(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）及び１つ以上の蚊種に対する殺虫活性を有する、単離されたブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株であって、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４６、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）  株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４５、及びブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４４からなる群から選択される、単離されたブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株。
【請求項２】
前記蚊種が、クレックス・プレビギランス（Ｃｕｌｅｘ  ｐｅｒｖｉｇｉｌａｎｓ）及びオピフェックス・フスクス（Ｏｐｉｆｅｘ  ｆｕｓｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株。
【請求項３】
生物学的に純粋な培養物の形態である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の単離されたブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株。
【請求項４】
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４６の生物学的に純粋な培養物。
【請求項５】
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４５の生物学的に純粋な培養物。
【請求項６】
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株ＮＭＩ  Ｎｏ．  Ｖ１２／００１９４４の生物学的に純粋な培養物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の１つ以上のＢ．  ラテロスポルス（Ｂ．  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株、又は請求項４〜６のいずれか１項に記載の１つ以上の培養物、及び農業的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２つ又は３つのＢ．  ラテロスポルス（Ｂ．  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株、又は請求項４〜６のいずれか１項に記載の２つ又は３つの培養物を含有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
殺虫組成物である、請求項７又は８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の害虫を防除する方法であって、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項１〜３のいずれか１項に記載の１つ以上のＢ．  ラテロスポルス（Ｂ．  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）株、又は請求項４〜６のいずれか１項に記載の１つ以上の培養物を、１つ以上の害虫に接触させる工程を含む、当該方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の害虫が昆虫である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の昆虫である害虫が、鱗翅目種及び双翅目種から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の昆虫が鱗翅目種である、請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記鱗翅目がトルトリシダエ（Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ）又はプルテリダエ（Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記鱗翅目種がコナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）及びキャベツルーパーモス（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記鱗翅目種が、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、コモンフォレストルーパーモス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｒｅｍｉａ  ｓｕａｖｉｓ）、コットンボールワームモス（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｍｉｇｅｒａ）、ライトブラウンアップルモス（Ｅｐｉｐｈｙａｓ  ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、ブラックレグドリーフローラーモス（Ｐｌａｎｏｔｏｒｔｒｉｘ  ｎｏｔｏｐｈａｅａ）、及びブラックライアリーフローラーモス（Ｃｎｅｐｈａｓｉａ  ｊａｃｔａｔａｎａ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記双翅目種が蚊種である請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記蚊種が、クレックス・プレビギランス（Ｃｕｌｅｘ  ｐｅｒｖｉｇｉｌａｎｓ）及びオピフェックス・フスクス（Ｏｐｉｆｅｘ  ｆｕｓｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記害虫が線形動物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記線形動物がマイクロワームである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マイクロワームがパナグレルス・レディビブス（Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ  ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記害虫がカリバチである、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記カリバチがベスプラ・ブルガリス（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の新規株及びこれを含有する組成物に関する。また、当該株及び組成物を使用したコナガ及び蚊を含む害虫の生物学的防除の方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
害虫は、現代の農業において、顕著な経済的支出を強いるものである。現行の農業システムは、広大な領域に渡り１つの又は幾つかの作物又は植物種を生育することを要する。そのような生態学的にアンバランスな系は、害虫による被害を受けやすい。
【０００３】
幾つかの害虫は、ヒトを含む動物の健康に対しても有害である。例えば、蚊は様々な疾病を運搬することが知られている。従って、それらは、疾病の蔓延における運搬体として作用する。
【０００４】
伝統的に、害虫の防除は、化学的な殺昆虫剤や殺虫剤を使用して行われてきた。しかしながら、消費者は、化学的残留物やそれらの動物及び植物の健康並びに環境に対する影響について注目するようになっている。更に、多くの害虫が、殺虫剤や殺昆虫剤に対する耐性を獲得しつつある。
【０００５】
生物学的防除は、化学物質に対する依存を減少させる、害虫防除の代替的手段を提供する。そのような「天然の」方法は、公衆に受け入れられやすく、化学的防除方法よりも有効で持続する場合がある。
【０００６】
細菌、酵母及び真菌を含む幅広い範囲の生物学的防除剤が、害虫防除への使用を検討されている。殺昆虫剤として使用される細菌として広く研究されている種は、バチルス（Bacillus）である。
【０００７】
バチルス属は、動物や植物の健康に対して有害なものや、昆虫の防除に有用なもの等、様々な性質を有する広範な細菌種を含んでいる。
【０００８】
特に、バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（Bt）は、Thuricide（登録商標）やDipel(登録商標)等の製品として市販されている、周知の生物学的防除剤である。
【０００９】
近年、Btに対する耐性を持った害虫が出現している。例えばTabashnik et al (1990); Baxter et al (2011);及びTabashnik et al (1998)を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、昆虫を含む害虫の防除に使用される新規バチルス種の需要は尚も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人は、生物防除剤として有効な多くの新規ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）を同定した。
【００１２】
本発明の一つの目的は、生物防除剤として有用な新規B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を提供することである。他の目的は、本発明の新規B. ラテロスポルス（B. laterosporus）の１つ以上を含有する組成物を提供すること；及び／又は少なくとも公衆に対して有用な選択肢を提供することである。
【００１３】
