(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたまたは実質的に精製された形態のヘパラン硫酸ＨＳ９であって、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化ならびに次いで結果として生じる二糖断片のキャピラリー電気泳動分析の後に、以下を含む二糖組成：
【表１】
0006407980.tif 000014
を有する、前記ヘパラン硫酸ＨＳ９。
【請求項２】
前記ＨＳ９が、アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）もしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）を有する、またはからなる、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある、請求項１に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９を製造する方法であって、
（ｉ）アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲまたはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲを有するヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ、
（ｉｉ）前記ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ、
（ｉｉｉ）前記混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ、
（ｉｖ）前記ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ、
（ｖ）解離された前記グリコサミノグリカンを回収するステップ
を含む、前記方法。
【請求項４】
グリコサミノグリカンを含む前記混合物が、ブタ腸粘膜から得られるヘパラン硫酸製剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９を含む組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９を含む医薬組成物または医薬。
【請求項７】
ビトロネクチンタンパク質をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物または医薬。
【請求項８】
医療の方法における使用のための、請求項６または７に記載の医薬組成物または医薬。
【請求項９】
医療の方法における使用のための、請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のＨＳ９を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器。
【請求項１１】
細胞培養表面の少なくとも一部がＨＳ９でコーティングされている、請求項１０に記載の細胞培養物品または容器。
【請求項１２】
ビトロネクチンをさらに含む、請求項１０または１１に記載の細胞培養物品または容器。
【請求項１３】
細胞培養基質を形成する方法であって、請求項１または２に記載のＨＳ９を細胞培養支持体表面に適用するステップを含む前記方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のＨＳ９を含む細胞培養基質と接触している細胞を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
【請求項１５】
前記細胞培養基質がビトロネクチンをさらに含む、請求項１４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
【請求項１６】
細胞を培養する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで請求項１または２に記載のＨＳ９を含む細胞培養基質と接触している細胞を培養するステップを含む前記方法。
【請求項１７】
前記細胞培養基質がビトロネクチンをさらに含む、請求項１６に記載の細胞を培養する方法。
【請求項１８】
請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９を含む培地。
【請求項１９】
バイオマテリアルおよび請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼ。
【請求項２０】
生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを形成する方法であって、バイオマテリアルを請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ９でコーティングするまたは含浸させるステップを含む前記方法。
【請求項２１】
ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器であって、前記ペプチドまたはポリペプチドが前記単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９と接触している前記細胞培養物品または容器。
【請求項２２】
前記ペプチドまたはポリペプチドが細胞外マトリクスタンパク質、またはそれに由来するペプチドである、請求項２１に記載の細胞培養物品または容器。
【請求項２３】
細胞培養基質を形成する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドを細胞培養支持体表面に結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９を適用するステップおよび前記単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９を前記ペプチドまたはポリペプチドと接触させるステップを含む前記方法。
【請求項２４】
前記ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）もしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）を有する、またはからなる、請求項２３に記載の細胞培養基質を形成する方法。
【請求項２５】
ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９を含む細胞培養基質と接触している細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、前記ペプチドまたはポリペプチドが前記単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９と接触している前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
【請求項２６】
前記ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）もしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）を有する、またはからなる、請求項２５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
【請求項２７】
細胞を培養する方法であって、前記方法がペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９を含む細胞培養基質と接触している細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するステップを含み、前記ペプチドまたはポリペプチドが単離されたヘパラン硫酸ＨＳ９と接触している前記方法。
【請求項２８】
前記ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）もしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）を有する、またはからなる、請求項２７に記載の細胞を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラン硫酸に関し、排他的にではないが、特に、ビトロネクチンを結合するヘパラン硫酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会への重症疾患の世界的な経済的コストと幹細胞がこれらの問題のいくつかを軽減することに関する可能性の間に強い相関がある［１］。これは、それらの限定された有効性にもかかわらず、幹細胞療法需要を指数関数的に駆動している［２］。ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞療法がこの成長している市場に寄与する可能性は、相当なものである。これらの細胞は、成体に存在する全ての細胞型に分化する能力を有する。ｈＥＳＣは、それらの供給が確実になりえれば、こうした再生医療戦略の中心となると断定されてきた［３］。心筋細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞系列へのｈＥＳＣの方向付けられた分化は、特に、大きな見込みを有する。２００９年および２０１０年に、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、ヒト胚幹細胞由来の細胞を用いる、Ａ級胸髄損傷の治療のための（ＮＣＴ０１２１７００８およびＮＣＴ０１３４４９９３）［４］ならびに黄斑ジストロフィーおよび萎縮型加齢黄斑変性のための（ＮＣＴ０１３４５００６およびＮＣＴ０１３４４９９３）［５］２つの臨床治験を承認した。しかしながら、これらの細胞を、将来の臨床的要求を満たすのに必要である後の方向付けられた分化のために、十分な細胞が利用可能となることを保証するのに必須である特質である、分化の前のそれらの元の状態で持続的に保存することは今なお非常に困難であるという問題が残っている。
【０００３】
第１の、最も重要な課題は、ｈＥＳＣ維持のための不活性化マウスまたはヒト支持細胞層への依存を軽減することである。第２の課題は、マウス肉腫基底膜由来の有用であるが不十分に定義された製品である、マトリゲル（登録商標）の使用を排除することである。第３に、細胞培地からのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）の分注は、大きな進歩であろう。我々が細胞を多数でナイーブな状態で最大の安全性をもって増殖させる場合、これらの障害は、克服される必要がある。
【０００４】
細胞培地製剤は、急速な進歩を遂げ、現在、ＸＶＩＶＯ−１０、ｈＥＳＦ９、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１およびＳＴＥＭＰＲＯなどの多くの化学的に定義された培地が入手可能である。［６〜９］しかしながら、正しく定義された細胞培養表面の領域では、今なお行なわれるべき多くの研究がある。多くの研究グループが、ラミニン（ＬＮ）［１０、１１］、ビトロネクチン（ＶＮ）［１２］、フィブロネクチン（ＦＮ）［１３］、Ｅカドヘリン［１４］、ペプチド［１５、１６］またはＰＭＥＤＳＡＨ重合体［１７］を含めた、ｈＥＳＣを培養するための方法を提案してきたが、これらの研究のいずれも、適用された化合物の実際の表面密度も、商業的規模のｈＥＳＣ増殖のためのそれらの経済費用便益もこれまで計算していない。
【０００５】
細胞培養のための細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を固定化するための最も広範に使用されている方法は、培養表面上への受動的な吸着を通してである。以前、本発明者らは、ｈＥＳＣをビトロネクチン（ＶＮ）が吸着した表面上で長期間成功的に増殖することができることを示した［１８］。しかしながら、この方法は、ＶＮの立体障害または高次構造の撹乱をもたらし、タンパク質の機能喪失をもたらすことがＭａｒｓｏｎらによって示された［１９］。
【０００６】
グリコサミノグリカンは、広範囲のタンパク質と相互作用してそれらの機能を制御する、複雑な、直鎖状の、高電荷の炭水化物である；通常、それらは、合成され、コアタンパク質に接着している。ＧＡＧは、非硫酸化型（ＨＡ）および硫酸化型（ＣＳ、ＤＳ、ＫＳ、ヘパリンおよびＨＳ）に分類される。
【０００７】
ＧＡＧの中で、ヘパラン硫酸（ＨＳ）ファミリーは、そのドメイン内の特異的な配列に基づいて標的タンパク質と相互作用するその能力のために、特に興味深い。該ファミリー（ヘパリンおよびＨＳ）は、Ｎ−、およびＯ−硫酸化の可変性のパターンを有する反復ウロン酸−（１→４）−Ｄ−グルコサミン二糖サブユニットからなる。例えば、ヘパリンの抗凝固活性は、ユニークな五糖配列を有するグルコサミン残基における３Ｏ−硫酸化を必要とする［２０］。ユニークな硫酸化パターンも、ＥＣＭタンパク質に明白である；ＦＮを結合する貪欲なヘパリン結合バリアントは、７から８Ｎ硫酸化二糖が必要とされ、通常より大きいドメインを有し（＞１４残基）、特に高電荷である［２１、２２］。しかしながら、ＨＳは、硫酸化されていないＮＡドメインによって分離された高度に硫酸化されたＮＳドメインを有することによって、こうした硫酸化ヘパリンとは異なる；こうした性質は、ヘパリンの副作用なく、タンパク質を選択的に結合するためのユニークな配列を提供する［２３］。
【０００８】
ＨＳの二糖組成は、グリコシド結合を切断するためにフラボバクテリウム・ヘパリニウム酵素ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩを使用した一連の酵素的卵割を通して解明されうる［２４〜２６］。３つ全てのヘパリナーゼが組合せで使用された場合、ヘパリンまたはＨＳの９０％を超える脱重合が可能である［２７、２８］。結果として生じる二糖混合物は、既知の二糖標準との比較により、ＰＡＧＥ［２９］、ＳＡＸ−ＨＰＬＣ［３０］、または高感度キャピラリー電気泳動（ＣＥ）［３１〜３４］によって分析されうる。
【０００９】
多くの研究も、ＨＳが幹細胞の維持および増殖に重要であることを示した［１５、３５〜３８］。Ｕｙｇｕｎらは、ＧＡＧ誘導体化表面が、ＴＣＰＳ表面と比較して、間葉系幹細胞増殖の５倍の増加を促進することができることを実証した［３９］。より効果的な様式でＶＮの提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｏｎ）を可能にするように特定のＨＳバリアントを操作することが可能でありうるという可能性が表れる。固定化戦略は、表面上への吸着を可能にするためにＧＡＧをＢＳＡとカップリングすること［４０、４１］；二糖単位を共有結合的に固定化するためのＥＤＣ化学的方法［４２］；ＧＡＧのビオチン化およびストレプトアビジンがコーティングされた表面へのカップリング［４３〜４５］、および正に帯電したプラズマ重合体フィルム［１９、４６］を含む。こうした誘導体化表面上の元素組成を分析するために、ＸＰＳなどの技法が用いられる［４７］。
【００１０】
本明細書で、本発明者らは、細胞培養のためのＶＮ表面密度を改善するための高ＶＮ結合能力を有するＨＳバリアントの探索を記載する。本発明者らは、最初に、ＶＮ−ヘパリン結合ドメイン（ＶＮ−ＨＢＤ）を捕獲リガンドとして使用したアフィニティークロマトグラフィーによる未加工のＨＳ出発物質からの新規なＶＮ結合ＨＳ種の精製を記載する。次いで、非結合および出発物質からのこの精製されたＨＳの結合能力を確認するための幅広い生化学的アッセイが用いられた。次いで、ＨＳの長さ、硫酸化パターンおよび組成必要条件がＥＬＩＳＡおよびＣＥによって分析された。次いで、３つの異なる戦略がＴＣＰＳ上の精製されたＨＳバリアントの固定化におけるそれらの適合性に関して評価された。アリルアミンを利用した方法は、試験された他の方法に対して明確な利点を提供した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ｈＥＳＣ培養のための十分なＶＮを提示するためにこうした方法を利用することは、効率的ではない。有害な効果を導きうるタンパク質の修飾の代わりに、効率的なＶＮ固定化のために表面を修飾することは、より合理的な手法であると思われる。本明細書で、本発明者らは、安価、測定可能かつ効率的でもある、ｈＥＳＣ培養のための十分な無修飾ＶＮの捕獲を可能にする様々な戦略を探索する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヘパラン硫酸製剤、ヘパラン硫酸ＨＳ９に関する。ＨＳ９は、ビトロネクチンを結合し、かつ培養された幹細胞の幹細胞性（例えば、多能性または多分化能）を維持しながら幹細胞の培養および増殖を支持する能力のある細胞培養基質を提供することにおける有用性を示すことが見出されている。
【００１３】
ＨＳ９とは、構造的および機能的に関連した単離されたヘパラン硫酸の新規クラスを指す。
【００１４】
本発明の一態様では、ヘパラン硫酸ＨＳ９が提供される。ＨＳ９は、単離された形態または実質的に精製された形態で提供されうる。これは、ヘパラン硫酸成分が少なくとも８０％のＨＳ９、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つである組成物を提供することを含みうる。
【００１５】
好ましい実施形態では、ＨＳ９は、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）またはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを結合する能力がある。ペプチドは、この配列の一方または両方の端に１個または複数のさらなるアミノ酸を有していてもよい。例えば、ペプチドは、この配列の一方または両方の端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれ以上のうちのいずれかのアミノ酸を有していてもよい。
【００１６】
他の実施形態では、ポリペプチドは、ビトロネクチンタンパク質である。一部の実施形態では、ＨＳ９は、配列番号１、配列番号３またはビトロネクチンタンパク質のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するまたはからなるペプチドに、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、または１００ｐＭのうちの１つよりも小さいＫＤで結合する。
【００１７】
ＨＳ９は、
（ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲもしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲのアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを含むまたはからなるポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ、
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ、
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ、
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ、
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収するステップ
を含みうる、本明細書中に記載の本発明者らの方法によって取得、同定、単離または濃縮されうる。
【００１８】
本発明者らの方法において、該混合物は、市販の供給源から得られるグリコサミノグリカンを含んでいてもよい。１つの好適な供給源は、ヘパラン硫酸画分、例えば、市販のヘパラン硫酸である。１つの好適なヘパラン硫酸画分は、ブタ腸粘膜からのヘパリンの単離中に得ることができる（例えば、Ｃｅｌｓｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  −  時に「Ｃｅｌｓｕｓ  ＨＳ」と呼ばれる）。
【００１９】
他の好適なヘパラン硫酸の供給源は、任意の哺乳動物（ヒトまたはヒト以外）からのヘパラン硫酸、特に、腎臓、肺または腸粘膜からのヘパラン硫酸を含む。一部の実施形態では、ヘパラン硫酸は、ブタまたはウシの腸粘膜、腎臓または肺由来である。
【００２０】
本発明の別の態様では、上記の態様のうちのいずれか１つによるＨＳ９およびビトロネクチンタンパク質を含む組成物が提供される。
【００２１】
本発明の一態様では、上記の態様によるＨＳ９を含む医薬組成物または医薬が提供される。医薬組成物または医薬は、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、疾患の治療の方法における使用のためのものである。一部の実施形態では、医薬組成物または医薬は、ビトロネクチンタンパク質をさらに含んでいてもよい。一部の他の実施形態では、医薬組成物または医薬は、唯一の活性成分としてＨＳ９を含む。
【００２３】
本発明の別の態様では、ＨＳ９は、医療の方法における使用のために提供される。本発明の関連態様では、医療の方法における使用のための医薬の製造におけるＨＳ９の使用が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様では、バイオマテリアルおよびＨＳ９を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼが提供される。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ９でコーティングされる。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ９で含浸される。インプラントまたはプロテーゼは、ビトロネクチンタンパク質でさらにコーティングまたは含浸されてもよい。
【００２５】
本発明の別の態様では、生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを形成する方法であって、バイオマテリアルをＨＳ９でコーティングするまたは含浸させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、バイオマテリアルをビトロネクチンタンパク質のうちの一方または両方でコーティングするまたは含浸させることをさらに含む。
【００２６】
本発明の別の態様では、ＨＳ９を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器が提供される。一部の実施形態では、細胞培養表面の少なくとも一部は、ＨＳ９でコーティングされていてもよい。細胞培養物品または容器は、ビトロネクチンをさらに含みうる。
【００２７】
本発明の別の態様では、細胞培養基質を形成する方法であって、ＨＳ９を細胞培養支持体表面に適用することを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様では、ＨＳ９を含む細胞培養基質と接触している細胞を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物が提供される。一部の実施形態では、細胞培養基質は、ビトロネクチンをさらに含む。
【００２９】
本発明の別の態様では、細胞を培養する方法であって、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＳ９を含む細胞培養基質と接触させて培養することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞培養基質は、ビトロネクチンをさらに含む。
【００３０】
本発明の別の態様では、細胞培養基質への細胞接着における使用のためのＨＳ９が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様では培地が提供され、当該培地はＨＳ９を含む。
【００３２】
本発明の別の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養におけるＨＳ９の使用が提供される。
【００３３】
本発明の一部の態様では、幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでヘパラン硫酸ＨＳ９と接触させて培養することを含む方法が提供される。ＨＳ９は、好ましくは、外因性であってかつ単離され、かつ補助剤として、例えば、培地の一部として、培養物に添加される。
【００３４】
好ましい実施形態では、ＨＳ９と接触しながら培養された幹細胞は、個体数が増大し、すなわち、幹細胞の数が増加し、かつ培養物中の高い割合の細胞が親幹細胞の多分化能または多能性の特性（例えば、幹細胞の型に特徴的な特定の組織型に分化する幹細胞の能力）を維持する。例えば、好ましくは、培養物中の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つの幹細胞が、親幹細胞の多分化能または多能性の特性を示す。好ましくは、ＨＳ９は、多分化能または多能性である培養物中の細胞の割合（例えば、百分率）を上昇させるために作用する。これは、多分化能または多能性である出発培養物中の細胞の数に対して相対的に測定されてもよい。一部の実施形態では、多分化能または多能性の細胞の割合の上昇は、外因性のＨＳ９の存在が欠けていることのみによって異なる対応する培養条件下におかれる幹細胞の対照培養物に対して比較されてもよい。幹細胞培養物は、任意選択でビトロネクチンを含んでいても、または含んでいなくてもよい。
【００３５】
本発明のさらに別の態様では、予め決定された量のＨＳ９および予め決定された量のビトロネクチンを含むキットオブパーツが提供される。キットは、予め決定された量のＨＳ９を含む第１の容器および予め決定された量のビトロネクチンを含む第２の容器を含んでいてもよい。細胞培養の方法における使用のためのキットが提供されうる。
【００３６】
本発明のさらなる態様では、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質を有する細胞培養物品または容器であって、ペプチドまたはポリペプチドが単離されたヘパラン硫酸に接触している細胞培養物品または容器が提供される。一部の実施形態では、細胞培養表面の少なくとも一部は、単離されたヘパラン硫酸でコーティングまたは含浸されている。
【００３７】
本発明の関連態様では、細胞培養基質を形成する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドを細胞培養支持体表面に結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を適用することおよび単離されたヘパラン硫酸をペプチドまたはポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。
