(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも１つがフレームワーク領域１（ＦＲ１）内に溶媒に露出される位置に置換された少なくとも２つのシステイン残基を含み、
（ｉ）前記少なくとも２つのシステイン残基が２つ、４つ、または６つのシステイン残基からなり、
（ｉｉ）前記システイン残基の少なくとも２つが化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間のＦＲ１内にジスルフィド結合が形成可能であり；及び
（ｉｉｉ）前記ＶＬが前記少なくとも２つのシステイン残基を含む場合にそれらは（ｉ）Ｌ７及びＬ１１、（ｉｉ）Ｌ８及びＬ１１、（ｉｉｉ）Ｌ８及びＬ１２、（ｉｖ）Ｌ１４及びＬ１７、並びに（ｖ）Ｌ１３およびＬ１９からなる群から選択されるＫａｂａｔ位置に置換されており、かつ、前記ＶＨが前記少なくとも２つのシステイン残基を含む場合にそれらは（ｉ）Ｈ７及びＨ１０、（ｉｉ）Ｈ１３及びＨ１６、または（ｉｉｉ）Ｈ１２及びＨ１８からなる群から選択されるＫａｂａｔ位置に置換されている、単離されたタンパク質。
【請求項２】
前記システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした化合物を含み、前記コンジュゲートした化合物が単離されたタンパク質の抗原との結合を低減しない、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
前記可変領域の少なくとも１つがＮ末端スレオニン残基又はＮ末端セリン残基を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物をさらに含む、請求項３に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の単離されたタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項６】
対象における抗原をインビボで位置特定又は検出するための医薬の製造のための請求項２に記載の単離されたタンパク質であって、前記コンジュゲートした化合物が検出可能標識である、単離されたタンパク質。
【請求項７】
生物試料中の抗原の検出方法であって、前記生物試料と請求項１に記載のタンパク質とを、前記タンパク質が抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり且つそのような条件下で、接触させるステップと、前記複合体を検出するステップとを含む方法。
【請求項８】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を各々が含む複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
（ｉ）前記ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号１１１に示される配列を含むＶＨを含み；及び
（ｉｉ）少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号１１３に示される配列を含むＶＬを含み、
（ｉ）における前記ポリペプチドの前記ＶＨと（ｉｉ）における前記ポリペプチドの前記ＶＬとが会合して、腫瘍抗原ＴＡＧ−７２との特異的な結合能を有するＦｖを形成し、前記免疫グロブリン可変領域の少なくとも１つが、前記少なくとも２つのシステイン残基置換を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】
Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離されたタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項１１】
少なくとも２つのシステイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした化合物を含むタンパク質の作製方法であって、
（ｉ）請求項１に記載のタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）ポリペプチドのＦＲ１における前記システイン残基の少なくとも１つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
【請求項１２】
Ｎ末端セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートした化合物を含むタンパク質の作製方法であって、前記方法が、化合物を請求項９に記載のタンパク質のポリペプチドのＮ末端の少なくとも１つのセリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記少なくとも２つのシステイン残基間にジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１４】
前記少なくとも２つのシステイン残基が２つまたは４つのシステイン残基からなる、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１５】
前記少なくとも２つのシステイン残基が２つのシステイン残基からなる、請求項１４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１６】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）との両方が前記少なくとも２つのシステイン残基を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１７】
Ａｖｉｂｏｄｙである、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１８】
ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである、請求項８に記載の単離されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年７月３日に出願された「Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａ
ｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅｍ」と題されるオーストラ
リア国特許第２００９９０３１２７号明細書；２００９年７月６日に出願された「Ｉｍｍ
ｕｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｔｈｅｍ」と題される米国仮特許出願第６１／２２３３５３号明細書；及び２００９年
１０月３０日に出願された「Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａ
ｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ」と題される米国仮特許出願第６１／２５６７０３
号明細書からの優先権を主張し、これらの内容は全て参照により援用される。
【０００２】
本発明は、免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質であって、それに対する化合物の
コンジュゲーションを促進するように修飾された、又はそれにコンジュゲートした化合物
を有するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリン、例えば、抗体及び抗体様分子（例えば、ラクダ科動物の免疫グロブリ
ン又は軟骨魚類由来の免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ））又はその抗原結合
ドメインを含むタンパク質は、その高度に特異的な結合性により、対象の特定の標的に分
子を送達するのに特に好適である。例えば、免疫グロブリン又はその抗原結合ドメインを
含むタンパク質は、腫瘍細胞などの細胞を死滅させたり、又はその増殖を阻害したりする
細胞傷害性化合物又は細胞増殖抑制化合物、例えば薬物とコンジュゲートすることができ
る（Ｌａｍｂｅｒｔ、２００５年）。かかるコンジュゲートは、免疫グロブリン又は断片
が結合する抗原を発現する細胞への細胞傷害性化合物又は細胞増殖抑制化合物の、対象の
全身にわたる非特異的な送達ではない、標的化された送達を促進する。かかるコンジュゲ
ートにより、毒性レベルの化合物が対象において、全身的にではなく、必要とされる部位
に送達されることが確実となり、対象にとって概して毒性である化合物の使用が可能とな
り得る。さらに、抗体又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質をフルオロフォア又は
放射性同位元素などの検出可能な化合物とコンジュゲートすることにより、対象における
標的分子の検出が促進され、例えば、癌細胞などの罹患細胞の検出が、例えば生体内イメ
ージングに基づく方法を用いて促進される。
【０００４】
化合物を抗体又は抗原結合ドメインを含むタンパク質に連結する従来の手段は、概して
、化合物が抗体上の多くの部位に結び付く異種分子混合物をもたらす。例えば、化合物は
典型的には抗体又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質に対し、抗体又は抗原結合ド
メイン中の、多くの場合に多数あるリジン残基を介してコンジュゲートさせることで、異
種抗体−化合物コンジュゲート混合物が生成されている。用いられる反応条件に応じて、
異種混合物は典型的には、０個から約８個に至る、又はそれ以上の化合物が結び付いたコ
ンジュゲートの分布を含む。加えて、化合物が抗体又はタンパク質に対して特定の整数比
を有する一部のコンジュゲートの各々の中に、化合物が抗体又はタンパク質上の様々な部
位に結び付いた潜在的に異種の混合物がある。コンジュゲーション反応によって生じた異
種混合物の中の様々なコンジュゲート種を分離して特徴付けるには、分析的及び調製的方
法は不適当である。
【０００５】
さらに、抗体又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質との化合物の非特異的コンジ
ュゲーションは、例えば化合物が抗原結合に必要な領域にコンジュゲートされる場合に、
抗体／タンパク質の抗原との結合を低減し、又は完全に妨害し得る。インタクトな抗体と
比べてはるかに小さい抗原結合ドメインを含み、抗原結合にとって重要でないコンジュゲ
ーションに好適な残基がほとんどないこともあるタンパク質では、このリスクは増加する
。例えば、抗体の抗原結合ドメイン程度しか含まないタンパク質は、抗原結合を低減又は
妨害することなしに化合物がコンジュゲートすることのできる部位をほとんど有しない。
【０００６】
抗体のＦｃ領域上の１つ又は複数の炭水化物は、化合物を結び付ける天然の部位である
。概して、炭水化物は過ヨウ素酸酸化により修飾されて反応性アルデヒドを生成し、次に
それを用いて反応性アミンを含有する化合物をシッフ塩基の形成により結び付けることが
できる。アルデヒドはアミン基と反応し得るため反応は低ｐＨで行われ、従って抗体又は
抗原結合ドメイン中のリジン残基はプロトン化され、非反応性である。生成されたアルデ
ヒドと結び付けるにはヒドラジド基が最も好適であり、これはヒドラジド基が低ｐＨで反
応性を有し、ヒドラゾン連結鎖を形成するためである。この連結鎖は、次にシアノ水素化
ホウ素ナトリウムで還元することによりヒドラジン連結鎖を形成してさらに安定化させる
ことができる（Ｒｏｄｗｅｌｌら、１９８６年）。この手法の欠点としては、連結に必要
な条件が厳しく、一部の抗体分子に損傷を与え、及びそれらを凝集させ得ることが挙げら
れる。例えば、一部の抗体可変領域中に存在するメチオニン残基は過ヨウ素酸による酸化
を特に受け易い可能性があり、これは抗原結合アビディティの消失につながり得る。ヒス
チジン残基及び／又はトリプトファン残基もまた酸化され易い。さらに、抗体の抗原結合
ドメインを含むタンパク質の多くはＦｃ領域を含むとは限らず、つまりそうしたタンパク
質は前述の方法では化合物とコンジュゲートすることができない。
【０００７】
ｐＨ７前後ではプロトン化されて求核性が低い多くのアミンと異なり、システインチオ
ールは中性ｐＨで反応性を有する。遊離チオール基は比較的反応性が高いため、システイ
ン残基を有するタンパク質は多くの場合にジスルフィドで連結されたオリゴマーとしてそ
の酸化された形態で存在するか、又は内部架橋されたジスルフィド基を有する。細胞外タ
ンパク質は、概して遊離チオールを有しない（Ｇａｒｍａｎ、１９９７年）。システイン
残基は遺伝子工学技術によってタンパク質に導入されており、リガンドとの共有結合が形
成され、又は新規の分子内ジスルフィド結合が形成されている。しかしながら、システイ
ンチオール基のタンパク質への挿入又は置換は、特に反応又は酸化に比較的利用し易いも
のの場合には、すなわち化合物のコンジュゲーションに有用な部位に位置する場合には、
潜在的に問題がある。これは、タンパク質の濃縮溶液中では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ  ｃｏｌｉ）のペリプラズム中であろうと、培養上清中であろうと、又は部分的若
しくは完全に精製されたタンパク質中であろうと、タンパク質の表面上のシステイン残基
が対形成して酸化し、分子間ジスルフィド、ひいてはタンパク質凝集体を形成し得るため
である。かかるタンパク質凝集は、例えば所望の生物活性を有する有用な形態の単離タン
パク質の収率低下につながることが多い。さらに、酸化的にタンパク質は、新規に操作さ
れたシステインと既存のシステイン残基との間に分子内ジスルフィド結合を形成すること
があり、これによるミスフォールディング又は三次構造の消失によりタンパク質が不活性
又は非特異的になり得る。前述の問題の各々は、正しいフォールディング及び安定性、並
びに結果として抗原結合活性を確保するよう互いに結合するいくつかのシステイン残基を
概して含む抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質では悪化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記から、当業者には、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含み、それとの化合物の
単純なコンジュゲーションを可能にするように修飾されたタンパク質が当該技術分野にお
いて必要とされていることは明らかであろう。好ましいタンパク質は、様々な系における
組換え作製を、好ましくは分子間結合により連結された著しいレベルの多量体凝集体を生
じることなく促進し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に至るまでの研究において、本発明者らは、免疫グロブリン、例えば抗体の可変
領域内の部位であって、可変領域の抗原との結合を妨害することなく化合物をコンジュゲ
ートすることが可能な部位を特定しようと努めた。本明細書において例証するとおり、本
発明者らは、可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ１）内に、コンジュゲーションに利
用可能であり、且つ可変領域の抗原結合部位から十分に外れていて、そこにコンジュゲー
トされる化合物が抗原結合を抑制又は妨害する可能性が低い多数の部位を決定した。これ
らの部位は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の双方に保存されている。こ
の決定に基づき、本発明者らは、ＦＲ１に２つのシステイン残基が挿入された変異可変領
域を含む様々なタンパク質を作製した。これらのシステイン残基は、それらの間にジスル
フィド結合が形成され得るような位置に置かれる。組換え作製及び／又は精製の間、シス
テイン残基はジスルフィド結合により連結され、そのためそれらの残基が同じタンパク質
内の、或いは別のタンパク質における他のシステイン残基と結合することが低減又は妨害
される。これにより、連結した多量体及び／又は異常に折り畳まれた可変領域が作製され
る可能性が低下し、機能タンパク質の作製及び／又は単離が可能となる。単離後、システ
イン残基は還元されるか、又は他の方法で分解され、化合物のタンパク質とのコンジュゲ
ーションが可能となる。本発明者らはまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの嵩
高い化合物及び放射性同位元素などのイメージング用化合物を含め、これらのタンパク質
に対する多数の化合物のコンジュゲーションが、可変領域の抗原との結合を妨害しないこ
とも実証した。
【００１０】
一例において、本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つ
のシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、
システイン残基の少なくとも１つが化合物にコンジュゲートされない場合にシステイン残
基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
【００１１】
別の例において、本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２
つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって
、システイン残基の少なくとも２つが化合物にコンジュゲートされない場合にシステイン
残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
【００１２】
代替的又は追加的な例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の少なくとも１つが、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも１つが別の化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
【００１３】
代替的又は追加的な例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免
疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも１つが、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステ
イン残基を含み、システイン残基の少なくとも２つが別の化合物にコンジュゲートされな
い場合にシステイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
【００１４】
好ましくは、タンパク質は、単一のポリペプチド鎖に少なくとも１つのＶＬと少なくと
も１つのＶＨとを含む。
【００１５】
好ましくは、システイン残基は、非還元条件下でジスルフィド結合が存在するように位
置する。
【００１６】
好ましくは、システイン残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基２と相補性決
定領域（ＣＤＲ）１との間に位置する。
【００１７】
一例において、システイン残基はＦＲ１の１つ又は複数のループ領域内に位置する。
【００１８】
代替的又は追加的な例において、前記システイン残基はＶＨ内にあり、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基２から３０の間に位置する。好ましくは、前記システイン残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７〜２０及び／又は残基２４〜３０の間に位置し、より好ましくは残基７〜２０の間に位置する。さらなる例において、前記残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基６〜１６の間に位置する。さらなる例において、前記残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７〜１６の間に位置する。
【００１９】
代替的又は追加的な例において、前記システイン残基はＶＬ内にあり、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基２から２２の間に位置する。好ましくは、前記システイン残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７〜２０の間に位置する。さらなる例において、前記残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７〜１９の間に位置する。さらなる例において、前記残基は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７〜１７の間に位置する。
【００２０】
本発明の例示的形態において、システイン残基は、ＶＨ及び／又はＶＬの保存されたシ
ステイン残基に対して追加的なものである。当業者は、天然に存在する抗体の少なくとも
大多数において、保存されたシステイン残基がＫａｂａｔ付番方式により付番してＶＬで
は残基２３にあり、及び／又はＶＨでは残基２２にあることを認識するであろう。
【００２１】
本発明の一つの好ましい形態において、システイン残基は保存されたシステイン残基に
対してＮ末端側に位置する。好ましくは、システイン残基は以下の１つ又は複数に位置す
る：
（ｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基８及び残基１１；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基１４及び残基１７；
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基７及び残基１１；
（ｉｖ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基１４及び残基１７；
（ｖ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基８及び残基１２；
（ｖｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基７及び残基１０；及び／又は
（ｖｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基１３及び残基１６。
【００２２】
本発明の別の好ましい例において、システイン残基は以下の１つ又は複数に位置する：
（ｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基１３及び残基１９；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基１３及び残基１９；
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基６及び残基９；及び／又は
（ｉｖ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基１２及び残基１８。
【００２３】
本発明は、可変領域内のさらなる残基の修飾又はそれを含むタンパク質を明確に企図す
る。例えば、本発明者らは、システイン残基間に位置する残基の置換が、又はさらにはＣ
ＤＲ内に天然に存在するシステイン残基を置き換えても、本発明のタンパク質の抗原との
結合を妨害しないことを明確に実証している。
【００２４】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のタンパク質を含むＦｖを含む単離されたタン
パク質であって、少なくとも１つのＶＬが少なくとも１つのＶＨと結合して抗原結合部位
を形成するタンパク質も提供する。
【００２５】
タンパク質の一形態は、単一のポリペプチド鎖にある、抗原結合部位を形成するＶＬ及
びＶＨを含む。例えば、タンパク質は、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）及
び／又は（ｉｉ）の少なくとも１つ
である。
【００２６】
或いは、タンパク質は、異なるポリペプチド鎖にある、抗原結合部位を形成するＶＬ及
びＶＨを含む。一例において、タンパク質の各ポリペプチド鎖がＶＬとＶＨとを含む。好
ましくは、かかるタンパク質は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；又は
（ｉｉｉ）テトラボディ
である。
【００２７】
別の例において、本発明のタンパク質は免疫グロブリンであり、好ましくは抗体である
。免疫グロブリンの例示的形態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用さ
れると解釈されるべきである。
【００２８】
本発明のいくつかの例において、本発明のタンパク質は、ジスルフィド結合により連結
されたシステイン残基を含む。或いは、本発明のタンパク質は、システイン残基の少なく
とも１つにコンジュゲートした化合物を含み、ここで化合物のコンジュゲーションは、タ
ンパク質の抗原との結合を妨害しない。例示的化合物としては、放射性同位体、検出可能
標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパ
ク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物が
挙げられる。当業者は、タンパク質という用語が、１つ又は複数の免疫グロブリン可変領
域を含むタンパク質、例えば、本明細書に記載されるものなどのＦｖ含有タンパク質を含
む抗体又はその断片を包含することを理解するであろう。
【００２９】
一例において、本発明のタンパク質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲ
ートされる。例えば、ＰＥＧは単分散ＰＥＧである。
【００３０】
一例において、ＰＥＧは約４０００Ｄａ以下の分子量、例えば、約２０００Ｄａ以下の
分子量、約１，５００Ｄａ以下などの分子量を有する。一例において、ＰＥＧは１，００
０Ｄａ以下の分子量、９００Ｄａ以下など、例えば、８００Ｄａ以下、６００Ｄａ以下な
どの分子量を有する。一例において、ＰＥＧは約５５０Ｄａ〜約１，０００Ｄａの分子量
を有する。
【００３１】
別の例において、ＰＥＧは約７０個又は７５個又は７７個以下のエチレングリコール単
位を有する。例えば、ＰＥＧは約５０個以下のエチレングリコール単位を有する。好まし
くは、ＰＥＧは４８個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約４０
個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約３０個以下のエチレング
リコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約２７個以下のエチレングリコール単位を有す
る。例えば、ＰＥＧは約２４個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧ
は約１５個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約１２個以下のエ
チレングリコール単位を有する。好ましくは、ＰＥＧは約１２〜２７個のエチレングリコ
ール単位を含む。
【００３２】
一例において、本発明のタンパク質は、配列番号５７に示される配列と少なくとも約８
０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％又は１００％同一
の配列を含み、且つＦＲ１におけるシステイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートさ
れた短鎖単分散ＰＥＧを有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。好ましくは、ＰＥ
Ｇは１５〜３０個のエチレングリコール単位、好ましくは２４個のエチレングリコール単
位を含む。タンパク質は１個以上の、及び好ましくは１０個又は５個又は４個又は３個又
は２個未満の置換、好ましくは保存的アミノ酸置換又は欠失又は挿入を含むことができる
。記載される配列に対する例示的な変化としては、Ｎ末端セリンの欠失、又はセリンによ
る別のアミノ酸残基の置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）及び／又はＣ末端リジン及
び／又はアルギニンの欠失若しくは置換が挙げられる。
【００３３】
本発明者らはまた、可変領域を含むタンパク質を、Ｎ末端にセリン残基又はスレオニン
残基を含むように修飾した。この残基により、それとの化合物の部位特異的コンジュゲー
ションが可能となる。Ｎ末端セリン／スレオニン変異を上記で考察されるシステイン変異
と組み合わせることにより、本発明者らは、少なくとも２つの異なる化合物を部位特異的
にコンジュゲートすることのできるタンパク質を作製した。
【００３４】
従って、本発明の例は、少なくとも１つのＮ末端スレオニン残基又はセリン残基をさら
に含む本発明のタンパク質を提供する。セリン残基又はスレオニン残基はタンパク質のＮ
末端に付加され得る（すなわち、タンパク質の配列に対して追加的なものである）。好ま
しくは、セリン残基又はスレオニン残基はタンパク質のＮ末端に天然に存在するアミノ酸
残基に置き換わり、すなわち置換変異の結果である。場合により、スレオニン残基又はセ
リン残基は化合物、例えば上記に記載される化合物に連結される。
【００３５】
一例において、本発明のタンパク質は、システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲ
ートした第１の化合物と、スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした第２の化
合物であって、第１の化合物と異なる第２の化合物とを含む。
【００３６】
本発明は、任意の抗原に特異的に結合することのできるタンパク質を企図する。本発明
の好ましいタンパク質は、ヒト上皮成長因子（Ｈｅｒ）２、腫瘍関連糖タンパク質Ｔａｇ
７２、ＭＵＣ１又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）からなる群から選択される抗原に特
異的に結合する。他のタンパク質は交差反応性のため、又はタンパク質が多重特異性であ
るため、抗原、例えば上記に挙げた抗原の複数に結合する。
【００３７】
本発明のタンパク質の例は、ＦＲ１内に位置する２つ以上を含むように修飾された、配
列番号５５、５９、６１、１０９、１１５又は１１７のいずれか１つに示される配列と８
０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％又は１００％同一
の配列を含む。修飾に好適な部位が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用
されると解釈されるべきである。例えば、タンパク質は、そのタンパク質がＦＲ１にシス
テイン残基を含むことを条件として、配列番号５７、６３、６５、７５、７７、７９、８
１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３又は１０
５、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１又は１３３のいずれか１
つに示される配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は
９８％又は９９％又は１００％同一の配列を含む。
【００３８】
上記に考察されるとおり、本発明者らはまた、Ｎ末端スレオニン残基又はセリン残基を
含むタンパク質も作製した。この部位はまた、ＦＲ１にシステイン残基が存在しない場合
であっても、化合物のコンジュゲーションに有用である。
【００３９】
従って、本発明はまた、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可
変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の少なくとも１つがＮ
末端スレオニン残基又はセリン残基を含むタンパク質も提供する。セリン残基又はスレオ
ニン残基は、タンパク質のＮ末端に付加され得る。好ましくは、セリン残基又はスレオニ
ン残基はタンパク質のＮ末端に天然に存在するアミノ酸残基に置き換わり、すなわち置換
変異の結果である。
【００４０】
好ましいタンパク質は、Ｎ末端スレオニン残基又はセリン残基を含む本発明の少なくと
も１つのタンパク質を含むＦｖを含み、ここでは少なくとも１つのＶＬが少なくとも１つ
のＶＨと結合して抗原結合部位を形成する。
【００４１】
一例において、抗原結合部位を形成するＶＬ及びＶＨは単一のポリペプチド鎖にある。
例えば、タンパク質は、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）及
び／又は（ｉｉ）の少なくとも１つ
である。
【００４２】
或いは、抗原結合部位を形成するＶＬ及びＶＨは異なるポリペプチド鎖にある。一例に
おいて、タンパク質の各ポリペプチド鎖がＶＬとＶＨとを含む。好ましくは、かかるタン
パク質は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；又は
（ｉｉｉ）テトラボディ
である。
【００４３】
別の例において、本発明のタンパク質は免疫グロブリンであり、好ましくは抗体である
。免疫グロブリンの例示的形態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用さ
れると解釈されるべきである。
【００４４】
一例において、タンパク質は、スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化
合物をさらに含む。例示的化合物が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用
されると解釈されるべきである。
【００４５】
一例において、タンパク質は、Ｎ末端スレオニン残基又はセリン残基を含むように修飾
された、配列番号５５、５９、６１、１０９、１１５又は１１７のいずれか１つに示され
る配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は
９９％又は１００％同一の配列を含む。例えば、タンパク質は、タンパク質がＮ末端スレ
オニン残基又はセリン残基を含むことを条件として、配列番号５７、６３、６５、７５、
７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、
１０３、１０５、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１又は１３３
のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又
は９７％又は９８％又は９９％又は１００％同一の配列を含む。
【００４６】
本発明はまた、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイ
ン残基及び／又はＮ末端スレオニン残基若しくはセリン残基を含む修飾された免疫グロブ
リン可変領域を含むタンパク質を本発明がさらに提供することもまた提供し、ここで未修
飾形態の可変領域は、システイン残基の少なくとも１つ（好ましくはシステイン残基の少
なくとも２つ又はその全て）及び／又はスレオニン残基若しくはセリン残基を含まない。
システイン残基及び／又はスレオニン残基若しくはセリン残基が位置するのに好適な部位
が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されるべきである。
【００４７】
一例において、本発明のタンパク質は、ヒトのもの、ヒト化されたもの、脱免疫化され
たもの、又はキメラのものである。
【００４８】
本発明はまた、本発明のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物も提供す
る。
【００４９】
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする単離核酸も包含する。例示的核酸とし
ては、コードされたタンパク質のＦＲ１における少なくとも２つのシステイン残基をコー
ドするコドンを含むように、及び／又はＮ末端セリン残基若しくはスレオニン残基を含む
ように改変された、配列番号５４、５８、６０、１０８、１１４又は１１６の任意の１つ
又は複数に示される配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７
％又は９８％又は９９％又は１００％同一の配列を有するものが挙げられる。一例におい
て、本発明の核酸は、配列番号５６、６２、６４、７４、７６、７８、８０、８２、８４
、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１１８、１２
０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２の任意の１つ又は複数に示される
配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９
９％又は１００％同一の配列を含み、但しその配列がＦＲ１における少なくとも２つのシ
ステイン残基及び／又はＮ末端セリン残基若しくはスレオニン残基を含むタンパク質をコ
ードすることを条件とする。当業者は、コドン使用の縮重に起因して、数多くのヌクレオ
チド配列が本発明のタンパク質をコードし得ることを認識するであろう。かかるヌクレオ
チド配列は全て本発明により包含される。例えば、コドン最適化された核酸を作製して、
特定の細胞型又は生物における発現を促進することができる。
【００５０】
本発明の核酸をプロモーターに作動可能に連結し、それにより発現コンストラクトを作
製することができる。好ましくはかかる発現コンストラクト又は核酸は、ベクター、好ま
しくは細胞において複製可能なベクター、例えばプラスミド又はファージミド又はコスミ
ド又は人工染色体に含まれる。
【００５１】
本発明はまた、本発明の外因性核酸又は発現コンストラクトを含む単離細胞であって、
好ましくは本発明のタンパク質を発現する細胞も提供する。例示的細胞としては、限定は
されないが、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。
【００５２】
本発明により提供される核酸及び／又は発現コンストラクト及び／又は細胞はまた、本
発明のタンパク質の作製方法の基盤も提供する。従って、本発明はまた、本発明のタンパ
ク質の作製方法も提供し、この方法は、本発明の発現コンストラクトを、コードされたタ
ンパク質が作製されるのに十分な条件下に維持するステップを含む。例えば、この方法は
、コードされたタンパク質が作製されるのに十分な（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｈｅ  ｅ
ｎｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｂｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ）条件
下で本発明の細胞を培養するステップを含む。一例において、この方法は、タンパク質を
単離するステップをさらに含む。この方法は、タンパク質を、例えば結合活性又はアフィ
ニティについて試験するステップをさらに含むことができる。この方法は、タンパク質を
医薬組成物に製剤化するステップをさらに含むことができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明のタンパク質を含むコンジュゲートの作製方法であって、
（ｉ）フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含
む本発明のタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）システイン残基の少なくとも１つに化合物をコンジュゲートするステップであっ
て、それによりコンジュゲートを作製するステップと、
を含む方法も提供する。
【００５４】
一例において、（ｉ）で得られるタンパク質のシステイン残基はジスルフィド結合によ
り連結され、及びこの方法は、化合物を１つ又は複数のシステイン残基に連結する前にジ
スルフィド結合を還元するか、又は他の方法で分解するステップをさらに含む。好ましく
は、ジスルフィド結合を還元するか、又は他の方法で分解するステップによりタンパク質
に遊離チオール基が生成され、及び化合物はチオール反応基を有する。チオール反応基を
有する化合物を反応させることにより、コンジュゲートが作製される。
【００５５】
一例において、化合物は、マレイミドを使用してタンパク質にコンジュゲートされる。
例えば、タンパク質を、マレイミド官能基を含む化合物と接触させることでコンジュゲー
ションが起こる。
【００５６】
本発明のさらなる例において、タンパク質は少なくとも１つのＮ末端セリン残基又はス
レオニン残基をさらに含み、及びこの方法は、化合物をセリン残基又はスレオニン残基に
コンジュゲートするステップをさらに含む。好ましくは、セリン残基又はスレオニン残基
にコンジュゲートされる化合物は、１つ又は複数のシステイン残基にコンジュゲートされ
る化合物とは異なる。
【００５７】
本発明は、本発明のタンパク質を含むコンジュゲートの代替的な作製方法であって、
（ｉ）Ｎ末端スレオニン残基又はセリン残基を含む本発明のタンパク質を得るステップと
、
（ｉｉ）タンパク質のＮ末端にある少なくとも１つのセリン残基又はスレオニン残基に化
合物をコンジュゲートするステップであって、それによりコンジュゲートを作製するステ
ップと、
を含む方法を提供する。
【００５８】
場合により、本発明のコンジュゲート作製方法は、コンジュゲートを単離するステップ
及び／又はコンジュゲートを医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む。
【００５９】
上記に基づけば当業者には、本発明者らが、罹患細胞、組織又は臓器（例えば、癌）に
対する毒性化合物又は放射性同位体の送達及び／又は生体内イメージング及び／又はタン
パク質の安定性向上を含めた、様々な用途に有用な試薬を作製したことは明らかであろう
。
【００６０】
従って、本発明はまた、医薬における本発明のタンパク質又は組成物の使用も提供する
。例えば、本発明は、病態の治療用又は予防用薬剤の製造における本発明のタンパク質の
使用を提供する。本発明はまた、対象における病態の治療又は予防方法であって、本発明
のタンパク質又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法も提供
する。例示的病態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈さ
れるべきである。さらに本発明のタンパク質の例示的なコンジュゲート形態が本明細書に
記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されなければならない。
【００６１】
本発明は、細胞への化合物の送達方法であって、化合物にコンジュゲートされた本発明
のタンパク質又はそれを含む組成物に細胞を接触させるステップを含む方法をさらに提供
する。一例において、細胞は、タンパク質又は組成物を投与することによって対象に接触
させられる。
【００６２】
本発明はまた、対象における抗原を位置特定又は検出する方法などの、イメージング方
法であって、
（ｉ）タンパク質が抗原に結合するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、
対象に本発明のタンパク質を投与するステップであって、タンパク質が検出可能標識にコ
ンジュゲートされる、ステップと、
（ｉｉ）検出可能標識をインビボで位置特定又は検出するステップと、
を含む方法も提供する。
【００６３】
当業者は、前述の方法が、抗原を発現する細胞、細胞群、例えば腫瘍、組織及び臓器な
ど、又はその一部を位置特定又は検出するのに有用であることを認識するであろう。例示
的抗原が本明細書全体を通じて記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈さ
れるべきである。
【００６４】
本発明はまた、対象における病態の診断又は予後判定方法であって、タンパク質が抗原
に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、対象か
らの試料を本発明のタンパク質又は組成物と接触させるステップと、複合体を検出するス
テップであって、複合体の検出が病態の診断又は予後判定をもたらすステップとを含む方
法も提供する。好ましくは、タンパク質は検出可能標識にコンジュゲートされ、標識の検
出が複合体の指標となる。
【００６５】
一例において、この方法は複合体のレベルを測定するステップであって、対照試料と比
較した前記複合体のレベルの亢進又は低下が病態の診断又は予後判定をもたらすステップ
を含む。
【００６６】
本発明は、本発明のタンパク質を複数含むライブラリをさらに提供する。一例において
、タンパク質は粒子（例えば、ファージ又はリボソーム）又は細胞の表面に提示される。
明らかに、本発明はまた、本発明のタンパク質を複数含む前記ライブラリをコードする核
酸のライブラリも提供する。
【００６７】
本発明は、本発明のタンパク質の単離方法であって、タンパク質が抗原に結合するのに
十分な（又は結合するような）時間にわたり、且つそのような条件下で、本発明のライブ
ラリを抗原と接触させるステップと、タンパク質を単離するステップとを含む方法をさら
に提供する。
【００６８】
本発明は、本発明のタンパク質を複数含むライブラリの作製方法であって、
（ｉ）免疫グロブリン可変領域を含む複数のタンパク質をコードする核酸を得る、又は作
製するステップであって、可変領域が、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少な
くとも２つのシステイン残基及び／又はＮ末端スレオニン残基若しくはセリン残基を含む
、ステップと、
（ｉｉ）以下の作動可能に連結された核酸：
ａ）プロモーター；
ｂ）（ｉ）で得られた、又は作製された核酸；及び
ｃ）可変領域を含むタンパク質の細胞又は粒子における／その上への提示を促進するポ
リペプチドをコードする核酸
を含む発現コンストラクトのライブラリを作製するステップと、
（ｉｉｉ）発現コンストラクトによりコードされたタンパク質を、それらが細胞又は粒子
において／その上に提示されるように発現させるステップと、
を含む方法をさらに提供する。
【００６９】
システイン残基及び／又はスレオニン残基若しくはセリン残基が位置するのに好適な部
位が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されるべきである
。
【００７０】
一例において、タンパク質のＣＤＲ中のアミノ酸はランダム若しくはセミランダムであ
るか、又はヒト抗体に由来する。
【００７１】
一例において、この方法は、タンパク質をコードする核酸を単離するステップをさらに
含む。かかる核酸は発現コンストラクトに導入することができる。場合により、タンパク
質を発現させてもよい。
【００７２】
本発明者らはまた、腫瘍抗原ＴＡＧ７２との特異的な結合能を有する免疫グロブリン可
変領域を含むタンパク質も作製した。本発明者らは、このタンパク質が生体内で安定であ
ることを見出した。
【００７３】
従って、本発明は、ＶＨとＶＬとの互いの会合を可能にするには不十分な数のアミノ酸
を含む領域によって連結された免疫グロブリンＶＨと免疫グロブリンＶＬとを各々が含む
複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
（ｉ）ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号１１１に示される配列又はそれと少な
くとも約６０％同一の配列を含むＶＨを含み；及び
（ｉｉ）少なくとも別のポリペプチドが、配列番号１１３に示される配列又はそれと少な
くとも約６０％同一の配列を含むＶＬを含み、
（ｉ）におけるポリペプチドのＶＨと（ｉｉ）におけるポリペプチドのＶＬとが会合し
て、腫瘍抗原ＴＡＧ７２との特異的な結合能を有するＦｖを形成するタンパク質をさらに
提供する。本明細書の記載では、このタンパク質は抗ＴＡＧ７２タンパク質と称される。
しかしながら、文脈上特に指示されない限り、「本発明のタンパク質」を参照する本明細
書の任意の記載が、このタンパク質に等しく適用される。
【００７４】
一例において、抗ＴＡＧ７２タンパク質は、６個以下のアミノ酸、例えば５個以下のア
ミノ酸、４個以下のアミノ酸など、例えば、３個以下のアミノ酸、２個以下のアミノ酸な
ど、例えば、１個又は０個のアミノ酸を有するＶＨとＶＬとを連結する領域を含む。
【００７５】
一例において、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質は、Ｋａｂａｔ付番方式により付番し
て５位にスレオニン及び／又はＫａｂａｔ付番方式による５３位にスレオニン及び／又は
Ｋａｂａｔ付番方式により付番して７９位にグルタミン酸を含むＶＬを含む。
【００７６】
代替的又は追加的な実施形態において、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質は、Ｋａｂａ
ｔ付番方式により付番して８０位にロイシンを含むＶＨを含む。
【００７７】
一例において、抗ＴＡＧ７２タンパク質は、
（ｉ）配列番号１１１に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含むＶ
Ｈと、
（ｉｉ）配列番号１１３に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含む
ＶＬと、
を各々が含む少なくとも２つのポリペプチドであって、
１つのポリペプチドのＶＨと別のポリペプチドのＶＬとが会合して、ＴＡＧ７２との特
異的な結合能を有するＦｖを形成するポリペプチドを含む。
【００７８】
例示的な抗ＴＡＧ７２タンパク質は、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディで
ある。
【００７９】
本発明の一例において、
（ｉ）ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号１１１に示される配列を含むＶＨの相
補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨを含み；及び
（ｉｉ）少なくとも別のポリペプチドは、配列番号１１３に示される配列を含むＶＬのＣ
ＤＲを含むＶＬを含む。
【００８０】
例示的ＣＤＲは以下のとおりである：
（ｉ）配列番号１１１のアミノ酸３１〜３５に示される配列を含むＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１１のアミノ酸５０〜６６に示される配列を含むＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１１１のアミノ酸９９〜１０４に示される配列を含むＣＤＲＨ３；
（ｉｖ）配列番号１１３のアミノ酸２４〜４０に示される配列を含むＣＤＲＬ１；
（ｖ）配列番号１１３のアミノ酸５６〜６２に示される配列を含むＣＤＲＬ２；及び
（ｖｉ）配列番号１１３のアミノ酸９５〜１０３に示される配列を含むＣＤＲＬ３。
【００８１】
一例において、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質は、
（ｉ）配列番号１１１に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むＶＨと
、
（ｉｉ）配列番号１１３に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むＶＬ
と、
を双方が含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。
【００８２】
本発明の例は、配列番号５５、１１５又は１１７に示される配列を各々が含む少なくと
も２つのポリペプチドを含む抗ＴＡＧ７２タンパク質を提供する。
【００８３】
一例において、抗ＴＡＧ７２タンパク質におけるポリペプチドの少なくとも１つは、以
上に記載されるとおりのフレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシ
ステイン残基を含む。例示的配列は上記に示される。例えば、配列は、配列番号５７、６
３、７５、７７、９９、１０３、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１
３１又は１３３の任意の１つ又は複数に示される配列と少なくとも約８０％又は９０％又
は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％又は１００％同一であり、且つシス
テイン残基を含む。好ましくは、配列は、配列番号５７に示される配列と少なくとも約８
０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％又は１００％同一
であり、且つシステイン残基を含む。
【００８４】
一例において、タンパク質は単一のポリペプチドを含み、且つ配列番号１０１に示され
る配列と少なくとも約８０％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は
９９％又は１００％同一の配列を含む。
【００８５】
一例において、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質は、それにコンジュゲートした化合物
を含む。例えば、化合物は、タンパク質におけるポリペプチドの少なくとも１つのシステ
イン残基又はセリン残基又はリジン残基にコンジュゲートされる。
【００８６】
一例において、抗ＴＡＧ７２タンパク質におけるポリペプチドの少なくとも１つは、Ｆ
Ｒ１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含み、システイン残基の少なくとも
２つが化合物にコンジュゲートされない場合に、システイン残基及び／又はＮ末端セリン
残基及び／又はスレオニン残基の間にジスルフィド結合が形成可能であり、及び化合物は
システイン残基の少なくとも１つ及び／又はセリン残基にコンジュゲートされる。例えば
、ポリペプチドはシステイン残基とＮ末端セリン残基及び／又はスレオニン残基とを含み
、及び化合物はシステイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートされ、及び異なる化合
物がセリン残基にコンジュゲートされる。
【００８７】
例示的化合物は、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、
ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれら
の混合物からなる群から選択される。
【００８８】
本発明者らは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を本発明のタンパク質にコンジュゲ
ートすることにより、その安定性及び腫瘍取り込みが実質的に増加することを見出した。
本発明者らは、単分散ＰＥＧ及び／又は低分子量を有するＰＥＧが、より高分子量のＰＥ
Ｇと実質的に同程度まで安定性及び／又は腫瘍取り込みを増加させることを見出した。概
して大きい分子は小さい分子と比べて対象からのクリアランスが遅いため、これは直感に
反するように思われる。概して大きいＰＥＧほど様々な分子量の分子の混合物を含むため
、より小さい、及び／又は単分散のＰＥＧの使用は、それが分子レベルで同様のタンパク
質コンジュゲートの作製を促進する限りは、利点を提供する。かかるコンジュゲートは生
体内用途に望ましい。
【００８９】
従って、一例において、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質はポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）にコンジュゲートされる。例えば、ＰＥＧは単分散ＰＥＧである。
【００９０】
一例において、ＰＥＧは約４０００Ｄａ以下の分子量、例えば、約２０００Ｄａ以下の
分子量、約１，５００Ｄａ以下の分子量などを有する。一例において、ＰＥＧは、１，０
００Ｄａ以下、９００Ｄａ以下など、例えば、８００Ｄａ以下、６００Ｄａ以下などの分
子量を有する。一例において、ＰＥＧは約５５０Ｄａ〜約１，０００Ｄａの分子量を有す
る。
【００９１】
別の例において、ＰＥＧは約７０個又は７５個又は７７個以下のエチレングリコール単
位を有する。例えば、ＰＥＧは約５０個以下のエチレングリコール単位を有する。好まし
くは、ＰＥＧは４８個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約４０
個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約３０個以下のエチレング
リコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約２７個以下のエチレングリコール単位を有す
る。例えば、ＰＥＧは約２４個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧ
は約１５個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、ＰＥＧは約１２個以下のエ
チレングリコール単位を有する。好ましくは、ＰＥＧは約１２〜２７個のエチレングリコ
ール単位を含む。
【００９２】
一例において、ＰＥＧはキレート剤などのさらなる化合物、例えば、１，４，７，１０
−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）などの大環状キレ
ート剤にコンジュゲートされる。
【００９３】
本発明はまた、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質及び薬学的に許容可能な担体も提供す
る。
【００９４】
本発明は、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質におけるポリペプチドの１つ又は複数をコ
ードする単離核酸をさらに提供する。
【００９５】
本発明は、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質又はそれに由来するポリペプチドをコード
する核酸を含む発現コンストラクトをさらに提供する。
【００９６】
本発明は、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質を発現する単離細胞をさらに提供する。例
えば、細胞は、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質又はそれに由来するポリペプチドをコー
ドする核酸及び／又はそれを含む発現コンストラクトを含む。
【００９７】
本発明は、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質の作製方法であって、それをコードする発
現コンストラクトを、コードされたポリペプチド及びタンパク質が作製されるように維持
するステップを含む方法をさらに提供する。
【００９８】
一例において、この方法は、コードされたタンパク質が作製されるのに十分な（ｓｕｆ
ｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｈｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｂ
ｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ）条件下で細胞を培養するステップを含む。
【００９９】
一例において、この方法は、タンパク質を単離するステップをさらに含む。
【０１００】
本発明は、システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした化合物を含む本発明
の抗ＴＡＧ７２タンパク質の作製方法であって、
（ｉ）ＦＲ１にシステイン残基を含む本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質を得るステップと
、
（ｉｉ）１つ又は複数のポリペプチドのＦＲ１におけるシステイン残基の少なくとも１つ
に化合物をコンジュゲートするステップであって、それによりタンパク質を作製するステ
ップと、
を含む方法をさらに提供する。
【０１０１】
一例において、（ｉ）で得られるタンパク質における１つ又は複数のポリペプチド中の
システイン残基はジスルフィド結合によって連結され、及びこの方法は、化合物を１つ又
は複数のシステイン残基にコンジュゲートする前に、ジスルフィド結合を還元するか、又
は他の方法で分解するステップをさらに含む。例えば、ジスルフィド結合を還元するか、
又は他の方法で分解するステップによりタンパク質に遊離チオール基が生成され、及び化
合物は、化合物のタンパク質とのコンジュゲーションを可能にするチオール反応基を有す
る。
【０１０２】
一例において、タンパク質における少なくとも１つのポリペプチドは少なくとも１つの
Ｎ末端セリン残基又はスレオニン残基を含み、及びこの方法は、化合物をセリン残基又は
スレオニン残基にコンジュゲートするステップをさらに含む。
【０１０３】
別の例において、本発明は、Ｎ末端セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートし
た化合物を含む本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質の作製方法であって、
（ｉ）Ｎ末端セリン残基及び／又はスレオニン残基を含む本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク
質を得るステップと、
（ｉｉ）ポリペプチドのＮ末端にある少なくとも１つのセリン残基又はスレオニン残基に
化合物をコンジュゲートするステップであって、それによりタンパク質を作製するステッ
プと、
を含む方法を提供する。
【０１０４】
一例において、化合物とコンジュゲートしたタンパク質の作製方法は、タンパク質をＰ
ＥＧにコンジュゲートするステップを含む。
【０１０５】
本発明は、対象において癌を位置特定及び／又は検出及び／又は診断及び／又は予後判
定する方法であって、
（ｉ）本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質又はそれを含む組成物を、それが、存在する場合
には腫瘍抗原ＴＡＧ７２に結合するように、対象に投与するステップと、
（ｉｉ）ＴＡＧ７２に結合したタンパク質をインビボで検出するステップであって、結合
したタンパク質の検出により癌が位置特定及び／又は検出及び／又は診断及び／又は予後
判定される、ステップと、
を含む方法をさらに提供する。
【０１０６】
本発明は、対象における癌の診断又は予後判定方法であって、
（ｉ）対象からの試料を本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質又はそれを含む組成物と、それ
が、存在する場合には腫瘍抗原ＴＡＧ７２に結合するように接触させるステップと、
（ｉｉ）ＴＡＧ７２に結合したタンパク質を検出するステップであって、結合したタンパ
ク質の検出が癌の診断又は予後判定をもたらす、ステップと、
を含む方法をさらに提供する。
【０１０７】
先述の２つの例のいずれかの一例において、タンパク質は検出可能標識にコンジュゲー
トされ、及びこの方法は、ＴＡＧ７２に結合したタンパク質を検出するため標識を検出す
るステップを含む。
【０１０８】
本発明は、癌の治療方法であって、本発明の抗ＴＡＧ７２タンパク質又はそれを含む組
成物を、それが癌細胞上の腫瘍抗原ＴＡＧ７２に結合して癌を治療するように投与するス
テップを含む方法をさらに提供する。
【０１０９】
一例において、タンパク質又はそれにコンジュゲートした化合物は癌細胞の死滅を誘導
する。
【０１１０】
一例において、タンパク質は、癌細胞の死滅を誘導する化合物にコンジュゲートされる
。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】インシリコでのホモロジーモデリングによる未変異ＡＶＰ０４−０７ダイアボディ（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）を示す図表現である。フレームワーク残基が灰色で示され、ＣＤＲ残基が黒色で示され、変異のため特定されるジスルフィド挿入残基候補が白色で示される。矢印はＦｖの１つにおける残基を、Ｋａｂａｔ付番を伴い特定する。
【図２】インシリコでのホモロジーモデリングによる未変異ＡＶＰ０７−１７ダイアボディ（配列番号５９に示される配列を含むポリペプチドを含む）を示す図表現である。フレームワーク残基が灰色で示され、ＣＤＲ残基が黒色で示され、変異のため特定されるジスルフィド挿入残基候補が白色で示される。矢印はＦｖの１つにおける残基を、Ｋａｂａｔ付番を伴い特定する。
【図３】インシリコでのホモロジーモデリングによる未変異ＡＶＰ０２−６０ダイアボディ（配列番号６１に示される配列を含むポリペプチドを含む）を示す図表現である。フレームワーク残基が灰色で示され、ＣＤＲ残基が黒色で示され、変異のため特定されるジスルフィド挿入残基候補が白色で示される。矢印はＦｖの１つにおける残基を、Ｋａｂａｔ付番を伴い特定する。
