(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容され得る担体と共に式Ｉ
【化１】
0006415568.tif 000012
（式中、ＸおよびＹは、Ｏであり；
Ｒ１およびＲ２が独立して、エチル、メチル、またはトリフルオロメチルであり、
Ｒ３およびＲ４が独立してエチルまたはメチルであり、
Ｒ５がエチルであり、かつＱが場合により置換されたフェニルまたは場合により置換されたピリジニルである）で示される化合物、
を含む、インフルエンザＡウイルスによるウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、Ａ０４３５／ＢまたはＡ０４３９／Ａ
【化２】
0006415568.tif 000013
【化３】
0006415568.tif 000014
である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
第二の抗ウイルス薬をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第二の抗ウイルス薬がウイルス複製を阻害する薬物であるか、または前記第二の抗ウイルス薬が、インターフェロンである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が、
【化４】
0006415568.tif 000015
であり、ピラゾロピリミジン核が、場合により置換されている、アルコキシアリールまたはジアルコキシアリール部分を含み、前記ピラゾロピリミジン核の前記アルキル部分のいずれか一方またはその両方が、置換されたアルキルによって場合により置き換えられている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記化合物が、
【化５】
0006415568.tif 000016
であり、ピラゾロピリミジン核が、場合により置換されている、アルコキシアリールまたはジアルコキシアリール部分を含み、前記ピラゾロピリミジン核の前記アルキル部分のいずれか一方またはその両方が、置換されたアルキルによって場合により置き換えられている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記化合物を必要とする患者に投与する場合に、前記化合物が、前記患者におけるインフルエンザＡウイルスのウイルス増殖を低減するのに効果的な量で前記医薬組成物中に存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
インフルエンザＡウイルスによるウイルス感染の治療における使用のための請求項１に定義される式Ｉの化合物であって、前記化合物を必要とする患者に投与する場合に、前記化合物が、前記患者におけるインフルエンザＡウイルスのウイルス増殖を低減するのに効果的な量で使用される、請求項１に定義される式Ｉの化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
発明の分野は、抗ウイルス性化合物および組成物である。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ａ型インフルエンザウイルスは、（−）−センスＲＮＡウイルスのオルトミクソウイルス科のウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスゲノムは、１１のタンパク質をコードする８つの分節または染色体で構成されている１。感染の際に、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）が、（−）鎖ＲＮＡを（＋）鎖メッセンジャーＲＮＡ、およびゲノム複製のテンプレートとして働く一組の全長相補性ゲノムＲＮＡ（またはｃＲＮＡ）に変換する。（＋）鎖メッセンジャーＲＮＡから発現されたウイルスタンパク質は、感染を確立して、感染周期を反復する最初の８つの（−）鎖染色体を含むウイルス粒子の増幅、組み立て、および放出に至るプロセスであるウイルス複製を促進するという作業に取り組む。
【０００３】
Ａ型インフルエンザゲノムの転写および複製に関連するプロセスは、数十年間にわたり研究されてきた。各Ａ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１季節性、Ｈ１Ｎ１「ブタ」、Ｈ３Ｎ２、およびＨ５Ｎ１「トリ」）の８つの染色体全てが、他の場合には異なるタンパク質をコードする、配列のタンパク質コード部分に隣接する同一の５’非翻訳領域およびほぼ同一の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。実験結果から、ＵＴＲがプロモータ要素としてＲｄＲＰにより認識され、両方の成分が、ウイルス遺伝子発現および複製に不可欠であることが実証されている。このため、ウイルスポリメラーゼおよびその同族ＵＴＲ  ＲＮＡリガンドは、ウイルスの生命周期を制御すると思われ、治療的介入の重要なターゲットになっている。
【０００４】
ウイルス複製のそのような比較的詳細な知識があるにもかかわらず、現在存在し、臨床用に認可された抗Ａ型インフルエンザ治療分子は、ウイルスコートタンパク質の２つのターゲット分類：ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびマトリックス２（Ｍ２）のうちの一方を阻害する低分子に制限されている。ＮＡは、末端シアル酸残基をビリオンおよび宿主細胞受容体タンパク質に開裂するグリコシドヒドロラーゼ酵素（Ｎ−またはＯ−結合ノイラミン酸が集合的にシアル酸と称されるため、シアリダーゼとしても公知）という広い分類に属する。Ａ型インフルエンザ感染の際、ＮＡ活性は、呼吸管の粘液分泌を通したウイルス通過に、ならびに複製の部位として働く感染細胞から分泌されたウイルスの生化学的分離／溶出に関与し、それにより付近の健常細胞を感染させる。現在、オセルタミビル（商品名Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））およびザナミビル（商品名Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標））が、ＮＡの阻害を通したインフルエンザ感染の処置のための臨床的に認可された２種の薬剤であるが、ラニナミビル（Ｉｎａｖｉｒ）およびペラミビルが、次世代のインフルエンザＮＡ阻害剤として、現在、臨床試験の後期段階にある。
