(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、該方法は、該細胞含有生体試料をブタンアミドと接触させることによるものであり、安定化された該試料に含まれる細胞に由来する細胞内核酸での、該生体試料に含まれる細胞外核酸集団の汚染が、低減または防止される、方法。
【請求項２】
前記細胞含有生体試料をカスパーゼ阻害剤とさらに接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞含有生体試料を、式１に従う少なくとも１つの化合物：
【化１１】
0006407248.tif 000044
（式中、Ｒ１は、水素残基またはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である）
とさらに接触させる、請求項１または２に記載の方法であって、
ここで、式１に従う少なくとも１つの該化合物が、細胞内核酸を安定化するためのものである、方法。
【請求項４】
前記細胞含有生体試料を、ブタンアミドと接触させた後、得られる混合物が、０．２５％（ｗ／ｖ）から１５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から１２．５％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）から９％（ｗ／ｖ）、１．２５％（ｗ／ｖ）から８％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、１．７５％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）、１．８％（ｗ／ｖ）から５．５％（ｗ／ｖ）、１．９％（ｗ／ｖ）から５．２５％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、２．１％（ｗ／ｖ）から４．７５％（ｗ／ｖ）、２．２％（ｗ／ｖ）から４．５％（ｗ／ｖ）、２．３％（ｗ／ｖ）から４．２５％（ｗ／ｖ）、２．４％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）から３．７５％（ｗ／ｖ）または０．７５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度でブタンアミドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
安定化のために、前記細胞含有試料を、
ａ）ブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤；
を含む安定化組成物と接触させる、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化が、（ｉ）添加剤の、該添加剤が有核細胞の溶解を誘導もしくは促進する濃度での使用を含まない、（ｉｉ）該安定化が、タンパク質−核酸架橋および／もしくはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤の使用を含まない、ならびに／または（ｉｉｉ）該安定化が、毒性物質の使用を含まない、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するために、該血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、式１に従う少なくとも１つの化合物、および抗凝固物質と接触させるステップを含み、該血液試料に含有されている細胞からの該血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞含有生体試料を少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーとさらに接触させる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、前記安定化の期間の後、
ａ）安定化された前記試料を核酸分析および／または検出法に供するステップ；
ｂ）安定化された該試料から細胞外核酸を単離するステップ；
ｃ）安定化された該試料から細胞外核酸を単離し、単離された該核酸を分析および／または検出するステップ；
ｄ）安定化された該試料に含まれている細胞を除去するステップ；
ｅ）安定化された該試料に含まれている細胞を核酸単離、分析および／または検出ステップを実行する前に除去するステップ；
ｆ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離するステップ；
ｇ）（ｉ）安定化された該試料、（ｉｉ）細胞が除去された安定化された該試料、および／または（ｉｉｉ）該試料から除去された細胞を保管するステップ；
ｈ）安定化された該試料から細胞を除去し、廃棄するステップ；および／または
ｉ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料から除去された細胞から核酸を単離するステップ；
ｊ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から、サイズ選択的核酸単離法を用いて細胞外核酸を単離するステップ
の１つ以上を含む、方法。
【請求項１０】
安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載の方法に従って該細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）核酸を単離するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
ステップａ）およびステップｂ）の間に前記細胞含有生体試料から細胞を除去するステップを含み、かつステップｂ）が、安定化された前記試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離することを含み、ならびに／あるいは
ここで、単離された該細胞外核酸をさらなるステップｃ）において処理および／または分析する、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞含有生体試料を安定化するための組成物であって、ブタンアミドと、アポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物
【化１２】
0006407248.tif 000045
（式中、Ｒ１は、水素残基またはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である）から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含み、ここで、式１に従う該化合物が、細胞内核酸を安定化するためのものであり、安定化された該試料に含まれる細胞に由来する細胞内核酸での、該生体試料に含まれる細胞外核酸集団の汚染が、低減または防止される、組成物。
【請求項１３】
カスパーゼ阻害剤および／もしくは式１に従う少なくとも１つの化合物
【化１３】
0006407248.tif 000046
（式中、Ｒ１は、水素残基またはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である）を含み、ここで、式１に従う少なくとも１つの該化合物が、細胞内核酸を安定化するためのものである、ならびに／または
少なくとも１つの抗凝固物質を含む、
請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、以下：
ａ）細胞を安定化することおよび前記細胞含有生体試料に含有されている細胞から該試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させることが可能である；
ｂ）安定化された該試料中に存在する核酸の分解を低減させることが可能である；
ｃ）安定化された該生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの該試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の汚染を低減させるまたは防止することが可能である；
ｄ）該安定化組成物が、添加剤を、該添加剤が細胞溶解を誘導または促進する濃度で含まない；
ｅ）該安定化組成物が、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まない；
ｆ）該安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤を含まない；
ｇ）該安定化組成物が、毒性物質を含まない；および／または
ｈ）該細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を冷蔵せずに、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から６日、および／または少なくとも２日から７日より選択される期間、安定化することが可能である；
の特徴の１つ以上を有する、組成物。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の組成物であって、以下：
ｉ）該組成物が、ブタンアミドを５％（ｗ／ｖ）から５０％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）から３５％（ｗ／ｖ）、１２．５％（ｗ／ｖ）から３０％（ｗ／ｖ）、または１５％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む；
ｉｉ）該組成物が、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む；
ｉｉｉ）該組成物が、式１に従う少なくとも１つの化合物を、２％から５０％、３％から４０％、３．５％から３０％、４％から２５％、４．５％から２０％、または５％から１７．５％の濃度で含む、および／または
ｉｖ）該組成物が、抗凝固物質を含む；
の特徴の１つ以上を有する、組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
式１に従う前記化合物が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記安定化組成物がさらに、
ｉ）式１に従う少なくとも１つの化合物、
ｉｉ）抗凝固物質
の１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーが、以下：
ａ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコールである；
ｂ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである；
ｃ）分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーが、安定化に使用され、該分子量の差が少なくとも１００である；および
ｄ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであり、前記細胞含有生体試料を、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）とさらに接触させる、
の特徴の１つ以上を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記処理および／または分析される単離された細胞外核酸を、
ｉ）改変する；
ｉｉ）少なくとも１つの酵素と接触させる；
ｉｉｉ）増幅する；
ｉｖ）逆転写する；
ｖ）クローニングする；
ｖｉ）配列決定する；
ｖｉｉ）プローブと接触させる；
ｖｉｉｉ）検出する；
ｉｘ）定量する；および／または
ｘ）同定する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞含有生体試料を、安定化に使用される添加剤と接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーが、以下：
ａ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコールである；
ｂ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである；
ｃ）分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーが、安定化に使用され、該分子量の差が少なくとも１００である；および
ｄ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであり、前記細胞含有生体試料を、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）とさらに接触させる、
の特徴の１つ以上を有する、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る活動は、承認番号ｎ°２２２９１６のもとで第７次欧州研究開発フレームワーク計画（ＦＰ７／２００７−２０１３）の出資を受けた。
【０００２】
本明細書に開示する技術は、細胞含有試料、特に血液試料中の細胞外核酸集団を安定化するのに好適な方法および組成物、ならびにそれぞれに安定化された生体試料から細胞外核酸を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞外核酸は、血液、血漿、血清および他の体液中で同定されている。それぞれの試料中に見出される細胞外核酸は、それらがヌクレアーゼから保護されることに起因して（例えば、それらが、プロテオリピド複合体の形態で分泌されるため、タンパク質と会合している、または小胞内に含有される）、ある程度は分解耐性である。多くの医学的状態、悪性疾患および感染プロセスにおける上昇したレベルの細胞外核酸、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡの存在は、とりわけ、疾患進行についてのスクリーニング、診断、予後予測、監視のために、潜在的な治療標的の同定のために、および処理応答のモニタリングのために関心をもたれている。加えて、母体血中の上昇した胎児ＤＮＡ／ＲＮＡは、例えば性同一性を決定するために、染色体異常を評価するために、および妊娠関連合併症をモニターするために用いられている。したがって、細胞外核酸は、非侵襲的診断および予後予測に特に有用であり、例えば、多くの応用分野、例えば非侵襲性出生前遺伝子検査、腫瘍学、移植医療または多くの他の疾患においてそれらを診断マーカーとして使用することができ、それ故、診断に適している（例えば、胎児由来または腫瘍由来核酸）。しかし、細胞外核酸は、健常な人間においても見出される。細胞外核酸の一般的応用例および分析方法は、例えば、国際公開第９７／０３５５８９号パンフレット、国際公開第９７／３４０１５号パンフレット、Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）、ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２、Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第２５巻、１１号、６３５−６４０頁；Ｆａｎら（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８に記載されている。
【０００４】
旧来、血液などの細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離する第一ステップは、前記試料の本質的に無細胞の画分の獲得、例えば、血液の場合は血清または血漿の獲得である。次いで、細胞外核酸を前記無細胞画分、血液試料を処理する場合には一般には血漿、から単離する。しかし、試料の本質的に無細胞の画分を得ることには問題が多く、分離は、破壊中に放出される細胞核酸で細胞外核酸を汚染し得る遠心分離中の細胞破壊を防止するために注意深い制御条件を用いることが重要であるので、多くの場合、冗長で時間がかかる多段階プロセスである。さらに、すべての細胞を除去することは、多くの場合、難しい。それ故、多くの場合および一般に「無細胞」と分類される多くの処理済み試料、例えば血漿または血清は、実際には、分離プロセス中に除去されなかった残留量の細胞をなお含有する。もう１つの重要な懸念は、試料を採集した後、エクスビボインキュベーション中の、典型的には血液採取イベントから比較的短期間のうちの、細胞破壊に起因して、試料に含有されている細胞から細胞の核酸が放出されることである。細胞溶解が始まると、溶解された細胞が大量のさらなる核酸を放出し、それらが細胞外核酸と混合され、試験のために細胞外核酸を回収することがますます難しくなる。これらの問題は、先行技術分野で論じられている（例えば、Ｃｈｉｕら（２００１）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：９  １６０７−１６１３；Ｆａｎら（２０１０）および米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書を参照されたい）。さらに、利用可能な細胞外核酸の量および回収可能性は、時間が経つにつれて分解に起因して実質的に減少し得る。
【０００５】
例えば、血漿および血清試料は、様々な起源の放出循環核酸を含有するので、診断のために重要な試料材料として役立つことができる。例えば、血漿試料中の腫瘍からＤＮＡを検出することができる。母体血漿中の胎児からのＤＮＡを検出し、遺伝性障害（例えば、トリソミー）があるかどうか分析することもできる。これは、ａｍｎｉｏｎｃｙｎｔｈｅｓｉｓより侵襲性がはるかに低く、したがって、母および胎児に対する有害性がはるかに低い。しかし、上で論じたように、腫瘍からのまたは胎児に由来する循環する無細胞核酸（ｃｆＮＡ）の分析に関する大きな問題は、−血清中でおよびことによると血漿中でも発生する分解に加えて−採血後の損傷または崩壊血球からの遺伝物質による細胞外ＤＮＡ（およびＲＮＡ）の起こり得る希釈である。特に、白血球はＲＮＡに加えて大量のゲノムＤＮＡを放出するので、白血球の溶解は問題である。赤血球はゲノムＤＮＡを含有しない。したがって、全血中の循環核酸の安定化は、安定化の間の細胞ゲノムＤＮＡおよびまたＲＮＡによる細胞外核酸集団の汚染を防止するために血球を安定化する機序を含まなければならない。
【０００６】
例えば腫瘍細胞または胎児に由来する哺乳動物細胞外核酸に加えて、細胞含有試料は、細胞に含まれていない目的の他の核酸も含むことがある。重要な、非限定的な例は、病原体核酸、例えばウイルス核酸である。細胞含有試料、例えば特に配送および取り扱い中の血液検体中の、ウイルス核酸の完全性の保存も、後の分析およびウイルス量モニタリングに非常に重要である。
【０００７】
細胞外核酸は、多くの場合、試料中に低濃度でしか含まれない。例えば、放出循環核酸は、血漿中に、１〜１００ｎｇ／ｍＬ血漿の濃度で存在する。さらに、細胞外核酸は、多くの場合、５００ｎｔ、３００ｎｔ（サイズおよびしたがって鎖長を示すとき、用語「ｎｔ」は、ＤＮＡの場合の「ｂｐ」も包含する）またはさらに小さい（循環ヌクレオソーム）サイズの断片として循環する。加えて、診断のために同定すべきであると考えられる実際の標的細胞外核酸もまた、通常、全細胞外核酸の中のほんの一部にしか相当しない。例えば、腫瘍特異的ＤＮＡ断片は非常に希少であり、多くの場合、「正常」細胞外核酸バックグラウンドより１０００倍低い濃度で含まれる。したがって、試料を採集した後、細胞内核酸によるこれらの希少な核酸のさらなる希釈を防止しなければならない。
【０００８】
上で論じた問題は、例えば全血試料での場合のように、試料が大量の細胞を含む場合、特に問題となる。したがって、上記問題を回避する、それぞれに減らすために、基本的には試料を得た直後に試料に含有される細胞から試料の本質的に無細胞の画分を分離することが一般的である。例えば、基本的に血液を採取した直後の全血から血漿を得ること、ならびに／または細胞外核酸の完全性を保存するために、および含有細胞から放出される細胞内核酸での細胞外核酸集団の汚染を避けるために、全血および／もしくは得られた血漿もしくは血清を冷却することが推奨される。しかし、血液を採取する多くの施設（例えば医師の診療所）は血漿の効率的分離を可能にする遠心分離器を持っていないので、血液から例えば血漿を直接分離する必要性は大きな欠点である。さらに、通例の条件下で得られる血漿は、多くの場合、残留細胞量を含み、したがって、それらの細胞が、試料の取り扱い中に損傷を受けることもあり、または死滅することがあり、その結果、上に記載したように、細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡを放出することがある。これらの残存細胞は、それらが取り扱い中に損傷を受け、その結果、それらの核酸含有量、特にゲノム（核）ＤＮＡおよび細胞質ＲＮＡが、細胞外の循環核酸画分と混合され、それによって細胞外の循環核酸画分を汚染し、それぞれに希釈するというリスクももたらす。これらの残存する汚染性細胞を除去するために、および上述の問題を回避する／減らすために、第二の遠心分離ステップをより高速で行うことは公知であった。しかし、この場合もやはり、かかる強力な遠心分離は、血液を得る施設では利用できないことが多い。さらに、たとえ血液を採取した直後に血漿を得たとしても、核酸を直接単離することができない場合には、その血漿を−８０℃で凍結させ、その中に含有されている核酸を保存することが推奨される。これは、例えば、血漿試料を凍結状態で配送しなければならないので、試料の処理に実施上の制約を過度に課す。これは、費用を増加させ、さらに、低温流通体系が中断された場合に試料を危険にさらすというリスクをもたらす。
【０００９】
細胞外核酸に加えて、細胞内核酸も多くの応用のために関心をもたれている。例えば、ゲノムの転写産物（特に、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）のプロファイルは、分子インビトロ診断においてバイオマーカーとして広く用いられており、通常の生物学的および病理学的プロセスに、疾患の転帰を予測するおよび個人に合わせた治療コースを指示するという希望を与える。したがって、細胞内核酸、特にＲＮＡのプロファイリングも、疾患診断、予後予測においておよび臨床試験においてバイオマーカー発見のために重要になってきている。分析すべき試料の安定化に関する予防措置を取らないと、試料は、標的分子の発現プロファイルを変更するかもしれない変化を輸送および保管中に被る。トランスクリプトームが、試料の取り扱いに起因して有意に変更されると、後の分析は、試料のおよびしたがって患者の元の状態を反映せず、それどころか試料取り扱い、輸送および保管中に生じた人工プロファイルを測定する。それ故、遺伝子発現プロファイルを安定化する、最適化された安定化プロセスが必要とされる。
【００１０】
血液試料は、現在、通常はスプレー乾燥または液体ＥＤＴＡを含有する採血チューブ（例えば、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２ＥＤＴＡ）に採集される。ＥＤＴＡは、マグネシウム、カルシウムおよび他の二価金属イオンとキレートを形成し、それによって例えば血液凝固またはＤＮａｓｅに起因するＤＮＡ分解などの、酵素反応を阻害する。しかし、たとえＥＤＴＡが効率的な抗凝固物質であったとしても、ＥＤＴＡは、保管中に放出された細胞内核酸による細胞外核酸集団の希釈、それぞれに汚染を効率的に防止しない。それ故、ＥＤＴＡで安定化した試料の無細胞部分において見出される細胞外核酸集団は、保管中に変化し、大量の細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡで汚染させることになる。したがって、ＥＤＴＡは、特に、例えば血液採取後に細胞分解によって生ずるならびに試料輸送および保管中の細胞不安定性により生ずるゲノムＤＮＡ断片での、細胞外核酸集団の汚染を回避することができないので、細胞外核酸集団を十分に安定化することが可能でない。
【００１１】
さらに、ＲＮＡ遺伝子発現プロファイルの即時安定化用の試薬およびしたがってトランスクリプトームを試料採集時点で収容している採血チューブは、公知である（例えば、米国特許第６，６１７，１７０号明細書、米国特許第７，２７０，９５３号明細書、Ｋｒｕｈｏｆｆｅｒら、２００７を参照されたい）。しかし、これらの方法は、試料に含有されている細胞の即時溶解に基づく。したがって、これらの方法、および細胞溶解を誘導する他の方法は、細胞内核酸の放出を誘導し、その結果、細胞内核酸が細胞外核酸集団と混合されることになるので、細胞含有試料中の細胞外核酸集団の安定化には好適でない。
【００１２】
さらに、細胞含有試料、例えば血液または組織試料を安定化するための方法であって、例えば、細胞、トランスクリプトーム、ゲノムおよびプロテオームを安定化する方法が、先行技術分野において公知である。かかる方法は、例えば、国際公開第２００８／１４５７１０号パンフレットに開示されている。前記方法は、特定の安定化化合物、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｙｈｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）の使用に基づく。しかし、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｙｈｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）は毒性物質（ｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）である。したがって、毒性物質の使用を回避する代替安定化方法を提供することが必要とされている。
【００１３】
さらに、全血に含有されている循環核酸を安定化することを特に目的とする方法が、先行技術分野において公知である。１つの方法は、ホルムアルデヒドの使用を利用して細胞膜を安定化し、それによって細胞溶解を低減させ、およびさらにホルムアルデヒドがヌクレアーゼを阻害する。それぞれの方法は、例えば、米国特許第７，３３２，２７７号明細書および米国特許第７，４４２，５０６号明細書に記載されている。同時の細胞安定化と核酸安定化という要求に対処するために、ホルムアルデヒド放出剤の使用に基づく安定化系が開発された。それぞれの安定剤は、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．からｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ＢＣＴ（採血チューブ）の名で市販されている。その１０ｍＬ採血チューブは、室温で３日までの間の血漿中の無細胞ＲＮＡの保存および安定化を意図したものである。その保存剤は、血漿中の無細胞ＲＮＡを安定化し、試料処理および保管中の血球からの非標的バックグラウンドＲＮＡの放出を防止する。米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１０号明細書には、同じ血液試料中の細胞およびＲＮＡ安定化を達成するためのホルムアルデヒドを放出する成分の使用が記載されている。したがって、この文献には、安定剤が、採取した血液中の血球を安定化し、それにより無細胞ＲＮＡまたはグロビンＲＮＡでの細胞ＲＮＡの汚染を防止する；少なくとも２時間、ＲＮＡ合成を阻害する；および血球内にある細胞ＲＮＡを、血液採取の際に血球のタンパク質発現パターンを実質的に不変に保つように保存する、技術が記載されている。それぞれに安定化された試料から白血球を単離することができ、次いでそれらの白血球から細胞ＲＮＡが抽出される。しかし、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出物質の使用には欠点がある。それらは、核酸分子間またはタンパク質と核酸間の架橋を誘導することにより細胞外核酸単離の有効性を損なうからである。血液試料を安定化するための方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書および米国特許出願公開第２０１０／０２０９９３０号明細書にも記載されている。これらのかなり最近開発された方法は、細胞含有生体試料を安定化するための手段を、かかる試料に含有されている例えば細胞外核酸の効率的回収を可能にするために提供することの大きな必要性を明示している。
【００１４】
未公開ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７０２１１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６８８５０には、全血試料などの細胞含有生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するための異なる方法が記載されている。これらの未公開出願に記載されている安定化組成物は、細胞外核酸集団の安定化、特に、その細胞外核酸集団への細胞内核酸の放出を防止することによる安定化に有効である。
【００１５】
細胞含有試料、例えば、特に血液試料を安定化する処理技術の開発が必要とされ続けている。特に、細胞含有生体試料（細胞を含有すると疑われる試料を含む）、特に全血、血漿または血清に含まれている細胞外核酸集団の安定化をもたらし、それによってかかる試料の取り扱い、それぞれに処理を（例えば、全血から血漿を直接分離する必要、または単離された血漿を冷却するもしくはさらには凍結する必要を回避することにより）さらに容易にする方法が必要とされている。後の核酸単離を妨げない効率的で信頼性のある試料安定化技術を提供することにより、かかる試料に含有されている細胞外核酸の単離および試験の信頼性がより高くなり、したがって、かかる安定化技術により細胞外核酸の診断および予後予測応用／使用が改善される。特に、全血試料中の細胞外核酸集団を保存するための溶液が、例えば、出生前検査のために、および／または疾患、例えば新生物疾患など、特に前悪性もしくは悪性疾患についてのスクリーニングのために、必要とされ続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第９７／０３５５８９号
【特許文献２】国際公開第９７／３４０１５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６１７，１７０号明細書
【特許文献５】米国特許第７，２７０，９５３号明細書
【特許文献６】国際公開第２００８／１４５７１０号
【特許文献７】米国特許第７，３３２，２７７号明細書
【特許文献８】米国特許第７，４４２，５０６号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１０号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１０／０２０９９３０号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９
【非特許文献２】Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）
【非特許文献３】ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２
【非特許文献４】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第２５巻、１１号、６３５−６４０頁
【非特許文献５】Ｆａｎら（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８
【非特許文献６】Ｃｈｉｕら（２００１）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：９  １６０７−１６１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、細胞含有試料に含まれている細胞外集団を安定化するための方法および組成物を提供することである。特に、先行技術の試料安定化方法の欠点の少なくとも１つを克服することが目的である。さらに、特に、本発明の目的は、細胞含有生体試料、特に全血試料、の室温での安定化に好適な方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、細胞含有生体試料を有効に安定化することが可能であり、および特に、その試料中に含まれている細胞外核酸集団を安定化することが可能である試料採集容器、特に採血チューブを提供することである。さらに、本発明の１つの目的は、前記試料中に含まれている核酸の良好な収率でのその後の単離を可能にする安定化技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ブタンアミドが、細胞外核酸を含む細胞含有生体試料、特に、全血試料または血液由来試料、例えば血漿もしくは血清などの安定化に有効であるという、驚くべき発見に基づく。ブタンアミドは、細胞外核酸集団を安定化することができ、および特に、試料を採集した後に細胞外核酸集団がゲノムＤＮＡで、特に断片化ゲノムＤＮＡで、汚染されることになるリスクを低下させることが可能であることが判明した。したがって、ブタンアミドの安定剤としての使用は、細胞外核酸集団が細胞内核酸によって希釈されることになるリスクを低下させ、このことは、その細胞外核酸集団のプロファイルの保存に有意に寄与する。有利なことに、ブタンアミドは、毒性物質にも、有害物にも、刺激物にも分類されない。さらに、標準的な核酸単離法を用いてブタンアミドで安定化した試料から核酸を効率的に単離することができる。
【００２０】
第一の態様に従って、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団の安定化に好適な方法であって、前記細胞含有試料をブタンアミドと接触させる方法を提供する。
【００２１】
第二の態様に従って、安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）本発明の第一の態様で定義の方法に従って前記細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）その安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む方法を提供する。
【００２２】
ステップａ）における安定化は、ブタンアミドの安定剤としての使用を含む上記の本発明の第一の態様に従って達成される。本発明による安定化には、細胞含有生体試料に含有されている細胞外核酸集団が、その生体試料を得、それぞれに採集しブタンアミドを使用して安定化した時点にその細胞外核酸集団が示した状態に実質的に保存されるという効果がある。実施例によって証明するように、ゲノムＤＮＡおよび他の細胞内核酸の放出が有意に低減される。それぞれに安定化された試料から単離される細胞外核酸は、非安定化試料から単離される細胞外核酸と比較して、細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡでの有意に少ない汚染を含む。非安定化試料から単離される細胞外核酸は、その試料に含まれている崩壊細胞によって保管期間中に放出される大量の細胞内核酸、例えばゲノムＤＮＡおよび細胞内ＲＮＡを含む。本明細書に記載する安定化技術を用いると、細胞外核酸集団のかかる希釈および変更を有意に低減させることができる。本明細書に記載する安定化技術で達成される細胞外核酸集団の実質的な保存は、細胞外核酸集団のこの安定化／保存が細胞外核酸の分析を目的とする任意の後の試験の精度を向上させるため、重要な利点である。これは、細胞外核酸集団の単離およびその後の分析を標準化することを可能にし、それによって、細胞外核酸画分に基づく診断または予後予測応用を、より信頼性の高いものにし、かつ用いる保管／取り扱い条件への依存がより低いものにする。その結果、それぞれに単離された細胞外核酸の診断および予後予測応用可能性を改善する。特に、本明細書に記載する安定化には、細胞外核酸の集団に含まれているある一定の細胞外核酸分子の比を実質的に一定に保つことができ、したがって、前記比がその生体試料を採集した時点で存在した比に匹敵するという利点がある。それ故、有利なことに、細胞外核酸集団のプロファイルを保存することができる。
【００２３】
第三の態様に従って、細胞含有生体試料を安定化するのに好適な組成物であって、ブタンアミドと、
−アポトーシス阻害剤、
−抗凝固物質および
−式１に従う化合物
【化１】
0006407248.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む組成物を提供する。
【００２４】
それぞれの安定化組成物は、細胞含有生体試料、特に全血、血漿および／または血清の、前記試料中に含まれている細胞および細胞外核酸集団を安定化することによる安定化に特に有効である。それぞれの安定化組成物は、安定化試料、例えば全血の、室温で少なくとも２日間、または好ましくは少なくとも３日間の、その試料の質、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸集団の質を実質的に損なわない、保管および／または取り扱い、例えば配送を可能にする。したがって、本発明による安定化組成物を使用すると、試料採集、例えば採血と核酸抽出の間の時間は、その試料に含有されている細胞外核酸集団に対する実質的影響なしに変動させることができる。これは、異なる取り扱い手順に起因する細胞外核酸集団の変動性を低減させるので、重要な利点である。例えば、血液試料を安定化するために前記安定化組成物を使用すると、安定化された試料から細胞画分を分離して、保存された細胞外核酸集団を含む血漿または血清試料を得ることができる。
【００２５】
本発明の第四の態様に従って、本発明は、細胞含有生体試料、好ましくは血液試料中の細胞外核酸集団を安定化するための第三の態様による組成物の使用に関する。
【００２６】
第五の態様に従って、細胞含有生体試料を採集するための容器であって、ブタンアミドと、
−アポトーシス阻害剤、
−抗凝固物質および
−式１に従う化合物
【化２】
0006407248.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む容器を提供する。細胞含有生体試料、好ましくは血液試料を採集するための前記容器は、本発明の第三の態様による安定化組成物を含み得る。前記安定化組成物を含むそれぞれの容器、例えば試料採集チューブ、の提供には、その試料をそれぞれの容器に採集するやいなや直ちにその細胞含有生体試料を安定化するという利点がある。さらに、それぞれの試料採集容器、特に採血チューブは、血液試料に含有されている血球、細胞外核酸および必要に応じてウイルス、それぞれにウイルス核酸の安定化が可能である。
【００２７】
第六の態様に従って、生体試料、好ましくは血液を、患者から直接、本発明の第五の態様による容器のチャンバーの中に採集する、好ましくは採取するステップを含む方法を提供する。
【００２８】
第七の態様に従って、本発明の第三の態様による組成物を生成する方法であって、前記組成物の成分を混合する、好ましくは溶液中で混合する方法を提供する。用語「溶液」は、本明細書で使用する場合は特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。それは、１相のみの均質混合物であってよいが、溶液が例えば沈殿物などの固体成分を含むことも本発明の範囲内である。
【００２９】
本出願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すものであるが、単に実例として与えるものに過ぎないことを理解されたい。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、該細胞含有生体試料をブタンアミドと接触させることによる方法。
（項目２）
前記細胞含有生体試料をカスパーゼ阻害剤とさらに接触させる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞含有生体試料を、式１に従う少なくとも１つの化合物：
【化１１】
0006407248.tif 000004
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、より好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
とさらに接触させる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
式１に従う前記化合物が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞含有生体試料を、安定化のために使用されるブタンアミドおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物が、０．２５％（ｗ／ｖ）から１５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から１２．５％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）から９％（ｗ／ｖ）、１．２５％（ｗ／ｖ）から８％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、１．７５％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）、１．８％（ｗ／ｖ）から５．５％（ｗ／ｖ）、１．９％（ｗ／ｖ）から５．２５％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、２．１％（ｗ／ｖ）から４．７５％（ｗ／ｖ）、２．２％（ｗ／ｖ）から４．５％（ｗ／ｖ）、２．３％（ｗ／ｖ）から４．２５％（ｗ／ｖ）、２．４％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）から３．７５％（ｗ／ｖ）または０．７５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度でブタンアミドを含む、項目１から４の一項以上、特に項目２、に記載の方法。
（項目６）
安定化のために、前記細胞含有試料を、
ａ）ブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤；
ｃ）必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド；および
ｄ）必要に応じて、抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
を含む安定化組成物と接触させる、項目２から５の一項以上に記載の方法。
（項目７）
前記安定化が、（ｉ）添加剤の、該添加剤が有核細胞の溶解を誘導もしくは促進する濃度での使用を含まない、（ｉｉ）該安定化が、タンパク質−核酸架橋および／もしくはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤の使用を含まない、ならびに／または（ｉｉｉ）該安定化が、毒性物質の使用を含まない、項目１から６の一項以上に記載の方法。
（項目８）
血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するために、該血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、式１に従う少なくとも１つの化合物、および抗凝固物質と接触させるステップを含み、該血液試料に含有されている細胞からの該血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される、項目３から７の一項以上、特に項目７から２５の一項以上に記載の方法。
（項目９）
前記細胞含有生体試料を少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーとさらに接触させる、項目１から８の一項以上に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコールである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量、好ましくは、２０００から４００００、２５００から３００００、３０００から２００００、３５００から１５０００、４０００から１００００、４５００から９０００、５０００から８０００、および５５００から７０００より選択される範囲の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを安定化のために使用し、それらの分子量の差が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００である、項目９から１１の一項以上に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞含有生体試料を、１０００以下の、好ましくは、１００から８００、１５０から７００、２００から６００、および２００から５００より選択される範囲内の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）とさらに接触させる、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
項目１から１３の一項以上に記載の方法であって、前記安定化の期間の後、
ａ）安定化された前記試料を核酸分析および／または検出法に供するステップ；
ｂ）安定化された該試料から細胞外核酸を単離するステップ；
ｃ）安定化された該試料から細胞外核酸を単離し、単離された該核酸を分析および／または検出するステップ；
ｄ）安定化された該試料に含まれている細胞を除去するステップ；
ｅ）安定化された該試料に含まれている細胞を核酸単離、分析および／または検出ステップを実行する前に除去するステップ；
