(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、
前記基材の表面に形成された炭素質膜とを備え、
前記炭素質膜に含まれる水素の量は、１２原子％以上、２０原子％以下であり、
前記炭素質膜におけるｓｐ2Ｃ−Ｃ結合炭素の全炭素に対する比率は、０．４２以上、０．５２以下であり、ｓｐ2Ｃ−Ｈ結合炭素の全炭素に対する比率は、０．２０以上、０．３０以下である、インプラント。
【請求項２】
前記炭素質膜におけるｓｐ3Ｃ−Ｃ結合炭素の全炭素に対する比率は、０．１３以上、０．２６以下であり、ｓｐ3Ｃ−Ｈ結合炭素の全炭素に対する比率は、０．０５以上、０．１２以下である、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
前記炭素質膜におけるｓｐ2／ｓｐ3比は２以上、５以下である、請求項１又は２に記載のインプラント。
【請求項４】
前記炭素質膜におけるｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比は２．０以上、６．５以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項５】
前記基材は、チタン又はチタン合金からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項６】
前記基材は、人工歯根、義歯、歯冠修復物、人工骨又は人工関節である請求項１〜５のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項７】
基材の表面に誘導結合プラズマ支援マグネトロンスパッタ法により炭素質膜を形成する工程を備え、
前記炭素質膜を形成する工程において、スパッタリングガスをアルゴンと炭化水素との混合ガスとし、水素含有量が１２原子％以上、２０原子％以下で、ｓｐ2Ｃ−Ｃ結合炭素の全炭素に対する比率が、０．４２以上、０．５２以下であり、ｓｐ2Ｃ−Ｈ結合炭素の全炭素に対する比率が、０．２０以上、０．３０以下である炭素質膜を形成する、インプラントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インプラント及びその製造方法に関し、特に、人工歯根及び義歯等の骨細胞との親和性が必要なインプラント及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、人工歯根等をはじめとする生体内に埋め込むインプラントの基材として、生体適合性、耐食性及び機械的強度に優れているという理由からチタン及びチタン合金が使用されている。しかし、チタン及びチタン合金からなる人工歯根を直接顎骨に固定した場合には、顎骨の骨組織再生の代謝バランスが崩れ、人工歯根のゆるみが生じたり、顎骨破壊が生じたりするおそれがあることが知られている。
【０００３】
このような人工歯根の埋め込みが失敗する原因として、人工歯根の周囲において破骨細胞が誘導され、骨破壊が生じるインプラント周囲炎がある。インプラント周囲炎は、細菌感染等の微生物刺激及び過度の咬合力等の機械的刺激に起因する場合もあるが、人工歯根自体による破骨細胞の活性化によっても生じる。
【０００４】
人工歯根による破骨細胞の活性化は、インプラント初期埋入時にも発生する。初期埋入時に出現した破骨細胞は、インプラントのオッセオインテグレーションを妨げ、インプラントが失敗に至る原因となる。
【０００５】
このような破骨細胞の活性化は、チタン及びチタン合金が骨細胞と十分な親和性を有していないことにより生じると考えられる。骨細胞との親和性が不十分な材料の表面では、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化が促進され、これにより骨破壊が生じてしまう。チタン及びチタン合金は比較的骨細胞との親和性が高い材料であることが知られている。しかし、親和性が十分とはいえず、埋め込み対象者の顎骨の状態及び口腔内の状態等によって人工歯根の埋め込みが失敗してしまう。
【０００６】
