(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）中鎖トリグリセリド、オイル及びレシチンを含む脂質構造物；及び
（ｂ）薬剤学的活性成分としてリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を含み、
前記中鎖トリグリセリド：前記オイル：前記レシチンの重量比が、１：０．５〜３：２〜１０であることを特徴とする脂質ナノ物質。
【請求項２】
前記リゾホスファチジルコリンが、下記化学式１で表され、前記エーテル誘導体が、下記化学式２で表される請求項１に記載の脂質ナノ物質。
［化学式１］
【化１】
0006259474.tif 000010
前記式で、Ｒ１は、Ｃ４−３０のアルキルであるか、１つ又はそれ以上の二重結合を有したＣ４−３０のアルケニルであり、
［化学式２］
【化２】
0006259474.tif 000011
前記式で、Ｒ２は、Ｃ４−３０のアルキルであるか、１つ又はそれ以上の二重結合を有したＣ４−３０のアルケニルである。
【請求項３】
前記リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体と脂質構造物の重量比が、１：１〜５０である請求項１に記載の脂質ナノ物質。
【請求項４】
前記脂質ナノ物質が、１〜１，０００ｎｍのサイズを有するナノ粒子である請求項１に記載の脂質ナノ物質。
【請求項５】
前記脂質ナノ物質が、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体に比べて、（ｉ）溶解度の向上、（ｉｉ）毒性の減少、（ｉｉｉ）赤血球溶血現象の減少、又は（ｉｖ）赤血球凝集現象の減少を示す請求項１に記載の脂質ナノ物質。
【請求項６】
次の工程を含むことを特徴とするリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体−含有脂質ナノ物質の製造方法：
（ａ）リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を水相溶媒、中鎖トリグリセリド、オイル及びレシチンと混合して脂質混合物溶液を得る工程であって、前記中鎖トリグリセリド：前記オイル：前記レシチンの重量比が、１：０．５〜３：２〜１０である工程；
（ｂ）工程（ａ）の脂質混合物溶液を均質化する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で均質化した脂質混合物溶液のｐＨを３〜７に調節する工程；そして、
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨが調節された脂質混合物溶液をエマルジョン化してナノサイズの脂質ナノ物質を形成する工程。
【請求項７】
前記工程（ａ）では、脂質混合物溶液をホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）に投入して２，０００〜１０，０００ｒｐｍで均質化する請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
次の工程を含むことを特徴とするリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の毒性を減少させる方法：
（ａ）リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を水相溶媒、中鎖トリグリセリド、オイル及びレシチンと混合して脂質混合物溶液を得る工程であって、前記中鎖トリグリセリド：前記オイル：前記レシチンの重量比が、１：０．５〜３：２〜１０である工程；
（ｂ）工程（ａ）の脂質混合物溶液を均質化する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で均質化した脂質混合物溶液のｐＨを３〜７に調節する工程；そして、
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨが調節された脂質混合物溶液をエマルジョン化してナノサイズの脂質ナノ物質を形成する工程。
【請求項９】
次の工程を含むことを特徴とするリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の赤血球溶血現象又は赤血球凝集現象を減少させる方法：
（ａ）リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を水相溶媒、中鎖トリグリセリド、オイル及びレシチンと混合して脂質混合物溶液を得る工程であって、前記中鎖トリグリセリド：前記オイル：前記レシチンの重量比が、１：０．５〜３：２〜１０である工程；
（ｂ）工程（ａ）の脂質混合物溶液を均質化する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で均質化した脂質混合物溶液のｐＨを３〜７に調節する工程；そして、
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨが調節された脂質混合物溶液をエマルジョン化してナノサイズの脂質ナノ物質を形成する工程。
【請求項１０】
（ａ）請求項１から５のいずれかに記載の脂質ナノ物質の薬剤学的有効量；及び
（ｂ）薬剤学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする経口又は非経口投与用の薬剤学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体−含有脂質ナノ物質、その製造方法、該化合物の赤血球溶血現象と凝集現象とを減少させる方法、そして、該脂質ナノ物質を含む薬剤学的製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＬＰＣ）は、酸化低密度リポタンパク質の主要構成成分であって、単核球、貪食細胞、及び中性好性白血球を含んだ多様な免疫担当細胞を活性化させて、敗血症に比較的有用な効果を示すことが知られている。また、腹膜炎動物モデルと盲腸結紮及び穿孔（Ｃｅｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｎｃｔｕｒｅ、ＣＬＰ）動物モデルとでＬＰＣ投与によって腹膜炎に起因した死亡率が有意に抑制され、先天性免疫増強作用によって、腹膜炎、肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、骨髄炎などを含めた多様な細菌性感染疾患の治療に効果があるということが知られている（特許文献１、特許文献２）。また、ＬＰＣは、急性呼吸困難症候群及び多発性臓器不全の治療剤として使われ得るということが知られている（特許文献３）。
【０００３】
しかし、ＬＰＣ化合物は、水相媒質（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）に対する溶解度が非常に低くて、滅菌水、注射用水、脱イオン水、及び緩衝溶媒のような医薬品製造用水相に溶解して、投与時に、体内利用率が低いか、ＬＰＣ化合物が可溶化された製剤であるとしても、体内投与直後、体液及び組織から析出されるなど安定した薬剤学的製剤の開発に限界があった。また、ＬＰＣ化合物は、赤血球の溶血及び凝集を誘導し（非特許文献１）、動物実験で皮下投与時に、著しいＬＰＣ自体の局所刺激性が表われ（非特許文献２）、それを克服するための新たな剤形の開発が要求される。