【００３８】
本発明の関連態様では、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質と接触している細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、ペプチドまたはポリペプチドが単離されたヘパラン硫酸と接触しているｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物も提供される。
【００３９】
本発明の関連態様では、細胞を培養する方法であって、該方法が、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある単離されたヘパラン硫酸を含む細胞培養基質と接触させて培養することを含み、ペプチドまたはポリペプチドが単離されたヘパラン硫酸と接触している方法が提供される。
【００４０】
一部の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、細胞外マトリクスタンパク質、またはそれに由来するペプチドである。
【００４１】
一部の実施形態では、単離されたヘパラン硫酸は、以下のステップを含みうる、本明細書中に記載の本発明者らの方法によって取得、同定、単離または濃縮される：
（ｉ）固体支持体に接着され、目的のタンパク質からのヘパリン結合ドメインを含む、またはからなる、ポリペプチド分子を有する該支持体を提供するステップ；
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物、好ましくはヘパラン硫酸製剤、と接触させて、ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体の形成を可能にさせるステップ；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ；
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収するステップ。
【００４２】
説明
本発明者らは、配列に基づくアフィニティークロマトグラフィープラットフォームを使用して、ビトロネクチン（ＶＮ）のヘパリン結合ドメインを利用した。これは、ＶＮ結合ヘパラン硫酸（ＨＳ）画分の濃縮を可能にした。結合アビディティーおよびＶＮに関するＶＮ結合ＨＳ９＋ｖｅの特異性が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびキャピラリー電気泳動の組合せを使用して確認された。組織培養物処理ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面上へのアリルアミン（ＡＡ）重合体のプラズマ重合は、ＨＳ９＋ｖｅの効率的な捕獲を可能にした。ＨＳおよびＶＮの表面組合せは、ｈＥＳＣの接着を支持した。各コーティング層の表面密度が、放射標識と結合アッセイの双方によって確認された。ＨＳ組成分析は、グルコサミン残基上のＮ−硫酸化と共に６Ｏ−硫酸化、および３個を超える二糖単位の長さがＶＮへのＨＳ９＋ｖｅ結合に決定的であったことを明らかにした。この組合せ基質は、オーソドックスな受動的なＶＮ吸着に対して細胞接着に必要なＶＮ表面密度の著しい減少を可能にする。この方法は、費用効果の高い様式でｈＥＳＣの３次元培養のために容易にスケールアップすることができる。
【００４３】
ＨＳ９
本発明は、ＨＳ９と呼ばれる一クラスのヘパラン硫酸分子に関する。ＨＳ９分子は、ビトロネクチンのヘパリン結合ドメインに相当するポリペプチドに結合する１種または複数のＧＡＧを含む化合物の混合物を濃縮する方法によって入手可能である。特に、ＨＳ９分子は、アミノ酸配列ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲもしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲを含むまたはからなるドメインである、ビトロネクチンのヘパラン結合ドメインに結合するヘパラン硫酸について濃縮することによって得られうる。濃縮のプロセスは、ＨＳ９を単離するために使用されてもよい。
【００４４】
本発明は、ＨＳ９で濃縮された化合物の混合物、およびこうした混合物を使用する方法にも関する。
【００４５】
ここに記載の方法によって入手可能であることに加えて、ＨＳ９は、機能的および構造的に定義もされうる。
【００４６】
機能的に、ＨＳ９は、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）もしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する、またはからなる、ペプチドを結合する能力がある。ペプチドは、このペプチドの一方または両方の端に１個または複数のさらなるアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４７】
好ましくは、ＨＳ９は、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、または１００ｐＭのうちの１つよりも小さいＫＤで該ペプチドを結合する。
【００４８】
好ましくは、ＨＳ９は、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、または１００ｐＭのうちの１つよりも小さいＫＤでビトロネクチンタンパク質も結合する。ＨＳ９とビトロネクチンタンパク質との間の結合は、以下のアッセイ方法によって決定されうる。
【００４９】
ビトロネクチンは、ブロッキング溶液（ＳＡＢ中に０．２％のゼラチン）中に３μｇ／ｍｌの濃度で溶解され、ブロッキング溶液中に０〜３μｇ／ｍｌの希釈系列が確立される。ヘパリンで予めコーティングされたヘパリン／ＧＡＧ結合プレートの３通りずつのウェル内に２００μｌのビトロネクチンの各希釈物の分注；３７℃で２時間インキュベートされ、ＳＡＢで注意深く３回洗浄されて、２００μｌの２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化された抗ビトロネクチンがブロッキング溶液中に添加される。３７℃で１時間のインキュベーション、ＳＡＢで注意深く３回洗浄し、２００μｌの２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰがブロッキング溶液中に添加される。３７℃で３０分間のインキュベーション、ＳＡＢでの注意深い３回の洗浄、残液を除去するために軽くたたき、２００μｌの発色試薬（ＳｉｇｍａＦＡＳＴ  ｐ−ニトロフェニルリン酸）が添加される。吸光度を４０５ｎｍで１時間以内で読み取りながら室温で４０分間インキュベートする。
【００５０】
このアッセイにおいて、結合は、吸光度を測定することによって決定されてもよく、かつ添加されたヘパラン硫酸の非存在下におけるビトロネクチンタンパク質、またはビトロネクチンタンパク質を結合しないヘパラン硫酸を添加されたビトロネクチンタンパク質などの対照に対して相対的に決定されてもよい。
【００５１】
ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲもしくはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲを含むペプチドと、またはビトロネクチンタンパク質と、高い親和性で結合する相互作用を示すヘパラン硫酸の選択を含む方法によってＨＳ９が他のヘパラン硫酸および／またはＧＡＧから選択されうることに関して、かつ非特異的な結合とは対照的に、ＨＳ９の結合は、特異的であることが好ましい。
【００５２】
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析後のＨＳ９の二糖組成は、図９に示されている。
【００５３】
本発明によるＨＳ９は、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析によって決定されるような、ＨＳ９が保持された種について図４５に各二糖についてまたはＨＳ９が保持された種について図４４に示される、標準化された百分率の値の±１０％（より好ましくは、±９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％のうちの１つ）の範囲内の二糖組成を有するヘパラン硫酸を含む。
【００５４】
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析によって決定されるようなＨＳ９の二糖組成は、以下のいずれか１つによる二糖組成を有しうる：
【００５５】
【表１】
0006407980.tif 000002
【００５６】
または
【００５７】
【表２】
0006407980.tif 000003
【００５８】
または
【００５９】
【表３】
0006407980.tif 000004
【００６０】
または
【００６１】
【表４】
0006407980.tif 000005
【００６２】
または
【００６３】
【表５】
0006407980.tif 000006
【００６４】
または
【００６５】
【表６】
0006407980.tif 000007
【００６６】
好ましい実施形態において、挙げられる８種の二糖の合計重量百分率は、１００％（任意選択で、±３．０％以下、または±２．０％以下、±１．０％以下、±０．５％以下）である。ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでのＨＳ９の消化ならびに／または二糖のキャピラリー電気泳動分析は、実施例に従って行われることが好ましい。
【００６７】
ヘパリンリアーゼ酵素でのＨＳ製剤の消化は、以下のように行われうる：ＨＳ製剤（１ｍｇ）は、（１０ｍＭの酢酸カルシウムを含む）５００μＬの酢酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中にそれぞれ溶解され、各２．５ｍＵの３種の酵素が添加される；試料は、試料チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃で一晩（２４時間）インキュベートされる；さらに各２．５ｍＵの３種の酵素が試料に添加され、この試料は、試料チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃でさらに４８時間インキュベートされる；消化物は、加熱（１００℃、５分）によって停止され、次いで、凍結乾燥される；消化物は、５００μＬの水中に再懸濁され、分析用に一定分量（５０μＬ）が分取される。
【００６８】
ＨＳ製剤の消化からの二糖のキャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、以下のように行われうる：キャピラリー電気泳動オペレーティングバッファーは、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４の水溶液を２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏの溶液に添加してｐＨ３．５にすることによって作製される；カラム洗浄液は、（５０％ｗ／ｗのＮａＯＨから希釈された）１００ｍＭのＮａＯＨである；オペレーティングバッファーおよびカラム洗浄液は、０．２μｍの酢酸セルロースメンブレンフィルターを取り付けたフィルターユニットを使用して、両方とも濾過される；二糖の保存溶液（例えば、１２種）は、水中に二糖を溶解（１ｍｇ／ｍＬ）することによって調製される；標準のための較正曲線は１０μｇ／１００μＬの各二糖を含むすべての標準を含む混合物を調製することによって決定され、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５μｇ／１００μｌを含む希釈系列が調製される；２．５μｇの内標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）を含む。ＨＳの消化物は水で希釈され（５０μＬ／ｍＬ）、同一の内標準が各試料に添加される（２．５μｇ）。溶液は、凍結乾燥され、水（１ｍＬ）中に再懸濁される。試料は、ＰＴＦＥ親水性ディスポーザブルシリンジフィルターユニットを使用して濾過される。
【００６９】
分析は、キャピラリー電気泳動機器を使用して、取り付けられた未コーティングのシリカキャピラリーチューブ上、２５℃で、２０ｍＭのオペレーティングバッファーを使用して、３０ｋＶのキャピラリー電圧で行われる。試料は、陰極（逆極性）端で流体力学的な注入を使用してキャピラリーチューブに導入される。各流動の前に、キャピラリーは、１００ｍＭのＮａＯＨ（２分）、および水（２分）で洗い流され、オペレーティングバッファー（５分）で予め調整される。バッファー補充システムは、一貫した容量、ｐＨおよびイオン濃度が確実に維持されるように、入口および出口のチューブにおいてバッファーを置換する。水のみのブランクは、試料シークエンスの最初、中間および最後のいずれもにおいて流動される。吸光度は、２３２ｎｍでモニターされる。すべてのデータは、データベースに保存され、その後、検索および再加工される。２通りずつまたは３通りずつでの消化／分析が行われてもよく、ＨＳ消化物中の二糖の標準化された百分率は、分析の結果の相加平均として算出される。
【００７０】
ＨＳ９を同定するために、本発明者らは、ヘパリン結合ドメインを有する特定のポリペプチドに対する結合を示すグリコサミノグリカン分子について濃縮することを含む方法を使用した。単離されたＧＡＧの混合物および／または分子は、次いで、同定され、ヘパリン結合ドメインを含むタンパク質を発現している細胞および組織の増殖および分化をモジュレートするそれらの能力について試験される。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方における、細胞および組織の増殖および分化に対する特定のＧＡＧ糖配列の効果の調節された分析を可能にする。この方法は、参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００４６９（ＷＯ２０１０／０３０２４４）に記載されている。本発明者らは、ビトロネクチンに高い結合を有するＧＡＧを単離および特徴付けするために、この方法をビトロネクチンに適用した。
【００７１】
したがって、ＨＳ９を同定するために、本発明者らは、ヘパリン／ヘパラン結合ドメインを有するタンパク質に結合する能力のあるグリコサミノグリカンを単離する方法を用意した。該方法は、
（ｉ）ヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意すること；
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させること；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収すること
を含む。
【００７２】
本発明者らは、この方法を使用して、ビトロネクチンに結合する能力のあるＧＡＧを同定した（これを彼らはＨＳ９と呼んだ）。ここで、本発明者らの方法において使用されたポリペプチドは、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）またはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）のヘパリン結合ドメインを含んでいた。
【００７３】
本発明者らの方法において、ＧＡＧを含む混合物は、合成のグリコサミノグリカンを含んでいてもよい。しかし、細胞または組織から得られたＧＡＧが好ましい。例えば、混合物は、細胞外マトリクスを含んでいてもよく、ここで、細胞外マトリクス材料は、ｉｎ  ｓｉｔｕで（すなわち、それが得られるヒトもしくは動物の体内の組織から直接に）生組織をかき集めることによって、またはヒトもしくは動物の体から抽出された（生または死）組織をかき集めることによって得られる。代替的に、細胞外マトリクス材料は、培養中に増殖した細胞から得られてもよい。細胞外マトリクス物質は、結合組織または結合組織細胞、例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靭帯または腱から得られてもよい。一実施形態では、ブタ粘膜からの市販のヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ  ＨＳまたはＨＳｐｍ）が使用された。
【００７４】
ＧＡＧ成分は、組織もしくは細胞試料または、当業者によく知られている、一連の日常的な分離ステップ（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）による抽出物から抽出されうる。
【００７５】
ＧＡＧ混合物は、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸を含みうる、異なる型のグリコサミノグリカンの混合物を含んでいてもよい。好ましくは、固体支持体と接触されるＧＡＧ混合物は、ヘパラン硫酸について濃縮される。ヘパラン硫酸が濃縮されたＧＡＧ画分は、ＧＡＧ混合物においてカラムクロマトグラフィー、例えば、弱い、中程度の、または強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびに強力な高圧液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、と共に適切な画分の選択を行うことによって得られうる。
【００７６】
回収されたＧＡＧは、ＧＡＧを同定するため、例えば、ＧＡＧの組成もしくは配列を決定するため、またはＧＡＧの構造特性を決定するために、さらなる分析に供されうる。ＧＡＧ構造は、一般には非常に複雑であり、現在利用可能な分析技法を考慮しても、ＧＡＧ配列構造を正確に決定することはほとんどの場合不可能である。
【００７７】
しかし、回収されたＧＡＧ分子を、部分的なまたは完全な糖消化（例えば、亜硝酸による化学なもの、またはヘパリナーゼＩＩＩなどのリアーゼを用いた酵素的なもの）に供して、ＧＡＧに特有であり特徴的な糖断片が得られうる。特に、二糖（または四糖）を得るための消化が、ＧＡＧの特有の二糖「指紋」をもたらす、得られる二糖のそれぞれの百分率を測定するために使用されうる。
【００７８】
ＧＡＧの硫酸化のパターンが決定され、ＧＡＧ構造を決定するために使用されうる。例えば、ヘパラン硫酸に関しては、アミノ糖における硫酸化のパターンならびにＣ２位、Ｃ３位およびＣ６位における硫酸化のパターンがヘパラン硫酸を特徴付けるために使用されうる。
【００７９】
二糖分析、四糖分析および硫酸化の分析が、それぞれＧＡＧについての独特のスペクトルをもたらすものであるＨＰＬＣ、質量分析およびＮＭＲなどの他の分析技法と併せて使用されうる。これらの技法を組み合わると、ＧＡＧの決定的な構造的特徴付けがもたらされうる。
【００８０】
ＧＡＧとヘパリン結合ドメインとの間の親和性の高い結合相互作用により、ＧＡＧが親和性の高い結合相互作用に寄与する特定の糖配列を含有することが示される。さらなるステップは、ＧＡＧの完全なもしくは部分的な糖配列、または結合相互作用に関与するＧＡＧの重要な部分を決定することを含みうる。
【００８１】
ＧＡＧ−ポリペプチド複合体は、グルコサミノグリカン鎖を溶解する薬剤、例えばリアーゼを用いた処理に供されうる。リアーゼ処理により、ポリペプチドとの結合相互作用に関与しない結合したＧＡＧの部分が切断されうる。ポリペプチドとの結合相互作用に関与するＧＡＧの部分はリアーゼ作用から保護されうる。リアーゼの除去後、例えば、洗浄ステップの後にポリペプチドに結合したままであるＧＡＧ分子が、ポリペプチドの特異的な結合パートナー（「ＧＡＧリガンド」）である。短いＧＡＧ分子の方が複雑さが少ないので、ＧＡＧリガンドの解離および回収後に、ＧＡＧリガンドの構造的特徴付けの程度がより高くなることが予測されうる。例えば、糖配列（すなわち、ＧＡＧリガンドに含有される単糖の一次（直鎖）配列）、硫酸化パターン、二糖および／または四糖消化分析、ＮＭＲスペクトル、質量分析スペクトルならびにＨＰＬＣスペクトルのいずれかの組合せにより、ＧＡＧリガンドの高レベルの構造的特徴付けがもたらされうる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「濃縮すること（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」、「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」などの用語は、それにより、混合物の相対的な組成が、１つまたは複数の実体によってもたらされるその混合物の画分が増加する一方で１つまたは複数の異なる実体によってもたらされる混合物の画分が減少するように変更される（または変更された）プロセス（または状態）を示す。濃縮によって単離されたＧＡＧは純粋である、すなわち、実質的にただ１つの型のＧＡＧを含有するものでありうる、または異なる型のＧＡＧの混合物のままでありえ、該混合物は、ヘパリン結合ドメインに結合する特定のＧＡＧを、出発混合物と比較して大きな割合で有する。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「接触させる」プロセスは、２つ以上の別個の実体を物理的近傍にさせることを含む。「接触させる」プロセスは、２つ以上の別個の実体を、それらの２つ以上の別個の実体の一部が分子レベルで相互作用することが可能になるのに十分な条件下でそれに十分な時間にわたって極めて近傍にさせることを含む。本明細書で使用される場合、「接触させる」プロセスは、１つまたは複数のＧＡＧおよびヘパリン結合因子のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドを有する化合物の混合物を極めて近傍にさせることを含むことが好ましい。「接触させる」プロセスの例は、混合、溶解、膨潤、洗浄を含む。好ましい実施形態では、ＧＡＧ混合物とポリペプチドの「接触」は、互いに対して高い親和性を示すＧＡＧとポリペプチドの間で、共有結合によるものであってよいが非共有結合によるものであることが好ましい複合体が形成されるのに十分である。
【００８４】
ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを有する選択されたタンパク質の完全長のまたは完全長に近い一次アミノ酸配列を含んでいてもよい。ヘパリン結合ドメインをＧＡＧ混合物から遮蔽する可能性をもたらす、より長いポリペプチドにおいて生じうるフォールディングにより、ポリペプチドについては短いことが好ましい。好ましくは、ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有することになり、かつ任意選択でペプチドのＮ末端およびＣ末端の一方またはそれぞれに１個または複数のアミノ酸を含む。これらのさらなるアミノ酸は、ポリペプチドを固体支持体に結合するために必要とされる、ポリペプチドへのリンカーまたは結合分子の付加を可能にしうる。
【００８５】
本発明者らの方法の好ましい実施形態では、ヘパリン結合ドメイン内のアミノ酸の数に加えて、ポリペプチドは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個のさらなるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸のうちの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％を占める。ポリペプチドを固体支持体の表面に接着するために、ポリペプチドは、分子タグを含むように改変されることが好ましく、かつ固体支持体の表面は、その分子タグに高い親和性を有する、すなわち、分子タグおよびプローブが結合対を形成する、対応する分子プローブを組み込むように改変される。タグおよび／またはプローブは、抗体、細胞受容体、リガンド、ビオチン、これらの構造体の任意の断片もしくは誘導体、上記の任意の組合せ、またはプローブが結合するようにもしくはこれ以外の場合には特異性と関連するように設計または構成されうる任意の他の構造体のうちのいずれか１つから選択されうる。タグおよびプローブとしての使用に好適な好ましい結合対は、ビオチンおよびアビジンである。
【００８６】
ポリペプチドは目的のタンパク質由来であり、それは、この場合はビトロネクチンである。「由来」とは、ポリペプチドが、目的のタンパク質中に存在するヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含むために、選出、選択または調製されることを意味する。ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、例えば、ＧＡＧ結合に対するヘパリン結合ドメイン配列における変化の効果を調べるために、目的のタンパク質から見出されるものから改変されてもよい。
【００８７】
本明細書において、該タンパク質は、ビトロネクチンである。好ましいヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号１）またはＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ（配列番号３）である。
【００８８】
特定のポリペプチドのアミノ酸配列における小さなバリエーションがその部分の本来の機能性の維持を可能にしうることは、当業者によって理解される。ペプチド中の特定のアミノ酸残基を、等配電子的および／または等電子的な他のアミノ酸残基で置換することは、無置換のペプチドの特定の特性を維持または改良のいずれかをしてもよいことも理解される。これらのバリエーションも、本発明の範囲内に包含される。例えば、アミノ酸アラニンは、ペプチドの１つまたは複数の特性を維持しながら、時にアミノ酸グリシンと置換されてもよい（その逆もまた同様である）。用語「等配電子的」は、２つの実体間の空間的類似性を指す。穏やかに上昇された温度で等配電子的である基の２つの例は、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチル基である。用語「等電子的」は、２つの実体間の電子的類似性を指し、例は、２つの実体が、同一の、または同様の、ｐＫａの機能性を有する場合である。
【００８９】
ヘパリン結合ドメインに対応しているポリペプチドは、合成物または組換え体であってもよい。
【００９０】
