(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドであって、前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドが式Ｉ：
【化９】
0006446026.tif 000026
（式中、
Ｘは、Ｎであり、
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、ホスホラミダイトまたは５’側もしくは３’側の１つもしくはそれを超えるヌクレオチドから独立して選択され、
Ｗ３は、非存在、Ｈ、アミン保護基、ホスホラミダイト、ホスホルアミデートエステル、ホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒまたは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸または他の分子コンジュゲートおよび
Ｂは、核酸塩基である）の構造を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記分子コンジュゲートが薬物コンジュゲートである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記アルコール保護基が、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから選択される、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アミン保護基が、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記核酸塩基がプリン塩基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記核酸塩基がピリミジン塩基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
５〜９つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ヌクレオチドの少なくとも２５％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ヌクレオチドの少なくとも５０％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ヌクレオチドの少なくとも７５％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
５〜５０ヌクレオチドの長さである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
１０〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが１０ヌクレオチド未満または８ヌクレオチド未満の長さである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが２’デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロまたは２’−４’メトキシ架橋構造から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
１つまたはそれを超えるホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが完全にホスホロチオエート結合されている、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
１〜３つのリン酸結合を含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドがホスホロチオエート結合されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
場合によりホスホロジアミデート結合である１つまたはそれを超える修飾リン酸結合を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが場合によりホスホロジアミデート結合である修飾リン酸結合によって完全に連結されている、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
１〜３つのリン酸結合を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドがホスホロジアミデート結合されている、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ホスホロジアミデート結合が
【化１０】
0006446026.tif 000027
（式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、ベンジル、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、アルコキシ、アルコール保護基またはアミノ保護基から独立して選択され、および
Ｂは、核酸塩基である）として示される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
少なくとも１つのプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記塩基修飾がカルボキサミドである、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記塩基修飾が、前記プリンのＣ−８位または前記ピリミジンのＣ−５位におけるカルボキサミド部分である、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
１つまたはそれを超えるモルホリノヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも７０％相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド配列が、表１から選択されるヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一または少なくとも７０％相補的である、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列が、表１から選択されるヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に同一または相補的である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記ヒトマイクロＲＮＡが表２から選択される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ヌクレオチド配列が、ヒトｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と少なくとも７０％相補的である、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列が、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と完全に相補的である、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
細胞内のマイクロＲＮＡ活性を低減または阻害するための組成物であって、細胞を請求項１〜３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３５】
前記マイクロＲＮＡが表１もしくは２に記載されているものであるか、またはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／もしくはｍｉＲ−４９９である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞が心臓細胞である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記細胞がインビボまたはエクスビボにある、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
表２のマイクロＲＮＡに関連するか、または表２のマイクロＲＮＡによって媒介される被験体における状態を予防または処置するための、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組成物であって、該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項４０】
前記状態が心臓の状態である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記状態が心肥大、心筋梗塞、心不全、血管損傷、病的心線維症、または表２に記載されている状態である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
非経口投与によって、または心臓組織への直接注射によって投与されることを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記非経口投与が静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテルまたは舌下投与によって投与されることを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９１，７０４号に対する優先権および利益を請求し、その全体が参照によって本明細書により援用される。
【０００２】
本発明は、合成、患者に投与した際の効力、送達効率、標的特異性、安定性および／または毒性において利点を有する修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤のオリゴヌクレオチド化学パターンまたはモチーフは、阻害剤の送達、安定性、効力、特異性および／または毒性プロファイルを改善する可能性があり、治療との関連でＲＮＡ機能を有効にターゲティングするのに必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）を含む修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにこの修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、これらのオリゴヌクレオチドおよび合成中間体の使用方法および合成方法を提供する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、効力、送達効率、標的特異性、安定性および／または毒性において利点を提供するアンチセンス阻害剤である。
【０００５】
一態様では、本発明は、式Ｉ：
【化１】
0006446026.tif 000002
（式中、Ｘは、ＮまたはＳであり、Ｗ１およびＷ２は独立して、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、ホスホラミダイトであり、Ｗ３は独立して、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホラミダイト、ホスホルアミデートエステル、ホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸または本明細書に記載される他のコンジュゲート分子、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒまたは−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートであり、Ｂは、核酸塩基である）の構造を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド（ＣＢＢＮ）を提供する。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、ピリミジン塩基である。他の実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基である。
【０００６】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチド内の２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドの数は、変化し得る。例えば、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドの数は、ヌクレオチドの少なくとも約１０％、ヌクレオチドの少なくとも約２５％、ヌクレオチドの少なくとも約５０％、またはヌクレオチドの少なくとも約７５％であり得る。オリゴヌクレオチドの長さも変化し得る。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、約５〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約１０〜約２５ヌクレオチドの長さであり得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド未満（例えば、約５〜約１０ヌクレオチド）の長さ、または約８ヌクレオチド未満（例えば、約５〜約８ヌクレオチド）の長さであり得る。
【０００７】
オリゴヌクレオチドは、２’デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロまたは２’−４’メトキシ架橋構造から選択される２’修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含み得る。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合および／またはホスホロジアミデート結合などの骨格修飾をさらに含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾を含む。例えば、塩基修飾は、ピリミジン塩基のＣ−５位および／またはプリン塩基のＣ−８位にあり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるモルホリノヌクレオチドを含む。
【０００８】
様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一または相補的なヌクレオチド配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。またさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に同一または相補的なヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲＮＡを模倣するか、またはアンチセンス阻害によってｍｉＲＮＡをターゲティングするように設計され得る。
【０００９】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る担体は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルまたはリポソームを含み得る。一実施形態では、医薬組成物は、水性製剤である。
【００１０】
また別の態様では、本発明は、アンチセンス作用によってＲＮＡを低減または阻害する方法であって、細胞内のｍＲＮＡ標的またはマイクロＲＮＡ標的を低減または阻害することを含む方法を提供する。この方法は、細胞を本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。様々な実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞であり得る。一実施形態では、細胞は、例えば、心臓細胞であり得る。別の実施形態では、細胞をインビボまたはエクスビボでオリゴヌクレオチドと接触させ得る。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、マイクロＲＮＡに関連するか、またはマイクロＲＮＡによって媒介される被験体における状態を予防または処置する方法であって、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡをターゲティングするオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を該被験体に投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態では、非経口投与によって、または心臓組織への直接注射によって医薬組成物を投与する。他の実施形態では、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテルまたは舌下投与によって医薬組成物を投与する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド、または対応するホスホラミダイト、または２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。この方法は、例えば、出発物質としてリボースを使用してメチル４，４−ビスメシルオキシメチル−２−ヒドロキシメチルフラノース誘導体に変換し、続いて、誘導体をグリコシル化することを含む。次いで、グリコシル化物質の２−ヒドロキシメチル基を保護アミンに変換し、次いで、対応する４−メシルオキシメチル基を用いてヌクレオシドのα面でこれを環化して、完全保護アザ二環式ヌクレオシド（これは、標準的な保護基化学反応を介してヌクレオシドホスホラミダイトに容易に変換される）を得る。代替的な合成方法は、２０１４年３月１６日に出願された「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ」という表題のＫｕｒｔ  Ｖａｇｌｅによる米国仮出願（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００１３】
本発明の他の態様および実施形態は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドが式Ｉ：
【化９】
0006446026.tif 000003
（式中、
Ｘは、ＮまたはＳから独立して選択され、
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェート、ホスホラミダイトまたは５’側もしくは３’側の１つもしくはそれを超えるヌクレオチドから独立して選択され、
Ｗ３は、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホラミダイト、ホスホルアミデートエステル、ホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒまたは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートであり、および
Ｂは、核酸塩基である）の構造を有する、項目１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３）
ＸがＮである、項目２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目４）
ＸがＳである、項目２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目５）
前記アルコール保護基が、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから選択される、項目２〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６）
前記アミン保護基が、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）から選択される、項目２〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目７）
前記核酸塩基がプリン塩基である、項目２〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目８）
前記核酸塩基がピリミジン塩基である、項目２〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目９）
５〜９つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有する、項目１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
ヌクレオチドの少なくとも２５％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、項目１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
ヌクレオチドの少なくとも５０％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、項目１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
ヌクレオチドの少なくとも７５％が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである、項目１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１３）
約５〜５０ヌクレオチドの長さである、項目１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１４）
前記オリゴヌクレオチドが約１０〜２５ヌクレオチドの長さである、項目１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１５）
前記オリゴヌクレオチドが１０ヌクレオチド未満または８ヌクレオチド未満の長さである、項目１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１６）