【０００４】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０８４２１６０号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０８４９４４８号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０８４２１５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｎａｋａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４（３）：８３３−４０（１９８３）
【非特許文献２】Ｒｙｂｏｒｇ  ＡＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．８０（４）：２４２−６（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、リゾホスファチジルコリンが示す低溶解度の問題、局所刺激性の問題、及び赤血球溶血と凝集現象の問題とを解消するために研究努力した。その結果、リゾホスファチジルコリンを脂質ナノ物質の形態に剤形化し、前記脂質ナノ物質剤形が局所刺激性を示さないということを動物実験を通じて確認し、リゾホスファチジルコリンの赤血球溶血及び凝集現象を著しく改善させ得るということを確認することによって、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を含む脂質ナノ物質を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記脂質ナノ物質の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の毒性を減少させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の赤血球溶血現象又は凝集現象を減少させる方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を含む経口又は非経口投与用の薬剤学的製剤を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によれば、本発明は、（ａ）トリグリセリド、オイル及びレシチンを含む脂質構造物；及び（ｂ）薬剤学的活性成分としてリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を含む脂質ナノ物質を提供する。
【００１５】
本発明者らは、リゾホスファチジルコリンが表わす低溶解度の問題、局所刺激性の問題、及び赤血球溶血と凝集現象の問題とを解消するために研究努力した。その結果、リゾホスファチジルコリンを脂質ナノ物質の形態に剤形化し、前記脂質ナノ物質剤形が局所刺激性を示さないということを動物実験を通じて確認し、リゾホスファチジルコリンの赤血球溶血及び凝集現象を著しく改善させ得るということを確認した。
【００１６】
本明細書で使われた用語“脂質構造物（ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）”は、トリグリセリド、オイル及びレシチンを含む脂質混合物を使って製造されたナノサイズの物質（例えば、ナノ粒子）を意味し、用語“脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌ）”は、前記脂質構造物とリゾホスファチジルコリン又はその誘導体とをいずれも含むナノサイズの物質を意味する。前記脂質ナノ物質は、ナノサイズを有する物質であれば、形態及び形状は、特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明の一具現例によれば、前記脂質ナノ物質は、脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）である。１つの特定例で、前記脂質ナノ粒子は、１〜１，０００ｎｍの直径を有し、他の特定例では、１〜５００ｎｍの直径を有し、さらに他の特定例では、２０〜２００ｎｍの直径を有し、さらに他の特定例では、５０〜２００ｎｍの直径を有する。前記脂質ナノ粒子のサイズが１ｎｍ未満であれば、薬物封入率が低下し、サイズが１，０００ｎｍを超過すれば、注射剤として使いにくい。
【００１８】
本発明の一具現例によれば、本発明の脂質構造物（あるいは、脂質ナノ物質）は、エマルジョン相のナノ粒子である。
【００１９】
本発明の一具現例によれば、前記脂質構造物の構成成分において、トリグリセリド及びオイルは、脂質構造物（あるいは、脂質ナノ物質）の構造を形成する脂質成分であり、レシチンは、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）である。
【００２０】
本発明の一具現例によれば、前記トリグリセリドは、中鎖トリグリセリド（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＭＣＴ）であり得る。前記中鎖トリグリセリドは、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）のＣ６〜Ｃ１２脂肪酸エステル化合物である。本発明で使える中鎖トリグリセリドは、Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１２（Ｃａｐｒｙｌｉｃ／Ｃａｐｒｉｃ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１８（Ｃａｐｒｙｌｉｃ／Ｃａｐｒｉｃ／Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８２９（Ｃａｐｒｙｌｉｃ／Ｃａｐｒｉｃ／Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、及びこれらの組合せを含む。
【００２１】
本発明の一具現例によれば、前記オイルは、植物性オイルである。本発明で使用可能な植物性オイルは、大豆油、ヤシ油、油菜油、ヒマワリ種子油、ピーナッツオイル、綿花種子オイル、ヤシ核油、ココナッツ油、ケシ種子オイル、紅花油、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、カノーラ油、及びこれらの組合せを含む。
【００２２】
本発明の一具現例によれば、前記レシチンは、エッグレシチン、大豆油レシチン、Ｎｏｎ−ＧＭＯレシチン、菜種（ｒａｐｅｓｅｅｄ）レシチン、ヒマワリレシチン、リゾレシチン（Ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）、及びこれらの組合せを含む。
【００２３】
本発明の一具現例によれば、前記脂質構造物は、その構造を形成するリン脂質、脂質構造物が互いに凝集されることを防止するイオン性脂質、又は脂質構造物の構造を安定化する安定化剤をさらに含み得る。
【００２４】
１つの特定例によれば、前記脂質構造物に添加することができるリン脂質は、任意のリン脂質又はリポソームを形成することができるリン脂質の組合せ体である。例えば、卵、大豆、又はその他の植物源から得られた天然リン脂質、半合成リン脂質又は合成リン脂質を含むホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、脂質鎖の長さが多様なリン脂質、及び不飽和リン脂質が本発明で使われる。具体的に、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（Ｓｏｙ  ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ  ＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びこれらの組合せで構成された群から選択される１つ以上を使うことができる。
