(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っている患者において出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法であって、
ｉ）前記患者から得られる生体外サンプル中のバイオマーカーＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰの濃度を測定し、そして
ｉｉ）前記バイオマーカーの前記濃度の統計的有意性を確立することを含む、方法。
【請求項２】
脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っている患者において出血性脳卒中の鑑別診断を支援する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉｉｉ）前記患者から得られる生体外サンプル中の前記バイオマーカーＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１の濃度を測定し；
ｉｖ）前記患者の性を確定し；そして
ｖ）前記患者の性と合わせて、５つのバイオマーカーの濃度の統計的有意性を確立することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカー濃度値の各々を１つの統計的アルゴリズムまたは複数の統計的アルゴリズムに入力して、出血性脳卒中、虚血性脳卒中または一過性脳虚血発作の鑑別診断と相関する出力値を得る、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
出血性脳卒中と虚血性脳卒中／一過性脳虚血発作との鑑別診断が支援される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記統計的アルゴリズムがロジスティック回帰式を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が脳卒中を現在患っているかまたは患ったことがあるとの診断が支援される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者から得られる生体外サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーの濃度を測
定し、そして各バイオマーカーの前記濃度値を対応する対照値と比較することにより前記バイオマーカーの前記濃度の統計的有意性を確立することによって、前記患者が、脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っているとの診断が支援され、ここで、前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＩＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ−ダイマーおよびＣＲＰから選択され、そして前記２つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つがＩＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＶＣＡＭ−１から選択され、前記患者および対照バイオマーカー濃度値の各々を１つの統計的アルゴリズムまたは複数の統計的アルゴリズムに入力して脳卒中が起こったかどうかを示す出力値を得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが血液、血清または血漿サンプルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の患者における出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援するための方法で使用するためのＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含む基体。
【請求項１１】
ＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１のプローブをさらに含む、請求項１０に記載の基体。
【請求項１２】
前記基体がその上に固定化されたプローブを有する、請求項１０または請求項１１に記載の基体。
【請求項１３】
前記基体がバイオチップである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の基体。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の患者における出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法におけるＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含む基体の使用。
【請求項１５】
前記基体がＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１のプローブをさらに含む、請求項１４に記載の基体の使用。
【請求項１６】
ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰ、ＣＲＰ、ＩＬ−６および／またはｓＴＮＦＲ１の、出血性脳卒中のバイオマーカーとして、および／または出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作間の識別因子としての使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳卒中は世界中で死因の第３位であり、脳への血液供給の遮断に起因する急速に進行する脳機能の喪失と定義できる。世界保健機関によると、世界中で１年間に１５００万人が脳卒中を患い、５００万人が亡くなり、さらに５００万人が回復不能の障害を抱える。これらの１５００万の脳卒中症例のうち１２７０万例で高血圧が要因であると推定される。英国では、毎年約１５０，０００人が脳卒中に罹患し、１年間に約５３，０００人の死因が脳卒中である。脳卒中は英国だけで１年間で経済に推定８０億ポンドの損失を与え、脳卒中患者はすべての緊急入院の約２０パーセントを占め、そして長期入院の２５パーセントを占める。
【０００２】
脳卒中は３つの亜型に分類できる：
ｉ）虚血性脳卒中（ＩＳ）は脳への血液供給が減少すると起こり、その結果、脳損傷が起こる。虚血性脳卒中は、通常、血栓により血管が詰まると起こる。この血栓はアテローム斑で局所的に生じ得る（血栓性脳卒中）か、または血流中のどこか他の場所で生じた移動する粒子もしくは破片のために起こり得る（塞栓性脳卒中）；
ｉｉ）一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、脳への血液供給が一時的に減少する場合に起こる「軽度の脳卒中」である。症状が急速に消失する（２４時間以内に消失し、個体は正常な健康状態に戻る）場合にＴＩＡと診断される；そして
【０００３】
ｉｉｉ）出血性脳卒中（ＨＳ）は、頭蓋冠内に血液がたまる場合、通常は、弱くなった血管が破裂する場合に起こる。出血性脳卒中は、２つの主な亜型、すなわち、大脳内（脳組織内）と、くも膜下（脳の表面付近およびその保護層下）とに分類できる。
【０００４】
ＩＳおよびＴＩＡは全脳卒中症例の約８５％を占め、そしてＨＳは１５％を占める。脳卒中後の神経障害を最小限に抑えるためには、適切な治療を施すことができるように、脳卒中患者を迅速かつ正確に診断することが重要である。例えば、血栓を破壊するために、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）などの血栓溶解治療を施すことができる。しかしながら、そのような治療はＩＳでのみ必要とされ、ＨＳでは有害である。ＴＩＡの本質はそのような治療を必要とせず、ワルファリンおよびアスピリンなどの抗凝血剤（blood thinner）がそのような症例で処方される。
【０００５】
現在のところ、脳卒中が疑われる場合、身体症状を評価し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを通常実施する。ＣＴスキャンはＨＳ患者を特定するためには感度が良好（約９０％感度）であるが、ＩＳおよびＴＩＡ患者を特定するためには感度が低い（約２０％感度）。実際には、その一時的性質のためにＴＩＡについておこる組織損傷はほとんどまたは全くなく、したがってＣＴスキャニングは診断技術として無効である。磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）はＩＳ診断の感度が（約８０％まで）改善されているが、必要とされる時間の増加、マシンアクセスビリティ（machine accessibility）、および高コストによっ
て脳卒中診断のためのその使用が限定される。ＩＳおよびＴＩＡの検出に関するＣＴスキャニングの低い感度は、ＩＳおよびＴＩＡを検出するための生体液ベースの診断バイオマーカー試験が脳卒中亜型の診断において臨床医を支援するための非常に貴重なツールであることを意味する。生体液ベースのバイオマーカーは脳卒中診断を促進し、その精度を増大させる可能性を有する。
【０００６】
様々な候補バイオマーカーが脳卒中および脳卒中亜型の線引きの診断のために提案され、例えば特許文献１〜４などの先行技術でＩＳ／ＴＩＡ対ＨＳ識別の複数の記載がある。
【０００７】
特許文献５は、ＩＳとＨＳとを識別し、全種類の脳卒中と非脳卒中対照とを識別するデータを開示する。しかしながら、今までのところどれも臨床診療で利用できず、正確な診断を可能にする高い感度および特異性を有する３つの脳卒中亜型すべてのバイオマーカーが臨床で真に必要とされている。
【０００８】
血液試験を使用する３つの異なる脳卒中亜型間の鑑別診断はより多くの情報を得た上での臨床決定を促進し、高価かつ非迅速な神経画像診断を不要にする可能性があり、そして患者の臨床転帰を改善できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１２３８２８４号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／０８６６９７号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１２８３４号
【特許文献４】国際公開第２００２／０１２８９２号
【特許文献５】欧州特許出願公開第１４１９３８８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