【０００５】
ＮＡとは異なり、インフルエンザＭ２は、ウイルス構造タンパク質であるマトリックス（またはＭ）をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生成される。感染の際に最も多量なウイルスタンパク質の１種であり、ウイルスコートタンパク質およびリボヌクレオタンパク質粒子が結合するスカフォールドとして働くＭとは異なり、Ｍ２は、微量のビリオン中に存在し、複製の重要なステップである、ウイルスの脱殻およびエンドソームコンパートメントから細胞質へのエスケープを可能にするイオンチャネルとして働く。Ｍ２の臨床的に認可された阻害剤としては、アマンタジン（商品名Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ（登録商標））およびリマンタジン（商品名Ｆｌｕｍａｄｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
【０００６】
ＮＡおよびＭ２阻害剤は、インフルエンザウイルス感染周期において重要なステップの概念実証に成功した低分子阻害剤として働く。しかし、それらの早期の成功にもかかわらず、ＮＡおよびＭ２阻害剤の両方の使用は、薬物耐性を示すウイルス変異体の出現による、インフルエンザ感染の処置における近年の難題に遭遇した。例えばＴａｍｉｆｌｕへのウイルス耐性の証拠は、２００９年パンデミック５、Ｈ３Ｎ２６、Ｈ５Ｎ１７、および２００８年の循環単離物の９９．６％に耐性が存在した季節性Ｈ１Ｎ１８をはじめとし、数多くの臨床関連のＡ型インフルエンザ単離物で記録された。それでもザナミビルへのＡ型インフルエンザ耐性が、報告されなければならないが、この薬剤に耐性のＢ型インフルエンザウイルス単離物の報告９から、インフルエンザ感染を処置するのに広範囲で使用されるこの薬剤への耐性が今後より流布する可能性が示され得るが、この試験で記載された耐性ウイルスは、この可能性を有意に低減するはずのＨＡタンパク質において、さらなる互助的突然変異を獲得している。Ｍ２阻害剤に関しては、アメリカ疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、２００９年秋にほぼ全ての循環Ｈ３Ｎ２およびパンデミックＨ１Ｎ１ウイルス単離物がアマンタジンに耐性を有したことを示している１０。
【０００７】
不幸にも、サーベランスの努力の成果で、オセルタミビル／アダマンタンの二重耐性単離物の近年の出現も同定されたことから１１、他の重要なウイルスターゲットを標的とする更なる低分子阻害剤の発見および利用の必要性が示された。したがって、処置耐性ウイルス変異体を生成する可能性が低い新規の、そして／または改善された抗ウイルス薬を提供することが、依然として求められている。特に、ウイルス複製、特にＲＮＡウイルス複製に必要となる必須の保存された構造を標的とする薬物または薬物組成物を有することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、Ａ型インフルエンザの感染生命周期、そしておそらくウイルス複製を妨害する様々な組成物および方法を発見した。それゆえ本発明者らは、ウイルス感染（そして特にＲＮＡウイルスへのウイルス感染）の処置のためのそのような化合物の使用、および／またはウイルス感染（そして特にＲＮＡウイルスへのウイルス感染）を処置する薬物の製造のためのそのような化合物の使用も企図する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題の一態様において、抗ウイルス特性を有する選択された化合物が、提供される。特に好ましい化合物（Ａ０４３５）を、ウイルスの２種の異なる血清型を表す３つの異なるＡ型インフルエンザ株を用いるインビトロウイルス増殖システムにおいて評価し、３つのウイルス全てを低μＭ濃度で阻害すること、および宿主細胞によるウイルス誘導性細胞変性効果（ＣＰＥ）の提示を防ぐことが見出された。これらの結果と一致して、特定の化合物、そして特にＡ０４３５は、Ａ型インフルエンザの生ウイルス感染哺乳動物モデルにおける抗ウイルス活性も実証した。
【００１０】
例えば、企図される化合物は、式Ｉ
【化１】
0006415568.tif 000002
（式中、ＸおよびＹは、独立してＯ、Ｓ、またはＮＲであり、ここでＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、Ｈ、場合により置換された低級アルキル、場合により置換された低級アルケニル、ＮＲ１Ｒ２、ＯＨ、またはハロゲンであり、Ｑは、場合により置換されたアリールまたは場合により置換されたヘテロアリールである）による構造を有するであろう。特に好ましい化合物において、ＸおよびＹは、酸素であり、そして／またはＲ１およびＲ２は、独立して、エチル、メチル、もしくはトリフルオロメチルであり、そして／またはＲ１およびＲ２は、独立して、エチル、メチル、もしくはトリフルオロメチルであり、そして／またはＲ３およびＲ４は、独立して低級アルキルであり、そして／またはＲ５は、低級アルキルであり、そして／またはＱは、場合により置換されたフェニルもしくは場合により置換されたピリジニルである。
【００１１】
別の例において、企図される化合物は、式ＩＩ
【化２】
0006415568.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはアルコキシ基であり；Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、低級アルキル、または一緒になって５員もしくは６員シクロアルキルもしくは複素環を形成しており；Ｒ５は、Ｈ、置換された飽和アルキル、または低級脂肪族フラグメントにより−ＮＨ−に連結した、場合により置換されたアリールもしくはヘテロアリールであり；Ｘは、独立して、Ｃ、ＣＨ、またはヘテロ原子である）による構造も有し得る。特に好ましい化合物としては、Ｒ２が、ＦもしくはＣｌであり、そして／またはＲ１およびＲ２が、独立して、エトキシ、メトキシ、もしくはトリフルオロメトキシであり、そして／またはＲ１およびＲ２が、一緒になって５員シクロアルキルもしくは複素環を形成し、そして／またはＲ１およびＲ２が、一緒になって６員シクロアルキルもしくは複素環を形成し、そして／またはＲ５が、フェニルもしくは置換ピリジニルで場合により置換された低級アルキルであり、そして／またはＲ５が、Ｈである、それらのものが挙げられる。
