(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体が、配列番号１５に規定されるＨＣＤＲ１と、配列番号１６に規定されるＨＣＤＲ２と、配列番号１７に規定されるＨＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域を有し、かつ配列番号１８に規定されるＬＣＤＲ１と、配列番号１９に規定されるＬＣＤＲ２と、配列番号２０に規定されるＬＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域を有する、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有し、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有するか、
前記重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有し、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有するか、
前記重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有し、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、
前記重鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有するか、
前記重鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びダイアボディから選択される、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記一本鎖抗体がｓｃＦｖである、請求項４に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
１００ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＤＬ−１に結合する、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
１０ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＤＬ−１に結合する、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記ＥＣ５０が間接ＥＬＩＳＡ法により決定される、請求項６又は７に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体が非ＣＤＲ領域を含み、前記非ＣＤＲ領域がマウス以外の種から得られる、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体が非ＣＤＲ領域を含み、前記非ＣＤＲ領域がヒト抗体から得られる、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４の定常領域から選択される、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の定常領域が、変異したヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記変異したヒトＩｇＧ１定常領域が、ＥＵ付番方式に従って重鎖定常領域にＮ２９７Ａ突然変異を含む、請求項１２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記変異したヒトＩｇＧ１定常領域が、ＥＵ付番方式に従って２３４、２３５又は２３７位に少なくとも１つの突然変異を有し、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＣ１ｑに対する前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の動力学的親和性が、変異後に下がる、請求項１２又は１３に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記変異したヒトＩｇＧ１定常領域が、ＥＵ付番方式に従って２３４、２３５及び２３７位に１つ、２つ又は３つの突然変異を有し、前記突然変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａから選択される、請求項１２又は１３に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記変異が、前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片のＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を減少させる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５により産生され、前記ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５が、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、受託番号が、ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３である、請求項１又は２に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
核酸分子Ａ及び核酸分子Ｂを含む、単離された核酸分子Ｃであって、
前記核酸分子Ａは、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域は、配列番号１５に規定されるＨＣＤＲ１と、配列番号１６に規定されるＨＣＤＲ２と、配列番号１７に規定されるＨＣＤＲ３と、を含み、
前記核酸分子Ｂは、前記ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含み、前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域は、配列番号１８に規定されるＬＣＤＲ１と、配列番号１９に規定されるＬＣＤＲ２と、配列番号２０に規定されるＬＣＤＲ３と、を含む、単離された核酸分子Ｃ。
【請求項１９】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０のアミノ酸配列を有し、
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の単離された核酸分子Ｃ。
【請求項２０】
前記核酸分子Ａが、配列番号１、配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列を有し、
前記核酸分子Ｂが、配列番号３、配列番号７又は配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の単離された核酸分子Ｃ。
【請求項２１】
前記核酸分子Ａと前記核酸分子Ｂとを接続するためのリンカーをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子Ｃ。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子Ｃを含む、ベクター。
【請求項２３】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子Ｃ又は請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、
適切な条件下で請求項２３に記載の宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞培養物から前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収するステップとを含む、方法。
【請求項２５】
受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３で中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５。
【請求項２６】
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、カップリング部分と、を含むコンジュゲートであって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記カップリング部分が検出可能な標識である、コンジュゲート。
【請求項２７】
前記カップリング部分が、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、コンジュゲートした部分と、を含む二機能性抗体コンジュゲートであって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記コンジュゲートした部分が第２の生物学的機能的断片である、二機能性抗体コンジュゲート。
【請求項２９】
前記第２の生物学的機能的断片が、結合活性を有し、かつ、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、核種、核酸、小分子毒素、受容体又はリガンドである、請求項２８に記載の二機能性抗体コンジュゲート。
【請求項３０】
第１の抗体若しくはその断片と、更なる抗体若しくはその断片又は抗体模倣体と、のコンジュゲーションにより形成される多重特異性抗体であって、各抗体若しくはその断片又は抗体模倣体が、元の結合特異性を保持しており、前記第１の抗体又はその断片が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、多重特異性抗体。
【請求項３１】
二重特異性抗体又は三重特異性抗体又は四重特異性抗体である、請求項３０に記載の多重特異性抗体。
【請求項３２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片を含む、又は請求項２６若しくは２７に記載のコンジュゲートを含む、又は請求項２８若しくは２９に記載の二機能性抗体コンジュゲートを含む、又は請求項３０若しくは３１に記載の多重特異性抗体を含む、キット。
【請求項３３】
前記抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記二次抗体が、検出可能な標識で標識されている、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記検出可能な標識が、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
キットの製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２６若しくは２７に記載のコンジュゲート、又は請求項２８若しくは２９に記載の二機能性抗体コンジュゲート、又は請求項３０若しくは３１に記載の多重特異性抗体の使用であって、前記キットを使用してサンプル中のＰＤＬ−１の存在又はレベルを検出する、使用。
【請求項３７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２６若しくは２７に記載のコンジュゲート、又は請求項２８若しくは２９に記載の二機能性抗体コンジュゲート、又は請求項３０若しくは３１に記載の多重特異性抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤をさらに含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
腫瘍若しくは貧血の予防及び／又は処置及び／又は補助療法及び／又は診断用医薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２６若しくは２７に記載のコンジュゲート、又は請求項２８若しくは２９に記載の二機能性抗体コンジュゲート、又は請求項３０若しくは３１に記載の多重特異性抗体の使用。
【請求項４０】
前記腫瘍が、乳がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、結腸直腸がん、食道がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎がん、前立腺がん、膀胱がん、膵臓がん、膠腫、黒色腫及び白血病から選択される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記結腸直腸がんが直腸がんである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
ａ）ＰＤ−１又はＢ７−１に対するＰＤＬ−１の結合を遮断するための薬物；
ｂ）ＰＤＬ−１活性又はＰＤＬ−１レベルを下方調節するための薬物；
ｃ）ＰＤ−１又はＰＤＬ−１による免疫抑制を除去するための薬物；又は
ｄ）Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−２の発現を強化するための薬物
の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２６若しくは２７に記載のコンジュゲート、又は請求項２８若しくは２９に記載の二機能性抗体コンジュゲート、又は請求項３０若しくは３１に記載の多重特異性抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療及び分子免疫学の分野に関係し、抗ＰＤＬ−１抗体、その医薬組成物及びその使用に関する。特に、本発明は、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路は、免疫寛容、微生物感染症及び腫瘍免疫回避の調節に必須である。ＰＤ−１（プログラム細胞死１）は、Ｔ細胞及び他の免疫細胞において主に発現され、そのリガンドＰＤＬ−１は、ヒト腫瘍型の多くで高度に発現されている。ＰＤＬ−１タンパク質の存在は、ヒト乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、食道がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎細胞癌、膀胱がん、膵臓がん、膠腫及び黒色腫において免疫組織化学的分析により実証されている。更に、ＰＤＬ−１の発現レベルは、患者の臨床的処置及び予後と密接に関係する。
【０００３】
ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路の遮断は、阻害されているＴ細胞を活性化し、活性化されたＴ細胞を誘導してがん細胞を攻撃することができる。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達の遮断は、腫瘍細胞を死滅させる役割を果たす腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の増殖を促進することができ、次いで局所腫瘍の成長を阻害し（Ｊｕｌｉｅ  Ｒら、２０１２年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６６：２４５５〜２４６５頁）；ＰＤＬ−１モノクローナル抗体は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞によりＩＦＮ−γの分泌を上方調節することができ、このことは、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路の遮断が、腫瘍細胞の免疫応答に役割を果たして免疫応答を誘導することを示している（Ｂｌａｎｋ  Ｃら、２００６年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１１９：３１７〜３２７頁）。
【０００４】
加えて、ＰＤＬ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−１に結合することもできる。研究は、ＰＤＬ−１／Ｂ７−１複合体が、Ｔ細胞活性化の負のシグナルであり、上記相互作用が、Ｔ細胞表面活性化マーカーの下方調節をもたらし、Ｔ細胞の増殖を阻害し得ることを示した。
【０００５】
ＩＬ−２（インターロイキン−２）は、Ｔｈ細胞により分泌されるリンフォカインの一種であり：（１）Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激する；（２）細胞傷害性Ｔ細胞の生成を刺激する；（３）ＮＫ細胞の増殖及び分化を刺激し、ＮＫ細胞の活性を強化する；（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３〜６日間のＩＬ−２の刺激下で、リンパ球から形質転換される殺腫瘍性免疫細胞の一種であるリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）の生成を刺激する、といった広範囲な免疫活性を有する。ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）はＴ細胞により産生され、腫瘍細胞の増殖を阻害し、ＭＨＣによる抗原の提示を増加させ、腫瘍壊死因子の発現を刺激し、腫瘍血管形成を防止することができる。最近の研究は、ＩＦＮ−γが、腫瘍細胞のＦａｓ／ＦａｓＬの発現を調節することにより免疫系からの攻撃をかわす腫瘍細胞の能力を抑制し、Ｆａｓ媒介アポトーシスに対する腫瘍細胞の感受性を強化し、悪性腫瘍細胞の阻害をもたらし得ると報告している。
