(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において慢性創傷および急性創傷からなる群より選択される既存の創傷における創傷治癒を促進するための医薬の製造における、5,6-もしくは6,7-エポキシチグリアン（epoxy-tigliane）化合物またはその薬学的に許容される塩の使用であって、前記5,6-もしくは6,7-エポキシチグリアン化合物が、式(I)の化合物である、前記使用：
0006415538.tif 000108
式中、
R1は水素であり、かつR2は-OR17であるか；またはR1およびR2は一緒にカルボニル基(=O)を形成し；
R3は水素またはC1-6アルキルであり；
R4およびR5は独立して水素もしくは-OR17であるか；またはR4およびR5は一緒に、二重結合もしくはエポキシド(-O-)を形成し；
R6は水素またはC1-6アルキルであり；
R7は-OHまたは-OR18であり；
R8は-OHまたは-OR18であり；但し、R7およびR8は両方ともがOHであることはなく；
R9およびR10は水素およびC1-6アルキルから独立して選択され；
R11およびR12またはR12およびR13は一緒にエポキシドを形成し、R11およびR13のうちの残りの基は水素、-OHまたは-OR17であり、
R14は水素または-R17であり；
R15は水素または-R17であり；
R16は水素または-R17であり；
R17は、水素、-C1-6アルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6アルキニル、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり；
R18は、C1-20アルキル、-C2-20アルケニル、-C2-20アルキニル、-C(O)C1-20アルキル、-C(O)C2-20アルケニル、-C(O)C2-20アルキニル、-C(O)シクロアルキル、-C(O)C1-10アルキルシクロアルキル；-C(O)C2-10アルケニルシクロアルキル、-C(O)C2-10アルキニルシクロアルキル、-C(O)アリール、-C(O)C1-10アルキルアリール、-C(O)C2-10アルケニルアリール、-C(O)C2-10アルキニルアリール、-C(O)C1-10アルキルC(O)R19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)R19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)R19、-C(O)C1-10アルキルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルケニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルキニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10アルキルSR19、-C(O)C2-10アルケニルSR19、-C(O)C2-10アルキニルSR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)OR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)SR19、
0006415538.tif 000109
であり；
R19は、水素、-C1-10アルキル、-C2-10アルケニル、-C2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は各々、置換されていてもよい。
【請求項２】
既存の創傷における創傷治癒の促進が、創傷治癒の速度を上げることを含む、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
既存の創傷における創傷治癒の促進が、創傷組織における瘢痕化を減少させることを含む、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
既存の創傷における創傷治癒の促進が、創傷治癒の速度を上げることおよび創傷組織における瘢痕化を減少させることの両方を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
既存の創傷における創傷治癒の促進が、治癒により既存の創傷の美容的アウトカムが改善されることを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
エポキシチグリアン化合物が植物抽出物の形態である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
植物抽出物が、フォンテイネア（Fontainea）種またはハイランディア（Hylandia）種である植物から得ることができる、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
式(I)の化合物が、式(II)
0006415538.tif 000110
（式中、R3、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。）
の化合物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
式(I)または(II)の化合物が、式(III)
0006415538.tif 000111
（式中、R7、R8、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。）
の化合物である、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
R1が水素であり、かつR2が、OHもしくは-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか、またはR1およびR2が一緒にカルボニル基を形成する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
R3が水素または-C1-3アルキルである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
R4およびR5が独立して、水素もしくは-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか、またはR4およびR5が一緒に、二重結合もしくはエポキシドを形成する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
R6が水素または-C1-3アルキルである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
R7が、-OH、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）、-OC(O)C1-15アルキルアリール、-OC(O)C1-10アルキルC(O)H、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)H、-OC(O)C1-10アルキルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C2-10アルケニルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C1-10アルキルSC1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルSC1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルC(O)OC1-6アルキル、または-OC(O)C2-10アルキルC(O)OC1-6アルキルである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
R8が、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、または-C(O)アリールであり、ここでアリール基は置換されていてもよい、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
R9およびR10が独立して-C1-3アルキルである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
R11およびR12がエポキシドを形成し、R13が、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニル、または-OC(O)C2-6アルキニルである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
R12およびR13がエポキシドを形成し、R11が、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニル、または-OC(O)C2-6アルキニルである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
R15が、水素、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニル、または-C(O)C2-6アルキニルである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
R14が水素である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
R16が水素である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
対象において治癒中の創傷における過度の瘢痕を予防するための医薬の製造における、5,6-もしくは6,7-エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用であって、前記5,6-もしくは6,7-エポキシチグリアン化合物が、式(I)の化合物である、前記使用：
0006415538.tif 000112
式中、
R1は水素であり、かつR2は-OR17であるか；またはR1およびR2は一緒にカルボニル基(=O)を形成し；
R3は水素またはC1-6アルキルであり；
R4およびR5は独立して水素もしくは-OR17であるか；またはR4およびR5は一緒に、二重結合もしくはエポキシド(-O-)を形成し；
R6は水素またはC1-6アルキルであり；
R7は-OHまたは-OR18であり；
R8は-OHまたは-OR18であり；但し、R7およびR8は両方ともがOHであることはなく；
R9およびR10は水素およびC1-6アルキルから独立して選択され；
R11およびR12またはR12およびR13は一緒にエポキシドを形成し、R11およびR13のうちの残りの基は水素、-OHまたは-OR17であり、
R14は水素または-R17であり；
R15は水素または-R17であり；
R16は水素または-R17であり；
R17は、水素、-C1-6アルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6アルキニル、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり；
R18は、C1-20アルキル、-C2-20アルケニル、-C2-20アルキニル、-C(O)C1-20アルキル、-C(O)C2-20アルケニル、-C(O)C2-20アルキニル、-C(O)シクロアルキル、-C(O)C1-10アルキルシクロアルキル；-C(O)C2-10アルケニルシクロアルキル、-C(O)C2-10アルキニルシクロアルキル、-C(O)アリール、-C(O)C1-10アルキルアリール、-C(O)C2-10アルケニルアリール、-C(O)C2-10アルキニルアリール、-C(O)C1-10アルキルC(O)R19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)R19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)R19、-C(O)C1-10アルキルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルケニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルキニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10アルキルSR19、-C(O)C2-10アルケニルSR19、-C(O)C2-10アルキニルSR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)OR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)SR19、
0006415538.tif 000113
であり；
R19は、水素、-C1-10アルキル、-C2-10アルケニル、-C2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は各々、置換されていてもよい。
【請求項２３】
過度の瘢痕がケロイドまたは肥厚性瘢痕である、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン（tigliaen）-3-オン (化合物5);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物6);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物7);
12-ブタノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物8);
12-[(2E,4E)-(6,6-ジメトキシヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物9);
12-[(2E,4E)-6-オキソヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物10);
12-[(2E,4E)-6,7-ジヒドロキシドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物11);
12-[(2E)-4,5-ジヒドロキシ-デカ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物12);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物13);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物14);
12-(2-メチルプロパ-2-エノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物15);
12-[(2E,4E)-ヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物16);
12-[(2E,4E)-8-オキソドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物17);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物18);
13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物19);
12-[(2E)-ブタ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物20);
12-チグロイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物21);
12-(3-ブテノイル)-13-ノナノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物22);
12-ベンゾイル-13-(2-メチルブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物23);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物25);
12-[(2E,4E)-6,7-(アンチ)-エポキシ-ドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物26);
12,13-ジブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物27)
12-ベンゾイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物28);
12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物29);
13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物30);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物31);
12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物32);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物33);
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物34);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物35);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物36);
12-{[2-(メチルスルファニル)カルボニル]-アセトイル}-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物39); および
12-[(2-メトキシカルボニル)-アセトイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物40);
12,13-ジ-ノノイル（nonoyl）-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物41);
12,13-ジ-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物42);
12,13-ジ-ペンタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物43);
12,13-ジ-チグロイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物44)
5,20-ジ-アセチル-12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物45);
12,13-ジ-(2E,4E)-ヘキサ-2,4-エノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物46);
12-ヘキサノイル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物47)
12-アセチル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物48);
12,13-ジ-ヘプタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物49);
12-ミリストイル-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物50);
12-ミリストイル-13(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物51);
12-(2-メチルブタノイル)-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物52); および
12-ヒドロキシ-13-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物53);
12,13-ジ-(3-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物60)
からなる群より選択される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
請求項24に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、エポキシチグリアン（epoxy-tigliane）化合物および創傷治癒の促進におけるその使用に関する。特定の態様において、エポキシチグリアン化合物は、エポキシ-チグリアエン（tigliaen）-3-オン化合物である。創傷治癒を誘導または促進する方法、ならびに創傷の治癒の際に瘢痕化を減少させ美容的アウトカムを改善する方法を記載する。創傷治癒における使用のための化合物および組成物も記載する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
創傷治癒は、皮膚または別の器官もしくは組織が損傷後に自己を修復する複雑なプロセスである。正常な皮膚において、表皮（最外層）および真皮（内層または深層）は、外部環境に対する保護バリアを形成して、定常状態において平衡で存在する。いったん保護バリアが壊れると、創傷治癒の通常の生理学的プロセスが直ちに作動される。創傷治癒の古典的モデルは、3つの逐次的な、しかし重複する段階、即ち、炎症期、増殖期、および最終のリモデリング期に分けられる。
【０００３】
創傷治癒の炎症期の間、周囲血管から創傷へ好中球および次いで単球が活発に動員される。好中球は、創傷における細菌および真菌感染症の初期の制御および破壊に不可欠である。単球は創傷に入るにつれてマクロファージへ成熟し、ここでは、それらは、最初のファゴサイトーシスならびにマトリックスおよび細胞破片の除去を含む、創傷消散の過程の間の多数の役割を有する。次いで、創傷における好中球およびマクロファージの両方による酵素、サイトカインおよび増殖因子の放出は、創傷および周囲組織内の他の細胞に対して著しい影響を及ぼし得る。例えば、マクロファージは、創傷を清拭するコラーゲナーゼ；線維芽細胞を刺激して血管新生を促進する、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子（TNF）；ならびに、ケラチノサイトを刺激する、形質転換増殖因子（TGF）を分泌する。それらはまた、血小板由来増殖因子および血管内皮増殖因子を分泌し、これらは、肉芽組織の形成を開始し、従って、増殖期およびリモデリング期への移行を開始する。迅速かつロバストな、しかし一過性の炎症期は、しばしば、良好な創傷治癒アウトカムと関連する。
【０００４】
創傷治癒の第2段階は細胞増殖および細胞移動ならびに創傷収縮を含む。これは、創傷内の細胞によって起こされる作用を含み、創傷の裂け目が閉鎖され、失われた組織が補充される。ケラチノサイトの移動および増殖は、創傷の再上皮化を達成するために必須であり、一方、下層の真皮の再構成は、線維芽細胞の移動、増殖および分化から生じ、これらは、閉鎖された創傷を引き上げるのを助け、コラーゲン線維の合成、束化および整列に寄与する。
【０００５】
最終のリモデリング段階において、創傷端で移動および増殖するケラチノサイトは、再層化し（restratify）、創傷を封鎖し、連続的な表皮を形成する。この段階の間、正常な皮膚構造および血管を復元するための細胞外マトリックスのリモデリングを含む、多くの変化も真皮において生じる。
【０００６】
ある場合には、創傷は、治癒するのが遅いかまたは全く治癒しない場合がある。多くの因子、例えば、負傷した対象の全体的な健康、負傷した対象の年齢、糖尿病などの疾患、もしくは循環に影響を与え得る他の疾患、感染症、異物もしくは壊死組織の存在が、創傷の治癒に影響を与え、または場合によっては、薬剤が、創傷治癒の速度に影響を与え得る。
【０００７】
さらに、いくつかの創傷において、創傷消散の不完全な調節は、線維症および過度の瘢痕形成を生じさせ、正常組織よりも機能的および美容的に劣る瘢痕組織を残し得る。
【０００８】
創傷治癒の改善および瘢痕組織の減少についての多くの研究が存在する。しかし、特に慢性創傷において、創傷治癒を促進することができる、例えば、創傷治癒の速度を上げることができる、薬剤を見つける必要性がある。自然に生じるよりも減少した瘢痕化を伴って、創傷が治癒することを可能にする薬剤についての必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、エポキシチグリアン化合物を含有する植物由来の抽出物が、創傷治癒を促進することができ、さらに、創傷の治癒の際に形成される瘢痕組織を減らすことができるという発見に、少なくとも一部基づいている。
【００１０】
本発明の第1局面において、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩を対象へ投与する工程を含む、対象において創傷治癒を促進する方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物は、植物抽出物、特にエタノール抽出物の形態である。いくつかの態様において、植物抽出物は、フォンテイネア（Fontainea）種またはハイランディア（Hylandia）種である植物から得ることができるかまたは得られる。いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物は、植物抽出物から単離される。他の態様において、エポキシチグリアン化合物は、単離されたチグリアン化合物の合成誘導体または半合成誘導体である。
【００１２】
いくつかの態様において、創傷治癒の促進は、創傷治癒の速度を上げることを含む。いくつかの態様において、創傷治癒の促進は、創傷組織における瘢痕化を減少させることを含む。いくつかの態様において、創傷治癒の促進は、創傷治癒の速度を上げることおよび創傷組織における瘢痕化を減少させることの両方を含む。いくつかの態様において、創傷は、慢性創傷、急性創傷または既存の創傷である。
【００１３】
本発明のさらに別の局面において、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩を創傷または瘢痕へ適用する工程を含む、過度の瘢痕を治療または予防する方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、過度の瘢痕はケロイドまたは肥厚性瘢痕である。
【００１５】
本発明の別の局面において、対象において創傷治癒を促進するための医薬の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の局面において、対象において創傷治癒を促進するためのエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
エポキシチグリアン（epoxy-tigliane）化合物またはその薬学的に許容される塩を対象へ投与する工程を含む、対象において創傷治癒を促進する方法。
［２］
創傷治癒の促進が、創傷治癒の速度を上げることを含む、［1］に記載の方法。
［３］
創傷治癒の促進が、創傷組織における瘢痕化を減少させることを含む、［1］に記載の方法。
［４］
創傷治癒の促進が、創傷治癒の速度を上げることおよび創傷組織における瘢痕化を減少させることの両方を含む、［1］〜［3］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
創傷治癒の促進が、治癒した創傷の美容的アウトカムを改善することを含む、［1］〜［4］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
創傷が、慢性創傷、急性創傷または既存の創傷である、［1］〜［5］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
エポキシチグリアン化合物が植物抽出物の形態である、［1］〜［6］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
植物抽出物が、フォンテイネア（Fontainea）種またはハイランディア（Hylandia）種である植物から得ることができる、［7］に記載の方法。
［９］
エポキシチグリアン化合物が、式(I)の化合物、またはその幾何異性体もしくは立体異性体もしくは薬学的に許容される塩である、［1］〜［8］のいずれか一項に記載の方法：
0006415538.tif 000002
式中、
R1は水素であり、かつR2は-OR17であるか；またはR1およびR2は一緒にカルボニル基(=O)を形成し；
R3は水素またはC1-6アルキルであり；
R4およびR5は独立して水素もしくは-OR17であるか；またはR4およびR5は一緒に、二重結合もしくはエポキシド(-O-)を形成し；
R6は水素またはC1-6アルキルであり；
R7は-OHまたは-OR18であり；
R8は-OHまたは-OR18であり；但し、R7およびR8は両方ともがOHであることはなく；
R9およびR10は水素およびC1-6アルキルから独立して選択され；
R11およびR12またはR12およびR13は一緒にエポキシドを形成し、R11およびR13のうちの残りの基は水素、-OHまたは-OR17であり、
R14は水素または-R17であり；
R15は水素または-R17であり；
R16は水素または-R17であり；
R17は、水素、-C1-6アルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6アルキニル、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり；
R18は、C1-20アルキル、-C2-20アルケニル、-C2-20アルキニル、-C(O)C1-20アルキル、-C(O)C2-20アルケニル、-C(O)C2-20アルキニル、-C(O)シクロアルキル、-C(O)C1-10アルキルシクロアルキル；-C(O)C2-10アルケニルシクロアルキル、-C(O)C2-10アルキニルシクロアルキル、-C(O)アリール、-C(O)C1-10アルキルアリール、-C(O)C2-10アルケニルアリール、-C(O)C2-10アルキニルアリール、-C(O)C1-10アルキルC(O)R19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)R19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)R19、-C(O)C1-10アルキルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルケニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルキニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10アルキルSR19、-C(O)C2-10アルケニルSR19、-C(O)C2-10アルキニルSR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)OR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)SR19、
