(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｉｓ−４−ヘプテナールを有効成分とする、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤であって、該ポリスルフィド化合物が、下記式（I）：
R1−[S]n−R2        (I)
（式中、Ｒ1とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）
で表される、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤。
【請求項２】
前記Ｒ1とＲ2が、同一又は異なって、炭素数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基であり、ｎは２又は３である、請求項１記載のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤。
【請求項３】
前記ポリスルフィド化合物がジメチルジスルフィド又はジメチルトリスルフィドである、請求項１又は２記載のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
排水口や生ごみなどの廃棄物から発生する揮発性硫黄化合物は、低濃度でも人々に不快感を与える悪臭成分である。これらの揮発性硫黄化合物は、汚水や廃棄物などに含まれるシステインやメチオニンといった含硫黄アミノ酸もしくはそれらを含むタンパク質が、細菌がもつメチオニンリアーゼやシステインリアーゼなどの代謝酵素の作用で分解を受けることにより発生する。例えば、不快臭の原因となる揮発性硫黄化合物のうち、メチルメルカプタンは、メチオニンからメチオニンリアーゼの作用によって生成され、硫化水素は、システインからシステインリアーゼの作用によって生成される。さらにメチルメルカプタンや硫化水素からは、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィドなどのポリスルフィド化合物が酵素的あるいは酸化的に生成され、これらも悪臭の原因となる。
【０００３】
特許文献１には、排水口等の洗浄、殺菌、防汚、消臭用の組成物に、消臭剤又は芳香剤として香料成分を添加することが開示されている。特許文献２には、特定の香料成分により、メチオニンからメチルメルカプタンを生成する酵素、又はシステインから硫化水素を生成する酵素の作用を阻害し、廃棄物や排水口等から発生する揮発性硫黄化合物による悪臭を抑制することが開示されている。
【０００４】
特許文献３には、有機スルフィドの酸化物（ＤＭＳＯなど）の臭気を防止するため、有機スルフィドの酸化物に、モノエステル、ジエステル、及び／又はトリエステル、アルコール、アルデヒド、ケトンならびにテルペンから選択される少なくとも１つの化合物を含む臭気遮蔽剤を添加することが記載されている。
【０００５】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００６】
したがって、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの抑制は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭と異なり、特定の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないという利点を有している。
【０００７】
嗅覚受容体アンタゴニズムの考え方に基づき、嗅覚受容体の活性を指標として悪臭抑制物質を同定する方法がこれまでにいくつか開示されている。例えば、特許文献４〜５には、ヘキサン酸やスカトール等の悪臭を抑制する物質を、それらの悪臭物質に特異的に応答する嗅覚受容体の活性を指標として探索することが開示されている。特許文献６には、特定のカルボン酸に応答する嗅覚受容体の活性を指標として、汗臭を抑制する物質を探索することが開示されている。特許文献７には、イソ吉草酸やその等価体の存在下で嗅覚受容体をコードするポリペプチドの活性を測定することで、当該ポリペプチドの機能を調節する薬剤を同定する方法が開示されている。特許文献８には、嗅覚受容体をコードするポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定することにより、嗅覚の感覚に関連する化合物について化学物質のライブラリーをスクリーニングする方法が開示されている。
【０００８】
しかしながら、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づいて、上記廃棄物や排水口等から発生する揮発性硫黄化合物の悪臭を抑える技術については、これまで報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２０６８８２号公報
【特許文献２】特開２０１０−００４９７１号公報
【特許文献３】特許第５５７５２４１号公報
【特許文献４】特開２０１２−０５０４１１号公報
【特許文献５】特開２０１２−２４９６１４号公報
【特許文献６】米国特許公開第２０１３／０３３６９１０号
【特許文献７】国際公開公報第２００６／０９４７０４号
【特許文献８】特表２００４−５０４０１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
排水口や生ごみなどの廃棄物からは、細菌による腐敗に伴い様々な揮発性硫黄化合物が発生し、悪臭の原因となる。その悪臭の主な原因物質の１種が、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィドなどのポリスルフィド化合物である。したがって、これらのポリスルフィド化合物の臭いの制御が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、ポリスルフィド化合物に特異的に応答する嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２の応答を抑制する物質が、嗅覚受容体アンタゴニズムにより、当該ポリスルフィド化合物の臭いを抑制することができることを見出した。
【００１２】
したがって、本発明は、２−メチルブタン酸ブチル、α−テルピネン、ジペンテン、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、トリメチルヘキシルアルデヒド及び（＋）−リモネンオキシドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤であって、該ポリスルフィド化合物が、下記式（I）：
R1−[S]n−R2        (I)
（式中、Ｒ1とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）
