(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の定常領域にシステイン残基を導入することによって人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ前記Ｔ細胞受容体のＴｍ値は≧４５℃であること、
ここで、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＲ５３ＣおよびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳ５４Ｃ、あるいは
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＹ１０ＣおよびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＥ２０Ｃ、
に置き換えられたこと
を特徴とする受容体。
【請求項２】
前記ＴＣＲは（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、および（ｉｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）はいずれもＴＣＲ鎖の機能性可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記ＴＣＲは可溶性のものであることを特徴とする請求項１または２に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲに天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しないことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲでは、天然ＴＣＲのＣ末端を短く切断することによって前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去したことを特徴とする請求項４に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記ＴＣＲでは、前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられたことを特徴とする請求項４に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記ＴＣＲのβ鎖の定常領域に未対合のシステイン残基は存在しないことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記ＴＣＲのβ鎖の定常領域では、未対合のシステイン残基はセリンまたはアラニンに置き換えられたことを特徴とする請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ末端またはＮ末端に抱合体が結合していることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ＴＣＲと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ＴＣＲと結合している治療剤は、前記ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のＣ末端またはＮ末端に連結した抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする請求項１０に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含むか、或いは染色体に外来の請求項１２に記載の核酸分子が組み込まれていることを特徴とする宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲを提示することを特徴とする分離された細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれかに記載のＴ細胞受容体を製造する方法であって、
（ｉ）請求項１４に記載の宿主細胞を培養し、請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖を発現する工程と、
（ｉｉ）前記の鎖および／または鎖を分離または精製する工程と、
（ｉｉｉ）前記の鎖および／または鎖をリフォールディングさせ、前記ＴＣＲを得る工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
一つまたは複数の請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲを含むことを特徴とするＴ細胞受容体複合体。
【請求項１８】
腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する試薬の製造に使用されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲの使用。
【請求項１９】
薬学的に許容される担体と安全有効量の請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＣＲ、請求項１５に記載の細胞または請求項１７に記載のＴ細胞受容体複合体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に属し、具体的に、高安定性の可溶性T細胞受容体およびその製法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
2種類だけの分子が特異的に抗原を認識することができる。その一つはイムノグロブリンまたは抗体で、もう一つはT細胞受容体（TCR）で、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖のヘテロ二量体の形態で細胞膜の表面に存在する糖タンパク質である。免疫系のTCR全配列の構成は、胸腺でV(D)J再構成を経てから、陽性と陰性の選択によって生成するものである。外周の環境において、TCRはT細胞の主要組織適合遺伝子複合体-ペプチド複合体（pMHC）に対する特異的認識を仲介するため、免疫系の細胞性免疫にとって非常に重要である。
【０００３】
TCRは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に提示された特異的抗原ペプチドの唯一の受容体で、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは細胞の異常発生の唯一の兆候であることがある。免疫系において、抗原特異的TCRとpMHC複合体の結合によってT細胞と抗原提示細胞（APC）が直接物理的に接触し、さらにT細胞およびAPCの両者のほかの細胞膜の表面の分子が互いに作用し、これによって一連の後続の細胞シグナル伝達やほかの生理反応が生じることで、異なる抗原に特異的なT細胞はその標的細胞に対して免疫反応を果たす。
【０００４】
T細胞の膜では、TCRはシグナル伝達に関与する定常タンパク質CD3と結合して複合体になる。TCRは様々な形態で存在し、かつ構造が似ているが、これらのTCRを発現するT細胞は異なる解剖学的部位に存在し、かつ異なる機能を有する。TCRの細胞外部分は、膜近位の2つの定常ドメインと膜遠位の2つの可変ドメインからなり、前記可変ドメインは抗体の相補性決定領域（CDRs）と類似の多型ループを有する。T細胞受容体分子の結合部位を形成し、かつペプチドの特異性を決定するのは、これらのループである。TCRに相応するMHCクラスIおよびクラスII分子のリガンドも、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原の提示に特異性を有し、様々な異なる短鎖ペプチド断片をAPC細胞の表面に提示できるように、多型のペプチド結合部位を持つ。
【０００５】
免疫グロブリン（抗体）が抗原認識分子とされるように、TCRも診断および治療のための開発が可能である。可溶性TCRは幅広い用途を有し、TCR-pMHCの相互作用の研究だけでなく、感染を検出する診断ツールまたは自己免疫疾患のマーカーとしても有用である。同様に、可溶性TCRは治療剤（たとえば細胞毒性化合物または免疫刺激化合物）の特異的抗原を提示する細胞への送達、あるいはT細胞（たとえば自己免疫性ペプチド抗原と反応するT細胞）に対する抑制に使用することができる。また、可溶性TCRはほかの分子（たとえば抗CD3抗体）と結合して改めてT細胞に標的を向けることによって、特定の抗原を提示する細胞を標的とすることもできる。大腸菌における可溶性TCRの発現では、TCRが膜と分離すると、その不安定性および低いタンパク質収量が治療剤または診断試薬の開発へのTCRまたはその断片の使用の主な障害になる。
【０００６】
天然に存在するTCRは膜タンパク質で、その膜貫通領域によって安定しているため、細菌で発現される可溶性TCRにとって、その元のリガンド（すなわちpMHC）との特異性結合能を維持する高安定性TCRを得ることは、特許文献WO99/18129に記載されたように、非常に困難である。一部の文献では、細胞外領域だけまたは細胞外および細胞質領域だけを含む、短縮された形態のTCRが記載されているが、このようなTCRは、TCR特異的抗体によって認識されるが、収率が低く、かつ低濃度の場合、主要組織適合遺伝子複合体-ペプチド複合体を認識することができないことから、変性しやすく、安定性が不十分であることがわかる。
【０００７】
Reiterらは免疫学（Immunity），1995,2:281-287でジスルフィド結合によって安定したTCRαとβ可変ドメインの可溶性分子の構築を記述したが、その一つの可変ドメインは短縮された形態の緑膿菌外毒素（PE38）と連結している。TCRの可変ドメインにおける新しいジスルフィド結合の位置は抗体の可変ドメインとの相同性によって同定される（Brinkmannら（1993），米国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）90:7538-7542,およびReiterら（1994）生物化学（Biochemistry）33:5451-5459を参照）。TCRの各鎖の定常ドメインの非システイン残基をシステインに突然変異させて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することによってTCRの安定性を向上させることができるが、抗体の定常ドメインとTCRの定常ドメインの間にこのような相同性が存在しないため、この技術はTCRの定常ドメインの間における新しい鎖間ジスルフィド結合の適切な位置の同定に使用することができない。
【０００８】
理論上、TCRに人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成できる位置が非常に多いが、TCRにおける人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する適切な位置を見つけることによって、人工的な鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRがいずれも再生・リフォールディングに成功して高収量、高安定性で、かつその元のリガンドとの特異性結合活性を有するTCRを得ることが非常に困難である。当業者は、人工的な鎖間ジスルフィド結合を含有する、好適に再生・リフォールディング・精製され、かつ高安定性で、再生収率が高いと同時に、その元のリガンドと特異的に結合できるTCRの開発に取り込んでいる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、高安定性の可溶性T細胞受容体およびその製法と使用を提供することにある。
【００１０】
本発明の第一の側面では、T細胞受容体（TCR）であって、前記TCRのα鎖および／またはβ鎖の定常領域にシステイン残基を導入することによって人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ前記人工的な鎖間ジスルフィド結合を含有するT細胞受容体のTm値は≧45℃である受容体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域に導入されたシステイン残基の置き換え位置は、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、19Aおよび20Eから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖の定常領域に導入されたシステイン残基の置き換え位置は、TRAC*01エクソン1の53R、89Pおよび10Yから選ばれる。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記TCRは（i）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のTCRα鎖、および（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のTCRβ鎖を含み、ここで、（i）および（ii）はいずれもTCR鎖の機能性可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
もう一つの好適な例において、前記TCRは可溶性のものである。
もう一つの好適な例において、前記TCRに天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。
もう一つの好適な例において、前記TCRでは、天然TCRのC末端を短く切断することによって前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去した。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記TCRでは、前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられた。
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域に未対合のシステイン残基は存在しない。
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域では、未対合のシステイン残基はセリンまたはアラニンに置き換えられた。
もう一つの好適な例において、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1の 53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、 