固体支持体は、共有結合または非共有結合を通して、直接的または間接的に、分子が結合されうる表面を有するいかなる基質であってもよい。固体支持体は、表面に結合されたプローブに物理的な支持を提供することができる任意の基質材料を含んでいてもよい。それは、マトリクス支持体であってもよい。材料は、一般に、表面へのプローブの結合、およびその後のあらゆる処理、取扱い、またはアッセイの実施中に生じる加工に関連した条件に耐えることができる。材料は、天然に存在していても、合成であっても、または天然に存在する材料の改変形態であってもよい。固体支持体は、プラスチック材料（ポリマー、例えば、ポリ（塩化ビニル）、シクロオレフィンコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）などを含む）などであってもよく、いずれも、単独でまたは他の材料と組み合わせて使用される。さらなる硬質の材料、例えば、ガラスが考えられてもよく、これは、シリカを含み、かつさらに、例えば、バイオガラスとして利用できるガラスを含む。採用されうる他の材料は、多孔性材料、例えば、調節された細孔ガラスビーズなど、を含む。１つまたは複数の官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基のうちのいずれかを有することのできる、例えば、その表面上に組み込まれる、当技術分野において既知の任意の他の材料も意図される。
【００９１】
好ましい固体支持体は、カラムの表面上に固定されたポリペプチドを有するカラムを含む。その表面は、カラムの壁であってもよく、かつ／またはカラムの中央のスペース内にパックされたビーズによって提供されてもよい。
【００９２】
ポリペプチドは、固体支持体上に固定されていてもよい。固定化の方法の例は、吸着、共有結合性結合、包括および膜限局を含む。本発明の好ましい態様では、ポリペプチドおよびマトリクスの間の相互作用は、実質的に恒久的である。本発明のさらに好ましい実施形態では、ペプチドおよびマトリクスの間の相互作用は、イオン交換クロマトグラフィーに対して好適に不活性である。好ましい配置では、ポリペプチドは、固体支持体の表面に結合される。当業者は、２つの実体を互いに物理的および／または化学的に結合するために選択する多数の選択肢を有するはずであることが理解される。これらの選択肢は、本発明の範囲内にすべて包含される。好ましい配置では、ポリペプチドは、ストレプトアビジンとのビオチンの相互作用を通して固体支持体に吸着される。この配置の代表的な例では、ビオチンの分子は、ポリペプチドに共有結合で結合され、その結果、ビオチン−ポリペプチドコンジュゲートは、固体支持体に共有結合で結合されているストレプトアビジンに結合する。別の配置では、ポリペプチドとビオチン、および／またはマトリクスとストレプトアビジンの分子を連結するためにスペーサーまたはリンカー部分が使用されてもよい。
【００９３】
ＧＡＧ混合物を固体支持体と接触させることによって、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体の形成が可能にされる。これらは、固体支持体から混合物の残りを除去することによって、例えば、固体支持体を洗浄して非結合材料を溶出させることによって、混合物の残りから分離される。カラムが固体支持体として使用される場合、ＧＡＧ混合物の非結合成分は、カラムに結合したＧＡＧ−ポリペプチド複合体を残して、カラムから溶出されうる。
【００９４】
特定のオリゴ糖が非特異的な様式でポリペプチドと相互作用しうることが理解される。ある特定の実施形態では、非特異的な様式でポリペプチドと相互作用するオリゴ糖は、含まれていてもよく、またはヘパリン結合因子の影響をモジュレートする１種または複数のＧＡＧで濃縮された化合物の混合物から除去されてもよい。非特異的な相互作用の例は、好適な大きさおよび／または形にされた分子のポケット内での一時的な限局である。さらに、これらのオリゴ糖は、ペプチドと全く相互作用を示さないオリゴ糖よりも遅く溶出されうることが理解される。そのうえ、非特異的に結合する化合物は、特異的な様式で（例えば、イオン性の相互作用を通して）結合する化合物の場合のようにそれらを溶出させるための同一の外部から刺激の入力を必要としなくてもよいことが理解される。本発明者らの方法は、オリゴ糖の混合物をその混合物の成分：特異的な様式でポリペプチドに結合するもの；非特異的な様式でポリペプチドに結合するもの；およびポリペプチドに結合しないものに分離することができる。これらの名称は、各ＧＡＧ−ペプチド対について操作上定められる。
【００９５】
ＧＡＧおよびポリペプチドの結合が生じる固体支持体の表面に存在する条件（例えば、塩濃度）を変化させることによって、ヘパリン結合ドメインに最も高い親和性および／または特異性を有するＧＡＧが選択されうる。したがって、目的のタンパク質および／または目的のタンパク質のヘパリン結合ドメインに高い結合親和性を有するＧＡＧが得られうる。結合親和性（Ｋｄ）は、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満のうちの１つから選択されてもよい。
【００９６】
記載の方法によって得られるＧＡＧは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、一範囲の適用において有用でありうる。
【００９７】
ＧＡＧは、こうした目的のための製剤として提供されてもよい。例えば、記載の方法によって得られるＧＡＧを含む、すなわち、ＨＳ９を含む培地が提供されてもよい。
【００９８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＳ９の存在下での細胞または組織の培養から得られる細胞または組織は、回収されて、治療を必要とするヒトまたは動物の患者内に埋め込まれてもよい。したがって、細胞および／または組織の埋め込みの方法が提供されてもよく、該方法は、
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞および／または組織をＨＳ９と接触させて培養するステップ、
（ｂ）細胞および／または組織を回収するステップ、
（ｃ）治療を必要とするヒトまたは動物の対象内に細胞および／または組織を埋め込むステップ
を含む。
【００９９】
細胞は、パート（ａ）においてＨＳ９と接触させて、細胞または組織の成長、増殖または分化を可能にするために十分な一定期間培養されてもよい。例えば、この一定期間は、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日または少なくとも４０日から選択されてもよい。
【０１００】
別の実施形態では、ＨＳ９は、疾患の予防または治療を含む、医療の方法における使用のために製剤化されてもよい。ＨＳ９および薬学的に許容される賦形剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物または医薬が提供されてもよい。こうした医薬組成物または医薬は、疾患の予防または治療のために提供されてもよい。疾患の予防または治療のための医薬の製造におけるＨＳ９の使用も提供される。任意選択で、本発明による医薬組成物および医薬は、ＧＡＧが結合するヘパリン結合ドメインを有する目的のタンパク質（すなわち、ビトロネクチン）も含んでいてもよい。
【０１０１】
本発明による医薬組成物および医薬は、したがって、
（ａ）ＨＳ９；
（ｂ）ＨＳ９によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えば、配列番号１または配列番号３）を含むタンパク質と組み合わせたＨＳ９
のうちの１つを含んでいてもよい。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、ＨＳ９を含む生物学的スキャフォールドを提供する。一部の実施形態では、本発明の生物学的スキャフォールドは、整形外科、血管、プロテーゼ、皮膚および角膜の用途で使用されてもよい。本発明によって提供される生物学的スキャフォールドは、持続放出性薬物送達装置、生体弁、生体弁尖頭、薬物溶出ステント、血管移植片、ならびに整形外科用のプロテーゼ、例えば、骨、靭帯、腱、軟骨および筋肉を含む。本発明の好ましい実施形態では、生物学的スキャフォールドは、内側（および／または外側）の表面が、カテーテルに結合された１種または複数のＧＡＧ化合物（ＨＳ９を含む）を含むカテーテルである。
【０１０３】
本発明の化合物は、薬学的に許容されるその塩として対象に投与されうる。例えば、本発明の濃縮された混合物の化合物のベースの塩は、これらに限定されないが、薬学的に許容される陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどで形成されたものを含む。本発明は、その範囲内に、陽イオン性の塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩を含む。
【０１０４】
カルボン酸基を有する本発明の濃縮された混合物の化合物が、投与可能なプロドラッグの形態で送達されてもよいことは理解されよう。ここで、その酸性基は、エステル化され（−ＣＯ２Ｒ’の形態を有す）る。用語「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、−ＯＲ’基から−ＯＨ基、またはそこからカルボン酸の陰イオンへの変換に特に関する。したがって、本発明のプロドラッグは、細胞内への薬物吸着および／または薬物送達を促進するために働きうる。プロドラッグのｉｎ  ｖｉｖｏでの変換は、リパーゼおよびエステラーゼなどの細胞酵素によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのエステル加水分解などの化学切断によって促進されうる。
【０１０５】
本発明の態様による医薬および医薬組成物は、疾患または傷害の部位での注入を含むがこれらに限定されない、いくつかの経路による投与用に製剤化されてもよい。医薬および組成物は、液体または固体の形態で製剤化されてもよい。液体製剤は、注入による、ヒトまたは動物の身体の選択された領域への投与用に製剤化されてもよい。
【０１０６】
個体に対する利益を示すのに十分である、「治療有効量」での投与が好ましい。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療中の傷害または疾患の性質および重症度に依存することになる。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般的な開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に知られている他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中で見出されうる。
【０１０７】
幹細胞
本明細書において培養され、記載される幹細胞は、いかなる種類の幹細胞であってもよい。該幹細胞は全能性、多能性、または多分化能であってもよい。多能性幹細胞は、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞であってもよい。
【０１０８】
本明細書では、幹細胞は、分裂（すなわち、自己再生）し、それぞれ全能性、多能性、または多分化能を保ち、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する任意の細胞型を意味する。
【０１０９】
本発明において培養される幹細胞は、現存する培養物もしくは細胞系から、または、血液、骨髄、皮膚、上皮もしくは臍帯（通常は廃棄される組織）を含めた任意の成体組織、胚組織または胎児組織から直接得られうる、またはそれに由来しうる。
【０１１０】
幹細胞の多分化能は、適切なアッセイを使用することによって決定されうる。そのようなアッセイは、多能性の１つまたは複数のマーカー、例えば、アルカリホスファターゼ活性、ＲＵＮＸ２、オステリックス（ｏｓｔｅｒｉｘ）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、ＳＯＸ９、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質２、（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（Ｃｏｌｌ２ａ）およびＳＯＸ９の検出を検出することを含んでよい。
【０１１１】
幹細胞は、任意の動物またはヒト、例えば、非ヒト動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類（げっ歯目の任意の動物由来の細胞を含める）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物体；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトから得られうる。幹細胞はヒトであることが好ましい。任意選択で、幹細胞は非ヒトである。任意選択で、幹細胞は非胚性幹細胞である。任意選択で、幹細胞は全能性ではない。任意選択で、幹細胞は多能性ではない。
【０１１２】
本発明のさらに別の態様では、本発明の方法のいずれかによって生成される幹細胞または他の細胞、またはその断片もしくは産物を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、医療の方法において有用でありうる。適切な医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明の別の態様では、本発明の方法のいずれかによって生成される幹細胞または他の細胞は、医療の方法において使用されてもよく、治療を必要とする個体に治療有効量の前記医薬または医薬組成物を投与するステップを含む医療の方法が提供されることが好ましい。
【０１１４】
本発明による培養方法および技法によって得られる幹細胞および他の細胞は、医療の方法において使用するための別の細胞型に分化させるために使用されうる。したがって、分化細胞型は、記載されている培養方法および技法によって得られ、その後分化させた、幹細胞に由来するものであってよく、その産物であるとみなされうる。そのような分化細胞を、任意選択で薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤と共に含む医薬組成物が提供されうる。そのような医薬組成物は、医療の方法において有用でありうる。
【０１１５】
多能性細胞の供給源
本発明の一部の態様および実施形態は、多能性細胞の使用に関係している。胚幹細胞および誘導多能性幹細胞が、こうした細胞の例として記載されている。
【０１１６】
胚幹細胞は、伝統的に胚盤胞期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）由来であった（Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．，およびＫａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．（１９８１）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２９２、１５４〜１５６。Ｍａｒｔｉｎ，  Ｇ．Ｒ．（１９８１）。
【０１１７】
奇形癌腫幹細胞によって条件付けられた培地中で培養されたマウス初期胚からの多能性細胞系の単離。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，７６３４〜７６３８。Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｓ．，Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．，およびＪｏｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）。Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、１１４５〜１１４７）。胚幹細胞の単離において、これらの方法は、胚の破壊を引き起こしうる。
【０１１８】
そこで、例えば、成体体細胞または生殖細胞を形質転換することによる、胚の破壊を導かない多能性幹細胞の単離のためのいくつかの方法が提供された。これらの方法は、以下を含む：
１．核移植による初期化。この技法は、体細胞から卵母細胞または接合体中への核の移植を伴う。一部の状況では、これは、動物−ヒトハイブリッド細胞の作製を導きうる。例えば、細胞は、動物卵母細胞または接合体とのヒト体細胞の融合または動物体細胞とのヒト卵母細胞または接合体の融合によって作製されうる。
【０１１９】
２．胚幹細胞との融合による初期化。この技法は、胚幹細胞との体細胞の融合を伴う。この技法も、上記の１のように、動物−ヒトハイブリッド細胞の作製を導きうる。
【０１２０】
３．培養による自発的な初期化。この技法は、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の産出を伴う。例えば、多能性胚生殖（ＥＧ）細胞が始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって産出された（参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｔｓｕｉら、Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ  ７０、８４１〜８４７、１９９２）。骨髄由来細胞の長期の培養後の多能性幹細胞の発生も報告されている（参照により本明細書に組み込まれている、Ｊｉａｎｇら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１８、４１〜４９、２００２）。彼らは、これらの細胞を多分化能成体前駆体細胞（ＭＡＰＣ）と命名した。Ｓｈｉｎｏｈａｒａらも、多能性幹細胞が新生仔マウス精巣からの生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養の過程中に産出されうることを実証し、彼らは、これを多分化能生殖系列幹（ｍＧＳ）細胞と命名した（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ  １１９、１００１〜１０１２、２００４）。
【０１２１】
４．定義された因子による初期化。例えば、例えば上記のような、マウス胚または成体線維芽細胞中への転写因子（Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４など）のレトロウイルス媒介導入によるｉＰＳ細胞の産出。Ｋａｊｉら（Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００９年３月１日）も、マウスとヒト線維芽細胞の双方を初期化することができる、単一の多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載しており、このベクターは、２Ａペプチドと連結しているｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む。この非ウイルスベクターで作製されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーの頑強な発現を示し、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの分化アッセイおよび成体キメラマウスの形成によって機能的に確認される初期化された状態を示している。彼らは、多能性マーカーの頑強な発現を有する胚線維芽細胞からの初期化されたヒト細胞系の樹立に成功した。
【０１２２】
１〜４の方法は、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７年７月１日  ａ２００７  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ）においてＳｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａによって記載され、考察されている。
【０１２３】
５．単一の卵割球または生検卵割球からのｈＥＳＣ系の誘導。全て参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｕ  ＳＪ，  Ｌａｎｚａ  Ｒ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ。Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４４：５１２，Ｌｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２〜６８８、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．２００６；４３９：２１６〜２１９．Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．２００６；４４４：４８１〜４８５．Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００８；２：１１３〜１１７およびＤｕｓｋｏ  Ｉｌｉｃら（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｉｅｄ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｘｅｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−ｐａｐｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）を参照されたい。
【０１２４】
６．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵割を止め、桑実胚および胚盤胞への発達に失敗した停止した胚から取得されたｈＥＳＣ系。どちらも参照により本明細書に組み込まれている、Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  Ｐ，  Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ  Ｓら  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：２６６９〜２６７６およびＬｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２〜６８８を参照されたい。
【０１２５】
７．単為発生（または単為生殖）。この技法は、未受精卵を胚幹細胞が由来しうる卵割球へ発達させるために、未受精卵の化学的または電気的刺激を伴う。例えば、不受精減数第二分裂中期卵母細胞の電気的活性化を用いて、幹細胞を作製したＬｉｎら  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００３；２１（２）：１５２〜６１を参照されたい。
【０１２６】
８．胎起源の幹細胞。これらの細胞は、可能性の観点で胚と成体幹細胞の間にあり、多能性または多分化能細胞を引き出すために使用されうる。（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１、β−ガラクトシダーゼ染色によって示される老化の最小限の証拠、およびテロメラーゼ活性の一貫した発現を含めた）多能性のマーカーを発現するヒト臍帯由来胎間葉系幹細胞（ＵＣ  ｆＭＳＣ）が、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｈｒｉｓ  Ｈ．Ｊｏら（Ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ（２００８）３３４：４２３〜４３３）によって成功的に引き出された。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｃｏｓｔａ  Ｐｅｒｅｉｒａら（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；２：３９４〜３９９）は、ヒト臍帯のワルトン膠様質から間葉系幹細胞の純粋集団を単離した。ワルトン膠様質由来の間葉系幹細胞は、Ｔｒｏｙｅｒ＆Ｗｅｉｓｓ（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｅ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８：２６：５９１〜５９９）にも概説されている。Ｋｉｍら（参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７  Ｗｉｎｔｅｒ；９（４）：５８１〜９４）は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉系細胞を単離することに成功した。臍帯は、通常捨てられる組織であり、この組織由来の幹細胞は、道徳的または倫理的反対を誘引しない傾向があった。
【０１２７】
９．Ｃｈｕｎｇら［（２００８）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２（２）１１３〜１１７．Ｅｐｕｂ  ２００８年１月１０日］は、胚の破壊でのヒト胚幹細胞系の産出を記載している。
【０１２８】
誘導多能性幹細胞は、それらが胚の破壊を引き起こさない方法によって、より詳細には、ヒトまたは哺乳類胚の破壊を引き起こさない方法によって取得されうるという利点を有する。Ｃｈｕｎｇら（上記の項目９）によって記載されている方法も、ヒト胚の破壊を引き起こさない方法によるヒト胚幹細胞の取得を可能にする。
【０１２９】
本発明は、これらの供給源のいずれかから取得されるまたはこれらの方法のいずれかによって作製される多能性または多分化能幹細胞の使用を含む。一部の実施形態では、本発明の方法において使用される多能性または多分化能細胞は、胚の破壊を引き起こさない方法によって取得されている。より好ましくは、一部の実施形態では、本発明の方法において使用される多能性または多分化能細胞は、ヒトまたは哺乳類胚の破壊を引き起こさない方法によって取得されている。したがって、本発明の方法は、排他的にそれらの細胞が由来しうるヒト胚の破壊を必ず伴う方法によって調製されてない細胞を使用して行なわれうる。この任意選択の制限は、ヨーロッパ特許庁の拡大審判部の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮に入れることを特に意図している。
【０１３０】
誘導多能性幹細胞
本明細書中に記載の方法および組成物は、誘導多能性幹細胞の増殖に使用してもよい。
【０１３１】
通例ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略される誘導多能性幹細胞は、いくつかの遺伝子を挿入することにより、非多能性細胞、典型的に成体体細胞に人工的に由来する多能性幹細胞の型である。ｉＰＳ細胞は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）、Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら（２００７）、Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら（２００７）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら（２００７）およびＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，Ｙｕ  Ｊら（２００７）およびＴａｋａｈａｓｈｉら，（２００７）において概説および考察されている。
