(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロ果肉濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成及び美白促進用組成物（ただし、コエンザイムＱ１０を含む組成物は除く）。
【請求項２】
前記組成物は食品または薬学組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ザクロ果肉濃縮物は、総重量ｇ当り０．８〜３ｍｇのエラグ酸；及び／または総重量ｇ当り８〜１５ｍｇのポリフェノールを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、強化食品、食餌補充剤、ノンアルコール飲料、スポーツ飲料、果実飲料、茶または牛乳ベース飲料、若しくは液状食品の形態であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、肌保湿改善に効果的であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
肌保湿及び美白促進用食品または薬学組成物を製造するためのザクロ果肉濃縮物の使用（ただし、前記食品または薬学組成物が、コエンザイムＱ１０を含む場合は除く）。
【請求項７】
前記組成物は、肌保湿改善及び美白効果と共に、しわ改善、弾力向上及び角質除去からなる群より選択された１以上の効果をさらに奏することを特徴とする請求項６に記載のザクロ果肉濃縮物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然植物素材を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進方法及びそれによって肌保湿、しわ改善、美白または角質改善など肌を改善する方法に関する。
【０００２】
本出願は、２０１４年７月２２日出願の韓国特許出願第１０−２０１４−００９２８１９号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）は、動物などの肌に多量存在する生体合成天然物質である。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）とも称される。水酸化基（−ＯＨ）が多く親水性物質であり、動物などの肌で保湿作用をする。多様な上皮細胞で発現されているＣＤ４４タンパク質と反応して多様な生理的作用を調節する。
【０００４】
一方、肌は外部と常に接する器官であって、外部から順に表皮、真皮、皮下脂肪組職の３つの層で大きく区分され、人体を外部の物理的及び／または化学的刺激から保護する機能をする。特に、肌は人体が有している約６５〜７０％の水分、すなわち人体に必要な各種の生理活性物質を運び、柔らかくてしっとりした状態を維持できるように、水分が体外に蒸発することを調節する重要な役割を果たす。
【０００５】
しかし、肌は、年を取るにつれて、内的には、老化の進行によって新進代謝を調節する各種ホルモンの分泌が減少すると共に、免疫細胞の機能と細胞の活性が低下して生体に必要な免疫及び生体タンパク質の生合成が減るようになる。また、外的には、オゾン層の破壊による太陽光線中の紫外線含量の増加と一層深刻化する環境汚染によってフリーラジカル及び有害活性酸素などが増加することで、肌の機能が低下するだけでなく視覚的な美しさが減少するようになる。
【０００６】
そこで、肌改善の有効性とともに安全性に優れた物質を見つけようとする研究が多く行われ、解決方案として化粧品のような外用的方法による肌状態の改善とともに、食餌摂取によって肌改善効果を奏する物質に関する研究が活発に行われている。
【０００７】
このような研究の一環として、肌改善効果を示す天然植物素材に対する関心が益々増加している。天然植物素材は、伝統的に数百年に亘って使用されて安全性や効果の側面で証明された物質が多数であるため、安全であって自然親和的である。
【０００８】
そこで、肌改善に効果的であると同時に安全な物質に対する必要性が増している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、ヒアルロン酸の合成に効果的な天然植物素材を提供することを技術的な課題とする。
【００１０】
また、本発明は、ヒアルロン酸の合成に効果的な天然植物素材を有効成分として含む肌改善、特に保湿用組成物及びそれを用いて肌改善、特に保湿効果を向上させる方法を提供することを技術的な課題とする。
【００１１】
また、本発明は、ヒアルロン酸の合成効果を向上させる天然植物素材組成物の加工方法を提供することを技術的な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の技術的課題を達成するため、本発明は、一態様として、ヒアルロン酸の合成促進が必要な対象にザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物を投与する段階を含むヒアルロン酸合成を促進する方法；及び／またはザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進用組成物を提供する。
【００１３】
望ましくは、前記ザクロ濃縮物中のエラグ酸が総重量ｇ当り０．８ｍｇ以上であり、より望ましくは０．８〜３ｍｇであり得る。
【００１４】
また、望ましくは、前記ザクロ濃縮物中のポリフェノールが総重量ｇ当り８ｍｇ以上であり、より望ましくは８〜１５ｍｇであり得る。
【００１５】
本発明者は、ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物を加熱濃縮する工程を経て製造されるザクロ濃縮物にヒアルロン酸の合成を促進する効果があり、このようなザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物が優れた肌保湿効果を奏するとの驚くべき知見を得、このようなザクロ濃縮物は肌保湿効果と共に肌弾力の向上、色素沈着の改善、美白、肌つっぱりの改善、肌キメの改善、肌トーンの改善及び／または肌角質の減少などの肌改善に優れた効果を見せることを見出した。
【００１６】
ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）は、アジア西南部、インド北西部及び米国カリフォルニアの自生植物であって、現在は亜熱帯及び熱帯の各地に広く広がっている植物である。昔からザクロ、特に赤ザクロは強壮剤として知られ、特に、高血圧と動脈硬化の予防に効果を奏すると知られている。また、水溶性糖質を３８〜４７％と多量含み、多様なビタミンとミネラルを含む。
【００１７】
本発明によるザクロ濃縮物は、ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物を加熱濃縮する工程を経て製造されるものを意味する。
【００１８】
望ましくは、４０〜６５℃で澱粉分解酵素を処理でき、４５〜６０℃で澱粉分解酵素を処理することがより望ましい。澱粉分解酵素の処理時間は１００分以内であることが望ましく、より望ましくは５０〜７０分、最も望ましくは約６０分間処理することができる。
【００１９】
また、３回以上加熱濃縮する段階を経ることが望ましい。より望ましくは、３回以上４０〜１１０℃範囲内で加熱濃縮する段階を経ることができる。
【００２０】
また、使用されるザクロの産地及び収獲時期などによって差があり得るが、最終ザクロ濃縮物の総重量ｇ当りエラグ酸の含量が０．８ｍｇ以上、望ましくは０．８ｍｇ〜３ｍｇ、より望ましくは１．８ｍｇ〜３ｍｇ、さらに望ましくは２．４ｍｇ〜３ｍｇ、最も望ましくは２．７ｍｇ〜３ｍｇになるザクロを使用することができる。また、最終ザクロ濃縮物の総重量ｇ当りポリフェノールの含量が８ｍｇ以上、望ましくは８ｍｇ〜１５ｍｇ、より望ましくは１１．５ｍｇ〜１３ｍｇ、さらに望ましくは１１．７９ｍｇ〜１２．５９ｍｇになるザクロを使用することができる。エラグ酸の濃度が０．８ｍｇ／ｇ未満であるか又はポリフェノールの濃度が８ｍｇ／ｇ未満である場合は、ヒアルロン酸の合成促進効果が弱く、エラグ酸の濃度が３ｍｇ／ｇを超えるか又はポリフェノールの濃度が１５ｍｇ／ｇを超える場合は、組成物を摂取したとき、肝機能数値であるＧＯＴとＧＰＴが正常範囲から外れるなどの副作用が発生する恐れがある。
