(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する菌株であって、その特徴は保蔵日が２０１４年１２月２９日で中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５７である一種の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株。
【請求項２】
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、請求項１に記載の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株をスタート菌種とし、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、枯草菌を得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させた枯草菌ＮＪ０９０２５９を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【請求項３】
一種の微生物が発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、請求項１に記載の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株をスタート菌種として利用し、シード培養と最適化した培地の発酵によりＤ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、枯草菌を得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させた枯草菌ＮＪ０９０２５９を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混交物を飽和水溶液にし、濃度が１２−１６％になるまで３７％濃塩酸を加え、９０℃で４５−９０分保温し、一晩冷却し、濾過して得た結晶体をエタノールで洗浄した後、真空乾燥させて測定を行うことで、高純度のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。
【請求項４】
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する菌株であって、その特徴は、保蔵日が２０１４年１２月２９日で中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５８であるバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株。
【請求項５】
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、請求項４に記載のバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株をスタート菌種とし、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、バシラス・リケニフォルミスを得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させたバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【請求項６】
一種の微生物が発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴として、請求項４に記載のバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株をスタート菌種として利用し、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、バシラス・リケニフォルミスを得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させたバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物を飽和溶液にし、３７％の濃塩酸を加えて濃度が１２−１６％にし、９０℃で４５−９０分保温し、一晩冷却し、濾過して得た結晶体をエタノールで洗浄した後、真空乾燥させて測定を行うことで、高純度のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。
【請求項７】
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、請求項２に記載の微生物の発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産方法。
【請求項８】
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、請求項３に記載の微生物の発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法。
【請求項９】
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、請求項５に記載の微生物の発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法。
【請求項１０】
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、請求項６に記載の微生物の発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に属し、具体的には一種の微生物の発酵によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する菌株とその方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは単糖で、真菌（担子菌類、糸状菌或いは酵母）菌体細胞壁キチン、或いは甲殻類動物、例えば蟹やエビの殻の組成成分で、食品にごく少量含まれる栄養成分でもある。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはグルコサミンと類似した効果を持ち、一定量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを摂取すると、新しい軟骨の形成を誘導することができ、関節炎の発作を抑制できる。一部の研究ではＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンも関節炎の治療に使われている。グルコサミンは苦みがあるが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは蔗糖５０％の甘味があり、摂取しやすいため、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはグルコサミンの代替物として広く注目されている。
【０００３】