【００２５】
１つの特定例によれば、前記脂質構造物に添加することができるイオン性脂質は、陰イオン性脂質又は陽イオン性脂質である。前記陰イオン性脂質の例としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジラウリルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジラウリルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、及びこれらの組合せが挙げられる。また、前記陽イオン性脂質の例としては、ジオレイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルオクタデシアンモニウム（ＤＭＯＡ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアルキルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＸＤＡＢ）、ジアルキルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＸＴＡＰ）、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００２６】
１つの特定例によれば、前記脂質構造物に添加することができる安定化剤は、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）である。
【００２７】
本発明の一具現例によれば、前記脂質構造物のトリグリセリド：オイル：レシチンの重量比は、１：０．５〜１０：１〜１５であり得る。１つの特定例で、前記重量比は、１：０．５〜３：２〜１０であり、他の特定例では、１：０．５〜２：２〜５である。
【００２８】
本発明の脂質ナノ物質は、薬剤学的活性成分としてリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を含む。前記リゾホスファチジルコリン又は誘導体は、敗血症、細菌性感染疾患（例えば、腹膜炎、肺炎）、急性呼吸困難症候群、及び多発性臓器不全などの疾病（疾患）に効果があると知られている。
【００２９】
本発明の一具現例によれば、前記リゾホスファチジルコリンは、下記化学式１で表される。
［化学式１］
【化１】
0006259474.tif 000002
【００３０】
前記式で、Ｒ１は、Ｃ４−３０のアルキルであるか、１つ又はそれ以上の二重結合を有したＣ４−３０のアルケニルである。
【００３１】
１つの特定例によれば、前記化学式１で表されるリゾホスファチジルコリンは、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、ステアロイル；Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、ミリストイル；Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、パルミトイル；ＤＬ−α−リゾホスファチジルコリン、パルミトイル；及びＬ−α−リゾホスファチジルコリン、オレオイルで構成された群から選択される。
【００３２】
本発明の一具現例によれば、前記リゾホスファチジルコリンのエーテル誘導体は、下記化学式２で表される。
［化学式２］
【化２】
0006259474.tif 000003
【００３３】
前記式で、Ｒ２は、Ｃ４−３０のアルキルであるか、１つ又はそれ以上の二重結合を有したＣ４−３０のアルケニルである。
【００３４】
１つの特定例によれば、前記化学式２で表されるリゾホスファチジルコリンの類似体は、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、γ−Ｏ−アルク−１−エニル；Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、γ−Ｏ−アルキル；ＤＬ−α−リゾホスファチジルコリン、γ−Ｏ−ヘキサデシル；及びＬ−α−リゾホスファチジルコリン、γ−Ｏ−ヘキサデシルで構成された群から選択される。
【００３５】
本発明の一具現例によれば、前記リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体と脂質構造物の重量比は、１：１〜５０であり得る。１つの特定例で、前記重量比は、１：１〜１０であり、他の特定例では、１：３〜７である。
【００３６】
本発明の一具現例によれば、前記脂質ナノ物質は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体に比べて、（ｉ）溶解度の向上、（ｉｉ）毒性の減少、（ｉｉｉ）赤血球溶血現象の減少、及び／又は（ｉｖ）赤血球凝集現象の減少の特性を有する。
【００３７】
本発明の他の様態によれば、本発明は、（ａ）前記脂質ナノ物質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容可能な担体を含む経口又は非経口投与用の薬剤学的製剤を提供する。
【００３８】
本発明による脂質ナノ物質は、多様な経口又は非経口投与の形態に剤形化され得る。経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、硬／軟質カプセル剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）などがあり、これら剤形は、前記有効成分以外に通常使われる充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤のような薬剤学的に許容可能な担体を１種以上使って製造可能である。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００３９】
前記崩壊剤としては、寒天、澱粉、アルギン酸又はそのナトリウム塩、無水リン酸一水素カルシウム塩などが使われ、滑沢剤としては、シリカ、タルク、ステアリン酸又はそのマグネシウム塩又はカルシウム塩、ポリエチレングリコールなどが使われ、結合剤としては、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリジン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが使われる。それ以外にも、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどを希釈剤として使い、場合によっては、一般的に知られた沸騰混合物、吸収剤、着色剤、香味剤、甘味剤などを共に使うことができる。
【００４０】
本発明による薬剤学的製剤は、非経口投与され、非経口投与は、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤又は胸部内注射剤を注入する方法、又は経皮吸収剤によって経皮投与する方法を含む。この際、注射剤に製剤化するためには、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を安定剤又は緩衝剤と共に水で混合して溶液又は懸濁液に製造し、それをアンプル又はバイアルの単位投与型に製造することができる。また、経皮吸収剤に製剤化するためには、薬物保護層、薬物貯蔵層、放出速度調節膜、及び粘着剤などで構成されるパッチ型の薬物貯蔵層に貯蔵させて製剤化され得る。
