(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを決定するための方法であって、
前記対象から単離された試料から得られる少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを取得するために標的遺伝子を同定するステップであり、同定される前記標的遺伝子は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＩＬ１１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせ、又は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＳＥＲＰＩＮＥ１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせを含む、ステップと、
前記対象から単離された試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを決定するために、前記試料から得られる少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを利用するステップであり、前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子は、前記同定された標的遺伝子の組み合わせから選択され、さらに、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルは、
前記試料から得られる少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルに対するデータを受け取るステップであり、前記ＴＧＦ−β転写因子要素は、前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の転写を制御する、ステップ、及び、
較正済み経路モデルを使用して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを計算するステップであり、前記較正済み経路モデルが、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較する、ステップ、
によって、プロセッサを有するコンピュータ処理デバイスにより決定される、ステップと、
前記試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを、前記試料における計算された前記ＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルに基づいて決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を、前記計算された試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルに割り当てるステップをさらに含み、前記活性状態は、活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路又は不活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を表示するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦ−β標的遺伝子のＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７の発現レベルに対するデータが受け取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらなるＴＧＦ−β標的遺伝子のＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＶＥＧＦＡ及びＳＮＡＩ２の発現レベルに対するデータが受け取られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記較正済み経路モデルは、条件付き確率関係を組み込む確率モデルであり、前記条件付き確率関係は、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記較正済み経路モデルが、ある関係を組み込む線形モデルであり、前記関係は、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを決定するためのコンピュータ・プログラムであって、コンピュータ可読プログラム・コードを具体化する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み、
少なくとも１つのプロセッサにより実施可能な前記コンピュータ可読プログラム・コードは、対象から単離された試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを計算し、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルは、
前記試料から得られる少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルに対するデータを利用するステップであり、前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＩＬ１１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせ、又は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＳＥＲＰＩＮＥ１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせを含む同定される標的遺伝子を含む、ステップと、
較正済み経路モデルを使用して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを計算するステップであり、前記較正済み経路モデルが、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較する、ステップと、
によって計算され、さらに、
前記コンピュータ可読プログラム・コードは、計算された前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルに基づいて前記試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを計算する、コンピュータ・プログラム。
【請求項９】
前記コンピュータ可読プログラム・コードは、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を、前記計算された試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルに割り当てるように、少なくとも１つのプロセッサによって実施可能であり、前記活性状態は、活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路又は不活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を示す、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１０】
前記コンピュータ可読プログラム・コードは、前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を表示するように少なくとも１つのプロセッサによって実施可能である、請求項９に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−β標的遺伝子のＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７の発現レベルに対するデータが受け取られる、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１２】
さらなるＴＧＦ−β標的遺伝子のＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＶＥＧＦＡ及びＳＮＡＩ２の発現レベルに対するデータが受け取られる、請求項１１に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１３】
前記較正済み経路モデルは、条件付き確率関係を組み込む確率モデルであり、前記条件付き確率関係は、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを決定する、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１４】
前記較正済み経路モデルが、ある関係を組み込む線形モデルであり、前記関係は、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを決定する、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項１５】
対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを決定するためのキットであって、
前記対象の試料から少なくとも７つのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現レベルを同定する能力を持つ１つ又は複数の構成要素であり、前記少なくとも７つのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＩＬ１１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせ、又は、ＣＤＣ４２ＥＰ３と、ＡＮＧＰＴＬ４と、ＩＤ１と、ＳＥＲＰＩＮＥ１と、ＪＵＮＢと、ＳＫＩＬと、ＳＭＡＤ７との組み合わせを含む同定される標的遺伝子を含む、構成要素と、
コンピュータ可読プログラム・コードを具体化する非一時的コンピュータ可読記憶媒体であり、少なくとも１つのプロセッサにより実施可能な前記コンピュータ可読プログラム・コードは、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを計算し、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルは、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達に関連し、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルは、
前記試料から得られる少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルに対するデータを利用するステップと、
較正済み経路モデルを使用して、前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルを計算するステップであり、前記較正済み経路モデルが、前記試料における少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを、ＴＧＦ−β転写因子要素の活性レベルを定める前記モデルにおける前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルと比較する、ステップと、
によって計算され、
前記コンピュータ可読プログラム・コードは、計算された前記試料におけるＴＧＦ−β転写因子要素のレベルに基づいて前記試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルを計算する、非一時的コンピュータ可読記憶媒体と、
を含む、キット。
【請求項１６】
前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態は、疾患又は疾患状態の有無を診断するため、特定の疾患又は疾患状態の有無を診断するため、特定の疾患又は疾患状態の進歩の状態を診断するため、及び／又は、疾患又は疾患状態の治療の過程を設計するために使用される指標であり、前記疾患は、免疫疾患、癌、気管支喘息、心臓疾患、糖尿病、遺伝性出血性末梢血管拡張症、マルファン症候群、脈管エーラス・ダンロス症候群、ロイス・ディーツ症候群、パーキンソン病、慢性腎疾患、多発性硬化症、肝線維症、肺線維症又は腎線維症などの線維性疾患、デュピュイトラン病、又はアルツハイマー病のうちの１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患は癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、又は脳癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌は乳癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、前記対象から抽出された試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料から前記少なくとも７つのＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を、前記計算された試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルに割り当てることをさらに含み、前記活性状態は、活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路又は不活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を示す、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２３】
疾患又は疾患状態の有無を診断すること、特定の疾患又は疾患状態の有無を診断すること、特定の疾患又は疾患状態の進歩の状態を診断すること、及び、疾患又は疾患状態の治療の過程を設計することの少なくとも１つに対して、前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を使用することをさらに含み、前記疾患は、免疫疾患、癌、気管支喘息、心臓疾患、糖尿病、遺伝性出血性末梢血管拡張症、マルファン症候群、脈管エーラス・ダンロス症候群、ロイス・ディーツ症候群、パーキンソン病、慢性腎疾患、多発性硬化症、肝線維症、肺線維症又は腎線維症などの線維性疾患、デュピュイトラン病、又はアルツハイマー病のうちの１つである、請求項２２に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２４】
前記疾患は癌である、請求項２３に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２５】
前記癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、又は脳癌である、請求項２４に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２６】
前記癌は乳癌である、請求項２５に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２７】
計算された前記対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性に基づいて、前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に機能しているかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記コンピュータ可読プログラム・コードは、計算された前記対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性に基づいて、前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が前記対象において異常に機能しているかどうかを決定するように少なくとも１つのプロセッサによって実施可能である、請求項８に記載のコンピュータ・プログラム。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性レベルに関する情報が、活性であるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を示す場合にＴＧＦ−β阻害剤を前記対象に投与するために、前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態を使用するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＧＦ−β阻害剤は、テラメプロコル、フレソリムマブ、ソタテルセプト、ガルニセルチブ、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ２１０９７６１、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＤＮ−１９３１８９ＨＣｌ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−２１４１１７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、ＬＤＮ−２１２８５４、ＤＭＨ１、ピルフェニドン、ヘスペレチン、トラベデルセン、レルデリムマブ、メテリムマブ、ｔｒｘ−ＳＡＲＡ、ＩＤ１１、Ｋｉ２６８９４、又はＳＢ−４３１５４２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズの所定のカットオフ値にて前記ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態の指標を設定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、バイオ・インフォマティクス、ゲノム処理技術、プロテオミクス処理技術、及び関連技術分野に関する。より詳細には、本発明は、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性をデジタル処理デバイスによって推測するための、コンピュータ実装方法に関連する。この推測は、対象の試料で測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに基づく。本発明はさらに、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、上記の方法を実行するように構成された、デジタル・プロセッサを備える装置と、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、上記の方法を実行するためにデジタル処理デバイスによって実行可能である命令を記憶する非一時的記憶媒体と、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、デジタル処理デバイスで実行されたときにデジタル処理デバイスに上記の方法を実行させるプログラム・コード手段を含むコンピュータ・プログラムとに関する。本発明はさらに、対象の試料中のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットと、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットと、上記の方法を実行する際の、このキットの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム及びプロテオミクスの分析は、腫瘍学などの医療分野における臨床応用に対し、実質的に実現されており、また潜在的な有望性がある。様々な癌が、ゲノムの突然変異／バリエーションの特定の組合せ、及び／又は特定の遺伝子の高発現レベル若しくは低発現レベルと関連することが知られており、これらは、癌の成長及び進化、たとえば細胞増殖及び転移においての役割を果たす。