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に置き換えられた。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記T細胞受容体は、以下の群から選ばれる細胞外α鎖アミノ酸配列および細胞外β鎖アミノ酸配列を含む。
配列番号2で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号4で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号6で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号8で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、 
配列番号10で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号12で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号14で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号16で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号18で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号20で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号22で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号24で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号26で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号28で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号30で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号32で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号34で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号36で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号38で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号40で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号42で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号44で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号46で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号48で示される細胞外β鎖アミノ酸配列。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に抱合体が結合している。
もう一つの好適な例において、前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせである。
好ましくは、前記検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI（磁気共鳴画像）またはCT（コンピューターX線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含む。
好ましくは、前記治療剤は、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばIL-2など）、抗体、抗体Fc断片、抗体scFv断片、金ナノ粒子/ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質（BPHL））、化学治療剤（たとえば、シスプラチン）または任意の様態のナノ粒子などを含む。
もう一つの好適な例において、前記T細胞受容体と結合している治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体あるいは任意のCD3と特異的に結合するタンパク質、小分子化合物または有機大分子化合物である。
【００１５】
本発明の第二の側面では、本発明の第一に記載のTCRの細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含む核酸分子を提供する。
本発明の第三の側面では、本発明の第二に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の第四の側面では、宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞であった、本発明の第三に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の本発明の第二に記載の核酸分子が組み込まれた細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞は、原核細胞および真核細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、CHO細胞などから選ばれる。
【００１６】
本発明の第五の側面では、分離された細胞であって、本発明の第一に記載のTCRを発現する細胞を提供する。
本発明の第六の側面では、本発明の第一に記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
（i）本発明の第四に記載の宿主細胞を培養することによって、本発明の第一に記載のT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖を発現させる工程と、
（ii）前記のα鎖および/またはβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖および/またはβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の第七の側面では、T細胞受容体複合体であって、一つまたは複数の本発明の第一に記載のTCRを含む複合体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の複合体は、本発明のT細胞受容体と治療剤の結合で形成された複合体、または本発明のT細胞受容体と検出可能なマーカーの結合で形成された複合体を含む。
もう一つの好適な例において、前記の複合体は、2つまたは3つ以上のT細胞受容体分子を含む。
【００１８】
本発明の第八の側面では、本発明の第一に記載のTCRの使用であって、腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC-ペプチド複合体を検出する試薬の製造における使用を提供する。
本発明の第九の側面では、薬学的に許容される担体と安全有効量の本発明の第一に記載のTCR、本発明の第四に記載の細胞または本発明の第七に記載のT細胞受容体複合体を含む薬物組成物を提供する。
本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に本発明の第一に記載のTCR、本発明の第五に記載の細胞、本発明の第七に記載のT細胞受容体複合体または本発明の第九に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
好ましくは、前記の疾患は、腫瘍、自己免疫疾患およびウイルス感染性疾患を含む。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1aおよび図1bはそれぞれTRAC*01エクソン1の53番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図２】図2aおよび図2bはそれぞれ図1aおよび図1bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３】図3は図1aおよび図1bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図４】図4は図1aおよび図1bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５】図5は図1aおよび図1bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図６】図6は図1aおよび図1bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のLC13TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【００２０】
【図７】図7aおよび図7bはそれぞれTRAC*01エクソン1の53番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図８】図8aおよび図8bはそれぞれ図7aおよび図7bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図９】図9は図7aおよび図7bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図１０】図10は図7aおよび図7bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図１１】図11は図7aおよび図7bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図１２】図12は図7aおよび図7bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度の1G4TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【００２１】
【図１３】図13aおよび図13bはそれぞれTRAC*01エクソン1の53番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図１４】図14aおよび図14bはそれぞれ図13aおよび図13bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図１５】図15は図13aおよび図13bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【００２２】
【図１６】図16は図13aおよび図13bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図１７】図17は図13aおよび図13bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図１８】図18は図13aおよび図13bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のJM22TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図１９】図19aおよび図19bはそれぞれTRAC*01エクソン1の53番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【００２３】
【図２０】図20aおよび図20bはそれぞれ図19aおよび図19bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図２１】図21は図19aおよび図19bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図２２】図22は図19aおよび図19bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図２３】図23は図19aおよび図19bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図２４】図24は図19aおよび図19bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のMGA3TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図２５】図25aおよび図25bはそれぞれTRAC*01エクソン1の89番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【００２４】
【図２６】図26aおよび図26bはそれぞれ図25aおよび図25bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図２７】図27は図25aおよび図25bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図２８】図28は図25aおよび図25bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図２９】図29は図25aおよび図25bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図３０】図30は図25aおよび図25bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のLC13TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図３１】図31aおよび図31bはそれぞれTRAC*01エクソン1の89番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【００２５】
