(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2が示すブタ由来の野生型初乳蛋白質のアミノ酸配列における３３番目のイソロイシンがアラニンに置換され、第１０１番目のグルタミン酸がシステインに置換され、及び第１７５番目のアルギニンがシステインに置換され、SEQ ID NO：１が示すアミノ酸配列を有することを特徴とする修飾初乳蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質が有するアミノ酸配列をコードし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３が示す塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする経口投与剤。
【請求項４】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする動物飼料組成物。
【請求項５】
前記修飾初乳蛋白質が占める比率が0.01ｗｔ％〜0.02ｗｔ％であることを特徴とする請求項４に記載の動物飼料組成物。
【請求項６】
薬学的担体とワクチンアジュバント及び請求項１に記載の修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質を用いて、動物の免疫を誘発する飼料を製造する方法。
【請求項８】
前記動物の免疫グロブリンＩｇAの生成を増加させることにより前記動物の免疫を誘発する請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質を用いて、動物に投与する飼料を製造する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質を用いて、動物に投与する医薬組成物を製造する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質を用いて、粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる飼料を製造する方法。
【請求項１２】
前記疾病が豚繁殖/呼吸障害症候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、口蹄疫、豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea, PED）、鳥インフルエンザ及びヒトインフルエンザを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の修飾初乳蛋白質を用いて、粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる医薬組成物を製造する方法。
【請求項１４】
前記疾病がPRRS、口蹄疫、PED、鳥インフルエンザ及びヒトインフルエンザを含むことを特徴とする請求項１3に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は初乳蛋白質、特に修飾された初乳蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体または免疫グロブリンは主に形質細胞により分泌されて、免疫システムが細菌やウィルスなどの病原体が含まれる異物の認識や中和に用いられる蛋白質である。抗体はIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが含まれていて、中でもIgAが母乳、唾液、涙液及び気管支粘液に見つけられることができ、人体が病原体に対する防御の最前線の粘膜免疫に対しては非常に重要である。詳しく言うと、様々な病原体は呼吸器、腸管および尿生殖路の粘膜表面との接触により人体に感染するが、粘膜にある分泌型IgA抗体は病原体の複数のエピトープに結合することによって、病原体が粘膜細胞に接触することを防ぐ。
【０００３】
畜産業は農業生産の重要な構成部分であるが、その内の、豚の飼育結果の不具合は豚の死亡率の高さに関係すると考えられる。一般的には、偏性病原体が豚の病気の主な原因であると考えられるが、台湾中興大学獣医病理学部の血清学的研究結果によれば、高病原性疾患、例えば豚コレラや仮性狂犬病は有意な集団発生が観察されないが、それに対して低病原性の病原体、たとえばマイコプラズマ、パスツレラおよびサルモネラは、それぞれが単独に感染する場合には顕著な症状がなくても、豚の病害抵抗性の低下かつ複数の病原の一次および二次感染を兼ねて、症状が悪化し死に至ることがある。即ち、このような低病原性の病原体は豚の平均個体数に大きな影響を与える。
【０００４】
哺乳類の雌が生産後２〜3日間に分泌される母乳は初乳と呼び、それ以後の母乳は常乳と呼ぶ。初乳はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの五種類の免疫グロブリンが含まれ、中ではＩｇＧの量が最も高く、他のグロブリンのの量は比較的に低い。前記グロブリンはヴィルス、細菌、寄生虫や酵母などの病原体に対して良好な防御効果を有する。
【０００５】