前記オリゴヌクレオチドが２’デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロまたは２’−４’メトキシ架橋構造から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１７）
１つまたはそれを超えるホスホロチオエート結合を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１８）
前記オリゴヌクレオチドが完全にホスホロチオエート結合されている、項目１７に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１９）
１〜３つのリン酸結合を含む、項目１７に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２０）
前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドがホスホロチオエート結合されている、項目１７〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２１）
場合によりホスホロジアミデート結合である１つまたはそれを超える修飾リン酸結合を含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２２）
前記オリゴヌクレオチドが場合によりホスホロジアミデート結合である修飾リン酸結合によって完全に連結されている、項目２１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２３）
１〜３つのリン酸結合を含む、項目２１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）
前記２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドがホスホロジアミデート結合されている、項目２１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２５）
前記ホスホロジアミデート結合が
【化１０】
0006446026.tif 000004
（式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、ベンジル、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、アルコキシ、アルコール保護基またはアミノ保護基から独立して選択され、および
Ｂは、核酸塩基である）として示される、項目２１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６）
少なくとも１つのプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾を含む、項目１〜２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２７）
前記塩基修飾がカルボキサミドである、項目２６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２８）
前記塩基修飾が、前記プリンのＣ−８位または前記ピリミジンのＣ−５位におけるカルボキサミド部分である、項目２６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２９）
１つまたはそれを超えるモルホリノヌクレオチドを含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３０）
ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３１）
前記ヌクレオチド配列が、表１から選択されるヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に同一または相補的である、項目３０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３２）
前記ヌクレオチド配列が、表１から選択されるヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に同一または相補的である、項目３１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３３）
前記ヒトマイクロＲＮＡが表２から選択される、項目３０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３４）
前記ヌクレオチド配列が、ヒトｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に相補的である、項目３０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３５）
前記ヌクレオチド配列が、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と完全に相補的である、項目３４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３６）
式Ｉ：
【化１１】
0006446026.tif 000005
（式中、
Ｘは、Ｎであり、
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェートまたはホスホラミダイトから独立して選択され、
Ｗ３は、Ｈ、アミン保護基、ホスホラミダイト、ホスホルアミデートエステル、ホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒまたは−ＣＯＯＲから独立して選択され、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートであり、および
Ｂは、核酸塩基である）の構造を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目３７）
式Ｉ：
【化１２】
0006446026.tif 000006
（式中、
Ｘは、Ｓであり、
Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェートまたはホスホラミダイトから独立して選択され、
Ｗ３は、ヌル、Ｏ、脂肪酸または他の分子コンジュゲートから独立して選択され、および
Ｂは、核酸塩基である）の構造を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（項目３８）
有効量の項目１〜３５のいずれか一項に記載のヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはそれらの薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
（項目３９）
前記薬学的に許容され得る担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルまたはリポソームを含む、項目３８に記載の医薬組成物。
（項目４０）
前記医薬組成物が水性製剤である、項目３８に記載の医薬組成物。
（項目４１）
細胞内のマイクロＲＮＡ活性を低減または阻害する方法であって、細胞を項目１〜３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目３８〜４０のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
（項目４２）
前記マイクロＲＮＡが表１もしくは２に記載されているものであるか、またはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／もしくはｍｉＲ−４９９である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞が心臓細胞である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞がインビボまたはエクスビボにある、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
表２のマイクロＲＮＡに関連するか、または表２のマイクロＲＮＡによって媒介される被験体における状態を予防または処置する方法であって、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の医薬組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目４７）
前記状態が心臓の状態である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記状態が心肥大、心筋梗塞、心不全、血管損傷、病的心線維症、または表２に記載されている状態である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
非経口投与によって、または心臓組織への直接注射によって前記医薬組成物を投与する、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記非経口投与が静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテルまたは舌下投与によって前記医薬組成物を投与する、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの合成を示す。
【図１−２】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの合成を示す。
【図１−３】図１は、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの合成を示す。
【００１５】
【図２】図２は、ホスホロジアミデート結合によって連結された２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドを示す。
【００１６】
【図３】図３Ａは、例示的なジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトを示す。図３Ｂは、ＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホラミダイト誘導体を示す。図３Ｃは、例示的なＤＭＴｒ−およびトリフルオロ酢酸保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトを示す。図３Ｄは、例示的なＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトを示す。図３Ｅは、例示的なＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトを示す。
【００１７】
【図４−１】図４Ａは、例示的なジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。図４Ｂは、ＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホラミダイト誘導体の合成を示す。図４Ｃは、例示的なＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。図４Ｄは、例示的なＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。
【図４−２】図４Ａは、例示的なジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。図４Ｂは、ＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホラミダイト誘導体の合成を示す。図４Ｃは、例示的なＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。図４Ｄは、例示的なＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトの合成を示す。
【００１８】
【図５】図５Ａは、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）、そのアミノＬＮＡカウンターパートならびに２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオシド（オキソＥＮＡ）およびそのアミノＥＮＡカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。図５Ｂは、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アミノＣＢＢＮ）とそのオキソＣＢＢＮカウンターパートに関する親和性増加（ΔＴｍ、Ｃ／修飾）の比較チャートを提供する。示されているように、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、そのオキソＣＢＢＮカウンターパートよりも大きな親和性／修飾を付与する。加えて、オリゴヌクレオチド内の単一および複数のアミノＣＢＢＮ修飾は、ＬＮＡヌクレオシドのものと同等かまたはそれを超える親和性を付与する。
【００１９】
【図６】図６は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイで測定した場合の、ｍｉＲ−２０８ａ発現に対する様々なｍｉＲ−２０８ａ阻害剤の有効性を示す。化合物Ｍ−１０５９１、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１１９１９およびＭ−１１９２０の活性を測定する。化合物Ｍ−１０５９１は、非ターゲティングコントロールである。化合物Ｍ−１０１０１（混合９ＬＮＡ／７ＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）は、最適化ｍｉＲ２０８ａ阻害剤である。Ｍ１０１０１化合物は、米国特許第８，６４２，７５１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。化合物Ｍ−１０９１９およびＭ−１１９２０は、親化合物（Ｍ−１０１０１）のＬＮＡチミジンがそれぞれ１つまたは２つのアミノＣＢＢＮ残基で置換されている混合ＬＮＡ／ＤＮＡ／アミノＣＢＢＮホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。示されているように、複数のＬＮＡ残基がアミノＣＢＢＮ残基で置換されている化合物Ｍ−１１９２０は、最適化Ｍ−１０１０１化合物のすべての活性を保持する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも１つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドおよびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、この修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、ならびにこれらのオリゴヌクレオチドの使用方法および合成方法を提供する。
【００２１】
様々な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、合成、効力、送達効率、標的特異性、安定性および／または毒性において利点を提供し得る。例示的な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、リガンドおよび／または薬物化合物を架橋部分（例えば、アミン）に結合させることによる細胞または組織のターゲティングについて利点がある新規コンジュゲーション戦略を提供する。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、効力、安定性および／または毒性において治療上の利点を提供する。
【００２２】
一態様では、本発明は、式Ｉ：
【化２】
0006446026.tif 000007
（式中、Ｘは、ＮまたはＳである）の構造を有する２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを提供する。一実施形態では、Ｘは、Ｎである。別の実施形態では、Ｘは、Ｓである。
【００２３】
様々な実施形態では、Ｗ１およびＷ２は独立して、Ｈ、アルコール保護基、リン酸エステル、ホスホロチオエートエステル、ジホスフェートもしくはトリホスフェートまたはホスホラミダイトである。Ｗ３は独立して、ヌル、Ｈ、Ｏ、アミン保護基、ホスホラミダイト、ホスホルアミデートエステル、ホスホルジアミデートエステル、メチル、アルキル、シクロアルキル、カルボキサミド、糖、脂肪酸、他の分子コンジュゲート、−Ｃ１−４（Ｏ）Ｒまたは−ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは、アリール、直鎖状もしくは環状のアルキルもしくはアルケニル、糖、脂肪酸または他の分子コンジュゲート、例えば薬物コンジュゲートである。
【００２４】
様々な実施形態では、アルコール保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから選択される。一実施形態では、Ｗ１およびＷ２はそれぞれ、４，４’−ジメトキシトリチル、アセチル、シリルまたは酸不安定エーテルから独立して選択されるアルコール保護基である。様々な実施形態では、アミン保護基は、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）である。一実施形態では、Ｗ３は、カルボキシベンジル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはトリフルオロアセトアミジルから選択されるアミン保護基である。
【００２５】
様々な実施形態では、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（２’−ＣＢＢＮ）である。
【００２６】
様々な実施形態では、オキソ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが酸素を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（オキソＣＢＢＮ）である。
【００２７】
様々な実施形態では、アミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドまたはアザ−２’−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが窒素を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｎ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（アミノＣＢＢＮ）である。
【００２８】
様々な実施形態では、チオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドは、２’Ｃおよび４’Ｃが硫黄を介して接続されて３原子結合（−Ｃ−Ｓ−Ｃ−）が生じた２’−デオキシ−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（チオＣＢＢＮ）である。
【００２９】
様々な実施形態では、アミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドおよびチオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、それぞれアミノ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドおよびチオ−２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３０】
様々な実施形態では、ロックドヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース環の２’位と４’位との間に２原子結合を有する２’−オキソ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（ＬＮＡ）である。コア糖は、２．５ジオキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン構造を形成する。
【００３１】
様々な実施形態では、ＥＮＡおよびオキソＥＮＡは、ヌクレオシドのリボース環の２’位と４’位との間に３原子結合を有する２’−オキソ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドである。コア糖は、２．６ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン構造を形成する。
【００３２】
様々な実施形態では、アミノＥＮＡおよびアザＥＮＡは、ヌクレオシドのリボース環の２’位と４’位との間に３原子結合を有する２’−アザ−４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドである。コア糖は、６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．１］オクタン構造を形成する。
【００３３】
