(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む化合物であって、前記第１のポリペプチドの各々は配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記第２のポリペプチドの各々は配列番号５のアミノ酸配列を有し、前記第１のポリペプチドの各々は前記第２のポリペプチドの各々とＨＣ領域において鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のポリペプチドは、もう一方の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、前記化合物。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドの各々は７つの鎖内ジスルフィド結合を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物、および許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
医薬品の製造で使用するための、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
癌治療用医薬品の製造で使用するための、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記癌は、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、または肝細胞癌である、請求項５の使用のための化合物。
【請求項７】
増殖性網膜症の治療用医薬品の製造で使用するための、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、または未熟児網膜症である、請求項７の使用のための化合物。
【請求項９】
眼内血管新生性疾患の治療用医薬品の製造で使用するための、請求項１〜２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である、請求項９の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）およびヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）に結合する化合物に関し、糖尿病性網膜症および他の増殖性網膜症のような眼内血管新生性疾患、ならびに癌、特に、胃癌、肺癌、肝細胞癌、卵巣癌、大腸癌、および乳癌を含む、ＶＥＧＦＡおよびＡｎｇ２によって引き起こされる固形腫瘍を治療するために有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
癌の特徴は、血管新生と呼ばれる、持続的な新しい血管の形成にある。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）経路は血管新生の調節において重要なシグナル伝達カスケードであり、ヒトＶＥＧＦＡはＶＥＧＦ経路における重要なリガンドである。
【０００３】
アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）およびＡｎｇ２は血管新生を調節する別の重要経路のメンバーであり、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、内皮細胞特異的受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２に結合する分泌因子である。Ａｎｇ１は周皮細胞によって恒常的に分泌され、Ｔｉｅ２受容体を介して血管統合性を安定化させている。Ａｎｇ２はもっぱら刺激（例えば、創傷治癒、腫瘍増殖）に応答して内皮細胞から放出され、血管の出芽を促進し、周皮細胞と内皮細胞の相互作用をＴｉｅ２シグナル伝達を介して抑制する。ヒトＡｎｇ２に対する抗体は、ＶＥＧＦ遮断薬アフリベルセプトと併用投与した場合、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍血管系を減少させることがマウス異種移植片腫瘍モデルにおいて示されている（Daly et al., Cancer Res (2013) 73(1):108）。複数の試験的Ａｎｇ２抗体は、現在、臨床試験が行われているところである。
【０００４】
癌に対する転帰を改善する可能性として、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ／Ｔｉｅ２の両血管新生経路の阻害が提案されている（例えば、Daly et al., Cancer Res (2013) 73:108を参照のこと）。現在のところ、ＶＥＧＦＡ抗体とＡｎｇ−２抗体の同時投与には、２製剤を別々に注射もしくは注入するか、または抗体混合物の合剤を投与することが必要となるであろう。個別投与の場合、投与する用量および時期を柔軟に変えることができるが、注入回数が多くなるため患者の服薬遵守および利便性の問題が生じる可能性が高い。合剤でも投与量にいくらかの柔軟性は得られるが、別個の２抗体の分子特性が異なることから両抗体が化学的および物理的に安定を保てるような配合条件を見出すことが課題となり得る。さらに、同時投与または合剤では、２種の薬物療法の追加コストがかかる。
【０００５】
国際公開第２０１２／００９７０５号では、抗体を含む足場に結合している１つまたはそれ以上のモジュール認識ドメイン（ＭＲＤ）を含有する複合体が開示された。複合体のＭＲＤ部分の対象となることが意図されるものとしてＡｎｇ２を挙げ、また、ＭＲＤに結合が可能な抗体としてＶＥＧＦＡ抗体が明記されていた。ＶＥＧＦＡ抗体に対して結合している対Ａｎｇ２のＭＲＤは例示されていなかった。国際公開第２０１０／０４０５０８号、国際公開第２０１１／１１７３２９号、および国際公開第２０１２／１３１０７８号は、ＶＥＧＦＡおよびＡｎｇ−２に対する二重特異性抗体を特許請求している。
【０００６】
ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２の双方を結合させて無効化することによって２つの血管新生経路を阻害する化合物を提供する必要性が依然としてある。より詳細には、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２の双方を結合させて無効化することによって２つの血管新生経路を阻害するが、Ａｎｇ２  ｓｃＦｖの使用によってＡｎｇ２のインビトロでの結合活性を有意に損なうことなく、かつ、ＶＥＧＦＡ抗体とＡｎｇ２  ｓｃＦｖを１つの化合物に合わせることによって細胞を用いるインビトロアッセイの活性を有意に損なうことのない化合物の提供が依然として必要とされている。また、Ａｎｇ２介在性のＴｉｅ２のリン酸化を無効化するが、Ａｎｇ１介在性のリン酸化は無効化しない化合物の提供が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、本発明の一実施形態では、２つの単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）ポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している抗体を含む化合物を提供し、ここで、
ａ）かかる抗体は、同一重鎖（ＨＣ）２本および同一軽鎖（ＬＣ）２本を含み、ここで、各重鎖は、アミノ酸配列が配列番号１に示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、各軽鎖は、アミノ酸配列が配列番号４に示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、
ｂ）２つのｓｃＦｖポリペプチドは同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに機能的に結合したＨＣＶＲを含み、ここで、各ＨＣＶＲは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣＶＲは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、かつ
ｃ）２つのリンカーはグリシンに富む同一リンカーであり、それぞれが、抗体の１本のＨＣのカルボキシ末端と、ｓｃＦｖポリペプチドの一方のアミノ末端とを機能的に結合している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
さらなる実施形態では、本発明は、２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している抗体を含む化合物を提供し、ここで、かかる２つのｓｃＦｖポリペプチドはそれぞれ、１つのｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲのアミノ末端に機能的に結合している、１つのｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲのカルボキシ末端を含む。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している抗体を含む化合物を提供し、ここで、かかる抗体は重鎖（ＨＣ）を２本および軽鎖（ＬＣ）を２本含み、各ＨＣは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣは配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している抗体を含む化合物を提供し、ここで、各ｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号６に示される同一アミノ酸配列を有する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む化合物を提供し、ここで、第１のポリペプチドの各々は配列番号３のアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドの各々は配列番号５のアミノ酸配列を有する。表１に示すように、２つの第１のポリペプチドは、抗体の重鎖、リンカー、およびｓｃＦｖポリペプチドを含み、２つの第２のポリペプチドは抗体の軽鎖を含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明はさらに、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む化合物を提供し、ここで、第１のポリペプチドの各々は第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、もう一方の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々は７つの鎖内ジスルフィド結合を形成する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２を結合する化合物を提供し、かかる化合物は、ヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を含み、ここで、
ａ）かかる抗体は、同一重鎖（ＨＣ）２本および同一軽鎖（ＬＣ）２本を含み、ここで、各重鎖は、アミノ酸配列が配列番号１に示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、各軽鎖は、アミノ酸配列が配列番号４に示される軽鎖可変領域（ＬＶＣＲ）を含み、
ｂ）２つのｓｃＦｖポリペプチドは同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに機能的に結合したＨＣＶＲを含み、ここで、各ＨＣＶＲは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣＶＲは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、かつ
