(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓細胞を培養するための組成物において、
肝臓細胞と、
ＬＦＭ−Ａ１３と、
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ＬＦＭ−Ａ１３が、０．１マイクロモル〜５０マイクロモルの濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＦＭ−Ａ１３が、１マイクロモル〜２０マイクロモルの濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が血清を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が血清を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記肝臓細胞が肝細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記肝臓細胞が肝細胞に由来する不死化細胞を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記肝臓細胞が細胞株を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞株が肝細胞に由来することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
候補化合物であって、その代謝物質が分析されることが所望される候補化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
培養中の肝臓細胞の代謝機能を増強する方法において、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物中で肝臓細胞を培養するステップであって、前記ＬＦＭ−Ａ１３は、実質的に類似するが、ＬＦＭ−Ａ１３を欠く培地中で培養された肝臓細胞に比べて、前記培養肝臓細胞における２つ以上の薬物代謝酵素のレベルを増強するのに有効な量で存在するステップ、
を有してなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
候補化合物の代謝物質を同定する方法において、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物中で肝臓細胞を培養するステップであって、前記ＬＦＭ−Ａ１３は、実質的に類似するが、ＬＦＭ−Ａ１３を欠く組成物中で培養された肝臓細胞に比べて、前記培養肝臓細胞における２つ以上の薬物代謝酵素のレベルを増強するのに有効な量で存在するステップ、
前記培養細胞を前記候補化合物と接触させるステップ、および
前記候補化合物の代謝物質を同定するステップ、
を有してなることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月２８日に提出された米国仮特許出願第６１／７３０７６２号明細書に対して米国法典第３５編第１１９条の下で優先権の利益を主張し、その内容に依拠し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、細胞培養培地、特に肝細胞または肝臓細胞を培養するのに有用な細胞培養培地およびその使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬物性肝障害は、市場からの薬剤撤退の主な原因の１つであり、市場から撤退させられた薬剤の約３０％を占める。今日、薬物性肝障害の正確な予測は、薬剤開発に対する主な課題のままとなっている。臨床試験について承認される前に、薬剤候補は、典型的に、初代肝細胞（ＰＨＨ）および肝臓細胞株などの様々なインビトロ肝臓細胞モデルにおいて薬物性肝障害について試験される。ＰＨＨは、薬物性肝障害の研究に「ゴールドスタンダード」として現在使用されているが、ＰＨＨの機能の維持は、インビトロにおいて困難となり得る。たとえば、フェーズＩ／ＩＩ薬物代謝酵素活性など、ＰＨＨの重要な肝臓機能のいくつかは、培養の最初の２４〜４８時間の間におよそ５０％減少する。そのうえ、ドナー間のばらつきおよび限りある供給量は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）などの初期薬剤毒性研究においてＰＨＨが使用されるのを妨げる。肝臓細胞株は、ＰＨＨに比べていくつかの利点を有する。たとえば、肝臓細胞株は、通常、無制限の継代培養により大量に入手可能であり、操作するのが容易であり、ハイスループットスクリーニングに適している。しかしながら、肝臓細胞株は、薬物代謝酵素のレベルが非常に低いなど、ＰＨＨに比べていくつかの不都合がある。肝細胞の生存能力および機能が、大部分は、それらの培養条件によって決定されるため、高度に機能的な肝細胞を維持するための細胞培養培地の改善は、非常に所望される。
【０００４】
体内では、肝細胞の生存、増殖、分化、および代謝機能は、様々な可溶性因子によって高度に調節される。これらの可溶性因子は、肝細胞が肝組織から単離された後、失われる。単離に際して、初代肝細胞は脱分化状態に移行し、それらの機能のほとんどを徐々に失う。数十年間の研究を通して、インスリン、肝細胞成長因子、ホルモン、およびその他同種のものなど、肝細胞機能を維持する可溶性因子のいくつかが同定され、特徴付けられた。これらの可溶性因子は、シグナル伝達経路、細胞周期コントロール、およびその他同種のものなどの様々なメカニズムを通して肝細胞機能を調整する。細胞培養培地へのこれらの可溶性因子の追加は、肝細胞の生存能力および機能を著しく改善した。しかしながら、肝細胞のインビボにおける機能は、培養培地中にこれらの可溶性因子が存在する時でさえ完全には回復しない。
【０００５】
培養初代肝細胞の機能は、小分子化学物質によって調整することができる。たとえば、ＣＹＰ３Ａ４の発現および機能は、プロテインキナーゼＡ活性化因子によって増強することができるが、プロテインキナーゼＣ活性化因子によって抑制される。そのため、ヒト体内における可溶性因子の調節機能を模倣し、かつ全体的な肝細胞機能を増強する能力を有する任意の小分子化学物質は、可能性として、細胞培養培地中の構成成分として使用することができるであろう。プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤が初代ヒト肝細胞増殖を促進するために細胞培養培地中で使用できることが示唆されてきたが、しかしながら、肝細胞機能を増強するために小分子ＰＫＡ阻害剤を含有する培養培地に関する報告はない。
【０００６】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、ＨｕＨ６ヒト肝芽腫細胞ではなく、ＨｅｐＧ２細胞において、ＣＹＰ２Ｂ６およびＵＧＴ１Ａ１を含む多くの肝酵素の発現を増強することが示されたが（非特許文献１）、全体的な肝機能を増強するための薬剤として示唆されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｕｇａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８：１７７−１８６，２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、とりわけ、培養中の細胞の全体的な薬物代謝機能を増強することができる化合物、組成物、および方法を記載する。たとえば、種々様々な薬物代謝酵素の発現の増加は、本明細書において記載される化合物、特にＬＦＭ−Ａ１３および構造的に関連する化合物を含有する培地中で肝細胞または肝臓細胞株を培養することによって達成することができる。本明細書において記載されるように、ＬＦＭ−Ａ１３は、強力なブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤であることが報告されてきたが、培養肝細胞においてシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素などの薬物代謝酵素の広範な発現を誘発する。そのうえ、ＬＦＭ−Ａ１３および構造的に関連する化合物はまた、他の肝機能をも増強することができる。驚いたことに、構造的に関連しないＢＴＫ阻害剤は、試験され、ＬＦＭ−Ａ１３に類似する結果をもたらさなかった。
【０００９】
本明細書において記載される実施形態では、細胞培養組成物が、ＬＦＭ−Ａ１３または構造的に関連する化合物を含むことができる。組成物は、培養肝臓細胞の全体的な代謝機能を増強する、培養肝臓細胞の肝機能を維持する、または幹細胞を肝細胞に分化させるために使用することができる。したがって、そのような細胞培養組成物は、創薬用の高機能ヒト肝臓細胞の培養に使用することができる。より高い薬物代謝機能の回復または維持は、薬物性肝障害の予測を改善するための、より優れた細胞ベースのモデルをもたらし得る。
【００１０】