【図４Ａ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０４−０７ダイアボディ（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。重鎖が黒色で示され、軽鎖が灰色で示され、インシリコで変異させたジスルフィド挿入変異側鎖が球棒で示される。左側：未変異ダイアボディモデル及び２つのジスルフィド挿入変異ダイアボディモデルからアラインメントしたＦｖ。中央：左側に同じ、但しＦＲ１のみを示す。右側  中央に同じ、但し横軸を中心に１００°回転させている。
【図４Ｂ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０４−０７ダイアボディ（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。示されるとおりの様々な変異を含むＦＲ１のモデルを表す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示す。未変異ＦＲ１  Ｈ／未変異ＦＲ１  Ｌ＝ＡＶＰ０４−０７、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０４−８４、Ｌ８−Ｌ１１＝ＡＶＰ０４−５０、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０４−８５、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０４−７８。
【図５】ＡＶＰ０４−ｘｘ  ＡｖｉｂｏｄｙのＣＤＲ基及びジスルフィドについての残基当たり平均溶媒露出表面積（ＡＳＡ）のグラフであり、ＶＨから得られたカラムが灰色で示され、ＶＬから得られたカラムが白色で示される。ＣＤＲ基における残基、保存されたシート間ジスルフィド残基（Ｈ２２−Ｈ９２及びＬ２３−Ｌ８８）及びジスルフィド挿入変異残基について残基当たり平均ＡＳＡとして示され、誤差バーは標準偏差を示す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示し、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０４−８４、Ｌ８−Ｌ１１＝ＡＶＰ０４−５０、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０４−８５、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０４−７８である。
【図６Ａ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０２−６０ダイアボディ（配列番号６１に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。重鎖が黒色で示され、軽鎖が灰色で示され、インシリコで変異させたジスルフィド挿入変異側鎖が球棒で示される。左側：未変異ダイアボディモデル及び２つのジスルフィド挿入変異ダイアボディモデルからアラインメントしたＦｖ。中央：左側に同じ、但しＦＲ１のみを示す。右側  中央に同じ、但し横軸を中心に１００°回転させている。
【図６Ｂ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０２−６０ダイアボディ（配列番号６１に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。示されるとおりの様々な変異を含むＦＲ１のモデルを表す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示す。未変異ＦＲ１  Ｈ／未変異ＦＲ１  Ｌ＝ＡＶＰ０２−６０、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０２−１０４、Ｌ８−Ｌ１１＝ＡＶＰ０２−１０１、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０２−１０５、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０２−１０２。
【図７Ａ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０７−１７ダイアボディ（配列番号５９に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。重鎖が黒色で示され、軽鎖が灰色で示され、インシリコで変異させたジスルフィド挿入変異側鎖が球棒で示される。左側：未変異ダイアボディモデル及び２つのジスルフィド挿入変異ダイアボディモデルからアラインメントしたＦｖ。中央：左側に同じ、但しＦＲ１のみを示す。右側  中央に同じ、但し横軸を中心に１００°回転させている。
【図７Ｂ】インシリコでのホモロジーモデリングによるＡＶＰ０７−１７ダイアボディ（配列番号５９に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＶＬ及びＶＨにおけるフレームワーク１内ジスルフィド挿入変異を示す図表現である。示されるとおりの様々な変異を含むＦＲ１のモデルを表す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示す。未変異ＦＲ１  Ｈ／未変異ＦＲ１  Ｌ＝ＡＶＰ０７−１７、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０７−９０、Ｌ７−Ｌ１１＝ＡＶＰ０７−８８、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０７−９１、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０７−８９。
【図８】ＡＶＰ０２−ｘｘ  ＡｖｉｂｏｄｙのＣＤＲ基及びジスルフィドについての残基当たり平均溶媒ＡＳＡのグラフであり、ＶＨから得られたカラムが灰色で示され、ＶＬから得られたカラムが白色で示される。ＣＤＲ基における残基、保存されたシート間ジスルフィド残基及びジスルフィド挿入変異残基についての残基当たり平均ＡＳＡとして示され、誤差バーは標準偏差を示す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示し、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０２−１０４、Ｌ８−Ｌ１１＝ＡＶＰ０２−１０１、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０２−１０５、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０２−１０２である。
【図９】ＡＶＰ０７−ｘｘ  ＡｖｉｂｏｄｙのＣＤＲ基及びジスルフィドについての残基当たり平均溶媒ＡＳＡのグラフであり、ＶＨから得られたカラムが灰色で示され、ＶＬから得られたカラムが白色で示される。ＣＤＲ基における残基、保存されたシート間ジスルフィド残基及びジスルフィド挿入変異残基についての残基当たり平均ＡＳＡとして示され、誤差バーは標準偏差を示す。Ｈ＝重鎖。Ｌ＝軽鎖。数字はシステイン残基（存在する場合）の位置を示し、Ｈ７−Ｈ１０＝ＡＶＰ０７−９０、Ｌ７−Ｌ１１＝ＡＶＰ０７−８８、Ｈ１３−Ｈ１６＝ＡＶＰ０７−９１、Ｌ１４−Ｌ１７＝ＡＶＰ０７−８９である。
【図１０Ａ】ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）Ｈｉｓ−Ｔａｇアフィニティークロマトグラフィー精製の２８０ｎｍクロマトグラフを示すグラフ表現である。矢印は対象となる溶出ピークを示す。点線は溶出緩衝液の割合を示す。
【図１０Ｂ】ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）の陽イオン精製の結果を示すグラフ表現である。矢印は対象となる溶出ピークを示す。点線は溶出緩衝液の割合を示す。
【図１０Ｃ】ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフ表現である。矢印は対象となる溶出ピークを示す。点線は対象となる画分の輪郭を示す。
【図１０Ｄ】ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）の精製後サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフ表現である。矢印は対象となる溶出ピークを示す。
【図１０Ｅ】精製後のＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）の純度を示す還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す写真表現である。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色済み分子量マーカー、レーン２：ＡＶＰ０４−５０タンパク質バンド。
【図１１Ａ】サイズ排除クロマトグラフィー後の本明細書に記載される精製Ａｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）のグラフ表現を含む。
【図１１Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィー後の本明細書に記載される精製Ａｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）のグラフ表現を含む。
【図１１Ｃ】サイズ排除クロマトグラフィー後の本明細書に記載される精製Ａｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）のグラフ表現を含む。
【図１２Ａ】本明細書に記載されるＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかでインキュベートしたＡｖｉｂｏｄｙの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１２Ｂ】本明細書に記載されるＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかでインキュベートしたＡｖｉｂｏｄｙの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１２Ｃ】本明細書に記載されるＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかでインキュベートしたＡｖｉｂｏｄｙの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１３Ａ】ｍａｌ−ＰＥＧ２４−ＭｅＯＨとのＡｖｉｂｏｄｙコンジュゲーションの結果を示す写真表現を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペグ化されていない対照（「ネイキッド」）Ａｖｉｂｏｄｙに対する分子量の増加を示す。レーン１及び１０：Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色済み分子量スタンダード、レーン２及び３：それぞれネイキッドＡＶＰ０７−７１及びＡＶＰ０７−７１−ＰＥＧ２４。レーン４及び５：それぞれネイキッドＡＶＰ０７−８８及びＡＶＰ０７−８８−ＰＥＧ２４。レーン６及び７：それぞれネイキッドＡＶＰ０２−１０１及びＡＶＰ０２−１０１−ＰＥＧ２４。レーン８及び９：それぞれネイキッドＡＶＰ０４−５０及びＡＶＰ０４−５０−ＰＥＧ２４。
【図１３Ｂ】ｍａｌ−ＰＥＧ２４−ＭｅＯＨとのＡｖｉｂｏｄｙコンジュゲーションの結果を示す写真表現を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペグ化されていない対照（「ネイキッド」）Ａｖｉｂｏｄｙに対する分子量の増加を示す。レーン１：Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色済み分子量スタンダード、レーン２及び３：それぞれネイキッドＡＶＰ０４−７０及びＡＶＰ０４−７０−ＰＥＧ２４。レーン４及び５：それぞれネイキッドＡＶＰ０４−８４及びＡＶＰ０４−８４−ＰＥＧ２４。
【図１３Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｍａｌ−ＰＥＧ２４−ＭｅＯＨとのＡｖｉｂｏｄｙコンジュゲーションの結果を示す写真表現を含む。レーン１：Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色済み分子量スタンダード、レーン２：ＡＶＰ０４−７４−ＰＥＧ２４コンジュゲート。レーン３：ＡＶＰ０４−７８−ＰＥＧ２４コンジュゲート。
【図１４Ａ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ  ＡＶＰ０７−７１（配列番号１０５）の原子質量単位（ＡＭＵ）のグラフ表現を含み、タンパク質＋コンジュゲーション後のＰＥＧ２４の２個の分子の追加分に比例する質量（３００７８．３６ａｍｕ）を示す。
【図１４Ｂ】抗ＴＡＧ７２  ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７）のＡＭＵのグラフ表現を含み、タンパク質＋コンジュゲーション後のＰＥＧ２４の２個の分子の追加分に比例する単量体鎖当たり質量（２８１６６．８４ａｍｕ）を示す。
【図１４Ｃ】抗ＨＥＲ２ダイアボディＡＶＰ０７−８８（配列番号８７）のＡＭＵのグラフ表現を含み、タンパク質＋コンジュゲーション後のＰＥＧ２４の２個の分子の追加分に比例する単量体鎖当たり質量（２９１９６．７２ａｍｕ）である。
【図１４Ｄ】抗ＭＵＣ１ダイアボディＡＶＰ０２−１０１（配列番号７９）のＡＭＵのグラフ表現を含み、単量体鎖当たりのコンジュゲートされるＰＥＧ２４の分子１個（２４７４９．０５ａｍｕ）を示す。
【図１５Ａ】本明細書に記載されるＰＥＧ化されたＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかにおけるＡｖｉｂｏｄｙ−ＰＥＧコンジュゲートの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１５Ｂ】本明細書に記載されるＰＥＧ化されたＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかにおけるＡｖｉｂｏｄｙ−ＰＥＧコンジュゲートの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１５Ｃ】本明細書に記載されるＰＥＧ化されたＡｖｉｂｏｄｙ（示されるとおり、命名は、本文全体を通じて、及び配列表において使用されるものと一致する）の免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。各グラフは、抗原の存在下（実線）又は不在下（点線）のいずれかにおけるＡｖｉｂｏｄｙ−ＰＥＧコンジュゲートの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１６】ユウロピウムコンジュゲート化ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７）Ａｖｉｂｏｄｙの免疫活性を測定するために使用されるカラムシフトアッセイのグラフ表現を含む。この表現は、抗原の存在下（点線）又は不在下（実線）のいずれかにおけるＡｖｉｂｏｄｙ−ユウロピウムコンジュゲートの２つを重ね合わせたサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを含む。
【図１７】抗原陽性細胞系（ＬＳ１７４Ｔ、実線）及び陰性細胞系（ＳＫ−ＯＶ−３、点線）に対する細胞結合アッセイにより測定するときのユウロピウムコンジュゲート化ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７）の免疫活性のグラフ表現を含む。
【図１８Ａ】確立されたＬＳ−１７４Ｔ異種移植マウスにおける１２５Ｉ及び１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−０７（配列番号５５に示される配列を含むポリペプチドを含む）の生体分布を示すグラフである。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図１８Ｂ】確立されたＬＳ−１７４Ｔ異種移植マウスにおける１２５Ｉ及び１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）の生体分布を示すグラフである。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図１９】確立されたＳＫＯＶ３異種移植マウスにおける１２５Ｉ標識したＡＶＰ０７−１７（配列番号５９に示される配列を含むポリペプチドを含む）及びＡＶＰ０７−６３（配列番号６５に示される配列を含むポリペプチドを含む）の生体分布を示すグラフである。濃い灰色のバー＝ＡＶＰ０７−６３、白抜きのバー＝ＡＶＰ０７−１７。
【図２０】確立されたＬＳ−１７４Ｔ異種移植マウスにおける、パネルＡ：ランダムな表面リジンにＰＥＧ３４００によりコンジュゲートされた１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−０７（配列番号５５に示される配列を含むポリペプチドを含む）、及びパネルＢ：操作的フレームワーク１内ジスルフィド変異にコンジュゲートされたサイズ単分散ＰＥＧ４８によりコンジュゲートされた１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）の生体分布を示すグラフである。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図２１Ａ】確立されたＬＳ−１７４Ｔ異種移植マウスにおける、ランダムな表面リジンにサイズ単分散ＰＥＧ２７によりコンジュゲートされた、６４Ｃｕ標識した非ペグ化ＡＶＰ０４−０７（配列番号５５に示される配列を含むポリペプチドを含む）ＡＶＰ０４−０７のＰＥＴ生体分布を示す画像表現である。上向きの矢印＝腫瘍の位置、下向きの矢印＝腎臓の位置。
【図２１Ｂ】確立されたＬＳ−１７４Ｔ異種移植マウスにおける、操作的フレームワーク１内ジスルフィド変異にコンジュゲートされたサイズ単分散ＰＥＧ４８によりコンジュゲートされたＡＶＰ０４−５０（配列番号５７に示される配列を含むポリペプチドを含む）のＰＥＴ生体分布を示す画像表現である。上向きの矢印＝腫瘍の位置、下向きの矢印＝腎臓の位置。
【図２２Ａ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１１１Ｉｎ標識したインタクトなＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図２２Ｂ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１２５Ｉ標識したインタクトなＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図２２Ｃ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおけるＰＥＧ３４００にコンジュゲートされた１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。矢先が開いた矢印＝腫瘍取り込み曲線、矢先が黒三角の矢印＝腎取り込み曲線、矢先が黒丸の矢印＝血中クリアランス曲線。
【図２３Ａ】１、インタクトＡＶＰ０４−０７ダイアボディ；２、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ２７コンジュゲート；３、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ１２コンジュゲート（２０：１比）；４、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ１２コンジュゲート（５０：１比）；５、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ３４００コンジュゲートの等電点分離の結果を示す写真表現である。
【図２３Ｂ】１、インタクトＡＶＰ０４−０７ダイアボディ；２、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ２７コンジュゲート；３、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ１２コンジュゲート（２０：１比）；４、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ１２コンジュゲート（５０：１比）；５、ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ３４００コンジュゲートのＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す写真表現である。
【図２４】１１１Ｉｎ放射標識インタクトＡＶＰ０４−０７ダイアボディ及びＰＥＧコンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフ表現である（放射活性は任意単位として示す）。ピーク（右から左に向かって）：符号１番：ＤＯＴＡインタクトダイアボディ、２番：ＤＯＴＡ−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓ−ＶＳ−ダイアボディコンジュゲート、３番：ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ−ＶＳ−ダイアボディコンジュゲート、４番：ＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＰＥＧ３４００−ダイアボディコンジュゲート。
【図２５】ＤＯＴＡ−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＶＳの合成スキームの図表現である。標準的な活性化化学（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）を用いてＦＭＯＣ−アミド−ＰＥＧ−酸をＷａｎｇ樹脂上でＳ−ｔ−ブチルシステインにコンジュゲートした。ＦＭＯＣをピペリジンで除去し、標準的な活性化化学（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）を用いてＤＯ３ＡｔＢｕＡｃにコンジュゲートした。生成物をＴＦＡによって樹脂から取り出し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＭＦ中の過剰ビニルスルホンと反応させて、逆相ＨＰＬＣにより再度精製した。
【図２６Ａ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１１１Ｉｎ標識したＰＥＧ２７コンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。
【図２６Ｂ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１２５Ｉ標識したＰＥＧ２７コンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。
【図２６Ｃ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１１１Ｉｎ標識したＰＥＧ１２コンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。
【図２６Ｄ】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおける１２５Ｉ標識したＰＥＧ１２コンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの生体分布を示すグラフ表現である。
【図２７Ａ】注入後１時間目、４時間目、２時間目及び４６時間目における６４Ｃｕ標識したインタクトＡＶＰ０４−０７ダイアボディを注入した単一のマウスについてのイメージングの経時的なＰＥＴ像を示す画像表現である。
【図２７Ｂ】６４Ｃｕ標識したＰＥＧ２７  ＡＶＰ０４−０７ダイアボディを注入した単一のマウスについてのイメージングの経時的なＰＥＴ像を示す画像表現である。
【図２７Ｃ】６４Ｃｕ標識したＰＥＧ１２  ＡＶＰ０４−０７ダイアボディを注入した単一のマウスについてのイメージングの経時的なＰＥＴ像を示す画像表現である。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
配列表の凡例
配列番号１−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号５−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号６−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号７−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号８−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号９−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１０−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１１−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１２−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１３−ヒト抗体重鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１４−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１５−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１６−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１７−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１８−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号１９−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２０−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２１−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２２−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２３−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２４−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２５−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２６−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２７−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２８−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号２９−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３０−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３１−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３２−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３３−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３４−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３５−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３６−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３６−ヒト抗体κ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３７−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３８−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号３９−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４０−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４１−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４２−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４３−ヒト抗体λ軽鎖のＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４４−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４５−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４６−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４７−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４８−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号４９−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号５０−ラクダ科動物免疫グロブリンのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号５１−アブラツノザメＩｇＮＡＲのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号５２−テンジクザメＩｇＮＡＲのＦＲ１のアミノ酸配列；
配列番号５３−リンカーのアミノ酸配列；
配列番号５４−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド配
列；
配列番号５５−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号５６−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−５０
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号５７−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−５０
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号５８−ＡＶＰ０７−１７抗Ｈｅｒ２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列
；
配列番号５９−ＡＶＰ０７−１７抗Ｈｅｒ２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号６０−ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド配列
；
配列番号６１−ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列
配列番号６２−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−８４
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号６３−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−８４
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号６４−ＦＲ１あるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去と、
Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−６３と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗Ｈｅｒ２ダ
イアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号６５−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−６３と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗Ｈｅｒ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号６６−ＡＶＰ０４−０７においてＮ末端Ｇｌｎ残基をＳｅｒ残基と置換するため
の変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号６７−ＡＶＰ０４−０７においてＮ末端Ｇｌｎ残基をＳｅｒ残基と置換するため
の変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号６８−ＡＶＰ０７−１７においてアラニン残基をシステインに置き換えるための
変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号６９−ＡＶＰ０７−１７においてアラニン残基をシステインに置き換えるための
変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号７０−ヒトＨｅｒ２のアミノ酸配列；
配列番号７１−ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列；
配列番号７２−ヒトＭＵＣ１のアイソフォームのアミノ酸配列；及び
配列番号７３−いくつかの型の癌で発現するヒトＭＵＣ１のアイソフォームのアミノ酸配
列。
配列番号７４−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−８５
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号７５−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−８５
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号７６−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７８
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号７７−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７８
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号７８−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
１と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号７９−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
１と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号８０−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
４と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号８１−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
４と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号８２−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
２と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号８３−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
２と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号８４−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
５と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号８５−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
５と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号８６−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−８８と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号８７−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−８８と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号８８−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−９０と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号８９−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−９０と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号９０−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−８９と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号９１−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−８９と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号９２−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−９１と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号９３−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−９１と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号９４−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
３と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号９５−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０２−１０
３と命名される修飾ＡＶＰ０２−６０抗ＭＵＣ１ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号９６−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−６８と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号９７−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除去
と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−６８と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ
２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号９８−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−５１
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号９９−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−５１
と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１００−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７
０と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド
配列；
配列番号１０１−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７
０と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２  ｓｃＦｖのアミノ酸配列；
配列番号１０２−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７
４と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２トリアボディをコードするヌクレオチ
ド配列；
配列番号１０３−ＦＲ１におけるシステイン残基とＮ末端セリンとを含むＡＶＰ０４−７
４と命名される修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２トリアボディのアミノ酸配列；
配列番号１０４−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除
去と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−７１と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥ
Ｒ２  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１０５−ＦＲ１におけるシステイン残基と、ＣＤＲ３Ｈ中のシステイン残基の除
去と、Ｎ末端セリンとを含むＡＶＰ０７−７１と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥ
Ｒ２  ｓｃＦｖのアミノ酸配列；
配列番号１０６−ＡＶＰ０４−０７におけるＶＬ鎖のＦＲ１領域のＫａｂａｔ位置Ｌ８及
びＬ１１にシステイン残基を導入するための変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号１０７−ＡＶＰ０４−０７におけるＶＬ鎖のＦＲ１領域のＫａｂａｔ位置Ｌ８及
びＬ１１にシステイン残基を導入するための変異原性プライマーのヌクレオチド配列；
配列番号１０８−ＣＤＲ３Ｈシステイン残基Ｃｙｓ１０４（Ｋａｂａｔ付番Ｈ１００）及
びＣｙｓ１０９（Ｈ１００Ｅ）をアラニンに置き換え、且つＮ末端セリンを含むＡＶＰ０
７−８６と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ２ダイアボディをコードするヌクレ
オチド配列；
配列番号１０９−ＣＤＲ３Ｈシステイン残基Ｃｙｓ１０４（Ｋａｂａｔ付番Ｈ１００）及
びＣｙｓ１０９（Ｈ１００Ｅ）をアラニンに置き換え、且つＮ末端セリンを含むＡＶＰ０
７−８６と命名される修飾ＡＶＰ０７−１７抗ＨＥＲ２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１１０−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのＶＨをコードするヌクレ
オチド配列；
配列番号１１１−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのＶＨのアミノ酸配列；
配列番号１１２−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのＶＬをコードするヌクレ
オチド配列；
配列番号１１３−ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのＶＬのアミノ酸配列；
配列番号１１４−リンカー配列を欠くＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディ（ＡＶ
Ｐ０４−６９と命名される）をコードするヌクレオチド配列；
配列番号１１５−リンカー配列を欠くＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディ（ＡＶ
Ｐ０４−６９と命名される）のアミノ酸配列；
配列番号１１６−リンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠く
ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディ（ＡＶＰ０４−０９と命名される）をコード
するヌクレオチド配列；
配列番号１１７−リンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠く
ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディ（ＡＶＰ０４−０９と命名される）のアミノ
酸配列；
配列番号１１８−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基を含むＡＶＰ０４−５０と命名される修
飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１１９−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基を含むＡＶＰ０４−５０と命名される修
飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１２０−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基を含み、且つリンカー配列を欠くＡＶＰ
０４−５０と命名される修飾ＡＶＰ０４−６９抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌ
クレオチド配列；
配列番号１２１−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基を含み、且つリンカー配列を欠くＡＶＰ
０４−５０と命名される修飾ＡＶＰ０４−６９抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列
；
配列番号１２２−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基を含み、且つリンカー配列及びＶＨ中の
リンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠くＡＶＰ０４−５０と命名される修飾ＡＶＰ０
４−０９抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１２３−ＦＲ１にシステイン残基を含み、且つリンカー配列及びＶＨ中のリンカ
ーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠くＡＶＰ０４−５０と命名される修飾ＡＶＰ０４−０
９抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１２４−ＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイ
アボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１２５−ＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０４−０７抗ＴＡＧ７２ダイ
アボディのアミノ酸配列；
配列番号１２６−リンカー配列を欠き、且つＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０
４−６９抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１２７−リンカー配列を欠き、且つＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０
４−６９抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１２８−リンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠き
、且つＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０４−０９抗ＴＡＧ７２ダイアボディを
コードするヌクレオチド配列；
配列番号１２９−リンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠き
、且つＶＨにＮ末端セリン残基を含む修飾ＡＶＰ０４−０９抗ＴＡＧ７２ダイアボディの
アミノ酸配列；
配列番号１３０−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基及びＶＨにＮ末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列を欠く修飾ＡＶＰ０４−５０抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌク
レオチド配列；
配列番号１３１−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基及びＶＨにＮ末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列を欠く修飾ＡＶＰ０４−５０抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１３２−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基及びＶＨにＮ末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠く修飾ＡＶＰ０４
−５０抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１３３−ＶＬのＦＲ１にシステイン残基及びＶＨにＮ末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列及びＶＨ中のリンカーに対してＮ末端側のアミノ酸を欠く修飾ＡＶＰ０４
−５０抗ＴＡＧ７２ダイアボディのアミノ酸配列；
配列番号１３４はリンカーのアミノ酸配列であり；及び
配列番号１３５はリンカーのアミノ酸配列である。
【０１１３】
概要
本明細書全体を通じて、特に具体的に明記しない限り、又は特に文脈上必要でない限り
、単一のステップ、組成物、一群のステップ又は一群の組成物に対する参照は、１つ及び
複数（すなわち１つ以上）のそれらのステップ、組成物、一群のステップ又は一群の組成
物を包含すると解釈されるべきである。
【０１１４】
当業者は、本明細書に記載される発明が、具体的に記載されるもの以外の変形例及び改
良例を受け入れる余地を有することを理解するであろう。本発明はかかる変形例及び改良
例を全て含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において参照され、
又は指示される全てのステップ、特徴、組成物及び化合物も、個別に、又はまとめて含み
、及び前記ステップ又は特徴のあらゆる組み合わせ又は任意の２つ以上も含む。
【０１１５】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態により範囲が限定されることはなく
、それらの実施形態は、あくまでも例示目的を意図しているに過ぎない。機能的に均等な
生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載されるとおり、明らかに本発明の範囲内に含
まれる。
【０１１６】
本明細書のいずれの実施形態も、特に具体的に明記されない限り、任意の他の実施形態
に準用されると解釈されなければならない。
【０１１７】
特に具体的に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は全て、当該技術
分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、生化学
及びホモロジーモデリング）の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する
と解釈されなければならない。
【０１１８】
特に指示されない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学
的技術は、当業者に周知の標準的手順である。かかる技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏ
ｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４年）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、
Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者）、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第１及び２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９１年）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者）、「ＤＮＡ  
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第１〜４巻、ＩＲＬ  
Ｐｒｅｓｓ（１９９５年及び１９９６年）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編者）、「
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、
Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉ
ｅｎｃｅ（１９８８年、現在までの改訂版を全て含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖ
ｉｄ  Ｌａｎｅ（編者）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕ
ａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８８
年）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編者）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの改訂
版を全て含む）などの資料において文献の各所に記載及び説明されている。
【０１１９】
本明細書における可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の記載及
び定義は、例えば、Ｋａｂａｔ（１９８７年及び／又は１９９１年）、Ｂｏｒｋら（１９
９４年）及び／又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７年及び１９８９年）又はＡｌ
−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）における論考によりさらに明確となり得る。
【０１２０】
用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」の
いずれも意味するものと理解されなければならず、及び双方の意味又は一方の意味の明示
的な支持を提供するものと解釈されなければならない。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、アミノ酸残基又はヌクレオチド残基の位置の定義との関連
における用語「〜の間」は、挙げられる２つの残基の間に位置する任意の残基及び挙げら
れる２つの残基を意味するものと解釈されなければならない。例えば、用語「残基８〜１
１の間」は、κ  ＶＬ又はＶＨとの関連においては残基８、９、１０及び１１を含むもの
と理解されなければならず、及び／又はλ  ＶＬとの関連における用語「残基８〜１２の
間」は、λ  ＶＬがＫａｂａｔ付番方式の残基１０を含まないため、残基８、９、１１及
び１２を意味するものと理解されなければならない。
【０１２２】
本明細書全体を通じて語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「〜を含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変
形は、記載される要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）若しくはステップ、又は一群の要素、
完全体若しくはステップが包含され、しかし任意の他の要素、完全体若しくはステップ、
又は一群の要素、完全体若しくはステップを除外するものではないことを含意するものと
理解され得る。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき用語「〜に由来する」は、特定の供給源から具体的な完全体
が、そのソースから、直接得る必要はないものの、得られ得ることを示すものと解釈され
なければならない。
【０１２４】
定義の抜粋
本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン」は、抗体又は任意の抗体関連タン
パク質を意味するものと解釈されなければならない。当業者は、抗体が、複数のポリペプ
チド鎖から構成される可変領域、例えば軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）
を含むタンパク質であると概して見なされることを認識するであろう。抗体はまた、概し
て、定常領域又は定常断片若しくは結晶性断片（Ｆｃ）として配列され得る定常ドメイン
も含む。抗体は、１個又は数個の密接に関連する抗原に特異的に結合することができる。
概して、抗体は、その基本単位として４本の鎖からなる構造を含む。完全長抗体は、共有
結合で連結された２本の重鎖（約５０〜７０ｋＤ）と２本の軽鎖（各約２３ｋＤ）とを含
む。軽鎖は、概して可変領域と定常ドメインとを含み、及び哺乳動物ではκ軽鎖又はλ軽
鎖のいずれかである。重鎖は、概して可変領域と、ヒンジ領域によって別の１つ又は複数
の定常ドメインに連結された１つ又は２つの定常ドメインとを含む。哺乳動物の重鎖は以
下の種類、すなわちα、δ、ε、γ、又はμのうちの一つである。各軽鎖はまた、重鎖の
一方に共有結合で連結されている。例えば、２本の重鎖及び重鎖と軽鎖とは、鎖間ジスル
フィド結合及び非共有結合性の相互作用により一体に保持される。鎖間ジスルフィド結合
の数は、抗体の種類によって異なり得る。各鎖は、Ｎ末端可変領域（ＶＨ又はＶＬ、各々
が約１１０アミノ酸長である）と、Ｃ末端における１つ又は複数の定常ドメインとを有す
る。軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ、約１１０アミノ酸長）は重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ
Ｈ、約３３０〜４４０アミノ酸長）と整列し、それにジスルフィド結合している。軽鎖可
変領域は重鎖の可変領域と整列する。抗体重鎖は２つ以上のさらなるＣＨドメイン（ＣＨ
２、ＣＨ３など）を含むことができ、定常ドメインＣＨ１とＣｍとの間に特定され得るヒ
ンジ領域を含むことができる。抗体は任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ
４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。好ましくは、抗体はネズミ科動
物（マウス又はラット）抗体又は霊長類（好ましくはヒト）抗体である。用語「抗体」は
また、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体も包含する。抗体に関連する
、ひいては用語「免疫グロブリン」に包含されるタンパク質には、ドメイン抗体、ラクダ
科動物抗体及び軟骨魚類由来の抗体（すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮ
ＡＲ））が含まれる。概して、ラクダ科動物抗体及びＩｇＮＡＲは、ＶＨを含むがＶＬを
欠き、重鎖免疫グロブリンと称されることが多い。本明細書で使用されるとき、用語「免
疫グロブリン」には、例えば可変領域を含む抗原結合部位を理由として、Ｔ細胞受容体及
び抗原との結合能を有しないタンパク質を含む他の免疫グロブリン様ドメインは包含され
ない。さらに、用語「免疫グロブリン」には、ＦＲ１を含まない免疫グロブリンドメイン
を含むタンパク質は、かかるタンパク質によっては本発明を実施できないため、包含され
ない。
【０１２５】
本明細書で使用されるとき、「可変領域」は、本明細書に定義されるとおりの抗体又は
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のなかで、ＣＤＲ、すなわちＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３、並びにＦＲのアミノ酸配列を含む部分を指す。ＩｇＮＡＲの場合、用語「可変領
域」にはＣＤＲ２の存在は必要でない。ＶＨは重鎖の可変領域を指す。ＶＬは軽鎖の可変
領域を指す。本発明で用いられる方法によれば、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ
酸位置はＫａｂａｔ（１９８７年及び１９９１年）に従い定義される。当業者は、本発明
の実施において他の付番方式、例えばＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７年及び／又
は１９８９年）及び／又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）の超可変ループ付番
方式を使用することが容易に可能であろう。
【０１２６】
本明細書で使用されるとき、用語「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」は、１つ又は複数の抗
原との結合能、好ましくは１つ又は複数の抗原との特異的結合能を有し、且つ少なくとも
約３０アミノ酸を含むＦＲ１を少なくとも含むタンパク質を意味するものと解釈されなけ
ればならない。重鎖の例示的ＦＲ１の配列を本明細書に提供する（例えば、配列番号１〜
１３を参照）。好ましくは、重鎖は３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ
３及び場合によりＦＲ４）を、３つのＣＤＲと共に含む。好ましくは、重鎖は以下のとお
り位置するＦＲ及びＣＤＲを含む：Ｋａｂａｔ付番方式により付番して、残基１〜２５又
は１〜３０（ＦＲ１）、３１〜２５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（
ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）及び１０３〜１１３（Ｆ
Ｒ４）。一例において、重鎖は、前記重鎖及び複数の（好ましくは３つ又は４つの）定常
ドメインを含むか、又は定常断片（Ｆｃ）に連結された免疫グロブリンに由来する。
【０１２７】
本明細書で使用されるとき、用語「軽鎖可変領域」又は「ＶＬ」は、１つ又は複数の抗
原との結合能、好ましくは１つ又は複数の抗原との特異的結合能を有し、且つ約２３アミ
ノ酸を含むＦＲ１を少なくとも含むタンパク質を意味するものと解釈されなければならな
