(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象試料を複数の所定の線（４）に沿って結合可能となるように、平面導波路（１）の外表面（１１）を用意する方法であって、
前記複数の所定の線（４）は、使用時、前記平面導波路（１）内に結合されて当該平面導波路（１）を通って伝播するコヒーレント光のエバネッセント場が、前記複数の所定の線（４）に沿って配置された対象試料で散乱し、前記平面導波路を通って伝播するコヒーレント光の波長の整数倍の光路長差となる所定の検出位置において強めあう干渉をするように配置され、または、
前記複数の所定の線（４）は、使用時、前記平面導波路（１）内に結合されて当該平面導波路（１）を通って伝播するコヒーレント光のエバネッセント場が、前記複数の所定の線（４）に沿って配置された対象試料で散乱し、前記平面導波路（１）内の所定の方向で干渉するように配置され、
前記方法は、
−  リンカー分子（２）を付着させることが可能な前記外表面（１１）を有する平面導波路（１）を準備するステップと、
−  少なくとも１組の複数のリンカー分子（２，５；２）を前記外表面（１１）に順次接触させるステップであって、当該少なくとも１組の複数のリンカー分子（２，５；２）は各組ごとに集合してリンカー分子（２，５；２）の個別レイヤーを形成し、複数の個別レイヤーが、前記平面導波路（１）の前記外表面（１１）上に一層ずつ積層され、各リンカー分子（２，５；２）は官能基（２２，５２；２２）および頭部基（２１，５１；２１）を有し、前記頭部基（２１，５１；２１）は、前記平面導波路（１）の前記外表面（１１）または一層手前のレイヤーのリンカー分子（２）の官能基（２２）に付着可能で、最上層レイヤーのリンカー分子（５；２）の官能基（５２；２２）は光解離性保護基（３）に結合して、当該光解離性保護基（３）に結合した最上層レイヤーの各官能基（５２；２２）が他の分子の相補的官能基を付着不能である、ステップと、
−  前記複数の所定の線（４）に沿って配置された最上層レイヤーの光解離性保護基（３）を所定の波長の光で露光して、当該露光された光解離性保護基（３）を前記官能基（５２；２２）から除去し、他の分子の相補的官能基を付着可能にするステップと
を有する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１組の複数のリンカー分子（２，５）を順次接触させるステップは、複数のリンカー分子（２，５）２組のみを接触させることからなり、当該２組のリンカー分子（２，５）は、集まって、前記平面導波路（１）の前記外表面（１１）上に、リンカー分子（２，５）の２層の別個のレイヤーを積層形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
−  対象試料（８）を結合可能な捕獲分子（６）の相補的官能基を、複数の所定の線（４）に沿って配置されたリンカー分子の最上層の官能基（５２）に付着させるステップと、
−  前記複数の所定の線（４）の間に配置された光解離性保護基（３）を、前記所定の波長の光で露光して、当該露光された光解離性保護基（３）を前記官能基（５２）から除去し、それらの官能基（５２）が前記他の分子の相補的官能基を付着させることができるようにするステップと、
−  前記捕獲分子（６）が結合することができる対象試料（８）には結合することができない修飾された捕獲分子（７）の相補的官能基を、前記複数の所定の線（４）の間に配置された前記官能基（５２）に付着させるステップと
をさらに有する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１組の複数のリンカー分子（２）を順次接触させるステップは、複数のリンカー分子（２）を１組のみ接触させることからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
他の組の複数のリンカー分子の頭部基を、前記複数の所定の線（４）に沿って配置された前記一層手前のレイヤーのリンカー分子（２）の官能基（２２）に付着させるステップを有し、当該他の組の複数のリンカー分子（５）に属するリンカー分子（５）の官能基（５２）は、光解離性保護基（３）と結合していないので、他の分子の相補的官能基を付着させることが可能であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
−  捕獲分子（６）の相補的官能基を、前記複数の所定の線（４）に沿って配置された前記他の組の複数のリンカー分子（５）に属するリンカー分子（５）の官能基（５２）に付着させるステップと、
−  前記複数の所定の線（４）の間に配置された光解離性保護基（３）を、所定の波長の光で露光して、当該露光した光解離性保護基（３）を前記官能基（２２）から除去し、当該官能基（２２）を他の分子の相補的官能基を付着させるようにするステップと、
−  さらに他の組の複数のリンカー分子（５）の相補的官能基を、前記複数の所定の線（４）の間に配置されている前記一層手前のレイヤーのリンカー分子（２）の官能基（２２）に付着させるステップであって、前記さらに他の組の複数のリンカー分子（５）に属するリンカー分子（５）の官能基（５２）は、光解離性保護基（３）とは結合していないので、他の分子の相補的官能基を付着可能である、ステップと、
−  修飾された捕獲分子（７）の相補的官能基を、前記複数の所定の線（４）の間に配置された前記さらに他の組の複数のリンカー分子（５）に属するリンカー分子（５）の官能基（５２）に付着させるステップと
を有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の所定の線（４）に沿って配置された光解離性保護基（３）を露光するステップが第１の照射線量で実行され、前記複数の所定の線（４）の間に配置された光解離性保護基（３）を露光するステップが第２の照射線量で実行され、前記第１の照射線量は前記第２の照射線量とは異なることを特徴とする請求項３から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の照射線量と前記第２の照射線量が１０ジュール／ｃｍ２未満であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の所定の線（４）に沿って配置された光解離性保護基（３）を露光するステップは、
−  第１屈折率ｎ１を有する複数の突出部（９１）を有する位相マスク（９）を前記光解離性保護基（３）に近接させて配置し、前記位相マスク（９）と前記平面導波路（１）の前記外表面（１１）との間に第２屈折率ｎ２を有する媒質を配置するステップであって、該第１屈折率ｎ１は、前記第２屈折率ｎ２とは異なる、ステップと、
−  前記所定の波長の光を、前記複数の所定の線（４）に沿って配置された光解離性保護基（３）を露光するための前記位相マスク（９）を通過させるステップと
を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記頭部基（２１）が前記外表面（１１）に付着する前記複数のリンカー分子（２）が、集まって、厚みが０．５ｎｍから１０ｎｍの個別のレイヤーを形成することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記頭部基（２１）が前記外表面（１１）に付着する前記複数のリンカー分子（２）が、集まって、リンカー分子（２）の単分子層を形成することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記頭部基（５１）が前記一層手前のレイヤーのリンカー分子（２）の官能基（２２）に付着する複数のリンカー分子（５）が、集まって、厚みが１０ｎｍから２００ｎｍの最上層の個別のレイヤーを形成することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の所定の線（４）は、前記平面導波路（１）の前記外表面（１１）における、それぞれ面積が２５μｍ２より大きい少なくとも２つの離れた回折スポット（４１）に配置されており、前記複数の所定の線（４）は、隣接する線（４）間の距離が１．５μｍ未満であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法を用いて用意された外表面（１１）を備えた平面導波路（１）であって、前記複数の所定の線（４）は、前記外表面（１１）における、それぞれ面積が２５μｍ２より大きい少なくとも２つの離れた回折スポット（４１）に配置されており、複数の所定の線（４）は、隣接する線（４）間の距離が１．５μｍ未満であることを特徴とする平面導波路（１）。
【請求項１５】
前記複数の所定の線（４）が、光カプラーを通って前記平面度波路（１）内に結合される光の伝播方向において、隣接する所定の線（４）間の距離が前記光の伝播方向に向かうにつれて狭くなるように配置され、もしくは前記光の伝播方向に対して角度をつけて配置されていることを特徴とする請求項１４に記載の平面導波路（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の所定の線に沿って対象試料を結合可能となるように平面導波路の外表面を用意する方法および平面導波路であって、それぞれ独立クレームに記載されたものに関する。
【背景技術】
【０００２】
導波路に関連するものではないので遠い技術分野ではあるが、自然チタンなどの金属面上にナノ構造のパターンを形成する技術が公知である（たとえば、Getachew Tizazu et al., による『干渉計フォトリソグラフィーによる酸化チタン表面上へのアルキルホスホン酸自己組織化単分子層の広域ナノパターン形成（Large area nanopatterning of alkylphosphonate self-assembled monolayers on titanium oxide surfaces by interferometric photo-lithography）』（Nanoscale, 2011, 3, 2511）が、２０１１年３月にhttp://pubs.rsc.orgにおいて、doi:10.1039/C0NR00994Fにて公開されている）。金属は、一般に、平面導波路の形成には適さない。金属表面の作成は、平面導波路の外表面の作成に資する示唆を提供するものではない。特に、自然チタンは、平面導波路に用いるのに適した材料ではない。  
