(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合性複合体(MHC)により細胞表面に提示されたペプチドを標的とするオリゴヌクレオチドアプタマーであって、
前記オリゴヌクレオチドアプタマーは、(1)配列番号1の配列、又は(2)配列番号2、1、及び3の配列からなり、前記配列番号2及び3の配列は、前記配列番号1の上流及び下流にそれぞれ連結して位置し、
前記ペプチドは、黒色腫関連抗原A3(MAGE-A3)に由来し、且つ配列番号4のアミノ酸配列を有する、オリゴヌクレオチドアプタマー。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドアプタマーが、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのうち1種以上の化学基で修飾されている、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアプタマー。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドアプタマーが蛍光色素、レポーター分子、造影剤、抗がん剤、ペプチド、又は磁性粒子に結合している、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアプタマー。
【請求項４】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドアプタマーを含有する、腫瘍の治療用医薬組成物であって、
前記腫瘍は、前記腫瘍上に発現された主要組織適合性複合体(MHC)によって提示されたペプチドを有し、前記ペプチドは、黒色腫関連抗原A3(MAGE-A3)に由来し且つ配列番号4のアミノ酸配列を有し、
前記オリゴヌクレオチドアプタマーは、抗がん剤と結合している、医薬組成物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために、前記オリゴヌクレオチドアプタマーが、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのうち1種以上の化学基で修飾されている、請求項4に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
1.技術分野
【０００２】
本開示はアプタマーに関する。より具体的には、本開示は、主要組織適合性複合体(MHC)により細胞表面に提示されたペプチドを特異的に標的とするアプタマーに関する。
【０００３】
2.背景技術
【０００４】
アプタマーは、リボ核酸(RNA)や一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)のようなオリゴヌクレオチド、又はペプチド分子であり、特定の二次構造及び三次構造を有するために高い親和性及び特異性で標的に結合できる。オリゴヌクレオチドアプタマーの同定は一般的に、RNA又はssDNAのランダム配列1013〜1016個からなる初期ライブラリから、試験管内選択法(いわゆるSELEX法)と呼ばれるin vitroセレクションによって行う。
【０００５】
オリゴヌクレオチドアプタマーは、抗体と同様、標的結合特異性をもつために基礎研究と臨床とに使用できるが、抗体にはない以下のような多様な利点を有する。(1)経済的に合成でき、修飾の自由度が高い点。具体的には、オリゴヌクレオチドアプタマーは選択後、大量に合成でき、意図する様々な目的に合わせて化学反応により修飾できる。(2)安定性が高い点。具体的には、オリゴヌクレオチドアプタマーは乾燥末状で長期安定であり、溶液状とした場合にも熱的に安定で構造的には変性後に変性前のコンフォメーションに戻ることができる。(3)生体適合性が高い点。具体的には、オリゴヌクレオチドアプタマーは免疫系により自己抗原として認識される核酸分子であるため、毒性が低く免疫原性も低いのが一般的である。(4)組織に迅速に浸透する点。具体的には、オリゴヌクレオチドアプタマーは核酸であるため、容易に浸透でき、トランスフェクション試薬を用いて細胞内の標的に結合させることができる。こうした物理的特性と化学的特性とをもつため、オリゴヌクレオチドアプタマーは、抗体の代わりにターゲティングツールとして、研究や診断、創薬、治療に使用できる。
【０００６】
腫瘍関連抗原(TAA)は、腫瘍細胞やがん細胞にのみ発現していることから、腫瘍細胞やがん細胞の特定、ターゲティング、又は治療に有用な腫瘍マーカーと見なすことができる。TAAの1つに黒色腫関連抗原A3(MAGE-A3)があり、非常に多くの腫瘍において大量に発現している。MAGE-A3は、転移性黒色腫の74%、食道癌の57%、胃癌の38%、肺がんの39%、多発性骨髄腫の33%で発現がみられ、これら以外の多様ながん、例えば、膀胱癌、乳癌、膵癌、腎癌、肝細胞癌、及び頭頸部扁平上皮癌などにも発現している。MAGE-A3の発現は悪性化や予後不良に関連する場合が多い。そのため、がん治療や腫瘍診断の分野で、異なるステージにある多種の腫瘍を正確且つ同時に標的とするマーカーとして有用である。
【０００７】
MAGE-A3はエピトープがいくつか同定されている。MAGE-A3はMHCクラスI及びクラスIIの両方により提示される。アミノ酸111〜126位領域にわたるMAGE-A3ペプチド断片が複数種、様々な腫瘍において同定されており、多様な民族で主にみられる多様なHLA(ヒトMHC座)分子(HLA-A、HLA-B、HLA-DP、及びHLA-DRの対立遺伝子を含む)に関連付けられている。このことから、MAGE-A3は、多くのがん患者におけるターゲティングに使用できる。
【０００８】
以上のことから、当該技術分野では、腫瘍関連MAGE-A3ペプチドを望ましい特異性及び親和性で認識できるアプタマーが求められている。
【発明の概要】
【０００９】
以下に、本開示に関する基礎知識を提供する目的で、本開示内容の概要を簡潔に記載する。以下に記載する概要は、本開示内容の全体像を広く示すものではなく、本発明の主要要素や重要要素を特定するものでもなく、本発明の範囲を詳細に示すものでもない。以下に記載する概要は、本明細書中に開示されるいくつかの概念を簡潔に示して、本概要に続いて記載する詳細な説明に先立って序文を提供することのみを目的とする。
【００１０】
本明細書中に実施形態を示し概括的に記載する通り、本開示は、ペプチドを標的とできるオリゴヌクレオチドアプタマー、上記ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマーを含有する組成物、及びMHCにより上記ペプチドが細胞表面に提示された細胞を標的としたそれらの使用に関する。上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、ターゲティング能力を有することから抗がん剤に結合させることができ、そのため、MHCにより上記ペプチドが細胞表面に提示された腫瘍を治療する際に使用できる。
【００１１】
本開示の一態様は、MHC分子により提示されたペプチドを標的とするオリゴヌクレオチドアプタマーに関する。一実施形態において、上記ペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を有する。特定の一実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、AGCACTCAATATTCCC(配列番号1)の配列を有する。別の特定の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、上流配列であるATCCAGAGTGACGCAGCA(配列番号2)及び下流配列であるTGGACACGGTGGCTTAGT(配列番号3)をさらに有する。
【００１２】
本開示の実施形態によっては、上記ペプチドは腫瘍関連ペプチドであり、MAGE-A3に由来する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、上記ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマー及び薬学的に許容される添加剤を含有する組成物を提供する。
【００１４】
本開示の実施形態によっては、上記ペプチドは、黒色腫、白血病、舌癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺がん、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、膵がん、腎がん、肝細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される腫瘍において発現している。
【００１５】