で表される、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、嗅覚受容体アンタゴニズムにより、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィドなどのポリスルフィド化合物の臭いを選択的に消臭することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】嗅覚受容体のスルフィド化合物に対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す。データは３回の独立した実験からの平均値を示す。Ａ：ジメチルジスルフィドに対する応答、Ｂ：ジメチルトリスルフィドに対する応答。
【図２】種々の濃度のスルフィド化合物に対する嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２の応答。Ａ：ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）に対する応答、Ｂ：ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）に対する応答。それぞれｎ＝３、エラーバー＝±ＳＥ。
【図３】メチルメルカプタンに対するＯＲ４Ｓ２の応答。＋；試験物質あり（３ｍＭ）、−；試験物質なし。ｎ＝３、エラーバー＝±ＳＤ。
【図４】各種試験物質による嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）応答抑制効果。横軸は試験物質の濃度、縦軸はＤＭＤＳに対するＯＲ４Ｓ２の応答（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ％）を示す。ｎ＝３、エラーバー＝±ＳＥ。
【図５】各種試験物質による嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２のジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）応答抑制効果。縦軸は試験物質存在下でのＤＭＴＳに対するＯＲ４Ｓ２の応答（ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ）を示す。−；試験物質なし。ｎ＝３、エラーバー＝±ＳＥ。
【図６】試験物質によるＤＭＤＳ臭抑制効果の官能評価結果。ＤＭＤＳ＝ＤＭＤＳのみ、Ｖｅｈｉｃｌｅ＝ミネラルオイルのみ。ｎ＝１０、エラーバー＝ＳＥ。
【図７】試験物質によるＤＭＴＳ臭抑制効果の官能評価結果。ＤＭＴＳ＝ＤＭＴＳのみ、Ｖｅｈｉｃｌｅ＝ミネラルオイルのみ。ｎ＝１１、エラーバー＝ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「嗅覚受容体アンタゴニズムによる臭いの抑制」とは、目的の臭い分子と他の分子をともに適用することにより、当該他の分子によって目的の臭い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される臭いを抑制する手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによる臭いの抑制は、同様に他の分子を用いる手段であっても、芳香剤による消臭のように、目的の臭いを香料の香気によって隠蔽する手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによる臭いの抑制の一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の臭いをもたらす臭い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該臭い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される臭いを抑制することができる。
【００１６】
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。
【００１７】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１９】
本発明によってその臭いが抑制される対象となる「ポリスルフィド化合物」は、下記式（I）で表される化合物である。以下の本明細書において、当該対象の「ポリスルフィド化合物」を“式（I）のポリスルフィド化合物”、又は単に“式（I）化合物”と称することがある。
R1−[S]n−R2        (I)
【００２０】
上記式（I）中、Ｒ1とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示す。該炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、及びヘキシルが挙げられる。該炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルケニル基の例としては、ビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、及びメチルブテニルが挙げられる。好ましくは、該Ｒ1とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、該炭素数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ビニル、プロペニル、アリル、及びブテニルが挙げられる。より好ましくは、該Ｒ1とＲ2は、同一又は異なって、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルであり、なお好ましくは、Ｒ1とＲ2はメチルである。
【００２１】
上記式（I）中、ｎは、２〜５の整数を示し、好ましくは２又は３を示す。
【００２２】
好ましくは、式（I）のポリスルフィド化合物は、式（I）で表される構造を有する揮発性物質である。より好ましい式（I）のポリスルフィド化合物の例としては、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）などを挙げることができる。
【００２３】
本発明により抑制される「ポリスルフィド化合物の臭い」とは、上述した式（I）のポリスルフィド化合物により生じる臭いであり、好ましくは、ＤＭＤＳ又はＤＭＴＳにより生じる臭いである。代表的には、本発明により抑制される「ポリスルフィド化合物の臭い」とは、腐敗した生ごみ、汚水、又は排水口から発せられる悪臭であり得る。
【００２４】
後述の実施例に示されるとおり、式（I）のポリスルフィド化合物は、嗅覚受容体の中で主にＯＲ４Ｓ２（ＧＩ：１１６５１７３２４：配列番号１）によって認識されていることが明らかにされた。したがって、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２の応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づいて、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いを選択的に抑制することができると考えられた。本発明者らは、この考えに基づいて、式（I）化合物に対するＯＲ４Ｓ２の応答を抑制するアンタゴニスト物質を探索した。その結果、探索された物質が、実際に式（I）のポリスルフィド化合物の臭いを抑制する作用を有し、該式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制のために使用できることが見出された。
