(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＡＲＤＳの進行をモニターする方法であって、異なる時点で患者から採取された血清試料中の３〜８個のＡＲＤＳ関連バイオマーカーが測定され、該バイオマーカーのうちの２つがＣＤ７３タンパク質およびＩＬ−６であり、他のバイオマーカーがＩＬ−８、ＩＬ−１５、エオタキシン、ＭＰＣ−１、ＭＩＰ−１ａおよびＩＬ−１ｒａからなる群より選択され、後の時点で採取された血清試料において得られたバイオマーカーのレベルまたは活性を、先の時点で採取された血清試料における同じバイオマーカーのレベルまたは活性と比較することに基づき、特定のバイオマーカーのレベルまたは活性の好ましい変化が、疾患の退縮を表し、特定のバイオマーカーのレベルまたは活性における有害な変化が疾患の悪化を表す方法。
【請求項２】
バイオマーカーが、
ｉ）試料を該バイオマーカーを認識する結合剤にさらすことにより、試料中のバイオマーカーのレベルを定量すること、または
ii）薄層クロマトグラフィーを用いることにより、または試料をバイオマーカーの基質にさらして、該基質の変化をモニターすることにより、試料中のバイオマーカーの活性を測定すること
を含む方法により測定される請求項１記載の方法。
【請求項３】
バイオマーカーが、
ａ）一組の捕捉結合剤を測定すべきいくつかのバイオマーカーを含む試料と接触させる工程であって、各捕捉結合剤が、測定すべき特定のバイオマーカーに特異的である工程、
ｂ）各バイオマーカーが対応する捕捉結合剤に結合できるように、試料中のバイオマーカーを捕捉結合剤とインキュベートする工程、
ｃ）工程ｂ）由来のアレイに、一組の標識されたバイオアフィニティー成分を加える工程であって、このような各標識されたバイオアフィニティー成分は、捕捉結合剤に結合している特定のバイオマーカーに特異的なバイオアフィニティーを有するか、またはこのような各標識化されたバイオアフィニティー成分は、測定すべき特定のバイオマーカーと捕捉結合剤上の結合部位について競合する能力を有する工程、
ｄ）検出可能なシグナルを生成ために標識を刺激する工程、
ｅ）シグナルを、試料中における特定のバイオマーカーの存在を示すため、および／または試料中の特定のバイオマーカーのレベルを示すため対照と比較する工程
を含むバイオアフィニティーアッセイ法である方法により測定される請求項２記載の方法。
【請求項４】
ａ）各捕捉結合剤が、支持体上にアレイ形式で配置されるように、支持体の表面上の所定の位置に固定され、
ｂ）試料がアレイに加えられ、その中のバイオマーカーが固定された結合剤と共にインキュベートされ、
ｃ）一組の標識されたバイオアフィニティー成分が、工程ｂ）由来のアレイに加えられ、このような各標識されたバイオアフィニティー成分が、特定の固定されたバイオマーカーに特異的なバイオアフィニティーを有するか、またはこのような各標識されたバイオアフィニティー成分が、特定の固定されたバイオマーカーと、捕捉結合剤上の結合部位について競合する能力を有し、
ｄ）標識が、検出可能なシグナルを生成するために刺激され、
ｅ）シグナルが、試料中における特定のバイオマーカーの存在を示すため、および／または試料中の特定のバイオマーカーのレベルを示すため対照と比較される
請求項３記載の方法。
【請求項５】
免疫学的方法であり、捕捉結合剤が、抗体、アプタマーまたはアフィボディである請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
捕捉結合剤がモノクローナル抗体である請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
サンドウィッチ免疫アッセイであり、標識されたバイオアフィニティー成分が、抗体、アプタマーまたはアフィボディであり、各々が、捕捉結合剤により占有されるエピトープ以外のバイオマーカーのエピトープに対するものである請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
標識されたバイオアフィニティー成分がモノクローナル抗体である請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
競合法であり、標識されたバイオアフィニティー成分が一組の標識された抗原であり、各標識された抗原が、捕捉結合剤上の結合部位について、試料由来の対応する固定されたバイオマーカーと競合することができる請求項５または６記載の方法。
【請求項１０】
標識が酵素または蛍光標識である請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
標識が酵素であり、該酵素の基質が加えられ、その後の酵素とその基質との反応が検出可能なシグナルを生成する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