本開示の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、上記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために1種以上の化学基で修飾されていて、上記化学基は、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのいずれかである。特定の一例において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーはホスホロチオエートキャップで修飾されている。
【００１６】
本開示の実施形態によっては、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、蛍光色素、レポーター分子、造影剤、抗がん剤、ペプチド、又は粒子に結合している。本開示の実施形態によっては、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは酸化鉄磁性粒子に結合している。本開示の他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは蛍光色素に結合している。
【００１７】
さらに別の態様において、本開示は、上記オリゴヌクレオチドアプタマー及びこれを含有する上記組成物の使用に関する。例えば、上記オリゴヌクレオチドアプタマー及びこれを含有する上記組成物は、上記ペプチド提示細胞を標的とする方法において使用できる。特定の一例において、上記ペプチドはMAGE-A3に由来し、MHC分子により細胞表面に提示される。
【００１８】
本開示の実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドアプタマーを含有する組成物を使用してペプチド提示細胞を標的とする方法が提供される。上記方法は、上記ペプチド提示細胞を、十分量の本発明の組成物とともにインキュベートすることによって、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーを上記ペプチド提示細胞に結合させる工程を含み、上記ペプチド提示細胞は、黒色腫、白血病、舌癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺がん、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、膵がん、腎がん、肝細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される腫瘍細胞である。本開示の実施形態によっては、上記ペプチドはMHC分子により提示され、MAGE-A3に由来する。
【００１９】
本開示の実施形態によっては、上記ペプチド提示細胞を標的とする上記組成物に含有される上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、上記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために1種以上の化学基で修飾されていて、上記化学基は、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのいずれかである。特定の一例において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーはホスホロチオエートキャップで修飾されている。
【００２０】
本開示の実施形態によっては、上記ペプチド提示細胞を標的とする上記組成物に含有される上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、様々な用途に応じて、蛍光色素、レポーター分子、造影剤、抗がん剤、ペプチド、又は粒子に結合できる。本開示の実施形態によっては、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは酸化鉄磁性粒子に結合している。一例において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーは蛍光色素に結合している。
【００２１】
さらなる態様において、本開示は、腫瘍関連ペプチドを提示している腫瘍の罹患が疑われる対象を治療する方法を提供する。上記方法は、上記腫瘍の進行を緩和又は寛解するために本発明の組成物の治療的有効量を上記対象に投与する工程を含み、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーは抗がん剤に結合していて、上記腫瘍は、黒色腫、白血病、舌癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺がん、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、膵がん、腎がん、肝細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される。本開示の実施形態において、上記腫瘍関連抗原は、MHC分子により提示されるMAGE-A3ペプチドである。
【００２２】
一実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドアプタマーに結合している上記抗がん剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブチル、イホスファミド、ブスルファン、N-ニトロソ-N-メチル尿素、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チオグアニン、メルカプトプリン、ビンカアルカロイド、タキサン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アントラサイクリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、又はマイトマイシンであってよい。
【００２３】
上記ペプチド提示腫瘍を治療するための本発明の組成物に含有される上記オリゴヌクレオチドアプタマーは、上記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのうち1種以上の化学基で修飾されていてよい。特定の一例において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーはホスホロチオエートキャップで修飾されている。
【００２４】
本開示の付随的な特徴及び利点の多くは、以下の詳細な記載を参照することにより十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の記載は、以下の詳細な記載と付属の図面とにより十分に理解される。
【００２６】
【図１】実施例2のAp52と特定のペプチドとの結合親和性及び特異性を調べたPCRの結果を示す写真である。ペプチドMAGE-A3111-125 (+)、ペプチドNY-ESO-1119-143 (N1)、ペプチドNY-ESO-1157-170 (N2)、ペプチドNY-ESO-187-111 (N3)、及びペプチドなし(-)をAp52と反応させ、続いて溶出及びPCR増幅を行った。PBはオリゴヌクレオチドアプタマーのコントロールとして使用した。
【００２７】
【図２】本開示の実施例2において、特定のがん細胞株におけるMAGE-A3の発現をイムノブロット分析によって調べた写真である。
【００２８】
【図３】種々の細胞株に対する実施例2のシアニン3(Cy3)結合Ap52によるターゲティングを示す、共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。(a)SK-MEL-28細胞、(b)MCF-7細胞、(c)Cal-27細胞、(d)DLD-1細胞、(e)HepG2細胞、(f)A549細胞、(g)AsPC-1細胞、(h)HEM-a細胞、(i)MCF-10A細胞、(j)OMF細胞、(k)FHC細胞、(l)THLE-3細胞、(m)BEAS-2B細胞、(n)hTERT-HPNE細胞。いずれの顕微鏡写真も、Cy-3(赤、励起561nm)、DAPI(青、核染色、励起405nm)、及びカルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)による結果を合成した画像である。
【００２９】
【図４】フローサイトメトリーアッセイのデータであり、実施例2のCy3結合Ap52による多様ながん細胞株のターゲティングを示す。(a)MCF-7細胞、(b)DLD-1細胞、(c)HepG2細胞、(d)A549細胞、(e)SK-MEL-28細胞、(f)Cal-27細胞、(g)AsPC-1細胞。右の曲線はCy3結合Ap52の細胞への結合を表す。結合を示す蛍光シグナルをアスタリスクで表す。未処理の細胞をコントロールとして使用した(左の曲線で表す)。
【００３０】
【図５】がん細胞株SK-MEL-28に対する実施例2のCy3結合Ap52によるターゲティングを示す、共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。SK-MEL-28細胞を、(a)カルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)、(b)DAPI(青、核染色、励起405nm)、及び(c)Cy3結合Ap52(赤、励起561nm)でそれぞれ処理した。(d)は(a)、(b)、及び(c)の合成画像である。
