定することができる。好ましい実施態様によれば、本発明の免疫原性組成物は、予防組成物である。
【０１００】
本発明の中和抗体は、ＨＩＶ−１感染の治療に有用なことがある。ＨＩＶ−１またはそれらの等価物を患う全ての動物（例えば、チンパンジー、マカク、ヒヒまたはヒト）をこの方法で治療できるが、本発明の中和抗体は、特にヒトにおける治療に使用される。しばしば、所望の治療効果を生じさせるために、複数回の投与を必要とすることがあり；厳密なプロトコル（投与量および頻度）は、標準臨床診断法により定めることができる。
【０１０１】
さらに、本発明は、ＨＩＶ感染と関連する症状を予防または減少することに関する。これらには、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪の感染、口のびらん、再発性鼻および咽喉感染ならびに体重減少を含む、ＨＩＶ感染の軽症期と関連した症状などがある。さらに、ＨＩＶ感染の主要な症候期と関連したさらなる症状には、例えば、口腔カンジダ症および膣内カンジダ症（カンジダ菌）、持続性下痢、体重減少、持続性咳および再活性結核または再発性ヘルペス感染、例えば、単純疱疹（単純ヘルペス）などがある。本発明により治療できる末期のＡＩＤＳの他の症状には、例えば、下痢、悪心および嘔吐、鵞口瘡びらんおよび口のびらん、持続性、再発性膣内感染および子宮頸がん、持続性全身リンパ節症（ＰＧＬ）、重度の皮膚感染、いぼおよび白癬、呼吸器感染、肺炎、とりわけニューモシスチスカリニ肺炎（ＰＣＰ）、帯状疱疹（帯状ヘルペス）、神経系障害、例えば、手足における疼痛、しびれ感または「しびれてピリピリする感覚」、神経的異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核または他の同様な日和見感染などがある。
【０１０２】
別の好ましい実施態様によれば、中和抗体が投与される対象は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、好ましくは高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を受けている対象である。
【０１０３】
本明細書において述べた全ての公報は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１０４】
上記した本発明は、明瞭および理解のためにある程度詳細に説明したが、この開示を読むことにより、当業者には、本発明の範囲および添付の請求の範囲のから逸脱することなく、形態および詳細の種々の変化をすることができることが理解されるであろう。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１プラスミドの構築
ヒトＣＤ４のＤ１−Ｄ２Ｎ末端領域は、白金ＴａｑＤＮＡＰｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、ＵＳ）および以下のプライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ一段ＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて標準ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した：
１）ＣＤ４Ｌセンス（配列番号：１）：  
５´−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＡＧ−３´  
２）ＣＤ４Ｌ  ＡＳ  ＮｈｅＩ（配列番号：２）：  
５´−ＴＡＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧ−３´  
【０１０６】
ヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出したＲＮＡを、鋳型として使用した。ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯキットを用い、メーカーの取扱説明書にしたがってＣＤ４アンプライマーをクローニングした後に精製した。
【０１０７】
マウスＩｇＧ１のヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３含有Ｆｃ領域は、プライマーを用いて上記で説明したようにして増幅した：
３）ＭＰＥＲ−ｍＩｇＧ１−Ｓ（配列番号：３）：  
５´−ＧＡＡＴＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴ−３´
４）ｍＩｇＧ１−ＡＳ（配列番号：４）：
５´−ＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧ−３´
【０１０８】
鋳型として、ＮＳ１マウス細胞株から抽出したＲＮＡを使用した。
【０１０９】
アンプライマーを精製し、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＮｈｅＩおよびＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＸｈｏＩ制限酵素（米国メリーランド州のＧｌｅｎ  ＢｕｒｎｉｅにあるＦｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）で消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ、ＵＳ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４（上記で同じ制限酵素で線状化した）に結紮した。最後に、ＤＮＡ構築一体性を、ＢｉｇＤｙｅターミーターｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、米国カリフォルニア州のＣａｒｌｓｂａｄにあるＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて配列決定することにより確認した。配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７および図１参照。
【０１１０】
実施例２
ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１組み換えタンパク質の産生
ＨＥＫ２９３細胞を、メーカーの指示書にしたがって、Ｃａｌｐｈｏｓ  トランスファクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）、日本国大津市にある宝バイオ株式会社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１プラスミドをトランスファクションした。４８時間後、上清を採取し、０．４５μｍフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ国ＤａｒｍｓｔａｄｔにあるＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社）による濾過で清澄化し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１１１】
