(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体ポリマと電解質が含まれる溶液を収納できる２つの槽と，
前記２つの槽にそれぞれ配置された一対の電極と，
ナノポアを有し，前記ナノポアを介して前記２つの槽が連通するように前記２つの槽の間に配置された薄膜と，
前記薄膜に載置された三次元構造体とを備え，
前記三次元構造体は空隙を有し，
前記空隙は前記溶液を前記ナノポアから前記三次元構造体の上まで通す流路を形成し，前記流路の表面は前記生体ポリマを吸着できる官能基を有しており，
前記官能基は少なくともシラノール基を含み，
前記一対の電極への電圧印加時に，少なくとも前記ナノポアを中心とし下式で定義される生体ポリマ捕捉長ｒを半径とする半球の範囲内において，前記三次元構造体が前記溶液に再分散しないことを特徴とする，生体ポリマ分析デバイス。
0006259741.tif 000004
ｄ：ナノポアの直径
μ：生体ポリマの電気泳動の移動度
Ｌ：薄膜の厚み
Ｄ：生体ポリマの拡散係数
ΔＶ：２つの電極間に印加した電圧差
【請求項２】
前記溶液はカオトロピック効果を有するチオシアン酸イオン（SCN-），リン酸二水素イオン（H2PO4-），硫酸水素イオン（HSO4-），炭酸水素イオン（HCO3-），ヨウ化物イオン（I-），塩化物イオン（Cl-），硝酸イオン（NO3-），アンモニウムイオン（NH4+），セシウムイオン（Cs+），カリウムイオン（K+），グアニジウムイオン，又はテトラメチルアンモニウムイオンを含むことを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項３】
前記溶液のpHは１以上１０以下であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項４】
前記溶液のイオン強度は10mM以上，飽和塩化カリウム溶液のイオン強度以下であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項５】
前記官能基はカチオンに電離する官能基であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項６】
前記カチオンに電離する官能基は，1級アミン基，2級アミン基，3級アミン基，4級アミン基，ピリジン基，イミノ基，イミダゾール基，ピラゾール基，又はトリアゾール基であることを特徴とする，請求項５に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項７】
前記溶液のpHは前記カチオンに電離する官能基のpKa以下であることを特徴とする，請求項５に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項８】
前記流路の断面積は前記生体ポリマの分子断面積以上，前記空隙の最大断面積以下であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項９】
前記流路の断面積は生体ポリマの分子断面積以上，下式に定義される生体ポリマの平均自由工程Ｓ以下であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
0006259741.tif 000005
Ｄ：生体ポリマの拡散係数
ｔ：ナノポア近傍における平均滞在時間
【請求項１０】
前記三次元構造体は表面に前記生体ポリマを吸着できる官能基を有する複数の粒子から成型されていることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１１】
前記成型後の粒子は非球状であり，前記薄膜に載置された粒子第１層を真上から前記薄膜へと投影した図形において，前記成型後の粒子中心間が正三角形の格子を描いている場合の前記投影図形の面積占有率がπ/(12)1/2よりも大きい，あるいは前記成型後の粒子中心間が正四角形の格子を描いている場合の前記投影図形の面積占有率がπ/4よりも大きいことを特徴とする，請求項１０に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１２】
前記成型後の粒子は多面体であることを特徴とする請求項１０に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１３】
前記粒子の材質はセラミックス又は樹脂であることを特徴とする，請求項１０に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１４】
前記成型後の粒子は焼結反応又はガラス転移温度以下にまで加熱することにより隣接する粒子同士が一体化していることを特徴とする，請求項１０に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１５】
前記三次元構造体は異なるサイズを有する２種類以上の粒子から成型されていることを特徴とする，請求項１０に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１６】
前記三次元構造体は逆オパール構造体であることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１７】
前記三次元構造体は，周囲を前記三次元構造体の厚みよりも厚い壁で覆われていることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１８】
前記三次元構造体は前記薄膜の両側に載置されていることを特徴とする，請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項１９】
前記三次元構造体の厚みは，前記生体ポリマ捕捉長よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【請求項２０】
請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイスと，
前記生体ポリマ分析デバイスが備える前記一対の電極の間に流れるイオン電流を計測するイオン電流計測装置と，
前記イオン電流計測装置の出力信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換装置と，
前記アナログデジタル変換装置から供給された信号を処理するデータ処理装置と，
を有することを特徴とする生体ポリマ分析システム。
【請求項２１】
請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイスの製造方法において，
空隙を有する三次元構造体であって，前記空隙は表面に生体ポリマを吸着できる官能基を有する三次元構造体が載置された絶縁体薄膜の表面及び裏面を，電解質を含んだ溶液に浸す工程と，
前記薄膜の表面が浸された溶液と裏面が浸された溶液に一対の電極を浸漬する工程と，  前記一対の電極にパルス状の電圧を印加する工程と，を有し，
前記薄膜と前記空隙が接する箇所にナノポアを開口することを特徴とする方法。
【請求項２２】
表面に標的生体ポリマが吸着できる官能基を有する複数の粒子を用いて，検体から前記標的生体ポリマを吸着回収する工程と，
ナノポアを有する薄膜上に前記粒子から成型された空隙を有する三次元構造体を載置する工程と，
前記ナノポアを有する薄膜を電解質を含む溶液に浸し，前記薄膜を挟んで配置された２つの電極間に電圧を印加する工程と，
前記標的生体ポリマが前記ナノポアを通過する時のイオン電流の変化から前記標的生体ポリマを分析する工程と，を有し，
前記官能基は少なくともシラノール基を含み，
前記空隙は前記電解質を含む溶液を前記ナノポアから前記三次元構造体の上まで通す流路を形成し，前記電圧印加時に，少なくとも前記ナノポアを中心として下式で定義される生体ポリマ捕捉長ｒを半径とする半球の範囲内において，前記溶液に再分散しないことを特徴とする分析方法。
0006259741.tif 000006
ｄ：ナノポアの直径
μ：標的生体ポリマの電気泳動の移動度
Ｌ：薄膜の厚み
Ｄ：標的生体ポリマの拡散係数
ΔＶ：２つの電極間に印加した電圧差
【請求項２３】