様々な実施形態では、Ｂは、核酸塩基である。核酸塩基または塩基は、修飾され得るプリンまたはピリミジン塩基であり得る。一実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基である。別の実施形態では、核酸塩基は、ピリミジン塩基である。様々な実施形態では、核酸塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシンまたはそれらの誘導体またはそれらの置換体などの天然ヌクレオシド塩基から選択され得る。加えて、本発明はまた、天然に存在しない核酸塩基の使用を企図する。ある実施形態では、天然に存在しない核酸塩基は、核酸塩基の環原子のいずれかが別の原子で置換されている塩基であり得る。例えば、ＣＨがＮで置換されていてもよいし、またはその逆も同様である。このような修飾は、複数の位置で起こり得る。天然に存在しない塩基の別の例は、天然に存在する塩基の２−置換基および４−置換基が逆転している塩基である。さらなるプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾は、国際公開第２０１２／０６１８１０号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、カルボキシアミノ、カルバモイルまたはカルバミド基などのアミノカルボニルである。様々な実施形態では、修飾は、１つもしくはそれを超えるピリミジン塩基のＣ−５位に、および／または１つもしくはそれを超えるプリン塩基のＣ−８位にある。例示的な核酸塩基としては、限定されないが、９−Ｎ−アデニン、９−Ｎ−グアニン、チミジン、シチジン、ウリジン、５−メチルシトシン、イノシン、５−置換ウリジン、５−置換シトシン、２−アミノアデノシンまたは５−メチルシトシンが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、国際公開第２０１２／０８３００５号および米国特許出願公開第２０１３／０３４５２８８号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているロックドヌクレオチドとして配置され得る。例えば、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドがｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂおよび／またはｍｉＲ−４９９の活性を強力に低減または阻害するようなものであり得る。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つを超える、または３つを超える、または２つを超える連続的な２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するヌクレオチドのストレッチを含有しない。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つを超える連続的な非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するヌクレオチドのストレッチを含有しない。例えば、オリゴヌクレオチドは、わずか１つの存在する連続的な非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有し得る。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、厳密に９つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドおよび７つの非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有する。例えば、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドのパターンは、少なくとも１位、６位、１０位、１３位および１５位が２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドであるようなものであり得る。ある実施形態では、少なくとも１位、５位、１０位および１６位は、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである。ある実施形態では、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位は２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドであり、残りの位置は非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである。他の実施形態では、１位、３位、４位、５位、６位、８位、１０位、１３位、１５位および１６位は２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドであり、残りの位置は非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、１位、４位、５位、７位、９位、１０位、１２位、１４位および１６位は２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドであり、残りの位置は非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである。非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、非ロックドヌクレオチドであり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約５〜５０ヌクレオチドの長さ、約８〜３０ヌクレオチドの長さ、または約１０〜２５ヌクレオチドの長さ、または１２〜１６ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１０ヌクレオチドの長さ、または約５〜約８ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチドの長さ、約９ヌクレオチドの長さ、約１０ヌクレオチドの長さ、約１１ヌクレオチドの長さ、約１２ヌクレオチドの長さ、約１３ヌクレオチドの長さ、約１４ヌクレオチドの長さ、約１５ヌクレオチドの長さ、または約１６ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１６ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さ、約１２ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さ、約１０ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さ、または約８ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、少なくとも３つ、少なくとも５つまたは少なくとも７つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、わずか１つ、２つまたは３つの２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％は、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドから完全に構成されない。例えば、この段落に記載されている実施形態は、アミノ２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドであり得る。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡベースのものであり得、および／または１つもしくはそれを超える核酸修飾、例えば修飾オリゴヌクレオチド骨格または１つもしくはそれを超える修飾ヌクレオシド単位などを用い得る。オリゴヌクレオチドまたは誘導体は、１つもしくはそれを超える一本鎖領域および／または１つもしくはそれを超える二本鎖領域を有し得る。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはリボザイムであり得る。
【００３７】
ある実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０１２／０６１８１０号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているプリンおよび／またはピリミジン塩基修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、一般に、カルボキシアミノ、カルバモイルまたはカルバミド基などのアミノカルボニルである。様々な実施形態では、修飾は、１つもしくはそれを超えるピリミジン塩基のＣ−５位に、および／または１つもしくはそれを超えるプリン塩基のＣ−８位にある。
【００３８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「２’修飾」という用語は、ＯＨ以外の任意の２’基を含む。いくつかの実施形態では、２’修飾は、（置換されていてもよい）Ｏ−アルキル、ハロ、デオキシ（Ｈ）および２’−４’メトキシ架橋ヌクレオチドから独立して選択され得る。例えば、２’修飾はそれぞれ、Ｏ−メチルおよびフルオロから独立して選択され得る。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドはそれぞれ２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドはそれぞれ２’−Ｆを有する。ある実施形態では、１〜約５つの２’位、または約１〜約３つの２’位が修飾されていないままである（例えば、２’ヒドロキシルのように）。
【００３９】
本発明の２’修飾は、小さな炭化水素置換基から選択され得る。炭化水素置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルが挙げられ、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニルおよびアルキニルは置換されていてもよいし、または置換されていなくてもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニルまたはアルキニル、例えば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３であり得る。炭化水素置換基は、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから独立して選択され得る１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含み得る。２’修飾は、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルのようにアルキル、アルケニル、およびアルキニルをさらに含み得る。
【００４０】
本発明の例示的な２’修飾としては、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔ）置換、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が挙げられる。
【００４１】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）、例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードを含有する。いくつかの実施形態では、２’ハロ修飾はフルオロである。オリゴヌクレオチドは、１〜約５つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１〜約３つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドの位置にすべての２’−フルオロヌクレオチドを含有する。ある実施形態では、２’−フルオロ基は、独立して、ジメチル化、トリメチル化またはメチル化されていない。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルについてのＨ）を有し得、いくつかの実施形態では、約１〜約１０個の２’−デオキシ修飾を含有する。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，３１６，１９８号、米国特許第６，４０３，５６６号、米国特許第６，７７０，７４８号、米国特許第６，９９８，４８４号、米国特許第６，６７０，４６１号、および米国特許第７，０３４，１３３号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている少なくとも１つのロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）をさらに含み得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の構造Ａによって示される構造を有する１つまたはそれを超えるＬＮＡを含有する。あるいはまたは加えて、オリゴヌクレオチドは、以下の構造Ｂによって示される構造を有する１つまたはそれを超えるＬＮＡを含有する。
【化３】
0006446026.tif 000008
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドに組み込むことができる他の適切なロックドヌクレオチドとしては、米国特許第６，４０３，５６６号および米国特許第６，８３３，３６１号（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【００４５】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であり得る。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、（末端リボヌクレオチドに関して）オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（５’末端の最後の２つのヌクレオチドと３’末端の最後の２つのヌクレオチドとの間の結合における修飾を含む）を含む。本明細書に記載されるキャップ構造により、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。このような修飾は、インビトロまたはインビボでのそれらの効力の増大に基づいて選択され得る。キャップは５’末端に存在することもでき（５’キャップ）、または３’末端に存在することもでき（３’キャップ）、または両末端に存在することができる。ある実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ）部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から独立して選択される。ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合は、キャップ構造の一部である場合、一般に、５’末端の２つの末端ヌクレオチドと３’末端の２つの末端ヌクレオチドとの間に配置される。
【００４６】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にあり得る。ホスホロチオエートモノホスフェートは、以下の構造（式中、Ｂは、塩基であり、Ｒは、上記２’修飾である）によって定義される。
【化４】
0006446026.tif 000009
【００４７】
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、例えば、５’末端および３’末端の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよいし（例えば、キャップ構造の一部として）、またはリン酸ジエステル結合と交互に存在してもよい。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端のいずれかまたはその両方に少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有し得る。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されているプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、このような脱塩基部分はヌクレオチド塩基を欠くか、または１’位にヌクレオチド塩基ではない他の化学基を有する。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、例えば、逆脱塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｂａｓｉｃ）ホスホルアミダイトが５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してカップリングされて５’−５’リン酸結合が生じた逆脱塩基ヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造は、以下に示されている。
【化５】
0006446026.tif 000010
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるホスホロチオエート結合を含有し得る。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる切断に対してより抵抗性にするために使用されてきた。例えば、ポリヌクレオチドは部分的にホスホロチオエート結合されていてもよく、例えば、ホスホロチオエート結合がリン酸ジエステル結合と交互になっていてもよい。しかしながら、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合されている。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜５つまたは１〜３つのリン酸結合を有する。さらなる実施形態では、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合されている。
【００４９】
また他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える修飾リン酸結合を含み得る。例示的な修飾リン酸結合は、式ＩＩおよびＩＩＩとして以下に示されている：
【化６】
0006446026.tif 000011
【化７】
0006446026.tif 000012
【００５０】
示されているように、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、ベンジル、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、アルコキシ、アルコール保護基またはアミン保護基、および式ＩＩに関しては二環式結合、例えばＬＮＡまたは２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドから独立して選択される。ＸおよびＹは、Ｈ、Ｏ、Ｓ、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ベンジルカルボキシレート、−Ｎ（アルキル）２、−Ｎ（アルケニル）２、−Ｎ（アリール）２、−Ｎ（ベンジル）２、−ＮＨ２、−ＢＨ２またはホウ酸エステルから独立して選択される。Ｂは、修飾され得る核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン塩基）から独立して選択され得る。示されているように、ポリヌクレオチドは、（図２に示されているように）部分的にホスホロジアミデート結合され得る。しかしながら、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロジアミデート結合されている。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜５つまたは１〜３つのリン酸結合を有する。さらなる実施形態では、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドは、（式ＩＩおよびＩＩＩに示されているように）修飾リン酸結合によってすべて連結されている。
【００５１】
またさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるモルホリノヌクレオチドを含み得る。モルホリノ（ｍｏｒｐｈｌｉｎｏ）ヌクレオチドは、以下の式ＩＶに例示されているように２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドに連結され得る。
【化８】
0006446026.tif 000013
【００５２】
式ＩＶに示されているように、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、ベンジル、ハロゲン、ＯＨ、−ＮＨ２、アルコキシ、アルコール保護基またはアミン保護基から独立して選択される。ＸおよびＹは、Ｈ、Ｏ、Ｓ、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、ベンジルカルボキシレート、−Ｎ（アルキル）２、−Ｎ（アルケニル）２、−Ｎ（アリール）２、−Ｎ（ベンジル）２、−ＮＨ２、−ＢＨ２またはホウ酸エステルから独立して選択される。Ｂは、修飾され得る核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン塩基）から独立して選択され得る。
【００５３】