実施例３
ＨｕＣＤ４ｍＩｇＧ１組み換えタンパク質を含有する上清の滴定
ＮＬ４．３慢性的感染ＭＯＬＴ細胞株を、ＣＤ４ｍＩｇＧ１含有上清の段階希釈液で、室温で３０分間インキュベーションした。Ｂｌａｎｃｏ  Ｊ等、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００４；７６（４）：８０４−８１１参照。ＰＢＳで洗浄後、細胞表面でｇｐ１２０に結合したＣＤ４ｍＩｇＧ１を、Ｆｃ特異的ＤｙＬｉｇｈｔ６４９−Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国フィラデルフィア州のＷｅｓｔ  ＧｒｏｖｅにあるＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。図２参照。
【０１１２】
実施例４
競合的サイトメトリーアッセイを用いたｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の同定
抗体のｇｐ１２０／ＣＤ４遮断活性をフローサイトメトリーにより測定できるかどうかを判定するために、ＮＬ４．３慢性的感染ＭＯＬＴ細胞を、ｇｐ１２０のＣＤ４ｂｓを認識するＩｇＧｂ１２抗体の段階希釈液（３倍）（４８μｇ／ｍＬで開始）で、室温で２５分間プレインキュベーションした。その後、ＩＣ５０濃度でＨｕＣＤ４ｍＩｇＧ１含有上清を添加し、インキュベーションを室温でさらに３０分間おこなった。ＰＢＳで２回洗浄後、二次抗体Ｆｃ特異的ＤｙＬｉｇｈｔ６４９−Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国フィラデルフィラ州のＷｅｓｔ  ＧｒｏｖｅにあるＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を添加し、再び室温で１５分間インキュベーションした。細胞試料を、ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。ＩｇＧｂ１２は、定量化可能濃度依存力学において相互作用ｇｐ１２０／ＣＤ４を遮断した。図３参照。
【０１１３】
実施例５
ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断特異性の判定
アッセイの特異性を評価するために、ＣＤ４ｂｓ以外のＥｎｖ糖タンパク質における領域を認識した抗体を、上記した同じ条件で使用した。表１参照。ｇｐ１２０におけるＣＤ４結合部位（ＩｇＧｂ１２、ＶＲＣ０１およびＶＲＣ０３）またはＣＤ４におけるｇｐ１２０結合部位（Ｌｅｕ３ａ）を認識した抗体のみが、相互作用ｇｐ１２０／ＣＤ４を遮断した。このことは、説明したアッセイは高度に特異的であることを示している。図４参照。
【０１１４】
【表１】
0006282655.tif 000002
【０１１５】
実施例６
血漿試料におけるｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の定量化
血漿試料におけるｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体を同定および定量化するため、およびアッセイを有効とするために、ＨＩＶ−１感染患者からいくつかの血漿試料を使用した。これらの試料については上記で述べた通りであり、細胞間アッセイを用いて、ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の中和能および存在について分析した。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐａｌｏｍｉｎｏ  Ｓ等、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１；２９：５２５０−５２５９参照。ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断Ａｂｓを含有する一連の４つの広域中和血漿試料、および６つの低中和血漿を、以下のようにして分析した：ＮＬ４．３ＭＯＬＴ細胞を、血漿試料の段階希釈液（３倍、１/１０で開始）を用いて、室温で２５分間プレインキュベーションした。標準として、ｂ１２抗体の３倍段階希釈液（開始濃度４８μｇ／ｍＬ）を使用した。続いて、ｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１上清を、ＩＣ５０濃度で添加し、さらに３０分間インキュベーションした。洗浄後、細胞の表面にｇｐ１２０が結合したｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１タンパク質を、Ｆｃ特異的ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９−Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国ペンシルベニア州のＷｅｓｔ  ＧｒｏｖｅにあるＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて検出した。最後に、試料を、ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより分析し、ｇｐ１２０／ＣＤ４遮断抗体の存在を、標準として使用したｂ１２抗体に関連した任意単位（ＡＵ）として定量化した。図５参照。
【０１１６】
上記した方法にしたがって、ＣＤ４／ｇｐ１２０遮断抗体の存在を、ＡＲＴ未処理ＨＩＶ−１感染患者、および陰性対照として使用された非感染個人からの血漿試料群で試験した。この場合、血漿試料を、１/５希釈液で試験した。結果を、ＣＤ４／ｇｐ１２０阻害％として示す。図６参照。
【０１１７】
アッセイを、異なるＨＩＶ−１分離株から得たエンベロープ糖タンパク質を用いることにより得て、さらに確認した。図６における試験した同じ一連の血漿試料を、ＨＩＶ−１Ｂａｌ分離株のエンベロープを発現するＭＯＬＴ細胞を用いて分析した。得られた結果を、図７に示す。図７では、ＨＩＶ＋個人から得た血漿におけるＣＤ４結合部位に対する定量化可能抗体の存在が確認される。さらに、各血漿試料について得られたＮＬ４−３およびＢａＬ分離株の両方に対するｈｕＣＤ４ｍＩｇＧ１の結合の阻害％から、強い相関関係があることが明らかとなった（ｐ＜０．０００１、ピアソン相関試験）。
【図１−１】
0006282655.tif 000003
【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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