【００３１】
【図６】フローサイトメトリーアッセイのデータであり、(a)K-562細胞、(b)Cy3結合Ap52で処理したK-562細胞、(c)GFPタグHLA-Iを発現しているK-562細胞、(d)GFPタグHLA-Iを発現しているK-562細胞をCy3-Ap52で処理したもの、(e)GFPタグHLA-IIを発現しているK-562細胞、(f)GFPタグを有するHLA-IIを発現しているK-562細胞をCy3-Ap52で処理したものについて、蛍光レベルを示す。(d)及び(f)における二重蛍光(右上の長方形)は、Cy3結合Ap52に結合したGFP発現細胞を表す。
【００３２】
【図７】実施例2のオリゴヌクレオチドアプタマーAp52(図7A)又は実施例3のオリゴヌクレオチドアプタマーAp16(図7B)の各々とMAGE-A3111-125ペプチドとの相互作用を示す。上記相互作用は等温滴定熱量測定により調べる。上の図は滴定で得た生データであり、アプタマーをペプチドに対して注入した際の熱量を示す。各ピークは注入を表す。下の図は滴定曲線であり、各滴定における熱量を合わせたものを示す。滴定データをone-set-of sites結合モデルでフィッティングして熱力学的パラメータを得た(MicroCal Origin 7)。Ap16について、Kd=95nM、ΔH=-41kcal/モル。Ap52について、Kd=57nM、ΔH=-24kcal/モル。
【００３３】
【図８】皮膚がん細胞株SK-MEL-28(a)又は対応する正常細胞株HEM-a(c)に対する実施例3のCy3結合Ap16によるターゲティングを示す、共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。ターゲティングコントロールとして、実施例3のCy3結合Ap16コントロールをSK-MEL-28(b)又はHEM-a(d)とともにインキュベートした。いずれの顕微鏡写真も、Cy-3(赤、励起561nm)、DAPI(青、核染色、励起405nm)、及びカルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)による結果を合成した画像である。
【００３４】
【図９】乳がん細胞株MCF-7(a)、乳房正常細胞株MCF-10A(b)、口腔がん細胞株Cal-27(c)、及び口腔正常細胞株OMF(d)に対する実施例3のCy3結合Ap16によるターゲティングを示す、共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。いずれの顕微鏡写真も、Cy-3(赤、励起561nm)、DAPI(青、核染色、励起405nm)、及びカルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)による結果を合成した画像である。
【００３５】
【図１０】黒色腫細胞株SK-MEL-28(a)及び口腔がん細胞株Cal-27(b)に対する実施例3のCy3結合Ap16によるターゲティングを示す、共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。いずれの顕微鏡写真も、Cy-3(赤、励起561nm)、DAPI(青、核染色、励起405nm)、及びカルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)による結果を合成した画像である。
【００３６】
【図１１】共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。実施例3のCy3結合Ap16で処理したSK-MEL-28細胞株のZ軸連続画像を示す。いずれの顕微鏡写真も、Cy-3(赤、励起561nm)、DAPI(青、核染色、励起405nm)、及びカルセインAM(緑、細胞質染色、励起488nm)による結果を合成した画像である。
【００３７】
周知の通り、上記の多様な特徴及び要素は、正確なサイズを示すものではなく、本発明の特定の特徴及び要素を例示するために記載するものである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に、付属の図面と関連させて詳細に記載するが、この詳細な記載は本発明の例を示すものである。以下の詳細な記載に示される形態は、本発明の例が構築又は利用される形態を限定するものではない。以下の記載は、本発明の例の機能及び本発明の例を構築し実施する工程の順序を説明するものであるが、これらと同一又は同等の機能及び順序が、下記以外の例によって実現されてもよい。
【００３９】
本明細書中において、用語「a」、「an」、及び「the」は、コンテクストにより別途明瞭に指定されない限り、「1つ以上」であることを意味し、複数であることを意味する場合も含まれる。
【００４０】
本明細書中において、用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2'-デオキシ-D-リボース又はその修飾形態を含む)すなわちDNA、ポリリボヌクレオチド(D-リボース又はその修飾形態を含む)すなわちRNA、及び任意の他の種類のポリヌクレオチド、すなわちプリン若しくはピリミジン塩基、被修飾プリン若しくはピリミジン塩基、又は基本形態のヌクレオチドのN-配糖体又はC-配糖体を指す。
【００４１】
本明細書中において、用語「アプタマー」又は「オリゴヌクレオチドアプタマー」は、目的の標的分子とともに複合体を形成できる特異的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを指す。ここで、同一環境下に共存する他の物質は、上記オリゴヌクレオチドと複合体を形成しないものとする。上記に定義される通り、上記オリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチド配列及び複数のオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００４２】
結合の特異性は、上記アプタマーと標的との間の解離定数(Kd)に基づいて定義される。上記解離定数(Kd)は、上記アプタマーと、同一環境下にある他の物質又は無関係な一般的分子と、の間の解離定数と比較した場合の相対値である、典型的には、上記アプタマーと標的との間のKd値は、標的と他の無関係な物質又は同一環境下にある付随物質との間のKd値の2分の1、好ましくは5分の1、より好ましくは10分の1である。さらに好ましくは、上記アプタマーと標的との間のKd値は、標的と他の無関係な物質又は同一環境下にある付随物質との間のKd値の50分の1、より好ましくは100分の1、より好ましくは200分の1である。解離定数の値は既知の方法により直接決定できる。
【００４３】
本明細書中において、「薬学的に許容される添加剤」は、妥当な対危険便益比にしたがって、過度の有害副作用(毒性、刺激、及びアレルギー反応等)を生じることなく、上記対象に好適に使用できるものである。上記添加剤は、上記医薬組成物に含有される他の成分と共存できるという点において、「許容される」ものでなければならない。上記添加剤の形態は、固体、半固体、又は液体で、希釈剤、クリーム、又はカプセル剤であってよい。
【００４４】
本明細書中において、用語「治療」は、MAGE-A3発現腫瘍に関連する症状、二次的障害、又はコンディションを、部分的又は完全に、予防、寛解、低減、及び/又は管理することを含む。本明細書中において、用語「治療」は、MAGE-A3発現腫瘍の1つ以上の症状、二次的障害、又は特徴を、部分的又は完全に、緩和、寛解、軽減、発症遅延、進行阻害、重症度低減、及び/又は発生頻度低減することを目的として、抗がん剤に結合したMAGE-A3ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマー又はこれを含有する本開示の組成物を、MAGE-A3発現腫瘍に関連する症状、二次的障害、又はコンディションを呈する対象に、適用又は投与することを指す。MAGE-A3発現腫瘍に関連する症状、二次的障害、及び/又はコンディションとして、原因不明の体重減少、発熱、疲労、疼痛、及び身体機能の変化が挙げられるが、これらに限定されない。治療は、MAGE-A3発現腫瘍に関連する症状、二次的障害、及び/又はコンディションの発生率を低下させる目的で、上記症状、障害、及び/又はコンディションの初期兆候のみを呈する対象に投与することであってもよい。用語「有効」の本明細書中における定義に関し、一般的に、1つ以上の症状又は臨床マーカーの量が低減された場合に、治療は「有効」である、とする。あるいは、症状、障害、又はコンディションの進行の程度が低下した場合又はその進行が停止した場合に、治療は「有効」である、とする。
【００４５】