本発明の一つの側面において、１つ以上の鱗翅目種及び１つ以上の双翅目種に対する殺虫活性を有する、単離されたブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株が提供される。
【００１４】
一つの態様において、前記１つ以上の鱗翅目種が、コナガ(Plutella xylostella)である。
【００１５】
一つの態様において、前記１つ以上の鱗翅目種が、キャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)である。
【００１６】
一つの態様において、前記鱗翅目種が、ハマキガ科（Tortricidae）及びコナガ科(Plutellidae)からなる群から選択される。
【００１７】
更なる態様において、前記双翅目種が蚊種である。
【００１８】
更なる態様において、前記蚊種が、クレックス・プレビギランス（Culex pervigilans）及びオピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）からなる群から選択される。
【００１９】
更なる態様において、前記B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株は、１つ以上のコナガ(Plutella xylostella)及びクレックス・プレビギランス（Culex pervigilans）及びオピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）から選択される１つ以上の蚊種に対する殺虫活性を有する。
【００２０】
一つの態様において、前記B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株は、生物学的に純粋な培養物の形態である。
【００２１】
前記単離されたB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株又は生物学的に純粋な培養物は、NMI No. V12/001946、NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944から選択される株であってもよい。
【００２２】
一つの側面において、本発明は、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株NMI No. V12/001946の生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００２３】
更なる側面において、本発明は、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株NMI No. V12/001945の生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００２４】
更なる側面において、本発明は、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株NMI No. V12/001944の生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００２５】
他の側面において、本発明は、本発明の１つ以上のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株及び農業的に許容される担体を含有する組成物を提供する。
【００２６】
一つの側面において、本発明は、NMI No. V12/001946, NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944から選択されるB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株、並びに農業的に許容される担体を含有する組成物を提供する。
【００２７】
一つの態様において、前記組成物は、本発明の２つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を含有してもよい。他の側面において、前記組成物は、本発明の３つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を含有してもよい。
【００２８】
一つの側面において、前記組成物は、NMI No. V12/001946, NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944から選択される１つ以上のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株、並びに農業的に許容される担体から本質的に構成される。
【００２９】
一つの態様において、前記組成物は、本発明の２つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株、並びに農業的に許容される担体から本質的に構成される。他の態様において、前記組成物は、本発明の２つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株から本質的に構成される。
【００３０】
一つの態様における組成物は、殺虫組成物である。
【００３１】
他の側面において、本発明は、１つ以上の害虫を防除する方法を提供し、当該方法は、１つ以上の本発明の組成物を、１つ以上の害虫に接触させる工程を含む。
【００３２】
他の側面において、本発明は、１つ以上の害虫を防除する方法を提供し、当該方法は、１つ以上の本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を、１つ以上の害虫に接触させる工程を含む。
【００３３】
好ましくは、前記１つ以上の害虫は、昆虫の害虫であり、より好ましくは、当該１つ以上の害虫は、鱗翅目及び双翅目から選択される。
【００３４】
本発明の方法における、本発明の株又は組成物の施用は、２種類以上の害虫を防除する場合もある。
【００３５】
従って、更なる態様において、前記１つ以上の害虫は、鱗翅目、双翅目又はそれらの両方から選択される、昆虫の害虫である。
【００３６】
一つの態様において、前記１つ以上の昆虫の害虫は、コナガ及び蚊から選択される昆虫の害虫である。
【００３７】
更なる態様において、前記１つ以上の昆虫の害虫は、コナガ、蚊、又はそれらの両方から選択される昆虫の害虫である。
【００３８】
一つの態様において、前記鱗翅目は、トルトリシダエ（Tortricidae）、プルテリダエ（Plutellidae）及びノクツイダエ（Noctuidae）から選択される。特定の態様において、前記鱗翅目は、トルトリシダエ（Tortricidae）及びプルテリダエ（Plutellidae）から選択される。
【００３９】
他の態様において、前記１つ以上の昆虫の害虫は、蛾である。一つの態様における蛾は、コナガ(Plutella xylostella)、キャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)、コドリンガ(Cydia pomonella)、コモンフォレストルーパーモス(Pseudocoremia suavis)、コットンボールワームモス(Helicoverpa armmigera)、ライトブラウンアップルモス(Epiphyas postvittana)、ブラックレグドリーフローラーモス(Planotortrix notophaea)、及びブラックライアリーフローラーモス(Cnephasia jactatana)からなる群から選択される。
【００４０】
他の態様において、前記害虫は、線形動物である。特定の態様において、前記線形動物は、マイクロワームである。好ましくは、前記マイクロワームは、パナグレルス・レディビブス（Panagrellus redivivus）である。
【００４１】
他の態様において、前記昆虫の害虫はカリバチである。特定の態様において、前記カリバチは、ベスプラ・ブルガリス（Vespula vulgaris）である。
【００４２】
他の態様において、前記昆虫の害虫は、マヌカビートル（ピロンタ  ｓｐ．（Pyronta sp.））である。
【００４３】
定義
本明細書中、「殺虫剤」という用語は、虫の死滅又は増殖の抑制に作用する薬剤を指す。
【００４４】
本明細書中、「接触」という用語は、害虫の防除に硬化を発揮するように、害虫に対して本発明の組成物又は株を提供することを指す。最も通常の接触は、本発明の組成物又は株を含有する材料を害虫に摂食させることを含み得るが、これに限定されない。従って、「接触」は、摂食を含む。
【００４５】
本明細書中、「防除」、「防除すること」、「生物防除」又は「生物学的防除」は、害虫、特に昆虫の害虫の数を、本発明の株又は組成物を使用することによって減少させることを指す。一般的に想定されることは、数の減少、又は害虫の根絶、又はそれらの繁殖速度を低下させることである。
【００４６】
本明細書中、「含む」とは、「少なくとも一部を構成する」ことを意味する。本明細書中で、用語「含む」を含む各文言を解釈するとき、当該用語に隣接するもの以外の特徴も存在し得る。これに関連する「含有する」、「包含する」等の用語も同様に解釈されるべきである。
【００４７】
本明細書中、用語「本質的に構成される」とは、言及されるものの他に、当該ものの基本的な特徴を物質的に変化させない他のものの存在を許容することを指す。
【００４８】
用語「農業的に許容される担体」は、水及び油、又は助剤、分散剤、接着剤、湿潤剤（wettant）、界面活性剤、保湿剤、粘着付与剤等の、殺虫組成物を含む防除組成物の調製に使用されることが当初から知られている、当該技術分野で公知の全ての液体及び固体の担体を包含する。
【００４９】
本明細書中、用語「有効量」は、害虫、特に昆虫の害虫を防除又は根絶するのに有効な量を意味する。
【００５０】
本明細書中、「生物学的に純粋な培養物」又は「生物学的に純粋な単離物」は、９０％以上、好ましくは95%以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９％以上のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を含有する、本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株の培養物を指す。
【００５１】
