(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
前記センス鎖は、
５’  ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵ  ３’のヌクレオチド配列を含み；
前記アンチセンス鎖は、
３’  ＣＵＧＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＵＡＧＡＡ  ５’のヌクレオチド配列を含み；
前記オリゴヌクレオチドは、以下の群から選択される２’−Ｏ−メチル修飾を含む；
ヌクレオチド配列  ５’  ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡｍＧＵＵＣＡＵＣＵＵ  ３’を含むセンス鎖；および
ヌクレオチド配列  ３’  ＣＵＧｍＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＵＡＧＡＡ  ５’を含むアンチセンス鎖；
［ここで、インデックスｍが付いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化されている］
を含む、オリゴヌクレオチドｓ１５／ａｓ３；
ヌクレオチド配列  ５’  ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡｍＵＣＵＵ  ３’を含むセンス鎖；および
ヌクレオチド配列  ３’  ＣＵＧｍＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＵＡＧＡＡ  ５’を含むアンチセンス鎖；
［ここで、インデックスｍが付いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化されている］
を含む、オリゴヌクレオチドｓ２０／ａｓ３；および
ヌクレオチド配列  ５’  ＧＡＣｍＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵ  ３’を含むセンス鎖；および
ヌクレオチド配列  ３’  ＣＵＧＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧｍＵＡＧＡＡ  ５’を含むアンチセンス鎖；
［ここで、インデックスｍが付いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化されている］
を含む、オリゴヌクレオチドｓ３／ａｓ１９；
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの１つの５’末端に少なくとも１つの三リン酸をさらに含み、および、２’−フルオロおよびホスホチオエート結合からなる群から選択される少なくとも１つの修飾をさらに含む、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端に少なくとも１つの三リン酸を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドはホスホチオエート結合修飾をさらに含み、
ヌクレオチド配列  ５’  ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡｍＧＵＵＣＡＵＣＰＴＯＵＰＴＯＵ  ３’を含むセンス鎖；および
ヌクレオチド配列  ３’  ＣＵＧｍＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＵＡＧＰＴＯＡＰＴＯＡ  ５’を含むアンチセンス鎖；
［ここで、インデックスｍが付いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化されており；
２つのヌクレオチドの間のインデックスＰＴＯは、前記の２つのヌクレオチドがホスホチオエート結合によって連結されていることを示し；および、
前記センス鎖は、５’末端に三リン酸を含む］
を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドであって、
前記オリゴヌクレオチドはホスホチオエート結合修飾、および、２’−フルオロ修飾をさらに含み、
ヌクレオチド配列  ５’  ＧＡＣＧＣＵＧｆＡＣＣＣＵＧＡＡｍＧＵＵＣＡＵＣＰＴＯＵｆＰＴＯＵ  ３’を含むセンス鎖；および
ヌクレオチド配列  ３’  ＣＵＧｍＣＧＡＣＵＧＧＧＡＣｆＵＵＣＡＡＧＵＡＧＰＴＯＡＰＴＯＡ  ５’を含むアンチセンス鎖；
［ここで、インデックスｍが付いたヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化されており；
インデックスｆが付いたヌクレオチドは２’−フルオロであり；
２つのヌクレオチドの間のインデックスＰＴＯは、前記の２つのヌクレオチドがホスホチオエート結合によって連結されていることを示し；および、
前記センス鎖は、５’末端に三リン酸を含む］、
を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む、
医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、皮下、皮内または髄腔内に投与される、
医薬組成物。
【請求項７】
請求項６の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、皮内に投与される、
医薬組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、タトゥーイング、マイクロニードルおよび／またはマイクロニードルパッチによって、皮内に投与される、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＩＧ−Ｉリガンドとして作用し得る新規の三リン酸修飾オリゴヌクレオチド、ならびに、医薬用途に適切な高い収率および純度での合成および精製が可能な新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｃｈｌｅｅら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００９，３１，２５−３４）は、一方の鎖に、ＲＩＧ−Ｉヘリカーゼを結合することによって免疫系の強力な刺激因子として作用する５’−Ｏ−三リン酸部分を有する平滑末端二本鎖ＲＮＡを開示している。このように、医薬用途に適切な三リン酸修飾オリゴヌクレオチドを高純度で調製するための単純かつ効率的な方法の提供が必要とされている。
【０００３】
ヌクレオシド化合物の５’−ＯＨ基への、三リン酸基またはそのアナログのカップリングは、当技術分野でよく知られている。Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ．ら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４，６３１−６３５）は、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンをホスファイト化剤（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として用いた、ヌクレオシドの５’−Ｏ−三リン酸およびアナログを調製するための溶液三リン酸化の方法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を開示している。Ｇａｕｒ  Ｒ．Ｋ．ら（１９９２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３，３３０１−３３０４）は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド５’−Ｏ−三リン酸およびそのＰα−チオアナログの合成のための、固相上での前記方法の使用を開示している。米国特許第６，９００，３０８号Ｂ２には、潜在的な抗ウイルス化合物としての修飾ヌクレオシド５’−Ｏ−三リン酸の固相合成が開示され、米国特許第７，２８５，６５８号、第７，５９８，２３０号および第７，８０７，６５３号には、糖中、核酸塩基中、および三リン酸物質（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｅｎｔｉｔｙ）中に、修飾を有するヌクレオシドの三リン酸アナログが開示されている。
【０００４】
ＷＯ９６／４０１５９は、キャップ化ＲＮＡまたはＲＮＡアナログ分子を生産する方法を開示し、ここで、ＲＮＡまたはＲＮＡアナログオリゴヌクレオチドは、ホスファイト化剤、例えば２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンまたはその環置換誘導体と反応する。生じる中間体は、リン酸またはピロリン酸またはそれらの塩と反応し、酸化され、または加水分解される。二リン酸化または三リン酸化ＲＮＡまたはＲＮＡアナログは、活性化されたｍ７Ｇ三リン酸、二リン酸または一リン酸またはアナログとの反応によりキャップ化される。
【０００５】
ＷＯ２００９／０６０２８１には、修飾オリゴリン酸部分を含む免疫刺激オリゴリボヌクレオチドアナログ、およびそのような化合物の調製方法が開示されている。この方法は、固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成を含み、ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの５’末端で、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンなどのホスファイト化剤と適切な溶媒中かつ塩基存在下で反応させ、ホスファイト化オリゴヌクレオチドをピロリン酸またはピロリン酸アナログと反応させ、酸化剤を用いてオリゴヌクレオチドを酸化し、そして、オリゴヌクレオチドを脱保護して三リン酸または三リン酸アナログ−修飾オリゴヌクレオチドを得る。
【０００６】
ＷＯ９６／４０１５９で用いられるポリアクリルアミドゲル電気泳動は、小スケールの分離にのみ適用できる。より長いオリゴリボヌクレオチドの５’一リン酸化、二リン酸化、三リン酸化産物に関するイオン交換クロマトグラフィーの分離能は制限される。要求される変性条件は、分離を煩わしい作業にし（Ｓｐｒｏａｔ，１９９９；Ｚｌａｔｅｖ，２０１０；ＷＯ２００９／０６０２８１）、さらに、産物は通常、ｎ−１、ｎ−２配列が混入しており、そして、それらの一リン酸および二リン酸は、不十分な純度をもたらす。ＲＩＧ−Ｉリガンドの正確な末端構造に対する感受性があるとすれば、これらの精製方法は、薬理学的適用に最適以下であろう。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、新規の三リン酸化オリゴヌクレオチドおよびそのアナログ（特にＲＩＧ−Ｉ選択性を有する）、ならびに、そのような化合物を調製する方法に対する高い必要性がある。
【０００８】
したがって、本発明は、潜在的な臨床用途のために大スケールで生産することのできる、新規の５’−三リン酸化オリゴヌクレオチドおよびそのアナログ、ならびに、そのようなオリゴヌクレオチドの便利な調製方法に関する。さらに、オリゴヌクレオチドのＲＩＧ−Ｉ選択性を確立、維持および／または改善する、またはそれらの化学的安定性を高める、オリゴヌクレオチドの修飾を開示する。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、式（Ｉ）
【化１】
0006313768.tif 000002
の修飾オリゴヌクレオチドに関し、
ここで、Ｖ１、Ｖ３およびＶ５は、それぞれ独立にＯ、ＳおよびＳｅから選択され；
Ｖ２、Ｖ４およびＶ６はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、ＳＲ１、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２およびＢＨ３−Ｍ＋から選択され、