本明細書中において、用語「治療的有効量」は、成分(本発明の抗がん剤結合オリゴヌクレオチドアプタマー等)について、望ましい反応を生じるのに十分な量を指す。具体的な有効量は、治療する特定のコンディション、上記対象の健康状態(例えば、上記対象の体重、年齢、又は性別)、治療する哺乳動物又は動物の種類、治療継続時間、併用療法(実施する場合)の種類、及び使用する具体的な処方等の因子によって異なる。また、治療的有効量は、上記成分又は組成物が有毒又は有害な効果を有していた場合にも、その有毒又は有害効果より治療上有益な効果が上回る量とする。有効量は、例えば、グラム、ミリグラム、マイクログラム、又は体重1キログラム当たりのミリグラム(mg/kg)で表記できる。あるいは、上記有効量は、医薬組成物中の有効成分の濃度、例えばモル濃度、質量濃度、体積濃度、質量モル濃度、モル分率、質量分率、及び混合比等でも表記できる。具体的には、用語「治療的有効量」は、本明細書中に記載される抗がん剤結合オリゴヌクレオチドアプタマーの量を指す場合には、上記対象における上記腫瘍の進行を緩和又は寛解するのに十分な量を指す。
【００４６】
用語「対象」は、上記オリゴヌクレオチドアプタマー、これを含有する組成物、及び/又は本発明の方法によって治療できる、ヒトを含む哺乳動物を指す。用語「対象」は、性別が具体的に記載される場合を除き、男性及び女性の両方を指すものとする。
【００４７】
本開示において、上記ペプチド提示細胞は、上記ペプチドを発現している細胞を指す。好ましくは、上記ペプチド提示細胞は、MHCにより上記ペプチドが細胞表面に提示された細胞を指す。同様に、上記ペプチド提示腫瘍は、上記ペプチドを発現している腫瘍を指す。好ましくは、上記ペプチド提示腫瘍は、MHCにより上記ペプチドが細胞表面に提示された細胞を有する腫瘍を指す。
【００４８】
以下に、本発明の実施について、MHC分子により提示されたペプチドに対して用いるオリゴヌクレオチドアプタマー、上記ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマーを含有する組成物、並びに上記ペプチド提示細胞のターゲティング及び/又は上記ペプチド提示腫瘍の治療におけるこれらの使用に関して、詳細を記載する。上記ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマーは抗がん剤にさらに結合している。本開示の実施形態によっては、上記ペプチドはMAGE-A3に由来する。
【００４９】
試験管内進化法(SELEX)により、ペプチド(例えば、MAGE-A3111-125ペプチド)を特異的に標的とするオリゴヌクレオチドアプタマーを得た。一般的には、まず、非常に大きなオリゴヌクレオチドライブラリ(約1013〜1016個のランダムなRNA又はssDNA配列からなる)を合成した。上記ライブラリは、プライマーとなる定常5'末端及び定常3'末端に隣接した一定長さの配列をランダムに作成させたものからなる。合成したライブラリを、標的ペプチド(例えば、MAGE-A3111-125ペプチド)に曝露し、その後、標的に特異的に結合したオリゴヌクレオチドについて評価を行い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。こうした結合と選択を数回繰り返すことにより溶出条件のストリンジェンシーを高め、結合親和性が最も高い配列を得た。
【００５０】
選択されたオリゴヌクレオチドアプタマーは、上記標的ペプチドに対する特異性が高い。本開示の一態様は、上記MAGE-A3ペプチドを標的とするオリゴヌクレオチドアプタマーを提供する。上記オリゴヌクレオチドアプタマーは16個のヌクレオチドAGCACTCAATATTCCC(以下に「Ap16」、配列番号1)からなり、上記MAGE-A3ペプチドは配列番号4のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本開示の別の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアプタマーAp16は、上流配列であるATCCAGAGTGACGCAGCA(配列番号2)及び下流配列であるTGGACACGGTGGCTTAGT(配列番号3)をさらに有する。得られたオリゴヌクレオチドアプタマーは、ヌクレオチド52個の長さを有することから「Ap52」と呼ぶ。
【００５２】
本開示の実施形態において、Ap16及びAp52はいずれも上記MAGE-A3ペプチドに結合していて、そのKd値はナノモルオーダーである。
【００５３】
別の態様において、上記MAGE-A3ペプチドに特異的に結合できる上記得られたオリゴヌクレオチドアプタマー(すなわちAp16又はAp52)を、MAGE-A3ペプチド提示細胞を標的とする組成物に配合してもよい。上記MAGE-A3ペプチドは腫瘍関連抗原(TAA)であり、黒色腫、白血病、舌癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺がん、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、膵がん、腎がん、肝細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される異なる種類の腫瘍において提示される。そのため、上記MAGE-A3ペプチド標的オリゴヌクレオチドアプタマー及びこれを含有する上記組成物は、MAGE-A3発現がん細胞を標識及び/又は治療するための生物学的ツールとして有用である。
【００５４】
本開示の実施形態によっては、上記MAGE-A3ペプチドはMHC分子により提示される。実施形態によっては、上記MAGE-A3ペプチドはMHCクラスI分子により提示される。実施形態によっては、上記MAGE-A3ペプチドはMHCクラスII分子により提示される。
【００５５】
上記組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマー(すなわちAp16又はAp52)に加えて、薬学的に許容される添加剤をさらに含有する。本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーとともに使用される薬学的に許容される添加剤は、基本的に、上記医薬組成物又は医療用組成物の望ましい製品形態に基づいて選択される。
【００５６】
本開示の実施形態において、Ap16又はAp52は、上記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために1種以上の化学基で修飾されている。ほとんどのオリゴヌクレオチドアプタマーは、核酸化学合成の過程において、具体的な適用目的に応じた好適な化学基で修飾できる。上記オリゴヌクレオチドアプタマー(例えばAp16及びAp56)の修飾に好適な化学基として、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、及び5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の一実施形態において、Ap16又はAp52はホスホロチオエートキャップで修飾されている。
【００５７】
本開示の他の実施形態において、検出又は治療の目的で、Ap16又はAp52はさらに、蛍光色素、レポーター分子、造影剤、抗がん剤、ペプチド、又は粒子に結合している。この結合は、当業者に知られた方法で実施できる。例えば、核酸化学合成の過程において、3'末端又は5'末端の第1級アミンを多様な分子と結合させることができる。あるいは、この結合は、第1級アルキルアミンタグがアリールアミンよりもはるかにヌクレオチドと化学反応しやすいことを利用する方法、例えば伝統的なカルボジイミド法、アルデヒド法、又はジアゾニウム法によっても実施できる。
【００５８】
一実施形態において、Ap16又はAp52は酸化鉄磁性粒子に結合している。別の実施形態において、Ap16又はAp52は蛍光色素に結合している。さらに別の実施形態において、Ap16又はAp52は抗がん剤に結合している。
【００５９】
蛍光色素のうちシアニン類は、発色が明るく蛍光シグナルの安定性が高いため、従来用いられるフルオレセイン(FITC)及びローダミン(TRITC、RRX)等の色素より好ましい。シアニン類のうち、シアニン3(Cy3)及びシアニン5(Cy5)が最もよく使用される。Cy3はオレンジ色の蛍光(励起:〜550nm、発光:〜570nm)を発する。Cy5は、赤色領域(〜650/670nm)の蛍光を発するが、オレンジ色領域(〜649nm)の蛍光は吸収する。Cy3は、テトラメチルローダミン(TRITC)用標準フィルターを備えた種々の蛍光光度計、撮像装置、及び顕微鏡で検出できる。この色素は吸光係数が本質的に高いため、ゲル又は溶液中、肉眼で容易に検出できる。したがって、本開示の分析アッセイにおいて上記オリゴヌクレオチドアプタマーとMAGE-A3ペプチド提示細胞との間の結合及びターゲティングを調べる際、Ap16又はAp52と結合させる蛍光色素として、Cy3が選択される。
【００６０】
