(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、Ｔａｕに特異的に結合する抗体；および
ｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤
を含む、エンドトキシン不含有の医薬製剤。
【請求項２】
抗体が、重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む重鎖を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
抗体が、重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む重鎖を含み、ここで重鎖が、Ｓ２４１Ｐ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むヒンジ領域を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】
抗体が、
（ｉ）重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む重鎖、および
（ｉｉ）軽鎖可変領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を含む軽鎖
を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
抗体が、
（ｉ）重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む重鎖、ここで、重鎖が、Ｓ２４１Ｐ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むヒンジ領域を含む、および
（ｉｉ）軽鎖可変領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を含む軽鎖
を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項６】
抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項７】
抗体が、血液脳関門の通過を促進する薬物と共に製剤されている、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項８】
ヒト対象におけるタウオパチーの処置における使用のための、請求項１−７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
タウオパチーが、進行性核上性麻痺である、請求項８に記載の使用のための医薬製剤。
【請求項１０】
タウオパチーが、前頭側頭骨性認知症である、請求項８に記載の使用のための医薬製剤。
【請求項１１】
タウオパチーが、アルツハイマー病である、請求項８に記載の使用のための医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年１１月２７日に出願した米国特許出願第１４／０９２，５３９号、２０１３年８月１５日に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５５２０３、および２０１３年６月１０日に出願した米国仮特許出願第６１／８３３，３５５号に基づく優先権を主張し、これらの特許出願の開示はそれぞれ、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
序章
微小管結合タンパク質ｔａｕは、中枢神経系に豊富に存在し、主にニューロンにより産生される。ｔａｕの主要な機能は、微小管の安定化である。ｔａｕの６種のイソ型が成人のヒト脳に存在する。ｔａｕイソ型は、単一遺伝子の選択的スプライシングの産物である。
【０００３】
タウオパチーは、いわゆる脳内の神経原線維変化（ＮＦＴ）におけるｔａｕタンパク質の病的凝集の結果生じる神経変性疾患の１つである。タウオパチーのいくつかの例には、前頭側頭骨性認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、および前頭側頭葉変性症が含まれる。
【０００４】
当技術分野では、タウオパチーの処置方法、およびかかる方法における使用に好適な反応材が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、抗Ｔａｕ抗体を投与することを含む、タウオパチーの処置方法を提供する。本発明は、該方法における使用のための、抗Ｔａｕ抗体、および該抗体を含む製剤もまた提供する。
【０００６】
特徴
本発明は、個体の神経細胞および／または細胞外液中のアミロイドβ（Ａβ）４０および／またはＡβ４２のレベルを低減する方法であって、該個体に、ａ）有効量の、細胞外ｔａｕ（ｅＴａｕ）ポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに結合する抗体；または、ｂ）該抗体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸１−１５８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープに結合する。ある態様において、エピトープは、配列番号４８（ｅＴａｕ４）と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＴａｕポリペプチド内にある。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内、２５−３０内、１９−４６内または１５０−１５８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ヒト化抗体である。ある態様において、抗体は、線形エピトープに結合する。ある態様において、抗体は、エピトープ内のアミノ酸のリン酸化に依存することなくエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、エピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する。ある態様において、抗体がヒト化抗体であるとき、該ヒト化抗体は、イソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖領域を含む。ある態様において、抗体がヒト化抗体であるとき、該ヒト化抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。ある態様において、抗体は、静脈内、髄腔内または皮下投与により投与される。ある態様において、細胞外液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質液（ＩＳＦ）、血液または血液画分（例えば、血漿もしくは血清のような血液画分）である。ある態様において、抗体は、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む。
【０００７】
本発明は、個体におけるＡβの蓄積と関係する疾患の処置方法であって、該個体に、ａ）有効量の、細胞外ｔａｕ（ｅＴａｕ）ポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに結合する抗体、またはｂ）該抗体を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸１−１５８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ｅＴａｕのアミノ酸２５−３０内、ｅＴａｕのアミノ酸７−１３内、またはｅＴａｕのアミノ酸１９−４６内のエピトープに結合する。ある態様において、エピトープは、配列番号４８（ｅＴａｕ４）と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＴａｕポリペプチド内にある。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内、２５−３０内、１９−４６内または１５０−１５８内のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、ヒト化抗体である。ある態様において、抗体は、線形エピトープに結合する。ある態様において、抗体は、エピトープ内のアミノ酸のリン酸化に依存することなくエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、エピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する。ある態様において、抗体がヒト化抗体であるとき、該ヒト化抗体は、イソ型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖領域を含む。ある態様において、抗体がヒト化抗体であるとき、該ヒト化抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。ある態様において、抗体は、静脈内、髄腔内または皮下投与により投与される。ある態様において、細胞外液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質液（ＩＳＦ）、血液または血液画分（例えば、血漿もしくは血清のような血液画分）である。ある態様において、抗体は、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む。ある態様において、該疾患はアルツハイマー病である。
【０００８】
本発明は、個体の神経細胞および／または細胞外液中のＡβポリペプチドのレベルを低減する方法であって、該個体に、ａ）有効量の、細胞外ｔａｕ（ｅＴａｕ）ポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに結合する抗体、およびｂ）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０００９】
本発明は、個体の神経細胞および／または細胞外液中のＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを低減する、単離されたヒト化抗体に関し、ここで、該抗体は、２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸２−１８内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内、またはアミノ酸２５−３０内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内、アミノ酸２−６８内、またはアミノ酸１９−４６内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸２８−１２６内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸１５０−１５８内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗体は、線形エピトープに結合する。ある態様において、エピトープは、配列番号４８（ｅＴａｕ４）に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＴａｕポリペプチド内にある。ある態様において、抗体は、エピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する。ある態様において、抗体は、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、を含む重鎖領域、を含む。上記の態様にいずれかにおいて、抗体は、エピトープ内のアミノ酸のリン酸化に依存することなくエピトープに特異的に結合する。本発明は、ａ）上記または本明細書中に記載の単離されたヒト化抗体、およびｂ）薬学的に許容される添加剤、を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明は、Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。ある場合において、エピトープは、リン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含まない。ある例において、エピトープは、リン酸化アミノ酸、ニトロ化アミノ酸、またはリン酸化アミノ酸およびニトロ化アミノ酸の両方を含む。
【００１１】
本発明は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域およびヒト化重鎖フレームワーク領域を含む単離された抗体を提供し、ここで、単離された抗体は、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する。ある場合において、軽鎖領域および重鎖領域は、別個のポリペプチド中に存在する。ある場合において、軽鎖領域および重鎖領域は、単一のポリペプチド中に存在する。ある場合において、重鎖領域は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものである。ある場合において、重鎖領域は、アイソタイプＩｇＧ４のものである。これらの態様のいくつかにおいて、ヒンジ領域はＳ２４１Ｐ置換を含む。例えば、Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30：105を参照のこと。ある場合において、抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。ある場合において、抗体は、共有結合した非ペプチド性合成ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む。ある場合において、抗体は、血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質に直接またはリンカーを介して結合されている。ある場合において、エピトープは、Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内にある。ある場合において、ヒト化軽鎖フレームワーク領域は、表３に記載のアミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を含む。ある例において、ヒト化重鎖フレームワーク領域は、表２に記載のアミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個を含む。
【００１２】
本発明は、抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である単離された抗体であって、該抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびに、ｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する、抗体を提供する。ある場合において、単離された抗体は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、ヒト化軽鎖フレームワーク領域は、表３に記載のアミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を含む。ある場合において、単離された抗体は、ヒト化重鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、ヒト化重鎖フレームワーク領域は、表２に記載のアミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個を含む。
【００１３】
本発明は、単離された抗体であって、該単離された抗体が、ヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域を含み、単離された抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびに、ｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、ａ）本発明の抗Ｔａｕ抗体、およびｂ）薬学的に許容される添加剤、を含む医薬製剤を提供する。
【００１５】
本発明は、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、を含むＴａｕのＮ末端部分内のエピトープに特異的に結合する抗体、ならびに、ｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含むエンドトキシン不含有の医薬製剤を提供する。ある場合において、抗体は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、ヒト化軽鎖フレームワーク領域は、表３に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む。ある場合において、抗体は、ヒト化重鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、ヒト化重鎖フレームワーク領域は、表２に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸置換を含む。ある場合において、抗体はリポソームに封入されている。ある場合において、抗体は、血液脳関門の通過を促進する薬物と共に製剤されている。ある場合において、抗体は、血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質に直接またはリンカーを介して結合されている。ある場合において、抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。
【００１６】
本発明は、本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が、真核細胞において活性な転写調節要素に操作可能に連結されている、組換え発現ベクターを提供する。本発明は、本発明の組換え発現ベクターで遺伝子組み換えされたインビトロの宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の医薬製剤を含む滅菌容器を提供する。ある場合において、該容器はシリンジである。
【００１８】
本発明は、個体におけるタウオパチーの処置方法であって、本発明の抗Ｔａｕ抗体または本発明の医薬組成物を該個体に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、個体におけるタウオパチーの処置方法であって、ａ）ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域中のエピトープへの結合に対して、ｉ）図１Ｂに記載の抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、および図１Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）図２Ｂに記載の抗体の軽鎖ＣＤＲ、および図２Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、を含む抗体と競合する抗体、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含む医薬組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。ある場合において、抗体は、（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｖｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、を含む。ある場合において、抗体は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、抗体は、ヒト化重鎖フレームワーク領域を含む。ある場合において、抗体は、リポソームに封入されている。ある場合において、抗体は、血液脳関門の通過を促進する薬物と共に製剤されている。ある場合において、抗体は、血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質に直接またはリンカーを介して結合されている。ある場合において、抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。ある場合において、静脈内に投与される。ある場合において、髄腔内に投与される。
【００２０】
ある場合において、対象への抗Ｔａｕ抗体の投与は、ａ）脳組織における細胞外の遊離ｔａｕの量、ｂ）間質液（ＩＳＦ）における細胞外遊離ｔａｕの量、ｃ）脳脊髄液（ＣＳＦ）における細胞外の遊離ｔａｕの量、ｄ）ニューロンから他のニューロンへのｔａｕの拡散、ｅ）ニューロン内のｔａｕ凝集量、ｆ）ミクログリアおよび／またはアストロサイトの活性化の低減、ｇ）リン酸化または過剰リン酸化ｔａｕの量、ｈ）ＩＳＦまたはＣＳＦにおける、完全ｔａｕまたは遊離ｔａｕの量、ｉ）細胞内のｔａｕのＮ末端フラグメントの量、ｊ）ニューロン過活動（neuronal hyperactivity）、ｋ）ＣＳＦにおける、Ａβ４０および／またはＡβ４２の量、ｌ）Ａβプラーク面積率、ｍ）ニューロンからのＡβ４０および／またはＡβ４２の分泌、ｎ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）プロモーター活性、ｏ）ＡＰＰ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベル、ｐ）β−セクレターゼおよび／またはγ−セクレターゼの活性、ｑ）Ａβ仲介シグナル伝達経路の活性化状態、ｒ）細胞内完全ｔａｕまたは遊離ｔａｕの量、ｓ）ＩＳＦまたはＣＳＦにおける、抗ｔａｕ抗体−結合ｔａｕの量、およびｔ）細胞内抗Ｔａｕ抗体−結合ｔａｕの量、のうち１つまたはそれ以上の変化をもたらす。
【００２１】
ある場合において、個体におけるタウオパチーを処置するための本発明の方法は、タウオパチーを処置する少なくとも１つの付加的薬物を投与することをさらに含む。
【００２２】
本発明は、個体におけるタウオパチーの進行をモニターする方法であって、ａ）第一の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第一レベルを決定し、ｂ）第二の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第二レベルを決定し、そしてｃ）Ｔａｕの第一レベルとＴａｕの第二レベルを比較すること（ここで、該決定は、ｉ）該生物学的サンプルを請求項１、５、１６および２１のいずれか一項に記載の抗体と接触させ、ｉｉ）該サンプル中に存在するＴａｕポリペプチドへの抗体の結合を定量することを含む）、を含む方法を提供する。ある場合において、生物学的サンプルは、脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、または唾液である。ある場合において、定量されたＴａｕポリペプチドは完全Ｔａｕポリペプチドである。ある場合において、定量されたＴａｕポリペプチドは、完全長ＴａｕポリペプチドのＮ末端フラグメントである。ある場合において、第一の時点は、処置レジメンの開始前の時点であり、第二の時点は、処置レジメンの開始後の時点である。
【００２３】
本発明は、生体中、インビボでＴａｕポリペプチドを検出する方法であって、ａ）個体に請求項１、５、１６、および２１のいずれか一項に記載の抗体を投与し、ｂ）個体の脳組織におけるｔａｕポリペプチドへの抗体の結合を画像検査法を用いて検出すること、を含む方法を提供する。ある場合において、抗体は、画像検査法における使用に好適な造影剤を含む。ある場合において、画像検査法は、磁気共鳴映像法または陽電子放出断層撮影法である。
【００２４】
本発明は、個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのインビトロでの検出方法であって、ａ）生物学的サンプルを、ＴａｕのＮ末端領域内のエピトープへの結合と競合する、ｉ）図１Ｂに記載の抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、および図１Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）図２Ｂに記載の抗体の軽鎖ＣＤＲ、および図２Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、を含む抗体と接触させ、そしてｂ）サンプル中に存在するＴａｕポリペプチドへの抗体の結合を検出すること、を含む方法を提供する。ある場合において、生物学的サンプルは、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液である。ある場合において、個体は、タウオパチーを有する疑いがある、タウオパチーを有すると診断されている、またはタウオパチーの遺伝的発症素因を有する。ある場合において、該方法は定量法である。ある場合において、検出されるＴａｕポリペプチドは完全Ｔａｕポリペプチドである。ある場合において、検出されるＴａｕポリペプチドは、完全長ＴａｕポリペプチドのＮ末端フラグメントである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＩＰＮ００１ ＶＨ（図１Ａ）およびＶＬ（図１Ｂ）のアミノ酸配列を提供する。相補性決定領域（ＣＤＲ）を太字および下線で示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＩＰＮ００２ ＶＨ（図２Ａ）およびＶＬ（図２Ｂ）のアミノ酸配列を提供する。相補性決定領域（ＣＤＲ）を太字および下線で示す。
【図３】図３Ａ−Ｄは、皮質ニューロンにおけるＴａｕ仲介性膜電位脱分極に対する抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図４】図４Ａ−Ｃは、脳脊髄液（ＣＳＦ）からのＴａｕのアフィニティー分離を示す。
【図５】図５は、Ｔａｕアフィニティー分離前および後のＣＳＦおよび馴化培地（ＣＭ）サンプルの定量化を示す。
【図６】図６Ａ−Ｄは、完全長ヒトＴａｕのアミノ酸配列を提供する。
【図７】図７は、Ｐ３０１Ｌ ｔａｕ マウスからの間質液（ＩＳＦ）中、ならびに進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）患者からのＣＳＦ中のＴａｕフラグメントの検出を示す。
【図８】図８Ａ−Ｄは、細胞外ｔａｕ（ｅＴａｕ）フラグメント（図８Ａ−Ｃ）による皮質ニューロン過活動（neuronal hyperactivity）の誘導、および抗Ｔａｕ抗体ＩＰＮ００１によるｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動の誘導を示す。
【図９】図９は、ヒト化ＩＰＮ００２ ＶＨ変異体１のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチドを示す。
【図１０】図１０は、ヒト化ＩＰＮ００２ ＶＨ変異体２のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒト化ＩＰＮ００２ ＶＨ変異体３のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は、ヒト化ＩＰＮ００２ ＶＨ変異体４のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３は、ヒト化ＩＰＮ００２ Ｖκ変異体１のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、ヒト化ＩＰＮ００２ Ｖκ変異体２のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１５】図１５は、ヒト化ＩＰＮ００２ Ｖκ変異体３のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１６】図１６は、ヒト化ＩＰＮ００２ Ｖκ変異体４のアミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、ヒト化ＩＰＮ−００２ 変異体のｅＴａｕタンパク質への結合特性を示す表４を提供する。
【図１８】図１８は、ヒト化ＩＰＮ−００２ 変異体のＴａｕ−３８３への結合特性を示す表５を提供する。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ヒト化ＩＰＮ００２ 変異体の特徴を示す。図１９Ａは、ｉＰＳＣ−ＣＮ馴化培地；ｉＰＳＣ−ＣＮ溶解物；ＡＤ脳溶解物；Ｐ３０１Ｌ ｔａｕ マウス脳皮質溶解物；および、カニクイザル脳溶解物の存在下での、ヒト化ＩＰＮ−００２ 変異体のｔａｕへの結合を示す。図１９Ｂは、ヒト化ＩＰＮ００２ 変異体によるｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動（neuronal hyperactivity）の阻害を示す。
【図２０】図２０は、胎児のｔａｕアミノ酸配列と整列させた、ｅＴａｕフラグメントのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
【図２１】図２１Ａ−Ｃは、ヒト化抗Ｔａｕ抗体（図２１Ａ）、キメラ抗体（図２１Ｂ）、およびヒト化Ａ３３（図２１Ｃ）に対する増殖応答を示す。
【図２２】図２２は、インビボでのリン酸化ＴａｕレベルへのＩＰＮ００２の効果を示す。
【図２３】図２３は、ＩＰＮ００２での処理後の、間質液（ＩＳＦ）中の遊離ｔａｕレベルおよび完全ｔａｕレベルの減少を示す。
【図２４】図２４は、ＩＰＮ００２での処理後の、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の遊離ｔａｕレベルの減少を示す。
【図２５】図２５は、ＩＰＮ００２によるｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動（neuronal hyperactivity）の低減を示す。
【図２６】図２６は、慢性外傷性脳症の可能性のある個体由来のＣＳＦ中のＴａｕフラグメントの存在を示す。
【図２７】図２７は、固相アッセイを用いた、合成ｔａｕペプチドへのＩＰＮ００２のヒト化変異体の結合を示す。
【図２８】図２８は、液相アッセイを用いた、合成ｔａｕペプチドへのＩＰＮ００２のヒト化変異体の結合を示す。
【図２９】図２９は、組み換えＴａｕおよびＰＡＤペプチドへのＩＰＮ００２のヒト化変異体の結合を示す。
【図３０】図３０は、ＩＰＮ００２のヒト化変異体への結合に対する、合成ｔａｕペプチドの非ビオチニル化形態と合成ｔａｕペプチドのビオチニル化形態の競合を示す。
【図３１】図３１は、Ｐ３１０Ｌマウスモデルにおけるクラスピングスコア(clasping score)に対する、対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２の投与の効果を示す。
【図３２】図３２は、Ｐ３１０Ｌマウスモデルの梁歩行試験(beam walk test)における平均遅延時間（average latency）に対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２の投与の効果を示す。
【図３３】図３３は、Ｐ３１０ＬマウスモデルのＣＳＦサンプルにおける遊離ｔａｕ（抗Ｔａｕ抗体に結合しないｔａｕ）レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２の投与の効果を示す。
【図３４】図３４は、ｅＴａｕ１ａ誘導性ニューロン過剰興奮性の抗体による阻害を示す。
【図３５】図３５は、皮質ニューロンにおけるニューロン過剰興奮性に対する、インビトロでの完全長のＰＨＦ１−反応性ｔａｕ、またはｅＴａｕ１ａの効果を図示する。
【図３６】図３６は、皮質ニューロンにおけるニューロン過剰興奮性に対する、インビトロでの完全長のＰＨＦ１−反応性ｔａｕ、またはｅＴａｕ１ａの効果を示す。
【図３７】図３７は、皮質ニューロンから分泌されるＡβ４０（左パネル）またはＡβ４２（右パネル）のレベルに対する、対照ＩｇＧ、ＢＡＣＥ阻害剤、またはＩＰＮ００２の効果を示す。
【図３８】図３８は、主に皮質ニューロンから分泌されるＡβ４０のレベルに対する対照ＩｇＧ、ＢＡＣＥ阻害剤、または抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図３９】図３９は、主に皮質ニューロンから分泌されるＡβ４２のレベルに対する対照ＩｇＧ、ＢＡＣＥ阻害剤、または抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図４０】図４０は、ＩＰＮ００２のヒト化変異体（ｈｕ−ＩＰＮ００２）のエピトープマッピングの結果を示す。
【図４１】図４１は、ＣＳＦにおける種々のｔａｕポリペプチドを検出するためのアッセイを示す。
【図４２】図４２は、ＩＰＮ００２、ＰＨＦ１、またはＴａｕのＣ末端中の直鎖状エピトープ（ｐＡｂ−ｔａｕ直鎖状エピトープ）を結合するポリクローナル抗体による、ＣＳＦにおけるＴａｕの結合を示す。
【００２７】
【図４３】図４３は、Ｐ３０１ＬマウスにおけるＣＳＦ中の完全ｔａｕレベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４４】図４４Ａ−Ｈは、Ｐ３０１Ｌマウスにおける種々の脳領域および組織中のＡＴ８ホスホＴａｕに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４５】図４５Ａ−Ｅは、Ｐ３０１Ｌマウスにおける種々の脳領域および組織中のリン酸化Ｔａｕレベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４６】図４６は、Ｐ３０１Ｌマウスにおける後脳中のＡＴ８ホスホＴａｕ組織学的レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４７】図４７は、Ｐ３０１Ｌマウスにおける後脳中のＡＴ１００ホスホＴａｕ組織学的レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂは、Ｐ３０１Ｌマウスにおける海馬ホモジネートおよび皮質ホモジネート中のＧＦＡＰタンパク質レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図４９】図４９Ａおよび４９Ｂは、Ｐ３０１Ｌマウスにおける海馬ホモジネートおよび皮質ホモジネート中のＩｂａ１タンパク質レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図５０】図５０Ａおよび５０Ｂは、Ｐ３０１Ｌマウスにおける皮質ホモジネートおよび皮質Ｓ１画分中のＡβ４０レベルに対する対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図５１】図５１は、Ｐ３１０Ｌマウスにおいて梁歩行試験を行うことができるマウスの割合に対する、対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２処理の効果を示す。
【図５２】図５２は、種々のＴａｕペプチドへのｈｕ−ＩＰＮ００２の結合を示す。
【図５３】図５３は、ｈｕ−ＩＰＮ００２への種々のビオチニル化Ｔａｕペプチドの結合を示す。
【図５４】図５４Ａおよび５４Ｂは、ＩＰＮ００２に結合しないＴａｕ（遊離Ｔａｕ）（図５４Ａ）、およびＩＰＮ００２に結合するＴａｕ（結合Ｔａｕ）（図５４Ｂ）用のアッセイの略図である。
【図５５】図５５Ａおよび５５Ｂは、ヒト胎児ニューロン（ＨＦＮ）の馴化培地における、Ａβ４０（図５５Ａ）およびＡβ４２（図５５Ｂ）のレベルに対するＴａｕポリペプチドの効果を示す。
【図５６】図５６Ａおよび５６Ｂは、ＨＦＮの馴化培地における、Ａβ４０（図５６Ａ）およびＡβ４２（図５６Ｂ）のレベルに対する抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図５７】図５７Ａおよび５７Ｂは、ＨＦＮの馴化培地における、Ａβ４０（図５７Ａ）およびＡβ４２（図５７Ｂ）のレベルに対する抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図５８】図５８Ａおよび５８Ｂは、５日（ｄ５）、１０日（ｄ１０）、１５日（ｄ１５）および２０日（ｄ２０）の期間での、ＨＦＮの馴化培地における、Ａβ４０（図５８Ａ）およびＡβ４２（図５８Ｂ）のレベルに対する抗Ｔａｕ抗体の効果を示す。
【図５９】図５９は、種々の抗体が結合するＴａｕの領域を示す図である。
【図６０】図６０は、非ヒト哺乳動物の脳脊髄液における、Ａβのレベルに対するＩＰＮ００２のヒト化変異体の効果を示す。
【図６１】図６１は、ｅＴａｕ４と位置合わせした２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
用語“抗体”および“免疫グロブリン”には、抗体または何れかのアイソタイプの免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、および抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的結合性を有する抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体で、検出可能な産物、蛍光タンパク質を生じる酵素などで検出可能に標識することができる。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などのような他の部分とさらに結合されていてよい。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むが、これらに限定されない、固体支持体に結合されていてよい。該用語はまた、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、および／または抗原への特異的結合性を有する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体を包含する。抗体は、一価でも二価でもよい。
【００２９】
本明細書に用いる用語“ヒト化免疫グロブリン”は、異なる起源の免疫グロブリンの複数部分を含む免疫グロブリンであって、少なくとも１つの部分がヒト起源のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンを意味する。例えば、ヒト化抗体は、例えばマウスのような、必要な特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリンに由来する複数部分、およびヒト起源の免疫グロブリン配列に由来する部分を含み（例えば、キメラ免疫グロブリン）、それらは、従来技術（例えば、合成）により化学的に共に結合されるか、または遺伝子操作技術を用いて（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコード化するＤＮＡが発現されて、隣接するポリペプチド鎖を生じる）、隣接するポリペプチドとして製造される。ヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖および／または重鎖に由来するフレームワーク領域を含む、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン鎖を含む免疫グロブリン（例えば、フレームワーク変化を有する、または有しないＣＤＲ移植抗体）である。キメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体はまた、用語ヒト化免疫グロブリンに包含される。一本鎖抗体に関して、例えば、Cabillyらの、米国特許番号第4,816,567号；Cabillyらの、欧州特許番号第0,125,023 B1号；Bossらの、米国特許番号第4,816,397号；Bossらの、欧州特許番号第0,120,694 B1号；Neuberger, M. S.らの、WO 86/01533；Neuberger, M. S. らの、欧州特許番号第0,194,276 B1号；Winterの、米国特許番号第5,225,539号；Winterの、欧州特許番号第0,239,400 B1号；Padlan, E. A. らの、欧州特許出願番号第0,519,596 A1号を参照のこと。また、adnerらの、米国特許番号第4,946,778号；Hustonの米国特許番号第5,476,786号；および Bird, R. E. et al., Science, 242：423−426 (1988))を参照のこと。
【００３０】
例えば、ヒト化免疫グロブリンは、合成および／または組み換え核酸を用いて製造され、所望のヒト化鎖をコード化する遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を製造することができる。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、ＰＣＲ変異導入法を用いて構築され、改変前のヒト化可変領域をＤＮＡテンプレートのようなヒトまたはヒト化鎖をコード化するＤＮＡ配列に改変することができる(例えば、Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17：5404 (1989))；Sato, K., et al., Cancer Research, 53：851−856 (1993)；Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9)：2471−2476 (1991);および、Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101：297−302 (1991)を参照のこと)。これらの、または他の好適な方法を用いて、変異体を容易に製造することも可能である。例えば、クローン化された可変領域に変異導入することができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択することができる（例えば、ファージライブラリから；例えば、Krebber et al., U.S. Pat. No. 5,514,548；Hoogenboom et al., WO 93/06213, published Apr. 1, 1993)を参照のこと）。
【００３１】
“抗体フラグメント”は、インタクト抗体の一部、例えば、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体(Zapata et al., Protein Eng. 8(10)：1057−1062 (1995)）；一本鎖抗体分子；ならびに、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、“Ｆａｂ”フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（それぞれが１つの抗原結合部位を有する）、および残りの“Ｆｃ”フラグメント(容易に結晶化する能力によりそのように呼ばれる)を生じる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原と結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００３２】
“Ｆｖ”は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、強力な非共有結合で連結した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定する構造をとる。すなわち、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異性のある３つのＣＤＲのみを含む半分のＦｖ）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。
【００３３】
“Ｆａｂフラグメント”もまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基を付加することによって、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基(複数)が１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、Ｆａｂ’フラグメント間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして産生された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【００３４】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明確に区別される２つの型のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって種々のクラスに分類される。免疫グロブリンには５つの主なクラス、IｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。
【００３５】
“一本鎖Ｆｖ”または“ｓＦｖ”抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。ある態様において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にあるポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、抗原結合のためにｓｃＦｖが所望の構造に形成することを可能にする。ｓｃＦｖについての検討は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)を参照のこと。
【００３６】
用語“二重特異性抗体”は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであり、該フラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖内で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、該ドメインは別の鎖の相補ドメインと対を形成して、２つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444−6448においてより詳細に記載されている。
【００３７】
本明細書で用いる用語“親和性”は、２つの物質（例えば、抗体および抗原）の可逆的結合の平衡定数を意味し、解離定数（Ｋｄ）として示される。親和性は、関係のないアミノ酸配列に対する抗体の親和性より高く、少なくとも１倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、少なくとも２０倍以上、少なくとも３０倍以上、少なくとも４０倍以上、少なくとも５０倍以上、少なくとも６０倍以上、少なくとも７０倍以上、少なくとも８０倍以上、少なくとも９０倍以上、少なくとも１００倍以上、または少なくとも１０００倍以上、またはそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）ないし約０．１ｎＭ、約１００ｎＭないし約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭないし約１フェムトモル（ｆＭ）またはそれ以上であり得る。本明細書で用いる用語“親和力(avidity)”は、２種以上の物質の複合体の希釈後の解離に対する抵抗性を意味する。用語“免疫反応性”および“特異的結合(preferentially bind)”は、本明細書中、抗体および／または抗原結合フラグメントに対して互換的に用いられている。
【００３８】