伝統的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産には甲殻類動物の殻を原料として使用していた。その生産方法では、甲殻類動物の殻の圧砕、希釈酸溶液で圧砕した殻に対して脱カルシウムし、アルカリによる精製で甲殻素を得る。酸で分解されて得られた甲殻素でグルコサミンを生産する。そしてグルコサミンに対して無水酢酸エタノール化を行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得る。甲殻素を酸分解してグルコサミンを得る方法には、真菌粉末（レモン酸発酵に用いるアスペルギルス・ニガーの菌粉末）を原料に、高濃度塩酸による分解でグルコサミンを生産する方法がある。詳しくは２００６年５月２３日公開の特許文献１を参照されたい。その中でグルコサミン及び微生物によるグルコサミンの生産方法が開示されている。
【０００４】
また伝統的な方法として（１）微生物の酵素によってエビ甲殻を分解して生産する甲殻素を使ったＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法があり、１９９９年１２月７日に開示された特許文献２を参照されたい。その中でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生成過程が開示されている。（２）微生物（トリコデルマ）の酵素で分解或いは酸を用いて一部分解し、精製した真菌粉末（レモン酸発酵時に使用するアスペルギルス・ニガーの菌粉末）を利用して甲殻素からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法があり、２００３年４月１７日に開示された特許文献３を参照されたい。その中でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びその生成方法が開示されている。（３）クロレラウイルス（Ｃｈｌｏｒｏｖｉｒｕｓ）に感染したクロレラ細胞或いはクロレラウィルス遺伝子を組み込んだ遺伝子組替大腸菌を培養することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法があり、２００４年１０月１４日開示の特許文献４を参照されたい。その中でグルコサミンとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生成する方法が開示されている。（４）遺伝子修飾した微生物、特に遺伝子修飾した大腸菌を使って発酵させＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法があり、２００４年１月８日に開示された特許文献５を参照されたい。その中でグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンの生産方法と材料が開示されている。（５）真菌粉末やエビ殻から生産した甲殻素とキチンオリゴ糖を使用せずに、トリコデルマを用いてブドウ糖を炭素源として発酵させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法があり、２０１１年３月１０日に開示された特許文献６を参照されたい。その中で微生物の発酵を利用してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法が開示されている。
【０００５】
上記の甲殻類動物の殻或いはアスペルギルス粉末（レモン酸粉末）を原料として化学分解反応を通してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン或いはＤ−グルコサミンを生産する方法は一般的に高濃度の酸溶液とアルカリ溶液を使用するため、大量の廃液が発生する。またエビ蟹の殻を原料としてＤ−グルコサミンを生産する場合、１ｔのＤ−グルコサミンを生産するために１００ｔ以上の排水と廃棄粉末が発生する。レモン酸粉末で生産した場合、３０−５０ｔのレモン酸粉末からは１ｔのＤ−グルコサミンしか生産できない。また微生物或いは微生物の酵素によって甲殻類動物、例えば蟹、エビ類の殻から甲殻素を得てＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法は生産量が低く、コストが高いという問題がある。
【０００６】
クロレラウィルス感染のクロレラ細胞を培養してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法は、圧砕細胞からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得る必要があり、操作が複雑である。遺伝子修飾をした微生物を利用したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法は施設内に微生物が拡散しないように適切な処置をとらざるを得ず、同じように操作が複雑であり、食品の安全、ひいては社会に対するリスクが存在する。
【０００７】
また、トリコデルマを用いてブドウ糖を直接炭素源として発酵させＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法は甲殻類動物の殻或いは真菌粉末から、またはエビ殻から生産した甲殻素とキチンオリゴ糖とを使用しないというメリットがあるが、トリコデルマ等の真菌発酵温度が低く、時間が長いうえに、産量に偏りがある為、生産期間が長く、コストが高くなり、汚染されやすいという欠点もあるので、工業上の応用が妨げられている。
【０００８】
よって、伝統的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンの生成方法における上記の欠点に対して、新しく、そして工業化応用がききやすいＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンの生産方法を積極的に模索するべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７０４９４３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５９９８１７３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００７３６６６号明細書
【特許文献４】特開２００４−２８３１４４号公報
【特許文献５】国際公開第２００４／００３１７５号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１１／００５９４８９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は一種の微生物発酵によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する方法を提供することで、現行技術における上記の不足を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は以下の技術によって実現される。
【００１２】
