(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖フレームワーク領域、配列ＩＤ番号：１９の配列を含むＣＤＲＨ１、配列ＩＤ番号：２０の配列を含むＣＤＲＨ２、および配列ＩＤ番号：２１の配列を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、
軽鎖フレームワーク領域、配列ＩＤ番号：２２の配列を含むＣＤＲＬ１、配列ＩＤ番号：２３の配列を含むＣＤＲＬ２、および配列ＩＤ番号：２４の配列を含むＣＤＲＬ３であって、前記ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ２は、Ｓ３２Ｙ、Ｅ５５Ｑ及びＦ６０Ｎの変異を有し、前記変異の位置は配列番号６の配列に基づくもの、を含む軽鎖可変領域とを有する、
ヒト化抗ＩＬ−２０抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片。
【請求項２】
前記重鎖フレームワーク領域が、サブグループＩＩＩ（ＶＨ３）のヒト免疫グロブリン重鎖内に、対応するフレームワーク領域の配列を含み、および／または前記軽鎖フレームワーク領域が、κサブグループＩＩ（Ｖκ２）のヒト免疫グロブリン軽鎖内に、対応するフレームワーク領域の配列を含む
請求項１に記載のヒト化抗ＩＬ−２０抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片。
【請求項３】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖サブグループＩＩＩ（ＶＨ３）可変領域が、ＩＧＨＶ３−７２＊０１（配列ＩＤ番号：２）またはＩＧＨＶ３−６６＊０４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を含み、および／または前記ヒト免疫グロブリン軽鎖κサブグループＩＩ（Ｖκ２）可変領域が、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２（配列ＩＤ番号：６）またはＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列ＩＤ番号：１７）の配列を含む
請求項２に記載のヒト化抗ＩＬ−２０抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片。
【請求項４】
前記ヒト化抗体内の前記重鎖可変領域が、配列ＩＤ番号：９の配列を含み、および／または前記ヒト化抗体内の前記軽鎖可変領域が、配列ＩＤ番号：１０の配列を含む
請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗ＩＬ−２０抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片。
【請求項５】
ＩＬ−２０関連の疾患を治療または防止用医薬組成物であって、
請求項１から４のいずれか一項に記載のヒト化抗ＩＬ−２０抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を含み、前記ＩＬ−２０関連の疾患が、炎症、骨粗鬆症、癌、脳卒中および腎不全からなる群から選択される疾患である
医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患が関節リウマチである
請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月１８日に出願された米国特許出願第１３／８６５６７１号に対する優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、インターロイキン−２０に対するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−２０（以下、「ＩＬ−２０」）は、ＩＬ−１０ファミリーに属する。ＩＬ−２０は、化学誘引、血管形成および破骨細胞形成の特性を備える多面的サイトカインであり、さまざまな炎症疾患および他の障害において重要な役割を果たす。さまざまな病態においてＩＬ−２０が関与していることを示唆する証拠には、アテローム性動脈硬化病変、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑液、およびヒトアテローム性動脈硬化症血管におけるＩＬ−２０およびその受容体両方の発現増加が含まれる。さらに、ＩＬ−２０は、アポリポタンパク質Ｅ欠乏マウスのアテローム性動脈硬化を促進し、好中球走化性を誘発し、関節リウマチ（ＲＡ）滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）の遊走を誘発し、血管形成を促進することが明らかになっている。例えば、Ｃｈａｎｇによる米国特許第７７８６２７４号明細書を参照されたい。
【０００４】
ＩＬ−２０の機能を抑制すると、これらの疾患または障害の発症を防いだり、減らしたりすることができることが示されている。例えば、ＩＬ−２０受容体Ｉ（デコイ受容体として）は、コラーゲン誘発関節炎を抑制することが示されている。したがって、抗ＩＬ−２０試薬（ＩＬ−２０に対する抗体など）は、ＩＬ−２０誘発性の疾患を治療および管理するための有望な治療上の選択肢になり得る。
【０００５】
Ｃｈａｎｇによる米国特許第７７８６２７４号明細書には、ＩＬ−２０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ  ７Ｅ）が開示されている。このモノクローナル抗体（ｍＡｂ  ７Ｅ）はマウスｍＡｂであり、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに組換えｈＩＬ−２０を免疫することにより産生される。このｍＡｂ  ７Ｅは、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、細菌誘導性の胃潰瘍および急性腎不全など、さまざまなＩＬ−２０関連の炎症性疾患の治療において有用であることが示されている。
【０００６】
例えば、米国特許第７６１１７０５号明細書には、ｍＡｂ  ７Ｅを用いてＩＬ−２０関連の炎症性疾患を治療することができることが示されている。米国特許第７８３７９９４号明細書および米国特許第８４５４９５６号明細書には、ｍＡｂ  ７Ｅを用いて骨粗鬆症を治療することができることが示されている。米国特許第８０１２４７８号明細書には、ｍＡｂ  ７Ｅを用いて虚血性脳卒中を治療することができることが示されている。
【０００７】
これらの先行技術の結果は、抗ＩＬ−２０抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）が、さまざまなＩＬ−２０関連の疾患を治療および抑制するための有用な治療薬になり得ることを示している。しかし、これらの抗体はマウス抗体であり、治療薬として用いられるとき、免疫応答を誘発することがある。このような免疫応答は、診療所でのこのような抗体の使用において大きな制約となる。最近、Ｃｈａｎｇらによる米国特許第８５９７６４７号明細書では、ｍＡｂ  ７Ｅのヒト化類似体が開示されたが、これは、６つすべてのＣＤＲ配列をｍＡｂ  ７Ｅからヒトの重鎖および軽鎖の可変配列に移植することにより生成された。得られたヒト化抗体は、元のｍＡｂ  ７Ｅと比較して、ＩＬ−２０に対する親和性が低い。
【０００８】
これらすべての先行技術の結果は、抗ＩＬ−２０抗体が有用であり得ることを示している。しかし、よりよい抗ＩＬ−２０抗体が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の実施形態は、抗ＩＬ−２０抗体またはその断片に関する。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはこれらの断片でもよい。このような抗体の断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２などを含んでもよい。本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列に基づいて産生され、そのＣＤＲ配列は、ＩＬ−２０と強く結合する、他の動物（例えば、マウス）からの既知の抗ＩＬ−２０抗体の配列に変異される（例えば、米国特許第７７８６２７４号明細書に開示されているｍＡｂ  ７Ｅ）。このような初期のヒト化抗体は、療法として用いられるとき、元のマウス抗ＩＬ−２０抗体と比較して、ＩＬ−２０に対する親和性が実質的に高く、かつ／または免疫原性が低い抗体となるようにさらに最適化されてもよい。
【００１０】
本発明の１つの態様は、ヒト化抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片に関する。本発明の１つの実施形態によれば、ヒト化抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、重鎖フレームワーク領域、配列ＩＤ番号：１９の配列を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＤ番号：２０の配列を有するＣＤＲＨ２、および配列ＩＤ番号：２１の配列を有するＣＤＲＨ３を含み、重鎖フレームワーク領域において少なくとも９０％の配列相同性を共有する重鎖可変領域またはその相同変異体と、軽鎖フレームワーク領域、配列ＩＤ番号：２２の配列を有するＣＤＲＬ１、配列ＩＤ番号：２３の配列を有するＣＤＲＬ２、および配列ＩＤ番号：２４の配列を有するＣＤＲＬ３を含み、軽鎖フレームワーク領域において少なくとも９０％の配列相同性を共有する軽鎖可変領域またはその相同変異体とを含む。