【０００３】
本発明の適用分野は、結合事象（イベント）の検出である。公知の装置が、励起すると蛍光を発することが可能なラベルを利用した対象試料の捕獲分子との結合イベントを検出する。たとえば、対象試料をラベリングするラベルとして蛍光タグを使用することができる。励起にあたり、蛍光タグは、特徴的な発光スペクトルを有する蛍光を発光させられる。この特徴的な発光スペクトルを特定のスポットで検出することは、ラベリングされた対象分子が、平面導波路の外表面上の各特定のスポットに存在する特定のタイプの捕獲分子に結合していることを示す。ラベリングされた対象試料を検出するためのセンサーは、論文『Zeptosensのタンパク質マイクロアレイ：低存在度タンパク質分析のための新規な高性能マイクロアレイプラットフォーム（Zeptosens’ protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis）』（Proteomics 2002, 2, S. 383-393, Wiley-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, Germany）に記載されている。  
【０００４】
結合イベントの光学的検出のための新しい装置が、捕獲分子における対象試料の存在を直接検出することによってラベルを不要にする有益な方法を提供している。この装置は、平面導波路を有し、光カプラーによって光が当該平面導波路の内部に結合され、当該平面導波路の中を通ってコヒーレント光が伝播し、当該コヒーレント光のエバネッセント場が当該平面導波路の外表面に沿って伝播するようになっている。平面導波路の外表面は、複数の所定の線に沿って対象試料を結合可能となるように用意され、エバネッセント場の光を、複数の所定の線に沿って配置された対象試料によって散乱させるようになっている。散乱光は所定の検出位置において強めあうように干渉するので、対象試料からの重ね合わさった散乱光から検出可能な信号が得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この新しい装置は、複数の所定の線に沿って配置された対象試料において散乱させられたコヒーレント光の重ね合せによって高い検出感度を達成しているが、この物理現象を「回折（diffraction）」という。異なる線上の対象試料で散乱させられた光が、所定の検出位置において、平面導波路を通って伝播する光の波長の整数倍の光路長差となるように、複数の所定の線に属する線が配置されているので、散乱させられた光は、強めあうように干渉し、たとえば、所定の検出位置における強度が最大となる。所定の検出位置は、強めあう干渉の要件を満たすために複数の所定の線を基準に配置される。さらに他の諸実施例において、光は、平面導波路内で所定の方向に干渉するように、複数の所定の線で回折する。  
【０００６】
したがって、複数の所定の線に沿って対象試料を結合可能となるように平面導波路の外表面を用意するための方法を提供することが本発明の一つの目的である。本発明のさらに別の目的は、複数の所定の線に沿って対象試料を結合可能となるように用意された外表面を有する平面導波路を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による方法の有利な実施形態は、各従属項の主題である。  
【０００８】
本発明によれば、複数の所定の線に沿って対象試料を結合可能となるように平面導波路の外表面を用意する方法が提供される。この方法は、次のステップを有する。  
【０００９】
リンカー分子の頭部基を付着させるよう構成された外表面を有する平面導波路を準備する。  
【００１０】
その後、少なくとも１組の複数のリンカー分子を前記外表面に順次接触させる。前記少なくとも１組のリンカー分子は各組ごとに集合してリンカー分子の個別レイヤーを形成し、複数の個別レイヤーが、前記平面導波路の外表面上に一層また一層と積層される。各リンカー分子は、少なくとも一つの官能基と、前記平面導波路の外表面または一層手前のレイヤーのリンカー分子の官能基に共有結合の形成を通じて付着可能もしくは静電相互作用を通じて吸収された頭部基とを有する。最上層レイヤーの複数のリンカー分子の官能基は、光解離性保護基に付着し、当該光解離性保護基により保護されている各官能基が他の分子の相補的官能基に付着不能となっている。  
【００１１】
そして、複数の所定の線に沿って配置された最上層レイヤーの光解離性保護基を所定の波長の光に露光して、当該露光された光解離性保護基を前記官能基から除去し、他の分子の相補的官能基を付着可能にする。  
【００１２】
その結果、露光された光解離性保護基を官能基から除去することで、他の分子の相補的官能基を付着可能なこれら官能基の幾何学的位置を規定する。官能基の位置は、複数の線となるよう選択される。導入部で説明したように、これら複数の線上の対象試料で散乱させられるコヒーレント光は所定の検出位置において強めあうように干渉する。技術的には、隣接する線の間の間隔が徐々に狭まるような複数の所定の曲線上に配置されるのが好ましい。隣接する線の間の間隔が徐々に狭まるような複数の所定の曲線上に配置することで、回折光を所定の検出位置に焦点を合わせ集束させることができる。複数の所定の曲線の配置は、一連の複数の所定の線の組を、１組がそれぞれ他の組の上になるよう繰り返し配置して（たとえば、手前の組の複数の所定の線に対して各後続の複数の組の所定の線をわずかに回転させることによって）別の焦点を提供するような配置を含む。一連の複数の所定の線の組はそれぞれが異なる化学的、生物学的、または薬学的な特徴を有するものとすることができる。また別の配置としては、平面導波路の平面内で光を回折させ、回折した光がその平面導波路内で所定の方向に干渉するように複数の直線を配置するのも好ましい。複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基の露光は、完全に（理想的にはすべての光解離性保護基が除去される）あるいは部分的に（所定割合、たとえば、１０％、２０％、の光解離性保護基が除去される）、さまざまなフォトリソグラフィー法（たとえば、接触モードあるいは遠隔場フォトリソグラフィー）で実行が可能であるが、フォトリソグラフィックマスクが導波路に接触せず、マスクと導波路の外表面との間に小さな隙間を形成する近接場フォトリソグラフィーにより実行するのが好ましい（それぞれ、導波路の外表面に付着したリンカー分子上の光解離性保護基の露光中は、液体で満たすことができるリンカー分子の露光された光解離性保護基）。フォトリソグラフィー法における露光は、フォトリソグラフィーで製造したツール、たとえば、John A. Rogers et al. による『エラストマー位相マスクによる近接場モードフォトフォトリソグラフィーを用いた約９０ナノメートルの特徴を生成する（Generating ~90 nanometer features using near-field contact-mode photophoto-lithography with an elastomeric phase mask）』（J. Vac. Sci. Technol. B 16(1), Jan/Feb 1998, page 59 et seq.）で詳細に記載されているような、近接場接触モードフォトフォトリソグラフィー用のエラストマー位相マスクのようなツールを使用することを含む。  
【００１３】
少なくとも１組の複数のリンカー分子を順次接触させるやり方として、好ましい例が２つあり、以下に説明する。一つの例は、１組の複数のリンカー分子を平面導波路の外表面に、直接接触させる。すると、それらが集まって一層の個別レイヤーとなる。もう一つの例は、第１の組の複数のリンカー分子を外表面に接触させ、続けて第２の組の複数のリンカー分子を接触させる。すると、それらが集まって、個別レイヤーが２層だけ積層される。それぞれの例において、リンカー分子の最上層レイヤーに集成されたリンカー分子の官能基は、光解離性保護基に結合する。これは、最上層の複数のリンカー分子を接触させる前または後において実現することができる。最上層レイヤーには、換言すれば、最外層レイヤーには、フォトリソグラフィックマスクを配置することができるので、その最上層レイヤーに対して、直接、そのマスクを介してのフォトリソグラフィーによる露光が可能である。  
【００１４】
本願の趣旨の範囲内における「分子（molecules）」は、広範な意味を含むが、基本的には、化学結合により結合している２個以上の原子のつながりである。原子の種類と数に限定はなく、分子（molecules）という用語は、２個以上の分子の組成物を明示的に含んでいる。分子（molecule）という用語は、分子間および分子内の結合における特定の種類にも、特定の化学的、薬学的、または物理的特徴にも限定されない。特に、高分子および分子集合体は、明示的にその用語の中に含まれている（たとえば、ポリマー、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、リポソーム、および、ペプチド）。基本的に、分子という用語は、任意の合成または天然の安定した多原子のつながりを表している。  
【００１５】
なお、本発明の範囲内で、化学結合は、当技術分野の専門家に知られた、イオン相互作用、疎水性相互作用、錯生成、水素結合、フルオラス相形成などのような分子相互作用の任意の他の安定的な固有の集合体により置き換えることができる。  
【００１６】
