(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の未知の微生物を同定するための方法であって、
その属または種の分類レベルまで遡るマススペクトル判定が、培養および/または調製された前記微生物への赤外スペクトルによる少なくともその属または種の一段階下層の分類レベルまたは変種の詳細な判定によって補完され、ここにおいて、より下層の該分類レベルまたは変種の該詳細な判定のために、前記マススペクトル判定に基づく属もしくは種に限定された参照IRスペクトルのライブラリが使用される、方法。
【請求項２】
前記種の前記マススペクトル判定が、赤外スペクトルによるその亜種および/または変種の詳細な判定によって補完され、ここにおいて、参照IRスペクトルの種固有ライブラリが該亜種/または変種の該詳細な判定に使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記種の前記マススペクトル判定が、赤外スペクトルによるその血清型、病原型または耐性挙動の詳細な判定によって補完され、参照IRスペクトルの種固有ライブラリが該詳細な判定に使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記属の前記マススペクトル判定が、赤外スペクトルによる前記種の詳細な判定によって補完され、参照IRスペクトルの属固有ライブラリが該詳細な判定に使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記詳細な判定に使用される前記赤外スペクトルが、前記マススペクトル判定に使用される該マススペクトル取得の前に取得され、同じ微生物物質の少なくとも一部が両方の取得に使用される、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記詳細な判定のための前記微生物の培養および/または調製が、前記属もしくは種に限定された前記参照IRスペクトルのライブラリが取得されたのと同一の条件を用いて行われる、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物の前記調製に、個々の細胞成分の選択または分離が含まれ、これに対して前記IRスペクトルが後に取得される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
精製細胞壁が、前記IRスペクトルの前記取得のために使用される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
勾配遠心分離により取得された細胞成分の断片が、前記IRスペクトルの前記取得のために使用される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
誘導体化細胞成分が、前記IRスペクトルの前記取得のために使用される、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の未知の微生物を同定するための方法であって、
参照マススペクトルを含むライブラリと、参照IRスペクトルを含むライブラリとを提供する工程と、
前記サンプルから微生物分離株を培養する工程と、
前記微生物分離株の微生物種のマススペクトル判定を行う工程と、
マススペクトル判定に基づく属もしくは種に限定された参照IRスペクトルのライブラリを選択する工程と、 
該選択されたライブラリのために該微生物が取得されたのと同一の条件を用いて、該微生物分離株の微生物の培養と調製を行う工程と、
該培養・調製済みの微生物の赤外スペクトルを取得する工程と、
該選択されたライブラリの該参照IRスペクトルを用いて、数理統計学的な分類方法によるその亜種または変種を判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１２】
サンプル中の未知の微生物を同定するための方法であって、
前記サンプル中に特定の微生物種が存在すると仮定的に推定する工程と、
参照マススペクトルを含むライブラリと、推定微生物種の参照IRスペクトルを含むライブラリとを提供する工程と、
該参照IRスペクトルのライブラリのために該微生物が取得されたのと同一の条件を用いて、IRサンプルサポートプレート上の該サンプルからの微生物分離株を培養・調製する工程と、
該微生物分離株の該培養・調製済みの微生物の赤外スペクトルを取得する工程と、
MALDIイオン化のために該微生物分離株の該微生物を調製する工程と、
該微生物分離株の該微生物種のマススペクトルの取得と判定を行う工程と、
該微生物分離株についての該仮定的推定が確認された場合、前記マススペクトルの判定に基づく属もくは種に限定された該ライブラリの該参照IRスペクトルを使用して、既に取得された該IRスペクトルの数理統計学的な分類を用いてその亜種または変種を判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１３】
前記IRサンプルサポートプレートが、セレン化亜鉛またはシリコンから構成される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルからの前記微生物分離株がさらに、同じ前記IRサンプルサポートプレート上でMALDIイオン化のために調製される、請求項12または請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
Shigella属の種またはEscherichia coli種の前記マススペクトル判定の後に、該Shigella属および該Escherichia coli種の微生物の赤外スペクトルのみを含む参照IRスペクトルのライブラリを使用して、赤外スペクトルを用いた前記種の前記詳細な判定を行う、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の微生物をスペクトルによって同定する方法に関するものである。
【０００２】