Ap16又はAp52と結合させる好適な抗がん剤として、アルキル化剤(メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブチル、イホスファミド、ブスルファン、N-ニトロソ-N-メチル尿素、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン等)、代謝拮抗薬(メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チオグアニン、及びメルカプトプリン等)、微小管阻害剤(ビンカアルカロイド及びタキサン等)、トポイソメラーゼ阻害剤(イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、及びアクラルビシン等)、及び細胞毒性抗生物質(アントラサイクリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、及びマイトマイシン等)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本開示の一実施形態において、ホスホロチオエートで修飾することによっても、蛍光色素を結合させることによっても、上記オリゴヌクレオチドアプタマー(すなわちAp16及びAp52)の安定性を効率よく改善できる。
【００６２】
本開示の別の態様は、Ap16又はAp5の使用に関する。この使用には、上記MAGE-A3ペプチド提示細胞を標的とする及び/又は上記MAGE-A3ペプチド提示腫瘍を治療する方法が含まれる。
【００６３】
本開示の実施形態において、本開示のAp16含有組成物又はAp52含有組成物を使用して上記MAGE-A3ペプチド提示細胞を標的とする方法が提供される。上記方法は、上記MAGE-A3ペプチド提示細胞を十分量の本発明の組成物とともにインキュベートすることによって、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーを上記MAGE-A3ペプチド提示細胞に結合させる工程を含み、上記MAGE-A3ペプチド提示細胞は腫瘍細胞であり、上記腫瘍は、黒色腫、白血病、舌癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肺がん、多発性骨髄腫、膀胱がん、乳がん、膵がん、腎がん、肝細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、及び頭頸部扁平上皮癌からなる群より選択される。
【００６４】
本開示の実施形態によっては、本発明の組成物のAp16又はAp52は、上記オリゴヌクレオチドアプタマーの安定性を増大させるために1種以上の化学基で修飾されていて、上記化学基は、2'-アミノピリミジニル基、2'-O-メチルプリニル基、5'-ジアルキル基、ホスホロチオエートキャップ、2'-OHヌクレオチド、2'-フルオロピリミジン、又は5-(1-ペンチニル)-2'-デオキシウリジンのいずれかである。一例において、本発明の組成物のAp16又はAp52はホスホロチオエートキャップで修飾されている。
【００６５】
本開示の実施形態によっては、本発明の組成物のAp16又はAp52は、蛍光色素、レポーター分子、造影剤、抗がん剤、ペプチド、又は粒子に結合している。本開示の実施形態によっては、本発明の組成物のAp16又はAp52は酸化鉄磁性粒子に結合している。本開示の実施形態によっては、本発明の組成物のAp16又はAp52はCy3蛍光色素に結合している。
【００６６】
Ap16又はAp52による上記MAGE-A3ペプチド提示細胞のターゲティングは、結合した分子により、検出できる方法が異なる。例えば、蛍光色素(例えばCy3)に結合したAp16又はAp52は、蛍光顕微鏡検査又はフローサイトメトリーアッセイで検出できる。
【００６７】
上記MAGE-A3発現細胞に結合させる本発明の組成物の十分な量は、約100〜1000nMである。すなわち、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000nMであってよい。好ましくは約300〜500nMである。特定の一例において、MAGE-A3発現の検出に使用される上記組成物の量は400nMである。
【００６８】
さらなる態様において、本開示は、MAGE-A3抗原が提示された腫瘍の罹患が疑われる対象を治療する方法を提供する。上記方法は、上記腫瘍の進行を緩和又は寛解するために本発明の組成物の治療的有効量を上記対象に投与する工程を含み、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーは抗がん剤に結合している。
【００６９】
上述の通り、抗がん剤に結合している上記オリゴヌクレオチドアプタマー(例えばAp16又はAp52)を、安定性を増大させるために好適な化学基で修飾してもよい。例えば、上記オリゴヌクレオチドアプタマーをホスホロチオエートキャップで修飾してもよい。
【００７０】
以下に、実施例により、本発明のMAGE-A3ペプチド標的アプタマーの同定、並びにMAGE-A3発現がん細胞のターゲティング及び/又は治療におけるその使用について説明する。以下に記載する実施例は、説明を目的とするのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
実施例
【００７２】
材料及び方法
【００７３】
細胞培養
【００７４】
舌癌細胞株Cal-27(ATCC:CRL-2095)、大腸腺癌細胞株DLD-1(ATCC:CCL-221)、肝細胞癌細胞株HepG2(ATCC:HB-8065)、乳腺癌細胞株MCF-7(ATCC:HTB-22)、及び口腔粘膜線維芽細胞(OMF)を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養した。慢性骨髄性白血病K-562(ATCC:CCL-243)、肺癌細胞株A549(ATCC:CCL-185)、及び膵腺癌細胞株AsPC-1(ATCC:CRL-1682)を、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)で培養した。悪性黒色腫細胞株SK-MEL-28(ATCC:HTB-72)を最小必須培地(MEM)で培養した。上記培地はいずれも、ウシ胎児血清(FBS)10%及び1Xペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを含有するものであった。線維嚢胞性疾患細胞株MCF-10A(ATCC:CRL-10317)を、ウマ血清5%、EGF 20ng/ml、ヒドロコルチゾン0.5mg/ml、コレラ毒素100ng/ml、インスリン20μg/ml、及び1Xペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを含有するDMEMで培養した。正常ヒト表皮メラノサイト初代細胞株HEM-a(ScienCell、米国)を、ポリ-L-リシン被覆T-75フラスコ中、メラノサイト用培地(MelM、ScienCell、米国)で培養した。正常ヒト気管支上皮細胞株BEAS-2B(ATCC:CRL-9609)及び正常ヒト肝上皮細胞株THLE-3(ATCC:CRL-11233)を、フィブロネクチン0.01mg/ml、ウシI型コラーゲン0.03mg/ml、及びウシ血清アルブミン0.01mg/mlを混合してBEBMに溶解したものとともに、被覆T-75フラスコ中においてBEGMで培養した。正常ヒト結腸上皮細胞株FHC(ATCC:CRL-1831)を、HEPES 10mM、ヒドロコルチゾン0.005ng/ml、コレラ毒素10ng/ml、インスリン0.005ng/ml、トランスフェリン0.005mg/ml、及び10%FBSを添加したDMEM/F12培地で培養した。正常ヒト膵上皮様細胞株hTERT-HPNE(ATCC:CRL-4023)を、グルコース非添加DMEM 75%と、M3培地(Medium M3 Base)(FBS 5%、EGF 10ng/ml、D-グルコース5.5mM、及びピューロマイシン750ng/mlを含有)25%と、を用いて培養した。細胞はいずれも37℃の5%CO2湿式チャンバ中で培養し、90%コンフルエントの時点で、トリプシン/EDTA及びトリプシン反応停止液(ScienCell Research Laboratories、米国)を添加して細胞を回収した。
【００７５】
細胞トランスフェクション
【００７６】
GFPタグを有するヒトHLA cDNAクローンHLA I(HLA-A、カタログ番号:RG200661)及びHLA II(HLA-DRB4、カタログ番号:RG202743)をpCMV6-AC-GFPベクターに挿入したものを、OriGene Technologies(米国)から入手した。PureLink(登録商標)HiPure Plasmid Midiprep Kit(Life Technologies、米国)を使用してプラスミドDNAを抽出し、リポフェクタミン(登録商標)3000トランスフェクション試薬(Life Technologies、米国)を使用してK-562細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、FBS10%及びG418 250μg/mlを含有するRPMI 1640中で3日間増殖させ、フローサイトメトリーによる結合アッセイに供した。