ｃ）２つのリンカーはグリシンに富む同一リンカーであり、それぞれが、抗体の１本のＨＣのカルボキシ末端と、ｓｃＦｖポリペプチドの一方のアミノ末端とを機能的に結合している。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２を結合する化合物を提供し、かかる化合物は、ヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を含み、ここで、各ｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲのカルボキシ末端はＬＣＶＲのアミノ末端に機能的に結合している。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２を結合する化合物を提供し、かかる化合物は、ヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を含み、ここで、かかる抗体は重鎖（ＨＣ）を２本および軽鎖（ＬＣ）を２本含み、各ＨＣは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣは配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦＡおよびヒトＡｎｇ２を結合する化合物を提供し、かかる化合物は、ヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する２つのｓｃＦｖポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を含み、ここで、各ｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号６に示される同一アミノ酸配列を有する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）およびヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する化合物を提供し、ここで、第１のポリペプチドの各々は配列番号３のアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドの各々は配列番号５のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
一実施形態では、本発明はさらに、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）およびヒトＡｎｇ２（配列番号１２）を結合する化合物を提供し、ここで、第１のポリペプチドの各々は第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、もう一方の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々は７つの鎖内ジスルフィド結合を形成する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を提供し、ここで、軽鎖は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を提供し、ここで、ＬＣは配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む、ＶＥＧＦＡ（配列番号１１）を結合する抗体を提供し、ここで、各軽鎖は配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、各重鎖は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、配列番号３に示される第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号５に示される第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含む哺乳類の細胞を提供し、ここで、かかる細胞は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力がある。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、配列番号３に示される２つの第１のポリペプチドと、配列番号５に示される２つの第２のポリペプチドとを含む化合物を作製するためのプロセスであって、かかる化合物が発現するような条件下で本発明の哺乳類の細胞を培養し、かつ発現した化合物を回収することを含む前記プロセスを提供する。
【００２４】
上記プロセスの一実施形態では、本発明の哺乳類細胞における２つのポリヌクレオチド配列は、同一核酸分子に含まれる（配列番号９および配列番号１０）。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、前述のプロセスの１つによって得ることができる化合物を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物、および許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供し、ここで、癌は乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、またはフォン・ヒッペル・リンドウ症候群である。
【００２８】
さらなる実施形態では、これらの方法は、有効量の本発明の化合物を、シスプラチン、カルボプラチン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射懸濁液用パクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（フォルフォックス）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フォルフィリ）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１種またはそれ以上の抗腫瘍薬と、同時に、個別に、または逐次組み合わせて投与することを含む。
【００２９】
さらなる実施形態では、これらの方法は、有効量の本発明の化合物を、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、およびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）からなる群から選択される１種またはそれ以上の癌免疫治療剤と、同時に、個別に、または逐次組み合わせて投与することを含む。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、増殖性網膜症を治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、増殖性網膜症を治療する方法を提供し、ここで、増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、または未熟児網膜症である。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、眼内血管新生性疾患を治療する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、眼内血管新生性疾患を治療する方法を提供し、ここで、眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、治療で使用するために提供する。一実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、癌の治療で使用するために提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、癌の治療で使用するために提供し、ここで、癌は乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、または肝細胞癌である。さらなる実施形態では、癌の治療で使用するために、本発明の化合物を、シスプラチン、カルボプラチン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射懸濁液用パクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（フォルフォックス）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フォルフィリ）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１種またはそれ以上の抗腫瘍薬と、同時に、個別に、または逐次組み合わせる。
【００３３】
さらなる実施形態では、癌の治療で使用するために、本発明の化合物を、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、およびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）からなる群から選択される１種またはそれ以上の癌免疫治療剤と、同時に、個別に、または逐次組み合わせる。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、増殖性網膜症の治療で使用するために提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、増殖性網膜症の治療で使用するために提供し、ここで、増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、外傷性網膜症、過粘稠度症候群、大動脈弓症候群、眼虚血症候群、内頚動脈海綿静脈洞瘻、多発性硬化症、網膜血管炎、全身性エリテマトーデス、ＳＳ−Ａ自己抗体を伴う細動脈炎、急性多巣性出血性血管炎、感染により生じた血管炎、ベーチェット病による血管炎、サルコイドーシス、凝固障害、鎌状化異常ヘモグロビン症、ＡＣおよびＣ−βサラセミア、小血管ヒアリン症、色素失調症、イールズ病、網膜動脈または網膜静脈分枝閉塞症、霜状分枝血管炎、特発性網膜血管炎、動脈瘤、視神経網膜炎、網膜塞栓症、未熟児網膜症、ブドウ膜炎、周辺部ぶどう膜炎、急性網膜壊死、散弾様網脈絡膜症、長期の網膜剥離、脈絡膜黒色腫、放射線網膜症、家族性滲出性硝子体網膜症、遺伝性網膜静脈数珠化、網膜分離症、網膜色素変性症、または常染色体優性硝子体脈絡膜網膜症である。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、眼内血管新生性疾患の治療で使用するために提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の化合物を、眼内血管新生性疾患の治療で使用するために提供し、ここで、眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である。加齢黄斑変性症の例は、非新生血管型（「乾燥型」としても知られる）および新生血管型（「湿潤型」または「滲出型」としても知られる）黄斑性変性である。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、癌治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、癌治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供し、ここで、癌は乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、またはフォン・ヒッペル・リンドウ症候群である。
【００３７】
さらなる実施形態では、本発明は、癌治療用医薬品を製造するために、本発明の化合物をシスプラチン、カルボプラチン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射懸濁液用パクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（フォルフォックス）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フォルフィリ）（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、およびセツキシマブからなる群から選択される１種またはそれ以上の抗腫瘍薬と、同時に、個別に、または逐次組み合わせて使用することを提供する。
【００３８】