前記生体ポリマは一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，薄膜に埋め込まれた細孔を用いた生体ポリマ分析方法，特にDNAやタンパク質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚み数Å〜数十nm程度の薄膜に埋め込まれた直径0.9nm〜数nm程度の細孔（以下，ナノポアと呼ぶ）を生体ポリマ１分子が通過すると，生体ポリマのモノマ配列パターンに応じて，ナノポア周辺部の電気的特性がパターン状に変化する。これを利用して，生体ポリマのモノマ配列解析を行う方法が近年盛んに研究されている。ナノポアは電解質を含んだ溶液を薄膜両側に配置した形態でしばしば用いられる。この薄膜の表裏に電圧印加して電位差を発生させることによって，ナノポアに電解質を含んだ溶液を通過させることができる。電気的特性としてこの時発生するイオン電流に着目し，生体ポリマがナノポアを通過した時に観測されるイオン電流の変化量がモノマ種によって異なることを原理とした方式が最も有望視されている（図２）。イオン電流の他には，ナノポア部に１対の電極を形成し，その電極間を流れるトンネル電流を利用して，生体ポリマがナノポアを通過する際に観測されるトンネル電流量がモノマ種によって異なることを原理とした方式が広く知られている。いずれの方式も従来のように生体ポリマの断片化を伴う化学操作を必要とせずに，生体ポリマを直接読取することができる。生体ポリマがDNAの場合は次世代DNA塩基配列解析システムであり，生体ポリマがタンパク質の場合はアミノ酸配列解析システムであり，それぞれ従来よりも遥かに長い配列長を解読可能なシステムとして期待されている。
【０００３】
ナノポアデバイスとしては，脂質二重膜に埋め込まれた中心に細孔を有するタンパク質を用いたバイオポアと，半導体加工プロセスにて形成した絶縁薄膜に細孔を加工したソリッドポアの２種類が存在する。バイオポアでは脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)等）の細孔（直径1.2nm，厚さ0.6nm）を生体ポリマ検出部としてイオン電流の変化量を計測する。しかしこの細孔厚みがモノマ１分子単位（DNAのモノマである核酸の隣接距離は0.34nm）よりも大きいためにイオン電流変化量にはモノマ複数分子の情報が混在してしまう。この空間分解能不足に加えて，タンパク質を利用するため，溶液条件や環境条件によりタンパク質の細孔部が変性してデバイスが劣化してしまう。安定性や寿命の観点からデバイスのロバスト性が低いという課題が存在する。一方，ソリッドポアではグラフェンや二硫化モリブデンのような単分子層からなる薄膜を形成できる。これらの厚みであればモノマ１分子単位を読取るのに十分な空間分解能を確保することができる。また，タンパク質と異なり，様々な溶液条件や環境条件において材料が安定であり，デバイスのロバスト性が高いという利点がある。加えて，半導体加工プロセスにてナノポア部を並列化可能であり，上記のような利点からバイオポアよりも優れたデバイスとして着目されている。
【０００４】
生体ポリマであるDNA鎖をナノポアまで搬送する手段として，イオン電流を発生させている電位差をそのまま駆動力として生体ポリマを電気泳動させる方法が最も広く用いられている。しかし，図３に示したように，電気泳動によるDNA鎖のナノポア通過速度は非常に速いためにモノマ複数分子の信号が混在した信号値しか得られず，配列解析を実現するためには通過速度を遅くする技術が必要であった。具体的には100μs／モノマ１分子単位以上の通過速度まで遅延できることが好ましいが，現状では0.01〜1μs／モノマ１分子単位の通過速度であるため，少なくとも100倍から10000倍程度の速度遅延を実現する必要がある。このように通過速度を遅くすることができればモノマ１分子のみの信号を取得できることが可能となる。
【０００５】
この課題を解決すべく，様々な手法が考案されている。溶液の物性を調整する方法が多種検討されており，例えば，高濃度グリセロールを添加することにより溶液粘度を上昇させ，電気泳動時におけるDNA鎖の引張力と反対方向の摩擦力を増やすことでナノポア通過速度を遅くする方法が試みられている（非特許文献１）。また，溶液中にリチウムイオンを添加することにより，DNA鎖の見かけ上の負電荷を低減することで電気泳動時の引張力を小さくしてナノポア通過速度の遅延させる方法が検証されている（非特許文献２）。
【０００６】
溶液の物性を調整する以外の方法としては，デバイス側に工夫をもたらす方法が検討されている。例えば，ナノポア自体を工夫する方法が検証されている。単純な方法としてナノポアの直径を小さくすることでDNA鎖がナノポアを通過する際の摩擦力を増大させ，ナノポア通過速度を遅くする方法が知られている（非特許文献３）。また，デバイスに新たな構造体を設ける方法が検討されている。特許文献１には二次元状流路で構成されるナノポアデバイスにおいて，二次元形状の障害物を設置する方法が開示されている。上記特許文献１では，ナノポアが加工された薄膜の両側に，規則的に距離を離して配置されたナノサイズの障害物群（円柱など）を設ける構造を開示している。他の障害物の例としては，ポリマや樹脂，無機系多孔体，ビーズから構成されるゲル材料が明示されている。電気泳動時に生体ポリマが障害物に衝突することで，泳動を妨げる向きの摩擦力が発生するため，ナノポア通過速度が低減することが言及されている。非特許文献４では，障害物の他の実現手段として，ナノポア上流側にランダムに多層積層させた樹脂材質のナノワイヤ群を設ける構造が開示されている。電気泳動時に生体ポリマがナノワイヤに衝突することによる摩擦力を利用してナノポア通過速度を低減することが言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2014-074599号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D. Fologea, et al. Nano Lett., 2005, 5(9), 1734.
【非特許文献２】S. W. Kowalczyk, et al. Nano Lett., 2012, 12(2), 1038.
【非特許文献３】R. Akahori, et al. Nanotechnology, 2014, 25, 275501.
【非特許文献４】A. H. Squires, et al. J. A. C. S., 2013, 135(44), 16304.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の方法では遅延効果が不十分であるという課題が存在する。
上記のグリセロール等を添加して粘度に代表される溶液物性を調整する手法では，例えば生体ポリマとして二本鎖DNAを対象とした場合が開示されており，添加前後でたかだか通過時間は5倍に遅延する程度にとどまる。加えて，生体ポリマ通過時に添加物も同時に通過するため，モノマ１分子単位のモノマ種別信号値差が小さくなり，モノマ種検出が困難になるという課題もある。リチウムイオンを添加する方法も，例えば生体ポリマとして一本鎖DNAを対象とした場合が開示されており，添加前後での遅延効果は10倍程度である。
【００１０】
従来の障害物を利用した生体ポリマのナノポア通過速度の遅延方法では，例えば生体ポリマとして二本鎖DNAを対象とした場合が開示されており，遅延効果が15倍程度にとどまる。そのため，障害物への生体ポリマ衝突を原理とした手法でも遅延効果が不十分であった。
【００１１】
したがって，いずれの手法にしても，生体ポリマのナノポア通過速度をモノマ配列解析可能になる速度以下まで十分には遅延できておらず，別の手段の開発が望まれていた。
【００１２】