人工歯根等のインプラントと骨細胞との親和性を向上させる方法としてダイヤモンド様薄膜（ＤＬＣ膜）による被覆が試みられている（例えば、特許文献１を参照。）。ＤＬＣ膜は、炭素を主成分とし、表面が平滑で不活性であるため生体との適合性に優れている。このため、骨細胞との親和性にも優れていると期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２０４８２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、インプラントと骨細胞との親和性は、破骨細胞の誘導抑制だけでなく、骨芽細胞への分化の促進という観点からも検討する必要がある。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制できたとしても、未熟骨芽細胞から骨芽細胞への分化が抑制されたり、骨芽細胞の増殖が阻害されたりすると、インプラントのオッセオインテグレーションは促進されない。ＤＬＣ膜が骨芽細胞への分化にどのような影響を与えるかについては、未だ明確になっていない。
【０００９】
本開示は、本願発明者らの検討により得られた骨芽細胞への分化にＤＬＣ膜が与える影響に関する知見に基づき、破骨細胞への誘導を抑制すると共に、骨芽細胞への分化を促進するインプラントを実現できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
インプラントの一態様は、基材と、基材の表面に形成された炭素質膜とを備え、炭素質膜に含まれる水素の量は、１２原子％以上、２０原子％以下である。
【００１１】
インプラントの一態様において、炭素質膜におけるｓｐ2／ｓｐ3比は２以上、５以下とすることができる。
【００１２】
インプラントの一態様において、炭素質膜におけるｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比は２．０以上、６．５以下とすることができる。
【００１３】
インプラントの一態様において、チタン又はチタン合金とすることができる。
【００１４】
インプラントの一態様において、基材は、人工歯根、義歯、歯冠修復物、人工骨又は人工関節とすることができる。
【００１５】
インプラントの製造方法の一態様は、基材の表面に誘導結合プラズマ支援マグネトロンスパッタ法により炭素質膜を形成する工程を備え、炭素質膜を形成する工程において、スパッタリングガスをアルゴンと炭化水素との混合ガスとし、水素含有量が１２原子％以上、２０原子％以下の炭素質膜を形成する。
【発明の効果】
【００１６】
本開示に係る炭素質薄膜及びその製造方法によれば、破骨細胞への誘導を抑制すると共に、骨芽細胞への分化を促進するインプラントを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】例示のインプラント用材料を示す断面図である。
【図２】成膜装置の一例を示す図である。
【図３】ＴＲＡＰの発現強度を示すグラフである。
【図４】カテプシンＫの発現強度示すグラフである。
【図５】タイプＩコラーゲンの発現強度を示すグラフである。
【図６】タイプＩコラーゲンの発現強度と水素含有量との関係を示すグラフである。
【図７】タイプＩコラーゲンの発現強度とｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比との関係を示すグラフである。
【図８】タイプＩコラーゲンの発現強度とｓｐ2／ｓｐ3比との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本実施形態においてインプラントとは、人工歯根だけでなく、義歯、歯冠修復材料及び義歯修復材料等を含む。また、歯科用だけでなく、生体内に埋め込まれる、人工骨及び人工関節等の骨細胞と親和性が必要とされる器具を含む。
【００１９】
炭素質膜とは、ダイヤモンド様膜（ＤＬＣ膜）に代表されるｓｐ2炭素−炭素結合（グラファイト結合）及びｓｐ3炭素−炭素結合（ダイヤモンド結合）を含む膜である。ＤＬＣ膜のようなアモルファス状態の膜であっても、ダイヤモンド膜のような結晶状態の膜であってもよい。
【００２０】