【０００６】
現在では、ＰＤＬ−１経路を標的とする抗体が、非小細胞肺がん、腎細胞癌、卵巣がん、黒色腫（Ｈｏｍｅｔ  Ｍ．Ｂ．、Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ．ら、Ａｎｔｉ−ＰＤ１  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５年６月；４２（３）：４６６〜４７３頁）を含めた様々な腫瘍、白血病及び貧血（Ｈｅｌｄ  ＳＡ、Ｈｅｉｎｅ  Ａ、ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＣＭＬ．Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１３年９月；１３（７）：７６８〜７４頁）の処置に進展をもたらすことになると一般に考えられている。
【０００７】
現在のところ、Ｔリンパ球を活性化するためのより優れた結合親和性及び遮断効率（ＰＤ−１に対するＰＤＬ−１）を持つ新たな抗ＰＤＬ−１抗体を開発することが依然として必要である。
【発明の概要】
【０００８】
徹底的な研究及び創造的な作業により、本発明者らは、マウスを免疫化するための抗原として哺乳動物細胞により発現させた組換えＰＤＬ−１を使用し、マウスの脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成した。多数のハイブリドーマをスクリーニングすることにより、ハイブリドーマ細胞株：ＬＴ００５を得た。この細胞株は、２０１５年８月４日に受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３で中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された。
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５が、ＰＤＬ−１に特異的に結合し、ＰＤ−１に対するＰＤＬ−１の結合を効果的に遮断できるモノクローナル抗体（５Ｃ１０と命名した）を分泌し得ることを見出した。加えて、本発明者らは、ＰＤ−１に対するＰＤＬ−１の結合を遮断する５Ｆ１０及び９Ｆ６と命名した他の２つのモノクローナル抗体も発見した。
【００１０】
更に、本発明者らは、ＰＤＬ−１に対するヒト化抗体を独創的に産生し、それぞれ５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２と命名した。
【００１１】
なお更に、本発明者らは、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の定常領域を独創的に変異させ、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）及び／又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）が効果的に下げられた５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ抗体を生成した。
【００１２】
なお更に、本発明者らは、本発明の抗体、特に５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｆ１０、９Ｆ６及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔが、ヒトＴ細胞を効果的に結合し、活性化してＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の分泌を誘導し得ることも見出し、このことは、肺がん、黒色腫、腎腫瘍、卵巣がん、白血病及び貧血の防止並びに処置に対する潜在性を示している。
【００１３】
従って、以下の発明が提供される：
一態様において、本発明はモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関し：
前記モノクローナル抗体が、配列番号１５〜１７に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、及び／又は配列番号１８〜２０に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し；
又は
前記モノクローナル抗体が、配列番号２９〜３１に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、及び／又は配列番号３２〜３４に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し；
又は
前記モノクローナル抗体が、配列番号３５〜３７に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、及び／又は配列番号３８〜４０に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有する。
【００１４】
５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１又は５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下と同じである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＳＮＹＤ（配列番号１５）
ＨＣＤＲ２：ＩＷＴＧＧＡＴ（配列番号１６）
ＨＣＤＲ３：ＶＲＤＳＮＹＲＹＤＥＰＦＴＹ（配列番号１７）
ＬＣＤＲ１：ＱＳＩＧＴＮ（配列番号１８）
ＬＣＤＲ２：ＹＡＳ（配列番号１９）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＮＳＷＰＹＴ（配列番号２０）。
【００１５】
５Ｆ１０のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＤＩＫＤＴＹ（配列番号２９）
ＨＣＤＲ２：ＩＤＰＡＤＧＮＴ（配列番号３０）
ＨＣＤＲ３：ＡＲＧＬＧＡＷＦＡＳ（配列番号３１）
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＴＮＳ（配列番号３２）
ＬＣＤＲ２：ＹＴＳ（配列番号３３）
ＬＣＤＲ３：ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号３４）。
【００１６】
９Ｆ６のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＮＩＫＤＴＹ（配列番号３５）
ＨＣＤＲ２：ＩＤＰＡＮＧＮＴ（配列番号３６）
ＨＣＤＲ３：ＳＲＧＰＰＧＧＩＧＥＹＩＹＡＭＤＹ（配列番号３７）
ＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＳＳＹ（配列番号３８）
ＬＣＤＲ２：ＳＴＳ（配列番号３９）
ＬＣＤＲ３：ＨＱＹＨＲＳＰＰＴ（配列番号４０）
【００１７】
上のＣＤＲは、当業者によく知られている技術的手法によって得ることができる。例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースによりＩＭＧＴ定義を使用して重鎖又は軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を分析することによる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって：
重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有し、及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号４、配列番号８及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有し；
又は
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２１であり、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２３であり；
又は
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２５であり、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２７である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、以下の（１）〜（７）から選択される：
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４に示される（５Ｃ１０）；
（２）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８に示される（５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１）；
（３）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２に示される（５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２又は５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ）；
（４）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２に示される（５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２）；
（５）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８に示される（５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１）；
（６）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２３に示される（５Ｆ１０）；
（７）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２７に示される（９Ｆ６）。
【００２０】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体若しくはダイアボディから選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ未満若しくはより小さいＥＣ５０でＰＤＬ−１に結合し、ＥＣ５０は間接ＥＬＩＳＡ法により決定されることが好ましい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体は非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域はマウス以外の種、例えば、ヒト抗体から得られる。
【００２３】
モノクローナル抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域から選択されることが好ましく；
モノクローナル抗体の定常領域は、変異したヒトＩｇＧ１定常領域であることが好ましく；変異したヒトＩｇＧ１定常領域は、ＥＵ付番方式に従って２３４、２３５及び２３７位に１つ、２つ又は３つの突然変異を有し、突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａから選択されることがより好ましい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５により産生され、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５は、中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３である。
【００２５】
本発明の別の態様は、抗体の重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子Ａに関し：
前記抗体は、配列番号１５〜１７に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、
前記抗体の重鎖は、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０のアミノ酸配列を有することが好ましく；
前記核酸分子は、配列番号１、配列番号５又は配列番号９のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、前記抗体は、配列番号２９〜３１に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、
前記抗体の重鎖は、配列番号２１のアミノ酸配列を有することが好ましく、
前記核酸分子は、配列番号２２のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、前記抗体は、配列番号３５〜３７に規定されるＣＤＲを含む重鎖可変領域を有し、
前記抗体の重鎖は、配列番号２５のアミノ酸配列を有することが好ましく、
前記核酸分子は、配列番号２６のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００２８】
本発明の更に別の態様は、抗体の軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子Ｂに関し：
前記抗体は、配列番号１８〜２０に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、
前記抗体の軽鎖は、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２のアミノ酸配列を有することが好ましく；
前記核酸分子は、配列番号３、配列番号７又は配列番号１１のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、前記抗体は、配列番号３２〜３４に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、
前記抗体の軽鎖は、配列番号２３のアミノ酸配列を有することが好ましく、
前記核酸分子は、配列番号２４のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、前記抗体は、配列番号３８〜４０に規定されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、
前記抗体の軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列を有することが好ましく、
前記核酸分子は、配列番号２８のヌクレオチド配列を有することがより好ましい。
【００３１】
本発明の更に別の態様は、前の核酸分子Ａ及び核酸分子Ｂを含む単離された核酸分子Ｃに関し；任意選択で、核酸分子Ｃは、核酸分子Ａ及び核酸分子Ｂを接続するためのリンカー配列を更に含む。
【００３２】
本発明の更に別の態様は、単離された核酸分子Ａ、単離された核酸分子Ｂ又は単離された核酸分子Ｃを含むベクターに関する。
【００３３】
本発明の更に別の態様は、単離された核酸分子Ａ、単離された核酸分子Ｂ若しくは単離された核酸分子Ｃ、又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【発明の効果】
【００３４】
本においてモノクローナル抗体５Ｃ１０は、ＰＤＬ−１に特異的に結合し、ＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することを非常に効果的に遮断し、ＰＤＬ−１による免疫系に対する免疫抑制を特異的に除去し、Ｔリンパ球を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）；通過画分（１０μＬ）；溶出（１０μＬ）。
【図２】ＰＤ−１−ｈＦｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）；マーカー（１０μＬ）。
【図３】Ｂ７−１−ｈＦｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）；マーカー（１０μＬ）。