【００１２】
さらに、本発明者らは、抗ウイルス特性を有する低分子化合物を同定するための細胞アッセイの成分および方法も発見した。特に好ましい態様において、該アッセイは、他のＡ型インフルエンザ成分とは独立した哺乳動物細胞内のＡ型インフルエンザＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の検出を可能にし、正常な細胞活性を破壊しないウイルス複製阻害剤の同定を可能にする。
【００１３】
本発明の様々な目的、特色、態様および利点が、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明からより明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａ型インフルエンザレポータアッセイ構築物の略図である。
【図２】ルシフェラーゼアッセイにおける成分の要件を示したグラフである。
【図３】ルシフェラーゼアッセイにおける発現増強のための例示的結果を示したグラフである。
【図４】Ａ−Ｃ。図４Ａは例示的化合物によるレポータシステムの特異的阻害を実証する高処理能力スクリーンの生データの略図であり、図４Ｂは例示的化合物の構造を示し、図４Ｃは例示的化合物へのレポータシステムの用量反応を示したグラフである。
【図５】Ａ−Ｂ。図５Ａは別の例示的化合物の構造を示し、図５Ｂは図５Ａの例示的化合物へのレポータシステムの用量反応を示すグラフである。
【図６】Ａ−Ｂ。図６Ａは例示的化合物を用いた赤血球凝集アッセイの写真であり、図６Ｂは図６Ａと同じアッセイにおける例示的化合物の用量反応を示した写真である。
【図７】Ａ−Ｂ。例示的化合物を用いた選択された細胞におけるウイルス増殖の阻害を示した写真である。
【図８】Ａ−Ｃ。例示的化合物による選択された細胞における細胞変性効果の阻害を示した写真である。
【図９】Ａ−Ｂ。例示的化合物を用いた選択された細胞における細胞毒性活性を示したグラフである。
【図１０】例示的化合物を用いた生ウイルス感染後の生存率上昇を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
ＲｄＲＰを基にしたレポータシステムを用いる、新たに開発された超高感度細胞アッセイに基づいて、明白に保存されたウイルスターゲット（おそらく、ウイルス複製および／または遺伝子発現機構）に対して有意な抗ウイルス活性を有する複数の化合物（例えば、Ａ０４３５およびＡ０４３９）が発見された。
【００１６】
細胞アッセイ系を用いたＲｄＲＰ活性の新規な低分子阻害剤を高処理能力で同定するために、本発明者らは、哺乳動物細胞内での発現のためにインフルエンザＲｄＲＰサブユニットタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ、ならびにアクセサリＮＰタンパク質）およびレポータＲＮＡをコードする一団の構築物を作製し、典型的なアッセイ系を、図１に略図として記載している。マウスＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ発現カセットを用いて、レポータＲＮＡをコードする構築物を、適切なウイルスＲＮＡドメインにより隣接されたホタルルシフェラーゼをコードするアンチセンスＲＮＡの転写を誘導するように設計した。マウスＢ１６−Ｆ１０細胞へのこれらの構築物のトランスフェクションは、５つのプラスミド（例えば、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、およびＲＮＡポリメラーゼＩ誘導ルシフェラーゼＲＮＡ構築物をコードする）の全てをトランスフェクトされた細胞において、ロバストなシグナルを示すが、図２に示された通り、これらの構築物のいずれかが除去された場合、またはＵＴＲベースのプロモータ要素を欠くレポータＲＮＡの存在下では、検出可能な発現を示さない。ヒト発現カセットおよび異なるウイルス血清型を用いた類似のアプローチが、これまでに報告されている２。
【００１７】
特に好ましい修飾において、ウイルス非構造１（ＮＳ１）タンパク質の発現を誘導する６つの構築物が、同時に含まれた。ＮＳ１およびＮＳ２は、Ａ型インフルエンザウイルスの分節８によりコードされた選択的ｍＲＮＡスプライシングアイソフォームである。ＮＳ１は、ウイルスＲＮＡ合成の調節およびウイルスタンパク質翻訳の増強３をはじめとし、ウイルス感染の際に非常に様々な機能を実施するが、ＮＳ２は、宿主細胞の核からのウイルスＲＮＡ輸送に不可欠である４。本発明者らは、反応速度試験における系のバックグランド「ノイズ」を変化させることなくシグナル強度をおよそ１０倍増幅させた（図３）。本発明者らは、潜在的阻害剤の添加のための好ましい時間枠が、検出可能なレポータ活性の出現前のトランスフェクションＤＮＡ／リポソーム複合体（または「リポプレックス」）除去後の最初の６時間以内にあることも見出した。感度上昇を示した例示的データを、図３に示す。
【００１８】
もちろん、本発明の主題が図および以下の説明に示された特異的成分に限定される必要がなく、１種または複数の修飾核酸を含み得ることは、認識されるはずである。例えばＲｄＲＰサブユニットタンパク質は、異なるウイルスのものであってもよく、そして／または薬物耐性突然変異体株を反映するように、もしくは様々なさらなる利点を付与するように、突然変異されていてもよい。同様に、レポータ遺伝子は、ルシフェラーゼに限定される必要はなく、他のレポータ遺伝子またはシステムであってもよい。したがって該シグナルは、光学シグナル（ルミネッセンス、蛍光、クエンチングなど）として、化学的に同定可能なシグナルとして（例えば、プロテアーゼ作用または抗原生成を介して）、および／または生物学的シグナル（例えば、細胞死、または表現型の変化）として発生させ得る。同様に該核酸は、トランスフェクションのために単一核酸に少なくとも部分的に組み入れてもよく、または細胞を一過性もしくは恒久的にトランスフェクトして（細胞株またはトランスジーンとして）、ＲｄＲＰサブユニットタンパク質を発現させてもよい。
【００１９】
特定の構成とは無関係に、そのようなアッセイ系を生物学的スクリーンとして用いると、大規模で多様な化学的ライブラリが即座に獲得され得ることは、認識されるはずである。類似のカウンタースクリーン（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎ）として、本発明者らは、細胞死活性化レポータ構築物を用いて同じスクリーニング試料を異なるレポータシステムで評価して、ウイルスＲｄＲＰを特異的に阻害する化合物と、哺乳動物遺伝子転写を非特異的に阻害し、そして／またはいずれかの結果が下流で望ましくない毒性を示し得る場合にヒト細胞に共通する細胞死経路を活性化する化合物と、を識別した。