本発明の一部は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを発酵させる一種の微生物の非遺伝子組替菌株を提供し、その特徴は、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関である中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵日が２０１４年１２月２９日で保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５７である一種の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９菌株、及び保蔵日が２０１４年１２月２９日で保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５８である一種のバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５菌株である。
【００１３】
本発明のもう一部は、上記菌株の発酵を利用して非動物源性Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する方法で、該当菌をスタート菌種としシード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、方法は以下の通りである。
【００１４】
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で培養を進め、単一コロニーを得る。コロニーを分離し、枯草菌バシラス・リケニフォルミスを得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
【００１５】
（２）発酵培養
培地上で活性化させた枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５をそれぞれ採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とする。発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
【００１６】
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５。
【００１７】
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２。
【００１８】
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ。
【００１９】
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ。
【００２０】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷ます。そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００２１】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物飽和溶液を生成し、加入濃度が１２−１６％になるまで３７％濃度の濃塩酸を加える。９０℃で４５−９０分間保温し、一晩冷却し、濾過して得た結晶体をエタノールで洗浄した後、真空乾燥させて測定を行うことで、高純度のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。収率は８６％である。
【００２２】
更に、上述の培地の炭素源とアンモニア源は以下の通りである：上記の炭素源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれる。上記のアンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母浸ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれる。
【００２３】
更に、上述の真菌は担子菌類、糸状菌と酵母菌種の一種或いは数種である。
【００２４】
本発明は異なる環境条件下の土壌から選別された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９とバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５に関するもので、上述のＮＪ０９０２５９菌株とＮＪ０９１１９５の細菌学的特性は以下の通りである。
【００２５】
１．ＮＪ０９０２５９菌株の細菌学的特性
（１）培養学／形態学的特性
ＮＪ０９０２５９菌株の成長時は膿状浅黄色半透明のコロニーで、コロニー表面は滑らかである。コロニーは円形で、直径４−７ｍｍ、低い突起を有し、規則的で放射状、縁に葉状が見られる。表面は皺状で、光沢はなく、灰白色、傘型で、コロニー表面は皺状で、コロニーは比較的大きく、中央が突起している。単菌は桿状で両端は鈍円形、単一の配列で、稀に２、３の細胞が連結している。塗抹乾燥後染色した細菌は０．７−０．８×２−３μｍで、グラム陰性菌、液体発酵２４時間後に芽胞が見られ、芽胞は楕円形で、明らかな膨張は見られない。液体基質は均等な混濁様を呈し菌膜や菌環は形成しない。
【００２６】
（２）生理生化特性
ＮＪ０９０２５９は好気性菌で、凝乳作用はない。過酸化ヘリウム酵素実験、硝酸塩還元実験、Ｖ−Ｐ実験に陰性である。フェニルアラニンデアミナーゼ実験、卵黄レシチン酵素試験に陰性である。ブドウ糖分解では酸生成時に気体を生成せず、アラビノース、カゼイン、ゼラチン、澱粉を分解できる。
【００２７】
２．ＮＪ０９１１９５菌株の細菌学的特性
（１）培養学／形態学的特性
ＮＪ０９１１９５菌株を肉エキス寒天平板培地で培養した場合、コロニーは円形、乳白色で、表面は暗く、不透明、縁は不規則である。コロニーと培地はしっかりくっつき、剥がれにくい。液体培養では菌膜があり、混濁せず、沈殿もしない。単菌は短棒状で、両端は鈍円形で、単体或いは２つで並列し、菌体は長さ１．５−３．０μｍである。菌体幅は０．６−１．０μｍで、グラム陰性であって、芽胞は楕円形で、中部が膨張し、芽胞は中間或いは片方に偏向している。
【００２８】
（２）生理学的特性
ＮＪ０９１１９５菌株は酵素接触試験に陽性で、７％のＮａＣｌを含む培地上で成長できる。５０℃の条件下で成長でき、運動性がある。レモン酸塩を使用でき、澱粉を分解できる。Ｍ−Ｒ試験に陰性、グラン染色陽性、卵黄レシチン酵素試験に陰性、Ｖ．Ｐ試験に陽性で、硝酸塩を利用したｐＨ５．７の培養肉スープ内で成長可能である。キチン、Ｄ−ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−産酸を発酵でき、ゼラチンを液化できる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の有益な効果は、一種のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンとを生産する新型菌株及びその生産方法を提供することで、本方法を用いることでＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの安定した生産と供給を実現でき、なおかつ非動物源性の安全なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産できるうえに、生産期間、コストを抑え、より環境に影響を及ぼさないことである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施例における図面に合わせて、本発明実施例における技術プロトコルを明確に記載する。なお以下の実施例は本発明の一部にすぎず、すべての実施例ではない。本発明における実施例、当業者が得たその他の実施例が本発明に含まれ、保護される。