方法が、特定時間後に患者から採取された別の試料において繰り返され、各バイオマーカーに起因するシグナルが、先のアッセイの対応するシグナルと比較され、違いが記録される請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者における急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の進行をモニターする方法およびＡＲＤＳの治療方法に関する。ＡＲＤＳの進行をモニターする方法は、後の時点で採取された試料において得られたバイオマーカーのレベルまたは活性を、先の時点で採取された試料中の同じバイオマーカーのレベルまたは活性と比較することに基づくものである。特定のバイオマーカーのレベルまたは活性における好ましい変化が、疾患の退縮（患者の回復）を表し、反対に、特定のバイオマーカーのレベルまたは活性の有害な変化が、疾患の悪化を表す。例えば、モニターされる１つ以上のバイオマーカーのレベルまたは活性が好ましい変化を示すことをやめ、好ましくない変化を示し始める場合、患者の治療は、ＡＲＤＳの治療において有用な治療的に活性な薬剤を投与することにより強化される。
【０００２】
本発明は、さらに、患者由来の試料中の複数のバイオマーカーの同時測定方法に関し、そのバイオマーカーがＡＲＤＳに関連付けられるものである。バイオマーカーのレベルまたは活性が測定される。本発明はまた、この方法を実行するのに有用な診断キット、とりわけバイオチップ技術における使用に適しているマイクロアレイなどのチップを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景を説明するために本明細書中において使用される刊行物およびその他の文献、およびとりわけ実施に関する追加的な詳細を提供するケースは、参考文献として組み込まれる。
【０００４】
多重アッセイ、すなわち試料中の複数の被検体の同時検出または同時定量の方法は、それ自体は良く知られている。このようなアッセイは、１回の実行において複数の被検体を同時に測定するアッセイである。多重アッセイは、１アッセイにつきどれだけ多くの被検体を測定できるかにより分類することができ、被検体の量は、少ないもの（少なくとも２つ）から非常に多数のものにまでおよぶ。市販の多重アッセイは、通常約５０までの被検体の同時検出のために設計されている。これらの方法は、核酸や抗体などのタンパク質の分析用に使用することができる。また、炭水化物や他の化学化合物も測定することができる。
【０００５】
多重法は、多くの代替的方法において実施することもできる。
【０００６】
１つの例としては、同時に多数の生物学的被検体を分析する固体支持体上の２Ｄアレイであるマイクロアレイを挙げることができる。抗体マイクロアッセイなどのタンパク質マイクロアッセイにおいては、種々の抗体が所定のパターンの独立した配置で固体支持体上に取り付けられている。これらの抗体は、試料中に存在する被検体（タンパク質）を捕捉することのできる捕捉分子として使用される。
【０００７】
商業的に入手可能なアッセイの例としては、マイクロタイタープレートにおいて直接行われるビーズに基づくアッセイであるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰテクノロジーを挙げることができる。各アッセイは、種々のマイクロスフェアの混合物（ビーズミックス）を含み、各ビーズの種類は、個々の蛍光色調により被検体分類に対して規定されており、その表面上に特定のタンパク質（抗体）などの特定の捕捉試薬を担持する。ビーズミックスを患者の試料と共にインキュベーションする間、相補的な反応パートナー（抗原）がマイクロスフェア上の捕捉抗体に結合する。第２のインキュベーション工程において、結合した抗原は、特定の蛍光マーカーを有する標識された抗体で検出される。結合した被検体（抗原）の量は、検出抗体の蛍光強度に直接的に相関し、被検体の定量を可能とする。ビーズの分類と抗原の定量は、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析システムを用いて行われ、このシステムは２つの異なるレーザーを用いるフローサイトメトリーの技術に基づく。
【０００８】
疾患の診断および予後診断のための多重連続的バイオマーカーの使用も提案されている。
【０００９】
非特許文献１は、ＡＫＩ（急性腎損傷）の罹患期間の評価のための、および透析要求や死亡率についての全体的な予後の予測のための多重連続的バイオマーカーの使用を示唆している。そのバイオマーカーは、血漿パネル中のＮＧＡＬ（好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン）およびシステインＣ、並びに尿パネル中のＮＧＡＬ、ＩＬ−１８（インターロイキン−１８）およびＫＩＭ−１（腎損傷分子−１）であった。
【００１０】
