(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含み、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なっており、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から目標物質と結合した磁性ナノ粒子を物理的に分離せずに決定されるものであり、
ＮＭＲデータをシグナル処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundがＴ2freeと識別され、
前記シグナル処理は、混合物から得られたＮＭＲデータに二重指数関数フィットを適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む、方法。
【請求項２】
生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するための請求項１記載のインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料を含む試験試料を用意するステップと、
（ｂ）目標物質と結合できる結合剤を含む複数の磁性ナノ粒子を用意するステップと、
（ｃ）試験試料と複数の磁性ナノ粒子とを接触させて、磁性ナノ粒子と試験試料とを含有する混合物を得るステップと、
（ｄ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含み、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なっており、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から目標物質と結合した磁性ナノ粒子を物理的に分離せずに決定されるものであり、
ＮＭＲデータをシグナル処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundがＴ2freeと識別され、
前記シグナル処理は、混合物から得られたＮＭＲデータに二重指数関数フィットを適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む、方法。
【請求項３】
二重指数関数フィットが式（１）
ｙ＝Ａ１＊ｅｘｐ−（ｘ／τ１）＋Ａ２＊ｅｘｐ−（ｘ／τ２）＋Ｏ（式１）
式中：
Ａ１、Ａ２＝ゼロ時における成分１及び２の振幅
τ１、τ２＝成分１及び２のＴ２減衰定数
Ｏ＝オフセット
を使用して適用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
混合物が、マルチエコースピンエコーパルスシーケンスに付される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
混合物中の目標物質の量を定量するステップをさらに含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ｔ2boundの値が混合物中の目標物質の量に依存し、（ａ）混合物中の目標物質の量を、Ｔ2boundの値と、様々な濃度の目標物質で測定されたＴ2bound値の標準プロットと比較することによって決定するか、或いは（ｂ）Ｔ2boundの値を、公知の量の目標物質を含む参照試料から得られた１以上の標準値と比較する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータから、試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和値（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含み、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和値（Ｔ2free）とは異なっており、
ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundがＴ2freeと識別され、
前記ＮＭＲデータの処理は、混合物から得られたＮＭＲデータに二重指数関数フィットを適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む、方法。
【請求項８】
生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和値（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含み、
Ｔ2boundは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和値（Ｔ2free）とは異なっており、
ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundがＴ2freeと識別され、
前記ＮＭＲデータの処理は、混合物から得られたＮＭＲデータに二重指数関数フィットを適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む、方法。
【請求項９】
生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るするステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeに対応する異なるＴ2値が存在するかどうかを決定するステップと
を含み、
Ｔ2boundは、存在していれば目標物質と結合する磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間であり、Ｔ2freeは、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間であり、
前記ＮＭＲデータの処理は、混合物から得られたＮＭＲデータに二重指数関数フィットを適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示の主題は、磁気共鳴を使用する、生体試料中の目標物質、例えば細胞又は病原体のインビトロ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の臨床関連物質、例えば細胞及び病原体の検出は、診断分野で重要である。多数の伝統的な検出戦略は、光学的技術に基づいている。しかし、このような技術は多くの場合、悪影響、例えば光の散乱、吸収及び自己蛍光などにより影響を受ける。このような影響の最小化には、記録測定前の試料の広範囲にわたる精製が要求され得る。
【０００３】
磁性ナノ粒子を用いる検出戦略は、伝統的な検出方法を上回る独特な有利性を提供する。例えば、生体試料は無視できるほどの磁性バックグラウンドを示し、したがって、磁性ナノ粒子の使用は、試料を重要な前処理ステップに供することなく、試料において非常に感度の高い測定を得る機会を提供する。
【０００４】
磁性ナノ粒子は、無機の磁性コア及び生理的条件下で粒子を安定化する生体適合性表面コーティングからなる。適切な界面化学を適用することにより、分子特異性をもたらすために、機能的リガンドをナノ粒子に組み込むことができる。
【０００５】
磁性ナノ粒子が外部場に配置される場合、各粒子は局所磁場を作り出し、この局所磁場は磁場の不均一性を増加させる。水分子がナノ粒子の近くに拡散した場合に、磁場の不均一性の増加は、水のプロトンのスピンのコヒーレントな歳差運動（ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｐｒｅｃｅｓｓｉｏｎｓ）を摂動する効果を有する。結論として、実際の効果は、磁気共鳴シグナルの変化であり、この変化が、縦（Ｔ１、スピン−格子）及び横（Ｔ２、スピン−スピン）の緩和時間の短縮として測定される。
【０００６】
「Ｔ2」という用語は、シグナルの減衰を特徴とするスピン−スピン緩和時間定数を指し、次の式で表すことができる。
【０００７】
Ｍxy（ｔ）＝Ｍxy（０）ｅ-t/T2
式中、Ｍxyは、無線周波数（ＲＦ）パルスによって倒れた磁化ベクトルの縦成分である。
【０００８】
磁性ナノ粒子は、以前から、生体標的、例えば細菌及び哺乳類細胞を検出するために使用されてきている。細胞表面バイオマーカーをタグ付けする標的特異的磁性ナノ粒子が使用され、それによって磁気モーメントがもたらされる。緩和速度Ｒ2＝１／Ｔ2の増加は、標的に結合されたナノ粒子の数に直接比例する（及び表面マーカーの量をさらに示す）。Ｒ2の変化及び故にＴ2の変化は、したがって試料溶液中の細胞の存在を検出するために使用できる（Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｎａｎｏｎｏｔｅｃｈｎｏｌ；（２０１０）；１；ｐａｇｅｓ  １４２−１５４）。しかし、先行技術に記載された方法は、未結合の磁性ナノ粒子を除去してアッセイの感度を確実に高めることが要求され、未結合の磁性ナノ粒子の除去は通常濾過により達成される。検出がマイクロＭＲデバイスを用いることによって達成される場合、このデバイスは、反応流路の末端に、未結合磁性ナノ粒子をフィルター除去するための濾過膜を必要とする（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ；（２００９）；４８；ｐａｇｅｓ５６５７−５６６０）。
【０００９】
未結合磁性ナノ粒子を結合磁性ナノ粒子から除去する必要性は、多数の問題を引き起こす。例えば、マイクロフルイディクスネットワーク及び濾過膜を用いることは、ＭＲ検出デバイスのコストを引き上げる。追加の濾過ステップは、手ごろな価格の試験技術が特に重要となる発展途上国で特に意味を持つ要素である試料調製のコストもまた引き上げることになる。さらに、追加の分離ステップの必要性は、診断試験を実施する技術者を、有害物質に曝露する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／１５７２５６号明細書
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料を含む試験試料を用意するステップと、
（ｂ）目標物質と結合できる結合剤を含む複数の磁性ナノ粒子を用意するステップと、
（ｃ）試験試料と複数の磁性ナノ粒子とを接触させて、磁性ナノ粒子と試験試料とを含有する混合物を得るステップと、
（ｄ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から目標物質と結合した磁性ナノ粒子を物理的に分離せずにＴ2boundを決定する、方法に関する。