本発明では、未知の微生物種の堅牢なマススペクトル同定は、主に、病原型 (例えばEHECやEPEC) や抗生物質耐性微生物 (例えばMRSA) などの医学的に重要な変種を同定するために、赤外スペクトルを用いた亜種と変種の詳細な分析により補完される。赤外スペクトルによる詳細な分析には、種固有および種制限の参照IRスペクトルのデータベース (ライブラリ) を使用し、特に、種固有の標準化された微生物培養を実施するために、微生物種の知識を必要とする。微生物のマススペクトル同定は、微生物のマススペクトルと、広範囲なデータベース(ライブラリ) 内のすべての分類学的ドメインにわたる参照スペクトルとの間の類似性比較により実施される。一方、亜種と変種の詳細な分析は、数理統計学的な分類分析を用いて、基本的に通常の方法でIRスペクトルを使用して実施されるが、ここでは、単一の微生物種のみの亜種と変種の参照IRスペクトルの量に適用された。この同定には少なくとも2つの工程があり、これは主に医療診断の関心対象のためである。
【背景技術】
【０００３】
迅速かつエラーのない微生物の同定は、特に臨床微生物検査において大きな役割を果たすが、食品分析、バイオテクノロジープロセスのモニタリングと制御、および河川や湖のモニタリングにおいても大きな役割を果たす。微生物(以下で細菌とも称される) は一般に微細な生物体であり、細菌や単細胞真菌(酵母など)、微細藻類、原生動物が含まれる。
【０００４】
微生物の同定とは、ドメイン、界、門、綱、目、科、属、種、亜種という分類学的階層構造に分類することを意味する。ただし、細菌の同定は、例えば血清型または病原型などの変種を追加的に包み得る。
【０００５】
血清型 (血清型変種の短縮形) という用語は、血清学的試験によって区別できる細菌の亜種内にある変種を説明するために使用される。これらは、細胞表面上の抗原に関して異なり、特定の抗体を用いて、従来の微生物学的な方法で同定される。血清型の分類階層は次の通りである：属> 種 > 亜種 > 血清型。例えば、拡張された二名法による種名はSalmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi (サルモネラエンテリカ亜種エンテリカ血清型チフス菌)、短縮形はSalmonella Typhi (サルモネラ チフス菌)。
【０００６】
病原型 (ギリシャ語のpathos (パトス) を由来とし、「苦しみ」や「病気」を意味する) は、同じ特性を持つ細菌株または株群で、その病原性に基づいて種まはた亜種内で他の株から区別される。病原型は二名法による種名に3つまたは4つの拡張部分を用いて表示される。例えば、ミカン類潰瘍病を起こし得る細菌Xanthomonas axonopodis (キサントモナスアクソノポディス) には、異なる宿主特化を伴う様々な病原型がある：X. axonopodis pv. Citri (キサントモナスアクソノポディスpv.シトリ) はその1例である。短縮形の「pv.」は「pathovar (病原型)」を意味する。ヒト病原体の毒性株にも病原型があるが、この場合、名前の前に追加した名により表示される。例えば、腸内細菌のEscherichia coli (大腸菌) は、ほとんど完全に無害であるが、極めて危険な病原型のenterohaemorrhagicE. coli (EHEC、腸管出血性大腸菌)、enteropathogenic E. coli (EPEC、腸管病原性大腸菌)、enterotoxigenic E. coli (ETEC、毒素病原性大腸菌)、enteroinvasive E. coli (EIEC、腸管侵入性大腸菌)、enteroaggregative E. coli (EAEC、腸管凝集性大腸菌) およびdiffusely adherent E. coli (DAEC、分散接着性大腸菌) がある。次に、病原型は異なる血清型を含み得る。EHECには多くの既知の血清型があり、同定されたすべてのEHEC血清型の約60パーセントがO157、O103およびO26である。特に危険なのは血清亜型O157/H7である。
【０００７】
広い意味で、微生物の同定は、その他の医学関連の特性が異なる変種も含み得る。特に、抗生物質に対する耐性(特にベータラクタム系抗生物質およびグリコペプチド系抗生物質) があるが、毒素形成 (「毒素型」) または抗生物質に対する同一あるいは同様のバクテリオファージ (「ファージ型」) に対する受容力もある。一般に、「次亜種」という用語は、1つの種または亜種の微生物群に、共通の生物学的性状がある場合に使用される。抗生物質耐性変種の一例はMRSA：Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (メシチリン耐性黄色ブトウ球菌) である。
【０００８】
「菌株」という用語は、1つの生物体から成長させた個体群を指し、微生物菌株保存機関(多くは国立機関) に保管されている。国際標準化された菌株表示が、属、種、亜種、変種で構成される命名法の一連に追加される。菌株の個々の生物体は遺伝学的に同一である。異なる菌株では遺伝子構造がわずかに異なる。
【０００９】
2つのスペクトル方法が最近、微生物同定のために微生物研究所で幅広く使用されるようになった。その1つはマススペクトル (MS) で、もう1つは赤外スペクトル (IR) である。不思議なことに、この2つの方法を並行に、または実際に組み合わせて使用している研究グループがないことは、ここで指摘されるべきである。しかし内実を見ると、これらのグループの研究分野はほとんどの場合異なり、同定の目的も異なる、という事実により、これは説明できる。
【００１０】
全く未知の種の微生物の同定を、事前のいかなる知識もなしに、種の分類レベルまで素早くかつ容易に同定する必要がある場合には、マススペクトルを使用することが常に好ましい。一般に、微生物を栄養培地上または培地内で培養できる限り、この方法は非常に上手く機能する。ペトリ皿内のゼラチン状の栄養培地上でコロニーを形成することが好ましい。この方法は非常に堅牢である：コロニーの培養時間と栄養は、マススペクトル同定に実際に影響を与えない。マススペクトルサンプル支持体上のサンプルの量、調製方法または保管時間も重要ではない。これは、サンプルの繁殖および調製方法には厳密な基準は必要ではないことを意味する。さらに、非常に少量のサンプルだけが必要なので、小さなコロニーで十分である。マススペクトルのピークは、非常に一般的であるか、または容易にイオン化する微生物タンパク質を示す。これらのピークの60〜85パーセントは、リボソームを構成する40〜60の異なるタンパク質に属する。それぞれのリボソームは各細胞内で数千回発生し、異なる微生物種のリボソームタンパク質の質量は特徴的に互いにすべて異なるため、これらのタンパク質の均一な発生は同定に理想的である。培養成功後、この方法は、自動コンピュータプログラムを用いて、微生物のマススペクトルと広範なスペクトルライブラリ(すべての分類学的ドメインにわたる数千の微生物の参照マススペクトルを含み得る) の参照マススペクトルを比較して、検査対象の微生物の分類上の種をわずか数分で同定する。この方法には非常に高い同定信頼度がある。2つの微生物種を信頼度を持って区別できないのは、ほんの少数例である。一方、亜種さらには変種を同定することはほとんどできない。現在の知識によれば、感度、速度および同定の正確さにおいて最適化された現在使用中の方法に基づくと、これはほとんど変わらないであろう。この主な理由は、変種はそのリボソームタンパク質に関しては異ならないからである。
