(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵性炭素源からブタジエンを生成させる方法であって、
ａ．）発酵性炭素源を準備すること；
ｂ．）該発酵性炭素源を、クロトニル−ＣｏＡ中間体を介したブタジエン生成経路における酵素をコードするポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で接触させること；および
ｃ．）クロトニル−ＣｏＡ中間体を介した該ブタジエン生成経路における該酵素をコードする該ポリヌクレオチドを、該微生物内で発現させ、ブタジエンを生成させること
を含み、ここで、該ポリヌクレオチドによってコードされる酵素が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ）クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼ、ここで、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである；
（ｉｉ）クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼ、ここで、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである；
である、方法。
【請求項２】
前記微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記炭素源が、任意の形態のサトウキビ汁、サトウキビ糖蜜、加水分解デンプン、加水分解リグノセルロース物質、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクテート、ラクトース、キシロース、ピルベートまたはグリセロール、あるいはそれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炭素源が単糖、オリゴ糖または多糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブタジエンが前記微生物によって前記発酵培地中に分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ブタジエンを前記発酵培地から回収することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、クロトニル−ＣｏＡ中間体を介したブタジエン生成経路における酵素をコードする前記ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が嫌気的方法である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
クロトニル−ＣｏＡ中間体を介したブタジエン生成経路における酵素をコードするポリヌクレオチドを含む微生物であって、ここで、該ポリヌクレオチドによってコードされる酵素が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか：
（ｉ）クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼ、ここで、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである；
（ｉｉ）クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼ、ここで、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである；
である、微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、クロトニル−ＣｏＡ中間体を介したブタジエン生成経路における酵素をコードする前記ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されたものである、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドによってコードされる酵素が、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（二機能性）、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼであり、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドによってコードされる酵素が、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼであり、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素が、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（二機能性）、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼであり、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１９】
前記酵素が、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ、およびクロトニルアルコールデヒドラターゼであり、該クロトニルアルコールデヒドラターゼがリナロールデヒドラターゼである、請求項１１に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
ブタジエン（１，３−ブタジエン、ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＡＳ  １０６−９９−０）は、典型的には（他の４炭素の分子とともに）石油系炭化水素の水蒸気分解によって製造される線状で共役型の４炭素の炭化水素である。このプロセスは過酷な条件と高温（少なくとも約８５０℃）を伴う。ブタジエン生成の他の方法は、毒性の、および／または高価な触媒、高度に可燃性および／またはガス状の炭素源、ならびに高温を伴うものである。全世界で年間、数百万トンのブタジエン含有ポリマーが生産されている。ブタジエンは、重合させるとポリブタジエンを形成させることができるか、またはニッケル触媒の存在下でシアン化水素（青酸）と反応させるとナイロンの前駆体であるアジポニトリルを形成させることができる。しかしながら、より一般的にはブタジエンは、他のオレフィンと重合させてコポリマー、例えば、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、アクリロニトリル−ブタジエン（ＡＢＲ）またはスチレン−ブタジエン（ＳＢＲ）コポリマーなどを形成させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
概要
本開示は、一般的に、炭素源のブタジエンへの変換を触媒する１つ以上の経路の酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物（例えば、非天然微生物、本明細書において改変型微生物とも称する）、ならびに工業プロセスにおける、例えば、ブタジエンの生産における使用のためのかかる微生物の使用およびそれにより得られる製品に関する。
【０００３】
本開示により、発酵性炭素源を準備すること；該発酵性炭素源を、該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で接触させること；および該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドと該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドとを該微生物内で発現させ、ブタジエンを生成させることを含む、発酵性炭素源からブタジエンを生成させる方法を提供する。
【０００４】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該発酵性炭素源の該ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する該酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである。
【０００５】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する該酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである。
【０００６】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ブタジエンがアセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡ中間体；クロトニル−ＣｏＡ中間体；および／またはギ酸中間体を経由して生成される。
【０００７】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、ケトチオラーゼ（例えば、配列番号：５８〜７８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたケトチオラーゼを含む）をコードするものである。
【０００８】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシアレリル（ａｌｅｒｙｌ）−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼ（例えば、配列番号：１０３〜１２３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼを含む）をコードするものである。
【０００９】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、（Ｒ）もしくは（Ｓ）ヒドロキシアレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デヒドラターゼ（例えば、配列番号：３７〜５５のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデヒドラターゼを含む）をコードするものである。
【００１０】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ（例えば、それぞれ、配列番号：１〜２８または２９〜３３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼを含む）をコードするものである。
【００１１】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デカルボキシラーゼ（例えば、配列番号：７９〜９８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデカルボキシラーゼを含む）をコードするものである。
【００１２】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、イソメラーゼ（例えば、配列番号：９９〜１０２のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたイソメラーゼを含む）をコードするものである。
【００１３】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デカルボキシラーゼ（例えば、配列番号：７９〜９８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデカルボキシラーゼを含む）をコードするものである。
【００１４】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２−ペンテノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号：１２４〜１３９のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデヒドロゲナーゼを含む）をコードするものである。
【００１５】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエン酸系（ｐｅｎｔ−２，４−ｄｉｅｎｏｉｃ）への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ（例えば、それぞれ、配列番号：１〜２８または２９〜３３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼを含む）をコードするものである。
【００１６】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２，４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デカルボキシラーゼ（例えば、配列番号：７９〜９８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデカルボキシラーゼを含む）をコードするものである。
【００１７】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、クロトニル−ＣｏＡのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼ（例えば、配列番号：１０３〜１２３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼを含む）をコードするものである。
【００１８】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼ（例えば、配列番号：１０３〜１２３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼを含む）をコードするものである。
【００１９】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、クロトンアルデヒドのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼまたはＣｏＡシンテターゼ（例えば、それぞれ、配列番号：１０３〜１２３または配列番号：３４〜３６のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼまたはシンテターゼを含む）をコードするものである。
【００２０】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、クロトニルアルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デヒドラターゼ（例えば、配列番号：３７〜５５のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデヒドラターゼを含む）をコードするものである。
【００２１】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ＣＯ２のギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号：１２４〜１３９のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデヒドロゲナーゼを含む）をコードするものである。
【００２２】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ピルベートおよびＣｏＡのアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、ケトチオラーゼ（例えば、配列番号：５８〜７８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたケトチオラーゼを含む）をコードするものである。
【００２３】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ギ酸のホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、トランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼ（例えば、それぞれ、配列番号：１〜２８または３４〜３６のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼを含む）をコードするものである。
【００２４】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、２つのアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、ケトチオラーゼ（例えば、配列番号：５８〜７８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたケトチオラーゼを含む）をコードするものである。
【００２５】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡの３，５−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、ケトチオラーゼ（例えば、配列番号：５８〜７８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたケトチオラーゼを含む）をコードするものである。
【００２６】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、３，５−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼ（例えば、配列番号：１０３〜１２３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼを含む）をコードするものである。
【００２７】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、オキシドレダクターゼ（例えば、配列番号：１０３〜１２３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたオキシドレダクターゼを含む）をコードするものである。
【００２８】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デヒドラターゼ（例えば、配列番号：３７〜５５のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデヒドラターゼを含む）をコードするものである。
【００２９】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ（例えば、それぞれ、配列番号：１〜２８または２９〜３３のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼを含む）をコードするものである。
【００３０】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドが、デカルボキシラーゼ（例えば、配列番号：７９〜９８のいずれか１つに示されたポリヌクレオチドにコードされたデカルボキシラーゼを含む）をコードするものである。
【００３１】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である。
【００３２】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である。
【００３３】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００３４】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該炭素源が、任意の形態の混合物のサトウキビ汁、サトウキビ糖蜜、加水分解デンプン（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）、加水分解リグノセルロース物質（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクテート、ラクトース、キシロース、ピルベートまたはグリセロール、あるいはそれらの混合物である。
【００３５】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該炭素源が単糖、オリゴ糖または多糖である。
【００３６】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ブタジエンが該微生物によって該発酵培地中に分泌される。
【００３７】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該方法がさらに、ブタジエンを該発酵培地から回収することを含み得る。
【００３８】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、発酵性炭素源の該ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチド、および該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ものである。