先の細胞培養組成物および方法に対する、本明細書において示される１つ以上の様々な実施形態の利点は、添付の図面と併せて読まれた場合に、以下の詳細な説明に基づいて当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培養初代ヒト肝細胞における、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ１Ａ２活性に対する、コントロール（培地のみ）に比べた、レフルノミド（ＬＥＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。
【図２】培養肝臓細胞株（ＨｅｐａＲＧおよびＣｏｒｎｉｎｇ肝臓細胞株）における、ＣＹＰ３Ａ４活性に対する、コントロール（培地のみ）に比べた、レフルノミド（ＬＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。
【図３】５つの異なる肝細胞培養培地中で培養した初代ヒト肝細胞における、ＣＹＰ３Ａ４活性に対する、コントロール（培地のみ）に比べた、レフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。
【図４】培養初代ヒト肝細胞における、基本的なおよびリファンピン（ＲＩＦ）誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性に対する、コントロール（培地のみ）に比べた、レフルノミド（ＬＥＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。
【図５Ａ】培養初代ヒト肝細胞における、基本的なおよびオメプラゾール誘発性のＣＹＰ１Ａ２活性に対する、様々な濃度のレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す図である。
【図５Ｂ】培養初代ヒト肝細胞における、基本的なおよびリファンピン誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性に対する、様々な濃度のレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す図である。
【図６】培養初代ヒト肝細胞における、様々な薬物代謝酵素および肝臓タンパク質についてのｍＲＮＡレベルに対する、コントロールに比べた、レフルノミド（ＬＥＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。それぞれのｍＲＮＡについて、結果を以下の順に示す：コントロール、ＬＥＦ、ＬＦＭ、ＬＦＭ−Ａ１３。
【図７】培養初代ヒト肝細胞における、様々な薬物代謝酵素および肝臓タンパク質についてのｍＲＮＡレベルに対する、コントロールに比べた、レフルノミド代謝物質アナログＡ１３（ＬＭＦ−Ａ１３）の効果を示す棒グラフである。それぞれのｍＲＮＡについて、結果を以下の順に示す：コントロール、ＬＦＭ−Ａ１３。
【図８】培養初代ヒト肝細胞における、ＣＹＰ３Ａ４酵素活性に対する、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）ならびにＰｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ２）、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４に向けられるｓｈＲＮＡの効果を示す棒グラフである。
【図９】ＬＦＭ−Ａ１３の存在下または非存在下において培養されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する蛍光染色された肝細胞の画像を示す。細胞核は、幹細胞についてのマーカーである４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）；肝臓前駆体マーカーであるアルブミン（ＡＬＢ）；肝機能についてのマーカーである多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）を使用して染色する。
【図１０】培養幹細胞由来の肝細胞の基本的なおよびリファンピシン誘発性のＣＹＰＡ４活性に対する、ＬＦＭ−Ａ１３の効果を示す棒グラフである。
【図１１】細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）オーバーレイ（ＭＯＬ）ありまたはなしのコラーゲンコートプレート（ＣＯＬ）上で培養された場合の、肝細胞または前駆体に分化したｈＥＳＣにおけるｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す棒グラフである。ＡＬＢはアルブミンであり、ＡＦＰはアルファ−フェトプロテインであり、ＣＹＰ３Ａ４はシトクロムＰ４５０  ３Ａ４であり、ＣＹＰ７Ａ１はシトクロムＰ４５０  ７Ａ１であり、ＰＧＣ１ａは、ペルオキシソーム−増殖因子−活性化受容体−ガンマコアクチベーター−１アルファである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の詳細な説明および実施例において、本明細書の一部を形成する添付の図面に対して参照がなされ、図面において、本明細書において記載される化合物、組成物、および方法の効果を例証するいくつかの特定の実験の結果が、例として示される。他の実施形態が、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく企図され、得られることを理解されたい。以下の詳細な説明および実施例は、そのため、限定的な意味に解釈されないものとする。
【００１３】
本明細書において使用される科学的および技術的用語はすべて、別段の定めがない限り、当技術分野において共通して使用される意味を有する。本明細書において提供される定義は、本明細書において頻繁に使用されるある用語についての理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【００１４】
さらに、本明細書および添付の請求項において使用されるように、名詞は、内容がその他に明確に指示しない限り、複数の指示物を有する実施形態を包含する。
【００１５】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、用語「または」は、一般に、内容がその他に明確に指示しない限り、「および／または」を含む意味で用いられる。
【００１６】
本明細書において使用されるように、「幹細胞」は、継続的に分裂する（自己複製）能力を有し、種々の範囲の特殊化した細胞に分化することができる細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞が、対象の器官または組織から単離することができる多分化能幹細胞、全能性幹細胞、または多能性幹細胞である。そのような細胞は、完全に分化したまたは成熟した細胞型をもたらすことができる。幹細胞は、骨髄由来幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、自己由来もしくはそうでなければ神経細胞幹細胞、または胚性幹細胞とすることができる。幹細胞は、上皮および脂肪組織、臍帯血、肝臓、脳、または他の器官に由来する多系列の細胞とすることができる。様々な実施形態では、幹細胞が、哺乳動物から単離された多能性胚性幹細胞などの多能性幹細胞である。適した哺乳動物は、マウスまたはラットなどのげっ歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長動物を含む霊長動物を含むことができる。
【００１７】
確立されたヒト胚性幹細胞系の例は、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、またはＨ１４（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎによって確立され、ＷｉＣｅｌｌから入手可能）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅから）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏから）；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌで誘導）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｃｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．８３（５）：１５１７−２９，２００５）；系ＨＵＥＳ１〜１７（Ｃｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３５０（１３）：１３５３−５６，２００４）；ならびに系ＡＣＴ−１４（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６５（９４７１）：１６３６−４１，２００５）を含むが、これらに限定されない。胚性幹細胞はまた、初代胚組織から直接得ることができる。典型的に、これは、通常は廃棄されるであろう、胚盤胞期の凍結インビトロ受精卵を使用して行われる。
【００１８】