【００３１】
本発明の実施例に基づき、一種の微生物の発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する菌株及びその方法を提供する。
【００３２】
一種のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを発酵させる微生物の菌株は中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵日が２０１４年１２月２９日で保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５７である一種の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９菌株、及び保蔵日が２０１４年１２月２９日で、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５８である一種のバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５菌株である。
【００３３】
実施例１：
本発明に基づき、上述した菌株の発酵によって上記菌株の発酵を利用したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンとを生産する方法はシード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、方法は以下の通りである。
【００３４】
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、３−１０倍に希釈した後、フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で培養を進め、単一コロニーを得る。コロニーを分離し、１１株のコロニーを得た。コロニーが大きく、成長状況が良好な菌株で、菌株コロニーの形態特徴、グラム染色、生理生化的鑑別試験によって菌株を鑑別し、３株の枯草菌と２株のバシラス・リケニフォルミスを得た。
【００３５】
活性化した斜面菌種を５０ｍｌシード培地に接種し、２５０ｍｌ容量の振とう瓶内で培養を進め、培養した液体菌を１０％の接種量で１００ｍｌの培地に接種し、５００ｍｌの容量の振とう瓶内で培養を進め、発酵液に含まれるキチン酵素活性に基づき菌株を選別する。
【００３６】
シード培地：ペプトン１０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ。
【００３７】
培養条件：ｐＨ７．４、培養温度３７℃、振とう速度２００ｒｐｍ、培養時間８時間。
【００３８】
発酵培地：粉末キチンｌ０ｇ／Ｌ、玉米粉５ｇ／Ｌ、澱粉３ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．４５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０３ｇ／Ｌ。
【００３９】
培養条件：ｐＨ７．０、培養温度３７℃、振とう速度２２０ｒｐｍ、培養時間７２時間。
【００４０】
発酵液キチン酵素活性測定：１０ｇの粉末キチンを量り取り、リン酸緩衝液で濃度１０％の懸濁液を生成し、１：１（Ｖ／Ｖ）の比率で遠心処理後の発酵液を加え、４５℃で４時間反応させ、酵素分解液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄み液を採取し、更に２倍体積の無水エタノールを加え、一晩放置し、遠心後に沈殿を取り除き、上澄み液を還元糖濃度が１％になるまで減圧濃縮し、ＨＰＬＣでＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
【００４１】
ＨＰＬＣ測定条件：
機器と設備：島津ＬＣ−１５Ｃ型液体クロマトグラフィー、ＲＩＤ−１０Ａ屈折率検出器、クロマトグラフィックカラム：Ａｍｉｎｅｘ  Ｈｐｘ−８７Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ）、移動相：５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液、流速：０．６ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、注入量２０μｌ、測定：ＲＩ。
【００４２】
酵素活性単位定義：酵素促進反応において、毎分１μｍｏｌ相当のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの還元糖を生産するのに必要な酵素の量を１酵素活性単位（ＵＩ）と定義する。
【００４３】
測定結果：３株の枯草菌と２株のバシラス・リケニフォルミスの酵素活性測定結果については表１を参照されたい。
【００４４】
【表１】
0006446141.tif 000002
【００４５】
酵素活性の最も高いＮｏ．２枯草菌を選択し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９と命名し、酵素活性の最も高いバシラス・リケニフォルミスを選択し、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５と命名する。
【００４６】
（２）発酵培養
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９、バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５及び標準菌株バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ）ＡＣＣＣ０２５６９をフラットスクリーニング上で活性化させた後、それぞれを採取し培地に接種し、１８時間、３０℃恒温振とう培養し、シード液とする。接種時１：１０の量で発酵培地に接種し、３０℃で７２時間、恒温振とう培養し、１２０００ｒｐｍの速度で５分間遠心機に掛けて上澄み液を採取し、ＨＰＬＣを利用してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。測定結果は表２を参照されたい。
【００４７】
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５。
【００４８】
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２。
【００４９】
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ。
【００５０】