【０００３】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）は、ヒトの多くの細胞型において増殖、分化及び傷治癒などの様々な機能を制御するサイトカインである。癌（たとえば、結腸、乳房、前立腺）などの病理学的障害に関して、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路は、腫瘍抑制因子又は腫瘍プロモータとして、２つの反対の役割を果たす。ＴＧＦ−βは、癌発生の初期段階では腫瘍抑制因子として働くが、より進行した癌組織ではＴＧＦ−βが、浸潤及び転移の制御因子として働くことによって、腫瘍プロモータとして働き得ることが知られている（Ｐａｄｕａ  Ｄ．及びＭａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．、「Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１，２００９、８９〜１０２頁参照）。ＴＧＦ−βは３つのアイソフォーム（遺伝子名はＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３）として存在し、また不活性潜在型ホモ二量体タンパク質として分泌され、これは癌細胞において、その正常な対応物と比べて増加することが知られている（Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．、「Ｈｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅａｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３，２０００、１６９〜１７８頁参照）。次に、潜在型ＴＧＦ−βは、タンパク質分解により活性とすることができ、こうして細胞膜上のＴＧＦ−β受容体に結合し、それによって、ＳＭＡＤ細胞シグナル伝達経路とも呼ばれることもある古典的なＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を開始することができる。最終的に、古典的なＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路は、受容体制御された、すなわちＲ−ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ８）並びにＳＭＡＤ４から成る転写複合体をＤＮＡに結合することになり、それによって、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の転写が開始される（図１参照、Ｌ．ＴＧＦ−β＝古典的なＴＧＦ−β、ＰＲ＝プロテオソーム、ＰＨ＝ホスファターゼ、Ｃｏ−Ｒ＝コリプレッサー、Ｃｏ−Ａ＝コアクチベータ）。「ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路」という用語は本明細書で、好ましくは、上述のＴＧＦ−β転写因子の転写活性につながる任意のシグナル伝達過程を指す。好ましくは、この用語は、細胞外ＴＧＦ受容体へのＴＧＦ−β結合によりトリガーされて細胞内ＳＭＡＤカスケードを引き起こすシグナル伝達過程を指す。細胞内ＳＭＡＤカスケードは最終的に、転写因子として働くＳＭＡＤ複合体の形成につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌におけるＴＧＦ−βシグナル伝達に関し、正しい標的薬治療の選択を可能にするには、腫瘍抑制活性と腫瘍促進活性を区別できることが重要になる。現在、抗ＴＧＦ−β療法が開発されている（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ  Ｊ．Ｍ．ら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１２，２００４、１０１１〜１０２２頁参照）。しかし今日、その活性状態において腫瘍を促進する可能性がより高いことを示し、その不活性状態において腫瘍を抑制する可能性がより高いことを示す、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の機能状態又は活性を評価するのに利用可能な臨床アッセイはない。したがって、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の腫瘍促進活性によって少なくとも部分的に駆動される癌、したがってＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の阻害剤に反応しそうな癌、たとえば、結腸癌、膵臓癌、肺癌、脳癌又は乳癌、がある患者を特徴づける可能性を改善できることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主態様によれば、上記の問題は、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、デジタル処理デバイスによって実行されるコンピュータ実装方法によって解決され、この推測するステップは、
対象の試料において測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上の標的遺伝子の発現レベルを受け取るステップと、
対象の試料におけるＴＧＦ−β転写因子（ＴＦ）要素の活性レベルを決定するステップであって、ＴＧＦ−β  ＴＦ要素が３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の転写を制御し、上記決定するステップが、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルをＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルに関係付ける較正済み数学経路モデルを評価することに基づく、ステップと、
対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料において決定されたＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルに基づいて推測するステップと、
を含み、
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２−５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、より好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、最も好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択される。
【０００６】
本明細書で、ＴＦ要素の「活性レベル」とは、ＴＦ要素の、その標的遺伝子の転写に関する活性レベルを指す。
【０００７】
本発明は、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に生じる効果を識別する適切な方法が、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路のシグナル伝達出力の測定に基づくことができるという本発明者らの新考案に基づいており、このシグナル伝達出力は、とりわけ、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路が制御するＴＧＦ−β転写因子（ＴＦ）要素によって制御される、標的遺伝子の転写である。本発明者らによるこの新考案では、ＴＦ活性レベルが、試料において、とりわけＴＧＦ−β標的遺伝子の発現値によって検出できる準安定状態にあると仮定している。本明細書で対象となるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路は、ヒトの多くの細胞型において増殖、分化及び傷治癒などの様々な機能を制御することが知られている。癌（たとえば、結腸癌、膵臓癌、脳癌又は乳癌）などの病理学的障害に関して、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路は、腫瘍抑制因子又は腫瘍プロモータとして、２つの反対の役割を果たす。このシグナル伝達経路は、標的遺伝子の発現特性プロファイルとして検出可能であり、したがって、較正済み数学経路モデルによって活用される。
【０００８】
本発明では、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を決定することが、（ｉ）対象の試料におけるＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルを決定することによって可能になり、ここで、決定することは、転写がＴＧＦ−β  ＴＦ要素によって制御されるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルをＴＦＧ−β  ＴＦ要素の活性レベルに関係付ける、較正済み数学モデルを評価することに基づいており、また（ｉｉ）対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料におけるＴＧＦ−β  ＴＦ要素の決定された活性レベルに基づいて推測することによって可能になる。これにより、好ましくは、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の腫瘍促進活性によって少なくとも部分的に駆動される癌、したがってＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の阻害剤に反応しそうな癌、たとえば、結腸癌、膵臓癌、肺癌、脳癌又は乳癌、がある患者を特徴づける可能性を改善できるようになる。特定の実施形態では、治療決定は、特異的なＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性に基づくことができる。特定の実施形態では、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達状態は、たとえば１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、又は１：１０の、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズのカットオフ値に設定することができる。
【０００９】
本明細書で「ＴＧＦ−β転写因子要素」又は「ＴＧＦ−β  ＴＦ要素」又は「ＴＦ要素」という用語は、特異的なＤＮＡ配列に結合することができ、それによって標的遺伝子の転写を制御するＴＧＦ−βメンバーの少なくとも１つ、又は好ましくは二量体（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ８と、ＳＭＡＤ４）、又は三量体（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ８からの２つのタンパク質と、ＳＭＡＤ４）を含むタンパク質複合体であると定義される。好ましくは、この用語は、ＴＧＦ−βがその受容体に結合することによって、又は、ＴＧＦ−βがその受容体に結合することと最終転写因子タンパク質又はタンパク質複合体との間の中間下流シグナル伝達作用因子によって、トリガーされるタンパク質若しくはタンパク質複合体転写因子を指す。たとえば、ＴＧＦ−βが、細胞内「ＳＭＡＤ」シグナル伝達経路を惹起する細胞外ＴＧＦ−β受容体に結合することが知られており、また、１つ又は複数のＳＭＡＤタンパク質（受容体制御された、すなわちＲ−ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ８）並びにＳＭＡＤ４）が、発現を制御するＴＧＦ−β転写シグナル伝達カスケードに関与し、また、それに関与するヘテロ複合体を形成できることが知られている。
【００１０】
較正済み数学経路モデルは、ＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルと３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルとを関係付ける条件付き確率に基づく確率モデル、好ましくはベイジアン・ネットワーク・モデルとすることができ、或いは、較正済み数学経路モデルは、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の一次結合に基づくことができる。特に、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性の推測は、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に記載されているように、或いは、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）に記載されているように実施することができ、これらの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。標的遺伝子発現の数学モデルを用いて細胞シグナル伝達経路活性を推測することに関するこれ以上の詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．１１，２０１４年、２９３６〜２９４５頁、に見出すことができる。
【００１１】
本明細書で「対象」という用語は、任意の生物を指す。いくつかの実施形態では、対象は動物、好ましくは哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、好ましくは医療対象者である。
【００１２】
本明細書で「標的遺伝子」という用語は、転写がＴＧＦ−β転写因子要素によって直接又は間接に制御される遺伝子を意味する。「標的遺伝子」は、「直接標的遺伝子」及び／又は「間接標的遺伝子」（本明細書に記載）であり得る。さらに、「標的遺伝子」は、（本明細書に記載のように）「直接標的遺伝子」及び／又は「間接標的遺伝子」とすることができる。
【００１３】
特に適切なＴＧＦ−β標的遺伝子は、以下の文字経路、並びに以下の実施例（たとえば、以下の表１から表４、表６、表８、及び表９参照）に記載されている。
【００１４】
すなわち、好ましい実施形態によれば、ＴＧＦ−β標的遺伝子が、以下の表１、表２、表３、表４、表６、表８、又は表９に列挙されたＴＧＦ−β標的遺伝子から成る群から選択される。
【００１５】
本発明者らによって、連続的に短いリストが、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を決定するための、ますますの証拠になることが見出された。
【００１６】
好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００１７】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、及びＳＮＡＩ２から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００１８】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択されることである。
【００１９】
好ましくは、選択された３個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４及びＣＤＣ４２ＥＰ３を含み、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７を含む。
【００２０】
特に好ましいのは、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡであることである。
【００２１】
本発明の別の態様は、（本明細書に記載の）方法に関し、この方法は、
ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が対象において腫瘍プロモータとして作用しているかどうかを、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づいて判定するステップをさらに含む。
【００２２】
本発明はまた、（本明細書に記載の）方法に関し、この方法は、
対象に、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の腫瘍促進作用を補正する薬物の処方を推奨するステップをさらに含み、この推奨するステップは、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が対象において腫瘍プロモータとして作用しているとＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づいて判定された場合に、実行される。
【００２３】
本発明により使用されるべき試料は、抽出試料、すなわち対象から取り出された試料とすることができる。試料の例には、それだけには限らないが、対象の組織、細胞、血液及び／又は体液が含まれる。これは、たとえば、癌病変部から、又は癌の疑いがある病変部から、又は転移腫瘍から、又は癌細胞で汚染されている流体が存在する体腔（たとえば、胸膜若しくは腹部の腔、又は膀胱腔）から、又は癌細胞を含有する他の体液などから、好ましくは組織診手順又は他の試料抽出手順を介して得られた試料とすることができる。試料が取り出される細胞はまた、悪性血液疾患（白血病又はリンパ腫など）からの腫瘍細胞とすることができる。場合によっては、細胞試料はまた、循環腫瘍細胞、すなわち血流に入った腫瘍細胞であることもあり、適切な分離技法、たとえばアフェレーシス又は従来の静脈血採血を用いて取り出すことができる。血液は別として、試料が取り出される体液は、尿、胃腸内容物、又は血管外湧出物であり得る。本明細書で「試料」という用語はまた、たとえば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が対象から採取され、たとえば顕微鏡スライドに載せられている場合と、特許請求された方法を実施するために、この試料の一部分が、たとえば、レーザーキャプチャ法（ＬＣＭ）によって、又は対象の細胞をスライドからかき取ることによって、又は蛍光活性化細胞選別技法によって取り出される場合とを包含する。加えて、本明細書で「試料」という用語はまた、たとえば、対象の組織及び／又は細胞及び／又は体液が対象から採取され、顕微鏡スライドに載せられ、また特許請求された方法がスライド上で実施される場合も含む。
【００２４】
別の開示態様によれば、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための装置は、本明細書に記載の本発明の方法を実施するように構成されたデジタル・プロセッサを備える。
【００２５】
別の開示態様によれば、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための非一時的記憶媒体は、本明細書に記載の本発明の方法を実施するデジタル処理デバイスによって実行可能である命令を記憶する。非一時的記憶媒体は、ハード・ドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは他の光記憶媒体、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、フラッシュ・メモリ、又は他の電子記憶媒体、ネットワーク・サーバなどの、コンピュータ可読記憶媒体とすることができる。デジタル処理デバイスは、手持ち型デバイス（たとえば、携帯情報端末又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ・コンピュータ、タブレット・コンピュータ若しくはデバイス、リモート・ネットワーク・サーバなどであり得る。
【００２６】
別の開示態様によれば、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのコンピュータ・プログラムは、コンピュータ・プログラムがデジタル処理デバイス上で実行されると、デジタル処理デバイスに本明細書に記載の本発明の方法を実施させるプログラム・コード手段を含む。デジタル処理デバイスは、手持ち型デバイス（たとえば、携帯情報端末又はスマートフォン）、ノート型コンピュータ、デスクトップ・コンピュータ、タブレット・コンピュータ若しくはデバイス、リモート・ネットワーク・サーバなどであり得る。
【００２７】
別の開示態様によれば、対象の試料におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上の、標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
対象の試料における、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素を含む。
【００２８】
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルを測定するための１つ又は複数の構成要素又は手段は、（例えばＤＮＡアレイ・チップ、オリゴヌクレオチド・アレイ・チップ、タンパク質アレイ・チップ等の）マイクロアレイ・チップ、抗体、複数のプローブ、たとえば標識されたプローブ、ＲＮＡリバーサ転写酵素配列決定構成要素の組、及び／又は、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むＤＮＡの増幅プライマーから成る群から選択することができる。一実施形態では、キットは、本明細書に記載の３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列の一部分を対象とする標識されたプローブの組を含む。一実施形態では、キットは、さらに以下に記載された３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列の一部分を対象とするプライマーとプローブの組、たとえば、表１１の配列から選択された特定のプライマーとプローブの組を含む。一実施形態では、標識されたプローブは、標準化９６ウェル・プレートに含まれる。一実施形態では、キットはさらに、たとえば表１２に表された参照遺伝子の組を対象とするプライマー又はプローブを含む。このような参照遺伝子は、たとえば、本明細書に記載の標的遺伝子発現レベルの発現レベルを正規化又は標準化するのに有用な、構造的に発現された遺伝子とすることができる。
【００２９】
一実施形態では、対象の試料における２つ以上の細胞シグナル伝達経路それぞれの３つ以上の標的遺伝子の発現レベルを測定するためのキットは、
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子を対象とするポリメラーゼ連鎖反応プライマー、
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子を対象とするプローブを含み、
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２−５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、より好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、最も好ましくはＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択される。
【００３０】
好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００３１】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、及びＳＮＡＩ２から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００３２】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択されることである。
【００３３】
好ましくは、選択された３個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４及びＣＤＣ４２ＥＰ３を含み、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７を含む。
【００３４】
特に好ましいのは、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡであることである。
【００３５】
別の開示態様によれば、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットは、
本明細書に記載の本発明のキットと、
本明細書に記載の本発明の装置、本明細書に記載の本発明の非一時的記憶媒体、又は本明細書に記載の本発明のコンピュータ・プログラムと、
を含む。
【００３６】
別の開示態様によれば、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのキットは、