【００２１】
上述したように、ヒアルロン酸の合成促進能を有するザクロ濃縮物を使用できる理由は、後述する特定の製造方法、特に、澱粉分解酵素の処理方法、ザクロ濃縮物の濃縮方法、加熱温度及び圧力などに因ると推測されるが、本発明がこのような事項に限定されることはない。より具体的に、本発明の具体的な実施例によれば、ザクロ果実を圧搾して得たザクロジュースと比べて、ザクロ果実を圧搾し澱粉分解酵素を処理した後、加熱濃縮する段階を経たザクロ濃縮物の場合、ヒアルロン酸合成促進効果の側面で格段に優れることが分かった。天然のザクロ果実に存在する多様な糖または同じ構造が繰り返して付着している構造の成分が、澱粉分解酵素の処理及び／または加熱濃縮による化学的処理工程によって非配糖体に転換され、これら転換された成分による複合機序による効果であると推測されるが、本発明がこのような事項に限定されることはない。一例として、本発明によるザクロ濃縮物のポリフェノール類含量は、同じ濃縮倍数のザクロジュースのポリフェノール類含量に比べて格段に多量含まれている。
【００２２】
本発明におけるザクロは、例えば、イラン産ザクロ、トルコ産ザクロ、米国産ザクロまたはこれらの混合物を使用でき、例えばトルコ産ザクロの品種にはＨｉｃａｚｎａｒ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｃｖ．、Ｃｅｋｉｒｄｅｋｓｉｚ ＶＩ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｃｖ．、Ｓｉｌｉｆｋｅ Ａｓｉｓｉ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｃｖ．、Ｋａｔｉｒｂａｓｉ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｃｖ．またはＬｅｆａｎ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｃｖ．などがあるが、これらに制限されない。
【００２３】
本発明によるザクロ濃縮物を製造するため、ザクロ果皮と種を含まないザクロ果肉のみを使用することができる。ザクロの果皮と種は副作用を引き起こす恐れがあるが、例えば、ザクロ果皮に含まれたアルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）は身体機能を低下させ得、呼吸系と筋肉に影響を及ぼすため、中毒すれば発作、痙攣、昏睡状態などが起き得る。また、ザクロ種の濃縮物を服用すれば、一部でアレルギーである舌の腫れなどの副作用が生じ得る。
【００２４】
他の様態として、本発明は、ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理する段階及びザクロ分解物を加熱濃縮する段階を含み、ヒアルロン酸の合成促進能を有するザクロ濃縮物の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明によるザクロ濃縮物は、次のような方法で製造することができる。ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理する段階及びザクロ分解物を加熱濃縮する段階を含む方法で製造することができる。例えば、先にザクロを洗浄した後、皮と種を完全に除去し、短時間殺菌し、澱粉分解酵素を添加してザクロに含まれている澱粉など多糖類を分解する。その後、選択的にゼラチン、二酸化ケイ素、ベントナイト、シリカゾル（ｓｉｌｉｃａｓｏｌ）、タンニン、セルロースまたはカゼインカリウムなどの添加剤を添加してザクロ濃縮物の濁度、色相、粘度などを調節し、加熱濃縮してザクロ濃縮物を製造することができる。また、各段階の間に濾過する段階をさらに含むことができ、例えば、皮と種を除去する段階と高温殺菌する段階との間、澱粉分解酵素を処理する段階と濃縮段階との間、または濃縮段階の後のいずれか１つ以上の段階で濾過する工程をさらに含むことができる。
【００２６】
ザクロ果実に澱粉分解酵素を処理したザクロ分解物を得る工程は、より具体的に下記のような段階を含むことができる：
Ｓ１）イラン産ザクロ、トルコ産ザクロ、米国産ザクロまたはこれらの混合物から皮と種を除去してザクロ果肉のみを得る段階
一実施例によれば、ザクロの皮と種を含まないザクロ果肉のみを使用した濃縮物を提供する。
【００２７】
Ｓ２）ザクロ果肉を殺菌する段階
ザクロ果肉は順次殺菌する段階を経る。高温殺菌または低温殺菌することができ、短時間（例えば、５０〜８０秒間）行うことが望ましい。
【００２８】
Ｓ３）殺菌したザクロ果肉に澱粉分解酵素を処理する段階
殺菌したザクロ果肉に澱粉分解酵素を処理する段階を経る。望ましくは４０〜６５℃で澱粉分解酵素を処理することができ、４５〜６０℃で澱粉分解酵素を処理することがより望ましい。また、酵素処理時間は、望ましくは１００分以内、より望ましくは５０〜７０分、さらに望ましくは６０分以内であり、約６０分であることが最も望ましい。使用可能な澱粉分解酵素は、特に制限されず、当業界で知られた多様な澱粉分解酵素が使用でき、例えばペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、アミラーゼ、セルラーゼなどを使用することができるが、ペクチナーゼを使用することが望ましい。
【００２９】
ザクロ分解物を加熱濃縮する工程は、望ましくは３回以上繰り返して加熱濃縮し、４０〜１１０℃範囲で行うことができる。より具体的に、下記のように２種の方式で加熱濃縮することができる：
Ｓ４−１）ザクロ果肉分解物を順次７０〜１００℃及び４００〜８５０ｍｂａｒで加温加圧して２回以上加熱濃縮し、４０〜８０℃及び１００〜３５０ｍｂａｒで減温減圧して１回以上加熱濃縮する段階によって加熱濃縮することができる。
【００３０】
ザクロ果肉分解物を順次加温加圧して加熱濃縮し、減温減圧して加熱濃縮する段階を経る。
【００３１】
望ましくは、加温加圧して２回以上、より望ましくは３回以上加熱濃縮し、減温減圧して１回以上、さらに望ましくは２回以上加熱濃縮することができ、総３回以上加熱濃縮することができる。
【００３２】
加温加圧して加熱濃縮することは、温度条件７０〜１００℃及び圧力条件４００〜８５０ｍｂａｒの範囲で行われ、加熱濃縮次数（回数）毎に温度及び圧力を変えるが、前記温度及び圧力範囲内で温度を上げて圧力を加えるものであれば、制限されず本発明の範囲に含まれ得る。望ましくは、７０〜８５℃、４００〜５５０ｍｂａｒで１次加熱濃縮、８５〜９２℃、５５０〜７５０ｍｂａｒで２次加熱濃縮、及び９２〜１００℃、７５０〜８５０ｍｂａｒで３次加熱濃縮することができる。より望ましくは、７８〜８２℃、４５０〜５００ｍｂａｒで１次加熱濃縮、８５〜９０℃、６００〜６５０ｍｂａｒで２次加熱濃縮、及び９２〜９８℃、８００〜８５０ｍｂａｒで３次加熱濃縮することができる。
【００３３】
減温減圧して加熱濃縮することは、温度条件４０〜８０℃及び圧力条件１００〜３５０ｍｂａｒの範囲で行われ、加熱濃縮次数（回数）毎に温度及び圧力を変えるが、前記温度及び圧力範囲内で温度を下げて減圧するものであれば、制限されず本発明の範囲に含まれ得る。望ましくは、６０〜８０℃、２５０〜３５０ｍｂａｒで４次加熱濃縮及び４０〜６０℃、１００〜２５０ｍｂａｒで５次加熱濃縮することができる。より望ましくは、６５〜７２℃、３００〜３３０ｍｂａｒで４次加熱濃縮及び４５〜５５℃、１００〜１５０ｍｂａｒで５次加熱濃縮することができる。
【００３４】
または、
Ｓ４−２）５５〜９０℃で１次加熱濃縮、１０５〜１１０℃で２次加熱濃縮、及び１００〜１０５℃で３次加熱濃縮することができる。
【００３５】
一実施例によれば、本発明によるザクロ濃縮物は、ヒアルロン酸の合成を促進する効果を有するため、ヒアルロン酸合成増加による有利な生理的効果を期待することができる。例えば、肌保湿改善に効果的である。
【００３６】