本発明は，上記課題に鑑みて為されたものであり，その目的とするところは新たな遅延原理を導入することにより生体ポリマのナノポア通過速度を大幅に遅延化し，生体ポリマ中のモノマ配列解析を安定に行うことが可能な生体ポリマ分析システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の代表的な形態は，生体ポリマと電解質が含まれる溶液を収納できる２つの槽と，２つの槽にそれぞれ配置された一対の電極と，ナノポアを有し，ナノポアを介して２つの槽が連通するように２つの槽の間に配置された薄膜と，薄膜に載置された三次元構造体とを備え，三次元構造体は空隙を有し，空隙は溶液をナノポアから三次元構造体の上まで通す流路を形成し，流路の表面は生体ポリマを吸着できる官能基を有しており，一対の電極への電圧印加時に，少なくともナノポアを中心とし生体ポリマ捕捉長を半径とする半球の範囲内において，三次元構造体が溶液に再分散しない生体ポリマ分析デバイスである。
【００１４】
本明細書では，再分散しないとは，溶液と接触している条件において，三次元構造体の一部が溶媒和，ブラウン運動，又は電圧印加時の電気泳動等により剥離しないこと，と定義する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により，三次元構造体中の流路表面に生体ポリマを吸着する官能基が存在することにより，電気泳動又は拡散現象により生体ポリマが流路表面近傍まで接近した際に，生体ポリマが流路表面に熱力学的に吸着する。この吸着の状態は，生体ポリマが溶液内に溶媒和又は電離して自由拡散している状態よりも，自由エネルギー的に安定であるために起こる。この時の吸着力は電気泳動時の生体ポリマの引張力に対して反対方向に働く力として作用する。この吸着力の強弱は，流路表面に修飾した官能基の種類と溶液条件を調整することによって任意に制御することが可能であり，生体ポリマのナノポア通過速度をモノマ配列解析が可能になる速度帯域に調整することができる。
【００１６】
また，吸着力を提供する構造体は電圧印加時においても溶液中に再分散しない。これによって安定な流路形状を維持することができ，様々な溶液条件及び環境条件下に対応したロバスト性の高い生体ポリマ分析デバイスを提供することが可能となる。
上記以外の，課題，構成及び効果は，以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】生体ポリマ分析デバイスの一例を示す模式図。
【図２】イオン電流の変化量がモノマ種によって異なることを原理とする生体ポリマ配列解析方法の概念図。
【図３】生体ポリマのナノポア通過速度が速すぎることによる課題を示した概念図。
【図４】生体ポリマの吸着過程を表した模式図。
【図５】生体ポリマ捕捉長の説明図。
【図６】生体ポリマ分析デバイスの別の形態を示すナノポア近傍の断面模式図。
【図７】デバイス内の三次元構造体の俯瞰図。
【図８】デバイス内の三次元構造体を表したナノポア周辺部の斜視模式図。
【図９】デバイス内の三次元構造体を表したナノポア周辺部の断面模式図。
【図１０】三次元構造体中の流路を強調表示したナノポア周辺部の断面模式図。
【図１１】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１２】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１３】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１４】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１５】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１６】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１７】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１８】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図１９】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図２０】別の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図。
【図２１】生体ポリマ分析システムの一例を示す概略図。
【図２２】ナノポア開口前の薄膜の断面模式図。
【図２３】ナノポア開口前の薄膜の断面模式図。
【図２４】検体回収と速度遅延を一体化させた分析プロトコルの一例を示す図。
【図２５】検体回収と速度遅延を一体化させた分析プロトコルを表す模式図。
【図２６】生体ポリマ検出の典型例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下，図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は，本発明による生体ポリマ分析デバイスの一例を示す模式図である。
【００１９】
本デバイスは，溶液１０２を収納することができる２つの槽１０１ａ，１０１ｂとナノポア１０６（詳細を図５以降に記載）を備えた薄膜１０４と，薄膜上に載置された三次元構造体１０３と，一対の電極１０５ａ，１０５ｂを有する。２つの槽に収納された溶液は電解質を含んでおり，少なくともどちらか一方の槽の溶液に生体ポリマ１０９が含まれていればよい。薄膜１０４は，ナノポア１０６を介して２つの槽１０１ａ，１０１ｂが連通するように２つの槽１０１ａ，１０１ｂの間に配置されている。図１に示したように２つの槽には溶液を導入するための溶液注入口１０７ａ，１０７ｂが備えられていることが好ましい。溶液注入口がなくても，液滴をデバイス表面に滴下し，開放状態で生体ポリマ測定を行うことも可能である。三次元構造体には空隙１０８（詳細を図７以降に記載）が備えられており，この空隙はナノポアから三次元構造体の上まで溶液を通すことができる流路となっている。図４に示すように，この流路表面には生体ポリマを吸着できる官能基１１０が備えられている。また，この三次元構造体は，電圧印加時に，ナノポアを中心とした半球内の範囲において，溶液中へ再分散しない剛直な性質を有している。この半球の半径は，下記で定義される生体ポリマ捕捉長ｒである。
【００２０】
［式１］
0006259741.tif 000002
ｄ：ナノポアの直径
μ：生体ポリマの電気泳動の移動度
Ｌ：薄膜の厚み
Ｄ：生体ポリマの拡散係数
ΔＶ：２つの電極間に生じた電圧差
【００２１】
生体ポリマとしては，モノマとして核酸から構成された，一本鎖DNA，二本鎖DNA，RNA，オリゴヌクレオチドなどと，モノマとしてアミノ酸から構成されたポリペプチドなどが対象である。計測時には高次構造が解消された直鎖状高分子の形態をとっていることが好ましい。以下では，生体ポリマとして一本鎖DNAを用いた場合の形態を示すが，上記そのほかの生体ポリマでも適用可能である。溶液の溶媒としては，最も好ましくは生体ポリマを安定に溶解可能な水である。上記溶媒に含まれる電解質としては，カリウムイオン，ナトリウムイオン，リチウムイオン，カルシウムイオン，マグネシウムイオン，フッ化物イオン，塩化物イオン，臭化物イオン，ヨウ化物イオン，硫酸イオン，炭酸イオン，硝酸イオン，フェリシアンイオン，フェロシアンイオンなどが挙げられる。電極の材質としては，炭素，金，白金，銀塩化銀などが挙げられ，電気化学計測に使用できる電極であれば特に制限はない。
【００２２】
ナノポア１０６としては一本鎖DNAが通過できる最小サイズである直径0.9nmから10nm程度であればよく，薄膜の厚みは数Åから数十nm程度であればよい。薄膜の材質は半導体微細加工技術で形成できる材質であればよく，典型的には窒化ケイ素，酸化ケイ素，酸化ハフニウム，二硫化モリブデン，グラフェンなどであればよい。ナノポアは，電子線照射やパルス電圧印加法により形成することが可能である。このような方法は文献（M. Wanunu, Physics of Life Reviews, 2012, 9, 125.）や文献（I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.）に詳しく開示されている。
【００２３】