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ、例えば以下の表１に記載されている成熟ｍｉＲＮＡを模倣またはターゲティングするための塩基配列を有する。これらのまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プレｍｉＲＮＡ形態またはプリｍｉＲＮＡ形態をターゲティングするように設計され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチド配列と実質的に相補的である。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチド配列と実質的に同一である。例示的なオリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡ配列、例えば以下の表１に記載されている成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的（すなわち、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％または１００％相補的）である。このようなアンチセンス配列およびセンス配列は、例えば、ｓｈＲＮＡ、またはステム部分およびループ部分を含有する他のＲＮＡ構造に組み込まれ得る。このような配列は、とりわけ、心肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、鬱血性心不全）、血管損傷および／または病的心線維症（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を処置または改善するために、とりわけ、ｍｉＲＮＡ機能を模倣またはターゲティングするのに有用である。例示的なｍｉＲＮＡ治療有用性は、以下の表２に記載されている米国特許文献およびＰＣＴ特許文献（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ｍｉＲＮＡの成熟形態およびプレプロセシング形態は、以下に記載されている特許文献に開示されており、このような説明も参照により本明細書に組み込まれる。
【表１−１】
0006446026.tif 000014
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表２−１】
0006446026.tif 000020
【表２−２】
0006446026.tif 000021
【００５４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ａもしくはｂ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９のヌクレオチド配列と実質的に相補的な配列を含む。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に相補的な配列を含み得る。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４５１および／またはｍｉＲ−４９９配列と実質的に同一な配列を含み得る。本明細書で使用される「実質的に相補的」または「実質的に同一」は、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的または同一な配列を指す。
【００５５】
本発明はさらに、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド、または対応するホスホラミダイト、または２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。この方法は、例えば、出発物質としてリボースを使用してメチル４，４−ビスメシルオキシメチル−２−ヒドロキシメチルフラノース誘導体に変換し、続いて、この誘導体をグリコシル化することを含む。次いで、グリコシル化物質の２−ヒドロキシメチル基を保護アミンに変換し、次いで、対応する４−メシルオキシメチル基を用いてヌクレオシドのα面でこれを環化して、完全保護アザ二環式ヌクレオシド（これは、標準的な保護基化学反応を介してヌクレオシドホスホラミダイトに容易に変換される）を得る。２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの例示的な合成スキームは、本明細書に示されている。代替的な合成方法は、２０１４年３月１６日に出願された「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ」という表題のＫｕｒｔ  Ｖａｇｌｅによる米国仮出願（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５６】
固相合成によるオリゴヌクレオチド（修飾ポリヌクレオチドを含む）の合成は周知であり、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、“Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，（７）：２１５−２３（１９８０）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって概説されている。オリゴヌクレオチドの合成は、利用されるヌクレオチドモノマーの選択に応じて変化するであろう。例示的な実施形態では、合成に使用されるヌクレオチドモノマーとしては、限定されないが、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホラミダイト誘導体、ＤＭＴｒ−およびトリフルオロ酢酸保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ならびにＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトが挙げられる（それぞれ図３Ａ〜３Ｅを参照のこと）。ある実施形態では、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ＤＭＴｒ−およびトリフルオロ酢酸保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト、ならびにＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトを利用するオリゴヌクレオチド合成の場合、長期のカップリング時間が必要であり得る。ある実施形態では、ＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの内部ホスホルアミダイト誘導体を用いるオリゴヌクレオチド合成の場合、Ａｃ２Ｏ／塩基を利用する通常のキャッピング試薬を非標準的なキャッピング試薬に交換することによって、標準的なオリゴヌクレオチド合成サイクルを改変し得る。あるいは、ホルアミダイトカップリングサイクルの後、しかし標準的なキャッピング工程の前に、新たにカップリングされたオリゴヌクレオチドを、合成サイクルに対して安定な（しかし、所望により後で除去可能な）アミン反応性コンジュゲートまたは保護基で処理することによって、合成を改変し得る。
【００５７】
オリゴヌクレオチドは様々な高分子集合体または組成物に組み込むことができる。このような送達用の複合体としては、患者に送達するために製剤化された様々なリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを挙げることができる。複合体は、細胞膜透過を開始させるための１つまたはそれを超える融合性分子または親油性分子を含み得る。このような分子は、例えば、米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。あるいは、オリゴヌクレオチドは、細胞への送達を補助するためのペンダント親油基、例えば、国際公開第２０１０／１２９６７２号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものをさらに含み得る。
【００５８】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００５９】
組成物または製剤は、本明細書に記載される少なくとも１つを含む複数の治療用オリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、組成物または製剤は、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ阻害剤の少なくとも約２つ、約３つ、約４つ、または約５つを用いることができる。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、様々な医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。例示的な送達／製剤系としては、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。本発明の核酸を心臓組織および骨格筋組織に送達するために適切な市販の脂肪エマルジョンとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似した脂質エマルジョンが挙げられる。インビボ送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このような系の調製および使用は当技術分野で周知である。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号、米国特許第６，２１７，９００号、米国特許第６，３８３，５１２号、米国特許第５，７８３，５６５号、米国特許第７，２０２，２２７号、米国特許第６，３７９，９６５号、米国特許第６，１２７，１７０号、米国特許第５，８３７，５３３号、米国特許第６，７４７，０１４号、および国際公開第２００３／０９３４４９号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。
【００６１】
医薬組成物および製剤は、送達ビヒクルを安定にして標的細胞による取り込みを可能にするための適切な塩および緩衝液を用いることができる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容され得る担体または水性媒体に溶解または分散させた特許請求の範囲に記載されているオリゴヌクレオチド（例えば、リポソームまたは他の複合体）を含む有効量の送達ビヒクルを含む。「薬学的に許容され得る」または「薬理学的に許容され得る」という語句は、動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」は、ヒトに投与するために適切な医薬品などの医薬品の製剤化において使用するために許容され得る１つまたはそれを超える溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含み得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。補足的な活性成分も組成物に組み込むことができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物の投与または送達は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の経路によるものであり得る。例えば、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射もしくは静脈内注射、または標的組織（例えば、心臓組織）への直接注射によるものであり得る。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの安定性および／または効力により、皮下、皮内、および筋肉内を含む簡便な投与経路が可能になる。ｍｉＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療剤を心臓に送達するために冠循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓および冠血管系に送達するための様々なカテーテルシステムは、当技術分野で公知である。本発明において使用するために適切なカテーテルに基づく送達方法または冠血管の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許公開第２００７／００６０９０７号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００６３】
組成物または製剤は、非経口的にまたは腹腔内に投与することもできる。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としてコンジュゲートの溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合されている水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で分散液を調製することもできる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の成長を予防するために保存剤を含有する。
【００６４】
注射用の使用またはカテーテルによる送達のために適切な医薬形態としては、例えば、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。一般に、これらの調製物は、滅菌されており、容易に注射可能な程度に流動性である。調製物は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００６５】
滅菌注射用溶液は、所望の通り、適量のコンジュゲートを任意の他の成分（例えば、上に列挙されているもの）と一緒に溶媒中に組み込むことによって調製することができる。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法として、活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過したその溶液から得る真空乾燥技術および凍結乾燥技術が挙げられる。
【００６６】
製剤化されたら、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与されることが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの様々な剤形で容易に投与することができる。水溶液で非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝し、液体希釈液を、まず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースを使用して等張性にする。このような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために使用することができる。当業者に公知であるように、滅菌水性媒体を特に本開示に照らして用いることが好ましい。例示として、単回用量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入用液に追加するか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５ページ〜１０３８ページおよび１５７０ページ〜１５８０ページを参照のこと）。処置される被験体の状態に応じて投与量のいくらかの変動が必ず生じるであろう。投与担当者は、いかなる場合においても、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓが求める滅菌、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００６７】
別の態様では、本発明は、細胞内のＲＮＡ発現または活性を低減または阻害する方法を提供する。このような実施形態では、この方法は、細胞を本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（またはその医薬組成物）と接触させることを含み、オリゴヌクレオチドは、細胞によって発現されるＲＮＡ転写産物とハイブリダイズする（例えば、少なくとも実質的に相補的である）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００６８】
別の態様では、本発明は、ＲＮＡもしくはその発現に関連するか、またはこれらによって媒介される被験体における状態を予防または処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。本発明の予防または処置の方法は、有効量のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る組成物を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【００６９】
本発明は、（例えば、本明細書に記載される組成物または製剤の一部として）本発明のオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するための方法、および哺乳動物患者における状態の進行を処置、改善または予防するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物をインビトロまたはインビボで標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）と接触させることができる。細胞は心臓細胞であり得る。
【００７０】
この方法は、一般に、オリゴヌクレオチドまたはこれを含む組成物を哺乳動物患者または標的細胞集団に投与することを含む。既に記載されているように、オリゴヌクレオチドは、（例えば、ｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有する）ｍｉＲＮＡ阻害剤であり得る。例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤がｍｉＲ−２０８ファミリーｍｉＲＮＡの阻害剤である場合、患者は、ｍｉＲ−２０８ファミリーの発現に関連するか、ｍｉＲ−２０８ファミリーの発現によって媒介されるか、またはｍｉＲ−２０８ファミリーの発現によって生じる状態を有し得る。このような状態としては、例えば、心肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、鬱血性心不全）、血管損傷、再狭窄または病的心線維症、癌、または他のｍｉＲＮＡ関連障害（本特許公報の表２に記載されている障害を含む）が挙げられる。したがって、本発明は、このような状態を処置するための、およびこのような処置用の医薬を調製するための、本発明の修飾オリゴヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。
【００７１】
ある実施形態では、患者（例えば、ヒト患者）は、例えば、長期の管理不良高血圧症、非矯正弁膜疾患、慢性狭心症、亜急性心筋梗塞、鬱血性心不全、心疾患に対する先天性素因および病的肥大を含む１つまたはそれを超える危険因子を有する。あるいはまたは加えて、患者は、例えば心肥大に対する遺伝的素因を有すると診断されていてもよいし、または例えば心肥大の家族歴を有していてもよい。
【００７２】
この態様では、本発明は、心不全または心肥大を有する患者において、運動耐容能の改善、入院の減少、優れた生活の質、罹患率の減少および／または死亡率の減少を提供し得る。
【００７３】
ある実施形態では、心臓組織における、または患者の血清中で決定されるマイクロＲＮＡの活性は、減少または阻害される。
【００７４】
様々な実施形態では、非経口投与によって、または心臓組織への直接注射によって医薬組成物を投与する。非経口投与は、静脈内、皮下または筋肉内であり得る。いくつかの実施形態では、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテルまたは舌下投与によって組成物を投与する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドを約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量、約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量、約１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量、または約５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で投与する。これらの実施形態では、筋肉内注射もしくは皮下注射によって、または静脈内にオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、方法は、処置後にｍｉＲＮＡ阻害剤を除去するまたは排除することをさらに含む。例えば、阻害剤と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを治療後に投与して、阻害剤の機能を減弱または停止させ得る。
【００７６】
本明細書で引用されるすべての参考文献（表１および２におけるものを含む）は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７７】
実施例１：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドの生産
本実施例では、アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを生産するための重要な中間体の例示的な合成を説明する（図１を参照のこと）。
【００７８】
メチル−Ｄ−リボース（２）
【００７９】
３つの５００ｍＬショットボトルにおいて、Ｄ−リボース（１）（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）、アンバーリスト１５（Ｈ＋）（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｒａｐ  Ｐａｃｋ（９０ｇ、５９９ｍｍｏｌ）を等分した（すなわち、各ショットボトルにおいて各３０ｇ）。等量のメタノール（容量：１３５０ｍｌ、すなわち４５０ｍＬ／ボトル）を各ボトルに充填して、無色の溶液を得た。すべてのボトルをオービタルシェーカー上に２５０ｒｐｍ／２５℃で１７時間置いた。展開溶媒として非保護リボースの１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ溶液を用いて、同時スポットと比較した反応混合物のＴＬＣによって、反応の進行をモニタリングした。木炭を用いるＨａｎｎｅｓｓｉａｎ染色によって、糖を可視化した。
【００８０】