本願の趣旨の範囲内における「官能基（functional groups）」とは、部分（分子の部分：sections of molecules）および分子（生体分子を含む：molecules including biomolecules）であり、特定の部分もしくは分子が、特に、他の分子の相補的官能基が、結合可能なものである。たとえば、リンカー分子は、少なくとも一つの官能基を有する。官能基の例としては、通常の官能基、たとえば、アミノ−、カルボン酸−、カルボン酸エステル、チオエステル、ヒドロキシル−、メルカプト−、ボロン酸−、アルキン−、アジド−、シクロオクチン−、マレインイミド−、ヨードアセチル−、アルデヒド−、ケト−、ヒドロキシルアミノ−、シアノ−、エポキシ−、スルホン酸といった基が挙げられる。他の例に、ビシナルジオール、芳香族オルトジアルデヒドまたはα−メルカプトアミノアルカン（たとえば、Ｎ末端システイン）のようなビスファンクショナル基、および、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）またはポリヒスチジンを形成するＮｉ２＋をもつ安定的な錯体、単鎖ＤＮＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、受容体またはその配位子などの有機またはペプチド金属キレート吸着剤がある。官能基のさらに別の例としては、「タグ（tags）」があり、タグと相補的「タグ」との間で共有結合を形成する酵素がこれを認識する。たとえば、Ｓｎａｐタグ、Ｃｌｉｐタグ、Ｓｏｒｔａｓｅタグが例として挙げられる。  
【００１７】
複数のリンカー分子の多くの官能基と他の分子の相補的官能基の多重相互作用も含まれる。他重相互作用は、共有結合性および非共有結合性であり得るが、疎水性相互作用も含む。すなわち、官能基という用語は、他の分子の疎水性の要素（hydrophobic entities）と相互作用することができる疎水性部分（hydrophobic moieties）をも含むものであることが含意されている。  
【００１８】
したがって、官能基および相補的官能基の、他の分子の固定化をもたらすあらゆる種類の相互作用が含まれる。  
【００１９】
「相補的官能基を有する他の分子（further molecule having a complementary functional group）」とは、本願の趣旨の範囲内においては、捕獲分子、修飾された捕獲分子、またはリンカー分子であって接触させる他の組の複数のリンカー分子の頭部基を有するものである。相補的官能基は、リンカー分子の官能基と反応もしくは相互作用することができる。  
【００２０】
本願の趣旨の範囲内において「相補的官能基（complementary functional group）」とは、部分（分子の一部）、分子、または生体分子であって、特定の部分または分子が結合可能なものである。たとえば、他の分子の相補的官能基は、リンカー分子の頭部基、および、手前のレイヤーのリンカー分子の官能基に結合可能な捕獲分子の一部である。たとえば、相補的単鎖ＤＮＡは、オルトゴナル結合化学反応を起こすために水素結合による二重螺旋を形成することができる。他に、タンパク質配位子相互作用を利用することによって安定的な非共有結合を形成するという選択肢もある。相補的官能基の例としては、通常の官能基、たとえば、ＮＨ２−、ＣＯＯＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−、スルホン酸や、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）またはポリヒスチジンを形成するＮｉ２＋をもつ安定的な錯体、単鎖ＤＮＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、受容体またはその配位子などの有機またはペプチド金属キレート吸着剤が挙げられる。一般に、相補的官能基は、前記した官能基の例が相補的官能基にも適用できるよう、その官能基と同じ種類のものとすることができる。  
【００２１】
「捕獲分子（capture molecules）」とは、任意の種類の、薬学的、生物学的、または化学的な分子であって、対象試料が結合イベントの検出のため結合可能な対象である。たとえば、生物学的受容体、タンパク質、リポソーム、ナノリアクター等である。一般に、「対象試料（target sample）」とは、結合イベントの検出のために捕獲分子に結合可能な試料中の対象分子である。
【００２２】
本願の趣旨の範囲内において「結合（binding）」または「結合イベント（binding event）」には、任意の種類の分子認識、および任意の種類の捕獲分子またはその結合サイトと任意の種類の対象試料との間の任意の種類の分子相互作用が含まれる。これには、２以上の結合相手の実際の結合、および、生体分子相互作用の相手（チャンネルタンパク質を有するタールリポ）の集積が含まれる。
【００２３】
「付着（attach）」という用語は、結合と似た使われ方をする語であり、一般に、１個の分子（たとえば、リンカー分子の頭部基または捕獲分子）を、共有結合の形成を通じて、もしくは、ファン・デル・ワールス力による化学吸着作用ないし物理吸着作用、または静電相互作用またはイオン相互作用または水素結合またはフルオラス相形成を通じて、平面導波路の外表面に、または、リンカー分子の官能基に、付着させる場合のような、各種の化学的もしくは物理的な付着（または結合coupling）に関する。一般に、一方の結合相手が他方の結合相手に結合するような各種の化学的な付着が含まれる。これは、化学的な相手方のペアを、それぞれ付着した各分子のそれぞれの結合能力について前提条件をつけることなく、互いに、付着させるものと理解されるべきである。たとえば、官能基を捕獲分子に付着させることは、捕獲分子を官能基に付着させること、あるいは、双方互いに付着させあうこと、と等しい。
【００２４】
準備される平面導波路は、リンカー分子の頭部基を付着させることができる材料からなる。本発明に好適な導波路材料は、導波特性を備える滑らかな光学膜の作成に薄膜蒸着技術が利用可能な、Ｔａ２Ｏ５、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５またはＳｉ３Ｎ４などの屈折率の高い材料である。光回折格子カプラーを形成したガラスおよびポリマー基板上の高屈折率導波路の、効率的な製造方法が、Fattinger et al.による『二回折格子カプラー：光学界面分析のための汎用トランスデューサ―（Bidiffractive grating coupler: Universal transducer for optical interface analytics）』（OPTICAL ENGINEERING, Vol.34 No. 9, page 2744-2753, September 1995）に詳述されている。平面導波路は、高屈折率のレイヤーを少なくとも一層含む複数のレイヤーを有するものとすることができる。準備される平面導波路は、該平面導波路の上面を形成する外表面上の媒質に対して高い屈折率を有する。たとえば、平面導波路の表面における媒質の屈折率が通常１〜１．５、特に、水や水性分析物に対して１．３３〜１．４、空気に対して１の範囲なのに対して、平面導波路の屈折率は、１．７〜２．８の範囲とすることができる。コヒーレント光は、平面導波路の外表面でエバネッセント場をともなって伝播するように光カプラーを通って平面導波路内に結合される。外表面から外部に浸透するエバネッセント場は、導波路の外表面における複数の所定の線に沿って結合された対象試料で回折される。導波路膜の厚みは、６０〜２０ｎｍの範囲が選好される。導波路の外表面におけるエバネッセント場の媒質への浸透深度は、１５０ｎｍ未満が選好される。
【００２５】
前記方法の第１の場合として、上述した、少なくとも１組の複数のリンカー分子を順次接触させるステップは、複数のリンカー分子を２組だけ接触させることからなる場合がある。この２組の複数のリンカー分子は、集まって、平面導波路の外表面上にリンカー分子の２層の別個のレイヤーを積層形成する。
【００２６】
この第１の場合の一態様によれば、前記方法は、さらに次のステップを有する。捕獲分子の相補的官能基を前記複数の所定の線に沿って配置された官能基に付着させる。各捕獲分子は対象試料を結合可能である。そして、複数の所定の線の間に配置された光解離性保護基を、所定の波長の光で露光して、当該露光された光解離性保護基を前記官能基から除去し、これらの官能基が前記他の分子の相補的官能基を付着させることができるようにする。その後、前記複数の所定の線の間に配置された前記官能基に、修飾された捕獲分子の相補的官能基を付着させる。各修飾された捕獲分子は、最初の捕獲分子が結合することができる対象試料に、結合することができないものが選択される。
【００２７】
前記複数の所定の線の間に配置された光解離性保護基の露光（２回目の露光）は、陰となる領域をつくらないように、残りの光解離性保護基が配置されているレイヤー全体に対して実行される。事実、前記複数の所定の線の間に配置された光解離性保護基は、前記複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基のフォトリソグラフィーによる最初の露光後に残っている光解離性保護基だけである。修飾された捕獲分子は、捕獲分子と比較して、コヒーレント光を同じように散乱させる分子である。捕獲分子および修飾された捕獲分子から散乱させられる光は、振幅と光路長差が一致しているので、所定の検出位置において弱めあうように干渉するという点で有利である。したがって、この所定の検出位置における最小信号が、光解離性保護基が除去される官能基の量に相関するそれぞれの露光時間を変更することによって、調整可能である。対象試料を接触させた後の検出位置における信号の変化が主として捕獲分子に結合している対象試料によるものである限りにおいて、最小信号は有利である。そのことで、検出位置における信号に対する対象試料の貢献が、対象試料のない捕獲分子からの信号に比べて、すなわち捕獲分子のみで散乱させられる光と比べて、大きくなる。捕獲分子または修飾された捕獲分子は、浸漬や液浸（immersion, dipping）またはスポッティング（spotting）または印刷（printing）あるいは流体装置（fluidic apparatus）の利用等によって、導波路の外表面に接触させる。