0006415538.tif 000003
であり；
R19は、水素、-C1-10アルキル、-C2-10アルケニル、-C2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は各々、置換されていてもよい。
［１０］
式(I)の化合物が、式(II)
0006415538.tif 000004
の化合物である、［9］に記載の方法：
式中、R3、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。
［１１］
式(I)または(II)の化合物が、式(III)
0006415538.tif 000005
の化合物である、［9］または［10］に記載の方法：
式中、R7、R8、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。
［１２］
R1が水素であり、かつR2が、OHもしくは-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか、またはR1およびR2が一緒にカルボニル基を形成する、［9］〜［11］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
R3が水素または-C1-3アルキルである、［9］〜［12］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
R4およびR5が独立して、水素もしくは-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか、またはR4およびR5が一緒に、二重結合もしくはエポキシドを形成する、［9］〜［13］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
R6が水素または-C1-3アルキルである、［9］〜［14］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
R7が、-OH、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）、-OC(O)C1-15アルキルアリール、-OC(O)C1-10アルキルC(O)H、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)H、-OC(O)C1-10アルキルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C2-10アルケニルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C1-10アルキルSC1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルSC1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルC(O)OC1-6アルキル、または-OC(O)C2-10アルキルC(O)OC1-6アルキルである、［9］〜［15］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
R8が、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、または-C(O)アリールであり、ここでアリール基は置換されていてもよい、［9］〜［16］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
R9およびR10が独立して-C1-3アルキルである、［9］〜［17］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
R11およびR12がエポキシドを形成し、R13が、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニル、または-OC(O)C2-6アルキニルである、［9］〜［18］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
R12およびR13がエポキシドを形成し、R11が、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニル、または-OC(O)C2-6アルキニルである、［9］〜［18］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
R15が、水素、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニル、または-C(O)C2-6アルキニルである、［9］〜［20］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
R14が水素である、［8］〜［21］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］
R16が水素である、［9］〜［22］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩を創傷または瘢痕へ適用する工程を含む、過度の瘢痕を治療または予防する方法。
［２５］
過度の瘢痕がケロイドまたは肥厚性瘢痕である、［24］に記載の方法。
［２６］
対象において創傷治癒を促進するかまたは過度の瘢痕を治療もしくは予防するための医薬の製造におけるエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
［２７］
対象において創傷治癒を促進するかまたは過度の瘢痕を治療もしくは予防するためのエポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
［２８］
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン（tigliaen）-3-オン (化合物5);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物6);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物7);
12-ブタノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物8);
12-[(2E,4E)-(6,6-ジメトキシヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物9);
12-[(2E,4E)-6-オキソヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物10);
12-[(2E,4E)-6,7-ジヒドロキシドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物11);
12-[(2E)-4,5-ジヒドロキシ-デカ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物12);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物13);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物14);
12-(2-メチルプロパ-2-エノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物15);
12-[(2E,4E)-ヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物16);
12-[(2E,4E)-8-オキソドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物17);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物18);
13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物19);
12-[(2E)-ブタ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物20);
12-チグロイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物21);
12-(3-ブテノイル)-13-ノナノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物22);
12-ベンゾイル-13-(2-メチルブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物23);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物25);
12-[(2E,4E)-6,7-(アンチ)-エポキシ-ドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物26);
12,13-ジブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物27)
12-ベンゾイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物28);
12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物29);
13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物30);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物31);
12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物32);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物33);
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物34);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物35);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物36);
12-{[2-(メチルスルファニル)カルボニル]-アセトイル}-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物39); および
12-[(2-メトキシカルボニル)-アセトイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物40);
12,13-ジ-ノノイル（nonoyl）-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物41);
12,13-ジ-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物42);
12,13-ジ-ペンタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物43);
12,13-ジ-チグロイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物44)
5,20-ジ-アセチル-12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物45);
12,13-ジ-(2E,4E)-ヘキサ-2,4-エノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物46);
12-ヘキサノイル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物47)
12-アセチル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物48);
12,13-ジ-ヘプタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物49);
12-ミリストイル-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物50);
12-ミリストイル-13(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物51);
12-(2-メチルブタノイル)-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物52); および
12-ヒドロキシ-13-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物53);
12,13-ジ-(3-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物60)
からなる群より選択される化合物またはその薬学的に許容される塩。
［２９］
［28］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】引っ掻き後24時間での、ビヒクルのみの対照で処理されたヒト新生児線維芽細胞における引っ掻き傷閉鎖の写真表示である。
【図２】引っ掻き後24時間での、30 ng/mLの化合物1で処理されたヒト新生児線維芽細胞における引っ掻き傷閉鎖の写真表示である。
【図３】ビヒクルのみの対照と比較した10 ng/mLまたは30 ng/mLの化合物1で処理されたヒト新生児線維芽細胞のMatrigel浸潤アッセイのグラフ表示である。細胞を24時間のインキュベーション後にカウントした。* p < 0.05; *** p < 0.001。
【図４】化合物1で処理されたヒト新生児線維芽細胞のウェスタンブロット分析であり、創傷修復および治癒に関与する重要なシグナル伝達分子の活性化およびそれに続く下方調節を示す。
【図５】α平滑筋アクチンの発現の増加および張力線維形成を特徴とする、筋線維芽細胞への分化に及ぼす、ある範囲の濃度の化合物1への線維芽細胞（TGF-β1の存在下で培養した）の曝露の効果の写真表示である。
【図６】α平滑筋アクチンの発現の増加および張力線維形成を特徴とする、筋線維芽細胞への分化に及ぼす、ある範囲の濃度の化合物37への線維芽細胞（TGF-β1の存在下で培養した）の曝露の効果の写真表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の説明
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００１９】
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは2つ以上（即ち、少なくとも1つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「1つの要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２０】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、参照の数量、レベル、値、寸法、サイズ、または量に対して30%、25%、20%、15%または10%ほど異なる、数量、レベル、値、寸法、サイズ、または量を指す。
【００２１】
本明細書全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」は、記載される工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの包含を意味するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの排除を意味しないように理解される。
【００２２】
用語「アルキル」は、1〜20個の炭素原子を有する、置換されていてもよい直鎖および分岐鎖の炭化水素基を指す。適切な場合には、アルキル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有するアルキル基を含む、-C1〜C6アルキルである。アルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、s-およびt-ブチル、ペンチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、2-エチルブチル、3-エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシルおよびペンタデシルが挙げられる。
【００２３】
用語「アルケニル」は、2〜20個の炭素原子を有しかつ少なくとも1つの二重結合を有する、置換されていてもよい不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。適切な場合には、アルケニル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で2、3、4、5または6個の炭素原子を有するアルケニル基を含む、C2〜C6アルケニルである。アルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、s-およびt-ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプタ-1,3-ジエン、ヘキサ-1,3-ジエン、ノナ-1,3,5-トリエンなどが挙げられる。
【００２４】
用語「アルキニル」は、2〜20個の炭素原子を有し、少なくとも1つの三重結合を有する、置換されていてもよい不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。適切な場合には、アルキニル基は、指定された数の炭素原子を有し得る；例えば、直鎖または分岐鎖の配置で2、3、4、5または6個の炭素原子を有するアルキニル基を含む、C2〜C6アルキニルである。非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが挙げられる。
【００２５】
用語「シクロアルキル」および「炭素環式」は、置換されていてもよい飽和または不飽和の単環、二環または三環の炭化水素基を指す。適切な場合には、シクロアルキル基は、指定された数の炭素原子を有し得、例えば、C3〜C6シクロアルキルは、3、4、5または6個の炭素原子を有する炭素環式基である。非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられ得る。
【００２６】
「アリール」は、各環に最大7個の原子を有し、少なくとも1個の環は芳香族である、C6〜C14員の単環、二環または三環の炭素環系を意味する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびビフェニルを含むが、これらに限定されるものではない。アリールは、1〜3個のベンゼン環を含んでよい。2個またはそれよりも多い芳香環が存在する場合、これらの環は共に縮合し、隣接環は共通の結合を共有することができる。
【００２７】
アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリールは各々、個々のエンティティーまたはより大きなエンティティーの部分としてにかかわらず、以下からなる群より選択される1つまたは複数の任意の置換基で置換されていてもよい：C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C3-6シクロアルキル、オキソ(=O)、-OH、-SH、C1-6アルキルO-、C2-6アルケニルO-、C3-6シクロアルキルO-、C1-6アルキルS-、C2-6アルケニルS-、C3-6シクロアルキルS-、-CO2H、-CO2C1-6アルキル、-NH2、-NH(C1-6アルキル)、-N(C1-6アルキル)2、-NH(フェニル)、-N(フェニル)2、-CN、-NO2、-ハロゲン、-CF3、-OCF3、-SCF3、-CHF2、-OCHF2、-SCHF2、-フェニル、-Oフェニル、-C(O)フェニル、-C(O)C1-6アルキル。好適な置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ビニル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ヒドロキシ、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、シアノ、ニトロ、-CO2H、-CO2CH3、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、ジフルオロメトキシ、ジフルオロメチルチオ、モルホリノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、フェニル、フェノキシ、フェニルカルボニル、ベンジルおよびアセチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。しかし、薬学的に許容されない塩も本発明の範囲内に入ることが認識され、何故ならば、これらは、薬学的に許容される塩の調製における中間体として有用であり得るか、または貯蔵もしくは輸送の間有用であり得るためである。好適な薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸および臭化水素酸などの、薬学的に許容される無機酸の塩、または、酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸（benezenesulphonic acid）、サリチル酸（salicyclic acid）、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、および吉草酸などの、薬学的に許容される有機酸の塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどの、薬学的に許容される陽イオンを用いて形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物のような低級アルキルハロゲン化物；ジメチルおよびジエチル硫酸のようなジアルキル硫酸などのような、薬剤を用いて四級化され得る。
【００３１】
本発明の化合物は、不斉中心を有してよく、従って2つ以上の立体異性型で存在することが可能であることも認識される。従って、本発明は、1つまたは複数の不斉中心において実質的に純粋な異性体型、例えば、約90％よりも大きいee、例えば約95％もしくは97％ee、または99％よりも大きいeeの化合物、更にはそれらのラセミ混合物を含む混合物にも関する。このような異性体は、天然の供給源からの単離により、例えばキラル中間体を使用する不斉合成により、またはキラル分割により得ることができる。本発明の化合物は、幾何異性体として存在してもよい。本発明は、実質的に純粋なシス(Z)もしくはトランス(E)型の化合物、またはそれらの混合物にも関する。
【００３２】
本発明の化合物は、植物もしくは植物部分からの単離、または単離された化合物の誘導体化、または関連する化合物の誘導体化によって得てもよい。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「創傷」は、組織構造の連続性または完全性の物理的破壊を指す。創傷は、急性または慢性であり得、切り傷および裂傷、外科的切創もしくは創傷、刺し傷、擦り傷、引っ掻き傷、圧迫傷、擦過傷、摩擦傷、褥瘡性潰瘍（例えば、褥瘡または床擦れ）；熱影響創傷（冷および熱源からの熱傷）、化学的創傷（例えば、酸もしくはアルカリ熱傷）または病原性感染症（例えば、ウイルス性、細菌性もしくは真菌性）、例えば開口したもしくはインタクトな腫れ物、皮膚発疹、しみおよびニキビ、潰瘍、慢性創傷（糖尿病関連創傷、例えば、下肢および足部の潰瘍、静脈性下肢潰瘍および褥瘡を含む）、皮膚移植片／移植組織ドナーおよびレシピエント部位、免疫反応状態、例えば、乾癬および湿疹、胃もしくは腸潰瘍、口腔内創傷、例えば口腔内潰瘍、損傷した軟骨もしくは骨、切断創、ならびに角膜病変を含み得る。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「慢性創傷」は、その他の点では健康な対象における治癒のための通常の期間内に治癒していない創傷を指す。慢性創傷は、対象の健康状態に起因して治癒しないものであり得、例えば、対象は血行不良または糖尿病などの疾患を有し、または対象は、正常な治癒プロセスを阻害する薬物治療中である。治癒はまた、細菌、真菌または寄生虫感染症などの、感染症の存在によって損なわれ得る。場合によっては、慢性創傷は、数週間、数ヶ月またはさらに数年間、未治癒のままであり得る。慢性創傷の例としては、糖尿病性潰瘍、褥瘡および熱帯性潰瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「創傷治癒の促進」は、本明細書において使用される場合、未処置の創傷において観察されるであろう創傷治癒と比較した創傷治癒の改善を指す。創傷治癒の促進は、創傷治癒の速度を上げることを含み、例えば、創傷は、創傷を未処置のままにした場合よりも数時間、数日または数週間早い速度で治癒し得る。創傷治癒の促進はまた、創傷を未処置のままにしておく場合に予想されるものと比較して、治癒中のまたは治癒した創傷における瘢痕組織の減少を包含し得る。
【００３６】
用語「創傷治癒」は、部分的または完全な、組織完全性の回復を指す。
【００３７】
用語「瘢痕化を減少させること」または「瘢痕組織を減少させること」は、本明細書において言及される場合、創傷を未処置のままにした場合と比較して、創傷の治癒によって引き起こされる異常組織の減少および／または美容的結果の改善に関する。いくつかの態様において、瘢痕組織を減少させることは、創傷を未処置のままにしておく場合と比較して、異常組織を減少させることもしくは最小にすること、皮膚色素沈着の変化を減少させることもしくは最小にすること、および／または発毛を改善することを含む。
【００３８】
用語「エポキシチグリアン化合物」は、以下の基本の炭素環式構造のうちの1つを有する化合物を指す：
0006415538.tif 000006
【００３９】
化合物は、6員環へ付加された縮合シクロプロパン環を有するトリシクロ[9.3.0.0]テトラデカン系を有する。エポキシドが、5,6位または6,7位において7員環へ縮合されている。
【００４０】
用語「エポキシ-チグリエン（tiglien）-3-オン化合物」は、5員環が1,2-エン-3-オン構造を有する、上記に定義されるエポキシチグリアン構造を有する化合物を指す：
0006415538.tif 000007
【００４１】
創傷治癒方法
本発明の第1局面において、エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩を対象へ投与する工程を含む、対象において創傷治癒を促進する方法を提供する。
【００４２】
治癒される創傷は、内部器官もしくは組織または外部組織、例えば皮膚を含む、任意の器官または組織中に存在し得る。創傷は、損傷、刺し傷または熱傷の結果であり得る。器官または組織は、皮膚、筋肉、肝臓、腎臓、肺、心臓、膵臓、脾臓、胃、腸  膀胱、卵巣、精巣、子宮、軟骨、腱、靭帯、骨などのうちのいずれか1つまたは複数であり得る。特定の態様において、創傷は皮膚および／または筋肉中にある。
【００４３】
いくつかの態様において、創傷が生じた直後に、エポキシチグリアン化合物を投与する。他の態様において、創傷は、数日間、数週間、数ヶ月間または数年間にわたって治癒しなかった慢性創傷である。さらに他の態様において、創傷は、通常の速度で治癒しなかったかまたは他の療法に反応しなかった既存の創傷である。
【００４４】
本発明の化合物はまた、過度の瘢痕を伴って治癒中のまたは治癒した創傷へ適用されてもよい。このような創傷の例は、ケロイド瘢痕または肥厚性瘢痕を形成中のまたは形成したものである。
【００４５】
いくつかの態様において、創傷は細菌感染症に感染している。細菌感染症は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、特にグラム陽性細菌により引き起こされ得る。本発明の化合物により制御される細菌の非限定的例としては、バチルス属(Bacillus)、例えば枯草菌(B. subtilis)、炭疽菌(B. anthracis)、B.セレウス(B. cereus)、B.ファーマス(B. firmis)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.プミルス(B. pumilus)、B.コアグランス(B. coagulans)、B.パントセンティカス(B. pantothenticus)、B.アルベイ(B. alvei)、B.ブレービス(B. brevis)、B.シルキュビンス(B. circubins)、B.ラテロスポラス(B. laterosporus)、B.マセランス(B. macerans)、B.ポリミクサ(B. polymyxa)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、およびB.スファエリカス(B. sphaericus)；ブドウ球菌属(Staphlococcus)、例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)、S.ヘモリディカス(S. haemolyticus)、腐性ブドウ球菌(S. saprophyticus)；連鎖球菌属(Streptococcus)、例えば、化膿連鎖球菌(S. pyrogenes)、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)、S.アガラクチアエ(S. alagactiae)、S.ディスガラクティエ(S. dysgalactiae)、S.エクイシミリス(S. equisimilis)、S.エクイ(S. equi)、S.ズーエピデミカス(S. zooepidemicus)、S.アンギノーサス(S. anginosus)、唾液連鎖球菌(S. salwarius)、S.ミレリ(S. milleri)、サングイス連鎖球菌(S. sanguis)、S.ミチオール(S. mitior)、S.ミュータンス(S. mutans)、糞便連鎖球菌(S. faecalis)、S.フェシウム(S. faecium)、S.ボビス(S. bovis)、S.エクイナス(S. equinus)、S.ユベリス(S. uberus)、およびS.アビウム(S. avium )；アエロコッカス属(Aerococcus)種、双子菌属(Gemella)種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、リステリア属(Listeria)種、カルシア属(Kurthia)種、乳酸桿菌属(Lactobacillus)種、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)種、アラクニア属(Arachnia)種、放線菌属(Actinomyces)種、プロピオン酸菌属(Propionibacterium)種、ロチア属(Rothia)種、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacteriun)種、クロストリジウム属(Clostridium)種、ユーバクテリウム属(Eubacterium)種、セラチア属(Serratia)種、クレブシエラ属(Klebsiella)種、プロテウス属(Proteus)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、シュードモナス属(Pseudomonas)種、ノカルジア属(Nocardia)種、およびミコバクテリウム属(Mycobacterium)種の細菌が挙げられる。