生体ポリマを吸着できる官能基１１０としては，例えばDNA，RNAやオリゴヌクレオチド等を対象とした場合，シラノール基が挙げられる。核酸がシラノール基に対して，カオトロピック効果にて吸着することは広く知られており，代表的にはシラノール基を表面に有するガラスを用いた例が文献（B. Volgenstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615.）に詳しく開示されている。上記カオトロピック効果による吸着を誘導するためには，水溶液にカオトロピック効果をもたらす分子が含まれていればよい。カオトロピック効果をもたらす分子としては，チオシアン酸イオン（SCN-），リン酸二水素イオン（H2PO4-），硫酸水素イオン（HSO4-），炭酸水素イオン（HCO3-），ヨウ化物イオン（I-），塩化物イオン（Cl-），硝酸イオン（NO3-），アンモニウムイオン（NH4+），セシウムイオン（Cs+），カリウムイオン（K+），グアニジウムイオン，テトラメチルアンモニウムイオンなどが好ましい。カオトロピック効果は酸性条件であるほど強く発現することが知られており，カオトロピック効果が十分に発現しているpH1以上，カオトロピック効果が発現し始めるpH10以下に溶液条件が調整されていることが好ましい。また，カオトロピック効果はイオン強度が増すほど強く発現することが知られており，塩化物イオンを例にとった場合，カオトロピック効果が発現し始める10mM以上，カオトロピック効果が十分に発現している飽和塩化カリウム溶液のイオン強度（約3.4M）以下に溶液条件が調整されていることが好ましい。これらの溶液条件は，例えば文献（P. E. Vandeventer, et al., J. Phys. Chem. B, 2012, 116(19), 5661.）に記載されている。
【００２４】
生体ポリマを吸着できる官能基の他の例としては，カチオンに電離する官能基が挙げられる。DNAやRNA等の核酸は水溶液中で負に帯電しているため，正に帯電したカチオン分子と静電相互作用で吸着することが知られている。カチオンに帯電する官能基としては，１級アミン基，２級アミン基，３級アミン基，４級アミン基，ピリジン基，イミノ基，イミダゾール基，ピラゾール基，トリアゾール基などが好ましい。カチオンに電離する官能基は様々に存在するが，水溶液中で安定な形態を保ち，かつ生体ポリマとの化学反応性を有さないことが好ましい。カチオンに電離する官能基を利用する場合，カチオンへと安定に電離するように，カチオンに電離する官能基のpKaよりも溶液のpHが小さいことが好ましい。例えば，１級アミン基のpKaは9〜11の範囲に存在し，代表的な１級アミンであるエチルアミンのpKaは10.5である。そのため，溶液pHを10.5以下に調整することでエチルアミンが完全にカチオンへと電離し，DNAなどを確実に流路表面へと吸着することが可能となる。
【００２５】
上記流路表面に上記官能基が備えられていることにより，図４に示したように電気泳動又は拡散現象により生体ポリマが流路表面近傍まで接近した際に，生体ポリマが流路表面に熱力学的に吸着する。この吸着の状態は，生体ポリマが溶液内に溶媒和又は電離して自由拡散している状態よりも，自由エネルギー的に安定であるために起こる。この時の吸着力は電気泳動時の生体ポリマへの引張力に対して反対方向に働く力として作用する。この吸着力により電気泳動時の生体ポリマへの引張力が低減し，ナノポアを通過する速度を遅延することが可能となる。この吸着力の強弱は，流路表面に修飾した官能基の種類と溶液条件を調整することによって任意に制御することが可能であり，生体ポリマのナノポア通過速度をモノマ配列解析が可能になる速度帯域に容易に調整することができる。ナノポア周囲に発生した電位勾配によるDNAへの引張力は文献（U. F. Keyser, et al., Nature Physics, 2006, 2, 473.）に詳しく記載されており，0.24pN/mVであることが知られている。一方，生体ポリマへの吸着力は，例えば，原子間力顕微鏡を用いて為された調査によりDNAのシラノール基への吸着力は約55pNであることが文献（F. Kuhner, Langmuir, 2006, 22, 11180.）に記載されている。また，同様の調査によりDNAのカチオン基（電離した１級アミン基）への吸着力は約200pNであることが文献（M. Erdmann, et al., Nature Nanotechnology, 2010, 5, 154.）に記載されている。したがって，これらの引張力と吸着力を任意に調整することにより，所望の生体ポリマのナノポア通過速度を実現することが可能となる。
【００２６】
生体ポリマ捕捉長rとは，図５に示したようにナノポア周囲（半径rの半球範囲）に発生した電位勾配を駆動力として，生体ポリマを電気泳動にて搬送することが可能な実効距離である。生体ポリマ捕捉長は式１で定義される。生体ポリマ捕捉長に関しては，文献（M. Wanunu, et al., Nature Nanotechnology, 2010, 5, 160.）に詳しく開示されている。ナノポア１０６を中心位置とし，この生体ポリマ捕捉長を半径とした半球近傍にまで生体ポリマ１０９が拡散過程で接近した時に，電気泳動による生体ポリマへのナノポアに向けた引張力が生じる。したがって，生体ポリマの通過速度を遅くするためには，上記半球の範囲内に，生体ポリマを吸着できる官能基を備えた上記流路が存在することが必須である。加えて，安定な生体ポリマ検出を実現するためには，電圧印加時において，上記半球の範囲内で上記構造体が溶液に再分散しない性質を備えていることが必要である。裏を返せば，上記半球の範囲外は生体ポリマの速度遅延に寄与しない領域であるため，後述するように構造体の領域を制限することにより生体ポリマの捕捉効率を高める等といった改善をすることが可能となる。
【００２７】
少なくとも生体ポリマが通過できるように，上記流路の最小断面積は生体ポリマの分子断面積以上，上記流路の最大断面積は空隙間の最大断面積以下である必要がある。一本鎖DNAを通過できる最小のナノポア直径が0.9nmであることが文献（K. Venta, et al., ACS Nano, 2013, 7(5), 4629.）に記載されている。したがって，この場合の分子断面積は0.81nm2である。また，生体ポリマが効率的に流路表面に吸着できるためには，式２で定義される生体ポリマの平均自由工程S（次元は距離）で形成される断面積よりも流路の最大断面積が小さいことが好ましい。
【００２８】
［式２］
0006259741.tif 000003
ここで，Dは生体ポリマの拡散係数，tはナノポア近傍における平均滞在時間である。
【００２９】
例えば，一本鎖DNA（30塩基のポリチミン）の場合，拡散係数は118μm2/sであることが文献（Q. Wang, et al., ACS Nano, 2011, 5(7), 5792.）に記載されており，ナノポア近傍における平均滞在時間は700msであることが文献（G. Ando, et al., ACS Nano, 2012, 6(11), 10090.）に記載されている。式２によれば，この場合の一本鎖DNAの平均自由工程は9μmである。したがって，一本鎖DNAがナノポア進入前に一度以上官能基１１０と吸着するための流路の最大断面積は81μm2である。以上より，この場合における流路の断面積は0.81nm2以上81μm2以下であることが好ましい。ここでは生体ポリマを一本鎖DNAとして，好適な断面積の範囲の例を挙げた。この断面積の範囲は生体ポリマや溶液のイオン成分，粘性等によって変化するものであり，上記以外の範囲でも本発明の効果は十分得られる。
【００３０】
また，上記流路の断面積の上限は，より好ましくは生体ポリマ捕捉長を半径とした円の面積以下である。生体ポリマが吸着した流路の範囲を生体ポリマ捕捉長の範囲内に限定することにより，生体ポリマの検出頻度を向上し，解析時間の短縮かつ低濃度の生体ポリマ分析が可能となる。
【００３１】
検出対象である生体ポリマをDNAとした場合，上記流路の断面積の上限を，DNAポリメラーゼ，DNAヘリカーゼ，エクソソーム（サイズ数nm以上数十nm以下）の分子断面積以下とすることで別の効果が得られる。実検体から抽出されたDNAには上記のタンパク質又は構造体が付着していたり，夾雑物として混入している可能性がある。これらの物質サイズよりも小さいナノポアを用いて分析を行った場合，これらがDNAに付着した状態だとナノポアでのDNA通過時に詰まってしまい，解析を継続できないことがある。そのため，上記流路の最大断面積を制限することにより，これらの物質をふるい落とす，又はこれらの物質が付着していないDNAのみを通過させることにより，円滑な分析を実行できる効果が得られる。