【００２８】
前記方法の第２の場合として、上述した、少なくとも１組の複数のリンカー分子を順次接触させるステップは、複数のリンカー分子を１組だけ接触させることからなる場合がある。
【００２９】
この第２の場合の一態様によれば、前記方法は、相補的官能基を有する前記他の分子としての（好ましくは、官能基を介して、部分的にもしくは全部が捕獲分子にすでに結合している）他の組の複数のリンカー分子の頭部基を、前記複数の所定の線に沿って配置された（脱保護された官能基をもつ）手前のレイヤーのリンカー分子の官能基に付着させるステップをさらに有する。当該他の組の複数のリンカー分子に属するリンカー分子の官能基は、光解離性保護基に結合していない（この場合において、前記他の組の複数のリンカー分子に属するリンカーリンカー分子は実際に光解離性保護基に結合したことはない）ので、他の分子の相補的官能基を付着させることが可能である。前記他の組の複数のリンカー分子のリンカー分子は、柔軟性、親水性、最小非特異的結合、および、平面導波路の外表面上に捕獲分子を固定するための最適な長さなどにおいて、異なる特徴を提供するため、手前のレイヤーのリンカー分子とは異なっている。このステップの後、前記他の組の複数のリンカー分子に属するリンカー分子および当該他の組の複数のリンカー分子に結合した捕獲分子は、複数の所定の線に沿った位置にのみ配置される。  
【００３０】
前記第２の場合の別の態様によれば、前記方法は、さらに次のステップを有する。前記複数の所定の線に沿って配置された前記他の組の複数のリンカー分子に属するリンカー分子の官能基に、捕獲分子の相補的官能基を付着させる。（これは、捕獲分子と共にリンカー分子を接触させることにより達成できる。）そして、前記複数の所定の線の間に配置されたこれら光解離性保護基を所定の波長の光で露光して、当該露光された光解離性保護基を官能基から除去し、これらの官能基が他の分子の相補的官能基を付着できるようにする。その後、さらに他の組の複数のリンカー分子の相補的官能基（頭部基）を前記複数の所定の線の間に配置されている手前のレイヤーのリンカー分子の官能基に付着させる。前記他の複数のリンカー分子に属するリンカー分子の官能基は、光解離性保護基には結合していない  −実際に結合したことがない−  のであり、他の分子の相補的官能基を付着することができる。その後、前記複数の所定の線の間に配置された前記他の複数のリンカー分子に属するリンカー分子の官能基に、相補的官能基を有する他の分子として、さらに他の複数の修飾された捕獲分子の相補的官能基を付着させる。  
【００３１】
この第２の場合には、第１の場合と同様の利点が得られるが、特に、所定の検出位置における捕獲分子及び修飾された捕獲分子から散乱させられる光が弱めあうように干渉するという点において有利である。前記他の複数のリンカー分子の接触が捕獲分子または前記修飾された捕獲分子の接触とともに行われる場合に有利である。このことは、捕獲分子および修飾された捕獲分子を前記他のリンカー分子により部分的に囲まれた状態で接触させることができるという利点をもたらす。このように、リンカー分子は、ゆるくまとまったマトリックス（たとえば、デキストランやポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のようなポリマー）に捕獲分子を埋め込んで提供することができる。これらの利点は、以下、詳細に説明する。
【００３２】
本発明の一態様によれば、複数の所定の線に沿って配置されている光解離性保護基を露光するステップが、第１の露光時間の間、実行されて、前記複数の所定の線の間に配置された光解離性保護基を露光するステップが、第２の露光時間の間、実行される。第１の露光時間は、第２の露光時間と比較すると、異なっている。一般に、露光時間は、複数のリンカー分子の官能基から除去される光解離性保護基の量に関連づけられている。これが、捕獲分子などの他の分子の相補的官能基を付着させることができる官能基の総数を決定する。官能基に結合されている捕獲分子の数は、検出位置に向かって散乱される光の信号を決定する。したがって、第１の露光時間および第２の露光時間は、複数の所定の線に沿って配置された捕獲分子で散乱される光の、複数の所定の線の間に配置された捕獲分子と比べたときの相対的な貢献度を決定する。両者の貢献は弱めあうように干渉するので、これら２種類の露光時間を独立に変更することによって、検出される信号を調整し最小化することができる。
【００３３】
最大露光時間は、所定の線の間隔の半分より狭い幅の線に沿って光解離性保護基を分離するため１〜１０ジュール／ｃｍ２となるよう選択される最大露光エネルギー線量に対応する。好ましくは、第１の露光線量および第２の露光線量を２ジュール／ｃｍ２未満とすることで、約３９０ｎｍ波長の標準的なＬＥＤ光源使用時で６０秒未満、より好ましくは１〜１０秒、の露光時間となる。この露光線量は、高収率で副反応を最小化させた過渡的な生体共役反応合成のためのジアリールスルフィド  −ＮＰＰＯＣ骨格を備える光開裂可能なリンカー分子としての官能基から光解離性保護基を除去するのに適していることが確認されている。
【００３４】
さらに他の例として、D. Woll, S. Walbert, K.-P. Stengele, T. Albert, T. Richmond, J. Norton, M. Singer, R. Green, W. Pfleiderer, U.E. Steinerによる『溶液中およびマイクロアレイチップ上のオリゴヌクレオチドのトリプレット増感光脱保護（Triplet-sensitized photodeprotection of oligonucleotides in solution and on microarray chips）』（Helv. Chim. Acta 2004, 87(1), 28-45）に記載されているような光脱保護の増感が、照射時のトリプレット−トリプレットＦＲＥＴエネルギー伝達による所望の波長での光脱保護ステップを達成するために有用かもしれない。
【００３５】
有利な態様において、複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基を露光するステップは、以下のステップを含む。前記光解離性保護基を担持する平面導波路の外表面に近接させて位相マスクを配置する。位相マスクは、第１屈折率ｎ１を有する材料からなる複数の突起をもち、第１屈折率ｎ１は、該位相マスクと平面導波路の外表面との間に存在する媒質の第２屈折率ｎ２とは異なっている（それぞれ、リンカー分子の最外層レイヤー）。前記所定の波長の光を、前記複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基を露光するための位相マスクを通過させる。
【００３６】
そのような位相マスクは、ガラス基板と、好ましくはＴａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，Ｎｂ２Ｏ５，Ｓｉ３Ｎ４などの適切な高屈折率の物質からなる、複数の突起を含む。位相マスクは、たとえば、バイナリー型回折位相マスクである。その突起はそれぞれ、所定の深さおよび（隣接する突起との間の）所定の間隔を有し、位相マスクの突起を通って伝播する光は、位相マスクの突起の間の液状媒質を通って伝播する光に対して、π（すなわち波長の半分）の位相のずれが生ずるようになっている。位相マスクを通って伝播する光の界面は、突起の縁に沿って光の強度が最小となる干渉パターンを形成する。したがって、位相マスク背後の干渉パターンは、位相マスクにおける突起の位置に係る周期性に対し、二倍周期の明暗パターンとなる。突起の幅および形状は、位相マスクに沿って変化していてもよい。フォトリソグラフィー露光は、Suleski, et al.による、『コンピューター生成近接場ホログラフィーによる高空間周波数回折格子の作成（Fabrication of high-spatial-frequency gratings through computer-generated near-field holography）』（Optics Letters, vol. 24, No. 9, pp. 602-604, May 1, 1999）に詳細に記載されているようなホログラフィー法を含む。複数の所定の線を生成（もしくは配置）するために近接場ホログラフィーなどのホログラフィー法を使用することができるので、対象試料が結合可能で複数の所定の線に沿って配置される結合サイトを示す「モログラム（mologramm）」という用語を新たに考案した。一例として、複数の所定の線をモログラムＡ（Mologram A）と呼ぶことができ、複数の所定の線の線間に（in-between the lines of the plurality of predetermined lines）配置された線をモログラムＢ（Mologram B）と呼ぶことができる。有用な用途において、検出器に入射する光は、モログラムＡで回折させた光が、モログラムＢで回折した光に対し位相π（波長の半分）ずれている。さらに、Pasi Laakkonen et al.による『ブラッグ回折格子の近接プリンティング用のコーティングされた位相マスク（Coated phase mask for proximity printing of Bragg gratings）』（Optics Communications 192 (2001) 153-159, ELSEVIER）に詳述されているように、干渉パターンの質を高めるため位相マスクをコーティングすることもできる。光解離性保護基の露光を位相マスクに通すのに用いられる光は、たとえば、３９０ｎｍ波長である。官能基から除去する光解離性保護基によっては、他の波長を用いることが必要であるかもしれない。露光は、いずれにせよ、直接光化学付着（たとえば、ベンゾフェノン−またはアリールアジド−またはジアジリン−媒介光ラジカル挿入反応またはチオキサントンのようなラジカル開始剤による増感を利用したもの）に適したものとすることができると考えられる。原則的に、突起の寸法は、その波長に応じて選択されなければならない。