【００４６】
いくつかの態様において、創傷は、真菌感染症に感染している。真菌感染症は、糸状菌または酵母により引き起こされ得る。本発明の化合物によって制御される真菌の非限定的な例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）種、ケカビ属（Mucor）種、白癬菌属（Trichtophyton）種、クラドスポリウム属（Cladosporium）種、ウロクラジウム属（Ulocladium）種、クルブラリア属（Curvularia）種、オウレオバシディウム属（Aureobasidium）種、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ属（Candida）種、クリプトコックス属（Cryptococcus）種、マレセジア・パチデルマティス（Malessezia pachydermatis）、マレセジア属（Malessezia）種、およびトリコスポロン属（Trichosporon）種などの属の真菌が挙げられる。
【００４７】
いくつかの態様において、創傷は、バイオフィルム中に含まれて、細菌感染症および真菌感染症の両方に感染している。
【００４８】
治癒される創傷を有する対象は、哺乳類、鳥類、魚類および爬虫類を含む、任意の対象であり得る。いくつかの態様において、対象は、ヒト、伴侶動物、実験動物、農業もしくは労働動物、飼育鳥、競争動物、または捕獲野生動物、例えば、動物園で維持されるものである。好適な対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ブタ、サル、有袋動物、ニワトリ、ガチョウ、カナリア、セキセイインコ、ワニ、ヘビ、トカゲなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様において、対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ラット、モルモット、カンガルー、ウサギまたはマウスである。
【００４９】
いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物の投与は、創傷の治癒の速度を上げることによって創傷の治癒を促進する。いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物の投与は、処置がない場合に形成するであろう瘢痕組織の量または瘢痕化を減少させることによって、治癒を促進する。いくつかの態様において、処置は、処置されていない創傷と比較して皮膚色素沈着の改善および発毛の改善を含む、いったん創傷が治癒したあとの、創傷の美容的結果もしくはアウトカムまたは外観を改善する。
【００５０】
創傷治癒の促進の特定の態様において、療法は、好ましくは、部位もしくは部位周囲に局所的であるか、または病巣内に施され、局所的効果が提供される。
【００５１】
「有効量」は、少なくとも部分的に所望の反応を得るために、例えば、創傷の治癒を開始するためにまたは創傷の治癒の速度を上げるために必要な量を意味する。この量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類群、組成物の製剤、医学的状況の評価、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。量は、慣例的な試験によって決定することができる比較的広い範囲内に収まることが予想される。ヒト患者に関する有効量は、例えば、約0.1 ng/kg体重〜1 g/kg体重/投薬の範囲であり得る。投薬量は、好ましくは、1μg〜1 g/kg体重/投薬の範囲内であり、例えば、0.5 mg〜1 g/kg体重/投薬の範囲内である。一態様において、投薬量は、1 mg〜500 mg/投薬の範囲内である。別の態様において、投薬量は、1 mg〜250 mg/投薬の範囲内である。さらなる別の態様において、投薬量は、1 mg〜100 mg/投薬の範囲内、例えば最大50 mg/投薬である。さらなる別の態様において、投薬量は、1μg〜1 mg/kg体重/投薬の範囲内である。用量用法は、最適な治療反応を提供するように、調節されてよい。例えば数回の分割投与量が、毎日、毎週、毎月または他の適当な時間間隔で投与されてもよく、または投与量は、状況の緊急性によって示されるように漸減されてもよい。
【００５２】
いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物または少なくとも1つのエポキシチグリアン化合物を含有する植物抽出物は、創傷治癒において有用である別の薬学的に活性な薬剤と別々に投与するか、同時もしくは逐次的に投与するか、または同じ組成物中で投与してもよい。例えば、エポキシチグリアン化合物を、抗生物質および／または抗炎症剤と組み合わせて投与してもよい。好適な抗生物質としては、βラクタム系抗生物質、例えば、ペニシリン、アンピシリン、アモキシリン、フルクロキサシリン、ジクロキサシリン、メタシリン（methacillin）、カルベニシリンおよびノロシリン（norocillin）；セファロスポリン、例えば、セファレキシン、セファセトリル、セファドロキシル、セファログリシン、セファロニウム、セファロルジジン（cefalordidine）、セファトリジン、セアクロル（ceaclor）、セフプロキシル（cefproxil）、セフゾナム、セフメトゾール（cefmetozole）、ロラカルベフ、セフミノクス、セフジニル、セフポドキシム、およびセフピロム；カルバペネム、例えば、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ダリペネム（daripenem）、パニペネムおよびビアペネム；アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、バンコマイシン、エリスロマイシンおよびアシスロマイシン（asithromycin）；オキサゾリジノン、例えば、リネゾリドおよびポシゾリド（posizolid）、リンコサミド、例えば、クリンダマイシン、キノリン、例えば、オキソリン酸、シプロフロキサシン、エノキサシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、レボフロキサシンおよびジフロキサシン；ならびにスルホンアミド、例えば、スルファメトキサゾール、スルホアジアジン（sulfoadiazine）およびスルファセタミド、または混合物、例えば、アモシキクラブ（amoxyclav）（アモキシリンおよびクラブリン酸（clavulinic acid））が挙げられる。好適な抗炎症剤としては、非ステロイド性抗炎症薬、例えば、メロキシカム、ピロキシカム、オキシカム、アスピリン、ジフニサル（difunisal）、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、インドメタシン、トルメチン、メフェナム酸、ヌミスリド（numisulide）など、ならびにコルチコステロイド、例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ブデソニド、ベタメタゾンおよびデキサメタゾンが挙げられる。
【００５３】
エポキシチグリアン化合物は、他の創傷治癒療法、例えば、包帯剤ならびに軟膏剤、ローション剤およびゲル剤と組み合わせて使用することができる。例えば、エポキシチグリアン化合物は、ヨウ素、アロエベラ、ポポー、もしくは医学的に活性なハチミツ、例えばマヌカハニー、または他の生物学的にもしくは生理学的に活性な薬剤、例えば、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、ならびにビタミン、例えば、A、C、DおよびEならびにそれらのエステルなどの、治療剤を含むシルバードレッシングおよび包帯剤、軟膏剤、ローション剤ならびにゲル剤と組み合わせて使用され得る。エポキシチグリアン化合物はまた、創傷に分子構造を提供する包帯剤と組み合わせて使用され得る。このような包帯剤は、ポリマーフィルムおよび架橋ポリマーフィルム、例えば、ヒアルロン酸および関連構造物、例えば架橋ヒアルロン酸を含み得る。
【００５４】
いくつかの態様において、エポキシチグリアン化合物は、式(I)の化合物、またはその幾何異性体もしくは立体異性体もしくは薬学的に許容される塩である：
0006415538.tif 000008
式中、
R1は水素であり、かつR2は-OR17であるか；またはR1およびR2は一緒にカルボニル基(=O)を形成し；
R3は水素またはC1-6アルキルであり；
R4およびR5は独立して水素もしくは-OR17であるか；またはR4およびR5は一緒に、二重結合もしくはエポキシド(-O-)を形成し；
R6は水素またはC1-6アルキルであり；
R7は-OHまたは-OR18であり；
R8は-OHまたは-OR18であり；但し、R7およびR8は両方ともが-OHであることはなく；
R9およびR10は水素およびC1-6アルキルから独立して選択され；
R11およびR12またはR12およびR13は一緒にエポキシドを形成し、R11およびR13のうちの残りの基は水素、-OHまたは-OR17であり；
R14は水素または-R17であり；
R15は水素または-R17であり；
R16は水素または-R17であり；
R17は、水素、-C1-6アルキル、-C2-6アルケニル、-C2-6アルキニル、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり；
R18は、C1-20アルキル、-C2-20アルケニル、-C2-20アルキニル、-C(O)C1-20アルキル、-C(O)C2-20アルケニル、-C(O)C2-20アルキニル、-C(O)シクロアルキル、-C(O)C1-10アルキルシクロアルキル；-C(O)C2-10アルケニルシクロアルキル、-C(O)C2-10アルキニルシクロアルキル、-C(O)アリール、-C(O)C1-10アルキルアリール、-C(O)C2-10アルケニルアリール、-C(O)C2-10アルキニルアリール、-C(O)C1-10アルキルC(O)R19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)R19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)R19、-C(O)C1-10アルキルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルケニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C2-10アルキニルCH(OR19)(OR19)、-C(O)C1-10アルキルSR19、-C(O)C2-10アルケニルSR19、-C(O)C2-10アルキニルSR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)OR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)OR19、-C(O)C1-10アルキルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルケニルC(O)SR19、-C(O)C2-10アルキニルC(O)SR19、
0006415538.tif 000009
であり；
R19は、水素、-C1-10アルキル、-C2-10アルケニル、-C2-10アルキニル、シクロアルキルまたはアリールであり；
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリール基は各々、置換されていてもよい。
【００５５】
いくつかの態様において、式(I)の化合物は、式(II)のエポキシ-チグリアエン-3-オン化合物である：
0006415538.tif 000010
式中、R3、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。
【００５６】
いくつかの態様において、式(I)または(II)の化合物は、式(III)
0006415538.tif 000011
の化合物である：
式中、R7、R8、R11、R12、R13およびR15は式(I)について定義される通りである。
【００５７】
式(I)、式(II)または式(III)の特定の態様において、以下のうちの1つまたは複数が適用される：
R1は水素であり、かつR2は、OHもしくは-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか、またはR1およびR2は一緒にカルボニル基を形成する；特に、R1およびR2は一緒にカルボニル基を形成する；
R3は、水素または-C1-3アルキルであり、特に-C1-3アルキル、より特にはメチルである；
R4は、水素もしくは-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであり、かつ
R5は、水素もしくは-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであるか；または、R4およびR5は一緒に、二重結合もしくはエポキシドを形成する；特に、R4およびR5は一緒に二重結合を形成する；
R6は、水素または-C1-3アルキルであり、特に-C1-3アルキル、より特にはメチルである；
R7は、-OH、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）、-OC(O)C1-15アルキルアリール、-OC(O)C1-10アルキルC(O)H、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)H、-OC(O)C1-10アルキルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C2-10アルケニルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C1-10アルキルSC1-6アルキル、-OC(O)C2-10アルケニルSC1-6アルキル、-OC(O)C1-10アルキルC(O)OC1-6アルキルまたは-OC(O)C2-10アルキルC(O)OC1-6アルキルであり、特に-OH、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-12アルケニル、-OC(O)C2-12アルキニル、-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）、-OC(O)C1-12アルキルアリール、-OC(O)C1-6アルキルC(O)H、-OC(O)C2-6アルケニルC(O)H、-OC(O)C1-6アルキルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C1-6アルキルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C2-6アルケニルCH(OC1-3アルキル)(OC1-3アルキル)、-OC(O)C1-6アルキルSC1-3アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルSC1-3アルキル、-OC(O)C1-6アルキルC(O)OC1-3アルキルまたは-OC(O)C2-6アルキルC(O)OC1-3アルキルである；
R8は、-OC(O)C1-15アルキル、-OC(O)C2-15アルケニル、-OC(O)C2-15アルキニル、または-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）であり、特に-OC(O)C1-10アルキル、-OC(O)C2-10アルケニル、-OC(O)C2-10アルキニルまたは-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）、より特には-OC(O)C1-10アルキル、-C(O)C2-10アルケニルおよび-OC(O)アリール（ここでアリール基は置換されていてもよい）である；
R9およびR10は、独立して-C1-3アルキルであり、特に、R9およびR10は両方ともメチルである；
R11およびR12は一緒にエポキシドを形成し、R13は、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであり、特に-OHもしくは-C(O)C1-3アルキルであるか；または
R12およびR13は一緒にエポキシドを形成し、R11は、-OH、-OC(O)C1-6アルキル、-OC(O)C2-6アルケニルもしくは-OC(O)C2-6アルキニルであり、特に-OHである；
R14は、水素、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり、特に水素である；
R15は、水素、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり、特に水素または-C(O)C1-3アルキルである；ならびに
R16は、水素、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)C2-6アルケニルまたは-C(O)C2-6アルキニルであり、特に水素である。
【００５８】
特定の態様において、エポキシチグリアン化合物は、表1〜6中の以下の化合物のうちの1つより選択される。
【００５９】
（表１）
0006415538.tif 000012
0006415538.tif 000013
0006415538.tif 000014
0006415538.tif 000015
【００６０】
（表２）
0006415538.tif 000016
【００６１】
（表３）
0006415538.tif 000017
【００６２】
（表４）
0006415538.tif 000018
【００６３】
（表５）
0006415538.tif 000019
【００６４】
（表６）
0006415538.tif 000020
【００６５】
本発明の化合物は、純粋な化合物の形態または植物抽出物の形態であり得る。
【００６６】
化合物が立体化学を有するように表される場合、表される立体化学は、関連する立体化学であり、生合成経路および化学分析の知識に基づく。
【００６７】
いくつかの態様において、植物抽出物は、フォンテイネア属またはハイランディア属の植物に由来し、特に、種は、フォンテイネア・パンケリ（Fontainea pancheri）、フォンテイネア・アウストラリス（Fontainea australis）、フォンテイネア・ボレアリス（Fontainea borealis）、フォンテイネア・フガックス（Fontainea fugax）、フォンテイネア・オラリア（Fontainea oraria）、フォンテイネア・ピクロスペルマ（Fontainea picrosperma）、フォンテイネア・ロストラタ（Fontainea rostrata）、フォンテイネア・サブパプアナ（Fontainea subpapuana）、フォンテイネア・ベノサ（Fontainea venosa）またはハイランディア・ドクリリ（Hylandia dockrillii）であり、特に、フォンテイネア・ピクロスペルマ、フォンテイネア・アウストラリス、フォンテイネア・ロストラタまたはハイランディア・ドクリリである。
【００６８】
植物の部分としては、果実、種子、樹皮、幹、葉、花、根、内乳、外果皮および樹木が挙げられ得、特に、抽出物は種子から得られる。
【００６９】
植物の抽出物は標準方法によって得てもよく、例えば、植物の種子、葉、果実、内乳、外果皮、幹または樹皮から得られたバイオマスは、例えばエタノールのような極性溶媒による、最初の溶媒抽出に供せられる。次いで、最初の抽出物は、濃縮され、水で希釈され、例えば酢酸エチルなどの第二の溶媒による抽出に供せされる。第二の抽出からの溶媒試料はプールされ、分取用HPLC分画による分離に供せられる。これらの画分を、分析用HPLCにより分析し、試料中に認められた化合物の保持時間に応じてプールする。プールされた画分を、秤量し、バイオアッセイし、分析用HPLCにより分析する。1種または複数種の分取用HPLCを用い更なる分画を行い、特定の化合物を単離する。各化合物を、バイオアッセイし、その構造を、UV、NMRおよび質量分析技術により同定する。
【００７０】
本発明の他の化合物は、植物または植物の部分から、特にフォンテイネア属から、特にフォンテイネア・ピクロスペルマ種から、特にフォンテイネア・ピクロスペルマの種子から、単離された化合物を誘導体化することにより得ることができる。
【００７１】
この天然の化合物の誘導体は、当技術分野において公知の技術により得ることができる。例えば、ヒドロキシ基は、クロム酸、ジョーンズ試薬、KMnO4、mCPBA(メタクロロ過安息香酸)のような過酸、またはジメチルジオキシラン(DMDO)およびメチル(トリフルオロメチル)ジオキシラン(TFDO)のようなジオキシランなどの酸化剤に曝すことにより、ケトン、アルデヒドまたはカルボン酸へ酸化されてよい。酸化剤は、その分子内の他の官能基が、酸化されるか、もしくは同じく酸化されないように、選択されてよい。例えば第1級アルコールは、第2級アルコールの存在下で、RuCl2(PPh3)3-ベンゼンなどの試薬を使用し、アルデヒドまたはカルボン酸へ選択的に酸化されてよい。第2級アルコールは、第1級アルコールの存在下で、Cl2-ピリジンまたはNaBrO3-セリック-アンモニウム硝酸を使用し、ケトンへ選択的に酸化されてよい。アルコールは、二重結合および三重結合の存在下で、隣接立体中心でのエピマー化を伴わずに、セライト(または塩化アンモニウム)を使うかまたは使わずに、ジョーンズ試薬を用いて、酸化されてよい。あるいは、選択された試薬は、より選択性が低く、2種以上の官能基の酸化を生じてもよい。
【００７２】
ヒドロキシ基は、エーテル化またはアシル化によっても誘導体化されてよい。例えばエーテルは、塩基の存在下でのアルコキシドイオンの形成、およびアルコキシドの適当なハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、ハロゲン化アルキニル、またはハロゲン化アリールとの反応により、調製されてよい。同様にアシル化は、アルコキシドイオンの形成、および適当なカルボン酸または活性化されたカルボン酸（例えば、無水物または塩化アシル）との反応により達成されてよい。
【００７３】
アシル基は、当技術分野において公知の酸または塩基加水分解により、加水分解され、アルコールを提供してよく、これらのアルコールは更に先のように誘導体化され得る。
【００７４】
α-不飽和のケトンを含む、ケトンは、二重結合の還元を伴うことなく、水素化アルミニウムリチウムおよび他の金属水素化物などの還元剤により、第2級アルコールへ還元され得る。
【００７５】
二重結合および三重結合は、例えばH2/Pdのような触媒還元を用い、単結合へ還元されてよい。二重結合は、例えばmCPBAなどの過酸、またはDMDOおよびTFDOのようなジオキシランのような酸化剤を用い、エポキシドへ酸化されてもよい。二重結合は、ハロ基、ヒドロキシまたはアルコキシ基などの置換基を導入する、付加反応にも供され得る。
【００７６】
当業者は、例えば合成法に関連する文献、例としてSmith M.B.およびMarch J.の「March's Advanced Organic Chemistry」第5版, John Wiley & Sons Inc., 2001、ならびにLarock R.C.の「Comprehensive Organic Transformations」、VCH Publishers Ltd., 1989などを参照し、単離された化合物の誘導体を得るための好適な条件を決定することができるであろう。更に官能基の選択的操作は、他の官能基の保護を必要とすることがある。望ましくない副反応を防止するための好適な保護基は、GreenおよびWutsの「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley & Sons Inc., 第3版, 1999に記されている。
【００７７】
本発明の化合物
本発明の別の局面において、以下を含む新規の化合物またはその薬学的に許容される塩がある：
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物5);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物6);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物7);
12-ブタノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物8);
12-[(2E,4E)-(6,6-ジメトキシヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物9);
12-[(2E,4E)-6-オキソヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物10);
12-[(2E,4E)-6,7-ジヒドロキシドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物11);
12-[(2E)-4,5-ジヒドロキシ-デカ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物12);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物13);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物14);
12-(2-メチルプロパ-2-エノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物15);
12-[(2E,4E)-ヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物16);
12-[(2E,4E)-8-オキソドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物17);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物18);
13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物19);
12-[(2E)-ブタ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物20); 
12-チグロイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物21);
12-(3-ブテノイル)-13-ノナノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物22);
12-ベンゾイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物23);
12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物25);
12-[(2E,4E)-6,7-(アンチ)-エポキシ-ドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物26);
12,13-ジブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物27);
12-ベンゾイル-13-ブタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物28);
12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物29);
13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物30);
12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物31);
12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物32);
12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物33);
12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物34);
12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物35);
12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物36);
12-{[2-(メチルスルファニル)カルボニル]-アセトイル}-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物39);
12-[(2-メトキシカルボニル)-アセトイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物40);