【００１１】
一方、赤外スペクトルでは、血清型や病原型などの亜種や変種を同定することが可能であり、場合によっては、この種の亜種と変種の参照スペクトルの好適なライブラリが利用できる場合、種内の個々の菌株さえも同定することが可能である。しかし、このライブラリをまとめるには、種固有の培養物、調製および測定仕様を正確に順守しなければならない。これは、マススペクトル使用での状況とは全く異なる。
【００１２】
IRスペクトルは、生体材料中の機能グループの何千もの振動と極性結合に基づく。次にこれらは、例えばDNA、RNA、タンパク質、内部構造、膜、細胞壁、エネルギー蓄積を通して、微生物細胞のすべての構成部分から生じる。スペクトルの個々の特性分子への明確な割り当てはないが、好ましくは、特定のスペクトル領域を特定の分子種に割り当てることができる：CH2およびCH3グループの振動を伴う3050〜2800 cm-1範囲の脂肪酸、ペプチド結合を伴う1750〜1500 cm-1範囲のアミド、1200〜900 cm-1範囲の多糖。900〜700 cm-1の範囲は「指紋範囲」と呼ばれる。この範囲にはすべての分子からの何かが含まれており、種を区別する上で非常に重要である。
【００１３】
同定はIRスペクトルのわずかな差異に依存する。このため、IRスペクトル経由の同定法の工程は通常すべて、規定された持続期間での微生物の培養から、規定された栄養培地の温度、そしてサンプルの調製と測定まで、標準化されている。栄養培地上の酸素含量と湿度を制御する必要がある。標準方式からのわずかな偏差(例えば30分を超える培養期間や1ケルビン超の培養温度) でさえ、同一がより困難となり、誤った同一につながる。
【００１４】
参照IRスペクトルのライブラリをまとめるためには、選択グループの微生物は標準化された条件下で培養・測定される。次に、この参照ライブラリのスペクトルは一まとめにして、数理統計学的な分類手順を受ける。いくつかの数理統計学的方法(例えばANN (人工ニューラルネットワーク分析)、PCA (主成分分析)、PLS-DA (部分最小二乗判別分析)、SVM (サポートベクターマシン)、階層的クラスタ分析またはその他の分類技法) が使用される。ライブラリのIRスペクトルを利用した学習と検証段階の後、分類アルゴリズムを、同じ方法で培養したサンプルの微生物の赤外スペクトルに適用できる。アルゴリズムは、分類学的分類(例えば種、亜種、血清型、病原型、菌株さえも) を提供する。ただし、サンプル中の微生物が近縁グループに属さない場合、詳細なIR分析は完全に誤った結果を提供し得る。一例として、微生物が推定通りのE. coliではなく、例えば比較的無害なCitrobacterであった場合、誤って病原型EHECとして示される場合がある。
【００１５】
取扱いと結果におけるこれらの違いは、MSとIRの適用分野は異なることを意味する。臨床診断ではマススペクトルのみが実際に使用される。なぜなら、未知の病原体はすべての分類学的ドメインにわたって推定されなければならないからである。同じことが、河川や湖のモニタリングや、微生物学的種の事前の知識なしに微生物のタイプを迅速に同定することが最も重要な、他のすべての分野に適用される。ここで微生物は、単細胞簿類または酵母などの真菌類を含めて、細菌、古細菌、真核生物のすべての分類学的ドメインに属し得る。
【００１６】
一方、汚染食品または感染した家畜の汚染源および伝染経路の検出が目的である場合、信頼性の高い感染源の同定には亜種と変種を判定することが重要である。この場合、少なくとも単一の微生物学的判定の後に、微生物種は既知であることが通常、推定され得る。従って、今日では、IRスペクトルは主に微生物種が既知である場合に使用されるが、亜種、場合によっては変種を正確に判定することが重要である。例えば、流行性サルモネラ中毒が起きた場合や、サルモネラはタイ産エビの水産養殖が発生源であると疑われる場合、タイ産エビにサルモネラを検出することだけでは十分ではない。現在の分類学によれば、サルモネラには2種がある。その1つ(Salmonella enterica (サルモネラエンテリカ)) には5つの亜種があるが、変種として約2600の異なる血清型が亜種内にある。話をエビに戻すが、次に、同じ変種のサルモネラが関与していることを証明しなければならない。従って、便サンプルからのサルモネラをサルモネラ固有の培養液で増殖させ、IRスペクトルを使用して選択的に増殖させたサルモネラの血清型を調べる。次にこの血清型を、タイの水産養殖まで突き止めなければならない。
【００１７】
従って、赤外スペクトルは主に食品生産、獣医学、公衆衛生機関で用いられ、一方、臨床診断はマススペクトルに独占されている。
【００１８】