多能性幹細胞の他の供給源は、誘発霊長動物多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を獲得するように再プログラムされた、ヒトなどの若年のまたは成熟した哺乳動物から得られる細胞を指す。再プログラムは、当業者に知られている方法によって達成することができる。細胞再プログラム方法は、たとえば、１つ以上の適切なベクターによるトランスフェクション感染によって細胞を遺伝的に修飾する方法またはたとえば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤などの小分子への曝露によって、細胞を後成的に修飾する方法を含むが、これらに限定されない。これらの再プログラムされた細胞によって獲得された表現型の形質は、胚盤胞から単離された幹細胞に似ている形態ならびに胚盤胞由来の胚性幹細胞に似ている表面抗原発現、遺伝子発現、およびテロメラーゼ活性を含む。ｉＰＳ細胞は、典型的に、一次胚葉のそれぞれ：外胚葉、内胚葉、および中胚葉から少なくとも１つの細胞型に分化する能力を有する。ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞はまた、免疫不全マウス、たとえばＳＣＩＤマウスに注射された場合に、奇形腫をも形成する。（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：５８５８）。
【００１９】
本明細書において使用されるように、培養「肝臓細胞」は、肝臓から単離された細胞；肝臓から単離された細胞に由来し、薬物代謝機能などのいくつかの肝機能を有する細胞；または肝臓細胞に分化した幹細胞もしくは薬物代謝機能などのいくつかの肝機能を有する細胞などの前駆細胞である。肝臓細胞の他の機能は、血漿タンパク質、たとえば血清アルブミン、インター−アルファ阻害剤プロテアーゼ、フィブリノーゲン、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体、免疫グロブリン、および凝固因子の生成および分泌を含むことができる。
【００２０】
肝臓細胞は、初代肝細胞などの肝細胞、肝臓腫瘍もしくは不死化肝細胞に由来する細胞株などの肝臓細胞株の細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞に由来するなどの肝前駆細胞または早期肝組織から単離された細胞、分化転換肝臓細胞（分化形質転換した細胞に由来する細胞、すなわち、肝臓以外の組織由来の細胞）とすることができる。実施形態では、初代肝細胞が、新たに単離されるまたは細胞培養における使用に先立って凍結保存される。
【００２１】
本明細書において使用されるように、「有する」、「有すること」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、またはその他同種のものは、それらのオープンエンド（ｏｐｅｎ  ｅｎｄｅｄ）の意味で使用され、一般に、「〜を含むが、それに限定されない」ということを意味する。「〜から実質的になる」、「〜からなる」、およびその他同種のものは、「含む」およびその他同種のものに含められることが理解されるであろう。
【００２２】
本明細書において言及される化合物は、特に参照される化合物の塩、異性体、水和物、溶媒和化合物、および多形体を含む。
【００２３】
本開示は、とりわけ、培養肝臓細胞の全体的な薬物代謝を増強することができる化合物、組成物、および方法を記載する。本明細書において使用されるように、「全体的な薬物代謝」を増強することは、２つ以上（たとえば３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上など）の薬物代謝酵素のレベルを増加させることを意味する。実施形態では、２つ以上の薬物代謝酵素が、所与の経路内の１つまたは複数の所与の酵素を誘発する典型的な薬物代謝誘発因子を区別するために、異なる経路由来の酵素とすることができる。増加させる酵素のレベルは、酵素、酵素を発現するｍＲＮＡ、または酵素活性のレベルとすることができる。１つ以上の酵素のレベルは、実質的に類似する条件下であるが、薬物代謝を増強する化合物の非存在下において培養された肝臓細胞に比べて、約５％以上（たとえば約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、または約５０％以上）など、任意の明らかな量、増加させることができる。「実質的に類似する条件」は、同じまたは類似する温度、気体比、培養培地（「増強」化合物なし）、およびその他同種のものなど、実行可能な限り類似することを意味することが理解されるであろう。
【００２４】
レベルを増加させることができる薬物代謝酵素は、フェーズＩ薬物代謝酵素、フェーズＩＩ薬物代謝酵素、およびフェーズＩＩＩ薬物代謝酵素を含む。フェーズＩ酵素は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ）酵素、フラビン含有酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、およびその他同種のものを含む。フェーズＩＩ薬物代謝酵素は、一般に抱合を触媒する酵素であり、メチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、アセチルｃｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ、およびその他同種のものを含む。フェーズＩＩＩ薬物代謝酵素は、一般に細胞から化合物を排出し、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター、溶質輸送体（ＳＬＣ）、およびその他同種のものを含む。本明細書において記載される実施形態では、２つ以上のＣＹＰ酵素（たとえば３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上など）のレベルは、本明細書において記載される「増強」化合物の存在下において培養される肝臓細胞において増加する。
【００２５】
レベルを増加させることができる特異的な酵素の非限定的な例は、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＳＬＣ０１Ａ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣＯ１Ｂ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＳＵＬＴ１Ａ２、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＵＬＴ１Ｂ１、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＵＧＴ２Ｂ４、ＧＳＴＡ２、およびその他同種のものを含む。
【００２６】
肝臓細胞機能は、肝臓転写因子、たとえばＨＮＦ１、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰベータの発現によって部分的にコントロールされる。たとえば、肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４アルファ）は、肝臓発達にならびに重要な代謝経路、たとえば薬物代謝、コレステロールおよび脂肪酸代謝、グルコースホメオスタシス、ならびに炎症に関連する、多くの肝臓特異的遺伝子の発現のコントロールに必要とされる核内受容体（ＮＲ）である。他の転写因子は、薬剤の代謝、処分、および毒性を決定する、フェーズＩ、フェーズＩＩ、およびフェーズＩＩＩの薬物代謝遺伝子の多くの発現をコントロールすることに直接関与する。ＤＭＥ関連遺伝子は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）、プレグネノロンｘ−受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロステン受容体（ＣＡＲ）、およびＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）を含む。「増強」化合物への曝露後の全体的な肝機能の増強は、１つ以上の転写因子の増強に起因し得る。
【００２７】
「増強」化合物への曝露によってレベルを増加させることができる転写因子の非限定的な例は、ＨＮＦ１、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰベータ、Ａｈｒ、ＣＡＲ、ＰＸＲ、およびＲＸＲを含む。
【００２８】
「増強」化合物への曝露後の全体的な肝機能の増強は、１つ以上の転写因子の増強または細胞機能を決定する転写因子の複雑な相互作用の調整に起因し得る。たとえば、ＨＮＦ４は、多数の薬剤代謝シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子の直接的なトランス活性化因子として作用し、この因子が、肝臓においてＣＹＰ転写を支援する全体的な調節因子であることを示唆する。ＨＮＦ４と他の転写因子との間の複雑な相互作用およびクロストークは、フェーズＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの薬物代謝遺伝子の多くに影響を与える。たとえば、ＨＮＦ４は、ＣＡＲ、ＰＸＲ、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、摂食−絶食サイクル標的、ＰＧＣ−１アルファ、Ｃ／ＥＢＰなどの他の肝臓に豊富な因子と相互作用することによって肝臓におけるフェーズＩ  ＣＹＰ発現を調整する。