【０１３２】
ｉＰＳ細胞は、成体線維芽細胞などの非多能性細胞中へのいくつかの幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって典型的に引き出される。トランスフェクションは、レトロウイルスなどのウイルスベクターを通して典型的に達成される。トランスフェクト遺伝子は、主要な転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘発の効率を増強することが示唆されている。３〜４週間後、少数のトランスフェクト細胞が形態学的におよび生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、形態学的選択、倍加時間を通して、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通して典型的に単離される。
【０１３３】
幹細胞特徴の維持
増殖された幹細胞は、親幹細胞の少なくとも１つの特性を保持しうる。幹細胞は、１回または複数回の継代後にこの特性を保持しうる。これらは、複数回の継代後にそのようにしうる。
【０１３４】
特性は、形態学的性質、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性などを含みうる。特性は、生物活性を含みうる。
【０１３５】
幹細胞特徴
本発明者らの方法によって増殖された幹細胞は、以下の幹細胞特徴のいずれかを示しうる。
【０１３６】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１の増加した発現を示しうる。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔの任意の１つまたは複数の発現は、低下しうる。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して、短縮された細胞周期を示しうる。
【０１３７】
幹細胞は、定義された形態学的特徴を示しうる。例えば、標準的な顕微鏡画像の二次元では、ヒト胚幹細胞は、画像の面における高い核／細胞質比、顕著な核小体、および識別しにくい細胞間結合を有するコンパクトなコロニー形成を示す。
【０１３８】
幹細胞は、以下でさらに詳細に記載する発現された細胞マーカーによっても特徴付けられうる。
【０１３９】
多能性マーカーの発現
保持される生物活性は、１つまたは複数の多能性マーカーの発現を含みうる。
【０１４０】
段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）は、いくつかの胚細胞型に特有である。ＳＳＥＡマーカーに関する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．）から入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と命名された抗体を使用して検出可能である（前掲のＡｎｄｒｅｗｓら，Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，ｉｎ  Ｅ．  Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７）。ヒト胚幹細胞は、典型的にＳＳＥＡ−１陰性、ＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的にＳＳＥＡ−１陽性である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｐＰＳ細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１発現の喪失およびＳＳＥＡ−１の増加した発現をもたらす。ｐＰＳ細胞は、製造者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）によって記載されているように、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで基質としてのＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄで展開することによって検出することができるアルカリホスファターゼ活性の存在によっても特徴付けることができる。
【０１４１】
胚幹細胞も、典型的にテロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、市販のキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．  ＸＫ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃａｔ．  ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ  Ｎ．Ｙ．；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌｕｓ，  Ｃａｔ．  ２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を使用して、ＴＲＡＰ活性アッセイ（Ｋｉｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１、１９９７）を使用して決定することができる。ｈＴＥＲＴ発現も、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで評価することができる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ定量化キット（Ｃａｔ．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、研究目的で商業的に入手可能である。
【０１４２】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０などを含めた任意の１つまたは複数のこれらの多能性マーカーは、増殖した幹細胞によって保持されうる。
【０１４３】
マーカーの検出は、当技術分野において知られている任意の手段を通して、例えば、免疫学的に、達成されうる。組織化学的染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが使用されてもよい。
【０１４４】
フロー免疫細胞化学的方法（ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が細胞表面マーカーを検出するために使用されうる。（例えば、固定細胞または組織切片の）免疫組織化学的検査を細胞内または細胞表面マーカーに使用してもよい。ウエスタンブロット分析を細胞抽出物に行なってもよい。酵素結合免疫測定法を細胞抽出物または培地中に分泌された産物に使用してもよい。
【０１４５】
この目的で、市販の供給源から入手可能な多能性マーカーに対する抗体を使用してもよい。
【０１４６】
段階特異的胚抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）および腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含めた幹細胞マーカーの同定のための抗体を、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から商業的に取得してもよい。モノクローナル抗体を使用したこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために広範に使用されてきた（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６〜１３７３１；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ら（２０００）．ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７〜１１３１２；Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ら（２０００）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．ら（２００２）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９〜３３７；Ｐｅｒａ  Ｍ．ら（２０００）．Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５〜１０）。
【０１４７】
組織特異的遺伝子産物の発現も、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析によって、または標準的な増幅方法で配列特異的プライマーを使用した逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで検出することができる。本開示において列挙された特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースから取得することができる。さらなる詳細は米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０１４８】
増殖した細胞の実質的に全て、またはそれらの相当な部分は、マーカーを発現しうる。例えば、マーカーを発現する細胞の百分率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１４９】
細胞生存率
生物活性は、一定回数の継代後の細胞生存率を含みうる。細胞生存率は、多様な方法で、例えば、トリパンブルー排出法によって、試験されうる。生体染色のためのプロトコールは、以下の通りである。好適な容量（２０〜２００μＬ）の細胞懸濁液を適切なチューブに入れ、等量の０．４％トリパンブルーを添加して穏やかに混合し、室温で５分間置かせる。１０μｌの染色された細胞を血球計数器に入れ、生存（染色されていない）細胞および死滅した（染色された）細胞の数を計数する。それぞれの４分の１において染色されていない細胞の平均の数を算出し、２×１０４を乗算して細胞／ｍｌを求める。生存細胞の百分率は、死滅細胞および生存細胞の数で除算された生存細胞の数である。
【０１５０】
細胞の生存率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１５１】
核型
増殖された幹細胞は、増殖の間または後に正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、ムカゴが由来した、またはそこから変化したがいかなる実質的な様式にもない、親幹細胞の核型と同一、類似、または実質的に類似の核型である。例えば、転座、染色体損失、欠失などのいかなる全体的異常もあってはならない。
【０１５２】
核型は、いくつかの方法によって、例えば、光学顕微鏡法の下で視覚的に、評価されうる。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載のように調製および分析されてもよい。細胞は、標準的なＧバンド分染技術（Ｏａｋｌａｎｄ  Ｃａｌｉｆ．にあるＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂなどのルーチン的核型分析サービスを提供する多くの臨床的診断学研究室で利用可能である）を使用して核型決定されてもよく、かつ公表されている幹細胞の核型と比較されてもよい。
【０１５３】
増殖された細胞のすべてまたは実質的な部分は、正常な核型を保持しうる。この割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１５４】
多能性
増殖した幹細胞は、全てのこれらの細胞系列、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。これらの系列のそれぞれに分化させるための幹細胞の誘導の方法は、当技術分野において知られており、増殖された幹細胞の能力をアッセイするために使用されうる。増殖された細胞のすべてまたは実質的な部分は、この能力を保持しうる。これは、増殖された幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０１５５】
グリコサミノグリカン
本明細書で使用される場合、「グルコサミノグリカン」および「ＧＡＧ」という用語は互換的に使用され、また、オリゴ糖を含み、それらの結合した糖の１つまたは複数がアミノ置換基またはその誘導体を有する分子の大きな集合を指すことが理解される。ＧＡＧの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「ＧＡＧ」という用語は、ＧＡＧコンジュゲートである分子を包含するように拡張される。ＧＡＧコンジュゲートの例は、ペプチド成分がオリゴ糖成分と共有結合したプロテオグリコサミノグリカン（ＰＧＡＧ、プロテオグリカン）である。
【０１５７】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、プロテオグリカンの高度に多様なサブグループであり、タンパク質骨格に共有結合により結合したヘパラン硫酸グルコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は３つの主要な形態：パールカンとして公知の分泌形態、グリピカンとして公知の、原形質膜内に固定された形態、およびシンデカンとして公知の膜貫通形態で存在する。これらは、哺乳動物の細胞表面および大多数の細胞外マトリクスに遍在する構成物である。ＨＳ鎖を、あまり一般的には見出されないコアに結合させることができるアグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質が存在する。
【０１５８】
「ヘパラン硫酸」（「ヘパラン硫酸」または「ＨＳ」）は、ゴルジ装置においてＤ−グルクロン酸（ＧＩｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）のタンデムな反復からなる多糖として最初に合成される。新生多糖は、その後、一連のステップ：ＧＩｃＮＡｃのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、ＧＩｃＡからイズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＣ５エピマー化、ＩｄｏＡおよびＧＩｃＡのＣ２におけるＯ−硫酸化、Ｎ−スルホグルコサミン（ＧＩｃＮＳ）のＣ６におけるＯ−硫酸化および時々ＧＩｃＮＳのＣ３におけるＯ−硫酸化で修飾されうる。ＨＳのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、２−Ｏ−硫酸化、６−Ｏ−硫酸化および３−Ｏ−硫酸化は、それぞれ、ＨＳ  Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳＮＤＳＴ）、ＨＳ  ２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ２ＳＴ）、ＨＳ  ６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ６ＳＴ）およびＨＳ  ３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼの特異的作用によって媒介される。修飾ステップのそれぞれにおいて、潜在的な基質のほんの一部のみが修飾され、その結果、大きな配列多様性が生じる。ＨＳのこの構造的な複雑さにより、その配列を決定すること、およびＨＳ構造と機能との間の関係を理解することが難しいものになっている。
【０１５９】
ヘパラン硫酸側鎖は、（１→４）グリコシド結合によって結合した、交互に配置されたＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸とＤ−グルコサミンからなる。グルコサミンは、多くの場合、Ｎ−アセチル化またはＮ−硫酸化され、ウロン酸とグルコサミンはどちらもさらにＯ−硫酸化される。特定の結合パートナーに対する特定のＨＳＰＧの特異性は、グルコサミンおよびウロン酸に結合したカルボキシル基、アセチル基および硫酸基の特定のパターンによって生じる。ヘパリンとは対照的に、ヘパラン硫酸は、Ｎ−硫酸基およびＯ−硫酸基よりもＮ−アセチル基を多く含有する。ヘパラン硫酸側鎖は、コアタンパク質のセリン残基に四糖結合（−グルクロノシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→４）−キシロシル−β−１−Ｏ−（セリン））領域を通じて結合する。
【０１６０】
ヘパラン硫酸鎖とコアタンパク質はどちらも、最終的にそれらの生物活性に影響を及ぼす可能性がある一連の修飾を受けうる。ＨＳの複雑さは、核酸の複雑さに勝ると考えられてきた（Ｌｉｎｄａｈｌら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２４９７９；ＳｕｇａｈａｒａおよびＫｉｔａｇａｗａ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０、５１８）。ＨＳ種内の変動は、Ｎ−アセチル化グルコサミンを含有する二糖の硫酸化されていない領域によって分離された、糖残基のランダムでない高度に硫酸化された配列の合成から生じる。Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−スルホグルコサミンへの最初の変換により、グルクロン酸からイズロン酸へのエピマー化およびグルコサミンまたはイズロン酸におけるＯ−硫酸化の複雑なパターンを含めた他の修飾のための焦点が生じる。さらに、修飾されていない、低硫酸化された、Ｎ−アセチル化された配列内では、ヘキサウロン酸残基はグルクロン酸として残るが、高度に硫酸化されたＮ−硫酸化された領域では、Ｃ−５エピマーイズロン酸が優性である。これにより、任意の所与の鎖内の可能性のある潜在的な二糖バリアントの数が限定されるが、それぞれの存在量が限定されない。大多数の修飾は、Ｎ−硫酸化ドメインにおいて、またはそれらのすぐ隣で起こり、したがって、成熟鎖では、低硫酸化のドメインによって分離された高硫酸化の領域が存在する（Ｂｒｉｃｋｍａｎら（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（８）、４３５０−４３５９、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１６１】
高度に変動するヘパラン硫酸鎖は、自己分泌、接触分泌およびパラ分泌フィードバックループの複雑な組合せによる増殖の調節および接着因子の細胞への提示を含めた多数の細胞外リガンドの作用のモジュレーションにおいて重要な役割を果たし、したがって細胞内シグナル伝達、およびそれにより幹細胞の分化を制御すると仮定される。例えば、ヘパラン硫酸グルコサミノグリカンは遺伝的に記載されうるにもかかわらず（Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ、８０４頁および８０５頁）、単一の供給源から単離されたヘパラン硫酸グルコサミノグリカンは生物活性が異なりうる。Ｂｒｉｃｋｍａｎら、１９９８、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８、４６３に示されている通り、神経上皮細胞から得たヘパラン硫酸グルコサミノグリカンの２つの別々のプールは、分裂促進的な状態に応じてＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかを特異的に活性化することができた。同様に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）のＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかと相互作用する能力はＷＯ９６／２３００３に記載されている。この特許出願によると、ＦＧＦ−１と相互作用することができるそれぞれのＨＳは胎齢約１１日〜約１３日のマウス細胞から得られ、一方、ＦＧＦ−２と相互作用することができるＨＳは胎齢約８日〜約１０日に得られる。
【０１６２】
上記の通り、ＨＳ構造は非常に複雑であり、ＨＳ間で変動する。実際に、ＨＳ構造の変動は、細胞の増殖を促進し、細胞分化を導くことにおける各ＨＳの異なる活性の寄与において重要な役割を果たすと考えられる。構造的な複雑さは、核酸の複雑さに勝ると考えられ、ＨＳ構造は特定の独特の硫酸化パターンを有する反復二糖単位の連続であると特徴付けることができるにもかかわらず、現在のところ、核酸配列決定のために利用可能なものと同等の、ＨＳ配列構造を決定するために利用可能な標準の配列決定技法は存在しない。重要なＨＳ配列構造を決定するための単純な方法の不在下で、ＨＳ分子は、当業者により、いくつもの分析技法によって積極的に同定され、構造的に特徴付けられる。これらとしては、二糖分析、四糖分析、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動および分子量決定の１つまたは組合せが挙げられる。これらの分析技法は当業者には周知であり、当業者に使用される。
【０１６３】
ＨＳから二糖および四糖を作製するための２つの技法として、亜硝酸消化およびリアーゼ消化が挙げられる。これらの消化技法を実施する１つのやり方についての記載が下で純粋に例として提供され、そのような記載は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６４】
亜硝酸消化
ヘパラン硫酸の亜硝酸に基づく解重合が完了すると、炭水化物鎖がその個々の二糖成分に最終的に分解される。
【０１６５】
例えば、亜硝酸は、０．５ＭのＨ２ＳＯ４および０．５ＭのＢａ（ＮＯ２）２、２５０μｌを別々に氷上で１５分冷却することによって調製されうる。冷却後、Ｂａ（ＮＯ２）２をＨ２ＳＯ４と混合し、ボルテックスした後に遠心分離して硫酸バリウム沈殿物を除去する。ＨＮＯ２、１２５ｍｌをＨ２Ｏ、２０μｌに再懸濁させたＧＡＧ試料に添加し、ボルテックスした後に２５℃で１５分、時々混合しながらインキュベートした。インキュベート後、１ＭのＮａ２ＣＯ３を試料に添加してｐＨ６にした。次に、０．１ＭのＮａＯＨ中０．２５ＭのＮａＢＨ４、１００μｌを試料に添加し、混合物を２０分にわたり５０℃まで加熱する。次いで、混合物を２５℃まで冷却し、酸性化した氷酢酸を試料に添加してｐＨ３にする。次いで、混合物を１０ＭのＮａＯＨで中和し、凍結乾燥によって体積を減少させる。分解の程度検証するために、最終的な試料をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２カラムに流して二糖および四糖を分離する。
【０１６６】
リアーゼ消化
ヘパリナーゼＩＩＩは、糖鎖をグルクロニド結合で切断する。一連のヘパリナーゼ酵素（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）はそれぞれ、ある特定のヘパラン硫酸配列を特定の硫酸化認識部位で解重合することにより比較的特異的な活性を示す。ヘパリナーゼＩは、ＨＳ鎖に沿ってＮＳ領域を伴うＨＳ鎖を切断する。これにより、硫酸化ドメインの破壊が導かれる。ヘパリナーゼＩＩＩは、ＮＡドメインを伴うＨＳを解重合させ、その結果、炭水化物鎖が個々の硫酸化ドメインに分離する。ヘパリナーゼＩＩは、主に、変動する硫酸化パターンが見出されるＨＳ鎖のＮＡ／ＮＳ「肩」ドメインで切断する。注：ヘパランポリマーの反復二糖骨格は、アミノ糖グルコサミンと結合したウロン酸である。「ＮＳ」とは、アミノ糖がアミノ基上に硫酸を有し、Ｃ２、Ｃ６およびＣ３の他の基を硫酸化することが可能であることを意味する。「ＮＡ」とは、アミノ基が硫酸化されておらず、アセチル化されたままであることを示す。
【０１６７】
例えば、ヘパリナーゼＩＩＩを使用したＮＡ領域における解重合のために、酵素および凍結乾燥したＨＳ試料の両方を、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中に調製する。純粋に例として、ヘパリナーゼＩＩＩをＨＳ  １μｇあたり５ｍＵで添加し、３７℃で１６時間インキュベートした後、５分にわたって７０℃まで加熱することによって反応を停止させることができる。
【０１６８】
二糖および四糖はカラムクロマトグラフィーによって溶出されうる。
【０１６９】
バイオマテリアル
本発明の医薬組成物および医薬は、ＨＳ９でコーティングおよび／または含浸されたバイオマテリアルの形態をとっていてもよい。インプラントまたはプロテーゼは、バイオマテリアルから形成されてもよい。こうしたインプラントまたはプロテーゼは、細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ）を補助するために外科的に埋め込まれてもよい。
【０１７０】
ＨＳ９は、望ましい部位における新しい組織の形成を促進するために、インプラントまたはプロテーゼに適用されてもよい。ヘパラン硫酸は、タンパク質とは異なり、特に壊れにくく、合成バイオスキャフォールドの製造ならびにインプラントおよびプロテーゼへの適用に必要とされる溶媒に耐える極めて良好な能力を有することは理解されよう。
【０１７１】
バイオマテリアルは、ＨＳ９でコーティングまたは含浸されていてもよい。含浸は、例えば重合中に、ＨＳ９をバイオマテリアルの構成的な成分と混合すること、またはバイオマテリアル内にＨＳ９を吸収することによって、バイオマテリアルを形成することを含んでいてもよい。コーティングは、バイオマテリアルの表面上にＨＳ９を吸着することを含んでいてもよい。
【０１７２】
対象に投与されたまたは埋め込まれたときに、バイオマテリアルは、コーティングまたは含浸されたＨＳ９がバイオマテリアルから放出されるのを可能にしなければならない。バイオマテリアル放出動態は、バイオマテリアルの構造、例えば、多孔性を改変することによって改変されてもよい。
【０１７３】