しかしながら、現在では初乳において、ラクトフェリンが精製、利用及びトランスジェニック動物の培養に使う以外、他の効果成分が効果的に精製し利用されることがごく僅かである。かつ、初乳の分泌期間は短く、さらに中に含まれる蛋白質は不安定で、収集しづらく、保存も困難であるといった原因により、例え初乳のメリットが数多くあったとしても、実際運用的にはまだ困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
故に、本発明の目的としては、体外での安定性が高く、かつ外来病原体を予防または抵抗する効果を有する修飾された初乳蛋白質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明が従来の技術問題を解決する技術手段として、SEQ ID NO:2が示すブタ由来の野生型初乳蛋白質のアミノ酸配列における３３番目のイソロイシンがアラニンに置換され、第１０１番目のグルタミン酸がシステインに置換され、また第１７５番目のアルギニンがシステインに置換され、SEQ ID NO：１が示すアミノ酸配列を有することを特徴とする修飾初乳蛋白質を提供する。
【０００８】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質が有するアミノ酸配列をコードし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３が示す塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする経口投与剤を提供する。
【００１０】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする動物飼料組成物を提供する。
【００１１】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質が占める比率が0.01ｗｔ％〜0.02ｗｔ％であることを特徴とする動物飼料組成物を提供する。
【００１２】
本発明の一つの実施形態では薬学的担体とワクチンアジュバント及び前記修飾初乳蛋白質が含まれることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質を用いて、動物の免疫を誘発する飼料を製造する方法を提供する。
【００１４】
本発明の一つの実施形態では前記動物の免疫グロブリンＩｇAの生成を増加させることにより前記動物の免疫を誘発する方法を提供する。
【００１５】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質を用いて、動物に投与する飼料を製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質を用いて、動物に投与する医薬組成物を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質を用いて、粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる飼料を製造する方法を提供する。
【００１８】
本発明の一つの実施形態では前記疾病が豚繁殖/呼吸障害症候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、口蹄疫、豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea, PED）、鳥インフルエンザ及びヒトインフルエンザを含むことを特徴とする前述の粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる飼料を製造する方法を提供する。
【００１９】
本発明の一つの実施形態では前記修飾初乳蛋白質を用いて、粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる医薬組成物を製造する方法を提供する。
【００２０】
本発明の一つの実施形態では前記疾病が豚繁殖/呼吸障害症候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、口蹄疫、豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea, PED）、鳥インフルエンザ及びヒトインフルエンザを含むことを特徴とする前述の粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる医薬組成物を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の技術手段により、本発明の修飾初乳蛋白質の三次構造は野生型と比べてより安定し、かつ、前記修飾初乳蛋白質は免疫グロブリンＩｇＡの生成を向上させることにより粘膜免疫を促進して、非特異的病原体の感染を予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は細菌の細胞膜と結合する初乳蛋白質を分離する結果を示す図である。
【図２】図２は豚の乳清におけるＰＧＲＰの発現の結果である。
【図３】図３は本発明の実施形態の修飾初乳蛋白質及び野生型初乳蛋白質が培養液に添加される50μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）により処理されることを示す折れ線グラフである。
【図４】図４は酵母で豚の蛋白質を認識システムを表現する図である。
【図５】図５は本発明の実施形態の修飾初乳蛋白質のウェスタンブロッティングの図である。
