(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルイベロマイセス・ラクティス種の酵母ゲノム中に、異種遺伝子として組み込まれた伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のVP2抗原をコードする遺伝子を有し、かつ異種タンパク質としての伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のVP2抗原の発現を可能にする組み換え酵母であって、該組み換え酵母がクルイベロマイセス・ラクティスDSM 25405またはクルイベロマイセス・ラクティスDSM 25407から選択されることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え酵母であって、前記組み換え酵母が、防御的体液性免疫応答の生成のために使用されることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組み換え酵母であって、前記組み換え酵母がサブユニットマーカーワクチンとして使用されることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項４】
請求項３に記載の組み換え酵母であって、前記サブユニットマーカーワクチンが、予防接種された個体と自然感染した個体とを区別するために使用されることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組み換え酵母であって、前記サブユニットマーカーワクチンが、同時に強いアジュバント特性を有することを特徴とする組み換え酵母。
【請求項６】
請求項３から５までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記サブユニットマーカーワクチンが、強い免疫原性を有することを特徴とする組み換え酵母。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記異種遺伝子の組み込みが、追加のベクター配列または選択マーカーなくして行われていることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記異種遺伝子発現が構成的に行われるか、または前記異種遺伝子発現が誘導可能であることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記異種遺伝子発現が、内因性のリポーター遺伝子の発現を介して間接的に定量化できることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記異種遺伝子が、抗原特性を有する異種タンパク質の発現を可能にすることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記組み換え酵母は、異種タンパク質として、配列番号４によるアミノ酸配列を有する伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のVP2-T2Sタンパク質であるか、あるいは配列番号６によるアミノ酸配列を有する伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のoVP2-T2Sタンパク質を、誘導可能または構成的に顕著な量で発現することを特徴とする組み換え酵母。
【請求項１２】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のVP2抗原が、配列番号３の核酸配列によってコードされるか、あるいは配列番号５の核酸配列によってコードされることを特徴とする組み換え酵母。
【請求項１３】
請求項１から１２までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、前記伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のVP2抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）の突然変異されたVP2抗原であり、かつ配列番号４によるアミノ酸配列を有するか、あるいは伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV）のコドン最適化されたVP2抗原であり、かつ配列番号６によるアミノ酸配列を有することを特徴とする組み換え酵母。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項に記載の組み換え酵母であって、皮下的な予防接種のための方法において使用するための組み換え酵母。
【請求項１５】
完全な酵母細胞による皮下的な予防接種のための、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の組み換え酵母を含むワクチン。
【請求項１６】
発現された異種タンパク質に対して防御的体液性免疫応答が生じる、請求項１５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、定義された抗原に対する体液性免疫応答の生成のための組み換え酵母、前記酵母の製造方法ならびに前記酵母の前記抗原を含む病原および悪性細胞に対する防御的予防接種のための使用に関する。
【０００２】
先行技術
ワクチンは、病気を予防するために（予防ワクチン）または確立された病気を治療するために（免疫療法ワクチン）使用される。予防的種痘計画は、過去約１００年において、本質的に感染症を減らすことに貢献している。免疫療法ワクチンは、約２０年前にはじめて開発され、ウイルス、細菌もしくは寄生虫による持続感染に対してまたは発癌性の病気に対して使用されている。種痘の目的は、細胞性免疫応答（すなわち主としてＴ細胞媒介性およびＮＫ細胞媒介性）および／または体液性免疫応答（すなわち主としてＢ細胞／抗体媒介性）の誘発ならびに病原もしくは悪性（腫瘍原性）細胞の抗原成分に対する免疫記憶（「memory」）の誘発である。
【０００３】
古典的なワクチンは、病原体全体を弱毒化（不活性化）もしくは死滅された形で、それらの遺伝物質、ＤＮＡもしくはＲＮＡの形の核酸を含めて含有する。これらの古典的なワクチンは、製造のために、大抵は特定の安全対策および／または実験動物の使用および／または細胞培養の使用を必要とする。更に、前記ワクチンは、しばしば高価であり、かつコールドチェーンを用いて貯蔵および輸送せねばならない。更に、前記ワクチンは、製造由来の物質（例えば実験動物由来または細胞培養由来）が接種された個体に副作用を引き起こすかまたは病原体の不所望な再活性化をもたらす危険をはらんでいる。問題は診断に際しても存在する：ここで、例えば有用動物の種痘の場合には種痘された動物は、自然感染した動物と区別できないので、新規感染の検出を基礎とする早期警戒システムが働かないことがある。従って、いわゆる「サブユニット」ワクチンという、病原体の一部のみを含むものが開発された。そのための前提条件は、その都度の病原体の「主要抗原」が公知であることである。主要抗原は、大抵は、病原体の表面構成成分であって、免疫系によって認識されうるものであり、例えばウイルスエンベロープまたはウイルスキャプシドのタンパク質である。これらは、完全なウイルス粒子が存在しなくても、宿主における該ウイルスに対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答ならびに免疫記憶を誘発しうる。「サブユニットワクチン接種」の場合には従って病原体の典型的な構成成分を欠いているので、鑑別診断によって種痘された個体と自然感染した個体とを区別することができる。従ってそれは「サブユニットマーカーワクチン」とも呼ばれる。多くのサブユニットワクチンの欠点は、しばしば手間と費用のかかる製造と、しばしば不十分な免疫原性である：該病原体自体は効率的に（上述の制限を伴って）培養できる一方で、その主要抗原は、コストがかかり大抵は非効率な方法によって遺伝子工学的に製造せねばならず、手間と費用をかけて精製せねばならない。こうして得られたサブユニットワクチンは、相応して繊細であり、同様にしばしば冷却して貯蔵および輸送せねばならず、耐久性が低い。これらの理由から、大部分の量産ワクチン（Massenimpfstoffe）は、依然として完全な病原体を用いた古典的な原理を基礎としている。例えば、広く知られた家禽の病気である伝染性ファブリキウス嚢病（IBD）に対する殆どのワクチンは、目下、大多数が、伝染性ファブリキウス嚢病のIBDを引き起こすウイルス（IBDV）の弱毒化（弱体化）または不活性化されたウイルスを基礎とするものである。
【０００４】
サブユニットワクチンにおけるより弱い免疫原性の問題は、アジュバントの追加の使用によって補償することが試みられている。アジュバントは、実験的に免疫刺激性であると見なされた物質である。アジュバントは、非特異的にかつしばしばあまり知られていない様式で免疫反応を増強する。今まで、僅かなアジュバントしかヒトへの使用のために許可されていない。例えば米国でヒトへの使用のために許可されている助剤は、アルミニウム塩、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムだけである。アルミニウム塩製剤は、しかしながら関連のワクチンの貯蔵に際して追加の困難を引き起こす。更に、これらのアジュバントは、全ての抗原で十分な作用を発揮しない。
【０００５】