そこで、一態様として、肌保湿を改善する方法；及び／または肌保湿用組成物を提供することができる。より具体的に、ザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進用組成物を含む肌保湿用組成物を提供することができる。また、一態様として、肌保湿の改善が必要な対象にザクロ濃縮物を有効成分として含む食品または薬学組成物を投与する段階を含む肌保湿を改善する方法を提供することができる。
【００３７】
また、一態様として、ザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物を、分離した細胞にインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）処理してヒアルロン酸の合成を促進する方法を提供することができる。
【００３８】
前記対象は、例えばげっ歯類、哺乳類などを含む動物が該当し、望ましくはヒトである。
【００３９】
また、前記細胞は、例えばげっ歯類、哺乳類などを含む動物から由来した細胞であり、望ましくはヒト由来であり得る。
【００４０】
さらに、本発明者は、ザクロ濃縮物は上述したヒアルロン酸合成促進能の外にも、ＭＭＰ−１及びエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）を濃度依存的に減少させてしわを改善する効果があり、メラニンを濃度依存的に減少させて美白に優れた効果があることを確認した。また、臨床評価を通じて、角質の除去、弾力向上、色、しわ、美白などの全般的な肌改善に顕著な効果があることを確認した。
【００４１】
そこで、本発明によるザクロ濃縮物を有効成分として含む組成物は、肌保湿の外に、全般的な肌改善のために使用でき、例えば肌弾力の向上、色素沈着の改善、美白、肌つっぱりの改善、肌キメの改善、肌トーンの改善及び／または肌角質の減少、望ましくは、保湿の外にしわ改善、美白、弾力向上及び角質改善からなる群より選択された１以上の肌改善効果のために使用することができる。
【００４２】
本発明による組成物は、ヒアルロン酸不足症状及び／または肌保湿不足症状が現れた後投薬しても良いが、ヒアルロン酸不足及び／または肌保湿不足が予想または診断される場合予め服用することも望ましい。
【００４３】
本発明による組成物は、上述した効果を目的とする多様な用途で活用でき、例えば食品（健康機能食品を含む）組成物、薬学組成物または化粧料組成物に使用することができる。
【００４４】
そこで、本発明は、上述した組成物を含む食品組成物、薬学組成物または化粧料組成物を提供する。より具体的に、上述した方法で製造されたザクロ濃縮物を有効成分として含むヒアルロン酸合成促進効果のある肌保湿改善用食品、薬学組成物または化粧料組成物を提供することができる。
【００４５】
ここで、「食品」とは、健康補助食品、健康機能食品、機能性食品などを含み、これらに制限されず、天然食品、加工食品、一般的な食材などに本発明によるザクロ濃縮物を添加したものも含むことができる。
【００４６】
本発明による食品組成物は、ザクロ濃縮物の外に、他の食品または食品組成物と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用することができる。天然植物濃縮物、例えば、白芍薬、山茱萸、五加皮、霊芝、陳皮、杜沖、当帰、梔子、皇耆、麦芽、カラタチ；及びビタミンＣ、フラクトオリゴ糖、ステビオシド、精製水、またはマルトデキストリンなどを、本発明の目的から逸脱しない範囲内で単独で又は混合してさらに含むことができるが、本発明の食品がさらに包含できる他の薬効成分及び／または添加剤は上記の例に限定されない。例えば、本発明による食品は、水溶性ビタミンとしてチアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン、アスコルビン酸、ナイアシン及びビタミンＢ６を含むことができ、脂肪酸としてミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸などを含むことができ、弱酸成分としてグリコール酸及び酢酸を含むことができ、アミノ酸としてトレオニン、バリン、メチオニン、イソルシン、ルシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びリシンの必須アミノ酸８種を含めて、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンなどを含むことができる。有効成分の混合量は、その使用目的に応じて（予防、改善または治療的処置など）好適に決定することができる。一般に、本発明による食品組成物は、食品または飲料の製造時、最終製品に対して１０重量％〜９０重量％で添加することができる。食品組成物のザクロ濃縮物の有効用量は、薬学組成物の有効用量に準じて使用できるが、長期間摂取する場合は、上記の範囲以下であり得、有効成分は安全性の側面で何ら問題もないため、上記の範囲以上の量で使用しても良い。
【００４７】
本発明による食品の種類には特別な制限がない。例えば、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などの経口投与用製剤の形態で使用でき、これら製剤は許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤または重量剤などを使用して調剤することができる。
【００４８】
本発明による食品形態の例には特に制限がない。例えば、強化食品（ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ ｆｏｏｄ）、食餌補充剤（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、ノンアルコール飲料（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｄｒｉｎｋ）、スポーツ飲料（ｓｐｏｒｔ ｄｒｉｎｋ）、果実飲料（ｆｒｕｉｔ ｄｒｉｎｋ）、茶または牛乳ベース飲料（ｔｅａ ｏｒ ｍｉｌｋ ｂａｓｅｄ ｄｒｉｎｋ）、若しくは液状食品（ｌｉｑｕｉｄ ｆｏｏｄ）の形態であり得るが、これらに制限されない。
【００４９】
本発明による薬学組成物は、経口的または非経口的に投与でき、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。望ましい薬剤学的製剤は、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤などのような経口投与用製剤があり、これら薬剤学的製剤は薬剤学的に許容可能な通常の担体、例えば経口投与用製剤の場合は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、保存剤または重量剤などを使用して調剤することができる。
【００５０】
本発明によるザクロ濃縮物を有効成分として含む薬学組成物の投与用量は、患者の状態、年齢、性別及び合併症などの多様な要因に応じて専門家によって決定できるが、一般には、成人体重１ｋｇ当り０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、望ましくは１０ｍｇ〜１ｇの用量で投与することができる。また、単位剤形当り前記薬学組成物の１日用量またはその１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９または１／１０の用量が含有され、１日１〜１０回投与できる。しかし、長期間摂取する場合は、上記の量は上記の範囲以下であり得、有効成分は安全性の側面で何ら問題もないため、上記の範囲以上の量で使用しても良い。一実施例によれば、本発明によるザクロ濃縮物を１日に１０ｍｌ服用する場合、服用後にも人体の健康指標（例えば、赤血球数（ＲＢＣ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）数値、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）数値、アラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）数値、クレアチン数値、グルコース数値、Ｓ−Ｇ数値など）がすべて正常範囲内にあり、生体に副作用なく、安全にヒアルロン酸合成促進効果及び／または保湿を含む肌改善の効果を達成することができる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、ザクロ濃縮物を通じてヒアルロン酸合成促進効果を期待でき、顕著な肌保湿効果は勿論、外にも肌しわの改善、美白及び角質除去などに優れた効果を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ザクロ濃縮物のＨａＣａＴ細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