【図４】抗体５Ｃ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；還元タンパク質サンプル（１μｇ）；クロマトグラフィーカラムの通過画分；非還元タンパク質サンプル（１μｇ）。
【図５】５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１（５Ｃ１０のヒト化抗体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムの溶出（１０μＬ）；通過画分（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）。
【図６】５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２（５Ｃ１０のヒト化抗体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムの溶出（１０μＬ）；通過画分（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）。
【図７】５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１（５Ｃ１０のヒト化抗体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムの溶出（１０μＬ）；通過画分（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）。
【図８】５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２（５Ｃ１０のヒト化抗体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。左から右にサンプル及びそのロード量：マーカー（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムの溶出（１０μＬ）；通過画分（１０μＬ）；クロマトグラフィーカラムにロードしたサンプル（１０μＬ）。
【図９】ＰＤＬ−１に対する抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合動態パラメーターを示す図である。
【図１０】ＰＤＬ−１に対する抗体ＨｐＬｐの結合動態パラメーターを示す図である。
【図１１】ＰＤＬ−１に対する抗体ＰＣＡＢの結合動態パラメーターを示す図である。
【図１２】抗体５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐによるＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することの遮断を示す図である（フォルテバイオ）。
【図１３】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対する５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１の結合を示す図である。
【図１４】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対する５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２の結合を示す図である。
【図１５】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１の結合を示す図である。
【図１６】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合を示す図である。
【図１７】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対するＨｐＬｐの結合を示す図である。
【図１８】ＰＤＬ−１陽性２９３Ｔ細胞に対するＰＣＡＢの結合を示す図である。
【図１９】間接ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤＬ−１組換えタンパク質に対する５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２又は５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１の結合を示す図である。
【図２０】間接ＥＬＩＳＡによるサルＰＤＬ−１組換えタンパク質に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２又はＨｐＬｐの結合を示す図である。
【図２１】ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤＬ−１、ヒトＰＤＬ−２又はマウスＰＤＬ−１組換えタンパク質に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合を示す図である。
【図２２】５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２又は５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１が、ＰＤＬ−１対する結合についてＰＤ−１と競合したことを示す図である（競合ＥＬＩＳＡ）。
【図２３】５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、ＰＤＬ−１に対する結合についてＢ７−１と競合したことを示す図である（競合ＥＬＩＳＡ）。
【図２４】５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、ＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することを遮断することによりＩＦＮ−γ分泌を増加させたことを示す図である。
【図２５】５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、ＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することを遮断することによりＩＬ−２分泌を増加させたことを示す図である。
【図２６Ａ】ビアコアによるＦｃγＲＩＩＩａに対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔの結合親和性及び動的定数を示す図である。
【図２６Ｂ】ビアコアによるＦｃγＲＩＩＩａに対するテセントリク（登録商標）（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）の結合親和性及び動的定数を示す図である。
【図２７Ａ】ビアコアによるＣ１ｑに対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔの結合親和性及び動的定数を示す図である。
【図２７Ｂ】ビアコアによるＣ１ｑに対するテセントリク（登録商標）の結合親和性及び動的定数を示す図である。
【図２８】非小細胞肺がん細胞に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔの治癒効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
用語「単離された核酸分子Ａ」「単離された核酸分子Ｂ」又は「単離された核酸分子Ｃ」に関して、文字Ａ、Ｂ若しくはＣは、明快さ又は区別する目的だけに使用され、文字自体に特別な意味はない。
【００３７】
本発明の更に別は、上述のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を調製する方法に関し、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップと、細胞培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収するステップとを含む。
【００３８】
本発明の更に別の態様は、 中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されており、受託番号が、ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３であるハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５に関する。
【００３９】
本発明の別の態様は、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５により分泌される抗体若しくは断片の抗原エピトープに競合結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。抗体又はその抗原結合断片は、
ＰＤ−１又はＢ７−１に結合するＰＤＬ−１を遮断する薬物、
ＰＤＬ−１活性又はＰＤＬ−１レベルを調節する（例えば下方調節）薬物、
ＰＤ−１又はＰＤＬ−１による身体免疫抑制を除去する薬物、又は
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−２の発現を強化する薬物
の活性のいずれか１つを有することが好ましい。
【００４０】
本発明の更に別の態様は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片及びカップリング部分を含むコンジュゲートに関し、モノクローナル抗体は、本発明に記述されるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つであり、カップリング部分は検出可能な標識であり、カップリング部分はラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素であることが好ましい。
【００４１】
本発明の更に別の態様は、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、又は前に上述したコンジュゲートを含むキットに関する；
キットは、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体を更に含むことが好ましく；任意選択で、二次抗体は、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、着色物質又は酵素など検出可能な標識で標識されている。
【００４２】
本発明の更に別の態様は、キットの製造における前記モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はそのコンジュゲートの使用に関し、前記キットを使用してサンプル中のＰＤＬ−１の存在又はレベルを検出する。
【００４３】
本発明の更に別の態様は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はコンジュゲートを含み、任意選択で、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明の更に別の態様は、腫瘍若しくは貧血の防止及び／又は処置及び／又は補助療法及び／又は診断用の医薬の製造における本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はコンジュゲートの使用に関し；前記腫瘍は、乳がん、非小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん又は直腸がんなどの結腸直腸がん、食道がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、膵臓がん、膠腫、黒色腫及び白血病から選択されることが好ましい。
【００４５】
本発明の更に別の態様は、
ＰＤ−１又はＢ７−１に結合するＰＤＬ−１を遮断するための薬物、
ＰＤＬ−１活性又はＰＤＬ−１レベルを調節（例えば下方調節）するための薬物、
ＰＤ−１又はＰＤＬ−１による免疫抑制を除去するための薬物、又は
Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−２の発現を強化するための薬物
の製造における本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はコンジュゲートの使用に関する。
【００４６】
本発明の更に別の態様は、本発明モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はコンジュゲートの有効量を細胞に投与するステップを含むｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、前記方法は：
ＰＤ−１又はＢ７−１に結合するＰＤＬ−１を遮断する方法、
ＰＤＬ−１活性又はＰＤＬ−１レベルを調節（例えば下方調節）する方法、
ＰＤ−１又はＰＤＬ−１による免疫抑制を除去する方法、又は
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−２の発現を強化する方法である。
【００４７】
本発明の一実施形態において、前記方法は、治療目的でない。
【００４８】
本発明の更に別の態様は、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片又はコンジュゲートの有効量を対象に投与するステップを含む腫瘍又は貧血の処置及び／若しくは予防の方法に関し；腫瘍は、乳がん、非小細胞肺がんなどの肺がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん又は直腸がんなどの結腸直腸がん、食道がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、膵臓がん、膠腫、黒色腫及び白血病から選択されることが好ましい。
【００４９】
本発明において、特に明記しない限り、本発明において使用される科学的及び技術的な用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。加えて、本発明において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学関連実験室手順は、関連分野において使用される一般的な手順である。同時に、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義及び解釈を以下に提供する。
【００５０】
本発明では、全長ＰＤＬ−１タンパク質、又はＰＤＬ−１の細胞外ドメイン（ＰＤＬ−１ＥＣＤ）若しくはＰＤＬ−１ＥＣＤを含有する断片を含めたＰＤＬ−１タンパク質（プログラム死−リガンド１、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）のアミノ酸配列を指す場合；ＰＤＬ−１ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウス又はヒト由来ＩｇＧ  Ｆｃ（ｍＦｃ又はｈＦｃ）と融合された断片も含まれる。更に、当業者に理解される通り、ＰＤＬ−１タンパク質は、アミノ酸配列の突然変異が生物学的機能に影響を及ぼすことなく天然又は人工的に導入されている（置きかえ、欠失及び／又は追加を含むがそれだけに限定されない）タンパク質も含むことになる。従って、本発明において、用語「ＰＤＬ−１タンパク質」は、上の配列リスト及びその天然又は人工的バリアントを含めたそのような配列全てを含むべきである。加えて、ＰＤＬ−１タンパク質の配列断片を指す場合、その断片は、上の配列断片だけでなく、天然又は人工的なバリアントの対応する配列断片も意味する。
【００５１】
用語ＥＣ５０は、最大効果の５０％の濃度、即ち最大効果の５０％を生じ得る濃度を指すために本明細書で使用される。
【００５２】
用語「抗体」は、２対のポリペプチド鎖（「軽」（Ｌ）鎖及び「重」（Ｈ）鎖による各対）から通常構成される免疫グロブリン分子を指すために本明細書で使用される。抗体軽鎖は、κ及びλ鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεに分類することができ、対応する抗体はそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義される。軽及び重鎖において、可変及び定常領域は、約１２又はより多くのアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は、約３又はより多くのアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、高度な可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲと呼ばれる）及びＣＤＲ間に分布するフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる保存領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。各領域又はドメインのアミノ酸の割当ては、免疫学的対象のタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｋａｂａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．［１９８７年及び１９９１年］）、又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁［１９８７年］；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３頁［１９８９年］）の定義に従った。用語「抗体」は、どんな特定の抗体生成方法にも限定されない。例えば、抗体には、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体がある。抗体は、異なるアイソタイプ若しくはサブアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であることができる。