殆どのサブユニットワクチンがそれに該当する異種タンパク質の遺伝子工学的な製造は、種々の宿主細胞において行うことができる。腸内細菌であるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）の他に、細胞培養において増殖させられる哺乳類細胞、植物細胞および種々の菌類を宿主系として確立できる。細菌および菌類などの微生物系は、特に廉価に大規模に培養することができる。酵母の属であるサッカロマイセス（Saccharomyces）、ピチア（Pichia）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）の酵母細胞は、数十年にわたって異種タンパク質の発現のために通常使用されている。酵母細胞は、細菌と比べて、それが真核生物であるという利点を有する。すなわち、酵母細胞は、多くの点で動物細胞と類似しており、かつ真核性タンパク質、すなわち動物細胞において形成されるおよび／または機能的でなければならないタンパク質は、酵母においてネイティブな形またはほぼネイティブな形で廉価に製造できるという利点を有する（Bathurst, 1994; Gellissen & Hollenberg, 1997）。酵母は、まず、異種タンパク質を生産するためだけに使用され、該タンパク質は、酵母細胞から精製されてサブユニットワクチンとして使用される。少し前にはじめて、酵母自体または酵母の細胞分画をワクチンとして投与することが試みられている。
【０００６】
５年ほど前から、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（「パン酵母」、Ｓ．セレビシエ）自体を予防接種のために使用することが試みられている：ここで、皮下的に適用されたＳ．セレビシエの抗原発現細胞によって樹状細胞が活性化され、抗原特異的Ｔ細胞の免疫応答、特に規定の抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞応答が引き起こされうることが証明できた。これらの細胞性免疫応答は、所定の腫瘍細胞の投与に対する防御的なものと見なされる。すなわち、予防接種された動物では、予防接種に引き続き対照動物と比較して僅かな腫瘍しか生じない。この方法は、当時、腫瘍疾患での免疫療法的使用においても試験されている（Stubbs et al., 2001; Lu et al., 2004）。
【０００７】
当業者には、以下の出典は、酵母ベースの予防接種が記載された先行技術から公知である：一連の米国特許、例えば米国特許第20090304741号、同第5830463号および同第10738646号ならびに同第20070166323は、少なくとも１つの組み換え抗原を含むＳ．セレビシエの免疫療法での使用を記載している。これらの酵母は、免疫反応を、特に細胞媒介性の免疫反応を刺激するために有効であることが明らかになった。
【０００８】
WO/2006/044923は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の種々のタンパク質を組み換え的に発現し、かつこのHCVタンパク質に対する免疫反応、とりわけＴ細胞応答を引き起こしうる、慢性Ｃ型肝炎に対するワクチンとして使用されるべき酵母（Ｓ．セレビシエ）を開示している。
【０００９】
WO/2007/092792は、インフルエンザウイルス感染に対する組み換えＳ．セレビシエの使用可能性を記載しており、その際、種々の酵母菌株の組み合わせが用いられ、前記菌株の適用は、Ｔ細胞誘発、つまり細胞性免疫応答をもたらす。
【００１０】
WO/2011/032119は、患者における酵母ベースの免疫療法の作用向上のための方法に関する。該方法は、ＣＤ４＋ ＴＨ１７細胞の産生または生存を改変する酵母ベースの手段を含む。
【００１１】
公開されている特許いずれにおいても、酵母は、感染症または腫瘍に対する防御的体液性免疫応答の誘発（本願の主題）のために明らかに使用されていない。加えて、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエまたはピチア・パストリス（Pichia pastoris）のいずれかが使用されているものの、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）（本願の主題）は使用されていない。
【００１２】
Ｓ．セレビシエと同様に、ここで「乳酵母（Milchhefe）」であるクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ラクティス）も、GRAS（GRAS：一般に安全と認められる（generally regarded as safe））ステータスを有する。すなわちＫ．ラクティスは動物またはヒトでの使用のために適している（van Ooyen et al. 2006）。パン酵母のＳ．セレビシエと形態学的に非常に類似しているにもかかわらず、両方の属の進化系統は、１億年以上も前に共通の前駆体から異なる方向に進化している。従って、Ｋ．ラクティスは、多くの特性においてＳ．セレビシエとは根本的に異なっている。これらの相違点の幾つかは、生物工学的使用における使用可能性にとって非常に重要である。Ｓ．セレビシエの進化は、アルコール発酵に対する代謝の特殊化を伴い、それにより前記前駆体の多くの遺伝子の損失を伴った。そのアルコール発酵は、しかしながら殆どの酵母にとっては一般的ではない。前記アルコール発酵は、Ｓ．セレビシエにおいては、高いグルコース濃度の場合に、酸素が存在してミトコンドリア呼吸が本来、糖転化からの非常に効率の高いエネルギー収支を可能にするときにも行われる：細胞の「発電所」であるミトコンドリアの機能は、「グルコース抑制」によって十分に抑えられる。Ｋ．ラクティスは、ミトコンドリアの機能の調節において、Ｓ．セレビシエとはかなり異なる（Chen and Clark-Walker, 1995、Clark-Walker, 2007）。Ｋ．ラクティスは、Ｓ．セレビシエとは異なり、いわゆる「クラブトリーネガティブ」酵母に属する。かかる酵母は、厳格な好気性条件下で一般にエタノールを形成せず、グルコースをミトコンドリア活性を介してＡＴＰを形成しつつ完全にＣＯ2にまで分解する。この生理学的特性は、根本的な重要性を有する。それというのも、その特性は、大規模な発酵におけるバイオマス収率の明らかな向上をもたらし、これは結果的に、この酵母を組み換えタンパク質の生産者として用いた場合に明らかなコスト削減をもたらすからである。更に、Ｋ．ラクティスでの研究は、ヘキソキナーゼに媒介されるグルコースシグナル経路における突然変異が、異種遺伝子の発現を改善できることを示している（Donnini et al., 2004）。グルコース抑制の低下、特に呼吸系遺伝子によるものは、「クラブトリーネガティブ」酵母の一つの特徴であり、かかる酵母における実験的に観察されるより良好な異種遺伝子発現と関わりがあるかもしれない。
【００１３】
Ｋ．ラクティスとＳ．セレビシエとは、更に、細胞壁グルカンの組成の点でかなりの相違点を有する（Backhaus et al., 2011）；これらの相違点は、おそらくは、糖タンパク質の成熟に関与するゴルジ装置におけるグリコシルトランスフェラーゼの違いに基づくものである：ここで、Ｓ．セレビシエにおける糖タンパク質は、しばしばリン酸マンノースを含有し、Ｋ．ラクティスにおける糖タンパク質は、とりわけ末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する（Raschke and Ballou, 1972）。これらのＳ．セレビシエとＫ．ラクティスとの間の、グリコシル化およびタンパク質分泌における相違点ならびに細胞壁生合成における相違点は、細胞内局在化、フォールディングならびに安定性に対してかなりの影響を及ぼし、従って異種発現された異種タンパク質の免疫原性にもかなりの影響を及ぼす（Uccelletti et al., 2004）と考えられる。
【００１４】
WO/2010/054649は、Ｋ．ラクティスの組み換え系の製造を記載している。そこに示される使用例においては、菌株VAK367-D4から誘導された組み換え菌株が、種々の抗原に対する粘膜的または経口的な予防接種のために使用されている。しかし、経口的／粘膜的な予防接種の欠点は、ワクチンを、防御的免疫化の達成のために大量に使用せねばならないということである。
【００１５】
図面の説明
図１は、IBDVのVP2異種遺伝子を有する接種菌株VAK887をVAK367-D4出発菌株での相同組み換えによって製造することを図示している。IBDV菌株D78のVP2遺伝子を含むプラスミドKlp3-MCS（配列番号１０）の形質転換によって、VP2異種遺伝子は、相同組み換えを介して、URA3遺伝子の挿入によって破壊された染色体のLAC4遺伝子座に導入された。宿主ゲノムへの組み換えに際して、URA3遺伝子はVP2によって置き換わり、LAC4遺伝子が再び回復した；組み換え酵母菌株は、ウラシルを含まないラクトース培地上での選択によって得ることができた。後に、LAC4（β−ガラクトシダーゼ）の発現は、KIGAL80プロモーターにより制御され、VP2遺伝子の発現は、LAC4プロモーターにより制御される。
【００１６】
図２Ａは、菌株VAK887によるIBDVのVP2の発現を、VP2特異的抗体を用いたウェスタン分析によって、本来の菌株（VAK367）と比較して、かつIBDV感染したニワトリ細胞と比較して示している。図２Ｂは、種々のVP2を発現するＫ．ラクティス変異体における組み換えIBDVのVP2もしくは突然変異されたIBDVのVP2-T2Sの発現分析を示している。前記の本来のＫ．ラクティス変異体VP2（VAK887）は、適度な量のウイルスタンパク質しか発現しなかった。VP2タンパク質発現は、菌株Ｋ．ラクティスVP2-T2S（VAK888）において、VP2タンパク質のアミノ酸位置２でのトレオニンをセリンを交換することによって高めることができた。更なる増大は、KlGAL4遺伝子量（VP2-T2S_GAL4=VAK890）の増加もしくは酵母コドンで最適化された合成VP2遺伝子（oVP2-T2S=VAK910）の使用によって達成できた。