【図３２】図32aおよび図32bはそれぞれ図31aおよび図31bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３３】図33は図31aおよび図31bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図３４】図34は図31aおよび図31bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図３５】図35は図31aおよび図31bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図３６】図36は図31aおよび図31bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度の1G4TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【００２６】
【図３７】図37aおよび図37bはそれぞれTRAC*01エクソン1の89番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図３８】図38aおよび図38bはそれぞれ図37aおよび図37bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図３９】図39は図37aおよび図37bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【００２７】
【図４０】図40は図37aおよび図37bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図４１】図41は図37aおよび図37bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図４２】図42は図37aおよび図37bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のJM22TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図４３】図43aおよび図43bはそれぞれTRAC*01エクソン1の89番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図４４】図44aおよび図44bはそれぞれ図43aおよび図43bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【００２８】
【図４５】図45は図43aおよび図43bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図４６】図46は図43aおよび図43bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図４７】図47は図43aおよび図43bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図４８】図48は図43aおよび図43bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のMGA3TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図４９】図49aおよび図49bはそれぞれTRAC*01エクソン1の10番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目にシステインが導入されたLC13TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【００２９】
【図５０】図50aおよび図50bはそれぞれ図49aおよび図49bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図５１】図51は図49aおよび図49bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図５２】図52は図49aおよび図49bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５３】図53は図49aおよび図49bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図５４】図54は図49aおよび図49bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のLC13TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図５５】図55aおよび図55bはそれぞれTRAC*01エクソン1の10番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目にシステインが導入された1G4TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【００３０】
【図５６】図56aおよび図56bはそれぞれ図49aおよび図49bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図５７】図57は図55aおよび図55bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図５８】図58は図55aおよび図55bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図５９】図59は図55aおよび図55bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図６０】図60は図55aおよび図55bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度の1G4TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【００３１】
【図６１】図61aおよび図61bはそれぞれTRAC*01エクソン1の10番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目にシステインが導入されたJM22TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図６２】図62aおよび図62bはそれぞれ図61aおよび図61bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図６３】図63は図61aおよび図61bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図６４】図64は図61aおよび図61bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【図６５】図65は図61aおよび図61bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【００３２】
【図６６】図66は図61aおよび図61bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のJM22TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図６７】図67aおよび図67bはそれぞれTRAC*01エクソン1の10番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外α鎖アミノ酸配列およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目にシステインが導入されたMGA3TCRの細胞外β鎖アミノ酸配列である。
【図６８】図68aおよび図68bはそれぞれ図67aおよび図67bにおけるアミノ酸に相応するヌクレオチド配列である。
【図６９】図69は図67aおよび図67bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディング後のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる溶離曲線である。
【図７０】図70は図67aおよび図67bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後のSECスペクトルである。
【００３３】
【図７１】図71は図67aおよび図67bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後測定されたDSCサーモグラムである。
【図７２】図72は図67aおよび図67bで示されるTCRα鎖とβ鎖のリフォールディングおよびタンパク質精製後得られた異なる濃度のMGA3TCR分子とその対応する抗原の結合曲線である。
【図７３】図73は人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたLC13TCR分子の還元・非還元ゲル画像で、ここで、レーン4は分子量マーカーである。
【図７４】図74は人工的鎖間ジスルフィド結合が導入された1G4TCR分子の還元・非還元ゲル画像で、ここで、レーン4は分子量マーカーである。
【図７５】図75は人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたJM22TCR分子の還元・非還元ゲル画像で、ここで、レーン4は分子量マーカーである。
【図７６】図76は人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたMGA3TCR分子の還元・非還元ゲル画像で、ここで、レーン4は分子量マーカーである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者は幅広く深く研究したところ、意外にTm値が45℃超の高安定性の可溶性T細胞受容体を得た。具体的に、本発明者はTCRのα鎖およびβ鎖における多くの異なる位置をシステインに突然変異させて人工的鎖間ジスルフィド結合を導入し、大量の選別を経て高安定性の可溶性T細胞受容体を得た。本発明のTCRのα鎖およびβ鎖の定常ドメインにおける特定の位置をシステインに突然変異させて新しい鎖間ジスルフィド結合を形成し、新しい人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRは高安定性を有し、そのTm値が45℃超で、かつ好適に再生・リフォールディングしてそして精製することができ、再生収率が高いと同時に、その元のリガンドと特異的に結合することができる。また、本発明は前記TCRの使用、およびその製造方法を提供する。
【００３５】
T細胞受容体（TCR）
天然のTCRは2本のポリペプチドからなるが、それぞれαβ型またはγδ型である。各ポリペプチドはそれぞれ一つの膜近位の定常ドメインおよび一つの膜遠位の可変ドメインを有する。各定常ドメインおよび可変ドメインにそれぞれ一つの鎖内ジスルフィド結合が含まれる。TCRの細胞外定常ドメインは一つの膜近位の領域および一つの免疫グロブリン領域を有する。天然TCRの膜近位領域の2本の鎖の間に1組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のTCR」、「本発明のT細胞受容体」は、入れ替えて使用することができ、いずれも本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRをいう。
【００３６】
本発明のTCRの命名法は国際免疫遺伝情報システム（IMGT）におけるTCRに対する命名法を使用する。すなわち、当該システムでは、「TRAC*01」はTCRのα鎖の定常ドメインを表し、ここで、「TR」はT細胞受容体の遺伝子を、「A」はα鎖の遺伝子を、Cは定常領域を、「01」は対立遺伝子1を表す。同様に、「TRBC1*01」または「TRBC2*01」はβ鎖の定常ドメインを表す。β鎖に二つの可能な定常領域の遺伝子「C1」および「C2」が存在する。各対立遺伝子によってコードして翻訳されるドメインはいくつかのエクソン由来の遺伝コードからなる。そのため、IMGTで提供されるTCR定常ドメインの配列は当業者に周知で得られるもので、ととえばIMGTの公開データベースで見つけることができる。IMGTのTRAC*01で示されるアミノ酸配列の53番目はRで、ここでTRAC*01エクソン1の53Rと表記するが、ほかもこのように表記する。TCRのα鎖は唯一の定常ドメインTRAC*01を有し、β鎖の2種類の定常ドメインは僅かな違いだけで、TRBC1*01はそのエクソンに4N、5Kおよび37Fを有するが、TRBC2*01はそのエクソンに4K、5Nおよび37Yを有する。そのため、TCR分子のβ鎖の定常領域はTRBC1*01でもTRBC2*01でも基本的に違いがない。以上のように、異なるTCRの定常領域のアミノ酸配列の一定性のため、異なるTCRの定常領域の空間構造も相同と思われる。
【００３７】
用語「安定性」とは、タンパク質の安定性の任意の面である。オリジナルの野生型のタンパク質と比べ、選別で得られる高安定性タンパク質は、アンフォールディングに対するより高い耐性、不適当または望ましくないフォールディングに対するより高い耐性、より強い再生能力、より強い発現能力、より高いタンパク質再生収率、熱安定性の増加のうちの一つまたは一つ以上の特徴を有し、好ましくはより高いタンパク質再生収率および/または熱安定性の増加をいう。
TCRの各鎖における非システイン残基をシステインに突然変異させて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。当該ジスルフィド結合はTCRの各鎖の定常領域に位置することが好ましい。
本発明の好ましい実施形態において、システインを導入して人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する位置は、
TRAC*01エクソン1の 53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20Eである。
【００３８】
本発明の一つの好ましい実施形態において、本発明のTCRは膜貫通ドメイン以外の完全な定常ドメインを含んでもよい（すなわち細胞外および細胞質ドメインを含む）。このような場合、天然のTCR鎖間ジスルフィド結合を形成する一つまたは複数のシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基に突然変異することが好ましい。
本発明のもう一つの好ましい実施形態において、本発明のTCRは膜貫通ドメイン以外の一部の定常ドメインを含んでもよいが、このような場合、天然のTCR鎖間ジスルフィド結合を形成する一つまたは複数のシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基に突然変異するか、あるいはこれらの残基の一つまたは複数を欠失させる。