今日では、マススペクトル同定法も世界中で医療診断用に使用されている。ヨーロッパやその他の多くの国において、個々の会社の方法と質量分析計は適切な法規定を満たしているため、すでに臨床的に承認されている。法定上の承認がその他の国で準備中である。マススペクトル法では最初に、コロニーから微生物が培養される。培養のための栄養培地は通常、ペトリ皿内の寒天培地であり、この方法により、微生物の成長力に応じて数時間〜数日間で、個別の微生物コロニーの純粋な「分離株」の培養が達成される。ただし、微生物を寒天上で成長させることは必要不可欠ではない。液体中でも成長させることができる。コロニーの重なり合いや混合が見られる場合は、通常の方法で再実施する二次培養において純粋なコロニーを得ることができる。小さなスワブ(好ましくは衛生的に清浄な木製の爪楊枝) を用いて、選択したコロニーからマススペクトルサンプル支持体上に移した、裸眼ではほとんど見えないごく少量の104〜106の微生物は、次に、マトリックス支援レーザー脱着(MALDI) によるイオン化のために、従来のマトリックス基質 (通常、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸 (HCCA)、または2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)) を強い酸性にした溶液が散布される。この酸 (通常は蟻酸またはトリフルオロ酢酸) が細胞壁を攻撃し、マトリックス溶液の有機溶媒 (通常はアセトニトリル) が微生物細胞内に侵入して、細胞壁を弱らせ、浸透圧により破裂させる。試料は次に、溶媒を蒸発させることにより乾かし、これにより、溶解していたマトリックス物質が晶出する。微生物の水溶性タンパク質と、細胞のごく少量の他の物質が、プロセス中にマトリックス結晶に組み込まれる。
【００１９】
埋め込まれた被検分子を備えたマトリックス結晶に、質量分析計内で、集束UVレーザーパルスが照射され、これによって気化プラズマ中に被検分子のイオンが生成される。これらのイオンは次に、質量分析計内で測定して質量に従って分離され得る。この目的には通常、単純な飛行時間質量分析計が使用される。マススペクトルは、これら分析対象イオンの質量値のプロファイルであり、ほとんどがタンパク質イオンである。同定に関して最も有用な情報を備えたイオンは、およそ3,000ダルトン〜15,000ダルトン(1ダルトン = 1原子質量単位) の質量を有する。マススペクトル法で通常なら実際に必要なように「質量電荷比」m/z を必ず用いるが、その代わりに、この方法では、タンパク質イオンはほぼ大部分が単電荷(電荷数 z = 1) であり、だからこそ、ここでのイオン質量m について単純に議論することができる。
【００２０】
単純な飛行時間質量分析計の代わりに、直交イオン射出を伴う飛行時間型質量分析計のような他のタイプも使用することができる。また、MALDIによるイオン化の代わりに、エレクトロスプレーイオン化 (ESI) のような他のタイプのイオン化を使用することももちろん可能であるが、これは、より複雑なマススペクトルを提供する。単純なマススペクトル生成用の異なるイオン化方法は、化学的イオン化(CI) である。例えばこれは、レーザー脱離プラズマと使用できる。 
【００２１】
水溶性タンパク質の質量分離プロファイル (すなわちマススペクトル) は、関心のある微生物種に非常に特徴的なものである。なぜなら、微生物の各種がそれぞれ独自の、遺伝学的にあらかじめ決められたタンパク質を生成し、このタンパク質それぞれが特徴的な質量を有するからである。すでに述べたように、60〜85パーセントのタンパク質はリボソームに由来する。これらは常に同じ構造を持つDNAとタンパク質の複合体であり、正確に同じ数と同じ成分の40〜60の種固有の異なるタンパク質を常に含む。細菌細胞はそれぞれ、数千から数万個までのリボソームを含む。真核生物の細胞では数十万個のリボソームを含む。これは、質量だけではなく、水溶性でさらに高濃度のこれらのタンパク質の出現も、遺伝学的にあらかじめ決められていることを意味する。例えば、リポタンパク質やエネルギー蓄積として機能する脂肪酸は栄養条件またはコロニーの成熟度に依存するが、これらは栄養条件またはコロニーの成熟度には依存しない。タンパク質プロファイル、特にリボソームタンパク質プロファイルは、指紋が個々の人間に特徴的であるのと同様に、微生物種に特徴的である。何千もの微生物の参照マススペクトルを備えた参照ライブラリは、医療用途での使用が合法的に認可されており、現在、利用可能である。
【００２２】
このマススペクトル法による同定は非常に成功を収めていることが証明されている。この正確な同定の信頼度は、現在使用されている微生物学的同定方法よりはるかに高い。様々な研究で、同定の信頼度は、何百もの異なる微生物種について95パーセントをはるかに上回り、通常98パーセントを超えることを証明することが可能になっている。現在の微生物学的同定方法から逸脱していると見られた疑い事例においては、遺伝子配列決定によって、非常に多くの場合にマススペクトル同定が正確であることが確認されてきた。
【００２３】
微生物を同定するには、例えば約2,000ダルトンから、高質量範囲の20,000ダルトンまでのマススペクトルが測定される。しかし、約3,000ダルトンまでの低質量範囲における質量信号はあまり評価され得ないことが見出されている。なぜなら、本質的にその存在が確率的かつ可変的な物質(例えば栄養の本質に従って蓄積される脂肪酸) に由来し得るからである。最良の同定結果は、3,000〜15,000ダルトンの質量範囲における質量信号の評価により得られる。この目的で現在使用される超高感度の質量分析計は、低い質量分解能のみを持つ。これは、質量信号がそれぞれ1ダルトンずつ異なる同位体群は、この質量範囲では分解され得ないことを意味する。同位体群の範囲のみが測定される。
【００２４】
原則としてこの微生物同定方法には、他の微生物の信号と重なり合わないようなマススペクトルを得るため、「分離株」と呼ばれる微生物の純粋培養が必要である。しかしながら、2つの微生物種の混合物のマススペクトルを評価することもでき、両方の微生物種とも同定できることが見出された。この同定の信頼度はわずかしか低下していない。マススペクトルに2つを超える微生物種が関わる場合、またはこれらの微生物種が非常に異なる濃度で存在する場合、同定の確率と同定の信頼度は大きく低下する。
【００２５】
IRスペクトルによる微生物の同定はまた、好適な栄養培地上にある微生物の純粋な培養物に基づく。しかしここで、それぞれの場合において細胞の全成分は全波長範囲のIRスペクトルに寄与するため、標準状態を維持することによって、微生物の培養時間と栄養に関する差異が生じるのを避けなければならない。標準化された条件下で標準化された寒天上で成長させた微生物は、純水に懸濁してIR透過支持プレート上に沈殿させる。微生物を均一な層に沈殿させるよう注意を払わなければならない。この層を乾燥させ、支持プレート上の微生物吸収が赤外分光光度計で測定される。高い分解能を持つフーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR) が通常使用される。スペクトルは通常、4000 cm-1〜500 cm-1の範囲で測定される。数百のスペクトルが測定され、信号対ノイズ比を改善するために、毎秒20スペクトルの取得率で計算される。