対象の試料においてＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３個以上の標的遺伝子の発現レベルを決定するための１つ又は複数の構成要素を含み、
１つ又は複数の構成要素は、好ましくは、マイクロアレイ・チップ、抗体、複数のプローブ、たとえば標識されたプローブ、ＲＮＡリバーサ転写酵素配列決定構成要素の組、及び／又は、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを含むＤＮＡの増幅プライマーから成る群から選択され、また
当該キットは、任意的に、本明細書に記載の本発明の装置、本明細書に記載の本発明の非一時的記憶媒体、又は本明細書に記載の本発明のコンピュータ・プログラムを含み、
３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＩＮＰＰ５Ｄ、ＪＵＮＢ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＮＫＸ２−５、ＯＶＯＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＩＭＰ１、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、さらに好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択され、最も好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択される。
【００３７】
好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＨＭＧＡ２、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＰＴＨＬＨ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＫ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、ＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００３８】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＰＤＧＦＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、及びＳＮＡＩ２から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡから成る群から選択されることである。
【００３９】
さらに好ましいのは、３個以上の、たとえば、３個、４個、５個、６個、７個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＩＬ１１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択され、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７から成る群から選択されることである。
【００４０】
好ましくは、選択された３個以上のＴＧＦ−β標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ４及びＣＤＣ４２ＥＰ３を含み、より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、及びＳＭＡＤ７を含む。
【００４１】
特に好ましいのは、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子が、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２、及びＶＥＧＦＡであることである。
【００４２】
別の開示態様によれば、本明細書に記載の本発明のキットは、本明細書に記載の本発明の方法を実施する際に使用される。
【００４３】
本明細書に記載の本発明はまた、たとえば、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく診断、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく予後、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく薬物処方、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく薬効の予測、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく有害作用の予測、
薬効の監視、
薬物開発、
アッセイ開発、
経路研究、
癌進行度分類、
対象のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく、臨床治験における対象の登録、
実施されるべき次の検査の選択、及び
コンパニオン診断検査の選択
と関連して有利に使用することもできる。
【００４４】
さらなる利点は、添付の図、及び以下の説明を読み理解すれば、特に本明細書で以下に提示される詳細な実施例を読めば、当業者には明らかになろう。
【００４５】
請求項１に記載の方法、請求項９に記載の装置、請求項１０に記載の非一時的記憶媒体、請求項１１に記載のコンピュータ・プログラム、請求項１２から１４に記載のキット、及び請求項１５に記載のキットの使用には、同様の、及び／又は同一の好ましい、特に、従属請求項に定義された実施形態があることを理解されたい。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態はまた、従属請求項又は上記の実施形態を、それぞれの独立請求項と任意に組み合わせたものにもできることを理解されたい。
【００４７】
本発明の上記その他の態様は、以下に記載の実施形態から明らかになり、またそれを参照して解明されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＴＧＦ−βタンパク質が受容体に結合すると古典的な細胞シグナル伝達経路（左部分）を開始させるＴＧＦ−βシグナル伝達を概略的及び例示的に示す図である。細胞シグナル伝達経路の開始により、ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４が核へ転位し、ＤＮＡに結合することになり、それによって、標的遺伝子転写が開始される（Ｓｈｅｅｎ  Ｙ．Ｙ．ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５，２０１３、３２３〜３３１頁参照）。
【図２】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の転写プログラムをモデル化するために使用される、本明細書ではベイジアン・ネットワーク・モデルである、数学モデルを概略的及び例示的に示す図である。
【図３】対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を、対象の試料において測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現レベルに基づいて推測するためのプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図４】本明細書に記載の較正済み数学経路モデルを得るためのプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図５】本明細書に記載の、対象の試料中のＴＧＦ−β転写因子（ＴＦ）要素の活性レベルを決定するためのプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図６】離散化観察可能物を用いて対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図７】連続観察可能物を用いて対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図８】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ解析からＣｑ値を決定するプロセスを例示的に示す流れ図である。
【図９】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）それぞれに基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、２−  ５ｎｇ／ｍＬで０．５時間のＴＧＦ−β刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬで１時間のＴＧＦ−β刺激、４−  ５ｎｇ／ｍＬで２時間のＴＧＦ−β刺激、５−  ５ｎｇ／ｍＬで４時間のＴＧＦ−β刺激、６−  ５ｎｇ／ｍＬで８時間のＴＧＦ−β刺激、７−  ５ｎｇ／ｍＬで１６時間のＴＧＦ−β刺激、８−  ５ｎｇ／ｍＬで２４時間のＴＧＦ−β刺激、９−  ５ｎｇ／ｍＬで７２時間のＴＧＦ−β刺激）
【図１０】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）それぞれに基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、２−  ５ｎｇ／ｍＬで０．５時間のＴＧＦ−β刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬで１時間のＴＧＦ−β刺激、４−  ５ｎｇ／ｍＬで２時間のＴＧＦ−β刺激、５−  ５ｎｇ／ｍＬで４時間のＴＧＦ−β刺激、６−  ５ｎｇ／ｍＬで８時間のＴＧＦ−β刺激、７−  ５ｎｇ／ｍＬで１６時間のＴＧＦ−β刺激、８−  ５ｎｇ／ｍＬで２４時間のＴＧＦ−β刺激、９−  ５ｎｇ／ｍＬで７２時間のＴＧＦ−β刺激）
【図１１】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）それぞれに基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、２−  ５ｎｇ／ｍＬで０．５時間のＴＧＦ−β刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬで１時間のＴＧＦ−β刺激、４−  ５ｎｇ／ｍＬで２時間のＴＧＦ−β刺激、５−  ５ｎｇ／ｍＬで４時間のＴＧＦ−β刺激、６−  ５ｎｇ／ｍＬで８時間のＴＧＦ−β刺激、７−  ５ｎｇ／ｍＬで１６時間のＴＧＦ−β刺激、８−  ５ｎｇ／ｍＬで２４時間のＴＧＦ−β刺激、９−  ５ｎｇ／ｍＬで７２時間のＴＧＦ−β刺激）
【図１２】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）それぞれに基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、２−  ５ｎｇ／ｍＬで０．５時間のＴＧＦ−β刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬで１時間のＴＧＦ−β刺激、４−  ５ｎｇ／ｍＬで２時間のＴＧＦ−β刺激、５−  ５ｎｇ／ｍＬで４時間のＴＧＦ−β刺激、６−  ５ｎｇ／ｍＬで８時間のＴＧＦ−β刺激、７−  ５ｎｇ／ｍＬで１６時間のＴＧＦ−β刺激、８−  ５ｎｇ／ｍＬで２４時間のＴＧＦ−β刺激、９−  ５ｎｇ／ｍＬで７２時間のＴＧＦ−β刺激）
【図１３】ＧＳＥ２８４４８のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ−ＴＲ）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  コントロール、ＴＧＦ−β、３−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−βなし、４−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−β、５−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−βなし、６−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−β）
【図１４】ＧＳＥ２８４４８のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ−ＴＲ）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  コントロール、ＴＧＦ−β、３−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−βなし、４−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−β、５−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−βなし、６−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−β）
【図１５】ＧＳＥ２８４４８のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ−ＴＲ）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  コントロール、ＴＧＦ−β、３−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−βなし、４−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−β、５−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−βなし、６−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−β）
【図１６】ＧＳＥ２８４４８のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ−ＴＲ）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  コントロール、ＴＧＦ−β、３−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−βなし、４−  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＤ４、ＴＧＦ−β、５−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−βなし、６−  ｓｉＲＮＡ  ＴＩＦγ、ＴＧＦ−β）
【図１７】精漿又は５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、ＧＳＥ３５８３０の子宮頸部上皮細胞（Ｅｃｔ１）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  １０％精漿で刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３で刺激）
【図１８】ＧＳＥ１６０１１の患者神経膠腫に対し標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  星状細胞腫（グレードＩＩ）、２−  星状細胞腫（グレードＩＩＩ）、３−  コントロール、４−  多形膠芽腫（グレードＩＶ）、５−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩ）、６−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩＩ）、７−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩ）、８−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩＩ）、９−  毛様細胞性星状細胞腫（グレードＩ））
【図１９】ＧＳＥ２１６５３の乳癌試料について標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  管腔Ａ、２−  管腔Ｂ、３−  ＨＥＲ２、４−  基礎、５−  正常様）
【図２０】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されない、ＧＳＥ４２３７３のＡ５４９肺腺癌細胞株の２次元及び３次元培養に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２次元コントロール、２−  ２次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３次元コントロール、４−  ３次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図２１】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されない、ＧＳＥ４２３７３のＡ５４９肺腺癌細胞株の２次元及び３次元培養に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２次元コントロール、２−  ２次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３次元コントロール、４−  ３次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図２２】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されない、ＧＳＥ４２３７３のＡ５４９肺腺癌細胞株の２次元及び３次元培養に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２次元コントロール、２−  ２次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３次元コントロール、４−  ３次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図２３】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されない、ＧＳＥ４２３７３のＡ５４９肺腺癌細胞株の２次元及び３次元培養に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表４〜表７参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２次元コントロール、２−  ２次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３次元コントロール、４−  ３次元ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図２４】標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用し、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルを用いてカプラン・マイヤー・グラフで表された、神経膠腫患者（ＧＳＥ１６０１１）の予後を示すグラフである。
【図２５】標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用し、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルを用いてカプラン・マイヤー・グラフで表された、乳癌患者（ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、Ｅ−ＭＴＡＢ−３６５、ＧＳＥ２０６８５及びＧＳＥ２１６５３）の予後を示すグラフである。
【図２６】ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推定標的遺伝子の広範な文献リスト（表５参照）に基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、２−  ５ｎｇ／ｍＬで０．５時間のＴＧＦ−β刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬで１時間のＴＧＦ−β刺激、４−  ５ｎｇ／ｍＬで２時間のＴＧＦ−β刺激、５−  ５ｎｇ／ｍＬで４時間のＴＧＦ−β刺激、６−  ５ｎｇ／ｍＬで８時間のＴＧＦ−β刺激、７−  ５ｎｇ／ｍＬで１６時間のＴＧＦ−β刺激、８−  ５ｎｇ／ｍＬで２４時間のＴＧＦ−β刺激、９−  ５ｎｇ／ｍＬで７２時間のＴＧＦ−β刺激）
【図２７】ＧＳＥ１６０１１の患者神経膠腫についての推定標的遺伝子の広範な文献リスト（表５参照）を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  星状細胞腫（グレードＩＩ）、２−  星状細胞腫（グレードＩＩＩ）、３−  コントロール、４−  多形膠芽腫（グレードＩＶ）、５−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩ）、６−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩＩ）、７−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩ）、８−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩＩ）、９−  毛様細胞性星状細胞腫（グレードＩ））
【図２８】ＧＳＥ２１６５３の乳癌試料について推定標的遺伝子の広範な文献リスト（表５参照）を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  管腔Ａ、２−  管腔Ｂ、３−  ＨＥＲ２、４−  基礎、５−  正常様）
【図２９】精漿又は５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３（ＧＳＥ３５８３０）で刺激された子宮頸部上皮細胞（Ｅｃｔ１）に対し「１１標的遺伝子リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  １０％精漿で刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３で刺激）