【００２９】
「増強」化合物への曝露後の全体的な肝機能の増強は、細胞機能を決定する転写因子の複雑な相互作用の調整に起因し得る。「エンハンサー」化合物への曝露後に全体的な肝機能を増加させる方法で相互作用を調整することができる特異的な転写因子の非限定的な例は、肝臓核内因子（ＨＮＦ１、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰベータ）、ＦＯＸＯタンパク質（たとえば、グルコース代謝を調整するＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＡ１、ＦｏｘＡ２、ＦＯＸＡ３）などのフォークヘッドボックス受容体、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、ならびにレチノイン酸受容体（ＲＡＲおよびＲＸＲ）、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）、プレグネノロンｘ−受容体（ＰＸＲ）、構成的アンドロステン受容体（ＣＡＲ）を含む。したがって、本明細書において記載される化合物および組成物はまた、薬物代謝以外の肝機能を増強する役目を果たすこともできる。そのうえ、本明細書において記載される化合物および組成物は、肝細胞への培養幹細胞の分化を促進する役目を果たすことができる。
【００３０】
転写因子の機能は、ステロイド受容体コアクチベーター（ＳＲＣ）ＳＲＣ１、ＳＲＣ２、ＳＲＣ３、またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１α（ＰＧＣ１アルファ）などのコアクチベーターならびにコインヒビター、たとえば、レチノイドおよび甲状腺受容体のサイレンシングメディエーター（ＳＭＲＴ）ならびに核内受容体コリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）によって部分的にコントロールされる。たとえば、ＰＸＲは、基本的に抑制されており、コリプレッサー（レチノイドおよび甲状腺受容体のサイレンシングメディエーター（ＳＭＲＴ）ならびに核内受容体コリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）ならびにコアクチベーター（ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ−１）、ＰＰＡＲ、およびグルココルチコイド受容体コアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）、肝細胞核因子４（ＨＮＦ−４））の、活性化を促進する相互作用における複雑な変化を通して、リガンドおよび組織特異的な方法で活性化される。
【００３１】
「増強」化合物への曝露後の全体的な肝機能の増強は、細胞機能を決定する転写因子、コアクチベーター、およびコインヒビターの複雑な相互作用の調整に起因し得る。
【００３２】
肝細胞またはその他同種のものへの培養幹細胞の分化を促進するために、培養肝臓細胞の全体的な薬物代謝を増強するために使用することができる１つの化合物は、式Ｉ
【００３３】
【化１】
0006307515.tif 000002
【００３４】
の化学構造を有するＬＦＭ−Ａ１３、［α−シアノ−β−ヒドロキシ−β−メチル−Ｎ−（２，５−ジブロモフェニル）プロペンアミド］である。
【００３５】
ＬＦＭＡ−１３は、強力なＢＴＫ阻害剤であることが報告されてきた。たとえば、Ｕｃｋｕｎらの米国特許第６，３０３，６５２号明細書を参照されたい。この特許は、それが本開示と矛盾しない程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６，３０３，６５２号明細書は、ＬＦＭ−Ａ１３に構造的に類似する様々なＢＴＫ阻害剤を開示する。例として、米国特許第６，３０３，６５２号明細書の教示に基づいて、下記の式ＩＩ
【００３６】
【化２】
0006307515.tif 000003
【００３７】
（式中、
Ｒ１は、（ｉ）（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（ｉｉ）（Ｃ１〜Ｃ３）シクロアルキル、（ｉｉｉ）ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、もしくはＮＲａＲｂから独立して選択される１つ以上の置換基により任意選択で置換されたフェニル、または（ｉｖ）ＮＲａＲｂであり；
Ｒ２は、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノキシアミノ（ａｌｋａｎｏｘｙ  ａｍｉｎｏ）（Ｃ２〜Ｃ５）アルコキシ；ヒドロキシ（Ｃ２〜Ｃ５）アルコキシアミノ（Ｃ２〜Ｃ５）アルカノキシ、またはヒドロキシル（Ｃ２〜Ｃ５）アルカノキシであり；
Ｒ３は、シアノまたは（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルであり；
Ｒ４は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシル（Ｃ２〜Ｃ５）アルキル、またはアミノ（Ｃ２〜Ｃ５）アルキルであり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ、独立して、水素もしくは（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルであるか、またはＲａおよびＲｂは、それらが結合した窒素が加わって、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、もしくはチオモルホリノであり；
ｎおよびｍは、独立して、０〜２の整数であり；
Ｘは、ハロであり；
Ｙは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃまたは−ＯＲｃであり；
Ｒｃは、（ｉ）非置換もしくはハロにより置換された（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルまたは（ｉｉ）アリールである）
による化合物がＢＴＫ活性を有することが期待されるであろう。
【００３８】
本主題の発明者らは、ＬＦＭ−Ａ１３に構造的に関連しないＢＴＫ阻害剤が、培養肝臓細胞の全体的な代謝機能を増強しなかったことを発見したが、ＬＦＭ−Ａ１３に構造的におよび機能的に（少なくともＢＴＫ阻害に関して）類似する式ＩＩによる化合物が、全体的な薬物代謝の増強または肝機能もしくは分化の増強に対して、ＬＦＭＡ−１３に類似する効果を有し得ると考えられる。
【００３９】
したがって、本明細書において記載される組成物および方法の実施形態は、式ＩＩによる化合物を含む。実施形態では、式ＩＩのＲ１が（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルまたは（Ｃ１〜Ｃ３）シクロアルキルである。実施形態では、式ＩＩのＲ２がヒドロキシルまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシである。実施形態では、式ＩＩのＲ３がシアノである。実施形態では、式ＩＩのＲ４が水素または（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである。実施形態では、式ＩＩのｍが０である。実施形態では、式ＩＩのｎが２である。実施形態では、式ＩＩのＸがＢｒである。実施形態では、式ＩＩのＹが−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり、Ｒｃが（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである。
【００４０】
実施形態では、本明細書において記載される化合物および組成物が、式ＩＩの一部である式ＩＩＩ
【００４１】
【化３】
0006307515.tif 000004
【００４２】
（式中、
ｎおよびｍは、独立して、０〜２の整数であり、
Ｘは、ハロであり、
Ｙは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃまたは−ＯＲｃであり、
Ｒｃは、（ｉ）非置換もしくはハロにより置換された（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルまたは（ｉｉ）アリールである）
による化合物を含む。
【００４３】
実施形態では、式ＩＩＩのｍが０である。実施形態では、式ＩＩＩのｎが２である。実施形態では、式ＩＩのＸがＢｒである。実施形態では、式ＩＩのＹが−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり、Ｒｃが（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである。