【００２６】
若干修正した実施形態において、IRスペクトルは反射光でも測定できる。この場合、例えばアルミニウム製の金属的に反射する支持体上で調製される。ラマン分光法を使用することもできる。この方法には、微生物スペクトルを液体中でも測定できるという利点がある。
【００２７】
食品検査や獣医学以外に、微生物をできるだけ詳細に亜種と変種に従って分類する必要がある他の分野があるが、これらの分野では、微生物種は通常、最初は全く未知である。医療診断では、例えば病原性、毒性、病毒性についての知識、特に微生物の抗生物質耐性の知識は非常に重要である。これらの特性は1つの微生物種の異なる亜種または変種について、非常に異なり得るのも確かである。
【００２８】
微生物の亜種、血清型、病原型、さらなるバリエーションは、微生物学的特徴により判定される。例えば付着挙動(血清型)、毒性、病原性 (病原型)、病毒性から判定され、異なる抗生物質に対する耐性または非耐性からも判定される。これらのどのバリエーションが分光測定で区別できるかという詳細な知識は(今のところ) ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
上記の見地から、特に種の分類レベルより下層 (すなわち亜種、病原型、毒素型、血清型、特に抗生物質に対する耐性) の明示まで分類を拡大する必要もある、幅広い分類クラスから微生物を同定するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、サンプル中の未知の微生物を同定する方法を提供し、ここにおいて属または種の分類レベルまで遡るマススペクトル判定の後に、赤外スペクトルの制限された参照ライブラリを使用して、赤外分光分析による、より下層の分類レベルまたは変種の詳細な判定が行われる。ライブラリは1つの属の微生物の赤外スペクトルのみを含む属固有か、あるいは1つの種の微生物の赤外スペクトルのみを含む種固有であり得る。
【００３１】
本発明は、赤外分光分析は現在、数理分析で使用する参照赤外スペクトルが近縁微生物の小グループのみに属し、かつ、特に赤外スペクトルが、関連微生物のこのグループの微生物の培養物、調製および測定の標準化された仕様に準拠して取得された場合にのみ、マススペクトル同定が浸透できるより、分類学的分類のより下層レベル(変種の判定を含む) まで浸透できる、という発見に基づいている。すべての分類学的ドメインにわたる全微生物の参照IRスペクトルをライブラリに集めて分類に使用した場合、結果として得られるサンプル中の細菌同定は、細菌がグラム陽性か、またはグラム陰性かを判定する(該当する場合) 以上のことを、期待することはできない。参照ライブラリが細菌に限定されており、加えて、顕微鏡により区別する細菌の特徴が考慮されており、作成されたIRスペクトルのそれぞれのライブラリが、棍棒状 (コリネバクテリウム属)、球状(球菌)、または桿状 (桿菌) あるいは他の形態のいずれかに制限されている場合に、結果は改善される。さらに制限して、参照ライブラリに単一の微生物亜種の異なる病原型のIRスペクトルのみが含まれる場合、赤外スペクトルを使用して、サンプル微生物が実際にこの亜種に属する場合にサンプル中の微生物の病原型を明確に判定することが通常可能である。ただし、検査対象の微生物の赤外スペクトルが予測した最初のグループに結局、属さない場合、この方法により誤った結果が導かれ、医療診断の場合、生命に関わり得る。最善の結果には、培養、調製および測定の仕様は微生物種によって異なる。
【００３２】
本発明は、例えば、微生物種のマススペクトル判定の後に、参照IRスペクトルの種固有ライブラリの使用を目的とする、赤外スペクトルによる亜種および/または変種の詳細な判定を行う方法を提供する。微生物種が既知となれば、亜種または変種に関するさらなる詳細が必要であるかを決定し、実行できる。亜種または変種に関する分類について、この種に制限したIRスペクトルのデータベースおよび異なる亜種と変種の含まれる参照スペクトルが利用可能であるべきである。必要性と可能性の質問に対する回答が肯定であるとき、亜種と変種用にIRスペクトルを分析できる。必要であれば、適切なIRスペクトルデータベースにある、この種の標準仕様に正確に従って微生物をさらに培養し、その後にIRスペクトルを取得するために微生物を調製できる。最善の結果には、変種のIR同定に最適である、それぞれの微生物種の培養と調製の個々の一組の条件を適用する必要がある場合がある。この一組の条件はまた、IRスペクトルの基礎も形成する。これは、個々のIR参照データベースはそれぞれの微生物種に対してまとめる必要があるということを意味する。
【００３３】
従って、本発明には、少なくとも次の2つの段階を伴うアプローチを含む：まず、マススペクトル法による微生物種の判定と、次に、赤外スペクトルによる病原型または血清型などの亜種と変種の判定である。いくつかの属に知られているように、マススペクトルは、種ではなく、属のみを信頼度を持って同定できるとすれば、適切にまとめられたIRスペクトルの属固有のライブラリに基づいて、IRスペクトルを使って微生物種を同定できる。その結果、亜種と変種の同定には3段階方法が必要となる場合がある。
【００３４】
本発明による別の方法において、詳細な判定のために使用する赤外スペクトルは、マススペクトル判定に使用するマススペクトルを取得する前に取得することができ、少なくとも同じ微生物物質の一部が、特に単一培養の後に、両方の取得のために使用できる。
【００３５】
亜種と変種の区別には、微生物細胞の特定の部分のみを使用できることが望ましい。例えば、IRスペクトルに、細胞壁の外側にタンパク質がある細胞壁が望ましいのは、これらのタンパク質は血清型を判定し、病原型も通常判定するからである。ここでの前提条件は、この場合も、信頼度のある事前の種の同定と、微生物細胞のこられの部分のIRスペクトルについて適切なデータベースが存在することである。従って、培養微生物の調製には、サンプル支持体上への簡易沈殿を含むが、細胞の破壊とこれらの細胞成分の選択も含まれる。バリエーションの判定には、これらは完全な微生物よりもより望ましい。細胞成分は遠心分離(特に液勾配遠心分離) によって分離され得、誘導体化、凝結、またはその他の改変後に分離することも可能である。