用語“結合”は、例えば、塩架橋および水架橋のような相互作用を含む、共有結合、静電的結合、疎水性結合、ならびにイオン結合および／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接結合を意味する。本発明の抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。非特異的結合は、約１０−７Ｍ未満の親和性での結合、例えば、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍなどの親和性での結合を意味し得る。
【００３９】
本明細書で用いる用語“ＣＤＲ”または“相補性決定領域”は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続な抗原結合部位を意味することが意図される。ＣＤＲは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252：6609−6616 (1977)；Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)；Chothia et al., J. Mol. Biol. 196：901−917 (1987)；および、MacCallum et al., J. Mol. Biol.  262：732−745 (1996)に記載されており、ここでは、定義は、互いを比較したとき、アミノ酸残基の重複または一部を含む。しかしながら、抗体もしくは移植抗体またはその変異体のＣＤＲについての定義の適用は、本明細書で定義され、かつ使用される用語の範囲内であることが意図される。上記の文献の何れかに定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基は、以下の表１に比較して記載される。
【００４０】
【表１】
0006446443.tif 000002
【００４１】
本明細書で用いる用語“フレームワーク”は、抗体の可変領域に関して用いるとき、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域の外側の全てのアミノ酸残基を意味することを意図する。可変領域フレームワークは、一般的に、約１００−１２０個のアミノ酸長の不連続なアミノ酸配列であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを意味することが意図される。本明細書で用いる用語“フレームワーク領域”は、ＣＤＲにより分断されるフレームワークの各ドメインを意味することが意図される。
【００４２】
“単離された”抗体とは、天然環境の成分から同定、分離および／または回収されたものである。天然環境の混入成分は、抗体の診断用途または治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る。ある態様において、抗体は、（１）ローリー法で決定したとき、抗体が９０重量％以上、９５重量％以上、または９８重量％以上、例えば、９９重量％を越えるまで精製され、（２）スピニングカップシーケネーター（spinning cup sequenator）の使用によってＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製され、または（３）クマシーブルーまたは銀染色を用いる還元または非還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で均質になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分も存在しないので、組換え細胞内に存在する抗体が含まれる。ある例において、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製され得る。
【００４３】
本明細書中、互換的に用いられる用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、何れかの長さのアミノ酸の多量体形態を意味し、それには、遺伝子的にコード化されたおよび非遺伝子的にコード化されたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドが含まれ得る。該用語は、融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を含む融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する、または有しないもの、免疫学的タグ付加タンパク質などを含むがこれらに限定されない。
【００４４】
本明細書で用いる用語“処置”、“処置する”などは、所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を得ることを意味する。該効果は、疾患またはその症状の完全または部分的な防止という点で予防的であってよく、かつ／または、疾患および／もしくは該疾患に起因する有害作用に関する部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書で用いる“処置”とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の全ての処置を包含し、以下の段階を含む。（ａ）疾病の素因を持ちうるが、それを有するとまだ診断されていない対象において、疾病の発症を防止する段階、（ｂ）疾病を阻害する、すなわち、その進行を阻止する段階、および（ｃ）疾病を緩和する、すなわち、疾病を緩解させる段階。
【００４５】
本明細書中、互換的に用いられる用語“個体”、“対象”、“宿主”および“患者”は、マウス（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ科、ネコ科、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。
【００４６】
“治療的有効量”または“有効量”は、疾患の処置のために哺乳動物または他の対象に投与されるとき、疾患のそのような処置に有効である十分量、抗Ｔａｕ抗体の量を意味する。“治療的有効量”は、抗Ｔａｕ抗体、疾患およびその重篤度ならびに処置される対象の年齢、体重などによって変わり得る。
【００４７】
“生物学的サンプル”は、個体から得られる種々のサンプルタイプを包含し、診断またはモニタリングアッセイで使用され得る。定義は、生物学的起源の血液および他の液状サンプル、生検標本または組織培養物もしくはそれらに由来する細胞およびその子孫細胞のような固体組織サンプルを包含する。定義はまた、それらを入手後に何れかの方法、例えば、試薬での処理、可溶化、またはポリヌクレオチドのようなある成分の富化により、操作されたサンプルを包含する。用語“生物学的サンプル”は、臨床サンプルを包含し、また、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織サンプルを包含する。用語“生物学的サンプル”は、尿、唾液、脳脊髄液、血漿および血清のような血液画分などを含む。
【００４８】
本発明をさらに記載する前に、本発明が記載される特定の態様に限定されることなく、もちろん変更されてもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得るため、本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを記載する目的であり、限定を意図しないことが理解されるべきである。
【００４９】
値の範囲が記載されるとき、その範囲の上限および下限との間の全ての値、他に明確に特記されない限り、下限の単位の１０分の１まで、何らかの他の記載または記載の範囲内の間の値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、その小さい範囲に独立して包含され得て、また、本発明の範囲内に包含され、特に記載の範囲に限定されることを意図しない。記載される範囲が、限定の一方または両方を包含するとき、それが包含する限定のどちらかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に包含される。
【００５０】
他に特記されない限り、本明細書に用いる全ての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と同様のまたは均等な方法および物質もまた、本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および物質が本明細書中に記載される。本明細書に記載の全ての文献は、引用により、その文献が引用される事柄に関する方法および／または物質についての開示および記載が本明細書中に包含される。
【００５１】
本明細書中、他に明確に記載がない限り、本明細書中および添付の特許請求の範囲における単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、複数の意味を含むことが特記されるべきである。従って、例えば、“ヒト化抗Ｔａｕ抗体”との記載は、そのような抗体の複数を包含し、“タウオパチー”との記載は、１種またはそれ以上のタウオパチーおよび当業者に公知のそれらと同等の疾患などが包含される。さらに、特許請求の範囲は、何らかの任意の要素を除くように記載され得ることが特記される。そのようなものとして、この記載は、“単に”、“のみ”などの排他的用語の使用および特許請求の範囲の要素の記載に関して同様の使用、または“ネガティブ”な限定の使用に対する先行記載となることが意図される。
【００５２】
明確にするために、本明細書中、別個の態様で記載される本発明の一定の特徴はまた、単一の態様の組み合わせで提供され得ることが認められている。逆に言えば、簡単にするために、一態様で記載される本発明の種々の特徴はまた、別個に、または任意の好適な下位の組み合わせで提供され得る。全ての本発明に関する態様の組み合わせは、特に本発明に包含され、各々のおよび全ての組み合わせが、個々に、そして明確に記載されているように、本明細書に記載される。さらに、種々の態様およびその要素の全ての下位の組み合わせもまた、本発明に特に包含され、各々のおよび全てのかかる下位の組み合わせが、個々に、および明確に記載されているように、本明細書に記載される。
【００５３】
本明細書に記載の文献は、本出願の出願日前にそれらの開示内容を単に提供するにすぎない。それらの何れも、本発明が、先行発明として、かかる文献に先行しないと認めるとの認識と解されるべきではない。さらに、提供される文献の出版日は、実際の出版日とは異なり得るので、個々に確認される必要がある。
【００５４】
詳細な記載
本発明は、抗Ｔａｕ抗体を投与することを含む、タウオパチーの処置方法を提供する。本発明はまた、抗Ｔａｕ抗体、それを含む製剤、または該方法におけるそれらの使用を記載する。本発明は、インビトロおよびインビボにおける、本明細書に記載の抗Ｔａｕ抗体を用いる検出方法をさらに提供する。
【００５５】
タウオパチーの処置方法
本発明は、タウオパチーの処置方法を提供する。該方法は、一般的に、有効量の本発明の抗Ｔａｕ抗体を、それを必要とする個体に投与することを伴う。ある場合において、対象への抗Ｔａｕ抗体の投与は、個体の細胞、組織、または体液における病理的ｔａｕポリペプチドのレベルを低減させ、タウオパチーを処置する。
【００５６】
ある態様において、本発明の方法は、抗Ｔａｕ抗体を投与することによりアミロイドベータ（Ａβ）（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２）を低減することを伴い、ここで、該抗体が結合するエピトープにはＴａｕのアミノ酸１−１５８内のアミノ酸残基が含まれ、該アミノ酸番号は図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−１８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは線形エピトープであり、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４８（ｅＴａｕ４；図６１に示す）に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するｅＴａｕ４ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−６８内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＥＦＥＶＭＥＤ（配列番号８７）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２５−３０内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＤＱＧＧＹＴ（配列番号８８）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２８−１２６内のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１５０−１５８内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１９−４６内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。
【００５７】
ある態様において、本発明の方法は、細胞外Ｔａｕ（ｅＴａｕ）に特異的に結合する抗体を投与することによりアミロイドベータ（Ａβ）（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２）を低減することを伴い、ここで、該抗体が結合するエピトープにはＴａｕのアミノ酸１−１５８内のアミノ酸残基が含まれ、該アミノ酸番号は図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−１８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは線形エピトープであり、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４８（ｅＴａｕ４；図６１に示す）に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するｅＴａｕ４ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ４ポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ｅＴａｕ４のアミノ酸２−６８内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ４ポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ｅＴａｕ４のアミノ酸１５−２４内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸７−１３内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＥＦＥＶＭＥＤ（配列番号８７）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２５−３０内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＤＱＧＧＹＴ（配列番号８８）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２８−１２６内のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸１５０−１５８内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸１９−４６内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。
【００５８】
例えば、ある態様において、本発明の方法は、有効量の単離されたヒト化モノクローナル抗体であって、Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内のエピトープに特異的に結合する抗体を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される添加剤、例えば、ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤を含む、医薬製剤として存在する。
【００５９】
例えば、ある態様において、本発明の方法は、有効量の、ヒト化軽鎖フレームワーク領域およびヒト化重鎖フレームワーク領域を含む単離された抗体であって、該単離された抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する抗体を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される添加剤、例えば、ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤を含む、医薬製剤として存在する。
【００６０】
例えば、ある態様において、本発明の方法は、有効量の、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である単離された抗体であって、該抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する抗体を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される添加剤、例えば、ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤を含む、医薬製剤として存在する。
【００６１】
例えば、ある態様において、本発明の方法は、有効量の、ヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域を含む単離された抗体であって、該単離された抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する抗体を、それを必要とする個体に投与することを含み得る。ある態様において、抗体は、薬学的に許容される添加剤、例えば、ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤を含む、医薬製剤として存在する。
【００６２】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、細胞外ｔａｕに結合する。本明細書で用いる“細胞外ｔａｕ”（“ｅＴａｕ”）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）または間質液（ＩＳＦ）中で検出され得る何れかのＴａｕポリペプチドを包含する。ある態様において、ｅＴａｕは、１７５アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６を含むポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、１７１アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７２（配列番号４４）を含むポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−２ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−３ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−４ポリペプチドである。
【００６３】
ある場合において、ｅＴａｕポリペプチドは、約５０アミノ酸〜約１７５アミノ酸長、例えば、約５０アミノ酸（ａａ）〜約７５ａａ、約７５ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜約１５０ａａ、または約１５０ａａ〜約１７５ａａの長さを有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６の、約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１２５、約１２５〜約１５０、または約１５０〜約１７５の隣接アミノ酸を含み得る。ｅＴａｕポリペプチドの例を図２０に記載する。
【００６４】
以下に、より詳細に記載するとおり、本発明の抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、該抗体によって結合されるエピトープは直鎖状エピトープであり、Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内の、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内の、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内の、Ｔａｕのアミノ酸９−１８内の、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内の、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内の、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む。ヒトＴａｕイソ型のアミノ酸配列を、図６Ａ−Ｄに示す。Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ（配列番号５３）である。例えば、Garcia−Sierra et al. (2003) J. Alzheimer’s Disease 5：65；および、Horowitz et al. (2004) J. Neurosci. 24：7895を参照のこと。Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である。
【００６５】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、該抗体によって結合されるエピトープは直鎖状エピトープであり、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、リン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、リン酸化アミノ酸を含む。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含む。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含み、リン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、リン酸化アミノ酸含み、ニトロ化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸を含む。
【００６６】
例えば、ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合する。ある態様において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合する。
【００６７】
ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープはリン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、リン酸化アミノ酸を含む。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープはニトロ化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含む。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープはニトロ化アミノ酸を含み、リン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープはリン酸化アミノ酸を含み、ニトロ化アミノ酸を含まない。ある場合において、本発明のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕのアミノ酸ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）内のアミノ酸残基を含む直鎖状エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ニトロ化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸を含む。
【００６８】
ある場合において、本発明のタウオパチーの処置のための方法は、ａ）ｉ）１、２または３個の図１に記載の抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、および１、２または３個の図１に記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）１、２または３個の図２に記載の抗体の軽鎖ＣＤＲ、および１、２または３個の図２に記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、を含む抗Ｔａｕ抗体、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００６９】
ある場合において、本発明のタウオパチーの処置のための方法は、ａ）ヒトＴａｕポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する抗体であって、エピトープへの結合に関して、ｉ）図１Ｂに記載の抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、および図１Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）図２Ｂに記載の抗体の軽鎖ＣＤＲ、および図２Ａに記載の抗体の重鎖ＣＤＲ、を含む抗体と競合する抗体、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００７０】
ある場合において、本発明のタウオパチーの処置のための方法は、ａ）ｈｕ−ＩＰＮ００２（例えば、ＴａｕのＮ末端部分内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９−１８内、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内の直鎖状エピトープ）により認識される、Ｔａｕ中のエピトープへの結合を、ヒト化ＩＰＮ００２（ｈｕ−ＩＰＮ００２）と競合する抗体、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００７１】
ＩＰＮ００１（本明細書中、“ＩＰＮ１”または“ＩＰＮ−１”とも言う）およびＩＰＮ００２（本明細書中、“ＩＰＮ２”または“ＩＰＮ−２”とも言う）は、Ｔａｕに特異的に結合する。ＩＰＮ００１により結合されるエピトープは直鎖状エピトープであり、Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内のアミノ酸残基を含む。
【００７２】
ある例において、タウオパチーの処置方法における使用に適する本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖可変領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖可変領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。
【００７３】
ある例において、タウオパチーの処置方法における使用に適する本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196：901−917 (1987)を参照のこと）。
【００７４】
他の例において、タウオパチーの処置方法における使用に適する本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに定義の通りである（例えば、上記の表１、および Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。
【００７５】
他の例において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する本発明の抗体であって、ここで、該エピトープは、Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９−１８内、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内に存在する）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196：901−917 (1987)を参照のこと）。
【００７６】
ある場合において、タウオパチーの処置のための本発明の方法は、ａ）Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９−１８内（ここで、Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（ここで、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）の直鎖状エピトープに特異的に結合する抗体であって、（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、（ｖｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤を含む、有効量の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００７７】
ＩＰＮ００１のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を、図１Ａおよび１Ｂに示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される）は、太字および下線で示される。ＩＰＮ００２のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を、図２Ａおよび２Ｂに示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される）は、太字および下線で示される。
【００７８】
配列番号１−１２は、以下の通りである。
ＲＳＳＱＴＩＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ  （配列番号１）；
ＫＶＳＫＲＦＳ  （配列番号２）；
ＦＱＧＳＬＶＰＷＡ  （配列番号３）；
ＳＹＧＭＳ  （配列番号４）；
ＴＩＳＳＳＧＳＲＴＹＦＰＤＳＶＫＧ  （配列番号５）；
ＴＷＤＧＡＭＤＹ  （配列番号６）；
ＫＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ  （配列番号７）；
ＫＶＳＮＲＦＳ  （配列番号８）；
ＦＱＧＳＬＶＰＷＡ  （配列番号９）；
ＫＹＧＭＳ  （配列番号１０）；
ＴＩＳＳＳＧＳＲＴＹＹＰＤＳＶＫＧ  （配列番号１１）；
ＳＷＤＧＡＭＤＹ  （配列番号１２）。
【００７９】
ある場合において、抗体は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域および／またはヒト化重鎖フレームワーク領域を含む。ヒト化抗Ｔａｕ抗体は、以下にて詳しく記載される。
【００８０】
タウオパチーは、個体の細胞、組織または体液中のｔａｕの異常なレベルにより特徴付けられる障害である。ある場合において、タウオパチーは、高レベル（正常より高いレベル）のｔａｕまたはｔａｕポリペプチドおよび／またはｔａｕの病理的形態が細胞、組織または体液中に存在することにより特徴付けられる。例えば、ある場合において、タウオパチーは、高レベルのｔａｕまたはｔａｕポリペプチドおよび／またはｔａｕの病理的形態が脳組織および／または脳脊髄液中に存在することにより特徴付けられる。細胞、組織または体液中の“正常より高い”レベルのｔａｕは、組織または体液中のｔａｕレベルが、正常レベル、対照レベルより高いレベルであること、例えば、同年齢群の個体または集団の正常レベル、対照レベルよりも高いレベルであることを意味する。例えば、Blomberg et al. (2001) “Cerebrospinal fluid tau levels increase with age in healthy individuals” Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 12：127を参照のこと。ある場合において、タウオパチーを有する個体は、タウオパチーの１つまたはそれ以上の付加的症状（例えば、認知低下）を示す。
【００８１】
他の場合において、タウオパチーは、正常レベルよりも低いレベルのｔａｕが細胞、組織または体液中に存在することにより特徴付けられる。組織または体液中の“正常より低い”レベルのｔａｕは、細胞、組織または体液中のｔａｕレベルが、正常レベル、対照レベルより低いレベルであること、例えば、同年齢群の個体または集団の正常レベル、対照レベルよりも低いレベルであることを意味する。
【００８２】
アルツハイマー病および前頭側頭骨性認知症の任意の病態（ピック病、散発性前頭側頭骨性認知症および染色体１７に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭骨性認知症）は、タウオパチーの最も一般的な病態である。本発明は、上記の処置方法を提供し、ここで、タウオパチーは、アルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭骨性認知症および染色体１７に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭骨性認知症である。他のタウオパチーには、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）および亜急性硬化性全脳炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
神経変性タウオパチーは、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズムを伴う認知症複合体、嗜銀顆粒性認知症、家族性脳アミロイド血管症(英国型)、脳アミロイド血管症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルトヤコブ症、ボクシング認知症（Dementia pugilistica）、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭骨性認知症（ＦＴＤ）、染色体１７に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭骨性認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン・シュパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、多発脳梗塞性認知症、虚血性卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、および卒中を含む。
【００８４】
本発明はまた、シヌクレイノパチー、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）；レビー小体型認知症（ＤＬＢ）；多系統萎縮症（ＭＳＡ）などの処置方法を提供し、例えば、認知症を伴うＰＤ（ＰＤＤ）は、本発明の方法で処置され得る。
【００８５】
１つの態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、対象における神経変性疾患であるタウオパチーの少なくとも１つの症状の発症を予防または遅延する。１つの態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、対象における神経変性疾患であるタウオパチーの少なくとも１つの症状を低減または排除する。該症状は、対象の脳または脊髄における、病理的ｔａｕ蓄積；細胞外可溶性Ｔａｕおよび／またはＴａｕフラグメント；過剰リン酸化ｔａｕ蓄積；不溶性ｔａｕ蓄積；神経原線維変化；神経原線維変性線維症(neurofibrillary fiber)；プレタングルホスホ−ｔａｕ凝集；神経細胞内の神経原線維変化；ニューロン過活動；および、神経細胞外の神経原線維変化の１つまたはそれ以上の形成であり得る。該症状は、神経学的症状、例えば、認知機能の障害、記憶障害、運動機能の低下などであり得る。ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、認知機能を改善することができる。ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、認知機能の低下速度を遅くし得る。ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、運動機能を改善し得る。ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、運動機能の低下速度を遅くし得る。
【００８６】
該症状はまた、個体のＣＳＦにおけるＴａｕポリペプチドのレベルであり得る。例えば、ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、タウオパチーを有する個体に単剤療法として、または併用療法として、単一用量または複数用量で投与されるとき、個体のＣＳＦにおけるＴａｕポリペプチドのレベルを、抗Ｔａｕ抗体での処置前の個体のＣＳＦにおけるＴａｕポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または５０％以上低減する。
【００８７】
個体への本発明の抗Ｔａｕ抗体の投与は、脳組織における細胞外遊離Ｔａｕの量の減少；Ｔａｕ（例えば、Ｔａｕフラグメント）の細胞から他の細胞への拡散（例えば、ニューロンから他のニューロンへの拡散）の減少；ｔａｕ凝集（例えば、細胞内（例えば、ニューロン内）ｔａｕ凝集）の量の減少；脳組織における神経原線維変化量の減少；ミクログリアの活性化および／またはアストロサイトの活性化のレベルの低下；リン酸化ｔａｕの量の減少；過剰リン酸化ｔａｕの量の減少；完全ｔａｕ（例えば、全細胞内Ｔａｕ；および／または全細胞外Ｔａｕ）の減少；遊離Ｔａｕ（例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体に結合していないＴａｕ）の減少；ニューロン過活動の低下；および、Ｎ末端Ｔａｕフラグメントの量の減少、の１つまたはそれ以上をもたらし得る。“完全ｔａｕ”は、何れかのイソ型の完全長Ｔａｕ；および、存在し、かつ本発明の抗Ｔａｕ抗体に認識されるエピトープを示すＮ末端Ｔａｕフラグメントの合計を含み得る。ヒト完全長Ｔａｕのアミノ酸配列を図６Ａ−Ｄに示す。リン酸化Ｔａｕの還元は、何れかの公知の方法を用いて、例えば、抗ホスホ−Ｔａｕ抗体を用いる免疫学的方法により決定され得る。
【００８８】
本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、ａ）脳組織における細胞外遊離ｔａｕの量；ｂ）間質液（ＩＳＦ）における細胞外遊離ｔａｕの量；ｃ）脳脊髄液（ＣＳＦ）における細胞外遊離ｔａｕの量；ｄ）ニューロンから他のニューロンへのｔａｕの拡散；ｅ）ニューロン内のｔａｕ凝集量；ｆ）ミクログリアおよび／またはアストロサイトの活性化の低減；ｇ）リン酸化または過剰リン酸化ｔａｕの量；ｈ）ＩＳＦまたはＣＳＦにおける、完全ｔａｕまたは遊離ｔａｕの量；ｉ）細胞内のｔａｕのＮ末端フラグメントの量；ｊ）ニューロン過活動；ｋ）ＣＳＦにおける、Ａβ４０および／またはＡβ４２の量；ｌ）Ａβプラーク面積率；ｍ）ニューロンからのＡβ４０および／またはＡβ４２の分泌；ｎ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）プロモーター活性；ｏ）ＡＰＰ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベル；ｐ）β−セクレターゼおよび／またはγ−セクレターゼの活性；ｑ）Ａβ仲介シグナル伝達経路の活性化状態；ｒ）細胞内完全ｔａｕまたは遊離ｔａｕの量；ｓ）ＩＳＦまたはＣＳＦにおける、抗ｔａｕ抗体−結合ｔａｕの量、およびｔ）細胞内抗Ｔａｕ抗体−結合ｔａｕの量、の１つまたはそれ以上の変化をもたらし得る。
【００８９】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、個体における認知機能を改善する、または少なくとも、個体における認知機能の低下を遅くする。
【００９０】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、細胞外遊離Ｔａｕポリペプチドの量（例えば、脳組織における細胞外遊離Ｔａｕポリペプチドの量）を、抗Ｔａｕ抗体での処置前の個体における細胞外遊離Ｔａｕポリペプチドの量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上低減する。
【００９１】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、細胞から他の細胞（例えば、ニューロンから他のニューロン）へのＴａｕポリペプチド（例えば、病理的Ｔａｕポリペプチド）の拡散を、本発明の抗Ｔａｕ抗体での処置前の細胞から他の細胞への拡散と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％低減する。
【００９２】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、ｔａｕ凝集（例えば、細胞内（例えば、ニューロン内）ｔａｕ凝集）の量を、抗Ｔａｕ抗体での処置前のｔａｕ凝集の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上減少する。
【００９３】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、個体における神経毒性を減少し、および／または個体における神経炎症を減少し、および／またはアストロサイトおよびミクログリアの活性化を低下し、および／または病理学的電気生理的作用の誘導を減少し、および／またはエキソソーム中のｔａｕの量を減少させる。
【００９４】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、ニューロン過活動を、抗Ｔａｕ抗体で処置する前のニューロン過活動のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上低下させる。ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体の個体への投与は、ニューロンの全細胞パッチクランプ法、例えば、多能性幹細胞に由来する皮質ニューロン（ｉＰＳＣ−ＣＮ）またはヒト皮質ニューロン培養物（ＨＣＣ）の全細胞パッチクランプ法により決定される通り、ニューロン過活動を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上低下させる。
【００９５】
好適な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、動脈内投与（例えば、頚動脈を介して）、筋肉内投与、鼻腔内投与、局所投与または皮内投与または脊髄へもしくは脳への送達により達成され得る。鼻腔用スプレー製剤のようなエアロゾル製剤には、活性剤と共に防腐剤および等張剤を含む精製した水溶液または他の溶液が含まれる。かかる製剤は、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張性に合わせられる。
【００９６】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、抗体に血液脳関門を通過する能力を提供するような方法で修飾または製剤される。そのような抗体または抗体組成物は、経口投与、静脈内投与などを含む、種々の経腸投与および非経腸投与により、タウオパチーを有する個体に投与され得る。
【００９７】
非経腸投与用製剤は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含めて、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経腸用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流動および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲル・デキストロースをベースとするもの）等が含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等が存在していてもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の目的とする使用によっては、ドーパミンまたは精神薬理作用を有する薬剤（psychopharmacologic drug）のようなさらなる薬物を含み得る。
【００９８】
投与量レジメンは、担当医または他の医療関係者により、種々の臨床的因子に基づき決定され得る。医薬分野の当業者にはよく知られている通り、何れかの患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時期および経路、全身的健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む種々の因子によって変わる。本発明の抗Ｔａｕ抗体の用量は、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲であり得る。しかしながら、この例示的範囲以下または以上の用量が考慮され、とりわけ下記の数値が考慮される。一般的に、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ、または約０．０１〜５ｍｇの範囲（例えば、０．０２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇなど）であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。上記の範囲の中間の用量はまた、本発明の範囲内であることが意図される。対象は、１日１回、２日に１回、１週間に１回または実験的分析により決定される何れかの他のスケジュールで、かかる用量を投与され得る。例示的処置は、長期間、例えば、少なくとも６ヶ月の複数回投与を必要とする。さらなる例示的処置レジメンは、２週間毎に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。例示的投与スケジュールは、１日１回連続して１−１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、２日に１回３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇを含む。ある方法において、２種またはそれ以上の異なる結合特異性を有するモノクローナル抗体を同時に投与し、このとき、投与される各抗体の投与量は、記載した範囲内である。疾患の進行を、定期的な評価によりモニターすることができる。
【００９９】
併用療法
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、それを必要とする個体に単独で（例えば、単剤療法として）、または１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤との併用療法にて投与され得る。