12,13-ジ-ノノイル（nonoyl）-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物41);
12,13-ジ-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物42);
12,13-ジ-ペンタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物43);
12,13-ジ-チグロイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物44)
5,20-ジアセチル-12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物45);
12,13-ジ-(2E,4E)-ヘキサ-2,4-エノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物46);
12-ヘキサノイル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物47)
12-アセチル-13-[2-(N-メチルアントラニロイル)]-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物48);
12,13-ジ-ヘプタノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物49);
12-ミリストイル-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物50);
12-ミリストイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物51);
12-(2-メチルブタノイル)-13-アセチル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物52);および
13-ヘキサノイル-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物53);
12,13-ジ-(3-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン (化合物60)。
【００７８】
本発明のさらに別の局面において、化合物5〜53もしくは60またはその薬学的に許容される塩のうちのいずれか1つは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と合わせた薬学的組成物の形態であり得る。
【００７９】
組成物
エポキシチグリアン化合物またはその薬学的に許容される塩をそのまま投与してもよいが、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と合わせた薬学的組成物の形態でエポキシチグリアン化合物を投与することが、より好都合であり得る。
【００８０】
薬学的用途のための剤形および投薬率ならびに組成物は、当業者により容易に決定される。
【００８１】
剤形は、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル、経皮貼付剤、含浸（密封）包帯剤、クリーム剤、ゲル剤などを含む。これらの剤形は、薬学的組成物の制御放出のために特にデザインされた、または変更された器具を注入または埋込むことも含み得る。治療剤の制御放出は、例えばアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸（polyactic acid）およびポリグリコール酸およびある種のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む疎水性ポリマーによる、治療剤のコーティングにより実現されてもよい。加えて、制御放出は、その他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用することにより実現されてもよい。
【００８２】
薬学的に許容される担体および全身投与のために許容される担体も、本発明の組成物へ組込まれてよい。
【００８３】
適当ならば、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤または許容される賦形剤を含有する。「薬学的に許容される賦形剤」とは、安全に使用することができる、固形または液体の充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野において周知の様々な担体を使用してよい。これらの担体または賦形剤は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチンまたは他のゲル化剤、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、アルコールおよび／またはポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水、およびパイロジェンフリー水を含む群から選択されてよい。
【００８４】
本発明の薬学的組成物をヒトまたは非ヒト患者へ提供するために、任意の好適な投与経路を使用してよい。例えば経口、局所、経直腸、非経口、舌下、頬内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用してよい。
【００８５】
投与に適した本発明の薬学的組成物は、本発明の薬学的活性化合物または抽出物を1種または複数種、予め決定された量で各々含有する注射器、バイアル、チューブ、カプセル、サシェまたは錠剤のような個別の単位で、散剤もしくは顆粒剤として、または水性液体、シクロデキストリン溶液、非水性液体、水中油型エマルションもしくは油中水型エマルション中の液剤もしくは懸濁剤として、またはクリーム剤もしくはゲル剤中の液剤もしくは懸濁剤として、または、シリカもしくはポリラクチドマイクロ粒子もしくはナノ粒子を含むがこれらに限定されない、本発明の化合物を組込んでいるマイクロ粒子もしくはナノ粒子の懸濁剤として、提供されてよい。このような組成物は、任意の調剤法により調製されてよいが、全ての方法は、1種または複数種の本発明の薬学的活性化合物を、1種または複数種の必要な成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、これらの組成物は、本発明の作用物質を、液体担体もしくは微粉化された固形担体または両方と、均質かつ密に混合し、次に必要ならば所望の形状に製品を造形することにより、調製される。
【００８６】
散剤において、担体は微粉化された固形物であり、これは微粉化された活性成分との混合物中にある。
【００８７】
錠剤において、活性成分は、好適な割合で必要な結合能を有する担体と混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。
【００８８】
散剤および錠剤について好適な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどが挙げられる。用語「調製」は、カプセル剤中で担体を伴うかまたは伴わない活性成分が、担体により取り囲まれ、その結果担体が活性成分と会合しているカプセル剤を提供する、担体としての封入物質を伴う活性化合物の製剤化を含むことを意図している。同様に、カシェ剤および舐剤が含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤および舐剤は、経口投与に適した固形の形態として使用することができる。
【００８９】
坐剤の調製に関して、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物のような、低融点ワックスが、最初に融解され、活性成分が攪拌によりその中で均質に分散される。融解した均質な混合物は次に、手頃なサイズの金型に注がれ、冷却され、これにより固化される。
【００９０】
膣内投与に適した製剤は、活性成分に加え、適当であることが当技術分野において公知である担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡剤または噴霧剤として提供されてよい。
【００９１】
液体形態の調製物は、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば水または水-プロピレングリコール溶液を含む。例えば、非経口注射用液体調製物は、緩衝液を伴うかまたは伴わない、水性1,2-プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、γシクロデキストリンもしくは2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンの水溶液、食塩水溶液またはポリエチレングリコール溶液中の液剤として製剤化することができる。好ましいpH範囲は3.5〜4.5である。好適な緩衝液は調製物をpH 3.5〜4.5に緩衝し、これには酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
従って本発明の化合物は、非経口的投与（例えば、ボーラス注射または連続注入などの注射による）のために製剤化されてよく、ならびに、アンプル、事前充填式シリンジ、小容量の輸液の単位剤形で、または保存剤が添加された反復投与用容器で提供されてよい。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル内の、懸濁剤、液剤または乳剤などの形をとってよく、ならびに懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用物質（formulatory agent）を含んでよい。あるいは活性成分は、使用前の例えば滅菌されたパイロジェンフリー水などの好適なビヒクルによる構成のために、滅菌固形物の無菌的単離によるか、または溶液の凍結乾燥により得られた粉末形態であることができる。
【００９３】
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶解し、ならびに望ましいならば、好適な着色剤、香料、安定化剤および増粘剤を添加することにより、調製することができる。
【００９４】
経口使用に適した水性懸濁剤は、粘度のある材料、例えば天然もしくは合成のゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは他の周知の懸濁化剤と共に、微粉化された活性成分を、水中に、分散することにより作製することができる。
【００９５】
経口投与のために使用直前に液体形態の調製物へ転換されることが意図された、固形形態の調製物も含まれる。このような液体形態は、液剤、懸濁剤および乳剤を含む。これらの調製物は、活性成分に加え、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工および天然の甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでよい。
【００９６】
表皮または他の器官への局所投与については、本発明の化合物は、ゲル剤、軟膏剤、乳剤、パスタ剤、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮貼付剤として製剤化されてもよい。ゲル剤は、好適な増粘剤を使用し、それらを化合物の水性／アルコール性組成物へ添加することによって、調製され得る。好適な増粘剤またはゲル化剤、例えば、ポリビニルカルボキシポリマー、Carbomer 940は、当技術分野において公知である。軟膏剤およびクリーム剤は、好適な増粘剤および／またはゲル化剤の添加に加え、例えば水性または油性基剤と共に製剤化されてよい。ローション剤は、水性または油性基剤と共に製剤化されてよく、ならびに乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤の1種または複数種も通常含む。
【００９７】
局所投与に適した製剤はまた、浴溶液もしくは浸漬溶液またはスプレーの形態で局所投与され得る液剤または懸濁剤を含む。これらの製剤は、皮膚刺激、虫刺されおよび足部創傷に対抗するために適切に適用され得る。
【００９８】
口内の局所投与に適した製剤は、通常ショ糖およびアカシアゴムまたはトラガントである、矯味矯臭された基剤中に、活性物質を含有する舐剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアゴムなどの不活性基剤中に、活性成分を含有する、香錠；ならびに、好適な液体担体中に活性成分を含有する、含嗽剤を含む。
【００９９】
液剤または懸濁剤は、例えば点滴注入器、ピペットまたはスプレーのような都合のよい手段により、鼻腔へ直接適用される。これらの製剤は、単回用量または反復用量の形で提供されてよい。点滴注入器またはピペットでの後者の場合、これは、患者による、適当な予め決められた容量の溶液または懸濁液の投与により実現されてよい。スプレーの場合、これは例えば計量噴霧スプレーポンプにより実現されてよい。経鼻送達および滞留を改善するために、本発明の化合物は、シクロデキストリンにより封入されるか、または鼻腔粘膜中での送達および滞留を増強すると期待される作用物質と共に製剤化されてよい。
【０１００】
気道への投与も、活性成分が、クロロフルオロカーボン（CFC）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体などの好適な噴射剤と共に、加圧された容器中に提供されるエアロゾル製剤により実現されてよい。エアロゾルは、レシチンのような界面活性剤も好都合に含有してよい。薬物の投与量は、定量バルブの提供により、制御されてよい。
【０１０１】
あるいは、これらの活性成分は、乾燥散剤、例えば、乳糖、デンプン、デンプン誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドン（PVP）などの、好適な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形で提供されてよい。
【０１０２】
好都合なことに、この粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。この粉末組成物は、例えば、ゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジ、またはそこから粉末が吸入器により投与され得るブリスターパックとして、単位剤形で提供されてよい。
【０１０３】
鼻腔内製剤を含む、気道への投与が意図された製剤において、化合物は一般に、例えば1〜10ミクロンまたはそれ未満の桁である、小さい粒子サイズを有するであろう。このような粒子サイズは、例えば微粉化によるような、当技術分野において公知の手段により得ることができる。
【０１０４】
ここで、本発明のいくつかの好ましい局面を説明する以下の実施例を参照して、本発明を説明する。しかし、本発明の以下の説明の特殊性は、本発明の前述の説明の一般性に優先しないことが、理解されるべきである。
【実施例】
【０１０５】
実施例1：植物抽出物
植物材料を切り刻み、植物材料1に対してエタノール2〜5というおおよその比率（w/w）でエタノールにより抽出することによって、全ての植物抽出物を調製した。抽出物を4℃で一晩静置し、次いで、上澄みをデカンテーションし、使用まで4℃で保存した。
【０１０６】
植物抽出物中のエポキシチグリアン化合物の存在を、ABI3200三連四重極質量分析計へ連結されたShimadzu HPLCを使用するLCMSMSによって確認した。Halo amide C18カラムを用い、溶媒系としてアセトニトリル／水混合物を使用して、混合物中の化合物を分離した。
【０１０７】
大部分のサンプルを、C18 Kinetix 4.6 mm x100 mm 2.6ミクロンC18カラムを使用して、KinC18Gen法で流した：
0006415538.tif 000021
【０１０８】
一部のサンプルを、Advanced Materials Technologyからの、Halo amideカラムRP 4.6 mm x 150 mm, 2.7ミクロンを使用するAmide Long法で流した：
0006415538.tif 000022
【０１０９】
実施例2：エポキシチグリアン化合物の単離および解明
下記に記載の一般法を用いて、抽出、およびシリカゲルでのクロマトグラフィー、続く分取用HPLC（C18カラム、メタノール／水の溶媒組み合わせ）によってフォンテイネア・ピクロスペルマの種子から化合物を精製した。
【０１１０】
およそ1〜2 kgの植物材料（葉、果実、種子、幹、根、花、樹皮または樹木）を細かく切り刻み、エタノール2部(w/v)で3回抽出し、抽出物を合わせ、蒸発させ、残渣を水および非混和性有機溶媒（典型的には石油スピリットbp 40-60（PE）または酢酸エチルEtOAc）に分配する。有機溶媒の蒸発からの残渣を、PEまたはヘプタンから始まりEtOAc次いでメタノールへと進む、漸増する極性の溶媒混合物中におけるシリカゲルでのクロマトグラフィーによって分離する。次いで、シリカゲルからの画分を、典型的にはメタノール-水勾配を使用して、C18カラム上での分取用HPLCによってさらに精製する。後半の画分を生物活性について分析し、分析用HPLCによって認められた化合物の保持時間に応じてプールし、さらなる分取用HPLCへ供し、純粋な化合物を得る。各化合物をバイオアッセイし、その構造をUV、NMRおよび質量分析技術によって確認する。
【０１１１】
化合物1：12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000023
【０１１２】
化合物2：12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000024
【０１１３】
化合物3：12-[(2E,4E,6E)-ドデカ-2,4,6-トリエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000025
【０１１４】
化合物4：12-[(2E,4Z)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000026
【０１１５】
化合物5：12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000027
【０１１６】
化合物6：12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000028
【０１１７】
化合物7：12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000029
【０１１８】
化合物8：12-ブタノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000030
【０１１９】
化合物9：12-[(2E,4E)-(6,6-ジメトキシヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000031
【０１２０】
化合物10：12-[(2E,4E)-6-オキソヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000032
【０１２１】
化合物11：12-[(2E,4E)-6,7-ジヒドロキシドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000033
【０１２２】
化合物12：12-[(2E)-4,5-ジヒドロキシ-デカ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000034
【０１２３】
化合物13：12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000035
【０１２４】
化合物14：12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000036
【０１２５】
化合物15：12-(2-メチルプロパ-2-エノイル-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000037
【０１２６】
化合物16：12-[(2E,4E)-ヘキサ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000038
【０１２７】
化合物17：12-[(2E,4E)-8-オキソドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000039
【０１２８】
化合物18：12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000040
【０１２９】
化合物19：13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000041
【０１３０】
化合物20：12-[(2E)-ブタ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000042
【０１３１】
化合物24：12-[(2E,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000043
【０１３２】
化合物25：12-[(2Z,4E)-デカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルプロパノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000044
【０１３３】
化合物26：12-[(2E,4E)-6,7-(アンチ)-エポキシ-ドデカ-2,4-ジエノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-6,7-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000045
【０１３４】
化合物29：12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000046
【０１３５】
化合物30：13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000047
【０１３６】
化合物31：12-アセチル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000048
【０１３７】
化合物32：12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000049
【０１３８】
化合物33：12-プロパノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000050
【０１３９】
化合物34：12-ヘキサノイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000051
【０１４０】
化合物35：12-チグロイル-13-(2-メチルプロパノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000052
【０１４１】
化合物36：12-[(2E)-3-メチルチオプロパ-2-エノイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000053
【０１４２】
化合物37：12-チグロイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,5,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000054
【０１４３】
化合物38：12,13-ジ-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000055
【０１４４】
化合物39：12-{[2-(メチルスルファニル)カルボニル]-アセトイル}-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000056
【０１４５】
化合物40：12-[(2-メトキシカルボニル)-アセトイル]-13-(2-メチルブタノイル)-5,6-エポキシ-4,7,9,12,13,20-ヘキサヒドロキシ-1-チグリアエン-3-オン
0006415538.tif 000057
【０１４６】
実施例3：チグリアン誘導体の調製
以下の方法を使用して、化合物1および関連化合物などのチグリアン化合物の5,20-アセトニドの混合物のC-12およびC-13エステルの加水分解、続いての標準試薬を用いてのC-12およびC-13での再エステル化によって、いくつかの化合物を半合成的に調製した。
【０１４７】
フォンテイネア・ピクロスペルマの種子150 gを粗く粉末化し、次いでこれを1Lフラスコ中でアセトンと共に撹拌することにより抽出するによって、チグリアンアナログの合成についてのチグリアンエステルの粗製混合物を調製した。4時間後、この懸濁液を真空濾過し、TLC (PE:EtOAc : 4:6)がチグリアンエステルの非存在を示すまで濾過ケーキをアセトンで洗浄した。プールした濾液を蒸発させ、エステルの粗製混合物を得た。次いで、脂肪をシリカゲル上でのショート重力カラムクロマトグラフィー(溶離剤として石油エーテル/酢酸エチル; PE/EtOAc 8:2→4:6)によって除去し、8.2 g (5.5%)の粗製エステル混合物が得られた。
【０１４８】
次いで、エステルの混合物を保護し、様々なアシル基を使用して以下の反応に示されるようにC-12およびC-13位で脱エステル化および再エステル化し、化合物21、22、23、27、28、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53および60を得た。
【０１４９】
0006415538.tif 000058
【０１５０】
ジメチルホルムアミド(DMF)中のエステル混合物Aの10 mL溶液を、DMF(10 mL)中のピリジニウム-p-トルエンスルホナート(PPTS, 4.1 g, 過剰量)の50 mL溶液へ添加し、室温で2分間撹拌した。次いで、120 mLの2,2-ジメトキシプロパン(DMP)を添加し、溶液を24時間撹拌した。反応物をNaCl溶液(150 mL)で希釈し、酢酸エチル(EtOAc, 50 mL)で洗浄した。有機相をNaCl溶液で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 8:2→6:4)、5.2 g (3.5%)の5,20-アセトニドエステル混合物Bを得た。未反応出発物質を同一条件下で再び反応させ、追加のエステル混合物Bを得た。
【０１５１】
0006415538.tif 000059
【０１５２】
撹拌メタノール(HPLC等級, 2 L)へナトリウムの小片(9.7 g)を徐々に添加することによって、0.21N NaOMe溶液を新たに調製した。激しい撹拌下で、次いで、この溶液128 mLを6.4 gの5,20-アセトニドエステル混合物Bへ素速く添加した。得られた溶液のpHは、pH 12.5を超えないように注意しながら、0.21 M NaOMeの慎重な添加によって11.5〜12.0の範囲に維持しなければならない。室温で24時間撹拌した後、反応物を酢酸で中和し、濾過し、もとの体積の約1/20へ蒸発させた。EtOAc(20 mL)を添加し、溶液を2N H2SO4(100 mL)で洗浄した。酸性洗浄液をEtOAcで向流抽出し（counter-extract）、プールしたEtOAc溶液をNaCl溶液(2 x 300 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 6:4→4:6)、1.4 gの白色粉末が得られた。
【０１５３】
対称エステル化パターンを有するチグリアンアナログの合成；例示的な方法
改変Steglichエステル化
1.
0006415538.tif 000060
【０１５４】
THF(5 mL)中のデアシル-チグリアンアセトニド(100 mg; 0,23 mMol)の溶液へ、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP) (15 mg; 0,12 mMol)を添加し、溶液を60℃(油浴温度)へ加熱した。別に、THF(10 mL/g)中のエステル化カルボン酸(10 Eq)の溶液へ、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 10 Eq)を添加し；約15分間撹拌した後、懸濁液を詰め綿によって濾過し、デアシル-チグリアンアセトニドのTHF溶液へ滴下した。60℃で24時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約200 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(約50 mL)、鹹水(2 x 約50 mL)での、次にsat. NaHCO3 (約50 mL)および鹹水(2 x約50 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→6:4)、111 mg (80%)の白色粉末が得られた。
【０１５５】
3.2 脱保護
0006415538.tif 000061
【０１５６】
方法A（CH2Cl2中のTFA）
アセトニドジエステル(100 mg)を、CH2Cl2(2% V/V; 200μL, 2μL/mg)中のトリフルオロ酢酸（trifloroacetic acid）(TFA)の新たに調製した溶液へ添加した。室温で6〜12時間撹拌した後、反応物を、sat. NaHCO3(約10 mL)および鹹水(約40 mL)の混合物での、次に鹹水単独(2x 約40 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 8:2→2:8)、チグリアンアナログ(収率約60〜70%)が得られた。
【０１５７】
方法B（MeOH中のHClO4）
アセトニドジエステル(100 mg)を、MeOH中のHClO4の新たに調製した溶液[pH範囲: 1.5〜2.0]へ添加した。室温で6〜24時間撹拌した後、反応物を、酢酸ナトリウムでの中和、濾過、およびもとの体積の約1/20への蒸発によって後処理した。EtOAc(10 mL)を次に添加し、溶液を2N H2SO4(30 mL)で、次いで鹹水(30 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc - →4:6)、ジエステルが収率約60〜70%で得られた。
【０１５８】
この方法を使用して、化合物27、41、42、43、44、46、49および60を生成した。
【０１５９】
非対称ジエステルの合成、例示的な方法：
1.