この溶液をガラス焼結漏斗に通してろ過した。過剰なＭｅＯＨ（各３０ｇのアンバーリストおよびＴｒａｐ  Ｐａｃｋｓを含有するボトル当たり約５００ｍＬ）で触媒およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｒａｐ  Ｐａｃｋｓを洗浄した。１５ｍＬのＴＥＡ（５ｍＬ／反応ボトル）を追加することによって、メタノール溶液を塩基性にした。混合物を濃縮乾固した。残留物をジクロロメタン（３×２００ｍＬ）と共に共蒸発させて、残留メタノールを共沸除去した。残留物を高真空下で一晩乾燥して、９７．５５ｇ（９９％）のメチル−Ｄ−リボース（２）を得、これをさらに精製せずに使用した。
【００８１】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３）
【００８２】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル−Ｄ−リボース（２、６０．１２ｇ、３６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１２８ｍｌ、７３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（容量：４００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。アルゴンでフラスコをフラッシュし、氷浴中で０℃に冷却した。ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（９９ｍｌ、３８５ｍｍｏｌ）を１０分間滴下し、混合物を一晩かけて室温にした。
【００８３】
反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１Ｌ）溶液に注いだ。ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、水（１×４００ｍＬ）およびブライン（１×４００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮して暗褐色の油状物質を得、これを４等分し、１００ｍＬ／分で７５分間かけて標準的な０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配でランし、続いて１００％ＥｔＯＡｃで７分間保持するシリカクロマトグラフィーによって精製することによって精製した。純粋な画分を合わせて、無色の油状物質として１２１．５９ｇ（８２％）のメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３）を得た。
【００８４】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４）
【００８５】
２Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（３、５５．０ｇ、１３７ｍｍｏｌ）を計量した。４０℃および高真空下において、この物質をトルエン（２×１００ｍＬ）と共に共蒸発させた。還流冷却器をフラスコに装着し、アルゴン下で出発物質をトルエン（容量：５００ｍｌ）に溶解した。水素化ナトリウム（２１．８６ｇ、５４７ｍｍｏｌ）を約５ｇずつ追加して、灰色の懸濁液を得た。混合物を３０分間かけて６０℃に加熱し、次いで氷浴で室温に冷却した。１−クロロ−４−（クロロメチル）ベンゼン（６６．０ｇ、４１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら約１５ｇずつ追加した。混合物を加熱し、還流で一晩撹拌した。
【００８６】
反応混合物を０℃に冷却し、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈した。ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）を徐々に追加することによって混合物をクエンチして、泡立ちを最小限にした。ＥｔＯＡｃで混合物を１．５Ｌにさらに希釈し、１０％Ｎａ２ＣＯ３（２×５００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１×５００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機物を脱水し、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出した。回収した純粋な画分を合わせて、琥珀色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４、６２．１５ｇ、７０％）を得た。
【００８７】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５）
【００８８】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−２，３−Ｏ−ビス（４−クロロベンジル）−α，β−Ｄ−リボフラノシド（４、６５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を６００ｍＬのＤＣＭに溶解して、黄色の溶液を得た。アルゴン下で混合物を０℃に冷却した。溶液が透明な暗褐色の溶液に変化する間に、塩化スズ（ＩＶ）（１５０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて徐々に追加した。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら４℃で一晩保存した。
【００８９】
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）で反応混合物を希釈し、４Ｌ分液漏斗で５００ｍＬの脱イオン水に追加した。混合物を激しく振盪し、分離した。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、第２のアリコートの水５００ｍＬで洗浄した。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、５００ｍＬの１０％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。ＭｅＯＨの追加および機械的撹拌によって、エマルジョンを減少させた。すべての有機物およびエマルジョン／沈殿物を保持し、最後に５００ｍＬのブラインで洗浄した。再度、ＭｅＯＨの追加および機械的撹拌によって、エマルジョンを減少させた。有機相を除去し、ＭｇＳＯ４懸濁液で乾燥した。さらなるＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で残りのエマルジョンおよび水相を抽出し、これをＭｇＳＯ４懸濁液と合わせた。有機相をろ過し、褐色の油状物質に濃縮した。０〜３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。回収した純粋な画分を合わせて、琥珀色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５、４１．２０ｇ、７８％）を得た。
【００９０】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（６）
【００９１】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（５、４１．００ｇ、７８ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＰＯ（１．２１５ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（容量：２５０ｍｌ）に溶解して、オレンジ色の溶液を得た。ヨードベンゼンジアセテート（３７．６ｇ、１１７ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を室温で一晩撹拌した。
【００９２】
ＤＣＭで反応混合物を５００ｍＬに希釈し、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２×３００ｍＬ）およびブライン（１×３００ｍＬ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮した。オレンジ色の残留物を５０℃の高真空下で３時間乾燥した。琥珀色の油状物質である未精製のメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（６、４０．５０、「９９％」）を次の反応に使用した。
【００９３】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７）
【００９４】
２０００ｍＬ丸底フラスコにおいて、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（６、２６．６ｇ、７５ｍｍｏｌ）をエーテル（比：２０．００、容量：１５００ｍｌ）に懸濁して、白色の懸濁液を得た。アルゴンでフラスコをフラッシュし、氷浴中で０℃に冷却した。ナトリウムｔ−ペンタオキシド（７．３９ｇ、６７ｍｍｏｌ）をベンゼン（比：１．０００、容量：７５ｍｌ）に溶解し、懸濁液に一度に追加した。アルゴンでフラスコを再度フラッシュし、２時間かけて室温にした。懸濁液をさらに４時間撹拌した。次いで、アセトン／ドライアイス浴中で懸濁液を−７２℃に冷却した。メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−オキソ−α−Ｄ−リボフラノシド（１９．５６ｇ、３７．２５ｍｍｏｌ）をさらなるエーテル（比：１．０６７，容量：４０ｍｌ）に溶解した。シリンジを介して炭水化物溶液を追加し、反応混合物を４℃で１７時間撹拌した。
【００９５】
ＴＬＣにより、反応が完了したことが明らかになった（１５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）。飽和ＮＨ４Ｃｌ（２×５００ｍＬ）およびブライン（１×２５０ｍＬ）で反応混合物を洗浄した。エーテル（１５０ｍＬ）で水相を逆抽出した。有機相を合わせ、ブラインの洗浄（１×２５０ｍＬ）およびＮａ２ＳＯ４の追加によって乾燥した。有機相をろ過し、濃縮した。０〜２０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、精製を行った。純粋な画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７、１４．７９ｇ、２８．３ｍｍｏｌ、収率７６％）を得た。
【００９６】
メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８）
【００９７】
アルゴン下で、９−ＢＢＮ（８．９７ｇ、７３．５ｍｍｏｌ）をメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−メチレン−α−Ｄ−リボフラノシド（７、２８．５０ｇ、５４．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍｌ）溶液に室温で追加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した後、ＴＬＣにより、すべての出発物質が消費されたことが明らかになった。
【００９８】
過ホウ酸ナトリウム四水和物（３３．９ｇ、２２１ｍｍｏｌ）および水（８０ｍＬ）を追加し、混合物を室温でさらに２時間撹拌した。有機層を分離し、水性部分を４００ｍＬに希釈し、次いで、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で脱水した。溶媒を除去し、０〜６０％の酢酸エチル／ヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。精製した画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８、２６．３９ｇ、４８．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。
【００９９】
メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０）
【０１００】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−Ｏ−（ＴＢＤＰＳ）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−ヒドロキシメチル−α−Ｄ−リボフラノシド（８、２６．３０ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）をアルゴン下でピリジン（２００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。ＤＭＴｒ−Ｃｌ（２０．５８ｇ、６０．８ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に一度に追加した。反応混合物を一晩撹拌した。５０ｍＬのＭｅＯＨを追加することによって、トリチル化反応をクエンチし、２０分間撹拌し、続いてＥｔＯＡｃで混合物を７５０ｍＬに希釈した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３×３５０ｍＬ）およびブライン（１×１５０ｍＬ）で有機相を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮乾固した。
【０１０１】
粗生成物（９）をＴＨＦ（容量：７０ｍｌ）に溶解した。１．０Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（７２．９ｍｌ、７２．９ｍｍｏｌ）を混合物に追加し、それを室温で１．５時間撹拌した。ＴＢＡＦを追加することにより、くすんだ暗色の溶液を得た。混合物を濃縮乾固し、３％ＴＥＡヘキサン溶液で前処理した３３０ｇ  ＩＳＣＯシリカカラムにアプライした。１００ｍＬ／分で５０分間かけて０〜６０％ＥｔＯＡｃヘキサン勾配で生成物を溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質としてメチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０、２７．１７ｇ、４４．９ｍｍｏｌ、収率９２％）を得た。
【０１０２】
メチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１）
【０１０３】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１０、２７．１５ｇ、４４．９ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（２７．８ｇ、１３５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１６６ｍｌ、２３３３ｍｍｏｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。４０ｍＬのＤＭＳＯ中でピリジン（５．４４ｍｌ、６７．３ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（１．７２８ｍｌ、２２．４３ｍｍｏｌ）を合わせ、得られた溶液を反応混合物に追加した。フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。
【０１０４】
水（２５ｍＬ）を追加し、反応物を室温で３時間撹拌した。５００ｍＬのＥｔＯＡｃで反応物を希釈し、ろ過した。さらに２００ｍＬのＥｔＯＡｃで沈殿物を洗浄した。合わせた有機物をブライン（５×４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてメチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１、２５．２２ｇ、４１．８ｍｍｏｌ、収率９３％）を得た。
【０１０５】
メチル４−Ｃ−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２）
【０１０６】
２Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル５−オキソ−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１１、２５．２０ｇ、４１．８ｍｍｏｌ）をジオキサン（１０００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。ホルムアルデヒド（２４９ｍｌ、３３４３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら追加した。氷浴中で反応混合物を０℃に冷却した。７５０ｍＬ圧力均等化滴下漏斗をフラスコに装着し、２．０Ｍ水酸化ナトリウム（６０６ｍｌ、１２１２ｍｍｏｌ）を３０分間かけて追加して、濁った白色の溶液を得た。混合物を４２時間かけて室温になるまで撹拌した。溶液は透明に変化した。第一リン酸ナトリウム一水和物（８６ｇ、６２７ｍｍｏｌ）を追加することによって、この溶液を中和した。この溶液をその容量の約１／３に濃縮し、５００ｍＬの水で希釈し、ＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブライン（１×３００ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を除去し、０〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって、生成物を精製した。精製した画分を合わせ、濃縮乾固して、無色の油状物質としてメチル４−Ｃ−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２、２２．５０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
【０１０７】
メチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１４）
【０１０８】
１Ｌ丸底フラスコにおいて、メチル４−ヒドロキシメチル−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１２、２２．５０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）をＡｒ下でピリジン（２００ｍｌ）に溶解して、無色の溶液を得た。氷浴中で混合物を０℃に冷却した。メシル−Ｃｌ（８．２８ｍｌ、１０６ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に１０分間かけて滴下した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、２０分間撹拌しながら水１５ｍＬを追加することによって、メシル化反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃで混合物を７５０ｍＬに希釈し、ブライン（３×４００ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮乾固した。
【０１０９】
粗生成物（１３）を８００ｍＬのＡｃＯＨに溶解した。水（２００ｍＬ）を撹拌溶液に追加した。この溶液を室温で２．５時間撹拌し、次いで、５００ｍＬの水で希釈した。混合物を約４００ｍＬに濃縮し、さらに２５０ｍＬの水で希釈した。次いで、この溶液を高真空下で濃縮乾固した。残留物を２２０ｇ  ＩＳＣＯシリカカラムにアプライし、０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出した。純粋な画分を合わせ、濃縮して、無色の油状物質としてメチル５−Ｏ−メシル−４−Ｃ−（メシルオキシメチル）−３−Ｏ−（４−クロロベンジル）−２−デオキシ−２−α−（ヒドロキシメチル）−α−Ｄ−リボフラノシド（１４、１０．０１ｇ、２０．４７ｍｍｏｌ、収率５７．８％）を得た。
【０１１０】
（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（１６）
【０１１１】
撹拌棒を有する１００ｍＬ丸底フラスコに、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−メトキシテトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（３．４１ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）を１００ｍｌ丸底フラスコに計量し、隔壁を密封した。フラスコを０℃に冷却し、ピリジン（容量：２５ｍｌ）および無水酢酸（１．３１６ｍｌ、１３．９５ｍｍｏｌ）を充填した。混合物を６時間かけて室温にした。混合物を０℃に冷却し、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を追加し、１５分間撹拌した。混合物を濃縮乾固し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解した。１％ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で有機相を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮した。
【０１１２】
１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、得られた油状物質を酢酸（９．９８ｍｌ、１７４ｍｍｏｌ）および無水酢酸（２．６３ｍｌ、２７．９ｍｍｏｌ）で再溶解した。Ｈ２ＳＯ４（０．０３７ｍｌ、０．６９７ｍｍｏｌ）を追加し、フラスコの隔壁を密封し、混合物を一晩撹拌した。水（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×７５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で慎重に洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮して、淡黄色の油状物質として３．１５ｇの未精製の（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（３．１５ｇ、５．６４ｍｍｏｌ、収率８１％）を得、これをさらに精製せずに使用した。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ６１７  （Ｍ  ＋  Ａｃｅｔａｔｅ）−