【図３０】精漿又は５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３（ＧＳＥ３５８３０）で刺激された子宮頸部上皮細胞（Ｅｃｔ１）に対し「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  コントロール、ＴＧＦ−βなし、２−  １０％精漿で刺激、３−  ５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３で刺激）
【図３１】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（ＧＳＥ４２３７３）で刺激された、又は刺激されないＡ５４９肺腺癌細胞株の２Ｄ及び３Ｄ培養において「１１標的遺伝子リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２Ｄコントロール、２−  ２Ｄ  ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３Ｄコントロール、４−  ３Ｄ  ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図３２】１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（ＧＳＥ４２３７３）で刺激された、又は刺激されないＡ５４９肺腺癌細胞株の２Ｄ及び３Ｄ培養において「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  ２Ｄコントロール、２−  ２Ｄ  ＴＧＦ−β及びＴＮＦα、３−  ３Ｄコントロール、４−  ３Ｄ  ＴＧＦ−β及びＴＮＦα）
【図３３】神経膠腫患者、及びＧＳＥ１６０１１からのいくつかのコントロール試料に対し「１１標的遺伝子リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  星状細胞腫（グレードＩＩ）、２−  星状細胞腫（グレードＩＩＩ）、３−  コントロール、４−  多形膠芽腫（グレードＩＶ）、５−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩ）、６−  乏突起膠星細胞腫（グレードＩＩＩ）、７−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩ）、８−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩＩ）、９−  毛様細胞性星状細胞腫（グレードＩ））
【図３４】神経膠腫患者、及びＧＳＥ１６０１１からのいくつかのコントロール試料に対し「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」を使用する、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示すグラフである。（説明文  １−  星状細胞腫（グレードＩＩ）、２−  星状細胞腫（グレードＩＩＩ）、３−  コントロール、４−  多形膠芽腫（グレードＩＶ）、５−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩ）、６−  乏突起膠星細胞腫瘍（グレードＩＩＩ）、７−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩ）、８−  乏突起膠細胞系腫瘍（グレードＩＩＩ）、９−  毛様細胞性星状細胞腫（グレードＩ））
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下の例は単に、特に好ましい方法、及びそれに関連する選択された態様を例示するにすぎない。そこに提示された教示は、たとえば、１つ又は複数の細胞シグナル伝達経路の異常な活性を検出、予測及び／又は診断するための、いくつかの検査及び／又はキットを構築するのに用いることができる。さらに、本明細書に記載の方法を用いると、薬物処方を有利に指導することができ、薬物応答予測、並びに薬効（及び／又は有害作用）監視を行うことができ、薬物耐性を予測及び監視して、たとえば、実施されるべき次の（コンパニオン診断検査のような）検査を選択することができる。以下の例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００５０】
実施例１  数学モデル構築
公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に詳細に記載されているように、確率モデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデルを構築することによって、また、細胞シグナル伝達経路、ここではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路、の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルと、細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御する転写因子（ＴＦ）要素、ここではＴＧＦ−β  ＴＦ要素、の活性レベルとの間の条件付き確率関係を組み込むことによって、このようなモデルを使用して、細胞シグナル伝達経路の活性を高い精度で決定することができる。さらに、確率モデルは、容易に更新して、より最近の臨床研究によって得られた付加的な知識を組み込むことが、条件付き確率を調整することによって、及び／又は新しいノードをモデルに追加して付加的な情報源を表すことによって可能である。このようにして、確率モデルは、最近の医学的知識を具現化するのに適切なように更新することができる。
【００５１】
公開されている国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）に詳細に記載されている、理解及び解釈するのが容易な別の手法では、細胞シグナル伝達経路、ここではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路、の活性は、細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルと転写因子（ＴＦ）要素、ここではＴＧＦ−β  ＴＦ要素、のレベルとの間の関係を組み込む、線形又は（擬似）線形モデルを構築及び評価することによって決定することができる。このＴＦ要素は、細胞シグナル伝達経路の１つ又は複数の標的遺伝子の転写を制御し、このモデルは、１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の一次結合に基づいている。
【００５２】
両方の手法に関して、１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルは、好ましくはｍＲＮＡのレベルの測定値とすることができ、この測定値は、たとえば、標的遺伝子ｍＲＮＡ配列と関連付けられたプローブを使用する（ＲＴ）−ＰＣＲ及びマイクロアレイ技法、並びにＲＮＡ配列決定の結果とすることができる。別の実施形態では、１つ又は複数の標的遺伝子の発現レベルは、タンパク質レベルによって、たとえば標的遺伝子によってコードされたタンパク質の濃度及び／又は活性によって、測定することができる。
【００５３】
上記の発現レベルは、任意選択で、この用途によりよく適切であることもないこともある多くの方法で変換することができる。たとえば、４つの異なる発現レベル、たとえばマイクロアレイによるｍＲＮＡレベルの変換は、
「連続データ」にすること、すなわち、ＭＡＳ５．０及びｆＲＭＡなどのよく知られているアルゴリズムを使用してマイクロアレイの処理後に得られる発現レベルとすること、
「ｚスコア」にすること、すなわち、全試料の平均が０になり標準偏差が１になるように基準化された連続発現レベルとすること、
「離散的」にすること、すなわち、ある特定の閾値を超えるすべての発現が１に、それ未満が０に設定される（たとえば、プローブセットの閾値は、いくつかの陽性の臨床試料と同じ数の陰性の臨床試料の組におけるその値の（重み付けされた）中央値に選ぶことができる）ものとすること、
「ファジー」にすること、すなわち、連続発現レベルが０と１の間の値に、次式
１／（１＋ｅｘｐ（（ｔｈｒ−ｅｘｐｒ）／ｓｅ））
のシグモイド関数を使用して変換されるものとすることができ、ここで、ｅｘｐｒは連続発現レベルであり、ｔｈｒは前述の閾値であり、ｓｅは０と１の間の差に影響を及ぼす軟化パラメータである。
【００５４】
構築することができる最も簡単な線形モデルの１つは、第１の層の転写因子（ＴＦ）要素、本明細書ではＴＧＦ−β  ＴＦ要素を表すノードと、たとえばマイクロアレイ又は（ｑ）ＰＣＲ実験において、第２の層の特定の標的遺伝子と特に高い相関関係がある１つのプローブセットによる、標的遺伝子発現レベルの直接測定値を表す重み付けノードとを有するモデルである。重みは、訓練データ・セットからの計算に基づくこと、又は専門的知識に基づくことができる。複数の発現レベルが標的遺伝子ごとに測定される可能性がある場合に（たとえば、１つの標的遺伝子が複数のプローブセットを用いて測定され得るマイクロアレイ実験の場合に）、標的遺伝子ごとに１つの発現レベルしか使用しないというこの手法は、特に単純である。特定の標的遺伝子に使用される１つの発現レベルを選択する具体的な方法は、訓練データ・セットの活性試料と不活性試料を最善に分離できるプローブセットによる発現レベルを使用することである。このプローブセットを決定する１つの方法は、統計的検定、たとえばｔ検定を行い、最小のｐ値を持つプローブセットを選択することである。最小のｐ値を持つ、訓練データ・セットの発現レベルのプローブセットは、定義により、（既知の）活性及び不活性試料の発現レベルが重なり合う確率が最小のプローブセットである。もう１つの選択方法は、オッズ比に基づく。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルが１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに与えられ、１つ又は複数の一次結合が、１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに重み付け項を含む一次結合を含み、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子に与えられた１つ又は複数の発現レベルのうちのただ１つの発現レベルに基づいている。１つでも発現レベルが標的遺伝子ごとに上述のように選ばれると、そのモデルは「最も判別的なプローブセット」モデルと呼ぶことができる。
【００５５】
「最も判別的なプローブセット」モデルの代替形態では、複数の発現レベルが標的遺伝子ごとに測定される可能性がある場合に、標的遺伝子ごとに与えられるすべての発現レベルを利用することが可能である。このようなモデルでは、１つ又は複数の発現レベルが１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに与えられ、１つ又は複数の一次結合が、１つ又は複数の標的遺伝子に与えられた１つ又は複数の発現レベルのうちの全発現レベルの一次結合を含む。言い換えると、１つ又は複数の標的遺伝子それぞれについて、それぞれの標的遺伝子に与えられた１つ又は複数の発現レベルのそれぞれに、一次結合においてそれ自体の（個々の）重みによって重み付けすることができる。この変形形態は、「全プローブセット」モデルと呼ぶことができる。これには、与えられた発現レベルすべてを利用しながらも比較的単純であるという利点がある。
【００５６】
上述の両モデルには、「単層」モデルと見なせるものであるという共通点があり、ＴＦ要素の活性レベルは、１つ又は複数の標的遺伝子の１つ又は複数のプローブセットの発現レベルの一次結合に基づいて計算される。
【００５７】
ＴＦ要素、ここではＴＧＦ−β  ＴＦ要素、の活性レベルがそれぞれのモデルを評価することによって決定された後、決定されたＴＦ要素活性レベルは、細胞シグナル伝達経路、ここではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路、の活性を推測するための閾値とすることができる。このような適切な閾値を計算する好ましい方法は、不活性細胞シグナル伝達経路を有することが分かっている訓練試料の決定されたＴＦ要素活性レベルｗｌｃと、活性細胞シグナル伝達経路を持つ訓練試料とを比較することである。そのようにする、またこれらの群において分散も考慮に入れる方法は、閾値
【００５８】
【数１】
0006415712.tif 000002
を使用して与えられ、
ここで、σ及びμは訓練試料についての、決定されたＴＦ要素活性レベルｗｌｃの標準偏差及び平均値である。少数の試料しか活性及び／又は不活性訓練試料において入手できない場合には、擬似数を計算分散に、２つの群の分散の平均に基づいて加えることができる。
【００５９】
【数２】
0006415712.tif 000003
ここで、νは、群の決定されたＴＦ要素活性レベルｗｌｃの分散であり、ｘは正の擬似数、たとえば１又は１０であり、ｎａｃｔ及びｎｐａｓはそれぞれ活性試料及び不活性試料の数である。標準偏差σは、次に、分散νの平方根をとることによって得ることができる。
【００６０】
閾値は、解釈を容易にするために、決定されたＴＦ要素活性レベルｗｌｃから差し引いて、細胞シグナル伝達経路の活性スコアを得ることができ、この場合、負の値が不活性細胞シグナル伝達経路に対応し、正の値が活性細胞シグナル伝達経路に対応する。
【００６１】
上述の「単層」モデルの代替形態として、「２層」モデルもまた一例において使用することができる。このようなモデルでは、要約値がすべての標的遺伝子について、一次結合を使用して、その関連するプローブセットの測定強度に基づいて計算される（「第１の（下部）層」）。計算要約値は引き続き、別の一次結合を使用して、細胞シグナル伝達経路の他の標的遺伝子の要約値と結合される（「第２の（上部）層」）。この場合でも、重みは、訓練データ・セットから、若しくは専門的知識に基づいて、又はこれらを合わせたものに基づいて、知ることができる。別の言い方をすると、「２層」モデルにおいて、１つ又は複数の発現レベルが１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに与えられ、１つ又は複数の一次結合は、１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに対し、それぞれの標的遺伝子に与えられた１つ又は複数の発現レベルのうちの全発現レベルの第１の一次結合を含む（第１の（下部）層）。このモデルはさらに、１つ又は複数の標的遺伝子のそれぞれに重み付け項を含む別の一次結合に基づいており、各重み付け項は、それぞれの標的遺伝子の第１の一次結合に基づいている（「第２の（上部）層」）。
【００６２】
要約値の計算は、「２層」モデルの好ましいバージョンでは、訓練データを使用して各標的遺伝子の閾値を定義すること、及び計算された一次結合から閾値を差し引いて標的遺伝子要約を得ることを含む。ここで、閾値は、負の標的遺伝子要約値が下方調節標的遺伝子に対応し、正の標的遺伝子要約値が上方調節標的遺伝子に対応するように選ぶことができる。また、標的遺伝子要約値が、たとえば上述の変換（ファジー、離散など）の１つを使用して、それらが「第２の（上部）層」で結合される前に変換されるということも可能性がある。
【００６３】
ＴＦ要素の活性レベルが、「２層」モデルを評価することによって決定された後、決定されたＴＦ要素活性レベルは、上述のように、細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための閾値とすることができる。
【００６４】
以下では、上述のモデルは「（擬似）線形」モデルと総称される。確率モデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデル、の訓練及び使用についてのより詳細な説明が、以下の実施例３に提示されている。
【００６５】
実施例２  標的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）は、タンパク質複合体（すなわち、特定の構造で結合したタンパク質の複合化したもの）又はタンパク質であり、特定のＤＮＡ配列に結合することによって標的遺伝子からの転写を調節し、それによってＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝情報の転写を制御することができる。このＴＦ複合体の作用により直接産生されたｍＲＮＡは、本明細書では（転写因子の）「直接標的遺伝子」と呼ばれる。細胞シグナル伝達経路活性化によりまた、「間接標的遺伝子」と呼ばれる、さらなる第２の遺伝子転写が生じ得る。以下では、細胞シグナル伝達経路活性とｍＲＮＡレベルの間の直接連結として直接標的遺伝子を含む、又は直接標的遺伝子から成る（擬似）線形モデル又はベイジアン・ネットワーク・モデルが（例示的数学モデルとして）好ましいが、直接標的遺伝子と間接標的遺伝子の差異がいつも明らかであるとは限らない。本明細書では、スコアリング関数を使用して、利用可能な科学文献データに基づき直接標的遺伝子を選択する方法が提示される。それにもかかわらず、限られた情報並びに生物学的バリエーション及び不確実性により、間接標的遺伝子の偶発的な選択を除外することはできない。標的遺伝子を選択するために、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ」でアクセスすることができ、本明細書では別に「Ｐｕｂｍｅｄ」と呼ばれる、国立保健研究所のＭＥＤＬＩＮＥデータベースが使用されて標的遺伝子のリストが生成された。さらに、標的遺伝子の３つの追加リストが、その発現の証拠となる性質に基づいて選択された。
【００６６】
推定ＴＧＦ−β標的遺伝子を含む刊行物は、２０１３年の第４四半期及び２０１４年の第１四半期の期間に、（「ＴＧＦ−β」  ＡＮＤ  「ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ」）などの照会文を使用することによって探索された。得られた刊行物はさらに、以下で詳細に説明する方法論に従って、手作業で解析された。
【００６７】
特定の細胞シグナル伝達経路ｍＲＮＡ標的遺伝子が科学文献から、ランキング・システムを使用することによって選択され、特定の標的遺伝子の科学的証拠が、証拠が累積された科学実験のタイプに応じて格付けされた。一部の実験的証拠は、たとえば、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が活性であることが分かっている細胞株のマイクロアレイ上で、増加するプローブセットの強度によって検出される増加するｍＲＮＡのように、遺伝子が直接標的遺伝子であることを単に示唆するにすぎないが、別の証拠は、同定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路ＴＦ結合部位と、細胞内の特定の細胞シグナル伝達経路の刺激後のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにおけるこの部位の検索と、細胞株における細胞シグナル伝達経路の特定の刺激後のｍＲＮＡの増加とを合わせたもののように、非常に強力になり得る。
【００６８】
特定の細胞シグナル伝達経路標的遺伝子を見つける実験のいくつかのタイプを科学文献で特定することができる。
１．対象の細胞シグナル伝達経路のＴＦがゲノム上のその結合部位に直接結合することが示される、ＣｈＩＰ実験。例として、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）技術を引き続き使用することによって、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の、たとえばＴＧＦ−βを用いた刺激による、活性誘導がある細胞株とない細胞株のＤＮＡの推定機能ＴＧＦ−β  ＴＦ結合部位が、純粋にヌクレオチド配列に基づいて認識された結合部位のサブセットとして同定された。推定機能が、ＴＦがＤＮＡ結合部位に結合することが見出されたというＣｈＩＰ由来の証拠として同定された。
２．結合配列を含むＤＮＡの断片へのＴＦの結合を生体外で示す電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイ。ＣｈＩＰによる証拠と比較して、ＥＭＳＡによる証拠は、それを生体外状況に変換することができないので、あまり強力ではない。
３．細胞シグナル伝達経路を刺激すること、及びｍＲＮＡ発現を、マイクロアレイ、ＲＮＡ配列決定、定量ＰＣＲ又は他の技法を使用して測定すること、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路誘導性細胞株を使用すること、及び誘導後の少なくとも１つの時点、しかし好ましくはいくつかの時点で測定されたｍＲＮＡプロファイルを、タンパク質への翻訳を阻害するシクロヘキシミドの存在下で測定すること。したがって誘導されたｍＲＮＡは直接標的遺伝子であると考えられる。
４．３と同様であるが、別法として、ｍＲＮＡ発現をさらに下流で、ウエスタンブロット法などのタンパク質存在量測定法を用いて測定する。
５．バイオ・インフォマティクス手法を使用してゲノム内のＴＦ結合部位を同定すること。ＴＧＦ−β  ＴＦ要素の例として、ＳＭＡＤ結合モチーフ５’−ＡＧＡＣ−３’を使用して、ヒトゲノム配列に対しソフトウェア・プログラムが実行され、潜在的な結合部位が、遺伝子プロモータ領域でも他の遺伝子領域でも同定された。
６．３と同様であるが、ただシクロヘキシミドがない状態で。
７．４と同様であるが、ただシクロヘキシミドがない状態で。
【００６９】
最も単純な形で、遺伝子が転写因子のＴＧＦ−βファミリーの標的遺伝子であると同定されたこれらの実験的手法のそれぞれについて、すべての潜在的遺伝子に１ポイントを与えることができる。この相対的なランキング方策を使用して、最も信頼できる標的遺伝子のリストを作ることができる。
【００７０】
或いは別の方法のランキングを使用して、生体外直接標的遺伝子に最も多くの証拠をもたらす技術により多くのポイント数を与えることによって、直接標的遺伝子である可能性が最も高い標的遺伝子を同定することができる。上記のリストでは、これは、実験手法１）では８ポイント、２）では７ポイントになり、実験手法８）では１ポイントまで下がっていくということになる。このようなリストは、「一般的な標的遺伝子リスト」と呼ぶことができる。
【００７１】