ＨＳ９でバイオマテリアルをコーティングするまたは含浸させることに加えて、１種または複数の生物学的に活性な分子が、バイオマテリアル上に含浸またはコーティングされてもよい。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＰ−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３；ＶＥＧＦ；コラーゲン；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種がある。上記の生理活性分子に加えてまたは代替的に、１種または複数のビスホスホネートが、ＨＳ９と共にバイオマテリアル上へ含浸またはコーティングされてもよい。有用なビスホスホネートの例は、エチドロン酸；クロドロン酸；アレンドロン酸；パミドロン酸；リセドロン酸；ゾレドロン酸からなる群から選択される少なくとも１種を含みうる。
【０１７４】
バイオマテリアルは、スキャフォールドまたはマトリクス支持体を提供する。バイオマテリアルは、組織における移植に好適でありうる、または（例えば、溶液中のマイクロカプセルとしての）投与に好適でありうる。
【０１７５】
インプラントまたはプロテーゼは、生体適合性、例えば、無毒性および低免疫原性（最も好ましくは、非免疫原性）でなければならない。バイオマテリアルは生分解性であってもよく、それによって、バイオマテリアルが分解される。代替的に、非生分解性のバイオマテリアルが使用されてもよく、任意選択の要件であるバイオマテリアルの外科的除去を伴う。
【０１７６】
バイオマテリアルは、軟性および／または柔軟性、例えば、ヒドロゲル、フィブリンウェブもしくはフィブリンメッシュ、またはコラーゲンスポンジであってもよい。「ヒドロゲル」は、天然または合成でありうる、有機ポリマーが、凝固または固体化されて水または他の溶液の分子を封入してゲルを形成する三次元の開放格子構造を生じるときに形成される物質である。固体化は、凝集、凝結、疎水性相互作用または架橋結合によって生じうる。
【０１７７】
代替的に、バイオマテリアルは、例えば、固体材料、例えば、プラスチックまたは生物学的に不活性な金属、例えば、チタンなどから形成された、相対的に硬質の構造であってもよい。
【０１７８】
バイオマテリアルは、架橋されたポリマーによって提供されうる多孔性マトリクス構造を有しうる。マトリクスは、骨成長のために必要とされる栄養素および増殖因子に対して浸透性であることが好ましい。
【０１７９】
マトリクス構造は、好適な架橋剤、例えば、カルシウム塩、ポリアクリル酸、ヘパリンで、繊維、例えば、フィブリンもしくはコラーゲン、またはアルギン酸ナトリウムの液境膜の繊維、キトサン、または他の多糖類を架橋することによって形成されてもよい。代替的に、スキャフォールドは、コラーゲンまたはアルギネートによって作製された、当業者に知られている十分に確立された方法を使用して架橋された、ゲルとして形成されてもよい。
【０１８０】
マトリクス形成のための好適なポリマー材料は、これらによって限定されないが、アガロース、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ポリカプロラクトン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリグリコリド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシアルカノエート、これらのコポリマー、または酢酸セルロース；酪酸セルロース、アルギネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、これらのコポリマーの群から選択されうる非生分解性ポリマーの群から選択されうる生分解性／生吸収性ポリマーを含む。
【０１８１】
コラーゲンは、その生体適合性ならびに支持細胞結合および機能の好ましい特性のために、マトリクス構築に有望な材料である（米国特許第５，０１９，０８７号；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｔａｋｉｇａｗａ，Ｔ．；Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｓ．＆Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄｅ  ｔｕｂｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６、４６、１４６１〜１４６７）。臨床的に許容されるコラーゲンスポンジは、マトリクスの一例であり、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから）。
【０１８２】
フィブリンスキャフォールド（例えば、フィブリン接着剤）は、代替のマトリクス材料を提供する。フィブリン接着剤は、創傷接合剤として、増殖因子を送達する貯蔵体、および生物学的インプラントの配置および固定における助剤として広範囲にわたる臨床的適用を受けている（Ｒａｊｅｓｈ  Ｖａｓｉｔａ、Ｄｈｉｒｅｎｄｒａ  Ｓ  Ｋａｔｔｉ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ．２００６；３（１）：２９〜４７；Ｗｏｎｇ  Ｃ、Ｉｎｍａｎ  Ｅ、Ｓｐａｅｔｈｅ  Ｒ、Ｈｅｌｇｅｒｓｏｎ  Ｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３  ８９（３）：５７３〜５８２；Ｐａｎｄｉｔ  ＡＳ、Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＪ、Ｆｅｌｄｍａｎ  ＤＳ．Ｆｉｂｒｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｃｉｄｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ−１）．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．２０００；１４（３）；２２９〜２４２；ＤｅＢｌｏｉｓ  Ｃｏｔｅ  ＭＦ．Ｄｏｉｌｌｏｎ  ＣＪ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｉｂｒｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂａｓｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１９９４；１５（９）：６６５〜６７２）。
【０１８３】
参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｕｏｎｇ−Ｖａｎら（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（２００７）２１２７〜２１３６）は、ポリカプロラクトンマイクロカプセルからのＨＳの持続性の局所的な送達を記載している。
【０１８４】
バイオマテリアルのさらなる例は、ヒドロキシアパタイトまたはヒアルロン酸を組み込んだポリマーである。
【０１８５】
他の好適なバイオマテリアルは、セラミックまたは金属（例えば、チタン）、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、脱灰された骨基質（ＤＢＭ）、自己移植片（すなわち、患者の組織に由来する移植片）、または同種移植片（患者でない動物の組織に由来する移植片）を含む。バイオマテリアルは、合成的（例えば、金属、フィブリン、セラミック）または生物学的（例えば、動物組織、例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ）、またはヒト）から作製される担体材料）であってもよい。
【０１８６】
バイオマテリアルは、さらなる細胞で補助されてもよい。例えば、バイオマテリアルに、幹細胞を「播種」する（またはそれを共合成する）ことができる。
【０１８７】
一実施形態では、バイオマテリアルは、ＨＳ９を含んでもまたはこれでコーティングされていてもまたは含浸されていてもよく、バイオマテリアルに接着した、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）（例えば、さらなるコーティングまたは含浸された成分として）および細胞、例えば幹細胞をさらに含む。
【０１８８】
治療される対象は、いかなる動物またはヒトであってもよい。対象は、哺乳動物であることが好ましく、より好ましくはヒトである。対象は、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他のげっ歯動物（げっ歯目の中の任意の動物からの細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌ウシ、例えば、乳牛、またはウシ属（Ｂｏｓ）の中の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ科（Ｅｑｕｉｄａｅ）の中の任意の動物を含む）、ロバ、およびヒト以外の霊長類）であってもよい。ヒト以外の哺乳動物は、家庭用ペット、または商業的な目的で飼育される動物、例えば、競走馬、または農業用家畜、例えば、ブタ、ヒツジもしくはウシであってもよい。対象は、雄性または雌性でありうる。対象は、患者であってもよい。
【０１８９】
本発明の方法は、指示された通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてもよい。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた操作を包含することが意図されるのに対して、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、完全な多細胞生物を用いた操作を包含することが意図される。
【０１９０】
培地
ＨＳ９（好ましくは単離されたＨＳ９）を含む培地は、いかなる種類であってもよいが液体またはゲルであることが好ましく、他の栄養素および増殖因子（例えば、ビトロネクチン）を含んでいてもよい。培地は、液体またはゲルへの再構成用の乾燥された形態、例えば、粉末（ｐｏｗｅｒｅｄ）形態で調製されてもよい。ＨＳ９は、好ましくは、微量でない量で存在することになる。例えば、培地中のＨＳ９の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ培地から約１０００ｎｇ／ｍｌ培地までの間の範囲に及びうる。好ましくは、培地中のＨＳ９の濃度は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、または５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つである。
【０１９１】
細胞培養基質
本発明者らの方法は、任意の選択されたタンパク質に結合するＨＳの単離を可能にする。これは、哺乳類またはヒト細胞外マトリクスタンパク質などの細胞培養基質として有用なタンパク質に結合するＨＳの単離を可能にする。
【０１９２】
したがって、目的のペプチドまたはタンパク質、例えば、細胞外マトリクスタンパク質、またはビトロネクチンを結合する単離されたＨＳを含む細胞培養基質が提供される。ＨＳは、ＨＳ９であってもよい。ＨＳは、細胞培養支持体表面と接触していてもよく、該表面は、培養皿、プレート、ビン、フラスコ、シート、組織培養プラスチック、組織培養ポリスチレンまたは他の従来の細胞培養支持体物質、物品または容器の形態であってもよい。細胞培養支持体表面は、本明細書中に記載の、細胞培養を支持する能力のある物質からおよび／またはバイオマテリアルから形成された三次元のスキャフォールドまたはマトリクスとしても提供されうる。細胞培養支持体は、本明細書中に記載のインプラントまたは人工器官の全てまたは一部を形成してもよい。
【０１９３】
したがって、細胞培養表面の少なくとも一部が単離されたＨＳでコーティングされている細胞培養物品または容器が提供されうる。ＨＳは、培養支持体表面に共有結合的に結合していてもまたは非共有結合的に支持体表面と接触していてもよい。一部の実施形態では、培養支持体表面は、ＨＳでのコーティング前にアリルアミンプラズマ重合によって処理されていてもよい。
【０１９４】
一部の実施形態では、基質は、好ましくはＨＳと接触している、細胞外マトリクスタンパク質またはビトロネクチンをさらに含む。基質は、ＨＳの層によって形成されてもよく、該層は、細胞外マトリクスタンパク質またはビトロネクチンと接触していてもまたはこれを含んでいてもよい。細胞外マトリクスタンパク質またはビトロネクチンは、隣接層として提供されうる。一部の実施形態では、ＨＳは、細胞外マトリクスタンパク質またはビトロネクチンに結合している。
【０１９５】
細胞培養基質を形成する方法であって、ＨＳを細胞培養支持体表面に適用するステップを含む方法が提供される。ＨＳは、例えばＨＳを支持体表面上に塗布する、噴霧するまたは注ぐことによって支持体表面上にコーティングされていてもよい。一部の実施形態では、ＨＳを支持体表面に適用する前に、支持体表面が支持体表面へのＨＳの接着を促進するまたは増強するために処理される。こうした処理は、プラズマ処理、例えば、プラズマ重合もしくはアリルアミンプラズマ重合、または化学処理を伴ってもよい。
【０１９６】
細胞培養基質上での細胞の培養
本明細書中に記載の細胞培養基質は、細胞、例えば幹細胞を培養する方法において使用してもよい。
【０１９７】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養における細胞を含む細胞培養物であって、細胞が本明細書中に記載の細胞培養基質と接触している細胞培養物が提供される。
【０１９８】
細胞、例えば幹細胞を培養する方法も提供される。方法は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本明細書中に記載の細胞培養基質と接触させて培養することを含む。
【０１９９】
ヘパラン硫酸の投与量
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の使用において、ＨＳ９は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つ；または約１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、または１ｍｇ以下の；または約０．３〜５μｇ／ｍｌ、０．３〜４、０．３〜３、０．３〜２．５、０．３〜２、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．９、０．３〜０．８、０．３〜０．７、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、１〜２、１〜１．７５、１〜１．５、１〜１．２５、１．２５〜２、１．５〜２、または１．７５〜２μｇ／ｍｌの間の濃度または投与量で使用されうる。
【０２００】
ビトロネクチン
ビトロネクチンは、細胞外マトリクスにおいて見出される糖タンパク質である。
【０２０１】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからのビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号２）は、以下に示される（配列番号１および配列番号３のヘパリン結合ドメインに下線が引かれている）。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受託番号ＡＡＨ０５０４６．１  ＧＩ：１３４７７１６９の下で入手可能である。
【０２０２】
【表７】
0006407980.tif 000008
【０２０３】
本明細書において、「ビトロネクチン」は、上記に例示されるビトロネクチンのアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つの配列同一性を有するタンパク質を含む。
【０２０４】
「ビトロネクチン」という用語は、こうしたタンパク質の断片も含む。断片は、相当する全長配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の最小長を少なくとも含みうる、すなわちこれを有しうる。断片は、最大長を有しうる、すなわち相当する全長配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％未満でありうる。断片は、５アミノ酸の最小長または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、または４００アミノ酸の１つを少なくとも含みうる、すなわちこれを有しうる。断片は、１０アミノ酸、または１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、または４００アミノ酸未満の１つの最大長を有しうる、すなわちこれら未満でありうる。断片は、前記最小と最大長の間の任意の長さを有しうる。
【０２０５】
ビトロネクチンタンパク質は、配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号３に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの１つの配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するヘパリン結合ドメインも含むことが好ましい。
【０２０６】
ビトロネクチンタンパク質は、任意の動物またはヒト、例えば、ヒト以外の動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他のげっ歯動物（げっ歯目の中の任意の動物からを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌ウシ、例えば、乳牛、またはウシ属の中の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ科の中の任意の動物を含む）、ロバ、およびヒト以外の霊長類または他のヒト以外の脊椎動物の生物；および／またはヒト以外の哺乳動物；および／またはヒトから、または由来であってもよい。
【０２０７】
ビトロネクチンの投与量
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の使用において、ビトロネクチンは、ＨＳ９と組み合わせて使用されてもよい。本発明の一部の細胞培養法において、外因性のＨＳ２が培養物に添加される。
【０２０８】
ビトロネクチンの好適な濃度または投与量は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つ；または約１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、または１ｍｇ以下の；または約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．１〜１．０、０．１〜１．５、０．１〜０．２．０、０．１〜２．５、０．１〜３．０、０．１〜３．５、０．１〜４．０、０．１〜４．５、０．１〜５．０ｎｇ／ｍｌの範囲の間を含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＳ９の使用は、外因性のビトロネクチンの添加を排除する。例えば、本発明の一部の細胞培養法において、外因性のビトロネクチンは、培養物に添加されない。
【０２１０】
本発明は、記載の態様および好ましい特徴の組合せを含む。ただし、こうした組合せが明らかに許すことのできないまたは明白に回避される場合を除く。
【０２１１】
本明細書中で使用される節の表題は、組織化目的のみのためのものであり、記載の対象事項を限定するものとして解釈されるものではない。
【０２１２】
本発明の態様および実施形態は、例として、添付の図を参照しながら、ここで例示されることになる。さらなる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。この文中で言及されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２１３】
本発明の原理を例示している実施形態および実験は、ここで、以下の通りである添付の図に関して述べられることになる。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化前および後のＨＥＳ−３細胞のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。酵素消化前の細胞の（ａ）１０Ｅ４（ｂ）３Ｇ１０抗体染色。細胞は、高レベルのインタクトなＨＳ鎖、および低レベルの消化されたＨＳ鎖を発現した。酵素消化後の（ｃ）１０Ｅ４および（ｄ）細胞の３Ｇ１０抗体染色。細胞は、低レベルのインタクトなＨＳ鎖および高レベルの消化されたＨＳ鎖を発現した。（ｅ）インタクトな細胞、ヘパリンでプレインキュベートした細胞、およびヘパリナーゼ消化細胞の細胞接着アッセイ。細胞が、ストレプトアビジン対照表面、ＶＮ−ＨＢＤペプチド表面またはＶＮ５表面上に播種された。ＶＮ−ＨＢＤペプチドへの接着は、ヘパリンおよびヘパリナーゼ処理後に約４０％減少したが、ＶＮ５を結合する細胞の能力は、影響を受けなかった。これは、細胞表面ＨＳがＶＮ−ＨＢＤへのｈＥＳＣの結合に重要であることを示唆している。
【図２】（ａ）３Ｈ−ヘパリンへのＶＮ−ＨＢＤの結合能力を示すグラフである。ＶＮ−ＨＢＤペプチドがニトロセルロース膜上にスポットされ、３Ｈ−ヘパリンでインキュベートされた。結合した３Ｈ−ヘパリンが液体シンチレーションによって決定された。ペプチド上の配列を確認するＶＮ−ＨＢＤペプチドへの３Ｈ−ヘパリン結合の濃度依存的増加は、実際にヘパリン結合ドメインである。（ｂ）ＨＳ９＋ｖｅ単離を示すクロマトグラムである。ＨＳ９＋ｖｅバリアントが、ＶＮ−ＨＢＤペプチドと予め結合したストレプトアビジンカラムを使用して、出発ＨＳｐｍ混合物から単離された。結合していないＨＳ９−ｖｅバリアントフロースルーおよび後の高塩洗浄（１．５Ｍ）（赤色トレース）でのフロースルーは、ＨＳ９＋ｖｅバリアント（青色トレース）を遊離した。双方のバリアントが回収され、さらなる分析の前に脱塩される。
【図３】（ａ）種々のＨＳバリアントのドットプロット結合プロファイルである。ＶＮが膜上にスポットされ、種々のＧＡＧ（ＨＳ９＋ｖｅ、ＨＳ９−ｖｅ、ＨＳｐｍおよびヘパリン）でインキュベートされた。ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ＨＳ９−ｖｅバリアントよりもヘパリンへの高い結合能力を有する；ＨＳｐｍは、中間の結合能力のみを有する。（ｂ）競合アッセイが可溶性ヘパリン、またはＨＳバリアントで行なわれた。ヘパリンビーズへのＶＮの結合に及ぼす様々なＨＳバリアントの阻害効果が観察された。可溶性ヘパリンは、ＶＮに最も貪欲に、次いでＨＳ９＋ｖｅ、ＨＳｐｍおよびＨＳ９−ｖｅに結合する。（ｃ）ヘパリンビーズへのＥＣＭタンパク質（ＶＮ、ＦＮおよびＬＮ）の結合に及ぼすＨＳ９＋ｖｅバリアントの阻害効果を示すグラフである。ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ヘパリンビーズへの結合においてＦＮおよびＬＮではなくＶＮを阻害した。一方、（ｄ）ＨＳ９−ｖｅバリアントは、競合ビーズアッセイにおいてＶＮおよびＬＮよりも高いＦＮへの親和性を有した。（ｅ）ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡによるＶＮへの様々なＧＡＧの結合プロファイルである。ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ＨＳｐｍおよびＨＳ９−ｖｅバリアントよりも有意に高いＶＮへの親和性を有した。（ｆ）ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡによるＶＮへの様々な脱硫酸化ヘパリンの結合プロファイルである。６−ＯおよびＮ硫酸化を有さないバリアントは、有意に減少した結合を有し、２−Ｏ硫酸化を有さないバリアントは、ＶＮ結合に及ぼす効果を有さなかった。（ｇ）ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡによるＶＮへの様々な長さのヘパリンの結合プロファイルである。ｄｐ２およびｄｐ４のＧＡＧは、ＶＮを結合することができなかったが、ｄｐ６単位およびこれ以上のものは、ＶＮに結合することができた。ヘパリンは、陽性対照として役立つ。＊＊＝Ｐ＜０．０５
【図４】（ａ）ＣＥを使用したΔ−二糖標準の電気泳動図である。標準は、明確なピークで個々に分離された。脱重合された試料の電気泳動図。（ｂ）ヘパリン、（ｃ）ＨＳｐｍ、（ｄ）ＨＳ９＋ｖｅおよび（ｅ）ＨＳ９−ｖｅ。ＩＳ：ΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ（２Ｓ、ＮＳ、６Ｓ）；ＩＩＩＳ：ΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ（２Ｓ、ＮＳ）；ＩＩＳ：ΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ（ＮＳ、６Ｓ）；ＩＡ：ΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（２Ｓ、６Ｓ）；ＩＶＳ：ΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ（ＮＳ）；ＩＩＩＡ：ΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（２Ｓ）；ＩＩＡ：ΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（６Ｓ）内標準は、各ピークを同定するのに役立った。
【図５】（ａ）共有結合的移植のための表面およびＥＤＣ濃度の最適化を示すグラフである。３Ｈ−リジンが、種々の表面上のＥＤＣ移植能力に関する読み取りとして使用された。ＮａＯＨが６日間ＰＳ表面をエッチングするために使用されて、種々の密度のカルボキシル基が作製された。ＴＣＰＳは、エッチングが何日行なわれたかにかかわらず、ＮａＯＨ処理表面と比較して最も高い移植能力を示す。最適化表面は、ＴＣＰＳであり、ＥＤＣ濃度は、５０ｍｇ／ｍｌであった。＊＊＝Ｐ＜０．０５。（ｂ）ＥＤＣ移植表面上のヘパリンおよびＨＳｐｍの表面密度を示すグラフである。表面上への３Ｈ−ＧＡＧ移植の濃度依存的増加。バーの上の数字（％での）は、移植効率を示している。この低効率は、さらなる研究に関して実行可能ではない。（ｃ）ＰＬＬ表面上のヘパリンおよびＨＳｐｍの表面密度を示すグラフである。増加する表面密度が増加する溶液濃度で観察された。２ｍｇのコーティング溶液への暴露後の３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍの表面密度は、それぞれ、約８００ｎｇ／ｃｍ２および４００ｎｇ／ｃｍ２であった。（ｄ）７日のＰＬＬ＋ＧＡＧ＋ＶＮ表面上での培養後のＨＥＳ−３細胞画像である。細胞は、広がらなかった、またはコンフルエンスに達しなかった。スケールバー＝０．３ｍｍ。