【００７７】
共焦点顕微鏡法
【００７８】
共焦点レーザー走査顕微鏡(TCS-SP5-MP-SMD、ライカ)により細胞の画像を取得した。細胞は、8ウェルスライドガラスMillicell EZ SLIDE(メルクミリポア)に播種した。培地は24時間ごとに交換した。培地で2000倍希釈したカルセイン AM(励起波長:488nm、Molecular Probes)を用い、培養用インキュベータ中で細胞の細胞質を30分間染色し、続いて洗浄用バッファーで2回洗浄した。DNA(300nM)にCy3(励起波長:520nm、Molecular Probes)を結合させ、結合用バッファー50μl中で95℃において5分間変性させて、氷上で30分間冷却した。続いて、冷却した結合用バッファー150μlを添加し、得られた混合物を室温でインキュベートした。接着細胞をCy3結合DNA溶液とともに、結合用バッファー全量200μl中で、室温において2時間、60rpmで振とうしながらインキュベートした。得られた細胞を洗浄用バッファー200μlで振とうしながら10分間洗浄することを3回繰り返し、これによって、結合していない細胞を除去した。続いて、3.7%ホルムアルデヒド溶液とともに10分間インキュベートすることによって、細胞を固定した。洗浄用バッファーで3回洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI、励起波長:405nm)で20分間にわたり核染色した。細胞を洗浄用バッファーで3回洗浄した後、共焦点顕微鏡で細胞の蛍光画像を取得した。
【００７９】
イムノブロット分析
【００８０】
12%SDS-PAGEで細胞溶解物を分離し、タンパク質ゲルブロットで抗MAGE-A3 mAb(クローン2F10、OriGene Technologies、米国)及びHRP標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国)を使用してMAGE-A3タンパク質を検出した。免疫反応画像をImageQuant LAS 4000(GE Healthcare Life Sciences、米国)で検出した。
【００８１】
等温滴定熱量測定(ITC)による解離定数(Kd)の測定
【００８２】
DNAとペプチドとの相互作用に関する熱力学的特性の測定を、MicroCal iTC200 (GE Healthcare Life Sciences)で、25℃において、洗浄用バッファー(グルコース0.45%及びMgCl2 5mMを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)中で行った。アプタマー2μl(0.1mM)を150秒間隔で18回連続して注入することにより、未修飾のMAGE-A3111-125ペプチド(0.3mM、200μl)の滴定を行った。得られたデータをMicroCal Origin 7で分析し、one-set-of sites結合モデルでフィッティングして、エンタルピー変化値(ΔH)及び会合定数値(Ka)を得た。
【００８３】
フローサイトメトリー
【００８４】
細胞を、洗浄用バッファー(グルコース0.45%及びMgCl2 5mMを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)で、37℃において2回洗浄した。濃度400nMのCy3結合Ap52アプタマーを、細胞1×106個とともに室温で2時間インキュベートした。細胞を洗浄用バッファー200μlで3回洗浄した後、洗浄用バッファー400μl中に再懸濁した。BD FACSAria IIuフローサイトメーター(BD Biosciences、米国)で50,000個計数することにより、蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析は細胞株1種につき3回実施した。未処理の細胞をコントロールとした。
【００８５】
ヌクレアーゼ耐性アッセイ
【００８６】
アプタマーのヌクレアーゼ耐性をDMEM希釈FBS10%中で37℃においてアッセイした。各アプタマー(すなわち、Ap52、ThioAp52:A*TCCAGAG*TGACGCAGCA-A*GCACTCA*ATATTCC*C-TGGACACG*GTGGCTTAG*T(ここで、*はホスホロチオエート修飾部位)、Cy3結合Ap52、及びCy3結合ThioAp52)を0.5マイクログラムずつ、減圧下で蒸発乾固させ、次いで300mlのFBS10%/DMEMとともに37℃でインキュベートした。0、1、2、6、12、及び24時間後に試料50mlを採取し、-20℃で少なくとも20分間置いた。続いて蒸発乾固させ、次いでゲルローディングバッファー10μl及びオートクレーブ水10μlを添加した。得られた混合物10μlをPAGEに供した。PAGEは、室温で、18%ポリアクリルアミドゲルを使用して0.5X TBEバッファー(Tris-borate-EDTA)中において実施した。ゲルでの分解度をImageJソフトウェアにより分析した。
【００８７】
実施例1  SELEX法によるMAGE-A3標的アプタマーの同定
【００８８】
MAGE-A3を特異的に標的とするオリゴヌクレオチドアプタマーを、SELEX法により選択した。本開示で使用するランダムオリゴヌクレオチドライブラリ及びオリゴヌクレオチドの全て(ビオチン又はCy3と結合させたものを含む)と、ビオチン化結合体とを、Genomics BioSci&Tech(台北、台湾)からオーダーメイドにより入手した。ストレプトアビジン結合磁気ビーズ(Dynabeads(登録商標)My One(商標)ストレプトアビジンC1)をLife Technologiesより購入した。
【００８９】
このランダムオリゴヌクレオチドライブラリを使用して、磁気ビーズ法によりin vitroセレクションを実施した。上記ライブラリは52塩基からなる分子を1015個含むものであった。この52塩基からなる分子はいずれも、その配列中に、ヌクレオチド18個からなる5'末端プライマー(ATCCAGAGTGACGCAGCA、配列番号2)、ヌクレオチド16個からなる中央ランダム領域、及びヌクレオチド18個からなる3'末端プライマー(TGGACACGGTGGCTTAGT、配列番号3)を有する。ストレプトアビジン結合磁気ビーズ10μl(107個)を洗浄用バッファー(グルコース0.45%及びMgCl2 5mMを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)で2回洗浄して、残留する防腐剤及び溶媒を除去した。得られたビーズを、ビオチン化ペプチドMAGE-A3111-125 (RKVAELVHFLLLKYR、配列番号4)とともに、洗浄用バッファー中で室温において1時間、99rpmで撹拌及び振とうしながらインキュベートした。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対するMAGE-A3111-125ペプチドの比率を、総体積100μl中において10:1となるように調節した。得られたビーズを洗浄用バッファーで2回洗浄することにより、非結合ペプチドを除去した。ストレプトアビジンの非結合部位のブロッキングを、ビオチン溶液100μl(1mg/ml)で30分間、上記インキュベーション条件下において行った。得られたペプチドと磁気ビーズの複合体を、結合用バッファー(酵母tRNA 0.01%及びBSA 0.1%を含有する洗浄用バッファー)で3回洗浄して、遊離ビオチン及び過剰なイオン種を除去し、下記選択に供した。
【００９０】
ストレプトアビジン結合磁気ビーズを使用して、非特異的に結合したオリゴヌクレオチドをすべて除去した。残ったオリゴヌクレオチドを分子量カットオフカラム(3,000 MWCO PES、Sartorius)を使用して回収し、室温において真空下で乾燥させ、結合用バッファー50μl中に溶解させて、input ssDNAライブラリとして使用した。
【００９１】
得られたライブラリを95℃において5分間変性させ、氷上で30分間冷却した。ライブラリとMAGE-A3111-125磁気ビーズ複合体との結合反応を、室温において1時間、常に撹拌及び振とうしながら進行させた。DNA-ペプチド-磁気ビーズ複合体を、磁石を用いて採取した。洗浄用バッファー100μlで3回洗浄後、結合したDNAを95℃の純水で溶出させた。続いて、PCRにより、配列番号2の配列を有する5'末端プライマー及び配列番号3の配列を有する3'末端プライマーと、PfuUltra High-Fidelity DNAポリメラーゼ(メルク、台湾)とを使用し、95℃150秒、95℃30秒、56.3℃30秒、72℃30秒、及び72℃180秒のサイクルを10回繰り返して増幅させた。得られたPCR産物(dsDNA)を、続いて行うアンカーPCRにおいて鋳型として使用した。アンカーPCRは、5'末端がビオチンで標識された順方向プライマーを使用して、上述の温度サイクル条件と同じ条件にて実施した。