【００２０】
これらのアッセイおよび研究基準を利用して、本発明者らは、なかでも低分子Ａ０４３５を同定した（図４ａ、ｂ参照）。該アッセイ系でのＡ０４３５の用量漸増試験から、およそ３μＭという５０％阻害濃度（ＩＣ５０）と、カウンタースクリーニングアッセイにより提供された構成的遺伝子発現のレベルに及ぼす視覚的阻害効果がないことが実証された（図４ｃ参照）。第二の構造的に類似した化合物Ａ０４３９もまた、レポータアッセイでテストし、ＩＣ５０がおよそ５μＭであること（図５ａ、ｂ参照）および沈殿のせいで高用量で毒性が増加するにもかかわらず、レポータシステムの類似の阻害を示すことが見出された。
【００２１】
もちろん、ピラゾロピリミジン（または以下の表１に示される類似の構造）を含むスカフォールドを有する数多くの他の化合物もまた、適切であると思われ、そのようなスカフォールドが、以下に示された様々な置換基を含むことは、認識されるはずである。最も好ましくは、そして化合物Ａ０４３５およびＡ４３９に特に関係して、ピラゾロピリミジン核（または他のスカフォールド）が、アルコキシアリールまたはジアルコキシアリール部分を含み、それがさらに場合により置換され得ることが企図される。そのような化合物において、少なくとも１つの酸素原子は、第一級、第二級もしくは第三級アミン、または硫黄もしくはセレン原子と置換されていてもよい。最も典型的には、該アリールは、フェニルまたはヘテロアリール（好ましくは窒素ヘテロ原子を含む）である。同様に該エチルピリジン部分は、アルキルヘテロアリールまたはアルキルアリールで置換されていてもよく、ピラゾロピリミジン核のアルキル部分の一方または両方が、置換アルキル、ヘテロアリールにより置換されていてもよく、または２つのアルキル基が、環を形成していてもよい。しかし注目すべきこととして、スカフォールドの複数の位置は、表１に列挙された化合物から即座に明白な通り、阻害作用の付随的な損失もしくは有意な減少、および／または毒性上昇を伴わずに修飾することができない。
【表１】
0006415568.tif 000004
0006415568.tif 000005
0006415568.tif 000006
0006415568.tif 000007
0006415568.tif 000008
0006415568.tif 000009
【００２２】
例えば、適切な別の化合物は、式Ｉ
【化３】
0006415568.tif 000010
（式中、ＸおよびＹは、独立してＯ、Ｓ、またはＮＲであり、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、Ｈ、場合により置換された低級アルキル、場合により置換された低級アルケニル、ＮＲ１Ｒ２、ＯＨ、またはハロゲンであり、Ｑは、場合により置換されたアリールまたは場合により置換されたヘテロアリールである）による構造を有するであろう。より好ましくは、企図される化合物中のＸおよびＹは、酸素であり、そして／またはＲ１およびＲ２は、独立して、エチル、メチル、もしくはトリフルオロメチルである。さらに、Ｒ３およびＲ４が、独立して低級アルキルであり、特にそれぞれメチルおよびエチルであることが、一般に好ましい。更に好ましい態様において、Ｒ５は、低級アルキル（そして特にエチル）であり、そして／またはＱは、場合により置換されたフェニルもしくは場合により置換されたピリジニルである。特に好ましい化合物としては、以下にさらに示されるＡ０４３５およびＡ０４３９が挙げられる。
【００２３】
同様に、そして以下にさらに詳述される通り、追加的に企図される化合物は、式ＩＩ
【化４】
0006415568.tif 000011
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはアルコキシ基であり；Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、低級アルキル、または一緒になって５員もしくは６員シクロアルキルもしくは複素環を形成しており；Ｒ５は、Ｈ、置換された飽和アルキル、または低級脂肪族フラグメントにより−ＮＨ−に連結した、場合により置換されたアリールもしくはヘテロアリールであり；Ｘは、独立して、Ｃ、ＣＨ、またはヘテロ原子である）による構造も有し得る。特に好ましい化合物としては、Ｒ２が、ＦもしくはＣｌであり、そして／またはＲ１およびＲ２が、独立して、エトキシ、メトキシ、もしくはトリフルオロメトキシであり、そして／またはＲ１およびＲ２が、一緒になって５員シクロアルキルもしくは複素環を形成し、そして／またはＲ１およびＲ２が、一緒になって６員シクロアルキルもしくは複素環を形成し、そして／またはＲ５が、フェニルもしくは置換ピリジニルで場合により置換された低級アルキルであり、そして／またはＲ５が、Ｈである、それらのものが挙げられる。
【００２４】
Ａ０４３５およびＡ０４３９の抗ウイルス能をインビトロでさらに評価するために、ＭＤＣＫ細胞を示された濃度の化合物と共に１時間プレインキュベートした後、ＭＤＣＫ適合Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）型インフルエンザ生ウイルスを添加した。１８〜２０時間のインキュベート後に上清を回収し、ニワトリ赤血球細胞による赤血球凝集アッセイを利用してウイルス複製の成功を示すウイルスヘマグルチニン活性の存在について評価した。このタイプのアッセイでは、ヘマグルチニン活性により、Ｕ形のウェルの底に沈殿した赤血球細胞により形成された特徴的な赤色の「ボタン」が存在しない。興味深いこととして、図６ａ、ｂから認められる通り、先に議論されたトランスフェクション阻害実験で観察された値によれば、Ａ０４３５は、４μＭを超える濃度で有意な抗ウイルス活性を示したが、Ａ０４３９は、７．５μＭを超えると同様の活性を示した。観察されたＡ０４３５の抗ウイルス活性が、他のウイルス単離物／血清型に及ぶかどうかを決定するために、類似のインビトロ感染実験を、同じくＡ０４３５により有意に阻害されたＡ／ＷＳ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）およびＨ３Ｎ２血清型Ａ／アイチ／２／６８インフルエンザウイルスを用いて実施し、その結果を図７ａ、ｂに示している。創薬にとって等しく重要なこととして、生ウイルスに感染した細胞は、図８ａ、ｂ、ｃから明らかな通り、Ａ型インフルエンザ感染に特徴的な細胞変性効果の兆候をほとんど〜全く示さなかった。これらの結果と一致して、本発明者らは、図９ａ、ｂから理解される通り、Ａ０４３５が広範囲の濃度で、肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞および初代腎臓近位尿細管上皮細胞（またはＲＰＴＥＣ）により提供されるような毒性の伝統的細胞モデルにおいて良好に耐容されることを見出した。