第１の態様によると、本発明は、脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っている患者において出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法であって、患者から得られる生体外サンプル中のバイオマーカーＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰの濃度を測定し、そしてバイオマーカーの濃度の有意性を確立することを含む方法を提供する。
【００１１】
第２の態様によると、本発明は、本発明の第１の態様による、患者における出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法で使用するためのバイオマーカーＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含む基体を提供する。
【００１２】
第３の態様によると、本発明は、本発明の第１の態様による、患者における出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法におけるＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含む基体の使用に関する。
【００１３】
第４の態様によると、本発明は、出血性脳卒中のバイオマーカーとして、ならびに／または出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作間の識別因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）としての、ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰ、ＣＲＰ、ＩＬ−６および／またはｓＴＮＦＲ１の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のバイオマーカーを使用してＴＩＡと脳卒中の他の種類とを識別するためのＲＯＣ曲線分析である。
【図２】図２は、本発明のバイオマーカーを使用してＩＳと脳卒中の他の種類とを識別するためのＲＯＣ曲線分析である。
【図３】図３は、本発明のバイオマーカーを使用してＨＳと脳卒中の他の種類とを識別するためのＲＯＣ曲線分析である。
【図４】図４は、男性対象および女性対象の両方における各脳卒中亜型のＧＦＡＰの濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、男性対象および女性対象の両方における各脳卒中亜型のＶＣＡＭ１の濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、男性対象および女性対象の両方における各脳卒中亜型のＣＲＰの濃度を示すグラフである。
【図７】図７は、男性対象および女性対象の両方における各脳卒中亜型のｓＴＮＦＲ１の濃度を示すグラフである。
【図８】図８は、男性対象および女性対象の両方における各脳卒中亜型のＩＬ−６の濃度を示すグラフである。
【図９】図９は、ＨＳとすべての脳卒中種類とを識別するための分類アルゴリズムを考案するためのロジスティック回帰および神経回路網法をそれぞれ比較するデータおよび対応するＲＯＣ曲線分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、３つの脳卒中亜型：出血性脳卒中（ＨＳ）と虚血性脳卒中（ＩＳ）と一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）との識別を支援するために使用できるバイオマーカーベースの方法およびバイオチップに関する。
【００１６】
特に指定のない限り、「脳卒中」という語に対する本明細書中のすべての言及は、脳卒中の３つの形態すべてを包含する。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「虚血性脳卒中（ＩＳ）」という語は、脳への血液供給が減少する場合に起こり、結果として脳損傷が起こる脳卒中の種類を指す。虚血性脳卒中は、血管が、通常は血栓によって詰まった場合に起こる。この血栓は、局所的にアテローム斑を生じる可能性があるか（血栓性脳卒中）、あるいは血流中のどこかほかの場所で生じた移動する粒子または破片のために起こる可能性がある（塞栓性脳卒中）。「一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）」という語は、脳への血液供給が一時的に減少する場合に起こる「軽度の脳卒中」を指す。ＴＩＡは、症状が急速に消失する（２４時間以内で消失し、個体は正常な健康状態に戻る）場合に診断される。「出血性脳卒中（ＨＳ）」という語は、血液が頭蓋冠内にたまる場合、通常は弱くなった血管が破裂する場合に起こる。出血性脳卒中は２つの主な亜型：大脳内（脳組織内）；および、くも膜下（脳の表面付近およびその保護層の下）に分類できる。
【００１８】
「脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っている患者」に対する本明細書中の言及は、脳卒中を現在患っていると診断された患者または脳卒中を患っていたことがあると診断された患者を包含する。脳卒中は最近の事象である可能性があり、そのような事象により臨床の助けを求めるという個体のプロセスは開始されている。