【００９２】
増幅した反応混合物を合わせた(総500μl)。空のDNA合成カラム(Glen Research、米国)を使用して、増幅ssDNAの5'末端のビオチンを、ストレプトアビジンセファロースビーズ(GE、英国)に結合させて除去した。続いて、溶出させたssDNAを脱塩処理し(NAP-5カラム、GE、英国)、真空乾燥させて、結合用バッファー50μlに再び溶解させた。これにより、次のセレクションで用いるinputライブラリを得た。in vitroセレクションを7回実施した後、溶出させたDNAをPCRで増幅させ、pCR(登録商標)2.1-TOPOベクター(インビトロジェン)にクローニングしてシークエンシングした。
【００９３】
異なる配列が全部で94個得られ、その各々について、MAGE-A3111-125との結合親和性及び特異性を調べた。まず、上述の通り、アンカーPCRによりプラスミドDNAを増幅した。得られたssDNA産物を12%変性PAGEによって精製し、ビオチン化ペプチドMAGE-A3111-125とともにインキュベートした。このビオチン化ペプチドMAGE-A3111-125は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ共存下でのインキュベートによりストレプトアビジンとビオチンとを相互作用させて得た、ペプチド-磁気ビーズ複合体である。上記ペプチドMAGE-A3111-125に特異的に結合した配列を、磁石を用いて単離し、ライブラリセレクションについて説明した部分で記載した手順でさらに精製した。
【００９４】
MAGE-A3111-125に特異的に結合したオリゴヌクレオチドアプタマーを選択して、次の分析に供した。選択したオリゴヌクレオチドアプタマーは、その配列中に、ATCCAGAGTGACGCAGCA(配列番号2)の5'末端プライマー、AGCACTCAATATTCCC(配列番号1)の中央ランダム領域、及びTGGACACGGTGGCTTAGT(配列番号3)の3'末端プライマーを有するものであった。このようなオリゴヌクレオチドアプタマーを、ヌクレオチド52個からなることから「Ap52」と称した。
【００９５】
実施例2  Ap52の特徴の決定
【００９６】
実施例1のAp52のMAGE-A3に対する特異性について、本実施例でさらに検証した。その結果を図1〜6中に示す。図1はAp52のMAGE-A3111-125ペプチドに対する結合特異性を示す。図2〜4はそれぞれ、MAGE-A3ペプチド発現がん細胞に対するAp52のターゲティング選択性を示す。図5及び6は、本発明の実施例1のAp52により認識且つ標的とされたがん細胞におけるMAGE-A3111-125発現部位を示す。
【００９７】
2.1  MAGE-A3111-125ペプチドに対するAp52の特異性
【００９８】
図1から明らかなように、Ap52はMAGE-A3111-125に対して良好な親和性及び特異性を示したが(Ap52で表す群の下に「+」で表すレーン)、NY-ESO-1由来のペプチドに対しては良好な親和性及び特異性を示さなかった(図1参照、レーンN1、N2、及びN3はそれぞれNY-ESO-1のエピトープ87〜111、119〜143、及び157〜170を表す)。この結合活性は配列特異的でもあった。というのは、その隣接領域をATAGGAGTCGACCGACAC(配列番号5)の5'末端プライマー及びGTCTACATCTAAGCTCAT(配列番号6)の3'末端プライマーで変化させたところ、ペプチドが存在しないにも関わらず、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズへの非特異的結合が生じたからである(PBで表す群のレーン)。これより、Ap52がMAGE-A3111-125ペプチドに高い特異性で結合することがわかる。
【００９９】
2.2  MAGE-A3発現がん細胞に対するAp52の特異性
【０１００】
Ap52のMAGE-A3発現がん細胞に対するターゲティングが特異的であるか否かを調べる目的で、本実施例中において、がん細胞株7種とこれらに対応する正常細胞株を使用した。使用したのは、MCF-7(乳腺癌)及びMCF-10A(線維嚢胞性疾患)、SK-MEL-28(悪性黒色腫)及びHEM-a(ヒト表皮メラノサイト初代細胞)、Cal-27(舌癌)及びOMF(口腔粘膜線維芽細胞)、DLD-1(大腸腺癌)及びFHC(結腸上皮細胞)、HepG2(肝細胞癌)及びTHLE-3(肝上皮細胞)、A549(肺癌)及びBEAS-2B(気管支上皮細胞)、並びにAsPC-1(膵腺癌)及びhTERT-HPNE(膵上皮様細胞)である。目的の実験を開始する前に、各がん細胞におけるMAGE-A3の発現をイムノブロット分析によって確認した。図2のデータが示すように、MAGE-A3はがん細胞でのみ発現しており、対応正常細胞ではシグナルが検出されなかった。
【０１０１】
Ap52とMAGE-A3発現細胞との結合を観察しやすくする目的で、Ap52にCy3を結合させ、接着細胞をAp52-Cy3とともにインキュベートして16、24、及び48時間にわたって培養した。細胞は予めカルセインAMで染色しておき、細胞質を可視化した。アプタマーを結合させて洗浄した後、核をDAPIで対比染色した。レーザー走査型共焦点顕微鏡で観察したところ、48時間培養した細胞において明らかなCy3シグナルがみられた。図3に示すように、7種のがん細胞のいずれにおいてもCy3シグナルが観察されたが(SK-MEL-28細胞(図3a)、MCF-7細胞(図3b)、Cal-27細胞(図3c)、DLD-1細胞(図3d)、HepG2細胞(図3e)、A549細胞(図3f)、及びAsPC-1細胞(図3g))、対応正常細胞、つまり非がん細胞で観察されたシグナルはバックグランドレベルであった(HEM-a細胞(図3h)、MCF-10A細胞(図3i)、OMF細胞(図3j)、FHC細胞(図3k)、THLE-3細胞(図3l)、BEAS-2B細胞(図3m)、及びhTERT-HPNE細胞(図3n))。Ap52シグナルの強度は、イムノブロット分析で検出されたMAGE-A3タンパク質レベルとおおよそ対応していた(図2と図3を比較)。
【０１０２】
がん細胞に対するAp52の結合特異性をフローサイトメトリーアッセイによってさらに調べた。図4の流動量データに示すように、Cy3結合Ap52で処理した7種のがん細胞(MCF-7細胞(図4a)、DLD-1細胞(図4b)、HepG2細胞(図4c)、A549細胞(図4d)、SK-MEL-28細胞(図4e)、Cal-27細胞(図4f)、及びAsPC-1(図4g))のいずれにおいても蛍光シグナル(アスタリスク付)が観察され、未処理群では観察されなかった。特にDLD-1細胞(図4b)、SK-MEL-28細胞(図4e)、及びCal-27細胞(図4f)では、その他のがん細胞よりも強い蛍光シグナルが観察された(図2と図4を比較)。蛍光シグナルは、イムノブロット分析で検出されたMAGE-A3タンパク質レベルを反映している。
【０１０３】
これらのデータから、Ap52は、種々のMAGE-A3発現がん細胞に対してターゲティング特異性を有するが、MAGE-A3を発現していない正常細胞、つまり非がん細胞にはターゲティング特異性を有さないことが分かる。
【０１０４】
2.3  Ap52が認識するMAGE-A3111-125の細胞内局在性
【０１０５】
図3中、がん細胞中におけるCy3結合アプタマーのシグナルは、細胞の表面又は周囲に存在しているように観察される。本発明のAp52が認識したMAGE-A3111-125が主に細胞表面に局在していることを確認するため、SK-MEL-28細胞をカルセインAM(細胞質染色、図5a)、DAPI(核染色、図5b)、及びCy3結合アプタマー(図5c)でそれぞれ処理した。合成画像(図5d)から、Cy3結合Ap52によるSK-MEL-28細胞表面のターゲティングは特異的であるが、細胞質や核のターゲティングは特異的でないことがわかる。この結果を、がん細胞株SK-MEL-28についてZ軸に沿って撮影した連続画像を示す図10により確認した。図10は、Cy3結合Ap52が発したシグナルが主に細胞の周囲又は細胞表面全体を覆うように発現していることを示す。
【０１０６】
以上より、Ap52が認識するMAGE-A3111-125はがん細胞の細胞膜上に主に提示されることがわかった。
【０１０７】
2.4  MHC分子によるMAGE-A3ペプチドの提示
【０１０８】
本実施例中において、MHCを有さず全長MAGE-A3タンパク質をはっきりと発現している細胞(すなわちK-562細胞)を使用して、Ap52によるターゲティング特異性を確認した。その結果、Ap52はMAGE-A3111-125ペプチドを特異的に認識したが、完全長タンパク質については特異的には認識しなかった。結果を図6に示す。
【０１０９】