【００２５】
これらの結果から裏づけられる通り、本発明者らは、Ａ／プエルトリコ／８／３４型インフルエンザの５０％致死用量の２倍（２×ＬＤ５０）に感染させた動物での生ウイルス感染と戦うことにおいて、Ａ０４３５の抗ウイルス効果を測定するための試験を開始した。図１０に示された通り、３．１７ｍｇ／ｋｇ投与量群で、動物５匹中３匹が感染後７日目に生存し、１ｍｇ／ｋｇ用量では５匹中２匹が生存し、ビヒクルのみ（１×ＰＢＳ、３％Ｗ／Ｖマウス血清アルブミン）の注射の場合、５匹中生存した動物はいなかった。
【００２６】
結論として、企図された化合物には、図１に例示的に示された通り、阻害アッセイにおいて同定され得るもの全てが含まれる。最も好ましくはそのような化合物は、１０μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下のＩＣ５０を有し、先の通り測定されたＩＣ５０では明白な毒性を有さない。したがって、企図された化合物を同定する方法は、図１のアッセイ系を用いて阻害化合物の化合物ライブラリをスクリーニングするステップを含む。候補化合物（典型的には１０μＭ以下のＩＣ５０を有する）が同定されたら、ＳＡＲを確認するため、そしてより高い効力、低い毒性、および／または高い生物学的利用度を有する化合物を生成するために、そのような化合物をさらに修飾することができる。
【００２７】
さらに、本明細書で企図される化合物が、プロドラッグとして調製され得ることが、留意されなければならない。用語「プロドラッグ」は、企図される化合物の修飾を指し、その場合、該修飾された化合物は、より低い薬理活性（修飾された化合物と比較して）を示し、該修飾された化合物は、標的細胞（例えば、Ｂ細胞）または標的臓器／解剖学的構造（例えば、関節）の中で修飾された形態に戻される。例えば、活性な薬物が安全な全身投与にとって毒性が高すぎる場合、あるいは企図される化合物が消化管または他のコンパートメントもしくは細胞による吸収性が低い場合、あるいは身体が企図される化合物を標的器官への到達前に破壊する場合、企図された化合物のプロドラッグへの変換が有用になり得る。したがって、本発明の主題による化合物は、数多くの手法で修飾することができ、特に好ましい修飾としては、１つまたは複数の薬物動態および／または薬力学パラメータを改善するものが挙げられる。例えば１つまたは複数の置換基を付加または置換して、より高い血清中ＡＵＣを実現してもよい。
【００２８】
その一方で、そして特に高い溶解度が望ましい場合には、親水性基が付加されてもよい。さらに、企図される化合物が、加水分解（または他の方法で開裂）され得る１つまたは複数の結合を含む場合には、反応生成物もまた、明白に企図される。企図される化合物の対応するプロドラッグ形態への変換に適した例示的プロトコルは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．  Ｓｌｏａｎによる「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  （Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ）」（ＩＳＢＮ：  ０８２４７８６２９７）、およびＢｅｒｎａｒｄ  Ｔｅｓｔａ，  Ｊｏａｃｈｉｍ  Ｍ．  Ｍａｙｅｒによる「Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（ＩＳＢＮ：  ３９０６３９０２５Ｘ）に見出すことができ、それらは両者とも参照により本明細書に組み入れられる。その上、特に企図される化合物が代謝された（例えば、加水分解、ヒドロキシル化、グルクロン酸化など）時により高い活性を有する場合には、企図される化合物の代謝産物もまた本明細書で明白に企図されることは、認識されるはずである。
【００２９】
加えて、企図された化合物が、少なくとも１種の他の医薬的有効成分と（インビボまたは製剤処方もしくは投与レジメンで）併用され得ること、および特に企図される他の成分が、様々な抗ウイルス薬（および特にウイルス複製、細胞侵入、および／またはウイルスタンパク質の組み立てを阻害または低減するもの）、様々な免疫調整薬（および特に様々なインターフェロン、例えばＩ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型）、および／または抗炎症薬（例えば、ステロイドおよびＮＳＡＩＤ）などを含むことが、企図される。第二の医薬的有効成分の濃度は、典型的には単独投与に推奨される濃度で、または好ましくはそれ未満であるが、より高濃度が本明細書での使用に適することも考えられる。
【００３０】
それゆえ、企図される医薬組成物は、特に企図される化合物（および更なる医薬的有効成分）が適切な担体と共に提供されて、企図される化合物が、好ましくは生物体および／または標的臓器内でのウイルス増殖を減少させるのに効果的な濃度で、ウイルス感染に関連する疾患の兆候および症状を低減するのに、そしてより好ましくは処置するのに効果的な程度に、存在することを含む。異なる見通しから検討して、企図される化合物は、ウイルス感染、特にＲＮＡウイルス（および特にインフルエンザウイルス）へのウイルス感染を処置するのに効果的な量で、組成物中に存在する。
【００３１】