【００３９】
本発明の一つの好ましい実施形態において、前記TCRに天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基をほかのアミノ酸残基に突然変異させるか、あるいは対応する鎖を短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含まないようにすることで、天然の鎖間ジスルフィド結合を欠失させる目的を果たす。
本発明の一つの好適な例において、本発明の高安定性のTCRはC末端が短く切断された天然のTCRのα鎖とβ鎖の定常領域を含み、好ましくは天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基から1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個またはそれ以上のアミノ酸の位置で短く切断し、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去し、このようなTCRが天然の鎖間ジスルフィド結合を含まない。 しかし、もちろん、本発明のTCRに天然の鎖間ジスルフィド結合が含まれてもよい。注意すべき点は、TCR鎖の1本だけが天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を有し、当該システインが本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有するTCR分子とほかの分子との連結に使用される場合もあることである。TCRのβ鎖に一つの遊離の未対合のシステイン残基が含まれる場合、本発明では、当該システインを別のアミノ酸、たとえばセリンまたはアラニンに突然変異させることが好ましい。本発明のTCRの各鎖は、その鎖間ジスルフィド結合を含んでもよい。
【００４０】
もちろん、TCRの定常ドメインは直接TCRとpMHCの結合に関与せず、C末端である程度の数のアミノ酸残基を切断してもTCRの機能にほぼ影響しないため、本発明のTCRの各鎖はさらに短くてもよい。任意の適切な方法によって本発明のTCRとその対応する抗原の結合親和力（解離平衡定数KDに反比例する）を測定することができる。TCRの親和力が倍になると、KDが半減することが知られている。本発明の好適な例において、TCRとその対応するpMHCの解離平衡定数KDはたとえば本発明の実施例4に記載のようにforteBIO Okeによって測定される。
TCR鎖におけるアミノ酸残基がすべてその抗原特異性および機能性に重要であるわけではないため、本発明のTCR鎖に適量の突然変異を導入してもその抗原特異性および機能性に影響しない場合もある。ほかの突然変異の様態は、1〜6個（通常は1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個）のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、ならびにC末端および/またはN末端への1個または2個以上（通常は5個以内、好ましくは3個以内、より好ましくは2個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。C末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の構造と機能を変えることはない。
【００４１】
本発明では、TCR鎖におけるシステインに突然変異させて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することによってTCRを安定させるのに適切な位置が同定された。本発明のTCRは、ヒトTCRだけでなく、ほかの種の可溶性の高安定性TCRに対しても、当業者は本発明によって提供される適切な位置に基づき、同様に得ることができる。たとえば、当業者は対応するTCR鎖で以下のモチーフを探すことによって突然変異の候補の残基を確定することができる（太字で下線の残基はシステインへの突然変異に使用される残基である）。
α鎖の定常領域10Y:     IQNPDPAVYQLRDSKSSDKS
α鎖の定常領域53R:     ITDKTVLDMRSMDFKSNSAV
α鎖の定常領域89P：    SIIPEDTFFCSPESSSAAAL
β鎖の定常領域20E:     EVAVFEPSEAEISHTQKATL
β鎖の定常領域54S:     WWVNGKEVHSGVSTDPQPLKおよび
β鎖の定常領域19A:     EVAVFEPSEAEISHTQKATL。
【００４２】
ほかの種のTCR鎖は以上のモチーフと100％相同の領域を有さないかもしれないが、当業者は上記モチーフに基づいて対応するTCRの同等の部分を同定して突然変異されるべきシステイン残基を得ることができる。たとえば、欧州バイオインフォマティクス研究所から得られるClustalWでほかの種のTCR鎖を以上のモチーフと比較し、対応する位置を得ることができる。
本発明は人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるヒトの安定性αβTCR、およびほかの哺乳動物の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるαβTCRを含み、前記哺乳動物はヤギ、ヒツジ、ブタ、マウスやラットを含むが、これらに限定されない。たとえば、本発明によれば、同定できたマウスににおけるシステインを導入して人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する位置は以下の通りである（太字で下線のアルファベットで示す）。
ヒトのα鎖の10Yのネズミの同等物：IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLF
ヒトのα鎖の53Rのネズミの同等物: GTFITDKTVLDMKAMDSKSNGA
ヒトのα鎖の89Pのネズミの同等物: QDIFKETNATYPSS
ヒトのβ鎖の20Eのネズミの同等物：FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLAT
ヒトのβ鎖の54Sのネズミの同等:  LSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESN
ヒトのβ鎖の19Aのネズミの同等:  FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLAT。
【００４３】
もちろん、ここで、アミノ酸の名称は、世界中に汎用の一文字のアルファベットの表示を使用し、その相応するアミノ酸の名称の三文字のアルファベットの略称はそれぞれAla (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)である。
【００４４】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの活性断片、誘導体および類似物を含む。ここで用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似物」とは、リガンド分子と結合することが可能なポリペプチドである。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似物は、（ｉ）1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、または（ｉｉ）1個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、、または（ｉｉｉ）本発明のTCRと他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、または（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または6Hisなどのタグ配列と融合して形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似物は当業者に公知の範囲に入っている。
【００４５】
1種類の好適な活性誘導体とは、5個以下、好ましくは3個以下、より好ましくは2個以下、最も好ましくは1個のアミノ酸が性質の類似または近似のアミノ酸で置換されてなるポリペプチドである。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【表１】
0006415716.tif 000002
【００４６】
また、本発明は、本発明のTCRの類似物を提供する。これらの類似物と本発明の元のTCRのポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態の違いでもよく、あるいは両者でもよい。類似物は、さらに、天然L-アミノ酸と異なる残基（例えばD-アミノ酸）を有する類似物、および非天然または合成のアミノ酸（例えばβ、γ-アミノ酸）を有する類似物を含む。もちろん、本発明のポリペプチドは、上記で挙げられた代表的なポリペプチドに限定されない。
【００４７】
修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外のポリペプチドの化学的に誘導された形態、例えばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえばポリペプチドの合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ったポリペプチドも含む。このような修飾は、ポリペプチドをグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（例えばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたポリペプチドまたは溶解性を改善したポリペプチドを含む。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、薬学的にまたは生理学的に許容される酸または塩基から誘導される塩の様態で使用することもできる。これらの塩は、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、またはヒドロキシエタンスルホン酸のような酸で形成する塩を含むが、これらに限定されない。ほかの塩は、アルカリ金属或はアルカリ土類金属(例えばナトリウム、カリウム、カリシウム或はマグネシウム)と形成する塩、及びエステル、カルバメートまたはほかの通常の「プロドラッグ」の様態を含む。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、多価複合体の様態で提供することができる。本発明の多価TCR複合体は、2個、3個、4個またはそれ以上のもう１つの分子と連結したT細胞受容体分ウィを含む。
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のヌクレオチド全長配列或いはの断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のポリペプチド（又はその断片、或いはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（たとえばベクター）や細胞に導入してもよい。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
【００５０】
コード配列
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関し、本発明に係るT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態でもRNA形態でもよい。DNAは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。たとえば、成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47で示されるコード領域の配列と同様でもよく、あるいは縮重変異体でもよい。ここで用いられるよに、「縮重変異体」とは本発明において配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするが、上記に対応するコード領域の配列と違う核酸配列である。 
【００５１】
本発明のヌクレオチド全長配列或いはの断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のポリペプチド（又はその断片、或いはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（たとえばベクター）や細胞に導入してもよい。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
一方、本発明は、さらに、本発明のTCRポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体も含む。
【００５２】
製造方法
新しい人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入は、任意の適切な方法を使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるもの、制限酵素によるクローンまたはライゲーション非依存的なクローン化（LIC）方法を含むが、これらに限定されない。多くの標準の分子生物学教材ではこれらの方法が詳記されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の誘導および制限酵素によるクローンの詳細は、SambrookおよびRussell, (2001) 「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）(第三版)CSHL出版社を参照する。LIC方法の詳細な情報はRashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6を参照する。 
【００５３】
本発明のポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドでもよい。本発明のポリペプチドは、化学合成のものでもよく、組み換えのものでもよい。相応に、本発明のポリペプチドは、通常の方法で人工的に合成してもよく、組み換え方法で生産してもよい。