本明細書中、「害虫」は、ヒトに対して都合の悪い生物を意味する。一つの態様において、当該用語は、ヒトを含む動物、又は植物に対して被害を及ぼす生物を意味する。被害とは、動物又は植物の健康、成長、収量、繁殖又は生存率に関するものであってもよく、外観上の被害であってもよい。好ましくは、被害とは、商業的重要性に関するものである。好ましい態様において、「害虫」とは、植物に対して被害を及ぼす生物を意味する。好ましくは、植物とは、栽培植物である。
【００５２】
一つの側面において、本発明は、昆虫、特に鱗翅目及び双翅目を含む害虫を含む害虫に対して活性を有するブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株に関する。
【００５３】
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）は、幾つかの昆虫種に対して病原性が知られている、嫌気性の胞子を形成する昆虫病原性細菌である。バチルス・ツリンギエンシス（thuringiensis）と同様に、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）は、胞子嚢が溶解した後に胞子の一端に形成される典型的なカヌー状パラスポラルボディ（ＣＳＰＢ）が形成されることを特徴とする。
【００５４】
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）は、寄生性の線形動物(Bone and Singer, 1991; Huang et al., 2005; Singer, 1996)、軟体動物、鞘翅目(Boets et al., 2004; Schnepf et al., 2003; Singer, 1996; Singer et al., 1997)、双翅目(Favret and Yousten, 1985; Rivers et al., 1991)、及び鱗翅目のアンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）(De Oliveira et al., 2004)の卵や幼虫に対する病原性を有するものとして記録されている。様々なB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株において、様々な毒性因子が記録されている(Favret and Yousten, 1985; Rivers et al., 1991; Zahner et al., 1999)。
【００５５】
B. ラテロスポルス（B. laterosporus）の傷害活性とその胞子及び結晶との協調は、ネッタイシマカのアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）を含む双翅目の幼虫に対するバイオアッセイにおいて、Orlova et al. (1998)により最初に実証された。この蚊は、黄熱病や、デング熱及びチクングンヤ熱等の他の疾患の媒体と見なされている。ブヨ(Simulium vittatum);蚊(Culex quinquefasciatus and Aedes aegypti) (Favret and Yousten, 1985; Rivers et al., 1991);及びウマアブ(Musca domestica (Ruiu et al. 2006))の幼虫に対する活性も報告されている（EP2,079,314）。
【００５６】
鞘翅目に対するB. ラテロスポルス（B. laterosporus）の活性は、最初に、予備的なバイオアッセイにおいて報告された。当該鞘翅目は、タバコシバンムシのラシオデルマ・セリコルネ（Lasioderma serricorne）及びコロラドハムシのレプチノタルサ・デケムリネアタ(Leptinotarsa decemlineata)を含む(Rivers et al., 1991)。様々なB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株の、コーンルートワームのジアブラティカ（Diabratica）類に対する活性が報告されている(Aronson et al., 1991; Schnepf et al., 2002; Boets et al., 2011)。コーンルートワームは、トウモロコシ作物の主要な農業的害虫である。
【００５７】
De Oliveira et al. (2004)は、穀物の被害に関連する害虫であるメキシカンコットンボールウィービルのアントノムス・グランディス（Anthonomus grandis）に対する高い毒性を報告した。ベルベットビーンキャタピラーのアンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）に対する鱗翅目活性も、同一の研究において報告された。
【００５８】
しかしながら、現在までに、双翅目及び鱗翅目の両方に対する株の活性を議論する報告は存在しない。Rivers et al. (1991)は、芋虫、蚊及び鞘翅目(コロラドハムシ)に対して２８種類の株をスクリーニングしたが、芋虫に対する活性は見られず、他の２つの群に対する活性が見られた。Favret及びYousten (1985)も、蚊に対する活性を確認したが、鱗翅目に対する活性は見出さなかった。
【００５９】
驚くべきことに、出願人は、幾つかの鱗翅目及び双翅目の両方を含む様々な昆虫の害虫に対して活性を有するブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の株を同定した。特に、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の３つの株が、アブラナの種子及びニュージーランドの土壌から単離された。スクリーニングアッセイは、３つの株のいずれも、コナガの幼虫(Plutella xylostella)及び蚊の幼虫(クレックス・ペルビギランス（Culex pervigilans）及びオピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）)の両方に対する活性を有することを示した。
【００６０】
これらの３つの新しいブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）株は、いずれも、特許手続のためのブダペスト条約に従い、2012年12月に、National Measurement Institute Laboratories (NMI), Suakin Street, Pymble, New South Walesに寄託された。当該単離物は、それぞれ受託番号NMI No. V12/001946、NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944として記録された。
【００６１】
当該単離物を取得するのに採用された単離及び選択プロセスは、実施例に記載する。本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）の形態的及び生理的特徴は、実施例３に示す。
【００６２】
出願人は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NMI No. V12/001946、NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944を、単離された形態で初めて提供する者である。
【００６３】
一つの態様において、本発明は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus） NMI No. V12/001946を提供する。
【００６４】
他の態様において、本発明は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus） NMI No. V12/001945を提供する。
【００６５】
他の態様において、本発明は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus） NMI No. V12/001944を提供する。
【００６６】
一つの態様において、本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株が単離される。好ましくは、当該株は、生物学的に純粋な培養物の形態で単離される。
【００６７】
本発明の株は、幾つかの鱗翅目及び双翅目の両方を含む広範な昆虫の害虫に対する殺虫剤活性を示した。３つの株のいずれも、殺虫活性が初めて示されたものである。より好ましくは、これらの株のいずれも、コナガ及び蚊の両方に対して活性を有する。
【００６８】
NMI No. V12/001946株の殺虫活性は：コドリンガ(Cydia pomonella)、コモンフォレストルーパーモス(Pseudocoremia suavis)、コットンボールワームモス(Helicoverpa armmigera)、ブラックライアリーフローラーモス(Cnephasia jactatana)、ブラックレグドリーフローラーモス(Planotortrix notophaea)、ライトブラウンアップルモス(Epiphyas postvittana)、マヌカビートル（ピロンタ  ｓｐ．（Pyronta sp.））、及びカリバチ（ベスプラ・ブルガリス（Vespula vulgaris））を含む、他の広範な昆虫の害虫に対しても示されている。
【００６９】
キャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)に対するNMI No's V12/001944及びV12/001945株の活性も実証された。
【００７０】
NMI No. V12/001944株は、コトリンガ(Cydia pomonella)に対しても活性を有する。
【００７１】
NMI No. V12/001944及びNMI No. V12/001946は、線形動物のマイクロワーム(Panagrellus redivivus)に対しても活性が示された。
【００７２】
本発明の株は、レピドプテラ・トルトリシダエLepidoptera Tortricidae）及びレピドプテラ・プルテリダエ（Lepidoptera Plutellidae）の科に対する特定の用途を有し得る。レピドプテラ・ノルツイダエ（Lepidoptera Noctuidae）に対しても、一定の活性が示されている。