【００３２】
また，上記流路の断面積の上限をDNAの高次構造の断面積以下に設定することで同様の効果が得られる。DNAの場合，例えばグアニンが連続する配列では高次構造（四量体，サイズ：2.6nm以上10nm以下）を形成することが知られている。そのため，上記制限を設けることで，高次構造を形成したDNAを直鎖にほどく，又は一量体のDNAのみを通過させることにより円滑な分析を実行することが可能となる。
【００３３】
図６は，本発明による生体ポリマ分析デバイスの別の形態を示すナノポア近傍の断面模式図である。図６では複数のナノポアを並列化していることを特徴とする。図１で示したように，単独のナノポアのみを用いてデバイスを構成する場合は，１つのナノポアに対して，三次元構造体が１つ，２つの電極が１組備えられていればよい。一方，図６に示したように複数のナノポアを並列化してデバイスとして用いる場合は，各々のナノポア１０６に対して１つの三次元構造体１０３がナノポアを有する薄膜１０４に載置されている必要がある。一方の溶液側に浸漬された電極（典型的には接地されている電極）１０５ａを共通電極として採用し，もう一方の溶液側には各々のナノポアに対して１つの独立した電極１０５ｂを設ければ良い。共通電極側の溶液１０２ａは各々のナノポア１０６に対して共通の溶液であり，共通電極に対して反対側の溶液１０２ｂは，各々のナノポア１０６に対して１つの独立した溶液が備えられている必要がある。尚，各溶液の独立性を担保する仕切りは絶縁性の材質であることが好ましく，例えばポリジメチルシロキサンや酸化ケイ素等が好ましい。このような構成により，各ナノポアは電気化学的にお互いに干渉することなく，独立した生体ポリマ分析を実行でき，生体ポリマ分析のスループットを向上することが可能となる。
【００３４】
［実施例１］
上記性質を備えた三次元構造体を実現する生体ポリマ分析デバイスの一形態として，図７にナノポア周辺部をデバイスに対して垂直上方から見た図を示す。また，図８は図７の断面Ａにて切断したナノポア周辺の斜視模式図であり，図９はナノポア周辺の断面模式図である。
【００３５】
本実施例は三次元構造体が複数の粒子１１１が薄膜１０４の上で一層積まれて成型されていることを特徴とする。ここで，図９において，斜線で示した領域は，断面Ａで切断された成型された粒子の断面部であり，グレーで示した環状の領域は，空隙の奥側に位置する成型後の粒子の一部分である。この粒子間の空隙１０８が生体ポリマと電解質を含んだ溶液がナノポアまで通過する流路１１２を形成している。図１０に流路１１２を太線にて強調表示した。ここで，電圧勾配はナノポア１０６を中心位置とし生体ポリマ捕捉長ｒを半径とした半球１１３の範囲にのみ発生する。そのため，本構造体に存在する多数の空隙の内，上記半球１１３の範囲に存在し，かつナノポア１０６まで連結している空隙のみが上記流路となりえる。上記粒子の表面は生体ポリマを吸着できる官能基で修飾されている。上記複数の成型後の粒子は，少なくとも上記半球の範囲内において，電圧印加時に電気泳動して薄膜表面から剥離して溶液中に再分散しないように，非球状の形状を取っている。この形態の利点の１つは，生体ポリマが上記流路表面へ吸着する確率を向上できることである。これは三次元構造体が粒子で成型されていることにより，十分大きい比表面積を提供することができるためである。粒子の平均直径を小さくすればするほど，空隙が小さくなって生体ポリマの吸着確率を向上させることが可能となる。一方で，空隙を小さくすればするほど，イオンが通過する際の抵抗値が上昇して得られるイオン電流が減少して信号値そのものが得られなくなってしまう。そのため，生体ポリマの吸着確率と抵抗値はトレードオフの関係にある。粒子の平均直径は好ましくは10nm以上1000nm以下である。尚，粒子がナノポアを塞いでしまうことが有り得るが，そのためには粒子がナノポアに対して点接触する必要があり，そのような確率は非常に低いために実用上は問題とならない。万が一粒子によって塞がれたナノポアがあった場合には，そのナノポアを分析には使わない。
【００３６】
もう１つの利点は粒子を用いた製造が容易な点である。粒子が分散した溶液を薄膜上に塗布して溶媒のみを蒸発除去することで，粒子から成型される三次元構造体を製造することができる。溶液を塗布する方法は，ディップコーティングやスピンコーティング，電気泳動によるコーティングなどを用いることができる。特にディップコーティングは簡便であるだけでなく，溶媒の表面張力により粒子が薄膜表面へと自己組織化して密に配置することができることから好ましい方法である。このような方法は，例えば文献（X. Ye, et al., Nano Today, 2011, 6, 608.）に開示されている。塗布後に溶媒を蒸発除去する方法としては加熱蒸発させる方法が好ましい。この時，粒子の材質を適切に選択することにより各粒子を変形させることができる。このような方法は，例えば文献（A. Kosiorek, et al., Small, 2005, 1, 439.）に開示されている。変形前では粒子同士は点接触のみに留まっており，電圧印加により電気泳動してしまう不安定な構造体であるため，この変形処理を施す必要がある。この変形処理を経ることにより，球状であった粒子は粒子同士で押し合って図９に示したように非球状に変形することで粒子同士が面接触するようになる。これにより，電圧印加時の粒子への引張力にも耐えることができる安定な構造体を形成できるという効果がある。この時の粒子の形状は，隣接する粒子同士で強く接触しあえるように多面体となることが望ましい。このような多面体は加熱圧着することにより得られ，例えば文献（Z. Q. Sun, et al., Langmuir, 2005, 21(20), 8987.）に記載されている。
【００３７】
上記三次元構造体を実現する粒子としては，成型性，溶液分散性の2点から選定する必要がある。成型性の観点からは変形し得る材質であることが望ましく，例えばポリスチレンやポリ乳酸などといった樹脂や，シリカや酸化チタンといったセラミックス，金や銀などといった金属が好ましい。溶液分散性の観点からは，粒子同士が十分な反発力を得られるように高いゼータ電位値を有していることが好ましい。特に前述したシリカは表面が負に帯電したシラノール基で覆われており，粒子が水中に独立分散するのに十分なゼータ電位値を実現できるため，望ましい材料である。
【００３８】
粒子表面には生体ポリマが吸着できる官能基が施されている必要があるが，薄膜への塗布前から粒子表面に施されていても，塗布後に化学反応処理により施してもよい。
【００３９】
粒子により成型された三次元構造体を用いる別の利点として，網目状の流路を形成できることが挙げられる。通常は生体ポリマ，特に一本鎖DNAは溶液中で直鎖状ではなく折りたたまれたガウス鎖状の形態を取っている。このような形状だと，ナノポア通過時には一本鎖DNAは薄膜部でひっかかりが生じてスムーズな検出が行えない可能性がある。本実施例によれば，一本鎖DNAが分子内の複数箇所が網目状流路へ吸着することにより直鎖状の形態へほどける効果が得られる。そのため，ナノポアでのスムーズな生体ポリマ検出を行うことが可能となる。
【００４０】
生体ポリマの吸着効率を高めるためには，三次元構造体に粒子が占める体積占有率が，粒子同士が最密充填構造で点接触した場合の占有率よりも高い方が好ましい。粒子１層積層の場合，三次元構造体を真上から薄膜へと投影した図形の面積占有率で考えるとわかりやすい。特に，成型前の粒子が球状形状であり投影図形の各粒子中心が正三角形の格子を描いている場合，面積占有率は点接触の理論値であるπ/√12よりも大きいことが好ましい。また，成型前の粒子が球状形状であり，投影図形の各粒子中心が正四角形の格子を描いている場合，面積占有率は点接触の理論値であるπ/4よりも大きいことが好ましい。
【００４１】