通常の組み換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチドで組み換えの本発明のポリペプチドを発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
（1）本発明のTCRポリペプチドをコードするポロヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポロヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
（2）適切な培地において宿主細胞を培養する。
（3）培地または細胞から本発明のTCRポリペプチドを分離し、精製する。
好ましくは、細菌、たとえば大腸菌において封入体の様態で発現させて体外でリフォールディングさせて本発明の可溶性の高安定性TCRを得ることができる。
【００５４】
薬物組成物および使用方法
本発明のTCRおよび本発明のTCRを移入したT細胞は、薬学的に許容される担体といっしょに薬物組成物で提供することができる。本発明のTCR、多価TCR複合体および細胞は、通常、無菌薬物組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。この薬物組成物は、任意の適切な様態でもよい（患者への投与に必要な方法によって決まる）。単位剤形で提供してもよいが、通常、密封の容器に入って提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、取り扱い説明書を含むが、必ず必要なものではない。複数の前記単位剤形を含んでもよい。
【００５５】
本発明のTCRは単独で使用してもよく、抱合体と結合または抱合してもよい。前記抱合体は、検出可能ななマーカー、治療剤、PK（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせを含む。
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI（磁気共鳴画像）またはCT（コンピューターX線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRと結合または抱合することができる治療剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。 1．放射性核種(Koppeら，2005，Cancer metastasis reviews，24，539)、2．生物毒素(Chaudharyら，1989，Nature，339，394；Epelら，2002，Cancer Immunology and Immunotherapy，51，565)、3．サイトカイン(Gilliesら，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Cardら，2004，Cancer Immunology and Immunotherapy， 53，345；Halinら，2003，Cancer Research，63，3202)、4．抗体Fc断片(Mosqueraら，2005，The Journal Of Immunology，174，4381)、5．抗体scFv断片 (Zhuら，1995，International Journal of Cancer, 62, 319)、6．金ナノ粒子/ナノロッド(Lapotkoら，2005，Cancer letters，239，36；Huangら，2006，Journal of the American Chemical Society，128，2115)、7．ウイルス粒子(Pengら，2004，Gene therapy， 11，1234)、8．リポソーム(Mamotら，2005，Cancer research，65，11631)、9．磁性ナノ粒子、10．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質（BPHL））、化学治療剤（たとえば、シスプラチン）など。
【００５６】
本発明のTCRと結合する抗体またはその断片は、抗T細胞抗体またはNK細胞決定抗体、たとえば抗CD3抗体または抗CD28抗体または抗CD16抗体を含み、上記抗体またはその断片とTCRの結合はエフェクター細胞をより好適に標的細胞にターゲッティングさせる。
薬物組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含有してもよい。用語の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のために使用される担体である。当該用語は、自身がその組成物を受ける個体に有害な抗体を誘導せず、且つ投与後過剰な毒性がないという条件を満足するような薬剤担体を指す。これらの担体は、本分野の技術者に熟知である。「レミントンの医薬科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.，N.J. 1991年））において、薬学的に允許される賦形剤に関する十分な検討が見つけられる。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、佐剤、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
治療性組成物において、薬学的に許容される担体は液体、例えば水、塩水、グリセリンやエタノールを含んでもよい。さらに、これらの担体には、補助的な物質、例えば湿潤剤或いは乳化剤、pH緩衝物質等が存在してもよい。
通常、治療性組成物は注射剤、例えば液体溶液または懸濁液に調製してもよく、注射直前に溶液または懸濁液に配合することに適する液体ビヒクルの固体形態に調製してもよい。
本発明の組成物にすれば、通常の経路で給与することができ、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、或いは局部給与を含むが、これらに限られない。予防・治療する対象は、動物、特にヒトでよい。
【００５８】
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、使用の状況に合わせて様々な異なる剤形の薬物組成物としてもよい。好ましくは、注射剤、経口投与剤などが挙げられる。
これらの薬物組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解で配合することができ、かつ適切な薬物添加剤、たとえば賦形剤、崩壊剤、バインダー、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤（isotonicities）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤や溶解助剤などを添加することもあり、またこの配合過程は剤形に合わせて通常の方法で行うことができる。
【００５９】
また、本発明の薬物組成物は、徐放剤の様態で投与することもできる。たとえば、本発明のポリペプチドは、徐放重合体を担体とするピルまたはマイクロカプセルに配合し、さらにこのピルまたはマイクロカプセルを手術で治療される組織に移植することができる。徐放重合体の例として、エチレン-酢酸ビニル共重合体、ポリヒドロメタクリレート（polyhydrometaacrylate）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、乳酸重合体、乳酸-グリコール酸共重合体などが挙げられ、好ましくは生分解可能な重合体、たとえば乳酸重合体および乳酸-グリコール酸共重合体が挙げられる。
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、活性成分としての本発明のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の投与量は、治療される患者それぞれの体重、年齢、性別、症状の程度によって合理的に決定することができる。
【００６０】
本発明のTCRの用途
本発明のTCRは、薬物または診断試薬として有用である。修飾またはほかの改良によって薬物または診断試薬として使用されることに適する特徴を持たせることができる。この薬物または診断試薬は、多くの異なる疾患の治療または診断に使用することができ、前記疾患は、癌（たとえば腎臓癌、卵巣癌、頭部および頚部癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宮頚癌、膀胱癌、前立腺癌やメラノーマなど）、自己免疫疾患、ウイルス感染性疾患、移植拒絶や移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRの特異性によって、薬物の部位特定または標的化投与を実現することで、多くの疾患の治療または診断の効果を向上させる。
【００６１】
癌に対し、腫瘍または転移癌の周囲を標的とすると、毒素または免疫刺激物の効果を向上させることができる。自己免疫疾患において、特異的に正常の細胞または組織に対する免疫反応を抑制し、または免疫抑制薬を徐々に放出させ、より長時間でより多い局部の効果を果たさせることで、被試者の全体の免疫力に対する影響を最小限にする。移植拒絶の防止において、同様の方法で免疫抑制の作用を最適化することができる。薬物が既存のウイルス性疾患、たとえばHIV、SIV、EBV、CMV、HCV、HBVに対し、薬物が感染細胞の周辺で放出され、または活性化機能を発揮することも有益である。
本発明のTCRは、T細胞の活性化の調整に有用で、本発明のTCRは特異的なpMHCと結合することによってT細胞の活性化を抑制する。T細胞が仲介する炎症および/または組織損傷に関する自己免疫疾患、たとえば1型糖尿病にこの方法が適用できる。
【００６２】
本発明のTCRは、細胞毒性剤を癌細胞に送達する目的、またはT細胞の形質移入に使用することによって、養子免疫治療と呼ばれる治療の過程で患者に投与し、HLA複合体を提示する腫瘍細胞を破壊するようにすることができる。
本発明のTCRは、診断試薬としても有用である。検出可能なマーカーで本発明のTCRを標識し、たとえば診断目的に適するマーカーで標識し、MHC-ペプチドとMHC-ペプチドに特異的な本発明のTCRの間の結合を検出することができる。蛍光標識されたTCR多量体はFACS分析に適し、TCRに特異的なペプチドを持つ抗原提示細胞の検出に使用することができる。
【００６３】
工業応用性
本発明の高安定性T細胞受容体は、TCRとpMHC（ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体）の間の相互作用の研究および疾患の診断と治療などの目的に使用することができる。
【００６４】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明のT細胞受容体は、高安定性を有し、好適に再生・リフォールディング・精製され、かつその元のリガンドと特異的に結合できる。
（2）本発明のT細胞受容体は高いTm値を有し、Tm値は45℃超である。
（3）本発明のT細胞受容体はタンパク質再生収率が高く、大規模製造が容易で、かつ生産コストの低下に有利である。
【００６５】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を詳述する。もちろん、異なるTCRの定常領域のアミノ酸配列と空間構造の相同性のため、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合をTCRの定常領域に導入して高安定性のTCR分子を得ることは、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合の作用の説明に十分である。以下の実施例において、数種類の異なる分子を入れ、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合をTCR分子に導入することで、リフォールディング効果がよく、再生収率が高く、安定性が高い可溶性TCRが得られることをさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookおよびRussellら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（第三版）(2001) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。 特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。本発明の実施例で使用された実験材料は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【００６６】
実施例1  TRAC*01エクソン1の53番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入したLC13分子のプライマー設計およびPCR突然変異
TCR分子LC13（抗原短鎖ペプチドHLA-B4405：EEYLKAWTF（配列番号49）に対するもの）のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記TCRのTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GATAAATGCGTGCTGGATATGTGCAGCATGGATTTCAAAAG(配列番号50)
CTTTTGAAATCCATGCTGCACATATCCAGCACGCATTTATC(配列番号51)
【００６７】
上記TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GGCAAAGAAGTGCATTGCGGTGTTTGTACCGATC(配列番号52)
GATCGGTACAAACACCGCAATGCACTTCTTTGCC(配列番号53)
【００６８】
PCRの手順は以下の通りである。
LC13 TCRαおよびβ鎖の遺伝子を含む発現プラスミドはそれぞれ上記αおよびβ鎖のプライマーで以下のような突然変異を行った。各PCR点突然変異反応において、10〜30ngのプラスミドDNAを5μL 10×KOD plus緩衝液、5μL 2.5mM dNTP Mix、 3μL 2mM MgSO4 、1単位のKOD plusポリメラーゼ(東洋紡上海生物科技有限公司)、10μMの上・下流プライマー1μLずつと混合し、最後にH2Oで50μLまで補充した。均一に混合した後、Bio-Rad PCR装置にセットして反応させた。94℃で2min初期変性させた後、18サイクルの増幅を行った（94℃で15sec変性、55℃で30secアニールおよび68℃で6min伸長）。その後、10単位のDpnＩ制限酵素（New England Biolabs）で37℃で1時間消化させた。10μLの消化産物を感受性E.coli DH5α細菌に形質転換して37℃で16時間生長させた。単一クローンを取って5mLのLB+カナマイシンで一晩培養した。メーカーの使用説明書に従ってZyppyプラスミドミニプレップキット（ZYMO RESEARCH）でプラスミドDNAを精製し、かつInvitrogen社に送ってシークエンシングによって同定され、正確に突然変異したら下流発現に使用した。