【０１１３】
（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（１７）
【０１１４】
Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（４．０７ｍｌ、１６．６４ｍｍｏｌ）を（（３Ｒ，４Ｓ）−２−アセトキシ−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（３．１０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）およびチミン（０．８７４ｇ、６．９３ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル（２０ｍｌ）混合物に追加した。反応混合物を１時間還流して、透明な溶液を得た。この溶液を４０℃に冷却し、ＴＭＳ−ＯＴｆ（１．３０３ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を追加した。混合物を６０℃で４時間加熱した。この溶液を室温に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮し、標準的なＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ勾配（０〜１０％ｖ／ｖ  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、白色の固体物質として（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（２．８４ｇ、４．５４ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ６２４  （Ｍ）−
【０１１５】
（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１９）
【０１１６】
撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、（（３Ｒ，４Ｓ）−４−（（４−クロロベンジル）オキシ）−２−（チミジン−イル）−５，５−ビス（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）酢酸メチル（２．８４ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）をメタノール（容量：２０ｍｌ）に溶解した。ナトリウムメトキシド（０．１２３ｇ、２．２７２ｍｍｏｌ）を追加し、フラスコに蓋をし、室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）により、反応が完了したことが明らかになった。反応混合物を真空下で蒸発乾固し、３ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔに直接アプライし、これを２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに装着した。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２．３２ｇ、３．９８ｍｍｏｌ、収率８８％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５８２  （Ｍ）−
【０１１７】
（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（チミジン−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２０）
【０１１８】
（（３Ｓ，４Ｒ）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１．０ｇ、１．７１５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１０ｍｌ）の混合物に、ＴＭＳ−Ｃｌ（０．２１９ｍｌ、１．７１５ｍｍｏｌ）を室温で追加した。１時間撹拌した後、反応混合物を０℃に冷却し、シリンジによって塩化ベンゾイル（０．１９９ｍｌ、１．７１５ｍｍｏｌ）を滴下した。次いで、氷浴を除去し、反応混合物を室温で４８時間撹拌した。水（２ｍＬ）を追加することによって、反応をクエンチした、室温で１５分間撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で混合物を希釈し、５％ＨＣｌ水溶液（２×２５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１×２５ｍＬ）およびブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、真空下で濃縮乾固した。最小限のＤＣＭを含む３ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔに残留物をアプライし、次いでこれを２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに装着した。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で所望の生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．８７ｇ、１．２６６ｍｍｏｌ、収率７３．８％）を得た。
【０１１９】
チミジンのＮ−ベンゾイル保護はジアステレオマー混合物をもたらし、３：２の比で２つのＣ−５メチルシングレットおよび２つのＣ−６プロトンシングレットを生じさせる。αアノマーの場合：
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ  ７．８９  （ｓ，  １Ｈ，  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ  １），  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ，  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ  ２），  ７．６７  −  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６０  −  ７．３９  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３９  −  ７．１７  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６７  −  ４．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．４２  −  ４．２６  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．８７  −  ３．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．９８  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．８２  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．０３  （ｓ，  ３Ｈ，  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ  １），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ，  ｄｉａｓｔｅｒｏｍｅｒ  ２）．
【０１２０】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２１）
【０１２１】
撹拌棒を装着した２０ｍＬシンチレーションバイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ）−５−（３−ベンゾイル−チミジン−イル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−４−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．２５ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）、（２，２，２−トリフルオロエチル）−ｔｅｒｔ−ブチル−イミノジカーボネート（０．０８８ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．０９５ｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）を計量した。ＴＨＦ（容量：４ｍｌ）およびＤＩＡＤをバイアルに充填し、１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液（０．３６４ｍｌ、０．３６４ｍｍｏｌ）を滴下した。一晩撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮乾固し、２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムにアプライした。４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（０．２２８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、収率６８．７％）を得た。
【０１２２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ  ７．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ５．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４９  （ｑｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ３．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４１  −  ４．２４  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．２０  −  ３．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９８  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９７  （ｓ，  ４Ｈ），  １．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４６  （ｓ，  ９Ｈ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ９７１  （Ｍ  ＋  Ａｃｅｔａｔｅ）−
【０１２３】
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（２２）
【０１２４】
２０ｍＬスクリューキャップシンチレーションバイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシ−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ジカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（３−ベンゾイル−−チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（１２５ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を磁気撹拌棒と共に計量した。ＴＨＦ（容量：１．５ｍｌ）および２．０Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液（１．５０７ｍｌ、３．０１ｍｍｏｌ）をバイアルに充填し、蓋をし、室温で一晩撹拌した。ＥｔＯＡｃ（７ｍＬ）で反応混合物を希釈し、飽和重炭酸ナトリウム（１×５ｍＬ）およびブライン（１×５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し真空下で濃縮して、灰白色の泡状物質として（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（８０ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ、収率８６％）（これは十分に純粋であり、精製せずに次の反応に使用した）を得た。
【０１２５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ  ８．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．０４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７４  −  ４．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４０  −  ４．２３  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．００  −  ３．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．６，  ６．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１７  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １４．３，  ８．４，  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．０９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．３２  （ｓ，  ９Ｈ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ６８１  （Ｍ）−
【０１２６】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２３）
【０１２７】
１０ｍＬコニカル反応バイアルにおいて、（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−３−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（チミジン−イル）テトラヒドロフラン−２，２−ジイル）ビス（メチレン）ジメタンスルホネート（６０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶解した。水素化ナトリウムの６０％油懸濁液（１２．２１ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）を一度にバイアルに追加し、撹拌棒およびテフロン（登録商標）ライニングセプタムスクリューキャップをバイアルに装着し、混合物を５５℃で一晩撹拌した。反応物を室温に冷却し、撹拌しながら数滴のＭｅＯＨを追加してクエンチした。ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で混合物を希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮して、黄褐色の泡状物質を得、これを最小量のＤＣＭに溶解し、１０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰカラムに装着した１ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｓａｍｐｌｅｔにアプライした。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で生成物を溶出して、白色の泡状物質として（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、収率７８％）を得た。
【０１２８】
環化は３：２のＮ−ジアステレオマー混合物をもたらし、これは、ＴＬＣ／カラムクロマトグラフィーによって分解不可能であったこの少数派のジアステレオマーの存在は、（＊）によって示されるいくつかの別個のシグナルを生じさせた。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ  ８．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５９＊  （ｓ），  ７．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５８＊  （ｓ），  ７．４０  −  ７．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ５．８０＊  （ｓ），  ５．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ４．６６  −  ４．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．４４  −  ４．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０９  −  ３．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６１＊  （ｄ，  Ｊ＝１２．６  Ｈｚ），  ３．３６  −  ３．１０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８１＊  （ｓ），  ２．７０  （ｓ，  １Ｈ），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４６  （ｓ，  ９Ｈ），  １．４４＊  （ｓ）．    ＥＳＩ−ＭＳ：  ５８５  （Ｍ）−
【０１２９】
１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−チミジン（２４）
【０１３０】
１０ｍＬガラス反応バイアルにおいて、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（３５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（１７．２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。撹拌棒をバイアルに装着し、テフロン（登録商標）ラインスクリューキャップセプタムで密封した。油浴中で混合物を一晩かけて１０５℃に加熱した。すべての要素が溶液を生じさせた。油浴からバイアルを取り出し、ＴＬＣによって反応の完了を評価するために１０μＬを取り出した。冷却すると直ぐに白色の結晶が形成し始めた。ＴＬＣにより、反応が５０％しか完了していないことが明らかになったため、さらなる安息香酸ナトリウム（１７．２１ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦと共に追加し、撹拌した。混合物をさらに４８時間かけて１０５℃に加熱し、ＴＬＣ分析のためにアリコートを定期的に取り出した。２日間かけて１０５℃に加熱した後であっても、厚い沈殿物は溶液を十分に生じさせなかったが、反応は、検出可能な分解を伴わずに完了した。
【０１３１】
反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、水（２×１０ｍＬ）、飽和重炭酸塩溶液（１×１０ｍＬ）およびブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、真空下で濃縮した。残留物をＭｅＯＨ（２ｍｌ）に再溶解し、ナトリウムメトキシド（６．４５ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を一度に追加した。混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣにより、反応が完了したことが明らかになり、混合物を濃縮乾固した。得られた残留物を１ｍＬの１：１  ＤＣＭ／ＴＦＡに再溶解し、室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮乾固し、最小量のＤＣＭを使用して４ｇ  ＲｅｄｉＳｅｐ  Ｒｆシリカカラムにアプライした。３％ＴＥＡを含有する０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ勾配で生成物を溶出した。生成物画分を合わせ、濃縮乾固した。得られた白色の粉末をＤＣＭ（３ｍＬ）に再溶解し、飽和重炭酸塩溶液（１×５ｍＬ）で洗浄した。７０／３０クロロホルム／イソプロパノール（２×５ｍＬ）で水性画分を逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色の粉末として１−（（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−イル）−チミジン（１７ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、収率６９．８％）を得た。