Ｗ１はＯまたはＳであり、
Ｗ２はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ２であり、
Ｗ３はＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＨａｌまたはＣ（Ｈａｌ）２であって、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−６アシルまたは環状基から選択され、それぞれ場合により置換され、
または、ここで、２つのＲ１は、それに結合したＮ原子と共に環を形成していてもよく、
Ｍ＋はカチオンであり、
ＸはＮＨ、ＮＲ３、ＯまたはＳであり、
ＺはキャプチャータグまたはＨを表し、
Ｙは、前記キャプチャータグをＸに連結する結合またはリンカーを表し、および
ＯＮは、少なくとも４つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックを含むオリゴヌクレオチドを表す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】オリゴヌクレオチド三リン酸エステル誘導体に関する合成方法の概略概要を示す。
【図２】デシル−Ｏ−ｐｐｐＲＮＡの２４ｍｅｒ合成（ＲＮＡ配列：５’−ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵ）のＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ分析を示す。  （Ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル：    ａ）４８％デシル−Ｏ−ｐｐｐＲＮＡを含む未精製の反応混合物（ＲＴ＝１４分）    ｂ）純粋デシル−Ｏ−ｐｐｐＲＮＡ        カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ４．１×２５０、１０μｍ        グラジエント：０〜１００％  Ｂ，１８分中、Ａ＝１００ｍＭ  ＴＥＡＢ；Ｂ＝８０％メタノール、１００ｍＭ  ＴＥＡＢ  （Ｂ）ＲＰ−ＬＣ／ＭＳを用いて記録した純粋デシル−Ｏ−ｐｐｐＲＮＡのＥＳＩ−ＭＳプロファイル（分子量計算値：７９８７、計測値：７９６８）
【図３】デシル−Ｏ−ｐｐｐＲＮＡの１μｍｏｌスケール反応のセミ分取スケールのＲＰ−ＨＰＬＣ精製を示す：デシルタグ化は、合成失敗配列、全長の非リン酸化ＯＨ−ＲＮＡおよび非誘導体化ｐｐｐＲＮＡを含む、タグ化されていない副産物から、目的産物（画分３）を効率的に分離することを可能にする。  カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ７×２５０ｍｍ、１０μｍ  グラジエント：０〜８０％  Ｂ  ５０分中、Ａ＝１００ｍＭ  ＴＥＡＢ；Ｂ＝８０％メタノール、１００ｍＭ  ＴＥＡＢ。
【図４】Ｙの特に好ましい実施態様である。
【図５】２’−Ｏ−メチル化のスクリーニングは、ＲＩＧ−Ｉ選択性を導入する位置を決定する。
【図６】メチル化は、デュプレックスを、ＲＩＧ−Ｉ特異性および高活性にさせる。
【図７】末端ホスホロチオエートは、選択的なデュプレックスの免疫原性を増大させる。
【図８】選択した２’−フルオロ−置換は、デュプレックスのＲＩＧ−Ｉ活性化能力を増大させる。
【図９】ＯＨ  ｄｓ−ＲＮＡ  ＯＨ−ＧＦＰ２の多重修飾パターンは、ＲＩＧ−Ｉ活性化能力の強力な亢進を導く。
【図１０】骨格修飾による免疫原性の亢進は、三リン酸化デュプレックスに移行可能である。
【図１１】求核開環試薬としてのアルキルポリエチレングリコール類の例としてジエチレングリコールモノブチルエーテルを用いた、本発明の方法の概略概要を示す。
【図１２】４５％  Ｃ４−ＤＥＧ−ｐｐｐＲＮＡ（８８．４ｍｌのグラジエント容量でピーク）および５０％  ｐｐｐＲＮＡ（７７．５ｍｌでピーク）を含むＣ４−ＤＥＧ−ｐｐｐＲＮＡ未精製反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣ精製。カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ７×２５０ｍｍ、１０μｍ  流速３ｍｌ／分。  グラジエント：１〜８０％  Ｂ  ５０分中、Ａ＝０．１Ｍ  ＴＥＡＢ；Ｂ＝８０％メタノール０．１Ｍ  ＴＥＡＢ
【図１３】ＨＰＬＣ精製後のＣ４−ＤＥＧ−ｐｐｐＲＮＡに対応するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。正確な質量ピークはｍ／ｚ  ７９７２．６（Ａ）に見られる。
【図１４】脂溶性ポリエーテル複合タグを用いた、ｐｐｐＲＮＡの合成スキームを示す。
【図１５】図１４に関するＨＰＬＣ精製およびＭＡＬＤＩのデータを示す。（ＲＮＡ配列：５’−ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵ）  （Ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ精製：  Ｃ１１−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨｐｐｐＲＮＡ  カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ４．１×２５０ｍｍ、１０μｍグラジエント：０〜８０％Ｂ  ５０分中、；Ａ＝１００ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝８０％メタノール、１００ｍＭ  ＴＥＡＢ  （Ｂ）脱塩後に未精製反応混合物から記録したＭＡＬＤＩスペクトルは、Ｃ１１−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨｐｐｐＲＮＡの存在を示す（Ｍｗ８２１４、８）。  （Ｃ）精製Ｃ１１−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨｐｐｐＲＮＡのｐＨ＝３．８加水分解産物のＭＡＬＤＩスペクトル（Ｍｗ７８３２．６）
【図１６】コレステリルタグ化ｐｐｐＲＮＡの合成スキームを、対応するｐｐｐＲＮＡへの随意的な切断とともに示す。
【図１７】コレステリルタグ化ｐｐｐＲＮＡ（ＲＮＡ配列：５’−ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵ）の精製および分析を示す：  （Ａ）コレステリル−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−ＮＨ−ｐｐｐ−ＲＮＡのＲＰ−ＨＰＬＣ精製。カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ４．１×２５０ｍｍ、１０μｍ  グラジエント：０〜１０％Ｂ  ５分中、１０％Ｂ  ９分間、１０〜１００％Ｂ  ３３分中；Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝９５％メタノール、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ  （Ｂ）純粋コレステリル−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−ＮＨ−ｐｐｐ−ＲＮＡのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。  カラム：Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ４．１×２５０ｍｍ、１０μｍ  グラジエント：０〜１００％Ｂ  １８分中、１００％Ｂ  ４分間；Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝９５％メタノール、５０ｍＭ  ＴＥＡＢ  （Ｃ）純粋コレステリル−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−ＮＨ−ｐｐｐ−ＲＮＡのＭＡＬＤＩスペクトル。  ｐｐｐＲＮＡピーク（７８２７．３Ｄａ）は、イオン化過程中のＰＮ−切断に起因する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本出願の文脈において、複数の、例えば少なくとも４つの、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックを含む、化合物を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、６〜１００個、例えば２０〜４０個のビルディングブロックを含む。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックは、サブユニット間結合により連結されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログサブユニットを含んでよい。ヌクレオシドサブユニットは、デオキシリボヌクレオシドサブユニット、リボヌクレオシドサブユニットおよび／またはそれらのアナログ、特に糖−および／または核酸塩基−修飾のヌクレオシドアナログを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドのビルディングブロック、および／または、さらなる末端および／または側鎖の修飾を含んでよい。
【００１２】
好ましい糖修飾サブユニットでは、リボヌクレオシドサブユニットの２’−ＯＨが、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基で置換されていて、ここで、ＲはＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルまたはＣ２−６アルキニルであり、ハロゲンはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。さらに好ましい糖修飾サブユニットでは、リボースが、例えば別の糖により、例えばアラビノースなどのペントースにより、置換されてよい。この糖修飾は、例えば２’−フルオロアラビノヌクレオシドサブユニットでの上述の２’−ＯＨ修飾と組み合わせてよい。さらにより好ましい糖修飾サブユニットは、ロック化ヌクレオシド（ＬＮＡ）または２’，３’−セコ−ヌクレオシド（ＵＮＡ）を含む。好ましい核酸塩基修飾ヌクレオシドビルディングブロックでは、非標準的な、例えば天然起源でない核酸塩基が、標準的な核酸塩基の代わりに用いられる。非標準的な核酸塩基の例は、５位が修飾されたウラシル類またはシトシン類、例えば５−（２−アミノ）プロピルウラシルまたは５−ブロモウラシル；ヒポキサンチン；２，６−ジアミノプリン；８位が修飾されたアデニン類またはグアニン類、例えば８−ブロモグアニン；デアザヌクレオシド類、例えば７−デアザグアニンまたは７−デアザアデニン；またはＯ−およびＮ−アルキル化核酸塩基、例えばＮ６−メチルアデニン、またはＮ６，Ｎ６−ジメチルアデニンである。さらに適切な核酸塩基アナログは、５−ニトロインドールなどのユニバーサルな核酸塩基アナログから選択してよい。
【００１３】
サブユニットの間の、サブユニット間結合は、ホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、または当業者に公知の他の修飾結合であってよい。
【００１４】