【００３９】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、発酵性炭素源のブタジエンへの変換がＡＴＰ陽性であり（例えば、生成されるブタジエン１モルに対して正味のＡＴＰが生じる）、さらにＮＡＤＨ消費経路と合わされて、ブタジエン生成のための嫌気的プロセスがもたらされ得る。
【００４０】
また、本開示により、発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。
【００４１】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該発酵性炭素源の該ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する該酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである。
【００４２】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する該酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである。
【００４３】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、ブタジエンがアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ中間体；クロトニル−ＣｏＡ中間体；ならびに／またはギ酸中間体を経由して生成される。
【００４４】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である。
【００４５】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である。
【００４６】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００４７】
上記または下記の実施形態のいずれかと合わせてもよい一部の実施形態では、該微生物が、発酵性炭素源の該ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されたものである。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）  発酵性炭素源からブタジエンを生成させる方法であって、
ａ．）発酵性炭素源を準備すること；
ｂ．）該発酵性炭素源を、該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で接触させること；および
ｃ．）該発酵性炭素源の該ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、該微生物内で発現させ、ブタジエンを生成させること
を含む、方法。
（項目２）  前記発酵性炭素源の前記ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する前記酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する前記酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである、項目１に記載の方法。
（項目４）  ブタジエンがアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ中間体；クロトニル−ＣｏＡ中間体；ならびに／またはギ酸中間体を経由して生成される、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）ヒドロキシアレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエン酸系への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ならびに／または２，４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記微生物が、クロトニル−ＣｏＡのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトンアルデヒドのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／またはクロトニルアルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記微生物が、ＣＯ２のギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートおよびＣｏＡのアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ギ酸のホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡの３，５−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ならびに／または３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）  前記微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である、項目１に記載の方法。
（項目１０）  前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、項目９に記載の方法。
（項目１１）  前記炭素源が、任意の形態のサトウキビ汁、サトウキビ糖蜜、加水分解デンプン、加水分解リグノセルロース物質、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクテート、ラクトース、キシロース、ピルベートまたはグリセロール、あるいはそれらの混合物である、項目１に記載の方法。
（項目１２）  前記炭素源が単糖、オリゴ糖または多糖である、項目１に記載の方法。
（項目１３）  前記ブタジエンが前記微生物によって前記発酵培地中に分泌される、項目１に記載の方法。
（項目１４）  前記ブタジエンを前記発酵培地から回収することをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）  前記微生物が、前記発酵性炭素源の前記ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されたものである、項目１に記載の方法。
（項目１６）  前記発酵性炭素源のブタジエンへの変換がＡＴＰ陽性であり、ＮＡＤＨ消費経路と合わさると、ブタジエン生成のための嫌気的プロセスがもたらされ得る、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）  発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、微生物。
（項目１８）  前記発酵性炭素源の前記ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する前記酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである、項目１７に記載の微生物。
（項目１９）  前記１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する前記酵素が、表１〜３のいずれか１つに示されたものである、項目１７に記載の微生物。
（項目２０）  ブタジエンがアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ中間体；クロトニル−ＣｏＡ中間体；ならびに／またはギ酸中間体を経由して生成される、項目１７に記載の微生物。
（項目２１）  前記微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）ヒドロキシアレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエン酸系への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ならびに／または２，４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１７に記載の微生物。
（項目２２）  前記微生物が、クロトニル−ＣｏＡのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトンアルデヒドのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／またはクロトニルアルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１７に記載の微生物。
（項目２３）  前記微生物が、ＣＯ２のギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートおよびＣｏＡのアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ギ酸のホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡの３，５−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ならびに／または３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである、項目１７に記載の微生物。
（項目２４）  前記微生物が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓからなる属より選択される細菌である、項目１７に記載の微生物。
（項目２５）  前記微生物が、酵母、糸状菌、原生動物または藻類である真核生物である、項目１７に記載の微生物。
（項目２６）  前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、項目２５に記載の微生物。
（項目２７）  前記微生物が、発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変されたものである、項目１７に記載の微生物。
【００４８】
本開示のこれらおよび他の実施形態を、本明細書において以下にさらに詳細に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本開示の前述の概要ならびに以下の詳細説明は、添付した図と併せて読むと、より良好に理解されよう。本開示の実例を示す目的のために、現時点で好ましい実施形態を図に示している。しかしながら、本開示は、図示した厳密な配置、実施例および手段に限定されないことを理解されたい。
【図１】図１は、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ中間体を経由する発酵性炭素源からのブタジエンの生成の例示的な経路を示す。
【図２】図２は、クロトニル−ＣｏＡ中間体を経由する発酵性炭素源からのブタジエンの生成の例示的な経路を示す。
【図３】図３は、ギ酸中間体を経由する発酵性炭素源からのブタジエンの生成の例示的な経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細説明
本開示は、一般的に、遺伝子改変された経路を含む微生物（例えば、非天然微生物；改変型微生物）および発酵性炭素源のブタジエンへの変換のための該微生物の使用（図１〜３参照）に関する。かかる微生物は、新規な酵素的経路により発酵性炭素源のブタジエンへの変換を触媒する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである。任意選択で、生成したブタジエンを続いてポリブタジエンまたは任意の数の他のブタジエン含有ポリマーに変換させてもよい。
【００５１】
本開示により、一部において、炭素源（例えば、発酵性炭素源）からのブタジエンの生成のための新規な酵素的経路（例えば酵素的経路の新規な組合せを含む）の知得を提供する。本明細書に開示の酵素的経路は、アセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡ中間体；クロトニル−ＣｏＡ中間体；および／またはギ酸中間体を経由するブタジエンの酵素による生成を可能にするものである。
【００５２】
本明細書において提供する方法では、生成プロセス全体にわたって滅菌を確立かつ維持するために典型的に必要とされる高い設備投資と継続的なより高価な管理コストとを伴わない滅菌の方法と同様の最終結果が得られる。この点について、ほとんどの工業規模のブタジエン生成プロセスは、該プロセスの好気的性質に起因して、測定可能な数の細菌汚染物の存在下で操作される。ブタジエン生成プロセスの細菌汚染により、生成収量の低下およびブタジエン産生微生物の増殖の阻害が引き起こされると考えられている。これまでの方法のかかる欠点は本開示の方法により、生成するブタジエンの毒性の性質によって該生成プロセスにおける汚染物が低減されるため回避される。
【００５３】
本明細書に開示の酵素的経路は、本明細書に開示の酵素的経路はＡＴＰ陽性であり、ＮＡＤＨ消費経路と合わさるとブタジエンへの嫌気性経路がもたらされ得るという点において、ブタジエン生成のためのこれまでの既知の酵素的経路よりも好都合である。ブタジエンの生成に好気的プロセスを使用することも可能であるが、発酵プロセス中、特にブタジエンの発酵ではオレフィン（これは本質的に爆発性である）が酸素と混合されると危険が生じるため嫌気的プロセスが好ましい。さらに、発酵槽内への酸素と窒素の補給には、空気圧縮機、発酵槽（気泡塔またはエアリフト型発酵槽）、温度制御および窒素のための追加投資が必要とされる。また、酸素の存在によってブタジエンの重合が触媒され得、発酵ブロス中で好気性汚染物の増殖が促進され得る。さらに、ブタジエン生成のための好気的発酵プロセスでは、工業規模（この場合、無菌状態を維持することが技術的に難しい）においていくつかの欠点、例えば、（ｉ）より大きなバイオマスでは、得られる炭素基準での所望の生成物の全収率が低くなる；（ｉｉ）存在および酸素は汚染物の増殖に有利となる（Ｗｅｕｓｔｈｕｉｓら，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．４，１５３−１５８）、ならびに（ｉｉｉ）酸素とブタジエンなどのガス状化合物との混合物は深刻な爆発の危険性をもたらし、（ｉｖ）酸素によってオレフィンの不要な重合反応が触媒されることがあり得、最終的に（ｖ）好気性条件での発酵および精製のコストが高くなるということが示される。さらに、本明細書に開示の方法によって生成されるブタジエンはＯ２とＮ２によって希釈されず、したがって、費用と時間の両方がかかる生成されるブタジエンの精製が回避される。
【００５４】
本明細書に記載の方法のいずれかおよびすべてに関与している諸工程は、任意の順序で行なわれ得、具体的に記載された順序に限定または制限されないことは理解されよう。例えば、本開示により、発酵性炭素源を準備すること；該発酵性炭素源を、該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で接触させること；および該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドおよび該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを該微生物内で発現させ、ブタジエンを生成させることを含む、発酵性炭素源からブタジエンを生成させる方法を提供する。したがって、ブタジエンを生成させるための該微生物内での該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドと該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現は、該発酵性炭素源を、該発酵性炭素源のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で接触させる前に行なっても後に行なってもよい。
【００５５】
また、本明細書に開示の微生物は、発酵性炭素源のブタジエンへの変換を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドのすべてを含む、図１〜３のいずれかに開示した経路全体を含むものであってもよいことも理解されよう。あるいはまた、本明細書に開示の微生物は、図１〜３のいずれかにおける発酵性炭素源のブタジエンへの変換を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むものであってもよい（例えば、微生物は、図１〜３のいずれかに開示した発酵性炭素源のブタジエンへの変換を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチドのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類またはそれ以上を含むものであり得る）ことも理解されよう。
【００５６】
一部の実施形態において、発酵性炭素源のグラム数に対する生成されるブタジエンのグラム数の比率は、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５０、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９または１．００である。
【００５７】
一部の実施形態において、生成されるブタジエンの炭素のモル数は、発酵性炭素源の炭素のモル数の２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を構成している。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「ブタジエン」は、一般式ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２および分子量５４．０９ｇ／ｍｏｌのブタ−１，３−ジエンまたは１，３−ブタジエン（ＣＡＳ  １０６−９９−０）を意味していることを意図する。
【００５９】
本明細書で用いる場合、用語「生物学的活性」または「機能的活性」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに言及している場合、該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、一部の生物学的プロセス、経路または反応に関して有用な機能性または性質を示すものであることを意味するものであり得る。生物学的または機能的活性は、例えば、別のポリペプチドまたは分子と相互作用または関連する（例えば、結合する）能力に言及している場合もあり得、他のタンパク質または分子の相互作用（例えば、酵素反応）を触媒または調節する能力に言及している場合もあり得る。
【００６０】
本明細書で用いる場合、用語「培養する」は、細胞集団、例えば微生物細胞集団を増殖のための適当な条件下で液体培地中または固体培地上にて増殖させることに言及したものであり得る。
【００６１】
本明細書で用いる場合、用語「〜に由来する」には、〜に起源を有する、〜から得られた、〜から得られ得る、〜から単離された、および〜から創出された、という用語が包含され得、一般的には、ある特定の物質が、その起源が別の特定の物質中に見られること、または該別の特定の物質と関連して説明できるという特徴を有することを示している。
【００６２】
本明細書で用いる場合、用語「発現ベクター」は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列、例えば、ＤＮＡコード配列（例えば、遺伝子配列）を含有しており、該配列が、宿主内での該コード配列の発現に影響を及ぼし得る１つ以上の適当な制御配列（単数または複数）に作動可能に連結されている、ＤＮＡ構築物に言及したものであり得る。かかる制御配列としては、転写に影響を及ぼすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意選択的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。該ベクターは、プラスミドであっても、ファージ粒子であっても、単純に潜在的ゲノム挿入体であってもよい。適当な宿主内で形質転換させると、該ベクターは、宿主のゲノムとは独立して複製して機能し得るか（例えば、独立したベクターもしくはプラスミド）、または場合によっては該ゲノム自体に組み込まれ得る（例えば、組み込みベクター）。プラスミドは最も一般的に使用されている発現ベクターの形態である。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たす当該技術分野で公知の、または当該技術分野で公知となるかかる他の形態の発現ベクターも包含していることを意図する。
【００６３】