図１は、本実施形態に係るインプラントの断面構成を示している。基材１０の表面に膜厚が０．００５μｍ〜３μｍ程度の炭素質膜２０が形成されている。炭素質膜２０は、水素を含むＤＬＣ膜である。また、ｓｐ2炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合及びｓｐ3炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、ｓｐ2炭素−水素（Ｃ−Ｈ）結合及びｓｐ3炭素−水素（Ｃ−Ｈ）結合を含んでいる。
【００２１】
炭素質膜２０における水素含有量は、１２原子％以上、好ましくは１３原子％以上、２０原子％以下、好ましくは１８原子％以下である。炭素質膜２０における水素濃度は、実施例において詳細に述べる高分解弾性反跳粒子検出（High Resolution-Elastic Recoil Detection Analysis、ＨＲ−ＥＲＤＡ）法により測定することができる。なお、原子％とは物質全体の原子数を１００とした場合における当該元素の原子数を表す。
【００２２】
炭素質膜２０におけるｓｐ2Ｃ−Ｃ/ｓｐ3Ｃ−Ｃ比は２．０以上、好ましくは２．５以上、６．５以下、好ましくは６以下である。炭素質膜２０におけるｓｐ2／ｓｐ3比は２以上、好ましくは２．４以上、５以下、好ましくは４以下である。ｓｐ2／ｓｐ3比は、ｓｐ2Ｃ−Ｃ成分とｓｐ2Ｃ−Ｈ成分との和を、ｓｐ3Ｃ−Ｃ成分とｓｐ3Ｃ−Ｈ成分との和で割った値である。
【００２３】
炭素質膜２０におけるｓｐ2Ｃ−Ｃ結合炭素の全炭素に対する比率は、０．４２以上、好ましくは０．４５以上、０．５２以下、好ましくは０．４９以下とすることができる。炭素質膜２０における全炭素に対するｓｐ3Ｃ−Ｃ結合炭素の比率は、０．１３以上、０．２６以下とすることができる。炭素質膜２０における全炭素に対するｓｐ2Ｃ−Ｈ結合炭素の比率は０．２０以上、０．３０以下とすることができる。炭素質膜２０における全炭素に対するｓｐ3Ｃ−Ｈ結合炭素の比率は０．０５以上、０．１２以下とすることができる。
【００２４】
ｓｐ2Ｃ−Ｃ成分、ｓｐ2Ｃ−Ｈ成分、ｓｐ3Ｃ−Ｃ成分、及びｓｐ3Ｃ−Ｈ成分は、それぞれ、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法により求めた炭素の１ｓ（Ｃ１ｓ）ピークをカーブフィッティング処理して求めることができる。詳細は実施例において説明する。
【００２５】
インプラント用材料は、骨細胞との親和性が非常に重要である。骨細胞との親和性は、破骨前駆細胞から破骨細胞への誘導の抑制と、未熟骨芽細胞から骨芽細胞への分化の促進及び骨芽細胞の増殖の促進との両方の観点から評価する必要がある。
【００２６】
基材の表面に炭素質膜を形成し且つ炭素質膜に含まれる水素含有量を１２原子％以上、２０原子％以下とすることにより、破骨細胞への誘導の抑制と、骨芽細胞への分化の促進及び骨芽細胞の増殖の促進とを実現することができることを本願発明者らは見出した。
【００２７】
炭素質膜の水素含有量を適切な値とすることにより、炭素質膜が吸着水を補足しやすくなり、骨芽細胞への分化の促進及び骨芽細胞の増殖の促進と、破骨細胞への誘導の抑制とが生じやすくなると考えられる。
【００２８】
炭素質膜は、ｓｐ2Ｃ−Ｃ成分の比率を高くし、ｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比を２．０以上、６．５以下とすることができる。これにより、骨芽細胞への分化の促進及び骨芽細胞の増殖の促進と、破骨細胞への誘導の抑制という効果をより高くすることができる。また、ｓｐ2／ｓｐ3比が比較的高い炭素質膜を用いることにより、基材と炭素質膜との密着性が向上するという利点も得られる。
【００２９】
本実施形態のインプラント用材料は基材の表面を炭素質膜によって覆うため、基材がどのような材質であっても優れた骨組織との親和性を示す。このため、基材は強度等の特性を満たしていればどのような材質であってもよい。例えば、チタン及びチタン合金等をはじめとする金属、樹脂又はセッラミック等を用いることができる。また、人工歯根をはじめ、義歯、人工骨及び人工関節等の骨細胞と親和性が必要とされる種々のインプラントに適用することが可能である。
【００３０】