【００１１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、重鎖フレームワーク領域は、サブグループＩＩＩ（ＶＨ３）のヒト免疫グロブリン重鎖内に、対応するフレームワーク領域の配列を含んでもよく、かつ／または軽鎖フレームワーク領域は、κサブグループＩＩ（Ｖκ２）のヒト免疫グロブリン軽鎖内に、対応するフレームワーク領域の配列を含んでもよい。
【００１２】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖サブグループＩＩＩ（ＶＨ３）可変領域は、ＩＧＨＶ３−７２＊０１（配列ＩＤ番号：２）またはＩＧＨＶ３−６６＊０４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を含んでもよく、かつ／またはヒト免疫グロブリン軽鎖κサブグループＩＩ（Ｖκ２）可変領域は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２（配列ＩＤ番号：６）またはＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列ＩＤ番号：１７）の配列を含んでもよい。
【００１３】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列ＩＤ番号：４の配列を含んでもよく、かつ／またはヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列ＩＤ番号：８の配列を含んでもよい。本発明の１つの実施形態によれば、抗体は、配列ＩＤ番号：４の配列を有する重鎖可変領域および配列ＩＤ番号：８の配列を有する軽鎖可変領域を含むＦＬＢ５Ｍ５である。ＦＬＢ５Ｍ５抗体は、ヒト免疫グロブリンからの定常部を含んでもよい。例えば、ＦＬＢ５Ｍ５は、配列ＩＤ番号：９に示される配列を有する完全な重鎖と、配列ＩＤ番号：１０に示される配列を有する完全な軽鎖と、配列ＩＤ番号：１１および配列ＩＤ番号：１２それぞれに示される対応するコード配列とを有してもよい。
【００１４】
本発明の上述の実施形態のいずれかにおいて、抗ＩＬ−２０抗体は、ＦＬＢ５Ｍ５（ｈＦＬＢ５Ｍ５とも呼ばれる）などのヒト化モノクローナル抗体を含んでもよい。ＦＬＢ５Ｍ５は、その親マウス抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体７Ｅ（ｍＡｂ  ７Ｅ）に対して、相補性決定領域（ＣＤＲ）に３つの変異アミノ酸を持ち、ヒトＶκ２の軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸に対して、軽鎖フレームワーク領域の５つの変異アミノ酸を持つヒト化モノクローナル抗体である。ＦＬＢ５Ｍ５は、ＩＬ−２０に対する結合特異性を保持するだけでなく、ｍＡｂ  ７Ｅよりも優れた予想外のＩＬ−２０に対する結合親和性も有する。また、ＦＬＢ５Ｍ５は、臨床応用において、ｍＡｂ  ７Ｅよりもヒト宿主に対する免疫原性が低い。
【００１５】
本発明の別の態様は、ＩＬ−２０関連の疾患を治療または防止するための方法に関する。本発明の１つの実施形態による方法は、上記の実施形態のいずれか１つによる有効量のヒト化抗体、あるいはそのｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を、これらを必要とする対象に投与するステップを含んでもよい。
【００１６】
上記の実施形態のいずれかによれば、ＩＬ−２０関連の疾患は、炎症性疾患、骨粗鬆症、癌、脳卒中および腎不全からなる群から選択される１つまたは複数の疾患でもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】重鎖可変領域（ＶＨ領域）におけるｍＡｂ  ７Ｅ（配列ＩＤ番号：１）、ヒト相同体（ＩＧＨＶ３−７２＊０１）（配列ＩＤ番号：２）、ＨＨ１２（配列ＩＤ番号：３）およびＦＬＢ５Ｍ５（配列ＩＤ番号：４）のアミノ酸の配列比較を示す図である。
【００１８】
【図２】軽鎖可変領域（ＶＬ領域）におけるｍＡｂ  ７Ｅ（配列ＩＤ番号：５）、ヒト相同体（ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２）（配列ＩＤ番号：６）、ＨＨ１２（配列ＩＤ番号：７）およびＦＬＢ５Ｍ５（配列ＩＤ番号：８）のアミノ酸の配列比較を示す図である。
【００１９】
【図３】重鎖可変領域（ＶＨ領域）におけるｍＡｂ  ７Ｅ（配列ＩＤ番号：１）、ヒト相同体（ＩＧＨＶ３−６６＊０４）（配列ＩＤ番号：１５）およびＤＤ１０Ｂ５（配列ＩＤ番号：１６）のアミノ酸の配列比較を示す図である。ＤＤ１０Ｂ５は、ＩＧＨＶ３−６６＊０４に基づく重鎖可変領域を有するヒト化抗体である。
【００２０】
【図４】軽鎖可変領域（ＶＬ領域）におけるｍＡｂ  ７Ｅ（配列ＩＤ番号：５）、ヒト相同体（ＩＧＫＶ１−３９＊０１）（配列ＩＤ番号：１７）およびＤＤ１０Ｂ５（配列ＩＤ番号：１８）のアミノ酸の配列比較を示す図である。ＤＤ１０Ｂ５は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１に基づく重鎖可変領域を有するヒト化抗体である。
【００２１】
【図５】ｍＡｂ  ７Ｅのアミノ酸と図１〜図４に示すさまざまなヒト相同体の配列比較をまとめたものである。
【００２２】
【図６】各種抗体：ｍＡｂ  Ｅ７、ＦＬＢ５およびＦＬＢ５Ｍ５によるＩＬ−２０誘発性増殖の抑制の結果を示す図である。
【００２３】
【図７Ａ】ラット関節リウマチモデルにおいて、異なる用量（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇ）のｈＦＬＢ５Ｍ５を用いて処理し、陽性対照としてＥｎｂｒｅｌ（６ｍｇ／ｋｇ）を用いた処理と比較した関節炎（関節炎スコア（ＡＳ）で評価）の防止の結果を示す図である。
【００２４】
【図７Ｂ】ラット関節リウマチモデルにおいて、異なる用量（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇ）のｈＦＬＢ５Ｍ５を用いて処理し、陽性対照としてＥｎｂｒｅｌ（６ｍｇ／ｋｇ）を用いた処理と比較した関節炎の防止の結果（後肢の厚さで評価）を示す図である。
【００２５】
【図７Ｃ】ラット関節リウマチモデルにおいて、異なる用量（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇ）のｈＦＬＢ５Ｍ５を用いて処理し、陽性対照としてＥｎｂｒｅｌ（６ｍｇ／ｋｇ）を用いた処理と比較した関節炎（体重で評価）の防止の結果を示す図である。
【００２６】
【図８】ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５のＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３における３つの重要な残基のアラニン置換の結果を示す。結果は、ＣＤＲＨ３のＷ１００が重要であることを示しており、その理由は、この位置でのアラニン置換が両方の抗体（ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５）の結合親和性を実質的に低下させるためである。ＣＤＲＬ３では、Ｆ９４がＱ９０よりも重要であるようである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
他に定義されていない限り、本明細書において用いられる科学用語および技術用語は、当業者に通常理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により要求されない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。本明細書において用いられる略記のリストは次の通りである：Ａｂ：抗体；ＢａＦ３：マウス前駆体Ｂ細胞；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＣＨ：重鎖定常部ドメイン；ＣＬ：軽鎖定常部ドメイン；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＩＬ−２０：インターロイキン−２０；ＬＴＭ：ルックスルー突然変異誘発；ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応；ＰＴＨ：後肢の厚さ；ＡＳ：関節炎スコア；ＲＰＭＩ培地：ロズウェルパーク記念研究所培地；ｓｃＦｖ：単鎖可変断片；ＳＤラット：スプラーグドーリーラット；ＶＬ：軽鎖可変ドメイン；ＶＨ：重鎖可変ドメイン。
【００２８】
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）に用いられる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様にしたがって、または当技術分野において一般に行われる通り、または本明細書に記述の通り実施される。これらの技術および手順は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法にしたがって、一般的な各種参考文献、および本明細書全体にわたって引用および議論される、より具体的な参考文献に記載の通り実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照されたい。