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を：０．０１ｍｏｌ／Ｌ、淡室発酵液流速：４０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：４０Ｌ／時間、単膜の電圧０．５Ｖで、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で５０℃に加熱し、８時間濃縮し、飽和させた濃縮後の発酵液の温度をまず２５℃に低下させ、０℃の水で１時間、０℃まで冷ます。０℃になってから５倍の無水エタノールで、１５分間撹拌する。７００ｒｐｍで１５分間遠心し同じ体積の無水エタノールを加え１０ｒｐｍで０．５時間撹拌する。これにより純度９０％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００５３】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物をガラス容器内に入れ、水を加えて飽和溶液を生成する。粗品置ガラス容器に入れ、水を加えて、飽和溶液を生成する。加入濃度が１２％になるまで３７％濃塩酸を加える。９０℃で４５分間保温する。４℃まで冷やし、一晩おき、濾過した結晶体をエタノールで洗浄し、真空乾燥させて測定を行うことで、９７．５％のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。白色で、総収穫率は８２％である。
【００５４】
もう一つの実施例の中で、（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化の手順は以下の通りである。
【００５５】
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を入れた。開始塩濃度は：０．０３ｍｏｌ／Ｌである。淡室発酵液流速：６０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：６０Ｌ／時間、単膜の電圧は０．５−１．４Ｖで、脱塩後の発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で６５℃に加熱し、１１時間濃縮し、過剰飽和させた後、濃縮後の発酵液を２５℃の水で３０℃まで冷やす。そして０℃の水で２時間、５℃まで冷ます。５倍の無水エタノールを加え、３７分間撹拌する。１０５０ｒｐｍで３７分間遠心し、同じ体積の無水エタノールにて５５ｒｐｍで、１．２時間撹拌することで、純度９３％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００５６】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化分解の手順は以下の通りである。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物をガラス容器に入れ、水に溶かし飽和溶液を生成する。濃度が１４％になるまで３７％濃塩酸を加え、９０℃で６７分間保温し、４℃まで冷やす。一晩置き、濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、９８．０％のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。白色、総収穫率は８４％だった。
【００５７】
別の実施例における（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化の手順は以下の通りである。
【００５８】
培地を遠心して得た上澄み液を電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を０．０５ｍｏｌ／Ｌとする。淡室発酵液流速：８０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：８０Ｌ／時間、単膜の電圧１．４Ｖで、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で８０℃まで加熱し、１５時間、過剰飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を２５℃の水で３５℃まで冷まし、更に０℃の水で３時間、１０℃まで冷ます。５倍の無水エタノールを加え、１時間撹拌し、１５００ｒｐｍで６０分間遠心したのち、同じ体積の無水エタノールにて１００ｒｐｍ、２時間撹拌すると、純度９５％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００５９】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解の手順は以下の通りである。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶体混交物をガラス容器に入れ、水に溶かし、飽和溶液を生成する。濃度が１６％になるまで３７％濃塩酸を加え、９０℃で９０分間保温し、４℃まで冷ます。一晩置き、濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、９８．５％のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。白色で、総収穫率は８６％である。
【００６０】
実施例２：
（１）紫外線照射による突然変異誘導
１×１０７個／ｍｌの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９懸濁液１０ｍｌを採取し直径９ｃｍの培養シャーレ内に置き、紫外線灯で２０分間、あらかじめ加熱し、培養シャーレを磁力撹拌機の上に置き、培養シャーレを１０Ｗ紫外線の真下３０ｃｍ前後の場所におく。磁力撹拌機で撹拌しながら、１５０、２００、２５０、３００秒間照射する。菌液の変異誘導後、冷蔵庫にて１−２時間遮光安置し、変異誘導後の菌種を取り出し、スタート菌種とそれぞれをキチン培地プレート上に接種し、成長速度の速いものを選択し、キチン分解圏とコロニー直径の比較値がスタート菌より１０％大きい、最大の突然変異体の酵素活性を測定する。
【００６１】
キチン培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ。
【００６２】
培養条件：ｐＨ６．５、培養温度３２℃、培養時間５時間。
【００６３】
（２）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産
実施例１で述べた発酵培養方法に基づき、紫外線照射修飾枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９突然変異体を接種し、発酵培養試験を行い、ＨＰＬＣで培養物上澄み液を分析する。結果：該当培養物を生産した培地には５．５ｇ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが含まれることが分かった。