0006415538.tif 000062
【０１６０】
10 mLテトラヒドロフラン(THF)中の12,13-デアシル-5,20-アセトニド(C) (1.4 g; 3,4 mMol)の溶液へ、740 mLの34 mMolトリエチルアミン(TEA)を添加し、溶液を60℃へ加熱した。別に、THF(20 mL)中の(S)-(+)-2-メチル酪酸(3,702 mL; 34 mMol)の溶液へ、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 7,015 g; 34 mMol)を添加した。約15分間撹拌した後、懸濁液を濾過し、出発ジオール(C)の加温溶液へ添加した。60℃で24時間撹拌した後、反応物をEtOAc(約200 mL)で希釈し、2N H2SO4(約50 mL)、NaCl溶液(2 x 約50 mL)、次いでNaHCO3溶液(約50 mL)およびNaCl溶液(2 x約50 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→6:4)、12-デアシル-5,20-アセトニド-13-[(S)-(+)-2-メチルブチラート(D)が白色粉末として得られた。
【０１６１】
2.
0006415538.tif 000063
【０１６２】
THF(5 mL)中の12,13-デアシル-5,20-アセトニドC(100 mg; 0,25 mMol)の溶液へ、(S)-(+)-2-メチル酪酸(109μL; 1,00 mMol)およびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 206,33 mg; 1,00 mMol)を添加した。溶液を60℃(油浴温度)で24時間撹拌し、次いで、EtOAc(約20 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(約50 mL)、鹹水(2 x 約50 mL)、sat. NaHCO3(約50 mL)、および鹹水(2 x約50 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→6:4)、106.2 mg (60%)の12-デアシル-5,20-アセトニド-13-((S)-2-メチルブチラート) Dが白色粉末として得られた。
【０１６３】
3.
0006415538.tif 000064
【０１６４】
THF(5 mL)中の12,13-デアシル-5,20-アセトニドC(100 mg; 0,25 mMol)の溶液へ、ジイソプロピルエチルアミン（diispropylethylamine）(DIPEA)(131μL; 0,75 mMol)および無水酢酸(94μL; 0,75 mMol)を添加した。室温で72時間撹拌した後、EtOAc(10 mL)を添加し、溶液を2N H2SO4(2 x 20 mL)および鹹水(20 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc - →4:6)、12-デアシル-13-アセチル-5,20-アセトニド104 mg(87%)が白色粉末として得られた。
【０１６５】
4.
0006415538.tif 000065
【０１６６】
トルエン(5 mL)/ジメチルホルムアミド(2 mL)中のデアシル-5,20-アセトニド(100 mg; 0,25 mMol)の溶液へ、N-メチルイサト酸無水物(266 mg; 1,50 mMol)およびジメチルアミノピリジン(DMAP)(31 mg; 0,25 mMol)を添加した。80℃で24時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに[2N H2SO4(約20 mL) + 鹹水(約60 mL)] (x2)、および[sat. NaHCO3(約20 mL) + 鹹水(約60 mL)] (x2)での連続洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、12-デアシル-13-[(N-メチル)-アントラニラート-5,20-アセトニド114 mg(80%)が白色粉末として得られた。
【０１６７】
13-モノエステルのアシル化：例示的な方法
1.
0006415538.tif 000066
【０１６８】
トルエン(10 mL)中の12-デアシル-5,20-アセトニド-13-[(S)-(+)-2-メチルブチラート(D)(1062 mg; 2,04 mMol)の溶液へ、ジメチルアミノピリジン(DMAP)(249 mg; 2.04 mMol)を添加した。別に、トルエン(20 mL)中の安息香酸1224 mg; 10.02 mMol)の溶液へ、トリエチルアミン(1.397 mL; 10.02 mMol)を添加し、溶液を完全溶解まで約2分間撹拌し；2,4,6-トリクロロベンゾイルクロリド(1.566 mL; 10.02 mMol)を次いで添加した(溶液1)。化合物Dを含有する組成物を6時間撹拌した後、懸濁液を濾過し、溶液1中へ注いだ。60℃で24〜48時間撹拌した後、反応物をEtOAc(約10 mL)で希釈し、NH2SO4溶液(約40 mL)、NaCl溶液(2 x 約40 mL)で、次いでNaHCO3溶液(約40 mL)およびNaCl溶液(2 x約40 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、5,20-アセトニド-12-ベンゾアート-13-[(S)-(+)-2-メチルブチラートEが白色粉末として得られた。
【０１６９】
2.
0006415538.tif 000067
【０１７０】
テトラヒドロフラン(THF, 5 mL)中のデアシル-13-(N-メチルアントラノイル（methyanthranoyl）)-5,20-アセトニド(100 mg; 0,18 mMol)の溶液へ、無水酢酸(51 mg; 0,54 mMol)およびジメチルアミノピリジン(DMAP)(2,2 mg; 0,018 mMol)を連続して添加した。50℃で6時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(2x約40 mL)、sat. NaHCO3(2x約40 mL)、および鹹水(2x約40 mL)での連続希釈によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 95:05→7:3)、12-アセチル-13-(N-メチル)アントラニラート-5,20-アセトニド105 mg (95%)が白色粉末として得られた。
【０１７１】
3.
0006415538.tif 000068
【０１７２】
トルエン(5 mL)中の12-デアシル-5,20-アセトニド-13-[(S)-2-メチルブチラート] (100 mg; 0,19 mMol)の溶液へ、ジメチルアミノピリジン(DMAP)(23 mg; 0,19 mMol)を添加した。別に、トルエン(5 mL)中のチグリン酸(95 mg; 0,95 mMol)の溶液へ、トリエチルアミン(132μL; 0,95 mMol)を添加し、溶液を完全溶液まで約2分間撹拌し；2,4,6-トリクロロベンゾイルクロリド(148μL; 0,95 mMol)を次いで添加し、そして、室温で6時間撹拌した後、懸濁液を濾過し(詰め綿)、トルエン中のジテルペノイドモノエステルの溶液へ滴下した。60℃で24〜48時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(約40 mL)、鹹水(2 x 約40 mL)での、次いでNaHCO3(約40 mL)および鹹水(2 x約40 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、12-チグロイル-13-メチルブチリル-5,20-アセトニド59 mg(50%)が白色粉末として得られた。
【０１７３】
4.
0006415538.tif 000069
【０１７４】
トルエン(10 mL)中の12-デアシル-5,20-アセトニド-13-(S)-2-メチルブチラート(100 mg; 0,19 mMol)の溶液を60℃へ加熱し、ミリスチン酸(217 mg; 0,95 mMol)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(196 mg; 0,95 mMol)およびジメチルアミノピリジン(DMAP)(23 mg; 0,19 mMol)を連続して添加した。60℃で12時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(2x 約40 mL)、sat. NaHCO3(2x 約40 mL)、および鹹水(2x 約40 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、12-ミリストイル-13-(2-メチルブタノイル)-5,20-アセトニド121 mg(70%)が白色粉末として得られた。
【０１７５】
5.
0006415538.tif 000070
【０１７６】
トルエン(10 mL)中の12-デアシル-5,20-アセトニド-13-アセタート(100 mg; 0,25 mMol)の溶液を60℃(油浴温度)へ加熱し、ミリスチン酸(286 mg; 1,00 mMol)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(206 mg; 1,00 mMol)およびジメチルアミノピリジン(DMAP)(31 mg; 0,25 mMol)を次いで添加した。60℃で12時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(2x約40 mL)、sat. NaHCO3(2x約40 mL)、および鹹水(2x約40 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、12-ミリスチル-13-アセチル-5,20-アセトニド121 mg(70%)が白色粉末として得られた。
【０１７７】
6.
0006415538.tif 000071
【０１７８】
トルエン(10 mL)中のデアシル-13-(N-メチルアントラノイル)-5,20-アセトニド(100 mg; 0,18 mMol)の加熱(60℃, 油浴温度)溶液へ、ヘキサン酸(84 mg; 0,72 mMol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 149 mg; 0,72 mMol)、およびジメチルアミノピリジン(DMAP 22 mg; 0,18 mMol)を連続して添加した。60℃で12時間撹拌した後、反応物を、EtOAc(約10 mL)での希釈、ならびに2N H2SO4(2x約40 mL)、sat. NaHCO3(2x約40 mL)、および鹹水(2x約40 mL)での連続洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 9:1→7:3)、12-ヘキサノイル-13-(N-メチルアントラノイル)-5,20-アセトニド108 mg(90%)が白色粉末として得られた。
【０１７９】
脱保護
1.
0006415538.tif 000072
【０１８０】
5,20-アセトニド-12-ベンゾアート-13-[(S)-(+)-2-メチルブチラートE(637 mg; 1.02 mMol)を、MeOH中のHClO4の新たに調製した溶液[1.5 < pH < 2.0]へ添加した。6〜24時間撹拌した後、反応物を、酢酸ナトリウムで中和し、濾過し、もとの体積の約1/20へ蒸発させた。EtOAc(10 mL)を添加し、溶液を2N H2SO4(30 mL)で、次いでNaCl溶液(30 mL)で洗浄した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc - →4:6)、12-ベンゾアート-13-[(S)-(+)-2-メチルブチラートF(化合物23)が白色粉末として得られた。
【０１８１】
2.
0006415538.tif 000073
【０１８２】
代表としての12-アセチル-13-N-メチルアントラノイル-5,20-アセトニドとの反応：CH2Cl2(10 mL)中の12-アセチル-13-N-メチルアントラノイル-5,20-アセトニド(100 mg; 0,16 mMol)の溶液へ、トリフルオロ酢酸(TFA)(300μL; 3% V/V)を添加した。約12時間撹拌した後、反応物を、[NaHCO3(約10 mL) + 鹹水(約40 mL)]、次いで鹹水(2x 約40 mL)での洗浄によって後処理した。乾燥(Na2SO4)、濾過および蒸発後、残渣をシリカゲル上での重力カラムクロマトグラフィーによって精製し(溶離剤としてPE/EtOAc 8:2→2:8)、12-アセチル-13-(N-メチルアントラノイル)-チグリアン69 mg(75%)が白色粉末として得られた。
【０１８３】
化合物21、22、23、28、45、47、48、50、51、52および53をこれらの方法によって調製した。
【０１８４】
化合物21
0006415538.tif 000074
【０１８５】
化合物22
0006415538.tif 000075
【０１８６】
化合物23
0006415538.tif 000076
【０１８７】
化合物27
0006415538.tif 000077
【０１８８】
化合物28
0006415538.tif 000078
【０１８９】
化合物41
0006415538.tif 000079
【０１９０】
化合物42
0006415538.tif 000080
【０１９１】
化合物43
0006415538.tif 000081
【０１９２】
化合物44
0006415538.tif 000082
【０１９３】
化合物45
0006415538.tif 000083
【０１９４】
化合物46
0006415538.tif 000084
【０１９５】
化合物47
0006415538.tif 000085
【０１９６】
化合物48
0006415538.tif 000086
【０１９７】
化合物49
0006415538.tif 000087
【０１９８】
化合物50
0006415538.tif 000088
【０１９９】
化合物51
0006415538.tif 000089
【０２００】
化合物52
0006415538.tif 000090
【０２０１】
化合物53
0006415538.tif 000091
【０２０２】
化合物60
HPLC：Kinetex C18カラム 4.6 mm、0.8 mL/分、メタノール-水(70:30)。保持時間：10.9分。
【０２０３】
創傷治癒に関与する細胞型に及ぼすインビトロ効果の実施例
実施例4：インビトロでの引っ掻き傷閉鎖および線維芽細胞移動
精製された化合物または植物抽出物での処理の後の、コンフルエントな単層において作製された引っ掻き傷を横切って移動する、RPMI 1640- 10%ウシ胎仔血清中で培養された初期継代新生児包皮線維芽細胞（NFF）の能力を、以下の3つの方法のうちの1つまたは複数を使用して決定した。
【０２０４】
方法1
細胞を16-mm直径ウェル(24-ウェルプレート)へ播種し、コンフルエントにし、無菌プラスチックピペット先端を使用して各ウェルにおいて2つの引っ掻き傷を作製した。培地を除去し、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水pH 7.2(PBS)で洗浄し、押しのけられた細胞を除去し、新鮮な培地、続いて、純粋な化合物または植物抽出物(2μL)の連続10倍希釈物を添加した。インキュベーションを16〜30時間継続した。未処理培養物の引っ掻き傷端部が最初の裂け目のおよそ25%閉鎖した際に、実験を終了した。単層をPBSで洗浄し、エタノールで固定し、0.05%クリスタルバイオレットで染色した。各ウェルの顕微鏡写真(EVOS顕微鏡)を印刷し、各引っ掻き傷を3つの場所で測定し、平均幅を決定した。残っている裂け目が未処理対照の裂け目の<40%である場合、創傷閉鎖の促進は有意であると考えた。
【０２０５】
方法2
細胞を、2〜6反復ウェル／希釈で、6 mmウェル(96-ウェルプレート)または16 mm(24-ウェルプレート)中に播種し、方法1のように処理した。処理直後に、引っ掻き傷端部の輪郭を、ファインポイントフェルトペンでウェルの下側において描いた。固定および染色後、移動を、計数線の助けにより顕微鏡下で評価し、最初の幅の0、25、50、75または100%(全面閉鎖)として移動をスコアリングした。反復物の平均四分位数が未処理対照のそれ未満であった場合、創傷閉鎖の促進は有意であると考えた(p<0.05、t-検定)。さらに、3 mmステンレス鋼ピンの存在下で細胞を播種することによって(96-ウェルプレート)、またはフラットエッジTeflonリングを挿入することによって、「創傷」領域を作った。これらのデバイスは、NFF細胞の一晩のインキュベーション後に除去した。
【０２０６】
方法3
96個の1mm厚テフロン加工ピンを有するツール(Essen Bioscience Woundmaker)を用いて1回の操作で引っ掻き傷を作製したことを除いては、細胞を方法2におけるように96-ウェルプレートにおいて播種および処理した（1希釈当たり5反復ウェル）。次いで、42時間、3時間間隔で位相コントラスト下にて各ウェルを撮影するようにプログラムされたIncuCyte FLR機器において、37℃、5% CO2加湿雰囲気中に、プレートを置いた。ソフトウェアは最初の引っ掻き傷境界およびそれらの閉鎖速度を決定した。初期の閉鎖速度が未処理対照の>10%であった場合、創傷閉鎖の促進は有意であると考えた。
【０２０７】
結果を表7〜9に示す。
【０２０８】
（表７）純粋な化合物での処理後のヒト新生児線維芽細胞における引っ掻き傷閉鎖の速度
0006415538.tif 000092
太字の灰色陰影は、引っ掻き傷閉鎖速度が対照処理よりも有意に高いことを示している。
【０２０９】
全ての純粋な化合物は、ビヒクルのみの対照処理と比較して有意に増強された引っ掻き傷閉鎖速度を有することが実証された。
【０２１０】
（表８）フォンテイネア・ピクロスペルマの異なる植物部分の未分画エタノール抽出物での処理後のヒト新生児線維芽細胞における引っ掻き傷閉鎖速度
0006415538.tif 000093
灰色陰影および太字は、引っ掻き傷閉鎖速度が対照処理よりも有意に高いことを示している。
【０２１１】
試験したフォンテイネア・ピクロスペルマの全ての植物部分のエタノール性粗製抽出物が、ビヒクルのみの対照処理と比較して有意に増強された引っ掻き傷閉鎖速度を有した。
【０２１２】
（表９）3つの異なる植物種の異なる植物部分の未分画エタノール抽出物での処理後のヒト新生児線維芽細胞における引っ掻き傷閉鎖速度
0006415538.tif 000094
灰色陰影および太字は、引っ掻き傷閉鎖速度が対照処理よりも有意に高いことを示している。
【０２１３】
フォンテイネアの2つの他の種、F.アウストラリスおよびF.ロストラタ、ならびに近縁種ハイランディア・ドクリリの植物部分からの抽出物は、ビヒクルのみの対照処理と比較して有意に増加した引っ掻き傷閉鎖速度を示した。
【０２１４】
さらに、顕微鏡下での試験プレートの観察(方法1)は、線維芽細胞が、化合物1での処理後に染色パターンの肉眼的な差異を示したことを示唆した。より詳細な研究によって、これは、細胞が外見上は多層様式で増殖することに起因することが明らかとなり、これは、接触阻止の減少、増殖の増加、またはリモデリング能力を潜在的に示している。引っ掻き後24時間での対照および化合物1処理における引っ掻き傷閉鎖の例を、それぞれ、図1および2に示す。
【０２１５】
実施例5：ヒト新生児線維芽細胞の移動能力についてのMatrigel浸潤アッセイ
Matrigel浸潤チャンバは、インビトロで細胞の浸潤性の評価を可能にする条件を細胞に提供する。Matrigel浸潤チャンバは、Matrigel Basement Membrane Matrixの薄層を有する8ミクロン細孔サイズPETメンブレンを含有するセル・カルチャー・インサートを有するセル・カルチャー・コンパニオン・プレートからなる。Matrigelマトリックスは、再構成された基底膜としてインビトロで役立つ。層はメンブレンの細孔を塞ぎ、非侵潤性細胞がメンブレンを通って移動するのを阻止する。対照的に、浸潤性細胞は、分離し、Matrigelマトリックスおよび8ミクロンメンブレン細孔を通って浸潤することができる。メンブレンは、光学および電子顕微鏡検査のために加工されてもよく、染色後に容易に除去され得る。