【００４１】
前記薬剤学的製剤は、滅菌されるか、又は防腐剤、安定化剤又は浸透圧調節のための塩、緩衝剤などの補助剤、及びその他の治療的に有用な物質を含有し、通常の方法である混合、顆粒化又はコーティング方法によって製剤化され得る。必要な場合、本発明の薬剤学的製剤は、その他の薬剤、例えば、他の敗血症治療剤と併用投与することもできる。
【００４２】
前記薬剤学的製剤は、水相の溶媒（水）を含み得る。
【００４３】
本発明の薬剤学的製剤を単位容量の形態に剤形化する場合、有効成分としてリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を約０．１〜１，５００ｍｇの単位容量で含有させ得る。適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的（傷）状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。成人治療に必要な投与量は、投与の頻度と強度とによって一日に約１〜５００ｍｇの範囲が通常である。成人に筋肉内又は静脈内投与時に、１回投与量に分離して、一日に通常約５〜３００ｍｇの全体投与量であれば、十分であるが、一部患者の場合、さらに高い一日投与量が望ましい。
【００４４】
また、本発明による薬剤学的製剤は、エチレンジアミン四酢酸、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、α‐トコフェロール、β‐トコフェロール、γ−トコフェロール、及びδ−トコフェロールなどの通常使われる抗酸化剤を含み得る。さらに、本発明による薬剤学的製剤は、スクロース、マンニトールなどの通常使われる張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含み得る。
【００４５】
本発明の他の様態によれば、本発明は、次の工程を含むリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体−含有脂質ナノ物質の製造方法を提供する：
（ａ）リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を水相溶媒、トリグリセリド、オイル及びレシチンと混合して脂質混合物溶液を得る工程；（ｂ）工程（ａ）の脂質混合物溶液を均質化する工程；（ｃ）工程（ｂ）で均質化した脂質混合物溶液のｐＨを３〜７に調節する工程；そして、（ｄ）工程（ｃ）でｐＨが調節された脂質混合物溶液をエマルジョン化してナノサイズの脂質ナノ物質を形成する工程。
【００４６】
本発明の脂質ナノ物質の製造方法と前記で説明した脂質ナノ物質との間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために省略する。
【００４７】
本発明の工程（ａ）では、トリグリセリド、オイル及びレシチンを含む脂質混合物とリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体とを水相溶媒に添加して脂質混合物溶液を得る。
【００４８】
本発明の一具現例によれば、前記リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体：トリグリセリド：オイル：レシチンの重量比は、１：０．５〜１０：０．５〜１０：１〜１５であり得る。１つの特定例で、前記重量比は、１：０．５〜３：０．５〜３：２〜１０であり、他の特定例では、１：０．５〜２：０．５〜２：２〜５である。
【００４９】
本発明の一具現例によれば、前記脂質混合物溶液でトリグリセリド、オイル、レシチン及びリゾホスファチジルコリン（又は、そのエーテル誘導体）の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００５０】
本発明の一具現例によれば、工程（ａ）では、抗酸化剤又は張性調節剤を添加して脂質混合物溶液を製造することができる。
【００５１】
本発明の工程（ｂ）では、通常の均質化方法を通じて脂質混合物溶液を均質化する。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、前記均質化は、ホモジナイザーを使って２，０００〜１０，０００ｒｐｍ（例えば、３，０００〜７，０００ｒｐｍ）で均質化することができる。均質化時間は、特に制限されず、２〜４時間均質化し、このような均質化過程を２回以上繰り返して実施することができる。
【００５３】
本発明の工程（ｃ）では、均質化した脂質混合物溶液に酸あるいは塩基を加えて溶液のｐＨが３〜７になるように調節する。前記のようにｐＨを調節する場合、脂質ナノ物質の薬剤学的利用及び安定性に有利である。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、工程（ｃ）では、脂質混合物溶液のｐＨが４〜６になるように調節することができる。
【００５５】
本発明では、ｐＨ調節された脂質混合物溶液を追加的に均質化することができる。
【００５６】
本発明の工程（ｄ）では、ｐＨ調節された脂質混合物溶液をエマルジョン化してナノサイズの脂質ナノ物質を形成させる。前記エマルジョン化は、マイクロ流体システム又はエンカプスレーターを使って実施することができる。
【００５７】
本発明の一具現例によれば、最終的に製造された脂質ナノ物質は、半透明なエマルジョンである。
【００５８】
本発明の一具現例によれば、工程（ｄ）では、必要に応じてポア（ｐｏｒｅ）サイズが０．１〜０．５μｍである膜を用いて濾過滅菌をさらに行うことができる。前記膜のポアサイズが０．１μｍ未満である場合には、一部脂質ナノ物質が通過することができず、０．５μｍを超過する場合には、注射剤に適していないサイズの脂質ナノ物質が含有され得る。
【００５９】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）工程を含むリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の毒性を減少させる方法を提供する。
【００６０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）工程を含むリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の赤血球溶血現象又は赤血球凝集現象を減少させる方法を提供する。
【００６１】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）工程を含むリゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の溶解度を向上させる方法を提供する。
【００６２】
下記の実施例から確認されたように、本発明の脂質ナノ物質は、リゾホスファチジルコリン（又は、そのエーテル誘導体）が表わす毒性の問題、赤血球溶血の問題及び赤血球凝集の問題を改善する効果を示す。したがって、前記（ａ）〜（ｄ）工程を通じて前記化合物を脂質ナノ物質に剤形化することによって、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体の安全性を向上させ、それを通じて医学的利用をより促進させることができる。
【発明の効果】