さらなる実施形態では、本発明は、癌治療用医薬品を製造するために、本発明の化合物をニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、およびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）からなる群から選択される１種またはそれ以上の癌免疫治療剤と、同時に、個別に、または逐次組み合わせて使用することを提供する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、増殖性網膜症の治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、増殖性網膜症の治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供し、ここで、増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、外傷性網膜症、過粘稠度症候群、大動脈弓症候群、眼虚血症候群、内頚動脈海綿静脈洞瘻、多発性硬化症、網膜血管炎、全身性エリテマトーデス、ＳＳ−Ａ自己抗体を伴う細動脈炎、急性多巣性出血性血管炎、感染により生じた血管炎、ベーチェット病による血管炎、サルコイドーシス、凝固障害、鎌状化異常ヘモグロビン症、ＡＣおよびＣ−βサラセミア、小血管ヒアリン症、色素失調症、イールズ病、網膜動脈または網膜静脈分枝閉塞症、霜状分枝血管炎、特発性網膜血管炎、動脈瘤、視神経網膜炎、網膜塞栓症、未熟児網膜症、ブドウ膜炎、周辺部ぶどう膜炎、急性網膜壊死、散弾様網脈絡膜症、長期の網膜剥離、脈絡膜黒色腫、放射線網膜症、家族性滲出性硝子体網膜症、遺伝性網膜静脈数珠化、網膜分離症、網膜色素変性症、または常染色体優性硝子体脈絡膜網膜症である。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、眼内血管新生性疾患の治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、眼内血管新生性疾患の治療用医薬品を製造するための本発明の化合物の使用を提供し、ここで、眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である。加齢黄斑変性症の例は、非新生血管型（「乾燥型」としても知られる）および新生血管型（「湿潤型」または「滲出型」としても知られる）黄斑性変性である。
【００４１】
本発明の化合物は、工学的に操作された、天然には生じないポリペプチド複合体である。本発明のＤＮＡ分子は、本発明の化合物にあるポリペプチドのうちの１ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、天然には生じないＤＮＡ分子である。
【００４２】
本発明の化合物の抗体部分は、工学的に操作されたＣＤＲを有し、かつ抗体のいくつかの部分（フレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域の一部または全部）が、ヒトゲノムの配列に由来するフレームワークおよび定常領域と同一または実質的に同一な（実質的にヒト）ヒト由来となるよう設計される。完全ヒトフレームワーク、完全ヒトヒンジ領域、および完全ヒト定常領域は、ヒト生殖細胞系列配列ならびに天然に生じる体細胞突然変異を有する配列および工学的に操作された変異を有する配列のものである。本発明の化合物の抗体部分は、完全ヒトフレームワーク、完全ヒトヒンジ、または完全ヒト定常領域に由来し、中にアミノ酸の置換、欠失、または付加を１つまたはそれ以上含有しているフレームワーク、ヒンジ、または定常領域を含んでよい。さらに、本発明の化合物の抗体部分は、好ましくは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００４３】
本発明の化合物の抗体部分はＩｇＧ型抗体であり、鎖内および鎖間のジスルフィド結合を介して共有結合で安定している、４本のアミノ酸鎖（「重」鎖２本および「軽」鎖２本）を有する。各重鎖は、Ｎ末端のＨＣＶＲおよび重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）で構成される。各軽鎖は、ＬＣＶＲおよび軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）で構成される。特定の生物系での発現では、天然型ヒトＦｃ配列を有する抗体を、Ｆｃ領域で糖鎖付加する。典型的に、糖鎖付加は、抗体Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ型糖鎖付加部位で生じる。典型的にはＮ−グリカンがアスパラギンに結合する。抗体は他の位置で糖鎖付加されてもよい。
【００４４】
任意選択で、本発明の化合物の抗体部分には、Ｆｃ受容体介在性の炎症機構を関与させる能力または補体活性化能力が低いためにエフェクター機能が低くなることから、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に由来するＦｃ部分を含有させる。
【００４５】
さらに、本発明の特定の化合物の抗体部分にＩｇＧ４−ＰＡＡ  Ｆｃ部分を含有させる。ＩｇＧ４−ＰＡＡ  Ｆｃ部分は、２３１位にセリンからプロリンへの変異、２３７位にフェニルアラニンからアラニンへの変異、および２３８位にロイシンからアラニンへの変異を有する。Ｓ２３１Ｐ変異は、半抗体の形成を防ぐヒンジ変異である（ＩｇＧ４抗体において半−分子が動的に交換される（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）現象）。Ｆ２３７ＡおよびＬ２３８Ａの各変異は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのすでに低いエフェクター機能をさらに低下させる。
【００４６】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡ分子は、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡと、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子とを機能的に結合させることによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒトの配列および他の哺乳類の配列の重鎖定常領域遺伝子は当技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、例えば標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。
【００４７】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡを、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡと、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子とを機能的に結合することによって完全長軽鎖遺伝子に変換してよい。ヒトの配列、および他の哺乳類の配列の軽鎖定常領域遺伝子は当技術分野で公知である。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得る。
【００４８】
「単鎖可変領域」または「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖポリペプチド」とは、ｓｃＦｖリンカー分子を介して結合している抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、工学的に操作され、天然には生じない１本の折り畳まれたポリペプチドを指す。本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、工学的に操作されたＣＤＲを有し、かつｓｃＦｖのいくつかの部分（フレームワークの一部または全部）が、ヒトゲノムの配列に由来するフレームワークと同一または実質的に同一な（実質的にヒト）ヒト由来となるよう設計されている、工学的に操作され、天然には生じないｓｃＦｖである。完全ヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系列配列ならびに天然に生じる体細胞突然変異を有する配列および工学的に操作された変異を有する配列のものである。本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、完全ヒトフレームワークに由来し、その中にアミノ酸の置換、欠失、または付加を１つまたはそれ以上含有しているフレームワークを含んでよい。さらに、本発明の化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、好ましくは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。任意選択で、化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分は、ＨＣＶＲのシステイン４４とＬＣＶＲのシステイン１００とでできたジスルフィドを有し得る（Ｃｙｓ４４およびＣｙｓ１００の位置番号は、ｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸位置番号と一致しており、抗体のＨＣ＋リンカー＋ｓｃＦｖポリペプチドの場合の位置番号では、Ｃｙｓ５０７およびＣｙｓ７０９である）。このようなｓｃＦｖポリペプチドでは、ＨＣＶＲドメインおよびＬＣＶＲドメインは、ＨＣＶＲ−ｓｃＦｖリンカー−ＬＣＶＲ、またはＬＣＶＲ−ｓｃＦｖリンカー−ＨＣＶＲのいずれの順序でもあり得る。ｓｃＦｖリンカーは、ＨＣＶＲ鎖およびＬＣＶＲ鎖が折り畳まれて、抗原を認識する機能的単量体ユニットとなれるようにする、グリシンに富む柔軟なペプチドリンカーであり得る。任意選択で、２×Ｇ４Ｓリンカー、３×Ｇ４Ｓリンカー、４×Ｇ４Ｓリンカー、または５×Ｇ４Ｓリンカーのようなグリシンに富むリンカーである。
【００４９】
用語「リンカー」および「ｓｃＦｖリンカー」とは、いずれもグリシンに富むペプチドリンカーを意味する。「リンカー」は、本発明の特定の実施形態では、抗体とｓｃＦｖとを連結させるために用いられ、「ｓｃＦｖリンカー」は、本発明の特定の実施形態では、ｓｃＦｖのＬＣＶＲとｓｃＦｖのＨＣＶＲとを連結させるために用いられる。好ましくは、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸を有する、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の、より好ましくは１０〜５０アミノ酸のグリシンに富むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態では、前記グリシンに富むペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３およびｎ＝３、４、５または６）または（ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５）である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、前記グリシンに富むペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｘ＝４およびｎ＝２、３、４または５（すなわち、それぞれ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である。抗体の定常領域の最後のアミノ酸がグリシンである本発明のいくつかの実施形態では、前記グリシンに富むペプチドリンカーはＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）である。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、各配列が発現制御配列に機能的に結合されてから宿主細胞に発現させることになる。発現ベクターは典型的に、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主生物内に複製可能である。一般的に、発現ベクターには、所望のＤＮＡ配列で細胞形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼが含有されるであろう。
【００５１】
本発明の化合物は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞のような哺乳類細胞で容易に産生され得る。宿主細胞は、当技術分野で周知の技術を使用して培養する。
【００５２】
対象とするポリヌクレオチド配列（例えば、化合物のポリペプチドおよび発現制御配列をコードするポリヌクレオチド）を含有しているベクターは、周知の方法によって宿主細胞内に移すことができ、宿主細胞の種類に応じて異なる。
【００５３】
タンパク質精製のさまざまな方法を使用してよく、そのような方法は当技術分野で公知であり、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)に記載されている。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、化合物、または該化合物をコードする核酸を、単離された形態で提供する。本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、細胞環境で見られる他のいかなる高分子種も含んでいない、または実質的に含んでいないタンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書で使用する「実質的に含んでいない」とは、対象とするタンパク質、ペプチド、または核酸が、存在する高分子種のうち８０％（モル基準で）以上、好ましくは９０％以上、およびより好ましくは９５％以上で含まれていることを意味する。