【０１３２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−ｄ３）  δ  ８．０５  （ｑ，  Ｊ  ＝  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｓ，  ４Ｈ），  ５．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ４．５２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３８．６，  １１．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３３．９，  １２．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．８９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．７５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．０，  ３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．５７  −  ２．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．９８  −  １．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  ３Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （１０１  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １６５．０１，  １５１．２２，  １３８．０７，  １３６．９８，  １３３．７２，  １３０．０５，  １２９．２３，  １０９．１９，  ８７．４２，  ８５．０４，  ７３．０６，  ７１．３８，  ６１．０４，  ４５．８５，  ４３．６０，  ４１．５８，  １２．７１．
【０１３３】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（２５）
【０１３４】
撹拌棒を備える１００ｍＬ丸底フラスコに、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（（４−クロロベンジル）オキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（（（メチルスルホニル）オキシ）メチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（１．０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）および安息香酸ナトリウム（０．６３ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を計量した。ＤＭＦ（１０ｍＬ）をフラスコに充填し、隔壁を密封し、４０時間かけて１００℃に加熱した。ＴＬＣ（６５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により、反応が完了したことが示された。飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）で混合物を希釈し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、真空下で濃縮して黄褐色の固体を得、これをジオキサン（２０ｍＬ）および２Ｍ  ＮａＯＨ（３ｍＬ）の混合物に溶解した。混合物を一晩かけて５０℃に加温した。反応混合物を真空下で固体に濃縮し、５０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ  ＳＮＡＰシリカカラムにアプライし、７カラム容量の５０〜１００％ＥｔＯＡｃヘキサン勾配を使用して溶出し、７カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで保持した。生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、白色の泡状物質として（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（ヒドロキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６３ｇ、１．２４ｍｍｏｌ、８４．６％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５０６  （Ｍ）−
【０１３５】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（２６）
【０１３６】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（ヒドロキシ）−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボキシレート（０．６ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をエタノール（２５ｍＬ）に溶解し、５００ｍＬ  Ｐａｒｒ水素化容器に移した。パールマン触媒（０．３５ｇ）および１滴の氷酢酸を一度に追加し、水素雰囲気（４０ｐｓｉ）下、Ｐａｒｒ水添器上で混合物を４時間振盪した。ＴＬＣにより、反応がスポットごとに完了したことが示された（５％メタノールＤＣＭ溶液）。数容量のメタノールで予め洗浄したセライトベッドに混合物を通して慎重にろ過した。酢酸エチル（１００ｍＬ）およびエタノール（１００ｍＬ）でセライトベッドを洗浄した。ろ液を真空下で約５ｍＬに濃縮し、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアルに移した。この物質を真空下で乾固して灰白色の粉末を得、これをさらに精製せずに使用した。
【０１３７】
マイクロ撹拌棒をガラスシンチレーションバイアルに装着し、ジクロロメタン（２ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を充填した。バイアルを密封し、３０分間撹拌した。マイクロ撹拌棒を除去し、揮発物を真空下で除去した。得られた油状物質をトルエン（２×４ｍＬ）、メタノール（１×４ｍＬ）およびＤＣＭ（２×４ｍＬ）と共に共蒸発させて、バイアル中に灰白色の粉末／残留物を得た。残留物をメタノール（５ｍＬ）に再溶解し、マイクロ撹拌棒をシンチレーションバイアルに入れた。トリフルオロ酢酸エチル（２．００ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．４１０ｍＬ、３．５４ｍｍｏｌ）を追加し、バイアルを密封し、混合物を一晩撹拌した。２０時間後、混合物のＴＬＣにより、出発物質が完全に消費され、新たな生成物が形成されたことが示された。揮発物を真空下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）およびトルエン（２×５ｍＬ）と共に共蒸発させて、次のトリチル化工程に直接使用するための（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（０．３０ｇ、７９．８％）を得た。粗物質の１Ｈ  ＮＭＲ分析により、約５５：４５の比のジアステレオマー混合物が形成されたことが示された（アノマーシグナルの積分による）。
【０１３８】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（２７）
５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）
【０１３９】
５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−８−ヒドロキシ−７−（チミジン−イル）−５−（ヒドロキシメチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（０．２８ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×１０ｍＬ）と共に共蒸発させた。無水ピリジン（７ｍＬ）をフラスコに充填し、ＤＭＴｒ−Ｃｌをこの溶液に一度に追加した。フラスコを密封し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより、すべての出発物質が消費されたことが明らかになった（９５％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘまたは５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）。メタノール（０．５ｍＬ）を追加し、３０分間撹拌し続け、続いて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）を追加することによって、反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、真空下で濃縮して、黄褐色の泡状物質を得た。この固体を最小量のＤＣＭに溶解し、６０ｍＬの２５％ＴＥＡヘキサン溶液で前処理し、２００ｍＬの３０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで平衡化した５０ｇ  ＢｉｏｔａｇｅシリカＳＮＡＰカラムにアプライした。１０カラム容量の３０〜１００％ＥｔＯＡｃヘキサン勾配と、それに続く４カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで生成物をカラムから溶出した。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−（Ｎ−ｔｆａ）−アミノＣＢＢＮを得た。１Ｈおよび１９Ｆ  ＮＭＲは両方とも、２つの異なるジアステレオマーを示している。１Ｈ  ＮＭＲ表のアスタリスクは、ジアステレオマープロトンが約５５：４５の比で分解されるピークを示す。
【０１４０】
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ  ７．７２＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６８＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４９  −  ７．３８  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３５  −  ７．２０  （ｍ，  １４Ｈ），  ６．９３  −  ６．７８  （ｍ，  ８Ｈ），  ５．７３＊  （ｓ，  １Ｈ），  ５．６８＊  （ｓ，  １Ｈ），  ４．５５  −  ４．３６  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．０５＊  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０１＊  （ｓ，２Ｈ），  ３．９４  −  ３．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７９  （ｑ，  Ｊ  ＝  ０．７  Ｈｚ，  １３Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  １２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５７  −  ３．３８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３８  −  ３．１５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７０＊  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６５＊  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．４７＊  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４１＊  （ｓ，  ３Ｈ），  １．２８  （ｂｓ，  ２Ｈ）．    １９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ｃｄｃｌ３）  δ  −６８．６１，  −６８．９０．
ＥＳＩ  ＭＳ：  ６８０  （Ｍ）−
【０１４１】
（１Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｓ）−７−（チミジン−イル）−５−（（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）メチル）−３−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−６，８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（２８）
５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）アミダイト
【０１４２】
撹拌棒を装着した１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）（０．３２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を計量した。ジクロロメタン（７ｍＬ）をフラスコに充填し、撹拌した。２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２８３ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）をシリンジに計量し、この溶液に一度に追加し、続いて４，５−ジシアノイミダゾール（５５．４４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を追加した。フラスコの隔壁を直ぐに密封し、一晩撹拌した。プロセスでは、２０時間の時点のＴＬＣにより、わずかに微量の出発物質と、生じた２つの新たなスポット（これらはトリチルポジティブであり、５％メタノール／ＤＣＭｗ／ＵＶ可視化による展開後にＨａｎｅｓｓｉａｎ染色で処理すると、開始ヌクレオシドと同様にチャーすると思われた）が存在していたことが明らかになった。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を追加することによって、反応をクエンチした。酢酸エチル（４×２０ｍＬ）で水相を抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（１×２０ｍＬ）で抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、ろ過し、濃縮して、無色の油状物質を得た。粗生成物を最小量のＤＣＭに溶解し、６０ｍＬの２５％ＴＥＡヘキサン溶液で前処理し、１５０ｍＬの３０％酢酸エチル／ヘキサンで平衡化した５０ｇ  ＢｉｏｔａｇｅシリカＳＮＡＰカラムにアプライした。１０カラム容量の３０〜１００％ＥｔＯＡｃヘキサン勾配と、それに続く４カラム容量の１００％ＥｔＯＡｃで生成物をカラムから溶出した。純粋な生成物を含有する画分を合わせ、濃縮して、白色の泡状物質としてＤＭＴｒ−（Ｎ−ｔｆａ）−アミノＣＢＢＮを得た。３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲは、予想通り、４つの異なる生成物の存在を示しており、これらはそれぞれ、環状アミンのｔｆａ保護およびホスフィチル化反応から生じる別個の立体異性体に対応する。
【０１４３】
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  １５０．０３，  １４９．９７，  １４７．４６．  １：１：２の相対強度。１９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＣＮ）  δ  −６９．３０，  −６９．３１，  −６９．４７，  −６９．４７．
ＥＳＩ  ＭＳ：  ９０４．８  （Ｍ  ＋  Ｎａ＋）＋
【０１４４】
実施例２：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトおよびコンジュゲートの生産
図４Ａに示されているジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト（３０）の合成
【０１４５】
ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７２，３７，１６７３ページ〜１６７４ページ，Ｂｏｒｃｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）または類似の還元剤（例えば、ＺｎＣｌ２／ＮａＢＨ４）の存在下で、化合物２４を還元的アミノ化に供することによって、化合物２４から化合物３０を合成した。還元的メチル化の後、生成物をエタノールに溶解し、水素雰囲気（４０ｐｓｉ）および微量の酢酸の下でパールマン触媒を使用する触媒水素化に混合物を供することによって、３’−ＯＨをアンマスクした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリドのピリジン溶液を滴下することによって、冷却ピリジン溶液中で、粗還元混合物を直接トリチル化し得る。混合物を一晩撹拌して５’−ジメトキシトリチル−ヌクレオシド（ｎｕｃｅｏｓｉｄｅ）を得、これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用することによって精製した。次いで、精製したヌクレオシドを、ジクロロメタン中でカップリング触媒として２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．５〜２当量）および４，５−ジシアノイミダゾール（１．１〜２当量）を使用するホスフィチル化に供した。反応物を少なくとも２４時間および飽和炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチするまで４８時間程度撹拌し、カラムクロマトグラフィーに供して、ホスホラミダイト３０を得た。化合物３０は、合成オリゴヌクレオチドに組み込むための自動固相オリゴヌクレオチド合成に使用するのに適切である。
【０１４６】
図４Ｂに示されているＤＭＴｒ保護アミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（３２）の内部ホスホラミダイト誘導体の合成
【０１４７】
最初に、ＬｉＯＨ／ＴＨＦ水溶液を使用するトリフルオロアセトアミド保護基のアルカリ加水分解に化合物２７を供することによって、化合物２７から化合物３２を２段階で合成した。飽和炭酸水素ナトリウムでこの水溶液を希釈し、酢酸エチルで抽出し得る。次いで、４〜１０当量の無水ＴＥＡまたはＤＩＥＡで前処理した２−シアノエチルホスホロジクロリダイトを用いて、未精製のヌクレオシドをホスフィチル化に供し得る。数カラム容量の３％ＴＥＡヘキサン溶液でシリカゲルを前処理してから、適切な移動相で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、得られたホスホラミダイトを精製した。また、分解を防止するために、ホスホラミダイトを微量のＴＥＡと共に保存しなければならない。化合物３２は、合成オリゴヌクレオチドに組み込むための自動固相オリゴヌクレオチド合成に使用するのに適切である。自動固相オリゴヌクレオチド合成において、カップリング工程および酸化工程の後に、適切なキャッピング試薬を使用するように注意しなければならない。無水酢酸は、二環式窒素上にアセトアミドを有する最終的な脱保護オリゴヌクレオチドを生成するであろう。他の活性化エステルまたは無水物を使用して、その二環式窒素中心でコンジュゲートを直接作製してから、残りの自動固相オリゴヌクレオチド合成を進めることができる。
【０１４８】
図４Ｃに示されているＤＭＴｒ保護脂肪酸コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（３３）の合成
【０１４９】
ＴＭＳ−Ｃｌのピリジン溶液による３’−ＯＨの過渡保護を利用することにより、化合物３１から化合物３３を直接合成した。反応の４時間後、氷浴中で混合物を冷却し、塩化ステアロイルを撹拌しながら滴下した。反応混合物を一晩かけて室温にした。飽和重炭酸ナトリウム溶液を追加することによって反応混合物をクエンチし、酢酸エチルで抽出し、有機物を乾燥した。粗物質を濃縮し、ＴＨＦに再溶解し、続いてＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１．２５当量）で処理した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに直接供して、化合物３３を得た。化合物２７の２８への変換について記載されているように、化合物３３はホスホラミダイト合成に適切である。
【０１５０】
図４Ｄに示されているＤＭＴｒ保護糖コンジュゲートアミン２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドの合成
【０１５１】
カップリング試薬としてＨＢＴＵ、５−［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）−３−アセチルアミノテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］吉草酸（国際公開第２００９０７３８０９号に記載されている手順によって調製したＧａｌＮＡｃ−Ｃ５酸）および少なくとも１当量のＮ−メチルモルホリンＤＭＦ溶液を利用することにより、化合物３１から化合物３４を直接合成した。反応が完了したら（４〜１７時間）、飽和重炭酸塩溶液で混合物を希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機物を乾燥し、粗物質を濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに直接供して、化合物３３を得た。化合物２７の２８への変換について記載されているように、化合物３３はホスホラミダイト合成に適切である。
【０１５２】
実施例３：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの合成
一般的な合成方法
【０１５３】