【図６】図６は本発明の実施形態の修飾初乳蛋白質が大腸菌と混合する場合の電子顕微鏡写真である。
【図７】図７は本発明の実施形態の修飾初乳蛋白質をマウスに供給した後の腸内の菌数を示す折れ線グラフである。
【図８】図８は本発明の実施形態の修飾初乳蛋白質をマウスに供給した後の腸の免疫染色パターンである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下は図１〜図8に基いて、本発明の実施形態について説明する。該当説明は本発明の実施形態の一つの例示にすぎず、本発明の実施形態を限定するものではない。
【００２４】
本発明の一つの実施形態の修飾初乳蛋白質では、SEQ ID NO:2が示す野生型初乳蛋白質のアミノ酸配列における３３番目のイソロイシンがアラニンに置換され、第１０１番目のグルタミン酸がシステインに置換され、及び第１７５番目のアルギニンがシステインに置換され、SEQ ID NO：１が示すアミノ酸配列を有する修飾初乳蛋白質である。前記修飾初乳蛋白質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３が示す塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００２５】
具体的に言うと、本発明の修飾初乳蛋白質はアミノ酸配列が修飾され、かつ細菌の細胞壁のペプチドグリカンに結合する蛋白質を精製することにより得られる。その特性から病原認識蛋白質(Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＲＰ)に命名する。
【００２６】
続いて、本発明の修飾初乳蛋白質は経口投与剤形、例えば固体、半固体、または液体の経口剤形に製造することができる。具体的に言うと、前記固体の経口剤形はさらにタブレット、細粒、粉末またはカプセルが含まれる。
【００２７】
続いて、本発明の修飾初乳蛋白質は動物飼料と組合せて動物飼料組成物を製造することができる。かつ、前記動物飼料組成物における前記修飾初乳蛋白質が占める比率が0.01ｗｔ％〜0.02ｗｔ％である。もちろん、本発明はこれに限らない。他の実施形態では、前記動物飼料組成物における前記修飾初乳蛋白質が占める比率は状況に応じて調整することができる。
【００２８】
続いて、本発明の修飾初乳蛋白質は、動物の免疫グロブリンＩｇＡの生成を誘発することによる前記動物の免疫を誘発する飼料の製造に用いられる。具体的に言うと、前記動物は哺乳動物、例えば豚や牛であることができる。
【００２９】
続いて、本発明の修飾初乳蛋白質は、薬学的担体とワクチンアジュバントが含まれる動物に投与する医薬組成物の製造に用いられる。
【００３０】
続いて、本発明の修飾初乳蛋白質は、粘膜免疫を誘発する疾病の治療や予防に用いる飼料または医薬組成物の製造に用いられ、前記疾病が豚繁殖/呼吸障害症候群(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、口蹄疫、豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea, PED）および鳥インフルエンザが含まれる。
【００３１】
まとめて言うと、本実施形態では、豚（他の実施形態では、異なる哺乳動物を採用することもでき、例えば牛）の初乳を原料として、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、細菌の細胞壁のペプチドグリカンに結合する初乳蛋白質を精製し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（LC/ MS/ MS）の分析および遺伝子プールに照合することによって、前記ペプチドグリカンに結合した蛋白質の種類や特性を認識し、前記ペプチドグリカンに結合した蛋白質を病原認識蛋白質（ＰＲＰ）に命名する。そしてＰＲＰのアミノ配列を取得したら、豚のＰＲＰジーンをクローニングして、酵母に構築する。そして以下に示すように、体外で発現される蛋白質を発現量の評価、発酵条件試験、マウス投与後の腸内細菌叢分析、活体大腸菌及びサルモネラの制御実験などで蛋白質の活性を確認する。
【００３２】
蛋白質の精製：
【００３３】
グラム陽性エンハンサーマトリックス（Ｇｒａｍ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｍａｔｒｉｘ、ＧＥＭ）粒子の準備：無菌の状態でＬａｃｔｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ菌液を取り、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ ＴＭ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ）に植菌し、培地の単独コロニーを選択し、単一な菌株を選択して250ｍｌのＭＲＳ培地に移動させて、嫌気性環境、37℃で18時間を培養する。培養した菌液を50ml遠心管に分注し、10分間の13000×g遠心分離を行い、上清を除去し、もとの体積の1/2のｄｄＨ2Ｏで菌体を懸濁して、10分間の13000×g遠心分離を行い、上清を除去し、もとの体積の1/5のacid solution（0.6M，TCA，pH＝1）、蓋を緩めて、沸騰水の中に入れて30分加熱し、以上の工程を3回繰返してから、さらに10分間の13000×g遠心分離を行い、上清を除去する。最後はもとの体積の1/10のPBSで菌体を懸濁して、セルカウンターを用いてml毎に含まれるGEM粒子の数を評価して、-80℃で保存する。