【図２】ザクロ濃縮物のヒアルロナン生成能試験を用いて保湿効能を評価した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図３】ザクロ濃縮物のＨＤＦ−Ｎ細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
【図４】ザクロ濃縮物のメラン−Ａ（ｍｅｌａｎ−Ａ）細胞に対する毒性試験結果を示した図である。
【図５】プロコラーゲン合成能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図６】ＭＭＰ−１抑制能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図７】エラスターゼ抑制能試験を用いてしわ改善効能を評価した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図８】チロシナーゼ抑制活性分析を通じて美白効能を評価した結果を示した図である。
【図９】メラニン合成抑制能試験を用いて美白効能を評価した結果を示した図である。
【図１０】メラニン合成抑制試験を通じてメラニン細胞を観察した結果を示した図である。
【図１１】時点毎に目元しわを目視で評価した結果を示した図である。
【図１２】製品服用による被験者の目元しわの程度変化を示した図である。
【図１３】時点毎に製品服用による肌水分量の変化を示した図である。
【図１４】時点毎に製品服用による経皮水分損失量の変化を示した図である。
【図１５】時点毎に製品服用による肌角質量の変化を示した図である。
【図１６】製品服用による被験者の顔及び前膊部位の肌角質量の変化を示した図である。
【図１７】時点毎に製品服用による目元しわ（レプリカ）の変化を示した図である。
【図１８】製品服用による被験者の目元しわの程度変化を示した図である。
【図１９ａ】時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
【図１９ｂ】時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
【図１９ｃ】時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
【図１９ｄ】時点毎に製品服用による肌弾力パラメータの変化を示した図である。
【図２０】時点毎に製品服用による肌色の明るさの変化を示した図である。
【図２１】製品服用による被験者の肌色の明るさの変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態で変形でき、本発明の範囲が後述される実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００５４】
＜製造例＞ザクロ濃縮物の製造
試験例１．加熱濃縮工程を経たザクロ濃縮物の製造
（１）１２ＮＫ２６の製造
まず、トルコ産ザクロ１０００ｋｇの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離することでザクロ果肉４５０ｋｇを得た。濾過後、１００〜１０５℃で６０秒間殺菌し、４８〜５５℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース１０００Ｌ当り７０〜１００ｍｌ投入し、４８〜５５℃で１時間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース１００００Ｌ当りベントナイト９００ｇを投入し、４８〜５５℃で１０分間撹拌した。次いで、１．５ｍｍ及び１ｍｍ真空濾過し、加熱濃縮（順次に、７０〜８５℃、４００〜５５０ｍｂａｒで１２ｂｒｉｘまで、８５〜９２℃、５５０〜７５０ｍｂａｒで１７ｂｒｉｘまで、９２〜１００℃、７５０〜８５０ｍｂａｒで３１Ｂｒｉｘまで、６０〜８０℃、２５０〜３５０ｍｂａｒで４３Ｂｒｉｘまで、そして４０〜６０℃、１００〜２５０ｍｂａｒで６５Ｂｒｉｘまで総５次加熱濃縮）した後、さらに０．１５ｍｍ濾過して、エラグ酸１．８〜３．０ｍｇ／ｇ及びポリフェノール１２．５９ｍｇ／ｇ（没食子酸発色法によって分析した数値）を含むザクロ濃縮物を製造した。ザクロ濃縮物の果実：濃縮物の重量比は１０：１であった。該ザクロ濃縮物を試料１２ＮＫ２６と称する。
【００５５】
（２）１２９１０９１０の製造
まず、イラン産ザクロの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、１６０ｂａｒで圧搾して種を分離した。その後、低温殺菌し、ペクチナーゼをザクロジュース６０００Ｌ当り１００〜１５０ｇ投入して４８〜６０℃で１時間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース６０００Ｌ当りゼラチン１２００〜１８００ｇ、二酸化ケイ素６０００ｇ、及びザクロジュース１００００Ｌ当りベントナイト１４ｋｇを投入し、５０〜６０℃で３０分間撹拌した。次いで、真空濾過し、加熱濃縮（順次に、５５〜９０℃（３分間）、１０５〜１１０℃（９０秒間）、及び１００〜１０５℃（９０秒間））して、エラグ酸０．８〜１．４ｍｇ／ｇ及びポリフェノール１１．７９ｍｇ／ｇ（没食子酸発色法によって分析した数値）を含むザクロ濃縮物を製造した。果実：ザクロ濃縮物の重量比は５：１であった。該ザクロ濃縮物を試料１２９１０９１０と称する。
【００５６】
比較例１．ザクロジュース（９２１２１７）の製造
まず、トルコ産ザクロ１０００ｋｇの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離することでザクロ果肉４５０ｋｇを得た。濾過後、９０〜９４℃で２０秒間殺菌し、１５〜２０℃に冷却して、エラグ酸含量０．２〜０．３２ｍｇ／ｇ及びポリフェノール含量０．７〜１．５５ｍｇ／ｇ（没食子酸発色法によって分析した数値）を含むザクロジュースを製造した。ザクロジュースの果実：ジュースの重量比は２：１であった。該ザクロジュースを試料９２１２１７と称する。
【００５７】
＜実施例２＞ザクロ濃縮物のヒアルロナン合成促進効果の評価
１．試験材料
前記試料１２ＮＫ２６、１２９１０９１０、９２１２１７の液相原液を１００％と見なし、細胞培地で適切な濃度に希釈して検液を製造した。また、ＷＳＴ−１アッセイを通じて予備実験を行った後、細胞毒性を示さない濃度を設定して検液の肌関連効能を評価した。陽性対照群も細胞培養培地で希釈して処理した。
【００５８】
【表１】
0006446120.tif 000002
【００５９】
２．細胞株及び培養
保湿効能試験で使われる細胞株は、ヒト角質細胞であるＨａＣａＴ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨａＣａＴ、ＡＴＣＣ）で培養皿の底に接種した後、ペニシリン（１００ ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０ μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）を入れて３７℃に維持し、５％二酸化炭素を含む培養器内で培養した。
【００６０】
３．細胞毒性試験