【００４４】
実施形態では、本明細書において記載される化合物および組成物が、ＬＦＭＡ−１３、［α−シアノ−β−ヒドロキシ−β−メチル−Ｎ−（２，５−ジブロモフェニル）プロペンアミド］、式Ｉを含む。
【００４５】
式ＩおよびＩＩＩによる化合物を含む式ＩＩによる化合物は、肝臓細胞もしくは幹細胞などの細胞を培養するための組成物の構成成分として含むことができるか、または細胞培養培地に追加することができる。組成物は、任意の適した細胞培養培地中の構成成分として含むことができるか、または任意の適した細胞培養培地に追加することができる。式ＩＩによる化合物を含むまたは追加することができる細胞培養培地の非限定的な例は、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）；改変イーグル培地（ＭＥＭ）とも呼ばれるイーグル最小必須培地；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；およびその他同種のものを含む。
【００４６】
例として、肝臓細胞または幹細胞などの哺乳動物細胞を培養するための細胞培養組成物は、１つ以上のアミノ酸（および多くの場合、タンパク質が合成される２０種のアミノ酸すべて）；ヌクレオチドまたはＲＮＡもしくはＤＮＡまたは１つ以上のヌクレオチドの合成のためのヒポキサンチンなどの１つ以上のプリンおよびチミジンなどの１つ以上のピリミジン；コリンおよびイノシトールなどのリン脂質の合成のための１つ以上の前駆体；特に、補酵素の一部分として機能する１つ以上のビタミン；エネルギー源もしくは他の適したエネルギー源としてのグルコース；または塩を介して提供することができる、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、およびＣｏ２＋などの１つ以上の様々な無機イオンを含むことができる。好ましくは、組成物は、インビボ環境を模擬するｐＨおよび塩の濃度を有する。
【００４７】
細胞培養組成物はまた、抗生物質、タンパク質もしくはポリペプチド、血清、またはその他同種のものを含むことができる。実施形態では、細胞培養組成物が、既知組成の組成物である。本明細書において使用されるように、「既知組成の培地」は、組成が知られていない構成成分を含有していない細胞培養培地を意味する。既知組成の細胞培養培地は、様々な実施形態では、組成が知られていないタンパク質、ヒドロシレート（ｈｙｄｒｏｓｙｌａｔｅ）、またはペプチドを含有し得ない。いくつかの実施形態では、既知組成の培地が、組換え成長ホルモンなどの組成が知られているポリペプチドまたはタンパク質を含有する。既知組成の培地の構成成分がすべて知られている化学構造を有するため、培養条件におけるばらつき、したがって細胞応答におけるばらつきを低下させ、再現性を増加させることができる。そのうえ、混入の可能性を低下させる。さらに、スケールアップ機能が、少なくとも部分的に、上記に議論される因子により、より容易になる。
【００４８】
細胞培養培地は、任意の適した濃度で式ＩＩによる化合物を含むことができる。たとえば、全体的な薬物代謝を増強することが所望される場合、式ＩＩの化合物は、実質的に類似する条件において培養される細胞に比べて、２つ以上の薬物代謝酵素（たとえば上記に議論される）のレベルの増強を引き起こすのに有効な濃度で追加することができる。実施形態では、式ＩＩの化合物が、約２５０マイクロモル未満、約１００マイクロモル未満、約５０マイクロモル未満、または約２０マイクロモル未満など、約５００マイクロモル未満の濃度で組成物中に存在する。一般に、式ＩＩの化合物は、約０．００５マイクロモル超、約０．０１マイクロモル超、または０．０５マイクロモル超など、約０．００１マイクロモル超の濃度で組成物中に存在する。実施形態では、式Ｉの化合物が、約０．０１マイクロモル〜約５０マイクロモルまたは約１マイクロモル〜約２０マイクロモルもしくは約１０マイクロモルなど、約０．０５マイクロモル〜約１００マイクロモルの濃度で組成物中に存在する。
【００４９】
式ＩＩによる化合物は、任意の適した方法で細胞培養組成物に追加することができる。例として、式ＩＩによる化合物を含有する原液は、ＤＭＳＯまたはその他同種のものなどの適切な溶媒中に化合物を溶解することによって作製することができる。原液は、一度追加されたら、結果として生じる細胞培養培地の所望の濃度よりも任意の倍数高い濃度で作製することができる。例として、原液は、１０００倍の濃度の溶液、２０００倍の濃度の溶液、またはその他同種のものとすることができる。原液は、適切な所望の濃度を実現するために、市販で入手可能な培地または他の培地とすることができる細胞培養培地に追加することができる。次いで、調製した培地は、０．２マイクロメートルのフィルターを使用するろ過によってなど、任意の適したプロセスを介して滅菌することができる。培地は、直ちに使用するまたは必要に応じて、たとえば４℃で、保管することができる。
【００５０】
細胞は、式ＩＩの化合物を含むまたは式ＩＩの化合物が追加された細胞培養培地中で培養することができる。当技術分野において知られている細胞培養技術および手順を用いることができる。例として、細胞は、接種に先立って収集し、一度接種されたら、細胞が培養されることになっている培養培地などの適した培地中に懸濁することができる。たとえば、細胞は、式ＩＩの化合物を含有する培養培地または式ＩＩの化合物を後で追加することができる培養培地中に懸濁することができる。
【００５１】
細胞は、任意の適した濃度で接種することができる。典型的に、細胞は、用いられる細胞培養デバイスの表面積の約１０，０００細胞／ｃｍ２〜約５００，０００細胞／ｃｍ２で接種される。たとえば、細胞は、用いられる細胞培養デバイスの表面積の約５０，０００細胞／ｃｍ２〜約１５０，０００細胞／ｃｍ２で接種することができる。しかしながら、より高いおよびより低い濃度を容易に使用することができる。温度、ＣＯ２およびＯ２レベル、培養培地組成、ならびにその他同種のものなどのインキュベーション時間ならびに条件は、培養されている細胞の性質に依存し、容易に変更することができる。細胞が培養される時間は、所望の細胞応答に依存して変えることができる。
【００５２】
培養細胞は、（ｉ）治験研究または治療上の用法の開発、（ｉｉ）培養中の細胞の治験研究、（ｉｉｉ）治療上の用法の開発、（ｉｖ）治療目的、（ｖ）遺伝子発現の研究、（ｖｉ）薬剤および毒性スクリーニングの研究、ならびに（ｖｉｉ）その他同種のものを含む任意の適した目的に使用することができる。
【００５３】
式ＩＩによる化合物の存在は、肝臓細胞の一般的な機能を増強することができる、培養肝臓細胞の全体的な薬物代謝を増強することができる、肝細胞の分化もしくは維持を促進することができる、またはその他同種のことをすることができる。
【００５４】
実施形態では、培養細胞は、候補薬剤化合物の代謝を研究するために使用される。好ましくは、培養細胞は、初代ヒト肝細胞もしくは肝臓細胞株由来の細胞などの肝臓細胞または幹細胞に由来する細胞である。肝臓細胞の薬物代謝機能は、式ＩＩによる化合物の存在下において細胞を培養することによって増強することができる。候補化合物は、細胞培養物に追加することができ、候補化合物に対する薬物代謝の効果を試験することができる。薬物代謝の効果を決定するための任意の適した方法を用いることができる。例として、培養培地由来の上清は、候補化合物の追加の後に、除去し、培養によって生成された代謝物質の組成を決定するために、分析（たとえばＨＬＰＣ、ガスクロマトグラフ、質量分析法、ＮＭＲ、もしくはその他同種のものまたはその組合せ）にかけることができる。同定された代謝物質は、濃縮しまたは合成し、当技術分野において一般に知られている培養または動物における毒性について試験することができる。培養肝臓細胞に対する、候補化合物および培養の間に生成された任意の代謝物質の影響を研究することができる。たとえば、酵素アッセイ（たとえば薬物代謝酵素誘発について）、遺伝子発現（たとえばｍＲＮＡ分析）、毒性分析、またはその他同種のものを培養肝臓細胞に対して実行することができる。
【００５５】
候補化合物は、任意の適した時間に培養物に追加することができる。実施形態では、候補化合物は、細胞が、全体的な薬物代謝を増強するのに十分な時間、式ＩＩの化合物を含有する培地中でインキュベートされた後に、培養物に追加される。実施形態では、候補化合物は、細胞が、少なくとも約３０分間、式ＩＩによる化合物が存在下において培養された後に、細胞培養物に追加される。実施形態では、候補化合物および式ＩＩによる化合物は、同時に細胞に与えられる。たとえば、候補化合物は、式ＩＩによる化合物を含有する細胞培養培地に追加することができ、次いで、結果として生じる培地は、細胞を培養するために使用することができる。その代わりに、候補化合物および式ＩＩによる化合物は、同時に、細胞培養培地または細胞培養物に追加することができる。
【００５６】