例えば、企図される化合物（そして特にＡ０４３５／Ａ０４３９）での処置に適したウイルス感染は、ＲＮＡウイルス（そして特に（−）鎖ＲＮＡウイルス）、および特にＡ型インフルエンザへの最大の類似性を担うそれらのウイルスへの感染により生じるものである。したがって企図されるウイルスとしては、Ｂ型インフルエンザ（Ａ０４３５により阻害可能であると本発明者らに確認された）、およびＣ型インフルエンザウイルスが挙げられる。企図される化合物での処置に適した系統学的に関連するさらなるウイルスとしては、パラミクソウイルス科［ニューカッスル病ウイルス；ヘンドラウイルス；ニパウイルス；リンダーペストウイルス；麻疹ウイルス；センダイウイルス；ウシパラインフルエンザウイルス３；ヒトパラインフルエンザウイルス１および３；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス２、４ａ、および４ｂ；メタニューモウイルス；呼吸器合法体ウイルスなど］、ラブドウイルス科［哺乳類動物伝染性水疱性口内炎ウイルスおよび狂犬病ウイルス；植物伝染性イチゴクリンクルサイトラブドウイルス、レタス黄化壊疽病ウイルス；ギョウギシバ退緑条斑ウイルス、トウモロコシモザイクウイルス、北地ムギモザイクウイルス、ラン壊疽斑紋ウイルス、イネ黄葉ウイルス、ノゲシイエローネットウイルス、およびタロイモ葉脈退緑ウイルス（Ｔａｒｏ  ｖｅｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）；魚類伝染性ヒラメラブドウイルス、伝染性造血器壊死ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、およびスネークヘッドウイルス、ならびにウシ流行熱ウイルスおよびアデレード川ウイルスなど］、フィロウイルス科［出血性エボラウイルスおよびマールブルグウイルスなど］およびボルナウイルス科をはじめとするモノネガウイルス目のものが挙げられる。本発明者らは、これらのウイルスを裏づける実際のデータを有さないが、ＲＳＶに基づく発現系を用いてこれらのウイルスの適合性を決定し得ること、およびそのような系が過度の実験を行わずに当業者により調製され得ることが、留意されるはずである。
【００３２】
それゆえ、特定の使用および構造に応じて、本発明の主題による化合物が、一用量単位あたり１μｇ〜１０００ｍｇの量で、より典型的には１０μｇ〜５００ｍｇの量で、最も典型的には５０μｇ〜５００ｍｇの量で存在することが企図される。したがって企図される化合物のインビボまたはインビトロでの好ましい濃度は、一般に０．１ｎＭ〜５００μＭ、より典型的には５０ｎＭ〜４００μＭ、最も典型的には１００ｎＭ〜２００μＭであろう。
【００３３】
さらに、配合剤の全てが、本明細書での使用に適すると思われ、特に経口および非経口配合剤を包含することが、認識されるはずである。例えば経口投与の場合、企図される組成物は、錠剤、カプセル、懸濁剤、または液体の形態であり得る。該医薬組成物は、好ましくは特定量の有効成分を含む投与単位の形態で作製される。そのような投与単位の例は、錠剤およびカプセルである。有効成分は、組成物として注入により投与することもでき、その場合、例えば生理食塩水、デキストロースまたは水を、適切な担体として用いることができる。特に好ましい態様において、該配合剤が、局所投与、エアロゾルを介した投与、および髄腔内投与に適することが企図される。結果として、特に適した配合剤は、局所スプレーもしくは滴下投与用の、またはチンキとして塗布される滅菌水溶液であり得る。あるいは適切な局所配合剤としては、クリーム、軟膏、フォーム、ローション、エマルジョンなどが挙げられる。さらに、該化合物が髄腔内投与用に配合される場合（例えば、脊髄損傷の処置）、該化合物が注射溶液、懸濁剤、またはエマルジョンとして調製されることが好ましい。さらに企図される配合剤において、企図される化合物は、エアロゾル送達用に配合され得る（例えば、微粉末化される、分散性担体にコーティングされる、噴霧可能な溶媒に溶解されるなど）。
【００３４】
特定の配合剤および担体の選択は、少なくとも一部が化合物の具体的な使用およびタイプに依存することが、認識されるはずである。当該技術分野で公知の薬物配合には数多くの手法があり、それらの全てが本明細書での使用に適すると思われる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  ｂｙ  Ｍａｒｋ  Ｇｉｂｓｏｎ；  Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，  ＩＳＢＮ：  １５７４９１１２０１；またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｂｙ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｏ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．  Ｔａｆｔ，  ａｎｄ  Ｊａｓｏｎ  Ｔ．  ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅ；    Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ；  ＩＳＢＮ：  １４２００４３８７０参照）。
【００３５】
本発明の化合物および／または組成物で疾患状態を処置するための投与される治療的活性化合物の量および投与レジメンは、対象の年齢、体重、性別および医学的条件、疾患の重症度、投与経路および頻度、ならびに用いられる特定の化合物など、様々な因子に依存し、したがって広範囲で変動し得る。しかし、特に適した量は、先に示されており、それゆえ約０．００１（またはそれ未満）〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の日用量を可能にする。典型的には日用量は、１〜４用量／日で投与され得る。
【００３６】
治療または予防目的の場合、企図される化合物は通常、示された投与経路に適した１種または複数の賦形剤と一緒にされる。経口投与される場合、該化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ならびに／またはポリビニルアルコールと混和され得、その後、簡便な投与のために打錠またはカプセル化され得る。そのようなカプセルまたは錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散物で提供され得るような、制御放出性配合剤を含み得る。非経口投与用の配合剤は、水性または非水性等張滅菌注射溶液または懸濁液の形態であり得る。これらの溶液および懸濁液は、経口投与用の配合剤中で使用するために挙げられた担体または希釈剤の１種または複数を有する滅菌粉末または顆粒から調製され得る。該化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または様々な緩衝剤に溶解され得る。他の賦形剤および投与様式は、医薬品業界で十分かつ広範に知られている。