【００６３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体−含有脂質ナノ物質、その製造方法及びその用途に関するものである。
（ｉｉ）本発明の脂質ナノ物質は、溶解度、毒性、赤血球溶血及び凝集現象において、リゾホスファチジルコリン及び又はそのエーテル誘導体に比べて、著しく改善された特性を示す。
（ｉｉｉ）したがって、本発明は、リゾホスファチジルコリン又はそのエーテル誘導体を有効成分とする敗血症、細菌性感染疾患などの治療剤として有用に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、実施例１で製造した脂質ナノ物質の粒子サイズを示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＰＣ濃度計算のための標準品検量曲線である。
【図３】図３は、ＬＰＣの局所刺激性（毒性）を示すマウスの皮膚写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＬＰＣ−Ｆ又はＬＰＣ−ＡＰＩ投与による局所刺激性（毒性）を示すマウスの写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬＰＣ−Ｆ又はＬＰＣ−ＡＰＩ投与による局所刺激性（毒性）を示すマウスの写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＬＰＣ−Ｆ又はＬＰＣ−ＡＰＩ投与による局所刺激性（毒性）を示す組織病理学的結果の写真である。ＥＰ：上皮、ＥＤ：表皮、ＤＭ：真皮、ＨＬ：毛嚢、ＣＭ：皮膚体幹筋（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒｕｎｃｉ  ｍｕｓｃｌｅ）、スケールバー：１６０μｍ。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＰＣ−Ｆ又はＬＰＣ−ＡＰＩ投与による局所刺激性（毒性）を示す組織病理学的結果の写真である。ＥＰ：上皮、ＥＤ：表皮、ＤＭ：真皮、ＨＬ：毛嚢、ＣＭ：皮膚体幹筋（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒｕｎｃｉ  ｍｕｓｃｌｅ）、スケールバー：１６０μｍ。
【図６Ａ】図６Ａは、赤血球溶血現象に対するＬＰＣ生理食塩水懸濁液（ＬＰＣ−ＡＰＩ）又はＬＰＣ脂質ナノ物質製剤（ＬＰＣ−Ｆ）の影響を示す図である。グループ：１＝非処理対照群、２＝食塩水処理陰性対照群、３＝蒸留水処理陽性対照群、４＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形ストック、５＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形２倍希釈、６＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形４倍希釈、７＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形８倍希釈、８＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形１６倍希釈、９＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形３２倍希釈、１０＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液ストック、１１＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液２倍希釈、１２＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液４倍希釈、１３＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液８倍希釈、１４＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液１６倍希釈、１５＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液３２倍希釈。ａ＝ＭＷテストによる非処理対照群と比較して、ｐ＜０．０１、ｂ＝ＭＷテストによる非処理陰性対照群と比較して、ｐ＜０．０１、ｃ＝ＭＷテストによる陽性対照群と比較して、ｐ＜０．０１、ｄ＝ＭＷテストによる陽性対照群と比較して、ｐ＜０．０５。
【図６Ｂ】図６Ｂは、赤血球溶血現象に対するＬＰＣ生理食塩水懸濁液（ＬＰＣ−ＡＰＩ）又はＬＰＣ脂質ナノ物質製剤（ＬＰＣ−Ｆ）の影響を示す図である。グループ：１＝非処理対照群、２＝食塩水処理陰性対照群、３＝蒸留水処理陽性対照群、４＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形ストック、５＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形２倍希釈、６＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形４倍希釈、７＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形８倍希釈、８＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形１６倍希釈、９＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形３２倍希釈、１０＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液ストック、１１＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液２倍希釈、１２＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液４倍希釈、１３＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液８倍希釈、１４＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液１６倍希釈、１５＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液３２倍希釈。
【図７Ａ】図７Ａは、赤血球凝集現象に対するＬＰＣ生理食塩水懸濁液（ＬＰＣ−ＡＰＩ）又はＬＰＣ脂質ナノ物質製剤（ＬＰＣ−Ｆ）の影響を示す図である。グループ：１＝非処理対照群、２＝食塩水処理陰性対照群、３＝蒸留水処理陽性対照群、４＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形ストック、５＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形２倍希釈、６＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形４倍希釈、７＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形８倍希釈、８＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形１６倍希釈、９＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形３２倍希釈、１０＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液ストック、１１＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液２倍希釈、１２＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液４倍希釈、１３＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液８倍希釈、１４＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液１６倍希釈、１５＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液３２倍希釈。