生物学的バリエーション及び不確実性にもかかわらず、本発明者らは、直接標的遺伝子が、組織に依存せずに誘導される可能性が最も高いと仮定した。これらの標的遺伝子のリストは「標的遺伝子の証拠精選リスト」と呼ぶことができる。このような標的遺伝子の証拠精選リストを使用して、様々な組織源から来る試料に適用できるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の計算モデルを構築した。
【００７２】
以下では、どのようにして証拠精選標的遺伝子リストの選択がＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路について具体的に構築されたかを例示的に示す。
【００７３】
刊行物で報告された、ＣｈＩＰ、ＥＭＳＡ、差次的発現、ノックダウン／アウト、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイ、配列解析などの実験的証拠のタイプごとにポイントを与えるスコアリング関数が導入された。同一の実験的証拠が場合により複数の刊行物に記載されていて、その結果、対応するポイント数が得られ、たとえば、２つの刊行物が１つのＣｈＩＰ結果について述べていると、単一のＣｈＩＰ結果に与えられるスコアの２倍になる。さらなる解析が行われて、１つのタイプの実験的証拠しかない、たとえば差次的発現ではなく、多様なタイプの実験的証拠がある遺伝子だけが認められた。利用可能な複数のタイプの実験的証拠があるこれらの遺伝子が選択された（表１に示す）。
【００７４】
標的遺伝子の証拠精選リスト（表２に列挙）の別の選択が、本発明者らによって行われた。訓練試料からＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性を決定する上でより証拠となることが判明した証拠精選リストの標的遺伝子が選択された。ここでは、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで４時間刺激されたＧＳＥ１７７０８からの試料が、活性又は腫瘍促進ＴＧＦ−β活性として選択されたのに対し、非刺激試料は、訓練のための非活性又は腫瘍抑制ＴＧＦ−β試料として選択された。別法として、ＴＧＦ−βで刺激され、それが取り除かれた一次細胞又は他の細胞株の患者試料、たとえばＧＳＥ６６５３、ＧＳＥ４２３７３及びＧＳＥ１８６７０を使用することもできる。負に制御された標的遺伝子に対し２を超える、又は０．５未満の、活性と不活性の訓練試料の間の「軟」オッズ比（下記参照）を有するすべての標的遺伝子が、「２０標的遺伝子ショートリスト」に選ばれた。１０を超える、又は０．１未満の「軟」オッズ比を有することが判明した標的遺伝子が、「１２標的遺伝子ショートリスト」に選ばれる（表３参照）。「７標的遺伝子ショートリスト」（表４参照）は、１５を超える、又は１／１５未満の「軟」オッズ比を有することが判明した標的遺伝子から成る。これら２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリストは、それぞれ表５から表７に示されている。
【００７５】
【表１】
0006415712.tif 000004
【００７６】
【表２】
0006415712.tif 000005
【００７７】
【表３】
0006415712.tif 000006
【００７８】
【表４】
0006415712.tif 000007
【００７９】
実施例３  数学モデルの訓練及び使用
数学モデルを使用して対象の細胞シグナル伝達経路の、本明細書ではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の、活性を推測することができるようにするには、モデルが適切に訓練されなければならない。
【００８０】
数学経路モデルが、ＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルに関連する条件付き確率と、対象の試料で測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルとに基づく、確率的なモデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデルである場合、訓練は、好ましくは、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に詳細に記載されているように実施することができる。
【００８１】
数学経路モデルが、対象の試料で測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の一次結合に基づいている場合、訓練は、公開された国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２号（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）に詳細に記載されているように実施することができる。
【００８２】
本明細書では、図２に示された例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルが使用されて、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の転写プログラムが簡単にモデル化された。モデルは、３つのタイプのノードから成る。すなわち、（ａ）第１の層１としての転写因子（ＴＦ）要素（状態「不在」及び「存在」で）、（ｂ）第２の層２としての標的遺伝子ＴＧ１、ＴＧ２、ＴＧｎ（状態「上」及び「下」で）、並びに（ｃ）第３の層３としての標的遺伝子の発現レベルと関連付けられた測定ノード、である。これらは、本明細書で以前に用いられたように、マイクロアレイプローブセットＰＳ１，１、ＰＳ１，２、ＰＳ１，３、ＰＳ２，１、ＰＳｎ，１、ＰＳｎ，ｍ（状態「低」及び「高」で）とすることができるが、ＲＮＡｓｅｑ又はＲＴ−ｑＰＣＲなどの他の遺伝子発現測定値とすることもできる。
【００８３】
数学モデルの、本明細書では例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルの、適切な実施態様はマイクロアレイ・データに基づいている。このモデルは、（ｉ）標的遺伝子の発現レベルがどのようにＴＦ要素の活性化に依存するか、及び（ｉｉ）プローブセット強度が、ひいては、どのようにそれぞれの標的遺伝子の発現レベルに依存するか、について記述する。後者については、プローブセット強度は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ，  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ｗｗｗ．  ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）から広範に入手可能である、ｆＲＭＡ事前処理アフィメトリクスＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイにより取得することができる。
【００８４】
例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルは細胞シグナル伝達経路の、本明細書ではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の、生物学の単純化であるので、また生物学的測定には一般にノイズが伴うので、確率論的アプローチが選択される。すなわち、（ｉ）ＴＦ要素と標的遺伝子、及び（ｉｉ）標的遺伝子とそれらの各プローブセット、の間の関係が確率論的用語で記述される。さらに、腫瘍増殖を促進する癌化細胞シグナル伝達経路の活性は、一時的及び動的に変化するのではなく、長期に、さらには不可逆的にも変化すると仮定された。したがって、例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルは、静的細胞状態の解釈のために開発された。この理由のために、複雑な動的細胞シグナル伝達経路特性はモデルに組み込まれなかった。
【００８５】
例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルが構築され較正されると（下記参照）、モデルは、第３の層３における観察結果としてのプローブセット測定値を入力することによって、またＴＦ要素が「存在」する確率がどうなるはずであったかをモデルで逆に推測することによって、新しい試料のマイクロアレイ・データに対して使用することができる。ここで、「存在」とは、ＴＦ要素がＤＮＡに結合し、細胞シグナル伝達経路の標的遺伝子の転写を制御している現象であると考えられ、「不在」とはＴＦエレメントが転写を制御していない場合であると考えられる。したがって、この確率は、細胞シグナル伝達経路の、本明細書ではＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の、活性を示すために使用できる一次読み出しであり、これは次に、活性であることと不活性であることの確率の比をとることによって、細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズに変換することができる（すなわち、オッズはｐ／（１−ｐ）で与えられ、ｐは細胞シグナル伝達経路が活性であることの予測確率である）。
【００８６】
例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルでは、確率論的関係が、定量的な確率的推論を可能にするために定量的になっている。組織型全体にわたって一般化挙動を改善するために、（ｉ）ＴＦ要素と標的遺伝子、の間の確率論的関係を記述するパラメータが慎重に精選された。ＴＦ要素が「不在」である場合、標的遺伝子は「下」になる可能性が最も高く、したがって、これには０．９５の確率が選ばれ、標的遺伝子が「上」になることには０．０５の確率が選ばれる。後者（非ゼロ）の確率は、標的遺伝子が他の因子によって調節される、又は（たとえば測定ノイズの故に）偶発的に「上」であると観察される（まれな）可能性に相当するものである。ＴＦ要素が「存在」する場合、０．７０の確率で標的遺伝子は「上」と考えられ、０．３０の確率で標的遺伝子は「下」と考えられる。後者の値は、ＴＦ要素が存在しても標的遺伝子が高度に発現しないいくつかの原因があり得るので、たとえば、遺伝子のプロモータ領域がメチル化されるので、このように選ばれる。標的遺伝子がＴＦ要素によって上には調節されないが下には調節される場合には、確率は同じようにして選ばれるが、ＴＦ要素が存在することに対し下方調節を反映する。（ｉｉ）標的遺伝子とそれらの各プローブセット、の間の関係を記述するパラメータは、実験データに対して較正された。後者に関して、この例では、活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路があることが知られている患者試料からのマイクロアレイ・データが使用されたのに対し、同じデータセットの正常で健康な試料が不活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路試料として使用されたが、これはまた、細胞株実験結果、又は既知の細胞シグナル伝達経路活性状態の他の患者試料を使用して行うこともできる。得られた条件付き確率表を以下に示す。
【００８７】
【表５】
0006415712.tif 000008
【００８８】
これらの表では、変数ＡＬｉ，ｊ、ＡＨｉ，ｊ、ＰＬｉ，ｊ、及びＰＨｉ，ｊは、「低」（Ｌ）又は「高」（Ｈ）プローブセット強度をそれぞれ有する「不在」（Ａ）又は「存在」（Ｐ）転写複合体がある較正試料の数を示す。０及び１の極端な確率を回避するために、ダミー数が加えられた。
【００８９】
観測されたプローブセット強度を離散化するために、各プローブセットＰＳｉ，ｊに対し閾値ｔｉ，ｊが使用され、これに満たない観察値は「低」と呼ばれ、これを超える観察値は「高」と呼ばれる。この閾値は、使用された較正データセット中のプローブセットの（重み付け）中心強度になるように選ばれた。マイクロアレイ・データにノイズが伴うことにより、ファジー法が、観察プローブセット強度をその閾値と比較するときに、報告強度まわりで０．２５（ｌｏｇ２スケールで）の標準偏差による正規分布を仮定することによって、また閾値の下及び上の確率質量を決定することによって、使用された。
【００９０】
上述の例示的なベイジアン・ネットワークの代わりに上記実施例１で記載された（擬似）線形モデルが使用された場合には、モデルを使用して試験試料の細胞シグナル伝達経路活性を推測できるようにするには、ノードと、ノードが「不在」であるか、それとも「存在」すると呼ぶための閾値との間の相関性の符号及び大きさを示す重みが決定される必要がある。専門的知識を用いてこれらの重み及び閾値を先験的に埋めることができるが、一般には、モデルは訓練試料の代表的な組を使用して訓練され、その好ましくはグランド・トルースが、たとえば、既知の「存在」転写因子複合体（＝活性細胞シグナル伝達経路）又は「不在」転写因子複合体（＝不活性細胞シグナル伝達経路）を有する試料中のプローブセットの発現データが、知られている。
【００９１】
当分野では、モデル・トポロジを考慮に入れる、またモデル・パラメータ、ここでは重み及び閾値を、モデル出力、ここでは重み付け線形スコアが最適になるように変更する、多数の訓練アルゴリズム（たとえば、回帰）が知られている。或いは、観察された発現レベルから直接重みを計算することも、最適化アルゴリズムを必要とせずに、可能である。
【００９２】
第１の方法、本明細書では「白黒」法という名称、は煎じ詰めると３進法であり、各重みは組｛−１，０，１｝のうちの１つの要素になる。これが生物学的文脈において言われる場合には、−１及び１が、細胞シグナル伝達経路活性の場合にそれぞれ下方及び上方調節される標的遺伝子又はプローブセットに対応する。プローブセット又は標的遺伝子が上方調節されるか、又は下方調節されるか統計的に証明され得ない場合には、プローブセット又は標的遺伝子は０の重みを受け取る。１つの例では、左側及び右側の、活性細胞シグナル伝達経路試料の発現レベル対不活性細胞シグナル伝達経路を有する試料の発現レベル、の２試料ｔ検定を用いて、プローブ又は遺伝子が上方調節されるか、それとも下方調節されるかを、使用された訓練データを前提として判定することができる。活性試料の平均が不活性試料よりも統計的に大きい、すなわち、ｐ値が特定の閾値、たとえば０．３未満である場合、標的遺伝子又はプローブセットは、上方調節されると判定される。逆に活性試料の平均が不活性試料よりも統計的に小さい場合には、標的遺伝子又はプローブセットは、細胞シグナル伝達経路が活性化すると下方調節される、と判定される。最低ｐ値（左側又は右側）が前述の閾値を超える場合には、標的遺伝子又はプローブセットの重みは０と定義することができる。
【００９３】
本明細書で「対数オッズ」重みという名称の第２の方法は、オッズ比の対数（たとえば、底ｅ）に基づいている。各標的遺伝子又はプローブセットのオッズ比は、プローブセット／標的遺伝子レベルが対応する閾値の、たとえば全訓練試料の（重み付け）中央値の、上及び下にある正及び負の訓練試料の数に基づいて計算される。擬似数を加えて、ゼロによる割り算を回避することができる。さらなる改善点は、プローブセット／標的遺伝子レベルが、たとえば、その観察値のまわりに特定の指定された標準偏差（たとえば、２ｌｏｇスケールで０．２５）で正規分布していると仮定することによって、また閾値の上及び下の確率質量を数えることによって、閾値の上／下の試料をある程度より統計的に数えることである。本明細書では、擬似数と組み合わせて、かつ決定的な測定値の代わりに確率質量を使用して、計算されたオッズ比は「軟」オッズ比と呼ばれる。
【００９４】
標的遺伝子発現の数学モデルを用いて細胞シグナル伝達経路活性を推測することに関するこれ以上の詳細は、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．１１，２０１４年、２９３６〜２９４５頁、に見出すことができる。
【００９５】
本明細書では、５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βで処理され、その結果としてＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の腫瘍促進活性（以降、ＴＧＦ−β活性と呼ぶ）となった、及びＴＧＦ−β刺激なしのコントロール実験の結果として、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の腫瘍抑制活性（以降、ＴＧＦ−β不活性と呼ぶ）となった、ヒトＡ５４９肺腺癌細胞株試料の発現データが較正のために使用された。これらのマイクロアレイは、ＧＳＥ１７７０８のもとで遺伝子発現オムニバスから公的に利用可能である（ＧＥＯ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／、最終アクセス２０１４年３月５日）。５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βで４時間刺激された試料が、訓練のための不活性すなわち腫瘍抑制ＴＧＦ−β試料として選ばれた非刺激試料と比較された、選択遺伝子（表１）の観測された折りたたみ変化に基づいて、活性すなわち腫瘍促進ＴＧＦ−β細胞株の代表として選ばれた。別法として、ＴＧＦ−βで刺激され、それが取り除かれた一次細胞又は他の細胞株の患者試料、たとえばＧＳＥ６６５３、ＧＳＥ４２３７３及びＧＳＥ１８６７０を使用することができる。
【００９６】
図９から図１２は、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の証拠精選標的遺伝子のリスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表１〜表４参照）それぞれに基づく例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの訓練結果を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。ＴＧＦ−βで４時間刺激されたＡ５４９細胞株試料（群５）は、活性すなわち腫瘍促進の訓練試料を代表するために使用されたのに対し、刺激されていない試料（群１）は、不活性すなわち腫瘍抑制のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の代表として使用された。異なる標的遺伝子リストを使用するモデルは、不活性訓練試料を活性訓練試料と明確に区別することができた。加えて、その結果から、１時間以上のすべての刺激によりＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が、腫瘍促進活性を４つすべての標的遺伝子リストについて有することになったことを理解することができる。ＴＧＦ−βで０．５時間の刺激では、ＴＧＦ−β不活性から活性に変化するＴＧＦ−β活性が得られ、これは、比較的短いＴＧＦ−β刺激によって引き起こされる可能性がある。
【００９７】
以下では、標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリストそれぞれを使用する、訓練された例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルの検証結果が図１３から図２３で示される。
【００９８】
図１３から図１６は、ＧＳＥ２８４４８のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ−ＴＲ）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表１〜表４参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。試料の一部は、ＴＩＦγ（群５及び群６）又はＳＭＡＤ４（群３及び群４）に対しｓｉＲＮＡを形質移入され、試料の他の組はコントロールから成る（形質移入なし、群１及び群２）。群２、群４及び群６の試料は５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激され、群１、群３及び群５のものは刺激されなかった。異なる標的遺伝子リストを使用するモデルはすべて、４つすべての標的遺伝子リストについて、群２（コントロール）及び群６（ＴＩＦγ発現抑制）のＴＧＦ−β刺激試料におけるＴＧＦ−β活性の増大と、ＳＭＡＤ発現抑制試料（群４）において、対応する未刺激試料と比べて有意な増加のないこととを正しく予測した（Ｈｅｓｌｉｎｇ  Ｃ．ら、「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＭＴ  ｂｙ  ＴＩＦ１γ  ａｎｄ  ＳＭＡＤ４  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．７，２０１１、６６５〜６７２頁参照）。
【００９９】
図１７は、精漿又は５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３で刺激された、ＧＳＥ３５８３０の子宮頸部上皮細胞（Ｅｃｔ１）に対し標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。精漿はまた、高レベルのＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３を含む。しかし、これらは大部分（９５％から９９％の間）、活性形態とは反対の潜在型変異体として存在する（Ｓｈａｒｋｅｙ  Ｄ．Ｊ．ら、「ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８９，Ｎｏ．２，２０１２、１０２４〜１０３５頁参照）。第３及び第４の、すなわち４つのうち２つのＴＧＦ−β３刺激試料（群３）は、腫瘍促進ＴＧＦ−β活性に対する強い選択性を示し、他の２つの試料、すなわち第１及び第２の試料は、精液群（群２）の第３及び第４の試料によりいっそう類似していることがクラスタ解析で判明した。未刺激試料（群１）は、不活性すなわち腫瘍抑制のＴＧＦ−β活性を正しく予測するのに対し、精漿で刺激された試料は、潜在型（すなわち不活性）ＴＧＦ−βアイソフォームの割合が高いことによって、すなわちＴＧＦ−β経路の刺激が低いことによって、生じ得る中間のＴＧＦ−β活性を有することが予測された。
【０１００】
図１８は、ＧＳＥ１６０１１の患者神経膠腫に対し標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。神経膠腫は正常細胞よりも多くのＴＧＦ−β（すべてアイソフォーム）を生成することが文献により知られている（Ｋａｍｉｎｓｋａ  Ｂ．ら、「ＴＧＦ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９８６，２０１３、１７１〜１８７頁参照）。これはまた、すべてのコントロール（群３）に対して陰性である予測ＴＧＦ−β活性にも見られるが、神経膠腫（群１、２、４〜９）の約１５％に腫瘍促進ＴＧＦ−βが、これらの腫瘍におけるＴＧＦ−β分泌の増加により当然のこととして予測された。