【００６９】
突然変異したTCR分子LC13のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図1aと1bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図2aと2bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
【００７０】
実施例2  TCRの発現、リフォールディングおよび精製ならびにその結果の測定
TCRタンパク質の発現
鋳型鎖を持つ目的遺伝子をNcoＩおよびNotＩで二重酵素切断し、NcoＩおよびNotＩで二重酵素切断されたpET28a（Novagen）ベクターと連結させた。連結産物をE.coli DH5α（Tiangen）に形質転換し、カナマイシン含有LBプレートを塗布し、37℃で逆さで一晩培養し、クローンを取ってPCR選別を行い、陽性組換え体に対してシークエンシングを行った。
【００７１】
TCRα鎖とβ鎖を含有する発現プラスミドをそれぞれ大腸菌株BL21(DE3)に形質転換し、LBプレート（カナマイシン  50μg/ml）を塗布して37℃で一晩培養した。翌日に、クローンを取って10 mlのLB液体培地（カナマイシン  50μg/ml）に接種して2〜3h培養し、体積比1:100で1LのLB培地（カナマイシン  50μg/ml）に接種し、OD600が0.5〜0.8になるまで培養を続けた後、最終濃度が1mMの IPTGで目的タンパク質の発現を誘導した。4時間誘導した後、6000rpmで10min遠心して細胞を得た。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、そして菌体を分け、200 mlの細菌培養物に相当する菌体を取って5mlのBugBuster Master Mix （Novagen）で細菌を分解させ、6000gで15min遠心して封入体を収集した。その後、洗浄剤で4回洗浄して細胞の破片および膜成分を除去した。その後、緩衝液、たとえばPBSで封入体を洗浄して洗浄剤および塩を除去した。最後に、封入体を6M塩化グアニジニウム含有緩衝液で溶解させ、かつ封入体の濃度を測定し、子分けした後-80で冷凍保存した。
【００７２】
TCRタンパク質のリフォールディング
-80℃超低温冷蔵庫から封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10mMになるようにジチオトレイトール（DTT）を入れ、ジスルフィド結合が完全に断裂するように37 ℃で30 min〜1時間インキュベートした。その後、封入体サンプル溶液（15mg α鎖と10mgβ鎖）を順に200mlの4℃に事前に冷やしたリフォールディング緩衝液（100mM Tris pH 8.1、400mM L-アルギニン、2mM EDTA、5M 尿素、6.5mMシステアミン塩酸塩および1.87mMシスタミン二塩酸塩）に滴下し、4℃でゆっくり約30分間撹拌した。再生溶液として8倍体積の事前に冷やしたH2Oを使用して16〜20時間透析した。さらに8倍体積の20mM Tris pH 8.0で2回透析し、4℃で約8時間透析を続け、透析後サンプルをろ過した後以下の精製を行った。
【００７３】
TCRタンパク質の第一段階の精製
透析を経たリフォールディング物(20 mM Tris pH 8.0中)はGE Hitrap Qアニオン交換クロマトグラフィー用充填カラム(GE Healthcare)を使用し、AKTA精製装置（GE Healthcare）によって0〜600 mM NaClで勾配溶離を行った。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによって各画分を分析した後、合併した。
【００７４】
TCRタンパク質の第二段階の精製
第一段階の精製で合併したサンプル溶液を濃縮してこの段階の精製に使用し、PBS緩衝液で事前に平衡化させたSuperdex 100 160/300 GLゲルろ過クロマトグラフィー用充填カラム（GE Healthcare）によってタンパク質を精製し、TCR分子LC13の溶離曲線はそれぞれ図3に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの画分を分析し、その還元・非還元ゲル画像は図73のレーン2およびレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。
【００７５】
HPLC法によるTCRタンパク質の純度の測定
TCRタンパク質は2段階の精製を経て合併した後、溶離画分の純度をHPLCによって測定した。条件は、 Agilent 1260、クロマトグラフィカラムBio SEC-3(300 A、φ7.8×300 mm)で、移動相が150 mMリン酸塩緩衝液で、流速0.5 mL/min、カラム温度25℃、紫外検出波長214 nmであった。TCR分子LC13のSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)スペクトルは図4に示す。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。
【００７６】
TCRタンパク質の再生収率の計算
本発明において、TCRタンパク質の再生収率の計算式は、
タンパク質再生収率（％）＝100×精製後得られたタンパク質量（mg）/再生に使用された封入体の量（mg）である。上記計算式では、TRAC*01エクソン1の53番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させたLC13 TCRのタンパク質再生収率は43.30％であった。収率が高かったというのは、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有する可溶性TCR分子が安定していることを説明した。
【００７７】
実施例3  人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRの安定性の測定
実施例2で得られたLC13 TCRタンパク質（濃度0.5 mg/ml）1 mlをPBSに透析し、米国TA（waters）社の示差走査熱量計（Nano DSC）によってTCRタンパク質に対して熱安定性の測定を行った。検出の温度範囲は10〜90℃で、昇温速度は1℃/minであった。透析外液のPBSをコントロールとし、基線を3回測定し、基線が安定したら、さらにタンパク質のサンプルを検出した。データを採取した後、分析ソフトTA_DSC_NanoAnalyzeでTCRのTm値を測定し、かつそのDSCサーモグラムを得た。体外可溶発現で得られた人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明のLC13 TCRのDSCサーモグラムは図5に示すように、そのTm値は55.82℃に達した。当該DSCサーモグラムから、室温で、ひいては41〜43℃の温度でも、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、これはその安定性が高いことを示す。
【００７８】
実施例4  結合の特徴付けおよび特異性の検出
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とその対応する抗原pMHC複合体の結合活性を検出した。
SAセンサーの表面に約2 nmのビオチン化pMHC複合体を固定化し、さらに0.05 mMのビオチンを10 μL/minの流速でチップを120 s通らせ、ストレプトアビジンの残りの結合位置をブロッキングした。動態学の分析方法によってその親和力を測定し、PBST緩衝液（PBS+0.005％ ツイン20、pH 7.4）でTCRタンパク質を5つの異なる濃度（通常は64、32、16、8、4、0 μM）に希釈し、その対応するpMHCの親和力を測定した。Evaluationソフトで1:1で結合するモデルでフィッティングして動態学のパラメーターを算出した。
【００７９】
上記pMHC複合体の製造過程は以下の通りである。
a．精製
100 mlの重鎖または軽鎖を誘導発現するE. coli菌液を収集し、4 ℃で8000 gで10 min遠心した後10 ml PBSで菌体を1回洗浄した後、5 mlのBugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁させ、室温で回転させながら20 minインキュベートした後、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、上清を捨て、封入体を収集した。
上記封入体を5 mlのBugBuster Master Mixに再懸濁させ、室温で回転させながら5 minインキュベートした。30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min延伸した。上清を捨て、30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、2回繰り返し、30 mlの20 mM Tris-HCl pH 8.0を入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、最後に20 mM Tris-HCl 8M尿素で封入体を溶解させ、SDS-PAGEによって封入体の純度を測定し、BCAキットによって濃度を測定した。
【００８０】
b．再生
所要の短鎖ペプチド（北京賽百盛遺伝子技術有限公司）を合成して濃度が20 mg/mlになるようにDMSOに溶解させた。軽鎖および重鎖の封入体を8 M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10 mM DTTで溶解させ、再生前に3 M塩化グアニジニウム、10 mM酢酸ナトリウム、10 mM EDTAを入れてさらに変性させた。短鎖ペプチドを25 mg/L（最終濃度）で再生緩衝液（0.4 M L-アルギニン、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM 酸化型グルタチオン、5 mM 還元型グルタチオン、0.2 mM PMSF、4 ℃に冷却）を入れた後、順に20 mg/Lの軽鎖および90 mg/Lの重鎖（最終濃度、重鎖は3回に分けて添加、8 h/回）を入れ、再生は完成まで4 ℃で少なくとも3日行われ、SDS-PAGEによって再生に成功したか検出した。
【００８１】
c．再生後の精製
10倍体積の20 mM Tris pH 8.0で透析して再生緩衝液を交換し、溶液のイオン強度が十分に低下するように緩衝液を少なくとも2回交換した。透析後、0.45 μm 酢酸セルロースろ膜でタンパク質溶液をろ過した後、HiTrap Q HP（GE社）アニオン交換カラムにかけた（5 ml床体積）。Akta精製装置（GE社）を使用し、20 mM Tris pH 8.0で調製された0〜400 mM NaCl直線勾配液でタンパク質を溶出させ、pMHCは約250 mM NaClで溶出し、各ピークの画分を収集し、SDS-PAGEによって純度を検出した。
【００８２】
d．ビオチン化
Millipore限外濾過管で精製されたpMHC分子を濃縮させ、同時に緩衝液を20 mM Tris pH 8.0に交換した後、ビオチン化試薬として0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酵素（GST-BirA）を入れ、室温で混合物を一晩インキュベートし、SDS-PAGEによってビオチン化が完全か検出した。
【００８３】
e．ビオチン化された複合体の精製
Millipore限外濾過管でビオチンで標識されたpMHC分子を1 mlに濃縮させ、ゲルろ過クロマトグラフィーによってビオチン化されたpMHCを精製し、Akta精製装置（GE社）を使用し、ろ過されたPBSで事前に平衡化したHiPrepTM 16/60 S200 HRカラム（GE社）を使用し、1 mlの濃縮されたビオチン化pMHC分子をかけた後、PBSで1 ml/min流速で溶出させた。ビオチン化pMHC分子は約55 mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分を合併し、Millipore限外濾過管で濃縮させ、BCA法（Thermo）によってタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail（Roche）を入れてビオチン化pMHC分子を小分けして-80℃で保存した。
異なる濃度のLC13分子とその対応する抗原の結合曲線は図6に示すように、KD値は10.5μMであった。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明のTCR分子とその対応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度TCR分子と同様の結合活性を示したことがわかるが、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有するTCRは安定していることが説明された。
【００８４】
TCRタンパク質の特異性の測定
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とその対応する抗原pMHC複合体の特異性を検出した。6種類の異なるビオチン化抗原（濃度0.5μM）をそれぞれ6本のSAセンサーの表面に載せた。その後、測定される各TCRタンパク質（濃度2〜20μM）と互いに作用させた。最後に、その相互作用によるシグナルを分析した。結果から、人工的鎖間ジスルフィド結合を導入したLC13TCRはその対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、A0201：KLVALGINAV(配列番号54)、A0201：KLVALGINAV(配列番号54)、A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0201: GILGFVFTL(配列番号56)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかったことがわかる。