【図７Ｂ】図７Ｂは、赤血球凝集現象に対するＬＰＣ生理食塩水懸濁液（ＬＰＣ−ＡＰＩ）又はＬＰＣ脂質ナノ物質製剤（ＬＰＣ−Ｆ）の影響を示す図である。グループ：１＝非処理対照群、２＝食塩水処理陰性対照群、３＝蒸留水処理陽性対照群、４＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形ストック、５＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形２倍希釈、６＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形４倍希釈、７＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形８倍希釈、８＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形１６倍希釈、９＝ＬＰＣ−ＩＶ剤形３２倍希釈、１０＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液ストック、１１＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液２倍希釈、１２＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液４倍希釈、１３＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液８倍希釈、１４＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液１６倍希釈、１５＝ＬＰＣ−ＡＰＩ食塩水懸濁液３２倍希釈。ａ＝ＭＷテストによる非処理対照群と比較して、ｐ＜０．０１、ｂ＝ＭＷテストによる非処理対照群と比較して、ｐ＜０．０５、ｃ＝ＭＷテストによる非処理陰性対照群と比較して、ｐ＜０．０１、ｄ＝ＭＷテストによる非処理陰性対照群と比較して、ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００６６】
実施例１．ＬＰＣを含む脂質ナノ物質の製造
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ  １８：０、ＮＯＦ）５．００ｇ、エッグレシチン（Ｌｉｐｏｉｄ  Ｅ−８０）１５．００ｇ、大豆油５．００ｇ、スクロース５０．００ｇ、ＥＤＴＡ２Ｎａ２Ｈ２Ｏ  ２７．５ｍｇ、及び中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１２）５．００ｇに精製水を投入して総重量５００ｇに作った。２０〜２５℃に保持しながら、ホモジナイザー（Ｌ５Ｍ−Ａ，Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）で５，０００ｒｐｍで３時間混合された溶液を均質化した。前記の過程を２回行って、均質化した溶液１，０００ｇを０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は０．１Ｎ塩酸溶液を使ってｐＨ５．５に調節した。ｐＨ調節後、３０分間さらに均質化した後、もう一度ｐＨを５．５に調節した。ｐＨ調節を行った溶液を１０℃以下で冷蔵保管した。前記のような過程を８回繰り返してｐＨ５．５に調節された溶液８，０００ｇを製造した。
【００６７】
前記リゾホスファチジルコリン化合物を含む脂質混合物溶液をマイクロフルダイザー（Ｍ−１１０ＥＨ−３０，ＭＦＩＣ  Ｃｏｒｐ．）を用いて２５，０００ｐｓｉの圧力で均質化してエマルジョン化した。このような均質化過程を５回繰り返した後、０．２μｍの膜に濾過してリゾホスファチジルコリン化合物を含む液体状態の脂質ナノ粒子を製造した。
【００６８】
実施例２．ＬＰＣを含む脂質ナノ物質のサイズ測定
実施例１の脂質ナノ粒子サイズを粒子分析器（ＥＬＳ−Ｚ２，Ｏｔｓｕｋａ）を用いて測定して、結果を表１及び図１に示した。
【００６９】
【表１】
0006259474.tif 000004
【００７０】
実施例３．ＬＰＣ濃度計算
実施例１から製造された脂質ナノ粒子が含有された製剤内のリゾホスファチジルコリン化合物の濃度計算は、１８：０ＬＰＣ標準溶液を使ってＥＬＳＤ定量ＨＰＬＣ条件で分析したリゾホスファチジルコリン化合物の面積比を図１で示した標準曲線の面積比と対比して計算した。
【００７１】
実施例４．ＬＰＣを含む脂質ナノ物質の安定性の評価
実施例１から製造された脂質ナノ粒子を冷凍、冷蔵、室温及び加温しながら、保管する間に安定性を評価した。評価結果は、表２に示した。
【００７２】
【表２】
0006259474.tif 000005
【００７３】
表２に示されたように、液相の脂質ナノ粒子は、１ヶ月間冷凍、冷蔵、室温及び加温保管（３０℃）した後にも、形状、純度、粒子サイズ、及びｐＨを保持する安定性を示した。
【００７４】
実施例５．ＬＰＣを含む脂質ナノ物質製剤のマウス皮下投与局所刺激性の実験
５−１．実験の方法
実施例１から製造されたＬＰＣを含む脂質ナノ粒子製剤（ＬＰＣ−Ｆ；１８：０  ＬＰＣ濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）の局所刺激性を評価するために、除毛されたマウスの背中側の皮膚に２０、１０及び５ｍＬ／ｋｇ（１８：０  ＬＰＣ  ２００、１００及び５０ｍｇ／ｋｇ）の容量で単回皮下投与し、韓国食品医薬品安全庁告示第２００９−１１６“医薬品などの毒性試験基準”［２００９］に基づいて、１４日間の死亡率、体重変化、臨床症状、及び投与部位周囲皮膚の肉眼及び組織病理学的の変化を同じ濃度のリゾホスファチジルコリン原料（ＬＰＣ−ＡＰＩ）１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水懸濁液皮下投与群とそれぞれ比較検討した。本実験で、陰性対照物質として生理食塩水を使い、最高投与量２００ｍｇ／ｋｇは、げっ歯類最大許容投与容量である２０ｍＬ／ｋｇ（Ｆｌｅｃｋｎｅｌｌ，１９９６；ＫＦＤＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｎｏｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２００９−１１６，２００９；ＯＥＣＤ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，＃４２３，２００１）を基準に設定して、中間及び低容量投与群では、それぞれ１０及び５ｍＬ／ｋｇに設定した。
【００７５】
実験動物は、雄ＩＣＲマウスとして入手時６週齢（体重３０〜３２ｇ）を２８日順化後、１０週齢（体重３６．４〜４９．０ｇ）を使い、下記のようにグループを分類して実験を進行した。
【００７６】
【表３】