【００７３】
上記昆虫の害虫は、植物及び動物の両方の健康における広範な問題を引き起こす重大な問題となるものである。特に蛾の類は、農業及び園芸作物における顕著な経済的損失の原因となる。例えば、現在、コナガ（ＤＢＭ）の防除のために世界で１０億ドルが消費されている。
【００７４】
蚊の防除には、年間４億ドル以上が費やされている。
【００７５】
一つの態様において、本発明の単離された株は、１つ以上の鱗翅目の種、及び１つ以上の双翅目の種に対する殺虫剤活性を有する。
【００７６】
一つの態様において、前記鱗翅目の種は、トルトリシダエ（Tortricidae）、プルテリダエ（Plutellidae）、ノクツイダエ（Noctuidae）及びゲオメトリダエ（Geometridae）から選択される科である。
【００７７】
好ましいトルトリシダエ種は、コドリンガ(Cydia pomonella)、ライトブラウンアップルモス(Epiphyas postvittana)、ブラックレグドリーフローラーモス(Planotortrix notophaea) 及びブラックライアリーフローラーモス(Cnephasia jactatana)を含む。
【００７８】
好ましいプルテリダエ種は、コナガ(Plutella xyostella)を含む。
【００７９】
好ましいノクツイダエ種は、キャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)及びコットンボールワームモス(Helicoverpa armmigera)を含む。
【００８０】
好ましいゲオメトリダエ種は、コモンフォレストルーパー(Pseudocoremia suavis)である。
【００８１】
一つの態様において、双翅目の種は、蚊科のものである。
【００８２】
好ましい蚊の種は、オピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）及びクレックス・プレビギランス（Culex pervigilans）を含む。
【００８３】
また、本発明は、１つ以上の本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株及び農業的に許容される担体を含有する組成物も提供する。
【００８４】
一つの態様において、本発明は、
(a)   B. ラテロスポルス（B. laterosporus）NMI No. V12/001946
(b)   B. ラテロスポルス（B. laterosporus）NMI No. V12/001945
(c)   B. ラテロスポルス（B. laterosporus）NMI No. V12/001944
から選択される１つ以上のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株、及び農業的に許容される担体又は助剤を含有する組成物を提供する。
【００８５】
当該組成物は、２つ以上の本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株の組み合わせを含有してもよい。当該組み合わせとは、（a）及び（ｂ）、（a）及び（ｃ）又は（ｂ）及び（ｃ）である。一つの態様において、当該組成物は、本発明の３つの株を全て含有してもよい。
【００８６】
本発明の株は、目的の害虫を防除するのに有効な量で、前記組成物中に存在する。当該有効濃度は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）が使用される形態、前記組成物が施用される環境、蔓延する害虫の種類、密度及び程度；温度；季節；湿度；植物が生長する季節における段階；植物の生長度；施用の方法、速度及び頻度；施用されている公知の殺真菌剤や殺虫剤の数及び種類、及び植物の処理（例えば剪定、放牧及び灌漑）に依存して変化し得る。全ての要素が、前記組成物の製剤化において考慮され得る。
【００８７】
本発明の組成物は、１つ以上の本発明の毒素を生産するB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株と所望の農業的担体とを混合することにより生産されてもよい。
【００８８】
典型的には、前記生産物は、噴霧用に製剤化された、胞子及び結晶を分離していない、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）の発酵材料を含有してもよい。発酵材料は、２日以上、典型的には４日経過したものを使用し得る。前記組成物におけるB. ラテロスポルス（B. laterosporus）は、細胞懸濁物として、所望の農業的担体を用いて製剤化される。当該細胞は、直接、又は胞子若しくは結晶を介して、殺虫性の毒素を生産する。
【００８９】
B. ラテロスポルス（B. laterosporus）の典型的な濃度範囲は、無傷の細胞の形態で前記組成物中に存在する場合、1 x 103〜1 x 1014、好ましくは1 x 104〜1 x 1010、より好ましくは1 x 106〜1 x 108 cells/mgである。細胞濃度が1 x 1011〜1 x 1014のオーダーの組成物が調製され、必要に応じて施用前に希釈されるのが好ましい。
【００９０】
B. ラテロスポルス（B. laterosporus）は、当該技術分野で公知の標準的な乾燥及び発酵技術を使用して前記組成物における使用のために調製され得る。増殖は、増殖に適した温度及びｐＨの培養槽中、好気条件下で実施される。典型的な増殖温度は１５〜３７℃、通常は２７〜３２℃である。
【００９１】
増殖培地は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）培養に適した任意の公知の培地であってもよい。例えば、Nutrient Yeast Extract Salt Medium (NYSM) (Favret, and Youstein 1985)が用いられる。
【００９２】
前記株は、公知の洗浄、濾過、又は遠心分離等の沈降技術を使用して回収されてもよく、又はサイクロン系を使用して回収されてもよい。回収された細胞は、直ちに使用されてもよく、又は低音条件下（例えば4℃）で保存されてもよく、又は凍結乾燥されてもよい。好ましくは細胞は回収直後に使用されるべきである。
【００９３】
また、前記細胞は、活性細胞抽出物、細胞懸濁物、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上澄、細胞濾過物、細胞ペレットを生産するために使用される前に処理されてもよく、又は全形の細胞の調製品として使用されてもよい。
【００９４】
本発明の組成物は、保湿剤、拡散剤、粘着付与剤、界面活性剤、安定化剤、浸透剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、緩衝剤、接着剤及び殺虫又は防除組成物の分野で典型的に採用される他の成分を含有してもよい。
【００９５】
本発明の組成物は液体であっても固体であってもよく、液体組成物は典型的には水、生理食塩水又は植物油や鉱物油等の油を含有する。本発明で使用出来る植物油の例は、大豆油及びココナッツ油である。
【００９６】
前記組成物は、噴霧、懸濁、濃縮、泡塊、灌注(drench)、スラリー、注射、ゲル、浸漬、ペースト等の形態であってもよい。液体組成物は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）細胞と液体の農業的に許容される担体とを混合することにより調製されてもよい。液体組成物を生産するために、公知の製剤技術が使用され得る。
【００９７】
一つの態様において、前記組成物は固体の形態である。当該組成物は、本発明の液体組成物を乾燥させることにより生産されてもよい。あるいは、本発明で使用される固体組成物は、本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）細胞と、様々な無機又は生物材料とを混合することにより調製されてもよい。例えば、固体の無機的な農業的担体は、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、軽石、石灰、ベントナイト、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。固体の生物材料は、粉末化したパーム外皮、トウモロコシの軸や鞘、及びナッツの殻を含んでもよい。
【００９８】
前記組成物は、粉塵、顆粒、種子コーティング、水和粉末等として製剤化されてもよい。当該組成物は、施用の際液体組成物を提供するように製剤化されてもよい。
【００９９】
本発明の組成物は、調整放出、又は持続放出製剤の形態であってもよい。
【０１００】
本発明の組成物は、殺虫剤、殺昆虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺ウイルス剤、増殖促進剤、栄養剤、発芽促進剤等の他の制御剤を、本発明のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株の機能に適合するものである限り、含有してもよい。
【０１０１】
本発明の株が直接使用される場合、上記で議論した株、調製及び適用の組み合わせと同様のものが適用される。
【０１０２】
他の側面において、本発明は、害虫を防除する方法を提供し、当該方法は、本発明の組成物を害虫に接触させることを含む。
【０１０３】
他の態様において、本発明は、害虫を防除する方法を提供し、当該方法は、本発明の１つ以上のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株を害虫に接触させることを含む。
【０１０４】
一つの態様において、本発明の方法により防除される害虫は、昆虫及び線形動物から選択される。
【０１０５】
線形動物として好ましくはマイクロワームを含む。好ましいマイクロワームは、パナグレルス・レジビブス（Panagrellus redivivus）である。
【０１０６】
一つの態様において、前記害虫は昆虫である。
【０１０７】
一つの態様において、前記昆虫は、鱗翅目、双翅目、膜翅目及び鞘翅目からなる群から選択される。
【０１０８】