【００１７】
図３は、本発明による酵母の９０℃での２時間にわたる熱不活性化が、組み換えVP2-T2Sタンパク質の損失をもたらさないことを示している（図３Ａ）。不活性化されていない酵母、不活性化された酵母および飼料ペレット由来の酵母からのそれぞれ同じタンパク質量をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、IBDVに感染したまたは感染していない家禽細胞からの細胞溶解物と比較して、抗VP2抗体を用いたウェスタンブロットで試験した。図３は、更に、変異体VAK890におけるVP2-T2Sの量が、酵母細胞当たりに約０．７ｆｇの異種タンパク質であることを示している（図３Ｂ）。ここでは、定義された量の精製されたVP2-T2Sが、定義された細胞数の発酵器で培養されたＫ．ラクティス（菌株VAK890）からのVP2と比較してウェスタンブロットで着色され、結果は濃度測定的に評価された。
【００１８】
図４は、マウスにおける、皮下的に適用された熱不活性化されたＫ．ラクティス変異体VAK890の完全な酵母細胞による予防接種を、Ｋ．ラクティス変異体VAK890の完全な酵母細胞での経口的な予防接種と比較して説明している。図４Ａは、免疫化スキームを示している：３回皮下的に免疫化して、それぞれ２週間休止した；比較のために２週間にわたり２回経口投与した。最後の酵母適用の２週間後（矢印）に、処置されたマウスからの血清サンプルを、IBDV特異的ELISA（図４Ｂ）および抗VP2抗体の存在下でのIBDV中和アッセイにおいて試験した（図４Ｃ）。図４Ｄは、VP2を発現するＫ．ラクティス（菌株Kl VP2-T2S_GAL4（VAK890））で処置されたマウスが、Ｋ．ラクティス野生型（菌株VAK367）で処置されたマウスと比較してより高い力価の抗体／中和抗体を有することをまとめている。更に、皮下適用されたＫ．ラクティス（菌株VAK890）が、Ｋ．ラクティス（菌株VAK890）を経口投与したマウスよりも明らかに高い力価の抗体／中和抗体を有することが判明した。Ｋ．ラクティス（菌株890）で経口的に免疫化したマウスは、しかしながら、Ｋ．ラクティス野生型（菌株VAK367）で処置されたマウスと比較して高められた力価の抗体／中和抗体も示した。
【００１９】
図５は、ニワトリにおける熱不活性化されたＫ．ラクティス変異体VP2-T2S_GAL4（VAK890）の完全な酵母細胞での経口的なおよび皮下的な予防接種を示している。経口的な予防接種のためには、短期の１／１／１／１／１のスキーム（１週間経口投与、１週間休止、１週間経口投与など）またはより長期の２／２／２のスキームを使用した（図５Ａ）。予防接種の１週間の休止後もしくは２週間の休止後に、全ての処置された動物に、IBDV（Edgar株）を１動物当たり１００EID50の濃度で感染させた（ウイルス負荷、黒い棒）。経口的な予防接種後に、特に延長された処置スキームの使用により、多くの動物において、高められた力価のウイルス中和抗体が検出できた。それに対して、組み換えＫ．ラクティスでの皮下的な予防接種は、全ての処置された動物において高力価のウイルス中和抗体を生成した（図５Ｂ、Ｃ；IBDV特異的ELISA、IBDV中和アッセイ）。組み換えＫ．ラクティス酵母で処置されたどの動物も、どの処置スキームを使用したかとは無関係にIBDVによる感染後に死ななかった。それに対して、対照群における死亡率は、１０〜３５％であった（図５Ｃ）。処置された動物のファブリキウス嚢における病変の解析は、経口的に処置された動物の約１０％は、延長された処置スキームの使用によりIBDVの接種後にウイルス感染の兆候を有さないことを示した：その場合に、いわゆる「病変スコア」を使用した。スコア１、２は、損傷したファブリキウス嚢を誘発しなかったまたは損傷したファブリキウス嚢を殆ど誘発しなかった；スコア３、４は、損傷したファブリキウス嚢を誘発した、強く損傷したファブリキウス嚢を誘発した。それに対して、組み換えＫ．ラクティス菌株VAK890を皮下的に適用した全ての動物は、IBDVに対して完全なワクチン防御を示した（図５Ｃ）。
【００２０】
図６は、ベクターKlp3-MCS（配列番号１０）の構造を図解している。
【００２１】
本発明の説明
皮下的な予防接種のための組み換え酵母の使用法は、当業者には技術水準から公知である：Stubbs et al., (2001) Nat. Med. 7: 625-629；Stubbs and Wilson (2002) Curr. Opin. Mol. Ther. 4: 35-40；Wansley et al., (2008) Clin. Cancer Res. 14: 4316-4325；US 5,830,463、WO/2006/044923；WO/2007/092792およびWO/2011/032119。前記刊行物の実施例においては、しかしながら、もっぱら酵母のサッカロマイセス・セレビシエで作業されている。「酵母」は、単細胞で増殖する真核性の微生物であって、数億年（Ｓ．セレビシエおよびＫ．ラクティスについては約１億年）にわたる分岐進化に基づき、部分的に非常に様々な特性を有する微生物についての総称である。従って、Ｓ．セレビシエとＫ．ラクティスの、動物またはヒトなどの高等真核生物における予防接種のための使用に際しては、Ｓ．セレビシエによって引き起こされる免疫応答は、Ｋ．ラクティスによって引き起こされる免疫応答とは大きく異なることを前提とすべきである。そのことは、酵母で発現された異種抗原に対する免疫応答についても、酵母固有の抗原に対する免疫応答についても当てはまる。完全なＳ．セレビシエ細胞での皮下的な免疫化に際しては、Ｔ細胞誘導、つまり細胞性免疫応答が生じた。組み換えＳ．セレビシエによる簡単な様式での（すなわち個々の抗原を発現する菌株の直接的な適用による）抗原に対する防御的体液性免疫応答は、今まで技術水準では裏付けられていなかった。
【００２２】
上述の背景から出発して、本発明の課題は、所定の抗原に対する防御的体液性免疫応答を生じうる方法を提供することである。更なる課題は、予防接種された個体と、自然感染した個体とを区別できるサブユニットマーカーワクチンを製造することにあった。更なる課題は、同時に強いアジュバント特性を有し、それにより免疫原性が強いサブユニットマーカーワクチンを製造することにあった。
【００２３】
前記課題は、異種遺伝子を酵母ゲノムへと狙い通りに組み込むことを可能にする酵母ベースの発現系を提供することによって解決された。異種遺伝子を発現する組み換え酵母は、前記系を用いて素早く（すなわち数週間以内）製造できる。酵母は、発酵器において多量に（例えばキログラム（ｋｇ）範囲）廉価に増殖させることができる。制御された発現と流加培養法での発酵によって、細胞毒性抗原も前記の酵母系において発現させることができる。異種遺伝子の発現後に該酵母は熱不活性化され、次いで粉体として冷却することなく貯蔵および輸送することができる。該酵母粉体は、直接的に、つまり更なる分別をせずに、エマルジョンまたはペレット（実施例を参照）としてのいずれかで、サブユニットマーカーワクチンとして使用できる。抗原形成および効果的な、つまり防御的免疫化のために必要なアジュバント効果は、２つの要因：（ｉ）発現される異種タンパク質の狙い通りの遺伝子工学的改変の可能性によって、（ｉｉ）酵母での異種タンパク質の発現と、経口形もしくは皮下形での酵母の直接的な使用によって保証される；その酵母自身は、強いアジュバント効果を有する。皮下的な適用が好ましい。組み換え酵母菌株を製造した；この菌株は、特異的なウイルス抗原を発現し、かつ本発明による方法においては皮下的な予防接種のために使用できる。関連のウイルスによる感染に対する完全な予防的防御を達成した。その際、非常に少量の酵母（例えば家禽での皮下的な使用に際してはミリグラム（ｍｇ）範囲で）しか使用されなかった。この防御を達成するために２〜３回の使用しか必要とされなかった。
【００２４】
本発明による方法は、ヒト医学分野での使用のためにも、獣医学分野での使用のためにも適している。本発明による方法の獣医学分野での使用が好ましい。
【００２５】
本発明による方法は、酵母を用いて実施される。好適な酵母は、例えばサッカロマイセス属の種、ピチア属の種およびクルイベロマイセス属の種の酵母である。好ましい一実施形態においては、本発明による方法は、サッカロマイセス属の種およびクルイベロマイセス属の種の酵母を用いて実施される。その際に特に、サッカロマイセス・セレビシエおよびクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ラクティス）の使用が好ましい。
【００２６】
最も好ましい実施形態においては、本発明による方法は、酵母のクルイベロマイセス・ラクティスを用いて実施される。
【００２７】
酵母のＫ．ラクティスは、GRASステータス（GRAS：一般に安全と認められる）を有する、いわゆる「食用（food grade）」の酵母に該当する。食品添加物として何千年にわたり試され有効であると実証されているパン酵母と同様に、乳製品でしばしば代表される酵母であるＫ．ラクティスも食品産業にとって心配ないものと見なされている。
【００２８】