【０２１６】
チャンバを、2つの研究において下記に記載するように、製造業者の説明書に従って使用し、ヒト新生児線維芽細胞の移動に及ぼす化合物1、2、5および42の効果を評価した。第1研究は、10%ウシ胎仔血清を含む培地を含有するウェル中の新生児線維芽細胞に及ぼす3つの濃度(0、10および30 ng/mL)の化合物1の効果を評価した。第2研究は、化合物1、2、5および42の各々について2つの濃度(0および30ng/mL)を使用し、処理前に2日間飢餓処理し次いで1%ウシ胎仔血清を含む培地へ移した新生児線維芽細胞の移動に及ぼす効果を調べた。
【０２１７】
再水和
チャンバを含有するパッケージを-20℃ストレージから取り出し、室温となるようにした。温かい(37℃)重炭酸塩ベースの培養培地を、インサートの内部(500μL)およびウェルの底部(750μL)へ添加した。Matrigelを含有するチャンバを、加湿組織培養インキュベーター、37℃、5% CO2雰囲気において2時間再水和させた。再水和後、メンブレン上のMatrigel（商標）マトリックスの層を乱すことなく、培地を吸引によって注意深く除去した。
【０２１８】
浸潤研究
細胞を採取し、1 mL当たり20,000細胞で再懸濁させた。合計250μLの細胞懸濁液をインサートの内部へ置いた（5,000細胞）。次いで、それぞれの化合物を含有する追加の250μL培地を、インサートの内部へ添加し、2つの研究の各々について所望の最終濃度にした。各処理における適切な濃度の各化合物を含有する合計750μLの培地を、適切なインサート下のウェル中に置いた。次いで、Matrigelチャンバを、加湿組織培養インキュベーター中、37℃、5% CO2雰囲気で、24時間インキュベートした。
【０２１９】
細胞浸潤測定
非浸潤細胞を「スクラビング」によってメンブレンの上部表面から除去した。綿棒を、培地の除去後にインサート中へ浸し、先端をメンブレン表面にわたって動かしながら、強く圧迫した。PBSで湿らせた第2の綿棒を用いて、スクラビングを繰り返した。インサートの外表面へ浸潤した細胞を、次いで、少なくとも5分間、100%メタノール500μL中に置くことによって固定した。次いで、インサートを、メタノール中0.1%クリスタルバイオレットを500μL含有するコンパニオンプレートへ移し、少なくとも15分間染色した。インサートを、水500μLを含有する3つのコンパニオンプレートを通過させることによって脱染し、その後、空気乾燥させた。
【０２２０】
翌日、インサートを反転し、ハウジング壁に隣接するメンブレンのエッジに鋭利なメス刃の先端を挿入することによって、メンブレンをインサートハウジングから取り出した。インサートハウジングをステーショナリーブレードに対して回転させ、メンブレンを外した。メンブレンをピンセットでハウジングから取り出し、Kaiserのグリセロール溶液10μL上に裏返して置き、カバーグラスで覆った。スライドを一晩乾燥させ、その後、浸潤細胞をカウントした。
【０２２１】
結果
第1研究において、10または30 ng/mLの化合物1で処理された線維芽細胞は、ビヒクル単独で処理された細胞と比較して、Matrigel浸潤チャンバシステムにおける移動能力の増加を示した（図3）。第2研究は、化合物1での第1研究の結果を確認し、化合物2、5および42についての移動能力の同様のレベルの増加を実証した（表10）。
【０２２２】
（表１０）30 ng/mLの各化合物で処理されたヒト新生児線維芽細胞のMatrigel浸潤アッセイ。データは、ビヒクルのみの対照と比較したメンブレン浸潤の%増加±2つの反復実験からの標準偏差として表される。細胞を24時間のインキュベーション後にカウントした。
0006415538.tif 000095
【０２２３】
実施例6：インビトロでの不死化ヒトケラチノサイト（HaCaT）による引っ掻き傷再増殖（repopulation）および閉鎖
化合物1または化合物37のいずれかでの処理の後の、コンフルエント単層中に作製された引っ掻き傷を横切って移動する不死化ヒトケラチノサイト細胞（HaCaT）の能力を、以下の方法によって測定した。
【０２２４】
トリプシン処理したHaCaT細胞を、24-ウェルBD Falcon平底組織培養プレート(VWR International, UK)において、L-グルタミン(2 mM)、抗生物質(100 U/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシンおよび0.25μg/mLアンホテリシンB)；ならびに10%ウシ胎仔血清(全てInvitrogen Ltd., UK)が補われた1 mLダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中に7.4x104細胞/mLの細胞密度で播種し、各ウェルにおいて7.4x104播種細胞の細胞密度を提供した。次いで、細胞を、37℃で、5% CO2/95%空気雰囲気中、一晩維持した。翌朝、10%ウシ胎仔血清含有DMEMを、無血清DMEMで置き換え、続いて、HaCaT細胞を48時間DMEM中において血清飢餓処理した。
【０２２５】
48時間後、無血清DMEMを除去し、単一の引っ掻き「創傷」を、各細胞層を横切って無菌ピペットで作製した。1mL PBSで2回洗浄した後、化合物1または化合物37含有培地(1mL)を各ウェルへ添加した。この培地は、最終濃度0、0.001、0.01、0.1、1.0、10または100μg/mLの化合物1または化合物37に加えて、L-グルタミン(2mM)、抗生物質(上記の通り)および1%ウシ胎仔血清が補われた、DMEMからなった。各化合物について1濃度当たり3つの反復ウェルが存在した。
【０２２６】
HaCaT培養物を37℃で5% CO2/95%空気雰囲気中に維持し、剥離された「創傷」領域の再増殖を、100x倍率でTime-Lapse Confocal Microscopy(Leica TCS SP5 Confocal Microscope, Leica Microsystems UK Ltd., UK)によってモニタリングし、デジタル画像を48時間の期間にわたって20分毎に固定位置でキャプチャーした。デジタル画像シーケンスをエクスポートし、LAS AF Software (Leica Microsystems)を使用して.avi動画ファイルとして作成した。インビトロでのHaCaT創傷閉鎖速度を、ImageJ Software (ImageJ 1.37v; http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用して定量化した。データを一元配置分散分析および検定後Tukey分析によって解析した。各実験を3つの個別の場合で行った。
【０２２７】
適用後48時間で、化合物1は、0.001、0.01および0.1 ng/mlの濃度で対照処理と比較して引っ掻き傷閉鎖速度を有意に増加させた(p<0.01)（表11）。48時間で、化合物37も、0.001、0.01、0.1および1.0μg/mlの濃度で対照処理と比較して引っ掻き傷閉鎖速度を増加させた(p<0.01)（表11）。
【０２２８】
（表１１）化合物1および化合物37のある範囲の濃度にわたる処理後48時間での不死化ヒトケラチノサイト（HaCaT）細胞による引っ掻き傷再増殖および閉鎖の程度。データは、処理後開いたままである引っ掻き傷領域の％（±標準誤差）についてである。
0006415538.tif 000096
【０２２９】
表11に示されるような引っ掻き傷再増殖および閉鎖の増強における化合物1および化合物37の効果は、細胞増殖または移動によって媒介されたかどうかを決定するために、2つのさらなる実験を行った。これらの実験のうち第1のものは、移動の局面に取り組んだものであり、引っ掻き傷再増殖研究を繰り返し、但し、化合物を適用したのと同時に培地へ1μg/mLのマイトマイシンCを添加した。マイトマイシンCは、HaCaT細胞の増殖を含む、細胞増殖を阻害することが公知であり；1μg/mL濃度では培養系において細胞毒性でないと決定された。この移動研究の結果は、化合物1および化合物37の両方について、0.001〜1.0μg/mLの濃度で、増強された(p<0.05)引っ掻き傷再増殖および閉鎖を見出した。
【０２３０】
増殖実験は、4つの時点（24、48、120および168時間）での培養系中のHaCaT増殖（MTTによって測定された通り）に及ぼす2つの化合物の効果を評価した。化合物1および37は両方とも、化合物が添加されなかった対照処理と比較して、0.001〜10μg/mLの範囲濃度にわたってHaCaT細胞の増殖を増加させることにおいて有意な効果（p<0.01）を有した。
【０２３１】
これらの結果は、増殖および増強された細胞移動の両方が、化合物1および37での引っ掻き傷再増殖および閉鎖プロセスに関与していることを示している。
【０２３２】
実施例7：化合物による単球のマクロファージへの分化
マクロファージは創傷治癒において多数の役割を果たし、これには、初期炎症段階での細胞破片および壊死組織の排除、続く後期治癒段階の間の細胞増殖および組織修復の支援が含まれる。M1表現型は初期炎症段階に関連し、M2表現型は治癒段階に関連すると考えられている。
【０２３３】
単球分化に及ぼすアレイ中の化合物1および15個の他のエポキシチグリアン化合物の可能性のある効果を測定するために、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を72歳の男性ヒトドナー由来のヘパリン添加血液のFicoll-Paque沈降によって単離し、RPMI-1640 10% FCS中に100,000細胞/ウェルで平板培養した。二つ組のウェルを化合物の10倍希釈物で処理し、37℃で4日間インキュベートした。ウェルを細胞接着および形態について視覚によってスコアリングし、次いでPBSで2回洗浄し、スルホローダミン（sulfurhodamine）で染色し、取り込まれた染色をELISAリーダーにおいて定量化した。次いで、プレートを水で洗浄し、写真撮影および接着細胞形態のスコアリングのためにメタノール中1%クリスタルバイオレットで染色した。
【０２３４】
ヒトPBMCでの用量反応実験からの結果（表12）は、M2表現型に典型的な樹状細胞とM1表現型に典型的な円形細胞との混合物であった形態および接着によって判断されたように、試験した16個のエポキシチグリアン化合物の全てが、ng濃度で末梢血単球をマクロファージへ分化させたことを示した。
【０２３５】
（表１２）アレイ中のエポキシチグリアン化合物によるヒト末梢血単球におけるマクロファージ表現型の誘導についての希釈系列におけるエンドポイント濃度。
0006415538.tif 000097
【０２３６】
実施例8：成人皮膚線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化に及ぼす化合物1および37の効果
線維芽細胞は創傷治癒プロセスにおいて中心的な役割を果たし、活性化されると、α-平滑筋アクチン（α-SMA）の発現を特徴とする筋線維芽細胞表現型へ分化する。筋線維芽細胞は組織修復および創傷の閉鎖に寄与するが、それらの過剰発現は、治癒不良および過度の瘢痕と関連する。
【０２３７】
筋線維芽細胞への皮膚線維芽細胞分化に及ぼす化合物1および37の効果を、TGF-β1で刺激された皮膚線維芽細胞によるα-SMA発現の程度によって調べた。
【０２３８】
方法
トリプシン処理後、線維芽細胞を、8-ウェル,Permanoxchamberスライド(VWR International)において、抗生物質、2 mM L-グルタミンおよび10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地(250μL、全てInvitrogenより購入)中に2.5x104細胞/ウェルの細胞密度で播種し、37℃で5% CO2/95%空気中48時間維持した。
【０２３９】
48時間で、線維芽細胞を無血清DMEM中で48時間、増殖阻止し、次いで、0、0.001、0.01、0.1、1.0および10.0μg/mLの濃度の化合物1または37(3ウェル/濃度/化合物)ならびにTGF-β1(10ng/ml, Peprotech)を含有する無血清DMEM(250μL)で置き換えた。線維芽細胞を37℃で5% CO2/95%空気中72時間維持した。
【０２４０】
72時間の時点で、チャンバスライドウェルを、PBS (x1, 250μL)で洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(100μL/ウェル)で10分間固定した。次いで、チャンバスライドウェルを、PBS (x1, 250μl)で再び洗浄し、PBS中0.1% Triton X-100(100μL, Sigma)で5分間処理し、PBS (x1, 250μL)で再洗浄した。ウェルをPBS中1% BSA(250μL, Sigma)で1時間ブロッキングし、0.1% BSA/PBSで洗浄した(x3)。
【０２４１】
ウェルを、モノクローナルマウス抗ヒトα-SMA, クローン1A4 (1:100, 150ul, Sigma)と共に4℃で一晩インキュベートし、0.1% BSA/PBS中で洗浄し(x6)、Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG抗体(1:1000, 250μL, Invitrogen)と共に、室温で1時間、暗所でインキュベートした。チャンバスライドを0.1% BSA/PBS中で洗浄し(x6)、Hoescht 33258溶液を用いて30分間暗所で対比染色した(1:2000, 250μL, Sigma)。続いて、チャンバをスライドのために取り除き、Fluorsave (Santa Cruz)を用いて10分間暗所で処理した。スライドを蛍光顕微鏡検査法(Leica Microsystem)によって観察し、デジタル画像をx200倍率でキャプチャーした。HC Image J Softwareを使用して、デジタル画像を処理した。
【０２４２】
結果
化合物を添加しないTGF-β1での対照処理において、成人皮膚線維芽細胞は筋線維芽細胞へ分化し、これは典型的には、α-SMA発現の増加、α-SMA張力線維の構築、および拡大された多角形細胞形態の全体的な発達を特徴とする。対照的に、TGF-β1で処理された成人皮膚線維芽細胞の化合物1および化合物37への曝露は、筋線維芽細胞への分化に対して濃度依存的な様式で影響を与えた。0.1μg/mLの濃度での化合物1の場合、線維芽細胞培養物は、筋線維芽細胞分化を表す、α-SMA張力線維形成および典型的な多角形細胞形態を欠いた（図5）。化合物37では、10μg/mL濃度でα-SMA張力線維形成および多角形形態の発達に対して破壊的な効果があった（図6）。
【０２４３】
さらに、化合物1の1〜10μg/mLおよび化合物37の0.1〜1.0μg/mLの濃度の範囲にわたって筋線維芽細胞形態の他の微妙な変化があるようである（図5および6）。
【０２４４】
線維芽細胞／筋線維芽細胞分化に及ぼす化合物の特異的効果は、化合物1を用いてインビボで処理された創傷において観察された最小の瘢痕形成と関連し得る（実施例16および17）。
【０２４５】
実施例9：化合物1に応答した好中球による活性酸素バーストの誘導
好中球は、自然免疫系の専用の食細胞であり、それらの流入および活性化は、創傷治癒の初期段階の間の細菌、真菌および細胞破片のクリアランスに不可欠である。好中球の広範囲の抗微生物活性は、活性酸素種（ROS）のバーストを含むいくつかの戦略に基づく。
【０２４６】
好中球による活性酸素バーストを誘導することにおける化合物1の可能性のある効果を評価するために、研究を行った。
【０２４７】
Ficoll-Paque沈降によって得られた赤血球ペレットの溶解によって、健康なヒトドナーの新鮮な血液から好中球を単離した。好中球(約4 x 106細胞/ml)を、無染色対照として試験される無染色細胞のアリコートと並行して、37℃で15分間、完全培養培地中において10μg/mlジヒドロエチジウム(DHE)(Sigma-Aldrich)と共にインキュベートした。このインキュベーションに続いて、ある範囲の濃度（0、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）での化合物1によって15分間処理した。インキュベーション後の活性酸素種の発生を、FACS Cantoフローサイトメーターを使用して測定し、DHEのエチジウムイオンへの酸化に起因する蛍光を測定した。
【０２４８】
この研究によって、化合物1が存在しない対照処理においてはROSが生成されないことがわかった。対照的に、化合物1は、用量依存的な様式で活性酸素種（ROS）の有意な生成を誘導し、ROS生成は化合物1の濃度と共に増加した。
【０２４９】
改善された創傷治癒アウトカムと関連するタンパク質、遺伝子およびサイトカインに及ぼす化合物の効果の実施例
実施例10：化合物1および42で処理されたヒト新生児線維芽細胞の分子解析
ウェスタンブロット法を使用して、ヒト新生児線維芽細胞（NFF）における創傷修復および治癒に関連するタンパク質に及ぼす化合物1および42の効果を確認した。2つの研究を行った。第1研究において、NFFを10または30 ngの化合物1/mLで6または24時間処理し、その後、採取およびタンパク質抽出を行った。第2研究において、NFFを30 ng/mL濃度の化合物1および42それぞれで6時間個々に処理した。両方の研究から得られた溶解物をウェスタンブロット分析へ供し、創傷修復および治癒に関与する重要なシグナル伝達分子に対する特異的抗体でプローブした。
【０２５０】
ウェスタンブロッティングのためのタンパク質サンプルの調製
75 cm2プレート中で増殖された接着性ヒト新生児線維芽細胞から培地を除去し、細胞を氷冷PBSで2回洗浄した。セルスクレーパー(Costar（登録商標）, Corning)を用いて10 mLの氷冷PBS中に接着細胞を採取し、5分間遠心分離によってペレット化し(1,500 rpm, RTemp)、1 mLの氷冷PBS中に再懸濁させ、1.5 mL微量遠心管へ移した。細胞を遠心分離(13,200 rpm, RTemp, 2 s)によって集め、PBSを除去し、必要とされるまでペレットを-20℃で保存した。
【０２５１】
凍結ペレットを氷上で解凍し、ピペットで上下させることによってペレットの体積の3〜4倍の体積の細胞溶解バッファー中に再懸濁させた。細胞懸濁液を4℃で60秒間超音波処理し、20分間遠心分離し（13,200 rpm, 4℃）、タンパク質を含有する中間相（interphase）を新たな1.5 ml微量遠心管へ移した。タンパク質を-20℃で保存した。
【０２５２】
タンパク質濃度の測定
BCA Protein Assayキット(Pierce)を使用して、タンパク質濃度を測定した。この方法は、アルカリ性溶液中におけるタンパク質によるCu2+のCu1+への還元に基づく。形成されたCu1+は、続いてビシンコニン酸（bicinchronic acid）（BCA）でキレート化され、紫色の反応生成物が形成される。
【０２５３】
タンパク質サンプルをMilliQ水中に1/10および1 /20 (v/v)で希釈し、10μLを平底96-ウェルプレート(Costar（登録商標）, Corning)中に二つ組でプレーティングした。サンプルと並行して、ウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を100、200、400、600、1,000、および1,200μg/mLで調製し、10μL/ウェルにて二つ組でプレーティングし、アッセイした。BCAワーキング試薬を、50部の試薬Aと1部の試薬Bとを混合することによって調製し、各ウェルへ100μLを等分した。プレートを37℃で30〜45分間インキュベートし、反応を生じさせた。生の吸光度をマイクロプレートリーダー(VERSAmax, Molecular Devices)においてA590 nmで読み取り、SOFTmax PROソフトウェア(Molecular Devices)を使用して標準曲線を作成した。未知サンプルの濃度を曲線から推定した。