本明細書で用いる場合、用語「発現」は、ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、遺伝子）に基づいて生成されるプロセスに言及したものであり得る。該プロセスには転写および翻訳の両方が包含される。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、融合タンパク質）の生成に関与しているＤＮＡ断片に言及したものであり得、コード領域の前および後の領域ならびに個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）を包含している。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「異種」は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドに関連している場合、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドが特定の細胞内、例えば宿主細胞内に天然に存在しないことに言及したものであり得る。該用語は、天然に存在する遺伝子、変異型遺伝子および／または合成遺伝子にコードされたタンパク質を包含していることを意図する。対照的に、同種という用語は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドに関連している場合、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドが細胞内に天然に存在することをいう。
【００６６】
本明細書で用いる場合、用語「宿主細胞」は、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、融合タンパク質）の発現のために組換え発現ベクターがトランスフェクトされ得る細胞または細胞株（例えば微生物などの細胞を含む）に言及したものであり得る。宿主細胞には宿主単細胞の子孫も包含され、子孫は、天然、偶発的または意図的な変異のため必ずしも元の親細胞と（形態または全ゲノムＤＮＡの相補体において）完全に同一でないことがあり得る。宿主細胞には、発現ベクターにてインビボでトランスフェクトまたは形質転換させた細胞も包含され得る。
【００６７】
本明細書で用いる場合、用語「導入される」は、細胞内への核酸配列またはポリヌクレオチド配列の挿入の状況においてトランスフェクション、形質転換または形質導入を包含するものであり得、真核生物細胞または原核生物細胞内への核酸配列またはポリヌクレオチド配列の組込みをいい、この場合、該核酸配列またはポリヌクレオチド配列は、細胞のゲノム内に組み込まれ得るか（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）、自律性レプリコンに変換され得るか、一過的に発現され得る。
【００６８】
本明細書で用いる場合、本発明の微生物体または微生物に関して使用している場合の用語「非天然」は、該微生物体が、言及している種の天然に存在する株、例えば言及している種の野生型株には通常みられない少なくとも１つの遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を有していることを意味していることを意図する。遺伝子改変としては、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸が導入される改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、他の核酸付加、核酸欠失および／または微生物体の遺伝物質の他の機能破壊が挙げられる。かかる改変は、例えば、言及している種の異種ポリペプチド、同種ポリペプチドまたは異種ポリペプチドと同種ポリペプチドの両方のコード領域およびその機能性断片を含むものである。さらなる改変は、例えば、改変によって遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コード調節領域を含むものである。本開示の非天然微生物体は安定な遺伝子改変を含んでいるものであり得、これは、微生物が、該改変の喪失なく５世代より後まで培養され得ることをいう。一般的に、安定な遺伝子改変としては１０世代より後まで持続される改変が挙げられ、特に安定な改変は約２５世代より後まで持続され、より特別には、安定な遺伝子改変は５０世代より後まで（例えば、無期限に）存在する。当業者には、遺伝子改変（例えば、本明細書に例示した代謝的改変）を大腸菌などの適当な宿主生物体およびその対応する代謝反応または所望の遺伝物質（所望の代謝経路の遺伝子など）の適当な供給源生物体に関して記載していることが理解されよう。しかしながら、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクス分野における高レベルの技術を考慮すると、当業者は、本明細書に示した教示および手引きを本質的にすべての他の生物体に容易に適用することができよう。例えば、本明細書に例示した大腸菌の代謝改変は、他の種に対して、言及している種以外の種に由来する同じまたは類似のコード核酸を組み込むことによって容易に適用され得る。かかる遺伝子改変としては、例えば、一般にはホモログ種の遺伝子改変、特に、オーソログ、パラログまたは非オーソロガス遺伝子の置換が挙げられる。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「ブタジエン」は、分子式Ｃ４Ｈ６、一般式ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ２および分子量５４．０９ｇ／ｍｏｌの共役型の線状ジエンを意味していることを意図する。また、ブタジエンは、当該技術分野において１，３−ブタジエン、ブタ−１，３−ジエン、ビエチレン、エリトレン、ジビニルおよびビニルエチレンとしても知られている。
【００７０】
本明細書で用いる場合、用語「作動可能に連結された」は、特定のエレメントの並置または配置により、該エレメントを協調して機能させ、効果をもたらすことに言及したものであり得る。例えば、プロモーターは、コード配列の転写が制御される場合、該コード配列に作動可能に連結されたものであり得る。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与し遺伝子の転写を開始させる調節配列に言及したものであり得る。プロモーターは誘導性プロモーターであっても構成的プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、環境調節条件または発生調節条件下で活性なプロモーターである。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、任意の長さならびに任意の３次元構造および一本鎖または複数本鎖（例えば、一本鎖、二本鎖、三重らせんなど）のポリマー形態のヌクレオチドに言及したものであり得、これは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの類似体もしくは改変型形態、例えば、改変型のヌクレオチドもしくは塩基またはその類似体を含むものである。かかるポリヌクレオチドまたは核酸配列は、アミノ酸（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば融合タンパク質）をコードするものであり得る。遺伝コードは縮重しているため、ある特定のアミノ酸をコードする１つより多くのコドンが使用されることがあり得、本開示には、ある特定のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドが包含されている。ポリヌクレオチドが使用条件下で所望の機能性を保持している限り、任意の型の改変型ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、ヌクレアーゼ耐性を増大させる改変体（例えば、デオキシ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ホスホロチオエートなど）が使用され得る。また、検出または捕捉の目的で、標識、例えば、放射性もしくは非放射性の標識またはアンカー（例えば、ビオチン）を組み込んでもよい。また、ポリヌクレオチドという用語はペプチド核酸（ＰＮＡ）も包含している。ポリヌクレオチドは天然に存在するものであっても非天然であってもよい。ポリヌクレオチド、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は本明細書において互換的に用いている。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくは両方および／またはその改変型形態および／または類似体を含むものであり得る。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。１つ以上のホスホジエステル結合を別の連結基で置き換えてもよい。このような別の連結基としては、限定されないが、ホスフェートをＰ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯＣＨ２（ホルムアセタール）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、あるいは任意選択でエーテル（−Ｏ−）結合を含む置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である）で置き換えた実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。ポリヌクレオチドは、線状であっても環状であってもよく、線状部分と環状部分の組合せを含むものであってもよい。
【００７３】
本明細書で用いる場合、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸で構成され、かつ当業者によってタンパク質と認識される組成物に言及したものであり得る。本明細書では、アミノ酸残基をコードする慣用的な１文字または３文字を用いている。タンパク質およびポリペプチドという用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマー、例えば、連結した（例えば、融合した）ペプチド／ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を構成するものを含むものを示すために互換的に用いている。該ポリマーは線状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含むものであってもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。また、該用語は、天然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも包含している。また、例えば、１つ以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸など）、ならびに当該技術分野で知られた他の改変を含むポリペプチドもこの定義に包含される。
【００７４】
本明細書で用いる場合、関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドにはバリアントタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが包含され得る。バリアントタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、親タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと、および／または互いにアミノ酸残基の数が少数異なっている。一部の実施形態において、異なるアミノ酸残基数は約１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のいずれかである。一部の実施形態では、バリアントは約１〜約１０個のアミノ酸が異なっている。あるいはまたさらに、バリアントは、例えば、配列アラインメントツール、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬ（下記参照）を用いて調べたとき参照タンパク質または核酸と特定の度合いの配列同一性を有するものであってもよい。例えば、バリアントタンパク質または核酸は、参照配列と少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するものであり得る。
【００７５】
本明細書で用いる場合、用語「回収された」、「単離された」、「精製された」、および「分離された」は、天然では結合している少なくとも１種類の成分から取り外された物質（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチドまたは細胞）に言及したものであり得る。例えば、これらの用語は、天然状態（例えば、インタクトな生物学的系など）で見られるとき通常、付随している成分が実質的または本質的にない物質に言及したものであり得る。
【００７６】
本明細書で用いる場合、用語「組換え」は、人間によって操作されたため自然界に見られる核酸、ポリペプチドおよび細胞と同じでない核酸配列またはポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはタンパク質およびそのベースの細胞に言及したものであり得る。また、組換えは、配列または発現の特徴が改変されるように改変された（例えば、改変ポリペプチドが生成するようにコード配列を変異させること、コード配列を別のコード配列または遺伝子のものに融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に配すること、遺伝子を異種生物体で発現させること、遺伝子をより低いまたは高いレベルで発現させること、遺伝子をその天然の発現プロフィールと異なる様式にて条件付きでまたは構成的に発現させることなどにより）遺伝物質（例えば、核酸配列またはポリヌクレオチド、これらにコードされたポリペプチドまたはタンパク質、ならびにかかる核酸配列またはポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞）に言及したものである場合もあり得る。
【００７７】
本明細書で用いる場合、用語「選択的マーカー」または「選択可能なマーカー」は、宿主細胞内で発現され得、導入された核酸配列、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主の容易な選択を可能にする遺伝子に言及したものであり得る。選択可能なマーカーの例としては、限定されないが、抗菌物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、もしくはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対して代謝上の利点（栄養上の利点など）を付与する遺伝子が挙げられる。
【００７８】
本明細書で用いる場合、少なくとも２つの核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドとの関連における用語「実質的に類似の」および「実質的に同一の」は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドが、参照（例えば、野生型）核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドとの比較において少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに９９．５％の配列同一性を有する配列を含むものであることを意味するものであり得る。配列同一性は、既知のプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬを使用し、標準的なパラメータを用いて測定され得る（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３；およびＨｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターにより公衆に利用可能である。また、ＦＡＳＴＡを用いてデータベースを検索してもよい（Ｐｅｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８）。一部の実施形態において、実質的に同一のポリペプチドは、１個または１個より多い保存アミノ酸の置換のみが異なっている。一部の実施形態では、実質的に同一のポリペプチドは免疫学的に交差反応性のものである。一部の実施形態では、実質的に同一の核酸分子はストリンジェント条件下で（例えば、ストリンジェンシーが中程度から高度の範囲内で）互いにハイブリダイズするものである。
【００７９】
本明細書で用いる場合、用語「トランスフェクション」または「形質転換」は、宿主細胞内への外来核酸またはポリヌクレオチドの挿入に言及したものであり得る。外来核酸またはポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター（例えば、プラスミド）として維持され得るか、あるいはまた宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得る。トランスフェクトする、またはトランスフェクションという用語は、宿主細胞内に核酸またはポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる慣用的な手法を包含していることを意図する。トランスフェクション手法の例としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。
【００８０】
本明細書で用いる場合、用語「形質転換させた」、「安定的に形質転換させた」、および「トランスジェニック」は、ゲノム内に組み込まれているか、または多世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして非天然の（例えば、異種）核酸配列またはポリヌクレオチド配列を有する細胞に言及したものであり得る。
【００８１】
本明細書で用いる場合、用語「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するために設計されたポリヌクレオチド配列に言及したものであり得る。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、一本鎖および二本鎖のカセットなどが挙げられる。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「野生型」、「天然の」または「天然に存在する」タンパク質は、自然界に見られるタンパク質に言及したものであり得る。野生型配列という用語は、自然界に見られる、または天然に存在するアミノ酸または核酸の配列を示す。一部の実施形態において、野生型配列は、タンパク質工学プロジェクト（例えば、バリアントタンパク質の作製）の出発点である。
【００８３】
本明細書において特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者にとって、本開示において用いている用語の多くの一般的辞書となろう。さらに、本明細書におけるいずれかの経路に開示した任意の基質には、択一的に該基質のアニオンまたはカチオンが包含され得ることは理解されよう。
【００８４】
本明細書に示した数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。
【００８５】
特に記載のない限り、それぞれ、核酸配列は左から右に５’から３’の方向に記載しており；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシルの方向に記載している。
【００８６】
本開示は種々の形態で具体化され得るが、いくつかの実施形態の以下の説明は、本開示の例示とみなされるべきという理解を伴ってなされたものであり、本開示を実例を示した具体的な実施形態に限定することを意図したものでない。見出しは、便宜上、示しているにすぎず、本開示をなんらの様式に限定するものと解釈されるべきでない。いずれかの見出しの下に実例を示した実施形態は、いずれかの他の見出しの下に実例を示した実施形態と組み合わせてもよい。
【００８７】
本出願において明示した種々の定量的な値における数値の使用は、そうでないことを明示していない限り、あたかも記載の範囲内の最小値と最大値の両方の前に文言「約」が記載されているかのように近似値として記載している。また、範囲の開示は、記載の最小値と最大値の間のどの値も含む連続範囲ならびにかかる値によって形成され得る任意の範囲を意図している。また、本明細書には、開示された数値を開示された任意の他の数値に分けることにより形成され得る任意のおよび全ての比率（ならびにかかる比率の任意の範囲）も開示されている。したがって、当業者には、多くのかかる比率、範囲および比率の範囲が本明細書に示された数値から明確に誘導でき、あらゆる場合においてかかる比率、範囲および比率の範囲は本開示の種々の実施形態を表していることが認識されよう。
【００８８】
微生物の改変