炭素質膜は、特に限定されず、化学気相堆積法（ＣＶＤ法）、スパッタ法、プラズマイオン注入法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、イオンビーム蒸着法及びレーザーアブレーション法等により形成することができる。中でも、スパッタ法が好ましく、誘導結合型放電プラズマ（ＩＣＰ）支援パルスマグネトロンスパッタ法がより好ましい。スパッタ法の場合には、スパッタリング用のプロセスガスに炭化水素を加えることにより、水素を含む炭素質膜を成膜できる。炭化水素は特に限定されないが、沸点が低いものが好ましい。具体的には、メタン、エタン、プロパン、アセチレン、ベンゼン等を用いることができる。また、フッ素と水素とを含むフルオロカーボン等を用いることもできる。炭化水素の炭素と水素との構成比率を変えることにより、炭素質膜の水素含有量を容易に制御することができる。
【００３１】
図２はＩＣＰ支援パルスマグネトロンスパッタ装置の一例を示している。図２に示すように、チャンバ２２１の下部に磁石を内蔵したターゲット台２１１が設けられ、ターゲット台２１１の上にターゲット２０７が配置されている。チャンバ２２１の上方には、電気的に浮いた（フローティング）状態であり、バイアス電圧を印加できるワークホルダ２１０が設けられ、ワークホルダ２１０にはワーク２０８が保持されている。ターゲット台２１１の内部にはターゲット２０７の中心部と対応する位置に中心磁石２０１が配置され、ターゲット２０７の周囲と対応する位置には外周磁石２０２が等間隔で配設されている。中心磁石２０１はＳ極をターゲット２０７側にして配置されており、外周磁石２０２はＮ極をターゲット２０７側にして配置されている。
【００３２】
チャンバ２２１の外壁の外側には、４つの外周磁石のそれぞれに対応して４つの第１外部磁石２０３及び４つの第２外部磁石２０４が重なるように配設されている。第１外部磁石２０３及び第２外部磁石２０４は、それぞれＮ極を中心磁石２０１側にして配置されている。第１外部磁石２０３及び第２外部磁石２０４はそれぞれ補助磁石として機能する。
【００３３】
チャンバ２２１の内部には、補助電極として機能するコイル２０５が設けられている。これによりプロセスガスを効率良くプラズマ化することができる。コイル２０５は、スパイラル状に巻かれ、一端がマッチング回路２１２を介して高周波電源２１３と接続されている。図２においては、コイル２０５の他端はフリーでどこにも接続されてないが、アース又は高周波電源と接続されていてもよい。
【００３４】
ターゲット台２１１には、ローパスフィルター２１４を介してスパッタ電源２１５が接続されている。ワークホルダ２１０には、ローパスフィルター２１６を介してバイアス電源２１８が接続されている。スパッタ電源２１５にはパルス電源を用いることができる。
【００３５】
基材の表面に形成する炭素質膜の厚さは特に限定されるものではないが、好ましくは０．００５μｍ〜３μｍ、より好ましくは０．０１μｍ〜１μｍの範囲である。
【００３６】
また、炭素質膜は基材の表面に直接形成することができるが、基材と炭素質薄膜とをより強固に密着させるために、基材と炭素質薄膜との間に中間層を設けてもよい。中間層の材質としては、基材の種類に応じて種々のものを用いることができるが、珪素（Ｓｉ）と炭素（Ｃ）、チタン（Ｔｉ）と炭素（Ｃ）又はクロム（Ｃｒ）と炭素（Ｃ）からなるアモルファス膜等の公知のものを用いることができる。その厚さは特に限定されるものではないが、好ましくは０．００５μｍ〜０．３μｍ、より好ましくは０．０１μｍ〜０．１μｍの範囲である。中間層は、例えば、スパッタ法、ＣＶＤ法、プラズマＣＶＤ法、溶射法、イオンプレーティング法又はアークイオンプレーティング法等を用いて形成すればよい。中間層は炭素質膜と異なる方法で成膜してもよいが、同じ方法で成膜すれば、１つの成膜装置で中間層と炭素質膜とを連続して成膜することができる。
【００３７】
炭素質膜は、炭素と水素以外にシリコン（Ｓｉ）又はフッ素（Ｆ）等が添加されていてもよい。また、酸素又は窒素等の原子が導入されていてもよい。但し、炭素と水素以外の元素が含まれていない構成とすることができる。なお、ここでいう他の元素を含まない構成とは、意図せずに混入する不純物が含まれている構成を含む。
【００３８】
以下に、本実施形態のインプラント用材料について実施例を用いてさらに詳細に説明する。
【００３９】
＜基材＞