【０２５４】
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
タンパク質サンプルを、適切な体積の2 × SDSローディングバッファーと混合することによって調製し、70℃で10分間加熱することによって変性させた。Laemmli (6)によって記載されるように、Mini-Protean IIデュアルスラブゲル装置(Bio-Rad Laboratories)を使用して、SDS-PAGEゲルを行った。分離用ゲルは、0.275 M Tris-HCl (pH 8.8)、0.1% (w/v) SDS、0.05% (w/v)の新たに作った過硫酸アンモニウム、1% (v/v) TEMEDおよび7.5〜12% (w/v) アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)からなった。溶液をMilliQ H2O中で5 mLにし、水飽和ブタノールを重層したまま、少なくとも30分間(RTemp)固めた。濃縮用ゲルを注ぐ前に、水飽和ブタノールを傾けて除去した。濃縮用ゲルは、0.125 M Tris-HCl (pH 6.8)、0.1% (w/v) SDS、0.05% (w/v)の新たに作った過硫酸アンモニウム、0.1% (v/v) TEMEDおよび4% (w/v) アクリルアミド/ビスアクリルアミド(29:1)からなった。溶液をMilliQ H2O中で1ゲル当たり2.5 mLにし、分離用ゲルの上部に注ぎ、10-ウェルコーム(Bio-Rad Laboratories)と共に少なくとも30分間固めた。電気泳動を、およそ1時間またはゲルの底部から流れ出るまで1× SDSランニングバッファー中で行った(200 V, RTemp)。
【０２５５】
ウェスタン転写
SDS-PAGE電気泳動に続いて、ゲルプレートを注意深く分離し、濃縮用ゲルを切り取り、Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories)へ移した。「転写サンドイッチ」を以下：多孔性スポンジ、ブロッティング（Whatmann）ペーパーの2つのシート、ニトロセルロース膜、ゲル、ブロッティングペーパーのブロッティングのもう2つのピース、および別の多孔性スポンジのように組み立て、転写装置中へ挿入した。スポンジ、膜およびブロッティングペーパーを、冷たいエレクトロブロットバッファー中に予め湿らせ、注意して気泡が形成しないようにした。何故ならば、これはタンパク質の一貫しない転写をもたらすだろうからである。ニトロセルロース膜(Hybond（商標）-C, Amersham Biosciences)を陰イオン側により近付け、アイスパックおよびマグネチックスターラーを加えて、4℃で氷冷転写バッファー中において100 Vで1時間（定電圧）タンパク質を転写した。
【０２５６】
タンパク質膜のプロービング
いったん転写されたら、0.1% (v/v) Tween 20/TBS中の5% (w/v) Blotto中、RTempで、少なくとも30分間、穏やかにオービタルシェイクしながら、膜をインキュベートし、非特異的結合部位をブロッキングした。一次抗体を製造業者によって推奨されるように5% (w/v) BSA中に最終体積2 mLまで希釈した（下記表13を参照のこと）。膜および抗体を含有するプラスチックエンベロープを作製し、ヒートシールし、可能な限り多くの気泡を除去した。エンベロープを4℃で一晩（およそ16時間）カスタムメイドのローター上で回転させた。
【０２５７】
膜をバッグから取り出し、0.1% (v/v) Tween 20/TBSを含むプラスチックトレイ中に置き、1洗浄当たり15分間激しくオービタルシェイクしながら室温で4回洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）へ結合された適切な二次抗体を、0.1% (v/v) Tween 20/TBS中の5% (w/v) Blotto中に1/1,000希釈し、新たなプラスチックエンベロープ中に置き、これを室温で2時間回転させることによって、膜へプローブさせた。
【０２５８】
タンパク質の免疫検出
結合されていないまたは非特異的に結合された抗体を除去するために、膜を0.1% (v/v) Tween 20/TBS/中において室温で4回各15分間洗浄した。Western Lighting（商標）Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences)を使用し、HRPで標識された二次抗体から検出可能なシグナルを生じさせた。試薬は、HRPによって触媒されるルミノールの酸化的分解に依存し、420 nmで検出可能である光が放出され、これをフィルム上にキャプチャーすることができる。ボトル1およびボトル2からの等しい体積を検出直前に混合した。1膜当たり総体積2 mLを適用し、室温で1分間インキュベートした。注意して、膜全体が等しく曝露されることを確実にした。膜を取り出し、いくらかのブロッティングペーパー上で素早く乾燥させ、フィルムカセット(Hypercassette（商標）, Amersham Biosciences)中へポリプロピレンシートプロテクターの2つのピース間に挿入し、フィルム(SuperRX, Fujifilm)のピースへ曝露した。2分間の最初の曝露を使用し、最適な検出時間を判断した。フィルムはKodak Image Station (Kodak)において現像された。
【０２５９】
（表１３）この研究において使用した抗体は以下であった。
0006415538.tif 000098
【０２６０】
化合物1での第1研究において、ウェスタンブロット分析：10または30 ng/mLの化合物1での処理の6時間後のMEK1/2およびERK1/2の両方の一過性の活性化、およびそれに続く、処理の24時間後の活性化の下方調節。MAPキナーゼ経路のMEK/ERKブランチの活性化は、線維芽細胞を含む多くの細胞型の移動表現型に影響を与えることが公知である。MMP9のレベルの差は検出されなかった。
【０２６１】
ホスホERKの同様のリン酸化パターンが、NFFついての30 ng/mL濃度の化合物1および42での第2研究においてウェスタンブロットで見られた。
【０２６２】
実施例11：創傷治癒に関与する遺伝子の発現に及ぼす化合物1の効果
創傷治癒に関連する遺伝子の発現に及ぼす化合物1の効果を、2つの状況(a)ヒトPBMCおよび(b)ヒト腫瘍異種移植片のマウス間質において調べた。
【０２６３】
材料および方法
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を68歳の男性ヒトドナー由来のヘパリン添加血液のFicoll-Paque沈降によって単離し、RPMI-1640 10% FCS中で培養した。30 ng/mLの化合物1を用いて処理した後、単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、細胞を無菌スクレーパーで採取し、ペレットとして-80℃で保存した。
【０２６４】
Sk-Mel-28ヒト黒色腫細胞株を各BALB/c Foxn1nuマウスの側腹部の2部位へ皮下注射し(2 x 106細胞/部位)、およそ7 mm直径へ成長させたマウスから、ヒト腫瘍異種移植片におけるマウス間質を得た。次いで、各腫瘍に、化合物1を30μg含有する20%プロピレングリコール50μL、または20%プロピレングリコール50μLを注射した。注射後の異なる時点で、マウスを安楽死させ、腫瘍を採取し、皮膚カバーを除去し、インタクトな腫瘍を-80℃で保存した。
【０２６５】
製造業者の説明書に従って、QiagenRNeasyPlus Mini Kitを使用して30 mgの凍結腫瘍または1 x 107細胞からRNAを抽出し、次いで、NanoDrop機器で定量化し、1 kb DNAマーカーを有する変性アガロースゲルにおいて完全性を確認し、臭化エチジウムで染色した。
【０２６６】
RNA増幅および標識化
およそ500 ngのトータル未標識RNAをヌクレアーゼフリー水で最終体積11μLへ調節した。RNAを、9μLの逆転写酵素マスターミックス（1μLのT7 Oligo (dT) Primer、2μLの10X第1ストランドバッファー、4μLのdNTPミックス、1μLのRNaseインヒビターおよび1μLのArrayScript）と共に42℃で2時間インキュベートした。これに続いて、第2ストランドcDNA合成ステップを行い、これは、80μLの第2ストランドマスターミックス（63μLのヌクレアーゼフリー水、10μLの10X第2ストランドバッファー、4μLのdNTPミックス、2μLのDNAポリメラーゼおよび1μLのRNase H）と共に16℃で2時間さらにインキュベーションすることを含んだ。250μLのcDNA結合バッファーを含むcDNA Filter Cartridgeで濾過し、キット中に提供された500μLの洗浄バッファーで洗浄することによって、cDNAを精製した。精製されたcDNAを、20μLの55℃ヌクレアーゼフリー水で溶出した。各cDNAサンプルを、7.5μLのIVTマスターミックス（2.5μLのT7 10X反応バッファー、2.5μLのT7酵素ミックスおよび2.5μLのビオチン-NTPミックス）と共に37℃で16時間インキュベートした。各cRNAサンプルへ75μLのヌクレアーゼフリー水を添加することによって、反応を停止した。フィルター上へのローディング前に一緒に混合された350μLのcRNA結合バッファーおよび250μLの100 %エタノールを含むcRNA Filter CartridgeでcRNAサンプルを濾過することによって、ビオチン化増幅RNAを精製した。結合されたRNAを含むcRNAフィルターカートリッジを、次いで、650μLの洗浄バッファーで洗浄し、その後、精製されたcRNAを200μLの55℃ヌクレアーゼフリー水で溶出した。
【０２６７】
Illumina Expression BeadChipハイブリダイゼーション。cRNAサンプルを65℃で5分間加熱し、パルス遠心分離によって集めた。65度で5分間加熱した後、およそ750 ngのcRNAサンプルを別個のチューブへ等分し、ここで、約5μLのRNaseフリー水および10μLのHyb Mixを添加した。およそ15μLの調製cRNAミックスをIllumina Expression BeadChip上へローディングした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後続の工程を、Illuminaによって供給されるWhole-Genome Gene Expression Direct Hybridization Assay Guideに従って行った。
【０２６８】
Human HT-12 v4 Expression BeadChipは、ヒトトランスクリプトームにわたる47,000を超える転写物および公知のスプライス変異体をカバーする。MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChipは、19,000超の特有の遺伝子を含む、およそ25,600の十分に注釈されたRefSeq (Reference Sequence)転写物をカバーする。
【０２６９】
データ解析。BeadChipをiScan Systemによって読み取り、GenomeStudioによってGeneSpring GX v12.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)へ移した。デフォルト設定での分位点標準化を使用して、発現値を標準化した。エンティティーを、GenomeStudioによって計算された検出スコアに基づいてフィルタリグし、ここで、p ≦ 0.05を有意とみなした。
【０２７０】
化合物1によってヒトPBMCにおいて誘導された創傷治癒関連遺伝子発現変化
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、創傷治癒プロセスに関連するサイトカインおよび組織リモデリング酵素の産生に関与するリンパ球およびマクロファージ前駆体（単球）に富んでいる。表14は、創傷治癒との公知の関係を有し、かつ、対照、未処理PBMCよりも>2倍高かったまたは>2倍低かった、30 ng/mL化合物1によって誘導された遺伝子発現変化を列挙している。創傷治癒は、複雑な多段階シーケンスであり、ここでは、炎症などのプロセスが、その後、下方調節される必要がある。従って、表14に示される遺伝子は、インビボでの組織特異的発現の順序を明示せずに、インビトロでの混合リンパ集団において化合物1によって調節される関連分子の範囲を示していることが、注意されるべきである。
【０２７１】
遺伝子は、感染症からの保護に関与する炎症性サイトカイン（IL-1α、IL-1βおよびIL-6）、炎症反応を緩和するためのサイトカイン（IL-10およびIL-24）、増殖因子（GMCSF、CSF1およびHBEGF）、ならびに組織リモデリングについてのある範囲のケモカインおよびマトリックスメタロペプチダーゼ（後者はTIMP2の下方調節によって促進される）を含んだ。肉芽組織形成を抑制する、THBS1の下方調節はまた、創傷治癒における陽性因子である。KLF10の上方調節は、血管新生を促進し、TGF-βの誘導を示す。トランスグルタミナーゼ（TGM）は、架橋によってタンパク質を安定させ、創傷治癒において他の有利な効果を有する。
【０２７２】
（表１４）化合物1によってヒトPBMCにおいて誘導される改善された創傷治癒アウトカムに関連する遺伝子の発現の変化
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【０２７３】
化合物1によってヒト腫瘍異種移植片のマウス間質において誘導された創傷治癒関連遺伝子発現変化
体毛および体毛色の回復ならびに最小の瘢痕化によって証明された、マウスおよび伴侶動物における腫瘍部位の優れた治癒は、腫瘍内注射による化合物1処理の顕著な特徴である（実施例16および17）。従って、創傷治癒に関連する遺伝子発現の変化を、腫瘍が依然としてインタクトであった注射後の早い時点で、ヒト腫瘍異種移植片のマウス由来間質においてアッセイした。
【０２７４】
マウス遺伝子特異的マイクロアレイを使用する発現データを、3つのビヒクルのみの部位と共に、30μgの化合物1での腫瘍内注射によって処理された2〜3個の個々のヒトSK-Mel-28異種移植片について行い、データを合わせた。化合物1処理部位におけるその発現がビヒクル注射部位におけるものよりも>2倍高かったまたは>2倍低かったマウス遺伝子のみを、創傷治癒との関連について調べた。
【０２７５】
表15は、上記の基準によっておよび創傷治癒との公知の関係で選択された遺伝子を列挙している。
【０２７６】
創傷治癒について公知の好ましい結果を有する多数の遺伝子が、化合物1によって少なくとも2倍上方調節された。これらは、筋収縮（ACTA1）、増殖（EGR1）、炎症の調節（CXCL1）、ケラチノサイトの再生のためのケラチン（krt5、10、14、15、17、71、krtdap）、ケラチノサイト移動（Col17a1）、表皮分化および細胞間情報伝達（lor、Tgm2、Itga7）に関与する遺伝子であった。
【０２７７】
ある創傷治癒関連遺伝子、トロンボスポンジン2（Thbs2）が下方調節された。この遺伝子の下方調節は、創傷治癒の初期段階における血管密度の増加およびフィブロネクチンの増加と関連する。
【０２７８】
（表１５）化合物1によってヒト腫瘍異種移植片のマウス間質において誘導される改善された創傷治癒アウトカムに関連する遺伝子の発現の変化
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【０２７９】
実施例12：サイトカイン産生に及ぼす化合物の効果
特定のサイトカインは、創傷治癒プロセスにおいて重要な役割を果たし、これらの物質を調節する薬剤は、創傷の治療および／または治癒の美容的アウトカムの改善（例えば、瘢痕化の減少）において有用であり得る。創傷治癒プロセスの初期段階において重要であることが公知の4つのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-8およびTNFα）の調節に及ぼす化合物1、2、5および42の効果を、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）において調べた。
【０２８０】
72歳男性（ドナー1）および34歳（ドナー2）男性ヒトドナーの両方から得られたヘパリン添加血液のFicoll-Paque沈降によって、PBMCを単離した。全ての細胞を、以前に詳述したように、10% FCS, RPMI中で培養した。
【０２８１】
PBMCを、10% FCS, RPMI中に1.5x105細胞/ウェルの密度で播種した。4つの化合物でのこれらの細胞の刺激を、37℃、5% CO2で加湿インキュベーター中において24時間、二つ組で4つの濃度（0 ng/mL、3 ng/mL、30 ng/mL、300 ng/mL）にて行った。培地サンプルを、必要とされるウェルの各々から取り、使用まで-80℃で凍結した。
【０２８２】
Cytometric Bead Array (CBA)アッセイを使用し、結果を測定した。CBAアッセイは、既知のサイズおよび蛍光の抗体コーティングビーズを使用して可溶性の分析物または分析物のセットを捕捉するための方法を提供する。次いで、別の蛍光標識二次抗体を使用し、サンドイッチ複合体を形成して、検出を行う。製造業者の説明書に従って、BD (Becton Dickinson) CBA Human Inflammatory Cytokine Detection Kitを使用して、可溶性のIL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70およびTNFαの存在について、各培地サンプルをアッセイした。各サンプルからの平均蛍光強度値を標準曲線に対して比較して、サイトカイン濃度(pg/mL)を決定した。
【０２８３】
各化合物についてのCBAアッセイの結果を表16に示す。
【０２８４】
4つの化合物は全て、処理されたPBMCからのアッセイされた上澄み中において検出された4つのサイトカイン（TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8）のレベルを有意に増加させ、2人のドナー由来のPBMC間で一貫した傾向があった。最も高いサイトカインレベルは、化合物の2つの最も高い濃度（30および300 ng/mL）で一般に生じた。
【０２８５】
（表１６）化合物1、2、5および42についての0、3、30および300 ng化合物/mlの濃度での24時間のインキュベーション後のPBMCからのサイトカインの産生。サイトカインレベルは、pg/ml ±標準偏差で表され、2人のドナーの各々について示される。
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【０２８６】
インビボ活性の実施例
実施例13：マウス皮膚における急性炎症反応
急性炎症反応は、創傷治癒プロセスの重要な初期段階である。炎症性細胞、主に好中球およびマクロファージは、部位へ移動し、感染症からそれを保護し、続く組織修復の開始および調節に関与するサイトカインおよびケモカインを放出する。
【０２８７】
雄性ヌードマウスの各側腹部に、20%プロピレングリコール中の化合物1、2、5および42それぞれ100μg/mLの溶液50μLを皮下注射した。各部位は4時間以内にかつ24時間まで赤くなり、影響を受けた領域は皮膚のおよそ1 cm直径に及んだ。硬結が次の6日間にわたってかつ14日間まで形成し、部位は最小の瘢痕化を伴って完全に治癒した。
【０２８８】