【００２９】
本明細書において用いられるとき、用語「抗体」は、一般に、大まかに免疫グロブリン、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの活性断片を指す。断片は、同種抗原（すなわち、ＩＬ−２０またはＩＬ−２０の断片）に結合するという点で活性があってもよく、または、生物学的に機能するという点で活性があってもよい。本発明の抗体は、当技術分野において既知の技術を用いるキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体でもよい。
【００３０】
本明細書において用いられるとき、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体の最小限の部分が他のヒト抗体に導入される抗体を指す。
【００３１】
本明細書において用いられるとき、用語「ヒト抗体」は、実質的にタンパク質のあらゆる部分がヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、配列変化または差異はわずかである抗体を指す。
【００３２】
抗原結合部位は、一般に、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）免疫グロブリンドメインによって形成され、ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲ）と呼ばれる６つの表面ポリペプチドループによって形成される抗原結合部位を伴う。ＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）およびＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）にはそれぞれ、フレームワーク領域（ＦＲ）と共に３つのＣＤＲがある。
【００３３】
用語「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）および後の版によって定義されているように、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の高頻度可変領域を意味する。抗体は、通常、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００３４】
本明細書において「ＣＤＲの組」と呼ぶ用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲの組は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３（ＨＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲを指す）を指し、ＬＣＤＲの組は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲは、可変軽鎖ＣＤＲを指す）を指す。他に記載されていない限り、「ＣＤＲの組」はＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
【００３５】
また、全抗体の断片が抗原に結合可能であることも明らかになっている。結合断片の例には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６）；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４）；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片（Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０）；（ｉｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４−５４６（１９８９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４，Ｈｏｌｔら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０］。これは、ＶＨまたはＶＬドメインからなる。；（ｖ）分離したＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（２つの結合Ｆａｂ断片を含む二価断片）（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）。ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによって結合される。（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）「二重特異性抗体」（遺伝子融合により形成される多価または多特異性断片）（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８）。
【００３６】
Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは二重特異性抗体分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを結合するジスルフィド架橋を取り込むことにより安定化されてもよい（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニ抗体が作製されることもある（Ｈｕ，Ｓ．ら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１）。結合断片の他の例はＦａｂ’であり、これは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が加えられることによりＦａｂ断片とは異なっており、抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステイン、および定常部ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨを含む。
【００３７】
酵素、パパインにより抗体を消化すると、「Ｆａｂ」断片としても知られる同一の２つの抗原結合断片と、抗原結合活性はないが、結晶化する能力を有する「ＦＣ」断片が生じる。酵素、ペプシンにより抗体を消化すると、抗体分子の２本の腕は結合したままで、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【００３８】
本明細書において用いられるとき、「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小限の断片を指す。本明細書において用いられるとき、「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常部ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指す。用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
【００３９】
本発明の実施形態は、ヒト化抗ＩＬ−２０抗体またはその断片に関する。本発明の抗体は、分子生物学的技術を用いて産生されるモノクローナル抗体である。これらの抗体の断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、キメラ抗体などを含んでもよい。米国特許第７７８６２７４号明細書に開示されているｍＡｂ  ７Ｅと比較して、本発明の抗体は、療法として用いられるとき、ＩＬ−２０に対する高い親和性および／または低い免疫原性を示す。
【００４０】
治療法において、非ヒト抗体の使用における主要な制約は、これらの抗体が望まれていない免疫応答を誘発する恐れがあるという点であるため、本発明の発明者らは、ヒト免疫グロブリン配列から出発することにより、よりよい抗ＩＬ−２０抗体の設計に着手した。具体的には、本発明の抗体は、ヒトフレームワーク配列から出発して産生される。次に、これらのヒト抗体フレームワーク配列は、ＩＬ−２０結合親和性を有するように改変される。改変は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を変えるものである。ランダム変異誘発およびランダムスクリーニング、ファージディスプレイおよびファージパニング、または既知の抗ＩＬ−２０抗体からのＣＤＲ配列の移植を含む、当技術分野において既知の任意の方法を用いてＩＬ−２０結合部位を形成してもよい。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、例えば、選択される免疫グロブリン配列は、ｍＡｂ  ７Ｅなど、既知の抗ＩＬ−２０抗体からＣＤＲ配列を取り込むことにより、ＩＬ−２０結合親和性が与えられてもよい。例としてｍＡｂ  ７Ｅを用いて、以下に、ヒトフレームワーク配列を有するが、ｍＡｂ  ７ＥのＣＤＲ配列を含む抗体の産生に関するいくつかの具体例を説明する。しかし、他の抗ＩＬ−２０抗体からのＣＤＲ配列を用いて、同様の抗体が産生されてもよいことを当業者なら理解するであろう。ＣＤＲ移植の直接産物はキメラ抗体であり、これは、ヒトフレームワーク配列、および別の源からのＣＤＲ配列（例えば、マウス配列）を含む。