【００３７】
頭部基が導波路の外表面に付着する複数のリンカー分子は、集まって、外表面から外側に０．５ｎｍ〜１０ｎｍの厚みをもつ個別のレイヤーを形成するのが好ましい。第１層のレイヤーのリンカー分子の平均密度は、導波路の外表面にさらに接触しようとする分子が接触しないように選択される。このことは、導波路の外表面に接触させる試料における捕獲分子および他の分子の非特異的結合を防ぐためには重要である。
【００３８】
リンカー分子の第１層のレイヤーは、直接、平面導波路の外表面に付着する。第１層のレイヤーは、密度が高く高さが低いと有利である。理想的には、第１層のレイヤーは、他の分子が外表面に接触することができないように、外表面を覆う。
【００３９】
有利な態様として、頭部基が導波路の外表面に付着する複数のリンカー分子は、集まって、リンカー分子の単分子層を形成する。第１層のレイヤーが外表面に整然と配置され、導波路の外表面のリンカー分子で散乱する光の非常に小さく平坦なバックグラウンドを提供するとき、検出位置における回折光の信号の質は向上する。第１層のレイヤーを形成する複数のリンカー分子としては、自己組織化単分子層（self-assembled monolayer：ＳＡＭ）が選好される。ＳＡＭは、フォトリソグラフィー処理が行えるよう、光解離性保護基を担持していてもよい。  
【００４０】
一実施形態において、ＳＡＭは、１０〜１００％のアミノ基を官能基としてもつアルカン混合物からなるものであってもよく、これを、本発明による光変調に適した望ましいＳＡＭを生成するために、ＳＡＭの形成前またはＳＡＭの形成後に光保護基により修飾してもよい。  
【００４１】
他の実施形態において、ＳＡＭは、１０〜１００％のカルボキシル基を官能基としてもつアルカン混合物からなるものであってもよく、これを、本発明による光変調に適した望ましいＳＡＭを生成するために、ＳＡＭの形成前またはＳＡＭの形成後に光保護基により修飾してもよい。
【００４２】
本発明の他の態様において、頭部基が手前のレイヤーのリンカー分子の官能基に付着する複数のリンカー分子は、集まって、厚みが１０ｎｍ〜２００ｎｍの最上層の個別のレイヤーを形成する。面積当たりのリンカー分子の局所平均密度は、捕獲分子がそこを通って散乱するように、または、捕獲分子が部分的にその中に囲まれるように、低い値が選択される。最上層のレイヤーは、第１層のレイヤーの分子に比べて長いリンカー分子を含むとよい。最上層のレイヤーは、対象試料の中の分子がそこを通って横に散乱することができるよう空間密度が低いものでなければならない。これらのリンカー分子は、形状を適合させることができるようフレキシブルなものとすることができる。これらのリンカー分子は、有利な例としては、ゆるくまとまったマトリックス（デキストラン、カルボキシメチル化したデキストラン、カルボキシメチル化したヒアルロン酸、ヒアルロン酸、アルギン酸などの多糖類や、ポリ乳酸、ポリアクリル酸、あるいは、たとえばD. Kyprianu et alのTalanta 103. 2013, 260-266所収論文に記載されているような親水性３Ｄアクリレート重合体、またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、または一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどのポリマー）からなる。
【００４３】
ポリマーは、さらに修飾して、骨格を修飾したポリマー網目組織を生成することができるが、そこでの骨格修飾は、イオン基、脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド等からなるものとすることができる。
【００４４】
方法の他の態様において、複数の所定の線は、平面導波路の外表面における少なくとも２つの離れた回折スポットに配置されている。各回折スポットは、面積が２５（μｍ）２（（μｍ）２＝μｍ２）よりも大きい。複数の所定の線は、隣接する線間の距離が１．５μｍ未満、特に１μｍ未満である。これによって、回折スポットで散乱した光を検出するための回折スポットとして、検出に適した強度の信号を提供する最小サイズの回折スポットが提供される。複数の所定の線は、隣接する線間の最大距離が回折スポットで回折する光によって決まる。好ましくは、可視光を用いる。この距離は、隣接する線間の距離が平面導波路を通って伝播する光の波長の倍数となる所定波長のハーモニックスを含む。
【００４５】
本発明は、さらに、前記方法により用意された外表面を有する平面導波路を提供する。複数の所定の線が、外表面の少なくとも２つの離れた回折スポットに配置される。各回折スポットは、面積が２５μｍ２よりも大きい。複数の所定の線は、隣接する線間の距離が１．５μｍ未満、特に１μｍ未満である。好ましくは、平面導波路は、複数の回折スポット、すなわち、１平方センチメートル当たり、１００個、１００００個、１０００００個、・・・、最大で４×１０６個の回折スポットを備えている。方法に対して説明した優位点は、この平面導波路にも同様に備わっている。
【００４６】
一態様によれば、各複数の所定の線は、曲線であり、隣接する線の間の距離が、光カプラーで平面導波路に結合される光の伝播方向に向かって徐々に狭くなるように配置されている。隣接する線間の距離が狭くなるように曲線を配置することで、対象試料で散乱した光が所定の検出位置に集束（そして干渉）する（位相格子レンズに相当する）。代替的配置によれば、複数の所定の線は、直線であり、導波路に結合される光の伝播方向に対して角度をつけて配置されている。このように、複数の所定の線を光の伝播方向に対して角度をつけて配置する代替的配置は、所定方向の強めあう干渉の要件を満たす（ブラッグ回折に相当する）。複数の所定の線は、光を、平面導波路の平面内で回折させる。平面導波路内で回折した光は、他の光カプラー（位相格子レンズ）を通って平面導波路外部の検出位置に結合される。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、キットが、前記のような平面導波路と、該平面導波路の外表面を用意するための位相マスクとを提供する。位相マスクは、本明細書に記載しているようなリソグラフィー法の実行を可能にする。このようなキットは、さらに、前述のような方法により平面導波路の外表面を用意するために適した化学的、薬学的および／または生物学的試薬を含む。この試薬は、キットごとに異なったものであってよい。
【００４８】
本発明のさらなる有利な態様は、以下の、添付の概略図面を参照しての本発明の実施形態の説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】平面導波路のための一実施形態を、複数の所定の線およびフォトリソグラフィーマスクの一部を拡大して詳しく示す図とともに示す。
【図２】図１に例示したような平面導波路に２組の複数のリンカー分子を接触させた状態の断面を側面視して示す。
【図３】図２の平面導波路において、他の複数のリンカー分子の組に属するリンカー分子が結合していない官能基を不活性化するステップを説明する図を示す。
【図４】図３の平面導波路において、複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基を露光するステップを説明する図を示す。
【図５】図４の平面導波路において、複数の捕獲分子を接触させるステップを説明する図を示す。
【図６】図５の平面導波路において、捕獲分子が結合していない官能基を不活性化するステップを説明する図を示す。
【図７】図６の平面導波路において、複数の所定の線の間に配置された光解離性保護基を露光するステップを説明する図を示す。
【図８】図７の平面導波路において、複数の修飾された捕獲分子を接触させるステップを説明する図を示す。
【図９】図８の平面導波路において、修飾された捕獲分子が結合されていない官能基を不活性化するステップを説明する図を示す。
【図１０】図９の平面導波路において、複数の対象試料を接触させるステップを説明する図を示す。
【図１１】図１に例示した平面導波路におけるリンカー分子が他の実施形態により配置されたものにおいて、光解離性保護基を有するリンカー分子のレイヤーを１層接触させるステップを説明する側面図を示す。
【図１２】図１１の平面導波路において、複数の所定の線に沿って配置された光解離性保護基を露光するステップを説明する図を示す。
【図１３】図１２の平面導波路において、官能基を介して捕獲分子に部分的に結合され、前記複数の所定の線に沿って配置される他の複数のリンカー分子を接触させるステップを説明する図を示す。
【図１４】図１３の平面導波路において、前記複数の線の間に配置された光解離性保護基を露光するステップを説明する図を示す。
【図１５】図１４の平面導波路において、修飾された捕獲分子に官能基を介して部分的に結合され、前記複数の所定の線に沿って配置される他の複数のリンカー分子を接触させるステップを説明する図を示す。
【図１６】図１５の平面導波路において、他のリンカー分子が結合していない第１のレイヤーのリンカー分子の残りの官能基および捕獲分子が結合していない第２のレイヤーのリンカー分子の残りの官能基を不活性化し、修飾された捕獲分子が結合していない第２のレイヤーのリンカー分子の残りの官能基を不活性化するステップを説明する図を示す。
【図１７】本発明の他の実施例により分子リンカーが配置された平面導波路の代替分子リンカーおよび代替捕獲分子を説明する側面図を示す。
【図１８】単一の回折スポットに複数の所定の線が３組、各組が回折光を異なる検出位置に集束させるように配置されている本発明の他の態様を示す。
【図１９】図１８の平面導波路において、該平面導波路の外表面上の回折スポット全体に複数のリンカー分子を、一番上の組が光解離性保護基を持つように２組接触させたようすを示す。