【０１００】
ＡＤの処置に関して、好適なさらなる治療剤には、Ａｒｉｃｅｐｔ（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（リバスチグミン）、メトリホナート、およびタクリン（Ｃｏｇｎｅｘ）を含むが、これらに限定されないアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；抗Ａβ抗体；イブプロフェンおよびインドメタシンを含むが、これらに限定されない非ステロイド性抗炎症剤；Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（セレブレックス）のようなシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ２）阻害剤；ならびに、セレギリン（Selegilene）（Ｅｌｄｅｐｒｙｌまたはデプレニル）のようなモノアミンオキシダーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。上記の各薬物の投与量は、当技術分野で公知である。
【０１０１】
ＡＤの処置における別の好適なさらなる治療剤は、ｔａｕ凝集を阻害する薬物、例えば、米国特許番号第７，６０５，１７９号に記載の、ｔａｕ凝集を阻害するナフトキノン誘導体である。別の好適なさらなる治療剤は、ｔａｕのリン酸化を阻害する薬物、例えば、米国特許番号第７，５７２，７９３号に記載の、ｔａｕタンパク質キナーゼ１を阻害する３−置換−４−ピリミドン誘導体である。
【０１０２】
本明細書で用いる“〜との併用”は、例えば、第一の化合物が、第二の化合物の全投与期間中に投与される；第一の化合物が、第二の化合物の投与と重複する期間に投与される、例えば第一の化合物の投与が、第二の化合物の投与前に始まり、そして第一の化合物の投与が、第二の化合物の投与終了前に終了する；第二の化合物の投与が、第一の化合物の投与前に始まり、そして第二の化合物の投与が、第一の化合物の投与終了前に終了する；第一の化合物の投与が、第二の化合物の投与開始前に始まり、そして第二の化合物の投与が、第一の化合物の投与終了前に終了する；第二の化合物の投与が、第一の化合物の投与開始前に始まり、第一の化合物の投与が、第二の化合物の投与終了前に終了する、ような使用を意味する。例えば“併用”はまた、２以上の化合物の投与を含むレジメンを意味し得る。本明細書で用いる“〜との併用”はまた、同じか、または異なる製剤において、同じか、または異なる投与経路で、そして同じか、または異なる投与量形態タイプで投与され得る、２以上の化合物の投与を意味する。
【０１０３】
投与されるべき個体
本発明の抗Ｔａｕ抗体での処置に好適な個体には、タウオパチーを有すると診断されている個体；一般集団よりもタウオパチーを発症する危険性の高い個体（例えば、タウオパチーを発症する遺伝的素因を有する個体）；ＰＤＤを有する個体などが含まれる。ある場合において、該個体は、成人である。ある場合において、成人は３０歳もしくはそれ以上、４０歳もしくはそれ以上、５０歳もしくはそれ以上、６０歳もしくはそれ以上、７０歳もしくはそれ以上、または８０歳もしくはそれ以上である。例えば、成人は、４０歳から５０歳、５０歳から６０歳、６０歳から７０歳、または７０歳以上であってよい。
【０１０４】
Ａβ４０およびＡβ４２レベルを低減する方法
本発明は、個体の神経細胞および／または細胞外液中のアミロイドβポリペプチド（例えば、Ａβ４０および／またはＡβ４２）のレベルを低減する方法を提供する。該方法は、一般的に、ａ）有効量のＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に特異的に結合する抗体；または、ｂ）該抗体を含む医薬組成物を、該個体に投与することを含む。ある場合において、該抗体はヒト化されている。細胞外液は、例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液分画であり得る。
【０１０５】
ある場合において、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／または細胞外液中のＡβ４０およびＡβ４２を低減する本発明の方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕのアミノ酸２−１７６内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸２−１５内、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内、Ｔａｕのアミノ酸２４−５０内、Ｔａｕのアミノ酸２−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１５〜５０内、Ｔａｕのアミノ酸５０〜７５内、Ｔａｕのアミノ酸４０〜６０内、Ｔａｕのアミノ酸７５〜１００内、Ｔａｕのアミノ酸６０〜８０内、Ｔａｕのアミノ酸１００〜１２５内、Ｔａｕのアミノ酸８０−１１５内、Ｔａｕのアミノ酸１２５〜１５０内、Ｔａｕのアミノ酸１１５〜１４０内、Ｔａｕのアミノ酸１５０〜１７６内、またはＴａｕのアミノ酸１４０〜１６０内のＴａｕのエピトープに結合する抗体である。Ｔａｕポリペプチドの例は、図２０に記載する。個体の神経細胞および／または細胞外液中のＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを低減する抗体は、図２０に記載のＴａｕポリペプチド内のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体であり得る。
【０１０６】
ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／または細胞外液におけるＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減する本発明の方法における使用に好適なヒト化抗体は、Ｔａｕのアミノ酸２−１７６内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸２−１５内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内、アミノ酸１５０−１７６内、またはアミノ酸１４０−１６０内の、Ｔａｕのエピトープに結合するヒト化抗体である。Ｔａｕポリペプチドの例を図２０に記載する。個体の神経細胞および／または細胞外液においてＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを低減する抗体は、図２０に記載のＴａｕポリペプチド中のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体であり得る。
【０１０７】
ある場合において、個体の神経細胞および／または細胞外液中のＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを低減し、本発明の方法における使用に好適な抗体は、本明細書に記載のヒト化抗Ｔａｕ抗体である。ある場合において、該抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープに結合するヒト化抗体である。
【０１０８】
ある態様において、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）においてＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減する本発明の方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−１５内、アミノ酸７−１３内、アミノ酸２−１８内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸２５−３０内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸１９−４６内、アミノ酸２８−１２６内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内またはアミノ酸１５０−１５８内のＴａｕのエピトープに結合する抗体であって、ここで、該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸番号に基づく。ある態様において、抗体はヒト化されている。
【０１０９】
ある態様において、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）においてＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減する本発明の方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−１５内、アミノ酸７−１３内、アミノ酸２−１８内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸２５−３０内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸１９−４６内、アミノ酸２８−１２６内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内、またはアミノ酸１５０−１５８内のＴａｕのエピトープに結合する抗体であって、ここで、該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸番号に基づく。ある態様において、抗体はヒト化されている。
【０１１０】
ある態様において、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／またはＣＳＦにおいてＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減する本発明の方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−１５内、アミノ酸７−１３内、アミノ酸２−１８内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸２５−３０内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸１９−４６内、アミノ酸２８−１２６内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内、またはアミノ酸１５０−１５８内のＴａｕのエピトープに結合する抗体であって、ここで、該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸番号に基づく。ある態様において、抗体はヒト化されている。
【０１１１】
ある態様において、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、神経細胞および／またはＩＳＦにおいてＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減する本発明の方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−１５内、アミノ酸７−１３内、アミノ酸２−１８内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸２５−３０内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸１９−４６内、アミノ酸２８−１２６内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内、またはアミノ酸１５０−１５８内のＴａｕのエピトープに結合する抗体であって、ここで、該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸番号に基づく。ある態様において、抗体はヒト化されている。
【０１１２】
ある態様において、本発明の方法は、抗Ｔａｕ抗体を投与することによりアミロイドベータ（Ａβ）（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２）を低減することを伴い、ここで、該抗体が結合するエピトープにはＴａｕのアミノ酸１−１５８内のアミノ酸残基が含まれ、該アミノ酸番号は図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−１８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは線形エピトープであり、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４８（ｅＴａｕ４；図６１に示す）に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するｅＴａｕ４ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−６８内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＥＦＥＶＭＥＤ（配列番号８７）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２５−３０内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＤＱＧＧＹＴ（配列番号８８）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２８−１２６内のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１５０−１５８内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１９−４６内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。
【０１１３】
ある態様において、本発明の方法は、細胞外Ｔａｕ（ｅＴａｕ）に特異的に結合する抗体を投与することによりアミロイドベータ（Ａβ）（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２）を低減することを伴い、ここで、該抗体が結合するエピトープにはＴａｕのアミノ酸１−１５８内のアミノ酸残基が含まれ、該アミノ酸番号は図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−１８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは線形エピトープであり、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４８（ｅＴａｕ４；図６１に示す）に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するｅＴａｕ４ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ４ポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ｅＴａｕ４のアミノ酸２−６８内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ４ポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ｅＴａｕ４のアミノ酸１５−２４内にある。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸７−１３内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＥＦＥＶＭＥＤ（配列番号８７）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２５−３０内のアミノ酸残基、例えば、アミノ酸ＤＱＧＧＹＴ（配列番号８８）を含む。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２８−１２６内のアミノ酸残基を含み、該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸１５０−１５８内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。ある態様において、投与される抗Ｔａｕ抗体はｅＴａｕに特異的に結合し、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸１９−４６内のアミノ酸残基を含み、アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列に基づく。
【０１１４】
本発明は、アミロイドベータ蓄積（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）におけるＡβ４０および／またはＡβ４２の蓄積）と関係する疾患の処置方法を提供する。該方法は、一般的に、ａ）有効量の、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）（抗体は、ヒト化抗体であってもよい）、またはｂ）該ヒト化抗体を含む医薬組成物、を個体に投与することを伴う。
【０１１５】
アミロイドベータ蓄積と関係する疾患は、個体における神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルが正常対照レベルより高い疾患であり得る。アミロイドベータ蓄積と関係する疾患には、例えば、アルツハイマー病が含まれる。本発明の方法は、抗Ｔａｕ抗体で処置していない個体におけるアミロイドベータタンパク質レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上のアミロイドベータタンパク質レベル（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４０および／またはＡβ４２）の低減を提供し得る。従って、例えば、ある態様において、抗Ｔａｕ抗体の有効量は、抗Ｔａｕ抗体で処置していないか、または抗Ｔａｕ抗体で処置する前の神経細胞および／または細胞外液におけるＡβ４２のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上の、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４２のレベルの低減を提供する量である。ある態様において、抗Ｔａｕ抗体の有効量は、抗Ｔａｕ抗体で処置していないか、または抗Ｔａｕ抗体で処置する前の神経細胞および／または細胞外液におけるＡβ４２およびＡβ４０のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または５０％以上の、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分）中のＡβ４２およびＡβ４０のレベルの低減を提供する量である。
【０１１６】
ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域に結合し、本発明のアミロイドベータ蓄積と関係する疾患の処置方法における使用に好適な抗体（要すれば、ヒト化抗体、例えば、モノクローナル抗体）は、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−１５内、アミノ酸７−１３内、アミノ酸２−１８内、アミノ酸１５−２４内、アミノ酸２４−５０内、アミノ酸２−２５内、アミノ酸１９−４６内、アミノ酸２５−３０内、アミノ酸１５−５０内、アミノ酸２８−１２６内、アミノ酸５０−７５内、アミノ酸４０−６０内、アミノ酸７５−１００内、アミノ酸６０−８０内、アミノ酸１００−１２５内、アミノ酸８０−１１５内、アミノ酸１２５−１５０内、アミノ酸１１５−１４０内またはアミノ酸１５０−１５８内のＴａｕのエピトープに結合する抗体であって、ここで、該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸番号に基づく。ある態様において、抗体はヒト化されている。
【０１１７】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）の蓄積のレベルを低減し、本発明のアミロイドベータ蓄積と関係する疾患の処置方法における使用に好適な抗体は、本明細書に記載のヒト化抗Ｔａｕ抗体である。ある態様において、抗体は、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープ（例えば、線形エピトープ）に結合するヒト化抗体である。
【０１１８】
ある態様において、アミロイドベータレベルを低減する方法は、Ｔａｕに結合するのにＴａｕの２Ｎインサートの存在を必要としない抗Ｔａｕ抗体の投与を伴う。ある態様において、個体において神経細胞および／または細胞外液におけるアミロイドベータ（例えば、Ａβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体により認識されるエピトープは、Ｔａｕの２Ｎインサート内にはない。Ｔａｕの２Ｎインサートは、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列のアミノ酸４５−１０２を含む。
【０１１９】
ある態様において、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体は、細胞外Ｔａｕ（ｅＴａｕ）に特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは線形エピトープであり、該抗体が結合するエピトープは、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のアミノ酸残基を含む。ある態様において、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するｅＴａｕ４ポリペプチドに特異的に結合する。ある態様において、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ４ポリペプチド内の線形エピトープに特異的に結合し、ここで、該エピトープは、ｅＴａｕ４のアミノ酸２−６８内にある。上記の態様のいずれかにおいて、抗体はヒト化され得る。
【０１２０】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１−１５８内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２１】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２−１８内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２２】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸７−１３内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２３】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２５−３０内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２４】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸２８−１２６内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２５】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１９−４６内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２６】
ある態様において、個体におけるアミロイドベータ（例えば、神経細胞および／または細胞外液（例えば、ＣＳＦ、ＩＳＦ、血液、または血漿もしくは血清のような血液画分中のＡβ４０および／またはＡβ４２）蓄積のレベルを低減し、アミロイドベータ蓄積と関係する疾患を処置する方法における使用に好適な抗体は、Ｔａｕに特異的に結合し、ここで、該抗体が結合するエピトープは、Ｔａｕのアミノ酸１５０−１５８内のアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸番号は、例えば、図６１に記載の、Ｔａｕの２Ｎ４Ｒ形態に基づく。これらの態様のいくつかにおいて、抗体はヒト化されている。これらの態様のいくつかにおいて、エピトープは線形エピトープである。
【０１２７】
抗ＴＡＵ抗体
本発明は、単離された抗Ｔａｕ抗体、およびそれを含む医薬製剤を提供する。
【０１２８】
本発明は、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープ（例えば、アミノ−末端内の直鎖状エピトープ（ＴａｕのＮ末端部分、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）））に特異的に結合する単離された抗体を提供する。ある例において、抗体はヒト化されており、例えば、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の１つまたはそれ以上のフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンフレームワークに由来する配列を含む。
【０１２９】
本発明は、Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。ある場合において、エピトープは、リン酸化アミノ酸を含まない。ある場合において、エピトープは、ニトロ化アミノ酸を含まない。ある場合において、エピトープはリン酸化アミノ酸、ニトロ化アミノ酸、またはリン酸化アミノ酸およびニトロ化アミノ酸の両方を含む。
【０１３０】
フレームワーク領域（複数可）のヒト化は、ヒトにおけるヒト−抗マウス−抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する抗体の危険性を低減する。免疫応答を決定する当業者に認められる方法は、特定の患者または臨床試験中の患者におけるＨＡＭＡ応答をモニターすることで実行され得る。ヒト化抗体を投与される患者は、治療開始時および投与期間中に免疫原性評価をされ得る。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）分析を含む当業者に公知の方法を用いて、患者からの血清サンプル中、ヒト化治療用薬剤に対する抗体を検出することにより、測定される。多くの場合に、目的のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、ヒト対象におけるＨＡＭＡ応答を実質的に誘発しない。ある場合において、目的のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、ＣＤ８＋欠失末梢血単核細胞を用いて行われるＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにより決定されるとおり、免疫原性を低減させた。ある場合において、目的のヒト化抗Ｔａｕ抗体は、２．０未満の刺激指数を示す。
【０１３１】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の任意のアミノ酸は、それらのＣＤＲ立体構造への考えられる影響および／または抗原への結合性に基づいて置換のために選択される。ヒト可変フレームワーク領域を含むマウスＣＤＲ領域の天然では生じない並置は、天然では生じない立体構造制限を生じることがあり、この制限は所定のアミノ酸残基の置換により修正されない限り、結合親和性の損失をもたらす。
【０１３２】
置換されるアミノ酸残基の選択は、１つには、コンピューターモデリングを用いて決定され得る。免疫グロブリン分子の３次元画像を作成するためのコンピューターハードウェアおよびソフトウェアが、当技術分野で公知である。一般的に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインに関する解明された構造から出発して生成される。モデリングされる鎖は、該鎖のアミノ酸配列の、解明された３次元構造の鎖またはドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖またはドメインが、分子モデル構成の出発点として選択される。少なくとも５０％の配列同一性を共有する鎖またはドメインが、モデリングのために選択され、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％以上の配列を共有するものがモデリングのために選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫グロブリン鎖またはドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との差異を許容するよう修飾される。次いで、修飾構造は、複合体免疫グロブリンに組み立てられる。最終的に、モデルは、エネルギー最小化し、また全ての原子が互いから適切な距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容される限界内にあることを検証することにより精密化される。
【０１３３】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Kabatの、Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 および 1991)により定義される。別の構造的定義が、Chothiaらの、J. Mol. Biol. 196：901 (1987)；Nature 342：878 (1989)；および、J. Mol. Biol. 186：651 (1989)（まとめて、“Chothia”と言う）により提案されている。上記のKabatに定義されるフレームワーク残基が、上記のChothiaに定義される構造的ループ残基を構成するとき、マウス抗体中に存在するアミノ酸は、ヒト化抗体への置換のために選択され得る。“ＣＤＲ領域に隣接する”残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中の１つまたはそれ以上のＣＤＲ、例えば、Kabatにより定義されるＣＤＲ、またはChothiaにより定義されるＣＤＲに直接隣接する位置のアミノ酸残基を含む（例えば、Chothia and Lesk JMB 196：901 (1987)を参照のこと）。これらのアミノ酸は、アクセプターから選択されたとき、特にＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用し、ドナーＣＤＲを変形させ、親和性を低減させる。さらに、隣接アミノ酸は、抗原と直接的に相互作用することができ（Amit et al., Science, 233：747 (1986)）、これらのアミノ酸をドナーから選択することは、元々の抗体に親和性を提供する全ての抗原接点を維持することが望ましいかもしれない。
【０１３４】
本発明は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域およびヒト化重鎖フレームワーク領域を含む単離された抗体を提供し、ここで、単離された抗体は、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する。ある場合において、軽鎖領域および重鎖領域は、別個のポリペプチド中に存在する。他の場合において、軽鎖領域および重鎖領域は、単一のポリペプチド中に存在する。単離された抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域を含む重鎖を含む。他の場合において、抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。抗体は、共有結合した非ペプチド合成ポリマーを含んでいてよく、例えば、合成ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）ポリマーである。ある場合において、単離された抗体は、血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質に直接またはリンカーを介して結合されている。ある場合において、単離された抗体により結合されるエピトープは、Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内である。単離された抗体のヒト化軽鎖フレームワーク領域は、表３に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含み得る。単離された抗体のヒト化重鎖フレームワーク領域は、表２に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸置換を含む。
【０１３５】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖領域を含み、ここで、該ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。
【０１３６】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。これらの態様のいくつかにおいて、抗Ｔａｕ抗体は、ヒト化ＶＨおよび／またはＶＬ フレームワーク領域を含む。
【０１３７】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００１抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Chothiaに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196：901−917 (1987)を参照のこと）。
【０１３８】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに定義の通りである（例えば、上記の表１、および Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。
【０１３９】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＬ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）ＩＰＮ００２抗体の１、２または３個のＶＨ ＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに定義の通りである（例えば、上記の表１、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196：901−917 (1987)を参照のこと）。
【０１４０】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）配列番号１、配列番号２、および配列番号３から選択される１、２または３個のＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）配列番号４、配列番号５、および配列番号６から選択される１、２または３個のＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含む。
【０１４１】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ−末端（Ｎ末端）部分内の直鎖状エピトープ、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、Ｔａｕのアミノ酸９〜１８内（Ｔａｕのアミノ酸１−１８は、ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号５３である）、Ｔａｕのアミノ酸１５−４４内、Ｔａｕのアミノ酸１３−２４内、またはＴａｕのアミノ酸１５−２４内（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４は、ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号５１）である）に特異的に結合する本発明の抗体）は、ａ）ｉ）配列番号７、配列番号８、および配列番号９から選択される１、２または３個のＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）ｉ）配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から選択される１、２または３個のＣＤＲ、およびｉｉ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域を含む。
【０１４２】
ある例において、抗体は、ａ）ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３、および（ｉｖ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、およびｉｖ）ヒト化重鎖フレームワーク領域、を含む重鎖領域、を含む。
【０１４３】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、配列番号４、５および６の１つまたはそれ以上から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１、２または３個、ならびにヒト化されている１、２、３または４個のＦＲ領域（フレームワーク領域）を含む重鎖可変領域を含む。例えば、ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に：ヒト化重鎖ＦＲ１；配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ヒト化重鎖ＦＲ２；配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ヒト化重鎖ＦＲ３；配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、ヒト化重鎖ＦＲ４を含む、重鎖可変領域を含む。
【０１４４】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、配列番号１、２および３の１つまたはそれ以上から選択されるポリペプチド配列を有する１、２または３個の軽鎖ＣＤＲ、およびヒト化されている１、２、３または４個のＦＲ領域、を含む軽鎖可変領域を含む。例えば、ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に：ヒト化軽鎖ＦＲ１；配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ヒト化軽鎖ＦＲ２；配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ヒト化軽鎖ＦＲ３；配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびにヒト化軽鎖ＦＲ４、を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４５】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、配列番号１０、１１および１２の１つまたはそれ以上から選択されるアミノ酸配列を有する１、２または３個の重鎖ＣＤＲ、ならびに１、２、３または４個のヒト化されているＦＲ領域を含む重鎖可変領域を含む。例えば、ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、ヒト化重鎖ＦＲ１；配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ヒト化重鎖ＦＲ２；配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ヒト化重鎖ＦＲ３；配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；ならびに、ヒト化重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４６】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、配列番号７、８および９の１つまたはそれ以上から選択されるポリペプチド配列を有する１、２または３個の軽鎖ＣＤＲ；ならびに、１、２、３または４個のヒト化されているＦＲ領域を含む軽鎖可変領域を含む。例えば、ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、ヒト化軽鎖ＦＲ１；配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ヒト化軽鎖ＦＲ２；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ヒト化軽鎖ＦＲ３；配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；ならびに、ヒト化軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４７】
ＩＰＮ００１のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、図１Ａおよび１Ｂに記載される。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される）は、太字および下線で示される。ＩＰＮ００２のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は、図２Ａおよび２Ｂに示される。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される）は、太字および下線で示される。
【０１４８】
配列番号１−１２は、下記の通りである。
ＲＳＳＱＴＩＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ  （配列番号１）；
ＫＶＳＫＲＦＳ  （配列番号２）；
ＦＱＧＳＬＶＰＷＡ  （配列番号３）；
ＳＹＧＭＳ  （配列番号４）；
ＴＩＳＳＳＧＳＲＴＹＦＰＤＳＶＫＧ  （配列番号５）；
ＴＷＤＧＡＭＤＹ  （配列番号６）；
ＫＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ  （配列番号７）；
ＫＶＳＮＲＦＳ  （配列番号８）；
ＦＱＧＳＬＶＰＷＡ  （配列番号９）；
ＫＹＧＭＳ  （配列番号１０）；
ＴＩＳＳＳＧＳＲＴＹＹＰＤＳＶＫＧ  （配列番号１１）；
ＳＷＤＧＡＭＤＹ  （配列番号１２）。
【０１４９】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１Ｂに記載の配列および配列番号１３と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５０】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１Ａに記載の配列および配列番号１４と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５１】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図２Ｂに記載の配列および配列番号１５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５２】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図２Ａに記載の配列および配列番号１６と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５３】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図９に記載の配列（ＶＨ変異体１）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５４】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１０に記載の配列（ＶＨ変異体２）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５５】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１１に記載の配列（ＶＨ変異体３）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５６】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１２に記載の配列（ＶＨ変異体４）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５７】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１３に記載の配列（Ｖｋ変異体１）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５８】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１４に記載の配列（Ｖｋ変異体２）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５９】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１５に記載の配列（Ｖｋ変異体３）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１６０】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、図１６に記載の配列（Ｖｋ変異体４）と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１６１】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、表２に示すＩＰＮ００２親抗体ＦＲアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のフレームワーク（ＦＲ）アミノ酸置換を含む重鎖可変領域を含み得る。
【表２】
0006446443.tif 000003
【０１６２】
例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＨ  ＦＲ１中のアミノ酸位置３におけるＨ→Ｑ置換および／またはＶＨ  ＦＲ１中のアミノ酸位置１９におけるＫ→Ｒ置換を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１６３】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＨ  ＦＲ２中のアミノ酸位置４０におけるＴ→Ａ置換および／またはＶＨ  ＦＲ２中のアミノ酸位置４２におけるＤ→Ｇ置換および／またはＶＨ  ＦＲ２中のアミノ酸位置４４におけるＲ→Ｇ置換を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１６４】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＨ  ＦＲ３中のアミノ酸位置６６におけるＱ→Ｒ置換および／またはＶＨ  ＦＲ３中のアミノ酸位置８３におけるＳ→Ｎ置換および／またはＶＨ  ＦＲ３中のアミノ酸位置８５におけるＬ→Ｓ置換および／またはＦＲ３中のアミノ酸位置８６におけるＫ→Ｒ置換および／またはＶＨ  ＦＲ３中のアミノ酸位置８７におけるＳ→Ａ置換および／またはＶＨ  ＦＲ３中のアミノ酸位置９３におけるＳ→Ａ置換を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１６５】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＨ  ＦＲ４中のアミノ酸位置１０８におけるＳ→Ｔ置換を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１６６】