実施形態では、細胞が、細胞のウイルス感染を促進するために、式ＩＩによる化合物を含む培地中で培養される。前記感染細胞は、抗ウイルス剤についてスクリーニングするために使用することができるか、またはワクチンを生成するために使用することができる。好ましくは、培養細胞は、初代ヒト肝細胞もしくは肝臓細胞株由来の細胞などの肝臓細胞または幹細胞に由来する細胞である。肝臓細胞の全体的な機能は、式ＩＩによる化合物の存在下において細胞を培養することによって増強することができる。ウイルスは、細胞培養物に追加することができ、ウイルスに対する化合物または化合物の存在下における細胞に対するウイルスの効果を評価することができる。ウイルスまたは化合物の効果を決定するための任意の適した方法を用いることができる。例として、感染率、感染密度、またはその他同種のものを決定することができる。細胞またはウイルス遺伝子発現、ｍＲＮＡ、またはタンパク質をアッセイすることができる。
【００５７】
実施形態では、細胞が、肝組織を導くために式ＩＩによる化合物を含む培地中で培養される。細胞は、初代肝細胞または幹細胞とすることができるか、またはそれを含むことができる。式ＩＩによる化合物の存在は、肝細胞への分化を容易にするか、または肝細胞機能を維持することが期待されるであろう。
【００５８】
実施形態では、細胞が、肝臓補助デバイス（たとえば、患者を肝移植に橋渡しするためのデバイス）を生成するためにまたは肝臓細胞移植において使用される細胞を生成するために、式ＩＩによる化合物を含む培地中で培養される。細胞は、初代肝細胞または幹細胞とすることができるか、またはそれを含むことができる。式ＩＩによる化合物の存在は、肝細胞への分化を容易にするか、または肝細胞機能を維持するもしくは増強することが期待されるであろう。
【００５９】
実施形態では、細胞が、肝細胞に由来する治療用タンパク質の発現を増強するために式ＩＩによる化合物を含む培地中で培養される。治療用タンパク質は、培養物から単離し、治療目的に使用することができる。式ＩＩによる化合物の存在下において発現を増強することができる肝細胞に由来する治療用タンパク質の例は、アルブミン、フィブリノーゲン、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体、糖タンパク質などを含むが、これらに限定されない。そのような肝細胞に由来する治療用タンパク質を発現するための式ＩＩによる化合物の存在下において培養された細胞は、初代肝細胞または幹細胞とすることができるか、またはそれを含むことができる。
【００６０】
実施形態では、幹細胞が、肝細胞への分化を容易にするまたは肝細胞機能を維持するために、式ＩＩによる化合物を含有する培地中で培養される。
【００６１】
組成物および方法の多くの実施形態が、本明細書において記載される。そのような組成物および方法の選択される態様の要約を下記に提供する。
【００６２】
第１の態様では、細胞を培養するための組成物が、式ＩＩ
【００６３】
【化４】
0006307515.tif 000005
【００６４】
（式中、
Ｒ１は、（ｉ）（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（ｉｉ）（Ｃ１〜Ｃ３）シクロアルキル、（ｉｉｉ）ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃ、もしくはＮＲａＲｂから独立して選択される１つ以上の置換基により任意選択で置換されたフェニル、または（ｉｖ）ＮＲａＲｂであり；
Ｒ２は、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカノキシアミノ（Ｃ２〜Ｃ５）アルコキシ；ヒドロキシ（Ｃ２〜Ｃ５）アルコキシアミノ（Ｃ２〜Ｃ５）アルカノキシ、またはヒドロキシル（Ｃ２〜Ｃ５）アルカノキシであり；
Ｒ３は、シアノまたは（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノイルであり；
Ｒ４は、水素、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキル、ヒドロキシル（Ｃ２〜Ｃ５）アルキル、またはアミノ（Ｃ２〜Ｃ５）アルキルであり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ、独立して、水素もしくは（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルであるか、またはＲａおよびＲｂは、それらが結合した窒素が加わって、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、もしくはチオモルホリノであり；
ｎおよびｍは、独立して、０〜２の整数であり；
Ｘは、ハロであり；
Ｙは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃまたは−ＯＲｃであり；
Ｒｃは、（ｉ）非置換もしくはハロにより置換された（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルまたは（ｉｉ）アリールである）
の構造を有する化合物を含む。組成物はまた、細胞のためのエネルギー源、アミノ酸、ビタミン、またはその他同種のものなどの細胞培養の１つ以上の構成成分を含むことができる。化合物は、培養肝臓細胞の代謝機能を増強するのに十分な量で組成物中に存在することができる。
【００６５】
第２の態様は、化合物が式ＩＩＩ
【００６６】
【化５】
0006307515.tif 000006
【００６７】
（式中、
ｎおよびｍは、独立して、０〜２の整数であり、
Ｘは、ハロであり、
Ｙは、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃまたは−ＯＲｃであり、
Ｒｃは、（ｉ）非置換もしくはハロにより置換された（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルまたは（ｉｉ）アリールである）
の構造を有する、第１の態様による組成物組成物である。
【００６８】
第３の態様は、ｍが０である、第１または第２の態様による組成物である。
【００６９】
第４の態様は、ｎが２である、第１〜第３の態様のいずれかによる組成物である。
【００７０】
第５の態様は、化合物がＬＦＭ−Ａ１３である、第１の態様による組成物である。
【００７１】
第６の態様は、化合物が約０．１マイクロモル〜約５０マイクロモルの濃度で組成物中に存在する、第１〜第５の態様のいずれかによる組成物である。
【００７２】
第７の態様は、化合物が約１マイクロモル〜約２０マイクロモルの濃度で組成物中に存在する、第１〜第５の態様のいずれかによる組成物である。
【００７３】
第８の態様は、組成物が血清を含む、第１〜第７の態様のいずれかによる組成物である。
【００７４】
第９の態様は、組成物が血清を含まない、第１〜第７の態様のいずれかによる組成物である。
【００７５】
第１０の態様は、肝臓細胞をさらに含む、第１〜第９の態様のいずれかによる組成物である。
【００７６】
第１１の態様は、肝臓細胞が肝細胞である、第１０の態様による組成物である。
【００７７】
第１２の態様は、肝細胞が初代肝細胞である、第１１の態様による組成物である。
【００７８】
第１３の態様は、幹細胞に由来する肝細胞をさらに含む、第１〜第１２の態様のいずれかによる組成物である。
【００７９】
第１４の態様は、第２の化合物をさらに含み、第２の化合物は、候補化合物であって、その代謝物質が分析されることが所望される候補化合物である、第１〜第１３の態様のいずれかによる組成物である。
【００８０】
第１５の態様は、培養肝臓細胞に感染することができるウイルスをさらに含む、第１〜第１４の態様のいずれかによる組成物である。
【００８１】
第１６の態様は、培養中の肝臓細胞の代謝機能を増強する方法において：（ｉ）第１〜第９の態様のいずれかによる組成物中で肝臓細胞を培養するステップであって、化合物は、実質的に類似するが、式ＩＩによる化合物を欠く培地中で培養された肝臓細胞に比べて、培養肝臓細胞における２つ以上のＣＹＰ酵素のレベルを増強するのに有効な量で存在するステップを有してなる方法である。
【００８２】
第１７の態様は、肝臓細胞が肝細胞である、第１６の態様による方法である。
【００８３】
第１８の態様は、肝細胞が初代肝細胞である、第１７の態様による方法である。
【００８４】
第１９の態様は、肝臓細胞が分化幹細胞である、第１６の態様による方法である。
【００８５】
第２０の態様は、肝臓細胞から分泌された組成物タンパク質から単離するステップをさらに含む、第１６〜第１９の態様のいずれかによる方法である。
【００８６】
第２１の態様は、培養物から肝臓細胞を単離するステップおよび肝臓補助デバイスに細胞を組み込むステップをさらに含む、第１６〜第１９の態様のいずれかによる方法である。
【００８７】
第２２の態様は、培養物から肝臓細胞を単離するステップおよびその必要がある対象の肝臓に単離された細胞を移植するステップをさらに含む、第１６〜第１９の態様のいずれかによる方法である。
【００８８】