検液の毒性を確認するため、ＨａＣａＴ細胞における細胞毒性を測定した。ＨａＣａＴ細胞を９６ウェルプレートにそれぞれ５×１０４細胞／ウェルに分株した後、細胞培養条件で２４時間培養した。培養後、１２時間の飢餓状態を維持した後、検液及び新たな培地（培地サプリメントを除く）を入れて、２４時間培養した。２４時間後、細胞の生存率を測定するため、ＷＳＴ−１反応液をサプリメントが除外された培地で１／１０に希釈して、それを各ウェル当り１００μｌずつ処理して１時間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６１】
その結果、ＨａＣａＴ細胞に対して試料３種のうち１２ＮＫ２６は０．５％以下で８０％以上の細胞生存率、９２１２１７は１％以下で８０％以上の細胞生存率、そして１２９１０９１０は０．５％以下で８０％以上の細胞生存率を示した。
【００６２】
【表２】
0006446120.tif 000003
【００６３】
４．ヒアルロナン合成増加試験
角質細胞におけるヒアルロナンの合成程度をＥＬＩＳＡで測定することで試料の保湿効能を評価した。そのため、ＨａＣａＴ細胞をプレートに５×１０４細胞／ウェルに分株して２４時間培養した。２４時間後、試験物質を細胞培養培地であるＤＭＥＭ（培地サプリメントを除く）に希釈し、濃度毎に細胞に処理した後、２４時間培養した。その後、培養された細胞の培地を回収し、ヒアルロナンＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ３６１４）を使用してヒアルロナン量を測定した。一方、底に付着している細胞はＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ ＮａＯＨで溶解（ｌｙｓｉｓ）させて総タンパク質量を測定し、一定タンパク質当りヒアルロナン合成量を計算した。
【００６４】
＊タンパク質量測定法
タンパク質測定法のうちローリー法（Ｌｏｗｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ ＤＣプロテインキットを使用して測定した。
【００６５】
（１）細胞溶解物（上澄液）をそれぞれ５μｌずつ９６ウェルプレートに入れる。
【００６６】
（２）プロテインスタンダード（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）の製造
１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、５００−０００７）を細胞溶解バッファに８種の濃度に希釈して５μｌずつ９６ウェルプレートに入れる。
【００６７】
（３）キットに含まれた試薬Ａと試薬Ｓとを４０：１の比率で混ぜて各ウェルに２５μｌずつ入れる。
【００６８】
（４）キットに含まれた試薬Ｂをそれぞれ２００μｌずつ入れる。
【００６９】
（５）常温で１５分間反応させた後、７５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００７０】
（６）ＢＳＡ検量線に沿って細胞の総タンパク質量を計算する。
【００７１】
５．統計
全ての資料は平均±標準偏差で示し、統計処理はスチューデントのt検定を使用し、有意確率Ｐ＜０．００５、両側検定を使用した。
【００７２】
６．結果
本試験は、ＥＬＩＳＡを用いてヒアルロナン合成様相を測定することで、試料１２ＮＫ２６、９２１２１７、１２９１０９１０の３種がヒアルロナン合成に及ぼす影響を評価しようとした。そのため、試料を処理した後、ヒアルロナンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ３６１４）で測定した。その結果、１２ＮＫ２６は対照群に比べて０．０１％、０．０５％、０．１％の濃度でそれぞれ１７９．６％、２１４．４％、３０５．１％のヒアルロナンが測定され、濃度依存的に増加する傾向を見せた。特に、３つの濃度全てで統計的に有意にヒアルロナンの合成が増加した。一方、９２１２１７は０．１％、０．５％、１％の濃度で対照群に比べてそれぞれ８４．０％、９８．３％、１０６．２％のヒアルロナンが測定され、３つの濃度全てで統計的有意差は示さなかった。また、１２９１０９１０は対照群に比べて０．０１％、０．０５％、０．１％の濃度でそれぞれ１６２．４％、２６２．４％、２９８．２％のヒアルロナンが測定され、濃度依存的に増加する傾向を見せた。特に、３つの濃度全てで統計的に有意にヒアルロナンの合成が増加した。また、陽性対照群として使用したＮＡＧは、２０ｍＭを処理したとき、対照群に比べて２２４．８％のヒアルロナンが生成され、ＨａＣａＴ細胞はＮＡＧによってヒアルロナンの生合成が促進されることが分かった（表３及び図２参照）。
【００７３】
【表３】
0006446120.tif 000004
【００７４】
＜実施例３＞ザクロ濃縮物の肌生理活性効果の評価
１．試験材料
本試験で使用される検液は、上述した＜試験例１＞の方法で製造されたザクロ濃縮物（すなわち、試料１２ＮＫ２６）の液相原液を１００％と見なし、細胞培地で適切な濃度に希釈して製造した。また、ＷＳＴ−１アッセイを通じて予備実験を行った後、細胞毒性を示さない濃度を設定して検液の肌関連効能を評価した。陽性対照群も細胞培養培地で希釈して処理した。
【００７５】
その他、本試験で使った試験材料は下記のようである。
【００７６】
【表４】
0006446120.tif 000005
【００７７】
２．細胞株及び培養
細胞株は試験項目によって適切に選別して使用した。しわ改善試験ではヒト新生児包皮に由来した正常ヒトプライマリー皮膚線維芽細胞−新生児（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ−Ｎｅｏｎａｔａｌ；ＨＤＦ−Ｎ）を使用し、培養皿の底に接種した後、０．１％インシュリン、０．１％ ｒｈＦＧＦ、０．１％ゲンタマイシン、２％ ＦＢＳを含む線維芽細胞基本培地（ＦＢＭ、ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１３１）培地を入れて３７℃に維持し、５％二酸化炭素を含む培養器内で培養した。
【００７８】
美白効能評価で使用されるメラン−Ａ（ｍｅｌａｎ−Ａ）細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｂｌａｃｋ、ａ／ａ）マウスに由来した不死化細胞系（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＤＣ、Ｃｏｏｐｅｒ ＰＪ、Ｈａｒｔ ＩＲ．Ａ ｌｉｎｅ ｏｆ ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８７；３９：４１４〜４１８）であって、Ｄｒ．Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｃ Ｂｅｎｅｔｔｅ（Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）から提供を受けて使用した。細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地にウシ胎児血清１０％、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２００ｎＭのホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）を添加した培地で３７℃、１０％ＣＯ２条件下で培養した。
【００７９】
３．細胞毒性試験
検液の毒性を確認するため、ＨＤＦ−Ｎ細胞及びメラン−Ａ細胞における細胞毒性を測定した。ＨＤＦ−Ｎ細胞及びメラン−Ａ細胞を９６ウェルプレートにそれぞれ６×１０３細胞／ウェル、９×１０３細胞／ウェルに分株した後、細胞培養条件で２４時間培養した。培養後、１２時間飢餓状態を維持した後、検液及び新たな培地（培地サプリメントまたはＦＢＳを除く）を入れて、２４時間培養した。２４時間後、細胞の生存率を測定するため、ＷＳＴ−１反応液をサプリメントが除外された培地で１／１０に希釈し、それを各ウェル当り１００μｌずつ処理して１時間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８０】