【００２５】
したがって、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２の応答を抑制するＯＲ４Ｓ２アンタゴニスト（拮抗剤）を、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制のために使用することができる。ＯＲ４Ｓアンタゴニストは、嗅覚受容体アンタゴニズムにより式（I）のポリスルフィド化合物に対するＯＲ４Ｓ２の応答を抑制することで、個体の該式（I）化合物による臭いの認識に変化を生じさせ、結果として、該式（I）化合物の臭いを抑制することができる。
【００２６】
ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストの例としては、下記表Ａ記載の化合物が挙げられる。
【００２７】
[表Ａ]
２−メチルブタン酸ブチル（2-Methyl butyl n-butyrate、又はButyl 2-methylbutanoate）
α−テルピネン（alpha-Terpinene、又はp-Mentha-1,3-diene）
ジペンテン（Dipentene）
ｃｉｓ−４−ヘプテナール（Cis-4-Heptenal、又は(Z)-Hept-4-enal）
１，４−シネオール（1,4-Cineole）
トリメチルヘキシルアルデヒド（Trimethylhexyl aldehyde、又は3,5,5-Trimethylhexanal）
（＋）−リモネンオキシド（(+)-Limonene oxide）
【００２８】
より詳細には、上記表Ａ記載の化合物は、ＯＲ４Ｓ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対するアンタゴニストである。本明細書において「ＯＲ４Ｓ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチド」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（I）のポリスルフィド化合物、好ましくはＤＭＤＳ及びＤＭＴＳに対する応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドをいう。
【００２９】
表Ａ記載の化合物は、これまで香料素材として知られていたが、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストとしての機能や、式（I）化合物の臭いを選択的に抑制する機能を有することは知られていなかった。
【００３０】
表Ａ記載の化合物は、いずれも市販のものを購入することができる。例えば、シグマアルドリッチ社、東京化成工業社などから入手することが可能である。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを有効成分とする、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤を提供する。言い換えれば、本発明のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤は、ＯＲ４Ｓ２のアンタゴニストとして働くことができる物質である。
【００３２】
一実施形態において、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制のための有効成分として、該式（I）化合物の臭いの抑制が所望されるあらゆる物質に対して適用され得るか、又は該式（I）化合物の臭いの抑制が所望されるあらゆる環境下において使用され得る。
【００３３】
一実施形態において、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制のための有効成分として、該式（I）化合物を含有するか又は含有する可能性のある物質に添加され得る。
【００３４】
別の一実施形態において、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤の製造のために使用され得る。一実施形態において、該式（I）化合物の臭いの抑制剤は組成物であり、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、該組成物に、該式（I）化合物の臭いを抑制するための有効成分として含有される。あるいは、該式（I）化合物の臭いの抑制剤は、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストから本質的に構成されていてもよい。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明で使用されるＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、表Ａ記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種である。例えば、本発明で使用されるＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、表Ａ記載の化合物のいずれか単独もしくはいずれか２つ以上の組み合わせである。
【００３６】
本発明により提供される式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤は、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストとともに、さらに他の消臭成分、防臭成分又は芳香成分、あるいは消臭剤又は防臭剤に一般的に添加される任意の成分を、その目的に応じて適宜含有していてもよい。このような他の成分としては、例えば、特許文献１に記載の排水口等の洗浄、殺菌、防汚、消臭用の組成物に含有され得る香料成分や、特許文献２に記載の廃棄物用又は排水口用の悪臭発生抑制剤に含まれ得る香料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明は、式（I）のポリスルフィド化合物と、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストとを共存させる工程を含む、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制方法を提供する。
【００３８】
一実施形態において、上記本発明の方法における上記共存させる工程は、式（I）のポリスルフィド化合物の存在下で、該式（I）化合物の臭いの抑制を必要とする個体、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによる式（I）化合物の臭いの抑制を必要とする個体に、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを適用することを含む。適用された該アンタゴニストは、該個体のＯＲ４Ｓ２に作用し、該式（I）化合物に対する該ＯＲ４Ｓ２の応答を抑制する。結果、嗅覚受容体アンタゴニズムによって、該式（I）の化合物の臭いが抑制される。
【００３９】