0006259474.tif 000006
【００７７】
あらゆるデータは、５匹のマウスの平均±標準偏差で表現した。服用量が異なるグループのための多重比較検査を行った。変異均質性（Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ（Ｌｅｖｅｎｅ  Ａ，Ｃｌｉｎ  Ｏｔａｌａｒｙ，１９８１；６：１４５−５１）を使って調査した。Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ結果が変異均質性から有意性のない偏差が導出された場合、グループ比較の如何なるグループ対が非常に異なるかを決定するために、得られたデータをｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ後のＳｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔによって分析した。また、変異均質性から有意性のある偏差がＬｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔから観察される場合には、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔを行った。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔから有意性のある差が観察された場合、非常に異なる差を示す特定グループ対を決定するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｗ  ｔｅｓｔを行った。統計学的分析は、ＳＰＳＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ  １４．０Ｋ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；Ｌｕｄｂｒｏｏｋ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７；２４：２９４−６）を使って行った。ｐ＜０．０５を統計的有意性として考慮した。
【００７８】
５−２．実験の結果
＜死亡率＞
ＬＰＣ−Ｆ投与と関連した死亡例は、１４日間の観察期間の間に発生していない。
【００７９】
＜臨床症状＞
陰性媒体対照群及びあらゆる３容量のＬＰＣ−Ｆ投与群では、何らの異常症状が観察されていない。しかし、ＬＰＣ−ＡＰＩ  ２００、１００及び５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、軽微［１＋］であるか、中等度［２＋］の投与部位周囲皮膚潰瘍所見が投与終了４８時間後から表われ始めて、ＬＰＣ−ＡＰＩ  ２００、１００及び５０ｍｇ／ｋｇ投与群で多様な［１−３＋］程度の投与部位周囲皮膚潰瘍所見が、投与後、３日からそれぞれ５例（５／５；１００％）、３例（３／５；６０％）、及び３例（３／５；６０％）確認された（表４及び図３）。
【００８０】
【表４】
0006259474.tif 000007
【００８１】
＜肉眼剖検の所見＞
陰性媒体対照群及びあらゆる３容量のＬＰＣ−Ｆ投与群では、投与部位周囲で意味のある肉眼剖検の所見が確認されていない一方、ＬＰＣ−ＡＰＩ  ２００、１００及び５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、多様な［１−３＋］程度の投与部位周囲皮膚潰瘍所見がそれぞれ５例（５／５；１００％）、３例（３／５；６０％）、及び３例（３／５；６０％）確認された（表５及び図４）。
【００８２】
【表５】
0006259474.tif 000008
【００８３】
＜組織病理学的所見＞
陰性媒体対照群及びあらゆる３容量のＬＰＣ−Ｆ投与群では、投与部位周囲皮膚で意味のある組織病理学的の変化が確認されていない。しかし、ＬＰＣ−ＡＰＩ  ２００、１００及び５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、多様な［１−３＋］程度の局所皮膚脱落、上皮増生、真皮結合組織のｃｏａｒｓｅ化、炎症細胞浸潤及び皮膚体幹筋の溶解所見などの典型的な皮膚潰瘍所見がそれぞれ５例（５／５；１００％）、３例（３／５；６０％）、及び３例（３／５；６０％）確認された（表６及び図５）。
【００８４】
【表６】
0006259474.tif 000009
【００８５】
＜結論＞
実験物質の皮下投与後、観察される投与部位周囲の肉眼及び組織病理学的の変化は、皮下投与物質の局所刺激性に対して迅速かつ信頼性のある証拠を提供し、それを通じて多様な物質の局所刺激性が評価された（Ｇｕｎｚｅｌ  ＶＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．２６：１４７６−９（１９７６）；Ｌｉｍｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｎｚ，Ｄｔｓｃｈ  Ｓｔｏｍａｔｏｌ．４１：４０７−１０（１９９１）；Ｒｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ  Ｚａｈｎａｒｚｔｌ  Ｚ．４６：６９４−８１９９１（１９９１））。本実験の結果、ＬＰＣ−ＡＰＩの単回皮下投与は、著しい投与部位周囲の皮膚潰瘍を誘発したが、ＬＰＣ−Ｆ投与群では、陰性媒体対照群と比較して何らの投与部位周囲皮膚の異常所見も確認されていない。
【００８６】
このような結果は、ＬＰＣが表わした局所刺激性が、本発明の脂質ナノ粒子製剤によって著しく改善されたということを示す。
【００８７】
実施例６．ＬＰＣを含む脂質ナノ物質製剤の溶血及び赤血球凝集の評価
６−１．実験の方法
実施例１から製造されたＬＰＣを含む脂質ナノ粒子（ＬＰＣ−Ｆ；１８：０  ＬＰＣ濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）の溶血及び赤血球凝集誘発程度を評価するために、２００μＬの生理食塩水、滅菌蒸留水、６濃度（原液、２、４、８、１６及び３２倍希釈）のＬＰＣ−Ｆ、又は製剤化されていないリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ−ＡＰＩ）１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水懸濁液を１ｍＬのヘパリン処理ラット（ＳＤ  ｒａｔ）全血に添加した後、３７℃の温度で振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１００ｒｐｍで３時間インキュベーションした。製造されたＬＰＣ−Ｆは、生理食塩水で倍数希釈して６濃度を準備し、ＬＰＣ−ＡＰＩを生理食塩水に懸濁して１０ｍｇ／ｍＬの濃度で準備した後、やはり生理食塩水で倍数希釈して原液を含んで６濃度で準備した。実験は、５回繰り返し実施し、可能であれば、同一動物から採血された血液を同一実験に使った。振盪培養器で１００ｒｐｍでインキュベーションした後、形成された赤血球凝集素を半定量（ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）的に評価し、１２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液で５７０ｎｍの吸光度を測定して溶血性をそれぞれ評価した。赤血球の溶血は、下記の数式１によって計算し、溶血指数が５％以上である場合を溶血反応が陽性であると判断した。
【００８８】
［数１］