その結果、試料ザクロ濃縮液は、ＨＤＦ−Ｎ細胞に対して０．１％以下の濃度で８０％以上の細胞生存率を示し（表５）、メラン−Ａ細胞に対して０．０５％以下で８０％以上の細胞生存率を示した（表６）。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
【表６】
0006446120.tif 000007
【００８３】
４．しわ改善効能の評価
４−１．プロコラーゲン（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）増加試験
検液のプロコラーゲン合成能を評価するため、ＨＤＦ−Ｎ細胞を４８ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルに分株して細胞培養条件で２４時間培養した。その後、培地を除去し、２４時間細胞の飢餓状態を維持した後、試験物質を細胞培養培地であるＦＢＭ（培地サプリメントを除く）で希釈して濃度毎に細胞に処理し、２４時間培養した。その後、培養された細胞の培地を回収してプロコラーゲンI型Ｃペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキット（ＴＡＫＡＲＡ、ＭＫ１０１）を使用してプロコラーゲン量を測定した。一方、底に付着している細胞はＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ ＮａＯＨに溶解させて総タンパク質量を測定し、一定タンパク質当りプロコラーゲンの合成量を計算した。
【００８４】
その結果、陽性対照群として使用したＴＧＦ−βは、１０ｎｇ／ｍｌを処理した結果、対照群に比べて１５０．８％のプロコラーゲンが生成され、ＨＤＦ−Ｎ細胞はＴＧＦ−βによってプロコラーゲンの生合成が促進されることが分かった。一方、試料を０．０１％、０．０５％、０．１％の濃度で処理した後、プロコラーゲン合成能を評価した結果、それぞれ９６．３％、５３．３％、５３．０％のプロコラーゲン生成を見せ、対照群に比べて統計的有意差は示さなかった（表７）。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
４−２．紫外線によるＭＭＰ−１発現抑制試験
本試験を通じて検液が紫外線によるＭＭＰ−１発現に及ぼす影響を評価した。ＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ；Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の活性程度を免疫ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定することで、試料のしわ改善効能を評価するためである。ＨＤＦ−Ｎ細胞を２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルに分株した後、細胞培養条件で２４時間培養した。２４時間後、培地を捨ててＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ ２００μｌを添加してＵＶ−Ａ ５Ｊ／ｃｍ２を照射した。試料を培地で適切な濃度に希釈した後、細胞に処理して細胞培養条件で２４時間培養した。その後、培養液を採取してヒトトータルＭＭＰ−１ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ９０１）でＭＭＰ−１の量を測定し、測定されたＭＭＰ−１の量は総タンパク質量で補正した。
【００８７】
その結果、ＵＶＡ照射群は非照射群に比べてＭＭＰ−１が２４０．２％生成され、それを通じてＨＤＦ−Ｎ細胞はＵＶＡ ５Ｊ／ｃｍ２によってＭＭＰ−１の発現が誘導されることが分かった。一方、ＨＤＦ−Ｎ細胞にザクロ濃縮液を０．００１％、０．００５％、０．０１％の濃度で処理した後、ヒトトータルＭＭＰ−１ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ９０１）で測定した結果、ＵＶ非照射群に比べてそれぞれ１３７．１％、６９．３％、７．１％のＭＭＰ−１の生成を示して、濃度依存的に減少する傾向を見せ、ＵＶ照射群に比べて統計的に有意に減少した。また、本試験で使用された陽性対照群であるレチノイン酸は、ＵＶ非照射群に比べて１７１．６％のＭＭＰ−１生成を示して、ＵＶ照射群に比べて統計的に有意に減少した。
【００８８】
【表８】
0006446120.tif 000009
【００８９】
４−３．エラスターゼ抑制分析（Ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
本試験は、検液のエラスターゼ活性を測定するため、肌線維芽細胞であるＨＤＦ−Ｎ細胞を酵素エラスターゼとして使用した。そのため、培養されたＨＤＦ−Ｎ細胞に０．１％トリトンＸ−１００が含有された０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）を添加した後、超音波粉砕機を用いて溶かした後、３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を採取し、それを定量して総タンパク質量で酵素の活性を測定した。
【００９０】
試料のエラスターゼ活性測定のため、均質化された線維芽細胞エラスターゼ２００μｇ／ｍｌ、０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液及び試料を濃度毎に添加した後、エラスターゼ特異的な基質である５０ｍＭ ＳＴＡＮＡを入れて３７℃で培養し、４０５ｎｍで吸光度を測定した。効能は検液を入れていない対照群に比べてエラスターゼ活性抑制程度を計算した。陽性対照群としてはホスホラミドン（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）を使用した。
【００９１】
ザクロ濃縮液を０．０５％、０．１％、１％の濃度で反応させた後、４０５ｎｍで測定した結果、対照群に比べてそれぞれ９２．３％、８９．５％、６３．６％のエラスターゼ活性が測定され、濃度依存的に減少する傾向を見せた。特に、３つの濃度全て対照群に比べて統計的に有意に減少した。また、本試験で使用された陽性対照群であるホスホラミドンは対照群に比べて７４．９％のエラスターゼ活性が測定され、統計的に有意に減少した。
【００９２】
【表９】
0006446120.tif 000010
【００９３】
５．美白効能の評価
５−１．チロシナーゼ抑制分析（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
検液をエタノールや適切な溶媒に溶かしてチロシナーゼ活性を抑制するための適切な濃度範囲に希釈したものを試料液にした。試験管に０．１Ｍのリン酸緩衝液２２０μｌ、試料液２０μｌ、そしてマッシュルームチロシナーゼ（１５００ Ｕ／ｍＬ〜２０００ Ｕ／ｍＬ）液２０μｌを順に入れ、該溶液に１．５ｍＭのチロシン液４０μｌを入れて３７℃で１０〜１５分間反応させた。そして、それをＥＬＩＳＡリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。空試料液として試料液の代わりに０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）を入れる。活性阻害率が５０％であるときの試料の濃度（ＩＣ５０）を適切なプログラムを用いて算出した。
【００９４】
０．１％濃度以下のチロシナーゼ酵素活性抑制率を測定した結果、ザクロ濃縮液は濃度０．１％までチロシナーゼ酵素の活性を抑制することができなかった。一方、陽性対照群として使用したコウジ酸（Ｋｏｊｉｃ ａｃｉｄ）のＩＣ５０値は３．６３４ｐｐｍと測定された。
【００９５】
【表１０】
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【００９６】
５−２．メラニン合成阻害試験