【００４２】
ＣＤＲ移植法を用いて、ＣＤＲ配列を与える抗体のフレームワーク配列と相同なヒト抗体フレームワーク配列から出発するのがよりよいであろう。このような相同配列は、問い合わせ配列として既知の抗ＩＬ−２０抗体フレームワーク配列を用いるコンセンサス配列またはホモロジー検索を用いて同定されてもよい。相同性の高い配列は、標的ＣＤＲ配列の結合親和性を保つ同じフレームワーク構造をもたらすこともあり得る。簡潔には、標的抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）との高い相同性を有するヒト免疫グロブリンサブグループからの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインフレームワーク配列が起点として認識されてもよい。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、重鎖フレームワーク配列は、ＶＨサブグループＩＩＩからでもよく、軽鎖フレームワーク配列は、ＶＬκサブグループＩＩ（Ｖκ２）からでもよい。例えば、本発明の１つの実施形態によれば、ｍＡｂ  ７Ｅのフレームワーク領域との相同性が高いＶＨサブグループＩＩ配列はＩＧＨＶ３−７２＊０１であることが分かり、ｍＡｂ  ７Ｅの対応するフレームワーク領域との相同性が高いＶκ２配列はＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２であることが分かる。ＩＧＨＶ３−７２＊０１とｍＡｂ  ７Ｅの重鎖可変領域との配列比較を図１に示しており、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２とｍＡｂ  ７Ｅの軽鎖可変領域との配列比較を図２に示している。図１および図２において、フレームワーク領域（すなわち、非ＣＤＲ領域）における配列の違いを枠で囲んだ残基として示している。
【００４４】
ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２の配列に基づき、それぞれにおいて、ＣＤＲ配列（すなわち、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３は、標的抗ＩＬ−２０抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）の対応するＣＤＲ配列に変換されてもよい）。これらの変換により、図１および図２にそれぞれ示したキメラ重鎖およびキメラ軽鎖が産生されるであろう。これらのキメラの重鎖および軽鎖を用いて、当技術分野において既知の技術を用い、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を構築してもよい。あるいは、ヒトフレームワーク配列およびマウスＣＤＲ配列は、以下の例で説明するオーバーラップＰＣＲを用いて、単一のステップでｓｃＦｖ断片またはＦｖ断片に構築されてもよい。
【００４５】
さらに別の代替方法において、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片は、まず、ＶＨ領域およびＶＬ領域について同定されたヒトフレームワーク配列（例えば、ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２の配列）に基づいて構築されてもよい。次に、Ｆａｂ断片のＣＤＲ配列を、標的抗ＩＬ−２０抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）の既知のＣＤＲ配列、または標的抗ＩＬ−２０抗体の既知のＣＤＲ配列と実質的に同じ配列に変異することにより、このようなｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片をヒト化抗ＩＬ−２０抗体に次に改変してもよい。
【００４６】
上で述べたように、変異またはＣＤＲ移植は、当技術分野において既知の任意の方法、例えば、部位特異的変異誘発、または変異残基／断片のＰＣＲ取り込み（例えば、オーバーラップＰＣＲ）により行われてもよい。
【００４７】
例として、重鎖の可変配列としてＩＧＨＶ３−７２＊０１、軽鎖の可変配列としてＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２に基づき、ｍＡｂ  ７Ｅからの６つすべてのＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖ断片は、ヒト化抗ＩＬ−２０抗体、ＨＨ１２であり、その重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれ図１および図２に示している。
【００４８】
本発明の実施形態によれば、初期のキメラ抗体（ＨＨ１２など）は、ＩＬ−２０に対するその親和性を改善するためにさらに改変されてもよい。これらの改変は、親和性成熟と呼ばれることもあり、ランダム変異誘発およびランダムスクリーニング、ファージディスプレイおよびファージパニングなど、当技術分野において既知の技術を用いて行われてもよい。これらの親和性成熟は、ＣＤＲ領域および／または非ＣＤＲ領域の残基に関与してもよい。
【００４９】
例として、ｓｃＦｖ断片、ＦＬＢ５Ｍ５（ｈＦＬＢ５Ｍ５とも呼ばれる）がＨＨ１２の親和性成熟によって得られた。ＦＬＢ５Ｍ５は、出発ＨＨ１２抗体または親マウス抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体７Ｅ（ｍＡｂ  ７Ｅ）と比べて、相補性決定領域（ＣＤＲ）に３つのアミノ酸変異を含む。これら３つのアミノ酸変異は、図２に丸で示している。
【００５０】
さらに、ＦＬＢ５Ｍ５は、ヒトＶκ２の軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸と比べて、軽鎖フレームワーク領域に５つのアミノ酸変異を含む。フレームワーク領域の５つのアミノ酸変異は、図２に下線付きの残基として例示した。非ＣＤＲ領域（すなわち、フレームワーク領域）の変異は、ランダム変異誘発によるものでもよい。あるいは、「モデル」マウス抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）の対応するアミノ酸とは異なるフレームワーク領域のアミノ酸残基を、元の「モデル」抗体のアミノ酸と選択的に置き換えてもよい。異なるアミノ酸を元の抗体にあったものに戻す（「復帰突然変異」と呼ぶ）論理的根拠は、フレームワーク領域のこのようなアミノ酸は、抗原結合領域のわずかな立体構造変化によって、抗原の結合に間接的に影響することがあるというものである。ＦＬＢ５Ｍ５のフレームワーク領域の５つのアミノ酸変異は、このような「復帰突然変異」から生じる。
【００５１】
ＦＬＢ５Ｍ５は、軽鎖可変領域のアミノ酸の変異による親和性成熟の産物の一例を代表するものである。他の親和性成熟抗体が同様に得られてもよいことを当業者なら理解するであろう。
【００５２】
ＦＬＢ５Ｍ５は人工的に産生された抗体であるが、驚いたことに、ＩＬ−２０に対する結合特異性を示すだけでなく、自然のｍＡｂ  ７Ｅよりも優れた結合親和性も有することが明らかになった。さらに、ＦＬＢ５Ｍ５はヒト免疫グロブリン配列の大部分を含むため、このヒト化モノクローナル抗体は、ヒト宿主において免疫応答を誘発しにくいことが予想される。したがって、ＦＬＢ５Ｍ５および同様のヒト化抗体は、臨床応用において有望な療法である。
【００５３】
ＦＬＢ５Ｍ５の親和性が向上する発現機序を理解する試みとして、構造活性相関（ＳＡＲ）の調査を実施した。このようなＳＡＲの調査は、アラニンスキャニングなど、当技術分野において既知の任意の技術を用いて実施されてもよい。
【００５４】
このようなＳＡＲの調査から、軽鎖可変ドメインＣＤＲ１に位置するチロシン残基（Ｙ３２）が、ＦＬＢ５Ｍ５におけるＩＬ−２０親和性の増大に重要な役割を果たすことが明らかになった。さらに、このチロシンと他のアミノ酸残基変異の組み合わせが結合親和性を向上させることが明らかになった。
【００５５】
本発明の一部の実施形態は、本発明のヒト化抗体の産生のための方法に関する。ヒト化抗体の産生のための方法は、（１）ヒト化抗体が設計される基礎となるモデルとしてマウスモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）の配列を得るステップと、（２）「モデル」マウスモノクローナル抗体との相同性に基づいてヒトフレームワークドナー抗体配列を選択するステップと、（３）フレームワークドナー抗体配列のＣＤＲ領域の配列をマウスモノクローナル抗体からの対応するＣＤＲ配列と置き換えるステップとを含んでもよい。いくつかの実施形態によれば、方法は、抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲ領域のアミノ酸の変異および／またはフレームワーク領域のアミノ酸を置き換えるステップを含んでもよい、親和性成熟ステップをさらに含んでもよい。フレームワーク領域の変異は、アミノ酸を「モデル」マウスモノクローナル抗体からのアミノ酸と置き換えることによるものでもよい。
【００５６】