【００１２】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から目標物質と結合した磁性ナノ粒子を物理的に分離せずにＴ2boundを決定する、方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るするステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータから、試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundをＴ2freeと識別する、方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundをＴ2freeと識別する、方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るするステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeに対応する異なるＴ2値が存在するかどうかを決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、存在していれば目標物質と結合する磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間であり、Ｔ2freeが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間である、方法をさらに提供する。
【００１６】
生体試料は、哺乳類被験体、好ましくはヒト、例えば疾患又は感染症を有する疑いのある個体から得られた試料であることが好ましい。目標物質は、例えば細胞又は病原体であり得、疾患又は感染症を示す標的を表し得る。
【００１７】
本発明は、したがって、目標物質と結合した磁性ナノ粒子を、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から物理的に分離／濾過する必要のない、磁性ナノ粒子を使用する、生体試料中の目標物質、例えば細胞又は病原体を検出する方法に関する。
【００１８】
本発明者らは、Ｔ2boundの値が、目標物質（例えば細胞、病原体又は細菌）の濃度に依存し、Ｔ2boundを決定できれば、目標物質の量（例えば、数又は濃度）を求めることができるという知見を得た。
【００１９】
したがって、本発明は、上記の分離ステップを必要とする先行技術の方法を上回る明確な有利性を有する。例えば、このステップの除去は、試料調製の時間及びコストを削減する。このステップの除去は、試験を実施する技術者を他の有害試料に曝露する可能性もまた低下させ得る。さらに、高度に訓練された人的資源の必要性も排除できる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、目標物質は、細胞及び／又は病原体、例えば細菌細胞である。
【００２１】
別の実施形態では、ＮＭＲデータをシグナル処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによって、Ｔ2boundをＴ2freeと識別する。シグナル処理は、好ましくは、二重指数関数フィットを混合物から得られたＮＭＲデータに適用して、Ｔ2bound及びＴ2freeの別々の値を得るステップを含む。
【００２２】
別の実施形態では混合物は、スピンエコーパルスシーケンス、特にマルチエコースピンエコーパルスシーケンスに付される。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明に従った方法は、試料又は混合物中の目標物質の量を定量するステップをさらに含む。この実施形態の一態様では、Ｔ2boundの値は、混合物中の目標物質の量に依存し、目標物質の量は、Ｔ2boundの値と、様々な濃度の目標物質で測定されたＴ2bound値の標準プロットと比較することによって決定される。さらに、又は代替的に、Ｔ2boundの値は、混合物中の目標物質の量に依存し、Ｔ2boundの値は、公知の量の目標物質を含む参照試料から得られた１以上の標準値と比較される。
【００２４】
別の実施形態では、本発明の方法は、マイクロＭＲデバイスで実施される。
【００２５】
別の実施形態では、磁性ナノ粒子は、結合剤に連結した超常磁性粒子を含む。各磁性粒子は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）を含むコアを含んでよく、この粒子は結合剤に連結される。
【００２６】
別の実施形態では、結合剤は、目標物質に特異的な結合部位を含む抗体又は抗体フラグメントである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】細菌標的化磁気ナノコンジュゲートと細菌との間の反応に関するＴ２緩和時間対時間を示すプロットである。
【図２】濾過ステップを用いる、目標物質の検出過程の略図である。
【図３】濾過ステップを必要としない本発明の方法を使用する、目標物質の検出過程の略図である。
【図４】本発明に採用可能なマイクロ磁気共鳴ユニットの透視分解立体図である。
【図５】本発明に採用可能な、試料及びナノ粒子の混合物を分析する方法のフローダイアグラムである。
【図６】本発明に採用可能な、マイクロ磁気共鳴システムの略図である。
【図７】マイクロ核ＭＲユニットの分析データを扱うインターフェイスユニットの略図である。
【図８】マイクロ核ＭＲユニットで作成される分析データを扱うインターフェイスユニットのための例示的環境である。
【図９】マイクロ磁気共鳴ユニットで分析データを扱う方法のフローダイアグラムを例示している。
【図１０】インターフェイスユニットで分析データを処理する方法のフローダイアグラムを例示している。
【図１１】一実施形態に従ったマイクロ磁気共鳴システムを使用する、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物を分析する方法のフローダイアグラムを例示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料を含む試験試料を用意するステップと、
（ｂ）目標物質と結合できる結合剤を含む複数の磁性ナノ粒子を用意するステップと、
（ｃ）試験試料と複数の磁性ナノ粒子とを接触させて、磁性ナノ粒子と試験試料とを含有する混合物を得るステップと、
（ｄ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、Ｔ2boundが、目標物質と結合した磁性ナノ粒子が、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から物理的に分離されずに決定される方法を提供する。
【００２９】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、
Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、Ｔ2boundが、目標物質と結合した磁性ナノ粒子が、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子から物理的に分離されずに決定される方法をさらに提供する。
【００３０】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るするステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータから、試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、
Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundをＴ2freeと識別する、方法をさらに提供する。
【００３１】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を磁気共鳴によって検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物を用意するステップと、
（ｂ）試料中の目標物質と結合した磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2bound）を決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間（Ｔ2free）とは異なり、ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeの別々の値を得ることによってＴ2boundをＴ2freeと識別する、方法をさらに提供する。
【００３２】
本発明は、生体試料中の目標物質の存在を検出するための方法であって、
（ａ）生体試料と複数の磁性ナノ粒子とを含む混合物であって、生体試料中に目標物質が存在する場合に目標物質と結合できる結合剤を磁性ナノ粒子が含んでいる混合物からＮＭＲデータを得るするステップと、
（ｂ）ＮＭＲデータを処理してＴ2bound及びＴ2freeに対応する異なるＴ2値が存在するかどうかを決定するステップと
を含んでいて、Ｔ2boundが、存在していれば目標物質と結合する磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間であり、Ｔ2freeが、目標物質と結合していない磁性ナノ粒子に対応するＴ2緩和時間である、方法をさらに提供する。
【００３３】
磁性ナノ粒子が外部場に配置される場合、各粒子は局所磁場を作り出し、この局所磁場は磁場の不均一性を増加させる。水分子がナノ粒子の近くに拡散した場合に、磁場の不均一性の増加は、水のプロトンのスピンのコヒーレントな歳差運動（ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｐｒｅｃｅｓｓｉｏｎ）を摂動する効果を有する。結論として、実際の効果は、磁気共鳴シグナルの変化であり、この変化が、縦（Ｔ1、スピン−格子）及び横（Ｔ2、スピン−スピン）の緩和時間の短縮として測定される。
【００３４】
本発明者らは、磁性ナノ粒子が、目標物質、例えば細胞に結合された場合、磁性ナノ粒子に関連するＴ2緩和値が低下することを特定した。より具体的には、本発明者らは、目標物質、例えば細胞型に特異的な結合剤を含む磁性ナノ粒子が、目標物質（例えば標的細胞）の存在下でインキュベートされた場合、２つのＴ2測定値を得ることが可能であることを実証した。第１のＴ2値（通常低い方の値）は、物質に結合されないナノ粒子に関連するＴ2値（本明細書ではＴ2freeと称される）に対応する。第２のＴ2値（通常高い方の値）は、物質に結合されたナノ粒子に関連するＴ2値（本明細書ではＴ2boundと称される）に対応する。
【００３５】
本発明者らは、目標物質（例えば細胞）及び磁性ナノ粒子の混合物中のＴ2free及びＴ2boundの値を、目標物質（例えば細胞）に結合されないナノ粒子を物理的に分離することなく、測定可能であることをさらに実証した。これは、混合物からのＮＭＲデータを処理してＴ2free及びＴ2bound両方の値を得ることによって達成可能である。処理ステップは、好ましくは、二重指数関数フィットを、混合物から得られたＮＭＲデータに適用するステップを含む。二重指数関数フィットは、２つの異なるＴ2値が、ＮＭＲ測定実験に付された混合物中に存在し得るという事実を満たす。