第２３の態様は、候補化合物の代謝物質を同定する方法において：（ｉ）第１〜第９の態様のいずれかによる組成物中で肝臓細胞を培養するステップであって、化合物は、実質的に類似するが、式ＩＩによる化合物を欠く組成物中で培養された肝臓細胞に比べて、培養肝臓細胞における２つ以上のＣＹＰ酵素のレベルを増強するのに有効な量で存在するステップ；（ｉｉ）培養細胞を候補化合物と接触させるステップ；および（ｉｉｉ）候補化合物の代謝物質を同定するステップを有してなる方法である。
【００８９】
第２４の態様は、肝臓細胞が、培養細胞を候補化合物と接触させる前に、薬物代謝酵素レベルを増強するのに十分な期間、第１〜第９の態様のいずれかによる組成物中で培養される、第２３の態様による方法である。
【００９０】
第２５の態様は、肝臓細胞が、培養細胞を候補化合物と接触させる前に、約３０分間、第１〜第９の態様のいずれかによる組成物中で培養される、第２３または第２４の態様による方法である。
【００９１】
第２６の態様は、肝臓細胞が肝細胞である、第２３〜第２５の態様のいずれかによる方法である。
【００９２】
第２７の態様は、肝細胞が初代肝細胞である、第２６の態様による方法である。
【００９３】
第２８の態様は、肝細胞への幹細胞の分化を促進する方法において、第１〜第９の態様のいずれかによる組成物中で幹細胞を培養するステップを有してなる方法である。
【００９４】
以下において、全体的な肝機能を増強するための代表的な組成物および方法の様々な実施形態を記載する非限定的な実施例が示される。
【実施例】
【００９５】
実施例１：培養肝臓細胞のＣＹＰ酵素レベルに対するＬＦ、ＬＦＭ、およびＬＦＭ−Ａ１３の効果
初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２の機能に対するレフルノミド（ＬＥＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ−１３（ＬＦＭＡ−１３）の効果を試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルコントロール、１０μＭ  ＬＦ、１０μＭ  ＬＦＭ、および１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有するＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地とインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２酵素アッセイをＰｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイキットを使用して実行する。アッセイ結果は、同じウェルにおいてＡＴＰレベルに対して標準化する。結果を図１に示す。
【００９６】
図１に示されるように、ＬＥＦは、ＣＹＰ３Ａ４活性に対して効果がほとんどないが、ＣＹＰ１Ａ２活性を約１２倍、増加させ、ＬＥＦがＣＹＰ１Ａ２誘発因子であることを示す文献の報告と一致する。ＬＦＭは、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２活性に対して効果がほとんどない。ＬＦＭ−Ａ１３は、ＣＹＰ３Ａ４活性において最も大きな増加をもたらし（約４倍増加）、またＣＹＰ１Ａ２活性をも増強した（約３倍）。
【００９７】
ＣＹＰ３Ａ４活性に対するこれらの化合物の効果はまた、肝臓細胞株に対しても試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養するＨｅｐａＲＧ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣｏｒｎｉｎｇ肝臓細胞株を、それぞれ、ビヒクルコントロール、１０μＭレフルノミド（ＬＦ）、１０μＭ  ＬＦＭ、および１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有する培地とインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、ＣＹＰ３Ａ酵素アッセイをＰｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイキットを使用して実行する。アッセイ結果は、同じウェルにおいてＡＴＰレベルに対して標準化する。結果を図２に示す。
【００９８】
図２に示されるように、肝臓細胞株におけるＣＹＰ３Ａ４活性に対する化合物の効果は、初代ヒト肝細胞における効果に類似する（図１を図２と比較する）。
【００９９】
異なる培地中で培養した初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４機能に対するＬＦＭ−Ａ１３の効果を試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルおよび１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有する５つの異なる培地（４つの市販で入手可能な肝細胞培地およびＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地）とインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、ＣＹＰ３Ａ酵素アッセイをＰｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイキットを使用して実行する。アッセイ結果は、同じウェルにおいてＡＴＰレベルに対して標準化する。結果を図３に示す。
【０１００】
図３に示されるように、ＬＦＭＡ−１３は、試験した細胞培養培地の５つすべてにおいて培養した細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を増加させた。
【０１０１】
基本的なおよび誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性に対するレフルノミド（ＬＥＦ）、レフルノミド代謝物質（ＬＦＭ）、およびレフルノミド代謝物質アナログＡ−１３（ＬＦＭＡ−１３）の効果について調査する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルコントロール、１０μＭ  ＬＦ、１０μＭ  ＬＦＭ、および１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有するＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地と、知られているＣＹＰ３Ａ４誘発因子である、２５μＭのリファンピンの存在下または非存在下においてインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、ＣＹＰ３Ａ酵素アッセイをＰｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイキットを使用して実行する。アッセイ結果は、同じウェルにおいてＡＴＰレベルに対して標準化する。結果を図４に示す。
【０１０２】
図４に示されるように、ＬＥＦもＬＦＭも、基本的なまたは誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性に対する効果をあまり有していない。対照的に、ＬＭＦ−Ａ１３は、基本的なおよび誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性を増加させた。ＬＦＭＡ−１３が誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性を増加させたことは、ＬＦＭＡ−１３が、単に遺伝子発現の誘発因子としてのものであるだけではないメカニズムによって全体的な薬物代謝を増強することを示唆する。理論によって拘束されることを意図するものではないが、低濃度のＬＦＭＡ−１３（たとえば約５マイクロモル未満）は、リン酸化など、翻訳後の制御的な（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌ）安定効果を有することができると考えられる。さらに理論によって拘束されることを意図するものではないが、より高濃度（たとえば約５マイクロモル）で、ＬＦＭＡ−１３は、薬物代謝酵素の遺伝子発現を誘発することもまた、考えられる。
【０１０３】