【００１９】
「対象」および「患者」という語は、本明細書中では交換可能に使用することができ、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）ならびに霊長類（例えば、サルおよびヒト）を包含する哺乳類を指す。好ましくは、対象または患者はヒトである。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、「バイオマーカー」という語は、患者から得られる生体サンプル中に存在する分子を指し、前記サンプル中のその濃度は、病的状態を示すものであり得る。異なる脳卒中亜型の識別で、単独もしくは他の診断法と組み合わせて、または他のバイオマーカーと組み合わせて相補的バイオマーカーとして有用であることが本発明者らによって見出された様々なバイオマーカーが明細書中で記載されている。本明細書中で用いられる場合、「相補的バイオマーカー」という語は、診断を裏付けるために他の脳卒中バイオマーカーとあわせて使用できるバイオマーカーを指す。
【００２１】
当該技術分野では、バイオマーカーの標準または「バックグラウンド」濃度は、例えば、年齢、性または民族的／地域的遺伝子型のために若干のばらつきを示す可能性があることはよく理解される。その結果、本発明の方法で使用されるカットオフ値も、標的患者／
集団に応じた最適化のために若干変動する可能性がある。
【００２２】
患者から得られる生体サンプルは、好ましくは血液、血清または血漿サンプルである。本明細書中で用いられる場合、「生体外」という語は、当該技術分野でのその通常の意味を有し、患者の身体から取り出されたサンプルを指す。
【００２３】
血液サンプルが分析のために患者から採取される場合、全血、血清または血漿が分析される。血液サンプルの分析は、クロマトグラフィーなどの前分離ステップと関連させた質量分析法などのいくつかの分析法によるものであり得る。好ましい方法は免疫検出に基づく。免疫検出技術はまた、臨床環境外で使用するために可搬型または携帯用機器に容易に組み込まれる。ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの定量的イムノアッセイを使用してタンパク質の量を検出できる。好ましい分析方法は、複数のタンパク質が同時に検出され、定量されるのを可能にする多検体（multi-analyte）バイオチップの使用を含む。
２Ｄゲル電気泳動も多検体分析のために使用できる技術である。
【００２４】
本発明の第１の態様は、脳卒中を患ったことがあるかまたは現在患っている患者において出血性脳卒中（ＨＳ）、虚血性脳卒中（ＩＳ）および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の鑑別診断を支援する方法であって、患者から得られる生体外サンプル中のＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰの濃度を測定し、そしてバイオマーカーの濃度の有意性を確立することを含む方法を提供する。逆方向段階的ロジスティック回帰（backwards stepwise logistic regression）を使用して、本発明者らは、バイオマーカーＧＦＡＰ、ＶＣＡＭ、ＣＲＰが、ＴＩＡとＩＳとＨＳとを識別できる予測モデルに重大な影響を及ぼすことを見出した。
【００２５】
好ましい実施形態において、方法は、患者から得られた生体外サンプル中のＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１の濃度を測定し、患者の性を確定し、そして５つのバイオマーカーの濃度の有意性を、患者の性とあわせて確立することをさらに含む。
【００２６】
性は、恒常性および疾患の両方におけるバイオマーカーレベルに対して大きな影響を及ぼすことが判明した。本発明者らは、どの種類の脳卒中を患者が呈する可能性があるのかを正確に予測できるアルゴリズムを開発して適切な治療を可能にするために、５つのバイオマーカーＧＦＡＰ、ＶＣＡＭ、ＣＲＰ、ＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１を、性と組み合わせて使用できることを見出した。
【００２７】
上述の実施形態のいずれかに加えて、本発明の方法は、バイオマーカーＩＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｄ−ダイマーおよびＦＡＢＰのうちの１つの濃度を測定し、そして統計的アルゴリズムで濃度値を使用して異なる脳卒中亜型を区別することもさらに含み得る。
好ましくは、バイオマーカー濃度値の各々を、１つの統計的アルゴリズムまたは複数の統計的アルゴリズムに入力して、ＨＳ、ＩＳまたはＴＩＡの鑑別診断と相関する出力値を得る。１つの実施形態において、方法を使用して、ＨＳおよびＩＳ／ＴＩＡを鑑別診断する。
【００２８】
当業者は、統計的アルゴリズムを開発するための多くの好適な方法を知っており、これらはすべて本発明の範囲内に含まれる。好適な分類アルゴリズムの例としては、多項ロジスティック回帰、多層パーセプトロン神経回路網（ＭＬＰ）、人工の神経回路網、サポートベクターマシンおよびランダムフォレスト分類器（random forest classifier）が挙げられる。本発明者らは、多項ロジスティック回帰およびＭＰＬの両方が本発明との関連で類似した性能を達成することを見出し、このことは、アルゴリズムモデルを生成させるために使用する方法よりもむしろ本発明の方法で使用される検体（すなわちバイオマーカー