「先行技術」で説明された発酵についての可能性の他に、酵母のＫ．ラクティスは、Ｓ．セレビシエに対して、異種遺伝子の発現に関して数多くの利点を有する。Ｋ．ラクティスは、いわゆる「プチットネガティブ（petite negative）」酵母に該当する。すなわち、ミトコンドリアＤＮＡの損失は致死的である（ミトコンドリア膜電位の崩壊に基づく（Chen et al., 1995；Clark-Walker, 2007））。該ミトコンドリア機能は、Ｃａ2+依存性シグナル伝達、反応性酸素化合物の産生、細胞のストレス応答、タンパク質グリコシル化および細胞壁完全性と密接に関連している。それにより、ミトコンドリア機能は、組み換え糖タンパク質の産生と細胞壁の組成に決定的な影響を及ぼす。
【００２９】
酵母と哺乳類の場合に、小胞体で行われるタンパク質のＮ−グリコシル化の第一工程は同じである。しかしながら、ゴルジ装置で行われる工程は互いに相違している。ゴルジ装置に存在するグリコシルトランスフェラーゼは、種々の酵母種において異なっている。それによって、細胞壁における糖タンパク質の組成における相違がもたらされる。Ｋ．ラクティスにおいて、該糖タンパク質は、Ｓ．セレビシエでのリン酸マンノースに対して、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有する（Raschke und Ballou, 1972）。それは、予防接種に際して、その都度の酵母種による免疫系の刺激に対してかなりの影響を及ぼしうる。
【００３０】
改変されたα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼを有するＫ．ラクティス突然変異体（KlOCH1）における組み換えタンパク質の改善された分泌は、タンパク質グリコシル化／分泌および細胞壁生合成の間の関係性を明らかにする（Uccelletti et al., 2004）。タンパク質グリコシル化における改変は、更に、組み換えタンパク質の細胞内局在化に影響を及ぼし、該タンパク質は、誤ったフォールディングに基づき分泌経路に留まる。
【００３１】
Ｋ．ラクティスは、ラクトースを炭素源およびエネルギー源として使用できる僅かな酵母種の一つである。ラクトースは安い糖であり、ホエイの成分として多量に（例えば酪農業での副産物として）生ずる。Ｋ．ラクティスは、ラクトースを用いて、グルコースを用いたのと同様の成長速度を達成できる。ラクトース代謝に関与する遺伝子の調節は、集中的に調査されている。強力なβ−ガラクトシダーゼプロモーター（LAC4）は、異種遺伝子の発現の調節および組み換えタンパク質の産生の調節のために用いることができる（van Ooyen et al., 2006、Breunig et al., 2000）。低減されたグルコース抑制に基づき、グルコース含有培地で培養されたＫ．ラクティス培養における遺伝子の異種発現は、素早くかつ効率的にラクトースの添加によって誘導できる。
【００３２】
本発明によれば、遺伝子工学的方法を介して、Ｋ．ラクティス株、好ましくはVAK367-D4およびこの菌株の変異体であって、酵母ゲノムのLAC4座での異種遺伝子の狙い通りの組み込みを可能にする株が製造された（図１）。この組み込みは、相応して構築されたプラスミドを介して一工程だけしか必要とされない；組み換え菌株の選択は、抗生物質耐性遺伝子の使用なくして可能であり、かつ組み換え菌株における異種遺伝子発現は、LAC4プロモーターを介して培地へのラクトースの添加によって誘導できる。異種遺伝子が組み込まれたＫ．ラクティス細胞は、この方法を介して数週間で生成でき、かつ特性決定できる。この系の２つの態様が大きな重要性を有する：一方では、ここで、それぞれ定義された量の異種タンパク質を含有する酵母細胞の再現可能な培養が可能である（図２、３）。他方では、可塑性（容易に改変可能な）抗原（例えばインフルエンザ抗原のヘマグルチニンなど）に対する予防接種のために使用する場合に、新規の酵母菌株を、例えば潜在的に汎流行的な新規のインフルエンザウイルス株が発生したときに短時間で生成できる。その場合に、新たに発生した組み換えＫ．ラクティスが、試されてきた菌株（例えば発酵器における増殖挙動に関して）と同様の特性を有する可能性は高い。KlGal4トランスアクチベーターの遺伝子の酵母ゲノムへの追加の組み込みによって、更に、異種遺伝子の発現率は大きく高めることができる（Kuger et al., 1990）。
【００３３】
更なる一実施形態においては、本発明による方法は、特定のＫ．ラクティス株VAK367-D4およびその子孫を用いて実施される。Ｋ．ラクティス株VAK367-D4を基礎とする一連の（VAK）組み換え変異体が生成された。一般に、これらの変異体は、誘導可能にかなりの量の異種タンパク質を発現し、またはこの異種タンパク質のドメインもしくはこの異種タンパク質のドメインと異種タンパク質ドメインと融合されたものを発現する。その場合に使用される異種タンパク質ドメインは、免疫応答の狙い通りの刺激（アジュバント）もしくは発現された異種タンパク質の酵母細胞における狙い通りの区画化に用いられる。アジュバント作用の他に、発現された異種タンパク質の区画化は、発現の最適化もしくは発現産物の形成（Formulierung）のために重要である。
【００３４】
更なる一実施形態においては、本発明による方法は、サブユニットマーカーワクチンとしての使用において、VAK367-D4およびその子孫を用いて実施される。定義されたタンパク質抗原（異種タンパク質）のみを発現する組み換えＫ．ラクティスのワクチンとしての使用は、鑑別診断において、予防接種された個体と自然感染した個体との区別を可能にする。前記の組み換えＫ．ラクティス株（実施例を参照）の一つは、経口的接種および皮下的接種のために効果的に使用された。皮下的な使用の場合には、被予防接種体は完全な防御を獲得した。
【００３５】
本発明の範囲における「異種タンパク質」とは、防御的免疫応答、好ましくは防御的体液性免疫応答を、ヒトまたは動物において、病原または癌原性に変質した細胞に対して生成するのに適したあらゆるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を意味する。異種タンパク質は、防御的免疫応答、好ましくは防御的体液性免疫応答をただ誘発できる抗原が特徴付けられたあらゆる種類の病原体または腫瘍に由来しうる。好ましい一実施形態においては、異種タンパク質は、防御的免疫応答、好ましくは防御的体液性免疫応答をただ誘発できる抗原が特徴付けられた病原体（ウイルス、細菌、寄生虫）に由来しうる。
【００３６】
それらの異種タンパク質は、例えば
寄生虫に由来する異種タンパク質
アメリカ鉤虫；ズビニ鉤虫：ＡＳＰタンパク質、ヘモグロビン分解性プロテアーゼ
リーシュマニア：ｇｐ６３、４６ｋＤのプロマスチゴート抗原、ＬＡＣＫ
プラスモジウム：ＣＳＰタンパク質、ＣＳＡ−１、ＣＳＡ−３、ＥＸＰ１、ＳＳＰ２、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＡＭＡ−１、ＧＬＵＲＰ、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、Ｐｖｓ２５、Ｐｖｓ２８、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０
住血吸虫：ＴＰ１、Ｓｍ２３、ＳｈＧＳＴｓ２６および２８、パラミオシン、寄生虫ミオシン、Ｓｍ１４
細菌に由来する異種タンパク質
マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobakterium tuberculosis）：Ａｇ８５Ａ、Ｈｓｐ６５、Ｒ８３０７、１９ｋＤ、４５ｋＤ、１０．４
ヘリコバクター・ピロリ（Heliobacter pylori）：ＶａｃＡ、ＬａｇＡ、ＮＡＰ、ｈｓｐ、ウレアーゼ、カタラーゼ
Ａ群ストレプトコッカス（Strepptococcus）：Ｍ、ＳＣＰＡペプチダーゼ、エキソトキシンＳＰＥＡおよびＳＰＥＣ、フィブロネクチン結合タンパク質
ストレプトコッカス・ニューモニア（Strepptococcus pneumonia）：ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、ＢＨＶ３、ＢＨＶ４
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）：Ｖｉ抗原
シゲラ（Shigella）：ＬＰＳ
ビブリオ・コレラ（Vibrio Cholera）：ＣＴＢ
エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＥＴＥＣ：ＬＴ、ＬＴ−ＳＴ、ＣＴＢ
エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）：Ｆ１、Ｖ
腫瘍細胞／腫瘍に由来する異種タンパク質（腫瘍関連抗原、ＴＡＡ）
ＣＥＡ
５Ｔ４
ＭＵＣ１
ＭＡＲＴ１
ＨＥＲ−２
である。
【００３７】
特に、ウイルスに由来する異種タンパク質
カリシウイルス科（ノーウォーク、ＨＥＶ）：ＮＶ６０ｋＤ；ＨＥＶ ＯＲＦ２
レオウイルス科（ロタ）：ＶＰ７、ＶＰ４
レトロウイルス科（ＨＩＶ）：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｅｎｖ、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ４１
フラビウイルス科（フラビウイルス属：ＷＮＶ、デング、ＹＦ、ＴＢＥ、ＪＥＶ）：ｐｒｅＭ−Ｅｎｖ、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５
フラビウイルス科（ペスチウイルス属ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶ、ＢＤＶ、ヘパシウイルス属ＨＣＶ）：Ｅ１、Ｅ２、ＥRNS（ペスチ）、Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５