【００３６】
Ｔ2free及びＴ2boundの値を求めるのに使用できる二重指数関数フィット式の例を、以下の式（１）に示す。
【００３７】
ｙ＝Ａ１＊ｅｘｐ−（ｘ／τ１）＋Ａ２＊ｅｘｐ−（ｘ／τ２）＋Ｏ  （式１）
式中、
Ａ１、Ａ２＝ゼロ時における成分１及び２の振幅
τ１、τ２＝成分１及び２のＴ２減衰定数
Ｏ＝オフセット。
【００３８】
通常、このような非線形フィットは、例えば、レーベンバーグ−マーカート（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）の非線形最小二乗フィットアルゴリズムを使用する、反復様式で実施される。反復過程は、未知数の推定により開始される。この場合、未知数は、相対振幅Ａ１、Ａ２、緩和時間τ1及びτ2並びにオフセットＯである。これらのすべてがアルゴリズムにより決定され、このアルゴリズムは、その反復過程の停止基準を有する。このようなフィットアルゴリズムは、大部分の市販の緩和時間測定機（ｒｅｌａｘｏｍｅｔｅｒｓ）で標準ルーチンとして利用可能である。
【００３９】
Ｔ2値のＮＭＲ決定において、Ｔ2値は、試料に対する適切なパルスシーケンスの適用の間に取得されたＮＭＲシグナルを使用して決定することができる。好ましい実施形態では、シーケンスは、マルチエコースピンエコーパルスシーケンスである。
【００４０】
適切なシーケンスの例は、カー−パーセル−マイボーム−ギル（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）（ＣＰＭＧ）スピンエコーシーケンスである。
【００４１】
｛ＲＤ−９０0−ｔａｕ−［（１８０90−ｔａｕ−）ＤＥ（１８０90−ｔａｕ−）ａｓｄ−ｔａｕ−］N｝NS
式中、ＲＤはリサイクルディレイであり、ｔａｕはディレイ間隔であり、ＤＥはエコーをサンプリングする前のダミーエコーの数であり、Ｎは収集される点の数であり、ＮＳはシグナルの平均値算出のためのスキャンの数であり、「ａｓｄ」は単一データの取得点を示す。
【００４２】
パラメーターの例は、ＲＤ＝６秒；ｔａｕ＝５ミリ秒、ＤＥ＝０、Ｎ＝７００、ＮＳ＝８である。ただし、本発明でＴ2値を決定することができる他のシーケンスを当業者が容易に決定できることは明らかであろう。
【００４３】
本発明者らは、Ｔ2boundの値が、目標物質（例えば、病原体又は細菌）の濃度に依存するという知見を得た。本発明は、したがって、試料中に存在し得る目標物質の量（例えば、細胞、病原体又は細菌の数又は濃度）を、未結合のナノコンジュゲートを濾過する必要なく、定量するためにさらに使用される。
【００４４】
したがって、一実施形態では、Ｔ2boundの値は、試験試料／混合物中の目標物質の量に依存し、試験試料中の目標物質の量は、Ｔ2boundの値を、様々な濃度の目標物質で測定されたＴ2bound値の標準プロットと比較することによって決定される。
【００４５】
別の実施形態では、Ｔ2boundの値は、試料中の目標物質の量に依存し、Ｔ2boundの値は、既知の量の目標物質を含む参照試料から得られた１以上の標準値と比較される。
【００４６】
本発明で得られる利点は、図２に示す概略ワークフローと図３に示す概略ワークフローとを比較することによって理解することができる。図２は、濾過ステップを用いる目標物質の検出過程の略図である。図３は、濾過ステップが必要条件でない、本発明の方法を使用する目標物質の検出過程の略図である。
【００４７】
本出願を通して、Ｔ2値の決定について説明する。しかし、Ｔ2＝１／Ｒ2（式中、Ｒ2は緩和速度定数である）なので、本発明の方法は、Ｒ2を決定することによって実施可能であることは理解されると思われる。したがって、Ｒ2値（例えば、Ｒ２bound及びＲ２free）を決定することによる試料中の目標物質の存在及び／又は量の決定は、Ｒ２がＴ２の逆数なので、本発明の技術的範囲に属する。例えば、Ｒ２値の決定は、式１においてＴ２定数を１／Ｒ２に置き換えることによってなし得る。したがって、Ｔ２値の決定は、対応するＲ２値の決定であるとみなすこともでき、逆もまた同じであることが言えるので、Ｒ２bound及びＲ２freeの値の検出による目標物質の存在の検出は、本発明の技術的範囲に属する。
【００４８】
本発明に用いることができる磁性ナノ粒子は、当技術分野で周知である。ナノ粒子としては、限定するものではないが、磁性ナノ粒子又は超常磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子は、ＭＲＩ及び他のＮＭＲ緩和時間測定機を使用して測定可能な隣接分子のスピン−スピン緩和時間を調節する近接センサーとして作用することができる。ナノ粒子は、適切に物理的及び化学的に安定であり、生体適合性及び環境的に安全である。
【００４９】
磁性ナノ粒子は、理想的には強力な磁気モーメントを有し、著しいＴ2変化を誘導する一方で、自発的磁性集合（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を避けるような超常磁性挙動を示さなければならない。さらに、ナノ粒子は、水溶液における集合を防止するために適切なコーティングにより被覆されなければならない。適切なコーティングは、通常親水性及び生体適合性である。コーティングは、好ましくは、１種以上の結合剤、例えば抗体、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド又は小分子を付着させる手段を提供するはずである。
【００５０】
磁性ナノ粒子の例としては、架橋酸化鉄（ＣＬＩＯ）ナノ粒子、アミノ化ＣＬＩＯ（アミノ−ＣＬＩＯ）ナノ粒子、マンガンがドープされた酸化鉄磁性ナノ粒子、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子及び元素鉄のコア／フェライトシェルのナノ粒子が挙げられる。このようなナノ粒子は、上記のように適切に被覆可能である。磁性ナノ粒子及びインビトロの磁気共鳴検出におけるこれらの使用の例は、表題「Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」、Ｊｅｒｅｄ  Ｂ．Ｈａｕｎ，Ｔａｅ−Ｊｏｎｇ  Ｙｏｏｎ，Ｈａｋｈｏ  Ｌｅｅ  及びＲａｌｐｈ  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ著（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ刊：Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．２；Ｉｓｓｕｅ３；Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ２０１０；Ｐａｇｅｓ２９１−３０４）の出版物に提供されている。その他の例としては、例えば、表題「Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ」、Ｖａｓｉｌｉｋｉ  Ｄｅｍａｓ及びＴｈｏｍａｓ  Ｊ  Ｌｏｗｅｒｙ著（Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ刊：Ｖｏｌｕｍｅ１３，Ｉｓｓｕｅ２（２０１１），ｐｐ．０２５００５）が提供される。
【００５１】
ナノ粒子を目標物質と結合させるために、ナノ粒子は、標識又は目標物質（例えば、細胞、病原体又は細菌）に特異的な結合剤と連結される。結合剤の特性及び構造は、検出される標的の特性に依存する。このような結合剤の例としては、目標物質の標的部分を認識又はこれに結合する抗体；ＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−標的に相補的なオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ配列；例えば標的のタンパク質、細菌、ウイルス、酵母もしくは真菌に結合するＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−アプタマー；例えば標的のタンパク質、細菌、ウイルス、酵母もしくは真菌に結合するタンパク質もしくはペプチド；標的に対する結合の強化を保有すると思われる、及び／又は環境的安定性の改善を保有する非天然アミノ酸を含むペプチド；標的に結合可能な小分子もしくは小分子の組合せが挙げられる。この部分は、共有結合又は非共有結合により、ナノ粒子（例えば、ナノ粒子のシェル）と連結可能である。この部分は、適切な官能基によりナノ粒子と連結可能である。適切な官能基としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−（Ｏ）ＣＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ2）n（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＯ−、−Ｓ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＳ−、−ＮＨ（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＯ−、−Ｓ（ＣＨ2）n−又は−（ＣＨ2）nＳ−、（式中、ｎはそれぞれ、１〜１００（例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９）であってよい）が挙げられる。結合剤とナノ粒子との連結方法は、当技術分野で周知であり、この例は、上述の出版物に提供されている。その他の例としては、例えば米国特許第７８２９３５０号が提供される。
【００５２】
好ましい実施形態では、結合剤は抗体である。「抗体」という用語は、天然又は部分的もしくは全体的に合成されたかに関わらず、免疫グロブリンを表す。抗体は、モノクローナルであっても、又はポリクローナルであってもよく、当技術分野で周知の技術、例えば、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の回収によって；又は連続ハイブリッド細胞系の調製及び分泌タンパク質の回収（モノクローナル）によって、又はヌクレオチド配列もしくはこれらの突然変異型のクローン化及び発現、少なくとも天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列のコード化により調製可能である。「抗体」という用語は、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質もまた包含する。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントとしては、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの分子及びダイアボディが挙げられる。
【００５３】