様々な濃度のＬＦＭ−Ａ１３の効果を、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４の基本的なおよび誘発性の活性について試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルコントロール、２０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、５μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、２．５μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、１．２５μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、０．６３μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、０．３２μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３、および０．１６μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有するＭＦＥ培地と、知られているＣＹＰ３Ａ４誘発因子である、２５μＭのリファンピンの存在下もしくは非存在下においてまたは知られているＣＹＰ１Ａ２誘発因子である、１００μＭのオメプラゾールの存在下もしくは非存在下においてインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２酵素アッセイをＰｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイキットを使用してそれぞれ実行する。アッセイ結果は、同じウェルにおいてＡＴＰレベルに対して標準化する。結果を図５Ａ〜５Ｂに示す。
【０１０４】
図５Ａ〜５Ｂに示されるように、ＬＦＭ−Ａ１３は、基本的なおよび誘発性のＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４活性の両方を増強した。基本的な活性は、誘発性の活性の増強よりもわずかに高い濃度でより大いに増強される。
【０１０５】
遺伝子発現に対するＬＥＦ、ＬＦＭ、およびＬＦＭ−Ａ１３の効果について試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルコントロール、１０μＭ  ＬＥＦ、１０μＭ  ＬＦＭ、および１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有するＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地とインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、全ＲＮＡを単離し、相対的ｍＲＮＡレベルはリアルタイムＰＣＲを使用して定量化する。結果を図６に示し、ここで、ＣＹＰはシトクロムＰ４５０酵素であり、ＳＵＬＴはスルホトランスフェラーゼであり、ＵＧＴはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼであり、ＡＢＣはＡＴＰ結合カセットトランスポーターであり、ＡＨＲはアリール炭化水素受容体であり、ＣＡＲは構成的アンドロステン受容体であり、ＰＸＲはプレグネノロンｘ−受容体である。
【０１０６】
図６において示されるように、ＬＦＭ−Ａ１３は、試験したＣＹＰ酵素のすべて（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、およびＣＹＰ３Ａ４）、ならびにＵＧＴ１Ａ１、ＡＢＣトランスポーターのいくつか、およびＡＨＲのｍＲＮＡレベルを大いに増加させ、ＬＦＭ−Ａ１３が肝機能を広く増強することを示唆した。
【０１０７】
種々様々の薬物代謝酵素および初代ヒト肝細胞の他のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに対するＬＦＭＡ−１３の効果について試験する。手短に言えば、コラーゲンＩコート表面上で培養した初代ヒト肝細胞を、それぞれ、ビヒクルコントロールおよび１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３を含有するＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地とインキュベートする。４８時間のインキュベーションの終わりに、全ＲＮＡを単離し、相対的ｍＲＮＡレベルはリアルタイムＰＣＲを使用して定量化する。結果を図７に示し、ここで、ＡＢＣはＡＴＰ結合カセットトランスポーターであり、ＣＹＰはシトクロムＰ４５０酵素であり、ＳＬＣは、溶質輸送体トランスポーターであり、ＳＵＬＴはスルホトランスフェラーゼであり、ＵＧＴはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼであり、ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり、ＡＨＲはアリール炭化水素受容体であり、ＦＯＸＯはフォークヘッドボックス受容体であり、ＨＮＦは肝臓核内因子であり、ＮＣＯは核内受容体コアクチベーターであり、ＮＲは核内受容体であり、ＰＰＡＲＧＣ１Ａはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１−アルファであり、ＲＸＲはレチノイドＸ受容体であり、ＶＤＲはビタミンＤ受容体である。
【０１０８】
図７に示されるように、ＬＦＭＡ−１３は肝細胞機能を増強する全体的な効果を有するように思われる。種々様々の薬物代謝酵素は、多くのＣＹＰを含めて、ＬＦＭＡ−１３の存在下においてレベルの増加を示す。多くの他の肝臓ｍＲＮＡの多くのレベルもまた、ＬＦＭＡ−１３の存在下において増加する。これらの結果は、培養肝臓細胞に対するＬＦＭ−Ａ１３の広範な効果について確認するものである。
【０１０９】
肝臓細胞に対する薬物代謝活性に対する効果を、テレイン酸およびＢＴＫ  ｓｉＲＮＡなどの他のＢＴＫ阻害剤について試験する。ＬＦＭ−Ａ１３により見られた肝機能の広範な増強は、これらの構造的に関連しないＢＴＫ阻害剤により観察されない。
【０１１０】
そのうえ、ＬＦＭ−Ａ１３がまたＰｏｌｏ様キナーゼ（ＰＬＫ）阻害剤でもあるため、全体的な肝機能を増強するためにＰＬＫ  ｍＲＮＡに向けられるｓｉＲＮＡの能力について評価する。ＬＦＭ−Ａ１３に構造的に関連しないＢＴＫ阻害剤に類似して、Ｐｏｌｏ様キナーゼｓｉＲＮＡは全体的な肝臓の増強をもたらさなかった。
【０１１１】
ＣＹＰ３Ａ４酵素活性に対する、ＢＴＫ、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、およびＰＬＫ４に向けられるｓｈＲＮＡの効果の結果を図８に示す。
【０１１２】
実施例２：肝細胞への幹細胞の分化に対するＬＦＭ−Ａ１３の効果
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する肝細胞に対するＬＦＭ−Ａ１３の効果について評価する。手短に言えば、ｈＥＳＣを、当業者に知られている方法を使用して肝細胞系列にコミットさせ、次いで、１０μＭ  ＬＦＭ−Ａ１３の存在下または非存在下においてＣｏｒｎｉｎｇ肝細胞培地中で培養する。７日後に、幹細胞に由来する肝細胞は、肝細胞タンパク質の発現を検出するために；（ｂ）肝臓前駆体マーカーであるアルブミン（ＡＬＢ）の存在について試験するために；ならびに（ｃ）ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのスーパーファミリーのメンバーおよび肝機能についてマーカーである多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）の存在について試験するために、一次抗体により免疫染色する。細胞の核は、すべての細胞を視覚化するために４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）により対比染色する（図ａ）。免疫染色の結果を図９に示す。示されるように、ＬＦＭ−Ａ１３の非存在下において培養されたｈＥＳＣ（左の列）は、低レベルの肝臓マーカー（ＡＬＢおよびＭＲＰ２）を有する。対照的に、ＬＦＭ−Ａ１３の存在下において培養されたｈＥＳＣ（右の列）は、より高いレベルの肝臓マーカー（ＡＬＢおよびＭＲＰ２）を有する。ＬＦＭ−Ａ１３が肝細胞へのｈＥＳＣの分化、維持、または機能を容易にしたことを示す。
【０１１３】
リファンピシン誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性および様々な肝臓マーカーのｍＲＮＡ発現に対するＬＦＭ−Ａ１３の効果もまた、分化ｈＥＳＣに対して決定する。図１０に示されるように、リファンピン誘発性のＣＹＰ３Ａ４活性は、ＬＦＭ−Ａ１３の存在によって大いに増強される。図１１に示されるように、ＬＦＭ−Ａ１３は、多くの肝臓マーカーの発現を増強した。図１１において、ＡＬＢはアルブミンであり、ＡＦＰはアルファ−フェトプロテインであり、ＣＹＰ３Ａ４はシトクロムｐ４５０  ３Ａ４であり、ＣＹＰ７Ａ１はシトクロムｐ４５０  ７Ａ１であり、ＰＧＣ１ａはグルココルチコイド受容体コアクチベーター−１ａである（ＣＯＬ＝コラーゲンＩコートプレート；ＭＯＬ＝Ｍａｔｒｉｇｅｌオーバーレイ）。
【０１１４】
このように、肝細胞機能の増強のための細胞培養培地についての実施形態が開示される。当業者は、本明細書において記載される化合物、組成物、および方法が、開示されたもの以外の実施形態により実施することができることを理解するであろう。開示される実施形態は、限定ではなく説明の目的のために示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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