【０１０１】
図１９は、ＧＳＥ２１６５３の乳癌試料について標的遺伝子の証拠精選リスト（表１参照）を使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。予想されるように、ほとんどの乳癌が、不活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を有すると予測された。また予測通りに、最も高い割合のＴＧＦ−β活性すなわち腫瘍促進ＴＧＦ−β活性が基礎試料中に見出された。
【０１０２】
図２０から図２３は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ及び２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されていない、ＧＳＥ４２３７３のＡ５４９肺腺癌細胞株の２次元及び３次元培養に対し標的遺伝子の証拠精選リスト、２０標的遺伝子ショートリスト、１２標的遺伝子ショートリスト、及び７標的遺伝子ショートリスト（表１〜表４参照）をそれぞれ使用する、訓練された例示的ベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。Ｃｉｅｓｌｉｋらの「Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ」、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，２０１３は、これらの実験において、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が効率的に３次元培養モデルにおいて誘導されることを示している。これはまた、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測でも示されている。というのは、この群（群４）からの両試料だけが、ＥＭＴを引き起こすことが知られている腫瘍促進ＴＧＦ−β活性によって予測される試料であるからである。刺激なしの２次元培養のコントロール群（群１）は、ＴＧＦ−β活性がないことが正しく予測されたのに対し、刺激された２次元培養（群２）は明らかに、ＴＧＦ−β腫瘍促進活性を惹起することができず（ＥＭＴなし）、これもまたＣｉｅｓｌｉｋらによって見出された。未刺激３次元培養試料（群３）もまた、不活性なＴＧＦ−β活性を有することが予測されるが、オッズは非常に小さい。
【０１０３】
図２４は、カプラン・マイヤー・グラフで表された、２８４人の神経膠腫患者（ＧＳＥ１６０１１、図１８も参照）の全体生存期間を示す。図で垂直軸は全体生存期間を患者群の割合として示し、水平軸は年単位の時間を示す。グラフは、腫瘍抑制ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路（ＴＧＦ−β不活性、点線）が全体生存期間に関し保護的であるのに対し、腫瘍促進ＴＧＦ−β経路を有することが、著しく高い死亡リスク（傾斜の急峻な曲線で示されている）と関連していることを示す（予測活性ＴＧＦ−β  ＴＦ要素を有する患者群が３７人の患者から成っていたのに対し（実線）、予測不活性ＴＧＦ−β  ＴＦ要素を有する患者群は２３５人の患者から成っていた（点線））。ＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルの予後値はまた、ＴＧＦ−β活性の予測確率のハザード比２．１７（９５％ＣＩが１．４４〜３．２８、ｐ＝１．２２ｅ−４）、及び中央生存期間でも示され、中央生存期間は、腫瘍抑制ＴＧＦ−β患者の１．３４年に対して腫瘍促進ＴＧＦ−β活性患者では０．７年である。
【０１０４】
図２５は、１１６９人の乳癌患者のコホート（ＧＳＥ６５３２、ＧＳＥ９１９５、Ｅ−ＭＴＡＢ−３６５、ＧＳＥ２０６８５及びＧＳＥ２１６５３、上記の図１３も参照）の、カプラン・マイヤー・グラフで表された無病生存期間を示す。図で垂直軸は全体生存期間を患者群の割合として示し、水平軸は月単位の時間を示す。グラフは、腫瘍抑制ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路（ＴＧＦ−β不活性、点線）が、無病生存期間に関し保護的であるのに対し、腫瘍促進ＴＧＦ−β経路を有することが、著しく高い疾患再発のリスク（傾斜の急峻な曲線で示されている）と関連していることを示す（予測活性ＴＧＦ−β  ＴＦ要素を有する患者群が１０３人の患者から成っていたのに対し（実線）、予測不活性ＴＧＦ−β  ＴＦ要素を有する患者群は１０６６人の患者から成っていた（点線））。ＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルの予後値はまた、ＴＧＦ−β活性の予測確率のハザード比３．６６（９５％ＣＩが２．３７〜５．３３、ｐ＝４．０ｅ−１０）、及び７５％生存期間でも示され、７５％生存期間は、腫瘍抑制ＴＧＦ−β患者の６．４年に対して腫瘍促進ＴＧＦ−β活性患者では２．３年である。
【０１０５】
較正済み数学モデル、たとえば例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルを、マイクロアレイ又はＲＮＡ配列決定から来るｍＲＮＡ入力データに適用する代わりに、たとえば、ｑＰＣＲを使用して標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定するための集積化プラットフォーム上で試料測定を行う専用のアッセイを開発することが、臨床応用において有益であり得る。次に、開示された標的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡ配列を使用して、どのプライマー及びプローブをこのようなプラットフォーム上で選択すべきかを決定することができる。
【０１０６】
このような専用アッセイの検証は、マイクロアレイ・ベースの数学モデルを参照モデルとして使用し、開発されたアッセイが検証試料の組に対して同様の結果を与えるかどうかを検証することによって行うことができる。専用アッセイに次いで、この検証はまた、ＲＮＡ配列決定データを入力測定値として使用する同様の数学モデルを構築及び較正するのに行うこともできる。
【０１０７】
特定の細胞シグナル伝達経路活性を最善に示すことが、較正済み数学モデル、たとえば、例示的なベイジアン・モデルを使用するマイクロアレイ／ＲＮＡ配列決定ベースの調査に基づいて分かっている標的遺伝子の組、たとえば表１から表４、表６、表８及び表９は、対象の試料において、かつ／又はＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、及び／又は発現測定値を解釈するためのコンピュータにおいて実施されるべき、定量的多重ＰＣＲアッセイに翻訳することができる。細胞シグナル伝達経路活性のこのような検査（たとえば、中央サービス検査所におけるＦＤＡ承認検査又はＣＬＩＡ省略検査、又は研究利用のためだけの研究所開発検査）を開発するには、標準化検査キットの開発が必要とされ、このキットは、規制上の承認を得るために臨床試験で臨床的に検証される必要がある。
【０１０８】
本発明は、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、デジタル処理デバイスによって実行されるコンピュータ実装方法に関連する。この推測は、対象の試料において測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルに基づく。本発明はさらに、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、上記の方法を実行するように構成されたデジタル・プロセッサを備える装置と、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、上記の方法を実行するようにデジタル処理デバイスによって実行可能である命令を記憶する、非一時的記憶媒体と、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するための、デジタル処理デバイスで実行されたときにデジタル処理デバイスに上記の方法を実行させるプログラム・コード手段を含む、コンピュータ・プログラムとに関する。
【０１０９】
この方法は、たとえば、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の（異常な）活性の診断に、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく予後に、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推測活性に基づく、臨床治験における対象の登録に、実施されるべき次の検査の選択に、コンパニオン診断検査の選択に、臨床判断支援システムに、又は同様のものに、用いることができる。この点について参照されるのは、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）、及びＶｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．１１，２０１４年、２９３６〜２９４５頁であり、これらの適用例を詳細に記載している。
【０１１０】
実施例４  証拠精選リストと広範な文献リストとの比較
文献証拠に基づき本明細書に記載の手順に従って構築されたＴＧＦ−β標的遺伝子のリスト（「標的遺伝子の証拠精選リスト」、表１参照）がここで、上述の手順に従わずに構築された推定ＴＧＦ−β標的遺伝子の「広範な文献リスト」と比較される。代替リストは、Ｔｈｏｍｓｏｎ−ＲｅｕｔｅｒｓのＭｅｔａｃｏｒｅ（最終アクセス２０１３年５月１４日）の中に提示されている、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性に対応するものとされる遺伝子をまとめたものである。このデータベースは、ＳＭＡＤタンパク質、すなわち、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８から成るファミリーの下流で直接転写調節される遺伝子に関して照会された。この照会の結果、２１７個の固有遺伝子が得られた。さらなる選択が、ＳＭＡＤファミリーによるそれぞれの遺伝子の転写調節とされるものを支持する公開参考文書の数に基づいて行われた。３つ以上の参照文書がある遺伝子が広範な文献リストに選ばれた。言い換えると、実験的証拠に基づいた、人手による参照文書の精選及び証拠スコア計算は行われなかった。この手順の結果として６１個の遺伝子が得られ、そのうち、１つのマイクロＲＮＡ（ＭＩＲ２９Ｂ２）がアフィメトリクス  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイ・プラットフォーム上で利用可能ではなく、また１つの遺伝子（ＢＧＬＡＰ）は、アフィメトリクス  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイ・プラットフォーム上でＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプラグインによって利用可能なプローブセットがあることが判明しなかった。結局、５９個の推定ＴＧＦ−β標的遺伝子ということになり、これらは表５に、アフィメトリクス  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイ・プラットフォーム上の関連プローブセットと共に示されている。
【０１１１】
【表６】
0006415712.tif 000009
【０１１２】
引き続き、例示的なベイジアン・ネットワーク・モデルが、本明細書で説明された手順を用いて構築された。証拠精選リストに基づくＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路モデルについての説明と同様に、プローブセットと、そのそれぞれの、広範な文献リストを含むこのモデルの推定ＴＧＦ−β標的遺伝子との間の各端の条件付き確率表は、ＧＳＥ１７７０８からのｆＲＭＡ処理データを用いて訓練された。図２６に表された訓練結果は、不活性（群１）と活性（群５）の訓練試料間の明確な分別を示す。証拠精選リストに基づくベイジアン・モデルの訓練結果と比べて、より極端な経路活性の値が、特に群２及び群３において見出される（図９〜図１２参照）。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。
【０１１３】
次に、広範な文献リストに基づく訓練された例示的ネットワーク・ベイジアン・モデルが、いくつかのデータセットについて検査された。
【０１１４】
図２７は、ＧＳＥ１６０１１の患者神経膠腫の広範な文献リストに基づく、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表す。神経膠腫が正常細胞よりも多くのＴＧＦ−β（すべてアイソフォーム）を生成することは文献から知られているが（Ｋａｍｉｎｓｋａ  Ｂ．ら、「ＴＧＦ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９８６，２０１３、１７１〜１８７頁参照）、多形神経膠芽腫（グレードＩＶ）患者（群４）の大部分（＞５０％）が明らかに、活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を有する腫瘍の数が過剰評価になっている。一方で、すべてのコントロール（群３）のＴＧＦ−β腫瘍促進活性は、陰性であると正しく予測されている。
【０１１５】
図２８は、ＧＳＥ２１６５３の乳癌試料の広範な文献リストに基づく、訓練されたベイジアン・ネットワーク・モデルのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を示す。図で垂直軸は、ＴＦ要素がそれぞれ「存在する」と「不在である」のオッズを示し、これは、それぞれ活性であるものと不活性であるものとのＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に対応し、水平軸の上の値は、「存在する」／活性である可能性がより高いＴＦ要素に対応し、水平軸の下の値は、ＴＦ要素が「不在である」／不活性であるオッズが、「存在する」／活性であるオッズよりも大きいことを示す。各バーは、データセットからの試料を表した。予想外にほとんどの乳癌試料が、腫瘍促進ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路を有すると予測された。加えて、腫瘍促進ＴＧＦ−β活性を有する患者試料の割合が最も高いのは、管腔Ａサブタイプであることが判明した。管腔Ａは、様々な乳癌サブタイプの中で予後が最良であることが知られており、このことはＴＧＦ−β腫瘍促進活性の攻撃性とは合致しない。
【０１１６】
実施例５  真のＴＧＦ−β標的遺伝子としてのＳＥＲＰＩＮＥ１の選択
ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路に関し利用可能な文献証拠の改訂が２０１５年１月に、２０１５年１月１９日までの新しい科学論文もすべて含めて行われた。同様に、刊行物が、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ」でアクセスできる国立保健研究所のＭＥＤＬＩＮＥデータベースを、（「ＴＧＦ−β」  ＡＮＤ  「ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ」）などの照会文を用いながら、使用して見出された。ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の推定標的遺伝子であるいくつかの標的遺伝子の実験的証拠を求めて、科学論文を上記の実施例２に記載の方法論を用いて手作業で評価した後に、２０１３年の第４四半期及び２０１４年の第１四半期の間の初期評価では活用されなかった、いくつかの推定ＴＧＦ−β標的遺伝子が見出された。すべての利用可能な実験的証拠が再評価され、推定標的遺伝子の新しい順位付けが、推定標的遺伝子それぞれについての利用可能な実験的証拠の強さに基づいて、実施例２に記載の方法論を用いて用意された。この結果、１つの追加推定ＴＧＦ−β標的遺伝子、すなわちＳＥＲＰＩＮＥ１が得られ、設定閾値を超える実験的証拠スコアを得た。その結果、ＳＥＲＰＩＮＥ１がＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の真の直接標的遺伝子であると見なされ、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性の推測の改善があるか検査された。
【０１１７】
１１個の最高順位付け標的遺伝子、すなわちＡＮＧＰＴＬ４、ＣＤＣ４２ＥＰ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＴＧＦ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、ＳＫＩＬ、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ２及びＶＥＧＦＡに、上記実施例３に記載のものと同じデータ及び方法論を用いて訓練されている新たに選択されたＳＥＲＰＩＮＥ１が加えられ、又は差し引かれたものに基づいた２つのベイジアン・ネットワークを使用し、その結果として、「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」（表６参照）及び「１１標的遺伝子リスト」（表７参照）がそれぞれ得られた。
【０１１８】
【表７】
0006415712.tif 000010
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
ＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子を追加して含むことに基づいて、標的遺伝子リスト（表２及び表４参照）は、表８及び表９に記載の、追加の非限定的実施形態に改定することができる。
【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
１つ又は複数の標的遺伝子を経路活性レベルの数学的推測に含めることが経路活性レベルの予測に及ぼす影響は小さいと予想され、その影響は、経路活性レベルが細かく増減するものと予期される。しかし、この予期される影響に加えて、著しく異なる経路活性レベルがいくつかの例にあることが判明しており、これは、予想外の有利な影響を経路活性推測に及ぼすＳＥＲＰＩＮＥ１によってしか説明することができない。
【０１２４】
図２９及び図３０は、精漿若しくは５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３で刺激された、又は刺激されないＥｃｔ１細胞株の、ＧＳＥ３５８３０の両モデルを使用するＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性の予測を示す。ＳＥＲＰＩＮＥ１を追加標的遺伝子として含むことにより、不活性試料を検出するモデルの能力が高い精度で改善することが明確に見てとれる。さらに、精漿で刺激された第２の群と、ＴＧＦ−β３で刺激された第３の群とのモデル予測は、それがＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の高い活性を予測するものであるため、より正確である。
【０１２５】
改善したＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測の第２の例は、ＴＮＦ及びＴＧＦ−βで刺激された、又は刺激されない、２Ｄ及び３Ｄ培養で増殖させたＡ５４９肺腺癌細胞株試料において見出される。「１１標的遺伝子リスト」ベイジアン・ネットワーク・モデルと「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１」ベイジアン・ネットワーク・モデルの両方を使用するモデル予測が、図３１及び図３２に示されている。ＥＭＴが、刺激があった３Ｄ培養モデルにおいてのみ効率的に誘発された（群４）。このＥＭＴの誘発は、「１１標的遺伝子リスト」モデルと比べると、「１１標的遺伝子リスト＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」モデルにおいて、また群３と群４の相対的差異が考察される場合にも、高い精度で診断される。
【０１２６】
第３の例は、ＧＳＥ１６０１１の神経膠腫患者といくつかのコントロール試料の両モデルを使用するＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測である。ＴＧＦ−βシグナル伝達が神経膠腫において重要な役割を果たすことが文献により知られている（Ｂ．Ｋａｍｉｎｓｋａらの「ＴＧＦ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９８６，２０１３、１７１〜１８７頁参照）。ＴＧＦ−β標的遺伝子の「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」に基づくベイジアン・ネットワークは、「１１標的遺伝子」ベイジアン・ネットワークと比べて、活性試料からの不活性試料の分離を改善する。加えて、高い割合の患者に活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路があると予測され、これは、科学的コンセンサスにいっそう即している（たとえば、Ｋａｍｉｎｓｋａら参照）。さらに、正常な脳試料には不活性ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が高い確率であることが予測され、これは、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路がその腫瘍抑制の役又は不活性の役にあると予想されることと合致する。
【０１２７】