非特許文献２は、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＩＬ−１ｒａ（インターロイキン−１受容体アンタゴニスト）、ＩＬ−１ベータ（インターロイキン−１ベータ）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）、ＭＩＰ−１ベータ（マクロファージ炎症性タンパク質−１ベータ）およびＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）などのバイオマーカーの連続的分析、ならびにＩＭＤ（侵襲性髄膜炎菌感染症）との、およびその重症度とのそれらの相関関係を説明している。
【００１１】
特許文献１（ファロン  ファーマシューティカルズ  オサケ  ユキチュア）は、ＣＤ７３が、患者における炎症性疾患、特にＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、ＡＬＩ（急性肺損傷）、ＡＲＤＳおよびＭＯＦ（多臓器不全）の進行をモニターするための有用なバイオマーカーであることを開示している。異なる時点で組織液試料が患者から得られ、その試料中のＣＤ７３活性が測定された。ＣＤ７３活性のレベルの増加が、疾患の退縮と相関することを見出した。
【００１２】
これまで誰も、患者におけるＡＲＤＳの進行をモニターするための多重連続的バイオマーカーの使用を提案していない。特に、誰も、ＣＤ７３およびＩＬ−６からなる一組のバイオマーカーを、またはこれらを含む一組のバイオマーカーをこの目的のために使用することを提案していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／０５３５２３号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Chirag R Parikh et al., Crit Care Med 2008 Vol. 36, No.4 (Suppl); p S159-S165
【非特許文献２】O Beran et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2009) 28: 793-799
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、ＡＲＤＳの重症度を、この症状の治療期間のあいだ見守るための方法および手段を提供することである。通常、ＡＲＤＳ患者は、最善の集中治療を受けているが、より重要なことには、任意の薬物治療を予測するためにバイオマーカーを使用することが、治療の有効性を評価するための非常に貴重な資産となってきている。そのような治療の１つは、Ｔｒａｕｍａｋｉｎｅ（登録商標）ＦＰ−１２０１（インターフェロンベータ）であり、ＡＲＤＳ患者の死亡率を減少させることが示されている。患者の症状について価値ある予測データを取得することにより、ＩＣＵの医師はその患者の治療を最適化することができる。
【００１６】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、患者から採取された試料中の複数のＡＲＤＳ関連バイオマーカーの同時測定のための方法であって、そのバイオマーカーの１つがＣＤ７３タンパク質である方法に関する。本発明によれば、この方法は、
ｉ）試料をバイオマーカーを認識する結合剤にさらすことにより、試料中のバイオマーカーのレベルを定量する工程、または
ii）薄層クロマトグラフィーを用いることにより、または試料をバイオマーカーの基質にさらして、その基質の変化をモニターすることにより、試料中のバイオマーカーの活性を測定する工程
を含む。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、患者から採取された試料中の複数のＡＲＤＳ関連バイオマーカーの同時測定用のバイオアフィニティーアッセイ法において使用するための診断キットであって、ＣＤ７３および追加のバイオマーカーを含むバイオマーカーの数が、少なくとも２、好ましくは２〜５０、最も好ましくは２〜８であるキットに関する。本発明によれば、このキットは、
（１）固体支持体に固定されたまたは固体支持体に固定することができる一組の捕捉結合剤であって、各々が測定すべき特定のバイオマーカーに特異的である捕捉結合剤、および
（２）一組の標識されたバイオアフィニティー成分であって、このような各標識されたバイオアフィニティー成分は、特定の固定化されたバイオマーカーに特異的なバイオアフィニティーを有するか、またはこのような各標識されたバイオアフィニティー成分は、特定の固定化されたバイオマーカーと結合部位について競争する能力を有するもの
を含む。
【００１８】
第３の実施態様において、本発明は、患者におけるＡＲＤＳの進行をモニターする方法に関し、異なる時点で患者から採取された試料中の少なくとも２、好ましくは２〜５０、最も好ましくは２〜８のＡＲＤＳ関連バイオマーカーが測定され、そして、そのバイオマーカーの１つがＣＤ７３タンパク質である。この方法は、後の時点で採取された試料中において得られたバイオマーカーのレベルまたは活性を、先の時点で採取された試料中の同じバイオマーカーのレベルまたは活性と比較することに基づき、特定のバイオマーカーのレベルまたは活性の好ましい変化が疾患の退縮を表し、特定のバイオマーカーのレベルまたは活性の有害な変化が疾患の悪化を表す。