炭素質膜を形成する基材として、純チタン（ＪＩＳ２種）からなる直径２０ｍｍのディスクを用いた。
【００４０】
＜スパッタ法＞
図２に示すＩＰＣ支援パルスマグネトロンスパッタ装置を用いた。ターゲットは、グラファイトとした。補助電極に印加する高周波電力は２０Ｗとし、周波数は１３．５６ＭＨｚとた。
【００４１】
まず、基材の表面に１０〜２０ｎｍの中間層を形成した。中間層は、シリコン含有ＤＬＣ（Ｓｉ−ＤＬＣ）膜とした。中間層を成膜する際は、チャンバ内にテトラメチルシラン（Ｓｉ（ＣＨ3）4）ガスを０．３Ｐａとなるように導入した。ターゲットには−２ｋＶの直流電圧を印加した。
【００４２】
次に、炭素質膜としてＤＬＣ膜を成膜した。ＤＬＣ膜を成膜する際は、チャンバ内にプロセスガスとしてアルゴン又はアルゴンと炭化水素との混合ガスを０．５Ｐａとなるように導入した。混合ガスの場合、アルゴンと炭化水素との分圧は１／９とした。ターゲットには、２００ｋＨｚ又は３５０ｋＨｚの直流パルス電圧を印加した。基材には−１００Ｖのバイアス電圧を印加した。成膜時間は６０分とした。
【００４３】
＜ＣＶＤ法＞
プラズマＣＶＤ装置を用いた。まず、基材の表面に中間層を形成した。中間層はＳｉ−ＤＬＣ膜とした。中間層の形成にはＳｉ（ＣＨ3）4を用いた。次に、ＤＬＣ膜を形成した。プロセスガスにはベンゼン（Ｃ6Ｈ6）を用いた。成膜時のチャンバ内の圧力は０．２Ｐａとし、基材のバイアス電圧は−２ｋＶとした。フィラメント電力は３００Ｗとした。
【００４４】
＜水素含有量の評価＞
ＤＬＣ膜中の水素含有量は、高分解能ラザフォード後方散乱分析装置（神戸製鋼所製HRBS-500）を用いた高分解弾性反跳粒子検出（ＨＲ−ＥＲＤＡ）法により行った。ＤＬＣ膜の表面にＮ2+イオンを衝突させ、水素原子の散乱を半導体検出器により検出した。イオンは、１原子核当たりのエネルギーを２４０ｋｅＶとし、試料面の法線に対して７０°の角度で入射させた。検出の散乱角は３０°とした。
【００４５】
得られたデータに対して水素ピークにおける高エネルギー側のエッジの中点を基準として横軸のチャネルを反跳イオンのエネルギーに変換する処理及びシステムのバックグラウンドを差し引く処理を行った。処理後のデータについてシミュレーションフィッテングを行い、３ｎｍ〜５ｎｍまでの範囲について水素のデプスプロファイルを求めた。さらに、ＤＬＣ膜に含まれる全原子に対する水素原子の割合（原子％）に換算した。この際に試料の構成元素は炭素と水素のみであると仮定した。デプスプロファイルの横軸をｎｍ単位に換算する際には、ＤＬＣ膜の密度はグラファイトの密度（２．２５ｇ／ｃｍ3）であるとした。定量値は、スパッタリング法により形成した既知濃度のＤＬＣ膜を測定することにより校正した。また、最表面に炭化水素からなる汚染層の存在を仮定した。汚染層の密度はパラフィンの密度（０．８９ｇ／ｃｍ3）とした。
【００４６】
＜炭素組成の評価＞
ＤＬＣ膜の炭素組成は、Ｘ線光電子分光法により測定した。測定には、日本電子製のＸＰＳ装置ＪＰＳ９０１０を用いた。ＸＰＳ測定の条件は、試料に対する検出角度を９０度とし、Ｘ線源にはＡｌを用い、Ｘ線照射エネルギーを１００Ｗとした。１回の測定時間は０．２ｍｓとし、１つの試料について３２回測定を行った。炭素中を進む光電子の非弾性平均自由工程を考慮すると、表面から９ｎｍまでの範囲について測定されると考えられる。さらに、光電子は表面から深くなるにつれて脱出しにくくなり、光電子の検出は表面から深くなるほど減衰する。従って、今回測定された情報の５０％は表面からおよそ１．５ｎｍまでの最表層の情報で占められていると考えられる。
【００４７】
得られた炭素１ｓスペクトルをカーブフィッティングによりｓｐ2Ｃ−Ｃ結合成分、ｓｐ3Ｃ−Ｃ結合成分、ｓｐ2Ｃ−Ｈ結合成分、ｓｐ3Ｃ−Ｈ結合成分に分割し、ピーク面積を求めた。各成分のピーク面積を炭素１ｓの総ピーク面積で割った値を、各成分の存在比とした。ｓｐ2Ｃ−Ｃ結合成分の存在比と、ｓｐ2Ｃ−Ｈ結合成分の存在比との和をｓｐ2成分存在比とし、ｓｐ3Ｃ−Ｃ結合成分の存在比と、ｓｐ3Ｃ−Ｈ結合成分の存在比との和をｓｐ3成分存在比とした。ｓｐ2成分存在比をｓｐ3成分存在比で割った値を、ｓｐ2／ｓｐ3比とした。
【００４８】