い。軽鎖の例示的ＦＲ１の配列を本明細書に提供する（例えば、配列番号１４〜４３を参
照）。好ましくは、軽鎖は３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び場
合によりＦＲ４）を、３つのＣＤＲと共に含む。好ましくは、軽鎖は以下のとおり位置す
るＦＲ及びＣＤＲを含む：Ｋａｂａｔ付番方式により付番して、残基１〜２３（ＦＲｌ）
、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８
８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）及び９８〜１０７（ＦＲ４）。一例において、軽
鎖は、１つの定常ドメインに連結された、及び／又は定常断片（Ｆｃ）に連結されない前
記軽鎖を含む免疫グロブリンに由来する。
【０１２８】
本発明のいくつかの例において、用語「フレームワーク領域」は、ＣＤＲ残基以外の可
変領域残基を意味するものと理解される。天然に存在する免疫グロブリン（例えば、抗体
）の各可変領域は、典型的には、ＦＲｌ、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として特定される４
つのＦＲを有する。ＣＤＲをＫａｂａｔにより定義する場合、例示的軽鎖ＦＲ（ＬＣＦＲ
）残基はおよそ残基１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（
ＬＣＦＲ３）、及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置する。λＬＣＦＲ１は、κＬＣＦ
Ｒ１には含まれる残基１０を含まないことに留意されたい。例示的重鎖ＦＲ（ＨＣＦＲ）
残基はおよそ残基１〜３０（ＨＣＦＲｌ）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（Ｈ
ＣＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。
【０１２９】
本発明の全ての免疫グロブリン可変領域について、「フレームワーク領域１」（ＦＲ１
）は、天然Ｎ末端残基と相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の始点との間の残基として定義さ
れる。これらの残基は、少なくとも２つの命名法、１）Ｋａｂａｔ（１９８７年及び／又
は２００１年）及び２）Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７年、１９８９年及びＡｌ
−Ｌａｚｉｋａｎｉら１９９７年）により付番されている。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ
付番方式は、十分に確立されたＫａｂａｔ方式をベースとして、免疫グロブリン可変領域
における軽鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ１の配列長のばらつきについて、三次元構造におけ
るそれらの実際の位置により良く適合するように付番し直すことを試みたものである。Ｃ
ｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋにより採用されたＣＤＲに特化した付番は、その後１９８９年
に修正されたが、次に１９９７年に元に戻された。これらの付番方式の間には、ＣＤＲル
ープ内に存在する残基を取り扱う際に僅かな違いがある。
【０１３０】
当業者は理解するであろうとおり、フレームワーク領域１内に、ひいてはＣＤＲ１に先
行して、単一の高度に保存されたシステイン残基（Ｃｙｓ）が概して存在する。κ及びλ
可変軽鎖の双方の中に、この保存されたシステインは不変的にＫａｂａｔ２３位にあり、
ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間のフレームワーク領域３として定義される領域内に不変的にＫ
ａｂａｔ８８位にある別の高度に保存されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成す
る。しかしながら本発明は、ＦＲ１の他のアミノ酸に対する保存システインの位置を変化
させ得るインデル、例えば１個、２個又は３個のアミノ酸の、概して人工的なインデルを
企図する。
【０１３１】
高度に保存されたシステインの対形成は可変重鎖では少し異なり、不変のＫａｂａｔ２
２位（ＦＲ１内）及び９２位（ＦＲ３内）の保存されたシステイン間に起こる。しかしな
がら、この対形成は全ての免疫グロブリンでほぼ完全に保存されており、このジスルフィ
ド結合がおそらくＩｇループ多様化の開始時に既に存在したこと、及び選択圧下に維持さ
れたことが示唆される。ジスルフィド結合のほぼ完全な保存は、それがＩｇループの安定
性に大きく寄与することをさらに示唆する。
【０１３２】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；すなわち、ＣＤ
Ｒｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３又は超可変領域）は、その存在が抗原結合に必要な、免疫
グロブリン可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域は典型的には、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ
２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（
１９８７年及び／又は１９９１年）により定義されるとおりの「相補性決定領域」のアミ
ノ酸残基を含み得る。例えば、重鎖可変領域では、ＣＤＲＨ１は残基３１〜３５の間にあ
り、ＣＤＲＨ２は残基５０〜６５の間にあり、及びＣＤＲＨ３は残基９５〜１０２の間に
ある。軽鎖では、ＣＤＲＬ１は残基２４〜３４の間にあり、ＣＤＲＬ２は残基５０〜５６
の間にあり、及びＣＤＲＬ３は残基８９〜９７の間にある。これらのＣＤＲはまた、例え
ばＫａｂａｔ（１９８７年及び／又は１９９１年）に記載されるとおりの、多数の挿入も
含み得る。
【０１３３】
用語「定常領域」（同義語ＣＲ又は結晶性断片又はＦｃ）は、本明細書で使用されると
き、少なくとも１つの定常ドメインを含む免疫グロブリンの一部分であって、概して（必
須ではないが）グリコシル化され、且つ１つ又は複数のＦ受容体及び／又は補体カスケー
ドの成分に結合する（例えば、エフェクター機能をもたらす）部分を指す。重鎖定常領域
は、５種のアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかから選択され得る。さらに
、様々なサブクラスの重鎖（重鎖のＩｇＧサブクラスなど）が、種々のエフェクター機能
に関与し、従って所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を
有するタンパク質を作製することができる。好ましい重鎖定常領域は、γ１（ＩｇＧ１）
、γ２（ＩｇＧ２）及びγ３（ＩｇＧ３）である。
【０１３４】
「定常ドメイン」は、免疫グロブリンにおけるドメインであって、その配列が同種の免
疫グロブリン／抗体、例えばＩｇＧ又はＩｇＭ又はＩｇＥにおいて極めて類似しているド
メインである。免疫グロブリンの定常領域は、概して複数の定常ドメインを含み、例えば
、γ、α及びδ重鎖の定常領域は３つの定常ドメインを含み、γ、α及びδ重鎖のＦｃは
２つの定常ドメインを含む。μ及びε重鎖の定常領域は４つの定常ドメインを含み、Ｆｃ
領域は２つの定常ドメインを含む。
【０１３５】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドから構成されるか、
又は単一のポリペプチドから構成されるかに関わらず、ＶＬとＶＨとが会合することによ
り、抗原結合部位を有する、すなわち抗原との特異的な結合能を有する複合体を形成する
任意のタンパク質を意味するものと解釈されなければならない。抗原結合部位を形成する
ＶＨ及びＶＬは単一のポリペプチド鎖にあっても、又は異なるポリペプチド鎖にあっても
よい。さらに本発明のＦｖ（並びに本発明の任意のタンパク質）は、同じ抗原を結合して
も、又はしなくてもよい複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、免疫グロブリンに
直接由来する断片も、並びに組換え手段を用いて作製されたかかる断片に対応するタンパ
ク質も包含するものと理解されなければならない。いくつかの例では、ＶＨは重鎖定常ド
メイン（ＣＨ）１に連結されず、及び／又はＶＬは軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結され
ない。ポリペプチド又はタンパク質を含む例示的なＦｖとしては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’
断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又は高
次複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン、例えばＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに
連結された前述のもののいずれかが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は免疫グロブリンの一価
の抗原結合性断片からなり、全免疫グロブリンを酵素パパインで消化することにより作製
することができ、それによりインタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる断片が得られ、
又は組換え手段を用いて作製することができる。免疫グロブリンの「Ｆａｂ’断片」は、
全免疫グロブリンをペプシンで処理し、続いて還元することにより得ることができ、それ
によりインタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子が得られる。このように処理した
免疫グロブリンにつき２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組換え手段
によっても作製することができる。免疫グロブリンの「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの
Ｆａｂ’断片が２つのジスルフィド結合により一体に保持される二量体からなり、全免疫
グロブリン分子を酵素ペプシンで、続く還元はなしに処理することにより得られる。「Ｆ
ａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いて連結される２つの
Ｆａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域
と重鎖の可変領域とが好適な柔軟性のあるポリペプチドリンカーにより共有結合で連結さ
れている免疫グロブリンの可変領域断片（Ｆｖ）を含む組換え分子である。この用語の範
囲内に含まれる例示的Ｆｖ含有タンパク質の詳細な考察は、本明細書で以下に提供される
。
【０１３６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合部位」は、抗原との特異的な結合能を有す
るタンパク質により形成される構造を意味するものと解釈されなければならない。抗原結
合部位は一連の連続するアミノ酸でなくてもよく、又はさらには単一のポリペプチド鎖に
あるアミノ酸でなくてもよい。例えば、２つの異なるポリペプチド鎖から作製されるＦｖ
において、抗原結合部位は、抗原と相互作用するＶＬ及びＶＨの一連の領域から構成され
るが、しかしながら概して各可変領域でＣＤＲの１つ又は複数にあるとは限らない。
【０１３７】
「Ｋａｂａｔ付番方式」は、Ｋａｂａｔ（１９８７年及び／又は１９９１年）に提示さ
れるとおりの免疫グロブリンの可変領域におけるＦＲ及びＣＤＲの位置を決定する付番方
式を意味する。
【０１３８】
用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、すなわちペプチド結合によって連結さ
れた一連の連続するアミノ酸、又は互いに共有結合的に若しくは非共有結合的に連結され
た一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むものと解釈されなけれ
ばならない。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を
用いて共有結合的に連結されてもよい。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合
、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。本発明により企図される非
共有結合は、例えば何らかの形態のダイアボディ又はトリアボディ又はテトラボディにお
けるＶＨとＶＬとの間の相互作用である。
【０１３９】
用語「ポリペプチド鎖」は、前段落から、ペプチド結合により連結された一連の連続す
るアミノ酸を意味するように意味するものと理解されるだろう。
【０１４０】
当業者は、「ジスルフィド結合」がチオール基のカップリングにより形成される共有結
合であることを認識するであろう。この結合は、ＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも称さ
れる。タンパク質では、ジスルフィド結合は概して２つのシステイン残基のチオール基間
で起こり、シスチンを生じる。
【０１４１】
当業者はまた、用語「非還元条件」が、タンパク質のスルフヒドリル（−ＳＨ）基の酸
化に十分な、例えばジスルフィド結合の形成を許容する条件を含むことを認識するであろ
う。
【０１４２】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は、免疫グロブリン反応（例えば、抗体反応
）を引き起こし得る任意の組成物を意味するものと理解されなければならない。例示的抗
原としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、リン酸基、蛍光ペプチド
又はポリペプチド、グリコシル化（ｇｌｙｓｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ペプチド又はペプチド
等が挙げられる。
【０１４３】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、本発明のタンパク質が特定
の１つ又は複数の抗原又はそれを発現する細胞と、別の抗原又は細胞との反応又は会合と
比べてより高い頻度で、より高速に、より長い持続時間で及び／又はより高いアフィニテ
ィで反応又は会合することを意味するものと解釈されなければならない。例えば、抗原に
特異的に結合するタンパク質は当該の抗原を、他の抗原との結合と比べてより高いアフィ
ニティ、アビディティで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する。また、
この定義を読むことで、例えば第１の抗原に特異的に結合するタンパク質が第２の抗原に
特異的に結合しても、又はしなくてもよいことが理解される。従って、「特異的な結合」
は、必ずしも用語「選択的な結合性」によって意味されるように結合が排他的であること
、又は別の抗原の結合が検出不可能であることを要求するものではない。必須ではないが
、概して結合と言うとき、それは特異的な結合を意味し、及び各用語は他の用語の明示的
な支持を提供するものと理解されなければならない。
【０１４４】
本発明のタンパク質の抗原に対する結合との関連における用語「妨害している」、「妨
害する」又は「妨害」は、抗原との結合の完全な抑止又は完全な阻害を意味するものと解
釈されなければならない。
【０１４５】
可変領域を含むタンパク質
本発明は、１つ又は複数の抗原に特異的又は選択的に結合し、且つ本明細書において任
意の実施形態により記載されるとおり修飾される免疫グロブリン可変領域を含む任意のタ
ンパク質を企図する。好ましいタンパク質は、少なくとも１つのＶＨと少なくとも１つの
ＶＬとを含む。例示的免疫グロブリン可変領域は、抗体及びその修飾された形態（例えば
、ヒト化抗体）並びにラクダ科動物免疫グロブリン及びＩｇＮＡＲなどの重鎖抗体由来の
可変領域である。
【０１４６】
免疫グロブリン可変領域
抗体可変領域
本明細書の記載に基づけば当業者には明らかなとおり、本発明のタンパク質は、ＦＲ１
に少なくとも２つのシステイン残基を含むように修飾された抗体由来の１つ又は複数の可
変領域を含む。本発明はまた抗体分子も提供する。かかる抗体は、初めに目的の抗原に対
する抗体を作製し、その抗体を（例えば組換え手段を用いて）修飾することによるか、又
は既に作製されている抗体を修飾することにより作製されてもよい。
【０１４７】
抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。例えば、ハイブリドーマ技術など
のモノクローナル抗体の作製方法が、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５年
）による。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿
主動物を免疫原又は抗原又はそれを発現する細胞で免疫し、その免疫原又は抗原に特異的
に結合し得る抗体を産生する、又は産生する能力を有するリンパ球を生じさせる。次に、
ポリエチレングリコールなどの好適な融剤を用いて免疫化動物のリンパ球又は脾臓細胞を
不死化細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年）。
得られたハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の成長又は生存を阻害する１
つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で培養してもよい。例えば、親細
胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨ
ＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細
胞の成長を妨げる。本明細書はまた、例えば、一般的にＬａｒｇａｅｓｐａｄａ（１９９
０年）又はＷｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９９１年）に詳細に記載されるＡＢＬ−ＭＹＣ技
術を用いる他の抗体作製方法も企図する。
【０１４８】
或いは、抗体、又はそれをコードする配列は、目的の抗体を発現する既に作製されてい
る細胞、例えばハイブリドーマ又はトランスフェクトーマから生成される。かかるハイブ
リドーマ及び／又はトランスフェクトーマの様々な供給源は当業者には明らかで、例えば
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及び
／又はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（
ＥＣＡＣＣ）が挙げられる。抗体の可変領域をコードする配列を単離及び／又は修飾する
方法は当業者には明らかで、及び／又は本明細書に記載される。
【０１４９】
抗体の作製及び／又はそれをコードする配列の単離後、抗体は、ＦＲ１において本明細
書において任意の実施形態により記載されるとおりの部位にシステイン残基を含むように
修飾される。概してこれは、抗体をコードする核酸を単離すること、領域をコードし、且
つ修飾された抗体を発現するＦＲ１の必要な部位に、システイン残基をコードするコドン
（すなわち、ＴＧＴ又はＴＧＣ）を含むようにその配列を修飾することを伴う。
【０１５０】
例示的ヒト抗体重鎖ＦＲ１配列は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫ
ＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１）；ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳ
ＧＹＴＬＴ（配列番号２）；ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹ
ＴＦＴ（配列番号３）；ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦ
Ｔ（配列番号４）；ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ（
配列番号５）；ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳ（配列
番号６）；ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳ（配列番号
７）；ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳ（配列番号８）
；ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号９）；Ｅ
ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１０）；ＥＶ
ＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１１）；ＥＶＱ
ＬＶＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤ（配列番号１２）；及びＥＶ
ＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１３）からなる
群から選択される配列を含む。
【０１５１】
例示的ヒト抗体κ軽鎖ＦＲ１配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴ
Ｃ（配列番号１４）；ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１５
）；ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号１６）；ＥＩＶＬＴＱ
ＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号１７）；ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳ
ＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号１８）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮ
Ｃ（配列番号１９）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号２０
）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２１）；ＥＩＶＭＴＱ
ＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号２２）；ＤＩＱＭＴＱＳＰＤＦＬＡＶＳ
ＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（配列番号２３）；ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴ
Ｃ（配列番号２４）；ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号２５
）；ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣ（配列番号２６）；ＥＩＶＬＴＱ
ＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣ（配列番号２７）；ＥＴＴＬＴＱＳＰＡＦＭＳＡＴ
ＰＧＤＫＶＮＩＳＣ（配列番号２８）；ＡＩＲＭＴＱＳＰＦＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴ
Ｃ（配列番号２９）；ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３０
）；ＮＩＱＭＴＱＳＰＳＡＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３１）；ＤＶＶＭＴＱ
ＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣ（配列番号３２）；ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＳＰＶＴ
ＬＧＱＰＡＳＩＳＣ（配列番号３３）；ＤＶＶＭＴＱＳＰＡＦＬＳＶＴＰＧＥＫＶＴＩＴ
Ｃ（配列番号３４）；ＶＩＷＭＴＱＳＰＳＬＬＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＳＣ（配列番号３５
）；及びＡＩＲＭＴＱＳＰＳＳＦＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号３６）からなる群
から選択される配列を含む。
【０１５２】
例示的ヒト抗体λ軽鎖ＦＲ１配列は、ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣ
（配列番号３７）；ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣ（配列番号３８）；
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣ（配列番号３９）；ＱＳＡＬＴＱＰＲＳ
ＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣ（配列番号４０）；ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡ
ＲＩＴＣ（配列番号４１）；ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣ（配列番号
４２）；及びＱＬＶＬＴＱＳＰＳＡＳＡＳＬＧＡＳＶＫＬＴＣ（配列番号４３）からなる
群から選択される配列を含む。
【０１５３】
前述の配列は単に本発明の実施に用いられ得る配列の例示であり、かかる配列の網羅的
なリストではない。これらの例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的
で提供される。公知の方法を用いて、及び／又は例えばＫａｂａｔ（１９８７年及び／又
は２００１年）の開示に基づき、さらなるＦＲ１の配列を決定することは、当業者の能力
の範囲内である。
【０１５４】
ＦＲ１領域の前述の例は、本明細書において任意の例又は実施形態に記載されるとおり
の位置に２つ以上のシステイン残基を含むように容易に修飾される。
【０１５５】
当業者は、当該技術分野における知識及び／又は本明細書に示される配列に基づき、Ｆ
Ｒ１をコードする核酸の配列を決定することが容易に可能であろう。
【０１５６】
キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体
本発明のタンパク質は、ヒト化抗体又はヒト抗体又はそれに由来する可変領域に由来し
てもよく、又はそれであってもよい。用語「ヒト化抗体」は、キメラ分子であって、概し
て組換え技術を用いて調製され、非ヒト種の抗体に由来する抗原結合部位を有し、及びそ
の分子の残りの抗体構造がヒト抗体の構造及び／又は配列に基づくキメラ分子を指すもの
と理解されなければならない。抗原結合部位は、好ましくは、ヒト抗体の可変領域におけ
る適切なＦＲにグラフトされた非ヒト抗体のＣＤＲと、ヒト抗体の残りの領域とを含む。
抗原結合部位は野生型であってもよく、又は１つ又は複数のアミノ酸置換により修飾され
てもよい。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基が対応する非ヒト残
基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、又は移入されたＣＤＲ
若しくはフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は
、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域
の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも
１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含み得る。非ヒト抗体をヒト化する方
法は当該技術分野において公知である。ヒト化は、本質的に、米国特許第５２２５５３９
号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書又は米国特許第５５８５０８９号明細書の
方法に従い実施することができる。他の抗体のヒト化方法が除外されることはない。当業
者は、完全抗体でない本発明のタンパク質もまたヒト化することができ、例えば、可変ド
メインがヒト化されてもよいことを理解するであろう。
【０１５７】
用語「ヒト抗体」は、抗体分子及び結合タンパク質との関連において本明細書で使用さ
れるとき、ヒト、例えばヒト生殖細胞系列又は体細胞に存在する配列に由来する、又はそ
れに対応する可変抗体領域、及び場合により定常抗体領域を有する抗体を指す。「ヒト」
抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、例えばランダム又は部位特異的変
異によりインビトロで導入された変異（特に保存的置換が関与する変異又は抗体の少数の
残基における変異、例えば抗体の残基の１、２、３、４又は５個における変異、好ましく
は例えば抗体のＣＤＲの１つ又は複数を構成する残基の１、２、３、４又は５個における
変異）を含み得る。これらの「ヒト抗体」は、実際にヒトによって産生される必要はなく
、むしろ、組換え手段を用いて作製されても、及び／又はヒト抗体定常領域及び／又は可
変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離され
てもよい。ヒト抗体又はその断片は、ファージディスプレイライブラリ（例えば、米国特
許第６３０００６４号明細書；米国特許第５８８５７９３号明細書；米国特許第６２０４
０２３号明細書；米国特許第６２９１１５８号明細書；又は米国特許第６２４８５１６号
明細書に記載されるとおり）を含めた、当該技術分野において公知の様々な技術を用いて
、又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を使用して（例えば
、国際公開第２００２／０６６６３０号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）
又はＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら（２００７年）に記載されるとおり）作製することができる
。
【０１５８】
一例において本発明のタンパク質はキメラ抗体又はその一部、例えばＦａｂ断片である
。用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種（例えば、マウスな
どのネズミ科動物）に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗
体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方、１つ又は複数の鎖の残りの部分が、別
の種（例えば、ヒトなどの霊長類）に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラ
スに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにかかる抗体の断片を
、それらが所望の生物活性を呈する限りにおいて指す（米国特許第４，８１６，５６７号
明細書）。典型的には、キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を作製するために
、げっ歯類又はウサギ可変領域とヒト定常領域とを利用する。例えば、キメラ抗体は、ヒ
ト定常ドメイン及び／又はヒト定常領域に融合した本発明の任意の実施形態により修飾さ
れたマウス抗体の可変領域を含む。かかるキメラの抗体の作製は当該技術分野において公
知であり、標準的な手段によって実現され得る（例えば、米国特許第５，８０７，７１５
号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書及び米国特許第４，８１６，３９７号
明細書に記載のとおり）。
【０１５９】
本発明はまた、脱免疫化タンパク質も企図する。脱免疫化タンパク質は、対象がそのタ
ンパク質に対して免疫応答を生じる可能性を低減するため除去された（すなわち変異させ
た）１つ又は複数のエピトープ、例えばＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを有する
。脱免疫化タンパク質の作製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開
第００／３４３１７号パンフレット、国際公開第２００４／１０８１５８号パンフレット
及び国際公開第２００４／０６４７２４号パンフレットに記載される。例えば、この方法
は、タンパク質におけるエピトープを予測するためインシリコ解析を実施するステップと
、予測されたエピトープにおける１つ又は複数の残基を変異させ、それによりその免疫原
性を低下させるステップとを含む。次にタンパク質が、例えばインシリコ又はインビトロ
又はインビボで分析され、抗原に結合するその能力を維持していることが確認される。好
ましくはＣＤＲ内に存在するエピトープを変異させることは、その変異が抗原結合性を低
下させる可能性が低くない限り行わない。抗原の予測方法は当該技術分野において公知で
あり、例えばＳａｈａ（２００４年）に記載される。ＡＶＰ０４−０７における例示的な
候補エピトープは、配列番号５５の以下の位置：３５〜４１；６８〜７７；８４〜９０；
１０９〜１１９；１２２〜１２８；１６０〜１６９；及び１８５〜１９４に存在する。免
疫原性が潜在的に低下するように変異させ得る残基としては、Ｋ３８、Ｔ７１、Ａ７２、
Ｋ７４、Ｔ８７、Ｔ１１２、Ｖ１１３、Ｓ１１４、Ｓ１１５、Ｇ１１６、Ｔ１２５、Ｑ１
６３、Ｑ１６４、Ｐ１６６、Ｆ１８８、Ｔ１８９、Ｇ１９０又はＳ１９１が挙げられる。
【０１６０】
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、それが重鎖を含み、しかし軽鎖を含まない限りにおいて、構造
的に多くの他の形態の免疫グロブリン（例えば、抗体）と異なる。従って、このような免
疫グロブリンは「重鎖のみの抗体（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｎｌｙ  ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）」とも称される。重鎖免疫グロブリンは、例えばラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮ
ＡＲとも称される）に見られる。
【０１６１】
天然に存在する重鎖免疫グロブリンに存在する可変領域は、従来の４本鎖抗体に存在す
る重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と称される）及び従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可
変領域（「ＶＬドメイン」と称される）と区別するため、概してラクダ科動物Ｉｇにおい
て「ＶＨＨドメイン」、及びＩｇＮＡＲにおいてＶ−ＮＡＲと称される。
【０１６２】
重鎖免疫グロブリンは、関連抗原との高アフィニティ且つ高特異性での結合に軽鎖の存
在を必要としない。この特徴によって重鎖免疫グロブリンは、ＶＨ及びＶＬの双方のドメ
インを含むいくつかの従来の４本鎖抗体と区別される。これは、単一のドメイン結合断片
が重鎖免疫グロブリンに由来できることを意味し、重鎖免疫グロブリンは発現し易く、概
して安定的で可溶性である。重鎖免疫グロブリン及びその可変領域ドメインであって、そ
れに由来するドメインはまた、長い表面ループ（特にＣＤＲ３）も含むことができ、これ
は、酵素などの抗原に、並びに感染症の原因となるウイルス及び病原体のタンパク質の表
面上に多く見られる空洞の貫通及びそれに対する結合を促進する。
【０１６３】
ラクダ科動物由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域並びにその作製及び／又は単
離及び／又は使用方法についての概要は、特に以下の参考文献、国際公開第９４／０４６
７８号パンフレット、国際公開第９７／４９８０５号パンフレット及び国際公開第９７／
４９８０５号パンフレットに見出される。
【０１６４】
ラクダ科動物由来の重鎖免疫グロブリンからのフレームワーク１ドメインの例示的配列
としては、以下のもの、すなわちＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＥＩＳＧＬＴＦＤ（配列
番号４４）；ＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＳＦＳ（配列番号４５）；ＧＧＳ
ＥＱＧＧＧＳＬＲＬＳＣＡＩＳＧＹＴＹＧ（配列番号４６）；ＧＧＳＶＱＰＧＧＳＬＴＬ
ＳＣＴＶＳＧＡＴＹＳ（配列番号４７）；ＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＧＳＧＦＰＹ
Ｓ（配列番号４８）；ＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＧＦＧＴＳ（配列番号４９）；
及びＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＳＦＳＰＳＳ（配列番号５０）が挙げられる。
【０１６５】
軟骨魚類由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域並びにその作製及び／又は単離及
び／又は使用方法についての概要は、特に国際公開第２００５／１１８６２９号パンフレ
ットに見出される。３型アブラツノザメＩｇＮＡＲ  ＦＲ１の例示的コンセンサス配列は
、配列ＡＷＶＥＱＴＰＲＴＡＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号５１）を含む。３
型テンジクザメＩｇＮＡＲ  ＦＲ１の例示的コンセンサス配列は、配列ＡＲＶＤＱＴＰＫ
ＴＩＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＳ（配列番号５２）を含む。
【０１６６】
可変領域を含むタンパク質
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
免疫グロブリン可変領域を含む例示的な好ましいタンパク質は、国際公開第９８／０４
４００１号パンフレット及び国際公開第９４／００７９２１号パンフレットに記載される
ものなどの、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び高次タンパク質複合体であ
る。
【０１６７】
本明細書で使用されるとき、用語「ダイアボディ」は、２つの会合したポリペプチド鎖
であって、各々が構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ又はＶＨ−Ｘ−ＶＬを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖
内のＶＨとＶＬとの会合（又はＦｖの形成）を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一方のポリペプチド鎖のＶＨが他方のポリペプチド鎖の
ＶＬに結合して抗原結合部位を形成し、すなわち、１つ又は複数の抗原との特異的な結合
能を有するＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖で同じである可能性が
あり、又はＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖で異なり、二重特異性ダイアボディ（すなわ
ち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）を形成する可能性がある。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、用語「トリアボディ」は、３つの会合したポリペプチド鎖
であって、各々が構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ又はＶＨ−Ｘ−ＶＬを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖
内のＶＨとＶＬとの会合（又はＦｖの形成）を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一つのポリペプチド鎖のＶＨが別のポリペプチド鎖のＶ
Ｌと会合し、それにより三量体タンパク質（トリアボディ）を形成する。例えば、第１の
ポリペプチド鎖のＶＨが第２のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、第２のポリペプチド鎖の
ＶＨが第３のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、及び第３のポリペプチドのＶＨが第１のポ
リペプチド鎖のＶＬと会合する。ＶＬとＶＨとが会合することにより、抗原結合部位、す
なわち１つ又は複数の抗原との特異的な結合能を有するＦｖが形成される。ＶＬ及びＶＨ
は各ポリペプチド鎖で同じである可能性があり（すなわち、単一特異性トリアボディが生
じる）、又はＶＬのうちの２つ及びＶＨのうちの２つが同じで、且つ各々における第３の
ものが第３のポリペプチド鎖において異なることで二重特異性タンパク質を生じる可能性
があり、又は各ポリペプチド鎖でＶＬ及びＶＨが異なり、それにより三価のタンパク質を
形成する可能性がある。
【０１６９】
本明細書で使用されるとき、用語「テトラボディ」は、４つの会合したポリペプチド鎖
であって、各々が構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ又はＶＨ−Ｘ−ＶＬを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖
内のＶＨとＶＬとの会合（又はＦｖの形成）を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一つのポリペプチド鎖のＶＨが別のポリペプチド鎖のＶ
Ｌと会合し、それにより四量体タンパク質（テトラボディ）を形成する。ＶＬとＶＨとが
会合することにより、抗原結合部位、すなわち１つ又は複数の抗原との特異的な結合能を
有するＦｖが形成される。例えば、第１のポリペプチド鎖のＶＨが第２のポリペプチド鎖
のＶＬと会合し、第２のポリペプチド鎖のＶＨが第３のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、
第３のポリペプチド鎖のＶＨが第４のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、及び第４のポリペ
プチド鎖のＶＨが第１のポリペプチド鎖のＶＬと会合する。ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチ
ド鎖で同じである可能性があり（すなわち、単一特異性テトラボディが生じる）、又はＶ
Ｌ及びＶＨは２本のポリペプチド鎖においてあるタイプで、且つ他の２本のポリペプチド
鎖において異なるタイプであって、二重特異性テトラボディを生じる可能性があり、又は
ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖で異なり、それにより四重特異性テトラボディを形成す
る可能性がある。
【０１７０】
当業者は、ダイアボディ、トリアボディ及び／又はテトラボディ並びにそれらの作製方
法を認識しているであろう。概してこれらのタンパク質は、ＶＨとＶＬとが直接連結され
た、又はＶＨとＶＬとの会合を可能にするには不十分な長さのリンカーを用いて連結され
たポリペプチド鎖を含む。ＶＨ及びＶＬは任意の順序で、すなわちＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−
ＶＬで位置することができる。ＶＨ及びＶＬは、例えば、それらのポリペプチド鎖をコー
ドする核酸を、目的の１つ又は複数の可変領域を含む免疫グロブリン（抗体又はキメラ抗
体又はヒト化抗体又はヒト抗体を含む）を発現する細胞から、又はＶＨ及びＶＬポリペプ
チド鎖を発現する組換えライブラリ（例えば、ｓｃＦｖライブラリ、例えば、欧州特許第
０２３９４００号明細書又は米国特許第４９４６７７８号明細書に記載のとおり）から単
離することにより容易に得られる。次にＶＨ及び／又はＶＬは、本明細書において任意の
実施形態により記載されるとおりの必要なシステイン残基を含むように容易に修飾するこ
とができる。
【０１７１】
ＶＨ及びＶＬを含むタンパク質は会合し、リンカー（存在する場合）の長さ及び／又は
ＶＨ及びＶＬドメインの順序に応じてダイアボディ、トリアボディ及び／又はテトラボデ
ィを形成する。好ましくは、リンカーは１２個以下のアミノ酸を含む。例えば、ＮからＣ
の順序に並んだ以下の構造ＶＨ−Ｘ−ＶＬ（式中、Ｘはリンカーである）を有するポリペ
プチド鎖の場合、３〜１２残基を有するリンカーは、概してダイアボディの形成をもたら
し、１又は２残基を有するリンカーは、又はリンカーが存在しない場合、概してトリアボ
ディの形成をもたらす。ＮからＣの順序で並んだ以下の構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ（式中、Ｘは
リンカーである）を有するポリペプチド鎖の場合、３〜１２残基を有するリンカーは、概
してダイアボディの形成をもたらし、１又は２残基を有するリンカーは、概してダイアボ
ディ、トリアボディ及びテトラボディの形成をもたらし、及びリンカーを欠くポリペプチ
ドは、概してトリアボディ又はテトラボディを形成する。
【０１７２】
融合タンパク質において使用されるリンカーは当該技術分野において公知である。リン
カー配列組成物は、融合タンパク質のフォールディングの安定性に影響し得る。融合タン
パク質と無関係なリンカーを介したタンパク質の間接的な融合により、２つのタンパク質
間の立体障害が回避され、連結の自由度が達成される。
【０１７３】
ヘリックス構造又はβストランド構造をとる傾向が強いリンカー配列を有することは好
ましくないことが多く、これらの構造はタンパク質の柔軟性、及び結果的にその機能的活
性を制限し得る。むしろ、より望ましいリンカーは、拡がったコンホメーションを選択的
にとる配列である。実際、ごく最近に設計されたリンカー配列は、リンカーに強制的にル
ープコンホメーションをとらせる高含量のグリシン残基を有する。概して設計リンカーで
はグリシンが使用され、これは、β−炭素がないことにより、ポリペプチド骨格が、他の
アミノ酸にはエネルギー的に禁じられた二面角にアクセス可能となるためである。
【０１７４】
一実施形態において、リンカーはグリシンリッチリンカーである。好ましくは、リンカ
ーは、アラニン及び／又はセリンをさらに含むグリシンリンカーである。かかるリンカー
は柔軟性を提供し、親水性を高め、及び比較的プロテアーゼ耐性が高い。例えば、Ｋｏｒ
ｔｔら、２００１年を参照のこと。
【０１７５】
グリシンによって付与されるコンホメーション上の柔軟性は、タンパク質のＣ末端とリ
ンカーのＮ末端との間の接合部に重要であり得る。従って、タンパク質のＣ末端に隣接す
る領域にグリシンを含むリンカーが好ましい。これに関連して、これはリンカーの第１の
アミノ酸残基がグリシンでなければならないという要件を付与するものではない。
【０１７６】
プロリン残基をリンカーに組み込み、リンカーによる有意な二次構造要素の形成を妨げ
ることができる。例えば、リンカーは配列Ｇｌｙｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙｎを含む（式中、ｎ
は約１〜約５の数字である）。
【０１７７】
好ましいリンカーは、Ｇ；ＧＧ；ＧＧＧ；ＧＧＧＧ（配列番号１３４）；ＧＧＧＧＳ（
配列番号１３５）；Ｓ；ＳＧ；ＳＧＧ；及びＳＧＧＧからなる群から選択される配列を含
む。
【０１７８】
ダイアボディ及び高次多量体はまた、例えば、国際公開第２００６／１１３６６５号パ
ンフレットに記載されるとおり、例えばタンパク質間のジスルフィド結合による、共有結
合で連結されたタンパク質も含むことができる。
【０１７９】
多重特異性ダイアボディ及び高次多量体は、短鎖リンカーによってある免疫グロブリン
のＶＬドメインに接続する別の免疫グロブリンからのＶＨドメインを含む２つの単鎖融合
産物を非共有結合的に会合させて、それにより各々が異なる免疫グロブリン由来の２つの
Ｆｖを形成することにより作製することができる。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ及びＫｏｒｔｔ
（１９９９年）を参照のこと。同様に、多重特異性トリアボディは、３つの単鎖融合タン
パク質を以下のとおり非共有結合的に会合させることにより作製することができる：
（ｉ）短鎖リンカーにより第２の免疫グロブリンのＶＬドメインに接続する第１の免疫グ
ロブリンからのＶＨドメインを含む第１のタンパク質；
（ｉｉ）短鎖リンカーにより第３の免疫グロブリンのＶＬドメインに接続する第２の免疫
グロブリンからのＶＨドメインを含む第２のタンパク質；及び
（ｉｉｉ）短鎖リンカーにより第１の免疫グロブリンのＶＬドメインに接続する第３の免
疫グロブリンからのＶＨドメインを含む第３のタンパク質。
【０１８０】
当業者は、二重特異性トリアボディ、二重特異性テトラボディ、三重特異性テトラボデ
ィ及び四重特異性テトラボディを作製するための上記に対する好適な修飾を判断すること
が容易に可能であろう。
【０１８１】
本発明は、任意の抗原又はそれらの組み合わせに対するダイアボディ、トリアボディ、
テトラボディ又は高次多量体を企図し、特定の抗原に結合するものに限定されると解釈さ
れてはならない。例示的抗原が、限定ではなく、例示を目的として本明細書に記載される
。
【０１８２】
例示的ダイアボディ、トリアボディ及び／又はテトラボディは、配列番号５５のアミノ
酸１〜１１５又は配列番号５９のアミノ酸１〜１２９又は配列番号６１のアミノ酸１〜１
２０又は配列番号１０９のアミノ酸１〜１２９に示されるＶＨ配列であって、ＦＲ１にお
ける２つ以上のシステイン残基及び／又はＮ末端スレオニン／セリン残基を含むように修
飾されるＶＨ配列を含む。例えば、ＶＨは、
（ｉ）配列番号５７のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｖ）配列番号７７のアミノ酸１〜１１５；
（ｖ）配列番号９９のアミノ酸１〜１１５；
（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸１〜１２９；
（ｖｉｉ）配列番号８７のアミノ酸１〜１２９；
（ｖｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸１〜１２９；
（ｉｘ）配列番号９１のアミノ酸１〜１２９；
（ｘ）配列番号９３のアミノ酸１〜１２９；
（ｘｉ）配列番号９７のアミノ酸１〜１２９；
（ｘｉｉ）配列番号７９のアミノ酸１〜１２０；
（ｘｉｉｉ）配列番号８１のアミノ酸１〜１２０；
（ｘｉｖ）配列番号８３のアミノ酸１〜１２０；
（ｘｖ）配列番号８５のアミノ酸１〜１２０；及び／又は
（ｘｖｉ）配列番号９５のアミノ酸１〜１２０
に示される配列を含む。
【０１８３】
ダイアボディ、トリアボディ及び／又はテトラボディは、配列番号５５のアミノ酸１２
１〜２３４又は配列番号５９のアミノ酸１３５〜２４５又は配列番号６１のアミノ酸１２
６〜２３２又は配列番号１０９のアミノ酸１３５〜２４５に示されるＶＬ配列であって、
ＦＲ１における２つ以上のシステイン残基及び／又はＮ末端スレオニン／セリン残基を含
むように修飾されるＶＬ配列を含む。例えば、ＶＬは、
（ｉ）配列番号５７のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｖ）配列番号７７のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｖ）配列番号９９のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｖｉｉ）配列番号８７のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｖｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｉｘ）配列番号９１のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｘ）配列番号９３のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｘｉ）配列番号９７のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｘｉｉ）配列番号７９のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｘｉｉｉ）配列番号８１のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｘｉｖ）配列番号８３のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｘｖ）配列番号８５のアミノ酸１２６〜２３２；及び／又は
（ｘｖｉ）配列番号９５のアミノ酸１２６〜２３２
に示される配列を含む。
【０１８４】
上記段落に記載されるＶＨ及びＶＬは任意の順序で並び、本明細書に記載されるとおり
の好適なリンカーにより連結されることができる。ダイアボディについては、リンカーは
好ましくは配列ＧＧＧＳを含む。トリアボディ又はテトラボディについては、好ましくは
リンカーはないか、又は単一のグリシン残基である。
【０１８５】
一例において、ダイアボディはＴＡＧ７２に結合し、ＦＲ１における２つ以上のシステ
イン残基及び／又はＮ末端スレオニン／セリン残基を含むように修飾される配列番号５５
に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは各々がそのよう
な配列を含む２つのポリペプチド鎖）を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号５７、
６３、７５、７７又は７９の１つ又は複数に示される配列を含む少なくとも１つのポリペ
プチド鎖（及び好ましくは各々がそのような配列を含む２つのポリペプチド鎖）を含む。
【０１８６】
一例において、トリアボディはＴＡＧ７２に結合し、配列番号１０２に示される配列を
含む少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは各々がそのような配列を含む２つ
又は３つのポリペプチド鎖）を含む。
【０１８７】
別の例において、ダイアボディはＨｅｒ２に結合し、ＦＲ１における２つ以上のシステ
イン残基及び／又はＮ末端スレオニン／セリン残基を含むように修飾される配列番号１０
９に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは各々がそのよ
うな配列を含む２つのポリペプチド鎖）を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号６５
、８７、８９、９１、９３又は９７の１つ又は複数に示される配列を含む少なくとも１つ
のポリペプチド鎖（及び好ましくは各々がそのような配列を含む２つのポリペプチド鎖）
を含む。
【０１８８】
別の例において、ダイアボディはＭＵＣ１に結合し、ＦＲ１における２つ以上のシステ
イン残基及び／又はＮ末端スレオニン／セリン残基を含むように修飾される配列番号６１
に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは各々がそのよう
な配列を含む２つのポリペプチド鎖）を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号７９、
８１、８３、８５又は９５の１つ又は複数に示される配列を含む少なくとも１つのポリペ
プチド鎖（及び好ましくは各々がそのような配列を含む２つのポリペプチド鎖）を含む。
【０１８９】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者は、ｓｃＦｖが単一のポリペプチド鎖にＶＨ及びＶＬ領域を含むことを認識する
であろう。好ましくは、ポリペプチド鎖はＶＨとＶＬとの間にポリペプチドリンカーをさ
らに含み、それによりｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成する（すなわち、単一の
ポリペプチド鎖のＶＨとＶＬとが互いに会合してＦｖを形成する）ことが可能となる。こ
れは、異なるポリペプチド鎖からの可変領域が互いに会合又は結合するダイアボディ又は
高次多量体とは区別される。例えば、リンカーは、よりｓｃＦｖに好適なリンカーの１つ
である（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３
））を有する過剰の１２アミノ酸残基を含む。
【０１９０】
例示的ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸１〜１１５又は配列番号５９のアミノ酸１
〜１２９又は配列番号６１のアミノ酸１〜１２０又は配列番号１０９のアミノ酸１〜１２
９に示されるＶＨ配列であって、ＦＲ１における２つ以上のシステイン残基及び／又はＮ
末端スレオニン／セリン残基を含むように修飾されるＶＨ配列を含む。一例において、ｓ
ｃＦｖはＴＡＧ７２に結合し、ＶＨは、
（ｉ）配列番号５７のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸１〜１１５；
（ｉｖ）配列番号７７のアミノ酸１〜１１５；又は
（ｖ）配列番号９９のアミノ酸１〜１１５；
の１つに示される配列を含み、及びＶＬは、
（ｉ）配列番号５７のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸１２１〜２３４；
（ｉｖ）配列番号７７のアミノ酸１２１〜２３４；又は
（ｖ）配列番号９９のアミノ酸１２１〜２３４
の１つに示される配列を含む。
【０１９１】
一例において、ｓｃＦｖはＴＡＧ７２に結合し、配列番号１０１に示される配列を含む
。
【０１９２】
別の例において、ｓｃＦｖはＨｅｒ２に結合し、ＶＨは、
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸１〜１２９；
（ｉｉ）配列番号８７のアミノ酸１〜１２９；
（ｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸１〜１２９；
（ｉｖ）配列番号９１のアミノ酸１〜１２９；
（ｖ）配列番号９３のアミノ酸１〜１２９；又は
（ｖｉ）配列番号９７のアミノ酸１〜１２９
の１つに示される配列を含み、及びＶＬは、
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｉｉ）配列番号８７のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｉｖ）配列番号９１のアミノ酸１３５〜２４５；
（ｖ）配列番号９３のアミノ酸１３５〜２４５；又は
（ｖｉ）配列番号９７のアミノ酸１３５〜２４５
の１つに示される配列を含む。
【０１９３】
別の例において、ｓｃＦｖはＨＥＲ２に結合し、配列番号１０５に示される配列を含む
。
【０１９４】
さらなる例において、ｓｃＦｖはＭＵＣ１に結合し、ＶＨは、
（ｉ）配列番号７９のアミノ酸１〜１２０；
（ｉｉ）配列番号８１のアミノ酸１〜１２０；
（ｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸１〜１２０；
（ｉｖ）配列番号８５のアミノ酸１〜１２０；又は
（ｖ）配列番号９５のアミノ酸１〜１２０
の１つに示される配列を含み、及びＶＬは、
（ｉ）配列番号７９のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｉｉ）配列番号８１のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸１２６〜２３２；
（ｉｖ）配列番号８５のアミノ酸１２６〜２３２；又は
（ｖ）配列番号９５のアミノ酸１２６〜２３２
の１つに示される配列を含む。
【０１９５】
本発明はまた、ジスルフィド安定化Ｆｖ（又はｄｉＦｖ又はｄｓＦｖ）も企図し、ここ
では単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、及びそれらのシステ
イン残基がジスルフィド結合によって連結され、安定的なＦｖをもたらす（例えば、Ｂｒ
ｉｎｋｍａｎｎら、１９９３年を参照のこと）。
【０１９６】
それに代えて又は加えて、本発明は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち非共有結合性又は共有
結合性の連結鎖によって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を提供する。か
かる二量体ｓｃＦｖの例としては、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、Ｆｏｓ
又はＪｕｎに由来する）に連結された２つのｓｃＦｖであって、それによりロイシンジッ
パードメインが会合して二量体化合物を形成するものが挙げられる（例えば、Ｋｏｓｔｅ
ｌｎｙ  １９９２年又はＫｒｕｉｆ及びＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、１９９６年を参照のこと
）。或いは、例えば米国特許出願公開第２００６０２６３３６７号明細書に記載されると
おり、２つのｓｃＦｖは、双方のｓｃＦｖの形成及び抗原との結合を可能にするのに十分
な長さのペプチドリンカーによって連結される。さらなる例において、例えばＡｌｂｒｅ
ｃｈｔら（２００４年）に記載されるとおり、各ｓｃＦｖがシステイン残基を例えばリン
カー領域に、又は末端に含むように修飾され、それらのｓｃＦｖがジスルフィド結合によ
って連結される。
【０１９７】
本発明はまた、修飾された形態のｓｃＦｖ、例えば米国特許第６２３３２２号明細書に
記載されるとおりの、例えばグリコシル化が可能であるように修飾されたリンカーを含む
ｓｃＦｖも企図する。
【０１９８】
当業者は、本明細書における開示に基づきｓｃＦｖ又は本発明に係る好適な修飾ＶＨ及
び／又はＶＬを含むその修飾された形態を作製することが容易に可能であろう。ＶＨ及び
／又はＶＬの例示的配列が本明細書に記載され、それらは本発明のこの実施形態に準用さ
れるものと解釈されるべきである。
【０１９９】
ｓｃＦｖについてのさらなる説明は、例えば米国特許第５２６０２０３号明細書に見出
される。
【０２００】
ミニボディ
当業者は、ミニボディが、免疫グロブリンのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインに融合し
た免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬドメインを含むことを認識するであろう。場合により、
ミニボディはＶＨとＶＬとの間にヒンジ領域を含み、時にこのコンホメーションはフレッ
クスミニボディ（Ｆｌｅｘ  Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Ｈｕら、１９９６年）と称される。ミ
ニボディはＣＨ１又はＣＬを含まない。好ましくは、ＶＨ及びＶＬドメインは免疫グロブ
リンのヒンジ領域とＣＨ３ドメインとに融合する。領域の各々は、同じ免疫グロブリンに
由来してもよい。或いは、ＶＨ及びＶＬドメインが一つの免疫グロブリンに由来し、ヒン
ジ及びＣＨ２／ＣＨ３が別の免疫グロブリンに由来する可能性があり、又はさらにヒンジ
とＣＨ２／ＣＨ３とが異なる免疫グロブリンに由来する可能性がある。本発明はまた、一
つの免疫グロブリン由来のＶＨ及びＶＬと、別の免疫グロブリン由来のＶＨ及びＶＬとを
含む多重特異性ミニボディも企図する。前記ミニボディの可変領域の少なくとも１つは、
本明細書に記載されるとおりＦＲ１にシステイン残基を含む。
【０２０１】
当業者は、当該技術分野において公知の方法を、本明細書に提供される教示と併せて用
いることにより、本発明のミニボディを作製することが容易に可能であろう。
【０２０２】
上記に基づけば、当業者は、ミニボディが、抗原結合領域と、二価分子となる構築を可
能にするＣＨ３ドメイン（又はＣＨ２ドメイン）と、ジスルフィド結合による二量体化に
適応する免疫グロブリンヒンジとを保持する単一のタンパク質鎖においてコードされる全
免疫グロブリンの小型版であることを理解するであろう。
【０２０３】
例示的ミニボディ及びその作製方法は、例えば国際公開第９４／０９８１７号パンフレ
ットに記載されている。
【０２０４】
その他の可変領域を含むタンパク質
米国特許第５，７３１，１６８号明細書は、組換え細胞培養物から回収され、それによ
り二重特異性タンパク質を生じるヘテロ二量体の割合が最大化されるように、一対のＦｖ