【００３４】
乳清の準備：取得した初乳を50ml遠心管に分注し、10000×g、4℃で30分間の遠心分離を行い、下層の液体を別の50ｍｌ遠心管に保存し移し、酢酸の最終濃度が1％になるように体積に応じて100％の酢酸を加えて、37℃のインキュベーターに10分間放置して、酸性化を行わせる。そして、もとの体積の1/10の1M酢酸塩で初乳を中和し、最後に10000×g、4℃で10分間の遠心分離を行い、上清を吸取り、乳清を得る。準備した乳清をブラッドフォード法で蛋白質定量を行い、-20℃で保存する。
【００３５】
GEM粒子と乳清との結合実験：GEM粒子100μｌ（約5.6×108GEM）を乳清（約7ｍｇ）を混合して、振とう機に置いて30分間室温で振盪して、１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、上清を除去する。沈澱物をPBS 1ｍｌで懸濁し、１０分間の13000×ｇ遠心分離を行う。前述工程を三回繰り返して、elution buffer（1M NaClを含む）1ｍｌで懸濁し、最後に１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、上清を除去してPBS buffer 20μｌで懸濁して、さらに同体積の２× sample bufferで十分に混合した後、ドライバスに置いて９５℃で１０分間加熱する、そして１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、上層溶液を吸取り、蛋白質電気泳動で分析する。
【００３６】
マウス免疫：GEM粒子2.2×109を初乳乳清（約25ｍｇ）と十分に混合して、１０分間の13000×ｇ遠心分離を行って上清を除去し、沈澱物をPBS buffer 1ｍｌで懸濁し、１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、前述工程を３回繰り返し、1M NaCl 1ｍｌで懸濁し、最後に１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、上清を除去してPBS buffer ５０μｌで懸濁し、同等体積の２× sample bufferで十分に混合した後、ドライバスに置いて９５℃で１０分間加熱し、そして１０分間の13000×ｇ遠心分離を行い、上層溶液を吸取り、100μｌになるようにPBS bufferを加えて、同等体積の完全フロイントアジュバント（Complete Freund's adjuvant, CFA）を加え、４℃で１２時間振とう混合して、一回目のマウス免疫注射剤とする。そしてアジュバントを不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund's adjuvant, IFA)にして、抗原蛋白質を乳化する。免疫実験では抗原の注射は三週で一つの免疫サークルとし、一週目は完全フロイントアジュバントを混合した抗原蛋白質でマウスの腹腔内免疫注射剤注射を行い、周毎に採血針でマウスの頬から採血して、血清を製造して-２０℃で保存する；三週目には、マウスの血清を取得しウェスタンブロットの一次抗体として用いて、初乳乳清におけるペプチドグリカン結合蛋白質を検出し、一週目や二週目の免疫血清と比べて抗体濃度が有意に向上する場合、四回目の不完全フロイントアジュバントを混合した抗原蛋白質注射剤の注射をさらに与え、次週でマウスの全血採集を行う。
【００３７】
ウェスタンブロット：ポリフッ化ビニリデン(PVDF膜)を無水エタノールで15分間浸けて、transfer bufferに浸して備える。泡が入らないようにゲルホルダーにスポンジ、ろ紙、ゲル、PVDF膜、ろ紙、スポンジを順に重ねてセットする。転写槽をtransfer bufferで満たして、転写槽を氷で冷却させ、100Vで1時間転写を行い、転写したPVDF膜を脱脂粉乳5％（w／v）を含むTBS ｂｕｆｆｅｒに浸し、4℃で少なくとも2時間振とうして、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで六回洗浄し、毎回5分、前述免疫実験で得られたマウスの対初乳乳清ペプチドグリカン結合蛋白質抗体をプローブにし、ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで1000倍希釈して一次抗体として用い、前記希釈した一次抗体をＰＶＤＦ膜に加えて室温で振とうしつつ 2 時間反応させて、もう一度ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで毎回5分の洗浄を六回行い、アルカリンフォスファターゼを有する抗体をＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで1500倍希釈して二次抗体として用い、前記希釈した二次抗体をＰＶＤＦ膜に加えて室温で振とうしつつ 1 時間反応させて、もう一度ＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒで毎回5分の洗浄を六回行い、最後にＢＣＩＰ／ＮＢＴで発色反応を行い、発色反応が完成すると二次洗浄で反応を停止させる。