【００５３】
用語、抗体の「抗原結合断片」は、全長抗体断片を含有するポリペプチドを指すために本明細書で使用され、抗原結合断片は、全長抗体と同じ抗原に特異的に結合する能力を維持しており、及び／又は抗原特異的結合について全長抗体と競合し、「抗原結合部分」としても公知である。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．［１９８９年］）のテキストにしばしば見られるそれは、全ての目的のために参照により本発明に統合される。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術又は完全な抗体の酵素的若しくは化学的切断により産生することができる。いくつかの場合において、抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ並びに抗体の抗原特異的結合能を付与するのに十分なポリペプチドの少なくとも一部を含むようなポリペプチドがある。
【００５４】
本発明に使用される通り、用語「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆｖ断片」は、抗体の一本鎖ＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を意味し；用語「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインからなる抗体断片を意味し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６頁［１９８９年］）；用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる抗体断片を意味し；用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合ブリッジによって接続されている２つのＦａｂ断片を含有する抗体断片を意味する。
【００５５】
いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、一本鎖抗体のＶＬ及びＶＨドメインは、単一ポリペプチド鎖を形成するためのリンカーにより一価の分子を形成する（参照については、例えばＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６頁［１９８８年］及びＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３頁［１９８８年］）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。リンカーの最近の適切な技術は、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそのバリアントで作製される。例えば、（ＧＧＧＧＳ）４、しかしそのバリアントも使用され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、［１９９３年］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８頁）。本発明において使用できる他のリンカーについては、Ａｌｆｔｈａｎら、（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら、（２００１年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４〜１０６頁、Ｈｕら、（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１〜５６頁、及びＲｏｏｖｅｒｓら、（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記述されている。
【００５６】
いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、ダイアボディ、即ち、二価抗体であり、ＶＨ及びＶＬは単一ポリペプチド鎖で発現され、しかしながら、非常に短いリンカーを使用して同じ鎖の２つのドメインの対合が防止され、従って、ドメインは、他の鎖の相補的ドメインと対にならざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される（参照については、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８頁［１９９３年］及びＰｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３頁［１９９４年］）。
【００５７】
他の場合において、抗体抗原結合断片は、「二重特異性抗体」であり、第１の抗体（断片）及び第２の抗体（断片）又はカップリングアームによりカップリングされた抗体模倣体により定義され、カップリング方法には、化学反応、遺伝子融合及び酵素反応があるがこれに限定されない。抗体抗原結合断片は、三重特異性抗体及び四重特異性抗体などの「多重特異性抗体」であることができ、前者は３つの異なる抗原に特異的に結合することができ、後者は４つの異なる抗原に特異的に結合することができる。例えば、ＣＮ第１０４３４１５２９Ａ号の場合のように設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体断片と；国際公開第２０１５１４１８６２号Ａ１の場合のように、抗−ＩＬ−１７ａフィノマーが、抗−ＩＬ−６Ｒ抗体と連結又は合体している。
【００５８】
他の場合において、抗体抗原結合断片は、「二重特異性抗体コンジュゲート」であり、第１の抗体（断片）及びカップリングアームによりカップリングされた第２の生物学的機能断片（抗体でもその模倣体でもない）により定義され、カップリング方法には、化学反応、遺伝子融合及び酵素反応があるがこれに限定されず、第２の生物学的機能断片には、結合活性があるペプチド、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性核種、核酸、小分子毒素、受容体又はリガンド、等があり、コンジュゲートは、各断片の活性を保持しており、従って二重機能／二重特異性である。
【００５９】
抗原結合断片（例えば、上記抗体断片）は、当業者に公知の従来通りの技術（例えば、組換えＤＮＡ又は酵素的若しくは化学的切断方法）により所与の抗体（例えば、本発明における５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２）から得ることができ、完全抗体と同じ特異的スクリーニング方法を抗原結合断片に適用することができる。
【００６０】
本発明において、特に言及しない限り、用語「抗体」は、完全抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
【００６１】
用語「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」は、高度に相同な群内の抗体又は抗体分子の断片を指すために本明細書で使用され、自然突然変異が起こらない限り、それは同一抗体分子の一群である。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体とは異なり、ポリクローナル抗体は、同じ抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ又はより多くの異なる抗体を通常含有している。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により通常得ることができ、その技術は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁、１９７５年）によって初めて報告されたが、組換えＤＮＡ技術により得ることもできる（米国特許第４，８１６，５６７号も参照のこと）。
【００６２】
用語「キメラ抗体」は、軽鎖及び／又は重鎖の部分がある抗体（特定の種から得ることができる又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属している）由来であり、軽鎖及び／又は重鎖の他の部分が別の抗体（同じ若しくは異なる種から得ることができる又は同じ若しくは異なる抗体クラス若しくはサブクラスに属している）由来であり、にもかかわらず、標的抗原に対する結合活性をなお保持している抗体を指すために本明細書で使用される（Ｃａｂｉｌｌｙら、に対する米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５頁［１９８４年］）。
【００６３】
用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲの全部又は一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）由来のＣＤＲ領域によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）を指すために本明細書で使用され、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性又は反応性を持つ非ヒト（例えば、マウス、ラット又はウサギ）抗体であり得る。加えて、アクセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸残基を、非ヒト抗体由来のアミノ酸又は他の抗体のアミノ酸によって置き換えて、抗体の性能を更に改善することができる。ヒト化抗体に関するより詳細については、例、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９頁（１９８８年）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６頁（１９９２年）；及びＣｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７〜４０２頁（２０００年）を参照のこと。
【００６４】
ヒト化の方法は、ヒト化のために一般に使用される方法の１つ又は複数の組み合わせに基づく。例えば、下記の方法を使用する。
【００６５】
ヒト化は、ＣＤＲ移植によって認識され得る。この方法において、マウス抗体のＣＤＲ領域がまず決定され、次いでマウス重鎖及び軽鎖の６つのＣＤＲが、マウスＦＲ領域に高い相同性を持つヒト供給源鋳型へ移植された。ヒト供給源鋳型は、ＩＭＧＴデータベースから得られる生殖細胞株配列など、元の生殖細胞株配列（生殖細胞株）から選択することができ、Ｇｅｎｅｂａｎｋから得られる抗体配列など、成熟した抗体配列から選択することもできる。復帰変異を、ＣＤＲ移植抗体に導入することができる。ヒト鋳型のいくつかのアミノ酸をマウス鋳型のアミノ酸に復帰変異させて、抗体の親和性を改善することができる。
【００６６】
ヒト化は、ＳＤＲ移植によっても認識され得る。この方法において、マウス抗体のＳＤＲ領域を、まず決定する必要がある。ＳＤＲ領域は、アラニンスキャニングなどの方法によって決定することができる。次いで、マウスＳＤＲ領域が、マウス鋳型に高い相同性を持つヒト鋳型へ移植された。ヒト供給源鋳型は、ＩＭＧＴデータベースから得られる生殖細胞株配列など、元の生殖細胞株配列（生殖細胞株）から選択することができ、Ｇｅｎｅｂａｎｋから得られる抗体配列など、成熟した抗体配列から選択することもできる。復帰変異を、ＳＤＲ移植抗体に導入することができる。ヒト鋳型のいくつかのアミノ酸をマウス鋳型のアミノ酸に復帰変異させて、抗体の親和性を改善することができる。Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．、Ｄ．Ｅ．Ｍｉｌｅｎｉｃ、Ｍ．Ｉｗａｈａｓｈｉ、Ｅ．Ｐａｄｌａｎ、Ｊ．Ｓｃｈｌｏｍ及びＳ．Ｖ．Ｋａｓｈｍｉｒｉ：Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＳＤＲｓ）  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｂｙ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＤＲｓ  ｏｎｌｙ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、１４３２〜４１頁（２０００年）。
【００６７】
ヒト化は、表面再建によっても認識され得る。この方法において、マウス抗体モデルが、コンピュータ相同性モデリング又はタンパク質結晶構造分析により得られる場合がある。抗体表面上のアミノ酸を、本モデルによって決定することができ、これらのアミノ酸が、ヒト抗体の対応するアミノ酸に突然変異された。同じ部位で頻度の高いヒト抗体のアミノ酸を、選択することができる。Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．：Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、４８９〜９８頁（１９９１年）。
【００６８】
ヒト化はまた、超ヒト化によって認識され得る。この方法において、マウス抗体のＣＤＲ領域がまず決定され、次いで６つのＣＤＲに高い相同性を持つヒト配列を、６つのマウスＣＤＲが移植される鋳型として選んだ。ヒト供給源鋳型は、ＩＭＧＴデータベースから得られる生殖細胞株配列など、元の生殖細胞株配列（生殖細胞株）から選択することができ、Ｇｅｎｅｂａｎｋから得られる抗体配列など、成熟した抗体配列から選択することもできる。復帰変異を、ＣＤＲ移植抗体に導入することができる。ヒト鋳型のいくつかのアミノ酸をマウス鋳型のアミノ酸に復帰変異させて、抗体の親和性を改善することができる。Ｔａｎ，Ｐ．、Ｄ．Ａ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｔ．Ｎ．Ｂｕｓｓ、Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｍｅｓ、Ｃ．Ａｎａｓｅｔｔｉ及びＪ．Ｆｏｏｔｅ：”Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ”  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、１１１９〜２５頁（２００２年）。
【００６９】
用語「分離する」又は「分離した」とは、天然の状態で人工的な手段による何かの獲得のことを指す。いわゆる「分離した」物質若しくは成分が天然に存在する場合、それは、置かれている物質若しくは成分が変化した、又は物質若しくは成分が自然環境下で分離した、又は両方の事例が起こった自然環境であり得る。例えば、生きている動物において、分離されていない天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドが存在し、高純度の同じポリヌクレオチド又はポリペプチドをこの天然の状態下で単離する過程を、分離すると呼ぶ。用語「分離する」又は「分離した」は、人工又は合成物質の存在を除外せず、活性に影響を及ぼさない他の不純物の存在を除外しない。
【００７０】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸媒体を指すために本明細書で使用される。発現ベクターは、挿入したポリヌクレオチドにコードされているタンパク質を発現することができるベクターである。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入されて、宿主細胞において運ばれた遺伝的エレメントを発現することができる。ベクターは、当業者に周知であり：プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ及び動物ウイルスがあるがこれに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスには、それだけには限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含める）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）がある。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント及びレポーター遺伝子を含むがこれに限定されない様々な発現制御エレメントを含有することができる。加えて、ベクターは複製起点を含有することもできる。