目標物質は、試験される生体試料中に存在し得る物質であり、目標物質の存在の知識は、例えば臨床診断への到達に望ましい物質である。目標物質の例としては、細胞（例えば、対象となる特定のバイオマーカーを発現する細胞）、細菌、病原体、ウイルス、寄生生物、酵母又は真菌が挙げられる。
【００５４】
本発明により検出可能な細菌の例としては、グラム陽性細菌、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；グラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；並びに抗酸菌、例えば、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などのマイコバクテリウムの株が挙げられる。
【００５５】
本発明により検出可能な病原体の例としては、細菌、真菌、寄生生物、酵母及びウイルスが挙げられる。
【００５６】
本発明により検出可能な細胞の例としては、細菌、腫瘍細胞、幹細胞、哺乳類細胞及び他の細胞が挙げられる。
【００５７】
磁性ナノ粒子上の結合剤は、対象となる目標物質に特異的に結合可能である。結合剤は、通常目標物質の標的部位に結合するものである。標的部位は、例えば、目標物質を特徴付けるバイオマーカーであり得る。
【００５８】
標的部位は、標的タンパク質を含んでよい。本発明の一実施形態に従った標的タンパク質は、目標物質の表面に存在してよい。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、生体試料の表面に本質的に存在しないこともあり、生体試料は、標的タンパク質を表面で利用可能にするように処理されなければならないこともある。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、組織中、細胞表面又は細胞内のいずれかに存在し得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、標的部位（例えばタンパク質）は、生体試料中の目標物質の有無についての情報を提供することができる。別の実施形態では、標的タンパク質は、生体試料の状態についての情報を提供することができる。例えば、本明細書に開示の方法を標的タンパク質の検出に使用できる場合、標的タンパク質は、異なる細胞型の比較、異なる発達段階の比較、疾患又は異常の存在の検出、又は疾患又は異常の型の決定を手助けできる。
【００６０】
適切な標的タンパク質は、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体、アフィボディ又はアプタマー）、酵素、リガンド、受容体、抗原又はハプテンの１つ以上を含み得る。前述の標的タンパク質の１つ以上は、特定の細胞の特徴であり得、一方、他の標的タンパク質は、特定の疾患又は病態に関連することがある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法を使用して、検出及び分析可能な、試料中の目標物質（例えば、細胞、細菌又は病原体）に存在する標的タンパク質としては、限定するものではないが、予後兆候マーカー、予測マーカー、ホルモンもしくはホルモン受容体、リンパ球、腫瘍マーカー、細胞周期関連マーカー、神経組織及び腫瘍マーカー又はクラスター分化マーカーを挙げることができる。
【００６１】
予後兆候マーカーの適切な例としては、酵素標的、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩ、ニューロン特異的エノラーゼ、プロトンＡＴＰアーゼ−２又は酸性ホスファターゼを挙げることができる。予後兆候タンパク質又は遺伝子マーカーの他の例としては、Ｋｉ６７、サイクリンＥ、ｐ５３、ｃＭｅｔが挙げられる。
【００６２】
予測マーカー（薬剤応答）の適切な例としては、タンパク質又は遺伝子標的、例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＡＬＫを挙げることができる。
【００６３】
ホルモン又はホルモン受容体の適切な例としては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、副腎皮質刺激ホルモン、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ｇＣ１ｑ−Ｒ／ｐ３３補体受容体、ＩＬ−２受容体、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ＰＴＨ受容体、甲状腺ホルモン受容体又はインスリン受容体を挙げることができる。
【００６４】
リンパ球の適切な例としては、アルファ−１−抗キモトリプシン、アルファ−１−抗トリプシン、Ｂ細胞標的、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｂリンパ球抗原３６ｋＤ、ＢＭ１（骨髄標的）、ＢＭ２（骨髄標的）、ガレクチン−３、グランザイムＢ、ＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＰ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＱ）抗原、ＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ）抗原、ヒト好中球デフェンシン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、カッパ軽鎖、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、リンパ球／組織球抗原、マクロファージ標的、ムラミダーゼ（リゾチーム）、ｐ８０未分化リンパ腫キナーゼ、形質細胞標的、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ１）、Ｔ細胞抗原受容体（ＪＯＶＩ３）、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ又は非クラスター化Ｂ細胞標的を挙げることができる。
【００６５】
腫瘍マーカーの適切な例としては、アルファ胎児タンパク質、アポリポタンパク質Ｄ、ＢＡＧ−１（ＲＡＰ４６タンパク質）、ＣＡ１９−９（シアリルルイスａ（ｓｉａｌｙｌ  ｌｅｗｉｓａ））、ＣＡ５０（癌腫関連ムチン抗原）、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、ＣＡ２４２（腫瘍関連ムチン抗原）、クロモグラニンＡ、クラスタリン（アポリポタンパク質Ｊ）、上皮膜抗原、上皮関連抗原、上皮特異的抗原、粗大嚢胞性疾患内容液タンパク質（ｇｒｏｓｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１５、肝細胞特異的抗原、ヘレグリン、ヒト胃ムチン、ヒト乳脂肪球、ＭＡＧＥ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ、メランＡ、メラノーマ標的（ＨＭＢ４５）、メソテリン、メタロチオネイン、小眼球症転写因子（ＭＩＴＦ）、Ｍｕｃ−１コア糖タンパク質、Ｍｕｃ−１糖タンパク質、Ｍｕｃ−２糖タンパク質、Ｍｕｃ−５ＡＣ糖タンパク質、Ｍｕｃ−６糖タンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、Ｍｙｆ−３（横紋筋肉腫標的）、Ｍｙｆ−４（横紋筋肉腫標的）、ＭｙｏＤ１（横紋筋肉腫標的）、ミオグロブリン、ｎｍ２３タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、プレアルブミン、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺インヒビンペプチド、ＰＴＥＮ、腎細胞癌腫標的、小腸ムチン抗原、テトラネクチン、甲状腺転写因子−１，マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織インヒビター、マトリックスメタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、チロシナーゼ、チロシナーゼ−関連タンパク質−１、ビリン又はヴィルブラント因子を挙げることができる。
【００６６】
細胞周期関連マーカーの適切な例としては、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１、ｂｃｌ−ｗ、ｂｃｌ−ｘ、ブロモデオキシウリジン、ＣＡＫ（ｃｄｋ−活性化キナーゼ）、細胞アポトーシス感受性タンパク質（ＣＡＳ）、カスパーゼ２、カスパーゼ８、ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、サイクリンＥ、サイクリンＧ、ＤＮＡ断片化因子（Ｎ末端）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、Ｆａｓリガンド、Ｆｅｎ−１、ＩＰＯ−３８、Ｍｃｌ−１、ミニ染色体維持タンパク質、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、増殖細胞核抗原、ｐ１６タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ３４ｃｄｃ２、ｐ５７タンパク質（Ｋｉｐ２）、ｐ１０５タンパク質、Ｓｔａｔ１アルファ、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩアルファ、トポイソメラーゼＩＩＩアルファ又はトポイソメラーゼＩＩを挙げることができる。
【００６７】
クラスター分化マーカーの適切な例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６及びＴＣＲ−ゼータを挙げることができる。
【００６８】
他の適切な標的タンパク質としては、セントロメアタンパク質−Ｆ（ＣＥＮＰ−Ｆ）、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、インボルクリン、ラミンＡ＆Ｃ（ＸＢ１０）、ＬＡＰ−７０、ムチン、核膜孔複合体タンパク質、ｐ１８０ラメラ体タンパク質、ｒａｎ、カテプシンＤ、Ｐｓ２タンパク質、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、Ｐ５３、Ｓ１００、上皮標的抗原（ＥＭＡ）、ＴｄＴ、ＭＢ２、ＭＢ３、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、サイトケラチン、ＰＩ３Ｋ、ｃＭｙｃ又はＭＡＰＫが挙げられる。
【００６９】