【００３８】
ジーンの取得：
【００３９】
液体クロマトグラフィータンデム質量分析計：LC-MS/ MSは、液体クロマトグラフィー計を2基のタンデム質量分析計に繋げてサンプルを分析するものである。その原理は、液体クロマトグラフィー計強大な分析能力を利用し、大量なペプチドが含まれる混合物を分離して、タンデム質量分析計のイオン源でサンプルをイオン化し、分子のサイズや荷電が異なるペプチドを生成し、第一段階のマスアナライザーに進入して、電子や気体などで分析したいイオンを衝撃を加え、より小さいなイオンのかけらを生成して、第二段階のマスアナライザーでサンプルのかけらのイオンの質量電荷比（mass to charge ratio， ｍ／ｚ）の計測を行い、これにより荷電によって分析目標物の質量を計算することが出来る。液体クロマトグラフィー計で分離したペプチドを、二回のイオン化と砕片化を経って、照合分析するとペプチドのアミノ配列を得ることが出来、さらにMascot Analysis（Matrix Science, London, UK）などのバイオインフォマティクスデータベースなどで、ＤＮＡ配列データベースに照合すれば対応するジーンを得ることが出来る。
【００４０】
豚病原認識蛋白質のクローニング及び活性分析：ＬＣ-ＭＳ／ＭＳで得られる部分アミノ配列に基いてdegenerate primerを設計する。このプライマーはOlgo-d（T）とともに豚乳腺cDNAにおいて病原性認識蛋白質ジーンを取り出すツールとして用いる、RT-PCR後、ゲルにおける全部のバンドはそれぞれTA-vectorにクローニングされ、核酸配列決定法およびバイオインフォマティクス照合によって豚の病原認識蛋白質の全ジーンを利用することができる。このジーンはSEQ ID NO:3に示す。クローニング及び編集された豚病原認識蛋白質はまず大腸菌の発現システムに構築し、菌の発現分泌を誘発してから精製を行い、精製した病原認識蛋白質は病原がGEM粒子と結合する能力の存在するか否か及びその安定性が試されて、結合してからウェスタンブロット法で分析する。
【００４１】
酵母発現ベクターの構築：大腸菌発現システムが成育環境を汚染することを防ぐため、飼料に用いられた酵母をベクターとして病原認識蛋白質を発現させ、クローニング、編集及びシークエシングされた豚病原認識蛋白質はｐYES2.1V5-Hiｓ TOPO vector（Invitrogen）に構築される。このベクターは酵母で発現されるものであり、故に構築後に酵母株INVSｃ1にトランスフェクションする。このシステムが元にあった発現メカニズムはすでに特定の温度及び栄養物が存在する場合しか病原認識蛋白質を発現しないが、特許出願が完成する前はその培養条件は公開しないこととする。
【００４２】
マウスの腸道微生物実験：腸内細菌叢の観察：給餌管でマウスに体重の1／100の病原認識蛋白質を投与し、二日で一回投与で合計六日投与し、対照組として、マウスに同体積の無菌水を投与し、実験終了する時に動物を犠牲して小腸（胃以後1.5〜2.5cm）を取り分析し、小腸の内容物は滅菌されたPBSで適当倍率に稀釈して、培地で24時間培養して、コロニー数を計算し、細菌叢はコロニーの対数（log cfu）で表現する。また高速細菌鑑定方法（API 20E）で腸内の桿菌及び他のグラム陰性菌を鑑定し、その結果を表1に示す。
【００４３】
【表１】
0006384928.tif 000002
【００４４】
発酵槽の発酵条件試験：構築、トランスフェクションされた酵母は連続発酵槽（Winpact Bioreactor and Fermentor）で培養し、酵母はまず活化及び懸濁する後、OD値に基いて稀釈し、培地交換後誘導環境で8時間培養を行い、その期間温度、回転速度、pH、および溶存酸素量を一定の範囲に入るように制御する。培養した酵母をそれぞれサンプリングしてウェスタンブロットで病原認識蛋白質の発現を分析する。8時間発酵を行った発酵液の酵母を分離すると、1Lの発酵液から約9〜10ｇの遺伝子組み換え酵母を得ることができる。前記遺伝子組み換え酵母を乾燥した環境で保存する。
【００４５】
初乳において菌の細胞膜に結合した蛋白質の精製と蛋白質の定性：異なる種類の蛋白質は微生物の細胞膜や細胞壁に結合する。その結合方法は概ね五つある：（1）transmembrane proteinにある疎水性transmembrane domainによって微生物の細胞膜に固定される、（2）リポ蛋白質のN末端のシスティンがアセチル化して細胞膜の長鎖脂肪酸に共役結合する、（3）LPXTG motifanchor供給蛋白質を通じて細胞膜に留まって、ソルターゼによりLPXTGmotifのスレオニン、グリシンをペプチドグリカンに共役結合する、（4）細胞壁と細胞壁結合蛋白質の非共役結合；例えば様々の細菌に存在するｌｙsin motif(LyｓM)及び（5）表面蛋白質の結合。実験で準備したGEM粒子はコラムの充填して初乳を流下した後、SDS-PAGEで菌の細胞膜に結合する未知の蛋白質を分析する。実験中で菌の細胞膜に結合することが出来る蛋白質は一つ以上であることが分かり、実験中分離してアミノ酸シークエンシングを行ったものは七つがあり（図1、C1〜7）、その中の一つは既知のラクトフェリンであり、C7はNCBIの配列と照合する後、ペプチドグリカン認識蛋白質ファミリである可能性があることが分かる（C7: RecName: Peptidoglycan recognition protein; Flags: Precursor，Nominal mass (Mr): 21024; Calculated pI value: 9.62，Variable modifications: Carbamidomethyl (C)，Oxidation (M) Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P，Sequence Coverage: 11%）。