ヘパドナウイルス科（ＨＢＶ）：ＨＢＳ抗原
パラミクソウイルス科（パラミクソウイルス亜科：ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ムンプス、センダイ、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−４、はしか）：Ｍ、ＨＮ、Ｎ、Ｆ
パラミクソウイルス科（ニューモウイルス亜科：ＲＳＶ）：Ｆ、Ｇ、ＳＨ、Ｍ
ラブドウイルス科（狂犬病）：Ｇ
ヘルペスウイルス科（ＥＢＶ、ＨＳＶ２）：ｇｐ３５０／２２０（ＥＢＶ）、ｇＢ２、ｇＤ２（ＨＳＶ）
コロナウイルス科（ＳＡＲＳ）：ＣｏＶ、Ｎ、Ｍ、Ｓ
オルトミクソウイルス科（インフルエンザＡ、Ｂ）：ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ
パピローマウイルス科：Ｌ２、Ｅ６、Ｅ７
が好ましい。
【００３８】
最も好ましい本発明の実施形態においては、前記異種タンパク質は、ビルナウイルス科、例えばＩＢＤウイルスなどの代表的なウイルスに由来し、前記タンパク質は、防御的免疫応答、好ましくは防御的体液性免疫応答を誘発できる。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態においては、Ｋ．ラクティスVAK367-D4変異体VP2（VAK887）であって、異種タンパク質として伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV菌株D78）のキャプシド形成性のVP2抗原を発現する変異体が作製された（配列番号１および２）。特に、Ｋ．ラクティスVAK367-D4変異体VP2-T2S（VAK888）であって、VP2タンパク質がアミノ酸位置２で突然変異された、配列番号３および４によるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を有する変異体（トレオニンをセリンに交換；Jagadish et al.(1991)）が好ましい。
【００４０】
特に好ましい本発明の一実施形態においては、最適化されたＫ．ラクティスVAK367-D4変異体VP2T2S_GAL4であって、VP2タンパク質がアミノ酸位置２で突然変異された（配列番号３および４）、追加的に少なくとも２つのKlGAL4遺伝子を含む変異体（VAK890）が作製された。特に、Ｋ．ラクティスVAK367-D4変異体oVP2-T2Sであって、突然変異されたVP2抗原が酵母コドンで最適化された配列番号５の核酸配列によってコードされた、もしくは組み換え発現された突然変異されたVP2抗原が配列番号６によるアミノ酸配列を有する変異体が好ましい。最適化されたＫ．ラクティスoVP2-T2S_GAL4変異体（VAK911）は、以下の利点：
−  突然変異によって異種タンパク質が更に安定化された
−  トランスアクチベーターの過剰発現および／または配列のコドン最適化によって、VP2発現の明らかな増加が達成できた（図２）
−  追加のKlGAL4遺伝子の組み込みは、このＫ．ラクティス変異体のより高い増殖速度とも相関した
−  このＫ．ラクティス変異体は、高細胞密度発酵および発現されたVP2タンパク質の量における特に高い再現性を有する（図３）
を有する。
【００４１】
本発明により作製されたＫ．ラクティスVP2-T2S_GAL4変異体であって、異種タンパク質としてIBDVの突然変異されたVP2抗原が組み換え的に発現され、かつKlGAL4トランスアクチベーター遺伝子の更なるコピーを含む変異体（VAK890）は、２０１１年１１月２９日に、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Deutschland）にブタペスト条約に応じてDSM 25405の番号で寄託された。
【００４２】
本発明により作製されたＫ．ラクティスoVP2-T2S変異体であって、異種タンパク質としてIBDVの突然変異されコドン最適化されたVP2抗原が組み換え的に発現される変異体（VAK910）は、２０１１年１１月２９日に、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Deutschland）にブタペスト条約に応じてDSM 25406の番号で寄託された。
【００４３】
本発明により作製されたＫ．ラクティスoVP-T2S変異体であって、異種タンパク質としてIBDVの突然変異され、コドン最適化されたVP2抗原が組み換え的に発現され、かつKlGAL4トランスアクチベーター遺伝子の更なるコピーを含む変異体（VAK911）は、２０１１年１１月２９日に、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Deutschland）にブタペスト条約に応じてDSM 25407の番号で寄託された。
【００４４】
更なる一実施形態は、本発明による組み換え酵母を、防御的免疫化、特に防御的体液性免疫化の生成のための方法において用いる使用に関する。かかる方法は、以下の工程：
ａ）本発明による組み換え酵母を培養および増殖させる工程、
ｂ）酵母を回収し、不活性化させる工程、
ｃ）組み換え酵母を決められた免疫化スキームに従って適用する工程、
ｄ）形成された抗体の力価を測定する工程、および／または
ｅ）免疫化を検証する工程
を含む。
【００４５】
本発明による組み換え酵母の培養および増殖は、通常利用可能なあらゆる方法で行うことができる。その場合に、廉価に高い細胞収率がもたらされる方法が特に好ましい。それに当てはまるのは、発酵法、特に高細胞密度発酵の方法である。前記の発酵を、流加培養プロトコールを使用して実施することが特に好ましいと見なされる。
【００４６】
好ましい一実施形態においては、前記の防御的体液性免疫化は、前記の組み換え酵母を経口的に／経粘膜的にまたは皮下的に適用することによって達成される。本発明の特に好ましい一実施形態においては、前記の組み換え酵母は、皮下的に適用される。本発明によれば、Ｋ．ラクティス、特に遺伝子工学的に改変された変異体VAK367-D4およびそれから誘導された変異体VAK890およびその変異体を、皮下的な適用のために用いる使用が特に好ましい。
【００４７】
前記組み換え酵母細胞は、本発明による方法において、不活性化させて／死滅させて使用すべきである。そのためには、前記酵母は、培養および異種遺伝子の発現の後に乾燥させ、引き続き不活性化される。不活性化は、あらゆる通常利用可能なあらゆる方法で実施できる。本発明による方法で使用するのに適しているのは、熱不活性化（例えば９０℃で２時間にわたる熱不活性化）である。
【００４８】
経口的な／経粘膜的な予防接種のためには、例えば短期の１／１／１／１／１の免疫化スキーム（１週間経口投与、１週間休止、１週間経口投与など）またはより長期の２／２／２のスキーム（２週間経口投与、２週間休止、２週間経口投与など）を使用することができる。皮下的な予防接種のためには、例えば２回または３回の使用を、それぞれ２週間の間隔で使用することができる（図４および図５）。
【００４９】
行われた免疫化の検証のために、あらゆる通常の方法が提供される。本発明の一実施形態においては、前記の免疫化の検出のためには、ウイルスを中和する抗体の力価が試験される。そのために、例えば特定のELISA試験または中和アッセイを実施できる。該中和アッセイにおいては、定義された数のIBDウイルスに、免疫化された動物または対照動物の定義された量の血清が加えられる。その後に、感染の阻害（中和）については、こうして処理されたウイルスによって細胞培養において試験される。免疫化に成功したかどうかは、「負荷」実験においても、例えば「ウイルス負荷」実験においても調べることができる。そのために、処置された動物に、通常は免役されていない動物の場合に病気が引き起こされるであろう病原の微生物またはウイルスの用量が与えられる。かかる負荷後に動物の病気が起こらないときには、免疫化が成功したことの立証がもたらされる（図５）。最後に、免疫化の検証は、免疫組織化学によってももたらすことができる。その場合に、前記の負荷後に、病原の目的臓器は、感染または病変に基づいて調査される（図５）。
【００５０】