さらに他の適切な標的タンパク質としては、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（乳癌及び胃癌で過剰発現される表皮成長因子、モノクローナル抗体による療法が腫瘍成長を遅延させる）；ＥＧＦ−Ｒ／ｅｒｂＢ（表皮成長因子受容体）；ＥＲ（一部の乳癌腫瘍の成長に必要なエストロゲン受容体、核に局在し、陽性患者でエストロゲンを制限する療法を決定するためにＩＳＨにより検出される）；ＰＲ（プロゲステロン受容体は、ＤＮＡと結合するホルモンである）；ＡＲ（アンドロゲン受容体は、アンドロゲン依存性腫瘍成長に関与する）；β−カテニン（細胞膜から核へ移行するがんの発現遺伝子であり、細胞接着及び潜在遺伝子調節タンパク質としての両方で機能する）；ホスホ−β−カテニン：β−カテニンのリン酸化型、（サイトゾルで分解して核へは移行しない）；ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βタンパク質、Ｗｎｔ経路でβ−カテニンをリン酸化して、プロテアソームで急速に分解するために、ホスホ−β−カテニンへとマーキングする）；ＰＫＣβ（受容体にカップリングされたメディエーターＧ−タンパク質）；ＮＦΚβ（核に移行した際の、炎症のための核内因子カッパＢマーカー）；ＶＥＧＦ（血管新生に関連する血管内皮成長因子）；Ｅ−カドヘリン（上皮細胞で発現される細胞と細胞との相互作用分子、この機能は、上皮癌で喪失される）；ｃ−ｍｅｔ（チロシンキナーゼ受容体）が挙げられる。
【００７０】
ある実施形態では、目標物質の標的部位は多糖類抗原である。
【００７１】
試験試料は、生体試料を含む、又はこれからなってよい。本発明の一実施形態に従った生体試料は、好ましくは流体である。生体試料は、好ましくは生物被験体から得られた試料、例えば、インビボ又はインビトロで得られた生体組織又は生体液起源の試料である。生体試料の適切な例としては、限定するものではないが、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰、精液、尿、便、涙、針吸引検体、皮膚の外部切片、呼吸器、腸及び尿生殖路の腫瘍、臓器、細胞培養液又は固体組織切片を挙げることができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、そのままで、すなわち、対象となる目標物質の採取及び／又は単離をせずに分析可能である。代替の実施形態では、試料は、磁性ナノ粒子との混合前に、例えば、分析前の試料の採取によって、又は適切なバッファー又は安定化剤の添加によって、処理されてもよい。
【００７２】
生体試料は、それらの物理的状態に関わらず、前述の試料のいずれかを含んでよい。いくつかの実施形態では、生体試料は、本来は試料に天然に混合されない化合物、例えば、保存料、抗凝固剤、バッファー、固定剤、栄養、抗生物質などを含んでもよい。
【００７３】
好ましい実施形態では、生体試料は、血液、痰又は任意の体液又は細針吸引検体（ＦＮＡ）を含む。
【００７４】
本発明の方法は、磁気共鳴（ＭＲ）デバイスを使用して実施される。磁気共鳴は、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲ分光分析及び／又はＮＭＲ緩和時間測定法を使用して検出可能である。これらの技術はすべて、スピン−スピン緩和時間（Ｔ2）を測定するために使用されている。臨床用及び実験用ＭＲＩスキャナーは、超電導磁石により発生される強力な磁場を用いる。しかし、ＭＲＩスキャナーは、高い運用コスト、嵩高な機器サイズ及び大容量の試料の必要性に悩まされる。ベンチトップ緩和時間測定機は、ポイントオブケア診断に関するより魅力的な選択肢を提供した（例えば、Ｈａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｖｏｌ．２，ｉｓｓｕｅ３，Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２０１０，ｐａｇｅｓ２９１−３０４；並びにＰｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０：ｐａｇｅｓ８１６−８２０を参照されたい）。ベンチトップシステムは、より低いＮＭＲ周波数（１００ｋＨｚ−５０ＭＨｚ）で動作し、磁場発生用の永久低磁場磁石を装備している。
【００７５】
近年、ＮＭＲ検出システムに基づくチップ（マイクロＭＲと呼ばれる）が開発され、より少ない試料体積についての、多重診断ＭＲ測定が実施されている（例えば、Ｈａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｖｏｌ．２，ｉｓｓｕｅ３，Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ  ２０１０，ｐａｇｅｓ２９１−３０４；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８，１４：ｐａｇｅｓ８６９−８７４；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００９，４８：ｐａｇｅｓ５６５７−５６６０；並びにＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００９，４８：ｐａｇｅｓ５６５７−５６６０を参照されたい）。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、マイクロＭＲデバイスを使用して実施される。マイクロＭＲデバイスは、好ましくは無線周波数（ＲＦ）励起及びＮＭＲシグナル検出の両方のための１以上のマイクロコイル、ＮＭＲ分光光度計及びマイクロ流体ネットワークを含む。
【００７７】
図４は、一実施形態に従った、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物を分析するための、マイクロ核磁気共鳴（ＭＲ）ユニットの透視分解立体図の略図である。マイクロ核ＭＲユニット１０２は、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物を受け取るように構成されている。ナノ粒子は、マイクロ核ＭＲユニット、例えばマイクロ核ＭＲユニット１０２で磁場に付された場合に磁化される。ナノ粒子の磁気モーメントは、磁力線に沿って並び、磁束を生み出す。各ナノ粒子は、磁気双極子を生み出し、磁気双極子は磁場勾配の形成をもたらす。磁場勾配は磁場の不均一性を発生し、この不均一性は分子における隣接するプロトンの核スピンの歳差運動周波数を変化させる。これは、磁気共鳴画像化又は核磁気共鳴技術により測定可能な、磁気共鳴シグナルの変化をもたらす。測定される磁気共鳴シグナルは、縦又はスピン−格子緩和時間Ｔ1及び横スピン−スピン緩和時間Ｔ2の短縮としてみなすことができる。ナノ粒子の磁気緩和特性は、粒子の緩和率及びナノ粒子の環境、例えば、ナノ粒子が、細胞／細菌／病原体などの目標物質に結合しているか、していないかに依存し、この環境は横緩和（Ｒ2＝１／Ｔ2）に影響を与え得る。
【００７８】
マイクロ核ＭＲユニット１０２は、磁石１０４、マイクロＭＲプローブ１０６、ケーシング１０８及びコントロールユニット１１０を含む。マイクロ核ＭＲユニット１０２は統合され、混合物の分析を実行するためのポータブルデバイスとして使用することができる。マイクロ核ＭＲユニット１０２は、小型化ＮＭＲシステム要素、例えば、磁石１０４、マイクロＭＲプローブ１０６、ケーシング１０８及びコントロールユニット１１０の統合のため、サイズを縮小することができる。磁石１０４は、永久磁石又はポータブル永久磁石であってよい。一実施形態では、磁石１０４は、より高い磁場を生み出すための複数の磁石のアセンブリであってよい。磁石１０４は、マイクロＭＲプローブ１０６の周りに配置されてよい。一実施形態では、磁石１０４は経路１１２を含むことができ、この経路を介して、マイクロＭＲプローブ１０６を、マイクロＭＲプローブ１０６の周りに磁石１０４が位置するように配置することができる。しかし、磁石１０４は、マイクロＭＲプローブ１０６の周り、又はこれに隣接して位置するような任意の他の構成を有することも企図される。マイクロＭＲプローブ１０６は、マイクロ流体用導管１１６の周りにマイクロコイル１１４が位置することによって製作されてもよい。マイクロコイル１１４は、マイクロコイル又は多重マイクロコイルの配列、例えばソレノイドコイルであってもよい。例えば、マイクロコイル１１４は、ポリエチレンチューブの周りに極細銅線を巻き付け、その後ポリマー材料、例えば、ポリジメチルシロキサンに浸漬することによって、製作することができる。マイクロＭＲプローブ１０６は小型化形態であってよく、したがって、マイクロＭＲチップとして提示することができる。マイクロ核ＭＲユニット１０２は、高安定性永久磁石を、内径２０〜５００ミクロンの範囲を有するマイクロＭＲコイルと組合せて含み、ＮＭＲ検出の感度を、卓上分光計と比較して数桁上昇させる。他の構成を有するマイクロコイルを、マイクロＭＲプローブ１０６で使用できることも想定可能である。マイクロ流体用導管１１６は、容器１１８をその中に受けるように構成される。少なくとも１種の試料及びナノ粒子を、容器１１８内に導入することができる。少なくとも１種の試料が、磁性ナノ粒子と混合され、混合物１２０が、マイクロ流体用導管１１６内で形成される。マイクロ流体用導管１１６は、感知工程において、流体試料の操作、磁性ナノ粒子と試料との再現可能な混合、並列感知のための異なるコイルへのアリコートの分配及び所与のマイクロコイルの最も感度の高い領域への試料の収容を含む重要な機能を提供する。
【００７９】
磁石１０４は、マイクロＭＲプローブ１０６の周りに磁場を発生させる。目標物質（例えば、細胞）が存在する場合、ナノ粒子とのクラスターが形成される。流体試料中の、例えば標的細胞の存在の検出は、ベースアナライト（すなわち、未反応のナノ粒子）のＴ２（すなわち、スピン−スピン緩和時間）から、流体試料が（ナノ粒子アナライトの反応が完了後）特定の標的を含有する場合のＴ２への変化の現象による。基本的に、励起パルス後、その後観察される横方向の磁化は、特徴的な指数関数的「自由誘導減衰」（ＦＩＤ）で減衰する。これは、スピン−スピン緩和及び磁場の不均一性の存在による緩和の組合せを含む。単一励起パルスの後にリフォーカスパルスの束が加えられた場合、「スピンエコー」が得られる。これらのスピンエコーは、Ｒ２（スピン−スピン緩和速度）と呼ばれる、非常に遅い指数関数的速度で減衰する。
【００８０】
ベースアナライトは基本的に、目標物質（例えば、バイオマーカー分子）と結合する特定の薬剤により活性化されている、非クラスター化ナノ粒子を含む。標的細胞の場合に、これらのナノ粒子は、例えば、細胞の細胞膜で結合部位と結合し、それによって、互いに接近したナノ粒子がクラスター化される。結合されたナノ粒子に対応する緩和時間（Ｔ2）は、未結合のナノ粒子に対応する緩和時間（Ｔ2）とは異なる。マイクロコイル１１４は、コントロールユニット１１０を介して所定の時間励起され、シグナル、例えば、無線周波数（ＲＦ）シグナルを発生し、混合物に送信する。その後、混合物は、時間と共に減衰するＮＭＲシグナルを発生する。したがって、結合されたナノ粒子対未結合のナノ粒子に関するこの緩和速度の変化は、上述のような試料及びナノ粒子の混合物中の目標物質（例えば、細胞）の存在を検出するために使用可能である。高緩和率のナノ粒子の使用は、流体試料中の極めて少数の標的細胞の検出を可能にし、検査を非常に感度の高いものにする。混合物中の標的細胞及びアナライトの検出された存在が記録される。上で詳細に記載したように、本発明の方法は、同じ試料中のＴ2bound及びＴ2freeの両方を検出するために使用でき、さらに、試料中の目標物質の量を定量するために使用可能である。