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログから選択してよい。デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドアナログは、前記のアナログ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの、ヌクレオシドおよび／またはリボースサブユニットで、化学修飾されてよい。デゾキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのアナログは、少なくとも１つのデゾキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドサブユニットおよび少なくとも１つの修飾ヌクレオシドサブユニット、および／または、例えば上述の少なくとも１つの修飾サブユニット間結合を含んでよい。オリゴヌクレオチドアナログは、その全体が修飾ヌクレオシドサブユニットから構成されてもよい。
【００１５】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖分子または二本鎖分子であってよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、完全または部分的な相補鎖を含んでよい。二本鎖分子は、平滑末端であってよく、または、少なくとも１つの突出、例えば５’−または３’−突出を含んでよい。突出は、存在する場合は、好ましくは、分子の遠位端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）に位置する。また、二本鎖オリゴヌクレオチドはヘアピン構造を含んでもよく、その場合、デュプレックスは、その遠位端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）でループにより閉じている。ループは、ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドビルディングブロック、例えばジオールに基づくビルディングブロック、例えばトリ（エチレン）グリコールまたはヘキサ（エチレン）グリコールなどのエチレングリコール部分；プロパン−１，３−ジオール；ドデカン−１，１２−ジオール；または３，１２−ジオキサ−７，８−ジチアテトラデカン−１，１４−ジオールを含んでよい。
【００１６】
好ましい実施態様では、二本鎖分子は、特にその近位端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）が平滑末端である。
【００１７】
特に好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、二本鎖の各鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さを有する。そのような長さの、平滑末端の二本鎖オリゴヌクレオチドが、特に好ましい。さらに好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチドの各鎖は、少なくとも１９〜５０個のヌクレオチド、１９〜３０個のヌクレオチド、２０〜３０個のヌクレオチド、２２〜２８個のヌクレオチド、特に好ましくは２２〜２６個のヌクレオチドの長さを有する。
【００１８】
オリゴヌクレオチドは、さらに末端および／または側鎖の修飾、例えば、それに共有結合している細胞特異的な標的物質を含んでよい。これらの物質は、細胞の、または細胞特異的な、取り込みを促進し得て、例えば、脂質、ビタミン、ホルモン、ペプチド、オリゴ糖およびそれらのアナログを含んでよい。例えば、標的物質は、当業者に公知の方法により、修飾核酸塩基または非ヌクレオチドビルディングブロックに結合してよい。
【００１９】
好ましい実施態様によれば、修飾は、所定の標的に対するオリゴヌクレオチドの選択性を確立および／または亢進させる。特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドのＲＩＧ−Ｉ選択性が確立され、または亢進される。所定のオリゴヌクレオチドのＲＩＧ−Ｉ選択性を決定する方法は、本明細書中に詳細に記載され（実施例参照）、および／または、当業者に知られている。
【００２０】
別の好ましい実施態様によれば、化学修飾は、オリゴヌクレオチドの化学的安定性を維持または亢進する。当業者は、所定のオリゴヌクレオチドの化学的安定性を決定する方法を知っている。そのような方法は、例えば実施例にも記載される。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、ハロゲン化、特にＦ−ハロゲン化、２’−Ｏ−アルキル化、特に２’−Ｏ−メチル化、および／または、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾を含む群から独立に選択される。特に、Ｆ−ハロゲン化およびホスホロチオエート修飾はオリゴヌクレオチドの安定性を増大させ、一方で、２’−Ｏ−メチル化はオリゴヌクレオチドのＲＩＧ−Ｉ選択性を確立または増大させる。２’−Ｏ−メチル化は、ＲＮＡの免疫原性を変更することも可能である。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、鎖あたり１つまたは２つの２’−Ｏ−メチル化、より好ましくは、鎖あたり１つの２’−Ｏ−メチル化のみ含む。
【００２２】
２’−Ｆ置換が特に好ましい。リボースの２’位において、ヒドロキシル基がフルオロに置換されている。ＲＮＡでの２’−Ｆ置換は、特に、ヌクレアーゼ消化に対する安定性を亢進させる。さらなる実施態様では、２’−フルオロ−置換は、特にＲＩＧ−Ｉ−依存性の免疫刺激を増大させ得る。
【００２３】
本明細書では、ホスホロチオエート化合物は、一般に、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾に関する。
【００２４】
オリゴヌクレオチドの末端に修飾を有するホスホロチオエート修飾化合物が、特に好ましい。ホスホロチオエート修飾では、核酸骨格において、架橋リン酸の非結合酸素原子は、硫黄原子に置換される。この置換は、この位置でのヌクレアーゼによる切断性を著しく低減させ、核酸鎖のより高い安定性をもたらす。
【００２５】
特に好ましい実施態様では、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、Ｆ−ハロゲン化、メチル化、特に２’−Ｏ−メチル化、および、特にオリゴヌクレオチドの末端でのホスホロチオエート修飾を示す。
【００２６】
所定のオリゴヌクレオチドの同定パターンは、オリゴヌクレオチドの配列および長さに依存し、各所定のオリゴヌクレオチドごとに決定することができる。当業者は、この決定をどのようにして行うか十分に知っている。
【００２７】
既に上述のとおり、所定のオリゴヌクレオチドのＲＩＧ−Ｉ選択性および／または安定性を決定するための、そのような方法は、本出願に詳細に記載されている。
【００２８】
式（Ｉ）または（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、三リン酸／三リン酸アナログ基を含む。この基において、Ｖ１、Ｖ３およびＶ５は独立に、Ｏ、ＳおよびＳｅから選択される。好ましくは、Ｖ１、Ｖ３およびＶ５は、Ｏである。Ｖ２、Ｖ４およびＶ６は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、ＳＲ１、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２およびＢＨ３−Ｍ＋から選択される。好ましくは、Ｖ２、Ｖ４およびＶ６は、ＯＨである。Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−６アシル、または、Ｃ３−８シクロ（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３−８シクロ（ヘテロ）アルケニル基、フェニルまたはＣ５−６ヘテロアリール基などの環状基であってよく、ここでヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。さらに、２つのＲ１は、それに結合したＮ原子と共に５員環または６員環などの環を形成してよい。Ｒ１は、ハロゲンなどの置換基、例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、Ｏ（ハロ）Ｃ１−２アルキルおよび、環状基の場合は、（ハロ）Ｃ１−２アルキルを含んでもよい。Ｍ＋は、無機または有機カチオン、例えばアルカリ金属カチオンまたはアンモニウムまたはアミンカチオンであってよい。
【００２９】
Ｗ１はＯまたはＳであってよい。好ましくは、Ｗ１はＯである。Ｗ２はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ２であってよい。好ましくは、Ｗ２はＯである。Ｗ３はＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＨａｌまたはＣ（Ｈａｌ）２であってよい。好ましくは、Ｗ３はＯ、ＣＨ２またはＣＦ２である。Ｒ２は、Ｒ１に関して上記に記載した群から選択してよい。ＨａｌはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであってよい。
【００３０】
特に好ましい実施態様によれば、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｗ１、Ｗ２およびＷ３はＯである。
【００３１】
三リン酸／三リン酸アナログ基は、好ましくはオリゴヌクレオチドの末端に結合している。好ましくは、その基は、オリゴヌクレオチドの５’末端、特にその５’末端糖の５’−ＯＨ基に結合している。
【００３２】
本明細書で定義されるように、ＺはキャプチャータグまたはＨを表す。キャプチャータグＺは、以下に示す一連の妥当な例により、機能的に定義することができる。一般的な規則は以下であってよい：Ｚは便利な精製を可能にしなければならず、ｐｐｐＲＮＡ安定性の要件と適合する条件下で除去可能でなければならない。当業者は、過度の負荷なく、所定のタグが機能的な定義を満たすか否かを判断することができる。したがって当業者は、特に本出願で提供される詳細例に関する、そのようなキャプチャータグを知っている。
【００３３】
好ましい実施態様によれば、キャプチャータグＺは、長鎖脂肪族残基、非共有結合の高親和性結合ペアのパートナー、反応性の化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｒｅｔｙ）、ＱまたはＮＨＣ２−Ｃ２４アルキルから選択され、Ｑは、好ましくは、Ｈ、アミノ酸、アミノ酸アナログ、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、好ましくはＣ１２−Ｃ２４アルキル、ペプチドおよび脂質から選択される。しかしながら、特に好ましい実施態様によれば、Ｚはデシル、すなわちＣ１０アルキルである。
【００３４】
本発明に係るキャプチャータグＺは、キャプチャータグを含まない他の種から、キャプチャータグを含む化合物、例えばオリゴヌクレオチド（Ｉ）を分離することが可能な条件下で、キャプチャー試薬と非共有結合的または共有結合的に相互作用が可能な部分である。好ましくは、キャプチャー試薬は固定化された試薬であり、または固定化が可能な試薬である。
【００３５】
適切なキャプチャータグは、例えば、長鎖の、例えばＣ８−２４、好ましくはＣ１３−２４、より好ましくはＣ１３−Ｃ１４の脂肪族アルキル残基、例えばオクタデシルまたは他の脂質／脂溶性残基、例えばコレステリル、トコフェリルまたはトリチルおよびそれらの誘導体である。しかしながら、特に好ましい実施態様によれば、Ｚはデシル残基である。この場合、タグ化三リン酸物質は、標準的な逆相クロマトグラフィー、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、固相上でキャプチャーおよび精製することができる。キャプチャータグは、例えば、Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から市販されるようなフルオラスアフィニティ支持体上で修飾オリゴ−三リン酸を特異的にキャプチャーするための、４−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシル）ベンジルまたは３−（ペルフルオロオクチル）プロピル残基などのペルフルオロアルキル物質であってもよい。