【００３７】
材料および方法
細胞に基づくレポータアッセイ：ＲｄＲＰの阻害剤を同定するために、本発明者らは、ウイルスの生物学に基づいてマウス細胞アッセイ系を設計した。この系を作製するために、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰおよびＮＳ１をコードするウイルス遺伝子を、遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを用いたＡ／プエルトリコ／８／３４型ウイルスｃＤＮＡテンプレートの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（またはＲＴ−ＰＣＲ）により増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、次にＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現カセットを用いて哺乳動物発現ベクター（ｐＶＡＸ）にクローニングし、挿入物の配列をＤＮＡ配列決定により検証した。ＲＮＡポリメラーゼＩ依存性発現カセットを作製するために、発表された報告１２と類似の手法で、マウス４５Ｓ  ｒＲＮＡ転写開始部位の上流の２５５ｂｐ配列から得られたＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ配列を、多重クローニング部位に、そして続いてオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより作製された３３ｂｐマウスＲＮＡポリメラーゼＩ終結配列に連結して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。ｐＰｏｌＩと呼ばれるこの構築物を、その後、多重クローニング部位内で消化し、５’ＵＴＲ／ルシフェラーゼ／３’ＵＴＲに方向性を持ってライゲートして、ｐＰｏｌＩ−Ｌｕｃを作製した。ｐＰｏｌＩ−Ｌｕｃ−ＤｅｌＵＴＲ（即ち、欠失されたＵＴＲを含む）およびｐＰｏｌＩ−ＧＦＰ（ルシフェラーゼの代わりに緑色蛍光タンパク質をコードするＵＴＲを有する）構築物を、類似の方式で作製した。
【００３８】
トランスフェクションを、マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞および市販のトランスフェクション試薬を用い、製造業者の示唆に従って実施し、系の活性を確認した。手短に述べると、プラスミド２μｇ（例えば、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰおよびｐＰｏｌＩ−Ｌｕｃをコードする構築物をそれぞれ４００ｎｇ）を試薬１５μＬと複合体化した後、対数関数的に分裂している黒色腫細胞に添加した。トランスフェクション複合体を４時間後に除去し、他に断りがなければ、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後２０時間目にアッセイした。ＮＳ１を含む実験を類似の手法で実施し、その場合、プラスミドＤＮＡの総量が一定して２μｇのままであったが、６つのプラスミドが必要であったため、各プラスミド３３３ｎｇのみを使用した。
【００３９】
ウイルスおよびインビトロウイルス増殖：Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）を、イヌＭＤＣＫ細胞内で増殖させた。感染の前日に、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＤ）にＭＤＣＫ細胞を播種して、翌日に７０〜９０％コンフルエントが得られる密度で３７℃の５％ＣＯ２中でインキュベートした。感染の当日、完全ＤＭＥＭ／７．５％ＢＳＡ／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／（２μｇ／ｍＬ）ＴＰＣＫ−トリプシンを用いて細胞を３回洗浄した後、ウイルス希釈物を受けた。
【００４０】
Ａ０４３５阻害試験：Ｂ１６−Ｆ１０トランスフェクション系を含む試験の場合、ＤＮＡ／脂質複合体を除去して、示された量のＡ０４３５を添加した後、細胞を５時間回収した。ルシフェラーゼ発現を、１４時間後に測定した。ウイルス増殖の阻害を含む試験の場合、細胞は示された量のＡ０４３５を３０分間受け、その後、ウイルス調製物を添加して２時間感染させ、その後、除去して、レシピエント細胞の非結合ウイルスを洗浄して、培地を対応する量のＡ０４３５と交換した。
【００４１】
赤血球凝集アッセイ：赤血球凝集アッセイを以下の通り実施した。手短に述べると、初回感染後１８〜２０時間目に、Ｕ底ウェル内で、他に断りがなければ上清を０．５０％ニワトリ赤血球細胞と１：１比（Ｖ／Ｖ）でインキュベートして、反応を写真でモニタリングした。
【００４２】
インビボ生存試験：複数群の５Ｂａｌｂ／Ｃマウス（齢／性別）を計量した後、試験を開始して、３％ｗ／ｖマウス血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水中に３．１７、１、または０ｍｇ／ｋｇの用量でＡ０４３５を含有する配合剤を、尾の付け根に静脈内注射した。４時間後に、これらのマウスに麻酔下で２×ＬＤ５０のＡ／プエルトリコ／８／３４型インフルエンザを鼻内にチャレンジ投与した。同一用量のＡ０４３５を初回投与後２４および４８時間目に投与し、動物の体重を毎日モニタリングした。生存している動物は、開始時の体重の７０％以上を保持する動物と定義した。
【００４３】
関連の技術分野
１）  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｍ  Ｋｎｉｐｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｍ  Ｈｏｗｌｅｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＵＳＡ，  ２００７．
２）  Ｌｕｔｚ  Ａ，  Ｄｙａｌｌ  Ｊ，  Ｏｌｉｖｏ  ＰＤ，  Ｐｅｋｏｓｚ  Ａ．  Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００５  Ｊｕｎ；  １２６（１−２）：１３−２０．