【００１９】
第４の実施態様において、本発明は、ＡＲＤＳを患う患者の治療方法であって、ＡＲＤＳの治療に有効な治療的に活性な薬剤を患者に投与することによる方法に関し、その投与は、本発明によるＡＲＤＳの進行のモニタリングに使用される１つ以上のバイオマーカーが、
好ましい変化を示すことをやめる、または
好ましくない変化が示され始める
とすぐに開始される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】捕捉結合剤が結合できるスポットを有する支持体を示す。
【図１Ｂ】捕捉結合剤が固定された図１Ａの支持体を示す。
【図１Ｃ】測定すべきバイオマーカーが捕捉結合剤に固定されている図１Ｂの支持体を示す。
【図１Ｄ】標識化された結合剤が、測定すべきバイオマーカーに固定されている図１Ｃの支持体を示す。
【図２】バイオマーカーに対する一次抗体および二次抗体のアセンブリを含む標識された抗体を示し、二次抗体は標識を有し、かつ一次抗体のＦｃ領域に結合する。
【図３】時間の関数として、一組の測定されたバイオマーカーのレベルに関する曲線を示す。Ｂ１からＢ４についての全線は、経時変化が好ましいものであることを示している。Ｂ５についての点線は、そのレベルの減少が有害な変化を表していることを意味する。
【図４ａ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｂ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｃ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｄ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｅ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｆ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｇ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーのレベルを時間の関数として示す。
【図４ｈ】ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している患者群についてバイオマーカーの活性を時間の関数として示す。
【図５】一例として、ＡＬＩまたはＡＲＤＳから回復している１人の患者について、可溶性ＣＤ７３の活性およびレベル（濃度）の両方を時間の関数として示す。可溶性ＣＤ７３活性（・、左ｙ軸）および可溶性ＣＤ７３濃度（・、右ｙ軸）を、同じ試料のアリコートから測定した。図５は、活性および濃度の測定値が同等であることを示す。ＣＤ７３（図５）およびＩＬ−６（図４ｂ）の値が、血漿濃度の劇的な変化を示し、好ましい変化を意味することが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
試料は、細胞を浸し取り囲むあらゆる組織液とすることができる。その用語は、例えば、血漿、血清、全血、リンパ液、尿、滲出液（胸膜の、腹膜の）、および脳脊髄液を含む。
【００２２】
ＡＲＤＳ関連バイオマーカーは、患者由来の試料中に存在する一組のバイオマーカーを意味する。一組のバイオマーカーは、少なくとも２つ、好ましくは２つから８つのバイオマーカー、特におおよそ５つのバイオマーカーを含み、その１つがＣＤ７３タンパク質である。他のバイオマーカーの例としては、サイトカインが挙げられる。サイトカインは、シグナル伝達化合物として生物において使用されるタンパク質またはペプチドである。サイトカインは、例えば、インターフェロン、インターロイキン、特にＩＬ−６、エオタキシンなどのケモカインなどを含む。他の適切なバイオマーカーの例としては、ＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）および他のペントラキシンなどが挙げられる。
【００２３】
好ましくは、バイオマーカーは、次の：ＩＬ−１・、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、塩基性ＦＧＦ、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−・、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１・、ＭＩＰ−１・、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−・、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１・、ＩＬ−２Ｒ・、ＩＬ−３、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＣＴＡＣＫ、ＧＲＯ−・、ＨＧＦ、ＩＦＮ−・２、ＬＩＦ、ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＧ、・−ＮＧＦ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ−・、ＳＤＦ−１・、ＴＮＦ−・、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ７３、ＣＲＰ、ネオプテリン、ＭｘＡ、およびベータ−２−ミクログロブリンを含む群から選択される。