【００３６】
別の実施態様では、キャプチャータグは、非共有結合の高親和性結合ペアの第一のパートナー、例えばビオチン、またはデスチオビオチンなどのビオチンアナログ、ハプテンまたは抗原であってよく、それは、高親和性結合ペアの第二の相補パートナーであるキャプチャー試薬（例えばストレプトアビジン、アビジンまたは抗体）と高親和力（例えば結合定数１０〜６  ｌ／ｍｏｌ以下）を有する。
【００３７】
さらに別の実施態様では、キャプチャータグは共有結合性ペアの第一のパートナーであってよく、それは、共有結合性ペアの第二の相補パートナーであるキャプチャー試薬と共有結合を形成してよく、ここで共有結合は、可逆または不可逆の結合であってよい。この実施態様では、Ｈｕｓｉｇｅｎの３＋２環化付加反応（Ｃｕ（Ｉ）により触媒されるいわゆる「クリック反応」、または、例えばシクロオクチン誘導体での重度の環ひずみのリリースを介してＣｕ（Ｉ）イオン無しで進行するその変異型）の場合、キャプチャータグの構成要素Ｚはアジド基またはアルキニル基などの反応性の化学物質であってよく、それぞれ、アルキニルまたはアジド部分などの相補反応基を含むキャプチャー試薬と共有結合反応が可能である。そのような場合のＺ−Ｙ−Ｘの具体例は、プロパルギルアミノである。
【００３８】
別の実施態様では、キャプチャータグ構成要素は、さらなる求核基、例えば、ＮＨ２−Ｙ−ＸＨタイプの試薬中の第二のアミノ基（ｓｅｃｏｎｄ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ）を含む化学物質であってよい。オリゴヌクレオチドを固相に結合させながら、様々の適切な求電子Ｚ試薬、例えばコレステロール、クロロフォルミエート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｉａｔｅ）またはビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを用いてタグ基を導入してよく、したがって、タグ化反応の範囲は著しく拡大される。
【００３９】
好ましい実施態様では、キャプチャータグは、長鎖アルキル残基、ペルフルオロアルキル物質、アジドまたはアルキニル基である。
【００４０】
本発明のさらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、第二のキャプチャータグを、異なる位置（例えば３’末端）に有してよい。第一および第二のキャプチャータグは、好ましくは、２つの直交法による精製を可能にするように選択され、純度が非常に高い物質を回収することが可能である。例えば、第一のキャプチャータグは親油基であってよく、それは適切なクロマトグラフィー支持体と相互作用し、第二のキャプチャータグはビオチンであってよく、それはストレプトアビジンと相互作用する。
【００４１】
第二のキャプチャータグは、オリゴリボヌクレオチド合成用の修飾ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を用いた合成を行なうことにより、好適に導入され得る。
【００４２】
Ｙは、化学結合またはリンカー、例えばアルキレン、好ましくはＣ１−６−アルキレンリンカー、より好ましくはＣ２−５−アルキレンリンカー、またはアラルキレンリンカーを表し、場合によりヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、例えばＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓを含み、および／または、場合によりＣ＝ＣまたはＣ≡Ｃ結合を含む。特に好ましい実施態様によれば、Ｙは結合である。
【００４３】
別の好ましい実施態様では、リンカーは、ポリアルキレンオキシド、好ましくはポリ−Ｃ２−Ｃ６−アルキレンオキシド、より好ましくはポリ−Ｃ２−Ｃ３−アルキレンオキシドである。リンカーの数平均分子量は、３０〜８００ｇ／ｍｏｌの範囲内、好ましくは４０〜４５０ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは４０〜２５０ｇ／ｍｏｌであってよい。リンカーは［−ＣＨ２ＣＨＲ４−Ｏ−］ｎであってよく、ｎ＝１〜１０、好ましくはｎ＝１〜７、より好ましくはｎ＝２〜５、およびさらにより好ましくはｎ＝３である。Ｒ４はＨまたはＣ１−６−アルキルであってよい。Ｙのさらに好ましい実施態様を図４に示す。好ましい実施態様では、Ｒ４はＨである。
【００４４】
特に好ましい実施態様によれば、
ＸはＮＨまたはＯであり、
Ｙは−Ｋ−（（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒ−、または、
（Ｏ−（ＣＨＲ３）ｍ３−ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−（ＣＨＲ２）ｍ２−ＣＨ２）ｎ２−（Ｏ−（ＣＨＲ１）ｍ１−ＣＨ２）ｎ３−であり、および、
ＫはＯまたはＮＨであり、
ｍ、ｍ１、ｍ２およびｍ３は独立に、１〜１２、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜５、およびさらにより好ましくは１〜３であり、
ｎ、ｎ１、ｎ２およびｎ３は独立に、０〜２０、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜５、およびさらにより好ましくは０〜３であり、および、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−Ｃ６−アシルまたは環状基であり、それぞれ場合により置換され、および、
Ｒは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ２−Ｃ６−アシルまたは環状基であり、それぞれ場合により置換される。好ましくは、ＲはＣＨ２ＣＨ２である。
【００４５】
Ｙが上記の定義のとおりである特に好ましい実施態様によれば、Ｒ１およびＲ２はＨであり、ｎ１はＯであり、ｎ２およびｎ３は１である。さらに好ましい実施態様は、図４から得ることができる。
【００４６】
Ｙは上記の定義のとおりである別の好ましい実施態様では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨであり、ｎ１、ｎ２およびｎ３は１である。
【００４７】
好ましい実施態様によれば、ＸはＮＨであり、ＫはＮＨであり、Ｙは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎであって、ｎは上記の定義のとおりであり、ここでＫは、コレステロール−Ｃ（Ｏ）−、トリチルまたはそれらの誘導体でさらに置換される。
【００４８】
式（Ｉ）によるオリゴヌクレオチドの特に好ましい実施態様では、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｙは結合であり、ＺはＣ１−Ｃ１２アルキルまたはＨ、好ましくはＣ１０、ＱまたはＮＨＣ２−Ｃ２４アルキルであり、ここでＱは、Ｈ、アミノ酸、アミノ酸アナログ、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、好ましくはＣ１２−Ｃ２４アルキル、ペプチドおよび脂質から選択され、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｗ１、Ｗ２およびＷ３は、Ｏである。
【００４９】
式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドのさらに好ましい実施態様によれば、ＸはＮＨまたはＯであり、Ｙは結合であり、ＺはデシルまたはＨであり、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｗ１、Ｗ２およびＷ３は好ましくはＯである。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、本明細書に定義される修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含んでよい。用語「担体」は、本明細書中で用いられる場合、担体、賦形剤および／または安定剤を含み、それは、用いられる用量および濃度で、それに曝される細胞または哺乳類に非毒性である。多くの場合、生理的に許容できる担体は、ｐＨ緩衝水溶液またはリポソームである。生理的に許容できる担体の例は、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー（しかしながら、本発明の製剤に関しては、リン酸バッファーが好ましい）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の糖類、ゲル化剤、例えばＥＤＴＡ、糖、アルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または、非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ、ポリエチレンまたはポリエチレングリコールを含む。特に好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は、滅菌脱イオン水に溶解される。
【００５２】
本発明に係る、そのような組成物および／または製剤は、それらを必要とする対象、特にヒト患者に対して、適切な方法により特定の状態を治療するのに十分な量で投与することができる。例えば、本発明に係る組成物および／または製剤は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバントとともに、医薬組成物として処方してよい。治療効率および毒性は、標準的なプロトコルによって決定してよい。医薬組成物は、全身性に、例えば腹腔内、筋肉内、または静脈内に、または、局所的に、例えば鼻腔内、皮下、皮内または髄腔内に、投与してよい。投与される組成物および／または製剤の投与量は、もちろん、治療すべき対象、および対象の状態、例えば対象の体重、対象の年齢および治療すべき疾患または損傷の種類および重症度、投与様式および処方医師の判断に依存する。
【００５３】
好ましい実施態様では、医薬組成物は皮内に投与される。タトゥーイング、マイクロニードルおよび／またはマイクロニードルパッチを介して、組成物を皮内に投与するのが特に好ましい。
【００５４】
本発明に係る化合物は、好ましくは、滅菌した脱イオン水（精製水）に所望の濃度で溶解および希釈され、それから、毛剃りしてエタノール消毒した皮膚上に、ピペッティング器具を用いて塗布し、そして続けて皮膚内にタトゥーイングする。
【００５５】
タトゥーイングについては、例えば、本発明に係る水ベースの医薬組成物は、マルチニードル（使い捨て）ニードルチップ（例えば９ニードル、使い捨てチップ）を装着した（医療用）タトゥー器具を用いて、皮膚へ皮内注入される。
【００５６】
典型的なタトゥーイングの手順は以下である：毛剃りしてエタノール洗浄した皮膚上に水ベースの医薬組成物をピペット後、稼働ニードルチップ（例えば、１００〜１２０Ｈｚ、特に１００Ｈｚのスピードで稼働）を、水ベースの医薬組成物の液滴上部に穏やかに置くことにより、水ベースの医薬組成物をタトゥー装置のマルチニードルチップ内に導入する。水ベースの医薬組成物の液滴が、稼働ニードルチップ内に完全に吸着され、それゆえに稼働ニードルの間に存在した時点で、この充填されたニードルチップを、皮膚に対して正確に９０度の角度で保持しながら、稼働チップを穏やかに皮膚の上で前後に動かす。この方法を用いることにより、水ベースの医薬組成物が皮膚中に完全にタトゥーイングされる。５０〜１００μｌの水ベースの医薬組成物については、これは典型的に、２〜４平方センチメートルの皮膚領域一面に１０〜１５秒を要する。この処置が標準的な単回の皮内ボーラス注射に勝る利点は、水ベースの医薬組成物が、より広い領域の皮膚一面に均一に注入され、標的組織一面に、より均一かつより正確に分けられることである：９ニードルチップを１００Ｈｚで１０秒間用いることにより、この方法は、処置される皮膚において９０００の均一分散した皮内注射を確実にする。