ｆ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離するステップ；
ｇ）（ｉ）安定化された該試料、（ｉｉ）細胞が除去された安定化された該試料、および／または（ｉｉｉ）該試料から除去された細胞を保管するステップ；
ｈ）安定化された該試料から細胞を除去し、廃棄するステップ；および／または
ｉ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料から除去された細胞から核酸を単離するステップ；
ｊ）安定化された該試料から細胞を除去し、安定化された該試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から、サイズ選択的核酸単離法を用いて細胞外核酸を単離するステップ
の１つ以上を含む、方法。
（項目１５）
安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）項目１から１４の一項以上に記載の方法に従って該細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）核酸、特に細胞外核酸を単離するステップ
を含む方法。
（項目１６）
ステップａ）およびステップｂ）の間に前記細胞含有生体試料から細胞を除去するステップを含み、かつステップｂ）が、安定化された前記試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
単離された前記細胞外核酸をさらなるステップｃ）において処理および／または分析する、好ましくは、
ｉ）改変する；
ｉｉ）少なくとも１つの酵素と接触させる；
ｉｉｉ）増幅する；
ｉｖ）逆転写する；
ｖ）クローニングする；
ｖｉ）配列決定する；
ｖｉｉ）プローブと接触させる；
ｖｉｉｉ）検出する；
ｉｘ）定量する；および／または
ｘ）同定する、
項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
細胞含有生体試料を安定化するのに好適な組成物であって、ブタンアミドと、アポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物
【化１２】
0006407248.tif 000005
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む組成物。
（項目１９）
カスパーゼ阻害剤および／もしくは式１に従う少なくとも１つの化合物
【化１３】
0006407248.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）を含む、ならびに／または
少なくとも１つの抗凝固物質、好ましくはキレート剤を含む、
項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
項目１８または１９に記載の組成物であって、以下：
ａ）細胞を安定化することおよび前記細胞含有生体試料に含有されている細胞から該試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させることが可能である；
ｂ）安定化された該試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡ、の分解を低減させることが可能である；
ｃ）安定化された該生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの該試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の汚染を低減させるまたは防止することが可能である；
ｄ）安定化された該生体試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸での該試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を低減させるまたは防止することが可能である；
ｅ）該安定化組成物が、添加剤を、該添加剤が細胞溶解を誘導または促進する濃度で含まない；
ｆ）該安定化組成物が、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まない；
ｇ）該安定化組成物が、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤を含まない；
ｈ）該安定化組成物が、毒性物質を含まない；および／または
ｉ）該細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から６日、および／または少なくとも２日から７日より選択される期間、安定化することが可能である；
の特徴の１つ以上を有する、組成物。
（項目２１）
項目１８から２０の一項以上に記載の組成物であって、以下；
ｉ）該組成物が、ブタンアミドを５％（ｗ／ｖ）から５０％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）から３５％（ｗ／ｖ）、１２．５％（ｗ／ｖ）から３０％（ｗ／ｖ）、または１５％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む；
ｉｉ）該組成物が、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む；
ｉｉｉ）該組成物が、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ−Ｎ−ジメチルプロパンアミドを、２％から５０％、３％から４０％、３．５％から３０％、４％から２５％、４．５％から２０％、または５％から１７．５％の濃度で含む、および／または
ｉｖ）該組成物が、抗凝固物質を含む；
の特徴の１つ以上を有する、組成物。
（項目２２）
少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む、項目１８から２０の一項以上に記載の組成物。
（項目２３）
前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコールである、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、少なくとも１５００の分子量、好ましくは、２０００から４００００、２５００から３００００、３０００から２００００、３５００から１５０００、４０００から１００００、４５００から９０００、５０００から８０００、および５５００から７０００より選択される範囲の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、項目２２または２３に記載の組成物。
（項目２５）
分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、該分子量の差が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００である、項目２２から２４の一項以上に記載の組成物。
（項目２６）
１０００以下の分子量、好ましくは１００から８００、１５０から７００、２００から６００、および２００から５００より選択される範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）をさらに含む、項目２４に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【図３】図３である。
【図４】図４である。
【図５】図５である。
【図６】図６である。
【図７】図７である。
【図８】図８である。
【図９】図９である。
【図１０】図１０である。
【図１１】図１１である。
【図１２】図１２である。
【図１３】図１３である。
【図１４】図１４である。
【図１５】図１５である。
【図１６】図１６である。
【図１７】図１７である。
【図１８】図１８である。
【図１９】図１９である。
【図２０】図２０である。
【図２１】図２１である。
【図２２】図２２である。
【図２３】図２３である。
【図２４】図２４である。
【図２５】図２５である。
【図２６】図２６である。
【図２７】図２７である。
【図２８】図２８である。
【図２９】図２９である。
【図３０】図３０である。
【図３１】図３１である。
【図３２】図３２である。
【図３３】図３３である。
【図３４】図３４である。
【図３５】図３５である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、ブタンアミドの安定剤としての使用に基づく、細胞含有生体試料を安定化するための、特に、前記細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法、組成物およびデバイスに、従って技術に関する。さらに、ブタンアミドと他の安定剤の有利な組み合わせを記載する。本明細書に開示する安定化技術は、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団が汚染されることになる、したがって、その試料に含有されている損傷細胞および／または死細胞に由来する細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡで希釈されることになるリスクを低減させる。本発明の方法および組成物で達成される安定化は、安定化された試料の室温で長期間の、その試料の質、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸集団の組成物の質を危険にさらすことのない、保管および／または取り扱いを可能にする。試料を得た時点で細胞外核酸集団の組成が安定化され、したがって、実質的に保存されるので、試料採集と核酸単離の間の時間は、その細胞外核酸集団の組成に対する有意な負の影響なく、好適な安定化期間内で変更することができる。これは、例えば、試料の取り扱い／保管の変動が、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の質に、それぞれに組成およびしたがってプロファイルにあまり影響を及ぼさないので、診断または予後予測の細胞外核酸分析の標準化を簡単にする。それ故、それぞれの細胞含有生体試料の分析、それぞれに、それぞれに安定化された試料から得られる細胞外核酸の分析は、より同等になる。さらに、本発明の教示は、保管／配送中に死滅または崩壊する細胞から別様に放出される細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡでの細胞外核酸の汚染を回避するため、それぞれに低減させるために、生体試料に含有されている細胞をその試料の無細胞部分から直接分離する必要を不要にする。この利点は、全血試料などの細胞含有生体試料の取り扱いを相当簡単にする。例えば、診療所で得られ、本発明の教示に従って安定化された全血試料を室温で配送することができ、受け取る臨床検査室においてその試料の細胞画分から細胞外核酸を含有する血漿を適便に分離することができる。しかし、本発明の教示は、細胞枯渇生体試料、または例えば血漿もしくは血清などの「無細胞」と一般に呼ばれる試料を処理するときにも有利である。それぞれの細胞枯渇または「無細胞」生体試料は、ゲノムＤＮＡを含む残留細胞、特に白血球を（用いられる分離プロセスにも依存して）まだ含むことがある。前記残留細胞は、それらの残存する（潜在的に）細胞が配送プロセスまたは保管プロセス中に損傷されるか死滅する場合、細胞外核酸集団が細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡでますます汚染されることになるというリスクをもたらす。このリスクは、本発明が教示する安定化方法を用いると相当低減される。本発明の技術は、試料を採集し、ブタンアミドとおよび必要に応じて本明細書において教示するような１つ以上の追加の安定剤と接触させた時点でのその試料の細胞外核酸集団を効率的に保存することを可能にするので、前記試料を受取施設で適正に処理して、細胞内核酸での細胞外核酸集団の汚染を実質的に回避し、それぞれに低減させつつ前記試料から細胞外核酸を単離することができる。例えば研究所などの前記試料を受け取る施設は、細胞枯渇試料中、例えば、血漿中などに存在し得る残留細胞を含めて、それらの安定化された試料中に含まれている細胞を効率的に除去するために必要な機器、例えば高速遠心分離器（または他の手段、下記も参照されたし）なども通常は有する。かかる機器は、細胞含有生体試料を得る施設には存在しないことが多い。それ故、本発明には、大量の細胞を含む生体試料、例えば全血試料などを安定化するときに多くの利点があり、しかし、例えば、血漿、血清、尿、唾液、滑液、羊水、涙液、リンパ液、髄液（ｌｉｑｕｏｒ）、脳脊髄液などのような、より少ないもしくはほんの少量の細胞を含む、または細胞を含有すると疑われるだけかもしれない生体試料を安定化するときにも重要な利点がある。
【００３２】
Ａ．安定化方法
第一の態様に従って、細胞含有生体試料をブタンアミドと接触させることによる、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の好適な安定化方法を提供する。
【００３３】
上に記載したように、ブタンアミドの安定剤としての使用に基づく前記方法は、細胞含有試料、例えば血液試料を効率的に安定化し、および特に、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化する。前記方法は、細胞外核酸集団が、含有されている細胞に由来する、例えば損傷細胞または死細胞に由来する細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡで重度に汚染されることになるリスクを低減させる。その結果、前記細胞含有試料を採集し、本発明による方法を用いて安定化した時点で前記細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団の組成を実質的に保存し、それぞれに安定化する。前記試料に含有されている細胞外核酸集団の組成およびしたがってプロファイルの保存は、細胞外核酸を後に診断目的で分析するとき、特に重要である。実施例によって証明するように、安定剤としてのブタンアミドの使用は、３日までの間の安定化効果を実現する。安定剤としてのブタンアミドの使用は、例えば、ブタンアミドは毒性でないので、例えば毒性物質Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを使用する方法より有利である。これは、安定化組成物の取り扱いを簡単にするので、必須の恩恵である。さらに、ブタンアミドは架橋特性を有さないので、標準核酸単離法を用いてブタンアミドで安定化した試料から核酸を効率的に単離することができる。これは、例えば、安定化された試料のさらなる処理を簡単にし、およびまた細胞外核酸集団に含まれている希少標的核酸を後に検出できる機会を増加させるので、重要な利点である。
【００３４】
本明細書において用いる場合の用語「細胞外核酸」（複数）または「細胞外核酸」（単数）は、特に、細胞に含有されない核酸を指す。それぞれの細胞外核酸は、多くの場合、無細胞核酸とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書では同義語として用いている。したがって、細胞外核酸は、通常、試料中の１細胞の外部または複数の細胞の外部に存在する。用語「細胞外核酸」は、例えば、細胞外ＤＮＡならびに細胞外ＲＮＡも指す。例えば体液などの生体試料の無細胞画分（それぞれ部分）において見出される典型的な細胞外核酸の例としては、哺乳動物細胞外核酸、例えば、細胞外腫瘍関連または腫瘍由来ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の細胞外疾患関連ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、エピジェネティック修飾ＤＮＡ、胎児ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなど）など、ならびに非哺乳動物細胞外核酸、例えば、ウイルス核酸、細胞外核酸集団へと例えば原核生物（例えば細菌）、ウイルス、真核寄生虫または真菌から放出される病原体核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞外核酸集団は、損傷細胞または死細胞から放出されたある一定の量の細胞内核酸を通常含む。例えば、血液中に存在する細胞外核酸集団は、損傷細胞または死細胞から放出された細胞内グロビンｍＲＮＡを通常含む。これは、インビボで発生する自然プロセスである。細胞外核酸集団中に存在するかかる細胞内核酸は、後の核酸検出方法における対照という目的に役立つこともできる。本明細書に記載する安定化方法は、特に、細胞外核酸集団に含まれている細胞内核酸、例えばゲノムＤＮＡの量が、細胞含有試料を採集した後、その試料のエクスビボでの取り扱いに起因して有意に増加するリスクを低減させる。したがって、エクスビボでの取り扱いのための細胞外核酸集団の変更を低減させ、さらに防止することができる。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料は、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、脳脊髄液、痰、涙液、汗、羊水またはリンパ液などの体液であるか、またはそれらに由来する。本明細書において、本発明者らは、循環体液、例えば血液またはリンパ液から得られる細胞外核酸を循環細胞外核酸または循環無細胞核酸と呼ぶ。１つの実施形態によると、用語細胞外核酸は、特に、哺乳動物細胞外核酸を指す。例としては、疾患関連または疾患由来細胞外核酸、例えば、腫瘍関連または腫瘍由来細胞外核酸、炎症もしくは傷害、特に外傷に起因して放出される細胞外核酸、他の疾患に関係したおよび／もしくは他の疾患に起因して放出される細胞外核酸、または胎児に由来する細胞外核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される場合の用語「細胞外核酸」（複数）または「細胞外核酸」（単数）は、他の細胞含有生体試料、特に、体液以外の生体試料から得られる細胞外核酸も指す。通常、試料は、１つより多くの種類またはタイプの細胞外核酸を含む。細胞外核酸は、細胞外ＤＮＡおよび細胞外ＲＮＡを包含する。
【００３５】
本明細書において用いる場合の用語「細胞外核酸集団」は、特に、細胞含有試料に含まれている様々な細胞外核酸の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ）を指す。細胞含有試料は、通常、特徴的なおよびしたがってユニークな細胞外核酸集団を含む。したがって、特定試料の細胞外核酸集団に含まれる１つ以上の細胞外核酸のタイプ、種類、比および／または量は、重要な試料特性であり得る。上で論じたように、それ故、前記細胞外核酸集団を安定化することおよびしたがって試料を採集した状態で前記細胞外核酸集団を実質的に保存することは重要である。試料の細胞外核酸集団に含まれる１つ以上の細胞外核酸のその組成および／または量は、価値のある医学、予後予測または診断情報を提供することができるからである。したがって、細胞外核酸集団のプロファイルが効率的に安定化されると有利である。本明細書に記載する安定化技術は、試料採集および安定化後、細胞内核酸による、特にゲノムＤＮＡによる、細胞外核酸集団の汚染およびしたがって希釈を低減させる。かくして、細胞外核酸集団の実質的保存が達成される。実施例によって証明するように、細胞外核酸集団の、含まれている細胞外核酸の量、質および／または組成に関する変化、特に、放出されたゲノムＤＮＡの増加に起因する変化は、安定化期間にわたって、非安定化試料に比べてまたは血液試料もしくは血液由来試料の場合は例えばＥＤＴＡによって安定化されている対応する試料に比べて、相当低減される。１つの実施形態によると、Ｔ０（安定化時点）から安定化期間の終わり（好ましくは、Ｔ０の４８時間、７２時間または９６時間後）までのゲノムＤＮＡの増加は、非安定化試料に比べて、または血液試料もしくは血液に由来する試料の場合は例えばＥＤＴＡによって安定化されている対応する試料（例えば、１．５ｍｇＥＤＴＡ／ｍＬ安定化血液試料）に比べて、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低減される。
【００３６】
細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させた後に得られる混合物は、ブタンアミドを、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．６％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．８５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．１％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．２％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．３％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．４％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．６％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．７％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．８％（ｗ／ｖ）、少なくとも２．９％（ｗ／ｖ）または少なくとも３％（ｗ／ｖ）の濃度で含んでよい。ブタンアミドは、それが細胞含有生体試料、特に、細胞含有試料の無細胞部分に含有、されている細胞外核酸集団に対して安定化効果を発揮する濃度で使用される。実施例によって証明するように、ブタンアミドは、様々な濃度において有効である。当業者が日常の実験を用いて、例えば、実施例に記載する試験アッセイで異なるブタンアミド濃度を試験することによって、異なる試料タイプについての好適なブタンアミド濃度を決定することもできる。実施例によって証明するように、ブタンアミドについての好適な濃度範囲は、１つ以上の追加の安定剤をブタンアミドと併用するかどうかにも依存する。例えば、例えば血液などの細胞含有生体試料を安定化するために、本明細書に記載の１つ以上の追加の安定化添加剤、好ましくは、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤および／または式１に従う化合物（下記参照）をブタンアミドと併用する場合、より低濃度のブタンアミドを使用することができる。細胞含有生体試料および必要に応じてさらなる添加剤と混合するときのブタンアミドの好適な濃度範囲としては、０．１％（ｗ／ｖ）から１５％まで、０．２５％（ｗ／ｖ）から１３％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）から１２％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から８％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）から７．５％（ｗ／ｖ）、１．２５％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）から６．５％（ｗ／ｖ）、１．７５％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）、１．８％（ｗ／ｖ）から５．５％（ｗ／ｖ）、１．９％（ｗ／ｖ）から５．２５％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、２．１％（ｗ／ｖ）から４．７５％（ｗ／ｖ）、２．２％（ｗ／ｖ）から４．５％（ｗ／ｖ）、２．３％（ｗ／ｖ）から４．２５％（ｗ／ｖ）、２．４％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）から３．７５％（ｗ／ｖ）または２．５％（ｗ／ｖ）から３．５％（ｗ／ｖ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させた後に得られる前記混合物は、ブタンアミドを、０．５％（ｗ／ｖ）から３．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．７５％（ｗ／ｖ）から３．２５％、または０．９％（ｗ／ｖ）から３％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度で含む。かかる濃度は、血液試料の安定化に特に好適である。実施例によって証明するように、これらの範囲に存する濃度でのブタンアミドの使用は、血液試料に対して優れた安定化効果をもたらし、およびさらに、血液試料に含有されている赤血球の溶血を防止する。２％（ｗ／ｖ）以下のより低いブタンアミド濃度は、特に、さらなる安定剤、例えば、好ましくはカスパーゼ阻害剤および／または式１に従う化合物をさらに使用するとき有効である。実施例によって証明するように、これらの安定剤の併用は、血液試料の安定化に特に有利である。
【００３７】
提供する実施例によって証明するように、細胞含有試料の安定化には、および細胞外核酸集団のその組成の変化、特に、断片化ゲノムＤＮＡでの汚染から生ずる変化を防ぐには、ブタンアミドのみで既に有効である。ブタンアミドを使用して血液試料を３日までの安定化期間、安定化することができた。例えば血液試料の通例の配送および取扱期間を考えるとこれで十分である。しかし、好ましい実施形態によると、細胞含有生体試料を少なくとも１つのアポトーシス阻害剤とさらに接触させる。本明細書において用いる場合の用語「アポトーシス阻害剤」は、特に、細胞含有生体試料中のその存在が、細胞のアポトーシスプロセスの低減、防止および／もしくは阻害を提供する、ならびに／またはアポトーシス刺激に対して細胞をより耐性にする化合物を指す。アポトーシス阻害剤としては、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質様もしくはペプチド様分子、有機および無機分子が挙げられるが、これらに限定されない。アポトーシス阻害剤は、代謝阻害剤、核酸分解の、それぞれに核酸経路の阻害剤、酵素阻害剤、特にカスパーゼ阻害剤、カルパイン阻害剤およびアポトーシスプロセスに関与する他の酵素の阻害剤として作用する化合物を含む。代表的なアポトーシス阻害剤を表１に収載する。好ましくは、細胞含有生体試料の安定化のために使用される少なくとも１つのアポトーシス阻害剤は、代謝阻害剤、カスパーゼ阻害剤およびカルパイン阻害剤から成る群より選択される。各クラスの例を表１にそれぞれのカテゴリーで収載する。好ましくは、アポトーシス阻害剤は、細胞透過性である。同じアポトーシス阻害剤クラスまたは異なるアポトーシス阻害剤クラスいずれかからの、異なるアポトーシス阻害剤の組み合わせを使用すること、それぞれに、同じ作用機序または異なる作用機序いずれかによってアポトーシスを阻害する、異なるアポトーシス阻害剤の組み合わせを使用することも、本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明の有利な実施形態において、アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、アポトーシスに重要な役割を果たす。個々のカスパーゼの基質選好または特異性は、カスパーゼと結合についてうまく競合するペプチドの開発に活用されている。カスパーゼ特異的ペプチドを例えばアルデヒド化合物、ニトリル化合物またはケトン化合物にカップリングさせることによりカスパーゼ活性化の可逆的または不可逆的阻害剤を生成することができる。適する例は、下に記載する。したがって、好ましい実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤と接触させる。実施例によって証明するように、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の併用は、達成される安定化効果を有意に改善する。特に、その安定化効果が長期間にわたって達成される。さらに、特に、大量の細胞を含有する生体試料であって、さらにそれらの組成が異なる生体試料、例えば血液試料などに関して、達成される安定化効果がより強く、より均一であることが判明した。例えば、異なるドナーに由来する血液試料は、エクスビボでの取り扱い中に発生する細胞外核酸集団の変化が異なることがある。一部の試料は、細胞外核酸集団のプロファイルの強い変化（特に、ゲノムＤＮＡの強い増加）を示すが、他の試料では、前記効果があまり顕著でない。かかる試料はまた、安定化に対して異なった反応をし得る。異なるドナーから得た血液試料を安定化するためにブタンアミドとカスパーゼ阻害剤を併用すると、より均等化された、均一な安定化効果が達成された。したがって、元の血液試料の変動は、達成される安定化にあまりまたはさらには全く影響しなかった。それ故、好ましくは、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤と接触させる。得られた混合物中に存在するカスパーゼ阻害剤は、安定化を有意に支援する。ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の組み合わせは、とりわけ、生体試料に含まれている有核細胞を安定化し、それによって、細胞内核酸、例えば特にゲノムＤＮＡが、生体試料に含まれている細胞から放出されることを防止する。カスパーゼ阻害剤とブタンアミドの組み合わせは、細胞外核酸集団が、試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡで汚染されるリスクを低減させるのに特に有効であることが判明した。記載したように、かかる汚染は、それが細胞外核酸を希釈し、さらにその細胞外核酸集団の組成およびしたがってプロファイルを変えるので、問題が多い。しかし、そのプロファイルの保存は、多くの場合、診断応用にとって重要である。さらに、試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡの分解は、安定剤の前記組み合わせによって低減される。したがって、ブタンアミドと少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤の併用は、安定化効果を有意に改善し、それによって試料に含有されている細胞外核酸集団を、その生体試料を得、それぞれに採集した時点でその集団が示した状態に、長期保管期間中でさえ、実質的に保存することを支援する。細胞外核酸集団、特にその組成／プロファイルの信頼性のある保存は、先行技術に重要な貢献をする。本発明による組み合わせには、カスパーゼ阻害剤単独またはブタンアミド単独よりよい安定化効果がある。ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の組み合わせで達成される結果は、カスパーゼ阻害剤とＮ，Ｎジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）の組み合わせで達成される安定化効果に匹敵した。安定剤のかかる組み合わせは、未公開ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７０２１１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６８８５０に記載されている。これらの未公開出願が示すように、カスパーゼ阻害剤とＤＭＡＡの組み合わせは、全血試料などの細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の安定化に非常に有効である。しかし、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドは毒性物質である。それとは対照的に、ブタンアミドは毒性でなく、さらに、有害でも刺激性でもない。したがって、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の組み合わせを使用することによる細胞含有生体試料の安定化は、カスパーゼ阻害剤とＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの併用を超える重要な利点を有する。本発明は、毒性物質の使用を伴わない、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の効率的安定化を可能にする。
【００３９】
好ましくは、前記カスパーゼ阻害剤は、細胞透過性である。異なるカスパーゼ阻害剤の組み合わせを使用することも本発明の範囲内である。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、アポトーシスに重要な役割を果たす。個々のカスパーゼの基質選好または特異性は、カスパーゼと結合についてうまく競合するペプチドの開発に活用されている。カスパーゼ特異的ペプチドを例えばアルデヒド化合物、ニトリル化合物またはケトン化合物にカップリングさせることによりカスパーゼ活性化の可逆的または不可逆的阻害剤を生成することができる。例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫなどのフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）誘導体化ペプチドは、追加の細胞毒性効果のない有効な不可逆的阻害剤として作用する。Ｎ末端およびＯメチル側鎖にベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）を有する、合成された阻害剤は、細胞透過性増強を呈示する。Ｃ末端にフェノキシ基を有する、さらなる好適なカスパーゼ阻害剤が合成される。例はＱ−ＶＤ−ＯＰｈであり、これは、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫよりアポトーシスの防止およびしたがって安定化の支援にさらにいっそう有効である、細胞透過性の不可逆的広域カスパーゼ阻害剤である。
【００４０】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料を安定化するためにブタンアミドと併用されるカスパーゼ阻害剤は、汎カスパーゼ阻害剤であり、したがって、広域カスパーゼ阻害剤である。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む。好ましくは、前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド化合物、ニトリル化合物またはケトン化合物によって改変されている。好ましい実施形態によると、前記カスパーゼ特異的ペプチドは、Ｏ−フェノキシ（ＯＰｈ）基またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で好ましくはカルボキシル末端が修飾されている。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態では、汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを使用し、これは、競合的不可逆的ペプチド阻害剤であり、カスパーゼ−１ファミリー酵素およびカスパーゼ−３ファミリー酵素を遮断する。好ましい実施形態では、カスパーゼの広域阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰｈを安定化のために使用する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、細胞透過性であり、アポトーシスによる細胞死を阻害する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、極めて高濃度でも細胞に対して毒性でなく、アミノ酸バリンおよびアスパラギン酸にコンジュゲートされたカルボキシ末端フェノキシ基を含む。それは、カスパーゼ−９とカスパーゼ−３、カスパーゼ−８とカスパーゼ−１０、およびカスパーゼ−１２という３つの主要アポトーシス経路によって媒介されるアポトーシスの防止に等しく有効である（Ｃａｓｅｒｔａら、２００３）。本発明の教示に従って使用することができるさらなるカスパーゼ阻害剤を表１に収載する。１つの実施形態によると、細胞含有試料の安定化のために使用されるカスパーゼ阻害剤は、細胞の細胞内細胞死経路において下流に位置する１つ以上のカスパーゼ、例えばカスパーゼ−３に作用する。本発明の１つの実施形態において、前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０およびカスパーゼ−１２から成る群より選択される１つ以上のカスパーゼに対する阻害剤である。記載したように、カスパーゼ阻害剤の併用も本発明の範囲内である。
【００４１】
生体試料をブタンアミドおよび少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤（および必要に応じてさらなる添加剤）と接触させた後に得られる混合物は、カスパーゼ阻害剤（またはカスパーゼ阻害剤の組み合わせ）を少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも０．６μＭ、少なくとも０．７μＭ、少なくとも０．７５μＭ  少なくとも０．８μＭ、少なくとも０．９μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１．２５μＭ、少なくとも１．５μＭ、少なくとも１．７５μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも２．２５μＭ、２．５μＭ、少なくとも２．７５μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも３．２５μＭまたは少なくとも３．５μＭの濃度で含んでよい。もちろん、安定化効果が維持されるならば、より高い濃度も使用することができる。細胞含有生体試料およびブタンアミド（および必要に応じてさらなる添加剤）と混合するときのカスパーゼ阻害剤（単数または複数）の好適な濃度範囲としては、０．０１μＭから１００μＭ、０．１μＭから７５μＭ、０．２５μＭから５０μＭ、０．５μＭから４０μＭ、０．６μＭから３０μＭ、０．７μＭから３５μＭ、０．８μＭから３０μＭ、０．９μＭから２５μＭ、１μＭから２０μＭ、１．１μＭから１７．５μＭ、１．２５μＭから１５μＭ、または１．５μＭから１２．５μＭが挙げられるが、これらに限定されない。濃度が高いほど有効であることが判明したが、良好な安定化結果は、より低い濃度においても達成された。したがって、効率的な安定化は、例えば、０．２５μＭから１０μＭ、０．５μＭから７．５μＭ、０．７５μＭから５μＭ、または１μＭから３μＭより選択される範囲の、より低濃度においても達成される。上に挙げた濃度は、単一のカスパーゼ阻害剤の使用、ならびにカスパーゼ阻害剤の併用にも適用される。カスパーゼ阻害剤の組み合わせを使用する場合、カスパーゼ阻害剤の前記混合物に使用する個々のカスパーゼ阻害剤の濃度は、アポトーシス阻害剤の組み合せの全体の濃度が、上に挙げた特徴を満たすならば、上に挙げた濃度より下に存してもよい。試料中に存在する細胞をなお効率的に安定化するおよび／または試料中に存在する核酸の分解を低減させる、より低いカスパーゼ阻害剤濃度の使用には、安定化の費用を低下させることができるという利点がある。とりわけ、カスパーゼ阻害剤はブタンアミドと併用、および必要に応じて、本明細書に記載の１つ以上の他の安定化添加剤と併用されるので、より低い濃度を用いることができる。上述の濃度は、特に、汎カスパーゼ阻害剤、特に、改変カスパーゼ特異的ペプチド、例えば、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよび／またはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを使用するときに好適である。上述の濃度は、例えば、全血の安定化に非常に好適である。個々のカスパーゼ阻害剤のおよび／または他の細胞含有生体試料の好適な濃度範囲は、当業者が日常の実験を用いて、例えば、実施例に記載する試験アッセイで異なる濃度のそれぞれのカスパーゼ阻害剤を試験することにより決定することができる。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、有効量で、それぞれのカスパーゼ阻害剤を含有しない対照試料と比較して細胞含有生体試料におけるアポトーシスを��なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、好ましくは少なくとも７５パーセント、さらに好ましくは少なくとも８５パーセント減少または低減させる。
【００４２】
１つの実施形態によると、安定化すべき細胞含有生体試料をブタンアミドおよび式１に従う少なくとも１つの化合物
【化３】
0006407248.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
と接触させる。
【００４３】
実施例によって証明するように、上で定義の式１に従う化合物は、単独でも、またはブタンアミドに加えて使用されるときでも、安定化効果の達成に有効である。式１に従う１つ以上の化合物の混合物も安定化のためにブタンアミドに加えて使用することができる。式１に従う１つ以上の化合物をブタンアミドに加えて使用することは、安定化に必要なブタンアミドの濃度を低下させるので、有利である。これは、ブタンアミドと式１に従う化合物とを含む安定化組成物の保管安定性が、特により低温で、増加されるので、有利である。これは、大量の細胞含有生体試料、例えば血液を安定化するための少ない体積の安定化組成物の使用を可能にする。
【００４４】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料を安定化のためにブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および式１に従う少なくとも１つの化合物と接触させる。好ましくは、前記細胞含有試料は、血液試料である。１つの実施形態によると、得られる混合物には、ブタンアミドが、３％（ｗ／ｖ）以下、２．５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは２．２５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましい２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で含まれる。好適な範囲としては、例えば、０．１％から３％、０．３％から２．５％、０．５％から２％、および０．６％から１．７５％−すべて（ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００４５】
式１に従う化合物のＲ２および／またはＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基および炭化水素残基から選択される。したがって、式１に従う化合物は、第一級、第二級または第三級アミドであることができる。好ましくは式１に従う化合物は、カルボン酸アミドである。１つの実施形態によると、Ｒ２およびＲ３は、同一のまたは異なる炭化水素残基である。炭化水素残基Ｒ２および／またはＲ３は、互いに独立して、アルキル（短鎖アルキルおよび長鎖アルキルを含む）、アルケニル、アルコキシ、長鎖アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルキルシリル、アルキルシリルオキシ、アルキレン、アルケンジイル、アリーレン、カルボキシレートおよびカルボニルを含む群より選択することができる。一般的な基、例えば、アルキル、アルコキシ、アリール等を請求し、本明細書および本特許請求の範囲に記載する。好ましくは、以下の基を、本発明の範囲内の一般に記載する基の中で用いる：
（１）アルキル：好ましくは、短鎖アルキル、特に線状および分岐Ｃ１−Ｃ５アルキル、または長鎖アルキル：線状および分岐Ｃ５−Ｃ２０アルキル；
（２）アルケニル：好ましくは、Ｃ２−Ｃ６アルケニル；
（３）シクロアルキル：好ましくは、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル；
（４）アルコキシ：好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；
（５）長鎖アルコキシ：好ましくは、線状および分岐Ｃ５−Ｃ２０アルコキシ；
（６）アルキレン：好ましくは、２から１８個の炭素原子を有し、必要に応じてヘテロ原子を含有する、二価線状または分岐脂肪族、環式脂肪族または芳香族炭化水素残基、例えば、メチレン；１，１−エチレン；１，１−プロピリデン；１，２−プロピレン；１，３−プロピレン；２，２−プロピリデン；ブタン−２−オール−１，４−ジイル；プロパン−２−オール−１，３−ジイル；１，４−ブチレン；１，４−ペンチレン；１，６−ヘキシレン；１，７−へプチレン；１，８−オクチレン；１，９−ノニレン；１，１０−デシレン；１，１１−ウンデシレン；１，１２−ドセジレン；シクロヘキサン−１，１−ジイル；シクロヘキサン−１，２−ジイル；シクロヘキサン−１，３−ジイル；シクロヘキサン−１，４−ジイル；シクロペンタン−１，１−ジイル；シクロペンタン−１，２−ジイル；およびシクロペンタン−１，３−ジイルを含む群より選択されるもの；
（７）アルケンジイル：好ましくは、１，２−プロペンジイル；１，２−ブテンジイル；２，３−ブテンジイル；１，２−ペンテンジイル；２，３−ペンテンジイル；１，２−ヘキセンジイル；２，３−ヘキセンジイル；および３，４−ヘキセンジイルを含む群より選択されるもの；
（８）アルキンジイル：−Ｃ≡Ｃ−に等しいもの；
（９）アリール：好ましくは、３００Ｄａ未満の分子量を有する芳香族から選択されるもの；