一つの態様において、前記鱗翅目は、トルトリシダエ（Tortricidae）、プルテリダエ（Plutellidae）、ノクツイダエ（Noctuidae）及びゲオメトリダエ（Geometridae）から選択される科である。
【０１０９】
好ましいトルトリシダエ種は、コドリンガ(Cydia pomonella)、ライトブラウンアップルモス(Epiphyas postvittana)、ブラックレグドリーフローラーモス(Planotortrix notophaea) 及びブラックライアリーフローラーモス(Cnephasia jactatana)を含む。
【０１１０】
好ましいプルテリダエ種は、コナガ(Plutella xyostella)である。
【０１１１】
好ましいノクツイダエ種は、キャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)及びコットンボールワームモス(Helicoverpa armmigera)を含む。
【０１１２】
好ましいゲオメトリダエ種は、コモンフォレストルーパー(Pseudocoremia suavis)である。
【０１１３】
一つの態様において、双翅目の種は、蚊科のものである。
【０１１４】
好ましい蚊の種は、オピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）及びクレックス・プレビギランス（Culex pervigilans）を含む。
【０１１５】
一つの態様において、膜翅目の種は、スズメバチ科のものである。
【０１１６】
好ましいスズメバチ科の種は、カリバチ（Vespula vulgaris）である。
【０１１７】
一つの態様において、鞘翅目の種は、コガネムシ科から選択される。
【０１１８】
好ましいコガネムシ科の種は、マヌカビートル(Pyronta sp)である。好ましいピロンタ種は、ピロンタ・フェスティバ（Pyronta festiva）である。
【０１１９】
一つの態様において、本発明の組成物又は株は、害虫に直接施用される。例えば、噴霧、浸漬、散布等により施用される。
【０１２０】
他の態様において、本発明の組成物又は株は、害虫の存在する環境、典型的には保護される植物又は動物、設備、土壌又は大気に施用される。利用可能な施用技術として、噴霧、粉塵、浸漬、種子コーティング、葉上噴霧、ミスト、エアロゾル、及び燻蒸が挙げられる。
【０１２１】
一つの態様において、本発明の組成物又は株は、植物又は動物の典型的には表面に、又は害虫が摂食する部分に施用される。
【０１２２】
施用は、１回だけ、又は必要に応じて反復して実施され得る。植物の生活環における複数の異なる時点での施用も想定される。例えば、害虫による収穫後の被害を予防し、又は最小にするため、収穫時に施用される。
【０１２３】
より一般的には、本発明の組成物又は株は、苗の時に、及び周期的に植物に施用され、施用率は、1010〜1014胞子／ヘクタール、好ましくは101２〜101３胞子／ヘクタールである。
【０１２４】
典型的な施用率は、50g/ヘクタール〜10,000g/ヘクタールであってもよい。通常は100g/ヘクタール〜5,000g/ヘクタール、又は500〜1500g/ヘクタールである。
【０１２５】
本発明の組成物を使用して、様々な植物が処理されてもよい。そのような植物として、穀物、野菜及び耕地作物、芝生（grasses、lawns）、牧草、果樹並びに観葉樹及び植物が挙げられる。
【０１２６】
本発明の組成物及び株の使用によって特に利益を受ける耕地植物として、アブラナ科の植物（crucifers及びbrassicas）が挙げられる。例えば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ及びチンゲン菜である。
【０１２７】
施用のために製剤化されるとき、本発明の組成物は、典型的には、製剤中に、1〜99重量％、5〜95重量％、10〜90重量％、15〜85重量％、20〜80重量％、30〜70重量％、又は40〜60重量％の濃度で存在してもよい。
【０１２８】
添付した図面を参照して、本発明が記述される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、宿主域の研究において使用されたバイオアッセイの図表示を示す。
【図２】図２は、ライトブラウンアップルモスのアッセイの図表示を示す。
【図３】図３は、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NMI No. V12/0001946、NMI No. V12/0001945及びNMI No. V12/0001944；並びにイタリアのB. ラテロスポルス（B. laterosporus） NCIMB41419、並びにエルウィニア  ｓｐ．（Erwinia sp．）(ICMP)株の、コナガ幼虫に対する活性の比較を示す一連のグラフを示す(n=10, 22℃)。
【図４】図４は、蚊のクレックス・ペルビギランス（Culex pervigilans）及びオピフェックス・フスクス（Opifex fuscus）に対するB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NMI No. V12/001946の活性を示す棒グラフを示す。処理は、単離NMI No. V12/001946 =１０ｍｌ中500 μl、NMI No. V12/001946  =１０ｍｌ中50 μｌ及びNMI No. V12/001946 (1821-2) =１０ｍｌ中5 μl(500 ppm)である。
【図５】図５は、各蚊の幼虫に対して１ｍｌの水当たり、NMI No. V12/001946、NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944、ICMP又はNCIMB41419の細菌懸濁物２０μｌを施用した、クレックス・ペルビギランス蚊の死亡率を示す棒グラフを示す。各希釈において１２匹の幼虫が独立して処理された。
【図６】図６は、Ｂｔ  Ｃｒｙ１Ａ耐性（図８Ａ）及び感受性（図８Ｂ）キャベツルーパートリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni）に対するNMI No. V12/001944及びV12/001945の効果を示す棒グラフを示す。
【図７】図７は、Ｃｒｙ  １Ａ耐性プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）(DBM)と、Ｃｒｙ１Ａ感受性ＤＢＭの第二齢幼虫との間のV12/001944希釈溶液に対する応答の比較を示すグラフを示す。
【図８】図８は、コドリンガの幼虫に対するNMI No. V12/001944の効果を示すグラフを示す。
【図９】図９は、V12/001946及びV12/001944で処理したマイクロワームの生存率を示す棒グラフを示す。評定は、生存数において５段階の尺度である。
【図１０】図１０は、NMI Nos V12/001944、V12/001945及びV12/001946、並びにイタリア株NCIMB41419の各株を同定するのに使用された16ｓ  ｒＤＮＡ配列の多重配列アラインメントを示す。ダッシュ（―）は、直上の配列と同一のヌクレオチドを意味する。
【実施例】
【０１３０】
下記非限定的な実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を何ら限定しない。
【０１３１】
実施例１−ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の選択のプロセス
害虫及びアブラナ科植物の病害に対する新規生物防除剤の探索の一部として、ブロッコリー、キャベツ、コールラビ及びチンゲン菜の野菜、並びにケール、葉株（Ｌｅａｆ  ｔｕｒｎｉｐ）、セイヨウアブラナ及びスウェードの試料植物の８種類のアブラナ科植物の３６個の種ロットから、微生物が単離された。
【０１３２】
全部で８１１個の微生物が単離され、標準的な微生物培地で純粋培養された。微生物の構成は、細菌の単離物584個、真菌の単離物２２７個であった。
【０１３３】
殆どの微生物は、不滅菌の種子から生じた（８４％）。バチリ（Bacilli）を形成する種は回収された細菌単離物の７４％を占めるが、ブレビバチルス（Brevibacillus）属に属する単離物は２つだけであった。
【０１３４】
２１種類の微生物（細菌単離物が１７種類、真菌が４種類）の生物活性を、切断葉アッセイを使用して、コナガ幼虫、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）に対して評価した。Lincoln Universityのカルチャーコレクションから細菌種２種類及び真菌６種類も、Ｐ．キシロステラに対する活性が追加でスクリーニングされた。葉の表面を細菌及び真菌の溶液で汚染し、これを幼虫に摂食させ、死亡率をモニタリングした。このスクリーニングで、１つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）単離物が同定された。同一の種類の更なる単離物が、残りの単離物の中から見いだされ、同様にＰ．キシロステラに対してスクリーニングされ、活性が示された。
【０１３５】
無関係のプログラムにおいて、滅菌されたジャガイモの匍匐枝表面から、更なるB. ラテロスポルス（B. laterosporus）の単離物が取得された。これも、葉アッセイにおいて、ＤＢＭの幼虫に対して活性を示した。これらの株は、更なる生物アッセイに供され、識別が確認された。
【０１３６】
実施例２−ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の単離  
ニュージーランドの植物又は種子から、３種類のB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株が単離された。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒの単離プレート上に形成されたコロニーを滅菌ループを使用して選択し、新しいプレートに展開して、純粋な培養物を取得した。
【０１３７】
NMI No. NMI No. V12/001946は、South Pacific Seeds (NZ) Ltdから取得されたハイブリッドキャベツ種子から単離された。 
【０１３８】