【００５７】
もちろん、当業者は、治療すべき患者または体の部分に応じて、手順を逸脱および調整してよい。マイクロニードルの手順は、タトゥーイングの手順とほぼ同様の手順で行なってよい。しかしながら、マイクロニードルでは、タトゥーニードルチップはマイクロニードルチップに置き換え、それはより表面の皮内投与を確実にする。水ベースの医薬組成物は、原理的には、毛剃りされエタノール洗浄された皮膚上にピペットされ、それからマイクロニードルチップを用いて、タトゥーの手順と同様に皮内に投与される。マイクロニードルは、マイクロニードルのニードル間に医薬組成物を事前に吸着させる必要はない。
【００５８】
加えて、医薬組成物でコーティングされた、またはそれ以外の方法で医薬組成物を含むマイクロニードルパッチを、経皮／皮内の送達に用いることができることが想定される。これは、病院訪問の必要および／または専門医のタトゥーイング／マイクロニードルの介在無しで、医薬組成物の皮内送達をレシピエント自身によって安全に行なうことができるという、特有の利点がある。これは、治療スキームに柔軟性を大いに与えることができ、非常にパーソナライズされた治療レジメンを可能にし、治療に関係する苦痛を軽減し、治療費を削減する。これらのパッチは、制限されないが、時間−制御−、持続−またはボーラスで医薬組成物を経皮送達するための、溶解性または非溶解性のマイクロニードルパッチを構成することができる。
【００５９】
本発明の別態様は、請求項１から１５のいずれかのオリゴヌクレオチドを調製する方法に関し、以下のステップを含む。
（ａ）式（ＩＩａ）の化合物を、酸化剤と反応させて、式（ＩＩｂ）の化合物を得るステップ、
【化２】
0006313768.tif 000003
［ここでＶ１、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ４、Ｖ６、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、およびＯＮは上記で定義されたとおりであり、ＯＮは少なくとも１つの保護基により保護されている。］
【化３】
0006313768.tif 000004
［ここでＶ１、Ｖ３、Ｖ５、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ６、Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３およびＯＮは上記で定義されたとおりであり、ＯＮは、少なくとも１つの保護基により保護されている。］
（ｂ）式（ＩＩｂ）の化合物を、式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤と反応させ、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを含む反応産物を得るステップ、
【化４】
0006313768.tif 000005
［ここでＸ、Ｚ、およびＹは上記で定義されたとおりであり、Ｘは好ましくはＯである。］
および、
（ｃ）前記の少なくとも１つのＯＮ保護基を脱保護するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の反応産物を、キャプチャータグと相互作用可能なキャプチャー試薬と接触させるステップ、
ここで、前記の接触させるステップは、前記の反応産物中に含まれる他の種からオリゴヌクレオチド（Ｉ）を分離するのを可能にする条件下で行なわれる。
【００６０】
ＸがＯである態様が特に好ましい。
【００６１】
本発明の方法において、ＯＮオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保護基を含む。本発明による保護基の使用は、特に、用いられるオリゴヌクレオチドの２’−ＯＨ基リボースサブユニットを保護することを目的とする。当業者、特にヌクレオチド合成の分野に従事する者は、どの保護基が合成に適切であるか知っている。保護基は、オリゴヌクレオチドのリボースサブユニットの２’−ＯＨ位が好ましい。本発明の好ましい実施態様では、フッ化物に不安定な保護基がリボースユニットの２’−位に用いられる。
【００６２】
特に好ましいのは、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳまたは２’−Ｏ−ＴＯＭ保護基である。特に好ましい実施態様では、ＴＢＤＭＳ保護基が用いられる。
【００６３】
特に、Ｚ−Ｙ−Ｘ−ＰＰＰ結合安定性が高い、Ｘ＝Ｏである化合物の合成においては、広範囲の脱保護条件が、２’−ＯＨ保護基の切断を導き得る。
【００６４】
全ての公知の脱保護試薬が、ＴＢＤＭＳ保護基を切断するのに適切である。特に、以下の試薬を用いてよい：
（ａ）トリエチルアミン−トリハイドロフルオリド（場合により極性溶媒と組み合わせる）、
（ｂ）トリアルキルアミン、トリエチルアミン−トリハイドロフルオリドおよび極性溶媒、
（ｃ）ピリジン−ＨＦおよび他の付加物（有機窒素塩基のハイドロフルオリド）、
（ｄ）アンモニウムフルオリド、
（ｅ）テトラ−ｎ−ブチル−アンモニウムフルオリド、
（ｆ）テトラメチル−アンモニウムフルオリド、および他のテトラアルキル−アンモニウムフルオリドおよびそれらの組み合わせ。
【００６５】
ステップ（ｃ）は、好ましくは、例えば以下に詳述のような、三リン酸部分の分解を生じない条件下で行なわれる。
【００６６】
本発明の方法のステップ（ａ）は、式（ＩＩａ）の環状Ｐ（Ｖ）−Ｐ（Ｖ）−Ｐ（ＩＩＩ）種と酸化剤との反応を含む。式（ＩＩａ）の化合物は、上記のＬｕｄｗｉｇら（１９８９）およびＧａｕｒら（１９９２）により記載の標準的な方法により、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’末端−ＯＨ基を、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのような三官能性ホスファイト化剤と、適切な条件下で、例えばジオキサンまたはジクロロメタンなどの適切な溶媒中、塩基（ピリジンまたはジイソプロピルメチルアミン）存在下で反応させて、その後に、ピロリン酸（Ｗ３＝Ｏ）または修飾ピロリン酸（Ｗ３がＯではなく、例えばＣＨ２、ＣＣｌ２、ＮＨまたはＣＦ２である）と反応させることにより、得てよい。好ましくは、ＤＭＦ中で、ピロリン酸または修飾ピロリン酸のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を用いる。生じる環状Ｐ（ＩＩＩ）−Ｐ（Ｖ）中間体（ＩＩａ）を、それから、無水条件下で、例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、（１０−カンファースルホニル）オキサジリジンなどの過酸化物を用いて、酸化させる。あるいは、フェニルアセチルジスルフィド（Ｖ２＝Ｓ）、またはボラン−ジイソプロピルエチルアミン複合体（Ｖ２＝ＢＨ３）を用いて、それぞれ対応する式（ＩＩｂ）の環状５’−三リン酸／三リン酸アナログを得ることもできる。本文脈での参照は、ＷＯ９６／４０１５９またはＷＯ２００９／０６０２８１にもなされ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【００６７】
反応ステップ（ａ）は、溶液中のオリゴヌクレオチドを用いて、または、固相（例えば有機樹脂またはガラス、ＣＰＧなど）に結合したオリゴヌクレオチドを用いて、行なってよい。オリゴヌクレオチドは、保護基、例えば当業者に良く知られた糖または核酸塩基の保護基を、さらに含んでよい。保護基の好ましい例は、ヌクレオシド間ホスホジエステルまたはホスホロチオエートについては２−シアノエチルであり、リボース２’−ヒドロキシル基については、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルオキシメチルまたはビス（アセトキシエトキシ）メチルであり、核酸塩基の環外アミノ基については、４−ｔ−ブチルフェノキシアセチルまたはフェノキシアセチル、アセチル、イソブチリル、ベンゾイルである。より好ましくは、ステップ（ａ）は、固相結合オリゴヌクレオチドを用いて行なわれる。
【００６８】
本発明の方法のステップ（ｂ）によれば、化合物（ＩＩｂ）は、式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤と反応する。
【化５】
0006313768.tif 000006
【００６９】
ここでＸは、ＮＨ、ＮＲ３、ＯまたはおよびＸから選択される基であり、Ｙは、上記で定義されたとおりである。Ｒ３は、Ｒ１について上述したとおりに定義される。
【００７０】
特に、ＸがＯである場合は、デカノールのような求核性が制限された試薬を開環に用いることができる（図１、ステップ４を参照）。そのようなステップは、室温で例えば４８時間行なうことができ、そして、シクロ三リン酸を所望の三リン酸γ−エステルに変換させる。
【００７１】
ステップ（ｃ）によってＯＮ保護基が切断される。
【００７２】
ステップ（ｃ）の間、例えば、上記で規定の脱保護試薬（ａ）および（ｂ）の後に、Ｘ＝Ｏの場合は、２０分〜１８０分、より好ましくは６０分〜約１５０分、特に約１２０分の時間にわたって、６０〜７０℃、特に約６５℃で、脱保護条件を続けてよい。Ｘ＝ＮＨの場合は、結合安定性が異なるためにそのような反応は行なわないか、または、著しくより悪い反応パラメータの下でのみ、例えば室温で４０時間にわたって、行なうことができる。
【００７３】
本発明の方法のステップ（ｄ）は、反応産物中に含まれる他の種から、キャプチャータグ含有オリゴヌクレオチド（Ｉ）を分離することを可能にする条件下で、ステップ（ｂ）の反応産物を、キャプチャータグＺと相互作用することが可能なキャプチャー試薬と接触させるステップを含む。ステップ（ｄ）の前に、固相結合オリゴヌクレオチド（Ｉ）は、固相から切断されて脱保護され、すなわち、保護基が部分的または完全に除去される。キャプチャー試薬は、好ましくは、クロマトグラフィー支持体などの適切な支持体上に固定化される。キャプチャータグ含有オリゴヌクレオチド（Ｉ）を、キャプチャータグを含まない種から分離するために、必要であれば、ステップ（ｂ）による反応産物を固相から切断して脱保護し、分離手段（好ましくはキャプチャータグＺとキャプチャー試薬との相互作用に基づくクロマトグラフィー分離手段）に供する。分離ステップの間、オリゴヌクレオチド（Ｉ）の純度は、一般に未精製の材料では配列の長さおよび複雑さに応じて２５〜７０％の範囲であるが、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上に高くなり得る。毒性試験については、８５％よりも高い純度が望ましく、一方で、臨床試験の後期段階では、純度は少なくとも９０〜９５％の範囲内であるべきである。したがって、本発明は、ヒト臨床試験に要求されるような高純度のｐｐｐＲＮＡを得る方法を提供する。
【００７４】
ステップ（ｄ）では、キャプチャータグおよびそれと相互作用可能なキャプチャー試薬は、好ましくは以下から選択される。（ｉ）疎水基またはフッ素化基、および、疎水基またはフッ素化基に関して親和性を有するクロマトグラフィー材料、例えば逆相材料またはフルオラスアフィニティ支持体；（ｉｉ）非共有結合の高親和性結合ペアの第一のパートナー、および、非共有結合の高親和性結合ペアの第二の相補パートナー、（ｉｉｉ）共有結合ペアの第一のパートナー、および、共有結合ペアの第二の相補パートナー（その際、第一および第二のパートナーは、共有結合を形成する）。
【００７５】
キャプチャータグは、一連の妥当な実施例により以下に機能的に定義される。一般的な規則は以下であってよい：