（１０）アリーレン；好ましくは、１，２−フェニレン；１，３−フェニレン；１，４−フェニレン；１，２−ナフタレニレン（ｎａｐｈｔｔｈａｌｅｎｙｌｅｎｅ）；１，３−ナフタレニレン（ｎａｐｈｔｔｈａｌｅｎｙｌｅｎｅ）；１，４−ナフタレニレン（ｎａｐｈｔｔｈａｌｅｎｙｌｅｎｅ）；２，３−ナフタレニレン（ｎａｐｈｔｔｈａｌｅｎｙｌｅｎｅ）；１−ヒドロキシ−２，３−フェニレン；１−ヒドロキシ−２，４−フェニレン；１−ヒドロキシ−２，５−フェニレン；１−ヒドロキシ−２，６−フェニレンを含む群より選択されるもの；
（１１）カルボキシレート：好ましくは、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（ここでのＲは、水素；Ｃ１−Ｃ６アルキル；フェニル；Ｃ１−Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５；Ｌｉ；Ｎａ；Ｋ；Ｃｓ；Ｍｇ；Ｃａから選択される）；
（１２）カルボニル：好ましくは、基−Ｃ（Ｏ）Ｒ（ここでのＲは、水素；Ｃ１−Ｃ６アルキル；フェニル；Ｃ１−Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５およびアミン（アミドをもたらすもの）から選択され、前記アミンは、基：−ＮＲ’２（ここでの各Ｒ’は、水素；Ｃ１−Ｃ６アルキル；Ｃ１−Ｃ６アルキル−Ｃ６Ｈ５およびフェニルから独立して選択される）から選択され、ここで、両方のＲがＣ１−Ｃ６アルキルを表す場合、それらはＮＣ３からＮＣ５複素環であって、他のアルキル鎖を形成するその環のアルキル置換基を有する複素環を形成することができる）；
（１３）アルキルシリル：好ましくは、基−ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３（ここでのＲ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、水素；アルキル；長鎖アルキル；フェニル；シクロアルキル；ハロアルキル；アルコキシ；長鎖アルコキシから選択される）；
（１４）アルキルシリルオキシ：好ましくは、基−Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３（ここでのＲ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、水素；アルキル；長鎖アルキル；フェニル；シクロアルキル；ハロアルキル；アルコキシ；長鎖アルコキシから選択される）。
【００４６】
Ｒ２および／またはＲ３の鎖長ｎは、特に、値１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０を有する。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、１〜１０の炭素鎖長を有する。この場合、鎖長ｎは、詳細には、値１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０を有する。好ましくはＲ２およびＲ３は、１〜５の炭素鎖長を有し、この場合の鎖長は、詳細には、値１、２、３、４および５を有することができる。Ｒ２およびＲ３については、１または２の鎖長が特に好ましい。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、両方ともアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基である。
【００４７】
Ｒ１の鎖長ｎは、好ましくは値１、２、３、４または５を有する。Ｒ１については１または２の鎖長が特に好ましい。
【００４８】
Ｒ４は、好ましくは酸素である。
【００４９】
好ましい実施形態によると、式１に従う化合物は、カルボン酸アミドである。それは、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドであることができる。特に好ましい実施形態において、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。好ましいＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、上に記載してある。式１に従うそれぞれの化合物の使用には、さらに、細胞含有試料中の細胞内核酸、例えば、特にＲＮＡ、例えばｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ転写産物を安定化することができるという利点がある。細胞内核酸、特に、遺伝子転写産物レベルのこのさらなる安定化は、例えば、含有される細胞における標的転写産物または転写産物プロファイルの後の分析を可能にするので、有利である。１つの実施形態によると、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ，Ｎ−ジエチルホルムアミドから成る群より選択される。Ｒ４として酸素ではなく硫黄を含むそれぞれのチオ類似体も好適である。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）は、例えば良好な安定化結果を達成するが、毒性物質である。好ましくは、細胞含有生体試料を安定化するために、式１に従う化合物を、ＧＨＳ分類に従って毒性物質でないブタンアミドと併用する。
【００５０】
特に好ましい実施形態によると、細胞含有生体試料を安定化のためにブタンアミド、およびＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミドである式１に従う化合物と接触させ、好ましくは、前記試料をブタンアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドと接触させる。好ましくは、カスパーゼ阻害剤を安定化のためにさらに使用する。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミド、カスパーゼ阻害剤およびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドと接触させる。実施例で証明するように、カスパーゼ阻害剤、ブタンアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドでの血液試料などの細胞含有生体試料の安定化は、優れた安定化結果を達成する。細胞外核酸集団の安定化、ならびに細胞内核酸の安定化は、それぞれの組み合わせで達成することができる。さらに、有利なことに、ＤＭＡＡとは対照的にＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドは毒性物質として分類されない。Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドは高価な化合物であるが、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドとブタンアミド（および好ましくはさらにカスパーゼ阻害剤）の併用により、安定化のための低濃度のＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの使用が可能になり、その結果、細胞含有試料を安定化するための費用削減が可能になる。
【００５１】
細胞含有生体試料をブタンアミドおよび式１に従う化合物と接触させた場合に得られる混合物、またはそれぞれの化合物（および必要に応じてさらなる添加剤、例えば、好ましくはカスパーゼ阻害剤）の混合物は、式１に従う化合物（またはかかる化合物の混合物）を、少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％または少なくとも１．５％の濃度で含んでよい。好適な濃度範囲としては、０．１％から３０％、０．２５％から２０％、０．５％から１５％、０．７％から１０％、０．８％から７．５％、０．９％から６％、および１％から５％が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において用いる場合、百分率値で示す濃度または濃度範囲を、詳細には、液体組成物中の固体化合物、物質または組成物については体積当たりの重量（ｗ／ｖ）百分率として与え、および液体組成物中の液体化合物、物質または組成物については体積当たりの体積（ｖ／ｖ）百分率で与える。それぞれの濃度は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミド、好ましくはＮ−Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを追加の安定剤として使用するとき、特に適している。上に挙げた濃度は、例えば、全血または血液製剤、例えば血漿の安定化に非常に好適である。本発明による方法で使用するための式１に従う他の化合物および／または他の細胞含有生体試料についての好適な濃度範囲は、当業者が日常の実験を用いて、例えば、実施例に記載する試験アッセイで化合物をそれぞれその異なる濃度で試験することによって決定することもできる。
【００５２】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料を安定化のためにブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および上で定義の式１に従う少なくとも１つの化合物と接触させる。上に記載したように、好ましくは、非毒性である式１に従う化合物を使用する。非毒性剤であるＮ−Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドとの併用が特に好ましい。
【００５３】
１つの実施形態によると、安定化すべき細胞含有生体試料をブタンアミドおよび安定剤としての少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーと接触させる。
【００５４】
用語ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、詳細には、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。それは、少なくとも２つのエチレンオキシド単位を含む。低分子量および高分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーが公知である。それらの分子量は、通常、そのモノマーの分子量である４４の倍数（ｍｕｌｔｉｔｕｔｅｓ）であり、１０００００までに及ぶことができる。本明細書に記載するそれぞれの分子量は、Ｄａでのものである。ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、線状であってもよいし、または分岐していてもよく、または他の幾何形状を有してもよい。線状ポリ（オキシエチレン）ポリマーが好ましい。ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、非置換であってもよいし、置換されていてもよく、好ましくはポリエチレングリコールである。実施例で実証するように、ポリエチレングリコールは、様々な分子量で、および様々な濃度で、細胞に対する安定化効果を有し、したがって、ポリエチレングリコールをブタンアミドおよび必要に応じて他の安定剤と併用して、細胞含有試料中の細胞外核酸集団の安定化を、詳細には、細胞内核酸、例えば特にゲノムＤＮＡによる細胞外核酸集団の希釈の低減を補助することによって支援することができる。しかし、ポリエチレングリコールについて示したような安定化効果を達成する他のポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用してもよい。述べたように、安定化効果を有する置換ポリ（オキシエチレン）ポリマー、例えば、アルキルポリ（オキシエチレン）ポリマー、例えばアルキルポリエチレングリコールを使用してもよいが、ポリ（オキシエチレン）エステル、ポリ（オキシエチレン）アミン、ポリ（オキシエチレン）チオール化合物、ポリ（オキシエチレン）グリセリドなども使用してよい。安定剤として使用されるポリ（オキシエチレン）ポリマーの好ましい実施形態は、ポリエチレングリコールである。それは、好ましくは分岐しておらず、および非置換であってもよくまたは置換されていてもよい。公知置換形態のポリエチレングリコールとしては、例えば一方または両方の末端がＣ１−Ｃ５アルキル基で置換されている、アルキルポリエチレングリコールが挙げられる。好ましくは、式ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈの非置換ポリエチレングリコールを使用する。本出願においてポリ（オキシエチレン）ポリマーについて一般に記載するすべての開示は、たとえ明確に述べていなくても、好ましい実施形態ポリエチレングリコールに具体的に当てはまり、好ましい実施形態ポリエチレングリコールを特に指す。様々な分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用することができる。好ましくは、用語ポリエチレングリコールは、具体的には好ましい実施形態ポリエチレングリコールにも当てはまるポリ（オキシエチレン）ポリマーについて本明細書に好適および好ましいと明記する分子量からも明白であるように、オリゴまたはポリマーを指す。
【００５５】
ポリ（オキシエチレン）ポリマーの安定化効果とその分子量との間に相関関係を見いだした。低分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーより高分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーのほうが、より有効な安定剤であることが判明した。低分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーで安定化効果の効率的支援を達成するためには、一般に、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと比較して高い濃度が推奨される。しかし、血液試料などの一部の応用例については、安定化のために使用する添加剤の量を低く保つほうが好ましい。したがって、より高分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーは、より低濃度の当該ポリ（オキシエチレン）ポリマーの使用を可能にする上に、細胞外核酸集団に対して強い安定化効果を達成するので、複数の実施形態において安定剤として使用される。
【００５６】
したがって、１つの実施形態によると、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらなる安定剤としてブタンアミドとともに使用し、細胞含有試料と接触させる。前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、１５００から５００００、２０００から４００００、２５００から３００００、３０００から２００００、３５００から１５０００、４０００から１００００、４５００から９０００、５０００から８０００、および５５００から７０００より選択される範囲に存する分子量を有してよい。これらの分子量は、ポリエチレングリコール、特に、非置換ポリエチレングリコールの使用に特に好ましい。非置換ポリエチレングリコールを実施例でも使用した。特定の分子量を有するポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量は、当業者には周知であるように、製造条件に従ってある一定の範囲内で変動し得る。
【００５７】
高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、細胞含有試料に含有されている細胞外核酸集団の安定化を支援する濃度で使用する。当業者は、例えば、実施例に記載する試験アッセイで異なる濃度の特定の高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを試験することによって、異なる試料タイプについての好適な濃度を決定することができる。実施例によって実証するように、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、様々な濃度で有効であり、ブタンアミドの安定化効果を支援する。達成される安定化効果および好ましい濃度は、ブタンアミドに加えて１つ以上のさらなる安定剤を使用するかどうかにも依存する。好ましい組み合わせを本明細書に記載する。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させた後に得られる混合物は、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、０．０５％から４％（ｗ／ｖ）、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、０．２％から２．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から２％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．７５％（ｗ／ｖ）、および０．３５％から１．５％（ｗ／ｖ）から選択される濃度範囲で含む。１つの実施形態によると、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、より低い濃度範囲、例えば、０．２５％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３５％から１％（ｗ／ｖ）、および０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）で使用する。上記濃度範囲は、血液の安定化に特に好適である。１．５％（ｗ／ｖ）以下、１．２５％（ｗ／ｖ）以下、１％（ｗ／ｖ）以下の濃度、および特に０．７５％（ｗ／ｖ）以下の濃度での高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの使用は、ある一定の実施形態では有利である。安定剤と血液試料などの細胞含有試料とを含む得られる混合物中、ある一定のより高い濃度で高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用した複数の実施形態において、細胞外核酸の後の単離は、例えばシリカカラムの使用を含むある一定の標準的核酸単離手順を用いたとき、損なわれ得ることもあることが判明した。しかし、殆どの標準的核酸単離方法と適合性である安定化技術の使用、および広く使用されており確立されている細胞外核酸を単離するためのシリカカラムの使用は、有利である。試料を含有する安定化混合物中、１．５％（ｗ／ｖ）以下、１．２５％（ｗ／ｖ）以下、１％（ｗ／ｖ）以下または０．７５％以下の濃度での高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの使用は、かかる標準的方法を用いて、より大きな体積の安定化組成物を使用した場合でも、安定化された試料から細胞外核酸を良好な収率で効率的に単離することができることを支持する。これは、細胞外核酸集団に含まれている細胞外核酸および特に特定の標的核酸がほんの数コピーのみで存在することが多いので、有利である。実施例で実証するように、観察される障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）は、高分子量（ポリオキシエチレン）ポリマーを含有する安定化組成物の使用体積にも依存する。より小さい体積の安定化組成物の安定化への使用は、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーをより高濃度で使用した場合でもその障害を補償することができ、したがって、後の核酸単離を損なわせない。それ故、試料を含有する混合物中の高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの全体の濃度を低下させること、および／または高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含有する安定化（ｓｔａｂｉｌｓａｔｉｏｎ）組成物の体積を低減させることは、障害を低減させるまたはさらには回避するための代替選択肢である。実施例において実証されるこの体積依存効果は、有意であり、および試料を含有する混合物中のポリ（オキシエチレン）グリコールの全体の濃度は同じであるので非常に驚くべきことであった。
【００５８】
１つの実施形態によると、安定化のためにブタンアミドに加えて使用するポリ（オキシエチレン）ポリマーは１５００未満の分子量を有し、および１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであってもよい。細胞含有生体試料の細胞外核酸集団に対する安定化効果を支援することができる濃度でそれを使用する。当業者は、例えば、実施例に記載する試験アッセイにおいて異なる濃度を試験することにより、異なる試料タイプについての好適な濃度を決定することができる。それぞれのポリ（オキシエチレン）ポリマー、例えば、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、細胞含有生体試料を前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させた後に得られる混合物中に、０．５％から１０％、１．５％から９％、２％から８％、２から７％、２．５％から７％、および３％から６％から選択される濃度範囲で存在することができる。前記百分率値は、ポリ（オキシエチレン）ポリマーが固体である場合には（ｗ／ｖ）を指し、ポリ（オキシエチレン）ポリマーが液体である場合には（ｖ／ｖ）を指す。示した濃度は、血液試料の場合の使用に特に好適である。少なくとも１％、好ましくは少なくとも１．５％というより高い濃度は、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーがブタンアミドとの組み合わせで細胞外核酸集団の安定化を支援するのに有利である。１０００以下、好ましくは７００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、より大きな体積の安定化組成物を使用した場合でさえ、安定化された試料からの細胞外核酸の後の単離を実質的に妨げないので、実質的により高い濃度で使用できることが判明した。しかし、安定化効果を達成するために要する量が多すぎる場合、これは、試料の処理および取り扱いに不便であり得る。どちらかと言えば少ない量または体積の安定剤で試料を安定化することが一般に好ましい。これは、特に、例えば血液試料などのある一定の試料の場合、試料に添加することができる安定剤の量は、使用する標準採集チューブによって制限される。例えば、１０ｍＬ血液を採集するために使用される標準的な採集デバイスについては、おおよそ２ｍＬ安定剤を上限として添加することができる。
【００５９】
１つの実施形態によると、分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを、ブタンアミドに加えて、安定化のために使用する。それらは、同じ種類のものであってもよく、好ましくは、両方がポリエチレングリコール、例えば非置換ポリエチレングリコールである。１つの実施形態によると、分子量の差は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００である。この実施形態の特定の実施形態については後で詳細に記載するように、分子量が異なる２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用することは有利である。本明細書に記載するように、ポリ（オキシエチレン）ポリマーの安定化効果は、それらの分子量に依存するように見える。試験した実施例において、分子量が高いほど、安定化効率が高いことが判明した。しかし、ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、それらの分子量に依存して後の核酸単離方法に対する効果が異なることがある。上に記載したように、より高分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーの安定剤としての使用を含むある一定の実施形態において、特に、試料を含有する安定化用混合物においてより大きな体積の安定化組成物およびより高濃度のポリマーを使用する場合、ある一定の核酸単離方法での核酸の単離があまり効率的でないことが判明した。実施例によって実証するように、ある一定のシナリオで起こるかかる問題点を、分子量が異なるポリ（オキシエチレン）ポリマーの混合物を使用した場合に、克服することができる。したがって、ブタンアミドに加えて、分子量が異なる少なくとも２つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを安定化のために使用するこの実施形態は、達成される安定化効果に関して望まれる特徴と例えばある一定の下流での使用に必要とされる特徴とを有するポリ（オキシエチレン）ポリマーのバランスのとれた組成物を提供することが可能であるので、有利である。
【００６０】
１つの実施形態によると、少なくとも１５００の分子量を有する、上で定義の高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと併用し、さらに細胞含有試料を両方のタイプのポリ（オキシエチレン）ポリマーと接触させる。高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの併用は、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーによって試料の有効な安定化を達成するために要する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの濃度を低下させることが可能になるので、有利である。したがって、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、試料との混合物において、例えば、シリカカラムを伴うものなどのある一定の標準的方法を用いる、後の核酸単離を、実質的を損なわせない濃度で使用することができる。この実施形態は、使用することができる安定化組成物の体積または量に関してより大きな自由を与えるので、有利である。低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは安定化を支援するが、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーとは対照的に、試験した実施例では、それらの実施例において、より高分子量のポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ある一定の濃度および／または体積で障害効果を示した方法、例えば、シリカカラムを伴う方法を用いたとき、核酸の後の単離に対する有意な障害は認めらなかった。したがって、ブタンアミドと高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの組み合わせを使用する細胞含有試料中の細胞外核酸集団の安定化は、有利な実施形態である。前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、上に記載した高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと同じ種類のものであることができる。前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーについても、ポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールを使用することが好ましい。前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、１００から１０００、１５０から８００、１５０から７００、好ましくは２００から６００、およびさらに好ましくは２００から５００より選択される範囲に存する分子量を有してよい。
【００６１】
１つの実施形態によると、好ましくは血液である細胞含有生体試料をブタンアミドならびに高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーならびに必要に応じて安定化に用いられるさらなる添加剤と接触させた後に得られる混合物は、０．２％から１．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）の範囲、およびある一定の実施形態では０．４（ｗ／ｖ）から０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度の、３０００から４００００、好ましくは４０００から２００００、さらに好ましい４５００から１００００の範囲の分子量を有し得る高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと、１．５％から８％、好ましくは２％から７％、または２％から６％より選択される範囲に存する濃度の、２００から８００、好ましくは２００から６００の範囲に存する分子量を好ましくは有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーとを含む。前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールである。ブタンアミドについての好適な濃度は、上に記載しており、この実施形態にも適用される。細胞含有生体試料は、この実施形態では血液であってよく、その血液試料をさらに抗凝固物質と接触させる。抗凝固物質の好適な例は、上に記載してある。
【００６２】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料を、安定化のためにブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびにさらに、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤および／または上で定義の式１に従う少なくとも１つの化合物と接触させる。特に、細胞含有生体試料を、安定化のために、ブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤と接触させてもよい。必要に応じて、上で定義の式１に従う少なくとも１つの化合物を、細胞含有試料の細胞外核酸集団を安定化するためにさらに使用してもよい。上に記載したように、好ましくは、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるか、または高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの組み合わせである。高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、少なくとも１５００の分子量、さらに好ましくは２０００から４００００、さらに好ましくは３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を好ましくは有する。ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールである。
【００６３】
１つの実施形態によると、安定化すべき細胞含有生体試料を、ブタンアミド、および安定化支持剤（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としてのモノ−エチレングリコール（１，２−エタンジオール）と接触させる。特に、安定化すべき細胞含有生体試料を、ブタンアミド、モノ−エチレングリコールおよび本明細書に記載する他の化合物のいずれか１つ以上（少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、および少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および／または上で定義の式１に従う少なくとも１つの化合物を含む）と接触させてもよい。
【００６４】
安定剤の組み合わせを用いて観察される安定化効果は、単独で使用したときの個々の安定化剤のいずれについて観察される効果よりも強く、および／またはより低濃度の個々の安定剤の使用を可能にし、その結果、安定剤の組み合わせ使用を、魅力的な選択肢にする。さらに、例えば、血液試料を安定化する場合に特に有用である抗凝固物質およびキレート剤などの、さらなる添加剤を安定化のために使用することができる。
【００６５】
本発明の背景技術で論じたように、細胞外核酸は、通常、細胞含有試料の細胞外部分に「裸」で存在せず、例えば、複合体中に放出され、保護されることにより、または小胞などの中に含有されることによりある程度は安定化されている。これは、細胞外核酸が既にある程度、本来安定化されている結果であり、したがって通常は、全血、血漿または血清などの細胞含有試料中のヌクレアーゼによって急速に分解されない。したがって、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸を安定化するつもりの場合、その細胞含有生体試料を得たまたは採集した後の主な問題の１つは、採集された細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の、その細胞含有生体試料に含有されている損傷した細胞または死細胞に由来する細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡによる汚染である。これは、細胞外核酸を希釈し、さらに、細胞外核酸集団のプロファイルを変化させる。これは、血漿または血清などの細胞枯渇試料（これらは、少量の残留細胞を含むことがあったとしても「無細胞」と記載されることもある）を処理するときに問題ももたらす。本発明による安定化技術は、試料中に存在する細胞外核酸を実質的に保護し、例えば、含まれている細胞外核酸の分解を（非安定化試料と比較して、または例えば、血液の場合にはＥＤＴＡで安定化した試料と比較して、安定化期間にわたって、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％。少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％）阻害するばかりでなく、さらに、得られた細胞含有生体試料中に含有されている細胞からのゲノムＤＮＡの放出を効率的に低減させもする、および／またはそれぞれのゲノムＤＮＡの断片化を低減させもするので、この点において特に有利である。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料を安定化するためのブタンアミド、必要に応じて、しかし好ましくはカスパーゼ阻害剤、および必要に応じて、式１に従う化合物、および必要に応じて抗凝固物質の使用には、試料に含有されている細胞からのゲノムＤＮＡの放出の結果として生ずるＤＮＡの増加を非安定化試料と比較して低減させるという効果がある。１つの実施形態によると、ゲノムＤＮＡの前記放出は、非安定化試料と比較して、またはＥＤＴＡで安定化されている対応する試料（特に、血液試料または血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清の場合）と比較して、安定化期間にわたって、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、または少なくとも２０倍低減される。１つの実施形態によると、ゲノムＤＮＡの前記放出は、非安定化試料と比較して、またはＥＤＴＡで安定化されている対応する試料（特に、血液試料または血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清の場合）と比較して、安定化期間にわたって、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減される。ＤＮＡの前記放出は、例えば、本明細書における実施例セクションに記載するようにリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡを定量することによって決定することができる。実施例で証明するように、本発明の教示を用いて達成可能な安定化は、安定化期間にわたってＤＮＡのこの放出を著しく低減させる。したがって、１つの実施形態によると、ブタンアミドを必要に応じてカスパーゼ阻害剤および／または式１に従う化合物と組み合わせて達成される安定化効果は、例えば、実施例に記載する１８Ｓ  ＤＮＡアッセイで決定可能であるように、安定化された試料に含有されている細胞からのＤＮＡの放出が、安定化期間にわたって、少なくとも下方に最大１０倍、好ましくは少なくとも下方に最大７倍、さらに好ましくは少なくとも下方に最大５倍低減され、さらに好ましくは、例えば少なくとも下方に最大４倍低減される、さらに好ましくは少なくとも下方に最大３倍または２倍低減される結果となる。実施例によって証明するように、本発明の方法を用いて、少なくとも３日間の期間にわたる、および本明細書に記載の安定剤の組み合わせを用いる場合にはさらには６日までの、細胞外核酸集団の有効な安定化が達成可能である。この安定化効果は、例えば、安定化のために、好ましくはカスパーゼ阻害剤に加えて、さらにポリ（オキシエチレン）ポリマー、例えばポリエチレングリコールを使用する実施形態では、より長くなることさえ可能になる。例えば、実施例に記載する１８Ｓ  ＤＮＡアッセイで決定可能であるように、より短い保管、それぞれに安定化期間、例えば最大３日までの間、ＤＮＡ放出を少なくとも下方に最大２倍までに低減させることができる。したがって、１つの実施形態によると、本発明による安定化方法を用いると、ＤＮＡ放出を３日までの保管期間、下方に３倍以下または２倍以下低減させることができる。これは、先行技術の方法と比較して細胞外核酸集団の安定化の著しい改善である。これは、細胞外核酸を分析する任意の後の試験の精度を有意に増強する。ある一定の場合、例えば、試料材料を長距離輸送しなければならない場合、または（例えば、ある一定の国での場合であり得るように）長期間、例えば室温で保管しなければならない場合、本発明によるプロセスは、かかる期間の後、これらの試験を確実に行うことを可能にする。しかし、もちろん、所望される場合には試料をもっと前にさらに処理してもよい。必ずしも達成可能な全安定化期間を使用する必要はない。本発明を用いて、特にブタンアミドをカスパーゼ阻害剤と併用して、達成される安定化は、採集後の試料の異なる取り扱い／処理（例えば、保管条件および期間）の結果として生じ得る細胞外核酸集団の変動を低減させる。さらに、試料の架橋が起こらないような標準的方法を用いてそれぞれに安定化された試料から核酸を効率的に単離することができる。これは、細胞外核酸の分析に依存する分子分析の標準化を大きく改善する。
【００６６】
記載したように、ブタンアミドに加えてさらなる添加剤を使用してもよい。上に記載したように、ブタンアミドを好ましくはカスパーゼ阻害剤と併用する。必要に応じて、ブタンアミドに加えて、またはブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の組み合わせに加えて、式１に従う化合物を使用して、細胞含有生体試料に対する安定化効果をさらに増強することができ、および／またはブタンアミドの濃度の低下を可能にすることができる。１つの実施形態によると、併用される式１に従う化合物は、Ｎ−Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。さらに、上に記載したように、ブタンアミドに加えてポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用して、安定化効果を支援してもよい。ブタンアミドと、カスパーゼ阻害剤と、好ましくはポリエチレングリコールである少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーとの組み合わせが、特に好適である。加えて、式１に従う化合物を使用してもよい。
【００６７】
安定化効果に寄与し得る好適な添加剤の選択は、安定化すべき細胞含有試料のタイプにも依存する。例えば、細胞含有生体試料として血液を処理する場合、血液凝固を防止するために抗凝固物質を含めることが有利であり、一般的でもある。抗凝固物質は、安定化すべき血液量の凝固を防止することができる濃度で使用する。抗凝固物質は、例えば、ヘパリン、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸塩またはシュウ酸塩などのカルボン酸の塩、およびこれらの任意の組み合わせから成る群より選択してよい。有利な実施形態では、抗凝固物質はキレート剤である。キレート剤は、有機化合物であって、その有機化合物の２つ以上の原子によって金属と配位結合を形成することが可能である有機化合物である。本発明によるキレート剤としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）およびさらに例えばシトレートまたはオキサレートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によると、ＥＤＴＡを抗凝固物質として使用する。本明細書において用いる場合、用語「ＥＤＴＡ」は、とりわけ、例えばＫ２ＥＤＴＡ、Ｋ３ＥＤＴＡまたはＮａ２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡ化合物のＥＤＴＡ部分を示す。ＥＤＴＡなどのキレート剤の使用には、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼを阻害し、それによって、例えば、ヌクレアーゼによる細胞外核酸の分解を防止するという有利な効果もある。したがって、ＥＤＴＡなどのキレート剤の使用は、血液とは異なる細胞含有試料を使用する場合にも有利である。さらに、より高濃度で使用される／添加されるＥＤＴＡは安定化効果を支援することが判明した。しかし、ＥＤＴＡ単独では、本明細書に記載する目的のために十分な安定化効果を達成しない。しかし、本発明の教示と併用すると、詳細にはブタンアミド（および本明細書に記載するさらなる添加剤）と併用すると、ＥＤＴＡは、上で論じた理由で安定化効果をさらに改善することができる。
【００６８】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じて１つ以上のさらなる添加剤と接触させたときに得られる混合物中のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度は、接触ステップ後、０．１ｍＭから１００ｍＭ、０．５ｍＭから５０ｍＭ、１ｍＭから３０ｍＭ、２．５ｍＭから２５ｍＭ、５ｍＭから２０ｍＭ、および７．５ｍＭから１７．５ｍＭより成る群から選択される範囲に存する。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じて１つ以上のさらなる添加剤と接触させたときに得られる混合物中のキレート剤、好ましくはＥＤＴＡの濃度は、０．５から４０ｍｇ／ｍＬ、１から３０ｍｇ／ｍＬ、１．６から２５ｍｇ／ｍＬ、５から２０ｍｇ／ｍＬ、および７．５から１７．５ｍｇ／ｍＬより成る群から選択される範囲に存する。それぞれの濃度は、血液試料、血漿試料および／または血清試料を安定化する場合に特に有効である。当業者が好適な濃度を決定することもできる。
【００６９】
細胞含有試料の安定化をさらに支持するために、それぞれに細胞外核酸集団の保存を支持するために、さらなる添加剤を使用することもできる。それぞれの添加剤の例としては、ヌクレアーゼ阻害剤、特に、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ阻害化合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮａｓｅ阻害剤の例としては、抗ヌクレアーゼ抗体またはリボヌクレオシド−バナジル複合体が挙げられるが、これらに限定されない。安定化を支援するためのそれぞれのさらなる添加剤を選択する場合、安定化効果を弱めないおよび／または打ち消さないことに注意すべきである。したがって、例えばカオトロピック剤などの添加剤を、安定化する細胞含有生体試料に含有されている有核細胞の溶解および／もしくは分解をもたらすもしくは支援する、ならびに／または前記生体試料の無細胞画分に含有されている核酸の分解を支援する濃度で使用してはならない。それ故、好ましくは、安定化は、（ｉ）有核細胞の溶解を誘導するもしくは促進する添加剤、（ｉｉ）一般に細胞の溶解を誘導もしくは促進する添加剤、および／または（ｉｉｉ）細胞含有生体試料の無細胞画分に含有されている核酸の分解をもたらす添加剤の使用を含まない。本明細書に記載する安定化方法は、細胞溶解に基づかず、細胞を保存するので、安定化期間後に細胞含有試料から細胞を分離することができ、その結果、細胞外核酸集団を含む無細胞画分または細胞枯渇画分を得ることを可能にする。本明細書に記載するブタンアミドベースの安定化のため、前記細胞外核酸集団は、試料採集および安定化の時点で存在する細胞外核酸集団に実質的に相当するまたは少なくとも近似している。さらに、分離した細胞から核酸を単離することができ、それを分析に利用することができる。上に記載したように、式１に従う化合物を含む組み合わせは、トランスクリプトーム安定化特性も有する。好ましいと上に記載している式１に従う化合物は、汚染された細胞のトランスクリプトームの安定化に特に好適である。このために、好ましくは、少なくとも３％、少なくとも３．５％、好ましくは少なくとも４％、さらに好ましい少なくとも５％の濃度を使用して、強いトランスクリプトーム安定化効果を達成する。したがって、ブタンアミドに加えての式１に従うかかる化合物の使用を含む方法は、細胞内核酸、特にＲＮＡのさらなる安定化に好適である。細胞外核酸集団に加えてトランスクリプトームを安定化することにより、それぞれに安定化された試料は、遺伝子発現プロファイリングにも好適である。さらに、それぞれに安定化された試料は、所望される場合には、その同じ安定化された試料からの細胞外核酸集団および細胞内核酸集団の別個の分析を可能にする。