【図６】（ａ）１００％のＡＡプレートのＸＰＳ結合エネルギープロファイルである。１００％のＡＡ表面は、Ｃ（７９．２％）、Ｎ（１６．４％）およびＯ（４．３４％）を有する。（ｂ）ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡを使用した１００％のＡＡ表面上のＶＮ結合プロファイルである。ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ＨＳ９−ｖｅバリアントよりも有意によくＶＮを結合する。コーティングされていないウェルおよびヘパリンがコーティングされたウェルは、それぞれ、陰性および陽性対照として役立った。（ｃ）１００％のＡＡ表面上のヘパリンおよびＨＳｐｍの表面密度を示すグラフである。ＧＡＧは、ＨＳｐｍよりも高いヘパリン密度で濃度依存的にＡＡ表面に結合する。３Ｈ−ＧＡＧ（１ｍｇ）がコーティングに使用された；３Ｈ−ヘパリンの最終表面密度は、約２５０ｎｇ／ｃｍ２であり、３Ｈ−ＨＳｐｍの最終表面密度は、約１００ｎｇ／ｃｍ２であった。（ｄ）ＴＣＰＳ、ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅおよびＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅがコーティングされた表面上の１２５Ｉ−ＶＮ表面密度を示すグラフである。全ての使用されたＶＮ濃度にわたって、最も高いＶＮ密度は、ＴＣＰＳ上で測定され、ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ表面が後に続き、最も低い密度は、ＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅ上で観察された。＊＊＝Ｐ＜０．０５。
【図７】１週間後のＡＡ＋ＧＡＧ＋ＶＮ２表面上のＨＥＳ−３細胞の顕微鏡写真である。（ａ）ＡＡ＋ヘパリン＋ＶＮ２、（ｂ）ＡＡ＋ＨＳｐｍ＋ＶＮ２、（ｃ）ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ＋ＶＮ２および（ｄ）ＡＡ＋ＨＳ９−ｖｅ＋ＶＮ２。細胞は、ＡＡ＋ヘパリン＋ＶＮ２およびＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ＋ＶＮ２基質に接着したままであったが、ＡＡ＋ＨＳｐｍ＋ＶＮ２およびＡＡ＋ＨＳ９−ｖｅ＋ＶＮ２基質上では剥離した。これは、ＨＥＳ−３細胞の接着および増殖に関してヘパリンおよびＨＳ９＋ｖｅが根底にある基質上に十分な固定化ＶＮがあることを示した。スケールバー＝１ｍｍ
【図８】ｈＥＳＣ培養に関する新規な基質の要約である。ｈＥＳＣ培養に関して、ＴＣＰＳ表面が正に帯電したＡＡで最初に重合され、次いで負に帯電したＨＳ９＋ｖｅバリアントおよびＶＮでコーティングされた。
【図９】表１は、脱重合されたＧＡＧ試料の種々のΔ−二糖組成物の比較である。
【図１０】表２は、０、５０、８０、９０および１００％のＡＡ表面のＮ：Ｃ比の要約である。
【図１１】ビオチン化ＶＮ−ＨＢＤペプチドローディングのクロマトグラムである。ペプチドがカラム中にロードされ、カラムから流れる過剰なペプチドが２８０ｎｍでモニターされた。カラムが１．５Ｍ高塩バッファーで洗浄されて、ペプチドがカラムに強固に結合していることが保証された。
【図１２】（ａ）ヘパリンビーズ上のＶＮ結合プロファイルである。ビーズが種々の量のＶＮでインキュベートされ、ＨＲＰで可視化された。非特異的結合を防ぐために、最適以下の量のＶＮがプローブとして使用された。小さい挿入物は、それぞれの量のＶＮの免疫ブロット画像を示している。（ｄ）ヘパリンビーズ競合アッセイ後にビーズ上に残されたＶＮの免疫ブロット画像である。脱塩されたＨＳｐｍは、ＨＳｐｍを含有するＮａＣｌよりもよくＶＮに結合することに注目されたい。ヘパリンビーズへの（ｂ）ＦＮおよび（ｃ）ＬＮの結合プロファイルである。ビーズは、増加する量のタンパク質に結合し、ＦＮに関して２００ｎｇ、ＬＮに関して１ｍｇで飽和に達した。
【図１３】ビーズへのＶＮ、ＦＮおよびＬＮの結合に及ぼすヘパリンの阻害効果を評価するための競合ヘパリンビーズアッセイを示すグラフである。ヘパリンが陽性対照として使用された。ヘパリンは、変動する親和性で濃度依存的にＶＮ、ＦＮおよびＬＮを結合することができた。
【図１４】ＧＡＧ  ＥＬＩＳＡでのＧＡＧの飽和量の決定を示すグラフである。異なる濃度の（ａ）ヘパリン、（ｂ）ＨＳｐｍ、（ｃ）ＨＳ９＋ｖｅおよび（ｄ）ＨＳ９−ｖｅがウェル上にコーティングされ、ＶＮを結合するそれらの能力が分析された。有意差は、５ｍｇ／ｍｌでも１０ｍｇ／ｍｌでも観察されなかった；したがって５ｍｇ／ｍｌが飽和濃度であった。コーティングされていないウェルは、陰性対照として役立った。
【図１５】フルオレサミンタンパク質アッセイによるＧＡＧにおける一級アミンの数を示すグラフである。０．５ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ  ＧＡＧへのアミンの数における増加。１ｍｇ／ｍｌのＨＳおよびヘパリンでの一級アミンの数の＞６０％の相違。
【図１６】ＥＬＩＳＡによる種々のアリルアミン表面上のＧＡＧ結合プロファイルである。ＧＡＧ（５ｍｇ／ｍｌ）が種々のＡＡ密度表面（０、５０、８０、９０および１００％）上にコーティングされ、次いで５００ｎｇ／ｍｌのＶＮが結合された。１００％の密度でのＡＡ表面は、最も高い量のＶＮを結合するが、密度＜１００％では、最適量のＧＡＧをもはや結合しない。
【図１７】５０〜１００％のＡＡプレートの代表的なＸＰＳ結合エネルギープロファイルである。結果がＣａｓａＸＰＳソフトウェアで分析されて、ピークの面積が決定され、Ｎ：Ｃ比が計算された。（ａ）５０％のＡＡ：５０％のオクタ−１，７−ジエン（ｂ）８０％のＡＡ：２０％のオクタ−１，７−ジエン（ｃ）９０％のＡＡ：１０％のオクタ−１，７−ジエン。より高い量の窒素原子がより高い％の利用されたＡＡから計算された。
【図１８】Δ−二糖標準の相対標準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ．）を示す表である。ＲＴは、保持時間を表す。面積ＲＳＤが＜５％であった場合、＜１％の移動時間ＲＳＤがよい再現性のある結果であると考えられた。
【実施例】
【０２１５】
材料および方法
ＶＮ−ＨＢＤペプチド表面の調製
本発明者らの以前の研究におけるＶＮ５プラットフォーム［１８］に従って、本研究は、Ｃｈｉｎａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ，  Ｃｈｉｎａによって合成されたＮ末端ビオチン化ＶＮ−ＨＢＤペプチド（ビオチン−ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲ）［４８］を利用した。ＲＧＤモチーフを欠いているこのペプチドが、表面を覆った、ヘパリナーゼ処理ｈＥＳＣの接着効率を評価するために、最初にストレプトアビジンがコーティングされた表面上に固定化された［１５］。ストレプトアビジン（Ｇｅｎｅｓｃｉｐｔ）が最初にＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｍｌストックに再構成され、その後２０μｇ／ｍｌ作用濃度として調製された。細菌性グレード（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｒａｄｅ）２４ウェルプレート（Ｂｅｃｋｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が６２５μｌの作用ストレプトアビジン濃度でコーティングされ、４℃で一晩インキュベートされた。次いでウェルがＰＢＳで２回洗浄され、１０μＭのＶＮ−ＨＢＤペプチドが室温で２時間インキュベートされ、その後、ウェルが再び洗浄され、１０μＭ  Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で補充された１ｍｌのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地［４９］がＫｌｉｍらの方法に従って添加された［１５］。コーティングされたプレートが、以前記載されたように直ちにクリスタルバイオレット細胞接着アッセイに使用された［１８］。
【０２１６】
ＨＥＳ−３細胞のヘパリナーゼ消化およびヘパリン阻害
細胞接着の研究のために細胞表面ＨＳを効率的に除去するために、ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩが用いられた。ヘパリナーゼＩ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．７）、ヘパリナーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号なし）およびヘパリナーゼＩＩＩ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．８）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が消化バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣＬ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁され、１凍結融解サイクル内で使用された。ウェル当たり１×１０６細胞でのＨＥＳ−３単一細胞がヘパリナーゼＩ（１０ミリ国際単位（ｍＩＵ））、ヘパリナーゼＩＩ（５ｍＩＵ）およびヘパリナーゼＩＩＩ（１０ｍＩＵ）を含有する１００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁された。細胞懸濁液が１０分毎に混合されながら、３７℃で１時間インキュベートされた。次いで細胞が１２，０００ｒｐｍで回転され、表面ＨＳ発現がＦＡＣＳによって分析された。可溶性ヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が細胞でプレインキュベートされ、ペプチド表面での表面に結合したＨＳへの競合物として役立った。同様に、細胞（１×１０６）が１００μｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁され、１０分毎に混合されながら５００μｇ／ｍｌ濃度での可溶性ヘパリンで１時間インキュベートされた。次いで細胞がクリスタルバイオレットアッセイでＶＮ−ＨＢＤ表面への結合に関して分析された。ヘパリナーゼ消化細胞および可溶性ヘパリンでインキュベートされた細胞の双方が、９６ウェルプレートにおける調製された１０μＭのＶＮ−ＨＢＤペプチド表面またはＶＮ５陽性対照上に播種された［１８］。プレートが、４５分間インキュベートされて、接着が可能にされ、クリスタルバイオレット細胞接着アッセイが行なわれた。ストレプトアビジンがコーティングされた表面は、陰性対照として役立ち、データがＶＮ５の吸光度に基準化された。
【０２１７】
ヘパリナーゼ消化細胞のＦＡＣＳ分析
酵素消化がＨＥＳ−３細胞からの外因性のＨＳ鎖を効率的に除去したことを保証するために、１０Ｅ４［５０］と３Ｇ１０［５１］抗ＨＳ抗体の双方を使用したＦＡＣＳ分析が行なわれた。２．５×１０５の密度で消化された細胞が１％ＢＳＡで洗浄され、２００μｌの１０Ｅ４または３Ｇ１０（１：１００）抗体（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）がそれぞれのアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）（ＤＡＫＯ）に対して１時間追加された。次いで細胞が洗浄され、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（ＤＡＫＯ）（１：５００）で３０分間染色された。次いで外因性のＨＳ発現がＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して決定され、結果がＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析された。ゲーティングがアイソタイプ対照と１０Ｅ４／３Ｇ１０発現間の交差点で行なわれた。
【０２１８】
３Ｈ−ヘパリンでのペプチド結合アッセイ
ヘパリンへの合成されたＶＮ−ＨＢＤペプチドの結合能力を確認するために、Ｂａｉｒｄら［５２］の様式で３Ｈ−ヘパリン結合アッセイが用いられた。簡潔に述べると、ビオチン化ＶＮ−ＨＢＤペプチドがＰＢＳで連続的に希釈され（０、１２．５、２５、５０および１００μｇペプチド）、０．２μＭニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）上に個々にスポットされた。ペプチドが膜上に残されて乾燥され、８０℃まで３０分間加熱された。次いで膜がＰＢＳで３回洗浄され、そこに４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１ｍｌの０．１μＣｉの３Ｈ−ヘパリン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が添加され、膜が一晩インキュベートされた。翌日、膜が３回洗浄され、１ｍｌのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が液体シンチレーションＴｒｉ−ｃａｒｂ  ２８００ＴＲカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）における分析で１分間添加された。
【０２１９】
アフィニティークロマトグラフィー
フロースルーにおけるＡ２８０ｎｍでの結合していないペプチドの検出によって評価されるビオチン化ＶＮ−ＨＢＤペプチド（３ｍｇ）の飽和量が１ｍｌストレプトアビジンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合された。ペプチドが堅くカラムに結合していることを保証するために、１．５Ｍ高塩バッファー洗浄が行なわれた。ＨＳトレース（Ａ２８０ｎｍ）が検出されなかった場合、カラムは、ＨＳローディングの前に低塩バッファーで平衡化された。
【０２２０】
粗ＨＳ（ＨＳｐｍ）（Ｃｅｌｓｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が１ｍｇ／ｍｌで低塩バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解された。合計１００ｍｇのＨＳｐｍ溶液が０．２ｍｌ／ｍｉｎでの低塩バッファー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ−Ｄｕｏｆｌｏｗクロマトグラフィー系；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）における合計３０の別々の注入でロードされ、ベースラインがゼロに達するまでカラムが同じバッファーで洗浄された。結合したＨＳが１．５Ｍ高塩（２０ｍＭリン酸バッファー、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）の一段階勾配で溶出され、結合したおよび結合していないバリアントが回収され（Ａ２３２ｎｍでモニターされ）、カラムが低塩バッファーで再び平衡化された。溶出剤（ＨＳ９＋ｖｅ）およびフロースルー（ＨＳ９−ｖｅ）ピーク試料が別々に回収され、凍結乾燥され、−２０℃で保管された。次いでＨＳ９＋ｖｅとＨＳ９−ｖｅバリアントの双方が１０ｍｌのＨＰＬＣグレード水（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に別々に溶解され、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で１回脱塩された。次いで種々のＨＳバリアントが回収され、凍結乾燥され、−２０℃で保管された。
【０２２１】
ドットブロッティング
ＶＮへの結合親和性に関して種々のＨＳバリアントを分析するために、ニトロセルロース膜がウェル中に添加されたＴＢＳＴおよびＶＮ（１μｇ）ですすがれた。膜が５％ＢＳＡで１時間ブロックされた。ＧＡＧ（２ｍｇ）が、１ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．５に溶解されたビオチン−ＬＣ−ヒドラジド（６０μｌの２ｍｇ／ｍｌ溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、最初にビオチン化された。簡潔に述べると、ＥＤＣ（１．５ｍｇ）が混合物に添加され、別の１．５ｍｇのＥＤＣの添加前に２時間インキュベートされ、その後取り込まれなかったビオチンがＦａｓｔ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＰＤ１０）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去された。これらのビオチン化ＧＡＧ（１μｇ）がドットブロット装置のウェル中に添加され、１０分間置かれ、次いでピペットで吸引され、ＴＢＳＴで洗浄された。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（２ｍｌ）が１０分間添加され、洗浄され、ＬｕｍｉＧＬＯ化学発光基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に暴露され、Ｘ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に暴露された。
【０２２２】
ヘパリン−セファロースビーズ競合アッセイ
ＶＮおよび他のＥＣＭタンパク質への各脱塩されたＨＳバリアント（ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅ）の結合親和性を調査するために、ヘパリン−セファロースビーズ競合アッセイがＯｎｏら［５３］に従って行なわれた。簡潔に述べると、アッセイが室温で行なわれ、反応当たり２０μｌのＢｉｏｇｅｌ  Ｐ１０（Ｂｉｏｒａｄ）を有する２０μｌのヘパリン−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が使用された。ビーズスラリーの「マスターミックス」が、誤差を減少させるために調製された。マスターミックスが１ｍｌの１％ＢＳＡで３回洗浄された。ビーズスラリーのアリコート（４０μｌ）が結合実験のために個々の１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に分離された。
【０２２３】
異なる濃度のＥＣＭタンパク質（ＶＮ、ＬＮ、およびＦＮ）が１００μｌ体積でビーズに添加された。懸濁液が一定の回転下で３０分間インキュベートされ、その後ビーズが１分間回転され（２０００ｒｐｍ）、１ｍｌの１％ＢＳＡおよびＰＢＳ中の１ｍｌの０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。ＰＢＳ中の相当する抗ＥＣＭ抗体（１００μｌ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（２５０ｎｇ／ｍｌ抗ＶＮ、５μｇ／ｍｌ抗ＬＮ、２μｇ／ｍｌ抗ＦＮ）が別の３０分間添加された。ビーズが洗浄され、ＰＢＳ中の１００μｌのＨＲＰがコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（１：１０，０００）が３０分間添加された。最後に、ビーズが洗浄され、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加され、色が展開された。３０分後、５０μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４が添加された。
【０２２４】
次に、ＥＣＭタンパク質へのＧＡＧの結合親和性が競合アッセイによって調査された［５３］。種々の濃度（０、５、５０および１００μｇ）のＧＡＧが、回転されながら１００μｌでの個々のＥＣＭタンパク質で３０分間プレインキュベートされた。次いで反応物が洗浄された４０μｌのビーズスラリー中に添加された。結果が、対照（未完成の）ビーズからの読みに基準化することによって、「結合した百分率」として表された。競合アッセイからの結果を確認するために、免疫ブロットが行なわれた。競合後、ビーズが洗浄され、３０μｌのＬａｅｍｍｌｉバッファー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で９５℃で煮沸された。ビーズが回転され、上清が１８０Ｖで４０分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にロードされ、ニトロセルロース膜に移された。次いで、膜が、相当する一次抗体で５％ＢＳＡにおいて４℃で一晩探索された。次いで、５％ＢＳＡ中のＨＲＰがコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（１：１００００）が室温で１時間インキュベートされた。最後に、膜が洗浄され、ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（登録商標）化学発光基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に暴露されたて、バンドが可視化された。
【０２２５】
グリコサミノグリカンＥＬＩＳＡ
このアッセイは、グリコサミノグリカン結合９６ウェルプレート（Ｉｄｕｒｏｎ）上へのＨＳバリアントの固定化および製造者の推奨に従って抗体を通して評価されるＶＮ結合能力に基づいた。ウェルが、２００μｌの５  ｇ／ｍｌ  ＧＡＧ（ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅ）、ヘパリン二糖標準（ｄｐ２からｄｐ１２）または標準アッセイバッファー（ＳＡＢ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＡｃ、（ｖ／ｖ）０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）において調製された選択的に脱硫酸化されたヘパリン標準で室温で一晩インキュベートされた。次いでウェルが２００μｌのＳＡＢで３回洗浄され、３７℃で１時間ブロックされた（ＳＡＢ中の０．４％（ｗ／ｖ）アイシングラス）。ウェルがＳＡＢで３回洗浄され、種々の濃度（０〜１μｇ／ｍｌ、各２００μｌ）のＶＮがウェル中に添加され、３７℃で２時間インキュベートされた。ウェルが再び洗浄され、２００μｌの抗ＶＮ抗体（２５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が３７℃で１時間添加された。ウェルが洗浄されて、結合していない抗体が除去され、２００μｌの２５０ｎｇ／ｍｌヤギ抗マウスビオチン化抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が３７℃で１時間添加された。インキュベーション後、ウェルが洗浄され、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（２００μｌの２２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が３７℃で３０分間添加された。最後に、ウェルが洗浄され（３回）、２００μｌのＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）リン酸ｐ−ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が４０分間添加された。比色吸光度が４０５ｎｍでＶｉｃｔｏｒマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読まれた。
【０２２６】
キャピラリー電気泳動
ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅバリアント（２００μｇ）がヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｉｄｕｒｏｎ）で全て消化されて（５０ｍＭ  ＮａＡｃ、１ｍＭ酢酸カルシウムおよび１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７）、２ｍｇ／ｍｌストックが得られた。ヘパリンが最初にそれぞれ４ｍＩＵのヘパリナーゼＩおよびＩＩで３０℃で３時間消化され、それから１ｍＩＵのヘパリナーゼＩＩで別の６０分間消化された。ＨＳ試料が４ｍＩＵヘパリナーゼＩで３０分間消化され、４ｍＩＵヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩで３０℃で別の３．５時間消化された。２３２ｎｍでの吸光度が消化プロセスを通して測定されて、完全な消化が保証された。反応が９５℃で１分間変性させることによって終結された。
【０２２７】
脱重合された試料における二糖の定量化が、ストック（２ｍｇ／ｍｌ）をＭｉｌｌｉＱ水で１ｍｇ／ｍｌに希釈することによって完了され、２５μｌの１ｍｇ／ｍｌ内標準（４ＵＡ−２Ｓ（登録商標）ＧｌｃＮＣＯＥｔ−６Ｓ）（Ｉｄｕｒｏｎ）Δ−二糖が添加された。次いで脱重合された試料がＣＥに供され、次いでピーク下面積が検量線と比較された。次いで各試料のモル百分率が各標準の分子量から計算された。比較のための標準プロファイルを産出するために、ヘパリン二糖（Δ−二糖）標準（Ｉｄｕｒｏｎ）が２５０μｇ／ｍｌで分離された。
【０２２８】
ＣＥがダイオードアレイ検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ）を備えたＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ装置上で２５℃で行なわれた。膜濾過された（０．２２μｍ）６０ｍＭギ酸溶液（ｐＨ３．４）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）がランニングバッファーとして使用された。分離が、６０ｃｍの長さおよび７５μｍの内径を有するコーティングされていない石英ガラスキャピラリーチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）において行なわれた。サイクルは、５分の水でのすすぎ、３分の１Ｍ  ＮａＯＨ、５分のバッファー洗浄および５秒の試料注入（６．４５１６平方センチメートル（平方インチ）（ｐ．ｓ．ｉ．）当たり２２７ｇ（０．５ポンド）の力、−１５ｋＶの逆極性）にプログラムされていた。二糖が４０分間分離され、個々のピークが２３２ｎｍで検出された。
【０２２９】
ポリスチレン表面の水酸化ナトリウムエッチング