間の接合部分が操作された分子について記載している。好ましい接合部分は、ＣＨ３ドメ
インの少なくとも一部を含む。この方法では、第１のタンパク質の接合部分の１つ又は複
数の小さいアミノ酸側鎖がより大きい側鎖｛例えば、チロシン又はトリプトファン）に置
き換えられる。第２のタンパク質の接合部分に対しては、大きいアミノ酸側鎖がより小さ
い側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置き換えられることにより、１つ又は複数
の大きい側鎖と同じ又は類似したサイズの補償的な「キャビティ」が設けられる。
【０２０５】
可変領域を含む二重特異性タンパク質は、架橋された、又は「ヘテロコンジュゲート」
タンパク質を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中のタンパク質の一方をアビジンとカ
ップリングし、他方をビオチンとカップリングすることができる。かかるタンパク質は、
例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するために提案されている（米国特許第
４，６７６，９８０号明細書）。可変領域を含むヘテロコンジュゲートタンパク質は、任
意の好都合な架橋方法を用いて作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において公知
であり、数多くの架橋技法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記載されて
いる。
【０２０６】
可変領域を含む二重特異性タンパク質はまた、化学的連結を用いて調製することもでき
る。Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５年）は、インタクトな抗体をタンパク質分解により切断し
てＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載する。これらの断片をジチオール錯生成剤の
亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元すると、隣接ジチオールが安定化し、分子間ジスルフィ
ドの形成が抑制される。次に生成されたＦａｂ’断片がチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘
導体に変換される。次にＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをメルカプトエチルアミンで還元
することによりＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導
体と混合することで、二重特異性タンパク質が形成される。
【０２０７】
進歩により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接回収が容易にな
り、これを化学的にカップリングして、可変領域を含む二重特異性タンパク質を形成する
ことができる。Ｓｈａｌａｂｙ（１９９２年）は、完全ヒト化二重特異性Ｆ（ａｂ’）２
分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から別個に
分泌させ、インビトロで特異的な化学カップリングに供することにより、可変領域を含む
二重特異性タンパク質を形成した。このように形成された二重特異性タンパク質は、関連
抗原を発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することが可能であったとともに、ヒト乳
房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を惹起する。
【０２０８】
さらなる可変領域を含むタンパク質としては、例えば、ドメイン抗体（ｄＡｂ）及びそ
の融合物（例えば、米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されるとおり）、単鎖Ｆａ
ｂ（例えば、Ｈｕｓｔら、２００７年）又はＦａｂ３（例えば、欧州特許第１９９３０３
０２８９４号明細書に記載されるとおり）が挙げられる。
【０２０９】
定常ドメイン融合物
本発明は、可変領域と定常領域（例えばＦｃ）又はそのドメイン、例えばＣＨ２及び／
又はＣＨ３ドメインとを含むタンパク質を包含する。例えば、本発明は、ミニボディ（上
記に考察されるとおり）又はｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物又はダイアボディ−Ｆｃ融合物又はト
リアボディ−Ｆｃ融合物又はテトラボディ−Ｆｃ融合物又はｓｃＦｃ−ＣＨ２融合物又は
ダイアボディ−ＣＨ２融合物又はトリアボディ−ＣＨ２融合物又はテトラボディ−ＣＨ２
融合物又はｓｃＦｖ−ＣＨ３融合物又はダイアボディ−ＣＨ３融合物又はトリアボディ−
ＣＨ３融合物又はテトラボディ−ＣＨ３融合物を提供する。これらのタンパク質のいずれ
も、可変領域と定常領域又は定常ドメインとの間にリンカー、好ましくは免疫グロブリン
ヒンジ領域を含み得る。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメイン
につなぎ合わせる重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は約２５残基を含み、及び柔
軟性を有するため、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことが可能となる。ヒンジ
領域は、３つの異なるドメイン、すなわち上部、中央、及び下部ヒンジドメインにさらに
分けることができる（Ｒｏｕｘら  １９９８年）。
【０２１１】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ  ＥＵ付
番方式による約２３１〜３４０位に延在する重鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。概
してインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ連結分枝状炭
水化物鎖が間置される。一実施形態において、本発明のタンパク質は、ＩｇＧ１分子（例
えばヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態において、本発
明のタンパク質は、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ２ドメイ
ンを含む。
【０２１２】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から
約１１０残基、例えば約３４１〜４４６ｂ位（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番方式）に延在する重
鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には免疫グロブリンの
Ｃ末端部分を形成する。しかしながら、いくつかの免疫グロブリンでは、さらなるドメイ
ンがＣＨ３ドメインから延在して分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖
及びＩｇＥのｅ鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施形態において、本発明のタンパク質
は、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の
実施形態において、本発明のタンパク質は、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）
に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【０２１３】
本発明のタンパク質の作製に有用な定常ドメイン配列は、数多くの異なる供給源から得
られ得る。好ましい実施形態において、タンパク質の定常領域ドメイン又はその一部分は
ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、定常領域ドメイン又はその一部分は、例
えば、げっ歯類種（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）又は非ヒト霊長類種（
例えばチンパンジー、マカク）を含めた別の哺乳類種の免疫グロブリンに由来してもよい
ことが理解される。さらに、定常領域ドメイン又はその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含めた任意の免疫グロブリンクラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、
ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含めた任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。好
ましい例において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
【０２１４】
様々な定常領域遺伝子配列（例えばヒト定常領域遺伝子配列）が、公的にアクセス可能
な寄託物の形態で利用可能であり、又はその配列を公的に利用可能なデータベースから入
手することができる。特定のエフェクター機能を有する（若しくは特定のエフェクター機
能を欠く）、又は特定の修飾を備えて免疫原性を低減する定常領域ドメインを選択するこ
とができる。
【０２１５】
本明細書で使用されるとき、用語「エフェクター機能」は、免疫系のタンパク質及び／
又は細胞を結合し、且つ様々な生物学的作用を媒介するＦｃ領域又はその一部分（例えば
ＣＨ２ドメイン）の機能上の能力を指す。エフェクター機能は抗原依存性であっても、又
は抗原非依存性であってもよい。「抗原依存性エフェクター機能」は、免疫グロブリンの
対応する抗原との結合後に通常誘導されるエフェクター機能を指す。典型的な抗原依存性
エフェクター機能としては、補体タンパク質（例えばＣ１ｑ）を結合する能力が挙げられ
る。例えば、補体のＣ１成分のＦｃ領域との結合は古典的補体系を活性化し、補体依存性
細胞傷害（ＣＤＣＣ）と称される過程である細胞病原体のオプソニン化及び溶解をもたら
すことができる。補体の活性化はまた炎症反応も刺激し、また自己免疫性の過敏症にも関
与し得る。他の抗原依存性エフェクター機能はまた、免疫グロブリンの、そのＦｃ領域を
介した、細胞上の特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）との結合により媒介される。種々のク
ラスの免疫グロブリンに特異的なＦｃ受容体が、ＩｇＧ（γ受容体、又はＩｇλＲ）、Ｉ
ｇＥ（ε受容体、又はＩｇεＲ）、ＩｇＡ（α受容体、又はＩｇαＲ）及びＩｇＭ（μ受
容体、又はＩｇμＲｓ）を含め、数多くある。細胞表面上のＦｃ受容体に対する免疫グロ
ブリンの結合は、免疫複合体のエンドサイトーシス、免疫グロブリンで被覆された粒子又
は微生物の貪食及び破壊（抗体依存性食作用、又はＡＤＣＰとも称される）、免疫複合体
のクリアランス、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒
介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーターの放出、免疫系細胞活
性化の調節、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含めた、数多くの重要且つ多様な
生物学的反応を引き起こす。
【０２１６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原非依存性エフェクター機能」は、その対応する
抗原を結合しているかどうかに関わらず、免疫グロブリンにより誘導され得るエフェクタ
ー機能を指す。典型的な抗原非依存性エフェクター機能としては、細胞輸送、免疫グロブ
リンの循環半減期及びクリアランス速度、及び精製の促進が挙げられる。サルベージ受容
体としても知られる構造的に固有のＦｃ受容体の「新生児Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲｎ」
が、半減期及び細胞輸送の制御に重要な役割を果たす。微生物細胞（例えばブドウ球菌プ
ロテインＡ又はＧ）から精製された他のＦｃ受容体は、Ｆｃ領域との高アフィニティでの
結合能を有し、Ｆｃ含有タンパク質の精製の促進に使用することができる。
【０２１７】
定常領域ドメインは、例えばポリメラーゼ連鎖反応及び目的のドメインを増幅するよう
選択されるプライマーを使用して、クローニングすることができる。免疫グロブリン配列
のクローニングは、例えば米国特許第５，６５８，５７０号明細書に記載される。
【０２１８】
本発明のタンパク質は、異なる種類の定常領域ドメインをいくつでも含んでよい。
【０２１９】
タンパク質の定常領域を構成する定常領域ドメイン又はその一部分は、異なる免疫グロ
ブリン分子に由来してもよい。例えば、タンパク質は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ド
メイン又はその一部分と、ＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３領域又はその一部分とを含み得
る。
【０２２０】
本発明の別の例において、本発明のタンパク質は、ＦｃＲｎ結合をもたらすのに十分な
Ｆｃの少なくともある領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の一部分は、Ｋ
ａｂａｔ付番によるＩｇＧ１のアミノ酸約２８２〜４３８を含む。
【０２２１】
一例において、本発明のタンパク質は、又は複数の定常領域ドメインを部分的に又は完
全に欠失させた改変合成定常領域（「ドメイン欠失定常領域」）を含む。本発明はまた、
エフェクター機能が改変された、例えば向上した、又は低減した修飾Ｆｃ領域又はその一
部も包含する。多くのかかる修飾Ｆｃ領域が当該技術分野において公知であり、例えば、
米国特許第７２１７７９７号明細書；米国特許第７２１７７９８号明細書；又は米国特許
出願公開第２００９００４１７７０号明細書（半減期の向上）又は米国特許出願公開第２
００５０３７０００号明細書（ＡＤＣＣの増加）に記載される。
【０２２２】
タンパク質に対する変異
本発明は、本発明のタンパク質の変異型の使用を企図する。例えば、かかる変異ポリペ
プチドは、本明細書に示される配列と比較して１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む
。いくつかの例では、ポリペプチドは１０個以下、例えば、９個又は８個又は７個又は６
個又は５個又は４個又は３個又は２個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置
換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖及び／又はヒドロパシー性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉ
ｃｉｔｙ）及び／又は親水性を有するアミノ酸残基に置き換わる置換である。
【０２２３】
好ましい例において、変異タンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較したとき、
１個又は２個又は３個又は４個のみの、又はそれ以下の保存的アミノ酸変化を有する。保
存的アミノ酸変化の詳細は以下に提供される。当業者は認識しているであろうとおり、か
かる小さい変化は、組換え細胞中で発現させたときポリペプチドの活性を変化させること
がないと合理的に予想することができる。
【０２２４】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており
、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタ
ミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプト
ファン）、β−分枝状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側
鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる
。
【０２２５】
本発明はまた、本明細書に示される配列と比較して１つ又は複数の挿入又は欠失も企図
する。いくつかの例において、ポリペプチドは１０個以下、例えば、９個又は８個又は７
個又は６個又は５個又は４個又は３個又は２個の挿入及び／又は欠失を含む。
【０２２６】
システイン残基の位置
本発明は、本明細書において任意の実施形態又は例に記載されるとおりのＦＲ１内の任
意の部位におけるシステイン残基の位置を企図する。
【０２２７】
一例において、本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つ
のシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、
システイン残基が、化合物との残基の少なくとも１つのコンジュゲーションが可能である
ように位置し、及びシステイン残基の少なくとも１つが化合物とコンジュゲートしない場
合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質を提供する。
【０２２８】
別の例において、本発明は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２
つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって
、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも１つのコンジュゲーションが可能であ
るように位置し、及びシステイン残基の少なくとも２つが化合物とコンジュゲートしない
場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質を提供する。
【０２２９】
代替的又は追加的な例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免
疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも１つがフレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイ
ン残基を含み、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも１つのコンジュゲーショ
ンが可能であるように位置し、及びシステイン残基の少なくとも１つが別の化合物とコン
ジュゲートしない場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパ
ク質を提供する。
【０２３０】
代替的又は追加的な例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免
疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも１つがフレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイ
ン残基を含み、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも１つのコンジュゲーショ
ンが可能であるように位置し、及びシステイン残基の少なくとも２つが別の化合物とコン
ジュゲートしない場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパ
ク質を提供する。
【０２３１】
本発明の上記の例の各々において、少なくとも２つの、又はその少なくとも２つのシス
テイン残基は、化合物とのコンジュゲーションが可能であるように位置することが好まし
い。
【０２３２】
本発明の一例において、システイン残基はＦＲ１のループ領域内に位置する。本明細書
で使用されるとき、用語「ＦＲ１のループ領域」は、ＦＲ１の２つの領域及び／又は２つ
のアミノ酸が互いに会合又は結合（例えば、水素結合により）する柔軟性を提供する、例
えば、βシート状の２つのアミノ酸が互いに会合又は結合するのに十分な柔軟性を提供す
るＦＲ１内のアミノ酸の配列を意味するものと解釈されなければならない。ＦＲ１のルー
プ領域はＣＤＲ１の一部ではない。
【０２３３】
別の例において、ＦＲ１におけるシステイン残基は、残基間でのジスルフィド結合の形
成を可能にするように位置する。
【０２３４】
「ジスルフィド結合の形成を可能にするように位置する」とは、タンパク質内で２つの
システイン残基が、タンパク質が折り畳まれたときに残基間にジスルフィド結合が形成さ
れるのに十分に近接するように位置することを意味するものと理解されなければならない
。例えば、２つのシステイン残基における２つの炭素原子間の距離は、互いの約６〜７Å
又は互いの２〜９Å、例えば互いの約３．５〜６．８Å、例えば、互いの約４Å以内であ
ってもよい。タンパク質における残基の近接性を予測する方法及び／又はジスルフィド結
合が形成される可能性を予測する方法は、当業者には明らかで、及び／又は本明細書に記
載される。
【０２３５】
従って一例において、本発明のタンパク質は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置
する少なくとも２つのシステイン残基であって、互いの約２〜９Å以内、好ましくは、互
いの約６〜７Å以内にあるシステイン残基を含む。
【０２３６】
別の例において、システイン残基は、タンパク質においてそれらの側鎖が溶媒に露出さ
れ得る残基に位置する。溶媒露出又は溶媒露出表面積の決定方法は当該技術分野において
公知であり、例えば、Ｓｈｒａｋｅ−Ｒｕｐｌｅｙアルゴリズム又はＬＣＰＯ法が挙げら
れる。
【０２３７】
従って別の例において、本発明のタンパク質は、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位
置する少なくとも２つのシステイン残基であって、それらの側鎖（好ましくはそのチオー
ル基）が溶媒に露出されるように位置するシステイン残基を含む。
【０２３８】
「溶媒に露出される」とは、システイン残基の側鎖が折り畳まれたときのタンパク質の
表面上にあり、従ってタンパク質が存在する、又は懸濁される溶媒と接触可能であること
を意味するものと理解されなければならない。好ましくは、側鎖の少なくとも１つ（又は
一方又は双方）が溶媒に十分に露出し、従ってそこに化合物がコンジュゲートすることが
できる。
【０２３９】
好ましくは、本発明のタンパク質は、以下の１つ又は複数、好ましくは２つ以上、好ま
しくは全てに位置する少なくとも２つのシステイン残基を含む：
（ｉ）それらの側鎖が互いに向かって傾くように位置する；
（ｉｉ）それらの側鎖原子が溶媒に露出されるように位置する；及び／又は
（ｉｉｉ）それらのＣα炭素原子が互いの約６〜７Åにあるように位置する。
【０２４０】
従って本発明のタンパク質（本明細書において本発明の任意の１つ又は複数の例により
記載されるとおりの）は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）内に位置する少なくとも２つ
のシステイン残基であって、ＦＲ１内にジスルフィド結合を形成することができ、或いは
化合物の化学量論的コンジュゲーションのために還元することができるシステイン残基を
提供する。本発明のこれらの生成物は、ＦＲ１内にジスルフィド結合を形成することので
きるフレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を提供
しない他のシステインコンジュゲーション戦略と比べて利点を有する。これらの先行する
非効率な戦略としては、単一のシステイン残基（Ｋｉｍら、２００８年）、Ｃ末端システ
イン残基（Ｓｉｒｋら、２００８年）及びインタクトな抗体における単一のシステイン残
基（Ｊｕｎｕｔｕｌａら、２００８年）が挙げられ、そのいずれもが、低い発現収率、ば
らつきのあるコンジュゲーション及び大規模処理に伴う複雑さをもたらす。さらに、鎖間
ジスルフィド結合の部分的な還元によりシステイン残基にコンジュゲートされた抗体は化
学量論にばらつきがあり（抗体当たり０個から８個に至る薬物）、及び潜在的に１００種
超が生じる（Ｊｕｎｕｔｕｌａら、２００８年）。
【０２４１】
折り畳まれたタンパク質内のループ及び／又は残基位置を予測する方法は、当業者には
明らかで、インシリコ法が挙げられる。例えば、タンパク質の構造的特徴は、Ｘ線結晶構
造解析及び／又はＮＭＲ分光法を用いて決定される三次元生体分子構造を含め、例えばＮ
ＣＢＩ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）によ
るなどの、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、８６００  
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ  ２０８９４のＮａｔｉｏｎａ
ｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｎ
ＣＢＩ）のウェブサイトで利用可能な適切なソフトウェアを使用して決定される。ＮＣＢ
Ｉ保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）は既知のＳｍａｒｔ及びＰｈａｍコレクションか
らのドメインを含み、３Ｄ構造ビューアー（Ｃｎ３Ｄ）へのリンクを有する。ＮＣＢＩ保
存ドメイン構造検索ツール（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕ
ｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌ：ＣＤＡＲＴ）は、隣接タンパク質に対してそのド
メイン構造により事前に計算されたドメイン割り当てを使用する。
【０２４２】
タンパク質又はペプチド二次構造を予測する別の方法が当該技術分野において公知であ
り、及び／又は、例えば、Ｍｏｕｌｔ、１９９６年；Ｃｈｏｕら、１９７４年；Ｃｈｏｕ
ら、１９７４年；Ｃｈｏｕら、１９７８年；Ｃｈｏｕら、１９７８年；又はＣｈｏｕら、
１９７９年に記載されている。
【０２４３】
加えて、タンパク質又はペプチドの二次構造の予測を補助するコンピュータプログラム
が現在利用可能である。一つのかかる二次構造予測方法は、ホモロジーモデリングに基づ
く。例えば、３０％より高い配列同一性、又は４０％より高い類似性を有する２つのタン
パク質は、多くの場合に同様の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（
ＰＤＢ）の最近の拡大により、タンパク質の構造内にある潜在的な折り畳みの数を含め、
二次構造の予測性の向上がもたらされている（Ｈｏｌｍら、１９９９年）。例えば、タン
パク質の構造の決定方法は、例えば米国特許出願公開第２００２０１５０９０６号明細書
に記載され、又はコンピュータプログラム若しくはアルゴリズム、例えば、ＭＯＤＥＬＬ
ＥＲを使用することである（Ｓａｌｉ及びＢｌｕｎｄｅｌｌ、１９９３年）。これらの技
法は、そのタンパク質の配列を、特徴付けられた構造を有するタンパク質の配列とアライ
ンメントすることによる。かかるアラインメントアルゴリズムは当該技術分野において公
知であり、例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴなどのソフトウェアパッケージを通じて利用可能
である。次に、既に特徴付けられているタンパク質又はペプチドにおけるアラインメント
された配列又は部分配列に対応する構造情報に基づき、問い合わせるタンパク質の構造情
報、すなわち三次元構造が予測される。このようにして、免疫グロブリンのＦＲ１領域に
対応するタンパク質の三次元構造のライブラリを作成することが可能である。
【０２４４】
二次構造のさらなる予測方法としては、例えば、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ、１
９９６年）、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１年；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、
１９９０年；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８９年）、及び「進化リンケージ（ｅｖｏｌｕｔ
ｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」が挙げられる。従来のタンパク質配列スレッディング
は、タンパク質の３Ｄ構造スキャフォールドの予測に使用される。典型的には、スレッデ
ィングは、タンパク質の折り畳みを、その配列並びに二次構造及び溶媒露出などのローカ
ルパラメータを組み込むスコアリング関数を用いることにより、候補構造鋳型（例えば、
Ｆｖ又はＦａｂ又はＦＲ１の既知の構造）のライブラリに対してその配列をスレッディン
グ（又は比較）することにより割り当てる方法である（Ｒｏｓｔら  １９９７年；Ｘｕ及
びＸｕ  ２０００年；及びＰａｎｃｈｅｎｋｏら  ２０００年）。例えば、スレッディン
グ法は、問い合わせ配列の各残基についてのアミノ酸配列の二次構造及び溶媒露出度を予
測することから始まる。得られた予測構造の一次元（１Ｄ）プロファイルが、既知の３Ｄ
構造のライブラリの各メンバーにスレッディングされる。各配列−構造対について、動的
計画法を用いて最適なスレッディングが得られる。総合的に最良の配列−構造対が、その
問い合わせ配列についての予測３Ｄ構造となる。二次構造が解かれた免疫グロブリンのＦ
ｖ及びＦａｂ断片の数に起因して、ここでの場合にスレッディングは比較的単純となる。
【０２４５】
２つより多いシステイン残基を含むタンパク質の場合、偶数のシステイン残基（ｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｅｓ）が含まれ、例えば４個又は６個又は８個又は１０個のシス
テイン残基が含まれることが好ましい。例えばシステイン残基は対になり、すなわち２個
の残基の組み合わせが、それらの間にジスルフィド結合が形成され得るように並べられる
。
【０２４６】
好ましくは、本発明のタンパク質は非還元条件下でＦＲ１に遊離チオールを含まず、及
び／又は非還元条件下で別のシステイン残基又は化合物に連結しないシステイン残基を含
まない。
【０２４７】
タンパク質の作製
突然変異誘発
可変領域を含むタンパク質をコードするＤＮＡは、当該技術分野の標準的方法を用いて
単離される。例えば、目的の領域に隣接する可変領域内の保存領域にアニールするプライ
マーが設計され、次にそれらのプライマーを用いて介在核酸が、例えばＰＣＲによって増
幅される。好適な方法及び／又はプライマーは当該技術分野において公知であり、及び／
又は例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）、１９９５年及び／又はＦｒｏｙｅｎら、１９９
５年に記載される。かかる増幅方法に好適な鋳型ＤＮＡ源は、例えば、例えば本明細書に
記載されるとおりの可変領域を含むタンパク質を発現するハイブリドーマ、トランスフェ
クトーマ及び／又は細胞に由来する。
【０２４８】
単離後、ＤＮＡが必要な場所にシステイン残基を含むように、当該技術分野において公
知の様々な方法のいずれかにより修飾される。そのような方法としては、限定はされない
が、タンパク質をコードする予め調製済みのＤＮＡの部位特異的（又はオリゴヌクレオチ
ド媒介性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が
挙げられる。組換えタンパク質の変異型はまた、制限酵素断片操作又は合成オリゴヌクレ
オチドとのオーバーラップ伸長ＰＣＲにより構築されてもよい。変異原性プライマーは１
つ又は複数のシステインコドン置換をコードし、例えばシステインをコードするコドン（
すなわち、ＴＧＴ又はＴＧＣ）を構成する残基を含む。標準的な突然変異誘発技法を用い
てかかる変異ＤＮＡをコードするＤＮＡを生成することができる。一般的な手引きは、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら  １９８９年；及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら  １９９３年に見ることが
できる。
【０２４９】
部位特異的突然変異誘発は、置換変異型、すなわち変異タンパク質を調製する一つの方
法である。この技法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒら  １９
８５年；Ｈｏら  １９８９年；及びＫｕｎｋｅｌ  １９８７年を参照のこと）。簡潔には
、ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発の実施では、初めに出発ＤＮＡを、所望の変異（例え
ば、システインをコードする１つ又は複数のコドンの挿入）をコードするオリゴヌクレオ
チドをかかる出発ＤＮＡの一本鎖とハイブリダイズすることにより変化させる。ハイブリ
ダイゼーション後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
且つ出発ＤＮＡの一本鎖を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼを使用して第２の鎖全
体を合成する。このように、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二
本鎖ＤＮＡに組み込まれる。発現プラスミドにおいて変異が誘発されるタンパク質を発現
する遺伝子内で部位特異的突然変異誘発を実施してもよく、得られたプラスミドを配列決
定し、所望のシステイン置換変異の組込みを確認してもよい。部位特異的プロトコル及び
フォーマットには、市販のキット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異
的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が含まれる。
【０２５０】
ＰＣＲ突然変異誘発もまた、出発タンパク質のアミノ酸配列変異型の作製に好適である
。Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９０年；Ｉｔｏら  １９９１年；Ｂｅｒｎｈａｒｄら  １９９４
年；及びＶａｌｌｅｔｔｅら  １９８９年を参照のこと。簡潔には、少量の鋳型ＤＮＡを
ＰＣＲにおける出発物質として使用するとき、鋳型ＤＮＡの対応する領域と配列が僅かに
異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なる位置においてのみ鋳型配列と異な
る特定のＤＮＡ断片を比較的多量に生成することができる。
【０２５１】
別の変異型調製方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５年により
記載される技法に基づく。出発物質は、変異させる出発タンパク質ＤＮＡを含むプラスミ
ド（又は他のベクター）である。変異させる出発ＤＮＡ中の１つ又は複数のコドンが同定
される。同定された１つ又は複数の変異部位の両側に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位
がなければならない。かかる制限部位が存在しない場合、制限部位を上述のオリゴヌクレ
オチド媒介性突然変異誘発法を用いて出発ＤＮＡにおける適切な位置に導入することで生
成してもよい。それらの部位でプラスミドＤＮＡを切断し、直鎖化する。制限部位間のＤ
ＮＡの配列をコードするが、但し所望の１つ又は複数の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオ
チドが、標準的手順を用いて合成され、ここでオリゴヌクレオチドの２本の鎖は別個に合
成され、次に標準的技術を用いて共にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオ
チドはカセットと称される。このカセットは、直鎖化されたプラスミドの末端と適合する
５’及び３’末端を有するように設計され、従ってこれはプラスミドに直接ライゲートす
ることができる。以上でこのプラスミドは変異ＤＮＡ配列を含む。コードされたシステイ
ン置換を含む変異ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０２５２】
単一の変異はまた、二本鎖プラスミドＤＮＡをＰＣＲベースの突然変異誘発による鋳型
として用いるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によっても生成される（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１年；Ｚｏｌｌｅｒら  １９８３年；Ｚｏｌｌｅｒ及び
Ｓｍｉｔｈ、１９８２年）。
【０２５３】
組換え発現
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸が好ましくは発現ベクター内に置かれ
、次に発現ベクターが、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、好ましく
はジスルフィド架橋又は結合を生じることのできる細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクトされることで、組
換え宿主細胞においてタンパク質の合成が達成される。免疫グロブリンをコードするＤＮ
Ａの細菌における組換え発現に関するレビュー論文としては、Ｓｋｅｒｒａら、（１９９
３年）及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）が挙げられる。これらの目的を達成す
る分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ又は
Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される。多岐にわたるクローニング及びインビトロ増幅方法が組
換え核酸の構築に好適である。組換え免疫グロブリンの作製方法もまた、当該技術分野に
おいて公知である。米国特許第４，８１６，５６７号明細書；米国特許第５２２５５３９
号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第７５６６７７１号明細書又は
米国特許第５５８５０８９号明細書を参照のこと。
【０２５４】
単離後、本発明のタンパク質をコードする核酸は好ましくは、さらなるクローニング（
ＤＮＡの増幅）のため、又は無細胞系若しくは細胞中での発現のため、発現コンストラク
ト又は複製可能ベクターに挿入される。好ましくは、核酸はプロモーターに作動可能に連
結される。
【０２５５】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」はその広義の文脈で解釈されるべき
であり、ＴＡＴＡボックス又はイニシエーターエレメントを含めた正確な転写開始に必要
なゲノム遺伝子の転写制御配列を含み、例えば発生刺激及び／又は外部刺激に応答して、
又は組織特異的な形で核酸の発現を変化させるさらなる制御エレメント（例えば、上流活
性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）は含まれても、又は含ま
れなくてもよい。ここでの文脈では、用語「プロモーター」はまた、それが作動可能に連
結される核酸の発現をもたらし、活性化し、又は亢進させる、組換え、合成若しくは融合
核酸、又は誘導体を記載するためにも用いられる。好ましいプロモーターは、発現をさら
に亢進させ、及び／又は前記核酸の空間的な発現及び／又は時間的な発現を変化させる１
つ又は複数の特定の制御エレメントのさらなるコピーを含み得る。
【０２５６】
本明細書で使用されるとき、用語「〜に作動可能に連結された」は、核酸に対してプロ
モーターが、そのプロモーターにより核酸の発現が制御されるような位置に置かれること
を意味する。
【０２５７】
無細胞発現系もまた本発明により企図される。例えば、本発明のタンパク質をコードす
る核酸が、好適なプロモーター、例えばＴ７プロモーターに作動可能に連結され、得られ
た発現コンストラクトが転写及び翻訳に十分な条件に曝露される。インビトロ発現又は無
細胞発現に典型的な発現ベクターについては記載がなされており、限定はされないが、Ｔ
ＮＴ  Ｔ７系及びＴＮＴ  Ｔ３系（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴベクター及
びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【０２５８】
細胞中での発現には多くのベクターを利用可能である。概してベクター成分としては、
限定はされないが、以下の１つ又は複数が挙げられる：シグナル配列、本発明のタンパク
質をコードする配列（例えば、本明細書に提供される情報から得られる）、エンハンサー
エレメント、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配
列を認識しているであろう。例えば、例示的シグナル配列としては、原核生物分泌シグナ
ル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は耐熱性
エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子
リーダー、又は酸性ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例えば、単純
ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【０２５９】
例示的プロモーターとしては、原核生物において活性であるもの（例えば、ｐｈｏＡプ
ロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ
、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターなどのハイブリッ
ドプロモーター）が挙げられる。これらのプロモーターは、グラム陰性又はグラム陽性微
生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、
例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）
、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモ
ネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア
・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌属（Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａ）、並びにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミ
ス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．エル
ギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含めた、原核生物での
発現に有用である。好ましくは、宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一つの好ましい
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２９４（ＡＴＣＣ  
３１，４４６）であるが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ  １７
７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  
２７，３２５）、ＤＨ５α又はＤＨ１０Ｂなどの他の株も好適である。
【０２６０】
哺乳動物細胞中で活性を有する例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス前
初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内
低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミ
アンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ
）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハン
サー／β−アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター又はその活性断片を含
むハイブリッド制御エレメントが挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４
０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１
）；ヒト胎児由来腎臓系統（２９３細胞又は懸濁培養で成長させるためサブクローニング
した２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；又は
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０２６１】
酵母細胞中、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカ
ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＳ．
ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む群から選択される酵母細胞中での発現に好適な典型的な
プロモーターとしては、限定はされないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモータ
ー、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロ
モーター、ＲＰＲ１プロモーター、又はＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。
【０２６２】
昆虫細胞中での発現に好適な典型的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＯＰ
ＥＩ２プロモーター、ボンビックス・ムリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｕｒｉ）から単離された昆
虫アクチンプロモーター、ドロソフィラ・エスピー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐ．）ｄ
ｓｈプロモーター（Ｍａｒｓｈら  ２０００年）及び誘導性メタロチオネインプロモータ
ーが挙げられる。組換えタンパク質の発現に好ましい昆虫細胞としては、ＢＴ１−ＴＮ−
５Ｂ１−４細胞、及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ）細胞（例えば、ｓｆ１９細胞、ｓｆ２１細胞）を含む群から選択される昆虫
細胞が挙げられる。核酸断片の発現に好適な昆虫としては、限定はされないが、ドロソフ
ィラ・エスピー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐ．）が挙げられる。Ｓ．フルギペルダ（Ｓ
．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の使用もまた企図される。
【０２６３】
単離核酸分子又はそれを含む遺伝子コンストラクトを発現用細胞に導入する手段は、当
業者に公知である。所与の細胞に用いられる技法は、成功を収めている公知の技法に依存
する。組換えＤＮＡの細胞への導入手段としては、とりわけ、マイクロインジェクション
、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆ
ｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ，米国）及び／又はセルフェクチン（ｃｅｌｌｆ
ｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ，米国）の使用によるなどのリポソーム媒介性トランス
フェクション、ＰＥＧ媒介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔及びＤＮＡがコーティングされた
タングステン又は金粒子の使用によるなどの微粒子銃（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．、
ＷＩ，米国）が挙げられる。
【０２６４】
本発明のタンパク質の作製に使用される宿主細胞は、用いられる細胞型に応じて様々な
培地で培養され得る。Ｈａｍ  Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓ
ｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（
ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、哺乳動物細胞の培養に好適である。本明
細書で考察される他の細胞型の培養用培地は、当該技術分野において公知である。
【０２６５】
タンパク質の単離
本発明のタンパク質は、好ましくは単離される。「単離される」とは、タンパク質が実
質的に精製され、又はその天然に存在する環境から取り出されて、例えば異種環境中にあ
ることを意味する。「実質的に精製される」とは、タンパク質が夾雑物質を実質的に含ま
ない、例えば、夾雑物質を少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０
％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％含まないことを意味する。
【０２６６】
本発明のタンパク質の精製方法は当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細
書に記載される。
【０２６７】
組換え技術を用いるとき、本発明のタンパク質は、細胞内で産生するか、細胞膜周辺腔
で産生するか、又は培地中に直接分泌させることができる。タンパク質が細胞内産生され
る場合、第一段階として、粒子状残屑が、宿主細胞又は溶解断片のいずれも、例えば遠心
又は限外ろ過により取り除かれる。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順について記載している。簡潔には
、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｐ
ＭＳＦ）の存在下で細胞ペーストを約３０分間解凍する。遠心により細胞残屑を取り除く
ことができる。タンパク質が培地中に分泌される場合、概して初めにかかる発現系からの
上清が、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮される。タンパク質分解を抑制するた
め、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を前述のステップのいずれかに含めてもよく、及
び外来性の夾雑物の増加を防ぐため、抗生物質を含めてもよい。
【０２６８】
細胞から調製されるタンパク質は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製すること
ができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。アフィニティリ
ガンドとしてのプロテインＡの適合性は、タンパク質中に存在する任意の免疫グロブリン
Ｆｃドメイン（仮に存在する場合）の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使
用して、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく免疫グロブリンを精製することができる
（Ｌｉｎｄｍａｒｋら  １９８３年）。プロテインＧは、あらゆるマウスアイソタイプ及
びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら  １９８６年）。他の場合には、本発明のタンパク
質における可変領域が結合する、又はそれを生じさせた抗原又はエピトープ決定基を使用
してアフィニティ精製を実施することができる。アフィニティリガンドが結び付くマトリ
ックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コ
ントロールド・ポア・グラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ
（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで実現
できるものと比べてより高い流量及びより短い処理時間が可能である。回収されるタンパ
ク質に応じて、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでの
クロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰
イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー
、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタ
ンパク質精製技法もまた利用可能である。
【０２６９】
当業者はまた、本発明のタンパク質が、精製又は検出を促進するタグ、例えば、ポリ−
ヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルス赤血球凝
集素（ＨＡ）タグ、又はシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、又はＦＬＡＧタグ、又はグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように修飾され得ることも認識す
るであろう。好ましくは、タグはヘキサ−ｈｉｓタグである。得られるタンパク質は、次
にアフィニティ精製などの当該技術分野において公知の方法を用いて精製される。例えば
、ヘキサ−ｈｉｓタグを含むタンパク質の精製は、タンパク質を含む試料を、固体又は半
固体担体上に固定化されたヘキサ−ｈｉｓタグを特異的に結合するニッケル−ニトリロ三
酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と接触させ、試料を洗浄して未結合のタンパク質を除去し、続いて
結合したタンパク質を溶離させることにより行われる。それに代えて又は加えて、アフィ
ニティ精製法ではタグに結合するリガンド又は抗体が用いられる。
【０２７０】
１つ又は複数の任意の予備的な精製ステップの後、本発明のタンパク質及び夾雑物を含
む混合物は、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０２７１】
タンパク質の合成
本発明のタンパク質は、その決定されたアミノ酸配列から標準的な技術を用いて、例え
ば、ＢＯＣ又はＦＭＯＣ化学を用いて容易に合成される。合成ペプチドは、固相、液相、
又はペプチド縮合の公知の技法、又はそれらの任意の組み合わせを用いて調製され、及び
天然及び／又は非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸
は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３年の当初の固相手順の脱保護、中和、カップリング
及び洗浄プロトコルを伴う標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル）アミノ酸樹脂、又はＣａｒｐｉｎｏ及びＨａｎ、１９７２年により記載される
塩基不安定Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸
であり得る。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃの双方のＮα−アミノ保護アミノ酸とも、例えば、Ｆｌ
ｕｋａ、Ｂａｃｈｅｍ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｂａｃｈｅｍ、又はＰｅｎｉｎ
ｓｕｌａ  Ｌａｂｓなどの様々な商業的供給元から入手することができる。
【０２７２】
コンジュゲート
本発明はまた、本明細書において任意の実施形態により記載されるタンパク質のコンジ
ュゲートも提供する。タンパク質をコンジュゲートすることのできる化合物の例は、放射
性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、
対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から
選択される化合物である。例示的治療剤としては、限定はされないが、抗血管形成剤、新
血管新生及び／又は他の血管新生の阻害剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤
又は治療用核酸が挙げられる。
【０２７３】
毒素としては、細胞にとって有害な（例えば、それを死滅させる）任意の薬剤が挙げら
れる。当該技術分野において公知のそれらの薬物クラス、及びその作用機序についての説
明は、Ｇｏｏｄｍａｎら、「Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第８版
、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９０年を参照のこと。免疫
グロブリン−免疫毒素コンジュゲートの調製に関するさらなる技法が、例えばＶｉｔｅｔ
ｔａ（１９９３年）及び米国特許第５，１９４，５９４号明細書に提供される。例示的毒
素としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（シュ
ードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、
リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、アリューリテス・フォルディイ
（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タ
ンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タン
パク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（ｍｏ
ｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害薬、クルシン、クロチン、サパオナリア・オ
フィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害薬、ゲロニン、ミ
トゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン
及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。例えば、国際公開第９３
／２１２３２号パンフレットを参照のこと。
【０２７４】
本発明のイムノコンジュゲートの形成に好適な化学療法剤としては、タキソール、サイ
トカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシ
ド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチ
ン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサント
ロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デ−ヒドロテストステロン、グルココ
ルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロ
マイシン、代謝拮抗薬（メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、
シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、
アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど）、アルキル化剤（メクロレタミン
、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮ
Ｕ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシ
ンＣ、シスプラチン及びその他の、カルボプラチンなどの白金誘導体など）、抗生物質（
ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（旧ダウノ
マイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキ
サントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）など）が挙げられる。
【０２７５】
好適な血管形成阻害薬（抗血管形成剤）の例としては、限定はされないが、ウロキナー
ゼ阻害薬、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬（マリマスタット、ノバスタット、Ｂ
ＡＹ  １２−９５６６、ＡＧ  ３３４０、ＢＭＳ−２７５２９１及び同様の薬剤など）、
内皮細胞の遊走及び増殖阻害薬（ＴＮＰ−４７０、スクアラミン、２−メトキシエストラ
ジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ペニシラミン、Ｓ
ＣＨ６６３３６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）
、Ｒ１１５７７７（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，Ｉｎｃ、Ｔｉｔｕｓ
ｖｉｌｌｅ，ＮＪ）及び同様の薬剤など）、血管形成成長因子の拮抗薬（ＺＤ６４７４、
ＳＵ６６６８、血管形成剤に対する抗体及び／又はその受容体（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及
びアンギオポエチン−１など）、サリドマイド、サリドマイド類似体（ＣＣ  ５０１３な
ど）、Ｓｕｇｅｎ  ５４１６、ＳＵ５４０２、抗血管形成リボザイム（アンギオザイムな
ど）、インターフェロンα（インターフェロンα２ａなど）、スラミン及び同様の薬剤な
ど）、ＶＥＧＦ−Ｒキナーゼ阻害薬及びその他の抗血管形成チロシンキナーゼ阻害薬（Ｓ
Ｕ０１１２４８など）、内皮特異的インテグリン／生存シグナル伝達の阻害薬（ビタキシ
ン及び同様の薬剤など）、銅アンタゴニスト／キレート剤（テトラチオモリブデート、カ
プトプリル及び同様の薬剤など）、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）、ＡＢＴ−
６２７、ＣＭ１０１、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＭ８６２、ＰＮＵ１４
５１５６Ｅ並びに血管形成を阻害するヌクレオチド分子（アンチセンス−ＶＥＧＦ−ｃＤ
ＮＡ、アンジオスタチンをコードするｃＤＮＡ、ｐ５３をコードするｃＤＮＡ及び欠損Ｖ
ＥＧＦ受容体−２をコードするｃＤＮＡなど）及び同様の薬剤が挙げられる。血管形成、
新血管新生、及び／又は他の血管新生の阻害薬の他の例は、抗血管形成ヘパリン誘導体及
び関連分子（例えば、ヘペリナーゼＩＩＩ（ｈｅｐｅｒｉｎａｓｅ  ＩＩＩ））、テモゾ
ロミド、ＮＫ４、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、シクロオキシゲナーゼ−２阻
害薬、低酸素誘導因子１の阻害薬、抗血管形成大豆イソフラボン、オルチプラズ、フマギ
リン及びその類似体、ソマトスタチン類似体、ペントサンポリサルフェート、テコガラン
ナトリウム、ダルテパリン、タムスタチン、トロンボスポンジン、ＮＭ−３、コンブレス
タチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン、アバスタチン、他の関連標的に対
する抗体（抗α−ｖ／β−３インテグリン及び抗キニノスタチンｍＡｂｓなど）及び同様
の薬剤である。
【０２７６】
一例において、本明細書において任意の実施形態により記載されるとおりのタンパク質
は、例えば本明細書に記載されるとおりの、免疫グロブリン又はそれに由来するタンパク
質などの、本発明の別のタンパク質又は免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質を含め
た、別のタンパク質にコンジュゲート又は連結される。他のタンパク質が除外されること
はない。さらなるタンパク質は当業者に明らかで、例えば、とりわけ免疫調節薬又は半減