改善されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性予測を、数学経路モデルにＳＥＲＰＩＮＥ１を含めることによって実証する最後の例は、ＧＳＥ１６０１１の２８４人の神経膠腫患者についてのコックスの回帰解析の結果を、ベイジアン・ネットワーク・モデルを使用して、ＴＧＦ−β標的遺伝子の「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」及び標的遺伝子の「１１標的遺伝子リスト」に基づいて比較することによって示される。図３３及び図３４に示されるように、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性の確率のハザード比は、ＴＧＦ−β標的遺伝子の「１１標的遺伝子＋ＳＥＲＰＩＮＥ１リスト」が使用される場合に有意に高くなり、２．５７、ｐ＝７．８７ｅ−１０対２．３３、ｐ＝３．０６ｅ−７である。
【０１２８】
実施例６  本発明を説明するためのさらなる情報
（１）遺伝子発現のレベルの測定
本発明に記載の標的遺伝子の固有の組から導出されたデータが、本明細書に記載の方法を用いてＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するために、さらに利用される。
【０１２９】
取り出された試料における遺伝子発現レベルを解析する方法は、広く知られている。たとえば、ノーザン・ブロット法、ＰＣＲの使用、ネステッドＰＣＲ、定量的リアル・タイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、又はマイクロアレイなどの方法はすべて、遺伝子発現レベル・データを導出するのに使用することができる。当技術分野で知られている、標的遺伝子の遺伝子発現を解析するためのすべての方法が本明細書では企図されている。
【０１３０】
遺伝子の発現産物をＰＣＲベースの方法を用いて決定する方法が特に使用され得る。遺伝子発現のレベルをＰＣＲの使用により定量化するために、対象の各ＰＣＲ産物の量が通常は、従来の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して推定されて、ＰＣＲ産物の蓄積が、増幅の各サイクル後にリアル・タイムで測定される。これには通常、挿入色素、副溝結合色素、又は蛍光発生プローブなどの検出可能レポーターを利用し、それによって、光を当てるとレポーターが励起されて蛍光を発生させ、発生させた蛍光が通常は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７１３，２９７号に開示されているものなどの、ＣＣＤカメラ又は光増倍管検出システムを使用して検出される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイにおいてＰＣＲ産物の検出に使用されるプローブは、蛍光マーカーを含み得る。多数の蛍光マーカーが市販されている。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）は、多種多様な蛍光色素を販売している。非限定的な例には、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、及びＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）が含まれる。付加的な蛍光マーカーには、ＩＤＴ  ＺＥＮ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｑｕｅｎｃｈｅｄ  Ｐｒｏｂｅが、ｑＰＣＲアッセイにおける従来の５’加水分解プローブと共に含まれ得る。これらのプローブは、たとえば、５’ＦＡＭ色素を３’ＴＡＭＲＡ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、３’Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ，Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又は内部ＺＥＮ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ及び３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＩＢＦＱ）と共に含有し得る。
【０１３２】
本発明によると有用な蛍光色素は、当技術分野でよく知られている方法を用いて、オリゴヌクレオチド・プライマーに付着させることができる。たとえば、蛍光標識をオリゴヌクレオチドに付加するための１つの一般的な方法は、色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）エステルを標的上の反応性アミノ基と反応させるものである。ヌクレオチドは、たとえば核酸塩基上にアリルアミン基を含むことによって、反応性アミノ基を保有するように修飾することができる。アリルアミンによる標識は、たとえば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７６，９２８号及び第５，９５８，６９１号に記載されている。蛍光でヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを標識する他の手段は、当業者によく知られている。
【０１３３】
他の蛍光発生の手法には、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ色素などの遺伝子検出系の使用が含まれ、これは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４３６，１３４号及び第５，６５８，７５１号に開示されているように、任意の遺伝子発現産物からの増幅ＤＮＡとインターカレートされると蛍光を発生させる。
【０１３４】
標的遺伝子発現レベルを決定するための別の有効な方法には、異なる生理学的条件間の遺伝子発現レベル差、又は発生中若しくは疾患進行の間に起こる変化を含めてトランスクリプトーム解析に使用される強力な解析ツールである、ＲＮＡ−ｓｅｑが含まれる。
【０１３５】
遺伝子発現レベルを決定するための別の手法には、マイクロアレイ、たとえばＲＮＡ及びＤＮＡマイクロアレイを使用することが含まれ、これは当技術分野でよく知られている。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現を同時に定量化するのに使用することができる。
【０１３６】
（２）ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達の活性を決定するための一般化されたワークフロー
ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達の活性を対象から分離された試料により推測するプロセスを例示的に図示する流れ図が、図３に示されている。第一に、試料からｍＲＮＡが分離される（１１）。第二に、本明細書に記載のように、少なくとも３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子から成る固有の組のｍＲＮＡ発現レベルが、当技術分野で知られている遺伝子発現を測定する方法を使用して測定される（１２）。次に、ＴＧＦ−β転写因子（ＴＦ）要素の活性レベルが、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルをＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルに関係付ける較正済み数学経路モデル（１４）を使用して決定される（１３）。最後に、対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性が、対象の試料におけるＴＧＦ−ＴＦ要素の決定された活性レベルに基づいて推測される（１５）。たとえば、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路は、その活性が特定の閾値を超える場合に活性であると判定され、活性が特定の閾値未満になる場合には不活性として分類することができる。
【０１３７】
（３）較正済み数学経路モデル
本明細書で企図されているように、本明細書に記載の３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の固有の組の発現レベルが、本明細書でさらに説明される較正済み数学経路モデルを使用してＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルを決定するために、使用される。較正済み数学経路モデルは、３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルをＴＧＦ−β  ＴＦ要素の活性レベルと関係付ける。
【０１３８】
本明細書で企図されているように、較正済み数学経路モデルは数学経路モデルを適用することに基づいている。たとえば、較正済み数学経路モデルは、確率モデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデル、又は線形若しくは擬似線形モデルに基づくことができる。
【０１３９】
一実施形態では、較正済み数学経路モデルは、ＴＧＦ−β  ＴＦ要素と３つ以上のＴＧＦ−β標的遺伝子の発現レベルとを結び付ける条件付き確率関係を組み込む確率モデルである。一実施形態では、確率モデルはベイジアン・ネットワーク・モデルである。
【０１４０】
一代替実施形態では、較正済み数学経路モデルは、線形又は擬似線形モデルとすることができる。一実施形態では、線形又は擬似線形モデルは、本明細書でさらに説明される線形又は擬似線形結合モデルである。
【０１４１】
較正済み数学経路モデルを生成するプロセスを例示的に示す流れ図が図４に示されている。最初のステップとして、ｍＲＮＡ発現レベルの訓練データが集められ正規化される。このデータは、たとえば、マイクロアレイ・プローブセット強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲ  Ｃｑ値（１０２）、生ＲＮＡｓｅｑリード（１０３）、又は当技術分野で知られている代替測定様式（１０４）を使用して集めることができる。次に、生発現レベル・データは、方法ごとにそれぞれ正規化することが、正規化アルゴリズム、たとえば凍結ロバスト軍分析（ｆＲＭＡ）又はＭＡＳ５．０（１１１）、参照遺伝子の平均Ｃｑに対する正規化（１１２）、１００万マッピング・リード当たり転写キロベース当たりリード／フラグメント（ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ）へのリードの正規化（１１３）、又は正規化ｗ．ｒ．ｔ参照遺伝子／タンパク質（１１４）を使用する正規化によってできる。この正規化手順は、方法ごとにそれぞれ、正規化プローブセット強度（１２１）、正規化Ｃｑ値（１２２）、正規化ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化測定（１２４）につながり、これらは、訓練試料中の標的遺伝子発現レベルを示す。
【０１４２】
訓練データが正規化されると、訓練試料識別名（１３１）が得られ、これら特定の試料の訓練データが、遺伝子発現を判定する方法の１つから得られる（１３２）。訓練試料からの最終遺伝子発現結果が訓練データ（１３３）として出力される。様々な訓練試料からのデータのすべてが取り込まれてモデルが較正される（たとえば閾値、たとえば確率的又はベイジアン・ネットワークの場合にＣＰＴ、たとえば線形又は擬似線形モデルの場合に重み、などを含む）（１４４）。加えて、経路の標的遺伝子及び測定ノード（１４１）を使用して、たとえば図２に記載されたモデル構造を生成する（１４２）。得られた経路のモデル構造（１４３）が次に、訓練データ（１３３）と共に取り込まれてモデルが較正される（１４４）。標的遺伝子の遺伝子発現レベルは、転写因子要素活性を表す。訓練試料におけるＴＦ要素判定の結果として、較正済み経路モデル（１４５）が生成され、これは、たとえば癌を有する対象からの、連続して調べられた対象の試料のＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性を、訓練試料における標的遺伝子発現レベルに基づいて指定する。
【０１４３】
（４）ＴＦ要素判定
ＴＦ要素の活性レベルを決定するプロセスを例示的に示す流れ図が図５に示されている。対象から抽出された試料の発現レベル・データ（検査データ）（１６３）が、較正済み数学経路モデル（１４５）に入力される。数学経路モデルは、確率モデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデル、線形モデル、又は擬似線形モデルとすることができる。
【０１４４】
数学経路モデルは、ＴＧＦ−β  ＴＦ要素と、対象の試料において測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルとを関係付ける条件付き確率に基づく確率モデル、たとえばベイジアン・ネットワーク・モデルとすることができ、或いは、較正済み数学経路モデルは、対象の試料において測定されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の３つ以上の標的遺伝子の発現レベルの１つ又は複数の一次結合に基づくことができる。特に、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性の判定は、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１３／０１１４７９Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）に記載されているように実施することができ、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。簡潔には、データがベイジアン・ネットワーク（ＢＮ）推論エンジン・コール（たとえば、ＢＮＴツールボックス）（１５４）に入力される。これは、ＢＮの全ノードの計算限界ＢＮ確率（１５５）に関する値の組になる。これらの確率から、転写因子（ＴＦ）ノードの確率（１５６）が決定され、ＴＦ要素の活性レベル（１５７）が確立される。
【０１４５】
別法として、数学モデルは線形モデルとすることもできる。たとえば、線形モデルは、公開されている国際特許出願ＷＯ２０１４／１０２６６８Ａ２（「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ」）に記載のように使用することができ、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。標的遺伝子発現の数学的モデル化を用いる細胞シグナル伝達経路活性の計算／決定に関するさらなる詳細はまた、Ｖｅｒｈａｅｇｈ  Ｗ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒｉｖｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７４，Ｎｏ．１１，２０１４、２９３６〜２９４５頁に見出すこともできる。簡潔には、データが、計算され重み付けされた一次結合スコア（ｗ／ｃ）（１５１）に入力される。これは、計算され重み付けされた一次結合スコアの値の組になる（１５２）。これら重み付け一次結合スコアから、転写因子（ＴＦ）ノードの重み付け一次結合スコア（１５３）が決定され、ＴＦの要素活性レベル（１５７）が確立される。
【０１４６】
（５）離散化観測可能物の手順
離散化観察可能物として対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのプロセスを例示的に示す流れ図が、図６に示されている。まず、検査試料が抽出され、検査試料識別名（１６１）が与えられる。次に、ｍＲＮＡ発現レベルの検査データが集められ正規化される（１６２）。この検査データは、図５の訓練試料について論じたのと同じ方法を用いて、マイクロアレイ・プローブセット強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲ  Ｃｑ値（１０２）、生ＲＮＡｓｅｑリード（１０３）、又は代替測定様式（１０４）を使用して集めることができる。次に、生発現レベル・データは、方法ごとにそれぞれ正規化することが、正規化アルゴリズム、たとえばｆＲＭＡ又はＭＡＳ５．０（１１１）、参照遺伝子の平均Ｃｑに対する正規化（１１２）、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへのリードの正規化（１１３）、及び正規化ｗ．ｒ．ｔ参照遺伝子／タンパク質（１１４）を使用する正規化によってできる。この正規化手順は、方法ごとにそれぞれ、正規化プローブセット強度（１２１）、正規化Ｃｑ値（１２２）、正規化ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化測定（１２４）に至る。
【０１４７】
訓練データが正規化されると、得られた検査データ（１６３）は、閾値化するステップ（１６４）で較正済み数学経路モデル（１４５）に基づいて分析されて、閾値化検査データ（１６５）が得られる。離散化観察可能物を使用する際、１つの非限定的な例では、特定の閾値を超えるすべての発現に、たとえば、１の値が与えられ、その閾値未満の値には０の値が与えられ、或いは、一代替実施形態では、本明細書に記載の、その閾値を超える確率質量が閾値化値として使用される。較正済み数学経路モデルに基づき、この値はＴＦ要素の活性レベル（１５７）を表し、この活性レベルは次に、細胞シグナル伝達経路の活性（１７１）を計算するために使用される。最終出力は、対象における細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）を与える。
【０１４８】
（６）連続観察可能物の手順
連続観察可能物として対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性を推測するためのプロセスを例示的に示す流れ図が図７に示されている。まず、検査試料が抽出され、検査試料識別名（１６１）が与えられる。次に、ｍＲＮＡ発現レベルの検査データが集められ正規化される（１６２）。この検査データは、図５の訓練試料について論じたのと同じ方法を用いて、マイクロアレイ・プローブセット強度（１０１）、リアルタイムＰＣＲ  Ｃｑ値（１０２）、生ＲＮＡｓｅｑリード（１０３）、又は代替測定様式（１０４）を使用して集めることができる。次に、生発現レベル・データは、方法ごとにそれぞれ正規化することが、正規化アルゴリズム、たとえばｆＲＭＡ（１１１）、参照遺伝子の平均Ｃｑに対する正規化（１１２）、ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭへのリードの正規化（１１３）、及びｗ．ｒ．ｔ参照遺伝子／タンパク質（１１４）に対する正規化を使用する正規化によってできる。この正規化手順は、方法ごとにそれぞれ、正規化プローブセット強度（１２１）、正規化Ｃｑ値（１２２）、正規化ＲＰＫＭ／ＦＰＫＭ（１２３）、又は正規化測定（１２４）に至る。
【０１４９】
検査データが正規化されると、得られた検査データ（１６３）は、較正済み数学経路モデル（１４５）で分析される。連続観察可能物を使用する際、１つの非限定的な例として、発現レベルは、本明細書でさらに詳細に説明されるシグモイド関数を使用して、０から１の間の値に変換される。本明細書に記載のＴＦ要素決定は、較正済み数学経路モデルと組み合わせて検査データを解釈するのに使用され、得られる値はＴＦ要素の活性レベル（１５７）を表し、この活性レベルは次に、細胞シグナル伝達経路の活性（１７１）を計算するために使用される。最終出力は、対象における細胞シグナル伝達経路の活性（１７２）を与える。
【０１５０】
（７）標的遺伝子発現レベル決定手順
対象から取り出された試料から標的遺伝子発現レベルを導出するためのプロセスを例示的に示す流れ図が、図８に示されている。例示的な実施形態では、試料は検査所で受け取られ登録される。試料は、たとえば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料（１８１）又は新鮮凍結（ＦＦ）試料（１８０）を含み得る。ＦＦ試料は、すぐ溶解することができる（１８３）。ＦＦＰＥ試料では、パラフィンは、プロテイナーゼＫを追加するときに加熱インキュベーション・ステップによって除去することができる（１８２）。次に細胞を溶解し（１８３）、それにより細胞及び核膜を破壊し、それにより、さらなる処理に利用可能な核酸（ＮＡ）が得られるようになる。核酸は、たとえばビーズ又はフィルタであり得る固相に結合される（１８４）。核酸は次に、洗浄バッファで洗浄されて、溶解後に存在する細胞デブリがすべて除去される（１８５）。清浄な核酸が次に固相から、溶出バッファを用いて引き離される（１８６）。ＤＮＡがＤＮＡｓｅ処理によって取り除かれて、ＲＮＡだけが試料中に存在することが確実になる（１８７）。核酸試料は次に、ＲＴ−ｑＰＣＲ試料混合物中ですぐに使用することができる（１８８）。ＲＴ−ｑＰＣＲ試料混合物は、ＲＮＡ試料、ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から調製するためのＲＴ酵素、及びｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ酵素、酵素の機能を確保するための緩衝液を含有し、また場合により、固定量の濃度を設定するために分子グレード水を含有し得る。試料混合物は次に、乾燥ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを含むマルチウェル・プレート（すなわち、９６ウェル又は３８４ウェル・プレート）に加えることができる（１８９）。ＲＴ−ｑＰＣＲを次に、ＰＣＲ機内で指定プロトコルに従って実行することができる（１９０）。例示的なＰＣＲプロトコルは、ｉ）５０℃で３０分、ｉｉ）９５℃で５分、ｉｉｉ）９５℃で１５秒、ｉｖ）６０℃で４５秒、ｖ）ステップｉｉｉ及びｉｖの５０サイクル繰り返し、を含む。Ｃｑ値が次に、生データによって、第２の誘導法を用いて決定される（１９１）。Ｃｑ値が解析のためにエクスポートされる（１９２）。
【０１５１】
（８）ＴＧＦ−β仲介疾患及び障害並びに治療の方法