【００３６】
この作業方法には、微生物亜種、さらには微生物亜種の細胞成分のIRスペクトルの種固有ライブラリの存在を必要とする。これは、習得できない膨大な仕事のように思われる。しかし、一般的経験によれば、微生物研究所の日常業務において、少数の微生物種のみが、日常的に行わなければならない同定の80パーセント以上を占めている。これらの微生物種の3種か4種のみが、さらに詳細な分類を必要とする可能性がある。加えて、さらに稀な微生物種のほんの一部が、さらなる詳細な分類を行う関心がある可能性がある。最も緊急な関心があるこれらの微生物種は、重視する特定事業により研究所によって異なる場合がある一方、これらの微生物種の数は比較的に少ないため、これらの微生物に好適なIRスペクトルのライブラリをまとめることが可能である。さらに、厳密な標準化が順守されれば、異なる研究所間でスペクトルライブラリを交換することも可能であることが明らかになっている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】第1の実施形態による、微生物の亜種および変種を同定するためのフローチャートの一例を示す。この方法は、MSスペクトルライブラリの提供から始まる。次に、種固有の培養と調製により取得された、個々の微生物種の亜種と変種のIRスペクトルライブラリが提供される。次に、サンプルから微生物分離株が培養される。次に、種のマススペクトル同定が実施される。次に、亜種および変種の同定が必要かつ可能であるか否かの質問が作成される。回答が「いいえ」の場合、この例では方法はここで終了する。回答が「はい」の場合、IRスペクトル取得のために分離株の微生物の種固有の培養と調製が後に続いて起こる。次に、IRスペクトルが取得される。最後に、種固有のIR参照スペクトルを用いて亜種と変種が同定される。
【図２】図２の左側の図は、微生物種同定の実施形態の簡単な図を示す。微生物に典型的なマススペクトル成分が取得され、これらの成分はマススペクトル内の特定の質量信号パターンにより表される。信号パターンは参照スペクトルのライブラリからのパターンと比較される。ここでは、MS参照No.1およびNo.2である。MS参照No.1は、測定信号パターンへの十分な一致を示していない。一方、MS参照No.2と測定信号パターンの間には良好な一致があるため、微生物種を同定し得る。図2の右側の図は、赤外吸収スペクトルを用いた亜種と変種の同定の実施形態の簡単な図を示す。このためには、特殊な一実施形態において、マススペクトル分析を用いて種の分類にすでに成功した微生物を培養・調製し、次に、あらかじめ決められた特定の条件下で、IR吸収スペクトルにより測定する。このよう取得された赤外吸収スペクトル (IRスペクトル) の特徴は次に、例えば主成分分析 (PCA) を適用して、種固有の参照IRスペクトル内で入念に作成されて視覚化できる。測定した赤外吸収スペクトルの主成分(星印★によって図中に表される) は次に、「マップ」に入力できる。マップには、既知の微生物種の亜種または変種のクラスタが含まれる。これはすなわち、同等な培養、調製およびIR測定後に、特定の亜種または変種のパラメータが配置されるロケーションである。第1の例では、パラメータ★はすべてのクラスタの外側にあるため、同定できない。第2の例では、パラメータ★はクラスタに割り当てることができるため、亜種または変種であると同定できる。
【図３】第2の実施形態による、微生物の亜種および変種を同定するためのフローチャートの一例を示す。この方法は、サンプル中の特定微生物種の仮定的推定から始まる。次に、MSスペクトルのライブラリ、および種固有の培養と調製により取得された推定微生物種の亜種と変種のIRスペクトルライブラリが提供される。次に、サンプルから微生物分離株が種固有に培養される。次に、分離株の微生物がIRスペクトル取得のためにIRサンプル支持体上で調製される。次に、単数のIRスペクトル (または複数のIRスペクトル) が取得される。次に、微生物がMALDIイオン化のためにIRサンプル支持体上で調製される。次に、MSスペクトルが取得される。次に、微生物種のマススペクトル同定が実施される。次に、微生物種に関する推定が正しかったか否かの質問が作成される。回答が「いいえ」の場合、この例では方法はここで終了する。回答が「はい」の場合、次に、すでに取得したIRスペクトルと種固有のIR参照スペクトルを利用して、亜種と変種が同定される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
現在使用されているマスペクトル法は通常、信頼性を持って種のみを同定することができる。好ましい場合においては亜種も同定できるが、稀な少数例においては、微生物の種のみが同定できる。本発明は、赤外スペクトルは現在、マススペクトル同定が浸透できるより、分類学的分類のより下層レベルまで浸透できる、という発見に基づいていることが、再度ここで強調されるべきである。これは、数理分類学分析で使用する参照赤外スペクトルが近縁微生物の小グループを含み(例えば1つの属または1つの種、さらには1つの亜種)、好ましくは標準化された属、種さらには亜種固有の条件下で微生物を成長させた場合に限り、適用される。参照ライブラリが単一微生物種の異なる病原型と血清型のIRスペクトルのみで構成される場合、サンプル中の微生物が実際にこの種に属することを条件として、サンプル中の微生物の病原型または血清型(または、少なくとも病原型または血清型のグループ) を明確に判定することが通常可能である。微生物スペクトルが予測した種に属さない場合、割り当ては不可能である。
【００３９】
しかし、医療診断において、特に血液、鼻の粘液、便または尿からの微生物が最初によく知られていない場合があるが、これらは種を判定した後に通常、次亜種、血清型、ファージ型または病原型のような変種まで遡ってできるだけ正確に特徴付けられなければならない。「病原型」という用語は単独で、種のすべての変種が病原性とは限らないことを意味するが、医療診断において考慮されるのは病原性が主である。この判定は通常、マススペクトルのみでは実施できないため、本発明による方法の1つがこのような場合に使用できる。