別の実施形態において、上記本発明の方法における上記共存させる工程は、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制を必要とする個体、好ましくは嗅覚受容体アンタゴニズムによる式（I）化合物の臭いの抑制を必要とする個体に対し、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを適用することと、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを適用した個体を該式（I）化合物に曝すこととを含む。予め適用された該アンタゴニストは、該個体のＯＲ４Ｓ２に作用し、後から曝露される該式（I）化合物に対する該ＯＲ４Ｓ２の応答を抑制する。結果、嗅覚受容体アンタゴニズムによって、該式（I）化合物の臭いが抑制される。
【００４０】
上記本発明の方法のより詳細な一実施形態においては、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制を必要とする個体に携行される。これによって、該個体に該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストが適用される。該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストが適用された個体が該式（I）化合物に曝されても、ＯＲ４Ｓ２は該ポリスルフィド化合物に対して低い応答を示し、結果として該式（I）化合物の臭いは抑制される。
【００４１】
別の詳細な一実施形態においては、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物が存在しているか又はその可能性のある環境に配置される。これによって、当該環境にいる式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制を必要とする個体に、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストが適用される。該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストが適用された個体が該式（I）化合物に曝されても、ＯＲ４Ｓ２は該ポリスルフィド化合物に対して低い応答を示し、結果として該式（I）化合物の臭いは抑制される。
【００４２】
また別の詳細な一実施形態においては、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、式（I）のポリスルフィド化合物を含有するか又は含有する可能性のある物質に添加される。好ましくは、式（I）のポリスルフィド化合物を含有するか又は含有する可能性のある物質と、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストとの組成物が調製され、該組成物が該式（I）化合物の臭いの抑制を必要とする個体に適用される。該組成物が該式（I）化合物の臭いを発した場合でも、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストがＯＲ４Ｓ２の応答を抑制するため、結果として該式（I）化合物の臭いは抑制される。
【００４３】
好ましい実施形態において、上記本発明の方法に適用されるＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、表Ａ記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種である。別の好ましい実施形態においては、上述した、表Ａ記載の化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する組成物が、該ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストとして適用される。
【００４４】
上記本発明の方法において、上記個体（subject）は哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。本発明の方法における、式（I）のポリスルフィド化合物の臭いの抑制を必要とする個体のより詳細な例としては、家庭や職場において生ごみを扱う人、ごみの清掃や収集作業に従事する人、排水管や汚水処理施設の点検、清掃又は工事に従事する人、などが挙げられる。
【００４５】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４６】
〔１〕嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを有効成分とする、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤。
【００４７】
〔２〕ポリスルフィド化合物の臭いの抑制のための、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストの使用。
【００４８】
〔３〕ポリスルフィド化合物の臭いの抑制剤の製造のための、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストの使用。
【００４９】
〔４〕ポリスルフィド化合物の臭いの抑制を必要とする個体に、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストを適用することを含む、ポリスルフィド化合物の臭いの抑制方法。
【００５０】
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ポリスルフィド化合物は、下記式（I）：
R1−[S]n−R2        (I)
（式中、Ｒ2とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）
で表される化合物である。
【００５１】
〔６〕上記〔５〕において、上記Ｒ1とＲ2は、
好ましくは、同一又は異なって、炭素数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、
より好ましくは、同一又は異なって、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを示し、
さらに好ましくは、Ｒ1とＲ2はメチルを示す。
【００５２】
〔７〕上記〔５〕又は〔６〕において、上記ｎは、好ましくは２又は３を示す。
【００５３】
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ポリスルフィド化合物は、ジメチルジスルフィド又はジメチルトリスルフィドである。
【００５４】
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ポリスルフィド化合物の臭いは、腐敗した生ごみ、汚水、又は排水口から発せられる悪臭である。
【００５５】