【００５５】
本発明の化合物、または本発明の化合物を含む医薬組成物は、非経口的に投与してよい（例えば、硝子体内注射、眼内注射、結膜下注射、皮下注射もしくは静脈内注射または埋込み）。本発明の化合物は、薬理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に単剤で、単回または頻回で患者に投与してよい。本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法によって調製可能であり（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ｔｈ ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.）、本明細書に開示するような化合物、および１種またはそれ以上の薬理学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含む。
【００５６】
用語「治療する（treating)」（または「治療する（treat)」または「治療（treatment）」）とは、既存の症状、障害、病態、もしくは疾患の進行または重症度を、緩徐にさせる、遮断する、停止させる、軽減させる、中止させる、低下させる、または回復させることを指す。患者とは、ＶＥＧＦＡおよび／またはＡｎｇ２の阻害により利益を受けると思われる疾患、障害、または病態を有する哺乳類、好ましくはヒトを指す。
【００５７】
本明細書において「結合する」とは、化合物、抗体、またはｓｃＦｖポリペプチドのヒトＶＥＧＦＡまたはヒトＡｎｇ２に対する親和性に関して使用する場合、特に明記しない限り、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを基本的には本明細書に記載のように２５℃または３７℃で使用することを含む、当技術分野で公知の一般的方法で決定したＫＤが約１×１０−８Ｍ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍ未満であることを意味するものとする。本明細書において用語「選択的（selective)」または「選択性（selectivity)」とは、本発明の化合物に関して使用する場合、標的、例えばヒトＡｎｇ２を結合する場合のほうが、標的のファミリーメンバー、例えばヒトＡｎｇ１などの他のタンパク質を結合する場合よりも、表面プラズモン共鳴で２５℃または３７℃にて測定したＫＤが約１０００倍、５００倍、２００倍、１００倍、５０倍、または約１０倍低い化合物を指す。追加または別法として、本発明のＡｎｇ２選択的化合物は、本明細書の下記実施例に記載の方法で評価した場合に、ヒトＡｎｇ２は結合するがヒトＡｎｇ１を結合しないかまたは最小限の結合にとどまる。
【００５８】
「有効量」とは、研究者、医師、または他の臨床医が求める、組織、系、動物、哺乳類もしくはヒトに対する生物学的または医療上の応答もしくは所望の治療効果を誘発することになる、本発明の化合物または本発明の化合物を含む医薬組成物の量を意味する。化合物の有効量は、因子、例えば、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに化合物の個体に対する所望応答誘発能によって異なり得る。有効量は、化合物の何らかの毒性または有害作用よりも治療上有益な作用のほうが上回る量でもある。
【実施例】
【００５９】
以下の非限定的な例によって本発明をさらに説明する。
【００６０】
実施例１：化合物の発現および精製
表１に示す実施例１（化合物Ａ）では、２つの第１のポリペプチド（化合物Ａの「抗体ＨＣ−リンカー−ｓｃＦｖ」）は配列番号３のアミノ酸配列を有し、２つの第２のポリペプチド（化合物Ａの抗体のＬＣ）は配列番号５のアミノ酸配列を有する。
【００６１】
抗体部分のポリペプチド、ｓｃＦｖ部分、および化合物Ａの「抗体−リンカー−ｓｃＦｖ」、ならびにそれをコードするヌクレオチド配列は、下記の「アミノ酸およびヌクレオチド配列」と題する項に記載している。
【００６２】
化合物Ａを含むが、これに限定されない本発明の化合物は、本質的に以下のとおり作製および精製される。適切な宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯは、所定の至適なＨＣ−リンカー−ｓｃＦｖ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）またはＨＣ−リンカー−ｓｃＦｖおよびＬＣの双方をコードする単一ベクター系を使用して、化合物を分泌させる発現系を用いて一過性または安定的いずれでもトランスフェクションされ得る。中に化合物が分泌されている清澄化した培地は、一般に使用されている数多くの技術のいずれを使用しても精製され得る。例えば、培地は、適合性のある緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化されているＦａｂ断片用のMabSelectカラム（GE Healthcare）、またはKappaSelectカラム（GE Healthcare）に好都合に塗布され得る。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去してよい。結合した化合物は、例えばｐＨ勾配によって（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７から１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０へ、またはリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４から１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０へというように）溶出させてよい。化合物画分を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、その後、プールしてよい。それ以降の精製は任意選択であり、意図する使用に依存する。一般的技術を使用して化合物を濃縮および／またはフィルター滅菌してよい。サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモード型クロマトグラフィー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの一般的技術によって可溶性の凝集体および多量体を効果的に除去してよい。これらのクロマトグラフィーステップを行った後の化合物純度は９５％超である。生成物を直ちに−７０℃で凍結しても、または凍結乾燥させてもよい。
【００６３】
【表１】
0006446560.tif 000002
【００６４】
アッセイ
結合動態、親和性、および選択性
本発明の化合物について、ヒトＡｎｇ２およびヒトＶＥＧＦＡに対する結合動態、親和性、および選択性を、Biacore(登録商標)2000、Biacore(登録商標)3000、もしくはBiacore(登録商標)T100（GE HealthCare）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを使用するか、または代替として、Kinexa3000もしくはKinexa3200と連携した結合平衡除外アッセイ（Sapidyne Instruments）により、当技術分野で公知の方法にしたがって決定する。
【００６５】
Biacore  ＳＰＲを使用した親和性測定
本発明の化合物について、可溶性完全長のヒトＡｎｇ２およびヒトＶＥＧＦＡに対する動態および平衡解離定数（ＫＤ）を、２５℃にて、またはBiacore表面プラズモン共鳴アッセイ法を使用して決定する。ヒトＡｎｇ２はR&D Systems（#623-AN-01M/CF）製であり、ヒトＶＥＧＦＡ１６５はR&D systems（#293-VE-001MG/CF）製、Peprotech（#00-20）製、または組換え発現法によって調製する。抗体捕捉用のタンパク質Ａ表面を以下の方法を用いて準備する。可溶性タンパク質Ａ（Calbiochem #539202）をCM4（GE Healthcare #BR-1005-34）またはCM5（GE Healthcare #BR-1000-99）上に固定化する準備を、ＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング方法（GE Healthcare #BR-1000-50）を使用して行う。手短に言えば、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入して、全４フローセルの表面を活性化させる。その後、可溶性タンパク質ＡをｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液で５０〜１００μｇ／ｍＬまで希釈し、フローセル（Ｆｃ）２、３または４上に流速１０μＬ／分で７分間固定化する。エタノールアミンを１０μＬ／分にて７分注入し、チップ表面に残っている未反応部位をブロッキングする。ランニング緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ添加、HBS-EP+（GE Healthcare #BR-1006-69）である。化合物試料は、ランニング緩衝液に希釈して１μｇ／ｍＬに調製する。２倍段階希釈を使用してランニング緩衝液に５０ｎＭ〜１．５６ｎＭの範囲のヒトＡｎｇ２またはヒトＶＥＧＦＡ１６５を調製する。各分析サイクルは５部に分かれ、すなわち、（１）別々のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）上に化合物を捕捉させる、（２）個々の濃度のヒトＡｎｇ２またはヒトＶＥＧＦＡ１６５の２５０μＬ（表面接触時間３００秒）を全Ｆｃに５０μＬ／分で注入する（kinject使用）、（３）緩衝液流に２０分間戻し、解離相を監視する、（４）ｐＨ１．５、１０ｍＭグリシンを１０μＬ（接触時間３０秒）注入してチップ表面の再生を行う、（５）HBS-EP+ランニング緩衝液１５μＬ（接触時間４５秒）を注入してチップ表面の平衡化を行う、という一連のステップで構成される。得られたデータを標準の二重参照を用いて処理し、Biacore 2000 Evaluationソフトウェア（バージョン４．１）を使用して１：１結合モデルに当てはめ、会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）を決定する。平衡解離定数（ＫＤ）を、関係ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算し、モル単位で表す。
【００６６】
本質的に本アッセイに記載のように実施した実験では、化合物Ａの抗ＶＥＧＦＡ親抗体はヒトＶＥＧＦＡ１６５に対し１３．２ｐＭのＫＤを示す。化合物Ａのうち、抗ＶＥＧＦＡ親抗体と、Ａｎｇ２  Ｍａｂ由来のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲで構成されるＣ末端重鎖ｓｃＦｖとを併せ持つＭａｂ−ｓｃＦｖ融合体は、８３．２ｐＭのＫＤを示す（表２）。Biacore  ＳＰＲを２５℃で使用して評価した化合物ＡのヒトＡｎｇ２に対する結合親和性（ＫＤ）は１３６ｐＭである（表３）。
【００６７】
表２：２５℃でのBiacore  ＳＰＲによるｈＶＥＧＦＡ１６５
【表２】
0006446560.tif 000003
【００６８】
解離速度が遅すぎて正確に定量化できないため、表２に表される値はレポート親和性の上限である。
【００６９】
表３：２５℃でのBiacore  ＳＰＲによるｈＡｎｇ２
【表３】
0006446560.tif 000004
【００７０】
KinExA KEAを用いた親和性測定