期を延長するタンパク質若しくはペプチド又は血清アルブミンに結合する他のタンパク質
が挙げられる。
【０２７７】
例示的免疫調節薬としてはサイトカイン及びケモカインが挙げられる。用語「サイトカ
イン」は、ある細胞集団により放出されるタンパク質又はペプチドであって、別の細胞に
対して細胞間メディエーターとして作用するタンパク質又はペプチドの総称である。サイ
トカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、成長因子及び従来のポリペプチドホ
ルモンが挙げられる。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成
長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン、サイロキシ
ン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン
、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）など、肝成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラク
チン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー管抑制
物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、イン
テグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−Ｂなどの神経成長因子、血小板成長因
子、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因
子−Ｉ又は−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、
−β、又は−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロ
ファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及
び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ
−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、Ｉ
Ｌ−９、ＩＬ−ＩＯ５  ＩＬ−Ｉ１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５
、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１及びＬＩＦなどが含まれる。
【０２７８】
ケモカインは、概して化学誘引物質として作用し、免疫エフェクター細胞をケモカイン
発現部位に動員する。ケモカインとしては、限定はされないが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ
、Ｍ１Ｐ１−α又はＭＩＰ１−βが挙げられる。当業者は、特定のサイトカインが化学走
化作用を有することでも知られ、それらもまた用語ケモカインに分類され得ることを認識
するであろう。
【０２７９】
例示的な血清アルブミン結合ペプチド又はタンパク質は、米国特許出願公開第２００６
０２２８３６４号明細書又は米国特許出願公開第２００８０２６０７５７号明細書に記載
される。
【０２８０】
放射性コンジュゲート化タンパク質の作製には、様々な放射性核種を利用することが可
能である。例としては、限定はされないが、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ
、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなどの、低エネルギー
放射性核種（例えば診断目的に好適）が挙げられる。好ましくは放射性核種は、投与とイ
メージング部位への局在化との間の経過時間後に活性又は検出を可能にするのに好適な半
減期を有する、γ線、光子、又は陽電子放出放射性核種である。本発明はまた、１２５Ｉ
、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１
６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅなどの高エネルギー放射性核種（例え
ば治療目的としての）も包含する。これらの同位体は、典型的には短い経路長を有する高
エネルギーα粒子又はβ粒子を生じる。かかる放射性核種は、それらが近接する細胞、例
えばコンジュゲートが結合又は侵入した腫瘍性細胞を死滅させる。放射性核種は局在化し
ていない細胞には影響をほとんど又は全く与えず、本質的に非免疫原性である。或いは、
高エネルギー同位体は、例えばホウ素中性子捕捉療法の場合のように、本来安定的な同位
体の熱照射により生成されてもよい（Ｇｕａｎら、１９９８年）。
【０２８１】
別の実施形態において、タンパク質は、プレターゲティングに利用される「受容体」（
ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートされ、ここではコンジュゲートが患者に投与
され、続いて未結合のコンジュゲートが除去剤を使用して循環中から除去され、次に治療
剤（例えば、ラジオヌクレオチド）にコンジュゲートした「リガンド」（例えば、アビジ
ン）が投与される。
【０２８２】
本発明のタンパク質は、当該技術分野において公知の、且つ容易に入手可能なさらなる
非タンパク様部分を含むように修飾することができる。好ましくは、タンパク質の誘導体
化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定
はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、
エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラ
ン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ
酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ
−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒ
ｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＰＧ）ホモポリマー、プロリプロピレンオキシド（
ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシ
エチレン化ポリオール（例えば、グリセロール；ＰＯＧ）、ポリビニルアルコール、及び
その混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが、水中でのそ
の安定性により、製造において利点を有し得る。
【０２８３】
ポリマー分子は、典型的には、例えば約２〜約１０００個、又は約２〜約３００個の反
復単位を有するものとして特徴付けられる。
【０２８４】
例えば水溶性ポリマーとしては、限定はされないが、ＰＥＧ、ポリ（エチレンオキシド
）（ＰＥＯ）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチ
ルセルロース、又はデキストランが挙げられ、これらはタンパク質の安定性又はサイズ等
を増加させるため、一般にタンパク質にコンジュゲートされる。
【０２８５】
ＰＥＧ、ＰＥＯ又はＰＯＥはエチレンオキシドのオリゴマー又はポリマーを指す。ＰＥ
Ｇの場合、これらのオリゴマー又はポリマーは、例えば、水酸化物イオンのエポキシド環
に対する求核攻撃により惹起されるエチレンオキシドのアニオン開環重合により生成され
る。タンパク質修飾に最も有用な形態のＰＥＧのうちの一つは、モノメトキシＰＥＧ（ｍ
ＰＥＧ）である。
【０２８６】
好ましいＰＥＧは単分散又は多分散であり、好ましくは単分散である。当業者は、ＰＥ
Ｇが多分散であっても、又は単分散であってもよいことを認識するであろう。多分散ＰＥ
Ｇは、異なる分子量を有するＰＥＧの混合物を含む。多分散ＰＥＧの場合、特定の分子量
に対する参照は、その混合物中のＰＥＧの数平均分子量を指すと理解され得る。サイズ分
布はその重量平均分子量（ＭＷ）及びその数平均分子量（Ｍｎ）により統計的に特徴付け
られ、それらの分子量の比は多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と称される。ＭＷ及びＭｎは、
特定の態様では質量分析により計測される。ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートの多く、
特に１ＫＤより大きいＰＥＧにコンジュゲートしたものは、親ＰＥＧ分子の多分散性に起
因して様々な範囲の分子量を呈する。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ
−０２０ＨＳ、ＮＯＦ）の場合、実際の分子質量は１．５〜３．０ＫＤの範囲に分布し、
多分散性指数は１．０３６である。
【０２８７】
上記に基づき当業者は、単分散ＰＥＧが、実質的に同じ分子量を含むＰＥＧの混合物を
含むことを認識するであろう。単分散ＰＥＧは、例えばＰｏｌｙｐｕｒｅ  ＡＳ、ノルウ
ェーから市販されている。
【０２８８】
ＰＥＧの平均分子量又は好ましい分子量は約５００Ｄａ〜約２００ｋＤａの範囲であり
得る。例えば、ＰＥＧの分子量は約１〜約１００ｋＤａ、約１．５〜約５０ｋＤａ、約１
．５〜約１０ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約５ｋＤａ、約１．５ｋＤａ〜約ｋＤａ、約１．
５〜約２ｋＤａである。
【０２８９】
好ましくは、ＰＥＧは単分散であり、約５００Ｄａの分子量を有する。好ましくは、Ｐ
ＥＧは約１．５ｋＤａの分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは約２ｋＤａの分子量を有
する。
【０２９０】
好ましくは、ＰＥＧは、マレイミド基などの反応基を含む。好ましくは、ＰＥＧはＰＥ
Ｇ２４−マレイミドである。
【０２９１】
生理学的に許容可能なポリマー分子は特定の構造に限定されるものではなく、様々な態
様において、直鎖状（例えばアルコキシＰＥＧ又は二官能性ＰＥＧ）、分枝鎖状又はマル
チアーム状（例えばフォーク型ＰＥＧ又はポリオールコアに結合したＰＥＧ）、樹枝状（
ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ）であるか、又は分解性連結を含む。さらに、ポリマー分子の内部構
造は種々のパターンのいずれかに組織化され、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダム
コポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロ
ックトリポリマーからなる群から選択される。
【０２９２】
タンパク質に結合するポリマーの数は様々であってよく、及び１つより多いポリマーが
結び付く場合に、ポリマーは同じ分子であっても、又は異なる分子であってもよい。一般
に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定はされないが、改良され
るタンパク質の特定の特性又は機能、タンパク質誘導体が限定条件下での治療に使用され
ることになるかどうか等を含む考慮事項に基づき決定することができる。
【０２９３】
当業者は、タンパク質とのコンジュゲーションに先立ち、一方又は双方の末端に官能基
を有する誘導体を調製することにより、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を活性化させる必要
があり得ることを認識するであろう。
【０２９４】
本発明のタンパク質とのコンジュゲーションに特に好ましい化合物を表１に示す。
【０２９５】
【表１】
0006371319.tif 000002
【０２９６】
本発明の一例では、化合物と、それがコンジュゲートされるタンパク質との間に、スペ
ーサー部分が含まれる。本発明のスペーサー部分は切断可能であっても、又は切断不可能
であってもよい。例えば、切断可能なスペーサー部分はレドックス切断可能なスペーサー
部分であり、従ってスペーサー部分は、細胞質などの、酸化還元ポテンシャルがより低い
環境中及び遊離スルフヒドリル基を含む分子の濃度がより高い他の領域において切断可能
である。酸化還元ポテンシャルの変化により切断され得るスペーサー部分の例としては、
ジスルフィドを含むものが挙げられ得る。切断刺激は、コンジュゲートタンパク質が細胞
内に取り込まれた時に提供されることができ、そこではより低い酸化還元ポテンシャルの
細胞質がスペーサー部分の切断を促進する。
【０２９７】
別の例では、ｐＨの低下によってスペーサーの切断が引き起こされ、それにより化合物
が標的細胞中に放出される。ｐＨの低下は、エンドソーム輸送、腫瘍増殖、炎症、及び心
筋虚血などの、多くの生理学的及び病理学的過程に関与する。ｐＨは生理学的な７．４か
らエンドソームにおいて５〜６に、又はリソソームにおいて４〜５に降下する。癌細胞の
リソソーム又はエンドソームの標的化に用いられ得る酸感受性スペーサー部分の例として
は、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、ｃｉｓ−アコニチ
ル、又はチオカルバモイルに見られるものなどの、酸切断可能な結合を有するものが挙げ
られる（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号明細書、同第４，６３１，１９０号明
細書、同第５，３０６，８０９号明細書、及び同第５，６６５，３５８号明細書を参照の
こと）。他の例示的な酸感受性スペーサー部分はジペプチド配列Ｐｈｅ−Ｌｙｓ及びＶａ
ｌ−Ｌｙｓを含む。
【０２９８】
切断可能なスペーサー部分は、特定の標的細胞に関連する生物学的起源の切断剤、例え
ば、リソソーム酵素又は腫瘍関連酵素に対して感受性を有し得る。酵素切断することので
きる連結部分の例としては、限定はされないが、ペプチド及びエステルが挙げられる。例
示的な酵素切断可能な連結部分としては、カテプシンＢ又はプラスミンなどの腫瘍関連プ
ロテアーゼに対して感受性を有するものが挙げられる。カテプシンＢにより切断可能な部
位としては、ジペプチド配列バリン−シトルリン及びフェニルアラニン−リジンが挙げら
れる。
【０２９９】
コンジュゲーション方法
システイン（チオール）とのコンジュゲーション
化合物をシステイン残基にコンジュゲートするための様々な方法が当該技術分野におい
て公知であり、当業者には明らかであろう。かかるコンジュゲーション用の試薬は、典型
的には反応性の官能基を有し、それが（ｉ）システインのシステインチオールと直接反応
して標識タンパク質を形成し得るか、（ｉｉ）リンカー試薬と反応してリンカー−標識中
間体を形成し得るか、又は（ｉｉｉ）リンカータンパク質と反応して標識タンパク質を形
成し得る。リンカーの場合、有機化学反応、条件、及び試薬を用いるいくつかの経路が当
業者に公知であり、それらとしては（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー
試薬と反応させ、それにより共有結合を介したタンパク質−リンカー中間体を形成し、続
いて活性化化合物と反応させること；及び（２）化合物の求核基をリンカー試薬と反応さ
せ、それにより共有結合を介した化合物−リンカー中間体を形成し、続いて本発明のタン
パク質のシステイン基と反応させることが挙げられる。上記から当業者には明らかなとお
り、本発明では二官能性リンカーが有用である。例えば、二官能性リンカーは、１つ又は
複数のシステイン残基と共有結合で連結するためのチオール修飾基と、化合物と共有結合
的又は非共有結合的に連結するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２のチオー
ル修飾部分）とを含む。
【０３００】
様々なタンパク質及び化合物（及びリンカー）を使用して、本発明のコンジュゲートを
調製することができる。システインチオール基は求核性であり、（ｉ）活性エステル、例
えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物；（ｉ
ｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド基
、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基；及び（ｉｖ）スルフィド交換を介した
、ピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む、リンカー試薬又は化合物−リンカー
中間体又は薬物上の求電子基と反応することにより共有結合を形成することが可能である
。化合物又はリンカー上の求核基としては、限定はされないが、リンカー部分及びリンカ
ー試薬上の求電子基と反応することにより共有結合を形成することが可能な、アミン基、
チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカル
バゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、及びアリールヒドラジン基が挙げられる。
【０３０１】
好ましい標識試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシン
イミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリア
ジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びホスホラミダイトが挙げられるが、他の
官能基もまた用いることができる。
【０３０２】
メイタンシンが、例えばＭａｙ−ＳＳＣＨ３に変換されてもよく、これを遊離チオール
のＭａｙ−ＳＨに還元して本発明のタンパク質と反応させることができ（Ｃｈａｒｉら、
１９９２年）、それによりジスルフィドリンカーを含むメイタンシノイド−イムノコンジ
ュゲートが得られる。ジスルフィドリンカーを含むメイタンシノイドコンジュゲートは報
告されている（国際公開第０４／０１６８０１号パンフレット；米国特許第６８８４８７
４号明細書；及び国際公開第０３／０６８１４４号パンフレット）。ジスルフィドリンカ
ーＳＰＰは、リンカー試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエー
トを含んで構成される。
【０３０３】
別の例示的な反応性官能基は、化合物、例えばビオチン又は蛍光色素又は毒素又はタン
パク質のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）で
ある。化合物のＮＨＳエステルは、予め形成し、単離し、精製し、及び／又は特徴付けて
もよく、又はインサイチュで形成してタンパク質の求核基と反応させてもよい。典型的に
は、カルボキシル型の化合物は、何らかの組み合わせのカルボジイミド試薬、例えばジシ
クロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、又はウロニウム試薬、例
えばＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロ
ニウムテトラフルオロホウ酸、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ
，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）、又はＨＡＴＵ（
Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ
ロニウムヘキサフルオロホスファート）、アクチベータ、例えば１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（ＨＯＢｔ）、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより活
性化され、化合物のＮＨＳエステルが得られる。ある場合には、化合物とタンパク質とを
化合物のインサイチュでの活性化及びタンパク質との反応によりカップリングして、一段
階でコンジュゲートを形成してもよい。他の活性化及びカップリング試薬としては、ＴＢ
ＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニ
ウムヘキサフルオロホスファート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ
ロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロホスファート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾー
ル−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、
ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイ
ミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，
４−トリアゾール、及びアリールスルホニルハライド、例えばトリイソプロピルベンゼン
スルホニルクロリドが挙げられる。
【０３０４】
さらなるコンジュゲーション方法としては、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド
（ｉｏｄｏａｃｅｔｉｍｉｄｅ）又はハロゲン化ハロアセチル／アルキル、アジリジン（
ａｚｉｒｉｄｎｅ）、アクリロイル誘導体を使用してシステインのチオールと反応させ、
化合物との反応性を有するチオエーテルを作製することが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｅ
ｌｔｅら、２０００年（マレイミドの使用）；Ｒｅｄｄｙら、１９８８年（マレイミド誘
導体の使用）；Ｒａｍｓｅｉｅｒ及びＣｈａｎｇ、１９９４年（ヨードアセトアミド（ｉ
ｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）の使用）；Ｅｉｓｅｎら、１９５３年（２，４−ジニトロベン
ゼンスルホン酸（ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）の使用）；
Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９８１年（アジリジンの使用）；又はＹｅｍら、１９９２年（ア
クリロイル誘導体の使用）。遊離チオールの活性化ピリジルジスルフィドとのジスルフィ
ド交換もまたコンジュゲートの作製に有用である（Ｋｉｎｇら、１９７８年及びそこで引
用される参考文献、例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香（ＴＮＢ）酸の使用）。好まし
くは、マレイミドが使用される。
【０３０５】
放射標識コンジュゲートの使用に関して、本発明のタンパク質は直接標識されてもよく
（ヨウ素化によるなど）、又はキレート剤の使用によって間接的に標識されてもよい。本
明細書で使用されるとき、語句「間接的に標識する」及び「間接的な標識手法」は双方と
も、キレート剤がタンパク質に共有結合で結び付き、且つ少なくとも１つの放射性核種が
そのキレート剤と会合することを意味する。かかるキレート剤は、タンパク質及び放射性
同位体の双方に結合するため、典型的には二官能性キレート剤と称される。例示的なキレ
ート剤は、１−イソチオシクマトベンジル（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ
）−３−メチルジオテレントリアミン五酢酸（ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ  ｔｒ
ｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）及びシクロヘ
キシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体、又はＤＯＴＡを含
む。ＤＯＴＡ−マレイミド（４−マレイミドブチルアミドベンジル−ＤＯＴＡ）などのリ
ンカー試薬は、Ａｘｗｏｒｔｈｙら（２０００年）の手順に従い、アミノベンジル−ＤＯ
ＴＡを、クロロギ酸イソプロピル（Ａｌｄｒｉｃｈ）により活性化されたＡ−マレイミド
酪酸（Ｆｌｕｋａ）と反応させることにより調製することができる。ＤＯＴＡ−マレイミ
ド試薬は本発明のタンパク質の遊離システインアミノ酸と反応し、そこに金属錯体リガン
ドを提供する（Ｌｅｗｉｓら、１９９８年）。ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（ｌ，４，７，１０−テ
トラアザシクロドデカン−ｌ，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル）などのキレート化リンカー標識試薬が市販されている（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌ
ｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）。
【０３０６】
連結前に、本発明のタンパク質をＤＴＴ（クレランド試薬のジチオスレイトール）又は
ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Ｇｅｔｚら、１９９９年
；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの還元剤で処理するこ
とにより、リンカー試薬とのコンジュゲーション用に反応性にすることが好ましい。室温
での希薄（２００ｎＭ）水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）との連結に必要のないシステイン残基
間に、ジスルフィド結合を再び確立することができる。当該技術分野において公知の他の
オキシダント、すなわち酸化剤、及び酸化条件が用いられてもよい。周囲空気酸化もまた
有効である。この穏やかな部分的再酸化ステップにより、鎖内ジスルフィドが高忠実度で
効率的に形成される。
【０３０７】
スレオニン／セリンとのコンジュゲーション
化合物をスレオニン残基又はセリン残基とコンジュゲートするための方法もまた、当該
技術分野において公知である。例えば、Ｚｈａｎｇ及びＴａｍ（１９９６年）は、セリン
又はスレオニンの１，２−アミノアルコールからカルボニル前駆体を誘導し、これを過ヨ
ウ素酸酸化により選択的に、且つ高速でアルデヒド型に変換することができる方法を記載
している。本発明のタンパク質に結合させる化合物中のシステインの１，２−アミノチオ
ールとアルデヒドを反応させると、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は
、Ｎ末端セリン残基又はスレオニン残基のタンパク質の標識に特に有用である。
【０３０８】
ペグ化方法
化合物、例えばＰＥＧをタンパク質とコンジュゲートするための様々な方法が当該技術
分野において公知である。ＰＥＧの場合、分子は、アミン又はイミダゾール、カルボン酸
基、ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基とのその結合を促進するように活性化すること
ができる。
【０３０９】
例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（１９７７年）は、塩化シアヌルを使用してＰＥＧを
活性化し、ＰＥＧジクロロトリアジン誘導体を作製した。この誘導体は、リジン、セリン
、チロシン、システイン及びヒスチジンなどの複数の機能的求核性官能基と反応すること
ができる。このプロトコルの改良版によりＰＥＧ−クロロトリアジンが作製されており、
これは反応性がより低く、リジン残基又はシステイン残基とより選択的にコンジュゲート
する（Ｍｕｔｓｕｓｈｉｍａら、１９８０年）。
【０３１０】
タンパク質とのコンジュゲーションに使用されるＰＥＧのなかで広く用いられている２
つの形態は、スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ；Ｚａｌｉｐｓｋｙら
、１９９２年）及びベンゾトリアゾールカーボネートＰＥＧ（ＢＴＣ−ＰＥＧ；米国特許
第５，５６０，２３４号明細書）である。これらの化合物の双方とも、リジン残基と選択
的に反応してカルバメート連結を形成するが、しかしながらヒスチジン及びチロシンと反
応することも知られている。ＳＣ−ＰＥＧは、ＢＴＣ−ＰＥＧと比べて加水分解に対する
抵抗性が若干高い。
【０３１１】
タンパク質とのコンジュゲーションに有用な別のＰＥＧは、ＰＥＧ−プロピオンアルデ
ヒドである（米国特許第５，２５２，７１４号明細書）。この化学の利点は、酸性条件下
（約ｐＨ５）では大部分がＮ末端α−アミンについて選択的であり、従って非特異的なコ
ンジュゲーションに関する潜在的な問題が回避される。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドの
アセタール誘導体、すなわちＰＥＧ−アセタールアルデヒドは、それがＰＥＧ−プロピオ
ンアルデヒドより長い貯蔵を提供する限りにおいてさらなる利益を提供する（米国特許第
５，９９０，２３７号明細書）。
【０３１２】
ＰＥＧカルボン酸の活性エステルは、おそらくタンパク質コンジュゲーションに最も用
いられているアシル化剤の一つである。活性エステルはほぼ生理学的条件で第一級アミン
と反応して安定なアミドを形成する。ＰＥＧ−カルボン酸のスクシンイミジル活性エステ
ルへの活性化は、ＰＥＧ−カルボン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ又はＨＯ
Ｓｕ）及びカルボジイミドと反応させることにより達成される。ＰＥＧの例示的カルボン
酸誘導体としては、カルボキシメチル化ＰＥＧ（ＣＭ−ＰＥＧ；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１
９９０年）、ブタン酸誘導体及びプロピオン酸誘導体（米国特許第５，６７２，６６２号
明細書）が挙げられる。メチレン単位の付加により活性エステルとＰＥＧ骨格との間の距
離を変化させると、水及びアミンに対する反応性に劇的な影響を（例えば、加水分解の減
少により）及ぼすことができる。それに代えて又は加えて、加水分解は、カルボン酸に対
してα−分枝部分を導入することにより低減することができる。
【０３１３】
タンパク質中の遊離システイン残基のペグ化は、部位特異的コンジュゲーション（例え
ば、本明細書に記載されるとおりのシステイン残基を含むように修飾されたタンパク質を
使用する）に有用である。システインコンジュゲーション用の例示的ＰＥＧ誘導体として
は、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド及びＰ
ＥＧ−オルトピリジルジスルフィドが挙げられる。ＰＥＧのシステイン残基との例示的な
コンジュゲーション方法は、Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ（１９９０）及び／又は上記
に記載される。ＰＥＧ−ビニルスルホンを使用した例示的コンジュゲーション方法は、例
えばＬｉら（２００６年）に記載される。
【０３１４】
米国特許第５９８５２６３号明細書は、ヒスチジンの、ｐＫａが第一級アミンより低い
第二級アミン基に対してＰＥＧをコンジュゲートする方法について記載する。この手法の
利点は、アシル−ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｎｅ）結合が安定でない、つまりタンパク質
が徐々に放出されることである（すなわち、コンジュゲートは徐放製剤又はプロドラッグ
として振舞う）。
【０３１５】
別のペグ化手法は、上記に考察されるとおりの過ヨウ素酸塩に変換することのできるＮ
末端セリン又はスレオニンを利用するものである。この手法を用いてＰＥＧが生理活性タ
ンパク質にコンジュゲートされている（例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ及びＯｆｆｏｒｄ、１
９９６年）。
【０３１６】
ＰＥＧはまた、炭水化物基にコンジュゲートすることもできる。
【０３１７】
本発明はまた、可逆的ペグ化戦略の使用も包含する。
【０３１８】
使用
本発明のタンパク質は、研究、診断及び治療における用途を含め、様々な用途に有用で
ある。タンパク質が結合する抗原によっては、例えば細胞を死滅させたり、又は増殖を抑
えたりするための、細胞への化合物の送達、及び／又はイメージング、及び／又はインビ
トロアッセイに有用であり得る。一例において、タンパク質は、イメージング及び細胞傷
害剤の細胞への送達の双方に有用であり、すなわち検出可能標識と細胞傷害剤とに、又は
一部が細胞傷害剤にコンジュゲートし、且つ一部が検出可能標識にコンジュゲートしてい
るタンパク質の混合物を含む組成物にコンジュゲートされる。
【０３１９】
本明細書に記載されるタンパク質はまた、（ａ）受容体に対する（例えば、リガンド、
阻害因子の）結合、（ｂ）受容体シグナル伝達機能、及び／又は（ｃ）刺激機能を阻害す
る（低減又は抑制することのできる）阻害薬としても作用することができる。受容体機能
の阻害薬として作用するタンパク質は、リガンド結合を直接的又は間接的に（例えば、コ
ンホメーション変化を引き起こすことにより）阻止することができる。
【０３２０】
抗原
本発明は、任意の１つ又は複数の抗原との特異的な結合能を有するＦＲ１に少なくとも
２つのシステイン残基を含む少なくとも１つの可変領域を含むタンパク質を企図し、すな
わち、本発明の例は、特定の抗原を要件とすることに対比して汎用的である。
【０３２１】
本発明の例は、疾患又は障害（すなわち、病態）に関連する、例えば、癌又は癌性／癌
化細胞に関連する、又はそれにより発現される、及び／又は自己免疫疾患に関連する、及
び／又は炎症性疾患又は病態に関連する、及び／又は神経変性疾患に関連する、及び／又
は免疫不全障害に関連する抗原に特異的に結合するタンパク質を企図する。
【０３２２】
本発明のタンパク質を作製する対象となり得る例示的抗原としては、ＢＭＰＲ１Ｂ（骨
形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｄｉｊｋｅら  １９９４年、国際公開第２００４０６３３
６２号パンフレット）；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、国際公開第２００４０４８９
３８号パンフレット）；ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原；国際公開第２００
４０６５５７７号パンフレット）；ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６、国際公開第２００４０４５
５５３号パンフレット）；ＭＰＦ（ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、国
際公開第２００３１０１２８３号パンフレット）；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰ
ＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４；国際公開第２００４０２２７７
８号パンフレット）；Ｓｅｍａ  ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、ＳＥＭＡ
５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ、セマドメイン、７トロンボスポンジンリピート（
１型及びＨｉｋｅ型）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリ
ン）５Ｂ、国際公開第２００４０００９９７号パンフレット）；ＰＳＣＡ（米国特許出願
公開第２００３１２９１９２号明細書）；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、国際公開
第２００４０４５５１６号パンフレット）；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、国際公開第２
００３１０４２７５号パンフレット）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−
Ｉ、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、
前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク
質、国際公開第２００３０８７３０６号パンフレット）；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、
ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位陽イオンチャネル、サ
ブファミリーＭ、メンバー４、米国特許出願公開第２００３１４３５５７号明細書）；Ｃ
ＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、テラトカルシノーマ
由来成長因子、米国特許出願公開第２００３２２４４１１号明細書）；ＣＤ２１（ＣＲ２
（補体受容体Ｔ）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）国際公開
第２００４０４５５２０号パンフレット）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧ
ｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９、国際公開第２００４０１６２２５号パンフレット
）；ＦｃＲＨ２（ＤＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファ
ターゼアンカータンパク質Ｉａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、国際公開第２００４０
１６２２５号パンフレット）；ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、国際公開第２００４０４８９３８
号パンフレット）；ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、国際公開第２００４０６３７０９号パンフ
レット）；ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、国際公開第２００３０１６４７５号パンフレット）；Ｉ
Ｌ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、欧州特許第１３９４２７４号明細書）；ブ
レビカン（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、米国特許出願公開第２００３１８６３７２号明細書）
；ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、国際公開第２０
０３０４２６６１号パンフレット）；ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、米国特許出願公開第２０
０４０１０１８９９号明細書）；ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、国際公開第２００
４０２２７０９号パンフレット）；ＧＥＤＡ（脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパ
ク質  国際公開第２００３０５４１５２号パンフレット）；ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化
因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、国際公開第２００４０５８３０９号パンフレッ
ト）；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｌｙｂ−８
、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＦＬＪ２２８１４、国際公開第２００３０７２０３６号
パンフレット）；ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連α、Ｉｇβ
（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用して表面上にＩｇ  Ｍ分子との複合体を形成し、
Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質である；国際公開第２
００３０８８８０８号パンフレット）；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸ
ＣＬ１３ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、Ｈ
ＩＶ−２感染並びにおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫及び白血病の発症において役
割を果たすＧタンパク質共役受容体である  国際公開第２００４０４００００号パンフレ
ット）；ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合し、それらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭ
ＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のβサブユニット；国際公開第９９５８６５８号パンフ
レット）；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、細胞外ＡＴ
Ｐによりゲート開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経形成に関わり得
る。欠損は特発性排尿筋不安定の病態生理に関与し得る；国際公開第２００４０４７７４
９号パンフレット）；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２；国際公開第２０
０４０４２３４６号パンフレット）；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ  １０５）、ロ
イシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞活性化及
びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の上
昇に関連する；米国特許出願公開第２００２１９３５６７号明細書）；ＦｃＲＨｌ（Ｆｃ
受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリ
ンＦｃドメインについての推定受容体であり、Ｂリンパ球分化において役割を有し得る  
国際公開第２００３０７７８３６号パンフレット）；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパ
ーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有する可能
性のある推定免疫受容体である；一部のＢ細胞悪性腫瘍では転座による遺伝子の調節解除
が起こる；国際公開第２００３０７７８３６号パンフレット）；ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ
２、トモレギュリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定膜貫通プロテオグリカンであり、
ＥＧＦ／ヘレグリン成長因子ファミリー及びフォリスタチンに関連する；国際公開第２０
０４０７４３２０号パンフレット）；ＣＤ２０（国際公開第９４／１１０２６号パンフレ
ット）；ＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年）；ｐ５３；ＥＧＦＲ；プロゲステ
ロン受容体；カテプシンＤ；Ｂｃｌ−２；Ｅカドヘリン；ＣＥＡ；ルイスＸ；Ｋｉ６７；
ＰＣＮＡ；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１１ｄ；ｃ−Ｍｙｃ；τ
；ＰｒＰＳＣ；又はＡβが挙げられる。
【０３２３】
好ましくは、本発明のタンパク質は、Ｈｅｒ２（例えば、配列番号７０に示される配列
を含む）、ＭＵＣ１（例えば、配列番号７２又は７３に示される配列を含む）、ＴＡＧ７
２（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８６年に記載されるとおりの高分子量ムチン様タン
パク質）又はＰＳＭＡ（例えば、配列番号７１に示される配列を含む）に特異的に結合す
る。例えば、本発明のタンパク質はＨｅｒ２に特異的に結合する。例えば、本発明のタン
パク質はＭＵＣ１に特異的に結合する。例えば、本発明のタンパク質はＴＡＧ７２に特異
的に結合する。例えば、本発明のタンパク質はＰＳＭＡに特異的に結合する。
【０３２４】
本発明のタンパク質が由来し得る他の例示的抗体は当業者に明らかで、例えば、リツキ
シマブ（Ｃ２Ｂ８；国際公開第９４／１１０２６号パンフレット）；又はベバシズマブ（
ヒト化Ａ．４．６．１；Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年））が挙げられる。
【０３２５】
例示的な二重特異性タンパク質は、目的の抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る
。他のかかるタンパク質は、ある抗原結合部位を別のタンパク質の結合部位と組み合わせ
得る。或いは、目的の抗−抗原領域を、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）などの、白
血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及び／
又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合
する領域と組み合わせ、それにより目的の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させ
、局在化させてもよい。二重特異性タンパク質はまた、目的の抗原を発現する細胞に細胞
傷害剤を局在化させるためにも用いられ得る。これらのタンパク質は、目的の抗原を結合
する領域と、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロ
イド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン）を結合する領域とを有
する。国際公開第９６／１６６７３号パンフレットは二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗Ｆｃγ
ＲＩＩＩ抗体を記載し、及び米国特許第５，８３７，２３４号明細書は二重特異性抗Ｅｒ
ｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体が国際公開
第９８／０２４６３号パンフレットに示される。米国特許第５，８２１，３３７号明細書
は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
【０３２６】
医薬組成物及び治療方法
本発明のタンパク質（同義語、有効成分）は、予防的処置又は治療的処置のための非経
口、局所、経口、若しくは局在投与、エアロゾル投与、又は経皮投与に有用である。医薬
組成物は、投与方法に応じた様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与
に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル及びロゼンジが挙げられ、さも
なければ非経口投与による。本発明の医薬組成物が経口投与されるときには、消化から保
護されなければならないことが認識される。これは、典型的には、タンパク質を組成物と
複合体化して、それを酸及び酵素の加水分解に対して耐性にするか、或いは化合物をリポ
ソームなどの適切な抵抗性を有する担体にパッケージングすることにより達成される。タ
ンパク質を消化から保護する手段は当該技術分野において公知である。
【０３２７】
典型的には、治療有効量のタンパク質が、対象に投与するための組成物中に製剤化され
る。語句「治療有効量」は、対象における処置又は他の治療効果を促進し、誘発し、及び
／又は亢進するのに十分な量を指す。明らかなとおり、これらの製剤中における本発明の
タンパク質の濃度は幅広く異なり得るとともに、選択された特定の投与方式及び患者の必
要性に従い、主として液量、粘度、体重などに基づき選択されることになる。疾患の種類
及び重症度に応じて、例えば１つ又は複数の別個の投与による場合であっても、或いは持
続注入による場合であっても、治療有効量は約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０
．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子であり得る。典型的な１日投薬量は約１μｇ／ｋｇ〜１０
０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲となる可能性がある。患者に投与されるタンパク質の例
示的投薬量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲である。数日間又はそれ
以上にわたる反復投与については、病態に応じて、処置は疾患症状の所望の抑制が起こる
まで続けられる。例示的投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量と、その後の約
２ｍｇ／ｋｇのタンパク質の週１回維持用量の投与を含む。他の投薬量レジメンが有用で
あり得る。この治療の経過は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる
。
【０３２８】
或いは、本発明のタンパク質は、対象への投与前に治療有効用量に希釈される濃縮用量
（ｄｏｅｓ）で製剤化される。
【０３２９】
本発明の医薬組成物は非経口投与に特に有用であり、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、
経皮、又は蠕動投与及び腫瘍若しくは疾患部位への直接注入（腔内投与）を含む他のかか
る経路を介した注射用に製剤化される。投与される組成物は、一般に、薬学的に許容可能
な担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明のタンパク質の溶液を含み得る。例えば
緩衝生理食塩水など、様々な水性担体を使用することができる。他の例示的担体としては
、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙
げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性媒体もまた用いられ得る。リポソー
ムもまた担体として用いられ得る。媒体は、等張性及び化学的安定性を亢進する少量の添
加剤、例えば緩衝剤及び防腐剤を含有してもよい。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒
性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、乳酸ナトリウムなどの、生理学的条件に近似させる必要に応じた薬学的に許容可能な
補助物質を含有してもよい。
【０３３０】
医薬組成物の調製技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、
１９８０年に例示されるとおり、概して当該技術分野において公知である。
【０３３１】
国際公開第２００２／０８０９６７号パンフレットは、例えば喘息の治療用タンパク質
を含むエアロゾル化された組成物を投与するための組成物及び方法について記載し、これ
は本発明のタンパク質の投与にも好適である。
【０３３２】
本発明の化合物の好適な投薬量は、特異性タンパク質、診断／治療／予防される病態及
び／又は治療される対象によって異なり得る。好適な投薬量の決定は技能を有する医師の
能力の範囲内であり、例えば、最適以下の投薬量で開始し、投薬量を漸増させながら変更
して最適又は有効な投薬量を決定することによる。或いは、治療／予防に適切な投薬量を
決定するため、細胞培養アッセイ又は動物試験のデータが使用され、ここで好適な用量は
、毒性をほとんど又は全く伴わない活性化合物のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である
。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路によってこの範囲内で異なり得る。
治療的に／予防的に有効な用量は、初めは細胞培養アッセイから推定することができる。
用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるときのＩＣ５０（すなわち、最大半
量の症状抑制を実現する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するように調整さ
れ得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有効用量をより正確に決定することができ
る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより計測されてもよい。
【０３３３】
本発明のタンパク質は、医薬複合製剤中で、又は併用療法としての投与レジメンにおい
て、第２の化合物と組み合わされてもよい。医薬複合製剤又は投与レジメンの第２の化合
物は、好ましくは組み合わせのタンパク質に対して、それらが互いに悪影響を及ぼし合う
ことがないよう補足的な活性を有する。
【０３３４】
第２の化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖抑制剤、抗ホルモン剤
、及び／又は心保護薬であってもよい。かかる分子は好適には、意図する目的に有効な量
で組み合わされて存在する。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物はまた、チューブ
リン形成阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、又はＤＮＡ結合剤などの、治療有効量の化学
療法剤も有し得る。
【０３３５】
医薬「徐放」カプセル又は組成物もまた用いられ得る。徐放製剤は、概して長期間にわ
たり一定の薬物濃度をもたらすように設計され、本発明の化合物の送達に使用することが
できる。
【０３３６】
本発明はまた、対象における病態の治療又は予防方法であって、治療有効量の本発明の
タンパク質をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法も提供する。
【０３３７】
本明細書で使用されるとき、病態の予防との関連における用語「予防している」、「予
防する」又は「予防」は、特定の疾患又は病態の少なくとも１つの症状の発症を止め、又
は妨げるのに十分な量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む。
【０３３８】
本明細書で使用されるとき、用語「治療している」、「治療する」又は「治療」は、本
明細書に記載される１つ又は複数の阻害薬及び／又は１つ又は複数の薬剤を、特定の疾患
又は病態の少なくとも１つの症状を軽減又は解消するのに十分な治療有効量で投与するこ
とを含む。
【０３３９】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、ヒトを含む任意の動物、好ましくは哺乳
動物を意味するものと解釈されなければならない。例示的対象としては、限定はされない
が、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン
動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モル
モット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。好ましく
は哺乳動物はヒト又は霊長類である。より好ましくは哺乳動物はヒトである。
【０３４０】
本明細書で使用されるとき、「病態」は正常な機能が乱されたり、又は妨げられたりす
ることであり、いかなる特定の病態にも限定されるものではなく、疾患又は障害を含み得
る。一例では、病態は癌又は免疫病理学的障害である。
【０３４１】
例示的癌としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病
又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、有棘細胞癌（例
えば上皮有棘細胞癌）、肺癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁
平上皮癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ
）又は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌
、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫又は子宮癌腫
、唾液腺癌腫、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）又は腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅ
ｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頸部癌が挙
げられる。好ましくは癌は乳癌又は卵巣癌又は前立腺癌である。
【０３４２】
本発明の一例において、癌はＨｅｒ２を発現する。例示的癌としては、乳癌、卵巣癌、
胃癌又は子宮癌、好ましくは乳癌が挙げられる。かかる癌は、例えばＨｅｒ２に結合する
本発明のタンパク質により治療することができる。
【０３４３】
本発明の別の例において、癌はＰＳＭＡを発現する。例示的癌としては前立腺癌が挙げ
られる。かかる癌は、例えばＰＳＭＡに結合する本発明のタンパク質により治療すること
ができる。
【０３４４】
本発明のさらなる例において、癌はＴａｇ７２を発現する。例示的癌としては、結腸直
腸癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、非小細胞肺癌、及び前立腺癌などの癌腫
が挙げられる。かかる癌は、例えばＴａｇ７２に結合する本発明のタンパク質により治療
することができる。
【０３４５】
本発明のさらなる例において、癌はＭＵＣ１、好ましくは癌に関連するＭＵＣ１のグリ
コフォームを発現する。例示的癌はとしては、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、肺癌、及
び膀胱癌などの癌腫が挙げられる。かかる癌は、例えばＭＵＣ１に結合する本発明のタン
パク質により治療することができる。
【０３４６】
免疫病理学は免疫学的原因を有する疾患の研究であり、免疫性疾患は、免疫グロブリン
の抗原との反応により引き起こされる任意の病態である。従って、「免疫病理学的障害」
は、対象の免疫系が抗原と反応することにより生じる障害と定義することができる。免疫
病理学的障害としては、自己免疫疾患及び過敏性反応（例えばＩ型：アナフィラキシー、
じんま疹、食物アレルギー、喘息；ＩＩ型：自己免疫性溶血性貧血、輸血反応；ＩＩＩ型
：血清病、壊死性血管炎、糸球体腎炎、関節リウマチ、ループス；ＩＶ型：接触性皮膚炎
、移植片拒絶反応）が挙げられる。自己免疫疾患としては、リウマチ性障害（例えば、関
節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などのループス、多
発筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎な
ど）、変形性関節症、自己免疫性胃腸及び肝障害（例えば、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍
性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁
性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など）、血管炎（例えば、チャーグ−
ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び多発性動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｉｔ
ｉｓ）を含むＡＮＣＡ関連血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば、多発性硬化症、
オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、及び自己免疫
性多発ニューロパチー）、腎障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及び
ベルジェ病など）、自己免疫性皮膚障害（例えば、乾癬、蕁麻疹、じんま疹、尋常性天疱
瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（例えば、血小板減少
性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など）
、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患及び難
聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌障害（例
えば、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病関連自己免疫疾患、アジソ
ン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病及び甲状腺炎）など）が挙げら
れる。より好ましいかかる疾患としては、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣ
Ａ関連血管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ
、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が挙げられる。
【０３４７】
別の実施形態において、障害は炎症性疾患である。炎症は刺激作用又は外傷に対する生
体組織の防御反応であり、急性であることも、又は慢性であることもある。従って、炎症
性障害は、好中球、単球、マスト細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージが関与する疾
患であって、サイトカイン放出、ヒスタミン放出、酸化的バースト、食作用、他の顆粒酵
素の放出及び走化性が生じる疾患を含む。過敏性反応（上記の免疫病理学的障害のなかで
定義される）はまた、多くの場合に補体活性化、及び好中球、マスト細胞、好塩基球等の
様々な白血球の動員／浸潤が関わるため、炎症性疾患（急性又は慢性）と見なすこともで
きる。
【０３４８】
本発明の組成物は、投薬製剤と適合する方法で、且つ治療的に／予防的に有効となるよ
うな量で投与され得る。製剤は、様々な方法で、例えば摂取又は注射又は吸入により、容
易に投与される。
【０３４９】
他の治療レジメンが本発明のタンパク質の投与と組み合わされてもよい。併用療法は、
同時的又は逐次的なレジメンとして投与され得る。逐次的に投与される場合、その組み合
わせは２回以上の投与で投与され得る。組み合わせ投与は、別個の製剤又は単一の医薬製
剤を使用した同時投与、及びいずれかの順序による連続投与であって、好ましくは、双方
の（又は全ての）活性薬剤が同時にその生物活性を及ぼす期間が存在する連続投与を含む
。
【０３５０】
治療での使用に先立ち、本発明のタンパク質は好ましくは、例えば以下に記載されると
おり、インビトロ及び／又はインビボで試験される。
【０３５１】
インビトロ試験
一例において、本発明のタンパク質は、化合物にコンジュゲートされていてもなお、抗
原に結合する。本タンパク質は、それが由来するタンパク質と少なくとも同程度に抗原に
結合し得る。或いは、タンパク質又はそれを含むコンジュゲートは、それが由来するタン
パク質の、又はシステイン残基を欠く、及び／又は化合物をコンジュゲートしていない形
態のタンパク質の少なくとも約１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６
０％又は７０％又は８０％又は９０％のアフィニティ又はアビディティで抗原に結合する
。
【０３５２】
タンパク質の結合のアフィニティを測定する例示的方法としては、未修飾のタンパク質
又はコンジュゲートされていないタンパク質の標的抗原との結合を阻止するタンパク質の
能力を示す単純な免疫測定法、例えば競合的結合アッセイが挙げられる。競合的結合は、