微生物は、当該技術分野で知られた任意の方法によって、発酵性炭素源をブタジエンに変換させ得る１つ以上の経路の酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチドおよび／または非異種ポリヌクレオチド）を含むように、および／または発現（例えば、過剰発現など）するように改変され（例えば、遺伝子操作され）得る。微生物は、発酵性炭素源をブタジエンに変換させるために必要とされる１つ以上の経路の酵素のすべてを天然に発現するものであってもよく、該１つ以上の経路における１つ以上の酵素を発現（例えば、過剰発現など）するように改変してもよい。一部の実施形態において、微生物は、そのような経路における全ての酵素より少ない酵素を含むものであり得、欠けている酵素をコードするポリヌクレオチドが該微生物に遺伝学的に導入され得る。例えば、改変型微生物は、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のブタジエン生成経路における１つ以上の中間体（例えば、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ；クロトニル−ＣｏＡ；および／またはギ酸）への変換を触媒する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むように改変されたものであり得る。さらにあるいはまた、改変型微生物は、該１つ以上の中間体（例えば、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ；クロトニル−ＣｏＡ；および／またはギ酸）のブタジエンへの変換を触媒する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むように改変されたものであり得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ブタジエン生成経路における１つ以上の中間体の変換を触媒する酵素をコードするものであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた酵素の基質特異性がモジュレート（例えば、増大または低減）されるように改変（例えば、遺伝子操作）され得、あるいはポリヌクレオチドは、コードされた酵素の基質特異性が変化するように改変され得る（例えば、ある基質に対して特異性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが、該酵素が別の基質に対して特異性を有するように改変され得る）。好ましい微生物は、表１〜３および図１〜３のいずれか１つに示された酵素のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むものであり得る。
【００８９】
微生物は、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものであり得る。一部の実施形態において、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドとしては、限定されないが：
−  アセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  （Ｒ）もしくは（Ｓ）ヒドロキシアレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼもしくはトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ２−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、Ｃ＝Ｃ結合転位イソメラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ２−ペンテノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンテノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡのペンタ−２，４−ジエン酸系への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、もしくはトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または
−  ２，４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンタ，２，４−ジエン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド
が挙げられ得る。
【００９０】
一部の実施形態において、微生物は、さらに、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のメチルマロニル−ＣｏＡおよび／またはアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである。
【００９１】
一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【００９２】
アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡをブタジエンに変換させる例示的な酵素を以下の表１に、作用対象の基質および生成される生成物とともに示す。表１に示した酵素番号は、アセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡ中間体を経由する発酵性炭素源のブタジエンへの酵素的変換を模式的に示す図１で使用した酵素番号付けと相関している。
【００９３】
表１：アセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡ中間体を経由するブタジエンの生成
【００９４】
【表１】
0006415326.tif 000002
微生物は、クロトニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものであり得る。一部の実施形態において、クロトニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドとしては、限定されないが：
−  クロトニル−ＣｏＡのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（二元機能性））をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  クロトンアルデヒドのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または
−  クロトニルアルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニルアルコールデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド
が挙げられ得る。
【００９５】
一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【００９６】
好ましい実施形態では、微生物は、さらに、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである。
【００９７】
一部の実施形態において、微生物は、さらに、発酵性炭素源（例えば、グルコース）の３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび／または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものであり得る。かかる実施形態において、微生物は、さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／または４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである。
【００９８】
クロトニル−ＣｏＡをブタジエンに変換させる例示的な酵素を以下の表１に、作用対象の基質および生成される生成物とともに示す。表１に示した酵素番号は、クロトニル−ＣｏＡ中間体を経由する発酵性炭素源のブタジエンへの酵素的変換を模式的に示す図１で使用した酵素番号付けと相関している。
【００９９】
表２：クロトニル−ＣｏＡ中間体を経由するブタジエンの生成
【０１００】
【表２】
0006415326.tif 000003
微生物は、ギ酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものであり得る。一部の実施形態において、ギ酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする該１つ以上のポリヌクレオチドとしては、限定されないが：
−  ＣＯ２のギ酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ピルベートおよびＣｏＡのアセチル−ＣｏＡおよびギ酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、アセチル−ＣｏＡ：ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ギ酸のホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ホルミル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  アセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡの３，５−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ケトバレリル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  ３，５−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  （Ｒ）もしくは（Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  （Ｒ）もしくは（Ｓ）−３，５−ジヒドロキシアレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
−  （Ｒ）もしくは（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼもしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または
−  ３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド
が挙げられ得る。
【０１０１】
一部の実施形態において、微生物は、さらに、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものである。
【０１０２】
一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１０３】
ギ酸をブタジエンに変換させる例示的な酵素を以下の表３に、作用対象の基質および生成される生成物とともに示す。表３に示した酵素番号は、ギ酸中間体を経由する発酵性炭素源のブタジエンへの酵素的変換を模式的に示す図３で使用した酵素番号付けと相関している。
【０１０４】
表３：ギ酸中間体を経由するブタジエンの生成
【０１０５】
【表３】
0006415326.tif 000004
また、発酵性炭素源のアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのメチルマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アクリロイル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、ペンテノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくはペンテノイル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、Ｃ＝Ｃ結合転位イソメラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ペンテン酸脂肪酸デカルボキシラーゼまたは２−ペンテン（ｐｅｔｅｎｏｉｃ）酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１０６】
また、発酵性炭素源のエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびエチル−マロニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡの酪酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；酪酸のエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブタノイル−ＣｏＡ：二酸化炭素リガーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；エチル−マロニル−ＣｏＡの２−（ホルモル）ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、エチル−マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成））をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−（ホルモル）ブタン酸の２−（ヒドロキシメチル）ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−（ホルミル）ブタン酸レダクターゼ（アルコール形成））をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；エチルマロニル−ＣｏＡの２−（ヒドロキシメチル）ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、エチル−マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成））をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−（ヒドロキシメチル）ブタン酸の２−（ホスファニルオキシメチル）ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−（ヒドロキシメチル）ブタン（ｂｕｔａｎｏｃ）酸キナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−（ホスファニルオキシメチル）ブタン酸の２−（ジホスファニルオキシメチル）ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−（ホスファニルオキシメチル）ブタン酸キナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−（ジホスファニルオキシメチル）ブタン酸の［（Ｅ）−ブタ−２−エノキシ］−ホスファニル−ホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−（ジホスファニルオキシメチル）ブタン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または［（Ｅ）−ブタ−２−エノキシ］−ホスファニル−ホスフェートのブタジエン（例えば、ブタジエンシンテターゼ）への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１０７】
また、発酵性炭素源の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のＰＥＰへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ＰＥＰのオキサロアセテートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ＰＥＰのピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼもしくはピルビン酸フェロドキシンオキシレダクターゼ（ｏｘｉｒｒｅｄｕｃｔａｓｅ））あるいはオキサロアセテート（例えば、ＰＥＰカルボキシキナーゼもしくはＰＥＰカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；オキサロアセテートのマレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；マレートのフマレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、フマラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；フマレートのスクシネートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、フマル酸レダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシネートのスクシニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくはスクシニル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシニル−ＣｏＡのスクシニルセミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシニルセミアルデヒドの４−ヒドロキシブチレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシネートの４−ヒドロキシブチレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、コハク酸レダクターゼ、ホスホパンタテイニラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔａｔｈｅｉｎｙｌａｓｅ）もしくは４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ヒドロキシブチレートの４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトンアルデヒドのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトニルアルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（二機能性）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／またはクロトニルアルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニルアルコールデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１０８】
また、発酵性炭素源のアクリロイル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびアクリロイル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのラクテートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクテートのラクトイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ラクトイル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクトイル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アクリロイル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡの３−ケト−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ケト−４−ペンテノイル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ケト−４−ペンテノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、もしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１０９】