）の重要性を示唆する。しかしながら、好ましい実施形態では、統計的アルゴリズムはロジスティック回帰式を含む。
【００２９】
本発明に従って使用する統計的方法の精度は、それらの受信者操作特性（ＲＯＣ）によって最もよく表すことができる。ＲＯＣ曲線は、試験の感度、真陽性の数、および特異性、真陰性の数の両方を対象とする。したがって、バイオマーカーの所定の組み合わせの感度および特異性値はアッセイの精度を表示するものである。例えば、バイオマーカーの組み合わせが８０％の感度および特異性値を有する場合、脳卒中に罹っている１００人の患者のうち８０人がバイオマーカーの特定の組み合わせの存在の決定から脳卒中に関して陽性であると正しく特定され、一方、脳卒中に患っていない１００人の患者のうち８０人はこの疾患について正確に陰性である。
【００３０】
２またはそれ以上のバイオマーカーが診断法で使用される場合、ロジスティック回帰式などの好適な数学モデルを誘導することができる。ロジスティック回帰式は、患者の年齢および性などの他の変数を含み得る。ＲＯＣ曲線を使用して、ロジスティック回帰モデルの精度を評価することができる。ロジスティック回帰式は、臨床決定を下すのを支援するために、独立して、またはアルゴリズムで使用できる。ロジスティック回帰式はそのような場合に使用される一般的な数学的／統計的手法であり、本発明の関連で好ましいが、他の数学的／統計的手法も使用できる。
一例として、脳卒中に罹っていたことがあるかまたは現在罹っていることが疑われる患者における脳卒中の種類を示すためのバイオマーカーの組み合わせＧＦＡＰ、ＣＲＰおよびＶＣＡＭの本発明に適用可能なロジスティック回帰式（分類カットオフ値０．５）は次のようにして算出される：
【００３１】
【数１】
0006415546.tif 000002
【００３２】
式中、［ＧＦＡＰ］、［ＣＲＰ］および［ＶＣＡＭ］は、患者から採取された血液サンプル中で測定されるＧＦＡＰ、ＣＲＰおよびＶＣＡＭの濃度である（ＡＵＣ値については表１の１１８番を参照のこと）。
【００３３】
好ましくは、ＨＳ、ＩＳおよびＴＩＡの鑑別診断を支援する方法は、脳卒中を患っていると、または脳卒中に患ったことがあると事前に診断された患者に対して実施される。本発明の方法の目的は、適切な治療を施すことができるように、患者が現在患っているか、または患ったことのある脳卒中亜型を特定することである。したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、脳卒中亜型の識別診断が下され次第、患者に適切な治療を施すさらなるステップを含む。例えば、本発明の方法を実施した結果として、患者がＩＳを患ったことがあるかまたは現在患っていると判定される場合、血栓溶解療法（例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ））などの適切な治療を施して血栓を破壊できる。これは、医師の判断により、他の適切な治療とあわせて施してもよい。本発明の方法を実施した結果として患者がＴＩＡを患っていたことがあるかまたは現在患っていると判定される場合、ワルファリンおよびアスピリンなどの抗凝血剤を処方し、投与することができる。本発明の方法を実施した結果として、患者がＨＳを患ったことがあるか、または現在患っていると判定される場合、これらの患者は典型的には損傷を受けた血管を修復するために手術室へ移送される。
【００３４】
患者が脳卒中を現在患っているかまたは患っていたことがあると診断する最初のステップは、ＣＴおよびＭＲＩなどのスキャニング技術をはじめとする当該技術分野で公知である任意の好適な診断法もしくは技術を使用して、または脳卒中のバイオマーカーについて患者のサンプルを分析して、実施することができる。しかしながら、好ましい実施形態において、患者は、患者から得られる生体外サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカーの濃度を測定し、そして各バイオマーカーの濃度値と対応する対照値とを比較することによりバイオマーカーの濃度の有意性を確立することによって、脳卒中を現在患っているかまたは患ったことがあると診断された。好ましくは、少なくとも２つのバイオマーカーは、ＩＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＬ−６、ｓＴＮＦＲ１、Ｄ−ダイマーおよびＣＲＰから選択され、好ましくは２つのバイオマーカーのうちの少なくとも１つは、ＩＣＡＭ−１、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＶＣＡＭ−１から選択される。脳卒中を最初に診断するこの好ましい方法に従って、患者および対照バイオマーカー濃度値の各々を１つの統計的アルゴリズムまたは複数の統計的アルゴリズムに入力して、脳卒中がおこったかどうかを示す出力値を得る。本発明のこの実施形態についての好ましいバイオマーカー組み合わせは、表１または表２で記載されているものである。これらの表は、脳卒中対対照についての様々なバイオマーカーの組み合わせの感度、特異性およびＡＵＣデータを提供する。
【００３５】
【表１−１】