【００２４】
特に好ましいバイオマーカーのセットは、ＣＤ７３およびＩＬ−６を含み、これら２つのバイオマーカー、またはこれら２つのバイオマーカーと１つまたは数個の追加のバイオマーカーとの組み合わせのいずれも含む。特に、そのような追加のバイオマーカーは、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、エオタキシン、ＭＰＣ−１、ＭＩＰ−１ａおよびＩＬ−１ｒａからなる群より選択される。好ましくは、このようなバイオマーカーのセットは、バイオマーカーＣＤ７３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、エオタキシン、ＭＰＣ−１、ＭＩＰ−１ａおよびＩＬ−１ｒａの３つから８つを含み、少なくともそれらの２つがＣＤ７３およびＩＬ−６である。特に好ましいセットは、８つのバイオマーカーＣＤ７３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、エオタキシン、ＭＰＣ−１、ＭＩＰ−１ａおよびＩＬ−１ｒａすべてを含む。
【００２５】
１つの選択肢において、バイオマーカーの活性が測定される。これは、例えば、薄層クロマトグラフィーを用いることにより、または試料をバイオマーカーの基質にさらし、その基質の変化をモニターすることにより行われる。
【００２６】
バイオマーカーの活性は、例えば、公表されたプロトコールに従って、薄層クロマトグラフィーを用いて測定することができる。この活性はまた、適切な基質の変換を測定する任意の酵素アッセイを用いて測定することもできる。例えば、ＣＤ７３については、活性は、ＣＤ７３基質として用いることのできるＡＭＰまたは他のプリンモノヌクレオチドの対応するヌクレオシドへの変換により測定することができる。例えば、そのアッセイは、放射能標識された基質または蛍光標識された基質の変換に基づくことができる。検出方法は、基質濃度の減少の定量化、または生成物濃度もしくはリン酸基の放出の増加の定量化を利用することができる。反応のＣＤ７３依存は、ＡＭＰＣＰなどの既知のＣＤ７３阻害剤の存在下または非存在下でアッセイを行うことにより決定することができる。
【００２７】
通常、活性測定のためのレポーター細胞株は、目的の化合物または分子（すなわちバイオマーカー）が、特にレポーター遺伝子の発現を誘導する遺伝子改変細胞株である。そのようなレポーター遺伝子発現は、定量可能な光生成または他の測定可能な機能を生じることができる。レポーター遺伝子活性の定量化は、その後、目的の化合物または分子の活性および／またはレベルを算出するために使用することができる。
【００２８】
上述のバイオマーカーに特異的なモノクローナル抗体は、文献に記載されており、それらはバイオラッド  ラボラトリーズ社（BioRad Laboratories, Inc.）、イエナ  バイオサイエンス社（Jena Bioscience GmbH）およびシノ  バイオロジカル社（Sino Biological, Inc.）などの多くの商業的供給源から入手可能である。
【００２９】
「ＡＲＤＳ関連バイオマーカー」の資格を得るためには、このバイオマーカーは、時間に対するバイオマーカーのレベルの変化が疾患の状態の変化を示すように、ＡＲＤＳ疾患の状態に相関することがわかっていなければならない。最も強い関係を有するそれらのバイオマーカーは、ＡＲＤＳバイオマーカーパネルに組み込まれることができる。例えば、１つの時点から後の時点までのＣＤ７３のレベルの増加は、治療的に活性な薬剤による治療の有効性およびその結果としてのＡＲＤＳの退縮を示している。しかしながら、ＣＲＰについては、レベルの増加は疾患の悪化を示している。したがって、まず、そのレベルの増加または減少が疾患の状態についての好ましい変化なのか、有害な変化なのかを見つけるために各適切なバイオマーカーを調査することが重要である。
【００３０】
「バイオアフィニティーアッセイ」は、バイオマーカーがタンパク質である場合には免疫アッセイとすることもできる。あるいは、バイオマーカーが核酸の場合には、ハイブリダイズアッセイを意味する。
【００３１】
「結合剤」（捕捉結合剤または標識された結合剤）は、測定すべきバイオマーカーがタンパク質またはペプチドである場合、抗体など（例えば、アフィボディおよびアプタマー）を意味する。バイオマーカーが核酸の場合は、結合剤は、好ましくはオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