【００４０】
サンプル中の微生物の分類学的同定の本発明による方法は、種のマススペクトル判定は、赤外スペクトルによる亜種および/または変種の判定により補完されるという事実により本質的に特徴付けられる。参照IRスペクトルの種固有のライブラリが亜種と変種の判定に使用される。
【００４１】
本発明による方法の第1の実施形態では、微生物種のマススペクトル同定の後に、亜種と変種の判定を目的とする微生物の再培養と調製が行われる。この再培養と調製は、参照スペクトルの種固有IRライブラリのIRスペクトルが取得されたのと全く同じ仕様に従って行われる。IRスペクトルのための微生物調製はさらに、IRスペクトルが取得される個々の細胞成分の選択または分離が含まれる場合がある。例えば、精製細胞壁を使用してIRスペクトルを取得することができる。勾配遠心分離により取得した細胞成分の選択された断片を使用することも可能である。細胞成分はまた、有益なIRスペクトルを取得するために誘導体化することもできる。
【００４２】
図1に見られるように、サンプル中の未知の微生物の種、亜種および/または変種を判定する本発明による方法のこの第1の実施形態は、次の工程から成る：
a) 参照マススペクトルのライブラリおよび種固有に取得された参照IRスペクトルのライブラリの提供。
b) サンプルからの微生物分離株の培養。
c) 微生物種のマススペクトル判定
d) この種の参照IRスペクトルのライブラリ用の微生物が取得された、種固有の仕様に従った分離株の微生物の培養と調整。
e) 赤外スペクトルの取得。
f) 種固有の参照IRスペクトルを用いて、数理統計学的な分類方法による亜種および/または変種の判定。
【００４３】
この方法を工程 c) の後で終了できるのは、工程c) で微生物をマススペクトルにより判定した後に、さらなる詳細な分類の必要がない、またはこのような分類用に利用できる参照IRスペクトルのデータベースがない、と確認された場合である。
【００４４】
参照IRスペクトルのライブラリに一致する、この種の仕様に従った微生物の培養と調整を行う工程d) は、それぞれの種に対して、標準方法に従って培養した微生物用の測定された参照スペクトルで、この種に正確に適合されている個別のコレクションがあることを、すでに示している。標準方法には、栄養培地、培養時間と温度、栄養培地上の酸素と湿度含量、また、IR分光光度計用のサンプル調整のタイプ、さらに最後に、分類用IRスペクトルの個々のセクションについての重み付け手法の規定が含まれている。
【００４５】
調整方法には、特定の細胞成分を選択することが、種を十分良好に区別するための唯一の方法である場合、これも必要であり得る。例えば、細菌の多くの血清型は、外側細胞膜(表面抗原として) の異なるタイプのリポ多糖により区別され、次に、例えばO104:H4 (これは、つい最近2011年に発生した流行性EHECのEHEC血清型である) により割り当てられる。ここで、「O」は、「表面抗原」を意味する。リポ多糖の正確な区別には、細胞壁の分離と精製が必要であるが、細胞膜外層を分解してはならない。
【００４６】
従って、この第1の実施形態には、微生物の細胞が注意深く破壊され、成分の1つのIRスペクトルが取得される前に、細胞成分がそれぞれ分離される調製方法が含まれ得る。細胞壁の破壊による細胞消化は、重要成分(例えば外皮タンパク質やリポ多糖) の損失や破壊がないような方法で実施されなければならない。細胞消化は通常、すべてのタンパク質をできる限り分離するために強酸(70パーセントの蟻酸またはトリフルオロ酢酸) を用いて実施される一方、ここでは、リゾチーム酵素を用いて細胞消化を実施することが好都合であり得る。消化された細胞は次に、好ましくは勾配遠心分離により個々の細胞成分に分離され、特定の成分(例えば細胞壁) のみがIRスペクトル測定に使用される。
【００４７】
第1の実施形態では、マススペクトルが最初に取得され、次にIRスペクトルのみが取得されるのに対して、第2の実施形態ではこの順序が逆になる。第2の実施形態は、サンプル中の微生物種が何であるかが見当がつく場合に好ましい。この推定に基づいて種固有の培養を成長させ、コロニーからの分離株をIRスペクトルサンプル支持体上で調製する。IR透過材 (例えばセレン化亜鉛またはシリコンのプレート) はIRサンプル支持体として首尾よく使用されている。IRスペクトルの取得後に、微生物サンプルはMALDIイオン化用に調製される。すなわち、微生物は消化され、微生物細胞成分がマトリックス結晶中で調製される。これは、IR測定自体のためにサンプル支持体 (例えばシリコンプレート) 上で実施され得る。マススペクトル取得により微生物種の同定をもたらし、これにより種についての推定が確認されるか、または間違いであることが証明される。正しい微生物種が存在していれば、今度は、亜種および、該当する場合、変種を、すでに取得したIRスペクトルから判定できる。マススペクトルにより推定種を確認せずにこのような判定を行うと、偽陽性または偽陰性という危険な結果となる。
【００４８】
この第2の実施形態は、IRスペクトルとマススペクトルは同じ微生物から取得でき、特殊な一実施形態において、同じサンプル支持プレート上でも取得できるため、特に魅力的である。図3は、この第2の実施形態のフローチャートの一例である。
【００４９】
この第2の実施形態は特に、腸内細菌 (すなわち、特にE. Coliが存在する場合) 用に好適である。訓練を受けた専門家はすでに、ペトリ皿中のゼラチン状の栄養培地上のコロニーを、約90パーセントの確率でE. Coliとして正しく同定することができるため、この手順が成功する確率は高い。E. coliが存在すれば、病原型 (例えばEHEC) を同定する緊急の必要性がある。ただし、マススペクトルによってE. coliの確認が見出されない場合 (例えばCitrobacter  (シトロバクター菌) である場合)、IRスペクトルの評価は診断的に危険な間違った結果をもたらし得る。
【００５０】