【００７０】
本明細書に開示の安定化方法は、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤などのような架橋試薬の使用に基づく細胞含有試料中の細胞外核酸集団の安定化に用いられる現行技術の安定化方法を超える有意な利点を提供する。架橋試薬は、核酸分子間のまたは核酸とタンパク質間の分子間共有結合または分子内共有結合を生じさせる。この架橋効果は、かかる安定化された試料からの核酸の後の単離を妨げることができる。例えば、全血試料中の循環核酸の濃度は既に比較的低いので、かかる核酸の収量をさらに低減させるいかなる手段も回避すべきである。これは、例えば悪性腫瘍に由来するまたは妊娠第一期の発育中の胎児に由来する非常に希少な核酸分子を検出および分析するときに特に重要であり得る。実施例によって証明するように、本発明の方法は、安定化のために架橋剤を必要としない。したがって、１つの実施形態によると、本発明による安定化方法は、タンパク質−核酸架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤の使用を含まない。詳細には、前記安定化は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤の使用を含まない。さらに、上に記載したように、１つの実施形態によると、本発明による安定化方法は、毒性物質と分類される添加剤の使用を含まない。
【００７１】
本発明の有利な実施形態では、好ましくは血液試料または血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清である細胞含有生体試料を以下のものと接触させる：
ａ）ブタンアミド、好ましくは、前記細胞含有生体試料との混合物中のブタンアミドの濃度が０．２５％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から３．５％（ｗ／ｖ）、または１％（ｗ／ｖ）から３％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度でのブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、好ましくは、前記細胞含有生体試料との混合物中のカスパーゼ阻害剤の濃度が０．５μＭから３０μＭ、さらに好ましい０．７５μＭから２５μＭ、さらに好ましい１μＭから１０μＭの範囲に存する濃度での前記カスパーゼ阻害剤；ならびに
ｃ）必要に応じて、上で定義した式１に従う少なくとも１つの化合物（好ましい実施形態、例えばＮ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、特にＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、ならびに好適および好ましい濃度は上に記載してある）、および／または
ｄ）必要に応じて、さらなる添加剤、好ましくはキレート剤、最も好ましくはＥＤＴＡ、好ましくは、前記細胞含有生体試料との混合物中のＥＤＴＡの濃度が１ｍＭから５０ｍＭ、好ましくは１．５ｍＭから２５ｍＭ、さらに好ましい２ｍＭから２０ｍＭの範囲に存する濃度でのＥＤＴＡ。
【００７２】
好ましくは、上記成分ａ）およびｂ）ならびに必要に応じてｃ）およびｄ）が安定化組成物に含まれる。
【００７３】
本発明の有利な実施形態では、好ましくは血液試料または血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清である、細胞含有生体試料を以下のものと接触させる：
ａ）ブタンアミド、好ましくは、前記細胞含有生体試料との混合物中のブタンアミドの濃度が０．２５％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から３．５％（ｗ／ｖ）、または１％（ｗ／ｖ）から３％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度のブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｃ）必要に応じて、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは、汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、好ましくは、前記細胞含有生体試料との混合物中のカスパーゼ阻害剤の濃度が０．５μＭから３０μＭ、さらに好ましい０．７５μＭから２５μＭ、さらに好ましい１μＭから１０μＭの範囲に存する濃度の前記カスパーゼ阻害剤；
ｄ）必要に応じて、上で定義した式１に従う少なくとも１つの化合物（好ましい実施形態、例えばＮ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、特にＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、ならびに好適および好ましい濃度は上に記載してある）および／または
ｅ）必要に応じて、さらなる添加剤、好ましくはキレート剤、最も好ましくはＥＤＴＡ。
【００７４】
前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、１つの実施形態によると、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば非置換ポリエチレングリコールである。好適な分子量および濃度は上に記載してあり、それについては上の開示を参照する。１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料との混合物中の前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーの濃度が、０．２％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１％（ｗ／ｖ）、または０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度でそれを使用する。１つの実施形態によると、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、少なくとも１５００の分子量、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を有する。有利な実施形態では、細胞含有試料をブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）グリコール、および少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤と接触させる。１つの実施形態によると、式１に従う化合物をさらに使用する。血液の安定化については、抗凝固物質、例えば、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡの使用を有利には用いる。
【００７５】
好ましくは、本発明の第三の態様による安定化組成物を細胞含有生体試料の安定化のために使用する。前記安定化組成物の成分を溶媒、例えば、水、緩衝液、例えば生物学的緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳなどに含めることができ、それぞれに溶解することができる。さらに、前記成分を極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してもよく、または前記安定化組成物が極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでもよい。
【００７６】
ブタンアミド、必要に応じて少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤および必要に応じて式１に従う化合物、ならびに必要に応じて存在するさらなる添加剤、例えば抗凝固物質は、細胞含有生体試料を採集するためのデバイス、好ましくは容器の中に存在することができる。少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをブタンアミドに加えて使用する場合、同じことが当てはまる。ブタンアミドおよび必要に応じて、安定化のためにさらに使用される１つ以上の化合物は、それぞれのデバイスの中に存在する安定化組成物中に存在することができ、または別々の実体（ｅｎｔｉｔｙ）として存在することができる。さらに、それらをそれぞれの採集デバイスに細胞含有生体試料の採集直前に添加することができ、またはそれらを採集デバイスに、細胞含有生体試料をそのデバイスに採集した直後に添加することができる。安定剤および必要に応じてさらなる添加剤（単数または複数）を別々に細胞含有生体試料に添加することも本発明の範囲内である。しかし、取り扱いの容易さのために、ブタンアミドおよび安定化のために使用する１つ以上のまたは任意のさらなる添加剤をそれぞれの採集デバイスに、例えば、単一組成物の形態で提供することが好ましい。しかし、それらが、採集デバイスの中に別々の成分または組成物として存在してもよい。１つの実施形態によると、ブタンアミドおよび安定化のために使用する１つ以上のまたはすべてのさらなる添加剤は、単一の安定化組成物に含有されない。有利な実施形態では、ブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および必要に応じて上記の式１に従う化合物、および必要に応じてさらなる添加剤（単数または複数）、例えばＥＤＴＡなどの抗凝固物質などが採集デバイスの中に、細胞含有生体試料を添加する前に存在する。これにより、本発明の教示に従って使用する安定剤と接触すると直ぐに細胞含有生体試料が確実に安定化される。安定剤は、採集され、それぞれに前記容器の中に含まれている細胞含有生体試料量を安定化するのに有効な量で容器の中に存在する。上で論じたように、ブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および必要に応じて上記の式１に従う化合物および必要に応じてさらなる添加剤（単数または複数）、例えばＥＤＴＡなどの抗凝固物質などは、採集デバイスの中に含まれている１組成物中に存在することができる。ブタンアミドに加えて少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用する場合、同じことが当てはまる。それぞれの採集デバイスについての好適なおよび好ましい実施形態も、本発明による第五の実施形態に関連して後で記載し、それについては前記開示を参照する。
【００７７】
好ましくは、細胞含有生体試料を、その細胞含有生体試料の採集直後および／または採集中に、ブタンアミドおよび必要に応じてさらなる添加剤と接触させる。したがって、上に記載したように、好ましくは、安定化のために使用する剤を安定化組成物の形態で提供する。好ましくは、前記安定化組成物を液体形態で提供する。それを、例えば、細胞含有生体試料が採集中に直ちに安定化されるように試料採集デバイスに予め充填することができる。１つの実施形態によると、安定化組成物を細胞含有試料と、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択される体積比で接触させる。これらの比は、血液試料の安定化に特に有用である。細胞含有試料、特に血液試料で得られる混合物中の添加剤の好適なおよび好ましい濃度は上に記載しており、それについてはそのそれぞれの開示を参照する。大きい試料体積の安定化を小さい体積の本発明による安定化組成物で達成できることが本発明の教示の特別な利点である。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２から１：７、さらに好ましくは１：３から１：５の範囲に存する。１つの実施形態によると、安定化組成物を細胞含有試料と１：１０から１：５の体積比で接触させる。この比は、例えば血液の安定化に有利である。
【００７８】
本明細書において用いる場合の用語「細胞含有生体試料」、「細胞含有試料」および類似の用語は、詳細には、少なくとも５０、２５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、または少なくとも５０００細胞を含む試料を指す。さらに、かなりより多くの細胞を含む細胞含有試料も前記用語によって包含され、本発明による教示を用いて安定化することができる。しかし、用語「細胞含有生体試料」は、それぞれの試料が残留細胞を含むことが多いので、細胞枯渇試料（例えば血漿などの一般に「無細胞」と呼ばれる細胞枯渇試料を含む）も指し、したがって前記細胞枯渇試料も包含する。少なくとも、血漿などのいわゆる「無細胞」試料であっても残留量の細胞を含み、したがって、前記「無細胞」試料が、前記残留細胞から放出される細胞内核酸で細胞外核酸集団が汚染されることになるというリスクをもたらすということを完全には排除できないことが多い。それ故、それぞれの細胞枯渇および「無細胞」試料も、１つの実施形態によると、用語「細胞含有生体試料」によって包含される。したがって、「細胞含有試料」は、例えば全血でのように、大量の細胞を含むことがあるが、しかしほんの少量の細胞しか含まないこともある。それ故、用語「細胞含有生体試料」は、細胞を含有するリスクが疑われるだけかもしれない試料または細胞を含有するリスクをもたらすかもしれない試料も包含する。上で論じたように、少量の、それぞれ残留量の細胞しか含まない生体試料、例えば血漿（血漿は、一般に無細胞である言われるが、−調製方法に依存して−通常は少ない残留量の細胞を含有する）に関しても、これらの残留細胞も、含まれている細胞外核酸の望ましくない汚染をもたらすことがあるので、本発明による方法には相当な利点がある。本発明の安定化技術の使用は、残留量の細胞しか含まない、または残留量の細胞のリスクが単に疑われる、または残留量の細胞のリスクをもたらすそれぞれの生体試料が、上でも詳細に記載しているように、効率的に安定化され、その結果、その試料に含有されている細胞外核酸集団を保存することを確実にする。１つの実施形態によると、細胞部分は、細胞含有生体試料の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％を構成する。細胞画分が４０％より多くを構成する細胞含有試料も、本明細書に記載する教示を用いて安定化することができる。本発明による安定化方法の使用には、細胞含有生体試料の組成およびその試料に含有されている細胞の数に実質的に関係なく、前記試料に含有されている細胞外核酸集団を実質的に保存する、それぞれに安定化することができ、その結果、含有されている細胞外核酸の後の単離および／または分析を標準化することが可能になるという利点がある。
【００７９】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料は、体液、および体液に由来する細胞含有試料、特に全血、血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清、バフィコート、尿、痰、涙液、リンパ液、汗、髄液、脳脊髄液、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、鼻分泌物、膣分泌物、精液／精漿、創傷分泌物、細胞培養物およびスワブ試料より成る群から選択される。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料は、体液、身体の分泌物または身体の排泄物、好ましくは、体液、最も好ましくは、尿、リンパ液、全血、バフィコート、血漿または血清である。特に、細胞含有生体試料は、循環体液、例えば、血液またはリンパ液であり得る。好ましくは、本明細書に記載する教示を用いて安定化される細胞含有生体試料は、血液試料である。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をヒトから得た。細胞含有生体試料は、細胞外部分の中の細胞外核酸を含む。本発明による方法で安定化することができる細胞含有生体試料の他の例としては、細胞外核酸を含む、細胞懸濁物、細胞培養物、細胞培養物の上清などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
１つの実施形態によると、本発明による方法は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するためのものであり、前記血液試料をブタンアミドおよび抗凝固物質と接触させるステップを含み、安定化期間中、前記血液試料に含有されている細胞からその血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される。詳細には、本発明は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、前記血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤および抗凝固物質と接触させるステップを含み、前記血液試料に含有されている有核細胞からその血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される方法を提供する。さらに、前記試料中に存在する核酸の分解がその安定化に起因して低減される。実施例で証明するように、カスパーゼ阻害剤は、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化を阻害することができる。本明細書に記載のポリ（オキシエチレン）ポリマーとの組み合わせは、これが白血球に対する安定化効果を有意に支援するので特に好ましい。詳細には、安定化の間、白血球の溶解が防止／低減される。１つの実施形態によると、前記方法は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するためのものであり、前記血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、式１に従う化合物、好ましくは第三級カルボン酸アミド、特にＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、および抗凝固物質と接触させるステップを含み、前記血液試料に含有されている細胞からその血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させる。好ましくは、前記安定化効果は、少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７８時間、達成される。１つの実施形態によると、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをブタンアミドおよびカスパーゼ阻害剤と併用する。記載したように、加えてさらなる安定剤および添加剤を使用することができる。
【００８１】
本発明による方法を用いて血液試料を安定化する場合のさらなる利点は、安定化期間中、溶血が有意に低減され得ることである。したがって、非安定化試料または標準的ＥＤＴＡ血液試料と比較して、溶血の発生は有意に少なく、防止される場合さえある。溶血は、赤血球の破裂であり、そしてそれらの細胞質の周囲の細胞外液への、例えば血漿への放出である。放出されるヘモグロビンが血清または血漿（ｐｌｅａｍｓａ）を赤色に見えるようにするので、溶血の程度を例えば目視検査によって分析することができる。インビトロ溶血の大半の原因は、検体採集に関係づけられる。しかし、インビトロ溶血は、通常、エクスビボ保管中の血液試料でも適正な安定化方法を用いないと発生する。目的の細胞外核酸によっては、溶血は相当な問題であり得る。目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、赤血球が核を含有しない、したがって、ゲノムＤＮＡを含有しないので、溶血はあまり問題にならない。それ故、溶血中に赤血球から細胞内ＤＮＡは放出されない。目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、特に、白血球の溶解または崩壊は問題である。この場合は細胞内ＲＮＡに加えてゲノムＤＮＡが放出されるからである。したがって、目的の細胞外核酸が細胞外ＤＮＡである場合、特に、白血球の溶解を防止しなければならない。白血球は、それらの安定特性が互いに異なり得る。したがって、一部のタイプの白血球は他のものより安定している。しかし、一般に、白血球は赤血球より有意に安定している。それ故、赤血球の溶解は、白血球が溶解されたことを必ずしも示すとは限らない。溶解に対する白血球および赤血球のこの異なる感受性をまた、当該技術分野において用いて、例えば、赤血球を特異的に溶解する一方で白血球を保存して例えば白血球の収集を可能にした。しかし、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、溶血およびしたがって赤血球の溶解は問題となる。成熟赤血球もＲＮＡを含有しないが、それらの前駆体（網状赤血球）は含有する。網状赤血球は、赤血球のおおよそ０．５％から１％を構成し、大量のグロビンＲＮＡを含有する。それ故、特に、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、保管中の赤血球およびしたがって網状赤血球の溶解を防止して／低減させて、細胞外核酸集団、特に細胞外ＲＮＡ集団のグロビンｍＲＮＡでの希釈を低減させるべきである。さらに、上に記載したように、本明細書に記載する安定化方法を用いて達成される細胞外核酸集団の組成およびしたがってプロファイルを維持することは、これが多くの診断応用にとって重要であるので、重要である。実施例によって証明するように、本発明による安定化方法を用いると溶血が効率的に防止／低減される。その結果、細胞外核酸集団は実質的に保存され、さらに、安定化された血液試料、特に、その安定化された血液試料から得られる血漿または血清は、溶血および一般に細胞溶解の防止に起因して、他の標準的実験室分析にも好適である。
【００８２】
上に記載したように、および実施例によって実証するように、本発明の方法の使用は、冷蔵および凍結せずに細胞含有試料の長期間の安定化を可能にする。したがって、前記試料を室温でまたはさらには上昇した温度（例えば３０℃までもしくはさらには４０℃まで）で保持することができる。１つの実施形態によると、安定化効果は、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間、さらに好ましい少なくとも４日間、達成される。１つの実施形態によると、本発明による安定化方法は、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の安定化を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から少なくとも６日および／または少なくとも２日から少なくとも７日の期間、達成する。好ましくは、前記安定化期間中、本発明による安定化方法には、試料に含有されている細胞が安定化される、試料に含有されている細胞からその試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される、および／または試料中に存在する核酸の分解が安定化に起因して低減されるという効果がある。特に、記載した安定化期間中、その安定化が、安定化期間中、安定化された生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの、その試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の希釈を低減させる。本発明による方法を用いて達成することができる安定化効果は上に詳細に記載しており、それについては上記開示を参照する。好ましくは前記安定化期間中の安定化は、その安定化期間中、安定化された試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡでの、その生体試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を低減させる。実施例で証明するように、血液試料を３日までまたはそれより長く室温で安定化することができた。６日までのまたはさらにいっそう長い室温でのより長期の保管中でさえ、ブタンアミドをカスパーゼ阻害剤および／または式１に従う化合物と併用したとき、細胞外核酸集団は（特に、非安定化試料と比較して、または例えば、ＥＤＴＡ処理などの標準的方法を用いて安定化された試料と比較して）実質的に安定化された。前記安定化効果は、たとえ経時的に減少することがあっても（これは、その細胞含有生体試料を得た源、例えばドナーにも依存し得る）、細胞外核酸の分析および／またはさらなる処理を可能にするために細胞外核酸集団の組成を保存するのになお十分なものである。したがって、本発明の方法に従って安定化された細胞含有生体試料、特に、ブタンアミドおよびカスパーゼ阻害剤で安定化された試料は、室温での長期保管後でさえ、それらの中に含有されている細胞外核酸の単離および分析になお好適であった。ブタンアミドと少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび必要に応じて少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤の併用は、細胞含有生体試料の安定性をさらにいっそう増加させ、およびそれ故、好適な保管時間をさらに有意に延長する。したがって、さらにいっそう長い保管／配送時間が考えられる。しかし、通例の保管および例えば、核酸単離および必要に応じて分析を行う研究所への配送時間は、通常は６または７日を超えず、通常は２または３日後に完了されるので、通常はより長い期間は必要ない。実施例で証明するように、この期間中、安定化効率が特に良好である。しかし、本発明による方法を用いて達成可能である長い安定化時間および安定化効率により、重要な安全係数が得られる。
【００８３】
本発明による方法およびまた後で記載する安定化組成物は、安定化のために本発明の教示に従って使用される安定剤のブタンアミドおよび記載した組み合わせが、特に組み合わせで、高活性であるので、添加する小さい体積／量の安定剤での大きな体積の細胞含有生体試料の安定化を可能にする。これは、特に、試料に含有されている細胞外核酸を単離するために自動プロセスを用いることを意図するとき、試料のサイズ／体積がその後の核酸単離手順に対して相当な制限を課すので、重要な利点である。さらに、細胞外核酸は、通常、細胞含有生体試料中に少量でしか含まれないと考えなければならない。したがって、より大きな体積の細胞含有生体試料、例えば血液試料などの処理には、より多くの細胞外核酸をその試料から単離することができ、したがって後の分析に利用できるという利点がある。
【００８４】
生体試料の安定化の直ぐ後に核酸の分析が続くこともあり、またはその安定化された試料から先ずは核酸を単離することもある。したがって、本発明の方法を用いて安定化された細胞含有生体試料を、核酸分析方法および／もしくは核酸検出方法で分析することができ、ならびに／またはさらに処理してもよい。例えば、安定化された試料から細胞外核酸を単離することができ、次いで、核酸分析方法および／もしくは核酸検出方法で分析することができ、またはさらに処理してもよい。核酸単離および分析に関する詳細は、本発明の第二の態様に関連して下に記載し、それについては前記開示を参照する。記載したように、本発明による安定化方法の１つの重要な利点は、安定化に起因して核酸の後の単離が、例えば安定化のためにホルムアミド放出剤などの架橋剤を使用する場合のようには、妨げられないことにある。
【００８５】
Ｂ．核酸単離方法
第二の態様に従って、細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）本発明の第一の態様に記載した方法に従って細胞含有試料を安定化するステップ；
ｂ）安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む方法を提供する。
【００８６】
好ましくは、前記方法は、細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するためのものであり、
ａ）本発明の第一の態様に記載した方法に従って細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するステップ；
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む。
【００８７】
上で論じたように、本発明による安定化には、試料に含有されている細胞外核酸集団が、その生体試料を得た、それぞれに採集した時点でそれが示した状態で実質的に保存されるという効果がある。詳細には、実施例で実証するように、保管／取り扱い中の、細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡ、さらに具体的には断片化ゲノムＤＮＡに起因する核酸の通常観察される大きな増加が、効率的に低減またはさらに防止される。理論に拘束されないが、本明細書に記載するブタンアミドベースの安定化は、安定化期間中、細胞を安定化し、および／または細胞の破壊を低減させ、その結果、細胞内核酸の放出を低減させると考えられる。前記方法により、所望の安定化期間の後、安定化された試料から細胞画分を分離することが可能になる。したがって、それぞれに安定化された試料から得られる細胞外核酸は、非安定化試料と比較して、分解細胞または死細胞に由来する細胞内核酸での有意に少ない汚染を含み、および特に、より少ない量の断片化ゲノムＤＮＡを含む。さらに、本明細書に記載するユニークな安定化により、回収可能な細胞外核酸の量を増加させることが可能になる。上に記載したように、本発明による安定化は、架橋剤の使用を必要としない。これは、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤などの架橋剤の使用を含む先行技術法を超える重要な利点である。なぜなら、これらの試薬は、標準的核酸単離技術を用いるとき、回収可能な細胞外核酸量を架橋のために低減させることが多いからである。対照的に、架橋剤を必要としない本発明の安定化方法は、その後の核酸単離を妨げない。したがって、本発明の方法は、細胞外核酸の診断および予後予測能を改善する。さらに、本明細書に記載する安定化により、試料に含有されている細胞を分離する前に、および／またはステップｂ）で試料に含まれている核酸を単離する前に−室温であっても−長期間、試料を保管すること、および／または取り扱うこと、例えば輸送することが可能になる。ステップａ）で行う安定化の詳細に関しては、上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。
【００８８】
１つの実施形態によると、例えば全血試料などの細胞含有生体試料を、ステップａ）で、ブタンアミドと、好ましくはカスパーゼ阻害剤である少なくとも１つのアポトーシス阻害剤と、必要に応じて、さらなる安定剤および／または添加剤とを使用して安定化する。上に記載したように、１つの実施形態によると、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを安定化のためにさらに（ａｓｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ）使用する。ステップａ）で行う本発明による安定化方法の好適なおよび好ましい実施形態は上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。安定化のためのブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤および必要に応じて式１に従う化合物の使用が特に好ましい。上に記載したように、これは、含有されている細胞のトランスクリプトームの安定化を達成することも可能にする。したがって、前記方法は、試料に含有されている細胞から細胞内核酸を単離するステップも含み得る。上に記載したように、それぞれの細胞を好ましくは前もって分離する。全血試料を安定化する場合、抗凝固物質、好ましくはキレート剤、例えばＥＤＴＡとの組み合わせが好ましい。上に記載したように、ブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、および少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤の、必要に応じて、本明細書に記載する１つ以上のさらなる添加剤と組み合わせた使用も有利である。ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、含有されている細胞の安定化を支持し、それによってゲノムＤＮＡなどの細胞内核酸の放出を防止するので、ポリ（オキシエチレン）ポリマーのさらなる使用は有利である。
【００８９】
例えば全血での場合のように、細胞含有生体試料が大量の細胞を含む場合、細胞を残りの試料から分離して、安定化された試料の無細胞の、それぞれに細胞低減または細胞枯渇画分を得、次いで、ステップｂ）においてそれらから細胞外核酸を単離する。したがって、１つの実施形態によると、ステップａ）およびステップｂ）の間に細胞含有試料から細胞を除去する。この中間ステップは、任意選択のものでしかなく、例えば、血漿もしくは血清などの少量の残留細胞しか含まない試料を処理する場合、および／または目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、もう用いられないこともある。本発明の安定化のために、含有細胞からの安定化期間中のゲノムＤＮＡの放出が低減されるか、またはさらには防止され、およびさらに、特にブタンアミドに加えてカスパーゼ阻害剤を使用すると、ゲノムＤＮＡの断片化が低減される。本明細書に記載するように、その相当大きいサイズのために、非断片化ゲノムＤＮＡをより小さい細胞外ＤＮＡと区別することができる。これにより、サイズ選択的単離プロトコルを使用することによって非断片化ゲノムＤＮＡの存在下でさえ細胞外ＤＮＡを選択的に単離することが可能になる。しかし、結果を改善するためには、ステップｂ）で細胞外核酸を単離する前にその安定化された試料から細胞（または潜在的に残存細胞）を除去して、そうしなければ核酸単離中に細胞から放出される細胞内核酸での細胞外核酸集団の汚染を低減させることが好ましい。含有細胞の除去は、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、細胞内ＲＮＡと細胞外ＲＮＡを区別することが困難であり得るため、およびさらに細胞外ＲＮＡの希釈をそれによって防止することができるので、特に有利である。しかし、目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合もステップｂ）の前の細胞枯渇ステップが一般に有利であり、したがって好ましい。なぜなら、これによりステップｂ）での標準的核酸単離手順の使用が可能になるからである。細胞含有生体試料のタイプに依存して、細胞（残留細胞を含む）を、例えば、遠心分離、好ましくは高速遠心分離によって、または遠心分離ステップを避けるべき場合には遠心分離以外の手段、例えば濾過、沈降もしくは表面への結合、例えば（必要に応じて磁性）粒子上への結合によって、分離および除去することができる。それぞれの細胞分離方法は先行技術分野において周知であり、したがって、それらを詳細に記載する必要なはい。それぞれの細胞枯渇ステップを自動試料分離プロトコルに容易に含めることもできる。それぞれに除去された細胞を、所望される場合には、さらに処理してもよい。細胞を、例えば、保管することができ、分析することができ、および／または除去された細胞から生体分子、例えば核酸もしくはタンパク質などを単離することができる。さらに、特に、式１に従う化合物、例えばＤＭＰＡを細胞含有試料の安定化のためにさらに使用すると、細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸を安定化できることが判明した。トランスクリプトームのさらなる安定化は、例えば、インビトロ診断のための重要なバイオマーカーであり得る単離された細胞内核酸中の転写産物のプロファイルの分析を可能にするので、有利である。
【００９０】
さらに、安定化された試料を処理するためのさらなる中間ステップを含めることも本発明の範囲内である。
【００９１】
ステップｂ）で、好ましくは、安定化された試料の無細胞の、それぞれに細胞枯渇画分から、例えば、安定化された細胞含有試料が血液試料である場合には上清からまたは血漿および／または血清から、細胞外核酸を単離する。細胞外核酸を単離するために、安定化された試料、それぞれに得られた細胞枯渇試料から核酸を単離するのに好適である任意の公知核酸単離方法を使用することができる。それぞれの精製方法の例としては、抽出、固相抽出、シリカベースの精製方法、磁性粒子ベースの精製、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（アニオン交換表面を使用）、電気泳動、濾過、沈殿およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、配列特異的結合を可能にする固体支持体にカップリングされた適切なプローブを使用することによって、特異的標的細胞外核酸を特異的に単離することも本発明の範囲内である。当業者に公知の任意の他の核酸単離技術も使用することができる。１つの実施形態によると、ステップｂ）でカオトロピック剤および／またはアルコールを使用して核酸を単離する。好ましくは、核酸を固相、好ましくは、シリカを含むまたはアニオン交換官能基を有する固相に結合させることによって、核酸を単離する。それぞれの方法は先行技術分野において周知であり、したがって、詳細な記載を一切必要としない。細胞外核酸を単離するために好適な方法およびキット、例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）、ならびに細胞外核酸の抽出および精製に好適な他の市販キット、も市販されている。
【００９２】
１つの実施形態によると、ステップａ）の後に得られる安定化された細胞含有試料から、または必要に応じて、安定化された細胞含有試料から中間ステップで細胞を除去した後に得られる試料から、全核酸を単離する。好ましくは、前記核酸をｔｈｅから、または安定化された試料の無細胞の、それぞれに細胞枯渇画分から単離する。例えば、全核酸を血漿または血清から単離することができ、細胞外核酸はこれらの抽出された核酸中の一部として含まれる。安定化された試料に含有されている細胞を核酸単離前に効率的に除去すると、単離された全核酸は、細胞外核酸を主として含むまたはさらには細胞外核酸から成る。
【００９３】
少なくとも主として特異的標的核酸を単離することも本発明の範囲内である。標的核酸は、例えば、ある一定のタイプの細胞外核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ミクロＲＮＡを含む）、他の非コード核酸、エピジェネティック修飾核酸、および他の核酸であることができる。例えば、標的細胞外核酸はＤＮＡであることができ、および非標的細胞外核酸はＲＮＡであることができ、その逆も同じである。ＤＮＡまたはＲＮＡの単離を特に目的にする標的特異的核酸単離方法は、先行技術分野において周知であり、したがって、本明細書での詳細な記載を一切必要としない。１つの実施形態によると、非標的核酸を特異的に破壊する適切な酵素、例えば、標的核酸がＤＮＡである場合にはＲＮａｓｅ、または標的核酸がＲＮＡである場合にはＤＮａｓｅを添加することにより、非標的核酸を破壊する。前記酵素を溶解混合物もしくは結合混合物に添加することができ、または細胞外核酸を固相に結合させた後に前記酵素を添加することができる。それぞれの非標的核酸消化ステップを行うための好適な実施形態は先行技術分野において公知であり、したがって、本明細書でのさらなる記載を一切必要としない。ＤＮＡおよびＲＮＡを固体支持体に結合させる場合に実施可能な１つの実施形態によると、標的核酸に対して選択的な溶離条件を適用して、固体支持体から標的核酸を主としておよびしたがって選択的に回収することができる。１つの実施形態によると、非標的核酸、例えばＲＮＡが結合しない条件下で標的核酸、例えばＤＮＡを固相に選択的に結合させる単離方法を用いる。好適な結合条件は、先行技術分野において周知であり、例えば、国際公開第９５／２１８４９号パンフレットに記載されている。１つの実施形態によると、非標的核酸の少なくとも一部分を適切な条件下で固相に結合させ、次いで、その固相に結合した非標的核酸を、標的細胞外核酸を含む残りの試料から分離することによって、非標的核酸を除去する。これは、例えば、主に非標的核酸、例えばＤＮＡを固相に結合させるが、非標的核酸、例えばＲＮＡは試料中に残存する条件下で好適な固相を添加し、その非標的核酸、例えばＲＮＡを別のステップでそこから回収することによって達成することができる。標的核酸から非標的核酸を選択的に除去するための好適な方法は、例えば、欧州特許第０８８０５３７号明細書および国際公開第９５／２１８４９号パンフレットに記載されており、それらは参照により本明細書に援用されている。所望される場合には、前記非標的核酸をさらに使用してもよく、例えば、固相から溶離するなど、例えば、さらに処理してもよい。しかし、それを廃棄してもよい。例えば、標的核酸の単離後にヌクレアーゼを使用して非標的核酸またはその残存物を消化することも、本発明の範囲内である。
【００９４】
用語標的核酸は、特定の種類の核酸、例えば、ある一定の疾患マーカーであることが公知である特定の細胞外核酸を指すこともある。上で論じたように、細胞外核酸の単離は、例えば、標的核酸の選択的単離を支持する適切な捕捉プローブを使用することによる、それぞれの標的核酸の特異的単離も含むことがある。
【００９５】
用語標的核酸は、ある一定の長さを有する核酸、例えば、５０００ｎｔ以下、２０００ｎｔ以下、１０００ｎｔ以下、９００ｎｔ以下、８００ｎｔ以下、７００ｎｔ以下、６００ｎｔ以下、５００ｎｔ以下、４００ｎｔ以下または３５０ｎｔ以下の長さを有する核酸を指すこともある。ある一定の最大サイズの標的核酸の単離は、本発明に関して有利であり得る。細胞外核酸が、通常、２０００ｎｔ未満、１０００ｎｔ未満および多くの場合さらには５００ｎｔ未満のサイズを有することは公知である。本明細書に示すサイズ、それぞれにサイズ範囲は、鎖長を指す。すなわち、二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡの場合、それはｂｐを指す。ステップｂ）におけるより小さい核酸の選択的単離は、単離された核酸中の得られる細胞外核酸部分を増加させることができる。本発明による安定化方法により、特に、ゲノムＤＮＡの放出の阻害および／または放出されたゲノムＤＮＡの断片化の阻害のため、より小さい細胞外核酸集団からのかかる高分子量ゲノムＤＮＡのより効率的な分離が可能になる。本発明による安定化技術を用いるとゲノムＤＮＡと細胞外核酸の間の実質的サイズ差が本質的に保存されるので、例えばサイズ選択的核酸単離プロトコルを用いて、ゲノムＤＮＡをより効率的に除去することができる。この効率的安定化のため、本明細書に記載するように安定化された試料中のゲノムＤＮＡ（通常、＞１０，０００ｂｐより大きい）と細胞外核酸（通常、＜１０００ｎｔ／ｂｐ）の間のサイズ差が通常は比較的大きいので、ある一定の標的長の核酸を選択的に単離するための公知方法を用いることができる。したがって、１つの実施形態によると、ステップｂ）は、５０００ｎｔ以下、２０００ｎｔ以下、１５００ｎｔ以下、１０００ｎｔ以下、９００ｎｔ以下、８００ｎｔ以下、７００ｎｔ以下、６００ｎｔ以下または５００ｎｔ以下の長さを有する標的核酸を選択的に単離するステップを含む。核酸のそれぞれのサイズ選択的単離を達成するために好適な方法、例えば高分子量ゲノムＤＮＡを枯渇させることによる方法は、先行技術分野において公知であり、したがって、本明細書での詳細な記載を必要としない。標的サイズのＤＮＡの古典的単離方法は、ゲルでのＤＮＡの分離、所望のゲルバンド（単数または複数）の切り出し、そしてその後のゲル断片（単数または複数）からの標的サイズのＤＮＡの単離を含む。別の広く用いられている技術は、ポリエチレングリコールベースの緩衝液でのサイズ選択的沈殿（ＬｉｓおよびＳｃｈｌｅｉｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９７５  ３月；２（３）：３８３−９）またはカルボキシル官能化ビーズ上への結合／沈殿（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９９５、第２３巻（２２）、４７４２−３；米国特許第５，８９８，０７１号明細書および米国特許第５，７０５，６２８号明細書、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒによって商品化されているもの（ＡｍＰｕｒｅ  ＸＰ；ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ）ならびに米国特許第６，５３４，２６２号明細書）である。さらに、アニオン交換基を含む固体支持体および可変ｐＨ値の使用に基づくサイズ選択的単離方法が公知である。サイズ選択的単離は、単離された細胞外核酸中の細胞内核��量を低減させるためのさらなる機会を与える。例えば、目的の標的細胞外核酸がＤＮＡである場合、核酸単離ステップｂ）中のゲノムＤＮＡの除去は、残留細胞を除去するための核酸抽出を開始する前の血漿試料の別の高ｇ−力遠心分離（ｈｉｇｈ  ｇ−ｆｏｒｃｅ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を補うまたはさらには置き換えることもできた。特にブタンアミドに加えてカスパーゼ阻害剤を使用すると、前記残留細胞から放出されるゲノムＤＮＡの大量分解が本発明による安定化のために防止され、および従って、ステップｂ）においてサイズ選択的核酸単離プロトコルを用いることにより前記非断片化または低断片化のゲノムＤＮＡを枯渇させることができる。多くの臨床検査室は、かかる高ｇ−力遠心分離を行うことが可能な遠心分離器または特に微量の残留細胞を除去するための他の手段を持っていないので、この選択肢は特に有利である。