【００７６】
Ｚは便利な精製を可能にしなければならず、ｐｐｐＲＮＡ安定性の要件と適合する条件下で除去可能でなければならない。
【００７７】
加えて、その方法は、キャプチャータグを除去して式（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドを得るステップ（ｅ）をさらに含んでよい。好ましい実施態様によれば、Ｘ＝Ｏについては、式（ＩＶ）ａまたは（ＩＶ）ｂの化合物
【化６】
0006313768.tif 000007
および、Ｘ＝ＮＨについては、式（ＩＶ）ａの化合物
【化７】
0006313768.tif 000008
が得られる。
【００７８】
ステップ（ｅ）は、三リン酸最終産物の安定性要件およびリボヌクレオチド間結合の安定性要件と適合しなければならない。ＸがＮＨである場合は弱酸性条件での切断を含んでよく、ＸがＳの場合は銀イオンを用いた切断を含んでよく、Ｙ−Ｘ−Ｐが−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｐを含む場合は、チイランの除去を導くジチオスレイトールなどのチオールによる切断を含んでよい。
【００７９】
さらなる実施態様では、キャプチャータグＺは除去されないか、または完全には除去されない。これらの実施態様では、そのようなタグ化オリゴヌクレオチドは、医薬品としての有用性などの、有用性を有し得る。
【００８０】
これらの実施態様では、試薬Ｚ−Ｙ−ＸＨは、ＲＩＧ−Ｉセンサーの構造上の要件と機能的に適合するＺ−残基のサブグループから選択しなければならない。例えば、Ｚ＝デシル−オクタデシル、Ｙ＝リンク、Ｘ＝ＮＨまたはＯの組み合わせが、これらの要件を満たすことが知られている。
【００８１】
本発明により生産される三リン酸／三リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドは、その高い純度のため、医薬用途に特に適切である。特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド（Ｉ）または（ＩＶ）は、ＲＩＧ−Ｉヘリカーゼのアクチベーターである。適切なＲＩＧ−Ｉアクチベーターの具体例は、上記のＳｃｈｌｅｅら（２００９）に記載されており、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【００８２】
実施例１：５’−デシル−Ｏ−三リン酸ＲＮＡの調製
概略（図１）に概説するように、デシル−Ｏ−三リン酸ＲＮＡ合成工程は、以下の合成ステップを含む：
【００８３】
１−４）５’−デシル−Ｏ−三リン酸ＲＮＡ
支持体に結合し、完全に保護された５’ＯＨ−ＲＮＡ（１μｍｏｌ）を、合成カラム内で、真空下で３時間乾燥させ、続いて、無水ピリジン／ジオキサン（１：３，  ｖ／ｖ，  ４ｍｌ）を用いて洗浄した。アルゴン下で、調製したばかりの、乾燥ジオキサン（１００μｌ，  １００μｍｏｌ）中、１Ｍの２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン溶液を、２ｍｌの無水ピリジン／ジオキサン（１：３，  ｖ／ｖ）を含むフラスコ内に注入した。生じた５０ｍＭのホスファイト化溶液を合成カラム内に吸引し、３０分の反応時間の間、ゆっくり前後に動かした。次に、ＤＭＦ（１ｍｌ，  ０，５ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ−ブチルアミン（２３８μｌ，  １ｍｍｏｌ）中、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の０，５Ｍ溶液を混合することにより、テトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸溶液を調製した。ピロリン酸溶液を押してカラムを通過させ、そして、過剰のホスファイト化試薬をカラムから排出および除去した後、２本のシリンジを用いて残存するピロリン酸溶液を前後に押した。１０分後、無水アセトニトリル（３ｍｌ）を用いてカラムを洗浄した。デカン（３００μｌ）中、５，５Ｍのｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液を、無水アセトニトリル（２ｍｌ）中に溶解させ、そして、合成支持体と接触させた。１５分後、無水アセトニトリル（６ｍｌ）を用いてカラムを洗浄した。続けて、Ｎ−メチルイミダゾール（２４０μｌ，  ３ｍｍｏｌ）、トリ−ｎ−ブチルアミン（２５０μｌ，  １，１ｍｍｏｌ）およびｎ−デシルアルコール（２ｍｌ，  １０，５ｍｍｏｌ）の均質溶液を、繰り返し前後に押してカラムを通し、放置して、シクロ三リン酸をデシル−Ｏ−三リン酸に変換するために４８時間反応させた。無水アセトニトリル（６ｍｌ）を用いてカラムを洗浄し、未反応のシクロ三リン酸の加水分解のために、０，１Ｍのトリエチルアンモニウムバイカーボネート（ＴＥＡＢ，  ２ｍｌ）を用いて２０分間処理して、この後の脱保護工程中の非特異的な誘導体化を避けた。無水アセトニトリル（９ｍｌ）を用いたさらなる洗浄ステップに続いて、合成支持体をアルゴン蒸気中で乾燥させた。
【００８４】
５−６）脱保護および精製
２本のシリンジを用いて、５’−デシル−Ｏ−三リン酸オリゴヌクレオチドを、４０％メチルアミン水および濃縮アンモニア水の、調製したばかりの溶液（ＡＭＡ，  １：１，  ｖ／ｖ，  ２ｍｌ）と接触させた。３０分の切断時間後、清潔なスクリューキャップのバイアルに溶液を移し、ＡＭＡ（１ｍｌ）を用いて支持体をリンスした。合わせた溶液および洗浄液を、６５℃で１０分間加熱した。氷上で冷却後、溶液を蒸発乾固させ、残渣を無水エタノールとの共蒸発により乾燥させた。２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を除去するために、修飾三リン酸部分を大きく失うことなく、トリエチルアミントリハイドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ）による処理を用いることができるリン酸。デシル−Ｏ−三リン酸オリゴヌクレオチドを、調製されたばかりのＮ−メチルピロリドン／トリエチルアミン／ＴＥＡ．３ＨＦ（ＮＭＰ／ＴＥＡ／ＴＥＡ．３ＨＦ，  ６：４：３，  ｖ／ｖ，  ３２５μｌ）溶液中に再溶解させて、その溶液を６５℃で２時間加熱した。あるいは、ＤＭＳＯ中、ＴＥＡ．３ＨＦの脱保護溶液（１：１，  ｖ／ｖ，  ６００μｌ）を用いてよい。完全に脱保護したデシル−Ｏ−三リン酸オリゴヌクレオチドを、ｎ−ブタノールを用いて脱保護溶液から析出させて、ＨＰＬＣにより精製した。脂溶性のデシルタグは、逆相クロマトグラフィーを使用することによって、タグを含まない不純物からデシル−Ｏ−三リン酸を分離することを可能にする。反応産物を、７×２５０ｍｍのＰＲＰ−１カラムにアプライして、３ｍｌ／分の流速で、５０分中、０〜１００％バッファーＢの直線グラジエントで分離した。バッファーＡは１００ｍＭ  ＴＥＡＢであり、バッファーＢは８０％メタノール中１００ｍＭ  ＴＥＡＢであった。産物画分を集めて、メタノールとの共蒸発を繰り返して蒸発および脱塩させた。残渣を水に溶解させ、０，３Ｍ塩化ナトリウム存在下で、エタノール沈殿によりナトリウム形態に変えた。
【００８５】
実施例２：５’−ｐｐｐＲＮＡγ２−（２−ブトキシエトキシ）エチル−エステルの調製（Ｃ４−ＤＥＧ−ｐｐｐＲＮＡ）
実施例２に記載の反応スキームの概略を図１１に示す。
【００８６】
ステップ１：２０３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを、アルゴン下で、１０ｍＬのセプタムバイアル中の乾燥ジオキサン１ｍＬ中に溶解させる。
【００８７】
ステップ２：脱トリチル化され（ｄｅｔｉｔｒｙｌａｔｅｄ）、アセトニトリルを用いて十分に洗浄された、完全に保護されたＲＮＡを含む合成カラムを、１２時間、真空中で乾燥させる。アルゴン雰囲気中で、２ｍＬの無水ジオキサン／ピリジン溶液（３：１（ｖ／ｖ））を繰り返し吸引および排出させることにより、カラム内容物を十分に洗浄する。
【００８８】
ステップ３：最初に、２ｍＬのピリジン／ジオキサン（３：１  ｖ／ｖ）をバイアル中に加え、続いて、乾燥ジオキサン中、１Ｍの２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン溶液１００μＬを加えて、ジオキサン／ピリジン（３：１（ｖ／ｖ））中、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−２−オンなどの、ホスファイト化試薬の、５０ｍＭ溶液を得る。穏やかに振とうして、溶液をホモジナイズする。２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン溶液を、バイアルから合成カラムを通して吸引することにより、反応を開始させる。
【００８９】
固相に支持されたＲＮＡとの完全な接触および良好な混合を可能にするために、反応の間、合成カラムから、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン含有溶液を、繰り返し吸引および排出させる。３０分の反応時間は、通常、２０〜４０ｎｔの範囲で、支持体に結合したオリゴマーの遊離５’−ＯＨ基のほぼ定量的な反応を与える。
【００９０】
ステップ４：３０分の反応時間後、過剰のホスファイト化剤を含むジオキサン／ピリジン溶液を廃棄容器中に排出させて、乾燥ＤＭＦ中、１ｍＬの０．５Ｍ  （Ｂｕ３ＮＨ）２  ピロリン酸と２３８μＬ（１ｍｍｏｌ）の乾燥Ｂｕ３Ｎとのボルティックス混合物で新しいシリンジを満たし、０．５Ｍ  （Ｂｕ３Ｎ）４  ピロリン酸溶液を得る。この溶液を、カラムを押し通し、それによりジオキサン／ピリジン溶液を置き換える。非常に過剰のピロリン酸が、中間体の、Ｐ（ＩＩＩ）−Ｐ（Ｖ）環状無水物ＩＩａへの定量的変換を確実にする。
【００９１】
ステップ５：３ｍＬのＣＨ３ＣＮを用いてカラムを洗浄して、ＤＭＦおよび過剰のＰＰｉを除去し、そして、カラムリアクターを乾燥ＣＨ３ＣＮで満たす。
【００９２】
ステップ６：３００μＬのｔ−ＢｕＯＯＨ（デカン中５．５Ｍ溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮに溶解して、およそ０．７Ｍの均質溶液を得る。酸化Ｐ（Ｖ）環状無水物ＩＩｂを得るために、合成支持体をこの溶液と１５分間接触させる。
【００９３】
ステップ７：３ｍＬの乾燥ＣＨ３ＣＮを用いてカラムを洗浄して、過剰の過酸化物を除去し、乾燥ＣＨ３ＣＮでカラムを満たす。
【００９４】
ステップ８：０．１Ｍ  Ｎ−メチルイミダゾールおよび０．１Ｍ  トリ−ｎ−ブチルアミンを含む２ｍｌの乾燥２−（２−ブトキシエトキシ）エタノール（ジエチレングリコールモノブチルエーテル）を、カラム中の支持体と接触させる。ＣＰＧとアルコールとの接触時間は、室温で少なくとも４８時間であるべきである。
【００９５】
ステップ９：９ｍＬのアセトニトリルを用いてカラムを完全に洗浄し、それから、未反応のシクロ三リン酸を加水分解するために、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（トリエチルアンモニウムバイカーボネート）水溶液２ｍｌとカラムを１時間接触させる。
【００９６】
ステップ１０−脱保護の第一段階：１ｍＬの脱保護溶液（４０％メチルアミン水溶液／濃縮アンモニア水溶液  １：１  ｖ／ｖ．  ＡＭＡ試薬）を、２〜３回支持体に通す。３０分の接触後、溶液を新しいバイアル中に移す。同量のＡＭＡ脱保護溶液を用いて支持体を洗浄し、洗浄液と合わせる。合わせた溶液および洗浄液を、６５℃で１０分間加熱する。氷上で冷却後、その溶液を３００〜５００μＬの容量に濃縮し、それから蒸発乾固させる。
【００９７】