３）  Ｈａｌｅ  ＢＧ，  Ｒａｎｄａｌｌ  ＲＥ，  Ｏｒｔｉｎ  Ｊ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｄ．  Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００８  Ｏｃｔ；  ８９（Ｐｔ  １０）：２３５９−７６．
４）  Ｒｏｂｂ  ＮＣ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｍ，  Ｖｒｅｅｄｅ  ＦＴ，  Ｆｏｄｏｒ  Ｅ．  ＮＳ２／ＮＥＰ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００９  Ｊｕｎ；  ９０（Ｐｔ  ６）：１３９８−４０７．
５）  ”Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ１Ｎ１  （２００９）  ｖｉｒｕｓｅｓ”．  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＷＨＯ）．  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，  ２０１０．
６）  Ｋｉｓｏ  Ｍ，  Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｋ；  Ｓａｋａｉｔａｇａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｋ，  Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｃ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｋ，  Ｈａｙｄｅｎ  Ｆ，  Ｓｕｇａｙａ  Ｎ，  Ｋａｗａｏｋａ  Ｙ．  （２００４）．  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ：  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３６４：  ７５９−７６５
７）  Ｌｅ  Ｍ，  Ｋｉｓｏ  Ｍ，  Ｓｏｍｅｙａ  Ｋ，  Ｓａｋａｉ  Ｔ，  Ｎｇｕｙｅｎ  Ｈ，  Ｎｇｕｙｅｎ  Ｈ，  Ｐｈａｍ  Ｄ，  Ｎｇｙｅｎ  Ｈ，  Ｙａｍａｄａ  Ｓ，  Ｍｕｒａｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｔａｋａｄａ  Ａ，  Ｇｏｔｏ  Ｈ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，  Ｋａｗａｏｋａ  Ｙ．  Ａｖｉａｎ  ｆｌｕ：  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，  ４３７（７０６２）：  １１０８
８）  Ｄｈａｒａｎ  ＮＪ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ１Ｎ１）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  ＪＡＭＡ，  ２００９．  ３０１（１０）：  ｐ．  １０３４−４１．
９）  Ｇｕｂａｒｅｖａ  ＬＶ，  Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ  ＭＮ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ，  Ｂｅｔｈｅｌｌ  ＲＣ，  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＲＧ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｚａｎａｍｉｖｉｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｃｈｉｌｄ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９９８  Ｎｏｖ；  １７８（５）：１２５７−６２．
１０）  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ｗｈｅｅｋｌｙ／ｗｅｅｋｌｙａｒｃｈｉｖｅｓ２００８−２００９／ｗｈｅｅｋｌｙ３５．ｈｔｍ
１１）  Ｓｈｅｕ  ＴＧ，  Ｆｒｙ  ＡＭ，  Ｇａｒｔｅｎ  ＲＪ，  Ｄｅｙｄｅ  ＶＭ，  Ｓｈｗｅ  Ｔ，  Ｂｕｌｌｉｏｎ  Ｌ，  Ｐｅｅｂｌｅｓ  ＰＪ，  Ｌｉ  Ｙ，  Ｋｌｉｍｏｖ  ＡＩ，  Ｇｕｂａｒｅｖａ  ＬＶ．  Ｄｕａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｄａｍａｎｔａｎｅｓ  ａｎｄ  ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ  ａｍｏｎｇ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ１Ｎ１）  ｖｉｒｕｓｅｓ：  ２００８−２０１０．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１１  Ｊａｎ  １；  ２０３（１）：１３−７．
１２）  Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ，  Ｚｏｂｅｌ  Ａ，  Ｈｏｂｏｍ  Ｇ．  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １９９４  Ｊｕｌ；  ２０２（１）：４７７−９．
【００４４】
このようにして、Ａ型インフルエンザＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの低分子阻害剤の具体的実施形態および適用を開示した。しかし、本明細書内の発明的概念から逸脱することなく、既に記載された改良以外の多くの改良が可能であることは、当業者に認識されるはずである。それゆえ本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の主旨以外では限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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