【００７１】
用語「宿主細胞」は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）若しくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核生物細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、ショウジョウバエ細胞Ｓ２若しくはＳｆ９などの昆虫細胞、又は繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはヒト細胞などの動物細胞を含むがこれに限定されないベクター導入に使用し得る細胞を指すために本明細書で使用される。
【００７２】
用語「特異的結合」は、抗体とその標的抗原の間の反応など、２つの分子間のランダムではない結合反応を指すために本明細書で使用される。いくつかの実施形態において、抗原に対する抗体の特異的結合（又は抗原に対して特異性がある抗体）は、抗原に対して１０−５Ｍ未満、例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ未満又はいっそう小さい結合親和性（ＫＤ）を持つ抗体を指すために本明細書で使用される。
【００７３】
用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すために本明細書で使用され、抗体と抗原との結合親和性を記述するために使用される。平衡解離定数がより小さい場合、抗体抗原結合はより堅く、抗体と抗原との親和性はより高い。通常、抗体（例えば、本発明のモノクローナル抗体５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２）は、フォルテバイオ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）分子間相互作用検出器により測定して１０−５Ｍ未満、例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ未満又はいっそう小さいＫＤで抗原（例えばＰＤＬ−１タンパク質）に結合する。
【００７４】
用語「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」は、同じ意味を有し、互換的に使用される；用語「ポリクローナル抗体」及び「ｐＡｂ」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される；用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味を有し、互換的に使用される。また、本発明において、アミノ酸は、本技術分野において受け入れられている１文字又は３文字の省略形により通常表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。
【００７５】
用語「ハイブリドーマ」及び「ハイブリドーマ細胞株」は互換的に使用され、用語「ハイブリドーマ」及び「ハイブリドーマ細胞株」について言及する場合、その用語は、ハイブリドーマのサブクローン及び後代細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５について言及する場合、その用語は、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５のサブクローン及び後代細胞を指すためにも本明細書で使用される。
【００７６】
用語「薬学的に許容される媒体及び／若しくは賦形剤」は、薬学及び／又は生理学においてレシピエント及び有効成分に適合する媒体及び／若しくは賦形剤を指すために本明細書で使用され、上記媒体及び／若しくは賦形剤は、本技術分野において周知であり（例、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照のこと）、ｐＨ変調物質、界面活性剤、アジュバント、イオン強度エンハンサーがあるがこれに限定されない。例えば、ｐＨ変調物質には、リン酸緩衝食塩水があるがこれに限定されない；界面活性剤には、陽イオン性、陰イオン性又はＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性界面活性剤があるがこれに限定されない；イオン強度エンハンサーには、塩化ナトリウムがあるがこれに限定されない。
【００７７】
用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を強化する又は事前に若しくは抗原と一緒に身体に送達された場合に免疫応答の型を変化させる非特異的免疫刺激剤を指すために本明細書で使用される。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカイン等を含むがこれに限定されない多くの種類のアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、動物実験において最も一般的に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより頻繁に使用されている。
【００７８】
用語「有効量」は、所望の効果を得る又は少なくともいくらか得るのに十分な量を指すために本明細書で使用される。例えば、腫瘍などの疾患を防止する有効量とは、腫瘍などの疾患の発症を防止、阻害、又は遅延させるのに十分な量を指すために本明細書で使用される；疾患を処置する有効量は、疾患及びその合併症を治癒する又は患者がそうなるのを少なくとも部分的に阻害するのに十分な量を指すために本明細書で使用される。そのような有効量の決定は、当業者の技能範囲内である。例えば、疾患を処置する有効量は、重症度、患者の免疫系全体の状態、年齢、体重及び性別など患者の全身状態、薬物送達、更には同時に適用されている他の処置によって決まることになる。
【実施例】
【００７９】
生物材料の保存の説明
ハイブリドーマ細胞ＬＴ００５は、２０１５年８月４日に受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３でＷｕｈａｎ大学（郵便番号：４３００７２）の中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された。
【００８０】
以下の例は、当業者に本発明の方法並びに組成物をどのように製作し、使用するかの完全な開示及び説明を提供するために提示するものであり、本発明者らが発明と考えるものの範囲を限定しないものとする。例に示されていない技術又は条件は、文献若しくは製品仕様に従って実施され得る。製造業者が示されていない試薬又は機器は、市場から購入することができる従来通りの製品である。
【００８１】
本発明において使用したＢＡＬＢ／ｃマウスは、広東省医学実験動物センターから購入された。本発明において使用したＴ細胞は、Ａｋｅｓｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．製であった。
【００８２】
調製例１：組換えタンパク質ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃ
１．ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃの遺伝子合成
キメラ遺伝子を、ＰＤＬ−１ＥＣＤと命名したＰＤＬ−１（プログラム細胞死１リガンド１、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）の細胞外ドメイン及びマウスＩｇＧのＦｃ断片（ｍＦｃ）を含むように設計した。２９３Ｆ細胞における標的遺伝子の発現効率を改善するために、ヌクレオチド配列をコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄで合成した。科学文献において、ＰＤＬ−１及びＰＤ−Ｌ１は互換的に使用することができ、本発明はＰＤＬ−１の使用に統一した。
【００８３】
２．ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドの生成
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄで合成したＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃ融合遺伝子を、発現ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより供給されている）にクローニングして、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドを得た。
【００８４】
３．ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃの組換えプラスミドの構築
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃを、酵素消化（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）、次いで電気泳動に供した。回収したＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃ遺伝子断片を、ライゲーションによりｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）にクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドを得た。ライゲーション産物を、使用説明書に従って大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＩＡＮＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＣＯ．ＬＴＤ．から購入した）に次いで形質転換した。陽性ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃコロニーをスクリーニングによって得、次いで従来通りの方法で増幅した。組換えプラスミドを、キットの使用説明書に従ってキット（ＴＩＡＮＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ［Ｂｅｉｊｉｎｇ］ＣＯ．ＬＴＤ．；ＤＰ１０３−０３）を使用して抽出した。
【００８５】
４．組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃを、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。
【００８６】
５．トランスフェクトした２９３Ｆ細胞を、７日間培養した。  組換えタンパク質を含有する培養上清を、高速遠心分離、微細孔膜真空ろ過及びＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラムにより次いで精製して、ＰＤＬ−１ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質を得た。そのタンパク質を、電気泳動ローディング緩衝液を添加して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析に供した。図１に示すように、標的タンパク質の分子量は、約５３ｋＤである。
【００８７】
調製例２：組換えタンパク質ＰＤ−１−ｈＦｃの調製
１．ＰＤ−１−ｈＦｃの遺伝子合成
キメラ遺伝子を、ＰＤ−１ＥＣＤと命名したＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００５００９．２）の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ断片（ｈＦｃ）を含むように設計した。２９３Ｆ細胞における標的遺伝子の発現効率を改善するために、ヌクレオチド配列をコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄで合成した。
【００８８】
２．ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃプラスミドの生成
ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃ遺伝子を、発現ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより供給された）にクローニングして、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃプラスミドを得た。
【００８９】
３．プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃの構築
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃを、酵素（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）で消化した。精製したＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃ遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）にクローニングして、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＩＡＮＧＥＮから購入した）に形質転換されたｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃを得た。陽性コロニーをスクリーニングにより得、次いで従来通りの大腸菌ＤＨ５ａ培養技術により増幅し、組換えプラスミドをキットの使用説明書（ＴＩＡＮＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ［Ｂｅｉｊｉｎｇ］ＣＯ．ＬＴＤ．ＤＰ１０３−０３）に従って抽出した。
【００９０】
４．組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃを、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。
【００９１】
５．２９３Ｆ細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃでトランスフェクトし、７日間培養した。  組換えタンパク質を含有する培養上清を、高速遠心分離、微細孔膜真空ろ過及びＭａｂｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムにより次いで精製して、ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃ融合タンパク質を得た。そのタンパク質を、電気泳動ローディング緩衝液を添加して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析に供した（図２）。
【００９２】
調製例３：組換えタンパク質Ｂ７−１−ｈＦｃの調製
１．Ｂ７−１−ｈＦｃの遺伝子合成
キメラ遺伝子を、Ｂ７−１（Ｂ７−１ＥＣＤ；分化抗原群８０［ＣＤ８０及びＢ７−１とも呼ばれる］、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００５１８２．１）の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ断片（ｈＦｃ）を含むように設計した。２９３Ｆ細胞における標的遺伝子の発現効率を改善するために、ヌクレオチド配列をコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄで合成した。
【００９３】
２．ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃプラスミドの生成
Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃ遺伝子を、発現ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄにより供給された）にクローニングして、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃプラスミドを得た。
【００９４】
３．プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃの構築