被験タンパク質が基準タンパク質の一般的な抗原との特異的結合を阻害するアッセイで測
定される。数多くのタイプの競合的結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接放射免疫測
定法（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセ
イ；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイ
ッチアッセイ；１２５Ｉ標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ；固相直接ビオチン−アビジン
ＥＩＡ；又は直接標識ＲＩＡが公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８
８年を参照のこと）。典型的にかかるアッセイには、未標識の試験タンパク質と、標識さ
れた基準タンパク質と、そのいずれかを有する細胞又は固体表面に結合した精製抗原との
使用が関わる。試験タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定す
ることにより、競合的阻害が計測される。
【０３５３】
本発明はまた、本発明のタンパク質の活性の試験方法も包含する。本発明のタンパク質
の活性をインビトロで評価するために、様々なアッセイを利用することができる。例えば
、本発明のタンパク質が細胞又はその集合に投与され、それが前記細胞に結合できるか否
か、及び／又は前記細胞により内部に取り込まれるか否かが決定される。かかるアッセイ
は、本発明のタンパク質を検出可能標識で標識する（すなわち、コンジュゲートを作製す
る）ことにより促進されるが、しかしながら本発明のタンパク質は標識タンパク質によっ
ても検出することができるため、これは必須ではない。かかるアッセイは、本発明のタン
パク質が細胞に化合物を送達する能力（すなわち、ペイロード）及び／又はイメージング
におけるその有用性の評価に有用である。好ましくは細胞は、本発明のタンパク質が結合
する抗原を発現し、より好ましくは検出又は治療が所望される細胞型の細胞系又は初代細
胞培養物である。
【０３５４】
概して、例えば細胞傷害性分子にコンジュゲートされた、本発明のタンパク質の細胞傷
害活性又は細胞増殖抑制活性の計測は、本発明のタンパク質が結合する抗原を発現する細
胞を本発明のタンパク質に曝露し；タンパク質が生物学的作用をもたらすのに好適な期間
、例えば約６時間〜約５日間にわたり細胞を培養し；及び細胞生存度、細胞毒性及び／又
は細胞死を計測することにより行われる。生存度（増殖）、細胞毒性、及び細胞死の計測
に有用な細胞ベースのインビトロアッセイは当該技術分野において公知である。
【０３５５】
例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネッセント細胞生存度アッセイ
（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が市販されており、これは鞘翅
目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ方法であ
る（米国特許第５５８３０２４号明細書；同第５６７４７１３号明細書及び同第５７００
６７０号明細書）。この細胞増殖アッセイは、代謝活性を有する細胞の指標となる、細胞
中に存在するＡＴＰの定量化に基づき培養物中の生細胞数を決定する（米国特許第６６０
２６７７号明細書）。或いは、細胞生存度は、非蛍光性レサズリンを使用してアッセイさ
れ、レサズリンが本発明のタンパク質の存在下で培養される細胞に加えられる。生細胞に
よりレサズリンが赤色蛍光レゾルフィンに還元され、例えば顕微鏡法又は蛍光プレートリ
ーダーを使用して、容易に検出可能となる。細胞生存度の解析キットが、例えばＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，米国から利用可能である。他の細胞生
存度アッセイとしては、３Ｈ−チミジン又は１４Ｃ−チミジンの、ＤＮＡの合成に伴うＤ
ＮＡへの取り込みの測定が挙げられ、これは細胞分裂に関連するＤＮＡ合成についてのア
ッセイである。かかるアッセイでは、細胞が標識チミジンの存在下で、細胞分裂が生じる
のに十分な時間にわたりインキュベートされる。組み込まれなかった全てのチミジンが洗
浄により取り除かれた後、標識（例えば放射性標識）が、例えばシンチレーションカウン
タを使用して検出される。細胞増殖を測定する別のアッセイとしては、例えばＢｒｄＵ取
り込みによるＤＮＡ合成の計測（ＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈからキットを入手可能）が挙げられる。細胞死を検出す
る例示的アッセイとしては、ＡＰＯＰＴＥＳＴ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈから入手可能）に
よるアポトーシス初期の細胞の染色が挙げられ、これは細胞試料の固定が不要である。こ
の方法は、アネキシンＶ抗体を利用してアポトーシスを受けている細胞に特有の細胞膜再
構成を検出する。このように染色されたアポトーシス細胞は、次に固定化されたアネキシ
ンＶ抗体を使用して、蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、又は付着及びパ
ニングのいずれかにより選別され得る。或いは、末端デオキシヌクレオチド転換酵素媒介
性ビオチン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて細胞死レベルが決定
される。ＴＵＮＥＬアッセイは酵素の末端デオキシヌクレオチド転換酵素を使用して、ア
ポトーシス中に生成される３’−ＯＨ  ＤＮＡ末端をビオチン化ヌクレオチドで標識する
。次に、検出可能なマーカーにコンジュゲートされたストレプトアビジンを使用してビオ
チン化ヌクレオチドが検出される。ＴＵＮＥＬ染色用のキットは、例えばＩｎｔｅｒｇｅ
ｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹから入手可能である。
【０３５６】
本発明のタンパク質の安定性もまた、本発明のタンパク質を血清及び／又は細胞に曝露
し、続いて本発明のタンパク質を、例えばイムノアフィニティー精製を用いて単離するこ
とにより評価することができる。本発明のタンパク質の回収量の低下が、血清中での、又
は細胞に対する曝露時の、本発明のタンパク質の分解を示す。
【０３５７】
別の例では、リガンドの受容体との結合を阻止する本発明のタンパク質の能力が、標準
的な放射性免疫測定法又は蛍光免疫測定法を用いて評価される。
【０３５８】
インビボ試験
本発明のタンパク質はまた、その安定性及び／又は効力についてインビボで試験するこ
ともできる。例えば、本発明のタンパク質が対象に投与され、タンパク質の血清レベルが
、例えばＥＬＩＳＡを用いて、又はタンパク質にコンジュゲートした検出可能標識の検出
により、経時的に検出される。これにより本発明のタンパク質の生体内安定性を判断する
ことが可能となる。
【０３５９】
本発明のタンパク質はまた、ヒト疾患の動物モデルに投与することもできる。当業者は
、本発明のタンパク質が結合する抗原に基づき好適なモデルを決定することが容易に可能
であろう。例示的なモデル、例えばヒト癌のモデルは、当該技術分野において公知である
。例えば乳癌のマウスモデルは、線維芽細胞成長因子３（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０年）
；ＴＧＦ−α（Ｍａｔｓｕｉら、１９９０年）；ｅｒｂＢ２（Ｇｕｙら、１９９２年）；
ＲＥＴ−１（Ｉｗａｍｏｔｏら、１９９０年）を過剰発現するマウス又はヒト乳癌細胞の
ＳＣＩＤマウスへの移植を含む。卵巣癌のモデルは、卵巣癌細胞のマウスへの移植（例え
ば、Ｒｏｂｙら、２０００年に記載されるとおり）；黄体形成ホルモンを慢性的に分泌す
るトランスジェニックマウス（Ｒｉｓｍａら、１９９５年）；又はＷｘ／Ｗｖマウスを含
む。前立腺癌のマウスモデルもまた当該技術分野において公知であり、例えば、ＳＶ４０
初期遺伝子の強制発現から得られるモデルを含む（例えば、ミニマルラットプロバシンプ
ロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒａｔ  ｐｒｏｂａｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を利用し
てＳＶ４０初期遺伝子を発現させるＴＲＡＭＰモデル、又はロングプロバシンプロモータ
ー（ｌｏｎｇ  ｐｒｏｂａｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用してラージＴ抗原を発現さ
せるトランスジェニックマウス、まとめて「ＬＡＤＹ」モデルと称されるもの、又はｃ−
ｍｙｃ又はＢｃｌ−２又はＦｇｆ８ｂを発現するか、又はドミナントネガティブＴＧＦβ
を発現するマウス（前立腺癌のトランスジェニックモデルのレビューについては、Ｍａｔ
ｕｓｉｋら、２００１年を参照のこと）。
【０３６０】
本発明のタンパク質はまた、癌以外の疾患の動物モデル、例えばＮＯＤマウスに投与し
て、糖尿病を抑制し、予防し、治療し、又は遅延させるその能力を試験することもでき（
例えば、Ｔａｎｇら（２００４年）に記載されるとおり）、及び／又はＧＶＨＤのマウス
モデルに（例えば、Ｔｒｅｎａｄｏ（２００２年）に記載されるとおり）及び／又は乾癬
のマウスモデルに（例えば、Ｗａｎｇら  ２００８年）及び／又は関節リウマチのモデル
、例えばＳＫＧ株のマウス（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら）、ラットＩＩ型コラーゲン関節炎モ
デル、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデル又はいくつかの種における抗原誘導性関節炎
モデル（Ｂｅｎｄｅｌｅ、２００１年））及び／又は多発性硬化症（例えば、実験的自己
免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ；Ｂｒａｄｌ及びＬｉｎｉｎｇｔｏｎ、１９９６年））及び／又
は炎症性気道疾患（例えば、ＯＶＡチャレンジ又はゴキブリ抗原チャレンジ（Ｃｈｅｎら
２００７年；Ｌｕｋａｃｓら  ２００１年）のモデル及び／又は炎症性腸疾患のモデル
（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎モデル又は大腸炎のＭｕ
ｃ２欠損マウスモデル（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｓら  ２００６年）に投与することも
できる。
【０３６１】
診断／予後判定方法
一例において、本発明は病態の診断又は予後判定方法を提供する。
【０３６２】
本明細書で使用されるとき、用語「診断」、及びその変形、例えば限定はされないが「
診断する」、「診断される」又は「診断の」などは、臨床状態の任意の一次診断又は再発
性疾患の診断を含む。
【０３６３】
「予後判定」、「予後判定の」及びその変形は、本明細書で使用されるとき、回復又は
再発の可能性を含め、疾患の起こり得る転帰又は進行を指す。
【０３６４】
一例において、この方法は、試料中の抗原の量を測定することを含む。従って、本発明
のタンパク質は、診断又は研究目的での、細胞ソーティング（例えば、フローサイトメト
リー、蛍光活性化細胞分離法）などの用途に有用性がある。例えば、試料を本発明のタン
パク質と、それが抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのよ
うな条件下で接触させ、次に複合体を検出するか、又は複合体のレベルを測定する。この
ために、タンパク質は標識されても、又は標識されなくてもよい。タンパク質は、例えば
本明細書に記載される方法を用いて、直接標識することができる。標識されない場合、タ
ンパク質は、例えば凝集アッセイにあるような、好適な手段を用いて検出することができ
る。未標識抗体又は断片はまた、タンパク質、例えばタンパク質と反応性を有する標識抗
体（例えば、第２の抗体）又は他の好適な試薬（例えば、標識プロテインＡ）の検出に使
用することのできる別の（すなわち、１つ又は複数の）好適な試薬と組み合わせて使用す
ることもできる。
【０３６５】
好ましくは、本発明のタンパク質は免疫測定法において使用される。好ましくは、免疫
組織化学法、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着測
定法（ＦＬＩＳＡ）  ウエスタンブロッティング、ＲＩＡ、バイオセンサーアッセイ、タ
ンパク質チップアッセイ及び免疫染色アッセイ（例えば免疫蛍光法）からなる群から選択
されるアッセイを用いること。
【０３６６】
様々な試料からのタンパク質の濃度測定では、標準的な固相ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡ
フォーマットが特に有用である。
【０３６７】
一形態では、かかるアッセイは、生体試料を固体マトリックス、例えばポリスチレン又
はポリカーボネート製マイクロウェル又はディップスティック、膜、又はガラス担体（例
えばスライドガラス）などの上に固定化することを含む。目的の抗原に特異的に結合する
本発明のタンパク質を固定化された試料と直接接触させ、前記試料中に存在するその標的
抗原のいずれかと直接的な結合を形成する。この本発明のタンパク質は、概して検出可能
なレポーター分子、例えば、ＦＬＩＳＡの場合には蛍光標識（例えばＦＩＴＣ又はテキサ
スレッド）又は蛍光性半導体ナノ結晶（米国特許第６，３０６，６１０号明細書に記載さ
れるとおり）で、又はＥＬＩＳＡの場合には酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はβ−ガラクトシダーゼ）で標識され、或
いは本発明のタンパク質に結合する標識抗体を使用することができる。未結合のタンパク
質を全て洗浄により取り除いた後、標識が、蛍光標識の場合には直接、或いは酵素標識の
場合には、基質、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、若しくはトルイジン、又は５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｇａｌａｏｔｏｐｙｒａｎ
ｏｓｉｄｅ）（ｘ−ｇａｌ）などを加えることにより検出される。かかるＥＬＩＳＡ又は
ＦＬＩＳＡに基づくシステムは、タンパク質が結合する既知量のタンパク質標準、例えば
、単離された、及び／又は組換えのタンパク質又はその免疫原性断片若しくはそのエピト
ープに対して検出システムを較正することにより、試料中のタンパク質量の定量化に特に
好適となる。
【０３６８】
別の形態では、ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡは、本発明のタンパク質又は目的の抗原に結
合する抗体を固体マトリックス、例えば、膜、ポリスチレン若しくはポリカーボネート製
マイクロウェル、ポリスチレン若しくはポリカーボネート製ディップスティック又はガラ
ス担体の上に固定化することから構成される。次に試料は、前記本発明のタンパク質と物
理的に関係付けられ、前記化合物が結合するタンパク質を結合し、又は「捕捉」する。次
に、異なるタンパク質又は同じタンパク質の異なる部位に結合する標識された本発明のタ
ンパク質を使用して、結合したタンパク質が検出される。或いは、第２の（検出する）抗
体を結合する第３の標識抗体を使用することができる。
【０３６９】
イメージング方法
当業者には上記から明らかなとおり、本発明はまた、本発明のタンパク質を使用したイ
メージング方法も企図する。イメージングのため、本発明のタンパク質が検出可能標識に
コンジュゲートされ、検出可能標識は、イメージングにより検出可能なシグナルを放出す
ることのできる任意の分子又は薬剤であってよい。例えば検出可能標識は、タンパク質、
放射性同位体、フルオロフォア、可視光発光フルオロフォア、赤外光発光フルオロフォア
、金属、強磁性物質、電磁気放出物質  特定のＭＲ分光シグネチャを有する物質、Ｘ線吸
収若しくは反射物質、又は音響変調物質であってもよい。
【０３７０】
本発明のタンパク質は、イメージング手技に先立ち、全身投与されても、又は画像化さ
れる腫瘍、臓器、若しくは組織に局所投与されてもよい。概してタンパク質は、腫瘍、組
織、又は臓器の所望の光学像を実現するのに有効な用量で投与される。かかる用量は、用
いられる特定のタンパク質、イメージング手技に供される腫瘍、組織、又は臓器、使用さ
れるイメージング機器などによって幅広く異なり得る。
【０３７１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は、限定はされないが、腫
瘍のイメージング、臓器の断層イメージング、臓器機能のモニタリング、冠動脈造影、蛍
光内視鏡検査、レーザーガイド手術、光音響法及び超音波蛍光法などを含めた、様々な生
物医学的応用における組織及び臓器の生体内光学イメージング造影剤として使用される。
本発明のタンパク質がイメージングに有用な例示的疾患、例えば癌が本明細書に記載され
、それらは本発明の本実施形態に準用されるものと解釈されなければならない。一例にお
いて、本発明のタンパク質コンジュゲートは、対象において本発明の特定のタンパク質が
集中しているところをモニタリングすることによる腫瘍及び他の異常の存在の検出に有用
である。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、腹腔鏡検査時に腫瘍の微小転移
を検出するためのレーザー応用ガイド手術に有用である。さらに別の実施形態において、
本発明のタンパク質は、動脈硬化性プラーク及び血餅の診断において有用である。
【０３７２】
イメージング方法の例としては、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、ＭＲ分光法、Ｘ線撮影、
ＣＴ、超音波、平面ガンマカメライメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法
（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、他の核医学に基づくイメージング、
可視光を使用する光学イメージング、ルシフェラーゼを使用する光学イメージング、フル
オロフォアを使用する光学イメージング、他の光学イメージング、近赤外光を使用するイ
メージング、又は赤外光を使用するイメージングが挙げられる。
【０３７３】
本発明の方法の特定の例は、対象に対する外科手技中に組織をイメージングすることを
さらに含む。
【０３７４】
様々なイメージング技法が当業者に公知である。本発明のイメージング方法との関連に
おいて検出可能標識からのシグナルを計測するために、それらの技法のいずれかを適用す
ることができる。例えば、光学イメージングは、特定の医学分野で幅広い支持を受けてい
るイメージングモダリティの一つである。例としては、細胞成分の光学標識、並びにフル
オレセイン血管造影及びインドシアニングリーン血管造影などの血管造影が挙げられる。
光学イメージング造影剤の例としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体
、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体の誘導体、ロー
ダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリトリロシン（ｅｒｙｔｌ
ｉｒｏｓｉｎ）、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノ
ゴールドスルホスクシンイミジルエステル（ｎａｎｏｇｏｌｄ  ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジ
ルオキサゾール（ｐｙｒｉｄｙｌｏｘａｚｏｌｅ）誘導体、カスケードイエロー色素、ダ
ポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）色素が挙げられる。
【０３７５】
検出可能標識から得られるシグナルの計測に利用することのできるイメージング方法と
して、ガンマカメライメージングが企図される。当業者は、ガンマカメライメージングの
応用技術に精通しているであろう。一実施形態において、シグナルの計測は、１１１Ｉｎ
又は９９ｍＴｃコンジュゲート、特に１１１Ｉｎ−オクトレオチド又は９９ｍＴｃ−ソマ
トスタチン類似体のγカメライメージングの使用を含み得る。
【０３７６】
本発明との関連におけるイメージングモダリティとして、コンピュータ断層撮影法（Ｃ
Ｔ）が企図される。ＣＴは、様々な角度から一連のＸ線写真を撮影し、次にそれらをコン
ピュータで合成することにより、身体の任意の部分の三次元画像の構築を可能にする。コ
ンピュータは、任意の角度からの、及び任意の深さの二次元スライスを表示するようにプ
ログラムされる。スライスを合成して三次元表現を構築してもよい。
【０３７７】
ＣＴでは、最初のＣＴスキャンで診断が下されない場合、目的の抗原に結合する本発明
のタンパク質にコンジュゲートした放射線不透過性造影剤を静脈注射することが、軟部組
織塊の特定及び描写に役立ち得る。同様に、造影剤は軟部組織病変の血管分布の評価にも
役立つ。例えば、造影剤の使用は、腫瘍と隣接する血管構造との関係の描写に役立ち得る
。
【０３７８】
ＣＴ造影剤としては、例えばヨウ化造影剤が挙げられる。これらの作用剤の例としては
、イオタラム酸、イオヘキソール、ジアトリゾ酸、イオパミドール、エチオドール、及び
イオパノ酸が挙げられる。ガドリニウム剤、例えばガドペンテート（ｇａｄｏｐｅｎｔａ
ｔｅ）もまた、ＣＴ造影剤として有用であることが報告されている。
【０３７９】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、高強度磁石及び高周波信号を使用して画像を生成するイ
メージングモダリティである。ＭＲＩでは、画像化される試料を強静磁場中に置き、高周
波（ＲＦ）放射パルスで励起することにより、試料において正味の磁化を生じさせる。次
に様々な磁場勾配及び他のＲＦパルスが、空間情報を記録信号に符号化するように働く。
それらの信号を収集して分析することにより三次元画像を計算することが可能となり、こ
の画像は、ＣＴ像と同じく、通常は二次元スライスで表示される。スライスを合成して三
次元表現を構築してもよい。
【０３８０】
ＭＲＩ又はＭＲ分光イメージングに使用される造影剤は、他のイメージング技法で使用
されるものと異なる。ＭＲＩ造影剤の例としては、ガドリニウムキレート、マンガンキレ
ート、クロムキレート、及び鉄粒子が挙げられる。例えば、本発明のタンパク質は、スカ
ンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリ
ブデン、ルテニウム、セリウム、インジウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、
サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、
エルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムからなる群から選択される常磁性金属のキレ
ートを含む化合物にコンジュゲートされる。本発明に有用な造影剤のさらなる例は、ハロ
カーボンベースのナノ粒子、例えばＰＦＯＢ又は他のフッ素ベースのＭＲＩ剤である。Ｃ
Ｔ及びＭＲＩの双方とも、組織境界及び血管構造を識別するのに役立つ解剖学的情報を提
供する。
【０３８１】
細胞生存度などの細胞レベルの情報に関する情報を提供するイメージングモダリティと
しては、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（
ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。ＰＥＴでは、患者が陽電子を放射する放射性物質を摂取する
か、又はそれを注入され、それらの陽電子が体内を移動する物質としてモニタリングされ
得る。
【０３８２】
ＰＥＴと近い関係にあるのが、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、すなわちＳＰ
ＥＣＴである。両者の主な違いは、陽電子を放射する物質の代わりに、ＳＰＥＣＴは高エ
ネルギー光子を放射する放射性トレーサーを使用することである。ＳＰＥＣＴは、冠動脈
疾患を含めた複数の病気の診断に役立ち、米国では、既に毎年約２５０万件のＳＰＥＣＴ
心臓検査が行われている。
【０３８３】
ＰＥＴについて、本発明のタンパク質は一般に陽電子放射体、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ
、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕ、及び６８Ｇａで標識される。本発明のタンパク
質はＳＰＥＣＴに対しては、陽電子放射体、例えば９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、及び６７Ｇ
ａ、１１１Ｉｎで標識される。
【０３８４】
動物及びヒトの非観血的蛍光イメージングもまた生体内診断情報を提供し、幅広い臨床
専門領域において使用することができる。例えば、フルオロフォアの紫外線励起後の単純
な観察から、先進的な機器を使用する高度な分光イメージングに至るまで、長年にわたり
技術開発が行われてきた（例えば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓら、１９９７年を
参照のこと）。蛍光、例えばフルオロフォア又は蛍光タンパク質からの蛍光をインビボ検
出するための当該技術分野において公知の具体的な装置又は方法としては、限定はされな
いが、生体内近赤外蛍光（例えば、Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ、２００３年を参照のこと）、Ｍ
ａｅｓｔｒｏ（商標）生体内蛍光イメージングシステム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ  ＆  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、フ
ライングスポットスキャナを使用した生体内蛍光イメージング（例えば、Ｒａｍａｎｕｊ
ａｍら、２００１年を参照のこと）などが挙げられる。
【０３８５】
光学的応答を検出するための他の方法又は装置としては、限定なしに、目視検査、ＣＣ
Ｄカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、フォトダイオ
ード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マ
イクロプレートリーダー、又は光電子増倍管を使用したシグナル増幅が挙げられる。
【０３８６】
いくつかの例において、造影剤は、ヒトにおける使用前にインビトロ又はインビボアッ
セイを用いて、例えば本明細書に記載されるモデルを使用して試験される。
【０３８７】
製品
本発明はまた、本発明のタンパク質を含む製品、又は「キット」も提供する。製品は、
場合により、容器と、例えば、本明細書において任意の実施形態により記載される方法に
おける本発明のタンパク質の使用についての説明を提供する容器上の、又は容器に関連付
けられたラベル又は添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シ
リンジ、ブリスターパック等が挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な
材料で形成され得る。容器は本発明のタンパク質組成物を保持するとともに、無菌のアク
セスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針により穿孔可能な栓を有する静注用溶
液の袋又はバイアルであってもよい）。それに代えて、又は加えて、製品は、注射用静菌
水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学
的に許容可能な緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでもよい。さらに製
品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含めた、商業的な及び使用者
の観点から望ましい他の材料を含み得る。
【０３８８】
以下の非限定的な例において本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０３８９】
実施例１−分子モデリング
１．１  Ａｖｉｂｏｄｙの分子モデル作成
Ａｖｉｂｏｄｙは、抗体の可変ドメインを含む組換えタンパク質である。Ａｖｉｂｏｄ
ｙはモノクローナル抗体の可変ドメインを、ＶＨからＶＬへの又はＶＬからＶＨへのいず
れかの向きで短鎖リンカー領域により分散して単一のポリペプチド鎖に融合することによ
り利用する。これらのＡｖｉｂｏｄｙは、リンカー長さに応じて、１、２、３又は４個の
機能的結合部位をそれぞれ含む安定的で生物学的に活性なモノボディ（ｓｃＦｖ）、ダイ
アボディ、トリアボディ又はテトラボディを形成するように設計される。
【０３９０】
モデル化するＡｖｉｂｏｄｙのＶＨ及びＶＬドメイン配列を用いて、ＢＬＡＳＴ及び／
又はＦＡＳＴＡの双方の検索を使用したＲＣＳＢ  ＰＤＢデータバンク（ｗｗｗ．ｐｄｂ
．ｏｒｇ）の検索を行った。最高の配列同一性、分解能及び完全性を有する構造ヒットを
選択し、モデル化されたＡｖｉｂｏｄｙのＦｖドメインの鋳型として用いた。ｐｄｂファ
イルの非対称ユニットが１つより多い鋳型モデルを含んだ場合、全ての鋳型を使用し、同
等に取り扱った。
【０３９１】
Ａｖｉｂｏｄｙダイアボディ及びトリアボディについては、空間における鋳型Ｆｖの配
置の設定に四次鋳型を使用し、これらのＡｖｉｂｏｄｙのモデリングを可能にした。ダイ
アボディについては１ＬＭＫ（Ｐｅｒｉｓｉｃら、１９９４年）又は１ＭＯＥ（Ｃａｒｍ
ｉｃｈａｅｌら、２００３年）を様々に使用し、トリアボディについては１ＮＱＢ（Ｐｅ
ｉら、１９９７年）を使用して、モデリングのため四次空間に鋳型を配置した。
【０３９２】
四次配置については、ＦｖドメインについてＩｓｒａｅｌ  Ｇｅｌｆａｎｄにより作成
されたコア座標セット（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９８年ａ）の複数部を四次鋳型と最小二
乗法でアラインメントし、「コア」ホモ二量体又はホモ三量体を形成した。各Ａｖｉｂｏ
ｄｙについて選択されたＦｖ鋳型を、次にこの「核」ホモ二量体又はホモ三量体中の各Ｆ
ｖと最小二乗法でアラインメントして鋳型ホモ二量体又はホモ三量体を形成した。続いて
これらのファイルを編集し、様々なＡｖｉｂｏｄｙのモデリングに必要な連結性を反映さ
せた。
【０３９３】
いずれの場合にも、最終モデリングの実行におけるＦｖドメインモデリングには「コア
」四次モデルを使用せず、連結残基は「アブイニシオ」でループとしてモデル化した。
【０３９４】
ソフトウェアに組み込まれたＭＯＤＥＬＬＥＲアルゴリズム（Ｓａｌｉ及びＢｌｕｎｄ
ｅｌｌ、１９９３年）を用いるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（ＤＳ）ソフトウェア
（ｖ２．５、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＣＡ，米国）を使用してＡｖｉｂｏｄｙの分子モデルを
作成し、ソフトウェアに含まれるスコアリング関数を用いて評価した。全物理的エネルギ
ーについてのＭＯＤＥＬＬＥＲ作成の確率密度関数（ＰＤＦ）の各々における高位ランキ
ングスコアの存在及び離散最適化タンパク質エネルギー（ＤＯＰＥ）スコアに基づき最良
のモデルを選択した（Ｓｈｅｎら、２００６年）。さらなる解析のため、選択されたモデ
ルをｐｄｂファイルに書き出した。得られたモデルの画像もまたＤＳを使用して作成した
。
【０３９５】
各選択されたモデルのさらなる解析には、画像ワークステーション上での目視検査及び
関連する残基の溶媒露出表面積（ＡＳＡ）の計算が含まれた。ＡＳＡは、本明細書では、
モデル化されたジスルフィド変異体のコンジュゲーションへの利用可能性の能力の評価と
して使用される。次にＡＳＡ平均値からの標準偏差（Ｅｘｃｅｌで計算）を、ジスルフィ
ドにおけるシステイン残基の双方若しくは一方又は残基（すなわち、ＣＤＲ）の他の基が
同様に露出していたかどうかに関する指標として用いた。例えば、大きい標準偏差は、ジ
スルフィド中の残基の一つについて、還元及び／又はコンジュゲーションのための露出が
少ない可能性があることを示す。ＣＤＲについては残基当たり平均の平均ＡＳＡもまた含
め、概して露出している残基の基とのジスルフィドの比較を促進する。シート内で保存さ
れたジスルフィドの平均ＡＳＡを使用して、ほぼ埋もれている、又は到達不可能な残基の
基とのジスルフィドの比較を促進した。
【０３９６】
ここに提示される研究において、単量体コンジュゲーションか、二量体コンジュゲーシ
ョンか、若しくは三量体コンジュゲーションであったのか、又はそれぞれのｓｃＦｖがＶ
ＨからＶＬへの向きにあったのか、若しくはＶＬからＶＨへの向きにあったのかに関わら
ず、コンジュゲーション確率の指標としてのＡＳＡに関して、モデル化されたジスルフィ
ド変異体の露出度に有意な差は認められなかった。
【０３９７】
１．２  ＡＶＰ０４−０７ダイアボディのＶＨからＶＬに連結された分子モデルの作成
ＡＶＰ０４−０７  Ａｖｉｂｏｄｙ（配列番号５５）は、理論的ｐＩ／Ｍｗ：８．０／
５１ｋＤａの、ＶＬκ軽鎖及びサブグループＩ  ＶＨ鎖を有する組換えダイアボディであ
る。ＡＶＰ０４−０７は腫瘍関連抗原ＴＡＧ７２を認識する。
【０３９８】
このＡｖｉｂｏｄｙはネズミ科動物モノクローナル抗体ＣＣ４９の可変領域を利用し、
それらを配列に融合して、２つの機能的結合部位を含む安定した生物学的に活性のダイア
ボディを形成する。ＣＣ４９の可変ドメインは、極めて優れたインビトロ及びインビボ特
性を有する高発現で高度に安定した組換え分子を実現するため、アミノ酸配列が修飾され
ている（Ｒｏｂｅｒｇｅら、２００６年）。
【０３９９】
ＡＶＰ０４−０７のＶＨ及びＶＬドメイン配列でＰＤＢを検索すると、ＰＤＢの１つの
抗体、１ＺＡ６が浮上し（Ｌａｒｓｏｎら、２００５年）、これはギャップなしアライン
メントでＶＨ及びＶＬの双方のドメインにおいてＡＶＰ０４−０７と８２％の同一性マッ
チを有した。
【０４００】
１ＺＡ６鋳型は、抗腫瘍性ＣＨ２ドメイン欠失ヒト化抗体の構造をコードする。この組
換えヒト化抗体もまた、ＴＡＧ７２抗原を認識する。
【０４０１】
１ＺＡ６  ｐｄｂファイル中のＦｖ構造を使用してＡＶＰ０４−０７ダイアボディのＦ
ｖドメインをモデル化した。上記に記載される１ＬＭＫを鋳型の四次空間アラインメント
に使用して、上記に記載される方法でＡＶＰ０４−０７ダイアボディを形成した。選択さ
れた最高スコアのＡＶＰ０４−０７ダイアボディモデルを図１に示し、これはこのＡｖｉ
ｂｏｄｙ二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
【０４０２】
１．３  ＡＶＰ０７−１７ダイアボディのＶＨからＶＬに連結された分子モデルの作成
ＡＶＰ０７−１７  Ａｖｉｂｏｄｙ（配列番号５９）は、理論的ｐＩ／Ｍｗ：６．４／
５５ｋＤａの、極めて長いＣＤＲＨ３ループ、ＶＬλ軽鎖及びサブグループＩ  ＶＨ鎖を
有する組換えダイアボディである。ＡＶＰ０７−１７は腫瘍関連抗原ＨＥＲ２を認識する
。
【０４０３】
ＡＶＰ０７−１７は、標準的なＦａｓｔａ及びＢｌａｓｔ検索を使用するとき、ＡＶＰ
０４−０７と比較してＲＣＳＢ  ｐｄｂで利用可能な構造との同一性が低い。ＡＶＰ０４
−０７について得られた結果と比較したとき、それほど高いＡＶＰ０７−１７との同一性
を示したＶＬ及びＶＨのＦｖ対はなかった。
【０４０４】
Ｆｖドメイン全体についての鋳型選択を改良するＰＤＢの別の検索方法を試験した。Ｍ
ＡＴＲＡＳサーバー（Ｋａｗａｂａｔａ  ２００３年、Ｋａｗａｂａｔａら  ２０００年
）は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた現行のＰＤＢに対する標準的な配列相同性検索を使
用し、アラインメント領域のグラフ表現を備えて鋳型選択を支援する。この方法から２つ
の良好な鋳型が明らかとなり、いずれもＶＬ及びＶＨの双方のドメインにおいて６４％超
の配列同一性を有した。
【０４０５】
選択されたＦｖ鋳型は、ａ）２Ｂ１Ｈ（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、２００６年）（これは
リンカー残基及びＣＤＲＨ３を除きＡＶＰ０７−１７と８０．６％の同一性を有した）、
及びｂ）３Ｇ０４（Ｓａｎｄｅｒｓら、２００７年）（これはリンカー残基及びＣＤＲＨ
３を除きＡＶＰ０７−１７と７３．５％の同一性を有した）のｐｄｂファイルに含まれた
。
【０４０６】
上記に記載される１ＬＭＫダイアボディを鋳型Ｆｖの四次空間アラインメントに使用し
て、上記に記載される方法でＡＶＰ０７−１７（「未変異の」）ダイアボディを形成した
。モデリングでは、ＡＶＰ０７−１７の長いＣＤＲＨ３ループ長さもまた、鋳型として使
用する相同構造が認められなかったため問題となった。これらは鋳型制約なしにループと
して（本質的にアブイニシオで）モデル化し、モデル化後に構造上の違反を評価した。こ
こに提示するいずれの場合にも、ループがＡｖｉｂｏｄｙの全体的な構造又はフレームワ
ーク領域に影響を及ぼすことはないと考えられたため、ＣＤＲ３ループは低い信頼水準で
モデル化し、及び一部の分析には含めない。
【０４０７】
選択された高スコアのＡＶＰ０７−１７ダイアボディモデルを図２に示し、これはこの
Ａｖｉｂｏｄｙ二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
【０４０８】
１．４  ＡＶＰ０２−６０ダイアボディの分子モデルの作成
ＡＶＰ０２−６０  Ａｖｉｂｏｄｙ（配列番号６１）は、理論的ｐＩ／Ｍｗ：８．４７
／５０．１ｋＤａの、ＶＬ鎖κ及びサブグループＩＩＩ  ＶＨ鎖を有する組換えダイアボ
ディである。これはＭＵＣ１遺伝子によりコードされる乳癌関連ムチンを認識する一次マ
ウスモノクローナルＣ５９５抗体であるＣＤ２２７に基づく（Ｇｅｎｄｌｅｒら、１９９
０年）。これはムチンのタンパク質コア内のエピトープＲＰＡＰ（配列中で約４０回反復
するモチーフ）を認識する。
【０４０９】
ＶＬ又はＶＨによるＢｌａｓｔ及びＦａｓｔａ検索から、ＶＬ及びＶＨの双方のドメイ
ンを含んだ高い同一性スコアを有するいくつかの鋳型が明らかとなった。しかしながら、
ＣＤＲＨ３をモデル化するのに配列の同一性及び長さが十分なＶＨを有する鋳型は１つの
みであった。従ってＶＨ及びＶＬモデリング用に２つの鋳型を選択した一方、１つの追加
的な鋳型をＶＨのみのモデリング用に選択した。選択された鋳型は、ａ）１ＭＨＰ  ＶＨ
及びＶＬ（８６．９％の同一性、８９．６％の相同性；Ｋａｒｐｕｓａｓら、２００３年
）、ｂ）２Ｂ２Ｘ  ＶＨ及びＶＬ（８５．７％の同一性、８８．３％の相同性；Ｃｌａｒ
ｋら、２００６年）及びｃ）２ＡＤＧ  ＶＨ：（８６．８％の同一性、９６．５％の相同
性；Ｚｈｏｕら、２００５年）（これはＣＤＲＨ３用のギャップなしアラインメントでの
唯一の鋳型であった、このＦｖのＶＬドメインはモデリングでは使用しなかった）であっ
た。
【０４１０】
全ての鋳型に関して、ＡＶＰ０２−６０は８８．４％の同一性及び９１．１％の相同性
を有した。上記に記載される１ＬＭＫダイアボディを鋳型Ｆｖの四次空間アラインメント
に使用して、上記に記載される方法でＡＶＰ０２−６０（「未変異の」）ダイアボディを
形成した。
【０４１１】
選択された最高スコアのＡＶＰ０２−６０ダイアボディモデルを図３に示し、これはこ
のＡｖｉｂｏｄｙ二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
【０４１２】
１．５  置換システイン変異を操作するためのフレームワーク１システイン挿入位置の同
定及びその分子モデリング
免疫グロブリンＶドメインの構造におけるフレームワーク１（ＦＲ１）は、２つのβシ
ートの一方の縁端に位置し、そのため、保存されたドメイン間ジスルフィド結合に隣接す
る残基を除いては概して溶媒に十分に露出しているため、システイン置換の操作に好まし
い候補である。従ってこの領域は、ジスルフィドを含有するコンストラクトとのコンジュ
ゲーション化学に自由に利用可能なはずである。
【０４１３】
操作的フレームワーク１内システイン置換を含むＡｖｉｂｏｄｙは、本明細書では「チ
オール化Ａｖｉｂｏｄｙ」と称する。
【０４１４】
抗体のＶＬ及びＶＨドメインは、第一に、古典的には２つのシートに７〜１０個のβ鎖
を典型的トポロジー及び連結度で含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであ
る。これらのドメインは、第二に、ドメイン軸の範囲内でＢシートの対称性を示すＶタイ
プ免疫グロブリン（ｉｍｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のメンバーである（Ｈａｌａｂｙ
ら、１９９９年）。抗体Ｖタイプ又はＶセットドメインは、ＳＣＯＰ（ｈｔｔｐ：／／ｓ
ｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｄａｔａ／ｓｃｏｐ．ｂ．ｃ
．ｂ．ｂ．ｂ．ｈｔｍｌ、Ｍｕｒｚｉｎら、１９９５年）、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＩＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ０
１３１０６、Ｈｕｎｔｅｒら、２００９年）及びＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓ
ｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０７６８６、Ｂａｔｅｍａｎら、２００４年）な
どのオンラインデータベースではＶＨ（１〜４型）、ＶＬκ、ＶＬλドメインに分けられ
る。
【０４１５】
これらの十分に定義された類似性を所与とすれば、ＡＶＰ０４−０７  ＶＬκドメイン
において同定されるフレームワーク１内システインペア置換変異の全ての候補をＶＨ（１
〜４型）ドメイン及びＶＬλドメインの双方に構造的に移すことが可能なはずであると仮
定することは妥当である。
【０４１６】
システインに変異させ得るとともにフレームワーク１内ジスルフィド架橋を形成可能で
、且つ還元及び続くペイロードとのコンジュゲーションに利用可能である残基ペアについ
て、作成されたＡＶＰ０４−０７のモデルのＶＬドメインを画像ワークステーションで調
べた。ＦＲ１における残基ペアであって、概して互いに向かって傾いた側鎖を有し、概し
て溶媒に露出した側鎖原子を有し、且つ約６〜７Å離れたＣα炭素原子を有するペアが、
ジスルフィド結合を形成可能なフレームワーク１内システイン挿入に好ましい候補と考え
られた。
【０４１７】
ＶＨドメインに移すため、Ｇｅｌｆａｎｄコア座標のＶＨ及びＶＬドメインの構造アラ
インメント（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９８年ａ；Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９８年ｂ）を生
成した。続いてこれらのアラインメントしたＶＬ及びＶＨコアを使用して、各未変異Ｆｖ
ドメインモデルからのＶＨ及びＶＬドメインをアラインメントした。この構造アラインメ
ントを、同定されたシステイン変異ペアのＶＬからＶＨ配列へのマッピングに使用し、次
にそれをＶＨドメインシステイン挿入変異のモデリングに使用した。いずれの場合も、単
一のモデリング実行を用いて、ＶＬ及びＶＨドメインの各々に単一の類似したシステイン
変異ペアを含む二重システイン挿入変異モデルを作成した。
【０４１８】
１．６  ＡＶＰ０４  Ａｖｉｂｏｄｙダイアボディにおけるシステイン置換変異を操作す
るために同定されたフレームワーク１システイン挿入位置及び分子モデリング
未変異ＡＶＰ０４−０７モデルを、上記のとおりのフレームワーク１内システイン挿入
変異をマッピングするための出発点とした。このマッピングから、同定されたＶＬシステ
イン挿入位置が、実際にＶＨドメインに対して構造的に容易にマッピングされ得たこと、
及びこれらの残基がジスルフィド結合を形成する可能性が高いことが示された。
【０４１９】
ＡＶＰ０４−０７のフレームワーク１  ＶＬ（Ｋａｂａｔ残基１から２３を含む）及び
フレームワーク１  ＶＨ（Ｋａｂａｔ残基１から３０を含む）において、フレームワーク
１内システイン挿入に好ましい位置を以下のとおり同定した：
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及びＬ１１（ＡＶＰ０４−５０、配列番
号５７）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ７−Ｈ１０（ＡＶＰ０４−８４、配列番号
６３）
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ１４及びＬ１７（ＡＶＰ０４−７８、配列
番号７７）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ１３−Ｈ１６（ＡＶＰ０４−８５、配列番
号７５）
【０４２０】
ＡＶＰ０４−０７モデル（実施例１．２）について概説した方法を用いて、上記の望ま
しい変異を反映した配列入力を除き同じ入力パラメータを使用してモデリングを繰り返し
た。モデル評価もまたＡＶＰ０４−０７モデルと同様に行った。
【０４２１】
各システイン挿入をモデリングに供し、１つのＶＬシステインペア変異及びその類似Ｖ
Ｈシステインペア変異を各モデリング実行に含めた。ＡＶＰ０４−０７  ＦＲ１構造に対
するシステイン挿入モデリングの結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ｂは、ジスルフィ
ド結合が形成された場合にも、操作的フレームワーク１内システイン変異の近傍に構造の
変化がほとんどないことを示している。
【０４２２】
予想どおり、還元及び続くペイロードとのコンジュゲーションに利用可能であり得る変
異可能な残基ペアを定義する目的において、各システイン変異ペアについての溶媒露出表
面積（ＡＳＡ）の値は、高度に保存された、且つ構造的に埋もれたシステインペアＨ２２
−Ｈ９２及びＬ２３−Ｌ８８より著しく高く、構造的に露出したＣＤＲ残基と同程度であ
ったことが示された（図５）。
【０４２３】
１．７  ＡＶＰ０７−ｘｘ及びＡＶＰ０２−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙダイアボディにおける
システイン置換変異を操作するために同定されたフレームワーク１システイン挿入位置及
び分子モデリング
上記に概説されるとおり、全抗体ファミリーにわたるＶＨ（１〜４型）、ＶＬκ、ＶＬ
λドメインの間の構造的類似性は公知であり、認められている。この構造的類似性によっ
て、ＡＶＰ０４−０７のモデルから同定されたシステイン挿入位置をＡＶＰ０２−ｘｘ及
びＡＶＰ０７−ｘｘシステイン挿入Ａｖｉｂｏｄｙモデルに構造的に移した。
【０４２４】
ＡＶＰ０２−６０の場合、システイン挿入に好ましいＫａｂａｔ位置はＡＶＰ０４−０
７の位置と同じであり、すなわち以下のとおりであった：
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及びＬ１１（ＡＶＰ０２−１０１、配列
番号７９）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ７−Ｈ１０（ＡＶＰ０２−１０４、配列番
号８１）
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ１４及びＬ１７（ＡＶＰ０２−１０２、配
列番号８３）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ１３−Ｈ１６（ＡＶＰ０２−１０５、配列
番号８５）
【０４２５】
ＡＶＰ０２−６０モデルは、Ｋａｂａｔ  Ｈ７−Ｈ１０の領域において、ＡＶＰ０４−
０７及びＡＶＰ０７−１７のＶＨ  Ｉ型ドメインと構造的に少し異なるＶＨ  ＩＩＩ型ド
メインを有する。しかしながら、ａ）Ｈ７及びＨ１０のＣα位置が極めて類似していた、
及びｂ）間にあるＨ８及びＨ９残基位置は異なっていたものの、それらの残基の双方とも
が、他のアミノ酸と比べて小さく、且つ柔軟性がより高い残基であるＧｌｙであったため
、ＡＶＰ０４−０７システイン挿入の構造移動はなお実現することができた。オンライン
免疫遺伝学データベース；ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）によ
り提供されるＶ遺伝子生殖細胞系列配列に基づけば、ヒト配列の９８％がＨ８にＧｌｙを
有し、４８％がＨ９にＧｌｙを有する。この柔軟性により、Ｈ７−Ｈ１０ジスルフィドを
ＡＶＰ０４−８４からＡＶＰ０２−１０４に構造的に移すことが可能であった。ＡＶＰ０
２−６０  ＦＲ１構造に対するフレームワーク１内システイン挿入／ジスルフィド結合形
成モデリングの結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。
【０４２６】
ＡＶＰ０７−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙの場合、このコンストラクトはＶＬλ鎖を含むため
、ＶＬκを含むＡＶＰ０４−５０  Ａｖｉｂｏｄｙ及びＡＶＰ０２−１０１  Ａｖｉｂｏ
ｄｙの双方に見られるＫａｂａｔ位置Ｌ８−Ｌ１１でのシステイン挿入は、構造的にＬ７
−Ｌ１１に移る。従ってＡＶＰ０７では、好ましいフレームワーク１内システイン挿入位
置は以下のとおり同定された：
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ７及びＬ１１（ＡＶＰ０７−８８、配列番
号８７）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ７−Ｈ１０（ＡＶＰ０７−９０、配列番号
８９）
・軽鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｌ１４及びＬ１７（ＡＶＰ０７−８９、配列
番号９１）
・重鎖フレームワーク１  Ｋａｂａｔ残基Ｈ１３−Ｈ１６（ＡＶＰ０７−９１、配列番
号９３）
【０４２７】
Ｋａｂａｔ付番方式におけるＶＬλはＬ１０配列位置が欠損しており（Ｊｏｈｎｓｏｎ
及びＷｕ、２０００年）、上述のとおり付番し直す必要があった。しかしながら構造的に
は、本発明との関連において、ＶＬκ  Ｌ８−Ｌ１１はＶＬλ  Ｌ７−Ｌ１１と等価であ
り、残基の欠損はない。これは、図４のＡＶＰ０４−０７  ＶＬ  ＦＲ１と図７のＡＶＰ
０７−１７  ＶＬ  ＦＲ１とのモデルを比較すると明確に認めることができ、これらの特
定の場合に配列における残基の欠失はＮ末端のシステイン挿入である。
【０４２８】
ＡＶＰ０４−０７について概説したシステイン挿入位置に関して認められる傾向を受け
て、ＡＶＰ０２  Ａｖｉｂｏｄｙ（図８）及びＡＶＰ０７  Ａｖｉｂｏｄｙ（図９）にお
ける各好ましいシステイン挿入についての露出表面積（ＡＳＡ）の値が、高度に保存され
た、且つ構造的に埋もれた／到達不可能なシステインペアＨ２２−Ｈ９２及びＬ２３−Ｌ
８８と比べて著しく高く、構造的に露出したＣＤＲ残基と同程度であることが示された。
【０４２９】
抗体のＶドメイン（ＶＨ及びＶＬ）は、長年、配列上及び構造上のサブタイプ、例えば
ＶＨ  Ｉ〜ＩＶ型及びＶＬκ及びＶＬλに細分化されていた。これらのサブタイプは主と
してそれらのドメインのＦＲ１配列及び構造の違いに基づく（Ｌｅｆｒａｎｃ、２００１
年ａ；ＬｅＦｒａｎｃ、２００１年ｂ；Ｐａｌｌａｒｅｓ、１９９９年）。本研究は、こ
の細区分にも関わらず、好ましいジスルフィド挿入位置を、未変異モデルのフレームワー
クを大幅に歪めることなく様々なこれらのサブタイプのモデルに容易に移すことができる
ことを示している。
【０４３０】
しかしながら、本発明者らは、未変異の構造モデルを画像上で調べる間、いくつかのＶ
Ｌ／ＶＨサブタイプが、概して上記に概説した好ましいジスルフィド挿入位置を１〜２残
基だけＮ末端側に（例えばＡＶＰ０２−１０３、ＦＲ１  Ｈ６−Ｈ９変異を含む、配列番
号９５）又は１〜２残基だけポリペプチド鎖のＣ末端側に（例えば対応するクローンＡＶ
Ｐ０７−６３（配列番号６５）及びＡＶＰ０７−６８（配列番号９７）、ＦＲ１  Ｌ８−
Ｌ１２を含む）シフトさせることによりフレームワーク１内システイン挿入を置くことの
できる追加的な（代替的な）位置を含んだことを注記する。
【０４３１】
しかしながら、上記で考察されるいずれの場合にも、フレームワーク１内ジスルフィド
挿入に適合すると特定された好ましい及び／又は代替となる位置は全て、実施例１．５に
概説した主要なモデリング制約を満たした。
【０４３２】
２  Ａｖｉｂｏｄｙコンストラクトの合成
２．１  フレームワーク１内ジスルフィド挿入を操作しない「未変異の」Ａｖｉｂｏｄｙ
の合成
ＴＡＧ７２に特異的なマウスｍＡｂ（配列番号５４）、ＨＥＲ２に特異的なヒトｍＡｂ
（配列番号５８）及びＭＵＣ１に特異的なネズミ科動物ｍＡｂ（配列番号６０）のＶＨ及
びＶＬ領域をコードするＤＮＡコンストラクトを適切な制限部位と合成し、ＧｅｎＳｃｒ
ｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）によりｐＵＣ５７にクローニングした。Ａ
ｖｉｂｏｄｙはＶ領域のいずれの向きでも、すなわちＶＨ−リンカー−ＶＬでも、及びＶ
Ｌ−リンカー−ＶＨでも単離されているが（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、２００３年）、本
明細書に記載される全てのコンストラクトはＶＨ−リンカー−ＶＬとして並べた。
【０４３３】
全てのＤＮＡ操作は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍ
Ａ，米国）から購入した試薬による標準的なプロトコルに従い行った。ダイアボディをコ
ードするＤＮＡコンストラクトをｐＵＣ５７から適切な制限酵素で切り取り、１％（ｗ／
ｖ）アガロースゲル上で解像し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使
用してゲルから精製した。コンストラクトを、同様に調製したｐＥＴ２２ｂ発現ベクター
にライゲートし、ライゲーション混合物を電気穿孔法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ
１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。Ｑｉａｇｅｎミニプレップスピンキットを使用して形
質転換体からミニプレップＤＮＡを抽出し、ダイターミネーターサイクルシーケンシング
キットをＡｍｐｌｉＴａｑと用いてＴ７プロモーター及びターミネータープライマーで配
列決定することにより、組換えクローンを同定した。ＶＨ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＶＬの向き
の抗ＴＡＧ７２  ｍＡｂのＶ領域を含むクローンをＡＶＰ０４−０７と命名した（配列番
号５４）。ＶＨ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＶＬの向きの抗ＨＥＲ２  ｍＡｂのＶ領域を含むクロ
ーンをＡＶＰ０７−１７と命名した（配列番号５８）。ＶＨ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−ＶＬの向
きの抗ＭＵＣ１  ｍＡｂのＶ領域を含むクローンをＡＶＰ０２−６０と命名した（配列番
号６０）。これらの３つのクローンが基本となる親配列を形成し、これらから他の全ての
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙを誘導した。
【０４３４】
このクローニング方法は、標的タンパク質をペリプラズム発現させるためのアミノ末端
ｐｅｌＢリーダー配列、及びカルボキシ末端（Ｈｉｓ）６タグ又はカルボキシ末端Ｍｙｃ
＋（Ｈｉｓ）６タグのいずれかの挿入を可能にする。（Ｈｉｓ）６などのアフィニティー
タグの付加をルーチン的に用いて下流精製プロセスを能率化した。この付加は生物活性上
中立的であることが知られている。
【０４３５】
ある場合には、同一のＶＨ／ＶＬ  Ａｖｉｂｏｄｙ配列を、カルボキシ末端（Ｈｉｓ）
６タグ及びカルボキシ末端Ｍｙｃ＋（Ｈｉｓ）６の双方のバージョンで構築した。この一
例は、Ｍｙｃ＋（Ｈｉｓ）６タグを含むＡＶＰ０７−６３（配列番号６４）、及び（Ｈｉ
ｓ）６タグのみを含むＡＶＰ０７−６８（配列番号９６）である。これらの２つのＡｖｉ
ｂｏｄｙは異なるカルボキシ末端タグを有したが、ＶＨ及びＶＬ配列は完全に同じで、従
ってこれらの２つのコンストラクトは互換的に使用した。
【０４３６】
２．２  部位特異的突然変異誘発によるフレームワーク１内操作的システインの導入及び
Ｎ末端セリン置換
作成したモデリングデータに基づき、フレームワーク１内操作的システイン挿入変異を
ＡＶＰ０４−０７、ＡＶＰ０７−１７及びＡＶＰ０２−６０の未変異Ａｖｉｂｏｄｙ配列
に導入し、以下のチオール化Ａｖｉｂｏｄｙを形成した：
ＡＶＰ０４−ｘｘファミリー鋳型配列（ＴＡＧ７２特異的）：
本明細書において考察されるとおり、Ａｖｉｂｏｄｙ名との関連における記号「ｘｘ」
の使用は、同じ系列のＡｖｉｂｏｄｙが多数存在し、記載が当該の系列中の全てのＡｖｉ
ｂｏｄｙに関連することを示す。「ｘｘ」が特定の数字に置き換えられると、記載がその
数を有するＡｖｉｂｏｄｙ（本明細書で使用される命名法に基づく）を参照することを示
す。
・ＡＶＰ０４−５０ダイアボディ核酸配列（配列番号５６）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及び
Ｌ１１が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号５７）を形成する。
・ＡＶＰ０４−５１ダイアボディ核酸配列（配列番号９８）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ１３及
びＬ１９が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号９９）を形成する。
・ＡＶＰ０４−７８ダイアボディ核酸配列（配列番号７６）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ１４及
びＬ１７が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号７７）を形成する。
・ＡＶＰ０４−８４ダイアボディ核酸配列（配列番号６２）、Ｋａｂａｔ残基Ｈ７及び
Ｈ１０が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号６３）を形成する。
・ＡＶＰ０４−８５ダイアボディ核酸配列（配列番号７４）、Ｋａｂａｔ残基Ｈ１３及
びＨ１６が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号７５）を形成する。
・ＡＶＰ０４−７０  ｓｃＦｖ核酸配列（配列番号１００）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及び
Ｌ１１が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号１０１）を形成する。
・ＡＶＰ０４−７４トリアボディ核酸配列（配列番号１０２）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及
びＬ１１が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号１０３）を形成する。
ＡＶＰ０７−ｘｘファミリー鋳型配列（ＨＥＲ２特異的）：
・ＡＶＰ０７−８８ダイアボディ核酸配列（配列番号８６）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ７及び
Ｌ１１が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号８７）を形成する。
・ＡＶＰ０７−７１  ｓｃＦｖ核酸配列（配列番号１０４）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及び
Ｌ１２が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号１０５）を形成する。
・ＡＶＰ０７−６３ダイアボディ核酸配列（配列番号６４）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及び
Ｌ１２が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号６５）を形成する。
・ＡＶＰ０７−６３と同じだが、カルボキシ末端（Ｈｉｓ）６タグを含み、且つカルボ
キシ末端Ｍｙｃ＋（Ｈｉｓ）６タグを含まないＡＶＰ０７−６８ダイアボディ核酸配列（
配列番号９６）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及びＬ１２が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号９
７）を形成する。
ＡＶＰ０２−ｘｘファミリー鋳型配列（ＭＵＣ１特異的）：
・ＡＶＰ０２−１０１ダイアボディ核酸配列（配列番号７８）、Ｋａｂａｔ残基Ｌ８及
びＬ１１が変異したＡｖｉｂｏｄｙ（配列番号７９）を形成する。
【０４３７】
これらのチオール化Ａｖｉｂｏｄｙについて、本明細書では、モデリングにより実現可
能と示唆されるとおり（実施例１．７を参照のこと）、好ましいフレームワーク１内操作
的システイン挿入変異が、ａ）ＶＬ及びＶＨドメイン及びその異なるサブタイプの間で機
能的に移すことが可能であり、ｂ）単一の（ｓｃＦｖ）又は複数の（ダイアボディ／トリ
アボディ）Ｆｖドメインを含むタンパク質（例えば、Ａｖｉｂｏｄｙ）と適合し、且つｃ
）好ましいフレームワーク１内ジスルフィド位置のいずれの側への（例えば、＋／−１〜
２残基の）移動も、機能を無効にすることなく可能にするのに十分なロバスト性を有する
ことを示すことを例証した。
【０４３８】
いずれの場合にも、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発法（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を指示どおりに用いて目的の特定のアミノ酸をコードするヌクレオ
チド配列を変化させることによりシステイン残基を導入した。例としてＡＶＰ０４−０７
Ａｖｉｂｏｄｙを用いると、Ｋａｂａｔ  Ｌ８位（ＦＲ１  ＶＬ領域）のプロリン残基
が配列ＣＣＧによりコードされ、Ｋａｂａｔ  Ｌ１１位（ＦＲ１  ＶＬ領域）のロイシン
残基が配列ＣＴＧによりコードされる。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突
然変異誘発技法を用いて、これらのヌクレオチド配列を、システインをコードするＴＧＣ
に変えた。
【０４３９】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発ＰＣＲベース方法は、プラ
イマーとしての所望の変異と鋳型としてのプラスミドＤＮＡとを含む２つの相補的な合成
オリゴヌクレオチドを使用して二本鎖変異ＰＣＲ産物を合成する。上記の例を用いると、
システイン残基をＡＶＰ０４−０７におけるＶＬ鎖のＦＲ１領域のＫａｂａｔ  Ｌ８位及
びＬ１１位に導入するため、以下の配列５’−ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ
ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＧＴＧ
ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  Ｇ−３’（配列番号１０６）をフォワードプライマーとして
使用し、５’−Ｃ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＧＣＡ
ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ
−３’（配列番号１０７）をリバースプライマーとして使用した。配列において以下の条
件を用いて増幅を行った：９５℃で３０秒間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び
６８℃で１３分間からなるサイクルを１８回；６８℃で７分間の最終伸長。鋳型を３７℃
で１時間、ＤｐｎＩで消化した。製造者の指示に従い形質転換体を得て、上記のとおりの
ＤＮＡ配列決定により同定した。
【０４４０】
同様の突然変異誘発手法を利用して全てのチオール化Ａｖｉｂｏｄｙを作製し、又はそ
の手法を用いてタンパク質の天然のＮ末端残基をセリン残基に置き換えた。Ｎ末端セリン
置換は、フレームワーク１内ジスルフィド変異の導入前又は導入後のいずれかに実施した
。ＡＶＰ０４−０７のＮ末端ＧｌｎのＳｅｒ残基との置換に使用した例示的なヌクレオチ
ド配列は、配列番号６６及び配列番号６７に示される。
【０４４１】
２．３  Ａｖｉｂｏｄｙコンストラクトの配列修飾
記載されるＤＮＡ配列に対する他の全ての修飾には、当業者に公知の標準的な分子生物