ある場合において、目的の単離された抗Ｔａｕ抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、ＥＶＸ１ＬＶＥＳＧＧＡＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳ（配列番号８３）；図２Ａに示すＶＨ  ＣＤＲ１；ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号８４）；図２Ａに示すＶＨ  ＣＤＲ２；ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＸ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５ＥＤＴＡＭＹＹＣＸ６Ｉ（配列番号８５）；図２Ａに示すＶＨ  ＣＤＲ３；ＷＧＱＧＴＸ７ＶＴＶＳＳ（配列番号８６）（式中、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＳまたはＮであり、Ｘ３はＳまたはＬであり、Ｘ４は、ＫまたはＲであり、Ｘ５は、ＳまたはＡであり、Ｘ６はＳまたはＡであり、Ｘ７はＳまたはＴである）を含むＶＨ領域を含み得る。
【０１６７】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、表３に示す、ＩＰＮ００２親抗体ＦＲアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のフレームワーク（ＦＲ）アミノ酸置換を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【表３】
0006446443.tif 000004
【０１６８】
例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＬ  ＦＲ１中のアミノ酸位置３におけるＬ→Ｖ置換および／またはＶＬ  ＦＲ１中のアミノ酸位置７におけるＴ→Ｓ置換および／またはＶＬ  ＦＲ１中のアミノ酸位置１４におけるＳ→Ｔ置換および／またはＶＬ  ＦＲ１中のアミノ酸位置１７におけるＤ→Ｑ置換および／またはＶＬ  ＦＲ１中のアミノ酸位置１８におけるＱ→Ｐ置換を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１６９】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＬ  ＦＲ２中のアミノ酸位置４５におけるＫ→Ｑ置換および／またはＶＬ  ＦＲ２中のアミノ酸位置４８におけるＶ→Ｉ置換を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１７０】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＬ  ＦＲ３のアミノ酸位置８３におけるＬ→Ｖ置換および／またはＶＬ  ＦＲ３中のアミノ酸位置８５におけるＴ→Ｖ置換を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１７１】
別の例としては、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＶＬ  ＦＲ４中のアミノ酸位置１０４におけるＬ→Ｖ置換を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１７２】
ある場合において、目的の単離された抗Ｔａｕ抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで順に、ＤＶＸ１ＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣ（配列番号５４）；図２Ｂに示すＶＬ  ＣＤＲ１；ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＸ２Ｙ（配列番号５５）；図２Ｂに示すＶＬ  ＣＤＲ２；ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＸ３ＹＹＣ（配列番号５６）；図２Ｂに示すＶＬ  ＣＤＲ３；ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）（式中、Ｘ１はＬまたはＶであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３はＴまたはＶである）を含むＶＬ領域を含み得る。
【０１７３】
ある場合において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、
ａ）図９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体１、および図１３に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体１；
ｂ）図９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体１、および図１４に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体２；
ｃ）図９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体１、および図１５に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体３；
ｄ）図９に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体１、および図１６に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体４；
ｅ）図１０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体２、および図１３に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体１；
ｆ）図１０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体２、および図１４に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体２；
ｇ）図１０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体２、および図１５に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体３；
ｈ）図１０に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体２、および図１６に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体４；
ｉ）図１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体３、および図１３に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体１；
ｊ）図１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体３、および図１４に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体２；
ｋ）図１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体３、および図１５に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体３；
ｌ）図１１に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体３、および図１６に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体４；
ｍ）図１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体４、および図１３に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体１；
ｎ）図１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体４、および図１４に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体２；
ｏ）図１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体４、および図１５に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体３；または
ｐ）図１２に示すアミノ酸配列を含むＶＨ変異体４、および図１６に示すアミノ酸配列を含むＶｋ変異体４
を含む。
【０１７４】
ある態様において、本発明の抗体は、抗Ｔａｕ重鎖ＣＤＲおよび抗Ｔａｕ軽鎖ＣＤＲの一本鎖ポリペプチドを含み、例えば、ある態様において、本発明の抗体はｓｃＦｖである。ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第一のアミノ酸配列；配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第二のアミノ酸配列；配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第三のアミノ酸配列；配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第四のアミノ酸配列；配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第五のアミノ酸配列；配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第六のアミノ酸配列；配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、約５アミノ酸から約２５アミノ酸長の第七のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、軽鎖ＦＲ１領域；配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；軽鎖ＦＲ２領域；配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；軽鎖ＦＲ３領域；配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；所望により、軽鎖ＦＲ４領域；リンカー領域；所望により、重鎖ＦＲ１領域；配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；重鎖ＦＲ２領域；配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；重鎖ＦＲ３領域；配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、重鎖ＦＲ４領域を含む。これらの態様のいくつかは、１つまたはそれ以上のＦＲ領域がヒト化ＦＲ領域である。これらの態様のいくつかが、各ＦＲ領域がヒト化ＦＲ領域である。リンカー領域は、約５アミノ酸から約５０アミノ酸長、例えば、約５ａａから約１０ａａ長、約１０ａａから約１５ａａ長、約１５ａａから約２０ａａ長、約２０ａａから約２５ａａ長、約２５ａａから約３０ａａ長、約３０ａａから約３５ａａ長、約３５ａａから約４０ａａ長、約４０ａａから約４５ａａ長、または約４５ａａから約５０ａａ長であり得る。
【０１７６】
ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、重鎖ＦＲ１領域；配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；重鎖ＦＲ２領域；配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；重鎖ＦＲ３領域；配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；所望により、重鎖ＦＲ４領域；リンカー；所望により、軽鎖ＦＲ１領域；配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；軽鎖ＦＲ２領域；配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；軽鎖ＦＲ３領域；配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、軽鎖ＦＲ４領域、を含む。これらの態様のいくつかにおいて、ＦＲ領域の１つまたはそれ以上は、ヒト化ＦＲ領域である。これらの態様のいくつかにおいて、各ＦＲ領域はヒト化ＦＲ領域である。リンカー領域は、約５アミノ酸から約５０アミノ酸長、例えば、約５ａａから約１０ａａ長、約１０ａａから約１５ａａ長、約１５ａａから約２０ａａ長、約２０ａａから約２５ａａ長、約２５ａａから約３０ａａ長、約３０ａａから約３５ａａ長、約３５ａａから約４０ａａ長、約４０ａａから約４５ａａ長、または約４５ａａから約５０ａａ長であり得る。
【０１７７】
ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、軽鎖ＦＲ１領域；配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；軽鎖ＦＲ２領域；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；軽鎖ＦＲ３領域；配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；所望により、軽鎖ＦＲ４領域；リンカー領域；所望により、重鎖ＦＲ１領域；配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；重鎖ＦＲ２領域；配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；重鎖ＦＲ３領域；配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、重鎖ＦＲ４領域を含む。これらの態様のいくつかにおいて、ＦＲ領域の１つまたはそれ以上は、ヒト化ＦＲ領域である。これらの態様のいくつかにおいて、各ＦＲ領域はヒト化ＦＲ領域である。リンカー領域は、約５アミノ酸から約５０アミノ酸長、例えば、約５ａａから約１０ａａ長、約１０ａａから約１５ａａ長、約１５ａａから約２０ａａ長、約２０ａａから約２５ａａ長、約２５ａａから約３０ａａ長、約３０ａａから約３５ａａ長、約３５ａａから約４０ａａ長、約４０ａａから約４５ａａ長、または約４５ａａから約５０ａａ長であり得る。
【０１７８】
ある態様において、本発明の抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、重鎖ＦＲ１領域；配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；重鎖ＦＲ２領域；配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；重鎖ＦＲ３領域；配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；所望により、重鎖ＦＲ４領域；リンカー；所望により、軽鎖ＦＲ１領域；配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；軽鎖ＦＲ２領域；配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；軽鎖ＦＲ３領域；配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；および、軽鎖ＦＲ４領域を含む。これらの態様のいくつかにおいて、ＦＲ領域の１つまたはそれ以上は、ヒト化ＦＲ領域である。これらの態様のいくつかにおいて、各ＦＲ領域はヒト化ＦＲ領域である。リンカー領域は、約５アミノ酸から約５０アミノ酸長、例えば、約５ａａから約１０ａａ長、約１０ａａから約１５ａａ長、約１５ａａから約２０ａａ長、約２０ａａから約２５ａａ長、約２５ａａから約３０ａａ長、約３０ａａから約３５ａａ長、約３５ａａから約４０ａａ長、約４０ａａから約４５ａａ長、または約４５ａａから約５０ａａ長であり得る。
【０１７９】
本発明の抗体への使用に好適なリンカーは、“可動性リンカー”を含む。リンカー分子は、それが存在するとき、一般的に、結合された領域間の柔軟な動きを可能にするのに充分な長さである。リンカー分子は一般的に、約６〜５０個の原子の長さである。これらのリンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることもできる。ポリペプチドに結合し得る他のリンカー分子は、本明細書に記載の長さで使用することができる。
【０１８０】
好適なリンカーは、容易に選択することができ、かつ１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸長、２アミノ酸から１５アミノ酸長、３アミノ酸から１２アミノ酸長、４アミノ酸から１０アミノ酸長、５アミノ酸から９アミノ酸長、６アミノ酸から８アミノ酸長、または７アミノ酸から８アミノ酸長のようないずれかの好適な異なる長さであってよく、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸長であり得る。
【０１８１】
可動性リンカーの例には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号５８）およびＧＧＧＳｎ（配列番号５９）、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で公知の他の可動性リンカーが含まれる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、それらが両方とも比較的構造化されておらず(unstructured)、そのため成分間のニュートラルなテザーとして機能することができるため興味深い。グリシンポリマーは、グリシンが、アラニンよりも有意にｐｈｉ−ｐｓｉ空間に到達し、より長い側鎖を有する残基よりも制限されないため、特に興味深い（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173−142 (1992)を参照のこと）。可動性リンカーの例には、ＧＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６１）、ＧＳＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＳＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６４）、ＧＳＳＳＧ（配列番号６５）などが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、上記の何れかの成分に結合するペプチドの設計が、全体または部分的に可動性のリンカーを含み得ることを認識し得る。例えば、該リンカーは、可動性リンカー、ならびにより柔軟性に劣る構造を与える１またはそれ以上の部分を含み得る。
【０１８２】
ある場合において、目的の単離された抗体は抗体フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。故に、本発明は、単離された抗体であって、該抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’であり、該抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する、抗体を提供する。これらの態様のいくつかにおいて、単離された抗体は、上記の通り、１、２、３または４個のヒト化ＶＬフレームワーク領域を含む。これらの態様のいくつかにおいて、単離された抗体は、上記の通り、１、２、３または４個のヒト化ＶＨフレームワーク領域を含む。
【０１８３】
ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ｓｃＦｖ抗体である。ある態様において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ｓｃＦｖ多量体を含む。例えば、ある態様において、本発明の抗体は、ｓｃＦｖ二量体（例えば、２つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ２）を含む）、ｓｃＦｖ三量体（例えば、３つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３）を含む）、ｓｃＦｖテトラマー（例えば、４つのタンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ４）を含む）であり、または５つ以上のｓｃＦｖの多量体（例えば、タンデムで）である。ｓｃＦｖ単量体は、約２アミノ酸から約１０アミノ酸（ａａ）長、例えば、２ａａ、３ａａ、４ａａ、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、または１０ａａ長のリンカーを介してタンデムに結合されていてよい。好適なリンカーには、例えば、（Ｇｌｙ）ｘ（式中、ｘは、２から１０の整数である）が含まれる。他の好適なリンカーは、上記のものである。ある態様において、目的のｓｃＦＶ多量体における各ｓｃＦｖ単量体は、上記の通り、ヒト化されている。
【０１８４】
ある場合において、本発明の抗体は、免疫グロブリンの定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含む。Ｆｃ領域は、存在するとき、ヒトＦｃ領域であり得る。定常領域が存在するとき、抗体は、軽鎖および重鎖定常領域の両方を含み得る。好適な重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含む。本明細書に記載の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを含む全タイプの定常領域を有する抗体を含む。好適な重鎖Ｆｃ領域の例は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１ Ｆｃである。ある場合において、該重鎖領域は、アイソタイプＩｇＧ４のものである。これらの態様のいくつかにおいて、ヒンジ領域はＳ２４１Ｐ置換を含む。例えば、Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30：105を参照のこと。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。本発明の抗体（例えば、目的のヒト化抗体）は、２以上のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を、個別の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして含むテトラマーとして発現され得るか、または重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して結合されている一本鎖抗体として発現され得る。
【０１８５】
ある態様において、本発明は、単離された抗体であって、該単離された抗体がヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域を含み、該単離された抗体が、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープへの結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する、抗体を提供する。これらの態様のいくつかにおいて、単離された抗体は、上記の通り、１、２、３または４個のヒト化ＶＬフレームワーク領域を含む。これらの態様のいくつかにおいて、単離された抗体は、上記の通り、１、２、３または４個のヒト化ＶＨフレームワーク領域を含む。
【０１８６】
本発明の抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール（−ＳＨ）基を含んでいてよく、ここで、該遊離チオール基は、第二のポリペプチド（例えば、本発明の抗体を含む別の抗体）、主鎖、担体などに該抗体を結合させるために用いることができる。
【０１８７】
ある態様において、本発明の抗体は、１つまたはそれ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。ある態様において、天然にコード化されないアミノ酸には、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキレン基が含まれる。好適な天然に存在しないアミノ酸に関して、例えば、米国特許番号第７，６３２，９２４号を参照のこと。天然に存在しないアミノ酸を含むと、ポリマー、第二のポリペプチド、主鎖などへの結合が可能となる。例えば、水溶性ポリマーに結合した本発明の抗体は、カルボニル基を含む水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を抗体に反応させることにより作製可能であって、ここで、該抗体は、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド基を含む天然にコード化されないアミノ酸を含む。別の例としては、水溶性ポリマーに結合した本発明の抗体は、アルキレン含有アミノ酸を含む本発明の抗体を、アジド基を含む水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と反応させて製造することができる。ある態様において、該アジドまたはアルキレン基は、アミド結合を介してＰＥＧ分子に結合している。“天然にコード化されないアミノ酸”は、２０種の必須アミノ酸うちの１つまたはパイロリジン（pyrrolysine）またはセレノシステインでないアミノ酸を意味する。用語“天然にコード化されないアミノ酸”と同義に用いられ得る他の用語は、“天然ではないアミノ酸”、“非天然アミノ酸”、“天然に存在しないアミノ酸”ならびにそのハイフンでつないだ変形およびハイフンでつながない変形を含む。用語“天然にコード化されないアミノ酸”はまた、翻訳複合体によりポリペプチド鎖の伸張時に天然に挿入されないが、天然にコード化されるアミノ酸（２０個の共通アミノ酸またはパイロリジン（pyrrolysine）およびセレノシステイン）の修飾（例えば、翻訳後修飾）により生じるアミノ酸を含むが、これらに限定されない。かかる天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８８】
ある態様において、本発明の抗体は、ポリマー（例えば、ポリペプチド以外のポリマー）に結合（例えば、共有結合）している。好適なポリマーには、例えば、生体適合性ポリマー、および水溶性の生体適合性ポリマーが含まれる。好適なポリマーには、合成ポリマーおよび天然に存在するポリマーが含まれる。好適なポリマーには、例えば、置換または非置換の直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー類または分枝状もしくは非分枝状ポリサッカライド類、例えばホモ−またはヘテロ−ポリサッカライドが含まれる。好適なポリマーには、例えば、エチレンビニルアルコールコポリマー（一般名ＥＶＯＨまたは商品名ＥＶＡＬとして知られる）；ポリブチルメタクリレート；ポリ（ヒドロキシバレレート）；ポリ（Ｌ−乳酸）；ポリカプロラクトン；ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート−コ−バレレート）；ポリジオキサノン；ポリオルトエステル；ポリ酸無水物；ポリ（グリコール酸）；ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）；ポリ（グリコール酸−コ−トリメチレンカーボネート）；ポリリン酸エステル；ポリリン酸エステルウレタン；ポリ（アミノ酸）；シアノアクリレート；ポリ（トリメチレンカーボネート）；ポリ（イミノカーボネート）；コポリ（エーテル−エステル）（例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ＰＥＯ／ＰＬＡ）のコポリマー）；ポリアルキレンオキサレート；ポリホスファゼン；フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲンおよびヒアルロン酸などの生体分子；ポリウレタン；シリコン；ポリエステル；ポリオレフィン；ポリイソブチレンおよびエチレン−αオレフィンコポリマー；アクリルポリマーおよびアクリルコポリマー；ポリ塩化ビニルなどのハロゲン化ビニルポリマーおよびハロゲン化ビニルコポリマー；ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテル類；ポリフッ化ビニリデンおよびポリ塩化ビニリデンなどのポリビニリデンハライド；ポリアクリロニトリル；ポリビニルケトン；ポリスチレンなどのポリビニル芳香族化合物；ポリビニルアセテートなどのポリビニルエステル類；エチレン−メチルメタクリレートコポリマー、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、およびエチレン−ビニルアセテートコポリマーなどの互いを有するビニルモノマーとオレフィンのコポリマー；ナイロン６６およびポリカプロラクタムなどのポリアミド;アルキド樹脂類；ポリカーボネート；ポリオキシメチレン；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂類；ポリウレタン；レーヨン；レーヨン−トリアセテート；セルロース；セルロースアセテート；セルロースブチレート；セルロースアセテートブチレート;セロファン；セルロースニトレート；セルロースプロピオネート；セルロースエーテル；アモルファステフロン；ポリ（エチレングリコール）；ならびに、カルボキシメチルセルロースが含まれる。
【０１８９】
好適な合成ポリマーには、非置換および置換の、直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、およびそれらの誘導体、例えば、置換ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）、およびその誘導体が含まれる。好適な天然に存在するポリマーには、例えば、アルブミン、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０１９０】
好適なポリマーは、５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば、５０００Ｄａから４００００Ｄａ、または２５０００から４００００Ｄａの範囲の平均分子量を有し得る。例えば、ある態様において、本発明の抗体が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを含むとき、ＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーは、約０．５キロダルトン（ｋＤａ）から１ｋＤａ、約１ｋＤａから５ｋＤａ、５ｋＤａから１０ｋＤａ、１０ｋＤａから２５ｋＤａ、２５ｋＤａから４０ｋＤａ、または４０ｋＤａから６０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。
【０１９１】
上記の通り、ある態様において、本発明の抗体は、ＰＥＧポリマーに共有結合している。ある態様において、目的のｓｃＦｖ多量体は、ＰＥＧポリマーに共有結合している。例えば、Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Methods 310：100を参照のこと。タンパク質のＰＥＧ化に好適な方法および反応材は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許番号第５，８４９，８６０号に見出され得る。タンパク質との結合に好適なＰＥＧは、一般に、室温で水に可溶であり、一般式  Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（式中、Ｒは水素またはアルキルもしくはアルカノール基のような保護基であり、ｎは１から１０００までの整数である）を有する。式中、Ｒが保護基であるとき、それは一般的に、１から８個の炭素を有する。
【０１９２】
ＰＥＧと複合体形成した本発明の抗体は直鎖状であってよい。ＰＥＧと複合体形成した目的のタンパク質はまた、分枝状であってもよい。米国特許番号第５，６４３，５７５号に記載のような“ｓｔａｒ−ＰＥＧ”、およびShearwater Polymers, Inc. catalog “Polyethylene Glycol Derivatives 1997−1998.”に記載のような多分枝ＰＥＧなどの分枝状ＰＥＧ誘導体が存在し、スターＰＥＧは、例えば、米国特許番号第６，０４６，３０５号を含む、当技術分野の文献に記載されている。
【０１９３】
本発明の抗体は、グリコシル化されていてよく、例えば、本発明の抗体は、共有結合した糖または多糖部分を含み得る。抗体のグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖部分の結合を意味する。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が存在することになる。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つが結合することを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが用いられることもある。
【０１９４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、上記のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位の場合）の１つまたはそれ以上が含まれるように変化させることによって都合よく達成することができる。この変化は、基となる抗体の配列への１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によってもなされる（Ｏ−結合グリコシル化部位の場合）。同様に、グリコシル化部位の除去は、抗体の天然のグリコシル化部位内のアミノ酸を改変することによって達成され得る。
【０１９５】
本発明の抗体は、ある態様において、“放射線不透過性の”標識、例えば、Ｘ線を用いて容易に可視化できる標識を含む。放射線不透過性物質は、当業者に周知である。最も一般的な放射線不透過性物質としては、ヨウ化物、臭化物またはバリウム塩が含まれる。他の放射線不透過性物質もまた公知であり、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許番号第５，９３９，０４５号を参照のこと）、放射線不透過性マルチウレタン（米国特許番号第５，３４６，９８１号を参照のこと）、有機ビスマス複合材料（例えば、米国特許番号第５，２５６，３３４号を参照のこと）、放射線不透過性バリウム多量体（例えば、米国特許番号第４，８６６，１３２号を参照のこと）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本発明の抗体は、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、またはヘテロ二官能性架橋剤を用いて、第２の部分（例えば、脂質、本発明の抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、糖など）と共有結合することができる。グルタルアルデヒドは、それらのアミノ部分を介してポリペプチドと結合する。ホモ二官能性架橋剤（例えば、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、またはホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤）は、２つまたはそれ以上の同一の反応性部分を含み、この架橋剤が、結合するポリペプチドの混合物を含む溶液に添加される一段階反応手順で使用することができる。ホモ二官能性ＮＨＳエステルおよびイミドエステルは、ポリペプチドを含むアミンを結合させる。穏やかなアルカリ性のｐＨでは、イミドエステルは第一級アミンとのみ反応して、イミドアミドを形成し、クロスリンクされたポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）、および１，４−ジ−（３’，２’−ピリジルジチオ）プロピオアミドブタン）（ＤＰＤＰＢ）が含まれる。
【０１９７】
ヘテロ二官能性架橋剤は、２つまたはそれ以上の異なる反応性部分（例えば、アミン反応性部分およびスルフヒドリル反応性部分）を有し、アミン反応性部分またはスルフヒドリル反応性部分を介して、ポリペプチドの１つとクロスリンクされ、次いで、反応していない部分を介して他のポリペプチドと反応する。ピリジルジスルフィド架橋剤のように、複数のヘテロ二官能性ハロアセチル架橋剤が利用できる。カルボジイミドは、アミド結合をもたらす、アミンにカルボキシルをカップリングするためのヘテロ二官能性架橋剤の典型例である。
【０１９８】
本発明の抗体は、固体支持体上に固定化することができる。好適な支持体は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップならびにガラスおよび／またはシリコンの表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、デュラサイト（ｄｕｒａｃｙｔｅ）、反応トレーのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、ならびにプラスチックチューブなどが含まれる。固体支持体は、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱を含む種々の物質のいずれかを含み得る。固体支持体上に本発明の抗体を固定化するための好適な方法は周知であり、イオン性、疎水性、および共有結合性の相互作用などを含むが、これらに限定されない。固体支持体は、例えば、水溶液に可溶性または不溶性であり得る。ある態様において、好適な固体支持体は、一般に、水溶液に不溶性である
【０１９９】
ある態様において、本発明の抗体は検出可能な標識を含む。好適な検出可能な標識には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。好適なものには、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、および黄色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で一般的に用いられる西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、および他の酵素）、ならびにコロイド金もしくは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックスなど）のビーズなどの比色標識が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
ある態様において、本発明の抗体は、造影剤または放射性同位元素を含み、この造影剤または放射性同位元素は、造影、例えば、ヒトで行われる造影法で使用するのに適するものである。標識の非限定的な例としては、１２３１Ｉ（ヨウ素）、１８Ｆ（フッ素）、９９Ｔｃ（テクネチウム）、１１１Ｉｎ（インジウム）、および６７Ｇａ（ガリウム）などの放射性同位元素、ならびにガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム、および鉄などの造影剤が含まれる。放射性Ｇｄアイソトープ（１５３Ｇｄ）も利用可能であり、非ヒト哺乳動物における造影処理に適する。本発明の抗体は、標準的な技術を用いて標識することができる。例えば、本発明の抗体は、クロラミンＴまたは１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコールウリルを用いてヨウ素化することができる。フッ素化では、フッ素は、フッ化物イオンの置換反応によって、合成時に本発明の抗体に添加される。かかる放射性同位元素を用いるタンパク質の合成の概説については、Muller−Gartner, H., TIB Tech., 16：122−130 (1998) and Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2)：209−244 (1999)を参照のこと。本発明の抗体は、標準的な技術を介して造影剤でも標識することができる。例えば、本発明の抗体は、Ｇｄジエチレントリアミン五酢酸（ＧｄＤＴＰＡ）またはＧｄテトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＧｄＤＯＴＡ）などの低分子Ｇｄキレートを該抗体に結合させることによってＧｄで標識することができる。Caravan et al., Chem. Rev. 99：2293−2352 (1999) and Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3：11−16 (1985)を参照のこと。本発明の抗体は、例えば、ポリリジン−Ｇｄキレートを本抗体に結合させることによってＧｄで標識することができる。例えば、Curtet et al., Invest. Radiol., 33(10)：752−761 (1998)を参照のこと。あるいは、本発明の抗体は、アビジンを有するＧｄキレート脂質を含む常磁性の重合リポソームおよびビオチン化抗体をインキュベートすることによってＧｄで標識することができる。例えば、Sipkins et al., Nature Med., 4：623−626 (1998)を参照のこと。
【０２０１】
本発明の抗体に結合することができる好適な蛍光タンパク質には、例えば、米国特許第６，０６６，４７６号、同第６，０２０，１９２号、同第５，９８５，５７７号、同第５，９７６，７９６号、同第５，９６８，７５０号、同第５，９６８，７３８号、同第５，９５８，７１３号、同第５，９１９，４４５号、同第５，８７４，３０４号に記載のオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質またはその変異体もしくは誘導体；例えば、高感度ＧＦＰ、例えば、クロンテック社から市販されている多くのそのようなＧＦＰ；赤色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質；ならびに、例えば、Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17：969−973に記載の、花虫類種由来の種種の蛍光タンパク質および着色タンパク質のいずれかなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
ある態様において、本発明の抗体は、融合パートナー、例えば、リガンド；エピトープタグ；ペプチド；および抗体以外のタンパク質などに結合（例えば、共有結合または非共有結合）させ得る。好適な融合パートナーには、インビボでの安定性の強化（例えば、血清半減期の増加）をもたらすペプチドおよびポリペプチド；精製の容易さをもたらすペプチドおよびポリペプチド、例えば、（Ｈｉｓ）ｎ、例えば、６Ｈｉｓなど；細胞から融合タンパク質を分泌させるペプチドおよびポリペプチド；エピトープタグを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、ＧＳＴ、ヘマグルチニン（ＨＡ；例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７１）、ＦＬＡＧ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６９）、ｃ−ｍｙｃ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号６８）など；検出可能なシグナルを提供するペプチドおよびポリペプチド、例えば、検出可能な産物を生成する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）、またはそれ自体が検出可能であるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など；ならびに、多量体化をもたらすペプチドおよびポリペプチド、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分などの多量体化ドメインが含まれる。
【０２０３】
融合には、例えば、同定または精製に有用な、固体支持体上に固定化されたものなどの結合パートナーと相互作用することができるペプチド配列を含む親和性ドメインも含まれ得る。ヒスチジンなどの連続した単一アミノ酸は、タンパク質と融合させると、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの高親和性結合によって、この融合タンパク質の一段階精製のために用いることができる。親和性ドメインの例としては、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）（配列番号６６）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６８）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６９）、ＳｔｒｅｐＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号７０）、赤血球凝集素、例えば、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号７２）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号７３）、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ末端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号７４）、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン、またはカルシウム結合タンパク質、例えば、カルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ−モジュリン、ビジニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパインの大サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、およびカルレチニン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、ロイシンジッパー配列、およびマルトース結合タンパク質に由来するドメインなどのカルシウム結合ドメインが含まれる。