【００６４】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌとする。淡室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、単膜の電圧０．５−１．４Ｖとし、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で５０−８０℃に加熱し、８−１５時間過剰飽和するまで濃縮し、濃縮後発酵液を２５℃の水で２５−３５℃まで冷まし、更に０℃の水で１−３時間、０−１０℃まで冷ます。その後５倍の無水エタノールを加え、１５分−１時間撹拌する。７００−１５００ｒｐｍ、１５−６０分間遠心し、同じ体積の無水エタノールで１０−１００ｒｐｍ、０．５−２時間撹拌すると、純度が９４％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００６５】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化分解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物をガラス容器に入れ、水を加えて飽和溶液を生成する。濃塩酸３７％を加えて濃度が１２−１６％になるように調整し、９０℃で４５−９０分保温する。４℃まで冷却し、一晩置き、濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、９８．０％のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。白色、総収穫率は８５％だった。
【００６６】
実施例３：
（１）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９紫外線誘導の突然異変体補料発酵試験
紫外線誘導した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９の最大の突然異変体を平板培地上で活性化させた後、培地に接種し、１８時間、３０℃恒温振とう培養し、シード液とする。接種時は１：１０の量で５０ｍｌの発酵培地に接種し、２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコに入れ、それぞれ２４時間、３６時間、４８時間、６０時間後に補料培地２．５ｍｌを追加する。
【００６７】
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ。
【００６８】
補料培地：コロイダルキチン１００ｇ／Ｌ、ブドウ糖１００ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０。
【００６９】
培養条件：ｐＨ６．５、培養温度３５℃、恒温振とう培養し、培養時間７２時間。
【００７０】
発酵終了後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心機に掛けて上澄み液を採取し、ＨＰＬＣでＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
【００７１】
（２）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産
実施例１で述べた発酵培養方法に基づき、紫外線照射修飾した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＪ０９０２５９突然変異体に対して、補料発酵試験を行い、ＨＰＬＣを利用して培養物上澄み液を分析した結果：該当培養物による培地内には２４．０ｇ／Ｌの−アセチル−Ｄ−グルコサミンが含まれていた。
【００７２】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌ、淡室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、単膜の電圧０．５−１．４Ｖ、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で５０−８０℃に加熱し、８−１５時間過剰飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を２５℃の水で２５−３５℃まで冷まし、更に０℃の水で１−３時間、０−１０℃まで冷ます。５倍の無水エタノールを加え、１５分−１時間、撹拌する。７００−１５００ｒｐｍで１５−６０分間遠心し、同じ体積の無水エタノールで１０−１００ｒｐｍ、０．５−２時間撹拌すると、純度９６％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００７３】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物を、ガラス容器に入れ、水を加えて、飽和溶液を生成する。濃塩酸（３７％）を加え濃度を１２−１６％になるようにし、９０℃で４５−９０分保温した後、４℃まで冷まして一晩寝かせ、濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、白色の９８．７％のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。総収穫率８６．５％だった。
【００７４】
実施例４：
（１）誘発剤による突然変異誘導
バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５を採取し、対数期の培養液まで活性培養し、遠心して上澄み液を除去し、細胞数が１０８個／ｍＬの菌懸濁液を生成する。それぞれ０．５ｍｌの４００、６００、８００、１０００μｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを試験管に加え、更に菌懸濁液を０．５ｍｌ、上記の各試験管に加える。混ぜ合わした後、すぐに３０℃の水で３０分保温し、（処理濃度はそれぞれ２００、３００、４００、５００μｇ／ｍＬ）希釈法で反応を止めたあと、暗所でキチン培地に希釈塗布し、３７℃で５日間培養した後、成長速度の速いものを選び、キチン溶解圏とコロニー直径比較値がスタート菌より１０％大きく、なおかつ最大の突然変異体の酵素活性を測定する。
【００７５】
（２）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産
実施例１の発酵培養方法に基づき、誘発剤で突然変異を誘発したバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５突然変異体を接種し、発酵培養試験を行う。ＨＰＬＣで培養物上澄み液を検査した結果：該当培養物の培地には３．０ｇ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが含まれていることがわかった。