【００８１】
ＮＭＲシグナルは、混合物に関連する分析データを含む。ＮＭＲシグナルは、コントロールユニット１１０により測定される。コントロールユニット１１０は、コントロールユニット１１０のすべての構成要素の全動作をコントロールする、マイクロコントローラ１２２を含む。マイクロコントローラ１２２は、コントロールユニット１１０で受信するデータを処理し、データ転送及びユーザーコントロールに関する外部端末と通信する。混合物への送信に必要なＲＦシグナルは発生装置１２４（すなわち、ＲＦ発生装置）により、マイクロコントローラ１２２からの命令に基づき発生される。ＲＦシグナルは、その後、トランシーバ１２６、例えば、ＲＦトランシーバにより送信される。ＲＦシグナルは、トランシーバ１２６中に存在する電圧コントローラスイッチを使用して変調され、ＮＭＲシグナルを測定するためのパルスシーケンスを送信することができる。ＮＭＲシグナルは、トランシーバ１２６で受信され、ヘテロダイン検出のために処理される。ヘテロダイン検出の工程は、低ノイズ増幅器における増幅、その後のミキサーによる可聴周波数への周波数下降変換を伴う。その後、下降変換されたシグナルは、低域フィルター及び増幅器により整えられる。これらの下降変換されたシグナルは、データ取得ユニット１２８に送られ、デジタル化される。データを帯域フィルターにかけ、（高忠実度、高サンプリング速度のアナログ−デジタル変換機を使用して）ＮＭＲ周波数で直接サンプリングすることも可能である。データ取得ユニット１２８は、アナログ−デジタル変換機（ＡＤＣ）を含む。ＡＤＣは、シグナルをデジタル化シグナルにさらに変換し、このようにしてＡＤＣから得られたシグナルが記憶される。マイクロコントローラ１２２は、デジタル化シグナルを処理し、分析データを得、コンピュータデバイスなどの外部端末に転送する。一実施形態では、コントロールユニット１１０は、集積回路（ＩＣ）チップに統合されてもよい。少量の流体試料から、及び磁石１０４により引き起こされる不均一性によるシグナルの急速な減衰の際に、低レベルのＮＭＲシグナルが存在する場合、ＮＭＲ測定を支持するためにＩＣチップを構成することもできる。
【００８２】
さらに、マイクロ核ＭＲユニット１０２のケーシング１０８は、磁石１０４及びマイクロＭＲプローブ１０６を覆い、外部環境への曝露からこれらの構成要素を保護するために使用可能である。
【００８３】
図５は、少なくとも１種の試験及びナノ粒子の混合物を、一実施形態に従って分析する方法のフローダイアグラムを例示している。ブロック２００で、試験試料及びナノ粒子が容器に導入される。容器は、マイクロ核ＭＲユニットのマイクロＭＲプローブ内に受け取られる。ブロック２０２で、少なくとも１種の試験試料及びナノ粒子が、容器で混合される。ブロック２０４で、マイクロＭＲプローブに隣接して位置する磁石がその後、容器を保持するマイクロＭＲプローブの周りに磁場を作り出すために使用される。ブロック２０６で、ナノ粒子のクラスターが、流体試料中の目標物質（例えば、細胞）との結合により形成される。マイクロコイルが、その後、ＲＦシグナルの発生のためにコントロールユニットを介して励起される。ブロック２０８で、これらのＲＦシグナルは混合物に送信される。ブロック２１０で、次いで、スピン−スピン緩和時間Ｔ2bound及びＴ2free（又は、代替として、対応する緩和速度Ｒ2、Ｒ2＝１／Ｔ2）が測定され、混合物中の目標物質（例えば、細胞）の存在が検出される。検出された目標物質（例えば、細胞）の存在が、その後ブロック２１２で記録され、後に使用される。
【００８４】
マイクロ核ＭＲユニットで実施される分析は、本来予備的なものであり、例えば、結核の分析又は細胞スクリーニングを含み得る。分析データは、その他の使用のための場所に記憶され、追加の検査のために取り出される、又は他の試験結果及び／又はデータと組合せる必要があると思われる。図６は、一実施形態に従ったインターフェイスユニットと通信する、マイクロ核ＭＲユニットを含むマイクロ磁気共鳴システムの略図である。得られた分析データは、インターフェイスユニット３０２により受信される。インターフェイスユニット３０２は、ネットワーク例えば、有線又は無線のネットワークを通じて、マイクロ核ＭＲユニット１０２と通信可能である。無線ネットワークとしては、限定するものではないが、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）無線ネットワーク又はＷｉ−Ｆｉ（登録商標）ネットワークが挙げられる。別の例では、分析データは、ユニバーサルシリアルバスを使用して、インターフェイスユニット３０２に転送可能である。インターフェイスユニット３０２は、分析データを処理するために構成可能である。ＮＭＲシグナルを介して受信された分析データは、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物に対して実施された分析試験に関連する生のデジタル化データであり得る。インターフェイスユニット３０２は、分析データをインターフェイスユニット３０２のユーザーに提示するために、分析データを処理する。分析データは、分析データをユーザーにディスプレイするために処理される。ユーザーは、例えば、医療関係者、医師及び様々な応用に関係する分析者であってよい。分析データは、例えば、血中脂質プロファイルの形態でディスプレイされても、又は血液試料中の様々な生体標的もしくは生体分子の存在もしくはレベルのディスプレイであってもよい。分析データは、デジタル値及びグラフの形態でディスプレイ可能である。さらに、分析データは、インターフェイスユニット３０２により、分析データが他の情報システムに統合可能なように、ユニバーサル形態又は標準形態又は互換性のある形態に処理することができる。
【００８５】
処理された分析データは、次いで、データ記憶システム３０４に転送することができる。インターフェイスユニット３０２は、ネットワークを通じてデータ記憶システム３０４と通信する。ネットワークは、有線又は無線ネットワークであってよい。無線ネットワークとしては、限定するものではないが、Ｗｉｄｅ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＷＡＮ）、Ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＷＬＡＮ）、Ｌｏｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＬＡＮ）、Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  ＭＡＮ）及びセルラー又はモバイルネットワークを挙げることができる。データ記憶システム３０４は、処理された分析データを受信及び記憶する。処理された分析データは、次いで、必要に応じて取り出すことができる。別の例では、処理された分析データは、追加の検査のために別のコンピュータデバイスに転送され、他の医療的診断試験を実施することができる。これは、図７と併せてさらに詳細に説明する。
【００８６】
図７は、一実施形態に従った、マイクロ核ＭＲユニットの分析データを扱うインターフェイスユニットを例示している。インターフェイスユニット３０２は、ユーザーデバイス、例えば、限定するものではないが、モバイルデバイス、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ（ＰＤＡ）及びパーソナルコンピュータで構成されてもよい。一実施形態では、インターフェイスユニット３０２は、ユーザーデバイスで動作するアプリケーションであってよい。インターフェイスユニット３０２は、マイクロ核ＭＲユニット１０２からの分析データを受信するように構成されたデータプロセッサ３０６を含む。分析データは、異なる被験体（例えば、患者）と関係することができる。分析データは、マイクロ核ＭＲユニット１０２で、１以上の異なる被験体に関する、少なくとも１種の試験試料及びナノ粒子の混合物に対して実行された分析に応じて作成される。データプロセッサ３０６は、ユーザーの入力に基づき、マイクロ核ＭＲユニット１０２で実行された分析をコントロールするように構成することができる。データプロセッサ３０６は、分析データを処理して、ユーザーインターフェイス３０８を介して分析データをユーザーにディスプレイするように構成することができる。ユーザーは、例えば、医療関係者、医師又は様々な応用に関係する分析者であってよい。分析データは、例えば、血中脂質プロファイルの形態でディスプレイされても、又は血液試料中の様々な生体標的もしくは生体分子の存在もしくはレベルのディスプレイであってもよい。分析データは、デジタル値及び／又はグラフの形態でディスプレイされてよい。
【００８７】
前述のように、分析データは、異なる被験体から受け取ることが可能であり、したがって、分析データと被験体との間の関係が確立される必要があり得る。この目的を達成するために、データプロセッサ３０６は、処理された分析データを、流体試料が得られた被験体にマッピングする。マッピングは、処理された分析データと被験体との間の関係を定義するために実施される。流体試料がマイクロ核ＭＲユニット１０２内に受け取られた場合、被験体の情報は、データプロセッサ３０６によりまず受信され得る。被験体の情報、例えば患者の情報としては、個人的詳細、疾患のタイプ、健康歴及び／又は他の患者の人口統計学的詳細が挙げられる。
【００８８】
一実施形態では、インターフェイスユニット３０２は、対照の情報を受信する。被験体の情報は、ユーザーインターフェイス３０８を介して、マイクロ核ＭＲユニット１０２における分析を実行する技術者又は実験室分析者により入力され得る（図４及び６に示す）。ひとたび被験体の情報が受信されると、その後、データプロセッサ３０６は、被験体の情報を、被験体の少なくとも１種の流体試料と関連する処理された分析データに追加する。被験体の情報は、自動的に、又はユーザーの入力に基づき追加させることができる。処理された分析データ及び追加の被験体の情報は、インターフェイスユニット３０２のメモリ３１０に記憶させることができる。別の実施形態では、被験体の情報及び処理された分析データは、別々に記憶させることができる。処理された分析データと被験体の情報との間の関係を示すマッピングテーブルは、提示又は記憶させることができる。一実施形態では、処理された分析データ及び被験体の情報は暗号化可能である。暗号化は、当技術分野で公知の任意の暗号化技術を使用して実行可能である。例としては、処理された分析データ及び被験体の情報の一部が暗号化することができる。
【００８９】