【０２０４】
ある態様において、本発明の抗体を、内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドに結合させる。内在性ＢＢＢ受容体に結合するポリペプチドに本発明の抗体を結合すると、例えば、本発明の抗体を、それを必要としている個体に投与することを含む本発明の治療法（以下参照）において、ＢＢＢの通過を促進する。内在性ＢＢＢ受容体に結合する好適なポリペプチドには、内在性ＢＢＢ受容体に特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントが含まれる。好適な内在性ＢＢＢ受容体には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様増殖因子受容体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開第２００９／０１５６４９８号を参照のこと。
【０２０５】
一例として、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ（例えば、Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、またはＴａｕのアミノ酸９から１８内の直鎖状エピトープ）に特異的に結合する第一の抗原結合部分、および内在性ＢＢＢ受容体に結合する第二の抗原結合部分を含む、二重特異性抗体であり得る。例えば、ある例において、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、Ｔａｕポリペプチド内のエピトープ（例えば、Ｔａｕのアミノ末端（Ｎ末端）部分内の、例えば、Ｔａｕのアミノ酸１−２５内、Ｔａｕのアミノ酸１−１８内、またはＴａｕのアミノ酸９から１８内の直鎖状エピトープ）に特異的に結合する第一の抗原結合部分、およびトランスフェリン受容体に結合する第二の抗原結合部分を含む、二重特異性抗体である。
【０２０６】
例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体は、ＢＢＢの通過を促進するペプチドに結合されていてよく、該ペプチドは、約１５アミノ酸から約２５アミノ酸長を有し、以下のペプチド：Ａｎｇｉｏｐｅｐ−１（ＴＦＦＹＧＧＣＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ；配列番号７５）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ；配列番号７６）；ｃｙｓ−Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２（ＣＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ；配列番号７７）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２−ｃｙｓ（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹＣ；配列番号７８）；ならびに、アプロチニンフラグメント（ＴＦＶＹＧＧＣＲＡＫＲＮＮＦＫＳ；配列番号７９）のうち１つに少なくとも約８５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、米国特許公開第２０１１／０２８８０１１号および同第２００９／００１６９５９号を参照のこと。ＢＢＢの通過を促進するペプチドは、抗Ｔａｕ軽鎖領域のＮ末端、抗Ｔａｕ軽鎖領域のＣ末端、抗Ｔａｕ重鎖領域のＮ末端、抗Ｔａｕ重鎖領域のＣ末端、目的の抗Ｔａｕ一本鎖抗体のＮ末端、および目的の抗Ｔａｕ一本鎖抗体のＣ末端などに連結されていてよい。
【０２０７】
ある態様において、本発明の抗体は、ポリアミン修飾を含む。本発明の抗体のポリアミン修飾は、修飾された抗体のＢＢＢでの透過性を高める。本発明の抗体は、天然に存在するかまたは合成のいずれかであるポリアミンで修飾することができる。例えば、米国特許第５，６７０，４７７号を参照のこと。有用な天然に存在するポリアミンには、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、１，３−ジアミノプロパン、ノルスペルミジン、合成のホモスペルミジン、テルミン(thermine)、テルモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、およびカナバルミンが含まれる。プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、特に有用である。合成ポリアミンは、実験式ＣＸＨＹＮＺで構成され、さらに、１〜６個のＮＲ部分またはＮ（Ｒ）２部分（式中、Ｒは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルである）を含む、環式もしくは非環式の、分枝状または非分枝状の３〜１２個の炭素原子の炭化水素鎖であり得る。ポリアミンは、任意の標準的なクロスリンク法を用いて抗体に結合させることができる。
【０２０８】
ある態様において、本発明の抗体は、糖部分を含むように改変され、この糖部分は本抗体に共有結合することができる。ある態様において、本発明の抗体は脂質部分を含むように改変され、この脂質部分は本抗体に共有結合することができる。好適な脂質部分には、例えば、Ｎ−ラウロイル、Ｎ−オレオイルなどのＮ−脂肪酸アシル基；ドデシルアミン、オレオイルアミンなどの脂肪族アミン；およびＣ３〜Ｃ１６の長鎖脂肪族脂質などが含まれる。例えば、米国特許第６，６３８，５１３号を参照のこと。ある態様において、本発明の抗体はリポソームに組み込まれている。
【０２０９】
本発明の抗体の製造方法
本発明の抗体は、例えば、常套のタンパク質合成法；組み換えＤＮＡ法などのいずれかの公知の方法により製造できる。
【０２１０】
本発明の抗体が一本鎖ポリペプチドであるとき、それは、標準的化学ペプチド合成法を用いて合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成されるとき、合成は、液相または固相を用いて行われ得る。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、次いで配列中の残りのアミノ酸の連続的付加を行う、固相ポリペプチド合成法（ＳＰＰＳ）は、本発明の抗体の化学合成のための好適な方法の一例である。ＦｍｏｃおよびＢｏｃのようなＳＰＰＳの種々の形態が、本発明の抗体を合成するために利用可能である。固相合成法は、Barany and Merrifield, Solid−Phase Peptide Synthesis；pp. 3−284 in The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85：2149−2156 (1963)；Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)；および、Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6：3−10 および、 Camarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12：723−8に記載される。要約すれば、低分子の不溶性の多孔質ビーズを、ペプチド鎖が構築される機能的単位（functional unit）で処理する。カップリング／脱保護の反復サイクル後、結合した固相の遊離Ｎ末端アミンを、単一のＮ−保護されたアミノ酸単位にカップリングさせる。その後、この単位を脱保護し、さらなるアミノ酸を結合させ得る新しいＮ末端アミンを出現させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、切断前に濾過工程を行う。
【０２１１】
標準的組み換え法を、本発明の抗体の製造に使用できる。例えば、所望により定常領域に結合した軽鎖および重鎖可変領域をコード化する核酸を、発現ベクター中に挿入する。該軽鎖および重鎖を、同じか、または異なる発現ベクター中でクローニングし得る。免疫グロブリン鎖をコード化するＤＮＡ断片を、発現ベクター中の制御配列に操作可能に連結して、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする。発現制御配列には、プロモーター（例えば、天然に結合しているか、または異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御配列は、真核宿主細胞（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクトすることの可能なベクター中の真核プロモーターシステムであり得る。一旦、ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主を、ヌクレオチド配列の高レベルな発現、ならびに抗体の収集および精製に好適な条件下で維持する。
【０２１２】
コードの縮重のため、種々の核酸配列が各々の免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。所望の核酸配列はｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成または所望のポリヌクレオチドの早期に調製された変異体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発によって産生することができる。標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体を調製するためには、オリゴヌクレオチドを仲介する突然変異誘発が好ましい方法の一例である。Adelman et al., DNA 2：183 (1983)を参照のこと。要約すれば、標的ポリペプチドＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡ鋳型に対し所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって、変性される。ハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込む鋳型の第２の相補鎖全体を合成するためにＤＮＡポリメラーゼが使用され、これが標的ポリペプチドＤＮＡ内の選択された変性をコードする。
【０２１３】
好適な発現ベクターは、典型的に、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一部として、宿主生体内で複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含む。
【０２１４】
大腸菌は、本発明の抗体をコード化するポリヌクレオチドをクローニングするのに使用され得る原核細胞宿主の一例である。使用に適したその他の微生物宿主には、バシラス・サチリスのようなかん菌、およびサルモネラ、セラチアなどのその他のエンテロバクター、および種々のシュードモナス種が含まれる。これらの原核生物宿主の中で、宿主細胞と相容性のある発現制御配列（例えば複製起点）を典型的に含むような発現ベクターも作ることができる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベーターラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系のような多数の周知のプロモーターが存在し得る。プロモーターは、典型的に、所望によりオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始し完成させるためリボソーム結合部位配列などを有する。
【０２１５】
酵母のような他の微生物も発現のために有用である。サッカロマイセス属（例えば、出芽酵母）およびピチア属が好ましい酵母宿主細胞の例であり、好適なベクターは、望まれる通りに、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼおよびその他の解糖酵素を含む。酵母の誘導プロモーターは、特に、アルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモーター、イソシトクロムＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素を含む。
【０２１６】
微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、インビトロ細胞培養において増殖される哺乳動物細胞）も、本発明の抗Ｔａｕ抗体（例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するポリヌクレオチド）を発現し産生するのに使用することができる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照のこと。好適な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、骨髄腫細胞株、および形質転換したＢ細胞またはハイブリドーマが含まれる。これらの細胞用の発現ベクターには、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、およびエンハンサー（Queen et al., Immunol. Rev. 89：49 (1986)）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列といった必要なプロセシング情報部位が含まれていてよい。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148：1149 (1992)を参照のこと。
【０２１７】
一旦、合成されると（化学的に、または組み換え的にの何れか）、全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または本発明の抗体の他の形態（例えば、ｓｃＦｖなど）は、硫酸アンモニウム沈降、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野で標準的な方法により精製することができる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer−Verlag, N.Y., (1982)を参照のこと）。本発明の抗体は、実質的に純粋であり得て、例えば、少なくとも約８０％から８５％純粋、少なくとも約８５％から９０％純粋、少なくとも約９０％から９５％純粋、または９８％から９９％、またはそれ以上純粋であり得て、例えば、細胞残屑、本発明の抗体以外の高分子などのような混入物質を含まない。
【０２１８】
組成物
本発明は、本発明の抗体を含む組成物を提供する。本発明の抗体組成物は、本発明の抗体に加えて、下記の１つまたはそれ以上：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などのような非イオン性洗浄剤；プロテアーゼ阻害剤；グリセロールなどを含み得る。
【０２１９】
核酸、発現ベクター、および宿主細胞
本発明は、本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【０２２０】
本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列であって、図１Ｂに示され、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２２１】
本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列は、重鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列であって、図１Ａに示され、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２２２】
本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列であって、図２Ｂに示され、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２２３】
本発明の抗Ｔａｕ抗体をコード化するヌクレオチド配列は、重鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列であって、図２Ａに示され、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２２４】
本発明の抗体をコード化するヌクレオチド配列は、意図する標的細胞（例えば、コードされた抗体を合成するために遺伝指摘に修飾された細胞）中でのヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーのような１つまたはそれ以上の制御エレメントに操作可能に結合されていてよい。
【０２２５】
好適なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、当技術分野で公知である。細菌細胞での発現に関して、好適なプロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ Ｐおよびｔｒｃが含まれるが、これらに限定されない。真核細胞における発現に関して、好適なプロモーターには、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；前記および後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルス由来の長い末端反復に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；および、多様な当技術分野で公知の組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２６】
ある態様において、例えば、酵母細胞における発現に関して、好適なプロモーターは、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーターなどの構成的プロモーター；または、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、およびＡＯＸ１（例えば、Ｐｉｃｈｉａでの使用用）などの調節可能プロモーターである。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０２２７】
原核宿主細胞での使用に好適なプロモーターとしては、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーターなど；ａｒａＢＡＤプロモーター；インビボで調節されたプロモーター、例えば、ｓｓａＧプロモーターまたは関連するプロモーターなど（例えば、米国特許公開第２００４０１３１６３７号を参照のこと）、ｐａｇＣプロモーター（Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol., 1991：173(1)：86−93；Alpuche−Aranda et al., PNAS, 1992；89(21)：10079−83）、ｎｉｒＢプロモーター（Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6：2805−2813）など（例えば、 Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67：5133−5141；McKelvie et al. (2004) Vaccine 22：3243−3255；および、 Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10：888−892を参照のこと）；ｓｉｇｍａ７０ プロモーター、例えば、コンセンサスｓｉｇｍａ７０プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１およびＡＸ７９８１８３を参照のこと）；静止期プロモーター、例えば、ｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーターなど；病原性アイランドＳＰＩ−２由来プロモーター（例えば、ＷＯ９６／１７９５１号を参照のこと）；ａｃｔＡプロモーター（例えば、Shetron−Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70：1087−1096を参照のこと）；ｒｐｓＭプロモーター（例えば、Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22：367を参照のこと）；ｔｅｔプロモーター（例えば、Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein−Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143−162を参照のこと）；ＳＰ６プロモーター（例えば、Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12：7035を参照のこと）などが含まれるが、これらに限定されない。大腸菌などの原核細胞で使用するのに好適な強力なプロモーターとしては、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７およびＰＬａｍｂｄａが含まれるが、これらに限定されない。細菌宿主細胞で使用するためのオペレーターの非限定的な例としては、ラクトースプロモーターオペレーター（ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触すると、立体構造を変化させて、それによりＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレーターと結合するのを防ぐ）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体を形成するとき、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合する立体構造を有する；トリプトファンの非存在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を有する）、およびｔａｃプロモーターオペレーター（例えば、deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：21−25を参照のこと）が含まれる。
【０２２８】
本発明の抗体をコード化するヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクター中に存在することができる。本発明の抗体が２つの別個のポリペプチドを含むとき、該２つのポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、同じか、または別個のベクター中にクローニングされ得る。発現ベクターは、選択可能マーカー、複製起点、およびベクターの複製および／または維持を提供するその他の機能を含み得る。
【０２２９】
多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、多くが目的の組み換え構築体の生成のために市販されている。以下のベクターは、例示として記載される。細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ Ｋｓ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ （Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmacia）。
【０２３０】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコード化する核酸配列の挿入を可能にするようにプロモーター配列の近くに位置した好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作動する選択可能マーカーが存在してもよい。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、種痘ウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543 2549, 1994；Borras et al., Gene Ther 6：515 524, 1999；Li and Davidson, PNAS 92：7700 7704, 1995；Sakamoto et al., H Gene Ther 5：1088 1097, 1999；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al., Hum Gene Ther 9：81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94：6916 6921, 1997；Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863, 1997；Jomary et al., Gene Ther 4：683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10：641 648, 1999；Ali et al., Hum Mol Genet 5：591 594, 1996；Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63：3822 3828；Mendelson et al., Virol. (1988) 166：154 165；および、 Flotte et al., PNAS (1993) 90：10613 10617を参照のこと）、ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al., PNAS 94：10319 23, 1997；Takahashi et al., J Virol 73：7812 7816, 1999を参照のこと）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
上記の通り、目的の核酸は、本発明の抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む。目的の核酸は、ＩＰＮ００１の重鎖および軽鎖ＣＤＲをコード化するヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、目的の核酸は、ＩＰＮ００２の重鎖および軽鎖ＣＤＲをコード化するヌクレオチド配列を含み、ここで、該ＣＤＲをコード化する配列は、ＦＲをコード化するヌクレオチド配列と共に組み込まれている。ある態様において、ＦＲをコード化するヌクレオチド配列は、ヒトのＦＲをコード化するヌクレオチド配列である。
【０２３２】
宿主細胞
本発明は、目的の核酸で遺伝子的に改変されている、分離された遺伝子的に改変された宿主細胞（例えば、インビトロ細胞）を提供する。ある態様において、目的の分離された遺伝子的に改変された宿主細胞は、本発明の抗体を製造し得る。
【０２３３】
好適な宿主細胞には、真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞；および、原核細胞、例えば細菌細胞が含まれる。目的の核酸の宿主細胞への導入は、例えばリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストランが仲介するトランスフェクション、リポソームが仲介するトランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の既知の方法によって実施可能である。
【０２３４】
好適な哺乳動物細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長動物細胞株、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）の細胞株などが含まれる。好適な哺乳動物細胞株には、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ1細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞 （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
好適な酵母細胞としては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシーエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピーチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ポリｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジューランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３６】
好適な原核細胞としては、大腸菌、乳酸菌属、サルモネラ属、赤痢菌属などの任意の多様な実験室株が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148：1176−1181；米国特許番号第6,447,784号；および、Sizemore et al. (1995) Science 270：299−302を参照のこと。典型的に、実験室株は、非病原性の株である。他の好適な細菌の限定されない例としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、宿主細胞は大腸菌である。
【０２３７】
医薬製剤
本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物を含む、組成物を提供する。一般に、製剤は、有効量の本発明の抗体を含む。“有効量”は、望まれる結果、例えば、タウオパチーと関係する有害な症状の軽減、タウオパチーの症状の改善、タウオパチーの進行遅延などを生じるのに充分な投与量を意味する。一般に、所望の結果は、対照と比較して、タウオパチーの症状が少なくとも軽減していることである。本発明の抗体は、以下により詳細に記載するとおり、血液脳関門を避けるような方法で送達され得る。本発明の抗体は、該抗体が血液脳関門を通過し得るように、製剤および／または修飾され得る。
【０２３８】
本発明は、ａ）ＴａｕのＮ末端部分内のエピトープに特異的に結合する抗体（ここで、該抗体は、（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および、（ｖｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む）、ならびにｂ）ヒトへの投与に好適な薬学的に許容される添加剤、を含む医薬製剤(該製剤はエンドトキシンを含まない)を提供する。
【０２３９】
本発明は、ａ）Ｔａｕポリペプチドのアミノ酸１５−２４内のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体、およびｂ）薬学的に許容される添加剤（ある態様において、該薬学的に許容される添加剤は、ヒトへの投与に好適である）を含む医薬製剤を提供する。
【０２４０】
本発明は、Ａ）ヒト化軽鎖フレームワーク領域およびヒト化重鎖フレームワーク領域を含む単離された抗体（ここで、単離された抗体は、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに対する結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域、ならびにｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する）、ならびにＢ）薬学的に許容される添加剤（ある態様において、該薬学的に許容される添加剤は、ヒトへの投与に好適である）を含む医薬製剤を提供する。
【０２４１】
本発明は、Ａ）単離された抗体であって、該抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’であり、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに対する結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域；ならびに、ｂ）（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する抗体；ならびに、Ｂ）薬学的に許容される添加剤（ある態様において、該薬学的に許容される添加剤は、ヒトへの投与に好適である）を含む医薬製剤を提供する。
【０２４２】
本発明は、Ａ）単離された抗体（該単離された抗体は、ヒト軽鎖定常領域およびヒト重鎖定常領域を含み、ＴａｕポリペプチドのＮ末端領域内のエピトープに対する結合を、ａ）（ｉ）配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖領域；ならびに、（ｉ）配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５または配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および、（ｉｉｉ）配列番号６または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖領域、を含む抗体と競合する）；ならびに、Ｂ）薬学的に許容される添加剤（ある態様において、該薬学的に許容される添加剤は、ヒトへの投与に好適である）を含む医薬製剤を提供する。
【０２４３】
製剤
本発明の方法において、本発明の抗体は、所望の治療効果または診断効果をもたらし得るいずれかの便利な手段を用いて宿主に投与され得る。故に、薬物は、治療的投与のために種々の製剤に組み込まれ得る。より具体的には、本発明の抗体は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に剤形されてよく、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐薬、注射、吸入剤およびエアロゾル剤のような固体、半固体、液体またはガス状の製剤に剤形され得る。
【０２４４】
医薬投与量形態において、本発明の抗体は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与され得るか、またはそれらは、単独でもしくは適当に、ならびに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用されてもよい。以下の方法および添加剤は、単に例示として記載され、限定を意図するものではない。
【０２４５】
経口用製剤に関して、本発明の抗体は、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するための適当な添加剤と組み合わせて、例えば、常套の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンデンプンまたはジャガイモデンプンなど；結合剤、例えば結晶質セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンデンプンまたはゼラチンなど；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなど；滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムなど；および、要すれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および着香剤と組み合わせて用いることができる。
【０２４６】
本発明の抗体は、水溶性溶媒または非水溶性溶媒、例えば、野菜もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどに；および、要すれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および防腐剤などの常套の添加剤と共に、それらを溶解、懸濁または乳化することにより、注射用製剤に製剤することができる。
【０２４７】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理的に許容される担体、添加剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することにより製造される。許容される担体、添加剤および／または安定化剤は、用いる投与量および濃度で受容者（レシピエント）に毒性ではなく、リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む、抗酸化剤；防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組合せなど）；アミノ酸、例えば、アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組合せなど；単糖類、二糖類および他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、ゼラチンまたは血清アルブミン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばトレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸など；ならびに／または、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ、プルロニック類、トライトン−Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが含まれる。
【０２４８】
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってよく、ここで、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌溶液で再構成される。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的方法は、（典型的に、凍結乾燥中に除かれる容量と等量の）純水を戻す方法である。しかしながら、抗菌剤を含む溶液は、非経腸投与用医薬組成物の製造に用いられ得る；Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311−54もまた参照のこと。
【０２４９】
目的の医薬組成物における抗体濃度の例は、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍｌまたは約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【０２５０】
抗体の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液として、例えば、約４．０から約７．０、または約５．０から約６．０の範囲のｐＨ、あるいは約５．５のｐＨで製造され得る。この範囲内のｐＨに好適な緩衝液の例には、ホスフェート−、ヒスチジン−、クエン酸−、コハク酸−、酢酸−緩衝液、および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約１００ｍＭ、または約５ｍＭから約５０ｍＭであり得て、例えば、緩衝液および製剤の所望の等張性によって変わる。
【０２５１】
等張化剤は、製剤の等張性を調節するために抗体製剤に包含され得る。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリンおよびアミノ酸群由来のいずれかの成分、糖類ならびにそれらの組合せが含まれる。ある態様において、高張性または低張性溶液が好適であり得るが、水性製剤は等張性である。用語“等張性”は、例えば、生理的な塩溶液または血清と比較される他の溶液と同程度の等張性を有する溶液を示す。等張化剤は、約５ｍＭから約３５０ｍＭの量、例えば、１００ｍＭから３５０ｎＭの量で使用され得る。
【０２５２】
界面活性剤はまた、製剤された抗体の凝集を減らす、および／または製剤中の粒子の形成を最小化する、および／または吸収を減らすために、抗体製剤に追加され得る。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（トライトン−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。好適なポリオキシエチレンそるビタン−脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０、（Ｔｗｅｅｎ  ２０(商標)の商品名で販売）およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０TM(商標)の商標名で販売）である。好適なポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーの例は、商標名プルロニック（登録商標）Ｆ６８またはポロキサマー１８８(商標)で販売されるものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、商標名Ｂｒｉｊ(商標)で市販されるものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％から約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２５３】
凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)はまた、凍結乾燥法の間に不安定化条件から変化しやすい活性成分（例えば、タンパク質）を保護するために添加され得る。例えば、公知の凍結乾燥保護剤としては、糖類（グルコースおよびスクロースを含む）；ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）；および、アミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が含まれる。凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭから５００ｎＭの量で含まれ得る。
【０２５４】
ある態様において、本発明の製剤は、本発明の抗体、および１つまたはそれ以上の上記の薬物（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤）を含み、１種またはそれ以上の防腐剤、例えばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組合せを基本的に含まない。他の態様において、防腐剤は、製剤、例えば、約０．００１から約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で、製剤中に含まれる。
【０２５５】
例えば、本発明の製剤は、非経腸投与に好適な液体または凍結乾燥製剤であってよく、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；約０．００１％から約１％の少なくとも１種の界面活性剤；約１ｍＭから約１００ｍＭの緩衝剤；任意に、約１０ｍＭから約５００ｍＭの安定化剤；および、約５ｍＭから約３０５ｍＭの等張化剤を含んでいてよく、約４．０から約７．０のｐＨを有する。
【０２５６】
別の例として、本発明の非経腸製剤は、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０４％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である、液体または凍結乾燥製剤である。
【０２５７】
別の例として、本発明の非経腸製剤は、１）１５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０４％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である凍結乾燥製剤、または２）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０４％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である凍結乾燥製剤、または３）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である凍結乾燥製剤、または４）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０４％Ｔｗｅｅｎ  ２０ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  トレハロースを含み、ｐＨ５．５である凍結乾燥製剤、または６）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭトレハロースを含み、ｐＨ５．５である凍結乾燥製剤、を含む。
【０２５８】
別の例として、本発明の非経腸製剤は、１）７．５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；１２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０  １２５ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または２）３７．５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、１２５ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または３）３７．５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、１２５ｍＭ  スクロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または４）３７．５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；１２５ｍＭ  トレハロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または５）３７．５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、１２５ｍＭ  トレハロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または６）５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  トレハロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または７）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  マンニトールを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または８）７５ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、１４０ｍＭ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または９）１５０ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  トレハロースを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または１０）１５０ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、２５０ｍＭ  マンニトールを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または１１）１５０ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、１４０ｍＭ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨ５．５である液体製剤、または１２）１０ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｗ／ｖ；２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；および、４０ｍＭ  塩化ナトリウムを含み、ｐＨ５．５である液体製剤である。