【００７６】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌ、淡室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、単膜の電圧０．５−１．４Ｖ、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で５０−８０℃に加熱し、８−１５時間過剰飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液先を２５℃の水で２５−３５℃まで冷まし、更に０℃の水で１−３時間、０−１０℃まで冷ます。５倍の無水エタノールを加え１５分−１時間撹拌し、７００−１５００ｒｐｍ、１５−６０分遠心し、同じ体積の無水エタノールで１０−１００ｒｐｍ、０．５−２時間撹拌すると、純度９７％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００７７】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化分解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物をガラス容器に入れ、水を加えて、飽和溶液を生成する。濃塩酸（３７％）を加え濃度を１２−１６％に調整し、９０℃で４５−９０分保温した後、４℃まで冷ます。一晩寝かせ濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、９８．６％のＤ−グルコサミン塩酸塩の白色を得る。総収穫率は８６．６％だった。
【００７８】
実施例５：
（１）バシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５誘発剤で誘導した突然変異体の補料発酵試験
実施例４で、誘発剤で突然変異させたバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５の最大突然変異体を平板培地で活性化させ、活性化後採取し培地に接種し、３０℃恒温振とう培養し１８時間、シード液とする。接種時は１：１０の量で５０ｍｌの発酵培地を加えた２５０ｍｌバッフル付き三角フラスコ内で培養を進め、それぞれ２４時間、３６時間、４８時間、６０時間毎に補料培地２．５ｍｌを加え、発酵終了後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心機に掛けて上澄み液を採取し、ＨＰＬＣを利用してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
【００７９】
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ。
【００８０】
補料培地：コロイダルキチン１００ｇ／Ｌ、ブドウ糖１００ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０。
【００８１】
培養条件：ｐＨ６．５、培養温度３５℃、培養時間７２時間、恒温振とう培養。
【００８２】
（２）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン的生産
実施例１で述べた発酵培養方法に基づき、紫外線照射修飾したバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＪ０９１１９５突然変異体に対して、補料発酵試験を実施しＨＰＬＣを用いて培養物の上澄み液を分析した結果、該当培養物の培地には１９．０ｇ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが含まれていた。
【００８３】
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を電気透析で脱塩し、濃室缶に発酵液を加え初期塩濃度を：０．０１−０．０５ｍｏｌ／Ｌ、淡室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、濃室発酵液流速：４０−８０Ｌ／時間、単膜の電圧０．５−１．４Ｖ、脱塩した発酵液を真空条件下（０．０９５ＭＰａ）で５０−８０℃に加熱し、８−１５時間過剰飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液先を２５℃の水で２５−３５℃まで冷まし、更に０℃の水で１−３時間、０−１０℃まで冷ます。５倍無水エタノールを加え１５分−１時間撹拌する。７００−１５００ｒｐｍで１５−６０分間遠心し、同じ体積の無水エタノールで１０−１００ｒｐｍ、０．５−２時間撹拌すると、純度が９７．９％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００８４】
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物をガラス容器に入れ、水を加えて、飽和溶液を生成する。濃硫酸（３７％）で濃度が１２−１６％になるよう調整し、９０℃で４５−９０分保温した後、４℃まで冷ます。一晩寝かせ、濾過した結晶体をエタノールで洗浄、真空乾燥させて測定を行うことで、９８．８％のＤ−グルコサミン塩酸塩、白色を得る。総収穫率は８７％。
【００８５】
Ｄ−グルコサミン塩酸塩含有量ＨＰＬＣ測定条件：
機器と設備：島津ＬＣ−１５Ｃ型液体クロマトグラフィー、測定器：可変波長紫外線測定器。クロマトグラフィックカラム：ＮＨ２クロマトグラフィックカラム（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、５μｍ）、移動相：アセトニトリル−リン酸緩衝液（６０：４０）、流速：１．５ｍｌ／分、測定波超：１９５ｎｍ、カラム温：３５℃、注入量：１０μｌ。
【００８６】
一般細菌の細菌学的特徴は変化しやすく不安定なため、上記のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産できる枯草菌ＮＪ０９０２５９とバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５に対して突然変異を誘発させた。誘発方法は既知の自然突然変異方法或いは一般的な人工突然変異方法で、例えば紫外線照射、Ｘ線照射或いは誘発剤（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使って細菌菌株の突然変異を誘発させた。どれも本発明に応用できる。
【００８７】
以上に述べたのは本発明の比較的良好な結果が得られた実施例だけで、本発明を制限するものではない。本発明の初心と原則に基づき、行った如何なる改訂、同等の代替、改新などは本発明の保護範囲に入るものとする。
【００８８】
（付記）
（付記１）
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する菌株であって、その特徴は保蔵日が２０１４年１２月２９日で中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５７である一種の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株。
【００８９】
（付記２）
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、付記１に記載の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株をスタート菌種とし、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、枯草菌を得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させた枯草菌ＮＪ０９０２５９を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００９０】