コミュニケータ３１２は、処理された分析データ（例えば、分析データ及び追加された被験体の情報）をデータ記憶システム、例えばデータ記憶システム３０４にネットワークを通じて通信又は送信するために存在し得る。コミュニケータ３１２は、データの送信及び受信を実行するための送信機及び受信機を含んでよい。受信機は、分析データをマイクロ核ＭＲユニット１０２から受信するように構成され得る。しかし、コミュニケータ３１２が、データの送信及び受信に適切な任意の他の構成を有してもよいことが企図され得る。
【００９０】
図８に例示された、例示的環境５００を参照すると、インターフェイスユニットは、マイクロ核ＭＲユニットにより作成された分析データを扱うために機能できる。インターフェイスユニット５０２は、マイクロ核ＭＲユニット５０６と通信可能に接続されたモバイルデバイス５０４中に構成され得る。モバイルデバイス５０４は、ＰＤＡ、スマートフォン又は任意の他のデバイスであってよい。マイクロ核ＭＲユニット５０６は、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物を保持する容器を受け取るように構成されたマイクロ流体用導管１１６の開口部５０８を含む。マイクロ核ＭＲユニット５０６は混合物を分析する。ひとたび分析が実施されると、分析データは、モバイルデバイス５０４中のインターフェイスユニット５０２に、マイクロ核ＭＲユニット５０６中のトランシーバ５１０により通信される。マイクロ核ＭＲユニット５０６は、様々な外部干渉、例えば無線周波数（ＲＦ）の干渉に付されることがあり、したがって、作成された分析データは、誤りを犯しがちである。したがって、干渉シールド５１２をマイクロ核ＭＲユニット５０６の周りに配置して、ユニットにおける干渉インシデントを遮蔽することができる。干渉シールド５１２は、外部から提供された「ファラデーケージ」として作用し、送信及び受信された低出力無線周波数シグナルによる電磁干渉の克服を助けることができる。一実施形態では、干渉シールド５１２は、マイクロ核ＭＲユニットをその中に囲い込む、被覆用の箱であってよい。例えば、干渉シールド５１２は、磁石及びマイクロ核ＭＲユニット５０６のマイクロＭＲプローブを封入するように構成することができる。干渉シールド５１２は、金属製シールド、例えば銅シールド、アルミニウムシールド、ミューメタルシールド、パーマロイシールド及びナノ結晶粒構造強磁性金属シールドであってよい。しかし、干渉シールド５１２が、異なる種類の干渉を遮蔽できる他の公知の材料で構成可能なことが企図されてもよい。例えば、干渉シールド５１２はまた、マイクロ核ＭＲユニット５０６中の構成要素が粉塵及び他の異物に曝露されることを容易に回避する。干渉シールド５１２は、マイクロ核ＭＲユニット５０６の遮蔽に都合の良い任意の他の構造又は構成を有してよい。一実施形態では、干渉シールド５１２は、例えば７．５ｃｍ×７．５ｃｍ×５ｃｍ（長さ×幅（Ｂｒｅａｄｔｈ）×幅（Ｗｉｄｔｈ））のサイズを有する箱形の構成を有してよい。
【００９１】
次いで、インターフェイスユニット５０２は分析データを処理し、処理された分析データを、ユーザーインターフェイス５１４を介してディスプレイする。インターフェイスユニット５０２は、処理された分析データを分析データの被験体とマッピングすることもできる。その後、処理された分析データは、データ記憶システム５１６に転送され記憶させることができる。記憶されたデータは、モバイルデバイス５０４で受信されたユーザーの入力に基づき、ユーザーにより必要に応じて取り出すことができる。処理された分析データは、データ記憶システム５１６と通信可能な任意の他のコンピュータデバイスを介してアクセスできる。処理された分析データは、モバイルデバイス５０４からコンピュータデバイス５１８に追加の分析のために通信され得る。処理された分析データは、コンピュータデバイス５１８の記憶ユニット（図示せず）に記憶させることができる。コンピュータデバイス５１８は、より詳細な分析が実行可能な実験室に位置してもよい。
【００９２】
例えば、ユーザーは、位置５２０で、試験試料及びナノ粒子の少なくとも１種の混合物を分析するために、マイクロ核ＭＲユニット５０６を使用することができる。混合物は、健康を分析される必要がある被験体から収集することができる。実行される分析に関係する分析データは、ユーザーのモバイルデバイス５０４に送ることができる。分析データは、モバイルデバイス５０４及びマイクロ核ＭＲユニット５０６との間の接続を通じて送信され得る。接続は、Ｗｉ−Ｆｉ（登録商標）又はＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）による接続であってよく、したがって、モバイルデバイス５０４は、マイクロ核ＭＲユニット５０６に隣接して位置してよい。モバイルデバイス５０４中のインターフェイスユニット５０２は、分析データを処理して、処理された分析データをユーザーにディスプレイすることができる。処理された分析データは、提供されたユーザーインターフェイス５１４を介してディスプレイさせることができる。インターフェイスユニット５０２は、被験体の情報を処理された分析データに追加し、位置５２２にあるデータ記憶システム５１６とリアルタイムで通信する。被験体の情報は、処理された分析データに追加されたメタデータとして機能する。したがって、メタデータとしては、例えば、患者の情報、例えば、限定するものではないが、個人的詳細、疾患のタイプ、健康歴及び他の患者の人口統計学的詳細が挙げられる。処理された分析データは、ネットワーク５２４、例えばＷｉｄｅ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＷＡＮ）、Ｗｉｄｅ  Ｌｏｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＷＬＡＮ）、Ｌｏｃａｌ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＬＡＮ）、Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  Ａｒｅａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  ＭＡＮ）及びセルラー又はモバイルネットワークを通じて転送可能である。処理された分析データは、次いで、インターフェイスユニット５０２を介して受信されたユーザーの入力に基づき転送され得る。ユーザーの入力は、ユーザーインターフェイス５１４を介してユーザーにより提出され得る。一実施形態では、インターフェイスユニット５０２はまた、ユーザーが、データ記憶システム５１６から処理された分析データを取り出すことを可能にする。
【００９３】
インターフェイスユニット５０２は、処理された分析データを、位置５２８に存在するコンピュータデバイス５２６にリアルタイムで送信するように構成されてもよい。データの送信は、モバイルデバイス５０４を介したユーザーの命令の受信に応じて実行することができる。コンピュータデバイス５２６は、処理された分析データに関する詳細な分析を実行することができる。一実施形態では、インターフェイスユニット５０２は、詳細な分析を受信して、位置５２０でユーザーに提示するように構成される。したがって、インターフェイスユニット５０２は、処理された分析データを、都合よく位置５２０から遠隔の位置５２２へ、ユーザーが容易に転送できるようにする。この方法では、分析データの予備処理が、モバイルデバイス５０４及びマイクロ核ＭＲユニット５０６を使用して、ユーザーによりこのフィールドでローカルに実行可能であり、その後、処理された分析データの記憶又は実験室における追加の分析のために遠隔位置に転送可能である。
【００９４】
図９は、マイクロ磁気共鳴ユニットで分析データを扱う方法のフローダイアグラムを例示している。分析データは、１以上の異なる被験体に関する、試験試料及びナノ粒子の混合物がマイクロ核ＭＲユニットで分析される場合に作成される。分析データは、マイクロ核ＭＲユニットに通信可能に接続されたインターフェイスユニットに送信可能である。インターフェイスユニットは、分析データをブロック６００で受信する。
【００９５】
次いで、インターフェイスユニットは、ブロック６０２で分析データを処理する。分析データは処理されて、ユーザーに提示又はディスプレイ可能である。ユーザーは、例えば、医療関係者、医師又は分析者であってよい。例えば、インターフェイスユニットは、処理された分析データをディスプレイ可能なユーザーデバイスでユーザーインターフェイスを提供することができる。処理された分析データは、ブロック６０４で、記憶及び取り出しのためにデータ記憶システムと通信可能である。データ記憶システムは、例えば、実験室に遠隔配置されてもよい。記憶された、処理された分析データは、ユーザーデバイスのインターフェイスユニットを介して受信されたユーザーの入力に基づき取り出し可能である。ユーザーの入力は、データ記憶システムに命令として送ることができる。処理された分析データは、混合物の処理された分析データを使用して追加の分析を実行するように構成可能な、任意の他のコンピュータデバイスにより取り出し可能である。
【００９６】
図１０は、本発明の一実施形態に従ったインターフェイスユニットで、分析データを処理する方法のフローダイアグラムを例示している。マイクロ核ＭＲユニットから受信された分析データは、ブロック７００でインターフェイスユニットで処理され、処理された分析データが作成される。処理された分析データは、ブロック７０２でユーザーに提示又はディスプレイされる。分析データは、リアルタイムで処理可能である。より詳細には、分析データは、マイクロ核ＭＲユニットから受信され、処理はインターフェイスユニットで実行可能であり、ユーザーデバイスを介してユーザーに提示又はディスプレイされる。これにより、少なくとも１種の流体試料の分析が実施された場合、ユーザーが分析結果をリアルタイムで都合よく見ることが可能である。分析データは処理され、分析データを、例えば、血液プロファイル、生体（例えば、血液）試料中の様々な生体標的（例えば、細胞、細菌又は病原体）の有無もしくは量の形態で提示可能にすることができる。
【００９７】
処理された分析データは、ブロック７０４で、分析データに関係する被験体にマッピング可能である。試料は、被験体から得ることができる。マッピングを実行して、処理された分析データと被験体との間の関係を定義できる。少なくとも１種の流体試料がマイクロ核ＭＲユニット内に受信される場合、被験体の情報は、インターフェイスユニットを介して受信可能である。被験体の情報としては、例えば、個人的詳細、疾患のタイプ、健康歴及び他の患者の人口統計学的詳細が挙げることができる。
【００９８】