本実施例において，流路の最小断面積とは，上記半球の範囲内における，変形した粒子間の空隙の内のナノポアまで連結した流路を形成している空隙の最小断面積のことを指す。数nm以上の粒子径を有する粒子を用いることで，上述した生体ポリマの分子断面積以上の断面積を確保することが可能である。同様に流路の最大断面積とは，上記半球の範囲内における，変形した粒子間の空隙の内のナノポアまで連結した流路を形成している空隙の最大断面積のことを指す。また，空隙の最大断面積とは，三次元構造体中の変形した粒子間の全空隙中の最大断面積のことを指す。したがって，上記半球の範囲外において，粒子が一部欠損したりして空隙の最大断面積が流路の最大断面積よりも大きくなることが有り得る。しかし，このような箇所は生体ポリマの分析に寄与しない領域であるため，実用上は問題とならない。本定義は，下記で説明する実施例２〜６，９においても同様である。
【００４２】
［実施例２］
図１１は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図１１に示した実施例は，図９の隣接する粒子同士を一体化させたことを特徴とする。
【００４３】
図９には粒子が変形した三次元構造体の例を示したが，成型性は化学反応や表面への材料積層による隣接粒子同士の一体化によっても実現できる。例えば，粒子材質が樹脂の場合，ガラス転移温度以上にまで加熱することで樹脂が塑性変形して接触した際に樹脂の分子鎖同士が絡み合って一体化させることができる。樹脂としては，ポリスチレン樹脂などが好ましい。このような方法は文献（A. Kosiorek, et al., Small, 2005, 1, 439.）に記載されている。また，粒子材質がシリカや酸化チタンなどのセラミックスの場合，焼結反応といった化学反応によっても実現可能であり，粒子同士を強固に一体化させることができる。このようなシリカ粒子を焼結する方法は，例えば文献（T. V. Le, et al., Langmuir, 2007, 23(16), 8554.）に記載されている。粒子間の空隙にモノマを導入して重合反応をさせて樹脂を積層させることによっても一体化させることができる。モノマは無機であっても有機であってもよい。また，粒子表面から表面グラフト重合を開始することによっても同様の構造を実現できる。その他の方法として，原子層堆積法（atomic layer deposition）によって粒子表面を覆う方法がある。粒子同士を一体化させることにより，より再分散しない安定な三次元構造体を実現し，ロバスト性の高いデバイスを実現できる効果がある。
【００４４】
［実施例３］
図１２は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図９には粒子が一層積層された三次元構造体の例を示したが，図１２に示した実施例は粒子が多層積層された三次元構造体の例を示している。多層積層することにより，比表面積が積層分増大するため，上述した生体ポリマの吸着確率が向上し，更なる遅延効果が得られる。また，網目状流路の長さが更に増大するため，上述した直鎖にほどける効果が更に向上し，よりスムーズな検出が実現できる。
【００４５】
多層積層する方法は，粒子分散溶液の粒子濃度を調整するか，又は図９で調整した一層積層された三次元構造体の上に同様の処理を多数回行う方法がある。このような方法は，例えば文献（P. Jiang, et al., Chem. Mater., 1999, 11(8), 2132.）に記載されている。この積層構造においても，実施例１又は実施例２と同様に形状を非球状に変形させるか，又は粒子同士を一体化させることによって，再分散しない安定な構造体を実現することができる。
【００４６】
［実施例４］
図１３は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図１３に示した実施例には，図１２において異なるサイズを有した２種類の粒子を用いて三次元構造体を形成した例を示した。大小異なる２種類の粒子を用いることにより，小さい粒子が大きい粒子間の空隙に自己配列して配置されるようになり，比表面積を更に増大して生体ポリマの吸着確率を高めることができる。
【００４７】
このような方法は，文献（K.W. Tan, et al., Langmuir, 2010, 26(10), 7093.）に記載されている。この構造体も上述したように粒子を変形させるか一体化させるかによって，溶液に再分散しない構造体を実現することができる。また，粒子同士の接触面積が増大するために，構造体がより再分散しにくく安定化する効果もある。ここでは２種類のサイズの粒子が多層積層された例を示したが，粒子のサイズは３種類以上でも構わない。
【００４８】
［実施例５］
図１４は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は，異なるサイズを有した２種類の粒子を用いて，図１３とは別形態の三次元構造体を形成したことを特徴とする。
【００４９】
図１４には，小さい粒子を薄膜に第一層として載置し，大きい粒子をその上の第二層として積層した例を示した。このように粒子を配列することにより，生体ポリマの遅延効果に加えて，ポリマ長によるフィルタリングが可能となる。短いポリマ長を有する生体ポリマは，第二層の大きい粒子間の空隙では自身の流体力学的半径が小さいために第二層を素通りして第一層に到着できるが，長いポリマ長を有する生体ポリマは，自身の流体力学的半径が大きいため，第二層の大きい粒子間の空隙にて吸着されて第一層まで到達しない現象が生じる。したがって，第一層と第二層の粒子のサイズを制御することにより，所望の範囲のポリマ長を有する生体ポリマのみを選択的に検出することが可能となる。尚，粒子の大きさを第一層から最上層まで勾配をつけて大きくしていく構造も効果的である。この積層構造においても，実施例１又は実施例２と同様に形状を非球状に変形させるか，又は粒子同士を一体化させることによって，再分散しない安定な構造体を実現することができる。
【００５０】
［実施例６］
図１５は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図１５に示した実施例は，例えば図１２で示した三次元構造体の周囲に，三次元構造体の厚みよりも大きい厚みを有した壁１１４が備えられていることを特徴とする。
【００５１】
三次元構造体の周囲に壁を配置することによる利点は２点ある。１点目は周囲に壁を有することで三次元構造体の可動域を制限できるため，三次元構造体の溶液への再分散を抑制する効果がある点である。２点目は生体ポリマの検出頻度向上により解析時間を短縮できる効果である。壁の高さ及び幅を，生体ポリマ捕捉長とほぼ同等又はそれ以下にすることで，三次元構造体を生体ポリマ捕捉長の範囲内に収めることができる。このような構成にすることで，構造体と相互作用する生体ポリマは同時に電位勾配によりナノポアに吸い寄せられる。したがって，ナノポアに進入する生体ポリマの頻度を向上させられる。解析時間短縮のほかに，より低濃度の生体ポリマを検出できる効果がある。壁面の高さや幅は生体ポリマ捕捉長よりも大きくても上記効果は得られる。
【００５２】
また，図１６に示したように第二の薄膜１１５を設けることで，壁の開口部の面積が薄膜の面積よりも小さくなっている構造も効果的である。このように溶液側へ向かって面積が小さくなっていく構造にすることで，より効果的に三次元構造体の可動域を制限でき，溶液への再分散を抑制できる効果がある。このような構造は，文献（I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.）に記載されており，例えば以下のような方法で製造できる。まず，酸化ケイ素等のフッ酸溶液等でエッチング可能な層をナノポア１０６が開口する薄膜１０４の上に設置し，次に上記溶液でエッチングされにくい材質（窒化ケイ素等）の層を設置する。次に一般的なドライエッチングにより上記２層を貫通した穴を形成する。この時点で工程を停止することで，図１５に示したような壁を有する構造を製造可能である。更にフッ酸等のエッチング溶液を用いてウェットエッチングを行うことでエッチング可能な層が半球上に削れ，図１６のような壁構造を有するデバイスを提供することが可能である。この時，粒子の塗布は実施例１に示した方法で最後の工程として行う。
【００５３】
［実施例７］