例えば、ヒト化抗体の調製において、モデルマウスモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）のアミノ酸配列は、データベースから得られてもよく、または、当技術分野において既知の方法を用いて決定されてもよい。次に、ｍＡｂ  ７Ｅのアミノ酸配列を用いて、ｍＡｂ  ７Ｅフレームワーク領域との相同性が最も高いヒト生殖細胞系列のＶＬおよびＶＨ配列を検索してもよい。ホモロジー検索は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）で入手できるＢＬＡＳＴ（塩基局所配列検索ツール）など、当技術分野において既知の任意の方法を用いて実施することができる。
【００５７】
ｍＡｂ  ７Ｅのヒト相同体の検索により、ＩＧＨＶ３−７２＊０１はｍＡｂ  ７ＥのＶＨの相同体であり、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２はｍＡｂ  ７ＥのＶＬの相同体であることが判明した。ｍＡｂ  ７Ｅと、これらの２つの配列の配列アラインメントを図１（ＶＨ領域）および図２（ＶＬ領域）に示している。図１および図２において、ｍＡｂ  ７Ｅとヒト相同体配列（ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２）の間で異なるフレームワーク領域のアミノ酸を枠内に示している。配列アラインメントを見て分かる通り、フレームワーク領域の違いは比較的わずかであり、これらの相同体配列が抗体のヒト化のよい候補となり得ることを示唆している。
【００５８】
したがって、これら２つのヒト相同体配列が、ヒト化抗体を産生するための塩基配列として用いられる。一例では、ヒト相同体（ＶＨについてはＩＧＨＶ３−７２＊０１、ＶＬについてはＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２）のＣＤＲ領域を、部位特異的変異誘発またはＣＤＲ移植など、当技術分野において既知の方法により、ｍＡｂ  ７Ｅの対応するＣＤＲ領域で置き換えた。ＣＤＲ移植は、例えば、ｃＤＲ領域のオリゴヌクレオチド配列を（例えば、ＰＣＲまたは化学合成により）得て、続いて、適したベクターに連結および／またはクローニングしてフレームワーク領域の残りの配列に連結することによって行われてもよい。ＣＤＲ置換によりヒト化抗ＩＬ−２０抗体、ＨＨ１２を産生した。図１および図２に示す通り、ＨＨ１２は、すべてのヒトフレームワーク配列を保持しながら、マウスｍＡｂ  ７Ｅからの６つすべてのＣＤＲ配列を含む。
【００５９】
ＨＨ１２を調製した後、ＩＬ−２０に対する結合親和性（すなわち、親和性成熟）を最適化するためにさらに改変した。加えて、ヒト宿主におけるその免疫原性の影響を最小限に抑えるために、さらに変異を実施してもよい。まず、ＨＨ１２の結合親和性をＣＤＲ領域の変異により最適化した。変異は、選択した部位（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３の残基）でのランダム変異と、それに続く強いバインダーの選択により行われてもよい。変異をＣＤＲに導入する複数の方法は、放射線、化学変異原およびエラープローンＰＣＲを含め、当技術分野において既知である。このような変異の後、変異をその結合親和性についてスクリーニングする。より強く結合する変異が選択され、この変異に、さらに親和性成熟を実施してもよい。この最適化工程により、図２に丸で示した３つの変異を含む新たな抗体が産生した。
【００６０】
最適化されたＣＤＲ配列を持つ抗体は、ヒト配列のフレームワークアミノ酸の一部をマウス配列のアミノ酸に戻すことによってさらに強化されてもよい。たとえ、フレームワーク領域は、抗原結合に直接関与しなくても、立体構造効果により結合に間接的に影響することがある。図２に示す通り、ＦＬＢ５Ｍ５のフレームワーク領域の５つのアミノ酸（図２の下線部）は、マウスｍＡｂ  ７Ｅ配列に見られるアミノ酸に復帰突然変異した。これらの改変は、順番に、または同時に、すなわち、まずフレームワークを、次にＣＤＲを改変して、または、まずＣＤＲを、次にフレームワークを改変して実施することができる。
【００６１】
これらの変異／最適化の後、よりよい抗体ＦＬＢ５Ｍ５が同定された。ＦＬＢ５Ｍ５において、ＨＨ１２軽鎖フレームワーク領域からの５つのアミノ酸が、マウスモノクローナル抗体７Ｅ（すなわち、Ｉ２Ｆ、Ｑ３Ｖ、Ｙ３６Ｌ、Ｑ４５ＫおよびＬ４６Ｈ）からのアミノ酸で置き換えられ、軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の３つのアミノ酸が変異された（すなわち、Ｓ３２Ｙ、Ｌ５０ＱおよびＤ５５Ｎ）。
【００６２】
図１および図２にＶＨおよびＶＬそれぞれのアラインメント、ｍＡｂ  ７Ｅ、ヒト相同体（ＶＨについてはＩＧＨＶ３−７２＊０１、ＶＬについてはＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２）、ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５のなかのアミノ酸配列をまとめた。図２において、ＣＤＲ領域のＦＬＢ５Ｍ５およびＨＨ１２が異なるアミノ酸を四角で囲っており、フレームワーク領域のアミノ酸に下線を引いている。
【００６３】
ＣＤＲの３つの変異（図２のＣＤＲ領域の丸で囲った残基）が親和性成熟から有益であることが判明し、軽鎖ＣＤＲ−１の１つの変異（セリンからチロシン）が特に有益であることが判明した。
【００６４】
表１に、親和性成熟によって生じるＣＤＲ領域のいくつかの変異におけるＩＬ−２０結合特性（ｋａ：会合速度；ｋｄ：解離速度；ＫＤ：解離定数（すなわち、親和性の反対））を示す。これらの結合パラメータは、以下で説明するＥＬＩＳＡアッセイまたはＢＩＡＣｏｒｅ結合アッセイなど、当技術分野において既知の任意の方法を用いて得られてもよい。
【表１】
0006358763.tif 000002
【００６５】
表１のデータから、ＣＤＲＨ３の変異は、ＩＬ−２０結合親和性においてあまり効果を生じないと結論づけることができる。一方、ＣＤＲＬ１のセリン−３２からチロシン−３２（すなわち、ＣＤＲＬ１の２７Ｅ位）の変異は、ＩＬ−２０結合親和性を大幅に改善した。
【００６６】
復帰突然変異により、ＩＬ−２０に対する結合親和性を向上させることができるＨＨ１２の軽鎖フレームワーク領域内の５つのアミノ酸を同定した。図２において、これらのアミノ酸に下線を引いている。
【００６７】
最後に、ＣＤＲの３つの変異と軽鎖フレームワーク領域内の５つの変異の組み合わせを、１つのヒト化抗ＩＬ−２０抗体、ＦＬＢ５Ｍ５としてすべて発現させた。
【００６８】
抗ＩＬ−２０抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）は、骨粗鬆症（米国特許第７８３７９９４号明細書および米国特許第８４５４９５６号明細書）、虚血性脳卒中（米国特許第８０１２４７８号明細書）、関節リウマチ（米国特許第７７８６２７４号明細書）などを含むさまざまなＩＬ−２０関連の疾患の治療または防止に効果的であることが示されている。したがって、本発明の抗体は、（ｍＡｂ  ７Ｅと比べて）よりよい抗ＩＬ−２０抗体であるが、これらＩＬ−２０関連の疾患または障害の治療または防止に同様に効果的であるはずである。
【００６９】
本発明の一部の実施形態は、炎症性疾患など、ＩＬ−２０関連の疾患または障害の治療または防止における本発明の抗体の使用に関する。本発明の実施形態によれば、ＩＬ−２０関連の疾患の治療または防止を必要とする対象は、治療上有効な量の本発明の抗体が与えられる。治療上有効な量は、所望の臨床効果を生じるのに十分な量である。薬剤的に有効な量は、患者の年齢、重量、状態、投与経路、剤形および抗体を含むいくつかの要素に左右されることを当業者なら理解するであろう。しかし、有効量を見出すことは発明的努力を必要としない日常業務であり、当業者なら、必要以上の実験をせずにこのような有効量を見出すことができる。
【００７０】
本発明の実施形態を以下の実施例を用いてさらに例示する。これらの具体例は例示のためだけであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態および変形形態が可能であることを当業者なら理解するであろう。
【００７１】
実施例
ヒト可変領域フレームワーク配列の選択：
ｍＡｂ  ７Ｅフレームワーク領域との相同性が最も高いヒト生殖細胞系列ＶＬおよびＶＨ配列をＩＭＧＴデータベース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））から同定した。ホモロジー検索は、ＢＬＡＳＴまたは同様の方法で実施してもよい。問い合わせ配列として用いられるｍＡｂ  ７Ｅ可変領域配列は、米国特許第７７８６２７４号明細書などの文献から入手できる。
【００７２】
ＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨ３）のヒト重鎖フレームワーク配列が多くのヒト化抗体においてうまく利用されており、ＶＬ  κサブグループＩＩ（Ｖκ２）のヒト軽鎖フレームワーク配列もよい候補であることが示されている。したがって、ＶＨ３およびＶκ２のサブグループのフレームワーク配列をＶＨおよびＶＬそれぞれのフレームワークの検索のために選択した。これらの検索により、ｍＡｂ  ７Ｅの対応する重鎖および軽鎖フレームワーク配列と最も相同なＶＨおよびＶＬ配列として、ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２がそれぞれ同定された。
【００７３】