メラン−Ａ細胞を３×１０４細胞／ウェルになるように２４ウェルプレートに分株した後、細胞がプレートによく付着するように２４時間細胞培養器で培養した後、各ウェル当り多様な濃度に希釈された検液が入っている培地を入れた。実験試料は濃度毎に培地に溶かして使用した。同じ方法で実験試料を３日に一回ずつ、６日間処理した。細胞内のメラニンは光学顕微鏡（ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。その後、細胞は細胞溶解バッファに溶かした後、遠心分離を通じて上澄液を分離してタンパク質定量し、メラニンは１ＮのＮａＯＨを添加して４０５ｎｍで吸光度を測定して、測定したタンパク質量に対するメラニン量に換算した。
【００９７】
その結果、検液を処理しない対照群に比べてそれぞれ９５．４％、８６．３％、６７．１％のメラニン合成が測定され、統計的に有意に濃度依存的に減少した。陽性対照群として使用したアルブチンを１０μＭ処理した結果、濃度依存的なメラニン合成抑制効能を示した。
【００９８】
【表１１】
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【００９９】
６．統計
全ての資料は平均±標準偏差で示し、統計処理はスチューデントのt検定を使用し、有意確率Ｐ＜０．００５、両側検定を使用した。
【０１００】
＜実施例４＞ザクロ濃縮物の肌生理活性効果に対する臨床評価
＜実施例４−１＞実験方法
１．被験者選定
乾燥肌であり、目元しわ、色素沈着が生じ始めたか又は既に生じた２５歳〜６０歳の女性被験者６２名を対象に実験を行った。選定された被験者に上述した＜試験例１＞の方法で製造したザクロ濃縮物（すなわち、試料１２ＮＫ２６）含有飲料（試験製品）とザクロ濃縮物未含有飲料（対照製品）とを二重盲検無作為に割り当てて８週間毎日１包ずつ（５０ｍｌ／包）服用させた後、試験製品の服用前、服用４週後、８週後の各時点で、目視評価、肌水分量、肌角質量、ＴＥＷＬ（Ｔｒａｎｓ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗａｔｅｒ Ｌｏｓｓ）、目元しわ（レプリカ）、肌弾力、肌色の明るさ（Ｌ＊値）及びアンケート評価、安全性評価、食餌調査、体重（ＢＭＩを含む）調査を行って肌改善効果を評価した。また、製品服用前と服用８週後の時点で血液検査を行った。
【０１０１】
ザクロ濃縮物（すなわち、試料１２ＮＫ２６）含有飲料（試験製品）とザクロ濃縮物未含有飲料（対照製品）に含まれた成分及び含量は次のようである：
【０１０２】
【表１２】
0006446120.tif 000013
【０１０３】
２．測定及び評価
被験者は、ブロックランダム化（ｂｌｏｃｋ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）を通じて対照製品グループと試験製品グループとに分け、被験者の顔、左側前膊または右側前膊を測定部位にした。顔では、被験者の顔の目尻と鼻先とが接する頬部位（水分量、角質、ＴＥＷＬ、弾力、色測定）、色素沈着部位（色測定）、目じりの小じわ（ｃｒｏｗ’ｓ ｆｅｅｔ）部位（しわ測定）を対象にし、前膊内側は前膊内側の屈側部位から５ｃｍ離れた部位を対象にした。被験者は、洗顔した後、空気の移動と直射光線のない恒温恒湿条件（２２±２℃、５０±５％）が保たれる空間で３０分間肌を安定させた後、目視評価、機器測定（肌水分量、角質量、経皮水分損失量、肌弾力、色、目元しわ−レプリカ）、アンケート評価、体重（ＢＭＩ）測定、食餌調査及び安全性評価に参加した。
【０１０４】
３．目視評価
目視評価は、被験者の目元しわの程度を２名の試験者が、２００５．７食品医薬品安全処機能性化粧品の有効性評価のためのガイドラインＩＩに開示された目視評価基準に基づいて、０〜９段階で評価した。時点毎の目尻部位のしわの状態は顔面撮影装置（ＶＩＳＩＡ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を使用して撮影（ＦＬ ｍｏｄｅ）した。
【０１０５】
【表１３】
0006446120.tif 000014
【０１０６】
４．機器測定
機器測定は、製品服用前、服用４週後、服用８週後の時点でそれぞれ被験者の左側頬又は右側頬の肌水分量、経皮水分損失量、角質量、肌弾力、肌色をそれぞれ測定し、左側又は右側の目じりの小じわを測定した。
【０１０７】
（１）Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ８２５を使用した肌水分量の測定
Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ＧｍｂＨ、ドイツ）は電気容量（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）を測定する原理で肌の角質層下３０〜４０μｍの水分量を測定する機器であって、プローブから電流を流せば肌の水分含有量による肌の電気伝導度によってプローブヘッドに残っている絶縁イオン値が数値化（ＡＵ：ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）されて示されるため、肌の水分含量が多いほど測定値が高くなる。本試験では正確な測定値を得るため、評価時点毎に試験部位（頬、前膊内側）をそれぞれ３回繰り返して測定してその平均値を分析した。
【０１０８】
（２）Ｖａｐｏｍｅｔｅｒ（登録商標）を使用した経皮水分損失量の測定
経皮水分損失は、肌から水分が発散されることを言い、保湿機能と密接な関係がある。乾燥が悪化する場合、ＴＥＷＬ値が増加するため、保湿力の有無はＴＥＷＬ測定程度で判断することができる。測定機器であるＶａｐｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｄｅｌｆｉｎ、フィンランド ）は、温度と湿度センサーが測定部位の単位面積当りの経時的水分蒸発量（ｇ／ｍ２ｈ）を測定する。本試験では各評価時点毎に試験部位（頬、前膊内側）を測定して水分蒸発量を分析した。
【０１０９】
（３）Ｄ−ｓｑｕａｍｅ（登録商標）を使用した肌角質量の測定
肌水分程度を評価する他の指標である角質量測定は、Ｄ−ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｂｌａｃｋ Ｔａｐｅを使用して試験部位（頬、前膊内側）の角質を採取する。本試験ではＤ５００ Ｄ−ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｄｉｓｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒで約５秒間２２５ｇ／ｃｍ２の圧力で肌に付着してから引き離す。採取した角質標本はＣｈａｒｍ ｖｉｅｗ（Ｍｏｒｉｔｅｘ、日本）で７００倍拡大して撮影し、イメージプログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）ｐｌｕｓ）を用いて角質の面積を分析した。
【０１１０】
（４）Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ（登録商標）ＶＬ−６５０を使用した目元しわ（レプリカ）の測定
Ｖｉｓｉｏｌｉｎｅ（登録商標）ＶＬ−６５０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ＧｍｂＨ、ドイツ）は、製作されたレプリカのしわの深さ、長さなどを測定する装備である。特別な光源が通過するように製作された標準カートリッジにレプリカを入れ、光源を通過させて影明暗映像をＣＣＤカメラを使用してファイル化した後、最大しわの深さ（Ｍａｘ ｗｒｉｎｋｌｅ ｄｅｐｔｈ）を分析した。
【０１１１】
（５）Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）を使用した肌弾力の測定
肌弾力はＣｕｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＭＰＡ ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ、ドイツ）を使用して測定する。近年、最も多く使用される方法は吸入力（負圧）を使用したものであって、再現性が高い方法である。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒの測定値は０〜１の値（ｍｍ、比率）で示される。本試験では、各評価時点毎に試験部位（頬の正面）を３回測定して各パラメータ（Ｒ０〜Ｒ９）の平均値を分析した。弾力パラメータは下記の表に基づいて解釈した。