【００９６】
次いで、ステップｃ）で好適なアッセイおよび／または分析方法を用いてそれらの単離された細胞外核酸を分析および／またはさらに処理することができる。例えば、それらを同定することができ、改変することができ、少なくとも１つの酵素と接触させることができ、増幅することができ、逆転写することができ、クローニングすることができ、配列決定することができ、プローブと接触させることができ、（それらの存在または不在を）検出することができ、および／または定量することができる。それぞれの方法が先行技術分野において周知であり、一般に、医療、診断および／または予後予測分野において細胞外核酸を分析するために応用されている（本発明の背景技術における詳細な記載も参照されたい）。したがって、細胞外核酸をステップｂ）において必要に応じて全核酸、全ＲＮＡおよび／または全ＤＮＡの一部として単離（上記参照）した後、それを分析して、例えば、多数の新生物疾患、特に、前悪性疾患および悪性疾患、例えば、様々な形態の腫瘍またはがんをはじめとする（しかしこれらに限定されない）疾患状態の存在、不在または重症度を同定することができる。例えば、単離された細胞外核酸を分析して、非侵襲性出生前遺伝子検査、それぞれにスクリーニング、疾患スクリーニング、病原体スクリーニング、腫瘍学、がんスクリーニング、早期がんスクリーニング、がん治療モニタリング、遺伝子検査（遺伝子型判定）、感染症検査、傷害診断、外傷診断、移植医療もしくは多くの他の疾患を含む（しかしこれらに限定されない）、多くの応用分野において診断および／または予後予測マーカー（例えば、胎児由来または腫瘍由来細胞外核酸）を検出することができ、したがって、単離された細胞外核酸は、診断および／または予後予測に適切なものである。１つの実施形態によると、単離された細胞外核酸を分析して、疾患または胎児の特性を同定および／または特性評価する。したがって、上で論じたように、本明細書に記載する単離方法は、核酸分析および／または処理のステップｃ）をさらに含むことがある。
【００９７】
したがって、１つの実施形態によると、単離された細胞外核酸をステップｃで分析して、疾患および／または少なくとも１つの胎児特性を同定する、検出する、スクリーニングする、モニターするまたは排除する。単離された細胞外核酸の分析／さらなる処理は、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、蛍光検出、紫外線分光法、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンシング、次世代シーケンシング、制限分析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、非対称ポリメラーゼ連鎖反応、線形後指数関数的ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応またはこれらの任意の組み合わせを含む（しかしそれらに限定されない）、任意の核酸分析／処理方法を用いて行うことができる。それぞれの技術は当業者に周知であり、したがって、ここでさらなる記載を必要としない。
【００９８】
１つの実施形態によると、本発明の教示に従って細胞含有生体試料を採集し、それぞれに安定化した後、少なくとも１日から３日まで、または２日から７日までに単離ステップｂ）および分析ステップｃ）のいずれかまたは両方を行う。本発明による方法を用いて細胞含有生体試料、特に血液試料、それぞれにそれらに含有されている細胞外核酸集団を安定化することができる好適な期間も安定化方法に関連して上に記載しており、そのそれぞれの開示はここにも適用される。１つの実施形態によると、本発明による方法に従って細胞含有生体試料を採集し安定化した少なくとも１日後、少なくとも２日後または少なくとも３日後に、核酸単離ステップｂ）を行う。
【００９９】
Ｃ．安定化組成物
さらに、本発明の第三の態様に従って、細胞含有生体試料を安定化するのに好適な組成物であって、ブタンアミドと、アポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物
【化４】
0006407248.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む組成物を提供する。
【０１００】
上で論じたように、本発明によって提供される安定化組成物、特に、ブタンアミドとアポトーシス阻害剤とを含むものは、含まれている細胞および含まれている細胞外核酸を安定化し、それによって安定化の時点に細胞外核酸集団を実質的に保存する、それぞれに安定化することにより、細胞含有生体試料、特に、血液、血漿および／または血清の安定化に特に有効である。それぞれの安定化組成物は、好ましくは全血である細胞含有生体試料の、室温での少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間またはさらにはそれより長く、その血液試料、それぞれにその試料に含有されている細胞外核酸集団の質を実質的に損なわせることなく、保管および／または取り扱い、例えば配送を可能にする。もちろん、全可能安定化期間を使用することは必須ではない。所望される場合には試料をもっと前に処理してもよい。生体試料を安定化組成物と接触させることで、含有されている細胞外核酸を単離する前、必要に応じて分析および／または処理する前に室温においてもその試料を保管すること、およびまたは取り扱うこと、例えば配送することが可能になる。したがって、細胞含有試料の採集および安定化と核酸抽出の間の時間は、その試料に含有されている集団、それぞれに細胞外核酸集団の組成に実質的な影響を及ぼすことなく変えることができる。特に、細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡでの細胞外核酸組成の希釈、それぞれに汚染を低減させ、またはさらには防止する。好ましくは、細胞含有生体試料の採集直後または採集中にその細胞含有試料と安定化組成物を接触させる。
【０１０１】
１つの実施形態によると、ブタンアミドを含む安定化組成物は、さらにカスパーゼ阻害剤を含む。カスパーゼ阻害剤とブタンアミドの併用、ならびにカスパーゼ阻害剤の好適および好ましい実施形態の使用の利点は、第一の態様による安定化方法に関連して上に詳細に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。好ましくは、前記カスパーゼ阻害剤は、汎カスパーゼ阻害剤である。好ましくは、前記カスパーゼ阻害剤は、改変カスパーゼ特異的ペプチド、好ましくはＣ末端がＯ−フェノキシ基で修飾されたもの、例えばＱ−ＶＤ−ＯＰｈである。
【０１０２】
１つの実施形態によると、前記組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。ポリ（オキシエチレン）ポリマーとブタンアミドの併用、ならびにポリ（オキシエチレン）ポリマーの好適および好ましい実施形態の使用の利点は、第一の態様による安定化方法に関連して上に詳細に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量は、例えば１００から４００００の範囲に存してよい。好ましくはポリ（オキシエチレン）ポリマーは、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである。好ましくは、ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールである。ある一定の実施形態において、前記分子量は、１５００から４００００、２０００から３００００、２５００から２５０００、３０００から２００００、３５００から１５０００、好ましくは４０００から１００００、４５００から９０００、および５０００から８０００より選択される範囲に存してよい。好ましくは、ブタンアミドと少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーとを含む前記組成物は、さらにカスパーゼ阻害剤を含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、ブタンアミドと高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーとを含む安定化組成物は、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。第一の態様による安定化方法に関連して上に記載したように、分子量の異なるポリ（オキシエチレン）ポリマーの併用は有利である。好ましくは、両方のポリ（オキシエチレン）ポリマーがポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールである。有利な実施形態によると、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む安定化組成物は、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーとして１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。詳細は、第一の態様による安定化方法に関連して上に記載してあり、それについてはそのそれぞれの開示を参照し、そのそれぞれ開示はここにも適用される。低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば、非置換ポリエチレングリコールである。低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量は、１００から１０００、１５０から８００より選択される範囲に存してよく、好ましくは、２００から６００の範囲に存する。
【０１０４】
１つの実施形態によると、ブタンアミドを含む安定化組成物は、式１に従う少なくとも１つの化合物
【化５】
0006407248.tif 000009
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基、Ｃ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である）
をさらに含む。好ましい実施形態は、安定化方法に関連して上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。式１に従う化合物は、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドであることができる。好ましくは、式１に従う少なくとも１つの化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。好ましくは、毒性物質に分類されない、式１に従う化合物を使用する。１つの実施形態によると、前記組成物は、ブタンアミドおよびＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを含む。Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドは、毒性物質に分類されない。さらに、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドには、細胞内核酸を安定化することが可能であり、特に、適切な濃度で使用すると転写産物プロファイルを安定化し得るという有利な効果がある。好ましくは、ブタンアミドと式１に従う化合物とを含む前記組成物は、さらにカスパーゼ阻害剤を含む。１つの実施形態によると、それは、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。
【０１０５】
１つの実施形態によると、安定化組成物は、ブタンアミドおよび少なくとも１つの抗凝固物質を含む。この実施形態は、血液試料または血液に由来する細胞含有試料の安定化に特に好適である。１つの実施形態によると、安定化組成物は、ブタンアミドおよびキレート剤を含む。抗凝固物質としても機能する好適なキレート剤、ならびに安定化のための好適な濃度も、本発明による方法に関連して上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。好ましくは、ＥＤＴＡを抗凝固物質として、それぞれにキレート剤として使用する。血液を安定化するために、安定化組成物は、好ましくは、ブタンアミドと、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤と、抗凝固物質と、必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物とを含む。式１に従う化合物は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。血液を安定化するために、安定化組成物は、ブタンアミドと、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤と、抗凝固物質と、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールと、必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物とを含んでよい。式１に従う化合物は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。
【０１０６】
安定化組成物は、上に記載したようなさらなる添加剤も含んでよい。
【０１０７】
アポトーシス阻害剤、特に、カスパーゼ阻害剤、式１に従う化合物および抗凝固物質の好適なおよび好ましい実施形態は、安定化方法に関連して上で詳細に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。同じことが少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーに関して適用される。さらに、安定化組成物と細胞含有生体試料とを含む安定化混合物における安定化のために使用することができる個々の剤の好適なおよび好ましい濃度は上に記載しており、当業者は、安定化組成物中の前記剤の適切な濃度を選択して、安定化組成物の所期の量を安定化する細胞含有試料の所期の量と混合するときにその混合物中の前記濃度を達成することができる。安定化組成物に関しては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。
【０１０８】
１つの実施形態によると、本発明の安定化組成物は、以下の特徴の１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、およびより好ましいすべてを有する：
ｉ）前記組成物は、ブタンアミドを５％（ｗ／ｖ）から５０％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）から３５％（ｗ／ｖ）、１２．５％（ｗ／ｖ）から３０％（ｗ／ｖ）、もしくは１５％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む、
ｉｉ）前記組成物は、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む
ｉｉｉ）前記組成物は、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ−Ｎ−ジメチルプロパンアミドを、２％から５０％、３％から４０％、３．５％から３０％、４％から２５％、４．５％から２０％、もしくは５％から１７．５％の濃度で含む、および／または
ｉｖ）前記組成物は、抗凝固物質を含む。
【０１０９】
１つの実施形態によると、本発明の安定化組成物は、以下の特徴の１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、およびより好ましいすべてを有する：
ｉ）前記組成物は、ブタンアミドを５％（ｗ／ｖ）から５０％（ｗ／ｖ）、７．５％（ｗ／ｖ）から４０％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）から３５％（ｗ／ｖ）、１２．５％（ｗ／ｖ）から３０％（ｗ／ｖ）、もしくは１５％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む、
ｉｉ）前記組成物は、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈを含む；
ｉｉｉ）前記組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは、少なくとも１５００の分子量、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；
ｉｖ）前記組成物は、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ−Ｎ−ジメチルプロパンアミドを、２％から５０％、３％から４０％、３．５％から３０％、４％から２５％、４．５％から２０％、もしくは５％から１７．５％の濃度で含む、および／または
ｖ）前記組成物は、抗凝固物質および／もしくキレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む。
【０１１０】
上に記載したように、１つの実施形態によると、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、使用するその高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーと併用する。前記さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００、または２００から６００の範囲の分子量を有する、低分子量ポリ（オキシエチレン）であってよい。詳細は、第一の態様による方法に関連して上に記載した。
【０１１１】
１つの実施形態によると、安定化組成物は液体である。
【０１１２】
１つの実施形態に従って、ブタンアミドと、好ましくはポリエチレングリコールである少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーとを含む液体の安定化組成物を提供する。続いて、血液試料の安定化に特に好ましい安定化組成物中に存在する場合の個々の剤の濃度を示す。例えば、下に示す濃度の安定剤を含む０．５ｍＬから２ｍＬ、好ましくは１ｍＬから１．５ｍＬの液体の安定化組成物を、１０ｍＬ血液を安定化するために使用することができる。１つの実施形態によると、前記組成物は、ブタンアミドおよび、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを０．４％から３５％（ｗ／ｖ）、０．８％から２５％（ｗ／ｖ）、１．５％から２０％（ｗ／ｖ）、３％から１５％（ｗ／ｖ）、および４％から１０％（ｗ／ｖ）より選択される濃度で含む。１つの実施形態によると、前記液体の安定化組成物は、ブタンアミドおよび、好ましくはポリエチレングリコールである１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを０．８％から９２．０％、３．８％から７６．７％、１１．５％から５３．７％、および１９．２％から３８．３％より選択される濃度で含む。上述の濃度は、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが液体であるか否かに依存して（ｗ／ｖ）または（ｖ／ｖ）を指す。上に記載したように、１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと併用するときに好適な濃度範囲の例としては、０．４％から３０．７％、０．８％から１５．３％、１％から１０％、１．５％から７．７％、および３．１％から５．４％より選択される濃度が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態によると、前記液体の安定化組成物は、ブタンアミドを、０．４％から３８．３％、０．８％から２３．０％、２．３％から１１．５％、および３．８％から９．２％−すべて（ｗ／ｖ）−より選択される濃度で含む。１つの実施形態によると、前記液体の安定化組成物は、カスパーゼ阻害剤を、０．１μＭから２２０μＭ、０．８μＭから１１５．０μＭ、７．７μＭから７６．７μＭ、および２３．０μＭから５０μＭより選択される濃度で含む。１つの実施形態によると、前記液体組成物は、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡ、例えばＫ２ＥＤＴＡを、９．５ｍＭから１１００ｍＭ、２０ｍＭから７５０ｍＭ、５０ｍＭから６００ｍＭ、７５ｍＭから５５０ｍＭ、１００ｍＭから５００ｍＭ、および１２５ｍＭから４５０ｍＭより選択される濃度で含む。
【０１１３】
本発明によって提供される安定化組成物は、細胞含有生体試料を安定化し、したがって、試料に含有されている有核細胞についての、および好ましくは無核細胞についても、溶解および／または破壊を誘導しない。したがって、前記安定化組成物は、添加剤を、該添加剤がそれぞれの細胞および好ましくは一般に細胞の細胞溶解を誘導または促進する濃度で含まない。例えば、実施例セクションに記載するアッセイ方法によって決定することができるように、前記安定化組成物は、試料に含まれている細胞の損傷を低減させることもある。詳細には、本明細書に記載する安定化組成物は、細胞含有生体試料に含有されている細胞からその試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させることが可能である。さらに、特にカスパーゼ阻害剤を含むとき、前記安定化組成物は、安定化された試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡの分解を低減させることが可能である。記載したように、前記安定化組成物は、安定化された生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの、その試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の汚染を低下または防止することが可能である。好ましくは、それは、安定化された試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸、特にＤＮＡおよびＲＮＡでの、その生体試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を低下または防止することが可能である。好ましくは、前記安定化組成物は、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まない。詳細には、前記安定化組成物は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドもしくはホルムアルデヒド放出剤、または同様の架橋剤を含まない。好ましくは、前記安定化組成物は、ＧＨＳに従って毒性物質に分類される剤を含まない。好ましくは、本発明の安定化組成物は、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から６日、および／または少なくとも２日から７日より選択される期間、安定化することが可能である。特に、上記安定化効果の１つ以上、好ましくはすべてが、定義された安定化期間中に達成される。
【０１１４】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、安定化剤、すなわち、ブタンアミドと、アポトーシス阻害剤（好ましくはカスパーゼ阻害剤である）、式１に従う化合物、および抗凝固物質（好ましくはキレート剤、例えばＥＤＴＡである）のうちの１つ以上と、必要に応じて溶媒および／または緩衝剤とから本質的に成る。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、１つ以上のポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。
【０１１５】
前記安定化組成物を固体形態で提供してもよいし、半液体形態で提供してもよし、または液体で提供してもよい。固体組成物は、例えば、安定化すべき細胞含有生体試料が固体を溶解するための液体（例えば、細胞含有体液、培地中の細胞、尿など）を含有する場合、または固体組成物を溶解するためにそれに液体、例えば水を添加する場合、好適な選択肢である。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体が、通常、化学的により安定していることである。しかし、液体の安定化組成物も使用してよい。液体組成物は、安定化すべき試料との混合を迅速に達成することができ、その結果、試料がその液体の安定化組成物と接触するやいなや即時安定化効果を基本的にもたらすことができるという利点を、多くの場合、有する。好ましくは、前記液体の安定化組成物中に存在する安定剤（単数または複数）は、溶解状態で安定したままであり、および使用者による前処理−例えば、限られた溶解度の沈殿物の溶解することなど−を、この種の前処理は安定化効率の変動のリスクをもたらすので、必要としない。それぞれの保管安定な液体の安定化組成物の例は、ブタンアミド、カスパーゼ阻害剤、および式１に従う化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、例えばＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを含む。それぞれの保管安定な液体の安定化組成物のさらなる例は、ブタンアミド、カスパーゼ阻害剤、および少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。
【０１１６】
本発明は、細胞含有生体試料と混合された本発明の第三の態様による安定化組成物を含む混合物も提供する。細胞含有生体試料の好適なおよび好ましい例、ならびにその細胞含有生体試料と混合するときの安定剤（単数または複数）の好適な濃度は、とりわけ本発明による安定化方法に関連して上に記載してある。それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。記載したように、好ましくは、細胞含有試料は血液試料である。
【０１１７】
１つの実施形態によると、本発明の安定化組成物は、試料を採集時または採集中に直ちに安定化するために試料採集デバイスに予め充填される。１つの実施形態によると、前記安定化組成物を細胞含有生体試料と、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択される体積比で接触させる。本発明の安定化組成物の特別な利点は、大きい試料体積の安定化を小さい体積の安定化組成物で達成することができることである。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２から１：７、さらに好ましくは１：３から１：５の範囲に存する。１つの実施形態によると、安定化組成物を細胞含有生体試料と、１：１０から１：５の体積比で接触させる。
【０１１８】
本発明の第三の態様による安定化組成物を使用して、好ましくは血液試料などの細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化することができる。少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーのさらなる使用は、特に有利である。さらに、本発明の第三の態様による安定化組成物は、試料に含有されている細胞、および／または細胞内核酸の安定化にも使用してよい。上に記載したように、前記安定化組成物は、細胞を安定させ、それによって、とりわけ、細胞含有生体試料に含まれている細胞からのゲノムＤＮＡおよび他の細胞内核酸の放出を低減することができる。それによって、ゲノムＤＮＡおよび他の細胞内核酸での細胞外核酸集団の汚染を低減させる。さらに、特に、安定化組成物が式１に従う化合物、例えば、特に、好ましいと上に記載したようなカルボン酸アミドを含む場合、トランスクリプトームを安定化することができる。
【０１１９】
Ｄ．使用
第四の態様によると、本発明は、細胞含有生体試料および特に、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための、ブタンアミドおよび好ましくは第三の態様による安定化組成物の使用に関する。特に、本発明の第一の態様による方法において安定化組成物を使用することができる。前記方法の詳細は上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。さらなる態様によると、本発明は、細胞含有生体試料中の細胞および／またはトランスクリプトームを安定化するための、第三の態様による組成物の使用に関する。好ましくは、上に記載したように、前記組成物は、細胞含有生体試料が血液である場合、抗凝固物質を含み、それは、好ましい実施形態である。
【０１２０】
Ｇ．製造方法
本発明の第三の態様による安定化組成物を製造方法であって、前記安定化組成物の成分を混合して、好ましくは、溶液をもたらす製造方法をも提供する。
【０１２１】
Ｅ．採集デバイス
本発明の安定化組成物を試料採集デバイス、特に、採血アセンブリ、例えば採血容器に組み込み、それにより、新たな有用なバージョンのかかるデバイスを提供することもできる。かかるデバイスは、典型的に、開口端と閉鎖端を有する容器を含む。前記容器は、好ましくは、採血チューブである。前記容器タイプは、採集すべき試料にも依存し、他の好適な形式は下に記載する。
【０１２２】
さらに、第五の態様に従って、本発明は、細胞含有生体試料を採集するための容器であって、ブタンアミドと、
−アポトーシス阻害剤、
−抗凝固物質および
−式１に従う化合物
【化６】
0006407248.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む容器を提供する。
【０１２３】
さらに、前記容器は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは少なくとも１つのポリエチレングリコールを含み得る。
【０１２４】
それぞれの容器、例えば試料採集チューブの提供には、試料をそれぞれの容器に採集したときのその試料が迅速に安定化されるという利点がある。細胞含有生体試料、好ましくは血液試料を採集するための容器は、本発明による安定化組成物を含み得る。安定化のためのブタンアミドおよび必要に応じて１つ以上のさらなる添加剤の使用ならびに安定化組成物に関する詳細は上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。
【０１２５】
１つの実施形態に従って、細胞含有生体試料を受け取るおよび採集するための採集容器であって、以下のものを含む容器を提供する：
ａ）ブタンアミドであって、前記細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のブタンアミドの濃度が、少なくとも０．２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．７５％（ｗ／ｖ）または少なくとも１％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも１．７５％（ｗ／ｖ）、少なくとも２％（ｗ／ｖ）または少なくとも２．５％（ｗ／ｖ）であるような濃度の、および好ましくは、前記得られる混合物が、０．２５％（ｗ／ｖ）から１５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）から１２．５％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）から９％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）から８％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）から７％（ｗ／ｖ）、１．１％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）、１．２％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）、１．３％（ｗ／ｖ）から５．５％（ｗ／ｖ）、１．４％（ｗ／ｖ）から５．２５％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）、１．７５％（ｗ／ｖ）から４．７５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）から４．５％（ｗ／ｖ）、２．２％（ｗ／ｖ）から４．２５％（ｗ／ｖ）、２．３％（ｗ／ｖ）から４％（ｗ／ｖ）、２．４％（ｗ／ｖ）から３．７５％（ｗ／ｖ）または２．５％（ｗ／ｖ）から３．５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度のブタンアミドを含むような濃度の、ブタンアミド；および
ｂ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤であって、前記細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のカスパーゼ阻害剤の濃度が、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２５μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも０．６μＭ、少なくとも０．７μＭ、少なくとも０．８μＭ、少なくとも０．９μＭｏｒ少なくとも１μＭであるような濃度の、および好ましくは、前記得られる混合物が、０．０１μＭから１００μＭ、０．１μＭから７５μＭ、０．２５μＭから５０μＭ、０．５μＭから４０μＭ、０．６μＭから３０μＭ、０．７μＭから３５μＭ、０．８μＭから３０μＭ、０．９μＭから２５μＭ、１μＭから２０μＭ、１．１μＭから１７．５μＭ、１．２５μＭから１５μＭまたは１．５μＭから１２．５μＭの範囲に存する濃度のカスパーゼ阻害剤を含むような濃度での、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤。
【０１２６】
１つの実施形態によると、前記容器は、さらに、以下のものを含む：
ｃ）式１に従う化合物、好ましくは、非毒性化合物、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドであって、前記細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中の式１に従う化合物の濃度が、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％または少なくとも１．５％であるような濃度の、および好ましくは、前記得られる混合物が、０．１％から３０％、０．２５％から２０％、０．５％から１５％、０．７％から１０％、０．８％から７．５％、０．９％から６％、または１％から５％の範囲に存する濃度の式１に従う化合物を含むような濃度の、式１に従う化合物。
【０１２７】
式１に従う化合物の好適なおよび好ましい実施形態は、安定化方法および安定化組成物に関連して上に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示はここにも適用される。実施例によって証明するように、カスパーゼ阻害剤とブタンアミドとＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドとを含む安定化組成物は、細胞含有生体試料、特に、全血試料の安定化に非常に有効である。
【０１２８】
１つの実施形態に従って、細胞含有生体試料を受け取るおよび採集するための採集容器であって、以下のものを含む容器を提供する：
ａ）ブタンアミドであって、前記細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のブタンアミドの濃度が、少なくとも０．２５％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．３％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．４％（ｗ／ｖ）、少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）または少なくとも０．７５％（ｗ／ｖ）であるような濃度の、および好ましくは前記得られる混合物が、０．１％から５％、０．２％から３．５％、０．３％から３％、０．５％から２．５％、および０．６％から２％−すべて（ｗ／ｖ）−の範囲に存する濃度のブタンアミドを含むような濃度の、ブタンアミド；および
ｂ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤であって、前記細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のカスパーゼ阻害剤の濃度が、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２５μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも０．６μＭ、少なくとも０．７μＭ、少なくとも０．８μＭ、少なくとも０．９μＭまたは少なくとも１μＭであるような濃度の、および好ましくは、前記得られる混合物が、０．０１μＭから１００μＭ、０．１μＭから７５μＭ、０．２５μＭから５０μＭ、０．５μＭから４０μＭ、０．６μＭから３０μＭ、０．７μＭから３５μＭ、０．８μＭから３０μＭ、０．９μＭから２５μＭ、１μＭから２０μＭ、１．１μＭから１７．５μＭ、１．２５μＭから１５μＭまたは１．５μＭから１２．５μＭの範囲に存する濃度のカスパーゼ阻害剤を含むような濃度の、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤；および
ｃ）少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー。
【０１２９】
ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよびまたポリ（オキシエチレン）ポリマーの組み合わせに関する好適なおよび好ましい実施形態は、上に詳細に記載しており、それについては上記開示を参照し、その上記開示もここにも適用される。１つの実施形態によると、少なくとも１５００の分子量、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを使用する。好ましくは、それは、ポリエチレングリコール、例えば非置換ポリエチレングリコールである。それは、細胞含有生体試料を容器に採集するとき、得られる混合物中のポリ（オキシエチレン）ポリマーの濃度が、０．０５％から４％（ｗ／ｖ）、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、０．２％から２．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から２％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．７５％（ｗ／ｖ）および０．３５％から１．５％（ｗ／ｖ）より選択される範囲に、好ましくは０．２５％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３５％から１％（ｗ／ｖ）または０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲に存するような濃度で、容器に含まれてよい。
【０１３０】
１つの実施形態によると、前記容器は、少なくとも１つのさらなる添加剤、好ましくは抗凝固物質、例えば、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。この実施形態は、前記容器が、血液、または血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清を採集するためのものである場合、特に好適である。前記抗凝固物質は、血液の凝固を防止することが可能である濃度で含まれる。好適な抗凝固物質は、第一の態様による方法に関連して上に記載しており、それについては上の開示を参照し、その上の開示はここにも適用される。１つの実施形態によると、前記容器は、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを、細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のキレート剤の濃度が、０．０５ｍＭから１００ｍＭ、０．１ｍＭから５０ｍＭ、０．５ｍＭから３０ｍＭ、１ｍＭから２０ｍＭ、１．５ｍＭから１５ｍＭまたは２ｍＭから１５ｍＭより選択される濃度範囲に存するような濃度で含む。１つの態様によると、前記容器は、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを、細胞含有生体試料を前記容器に採集するとき、得られる混合物中のキレート剤の濃度が、０．５から４０ｍｇ／ｍＬ、１から３０ｍｇ／ｍＬ、１．６から２５ｍｇ／ｍＬ、５から２０ｍｇ／ｍＬ、および７．５から１７．５ｍｇ／ｍＬより選択される濃度範囲に存するような濃度で含む。
【０１３１】
前記採集容器に含まれる安定化に使用した安定化組成物および／または個々の化合物を、液体；半液体、または乾燥形態で提供することができる。上で論じたように、ブタンアミド、ならびにアポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤を安定化組成物の形態で提供することができる。少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを、安定化を支持するためにブタンアミドと併用する場合、同じことが適用される。安定化のために使用する化合物を前記容器に別々の実体として提供してもよく、および異なる形態で前記容器に提供してもよい。例えば、ブタンアミドを乾燥形態で提供してもよく、その一方で式１に従う化合物を液体として提供してもよい。他の組み合わせも実施可能である。さらに、安定化組成物の形態でのブタンアミドおよび例えばアポトーシス阻害剤と、抗凝固物質および／または式１に従う化合物とを別々に容器に提供することは範囲内である。好適な処方および製造選択肢は当業者に公知である。
【０１３２】
全血を安定化するために、抗凝固物質、例えばＥＤＴＡを前記容器に、例えば安定化組成物に包含することが好ましい。乾燥形態は、例えば、安定化すべき生体試料が固体を溶解するための液体（例えば、細胞含有体液、培地中の細胞、尿など）を含有する場合、または固体を溶解するためにそれに液体、例えば水または他の溶媒を添加する場合、好適な選択肢である。固体の安定化組成物を使用する利点は、固体が、通常、化学的に液体より安定していることである。１つの実施形態によると、前記容器の内壁を本発明による安定化組成物で、またはその個々の成分、例えば抗凝固物質などで処理／被覆する。例えば噴霧乾燥法を用いて、前記組成物または成分を前記内壁に塗布することができる。液体除去技術を安定化組成物に対して実施して、実質的に固体状態の保護組成物を得ることができる。液体除去条件は、施される液体の安定化組成物の元の量の少なくとも約５０重量％、少なくとも約７５重量％、または少なくとも約８５重量％の除去をもたらすような条件であってもよい。液体除去条件は、得られる組成物が、皮膜、ゲルまたは他の実質的に固体もしくは高粘稠層の形態であるために十分な液体の除去をもたらすような条件であってもよい。例えば、それは、実質的に不動のコーティング（好ましくは、細胞含有試料（好ましくは血液製剤試料である）と接触させると再び溶解するか別様に分散させることができるコーティング）をもたらし得る。凍結乾燥または他の技術を利用して、保護剤の実質的に固体形態（例えば、１つ以上のペレット形態）を実現し得ることが可能である。したがって、液体除去条件は、考慮中の試料（例えば、全血試料）と接触させると、保護剤が試料中に分散し、その試料中の成分（例えば、細胞外核酸）を実質的に保護する材料をもたらすような条件であってもよい。液体除去条件は、実質的に結晶性のない残存組成物、その残存組成物が周囲温度で実質的に不動である十分に高い粘度を有する残存組成物、または両方をもたらすような条件であってもよい。
【０１３３】
しかし、また、液体組成物を使用してよく、液体組成物には血液の安定化に利点を有する。液体組成物には、安定化すべき細胞含有生体試料との混合を迅速に達成することができ、それによって基本的に、その試料を液体の安定化組成物と接触させるやいなや即時安定化効果をもたらすという利点が、多くの場合ある。さらに、液体組成物は、より大量の安定化組成物を使用する、したがって噴霧乾燥できないか噴霧乾燥が難しい場合、または前記組成物が乾燥組成物をもたらすことを妨げる場合に有利である。好ましくは、液体の安定化組成物中に存在する安定剤は、溶解状態で安定したままであり、および使用者による前処理−例えば、限られた溶解度の沈殿物の溶解など−を、この種の前処理は安定化効率の変動のリスクをもたらすので、必要としない。本明細書に記載するように、ブタンアミドと、式１に従う化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドと、必要に応じてカスパーゼ阻害剤、必要に応じて抗凝固物質、例えばＥＤＴＡとを含む安定化組成物は、保管安定である。特に、それは、広い温度範囲にわたって保管安定である。血液を安定化するために、１つの実施形態によると、すべての成分が安定化組成物中に存在する。上に記載したように、有利な実施形態では、安定化組成物は、好ましくはポリエチレングリコールである、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。