KinExA 3200装置を使用してヒトＶＥＧＦＡ１６５に対する結合動態を測定する。手短に言えば、ＮＨＳ活性化させたsepharoseビーズ（GE Healthcare #17-0906-01）にヒトＶＥＧＦＡ１６５を共有結合で結合させ、複合体化したビーズに対する遊離Ｍａｂの結合をKinExA 3200で検出する。ＫＤを測定するため、固定濃度（典型的に１〜５ｐＭ）の化合物を含有する個々のチューブを、段階希釈で徐々に濃度を低くしながらヒトＶＥＧＦＡ１６５と混合し、Casein Blocking Buffer（ThermoFisher #37528）中で２５℃または３７℃にて（分析温度に応じて）、２４時間以上プレインキュベートする。プレインキュベーションで定常的な平衡状態に達した後、各試料を、以下の５ステップからなる分析サイクル、すなわち、１）小カラムのＶＥＧＦＡ１６５結合ビーズをキャピラリの所定の高さまで充填し、２）個々のヒトＶＥＧＦＡ１６５／化合物混合物のそれぞれの定義された容量を定義された時間カラムに注入し、３）適切な蛍光標識抗体（すなわち、ＣＹ５標識した抗ヒトＦｃガンマ特異的抗体：Jackson Immunoresearch #309-175-008）の定義された容量をカラムに注入し、４）カラムを１×ＰＢＳで洗浄して過剰の検出抗体および非特異的に結合した物質を除去し、５）特異的に結合した物質の検出を、結合二次抗体に励起し、その後の発信を監視して測定する、というサイクルに供する。これらのステップの発生シグナルの相対強度は、各被験溶液中に存在する遊離／未結合化合物の程度に比例する。混成セットとして得られた蛍光強度を、各個別試料に存在するヒトＶＥＧＦＡ１６５濃度の関数としてプロットし、Ｎ曲線分析ソフトウェア（KinExA）を使用して標準的２状態結合モデル（two state binding model）に当てはめ、所与のＭＯＩに対するＫＤを決定する。統計的信頼性は、９５％信頼区間の算出によりレポートされる。
【００７１】
本質的に記載の通り実施した実験では、化合物Ａの３７℃での結合は８４ｐＭ（表４）、また化合物Ａの２５℃での結合は２６．６ｐＭ（表５）であった。
【００７２】
表４：３７℃でのKinExA KEAによるｈＶＥＧＦＡ１６５
【表４】
0006446560.tif 000005
【００７３】
表５：２５℃でのKinExA KEAによるｈＶＥＧＦＡ１６５
【表５】
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【００７４】
固相Ｅｌｉｓａ法による、ヒトＡｎｇ２とヒトＴｉｅ２との相互作用の阻害
本発明の化合物による、ヒトＡｎｇ２とその受容体のヒトＴｉｅ２との結合遮断を固相インビトロＥＬＩＳＡ法で測定する。細胞を用いるインビトロアッセイを使用して、本発明の化合物と、かかる化合物のｓｃＦｖポリペプチド部分と同一のＨＣＤＲ配列およびＬＣＤＲ配列を有するＡｎｇ２抗体との間の比較可能な遮断活性を確立した。
【００７５】
このアッセイでは、高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Costar #2592）を、４μｇ／ｍｌ（１００μｌ中）の組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃ（R&D Systems #313-TI）で室温にて一晩コーティングする。プレートを、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、その後、ウェルあたり３００μｌのブロッキング緩衝液を用いて（０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ）（ＢＳＡ：Jackson ImmunoResearch #001-000-162製；ＩｇＧ不含、プロテアーゼ不含）室温にて１〜２時間振盪機にかけてブロッキングする。ブロッキングステップの間、別々のポリプロピレン製マルチウェルプレートに、７５μｌずつ２連の被験化合物（ブロッキング緩衝液で１：３に段階希釈）を、７５μｌずつ２連のビオチン化ヒトＡｎｇ２（R&D Systems #BT623）（ブロッキング緩衝液で希釈）とともに加える。その後、化合物／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を３７℃で１時間インキュベートする（最終ビオチン化Ａｎｇ２濃度は１００ｎｇ／ｍｌであった）。Ｔｉｅ２−ＦｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートからブロッキング溶液を除去し、その後、ウェルあたり５０μｌの化合物／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を加える（２連ウェル）。その後、プレートをプレートシーラーで覆って振盪機で室温にて２時間インキュベートする。その後、プレートを３回洗浄してから、ブロッキング緩衝液で１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（R&D Systems #DY998）をウェルあたり１００μｌ加える。次いで、プレートをプレートシーラーで覆って振盪機で室温にて３５分インキュベートする。その後、プレートをさらに３回洗浄する。
【００７６】
ウェルあたり１００μｌのOne Component TMB基質（Surmodics/BioFX Labs #TMBW-1000-01）を加え、室温まで温め、プレートを反応させる。反応を室温で１０分間進行させ、プレートをアルミホイルで覆う。ウェルあたり１００μｌの反応停止液（Surmodics/BioFX Labs #LSTP-1000-01）で反応を停止させる。プレートを振盪機で混合した後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Molecular Devices SpectraMax 190）でSOFTmax PRO 5.4.1ソフトウェア（Molecular Devices Corp.）を使用してプレートの４５０ｎＭの値を読み取る。Ａ４５０値は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに結合したままのビオチン化Ａｎｇ２の量を示す。Ａ４５０値の減少は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに対するビオチン化Ａｎｇ２の結合がブロッキングされていることを示す。
【００７７】
SigmaPlot 9.0の「Pharmacology」メニューの「Standard Curves Analysis」機能を使用して、Ｔｉｅ−２に対するＡｎｇ２結合の阻害についてＩＣ５０値を計算する。４パラメータ・ロジスティックフィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔ）を使用して曲線を当てはめる（Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ方法）。
【００７８】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物Ａおよび化合物ＡのＡｎｇ２親抗体はそれぞれ、幾何平均ＩＣ５０値（ｎ＝１）が０．１１８ｎＭおよび０．０８７ｎＭとなる。化合物Ａは、ヒトＴｉｅ−２に対するヒトＡｎｇ２の結合を用量依存的に遮断し、Ａｎｇ２親抗体の場合に匹敵する。このデータは、化合物ＡのＡｎｇ２  ｓｃＦｖポリペプチド部分は、本アッセイでは、親Ａｎｇ２抗体に匹敵する効力があることを示している。
【００７９】
Ａｎｇ１介在性リン酸化ではなくＡｎｇ２介在性Ｔｉｅ２リン酸化を無効化する．
細胞を用いるインビトロでの本発明化合物によるヒトＡｎｇ２の阻害を、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が結合してヒトＴｉｅ２リン酸化が用量依存的に誘導される細胞系アッセイで測定する。細胞を用いるインビトロアッセイを使用して、本発明の化合物が、用量依存的にＡｎｇ１介在性ではなくＡｎｇ２介在性のＴｉｅ−２受容体のリン酸化を選択的に無効化する能力を評価する。Ａｎｇ２抗体、Ａｎｇ２／Ａｎｇ１抗体、および対照ヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ抗体をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として含めた。
【００８０】
完全長ヒトＴｉｅ２受容体（Ｃ末端に３Ｘ  ＦＬＡＧタグを有する）の安定トランスフェクションによりＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞株を作製する。ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞を、Ｈａｍｓ  Ｆ−１２（CellGro/Mediatech #10-080-CV）、１０％熱非働化処理ＦＢＳ（Life Technologies/Invitrogen #10082-147）、１×抗生物質−抗真菌剤（Life Technologies/Invitrogen #15240-062）、１．２５ｍｇ／ml G418（Corning Cellgro #30-234-CI）、１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（Calbiochem #540411）、および０．０７８％炭酸水素ナトリウム（Thermo Hyclone #SH30033.01）の完全培地に維持する。
【００８１】
このアッセイでは、ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞（増殖培地１００μｌ中）で、ポリ−リシンでコーティングした９６ウェルプレート（BD Biocoat #356640）の内側６０のウェル内に再懸濁させる。２００μｌのＤ−ＰＢＳは、エッジウェル内に入れて蒸発を抑制する。細胞を３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を１回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有する無血清増殖培地１００μｌ（Sigma #A7979、低エンドトキシン）で培地を交換する。その後、細胞を、無血清培地中で３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて７〜２４時間飢餓させる。飢餓期間中、化合物（最終濃度６倍）を、０．１％ＢＳＡを含有する無血清増殖培地でポリプロピレン製プレート内に１：２に段階希釈する。ヒトＡｎｇ２（R&D Systems #623-AN、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で再調製）およびヒトＡｎｇ１（R&D Systems #923-AN、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で再調製）も、０．１％ＢＳＡを含有する無血清増殖培地で最終濃度の６倍まで希釈する。その後、被験化合物およびＡｎｇ２リガンドもしくはＡｎｇ１リガンドをポリプロピレン製プレート内で１：１比（ｖ／ｖ）で混合し、３７℃で６０〜８０分インキュベートする。その後、化合物／リガンド混合物を、ウェルあたり５０μｌで細胞に加え（１処理につき３連ウェルで行う）、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて１３分〜２１時間インキュベートする。化合物の最終濃度範囲は０．１２５〜３８３ｎＭ、ならびにヒトＡｎｇ２およびＡｎｇ１の最終濃度はそれぞれ０．３μｇ／ｍｌ（約６ｎＭ）および０．５μｇ／ｍｌ（約８．９ｎＭ）である。インキュベーション時間経過後、細胞から培地を迅速かつ完全に除去し、添加したばかりのプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（１×プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma #P8340；１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２、Sigma #P5726；１×ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Sigma #P0044；１ｍＭ最終活性化オルトバナジン酸ナトリウムEMD Chemicals #567540）を含有する冷１×Ｔｒｉｓ溶解バッファー（Meso Scale Discovery #R60TX；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）６０μｌ／ウェルに細胞を溶解させる。その後、プレートを氷上に１０分間置いた後、４℃にて低速で２５分振盪機にかけてよい。その後、プレートを密封し−８０℃で凍結させる。
【００８２】
リン酸−Ｔｉｅ２分析（R&D Systems製ヒトリン酸−Ｔｉｅ２  DuoSet ELISAキット（#DYC2720）を用いる）の前日、高結合ＥＬＩＳＡプレート（Greiner BioOne, #655081）を、４μｇ／ｍｌマウス抗ヒトＴｉｅ２捕捉全抗体を含有する１×ＥＬＩＳＡコーティングバッファー（Surmodics/BioFX Labs #COAT-1000-01）で４℃にて一晩コーティングする。