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストは、２−メチルブタン酸ブチル、α−テルピネン、ジペンテン、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、トリメチルヘキシルアルデヒド及び（＋）−リモネンオキシドからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００５６】
〔１１〕２−メチルブタン酸ブチル、α−テルピネン、ジペンテン、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、トリメチルヘキシルアルデヒド及び（＋）−リモネンオキシドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、ＯＲ４Ｓ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対する拮抗剤。
【００５７】
〔１２〕ＯＲ４Ｓ２又はそれと同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドに対するアンタゴニストとしての、２−メチルブタン酸ブチル、α−テルピネン、ジペンテン、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、トリメチルヘキシルアルデヒド及び（＋）−リモネンオキシドからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【００５８】
〔１３〕上記〔１１〕又は〔１２〕において、
好ましくは、ＯＲ４Ｓ２が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる嗅覚受容体ポリペプチドであり、かつ
好ましくは、ＯＲ４Ｓ２と同等な機能を有する嗅覚受容体ポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記式（I）で表されるポリスルフィド化合物に対する応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドである、
R1−[S]n−R2        (I)
（式中、Ｒ2とＲ2は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、ｎは２〜５の整数を示す）。
【００５９】
〔１４〕上記〔１３〕において、上記Ｒ1とＲ2は、
好ましくは、同一又は異なって、炭素数１〜４の直鎖又は分枝鎖のアルキル又はアルケニル基を示し、
より好ましくは、同一又は異なって、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを示し、
さらに好ましくは、Ｒ1とＲ2はメチルを示す。
【００６０】
〔１５〕上記〔１３〕又は〔１４〕において、上記ｎは、好ましくは２又は３を示す。
【００６１】
〔１６〕上記〔１３〕〜〔１５〕のいずれか１項において、好ましくは、上記ポリスルフィド化合物は、ジメチルジスルフィド又はジメチルトリスルフィドである。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００６３】
本実施例で用いた臭い化合物及び試験物質を下記表１に示す。
【００６４】
【表１】
0006371336.tif 000002
【００６５】
実施例１  ポリスルフィド化合物に応答する嗅覚受容体の同定
（１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組み込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
【００６６】
（２）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するタンパク質ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＴＰ）を発現するベクターを調製した。具体的には、ヒトＲＴＰ１Ｓ（ＧＩ：５０２３４９１７）をコードする遺伝子を、ｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
【００６７】
（３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体のいずれか１種を発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表２に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を９０μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として用いるために、嗅覚受容体を発現させない条件の細胞（Ｍｏｃｋ）も用意し、同様に実験に用いた。
【００６８】
【表２】
0006371336.tif 000003
【００６９】
（４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
【００７０】
上記（３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ）で調製したポリスルフィド化合物を含む溶液を７５μＬ添加した。ポリスルフィド化合物は、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）又はジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）１００μＭとした。細胞をＣＯ2インキュベータ内で３時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。各種刺激条件について、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを算出した。ポリスルフィド化合物刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを、ポリスルフィド化合物刺激を行わない細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃで割った値をｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００７１】
（５）結果
４２８種類の嗅覚受容体についてＤＭＤＳ又はＤＭＴＳに対する応答を測定した結果、嗅覚受容体ＯＲ４Ｓ２が、ＤＭＤＳ及びＤＭＴＳの両方に対して特異的な応答を示すことが明らかになった（図１）。ＯＲ４Ｓ２のＤＭＤＳ及びＤＭＴＳに対する応答は濃度依存的であった（図２）。一方で、ＯＲ４Ｓ２は、同じく揮発性硫黄化合物であるメチルメルカプタン３ｍＭに対しては応答しなかった（図３）。したがって、ＯＲ４Ｓ２は、ポリスルフィド化合物に対して応答性をもつポリスルフィド化合物受容体である。またＯＲ４Ｓ２は、これまでポリスルフィド化合物に応答することが見出されていない、新規のポリスルフィド化合物受容体である。
【００７２】
実施例２  ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストの探索