0006415546.tif 000003
【表１−２】
0006415546.tif 000004
【表１−３】
0006415546.tif 000005
【表１−４】
0006415546.tif 000006
【表１−５】
0006415546.tif 000007
【００３６】
【表２−１】
0006415546.tif 000008
【表２−２】
0006415546.tif 000009
【００３７】
上記の脳卒中を最初に診断する好ましい方法において、対照値は、脳卒中に罹っていない１つの個体または複数の個体から得られる生体サンプル中の対応するバイオマーカーの濃度から誘導できる。脳卒中に罹ったことがないそのような個体は、例えば、健常な個体、脳卒中以外の疾患を患っている個体であり得る。あるいは、対照値は、脳卒中事象前の患者から得られるサンプル中のバイオマーカーの各々の濃度に対応し得る。
【００３８】
誤解を避けるために、「対応するバイオマーカー」という語は、患者のサンプルに関して決定されるバイオマーカーの同じ組み合わせの濃度が、対照値を決定するためにも使用されることを意味する。例えば、患者のサンプル中のＩＣＡＭ−１およびＬ−セレクチンの濃度が決定される場合、対照サンプル中のＩＣＡＭ−１およびＬ−セレクチンの濃度も決定される。
【００３９】
好ましい実施形態において、患者および／または対照バイオマーカー濃度値の各々を１以上の統計的アルゴリズムに入力して、脳卒中が起こったかどうかを示す出力値を得る。
【００４０】
カットオフ濃度またはカットオフ値は、統計的技術を使用して誘導され、統計的アルゴリズムを開発するために様々な異なる方法が利用可能であり、当業者には周知である。バイオマーカー統計的分析の標準的方法は、一変量法を使用して、様々な群におけるバイオマーカーレベルを比較し、その濃度が特定の群全体にわたって、また特定の群間で有意に異なるそれらバイオマーカーをハイライトすることである。
【００４１】
バイオマーカー濃度は、サンプルと、バイオマーカーの組み合わせに含まれるバイオマーカーの各々に特異的なプローブを有する基体とを接触させることによって決定できる。バイオマーカーとその各々のプローブとの間の相互作用は、当該技術分野で周知の様々な技術を使用してモニタリングすることができ、定量化できる。バイオマーカー濃度は、好ましくはｎｇ／ｍｌで測定される。
【００４２】
したがって、本発明の第２の態様は、ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰに特異的なプローブを含む基体を提供する。基体は、ＨＳ、ＩＳおよびＴＩＡの鑑別診断を支援するための本発明の方法で使用するために好適である。好ましくは、基体は、ＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１に特異的なプローブをさらに含み、そして場合によって表１および／または２に記載のバイオマーカーのいずれか１以上のプローブをさらに含んでもよい。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、「特異的」という語は、プローブが、本発明のバイオマーカーのうちの１つだけと結合し、分析される生体サンプル中の本発明の他のバイオマーカーまたは他の検体との結合は無視できることを意味する。このことは、診断アッセイの完全性および本発明のバイオマーカーを使用するその結果が、さらなる結合事象によって損なわれないことを保証する。
【００４４】
好ましくは、プローブを基体の表面上に固定し、好ましくは共有結合で固定する。基体は、１以上のプローブを支持できる任意の物質であり得るが、好ましくはバイオチップなどの固体素子である。バイオチップは、例えば、鉱物またはポリマーベースで有り得るが、好ましくはセラミックである平面基体である。本発明の様々なバイオマーカー／タンパク質を同定する場合、タンパク質の正確な同定を可能にするならば、完全長タンパク質の同定と同様にタンパク質の１つまたは複数のフラグメントの同定が可能であることは当業者には明らかであろう。同様に、本発明の好ましいプローブはポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるが、他のプローブ、例えばアプタマー、分子インプリントポリマー、ファージ、短鎖抗体フラグメントおよび他の抗体ベースのプローブを使用してもよい。
【００４５】
好ましくは、固体素子を、好ましくはＢｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙシステム（ＢＡＴ）（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄから入手可能）を本発明の方法で使用する。さらに好ましくは、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ＥｖｏｌｕｔｉｏｎおよびＥｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ装置（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）を使用してサンプル中のバイオマーカーのレベルを測定してもよい。
【００４６】