【００８５】
実施例5  TRAC*01エクソン1の53番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた1G4分子
TCR分子1G4（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/SLLMWITQC（配列番号55）に対するもの、NY-ESO-1腫瘍特異的抗原）のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子1G4のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図7aと7bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図8aと8bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
【００８６】
実施例2に記載の方法を使用して1G4TCRに対して発現、リフォールディングおよび精製を行い、第二段階の精製を経た溶離曲線は図9に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの画分を分析し、その還元・非還元ゲル画像は図74のレーン2およびレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。
実施例2に記載の方法によって1G4TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図10に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する1G4TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は40％に達した。
【００８７】
実施例3に記載の方法を使用してで人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する1G4TCRの安定性をを測定したところ、そのDSCサーモグラムは図11に示すように、えられたそのTm値は55.21℃であった。当該DSCサーモグラムから、室温で、ひいては47〜48℃の温度でも、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、これはその安定性が高いことを示す。
【００８８】
実施例4に記載の方法を使用して1G4TCRタンパク質とその対応する抗原であるpMHC複合体の結合活性および特異性を検出し、得られた結合曲線は図12に示すように、KD値は6.96μMであった。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明の安定性TCR分子とその対応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度TCR分子と同様の結合活性を示したことがわかるが、側面から本発明の鎖間ジスルフィド結合を有するTCRは安定していることが説明された。
同時に、本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: GILGFVFTL(配列番号56)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。
【００８９】
実施例6  TRAC*01エクソン01の53番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させたJM22分子
TCR分子JM22（抗原短鎖ペプチドHLA-A2/GILGFVFTL（配列番号56）に対するもの、インフルエンザウイルス基質タンパク質由来）のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子JM22のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図13aと13bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図14aと14bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
【００９０】
実施例2に記載の方法を使用してJM22TCRに対して発現、リフォールディングおよび精製を行い、第二段階の精製を経た溶離曲線は図15に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの画分を分析し、その還元・非還元ゲル画像は図75のレーン2およびレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。
実施例2に記載の方法によってJM22TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図16に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するJM22TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は31.65％に達した。
【００９１】
実施例3に記載の方法を使用してで人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するJM22TCRの安定性をを測定したところ、そのDSCサーモグラムは図17に示すように、えられたそのTm値は49.06℃であった。当該DSCサーモグラムから、室温で、ひいては40℃の温度でも、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、これはその安定性が高いことを示す。
【００９２】
実施例4に記載の方法を使用してJM22TCRタンパク質とその対応する抗原であるpMHC複合体の結合活性および特異性を検出し、得られた結合曲線は図18に示すように、KD値は7.14μMであった。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明の安定性TCR分子とその対応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度TCR分子と同様の結合活性を示したことがわかるが、側面から本発明の鎖間ジスルフィド結合を有するTCRは安定していることが説明された。
同時に、本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。     
【００９３】
実施例7  TRAC*01エクソン01の53番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させたMGA3分子
TCR分子MGA3（抗原短鎖ペプチドHLA-A1：EVDPIGHLY（配列番号57）に対するもの、MageA3腫瘍特異的抗原）のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子MGA3のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図19aと19bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図20aと20bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
【００９４】
実施例2に記載の方法を使用してMGA3TCRに対して発現、リフォールディングおよび精製を行い、第二段階の精製を経た溶離曲線は図21に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの画分を分析し、その還元・非還元ゲル画像は図76のレーン2およびレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。
実施例2に記載の方法によってMGA3TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図22に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するMGA3TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は30.14％に達した。
【００９５】
実施例3に記載の方法を使用してで人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するMGA3TCRの安定性をを測定したところ、そのDSCサーモグラムは図23に示すように、えられたそのTm値は53.86℃であった。当該DSCサーモグラムから、室温で、ひいては45〜46℃の温度でも、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、これはその安定性が高いことを示す。
【００９６】
実施例4に記載の方法を使用してMGA3TCRタンパク質とその対応する抗原であるpMHC複合体の結合活性および特異性を検出し、得られた結合曲線は図24に示すように、KD値は1.42μMであった。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明の安定性TCR分子とその対応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度TCR分子と同様の結合活性を示したことがわかるが、側面から本発明の鎖間ジスルフィド結合を有するTCRは安定していることが説明された。
本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0101: GILGFVFTL(配列番号56)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。          
【００９７】
実施例8  TRAC*01エクソン1の89番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた分子の機能テスト
それぞれTCR分子LC13、1G4、JM22およびMGA3のTRAC*01エクソン1の89番目のプロリンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目のアラニンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記数種類のTCRのTRAC*01エクソン1の89番目のプロリンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
CGGAAGATACGTTCTTCTGCAGCCCAGAAAGTTCC(配列番号60)
GGAACTTTCTGGGCTGCAGAAGAACGTATCTTCCG(配列番号61)
【００９８】
上記数種類のTCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目のアラニンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GTTTTTGAACCGAGCGAATGCGAAATTAGCCATACC(配列番号62)
GGTATGGCTAATTTCGCATTCGCTCGGTTCAAAAAC(配列番号63)
実施例1〜実施例4に記載の方法を使用してTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
【００９９】
突然変異後、TCR分子LC13のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図25aと25bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図26aと26bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図27および図73のレーン3およびレーン7に示す。HPLC溶離ピークは図28に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率も相当高く、42.82％に達した。そのTm値は55.65℃、体操するDSCチャートは図29に示す。LC13分子とその対応する抗原の結合曲線は図30に示すように、KD値は10.3 μMであった。
【０１００】
突然変異後、TCR分子1G4のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図31aと31bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図32aと32bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図33および図74のレーン3およびレーン7に示す。HPLC溶離ピークは図34に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率も相当高く、48％に達した。そのTm値は55.82℃、体操するDSCチャートは図35に示す。1G4分子とその対応する抗原の結合曲線は図36に示すように、KD値は6.63 μMであった。
【０１０１】
突然変異後、TCR分子JM22のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図37aと37bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図38aと38bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図39および図75のレーン3およびレーン7に示す。HPLC溶離ピークは図40に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は14.93％に達した。そのTm値は51.08℃、体操するDSCチャートは図41に示す。JM22分子とその対応する抗原の結合曲線は図42に示すように、KD値は7.61 μMであった。
【０１０２】
突然変異後、TCR分子MGA3のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図43aと43bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図44aと44bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図45および図76のレーン3およびレーン7に示す。HPLC溶離ピークは図46に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は13.76%に達した。そのTm値は54.49℃、体操するDSCチャートは図47に示す。MGA3分子とその対応する抗原の結合曲線は図48に示すように、KD値は2.04 μMであった。