【図２０】図１９の平面導波路において、複数の所定の線の第１の組に沿って配置された光解離性保護基を部分的に露光するステップを説明する図を示す。
【図２１】図２０の平面導波路において、続けて、３組の部分的に露光された複数の所定の線に配置されるよう３種類の一本鎖ＤＮＡを接触させたようすを示す。
【図２２】図２１の平面導波路において、異なる３組の複数の所定の線に異なる３タイプの捕獲分子が配置されたようすを示す。
【図２３】単一の回折スポットに複数の所定の線が２組、各組が回折光をそれぞれ個別の検出位置に集束させるように配置されている本発明の他の態様を示す。
【図２４】前記した例と比べて異なる種類の異なる２つのタイプの捕獲分子を図２３の複数の所定の線の異なる２つの組に配置した平面導波路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
図１に、本発明によりリンカー分子を配置することができる外表面１１を有する平面導波路１の一例の斜視図を示す。構造上、平面導波路１は、図示せぬ基板上に配置されていて、外表面１１に配置された２５の離れた回折スポット４１を有する。複数の所定の線４（図示されている線はそれぞれ多数の線を代表している）が、この各回折スポット４１の中に配置されている。図示されている例における線４は曲線であるが、他の実施例では直線とすることもあり得る。この例の線４は、検出信号を改善するために、隣接する線４の間の間隔が左から右へ（光が平面導波路を通って伝播する方向に）向かうにつれて狭くなるようになっている。代替的に、線４は等間隔に配置されていてもよいし、異なる組の複数の所定の線４が前記回折スポット４１内に配置されていてもよい。さらに、平面導波路１のそれぞれ内部および外部にコヒーレント光を結合するために、平面導波路１に光カプラー１２および別の光カプラー１３が配置されている。両者とも、ガラスまたはポリマー材料でつくられた基板の表面に形成することができる。別の光カプラー１３は、代替的もしくは追加的に光吸収手段であってもよい。図示されている平面導波路１を含む結合イベント検出装置の実施原理にしたがって、コヒーレント光が、外表面１１にエバネッセント場を伴って伝播するように、光カプラー１２を通って平面導波路１内に結合される。コヒーレント光のエバネッセント場は、外表面１１上に複数の所定の線４に沿って配置された分子（リンカー分子、捕獲分子、対象試料等）で散乱し、散乱したコヒーレント光が図示せぬ所定の検出位置で強めあうように干渉するようになっている。
【００５１】
図示されている円は、黒線４２を備え、白線４３を間に備え、前記したようなスポット４１に配置された複数の所定の線４のいくつかの組を誇張して示すものである。黒線４２に沿って、リンカー分子の官能基に捕獲分子が配置される。捕獲分子は、対象試料（この図面では分子は、装置のサイズに比べてサイズが小さいので図示していない）を結合可能である。白線４３は、捕獲分子が結合可能な対象試料を結合できない修飾された捕獲分子を含む。平面導波路１内部へ結合されたコヒーレント光のエバネッセント場は、図の黒線４２および白線４３に配置された分子で散乱する。黒線４２に配置された分子によって散乱する光は、図示せぬ検出位置に対し第１の光路長を有し、そこで最大強度まで強めあう干渉が起こるようになっている。黒線４２の間の複数の白線４３に配置された分子で散乱するコヒーレント光は、検出位置に対し第２の光路長を有し、そこで最大強度まで強めあう干渉が起こるようになっている。両最大値は、互いにπの位相のずれがあり、全体強度としては最小強度まで弱めあう干渉となるようになっている。これによって、捕獲分子に結合された対象試料以外の散乱光からのバックグラウンド信号を最小化することができる。最小信号は、捕獲分子および修飾された捕獲分子が結合可能な各官能基を脱保護するための露光時間を変えることで調整することができる。理論的には、対象試料を接触させる前に、黒線４２に配置された捕獲分子および白線４３に配置された修飾された捕獲分子が生ずる、単一の検出位置で散乱する光のバックグラウンド信号は、全体としてゼロである。
【００５２】
誇張された図を示す円の上に、複数の所定の線４に沿って配置された光解離性保護基のフォトリソグラフィー露光を説明するため、位相マスク９の一部を示してある。位相マスク９は、ガラス基板９２と、Ｔａ２Ｏ５、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５、Ｓｉ３Ｎ４など屈折率の高い物質で作られている複数の突起９１とを含んでいる。突起９１の厚み（深さ）は、所定の位相のずれを生ずるように、突起９１（たとえば、Ｔａ２Ｏ５）の材料の第１の屈折率ｎ１に対応するように、そして、位相マスク９と平面導波路１の外表面１１との間に存在する媒質の第２の屈折率ｎ２に対応するように選択される。Ｔａ２Ｏ５の第１の屈折率ｎ１は、３９０ｎｍの波長で、ｎ１＝２．２４６である。使用時、位相マスク９は、近接場露光により複数の所定の線４に沿って配置される光解離性保護基を露光するために、突起９１を外表面１１に近接させて、配置されている。これらの光解離性保護基（同程度にサイズが小さいため不図示）を備えたリンカー分子は、外表面１１と位相マスク９との間の隙間を埋めるため、たとえば、５％の水を含むＤＭＳＯの溶液内で、外表面１１に接触させる。ＤＭＳＯ溶液の第２の屈折率ｎ２は、以下のように推定することができる。ＤＭＳＯは、５９０ｎｍの波長でｎ２＝１．４７７の屈折率を有する。３９０ｎｍの波長に対して計算で求めた屈折率は、Kozmaによる論文J. Opt. Soc. Am. B, 22(7), p 1479 (2005) に詳述されているように、ｎ２＝１．５０である。３９０ｎｍに対する５％の水を含むＤＭＳＯの概算屈折率は、Le Bel and Goringによる論文J. Chem. Eng. DATA 7(1), p 100 (1962) に詳述されているように、ｎ２＝１．４９４である。ある実施例によれば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を、分子リンカーおよび光解離性保護基を接触させるための溶液として使用することができる。位相マスク９は、突起９１を通って伝播する光の、位相マスク９と外表面１１との間の媒質を通って伝播する光に対する位相をずらす。干渉は、位相マスク９のパターンに対して周波数二倍化明暗パターンを作出する。突起９１の高さは、Ｔａ２Ｏ５の場合、ｄ＝２５９ｎｍ（ｄ＝λ／２（ｎＴａ２Ｏ５−ｎＤＭＳＯ））となるように選択される。突起９１の幅は、スポット４１の中で、たとえば平面導波路１を通る光の伝播方向に沿って、変化するものとすることができる。突起９１の幅は、好ましくは、平面導波路１の外表面１１における所定の線４，４２，４３の距離に等しいか最も近くなるよう選択される。光解離性保護基のフォトリソグラフィー露光は、位相マスク９をそれに近接配置し、黒線４２に沿って配置されている光解離性保護基を位相マスク９を通過した光で露光することによって実行される。位相マスク９を介した露光は、第１露光時間の間実行される。複数の黒線４２の間の白線４２に沿って配置された光解離性保護基の第２の露光は、位相マスク９なしで実行される。
【００５３】
黒線４２の上に図示されている実線グラフ６１および白線４３の下の点線グラフ６２は、位相マスク９を通過する光の近接場における光強度グラフ（あるいは干渉パターン）を表している。両グラフは、さらに、リンカー分子のそれぞれ露光された官能基に結合された、捕獲分子の、または脱保護された官能基（黒線４２）および修飾された捕獲分子（白線４３）の、局所平均密度を表すと解釈することができる。さらに前記した理想的な場合において、黒線４２上に配置された捕獲分子で散乱する光および黒線４２の間で白線４３に沿って配置されている修飾された捕獲分子は、検出位置において、バックグラウンド信号を最小化（理想的にはゼロに）することに寄与する。このことは、理論的には、捕獲分子および修飾された捕獲分子の局所平均密度が一致することにより達成される。黒線４２と白線４３との間のシャープな縁は、黒線と白線との間の正弦遷移に近似する（方式上の制約から、そのような濃淡は図示してはいないが、より現実的であろう）。原理的に、捕獲分子の局所密度は、位相マスク９を通した近接場露光の正弦強度特性によってもたらされる。
【００５４】
方法の第１実施形態および第２実施形態を以下に示す。ともに、本発明を実施することを可能にするものである。両実施形態は、図１に例示したような平面導波路を用いるものである。これらの実施形態において、フォトリソグラフィーのステップは、同様のやり方ではあるが、異なるステップで実施される。実際に、光解離性保護基の露光は、フォトリソグラフィックマスクを用いて一度だけ実行される。フォトリソグラフィックマスクの再アラインメントは、困難かつ非現実的なので、第２の露光は、マスクなしで実行される残った光解離性保護基の露光である。
【００５５】
以下の図２〜図１０において、本発明による方法の第１実施形態を説明する。
【００５６】