図１７は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は，図９や図１２とは逆の構造であり，粒子が空隙部，空隙部がバルク体部へと変更した逆オパール構造を三次元構造体に用いることを特徴とする。
【００５４】
本実施例の構造は，本質的には図９及び図１２と同等の構造であるため，本構造によっても，図９及び図１２と同様の効果を実現することが可能である。逆オパール構造は文献（J. H. Moon, et al., Chem. Rev., 2010, 110, 547.）に詳しく記載されている。本構造は，次の方法によって得られる。まず粒子を自己配列化によって規則正しい構造に配置した後，粒子を変形又は一体化させずに粒子間空隙にモノマ（有機，無機どちらでもよい）を充填して重合反応を進めてバルク体１１６を形成する。次に，粒子部分のみを溶解可能な溶媒を用いて粒子部分を溶解除去する処理を行う。最後に構造体表面に官能基を処理するために，例えば１級アミンを有するシランカップリング剤などの反応性の強い表面処理剤を含む溶液を浸漬し，アルコール等で洗浄を行う。このように粒子を鋳型として用いることで形成された逆オパール構造の利点は粒子充填の場合と同等の表面積を実現しながら溶液部分の体積を更に大きくして抵抗値を下げることができる点にある。したがって，より高いイオン電流値を確保できるので，計測の高感度化の効果がある。本構造のバルク体形成に用いる材料としては，ポリスチレンやシリカなどが好ましい。本構造は，三次元構造体がバルク体として一体化しているため，溶液に対して再分散しない安定な構造体を実現することができる。
【００５５】
本実施例において，流路の最小断面積とは，上記式１で表される生体ポリマ捕捉長ｒを半径とする半球の範囲内における，鋳型となった粒子状の空隙の内，ナノポア１０６まで連結した流路を形成している空隙の最小断面積のことを指す。実施例１の場合と同様に，数nm以上の粒子径を有する粒子を鋳型に用いることで，生体ポリマの分子断面積以上の断面積を確保することができる。同様に流路の最大断面積とは，上記半球の範囲内における，鋳型となった粒子状の空隙の内，ナノポアまで連結した流路を形成している空隙の最大断面積のことを指す。また，空隙の最大断面積とは，鋳型となった粒子状の全空隙中の内の最大断面積のことを指す。
【００５６】
［実施例８］
図１８は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。図１８には三次元構造体の最も単純な例として，ナノポア１０６を有する第一の薄膜１０４の上に，ナノポアの真上に空隙を有する第二の薄膜１１７を載置する例を示した。
【００５７】
本実施例は，空隙１０８の断面積と薄膜１１７の厚みを制御することが容易であり，生体ポリマの吸着確率を制御しやすいという利点がある。空隙１０８は電子線照射により所望のサイズの空隙を開口することができ，第一の薄膜１０４にナノポアが開口されていない状態で第一の薄膜１０４と第二の薄膜１１７に同時にナノポア１０６と空隙１０８を開口することもできる。この第二の薄膜１１７は，半導体微細加工技術で形成することが可能である。このような薄膜の材料は，半導体加工技術で形成できる材料であって，静電容量が低くなるように誘電率の低い材質，例えば二酸化ケイ素などが好ましい。このように静電容量を低減することで高周波計測を行った時に周波数応答性を有する静電容量依存のノイズを低減することができ，より安定に生体ポリマ検出を行うことができる。本実施例も実施例７と同様に，三次元構造体を形成した後に化学反応処理にて表面に官能基を形成する。官能基を処理する方法としては，実施例７と同様に，１級アミンを有するシランカップリング剤等を含む溶液に浸漬し，アルコール等で洗浄する方法が挙げられる。半導体微細加工技術用の材料として，水溶液に溶解しない酸化ケイ素や窒化ケイ素を用いて作製することで，溶液に再分散しない安定な構造体を実現することができる。
【００５８】
本実施例において，流路の最小断面積とは，上記式１で表される生体ポリマ捕捉長ｒを半径とする半球の範囲内における，空隙１０８を有する第二の薄膜１１７の，空隙の最小断面積のことを指す。第二の薄膜の，空隙の直径を1nm以上とすることで，生体ポリマの分子断面積以上の断面積を確保することができる。同様に流路の最大断面積とは，上記半球の範囲内における空隙を有する第二の薄膜１１７の空隙１０８の最大断面積のことを指す。この実施例では流路の断面積と空隙の断面積は完全に一致している。
【００５９】
［実施例９］
図１９は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。これまでの実施例では三次元構造体は全て薄膜の片側のみに載置した例を示していたが，本実施例は両側に載置することを特徴とする。これにより，更なる遅延効果を得ることが可能である。図１９には図１２に示した三次元構造体を薄膜１０４の両側に載置した例を示した。
【００６０】
ナノポア周囲の電位勾配は入口側と出口側の両方に発生しているため，ナノポア１０６の入口側と出口側の両方に三次元構造体を設置することにより，どちらの側でも生体ポリマ１０９の引張力を低減し，更なる遅延効果を実現することが可能となる。図１９では薄膜の両側に同等の三次元構造体を載置したが，三次元構造体は図９〜１８の実施例のどの組み合わせやその変形例であっても構わない。また，出口側のみに三次元構造体を載置しても構わない。この積層構造においても，実施例１又は実施例２と同様に形状を非球状に変形させるか，又は粒子同士を一体化させることによって，再分散しない安定な構造体を実現することができる。
【００６１】
［実施例１０］
図２０は，本発明の生体ポリマ分析デバイスにおける別形態の三次元構造体のナノポア周辺部を示す断面模式図である。本実施例は，三次元構造体の厚みが生体ポリマ捕捉長よりも小さいことを特徴とする。ここでは一例として，図９の実施例を示した。
【００６２】
このように三次元構造体の厚みを制限することにより，実施例６と同様の効果が得られる。すなわち，三次元構造体と相互作用する生体ポリマ１０９は同時に電位勾配によりナノポア１０６に吸い寄せられる。したがって，ナノポアに進入する生体ポリマの頻度を向上できる。解析時間短縮のほかに，より低濃度の生体ポリマを検出できる効果がある。本実施例は，図９〜図１９で説明したいずれの構造にも適用できる。三次元構造体の厚みは，図９，１１の場合は粒子径により，図１２〜１６，１９の場合は粒子径及び積層数により，図１７の場合は除去対象の粒子径と積層数により，図１８の場合は薄膜厚みにより，それぞれ制御可能である。この積層構造においても，実施例１又は実施例２と同様に形状を非球状に変形させるか，又は粒子同士を一体化させることによって，再分散しない安定な構造体を実現することができる。
流路及び空隙の断面積に関する定義は実施例１にて説明した内容と同一である。
【００６３】
［実施例１１］
図２１は，本発明による生体ポリマ分析デバイスを用いた生体ポリマ分析システムの一例を示す概略図である。本システムは典型的には図１で示した生体ポリマ分析デバイス１１８，生体ポリマ分析デバイスの一対の電極の間に流れるイオン電流を計測するイオン電流計測装置１１９，イオン電流計測装置１１９の出力信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル出力変換装置１２０，アナログデジタル出力変換装置１２０から供給された信号を処理するデータ処理装置１２１，データ処理装置１２１による処理結果を表示するデータ表示出力装置１２２，入出力補助装置１２３から構成される。典型的にはイオン電流計測装置には電流電圧変換型の高速増幅回路が搭載され，データ処理装置には演算装置，一時記憶装置，不揮発性記憶装置が搭載されている。外部ノイズを低減するため，生体ポリマ分析デバイス部はファラデーケージで覆われていることが好ましい。
【００６４】
［実施例１２］
三次元構造体をナノポアが開口していない状態の絶縁薄膜の上に載置してからナノポアを開口することもできる。絶縁薄膜にパルス状の電圧を連続的に印加することにより所望の直径のナノポアを開口できる技術が文献（I. Yanagi, Scientific Reports, 2014, 4, 5000.）に記載されている。本発明の三次元構造体は薄膜まで接続された空隙を保有しており，この薄膜と接している空隙部が最も抵抗値が低い箇所となっている。そのため，上記パルス電圧を連続的に印加した際にこの薄膜と接した空隙部に電圧が集中することで，ナノポアを開口できる。