用語「固体支持体」は、例えば、マイクロスフェアまたはビーズであり、それらは標識を有する。あるいは、固体支持体は、マイクロタイタープレートまたはチップを意味する。好ましくは、固体支持体は、マイクロアレイなどの、バイオチップ技術における使用に適したチップである。ここで、マイクロアレイは、結果の変換、シグナル処理および表示のための更なる手段を含むバイオチップ技術アセンブリの構成要素である。
【００３３】
用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、その任意のフラグメントおよび遺伝的に改変された抗体を含むと理解されるべきである。
【００３４】
「標識」は、例えば、酵素または蛍光標識とすることができる。蛍光標識の特に好ましい群は、ランタニドキレートなどの時間分解蛍光標識である。標識が酵素の場合、その酵素のための基質が加えられ、酵素とその基質との後の反応が検出可能なシグナルを生成する。標識が蛍光標識の場合、レーザーなどの放射線により刺激が行われ、検出可能なシグナルが産生される。
【００３５】
好ましくは、測定すべきすべてのバイオマーカーは、タンパク質またはペプチドであり、それらの各々は、特定の捕捉抗体に固定化することができる。この場合、標識された結合剤も抗体である。各標識された抗体は、特定のバイオマーカーのエピトープに対するものであり、そのエピトープは、捕捉抗体に結合するエピトープとは異なる。
【００３６】
複数のＡＲＤＳ関連バイオマーカーは、例えば以下にしたがって解釈されるバイオアフィニティーアッセイを用いて試料から同時に測定される。捕捉結合剤が、固体支持体の表面の所定の位置、通常、ビオチン化スポット、またはマイクロタイタープレートのウェルなどに固定される。捕捉結合剤は、したがって、固体支持体（マイクロタイタープレート）上にアレイ形式で配置されることになる。各捕捉結合剤は、測定すべき特定のバイオマーカーに特異的である。試料をアレイに加えること、およびバイオマーカーを、固定化された捕捉結合剤と共にその中でインキュベートすることにより、各バイオマーカーの対応する捕捉結合剤への固定化が生じる。
【００３７】
バイオマーカーの検出は、二通りで、非競合のいわゆる「サンドウィッチアッセイ」により、または競合アッセイにより行うことができる。非競合アッセイにおいて、標識されたバイオアフィニティー成分、例えば標識抗体が、固定化されたバイオマーカーを有するプレートに加えられる。インキュベーションおよび任意には未結合の標識されたバイオアフィニティー成分の除去の後、標識が刺激され、検出可能なシグナルを与える。この種のアッセイでは、シグナルの強度が、直接固定化されたバイオマーカーの濃度に比例する。マイクロタイタープレート上の「サンドウィッチ」の位置が、どのバイオマーカーが検出されているのかの情報を与える。
【００３８】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術において、捕捉抗体はビーズに固定されており、特定の色が、特定の種類の捕捉抗体を表すように、蛍光色で標識される。検出すべきバイオマーカーを含む試料とのインキュベートおよび一組の二次抗体（ビーズの色とは異なる蛍光色で標識された標識抗体）のその後の添加により、「ビーズ−捕捉抗体−バイオマーカー−標識抗体」を含むサンドウィッチが形成される。このような各サンドウィッチは、フローサイトメトリーに移され、各サンドウィッチは、デュアルレーザー装置を用いて分類および定量される。
【００３９】
競合アッセイにおいては、試料由来の固定化されたバイオマーカーを有するプレートが、標識された一組の抗原にさらされ、各標識された抗原が、試料由来の対応する固定されたバイオマーカーと、捕捉結合剤上の結合部位について競合できる。標識が刺激されると、検出されるシグナルが、間接的に試料由来のバイオマーカーの濃度に比例することができる。
【００４０】
本発明は、図面を参照することにより、より詳細に説明される。図１Ａは、スポットＳ１〜Ｓ５を有する支持体（マイクロタイタープレート）を示す。捕捉抗体Ｃ１〜Ｃ５は、所定のスポットに結合されており（図１Ｂ）、所定のスポットは、その上への捕捉抗体の結合を有効にするためにビオチン化されていてもよい。各捕捉抗体は、測定される特定のバイオマーカーＢ１〜Ｂ５に特異的である。試料を図１Ｂに示されるプレートに添加すると、各捕捉抗体は、捕捉抗体が立ち上がっている方にバイオマーカーを固定することができる。未結合のバイオマーカーは、標識抗体Ｌ１〜Ｌ５の添加前に洗浄除去され得、それらのうちの１つの標識抗体が、特定の固定されたバイオマーカーに特異的である。標識Ｌの刺激により（標識Ｌに依存して放射または酵素基質の添加）、検出可能なシグナルが産生される。
【００４１】
標識抗体は、必要な特異性およびラベルを有する単一の抗体であってもよい。あるいは、標識抗体は、バイオマーカーに対する一次抗体（ＰＡ）および二次抗体（ＳＡ）とのアセンブリであってもよく、二次抗体は、標識Ｌを有し、かつ一次抗体のＦｃ領域に結合する。図２参照。このアセンブリは、検出したい全てのバイオマーカーのための標識抗体を作製する費用のかかるプロセスを回避することができる。