また、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のアセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびアセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのラクテートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクテートのラクトイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ラクトイル−ＣｏＡトランスフェラーゼもしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクトイル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アクリロイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アクリロイル−ＣｏＡヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートの３−ヒドロキシプロピオネートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ヒドロキシプロピオネートの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡの５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、もしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１１０】
また、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のアセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびアセトアセチル−ＣｏＡおよびホルミル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡおよびホルメートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ピルビン酸ギ酸リアーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ＣＯ２のホルメートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ホルメートのホルミル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ホルミル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、もしくはホルミル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ホルミル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−ＣｏＡの３，５−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ケトバレリル−ＣｏＡの５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、もしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１１１】
また、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のアセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびアセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アクリロイル−ＣｏＡの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートの３−ヒドロキシプロピオネートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ヒドロキシプロピオネートの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡの５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡの（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、５−ヒドロキシ−３−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）ポリヌクレオチド；（Ｒ）もしくは（Ｓ）３，５−ジヒドロキシ−バレリル−ＣｏＡの３，５−ヒドロキシペンタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシペンタン酸キナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ヒドロキシペンタン酸の３，５−ヒドロキシペンタン酸ホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシペンタン酸キナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ヒドロキシペンタン酸ホスフェートの３，５−ヒドロキシペンタン酸ジホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３，５−ヒドロキシペンタン酸リン酸キナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３，５−ヒドロキシペンタン酸ジホスフェートの１−ブテニル−４−ジホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ヒドロキシペンタン酸二リン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／または１−ブテニル−４−ジホスフェートのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブタジエンシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１１２】
また、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびエチル−マロニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ／レダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡの酪酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；酪酸のエチル−マロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブタノイル−ＣｏＡ：二酸化炭素リガーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；エチル−マロニル−ＣｏＡの２−ヒドロキシメチル−ブタン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、エチル−マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ヒドロキシメチル−ブタン酸の２−ブテニル４−ジホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、２−ヒドロキシメチル−ブタン酸キナーゼ、ヒドロキシメチルブタノエート−ホスフェートキナーゼ、もしくは２−ヒドロキシメチルブタノエート−ジホスフェートデカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ヒドロキシメチル−ブタン酸の２−ブテニル４−ホスフェートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ブテニル４−ホスフェートのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および／または２−ブテニル４−ジホスフェートのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ブタジエンシンテターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上、例えば上記のポリヌクレオチドのすべてを含む微生物を提供する。
【０１１３】
また、発酵性炭素源（例えば、グルコース）のラクテートおよびアセチル−ＣｏＡとオキサルアセテートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよびラクテートおよびアセチル−ＣｏＡとオキサルアセテートのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（発酵性炭素源（例えば、グルコース）のＰＥＰへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ＰＥＰのピルベートへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ピルベートのアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクテートのラクトイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ラクテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ラクトイル−ＣｏＡのアクリロイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；アクリロイル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アクリロイル−ＣｏＡオキシドレダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；プロピオニル−ＣｏＡのケトバレリル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、チオラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ケトバレリル−ＣｏＡの２−ペンテノイル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、ケトバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテノイル−ＣｏＡの２−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、もしくはシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；２−ペンテン酸の４−ペンテン酸への変換を触媒する経路における酵素（例えば、Ｃ＝Ｃ結合転位イソメラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ペンテン酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；オキサルアセテートのマレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；マレートのフマレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、フマラーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；フマレートのスクシネートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、フマル酸レダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシネートのスクシニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシニル−ＣｏＡのスクシネートセミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、スクシニル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；スクシネートセミアルデヒドの４−ヒドロキシブチレートへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ヒドロキシブチレートの４−ヒドロキシブチリル（ｂｕｔｙｒｉｌ）−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、もしくは４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトニル−ＣｏＡのクロトニル−アルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼもしくは二機能性アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；クロトンアルデヒドのクロトニル−アルコールへの変換を触媒する経路における酵素（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；および／またはクロトニル−アルコールのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、クロトニルアルコールデヒドラターゼ）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む微生物も提供する。
【０１１４】
本明細書において提供される任意の微生物は、任意選択で、発酵性炭素源のブタジエンへのレドックス均衡型の変換を許容する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
【０１１５】
微生物は古細菌（ａｒｃｈｅａ）、細菌または真核生物であり得る。一部の実施形態において、細菌はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉまたはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉが挙げられる）である。一部の実施形態において、真核生物は酵母、糸状菌、原生動物または藻類である。一部の実施形態において、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【０１１６】
一部の実施形態において、本開示では、本明細書において提供される酵素の１つ以上の改変（例えば、操作）を想定している。かかる改変は、該酵素の基質特異性が再設計されるように、および／または所与の基質に対する選択性を増大させるために他の基質に対する活性が改変（例えば、低減）されるように行なわれ得る。さらにあるいはまた、本明細書において提供される１つ以上の酵素は、その特性の１つ以上が改変される（例えば向上する、例えば、その触媒活性または基質特異性が増大する、など）ように操作され得る。
【０１１７】
任意の該酵素（例えば、該酵素をコードするポリヌクレオチド）が、その基質特異性が拡張または改変される（例えば、ある酵素の基質特異性がある基質から別の基質に変化する）ように、当該技術分野で知られた任意の方法によって改変（例えば、変異誘発または多様化）され得る。かかる方法としては、限定されないが、ＥｐＰＣＲ  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４：４９７−５０９（２００５））；エラープローンローリングサークル型増幅（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｅｐＲＣＡ）Ｆｕｊｉｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１４５（２００４）；およびＦｕｊｉｉら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：２４９３−２４９７（２００６））；ＤＮＡもしくはファミリーシャッフリング（ＤＮＡ  ｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１（１９９４））；Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳｔＥＰ）Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１（１９９８））；および／またはランダムプライミング組換え（Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＰＲ）Ｓｈａｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：６８１−６８３（１９９８））が挙げられる。
【０１１８】
ポリヌクレオチドの変異誘発のためのさらなる例示的な方法としては、ヘテロ二本鎖組換え（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（Ｖｏｌｋｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：ｅ１８（１９９９）；およびＶｏｌｋｏｖら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４５６−４６３（２０００））；一時的なテンプレートに対するランダムなキメラ形成（Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＡＣＨＩＴＴ）（Ｃｏｃｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３５４−３５９（２００１））；切断型テンプレートに関する組換え伸長（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＥＴＴ）（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２６：１１９−１２９（２００３））；縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（ＤＯＧＳ）（ＢｅｒｇｑｕｉｓｔおよびＧｉｂｂｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：１９１−２０４（２００７）；Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２：６３−７２（２００５）；Ｇｉｂｂｓら，Ｇｅｎｅ  ２７１：１３−２０（２００１））；ハイブリッド酵素の作製のための増加性切断（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：３５６２−３５６７（１９９９）；およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１２０５−１２０９（１９９９））；ハイブリッド酵素の作製のためのチオ‐増加性切断（Ｔｈｉｏ−Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＴＨＩＯ−ＩＴＣＨＹ）（Ｌｕｔｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ１６（２００１））；ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Ｌｕｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１１２４８−１１２５３（２００１））；ランダムドリフト変異誘発（Ｒａｎｄｏｍ  Ｄｒｉｆｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＮＤＭ）（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔら，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２２：６３−７２（２００５））；配列飽和変異誘発（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＳｅＳａＭ）（Ｗｏｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３：７４−８２（２００８）；Ｗｏｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ２６（２００４）；およびＷｏｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４１：１８７−１８９（２００５））；合成シャッフリング（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｎｅｓｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２５１−１２５５（２００２））；ヌクレオチド交換及び切除技術（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＮｅｘＴ）（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１１７（２００５））が挙げられる。さらなる例示的な方法としては、配列相同性非依存的タンパク質組換え（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＨＩＰＲＥＣ）（Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４５６−４６０（２００１））；遺伝子部位飽和変異誘発（Ｇｅｎｅ  Ｓｉｔｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（商標）（ＧＳＳＭ（商標））（Ｋｒｅｔｚら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｙｍｏｌ．３８８：３−１１（２００４））；コンビナトリアルカセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＣＭ）（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６（１９９１）；およびＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８））；コンビナトリアル多重カセット変異誘発（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＣＭＣＭ）（Ｒｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４０：３５８９−３５９１（２００１））；ならびにミューテーター株技術（Ｍｕｔａｔｏｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３６４５−３６４９（２００１）；Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８０（１９９６））が挙げられる。さらなる例示的な方法としては、探索型変異誘発（Ｌｏｏｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：８４６６−８４７１（２００５））；遺伝子再構築（Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｉｔｏｎによって提供されるＴｕｎａｂｌｅ  ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）（ＴＧＲ（商標））技術）、インシリコタンパク質設計自動化（ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）（ＰＤＡ）（Ｈａｙｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１５９２６−１５９３１（２００２））；ならびに反復性飽和変異誘発（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＩＳＭ）（Ｒｅｅｔｚら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：８９１−９０３（２００７）；およびＲｅｅｔｚら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４５：７７４５−７７５１（２００６））が挙げられる。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に開示の酵素の１つ以上を改変するために、タンパク質の配列アラインメントおよび比較モデリングが使用され得る。相同性モデリングまたは比較モデリングは、所望のタンパク質の原子分解モデルをその一次アミノ酸配列と同様のタンパク質の実験的３次元構造から構築することをいう。このモデルにより、酵素の基質結合部位を確定すること、およびその基質特異性を再設計するために他の天然アミノ酸に置き換えられ得る具体的なアミノ酸位置の特定が可能となり得る。
【０１２０】
本明細書に開示の酵素をコードするポリヌクレオチドと実質的同一性または相同性を有するバリアントまたは配列を本開示の実施に使用してもよい。かかる配列はバリアントまたは改変配列と称され得る。すなわち、該ポリヌクレオチド配列は改変されているが、所望の活性を示すポリペプチドをコードする能力をまだ依然として保持しているものであり得る。したがって、かかるバリアントまたは改変配列は等価物である。一般的に、バリアントまたは改変配列は、天然の配列と少なくとも約４０％〜６０％、好ましくは約６０％〜８０％、より好ましくは約８０％〜９０％、さらにより好ましくは約９０％〜９５％の配列同一性を含むものであり得る。
【０１２１】
一部の実施形態において、微生物は、本明細書において提供される１つ以上の酵素を発現（例えば、過剰発現など）するように改変され得る。微生物は、遺伝子操作手法（すなわち、組換え技術）、古典的な微生物学的手法、またはかかる手法の組合せによって改変され得、また、遺伝子改変型微生物を作製するための天然に存在する遺伝子バリアントも包含され得る。かかる手法の一例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓに一般的に開示されている。
【０１２２】
微生物には、かかる改変によって該微生物内で本明細書において提供される１つ以上の酵素の所望の発現効果（例えば、過剰発現）がもたらされるような様式でポリヌクレオチドが挿入、欠失または改変された（すなわち、変異された；例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または逆位により）微生物も包含され得る。遺伝子の発現または機能の増大をもたらす遺伝子改変は、遺伝子の増幅、過剰生成、過剰発現、活性化、増強、付加または上方調節と称され得る。遺伝子発現を増大させるためのクローン化遺伝子の付加には、クローン化遺伝子（単数もしくは複数）を複製するプラスミド上に維持すること、またはクローン化遺伝子（単数もしくは複数）を産生生物体のゲノム内に組み込むことが包含され得る。さらに、所望のクローン化遺伝子の発現増大には、クローン化遺伝子（１つまたは複数）を天然または異種転写制御エレメントに作動可能に連結することが包含され得る。
【０１２３】
所望される場合、本明細書において提供される酵素の１つ以上の発現は、該酵素の発現を、発酵反応の間、時間依存的様式で直接または間接的に制御する調節配列の制御下におく。
【０１２４】
一部の実施形態では、微生物を遺伝媒体、例えば、本明細書において提供される酵素をコードする外来ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトする。
【０１２５】
原核生物宿主または真核生物宿主内への導入のために調製されるポリヌクレオチド構築物は、典型的には（常にそうではないが）、所望のポリペプチドをコードする意図されるポリヌクレオチド断片を含む、宿主によって認識される複製系（すなわちベクター）を含むものであり得、また、好ましくは（必ずしもそうではないが）該ポリペプチドコード断片に作動可能に連結された転写および翻訳の開始調節配列を含むものであり得る。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）ならびに発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、ｍＲＮＡ安定化配列、宿主の染色体ＤＮＡに相同なヌクレオチド配列、および／またはマルチクローニング部位を含むものであり得る。また、適切な場合は、好ましくは同じ種または関連種の分泌ポリペプチドに由来し、タンパク質が細胞膜を通過すること、および／または細胞膜内に貯留されること、あるいは細胞から分泌されることを可能にするシグナルペプチドを含めてもよい。
【０１２６】
ベクターは標準的な方法を用いて構築され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏ．Ｎ．Ｙ，１９９５参照）。
【０１２７】
本開示のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に開示の酵素の１つ以上をコードするポリヌクレオチドの操作は、典型的には組換えベクターにて行なわれる。数多くのベクターが公衆に利用可能であり、細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体、エピソームベクターおよび遺伝子発現ベクターが挙げられ、これらはすべて使用可能である。本開示に従って有用なベクターは、所望のサイズのタンパク質コード配列が収容されるように選択され得る。適当な宿主細胞が、インビトロクローニング操作後にベクターで形質転換される。宿主細胞は、原核生物のもの（いくつかの細菌株のいずれかなど）であってもよく、真核生物のもの（酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類の細胞など、または哺乳動物の細胞、例えば、齧歯類、サルもしくはヒトの細胞など）であってもよい。各ベクターには種々の機能性成分が含有されており、該成分としては、一般的に、クローニング部位、複製起点および少なくとも１種類の選択可能なマーカー遺伝子が挙げられる。所与のベクターが発現ベクターである場合、これは、さらに以下：エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列のうちの１つ以上を有しており、各々はクローニング部位の近傍に、本開示によるポリペプチドレパートリー構成員をコードする遺伝子に作動可能に連結されるように配置される。
【０１２８】
ベクター（例えば、クローニングベクターおよび発現ベクター）に、該ベクターが選択された１つ以上の宿主細胞内で複製されることを可能にする核酸配列を含めてもよい。例えば、該配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり得、複製起点または自己複製配列が挙げられ得る。さまざまな細菌、酵母およびウイルスのかかる配列がよく知られている。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、２ミクロンプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルスの起点（例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点は、哺乳動物発現ベクターには、該ベクターが高レベルのＤＮＡ複製できる哺乳動物細胞（ＣＯＳ細胞など）において使用されない限り必要とされない。
【０１２９】
クローニングベクターまたは発現ベクターに、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含めてもよい。この遺伝子は、選択培養培地中で培養している形質転換させた宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードするものである。したがって、選択遺伝子を含むベクターで形質転換させていない宿主細胞は培養培地中で生き残れない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、ハイグロマイシン、チオストレプトン、アプラマイシンもしくはテトラサイクリン、補充栄養素要求性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ）欠陥に対する耐性を付与するタンパク質、または増殖培地中では得られ得ない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードするものである。
【０１３０】
ベクターの複製は大腸菌（例えば、菌株ＴＢ１またはＴＧ１、ＤＨ５α、ＤＨ１０β、ＪＭ１１０）内で行なわれ得る。大腸菌の選択可能なマーカー、例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が有用であり得る。このような選択可能なマーカーは、大腸菌プラスミド（ｐＢＲ３２２など）あるいはｐＵＣプラスミド（ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９、またはｐＵＣ１１９など）から得られ得る。
【０１３１】
発現ベクターに、宿主生物体によって認識されるプロモーターを含めてもよい。プロモーターは対象のコード配列に作動可能に連結され得る。かかるプロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが意図された様式で機能することが許容される関係にある場合、作動可能に連結されている。
【０１３２】
原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、例えば、α−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、エリスロマイシンプロモーター、アプラマイシンプロモーター、ハイグロマイシンプロモーター、メチレノマイシンプロモーターならびにハイブリッドプロモーター（ｔａｃプロモーターなど）が挙げられ得る。さらに、宿主の構成的または誘導性プロモーターを使用してもよい。また、細菌系における使用のためのプロモーターには、一般的に、コード配列に作動可能に連結させたシャイン・ダルガーノ配列も含める。
【０１３３】
ウイルスゲノムから得られるウイルスプロモーターとしては、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２または５）、単純ヘルペスウイルス（チミジンキナーゼプロモーター）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＭｏＭＬＶ、またはＲＳＶ  ＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター（ＭＰＳＶ）、ＶＩＳＮＡ、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターが挙げられる。異種哺乳動物プロモーターとしては、例えば、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックタンパク質プロモーターが挙げられる。
【０１３４】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは制限断片として簡便に得られ、該制限断片にはＳＶ４０ウイルス複製起点も含まれている（例えば、Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８）；ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１４２２−１４２７（１９８０）；ならびにＰａｖｌａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７３９８−７４０２（１９８１）参照）。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極初期プロモーターはＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。（例えば、Ｇｒｅｅｎａｗａｙら，Ｇｅｎｅ，１８：３５５−３６０（１９８２）参照）。広範な宿主のプロモーター（ＳＶ４０初期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスＬＴＲなど）が本発明の発現ベクターにおける使用に適している。
【０１３５】
一般的に、所望の産物の高レベルの転写および発現を得るためには強力なプロモーターが使用され得る。中でも、高レベル発現のための強力なプロモーターであると確認されている真核生物プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、およびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶまたはＣＭＶ  ＩＥ）である。一実施形態では、プロモーターはＳＶ４０またはＣＭＶ初期プロモーターである。
【０１３６】
使用されるプロモーターは構成的であっても調節可能なもの、例えば誘導性であってもよい。例示的な誘導性プロモーターとしては、ｊｕｎ、ｆｏｓおよびメタロチオネインならびに熱ショックプロモーターが挙げられる。転写ユニットの一方または両方のプロモーターが誘導性プロモーターであり得る。一実施形態では、ＧＦＰが構成的プロモーターから発現され、一方、誘導性プロモーターにより、本明細書に開示の１つ以上の酵素をコードする遺伝子および／または増幅可能な選択可能なマーカーの転写が誘導される。
【０１３７】
高等真核生物の転写調節領域にはエンハンサー配列が含まれている場合があり得る。哺乳動物の遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列、例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン遺伝子に由来のものが知られている。好適なエンハンサーは、真核生物細胞ウイルスに由来するエンハンサーである。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス最初期プロモーターのエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５））、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー（また、例えば、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関するＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと）が挙げられる。エンハンサー配列は、ベクター内に対象遺伝子に対して５’位に導入しても３’位に導入してもよいが、好ましくはプロモーターに対して５’の部位に配置する。
【０１３８】
酵母および哺乳動物の発現ベクターに、細菌内でのベクターの増殖を助長する原核生物配列を含めてもよい。したがって、ベクターは、他の成分、例えば、複製起点（例えば、ベクターが、選択した１つ以上の宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列）、細菌内での選択のための抗生物質耐性遺伝子、および／またはコドンを読み通すための翻訳を許容し得るアンバー停止コドンを有するものであってもよい。さらなる真核生物系の選択可能な遺伝子（１つまたは複数）を組み込んでもよい。一般的に、クローニングベクター内において、複製起点は、該ベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列が挙げられる。かかる配列はよく知られており、例えば、細菌のＣｏｌＥ１複製起点である。種々のウイルスの起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、真核生物レプリコンは、染色体外（エピソーム）複製が意図されていない限り、哺乳動物細胞での発現には必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモーターを含んでいるからというだけで使用され得る）。
【０１３９】
本明細書に開示の酵素をコードする異なる遺伝子の構築物および発現ベクターからの挿入ならびに発現を促進するため、本明細書に開示の任意の酵素をコードする任意の遺伝子の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を有する構築物が設計され得る。クローニング部位は、例えば、複数の制限部位を含むマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）であり得る。
【０１４０】
プラスミドは細菌宿主細胞内で増殖し、サブクローニング工程のため、または真核生物宿主細胞への導入のためのＤＮＡストックが準備され得る。真核生物宿主細胞のトランスフェクションは、当該技術分野で周知の任意の方法によって任意に行なわれ得る。トランスフェクション法としては、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、塩化ルビジウムまたはポリカチオン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合およびマイクロインジェクションが挙げられる。好ましくは、トランスフェクションは安定なトランスフェクションである。具体的な宿主の細胞株および型において構築物の最適なトランスフェクション頻度および発現がもたらされるトランスフェクション法が有利である。好適な方法は、常套的な手順によって決定され得る。安定なトランスフェクタントでは、構築物は宿主の染色体内に安定的に維持されるように組み込まれる。
【０１４１】
ベクターは選択した宿主細胞に、当業者に知られたいくつかの適当な方法のいずれかによって導入され得る。例えば、ベクター構築物は適切な細胞に、プラスミドベクターでのいくつかの形質転換方法のいずれかによって導入され得る。例えば、標準的な塩化カルシウム媒介性細菌形質転換は、裸のＤＮＡを細菌に導入するために依然として一般的に使用されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）が、エレクトロポレーションおよびコンジュゲーションもまた使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【０１４２】
酵母または他の真菌細胞へのベクター構築物の導入では、化学的形質転換法が使用され得る（例えば、Ｒｏｓｅら，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。形質転換細胞は、使用した選択可能なマーカーに適切な選択的培地上で単離され得る。あるいはまたさらに、プレートまたはプレートから取り上げたフィルターをＧＦＰ蛍光についてスキャンし、形質転換クローンを同定してもよい。