上述の例示方法は、IRスペクトルの種固有または調製固有のライブラリの存在を必要とする。これらは実際に微生物研究所の専門家により独自に作成できるのだが、習得できない膨大な仕事のように最初は思われる。しかし、第1に、厳密な標準化により異なる研究所間でスペクトルライブラリを交換することが可能であり、第2に、微生物研究所の日常業務において、4〜6種の微生物種のみが、日常的に行わなければならない同定の80パーセント以上を占めていることが明らかになっている。これらの3〜4種のみが詳細な分類 (例えば、E. coli、salmonella、S. aureus) が必要な場合がある。加えて、さらに稀な微生物種のほんの一部が、さらなる詳細な分類を行う関心がある可能性がある。最も緊急な関心があるこれらの微生物種は、重視する特定事業により研究所によって異なる場合がある一方、個々の研究所がこれらの微生物のIRスペクトルのこのようなライブラリを時間をかけてまとめることは可能である。
【００５１】
上記に簡潔に示されているように、少数ではあるが、時には重要な例において、マススペクトル同定法により2種間 (さらには属間) の区別を信頼度を持って良好に提供できない場合がある。1つの微生物種用に、マススペクトル参照ライブラリには通常、異なる菌株の5〜20の参照スペクトルが含まれる。これらの菌株は、菌株の参照スペクトルがこの微生物種のマススペクトル中のバリエーションをできるだけ広範に取り扱うような方法で選択されている。特定の種のマススペクトルのバリエーションは、異なる種さらには属のマススペクトルと、相似性において重複することが起こり得る。このような事例(これは分類の境界線が引きにくいと見なされなければならない) は、E. coli種(上述のEHEC変種は別として、比較的に無害な旅行者下痢症の病原体である変種も含む) と、Shigella属(4種；細菌性赤痢 (bacillary dysentery) 病原体で、治療が必要) との明確な区別を行う際の問題である。E. coli種は著しく大きなバリエーションのマススペクトルを持つ。そのため、これらは4種のShigella種(Shigella boydii、Shigella dysentenae、Shigella flexneri およびShigella sonnei) のうちのどれかに時折、非常に似ており (これらの種はマススペクトル的に互いに容易に区別できる)、その結果として明確なマススペクトル同定は、しばしば不可能である。
【００５２】
現時点で、系統発生的相似性により、一部の分子生物学者が、4種のShigella種は異種属を形成しないが、実際にはE. coliの4種の亜種を表していると確信するようになったことは、言及すべきである。将来、このような再分類が起こるか否かに関わらず、治療要件が異なるため、この亜種を同定する問題は依然として残ることを意味する。
【００５３】
上述の本発明による方法の特殊な一実施形態がここで支援を提供するのだが、この場合、Shigella属とE. coli種の微生物を含むIR参照ライブラリが使用される。ShigellaまたはE. coli のマススペクトル同定が完全に明確であれば、手順は首尾よく完了する。ただし、明確でなければ、Shigella属とE. coli種から成るIRスペクトル参照ライブラリが使用され、このIRスペクトル参照ライブラリの参照スペクトル用の微生物培養に使用された仕様に従って、微生物を培養することが好ましい。その後、IRスペクトルにより、存在する種の信頼できる判定が可能になる。このタイプの同様な少数の事例は種の最終判定のためのIRスペクトルを必要とし、このために、マススペクトルでは区別できないすべての種の参照IRスペクトルを伴うデータベースが必要となる。
【００５４】
この種の亜種と変種を判定するには、種固有となるように選択された、この種の特殊な参照IRスペクトルか、または属の参照スペクトルの特殊の評価アルゴリズムを用いて、分析の第3工程が必要である場合がある。そのため、E. coliの明確な同定の後に変種の判定が行われる。E. coliは正常な腸内フローラの一部であり、それ自体は無害であるが、多くの病原性の変種がある。1977年に初めて報告され、様々な変種 (例えば血清型O157、血清型O103、および血清型O26) から成る、すでに述べたEHECとは別に、次のような病原性のE. coli:がさらに存在する：
enteropathogenic E. coli (EPEC、腸管病原性大腸菌)、enterotoxigenic E. coli (ETEC、毒素病原性大腸菌)、enteroinvasive E. coli (EIEC、腸管侵入性大腸菌)、enteroaggregative E. coli (EAEC、腸管凝集性大腸菌) およびdiffusely adherent E. coli (DAEC、分散接着性大腸菌)。ここでも、細胞成分の1つからIRスペクトルを取得する前に、微生物細胞を破壊して細胞成分を互いに分離する基本的方法を適用することが好都合であり得る。特定の成分(例えば細胞壁) のみが、IRスペクトル測定に使用される。
【００５５】
特定の抗生物質に対する微生物の耐性は治療の特別な関心であり、いまだに骨の折れる分析方法で判定されなければならない。洗練されたIRスペクトル測定方法により特定の耐性タイプを判定できるようになることも可能である。血清型が抗生物質に対する耐性に相関し得ることも予測される。
【００５６】
本発明による方法により、IRスペクトルを用いて、おそらくは特殊な測定に使用される微生物の特定の断片のみを用いて、抗生物質に対する異なる耐性を直接検出できる可能性がある。例えば、遠心分離(特に密度勾配遠心分離) で細胞壁が破壊された後に、これらの断片は既知の方法で基本的に取得できる。該当する場合、微生物成分は、誘導体化、凝結、または異なる耐性を持つ微生物がそれらのIRスペクトルによって互いに区別できるようなその他の生化学的改変によって、調製することも可能である。
【００５７】
本発明は、数多くの異なる実施形態を参照して説明されている。ただし、本発明の様々な態様または詳細は、本発明の技術的教示から逸脱することなく、変更可能であり、また異なる実施形態の様々な態様または詳細は、実践可能であれば任意に組み合わせられることが理解されよう。一般に、上述の説明は説明のみを目的としたものであり、本発明を制限する目的ではない。本発明の制限範囲は添付の請求項でのみ定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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