ＨＳを化学的に固定化するために、ＮａＯＨがポリスチレン表面のエッチングのために用いられて、白壁透明底９６ウェルＴＣＰＳプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）においてカルボキシル基の最大数が暴露された［５４］。４：１（ｖ／ｖ）ＮａＯＨ（４Ｎ）：メタノールの溶液が調製され、２５０μｌが各ウェル中に指定された時点（０日から７日）で３７℃で添加された。７日後、ウェルが１０％クエン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間洗浄され、後の３Ｈ−ＧＡＧ移植アッセイに使用された。
【０２３０】
フルオレサミンアッセイ
様々なＧＡＧ（ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅ）の一級アミン含有量を比較するために、フルオレサミンタンパク質色素アッセイが利用された。フルオレサミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（３ｍｇ／ｍｌ）の新鮮ストックが琥珀色のチューブ中で活発に混合されながらジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製された。２つのＧＡＧ濃度（０．５および１ｍｇ／ｍｌ）が利用された。ＧＡＧ溶液（９０μｌ）が３０μｌのストックフルオレサミン溶液に添加され、ピペッティングによって混合された。反応物は、１５分間進行させておかれ、その後反応物は、徹底的に混合され、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して読まれた。検量線がＢＳＡ（５００μｇ／ｍｌから）標準の２倍希釈から産出された。９０μｌ標準が３０μｌの色素と室温で１５分間混合され、読まれた。一級アミンの濃度が検量線との比較によって定量化された。
【０２３１】
ＥＤＣでのＴＣＰＳへのＧＡＧの共有結合
ＨＳをＮａＯＨがエッチングしたＰＳおよびＴＣＰＳ表面上に物理的に連結するために、共有結合的固定化が探索された。ここで、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が５０ｍｇ／ｍｌの作用濃度まで３Ｈ−リジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）におけるアミンのクロスリンクに最適化された。これが０．１Ｍ  ＭＥＳバッファー、ｐＨ６に溶解され、２００μｌのこの溶液がホワイトウォール、透明底９６ウェルＴＣＰＳプレート中に添加されて、撹拌されながら室温で１時間反応させられた。６０分後、プレートが最初に０．１Ｍ  ＭＥＳバッファーで、次いで水でそれぞれ２回洗浄された。ＰＢＳ（１００μｌ）中の種々の濃度の３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳ（０から１００ｍｇ／ｍｌ）が３重のウェル中に添加され、撹拌されながら室温で２時間インキュベートされた。最後に、ウェルが１０×ＰＢＳで２回（各１０分）、水で１回（１０分）、水でさらに３回（各５分）洗浄された。シンチレーション液（２００μｌ）が各ウェル中に添加され、放射性カウント（１分）がＭｉｃｒｏＢｅｔａカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でモニターされた。
【０２３２】
ポリ−Ｌ−リジンコーティング
正に帯電した表面を作製する簡単な方法は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でのコーティングによる。０．０１％ＰＬＬ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（５０μｌ）がホワイトウォール、透明底９６ウェルＴＣＰＳプレートの各ウェル中にまたは３００μｌが２４ウェルプレートの各ウェル中に撹拌されながら室温で５分間添加された。過剰な結合していないＰＬＬ溶液が除去され、表面がＰＢＳで２回洗浄された。プレートが３時間風乾された。次いでポリ−Ｌ−リジンがコーティングされた正に帯電した表面がＧＡＧ（５μｇ／ｍｌ）の固定化および後の細胞培養に利用された。
【０２３３】
ＨＥＳ−３  ＥＳＣでのＰＬＬ表面のスクリーニング
ＥＳＣ培養に関するＰＬＬ表面の適合性を保証するために、細胞接着アッセイがＨＥＳ−３で行なわれた。ＰＬＬが予めコーティングされた２４ウェルプレートがＰＢＳ中の４００μｌのＧＡＧ（ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅ、ＨＳ９−ｖｅ）（５  ｇ／ｍｌ）で室温で２時間コーティングされた。ウェルがＰＢＳで洗浄され、その後ＰＢＳ中のＶＮ２．５またはＶＮ５（ウェル当たり３００μｌ）で４℃で一晩コーティングされた。ＨＥＳ−３細胞が、常法に従って、ＭＴｅＳＲ（登録商標）１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＶＮ５でコーティングされたＴＣＰＳ上で維持された。分化した細胞が手動のピペッティングによって除去され、残りが機械的に解離された。細胞（３×１０５）が各試験ウェル中に播種され、細胞増殖が７日目の終わりに評価された。
【０２３４】
アリルアミンプラズマ重合および分析
負に帯電したＧＡＧの静電気的な固定化のために正に帯電したＴＣＰＳ表面を頑強に産出するために、アリルアミン単量体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用したプラズマ重合が用いられた［４７］。ポリスチレンプレート（９６ウェルまたは２４ウェル）（ＳＡＲＳＴＥＤＴ）およびアルミホイルがプラズマチャンバーに真空下で一晩置かれて、翌日のプラズマコーティングの前に全ての空気が除去された。反応器が５×１０−２パスカル（５×１０−４ミリバール）未満のベース圧力まで排気された。
【０２３５】
アリルアミン単量体がいくつかの凍結融解サイクルで脱気されて、使用前に溶解した気体が除去された。分当たり約５標準立法センチメートル（ｓｃｃｍ）の単量体流速［４６］がニードル弁で調整され、沈着前に安定化することが可能にされた。ＡＡがコーティングされたプレートの種々の百分率を達成するために、流れがアリルアミンおよびオクタ−１，７−ジエンの種々の比と混合された。使用された単量体比は、１００％のアリルアミン、９０％のアリルアミン：１０％のオクタ−１，７−ジエン、８０％のアリルアミン：２０％のオクタ−１，７−ジエン、５０％のアリルアミン：５０％のオクタ−１，７−ジエンおよび１００％のオクタ−１，７−ジエンであった。流速が式によって計算された［５５］：
（３０秒の終わりでチャンバーを単離した後の圧力  −  チャンバーを単離する前の圧力）／３０＊１２５１
次いでプラズマが１３．５６ＭＨｚおよび５ワットで無線周波発生器（Ｃｏａｘｉａｌ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｔｄ）で点火された。プラズマが４０分間オンにされ、その後チャンバーがベース圧力に汲み出され戻された。プレートが除去され、蓋が交換されて、無菌性が維持された。次いでこれらの無菌のプレートが細胞培養のためのＧＡＧの固定化を伴う実験に使用された。チャンバーにおけるアルミホイルが、アルミニウムアノードおよびプレート上に沈着したアミンの密度を確認するためのワイドスキャン分析を備えたＸＰＳによって読まれた。結果がＣａｓａＸＰＳソフトウェアで分析された。窒素：炭素（Ｎ：Ｃ）比がＮおよびＣピーク下の面積から計算されて、表面上のＡＡの相対量が取得された。様々な百分率のＡＡがコーティングされた９６ウェルプレート上の固定化ＧＡＧが、ＧＡＧ  ＥＬＩＳＡアッセイ方法を使用して、ＶＮへのそれらの結合能力に関して分析された。
【０２３６】
３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍの定量化
１００％のＡＡが重合した９６ウェルプレートに結合しているＧＡＧの量を決定するために、３Ｈ−ヘパリン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）および３Ｈ−ＨＳｐｍ（ＲＣ  ＴＲＩＴＥＣ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって放射標識された）を使用した結合アッセイが用いられた。上昇する濃度（０、１．２５、２．５および５μｇ／ｍｌ）の９０％の非標識ヘパリンまたはＨＳｐｍ：１０％の３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍ放射性溶液の混合物がＰＢＳ中で調製された。各ＧＡＧ溶液（２００μｌ）が試験される表面（ＴＣＰＳ、ＰＬＬ、ＡＡ）上で室温で一晩インキュベートされた。翌日、ウェルがＰＢＳで洗浄され、２００μｌのシンチレーションカクテルが添加され、プレートがＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーションカウンターにおいてそれぞれ１分間３回読まれた。検量線が３Ｈ−ＧＡＧの既知量で産出され、ヘパリンおよびＨＳｐｍの表面密度が決定された。
【０２３７】
表面上の１２５Ｉ−ＶＮ定量化
種々の９６ウェルプレート（ＨＳ９＋ｖｅでコーティングされた、ＴＣＰＳ、ＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅおよび１００％のＡＡが重合した表面）に結合しているＶＮの量を定量化するために、ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ放射性標識されたＶＮが用いられた。表面がウェル当たり３００μｌで５μｇ／ｍｌのＨＳ９＋ｖｅでコーティングされた。ＶＮがヨウ素化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１２５Ｉアイソトープ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で標識され、ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で定量化された。
【０２３８】
統計的分析
全てのデータ値が±標準誤差として全て３重で報告された。一元配置ＡＮＯＶＡが行なわれて、群にわたる相違が比較され、Ｐ＜０．０５が有意であるとみなされた。両側スチューデントＴ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）が行なわれて、２つの試料群間の相違が決定された。Ｓｉｇｍａプロットソフトウェアを使用して、グラフがプロットされ、データが変換された。
【０２３９】
結果
表面ヘパラン硫酸は、ＶＮ−ＨＢＤ基質への接着に重要である
内在性ＧＡＧはＶＮとの接着複合体の一部でありえたため、最初に、本発明者らは、細胞接着における表面ＨＳの役割を調査しようと努めた。Ｂｒａａｍらは、αＶβ５インテグリンが、ｈＥＳＣが全長ＶＮに接着するために必要であることを以前示した［１２］。Ｋｌｉｍらによる研究も、表面ＧＡＧが、コンドロイチナーゼ（ｃｈｒｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ）ＡＢＣでの消化後にｈＥＳＣがＲＧＤモチーフを欠いているＶＮ−ＨＢＤを結合することができるために重要であることを実証した。しかしながら、コンドロイチナーゼＡＢＣは、幹細胞表面上で最も豊富なＧＡＧ、ＨＳよりも、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を主に消化する。したがって、ＶＮがコーティングされたＴＣＰＳへの細胞接着に関する表面ＨＳの機能的役割を調査するために、酵素ヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩが最初に使用されて、内在性細胞表面ＧＡＧが特異的に消化された。組合せで使用された場合、酵素は、＞９０％の内在性ＨＳを除去することができる［５６］。消化後、細胞がＦＡＣＳによって分析されて、１０Ｅ４と３Ｇ１０抗体の双方で表面ＨＳがないことが確認された（図１）。１０Ｅ４抗体は、インタクトなＨＳに結合し、３Ｇ１０抗体は、脱重合されたＨＳ鎖に結合する。消化前、細胞は、高レベル（＞９０％）のインタクトな１０Ｅ４反応性ＨＳおよび低レベル（＜２％）の消化された３Ｇ１０反応性ＨＳを発現した。ヘパリナーゼ消化後、インタクトなＨＳ鎖が除去され、細胞表面上の＞９５％の３Ｇ１０反応性不飽和化ウロン酸残基が明らかになった（図１ａ〜ｄ）。これは、ヘパリナーゼ消化後に内在性ＨＳがないことを確認した。
【０２４０】
次いで消化された細胞がＶＮまたはＶＮ−ＨＢＤ表面上に播種され、それらの接着が評価された。データは、このペプチド表面への結合能力が消化された細胞に関して減少したが、処理されていない細胞は影響されなかったことを明確に示した（図１ｅ）。可溶性ヘパリンでの細胞のプレインキュベーションも、その結合を減少させ（約４０％）、ヘパリンがペプチドへの結合において内在性ＨＳと競合することができたことを示唆している。まとめると、これは、細胞が内在性ＨＳを通してＶＮ−ＨＢＤペプチドに結合することを実証した。対照的に、細胞は、処理されていない細胞と同様に、どちらの処理後でも、ＶＮ５表面上でのそれらの結合を減少させなかった。これは、表面ＨＳが、細胞がαＶβ５インテグリンを主に利用する結合である、全長ＶＮへの結合に決定的ではないことを示唆した。
【０２４１】
ＨＳ９＋ｖｅバリアントの単離
次に本発明者らは、増加したＶＮ結合親和性を有するＨＳバリアントを単離した。合成されたビオチン化ＶＮ−ＨＢＤペプチドのヘパリン結合能力を確認するために、３Ｈ−ヘパリン結合アッセイが最初に行なわれた［５２］。データは、ペプチドが濃度依存的に３Ｈ−ヘパリンに結合することができたことを示し（図２ａ）、ＶＮにおけるこの配列が実際にヘパリン結合性であり、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用されるであろうことを示唆している。最初に、カラムが、過剰なペプチド（緑色トレース）が２８０ｎｍでのフロースルーにおいて観察されるまでビオチンペプチドで飽和させられた（図１１）。カラムが、ＨＳｐｍの市販の製剤のローディングのための準備として低塩バッファーで平衡化された（図２ｂ）。ペプチドに結合しなかったフロースルーＨＳ（青色トレース）は、ＨＳ９−ｖｅと命名された。結合したバリアントが、一段階１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出（赤色トレース）を使用してカラムから溶出され、ＨＳ９＋ｖｅ（青色トレース）として回収され、脱塩された。１００ｍｇの出発ＨＳｐｍから、１９．６ｍｇ（１９．６％）のＨＳ９＋ｖｅおよび４３．４ｍｇ（４３．４％）のＨＳ９−ｖｅが単離された；重量の残りは、ＮａＣｌによって構成された。興味深い所見は、高塩洗浄中にＨＳ９＋ｖｅの最大溶出に達するための遅延時間の存在であった。これは、ＨＳ９＋ｖｅを含む高から低結合親和性種の不均一な集団があることを示唆した。次に、ＶＮへのＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅバリアントの結合能力が決定された。
【０２４２】
ＨＳバリアント特徴付け
ヘパリン、出発物質（ＨＳｐｍ）、ならびに結合したおよび結合していないバリアントの結合親和性をさらに調査するために、ドットブロッティング、ヘパリン−セファロースビーズアッセイおよびＧＡＧマイクロタイタープレートアッセイが行なわれた。これらのアッセイは、ＶＮまたはＧＡＧを固定化することまたはヘパリンビーズへのＶＮ結合に関する競合によってそれらのＶＮ結合親和性を評価するための種々の戦略を使用した。
【０２４３】
ドットブロッティング
ニトロセルロース−固定化ＶＮ、後のビオチン化ＧＡＧを使用した免疫ブロットが使用されて、各ＨＳバリアントの結合能力が検証された。陰性対照においてスポットがないことによって示されるように、ＧＡＧの非特異的結合は、検出されなかった、（図３ａ）。陽性対照では、ヘパリンは、ＶＮに強く結合することが見出され、フィルム上の強いスポットを作製した。ＨＳ９＋ｖｅは、ＨＳ９−ｖｅバリアントよりもよくＶＮに結合し、ＨＳｐｍは、中間の結合能力を有することが見出された。本発明者らは、ＨＳｐｍが陽性および陰性ＨＳの混合物、したがって高度に可変性の程度の結合能力を含有することを推測していたので、これは、予測されていた。
【０２４４】
ヘパリン−セファロースビーズ競合アッセイ
このアッセイは、ＨＳバリアントがヘパリンビーズへのＶＮの結合を阻害する能力を測定する。極端な負電荷を有するヘパリンは、最も高い親和性でＶＮに結合する。したがって、ＶＮに関するヘパリンの結合能力が種々のＨＳバリアントで検証された。ＶＮがヘパリンビーズにまさに結合したことを確認するため、および好適な作用濃度を決定するために、様々な量のＶＮが利用され（０〜８０ｎｇ）、このＥＬＩＳＡ方法を使用して検出された。ＶＮ飽和曲線は、それが４０ｎｇで生じる最大の結合で濃度依存的に結合したことを明らかにした。曲線から同定された最適以下のＶＮ量は、２０ｎｇであった（補足図２ａ）。次いでＶＮ（２０ｎｇ）からの吸光度が１００％結合したレベルとして使用された。
【０２４５】
さらなるアッセイが、それぞれ５、５０および１００μｇでの可溶性ヘパリン（陽性対照として）またはＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅもしくはＨＳ９−ｖｅバリアントでのＶＮのプレインキュベーションによって行なわれた。結果が以前測定された１００％ＶＮ結合ビーズの吸光度に基準化され、ビーズに％結合したとしてプロットされた（図３ｂ）。ＶＮに特異的に結合するＨＳバリアントは、ヘパリンビーズへのＶＮの結合を競合的に阻害する。可溶性ヘパリン（１００μｇ）は、結合したＶＮの検出がないことによって確認されるようにビーズへのＶＮ結合（＜１０％の結合）をほぼ完全に阻害した。ＨＳ９−ｖｅバリアントは、検出された高い吸光度によって示されるように、ＶＮへの最も弱い結合親和性を有した。１００μｇにまでも増加する量のＨＳ９−ｖは、ＶＮとヘパリンビーズ間の相互作用を阻害しなかった。対照的に、増加する量のＨＳ９＋ｖｅで、ビーズへのＶＮ結合の濃度依存的阻害が観察された（１００μｇ  ＶＮで約１０％結合した）。中間の阻害によって示唆されるように、中程度の結合親和性がＨＳｐｍから検出された（１００μｇ  ＶＮで約３０％結合した）。同時に、これらの知見は、ＨＳ９＋ｖｅバリアントの結合親和性がＨＳ９−ｖｅバリアントよりも高く、ＨＳｐｍが中間の親和性を有することを示唆した。
【０２４６】
ＨＳ−ＶＮ結合の必要条件をさらに理解するために、結合バッファーのイオン強度も、系統的に（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ）変動された。免疫ブロット結果は、バンド強度の低下によって示されるように、脱塩されたＨＳｐｍがＶＮ−ビーズ結合を阻害したことを明らかにした。しかしながら、ＮａＣｌ含有ＨＳｐｍは、強いバンド強度によって確認されるように、ＶＮに結合しなかった（図１２ｄ）。したがって、ＰＢＳなどの生理学的バッファーのみが後の結合実験に使用された。
【０２４７】
ＶＮへのＨＳ９＋ｖｅの相対的特異性を確認するために、他のＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン（ＦＮ）およびラミニン（ＬＮ））へのその親和性も、調査された。各ＥＣＭタンパク質の最適以下の作用量が最初に予め決定された。ＦＮおよびＬＮの飽和結合プロファイルは、最適以下の量がそれぞれ２００ｎｇおよび１μｇであることを示した（図１２ｂおよびｃ）。これらの量は、ビーズ上の％結合を達成するために後の競合アッセイおよび競合データの基準化に利用された。
【０２４８】
増加する濃度の可溶性ＨＳ９＋ｖｅバリアントがヘパリンビーズへの種々のＥＣＭタンパク質の結合を競合的に阻害するために使用され、ビーズ上に残されたタンパク質の量がそれらのそれぞれの抗体で測定された（図３ｃ）。ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ビーズへのＶＮの結合を用量依存的に阻害し、検出されたＶＮの低レベルをもたらしたが、ＦＮおよびＬＮの結合を阻害しなかった。これは、１００μｇのＨＳ９＋ｖｅでさえも結合したタンパク質の用量依存的低下がないことによって示され、ここでもＨＳ９＋ｖｅがＶＮに関する相対的特異性を有することを実証している。同時に、ＨＳ９−ｖｅバリアントも、ヘパリンビーズへのＶＮ結合を阻害するために使用された（図３ｄ）。データは、ＨＳ９−ｖｅバリアントがＶＮまたはＬＮよりもよくビーズへのＦＮ結合を阻害することができたことを示した。これは、ＨＳ９−ｖｅバリアントがＦＮ結合配列に関して濃縮されたことを示唆した。
【０２４９】
この競合的阻害をさらに確認するために、可溶性ヘパリンが競合物として使用された（図１３）。ヘパリンは、ヘパリンビーズへの結合においてＦＮおよびＬＮよりもよいＶＮ阻害で３つ全てのＥＣＭタンパク質を異なる程度まで阻害した。まとめると、これらの知見は、ＨＳ９バリアントがヘパリン＞ＨＳ９＋ｖｅ＞ＨＳｐｍ＞ＨＳ９−ｖｅの段階的なＶＮへの結合親和性を有することを明確に示している。
【０２５０】
グリコサミノグリカンＥＬＩＳＡ
ＨＳ９バリアント結合親和性のさらなる検証を提供するために、ＶＮへのＧＡＧ結合に基づくＥＬＩＳＡが用いられた；最初の実験は、プレート表面を完全に飽和させるのに必要なヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅの濃度を最適化するように設計された。ウェルが１、５および１０μｇ／ｍｌの各ＧＡＧでコーティングされ、ＶＮへの結合親和性が探索された（図１４）。データは、５μｇ／ｍｌのＧＡＧ溶液がウェルを完全に飽和させるのに十分であることを明らかにした；したがって、この飽和濃度が実験の残りの部分に使用された。
【０２５１】
次いでＧＡＧが一晩コーティングされ、ＶＮへのそれらの結合親和性に関して調査された（図３ｅ）。結合曲線は、ＧＡＧにかかわらず、ＶＮ結合の用量依存的増加があることを示した。ＨＳ９＋ｖｅは、出発物質ＨＳｐｍおよびフロースルーＨＳ９−ｖｅよりも有意に高いＶＮへの親和性を有した。最も負に帯電したバリアントであるヘパリンは、残りのものよりも有意に高いレベルでＶＮに結合していた。これは、ヘパリンビーズ競合アッセイの結果を強化した。
【０２５２】
ＨＳ結合は、部分的には、二糖鎖と共に負に帯電した硫酸残基の結果であるので、ＶＮと相互作用するＨＳバリアントの構造組成を理解することは、重要である。選択的に脱硫酸化されたヘパリン標準がＥＬＩＳＡ表面上に固定化された（図３ｆ）。選択的に脱Ｎ硫酸化または脱６−Ｏ硫酸化されたヘパリンは、ＶＮへの有意に減少したレベルの結合を有することが見出された。対照的に、２−Ｏ硫酸化がない鎖は、影響を受けず、インタクトなヘパリンの様式に匹敵する様式でＶＮに強く結合していた。類似の実験では、２個の二糖（重合の程度（ｄｐ２））から１２個の二糖（ｄｐ１２）まで変動する長さのヘパリン標準がＶＮ結合に必要な最小のサイズを探すために使用された（図３ｇ）。ｄｐ２およびｄｐ４鎖への結合の有意な欠如があった。３繰返し単位を超える鎖に関して、ＶＮへの概して同様の結合親和性があった。したがって、これらの結果は、少なくとも３個の二糖繰返し単位の鎖上のＮ−および６−Ｏ−硫酸化がヘパリンへのＶＮ結合に必要であることを強く示唆している。この結論は、ＨＳに関しても妥当でありうる。
【０２５３】
キャピラリー電気泳動
この技法は、サイズおよび電荷に基づいて個々の二糖を分離する。７ヘパリン二糖標準の分離が完了され、図４ａに示されている。Δ−二糖標準ＩＳ命名は、２Ｏ−、６Ｏ−およびＮ−硫酸化を含有するΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを表し；ＩＩＳは、６Ｏ−およびＮ−硫酸化を含有するΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを表し；ＩＩＩＳは、２Ｏ−およびＮ−硫酸化を含有するΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳを表し；ＩＶＳは、Ｎ−硫酸化のみを含有するΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＳを表し；ＩＡは、２Ｏ−および６Ｏ−硫酸化を含有するΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓを表し；ＩＩＡは、６Ｏ−硫酸化のみを含有するΔＵＡ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓを表し、ＩＩＩＡは、２Ｏ−硫酸化のみを含有するΔＵＡ２Ｓ（１→４）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃを表す。元素構造は、Ｒｕｉｚ−Ｃａｌｅｒｏらにおいて表されている［５７］。
【０２５４】
最後のピーク（ＩＶＡ）は、６．４５１６平方センチメートル（平方インチ）（ｐ．ｓ．ｉ．）当たり推奨された２２７ｇ（０．５ポンド）圧力勾配がランの完了後にさらなる３０分間適用された場合でさえも、検出されなかった。したがって、ＩＶＡは、この研究から省略される。Ｒｕｉｚ−Ｃａｌｅｒｏらとの検出時間の観察された相違は、使用された異なる機器、または０．５ｐ．ｓ．ｉ．を達成できないことによるであろう；にもかかわらず、ピークは、互いによく分離された。内標準が消化された試料における様々なピークの同定を補助するために添加された。
【０２５５】
再現性のある結果を達成し、試料における相違を説明するために、Δ−二糖標準の５つの複製が分離された。移動時間およびピーク面積が相対標準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ．）として表された（図１８）。Ｒ．Ｓ．Ｄ．は、面積標準偏差が＜５％であり、＜１％の移動時間標準偏差が達成された場合、信頼できるとみなされた。測定標準（Ｒ．Ｓ．Ｄ．）は、個々のピーク面積からの各Δ−二糖標準に関する較正曲線の産出を可能にした（適合度（Ｒ２）＞０．９９）。
【０２５６】
次に、脱重合されたヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅまたはＨＳ９−ｖｅバリアントの電気泳動図プロファイルが産出された。ＣＥ分析前に、各ＨＳバリアントの脱重合が２３２ｎｍでモニターされた。消化されていない試料は、０．０１の吸光度を有し、約１．１まで増加し、さらなる増加が見られない場合、脱重合が完了しているとみなされた。各試料プロファイルを示している電気泳動図が図４ｂからｅに示されている。３回の反復試験が行なわれ、平均ピーク下面積が計算され、検量線と比較された。各ピークの同一性が混合物中に添加された内標準からの相対的シフトと各ピークの移動時間の双方から決定された。ＩＩＩＡに関するほぼ検出不可能なピークにより、その同一性がＩＩＩＡΔ−二糖標準を脱重合されたＨＳ試料中に添加することによって確認された。
【０２５７】