学的技術を用いた。Ａｖｉｂｏｄｙ配列が、超可変ＣＤＲ領域の、モデリングデータ（図
５、図８及び図９を参照）により示唆されるとき表面露出する可能性の高い位置に「天然
の」システイン残基を含んだ場合、それらの残基は、本質的に上記のとおりの部位特異的
突然変異誘発により代替的な非チオール含有アミノ酸に変異させた。例として、ＡＶＰ０
７ファミリーの親クローンであるＡＶＰ０７−１７は、ＶＨ  ＣＤＲ３領域内に２つのか
かるシステイン残基、すなわちＣｙｓ１０４（Ｋａｂａｔ付番Ｈ１００）及びＣｙｓ１０
９（Ｈ１００Ｅ）を含んだ。これらの残基を、変異原性プライマー配列番号６８及び配列
番号６９を使用した標準的なＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発
を用いてアラニンに置換し、ＡＶＰ０７−８６（配列番号１０９）を形成した。全てのＡ
ＶＰ０７−ｘｘチオール化ＡｖｉｂｏｄｙはＶＨ  ＣＤＲ３のこの追加的な修飾を含み、
これによりＡＶＰ０７−ｘｘファミリーがフレームワーク１内ジスルフィド変異戦略に適
合する。
【０４４２】
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙはまた、チオール化型のｓｃＦｖ又はトリアボディを生成す
るため、リンカー長さの修飾を伴い生成された。抗体分野の既刊の文献から、リンカーの
組成及び長さを修飾すると、Ａｖｉｂｏｄｙ多量体の形成に影響し得ることが周知されて
いる（Ｋｏｒｔｔら  １９９７年）。追加の残基をコードする変異原性プライマーを用い
て、ダイアボディ親のリンカー長さを、５残基、典型的にはＧＧＧＧＳ（配列番号１３５
）から１５残基、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）に修飾することによ
り、ｓｃＦｖ形成の促進を操作した。
【０４４３】
同様に、そのリンカー残基を除去することにより、及びある場合には、さらに先行する
可変ドメインの最大２残基を除去することにより、トリアボディ形成を促進した。例えば
、ＡＶＰ０４−７４  Ａｖｉｂｏｄｙ（配列番号１０２）をコードする核酸は、リンカー
領域の代わりに残基「ＶＴＶＳＳ−ＤＩＶＭ」を有するトリアボディをコードする。この
クローンは、上記の所望の配列をコードする変異原性プライマーを用いた欠失突然変異誘
発により、親ＡＶＰ０４−５０から操作した。
【０４４４】
３  細菌発現を用いた「未変異の」Ａｖｉｂｏｄｙ及びチオール化Ａｖｉｂｏｄｙの発現
及び精製
製造者の標準的なプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、個々のＡｖｉｂｏｄ
ｙコンストラクトのＤＮＡを化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細
胞に形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１発現株は、例示する全てのＡｖｉｂ
ｏｄｙについての主要な発現株として機能した。発現には、見込まれる収率要件に応じて
２つの互換的な手法、すなわち細菌振盪フラスコ発現又は細菌流加発酵のいずれかを用い
た。いずれかの方法によるタンパク質Ａｖｉｂｏｄｙに対する品質評価から、２つの方法
が相互に代替可能で、タンパク質品質及び特性は同程度であることが明確に示された。
【０４４５】
３．１  細菌振盪フラスコ発現
単一の形質転換体コロニーを５００ｍｌの２×ＹＴ含有１％Ｄ−グルコース及び１００
μｇ／ｍｌアンピシリンに接種し、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベ
ートした。１８Ｌの同じ培地に一晩培養物を最終ＯＤ６００が０．１となるよう播種し、
ＯＤ６００が約０．６〜０．８となるまで３０℃でインキュベートした。培養物を１２℃
に移し、誘導温度に達するまで振盪を続けた。０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク
質発現を誘導し、培養物を１２℃で１５時間インキュベートした。１０，０００×ｇで遠
心することにより細菌ペレットを調製し、回収して計量し、−２０℃で保存した。
【０４４６】
この発現系からの発現したタンパク質を含む細菌ペレットは、平均約６ｇ／Ｌ（培養培
地）であった。
【０４４７】
３．２  細菌流加発酵
５００ｍＬの複合培地を含む２Ｌバッフル付き三角フラスコ中で種培養物を成長させ、
２００ｒｐｍで振盪しながら１６時間、３７℃でインキュベートした；複合培地は（１Ｌ
当たり）、トリプトン、１６ｇ；酵母エキス、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇ；アンピシリン、２
００ｍｇを含有した。タンパク質発現には限定培地を使用し、この培地は（１Ｌ当たり）
、ＫＨ２ＰＯ４、１０．６４ｇ；（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、４．０ｇ；及びクエン酸一水和
物、１．７ｇ；グルコース  ２５ｇ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．２５ｇ；ＰＴＭ４微量
塩（ｔｒａｃｅ  ｓａｌｔ）、５ｍＬ；アンピシリン、２００ｍｇ；チアミン−ＨＣｌ、
４．４ｍｇを含有した。ＰＴＭ４微量塩は（１Ｌ当たり）、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、２．
０ｇ；ＮａＩ、０．０８ｇ；ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、３．０ｇ；ＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、
０．２ｇ；Ｈ３ＢＯ３、０．０２ｇ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＺｎＣｌ２、７
．０ｇ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２２．０ｇ；ＣａＳＯ４．２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；Ｈ２Ｓ
Ｏ４、１ｍＬを含有した。全ての培地及び添加剤は、ろ過滅菌したＰＴＭ４微量塩、塩酸
チアミン及びアンピシリンを除き、オートクレーブ処理により１２１℃で３０分間滅菌し
た。
【０４４８】
１．６Ｌの限定培地を含む２Ｌのガラス製Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂバイオリアクター（Ｓａ
ｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，独国）の中でタンパク質発現を完了さ
せた。溶存酸素濃度は、撹拌速度を５００〜１，２００ｒｐｍで、及び曝気速度（５％酸
素を給気）を０．３〜１．５Ｌ分−１で自動的に変えることにより、２０％に維持した。
必要に応じて空気流の酸素補給量を手動で増加させた。培養物のｐＨは、１０％（ｖ／ｖ
）Ｈ３ＰＯ４又は１０％（ｖ／ｖ）ＮＨ３溶液を自動的に添加することにより７．０に制
御し、及び泡は、消泡剤［１０％（ｖ／ｖ）ポリプロピレン２０２５）］を自動的に添加
することにより制御した。特に指定のない限り、容器温度は３７℃に維持した。０．２５
の出発光学濃度（６００ｎｍで計測）に達するよう、バイオリアクターに種培養物を接種
した。
【０４４９】
培地に添加されたグルコースが全て利用された後、グルコース、６００ｇ；及びＭｇＳ
Ｏ４．７Ｈ２Ｏ  ２２．４ｇ（１Ｌ当たり）を含む栄養液（フィード）を４０ｍＬ時−１
の流量でバイオリアクターに圧送した。フィードの開始２時間後、容器温度を２０℃まで
２．５時間の時間をかけて徐々に低下させ（６．８℃時間−１）、その後０．２ｍＭのＩ
ＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導し、供給速度を６ｍＬ時間−１に下げ
た。誘導１２時間後に培養物を回収し、典型的には光学濃度（６００ｎｍで計測）は１１
０に達し、及び各２Ｌ培養物から約３３０ｇの湿った細胞ペーストが回収された。
【０４５０】
３．３  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現したＡｖｉｂｏｄｙの精製
実施した発現手法に関わりなく、Ａｖｉｂｏｄｙタンパク質はいずれも、本質的に以下
に概説するとおり精製した。
【０４５１】
発現培養物から回収した細菌ペレット（発現方法に応じて約５０〜４００ｇ）を溶解さ
せて、タンパク質を抽出し、続いて標準的なクロマトグラフ技法により精製した。細菌ペ
レット１グラムにつき５ｍＬのＨｉｓ−Ｔａｇアフィニティークロマトグラフィー溶解緩
衝液（２０ｍＭ  リン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、０．２５ｍ
ｇ／ｍｌ  リゾチーム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５０ｕｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅＩ、ｐＨ７．４
）を用いて細胞ペレットを再懸濁した後、機械的に均質化し、次に超音波処理（氷上での
６×３０秒パルス）することによるか、或いはＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ−Ｃ５細胞破壊器（
ＡＶＥＳＴＩＮ  Ｉｎｃ．、カナダ）に３回通すことによって溶解させた。続いて細菌ラ
イセートを室温で１時間インキュベートした後、遠心（１６，０００×ｇ、３０分間）及
びろ過（０．４５μｍフィルター膜）を行った。
【０４５２】
次にＡＫＴＡ精製装置１０（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＨｉｓ−Ｔ
ａｇアフィニティークロマトグラフィー精製を用いてろ過した細菌ライセートからダイア
ボディを精製した。精製の規模に応じて１〜４本の５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ（商標）（Ｇ
Ｅ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）粗精製ＦＦカラムを精製のため直列で用いた。ライセー
トを外部Ｐ９６０ポンプを介してＨｉｓＴｒａｐ（商標）カラムに通した。ＨｉｓＴｒａ
ｐ（商標）カラムを１０カラム容量のＨｉｓ−Ｔａｇアフィニティークロマトグラフィー
抽出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾ
ール、ｐＨ７．４）で洗浄した。精製したタンパク質を、５０％Ｈｉｓ−Ｔａｇアフィニ
ティークロマトグラフィー溶出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５００ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）及び５０％Ｈｉｓ−Ｔａｇアフィニティ
ークロマトグラフィー抽出緩衝液（２６０ｍＭ  イミダゾールの最終濃度）で溶出させた
。溶出したタンパク質を含む画分（ＡＫＴＡ  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアで２８０ｍＭ
吸光度により決定されるとおり）を回収し、プールし、タンパク質濃度を決定し、及び適
切なイオン交換緩衝液で透析した。ＴＡＧ７２特異的ＡＶＰ０４−５０（配列番号５７）
ダイアボディを使用した典型的なＨｉｓ−Ｔａｇアフィニティークロマトグラフィー溶出
プロファイルを図１０Ａに示す。本明細書に記載されるＡｖｉｂｏｄｙは全て、同様の溶
出プロファイルを示した。
【０４５３】
続いて、タンパク質のｐＩ計算値より１．０〜１．５ｐＨ単位低い（陽イオン交換につ
いて）又はタンパク質のｐＩより１．０〜１．５ｐＨ単位高い（陰イオン交換について）
緩衝液に、部分的に精製したＡｖｉｂｏｄｙを透析した。典型的には、７．０〜８．０の
ｐＩのＡｖｉｂｏｄｙはＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、陽イオン交換についてｐＨ６
．０）に透析し、８．０〜９．０のｐＩのＡｖｉｂｏｄｙはリン酸緩衝液（５０ｍＭ  リ
ン酸、陽イオン交換についてｐＨ７．０）に透析し、及び５．０〜６．５のｐＩのＡｖｉ
ｂｏｄｙはトリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、陰イオン交換についてｐＨ８）に透
析した。ＡｖｉｂｏｄｙのｐＩ値は全て、これらの範囲内に収まった。Ａｖｉｂｏｄｙは
２００×超の容量の緩衝液に、２時間以上を空けることなく緩衝液を３回交換して透析し
た。透析は、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ  ６−８０００Ｄａ  ＭＷカットオフ透析管を使用し
て４℃で実施した。
【０４５４】
透析後、タンパク質試料を３２２０×ｇで１０分間遠心し、変性した不溶性材料をペレ
ット状にした後イオン交換を行った。イオン交換の実施にはＡＫＴＡ精製装置１０を使用
し、最大２本の５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ  ＨＰカラムを直列で用いて、清澄化
した透析材料をＰ９６０外部ポンプを介してカラムに通過させた。このステップの後、カ
ラムを１０カラム容量のイオン交換緩衝液で洗浄してから線形緩衝液勾配（塩勾配）を開
始し、カラムからタンパク質を溶出させた。このプロセスでイオン交換緩衝液は、線形勾
配にわたり同じ緩衝液で交換し、ＮａＣｌを１Ｍの最終濃度まで添加した。３００ｍＬに
対して６００ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度で溶出勾配を実施した。
【０４５５】
溶出したダイアボディ（Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアで２８０ｎｍ吸光度プロファイル
により決定されるとき）に対応する画分をプールし、定量化した。ＡＶＰ０４−５０につ
いての典型的なイオン交換溶出プロファイルを図１０Ｂに提供する。ＡＶＰ０４−５０ダ
イアボディは、約３７ｍＳ／ｃｍ又は３２％Ｂの塩濃度でルーチン的に溶出し、ここでＡ
ＶＰ０４−５０の主要な二量体アイソフォーム（矢印）は、電荷及びサイズの変異型と容
易に分離することができた。ダイアボディクローンは、異なるファミリー由来のものであ
っても、塩勾配における同様の時点でルーチン的に溶出された。ある場合には、１×ＰＢ
Ｓ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、
１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中でのキャリブレートされたＳｕｐｅｒｄｅ
ｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した分析的
サイズ排除法を実施して、特定の画分の所望の種又は組成のピークアイデンティティをプ
ールする前に確認した。目的とする主要なアイソフォームを含む溶出画分を、下流精製の
ためプールした。
【０４５６】
イオン交換後、溶出したタンパク質材料は、ゲルろ過前に４℃で約３ｍｇ／ｍＬに濃縮
した。ゲルろ過は、ＡＫＴＡ精製装置１０でＰＢＳ中のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５  ２６／
６０プレップグレードカラムを使用して実施した。例としてＡＶＰ０４−５０ダイアボデ
ィを用いると、ダイアボディは注入後約１４０ｍｌ（又は５３．５分間）で溶出した（図
１０Ｃ）。ダイアボディ変異型は、ＡＶＰ０４ファミリー内のものも、他のものも、分子
量が約５４ｋＤａの任意の球状タンパク質についての予想どおり同様の溶出容量でルーチ
ン的に溶出された。溶出したＡＶＰ０４−５０二量体に対応する、図１０Ｃに輪郭が示さ
れる範囲内の画分をプールし、１０Ｋ  ＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒ
ｅｅスピンコンセントレータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を３２００×ｇ、４℃で使用
して０．５〜３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０４５７】
精製産物の最終純度を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００  １０／３００カラムで
のゲルろ過クロマトグラフィー法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によりルーチン的に評
価した。例として、ＡＶＰ０４−５０の精製方法では、ゲルろ過で単一のクリーンな溶出
ピーク（図１０Ｄ）を、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で単一の定義された種（図１０
Ｅ）を生じる純度を有するタンパク質がルーチン的に回収された。
【０４５８】
試験されたＡｖｉｂｏｄｙのいずれの間にも、精製戦略及び得られる純度プロファイル
に大きい違いはなかった。図１１Ａ〜図１１Ｃは、本明細書に記載され、及び図に示され
るとおりのＡｖｉｂｏｄｙの最終的なサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを取り
上げる。予想どおり、Ａｖｉｂｏｄｙファミリー内及び異なるＡｖｉｂｏｄｙファミリー
間の双方における僅かな差異は別として、Ａｖｉｂｏｄｙの溶出時間は予想される分子サ
イズと十分に対応した；トリアボディはダイアボディより早く溶出し、ダイアボディはｓ
ｃＦｖより遅く溶出した。本明細書に記載されるＡｖｉｂｏｄｙは全て、機能的に発現さ
せて、実質的に均質となるよう精製することができた。フレームワーク１内システイン置
換変異の存在が、Ａｖｉｂｏｄｙを機能的に発現させて実質的に均質となるよう精製する
能力に影響を与えなかったことから、チオール化Ａｖｉｂｏｄｙのフレームワーク１内に
操作的システインを置くことが、Ａｖｉｂｏｄｙの不安定化につながる有害な構造的コン
ホメーション上の変化を引き起こさなかったことを示唆するモデリングデータが、部分的
に確認された。
【０４５９】
実施例４−ダイアボディのインビトロ免疫反応性評価
可溶性抗原に対する結合活性を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたカラムシフト
アッセイにより確立した。ＡＶＰ０４−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙに対する抗原は、ウシ顎下
腺ムチン（ＢＳＭ）（Ｓｉｇｍａ）から可溶形態で利用可能なＴＡＧ７２である。ＡＶＰ
０７−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙについては、可溶性抗原は組換えＨＥＲ２エクトドメインで
ある。ＡＶＰ０２−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙについては、可溶性抗原は組換え完全長ＭＵＣ
１である。Ａｖｉｂｏｄｙ又は抗原に関わりなく、カラムシフトアッセイは本質的に以下
に記載するとおり実施した。
【０４６０】
ダイアボディに対する少なくとも２倍モル過剰の可溶性抗原をＰＢＳ緩衝液中、周囲温
度で１時間インキュベートした。得られたＡｖｉｂｏｄｙ−抗原複合体ピークを遊離ダイ
アボディピークと比較することにより、結合活性を決定した。インキュベーション後の遊
離Ａｖｉｂｏｄｙに対応するピークの減少、及び／又はＡｖｉｂｏｄｙ−抗原複合体に対
応するピークのサイズ増加を陽性の結合結果と見なした。Ａｖｉｂｏｄｙ又はＡｖｉｂｏ
ｄｙ−抗原複合体の溶出プロファイルを、２８０ｎｍの吸光度によりモニタリングした。
いずれの場合にも、Ａｖｉｂｏｄｙ単独では２８〜３３分に溶出し、Ａｖｉｂｏｄｙ−抗
原複合体は１０〜２５分に溶出した。
【０４６１】
上記に記載されるプロトコルを用いて本明細書に記載される全てのＡｖｉｂｏｄｙの免
疫活性を評価し、結果を図１２Ａ〜図１２Ｃに示した。いずれの場合にも、ゲルろ過にお
ける溶出時間の大幅な短縮、及び／又は未結合のＡｖｉｂｏｄｙの量の減少から明らかな
とおりの、Ａｖｉｂｏｄｙ−抗原複合体の形成が観察されたことから、Ａｖｉｂｏｄｙが
免疫反応性であることが示される。ｓｃＦｖ  Ａｖｉｂｏｄｙは各分子に結合部位を１つ
のみを有し、そのため複数の結合部位を有することで活発な結合性を呈するダイアボディ
及びトリアボディと比べて弱い結合特性を呈するものと予想される。予想どおり、異なる
ＳＥＣプロファイルにより明らかなとおり、ＡＶＰ０４−７０  ｓｃＦｖはダイアボディ
又はトリアボディクローンと比べて安定性が低いＡｖｉｂｏｄｙ：抗原複合体を形成する
。しかしながら、「未結合の」ＡＶＰ０４−７０ピークの減少及びＡｖｉｂｏｄｙ：抗原
複合体ピークの形成はプロファイル上明らかで、それが免疫反応性であることが示される
。
【０４６２】
Ａｖｉｂｏｄｙを無関係の抗原と共にインキュベートしたとき、複合体形成は認められ
なかったことから、特異的な結合相互作用が生じたことが示される。
【０４６３】
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおけるフレームワーク１内システイン置換変異の存在又は
不在が結合を無効にすることはなかったことから、フレームワーク１内システイン置換変
異部位が、Ａｖｉｂｏｄｙの機能特性に影響をほとんど又は全く与えない適切な位置で操
作されたことがさらに示される。
【０４６４】
実施例５−チオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおける遊離スルフヒドリルの定量化
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙをルーチン的に発現させ、実質的に均質になるよう精製し、
及び機能的に活性を有することを示した。チオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおける操作的フレ
ームワーク１内ジスルフィド架橋の存在、及びその還元に対する利用可能性を、比色アッ
セイにより評価した。
【０４６５】
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙを、３．８ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル
）ホスフィン塩酸塩）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）と共にＰＢＳ中
室温で２５分間インキュベートした。還元後、１００ｍＭリン酸緩衝液＋１ｍＭのＥＤＴ
Ａ  ｐＨ６．５で予め平衡化したＰＤ１０脱塩カラムによりＴＣＥＰを除去し、０．５ｍ
Ｌの画分を回収した。ピークタンパク質画分をＵＶ分光法により特定し、プールした。
【０４６６】
反応性チオールを試験するため、５０〜７５μｇの還元タンパク質を、５μｌの４ｍｇ
／ｍＬ  エルマン試薬（５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）；ＤＴＮＢ）（
Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）を含む１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、
１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に希釈した。反応を周囲温度で１５分間進めた。反応性ス
ルフヒドリル濃度を分光法により定量化し、この緩衝系における４１２ｎｍでのＴＮＢの
モル吸光係数は１４，１５０Ｍ−１ｃｍ−１と仮定した。スルフヒドリルのモル濃度をダ
イアボディのモル濃度で除すことにより、ダイアボディ当たりの反応性スルフヒドリル基
の推定値を得た。インタクトなＩｇＧ及びフレームワーク１内システイン置換変異を含ま
ない非チオール化Ａｖｉｂｏｄｙ（ＡＶＰ０４−０７又はＡＶＰ０２−６０のいずれかと
同義）を標準化対照として使用した。
【０４６７】
これらの還元条件下では、予想どおり、不変のＫａｂａｔ  Ｌ２３位とＬ８８位との間
及び不変のＫａｂａｔ  Ｈ２２位とＨ９２位との間の保存されたジスルフィド結合は反応
性を示さず、コンジュゲーションには利用できない。
【０４６８】
上記に概説する還元条件を用いると、インタクトなＩｇＧ対照は、配列分析から予想さ
れたとおり（データは示さず）、還元後に平均して８個の反応性チオールを示した。対照
的に、ＡＶＰ０４−０７及びＡＶＰ０２−６０などの対照Ａｖｉｂｏｄｙは、一貫して遊
離又は反応性チオールを示さなかった。
【０４６９】
表２は、ＶＬ  Ｌ８−Ｌ１１（又はＶＬλを含むＡＶＰ０７−ｘｘファミリーの場合、
Ｌ７−Ｌ１１）にフレームワーク１内システイン置換変異を有するＡＶＰ０４−ｘｘ、Ａ
ＶＰ０２−ｘｘ及びＡＶＰ０７−ｘｘチオール化Ａｖｉｂｏｄｙの一部を示す。いずれの
場合にも、フレームワーク１内システイン置換変異を含む非還元Ａｖｉｂｏｄｙが表面上
に有する反応性チオールは０．５個未満であると見られたことから、フレームワーク１内
システイン置換変異が、還元されていない状態では、確かにジスルフィド架橋を形成した
ことを明確に示している。
【０４７０】
このジスルフィド架橋は、記載のとおり容易に還元でき、コンジュゲーションに利用可
能であった。還元された状態では、フレームワーク１内システイン置換変異を含む全ての
Ａｖｉｂｏｄｙが平均４個の反応性チオールを呈した。
【０４７１】
【表２】
0006371319.tif 000003
【０４７２】
実施例６−チオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおける還元した操作的ジスルフィドとのペイロー
ドコンジュゲーション
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおける操作的フレームワーク１内ジスルフィド架橋の還元
に対する利用可能性から、多数のチオール反応性ペイロードのいずれかを、露出していて
、且つ還元されているシステインとコンジュゲート可能であることが示された。
【０４７３】
この能力を実証するため、マレイミド−ＰＥＧ２４−メトキシペイロードを、本質的に
本明細書に記載されるとおりの還元した操作的フレームワーク１内システインとコンジュ
ゲートした。
【０４７４】
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙを還元し、還元剤を除去した後、過剰のマレイミド−ＰＥＧ
２４−メトキシ（ｍａｌ−ＰＥＧ２４−ＯＭｅ）（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、
ＯＨ，米国）をＡｖｉｂｏｄｙ当たり２０当量で添加し、４℃で一晩反応させた。ペグ化
後、反応しなかったＰＥＧを十分な透析により除去し、ＰＥＧ負荷の成功をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ及び質量分析により判断した。
【０４７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析については、ウェル当たり２μｇの総タンパク量を負荷し、ＭＥ
Ｓ−ＳＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲ
ルを用いて解像した。得られたタンパク質バンドを、クマシーブルー染色を用いて可視化
した。成功したペグ化は、単量体鎖当たり５ｋＤａの近似質量増加を再現性のある形で示
した（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。
【０４７６】
質量分光分析については、ＭａｓｓＰＲＥＰオンライン脱塩カートリッジ（Ｗａｔｅｒ
ｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ｅｓｉＴＯＦ質量分析器
を使用してＰＥＧ化Ａｖｉｂｏｄｙの質量スペクトルを記録した。このシステムは５％の
ＣＨ３ＣＮで１分間平衡化し、続いて５〜９５％のアセトニトリルの溶出勾配を９分間に
わたり行った。ＰＥＧ化Ａｖｉｂｏｄｙは、典型的には７分に溶出した。ＭａｓｓＨｕｎ
ｔｅｒソフトウェアを使用して、生成された関連ｍ／ｚ電荷ピークのデコンボリューショ
ンにより試料の平均質量を決定した。データを表３に報告し、これは質量スペクトルのデ
コンボリューション後に得られた平均単量体鎖Ａｖｉｂｏｄｙ質量を要約する。ＰＥＧ２
４の式量は１２３９．４４ｇ／ｍｏｌと報告され、従って少なくとも２４７８．８８質量
単位の増加が、操作的システインとの完全なコンジュゲーションを示す。ＡＶＰ０７−７
１、ＡＶＰ０４−５０、ＡＶＰ０７−８８及びＡＶＰ０２−１０１についての典型的な質
量スペクトルの例を、それぞれ図１４Ａ〜図１４Ｄに示す。
【０４７７】
【表３】
0006371319.tif 000004
【０４７８】
実施例７−ペイロードをコンジュゲートしたチオール化Ａｖｉｂｏｄｙのインビトロ免疫
反応性評価
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙを発現させて精製することができ、その未変性の（コンジュ
ゲートされていない）状態で免疫反応性であることが示された。上記に報告されるデータ
は、操作的システインとの化学量論的に定義されたコンジュゲーションが高効率で起こっ
ていたことを明確に示した。以下のデータは、フレームワーク１内システイン置換変異を
選択的に還元して小さいチオール反応性ペイロードをコンジュゲートしたとき、免疫活性
が無効にならなかったことを示す。
【０４７９】
このため、マレイミド−ＰＥＧ２４−メトキシ（実施例６）のペイロードを負荷したチ
オール化Ａｖｉｂｏｄｙについて、本質的に実施例４に記載のとおり免疫活性を評価した
。
【０４８０】
いずれの場合にも、ゲルろ過における溶出時間の大幅な短縮により明らかなとおりの、
Ａｖｉｂｏｄｙ−抗原複合体形成が観察された（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。いずれの場合に
も、Ａｖｉｂｏｄｙ単独では２８〜３３分間で溶出し、Ａｖｉｂｏｄｙ−抗原複合体は１
０〜２５分で溶出した。予想どおり、Ａｖｉｂｏｄｙを無関係な抗原と共にインキュベー
トしたときには、複合体形成は観察されなかった。この結果から、チオール化Ａｖｉｂｏ
ｄｙの還元したフレームワーク１内システイン置換変異に対する比較的小さいペイロード
のコンジュゲーションが、結合性を無効にしないことが示された。
【０４８１】
しかしながら、操作的フレームワーク１内システイン置換変異に対するペイロードの負
荷は、ＰＥＧ又はＰＥＧ様分子に限定されるものではない。
【０４８２】
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙが、ここでも結合性を無効にすることなく、上記に例示され
るＰＥＧコンジュゲートと大きく異なるペイロードとコンジュゲートし得ることを示すた
め、ＡＶＰ０４−５０に検出可能標識ユウロピウムのペイロードを負荷した。
【０４８３】
１−（ｐ−ヨードアセトアミドベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ１−Ｎ１，Ｎ２，
Ｎ３，Ｎ３−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋｕ，フィンラ
ンド）のＥｕ３＋キレートを使用して、製造者の指示に従いＡＶＰ０４−５０の還元した
フレームワーク１内システイン置換変異とコンジュゲートした。簡潔には、タンパク質を
５０〜１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム緩衝液＋４ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中、３ｍ
ｇ／ｍｌに濃縮した。Ｅｕ−ＤＴＰＡを３０倍（Ｅｕ−ＤＴＰＡ：タンパク質）モル過剰
で添加してＡＶＰ０４−５０を還元した。４℃で３〜１６時間後、反応を完了した。未反
応のＥｕ−ＤＴＰＡを、トリス−緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で予め平衡化したＳｕｐｅ
ｒｄｅｘ（登録商標）２００  １０／３００カラムでのゲルろ過によりタンパク質と分離
した。得られた画分の各々をエンハンスメント溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋ
ｕ，フィンランド）に希釈し、ユウロピウムカウントについてＶｉｃｔｏｒ時間分解蛍光
光度計（ｆｌｕｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して評価した。ピークタンパク質画分に対応する
ピークユウロピウムカウントをプールし、０．１％の高純度ＢＳＡで安定化させ、及び４
℃で遮光保存した。キットにより供給された１００ｎＭのＥｕ標準に対する試料のＥｕカ
ウントを計算することにより、組み込まれたＥｕ−ＤＴＰＡの濃度を測定した。
【０４８４】
Ｅｕ３＋−ＤＴＰＡをコンジュゲートしたＡＶＰ０４−５０は、本質的に実施例４に記
載のとおりの方法により、免疫反応性であることが示された。Ｅｕ３＋−ＤＴＰＡをコン
ジュゲートしたＡＶＰ０４−５０は、抗原：Ａｖｉｂｏｄｙ複合体の形成により示される
とおり、ＢＳＭに対する特異性を示した。この複合体形成は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商
標）２００  １０／３００カラムでのゲルろ過クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶
出時間の短縮から明らかであった（図１６）。
【０４８５】
Ｅｕ３＋−ＤＴＰＡをコンジュゲートしたＡＶＰ０４−５０の免疫活性を、細胞結合ア
ッセイにより測定した。標識したＡｖｉｂｏｄｙをＴＡＧ７２陽性細胞系（ＬＳ１７４Ｔ
）及び陰性細胞系（ＳＫ−ＯＶ−３）と共にインキュベートした。インキュベーション期
間後（１時間、周囲温度）、細胞を十分に洗浄し、ユウロピウム活性についてアッセイし
た。ユウロピウム標識したＡＶＰ０４−５０は、ＳＫ−ＯＶ３（ＴＡＧ７２陰性）細胞系
と比較してＬＳ１７４Ｔ（ＴＡＧ７２陽性）に関する蛍光強度の大幅な増加により示され
るとおり、インタクトな免疫活性及び抗原特異性を示した（図１７）。
【０４８６】
まとめると、これらのデータは、抗原に対する結合性を無効にすることなくペイロード
をチオール化Ａｖｉｂｏｄｙにおける操作的フレームワーク１内システイン置換変異に部
位特異的にコンジュゲートすることが可能であることを示唆している。
【０４８７】
実施例８−放射標識ＡＶＰ０４−ｘｘ  Ａｖｉｂｏｄｙの生体内効力
チオール化Ａｖｉｂｏｄｙ  ＡＶＰ０４−５０をマウス異種移植モデルにおいてインビ
ボで使用して、チオール化Ａｖｉｂｏｄｙのフレームワーク１内操作システイン変異が生
体内安定性又は効力に影響を与えないことを示した。ＡＶＰ０４−５０の（１２５Ｉ又は
１１１Ｉｎ）を用いた生体分布を、「未変異の」親ＡＶＰ０４−０７のものと比較した。
【０４８８】
８．１  １２５ＩによるＡｖｉｂｏｄｙの放射標識
標準的なヨードジェン法（Ｙａｚａｋｉら、２００１年）を用いて、ＡＶＰ０４−０７
及びＡＶＰ−０４−５０  Ａｖｉｂｏｄｙの１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によ
る放射性ヨウ素化を実施した。所要量（５〜１０μＬ）のＮａ１２５Ｉ（２６ｍＢｑ）を
、２０μｇのヨードジェン（Ｐｉｅｒｃｅ）により予めコーティングした試験管中の２０
０μｇのＡｖｉｂｏｄｙに添加した。室温で３分間インキュベートした後、上記のとおり
ＦＰＬＣによりＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５又は２００カラムを使用して標識材料を精製した
。カラム溶出物を分画して計数し、その後ピーク画分をプールしてインビトロ及びインビ
ボ試験に使用した。放射標識収率は、典型的には８０〜１００％であった。
【０４８９】
８．２  ＮＨＳ−ＤＯＴＡのＡｖｉｂｏｄｙとのコンジュゲーション及び１１１Ｉｎによ
る放射標識
ＡＶＰ０４−０７をＮＨＳ−ＤＯＴＡ［１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン
−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）］とコンジ
ュゲートした。ＡＶＰ０４−０７及びＡＶＰ０４−５０を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉ
ｃｏｎ  ＹＭ−１０（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）遠心ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ
ｒｐ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）を使用して、４℃、４，０００ｒｐｍで遠心するこ
とにより（Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ１５Ｒ、ＳＸ４７５０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕ
ｌｔｅｒ）、３〜６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。金属夾雑物を取り除くため、タンパク質（０
．４ｍＬ）を、Ｂｉｏｍａｘ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＰＢＱＫ０２５１０）を
備えた改良型限外ろ過セルを使用して、１４容量のコンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ
重炭酸ナトリウム、５ｍＭの９ジエチレントリアミン五酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒ
ｉａｍｅｎｅ  ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ）（ＤＴＰＡ）、ｐＨ８．５）で２時間透析し
た。プラスマグレードの水（ｐｌａｓｍａｇｒａｄｅ  ｗａｔｅｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，米国）の中で１０ｍｇ／ｍＬ（０．１９ｍ
ｇ、２５０ｎモル）の１９μＬのＮＨＳ−ＤＯＴＡ（Ｂ−２８０；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉ
ｃｓ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，米国）を、限外ろ過セル中の５倍モル過剰のＡｖｉｂｏｄｙ
（２．５ｍｇ、４８ｎモル）に添加し、室温で１時間撹拌した。続いてタンパク質を１４
容量の２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．２で透析し、４℃で保存した。
【０４９０】
１１１ＩｎＣｌ２（Ｔｒａｃｅ  Ｌｉｆｅ  １１  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｅｎｔｏｎ，
ＴＸ，米国）を使用して、ＤＯＴＡコンジュゲート化Ａｖｉｂｏｄｙ（ＡＶＰ０４−０７
−ＤＯＴＡ及びＡＶＰ０４−５０−ＤＯＴＡ）の放射性金属標識を実施した。典型的な実
験では、１９ｍＢｑの１１１ＩｎＣｌ２をさらなる０．１ＭのＨＣｌにより希釈し、０．
２５Ｍの酢酸アンモニウム  ｐＨ７．０（最終ｐＨは５．５に調整）中の１２５μｇのＤ
ＯＴＡコンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７に添加した。４３℃で４５分間インキュベート
した後、溶液を０．１ｍＭ  ＤＴＰＡに調整して任意の残存１１１Ｉｎを結合させ、室温
でさらに１０分間インキュベートした。放射標識収率は、典型的には７０〜９０％であっ
た。次にＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５又は２００カラムを使用して標識した材料をＨＰＬＣに
より精製し、カラム溶出物を分画して計数した。
【０４９１】
８．３  ＬＳ−１７４Ｔ異種移植片を使用したインビボ生体分布
マウス異種移植モデルのため、６〜８週齢の雌性無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対してＬＳ−１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ
）（１０６個）を側腹部に皮下注射し、腫瘍を試験前の約１０日間成長させた。生体分布
試験のため、ＬＳ−１７４Ｔ異種移植片を有するマウスに対し、３７０ｋＢｑの１２５Ｉ
標識及び１５０ｋＢｑの１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−０７又はＡＶＰ０４−５０（２〜６
μｇの総タンパク量）の混合物（２００μｌ）を静脈内注射した。様々な時間点でマウス
（４〜６匹のマウス／群）を安楽死させ、腫瘍、血液及び主要臓器を採取し、計量及び計
数した。カウントは、１２５Ｉチャネルにおける１１１Ｉｎカウントの重複について補正
した。放射性核種ごとに組織のグラム当たりの注射量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算した。
【０４９２】
８．４  Ａｖｉｂｏｄｙのインビボ生体分布
ＬＳ−１７４Ｔ異種移植片を有する無胸腺マウスにおいて１２５Ｉ−及び１１１Ｉｎ−
ＤＯＴＡ標識Ａｖｉｂｏｄｙの生体分布を計測した。
【０４９３】
ＡＶＰ０４−０７及びＡＶＰ０４−５０  Ａｖｉｂｏｄｙの生体内効力は完全に同程度
であったことから、モデリングにより定義されるフレームワーク１内ジスルフィド架橋が
Ａｖｉｂｏｄｙ効力を不安定化させることも、又はそれに負の影響を及ぼしたりすること
もなかったことが示唆される（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。
【０４９４】
２つの放射性トレーサー（１２５Ｉ−及び１１１Ｉｎ）は同様の方法で血液中から除去
し、ＡＶＰ０４−５０とＡＶＰ０４−０７とのクリアランスには僅かな差しか認められな
かった。注入後１時間までに約５０％が除去され、４時間目で循環中になお約６〜１２％
が残存した。このサイズのタンパク質について予想されるとおり、１１１Ｉｎ標識ＡＶｉ
ｂｏｄｙについては相当量の腎取り込み（２４時間目で＞１００％ＩＤ／ｇ）があったが
、１２５Ｉ標識ＡＶｉｂｏｄｙについてはなく、腎臓がクリアランスの主要な経路であっ
たことを実証している。
【０４９５】
１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０７については腫瘍で多量に取り込まれ、注射後４時間ほど
の早い段階で２５％ＩＤ／ｇ超が観察され、４８時間目にも２０％ＩＤ／ｇより多く腫瘍
に残存した。１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−５０の腫瘍取り込みは、注射後０〜４時間の期間
では１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０７の取り込みと一致したが、その後１１１Ｉｎ−ＡＶＰ
０４−０７の取り込みを超え、２４時間目に最大腫瘍取り込みの３０％ＩＤ／ｇ超に達し
た。腫瘍取り込みは、１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０７及び１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−５０
の双方について注射後４８時間目で同程度のままであった。１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０
７の腫瘍対血液比は２４時間目に＞５０：１であった。１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−５０の
場合、腫瘍対血液比は２４時間目に＞６０：１に上昇した。ヨウ素１２５標識Ａｖｉｂｏ
ｄｙはいくらか低い腫瘍対血液比及び腫瘍取り込みを示した（ＡＶＰ０４−０７について
４時間目及び４８時間目にそれぞれ約１７％及び１０％ＩＤ／ｇ、及びＡＶＰ０４−５０
について４時間目及び４８時間目にそれぞれ１９％及び１０％ＩＤ／ｇ）。予想どおり、
一部の１１１Ｉｎは脾臓、肝臓及びカーカス（carcass）に貯留し、一方１２５Ｉ標識Ａ
Ｖｉｂｏｄｙはこれらの組織には貯留しなかった。
【０４９６】
ＡＶＰ０４−０７及びＡＶＰ０４−５０の生体分布に加え、チオール化されたＨＥＲ２
特異的ＡｖｉｂｏｄｙであるＡＶＰ０７−６３（配列番号６５）もまた、その非チオール
化親ＡＶＰ０７−１７と同程度に生体内で有効であることが示された。
【０４９７】
これらの生体内実験では、ＡＶＰ０７−１７及びＡＶＰ０７−６３は、本質的に記載さ
れるとおり（Ａｄａｍｓら  １９９３年）、クロラミンＴ法（１２５Ｉ：タンパク質比、
１：１０）を用いて１２５Ｉで放射標識した。放射性医薬品の品質及び免疫活性は、記載
されるとおり（Ａｄａｍｓら  １９９３年）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、及び生細胞結合
アッセイで評価した。６〜８週齢のＣＢ．１７  Ｉｃｒ  ｓｃｉｄマウスに対し、ＳＫＯ
Ｖ３細胞（２．５×１０６個）を腹部に皮下移植した。腫瘍が５０〜２００ｍｇのサイズ
に達したとき（約８週）、その飲用水にルゴール液を入れて放射性ヨウ素の甲状腺蓄積を
阻止し、生体分布試験を開始した。各マウスに対し、２０マイクログラム（１００ｍｌ）
の放射性ヨウ素化ＡＶＰ０７−１７又はＡＶＰ０７−６３を尾静脈注射により静脈内投与
した。注射後２４時間目に、１２５Ｉ−Ａｖｉｂｏｄｙを投与されたコホートの５匹のマ
ウスを犠牲にした。組織中（％ＩＤ／ｇ）及び血液中（％ＩＤ／ｍｌ）における各放射性
医薬品の残留の平均値及びＳＥＭを、記載されるとおり（Ａｄａｍｓら  １９９３年）、
崩壊補正したカウントから決定した。
【０４９８】
２４時間生体分布の結果から、ＡＶＰ０４−１７及びＡＶＰ０７−６３の腫瘍取り込み
は、３．０〜３．６％ＩＤ／ｇの範囲で（図１９）、極めて類似していることが示された
。チオール化Ａｖｉｂｏｄｙ及び非チオール化Ａｖｉｂｏｄｙの腫瘍取り込みは極めて類
似していたが、他の全ての組織では、２４時間目のＡＶＰ０７−６３取り込みは有利には
、親の非チオール化ＡＶＰ０７−１７の取り込みより少なかった。
【０４９９】
これらの結果は、フレームワーク１内ジスルフィド挿入を受け入れる際に生体内効力、
安定性又は機能に負の影響を及ぼすことのないフレームワーク１領域のロバスト性を明確
に示している。さらに、好ましいフレームワーク１内ジスルフィド挿入の追加（ＡＶＰ０
４−５０の場合など）は、コアモデリング制約をなお満たす限り、Ａｖｉｂｏｄｙの効力
又はジスルフィド形成に影響することなく１〜２残基だけ僅かにシフトさせることができ
る（ＡＶＰ０７−６３の場合など）。
【０５００】
実施例９−ペイロードコンジュゲート化チオールＡｖｉｂｏｄｙの生体内効力は非「未変
異」Ａｖｉｂｏｄｙより優れている。
Ｆｖ含有タンパク質との部位特異的な、且つ化学量論的に定義されたペイロードコンジ
ュゲーションを可能にするようにジスルフィド挿入変異を設計した。操作的なフレームワ
ーク１内ジスルフィド架橋の挿入は、インビトロ及びインビボの双方でチオール化Ａｖｉ
ｂｏｄｙの効力に影響しないことが示された。
【０５０１】
Ａｖｉｂｏｄｙの表面上の操作的フレームワーク１内ジスルフィド挿入変異に対する部
位特異的及び化学量論的に定義されたペイロードコンジュゲーションが、リジンなどの他
のＡｖｉｂｏｄｙ表面残基に対するペイロードのランダムコンジュゲーションと比べてイ
ンビボで利点を提供したことを示すため、４８−ＰＥＧリピートのサイズ単分散ポリエチ
レングリコール（ｄＰＥＧ４８、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ、ＯＨ，米
国）を、操作的フレームワーク１内部位を介してＡＶＰ０４−５０にコンジュゲートした
。この試薬（ＰＥＧ４８−ＡＶＰ０４−５０）の生体分布を、ＰＥＧが表面リジンにコン
ジュゲートされたＡＶＰ０４−０７のＰＥＧコンジュゲート（ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０
４−０７）で観察されたインビボ生体分布の結果と比較した。
【０５０２】
９．１  ＡＶＰ０４−０７  ＡｖｉｂｏｄｙのＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＰＥＧ３４００
コンジュゲートの生成
ＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−ＶＳを、これまでに記載されるとおり（Ｌｉら  ２００８年
）１５：１のモル比及びｐＨ６．０でＡＶＰ０４−０７ダイアボディにコンジュゲートし
た。簡潔には、ＮＨＳＰＥＧ３４００−ＶＳ（３．１ｍｇ、８００ｎモル）を１ｍＬのｐ
Ｈ７．５  ＰＢＳ中の２．７５ｍｇ（５０ｎモル）のダイアボディ（５２，５００ダルト
ンの二量体分子量に基づく）と混合し、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に調整し、混
合物を室温で２時間反応させた。ＳＤＳゲルにより反応をモニタすると、２時間までに７
０％超が完了しているものと思われた。２時間後、反応混合物全体をＳｕｐｅｒｄｅｘ  
７５カラムに加え、１６．３分に溶出したコンジュゲートを回収した。コンジュゲート（
８ｍＬ）を１０，０００ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔ
ｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）において０．３５ｍｌに濃縮し、１．４ｍｇ（２．７
６μモル）のシステインアミド−ＤＯＴＡと混合し（Ｌｅｗｉｓら  １９９８年）、ｐＨ
を８．５に調整し、試料ロータにおいて混合物を室温で１７時間反応させた。試料を０．
２５Ｍの酢酸アンモニウムで透析し、１０，０００ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎで
１〜３ｍｇ／Ｌに濃縮し、無菌ろ過した。得られたコンジュゲートを、本質的に実施例８
．２に記載するとおり１１１Ｉｎで放射標識した。
【０５０３】
９．２  ＡＶＰ０４−５０  ＡｖｉｂｏｄｙのＤＯＴＡ−ＰＥＧ４８コンジュゲートの生
成
Ｎ−ＦＭＯＣ−アミド−ＰＥＧ４８−酸（０．１ｍモル）を、Ｎ−メチルピロリジン／
ジクロロメタン中のＤＣＣ／ＨＯＢｔにより室温で９０分間活性化し、ＤＣＵをろ去し、
活性化Ｎ−ＦＭＯＣ−ＰＥＧ４８−酸をＣｙｓ−ポリスチレンＷａｎｇ樹脂（０．３ｍモ
ルｃｙｓ／ｇ樹脂）と７５℃で３分間カップリングした。ＦＭＯＣ基をエタノール／ＤＭ
Ｆ（１３：２００、ｖ／ｖ）中の０．５Ｍピペラジンにより６５℃で３分間除去し、ＤＭ
Ｆ、エタノール、及びＤＣＭで洗浄し、次に上記のとおりトリ−ｔ−ブチル−ＤＯＴＡの
活性エステル（０．５ｍモル）とカップリングした。樹脂を５ｍＬのＴＦＡ（５％水、５
％トリイソプロピルシラン、５％エタンジチオール）により４０℃で６０分間処理した。
粗生成物をＤＣＭ／ヘキサン（５ｍＬ、２：５ｖ／ｖ、５×）で抽出し、−２０℃の１０
ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルで沈澱させ、ＰＲＰ−１カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒ
ｅｎｏ，ＮＶ、１０×２５０ｍｍ）において、１００％Ａ（０．１ＴＦＡ、９４．９水、
５ＭｅＣＮ）から１００％Ｂ（０．１ＴＦＡ、２９．９水、７０ＭｅＣＮ）への勾配を用
いて１５分間にわたり８ｍＬ／分の流量でクロマトグラフ処理した。ＤＭＦ中のＤＯＴＡ
−ＰＥＧ４８−Ｃｙｓにビニルスルホン及びトリエチルアミンを添加し、反応混合物をア
ルゴン下室温で２３時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を再度水中に溶解し、Ｇ
ｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）における逆相ＨＰＬＣにより
精製し、凍結乾燥した。ＤＯＴＡ−ＰＥＧ４８−Ｃｙｓ−ＶＳをダイアボディと２０：１
〜５０：１のモル比でコンジュゲートした。簡潔には、ＡＶＰ０４−５０をＤＯＴＡ−Ｐ
ＥＧ４８−Ｃｙｓ−ＶＳに対して記載される比で添加し、０．１ＮａＯＨでｐＨを９．０
に調整した。ロータにおいて混合物を室温で１８時間反応させた。試料を０．２５Ｍの酢
酸アンモニウムで透析し、１０，０００ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏ
ｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）において１〜４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、
無菌ろ過した。アリコートを取り出し、ＳＤＳ及びＩＥＦゲル電気泳動並びに質量分析法
によりコンジュゲーションを確認した。
【０５０４】
９．３  ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ３４００及びＡＶＰ０４−５０−ＰＥＧ４８の比較生
体分布
ＰＥＧ３４００を使用した生体分布では、非ＰＥＧ化ＡＶＰ０４−０７と比較して腎取
り込みが大幅に低減した。ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０４−０７は２４時間目に約８．４％
ＩＤ／ｇの腎取り込みを示した（図２０パネルＡ）。ペグ化による腎取り込みの大幅な低
減は、２４時間目に２２％ＩＤ／ｇから４６％ＩＤ／ｇへの腫瘍取り込みの増加（図１８
に示されるとおりの非ＰＥＧ化ＡＶＰ０４−０７と比べたとき）を伴った。腫瘍貯留の増
加は、明らかにＰＥＧ化ダイアボディの血中クリアランス（ｔ１／２ｂ、３６時間）が非
ＰＥＧ化ダイアボディ（ｔ１／２ｂ、１８時間）と比べて長いことに起因する。
【０５０５】
ＰＥＧ４８−ＡＶＰ０４−５０の生体分布（操作的フレームワーク１内システイン置換
変異に対するＰＥＧ化）は、ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０４−０７と比べて腫瘍取り込みの
さらなる全般的な向上、より速い血中クリアランス及びより高い腫瘍対血液比を示した（
図２０パネルＢ）。ＰＥＧ４８−ＡＶＰ０４−５０の腫瘍取り込みは７０％ＩＤ／ｇまで
さらに上昇し、腫瘍対血液比は２４時間目に１１：１となり、４８時間目には１９：１の
高さにまで上昇した。
【０５０６】
ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０４−０７などのリジンを対象としたコンジュゲートと比べて
、ＰＥＧ４８−ＡＶＰ０４−５０については腫瘍対血液比の向上、より高い腫瘍取り込み
及び許容できる非特異的な腎取り込みが観察されたことから、操作的フレームワーク１内
システイン置換変異に対するペイロードのコンジュゲーションが生体内効力又は機能に影
響しないことが明らかに示された。
【０５０７】
９．４  ＡＶＰ０４−０７−ＰＥＧ３４００及びＡＶＰ０４−５０−ＰＥＧ４８の比較Ｐ
ＥＴイメージング
本質的に他に記載されるとおり（Ｌｉら  ２００８年）、比較ＰＥＴイメージングを実
施した。要約すれば、腫瘍を有するマウスに対し、６４Ｃｕ標識ＡＶＰ０４−０７又はＡ
ＶＰ０４−０７ダイアボディ−ＰＥＧコンジュゲート（リジンにコンジュゲートした）又
はＡＶＰ０４−５０ダイアボディ−ＰＥＧコンジュゲート（操作的フレームワーク１内シ
ステイン置換変異にコンジュゲートした）を静脈内注射し、１、４、２１〜２２、及び４
５〜４６時間目に小動物用ＰＥＴスキャナ（ｍｉｃｒｏＰＥＴ  モデルＲ４；Ｓｉｅｍｅ
ｎｓ／ＣＴＩＭＩ）で画像化した。マウスはイソフルランで麻酔し、１時間目及び４時間
目の時間点では２０分間；２１〜２２時間目には４５分間、及び４５〜４６時間目には６
０分間走査した。データはフーリエリビニング法を用いて２次元サイノグラムに並べ替え
、走査内放射性崩壊、検出器の不均一性、及び偶発同時ノイズについて補正した。画像は
、反復的オーダードサブセット期待値最大化法（４反復、１６サブセット）により再構成
した。
【０５０８】
未修飾及び非コンジュゲート化ＡＶＰ０４−０７から得られたＰＥＴ像は、このサイズ
のタンパク質について予想されるとおりの著しい腎取り込みを示した（図２１Ａ）。これ
は、上記の図１８に報告されるＡＶＰ０４−０７の１１１Ｉｎ生体分布と同等である。２
７残基のサイズ単分散ＰＥＧ（可能な最良のインビボ生体分布を提供するよう最適化した
サイズ）をランダム表面ＡＶＰ０４−０７リジンに付加すると、腫瘍取り込みが増加し、
且つ腎取り込みが大幅に低下した（図２１Ａ）ことによって、全体的な生体分布が劇的に
向上した。
【０５０９】
ＡＶＰ０４−５０の操作的フレームワーク１内システイン置換変異に対するサイズ単分
散ＰＥＧの部位特異的且つ化学量論的に定義された付加はまた、非ＰＥＧ化ＡＶＰ０４−
０７と比べた生体分布も改良し（図２１Ｂ）、望ましくない腎取り込みの大幅な低減及び
腫瘍特異的取り込みの全般的な増加を実証した。リジンにＰＥＧ化されたＡＶＰ０４−０
７と操作的チオールにＰＥＧ化されたＡＶＰ０４−５０とは、生成されたＰＥＴ像が極め
て類似していたが、操作的フレームワーク１内システイン置換変異に対する再現性のある
形での部位が定義され、且つ化学量論的に定義されたコンジュゲーションは生体内効力に
負の影響を及ぼすことなくロバストな臨床的利点を提供する。
【０５１０】
実施例１０−抗ＴＡＧ７２ダイアボディコンジュゲート及びイメージングへのその使用
１０．１  実験手順
材料、放射標識、質量分析法
ＡＴＣＣからＬＳ−１７４Ｔ細胞を入手し、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｏ
ｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ，米国）、１％Ｌ−グルタミン
、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補足したイーグル最小
必須培地１×（ＥＭＥＭ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ，米国）からなる無
菌成長培地に維持した。Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス（酢酸ｔ−ブチル）
−１０−酢酸を入手した。Ｎｅｋｔａｒ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）からＮＨＳ−Ｐ
ＥＧ３４００−ＶＳ（カタログ番号４Ｍ５Ｂ０Ｆ０２）を購入した。Ｎｏｖａｂｉｏｃｈ
ｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からＮ−ＦＭＯＣ
−アミド−ｄＰＥＧ−２７酸を入手し、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ（Ｐ
ｏｗｅｌｌ，ＯＨ）からＮ−ＦＭＯＣ−アミド−ｄＰＥＧ−１２酸を購入した。キレート
コンジュゲート化抗体を、実質的にこれまでに記載されるとおり（Ｌｅｗｉｓら、１９９
４年）１１１Ｉｎ塩化物（Ａｍｅｒｓｈａｍ、２〜９ｍＣｉ／ｍｇのタンパク質）若しく
は６４Ｃｕ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ、１０ｍＣｉ／ｍｇの抗体）で、又はヨードジェン法（実質的にＹａｚａｋ
ｉら、２００１年に記載されるとおり）により１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、３
〜９ｍＣｉ／ｍｇの抗体）で放射標識した。標識化率はＩＴＬＣ又はサイズ排除クロマト
グラフィー（ＳＥＣ）によりＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５又は２００カラム（１×３０ｃｍ、
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で決定した。放射標識抗体をＳＥＣにより同じカラムで精
製した（生理食塩水中、流量０．５ｍＬ／分、画分サイズは０．５ｍＬであった）。Ａｇ
ｉｌｅｎｔ  ６５２０四重極飛行時間型液体クロマトグラフィー質量分析装置で質量スペ
クトルを記録した。
【０５１１】
抗ＴＡＧ７２ダイアボディの構築、クローニング、発現、及び精製
抗ＴＡＧ７２ダイアボディをコードする配列を、ＣＣ４９モノクローナル抗体をコード
する配列から誘導し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現用にコドン最適化した。Ｖドメインの
向き（ＶＨ−ＶＬ）が保存され、且つ５残基リンカー（Ｇ４Ｓ）により連結されたＤＮＡ
コンストラクトを設計した。ＤＮＡ配列を適切な制限部位（ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ）と合
成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国）によってｐ
ＵＣ５７にクローニングした。配列をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩによりｐＵＣ５７から切り取
り（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，米国）、精製し
、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）に
クローニングし、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ
１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ
’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，米国）に電気穿孔処理した。配列決定により陽性クローン
を同定し、ＡＶＰ０４−０７と命名した（このダイアボディをコードする配列は配列番号
５４に示す）。
【０５１２】
ＡＶＰ０４−０７の細菌産生及び精製
標準的なプロトコルを用いてＡＶＰ０４−０７を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）（Ｆ−  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３））（
Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。単一コロニーを使用して１％（ｖ／ｖ）Ｄ−
グルコースと１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンとを含有する５００ｍＬの２×ＹＴに接種し
、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。１８リットルの同じ培地（グルコース
は０．１％に低減）に、最終Ａ６００ｎｍが０．１となるよう一晩培養物を播種し、３０
℃でインキュベートしてＯＤ６００が０．６〜０．８になった時点で培養物を１２℃に移
した。０．２ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）を添加してＡＶＰ０４−０７発現を誘導し、培
養物を１２℃で一晩インキュベートした。細菌ペレットを遠心により回収し、計量し、精
製まで−２０℃で保存した。
【０５１３】
精製の開始に当たり、発現した細菌ペレットは解凍し、０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム
（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）と１ｍＭ  ＰＭＳＦ（
Ｓｉｇｍａ）と２５Ｕ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，独国）
とを含有するＨｉｓＴｒａｐ抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２
０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓ−４０００ソニケ
ーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，米国）を使用した音波処理に
より４℃で溶解した。細菌ライセートを３７℃で３０分間インキュベートした後、遠心（
１６，０００×ｇ、３０分間）及び０．４５μｍのろ過により清澄化した。発現したＡＶ
Ｐ０４−０７を含有する清澄化ライセートを、ＡＫＴＡ精製装置１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔ
ｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）を使用した三段階精製法により精製した。
【０５１４】
ＡＶＰ０４−０７を含有する清澄化ライセートを、予め平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  粗