図２は、平面導波路１の外表面１１上に２層の別体の個別レイヤーを集成させるために、複数のリンカー分子２を接触させ、続けて他の複数のリンカー分子５を接触させることを示している。前記複数のリンカー分子２に属するリンカー分子２は、外表面１１に直接集合して自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を形成する。これらのリンカー分子２は、外表面１１に付着するための頭部基２１（たとえば、−（ＰＯ３）２−、−（Ｏ−ＰＯ３）２−、トリアルコキシシランまたはポリ（Ｌ−リシン）および他の分子の相補的官能基を付着することができる官能基２２を有している。遷移金属酸化物、たとえば、Ｔａ２Ｏ５、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５などの上に自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を形成するために好適なリンカー分子２としては、たとえば、ＮＨ２末端自己組織化分子アミノ−ドデシル−ホスホン酸（ＮＨ２−（ＣＨ２）１２−（ＰＯ３）Ｈ２）、ＣＯＯＨ末端自己組織化分子カルボキシ−ペンタデシル−ホスホン酸（ＣＯＯＨ−（ＣＨ２）１５−（ＰＯ４）Ｈ２）、または、ＯＨ末端自己組織化分子ヒドロキシ−ドデシル−ホスホン酸アンモニウム塩（ＯＨ−（ＣＨ２）１２−（ＰＯ４）（ＮＨ４）２）などがある。（Samue1e Guido Pio Tosatti:による論文『生物医学用途の官能性を持たせたチタン表面：物理化学的キャラクタリゼーションおよび生物学的インヴィトロ評価（FUNCTIONALIZED TITANIUM SURFACES FOR BIOMEDICAL ApPLICATIONS: PHYSICO-CHEMICA CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL IN VITRO EVALUATION）』（DISS. ETH NO. 15095）参照）。官能基２２としては、通常の官能基、有機物もしくはペプチドの金属キレート吸着剤、単鎖ＤＮＡ、タンパク質受容体またはその配位子を挙げることができる。他の分子は、特定の種類の分子に限定されないが、ここに示した例では、相補的官能基（頭部基）５１（たとえば、続けて接触させる複数のリンカー分子５に属するリンカー分子５のカルボキシのような通常の官能基）で官能性を持たせたゆるやかにまとまったマトリックス（たとえば、デキストランやポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））である。また、続けて接触させる複数のリンカー分子５に属するリンカー分子５は、先だって接触させた層の官能基２２に付着することができる頭部基を含む。官能基５２は、他の分子の相補的官能基を付着可能である。官能基５２は、ここに示した例では、光解離性保護基３によって保護されている。光解離性保護基３は、他の分子、たとえば捕獲分子、の相補的官能基が結合できないように官能基５２を保護する。したがって、官能基５２は、アミノ−、メルカプト−、ヒドロキシル、カルボン酸基のような、光解離性保護基による保護を受けることができる官能基に限定される。  
【００５７】
図３において、他の複数のリンカー分子５の頭部基５１が結合していない複数のリンカー分子２の官能基２２が、たとえば、相補的官能基を備える他の分子と反応または相互作用することができる官能基を有していない他の分子と反応することによって、不活性化されている。不活性化された官能基２２１は、さらなる結合が不可能である。  
【００５８】
図４において、複数の所定の線４に沿って配置された他の複数のリンカー分子５の官能基５２に結合された光解離性保護基３が露光され、官能基５２から除去されている。したがって、複数の所定の線４に沿って配置された官能基５２は、捕獲分子のような他の分子の相補的官能基を付着することができる。そして、複数の所定の線４の間に配置された官能基５２は光解離性保護基３を持っている。露光は、位相マスクにより、図１について説明したように、フォトリソグラフィー法で実施することができる。示されている一本の線４は、光解離性保護基３がそれらに沿って露光されるところの複数の所定の線４のうちの一本の線を例示するものである。  
【００５９】
理論的には、方法のこの状態は、結合イベントの検出に使用可能な平面導波路を提供する。たとえば、接触させる対象試料が、前記複数の所定の線に沿って配置された複数のリンカー分子の官能基に直接結合する場合に。  
【００６０】
図５においては、複数の捕獲分子６を、複数の所定の線４に沿って配置された官能基５２に接触させている。一般に、そのような捕獲分子６は、分子リンカー５の官能基５２および（図１０に示した）調査対象試料内の対象分子に同時に結合することが可能な分子である。図示した捕獲分子６は、試料中の対象分子を結合するための２つの結合サイトを備えたタンパク質を表している。リンカー分子５は、リンカー分子間に隙間を残してゆるやかにまとまっていてもよく、その隙間は捕獲分子６で満たすことができる。この場合、捕獲分子６は、ゆるやかにまとまった複数のリンカー分子５内に埋め込まれるのが好ましい。そのような複数のゆるやかにまとまったリンカー分子５は、捕獲分子６および接触させる試料内の分子と非特異的相互作用が生じないあるいは最小化されたゆるやかにまとまったマトリックス（たとえば、デキストランやポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリマー）からなる。  
【００６１】
各リンカー分子５は、そのリンカー分子５に沿って配置した複数の（すなわち２つ以上の）官能基５２を持つものであってもよい。本発明による方法の第１実施形態のこの実施例において、リンカー分子５に沿って配置されたすべての官能基５２は、第１の露光により官能基から保護基を除去する以前には光解離性保護基により保護されている。
【００６２】
図６において、捕獲分子６が結合していない他の複数のリンカー分子５の官能基５２は不活性化されている。不活性化された官能基５２１は、さらに結合することはできない。
【００６３】
このことによって、結合イベントの検出に使用することができる平面導波路が提供される。対象試料は、所定の検出位置において最大の干渉が生じるようにコヒーレント光を散乱させるための複数の所定の線に沿って配置された捕獲分子により提供される結合サイトに結合可能である。しかし、実際には、捕獲分子のみある（すなわち捕獲分子に対象試料が結合されていない）ところで散乱する光によって、同等に強いバックグラウンド信号が、検出位置の信号に影響を与えている。検出信号に対するバックグラウンド信号を減少させる可能性について、以下に示す。
【００６４】
図７において、複数の所定の線４の間に配置されている他の複数のリンカー分子５の官能基５２から、露光によって、光解離性保護基が除去される。この第２の露光は、（第１の露光が位相マスクを通して実行されるのに対し）フォトリソグラフィーマスクを必要としないが、その理由は、第１の露光で形成された、複数の所定の線４の間に形成された複数の所定の線に沿って、適切に、残った光解離性保護基が配置されているからである。
【００６５】
図８において、複数の修飾された捕獲分子７を複数の所定の線４の間に配置された他の複数のリンカー分子５の官能基５２に接触させている。修飾された捕獲分子７は、本実施例では、突然変異させたタンパク質である。一般に、修飾された捕獲分子７は、構造的には、捕獲分子６と類似しており、捕獲分子６が結合可能な図示せぬ試料内の対象分子を結合することができないように、突然変異により、または、化学的に、修飾がなされている。換言すれば、修飾された捕獲分子７は、対象試料を結合することのできる結合サイトを持たず、捕獲分子６と比べて同様にコヒーレント光を散乱させる。
【００６６】
図９において、修飾された捕獲分子７が結合していない複数のリンカー分子５の官能基５２は不活性化されている。不活性化された官能基５２は、さらに結合することができない。
【００６７】
その結果、結合イベントの検出に用いることができる平面導波路が得られる。このような平面導波路の優位点は、上述のように、捕獲分子から、そして修飾された捕獲分子から、の散乱光の効果で弱めあう干渉が生じ信号が最小化することである。最小信号は、検出位置におけるバックグラウンド信号が最小化するように、露光時間を変更すること、および、その結果として脱保護された官能基に付着する捕獲分子または修飾された捕獲分子の数を変更することにより調整される、という利点がある。
【００６８】
図１０は、試料内の複数の対象分子８を、複数の所定の線４に沿って配置された捕獲分子６へ接触させている状態を示している。図からわかるように、それらの対象試料８は、捕獲分子６にのみ結合する。修飾された捕獲分子７は、対象試料８を結合することができない。したがって、図示せぬ検出位置における光は、修飾された捕獲分子７で散乱する光に対する捕獲分子６で散乱する光の貢献度を調整することによって最小化されている。対象試料８を接触させた後、検出位置における検出光の変化は、対象試料８の捕獲分子６への実際の結合によって起こるようになる、という利点がある。
【００６９】
結合イベントの検出は、コヒーレント光が（図１の黒線４２に対応する）複数の所定の線４に沿って配置された捕獲分子６によって散乱させられるだけでなく、（図１の白線４３に対応する）修飾された捕獲分子７によっても散乱させられるという点で有利である。捕獲分子６と修飾された捕獲分子７の間の間隔は、コヒーレント光の波長の半分（または、波長の倍数プラス半波長）となるよう選択されているので、散乱した光は、理論的には、検出位置において干渉して最小化する。実際には、検出位置における捕獲分子６および修飾された捕獲分子７からの寄与が干渉してゼロ光となることはなく、いくらかバックグラウンド光が存在することになるだろう。対象試料の結合は、最小バックグラウンド信号に対して比較的大きな前記最小信号への変化をもたらすだろう。  
【００７０】
次の図１１〜図１６において、本発明による方法を実施する他のやり方を説明するため、第２実施形態を説明する。  
【００７１】
図１１において、複数のリンカー分子２を、平面導波路１の外表面１１に頭部基２１で付着するように接触させている。複数のリンカー分子２は光解離性保護基３により保護された官能基（覆われているので図には示されていない）を有する。第２実施形態は、光解離性保護基３をもつ複数のリンカー分子２を１組だけ（ＳＡＭのみを）、第１のステップで、接触させるという点で、第１実施形態と異なる。
【００７２】
図１２において、複数の所定の線４に沿って配置された光解離性保護基３が露光されて除去されている。複数の所定の線４に沿った露光は、フォトリソグラフィー法により実施される。したがって、リンカー分子２の脱保護された官能基２２は、複数の所定の線４に沿って配置される。
【００７３】