本発明の関連する第３の態様では、本発明の第２の態様によるＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含む基体を、本発明の第１の態様による患者における出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作の鑑別診断を支援する方法で使用する。
【００４７】
第４の態様によると、本発明は、ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰ、ＣＲＰ、ＩＬ−６および／またはｓＴＮＦＲ１の出血性脳卒中のバイオマーカーならびに／または出血性脳卒中、虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作間の識別因子としての使用に関する。
【００４８】
本発明はまた、ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰおよびＣＲＰのプローブを含み、場合によって
ＩＬ−６および／またはｓＴＮＦＲ１、さらなる試薬、基体／反応表面および／または使用説明書も含んでもよいキットも提供する。そのようなキットを使用して、本発明の第１の態様による患者における脳卒中亜型を鑑別診断することができる。
【００４９】
ここで、本発明を以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明する。
【実施例】
【００５０】
患者群
試験は、ギリシャ国アテネのＫＡＴ総合病院の救急科に入院している、脳卒中症状を呈する９８人の患者から構成されていた。血液サンプルを入院時ならびに１日、２日、３日および７日に採取した。脳卒中症状の開始および入院からの平均時間は３．２時間であった。患者の平均年齢は７５．２歳（標準偏差９．４）であった。臨床医評価（背景技術の節で強調した基準を使用）および神経画像技術により、４４人の虚血性脳卒中（ＩＳ）、２５人の出血性脳卒中（ＨＳ）、２９人の一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）が特定され、６０人の健常対象は対照（Ｃ）としての役割を果たした。
【００５１】
サンプル分析
以下のタンパク質を、試験群の患者から得られる血液のＥＤＴＡ血漿サンプルに対して試験した：ＶＣＡＭ−１、ＧＦＡＰ、ＣＲＰ、ＩＬ−６およびｓＴＮＦＲ１。タンパク質は、バイオマーカー特異的抗体を組み入れた多重バイオチップおよびＥｖｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ（Ｒａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ（英国クラムリン））を使用して検出し、定量化した。同時イムノアッセイを製造業者の指示に従って実施した。９点較正曲線および３つの参考対照（reference control）を各バイオマ
ーカーについて分析して、結果の検証を可能にした。ＣＲＰ  ＩＳ対ＴＩＡ分析のために、サンプルを１０倍に希釈した。
【００５２】
統計的分析
単一バイオマーカーをＲＯＣ曲線分析に供して、感度および特異性を評価した。ロジスティック回帰を使用して、バイオマーカーの様々な組み合わせの濃度に対する脳卒中および脳卒中亜型の依存性のモデルを作製し、続いてＲＯＣ曲線分析を行ってモデルの分類精度を評価した。結果を図１〜３に示す。
【００５３】
脳卒中亜型を決定するためのバイオマーカーの各々に関する性の関連性を図４〜８に示す。
【００５４】
結果
表３中に示されるデータは、ＨＳとＩＳ／ＴＩＡとを識別するための本発明のバイオマーカーの使用を示す。本発明のバイオマーカーを用いたＨＳ患者とＩＳおよびＴＩＡ患者とを識別するためのＲＯＣ曲線分析を図３に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
さらに、図１〜３および表４は、多項ロジスティック回帰を使用するこの例で、全ての脳卒中患者をＴＩＡ、ＩＳまたはＨＳ患者のいずれかに分類するためにバイオマーカーの組み合わせを使用することによって、単独でのバイオマーカーのどれよりも改善された区別ができることを示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
加えて、人工の神経回路網を使用するなどのカテゴリー化アルゴリズムを考案する別のアプローチ（図９および表５を参照のこと）は類似した性能特性を示す。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
これは、当該技術分野で公知の任意の方法によって導かれるアルゴリズムで関心対象のバイオマーカーを組み合わせる際の確固とした本質をさらに例示する。
【００６１】
略語
ＧＦＡＰ  グリア細胞繊維性酸性タンパク質
ＩＬ−６  インターロイキン−６
ＩＣＡＭ−１  細胞内接着分子−１
ＶＣＡＭ−１  血管細胞接着分子−１
ＣＲＰ  Ｃ反応性タンパク質
ＦＡＢＰ  脂肪酸結合タンパク質
ｓＴＮＦＲ１  可溶性ＴＮＦα受容体１
Ｌ−セレクチン  リンパ球接着分子（ＣＤ６２Ｌ）
Ｐ−セレクチン  血小板細胞接着分子
Ｄ−ダイマー  フィブリン分解産物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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