NMI No. NMI No. V12/001945は、PGG Wrightson Seeds Ltd, New Zealandから取得されたフォレージレイプ種子から単離された。
【０１３９】
NMI No. NMI No. V12/001944は、Southbridge, New Zealand付近の商業的農場からのジャガイモ植物（ｃｖイラムハーディ（Ilam hardy）から単離された。
【０１４０】
単離手順
アブラナの種子において、種子の実滅菌の表面から細菌がＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒの表面に単離された。各コロニーを純粋培養した。
【０１４１】
ジャガイモ植物において、匍匐枝を熱処理（80℃20分）し、表面を滅菌し（２％次亜塩素酸ナトリウム中５分間）、そして組織を浸漬し、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ上に展開した。
【０１４２】
実施例３−形態的及び生理的同定
全ての単離物を、ブレビバチルスの特徴を検査するために、光学顕微鏡を使用して同定した。
【０１４３】
API 50CH (bioMerieux)を用いた生化学的特定
市販の基質利用キットAPI 50CH (bioMerieux)を説明書に従って使用して、NMI No V12/001946及びNMI No. V12/001945を更に同定した。説明書の勧めに従い、それぞれAPI 50 CHB/E培地中の細菌を播種した。bioMerieuxによる同一性のチェックから、それらのデータベース上でB. ラテロスポルス（B. laterosporus）と９９．９％の同一性を示した。
【０１４４】
形態学的特性
ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）は、好気性、グラム陽性、芽胞形成細菌であり、通性嫌気性菌でもある(Shida et al., 1996)。
【０１４５】
３種類のブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）NMI No. V12/001946、NMI No. V12/001945及びNMI No. V12/001944は、当該種の典型である、以下の形態学的特徴を有する：３株全て最初は栄養細胞として増殖し、パラスポラルボディ(CSPB)及び隣接胞子（adjacent spore）を含有する胞子嚢を形成する。
【０１４６】
増殖の特性
好気性で、通性嫌気性であり；寒天上のコロニーは白黄色で、縁が不規則である。
【０１４７】
１６ｓ  ｒDNA同定
１６ｓ  ｒDNAの領域を、B. ラテロスポルス（B. laterosporus）の４つの各株のゲノム配列から取得した。ゲノムDNAを、New Zealand Genomics Ltd, Dunedin, New Zealandによりシークエンシングした。B. ラテロスポルス（B. laterosporus）からの他の１６ｓ  ｒDNA配列、及び抽出された全長１６ｓ  ｒDNA遺伝子を使用してコンティグが探索され、Geneious (http://www.geneious.com/)及び DNAman (Lynnon Biosoft, Canada)プログラムを使用して重ね合された。
【０１４８】
NMI V12/001946を特徴付けるために配列番号１を使用し;NMI V12/001945を特徴付けるために配列番号２を使用し；NMI V12/001944を特徴付けるために配列番号３を使用し；NCIMB41419を特徴付けるために配列番号４を使用した。EP 2,079,314で同定されたNCIMB41419は、NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotlandから取得されたB. ラテロスポルス（B. laterosporus）の株である。
【０１４９】
配列番号１〜４の重ね合わせを図１０に示す。この図は、各株間の配列及び特徴の違いを示す。
【０１５０】
実施例４−バイオアッセイ手順
コナガ(Plutella xylostella) (鱗翅目：コナガ科)、モンシロチョウ（Pieris rapae）(鱗翅目：シロチョウ科)及びキャベツルーパーモス(Trichoplusia ni)(鱗翅目：ヤガ科)
コナガの幼虫を、Lincolnのアブラナ科植物（キャベツ植物）上で飼育し、又はCry1A及びCry1Cに耐性の株、並びに感受性の株（G88）を取得し、Geneva, NY, USAのCornell University, New York State Agricultural Experiment Station, College of Agriculture and Life Sciencesで試験を行った。モンシロチョウの幼虫は、Lincoln University, New Zealandの農場から野外採集した。
【０１５１】
１０匹の２〜３齢幼虫を使用し、細菌を含有する株(NMI No's: V12/00944, V12/001945 or V12/001946)のいずれかの溶液で処理したキャベツの葉の３ｃｍ円盤上に置き、又はそれらの溶液に浸漬した。イタリアのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NCIMB41419、及び他の細菌属エルウィナ（Erwina）(ICMP)の培養物も、DBMの幼虫に対する活性の比較対象として使用された。水和剤のSiliwet L-77 (Momentive Performance Materials, New York, USA)又はTriton X-100 (Rohm and Hass Co, Philidelphia, USA)は、＜０．０５％で使用された。各処理は、３〜５回反復された（処理当たり幼虫３〜５０匹）。処理された幼虫を、２３℃  16L:8HD (Lincoln)、又は27℃  16hL:8hD (USA)でキャベツの葉の上に置き、生死を毎日チェックした。
【０１５２】
感受性及びCry1A耐性トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）も取得され、Geneva, NY, USAのCornell University New York State Agricultural Experiment Station, College of Agriculture and Life Sciencesで試験された。第二の３齢幼虫もDBMと同様に接種及び維持したが、反復実験あたり５匹の幼虫しか使用しなかった（実験あたり合計で幼虫２５匹）。幼虫は処理後27℃  16hL:8hDで維持された。
【０１５３】
コドリンガ(Cydia pomonella)バイオアッセイ（鱗翅目：ハマキガ科）
バイオアッセイは、Plant and Food Research Center, (PFR), Auckland, New Zealandにより提供された卵に由来するコドリンガの幼虫を使用して準備された。PFRも、昆虫の飼育に使用される人工飼料を供給した。
【０１５４】
予備的及び確認的試験を行い、NMI NO. V12/001946に対する昆虫の反応を評価した。各バイオアッセイは、a)無希釈（30℃のNYSM中で４日間シェーカーフラスコ中で増殖させた材料を希釈せずに使用し、水和剤として０．０２５％のコンタクトを含有する）のNMI No. V12/001946又はV12/001944で処理した飼料、及びｂ）対照としての未処理の飼料からなる２つの処理を有する。予備的なセットアップにおいて、各処理は、１０回反復され、１つのチューブは１つの複製物を表す。確認的試験において、各処理は３０個の複製物を有し、又は複製物として１つのチューブを有する。処理した飼料において、その表面に１０μｌのNMI No. V12/001946を散布し、１０分間送風により乾燥させた。２匹の２齢幼虫を各チューブに入れ、チューブをパラフィルムで封じた。
【０１５５】
全てのチューブをラックに置き、25℃のインキュベーターに入れ、照明時間を１６：８（L:D）とした。幼虫の死亡率を毎日観察し、接種の１日後からデータを収集した。
【０１５６】
イエバエ(Musca domestica)バイオアッセイ（双翅目：イエバエ科）
バイオアッセイの試行は、Auckland, New Zealandに本拠地を置く生きた昆虫を供給する会社であるBiosuppliers Insects (www.biosuppliers.com)から購入した幼虫（蛆虫）及び蛹を使用して実行された。セットアップにおいて、Ruiu et al. 2006による人工飼料が使用された。
【０１５７】
蛆虫及び蛹のNMI No. V12/001946に対する反応は、a)無希釈のNMI No. V12/001946で処理した飼料、及びｂ）対照としての未処理の飼料の、２つの処理において観察された。蛆虫を使用した予備的なセットアップにおいて、各処理は、１０ｍｌの飼料を有する３つのポッテルカップ（pottel cups）(Huhtamaki Co., Henderson, Auckland, New Zealand)を有する。処理した飼料において、２００μｌの無希釈のNMI No. V12/001946を飼料と粗く混合した後、６匹の蛆虫に与えた。蛹を使用するセットアップにおいて、各処理は、各カップに５匹の蛹を入れたポッテルを有する。
【０１５８】
前記セットアップは21度のインキュベーター中に置かれ、照明時間を１６：８（L:D）とした。当該セットアップを毎日観察した。
【０１５９】
コモンフォレストルーパーモス(Pseudocoremia suavis)バイオアッセイ（鱗翅目：シャクガ科）
コモンフォレストルーパーの卵は、PFRから供給された。卵を、Bioprotection Center, Lincoln, New Zealandの20℃及び照明時間１６：８（L:D）のControlled Temperature (CT)室の一つの中で孵化させた。新生の幼虫をLincoln University Nursery, Lincoln, New Zealandにおいて、切り離したラジアータパインの芽の中で生育させた。当該芽は、軽く洗浄し、水気を切り、湿ったペーパータオルを敷いたプラスチック容器に入れられた。当該容器は空気が通るように網蓋で覆われた。新鮮な松の葉は、バイオアッセイに用いる３齢幼虫になるまで毎日供給された。