【００４２】
方法を、別の時点で採取された試料で繰り返した場合、各標識した抗体から得られるシグナルは、時間に対して記録され、プロットされる（図３）。いくつかのバイオマーカー（Ｂ１およびＢ２）については、レベルの増加が、患者の疾患の好ましい変化を表し、一方、Ｂ３およびＢ４ではレベルの減少が好ましい変化を表す。対照的に、Ｂ５のレベルの減少は、患者の疾患の有害な変化を表し、したがって、その曲線は、好ましい変化を表す曲線から迅速に区別するために、好ましくは、異なる記号または色でプロットされる。
【００４３】
測定から得られたデータは、任意には臨床観察や治療方法などと共に、データベースに集められる。
【００４４】
本発明を、次の非限定的な実施例により説明する。
【実施例】
【００４５】
実施例１
臨床試験において、ＡＬＩまたはＡＲＤＳを患う２６人の患者に、インターフェロンベータ−１ａを１０マイクログラムの用量で６日間連続で投与した。この治療は、治療無しで通常頻度で観察した場合と比較して死亡率を７５％まで減少させた。患者由来の血清試料を次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ（ｒａ＝受容体アンタゴニスト）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、エオタキシン、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＩＰ−１ａ（マクロファージ炎症性タンパク質）およびＣＤ７３について分析した。図４のａ）〜ｈ）において、各バイオマーカーのレベル（ＣＤ７３については活性）が、すべての患者の平均値として、標準偏差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）と共に示され、時間に対してプロットされる。１日目は、インターフェロンベータ投与前の値を示す。２日目は、最初のインターフェロンベータ投与の２２時間後の値を示す。３日目は、２回目の投与（２日目）の２２時間後の値を示し、以下同じ。７日目は、インターフェロンベータの最終投与の２２時間後のレベルを表す。図４は、バイオマーカー、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５およびＭＣＰ−１のレベルが急速に、時間、すなわち患者の回復と共に減少していることを示す。他方、可溶性ＣＤ７３活性（ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒ）は、９日目、すなわち最終投与の２日後まで増加し、その後、基底線の値に向かって減少した。バイオマーカー、エオタキシンおよびＭＩＰ−１ａのレベルも、時間、すなわち患者の回復と共に増加した。
【００４６】
実施例２
可溶性ＣＤ７３活性は、上述の試験において治療した患者のうちの１人の、示した時点（図５参照）での試料から、すでに公開されている薄層クロマトグラフィーに基づく技術を用いて測定された。この患者は、可溶性ＣＤ７３活性の非常に強い誘導を示した。可溶性ＣＤ７３濃度を、サンドウィッチアッセイの捕捉抗体および検出抗体の使用に基づくＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。可溶性ＣＤ７３の活性および濃度は、同じ試料のアリコートから測定した。図５は、可溶性ＣＤ７３活性および濃度が同様にふるまうことを示す。
【００４７】
当然のことながら、本発明の方法は、多種多様な態様の形態で組み込まれることができ、本明細書に開示されているのはそのうちの数例のみである。他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱しないことは当業者には明らかである。したがって、記載された実施態様は、説明のためのものであり、制限的なものとして解釈されるべきものではない。
【図１Ａ】
0006337020.tif 000002
【図１Ｂ】
0006337020.tif 000003
【図１Ｃ】
0006337020.tif 000004
【図１Ｄ】
0006337020.tif 000005
【図２】
0006337020.tif 000006
【図３】
0006337020.tif 000007
【図４ａ】
0006337020.tif 000008
【図４ｂ】
0006337020.tif 000009
【図４ｃ】
0006337020.tif 000010
【図４ｄ】
0006337020.tif 000011
【図４ｅ】
0006337020.tif 000012
【図４ｆ】
0006337020.tif 000013
【図４ｇ】
0006337020.tif 000014
【図４ｈ】
0006337020.tif 000015
【図５】
0006337020.tif 000016