【０１３４】
安定化組成物は、容器に、前記容器に採集する試料量の安定化をもたらすのに有効な量で含まれる。１つの実施形態によると、液体の安定化組成物を生体試料と、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択される体積比で接触させる。１つの実施形態によると、液体の安定化組成物を生体試料と、１：１０から１：５の体積比で接触させる。大きい試料体積の安定化を小さい体積の安定化組成物で達成できることが、本発明の安定化組成物の特別な利点である。したがって、好ましくは、安定化組成物の試料に対する比は、１：２から１：７、さらに好ましい１：３から１：５の範囲に存する。
【０１３５】
１つの実施形態によると、前記容器を排気する。排気は、好ましくは、特定の体積の流体の細胞含有生体試料を内部に引き込むのに有効である。それにより、正確な量の試料を、前記容器に含まれている予め充填された量の安定化組成物と確実に接触させ、およびしたがって、安定化を確実に効率的にする。１つの実施形態によると、前記容器は、セプタムによって封止された開口端を有するチューブを含む。例えば、前記容器は、固体または液体いずれかの形態の定義された量の安定化組成物が予め充填され、定義された真空度を与えられ、セプタムで封止されている。前記セプタムは、標準的な試料採取用付属品（例えば、カニューレなど）に適合可能であるように構成される。例えばカニューレと接触したとき、前記真空度によって予め決められる試料量が前記容器内に採集される。それぞれの実施形態は、採血に特に有利である。適する容器は、例えば、米国特許第６，７７６，９５９号明細書に開示されている。
【０１３６】
本発明による容器は、ガラス製、プラスチック製、または他の好適な材料製であることができる。プラスチック材料は、酸素不透過性材料であることができ、または酸素不透過層を含有することができる。あるいは、前記容器は、通気性プラスチック材料製であることができる。本発明による容器は、好ましくは、透明材料製である。適する透明熱可塑性材料の例としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートが挙げられる。前記容器は、採集する生体試料の必要とされる体積に従って選択される好適な寸法を有し得る。上に記載したように、好ましくは、前記容器を大気圧より低い内部圧力に排気する。かかる実施形態は、全血などの体液の採集に特に好適である。前記圧力は、好ましくは、前記容器に所定体積の生体試料を引き込むように選択される。かかる真空チューブに加えて、非真空チューブ、機械式分離チューブ（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｔｕｂｅ）またはゲル―バリアチューブも、特に血液試料採集用の、試料容器として使用することができる。適する容器およびキャッピングデバイスは、米国特許第５，８６０，３９７号明細書および米国特許出願公開第２００４／００４３５０５号明細書に開示されている。細胞含有試料を採集するための容器として、さらなる採集デバイス、例えば注射器、尿採集デバイスまたは他の採集デバイスも使用することができる。容器のタイプは、採集すべき試料タイプにも依存することがあり、好適な容器も当業者に利用可能である。
【０１３７】
１つの実施形態によると、前記容器は、開口上部と、底部と、チャンバーを規定するそれらとの間に広がる側壁とを有し、ブタンアミド、ならびにアポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤、または本発明による安定化組成物がそのチャンバー内に含まれる。それは、そのチャンバー内に液体形態で含まれることもあり、または固体形態で含まれることもある。１つの実施形態によると、それは液体である。１つの実施形態によると、さらに少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールが前記チャンバー内にさらに含まれる。１つの実施形態によると、前記容器はチューブであり、その底部は、閉鎖底部であり、前記容器は、開口上部にクロージャーを備えており、前記チャンバーは、減圧下にある。前記チャンバーにおける減圧の利点は上に記載した。好ましくは、前記クロージャーは、針またはカニューレでの貫入が可能であり、指定体積の液体試料を前記チャンバーに引き込むように減圧を選択する。１つの実施形態によると、前記チャンバーは、指定体積の液体試料を前記チャンバーに引き込むように選択された減圧下にあり、前記安定化組成物は液体であり、該安定化組成物の前記指定体積の細胞含有試料に対する体積比が１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択されるように前記チャンバーの中に配置される。１つの実施形態によると、前記比は、１：１０から１：５である。付随する利点は上に記載した。
【０１３８】
好ましくは、前記容器は、患者からの採血用である。
【０１３９】
Ｆ．細胞含有試料の採集方法
第六の態様に従って、本発明の第五の態様による容器のチャンバーに患者からの細胞含有生体試料を直接採集するステップを含む方法を提供する。容器および細胞含有生体試料に関する詳細は上に記載した。それについてはそのそれぞれの開示を参照する。１つの実施形態によると、血液試料を採集し、好ましくは、それを患者から抜き取って容器に入れる。
【０１４０】
本明細書に開示する方法および組成物は、細胞含有生体試料を安定化し、例えば、細胞含有生体試料の採集後、前記生体試料に含まれている細胞に由来する細胞内核酸であって、細胞損傷、それぞれに細胞溶解に起因して放出され得る細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡで、細胞外核酸集団が汚染、特に希釈されるというリスクを低減しながら、細胞外核酸の十分な保存および単離を可能にする。本発明よる方法、ならびに組成物および開示するデバイス（例えば、採集容器）は、細胞外核酸の分解を低減することを可能にし、細胞溶解および／または細胞からのゲノム核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡの放出を低減することも可能にし、したがって本発明に従う教示により、試料に含有されている細胞外核酸は細胞内核酸で汚染されることにならず、それぞれに、それぞれの汚染が低減される。上で論じたように、細胞外核酸および細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡの混合は、生体試料中の細胞外核酸の量のあらゆる測定の精度を低下させ得る。上で論じたように、本発明の重要な利点は、試料に含有されている細胞（特に、白血球、または全血、血漿もしくは血清の場合は白血球の型）および細胞外核酸の両方を本質的に同時に安定化する可能性である。これは、ゲノムＤＮＡなどの細胞核酸が試料の無細胞部分に放出されることおよび目的の、含まれている細胞外核酸（および関連バイオマーカー）を希釈することを防止するのに役立つ。本明細書で論じるように、細胞含有生体試料、例えば全血または血漿と本発明の教示に従って使用される安定剤（単数または複数）との接触により、細胞外核酸を単離する前の期間、試料を保管することが可能になる。さらに好ましくは、細胞含有生体試料、例えば血液または血漿を安定剤（単数または複数）と接触させる場所（例えば、医療施設）で採取し、その後、核酸単離および試験プロセスのために別の遠隔地（例えば、研究所）に輸送してもよい。さらに、上に記載したように、安定剤のある一定の組み合わせは、さらに含有細胞のトランスクリプトームを安定化するのに特に有効であり、これには上記の利点がある。
【０１４１】
さらに、本明細書に開示の安定化技術は、架橋試薬、例えば、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤などの使用を含む公知の現行技術の安定化試薬を超える利点をもたらす。なぜなら、本発明による試料の安定化は、かかる架橋試薬の使用を必要としないからである。架橋試薬は、核酸分子間または核酸とタンパク質間の分子間共有結合または分子内共有結合を引き起こす。この作用は、複雑な生体試料からの精製または抽出後の、かかる安定化され、部分的に架橋された核酸の回収の低減をもたらし得る。例えば、全血試料中の循環核酸の濃度は既に比較的低いので、かかる核酸の収量をさらに低減させるいずれの手段も回避すべきである。これは、悪性腫瘍に由来するまたは妊娠第一期の発育中の胎児に由来する非常に希少な核酸分子を検出および分析するとき、特に重要であり得る。したがって、１つの実施形態によると、架橋剤、例えば、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤は、前記安定化組成物には含まれず、それぞれに、安定化のためにさらに使用されない。
【０１４２】
本発明は、本明細書に開示する例示的方法および材料により限定されず、本明細書に記載するものと同様または等価のあらゆる方法および材料を本発明の実施形態の実施および試験に使用することができる。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。本明細書において提供する表題は、本明細書を全体として参照することにより読み取ることができる本発明の様々な態様または実施形態に対する限定ではない。
【０１４３】
本明細書において用いる場合の用語「溶液」は、特に、液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。それは、１相だけの均質混合物であってもよいが、溶液が、例えば沈殿物、特に安定剤などの含有化学物質の沈殿物などの固体添加剤を含むことも、本発明の範囲内である。
【０１４４】
ヌクレオチド（ｎｔ）に関して本明細書に示すサイズ、それぞれにサイズ範囲は鎖長を指し、一本鎖分子ならびに二本鎖分子の長さを記載するために用いている。二本鎖分子の場合、前記ヌクレオチドは対合している。
【０１４５】
１つの実施形態によると、方法の場合に、ある一定のステップを含むとしてまたは組成物、溶液および／もしくは緩衝液の場合に、ある一定の成分を含むとして本明細書に記載する主題は、それぞれのステップまたは成分から成る主題を指す。本明細書に記載する好ましい実施形態を選択および組み合わせることは好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組み合わせから生ずる特定の主題も本開示に属する。
【０１４６】
特に好ましい態様および実施形態を下記に再び記載する。
【０１４７】
第一の態様において、本発明は、細胞含有生体試料をブタンアミドと接触させることによって細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法に特に関する。１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料を少なくとも１つのアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤とさらに接触させる。１つの実施形態によると、前記試料を、汎カスパーゼ阻害剤であるカスパーゼ阻害剤とさらに接触させ、好ましくは、前記汎カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、前記カスパーゼ阻害剤は、好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈである。
【０１４８】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をさらに少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーと接触させる。前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば非置換ポリエチレングリコールである。上に記載したように、前記少なくとも１つのポリマーは、１００から４００００の範囲の分子量を有し得、好適な実施形態は上に記載してある。好ましくは、前記少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるか、または高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーとの組み合わせである。前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、少なくとも１５００の分子量、さらに好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を有する。好適な濃度は上に記載してある。
【０１４９】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料を、式１に従う少なくとも１つの化合物
【化７】
0006407248.tif 000011
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
とさらに接触させる。式１に従う化合物は、好ましくは第三級カルボン酸アミドであり、およびこの場合、好ましくは、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。式１に従う化合物は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドから成る群より選択される。式１に従う化合物は、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。式１に従う化合物は、好ましくは毒性物質でない。ブタンアミドに加えて、式１に従うかかる化合物およびカスパーゼ阻害剤を使用することが特に好ましい。
【０１５０】
１つの実施形態によると、細胞含有生体試料は、血液試料、または血液に由来する試料であり、前記試料を抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡとさらに接触させる。
【０１５１】
１つの実施形態によると、前記試料に含有されている細胞を安定化し、その安定化のために、前記試料に含有されている細胞から前記試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される、および／または前記試料中に存在する核酸の分解が低減される。１つの実施形態によると、前記安定化は、安定化された生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの、その試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の汚染を安定化期間中、低減させる。１つの実施形態によると、前記安定化は、安定化された生体試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸での、その試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を安定化期間中、低減させる。
【０１５２】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、ブタンアミドを少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも１．７５％、少なくとも２％または少なくとも２．５％の濃度で含む。１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミドおよび必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、ブタンアミドを０．２５％から１５％、０．５％から１２．５％、０．７５％から１０％、１％から９％、１．２５％から８％、１．５％から７％、１．７５％から６％、１．８％から５．５％、１．９％から５．２５％、２％から５％、２．１％から４．７５％、２．２％から４．５％、２．３％から４．２５％、２．４％から４％、２．５％から３．７５％または０．７５％から２％の濃度範囲で含む。ブタンアミドについての濃度は、好ましくは（ｗ／ｖ）である。
【０１５３】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミド、カスパーゼ阻害剤、および必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、上に記載したように好ましくは汎カスパーゼ阻害剤であるカスパーゼ阻害剤を、
ｉ）少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２５μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも０．６μＭ、少なくとも０．７μＭ、少なくとも０．８μＭ、少なくとも０．９μＭまたは少なくとも１μＭの濃度で、および／または
ｉｉ）０．０１μＭから１００μＭ、０．１μＭから７５μＭ、０．２５μＭから５０μＭ、０．５μＭから４０μＭ、０．６μＭから３０μＭ、０．７μＭから３５μＭ、０．８μＭから３０μＭ、０．９μＭから２５μＭ、１μＭから２０μＭ、１．１μＭから１７．５μＭ、１．２５μＭから１５μＭまたは１．５μＭから１２．５μＭの範囲に存する濃度で
含む。
【０１５４】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミド、少なくとも１０００の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、前記少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、
ｉ）０．０５％から４％（ｗ／ｖ）、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、０．２％から２．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から２％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．７５％（ｗ／ｖ）および０．３５％から１．５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度で；および／または
ｉｉ）０．２５％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３５％から１％（ｗ／ｖ）および０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度で
含む。
【０１５５】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミド、式１に従う化合物、および必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、式１に従う化合物を、
ｉ）少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％または少なくとも１．５％の濃度で、および／または
ｉｉ）０．１％から３０％、０．２５％から２０％、０．５％から１５％、０．７％から１０％、０．８％から７．５％、０．９％から６％または１％から５％の範囲に存する濃度で
含む。
【０１５６】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料をブタンアミド、抗凝固物質、および必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤と接触させた後、得られる混合物は、好ましくはＥＤＴＡである抗凝固物質を、０．０５ｍＭから１００ｍＭ、０．０５ｍＭから５０ｍＭ、０．１ｍＭから３０ｍＭ、０．５ｍＭから２５ｍＭ、１ｍＭから２０ｍＭ、１．５ｍＭから１５ｍＭおよび２ｍＭから１０ｍＭより選択される濃度範囲で含む。
【０１５７】
１つの実施形態によると、安定化のために、前記細胞含有試料を、以下のものを含む安定化組成物：
ａ）ブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤；
ｃ）必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド；および
ｄ）必要に応じて、抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
と接触させ、および好ましくは、前記細胞含有試料を本明細書で定義するとおりの安定化組成物と接触させる。
【０１５８】
１つの実施形態によると、安定化のために、前記細胞含有試料を、以下のものを含む安定化組成物：
ａ）ブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール；
ｃ）必要に応じて、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤；
ｄ）必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド；および
ｅ）必要に応じて、抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
と接触させ、および好ましくは、前記細胞含有試料を本明細書で定義するとおりの安定化組成物と接触させる。
【０１５９】
ブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤での安定化が特に有利である。
【０１６０】
１つの実施形態によると、前記安定化は、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から６日、および／または少なくとも２日から７日から選択される期間、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団の安定化を達成する。１つの実施形態によると、前記安定化は、その安定化期間中、前記細胞含有生体試料に含有されている細胞の安定化を達成し、かつ安定化された前記試料に含まれている前記細胞からのゲノムＤＮＡの放出を低減させる。１つの実施形態によると、前記安定化は、添加剤の、前記添加剤が有核細胞の溶解を誘導または促進する濃度での使用を含まない。特に、前記安定化は、カオトロピック剤などの溶解剤の使用を含まない。１つの実施形態によると、前記安定化は、タンパク質−核酸架橋および／もしくはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤の使用を含まず、ならびに／または前記安定化は、毒性物質の使用を含まない。
【０１６１】
１つの実施形態によると、前記細胞含有生体試料は、以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）それは、体液、全血、血液に由来する試料、血漿、血清、リンパ液、尿、髄液、脳脊髄液、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、精液／精漿、スワブ／スミア、身体の分泌物、鼻分泌物、膣分泌物、創傷分泌物および排泄物ならびに細胞培養上清からなる群より選択される；
ｂ）それは細胞枯渇体液または細胞含有体液である；
ｃ）それは細胞含有体液である；
ｄ）それは循環体液である；
ｅ）それは血液、血漿、血清または尿から選択される；
ｆ）それは血液である。
【０１６２】
１つの実施形態によると、前記方法は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、前記血液試料をブタンアミドおよび抗凝固物質と接触させるステップを含み、前記血液試料に含有されている細胞から前記血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される方法である。１つの実施形態によると、前記方法は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、前記血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および抗凝固物質と接触させるステップを含み、前記血液試料に含有されている細胞から前記血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される方法である。１つの実施形態によると、前記方法は、血液試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、前記血液試料をブタンアミド、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、式１に従う少なくとも１つの化合物、および抗凝固物質と接触させるステップを含み、前記血液試料に含有されている細胞から前記血液試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出が低減される方法である。
【０１６３】
１つの実施形態によると、前記安定化は、安定化期間中、溶血を低減させる。１つの実施形態によると、ブタンアミドおよび必要に応じて安定化のために使用するさらなる添加剤が安定化組成物に含まれ、およびこの場合、安定化組成物の、指定体積の細胞含有試料に対する体積比は、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択される。１つの実施形態によると、それは１：１０から１：５である。
【０１６４】
１つの実施形態によると、安定化期間後、前記方法は、以下の１つ以上を含む
ａ）安定化された試料を核酸分析および／または検出方法に供する；
ｂ）安定化された試料から細胞外核酸を単離する；
ｃ）安定化された試料から細胞外核酸を単離し、単離された核酸を分析および／または検出する；
ｄ）安定化された試料に含まれている細胞を除去する；
ｅ）安定化された試料に含まれている細胞を除去した後、核酸の単離、分析および／または検出ステップを行う；
ｆ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離する；
ｇ）（ｉ）安定化された試料、（ｉｉ）細胞が除去された安定化された試料および／または（ｉｉｉ）試料から除去された細胞を保管する；
ｈ）安定化された試料から細胞を除去し、廃棄する；および／または
ｉ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料から除去された細胞から核酸を単離する；
ｊ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から、サイズ選択的核酸単離方法を用いて細胞外核酸を単離する。
【０１６５】
第二の態様において、本発明は、
ａ）第一の態様による方法に従って細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）その安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む、安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法に特に関する。
【０１６６】
特に、前記第二の態様は、
ａ）第一の態様による細胞外核酸集団を安定化するための方法に従って細胞含有試料中の細胞外核酸集団を安定化するステップ；および
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む、安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法を提供する。
【０１６７】
１つの実施形態によると、前記方法は、ステップａ）およびステップｂ）の間に細胞含有生体試料から細胞を除去するステップを含み、ステップｂ）は、安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離するステップを含む。１つの実施形態によると、前記方法は、以下のステップの１つ以上の実施を含む：
ａ）安定化された試料を核酸分析および／または検出方法に供する；
ｂ）安定化された試料から細胞外核酸を単離する；
ｃ）安定化された試料から細胞外核酸を単離し、単離された核酸を分析および／または検出する；
ｄ）安定化された試料に含まれている細胞を除去する；
ｅ）安定化された試料に含まれている細胞を除去した後、核酸の単離、分析および／または検出ステップを行う；
ｆ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離する；
ｇ）（ｉ）安定化された試料、（ｉｉ）細胞が除去された安定化された試料および／または（ｉｉｉ）試料から除去された細胞を保管する；
ｈ）安定化された試料から細胞を除去し、廃棄する；および／または
ｉ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料から除去された細胞から核酸を単離する；
ｊ）安定化された試料から細胞を除去し、その安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から、サイズ選択的核酸単離方法を用いて細胞外核酸を単離する。
【０１６８】
１つの実施形態によると、前記細胞含有試料は血液試料であり、この場合、ステップａ）での安定化は、第一の態様による方法について定義したとおりに行う。
【０１６９】
１つの実施形態によると、前記単離された細胞外核酸をさらなるステップｃ）において処理および／または分析し、ならびに好ましくは、
ｉ）改変する；
ｉｉ）少なくとも１つの酵素と接触させる；
ｉｉｉ）増幅する；
ｉｖ）逆転写する；
ｖ）クローニングする；
ｖｉ）配列決定する；
ｖｉｉ）プローブと接触させる；
ｖｉｉｉ）検出する；
ｉｘ）定量する；および／または
ｘ）同定する。
【０１７０】
１つの実施形態によると、ステップｂ）で単離される細胞外核酸集団は、以下の特徴の１つ以上を有する：
ｉ）それは単離される全核酸の一部分として含まれる；
ｉｉ）それはＤＮＡとＲＮＡの混合物である；
ｉｉｉ）それは主としてＤＮＡを含む；
ｉｖ）それは主としてＲＮＡを含む；
ｖ）それは哺乳動物細胞外核酸を含む；
ｖｉ）それは循環細胞外核酸を含む；
ｖｉｉ）それは疾患関連核酸を含む；
ｖｉｉｉ）それは腫瘍関連核酸または腫瘍由来核酸を含む；
ｉｘ）それは炎症関連核酸を含む；
ｘ）それはウイルス核酸を含む；
ｘｉ）それは病原体核酸を含む；および／または
ｘｉｉ）それは胎児核酸を含む。
【０１７１】
１つの実施形態によると、ステップｃ）で分析されるおよび／またはさらに処理される、好ましくは検出される細胞外核酸は、次の特徴と１つ以上を有する：
ｉ）それはＤＮＡである；
ｉｉ）それはＲＮＡである；
ｉｉｉ）それは哺乳動物細胞外核酸である；
ｉｖ）それは循環細胞外核酸である；
ｖ）それは疾患関連核酸である；
ｖｉ）それは腫瘍関連核酸または腫瘍由来核酸である；
ｖｉｉ）それは炎症関連核酸である；
ｖｉｉｉ）それはウイルス核酸である；
ｉｘ）それは病原体核酸である；
ｘ）それは胎児核酸である。
【０１７２】
第三の態様において、本発明は、細胞含有生体試料を安定化するのに好適な組成物であって、ブタンアミドと、アポトーシス阻害剤、抗凝固物質および式１に従う化合物
【化８】
0006407248.tif 000012
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
から成る群より選択される少なくとも１つのさらなる添加剤とを含む組成物に特に関する。
【０１７３】
１つの実施形態によると、前記組成物は、アポトーシス阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤を含む。１つの実施形態によると、前記組成物は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される汎カスパーゼ阻害剤を含み、およびこの場合、前記カスパーゼ阻害剤は、さらに好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈである。
【０１７４】
１つの実施形態によると、前記組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含む。上に記載したように、好ましくは、前記少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、または高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの組み合わせである。前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、好ましくは、ポリエチレングリコール、例えば非置換ポリエチレングリコールである。前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、少なくとも１５００の分子量、さらに好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい３０００から２００００、または４５００から１００００の範囲の分子量を好ましくは有する。好ましくは、前記組成物は、カスパーゼ阻害剤をさらに含む。
【０１７５】
１つの実施形態によると、前記組成物は、式１に従う少なくとも１つの化合物
【化９】
0006407248.tif 000013
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
を含む。式１に従う化合物は、好ましくは第三級カルボン酸アミドであり、およびこの場合、好ましくは、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。式１に従う化合物は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドから成る群より選択される。式１に従う化合物は、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。式１に従う化合物は、好ましくは毒性物質でない。好ましくは、式１に従う化合物をカスパーゼ阻害剤およびブタンアミドと併用する。１つの実施形態によると、前記組成物は、少なくとも１つの抗凝固物質、好ましくはキレート剤を含む。
【０１７６】
１つの実施形態によると、前記組成物は、以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）それは、細胞を安定させること、および細胞含有生体試料に含有されている細胞からその試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させることが可能である；
ｂ）それは、安定化された試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡの分解を低減させることが可能である；
ｃ）それは、安定化された試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの、その生体試料に含まれている細胞ＤＮＡ集団の汚染を低減または防止することが可能である；
ｄ）それは、安定化された生体試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸での、その試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を低減または防止することが可能である；
ｅ）前記安定化組成物は、添加剤を、前記添加剤が細胞溶解を誘導または促進する濃度で含まない；
ｆ）前記安定化組成物は、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まない；
ｇ）前記安定化組成物は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、またはホルムアルデヒド放出剤を含まない；
ｈ）前記安定化組成物は、毒性物質を含まない；および／または
ｉ）それは、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を、冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも２日から３日、少なくとも２日から６日、および／または少なくとも２日から７日より選択される期間、安定化することが可能である。
【０１７７】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、安定化するべき所期の量の細胞含有生体試料（好ましくは血液である）と混合したときに、得られる混合物が、
−  ブタンアミドを、ｉ）少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも１．７５％、少なくとも２％もしくは少なくとも２．５％の濃度で、および／またはｉｉ）０．２５％から１５％、０．５％から１２．５％、０．７５％から１０％、１％から９％、１．２５％から８％、１．５％から７％、１．７５％から６％、１．８％から５．５％、１．９％から５．２５％、２％から５％、２．１％から４．７５％、２．２％から４．５％、２．３％から４．２５％、２．４％から４％、２．５％から３．７５％または０．７５％から２％の濃度範囲で；
−  カスパーゼ阻害剤を、存在する場合、ｉ）少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２５μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも０．６μＭ、少なくとも０．７μＭ、少なくとも０．８μＭ、少なくとも０．９μＭもしくは少なくとも１μＭの濃度で、および／またはｉｉ）０．０１μＭから１００μＭ、０．１μＭから７５μＭ、０．２５μＭから５０μＭ、０．５μＭから４０μＭ、０．６μＭから３０μＭ、０．７μＭから３５μＭ、０．８μＭから３０μＭ、０．９μＭから２５μＭ、１μＭから２０μＭ、１．１μＭから１７．５μＭ、１．２５μＭから１５μＭまたは１．５μＭから１２．５μＭの範囲に存する濃度で；
−  式１に従う化合物を、存在する場合、ｉ）少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７５％、少なくとも１％、少なくとも１．２５％もしくは少なくとも１．５％の濃度で、および／またはｉｉ）０．１％から３０％、０．２５％から２０％、０．５％から１５％、０．７％から１０％、０．８％から７．５％、０．９％から６％、もしくは１％から５％の範囲に存する濃度で；および／または
−  抗凝固物質を、存在する場合、０．０５ｍＭから１００ｍＭ、０．０５ｍＭから５０ｍＭ、０．１ｍＭから３０ｍＭ、０．５ｍＭから２５ｍＭ、１ｍＭから２０ｍＭ、１．５ｍＭから１５ｍＭ、および２ｍＭから１０ｍＭより選択される濃度範囲で
含む濃度で、前記安定化剤を含む。
【０１７８】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、安定化するべき所期の量の細胞含有生体試料（好ましくは血液である）と混合したとき、得られる混合物が、ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、ｉ）０．０５％から４％（ｗ／ｖ）、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、０．２％から２．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から２％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．７５％（ｗ／ｖ）および０．３５％から１．５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度で；ならびに／または、ｉｉ）０．２５％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３５％から１％（ｗ／ｖ）および０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）の範囲に存する濃度で含む濃度で、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。
【０１７９】
１つの実施形態によると、前記組成物は、以下の特徴の１つ以上を有する；
ｉ）前記組成物は、ブタンアミドを５％から５０％、７．５％から４０％、１０％から３５％、１２．５％から３０％、または１５％から２５％の濃度で含む、
ｉｉ）前記組成物は、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む、
ｉｉｉ）前記組成物は、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ−Ｎ−ジメチルプロパンアミドを、２％から５０％、３％から４０％、３．５％から３０％、４％から２５％、４．５％から２０％、または５％から１７．５％の濃度で含む、および／または
ｉｖ）前記組成物は、抗凝固物質を含む。
【０１８０】
１つの実施形態によると、前記組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。
【０１８１】
１つの実施形態によると、前記組成物を固体形態、半液体形態、または液体形態で提供する。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、細胞含有生体試料との混合物として存在し、およびこの場合、前記細胞含有生体試料は、以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）それは、体液、全血、血液に由来する試料、血漿、血清、リンパ液、尿、髄液、脳脊髄液、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、精液／精漿、スワブ／スミア、身体の分泌物、鼻分泌物、膣分泌物、創傷分泌物および排泄物ならびに細胞培養上清からなる群より選択される；
ｂ）それは細胞枯渇体液または細胞含有体液である；
ｃ）それは細胞含有体液である；
ｄ）それは循環体液である；
ｅ）それは血液、血漿、血清または尿から選択される；
ｆ）それは血液である。
【０１８２】
特に、前記混合物は、上で定義の濃度の特徴の１つ以上を有する。さらに、前記安定化組成物の、指定体積の細胞含有試料に対する体積比は、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、および１：２から１：５より選択される。１つの実施形態によると、それは１：１０から１０：１である
【０１８３】
第四の態様において、本発明は、細胞含有生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するための本発明の第三の態様による組成物の使用に特に関する。１つの実施形態によると、前記組成物は抗凝固物質を含み、およびこの場合、前記細胞含有生体試料は血液である。１つの実施形態によると、前記組成物を本発明の第一または第二の態様による方法で使用する。
【０１８４】
第五の態様において、本発明は、細胞含有生体試料、好ましくは血液、血漿または血清試料の採集に好適な容器であって、前記細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するのに好適な安定化組成物を含み、前記安定化組成物がブタンアミドを含むものである容器に特に関する。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、
ａ）少なくとも１つのアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤；および／または
ｂ）式１に従う少なくとも１つの化合物
【化１０】
0006407248.tif 000014
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）；および／または
ｃ）抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む。
【０１８５】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくはポリエチレングリコールを含む。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、ブタンアミド、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーおよびアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤を含む。
【０１８６】
式１に従う化合物は、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。前記アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）阻害剤は、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤であり、前記汎カスパーゼ阻害剤は、好ましくは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、およびさらに好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈである。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、
ａ）ブタンアミド；
ｂ）少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤；
ｃ）必要に応じて、式１に従う少なくとも１つの化合物、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボン酸アミド、さらに好ましいＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド；および