本発明によれば、それぞれVAK367-D4から誘導された組み換えＫ．ラクティス変異体は、皮下的な適用による予防接種のために効果的に使用できることが示された。実施例において挙げられる変異体株VAK890は、伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV；D78株）のVP2抗原を発現する。IBDVのVP2は、ウイルスキャプシド形成性タンパク質である。VP2については、この抗原に対する体液性免疫応答が十分に引き起こされて、感染された生物が予防的に関連のウイルス（IBDV）による後の感染に対して防御されることが知られている。有効な体液性免疫応答の惹起は、一方ではウイルスを中和する抗体の定量化を介して誘発できた。他方で、防御的免疫応答の検証は、「ウイルス負荷実験」およびウイルス負荷後の免疫組織化学を介して導かれた。本発明によれば、ここで組み換えＫ．ラクティスもしくはVAK367-D4株から出発する組み換えＫ．ラクティスは、皮下的な使用において、効果的に作用する、すなわち９０〜１００％までの防御的なワクチン（９０〜１００％は、予防接種における「ゴールドスタンダード（Gold-Standard）」に相当する）として確立できた（図４および図５）。組み換えＫ．ラクティスもしくはVAK367-D4から出発する組み換えＫ．ラクティスは、従って感染病原体、例えばウイルスなどの病原体に対する「サブユニット」マーカーワクチンとして確立された。すなわち、抗原としては、ウイルスの個々の免疫原性タンパク質サブユニットを使用した。「サブユニット」マーカーワクチンとしての使用は、その使用が予防接種された生物と予防接種されていない感染した生物との区別を可能にすることを暗示する。そのことは、例えば予防接種のために使用される抗原に対する抗体も、感染病原体の更なる抗原に対する抗体も検出する鑑別診断法の使用により可能である。VAK367-D4株から出発する組み換えＫ．ラクティス株VAK890（DSM 25405）での免疫化によって、相応のウイルス抗原に対して高い抗体力価を生成できた。これらの抗体については、それらがウイルス中和性であると示すことができた。既にこの特性と測定された高い力価によって、経験的に、この体液性免疫応答が、生物を関連のウイルスでの後の感染から防御するために十分であると導き出すことができる。最終的な裏付けは、IBDVについてもたらすことができた。生成されたウイルス中和抗体の高い力価は、ニワトリモデルにおいて、後のウイルス感染に対する予防接種された動物の完全な防御と相関した（図５）。Ｋ．ラクティス、特に遺伝子工学的に改変された変異体VAK367-D4およびその子孫、例えばＫ．ラクティスVP2-T2S_GAL4（VAK890）の使用は、従来の方法に対する以下の本質的な利点を有する：
１．異種遺伝子発現に使用するためには、Ｋ．ラクティスは、Ｓ．セレビシエと比べて、何百万年にもわたりＳ．セレビシエから多様化しているＫ．ラクティスの生理学によるものである本質的な基本的な利点を有する。
【００５１】
２．異種遺伝子の発現は、プラスミドベクターを介して行われずに、該異種遺伝子をＫ．ラクティスゲノムの定義された遺伝子座に狙い通りにかつ安定的に組み込むことにより行われる。そのことは、非選択的な条件下でのタンパク質発現の高い再現性を可能にする。この観点は、発酵器で酵母株を培養することによってワクチンを再現的に生成するために必須である。菌株VAK367-D4およびその子孫の原理は、既に経口的な予防接種について記載されている（WO 20101054649 A2）。本発明においては、菌株VAK367-D4およびその子孫、特にＫ．ラクティスVP2-T2S_GAL4（VAK890）およびoVP2-T2S_GAL4（VAK911）は、皮下的な予防接種において、本質的により少ない酵母量を使用しつつウイルス感染に際しての効果的な防御をもたらすことが示されている。
【００５２】
３．遺伝子発現は、誘導でき、かつ転写アクチベーターGal4の濃度の増大および／または酵母宿主への適合において異種遺伝子のヌクレオチド配列のコドン最適化によって更に高めることができる。流加培養発酵プロトコールの確立は、細胞毒性抗原の効率的な産生を可能にする。
【００５３】
４．VAK367-D4およびその子孫への異種遺伝子の組み込みは、「１ステップ法」である。すなわち、約３週間で、新たな組み換え菌株が作製されて特性決定できる；そのことは、改変されたウイルス変異体に対する効果的なワクチンの迅速な開発のために特に重要である。
【００５４】
５．Ｋ．ラクティスのタイプの組み換え酵母、特に菌株VAK367-D4およびその子孫の組み換え酵母の皮下的な投与によって、マウスにおいても、ニワトリにおいても、防御的な免疫応答を作製できた。該方法は非常に簡単である：不活性化された（熱で死滅された）酵母細胞の定義された量を、被予防接種体に２〜３回の方法で皮下に注入する。最後の使用の２週間後に、被予防接種体の血清を、抗原特異的抗体の存在および機能性に基づき調査する。ウイルス中和試験によって、この免疫応答が、主として、中和抗体の生成のみに基づかないものである（防御的体液性免疫応答）ことを立証できた。従って、Ｋ．ラクティスによって皮下的な使用で誘導できる免疫応答は、根本的に、とりわけＴ細胞応答を誘導するＳ．セレビシエによって誘導可能な免疫応答とは異なる。従って、Ｋ．ラクティスの皮下的な使用の可能性は、基本的に、Ｓ．セレビシエの皮下的な使用の可能性とは別である：Ｋ．ラクティスは、防御的体液性免疫応答を生じうる抗原の場合のサブユニットワクチンとして使用できる（例えばウイルス抗原、例えば伝染性ファブリキウス嚢病のウイルスIBDVのVP2抗原またはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA抗原）が、一方で、Ｓ．セレビシエは、防御的細胞性免疫応答を生じうる抗原の場合のサブユニットワクチンとして使用できる（例えばＣ型肝炎ウイルスのNS3タンパク質またはHer-2などの腫瘍抗原の場合）。誘導された免疫応答の形における前記の相違は、おそらく上述したＳ．セレビシエとＫ．ラクティスの細胞の大きく異なる特性に起因しうる。
【００５５】
まとめると、本発明は、先行技術に対して広範囲に寄与し、先行技術に対する数多くの好ましい実施形態を提供する：
・  本発明者は、予防接種された個体と自然感染された個体とを区別できるサブユニットマーカーワクチンを製造することに成功している
・  更に、同時に強いアジュバント特性を有し、それにより免疫原性が強いサブユニットマーカーワクチンを製造できる
・  本発明によるサブユニットマーカーワクチンは、何度も使用できる
・  本発明によるサブユニットマーカーワクチンは、被予防接種体において全身性の防御的免疫応答および免疫学的記憶を生ずる
・  本発明により、細胞毒性抗原に対するワクチンを製造することも可能である
・  本発明による方法は、新規のワクチン変異体のできるだけ迅速な生成を可能にする
・  予防接種法は、特に非常に廉価である
・  本発明によるワクチンの製造のために、実験動物は必要なく、または培養において動物もしくはヒトの細胞の使用が必要である
・  本発明によるワクチンは、温度感受性でなく、冷却せずに輸送および貯蔵することができる
・  本発明による方法では、生きている組み換え細胞または生物は使用されない
・  本発明による方法を用いて、使用されるワクチンの量も、防御的免疫化の達成に必要な使用数も、最低の水準に制限できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、IBDVのVP2異種遺伝子を有する接種菌株をVAK367-D4出発菌株での相同組み換えによって製造することを図示している。
【図２】図２のＡは、菌株VAK887によるIBDVのVP2の発現を、VP2特異的抗体を用いたウェスタン分析によって、本来の菌株（VAK367）と比較して、かつIBDV感染したニワトリ細胞と比較して示しており、図２のＢは、種々のVP2を発現するＫ．ラクティス変異体における組み換えIBDVのVP2もしくは突然変異されたIBDVのVP2-T2Sの発現分析を示している。
【図３】図３のＡは、本発明による酵母の９０℃での２時間にわたる熱不活性化が、組み換えVP2-T2Sタンパク質の損失をもたらさないことを示しており、図３のＢは、変異体VAK890におけるVP2-T2Sの量が、酵母細胞当たりに約０．７ｇの異種タンパク質であることを示している。
【図４】図４は、マウスにおける、皮下的に適用された熱不活性化されたＫ．ラクティス変異体VAK890の完全な酵母細胞による予防接種を、Ｋ．ラクティス変異体VAK890の完全な酵母細胞での経口的な予防接種と比較して説明している。
【図５】図５は、ニワトリにおける熱不活性化されたＫ．ラクティス変異体VP2-T2S_GAL4（VAK890）の完全な酵母細胞での経口的なおよび皮下的な予防接種を示している。
【図６】図６は、ベクターKlp3-MCS（配列番号１０）の構造を図解している。
【００５７】
実施例
１．Ｋ．ラクティス菌株VAK367-D4（metA ura3-5 lac4::ScURA3）の作製。
【００５８】
異種タンパク質の異種発現のための出発菌株VAK367は、以下の特性を有する：前記菌株は、高い細胞密度までの培養を、その際に細胞内タンパク質が検出可能なほど遊離させずに可能にする。その点で、前記菌株は、使用される多くの近縁のＫ．ラクティス菌株とは異なる。菌株VAK367は、二回の突然変異誘発によって菌株CBS2359（Centraalbureau voor Schimmeicultures http://www.fungalbiodiversitycentre.com）から導かれ、アミノ酸のメチオニンとヌクレオベースのウラシルについて栄養要求性である。菌株VAK367から、遺伝子工学的手法によって菌株VAK367-D4（２００９年１１月１８日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）（Braunschweig）で寄託番号DSM23097として寄託された）は、プラスミドpD4-2を用いてLAC4遺伝子の＋３５８〜＋１１８１の配列をScURA3遺伝子によって置き換えることで導かれた。菌株VAK367-D4は、ここで追加のマーカーなくしてLAC4座での異種遺伝子の組み込みを、ラクトース増殖について選択することによって可能にする。その場合に、好適な組み込みベクター、例えばKlp3-MCS（図６）を使用する場合に、相同組み換えによって、分解カセットを、ScURA3マーカーの損失下にインタクトなLAC4遺伝子が再構築されるように交換する（図１）。
【００５９】
２．異種遺伝子の誘導可能な発現を可能にする組み込みベクターの作製（ベクター：Klp3-MCS）
ベクター：Klp3-MCS（配列番号１０）
ベクターKlp3-MCS（配列番号１０）（図６）は、YRp7をベースとするＥ．コリベクターであって、ARS1配列を欠失しているため酵母において自己複製できないベクターである。Klp3-MCS（配列番号１０）は、Ｋ．ラクティスのLAC4プロモーターと、LAC4座での組み込みを相同組み換えによって可能にする配列とを含む。