【００４６】
豚のPGRP抗体の入手が困難なため、本実験は精製したC7蛋白質でマウスの腹部に注射し、免疫が誘発された腹水で豚の初乳と常乳の前記蛋白質の発現形態を観察した結果は図が示すように、豚の乳清は本実験でもPGRPが含まれることを発見した。そして豚の初乳の乳清（図２、分娩後2〜4日、*はPGRPが約17ｋDaであることを表す）におけるPGRPの量は明らかに豚の常乳の乳清におけるPGRPの量より多い。しかしながら、図３が示すように、実験では前記蛋白質は非常に不安定であり、同じサンプルは低温（-２０度）環境で二日保存すると蛋白質が消える。このような不安定な性質は前記蛋白質の産業的な運用を妨げることになる。故に、以下の実施形態において、前記蛋白質に対して三次構造がより安定するよう編集を加え、その特性に基いて病原認識蛋白質（pathological recognition protein, PRP）、即ち本発明における修飾初乳蛋白質と命名する。
【００４７】
豚の病原認識蛋白質のジーンクローニング、酵母発現及びモニタリング：従来商用組換え蛋白質の開発の前例によれば、実験室では市場価値のある蛋白質を開発することができても、蛋白質の発現量、安定性及び生産コストの問題を解決するのは容易ではない。これに鑑して、豚の病原認識蛋白質ジーンを酵母発現システムにクローニングする。培養条件はより精密な調整が必要だが、酵母は商業的な運用においては多くのメリットを備えるため、実験では酵母を豚病原認識蛋白質の発現システムにすることにしている（図４）。培地の成分、温度、溶存酸素量及び発酵時間について研究を重ねた後、今では豚病原認識蛋白質を安定的に発現することができ、月ごと280トンの哺乳豚飼料を製造することができる。発酵開始するときにサンプル1ｍｌを取り、発酵完了する時もう一度サンプリングを行い、二回取得したサンプルをウェスタンブロットで病原認識蛋白質の発現及び産量を確認する。図5は途中の蛋白質発現のモニタリング結果、異なる時間で収集した発酵サンプルを抗体で発色した結果、矢印が指す所が示すように8時間の発酵を行った場合最も良好な発現量が取れる。このようなモニタリングは発酵を行う度に行って、発酵条件や菌株が最も良好な状態であるかどうかを確認する。発酵後で収集した酵母は遠心分離で上清を除去し、固体成分を-50℃環境で冷却して乾燥を行い、乾燥した後に水分を避けて予備にして、飼料が配合するときにまず飼料の主な組成分と混合した後、他の組成分と混合する。
【００４８】
同時に図6〜図8を参照する。ICR系のマウスに給餌管で体重の1／100の病原認識蛋白質を投与し、二日で一回投与で合計六日投与し、対照組として、マウスに同体積の無菌水を投与し、実験終了する時に動物を犠牲して小腸（胃以後1.5〜2.5cm）を取り分析する。毎回の実験では実験組と対照組はそれぞれ25体であり、もし給餌管の給餌による動物の死亡が発生すれば、そのデータを破棄する。豚病原認識蛋白質を投与したマウスが対照組と比べるとトータル菌数では15〜50％下がった（青色の曲線はPRPを投与した実験組、時間を延長すると細菌を約50％で制御する）、そして菌叢の同定により、減少した細菌は主にグラム陰性菌であることが分かる。他に、病原認識蛋白質は菌の細胞膜に接着することが有するため、実験では酵母が発現して精製した病原認識蛋白質を大腸菌と混合して、二回培地を交換した後、電子顕微鏡で菌の細胞膜に病原認識蛋白質が結合しているかどうかを観察する。マークした場所は蛋白質の結合をはっきり見えるところである。
【００４９】
以下は本発明の修飾蛋白質を動物飼料と混合して、豚に投与する実験。
【００５０】
同期間対照：生後4週の子豚16匹を、8匹ずつ2つの豚舎で飼育し、採血してPRRSの抗体価（IgG）を検出する。0.02％のPRPを添加する飼料を4週間投与して（生後8週）、もう一度血液中のPRRS抗体価（IgG）を検出する。
【００５１】
結果：表２が示すように、豚が実験前に実験組も対照組も血液中の免疫グロブリンIgGは陰性であるが、齢8週の時、PRP処理を加えた組は陰性のままで、対照組は全部感染したことを示す陽性反応になった。これによりPRPは免疫グロブリンIgAの生成を誘発して、豚舎で豚の粘膜を通じて体内に侵入しようとするPRRSウィルスを粘膜で中和する。故にPRRSウィルスが粘膜を通過する可能性を減少させて、リンパ免疫系を刺激し、免疫グロブリンIgGを製造させる。
【表２】
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【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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