【０２５９】
本発明の抗体は、吸入により投与されるエアロゾル製剤に利用され得る。本発明の抗体は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された許容される噴射剤に製剤され得る。
【０２６０】
さらに、本発明の抗体は、乳化基剤または水溶性基剤のような種々の基剤と混合されて坐薬に製剤され得る。本発明の抗体は、坐薬の形で直腸から投与され得る。坐薬は、カカオバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビークルであって、体温で融解するが、室温では固化するビークルを含み得る。
【０２６１】
シロップ剤、エリクシル剤、および懸濁液のような経口または直腸投与用単位投与量形態は、各投与量単位、例えば、小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤または坐薬が、所定の量の、１つまたはそれ以上の阻害剤を含む組成物を含むように提供され得る。同様に、注射または静脈内投与用の単位投与量形態は、滅菌水、通常の生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中に本発明の抗体を含み得る。
【０２６２】
本明細書で用いる用語“単位投与量形態”は、ヒトおよび動物対象の単位投与量として適する、物理的に分離された単位を意味し、それぞれの単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビークルと共に、所望の効果を生じるために十分な量で計算された、事前に決定された量の抗Ｔａｕ抗体を含む。本発明の抗体の仕様は、用いる特定の抗体および達成する効果、ならびに宿主におけるそれぞれの抗体に関連する薬理学に左右され得る。
【０２６３】
他の投与方法はまた、本明細書に記載の方法との使用が見出され得る。例えば、本発明の抗体は、坐薬に製剤され得て、いくつかの場合に、エアロゾルおよび点鼻組成物に製剤され得る。坐薬について、ビークル組成物は、従来の結合剤および例えばポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドのような担体を含み得る。そのような坐薬は、約０．５％から約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％から約２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。
【０２６４】
点鼻製剤は、通常、鼻粘膜に炎症を起こさせず、繊毛機能を顕著に低下させない、ビークルを含み得る。水、生理食塩水または他の公知の物質のような希釈剤が用いられ得る。鼻用製剤はまた、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムのような防腐剤を含み得るが、これらに限定されない。界面活性剤は、鼻粘膜による本発明の抗体の吸収を増強するために存在し得る。
【０２６５】
本発明の抗体は、注射可能製剤として投与され得る。典型的に、注射可能組成物は、液体溶液または懸濁液として製造され、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態としても製造することができる。該製剤を乳化すること、または該抗体をリポソームビークル中に封入されてもよい。
【０２６６】
好適な添加剤ビークルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、要すれば、該ビークルは、少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などを含み得る。そのような投与量形態を製造する実際の方法は公知であり、または当業者には明らかであり得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985を参照のこと。いずれにしても、投与される組成物または製剤は、処置されるべき対象を所望の状態にするのに充分な量の本発明の抗体を含み得る。
【０２６７】
薬学的に許容される添加剤、例えばビークル、アジュバント、担体または希釈剤は、容易に入手可能である。さらに、薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調節剤、安定化剤、および湿潤剤などは、容易に入手可能である。
【０２６８】
ある態様において、本発明の抗体を、制御放出製剤に製剤化する。持続放出製剤は、当技術分野で公知の方法を用いて製造され得る。持続放出製剤の好適な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは、成形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。持続放出製剤中に含まれる抗体の生物活性を消失させ、免疫原性を変化させる可能性は、適当な補助物質を用いること、水分含量を調節すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、妨げられ得る。
【０２６９】
本発明の範囲内の制御放出は、多くの持続放出投与量形態のいずれか１つを意味すると解釈することができる。以下の用語は、本発明の目的のために、制御放出と実質的に同等とみなすことができる：連続的放出、制御放出、遅延放出（delayed release）、デポー、徐放、長期放出、プログラム放出、持続放出、比例放出、遅延放出（protracted release）、持続性の、遅らせた、遅い放出、間隔をあけた放出、持続放出（sustained release）、タイムコート、持続放出（timed release）、遅延作用、延長された作用、レイヤードタイム作用、長時間作用型、持続性作用、反復作用、遅行性、持続作用（sustained action）、持続作用薬、および持続放出（extended release）。これらの用語のさらなる詳解は、Lesczek Krowczynski, Extended−Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.)に見出され得る。
【０２７０】
種々の制御放出技術は、非常に広い範囲の薬物投与量形態を包含する。制御放出技術には、物理システムおよび化学システムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
物理システムには、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、および膜システムなどの速度制御膜を含む貯蔵システム；中空繊維、超微小孔性セルローストリアセテート、および多孔質ポリマー基質および発泡体などの速度制御膜を含まない貯蔵システム；非多孔性のポリマーマトリクスまたはエラストマーマトリクス（例えば、浸食されない環境の、浸食され得る環境の、薬剤移入、および分解）に物理的に溶解されるそれらのシステム、および非多孔性のポリマーマトリクスまたはエラストマーマトリクス（例えば、浸食されない環境の、浸食され得る環境の、薬剤移入、および分解）に物理的に分散した物質を含む一体化したシステム；外側制御層に化学的に類似の、または非類似の貯蔵層を含む積層構造；ならびに、浸透圧ポンプ、またはイオン交換樹脂上の吸着などの他の物理的方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７２】
化学システムには、ポリマーマトリックスの化学的浸食（例えば、不均一な浸食、もしくは均一な浸食）、またはポリマーマトリックスの生物学的浸食（例えば、不均一、もしくは均一）が含まれるが、これらに限定されない。制御放出システムのカテゴリーのさらなる詳解は、Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies：Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.)中に見出され得る。
【０２７３】
経口投与用に開発される多くの制御放出製剤がある。これらには、浸透圧制御型消化管送達システム；動水圧制御型消化管送達システム；微多孔膜透過制御型消化管送達デバイスを含む膜透過制御型消化管送達システム；胃液耐性腸標的化制御放出型消化管送達デバイス；ゲル拡散制御型消化管送達システム；および、イオン交換制御型消化管送達システムが含まれるが、これらに限定されず、これらには、カチオン性薬物およびアニオン性薬物が含まれる。制御放出型薬物送達システムに関するさらなる情報は、Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.)中に見出され得る。
【０２７４】
投与量
好適な投与量は、担当医または他の有資格医療従事者により、種々の臨床的因子に基づき決定され得る。医学分野の当業者には周知の通り、ある患者への投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、患者の性別、投与時間および投与経路、全身的健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子によって変わる。本発明の抗体は、１投与当たり、１ｎｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ体重から５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され得る。しかしながら、例示範囲以下の用量または以上の用量が、とりわけ上記の因子を考慮して、考えられる。レジメンが持続点滴療法であるとき、それは、体重１ｋｇ当たり、１分当たり、１μｇから１０ｍｇの範囲であり得る。
【０２７５】
当業者なら、用量レベルは、特定の抗体、対象の症状の重症度および副作用に対する感受性に応じて変えることができることを容易に理解するであろう。所定の化合物の好ましい投与量は、様々な手段によって、当業者が容易に決定することができる。
【０２７６】
投与経路
本発明の抗体を、インビボ法およびエキソビボ法、ならびに全身投与経路および局所投与経路を含む、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与する。
【０２７７】
従来の投与経路および薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内投与、筋肉内投与、気管内投与、頭蓋内投与、皮下投与、皮内投与、局所適用、静脈内投与、動脈内投与、経腸投与、経鼻投与、経口投与および他の経腸投与ならびに非経口投与が含まれる。投与経路は、必要に応じて、抗体および／または所望の効果に応じて組み合わせるか、または調整することができる。本発明の抗体組成物は、単回用量または複数回用量で投与することができる。ある態様において、本発明の抗体組成物を経口投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を、吸入経路を介して投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を鼻腔内投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を鼻腔内投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を局所投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を頭蓋内投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を静脈内投与する。ある態様において、本発明の抗体組成物を髄腔内投与する。
【０２７８】
本発明の抗体は、全身経路または局所経路を含む従来の薬物の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を用いて、宿主に投与することができる。一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸経路、非経腸経路、または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２７９】
吸入投与以外の非経腸経路には、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、嚢内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、静脈内経路、および動脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。非経腸投与は、本発明の抗体の全身送達または局所送達をもたらすために行うことができる。全身送達が望まれるとき、投与には、典型的に、侵襲的または全身に吸収される医薬製剤の局所投与または粘膜投与が含まれる。
【０２８０】
本発明の抗体は、経腸投与によって、対象に送達することもできる。経腸投与には、経口送達および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２８１】
治療とは、少なくとも、宿主を苦しめている病的状態と関連する症状の改善を意味し、改善は、少なくとも、あるパラメーター、例えば、タウオパチーのような、治療されている病的状態と関連する症状の大きさの低下を意味ために広い意味で用いられる。このように、治療には、病的状態、または少なくともそれと関連する症状が、完全に抑制される、例えば、発生を防ぐか、または止める、例えば、終わらせる状態も含まれ、その結果、宿主は、もはや病的状態を有しない、または少なくともその病的状態を特徴づける症状を有しない。
【０２８２】
ある態様において、本発明の抗体は、例えば、脳動脈のある部位に、または脳組織に直接、注射および／または送達により投与される。本発明の抗体はまた、標的部位に直接、例えば、標的部位に微粒子銃送達系（biolistic delivery）により投与される。
【０２８３】
様々な宿主（ここで、用語“宿主”は、本明細書で“対象”、“個体”および“患者”という用語と互換的に用いられる）は、本方法に従って治療可能である。一般に、かかる宿主は“哺乳動物”または“哺乳類（ｍａｍｍａｌｉａｎ）”であり、これらの用語は、飼育肉食動物（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯動物（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、ならびに霊長動物（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類クラス内の生物を記載するために広く用いられる。ある態様において、これらの宿主はヒトである。
【０２８４】
本発明の抗体の単位用量、例えば経口または注射用量を含むキットが提供される。かかるキットにおいて、単位用量を含む容器に加えて、目的の病状の治療における抗体の使用および付随する利点を記載する情報のパッケージ挿入物がある。好ましい化合物および単位用量は、上記のものである。
【０２８５】
検出法
本発明は、個体から得られた生物学的サンプル中のＴａｕポリペプチドを検出するインビトロ方法、および生存個体中のＴａｕポリペプチドのインビボ検出方法を提供する。本発明のインビトロ検出方法は、定量的であり得る。故に、Ｔａｕは、タウオパチーの進行、またはタウオパチー処置への応答のバイオマーカーとなり得る。
【０２８６】
検出／定量されるＴａｕポリペプチドは、ａ）完全長Ｔａｕ；ｂ）完全長ＴａｕのＮ末端フラグメント；ｃ）完全Ｔａｕ（ここで、“完全Ｔａｕ”とは、いずれかのイソ形の完全長Ｔａｕを含み得る）；ｄ）遊離Ｔａｕ、例えば、本発明の抗Ｔａｕ抗体に結合していないＴａｕ；ならびに、ｅ）生物学的サンプル中に存在し、本発明の抗Ｔａｕ抗体により認識されるエピトープを提示する、いずれかのＮ末端Ｔａｕフラグメントであり得る。ヒト完全長Ｔａｕのアミノ酸配列は、図６Ａ−Ｄに示す。
【０２８７】
ある場合において、本検出法はさらに、生物学的サンプルにおけるＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを決定することを含み得る。生物学的サンプルにおけるＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルの決定は、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて、例えば、Ａβ４０および／またはＡβ４２を結合する抗体を用いて、行われ得る。
【０２８８】
好適な生物学的サンプルには、例えば、脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、および唾液が含まれる。
【０２８９】
個体から得られた生物学的サンプル中のＴａｕポリペプチドの本発明のインビトロ検出方法は、ａ）本明細書に記載の通り、生物学的サンプルと抗Ｔａｕ抗体を接触させ、そしてｂ）サンプル中に存在するＴａｕポリペプチドへの抗体の結合を検出すること、を含む。ある場合において、抗Ｔａｕ抗体は、図１Ａおよび１Ｂに示されるＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを含む。ある場合において、抗Ｔａｕ抗体は、図２Ａおよび２Ｂに示されるＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを含む。
【０２９０】
本発明の検出方法は、個体がタウオパチーを有する、またはその発症リスクを有するかどうかを決定するために用いられ得る。本発明の検出方法は、タウオパチーのステージ（重症度）を決定するために用いられ得る。本発明の検出方法は、タウオパチーを処置するための処置レジメンに対する患者の応答を決定するために用いられ得る。生物学的サンプルは、本発明の検出方法を用いて試験され得て、ここで、該生物学的サンプルは、タウオパチーを有する個体、タウオパチーを有すると診断された個体、タウオパチーを発症する遺伝的素因を有する個体などから得られる。
【０２９１】
本発明は、個体における神経変性タウオパチーの診断方法を提供する。該方法は、一般的に、（ａ）個体から得られた生物学的サンプル中のＴａｕポリペプチドのレベルを評価し、そして（ｂ）Ｔａｕポリペプチドのレベルを、参照対照値、標準対照値、または正常対照対象におけるＴａｕのレベルを示す正常対照値と比較すること、を含む。生物学的サンプルおよび正常対照値におけるＴａｕポリペプチドのレベルの顕著な相違は、該個体が神経変性タウオパチーを有することを示す。
【０２９２】
本発明は、個体における神経変性タウオパチーの進行をモニターする方法、またはその処置に対する応答をモニターする方法を提供する。該方法は、一般的に、第一の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルを、第二の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルと比較することを含む。第二の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルの、第一の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルとの比較における相違は、ｉ）タウオパチーが進行しているかどうか、または疾患の進行が停止しているかどうか、および／またはｉｉ）タウオパチーがどの程度早く進行しているか、および／またはｉｉｉ）個体が、タウオパチーを処置するための薬剤または他の処置レジメンでの処置に有益な臨床応答を示しているかどうかの指標を提供し得る。
【０２９３】
本発明は、タウオパチーの診断方法を提供する。例えば、本発明の方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断を提供し得る。例えば、生きている個体由来の生物学的サンプル（例えば、ＣＳＦまたは他の液体生物学的サンプル）におけるＴａｕポリペプチドのレベルは、ＡＤのＢｒａａｋステージとしての指標を提供し得る。Braak and Braak (1995) Neurobiol. Aging 16：271。例えば、生きている個体由来の生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルは、該個体がＡＤの移行嗅内野ステージ（transentorhinal stage）Ｉ−ＩＩ；ＡＤの固有海馬ステージ（limbic stage）ＩＩＩ−ＩＶ；または、ＡＤの新皮質連合ステージ（neocortical stage）Ｖ−ＶＩであるかどうかの指標を提供し得る。
【０２９４】
生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドのレベルは、当技術分野で公知の好適な方法により評価することができる。好適な方法は、タンパク質（“ウエスタン”）ブロット法、免疫沈降法、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動法、質量分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）、高圧タンパク質液体クロマトグラフィー法（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）とその後のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、ならびにレーザー濃度測定法が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９５】
本発明は、個体におけるタウオパチーの進行をモニターする方法を提供し、ここで、該方法は、一般的に、ａ）第一の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第一レベルを決定し、ｂ）第二の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第二のレベルを決定し、そしてｃ）Ｔａｕの第一レベルと第二レベルを比較すること、を含む。該決定する工程は、ｉ）生物学的サンプルを本発明の抗Ｔａｕ抗体と接触させ、ｉｉ）サンプル中に存在するＴａｕポリペプチドへの抗体の結合を定量すること、を含み得る。
【０２９６】
ある場合において、第一の時点は、処置レジメンの開始前の時点であり、第二の時点は、処置レジメンの開始後の時点である。従って、本明細書は、タウオパチーを処置する薬物での処置に対する応答をモニターする方法を提供し、ここで、該方法は、ａ）タウオパチーの薬物処置が始まる前の第一の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第一レベルを決定し、ｂ）タウオパチーの薬物処置開始後の第二の時点で個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの第二のレベルを決定し、そしてｃ）Ｔａｕの第一レベルと第二レベルを比較すること、を含む。
【０２９７】
タウオパチーの進行をモニターする本発明の方法はまた、シヌクレイン病、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）；レビー小体型認知症（ＤＬＢ）；多系統萎縮症（ＭＳＡ）などの進行をモニターする方法にも適用され得て、例えば、認知症を伴うＰＤ（ＰＤＤ）の進行は、本発明の方法でモニターできる。
【０２９８】
あるタウオパチーにおいて、Ｔａｕのレベルは、疾患の進行に従って増加する。他のタウオパチーにおいて、Ｔａｕのレベルは、疾患の進行に従って減少する。従って、例えば、Ｔａｕのレベルは、ＡＤの進行に従って増加し、ＦＴＤの進行に従って減少する。
【０２９９】
本発明の方法は、本発明の抗Ｔａｕ抗体を含むキットまたはアッセイ装置の使用を含み得る。本発明は、本明細書に記載の方法を実行するためのキットおよびアッセイ装置を提供する。本発明のキットは、本明細書に記載の抗Ｔａｕ抗体を含む。
【０３００】
抗Ｔａｕ抗体は、不溶性支持体（例えば、テストストリップ、マルチウェルプレートの各ウェル、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）など）に固定化され得る。好適な支持体は当技術分野で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップならびにガラスおよび／またはシリコンの表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、反応トレイ（例えば、マルチウェルプレート）のウェル、ならびにプラスチックチューブなどが含まれる。固体支持体は、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱を含む種々の物質のいずれかを含み得る。固体支持体上に本抗体を固定化するための好適な方法は周知であり、イオン性、疎水性、および共有結合性の相互作用などを含むが、これらに限定されない。固体支持体は、例えば、水溶液に可溶または不溶であり得る。ある態様において、好適な固体支持体は、一般に、水溶液に不溶である。
【０３０１】
本発明の抗Ｔａｕ抗体は、検出可能な標識を含む。抗体が検出可能な標識を含むとき、本発明のキットは、検出可能な標識を生じる１種またはそれ以上の試薬を含み得る。標識された抗体は、化学発光剤、微粒子標識、比色剤、エネルギー転移剤、酵素、蛍光剤、または放射性同位元素のような標識を含み得る。好適な検出可能な標識には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。好適な検出可能な標識には、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）；放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）；および、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ならびに蛍光的手段、比色手段または分光学的手段により検出され得る生成物を生じる基質として働く他の酵素）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０２】
本発明のキットはさらに、１つまたはそれ以上の付加的成分を含んでいてよく、ここで、好適な付加的成分には、１）陽性対照；２）バッファー（例えば、結合バッファー；洗浄バッファーなど）；３）検出可能なシグナルを生じるのに使用される試薬などが含まれる。該キットの他の任意の成分には、プロテアーゼ阻害剤；検出可能な標識などが含まれる。該キットの種々の成分は、別個の容器中に存在していてよいか、または任意の相溶性成分が、要すれば、単一の容器内で予め混合されていてよい。
【０３０３】
上記の成分に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実行するためのキットの成分の使用のための指示書を含み得る。本発明の方法を実行するための指示書は、一般に、好適な記録媒体に記録されている。例えば、該指示書は、紙またはプラスチックなどのような物質に印刷されていてよい。そのようなものとして、指示書は、パッケージ挿入物としてキット中に存在する、キットまたはその構成要素（すなわち、パッケージまたはサブパッケージと関連して）などの容器の標識に存在していてよい。他の態様において、該指示書は、好適なコンピューターの読み出し可能な記録媒体、例えば、コンパクトディスク−読み出し専用記憶装置（ＣＤ−ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、フロッピーディスクなどに存在する電子記憶データとして存在する。さらに他の態様において、実際の指示書は、キットに存在せず、リモート・ソースから、例えばインターネットを介して、指示書を得るための手段が提供される。この態様の例は、指示書が見られ、および／または指示書がダウンロードされ得る、ウェブアドレスを含むキットである。指示書と共に、この指示書を得るための手段が、適当な回路基板に記録される。
【０３０４】
アッセイ装置は、固体基質上に固定された本発明の抗Ｔａｕ抗体を含んでいてよい。アッセイ装置は、さまざまな形式のもの、例えば、テストストリップ、ディップスティックなどであり得る。
【０３０５】
インビボイメージング
上記の通り、本発明は、例えば、インビボイメージング技術により、生きている個体におけるＴａｕポリペプチドの検出方法を提供する。例えば、１つの態様において、Ｔａｕポリペプチドのインビボイメージングは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）分光法、または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により達成できる。本発明の抗Ｔａｕ抗体が個体に投与され、Ｔａｕポリペプチドの存在および／またはレベルが検出される。抗Ｔａｕ抗体は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＮＩＲ、またはＭＲＩにおける使用に好適な標識を含み得る。そのような標識には、造影剤または放射性同位元素が含まれ、該造影剤または放射性同位元素は、イメージング、例えば、上記の通り、ヒトに行われるイメージング方法における使用に好適なものである。ある場合において、抗Ｔａｕ抗体は、ＩＰＮ００１のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを含む。ある場合において、抗Ｔａｕ抗体は、ＩＰＮ００２のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを含む。抗Ｔａｕ抗体は、上記の通り、１つまたはそれ以上のヒト化フレームワーク領域を含む。
【０３０６】
レポート作成
ある例において、本発明の検出方法は、個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドの検出、および検出したＴａｕポリペプチドのレベルに基づき、レポートの作成および／または生物学的サンプルが得られた個体の治療またはマネジメントの方向付けを行うことを含む。
【０３０７】
レポートは、個体がタウオパチーを有する可能性があるかどうかの指標、タウオパチーの重症度の指標、個体がタウオパチーの処置に対して有益な臨床応答を示すかどうかの指標などの１つまたはそれ以上を含み得る。
【０３０８】
従って、レポートは、個体がタウオパチーを有する、またはタウオパチーを発症し得るかどうかの予測；さらなる評価に関する勧告；治療薬および／または他の健康管理への介入に関する勧告などのような情報を含み得る。
【０３０９】
例えば、本明細書に記載の方法はさらに、目的の評価の結果を提供するレポートを作成または出力する工程を含み得て、該レポートは、電子媒体の形態（例えば、コンピューターモニター上の電子表示）で、または有形的表現媒体の形態（例えば、紙に印刷されたものまたは他の有形的表現媒体）で提供され得る。個体がタウオパチーを有する、またはタウオパチーを発症する危険性を有する可能性の評価は、“リスクリポート”、“リスクスコア”または“可能性のスコア”として示され得る。レポートを作成する個人または機関（“レポート作成者”）はまた、サンプル収集、サンプル処理などのような工程を行うこともできる。あるいは、レポート作成者以外の機関は、サンプル収集、サンプル処理などのような工程を行うことができる。リスク評価レポートは、ユーザーに提供され得る。“ユーザー”とは、医療専門家（例えば、臨床医、研究者、または研究医）であり得る。
【０３１０】
健康管理の指示
ある例において、本発明の検出方法は、個体から得られた生物学的サンプルにおけるＴａｕポリペプチドを検出すること、および検出されたＴａｕポリペプチドのレベルに基づき、レポートの作成および／または生物学的サンプルが得られた個体の治療またはマネジメントの指示を行うことを含む。
【０３１１】
従って、例えば、本発明の検出方法の結果によって、タウオパチーの治療的介入（処置）を施されている個体および／または特別な健康管理が考慮されている個体に、忠告がなされ得る。
【０３１２】
治療的介入には、例えば、アルツハイマー病の処置のための薬物療法が含まれ得る。アルツハイマー病の処置のための薬物療法の例としては、Ａｒｉｃｅｐｔ（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（リバスチグミン）、メトリホナート、およびタクリン（Ｃｏｇｎｅｘ）を含むが、これらに限定されないアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；抗Ａβ抗体（例えば、ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ（ソラネズマブ））；抗Ｔａｕ抗体；イブプロフェンおよびインドメタシンを含むが、これに限定されない非ステロイド性抗炎症剤；Ｃｅｌｅｂｒｅｘのようなシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ２）阻害剤；ならびに、Ｓｅｌｅｇｉｌｅｎｅ（Ｅｌｄｅｐｒｙｌまたはデプレニル）のようなモノアミンオキシダーゼ阻害剤、が含まれるが、これらに限定されない。上記の各薬物の投与量は、当技術分野で公知である。例えば、Ａｒｉｃｅｐｔは、６週間の間、１日当たり５０ｍｇの経口用量が投与されてよく、個体が良好な耐容性を示すとき、その後１日当たり１０ｍｇが投与されてよい。
【０３１３】
遊離および結合細胞外ＴＡＵの量の決定
抗ｅＴａｕ抗体の個体への投与後、ＣＳＦまたはＩＳＦ中に残る、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定することが目的であり得る。本発明は、そのような遊離ｅＴａｕの量を決定するための方法を提供する。ＣＳＦまたはＩＳＦ中に残る、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定するための方法の略図を、図５４Ａに示す。抗ｅＴａｕ抗体の個体への投与後、抗ｅＴａｕ抗体に結合しているＣＳＦまたはＩＳＦ中のｅＴａｕの量を決定することも興味を持たれ得る。抗ｅＴａｕ抗体に結合しているＣＳＦまたはＩＳＦ中のｅＴａｕの量を決定する方法の略図を、図５４Ｂに示す。
【０３１４】
細胞外遊離Ｔａｕの量の決定
本発明は、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を施されている対象から得られた、ＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合していない細胞外Ｔａｕ（ｅＴａｕ）の量を決定する方法を提供する。該方法は、一般に、ａ）固定化抗体と、対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプルを接触させ（ここで、該固定化抗体は、ｅＴａｕへの結合に対して、対象に投与された抗ｅＴａｕ抗体と競合し、該接触は、固定化抗体への非結合型ｅＴａｕの結合に好適な条件下で行われる）、そしてｂ）固定化抗体に結合したｅＴａｕの量を決定すること、を含む。固定化抗体に結合するｅＴａｕの量は、サンプル中の抗Ｔａｕ抗体に結合しないｅＴａｕの量の指標である。ある場合において、固定化抗体に結合したｅＴａｕの量は、ｅＴａｕへの結合に対して、固定化抗体と競合しない、検出可能に標識された三次抗体を用いて決定される。
【０３１５】
上記の通り、該アッセイは、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を施されている個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中のｅＴａｕの量を測定する。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、治療的ヒト化抗ｅＴａｕ抗体である。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、本明細書に記載のヒト化抗ｅＴａｕ抗体である。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、ｈｕ−ＩＰＮ００２である。
【０３１６】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を施されている個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定すること、およびｂ）サンプル中の完全ｔａｕレベルを決定すること、を含み得る。
【０３１７】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を施されている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定すること、およびｂ）サンプル中の該結合していないＴａｕレベルと、抗ｅＴａｕ抗体での処置前に個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕのレベルを比較すること、を含み得る。
【０３１８】
本発明の検出方法は、細胞外ｔａｕのレベルを決定するのに好適である。本明細書で用いる“細胞外ｔａｕ”（“ｅＴａｕ”）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）または間質液（ＩＳＦ）において検出され得るＴａｕポリペプチドを含み得る。ある態様において、ｅＴａｕは、１７５アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６を含む、ポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、１７１アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７２を含む、ポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−２ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−３ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む、ｅＴａｕ−４ポリペプチドである。
【０３１９】
ある場合において、ｅＴａｕポリペプチドは、約５０アミノ酸から約１７５アミノ酸長、例えば、約５０アミノ酸（ａａ）から約７５ａａ長、約７５ａａから約１００ａａ長、約１００ａａから約１２５ａａ長、約１２５ａａから約１５０ａａ、または約１５０ａａから約１７５ａａを有し、約５０から約７５、約７５から約１００、約１００から約１２５、約１２５から約１５０、または約１５０から約１７５の、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６の隣接アミノ酸を含み得る。ｅＴａｕポリペプチドの例を、図２０に示す。
【０３２０】
抗ｅＴａｕ抗体に結合した細胞外Ｔａｕの量の決定
本発明は、治療的抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の治療的抗ｅＴａｕ抗体に結合しているｅＴａｕの量を決定する方法を提供する。該方法は、一般に、ａ）固定化抗体と対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプルを接触させ（ここで、固定化抗体は、ｅＴａｕへの結合に対して、対象に投与される抗ｅＴａｕ抗体と競合せず、該接触は、固定化抗体への治療的抗体結合型ｅＴａｕの結合に好適な条件下で行われる）、そしてｂ）固定化抗体に結合した治療的抗ｅＴａｕ／ｅＴａｕ複合体の量を決定すること（ここで、固定化抗体に結合した治療的抗ｅＴａｕ抗体／ｅＴａｕ複合体の量は、サンプル中に存在する治療的抗体結合型ｅＴａｕの量の指標である）、を含む。固定化抗体に結合した治療的抗ｅＴａｕ抗体／ｅＴａｕ複合体の量は、抗ｅＴａｕ抗体／ｅＴａｕ複合体中に存在する抗ｅＴａｕ抗体を検出することにより決定される。抗ｅＴａｕ抗体／ｅＴａｕ複合体中に存在する抗ｅＴａｕ抗体を検出することにより決定される、固定化抗体に結合した治療的抗ｅＴａｕ抗体／ｅＴａｕ複合体の量は、ＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の治療的抗体に結合したＴａｕの量の指標を提供する。
【０３２１】
上記の通り、該アッセイは、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を施されている個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の治療的抗体結合型ｅＴａｕの量を測定する。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、治療的ヒト化抗ｅＴａｕ抗体である。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、本明細書に記載のヒト化抗ｅＴａｕ抗体である。ある場合において、抗ｅＴａｕ抗体は、ｈｕ−ＩＰＮ００２である。
【０３２２】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定し、そしてｂ）該サンプル中の完全ｔａｕのレベルを決定すること、を含み得る。ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定すること、そしてｂ）治療的抗ｅＴａｕ抗体に結合していない、ＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中のｅＴａｕの量を決定すること、を含み得る。ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定すること、ｂ）該サンプル中の完全ｔａｕレベルを決定すること、そしてｃ）治療的抗ｅＴａｕ抗体に結合していない、ＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中のｅＴａｕの量を決定すること、を含み得る。
【０３２３】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定すること、そしてｂ）該サンプル中の抗ｅ−Ｔａｕ抗体結合型Ｔａｕレベルを、抗ｅＴａｕ抗体を用いる処置前の個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕレベルと比較すること、を含み得る。
【０３２４】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定し、ｂ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定し、そしてｃ）該サンプル中の結合していないＴａｕレベルおよび抗ｅＴａｕ抗体結合型Ｔａｕレベルと、抗ｅＴａｕ抗体を用いる処置前の個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕレベルを比較すること、を含み得る。
【０３２５】
本発明の検出方法は、治療的抗体に結合した細胞外ｔａｕレベルを決定するのに好適である。本明細書で用いる“細胞外ｔａｕ”（“ｅＴａｕ”）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）または間質液（ＩＳＦ）中で検出され得る何れかのＴａｕポリペプチドを包含する。ある態様において、ｅＴａｕは、１７５アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６を含むポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、１７１アミノ酸長を有し、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７２を含むポリペプチドである。例えば、ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むｅＴａｕ−２ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むｅＴａｕ−３ポリペプチドである。ある態様において、ｅＴａｕは、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むｅＴａｕ−４ポリペプチドである。
【０３２６】
ある場合において、ｅＴａｕポリペプチドは、約５０アミノ酸から約１７５アミノ酸長、例えば、約５０アミノ酸（ａａ）から約７５ａａ長、約７５ａａから約１００ａａ長、約１００ａａから約１２５ａａ長、約１２５ａａから約１５０ａａ長、または約１５０ａａから約１７５ａａ長を有し、約５０から約７５、約７５から約１００、約１００から約１２５、約１２５から約１５０、または約１５０から約１７５の、完全長ｔａｕのアミノ酸２−１７６の隣接アミノ酸を含み得る。ｅＴａｕポリペプチドの例を、図２０に示す。
【０３２７】
レポート作成
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定すること、そしてｂ）レポートの作成および／またはサンプルが得られた個体の治療またはマネジメントの方向付けを行うことを含み得る。ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定すること、ｂ）該サンプル中の結合していないＴａｕのレベルを、抗ｅＴａｕ抗体を用いる処置前の個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕレベルと比較すること、そしてｃ）レポートの作成および／またはサンプルが得られた個体の治療またはマネジメントの方向付けを行うこと、を含み得る。
【０３２８】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合したｅＴａｕの量を決定すること、そしてｂ）該決定の結果を含むレポートを作成することを含み得る。該レポートはさらに、抗Ｔａｕ抗体を用いる処置後のＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕのレベルに対する該サンプル中の結合していないＴａｕの量、および抗ｅＴａｕ抗体を用いる処置前の個体から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の完全ｔａｕの量、の一方または両方を含み得る。
【０３２９】
レポートは、例えば、個体がタウオパチーの処置に対して有益な臨床応答を示すかどうかの指標、抗ｅＴａｕ抗体の投与量を維持、増加または減少などすべきかどうかの指標を含み得る。
【０３３０】
従って、レポートは、さらなる評価に関する勧告、治療薬物および／または他の健康管理の介入に関する勧告、抗ｅＴａｕ抗体の投与量を増加する勧告、抗ｅＴａｕ抗体の投与量を維持する勧告、抗ｅＴａｕ抗体の投与量を減少する勧告などのような情報を含み得る。
【０３３１】