ｄ）必要に応じて、抗凝固物質、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
を含む。
【０１８７】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物または前記容器は、タンパク質−核酸架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まず；および／またはこの場合、前記安定化組成物または前記容器は、毒性物質を含まない。１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、本発明の第三の態様による組成物である。１つの実施形態によると、前記容器は、本発明の他の態様について本明細書中で定義したとおりの特徴の１つ以上を有する。
【０１８８】
第六の態様において、本発明は、本発明の第五の態様による容器のチャンバーへの、患者からの試料を採集するステップを含む方法に関する。
【０１８９】
【表１−１】
0006407248.tif 000015
【表１−２】
0006407248.tif 000016
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
0006407248.tif 000020
【表１−７】
0006407248.tif 000021
【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
0006407248.tif 000038
【表１−２５】
0006407248.tif 000039
【実施例】
【０１９０】
以下の実施例は、単に例証を目的とするものであり、いかなる点においても本発明を限定するものと解釈すべきでないことを理解されたい。
【０１９１】
いつかの異なる化合物を、単独での、またはカスパーゼ阻害剤および／もしくは式１に従う異なる化合物と組み合わせての、細胞含有生体試料、ここでは全血試料、を安定化するそれらの能力について試験した。リファレンス試料（ＥＤＴＡで安定化した血液）と比較して、ブタンアミド（ＢＡ）は、血液試料を効率的に安定化できることは判明し、詳細には、安定化された血液試料に含まれている細胞から細胞外核酸集団へのゲノムＤＮＡの放出を阻害することが判明した。さらに、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の併用は、達成される安定化効果を有意に改善することが判明した。詳細には、安定化のためのブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の併用は、長期安定化効果をもたらし、およびさらに、異なるドナーから得た血液試料で達成される安定化効果に関してより少ない変動を示した。その併用が血液試料の均一で信頼性のある安定化方法を提供するので、これは重要な利点である。
【０１９２】
実施例１
実施例１では、ＥＤＴＡで安定化した血液試料に対する単独でのまたはカスパーゼ阻害剤と組み合わせてのブタンアミドの安定化効果を試験し、リファレンスとしてのＥＤＴＡで安定化した血液と比較した。
【０１９３】
採血および血液安定化
２名の異なるドナーからの血液を１０ｍＬ  Ｋ２  ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）に採集した。４．５ｍＬのそれぞれに採集した血液を０．９ｍＬの２つの異なる安定化溶液ＡおよびＢと混合した。前記安定化溶液は、（１ｍＬの安定化溶液あたり）以下のものを含有した：
【０１９４】
Ａ：水中３４．２ｍｇ  Ｋ２  ＥＤＴＡおよび０．１５ｇまたは０．１８ｇのブタンアミド。安定化溶液Ａを使用したとき、血液／安定化混合物中、次の最終濃度を得た：７．２ｍｇ  Ｋ２  ＥＤＴＡ／ｍＬおよび２．５％（ｗ／ｖ）または３％（ｗ／ｖ）ブタンアミド。
【０１９５】
Ｂ：３４．２ｍｇ  Ｋ２  ＥＤＴＡ、０．１８ｇ  ブタンアミドおよび１．２μＬ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）溶液（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）。安定化溶液Ｂを使用したとき、血液／安定化混合物中、次の最終濃度を得た：７．２ｍｇ  Ｋ２  ＥＤＴＡ／ｍＬ、３％（ｗ／ｖ）ブタンアミドおよび１μＭ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）。
【０１９６】
すべての安定化された血液試料を、条件および試験時点ごとに三重反復で用意した。安定化溶液と血液を混合した直後の時点０（リファレンス）で、血漿を生成し、循環細胞外ＤＮＡを抽出した。残りの安定化された血液試料を３日間および６日間、室温で保管した。
【０１９７】
リファレンス対照として、ＥＤＴＡで安定化した血液試料（さらなる添加剤なしでＫ２  ＥＤＴＡチューブに採集したもの）も３日間および６日間、保管した。
【０１９８】
細胞外核酸単離および分析
血液が入っているチューブを４回反転させることによって、安定化血液試料および非安定化（ＥＤＴＡ）血液試料から血漿を生成した。次いで、それらのチューブを１０分間、１９００×ｇで、４℃で遠心分離した。２．５ｍＬの血漿画分を新鮮な１５ｍＬファルコンチューブに移し、１０分間、１６，０００×ｇで、４℃で遠心分離した。２ｍＬのそれぞれに清澄化された血漿を、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ）をその製造業者の指示にしたがって使用する細胞外核酸単離に使用した。
【０１９９】
単離された細胞外ＤＮＡを、異なる断片長の１８ＳリボソームＤＮＡ：
１８ＳリボソームＤＮＡ：６６ｂｐアンプリコン
１８ＳリボソームＤＮＡ：５００ｂｐアンプリコン
を標的にする２つの異なるｑＰＣＲアッセイを用いて分析した。
【０２００】
【表２−１】
0006407248.tif 000040
【表２−２】
0006407248.tif 000041
【０２０１】
個々の試料のサイクル閾値を、ｇＤＮＡ標準曲線に従って、溶離液中のｇＤＮＡ量に変換した。保管時点のｇＤＮＡ量を同じドナーからの時間ゼロのｇＤＮＡレベルと比較した。それを倍増加（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）として図に示す。特に、保管後の血液試料の血漿画分中の５００ｂｐ断片の増加は、白血球の溶解／破壊の指標である。したがって、放出される５００ｂｐＤＮＡの量が少ないほど、安定化方法の性能がよい。
【０２０２】
結果
結果を図１および２に示す。異なるアンプリコン長の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用する異なる安定化溶液での時点０に対するＤＮＡの増加（倍変化）を示す。バーは、条件および試験時点ごとの三重反復試料の平均値である。本発明による、したがってブタンアミドを含む、すべての安定化溶液は、３日間、室温での保管後、非安定化ＥＤＴＡ血液と比較して有意に少ない放出ＤＮＡ量を示す。明らかなように、安定化溶液Ａの添加は、被験試料において少なくとも３日間の安定化を達成した。安定化効果は、ＥＤＴＡで安定化したリファレンス試料と比較して有意に改善された。３日間の安定化効果は、血液試料についての通例の配送／保管時間をカバーするので、多くの応用例に十分なものである。さらに、カスパーゼ阻害剤をさらに含む本発明による安定化溶液Ｂは、少なくとも６日間の長期安定化効果を達成した。さらに、数名の異なるドナーからの血液試料に対して安定化溶液を試験したとき、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤の組み合わせで達成される安定化効果は、達成される安定化効果に関してより少ない変動を示すことが判明した（データを示さない）。したがって、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤を併用したとき安定化が有意に改善した。
【０２０３】
実施例２
実施例２では、ＥＤＴＡで安定化した血液試料に対する、カスパーゼ阻害剤と組み合わせたブタンアミドの安定化効果を試験し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）と組み合わせたカスパーゼ阻害剤の安定化効果およびリファレンスとしてのＥＤＴＡで安定化した血液と比較した。
【０２０４】
採血および血液安定化
４名の異なるドナーからの血液を１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）に採集した。４．５ｍＬの血液を０．９ｍＬの異なる安定化溶液と混合し、これらの安定化溶液は（１ｍＬの安定化溶液あたり）以下のものを含有した：
−  ３４．２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  １．２μＬ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）溶液（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）
−  ０．１５ｇ、０．１８ｇまたは０．２１ｇ  ブタンアミドまたは０．３ｍＬ  ＤＭＡＡ、それぞれ。
【０２０５】
それにより、血液／安定化混合物において、以下の最終濃度を得た：
−  ７．２  Ｋ２ＥＤＴＡ／ｍＬ
−  １μＭ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）
−  ２．５、３または３．５％（ｗ／ｖ）ブタンアミドまたは５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡＡ、それぞれ。
【０２０６】
すべての安定化された血液試料を、条件および試験時点ごとに三重反復で用意した。安定化溶液と血液を混合した直後の時点０（リファレンス）で、血漿を生成し、循環細胞外ＤＮＡを抽出した。残りの安定化された血液試料を３日間および６日間、室温で保管した。
【０２０７】
リファレンス対照として、ＥＤＴＡで安定化した血液試料（さらなる添加剤なし）も３日間および６日間、保管した。
【０２０８】
細胞外核酸単離および分析
実施例１に記載したように血漿を調製し、細胞外核酸を単離し、分析した。
【０２０９】
結果
４名の異なるドナーからのｑＰＣＲ分析結果を図３から６に示す。異なるアンプリコン長の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を使用する、２．５％、３％および３．５％ブタンアミドまたは５％ＤＭＡＡによる時点０に対するＤＮＡの増加（倍変化）を示す。バー（ｂａｒｒ）は、条件および試験時点ごとの三重反復試料の平均値である。使用したすべての安定化溶液が、３日間および６日間、室温での保管後、リファレンスのＥＤＴＡ血液試料と比較して有意に少ない放出ＤＮＡ量を示した。ブタンアミドの３つすべての被験濃度が、ＤＭＡＡに少なくとも匹敵する安定化能、およびＥＤＴＡ血液と比較して明白な利点を示した。ＤＭＡＡは、特にカスパーゼ阻害剤と組み合わせた、血液試料のための安定剤である（未公開ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７０２１１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６８８５０を参照されたい）。本実施例によって証明するように、ブタンアミドは、その安定化特性に関して少なくとも同等に有効である。さらに、ブタンアミドは毒性でなく、有害でも刺激性でもないので、ブタンアミドにはＤＭＡＡを超える有意な利点がある。したがって、本発明は、毒性でも有害でもない安定化組成物の提供を可能にする。これは、安定化組成物の取り扱い、ならびに使用者にとっての安定化された試料の取り扱いを簡単にする。
【０２１０】
さらに、溶血に対する異なる安定化溶液の効果（血漿画分の赤色の増加として明らかである）を６日の保管後にそれらの安定化された試料の目視検査によって分析した。図７に示す結果は、溶血の防止が、４名すべてのドナーについてＥＤＴＡ対照におけるものより本発明による安定化溶液でのほうが明白に良好であったことおよびさらにＤＭＡＡで安定化した試料に匹敵したことを実証する。
【０２１１】
実施例３
実施例３では、ＥＤＴＡで安定化した血液試料に対するブタンアミド、カスパーゼ阻害剤およびＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（ＤＭＰＡ）の安定化効果を試験し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）と組み合わせたカスパーゼ阻害剤の安定化効果およびリファレンスとしてのＥＤＴＡ血液と比較した。
【０２１２】
採血および血液安定化
採血および血液安定化は、概して、実施例２に記載したとおり行ったが、異なる安定化溶液を使用した。血液／安定化混合物において、以下の最終濃度を用意した
−  ７．２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ／ｍＬ（全試料）
−  １μＭ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）（全試料）および
−  ０．５％（ｗ／ｖ）ブタンアミドおよび２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ；または
−  １．５％（ｗ／ｖ）ブタンアミドおよび１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ；または
−  ２％（ｗ／ｖ）ブタンアミドおよび１％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ；または
−  ５％（ｖ／ｖ）ＤＭＡＡ。
【０２１３】
細胞外核酸単離および分析
実施例１に記載したように血漿を調製し、細胞外核酸を単離し、分析した。
【０２１４】
結果
結果を図８から１１に示す。異なるアンプリコン長の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づく本発明による安定化溶液（カスパーゼ阻害剤（１μＭ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ）、および抗凝固物質としてのＥＤＴＡに加えて、（ｉ）０．５％ブタンアミドおよび２．５％ＤＭＰＡ、（ｉｉ）１．５％ブタンアミドおよび１．５％ＤＭＰＡまたは（ｉｉｉ）２％ブタンアミドおよび１％ＤＭＰＡを含む）での時間ゼロに対するＤＮＡの増加（倍変化）を示す。バーは、条件および試験時点ごとの三重反復試料の平均値を示す。本発明によるすべての安定化溶液は、３日間および６日間、室温での保管後、リファレンスのＥＤＴＡ血液と比較して有意に少ない放出ＤＮＡ量を示した。３つすべての被験濃度のブタンアミドが、ＤＭＰＡとの組み合わせで、匹敵する安定化能（ＤＭＡＡを含む安定化溶液と比較して）を示し、かつリファレンスのＥＤＴＡ血液と比較して明白な利点を示した。ブタンアミドおよびＤＭＰＡの併用は、安定化効果を保持しながら、より低濃度のブタンアミドの使用を可能にする。これは利点である。なぜなら、ブタンアミドを高濃度で含む安定化溶液は、安定化組成物を低温で保管するとブタンアミドの沈殿を生じさせることがあるからである。したがって、ブタンアミドと式１に従う化合物、例えばＤＭＰＡとの併用は、より低い温度で配送することもできる、非常に有効な、保管安定なおよび特に温度安定な安定化組成物の提供を可能にする。かかる安定化組成物におけるブタンアミドとＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドとの組み合わせは、達成される良好な安定化特性のため、およびさらにブタンアミドとＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドの両方が毒性でないため、有利である。さらに、溶血に対する異なる安定化溶液の効果（血漿画分の赤色の増加として明らかである）を６日の保管後にそれらの安定化された試料の目視検査によって分析した。図１１に示す結果は、溶血の防止が、４名すべてのドナーについてＥＤＴＡ対照におけるものより本発明による安定化溶液でのほうが明白に良好であったこと、およびそれがＤＭＡＡで安定化した試料に匹敵したことを実証する。したがって、溶血を効率的に低減させ、防止することさえできる。
【０２１５】
実施例４
実施例４では、血液試料を安定化するために、異なる濃度のブタンアミドをカスパーゼ阻害剤と併用した。この場合もやはり、分析の焦点は、１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加を分析することによって決定されるような細胞外核酸集団の安定化であった。試料の安定化および処理は、実施例２に記載したように行った。血液試料に被験安定化溶液を添加したとき、血液／安定化溶液混合物において、以下の最終濃度を得た：
【０２１６】
７．２ｍｇ  Ｋ２  ＥＤＴＡ／ｍＬ、１μＭ  キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）および異なる濃度のブタンアミド（０．５％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）および２．５％（ｗ／ｖ））。
【０２１７】
図１２は、得られた安定性結果を示す。明らかなように、ブタンアミドは、カスパーゼ阻害剤との組み合わせでは、より低濃度でも、ブタンアミドで安定化した試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ増加の有意な低減から分かるように、細胞外核酸集団の安定化に有効であった。
【０２１８】
実施例５
実施例５では、単独でのおよびＤＭＡＡと組み合わせたカスパーゼ阻害剤の、血液試料に対する安定化効果を明らかにする。
【０２１９】
１．材料および方法
１．１  血漿の分離
全血から血漿を分離するために、血液試料を１５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた血漿試料を再び１０分間、１６，０００×ｇで、４℃で遠心分離した。
【０２２０】
得られた血漿を、その中に含有されている核酸を単離するために使用した。
【０２２１】
１．２  核酸精製
得られた血漿試料から、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ハンドブックに準拠）を使用して循環の細胞外核酸を精製した。簡単に言うと：
−  １０ｍＬ  試料投入；
−  溶解：１ｍＬ  プロテイナーゼＫおよび８ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＣＬ（ＱＩＡＧＥＮ）
−  結合：１８ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＣＢ（ＱＩＡＧＥＮ）
−  洗浄ステップ：ハンドブックに対する変更なしでハンドブックに準拠
−  ６０μＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＥ（ＱＩＡＧＥＮ）で溶離
【０２２２】
１．３  溶離液の分析
核酸精製後に得た溶離液は、すべての試料（第６／７日試料を含む）を精製するまで−２０℃で保管した。その後、同じ条件の溶離液をプールし、次のように試験した：
【０２２３】
１．３．１  チップゲル電気泳動（２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｉｎｃ．、米国）を、１μＬではなく１．５μＬの試料をウェルに移したことを除いて製造業者の指示（ハンドブックＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００およびＤＮＡ  １２０００Ｋｉｔ  Ｇｕｉｄｅを参照されたい）に従って使用する、ＤＮＡサイズ分布の決定による血球安定性／ＤＮＡ放出の測定。
【０２２４】
１．３．２  ＤＮＡ分解（標的：５００および６６ｂｐ長のリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡコード配列）に感受性の、リアルタイムＰＣＲアッセイでのＤＮＡ定量。
【０２２５】
以下のことを適応させてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲハンドブック（Ｑｉａｇｅｎ）に準拠してＤＮＡデュプレックスアッセイを行った：
−  プライマー濃度を８μＭから１６μＭに拡大した。
−  アニーリング／伸長ステップを１分から２分に延長した。
（試料を増幅前に１：１０希釈した）
【０２２６】
ｑＰＣＲに関する詳細については、実施例１を参照する。
【０２２７】
２．実施した実験および結果
続いて、行った実験に関する詳細を説明する。本実施例で用いた方法の詳細は、上の１のもとで記載した。
【０２２８】
２．１  カスパーゼ阻害剤の添加による安定化
広域カスパーゼ阻害剤として作用する２つの異なるオリゴペプチド、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを試験した：
【０２２９】
【表３】
0006407248.tif 000042
【０２３０】
各被験カスパーゼ阻害剤を全血試料に添加した（１０ｍＬ血液中２０μＭの最終濃度；血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅ  Ｔｕｂｅｓ；ＢＤに採集した）。全血試料をセクション１（血漿調製および核酸単離）に記載したように処理した。
【０２３１】
チップゲル電気泳動の結果
溶離した循環無細胞ＤＮＡを、チップゲル電気泳動を用いてサイズにより分離した（方法に関する詳細については上を参照されたい）。図１３は、得られた結果を示す。ＤＭＳＯ対照およびＫ２Ｅ血液（本発明の教示に従って処理していないもの）は、同じラダー様バンドパターンを示す。このパターンは、アポトーシスが起こる試料で発生する。アポトーシス中、エンドヌクレアーゼがゲノムＤＮＡをヌクレオソーム間リンカー領域で分解し、約１８０ｂｐのまたは１８０ｂｐの倍数のＤＮＡ断片を生じさせる。したがって、アポトーシスは、明確なラダー様パターンを示す試料で発生する。さらに、パターンの強度（暗い色）が決め手となる。より暗いバンドほど、より多くのゲノムＤＮＡが細胞から放出され、したがって細胞外核酸集団を汚染する。
【０２３２】
図１３は、ＤＭＳＯ対照およびＫ２Ｅ血液試料が第３日で既に強いラダー様パターンを示し、それが第７日にはよりいっそう強くなることを示している。したがって、ゲノムＤＮＡは、試料に含有されている細胞から放出され、そしてまた分解された。この放出され、分解されたＤＮＡは、試料に含有されている無細胞核酸を汚染する。それ故、これらの試料では許容され得る安定化が達成されない。
【０２３３】
対照的に、Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫで処理した全血試料は、対照と比較して特に第７日に低減されたラダー様パターンを示し、これは、アポトーシスに起因するゲノムＤＮＡの放出、それぞれにゲノムＤＮＡ断片化の阻害を示す。この効果は、図１４に示す結果によって確認される（下記参照）。この効果は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処理した血液試料ではよりいっそう顕著であり、この試料は、第３日および第７日で既に有意に低減されたラダー様パターンを示す。それ故、ゲノムＤＮＡの放出および分解、特に断片化は、カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの添加によって有効に防止、それぞれに低減される。
【０２３４】
ＤＮＡ定量の結果
溶離した循環無細胞ＤＮＡを、ＤＮＡ分解に感受性であるリアルタイムＰＣＲアッセイでも定量した（方法の詳細については実施例１を参照されたい）。図１４は、室温で保管７日以内の細胞外核酸集団の安定化に対する被験カスパーゼ阻害剤の効果、ここではＤＮＡの増加、を示す（１８Ｓ  ＤＮＡデュプレックスアッセイ）。
【０２３５】
定量的リアルタイムＰＣＲによるリボソーム１８Ｓ  ＤＮＡの検出は、第０日から第３または７日へのＤＮＡのｘ倍増加の計算を可能にする（計算：第３日（または第７日）のコピー数を第０日のコピー数で割る）。図１４に示す結果は、カスパーゼ阻害剤、特にＱ−ＶＤ−ＯＰｈを全血試料に添加したときの低減されたＤＮＡ増加を実証する。標準試料と比較してＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫの安定化効果は、第７日ではより顕著であり、それによって図１３に示されている結果が確証された。
【０２３６】
要約
リアルタイムＰＣＲおよびゲル電気泳動の結果を要約すると、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈまたはＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫの添加は、ＤＮＡ断片化を阻害し、およびさらに、ゲノムＤＮＡの血漿への放出を低減させることが実証された。したがって、全血へのカスパーゼ阻害剤の添加は、室温においてさえ試料および特に細胞外核酸集団の安定化に有効である。それ故、ブタンアミドとカスパーゼ阻害剤とを併用することが好ましい。組み合わせた両方の安定剤は、安定化効果を有意に改善し、延長する。したがって、ブタンアミドおよびカスパーゼ阻害剤の使用を含む本発明による安定化方法の使用は安定化を改善し、そして室温でさえ試料の質を危険にさらすことなく全血試料の配送を可能にする。より長い保管期間中にもゲノムＤＮＡの放出を完全に防止するために、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈの濃度を増加させてもよい。
【０２３７】
２．２．Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）の添加による安定化
２つの異なる濃度のＤＭＡＡをＫ２ＥＤＴＡとともに試験し、単独のＥＤＴＡ（Ｋ２Ｅ  ＢＤ；１８ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ）と比較した。
【０２３８】
ＤＭＡＡを全血試料（１０ｍＬ血液中、０．７５％および１．５％最終濃度；血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅ  Ｔｕｂｅｓ；ＢＤに採集した）の反復試験試料（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）に添加した。
【０２３９】
血液試料を最長６日間、室温でインキュベートした。第０、３および６日に、全血試料を１９１２×ｇで１５分間、室温で遠心分離し、その後、血漿試料を１６，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。材料および方法セクションに記載したプロトコルに従ってＤＮＡ単離のために１ｍＬの試料投入量を使用した。ＤＮＡを８０μＬ  ＥＢ緩衝液で溶離し、実施例１に記載したＲＴ  ＰＣＲアッセイで定量した。
【０２４０】
ＤＮＡ定量の結果
図１５は、血漿中のゲノムＤＮＡの増加に対する被験濃度のＤＭＡＡの効果を示す。ＤＭＡＡの添加は、血漿へのゲノムＤＮＡの放出を有意に低減させる。全血に添加するＤＭＡＡが多いほど、放出されるＤＮＡが少ない。ＤＭＡＡを全血試料に添加した場合、保管３日以内に無細胞ＤＮＡのごく微量の増加が観察された。
【０２４１】
要約すると、ＤＭＡＡの添加は、血漿へのゲノムＤＮＡの放出を低減させる。したがって、血液試料へのＤＭＡＡの添加は、室温においてさえ試料の安定化に有効である。しかし、ＤＭＡＡは、毒性物質である。
【０２４２】
２．３．ｃｃｆＤＮＡレベルに対するＤＭＡＡ濃度およびＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤）濃度の組み合わせの影響
１０ｍＬ全血試料を先ずＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅ−ＥＤＴＡ（４．４５ｍＭ  ＥＤＴＡ＝リファレンス）に採集した。次いで、２ｍＬの下記溶液を添加した（所与の濃度は、安定化された血液溶液中の最終濃度を表す）。各条件を異なるドナーからの６本のチューブで試験した。
【０２４３】
１：ＥＤＴＡリファレンス（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅ）
２：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ、１μＭ  ＯＰＨ；
３：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ、２μＭ  ＯＰＨ；
４：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ、１μＭ  ＯＰＨ、５％ＤＭＡＡ；
５：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ、１μＭ  ＯＰＨ、１０％ＤＭＡＡ；
６：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ、２μＭ  ＯＰＨ、５％ＤＭＡＡ；
７：５０ｍｇ  ＥＤＴＡ；２μＭ  ＯＰＨおよび１０％ＤＭＡＡ。
【０２４４】
試料インキュベーション、血漿の単離、および清澄化された血漿画分からの核酸からの単離を実施例１に記載したように行った。しかし、３，０００ｒｐｍでの第一の遠心分離ステップ後、同一安定化条件の血漿試料をプールした後に血漿清澄化のための第二の遠心分離ステップ（１６，０００×ｇ）を行った。結果を図１６に示す。明らかなように、カスパーゼ阻害剤およびＤＭＡＡを使用する組み合わせは、単独のカスパーゼ阻害剤より有効である。さらに、上の実施例によって証明したように、非毒性物質ブタンアミドはＤＭＡＡと同等に有効であり、それ故、非毒性安定化の代替手段となる。図１７は、図１６と同じ結果を、しかしリファレンスデータの除外（ｅｘｃｌｏｓｕｒｅ）のため異なるスケーリングで、示す。
【０２４５】
２．４．検出限界（ＬｏＤ）
細胞外核酸は、多くの場合、試料に非常に少量で含まれる。したがって、安定化された試料中の細胞外核酸を効率的に保存するばかりでなく、その後、その安定化された試料からの高収率での細胞外核酸の単離を可能にもする安定化手順を有することは、重要である。実施例５．（２．４）は、ホルムアルデヒド放出剤の使用を含まない安定化方法が、安定化された試料から細胞外核酸を高収率で単離することができる点で、先行技術の安定化方法より優れていることを実証する。これは、検出限界を有利に低下させ、したがって、細胞外核酸の集団内の希少な標的核酸も確実に決定できるようにする。
【０２４６】
以下の安定化溶液／チューブを比較した：
１．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ、カタログ番号２１８９７６−安定剤としてホルムアルデヒド放出剤を含む）
２．ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅ（ＢＤ、カタログ番号３６７５２５−ＥＤＴＡを含む）＝リファレンス
３．ＱＧＮ安定化（５％ＤＭＡＡ、１４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＭ  ＯＰＨ（カスパーゼ阻害剤））
【０２４７】
全血試料をｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ＢＣＴおよびＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｋ２Ｅチューブに採集した。ＢＤチューブに採集した血液の二分の一に、ＱＧＮ安定化溶液を添加した。それ故、本発明に従って安定化した試料は、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ安定化が寄与する追加量のＥＤＴＡを含む。それらの試料を３，０００×  ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られた血漿を等分して１．５ｍＬ反復試験試料（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）にした。その後、次の量のＤＮＡスパイクイン対照（１，０００ｂｐ）を試料ごとに添加した：１，０００コピー、５０００コピー、１００コピー、５０コピーおよび１０コピー。
【０２４８】
５００から１０コピー／試料の８つの反復試験試料、１，０００コピー／試料および５コピー／試料の４つの反復試験試料を調製した。それらの試料を３日間、室温でインキュベートした。血漿試料からの細胞外核酸の単離を可能にするＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ｖｉｒｕｓ／ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  １０００アプリケーションを用いて、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＳＰ自動化システムで試料調製を行った。核酸を６０μＬで溶離した。その後のＰＣＲを三重反復で行った。
【０２４９】
結果を図１８に示す。明らかなように、ＢＤ  ＥＤＴＡチューブまたは本発明による安定化溶液いずれかを使用したとき、１００％ヒット≧１，０００コピー／試料を得た。これは、カスパーゼ阻害剤およびＤＭＡＡを含む安定化溶液を使用したときに核酸の単離が害されなかったことを示す。対照的に、ホルムアルデヒド放出剤（Ｓｔｒｅｃｋ）の使用に基づく安定化は、核酸単離の強い阻害を示す。明らかなように、有意に少ない核酸をそれぞれの試料から、５００またはさらには１，０００コピーをスパイクインした試料を用いても、単離することができた。さらに、図１８は、カスパーゼ阻害剤およびＤＭＡＡを使用して安定化した試料で最高感度が得られたことを示す。試料あたりたった１０コピーしかスパイクインしなかった実施形態についてでさえ、１３％の正のＰＣＲヒットが得られた。したがって、ホルムアルデヒド放出剤を使用しない安定化方法は、非常に存在量の少ない細胞外核酸であってもその後のそれらの回収を可能にする。これは、架橋に基づく安定化を超える重要な利点である。なぜなら、かかる方法を診断応用および例えば、希少な標的細胞外核酸、例えば腫瘍由来細胞外核酸または胎児核酸などの検出に特に好適なものにするからである。特に、より少ないコピー数の場合、ホルムアルデヒド放出剤の使用に基づく安定化溶液は、非常に低い性能を有し、最も高い検出限界を示した。これは、表４によっても確証される。
【０２５０】
【表４】
0006407248.tif 000043
【０２５１】
前記表から分かるように、１０００ｂｐ断片について、ＥＤＴＡ試料で達成された結果と、ＤＭＡＡおよびカスパーゼ阻害剤を含む安定化溶液で達成された結果は、同程度である。したがって、この安定化は、その後の核酸単離を害さない。ホルムアルデヒド放出剤を使用する安定化は、最高の検出限界を示しており、したがって、その後の核酸単離を強度に損なわせたことを明示する。
【０２５２】
これは、図１９および２０に示す結果によっても確証される。明らかなように、ＥＤＴＡで安定化した試料と、カスパーゼ阻害剤およびＤＭＡＡで安定化した試料について（１８Ｓ  ｒＤＮＡ  ｑＰＣＲによって測定して）匹敵するｃｃｆＤＮＡ収量が得られる。しかし、ホルムアルデヒド放出剤の使用を含む安定化（Ｓｔｒｅｃｋチューブ）については低減されたｃｃｆＤＮＡ収量が得られた。ホルムアルデヒドで安定化した試料の収量は、ＥＤＴＡで安定化した試料と比較しておおよそ５０％低減された。対照的に、ホルムアルデヒド放出剤を含まない安定化試薬は、従来の核酸単離方法を用いたとき、ｃｃｆＤＮＡ収量に対して有害効果を示さなかった。上の実施例１から４によって分かるように、安定剤としてブタンアミドを使用する安定化方法は、下流の核酸単離に関してＤＭＡＡと同等の性能を示す。それ故、ホルムアルデヒド放出剤ベースの安定化との間接的比較を行うことができる。したがって、架橋剤の使用を含まないブタンアミドベースの安定化にもｃｃｆＤＮＡ収量に対する有害効果がない。これは、かかる安定化方法を既存の核酸単離手順およびワークフローに組み込むことを可能にするので、重要な利点である。ブタンアミドの使用に基づく本発明による方法で類似の結果が達成される。同じく架橋剤を使用しないので、核酸単離を損なわせない。
【０２５３】
実施例６
使用する略語：
ＢＡ：ブタンアミド
ｃｃｆＤＮＡ：循環の無細胞ＤＮＡ
ＤＭＰＡ：ジメチルプロピオンアミド
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
【０２５４】
実施例６では、単独での、またはブタンアミドとの、ならびに必要に応じてカスパーゼ阻害剤および／または第三級アミドを含む、組み合わせでの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、細胞含有生体試料、ここでは血液試料を安定化するその能力について試験した。リファレンス試料（ＥＤＴＡ血液）と比較して、ＰＥＧは、ゲノムＤＮＡの細胞外核酸集団への放出を防止するという方法で、全血試料中の白血球を効率的に安定化できることが判明した。この安定化効果を、異なる分子量のＰＥＧについて、および異なる濃度で使用して、実証した。ＰＥＧを無水粉末もしくは液体として、純粋な試薬として添加することができ、または水溶液に溶解することができることを実証した。単独でのＰＥＧは、それ自体で強い安定化効果を有するが、ブタンアミドとの組み合わせでも安定化を有意に改善する。好ましくは、さらにカスパーゼ阻害剤を使用する。第０日（採血直後）と第６日（室温で６日の保管）の間の白血球から血漿へと放出されるＤＮＡの増加を再現可能に、２倍またはさらにはより多く低減させることがこの有利な併用によって達成されることを実証する。したがって、安定化効果を最大６日まで、またはさらにはそれより長く延長することもできる。この達成される長期効率的安定化は、血液試料などの細胞含有試料についての均一で確実な安定化方法を提供するので、重要な利点である。さらに、これらの実施例は、高分子量ＰＥＧと低分子量ＰＥＧの併用が、強い安定化効果を達成し、例えばシリカカラムベースの核酸単離方法を用いて、細胞外核酸を安定化された試料から効率的に単離することができるので、有利であることの証拠となる。
【０２５５】
材料および方法
別段の指示がない限り、実施例６では以下の手順に従った：
【０２５６】
採血および血液安定化
全血１ｍＬにつき１．８ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡを有する１０ｍＬ噴霧乾燥ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）に血液を採取した。採取後３０分以内に、安定化試薬を直接添加するか、または安定化試薬を収容している新たなチューブにその血液をデカントした。チューブを１０回反転させることによって血液と試薬を混合した。安定化された血液試料を直立に立てて室温で保管した。
【０２５７】
血漿の調製
全血試料を周囲温度で１５分間、３，０００ｒｐｍ（１分あたりの分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ））で遠心分離した。清澄な血漿画分をピペッティングによって取り出し、新鮮な遠心分離チューブに移した。第二ラウンドでは、血漿試料を４℃で１０分間、１６，０００×ｇで遠心分離した。上清を新たなチューブに写し、ｃｃｆＤＮＡの精製に直接使用するか、または使用するまで−２０℃で保管した。
【０２５８】
ｃｃｆＤＮＡの精製
「１ｍＬ、２ｍＬまたは３ｍＬ血清または血漿からの循環核酸の精製」についてのプロトコルを用いて、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で血漿からＤＮＡを単離した。別段の明記がない限り、２ｍＬの血漿をプロテイナーゼＫおよび溶解緩衝液ＡＣＬと混合し、３０分間、６０℃でインキュベートし、緩衝液ＡＣＢと混合し、製造業者の推奨に従って、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ真空マニホールドを使用してＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉカラム（核酸を結合するためのシリカ固相を具備する）に結合させ、洗浄し、６０μＬ溶離緩衝液ＡＶＥで溶離した。
【０２５９】
単離された細胞外ＤＮＡを分析するための定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ
単離された細胞外ＤＮＡを、３μＬの溶離液を使用して、Ａｂｉ  Ｐｒｉｓｍ  ＨＴ７９００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのリアルタイムＰＣＲアッセイで分析した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を使用する２０μＬアッセイ体積で、ヒト１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の２つの断片、６６ｂｐ断片および５００ｂｐ、をマルチプレックスＰＣＲで増幅した。個々の試料のサイクル閾値（Ｃｔ値）を、ｇＤＮＡ標準曲線に従って溶離液中のｇＤＮＡの量に変換した：３０００から０．３ゲノム当量に希釈したヒトゲノムＤＮＡ（１ゲノム当量は、約６．６ｐｇのヒトゲノムＤＮＡに等しい）を用いて作成した標準曲線との比較により完全定量を達成した。保管時点（一般に、採血後６日）のｇＤＮＡ量を同じドナーからの時間ゼロのｇＤＮＡレベルと比較した。定量的リアルタイムＰＣＲ  Ｔａｒｇｅｔによって検出された、使用したＤＮＡ標的配列に関する詳細は上の表２に要約してある。
【０２６０】
６６ｂｐ断片の定量を再び用いて、血漿中の１８Ｓ  ｒＤＮＡコピーの総量を偏向させた（ｄｅｆｌｅｃｔ）。５００ｂｐの定量を用いて、アポトーシスに由来するまたは全血から機械的に溶解された白血球に由来する１８Ｓ  ｒＤＮＡコピーの量を決定した。無細胞ＤＮＡは、典型的に１４０〜１７０ｂｐの長さを有する。それ故、５００ｂｐ断片は、アポトーシス血球、溶解血球または別様に破壊された血球に由来すると考えられる。Ｔ０と６日保管の間の５００ｂｐ断片からのコピー数の増加を安定性効率の測定値として使用した。したがって、放出５００ｂｐＤＮＡの量が少ないほど、安定化方法の性能が良い。より多い放出５００ｂｐ  ＤＮＡ量は、白血球の溶解が起こるたこと、およびしたがって、細胞外核酸集団が細胞内ゲノムＤＮＡで汚染されたことを示す。
【０２６１】
異なる安定化組成物でのその後の実験には、複数の異なる個々のドナーからの血液試料を使用した。採血後の時点０（第０日）に対する室温で異なる時点（日数）についての保管された安定化血液または非安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片のコピー数の平均倍変化を、個々のドナー試料各々について単一計算した。対応する単一計算平均値（倍変化）の平均を、使用した異なる安定化組成物の安定化効率の尺度として用いた。血液試料は、それらの組成のおよびドナーに依存する含有細胞外核酸の量の自然な個々の変動のもとになるので、これは、標準偏差上昇をもたらし得る。
【０２６２】
５．ヘモグロビンの測定
血漿の溶血変色と線形相関があることが判っている４１４ｎｍでの吸光度をｓｐｅｃｔｒａｍａｘ光度計で測定した。
【０２６３】
実施例６で試験した条件
【０２６４】
６．１．実施例６．１
実施例６．１では、水不在下でＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）と組み合わせた、異なる分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の安定化効果を試験し、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）の組み合わせのアプローチと比較した。さらに、血漿試料中のかかる安定化混合物の溶血に対する効果を並行して測定した。ＥＤＴＡ血液試料は、非安定化リファレンス対照としての役割を果たした。
【０２６５】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、水を添加することなく異なる分子量のＰＥＧを伴うまたは伴わないブタンアミド（ＢＡ）およびＥＤＴＡの混合物で安定化した。ＤＭＳＯに溶解したカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をピペッティングによって添加した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２６６】
安定化されたすべての血液試料を条件および試験時点あたり三重反復で用意した。安定化溶液と血液とを混合した直後の時点０（リファレンス時点）で、血漿を生成し、循環細胞外ＤＮＡを抽出した。リファレンス対照として、ＥＤＴＡで安定化した血液試料（さらなる添加剤なしでＫ２  ＥＤＴＡチューブに採集したもの）も０または６日間保管し、三重反復で分析した。
【０２６７】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１００ｍｇ  ＢＡ、１３２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ（６００、１０００または３０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２５０ｍｇ  ＰＥＧ（６００、１０００または３０００）、１００ｍｇ  ＢＡ、１３２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）（水なし）