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃを、酵素（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）で消化した。精製したＢ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃ遺伝子断片を、ライゲーションによりｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）にクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃを得た。ライゲーション産物を、大腸菌ＤＨ５ａ株（ＴＩＡＮＧＥＮから購入した）に、次いで形質転換した。コロニースクリーニングを遂行し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃの陽性クローンを得、次いでそのクローンを従来通りの大腸菌ＤＨ５ａ培養技術により増幅し、組換えプラスミドをキットの使用説明書（ＴＩＡＮＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ［Ｂｅｉｊｉｎｇ］ＣＯ．ＬＴＤ．ＤＰ１０３−０３）に従って抽出した。
【００９５】
４．組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃを、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。
【００９６】
５．２９３Ｆ細胞をｐｃＤＮＡ３．１−ＰＤ−１ＥＣＤ−ＴＥＶ−ｈＦｃプラスミドでトランスフェクトし、次いで７日間培養した。組換えタンパク質を含有する培養上清を、高速遠心分離、微細孔膜真空ろ過及びＭａｂｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムにより次いで精製して、Ｂ７−１ＥＣＤ−ｈＦｃ融合タンパク質を得た。そのタンパク質を、電気泳動ローディング緩衝液を添加して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析に供した（図３）。
【００９７】
実施例１：ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５及びモノクローナル抗体５Ｃ１０、５Ｆ１０及び９Ｆ６の生成
哺乳動物細胞により発現された組換えＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃタンパク質を免疫原として使用して、マウスを免疫化した。免疫化したマウスの脾細胞を回収し、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を生成した。多数のサンプルによるスクリーニング後に、次いでハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５を得、その細胞株は、ＰＤＬ−１に特異的に結合し得るモノクローナル抗体５Ｃ１０を産生した。他の２つのモノクローナル抗体５Ｆ１０及び９Ｆ６も、本発明において得られた。
【００９８】
詳細は以下の通りである：
１．ハイブリドーマ細胞の生成
調製例１において得られた組換えＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質を免疫原として使用して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（広東省医学実験動物センター）を免疫化した。免疫化したマウスの脾細胞を回収し、一般的な方法に従ってマウス骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を生成した（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｓ．Ｊ．「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｈｏｄｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｇ．Ｃ．Ｈｏｗａｒｄ及びＤ．Ｒ．Ｂｅｔｈｅｌｌ編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）。
【００９９】
被覆抗原としてＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃを使用して間接ＥＬＩＳＡ分析を実行して、ＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ｍＦｃに特異的に結合できる抗体を産生しているハイブリドーマ細胞を得た。その後ハイブリドーマ細胞を競合ＥＬＩＳＡに供し、ＰＤＬ−１に対する結合においてＰＤ−１（調製例２から得たＰＤ−１−ｈＦｃ）と競合するモノクローナル抗体を分泌している細胞を選択した。そして、モノクローナル抗体５Ｃ１０を産生している安定なハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５を、限界希釈により更に得た。
【０１００】
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５は、２０１５年８月４日に受託番号ＣＣＴＣＣ  Ｃ２０１５１３３でＷｕｈａｎ大学（郵便番号：４３００７２）の中国タイプカルチャーコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）に寄託された。
【０１０１】
同様に、マウス抗体を産生している更に２つのハイブリドーマ細胞株（それぞれ５Ｆ１０及び９Ｆ６と命名した）も得た。
【０１０２】
２．モノクローナル抗体５Ｃ１０、５Ｆ１０及び９Ｆ６の調製
ＰＤＬ−１−５Ｃ１０ハイブリドーマ細胞株を、１０％（低ＩｇＧ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培地中で７日間培養し、次いで細胞培養上清を採取し、精製して抗体５Ｃ１０を得た。
【０１０３】
同様に、抗体５Ｆ１０、９Ｆ６を上の方法に従って調製した。
【０１０４】
３．抗体５Ｃ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製したタンパク質のサンプルに、還元ローディング緩衝液及び非還元ローディング緩衝液をそれぞれ添加した。精製からの通過画分と一緒に、全てのサンプルを煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして分析した。結果は、還元タンパク質の分子量が約５０ｋＤ及び２５ｋＤであり、非還元タンパク質が約１５０ｋＤであることを示した（図４）。
【０１０５】
４．マウス抗体５Ｃ１０、５Ｆ１０及び９Ｆ６に対する親和性、競合親和性及び細胞親和性の決定：
抗体の親和性を、例９及び例１３に記述される方法を使用してＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによりそれぞれ決定し、細胞に対する親和性を、例８に記述される方法を使用してＦＡＣＳにより決定した。
【０１０６】
結果を、表１に示す。
【表１】
0006432121.tif 000002
【０１０７】
結果は、３つのマウス抗体が、親和性及び競合親和性の点で参照抗体ＰＣＡＢ（例５で得た）に劣っていないことを示した。５Ｃ１０は、細胞親和性及び陽性率において最良の性能を有した。５Ｆ１０の細胞親和性は、ＰＣＡＢより優れており、９Ｆ６の陽性率はＰＣＡＢより優れている。
【０１０８】
実施例２：モノクローナル抗体５Ｃ１０、５Ｆ１０並びに９Ｆ６の重鎖及び軽鎖の配列の取得
全ｍＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＲＮＡ単離キット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４３０）を使用して、例１で得られたハイブリドーマ細胞株ＬＴ００５から抽出した。
【０１０９】
ｃＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘキットを使用して合成し、ＰＣＲにより増幅した。ＴＡ−クローニングを、ｐＥＡＳＹ−Ｔ１クローニングキット（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  ＣＴ１０１）の使用説明書に従ってＰＣＲ産物に対して実行した。ＴＡ−クローニングの産物を配列決定に供し、結果は以下の通りである：
【０１１０】
抗体５Ｃ１０のＶＨをコードしているヌクレオチド配列（３６０ｂｐ）：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号１）
【０１１１】
抗体５Ｃ１０のＶＨのアミノ酸配列（１２０ａａ）：
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＮＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＮＹＤＩＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＴＧＧＡＴＮＹＮＳＡＦＭＳＲＬＳＩＳＲＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＳＮＹＲＹＤＥＰＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２）
【０１１２】
抗体５Ｃ１０のＶＬをコードしているヌクレオチド配列（３１８ｂｐ）：
ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡ（配列番号３）
【０１１３】
抗体５Ｃ１０のＶＬのアミノ酸配列（１０６ａａ）：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＦＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（配列番号４）
同様に、モノクローナル抗体９Ｆ６及び５Ｆ１０の軽及び重鎖配列を得た。
【０１１４】
抗体５Ｆ１０のＶＨのアミノ酸配列（１１７ａａ）：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＤＩＫＤＴＹＩＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＤＧＮＴＲＹＤＰＫＦＱＤＫＴＴＩＴＴＤＴＳＳＮＴＡＨＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＧＡＷＦＡＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２１）
【０１１５】
抗体５Ｆ１０のＶＨをコードしているヌクレオチド配列（３５１ｂｐ）：
ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＧＡＣＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＧＧＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ（配列番号２２）
【０１１６】
抗体５Ｆ１０のＶＬのアミノ酸配列（１０６ａａ）：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＴＮＳＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＨＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＨＴＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（配列番号２３）
【０１１７】
抗体５Ｆ１０のＶＬをコードしているヌクレオチド配列（３１８ｂｐ）：
ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣ（配列番号２４）
【０１１８】
抗体９Ｆ６のＶＨのアミノ酸配列（１２４ａａ）：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＭＹＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＡＤＴＳＡＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＧＰＰＧＧＩＧＥＹＩＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
【０１１９】
抗体９Ｆ６のＶＨをコードしているヌクレオチド配列（３７２ｂｐ）：
ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２６）
【０１２０】
抗体９Ｆ６のＶＬのアミノ酸配列（１０７ａａ）：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＨＲＳＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩ（配列番号２７）
【０１２１】
抗体９Ｆ６のＶＬをコードしているヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣ（配列番号２８）
【０１２２】
実施例３：ヒト化抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１並びに５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の軽及び重鎖配列の設計
ＰＤＬ−１タンパク質の三次元結晶構造（ＰＤＢ  Ｃｏｄｅ  ３ＢＩＫ，Ｌｉｎ、ＤＹら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０５（８）：３０１１〜６［２００８年］）及び実施例２における配列に基づくコンピュータモデリングによって得られた５Ｃ１０構造を突然変異設計に使用し、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の変異した抗体可変領域配列を、次いで生成した（重鎖の定常領域は、Ｉｇγ−１鎖Ｃ領域、受託番号：Ｐ０１８５７であり；軽鎖の定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、受託番号：Ｐ０１８３４であった）。可変領域の配列を以下に示す：
【０１２３】
１．ヒト化モノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１の軽及び重鎖の配列
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１のＶＨのヌクレオチド配列（３６０ｂｐ）：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号５）
【０１２４】
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１のＶＨのアミノ酸配列（１２０ａａ）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＮＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＮＹＤＩＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＴＧＧＡＴＮＹＮＰＡＦＫＳＲＬＴＩＳＲＤＮＳＫＳＱＶＳＬＫＭＳＳＬＱＡＡＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＳＮＹＲＹＤＥＰＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）
【０１２５】
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１のＶＬをコードしているヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号７）
【０１２６】
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１のＶＬのアミノ酸配列（１０７ａａ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＴＬＳＶＴＰＫＥＫＶＴＬＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８）
２．ヒト化モノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の軽及び重鎖の配列
【０１２７】