修飾ヌクレオシドを合成し、適切な反応性基で遊離５’および３’−ヒドロキシル基をマスクしてヌクレオチドモノマーにしたら、糖および塩基修飾を有するオリゴヌクレオチドの短鎖を調製し得る。例えば、ホスホラミダイト化学を使用する自動固相合成を使用し得る（ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：２４５〜２４８（１９８３）およびＳｉｎｈａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：５８４３〜５８４６（１９８３）を参照のこと）。ホスホラミダイト化学は、オリゴヌクレオチド化学におけるそれらの使用に関して、水素ホスホネート化学などの関連方法と共に広く概説されている（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３〜２３１１（１９９２）を参照のこと）。固相オリゴヌクレオチド合成では、一連のヌクレオチドモノマーを、それらのホスホラミダイト誘導体を介して、所定の順序で、鎖伸長の方向に応じて、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の５’官能基または３’−官能基のいずれかに逐次に結合させる。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド鎖を、孔制御ガラスまたはポリスチレン樹脂ビーズなどの不溶性部分にアンカリングする。各モノマーの結合方法は、一般に、以下の工程１〜５から構成される。工程１は、反応性官能基の保護を含む。一般的な反応性官能基は、末端ヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基である。通常、酸処理によって除去され得る４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）部分でこの官能基を保護する。ＤＭＴ部分の特徴の１つは、酸脱保護中に、それが明るいオレンジ色のＤＭＴカチオンを形成することである。このカチオンはレポーター基として有効に機能し、先のカップリング工程の完全性を判断するために、４８０〜５００ｎｍの波長でモニタリングすることができる。ほとんどの市販の自動合成機は、放出されたＤＭＴカチオンをモニタリングする能力を有する。このデータは、合成が任意の工程で失敗したか否かについての指標を操作者に瞬時に与える。工程２は、ホスホラミダイト誘導体および活性化剤の追加によるカップリングを含む。ホスホラミダイト誘導体は、通常、ヌクレオシドホスホラミダイトである。しかしながら、それはまた、異なる有機部分で誘導体化されたホスホラミダイトであり得る。工程３は、未反応の末端官能基のキャッピングを含む。この工程は、さらなるカップリングを防止する不活性保護基を失敗配列に導入する。工程４は、新たに形成されたリンヌクレオチド骨格結合の、三価の亜リン酸から安定性の五価状態への酸化を含む。この酸化工程は、リン酸ヌクレオチドをもたらす酸素系酸化剤、またはホスホロチオエートヌクレオチドをもたらす硫化酸化剤のいずれかを用いて実施され得る。工程５は、洗浄工程後にこのプロセスを繰り返すことを含む。
【０１５５】
ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システム（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）において、ヒトｍｉＲ−２０８ａのヌクレオチド配列に相補的な短縮型１６ヌクレオチド配列を１μｍｏｌスケールで合成した。当業者に公知の標準的な脱トリチル化、活性化剤およびキャッピング溶液を使用して、合成機を操作した。各デオキシヌクレオチドアミダイトについては４２０秒間のシングルカップリング、ＬＮＡアミダイトについては合計９００秒間継続するダブルカップリング、および新規ヌクレオシドアミダイト（例えば、ＤＭＴｒ−ａＣＢＢＮ（ｔｆａ）アミダイト）については合計１８００秒間継続するトリプルカップリングを使用して、オリゴヌクレオチド鎖の伸長に影響を与えた。各カップリングサイクル後、０．０２５Ｍヨウ素溶液または０．２Ｍ  ＰＡＤＳ酸化溶液のいずれかを用いて酸化を実施して、それぞれホスホジエステルヌクレオチド間結合またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合のいずれかを生成した。非修飾抗２０８ａＤＮＡ配列は、チミジンＬＮＡ（ｌＴ）、チミジンオキソＣＢＢＮ（ｂＴ）、シチジンオキソＣＢＢＮ（ｂＣ）またはチミジンアミノＣＢＢＮ（ａｂＴ）ヌクレオチドで選択的に置換した９つの２’−デオキシチミジン残基を取り込んでいる。チミジンＬＮＡアミダイトは商業的供給源から購入したものであり、報告されている分光データに一致している（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．、Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，４５５−６を参照のこと）。チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（チミジンオキソＣＢＢＮ、ｂＴ）およびシチジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシド（シチジンオキソＣＢＢＮ、ｂＣ）は、文献の手順にしたがって合成したものであり、すべての分光データは、報告値に一致していた（米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）。ヌクレオチドのバランスは、天然抗２０８ａＲＮＡ配列に対応する塩基を有する２’−デオキシヌクレオチドまたはＬＮＡヌクレオチドから構成されていた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、塩基の後ろに「ｓ」を付けて示されており（例えば、ａｂＴｓまたはｄＧｓ）、塩基の後ろに文字がないのは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を示す（例えば、ａｂＴまたはｄＧ）。
【０１５６】
化合物Ｍ−１１９１５：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製
【０１５７】
単一修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８４５．２、実測値４８４４．０（Ｍ）−。
【０１５８】
化合物Ｍ−１１９１６：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製
【０１５９】
二重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８８６．２、実測値４８８５．２（Ｍ）−。
【０１６０】
化合物Ｍ−１１９１７：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ａｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製
【０１６１】
三重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４９２７．３、実測値４９２６．１（Ｍ）−。
【０１６２】
化合物Ｍ−１１９１８：ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ａｂＴ．ａｂＴ．ｄＧ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製
【０１６３】
二重修飾アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８８６．２、実測値４８８５．０（Ｍ）−。
【０１６４】
化合物Ｍ−１１９１９：ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ａｂＴｓ．ａｂＴｓ．ｄＧｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｌＧｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＴｓ．ｌＡの調製
【０１６５】
キメラＤＮＡ／ＬＮＡ／アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、０．２Ｍ  ＰＡＤＳの１：１ピリジン／ＡＣＮ溶液を酸化溶液に交換して、市販の合成試薬を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３７９．３、実測値５３７８．３（Ｍ）−。
【０１６６】
化合物Ｍ−１１９２０：ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｌＴｓ．ｌＴｓ．ｄＧｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｌＧｓ．ｄＴｓ．ｌＣｓ．ｄＴｓ．ａｂＴｓ．ｌＡの調製
【０１６７】
キメラＤＮＡ／ＬＮＡ／アミノＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、ホスホラミダイト試薬（２８）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、０．２Ｍ  ＰＡＤＳの１：１ピリジン／ＡＣＮ溶液を酸化溶液に交換して、市販の合成試薬を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。上記「短縮型ヌクレオチドの一般的な合成方法」に記載されているように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３６６．３、実測値５３６５．３（Ｍ）−。
【０１６８】
化合物Ｍ−１０９３０  ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＧ．ｄＣ．ｂＴ．ｄＣ．ｄＧ．ｄＴ．ｄＣ．ｄＴ．ｄＴ．ｄＡの調製
【０１６９】
単一修飾オキソＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト（例えば、米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてすべてのホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値４８４６．１、実測値４８４５．８（Ｍ）−。
【０１７０】
化合物Ｍ−１０９２４  ｂＣ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｂＴ．ｄＧ．ｂＣ．ｂＴ．ｂＣ．ｄＧ．ｂＴ．ｂＣ．ｂＴ．ｂＴ．ｄＡの調製
【０１７１】
単一修飾オキソＣＢＢＮオリゴヌクレオチドの合成では、チミジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイトおよびＮ−Ｂｚ−シチジル−２’−Ｃ，４’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオシドホスホラミダイト（例えば、米国特許第６，４０３，５６６号、Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ｇｉｒａｒｄｅｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｉｃ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５，１９９９，７７０７〜７７２４を参照のこと）を使用した。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ＭｅｒＭａｄｅ−１２自動オリゴヌクレオチド合成システムを使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。製造業者の推奨にしたがって、市販の合成試薬および０．０２５Ｍヨウ素溶液を用いてＤＭＴ−ＯＮモードで、合成を実施した。前述のように、適切なカップリングサイクル中に、０．１Ｍアセトニトリル溶液としてすべてのホスホラミダイト試薬を追加した。濃縮水酸化アンモニウム水溶液と共にＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドを５５℃で１７時間加熱することによって、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断を達成した。未精製のＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  Ｃ１８カートリッジにロードし、当業者に公知の標準的なＤＭＴ−ＯＮオリゴヌクレオチド脱塩手順を使用して溶出することにより、得られたオリゴヌクレオチド水溶液をさらに精製した。当業者に公知の標準的な方法を利用して、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＭＤ  ＨＰＬＣに装着したＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５ｕｍカラムを利用するＨＰＬＣ−ＭＳ質量分析によって、生成物の特性決定を実施した。計算値５３５０．６、実測値５３５０．２（Ｍ）−。
【０１７２】
実施例４：２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの機能的特性決定
融解温度（Ｔｍ）の決定
【０１７３】
アンチセンスおよびマイクロＲＮＡ標的に対する薬物として合成オリゴヌクレオチド配列を設計する際、融解温度（Ｔｍ）は重要なパラメータである。一般に、活性を決定する閾値を上回るまたは下回る特定のＴｍはない。しかしながら、アンチセンスおよびマイクロＲＮＡ阻害剤オリゴヌクレオチド薬物の場合、Ｔｍは極めて高くなければならないと認識されている。さらに、合成オリゴヌクレオチド薬物のヌクレオチド骨格（例えば、ホスホロチオエート）の化学修飾は、インビボにおける生分解に対する安定性を付与するために使用されることが多い。それにもかかわらず、ほとんどのヌクレオチドリン酸骨格の修飾は、その標的と二重鎖形成したオリゴヌクレオチド薬物のＴｍの低下を引き起こすことが多い。したがって、合成オリゴヌクレオチド薬物が十分な特異性を有するために、標的結合のために、および最終的には標的によって制御される細胞プロセスのダウンレギュレーションのためには、その標的配列に対する合成オリゴヌクレオチド薬物のＴｍが、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡおよび他の類似ヌクレオチド単位に固有のＴｍよりも十分に大きいことが必要である。
【０１７４】
修飾１６ヌクレオチドホスホジエステル鎖の融解温度（Ｔｍ）を決定し、天然ホスホジエステルＤＮＡヌクレオチドを有する同一の１６ヌクレオチド配列のＴｍと比較した。具体的には、１６ヌクレオチドの長さのアミノ修飾ホスホジエステル鎖の融解温度と、２’−デオキシヌクレオシドまたはオキソＣＢＢＮホスホジエステルＤＮＡヌクレオチドのいずれかを利用する同一の１６ヌクレオチド配列の融解温度との間の差異を組み込みベースで決定することによって、同じ核酸塩基を有する２’−デオキシヌクレオシドまたはオキソＣＢＢＮヌクレオシドと比較した相対的なアミノＣＢＢＮ融解温度（Ｔｍ）を決定した。それらを配列の同じ位置に配置した場合にのみ、置換のＴｍ差異を比較した。アミノ−ＬＮＡおよびそのオキソＬＮＡカウンターパートに関する比較可能な値は、文献の基準を介して得た（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．２６，１９９８を参照のこと）。
【０１７５】
例えば、修飾抗２０８ａオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡヌクレオシドおよびリン酸骨格から構成される２２ヌクレオチドの長さの相補配列とアニーリングした。相補配列は、内因性成熟ｍｉＲＮＡと同一であった。融解曲線の一次導関数プロットの最大値として、熱変性温度（Ｔｍ）を測定した（Ａ２６０対Ｔｅｍｐ）。０．９％ＮａＣｌ緩衝液中、１μＭで二重鎖が構成された。１℃／分で２５℃から９５℃に温度を上昇させ、２６０ｎｍのＯＤを３０秒ごとに１回読んだ。Ｔｍ値は、少なくとも２回の測定の平均である。
【０１７６】
成熟ヒトｍｉＲ−２０８ａのヌクレオチド配列に相補的な１６ヌクレオチド配列の様々な修飾の二重鎖融解温度を、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  １Ｅ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用して測定した。試験した抗ｍｉＲＮＡ  ２０８ａオリゴヌクレオチド配列には、完全ＤＮＡホスホジエステル（化合物Ｍ−１０９３１）、ｄＴ残基に代えて１つ、２つまたは３つのアミノＣＢＢＮチミジン残基を有する４つのＤＮＡホスホジエステルオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１１９１５、Ｍ−１１９１６、Ｍ−１１９１７およびＭ−１１９１８）、混合９ＬＮＡ／７ＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１０１０１）、および親化合物（化合物Ｍ−１０１０１）のチミジンを１つまたは２つのアミノＣＢＢＮ残基のいずれかで置換した２つの混合ＬＮＡ／ＤＮＡ／アミノＣＢＢＮホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（化合物Ｍ−１１９１９およびＭ−１１９２０）が含まれていた。０．９％ＮａＣｌ中、１μＭで二重鎖が構成された。１℃／分で２５℃から９５℃に温度を上昇させ、２６０ｎｍのＯＤを３０秒ごとに１回読んだ。
【０１７７】
アミノＣＢＢＮ修飾を有するホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、一様に、それらの完全ＤＮＡカウンターパートよりも高い融解温度を有しており、したがって相補配列に対してより高い親和性を有していた（表３を参照のこと）。親和性増強は、ＤＮＡに対して約５〜９℃／修飾であった。これらの親和性増加は、ＬＮＡおよびアミノＬＮＡに関する文献値と同程度であるか、またはそれよりも優れている。
【表３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【０１７８】
アミノＬＮＡ−Ｔとそのオキソ類似体ＬＮＡ−Ｔとの比較は、アミノＬＮＡ−Ｔが、その相補体に対する安定性がＬＮＡ−Ｔよりも低いことを示している。同様に、アミノＥＮＡ−Ｔは、そのオキソ類似体のものよりも非常に低い二重鎖安定化効果を有すると思われる。驚くべきことに、アミノＣＢＢＮ−ＴとそのオキソＣＢＢＮ−Ｔ類似体との比較は、アミノＣＢＢＮ修飾がオキソＣＢＢＮ−Ｔよりも２〜４℃／修飾だけ有意に安定性であることを示している（表５および図５を参照のこと）。理論に縛られるものではないが、ＬＮＡの２’−Ｏ（プロトン受容体）は、アミノＬＮＡの場合のように、それを２’位でプロトン供与体により置換する場合よりも、二重鎖水和および安定性に対する安定化効果が高いと仮定する。反対に、アミノＣＢＢＮは、そのオキソＣＢＢＮ類似体よりも、二重鎖水和および安定性に対するプラス効果がかなり高いと思われ、いかなる他の２’４’−炭素−架橋二環式ヌクレオチドにおいても見られないＴｍの増強を提供する（図５を参照のこと）。
【表５】
0006446026.tif 000025
【０１７９】
抗２０８ａオリゴヌクレオチドの細胞培養活性
【０１８０】
ｍｉＲ−２０８ａを安定発現するＨｅＬａ細胞株を作製した。具体的には、ｍｉＲ−２０８ａを発現するｍｉＲＮＡ発現ベクター（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。次いで、ピューロマイシン選択スクリーニングを使用して細胞を選択し、ｑＰＣＲによって測定した場合に検出可能なｍｉＲ−２０８ａ発現を有していたクローンを単離した（Ｃｔ値＝約３０）。
【０１８１】
細胞を１ウェル当たり細胞１０，０００個でブラックウェル９６ウェルプレートにプレートした。プレートした２４時間後、ウミシイタケ遺伝子の３’ＵＴＲ内のｍｉＲ−２０８ａ結合部位および様々なｍｉＲ−２０８ａ阻害剤（化合物Ｍ−１１９１９、Ｍ−１１９２０およびＭ−１０１０１）を含有するデュアルルシフェラーゼプラスミドで細胞をトランスフェクトした。化合物Ｍ−１０５９１は、非ターゲティングコントロールであった。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光によって、ホタルレベル（トランスフェクション正規化として）およびウミシイタケレベルの両方を測定した。ｍｉＲ−２０８ａデュアルルシフェラーゼプラスミド（ｐｓｉ  ｃｈｅｃｋ２０８ａ）のみで処理した細胞に対して、データを正規化した。ｍｉＲ−２０８ａ結合部位を含まないデュアルルシフェラーゼプラスミドでｐｓｉ  ｃｈｅｃｋ２細胞を処理した。
【０１８２】
結果は、化合物Ｍ−１１９２０が化合物Ｍ−１０１０１（これは、ＬＮＡ／ＤＮＡ塩基のみを含む最適化ｍｉＲ２０８ａ阻害剤である）と同程度の活性を有することを実証している（図６を参照のこと）。したがって、アミノＣＢＢＮ残基でＬＮＡ残基を複数置換することにより、ｍｉＲ２０８ａ阻害活性が完全に保持される。化合物Ｍ−１１９１９は、他の２つの阻害剤と比較してわずかに低い活性を有する（図６を参照のこと）。化合物Ｍ−１１９１９の活性はＴｍデータと相関しているが、これは、化合物Ｍ−１１９１９が、Ｍ−１１９２０化合物よりも低いｍｉＲ−２０８ａ  ＲＮＡ親和性を有することを示している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
0006446026.tif 000036
【図４−１】
0006446026.tif 000037
【図４−２】
0006446026.tif 000038
【図５】
0006446026.tif 000039
【図６】
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【配列表】
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