【０２６８】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ（６００、１０００または３０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（６００、１０００または３０００）、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２６９】
結果
採血後時点０（第０日）に対する室温で６日間保管した８名のドナーからの安定化血液または非安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片のコピー数の平均変化（ｘ倍変化）を８名の血液ドナーの各々について単一計算した。図２１は、条件あたり８名のドナーからのコピー数の対応する平均倍変化を示すものである。すべての安定化組成物は、室温で６日間の保管後、非安定化対照（ＥＤＴＡ血液）と比較して、平均倍変化が有意により少ない増加なので、有意に少ない放出されたゲノムＤＮＡ量を示す。したがって、安定化効果は、６日というこの長い安定化期間全体にわたってでさえ達成された。図２１は、血液試料をさらにポリエチレングリコールと接触させることが、達成される安定化効果を有意に改善したことを実証する。それ故、異なる分子量のＰＥＧは、安定化効果の改善に非常に有効であった。平均倍変化の増加が一貫して２倍より低く、複数の実施形態において１倍より低いことさえあったからである。すなわち、第６日でのＤＮＡレベルは、基礎時点（第０日）のものに匹敵する。
【０２７０】
要約すると、カスパーゼ阻害剤およびブタンアミドを含む安定化組成物の安定化効果は、ポリエチレングリコールと併用すると有意に増加させることができる。ポリエチレングリコールは、異なる分子量で有効であった。さらに、これらの結果は、ＰＥＧの分子量を増加させるとＰＥＧの安定化特性が増加したことを示す。これは、使用したＰＥＧの分子量と得られる試料の安定化効果との間に正の相関関係があることを示す。高い分子量のほうが、達成される安定化効果を改善した。
【０２７１】
６．２．実施例６．２
実施例６．２では、水不在下でＥＤＴＡとＢＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせの安定化効果を試験し、異なる量（０．２ｇ、０．３ｇまたは０．４ｇ）の、６００の分子量を有するＰＥＧ（ＰＥＧ６００）をさらに含む対応する組成物と比較した。ＥＤＴＡ血液は、非安定化リファレンスとしての役割を果たした。
【０２７２】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した６名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、水を添加することなく、異なる量の、６００の分子量を有するＰＥＧ（ＰＥＧ６００）を伴うまたは伴わないブタンアミド（ＢＡ）およびＥＤＴＡの混合物で安定化した。さらに、ＤＭＳＯに溶解したカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をピペッティングによって添加した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を条件および試験時点ごとに三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。リファレンス対照として、ＥＤＴＡで安定化した血液試料（さらなる添加剤なしでＫ２  ＥＤＴＡチューブに採集したもの）も６日間、保管した。
【０２７３】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１００ｍｇ  ＢＡ、１８２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ６００（０．２〜０．４ｇ）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２００、３００および４００ｍｇ  ＰＥＧ６００、１００ｍｇ  ＢＡ、１８８ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）
【０２７４】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、２０ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６００（０．２〜０．４ｇ）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２、３および４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、２０ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２７５】
結果
平均倍変化として図示した６名の個々のドナーの試料からの定量的リアルタイムＰＣＲ解析の結果を図２２に示す。０．２ｇ、０．３ｇまたは０．４ｇ  ＰＥＧ６００による時間ゼロに対するＤＮＡ（６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片）の増加（平均倍増加）を示す。すべての被験安定化組成物は、室温で６日間の保管後、リファレンスのＥＤＴＡ血液と比較して有意に低い放出ＤＮＡ量を示した。その安定化効果は、細胞含有試料をポリエチレングリコールとさらに接触させると有意に改善した。３つすべてのＰＥＧベースの安定化アプローチにおける両方の１８Ｓ  ｒＤＮＡアンプリコンコピー数の平均倍変化は、ＰＥＧを含まない組成物（ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）と比較して明らかに少なかった。ｘ倍変化は、全ての場合、２倍より低かった。この実施例は、細胞外核酸集団を安定化するための、異なる量のポリエチレングリコールのさらなる使用が、カスパーゼ阻害剤およびブタンアミドで達成される安定化結果を有意に改善することを実証する。
【０２７６】
６．３．実施例６．３
実施例６．３では、水の存在下で採血管中に直接凍結乾燥させた、高分子量ＰＥＧ（ＰＥＧ３０００）、ＥＤＴＡ、ＢＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を含む試薬混合物の安定化効果を試験し、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を含む溶液で同時に処理した試料と比較した。
【０２７７】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、ＰＥＧ３０００を伴うまたは伴わないブタンアミド（ＢＡ）とＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。凍結乾燥のために、カスパーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ、ＢＡおよびＰＥＧを含むすべての成分を水に溶解した。１ｍＬの体積（最終濃度は下記参照）を５ｍＬチューブの中でドライフリーザーＥｐｓｉｌｏｎ  ２−２５Ｄ（Ｃｈｒｉｓｔ  ＧｍｂＨ）で凍結乾燥させた。Ｋ２ＥＤＴＡチューブから、凍結乾燥させた安定化試薬を有する５ｍＬチューブに血液を移し、チューブを１０回反転させることによって安定化した。リファレンスとして、試薬を新たに調製し、ＤＭＳＯに溶解したカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をピペッティングによって添加した。
【０２７８】
血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２７９】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  新たに調製したＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１００ｍｇ  ＢＡ、１３２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  新たに調製したＰＥＧ３０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２５０ｍｇ  ＰＥＧ３０００、１００ｍｇ  ＢＡ、１３２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１０μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）（水なし）
【０２８０】
５ｍＬチューブへの凍結乾燥のための０．５ｍＬ中の安定化試薬混合物の組成：
−  凍結乾燥：１２５ｍｇ  ＰＥＧ３０００、５０ｍｇ  ＢＡ、６７．５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）を含有する０．５ｍＬの安定化試薬
【０２８１】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ３０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３０００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２８２】
結果
結果を図２３に示す。１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の異なるアンプリコン長に基づく、時間ゼロに対する採血６日後のＤＮＡの増加（平均倍変化）を示す。この場合もやはり、これらの結果は、ポリエチレングリコールを安定化のためにさらに使用すると安定化効果が有意に改善すること、およびそれがＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）で達成される安定化効果を増強することを実証する。また、試験した長期安定化期間（６日）中のｘ倍変化は２倍より低かった。さらに、この実施例は、これらの安定化組成物が新たに調製したものであってもよく、または凍結乾燥形態であってもよいことを実証する。
【０２８３】
６．４．実施例６．４
実施例６．４では、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をさらに含む安定化水溶液中の異なる分子量を有するＰＥＧ（ＰＥＧ３００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００）の安定化効果を試験し、ＢＡ、ジメチルプロピオンアミド（ＤＭＰＡ）、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）で共処理した試料と比較した。非安定化ＥＤＴＡ血液は、リファレンス対照としての役割を果たした。
【０２８４】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、異なる分子量のＰＥＧを伴うまたは伴わない水溶液中のブタンアミドとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２８５】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ（３００、６００または１０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２８７．５ｍｇ  ＰＥＧ（３００、６００または１０００）、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５４．５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
【０２８６】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ（３００、６００または１０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２８７】
結果
図２４は、達成された安定化結果を示す。明らかなように、異なる分子量のＰＥＧを含む水性安定化組成物は、ブタンアミドおよびカスパーゼ阻害剤で達成される安定化効果を増加させた。汚染するゲノムＤＮＡの量の低減から分かるように、白血球の安定化が有意に改善された。これらの結果は、その安定化効果が使用するＰＥＧの分子量の増加に伴って増加することも実証する。５００ｂｐ断片の増加は、１０００の分子量を有するポリエチレングリコールを使用すると２倍より下に低減された。
【０２８８】
６．５．実施例６．５
ここでは、安定化水溶液中の漸減ＰＥＧ濃度（２％、１．５％、１％または０．７％）の安定化効果をブタンアミド、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで試験した。非安定化ＥＤＴＡ血液は、リファレンス対照としての役割を果たした。ＢＡとＥＤＴＡとＱ−ＶＤ−ＯＰｈとを含む組成物を並行して試験した。
【０２８９】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、異なる濃度のＰＥＧ６０００を伴うまたは伴わない水溶液中のブタンアミドとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２９０】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１１０ｍｇ  ＢＡ、１４７ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００（２〜０．７％）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２２０、１６５、１１０、７７ｍｇ  ＰＥＧ６０００、１１０ｍｇ  ＢＡ、１４７ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１ｍＬ
【０２９１】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００（２〜０．７％）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２、１．５、１、０．７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２９２】
結果
実施例６．５では、漸減濃度（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のより分子量の高いＰＥＧ６０００を、ブタンアミド、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤との組み合わせで利用したときの白血球の安定化に対するそれらの影響について試験した。図２５は、定量的リアルタイムＰＣＲによって１８Ｓ  ｒＤＮＡの増加を分析することにより決定して、細胞外核酸集団の得られた安定化結果を図示するものである。ＰＥＧを含む本発明によるすべての安定化組成物は、室温で６日間の保管後、有意に少ない放出ＤＮＡ量を示し、それによって、かかる長い安定化期間中、ブタンアミド、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤を含む安定化アプローチを改善する。さらに、明らかなように、高分子量ポリエチレングリコールを異なる濃度で使用して水溶液中の白血球を安定化することができ、それによってゲノムＤＮＡでの細胞外核酸集団の汚染を低減させることができる。さらに、この場合もやはり、ＰＥＧはブタンアミドおよびカスパーゼ阻害剤の安定化効果を増加させ、それによって非常に有効な安定化アプローチを提供することが証明される。
【０２９３】
６．６．実施例６．６
実施例６．６では、異なる体積を有する安定化水溶液中のＰＥＧを、ＥＤＴＡ、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）およびＢＡと組み合わせによる安定化効果を試験した。非安定化ＥＤＴＡ血液は、リファレンス対照としての役割を果たした。ＢＡとＤＭＰＡとＥＤＴＡとＱ−ＶＤ−ＯＰｈとを含む組成物を並行して試験した。
【０２９４】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、異なる体積０．８ｍＬおよび１．２ｍＬを有する水溶液中のＰＥＧ６０００とブタンアミドとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０２９５】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１１２ｍｇ  ＰＥＧ６０００、５６ｍｇ  ＢＡ、１５０ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、２．２３μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．２ｍＬまたは０．８ｍＬ
【０２９６】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ  全量１．２ｍＬ：１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ  全量０．８ｍＬ：１．０４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．５２％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５．６ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１．０３μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０２９７】
結果
図２６は、これらの安定化アッセイの結果である。採血後時点０（第０日）に対する、室温で６日間保管した安定化血液または非安定化血液中の異なる１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコン（６６ｂｐまたは５００ｂｐ）のＤＮＡコピーのコピー数の平均変化（倍変化）を示す。本結果は、ポリエチレングリコールを異なるアミドと組み合わせて異なる体積の水溶液中の白血球を安定化することができ、それによって、細胞外核酸集団が細胞内核酸での希釈の防止により保護される、安定化された血液試料が得られることを実証する。
【０２９８】
６．７．実施例６．７
実施例６．７では、安定化水溶液中の安定化試薬の効果を溶血アッセイによって試験する。
【０２９９】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、水を添加した、ＰＥＧを伴うまたは伴わないブタンアミドとＥＤＴＡとの混合物またはブタンアミドと併せたＤＭＰＡとＥＤＴＡとの混合物で安定化した。ＤＭＳＯに溶解したカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をピペッティングによって添加した。血漿を５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から直接生成した。残りの血液は、さらに３、６および１０日間、室温で保管した後、血漿を生成した。分光光度計を用いて４１４ｎｍでの吸光度を測定することによってヘモグロビン含有量を決定した。
【０３００】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１３７．５ｍｇ  ＰＥＧ６０００、５５ｍｇ  ＢＡ、１６５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．０ｍＬ
【０３０１】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３０２】
結果
図２７は、８名の異なるドナーからの血漿試料における０、３、６および１０日の保管後の溶血に対する効果を示す。図２７は、８名のドナーからの溶血の平均増加を血漿画分における４１４ｎｍでの吸光度の増加として図示する。
【０３０３】
図２７から分かるように、ＥＤＴＡ対照実験では、溶血が保管時間の経過とともに上昇するのに対し、ＥＤＴＡリファレンスと比較してＥＤＴＡおよびＢＡと併せてＰＥＧ６０００を含有する本発明による安定化水溶液を用いると分析時点で溶血が低減された。注目すべきこととして、ＥＤＴＡ対照で見られる保管第６日から保管第１０日への溶血増加は、本発明の安定化試薬組成物および水を含むすべての被験溶液中で本質的に低減される。ＰＥＧ含有水溶液中での低減される溶血の程度は、ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）併用による試料の安定化に匹敵した。したがって、水性安定化組成物は、溶血を効率的に低減させるので有利である。
【０３０４】
６．８．実施例６．８
実施例６．８では、ｃｃｆＤＮＡコピー数に対する異なる分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ３００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３０００）の使用の効果を、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで試験し、非安定化ＥＤＴＡ対照血液と比較する。ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）含有組成物を並行して試験した。
【０３０５】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、漸増分子量（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）のＰＥＧを含む水溶液中のブタンアミドとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで安定化した。採血の１時間後、５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を直接生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３０６】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ（３００、６００、１０００、もしくは３０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２８７．５ｍＬ  ＰＥＧ３００または２８７．５ｍｇ  ＰＥＧ（６００，１０００もしくは３０００）、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５４．５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
【０３０７】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ（３００、６００、１０００、もしくは３０００）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：２．５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）ＰＥＧ、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３０８】
結果
８名の異なるドナーからの絶対定量的リアルタイムＰＣＲ分析の結果を図２８に平均として示す。詳細には、採血後第０日の、ドナーの安定化血液試料または非安定化血液試料中の異なる１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコン（６６ｂｐまたは５００ｂｐ）のＤＮＡの絶対コピー数の平均を示す。その目的は、シリカカラムベースの核酸単離手順を用いるときの、後の核酸収量に対する使用された安定化アプローチの効果を試験することであった。図２８は、ＥＤＴＡリファレンス試料（非安定化アプローチ）と比較して、またはＢＡとＤＭＰＡとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）とを含有する安定化された血液溶液と比較して、より高分子量のＰＥＧの添加が血漿中の検出可能アンプリコン遺伝子コピー数の低減をもたらしたことを示す。これらの結果は、安定化のための漸増分子量または漸増鎖長を有するＰＥＧの使用が、より高濃度で使用すると、安定化された試料から細胞外核酸を単離するためにシリカカラムベースの核酸単離アプローチを用いる場合に血漿中の検出可能ｃｃｆＤＮＡ遺伝子コピー数の低減をもたらし得ることを示す。
【０３０９】
６．９．実施例６．９
実施例６．９では、異なる濃度（１．０％。１．２５％または１．５％）のＰＥＧ６０００を、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで試験した。ＥＤＴＡは安定化血液試料、リファレンス対照としての役割を果たした。ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）含有血液混合物を並行して分析した。
【０３１０】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、体積１．５ｍＬから１０ｍＬの血液において、ＰＥＧ６０００を伴う（漸増濃度のＰＥＧを用いて）または伴わないアミド（ＤＭＰＡおよび／またはＢＡ）とＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで安定化した。採血の１時間後、５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３１１】
１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々についての安定化試薬混合物の組成：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００（１〜１．５％）、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−全量１．５ｍＬ：１１５、１４４および１７２ｍｇ  ＰＥＧ６０００、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
【０３１２】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１、１．２５および１．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３１３】
結果
実施例６．９の結果を図２９に示す。異なる濃度（１．０％、１．２５％または１．５％）のＰＥＧ６０００と、ＢＡと、ＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）とを含む本発明による安定化組成物での、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の異なるアンプリコン長に基づく、８名のドナーから採血後第０日のｃｃｆＤＮＡの絶対コピー数の平均減少を示す。図２９は、ＰＥＧを含有する安定化された血漿中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片の絶対コピー数の低減が、ＰＥＧ濃度依存的様式で起こることを示す。これは、安定化溶液中の、漸増濃度のより大きな分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ６０００）が、シリカカラムベースの核酸単離アプローチを使用したときに血漿中の検出可能ｃｃｆＤＮＡ遺伝子コピー数の低減をもたらすことを実証する。
【０３１４】
６．１０．実施例６．１０
実施例６．１０では、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで高分子量ＰＥＧ（ＰＥＧ６０００）を含む異なる体積の水性安定化組成物の安定化効果を分析した。２つのアミド（ＤＭＰＡ、ＢＡ）と、ＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせを含む安定化溶液とともにインキュベートした血液を並行して分析した。ＥＤＴＡ血液は非安定化リファレンスとしての役割を果たした。
【０３１５】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、異なる体積の水溶液中の、ＰＥＧ６０００を伴うまたは伴わないアミド（ＤＭＰＡおよび／またはＢＡ）とＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせで安定化した。採血の１時間後、５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３１６】
１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々についての安定化試薬混合物の組成：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−全量１ｍＬ：１１０ｍｇ  ＰＥＧ６０００、１１０ｍｇ  ＢＡ、１４７ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−全量１．５ｍＬ：１１５ｍｇ  ＰＥＧ６０００、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−全量２ｍＬ：１２０ｍｇ  ＰＥＧ６０００、１２０ｍｇ  ＢＡ、１６２ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
【０３１７】
それによって、前記混合物中の異なる成分の次の最終濃度を血液との接触後に得る：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ  全量１、１．５または２ｍＬ：１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３１８】
結果
実施例６．１０では、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との組み合わせでＰＥＧ６０００を含む本発明による異なる体積（１ｍＬ、１．５ｍＬまたは２ｍＬ）の安定化溶液を試験した。図３０に示す結果は、安定化された試料中の２つの被験１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の断片の絶対コピー数の低減が安定化試薬の体積に依存することを実証する。したがって、高分子量ＰＥＧを含有する安定化組成物の体積の増加（およびしたがって安定化組成物の血液に対する比の増加）は、血漿中の検出可能ｃｃｆＤＮＡ遺伝子コピー数の低減をもたらす。１ｍＬ安定化溶液について示した結果から明らかであるように、より少ない体積を使用するとコピー数は有意に低減されなかった。
【０３１９】
６．１１．実施例６．１１
実施例６．１１では、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を有する安定化水溶液と併せた高分子量ＰＥＧ（０．５％ＰＥＧ６０００）と低分子量ＰＥＧ（２．５％または５％ＰＥＧ３００）との組み合わせの安定化効果を分析した。２つのアミド（ＤＭＰＡ、ＢＡ）とＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物を含む安定化溶液とともにインキュベートした血液を共分析した。ＥＤＴＡ血液は、非安定化リファレンス対照としての役割を果たした。
【０３２０】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、１．５ｍＬの体積を有する水溶液中のＰＥＧ３００およびＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３２１】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ０．５％ＰＥＧ６０００、２．５または５％ＰＥＧ３００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−１．５ｍＬ：５７．５ｍｇ  ＰＥＧ６０００、２８７．５μＬまたは５７５μＬ  ＰＥＧ３００、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
【０３２２】
それによって、全血／安定化混合物中の異なる成分の次の最終濃度を得た：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ−１．５ｍＬ：０．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、２．５または５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３２３】
結果
図３１は、８名のドナーからの、採血後時点０（第０日）に対する室温で６日間保管した前記ドナーからの安定化血液または非安定化血液中の被験６６ｂｐまたは５００ｂｐ長１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコンのコピー数の平均変化（ｘ倍変化）としての、ｑＰＣＲ分析の結果を示す。非安定化ＥＤＴＡ血液対照はコピー数の平均倍変化の上昇を明らかにしたが、ＰＥＧを含有するすべての安定化組成物は、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコンコピー数の平均ｘ倍変化に関して少ない増加しか示さなかった。これらの結果は、被験ＰＥＧ含有安定化組成物の類似した安定化能を示す。達成される安定化は、ＢＡとＤＭＰＡとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤とを含む安定化組成物を増量させ、それにより、この場合もやはり、ポリエチレングリコールをさらに使用したときに達成される重要な利点を実証した。
【０３２４】
加えて、高分子量ＰＥＧと低分子量ＰＥＧとの組み合わせを有する、使用される安定化溶液の記載した有利な安定化能は、ｃｃｆＤＮＡコピー数の低減を伴わないことが確認された。これは、採血後０日に血漿中の１８Ｓ  ｒＤＮＡの絶対コピー数の変化について同じ溶液を試験することによって分析した。図３２は、得られた結果を示す。得られた絶対コピー数は、ＢＡとＤＭＰＡとＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤とを含む安定化組成物と同様であった。それ故、絶対ｃｃｆＤＮＡコピー数の有意な低減は、このアッセイで検出されなかった。したがって、異なる分子量ＰＥＧの組み合わせ、特に、高分子量ＰＥＧと低分子量ＰＥＧとの組み合わせを、ＢＡを含有する異なる体積の水溶液に組み合わせて、特に白血球を安定化することにより、血液試料中の細胞外核酸集団を、シリカ膜を含む標準的核酸単離手順を用いたときに絶対ｃｃｆＤＮＡコピー数の有意な低減がなく、有効に安定化することができる。
【０３２５】
６．１２．実施例６．１２
実施例６．１２では、安定化水溶液の効果を溶血アッセイによって試験した。ここでは、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）と組み合わせた、高分子量ＰＥＧ（０．５％ＰＥＧ６０００）と低分子量ＰＥＧ（２．５％または５％ＰＥＧ３００）との組み合わせを分析した。２つのアミド（ＤＭＰＡ、ＢＡ）とＥＤＴＡとカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物を含む安定化溶液とともにインキュベートした血液を共分析した。ＥＤＴＡ血液は、非安定化リファレンス対照としての役割を果たした。
【０３２６】
採血および血液安定化
１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブに採集した８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、１．５ｍＬの体積を有する水溶液中のＰＥＧ３００およびＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）との混合物で安定化した。５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を直接生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。分光光度計を用いて４１４ｎｍでの吸光度を測定することによってヘモグロビン含有量を決定した。
【０３２７】
安定化試薬混合物の組成（１０ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血各々について）：
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１８０ｍｇ  ＢＡ、１８０μＬ  ＤＭＰＡ、６８．４ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１２μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量２ｍＬ
−  ０．５％ＰＥＧ６０００、２．５または５％ＰＥＧ３００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：５７．５ｍｇ  ＰＥＧ６０００、２８７．５μＬまたは５７５μＬ  ＰＥＧ３００、１１５ｍｇ  ＢＡ、１５５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１．５μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．５ｍＬ
【０３２８】
それによって、全血／安定化混合物中の異なる成分の次の最終濃度を得た：
−  非安定化：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  ＢＡ、ＤＭＰＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：１．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＰＡ、７．２ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ：０．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、２．５または５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３００、１％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
【０３２９】
結果
図３３は、採取後０日および６日の血液保管後の８名の異なるドナーからの血漿試料における溶血に対する、異なる分子量のＰＥＧとＢＡとを含む分析した水溶液の効果を示す。図３３は、０日および６日の血液保管後の血漿画分における４１４ｎｍでの吸光度の増加として溶血の増加を示す。
【０３３０】
図３３から分かるように、ＥＤＴＡ対照実験は、保管後０日の最初の時点と比較して６日の血液試料保管後の溶血増加（４１４ｎｍでの吸光度増加）を示す。ＥＤＴＡ、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）およびＢＡとの組み合わせの、０．５％濃度のＰＥＧ６０００（より高分子量のＰＥＧ）と５％濃度のＰＥＧ３００（より低分子量のＰＥＧ）の混合物を含む安定化組成物を用いると、溶血はＥＤＴＡリファレンス試料と同様であった。対照的に、０．５％ＰＥＧ６０００と組み合わせたより低い濃度のＰＥＧ３００（ここでは２．５％）と、ＥＤＴＡと、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）とＢＡとを使用する本発明による安定化組成物は、６日間の血液保管後の溶血を低減させた。これは、水溶液に溶解したとき高分子量ＰＥＧと低分子量ＰＥＧとのバランスの取れた組成を含有する安定化組成物で溶血が防止され得ることを実証する。
【０３３１】
６．１３．実施例６．１３
真空にした採血チューブ（Ａｌｐｈａチューブ）に予め充填されたＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡおよびカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を含む安定化組成物を、安定剤としてのホルムアルデヒド放出剤の使用に基づく安定化組成物を含む市販のＳｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブと比較した。
【０３３２】
採血および血液安定化
８名のドナーからの１０ｍＬ全血の試料を、１０ｍＬ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡに、ＰＥＧ６０００、ＥＤＴＡ、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）およびＢＡを含む本発明の安定化組成物量が予め充填されたＡｌｐｈａチューブに、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブに採集した。５ｍＬの安定化血液試料または非安定化血液試料から血漿を直接生成した。残りの血液は、さらに３、６および１０日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍＬ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３３３】
異なるチューブの中の安定化試薬混合物の組成（すべて、１０ｍＬ採血体積で）：
−  ＥＤＴＡ−１０ｍＬ噴霧乾燥ＥＤＴＡ、
−  Ａｌｐｈａ１−チューブ（ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）：１３７．５ｍｇ  ＰＥＧ６０００、５５ｍｇ  ＢＡ、１６５ｍｇ  Ｋ２ＥＤＴＡ、１１μＬ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（１ｍｇを３８８μＬ  ＤＭＳＯに溶解）、水で全量１．０ｍＬ
−  Ｓｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブ：安定剤としてのホルムアルデヒド放出剤を含む
【０３３４】
それによって、全血／安定化混合物中の異なる成分の次の最終濃度を得た：
−  ＥＤＴＡチューブ：１．８ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ
−  Ａｌｐｈａ１−チューブ（ＰＥＧ６０００、ＢＡ、ＥＤＴＡ、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）：１．２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＡ、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｋ２ＥＤＴＡ、５μＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ
−  Ｓｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブ：該当する濃度なし
【０３３５】
結果
結果を図３４および３５に示す。
８名の血液ドナーから採血後の時点０（第０日）に対する室温で３、６または１０日間保管した８名のドナーからの安定化血液または非安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐ断片（図３４）および５００ｂｐ断片（図３５）のコピー数の平均変改（ｘ倍変化）を分析した。バーは、８名のドナーからのコピー数の平均倍変化の対応する標準偏差を条件ごとに示すものである。図３４および３５に示されるように、ＰＥＧ６０００、ＥＤＴＡ、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）およびＢＡを含む両方の被験安定化組成物は、血液中の細胞外核酸集団の安定化に関して高度に効率的である。１８Ｓ  ｒＤＮＡの６６ｂｐ断片のコピー数の平均倍変化は、試験したすべての時点について、時点ゼロの基礎レベル（約１．０での倍変化）に留まった。図３５は、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片レベルについて同等の結果を示す、すなわち、細胞破壊中に放出される細胞核酸についての試験断片は、試験した時点にわたって時間点ゼロの状態に実質的に留まった。この安定化効果は、Ｓｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブを使用した結果に匹敵した。したがって、本発明による安定化組成物は、ホルムアルデヒド放出剤を含むＳｔｒｅｃｋ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴチューブに類似して白血球からの細胞内核酸、例えば特にゲノムＤＮＡの放出を低減させることにより血液試料中の細胞外核酸集団を効率的に安定化する。しかし、上に記載したように、ホルムアルデヒド放出物質の使用には、それらが核酸分子間またはタンパク質と核酸間の架橋の誘導により細胞外核酸単離の効力を弱めるので、欠点がある。それ故、特異的核酸単離方法を用いなければならない。かかる架橋物質の使用を含まない本発明による安定化組成物には、架橋ベースの安定化技術を超える重要な利点がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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