本明細書で企図されているように、本発明の方法及び装置は、対象、たとえば疾患若しくは障害があることが疑われる、又は疾患若しくは障害がある対象におけるＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性を評価するために利用することができる。このＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の状態は、疾患の存在又は進行の全体的又は部分的な証拠となるものである。一実施形態では、対象を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の方法を用いて対象から抽出された試料から導出されたＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性状態に関する情報を受け取ること、並びに、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路の活性に関する情報が、活性のＴＧＦ−βシグナル伝達経路を示す場合に、対象にＴＧＦ−β阻害剤を投与することを含む。特定の実施形態では、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路活性は、１０：１、５：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：５、又は１：１０の、ＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路が活性であるオッズのカットオフ値に設定される。
【０１５２】
本発明において使用され得るＴＧＦ−β阻害剤はよく知られている。ＴＧＦ−β阻害剤の例には、それだけには限らないが、テラメプロコル、フレソリムマブ、ソタテルセプト、ガルニセルチブ、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ２１０９７６１、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＬＤＮ−１９３１８９ＨＣｌ、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−２１４１１７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、ＬＤＮ−２１２８５４、ＤＭＨ１、ピルフェニドン、ヘスペレチン、トラベデルセン、レルデリムマブ、メテリムマブ、ｔｒｘ−ＳＡＲＡ、ＩＤ１１、Ｋｉ２６８９４、又はＳＢ−４３１５４２が含まれる。
【０１５３】
一実施形態では、疾患又は障害は、自己免疫性又は他の免疫性障害、癌、気管支喘息、心臓疾患、糖尿病、遺伝性出血性末梢血管拡張症、マルファン症候群、脈管エーラス・ダンロス症候群、ロイス・ディーツ症候群、パーキンソン病、慢性腎疾患、多発性硬化症、肝線維症、肺線維症又は腎線維症などの線維性疾患、デュピュイトラン病、又はアルツハイマー病のうちの１つである。
【０１５４】
特定の実施形態では、対象は癌に罹患している、又はその疑いがあり、その癌は、たとえば、それだけには限らないが、原発性腫瘍又は転位腫瘍、固形腫瘍、たとえば、メラノーマ、肺癌（肺腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞癌、気管支原性肺癌、非小細胞癌、小細胞癌、中脾腫を含む）と、乳癌（腺管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液性癌、漿膜腔乳癌を含む）と、結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌、結腸直腸腺癌）と、肛門癌と、膵臓癌（膵臓腺癌、膵島腺癌、神経内分泌腫瘍を含む）と、前立腺癌、前立腺腺癌と、卵巣癌（漿液性腫瘍を含む卵巣上皮癌又は表面上皮間質性腫瘍、子宮内膜性腫瘍及び粘液性嚢胞腺癌、性索間質性腫瘍）と、肝臓及び胆管癌（肝細胞癌、胆管細胞癌、血管腫を含む）と、食道癌（食道腺癌及び扁平上皮癌を含む）と、口腔及び中喉頭扁平上皮癌と、唾液腺嚢胞癌と、膀胱癌と、膀胱癌と、子宮の癌（子宮内膜腺癌、眼性、子宮乳頭漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫及び平滑筋肉腫、混合ミュラー管腫瘍を含む）と、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、及び脳の他の腫瘍と、腎臓癌（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍を含む）と、頭及び首の癌（扁平上皮癌を含む）と、胃の癌（胃癌、胃腺癌、消化管間質性腫瘍）と、精巣癌と、胚細胞性腫瘍と、神経内分泌腫瘍と、子宮頸癌と、消化管、乳房、及び他の器官のカルチノイドと、印環細胞癌と、肉腫を含む間葉腫、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周皮細胞腫、偽血管腫間質性過形成、筋組織新生物、線維種症、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫、神経線維種、シュワン腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、皮膚、メラノーマを含む、頸部、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓、脳、甲状腺、精巣、腎臓、膀胱、軟組織、副腎、尿道、陰茎癌、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、悪性線維性組織球腫、琳派肉腫、中皮腫、扁平上皮癌と、類表皮癌、悪性皮膚付属器腫瘍、腺癌、環細胞腫、環細胞癌、腎細胞癌、副腎腫、胆管細胞癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮癌、胚的細胞癌、未分化神経膠腫と、多形神経膠芽腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、悪性髄膜腫、悪性シュワン腫、神経線維肉腫、副甲状腺癌、甲状腺の髄様癌、気管支カルチノイド、褐色細胞腫、膵島細胞癌、悪性カルチノイド、悪性傍神経節腫、メラノーマ、メルケル細胞新生物、葉状腫瘍、唾液腺癌、胸腺癌と、とりわけ膣癌である。
【０１５５】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、リンパ腫又はリンパ球若しくは骨髄球増殖の障害又は異常に罹患している宿主を治療するのに有効である。たとえば、非ホジキンリンパ腫のホジキンリンパ腫に罹患している対象。たとえば、対象は非ホジキンリンパ腫に罹患している場合があり、これには、それだけには限らないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫（小型非分割細胞リンパ腫）、慢性リンパ性白血病／小型リンパ球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、肝脾ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、鼻Ｔ細胞リンパ腫、小児リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、Ｔ細胞白血病、形質転換リンパ腫、治療関連Ｔ細胞リンパ腫、又はワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症などがある。
【０１５６】
或いは、対象はホジキンリンパ腫に罹患していることがあり、これには、それだけには限らないが、結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、混合細胞型ＣＨＬ、リンパ球枯渇型ＣＨＬ、リンパ球豊富型ＣＨＬ、リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、又は結節性リンパ球優位型ＨＬがある。
【０１５７】
一実施形態では、対象は、特異的Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞によるリンパ腫、増殖性障害、又は異常に罹患していることがある。たとえば、対象は特異的Ｔ細胞又はＮＫ細胞リンパ腫に罹患している場合があり、これには、たとえば、それだけには限らないが、末梢Ｔ細胞リンパ腫、たとえば、末梢Ｔ細胞リンパ腫、及び特にことわらなければ末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、又は未分化大細胞型リンパ腫、たとえば未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、ＡＬＫ陰性未分化大細胞型リンパ腫、又は原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、又は自己免疫芽細胞性リンパ腫、又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫、たとえば菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、原発性皮膚ＣＤ３０＋Ｔ細胞リンパ増殖性障害、又は原発性皮膚侵襲性表皮向性ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞リンパ腫、又は原発性皮膚ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、又は原発性皮膚小／中ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫、及びリンパ腫様丘疹症、又は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、又は芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、又は腸症型Ｔ細胞リンパ腫、又は肝脾ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、又はリンパ芽球性リンパ腫、又は鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、又は治療関連Ｔ細胞リンパ腫、又はたとえば、実質臓器又は骨髄移植の後に現われるリンパ腫、又はＴ細胞前リンパ球性白血病、又はＴ細胞大顆粒リンパ球性白血病、又はＮＫ細胞の慢性リンパ増殖性障害、又は侵襲性ＮＫ細胞白血病、又は子供の全身性ＥＢＶ＋Ｔ細胞リンパ球増殖性疾患（慢性活動性ＥＢＶ感染を伴う）、又は種痘様水泡症様リンパ腫、又は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、又は腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、又は肝脾Ｔ細胞リンパ腫、又は皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫などがある。
【０１５８】
或いは、対象は特異的Ｂ細胞リンパ腫又は細胞増殖性障害に罹患していることがあり、これには、それだけには限らないが、多発性骨髄腫、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は濾胞性リンパ腫、又は粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、又は小細胞型リンパ球性リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、又はバーキットリンパ腫、又は縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又はワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、又は結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、又は脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、又は血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は原発性滲出リンパ腫若しくはリンパ腫様肉芽腫症、又は慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、又はＢ細胞前リンパ球性白血病、又はヘアリー細胞白血病、又は脾リンパ腫／白血病、分類不能、又は脾びまん性赤髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又はヘアリー細胞白血病変種、又はリンパ形質細胞性リンパ腫、又は重鎖疾患、たとえば、α重鎖疾患、γ重鎖疾患、μ重鎖疾患、又は形質細胞性骨髄腫、又は骨の孤立性形質細胞腫、又は骨外性形質細胞腫、又は原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、又はＴ細胞／組織球豊富大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は慢性炎症関連ＤＬＢＣＬ、又は高齢者のエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）＋ＤＬＢＣＬ、又は原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は原発性皮膚ＤＬＢＣＬ、脚型、又はＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又は形質芽球性リンパ腫、又はＨＨＶ８関連多中心性に生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、又はキャッスルマン病、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間の特徴を持つ、分類不可能なＢ細胞リンパ腫、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間の特徴を持つ、分類不可能なＢ細胞リンパ腫、又は結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫、又はリンパ球豊富古典的ホジキンリンパ腫、又は混合細胞性古典的ホジキンリンパ腫、又はリンパ球枯渇古典的ホジキンリンパ腫などがある。
【０１５９】
一実施形態では、対象は白血病に罹患している。たとえば、対象は、リンパ球性又は骨髄性起源の急性又は慢性白血病に罹患していることがあり、これには、それだけには限らないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、又はヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、又は急性前骨髄球性白血病（ＡＭＬのサブタイプ）、又はＴ細胞前リンパ性白血病（ＴＰＬＬ）、又は大顆粒リンパ球性白血病、或いは成人Ｔ細胞慢性白血病、又は大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）などがある。一実施形態では、対象は急性骨髄性白血病に罹患しており、これには、たとえば未分化型ＡＭＬ（Ｍ０）、又は骨髄芽球白血病（Ｍ１、又は最小限細胞成熟あり／なし）、又は骨髄芽球白血病（Ｍ２、又は細胞成熟あり）、又は前骨髄球性白血病（Ｍ３若しくはＭ３変種［Ｍ３Ｖ］）、又は骨髄球性白血病（好酸球増加症を伴うＭ４若しくはＭ４変種［Ｍ４Ｅ］）、又は単球性白血病（Ｍ５）、又は赤白血病（Ｍ６）、又は巨核芽球白血病（Ｍ７）がある。
【０１６０】
特定の実施形態では、対象は、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、又は脳癌に罹患しているか、又は罹患している疑いがある。特定の実施形態では、対象は乳癌に罹患しているか、又は罹患している疑いがある。
【０１６１】
本出願では、いくつかの好ましい実施形態を記載している。変更及び変形は、これまでの詳細な記述を読み理解することにより他の人にも想起されよう。本出願は、このような変更及び変形を、それが添付の特許請求の範囲、又はその等価物の範囲に入る限りにおいて含むと解釈されるものである。
【０１６２】
開示された実施形態に対する他の変形形態は、特許請求された本発明を実践するにおいて、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲を検討することにより、当業者によって理解され、もたらされ得る。
【０１６３】
特許請求の範囲で、「備える」という語は他の要素又はステップを除外せず、また不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を除外しない。
【０１６４】
単一のユニット又はデバイスは、特許請求の範囲に列挙されたいくつかの物品の機能を実現することができる。いくつかの方策が互いに異なる独立請求項に列挙されているにすぎないことは、これらの方策の組合せを有利に使用できないことを示すものではない。
【０１６５】
１つ又はいくつかのユニット又はデバイスによって実行されるリスク・スコアの決定のような計算は、他の任意の数のユニット又はデバイスによって実行することができる。
【０１６６】
コンピュータ・プログラムは、光記憶媒体、又は他のハードウェアと一緒に、若しくはその一部として供給される固体媒体などの、適切な非一時的媒体に記憶／配布することができるが、インターネット、又は他の有線若しくは無線通信システムなどを介する他の形で配布することもできる。
【０１６７】
実施例６  適用に使用される配列リスト
配列リスト
Seq.  No.    Gene:
Seq.  1      ANGPTL4
Seq.  2      ATF3
Seq.  3      CCL2
Seq.  4      CDC42EP3
Seq.  5      CDH1
Seq.  6      CDKN1A
Seq.  7      CDKN2B
Seq.  8      COL1A2
Seq.  9      COL3A1
Seq.  10      COL7A1
Seq.  11      CTGF
Seq.  12      CTNNB1
Seq.  13      DLX5
Seq.  14      EDN1
Seq.  15      FN1
Seq.  16      FOXP3
Seq.  17      FSHB
Seq.  18      FST
Seq.  19      FSTL3
Seq.  20      GADD45A
Seq.  21      GADD45B
Seq.  22      GNRHR
Seq.  23      GSC
Seq.  24      HAMP
Seq.  25      HEY1
Seq.  26      HMGA2
Seq.  27      IBSP
Seq.  28      ID1
Seq.  29      ID2
Seq.  30      ID3
Seq.  31      IL11
Seq.  32      IL6
Seq.  33      INPP5D
Seq.  34      ITGB1
Seq.  35      ITGB5
Seq.  36      JUN
Seq.  37      JUNB
Seq.  38      LEFTY2
Seq.  39      MIXL1
Seq.  40      MMP13
Seq.  41      MMP2
Seq.  42      MMP9
Seq.  43      MSX2
Seq.  44      MYC
Seq.  45      NKX2-5
Seq.  46      NODAL
Seq.  47      OVOL1
Seq.  48      PDGFB
Seq.  49      PMEPA1
Seq.  50      PPARG
Seq.  51      PTGS2
Seq.  52      PTHLH
Seq.  53      SERPINE1
Seq.  54      SGK1
Seq.  55      SKIL
Seq.  56      SLC25A5
Seq.  57      SMAD4
Seq.  58      SMAD5
Seq.  59      SMAD6
Seq.  60      SMAD7
Seq.  61      SNAI1
Seq.  62      SNAI2
Seq.  63      SP7
Seq.  64      SPP1
Seq.  65      TAGLN
Seq.  66      TERT
Seq.  67      TGFBR1
Seq.  68      TIMP1
Seq.  69      VEGFA
Seq.  70      VIM
Seq.  71      SERPINE1
【０１６８】
【表１１】
0006415712.tif 000014
【０１６９】
【表１２】
0006415712.tif 000015
【図１】
0006415712.tif 000016
【図２】
0006415712.tif 000017
【図３】
0006415712.tif 000018
【図４】
0006415712.tif 000019
【図５】
0006415712.tif 000020
【図６】
0006415712.tif 000021
【図７】
0006415712.tif 000022
【図８】
0006415712.tif 000023
【図９】
0006415712.tif 000024
【図１０】
0006415712.tif 000025
【図１１】
0006415712.tif 000026
【図１２】
0006415712.tif 000027
【図１３】
0006415712.tif 000028
【図１４】
0006415712.tif 000029
【図１５】
0006415712.tif 000030
【図１６】
0006415712.tif 000031
【図１７】
0006415712.tif 000032
【図１８】
0006415712.tif 000033
【図１９】
0006415712.tif 000034
【図２０】
0006415712.tif 000035
【図２１】
0006415712.tif 000036
【図２２】
0006415712.tif 000037
【図２３】
0006415712.tif 000038
【図２４】
0006415712.tif 000039
【図２５】
0006415712.tif 000040
【図２６】
0006415712.tif 000041
【図２７】
0006415712.tif 000042
【図２８】
0006415712.tif 000043
【図２９】
0006415712.tif 000044
【図３０】
0006415712.tif 000045
【図３１】
0006415712.tif 000046
【図３２】
0006415712.tif 000047
【図３３】
0006415712.tif 000048
【図３４】
0006415712.tif 000049