【００８３】
リン酸−Ｔｉｅ２測定の当日、溶解物が含有されたプレートを氷上で融解させる。コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１×ＴＢＳＴ）で洗浄し、ウェルあたり３００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ（Jackson ImmunoResearch #001-000-162；ＩｇＧ不含、プロテアーゼ不含）、０．０１％アジ化ナトリウム）を用いて室温で少なくとも１時間振盪機にかけて（プレートシーラーで覆う）ブロッキングする。ブロッキング中、ポリプロピレン製プレート内に、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有している冷溶解バッファーで溶解物を１：５または１：１０に希釈する。ＥＬＩＳＡプレートを４回洗浄し、希釈溶解物またはリン酸−Ｔｉｅ２ＥＬＩＳＡ標準液１００μｌ／ウェルを加え、シーラーで覆い、室温で２時間振盪機にかけてインキュベートする。プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ結合マウス抗チロシンリン酸化抗体（ＴＢＳＴ／０．１％ＢＳＡ中に、バイアルに記載の推奨通りに希釈）をウェルあたり１００μｌ加える。その後、プレートをシーラーで覆って室温にて２時間、振盪機にかけてインキュベートしてよい。その後、プレートを６回洗浄し、ウェルから液体を確実に除去する。プレートを、その後、ウェルあたり１００μｌのOne Component TMB基質（Surmodics/BioFX Labs #TMBW-1000-01）を加えることによって作製する。プレートをアルミホイルで覆って室温で３０分反応させる。ウェルあたり１００μｌの反応停止液（Surmodics/BioFX Labs #LSTP-1000-01）で反応を停止させる。その後、プレートを振盪機で混合する。ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Molecular Devices SpectraMax 190）でSOFTmax PRO 5.4.1ソフトウェア（Molecular Devices Corp.）を使用してプレートの４５０ｎＭの値を読み取る。標準曲線（４パラメータ・ロジスティックフィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔ））から試料のリン酸−Ｔｉｅ２値を取得し、それに希釈倍率５または１０を掛ける。
【００８４】
Ａｎｇ２誘導によるリン酸−Ｔｉｅ２阻害のＩＣ５０値を、対数変換したＸの値を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４で計算する。非線形回帰（曲線フィッティング）分析（シグモイド型用量−反応、可変傾斜）を対数変換したデータに対して実施し、ＩＣ５０値を得る。
【００８５】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物Ａは、ＣＨＯ−Ｔｉｅ２細胞においてヒトＡｎｇ２誘導によるリン酸−Ｔｉｅ２を用量依存的に無効化し、ＩＣ５０は０．８７ｎＭ（ｎ＝１）であり、一方Ａｎｇ２親抗体の方はＩＣ５０は１．０１ｎＭである。結果から、陽性対照のＡｎｇ２／Ａｎｇ１抗体と比較した場合、化合物Ａは、ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞においてＡｎｇ２誘導によるリン酸−Ｔｉｅ２は無効化するが、ヒトＡｎｇ１誘導によるリン酸−Ｔｉｅ２は無効化しないことが示される。さらに、このデータは、化合物ＡのＡｎｇ２  ｓｃＦｖポリペプチド部分は親Ａｎｇ２抗体に匹敵する効力を本アッセイで維持したことを示している。
【００８６】
ヒトＶＥＧＦＡ誘導によるヒトＶＥＧＦＲ２リン酸化を無効化する
ＶＥＧＦＲ２発現細胞株上でＶＥＧＦＡ１６５がＶＥＧＦＲ２に結合すると、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化が用量依存的に誘導される細胞系アッセイにおいて、細胞を用いたインビトロでのヒトＶＥＧＦＡ阻害を測定する。アッセイを使用して、本発明の化合物が、用量依存的にＶＥＧＦＲ２受容体のＶＥＧＦＡ介在性リン酸化を選択的に無効化する能力を評価する。ＶＥＧＦＡ抗体と、無関係の抗体であるヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプとをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として含めた。
【００８７】
アッセイでは、ＶＥＧＦＲ２を発現しているヒトＥＣＦＣ（内皮コロニー形成細胞、臍帯血内皮前駆細胞由来）（Endgenitor Technologies、ロット100506-14-P4、８〜１０回継代）を、コラーゲンＩコーティング９６ウェルプレート（BD Biocoat #35-4407）の内側６０のウェル内の増殖培地：EGM-2MV BulletKit（Lonza #CC-4147）にウェルあたり１４，０００細胞（１００μｌ増殖培地中）で播種する。EGM-2MV Singlequotバッグに含まれている成分を５００ｍｌのＥＢＭ−２基本培地に加え、最終ＦＢＳ濃度を１０％（Life Technologies/Invitrogen #10082-147、熱非働化処理済み）に調整してよい。２５０μｌの増殖培地は、エッジウェル内に入れて蒸発を抑制する。細胞を、ＯＮで３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にてインキュベートする。翌日、培地を除去し、０．１％ＢＳＡ（Sigma #A7979、低エンドトキシン）を含有している無血清ＥＢＭ−２基本培地１００μｌを用いて交換する。細胞を、６．５時間３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて飢餓させる。飢餓期間中、化合物（最終濃度６倍）をポリプロピレン製プレート内にＥＢＭ−２／０．１％ＢＳＡで１：４に段階希釈する。ヒトＶＥＧＦＡ１６５をＥＢＭ−２／０．１％ＢＳＡで最終濃度の６倍に希釈する。その後、化合物およびＶＥＧＦＡ１６５をポリプロピレン製プレートで１：１比（ｖ／ｖ）で混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、化合物／ＶＥＧＦＡ１６５混合物を、ウェルあたり５０μｌで細胞に加え（１処理につき３連ウェルで行う）、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて５分間インキュベートする。（化合物の最終濃度範囲は０．０１８〜３００ｎＭであり、ヒトＶＥＧＦＡ１６５の最終濃度は０．１６ｎＭである）。培地を細胞から除去し、添加したばかりの１×プロテアーゼおよびホスファターゼ両阻害剤（リン酸−ＶＥＧＦＲ２アッセイキットに同梱）を含有している冷１×Ｔｒｉｓ溶解バッファー（Meso Scale Discovery #R60TX；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）６０μｌ／ウェルに細胞を溶解させる。プレートを氷上に１０分間置いてから４℃にて低速で２０分振盪機にかける。その後、プレートを密封し−８０℃で凍結させる。
【００８８】
リン酸−ＶＥＧＦＲ２測定の当日、溶解物が含有されたプレートを氷上で融解させる。リン酸−ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１０５４）全細胞溶解物キット（Meso Scale Discovery #K151DJD）を使用してリン酸−ＶＥＧＦＲ２レベルを測定する。リン酸−ＶＥＧＦＲ２に対する抗体でプレコーティングされたMeso Scaleアッセイプレートを、ウェルあたり１５０μｌのブロッキング緩衝液（３％ブロッカーＡ含有ＴＢＳＴ）を用いて室温にて少なくとも１時間、振盪機（プレートシーラーで覆う）にかけてブロッキングする。プレートを１×Meso Scale洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ウェルあたり５０μｌの溶解物を加える（シーラーで覆い、室温で１時間振盪機にかけてインキュベートする）。プレートを３回洗浄し、ウェルあたり２５μｌの１×MSD SULFO-TAG(商標)結合抗トータルＶＥＧＦＲ２（製造者推奨の抗体希釈剤で希釈）を加え、シーラーで覆い、室温で１時間振盪機にかけてインキュベートする。プレートを３回洗浄し、ウェルから液体を除去する。ウェルあたり１５０μｌの１×Read Buffer Tをプレートに加え、Meso Scale Discovery SECTOR Imager MA6000で直ちに読み取る。
【００８９】
ＶＥＧＦＡ１６５誘導によるリン酸−ＶＥＧＦＲ２阻害のＩＣ５０値を、対数変換したＸの値を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４で計算する。非線形回帰（曲線フィッティング）分析（シグモイド型用量−反応、可変傾斜）を対数変換したデータに対して実施しＩＣ５０値を得る。実験を１回以上実施した場合は、実験間の幾何平均ＩＣ５０値を計算する。
【００９０】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物ＡはＩＣ５０値が０．２５２ｎＭ（ｎ＝２）であり、これはＶＥＧＦＡ親抗体のＩＣ５０値０．１９４ｎＭ（ｎ＝２）に匹敵する。結果は、化合物ＡのＶＥＧＦＡ抗体部分は効力を維持したことを示している。また、結果から、化合物Ａは、ＩＣ５０が０．２９０ｎＭであるベバシズマブ（Myoderm Medical Supply（ペンシルバニア州ノリスタウン）から購入）に匹敵するＶＥＧＦＡ１６５無効化活性を有することがわかる。
【００９１】
ＶＥＧＦＡ誘導による細胞増殖を無効化する．
本発明の化合物による、細胞を用いたインビトロでのヒトＶＥＧＦＡ阻害を、ＶＥＧＦＡ１６５が用量依存的に増殖を誘導する細胞系アッセイで測定した。本発明の化合物がヒトＶＥＧＦＡ１６５誘導による増殖を無効化する能力を、ヒトＥＣＦＣ（内皮コロニー形成細胞、臍帯血内皮前駆細胞由来）で測定した。ＶＥＧＦＡ抗体と、無関係のヒトＩｇＧ４  ＰＡＡ抗体とを、陽性対照および陰性対照として含めた。
【００９２】
ヒトＥＣＦＣ（Endgenitor Technologies、ロット100506-14-P4）を、コラーゲンでコーティングしたフラスコに入れたEGM-2MV BulletKit（Lonza #CC-4147）に維持する。EGM-2MV Singlequotバッグに含まれている成分を、５００ｍｌのＥＢＭ−２基本培地に加え、最終ＦＢＳ濃度を１０％に調整する（Life Technologies/Invitrogen #10082-147、熱非働化処理済み）。
【００９３】
アッセイでは、継代７〜１２代目のＥＣＦＣを予め加温した細胞播種培地内で２回洗浄し、コラーゲンＩでコーティングした９６ウェルプレート（BD Biocoat #35-4407）の内側６０のウェルに、細胞播種培地１５０μｌ／ウェルあたり４，２００細胞で播種する。２５０μｌの測定用希釈液は、エッジウェル内に入れて蒸発を抑制する。細胞播種培地は、３．３％ＦＢＳ（Life Technologies/Invitrogen #10082-147、熱非働化処理済み）を含有する、アール塩を用いたMedium 199（Ｍ１９９）（Life Technologies/Invitrogen #11150-059）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Thermo Scientific/HyClone #SH30237.01）および１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Thermo Scientific/HyClone #SV30010）で構成される。測定用希釈液は、無血清Ｍ１９９／ＨＥＰＥＳ／ペニシリン−ストレプトマイシンで構成され、０．１％ＢＳＡ（Sigma #A7979、低エンドトキシン）を含有する。細胞は、処理前に３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて６０〜９０分インキュベートする。化合物およびヒトＶＥＧＦＡ１６５を、測定用希釈液で最終濃度の８倍希釈をする。化合物を、測定用希釈液でポリプロピレン製プレート内に１：４で段階希釈する。その後、化合物およびＶＥＧＦＡ１６５を、ポリプロピレン製プレートで１：１比（ｖ／ｖ）で混合し、３７℃で１〜３時間インキュベートする。次いで、化合物／ＶＥＧＦＡ１６５混合物を、１処理につき３連で用意したウェルに５０μｌ／ウェルで細胞に加え、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ２にて計３日間インキュベートする。化合物の最終濃度範囲は０．０４９〜８００ｎＭであり、ヒトＶＥＧＦＡ１６５の最終濃度は０．１６〜０．５ｎＭである。