【０１４３】
差次的発現配列を含むベクターの哺乳動物細胞への導入では、使用される方法はベクターの形態に依存し得る。プラスミドベクターは、いくつかのトランスフェクション法のいずれか、例えば、脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿などによって導入され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【０１４４】
多種多様な形質転換細胞および非形質転換細胞または一次細胞の一過性トランスフェクションに適したリポフェクションの試薬および方法が広く利用可能であり、リポフェクションは、構築物を真核生物細胞に、特に培養哺乳動物細胞に導入する魅力的な方法となっている。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットが利用可能である。リポフェクションのための試薬および方法を提供している他の会社としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡが挙げられる。
【０１４５】
宿主細胞は、所望のタンパク質をコードする構築物が発現され、該タンパク質がプロセッシングされ、分泌タンパク質が分泌のために細胞表面に輸送され得るものであり得る。プロセッシングには、共翻訳修飾および翻訳後修飾、例えば、リーダーペプチド切断、ＧＰＩ結合、グリコシル化、ユビキチン化、およびジスルフィド結合形成が包含される。トランスフェクションに適した不死化宿主細胞培養物および遺伝子操作に典型的に使用されるその種の（ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｎｄ）インビトロ細胞培養物が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（浮遊培養での培養に適合させた２９３または２９３誘導株，Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；ＤＨＦＲ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−派生物（ＥＰ３０７，２４７，１９８９年３月１５日公開）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＰＥＥＲヒト急性リンパ芽球細胞株（Ｒａｖｉｄら  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２５：７０５−７１０（１９８０））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒトＨＴ１０８０細胞、ＫＢ細胞、ＪＷ−２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ６細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞である。また、トランスジェニック動物の作製に使用される胚細胞も適している（例えば、接合体および胚性幹細胞）。
【０１４６】
ベクター内のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）のクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、例えば、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞が挙げられ得る。この目的に好適な原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１  Ｐ）、シュードモナス属、例えばＰ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の一例はＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１１０（ＡＴＣＣ  ４７，０１３）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）も適している。
【０１４７】
原核生物に加え、真核生物系の微生物、例えば糸状菌または酵母も１つ以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクター用の適当なクローニング宿主または発現宿主であり得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されているものである。しかしながら、いくつかの他の属、種および菌株、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒも一般的に利用可能であり、本明細書において有用である。
【０１４８】
酵素をグリコシル化する場合、発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物体に由来するものであり得る。無脊椎動物細胞の例としては植物および昆虫の細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株およびバリアントならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（カイコガ）などの宿主に由来する対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用のさまざまなウイルス株が公衆に利用可能であり（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）、かかるウイルスは、本開示に従って、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのための本開示におけるウイルスとして使用され得る。
【０１４９】
また、綿、トウモロコシ、イモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、ウキクサ（ｌｅｍｎａ）、および他の植物細胞の植物細胞培養物も宿主細胞として使用することができる。
【０１５０】
有用な哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０によって形質転換させたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（浮遊培養での培養のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１５１】
宿主細胞は、本明細書に開示の１つ以上の酵素の生成用の上記の発現ベクターもしくはクローニングベクターで、または本明細書に開示の１つ以上の酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされ、適宜、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のための改変した慣用的な栄養培地中で培養される。
【０１５２】
開示している酵素をコードする所望の核酸配列を含む宿主細胞は、さまざまな培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞の培養に適している。また、Ｈａｍら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，（１９７９）；Ｂａｒｎｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれかに必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の終濃度で存在する無機化合物と定義する）、ならびにグルコースまたは等価のエネルギー源を補充してもよい。また、任意の他の必要な補充物を、当業者にわかり得る適切な濃度で含めてもよい。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択した宿主細胞で先に使用したものであり、当業者に自明であろう。
【０１５３】
ポリヌクレオチドおよびコードされた酵素
酵素的変換を触媒し得る酵素またはそのバリアント、例えば表１〜３または図１〜３のいずれか１つに示した酵素などをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）が本開示による使用に想定される。かかるポリヌクレオチドは、コードされた酵素の基質特異性がモジュレート（例えば、増大もしくは低減）されるように改変（例えば、遺伝子操作）され得るか、または該ポリヌクレオチドは、コードされた酵素の基質特異性が変化するように改変され得る（例えば、ある基質に対して特異性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが、該酵素が別の基質に対して特異性を有するように改変され得る）。好ましい微生物は、表１〜３および図１〜３のいずれか１つに示された酵素のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むものであり得る。
【０１５４】
一部の実施形態において、微生物は、オキシドレダクターゼ、例えば、ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（二機能性）、クロトンアルデヒドデヒドロゲナーゼ、クロトニルアルコールデヒドロゲナーゼ、３，５−ケトバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、または配列番号：１０３〜１２３に示すオキシドレダクターゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、トランスフェラーゼ、例えば、ペンテノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ホルミル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、または配列番号：１〜２８に示すトランスフェラーゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、ヒドロラーゼ、例えば、ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、ペンタ−２，４−ジエノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡヒドロラーゼ、または配列番号：２９〜３３に示すヒドロラーゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、ＣｏＡシンターゼ、例えば、ホルミル−ＣｏＡシンターゼまたは配列番号：３４〜３６に示すＣｏＡシンターゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、ケトチオラーゼ、例えば、チオラーゼ、アセチル−ＣｏＡ：ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、３，５−ケトバレリル−ＣｏＡチオラーゼ、または配列番号：５８〜７８に示すケトチオラーゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、デヒドロゲナーゼ、例えば、ペンテノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、または配列番号：１２４〜１３９に示すデヒドロゲナーゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、デヒドラターゼ、例えば、ヒドロキシバレリルＣｏＡデヒドラターゼ、クロトニルアルコールデヒドラターゼ、３，５−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡデヒドラターゼ、または配列番号：３７〜５５に示すデヒドラターゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、イソメラーゼ、例えば、Ｃ＝Ｃ結合転位イソメラーゼ、または配列番号：９９〜１０２に示すイソメラーゼを含むものであり得る。一部の実施形態では、微生物は、デカルボキシラーゼ、例えば、２−ペンテン酸デカルボキシラーゼ、４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ、ペンタ，２，４−ジエン酸デカルボキシラーゼ、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸デカルボキシラーゼ、または配列番号：７９〜９８に示すデカルボキシラーゼを含むものであり得る。
【０１５５】
図１〜３の変換を触媒する酵素を、酵素（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）（ＥＣ）番号、機能、および変換を触媒する図１〜３における工程によって表４に類別する（表４）。
【０１５６】
表４：使用した酵素のＥＣ番号
【０１５７】
【表４】
0006415326.tif 000005
図１の工程ＤとＩおよび図３の工程ＣとＩは、ＥＣ２．８．３のトランスフェラーゼ（例えば、ある分子から別の分子へのＣｏＡ部分の可逆的移動を触媒するトランスフェラーゼを含む）によって触媒され得る。ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素をコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表５に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１５８】
表５：ＥＣ２．８．３の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１５９】
【表５−１】
0006415326.tif 000006
【０１６０】
【表５−２】
0006415326.tif 000007
図１の工程ＤとＩおよび図３の工程ＩはＥＣ３．１．２のヒドロラーゼ（例えば、広い基質範囲を有し、２−ペンテノイル（ｐｅｔｅｎｔｅｎｏｙｌ）−ＣｏＡ、２，４−ペンテノイル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシペンテノイル−ＣｏＡをその対応する酸に加水分解し得るヒドロラーゼを含む）によって触媒され得る。ヒドロラーゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表６に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１６１】
表６：ＥＣ３．１．２．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１６２】
【表６】
0006415326.tif 000008
図３の工程Ｃは、ＥＣ６．２．１．のＣｏＡシンテターゼ（例えば、広い基質範囲を有し、ギ酸をホルミル−ＣｏＡに活性化し得るＣｏＡシンテターゼを含む）によって触媒され得る。ＣｏＡシンテターゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表７に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１６３】
表７：ＥＣ６．２．１．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１６４】
【表７】
0006415326.tif 000009
二重結合の水和はＥＣ４．２．１のヒドラターゼ酵素によって触媒され得、二重結合を形成するための水の除去はＥＣ４．２．１のデヒドラターゼ酵素によって触媒され得る。ヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆的であり、脱水を触媒することもあり得る。同様に、デヒドラターゼ酵素は場合によっては可逆的であり、水和を触媒することもあり得る。所与の基質からの水の付加または水の除去は、図１の工程Ｃ、図２の工程Ｄおよび図３の工程Ｈで必要とされる。ヒドラターゼまたはデヒドラターゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表７に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１６５】
表８：ＥＣ４．２．１．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１６６】
【表８】
0006415326.tif 000010
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ株６５Ｐｈｅｎ由来のリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼはβ−ミルセンの（３Ｓ）−リナロールへの立体特異的水和、（３Ｓ）−リナロールのゲラニオールへの異性化を触媒し、モノテルペンであるβ−ミルセンの嫌気性分解の初期工程に関与している。さらに、このリナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼは、逆反応、すなわち、ゲラニオールのリナロールへの異性化およびリナロールのミルセンへの脱水を触媒する。この方向では、ゲラニオールからのミルセンの形成は、モノテルペンアルコールの解毒プロセスとして確認され得る。他のデヒドラターゼ−イソメラーゼとしては、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ／ビニルアセチル−ＣｏＡ−Δ−イソメラーゼが挙げられる。デヒドラターゼ／イソメラーゼは、クロトニル−アルコールが基質として許容される標準的な方法によって操作され得、したがって、以下のこのような図２の工程Ｄの適当な候補となる：
表９：クロトニルアルコールデヒドラターゼへと操作され得る例示的な遺伝子
【０１６７】
【表９】
0006415326.tif 000011
図１の工程Ａならびに図３の工程Ｃ、ＤおよびＥには、アセチル−ＣｏＡまたはアセトアセチル−ＣｏＡのいずれかのホルミル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡとの縮合が必要とされる。かかる縮合は、ＥＣ２．３．１に示されるケトチオラーゼにより触媒され得る。しかしながら、ケトチオラーゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表１０に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１６８】
表１０：ＥＣ２．３．１．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１６９】
【表１０−１】
0006415326.tif 000012
【０１７０】
【表１０−２】
0006415326.tif 000013
図１の工程Ｅ、ＧおよびＪならびに図２の工程Ｊは、ＥＣ分類４．１．１に示されるデカルボキシラーゼ酵素によって触媒され得る。数多くのデカルボキシラーゼが特性評価されており、構造的に類似した基質を２−ペンテン酸、２，４−ペンテジエン酸（図１）および３−ヒドロキシペンテン酸（図３）に脱炭酸することが示されている。図１の工程Ｊのための例示的な酵素としては、ＥＣ４．１．１．１６に示されるソルビン酸デカルボキシラーゼおよびアコニット酸デカルボキシラーゼが挙げられる。図１の工程ＧおよびＥのための例示的な酵素としては、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ由来のｐ４５０脂肪酸デカルボキシラーゼが挙げられ得る。図３の工程Ｊのための例示的な酵素としては、ＥＣ４．１．１．３３に示される酵素、例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが挙げられ得る。しかしながら、デカルボキシラーゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表１１に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１７１】
表１１：ＥＣ４．１．１．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１７２】
【表１１−１】
0006415326.tif 000014
【０１７３】
【表１１−２】
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図１の工程Ｆは、ＥＣ５．３．３に示されるイソメラーゼ酵素を伴う。該工程のための例示的な酵素としてはイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼが挙げられる。しかしながら、イソメラーゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表１２に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１７４】
表１２：ＥＣ５．３．３．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１７５】
【表１２】