ステップ１１−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基の除去：３００μＬの乾燥ＥｔＯＨを添加し共蒸発により残渣を乾燥させ、ＴＨＦ中、１ｍＬの乾燥１Ｍ  ＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド）を添加し、きつく密閉して、１６時間、シェイカー上に置く。１ｍＬの滅菌１Ｍ  ＴＥＡＢ（トリエチルアンモニウムバイカーボネート）水を用いて反応を止めて、滅菌水を溶離液として用いて、ＮＡＰＴＭ−２５（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）カラム上でそれを脱塩する。滅菌２μｍフィルターを通した濾過が、このステップで必要であり得る。ＵＶ吸収画分を合わせて、１５０μＬの容量に蒸発させて、１００ｍＬの１Ｍ  ＴＥＡＢ  ｐＨ８を添加して、ＨＰＬＣ精製を行なうことができるまで、その溶液を−２０℃で冷凍保存する。
【００９８】
ステップ１２−ＨＰＬＣ精製：ステップ１１による１μｍｏｌスケールの反応混合物からの反応産物を、７×２５ｍｍのＰＲＰ−１カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）中にロードした。精製は、流速３ｍＬ／分で、５０分中、直線グラジエントバッファーＢ  ０〜８０％を用いて行なった。バッファーＡは１００ｍＭ  ＴＥＡＢであり、バッファーＢはメタノール／水  ８：２  ｖ／ｖ中の１００ｍＭ  ＴＥＡＢである。２４−ｍｅｒの精製の典型的な例を図３に示す。４原子アルキルタグとジエチレングリコール残渣との組み合わせは、ｐｐｐＲＮＡからベースライン付近を分離するのに十分である。８８．４ｍｌのピークに対応する画分を合わせて、ロータリーエバポレーター上で蒸発させ、乾燥メタノールを用いた数回の共蒸発により脱塩した。
【００９９】
実施例３：予め形成した脂溶性ポリエーテルアミンを用いた、脂溶性ポリエーテル複合タグを使用したｐｐｐＲＮＡの誘導体化
実施例３は、ＺＹ−Ｈ構造の脂溶性ポリエーテルアミンを用いて、ＺＹＮＨｐｐｐＲＮＡを生産する。
【０１００】
パートＡ：脂溶性ポリエーテルアミンの、経済的な大スケール調製
この工程は、フラッシュカラムクロマトグラフィーを用いずに行なうことができ、一般的に、水溶性ジアミンと脂溶性カルボン酸メチルエステルからの、モノアミド合成に適用できる。
【０１０１】
Ｎ−ラウリル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（化合物３，図１４）の合成：４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（４３，８ｍｌ，２００ｍｍｏｌ）を、３２．５ｍｌのメタノール中に溶解させた。ラウリン酸メチルエステル（４．９２ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）を、撹拌しながらゆっくり添加して、密閉フラスコを室温で５日間維持した。ロータリーエバポレーター上で反応混合物からメタノールを除去し、残渣を１００ｍｌ酢酸エチル中に溶解させた。
【０１０２】
水（２＊１２０ｍｌ）に続いて濃縮塩化ナトリウム（２＊１００ｍｌ）を用いた抽出により、過剰のジアミンを除去した。酢酸エチル相を蒸発させて、−２０℃で静置して残油を結晶化し、６．８ｇ（１７ｍｍｏｌ）の純粋Ｎ−ラウリル４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンを得た。
【０１０３】
パートＢ：Ｎ−ラウリル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンを用いたＣＰＧ結合ＲＮＡシクロ三リン酸の開環反応
【０１０４】
ＣＰＧ結合ＲＮＡシクロ三リン酸（化合物４、図１４）を、上記実施例２のステップ１〜７に従って合成した。固相固定化ＲＮＡシクロ三リン酸の開環反応は、アセトニトリル中のＮ−ラウリル−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンの０，０８Ｍ溶液を用いて行なった。室温で３時間、アセトニトリル溶液をＣＰＧと接触させ、それから、１０ｍｌの乾燥アセトニトリルを用いて支持体を洗浄し、アルゴンを流して乾燥させた。支持体からの切断、脱保護およびさらなるＨＰＬＣ処理は、実施例２のステップ１０〜１２のとおりに行なった。産物５を７５％メタノール濃度（図１５Ａ）で溶出した。反応混合物のＭＡＬＤＩスペクトル分析は、化合物５の構造を確認する（Ｍｗ  ８２１４．８Ｄａ，図１５Ｂ）。
【０１０５】
場合により、精製タグを除去して対応する三リン酸オリゴヌクレオチドを得てよい：１００ｎｍｏｌのｎ−ラウリル置換γアミド（化合物５、図１４）を、２ｍｌエッペンドルフチューブ中のｐＨ３．８脱保護バッファー４００μｌ中に溶解させ、密封チューブを６０℃で７０分間加熱した。これらの条件は、三リン酸部分を分解せずに、化合物５のホスホロアミデート結合の定量的切断を生じさせる。反応混合物を氷上で冷却し、１４μＬの滅菌５Ｍ  ＮａＣｌ溶液および１．２ｍＬの無水エタノールを添加した。沈殿物を遠心分離により集めて、冷エタノールを用いて洗浄し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ上で乾燥させ、滅菌水中に溶解させて、−２０℃で冷凍保存した。
【０１０６】
ＭＡＬＤＩスペクトル分析は、ｐｐｐＲＮＡ産物の期待分子量を確認する（Ｍｗ  ７８３２  Ｄａ，図１５Ｃ）。
【０１０７】
実施例４：脂溶性ポリエーテル複合タグを使用したｐｐｐＲＮＡの誘導化のための、オンカラムアプローチ
実施例４は、ＺＹＮＨｐｐｐＲＮＡを生産するための、固定化ＨＹＮＨｐｐｐＲＮＡオリゴヌクレオチドのオンカラム誘導体化を用いた２ステップ工程である。
【０１０８】
コレステリル−タグ化三リン酸ＲＮＡの調製
（Ｃｈｌ−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）２−ＮＨ−ｐｐｐ−ＲＮＡ、化合物４、図１６）
脂溶性コレステリル−タグの、三リン酸ＲＮＡへのコンジュゲーションは、ＲＰ−ＨＰＬＣによる、非タグ化不純物からのタグ−ｐｐｐＲＮＡ産物の効率的な分離を可能にする。コレステリル−タグ化三リン酸ＲＮＡの調製に関する反応スキームの概略を図１６に示す。最初のステップにおいて、実施例２のステップ１〜７に記載のように、支持体に結合し完全に保護された５’ＯＨ−ＲＮＡを、シクロ三リン酸中間体に変換した（化合物２、図１６）。
【０１０９】
続いて、無水アセトニトリル（３ｍｌ）を用いてカラムを洗浄した。１７６μｌの２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン（化合物１、図１６；１，２ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（１ｍｌ）中に溶解させ、その溶液を、カラム中の支持体と接触させた。３分後に、無水アセトニトリル（３ｍｌ）および無水ジクロロメタン（６ｍｌ）を用いてカラムを洗浄した。
【０１１０】
次に、アミノ−修飾三リン酸（すなわち化合物３、図１６）を、無水ジクロロメタン（５ｍｌ）中、４−ジメチルアミノピリジン（４，９ｍｇ、４０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３，９μｌ、４０μｍｏｌ）およびコレステリルクロロホルメート（３６ｍｇ、８０μｍｏｌ）の予混合溶液を用いて、１５分間処理した。無水ジクロロメタン（３ｍｌ）および無水アセトニトリル（６ｍｌ）を用いてカラムを洗浄し、アルゴン流中で乾燥させた。支持体からの切断および脱保護のために、２本のシリンジを用いて、誘導体化オリゴヌクレオチドを、４０％メチルアミン水および濃縮アンモニア水の、調製したばかりの溶液（ＡＭＡ，１：１，ｖ／ｖ，２ｍｌ）と接触させた。３０分の切断時間後、その溶液をスクリューキャップのバイアルに移し、６５℃で１０分間加熱し、蒸発乾固させた。無水エタノールとの共蒸発により残渣を乾燥させ、ＴＨＦ中、１Ｍのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（１ｍｌ，１ｍｍｏｌ）を用いて、振とうしながら１６時間処理した。ＮＡＰ−２５カラムでの脱塩後、完全に脱保護されたコレステリル−タグ化三リン酸オリゴヌクレオチドを、逆相カラムを用いてＨＰＬＣにより精製した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１，４．１×２５０ｍｍ、図１７Ａ）。化合物４を９５％メタノール濃度で溶出し、予測構造をＭＡＬＤＩ分析により確認した（Ｍｗ  ８３７０，６  Ｄａ、図１７Ｃ）。
【０１１１】
場合により、６０℃でｐＨ３．８での酸加水分解によりコレステリル−タグを除去し、対応する三リン酸オリゴヌクレオチド（化合物５、図１６）を得て、実施例３に記載したのと同様の工程を続ける。
【０１１２】
実施例５：２’−Ｏ−メチル化の体系的な導入は、ＲＩＧ−Ｉ選択性のＲＮＡデュプレックスをもたらす
略称のリストおよびそれらの意味は、本出願書類の最後に見ることができる。
【０１１３】
身体自体の（ｂｏｄｙ’ｓ  ｏｗｎ）ＲＮＡは、ＲＮＡ機能（ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ）に影響を及ぼし得る複数の修飾により特徴付けられる。２’−Ｏ−メチル化は、したがって、ＲＮＡの免疫原性を変更することができる。選択性ＲＩＧ−Ｉリガンドは、したがって、鎖あたり１つを超える２’−Ｏ−メチル化は含むべきでない。これらの特性は、適切にメチル化されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の組み合わせにより、ＲＮＡデュプレックスに含まれる。
【０１１４】
２’−Ｏ−メチル化のスクリーニングにより、ＲＩＧ−Ｉ選択性を導入する部位を決定した（図５）。ＯＨ−ＧＦＰ２のセンス鎖（Ａ）およびアンチセンス鎖（Ｂ）に関して、全体的な２’−Ｏ−メチル化スクリーニングを行なった。それぞれの位置を２’−Ｏ−メチル化によってそれぞれ修飾し、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の刺激に用いた。ＲＩＧ−Ｉの刺激に関しては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、クロロキンにより阻害し、デュプレックスのリポフェクションにより刺激した。ＩＦＮａは、ＥＬＩＳＡによって、刺激の２０時間後に測定した。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に関しては、関連のある一本鎖のみ刺激能をスクリーニングし、阻害していないＰＢＭＣを調べた。ポリ−Ｌ−アルギニンとの複合体形成により一本鎖をトランスフェクトし、そして、トランスフェクションの２０時間後に、ＴＬＲ７活性化についてはＩＦＮａを、ＴＬＲ８活性化についてはＩＬ  １２ｐ７０を、ＥＬＩＳＡによって測定した。センス鎖についてＧＦＰ２を用いた１００％誘導は、ＲＩＧ−Ｉについては３０８５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、ＴＬＲ７については２７５８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、そして、ＴＬＲ８については１２０６ｐｇ／ｍｌのＩＬ  １２ｐ７０に相当した。ＧＦＰ２のアンチセンス１００％に関しては、ＲＩＧ−Ｉについては２３４２ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、ＴＬＲ７については１８３１ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、そして、ＴＬＲ８については３０１８ｐｇ／ｍｌのＩＬ  １２ｐ７０に相当した。２’−Ｏ−メチル化の位置依存的な導入の影響の概略を、表形式で示す（図５）。効果は、参照として非修飾鎖に対してノーマライズされる。白＝変化無し、黄＝免疫刺激の減少、赤＝免疫刺激無し、緑＝免疫刺激の増大。