【００６０】
LAC4プロモーターと転写開始との間に、TEF1ターミネーターとKlGAL80プロモーターとを含むＤＮＡ断片を挿入した。それにより、LAC4読み枠は、相同組み換えによる再構築後にKlGAL80プロモーターの制御下に発現されうる。KlGAL80プロモーターは、転写因子KlGal4を介してLAC4プロモーターで同時に調節される（Zenke et al. 1933）。この構築は、LAC4にコードされるβ−ガラクトシダーゼの測定を介して、異種遺伝子発現の誘導を追跡できる。Klp3-MCS（配列番号１０）は、異種遺伝子の挿入を、LAC4プロモーターおよびTEF1ターミネーターとの間で、マルチクローニングサイト（MCS）におけるユニークな切断部位の一つを介して可能にする（図６）。組み込みのために、得られたプラスミドを適切な制限酵素で消化し、発現カセットとＥ．コリベクター配列とを分離する。Ｋ．ラクティスVAK367-D4における形質転換の後に、該発現カセットは染色体に組み込まれる；得られた菌株は、細菌性配列を含まない。
【００６１】
３．伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV変異体D78）のVP2抗原を発現するＫ．ラクティス変異体
組み換え酵母菌株の製造
IBDVのD78 VP2をコードするｃＤＮＡを、プラスミドpD78A（Icard et al., 2008）から以下のオリゴヌクレオチド：
AscI制限切断部位を含むIBDV_AscI_fwd（5'-GGCGCGCCGATGACAAACCTGCAAGATC-3'）（配列番号７）、および
NotI制限切断部位を含むVP2_NotI_rev（5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCACACAGCTATCCTCCTTATG-3'）（配列番号８）
を用いて増幅させた。
【００６２】
VP2-T2Sの作製のために、以下のオリゴヌクレオチド対：
IBDV_S:T_AscI_fwd（5'-GGCGCGCCGATGTCTAACCTGCAAGATCAAACCCA-3'）（配列番号９）、および
VP2_NotI_rev（前記参照）
を使用した。
【００６３】
こうして増幅されたＤＮＡ断片を、ヌクレオチド配列の検査および確認の後に、AscIおよびNotI切断部位を介してベクターKlp3-MCS（配列番号１０）（図６）にクローニングした。次いでゲノムへの組み込みを行った（図１）。詳細には、組み込みプラスミドを制限酵素EcoRIで消化し、消化された断片をコンピテントなVAK367-D4細胞に形質転換させた。形質転換された細胞を、YEPD培地にプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーを見つけるために、該形質転換プレートを、炭素源としてラクトースを含有するＳＭ培地に複製し、３０℃で２日間インキュベートした。この方法で同定された陽性クローンを更に調査した。
【００６４】
追加のKlGAL4遺伝子コピーのゲノム組み込みは、慣用の方法により実施した（Kuger et al.(1990)）。コドン最適化は、サッカロマイセス・セレビシエアルゴリズム（mr.gene.com, Raab et al., 2010）に従った。コドン最適化されたＤＮＡ断片を直接合成した。その合成に際して、5' AscIおよび3' NotI制限切断部位は既に消化されている（mr.gene.com, Regensburg, Deutschland）。引き続き、ベクターKlp3-MCS（配列番号１０）へのクローニングを行った。
【００６５】
ウェスタンブロット分析
細胞ペレットを、B60バッファー（５０ｍＭのHEPES-KOH pH7.3；６０ｍＭの酢酸カリウム；５ｍＭの酢酸マグネシウム；０．１％のTriton X100；１０％のグリセロール；１ｍＭのフッ化ナトリウム；２０ｍＭのリン酸グリセロール；１０ｍＭのＭｇＣｌ2；１ｍＭのDTT；プロテアーゼコンプリートインヒビター（ロシュ））中に再懸濁し、ガラスビーズと一緒に激しく混ぜることによって破砕した。抽出物を遠心分離し（１４０００回転／分、４℃で２０分）、そしてタンパク質濃度を測定した。４０μｇのタンパク質抽出物を、１２％のゲル中でSDS-PAGEによって分離した。次いで、前記タンパク質をメンブレンにトランスファーした。ウェスタンブロット分析は、ウサギ由来のα-IBDV抗血清（１：１５０００；Granzow et al., 1997）およびヤギ−α−ウサギHRP結合抗体（１：３０００、Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を用いて慣用の方法を利用して実施した。
【００６６】
ノーザンブロット分析
ＲＮＡの完全な抽出のために、５ｍｌの酵母培養を氷上で冷却した。細胞溶解は、Prot Kバッファー（１００ｍＭのTris/HCl pH7.9、１５０ｍＭのNaCl、２５ｍＭのEDTA、１％のSDS）および５０ｍｇのプロテイナーゼＫ（Fermentas）中でガラスビーズと一緒に激しく振盪しながら実施した。それらのサンプルを、３５℃で１時間にわたりインキュベートし、ＲＮＡを抽出し、エタノールで沈殿させ、DEPC水中に再懸濁させた。ノーザン分析は、Engler-Blum et al., 1993に記載されている通りであるが、幾つかの相違点をもって実施した。５μｇの全ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレン（Amersham HybondTM-N+、GE Healthcare）にトランスファーした。そのメンブレンを、DIG標識されたRNAプローブと一緒に６８℃でインキュベートした。前記プローブは、PCR断片のDIG-NTPs（ロシュ）の存在下でのインビトロ転写によって製造されたものである。前記ブロットを、ブロッキング溶液で処理し、抗DIGアルカリ性ホスファターゼ結合抗体（ロシュ）と一緒にインキュベートした。アルカリ性ホスファターゼの活性の測定は、通常の方法によって実施した。
【００６７】
異種発現されたVP2の定量化
Saugar et al., 2005によるプロトコールを改変したものを使用した。エピソームVP2プラスミド（pADH1-P_VP2-T2S）で形質転換された２０００ODEの酵母細胞を、選択培地（０．６７％のYNB、２％のグルコースと以下の添加剤：１１ｍｇ／ｌのAde；１４ｍｇ／ｌのTyr；それぞれ３８ｍｇ／ｌのHis、Trp、Arg、Met；４８ｍｇ／ｌのPhe；それぞれ５８ｍｇ／ｌのLeu、Ile、Lys、Val、Thr）上で一晩培養した。回収し蒸留水で洗浄した後に、該細胞をガラスビーズを用いて溶解バッファー（１０ｍＭのTris（pH8.0）、１５０ｍＭのNaCl、２０ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのEDTA、プロテアーゼコンプリートインヒビター（ロシュ）、ｐＨ８．０）中で破砕した。得られたタンパク質抽出物を、遠心分離（１００００ｇ、４℃で１時間）し、可溶性フラクションをスクロースバッファー中の２０％（ｗ／ｖ）スクロースクッション上に成層させた（１０ｍＭのTris pH8.0、１５０ｍＭのNaCl、２０ｍＭのＣａＣｌ2；プロテアーゼコンプリートインヒビター（ロシュ）を含有する）。１７００００ｇで４℃で３時間にわたり遠心分離した後に、ペレットを、２００μｌのスクロースバッファー中に溶解させ、そして更に１７時間にわたり１１４０００ｇでスクロースバッファー中の２０％から５３％のスクロース勾配で遠心分離した。前記勾配は、７００μｌのフラクションで受け止められ、それをSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析した。異種発現されたVP2のオリゴマーのタンパク質複合体を、このようにして濃縮して精製できた。タンパク質を検出し、タンパク質量をSDS PAGEおよびクーマシー染色によって標準タンパク質と比較して測定できた（示さず）。こうして精製されたVP2を、次いで抗VP2抗体を用いた比較ウェスタンブロットにおける標準として使用した。VP2量を種々の発酵からの酵母細胞の定義された数と比較した（図３）。
【００６８】
酵母発酵および熱不活性化
全ての実験的な発酵は、４つの完全装備（voll ausgeruestet）の２ｌ発酵器を有するDasGipパラレルバイオリアクターシステム（DasGip AG, Juelich, Deutschland）中で実施した。生産規模での発酵は、Organobalance GmbH社（Berlin, Deutschland）によってまたは専用研究室で１０ｌの作業容量を有するBiostat EDバイオリアクター（B.Braun Biotech, Melsungen, Deutschland）において実施した。全ての生産プロセスは、流加培養法で実施した。２％の酵母エキスおよび１％のペプトンを有する複合培養培地と２０％のラクトース供給溶液を用いた。酵母培養の温度は、３０℃で保持し、ｐＯ2は３０％飽和に制御した。ｐＨ値は、発酵の間に２ＭのNaOHまたは２ＭのＨ3ＰＯ4の添加によって５．０に保持した。
【００６９】
マウスおよびニワトリにおけるインビボ実験のために、酵母を凍結乾燥させ、次いで９０℃で２時間にわたり熱不活性化させた。この方法の利用により、１グラムの細胞乾燥質量あたり１０細胞未満が生存可能であった。
【００７０】
４．マウスにおける皮下的な適用
伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV変異体D78）のVP2抗原を発現するＫ．ラクティス（VAK890）をマウスにおいて皮下的に適用するために、乾燥させて粉体化させた酵母を初回使用のために完全フロイントアジュバント（CFA）と混合し、更なる使用においては、該酵母を不完全フロイントアジュバント（IFA）と混合した（２００μｌのCFAまたはIFA当たりに１００μｇの酵母材料）。２００μｌのエマルジョン（１００μｇの酵母を含有する）を、免疫化／追加免疫（boost）当たりに１個体につき注射した。それにより、皮下的な免疫化につき１マウス個体に投与されたVP2の量は、約１８ｎｇに相当した（図３）。初回注射（０日目）後に、２週間の間隔で２回「追加免疫」した（１４日目および２８日目；図４）。更に２週間後に、それらの動物を血清取得のために麻酔により屠殺した。
【００７１】
５．ニワトリにおける皮下的な適用
ニワトリにおける皮下的な適用のために、伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス（IBDV変異体D78）のVP2抗原を発現する乾燥して粉体化されたＫ．ラクティス変異体（VAK890）５ｍｇを、７５０μｌのリン酸緩衝液／生理食塩水（PBS）ならびに５００μｌの滅菌蒸留水中に溶解させ、１．２５ｍｌのIFAを用いてエマルジョンを製造した。このエマルジョン（１ｍｇの酵母を含有する）５００μｌを、０日目、１４日目ならびに２８日目に注射した（図５）。それにより、１ニワトリ個体の皮下的な免疫化につき投与されたVP2の量は、約１８０ｎｇに相当した（図３、４）。
【００７２】
６．ウイルス「負荷」
予防接種（図５）後に、ニワトリ被予防接種体を４２日目に経口的な経路を介して１００EID50のIBDV株「Edgar」を感染させ、６日後に死亡率を調べた。引き続き動物を麻酔により屠殺した後に、血清を得て、該動物のファブリキウス嚢を取り出した。該ファブリキウス嚢を、まず２４時間にわたり１０％の中性緩衝されたホルマリン中に固定し、引き続きパラフィンに包埋させた。
【００７３】
７．酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
前記被予防接種体の血清におけるIBDV特異抗体力価を、市販のELISA試験により測定した（IDEXX FlockChek（登録商標）IBD ELISAキット（IDEXX Laboratories, Inc.）。マウス被予防接種体の血清の場合には、製造元のとは異なる二次抗体を使用した（Sigma Aldrich）。
【００７４】
８．中和アッセイ
ウイルスを中和する抗体の濃度の測定のための中和アッセイは、Schroeder et al., 2000のプロトコールに従って実施した。
【００７５】
９．免疫組織化学
パラフィン中に包埋されたファブリキウス嚢から、４マイクロメートル厚の臓器切片を作製した。パラフィンを除去した後に、これらを標準的手順に従ってヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。サンプルを顕微鏡により調査し、いわゆる「病変スコア」を１〜４のスケールで決定した（１は正常ないし１０％の毛包萎縮であり、２は１０〜３０％の毛包萎縮であり、３は３０〜７０％の毛包萎縮であり、４は７０％超の萎縮である）。
【００７６】
結果
IBDVのVP2を発現するＫ．ラクティス菌株の製造および最適化
IBDVのVP2遺伝子が組み込まれた種々のＫ．ラクティス変異体を作製した。予防接種実験のために、VP2タンパク質がアミノ酸位置２で突然変異されており（トレオニンのセリンとの交換；Jagadish et al.(1991)）、かつ少なくとも２つのKlGAL4遺伝子の追加のタンデムな組み込みを含む最適化された変異体（変異体VP2-T2S_GAL4；菌株VAK890）を使用した。突然変異によって異種タンパク質を更に安定化させた；トランスアクチベーターの過剰発現によって、VP2発現の明らかな増加を達成できた（図２）。追加のKlGAL4遺伝子の組み込みは、このＫ．ラクティス変異体のより高い増殖速度とも相関していた。関連のVP2を発現するＫ．ラクティス株VAK890のための増殖条件を、酵母が高い密度でかつ発現されたVP2の再現可能な量で発酵できるように最適化した。製造後に、該酵母を凍結乾燥させ、９０℃で２時間にわたり不活性化させた。不活性化の立証がもたらされた：１ｇの不活性化された酵母材料当たりに１０未満の生きている酵母細胞が残されている。１酵母細胞当たりのVP2の量を測定した：その量は、菌株VAK890では１酵母細胞当たり約０．７ｆｇの異種VP2タンパク質であった（図３）。
【００７７】
マウスおよびニワトリにおける皮下的な適用
免疫化は上記のように実施した；最後の適用の２週間後に処置された被予防接種体の血清を中和抗体の存在に基づき調査した。そのために、IBDV特異的ELISAを使用し、IBDV中和アッセイを実施した（図４および図５）。予防接種されたニワトリで、更に「ウイルス負荷」実験を実施した。このために、該動物に、１動物当たりに１００EID50のウイルス力価の、伝染性の高い菌株「Edgar」を供給した。その濃度は、予防接種されていない家禽の場合に約１０〜３５％（図５Ｄ）の死亡率でファブリキウス嚢病に導く濃度である。「ウイルス負荷」実験に引き続き、被予防接種体のファブリキウス嚢を免疫組織化学によって、該ファブリキウス嚢における感染兆候および病変に基づき調査し、いわゆる「病変スコア」（図５）を特徴付けた。
【００７８】
マウスでの実験もニワトリでの実験もいずれも、Ｋ．ラクティス株VAK890の皮下的な適用によって高い力価のウイルス中和抗体が実質的に全ての処置された動物において生成されえたことを示した（図４Ｂ、４Ｃ；図５Ｂ、５Ｃ）。同様に、実質的に全ての予防接種されたニワトリ被験体はウイルス負荷に対して防御されており、かつそのファブリキウス嚢のいずれにおいてもウイルス感染の気配はないことを示すことができた（図５）。Ｋ．ラクティス株VAK890が皮下的に接種された全ての動物は、従ってVP2に対して相当の体液性免疫応答を示した。この免疫応答は、既に初回の追加免疫後に観察できており、そのことから推定できることは、更に不完全フロイントアジュバントで実施できる２種類の感染（免疫化および追加免疫）は、既に、防御の発生のために十分であるということである。更に、Ｋ．ラクティス株VAK890が接種された全てのニワトリ被験体は、後のウイルス感染に対して防御されている（図５）。
【００７９】
略語
ARS1  自己複製する配列；複製を引き起こすＤＮＡのヌクレオチド配列
Asc l  制限エンドヌクレアーゼAsc l
CFA  完全フロイントアジュバント
DNA  デオキシリボ核酸
DEPC  ジエチルピロカーボネート
DIG-NTP  ジゴキシゲニン−ヌクレオチド三リン酸
DSMZ  ドイツ微生物細胞培養コレクション
DTT  ジチオトレイトール
E.コリ  エシェリキア・コリ
EcoRI  制限エンドヌクレアーゼEcoRl
EDTA  エチレンジアミン四酢酸
EID50  卵または胚の感染用量  −  感染した卵の５０％に感染を引き起こすのに必要な感染性ウイルスの数
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ
GAL4  酵母特異的な転写アクチベーター
GRAS  一般に安全と認められる
HEPES  ２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸
Hpa l  制限エンドヌクレアーゼHpa l
HRP  セイヨウワサビペルオキシダーゼ
IBDV  伝染性ファブリキウス嚢病のウイルス
IFA  不完全フロイントアジュバント
K.ラクティス  クルイベロマイセス・ラクティス
KIGAL4  KlGal4/Lac9タンパク質をコードするＫ．ラクティス遺伝子
KIGAL80  KlGal80タンパク質をコードするＫ．ラクティス遺伝子
LAC4  β−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＫ．ラクティス遺伝子
Not l  制限エンドヌクレアーゼNot l
ODE  光学密度単位
PBS  リン酸緩衝液／生理食塩水
PCR  ポリメラーゼ連鎖反応
RNA  リボ核酸
S.セレビシエ  サッカロマイセス・セレビシエ
Sal l  制限エンドヌクレアーゼSal l
SDS  ドデシル硫酸ナトリウム
SDS-PAGE  SDSを使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動
TEF1  翻訳因子EF-1αをコードするアルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）の遺伝子
VP2  IBDVのキャプシド形成性ウイルスタンパク質
VP2-T2S  位置２でのトレオニンのセリンへのアミノ酸交換を有するVP2
VAK  ワクチン株
YEPD  酵母エキス−ペプトン−デキストロース
YRp7  S.セレビシエ−E.コリのシャトルベクター、ジーンバンクアクセッション番号U03501（Botstein et al., 1979）
【００８０】
0006313215.tif 000002
【００８１】
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【００８２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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