【０１０３】
以上の数種類の分子の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離ピークの画分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、SDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されたTCR分子はTm値も高く、いずれも45℃超で、高い温度でも正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、その安定性が高いことを示す。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線では、TCR濃度の低下はそのリガンドとの結合に影響しなかったことが示され、側面から本発明の鎖間ジスルフィド結合を有するTCR分子は安定していることが説明された。特異性の測定では、これらの人工的鎖間ジスルフィド結合を導入したTCR分子はいずれも優れた特異性を示した。
【０１０４】
実施例9  TRAC*01エクソン1の10番目およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた分子の機能テスト
それぞれTCR分子LC13、1G4、JM22およびMGA3のTRAC*01エクソン1の10番目のチロシンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目のグルタミン酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記数種類のTCRのTRAC*01エクソン1の10番目のチロシンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
CCGGATCCGGCCGTTTGCCAGCTGCGTGATAGC(配列番号64)
GCTATCACGCAGCTGGCAAACGGCCGGATCCGG(配列番号65)
【０１０５】
上記数種類のTCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目のグルタミン酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GAACCGAGCGAAGCGTGCATTAGCCATACCCAG(配列番号66)
CTGGGTATGGCTAATGCACGCTTCGCTCGGTTC(配列番号67)
実施例1〜実施例4に記載の方法を使用してTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
【０１０６】
突然変異後、TCR分子LC13のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図49aと49bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図50aと50bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図51および図73のレーン1およびレーン5に示す。HPLC溶離ピークは図52に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は16.19%に達した。そのTm値は50.42℃、体操するDSCチャートは図53に示す。LC13分子とその対応する抗原の結合曲線は図54に示すように、KD値は10 μMであった。
【０１０７】
突然変異後、TCR分子1G4のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図55aと55bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図56aと56bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図57および図74のレーン1およびレーン5に示す。HPLC溶離ピークは図58に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は29％に達した。そのTm値は54.68℃、体操するDSCチャートは図59に示す。1G4分子とその対応する抗原の結合曲線は図60に示すように、KD値は6.68 μMであった。
【０１０８】
突然変異後、TCR分子JM22のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図61aと61bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図62aと62bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図63および図75のレーン1およびレーン5に示す。HPLC溶離ピークは図64に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は10.50％に達した。そのTm値は49.95℃、体操するDSCチャートは図65に示す。JM22分子とその対応する抗原の結合曲線は図66に示すように、KD値は5.54 μMであった。
【０１０９】
突然変異後、TCR分子MGA3のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図67aと67bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図68aと68bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図69および図76のレーン1およびレーン5に示す。HPLC溶離ピークは図70に示すように単一で対称のものである。タンパク質再生収率は4.53％に達した。そのTm値は53.38℃、体操するDSCチャートは図71に示す。MGA3分子とその対応する抗原の結合曲線は図72に示すように、KD値は3.45 μMであった。
【０１１０】
以上の数種類の分子の溶離曲線およびSDSゲル画像から、溶離主要ピークの画分は本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、SDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。タンパク質再生収率も高かった。また、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されたTCR分子はTm値も高く、いずれも45℃超で、高い温度でも正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、その安定性が高いことを示す。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線では、TCR濃度の低下はそのリガンドとの結合に影響しなかったことが示され、側面から本発明の鎖間ジスルフィド結合を有するTCR分子は安定していることが説明された。特異性の測定では、これらの人工的鎖間ジスルフィド結合を導入したTCR分子はいずれも優れた特異性を示した。
【０１１１】
以上の実施例によって、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合をTCRの定常領域に導入して得られた本発明のTCR分子は高安定性を有し、そのTm値も45超であることが証明された。そして、好適に再生・リフォールディング・精製され、再生収率が高く、かつその元のリガンドと特異的に結合できる。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１ａ】
0006415716.tif 000003
【図１ｂ】
0006415716.tif 000004
【図２ａ】
0006415716.tif 000005
【図２ｂ】
0006415716.tif 000006
【図３】
0006415716.tif 000007
【図４】
0006415716.tif 000008
【図５】
0006415716.tif 000009
【図６】
0006415716.tif 000010
【図７ａ】
0006415716.tif 000011
【図７ｂ】
0006415716.tif 000012
【図８ａ】
0006415716.tif 000013
【図８ｂ】
0006415716.tif 000014
【図９】
0006415716.tif 000015
【図１０】
0006415716.tif 000016
【図１１】
0006415716.tif 000017
【図１２】
0006415716.tif 000018
【図１３ａ】
0006415716.tif 000019
【図１３ｂ】
0006415716.tif 000020
【図１４ａ】
0006415716.tif 000021
【図１４ｂ】
0006415716.tif 000022
【図１５】
0006415716.tif 000023
【図１６】
0006415716.tif 000024
【図１７】
0006415716.tif 000025
【図１８】
0006415716.tif 000026
【図１９ａ】
0006415716.tif 000027
【図１９ｂ】
0006415716.tif 000028
【図２０ａ】
0006415716.tif 000029
【図２０ｂ】
0006415716.tif 000030
【図２１】
0006415716.tif 000031
【図２２】
0006415716.tif 000032
【図２３】
0006415716.tif 000033
【図２４】
0006415716.tif 000034
【図２５ａ】
0006415716.tif 000035
【図２５ｂ】
0006415716.tif 000036
【図２６ａ】
0006415716.tif 000037
【図２６ｂ】
0006415716.tif 000038
【図２７】
0006415716.tif 000039
【図２８】
0006415716.tif 000040
【図２９】
0006415716.tif 000041
【図３０】
0006415716.tif 000042
【図３１ａ】
0006415716.tif 000043
【図３１ｂ】
0006415716.tif 000044
【図３２ａ】
0006415716.tif 000045
【図３２ｂ】
0006415716.tif 000046
【図３３】
0006415716.tif 000047
【図３４】
0006415716.tif 000048
【図３５】
0006415716.tif 000049
【図３６】
0006415716.tif 000050
【図３７ａ】
0006415716.tif 000051
【図３７ｂ】
0006415716.tif 000052
【図３８ａ】
0006415716.tif 000053
【図３８ｂ】
0006415716.tif 000054
【図３９】
0006415716.tif 000055
【図４０】
0006415716.tif 000056
【図４１】
0006415716.tif 000057
【図４２】
0006415716.tif 000058
【図４３ａ】
0006415716.tif 000059
【図４３ｂ】
0006415716.tif 000060
【図４４ａ】
0006415716.tif 000061
【図４４ｂ】
0006415716.tif 000062
【図４５】
0006415716.tif 000063
【図４６】
0006415716.tif 000064
【図４７】
0006415716.tif 000065
【図４８】
0006415716.tif 000066
【図４９ａ】
0006415716.tif 000067
【図４９ｂ】
0006415716.tif 000068
【図５０ａ】
0006415716.tif 000069
【図５０ｂ】
0006415716.tif 000070
【図５１】
0006415716.tif 000071
【図５２】
0006415716.tif 000072
【図５３】
0006415716.tif 000073
【図５４】
0006415716.tif 000074
【図５５ａ】
0006415716.tif 000075
【図５５ｂ】
0006415716.tif 000076
【図５６ａ】
0006415716.tif 000077
【図５６ｂ】
0006415716.tif 000078
【図５７】
0006415716.tif 000079
【図５８】
0006415716.tif 000080
【図５９】
0006415716.tif 000081
【図６０】
0006415716.tif 000082
【図６１ａ】
0006415716.tif 000083
【図６１ｂ】
0006415716.tif 000084
【図６２ａ】
0006415716.tif 000085
【図６２ｂ】
0006415716.tif 000086
【図６３】
0006415716.tif 000087
【図６４】
0006415716.tif 000088
【図６５】
0006415716.tif 000089
【図６６】
0006415716.tif 000090
【図６７ａ】
0006415716.tif 000091
【図６７ｂ】
0006415716.tif 000092
【図６８ａ】
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【図６８ｂ】
0006415716.tif 000094
【図６９】
0006415716.tif 000095
【図７０】
0006415716.tif 000096
【図７１】
0006415716.tif 000097
【図７２】
0006415716.tif 000098
【図７３】
0006415716.tif 000099
【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【配列表】
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