各消化されたＨＳバリアントの二糖組成の比較が図９における表に示されている。結果は、ヘパリンにおける主要な単位が、それぞれ、６６．１％および２０．８％での三硫酸化（２Ｓ、６ＳおよびＮＳ）ＩＳおよび二硫酸化（６ＳおよびＮＳ）ＩＩＳであることを明らかにした。対照的に、ＨＳｐｍにおける主要な単位は、単一硫酸化（ＮＳ）ＩＶＳおよび二硫酸化（６ＳおよびＮＳ）ＩＩＳ（それぞれ、３６．８％および２３．７％）である。ＨＳｐｍにおいて観察される三硫酸化（２Ｓ、６ＳおよびＮＳ）ＩＳの大きな低下は、ＨＳのより低い硫酸化のためであろう。アフィニティークロマトグラフィーステップ後、ＨＳ９＋ｖｅバリアントが三硫酸化（２Ｓ、６ＳおよびＮＳ）ＩＳおよび二硫酸化（６ＳおよびＮＳ）ＩＩＳ（それぞれ、２６．０％および３０．６％）に関して濃縮された一方、ＨＳ９−ｖｅバリアントは、単一硫酸化（ＮＳ）ＩＶＳ（３３．３％）を最も顕著に有したことも観察された。
【０２５８】
明確に、最も注目すべきポイントは、ＨＳ９＋ｖｅにおける三硫酸化ＩＳおよび二硫酸化ＩＩＳΔ−モチーフのＨＳ９−ｖｅにおけるよりも高い比率の存在である。これは、６Ｏ−およびＮ−硫酸化の組合せがＶＮへのＨＳ結合に非常に重要であることを明確に示唆しており、結果は、ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡによっても支持された（図３ｆ）。出発ＨＳｐｍ物質と比較してＨＳ９＋ｖｅバリアントにおける単一硫酸化（ＮＳ）ＩＶＳおよび単一硫酸化（６Ｓ）ＩＩＡの濃縮がないことは、どちらのドメイン単独もＶＮ結合に十分ではないことを示唆している。対照的に、２Ｏ−硫酸化は、以前のＧＡＧ  ＥＬＩＳＡとＨＳ９＋ｖｅにおける単一硫酸化（２Ｓ）ＩＩＩＡ、二硫酸化（２Ｓ、６Ｓ）ＩＡおよび二硫酸化（２ＳおよびＮＳ）ＩＩＩＳΔ−二糖単位の濃縮がないことの双方によって証明されるように、ＶＮへのＨＳの結合にそれほど必須ではないように見える。
【０２５９】
まとめると、この節における結果は、ＶＮアフィニティークロマトグラフィーによって単離された高６Ｏ−およびＮ硫酸化ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ＨＳｐｍ出発物質またはＨＳ９−ｖｅフロースルーよりも高いＶＮに関する能力を有することを実証している。それは、ＬＮまたはＦＮを結合する能力よりも大きいＶＮを結合する能力も有し、ＨＳ９＋ｖｅの特異性が増加したことを示唆している。
【０２６０】
ＨＳ９バリアントの固定化
次に、共有結合的および静電気的な方法を使用した、細胞培養のための無修飾ＶＮの提示のためにＨＳ９＋ｖｅを表面上に効率的に固定化するための戦略が探求された。
【０２６１】
共有結合的ＥＤＣ化学的方法
次にＮａＯＨが、表面をエッチングして、低カルボキシル化ポリスチレン（ＰＳ）表面上に遊離のカルボキシル基を作製するために利用された。表面上へのＨＳ中の一級アミン基のカップリングがＥＤＣ化学的方法で達成された（図５ａ）。ＥＤＣ化学的方法が二糖単位をそれらの遊離のアミン末端を通して表面カルボキシル基に繋ぎ止めるために使用されうることがＰｌａｎｔｅらによって以前示された［４２］。
【０２６２】
ＥＤＣ濃度（１０、５０および１００ｍｇ／ｍｌ）の最適化が最初に必要とされた。アミンが制限因子とならないために、全ての分子がカップリングのための２つの一級アミンを含有するので、３Ｈ−リジンが使用された。結果は、２４時間のＮａＯＨ処理がＰＳ表面上のカルボキシル基の最大レベルをエッチングするために十分であったことを実証した。しかしながら、ＴＣＰＳは、ＮａＯＨ処理ＰＳよりもよい移植を産み出した；したがって、ＴＣＰＳが後の反応に使用された。３Ｈ−リジンの移植における濃度依存的増加が１０および５０ｍｇ／ｍｌで観察された。しかしながら、ＥＤＣの５０から１００ｍｇ／ｍｌの著しい増加は、観察されず、移植濃度が５０ｍｇ／ｍｌで飽和したことを示唆している。
【０２６３】
考慮を必要とした別のパラメーターは、ヘパリンおよびＨＳｐｍにおける一級アミンの量であった。これらのレベルを確認するために、フルオレサミンタンパク質アッセイが各ＧＡＧの２つの濃度（０．５および１ｍｇ／ｍｌ）で用いられた（図１５）。ヘパリンにおけるよりも多い（＞６０％）ＨＳｐｍに存在する一級アミンがある。１ｍｇ／ｍｌヘパリンおよびＨＳｐｍバリアントを比較することによって、６０％の相違である、ヘパリンに存在する３×１０１６アミンおよびＨＳｐｍに存在する５×１０１４アミンがあることが示された。この相違は、ＨＳ９バリアント（２×１０１６アミン）と比較してヘパリンにおいてより少なく（４０％）、アフィニティークロマトグラフィー後のそれらの双方におけるいくつかの組成上の相違を示唆しており、ＣＥで以前取得されたデータを裏づけた。したがって、ＧＡＧにおけるアミンの数は、ＥＤＣ移植効率に直接影響する。次いで、３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍがＴＣＰＳ表面上に移植された（図５ｂ）。３Ｈ−ＧＡＧ結合の濃度依存的増加が、試験された全ての濃度での３Ｈ−ヘパリンよりも著しく高い３Ｈ−ＨＳｐｍの表面密度で観察された。ヘパリンは、＞８０％のそのアミノ基をＮ硫酸として有し、遊離のアミンの数がＨＳにおけるよりも低いので、これは、予測されていた［２３］。
【０２６４】
この方法は、ＧＡＧを表面上にまさに固定化するが、全体的な移植は、非効率的である。ウェル（０．３２ｃｍ２）当たり３ｍｇでの３０ｍｇ／ｍｌの３Ｈ−ＧＡＧの使用で、それぞれ、０．０５％および０．２％の移植効率に等しい、約１．５μｇのみの３Ｈ−ヘパリンおよび約６μｇの３Ｈ−ＨＳｐｍが表面上で検出可能であった。さらに、Ｒｏｙらによる研究は、表面にＧＡＧを共有結合することは、著しい不都合を有することを示した。特に、カップリングのためにＮドメインを利用することは、ＧＡＧの生物活性を損なう［５８］。したがって、よりよく、より効率的な戦略が探求された。
【０２６５】
ポリ−Ｌ−リジンコーティング
次に、負に帯電したＨＳと正に帯電した表面の間の静電相互作用を利用する戦略が用いられた。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）は、幹細胞の多くの型のための基質として成功的に使用されてきたが、ＴＣＰＳ上のｈＥＳＣのためには使用されてきていない［５９〜６１］。したがって、こうした表面を試験するために、ＰＬＬがコーティングされたＴＣＰＳプレートが種々の濃度の３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍでのコーティングに一晩供された（図５ｃ）。次いで、各ＧＡＧの表面密度が決定された：１μｇの３Ｈ−ＧＡＧ溶液は、２μｇの３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍでの、それぞれ、約８００ｎｇ／ｃｍ２および４００ｎｇ／ｃｍ２まで増加する密度で約２００ｎｇ／ｃｍ２の表面密度を産み出した。観察された３Ｈ−ヘパリンのより高い密度は、そのより高い全体的な負電荷のためであった。興味深いことに、表面密度の相違は、２μｇでのみヘパリンおよびＨＳｐｍにおいて観察され、より低いＧＡＧ濃度でのＰＬＬ表面上へのＧＡＧの下位の結合を示唆している。したがって、その後、２μｇがＰＬＬ表面上でのＧＡＧの固定化に使用された。
【０２６６】
細胞培養のためのＰＬＬ表面の有用性をさらに分析するために、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）が、ＰＬＬがコーティングされたＧＡＧ（ＰＬＬ＋ＧＡＧ）表面上での細胞増殖に関してスクリーニングされた（図５ｄ）。２．５μｇ／ｍｌ（ＶＮ２．５）および５μｇ／ｍｌ（ＶＮ５）のＶＮ濃度がＰＬＬ＋ＧＡＧ表面上にコーティングされ、ＨＥＳ−３細胞が播種され、７日間増殖させておかれた。一週間後の顕微鏡写真は、細胞がＰＬＬ＋ヘパリン＋ＶＮ５上のものを除いて、これらの表面上でよく広がらなかったことを明らかにした。これは、ＰＬＬがコーティングされた表面がｈＥＳＣ培養に最適ではないことを示唆した。
【０２６７】
アリルアミン重合
前の２つの方法が、操作された基質に必須である主要な必要条件（コスト、単純性、安全性および有効性）に対処することに失敗したため、別の表面がＧＡＧを長期細胞増殖のために固定化するために明確に必要であった。本発明者らは、プラスチック表面上へのアリルアミン（ＡＡ）単量体のプラズマ重合が、ＧＡＧを効率的に固定化することができることを以前報告した［４７］。ＡＡ単量体は、正に帯電しており、表面上に重合した場合、表面に超過時間持続する正味の正電荷を与える［６２］。
【０２６８】
ＨＳを表面上で固定化するための最適なＡＡ密度を評価するために、ＥＬＩＳＡによって評価される、どの密度がＧＡＧへの最も高い機能的結合能力を有するかを決定するために、種々の百分率のＡＡ表面が産出された。表面密度は、中性のオクタ−１，７−ジエン単量体で制御された。密度は、０％のＡＡ：１００％のオクタ−１，７−ジエン、５０％のＡＡ：５０％のオクタ−１，７−ジエン、８０％のＡＡ：２０％のオクタ−１，７−ジエン、９０％のＡＡ：１０％のオクタ−１，７−ジエンから１００％のＡＡ：０％のオクタ−１，７−ジエンまで変動した。結果は、１００％のＡＡ表面が最も高い量の機能的ＧＡＧを結合し、９０％のＡＡ表面がそれに続いたことを明らかにした（図１６）。８０％のＡＡ表面に結合しているＧＡＧがＶＮを結合するそれらの能力をもはや保持せず、その代わりに負の効果を有することに注目することは興味深かった。これは、ほぼ確実に、アイシングラスの無効なブロッキングのためでありえた、空のウェルにおいて観察される高いバックグラウンドのためであった。５０％のＡＡ表面は、任意のＶＮ結合をトリガーせず、不十分なＧＡＧが表面上にそれによって固定化されたことを示唆している。したがって、１００％のＡＡが重合した表面は、圧倒的に最もよい結合を与え、全てのさらなる分析に使用された。
【０２６９】
表面上のＡＡ重合体の存在を確認するために、ＸＰＳ分析が行なわれて、プラズマ反応器チャンバー中に一緒に置かれたＡＡが重合したアルミホイル表面の酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）および炭素（Ｃ）含有量が決定された。ホイル上の読みは、プレート表面上の各原子の量を反映した［４７］。５０％のＡＡ表面は、Ｃ（９２．５％）、Ｎ（４．５６％）およびＯ（２．９３％）の読みを与え；８０％のＡＡ表面は、Ｃ（８５．２％）、Ｎ（１２．１４％）およびＯ（２．７％）を作製し；９０％のＡＡ表面は、Ｃ（８０．７％）、Ｎ（１５．３％）およびＯ（４％）を作製し（図１７）；１００％のＡＡ表面は、Ｃ（７９．２％）、Ｎ（１６．４％）およびＯ（４．３４％）を有した（図６ａ）。０．１８対０．２２の一貫した窒素：炭素（Ｎ：Ｃ）比が１００％のＡＡプレートのいくつかのバッチに関して観察された（図１０）。この全ては、プラズマ重合反応の再現性を実証し、これは、本発明者らの以前の研究とも一貫している［４６、４７］。したがって、０．１８対０．２２のＮ：Ｃ比は、機能的ＨＳ９結合に最適であり、その後、無修飾ＶＮの固定化に使用された。
【０２７０】
ＨＳ固定化の成功の後に、各ＧＡＧバリアントがＶＮを結合する能力がＥＬＩＳＡによって評価された（図６ｂ）。ＧＡＧにかかわらず、吸光度の濃度依存的増加があった。ＧＡＧを有さないウェルは、陰性対照として役立ち、非特異的相互作用を示さなかった。結合データは、ヘパリンおよびＨＳ９＋ｖｅバリアントがＶＮへの最も高い親和性を有し、フロースルーＨＳ９−ｖｅバリアントおよび出発ＨＳｐｍがＶＮへの最も弱い親和性を有したことを明らかにした。さらに、ＨＳ９＋ｖｅバリアントは、ＨＳ９−ｖｅバリアントよりも高い吸光度を作製し、ＶＮへの有意に高い親和性を示した。この結果は、ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡを用いたものと同様であり（図３ｅ）、ＨＳ９＋ｖｅのより高い結合親和性を示唆している。
【０２７１】
ＡＡ表面上のＧＡＧの存在を確認するために、３Ｈ−ヘパリンおよび３Ｈ−ＨＳｐｍの表面密度が決定された。３Ｈ−ＧＡＧが表面上に一晩固定化され、洗浄され、シンチレーションカウンターにおいて読まれた（図６ｃ）。表面密度の濃度依存的増加があり、ＨＳｐｍに関してよりもヘパリンに関してより高い密度が見られた。１μｇのＧＡＧがコーティングに使用された場合、３Ｈ−ヘパリンは、約２５０ｎｇ／ｃｍ２の表面密度を産み出し；３Ｈ−ＨＳｐｍは、約１００ｎｇ／ｃｍ２のみを産み出した。これは、それぞれ、約８％および約３．２％の固定化効率に相当し、これは、共有結合的ＥＤＣ固定化化学的方法の使用に対して有意な増加であった。ヘパリンが単位長さ当たりの負電荷のそのより高い密度のために、表面によりよく結合するということが予測された。したがって、この単純で頑強なＡＡ＋ＧＡＧ表面がＶＮの全てのさらなる固定化に使用された。
【０２７２】
１２５Ｉ−ＶＮ表面密度
本発明者らの以前の研究［１８］は、ＶＮ吸着ＴＣＰＳ表面上でのｈＥＳＣの成功的な維持のための閾値密度が２５０ｎｇ／ｃｍ２であることを実証した。ここで、問題は、ＶＮへの調整された親和性を有するＨＳがＶＮを効率的に捕らえ、提示するための基質として使用されうるかどうかになった。ＴＣＰＳ、ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅおよびＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅ基質上のＶＮの表面密度が測定され、比較された。増加する濃度（０、１．２５、２．５および５μｇ／ｍｌ）の１２５Ｉ−ＶＮが種々の表面上でインキュベートされ、量がシンチレーションによって測定され、検量線と比較された（図６ｄ）。全ての表面は、１２５Ｉ−ＶＮの結合の濃度依存的増加を示し、最も低いＶＮ表面密度がＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅ表面上で記録され、最も高いＶＮ表面密度がＴＣＰＳ表面上で記録された。ＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅ表面上で細胞が接着し、増殖するための不十分なＶＮが表面上にあり、これは、おそらく、図５ｄにおいて見られたＨＥＳ−３細胞応答を説明している。
【０２７３】
ｈＥＳＣ培養
連続的な培養のためのＡＡ＋ＧＡＧ＋ＶＮからなる基質コーティングの適合性を決定するために、ｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３）増殖が７日の期間にわたって評価された。ＡＡおよびＧＡＧ（ヘパリン、ＨＳｐｍ、ＨＳ９＋ｖｅおよびＨＳ９−ｖｅ）で予めコーティングされた表面が２μｇ／ｍｌのＶＮ溶液濃度（ＶＮ２）を固定化するために使用された。７日後に撮影された顕微鏡写真は、ＶＮ２上での細胞接着および増殖がヘパリンおよびＨＳ９＋ｖｅの予めコーティングでのみ支持されたことを明らかにした（図７ａおよびｃ）。明確に、ＨＳｐｍおよびＨＳ９−ｖｅ基質と比較してより高い量のＶＮがヘパリンおよびＨＳ９＋ｖｅ基質上で吸着した（図７ｂおよびｄ）。このバイオアッセイは、アフィニティークロマトグラフィーが、より高いＶＮ結合親和性を有する「調整」ＨＳを低結合ＨＳ９−ｖｅおよび中間結合ＨＳｐｍから分離することができたことを確認した。ヘパリンは、広範囲のＥＣＭタンパク質に強く結合するため、それは、実験のための陽性対照として利用された。ヘパリンは、ＨＥＳ−３細胞を低ＶＮ濃度（ＶＮ２）で支持することができるが、それは、その有害な臨床的副作用のために、将来の療法のための好適な予めコーティングではない［２３］。
【０２７４】
１２５Ｉ−ＶＮで同定されたＶＮ表面密度によれば（図６ｄ）、ＡＡ＋ヘパリン＋ＶＮ２およびＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ＋ＶＮ２上の密度は、本発明者らが以前報告したＶＮ閾値（２５０ｎｇ／ｃｍ２）よりも遙かに低かった。これは、ＨＳ９＋ｖｅ画分の予めコーティングで、本発明者らは、ｈＥＳＣ増殖に必要なＶＮ密度を減少させることができることを示唆した。しかしながら、本発明者らは、コロニーの縁での細胞の回転によって明らかにされるように、ＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ＋ＶＮ２基質上に接着した細胞が弱い接着のサインを示したことを観察した。したがって、長期ｈＥＳＣ培養を頑強に支持することができるＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ基質上のＶＮの正確な表面密度を評価するためのフォローアップ研究が必要である。
【０２７５】
この層ごとのモデルの略図は、図８に示された。結論として、細胞培養結果は、この新規な操作されたＡＡ＋ＨＳ９＋ｖｅ＋ＶＮ基質がｈＥＳＣの培養に十分なＶＮを捕らえることができるという論点を反復する。
【０２７６】
考察
ＶＮ−ＨＢＤペプチドアフィニティークロマトグラフィーを経たＶＮ結合ＨＳバリアントの単離は、本発明者らが新規なｈＥＳＣ培養プラットフォームを操作することを可能にした。種々のバリアントの結合能力がドットブロット、ＥＬＩＳＡおよびヘパリンビーズ競合アッセイの組合せを使用して比較された。ＶＮ結合へのＨＳ９＋ｖｅバリアントの明らかな特異性を調べるために、それは、ＬＮおよびＦＮの結合と比較された。共に、これらの結果は、ＨＳ９＋ｖｅバリアントが相対的特異性で、ＨＳｐｍおよびＨＳ９−ｖｅバリアントよりも確実によりよくＶＮを結合することを確認した。この結果は、特異的な基質の範囲を産出するために他のＥＣＭタンパク質に調整されたＨＳバリアントのライブラリーを単離する可能性を示唆している。ＨＳ９＋ｖｅにおける異なる種を分離するための異なるモル濃度バッファーでの段階的な溶出を伴う、アフィニティークロマトグラフィー中の溶出バッファーへの改変が、将来の可能性である。
【０２７７】
グリコサミノグリカンは、ＥＣＭの重要な構造的および機能的成分である［２３］。幹細胞表面上の最も豊富なＧＡＧの１つは、ＨＳであり、ＣＳが成熟した骨、軟骨および心臓弁のＥＣＭにおいて支配的である［２３］。以前、研究は、可溶性ヘパリンおよびヘパリナーゼ処理後に示されるように、細胞表面ＨＳＰＧがＦＮヘパリン−結合ペプチドへの細胞接着に重大であることを示した［２２、６３］。したがって、これらの知見を拡張するために、表面ＨＳのヘパリナーゼ消化がＶＮ−ＨＢＤへの細胞結合に関するその重要性を決定するために用いられた。結果は、細胞が表面ＨＳを通してＶＮ−ＨＢＤペプチドに結合するが、ＲＧＤモチーフが存在している場合、それらは決定的ではないことを示した。いくつかの研究は、ヘパリンおよびＨＳがｈＥＳＣ自己再生および増殖を支持することができることも示した［７、６４］。これに従って、本発明者らは、ＶＮを効率的に提示するために混合物から高親和性ＶＮ結合ＨＳバリアントを単離することを目標とした。
【０２７８】
親和性分離ヘパリンバリアントが前に単離されたが、親和性ステップ中に天然のタンパク質全体を用いることによってであった。したがって、フィブロネクチン［２１］、ヘパリン補助因子ＩＩ［６５］、組織プラスミノーゲン活性化因子［６６］、ＦＧＦ−１［３３、６７］および抗トロンビンＩＩＩ［６８、６９］への高親和性を有するヘパリンバリアントが単離された。しかしながら、タンパク質全体の使用は、特にこの規模では非実用的かつ高価である。ＭｃＣａｆｆｒｅｙおよび同僚は、その後、高および低ＴＧＦ−β結合親和性を有する２つのバリアントが、ＴＧＦ−β  ＨＢＤを模倣した合成ペプチドを用いてヘパリン混合物から単離されたことを実証した［７０］。彼らの研究は、組織再生に好適ではない化合物であるヘパリンを出発物質として使用した。バリアントの組成を理解することは、合成ＨＳ９模倣物の将来設計に明白に重要である。全ての脱重合された試料での低Ｒ．Ｓ．Ｄ．値によって証明されるように、ヘパリンおよびＨＳの組成分析は、信頼できると考えられる。ヘパリンにおける二糖の百分率は、他のグループによって公表されたものと一貫していた［３２、５７、７１〜７４］。ブタ腸粘膜ヘパリン、ＩＳおよびＩＩＳの主要な二糖のモル百分率は、それぞれ、５０％から６８％および１０％から２０％にわたる。組成研究は、ブタ粘膜ＨＳで行なわれていない；しかしながら、ウシ腎臓などの他の供給源からのＨＳ間の以前の比較は、単一硫酸化ＩＶＳ二糖単位が他の単位と比較してより高いモル百分率比を有し、同様の傾向を明らかにした［３４、７１］。
【０２７９】
ヘパリンにおける抗凝固五糖配列の解明は、３Ｏ−硫酸化がその抗凝固効果に必須であることを明らかにした［７５］；同様に、ＨＳへのＦＧＦ−２結合は、２Ｏ−硫酸化を必要とする［７６、７７］が、６Ｏ−およびＮ−硫酸化は、結合を損なう傾向がある［７８］；対照的に、ＨＳとのＦＧＦ−１相互作用は、６Ｏ−硫酸基を必要とする［７９］。ＦＧＦ−４は、結合およびシグナル伝達のために２Ｏ−と６Ｏ−の双方の硫酸化を必要とし［８０、８１］、肝細胞増殖因子は、６Ｏ−硫酸化を必要とする［８２］。ＦａｌｃｏｎｅらおよびＭａｈａｌｉｎｇａｍらは、ＦＮに選択性の貪欲なヘパリン−結合バリアントが、７から８Ｎ硫酸化二糖が必要とされ、特に高電荷、未分画ヘパリンよりも大きいドメイン（＞１４残基）であると思われることを実証した［２１、２２］。Ｌｉｎｇらも、ヘパリンにおけるＮ−硫酸化がその骨原性活性に関してＷｎｔ３ａリガンドの結合および活性に寄与することを示した［８３］。これらの研究は、差次的に修飾されたＨＳモチーフが明確なタンパク質認識特徴をＨＳに与えるという考えを支持している。ＧＡＧ  ＥＬＩＳＡおよびＣＥ分析はどちらも、グルコサミン残基の６Ｏ−およびＮ−硫酸化、およびその少なくとも３個の二糖単位がＨＳへのＶＮ結合に必要であることを直接的または間接的に明らかにした。ヘパリン標準からのＮ−硫酸化の除去も、ＶＮへの結合のレベルを減少させ、６Ｏ−硫酸化と共にＮ−硫酸化が重大であることを示した。これは、ＶＮ結合に重要なＨＳ内の必須硫酸化モチーフの最初の報告である。
【０２８０】
ＨＳ９＋ｖｅバリアントをＴＣＰＳ上に固定化するための効果的および効率的な方法の探索において、結果は、ＨＳにおける一級アミンの低い割合がＥＤＣカップリング方法を非効率的にすることを実証した。これは、１２５Ｉ−ＶＮ結合アッセイにおいて明らかにされた、ＶＮがコーティングされたＰＬＬ表面上での増殖がないことも説明している。ＰＬＬ表面上の低ＶＮ表面密度も、ｈＥＳＣの頑強な培養を支持するのに十分ではなかった。以前示されたように、ＴＣＰＳ上で必要とされる最小のＶＮ表面密度は、少なくとも２５０ｎｇ／ｃｍ２である［１８］。
【０２８１】
ＧＡＧを固定化するために単純な非共有結合的方法（ＡＡプラズマ重合）を使用する本発明者らの以前の報告に基づき［４７］、ここで本発明者らは、ＨＳ９＋ｖｅバリアントの固定化のためにこの方法を選択した。ＡＡが重合した細胞培養表面が、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）［８４］とチタン［８５］の双方の表面上で間葉系幹細胞を培養するのを助けるためにＰｕｎｚｏｎ−ＱｕｉｊｏｒｎａらおよびＳｃｈｒｏｄｅｒらによって研究された。ＡＡ表面は、細胞培養に使用されてきたが、この研究は、特に、それらの基質の選択に非常に要求が厳しいことが知られている、ｈＥＳＣの培養に興味がある。
【０２８２】
ＶＮが同様の数の負に（６６）および正に（５６）帯電した残基を含有すること（ＥｘＰＡＳｙウェブサイト、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｏｍ上のデータから計算された）に関して、これは、なぜＶＮが負に帯電した表面と正に帯電した表面の双方に結合するのかを説明する。したがって、本発明者らは、親水性の、正味の負に帯電したＴＣＰＳ表面がＶＮ結合に都合よいが、高度に正に帯電したＡＡ表面がＰＬＬよりもＶＮ結合を支持すると仮定する。ＰＬＬは、表面を均一にコーティングせず、そのためより少ない正電荷が置かれ、これは、より低いＶＮ密度を説明する。こうしたパッチ状のコーティングも、幹細胞がＰＬＬ＋ＨＳ９＋ｖｅ表面上で増殖できないことにつながる。
【０２８３】
ヘパリンは、ｈＥＳＣの自己再生を制御する役割を果たすことが認識されており、微小環境の重要な成分である［３９］。しかしながら、重要なことに、より少なく硫酸化された、ＶＮ調整されたＨＳを使用することによって、本発明者らは、以前報告された２５０ｎｇ／ｃｍ２と比較してより低いＶＮ密度でｈＥＳＣ接着および増殖をよりよく支持することができる［１８］。
【０２８４】
ＨＢＤ−ＶＮペプチドへの親和性結合によってＨＳの不均一な集団から単離された「調整された」ＨＳバリアントを最初に取得するこのテクノロジーは、特定のＥＣＭ構成成分を目的としている他の「調整された」ＨＳバリアントの単離に関するその適用性を明確に実証している。次いで、これらは、準拠した環境におけるｈＥＳＣの増殖および分化を司る機構を研究するために使用されうる。
【０２８５】
この研究の目的は、ヘパラングリコサミノグリカンへのその親和性を通して無修飾ＶＮを結合する能力がある基質を開発することであった。ＨＳｐｍ由来の貪欲なＶＮ結合バリアント（ＨＳ９＋ｖｅ）がアフィニティークロマトグラフィーを使用して単離された。ＨＳ９＋ｖｅ、ＨＳ９−ｖｅおよびＨＳｐｍバリアントの比較は、ＨＳ９＋ｖｅバリアントがＶＮへのより高い結合傾向を有することを明らかにし、これは、アフィニティークロマトグラフィーが、特定の接着タンパク質に調整された活性ＧＡＧバリアントの分離のための有力な技法であることを示唆している。ＣＥでの組成分析は、ＨＳ９＋ｖｅバリアントにおける三硫酸化（２Ｓ、６ＳおよびＮＳ）ＩＳおよび二硫酸化（６ＳおよびＮＳ）ＩＩＳ二糖の濃縮を確認した。したがって、ＧＡＧ−ＥＬＩＳＡ結果と共に、グルコサミン残基上のＮ−硫酸化と一緒になった６Ｏ−硫酸化および少なくとも３個の二糖単位がＶＮへのＨＳ９＋ｖｅ結合に決定的であることが結論づけられうる。ＡＡ−プラズマが重合した表面は、機能的ＧＡＧに結合することができ、これは次に、成功的な細胞培養に十分な量のＶＮを結合することができた。要約すれば、この研究は、細胞培養のための無修飾ＶＮの提示に関してだけでなく、ＨＢＤを有する任意のＥＣＭ成分にも関する、頑強、単純かつ対費用効果の高い基質のプロセス開発を樹立した。
（参考文献）
【０２８６】
【表８】
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【０２８７】
【表９】
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【０２８８】
【表１０】
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【０２８９】
【表１１】
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【０２９０】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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