【０１１２】
【表１４】
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【０１１３】
（６）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ−７００ｄを使用した肌色測定
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ−７００ｄは物体色の分光反射率を測定する装備であって、三刺激値を測定してＣＩＥＬＡＢの表色系であるＬ＊、ａ＊、ｂ＊で計算する。Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系では、明度をＬ＊、色相と彩度を示す色度をａ＊、ｂ＊で表す。ａ＊、ｂ＊は色の方向を示し、ａ＊は赤色方向、−ａ＊は緑色方向、ｂ＊は黄色方向、−ｂ＊は青色方向を表している。Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊の数値が中央になるほど無彩色になり、逆になれば色度が高くなることを示す。本試験では試験部位（頬正面、色素沈着部位）を３回測定して肌色の明るさ（Ｌ＊値）の平均値を計算して分析した。
【０１１４】
５．血液分析
試験製品の服用前及び服用８週後の被験者の血液を検査し、試験製品が人体の代謝に影響を及ぼさなかったことを確認した。
【０１１５】
６．食餌調査及び体重測定
被験者の食習慣の変化が実験結果に影響を及ぼさなかったことを確認するため、試験製品の服用前、服用４週後、服用８週後の時点で体重を測定し、食餌調査を通じて試験期間中の食習慣が普段通りに維持されたか否かを確認した。被験者は提供される食餌調査評価書に本人の食事量程度を自ら評価して訪問時に持参し、試験者が確認及び記録した。
＊食事量程度：（食べない：０、少ない：１、普通：２、多い：３）。
【０１１６】
７．アンケート評価
試験製品の服用４週後、服用８週後に被験者が作成した応答に基づいて試験製品の効能と服用性に対する満足度を評価した。
【０１１７】
８．安全性評価
試験製品の服用４週後、服用８週後に、試験者が被験者の肌の状態を観察し、被験者との質疑応答を通じて肌の状態と身体の状態、製品の刺激有無を確認して記録、評価した。
【０１１８】
９．データ分析
試験製品の服用前、服用４週後、服用８週後の時点で機器測定値の平均及び標準偏差値（Ｓ．Ｄ）をそれぞれ求め、測定値の時点毎、群毎の差異有無を統計分析した。製品服用時点毎の比較はペアｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）（ｐ＜０．０５）によって、製品群毎の比較は対応のないｔ検定（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔ）（ｐ＜０．０５）によって分析し、統計分析プログラムはＳＰＳＳ（登録商標）２０．０を使用し、アンケート調査の結果は頻度分析した。
【０１１９】
＜実施例４−２＞実験結果
１．目視評価
時点毎に製品服用前後の目元しわを目視で評価分析した結果、製品服用前と比べて製品服用８週後の時点で試験製品（Ｂ製品）の目元しわの目視評価点数が統計的に有意に減少（改善）した（ｐ＜０．０５）（表１４、図１１〜１２）。
【０１２０】
【表１５】
0006446120.tif 000016
【０１２１】
２．肌水分量
分析の結果、製品服用４週後、８週後のいずれも顔及び前膊部位で対照群（Ａ製品）に比べて試験群（Ｂ製品）で統計的に有意に肌水分量が増加（改善）した（ｐ＜０．０５）（表１５、図１３）。
【０１２２】
【表１６】
0006446120.tif 000017
【０１２３】
３．経皮水分損失量（ＴＥＷＬ）
分析の結果、製品服用４週後、８週後の時点いずれも前膊部位でＡ製品（対照群）に比べてＢ製品（試験群）で統計的に有意にＴＥＷＬが減少（改善）した（ｐ＜０．０５）（表１６、図１４）。
【０１２４】
【表１７】
0006446120.tif 000018
【０１２５】
４．肌角質量
分析の結果、製品服用前と比較して、製品服用４週後の時点では試験群の顔部位で、製品服用８週後の時点では顔及び前膊部位で肌角質量が統計的に有意に減少（改善）した（ｐ＜０．０５）。肌角質量の最大減少率は、製品服用８週後の時点で、顔部位ではＡ製品（対照群）が１．８４％、Ｂ製品（試験群）が６．１２％の減少率を見せ、前膊部位ではＡ製品が０．３７％、Ｂ製品が４．０９％の減少率を見せた（ｐ＜０．０５）（表１７）。
【０１２６】
【表１８】
0006446120.tif 000019
【０１２７】
また、顔及び前膊部位いずれも製品服用８週後の時点でＡ製品に比べてＢ製品で統計的に有意に肌角質量が減少（改善）した（ｐ＜０．０５）（表１８、図１５、図１６）。
【０１２８】
【表１９】
0006446120.tif 000020
【０１２９】
５．目元しわ（レプリカ）
分析の結果、製品服用前と比較して、製品服用８週後にＢ製品（試験群）において、パラメータのうちしわの最大深さ（Ｍａｘ ｗｒｉｎｋｌｅ ｄｅｐｔｈ）が有意に減少（改善）した（ｐ＜０．０５）（表１９、図１８）。
【０１３０】
【表２０】
0006446120.tif 000021
【０１３１】
６．肌弾力
分析の結果、群同士を比較したとき、パラメータのうちＲ１（元の状態に戻る能力）とＲ４（最終カーブの最低点）は、製品服用８週後の時点でＡ製品（対照群）に比べてＢ製品（試験群）で統計的に有意に減少（改善）し、Ｒ５（ネット弾力）とＲ７（生物学的弾力）は有意に増加（改善）した。また、Ｒ２（総弾力）は製品服用４週後、８週後の時点いずれもＡ製品に比べてＢ製品で統計的に有意に増加（改善）した（ｐ＜０．０５）（表２０、図１９ａ〜図１９ｄ）。
【０１３２】
【表２１】
0006446120.tif 000022
【０１３３】
７．肌色の明るさ
製品服用４週後の時点では頬部位で、製品服用８週後の時点では頬、色素沈着部位で、Ａ製品（対照群）に比べてＢ製品（試験群）で統計的に有意に肌色の明るさ値が増加（改善）した（ｐ＜０．０５）（表２１、図２０、図２１）。
【０１３４】
【表２２】
0006446120.tif 000023
【０１３５】
８．血液分析
分析の結果、群同士を比較したとき、すべてのパラメータで２つの群の間に統計的に有意な差は見せなかった（ｐ＜０．０５）（表２２）。
【０１３６】
【表２３】
0006446120.tif 000024
【０１３７】
９．食餌調査及び体重調査
分析の結果、製品服用前と比べて、製品服用４週後、８週後の時点で、Ａ製品とＢ製品のいずれも食餌調査、体重、ＢＭＩ指数に有意な差は見せなかった（ｐ＜０．０５）（表２３）。
【０１３８】
【表２４】
0006446120.tif 000025
【０１３９】
１０．アンケート評価
試験製品の服用４週後、服用８週後に被験者が作成した応答に基づいて試験製品の効能に対する満足度を評価した。評価結果は次のようである（表２４）。
【０１４０】
【表２５】
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【０１４１】
１１．安全性評価
本試験の期間中、いずれの被験者からも肌、身体の症状に何ら異常反応が観察されなかった（表２５）。
【０１４２】
【表２６】
0006446120.tif 000027
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006446120.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0006446120.tif 000045
【図１９ａ】
0006446120.tif 000046
【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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