例えば、本明細書に記載の方法はさらに、目的の評価の結果を提供するレポートを作成または出力する工程を含み得て、該レポートは、電子媒体の形態（例えば、コンピューターモニター上の電子表示）で、または有形的表現媒体の形態（例えば、紙に印刷されたものまたは他の有形的表現媒体）で提供され得る。レポートを作成する個人または機関（“レポート作成者”）はまた、サンプル収集、サンプル処理などのような工程を行うこともできる。あるいは、レポート作成者以外の機関は、サンプル収集、サンプル処理などのような工程を行うことができる。リスク評価レポートは、ユーザーに提供され得る。“ユーザー”とは、医療専門家（例えば、臨床医、研究者、または研究医）であり得る。
【０３３２】
健康管理の指示
ある例において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定すること、そしてｂ）抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの決定された量に基づき、レポートを作成および／または生物学的サンプルが得られた個体の治療またはマネジメントを指示することを含む。
【０３３３】
ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定し、そしてｂ）抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの決定された量に基づき、対象に投与された抗ｅＴａｕ抗体の投与量を維持することを含む。ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定し、そしてｂ）抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの決定された量に基づき、対象に投与された抗ｅＴａｕ抗体の投与量を増加することを含む。ある場合において、本発明の方法は、ａ）上記の通り、抗ｅＴａｕ抗体を用いる治療を受けている対象から得られたＣＳＦまたはＩＳＦサンプル中の、抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの量を決定し、そしてｂ）抗ｅＴａｕ抗体に結合していないｅＴａｕの決定された量に基づき、対象に投与された抗ｅＴａｕ抗体の投与量を減少することを含む。
【実施例】
【０３３４】
実施例
以下の実施例は、本発明を如何に実施し、使用するかを完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定するものではなく、また、以下の実験が実行される全ての実験または唯一の実験であると示すためのものでもない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保する努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に示さない限り、％は重量％であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近いものである。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；およびｓ．ｃ．、皮下などを用いることができる。
【０３３５】
実施例１：ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２ ＶＨおよびＶＬ領域のクローニングおよび配列決定
ＩＰＮ００１（本明細書中、“ＩＰＮ１”または“ＩＰＮ−１”とも言う）およびＩＰＮ００２（本明細書中、“ＩＰＮ２”または“ＩＰＮ−２”とも言う）抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列が決定される。ＩＰＮ００１のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示される。ＩＰＮ００２のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示される。ＣＤＲは、太字および下線で示される。ＣＤＲは、Kabat et al. の方法を用いて決定した(表１;および、 J. Biol. Chem. 252：6609−6616 (1977);および、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)を参照のこと）。
【０３３６】
実施例２：抗Ｔａｕ抗体の効果の電気生理学的分析
材料および方法
正常なヒトアストロサイトの単層上に培養した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する皮質ニューロンからのホールセル（全細胞）パッチクランプ記録を、Ｋ−メチル−硫酸（１４０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、Ｍｇ−ＡＴＰ（３ｍＭ）；Ｎａ−ＧＴＰ（０．４ｍＭ）、ＥＧＴＡ（０．２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ホスホクレアチンを含む、ｐＨ＝７．３およびｍＯｓｍ＝３００に調節した溶液で満たしたパッチピペット（２−５ＭＯｈｍ）を用いて行った。ニューロンを、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（２．５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（１０ｍＭ）、スクロース（２０ｍＭ）を含む、ｐＨ＝７．４、ｍＯｓｍ＝３１０に調節した人工の脳脊髄液(ａＣＳＦ)でかん流した（２ｍｌ／分）。ｐＣｌａｍｐ−１０．３データ収集ソフト（Molecular Devices）およびＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Axon Instrument；Foster City CA）を用いて記録を行った。ＡＤ  ｔａｕおよびＩＰＮ００１またはＩＰＮ００２を用いて予めインキュベートしたＡＤ  Ｔａｕ（１０：１の重量比で、室温で２時間または４℃で２４時間）を、ＭｉｎｉｓＱｕｉｒｔ  マイクロパヒュージョンシステム（AutoMate, Berkeley, CA）に適用した。データ分析を、Clampfit 10.2 分析ソフト (Molecular Devices)を用いてオフラインで行った。全ての記録を室温で行った。
【０３３７】
結果
データを図３Ａ−Ｄに示す。
ＡＤ−Ｔａｕ（６μｇ／ｍｌ）の適用は、皮質ニューロン膜脱分極を引き起こす（Ａ、Ｂ、およびＣ）。ＡＤ−Ｔａｕ（６μｇ／ｍｌ）をＩＰＮ００１（６０μｇ／ｍｌ）（Ａ）またはＩＰＮ００２（６０μｇ／ｍｌ）（Ｂ）と共に、＞２時間の間、予めインキュベートすると、ＡＤ−Ｔａｕ仲介性膜脱分極が減少する。（Ｃ）ＡＤ−Ｔａｕ（６μｇ／ｍｌ）をマウスＩｇＧ（６０μｇ／ｍｌ）と共に予めインキュベートしても、皮質ニューロンにおけるＡＤ−Ｔａｕ仲介性膜脱分極は減少しなかった。（Ｄ）ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２がＡＤ−Ｔａｕ仲介性膜脱分極を顕著に減少することを示すデータ一覧（対応のあるｔ検定  ＊  ｐ＜０．０３７；＊＊  ｐ＜０．００９、ｐ＜０．００３）。
【０３３８】
実施例３：ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２の、ＡＤ患者からのＣＳＦ中のＴａｕとの免疫反応性
脳脊髄液（ＣＳＦ）を、１０名の健常ドナーから集めた（各１ｍｌ）。ＣＳＦもまた、１０名のアルツハイマー病（ＡＤ）患者から集めた（各１ｍｌ）。集めたＣＳＦのアリコートをＥＬＩＳＡ分析のために取り置いた。ダウン症候患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）ｉＰＳＣ株（８９４１．１）から、３１５日間、分化させた皮質ニューロンからの１０ｍｌの馴化培地を、ＣＳＦのアフィニティー分離のためのコントロールとして用い、１つのアリコートを、ＥＬＩＳＡ分析のために取り置いた。ＣＳＦがＩＰＮ００２−反応性Ｔａｕを含むかどうかを決定するために、ＣＳＦの収集サンプルおよび馴化培地のそれぞれを、ＩｇＧ１結合樹脂上でプレクリア（precleared）をして、その後、ＩＰＮ００１結合樹脂に適用した。ＩＰＮ００１樹脂をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で完全に洗浄し、５０ｍＭ  グリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．３で結合タンパク質を溶出し、溶出後に１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３で中和した。溶出タンパク質を、ＹＭ１０濃縮器を用いて濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティング分析のためにサンプルバッファーに添加した。
【０３３９】
ＩＰＮ００２が、ＣＳＦ中のいずれかの形態のＴａｕと反応するかどうかを決定するために、ＩＰＮ００２溶出タンパク質のウェスタンブロットを、ＩＰＮ００１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔａｕ  Ｈ−１５０（ａａ１−１５０）およびＴａｕのＣ末端（ａａ＃２４３−４４１）と反応するＤａｋｏ’ｓ  Ｔａｕ  ＃Ａ００２４抗体を用いてプローブ化した。データを図４Ａ−Ｃに示す。
【０３４０】
ウェスタンブロットは、〜２５ｋｄから３７ｋｄの分子量範囲に健常およびＡＤ両方からのＣＳＦのＩＰＮ００２親和性制精製タンパク質中に、ＩＰＮ００１（図４ａ）およびＴａｕ  Ｈ−１５０（図４ｂ）免疫反応性バンドが存在することを示した。これらのＴａｕフラグメントは、ダウン症患者由来の細胞株の馴化培地から単離されたｅＴａｕフラグメントと比較してそのサイズは類似しているが、相対存在量は異なっていた。Ｄａｋｏ  Ｃ末端Ｔａｕ抗体（図４ｃ）は、何れのＣＳＦまたは馴化培地からのＩＰＮ００２アフィニティー分離からも反応性種を検出しなかった。完全長Ｔａｕは、ＩＰＮ００２アフィニティー分離からのＴａｕ抗体の何れかにより検出されなかった。ＩＰＮ００２アフィニティー分離されたタンパク質は、ウェスタンブロットにおいてＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２と反応性であったため、ＣＳＦ中のＴａｕもＩＰＮ００１反応性であると結論づけた。
【０３４１】
その後、ＩＰＮ００２親和性樹脂からのＣＳＦおよび馴化培地フロースルーが、ＩＰＮ００２により単離されなかったｔａｕフラグメントのいずれかのＣ末端または中間領域が存在するかどうかを決定するために、Ｔ４６（Ｔａｕ  ＃４２８−４４１）およびＨＴ７（Ｔａｕ  ＃１５９−１６３）に連続適用され、溶出された。溶出物をＤａｋｏ  Ｃ末端抗体（図４ｃ）を用いてプローブ化したが、免疫反応性は検出されなかった。これらのデータは、ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２免疫反応性ｔａｕが、全長、中間領域のみ、またはＣ末端ｔａｕフラグメントよりも豊富に存在することを示唆する。
【０３４２】
ＣＳＦおよび馴化培地のそれぞれからのフロースルーのアリコートを、ＣＳＦ中のＴａｕレベルを決定するのに通常用いられる市販のキットを用いて、全ての検出可能なｔａｕが単離中に除去されたかどうかを決定するために、単離前と単離後の比較のために取り置いた。データを図５に示す。この分析は、全ての検出可能なｔａｕが、アフィニティー分離工程中にポスト−ＣＳＦサンプルから除去されたことを示した。
【０３４３】
これらのデータは、ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２の両方が、健常者およびＡＤ患者の両方からのＣＳＦ中に存在する主なｔａｕ種と反応することの強力な証拠を提供する。
【０３４４】
実施例４：患者サンプル中のｅＴａｕの検出
材料および方法
ｉＰＳＣ由来の皮質ニューロンからの馴化培地収集
ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）を、健常な年齢を適合させた対照およびアルツハイマー患者から、Dimos et al. (2008) Science 321：1218に記載された山中法（Takahashi et al. (2007) Cell 131(5), 861）を用いて作製した。ｉＰＳＣを、デュアルＳＭＡＤ単層培養法（Chambers et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27：275）を用いて公開されたプロトコルにて該株の大部分を皮質ニューロンに分化させ、その後、皮質ニューロン分化を、Shi et al. (2012) Nat. Neurosci. 15：477に記載の方法と同様の方法で行った。特記されない限り、１０８日間培養したｉＰＳＣ由来の皮質ニューロン（ｉＰＳＣ−ＣＮ）を洗浄し、新鮮な培地を添加し、３日後に馴化培地を集めた。該株からの多重分化が、ｅＴａｕレベルの再現性を確保するために行われた。馴化培地を、ウェスタンブロットまたはｔａｕ ＥＬＩＳＡ法の前に、１５，０００ｒｐｍで１５分間、遠心した。ブレフェルディンＡ実験のために、ｉＰＳＣ−ＣＮ培養物をＰＢＳで洗浄し、その後、１μＭのブレフェルディンＡを添加した新鮮培地およびブレフェルディンＡを添加しない新鮮培地を添加し、収集前の１時間、培地を馴化した。
【０３４５】
ヒト初代皮質ニューロンから馴化培地収集
ヒト皮質ニューロン培養（ＨＣＣ）を、Wright et al. (2007) Neurobiol. Aging 28：226に記載の通りに作製した。要約すれば、ヒト胎児脳皮質組織をAdvanced Bioscience Resources (Alameda, CA)から得て、胎児研究に関する連邦のガイドラインおよび統一死体提供法（Uniform Anatomical Gift Act）に従った。組織をハンク緩衝食塩水溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で濯ぎ、１μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ（ＥＭＤ）の存在下で粉砕し、１００μｍの細胞ストレーナーを通して篩い分けした。遠心後、ペレットを、０．０５％  トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen）中に、３７℃で２０分間、再懸濁した。トリプシンは、等量の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地を加えることにより不活性化され、サンプルをＤＮａｓｅの存在下で再び穏やかに粉砕した。遠心後、細胞を平板培地（Neurobasal containing B27, Invitrogen）に再懸濁し、数カウントした。細胞をプレートまたはポリ−ｄ−リシンおよびラミニンでコートしたカバーガラス上に播種した。３週間後にＨＣＣを洗浄し、新鮮な培地を添加し、馴化の３日後に培地を集めた。馴化培地を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その後、ウェスタンブロットした。
【０３４６】
Ｐ３０１Ｌ  マウスＩＳＦおよびヒト  ＣＳＦ収集
マウスをイソフルラン（２％、８００ｍＬ／分  Ｏ２）で麻酔した。ブピバカイン／エピネフリンを局所麻酔に用いて、ファインダインまたはカルプロフェンを術中術後鎮痛に用いた。動物を定位フレーム（Kopf instruments, USA）中に置いた。プッシュ・プルマイクロダイアリシス法によるプローブ（ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＥ）膜、Brainlink, the Netherlands）を、海馬（３ｍｍ  露出表面）中に挿入した。マイクロダイアリシス法によるサンプリングを、術後２４時間および４８時間に行った。サンプリングの日に、動物のプローブを、微量灌流ポンプと接続されたフッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）管（Harvard PHD 2000 Syringe pump, Holliston, MA or similar）と接続した。マイクロダイアリシス法によるプローブを、１４７ｍＭ ＮａＣｌ、３．０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２および１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）、ならびに０．１５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に、０．７５μＬ／分の流速でかん流させた。マイクロダイアリシス法によるサンプルを６０分間集めた。安定化後、基準サンプルを集めた。サンプリングの２日目に、上記の方法を繰り返した（Brains Online）。間質液（ＩＳＦ）を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄み液をｅＴａｕウェスタンブロットに用いた。
【０３４７】
１０名の健常者（Precision Med）、１０名のＡＤ患者（Precision Med）および１０名のＰＳＰ患者の集団から、１０ｍｌのＣＳＦ（Precision Med）を集め、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をＩｇＧ親和性樹脂上でプレクリア（precleared）をして、次いで、ＩＰＮ００２  抗ｔａｕ親和性樹脂上でｔａｕを単離し、洗浄し、１Ｍ  ＴＢＳ、ｐＨ８．３を含むチューブ中、５０ｍＭ  グリシン、ｐＨ２．３と１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、ｐＨを中和し、ＹＭ１０フィルターで濃縮し、ｔａｕ  ウェスタンブロットを行った。ｆＡＤ  ＰＳＥＮ１  患者からのｉＰＳＣ−ＣＮ  馴化培地を、結合パターンを比較するために陽性対照として、同様に単離した。
【０３４８】
ウェスタンブロット
馴化培地をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｓｉｇｍａ）で希釈した。培養ニューロンをＰＢＳで濯ぎ、その後、ＤＭＥＭ中の０．０５％  トリプシン（Invitrogen）中でインキュベートし、濯ぎ、そしてＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー中で溶解した。全てのサンプルを沸騰させ、トリ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）上で分離させ、ｉＢｌｏｔ（Invitrogen）を用いてニトロセルロースに転写した。膜をブロッキングバッファー（ＬｉＣｏｒ）中でインキュベートし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むブロッキングバッファー中、０．５μｇ／ｍｌのｔａｕに対するＩＰＮ００１抗体およびβ−アクチンに対する抗体（１：２０００；Ａｂｃａｍ）でプローブ化し、抗マウス６８０および抗ウサギ８００二次抗体（ＬｉＣｏｒ）でプローブ化した。ブロットをＯｄｙｓｓｅｙ  ＳＡのインフラレットイメージングシステムを用いてスキャンし、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＳＡソフトウエア（ＬｉＣｏｒ）を用いて分析した。
【０３４９】
Ｔａｕ  ＥＬＩＳＡ
ｉＰＳＣ由来の皮質ニューロン培養物から３日の馴化期間後に培地を集め、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎホモジニアスアッセイを用いてアッセイしてｔａｕを測定した。１０μｇ／ｍｌの抗ｔａｕ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズおよび１ｎＭ  ビオチニル化−抗Ｔａｕ抗体を、馴化培地と共に、室温にて一晩、混合した。４０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ドナービーズ（Perkin Elmer）を、室温で３０分間添加し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにて読み出した。
【０３５０】
ｅＴａｕ精製
ＡＤ患者由来のｉＰＳＣ−ＣＮから集めた馴化培地を、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ＩｇＧ親和性樹脂上でプレクリアした上清を集めた。プレクリアした上清をＩＰＮ００２  抗Ｔａｕ抗体樹脂を通して濾過し、洗浄し、１Ｍ  ＴＢＳ、ｐＨ８．３を含むチューブ中、ｅＴａｕを５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．３と１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、ｐＨを中和した。溶出物を濃縮し、バッファーをＰＢＳに取り換えた。
【０３５１】
免疫蛍光
ＭＣＣをＰＢＳで濯ぎ、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１０％ロバ血清（Jackson ImmunoResearch）でブロックし、ＰＢＳ中の０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００で１５分間透過処理し（特記されない限り）、ｔａｕに対するＩＰＮ００１抗体とロバ−抗マウス−Ａ４８８二次抗体（Molecular Probes）およびＤＡＰＩ（Invitrogen）を用いて染色した。イメージを、ＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を用いて４０倍でＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６００  Ｂ顕微鏡を用いて得た。共焦点イメージを、ニコン  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて得た。
【０３５２】
結果
アッセイを、種々の液体中のｅＴａｕフラグメントを検出することにより行った。結果を図７に示す。図７、左パネルに示す通り、内生ｔａｕは、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳＣ−皮質ニューロン；ｉＰＳＣ−ＣＮ）に由来する皮質ニューロンから分泌され、該分泌されたＴａｕは、細胞外Ｔａｕまたは“ｅＴａｕ”と呼ばれる。図７、左から２番目のパネルに示す通り、ｅＴａｕは、ヒト初代ニューロン（ヒト皮質細胞；“ＨＣＣ”）からの馴化培地にも存在し、ｅＴａｕがｉＰＳＣ分化の人工物ではないことが確認される。これらのｅＴａｕフラグメントは、ニューロンの溶解物にも検出され、ｔａｕが、ｅＴａｕ分泌の前にニューロン内部で切断されることが示唆される。
【０３５３】
図７、中パネルに示す通り、類似のｔａｕフラグメントが、Ｐ３０１Ｌ ｔａｕマウス由来の間質液（ＩＳＦ）中に検出され、完全長ｔａｕはどちらのシステムでも検出されなかった。Ｐ３０１Ｌマウスは、Ｐ３０１Ｌ変異を有するヒトｔａｕ形態の遺伝子導入マウスである。Ｐ３０１Ｌマウスは、ヒトタウオパチーのモデルである。例えば、Goetz et al. (2001) J. Biol. Chem. 276：529；および、 Lewis et al. (2000) Nature Genetics 25：402を参照のこと。
【０３５４】
図７、右パネルに示す通り、ｅＴａｕレベルは、健常者のレーンと比較して、ＡＤ患者からのＣＳＦ、および家族性ＡＤ（ｆＡＤ）患者からの複数のレーンで増加する。図７、右パネルに示す通り、ｅＴａｕは、ＰＳＰ患者からのＣＳＦ中でも検出される。
【０３５５】
実施例５：ｅＴａｕは、ニューロン過活動を誘導する
方法
マイクロピペット（２−５ＭＯｈｍ）を用いて正常なヒトアストロサイトの単層上に培養したｉＰＳＣ−ＣＮからの全細胞パッチクランプ記録を、Ｋ−メチル−硫酸（１４０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、Ｍｇ−ＡＴＰ（３ｍＭ）；Ｎａ−ＧＴＰ（０．４ｍＭ）、ＥＧＴＡ（０．２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ホスホクレアチン（１０ｍＭ）を含む、ｐＨ＝７．３およびｍＯｓｍ＝３０５に調節した溶液で満たして行った。ニューロンを、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（２．５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（１０ｍＭ）、スクロース（２０ｍＭ）を含む、ｐＨ＝７．４、ｍＯｓｍ＝３１０に調節した人工脳脊髄液でかん流した（２ｍｌ／分）。記録を、ｐＣｌａｍｐ−１０．３データ収集ソフトウェア（Molecular Devices）およびＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Axon Instrument；Foster City CA）を用いて記録を行った。ｅＴａｕ、または阻害剤、テトロドトキシン（ＴＴＸ）（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＭＫ８０１（Ｓｉｇｍａ）、ＮＢＱＸ（Ｔｏｃｒｉｓ）もしくは抗Ｔａｕ抗体、ＩＰＮ００１を含むｅＴａｕのパフアプリケーション(Puff application)を、ＭｉｎｉｓＱｕｉｒｔ  マイクロパヒュージョンシステム（AutoMate, Berkeley, CA）を用いて行った。オフラインでデータ分析を、Clampfit 10.2 分析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて行った。記録を３４−３７℃で行った。
【０３５６】
結果
ｅＴａｕが神経機能を変え得るかどうかを決定するために、精製したｅＴａｕフラグメントを、ｉＰＳＣ−ＣＮまたはＨＣＣに用いた。結果を図８Ａ−Ｃに示す。
【０３５７】
図８Ａに示す通り、精製したｅＴａｕフラグメント混合物のこれらのニューロンへの添加は、ニューロン過活動を促進した。図８Ｂに示す通り、ｅＴａｕ混合物により誘導される過活動は、テトロドトキシン（ＴＴＸ）により、ならびにＮＭＤＡおよびＡＭＰＡグルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＭＫ８０１およびＮＢＱＸにより、阻害された。ＴＴＸは、神経細胞膜における電位依存性開口型の高速ナトリウムチャネルに結合することによりニューロンにおける活動電位を阻止する。これらのデータは、ｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動が、グルタミン酸塩の活動電位仲介性放出に依存することを示唆する。対称的に、図８Ａの中パネルに示す通り、完全長ｔａｕの適用は、顕著に高い濃度のときでさえもニューロン活動における検出可能な変化を生じず、ｅＴａｕ誘導性過活動が、ｔａｕフラグメントに依存することを示した。これらのｅＴａｕ誘導性過活動の結果は、カルシウム動員が、ニューロン内で生じ得ることを強く示唆する。カルシウム動員がニューロン内で生じるかどうかを決定するために、ｅＴａｕのカルシウム動員への作用を試験した。図８Ｃに示す通り、ｅＴａｕ−１ａは、確実にカルシウムを動員する。このタイプのニューロン過活動は、ＡＤにおけるような慢性化の状態に維持されるとき、変更されたシナプスの発火および異常な神経刺激を回するニューロンの機能不全を結果として生じ得る。ｅＴａｕ−１ａは、胎児ｔａｕのアミノ酸２−１６６、すなわち、配列番号２７のアミノ酸２−１６６を含む。
【０３５８】
実施例６：抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ仲介性ニューロン過活動を低減する。
電気生理的分析を、実施例５に記載の通りに行う。ＩＰＮ００１およびＩＰＮ００２のｅ−Ｔａｕ仲介性ニューロン過活動への作用を評価した。
【０３５９】
図８Ｄに示す通り、ＩＰＮ００１は、ｅＴａｕ−仲介性ニューロン過活動を低減する。図１９Ｂに示す通り、ＩＰＮ００２は、ｅＴａｕ−仲介性ニューロン過活動を低減する。
【０３６０】
実施例７：ヒト化抗Ｔａｕ抗体
ＩＰＮ００２のヒト化変異体を作製した。ヒト化変異体１−４の重鎖ＶＨドメインのアミノ酸配列、および該ヒト化変異体の重鎖ＶＨドメインをコード化するヌクレオチド配列を、図９−１２に示す。ヒト化変異体１−４の軽鎖ＶＬドメインのアミノ酸配列、および該ヒト化変異体の軽鎖ＶＬドメインをコード化するヌクレオチド配列を、図１３−１６に示す。ＩＰＮ００２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の相違を表４および５にまとめる。
【０３６１】
【表４】
0006446443.tif 000005
【表５】
0006446443.tif 000006
【０３６２】
一文字アミノ酸コードは以下の通りである。
Ｇ  −  グリシン（Ｇｌｙ）
Ｐ  −  プロリン（Ｐｒｏ）
Ａ  −  アラニン（Ａｌａ）
Ｖ  −  バリン（Ｖａｌ）
Ｌ  −  ロイシン（Ｌｅｕ）
Ｉ  −  イソロイシン（Ｉｌｅ）
Ｍ  −  メチオニン（Ｍｅｔ）
Ｃ  −  システイン（Ｃｙｓ）
Ｆ  −  フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
Ｙ  −  チロシン（Ｔｙｒ）
Ｗ  −  トリプトファン（Ｔｒｐ）
Ｈ  −  ヒスチジン（Ｈｉｓ）
Ｋ  −  リシン（Ｌｙｓ）
Ｒ  −  アルギニン（Ａｒｇ）
Ｑ  −  グルタミン（Ｇｌｎ）
Ｎ  −  アスパラギン（Ａｓｎ）
Ｅ  −  グルタミン酸（Ｇｌｕ）
Ｄ  −  アスパラギン酸（Ａｓｐ）
Ｓ  −  セリン（Ｓｅｒ）
Ｔ  −  スレオニン（Ｔｈｒ）
【０３６３】
実施例８：ヒト化ＩＰＮ００２変異体の特性化
ＶＨ＃１−４とＶｋ＃１−４の１６種の抗体組合せのそれぞれについての、各組み換えｔａｕ（３８３アミノ酸の組み換えｔａｕ）ならびにｅＴａｕ １ａ、ｅＴａｕ １ｂ、ｅＴａｕ ２、ｅＴａｕ ３およびｅＴａｕ ４への相対的ｔａｕ結合親和性を、図１７に示す表４に記載する。各ｔａｕおよびｅＴａｕ種の相対的結合親和性は、ＶＨ／Ｖｋ抗体組合せのそれぞれについて１２１ｐＭから１０３０ｐＭの範囲である。ｅＴａｕ １ａは、胎児ｔａｕのアミノ酸２−１６６、すなわち、配列番号２７のアミノ酸２−１６６を含み、ｅＴａｕ １ｂは、胎児ｔａｕのアミノ酸２−１９６および２１７−２２８、すなわち、配列番号２７のアミノ酸２−１９６および２１７−２２８を含む。ｅＴａｕ３およびｅＴａｕ４のアミノ酸配列を図２０に示す。
【０３６４】
これらのＶＨ／Ｖｋヒト抗体について絶対的親和性ならびにＫｏｎおよびＫｄｉｓを得るため、Ｏｃｔｅｔ分析をｔａｕ（３８３アミノ酸の組み換えｔａｕ）を用いて行った。ＫＤ値は、４２．６ｐＭから２１２０ｐＭの範囲であった。全てのＶＨ／Ｖｋ変異体に関して、Ｔａｕおよび各ｅＴａｕ種に対してＫｏｎ値が高く、Ｋｄｉｓ値が低かった。データを図１８に示す表５に記載する。
【０３６５】
上記のヒト化ＩＰＮ００２ 変異体のサブセットを、さらなる分析にて試験した。図１９Ａに示す通り、３つの変異体、ＶＨ２／Ｖｋ１、ＶＨ２／Ｖｋ２およびＶＨ２／Ｖｋ３を、ｔａｕを含む種々のサンプルと共にウェスタンブロットアッセイに用いた。ｔａｕ含有サンプルは、ｉＰＳＣ−ＣＮ馴化培地、ｉＰＳＣ−ＣＮ溶解物、ＡＤ脳溶解物、およびＰ３０１Ｌ  ｔａｕ  マウス脳皮質溶解物、およびカニクイザル脳溶解物を含む。データは、上記のヒト化ＩＰＮ００２変異体が、種々のサンプルにおいてｔａｕと反応することを示す。
【０３６６】
上記のヒト化ＩＰＮ００２変異体のサブセットを、ｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動を低減する能力について試験した。図１９Ｂに示す通り、親ＩＰＮ００２、ならびに変異体ＶＨ２／Ｖｋ１、ＶＨ２／Ｖｋ２、およびＶＨ２／Ｖｋ３が、ｅＴａｕ誘導性過活動を阻止した。
【０３６７】
実施例９：ヒト化ＩＰＮ００２変異体の免疫原性の試験
ヒト化抗Ｔａｕ抗体を、免疫原性について評価した。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ(商標)アッセイを用いた。例えば、Jones et al. (2004) J. Interferon Cytokine Res. 24：560；および、Jones et al. (2005) J. Thromb. Haemost. 3：991を参照のこと。タイムコースＴ細胞アッセイを、ＣＤ８＋−欠損末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて行い、Ｔ細胞増殖を、試験抗体サンプルの添加後の種々の時点で［３Ｈ］−チミジンを挿入することにより測定した。
【０３６８】
ＰＢＭＣを、健常なドナー群からのバフィーコート（例えば、試験の２４時間以内の採血）から単離した。試験抗体（例えば、ヒト化ＩＰＮ００２ 変異体）に対するＴ細胞応答を、臨床基準抗体と比較した。
【０３６９】
精製した試験抗体（ヒト化ＩＰＮ００２ 変異体）を、インビトロにてＰＢＭＣ培養物に、培養培地中の終濃度５０μｇ／ｍｌまで添加し、試験サンプルを作製した。臨床抗体対照（陽性対照）、および培養培地−対照のみ（刺激しない対照）を、対照サンプルとして含んだ。試験サンプル（ＰＢＭＣ＋試験抗体）、および対照サンプルを、３７℃、５％ＣＯ２にて８日間、インキュベートした。５、６、７および８日目に、試験細胞および対照サンプルを懸濁し、マルチウェル培養プレートのウェルに移した。試験および対照サンプルを、０．７５μＣｉ  ［３Ｈ］−チミジンでパルス標識し、濾過マット上に集める前に、さらに１８時間インキュベートした。各ウェルについての（ｃｐｍ）を、シンチレーション計数法を用いて決定した。
【０３７０】
増殖アッセイに関して、ＳＩ（刺激指数）の等しいか、または２倍以上の閾値を用い、ここで、上記の閾値の増殖性応答をもたらすサンプルを陽性とみなした。ＳＩは、刺激していない対照の平均で割った平均試験サンプル計算値である。
【０３７１】
データを図２１Ａ−Ｃに示す。健常なドナーＴ細胞増殖は、ヒト化ＩＰＮ００２試験抗体に対して反応する。バルク培養物からのＰＢＭＣは、試験サンプルと共にインキュベート後、５、６、７および８日目にサンプリングし、増殖を評価した。水平な点線で示されるＳＩ≧２．０の増殖反応（ｐ＜０．０５）は、対応のない２つのサンプルのスチューデントのｔ検定を用いて有意であり（ｐ＜０．０５）、陽性であるとみなされた。
【０３７２】
図２１Ａに示す通り、試験完全ヒト化ＩＰＮ００２抗体は、低い免疫原性を有した（ＳＩの２．０閾値以下）。図２１Ｂは、参照キメラ抗体を用いた結果を示し、該参照キメラ抗体は、ＩＰＮ００２マウス重鎖および軽鎖可変領域ならびにヒトＩｇＧ４定常領域を有する。図２１Ｃは、免疫原性の臨床対照ヒト化Ａ３３抗体を用いた結果を示す。
【０３７３】
実施例１０：ＩＰＮ００２は、インビボにてリン酸化Ｔａｕのレベルを低減する
アミノ酸２０２および２０５におけるＴａｕのリン酸化レベルに対するＩＰＮ００２投与の効果を評価した。
【０３７４】
Ｐ３０１Ｌマウスモデルを用いた。Ｐ３０１Ｌマウスは、Ｐ３０１Ｌ変異を有するヒトｔａｕの一形態の遺伝子導入マウスである。Ｐ３０１Ｌマウスは、ヒトタウオパチーのモデルである。例えば、Goetz et al. (2001) J. Biol. Chem. 276：529を参照のこと。
【０３７５】
Ｐ３０１Ｌマウス（３−４月齢）を、１）対照ＩｇＧ；２）ＰＨＦ１抗リン酸化Ｔａｕ抗体；または３）ＩＰＮ００２で処理した。ＩｇＧ対照およびＩＰＮ００２抗体を、濃度１０ｍｇ／ｋｇで４週間、次いで、２０ｍｇ／ｋｇでさらに４週間、腹腔内注射した。ＰＨＦ１を、全８週間の間、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。抗体処理レジメンの開始後６０日目に、海馬にてリン酸化Ｔａｕのレベルを測定した。データを図２２に示す。
【０３７６】
アミノ酸２０２および２０５でリン酸化されているＴａｕを、“ＡＴ８”と言う。図２２に示す通り、ＩＰＮ００２での処理は、ＩｇＧ対照処理と比較して、ＥＬＩＳＡにより評価される通り、不溶性ホスホ−Ｔａｕ（ＡＴ８）の統計的に有意な減少をもたらし（左パネル）、ウェスタンブロット分析により評価される通り、減少傾向にあった（右パネル）。ＰＨＦ１処理は、不溶性ＡＴ８の減少傾向を示し、これは、Chai et al. ((2011) J. Biol. Chem. 286：34457) および Boutajangout et al. ((2011) J. Neurochem. 118：658)による発見を支持する。
【０３７７】
実施例１１：ＩＰＮ００２は、ＩＳＦおよびＣＳＦの両方における遊離ｔａｕレベルを低減する
ＣＳＦおよび間質液（ＩＳＦ）における遊離ｔａｕレベルに対するＩＰＮ００２投与の効果を決定した。Ｐ３０１Ｌマウスを、実施例１０に記載の通りに処理した。ＩＰＮ００２に結合していない、ＩＳＦ中に存在する遊離ｔａｕのレベルを、ＩＰＮ００１を用いて決定した。図２３に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、ＩＰＮ００２で処理したＰ３０１Ｌマウスにおいて、ＩＳＦにおける遊離（ＩＰＮ００２に結合していない）Ｔａｕレベルを低減した（左パネル）。
【０３７８】
ＩＰＮ００２が、ＩＳＦにおけるのと同程度、ＣＳＦにおける遊離Ｔａｕレベルを低減するかどうかを決定するために、Ｐ３０１Ｌマウスを実施例１０に記載の通りに処理し、処理マウスのＣＳＦにおける遊離（ＩＰＮ００２に結合していない）ｔａｕのレベルに対するＩＰＮ００２処理の効果を決定した。結果を図２４に示す。
【０３７９】
未処理の、対照ＩｇＧ処理、ＰＨＦ１処理、およびＩＰＮ００２処理マウスのＣＳＦにおける遊離ｔａｕ（ＩＰＮ００２に非結合；“（ＩＰＮ００２の）遊離ｔａｕ”とも言う）のレベルを、図２４の左パネルに示す。図２４の右パネルに示す通り、ＣＳＦにおける遊離ｔａｕレベルは、ＩＰＮ００２処理マウスのＩＳＦにおける遊離ｔａｕレベルと同程度であり、ＩＳＦのｔａｕ分析が、より臨床的に関連した素材であるＣＳＦとよく相関していることを証明する。
【０３８０】
実施例１２：抗Ｔａｕ抗体は、ｅＴａｕ仲介性ニューロン過活動を低減する
電気生理的分析を実施例５に記載の通りに行った。ｅ−Ｔａｕ誘導性ニューロン過活動に対するＩＰＮ００２の効果を評価した。
【０３８１】
図２５に示す通り、ＩＰＮ００２は、ｅＴａｕ仲介性ニューロン過活動を低減した。
【０３８２】
実施例１３：Ｔａｕフラグメントは、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の可能性を有する個体から得られたＣＳＦに存在する
ＣＳＦサンプルは、全米プロフットボールリーグの元ラインマンから得られ、彼は、行動／認知障害を示し、ＣＴＥを有する可能性があるとみなされていた。該ＣＳＦサンプルを、ｅＴａｕフラグメントの存在についてアッセイした。ｅＴａｕフラグメントを、健常な個人およびＣＴＥの可能性のある個人から集めたＣＳＦより親和的に単離した。単離されたｅＴａｕフラグメントを、ポリアクリルアミド出る電気泳動を用いて分離した。分離したフラグメントを膜に転写した。膜をＩＰＮ００１でプローブ化した。結果を図２６に示し、それは、Ｔａｕフラグメントが、ＣＴＥの可能性のある個体から得られたＣＳＦに存在することを示す。
【０３８３】
実施例１４：ＩＰＮ００２のヒト化変異体の合成Ｔａｕペプチドへの結合
ＩＰＮ００２のヒト化変異体（“ｈｕ−ＩＰＮ００２”）の合成ビオチニル化Ｔａｕペプチド１および２への結合を、固相および液相アッセイの両方にて試験した。
【０３８４】
ペプチド１およびペプチド２のアミノ酸配列は、以下の通りである。
ペプチド１（Ｔａｕアミノ酸１３−２４）：ＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号４９）；
ペプチド２（Ｔａｕアミノ酸１５−４４）：ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫ（配列番号５０）。
【０３８５】
抗体またはビオチニル化ペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水に希釈した。終濃度は以下の通りである：１μｇ／ｍｌ  ｈｕ−ＩＰＮ００２；１μｇ／ｍｌ  ｒＴａｕ３８３（全長組み換えＴａｕ）；５μｇ／ｍｌ（ビオチニル化ペプチド１）；および、５μｇ／ｍｌ（ビオチニル化ペプチド２）。１００μｌのＰＢＳ中の０．１％カゼインを、マルチウェルプレートの複数ウェルに添加した。１５０μｌのｈｕ−ＩＰＮ００２の１μｇ／ｍｌ溶液を添加した。連続希釈を行った。１００μｌのビオチン−ペプチドを、連続希釈した抗体を含むウェルに添加した。マルチウェルプレートを、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３８６】
ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体をウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３８７】
ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、１−１５分間インキュベートした。反応を、１００μｌの１Ｎ硫酸の添加により停止した。４５０ｎｍでの吸光度を読み出した。
【０３８８】
結果を図２７および２８に示し、表６にまとめる。
【表６】
0006446443.tif 000007
【０３８９】
図２９は、完全長組み換えＴａｕ（ｒＴａｕ−３８３）およびホスファターゼ−活性化ドメイン（ＰＡＤ）ペプチド（ｔａｕアミノ酸２−２８；ＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ；配列番号８０）に対するｈｕ−ＩＰＮ００２の結合を示す。図２９に示す通り、ｈｕ−ＩＰＮ００２はＰＡＤペプチドに結合しない。
【０３９０】
図３０は、非ビオチニル化Ｔａｕペプチド１（Ｔａｕアミノ酸１３−２４）および非ビオチニル化ペプチド２（Ｔａｕアミノ酸１５−４４）が、ｈｕ−ＩＰＮ００２への結合に関して、Ｔａｕペプチド１およびＴａｕペプチド２のビオチニル化形態と競合することを示す。これらのデータは、Ｔａｕペプチド１およびＴａｕペプチド２のｈｕ−ＩＰＮ００２への結合が特異的であり、ビオチンの添加によるものではないことを示す。
【０３９１】
実施例１５：病理学におけるＩＰＮ００２のインビボでの効果
この実験において、タウオパチーの遺伝子導入マウスモデル（ｈＴａｕ．Ｐ３０１Ｌ−Ｔｇ）における減少した運動性およびＴａｕ病理への治療的介入の効果を調査した。これらのマウスにおいて、ヒトＴａｕの臨床的変異（Ｐ３０１Ｌ）が、マウスＴｈｙ１プロモーターの制御下ので発現された（ニューロン特異的発現）。行動（梁歩行）を、７月齢、８月齢、８．５月齢および９月齢ならびに実験終了の前日に測定した。実験の終点は、（１）生存、（２）行動：梁歩行パフォーマンスおよび握り締め（clasping）スコア、（３）生化学：全ホモジネート、可溶性および不溶性の脳幹画分における、ｐａｎ−Ｔａｕ、および（４）バイオマーカー：全ホモジネートおよび不溶性脳幹画分における、ＡＴ８、を含む。
【０３９２】
材料および方法
Ｐ３０１Ｌマウス（３−４月齢）を、１）対照ＩｇＧ；２）ＰＨＦ１抗リン酸化Ｔａｕ抗体；または３）ＩＰＮ００２で処理した。ＩｇＧ対照およびＩＰＮ００２抗体を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で１週間に１回、６週間の間、腹腔内に注射した。ＰＨＦ１を、１０ｍｇ／ｋｇで６ヶ月間投与した。ＰＨＦ１は、ホスホ−Ｓｅｒ３９６およびホスホ−Ｓｅｒ４０４を含むエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体である。Santacruz et al. (2005) Science 309：476。
【０３９３】
体重および握り締め（clasping）行動
体重を、処理期間中毎週および解剖時に決定した。体重および握り締めスコアを、７月齢までの実験開始まで毎週記録した。７月齢以降より、マウスをケージ中での行動、体重減少ならびに後ろおよび前足の握り締めの最初のサインについて１週間に２回モニターした。一旦、握り締めのサインが存在したら、体重を毎日決定し、握り締め行動を、‘早期の屠殺（premature sacrifice）’の瞬間までスコア化した。握り締め行動をスコア化するために、約１０秒間、マウスを尾の付け根から約１．５ｃｍ上で持った。握り締めを、４点評価スケールを用いて個々の手足それぞれについてスコア化した。早期に屠殺されたマウスは、最大スコアが原因であった。前肢スコアを、主に、屠殺決定を支持する証拠として用いた。後肢スコアを、握り締めの観察、体重減少およびホームゲージ内での運動性の組合せで、あらかじめ決められた標準に従って作成した。１つの握り締めスコアに統一した左および右後肢スコアを、実験終了時に、処理中の握り締めの発生の評価およびグループ間の差の評価に用いた。癲癇のために早期に死んだマウスは、分析から除かれる。統計的分析を、それぞれ、繰り返しのある二元配置ＡＮＯＶＡとその後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後比較試験を用いて、および屠殺前の握り締めスコアのグループ平均に対するスチューデントのＴ検定を用いて行った。
【０３９４】
梁歩行
運動機能障害および運動学習を決定するために、ベースライン群および処理群の７月齢、８月齢、８．５月齢、および９月齢、ならびに実験終了の前日に、梁歩行試験を行った。所定のマウスの梁上でのバランスを保つ能力および１メートル先まで歩行するのに要する時間は、マウスのバランス、協調、身体状態および運動計画の１つの尺度である。丸い直径１２ｍｍの銅線（梁）を、角度３０°下に置いた。梁の開始エリアは、卓上スタンドで照らされており、ゲージ内の脱出プラットフォームは末端に置かれた。トレーニングトライアル試験のために、より幅の広い梁を用いてマウスをバランスおよびプラットフォームへの歩行について訓練した。訓練試験後、マウスの実行時間を、１ｍ先までに要した時間とした。さらに、歩行観察により、運動機能障害の初期症状（足を滑らす、および腹部の引きずり）を決定した。待ち時間のスコアの統計分析は、二元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後比較試験を用いて行った。
【０３９５】
結果
握り締め行動および梁歩行
ＩＰＮ００２の握り締め行動への効果を図３１に示す。図３１に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、対照ＩｇＧと比較して、握り締めスコアを低減した。ＩＰＮ００２の運動機能への効果は、梁歩行により評価される通り、図３２に示される。図３２に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、対照ＩｇＧと比較して、平均実行時間（average latency）を顕著に減少する（故に、運動機能を改善する）。故に、ＩＰＮ００２処理は、Ｐ３０１Ｌ  ｔａｕ遺伝子導入マウスにおける運動障害を顕著に低減する。同じ統計法を用いると、ＰＨＦ１処理での結果は、統計的有意に達しなかった。
【０３９６】
Ｔａｕレベル
対照ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２で処理後のＰ３０１ＬマウスのＣＳＦにおける、遊離ｔａｕ（ＩＰＮ００２に結合していないｔａｕ）のレベルを評価した。ＣＳＦ中に存在する、ＩＰＮ００２に結合していない遊離ｔａｕのレベルを、ＩＰＮ００１を用いて決定した。データを図３３に示す。図３３に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、対照ＩｇＧで処理したマウスでのレベルと比較して、遊離ｔａｕ（ＩＰＮ００２に結合していない）レベルを９６％低減させた。
【０３９７】
実施例１６：ｅＴａｕ誘導性ニューロン過活動に対するＩＰＮ００２の効果
材料および方法