図１に示す通り、ＩＧＨＶ３−７２＊０１重鎖フレームワーク領域の配列は、１９個のアミノ酸（枠で囲んだ残基）でｍＡｂ  ７Ｅの配列とは異なっており、これは、２３．４５％（フレームワーク領域の全残基８１のうち１９）の差異に対応する。図２に示す通り、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２軽鎖フレームワーク領域の配列は、１０個のアミノ酸（枠で囲んだ残基）でｍＡｂ  ７Ｅの配列とは異なっており、これは、１３．１６％（フレームワーク領域の全残基７６のうち１０）の差異に対応する。
【００７４】
フレームワーク領域のこの程度の差異でも、ｍＡｂ  ７ＥからのＣＤＲ配列をＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２配列に移植することによって産生されたｓｃＦｖ（ＨＨ１２）は、ＩＬ−２０に対して比較的良好な親和性を有する（ＫＤ＝２．６８×１０−９Ｍ）（比較として、ｍＡｂ  ７Ｅ、ＫＤ＝７．８１×１０−１０Ｍ）（下表２参照）。これらの結果は、フレームワーク領域が、ＣＤＲ領域の立体構造に影響せずに比較的大きな差異に耐えられることを示唆する。
【００７５】
これら２つの配列、ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２を、ＩＬ−２０に対するヒト化抗体の構築の例として用いる。しかし、相同性の高い他の同様の配列も用いることができることを当業者なら理解するであろう。他の配列の例は、例えば、ヒトＩＧＨＶ３−６６＊０４（図３）およびヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（図４）を含んでもよい。これらの例の相同性を図５の表に示す。
【００７６】
これらの具体例は例示のためだけであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを当業者なら理解するであろう。モデル抗体の相同配列を検索するためのホモロジー検索方法およびヒト免疫グロブリンライブラリ（ここで、フレームワーク領域はヒト配列に置き換えられる）の利用は、通常の技術のみ必要とし、当業者なら所望の目的に適した相同配列を同定できるであろう。任意の同様の相同なヒト配列を用いてもよい。好ましくは、これらのヒト配列は、モデル抗体（例えば、７Ｅ）のフレームワーク領域に高い相同性を有する。さらに、自然に存在するヒト重鎖または軽鎖の可変配列と実質的に相同な変異体配列（すなわち、「相同変異体」）も用いることができる。例えば、相同変異体は、ヒト重鎖または軽鎖の可変配列との９０％以上（例えば、９３％、９５％、９８％または９９％）の同一性を有してもよい。
【００７７】
ＨＨ１２  ｓｃＦｖの構築およびディスプレイ：
選択したヒト重鎖および軽鎖可変領域相同体（例えば、ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２）に基づいて、抗ＩＬ−２０抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）は、既知の抗ＩＬ−２０抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅ）からの既知のＣＤＲ配列を相同なヒト重鎖および軽鎖可変配列に移植することにより構築されてもよい。以下の実施例では、ｍＡｂ  ７ＥからのＣＤＲ配列を用いる。しかし、任意の抗ＩＬ−２０抗体からのＣＤＲ配列を用いてもよいことを当業者なら理解するであろう。
【００７８】
この特定の実施例では、ｓｃＦｖ断片を産生した。ｓｃＦｖ断片（ＨＨ１２と呼ぶ）は、ＩＧＨＶ３−７２＊０１およびＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２それぞれからの完全なヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列、ならびにｍＡｂ  ７Ｅからの６つの完全なマウスのＣＤＲ配列からなる。この実施例において、ＨＨ１２  ｓｃＦｖ構築物はオーバーラップ伸長ＰＣＲにより構築した。まず、オーバーラップ配列を有するオリゴヌクレオチドを調製した。次に、オリゴヌクレオチドの等モルの混合物（例えば、０．４μＭの最終濃度）を、０．５μｌのＰｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌのＰｆｘ５０緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、メーカーの手順にしたがってＰＣＲで構築した。
【００７９】
オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いてＨＨ１２  ｓｃＦｖ構築物を構築した後、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第２のＰＣＲを実施し、５′ＳｆｉＩおよび３′ＮｏｔＩ制限部位を取り込んだ。これにより、改変されたファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）への方向性サブクローニングのための５’末端および３’末端に所望の制限部位を持つ全長のＨＨ１２  ｓｃＦｖ構築物を産生した。このベクターは、ＨＨ１２  ｓｃＦｖの産生に用いられてもよい。
【００８０】
復帰突然変異：
全長の抗体をｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ２９３細胞中で発現させるために、プラスミドｐＴＣＡＥ８．３を可変領域のサブクローニングに用いた。このプラスミドは、ヒトκＣＬ領域およびヒトγＣＨ領域をコードするＤＮＡ断片を含む。可変領域の変異については、ＰＣＲを用いて個々のオリゴヌクレオチドを合成し、所望の変異をコードした。これらのオリゴヌクレオチドは、ＨＨ１２テンプレートからのＰＣＲプライミングに十分なオーバーラップを含む。次に、ＰＣＲ産物をゲル精製した。次に、精製したＰＣＲ産物の等モルの一定分量をメガプライムＰＣＲのために合わせ、全長のＶＬ（または、変異が重鎖の場合はＶＨ）を再生した。次に、所望の変異を含む全長の抗体を発現するために、全長のＶＬ断片をｐＴＣＡＥ８．３ベクターにサブクローニングした。
【００８１】
ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）ライブラリ構築：
ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ）は、標的ペプチドセグメントの選択したアミノ酸のコンビナトリアル変異を同時に評価および最適化することができる多次元的な変異誘発である。ＬＴＭは、ＣＤＲ配列の最適化にうまく利用できた。変異誘発工程は、通常、１つまたは複数のＣＤＲドメインに焦点を合わせ、抗原結合におけるアミノ酸側鎖の相乗的な寄与を含めた寄与を調査する。Ｒａｊｐａｌら「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，１０２（２４），ｐ．８４６６−８４７１，２００５を参照されたい。
【００８２】
ＬＴＭライブラリを作成するために、個々のオリゴヌクレオチドを合成し、各ＣＤＲ位の各アミノ酸置換をコードした。各オリゴヌクレオチドは、ＨＨ１２テンプレートからのＰＣＲプライミングに十分なオーバーラップを含む。個々のＣＤＲに対応するＬＴＭオリゴヌクレオチド混合物を含むＰＣＲを用いてＬＴＭ置換ＣＤＲ断片を増幅した。次に、これらのＰＣＲ断片をゲル精製し、精製した断片の等モルの一定分量をメガプライムＰＣＲのために合わせ、全長の可変領域を再生した。これらの全長の可変領域をｐＣＡＮＴＡＢ５ｅファージミドベクターに挿入した。連結したＤＮＡ（ファージミド）をＥ．ｃｏｌｉのＴＧ１細胞に電気穿孔により導入し、ライブラリストックを作成した。
【００８３】
ファージの調製およびファージ抗体ライブラリの選択
バイオパニングを行ってファージ（ＬＴＭ）ライブラリを選択するために、上記のＥ．ｃｏｌｉのライブラリストックを対数期まで増殖した。ｓｃＦｖを示すファージ粒子を、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）で感染させて救出し、２ＹＴＡＫ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ）中、３０℃で一晩増幅した。ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のＰＥＧ８０００／２．５ＭのＮａＣｌ）で沈殿させ、次に、ＰＢＳに再懸濁した。以下で説明するビオチン化ＩＬ−２０およびストレプトアビジン被覆常磁性ビーズＭ２８０（Ｄｙｎａｌ）を用いてライブラリを選択した。
【００８４】
ＬＴＭライブラリを選択するために、４．０×１０−８Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、１．０×１０−１２Ｍおよび１．０×１０−１３Ｍの濃度のビオチン化ＩＬ−２０を選考ラウンド１、２、３、４および５のそれぞれに用いた。ファージおよびビオチン化ＩＬ−２０抗原の混合物を室温で１時間、穏やかに回転し、５０〜１００μｌのストレプトアビジン被覆Ｍ２８０磁性ビーズを５分間用いてビオチン化ＩＬ−２０抗原に結合したファージを回収した。ファージを回収後、Ｄｙｎａｌ製磁性粒子選別機を用いて、ビーズを合計１０回洗浄した（４×ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、２×ＰＢＳＭ（２％脱脂粉乳を含む）、４×ＰＢＳ）。３回目、４回目、５回目の洗浄は、１．４μＭのＩＬ−２０（非ビオチン化）と競争させて実施した。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を３０分間用いて順次インキュベーションすることにより、結合したファージをビーズから溶出させた。溶出液を合わせ、０．５ｍｌの１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和し、溶出液の半分を用いて対数期のＥ．ｃｏｌｉのＴＧ１に感染させた。結合、回収、洗浄、溶出、およびＥ．ｃｏｉｌの再感染を所望のサイクル数繰り返した。