カーブフィッティングの際には、ｓｐ2Ｃ−Ｃ結合のピーク位置を２８４．２ｅＶ〜２８４．３ｅＶ、ｓｐ3Ｃ−Ｃ結合のピーク位置を２８３．７ｅＶ〜２８３．８ｅＶ、ｓｐ2Ｃ−Ｈ結合のピーク位置をｐ２８５．３ｅＶ〜２８５．４ｅＶ、ｓｐ3Ｃ−Ｈ結合のピーク位置を２８４．７ｅＶ〜２８４．８ｅＶとした。
【００４９】
＜適合性の評価＞
−骨破壊細胞分化の評価−
直径２０ｍｍのウェル内において試料と破骨前駆細胞とを破骨細胞分化誘導因子（Receptor Activator of NF-kB Ligand：ＲＡＮＫＬ）の存在下において接触させ、細胞培養した。破骨前駆細胞は、ＲＡＮＫＬの存在により破骨細胞へと分化することが確立されているセルラインRAW264.7細胞 (TIB-71, ATCC)を用いた。細胞は１ウェル当たり５×１０4個播種した。培養培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１．５ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム及び５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ（PeproTech社製：ｓＲＡＮＫＬ）を添加したα変法イーグル培地（α−ＭＥＭ）を用いた。培養温度は３７℃とし、５％二酸化炭素雰囲気で培養した。
【００５０】
細胞を３日間培養した後、分化関連遺伝子である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｔｒａｐ）及びカテプシンＫ（cathepsin K）の発現を定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて定量することにより、破骨細胞への分化を評価した。βアクチンを内部標準遺伝子として用いて相対定量した。
【００５１】
−骨芽細胞分化の評価−
直径２０ｍｍのウェル内において試料とマウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（以下、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞という。）とを接触させて培養した。細胞は１ウェル当たり５×１０4個播種した。培養培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、混合抗生物質（Invitrogen社製）及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を添加したα変法イーグル培地（α−ＭＥＭ）を用いた。培養温度は３７℃とし、５％二酸化炭素雰囲気で培養した。
【００５２】
細胞を３日、７日及び１４日間培養した後、骨分化マーカー遺伝子であるタイプＩコラーゲン（ＣｏＩ−Ｉ）の発現について評価した。具体的には、培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞からTRIzol試薬（Invitrogen社製）を用いてＲＮＡを抽出した後、ReverTra Ace reverse transcriptase（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを作成した。作成したｃＤＮＡを、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Rela-time Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）法により評価した。βアクチンを内部標準遺伝子として用いて相対定量した。
【００５３】
（実施例１）
スパッタ法により基材の表面にＤＬＣ膜を成膜した。プロセスはアルゴンと炭化水素との混合ガスとした。炭化水素はメタン（ＣＨ4）とした。スパッタ電源にはパルス電源を用いパルス周波数は２００ｋＨｚとした。水素含有量は１７．８原子％であった。
【００５４】
（実施例２）
プロセスガスに用いる炭化水素をアセチレン（Ｃ2Ｈ4）とした他は実施例１と同様にしてＤＬＣ膜を成膜した。水素含有量は１３．５原子％であった。
【００５５】
（比較例１）
ＤＬＣ膜を成膜していない基材を比較例１とした。
【００５６】
（比較例２）