精製ＦＦカラム（２×５ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。未結合のタ
ンパク質をＨｉｓＴｒａｐ抽出緩衝液による洗浄で取り除いた後、ＨｉｓＴｒａｐ溶出緩
衝液（２０ｍＭ  リン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２６０ｍＭ  イミダゾール）中でカラ
ムからＡＶＰ０４−０７を溶出した。溶出したＡＶＰ０４−０７を４℃の５０ｍＭ  ＭＥ
Ｓ、ｐＨ６．０で透析し、遠心により全ての沈澱物を除去した。透析したＡＶＰ０４−０
７を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０中の予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラ
ム（２×５ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。カラムを５０ｍＭ  ＭＥ
Ｓ、ｐＨ６．０中で洗浄することにより未結合のタンパク質を除去した後、線形的に増加
するＮａＣｌ勾配下（０〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ）で５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０中の
結合したＡＶＰ０４−０７を溶出した。溶出したＡＶＰ０４−０７ダイアボディを含有す
る画分をプールし、定量化し、濃縮した後、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  
７５（２６／６０プレップ等級）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイ
ズ排除クロマトグラフィーに供した。２８０ｎｍの単一ピークに対応する画分をプールし
、定量化し、約３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ＰＢＳで透析して４℃で保存した。
【０５１５】
分析的超遠心法によるＡＶＰ０４−０７アイソフォームの確認
精製したＡＶＰ０４−０７について、分析的超遠心法により二量体であることを確認し
た。ＢｅｃｋｍａｎモデルＸＬ−Ｉ分析的超遠心機（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ，米国）
を使用して２０℃で沈降速度実験を行った。精製したＡＶＰ０４−０７を２０ｍＭトリス
、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で透析し、ダブルセクタ石英セルに負荷し、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ４穴Ａｎ−６０  Ｔｉロータに装着した。ＡＶＰ０４−０７及び参照溶液を４０
，０００ｒｐｍのロータ回転数で遠心し、３００秒間の時間間隔及び０．００３ｃｍの刻
み幅を用いて連続モードでＡ２９０ｎｍのデータを収集し、平均化は行わなかった。溶媒
密度（２０℃で１．００４９９ｇ／ｍＬ）、溶媒粘度（１．０２１４ｃｐ）の推定値、並
びにＡＶＰ０４−０７の偏比容の推定値を、プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰを使用して計算
した。複数の時間点における沈降速度データを、プログラムＳＥＤＦＩＴを使用して連続
サイズ分布モデルにフィットさせた。
【０５１６】
免疫活性のインビトロ評価
ウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ、Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
）に存在する可溶性抗原ＴＡＧ７２を結合するＡＶＰ０４−０７の能力を、カラムシフト
アッセイにより評価した。２つのモル過剰のＢＳＭを５５℃に５分間加熱し、遠心により
清澄化してからＡＶＰ０４−０７ダイアボディを添加し、室温で１時間インキュベートし
た。試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにおけるゲルろ過により直ちに解像した。溶
出プロファイルを関連する対照と比較することにより、ダイアボディ−抗原複合体の形成
を判断した。
【０５１７】
ＡＶＰ０４−０７のＮＨＳ−ＤＯＴＡとのコンジュゲーション
ＡＶＰ０４−０７をＮＨＳ−ＤＯＴＡ［１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン
−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）］にコンジ
ュゲートした。ＡＶＰ０４−０７は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（
１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）遠心ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、Ｂｅｄｆｏｒｄ
，ＭＡ，米国）を使用して、４℃、４，０００ｒｐｍで遠心することにより（Ａｌｌｅｇ
ｒａ  Ｘ１５Ｒ、ＳＸ４７５０ロータ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、５．８ｍｇ
／ｍＬに濃縮した。金属夾雑物を除去するため、タンパク質（０．５ｍＬ）を、Ｂｉｏｍ
ａｘ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＰＢＱＫ０２５１０）を備えた改良型限外ろ過セ
ルを使用して１４容量のコンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、５ｍＭ
ジエチレントリアミン五酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｅｎｅ  ｐｅｎｔａａｃ
ｅｔａｔｅ）（ＤＴＰＡ）、ｐＨ８．５）で２時間透析した。プラスマグレードの水（Ｆ
ｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，米国）の中で１０ｍｇ／ｍ
ＬのＮＨＳ−ＤＯＴＡ（Ｂ−２８０；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，
米国）を、限外ろ過セル中の１５倍モル過剰のＡＶＰ０４−０７に添加し、室温で１時間
撹拌した。続いてタンパク質を１４容量の２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．２で透析
し、カセットから取り出し、４℃で保存した。
【０５１８】
ＡＶＰ０４−０７のＤＯＴＡ−ＰＥＧとのコンジュゲーション
ＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＰＥＧ３４００−ダイアボディ。ＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−
ＶＳを、これまでに記載されるとおり（Ｌｉら、２００８年）、ＡＶＰ０４−０７ダイア
ボディに３０：１のモル比及びｐＨ６．０でコンジュゲートした。簡潔には、ＮＨＳ−Ｐ
ＥＧ３４００−ＶＳ（３．１ｍｇ、８００ｎモル）を１ｍＬのｐＨ７．５  ＰＢＳ中の２
．７５ｍｇ（５０ｎモル）のダイアボディと混合し、ｐＨを０．１ＭのＮａＯＨで６．０
に調整し、混合物を室温で２時間反応させた。反応をＳＤＳゲルによりモニタすると、２
時間が経った時点で７０％超が完了したものと思われた。２時間が経った時点で全ての反
応混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（１×３０ｃｍ、０．５ｍｌ／分、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）に加え、１６．３分に溶出したコンジュゲートを回収した。コンジュゲート（
８ｍＬ）を１０，０００ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔ
ｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）において０．３５ｍｌに濃縮し、１．４ｍｇ（２．７
６μモル）のシステインアミド−ＤＯＴＡと混合し、ｐＨを８．５に調整し、試料ロータ
で混合物を室温で１７時間反応させた。試料を０．２５Ｍ酢酸アンモニウムで透析し、１
０，０００ｋＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎで１〜３ｍｇ／Ｌに濃縮し、無菌ろ過した
。コンジュゲートをＳＤＳ及びＩＥＦゲル電気泳動により特性決定した。
【０５１９】
ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ−ＶＳ−ダイアボディ。Ｎ−ＦＭＯＣ−アミド−ＰＥＧ
２７−酸（０．１ｍモル）を、Ｎ−メチルピロリジン／ジクロロメタン中のＤＣＣ／ＨＯ
Ｂｔにより室温で９０分間活性化し、ＤＣＵをろ去し、及び活性化Ｎ−ＦＭＯＣ−ＰＥＧ
酸をＣｙｓ−ポリスチレンＷａｎｇ樹脂（０．３ｍモルｃｙｓ／ｇ樹脂）と７５℃で３分
間カップリングした。ＦＭＯＣ基を上記のとおりエタノール／ＤＭＦ（１３：２００、ｖ
／ｖ）中の０．５Ｍピペラジンにより６５℃で３分間除去し、ＤＭＦ、エタノール、及び
ＤＣＭにより洗浄し、次にトリ−ｔ−ブチル−ＤＯＴＡ（０．５ｍモル）の活性エステル
とカップリングした。樹脂を５ｍＬのＴＦＡ（５％水、５％トリ−イソプロピルシラン、
５％エタンジチオール）により４０℃で６０分間処理した。ＤＣＭ／ヘキサン（５ｍＬ、
２：５ｖ／ｖ、５×）で粗生成物を抽出し、−２０℃で１０ｍＬのｔ−ブチルメチルエー
テルにより沈澱させ、ＰＲＰ−１カラム（１０×２５０ｍｍ）において１００％Ａ（０．
１ＴＦＡ、９４．９水、５ＭｅＣＮ）から１００％Ｂ（０．１ＴＦＡ、２９．９水、７０
ＭｅＣＮ）への勾配を使用して１５分間、８ｍＬ／分の流量でクロマトグラフ処理した。
ＤＭＦ中の２００μＬのＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ（３０ｍｇ、１６．６μｍｏｌ）
に対し、ビニルスルホン（１２μｌ、１１６μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６μｌ、
４３μｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン下に室温で２３時間撹拌した。溶媒を蒸
発させた後、残基を再び３００μｌの水に溶解させ、逆相ＨＰＬＣによりＧｅｍｉｎｉ  
Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）で精製し、凍結乾燥した（収率５５％）。
ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ−ＶＳをダイアボディに５０：１のモル比でコンジュゲー
トした。簡潔には、２ｍｇ（３８ｎモル）のダイアボディ（ＰＢＳ中２．７５ｍｇ／ｍＬ
）を２２μＬのＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ−ＶＳ（水中０．１７５ｍｇ／ｍＬ、２μ
モル）に添加し、ｐＨを０．１  ＮａＯＨで９．０に調整し、混合物をロータにおいて室
温で１８時間反応させた。試料を０．２５Ｍ酢酸アンモニウムで透析し、１０，０００ｋ
ＤａカットオフＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ
、独国）において１〜４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、無菌ろ過した。アリコートを取り出し、Ｓ
ＤＳ及びＩＥＦゲル電気泳動及び質量分析法によりコンジュゲーションを確認した。
【０５２０】
ダイアボディ−ＶＳＣ−ＰＥＧ１２−ＤＯＴＡ。ＤＯＴＡ−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓ−ＶＳ
のダイアボディとの２０：１及び５０：１のモル比での合成及びコンジュゲーションを、
上記のとおり実施した。
【０５２１】
ＡＶＰ０４−０７コンジュゲートの等電点分離
ＩＥＦプレキャストゲル（ｐＨ３〜１０）（Ｎｏｖｅｘ）又はＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｐ
ｈａｓｔＧｅｌのいずれかにおいて製造者の指示どおりに等電点ゲル電気泳動法を実行し
た。
【０５２２】
ＡＶＰ０４−０７及びそのコンジュゲートの放射標識
標準的なヨードジェン法（Ｙａｚａｋｉら、２００１年）を用いてＡＶＰ０４−０７及
びそのコンジュゲートの１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）による放射性ヨウ素化を
実施した。所要量（５〜１０μＬ）のＮａ  １２５Ｉ（２６ｍＢｑ）を、２０μｇのヨー
ドジェン（Ｐｉｅｒｃｅ）で予めコーティングした試験管内の２００μｇのＡＶＰ０４−
０７に添加した。室温で３分間インキュベートした後、標識された材料をＨＰＬＣにより
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５又は２００  １０／３００  ＧＬ  ＦＰＬＣカラム（ＧＥ  Ｈｅ
ａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。カラム溶出物を分画して計数し、その後ピーク
画分をプールしてインビトロ及びインビボ試験に使用した。放射標識収率は、典型的には
８０〜１００％であった。
【０５２３】
１１１ＩｎＣｌ２（Ｔｒａｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄｅｎｔｏｎ，ＴＸ，
米国）又は６４ＣｕＣｌ２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ．）を使用してＤＯＴＡ−ＡＶＰ０４−０７の放射性金属標識を実施した。
典型的な実験では、１９ｍＢｑの１１１ＩｎＣｌ２をさらなる０．１Ｍ  ＨＣｌにより希
釈し、０．２５Ｍの酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｔｅｔａｔｅ）  ｐＨ７
．０（最終ｐＨは５．５に調整）中の１２５μｇのＤＯＴＡコンジュゲート化ＡＶＰ０４
−０７に添加した。４３℃で４５分間インキュベートした後、溶液を０．１ｍＭ  ＤＴＰ
Ａに調整して任意の残存１１１Ｉｎを結合させ、室温でさらに１０分間インキュベートし
た。６４Ｃｕ標識も同じように実施した。放射標識収率は、典型的には７０〜９０％であ
った。次に標識された材料をＨＰＬＣによりＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５又は２００  １０／
３００  ＧＬ  ＦＰＬＣカラムを使用して精製し、カラム溶出物を分画して計数した。
【０５２４】
放射標識産物の純度について、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによりＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／
３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。放射標識タン
パク質（４ｋＢｑ）を１％ＨＳＡ／ＰＢＳに希釈し、カラムに０．５ｍｌ／分で注入した
。フロースルー検出器を使用して放射活性及びＵＶ吸光度を検出した。
【０５２５】
ＬＳ−１７４Ｔ異種移植モデル
６〜８週齢の雌性無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）に対し、ＬＳ−１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）（１０６個）を側腹部に皮下
注射し、試験前の約１０日間、腫瘍を成長させた。生体分布試験のため、ＬＳ−１７４Ｔ
異種移植片を有するマウスに対し３７０ｋＢｑの１２５Ｉ標識ＡＶＰ０４−０７と１５０
ｋＢｑの１１１Ｉｎ標識ＡＶＰ０４−０７との混合物（２００μｌ）（２〜６μｇの総タ
ンパク量）を静脈内注射した。様々な時間点でマウスを犠牲にし、腫瘍、血液及び主要臓
器を採取し、計量及び計数した。カウントは、バックグラウンド及び１２５Ｉチャネルに
含まれる１１１Ｉｎカウントについて補正した。放射性核種ごとに組織１グラム当たりの
注入量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算した。
【０５２６】
ＰＥＴイメージング
腫瘍を有するマウス（２１〜２５ｇ）に６４Ｃｕ標識ダイアボディ又はダイアボディ−
ＰＥＧコンジュゲートを静脈内注射し、小動物用ＰＥＴスキャナ（ｍｉｃｒｏＰＥＴモデ
ルＲ４；Ｓｉｅｍｅｎｓ／ＣＴＩＭＩ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｌｅ，ＴＮ）で１．０時間目か
ら始まり、４時間目、２１〜２２時間目及び４５〜４６時間目に画像化した。注入した活
性及びタンパク質負荷は、それぞれ６３〜１６９ｋＢｑ／ｇ及び０．４〜０．７μｇ／ｇ
の範囲であった。走査の少し前に、マウスをイソフルランで麻酔し、腹臥位に保定し、機
器の視野の中心に置いた。走査時間は、１時間及び４時間の時間点について２０分間、２
１〜２２時間の時間点について４５分間、及び４５〜４６時間の時間点について６０分間
とした。各走査において、ｍｉｃｒｏＰＥＴのレーザー位置合わせツールを使用して尾の
基部を８．０ｃｍ長の視野の軸方向中心から約４．０ｃｍのところに位置決めした。
【０５２７】
最後の走査を完了した直後、心穿刺により血液試料（０．２ｃｃ）を採取し、マウスを
犠牲にし、腫瘍及び様々な主要な臓器を切除し、計量し、及び計数した。計測した活性は
注射後の放射性崩壊について補正し、各標本について％ＩＤ／ｇを計算した。犠牲時の腫
瘍重量は１０７〜２７５ｍｇの範囲であった。
【０５２８】
標準的なｍｉｃｒｏＰＥＴソフトウェアにより画像処理を実施した。走査データはフー
リエリビニング法を用いて二次元サイノグラムに並べ替え、走査内放射性崩壊、検出器の
不均一性及び偶発同時ノイズについて補正した。画像は、反復的オーダードサブセット期
待値最大化（ＯＳＥＭ）法（４反復、１６サブセット）により再構成した。
【０５２９】
１０．２  結果
ＡＶＰ０４−０７ダイアボディの構築、発現及び特性決定
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてＡＶＰ０４−０７を可溶性タンパ
ク質として産生し、三段階精製法により精製した。精製した産物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  
２００ゲルろ過カラムから単一種として溶出した。連続質量ｃ（Ｍ）分布分析からは、残
留物のランダムな分布及びベストフィットの結果となる統計的パラメータ（すなわち、全
てのｒｍｓｄ値＜０．００５４及びＲｕｎｓ検定Ｚ値＜１４．４）により表されるとおり
、優れたフィットが得られた。ＡＶＰ０４−０７のｃ（Ｍ）分布分析からは、それが、見
かけの分子質量が５２．５ｋＤａの、単分散二量体（すなわちダイアボディ）として存在
することが示唆される。
【０５３０】
精製したＡＶＰ０４−０７は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのカラムシフトアッ
セイにより、インビトロで可溶性抗原を結合することが示された。ＢＳＭとの関連におい
てその抗原と複合体化したとき、ＡＶＰ０４−０７の溶出プロファイルは、ＡＶＰ０４−
０７単独の溶出プロファイルから大幅に変化した。主要タンパク質ピークは、精製したＡ
ＶＰ０４−０７単独での予想される３１分の溶出時間と比較して、約１６分にカラムから
溶出した。ダイアボディ−抗原複合体の形成を示す同様の溶出時間の短縮は、関連のない
ダイアボディ又は関連のない抗原では認められなかった。
【０５３１】
ヌードマウスＬＳ１７４Ｔ異種移植モデルにおける１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−及び１２５Ｉ
−ＡＶＰ０４−０７の生体分布及びイメージング
１２５Ｉ−又は１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＡＶＰ０４−０７を注入したＬＳ１７４Ｔ異種
移植片を有する無胸腺マウスにおいて生体分布を計測した。２つの放射性トレーサーは同
様の方法で血液中から除去し、注入後１時間までに約５０％が除去され、４時間目で循環
中になお約１０％が残存した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。このサイズのタンパク質につい
て予想されるとおり、１１１Ｉｎ標識ダイアボディについては相当量の腎取り込み（２４
時間目に１００％ＩＤ／ｇ）があったが、１２５Ｉ標識ダイアボディについてはなく、腎
臓が主要なクリアランス経路であったことを実証している。
【０５３２】
１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０７については腫瘍で多量に取り込まれ、注射後４時間ほど
の早い段階で２５％ＩＤ／ｇ超が観察され、４８時間目にもなお２０％ＩＤ／ｇより多く
腫瘍に残存した。１１１Ｉｎ−ＡＶＰ０４−０７の腫瘍対血液比は２４時間目に＞５０：
１であった。ヨウ素１２５標識ＡＶＰ０４−０７はいくらか低い腫瘍対血液比及び腫瘍取
り込みを示した（４時間目及び４８時間目にそれぞれ約１７％及び１０％ＩＤ／ｇ）。予
想どおり、一部の１１１Ｉｎは脾臓、肝臓及びカーカスに貯留し、一方１２５Ｉ−ＡＶＰ
０４−０７はこれらの組織には貯留しなかった。
【０５３３】
ＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０４−０７の生成及び生体分布試験
ＡＶＰ０４−０７を、本質的にこれまでに記載されるとおり（Ｌｉら、２００６年）、
ＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳにコンジュゲートした。ＶＳ−ＰＥＧ
３４００−ＮＨＳは、初めにタンパク質の表面リジンに（活性エステルを介して）コンジ
ュゲートし、次に反応性チオールを有する試薬と（ビニルスルホンを介して）反応させる
ことのできるヘテロ二官能性ペグ化剤である。チオール型のＤＯＴＡ、すなわちＤＯＴＡ
−Ｃｙｓ（Ｌｅｗｉｓら、１９９８年）をＶＳ−ＰＥＧ３４００−ＡＶＰ０４−０７にコ
ンジュゲートし、そのコンジュゲートをＩＥＦ及びＳＤＳゲル電気泳動により分析した（
図２３）。結果は、酸性ＤＯＴＡが加わったことによるより低いｐＩへのシフト（ＩＥＦ
ゲル、図２３Ａ）と、ＰＥＧ３４００が加わったことによるより大きい見かけの分子サイ
ズへのシフト（ＳＤＳゲル、図２３Ｂ）とを示す。コンジュゲートを１１１Ｉｎで放射標
識し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５でクロマトグラフ処理し、コンジュゲート化していないＡ
ＶＰ０４−０７と比較した（図２３Ａ〜図２３Ｂ）。コンジュゲート化していないダイア
ボディの５０ｋＤａと比較して、ＰＥＧ３４００誘導体の見かけの分子サイズは８０ｋＤ
ａであった。見かけの分子サイズの増加は、ペグ化がタンパク質のストークス半径に影響
を及ぼしたことに起因し得る。
【０５３４】
１１１Ｉｎ放射標識ＡＶＰ０４−０７についての生体分布試験の結果を図２２Ｃに示す
。腎取り込みは、未修飾ダイアボディについて２４時間目で９８％ＩＤ／ｇ（図７Ａ）で
あり、及びＰＥＧ化ダイアボディについて２４時間目で８．４％ＩＤ／ｇ（図２２Ｃ）で
あった。この腎取り込みの大幅な低減は、２４時間目における腫瘍取り込みの２３％から
４７％ＩＤ／ｇへの増加及び腫瘍／血液比の低下（２４時間目に＞４６：１から２：１）
を伴った。腫瘍貯留の増加は、明らかに、ＰＥＧ化ダイアボディの血中クリアランス（ｔ
１／２＝３６時間）が未コンジュゲート化ダイアボディ（ｔ１／２＝１８時間）と比べて
長いことに起因する。意外にも、腎取り込みの低下は、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−Ｃｙｓ−
ＶＳ−ＰＥＧ３４００抗ＣＥＡ−ダイアボディ（Ｌｉら、２００６年）で既に認められて
いるもの（Ｌｉら、２００６年）よりはるかに大きい。
【０５３５】
単分散ＰＥＧ２７  ＡＶＰ０４−０７コンジュゲートの生成及び生体分布試験
ＡＶＰ０４−０７のＰＥＧ３４００部分とのコンジュゲーションにより所望の腎取り込
みの低下が実現されたが、ＰＥＧ３４００は固有の多分散性を有し、結果として化学的に
容易に特徴付けられる製品を製造できないため、臨床用生成物としては欠点を有し得る。
この点で、ペプチド合成法を用いてヘテロ二官能性試薬に変換することのできるいくつか
の単分散ＰＥＧ構成要素が市販されている。このカテゴリーで利用可能な最大のＰＥＧの
一つである市販の単分散ＰＥＧ  ＦＭＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ２７−酸を使用して、ヘテロ二
官能性単分散ペグ化剤を生成した。初めに標準的なペプチド合成プロトコルによりこのＰ
ＥＧ誘導体の活性エステルをＣｙｓ−ポリスチレンＷａｎｇ樹脂にカップリングし、ＦＭ
ＯＣを除去し、市販のトリ−ｔ−ブチル保護モノ酸誘導体を使用してＤＯＴＡにカップリ
ングした。ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−ＣｙｓをＴＦＡで樹脂から切断し、精製し、過剰のビ
ニルスルホンと反応させ、逆相ＨＰＬＣを用いて再度精製した。生成物の合成を図１０に
示す。ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２７−Ｃｙｓ−ＶＳは予想分子量がＰＥＧ３４００のほぼ半分の
１９２８．６であるため、さらなる分子サイズが腎クリアランスにおいて低下をもたらす
のに十分かどうかは明確ではなかった。それにもかかわらず、それをダイアボディの表面
リジンにｐＨ９．５及び５０：１のモル比でコンジュゲートした。コンジュゲートをＩＥ
Ｆ及びＳＤＳゲル電気泳動により特性決定すると（図８）、ｐＩ及び分子サイズの予想さ
れたシフトが観察された。１１１Ｉｎ及び１２５Ｉ二重放射標識生成物をＳｕｐｅｒｄｅ
ｘ  ７５でクロマトグラフ処理し（図２４）、主要ピークを補正し、生体分布試験を実施
した。クロマトグラムを調べ、コンジュゲート化していないダイアボディと比較すること
により、ＰＥＧ３４００−ダイアボディ誘導体と同等の見かけの分子サイズのシフトが明
らかである。
【０５３６】
生体分布試験の結果を図２６Ａ〜図２６Ｂに示す。ＰＥＧ２７誘導体はＰＥＧ３４００
誘導体と比較して分子サイズが低いにもかかわらず、ほぼ同等の結果が得られた。２４時
間目、１１１Ｉｎ標識コンジュゲートの腎取り込みは８．３％ＩＤ／ｇ、腫瘍取り込みは
４９％ＩＤ／ｇ、及び腫瘍対血液比は４．２：１であった。ＰＥＧ２７誘導体の意外な好
結果をふまえてＰＥＧ１２誘導体を作製した。
【０５３７】
単分散ＰＥＧ１２  ＡＶＰ０４−０７の生成及び生体分布試験
上記と同じ化学（図２５）によりＦＭＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ１２−カルボキシルをＤＯＴ
Ａ−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓ−ＶＳに変換し、ｐＨ９．０で２０：１及び５０：１のモル比を
用いてＡＶＰ０４−０７にコンジュゲートした。高解像度ナノスプレー質量分析法により
未修飾及び２つのコンジュゲートを分析し、それらの置換度を決定した。未修飾ダイアボ
ディからは、デコンボリューション処理したときにアミノ酸配列からの予測と良好に一致
する質量である２６，８６９の質量計算値が得られる一連のｍ／ｚ種が得られた。ＤＯＴ
Ａ−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓ−ＶＳに２０：１のモル比でコンジュゲートすると、一連のデコ
ンボリューション後ピークが得られ、それらのピークは全て、ＤＯＴＡ−ＰＥＧ１２−Ｃ
ｙｓ−ＶＳの予想質量である１２２５質量単位だけ異なった。同様に、質量の差は５０：
１モル比のコンジュゲーションについても同じであるが、より高い置換度のほうにシフト
する。この種の反応については予想ガウス分布が得られるため、ピーク高さが、存在する
各種の実際の量に対応すると仮定することは妥当である。ピーク高さを推定値として用い
ると、２０：１コンジュゲートについてダイアボディ当たり平均１．７ＰＥＧ、及び５０
：１コンジュゲートについてコンジュゲート当たり平均３．０ＰＥＧと推定された。各コ
ンジュゲートを１１１Ｉｎ（１７８ｍＢｑ／ｍｇ）で試験標識したとき、２０：１コンジ
ュゲートは８．３％の放射標識取り込み、及び５０：１は９２％の取り込みを示した。こ
れらの結果は、より高い置換度が得られるより高いモル比ほど、放射標識について優れた
結果をもたらすことを示している。
【０５３８】
１１１Ｉｎ及び１２５Ｉ二重標識ＤＯＴＡ−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓ−ＶＳ−ＡＶＰ０４−
０７で生体分布試験を実施した。総じて、腫瘍取り込み及び腎取り込み、血中クリアラン
ス、及び腫瘍対血液比は、ＰＥＧ３４００誘導体及びＰＥＧ２７誘導体と同等であった（
図２６Ｂ）。特に腎取り込みは、最初はＰＥＧ１２においてＰＥＧ２７コンジュゲートよ
り高かったが（１３．４％ＩＤ／ｇ）、９６時間までにより低いレベル（６．１％ＩＤ／
ｇ）に降下した。しかしながら、腫瘍取り込みレベル及び血中クリアランス曲線は２つの
コンジュゲート間でほぼ同じであった。
【０５３９】
ＤＯＴＡ−ＰＥＧコンジュゲートＡＶＰ０４−０７の６４Ｃｕ  ＰＥＴイメージング
半減期が１３時間の陽電子放射体である６４Ｃｕは、ＰＥＧ化ＡＶＰ０４−０７の血中
クリアランス動態（ｔ１／２β＝１８時間）と良好に適合する。ＡＶＰ０４−０７のＤＯ
ＴＡ−ＰＥＧコンジュゲートに対するＰＥＴイメージング特性をＬＳ１７４Ｔ異種移植モ
デルを使用して評価した。図２７Ａに示される非ＰＥＧ化ダイアボディについての結果か
ら、２日間のイメージング実験の時間経過にわたる比較的少量の腫瘍取り込み及び極めて
高い腎取り込みが実証される。対照的に、ＰＥＧ１２及び２７コンジュゲートは、全体を
通じて比較的少ない腎取り込み及び２１〜２２時間の早い段階での高い腫瘍取り込みを示
した。ＰＥＧ２７コンジュゲートで計測された腫瘍取り込みは、４６時間目の腫瘍につい
て４５．１％ＩＤ／ｇで、腫瘍対血液比が７．９：１であり（図２７Ｂ）、ＰＥＧ１２に
ついての計測された腫瘍取り込みは、４６時間目の腫瘍について４９±３％ＩＤ／ｇで、
腫瘍対血液比は（９±４）：１であった（値は平均値±ＳＤである、ｎ＝２）（図２７Ｃ
）。これらの結果は、１１１Ｉｎ標識コンジュゲートについての生体分布の結果と緊密に
一致し、放射性金属の選択は生体分布にほとんど影響を与えないことが示唆される。
【０５４０】
１０．３  考察
理想的な放射標識抗体ベースの造影剤の探求では、抗体断片の急速な血中クリアランスがインタクトなＩｇＧと比べてより早い段階での腫瘍対血液比の改善につながるため、抗体断片に焦点が置かれた。しかしながら、血中クリアランスを増加させる通常の機序は腎臓を介した排泄であり、放射性金属標識断片の場合、腎中の正味蓄積量によりその主要な利点が消失する。さらに、血中クリアランスの経過が過度に急速であると、腫瘍を標的化するのに十分な時間がなく、従って十分な画像を得るために高用量の放射標識の投与が必要となる。ペグ化は魅力的な腎蓄積低減方法である。Ｙａｚａｋｉら（２００１年）は、比較的大きい多分散ＰＥＧ３４００を抗ＣＥＡダイアボディにコンジュゲートすることにより、２４時間目の腎取り込みを２００％ＩＤ／ｇから５０％ＩＤ／ｇに低下させることができたことを示している。この低下は、大きいものではあるが、なお容認できない腎取り込みをもたらす。ここでは、ダイアボディをより小さい単分散ＰＥＧとＰＥＧ化して、２４〜４８時間目に１２％ＩＤ／ｇを下回るレベルまで腎取り込みを低下させることが可能であることを初めて実証する。この結果は、いずれのＰＥＧ化コンジュゲートも未修飾ダイアボディより優れていることを実証している。インビボで得られた結果から、以下の順序のインビボ改良を結論付けることができる：インタクト＜＜ＰＥＧ３４００＜ＰＥＧ２７＜ＰＥＧ１２。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、前記システイン残基の少なくとも２つが化合物にコンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質。
［２］
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも１つがフレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも２つが別の化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質。
［３］
前記ジスルフィド結合が非還元条件下で存在する、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基２と相補性決定領域（ＣＤＲ）１との間に位置する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［５］
前記システイン残基がＶＨ内にあり、且つＫａｂａｔ付番方式による残基２から３０の間に位置する、［２］〜［４］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［６］
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７から２０の間及び／又は残基２４から３０の間に位置する、［５］に記載のタンパク質。
［７］
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７から２０の間に位置する、［６］に記載のタンパク質。
［８］
前記システイン残基がＶＬ内にあり、且つＫａｂａｔ付番方式により付番して残基２から２２の間に位置する、［２］〜［４］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［９］
前記システイン残基が、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して残基７から２０の間に位置する、［８］に記載のタンパク質。
［１０］
前記システイン残基が、前記可変領域の前記保存されたシステイン残基に対して追加的なものである、［１］〜［９］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［１１］
前記保存されたシステイン残基が、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して、前記ＶＬにおいて残基２３にあり及び／又は前記ＶＨにおいて残基２２にある、［１０］に記載のタンパク質。
［１２］
前記システイン残基が、前記保存されたシステイン残基に対してＮ末端側に位置する、［１０］又は［１１］に記載のタンパク質。
［１３］
前記システイン残基が、以下：
（ｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基８及び残基１１；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基１４及び残基１７；
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基７及び残基１１；
（ｉｖ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基１４及び残基１７；
（ｖ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基８及び残基１２；
（ｖｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基７及び残基１０；
（ｖｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基１３及び残基１６
の１つ又は複数に位置する、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［１４］
前記システイン残基が、以下：
（ｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してκ  ＶＬの残基１３及び残基１９；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してλ  ＶＬの残基１３及び残基１９；
（ｖｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基６及び残基９；及び／又は
（ｖｉｉ）Ｋａｂａｔ付番方式により付番してＶＨの残基１２及び残基１８
の１つ又は複数に位置する、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［１５］
少なくとも１つの［２］〜［１４］のいずれか一項に記載のタンパク質を含むＦｖを含む単離されたタンパク質であって、少なくとも１つのＶＬが少なくとも１つのＶＨと結合して抗原結合部位を形成する、タンパク質。
［１６］
前記抗原結合部位を形成する前記ＶＬと前記ＶＨとが単一のポリペプチド鎖にある、［１５］に記載のタンパク質。
［１７］
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の少なくとも１つ
である、［１６］に記載のタンパク質。
［１８］
前記抗原結合部位を形成する前記ＶＬとＶＨとが異なるポリペプチド鎖にある、［１５］に記載のタンパク質。
［１９］
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；又は
（ｉｉｉ）テトラボディ
である、［１８］に記載のタンパク質。
［２０］
免疫グロブリンである、［１８］に記載のタンパク質。
［２１］
前記システイン残基がジスルフィド結合によって連結される、［１］〜［２０］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［２２］
前記システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした化合物を含む、［１］〜［２０］のいずれか一項に記載のタンパク質であって、前記化合物のコンジュゲーションが前記タンパク質の抗原との結合を妨害しない、タンパク質。
［２３］
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、［２２］に記載のタンパク質。
［２４］
少なくとも１つのＮ末端スレオニン残基又はセリン残基をさらに含む、［１］〜［２３］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［２５］
前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物を含む、［２４］に記載のタンパク質。
［２６］
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、［２５］に記載のタンパク質。
［２７］
前記システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした第１の化合物と、前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした第２の化合物であって、前記第１の化合物と異なる第２の化合物とを含む、［２５］又は［２６］に記載のタンパク質。
［２８］
前記タンパク質が、配列番号５７に示される配列と少なくとも約８０％同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含み、前記化合物が単分散ＰＥＧである、［２２］に記載のタンパク質。
［２９］
前記単分散ＰＥＧが４８個以下のエチレングリコール単位を有する、［２８］に記載のタンパク質。
［３０］
前記単分散ＰＥＧが約２４個のエチレングリコール単位を有する、［２８］又は［２９］に記載のタンパク質。
［３１］
ヒト上皮成長因子（Ｈｅｒ）２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する、［１］〜［３０］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［３２］
フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する２つ以上のシステイン残基を含むように修飾された、配列番号５５、５９、６１又は１０９のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％同一の配列を含む、［３１］に記載のタンパク質。
［３３］
配列番号５７、６３、６５、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３又は１０５、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１又は１３３のいずれか１つ又は複数に示される配列と少なくとも約８０％同一の配列を含む、［３２］に記載のタンパク質。
［３４］
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも１つがＮ末端スレオニン残基又はセリン残基を含む、タンパク質。
［３５］
少なくとも１つの［３１］に記載のタンパク質を含むＦｖを含む単離されたタンパク質であって、少なくとも１つのＶＬが少なくとも１つのＶＨと結合して抗原結合部位を形成する、タンパク質。
［３６］
前記抗原結合部位を形成する前記ＶＬと前記ＶＨとが単一のポリペプチド鎖にある、［３５］に記載のタンパク質。
［３７］
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；又は
（ｉｉｉ）Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の少なくとも１つ
である、［３６］に記載のタンパク質。
［３８］
前記抗原結合部位を形成する前記ＶＬと前記ＶＨとが異なるポリペプチド鎖にある、［３５］に記載のタンパク質。
［３９］
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；又は
（ｉｉｉ）テトラボディ
である、［３８］に記載のタンパク質。
［４０］
免疫グロブリンである、［３８］に記載のタンパク質。
［４１］
前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物をさらに含む、［３４］〜［４０］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［４２］
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、［４１］に記載のタンパク質。
［４３］
前記Ｎ末端スレオニン残基又はセリン残基を含むように修飾された、配列番号５５、５９、６１又は１０９のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％同一の配列を含む、［３４］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［４４］
［１］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
［４５］
［１］〜［２１］、［２４］、［３１］〜［４０］［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
［４６］
プロモーターに作動可能に連結された［４５］に記載の核酸を含む発現コンストラクト。
［４７］
［４５］に記載の外因性核酸及び／又は［４６］に記載の発現コンストラクトを含む単離細胞であって、前記タンパク質を発現する細胞。
［４８］
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である、［４７］に記載の細胞。
［４９］
［１］〜［２１］、［２４］、［３１］〜［４０］［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、［４６］に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な条件下に維持するステップを含む方法。
［５０］
前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な（sufficient the encoded for the protein to be produced）条件下で［４７］［４８］に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、［４９］に記載の方法。
［５１］
前記タンパク質を単離するステップを含む、［４９］［５０］に記載の方法。
［５２］
［２２］〜［３０］のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
（ｉ）［１］〜［２１］、［２４］又は［３１］〜［３３］のいずれか一項に記載のタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）前記タンパク質のＦＲ１における前記システイン残基の少なくとも１つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
［５３］
（ｉ）で得られた前記タンパク質における前記システイン残基がジスルフィド結合によって連結され、及び前記方法が、前記化合物を１つ又は複数の前記システイン残基にコンジュゲートする前に、前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップをさらに含む、［５２］に記載の方法。
［５４］
前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップにより前記タンパク質に遊離チオール基が生成され、及び前記化合物が、前記化合物の前記タンパク質とのコンジュゲーションを可能にするチオール反応基を有する、［５３］に記載の方法。
［５５］
前記タンパク質が少なくとも１つのＮ末端セリン残基又はスレオニン残基を含み、及び前記方法が、化合物を前記セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートするステップをさらに含む、［５２］〜［５４］のいずれか一項に記載の方法。
［５６］
［２６］、［２７］又は［４１］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
（ｉ）［２４］又は［３４］〜［４０］のいずれか一項に記載のタンパク質を得るステップと、（ｉｉ）前記タンパク質の前記Ｎ末端にある少なくとも１つのセリン残基又はスレオニン残基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
［５７］
医薬における［１］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［４４］に記載の組成物の使用。
［５８］
対象における病態の治療又は予防方法であって、［１］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［４４］に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
［５９］
細胞への化合物の送達方法であって、［２２］〜［３０］、［４１］又は［４２］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［４４］に記載の組成物に前記細胞を接触させるステップを含む方法。
［６０］
対象に前記タンパク質又は組成物を投与することによって前記細胞を接触させる、［５９］に記載の方法。
［６１］
対象における抗原を位置特定又は検出する方法であって、
（ｉ）［２２］〜［３０］、［４１］又は［４２］のいずれか一項に記載のタンパク質が抗原に結合するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、前記タンパク質又は［４４］に記載の組成物を対象に投与するステップであって、前記タンパク質が検出可能標識にコンジュゲートされる、ステップと、
（ｉｉ）前記検出可能標識をインビボで検出又は位置特定するステップと、
を含む方法。
［６２］
対象における病態の診断又は予後判定方法であって、［１］〜［４３］のいずれか一項に記載のタンパク質が抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、前記対象からの試料を前記タンパク質又は［４４］に記載の組成物と接触させるステップと、前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出が前記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップとを含む方法。
［６３］
前記複合体のレベルを測定するステップであって、前記複合体のレベルの亢進又は低下が、前記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップを含む、［６２］に記載の方法。
［６４］
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）との互いの会合を可能にするには不十分な数のアミノ酸を含む領域によって連結された前記ＶＨと前記ＶＬとを各々が含む複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
（ｉ）前記ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号１１１に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含むＶＨを含み；及び
（ｉｉ）少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号１１３に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含むＶＬを含み、
（ｉ）における前記ポリペプチドの前記ＶＨと（ｉｉ）における前記ポリペプチドの前記ＶＬとが会合して、腫瘍抗原ＴＡＧ−７２との特異的な結合能を有するＦｖを形成する、タンパク質。
［６５］
前記ＶＨと前記ＶＬとを連結する前記領域が６個以下のアミノ酸を含む、［６４］に記載のタンパク質。
［６６］
前記ＶＬが、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して５位にスレオニン及び／又はＫａｂａｔ付番方式による５３位にスレオニン及び／又はＫａｂａｔ付番方式により付番して７９位にグルタミン酸を含む、［６４］又は［６５］に記載のタンパク質。
［６７］
前記ＶＨが、Ｋａｂａｔ付番方式により付番して８０位にロイシンを含む、［６４］〜［６６］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［６８］
（ｉ）配列番号１１１に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含むＶＨと、
（ｉｉ）配列番号１１３に示される配列又はそれと少なくとも約６０％同一の配列を含むＶＬと、
を各々が含む少なくとも２つのポリペプチドを含む、［６４］〜［６７］のいずれか一項に記載のタンパク質であって、
一つのポリペプチドの前記ＶＨと別のポリペプチドの前記ＶＬとが会合して、ＴＡＧ７２との特異的な結合能を有するＦｖを形成する、タンパク質。
［６９］
ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである、［６４］［６８］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７０］
（ｉ）前記ポリペプチドの少なくとも１つが、配列番号１１１に示される配列を含むＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨを含み；及び
（ｉｉ）少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号１１３に示される配列を含むＶＬのＣＤＲを含むＶＬを含む、
［６４］〜［６９］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７１］
（ｉ）配列番号１１１に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化（deimmunized
）形態を含むＶＨと、
（ｉｉ）配列番号１１３に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むＶＬと、
を双方が含む少なくとも２つのポリペプチドを含む、［６４］［７０］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７２］
配列番号５５に示される配列と少なくとも８０％同一の配列を各々が含む少なくとも２つのポリペプチドを含む、［６４］〜［７１］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７３］
前記ポリペプチドの少なくとも１つが、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも２つが化合物にコンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、［６４］［７３］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７４］
前記ポリペプチドの少なくとも１つがＮ末端セリン残基及び／又はスレオニン残基を含む、［６４］［７３］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７５］
配列番号５７、６３、７５、７７、９９、１０１、１０３、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１又は１３３のいずれか１つ又は複数に示される配列を含む、［７３］又は［７４］に記載のタンパク質。
［７６］
それにコンジュゲートした化合物を含む、［６４］〜［７５］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［７７］
前記化合物が、前記ポリペプチドの少なくとも１つにおけるシステイン残基又はセリン残基又はリジン残基にコンジュゲートされる、［７６］に記載のタンパク質。
［７８］
前記ポリペプチドの少なくとも１つが、フレームワーク領域（ＦＲ）１内に位置する少なくとも２つのシステイン残基を、前記システイン残基の少なくとも２つが化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるように位置して含み、及び／又は、前記ポリペプチドの少なくとも１つがＮ末端セリン残基及び／又はスレオニン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも１つ及び／又は前記セリン残基にコンジュゲートされる、［７６］又は［７７］に記載のタンパク質。
［７９］
前記ポリペプチドが前記システイン残基及び前記Ｎ末端セリン残基及び／又はスレオニン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートされ、場合により異なる化合物が前記セリン残基にコンジュゲートされる、［７８］に記載のタンパク質。
［８０］
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、［７６］〜［７９］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［８１］
前記化合物が生理学的に許容可能なポリマーである、［７６］〜［８０］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［８２］
前記化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、［７６］〜［８１］のいずれか一項に記載のタンパク質。
［８３］
前記ＰＥＧが単分散ＰＥＧである、［８２］に記載のタンパク質。
［８４］
前記ＰＥＧが４０００Ｄａ以下の分子量を有する、［８２］又は［８３］に記載のタンパク質。
［８５］
前記ＰＥＧが２０００Ｄａ以下の分子量を有する、［８２］〜［８４］に記載のタンパク質。
［８６］
前記ＰＥＧが１，５００Ｄａ以下の分子量を有する、［８２］〜［８５］に記載のタンパク質。
［８７］
［６４］〜［８６］のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
［８８］
［６４］〜［７５］のいずれか一項に記載のタンパク質における前記ポリペプチドの１つ又は複数をコードする単離核酸。
［８９］
プロモーターに作動可能に連結された［８８］に記載の核酸を含む発現コンストラクト。
［９０］
［６４］〜［７５］のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する単離細胞。
［９１］
［８８］に記載の核酸及び／又は［８９］に記載の発現コンストラクトを含む、［９０］に記載の細胞。
［９２］
［６４］〜［７５］のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、［８９］に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたポリペプチド及び前記タンパク質が作製されるように維持するステップを含む方法。
［９３］
前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な（sufficient the encoded for t
he protein to be produced）条件下で［９０］又は９１に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、［９２］に記載の方法。
［９４］
前記システイン残基の少なくとも１つにコンジュゲートした化合物を含む［７６］〜［８６］のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
（ｉ）［７３］又は［７５］のいずれか１項に記載のタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）１つ又は複数の前記ポリペプチドのＦＲ１における前記システイン残基の少なくとも１つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
［９５］
Ｎ末端セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートした化合物を含む［７８］又は［７９］に記載のタンパク質の作製方法であって、
（ｉ）［７４］又は［７５］に記載のタンパク質を得るステップと、
（ｉｉ）前記ポリペプチドのＮ末端にある少なくとも１つのセリン残基又はスレオニン残基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
［９６］
前記化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、［９４］又は［９５］に記載の方法。
［９７］
対象における癌を位置特定及び／又は検出及び／又は診断及び／又は予後判定する方法であって、
（ｉ）［６４］〜［８６］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［８７］に記載の組成物を、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原ＴＡＧ−７２に結合するように、対象に投与するステップと、
（ｉｉ）前記ＴＡＧ７２に結合した前記タンパク質をインビボで検出するステップであって、前記結合したタンパク質の検出により前記癌が位置特定及び／又は検出及び／又は診断及び／又は予後判定されるステップと、
を含む方法。
［９８］
対象における癌の診断又は予後判定方法であって、
（ｉ）前記対象からの試料を［６４］〜［８６］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［８７］に記載の組成物と、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原ＴＡＧ−７２に結合するように接触させるステップと、
（ｉｉ）前記ＴＡＧ７２に結合した前記タンパク質を検出するステップであって、前記結合したタンパク質の検出が前記癌の診断又は予後判定をもたらすステップと、
を含む方法。
［９９］
前記タンパク質が検出可能標識にコンジュゲートされ、及び前記方法が、ＴＡＧ７２に結合した前記タンパク質を検出するために前記標識を検出するステップを含む、［９７］又は［９８］に記載の方法。
［１００］
癌の治療方法であって、［６４］〜［８６］のいずれか一項に記載のタンパク質又は［８７］に記載の組成物を、それが癌細胞上の腫瘍抗原ＴＡＧ−７２に結合して前記癌を治療するように投与するステップを含む方法。
［１０１］
前記タンパク質又はそれにコンジュゲートした化合物が前記癌細胞の死滅を誘導する、［１００］に記載の方法。
［１０２］
前記タンパク質が、前記癌細胞の死滅を誘導する化合物にコンジュゲートされる、［１００］又は［１０１］に記載の方法。

【０５４１】
参考文献
0006371319.tif 000005
0006371319.tif 000006
0006371319.tif 000007
0006371319.tif 000008
0006371319.tif 000009
0006371319.tif 000010
【図１】
0006371319.tif 000011
【図２】
0006371319.tif 000012
【図３】
0006371319.tif 000013
【図４Ａ】
0006371319.tif 000014
【図４Ｂ】
0006371319.tif 000015
【図５】
0006371319.tif 000016
【図６Ａ】
0006371319.tif 000017
【図６Ｂ】
0006371319.tif 000018
【図７Ａ】
0006371319.tif 000019
【図７Ｂ】
0006371319.tif 000020
【図８】
0006371319.tif 000021
【図９】
0006371319.tif 000022
【図１０Ａ】
0006371319.tif 000023
【図１０Ｂ】
0006371319.tif 000024
【図１０Ｃ】
0006371319.tif 000025
【図１０Ｄ】
0006371319.tif 000026
【図１０Ｅ】
0006371319.tif 000027
【図１１Ａ】
0006371319.tif 000028
【図１１Ｂ】
0006371319.tif 000029
【図１１Ｃ】
0006371319.tif 000030
【図１２Ａ】
0006371319.tif 000031
【図１２Ｂ】
0006371319.tif 000032
【図１２Ｃ】
0006371319.tif 000033
【図１３Ａ】
0006371319.tif 000034
【図１３Ｂ】
0006371319.tif 000035
【図１３Ｃ】
0006371319.tif 000036
【図１４Ａ】
0006371319.tif 000037
【図１４Ｂ】
0006371319.tif 000038
【図１４Ｃ】
0006371319.tif 000039
【図１４Ｄ】
0006371319.tif 000040
【図１５Ａ】
0006371319.tif 000041
【図１５Ｂ】
0006371319.tif 000042
【図１５Ｃ】
0006371319.tif 000043
【図１６】
0006371319.tif 000044
【図１７】
0006371319.tif 000045
【図１８Ａ】
0006371319.tif 000046
【図１８Ｂ】
0006371319.tif 000047
【図１９】
0006371319.tif 000048
【図２０】
0006371319.tif 000049
【図２１Ａ】
0006371319.tif 000050
【図２１Ｂ】
0006371319.tif 000051
【図２２Ａ】
0006371319.tif 000052
【図２２Ｂ】
0006371319.tif 000053
【図２２Ｃ】
0006371319.tif 000054
【図２３Ａ】
0006371319.tif 000055
【図２３Ｂ】
0006371319.tif 000056
【図２４】
0006371319.tif 000057
【図２５】
0006371319.tif 000058
【図２６Ａ】
0006371319.tif 000059
【図２６Ｂ】
0006371319.tif 000060
【図２６Ｃ】
0006371319.tif 000061
【図２６Ｄ】
0006371319.tif 000062
【図２７Ａ】
0006371319.tif 000063
【図２７Ｂ】
0006371319.tif 000064
【図２７Ｃ】
0006371319.tif 000065
【配列表】
0006371319000001.app