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図１の工程Ｂ、図２の工程Ａ、ＢおよびＣならびに図３の工程ＦおよびＧは、ケトンのアルコールへの還元を伴い、ＥＣ分類１．１．１のオキシドレダクターゼ酵素によって触媒され得る。しかしながら、オキシドレダクターゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表１３に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１７６】
表１３：ＥＣ１．１．１．の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１７７】
【表１３−１】
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【０１７８】
【表１３−２】
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図１の工程Ｉおよび図３の工程ＡはＥＣ１．３．１または１．２．９９に示されるデヒドロゲナーゼを伴う。しかしながら、デヒドロゲナーゼをコードする任意の既知のポリヌクレオチド（例えば、以下の表１４に示すポリヌクレオチドが挙げられる）が本開示による使用に想定される。
【０１７９】
表１４：ＥＣ１．３．１または１．２．９９の酵素をコードする例示的な遺伝子
【０１８０】
【表１４】
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ブタジエン生成のための方法
ブタジエン（例えば、発酵生成物）は、本明細書において提供される１つ以上の遺伝子改変型微生物を発酵性炭素源と接触させることにより生成させ得る。かかる方法は、好ましくは、発酵性炭素源を、該発酵性炭素源の表１〜３または図１〜３に示す中間体のいずれかへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび表１〜３または図１〜３に示す該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む微生物と、発酵培地中で、例えば充分な条件下で適当な期間接触させること；ならびに該発酵性炭素源の表１〜３または図１〜３に示す該１つ以上の中間体への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドならびに表１〜３または図１〜３に示す該１つ以上の中間体のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを該微生物内で発現させ、ブタジエンを生成させることを含むものである。一部の実施形態において、発酵性炭素源のブタジエンへの変換はＡＴＰ陽性であり（例えば、生成されるブタジエン１モルに対して正味のＡＴＰが生じる；ＡＴＰが副生成物として生成される）、ＮＡＤＨ消費経路と合わさると、ブタジエン生成のための嫌気的プロセスがもたらされ得る。例えば、発酵性炭素源（グルコースまたはフルクトースなど）のブタジエンへの変換では、生成されるブタジエン１モルに対して正味１ｍｏｌのＡＴＰが生成され得る。
【０１８１】
例示的な発酵性炭素源としては、限定されないが、任意の形態のサトウキビ汁、サトウキビ糖蜜、加水分解デンプン、加水分解リグノセルロース物質、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクテート、ラクトース、キシロース、ピルベート、またはグリセロール、あるいはそれらの混合物が挙げられ得る。一部の実施形態では、該炭素源が単糖、オリゴ糖または多糖である。
【０１８２】
ブタジエンなどの工業的に重要な化合物の生成に至る代謝経路は酸化−還元（レドックス）反応を伴う。例えば、発酵中、グルコースが、一連の酵素反応においてエネルギーの放出を同時に伴って小分子に酸化される。放出された電子は、ある反応から別の反応にユニバーサル電子担体（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ））など、これらはオキシドレダクターゼ酵素の補因子として作用する）によって伝達される。微生物の異化では、グルコースは、酵素により該補因子の酸化型形態（ＮＡＤ（Ｐ）＋および／またはＮＡＤ＋）を補因子として用いて酸化され、したがって、還元型補因子の形態の還元性等価物（ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＮＡＤＨ）が生じる。発酵が継続されるためには、レドックス均衡型の代謝が必要とされる、すなわち、補因子は、微生物細胞の代謝化合物の還元によって再生されなければならない。一部の実施形態において、本明細書に開示の新規な経路は、レドックス均衡を得るために最終生成物が再分配される経路を経て発酵性炭素源のブタジエンへの変換がもたらされるという点で好都合である。
【０１８３】
本明細書に開示の１つ以上の改変型微生物による発酵性炭素源の効率的な発酵のための重要なパラメータの一例としては：微生物をより大きな細胞密度まで培養する能力、所望の生成物の収量の増加、容積生産性の量の増加、不要な共代謝産物の除去、廉価な炭素源および窒素源の利用の改善、種々の発酵槽条件への適合、主要代謝産物の生成の増加、副次代謝産物の生成の増加、酸性条件に対する耐容性の増加、塩基性条件に対する耐容性の増加、有機溶媒に対する耐容性の増加、高塩分条件に対する耐容性の増加ならびに高温または低温に対する耐容性の増加が挙げられる。これらのパラメータのいずれかにおける低効率により、高い製造コストがもたらされ得、市場シェアを獲得もしくは維持することができなくなり得、そして／または発酵最終生成物を市場に出すことができなくなり得る。
【０１８４】
本開示の方法は、慣用的な発酵バイオリアクター（例えば、バッチ型、フェッドバッチ型、細胞再利用型および連続発酵）に適合させることができる。一部の実施形態において、本明細書において提供される微生物（例えば、遺伝子改変型微生物）は、発酵培地中に発酵生成物（単数または複数）の排出がもたらされる液体発酵培地中で培養される（すなわち、液内培養）。発酵は、撹拌槽、気泡塔、エアリフト型反応器または当該技術分野で知られた任意の他の適当な構成体として構成されたバイオリアクターで行なわれ得る。一実施形態において、発酵最終生成物（単数または複数）は、発酵培地から当該技術分野で知られた任意の適当な方法を用いて単離され得る。
【０１８５】
一部の実施形態において、発酵生成物の形成は、微生物の初期の高速増殖期間中に起こり得る。一実施形態では、発酵生成物の形成は、培養物が低速増殖状態または非増殖状態に維持される第２期間中に起こり得る。一実施形態では、発酵生成物の形成は、微生物の１つより多い増殖期間中に起こり得る。かかる実施形態において、単位時間あたりに形成される発酵生成物の量は、一般的に、微生物の代謝活性、生理学的培養条件（例えば、ｐＨ、温度、培地の組成）、および発酵プロセス中に存在している微生物の量の関数である。
【０１８６】
一部の実施形態において、発酵生成物は、ペリプラズムまたは培養培地から分泌代謝産物として回収される。一実施形態では、発酵生成物は、例えば微生物が発酵生成物に対応する分泌シグナルを欠損している場合、微生物から抽出される。一実施形態では、微生物を破砕し、培養培地またはライセートを遠心分離し、粒状の細胞残屑を除去する。次いで、必要な場合は膜画分および可溶性タンパク質画分を分離してもよい。次いで、目的の発酵生成物が残留上清み溶液または懸濁物から、例えば、蒸留、分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、クロマトグラフィー、沈殿、濾過などによって精製され得る。一実施形態において、発酵生成物は、蒸留、反応蒸留、共沸蒸留および抽出蒸留のうちの１つ以上によって抽出される。
【０１８７】
本開示の方法は嫌気性条件下で好ましく行なわれる。生成物の還元度ならびにその合成のＡＴＰ要求性の両方によって、生成プロセスを好気的に進行できるか、または嫌気的に進行できるかが決定される。ブタジエンを嫌気性微生物変換によって、または少なくとも低減された酸素消費量でのプロセスを用いることによって生成させるためには、レドックス不均衡を回避すべきである。いくつかの型の代謝変換工程は、表１〜３または図１〜３に示す変換のいくつかを含むレドックス反応を伴う。かかるレドックス反応は、レドックス補因子（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびフェレドキシンなど）の関与によって媒介される電子伝達を伴う。細胞内のレドックス補因子の量は代謝過程の継続が許容されるように制限されているため、補因子は再生されなければならない。かかるレドックス不均衡を回避するため、別の補因子再生様式を画策してもよく、一部の場合では、さらなるＡＴＰ生成源が供給され得る。あるいはまた、酸化プロセスおよび還元プロセスを生物電気化学的系内で空間的に分離してもよい（ＲａｂａｅｙおよびＲｏｚｅｎｄａｌ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第８巻：７０６−７１６）。
【０１８８】
一部の実施形態において、レドックス不均衡は、より酸化された、またはより還元された基質（例えば、発酵性炭素源）を使用することにより回避され得る。例えば、基質の利用によって電子の不足または余剰がもたらされる場合、それぞれ、より還元された、またはより酸化された基質を使用することにより酸素に対する要求性が回避され得る。例えば、バイオディーゼル生産の主要副生成物であるグリセロールは、糖よりも還元されており、したがって、糖からの生成によって補因子の酸化がもたらされる化合物（コハク酸など）の合成に、より適している。一部の実施形態では、基質の生成物への変換によって電子不足がもたらされる場合、電子供与体として機能する補基質が添加され得る（Ｂａｂｅｌ  ２００９，Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．９，２８５−２９０）。補基質の嫌気的使用の重要な基準は、その酸化還元電位がＮＡＤＨのものより高いことである（Ｇｅｅｒｔｍａｎら，２００６，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．６，１１９３−１２０３）。基質の生成物（ｐｒｏｄｕｃｅ）への変換によって電子余剰がもたらされる場合、電子受容体としての機能を果たす補基質が添加され得る。
【０１８９】
ブタジエンからのポリブタジエンおよび他の化合物の生成方法
ブタジエンは室温または発酵条件（２０〜４５ｏＣ）においてガス状であり、発酵プロセスでのその生成により発酵槽の上部空間内に蓄積され得るガスがもたらされ、サイフォン処理および濃縮される。ブタジエンは、発酵ガス、例えば、ガス状アルコール、ＣＯ２および他の化合物から溶媒抽出、低温処理、蒸留、分別、クロマトグラフィー、沈殿、濾過などによって精製され得る。
【０１９０】
本明細書に開示のプロセスまたは方法のいずれかを経由して生成されるブタジエンをポリブタジエンに変換してもよい。あるいはまた、本明細書に開示の方法を経由して生成されるブタジエンを他のオレフィンと重合させ、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、アクリロニトリル−ブタジエン（ＡＢＲ）、またはスチレン−ブタジエン（ＳＢＲ）コポリマー、ＢＲブチルゴム（ＲＢ）、ポリブタジエンゴム（ＰＢＲ）、ニトリルゴムおよびポリクロロプレン（ネオプレン）などのコポリマーを形成してもよい。該合成ゴムまたはプラスチックエラストマーの用途としては、タイヤ、プラスチック材料、靴底、靴のヒール（ｈｉｌｌ）、工業製品、家電製品、ネオプレン、紙コーティング（ｐａｐｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇ）、手袋、ガスケットおよびシール品の生産が挙げられる。
【０１９１】
さらに説明しないが、当業者には、先の説明および以下の例示の実施例を使用すると、本開示の作用物質が作製および使用され、請求項に記載の方法が実施され得ようということが考えられる。以下の実施例は、本開示の実施を容易にするために示しており、本開示の残余部をなんら限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【０１９２】
実施例
実施例１：ブタジエン生成のための微生物の改変
細菌などの微生物は、発酵性炭素源（例えば、グルコースなど）からブタジエンが生成されるように遺伝子改変され得る。
【０１９３】
例示的な方法では、微生物は、当該技術分野で知られた任意の方法によって：ｉ．）発酵性炭素源のアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはアセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；ｉｉ．）発酵性炭素源のクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはクロトニル−ＣｏＡのブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；あるいはｉｉｉ．）発酵性炭素源のギ酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはギ酸のブタジエンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作され得る。
【０１９４】
あるいはまた、発酵性炭素源のブタジエンへの変換のための１つ以上の酵素（例えば、触媒活性である１つ以上の機能性酵素）を欠損している微生物は、発酵性炭素源のブタジエンへの変換を触媒する該微生物に欠けている経路の酵素（例えば、機能性酵素、例えば、本明細書に開示の任意の酵素など）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変され得る。
実施例２：ブタジエン生成のための遺伝子改変型微生物による炭素源の発酵
上記の実施例１で作出した遺伝子改変型微生物が炭素源の発酵に使用され、ブタジエンが生成され得る。
【０１９５】
例示的な方法では、発酵性炭素源（例えば、９ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、５ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および１０ｇ／Ｌの酵母エキス）を含む事前に滅菌した培養培地をバイオリアクター内に仕込む。
【０１９６】
発酵中、嫌気性条件を、例えば窒素を培養培地中にスパージングすることによって維持する。発酵に好適な温度（例えば、約３０℃）は、当該技術分野で知られた任意の方法を用いて維持する。ほぼ生理学的ｐＨ（例えば、約６．５）は、例えば水酸化ナトリウムの自動添加によって維持する。バイオリアクターは、例えば約５０ｒｐｍで撹拌する。発酵は完了するまで実施する。
【０１９７】
次いで、生成したブタジエンを培養培地から慣用的な方法を用いて回収する。発酵生成物を蒸留によって回収する場合、ブタジエン画分を任意選択で重合させ、ポリブタジエンを形成してもよい。ブタジエン経路の他の中間体を含有している蒸留画分（あれば）を、その後バイオリアクター内での発酵に供し、さらなるブタジエンを生成させてもよい。
【０１９８】
特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いた成分の量、特性、例えば、分子量、反応条件などを示す数字はすべて、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されたい。したがって、そうでないことを記載していない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示した数値パラメータは、本開示によって得ようとしている所望の特性に応じて異なり得る近似値である。最低限でも、また、均等論の適用を特許請求の範囲の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告した有効桁の数字に鑑みて、および通常の丸め手法を適用することにより解釈されたい。
【０１９９】
本開示の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるとは述べたものの、具体的な実施例に示した数値は可能な限り厳密に報告している。しかしながら、いずれの数値にも、それぞれの試験測定値にみられる標準偏差によって必然的に生じる一定の誤差が固有に含まれている。
【０２００】
本開示の説明の文中で（特に以下の特許請求の範囲の文中で）用いている用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の指示対象は、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明確に矛盾していない限り、単数と複数の両方を包含していると解釈されたい。本明細書における値の範囲の記載は、該範囲に含まれる個別の各値を個々に示すことの簡便な方法の役目を果たすことを意図したものにすぎない。本明細書において特に記載のない限り、個々の各値が本明細書に、あたかも該値が本明細書に個々に記載されているかのように組み込まれている。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書において特に記載のない限り、あるいは文脈と明確に矛盾していない限り、任意の適当な順序で行なわれ得る。本明細書において示したありとあらゆる例または例示の文言（例えば、“ｓｕｃｈ  ａｓ（例えば／など）”）の使用は、本開示をよりよく説明（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅ）することを意図したものにすぎず、請求項に記載以外の本開示の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書に文言がないことは、請求項に記載されていないが本開示の実施に必須である任意の要素を示していると解釈されたい。
【０２０１】
本明細書に開示した本開示の別の要素または実施形態の群分けは、限定と解釈されるべきでない。各群の構成員は、個々に、または本明細書にみられる群の他の構成員もしくは他の要素との任意の組合せで言及され、請求項に記載されている場合があり得る。群の１つ以上の構成員が、便宜上および／または特許性の理由で群に包含されるか、群から削除されることが予測される。かかる包含または削除（あれば）が生じる場合、本明細書は、修正された群を含んでおり、したがって、添付の特許請求の範囲で使用したすべてのマーカッシュ群の記載要件を満たすとみなす。
【０２０２】
本明細書では、本開示を実施するための本発明者の知るところの最良の形態を含む本開示の一部の特定の実施形態を説明している。もちろん、記載のこれらの実施形態に対する変形例が、前述の説明を読むと当業者には自明となろう。本発明者らは、当業者がかかる変形例を適宜使用することを予測しており、本発明者らは、本開示が、本明細書に具体的に記載したものとは別の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の主題の適応法によって許容されるあらゆる修正例および均等物を包含している。さらに、本明細書において特に記載のない限り、あるいは文脈と明確に矛盾していない限り、可能なすべての変形例における上記の要素の任意の組合せが本開示に包含される。
【０２０３】
本明細書に開示の具体的な実施形態は、特許請求の範囲において、〜からなる、またはおよび本質的に〜からなるという文言の使用によりさらに限定されている場合があり得る。特許請求の範囲で用いている場合、出願時であれ補正の際の追加時であれ、転換語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）”は、特許請求の範囲に明示していない要素、工程または成分（あれば）を除外している。転換語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）”は、請求項の範囲を、明示した材料または工程および基本的な新規の特徴（単数もしくは複数）に実質的に影響しないものに限定している。そのように請求項に記載している本開示の実施形態は、本明細書において固有に、または明白に記載し、有効である。
【０２０４】
本明細書に開示した本開示の実施形態は、本開示の原理の例示であることは理解されよう。使用され得る他の修正は本開示の範囲に含まれる。したがって、一例であって限定されないが、本開示の別の構成が本明細書の教示に従って使用され得る。したがって、本開示は図示および記載のものに厳密には限定されない。
【０２０５】
本開示を本明細書において種々の具体的な材料、手順および実施例を参照して記載および説明したが、本開示が、その目的のために選択した材料および手順の具体的な組合せに制限されないことは理解されよう。かかる詳細の数多くの変形例が暗示され得、当業者には認識されよう。本明細書および実施例は例示的にすぎないとみなされることを意図しており、本開示の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。本出願において言及した参考文献、特許および特許出願はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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