【００９４】
インキュベーション期間終了の２日前、細胞を、１０μｌ（１μＣｉ）のメチル−３Ｈチミジン（Perkin Elmer #NET027005MC、６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１ｍＣｉ／ｍｌストックをＰＢＳで１：１０に希釈）でパルスする。インキュベーション期間終了時、プレートを−８０℃で凍結させた後、３７℃で１〜２時間融解させる。その後、細胞を蒸留水で９６ウェルガラス線維フィルタープレート（Perkin Elmer UniFilter, GF/C, #6005174）に回収する。フィルタープレートを風乾後、ウェルあたり２０μｌシンチラント（MicroScint 0、Perkin Elmer #6013611）を入れ、取り込ませた３ＨチミジンをPerkin Elmer-Packard TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターで計数する。
【００９５】
ＶＥＧＦＡ１６５誘導による増殖の阻害のＩＣ５０値を、対数変換したＸの値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４で計算する。培地単独の値を曲線の最高点として含め、培地単独のＸ値（濃度）を最高Ｘ値より１００倍高く設定する。また、ＶＥＧＦＡ単独の値を曲線の最低点として含め、ＶＥＧＦＡ単独の濃度を最低値よりも１００倍低く設定する。非線形回帰（曲線フィッティング）分析（シグモイド型用量−反応、可変傾斜）を対数変換したデータに対して実施し、ＩＣ５０値を得る。実験を１回以上実施した場合は、実験間の幾何平均ＩＣ５０値を計算する。
【００９６】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物Ａは、ヒトＶＥＧＦＡ１６５誘導性のＥＣＦＣ増殖を、親ＶＥＧＦＡ抗体およびベバシズマブ（ｎ＝２〜３回実験）双方と同様のレベルまで用量依存的に無効化し、ＩＣ５０値はそれぞれ１．１８ｎＭ、１．３８ｎＭおよび２．６８ｎＭである。
【００９７】
酸素誘発性網膜症モデルにおける病理学的血管新生の抑制．
インビボにおけるＶＥＧＦＡ−Ａｎｇ２二重特異性分子、例えば化合物Ａによる病理学的血管新生の抑制を、マウス網膜の酸素誘発性網膜症モデルで測定する。アッセイを使用して、本発明の化合物が、マウス網膜の病理学的血管新生を抑制する能力を試験する。
【００９８】
このアッセイでは、妊娠雌マウスの仔マウス出産日をＰ０（Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｄａｙ  ０：生後０日）とする。出産後、７日目（Ｐ７）に仔マウスを７５％酸素のチャンバーに入れる。Ｐ１２に、仔マウスを室内空気（２０％酸素）に戻し、比較可能な分子モル量を維持するために、ビヒクル対照（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇ２もしくはＶＥＧＦＡ抗体または１３．５ｍｇ／ｋｇの被験化合物を注射する。Ｐ１５に、仔マウスに同一用量で２回目の注射をする。Ｐ１７に、マウスを屠殺して眼を回収し、ホルマリンに５時間固定してからＰＢＳで洗浄する。
【００９９】
その後、網膜を切除し、１：２００に希釈した抗ＣＤ３１（BD Pharmingen；クローンMEC 13.3；#553370）、および１：２００に希釈した抗ＳＭＡ−ＦＴＩＣ（Sigma; Clone1A4 #F3777）で染色する。抗ＣＤ３１処理した網膜には、１：４００に希釈した抗ラットAlexa-647抗体（Jackson Immuno Research; #712-606-153）を二次抗体として使用する。Nikon Tiを使用して網膜を取得し、病理学的血液内皮細胞構造を包囲している領域、すなわち、全網膜の糸球体微小血管増殖（ＧＭＰ）の定量をFIJIソフトウェアを使用して実施する。共焦点Nikon A1を使用して高倍率画像を取得する。
【０１００】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物Ａ、および親Ａｎｇ２抗体と親ＶＥＧＦＡ抗体との併用処置では、全網膜のＧＭＰ領域は同程度に抑制され、平均（％）はそれぞれ、１７．２０％（標準誤差３．８５３）および１４．１０％（標準誤差３．８２２）であり、ｐ＝０．９７７８である。さらに、化合物Ａは、親Ａｎｇ２抗体処置または親ＶＥＧＦＡ抗体処置を単独で行った場合よりも全網膜のＧＭＰ領域の高い抑制を示し、平均（％）はそれぞれ、８３．０３％（標準誤差４．５４２）、ｐ＜０．０００１、および４０．１４％（標準誤差２．１８９）、ｐ＝０．０２９を示す。これらの結果は、化合物Ａは、Ａｎｇ２抗体とＶＥＧＦＡ抗体の併用処置と同等な機能および効力を維持しただけではなく、各薬剤単体の場合と比較して優れた処置効果も有することを示している。
【０１０１】
表６
【表６】
0006446560.tif 000007
【０１０２】
ＶＥＧＦＡ誘導性の索状形成の阻害
インビトロにおけるＶＥＧＦＡ誘導性の索状形成の阻害をインビトロ共培養系で測定する。アッセイを使用して、本発明の化合物によるＶＥＧＦＡ誘導性の索状形成の阻害を測定する。
【０１０３】
このアッセイでは、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ；Lonza #PT5006、ロット#OF4505-01）を、Corning製培養フラスコ（Corning #431082）でＥＧＭ−２ＭＶ培地（Lonza #CC3202）に入れて培養する。内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ；Lonza、ロット#EGT-ECFC100506r）を、コラーゲンＩでコーティングしたフラスコ（BD Biosciences #356486）で、５％熱非働化処理ＦＢＳ（Gibco #10082-147）を添加したＥＧＭ−２ＭＶ培地に入れて培養する。継代４〜６代目のＡＤＳＣを培養フラスコから回収し、ＤＰＢＳ（Hyclone #SH30028.03）ですすいだ後、TrypLE Express（Gibco #12605-010）で処理する。ＡＤＳＣ細胞をBasal Medium（１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、３０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリンおよび５０μｇ／ｍｌトブラマイシンを添加したMCDC-131（Gibco #10372-019））に懸濁させる。生細胞数を測定し、細胞を黒クリアボトム９６ウェルプレート（BD Falcon #353219）のBasal Medium１００μｌ中にウェルあたり４×１０４細胞を播種する。細胞が接着するよう、５％ＣＯ２で３７℃にて一晩インキュベートする。翌日、継代７〜１０代目のＥＣＦＣを上記のようにBasal Mediumに回収し、生細胞数を４×１０４細胞／ｍｌに調整する。ＡＤＳＣ細胞から培地を除去し、１００μｌのＥＣＦＣ細胞懸濁液を各ウェルに加える。細胞がＡＤＳＣ単層上に沈殿するよう、プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて２〜３時間インキュベートする。本発明の化合物を、Basal Mediumに８０μｇ／ｍｌとなるよう希釈した後、Basal Mediumを用いて１：３に段階希釈し、９点測定用量反応系列を作成する。各希釈度の化合物５０μｌを共培養に加える。Basal Mediumに調製したｒｈＶＥＧＦＡ（R&D #293-VE/CF、ＤＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ）の８０ｎｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを、共培養と化合物とを合わせたものに加える。化合物およびｒｈＶＥＧＦＡの最終濃度はそれぞれ、２０μｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌである。アッセイの陽性対照は化合物を存在させない２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦＡである。アッセイの陰性対照はｒｈＶＥＧＦＡを含まないBasal Mediumである。その後、索状が形成するよう、プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて３日間インキュベートする。
【０１０４】
インキュベーション期間終了時、各ウェルから培地を吸引し、室温の８０％エタノール１００μｌを慎重に加える。プレートを室温で２０分間インキュベートする。エタノール溶液を吸引し、ウェルを１５０μｌのＤＰＢＳで２回洗浄する。抗ｈｕＣＤ３１（R&D #AF806、アフィニティー精製ヒツジＩｇＧ、２００ｕｇ／ｍｌ）およびMAB Anti-Actin、alpha-Smooth Muscle-Cy3（Sigma #C6198）それぞれを、２．５％ＦＢＳ／ＤＰＢＳで１：２５０に希釈する。抗体混合物１００μｌをウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて２時間インキュベートする。その後、プレートを吸引し、ウェルを１５０μｌのＤＰＢＳで２回洗浄する。Alexa Fluor 488ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Life Technologies #A11015）を１：４００に希釈し、Hoescht 33342（Life Technologies #H3570）を２．５％ＦＢＳ／ＤＰＢＳで１：１０００に希釈して、プレートにウェルあたり１００μｌを加える。プレートを遮光し室温で３０分間インキュベートする。その後、ウェルを１５０μｌのＤＰＢＳで２回洗浄する。１５０μｌのＤＰＢＳを各ウェルに加え、プレートを黒粘着シール（PerkinElmer #6050173）で密封する。
【０１０５】
ArrayScan VTI HCS Reader（Cellomics-Thermo Fisher）でTubeFormation Bio-applicationを使用してプレートを読み取る。GraphPad Prism 6で全Tube Area（管腔領域）データをｎＭ単位の化合物濃度に対してプロットする。化合物濃度を対数データに変換し、阻害のＩＣ５０値を非線形回帰（シグモイド型用量−反応、可変傾斜）によって計算する。各実験は、３連の平均値を表しており、３連実験は、幾何平均および９５％信頼区間の計算値で表される。
【０１０６】
本質的に本アッセイに記載の通り実施した実験では、化合物Ａは、ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ共培養系において、ベバシズマブおよび親ＶＥＧＦＡ抗体と同程度にヒトＶＥＧＦＡ誘導性の索状形成を用量依存的に抑制し、平均ＩＣ５０はそれぞれ、１．６８０ｎＭ、１．５７８ｎＭおよび１．５７０ｎＭである（ｎ＝３）。これにより、細胞を用いた本アッセイにおいて、化合物ＡのＶＥＧＦＡ抗体部分が親ＶＥＧＦＡ抗体に匹敵する効力を維持したことが示される。
【０１０７】
化合物Ａはインビボでの腫瘍増殖を抑制する
本発明の化合物の有効性をインビボ異種移植モデルにより測定する。親ＶＥＧＦＡ抗体、化合物Ａ、およびその併用の抗腫瘍効果を、トリプルネガティブ患者由来の乳癌皮下移植モデル（ＥＬ１９９７）および卵巣異種移植皮下モデル（ＳＫＯＶ３ｘ．１）で評価する。腫瘍担持マウスを、ＰＢＳで希釈した化合物を週２回腹腔内注射して処置する。処置期間中、週２回、腫瘍容量の三次元カリパス測定を行って腫瘍増殖を決定する。
【０１０８】
トリプルネガティブ乳癌患者由来異種移植片ＥＬ１９９７：トリプルネガティブ乳癌患者由来の異種移植片ＥＬ１９９７（ＴＮＢＣ  ＰＤＸ）を容量約３５０ｍｍ３担持する免疫不全マウスを、マウス７匹／群で無作為化し、それらをビヒクル対照、親ＶＥＧＦＡ抗体２０ｍｇ／ｋｇ、親Ａｎｇ２抗体２０ｍｇ／ｋｇ、または用量２６．７ｍｇ／ｋｇの抗体Ａで処置する。処置剤を週２回、４週間連続で投与する。
【０１０９】
本質的に記載の通り実施した実験では、親ＶＥＧＦＡ抗体および親Ａｎｇ２抗体による各処置群はそれぞれ、１２％および５６．７％の％Ｔ／Ｃ（腫瘍容量の変化）を示す。化合物Ａは、親ＶＥＧＦＡ抗体と比較した場合の％退縮は−１５．４％、ｐ＝０．０１５１という結果になる。これらの結果から、化合物Ａは、親ＶＥＧＦＡ抗体または親Ａｎｇ２抗体いずれか単剤による処置よりも有効性が高いことが示される。