【０１１５】
さらに、特定のメチル化が、デュプレックスＲＩＧ−Ｉを特異的かつ高活性にさせることを示し得る。
【０１１６】
図６：（Ａ）ＲＩＧ−Ｉ活性化に不活性のメチル化をアンチセンス鎖に組み合わせて、生じたデュプレックスを、クロロキンでブロックしたＰＢＭＣの刺激のために０，８μｇ／ｍｌの濃度で用いた。刺激の２０時間後に、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮａを測定した。ＯＨ−ＧＦＰ２の１００％は、２７２９ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａと類似する。（Ｂ）センス鎖およびアンチセンス鎖で異なる組み合わせの２’−Ｏ−メチル化をハイブリダイズし、ＰＢＭＣの刺激に用いた。ＲＩＧ−Ｉの刺激については、ＰＢＭＣをクロロキンにより阻害し、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトし、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８については、非阻害のＰＢＭＣを用い、ポリ−Ｌ−アルギニンと複合体化したデュプレックスでトランスフェクトした。ＩＶＴ−２に関する１００％は、ＲＩＧ−Ｉについては４８６１ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、９．２Ｓでの１００％は、ＴＬＲ７については１９７５ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、ＴＬＲ８については７７１ｐｇ／ｍｌのＩＬ  １２ｐ７０に相当する。（Ａ）および（Ｂ）は、３ドナーの平均±ＳＥＭを示す。
【０１１７】
実施例６：ＲＮＡを安定化する修飾の挿入によるＲＩＧ−Ｉ活性化の増大
ｓｉＲＮＡ療法の間、短いｄｓＲＮＡフラグメントが体内に入れられ、体内でそれらは、標的細胞での特定のタンパク質の形成を阻害する。この形態の治療における問題は、ｓｉＲＮＡデュプレックスが非常に不安定であることである。ＲＮＡは、標的細胞への輸送中に、血清中のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによって簡単に分解され得る。
【０１１８】
治療目的で用いられる外来性ＲＮＡのかなりの部分が、それが投与される対象の血清および細胞基質内で変性しているようである。
【０１１９】
それぞれの５’−ＰＴＯ修飾が、デュプレックス免疫活性に対して好ましい効果を有すること、および、センス鎖およびアンチセンス鎖での５’ＰＴＯの組み合わせが、活性を最大限に増加させることが、示され得る（ｓ１５  ＰＴＯ／ａｓ３  ＰＴＯに対してｓ１５／ａｓ３；図７Ｂ）。したがって、ＲＩＧ−Ｉ選択性リガンドにおけるＲＮＡ骨格のそのような修飾の使用は、有益であると考えることができる。
【０１２０】
特に、５’−ホスホロチオエートが選択性デュプレックスの免疫原性を増大させることが、示され得る。
【０１２１】
図７：（Ａ）ＰＢＭＣをクロロキンでブロックし、０，８μｇ／ｍｌの濃度でデュプレックスにより刺激した。刺激の２０時間後、ＩＦＮａをＥＬＩＳＡにより測定した。１００％のＩＶＴ２は、６１３８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当する。（Ｂ）示されたデュプレックスを滴定し、ＲＩＧ−Ｉの刺激に用いた。ＰＢＭＣをクロロキンでブロックし、リポフェクタミンを用いてデュプレックスをトランスフェクトした。刺激の２０時間後に、上清中のＩＦＮａをＥＬＩＳＡによって決定した。１００％の５０ｎＭ  ３Ｐ−ＧＦＰ２は１６０４４  ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当する。結果は４ドナーの平均±ＳＥＭを示す。
【０１２２】
治療用ｓｉＲＮＡの開発において、血清安定性の問題は、別の種類の修飾により解決された：２’−フルオロ置換がＲＮＡに組み込まれた場合、生じるＲＮＡはヌクレアーゼ消化に関してより安定であった。しかしながら、ＲＩＧ−Ｉ依存的な免疫刺激の場合は、２’−フルオロ置換は免疫刺激を活性化することができることが分かった。
【０１２３】
特に、５’−ホスホロチオエートは、選択性デュプレックスの免疫原性を増大させることが、示され得た。
【０１２４】
しかしながら、本発明によれば、選択された２’−フルオロ置換は、デュプレックスのＲＩＧ−Ｉ活性化能を増大させることが分かった。
【０１２５】
デュプレックスのセンス鎖（Ａ）およびアンチセンス鎖（Ｂ）に関して、それぞれの位置を、２’−フルオロ−置換により個々に修飾した（図８）。生じたデュプレックスを、０，８μｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＭＣの刺激に用いた。ＲＩＧ−Ｉ活性化の評価については、ＰＢＭＣをブロックしリポフェクタミンによりトランスフェクトして、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の刺激については、ＰＢＭＣをブロックせずに用いポリ−Ｌ−アルギニンと複合体化したデュプレックスでトランスフェクトした。刺激の２０時間後に、ＥＬＩＳＡによりサイトカインを測定した。センス鎖では、ＧＦＰ２に関する１００％は、ＲＩＧ−Ｉについては２４０７ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａ、ＴＬＲ７については３２８１ｐｇ／ｍｌ、そして、ＴＬＲ８については１９９０ｐｇ／ｍｌと、同様である。アンチセンス鎖に関しては、１００％のＧＦＰ２は、ＲＩＧ−Ｉについては４５１２ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、ＴＬＲ７については４６９１ｐｇ／ｍｌのＩＦＮａに相当し、そして、ＴＬＲ８については１９９７ｐｇ／ｍｌのＩＬ  １２ｐ７０に相当する。４ドナーの平均±ＳＥＭを示す。
【０１２６】
したがって、デュプレックスを、出来る限り活性で、その強い活性によってＲＮＡの損失を補うことができるように確立することが、非常に重要であった。前節では、ＲＮＡ修飾がどのように特定され得るかを、選択性ＰＴＯ結合および２’−フルオロ置換によって示し、それらはデュプレックスの活性の増加をもたらした。
【０１２７】
実施例７：全ての修飾の組み合わせは、免疫原性の強いＲＩＧ−Ｉリガンドをもたらす
ＰＴＯ結合または２’−フルオロ置換を、２’−Ｏ−メチル化と組み合わせて、選択性を増大することができるかどうか試すために、段階的にそれらをデュプレックスで組み合わせた。
【０１２８】
ＰＢＭＣをクロロキンでブロックし、ＲＩＧ−Ｉの刺激のために用いた。ＯＨ−ＧＦＰ２に基づいて示差的に修飾したデュプレックスを用い、ＩＦＮａについて、ＥＬＩＳＡによって、刺激の２０時間後にＲＩＧ−Ｉ活性化を測定した（図９）。多重に修飾したデュプレックスを、ＯＨ−ＧＦＰ２（Ａ）または三リン酸化３Ｐ−ＧＦＰ２（Ｂ）のいずれかと比較した。１００％のＩＶＴ  ４は、２１３０５ｐｇ／ｍｌのＩＮＦａに相当する。２ドナーの平均±ＳＥＭを示す。
【０１２９】
最初に、２’−Ｏメチル化ｓ１５／ａｓ３を、開始のＲＮＡ  ＯＨ−ＧＦＰ２に加え（ＯＨ−ＧＦＰ２  ｏＭｅｔ１５ｓ／ｏＭｅｔ３ａｓ、図９Ａ）、そしてそれから、センスおよびアンチセンスでの５’−ＰＴＯ修飾と比較した（ＯＨ−ＧＦＰ２  ＰＴＯ  ５’、図９Ａ）。次に、両方の型の修飾を、デュプレックス（ＯＨ−ＧＦＰ２ｏＭｅｔ１５／ｏＭｅｔ３  ＰＴＯ、図９Ａ）と組み合わせた。最後に、センスの７位および２３位およびアンチセンスの１３位に３つの２’−フルオロ置換をさらに含むデュプレックスを生産した（ＯＨ−ＧＦＰ２ｏＭｅｔ１５／３−Ｆ２３／１３−ＰＴＯ、図９Ａ）。これらのＲＮＡ二本鎖の比較滴定は、多重修飾したオリゴＯＨ−ＧＦＰ２ｏＭｅｔ１５／３−Ｆ２３／１３−ＰＴＯは、他のデュプレックスよりも活性がはるかに勝ることを示した。その活性をさらに評価するために、デュプレックスを滴定し、その非修飾三リン酸デュプレックスと比較した（図９Ｂ）。修飾の挿入は、オリゴヌクレオチドの免疫活性がその三リン酸の免疫活性と比べて同等になるように、オリゴヌクレオチドを変えることを可能にすることが分かった（３Ｐ−ＧＦＰ２、図９Ｂ）。
【０１３０】
実施例８：要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）は、３Ｐ−ｄｓＲＮＡ系に移行可能である
ＲＩＧ−Ｉ選択性リガンドの開発全体は、配列ＧＦＰ２のＯＨレベルで行なった。適切な修飾により、活性を著しく増大することができたが、リガンドの三リン酸化は、その活性をさらに増大させる。
【０１３１】
これまで、修飾およびそれぞれの位置を、３Ｐ−ＧＦＰ２系にそのまま移行することができるかどうか不明であった。
【０１３２】
この疑問に対する答えを見つけるために、デュプレックス（全て、活性を増大する修飾を有する）を生産した：センス鎖の塩基１５での２’−Ｏメチル化、塩基７および２３での２’−フルオロ置換、および、５’末端および３’末端での２つのＰＴＯ結合（２Ｓ２Ｆ、図１０）。アンチセンス鎖では、塩基３での２’−Ｏメチル化、塩基１３での２’−フルオロ置換、および、２つの５’−ＰＴＯ結合を組み合わせた。センス鎖での２つの５’−ＰＴＯの結合が、三リン酸にそれらが近接することにより中断するのを避けるために、５’−ＰＴＯの無い多重修飾センス鎖をさらに生産した（１Ｓ２Ｆ、図１０）。
【０１３３】
三リン酸化による活性増加の評価を可能にするために、５’−ヒドロキシルおよび５’−三リン酸（ＯＨ  ｖｓ  ３Ｐ、図１０）を用いてデュプレックスをそれぞれ生産し、ＰＢＭＣに対する刺激滴定により互いに比較した。
【０１３４】
図１０：（Ａ）三リン酸有りおよび無しで、多重修飾デュプレックスを合成した。用量滴定を、クロロキンでブロックしたＰＢＭＣに対して行なった。刺激の２０時間後、ＩＦＮａについて、免疫活性化をＥＬＩＳＡにより測定した。４ドナーの平均±ＳＥＭを示す。（Ｂ）滴定曲線に基づき、生物学的ＥＣ５０値を計算した。
【０１３５】
多重修飾ＯＨデュプレックスは、１つまたは２つのＰＴＯ末端の存在に関係なく、無修飾形態のＯＨ−ＧＦＰ２の活性限界に到達することができることが分かった（ＯＨ  Ｍｕｌｔｉ  １Ｓ２Ｆ，ＯＨ  Ｍｕｌｔｉ  ２Ｓ２Ｆ，ＯＨ−ＧＦＰ２，図１０）。センス鎖への５’−三リン酸のさらなる付加は、ヒドロキシル複合体と比較して活性をさらに５倍増加させた（３Ｐ−Ｍｕｌｔｉ  １Ｓ２Ｆ，３Ｐ−Ｍｕｌｔｉ  ２Ｓ２Ｆ，図１０）。
【０１３６】
結果として、様々な修飾により活性を増加させる効果は、オリゴヌクレオチドの三リン酸化と組み合わせることができることが確認され、そして、これらはそこで好ましい影響を示すことも確認された。
【０１３７】
オリジナルのデュプレックスＯＨ−ＧＦＰ２の選択性レベルの漸進的増加（２’−Ｏメチル化）、安定化する修飾による活性増加（ＰＴＯ結合および２’−フルオロ置換）、および、結合ポケットに対する親和力（三リン酸）、により、強力な選択性ＲＩＧ−Ｉリガンド（３Ｐ−Ｍｕｌｔｉ  １Ｓ２Ｆ）を定義することが可能となった。
【０１３８】
最後に、３Ｐ−ｄｓＲＮＡは、特定の修飾を挿入することにより、免疫を刺激する活性を最大限まで増加させて開発することができた。この免疫原性の増大は、薬剤の用量を低レベルに維持することを可能にし、および、薬剤の適用から細胞内に入るまでの期間に生じるＲＮＡの損失を補うことを可能にする。
【０１３９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２１】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３１】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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