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＶＨをコードしているヌクレオチド配列（３６０ｂｐ）：
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＴＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号９）
【０１２８】
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＶＨのアミノ酸配列（１２０ａａ）：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＮＹＤＩＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＴＧＧＡＴＮＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＭＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＳＮＹＲＹＤＥＰＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０）
【０１２９】
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＶＬをコードしているヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号１１）
【０１３０】
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＶＬのアミノ酸配列（１０７ａａ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＴＬＳＶＴＰＫＥＫＶＴＬＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１２）
３．ヒト化モノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２の軽及び重鎖の配列
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２のＶＨをコードしているヌクレオチド配列：配列番号５
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２のＶＨのアミノ酸配列：配列番号６
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２のＶＬをコードしているヌクレオチド配列：配列番号１１
抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２のＶＬのアミノ酸配列：配列番号１２
４．ヒト化モノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１の軽及び重鎖の配列
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１のＶＨをコードしているヌクレオチド配列：配列番号９
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１のＶＨのアミノ酸配列：配列番号１０
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１のＶＬをコードしているヌクレオチド配列：配列番号７
抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１のＶＬのアミノ酸配列：配列番号８
【０１３１】
実施例４：５Ｃ１０のヒト化抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の調製及びそのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の重鎖（ＶＨ：配列番号５又は配列番号９；ＣＨ：ｈＩｇＧ１）並びに軽鎖（ＶＬ：配列番号７又は配列番号１１；ＣＬ：ヒトκ配列）のｃＤＮＡを、ベクターｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）にクローニングして、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−５Ｃ１０Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ５Ｃ１０Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−５Ｃ１０Ｈ２及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−５Ｃ１０Ｌ２プラスミドを得た。
【０１３２】
配列を、調製例１に記述されている方法に従って、ベクターｐｃＤＮＡ３．１に更にクローニングした。組換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。７日間培養した後、培養上清を、高速遠心分離、微細孔膜真空ろ過及びＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラムにより次いで精製した。
【０１３３】
精製したタンパク質のサンプルに還元及び非還元ローディング緩衝液を別々に添加し、全てのサンプルを煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして分析した。結果を図５、図６、図７及び図８に示す。還元サンプルは、ゲル上でタンパク質マーカーに対して５０ｋＤ及び２５ＫＤバンドにそれぞれ対応する２本のバンドを有し、非還元タンパク質は、１５０ｋＤにバンドを有する。
【０１３４】
実施例５：ヒト化抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合動的パラメーターの分析
抗原ＰＤＬ−１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１、ヌクレオチド配列：配列番号１３；アミノ酸配列：配列番号１４）に対するヒト化抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合動的パラメーターを、フォルテバイオにより決定した。
【０１３５】
１．サンプル調製
（１）ＰＤＬ−１−ｍＦｃタンパク質を、調製例１に記述される方法により調製し、次いでＰＤＬ−１−ｍＦｃタンパク質を、ＴＥＶプロテアーゼで消化し、カラムクロマトグラフィーによって精製してＰＤＬ−１抗原を得た。
【０１３６】
ＰＤＬ−１のＤＮＡ配列（８７０ｂｐ）：
ＡＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＡＣＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号１３）
【０１３７】
ＰＤＬ−１のアミノ酸配列（２９０ａａ）：
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号１４）
【０１３８】
（２）陽性対照抗体ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢの調製
本発明において、ＨｐＬｐ又はＰＣＡＢを陽性対照として選択し、ＨｐＬｐは、市場においてアテゾリズマブ（商品名テセントリク［登録商標］）であり、ＰＣＡＢは、臨床試験におけるＰＤＬ−１抗体である。
【０１３９】
アテゾリズマブ（商品名テセントリク［登録商標］）は、Ｒｏｃｈｅから購入した。ＨｐＬｐ（別名ＫＦ０２５ＨｐＬｐ）を生成する方法は、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６号Ａ１（例えば、例１０）に見ることができ、その中でＨｐＬｐ抗体のＶＨ配列は、配列番号２０に記述され、一方ＶＬ配列は、配列番号２１に記述された。
【０１４０】
ＰＣＡＢを生成する方法は、米国特許第７９４３７４３号Ｂ２（例えば、例１）に見ることができ、抗体のＶＨ配列は、配列番号１に記述され、ＶＬ配列は、配列番号１１に記述された。
２．方法
【０１４１】
抗原ＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢの結合親和性を検出するために、抗原ＰＤＬ−１（５μｇ／ｍＬ）をアミノカップリングによりＡＲ２Ｇセンサの表面上にコーティングし、その後エタノールアミンでブロッキングした。ＰＢＳＴ中での平衡後に、バイオセンサに捕捉された抗原と抗体との結合を実施し、抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ）で、３倍希釈（初期濃度：２００ｎＭ）で段階的に希釈した。抗原ＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢの結合親和性を、フォルテバイオＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７．０により分析した。
【０１４２】
３．結果
ＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢの結合親和性及び動的定数を、表２及び図９〜１１に示す。
【表２】
0006432121.tif 000003
【０１４３】
結果は、３つ全ての抗体が非常に高い親和性で抗原に結合することを示した。そして、抗原に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐの結合親和性は、ＰＣＡＢより高かった。
実施例６：抗体５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐによるＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することの遮断（フォルテバイオ）
【０１４４】
ＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することを遮断する５Ｃ１０、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐの能力を検出するために、抗原ＰＤＬ−１（５μｇ／ｍＬ）をアミノカップリングによりＡＲ２Ｇセンサの表面上にコーティングし、その後エタノールアミンでブロッキングした。  ＰＢＳＴ中での平衡後に、バイオセンサに捕捉された抗原と抗体との結合を実施し、抗体を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ）で、３倍希釈（初期濃度：３３．３３ｎＭ）で段階的に希釈した。次いでバイオセンサチップを、ＰＤ−１タンパク質（１０μｇ／ｍＬ）を含有する溶液に４２０秒間浸漬した。
【０１４５】
図１２に示すように、各抗体は、ＰＤ−１に対するヒトＰＤＬ−１の結合を用量依存的様式で効果的に阻害することができ、各用量の蛍光強度及びフィッティングしたＥＣ５０を、表３に示した。
【表３】
0006432121.tif 000004
【０１４６】
結果は、３つ全ての抗体が、ＰＤ−１に対するヒトＰＤＬ−１の結合を用量依存的様式で効果的に阻害できたことを示す。
【０１４７】
実施例７：抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐによる、ＰＤＬ−１がＰＤ−１と相互作用することの遮断
ＰＤ１／ＰＤＬ−１相互作用を遮断する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の能力を、ＰＤ１／ＰＤＬ−１結合アッセイのキット（ＣＩＳＢＩＯ；６３ＡＤＫ０００ＣＰＬＰＥＨ）を使用してＨＴＲＦによりＨｐＬｐと比較した。抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐを、希釈緩衝液で、３倍希釈（初期濃度：１００μｇ／ｍＬ；１０段階）で段階的に希釈した。サンプル２μＬ、ＰＤＬ−１−ＥｕＫ  ４μＬ及びＴａｇ−ＰＤ１  ４μＬを溶液に添加し、その後瞬間遠心し、インキュベートした（室温で２０分間）。次いで、抗−Ｔａｇ−ＸＬ６６５  １０μＬを溶液に更に添加し、その後瞬間遠心し、インキュベートした（室温で２時間）。最後に、値を、ＰＨＥＲＡ  ｓｔａｒ  Ｆｓ（ＢＭＧ）によって読み取り、データをＧｒａｐｈ  Ｐｒｉｓｍによって分析した。
【０１４８】
結果は、ＨｐＬｐ及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、ＰＤ１／ＰＤＬ−１の相互作用を遮断する同程度の能力を有することを示した（それぞれ６７．２９ｎｇ／ｍＬ及び６８．９７ｎｇ／ｍＬ）。両方の抗体が、ＰＤ−１に対するヒトＰＤＬ−１の結合を効果的に阻害し得る。
【０１４９】
実施例８：ＦＡＣＳにより決定した、ＰＤＬ−１を発現している細胞に対するヒト化抗ＰＤＬ−１抗体の結合
最初に、ＰＤＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞を構築し、次いで宿主細胞を、ヒト化抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び陽性対照抗体（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）で標識した。細胞表面において天然の立体配座を持つ抗原に対する抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び陽性対照抗体（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の特異的結合を、ＦＡＣＳにより分析した。
【０１５０】
詳細は以下の通りである：
１．ＰＤＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞の構築
ＰＤＬ−１を含有するベクターｐＬｅｎｔｉ６．３−ＰＤＬ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）を、リポフェクタミントランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）のマニュアルに従って２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＰＤＬ−１を安定して発現する細胞を、スクリーニング後に得た。
【０１５１】
２．抗体標識及びＦＡＣＳ分析
２９３Ｔ細胞を、従来通りのトリプシン処理後に採取し、採取チューブ当たりの細胞数は、２×１０５であった。各抗体希釈を、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ及び０ｎＭの濃度で、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ）でそれぞれ調製した。次いで抗体希釈を、ＰＤＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞と氷上で２時間インキュベートし、その後３回ＰＢＳ洗浄した。ＦＩＴＣ−ヤギ−抗ヒトＩｇＧをＰＢＳで希釈し（１：１００）、各チューブに１００μＬ添加し、次いで氷上で１時間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄後に、細胞をＰＢＳ  ３００μＬによって再懸濁し、蛍光シグナルを、フローサイトメトリーのＦＩＴＣチャネルによって検出した。
【０１５２】
３．結果
ＰＤＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞に対する抗体５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及び陽性対照（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の抗体の結合を、図１３〜１８に示した。
【０１５３】
結果は、全ての抗体が、２９３Ｔ細胞の表面上のＰＤＬ−１に対して用量依存的様式で効率的に結合し得ることを示した。結合した抗体に対する蛍光定量分析後に、結合曲線を標準モデルでフィッティングし、表４に示すように各抗体の結合有効性ＥＣ５０を算出する。
【表４】
0006432121.tif 000005
【０１５４】
結果は、全ての抗体が、２９３Ｔ細胞の表面上の標的タンパク質（ＰＤＬ−１）に対して用量依存的様式で効率的に結合し得ることを示した。
実施例９：間接ＥＬＩＳＡによるＰＤＬ−１に対するヒト化抗ＰＤＬ−１抗体の結合親和性の決定
【０１５５】