図１３において、リンカー分子５の官能基５２に結合された複数の捕獲分子６を、複数の所定の線４に沿って一緒に（互いに付着しあうように）接触させている。捕獲分子６の相補的官能基は、リンカー分子５の官能基５２に付着され、ともに官能基２２に頭部基５１を介して付着されている。このことにより、好ましい例においては、捕獲分子６を前記リンカー分子５内に部分的に囲う（たとえば、リンカー分子５が、ゆるやかにまとまったマトリックス（たとえば、デキストランやポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリマー）を形成する）ことができるとともに、図示せぬ対象試料を捕獲分子６により提供される結合サイトに結合させることができる。
【００７４】
図１４において、複数の所定の線４の間に配置された光解離性保護基は、所定の波長の光で露光される（フォトリソグラフィックマスクを用いない第２の露光）。脱保護された官能基２２は、修飾された捕獲分子のような他の分子の相補的官能基を付着させることができる。第２実施形態では、第１実施形態について説明したのと同様に（図７参照）、バックグラウンド信号の最小化を達成することができる。
【００７５】
図１５において、リンカー分子５の官能基５２に付着（結合）した複数の修飾された捕獲分子７を、（図１３と同様に）複数の所定の線４の間に配置された官能基２２に接触させている。
【００７６】
図１６において、修飾された捕獲分子が結合していない官能基５２１およびリンカー分子の頭部基が結合していない官能基２２１が不活性化されている。これにより、図１０で説明したように使用されるべく準備された平面導波路が得られる。
【００７７】
図１７に、代替頭部基５１１と代替官能基５２２を有する代替分子リンカーを使用する本発明の他の実施例を示す。膜状上部構造（たとえば、ベシクルやリポソーム）６１と修飾された膜状上部構造（たとえば、修飾されたベシクルやリポソーム）７１とが代替官能基５２２に配置されている。組み込みまたは再構成がなされた膜輸送タンパク質６１１（輸送体またはチャネル）を有する膜状上部構造６１は、捕獲性の捕獲分子を表している。組み込みまたは再構成がなされた修飾された膜輸送タンパク質７１１（修飾された輸送体または修飾されたチャネル）を有する修飾された膜状上部構造７１は、修飾された捕獲性の捕獲分子を表している。図１０および図１７に対応して、膜状上部構造６１および修飾された膜状上部構造７１は、複数の所定の線４に沿って、および、複数の所定の線４の間に、それぞれ配置されている。対象試料８１は、捕獲性捕獲分子に捕獲される（膜状上部構造の内側に捕獲される）ことが可能である。このように、捕獲分子という用語は、対象試料が結合可能な個別の結合サイトを複数提供するものと考えることができるだけではなく、そうではなくむしろ、膜輸送タンパク質で対象試料を捕獲するのに適している。これにより、対象試料８１をまとめて検出するために一定時間の間捕獲された対象試料８１１を蓄積するための方法が得られる。
【００７８】
図１８に、本発明の他の態様を図示する。３組の複数の所定の線４０１，４０２，４０３は、平面導波路上の一つの回折スポット４１に配置されている。各組は、光カプラー１２で平面導波路内部に結合された光が複数の所定の線の各組４０１，４０２，４０３で回折し、それぞれ別個の検出位置４２１，４２２，４２３で強めあうように干渉するように配置されている。このように３組の複数の所定の線４０１，４０２，４０３を配置する構成は、一例とみなされるべきであり、他の数の組の複数の所定の線４０１，４０２，４０３を配置することもできる。示されている線の形状についても同様で、本実施例では、光カプラー１２で結合された光が１本の線に沿って配置された３つの異なる検出位置４２１，４２２，４２３で強めあうように干渉するような形状が選択されている。複数の検出位置を備える回折スポット４１は、複数の焦点を有するモログラム（mologram）として示され（を表し）ている。
【００７９】
次に、（３つの）異なる種類の捕獲分子をそれぞれ異なる（３つの）組の複数の所定の線上に接触させる方法について説明する。この配置は、プロセスカスケードが検出可能なので有利である。たとえば、対象試料は、第１の検出位置において信号が得られるように、第１の種類の捕獲分子で別個の生成物に分割される。そして、この反応の第１の生成物は、第２の検出位置において信号が得られるように、第２の種類の捕獲分子に結合する。反応の第２の生成物は、第３の検出位置において信号が得られるように、第３の種類の捕獲分子に結合する。異なる種類の捕獲分子を複数の所定の線の異なる所定の組に付着させることが、たとえば、後述するような単鎖ＤＮＡの使用（直交化学反応）によって、達成可能である。代替的に、露光と光解離性保護基の除去に異なる波長を使用する直交光化学を実行して、回折スポット内の複数の所定の線の所定の組への所定の種類の捕獲分子のみの配置を実現することもできる。  
【００８０】
図１９は、２組の複数のリンカー分子２，５を接触させている外表面１１を有する平面導波路１である。最上層の組に属する複数のリンカー分子５が光解離性保護基３を持っている（図３と同様）。  
【００８１】
図２０に、第１の組に属する複数の所定の線４０１に沿って配置された光解離性保護基３を部分的に露光するステップを示す。「部分的（に）露光（する）」とは、その線４０１に沿っている光解離性保護基３の内のいくつかだけを除去することである。その数は、複数の第１の捕獲分子に結合する対象試料に対応する回折光の検出可能な信号が充分得られる数である。その数は、他の複数の所定の線（４０２，４０３）に沿ってさらなる（部分的な）露光を実行して、同じ回折スポット内の他の線（４０２，４０３）に沿った他の複数の光解離性保護基を除去することができる程度に少なくなくてはならない。それらの線（４０１，４０２，４０３）は交わっていることが可能であり、換言すれば、いくつかの線を互いに重ねて形成することができる。図１８を参照すると、線（４０１，４０２，４０３）の交差が、異なる検出位置（４２１，４２２，４２３）における信号に貢献している。図２０は、複数の焦点をもつモログラムの可能な分子構造を示している。
【００８２】
図２１に、３組の複数の所定の線に配置すべく、図２０に説明した部分的露光を繰り返すことで続けて接触させる３種類の単鎖ＤＮＡ６２１（タイプＩ）、６２２（タイプＩＩ）、６２３（タイプＩＩＩ）を示す。異なる組の複数の所定の線は、異なる焦点（離れた検出位置）の光を回折させる。
【００８３】
単鎖ＤＮＡは、所定の種類の捕獲分子のみを所定の組の複数の所定の線に配置するために、異なる捕獲分子６，７２，７３が異なる相補的単鎖ＤＮＡ６３１，６２２，６２３に選択的に結合されるような直交化学反応の実行を可能にする。図２２に示した配置は、それぞれの検出位置（４２１，４２２，４２３）において薬学的、生物学的ないし化学的反応を個別に検出することを可能にする。
【００８４】
図２３に、本発明の他の態様を示す。２組の複数の所定の線４０２，４０３が（図１８と同様の）平面導波路上の一つの回折スポット４１内に配置されている。各組の配置は、光カプラー１２で平面導波路内に結合された光が、各組の複数の所定の線４０２，４０３で回折して、離れた個々の検出位置４２２，４２３で強めあうように干渉するよう構成されている。
【００８５】
図２４は、図２３の平面導波路１であって、２組の複数の所定の線４０２，４０３に属する線が交差している、外表面１１の領域を示している。異なる捕獲分子（この例では、対象試料として接触させるタンパク質の少なくとも２つの結合サイトの内の一つへの結合が可能な分子）７５，７６が、直交化学反応により実現可能な異なる複数の所定の線（図２３の４０２，４０３参照）に配置されている。上述のように、直交化学反応は、同じ回折スポット（図２３、４１参照）内の異なる組の複数の所定の線に配置されるように異なる種類の捕獲分子７５，７６を固定化するために、たとえば、異なる単鎖ＤＮＡ６２１，６２２と、対応する相補的単鎖ＤＮＡ６３１，６３２とを用いている。代替方案としては、光解離性保護基の露光用に異なる波長を用いる直交光化学反応がある。両捕獲分子７５，７６に結合可能なタンパク質である対象試料８１は、多重結合反応を通じて協同的結合を形成することができる。このような多重結合反応は、対象試料８１の捕獲分子７５への結合、および、対象試料８１の捕獲分子７６への結合が両方あわさった結合力があるため、高い強度をもつ。両方の結合は、同時に、あるいは短時間内に即時に、形成が可能である。多重結合反応は、両方の検出位置を通じて光学的に検出されるので、２つの検出位置において相関する信号を生じる。これは、時間分解検出法を用いて達成することが可能であるという利点がある。
【図１】
0006358476.tif 000002
【図２】
0006358476.tif 000003
【図３】
0006358476.tif 000004
【図４】
0006358476.tif 000005
【図５】
0006358476.tif 000006
【図６】
0006358476.tif 000007
【図７】
0006358476.tif 000008
【図８】
0006358476.tif 000009
【図９】
0006358476.tif 000010
【図１０】
0006358476.tif 000011
【図１１】
0006358476.tif 000012
【図１２】
0006358476.tif 000013
【図１３】
0006358476.tif 000014
【図１４】
0006358476.tif 000015
【図１５】
0006358476.tif 000016
【図１６】
0006358476.tif 000017
【図１７】
0006358476.tif 000018
【図１８】
0006358476.tif 000019
【図１９】
0006358476.tif 000020
【図２０】
0006358476.tif 000021
【図２１】
0006358476.tif 000022
【図２２】
0006358476.tif 000023
【図２３】
0006358476.tif 000024
【図２４】
0006358476.tif 000025