マウス皮膚において化合物によって開始された急性炎症反応、続く迅速な消散は、炎症性細胞に及ぼす（実施例7および9）ならびにPBMC中の遺伝子発現およびサイトカインプロフィールに及ぼす（実施例11および12）化合物の観察された直接効果と一致している。このようなロバストなしかし一過性の炎症性反応は、良好なインビボ創傷治癒アウトカムと関連することが多かった。
【０２８９】
実施例14：化合物1のゲル製剤
30 mgまたは50 mgの化合物1(HPLCによる純度>97%)を、5 mLの99.5%イソプロピルアルコール(Biotech Pharmaceuticals)中に溶解し、一晩静置させた。0.6% Carbomer 940 (Snowdrift Farms)の溶液を、5mLの滅菌水中でゲル化剤として調製した。次いで、化合物1濃縮物および0.6% Carbomer 940溶液を20 mL注射器中に一緒に添加し、徹底的に混合した。20μLの100%トリエタノールアミン(Sigma-Aldrich)を次いで添加し、素早く混合した。得られた化合物1ゲルを、次いで、個々の1 mLインスリン注射器中へ分配し、3 mg化合物1/mLおよび5mg化合物1/mLの用量を製造した。
【０２９０】
実施例15：化合物1の注射用製剤
20mgの化合物1(HPLCによる純度>97%)を、20 mL容量ガラスシンチレーションバイアル中において8 mLの1,2プロパンジオール(Sigma-Aldrich)中に溶解し、一晩室温で静置させた。12 mLの30 mM酢酸緩衝液pH 4.2または食塩水（塩化ナトリウム、注射BP 0.9% - AstraZeneca）を次いで溶液へ添加し、徹底的に混合した。次いで、溶液を濾過滅菌し、1 mg/mL濃度の化合物1の1 mL用量へ分配した。
【０２９１】
実施例16：非治癒性創傷および現在の標準治療に反応しない創傷の獣医学的臨床治療
二次癒合創傷治癒を改善することを目的として、化合物1を使用して、10匹のペット（即ち、私有され、世話されている）動物における治癒困難な創傷を治療した。
【０２９２】
これらの適応症についての現在の獣医学的標準治療に反応しなかった慢性の非治癒性創傷を有する7匹のイヌ（カニス・ルプス・ファミリアリス（Canis lupus familiaris））および1匹のキノボリカンガルー（デンドロラガス・ルムホルツジイ（Dendrolagus lumholtzii））が、独立した獣医によって化合物1で治療された。現在の標準治療での初回治療に適さなかった創傷を有する第2のキノボリカンガルーおよびメガネオオコウモリ（プテロプス・コンスピシラタス（Pteropus conspicillatus））も、化合物1で治療された。全ての症例は、化合物1での治療の過程および続く創傷消散の期間の間、包帯剤またはその他の包帯法を使用することなく開放創として管理された。個々の症例研究において記載されない限り、化合物1での治療の過程にわたって併用薬は使用されなかった。
【０２９３】
これらの患畜の各々についての症例および治療記録を下記に要約する。治療する獣医へのこれらの動物の回復プレゼンテーションは、多くの場合不定期であり、創傷治癒アウトカムが、回復評価訪問の十分前に生じる場合があったことに注意のこと。
【０２９４】
化合物1での治療は、8つの完了した症例において、最小の瘢痕化を伴って有効な創傷消散をもたらした。創傷消散は、ごく最近に治療された2つの継続中の症例研究においても十分に進んだ（症例研究8および10）。
【０２９５】
症例研究1〜8：非治癒性創傷
症例研究1：非治癒性の深い壊死性の顔の創傷、3歳のバーニーズ・マウンテン・ドッグ（Bernese mountain dog）
症例記録：
・患畜の鼻の左側にある大きな楕円形状の顔の創傷、長さ7cm x 幅4cm x 深さ最大2cm。
・創傷には痂皮があり、壊死性化膿性分泌物の斑を伴った。
・組織病理学：クモ咬傷と恐らく関連し、球菌および化膿性炎症の存在を特徴とする、深い壊死性の傷。
・創傷は、3ヵ月の期間にわたる抗生物質（セファレキシン、アモシキクラブ、ゲンタマイシン）および抗炎症剤（マクロロン（macrolone））を含む標準創傷治療プロトコールに反応しなかった。
・創傷は、徐々に、サイズを増し、眼を閉じさせ、患畜の視力および全体的な振る舞いに著しく影響を与えた。患畜の下顎リンパ節は拡大した。
・残っている標準治療オプションは、積極的な顔面手術および再建についてであった。
・初回治療は、最初の14日の期間にわたる化合物1ゲル(3 mg/mL)の5回の適用（合計5.3mL）を含んだ（化合物1を第1、2、6、10および14日に適用した）。
・28日の時点での創傷の部分的な消散後、創傷領域の全体にわたって複数の場所で表面直下に注射した単回1 mL用量の化合物1(0.5 mg/mL)で、患畜を治療した。
・化合物1の注射後35日に、創傷は、健康な分化性肉芽組織で塞がれており、感染症の証拠はなかった。
・化合物1での治療の過程にわたる併用薬は、ゲル製剤での最初の治療時のテムジェシック（temgesic）およびリグノカインであり、注射治療時および注射治療直後の日（即ち、第28日および第29日）のテムジェシックおよびトラマドールであり、次いで第42日から毎日の低用量経口コルチコステロイド（マクロロン）の支持カバー（supportive cover）であった。
・最終治療後の76日に、創傷は治癒し、最小の瘢痕化で正常組織によって塞がれ、さらに発毛がもとの創傷領域の95%超に及んだ。
【０２９６】
症例研究2：破裂した感染腹部嚢胞、13歳のボクサー（Boxer）
症例記録：
・重篤な変形性関節症を有する虚弱な患畜は、いずれの外科的介入についても高い麻酔リスクがあると考えられた。
・患畜は、5ヵ月の期間にわたって定期的な排出および抗生物質（ゲンタマイシン、エンロフロキサシン、ノロシリン）の嚢胞への注射に反応しなかった、尾に近い背部上の持続性感染嚢胞を有した。
・患畜は、破裂嚢胞および高熱を示した。嚢胞を清浄し、死んだ皮膚を除去し、次いで、食塩水およびクロルヘキシジン（chlorhexidene）で洗い流した。患畜を抗生物質（クリンダマイシンおよびノロシリン）ならびに抗炎症剤（メタカム）で治療した。
・5日後、破裂嚢胞を伴う創傷は、消散の徴候を示さず、深刻な局所炎症によって囲まれていた。次いで、創傷の露出した領域（およそ長さ5cm x 幅3 cm 深さ最大2.5cm）を食塩水で洗い流し、0.5 mLの化合物1ゲル(3 mg/mL)を創傷領域上へ均一に適用した。
・化合物1ゲルでの治療後5日までに、創傷は、もとの創傷の領域の30%未満へ著しく縮小し（およその寸法：長さ3cm x 幅1.5cm x 深さ1cm）、健康な肉芽組織から構成されていた。
・30日で、創傷は、正常組織、およびもとの創傷領域にわたって70%超の発毛を伴って消散した。
・化合物1での治療の過程にわたるこの患畜についての併用薬は、治療時の注射用非ステロイド性抗炎症薬（メタカム）であった。
【０２９７】
症例研究3：非治癒性の感染した穿刺創、11歳のチャウチャウ（Chow Chow）
症例記録：
・患畜は、闘犬によって臀部に2つの大きな咬傷（各々、およそ長さ4cm x 幅1.5cm x 深さ2cm）を示した。
・創傷を洗浄し、患畜を抗生物質（アモシキクラブ錠剤および注射用ノロシリン）で治療した。
・8日後、創傷は、持続性であり、塞がっておらず、感染していた。
・創傷を清浄し、0.4 mLの化合物1ゲル(3 mg/mL)を各創傷へ均一に適用した。
・化合物1での治療後15日までに、創傷は、もとのサイズの40%未満へ著しく縮小し、焼痂を形成し、感染症の証拠はなかった。
・化合物1での治療後46日で、創傷は完全に消散し、創傷領域にわたって正常組織を有し、瘢痕化は無く、完全な発毛を伴った。
・化合物1での治療にわたってこの患畜には併用薬はなかった。
【０２９８】
症例研究4：イヌ（11歳のボクサー）の顔および中足骨上の非治癒性の感染した創傷
症例記録：
・患畜は、非治癒性の感染性かつ炎症性の創傷の2つの領域を示し、1つは顔の左側にあり、1つは左後肢の中足骨にあり、これらは、長期間の8週過程の抗生物質（セファレキシン、ドキシサイクリン）およびコルチコステロイド（マクロロン）に反応しなかった。
・化合物1の5 mg/mLゲル製剤の単回治療を、顔の創傷（0.4 mL）および肢の創傷（0.6 mL）へ適用した。
・顔の創傷は、化合物1での治療に素早く反応し、治療後7日で小さな焼痂が存在し、14日までに著しい明らかな発毛を含む完全な創傷閉鎖を伴った。創傷領域は、治療後63日までに完全に治癒した。
・肢の創傷も、局所領域に存在した焼痂を伴って、素早く反応した。14日までに、焼痂は、大部分が脱落し、健康な下層の肉芽組織が観察された。創傷領域は、治療後63日で、完全に閉じ、95%超が体毛で覆われていた。
・化合物1での治療の過程にわたるこの患畜についての併用薬は、イヌアトピー性皮膚炎症候群の治療用の継続中の毎日のコースの低用量コルチコステロイド（マクロロン）であった。
【０２９９】
症例研究5：イヌ（4歳のブル・アラブ（Bull Arab））の耳上の非治癒性の感染した創傷
症例記録：
・患畜は、6週間を超える間、左耳上に存在した狩猟事故に起因する非治癒性裂傷を示した。
・化合物1の5 mg/mLゲル製剤を各々0.1 mLの3回の治療を、8日間隔で、患部へ適用した。化合物1での患畜の治療過程の間に併用薬を使用しなかった。
・化合物1での最初の治療後41日までに、創傷は完全に閉じた。初回治療後152日でのさらなる評価では、完全な創傷消散、もとの創傷部位を覆う80%を超える体毛被覆率を伴う最小の瘢痕化を示した。
【０３００】
症例研究6：イヌ（11歳のボクサー）の耳上の非治癒性の感染した創傷
症例記録：
・患畜は、左耳の上部上に非治癒性の（感染したおよび炎症性の）ただれを示し、以下の定期的な適用を含む標準治療プロトコールで10週間治療された：(i)抗細菌剤(硫酸ネオマイシン)、抗炎症剤(ヒドロコルチゾン)および止痒薬(リグノカイン)を組み合わせた局所皮膚科学製剤（Neotopic）、ならびに(b)抗炎症(プレドニゾロン)、抗真菌(硝酸ミコナゾール)および抗細菌(硫酸ポリミキシンB)成分を含む市販の懸濁剤（Auracol）。これらの治療の前に、患畜は、慢性イヌアトピー性皮膚炎症候群の治療用の低用量経口コルチコステロイド（マクロロン）の継続中の過程にあった。
・標準治療プロトコールの10週間後、創傷消散の徴候はなかった。
・化合物1の5 mg/mLゲル製剤の3 mLの単回治療を患部へ適用し、化合物1の適用の15分以内に、治療された領域の認識可能な発赤があった。
・化合物1での治療後4日から、患畜は、重篤なアトピー性皮膚炎の治療用の低用量の毎日のコルチコステロイド（マクロロン）を再開した。この治療は、創傷治癒および消散の全過程にわたって継続された。
・化合物1での治療後17日で、感染症または炎症の徴候はなく、十分に肉芽化した創傷床が治療部位に生じた。
・治療後83日で、完全な創傷閉鎖が存在し、発毛が、もとの創傷領域の90%超にわたって生じた。
・治療後139日までに、もとの創傷の部位を識別することは可能ではなくなり、治療された領域においておよびその周囲で、瘢痕化およびまたは皮膚色素沈着もしくは外見上の厚みの差の証拠はなかった。
【０３０１】
症例研究7：イヌ（8歳のジャック・ラッセル・テリア（Jack Russell terrier））の耳および顔上の非治癒性の感染した創傷
症例記録：
・患畜は、飼い主が4週間を超えて存在したのを観察した、右耳の先端および底部での2つの非治癒性創傷ならびに鼻上の非治癒性創傷を示した。可能性のある原因は、感染したクモまたは他の昆虫による刺傷であった。
・化合物1の5 mg/mLゲル製剤を各々0.1 mLの2回の治療を、5日間隔で、耳上の両方の患部へ適用した。化合物1の5 mg/mLゲル製剤の0.1mLの単回治療を、顔面の病巣へ適用した。
・化合物1での最初の治療後13日までに、耳上の両方の創傷は著しく縮小し、焼痂を形成した。29日までに、創傷は完全に閉じ、体毛増殖による完全な被覆を伴った。
・治療後16日で、鼻上の創傷は完全に消散した。
・この患畜についての併用薬は、初回治療時の経口抗生物質アモキシシリンおよびクラブラン酸（アモシキクラブ）の5日コースであった。
【０３０２】
症例研究8：キノボリカンガルー（有袋類、デンドロラガス・ルムホルツジイ）の肢上の感染した骨創傷
症例記録：
・患畜は、ラクロサクラル脱臼（lacrosacral luxation）および骨髄炎を生じさせた、イヌによる攻撃で負傷した野生のキノボリカンガルーとして示された。患畜を注射用抗生物質セフタジジム（フォータム（Fortum））およびトリメトプリム-スルファメトキサゾール（TMS）で1ヵ月間治療した。炎症は減少したが、細菌スワブは、グラム陰性細菌およびセラチアマルセセンス（Serratiamarcesens）が依然として存在したことを明らかにした。影響を受けた肢は体重を支えていなかった。
・さらに2週間のセフタジジムでの治療は状態を改善させず、獣医は、骨からの感染症の除去について予後不良および将来の歩行を含むであろう骨格への可能性の高い深刻な機械的な破壊を助言した。その時点での飛節および足上の放出洞から採取された新たな細菌スワブによって、混合された嫌気性生物種およびグラム陽性アクチノミセス（Actinomyces）種が明らかとなり、従って、ヨウ化ナトリウム(Sodide)の単回の低速IV注入を送達した。
・他の治療に対する反応の欠如およびこれらの標準治療での全体的な予後不良のため、化合物1の5 mg/mLゲル製剤の4回適用を含む救命治療を2週間後に開始した。
・最初の適用について、0.1 mLの化合物1ゲルを、右の飛節上の3つの病巣の各々（1つは足関節上、1つは足蹠の真下、および踵の底部での小さな病巣）へ適用し、ヨウ化ナトリウムの低速IV注入を開始した。化合物1ゲルの適用の10分以内に、治療された領域からの膿性分泌物があった。
・最初の治療後8日のプレゼンテーションにおいて、膿性分泌物が、肢上の3つの創傷のうちの2つからにじみ出ていた。他方の創傷（踵上の最も小さな病巣）は縮小し、治癒を開始した。化合物1の5 mg/mLゲル製剤の0.15 mLでのさらなる治療を使用し、2つの開放創（一方は足関節上、他方は足蹠の底部上）の各々を治療した。ヨウ化ナトリウムの低速IV注入も与えた。
・さらに15日後（初回治療の23日後）、数mLの濃厚な化膿性の膿を、足蹠上の創傷から絞り出し、その後、排出された創傷洞中へ化合物1の5 mg/mLゲル製剤の0.15 mLを押し込んだ。
・1週間後、感染症の著しい改善があった。骨の小片を足蹠の穴から除去した。明らかな膿はなかったが、漿液性分泌物があった。さらに0.2 mLの化合物1ゲルを病巣の各々（一方は足関節上、他方は足の真下）へ適用した。ヨウ化ナトリウムの低速IV注入も送達した。肢はここで体重を支えているが、踵および足蹠は、炎症を伴って依然として非常に堅く、動物の歩行は非常に不均衡であり、無傷の後肢を強く好んだ。
・さらに15日後、足関節上の創傷は完全に閉じ、体毛が再び生えていた。足蹠の踵上の創傷は前の訪問時のサイズの50%未満へ縮小しており、周囲の皮膚および組織は柔らかく、しなやかかつ正常であった。肢は、ここで、完全に体重を支えており、動物の歩行に不均衡はなかった。
・注射用ヨウ化ナトリウム以外には、化合物1での治療過程にわたって他の併用薬を患畜へ投与しなかった。
【０３０３】
現在の標準治療に適さない困難な創傷の症例研究
症例研究9：キノボリカンガルー（有袋類、デンドロラガス・ルムホルツジイ）の耳中の感染性脈管炎
症例記録：
・患畜は、野外で見つけられた若い負傷した動物として示された。
・患畜は、非常に弱っており、脱水および貧血状態であった。尿サンプルは、血液および細菌感染症、恐らく敗血症を明らかにした。患畜を輸液療法に置き、制吐薬クエン酸マロピタント（maropitant citrate）（セレニア（cerenia））ならびに2つの注射用抗生物質製剤Tribacteral（トリメトプリム、スルファジアジン）およびセフタジジム（フォータム）を投薬した。
・輸液の9日後、患畜の状態は改善したが、右耳の外傷ならびに恐らく感染性脈管炎および壊疽があった。患畜の非常に損なわれた状態に起因する深刻な麻酔リスクのために、手術は可能ではなかった。代わりに、化合物1のゲル製剤での治療を開始した。
・5 mg/mL濃度化合物1ゲルの0.1 mLの3回治療を、7日間隔で、患部へ適用した。この期間の間の唯一の併用薬は、セファロスポリン抗生物質であるセフタジジム（フォータム）であった。
・化合物1ゲルの最初の治療後7日で、堅く接着性の焼痂が創傷表面を覆った。この焼痂は10日で持ち上がり、十分に発達したピンク色の肉芽化床が現れた。
・初回治療後14日での第3かつ最終の治療適用の時までに、創傷領域はおよそ50%減少し、25日で、健康な組織が創傷の全領域にわたって存在した。
・67日で、病巣は完全に消散し、耳にわたって完全に体毛で覆われていた。
【０３０４】
症例研究10：メガネオオコウモリ（哺乳綱、プテロプス・コンスピシラタス）の頭部上の重篤な裂傷
症例記録：
・患畜は、有刺鉄線中でのもつれによって引き起こされた月齢4ヵ月のオオコウモリの頭部上の深い穿通創を有する月齢4ヵ月のオオコウモリとして示された。
・野生生物の傷（オオコウモリを含む）に広い経験を有した治療する獣医の見解では、通常の標準治療は、手術に伴う過度の瘢痕組織形成または創傷治癒包帯剤が適用される場合に必要とされる肉芽化の程度のいずれかに起因して、右目が形状を失い、閉じることができないようなる点で、非常に問題となる可能性が高かった。
・化合物1を、28日期間にわたって5 mg/mLゲル製剤の0.1 mLの3回適用で創傷へ適用した（第1、10および28日）。他の併用薬または介入を治療過程の間に使用しなかった。
・初回治療後14日で、著しい組織充填およびリモデリングが存在し、28日までに、眼は完全に閉じることができた。38日までに、焼痂は全創傷領域を覆い、これは、49日で脱落し始め、良好な肉芽化床が現れた。
・初回治療後55日までに、もとの創傷の全領域にわたって十分な組織充填が存在し、右目はそのもとの位置に戻っていた。非常に健康な肉芽化床が存在した。
【０３０５】
実施例17：化合物1で治療された伴侶動物における自然発生腫瘍の壊死および脱落後に生じた創傷の消散および美容的アウトカム
24匹の伴侶動物における、化合物1（0.5または1.0 mg/mL濃度での30% 1,2プロパンジオール製剤）の腫瘍内注射によって治療された、自然発生腫瘍の壊死および脱落後に形成された創傷の消散の速度に関する獣医学的臨床データを、表17に要約する。
【０３０６】
全ての創傷は開放創として管理され、包帯法、包帯剤、ローション剤または併用薬はこれらの症例のいずれにおいても使用されなかったことに注意のこと。
【０３０７】
（表１７）化合物1の注射用製剤で治療された自然発生腫瘍の脱落後の伴侶動物における創傷サイズおよび消散速度（閉鎖までの時間）。
0006415538.tif 000106
【０３０８】
これらの症例からのデータはまた、大部分の患畜において最小の瘢痕化および正常な発毛を伴う創傷消散についての良好な美容的アウトカムを示している（表18）。瘢痕化が生じた少数の症例において、これらは、通常は薄い皮膚の領域（例えば、ウマおよびイヌの四肢上）と通常は一致した。
【０３０９】
（表１８）化合物1の注射用製剤で治療された自然発生腫瘍の脱落後の伴侶動物における治癒した創傷部位の組織、皮膚および体毛の特徴。
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1 組織欠損カテゴリー
皆無または最小：もとの創傷領域にわたって<5%の組織欠損
軽微：もとの創傷領域にわたって5〜10%の組織欠損
実在：もとの創傷領域にわたって>10%の組織欠損
2. 瘢痕化および皮膚肥厚カテゴリー：
皆無または最小：視覚または触覚によって明白でない瘢痕
軽微：もとの創傷領域の<10%を覆う局所的な瘢痕
実在：もとの創傷領域の>10%を覆う瘢痕
3. 創傷領域上の発毛カテゴリー：
完全：体毛がもとの創傷領域の>95%を覆う
部分的：体毛がもとの創傷領域の>50%を覆う
希薄：体毛がもとの創傷領域の<50%を覆う
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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