【００８５】
ＨＨ１２変異体の発現および親和性測定
ＨＨ１２のＶＨ鎖およびＶＬ鎖ならびにその変異をコードする遺伝子をｐＴＣＡＥ８．３発現ベクターに挿入してｓｃＦｖ構築物を産生した。ｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ０を、構築物を用いてトランスフェクトした。ベクターを、リポフェクタミン２０００により、添付の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にしたがって宿主細胞にトランスフェクトした。プールした上清から全長のｓｃＦｖを精製した後、競合ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢＩＡＣｏｒｅアッセイを用いてエピトープ特異性および結合親和性を検出および評価した。
【００８６】
有益なコンビナトリアルクローン
上述の実験から、依然としてＩＬ−２０に結合できる変異抗体が同定されるであろうが、一方で、ＩＬ−２０に対する結合親和性を失った変異は同定されないであろう。結果の解析、ＨＨ１２軽鎖ＣＤＲ領域の３つの変異が、ＩＬ−２０に対する結合が強化された抗体を産生したことが明らかである。これら３つの変異には、Ｓ３２Ｙ（ＣＤＲＬ−１内）、Ｌ５０Ｑ（ＣＤＲＬ−２内）およびＤ５５Ｎ（ＣＤＲＬ−２内）が含まれ、これらは、図２に丸で囲った残基として示している。
【００８７】
また、これらの結果は、ファージ集団の最も強いバインダーに有利になる傾向があるファージパニングによって選択されないように、ＣＤＲ領域の他の残基での変異によって、おそらく、親和性が比較的低い抗体が産生された可能性があることも示唆する。したがって、ＣＤＲのこれらの他のアミノ酸は、ＩＬ−２０との結合相互作用に比較的適しており、大幅な改善は、これらの他の位置での置換では実現されない可能性がある。
【００８８】
ＣＤＲ領域の３つの「改善された」置換に加えて、ファージディスプレイ−バイオパニング工程から同定された最良の抗体、ＦＬＢ５Ｍ５も、ＨＨ１２フレームワーク領域に５つの有益な変異を含む。これら５つのアミノ酸は、ＨＨ１２の残基からｍＡｂ  ７Ｅの対応する残基に戻って変異されたことが分かる（すなわち、復帰突然変異）。これら５つのアミノ酸は、Ｆ２、Ｖ３、Ｌ３６、Ｋ４５およびＨ４６であり、図２に示す通り、すべて軽鎖の可変配列内にある。復帰突然変異により、よりよいバインダーが産生されたことは、フレームワーク領域のこれらの残基がＩＬ−２０への結合に間接的に寄与することを示唆する。これらの残基は、おそらく、ＣＤＲ領域の適切な構造の維持に寄与する。
【００８９】
ＬＴＭライブラリのパニングから同定された抗体、ＦＬＢ５Ｍ５は、表２に示す通り、（ｍＡｂ  ７Ｅと比較して）より強くＩＬ−２０に結合することが分かった。また、この抗体は、図６に示す通り、よりよい治療効果を有する。この知見（すなわち、ヒト化抗体が自然抗体よりも優れていること）は驚くべきであり、その理由は、ｍＡｂ  ７Ｅが免疫システムによって産生される自然抗体であるからである。免疫システムは、抗原と結合する「最適化された」抗体の産生におけるその効率で知られている。したがって、抗体のヒト化は、通常、標的抗原との結合の点で劣る抗体を産生すると予想される。
【００９０】
重鎖可変領域配列（配列ＩＤ番号：４）および軽鎖可変領域配列（配列ＩＤ番号：８）をそれぞれ図１および図２に示した。全重鎖配列（ヒト免疫グロブリンからの定常部を含む）および全軽鎖配列（定常部を含む）の一例をそれぞれ配列ＩＤ番号：９および配列ＩＤ番号：１０として示した。一方、配列ＩＤ番号：９および配列ＩＤ番号：１０をコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ対応する配列ＩＳ番号：１１および配列ＩＤ番号：１２として示した。
【００９１】
アラニンスキャニングによるＣＤＲ領域の重要な残基
ＬＴＭライブラリの上記ファージパニングは、最適化された（すなわち、より強いバインダー）抗体を同定できる。しかし、このファージパニング法は、ＣＤＲ領域のある特定のアミノ酸の重要性を意味するのみであり、これらの位置で置換が起きたときにより強いバインダーがないことから類推される通りである。ＩＬ−２０の結合に対するＣＤＲ領域の各種アミノ酸側鎖の寄与を明確に評価するために、アラニンスキャニングを実施してＣＤＲ領域の個々のアミノ酸をアラニンで置き換えた。元のアミノ酸側鎖が結合にとって重要な場合、このようなアラニン置換により、結合親和性は低下するであろう。このような例示的な構造活性相関（ＳＡＲ）の調査結果を図５に示した。
【００９２】
図８は、アラニン置換により産生した抗体の結合アッセイの結果を示す。ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５のＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の３つの残基が重要であることが分かる。具体的には、ＣＤＲＨ３のＷ１００が重要であり、その理由は、この位置でのアラニン置換が両方の抗体（ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５）の結合親和性を実質的に低下させるためである。ＣＤＲＬ３では、Ｆ９４がＱ９０よりも重要であるようである。
【００９３】
また、他の位置でのアラニン置換が、ＩＬ−２０との結合において著しい変化を生じないことも分かった。
【００９４】
ＩＬ−２０結合活性
精製した各抗ＩＬ−２０抗体のヒトＩＬ−２０結合速度を表面プラズモン共鳴測定により、ＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ１００バイオセンサー装置を用いて推定した。抗ＩＬ−２０  Ａｂを抗ヒトＩｇＧ固定化ＣＭ５センサーチップ上で捕捉した。抗ヒトＩｇＧの固定化量は約９，０００〜１０，０００ＲＵ、抗ＩＬ−２０抗体の捕捉量は約３５０〜４００ＲＵであった。結合は、さまざまな希釈度のＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＢＩＡ認定）中、３０μｌ／分の一定流量のＩＬ−２０で６０秒間実施した。解離は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中を４８０秒間通過させて実施した。表面の再生は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０／１．５（５０：５０）を４０秒間感染させて実施した。
【００９５】
各抗ＩＬ−２０抗体のＩＬ−２０親和性は、ＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０により提供される事前に定義されたモデル（１：１結合）を用いて、親和性結合カーブフィットから計算した。ｍＡｂ  ７Ｅ、ＨＨ１２およびＦＬＢ５Ｍ５の結合親和性データを表２にまとめた。表２のデータを見て分かる通り、ＨＨ１２は、ｍＡｂ  ７ＥよりもＩＬ−２０に対する親和性が低いが、ＦＬＢ５Ｍ５は、ｍＡｂ  ７Ｅよりも親和性が高い（すなわち、ＫＤが低い）。
【表２】
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【００９６】
人工抗体、ＦＬＢ５Ｍ５が、ｍＡｂ  ７ＥとＩＬ−２０の間の結合よりも数倍強くＩＬ−２０に結合することは全く予想外である。ｍＡｂ  ７Ｅは、マウス免疫システムにより産生される自然抗体である。各種サイトカインとヘルパー細胞の共同作用により、免疫システムは、抗原と結合する最適化された抗体の産生におけるその効率で知られている。したがって、自然抗体のヒト化は、しばしば「最適でない」抗体を産生し、すなわち、ヒト化抗体は通常、元の抗体よりも親和性が低い（例えば、米国特許第８５９７６４７号明細書を参照）。
【００９７】
ＩＬ２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ  ＢａＦ３増殖アッセイ
ＩＬ−２０はｐｌｅｉｔｒｏｐｉｃサイトカインであり、さまざまな炎症性疾患および他の障害に関与することが示されている。また、ＩＬ−２０の機能を抑制すると、さまざまなＩＬ−２０関連の疾患および障害を防いだり、減らしたりすることができることが示されている。本発明の抗体は、非常に高い親和性でＩＬ−２０に結合する。したがって、本発明の抗体は、ＩＬ−２０関連の疾患または障害の治療または防止のための療法としても有用であるはずである。
【００９８】
本発明の一部の実施形態は、ＩＬ−２０に関連する疾患を治療または防止するための方法に関し、この疾患は、例えば、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、骨粗鬆症、癌、脳卒中および腎不全、エストロゲン欠乏（例えば、閉経期）、アンドロゲン欠乏症（例えば、男性更年期）または癌誘発性の骨溶解を含んでもよい。本発明の１つの実施形態による方法は、このような治療を必要とする対象に有効量の本発明の抗体を投与するステップを含んでもよい。