（付記３）
一種の微生物が発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、付記１に記載の枯草菌ＮＪ０９０２５９菌株をスタート菌種として利用し、シード培養と最適化した培地の発酵によりＤ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、枯草菌を得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させた枯草菌ＮＪ０９０２５９を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混交物を飽和水溶液にし、濃度が１２−１６％になるまで３７％濃塩酸を加え、９０℃で４５−９０分保温し、一晩冷却し、濾過して得た結晶体をエタノールで洗浄した後、真空乾燥させて測定を行うことで、高純度のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。
【００９１】
（付記４）
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンを生産する菌株であって、その特徴は、保蔵日が２０１４年１２月２９日で中国微生物菌種保蔵委員会普通微生物センターに保蔵されている、保蔵番号がＣＧＭＣＣ１０２５８であるバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株。
【００９２】
（付記５）
一種の微生物が発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴は、付記４に記載のバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株をスタート菌種とし、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、バシラス・リケニフォルミスを得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させたバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
【００９３】
（付記６）
一種の微生物が発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法であって、その特徴として、付記４に記載のバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５菌株をスタート菌種として利用し、シード培養と最適化した培地の発酵によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産することであり、以下の工程を含む方法。
（１）菌株スクリーニング、鑑定と培養
５０単位の土壌サンプルを採取、希釈後フラットスクリーニングに塗布し、フラットスクリーニング培地を使用する。コロイダルキチン２．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、培養温度３７℃、培養時間７２時間で、培養を進め、単一コロニーを得て、コロニーを分離し、バシラス・リケニフォルミスを得て、これに対して振とう発酵培養を行い、発酵液のキチン酵素活性を測定し、酵素液が含むキチン酵素の活性に基づき菌株を選別する。
（２）発酵培養
培地上で活性化させたバシラス・リケニフォルミスＮＪ０９１１９５を採取し培地に接種し、恒温振とう培養し、シード液とし、発酵培地に接種し、恒温振とう培養し、遠心機に掛けて上澄み液を採取し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含有量を測定する。
平板培地：コロイダルキチン３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．５；
シード培地：ペプトン５．０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト５．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０−７．２；
発酵培地：コロイダルキチン１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、酵母ペースト３．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．００１ｇ／Ｌ；
発酵条件：温度３５℃、発酵時間１８時間、開始ｐＨ６．５、接種量１０％、容量５０ｍｌ／２５０ｍｌ；
（３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン発酵液の純化
培地を遠心して得た上澄み液を、電気透析で脱塩し、脱塩した発酵液を真空加熱し、飽和するまで濃縮し、濃縮後の発酵液を冷まし、そして５倍の無水エタノールで、攪拌しながら遠心し、高純度のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶を得る。
（４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸化水解
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン結晶混合物を飽和溶液にし、３７％の濃塩酸を加えて濃度が１２−１６％にし、９０℃で４５−９０分保温し、一晩冷却し、濾過して得た結晶体をエタノールで洗浄した後、真空乾燥させて測定を行うことで、高純度のＤ−グルコサミン塩酸塩を得る。
【００９４】
（付記７）
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、付記２に記載の微生物の発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産方法。
【００９５】
（付記８）
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、付記３に記載の微生物の発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法。
【００９６】
（付記９）
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、付記５に記載の微生物の発酵によってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを生産する方法。
【００９７】
（付記１０）
前記培地のカーボン源とアンモニア源は以下の通り、前記カーボン源にはブドウ糖、アスペルギルス・ニガー粉末、トリコデルマ粉末、キクラゲ生産廃棄物、キノコ生産廃棄物、果糖、蔗糖、ガラクトース、デキストリン、グリセリン、澱粉、シロップと糖蜜の一種或いは数種が含まれ、前記アンモニア源にはアンモニア水、大豆粉末、麦芽、コーンシロップ、綿実粕、酵母ペースト、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムと尿素の一種或いは数種が含まれることを特徴とする、付記６に記載の微生物の発酵によってＤ−グルコサミンを生産する方法。