【０１６０】
葉を浸漬する方法を使用して行われたバイオアッセイは２つ存在する。各バイオアッセイは、a)０．０１％TritonX100（水和剤、Rohm and Haas Co. Philadelphia, USA）を有する細菌中に浸漬したラジアータパインの葉、及びｂ）対照の、０．０１％TritonX100を有する滅菌蒸留水中に浸漬した葉の、２つの処理を有する。各処理は２つの複製を表す２つの葉の試料を有する。第一のバイオアッセイにおいて、10-1の細菌希釈が使用され、第二の試行において、無希釈が利用された。葉は送風により乾燥され、その葉に５匹の幼虫が導入された。当該セットアップは、CT室で、20℃、１６：８（L:D）照明時間に置かれた。
【０１６１】
グラスグラブ（Costelytra zealandica）バイオアッセイ（鞘翅目：コガネムシ科）
グラスグラブの幼虫を近所の野原から採集した。バイオアッセイの前に、当該幼虫に、１２ウェルの組織培養プレート中の人参キューブを与えた。必要に応じて新鮮な人参キューブを再び与えた。２日後、活発に餌を食べる全ての幼虫をバイオアッセイ用に選択した。
【０１６２】
バイオアッセイは、NMI No. V12/001946で処理した人参キューブ、及び対照である未処理の人参キューブの、２種類の処理を有する。NMI No. V12/001946で処理した人参キューブにおいて、各キューブは、２日間栄養寒天中で増殖させたNMI No. V12/001946上で転がされた。処理あたり１２個のウェルが割り当てられ、ウェル当たり１匹の幼虫が割り当てられた。プレートは湿ったペーパータオルを敷いたトレイ中に置かれ、透明なプラスチックバッグに入れられ、湿度を増大させて人参キューブの乾燥を防いだ。トレイは、２１℃、１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置かれた。観察は毎日行われた。
【０１６３】
マヌカビートル(Pyronota spp.)バイオアッセイ（鞘翅目：コガネムシ科）
マヌカビートルの幼虫に関して、人参キューブバイオアッセイ及び土壌バイオアッセイの２つのバイオアッセイが行われた。マヌカビートルの幼虫は、Landcare Farming Ltd, Westport, New Zealandから提供された。
【０１６４】
人参キューブバイオアッセイにおいて、グラスグラブと同一の工程がなぞられた。土壌バイオアッセイにおいて、幼虫は、１２ウェル組織培養プレート中で２日間人参キューブを与えられた。バイオアッセイには良く食べる幼虫が選択した。滅菌した土壌１０ｇをユニバーサルボトル中に入れた。当該土壌中に２ｍｌの滅菌蒸留水を添加し、よく混合した。処理した土壌には５００ｍｌの無希釈NMI No. V12/001946が加えられ、土壌とよく混合された。対照には、２ｍｌの滅菌蒸留水のみ土壌と混合された。各ボトルに１匹の幼虫が導入され、１つの人参キューブが与えられた。ボトルの蓋は軽く締められ、２１℃で１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置かれた。幼虫の死亡率が毎日観察された。
【０１６５】
ライトブラウンアップルモス（LBAM）(Epiphyas postvittana)バイオアッセイ（鱗翅目：ハマキガ科）
このバイオアッセイは、Wearing et al. (2003)の方法を改変したものである。彼らの方法は、完全に展開したリンゴの葉を使用し、幼虫は、４齢になるまで毎週新しい葉に移された。当該葉は、背軸面を下にして平らな所に置かれた。BHU, Lincoln Universityからの若いリンゴの葉、及びPlant & Food Researchから提供された卵から育てたLBAMの幼虫を、セットアップに使用した。
【０１６６】
予備的なバイオアッセイにおいて、Wearing et al. (2003)のプロトコルからの改変は、１）全形の葉の代りに、葉は１インチ四方にカットされた点、２）２つの葉の方向が使用された点、及び３）幼虫が新しい葉に移されなかった点である。
【０１６７】
予備的バイオアッセイは：対照としての無処理の葉及び無希釈１８２１で処理した葉の２つの処理を有する。若い完全に展開した葉から１平方インチの葉を切り出した。処理された葉の試料において、無希釈の40 μl V12/001946が表面に散布され、送風で乾燥された。対照及び処理された葉の試料は、水寒天の表面に、１）葉の葉軸面側（下側）を寒天とさせる、及び２）葉の向軸面（上側）を寒天と接触させる、２つの方法で置かれた。処理あたり、及び葉の方向あたり、２つの葉の試料が用意された。各葉の試料に、５枚の葉が置かれた。
【０１６８】
第二のバイオアッセイは、全形の葉を使用して行われた。処理及び手順は、第一のバイオアッセイと同一であった。
【０１６９】
トマトフルーツワームモス（アカコーンイヤーワーム及びコモンボールワームモス）(Helicoverpa armigera)バイオアッセイ（鱗翅目：ヤガ科）
トマトフルーツワームに対するV12/001946の反応は、PFRから提供された卵から育てた幼虫及び人工飼料を使用して、Singh (1983)の方法の改変に基づいて評価された。改変は、保存料、抗生物剤、及び抗真菌剤の化合物を試料に入れない点である。
【０１７０】
このバイオアッセイは：無希釈V12/001946で処理した飼料、及び対照としての無処理試料の、２つの処理を有する。処理あたり５ｍｌの試料と６個のポーションカップ(Huhtamaki Co., Henderson, Auckland)が使用された。処理した飼料において、無希釈V12/001946  ２０μｌが試料の表面に散布され、通気乾燥された。処理された及び無処理の飼料において、カップあたり５匹の幼虫が導入された。このカップは、試料の乾燥を防ぐためにパラフィルムで覆われた。処理された及び無処理のカップは、２５℃の１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置かれた。
【０１７１】
蚊バイオアッセイ(Culex pervigilans及びOpifex fuscus)（双翅目：カ科）
このバイオアッセイは、Oxford, Canterbury, New Zealandの閉鎖されたプールからLincoln Universityが採集した(Culex pervigilans)、又はNew Zealand BioSecure Entomology Laboratory Research, Lincoln, Christchurchにより供給された(Culex pervigilans and opifex fuscus)蚊の幼虫を使用して実施された。当該アッセイは、７つの処理、即ち無希釈NMI No. V12/001946（シェーカーフラスコから）、10-2、10-4、10-6、10-8、10-10の５つの細菌希釈物、及び対照としての無処理の幼虫を有する。各処理は、１２個の複製物を示す１２ウェルを有し、完全にランダム化されるように設計された。
【０１７２】
水１ｍｌ及び１匹の幼虫を１２ウェル組織培養プレートの各ウェルに注入した。処理された幼虫において、２０μlのNMI No. V12/001946が各ウェルに導入された。プレートを蓋で覆い、２５℃の１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置かれた。幼虫の死亡は、ゆっくり混ぜたときに幼虫が動かなくなったことにより示され、死亡率は毎日評価された。
【０１７３】
当該アッセイは、NMI V12/001944、V12/001945及びV12/001946の３つの株、イタリアのB. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NCIMB41419を使用して繰り返され、他の細菌種Erwina (ICMP)の培養物も、比較として使用された。
【０１７４】
ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)バイオアッセイ（鱗翅目：ヤガ科）
このバイオアッセイで使用される幼虫は、PFRにより供給された卵から育てたものである。新生の翌日、トマトフルーツワーム用に開発された人工飼料中で幼虫を一昼夜育成した。飼料の表面の排泄物の存在により示されるように、この飼料がハスモンヨトウにも好適であることが証明された。
【０１７５】
このバイオアッセイには、無希釈NMI No. V12/001946で処理した飼料と、対照としての無処理飼料の、２種類の処理がある。各処理は、６個の複製物を表す６個のポッテルカップを有する。飼料の表面に２０μｌの細菌を散布し、通気乾燥させる。各ポッテルカップに、５匹の幼虫を導入した。このカップを、幼虫の導入後に、パラフィルムで封じた。
【０１７６】
このセットアップを２５℃及び１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター内に置いた。
【０１７７】
ブラックレグドリーフローラーモス(Planotortrix notophaea)及びブラックライアリーフローラーモス(Cnephasia jactatana)バイオアッセイ（鱗翅目：ハマキガ科）
２つのバイオアッセイの為の試験用の昆虫及び人工飼料は、PFRにより提供された。卵から孵化した翌日、幼虫を人工飼料中で一昼夜飼育し、２１℃及び１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置いた。
【０１７８】
両バイオアッセイは、無希釈NMI No. V12/001946で処理した飼料と、対照としての無処理飼料の、２つの処理を有する。ブラックレグドリーフローラーを含むバイオアッセイにおいて、対照のチューブは１５本あり、各チューブは１つの複製物を表す。処理された試料は、１４個の複製物を有する。ブラックライアのバイオアッセイにおいて、処理された飼料及び無処理の飼料はそれぞれ１５個の複製物を有する。各チューブに２匹の２齢幼虫が導入され、パラフィルムで封じられた。
【０１７９】
両バイオアッセイにおいて、処理された及び無処理のチューブは、２１℃及び１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置かれた。幼虫の死亡率は、双眼顕微鏡下で毎日観察された。ラクダのブラシで軽くこすったときに動かない幼虫は、死んでいると評価された。