【０１１０】
卵巣異種移植片ＳＫＯＶ３ｘ．１：卵巣異種移植片ＳＫＯＶ３ｘ．１を容量約２５０ｍｍ３担持する免疫不全マウスを、マウス１０匹／群で無作為化し、それらをビヒクル対照、親ＶＥＧＦＡ抗体１０ｍｇ／ｋｇ、親Ａｎｇ２抗体１０ｍｇ／ｋｇ、親ＶＥＧＦＡ抗体と親Ａｎｇ２抗体１０ｍｇ／ｋｇずつの配合剤、または１３．３ｍｇ／ｋｇ（抗体１０ｍｇ／ｋｇと等モル）の化合物Ａで処置する。処置剤は、週２回、４週間投与してよい。
【０１１１】
本質的に記載の通り実施した実験では、親ＶＥＧＦＡ抗体および親Ａｎｇ２抗体の各単剤処置療法では、％Ｔ／Ｃはそれぞれ、９．６％および３８．５％となる。親ＶＥＧＦＡ抗体と親Ａｎｇ２抗体の配合剤または化合物Ａでは、腫瘍退縮はそれぞれ−８．１％および−２．７％という結果になる。これらの結果から、異種移植モデルでは、化合物Ａは、親ＶＥＧＦＡ抗体または親Ａｎｇ２抗体の単剤よりも有効性が高い可能性があることが示される。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号１（抗体のＨＣＶＲ−化合物Ａ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＳＤＳＳＳＷＹＦＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２（抗体のＨＣ−化合物Ａ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＳＤＳＳＳＷＹＦＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号３（抗体のＨＣ／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ａ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＳＤＳＳＳＷＹＦＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号４（抗体のＬＣＶＲ−化合物Ａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＱＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＲＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＴＩＳＫＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号５（抗体のＬＣ−化合物Ａ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＱＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＲＮＮＬＡＷＹＱＱＫＲＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＴＩＳＫＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６（ｓｃＦｖポリペプチド−化合物Ａ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号７（ｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲ−化合物Ａ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号８（ｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲ−化合物Ａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号９（抗体重鎖／リンカー／ｓｃＦｖポリペプチド−化合物ＡのＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＧＧＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＡＴＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
配列番号１０（抗体軽鎖−化合物ＡのＤＮＡ）
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号１１（ヒトＶＥＧＦＡ１６５）
ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣＤＫＰＲＲ
配列番号１２（ヒトＡｎｇ２）
ＹＮＮＦＲＫＳＭＤＳＩＧＫＫＱＹＱＶＱＨＧＳＣＳＹＴＦＬＬＰＥＭＤＮＣＲＳＳＳＳＰＹＶＳＮＡＶＱＲＤＡＰＬＥＹＤＤＳＶＱＲＬＱＶＬＥＮＩＭＥＮＮＴＱＷＬＭＫＬＥＮＹＩＱＤＮＭＫＫＥＭＶＥＩＱＱＮＡＶＱＮＱＴＡＶＭＩＥＩＧＴＮＬＬＮＱＴＡＥＱＴＲＫＬＴＤＶＥＡＱＶＬＮＱＴＴＲＬＥＬＱＬＬＥＨＳＬＳＴＮＫＬＥＫＱＩＬＤＱＴＳＥＩＮＫＬＱＤＫＮＳＦＬＥＫＫＶＬＡＭＥＤＫＨＩＩＱＬＱＳＩＫＥＥＫＤＱＬＱＶＬＶＳＫＱＮＳＩＩＥＥＬＥＫＫＩＶＴＡＴＶＮＮＳＶＬＱＫＱＱＨＤＬＭＥＴＶＮＮＬＬＴＭＭＳＴＳＮＳＡＫＤＰＴＶＡＫＥＥＱＩＳＦＲＤＣＡＥＶＦＫＳＧＨＴＴＮＧＩＹＴＬＴＦＰＮＳＴＥＥＩＫＡＹＣＤＭＥＡＧＧＧＧＷＴＩＩＱＲＲＥＤＧＳＶＤＦＱＲＴＷＫＥＹＫＶＧＦＧＮＰＳＧＥＹＷＬＧＮＥＦＶＳＱＬＴＮＱＱＲＹＶＬＫＩＨＬＫＤＷＥＧＮＥＡＹＳＬＹＥＨＦＹＬＳＳＥＥＬＮＹＲＩＨＬＫＧＬＴＧＴＡＧＫＩＳＳＩＳＱＰＧＮＤＦＳＴＫＤＧＤＮＤＫＣＩＣＫＣＳＱＭＬＴＧＧＷＷＦＤＡＣＧＰＳＮＬＮＧＭＹＹＰＱＲＱＮＴＮＫＦＮＧＩＫＷＹＹＷＫＧＳＧＹＳＬＫＡＴＴＭＭＩＲＰＡＤＦ
配列番号１３
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１４
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１５
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１６
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１７
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
２つの単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）ポリペプチドに対し２つのリンカーにより融合している抗体を含む化合物であって、
ａ）前記抗体は、同一重鎖（ＨＣ）２本および同一軽鎖（ＬＣ）２本を含み、ここで、各重鎖は、アミノ酸配列が配列番号１に示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、各軽鎖は、アミノ酸配列が配列番号４に示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、
ｂ）前記２つのｓｃＦｖポリペプチドは同一であり、それぞれが、ＬＣＶＲに機能的に結合したＨＣＶＲを含み、ここで、各ＨＣＶＲは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣＶＲは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、かつ
ｃ）前記２つのリンカーは、グリシンに富む同一リンカーであり、それぞれが、前記抗体の１本のＨＣのカルボキシ末端と、前記ｓｃＦｖポリペプチドの一方のアミノ末端とを機能的に結合する、前記化合物。
［２］
前記２つのｓｃＦｖポリペプチドは、それぞれが、１つのｓｃＦｖポリペプチドのＬＣＶＲのアミノ末端に機能的に結合した１つのｓｃＦｖポリペプチドのＨＣＶＲのカルボキシ末端を含む、［１］に記載の化合物。
［３］
前記抗体は、重鎖（ＨＣ）を２本および軽鎖（ＬＣ）を２本含み、各ＨＣは配列番号２のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有し、各ＬＣは配列番号５のうちの１つに示されるアミノ酸配列を有する、［１］または［２］に記載の化合物。
［４］
各ｓｃＦｖポリペプチドは、配列番号６に示される同一アミノ酸配列を有する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物。
［５］
２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む化合物であって、前記第１のポリペプチドの各々は配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記第２のポリペプチドの各々は配列番号５のアミノ酸配列を有する、前記化合物。
［６］
前記第１のポリペプチドの各々は前記第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のポリペプチドは、もう一方の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ前記第１のポリペプチドの各々は７つの鎖内ジスルフィド結合を形成する、［５］に記載の化合物。
［７］
配列番号３に示される第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号５に示される第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を含む哺乳類の細胞であって、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとを含む化合物を発現する能力がある、前記哺乳類細胞。
［８］
配列番号３に示される２つの第１のポリペプチドおよび配列番号５に示される２つの第２のポリペプチドを含む化合物を作製するプロセスであって、前記化合物が発現するような条件下で［７］に記載の哺乳類細胞を培養すること、および前記発現した化合物を回収することを含む、前記プロセス。
［９］
［８］に記載のプロセスによって得ることができる、化合物。
［１０］
［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物、および許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
［１１］
［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
［１２］
前記癌は、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、または肝細胞癌である、［１１］に記載の方法。
［１３］
［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、増殖性網膜症を治療する方法。
［１４］
前記増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、または未熟児網膜症である、［１３］に記載の方法。
［１５］
［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、眼内血管新生性疾患を治療する方法。
［１６］
前記眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である、［１５］に記載の方法。
［１７］
治療で使用するための、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［１８］
癌の治療で使用するための、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［１９］
前記癌は、乳癌、肺癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、または肝細胞癌である、［１８］の使用のための化合物。
［２０］
増殖性網膜症の治療で使用するための、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［２１］
前記増殖性網膜症は、糖尿病網膜症、または未熟児網膜症である、［２０］の使用のための化合物。
［２２］
眼内血管新生性疾患の治療で使用するための、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［２３］
前記眼内血管新生性疾患は、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼内血管新生性疾患、血管再狭窄、または動静脈奇形（ＡＶＭ）である、［２２］の使用のための化合物。
【配列表】
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