【００６５】
本実施例のナノポアを開口する方法は，一例として，空隙を有する三次元構造体であって，この空隙は表面に生体ポリマを吸着できる官能基を有する三次元構造体が載置された絶縁体薄膜の表面及び裏面を，電解質を含んだ溶液に浸す工程，薄膜の表面が浸された溶液と裏面が浸された溶液に一対の電極を浸漬する工程，一対の電極にパルス状の電圧を印加する工程，を有し，薄膜と空隙が接する箇所にナノポアを開口するものである。
【００６６】
具体例として，図２２に，図９においてナノポアが開口していない薄膜１０４を用いた場合を示した。この構成では，薄膜と成型後の粒子が接していない箇所に電圧が集中することでナノポアが開口し，図９と同等の構造を得ることができる。従来の電子線照射による開口工程では上記三次元構造体が遮蔽物となって薄膜まで電子線が届かない場合があるため，開口工程後に三次元構造体を配置することが好ましい。本工程を用いれば三次元構造体の載置の前後にかかわらず，任意のタイミングでナノポアを開口することが可能となる。加えて，薄膜と接している空隙部を制御することによりナノポアを開口する場所を制御することも可能となる。例えば，図２３に示したように，図１５に例示した粒子から成型された三次元構造体と壁面を有するデバイスを用いると，粒子と接触せず，かつ壁面から離れた箇所に電圧が集中し，矢印で図示した場所にナノポアを開口することができる。本工程は，実施例１〜１０及び図９〜図２０で説明したいずれの構造にも適用できる。上記で説明した理由により，電圧印加時においても三次元構造体は再分散せず，ナノポア開口前後で構造体が劣化しない，安定なデバイスを供給することが可能となる。
本実施例における流路及び空隙の断面積に関する定義は実施例１で説明した内容と同一である。
【００６７】
［実施例１３］
粒子を用いて三次元構造体を形成する場合には，検体からの標的生体ポリマ回収と，速度遅延の両方を一体化した生体ポリマ分析デバイスを実現することもできる。図２４には本実施例のプロトコルの概念フローを，図２５にはプロトコル手順の模式図を示した。
【００６８】
まず，標的生体ポリマが溶解している検体溶液へ，標的生体ポリマが吸着する官能基を有する粒子が分散した溶液を導入する（Ｓ１１）。導入後，粒子表面へ生体ポリマが十分に吸着するように十分時間経過するのを待つ（Ｓ１２）。十分時間経過後，超遠心分離を利用することで標的生体ポリマが吸着した粒子のみを選択的に回収する（Ｓ１３）。磁気粒子を用いた場合は，磁場により粒子のみを回収することが可能である。回収後，標的生体ポリマが吸着した粒子から成型された図９〜１６あるいは図１９，２０の三次元構造体をナノポアを有する薄膜の上に載置する（Ｓ１４）。最後に図２１に示した生体ポリマ分析システムに上記で作製したデバイスを組み込み，電圧を印加して生体ポリマの検出を行う（Ｓ１５）。本工程では，粒子回収を円滑にするため，粒子材質に常磁性を帯びたフェライトなどの磁性粒子を用いることが好ましい。
【００６９】
すなわち，本実施例の分析方法は，表面に標的生体ポリマが吸着できる官能基を有する複数の粒子を用いて，検体から標的生体ポリマを吸着回収する工程，ナノポアを有する薄膜上に前記粒子から成型された空隙を有する三次元構造体を載置する工程，ナノポアを有する薄膜を電解質を含む溶液に浸し，薄膜を挟んで配置された２つの電極間に電圧を印加する工程，標的生体ポリマがナノポアを通過する時のイオン電流の変化から標的生体ポリマを分析する工程，を有する。このとき，三次元構造体の空隙は電解質を含む溶液をナノポアから三次元構造体の上まで通す流路を形成し，電圧印加時に，少なくともナノポアを中心として式１で定義される生体ポリマ捕捉長ｒを半径とする半球の範囲内において，溶液に再分散しない。
【００７０】
本実施例では，予め生体ポリマをナノポア近傍に配置できるため，検出頻度を上げることができる。したがって，解析時間短縮及び低濃度の生体ポリマを検出できる効果がある。尚，実施例１〜６，９，１０で説明した理由により，三次元構造体は溶液に再分散せず，安定な計測を行うことが可能となる。本実施例における流路及び空隙の断面積に関する定義は実施例１で説明した内容と同一である。
【００７１】
［実施例１４］
以下では，図２１に示した生体ポリマ分析システムを用いた生体ポリマの分析例を示す。生体ポリマ分析デバイスとしては，図１５に示した三次元構造体を有するデバイスを用いた。薄膜には，直径2nmのナノポアを有する窒化ケイ素から成る薄膜を用いた。粒子には表面がシラノール基で覆われた直径100nm，50nmのシリカナノ粒子と表面が１級アミン基で覆われた直径50nmのシリカナノ粒子を用いた。三次元構造体は上記粒子をディップコーティングにて塗布後，加熱乾燥することで成型した。また，対照実験として，三次元構造体が載置されていない直径2nmのナノポアを有する窒化ケイ素から成る薄膜だけから構成される分析デバイスも用意した。生体ポリマとしては人工的に合成された5000塩基長のポリアデニン（polyA）を用いた。溶液には１Ｍの塩化カリウムが溶解した水溶液を用いた。生体ポリマを搬送するための電位差としては１Ｖを印加した。
【００７２】
図２６に，上記実施例の生体ポリマ分析システムによる生体ポリマ検出の典型例を示した。三次元構造体が載置されていないデバイスでは，polyAの典型的な通過速度は0.01μs/モノマ１分子単位であった。一方，図１５に示した三次元構造体を載置したデバイスでは，表面がシラノール基で覆われた直径100nmのシリカナノ粒子を用いた場合では0.46μs/モノマ１分子単位，直径50nmのシリカナノ粒子を用いた場合では4.6μs/モノマ１分子単位であった。また，表面が１級アミン基で覆われた直径50nmのシリカナノ粒子を用いた場合では230μs/モノマ１分子単位となった。したがって，本発明のデバイスを用いて最適な条件に調整することにより，三次元構造体を用いない場合に比べて100倍から10000倍の十分な速度遅延を実現できることが確認できた。
【００７３】
本発明の生体ポリマ分析デバイスと薄膜に単分子層の材質（グラフェンなど）と，例えば文献（A. H. Laszlo, Nature Biotechnology, 2014, June 25）に開示された溶液条件・分析条件を組合わせることで，生体ポリマ，特に一本鎖DNAのナノポア通過速度を十分に遅くし，モノマ配列に依存した信号パターンを得ることができる。得られた信号パターンからモノマ種に依存した信号値差に基づいて解析を行うことで，生体ポリマ中のモノマ配列パターンを解析することができる。
【００７４】
なお，本発明は上記した実施例に限定されるものではなく，様々な変形例が含まれる。例えば，上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したものであり，必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また，ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり，また，ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また，各実施例の構成の一部について，他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００７５】
１０１  槽
１０２  溶液
１０３  三次元構造体
１０４  薄膜
１０５  電極
１０６  ナノポア
１０７  溶液注入口
１０８  空隙
１０９  生体ポリマ
１１０  官能基
１１１  粒子
１１２  流路
１１４  壁
１１５  第二の薄膜
１１６  バルク体
１１７  空隙を有する第二の薄膜
１１８  生体ポリマ分析デバイス
１１９  イオン電流計測装置
１２０  アナログデジタル出力変換装置
１２１  データ処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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