【００９９】
この実施例において、本発明の抗体がＩＬ−２０誘発性の細胞増殖を抑制または低下する能力を試験した。簡潔には、ＢａＦ−３（ＩＬ−２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ）細胞を標的として産生するために、全長のヒトＩＬ−２０受容体複合体ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒ２を用いて安定にトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞。Ｂａ／Ｆ３細胞は、初期のリンパ芽球様細胞系譜のマウス前駆体Ｂ細胞であり、その生存率および増殖はＩＬ−３に依存する。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清および１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含むＲＰＭＩ培地内で培養されてもよい。ヒト組換えＩＬ−２０は、これらの細胞の増殖を誘導することができる。このＩＬ−２０誘発性の細胞増殖系を用いて、本発明の抗体がＩＬ−２０に結合することによってＩＬ−２０の機能を抑制する能力を評価することができる。
【０１００】
増殖アッセイにおいて、ＢａＦ−３（ＩＬ−２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ）細胞を、５％ＣＯ２のインキュベーター内でＩＬ−３なしで３７℃で２時間、マイクロタイタープレートのウェル内にて培地に１０４細胞／ウェルで播種した。次に、プレインキュベートした３００ｐＭのヒトサイトカインＩＬ２０を用い、試験抗体の量を増やして（１０００〜０．１５ｎＭの３倍希釈）、ＢａＦ−３（ＩＬ−２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ）細胞をさらに７２時間培養した。この実施例において、３つの抗体、ｍＡｂ  ７Ｅ、ＦＬＢ５およびＦＬＢ５Ｍ５を試験した。ＦＬＢ５は、ＨＨ１２と比較して、図２に示したＣＤＲ領域で３つのアミノ酸を変えた抗体である。しかし、ＦＬＢ５は、ＨＨ１２のフレームワーク領域と同じフレームワーク領域を含む。言い換えれば、ＦＬＢ５には、ＦＬＢ５Ｍ５と比較して、フレームワーク領域に５つの「復帰突然変異した」アミノ酸がない。
【０１０１】
インキュベーション後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（比色／ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ増殖指示薬）を培養液に加え、細胞をさらに６時間インキュベートした。次に、マイクロタイタープレートを蛍光光度計で励起５３０ｎｍおよび発光５８０ｎｍで読み取った。蛍光の読み取り値をＳｉｇｍａＰｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析し、抗ヒトＩＬ２０抗体の最大半量応答（ＥＣ５０）を求めた。
【０１０２】
図６に増殖アッセイの結果を示す。図６に示す通り、抗体ＦＬＢ５は、ＩＬ−２０誘発性の増殖の抑制においてｍＡｂ  ７Ｅと同じか、またはｍＡｂ  ７Ｅよりもわずかに優れている一方、ＦＬＢ５Ｍ５はｍＡｂ  ７Ｅよりもかなり優れている。改変された抗体が自然に産生した抗体よりも強い結合を有することは予想外である。
【０１０３】
ｍＡｂ  ７Ｅと比較したＦＬＢ５Ｍ５のＥＣ５０値を表３に示す。これらのデータは、ＩＬ−２０誘発性の細胞増殖の抑制において、ＦＬＢ５Ｍ５がｍＡｂ  ７Ｅよりも数倍優れていることを示している。やはり、この人工的に作製した抗体が自然抗体ｍＡｂ  ７Ｅよりも効果的であることは予想外である。
【表３】
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【０１０４】
コラーゲン誘発関節炎ラットモデル：
上で述べたように、ＩＬ−２０はｉｍｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓに関与し、ＩＬ−２０に対する抗体が、ｔｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓなどの炎症性疾患を減らすことに効果的であることが示されている。本発明の抗体は、関節炎の治療においても有用であるはずである。これは、ラットのコラーゲン誘発関節炎モデルを用いた試験であった。
【０１０５】
この動物モデルにおいて、６週齢の雄のスプラーグドーリー（ＳＤ）ラットをＩＩ型コラーゲンで０日目と７日目に免疫して関節炎を誘発させた。例えば、ラットを等分のフロイント完全アジュバント、４ｍｇ／ｍｌの熱殺菌した結核菌、および０．０５Ｍ酢酸に可溶化した２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲンを含む乳剤で免疫した。各ラットの背側に、０日目に２００μｌの乳剤を皮内注射した。７日目、ラットの尾の付け根に追加免疫として１００μｌの同じ乳剤を皮下投与した。コラーゲンのない緩衝液（ブランク）を注射したラットを陰性対照（関節炎なし）とした。
【０１０６】
関節炎の発症後（通常１０〜１３日目）、処置を開始した。ラットに週２回投与し、合計で３回注射した。すなわち、すべての処置群の動物の背中に、１０日目、１４日目および１８日目に単回ボーラス皮下注射を行った。処置は、１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｇ）、３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇの用量の抗体、ｈＦＬＢ５Ｍ５で行った。Ｅｍｂｒｅｌ（６ｍｇ／ｋｇ）を処置の陽性対照として用いた。体重（図７Ｃ）、後肢の厚さ（ＰＴＨ）（図７Ｂ）および関節炎スコア（ＡＳ）（図７Ａ）を測定して、抗体の３種類の用量での治療効果を評価した。
【０１０７】
図７Ａに、関節炎スコア（ＡＳ）で評価した試験の結果を示す。図７Ａに示す通り、ＦＬＢ５Ｍ５の投与はＡＳを大幅に低下させ、この抗体が関節炎の症状の軽減に効果があることを示している。ＦＬＢ５Ｍ５抗体は、１ｍｇ／ｋｇでもＡＳの低下に効果がある一方で、３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇでは、この抗体は、陽性対照（６ｍｇ／ｋｇのＥｍｂｒｅｌ）と同様の効果があった。これらの結果は、ＦＬＢ５Ｍ５を関節炎の治療または防止に用いることができることを明確に示している。
【０１０８】
図７Ｂは後肢の厚さのアッセイの結果を示している。図７Ｂに示す通り、ＦＬＢ５Ｍ５の投与は、後肢の厚さを大幅に低減し、この抗体が関節炎の症状の軽減に効果があることを示している。ＦＬＢ５Ｍ５抗体は、１ｍｇ／ｋｇでも後肢の厚さの低減に効果がある一方で、３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇでは、この抗体は、陽性対照（６ｍｇ／ｋｇのＥｍｂｒｅｌ）と同様の効果があった。これらの結果は、ＦＬＢ５Ｍ５を関節炎の治療または防止に用いることができることを明確に示している。
【０１０９】
図７Ｃは体重のアッセイの結果を示している。図７Ｃに示す通り、ＦＬＢ５Ｍ５の投与は、体重を大幅に低減し、この抗体が関節炎の症状の軽減に効果があることを示している。ＦＬＢ５Ｍ５抗体は、１ｍｇ／ｋｇでも体重の低減に効果がある一方で、３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇでは、この抗体は、陽性対照（６ｍｇ／ｋｇのＥｍｂｒｅｌ）と同様の効果があった。これらの結果は、ＦＬＢ５Ｍ５を関節炎の治療または防止に用いることができることを明確に示している。
【０１１０】
関節炎に加えて、ＩＬ−２０に対する抗体は、骨粗鬆症、関節リウマチ、癌、脳卒中または腎不全を含むＩＬ−２０媒介性シグナル伝達経路に関連する疾患の治療に効果的であるが、これらに限定されない。本発明の実施形態によれば、疾患は、骨粗鬆症を含んでもよいが、これは、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）、骨粗鬆症、癌、脳卒中および腎不全、エストロゲン欠乏（例えば、閉経期）、アンドロゲン欠乏症（例えば、男性更年期）または癌誘発性の骨溶解によって引き起こされ得る。これらの疾患の治療に用いることができる抗ＩＬ−２０抗体は当技術分野において既知であり、例えば、Ｃｈａｎｇらによる米国特許第８５９７６４７号明細書を参照されたい。
【０１１１】
本発明は、限られた数の実施形態に関して説明されてきたが、本開示の恩恵を受ける当業者は、本明細書に開示されている本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態が工夫され得ることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006358763.tif 000010
【図７Ａ】
0006358763.tif 000011
【図７Ｂ】
0006358763.tif 000012
【図７Ｃ】
0006358763.tif 000013
【図８】
0006358763.tif 000014
【配列表】
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