ＣＶＤ法により基材の表面にＤＬＣ膜を成膜した。水素含有量は２０．９原子％であった。
【００５７】
（比較例３）
プロセスガスをアルゴンガスとし、パルス周波数を３５０Ｈｚとした他は実施例１と同様にしてＤＬＣ膜を成膜した。水素含有量は１．１原子％であった。
【００５８】
（比較例４）
プロセスガスをアルゴンガスとした他は実施例１と同様にしてＤＬＣ膜を成膜した。水素含有量は０．８原子％であった。
【００５９】
表１に各実施例及び比較例の製造条件、水素含有量及び炭素組成をまとめて示す。プラズマＣＶＤにより成膜した比較例２は水素含有量が高く、成膜時に炭化水素を供給していない比較例３及び４は水素含有量が低くなっている。また、水素含有量が高くなるほど、ｓｐ2／ｓｐ3存在比が大きくなった。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
図３及び図４は、それぞれ破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ及びカテプシンＫ遺伝子の発現を示している。縦軸は比較例１の値を１として規格化している。ＤＬＣ膜を形成した実施例１及び２並びに比較例２〜４は、ＤＬＣ膜を形成していない比較例１と比べ、ＴＲＡＰ及びカテプシンＫの発現が抑えられている。
【００６２】
図５は、骨分化マーカーであるタイプＩコラーゲンの発現を示している。縦軸は培養３日目の比較例１の値を１として規格化している。培養７日目までは、各実施例及び比較例の間でタイプＩコラーゲンの発現に大きな差は認められない。しかし、培養１４日目には、水素含有量が高いＤＬＣ膜を形成した実施例１（発現強度８．５）及び２（発現強度６．１）並びに比較例２（発現強度４．５）において、ＤＬＣ膜を形成していない比較例１よりもタイプＩコラーゲンの発現が高くなったのに対し、水素含有量が低いＤＬＣ膜を形成した比較例３（発現強度２．０）及び４（発現強度０．５）においては、比較例１（発現強度３．５）よりもタイプＩコラーゲンの発現が低くなった。特に、タイプＩコラーゲンの発現は、実施例１及び２において特に高くなった。
【００６３】
図６は、ＤＬＣ膜の水素含有量と、タイプＩコラーゲンの発現との関係を示している。水素含有量が１２原子％以上、２０原子％以下の範囲において、培養１４日目のタイプＩコラーゲンの発現強度は６を越えている。
【００６４】
図７は、ＤＬＣ膜のｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比と、タイプＩコラーゲンの発現との関係を示している。ｓｐ2Ｃ−Ｃ／ｓｐ3Ｃ−Ｃ比を２．０以上、６．５以下の範囲において、培養１４日目のタイプＩコラーゲンの発現強度は６を越えている。
【００６５】
図８は、ＤＬＣ膜のｓｐ2／ｓｐ3比と、タイプＩコラーゲンの発現との関係を示している。ｓｐ2／ｓｐ3比が２以上、５以下の範囲において、培養１４日目のタイプＩコラーゲンの発現強度は６を越えている。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明に係るインプラント用材料及びその製造方法は、破骨細胞への誘導を抑制すると共に、骨芽細胞への分化を促進するインプラント用材料を実現でき、特に、人工歯根及び義歯等の骨細胞との親和性が必要な歯科用材料及びその製造方法等として有用である。
【符号の説明】
【００６７】
１０        基材
２０        炭素質膜
２０１      中心磁石
２０２      外周磁石
２０３      第１外部磁石
２０４      第２外部磁石
２０５      コイル
２０７      ターゲット
２０８      ワーク
２１０      ワークホルダ
２１１      ターゲット台
２１２      マッチング回路
２１３      高周波電源
２１４      ローパスフィルター
２１５      スパッタ電源
２１６      ローパスフィルター
２１８      バイアス電源
２２１      チャンバ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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