溶血指数（％）＝（ＯＤサンプル−ＯＤ陰性）／（ＯＤ陽性−ＯＤ陰性）×１００
陰性＝食塩水、陽性＝蒸留水
【００８９】
赤血球凝集素の半定量的評価基準は、次の通りであった：
半定量赤血球凝集点数（最大＝３）
０＝非凝集；１＝少し凝集；２＝中間程度凝集；３＝激しい凝集。
【００９０】
ＯＤ値及び半定量赤血球凝集点数は、５回の独立した実験の平均±標準偏差で表現した。服用量が異なるグループのための多重比較検査を行った。変異均質性は、Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ（Ｌｅｖｅｎｅ  Ａ，Ｃｌｉｎ  Ｏｔａｌａｒｙ，１９８１；６：１４５−５１）を使って調査した。Ｌｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔ結果が変異均質性から有意性のない偏差が導出された場合、グループ比較の如何なるグループ対が非常に異なるかを決定するために、得られたデータをｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ後のｌｅａｓｔ−ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（ＬＳＤ）ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔによって分析した。また、変異均質性から有意性のある偏差がＬｅｖｅｎｅ  ｔｅｓｔから観察される場合には、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔを行った。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ  ｔｅｓｔから有意性のある差が観察された場合、非常に異なる差を示す特定グループ対を決定するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｗ  ｔｅｓｔを行った。統計学的分析は、ＳＰＳＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ１４．０Ｋ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；Ｌｕｄｂｒｏｏｋ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７；２４：２９４−６）を使って行った。ｐ＜０．０５を統計的有意性として考慮した。
【００９１】
６−２．実験の結果
＜溶血指数の変化＞
ＬＰＣ−Ｆ  ４、８、１６及び３２倍希釈液、ＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液１６及び３２倍希釈液処理群では、陽性対照群である滅菌蒸留水処理群に比べて、有意性のある（ｐ＜０．０１）吸光度の減少をそれぞれ示した。したがって、ＬＰＣ−Ｆ原液、２、４、８、１６及び３２倍希釈処理群の溶血指数（％）は、それぞれ１４４．２８±１８．８２、１１０．６６±１１．２３、５３．７０±６．５７、１１．６０±６．９２、８．６５±２．３８、及び−１．５４±３．１６％に算出され、ＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液原液、２、４、８、１６及び３２倍希釈処理群では、１５７．６８±１０．４４、１４８．６５±１５．０１、１２９．７０±７．２３、１１７．６７±５．９７、７８．７４±３．３０、及び２６．８６±６．４０％にそれぞれ算出された（図６）。
【００９２】
吸光度の増加は、赤血球溶血による血色素の血しょう内露出を意味することである（Ｋａｎｇ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０：８５−９０（２００９）；Ｚａｐｏｒｏｗｓｋａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．３４：９９−１００（１９９６））。本実験の結果、ＬＰＣ−Ｆ  ３２倍希釈液処理群では、有意性のあるＯＤ値の増加が表われず、溶血指数が５％未満であり、ＬＰＣ−Ｆ  ４倍希釈液処理群では、滅菌蒸留水陽性対照群に比べて、少ない溶血効果を示したので、ＬＰＣが表わす溶血効果が、本発明の脂質ナノ粒子製剤によって著しく減少したということを確認することができた。一方、ＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液処理群では、著しいＯＤ値の増加が確認され、処理最低濃度である３２倍希釈液処理群を含んだあらゆる濃度の処理群で５％以上の溶血指数が表われた。ＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液原液、２、４及び８倍希釈液処理群では、滅菌蒸留水陽性対照群に比べて、有意性のあるＯＤ値の増加が確認された。
【００９３】
このような結果は、本発明の脂質ナノ物質製剤によってＬＰＣが表わす溶血反応が著しく改善され得るということを示す。
【００９４】
＜赤血球凝集性の評価＞
非処理及び食塩水陰性対照群に比べて、有意性のある（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）赤血球凝集点数の増加が、ＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液原液、２及び３２倍希釈液処理群から確認されたが、最低処理濃度である３２倍希釈液を含んだあらゆる濃度のＬＰＣ−ＡＰＩ生理食塩水懸濁液処理群で赤血球凝集点数の著しい増加が観察された。しかし、本発明のＬＰＣ−Ｆ処理群では、滅菌蒸留水陽性対照群に比べて、著しく低い赤血球凝集があらゆる処理群から認められ、非処理及び陰性対照群に比べて、有意性のある赤血球凝集点数の増加が確認されていない（図７）。
【００９５】
赤血球凝集の増加は、血流障害及び多様な血管刺激性を誘発するので、潜在的毒性と直結される（Ｍｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｓｅｉｐｐ，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４０：８１７−２２（１９９０）；Ｐｒａｓａｎｔｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．１９：４４９−５６（２００５））。本実験の結果、ＬＰＣは、最低処理濃度である３２倍希釈液までも著しい赤血球凝集点数の増加を示したが、本発明の脂質ナノ粒子製剤は、原液を含んだあらゆる処理群で意味のある赤血球凝集点数の増加が確認されていない。
【００９６】
このような結果は、本発明の脂質ナノ物質製剤によってＬＰＣが表わす赤血球凝集が解消され得るということを意味する。
【００９７】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
0006259474.tif 000012
【図２】
0006259474.tif 000013
【図３】
0006259474.tif 000014
【図４Ａ】
0006259474.tif 000015
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
0006259474.tif 000019
【図６Ｂ】
0006259474.tif 000020
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0006259474.tif 000022