実施例１（１）〜（３）と同様の手順で、ＯＲ４Ｓ２（配列番号１）を発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。実施例１（４）の手順に従って、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにより、試験物質存在下及び非存在下での嗅覚受容体のＤＭＤＳに対する応答（ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値）を測定した。ＤＭＤＳ単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｘ）、ＤＭＤＳ刺激を行わなかった細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）、ＤＭＤＳと試験物質との共刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｚ）を求め、以下の計算式により、試験物質存在下での受容体のＤＭＤＳ応答強度（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（％））を求めた。
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（％）＝（Ｚ−Ｙ）／（Ｘ−Ｙ）×１００
独立した実験を３回行い、各回の実験の平均値を求めた。培養物へのＤＭＤＳの添加濃度は１ｍＭとし、試験物質の添加濃度は０〜３０００μＭの範囲で変更した。
【００７３】
ＤＭＴＳ応答については、ＤＭＴＳ単独刺激に対するｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｘ’）を、ＤＭＴＳ刺激を行わなかった細胞のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）で除した値（Ｘ’／Ｙ）をＤＭＴＳ応答値（Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）として算出した。このＤＭＴＳ応答に対する試験物質の効果を比較するために、ＤＭＴＳと試験物質との共刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｚ’）を同様に刺激を行わなかった細胞のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）で除して（Ｚ’／Ｙ）を算出し、Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとした。独立した実験を３回行い、各回の実験の平均値を求めた。培養物へのＤＭＴＳの添加濃度は３００μＭ、試験物質の添加濃度は１００μＭとした。
【００７４】
結果を図４及び図５に示す。トリメチルヘキシルアルデヒド（ＴＨＡ）、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、（＋）−リモネンオキシド、α−テルピネン、２−メチルブタン酸ブチル、及びジペンテンは、いずれも濃度依存的にＯＲ４Ｓ２のＤＭＤＳ応答を抑制し、これら７つの化合物がＯＲ４Ｓ２アンタゴニストであることが明らかにされた。またトリメチルヘキシルアルデヒド（ＴＨＡ）、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、１，４−シネオール、（＋）−リモネンオキシド、α−テルピネン、及び２−メチルブタン酸ブチルはいずれも、ＯＲ４Ｓ２のＤＭＴＳ応答も抑制した。
【００７５】
実施例３  ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストによるポリスルフィド化合物の臭いの抑制能
実施例２で同定したＯＲ４Ｓ２アンタゴニストであるトリメチルヘキシルアルデヒド、（ＴＨＡ）、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、及び１，４−シネオールによるポリスルフィド化合物の臭いの抑制効果を、官能試験により確認した。
【００７６】
ＤＭＤＳ、ＴＨＡ、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、又は１，４−シネオールについては、ミネラルオイルの０．１％（ｖ／ｖ）溶液を調製した。ＤＭＴＳについては、ミネラルオイルの０．０１％（ｖ／ｖ）溶液を調製した。２０ｍＬ容のガラス瓶（マルエム、Ｎｏ．６）に２つの綿球を入れ、１つの綿球にはＤＭＤＳ又はＤＭＴＳの溶液３０μＬを、もう１つの綿球には上記３つのＯＲ４Ｓ２アンタゴニストのいずれかの溶液３０μＬを染み込ませた。上記綿球を入れたガラス瓶は、蓋をして３７℃で１時間静置した後、試験サンプルとして官能試験に用いた。基準サンプルとしてＤＭＤＳ又はＤＭＴＳの溶液を含む綿球のみを入れたガラス瓶を、対象サンプルとしてミネラルオイル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を含む綿球のみを入れたガラス瓶を準備した。
【００７７】
官能試験は、ＤＭＤＳに関しては１０名、ＤＭＴＳに関しては１１名の評価者により単盲式にて行った。試験は、食後１時間半以上を経過した１４時以降から開始した。匂いの拡散を防ぐため、試験は基本的にドラフト付近で行った。ポリスルフィド化合物の臭いへの順応の影響を排除するため、試験中には適宜、ＤＭＤＳ又はＤＭＴＳ臭の認知強度を確認させ、必要であれば休憩をとった。評価者を二群に分け、一方の群はＴＨＡ、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、次いで１，４−シネオールの順序で、他方の群は１、４−シネオール、ｃｉｓ−４−ヘプテナール、次いでＴＨＡの順序で、ＤＭＤＳ又はＤＭＴＳ臭の抑制効果を評価した。試験サンプルは３名の評価者による評価後に新しいものと交換した。
試験サンプルの臭い評価では、各評価者に、次の５段階の基準「ＤＭＤＳ（又はＤＭＴＳ）の臭いが、１：わからない、２：感知できる、３：楽にわかる、４：強く感じる、５：耐えられないほど強く感じる」を設定し、ＤＭＤＳ（又はＤＭＴＳ）単独での臭い強度を３としたときの各試験サンプルのＤＭＤＳ（又はＤＭＴＳ）臭の強度を１．０から０．５刻みで５．０までの９段階で評価させた。各評価者による評価結果の平均値を求めた。
【００７８】
官能試験の結果を図６及び図７に示す。ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストであるＴＨＡ、ｃｉｓ−４−ヘプテナール及び１，４−シネオールは、いずれもＤＭＤＳ及びＤＭＴＳの臭い強度を抑制した。以上の結果から、ＯＲ４Ｓ２アンタゴニストにより、ＤＭＤＳやＤＭＴＳなどのポリスルフィド化合物の臭いが抑制されることが明らかになった。
【図１】
0006371336.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006371336.tif 000009
【図７】
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【配列表】
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