被験体の情報は、インターフェイスユニットを介して受信可能である。例えば、被験体の情報は、マイクロ核ＭＲユニットで分析を実行する技術者又は実験質分析者により、ユーザーデバイスを介して入力可能である。受信された被験体の情報は、被験体の少なくとも試料に関連する処理された分析データに追加可能である。被験体の情報は、自動的に追加させることができる。被験体の情報は、ユーザーの入力に基づいて追加させることができる。別の実施形態では、被験体の情報及び処理された分析データは、別々に記憶可能させることができる。マッピングテーブルは、この場合、提示又は記憶され、処理された分析データと被験体の情報との間の関係を示すことができる。処理された分析データ及び被験体の情報は、暗号化可能である。暗号化は、当技術分野で公知の任意の技術を使用して実行可能である。一実施形態では、処理された分析データ及び被験体の情報の一部が暗号化されることがある。処理された分析データ及び被験体の情報は、その他の使用のためにユーザーデバイスに記憶させることができる。
【００９９】
図１１は、本発明の一実施形態に従ったマイクロ磁気共鳴システムを使用する、少なくとも１種の流体試料及びナノ粒子の混合物を分析する方法のフローダイアグラムを例示している。マイクロ磁気共鳴システムのマイクロ核磁気共鳴（ＭＲ）ユニットは、ブロック８００で、少なくとも試料及びナノ粒子の混合物を受け取る。混合物は、マイクロ核ＭＲユニットのマイクロ流体用導管内に受け取り可能な容器で形成される。次いで、混合物は、ブロック８０２で、マイクロ核ＭＲユニットにより分析され、混合物中の少なくとも１種の目標物質（例えば、細胞）が検出される。
【０１００】
混合物に対して実施された分析により作成された分析データは、ブロック８０４でマイクロ核ＭＲユニットに通信可能に接続されたインターフェイスユニットに通信可能である。インターフェイスユニットは分析データを受信し、その後、ブロック８０６で分析データを処理する。分析データは処理可能であり、その後、ユーザーに提示又はディスプレイ可能である。ユーザーは、例えば、医療関係者、技術者又は医師であってよい。例えば、インターフェイスユニットは、処理された分析データをディスプレイ可能なユーザーデバイスに、ユーザーインターフェイスを提供することができる。処理された分析データは、ブロック８０８で、記憶及び取り出しのためにデータ記憶システムと通信可能である。データ記憶システムは、遠隔、例えば実験室に位置してもよい。記憶された、処理された分析データは、ユーザーデバイスのインターフェイスユニットを介して受信されたユーザーの入力に基づいて取り出し可能である。ユーザーの入力は、データ記憶システムに命令として送ることができる。処理された分析データは、データ記憶システムに通信可能に接続された任意の他のコンピュータデバイスにより収集可能である。コンピュータデバイスは、少なくとも１種の試料及びナノ粒子の混合物の詳細な分析を実施するために、処理された分析データを使用して追加の分析を実行するように構成可能である。
【０１０１】
図９、図１０及び図１１に関して記載された方法は、プロセッサ又は任意の他の処理デバイスを使用して実行可能である。方法ステップは、有形のコンピュータにより読み取り可能な媒体に記憶された、コード化された命令（例えば、コンピュータにより読み取り可能な命令）を使用して実施可能である。有形のコンピュータにより読み取り可能な媒体は、フラッシュメモリ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は任意の他のコンピュータにより読み取り可能な記憶媒体もしくは任意の複数の記憶媒体であってよい。マイクロ核ＭＲユニットで作成された分析データを扱う方法が、図９、１０及び１１のフローチャートを参照して説明されたが、この方法を実施する他の方法を用いることも可能である。例えば、各方法ステップの実行順序は変更可能であり、及び／又は記載された方法ステップのいくつかは、変更、削除、分割又は組合せが可能である。さらに方法ステップは、マイクロ核ＭＲユニットで作成された分析データを扱うために、連続して、又は同時に実行されてもよい。
【０１０２】
本発明を、これから下記の限定されない実施例と関連させて記載するものである。
【実施例】
【０１０３】
材料及び方法：
カルボキシル官能化超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ結晶及びそのコンジュゲーションキットは、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ  ＬＬＣ、ＵＳＡから入手した。ウサギポリクローナル抗体は、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）から産生させ、セレウス菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｂ２０５５６）と交差反応性であり、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡから購入した。枯草菌亜種スピジゼニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉ）（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃６６３３）は、ＨｉＭｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｕｍｂａｉ、Ｉｎｄｉａから購入し、販売業者のプロとコルに従って維持した。
【０１０４】
ＳＰＩＯ−バチルス抗体の合成及び特徴付け
枯草菌と反応する抗体を、カルボキシル末端ＳＰＩＯナノ粒子（サイズ＝３０ｎｍ）と、製造業者のプロトコルに従って連結させた。簡潔には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のストック溶液を、製造業者の取扱説明書により調製し、最終濃度２ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ及び１ｍｇ／ｍＬのＮＨＳを得た。１００μＬのＳＰＩＯを５０μＬの活性化バッファー中にエッペンドルフ管で取り、５０μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液をそこに加えた。混合物を、室温（ＲＴ）で１０分間、連続混合しながら反応させた。活性化されたＳＰＩＯナノ粒子に、２５０μＬのカップリングバッファーを加え、その後、枯草菌と反応する４μｇの抗体を加えた。混合物を、ＲＴで連続混合しながら２時間反応させた。２時間の終わりに、５μＬの反応停止バッファーを加えることによって、反応を停止させた。ナノコンジュゲートを、１００ｋＤａの分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎフィルターを使用した反応混合物の濾過により、遊離のＳＰＩＯナノ粒子から分離し、保存バッファーにより洗浄した（２×１ｍＬ）。本研究に使用した最終コンジュゲートのサイズを、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ）により測定し、平均流体力学的径が４５ｎｍであることが示された。ナノコンジュゲート溶液の鉄濃度が、２５０μｇ／ｍＬであることを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ７５００ｃｘ  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＩＣＰ−ＭＳ）機器を使用して測定した。
【０１０５】
細胞培養のための培地の調製
０．４ｇのＤｉｆｃｏ（商標）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｒｅｆ２３４０００、ＢＤ）を、２５０ｍＬの三角フラスコに移し、５０ｍＬのＤＭ水に溶解した。得られた溶液を、１２１℃で１５分間、オートクレーブ処理した。培地を含む冷却したフラスコを、その後培養に使用した。
【０１０６】
枯草菌の培養
枯草菌のストック培養液及び栄養ブロス溶液を、インキュベータに３７℃１０〜１５分間配置した。その後、フラスコを空気層流フードに移した。ストック溶液から、５００μＬを、ピペットで慎重に５０ｍＬの栄養ブロスに移し、滅菌状態で維持した。フラスコをその後、Ｉｎｎｏｖａ４０８０インキュベータ−シェーカーセットに、３７℃で１１５ｒｐｍで６時間配置した。インキュベーション６時間後の細菌のカウントを、標準的プレートカウント方法により決定し、約１０8ＣＦＵ／ｍＬであることが見出された。
【０１０７】
段階希釈及び試料調製
段階希釈を、６時間の枯草菌培養液に対して実施し、１０7、１０5及び１０3濃度の細菌を得た。
【０１０８】
６４μＬの２５０μｇ／ｍＬのＦｅナノコンジュゲート溶液を、１ｍＬの１０7、１０5及び１０3の枯草菌試料それぞれに加え、混合物中最終濃度１６μｇ／ｍＬのＦｅを得た。Ｔ２緩和測定を、混合後すぐに実行した。
【０１０９】
緩和時間測定機による測定
緩和時間測定を、４０℃でＢｒｕｋｅｒ  ｍｑ２０  Ｍｉｎｉｓｐｅｃを０．５Ｔで使用して実行した。データを規則的な時間間隔、初めの９回の時点は１分ごと、その後次の６回の時点は５分ごと、次の６回の時点は１０分ごと、次の３回の時点は１５分ごと、最終的に、最後の３回の時点は３０分ごとで取得した。Ｔ２緩和時間測定に関して、用いたパルスシーケンスは、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）スピンエコーである。
【０１１０】
ＣＰＭＧパルスシーケンス：
｛ＲＤ−９０0−ｔａｕ−［（１８０90−ｔａｕ−）ＤＥ（１８０90−ｔａｕ−）ａｓｄ−ｔａｕ−］N｝NS
式中：
ＲＤはリサイクルディレイであり、ｔａｕはディレイ間隔であり、ＤＥはエコーをサンプリングする前のダミーエコーの数であり、Ｎは収集される点の数であり、ＮＳはシグナルの平均値算出のためのスキャンの数であり、「ａｓｄ」は単一データの取得点を示す。
【０１１１】
下記のパラメーターを実験に使用した；ＲＤ＝６秒；ｔａｕ＝５ミリ秒、ＤＥ＝０、Ｎ＝７００、ＮＳ＝８。
【０１１２】
スピンエコーからのデータを、下記の二重指数関数式にフィットさせた：
ｙ＝Ａ１＊ｅｘｐ−（ｘ／τ１）＋Ａ２＊ｅｘｐ−（ｘ／τ２）＋Ｏ
式中：
Ａ１，Ａ２＝ゼロ時における成分１及び２の振幅
τ１、τ２＝成分１及び２のＴ２減衰定数
Ｏ＝オフセット
結果
すべての試料で、ナノコンジュゲートを様々な濃度の枯草菌に加えた後で、二重指数関数的Ｔ２が観察された。図１は、ＳＰＩＯ−ナノコンジュゲート及び異なる濃度の細菌の混合物に関する、継時的Ｔ２変化を示す。２時間後に得られた長いＴ２は、完全な試料調製を実行した実験で観察されたＴ２と同様であった。したがって、長いＴ２は、細菌の結合したナノコンジュゲートに割り当てられ、短いＴ２は、溶液中で未結合又は遊離のナノコンジュゲートに割り当てられた。加えて、結合されたナノコンジュゲートの長いＴ２が、細菌の濃度に依存することがさらに観察された。したがって、試料中の細菌数は、長いＴ２を使用して、未結合のナノコンジュゲートを濾過するフィルターステップを必要とせずに定量可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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