【０１８０】
ミールワーム(Tenebrio molitor)バイオアッセイ（鞘翅目：ゴミムシダマシ科）
このバイオアッセイの為の幼虫及び飼料は、Biosuppliers Live Insects, Auckland, New Zealandから購入した。無希釈で処理した飼料と、対照としての無処理飼料の、２つの処理が存在する。各処理は２つの複製物を有し、１つの複製物は１つの容器を有する。
【０１８１】
各容器中に２５０ｍｇの飼料が置かれた。処理された飼料において、２００μｌの細菌溶液が飼料と粗く混合され、通気乾燥された。対照の飼料には、同量の滅菌蒸留水が混合された。各容器に５匹の幼虫が入れられ、中央に穴が空けられた蓋で封じされた。これらの容器を、２５℃及び１６：８（L:D）照明時間のインキュベーター中に置いた。
【０１８２】
サワーペーストネマトード／マイクロワーム(Panagrellus redivivus)バイオアッセイ（線形動物：桿線虫類）
自由な生きた線形動物を、Biosuppliersから購入した。B. ラテロスポルス（B. laterosporus）細菌のマイクロワームに対する反応を試験するために、２つのバイオアッセイが実施された。２つのバイオアッセイにおいて、マイクロワームはペーストの状態で提供され、当該ペーストから掬い取り、滅菌蒸留水の入った深いペトリ皿中に置かれて、個々の線形動物に分離させた。チップカットを有する１ｍｌピペットチップを使用して、個別のマイクロワームを滅菌蒸留水中に取った。
【０１８３】
第一のバイオアッセイにおいて：１）無希釈V12/001946で処理したマイクロワーム、２）無希釈V12/001944で処理したマイクロワーム、及び３）対照としての無処理マイクロワームの、３つの処理がある。１２ウェル組織培養プレートの各ウェル中に１０匹のマイクロワームが置かれた。各ウェル中に、１ｍｌの滅菌蒸留水が入れられた。各処理は、完全に無作為化される設計で６個の複製ウェルを有する。処理されたマイクロワームにおいて、ウェルあたり１０μｌの細菌が入れられた。このバイオアッセイは、室温で行われた。
【０１８４】
マイクロワームの死亡率は、播種後３日まで毎日評価された。幼虫の死亡率は、双眼顕微鏡下で観察された。
【０１８５】
第二のバイオアッセイにおいて、遠心分離された材料の代りに細菌ブロスが使用された。１）無希釈V12/001944ブロス、2)10-2希釈物、3)10-3希釈物、4)10-4希釈物及び5)対照としての無処理物の、５つの処理が評価された。処理あたり６ウェルを用い、各ウェルには１０匹のマイクロワームが入れられ、完全に無作為化するように設計された。処理されたマイクロワームにおいて、ウェルあたり２０μｌの細菌ブロスが添加された。当該バイオアッセイも、室温で実施された。
【０１８６】
死亡率は、播種後３日間毎日評価された。幼虫の死亡率は双眼顕微鏡下で観察された。
【０１８７】
アルゼンチンステムウィービル(Listronotus bonariensis)（鞘翅目：ゾウムシ科）
アルゼンチンステムウィービルに対するV12/001946の反応を評価するために、２つのバイオアッセイが実施された。両バイオアッセイのための試験材料として、ホソムギとゾウムシは、Canterbury, New Zealandの野外採集された材料である。
【０１８８】
最初のバイオアッセイは：無希釈V12/001946ブロスで処理されたホソムギ及び対照としての無処理の葉の、２つの処理を有する。ホソムギは２インチの長さに切られた。V12/001946処理草において、草試料は無希釈V12/001946ブロスに浸漬され、１０〜１５分間通気乾燥された。対照及び処理草試料は、ペトリ皿中に置かれた。処理草は５枚のペトリ皿を有し、対照は４枚有する。各草試料に１０匹のゾウムシが導入された。ペトリ皿はラッピングフィルムでシールされた。全てのペトリ皿は、２２℃及び１２：１２（L:D）照明時間のインキュベーター内に置かれた。幼虫の死亡率は、毎日観察された。
【０１８９】
第二のバイオアッセイは、全形のホソムギ苗が使用された。三週齢のホソムギ苗が使用された。ホソムギ苗の根は小さいプラスチックバッグに入れられ、十分な水を入れて苗の乾燥を防いだ。プラスチックバッグは根の少し上で縛られプラスチックジッパーが閉じられて、バッグから水が出ることを防いだ。
【０１９０】
このバイオアッセイは：V12/001946処理ホソムギと、対照としての無処理ホソムギの、２つの処理を有する。処理あたり３本のホソムギ苗を使用する。無処理ホソムギにおいて、エアーブラシを用いて各苗に５００μｌの滅菌蒸留水がスプレーされた。処理ホソムギにおいて、５００μｌのV12/001946ブロスがスプレーされた。苗はスプレー後通気乾燥され、メッシュ蓋付きの長方形のプラスチック容器内に置かれた。各苗に１０匹のゾウムシが導入された。全ての容器は、２２℃及び１２：１２（L:D）照明期間のインキュベーター中に置かれた。幼虫の死亡率の評価は毎日実施された。
【０１９１】
ウォーターボートメン（半翅目：ミズムシ科）
このバイオアッセイは、Oxford, New Zealandで野外採集したウォーターボートメンを使用して行われた。V12/001946で処理されたウォーターボートメンと、対照としての無処理のものの、２つの処理がある。１つのウォーターボートメンが、５ｍｌの滅菌蒸留水が入ったユニバーサルボトル中に入れられた。処理あたり５本のボトルがある。処理されたウォーターボートメンにおいて、滅菌蒸留水に４０μｌの無希釈V12/001946が添加された。この実験は室温（２０〜２４℃）で行われた。死亡率は毎日評価された。
【０１９２】
ゲンゴロウ(Antiporus duplex)（鞘翅目：ゲンゴロウ科）
このバイオアッセイにおいて、Oxford, New Zealandで野外採集されたゲンゴロウが使用された。このバイオアッセイは、V12/001946処理ゲンゴロウ及び対照としての無処理ゲンゴロウの、２つの処理を有する。
【０１９３】
１２ウェル組織培養プレートをバイオアッセイで利用した。処理あたり６ウェルが用いられ、ウェルあたり１匹のゲンゴロウを入れた。２ｍｌの蒸留水を各ウェルに入れた。V12/001946処理ゲンゴロウにおいて、１０μｌの無希釈V12/001946を添加した。このバイオアッセイは室温（２０〜２４℃）で行われ、死亡率は毎日記録された。
【０１９４】
コモンワスプ（Vespula vulgaris）成虫（膜翅目：スズメバチ科）
このバイオアッセイは、Lincoln University周辺の顕花植物から回収したカリバチの成虫を使用して行われた。V12/001946で処理したカリバチと、対照としての無処理のものの、２つの処理が評価された。小さい穴が空けられた蓋付きのプラスチック容器中に５匹のカリバチが入れられた。
【０１９５】
対照のカリバチは、小さいプラスチックの蓋の中に置かれた２ｍｌの１０％スクロース溶液を与えた。V12/001946処理カリバチにおいて、２ｍｌの１０％スクロースは１ｍｌのV12/001946無希釈（濃縮）物と混合された。スクロース溶液（V12/001946を含む又は含まない）は、各容器にカリバチを入れる前に置かれた。
【０１９６】
このバイオアッセイは、室温（２０〜２４℃）で行われた。死亡率は毎日記録された。
【０１９７】
New Zealandで単離された３つのB. ラテロスポルス（B. laterosporus） (NMI No's V12/001944、V12/001945及びV12/001946)は、DBMの幼虫に対する活性を示した（図３）。これらの細菌は、他の鱗翅目の幾つかの種に対しても毒性であった（表１）。リーフローラー（ブラックレグドリーフローラー、ブラックライアリーフローラー、ライトブラウンアップルモス、全てハマキガ科）、コドリンガ（ハマキガ科）及びDBM(コナガ科)及びヤガ科が感受性であった。
【０１９８】
蚊（双翅目：カ科）も、前記細菌に対して大いに感受性であった（図４及び５）。マヌカビートル（コガネムシ）もある程度感受性であるが、幼虫が土壌中にある場合には感受性が見られなかった。他のコガネムシのグラスグラブは、感受性は見られなかった（表２）。膜翅目のカリバチ、ヴェスプラ・ブルガリス（Vespula vulgaris）の成虫は、感受性が認められた。
【０１９９】
線形動物に対する活性は、線形動物の一種のマイクロワーム（Panagrellus redivivus）により実証された（図９）。
【０２００】
B. ラテロスポルス（B. laterosporus）株NCIMB 41419は、ダイヤモンドバックモス（図３）又は蚊（図５）に対して有効ではなかった。
【０２０１】
表１：V12/001946株を用いた鱗翅目の昆虫に対するバイオアッセイの結果をまとめる。（無希釈は、３〜４日培養した約1010cells/mlの培養物を示す。）
【表１】
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【０２０２】
表２：他の種
【表２】
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【０２０３】
ニュージーランドの植物から単離されたB. ラテロスポルス（B. laterosporus）の３つの株は、いずれも、幾つかの鱗翅目及び双翅目に対して活性を有する。鱗翅目の中で、試験された全てのハマキガ科及びコナガ科の種は感受性であった。双翅目の中で、カ科が感受性であった。
【０２０４】
本明細書において、特許明細書、他の外的文献、又は他の情報源が引用されている場合、これは、一般に、本発明の特徴を議論するためのコンテクストを提供するためのものである。別に言及が無い限り、そのような外的文献の参照は、そのような文献又は情報源が、いずれかの管轄において、先行技術であること、又は当該技術分野の技術常識の部分を形成することと見做されるべきではない。
【０２０５】
参考文献の一覧
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【図１】
0006371288.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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