フローサイトメトリー分析の結果、K-562細胞はCy3結合Ap52に結合できないことがわかった(図6)。しかし、この細胞をGFPタグcDNAクローンでトランスフェクションしてMHCタンパク質を一過性に発現させると、Ap52の上記細胞への結合が明らかに観察された(図6c〜6f)。MHCクラスI(すなわちHLA I又はHLA-A)タンパク質とMHCクラスII(すなわちHLA II又はHLA-DRB4)タンパク質のいずれによっても、Cy3-Ap52の上記細胞への結合が有効に誘導された(図6d及び6f参照)。おそらく、上記細胞のMAGE-A3111-125領域にペプチドが提示されていたと考えられる。上記フローサイトメトリー分析の結果を定量したものを表1にまとめる。
【０１１０】
表1 MHCによりMAGE-A3ペプチドが提示された細胞へのAp52の結合
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数値は、50,000個のうちGFP陽性又はGFP及びCy3ともに陽性であったカウントの割合を示す。実験を独立して2回実施した平均値を示す。
【０１１１】
本実施例のデータから、多様なHLA対立遺伝子により細胞表面に提示されたMAGE-A3111-125をAp52が特異的に認識し標的としていることが示される。
【０１１２】
2.5  Ap52の修飾
【０１１３】
生理的液体中におけるDNAの安定性を高める目的で、Ap52の7つ部位をホスホロチオエートで置換して、修飾Ap52(ThioAp52と称する)を作成した。アプタマーのヌクレアーゼ耐性を血清含有培地中で試験した。表2に示すように、未修飾Ap52の量は、6時間後に約20%まで低下し、24時間後には10%まで低下した。一方、ThioAp52は、6時間後及び24時間後それぞれにおいて約50%及び30%が残留していた。Ap52をCy3に結合させることで(Cy3結合Ap52)、24時間アッセイした際のアプタマーの安定性が実質的に改善され、上記2種の修飾が相乗効果を呈したようであった(表2)。以上の結果は、将来的には種々の化学修飾アプタマーを用いた診断及び治療が実現し得ることを示す。
【０１１４】
表2 アプタマー安定性アッセイ
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1数値は、試験培地中に残留するアプタマーの割合を経時的に示す。実験を独立して2回実施した平均値を示す。
2ThioAp52=ホスホロチオエート修飾Ap52。Cy3-Ap52及びCy3-ThioAp52は、Ap52又はThioAp52にCy3を結合させたものを示す。
【０１１５】
実施例2における2.1〜2.5のデータから、Ap52はin vitroにおいてMAGE-A3111-125ペプチドへの結合特異性を呈するだけでなく、MHC分子によりがん細胞の表面に提示されたMAGE-A3111-125ペプチドに対して優れたターゲティング選択性を有することが示された。さらに、こうした実施例データから、Ap52を好適に修飾することにより(すなわち、ホスホロチオエート置換基を付加したり、蛍光色素を結合させたりすることにより)アプタマーの安定性を高めることができることが確認された。
【０１１６】
実施例3  Ap16の特徴の決定
【０１１７】
SELEX法を実施したところ、上記アプタマーの親和性及び特異性は第一に中央ランダム領域による影響を受け、中央ランダム領域の上流及び下流の配列が上記アプタマーの標的認識力を高めている可能性があることがわかった。この結果を受け、中央ランダム領域の呈するMAGE-A3111-125ターゲティング力がAp52の呈するMAGE-A3111-125ターゲティング力と同等であるか否かを評価する目的で、Ap52の中央ランダム領域であるヌクレオチド16個、すなわちAGCACTCAATATTCCC(配列番号1、以下に「Ap16」)について、その結合親和性を分析した。
【０１１８】
3.1  Ap16又はAp52のMAGE-A3111-125に対する結合親和性
【０１１９】
等温滴定熱量測定(ITC)は、2つの分子間の相互作用についてその熱力学的特性を測定する技術である。この技術を用いて、MAGE-A3111-125ペプチドに対するAp16及びAp52それぞれの結合親和性を調べることができる。結果を図7A及び7Bに示す。ペプチドMAGE-A3111-125のAp16に対する結合親和性(図7A)とAp52に対する結合親和性(図7B)との差異は2倍より小さく、解離定数はそれぞれ95nM及び57nMであった。したがって、Ap52及びAp16はいずれも、MAGE-A3111-125ペプチドのターゲティングに有効である。
【０１２０】
3.2  Ap16のがん細胞に対する特異性
【０１２１】
実施例3における3.1の結果を考慮して、悪性黒色腫細胞株SK-MEL-28においてAp16の細胞ターゲティング力をさらに調べた。まず、Ap16をCy3と結合させ、次いでCy3結合Ap16をSK-MEL-28細胞とともに上述の手順でインキュベートした。Cy3の蛍光シグナルを共焦点レーザー走査顕微鏡で追跡することによって、Ap16とSK-MEL-28細胞の相互作用を観察した。図8aに示すように、Cy3結合Ap16はSK-MEL-28細胞ひとつひとつの表面及び周囲に効果的に結合した。Ap16-Cy3シグナルの強度は、Cy3結合Ap52の結合によるもの(データ記載せず)と類似又はそれを上回った。別のオリゴヌクレオチドにおいてヌクレオチド16個からなる領域(配列番号7、以下に「Ap16コントロール」と呼ぶ)をSELEXにより選択し、結合アッセイで検証したところMAGE-A3111-125に結合しなかったので、ネガティブコントロールとして使用した。Cy3結合Ap16コントロールがSK-MEL-28細胞において生成したシグナルは、バックグランドレベルを超えなかった(図8b)。一方、Cy3を結合させたAp16コントロール(図8c)又はAp16コントロール(図8d)とともにインキュベートした正常HEM-a細胞は、蛍光シグナルを生成しなかったことから、Ap16と正常HEM-a細胞は相互作用しないことがわかった。上記結果から、Ap16配列は細胞表面のMAGE-A3111-125ペプチド抗原を特異的に標的とするのに十分且つ重要であることがわかった。
【０１２２】
黒色腫細胞以外の種類のがん細胞についても、Ap16の結合親和性を調べた。その結果を示す図9から、Cy3結合Ap16は、乳がん細胞株MCF-7(図9a)及び口腔がん細胞株Cal-27(図9c)の表面は標的とするが、正常乳房細胞株MCF-10A(図9b)及び正常口腔細胞株OMF(図9d)の表面は標的としていない可能性が確認された。また、SK-MEL-28黒色腫細胞(図10a)及びCal-27口腔がん細胞(図10b)の共焦点顕微鏡画像から、細胞の周囲又は細胞表面全体を覆うように蛍光シグナルを呈した細胞があることが確認された。図11は、図10aの細胞についてZ軸に沿って撮影した連続写真である。写真中の数字は、SK-MEL-28黒色腫細胞を連続的に切断した際の順序を表す。すなわち、Ap52と同様にAp16も、MAGE-A3発現がん細胞に対するターゲティング特異性を呈した。
【０１２３】
上述したように、上記アプタマーの上流配列及び下流配列は上記アプタマーの全構造及び機能に関与している可能性があるため、これらの配列を必須とするケースがある可能性がある。しかし本発明においては、上記データから、Ap16単独又はAp52中央ランダム領域単独でも、MAGE-A3111-125を効果的且つ特異的に標的とするのに十分であることが示された。短いオリゴヌクレオチドが要求される用途においてはAp16が適している場合があり、その場合には、Ap52に代わってAp16が使用される。
【０１２４】
結論として、腫瘍特異的MAGE-A3抗原に対する結合親和性及び特異性を有するAp52及びAp16について、特徴を決定したところ、こうした分子を用いて複数種類のがん細胞をターゲティングできる可能性が確認された。アプタマーが、他の試薬にない利点を有し、他の試薬よりもSELEXスクリーニング用ペプチドを合成しやすいことから、非常に多様なアプタマーを作成して相当数の腫瘍特異的抗原に対応できる可能性がある。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドアプタマーを使用して診断及び/又は治療目的でがん細胞を効果的にターゲティングできる可能性がある。
【０１２５】
実施形態についての上記記載は例を提供するのみであり、当業者による種々の改変が可能である。明細書、実施例、及びデータにより上述した内容は、本発明の実施形態の構造及び使用を包括的に記載するものである。上記に、本発明の多様な実施形態を、1つ以上の実施形態を参照してある程度詳細に記載したが、当業者であれば、本発明の思想や範囲を逸脱することなく、上記に開示する実施形態を様々に変更できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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