全細胞パッチクランプ記録を、ヒト初代皮質培養物に行った。ニューロンを、ｐＨ＝７．４、ｍＯｓｍ＝３１０に調整した、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）、ＫＣｌ（２．５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（１０ｍＭ）、スクロース（２０ｍＭ）を含む、人工脳脊髄液を用いて灌流した（２ｍｌ／分）。記録を、ｐＣｌａｍｐ−１０．３データ収集ソフトウェア（Molecular Devices）およびＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Axon Instrument；Foster City CA）を用いて行った。１）ｅＴａｕ１ａ（アミノ酸２−１６６）；２）阻害剤を含む、リン酸化ｔａｕまたはｅＴａｕ；３）対照ＩｇＧ；または４）抗Ｔａｕ抗体、ＰＨＦ１、ＩＰＮ００１、またはＤａｋｏ（ポリクローナル抗Ｃ末端ｔａｕ）のパフアプリケーションを、ＭｉｎｉＳｑｕｉｒｔのｍｉｃｒｏ−ｐｅｒｆｕｓｉｏｎシステム（ＡｕｔｏＭａｔｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いて行った。オンラインデータ分析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０．２  分析ソフトウェア（Molecular Devices）を用いた。記録を、３４−３７℃で行った。
【０３９８】
結果
データを図３４および３５に示す。図３４に示す通り、ＩＰＮ００２は、ｅＴａｕ１ａ誘導性ニューロン過活動を低減した。対照ＩｇＧと“Ｄａｋｏ”（抗Ｃ末端ポリクローナルＡｂ）はどちらも、ニューロン過活動を顕著に低減させる効果はなかった。ＰＨＦ１は、ｅＴａｕ１ａ誘導性ニューロン過活動を低減させなかった。
【０３９９】
ニューロン過活動へのｅＴａｕ１ａの効果を、全長のＰＨＦ１反応性リン酸化Ｔａｕ（ホスホ−Ｔａｕ）のニューロン過活動への効果と比較した。図３５、中パネルに示す通り、全長のＰＨＦ１反応性ホスホ−Ｔａｕは、試験した３細胞のうち、２細胞において、ニューロン過活動を誘導しなかった。試験した第３の細胞は、ベースライン（上パネル）と比較して、僅かなニューロン過活動を示した。これに対して、ｅＴａｕ１ａは、試験した３つ全ての細胞においてニューロン過活動を誘導した（下パネル）。これらのデータを図３６に図示する。
【０４００】
実施例１７：ＩＰＮ００２のＡβレベルへの効果
材料および方法
ｉＰＳＣ誘導性皮質ニューロンからのＡβ分泌
ｉＰＳＣ誘導性皮質ニューロン（ｉＰＳＣ−ＣＮ）を、インビトロで培養した。ｉＰＳＣを健常個体、プレセニリンタンパク質（ＰＳＥＮ１）に変異を有する家族性ＡＤの個体、プレセニリンタンパク質（ＰＳＥＮ２）に変異を有する家族性ＡＤの個体、および散発性ＡＤ（ＡＤ）の個体から作製した。約５５から６０日間培養後、ｉＰＳＣ−ＣＮを、成熟皮質ニューロンを富化するＬ１−ＣＡＭ（ＣＤ１７１）発現に基づいて分類した。分類した細胞を、正常なヒト星状細胞と共に３０日間、共培養した。３０日間の共培養後、ｉＰＳＣ−ＣＮを、週に２回培地を交換しながら、種々の濃度のベータ−部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素（ＢＡＣＥ）阻害剤、対照ＩｇＧ、またはＩＰＮ００２でさらに２５日間処理した。馴化培地を集め、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの高感度ヒトアミロイド−β４０およびアミロイド−β４２ ＥＬＩＳＡで試験して、Ａβ１−４０（“Ａβ４０”）およびＡβ１−４２（“Ａ４２”）を検出した。Ａβ４０およびＡβ４２は、アミロイド前駆体タンパク質の切断産物である。老人斑は、Ａβ４２およびＡβ４０の両方を含む。
【０４０１】
初代ヒト皮質ニューロンからのＡβ分泌
ヒト胎児大脳皮質組織を、Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA)から得て、胎児研究に関する連邦のガイドラインおよび統一死体提供法（Uniform Anatomical Gift. Act）に従った。組織をハンク緩衝食塩水溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で濯ぎ、１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ（ＥＭＤ）の存在下で粉砕し、１００ｍｍの細胞ストレーナーを通して篩い分けした。遠心後、ペレットを、０．０５％  トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen）中に、３７℃で２０分間、再懸濁した。トリプシンは、等量の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地を加えることにより不活性化され、サンプルをＤＮａｓｅの存在下で再び穏やかに粉砕した。遠心後、細胞を平板培地（Neurobasal containing B27, Invitrogen）に再懸濁し、数カウントした。細胞をプレートに播種し、５週間培養し、一定濃度で抗体を含む新鮮培地を、３−４日毎に培地交換しながら１０日間添加して、処理の１０日後に馴化培地を集めた。馴化培地を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、その後、上記の通り、Ａβ４０およびＡβ４２  ＥＬＩＳＡ分析を行った。
【０４０２】
結果
結果を図３７−３９に示す。
図３７に示す通り、ＩＰＮ００２でのｉＰＳＣ−ＣＮの処理は、全てのｉＰＳＣ−ＣＮにより分泌されるＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減させ、一方、対照ＩｇＧは、Ａβ４０またはＡβ４２分泌を低減しなかった。
【０４０３】
図３８は、初代ヒト皮質ニューロンから分泌されるＡβ４０の量に対する種々の抗体の用量依存的効果を示す。図３８に示す通り、初代ヒト皮質ニューロンを１０μｇ／ｍｌまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩＰＮ００１、ＩＰＮ００２またはｈｕ−ＩＰＮ００２（ＩＰＮ００２のヒト化変異体）と共にインキュベートすると、Ａβ４０分泌の量が減少する。対照ＩｇＧとＰＨＦ１は両方とも、Ａβ４０分泌の量に顕著な効果を有さなかった。
【０４０４】
図３９は、初代ヒト皮質ニューロンから分泌されるＡβ４２の量に対する種々の抗体の用量依存的効果を示す。図３９に示す通り、初代ヒト皮質ニューロンを１０μｇ／ｍｌまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩＰＮ００１、ＩＰＮ００２、またはｈｕ−ＩＰＮ００２と共にインキュベートすると、Ａβ４２分泌の量が減少する。対照ＩｇＧとＰＨＦ１は両方とも、Ａβ４２分泌の量に顕著な効果を有さなかった。
【０４０５】
実施例１８：ＩＰＮ００２のヒト化変異体のエピトープマッピング
材料および方法
抗体またはビオチニル化ペプチドを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。終濃度は以下の通りである。１μｇ／ｍｌ  ＩＰＮ００２のヒト化変異体（ｈｕ−ＩＰＮ００２）；１μｇ／ｍｌ  ｒＴａｕ３８３（完全長組み換えＴａｕ）；５μｇ／ｍｌ  ビオチニル化ペプチド。１００μｌのＰＢＳ中の０．１％カゼインを、マルチウェルプレートの各ウェルに添加した。１５０μｌのｈｕ−ＩＰＮ００２の１μｇ／ｍｌ溶液を添加した。ｈｕ−ＩＰＮ００２の連続希釈を行い、マルチウェルプレートの各ウェルをコーティングした。１００μｌのビオチン−ペプチドまたはビオチン−完全長Ｔａｕを、連続希釈した抗体を含むウェルに添加した。マルチウェルプレートを、室温で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０４０６】
ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体をウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０４０７】
ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、１−１５分間インキュベートした。反応を、１００μｌの１Ｎ硫酸の添加により停止した。４５０ｎｍでの吸光度を読み出した。
【０４０８】
結果
データを図４０に示す。図４０に示すデータは、ビオチン−Ｔａｕ１３−２４、ビオチン−Ｔａｕ１５−２４、ビオチン−Ｔａｕ１５−４４、およびビオチン−ホスホＴａｕ１５−２４（完全長Ｔａｕのアミノ酸１８に対応するリン酸化Ｔｙｒを有する）、および完全長Ｔａｕ（ｒＴａｕ３８３）が全て、ｈｕ−ＩＰＮ００２に効率よく結合することを示す。従って、ｈｕ−ＩＰＮ００２は、Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープに、Ｔｙｒ−１８のリン酸化状態に関わらず結合する。
【０４０９】
実施例１９：ＣＳＦにてｔａｕに結合する抗体
ＩＰＮ００２、ＰＨＦ１、直鎖状リン酸化エピトープに特異的な抗体、および対照抗体の、ＣＳＦ中に存在するｔａｕへの結合を評価した。
【０４１０】
ＣＳＦ中に存在するｔａｕに結合する抗体を同定するための結合アッセイを行った。該アッセイを、図４１に図示する。対照ＩｇＧ、直鎖状リン酸化エピトープ（“ポリＡｂ−Ｃ末端ｔａｕ”）に特異的なポリクローナル抗体、ＰＨＦ１、またはＩＰＮ００２を、マルチウェルプレートの複数ウェル上にコーティングした。抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。終濃度は以下の通りである。５μｇ／ｍｌ  ＩＰＮ００２、ＩｇＧ、ＰＨＦ１、またはポリＡｂ−Ｃ末端ｔａｕ。１００μｌのＰＢＳ中の０．１％カゼインを、マルチウェルプレートの各ウェルに添加した。１００μｌのヒトＣＳＦを添加し、室温で１時間インキュベートした。１００μｌのビオチン−ＢＴ２＋ビオチン−ＨＴ７を各ウェルに添加した。ＢＴ２は、ヒトｔａｕのアミノ酸１９４−１９８内のエピトープに結合するマウスモノクローナル抗体である。ＨＴ７は、ヒトｔａｕのアミノ酸１５９−１６３内のエピトープに結合するマウスモノクローナル抗体である。マルチウェルプレートを、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０４１１】
ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体をウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で５回洗浄し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、１−１５分間インキュベートした。反応を、１００μｌの１Ｎ硫酸の添加により停止した。４５０ｎｍでの吸光度を読み出した。
【０４１２】
アッセイを、公知の量の完全長ホスホ−ｔａｕまたは公知の量のｅＴａｕ１ａ（ｔａｕのアミノ酸２−１６６）を用いて定量化した。図４１下パネルに示す通り、アッセイを、完全長ｔａｕ（左下パネル）またはｅＴａｕ−１ａ（右下パネル）を、０ｎｇ／ｍｌ、０．１６ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて行った。図４１左下パネルに示す通り、ＩＰＮ００２、ポリＡｂ−Ｃ末端ｔａｕ、およびＰＨＦ１は、完全長ｔａｕに結合する。図４１右下パネルに示す通り、ＩＰＮ００２のみがｅＴａｕ１ａに結合する。
【０４１３】
上記のアッセイを、１）対照（健常な）患者；２）ＭＣＩ患者；３）軽度ＡＤ患者（“軽度”）；４）中等度ＡＤ患者（“中等度”）；および、重度ＡＤ患者からの、ヒトＣＳＦ中に存在するｔａｕに対するポリＡｂ−Ｃ末端ｔａｕ、ＰＨＦ１、およびＩＰＮ００２の結合を試験するために行った。結果を図４２に示す。図４２に示す通り、ＣＳＦ中に存在するｔａｕには、ＩＰＮ００２が結合するが、ｐＡｂ−ｔａｕ直鎖状エピトープまたはＰＨＦ１は結合しない。データは、１）Ｎ末端ＴａｕフラグメントがＣＳＦ中に存在すること、２）完全長ｔａｕがＣＳＦ中に検出されたこと、および３）ＢＴ２およびＨＴ７エピトープを含むＣ末端ｔａｕフラグメントが、ＣＳＦ中に検出されなかったこと、を示す。
【０４１４】
実施例２０：ＩＰＮ００２のインビボ効果
結果は、Ｐ３０１Ｌ ｔａｕ 遺伝子導入マウスにおける６ヶ月のＴａｕ抗体効力試験から得られた。ＣＳＦ中の顕著に低下した遊離ｔａｕレベル、アストログリオーシスのたんぱく質マーカーの低下したレベル、複数の脳領域に亘るｔａｕ病理およびホスホ−ｔａｕ−エピトープのｔａｕ病理の改善、ならびに改善された行動的／機能的読み出し結果により例示される通り、ＩＰＮ００２が疾患の進行を全体的に阻止することが見出された。ＩＰＮ００２は、抗Ｔａｕ抗体ＰＨＦ１と同程度またはより良好に作用した。最後に、インビボでの確認が、新たに分泌されたｔａｕの作用機序：アミロイドベータレベルの正のフィードバック調節から得られた。この実験は、ＰＨＦ１と比較して、アミロイドベータレベルを調節する、ｅＴａｕ抗体、ＩＰＮ００２の能力を明確に特徴付けた。
【０４１５】
材料および方法
動物実験
Ｐ３０１Ｌ遺伝子導入マウスモデルを用いた。Ｐ３０１Ｌ遺伝子導入マウスは、導入遺伝子としてＰ３０１Ｌ変異した４Ｒ２Ｎ  ヒトｔａｕを発現するマウスＴｈｙ１プロモーター（ニューロン特異的発現）を含む。Ｐ３０１Ｌ遺伝子導入モデルは、脊髄、脳幹、中脳、および皮質におけるｔａｕの加齢依存性高リン酸化（ＡＴ８およびＡＴ１００）を示す。高リン酸化ｔａｕはｔａｕ凝集をもたらし、発症に高い変動があるが、マウスは、６月齢から神経原線維変化を生じる構造変化を示す。病状と共に、これらのマウスは、８−１１月齢の範囲で、後肢握り締め、梁歩行における低下した運動性および屠殺の必要性などの運動障害を徐々に生じる。Terwel et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 280：3963。
【０４１６】
１００匹の無作為化マウスに、６月齢から９．５月齢までの３．５ヶ月の間、毎週、抗体を腹腔内投与した。２０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＩＰＮ００２処理を、陰性対照抗体である２０ｍｐｋ  ＩｇＧ１、および抗Ｔａｕ抗体である１０ｍｐｋ  ＰＨＦ１と比較した。ＰＨＦ１は、ホスホ−Ｓｅｒ３９６およびホスホ−Ｓｅｒ４０４を含むエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体である。Santacruz et al. (2005) Science 309：476。生きているマウスを、握り締め欠失および梁歩行能について調査した。終末期疾患まで急速に進行したマウスを、予め決められた基準を用いて、予定より早く（９．５月齢より前に）殺した。血清、ＣＳＦ、海馬、皮質、中脳および後脳を得た。そして、半脳を組織病理学用に矢状に切片化した。抗体レベルを血清およびＣＳＦにおいて測定した。完全ｔａｕおよび遊離ｔａｕ（ＩＰＮ００２に結合していないｔａｕ；“ＩＰＮ００２の遊離”ｔａｕ）を、ＣＳＦにおいて測定した。ヒトおよびマウスｔａｕの生化学的／組織学的分析を行った。そして、マウスのアミロイドベータ、炎症性およびシナプス性タンパク質マーカー、および炎症部位における遺伝子発現変化、シナプス活性およびニューロン活性マーカーを分析した。全ての分析を、盲検法で行った。
【０４１７】
この実験に用いたマウスの数は、１実験当たり２５−３３匹およびベースラインとして１０匹であった。この実験用に確保された全てのマウスは、コンピューターにより無作為に番号が付され、処理に無作為に割り当てられた。マウス群を表７に示す。
【０４１８】
【表７】
0006446443.tif 000008
【０４１９】
全ての動物実験は、実験用動物の世話および使用のための国際的に認められた原則に完全に従う生命倫理のガイドラインに従って実施された。表８は処理パラメーターを提供する。
【０４２０】
【表８】
0006446443.tif 000009
【０４２１】
体重を、処理中毎週および屠殺時に決定した。握り締めスコアを、７月齢から毎週記録した。７月齢から、マウスを、ケージ内での運動性、重量損失および後肢の握り締めの最初のサインについて、週に２回モニターした。
【０４２２】
握り締め行動。握り締め行動をスコア化するために、マウスを１０秒間、その尻尾の付け根で維持した。後肢握り締めを、３点評価スケールを用いてスコア化した。０、後肢伸張および足指拡大（toe spread）。１、＞５０％の時間の一方の後肢の部分的引き込み。２、＞５０％の時間の両方の後肢の部分的引き込み。３、＞５０％の時間の両方の後肢の完全な引き込み。前肢の握り締めを、３点評価スケールに従ってスコア化する。０、身体の前後での前肢伸張。１、＞５０％の時間の一方の前肢の部分的引き込み。２、＞５０％の時間の両方の前肢の部分的引き込み。３、両方の前肢の完全な引き込み、不動、筋肉喪失（マウスは、“祈っている”）。重度の握り締め表現型を示すマウスを早期に屠殺した。
【０４２３】
梁歩行。梁歩行を、運動機能障害および運動学習を決定するために、７月齢、８月齢、８．５月齢、９月齢および９．５月齢で行った。マウスの梁の上でバランスを保つの能力および１メートル歩くのに要する時間は、そのバランス力、協調、身体状態、および運動計画の１つの尺度である。丸い直径１２ｍｍの銅製の梁を３０°の角度で置いた。出発エリアに照明を当て、ゲージ内の脱出プラットフォームを反対側の終点に置いた。トレーニングトライアル後、マウスの実行時間を計測した。さらに、足を滑らす(foot slip)、および腹部の引きずり(belly dragging)を計数した。
【０４２４】
ベースライン群を、実験開始前に屠殺した。重度の握り締め、体重減少および／または瀕死の状態を示す実験群マウスを、早期に屠殺した（早期屠殺）。残りのマウスは、処理の６ヶ月後に屠殺した（後期屠殺）。
【０４２５】
【表９】
0006446443.tif 000010
【０４２６】
血漿中の遊離ＰＨＦ１を、ｔａｕをコーティングしたプレートに適当に希釈した血漿を添加し、ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体およびＴＭＢを用いるＥＬＩＳＡを用いて検出することにより測定した。遊離ＰＨＦ１アッセイの感度は、ＣＳＦ中の遊離ＰＨＦ１レベルを測定するのに不適当であった。
【０４２７】
血漿およびＣＳＦ中の遊離ＩＰＮ００２を、ｔａｕをコーティングしたプレートに適当に希釈した血漿またはＣＳＦを添加し、ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体およびＴＭＢを用いるＥＬＩＳＡを用いて検出することにより測定した。
【０４２８】
ＣＳＦ中の完全ｔａｕを、ＩＰＮ００２またはＰＨＦ１の何れとも競合しないことが証明されたコーティング用抗Ｔａｕ抗体および検出用抗Ｔａｕ抗体の両方を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【０４２９】
ＣＳＦ中の遊離ｔａｕ（ＩＰＮ００２の）を、ＣＳＦ中のｔａｕを捕捉するために２種の抗Ｔａｕ抗体を用いるホモジニアスＥＬＩＳＡを用いて測定した。これらの抗体の１つがＩＰＮ００２と競合し、故に、ＣＳＦ中のＩＰＮ００２に既に結合しているｔａｕと相互作用しないであろう。
【０４３０】
海馬および皮質を、１０容積重量の冷却ＴＢＳ／Ｒｏｃｈｅのプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル中に均質化することにより分別した。ホモジネートを、１０，０００ｇで１５分間遠心して、細胞残屑を排除した。ＢＣＡタンパク質内容物をホモジネートした。全てのホモジネートを、１ｍｇ／ｍｌに希釈し、対応する画分を同等に希釈した。ホモジネートの一部を、４℃にて、１００，０００ｇで１時間遠心して、可溶性画分（Ｓ１）および不溶性ペレットを作製した。不溶性ペレットを、１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌ／Ｒｏｃｈｅ  プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル中に再懸濁し、再び、１００，０００ｇで１時間、遠心した。Ｓａｒｋｏｓｙｌ可溶化上清をラベル付けした（Ｐ１）。Ｓａｒｋｏｓｙｌ不溶性ペレットを再懸濁して、ラベル付けした（Ｐ２）。後脳を、高塩濃度（０．８５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いること以外、同様に分画化し、次いで、１％  Ｓａｒｋｏｓｙｌを用いてＰ１ペレットを可溶化した。
【０４３１】
ヒトｔａｕホモジニアスＥＬＩＳＡは、ヒトｔａｕについて特に報告し、海馬、皮質および後脳におけるホモジネート、Ｓ１、Ｐ１およびＰ２画分中のヒトｔａｕレベルを決定するために用いられた。
【０４３２】
ヒトＡＴ８ホモジニアスＥＬＩＳＡは、ヒトｐ２０２／２０５ｔａｕについて特に報告し、海馬、皮質および後脳におけるホモジネート、Ｓ１、Ｐ１およびＰ２画分中のヒトＡＴ８レベルを決定するために用いられた。
【０４３３】
ＨＴ７、ＩＰＮ００１、Ｄａｋｏポリクローナル−ｔａｕ、ＡＴ８、ＡＴ１００、抗ｐ２６２、抗ｐ３９６およびＡＤ２、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、シナプシンＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットを、海馬、皮質および／または後脳画分（ホモジネート、Ｓ１、Ｐ１および／またはＰ２）に行った。ゲル間の適切な正規化を保証するために、個々のゲルにおいて１つまたはそれ以上の溶解物対照を流した。全ての分析バンドを、対応するホモジネートサンプルにおけるβ−アクチンに対して正規化した。抗体およびそれらの標的を表１０に示す。
【０４３４】
【表１０】
0006446443.tif 000011
【０４３５】
組織病理学のために、６／３２の無作為化した半脳の矢状断面を、ＡＴ８およびＡＴ１００について染色した。シグナルをＤＡＢ発色で生じさせた。視床下核に付随する不確帯（ブレグマ２．０８−１．１２）および小脳（前葉および後葉部分）に付随する側方小脳核（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ；ブレグマ２．２８−１．３２）の挿入核の両方を定量化した（盲検）。
【０４３６】
マウスアミロイドベータＥＬＩＳＡ（Ａβ４０およびＡβ４２の両方）を、マウス脳ホモジネートにおけるＡβ４０およびＡβ４２の特異的検出のために行った。マウスＡβ４２ＥＬＩＳＡは、マウス脳ホモジネートにおけるレベルの正確な検出に充分な感度ではなかった。マウスＡβ４０ＥＬＩＳＡは、アッセイの線形範囲内にマウスＡβ４０レベルを検出した。マウスＡβ４０ＥＬＩＳＡを、全てのコホートホモジネートおよび可溶性画分（Ｓ１）におけるＡβ４０レベルを決定するために用いた。
【０４３７】
Ｔａｑｍａｎ分析を、炎症のマーカー、シナプスマーカーおよびニューロン活動のマーカーについて行った。表１１に該マーカーを列記する。
【０４３８】
【表１１】
0006446443.tif 000012
【０４３９】
統計法
握り締めおよび梁歩行の時系列(longitudinal)統計分析を、独立した統計専門家により行った。要約すれば、低下の曲線の傾きは、握り締めの欠如および梁歩行の両方について各マウスにより決定し、これらの係数を、グループ間で有意な相違が存在するかどうかを決定するために用いた。複数の方法を、曲線の傾きおよび有意性を決定するために用いた。握り締めに関して、これらには、経時観察完全データ解析法（Longitudinal Complete Case Analysis）、欠測データを調整するジョイントモデル法（Joint Model Adjusting for Missing Data）およびベイズ順序経時的分析（Bayesian Ordered Longitudinal Analysis）が含まれた。梁歩行に関して、これらには、経時観察完全データ解析法、欠測データを調整するジョイントモデル法、30秒の値を用いる経時観察分析法（Longitudinal Analysis using 30 Second Values）、欠測値を含むベイズ経時的分析(Bayesian Longitudinal Analysis with Missing Value)および生存するが、交差しない分析(Alive but Non−cross Analysis)が含まれる。
【０４４０】
生化学、組織学および遺伝子発現についての有意性を決定するための統計分析を、コホート全体、早期の屠殺および遅い屠殺のコホート群について、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、次いでＤｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析を用いて行った。ｔ検定もまた、一元配置ＡＮＯＶＡ分析からの有意性に対するコンパレーターとして、疾患の進行（３．５ヶ月  ベースライン群  対  ９．５ヶ月  ＩｇＧ処置群）について行われた。ＰＨＦ１またはＩＰＮ００２が、大きな変化の傾向があるが、一元配置ＡＮＯＶＡ分析によりこれを反映しないことが明らかであったとき、ＩｇＧとＰＨＦ１またはＩＰＮ００２とを比較するｔ検定は、傾向パターンが、一元配置ＡＮＯＶＡの有意性に達しない終点を出現させるかどうかを決定するためにのみ行われた。
【０４４１】
１１６個の終点のうち、どれが互いに相関しているかを決定するために、相関行列を行った。最も高い相関が、それらのｒ２値とｐ値の組合せに基づいて順にランク付けされた
【０４４２】
結果
抗体レベルおよび標的との結合（Target Engagement）
血漿およびＣＳＦを、屠殺前に得た。血漿中の遊離ＩＰＮ００２および遊離ＰＨＦ１、およびＣＳＦ中の遊離ＩＰＮ００２を、決定した。遊離ＰＨＦ１アッセイは、ＣＳＦ中の遊離ＰＨＦ１レベルを測定するのに十分な感度ではなかった。十分なＣＳＦはまた、完全ｔａｕおよび遊離Ｔａｕ（ＩＰＮ００２に結合していない）の両方のレベルを決定するために得られた。
【０４４３】
血漿遊離ＩＰＮ００２および遊離ＰＨＦ１レベル
Ｐ３０１Ｌ  Ｔａｕ遺伝子導入マウスを、２０ｍｐｋ  ＩｇＧ、２０ｍｐｋ  ＩＰＮ００２または１０ｍｐｋ  ＰＨＦ１で処理した。これらの投与量は、標的との結合試験（Target Engagement）  ＃１から得られた結果を基に選択された。まとめたデータを表１２に示す。
【０４４４】
【表１２】
0006446443.tif 000013
【０４４５】
１０ｍｐｋ  ＩＰＮ００２で４週間、その後、２０ｍｐｋ  ＩＰＮ００２でさらに４週間の処理により、血漿中に平均で０．６５μＭの遊離ＩＰＮ００２が得られることが標的との結合試験  ＃１にて見出された。同じ濃度である０．６５μＭの遊離ＰＨＦ１が、一定の１０ｍｐｋ  ＰＨＦ１にて８週間の処理で得られた。本実験において、表１２に示す通り、平均血漿濃度は、０．５５μＭ  遊離ＰＨＦ１、および０．９μＭ  ＩＰＮ００２であった。従って、遊離ＩＰＮ００２の平均レベルは、血漿中の遊離ＰＨＦ１よりも高かった。
【０４４６】
表１３に示す通り、平均０．９ｎＭの遊離ＩＰＮ００２が、ＩＰＮ００２処理したＰ３０１Ｌ  ｔａｕマウスのＣＳＦ中に存在した。これは、ＣＳＦ：血漿中において０．１％の遊離ＩＰＮ００２である。すなわち、ＣＳＦにおけるＩＰＮ００２の濃度は、血漿中のＩＰＮ００２の濃度の０．１％である（ＣＳＦ中、０．９ｎＭ；血漿中、０．９μＭ）。ＣＳＦ中の０．１％  抗体は、末梢投与後の脳へのアクセスおよびＣＳＦへの流出における、他の抗体について決定された割合と一致している。しかしながら、遊離ＩＰＮ００２アッセイは、ｔａｕに結合していないＩＰＮ００２を報告するのみである。Ｔａｕは、ＣＳＦにてＩＰＮ００２に結合している。従って、０．１％の値は、ＣＳＦにおける全ＩＰＮ００２を実際より少なく示す。遊離ＩＰＮ００２レベルとｔａｕに結合しているＩＰＮ００２レベルを加算することにより、ＣＳＦ中の全ＩＰＮ００２レベルが、血漿レベルの〜０．２％であることが示唆される。方法に記載の通り、遊離ＰＨＦ１アッセイは、ＣＳＦの遊離ＰＨＦ１レベルの測定に十分な感度ではない。
【０４４７】
【表１３】
0006446443.tif 000014
【０４４８】
ＣＳＦ中の完全ｔａｕ
ＣＳＦ中の完全ｔａｕのレベルを、ＰＨＦ１またはＩＰＮ００２の何れかが、これらのレベルを変える可動かを決定するために、測定した。図４３に示す通り、ＣＳＦ中の完全ｔａｕのレベルは、ＰＨＦ１またはＩＰＮ００２処理により顕著に変化しなかった。この結果は、標的との結合試験により得られたデータから予期された。
【０４４９】
図４３：Ｐ３０１Ｌ  ｔａｕ  遺伝子導入マウスのＣＳＦにおける完全ｔａｕレベルを、Ｔａｕ抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。図４３に示す通り、ＣＳＦにおけるｔａｕレベルは、月齢に応じて顕著に増加した（マウスＩｇＧの３月齢のベースラインと比較して）。ＰＨＦ１とＩＰＮ００２は両方とも、完全ｔａｕレベルを変化させた。
【０４５０】
ＣＳＦ中の（ＩＰＮ００２の）遊離Ｔａｕ
ＣＳＦアッセイにおける（ＩＰＮ００２の）遊離Ｔａｕは、方法に記載の通り、２つのＴａｕ抗体のうち１つがＩＰＮ００２と競合するＥＬＩＳＡである。故に、該アッセイは、ＩＰＮ００２に結合しているｔａｕを検出しない。このアッセイは、ＩＰＮ００２が、脳およびＣＳＦ内に入り、その標的を結合したかどうか（すなわち、ｔａｕに結合したかどうか）を示す。ＩＰＮ００２がその標的に結合したとき、アッセイにおけるシグナルは低くなり得る。このアッセイは、ＩＰＮ００２の遊離ｔａｕに特異的であり、故に、（ＰＨＦ１の）遊離Ｔａｕを検出しない。図３３に示す通り、（ＩＰＮ００２の）遊離Ｔａｕレベルは、疾患の進行に伴い増加し、上記のデータと一致している。ＰＨＦ１は、遊離Ｔａｕレベルに影響を与えない。対称的に、ＩＰＮ００２処理は、（ＩＰＮ００２の）遊離Ｔａｕシグナルのレベルを９６％減少させる。これらのデータは、ＩＰＮ００２がその標的であるＣＳＦ  ｔａｕに完全に結合したことを示す。
【０４５１】
ＴａｕおよびホスホＴａｕの生化学および組織学
方法に記載の通り、海馬、皮質、および後脳を、ホモジネート、可溶性（Sarkosylによる可溶）画分、および不溶性（Sarkosylによる不溶性）画分に断片化した。該画分をヒトおよびマウスｔａｕの両方について、多数のホスホｔａｕ  エピトープ（ＡＴ８、ＡＴ１００、ｐ２６２、ｐ３９６およびＡＤ２）について、それらがアルツハイマー病の脳にて高度にリン酸化されていることを分析した。図４４Ａ−Ｈに示す通り、ＩＰＮ００２処理は、マウスＩｇＧ対照抗体での処理と比較して、海馬ホモジネート（図４４Ａ）、海馬Ｓ１フラクション（図４４Ｂ）、海馬Ｐ１フラクション（図４４Ｃ）、海馬Ｐ２フラクション（図４４Ｄ）、皮質ホモジネート（図４４Ｅ）、および皮質Ｐ１フラクション（図４４Ｇ）におけるＡＴ８レベルを低減した。図４４Ａ−Ｈにおけるデータは、ＩＰＮ００２処理が、ＰＨＦ１処理と同程度またはそれよりもＡＴ８レベルを低減したことを示す。図４４Ａ−Ｈに示すデータは、ＢＣＡに対して正規化した。
【０４５２】
図４５Ａに示す通り、ＩＰＮ００２処理は、マウスＩｇＧ対照抗体での処置と比較して、皮質Ｓ１フラクションにおけるヒトｐ３９６−ｔａｕのレベルを低減した。図４５Ｂおよび４５Ｃに示す通り、ＩＰＮ００２処理は、マウスＩｇＧ対照抗体での処理と比較して、皮質ホモジネート（図４５Ｂ）および皮質Ｓ１フラクション（図４５Ｃ）におけるホスホ−ｔａｕ  Ｓ２６２のレベルを低減した。図４５Ｄおよび４５Ｅに示す通り、ＩＰＮ００２での処理は、マウスＩｇＧ対照抗体での処理と比較して、皮質Ｓ１フラクション（図４５Ｄ）におけるマウスｐ３９６−ｔａｕのレベルを低減し、皮質Ｓ１フラクション（図４５Ｅ）におけるマウスＡＴ１００のレベルを低減した。
【０４５３】
Ｔａｕ組織病理（ＡＴ８およびＡＴ１００）を、後脳内の２つの別個の核、視床下核に付随する不確帯（ＳＴＨ）ならびに小脳（前葉および後葉部分）に付随する側方小脳核（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ）の挿入核にて分析した。図４６に示す通り、ＩＰＮ００２は、後期屠殺マウスにおいて、ＡＴ８疾患の病理を顕著に改善した。ＰＨＦ１は、減少させる傾向にあったが、ｔａｕ組織病理を有意に改善しなかった。図４７に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、対照ＩｇＧでの処理と比較して、ＡＴ１００およびＭＣ１疾患の病理を改善した。
【０４５４】
炎症
アストログリオーシスおよび小神経膠細胞症 (microgliosis)は両方とも、ＡＤおよびタウオパチーのモデルにおいて発症する。しかしながら、活性化アストロサイトまたはミクログリアが疾患にて果たす役割は、完全に明らかではない。アストロサイトまたはミクログリアが、Ｐ３０１Ｌ  ｔａｕ遺伝子導入モデルにて活性化されるとき、かかる活性化は、変異したｔａｕの過剰発現に起因し得る。分泌されたｔａｕがＡＤ病理を引き起こすと過程される。分泌されたｔａｕがＡＤ病理を引き起こすとき、それは、グリアの活性化も引き起こし得る。そのようなものとして、該タンパク質が、Ｐ３０１Ｌ遺伝子導入マウスモデルにおいて、アストログリオーシス（ＧＦＡＰ）または小神経膠細胞症（Ｉｂａ１）を増加させるかどうかが決定された。
【０４５５】
図４８Ａおよび４８Ｂに示す通り、ＧＦＡＰタンパク質レベルは、海馬および皮質の両方で疾患の進行に伴い増加した。これらのデータは、アストロサイトが海馬および皮質で活性化されるか、またはそれらが、これらの脳領域に流入したことを示す。ＩＰＮ００２処理は、海馬および皮質の両方におけるＧＦＡＰタンパク質レベルを顕著に低減し、ＩＰＮ００２処理が、アストログリオーシスにおける疾患に関連する増加を低減することを示した。ＰＨＦ１は、海馬におけるＧＦＡＰを顕著に低減したが、皮質においては低減しなかった。
【０４５６】
ミクログリアのマーカーであるＩｂａ１タンパク質レベルを、海馬および皮質の両方で測定した。図４９Ａおよび４９Ｂに示す通り、Ｉｂａ１は、海馬における疾患の進行にて増加しなかったが、皮質において増加した。ＩＰＮ００２処理は、疾患の進行に関して、Ｉｂａ１タンパク質レベルに影響を与えなかった。対称的に、ＰＨＦ１処理は、Ｉｂａ１タンパク質レベルを顕著に低減した。データは、ＩＰＮ００２およびＰＨＦ１の作用機序の違いを示唆する。
【０４５７】
アミロイドベータレベルの調節
実施例１７に示す通り、ｉＰＳＣ−ＣＮのＩＰＮ００２での処置は、全てのｉＰＳＣ−ＣＮより分泌されるＡβ４０およびＡβ４２のレベルを低減したが、対照ＩｇＧでの処置は、Ａβ４０またはＡβ４２分泌を低減しなかった。そこで、ＩＰＮ００２がインビボにおいてもＡβレベルを調節するかどうかを決定した。Ｐ３０１Ｌマウスモデルにおいて、ヒトＡＰＰの過剰発現はなかった、従って、マウスＡβレベルが測定された。マウスＡβ４２  ＥＬＩＳＡの感度は、これらのホモジネート中のＡβ４２レベルを測定するのに十分ではなかった。しかしながら、マウスＡβ４０  ＥＬＩＳＡは、十分な感度であり、故に、ｔｈｅホモジネートおよび上清画分におけるマウスＡβ４０レベルを決定するために用いられた。マウスＡβ４０レベルは、疾患の進行に伴い増加する。Ａβ４０レベルの観察された増加は、ｔａｕおよび／または年齢に依存し得る。図５０Ａおよび５０Ｂに示す通り、ＩＰＮ００２処置は、ホモジネート（図５０Ａ）および可溶性フラクション（図５０Ｂ）の両方においてＡβ４０レベルを低下させた。
【０４５８】
図５０Ａおよび５０Ｂのデータは、ｔａｕの過剰発現（多分、加齢と関係する）が、Ａβ４０レベルの増加と関連して疾患の進行をもたらすことを示す。データは、分泌されたｔａｕがＡβレベルの増加をもたらす原因であることを示唆し、同様に、ＩＰＮ００２がｅＴａｕ機能を阻止することにより阻害することを示唆する。これに対して、ＰＨＦ１、非ｅＴａｕ結合抗体は、Ａβレベルに影響を与えない。
【０４５９】
運動機能
ＩＰＮ００２処理の運動機能に対する効果は、握り締めおよび梁歩行試験により評価される通り、決定された。データを図３１、３２、５１、および５２に示す。
【０４６０】
図３１に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、マウスＩｇＧ対照での処理と比較して、握り締めスコアを改善した。
【０４６１】
図３２および５１に示す通り、ＩＰＮ００２処理は、マウスＩｇＧ対照での処理と比較して、梁歩行試験における平均実行時間（average latency）を改善し（図３２）、梁を歩行することができないマウスの割合を減らした（図５１）。
【０４６２】
実施例２１：エピトープマッピング
ペプチド結合および競合アッセイを、上記の実施例１８に記載の通りに行った。
以下のペプチドを用いた。
ＩＰＩＧ−１：ＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号８１；ｔａｕのアミノ酸９−２４）；
ＩＰＩＧ−２：ＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫ（配列番号４９；ｔａｕのアミノ酸１３−２４）；
ＩＰＩＧ−３：ＡＧＴＹＧＬＧＤ（配列番号８２；ｔａｕのアミノ酸１５−２２）；
ＩＰＩＧ−４：ＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫ（配列番号５０；ｔａｕのアミノ酸１５−４４）；
ＰＡＤペプチド：ＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ（配列番号８０；ｔａｕのアミノ酸２−１８）。
結果を図５３−５５に示す。
【０４６３】
図３０は、非ビオチニル化ｔａｕペプチドがｔａｕのビオチニル化形態と競合することを示す。上パネルは、ビオチニル化Ｔａｕ１３−２４ペプチド（ＩＰＩＧ−２；配列番号４９）と非ビオチニル化Ｔａｕ１３−２４のｈｕ−ＩＰＮ００２への結合に対する競合を示す。
【０４６４】
図５２は、完全長ｔａｕ、ＩＰＩＧ−１、ＩＰＩＧ−２、およびＩＰＩＧ−４がｈｕ−ＩＰＮ００２に結合したことを示す。残基２３および２４を欠くＩＰＩＧ−３、およびＰＡＤは、ｈｕ−ＩＰＮ００２に結合しなかった。従って、残基２３および２４は、ｈｕ−ＩＰＮ００２結合に必要なことが明らかである。
【０４６５】
図５３は、ｅＴａｕ−４ペプチドがｈｕ−ＩＰＮ００２に結合することを示す。しかしながら、ＰＡＤ（ｔａｕ２−１８）、Ｔａｕ１５−２２、Ｔａｕ１９−２８、およびＴａｕ２１−３１ペプチドは、ｈｕ−ＩＰＮ００２に結合しない。
【０４６６】
データは、残基１５−２４がｈｕ−ＩＰＮ００２結合に必須なことを示す。
【０４６７】
実施例２２：ＨＦＮにおけるＡβ４０およびＡβ４２レベルに対する合成ｅＴＡＵ４の効果
ヒト胎児ニューロン（ＨＦＮ）によるＡβ４０およびＡβ４２の産生に対する合成ｅＴａｕ４ポリペプチドの効果を評価した。ＨＦＮを、５日（ｄ０５）、１０日（ｄ１０）、１５日（ｄ１５）、または２０日（ｄ２０）の期間、５００ｎＭ  ｅＴａｕ４（配列番号４８）、１μＭ  組換えＴａｕ−３８３、またはｍｏｃｋ対照ポリペプチドを含む培養培地中で培養した。該培養培地中に存在するＡβ４０およびＡβ４２の量を上記の通りに測定した。結果を図５５Ａおよび５５Ｂに示す。
【０４６８】
図５５Ａに示す通り、１５日目および２０日目のＨＦＮの馴化培地中のＡβ４０の量は、５００ｎＭ  ｅＴａｕ４で処理したＨＦＮにおいて減少した。図５５Ｂに示す通り、１５日目および２０日目のＨＦＮの培養培地中のＡβ４２の量は、５００ｎＭ  ｅＴａｕ４で処理したＨＦＮにおいて増加した。
【０４６９】
実施例２３：ＨＦＮにおけるＡβ４０およびＡβ４２レベルに対する抗ＴＡＵ抗体の効果
ＨＦＮによるＡβ４０およびＡβ４２の産生に対する抗Ｔａｕ抗体の効果を評価した。ＨＦＮを、種々の抗Ｔａｕ抗体または対照抗体を、終濃度３０μｇ／μＬで含む培養培地中、２０日間培養した。
【０４７０】
対照抗体および抗Ｔａｕ抗体は以下の通りである。
１）ｍｏ  ＩｇＧ：（非特異的マウスＩｇＧ）；
２）ｈｕ  ＩｇＧ（非特異的ヒトＩｇＧ）；
３）ＩＰＮ００２（Ｔａｕのアミノ酸１５−２４内のエピトープを認識する抗Ｔａｕ抗体であって、該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
４）ＩＰＮ００２のヒト化変異体（ｈｕ−ＩＰＮ００２）；
５）ＩＰＮ００２のヒト化変異体（ｈｕ−ＩＰＮ００２  ｖ１）；
６）ＩＰＮ００２のヒト化変異体（ｈｕ−ＩＰＮ００２  ｖ２）；
７）免疫原としてＴａｕ  ２−１８ペプチドを用いて作製されたＴＮＴ−１−マウスモノクローナル抗体（例えば、Kanaan et al. ((2011) J. Neurosci. 31：9858)を参照）（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
８）Ｔａｕのアミノ酸１９−４６内のエピトープを認識することが報告されている、５Ａ６−マウスモノクローナル抗体（例えば、Horowitz et al. (2004) J. Neurosci. 24：7895を参照）（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
９）Ｔａｕのアミノ酸２８−１２６内のエピトープを認識するＭＣ１−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
１０）Ｔａｕのアミノ酸ＰＰＧＱＫ（Ｔａｕのアミノ酸１５９−１６３；例えば、ＵＳＰＮ  ７，３８７，８７９参照）を含むエピトープを認識することが報告されている、ＨＴ７−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
１１）Ｔａｕのアミノ酸ＲＳＧＹＳ（Ｔａｕのアミノ酸１９４−１９８；例えば、ＵＳＰＮ  ６，２３２，４３７参照）を含むエピトープを認識することが報告されている、ＢＴ２−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
１２）Ｓｅｒ２１０−Ａｒｇ２３０内のエピトープを認識することが報告されている（例えば、Carmel et al. (1996) J. Biol. Chem. 271：32789参照）、Ｔａｕ５−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
１３）ｔａｕのＣ末端内のエピトープを認識する、ＩＰＮ００８−抗Ｔａｕ抗体；
１４）ホスホ−Ｓｅｒ３９６およびホスホ−Ｓｅｒ４０４を含むエピトープを認識することが報告されている（例えば、Santacruz et al. (2005) Science 309：476を参照）、ＰＨＦ１−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；
１５）ｔａｕの２Ｎインサート内のエピトープを認識する、ＤＣ３９ｎ１−マウスモノクローナル抗体；
１６）Ｔａｕのアミノ酸１５０−１９０内のエピトープを認識する、ＤＡ３１−マウスモノクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）；および、
１７）Ｔａｕのアミノ酸２４３−４４１内のエピトープを認識する、Ｄａｋｏ−ポリクローナル抗体（該アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒアミノ酸配列に基づく）。
【０４７１】
種々の抗体によって認識されるエピトープの位置を示す図を図５９に提供する。図６１は、２Ｎインサートを含まないｅＴａｕ４のアミノ酸配列と、２Ｎインサート（２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕのアミノ酸４５から１０２）を含まないＴａｕの２Ｎ４Ｒ形態のアミノ酸配列とのアライメントを提供する。
【０４７２】
２０日の培養期間の最後に、培養培地中に存在するＡβ４０およびＡβ４２の量を上記の通り測定した。結果を図５６Ａおよび５６Ｂに示す。
【０４７３】
図５６Ａに示す通り、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のエピトープに特異的な抗体は、ＨＦＮによるＡβ４０の産生を低減する。図５６Ｂに示す通り、ｅＴａｕのアミノ酸２−６８内のエピトープに特異的な抗体は、ＨＦＮによるＡβ４２の産生を低減する。
【０４７４】
ＨＦＮによるＡβ４０およびＡβ４２の産生に対する抗Ｔａｕ抗体ＤＡ３１の効果を評価した。ＨＦＮを、種々の抗Ｔａｕ抗体または対照抗体を終濃度３０μｇ／μＬで含む培養培地中で２０日間培養した。結果を図５７Ａおよび５７Ｂに示す。
【０４７５】
ＤＡ３１は、Ｔａｕのアミノ酸１５０−１９０内のエピトープに結合するマウスのモノクローナル抗体である（アミノ酸番号は、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕに基づく）。図５７Ａに示す通り、ＤＡ３１はＨＦＮによるＡβ４０の産生を低減させるが、ＨＴ７（アミノ酸１５９−１６３内のエピトープに特異的な抗体）は低減させない。図５７Ｂに示す通り、ＤＡ３１は、ＨＦＮによるＡβ４２の産生を低減させるが、ＨＴ７は低減させない。
【０４７６】
Ａβ４０およびＡβ４２の産生に対する経時的な抗Ｔａｕ抗体の効果を評価した。ＨＦＮを、上記の種々の抗体を含む培養培地中、５日（ｄ５）、１０日（ｄ１０）、１５日（ｄ１５）、または２０日（ｄ２０）の期間、培養した。対照ＩｇＧ、ＭＣ１、ＩＰＮ００２、ＰＨＦ１およびＤＣ３９ｎ１（“Ｎ１インサート”）の効果を試験した。ＤＣ３９ｎ１は、Ｔａｕの２Ｎインサート内（例えば、図６１に記載の２Ｎ４Ｒ  Ｔａｕアミノ酸配列のアミノ酸４５−１０２内）のエピトープに結合するマウスモノクローナル抗体である。培養期間の最後に、培養培地中に存在するＡβ４０およびＡβ４２の量を上記の通りに測定した。結果を図５８Ａおよび５８Ｂに示す。
【０４７７】
図５８Ａに示す通り、ＭＣ１およびＩＰＮ００２は、ＨＦＮによるＡβ４０の産生を低減させるが、ＰＨＦ１またはＤＣ３９ｎ１（Ｎ１インサート）は低減させない。図５８Ｂに示す通り、ＭＣ１およびＩＰＮ００２は、ＨＦＮによるＡβ４２の産生を低減させるが、ＰＨＦ１またはＤＣ３９ｎ１は低減させない。
【０４７８】
実施例２４：非ヒト哺乳動物のＣＳＦにおけるＡβレベルに対するＩＰＮ００２のヒト化変異体の効果
非ヒト哺乳動物のＣＳＦにおけるＡβレベルに対する、ＩＰＮ００２のヒト化変異体であるｈｕ−ＩＰＮ００２の効果を評価した。オスのカニクイザル（Macaca fascicularis）に、ｈｕ−ＩＰＮ００２を５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇの用量で単一の遅延ボーラス注入により投与した。脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを注入後の種々の時間点で回収した。ＣＳＦサンプルを、市販のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ａβ４０の存在を測定した。結果を図６０に示す。値は、特定の時間点で回収した全てのサンプルの平均を示す（平均±平均の標準誤差）。
【０４７９】
図６０に示す通り、単一の２０ｍｇ／ｋｇ  ｈｕ−ＩＰＮ００２注入は、約１５０時間後にＣＳＦ中のＡβ４０レベルを低減させた。ＣＳＦ中のＡβ４０レベルは、約３５０時間まで低減し続けた。
【０４８０】
本発明は、その特定の態様を引用して記載されているが、種々の変更が行われ得て、同等物は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置き換えることができることが、当業者には理解されるべきである。さらに、多くの改良が、本発明の目的、精神および範囲に、特定の状況、材料、物質の組成、方法、１工程または複数工程を適合させて行うことができる。全てのそのような改良は、本明細書に添付した特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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