間接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実行して、ヒトＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び陽性対照抗体（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の結合親和性を評価した。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＰＤＬ−１でコーティングし、４℃で終夜インキュベートし、その後１％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロッキングした。次いで抗体を、各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。二次抗体、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０８８）を、添加した。ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を、発色反応のために添加し、５分間インキュベートした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０１５６】
結果を、図１９に示す。図が示すように、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢは、ヒトＰＤＬ−１に用量依存的様式で効果的に結合し得る。各用量の蛍光強度及び曲線フィッティング後のＥＣ５０により表される算出した結合効率を、表５に挙げる。
【表５】
0006432121.tif 000006
【０１５７】
結果は、本発明の抗体が、ヒトＰＤＬ−１に用量依存的様式で効果的に結合し得ることを示した。
【０１５８】
実施例１０：間接ＥＬＩＳＡによる、サルＰＤＬ−１に対する抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合親和性
実験動物に対して遂行される薬物動態学及び毒性学実験を考慮して、この実験の目的は、抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、サルＰＤＬ−１に結合できるかどうか決定することであり；抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２が、サルＰＤＬ−１に結合できる場合、その後サルを薬物動態学及び毒性学実験に使用することができる。
【０１５９】
サルＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及び陽性対照ＨｐＬｐの結合を、間接ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートをサルＰＤＬ−１でコーティングし、４℃で終夜インキュベートし、その後ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロッキングした。次いで抗体を、各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。二次抗体、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０８８）を、添加した。ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を、発色反応のために添加し、５分間インキュベートした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０１６０】
サルＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐの結合活性の結果を、図２０に示す。図２０に示すように、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐは、サルＰＤＬ−１に用量依存的様式で効果的に結合することができる。各用量の蛍光強度及び曲線フィッティング後のＥＣ５０により表される算出した結合効率を、表６に示す。
【表６】
0006432121.tif 000007
【０１６１】
結果は、両方の抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及びＨｐＬｐが、サルＰＤＬ−１に用量依存的様式で効果的に結合することができ、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合能が、ＨｐＬｐより高いことを示した。
【０１６２】
実施例１１：間接ＥＬＩＳＡによる、ヒトＰＤＬ−１、ヒトＰＤ−Ｌ２及びマウスＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合
ヒトＰＤＬ−１、ヒトＰＤ−Ｌ２（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ１０２９２−Ｈ０８Ｈ）及びマウスＰＤＬ−１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ５００１０−Ｍ０８Ｈ）に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の結合を、間接ＥＬＩＳＡによって分析した。ヒトＰＤＬ−１、ヒトＰＤ−Ｌ２又はマウスＰＤＬ−１を、ウェル当たり０．５μｇ／ｍＬ  １００μＬでＥＬＩＳＡプレートに個別に添加し、４℃で終夜インキュベートした。抗体を、１μｇ／ｍＬから開始して段階的に希釈した（３倍希釈；１１段階）。ウェルを、１％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロッキングした。二次抗体、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０８８）を、１：２００００希釈で添加した。ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を、発色反応のために添加し、５分間インキュベートした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０１６３】
ヒトＰＤＬ−１、ヒトＰＤ−Ｌ２及びマウスＰＤＬ−１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２結合の結果を、図２１に示す。図２１に示すように、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２は、ヒトＰＤＬ−１に用量依存的様式で効果的に結合し得る。各用量の蛍光強度及び曲線フィッティング後に算出した結合効率はＥＣ５０＝９．１６ｎｇ／ｍＬであるが、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２は、ヒトＰＤ−Ｌ２及びマウスＰＤＬ−１に結合しない。
【０１６４】
結論として、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２は、ヒトＰＤＬ−１に特異的に組み合わさることができ、アテゾリズマブは、マウスＰＤＬ−１に結合することができる（テセントリク［登録商標］）ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＲＥＶＩＥＷ、ＦＤＡ、出願番号７６１０３４Ｏｒｉｇ１ｓ０００）。これらのデータは、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２抗体が優れた特異性を有することを示している。
【０１６５】
実施例１２：競合ＥＬＩＳＡによる、ＰＤＬ−１に対するＰＤ−１とヒト化抗体の競合結合活性の決定
競合ＥＬＩＳＡを実行して、ヒトＰＤＬ−１に対する結合においてＰＤ−１と競合する５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１及び陽性対照（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の能力を評価した。ＥＬＩＳＡプレートを受容体でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ウェルを、１％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロッキングした。その後、抗体及びＰＤＬ−１−ｍＦｃを混合し、室温で１５分間インキュベートし、次いで各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。二次抗体、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０６２）を、添加した。ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を、発色反応のために添加し、５分間インキュベートした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０１６６】
ＰＤＬ−１に対するこれらの抗体の結合活性の結果を、図２２に示す。５Ｃ１０Ｈ１Ｌ１、５Ｃ１０Ｈ１Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ１、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢが、ＰＤＬ−１に対する結合においてＰＤ−１と用量依存的様式で競合し得ることが分かる。各用量の蛍光強度及び曲線フィッティング後のＥＣ５０により表される算出した結合効率を、表７に示す。
【表７】
0006432121.tif 000008
【０１６７】
結果は、検出した抗体の全てが、抗原ＰＤＬ−１に用量依存的様式で競合的及び効果的に結合し得ることを示した。
【０１６８】
実施例１３：競合ＥＬＩＳＡによる、ＰＤＬ−１に対するＢ７−１と抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の競合結合活性の決定
ＰＤＬ−１に対する結合についてＢ７−１（Ｂ７−１−ｈＦｃ、調製例３により得た）と競合する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及び陽性対照抗体（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の能力を、競合ＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＤＬ−１でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ウェルを、１％ＢＳＡを用いて３７℃で２時間ブロッキングした。その後、抗体及びＰＤＬ−１−ｍＦｃを混合し、室温で１５分間インキュベートし、次いで各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。二次抗体、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−０６２）を、添加した。ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、３０８１７７）を、発色反応のために添加し、５分間インキュベートした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。
【０１６９】
ＰＤＬ−１結合に対するＢ７−１と５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の競合の結果を、図２３に示し、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢは、ＰＤＬ−１結合についてＢ７−１と効果的に競合し得る。各用量の蛍光強度及び曲線フィッティング後のＥＣ５０により表される算出した結合効率を、表８に示す。
【表８】
0006432121.tif 000009
【０１７０】
結果は、決定した抗体全てが、ＰＤＬ−１結合についてＢ７−１と競合でき、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２の競合結合活性は、ＰＣＡＢより強く、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２のＥＣ５０は、ＰＣＡＢの約半分であることを示す。ＨｐＬｐの競合結合活性は、その濃度増加につれて有意に増加しない。
【０１７１】
実施例１４：５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２及び陽性対照抗体（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の細胞生物活性分析
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌に対するモノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２並びに陽性対照（ＨｐＬｐ及びＰＣＡＢ）の効果を調査するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ロット番号１７１４４０−０２）を使用して、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣにＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｋ２５１３、１０００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｈ１５１３、１０００Ｕ／ｍＬ）を添加して、６日間誘導した。その後、ＰＢＭＣ及び細胞にＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｇ１５１３、２００Ｕ／ｍＬ）を更に添加して、３日間誘導し、それによってＤＣ細胞を得た。
【０１７２】
Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。ＤＣ細胞をＴ細胞と混合し、１：１０の比で培養した。異なる濃度の抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２（対照としてｈＩｇＧ）と５〜６日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡを実施してＩＦＮ−γ（Ｄａｋｅｗｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入したキット）及びＩＬ−２（Ｄａｋｅｗｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入したキット）の分泌を評価した。
【０１７３】
ＤＣ及びＴ細胞混合物からのＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の分泌の結果を、それぞれ図２４及び図２５に示した。結果は、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２、ＨｐＬｐ並びにＰＣＡＢが、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の分泌を用量依存的様式で効果的に誘導し得ることを示す。
【０１７４】
実施例１５：修飾ＩｇＧ１定常領域を持つモノクローナル抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔの設計及び調製
本発明において、重鎖定常領域は、Ｉｇγ−１鎖Ｃ領域、受託番号：Ｐ０１８５７であり；軽鎖定常領域は、Ｉｇκ鎖Ｃ領域、受託番号：Ｐ０１８３４である。ＥＵ付番方式による２３４、２３５及び、２３７部位でアミノ酸を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａに突然変異させた。変異体抗体を、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔと命名し、実施例４の方法により調製した。
【０１７５】
実施例１６：フォルテバイオにより決定したＦｃγＲＩＩＩａ及びＣ１ｑに対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔの動力学的親和性
１．ＦｃγＲＩＩＩａに対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ、テセントリク（登録商標）の親和性及び結合動態を、フォルテバイオ（Ｐａｌｌ  カタログ番号Ｏｃｔｅｔ、Ｑｋｅから購入した）により以下の通り特徴づけた：
【０１７６】
精製したＦｃγＲＩＩＩａ−ビオチンを、固定条件（１μｇ／ｍＬ  ＦｃγＲＩＩＩａ−ビオチン、３００秒）でフォルテバイオにより提供される標準的な方法及びキットを使用してビオチン−ストレプトアビジン結合によってストレプトアビジンコートされているＳＡチップにカップリングした。チップに、抗体を濃度４０００ｎＭで１２０秒間結合させ、その後ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中で１８０秒間インキュベートして解離させた。結合及び解離曲線を、Ｏｃｔｅｔソフトウェアにより分析した。
【０１７７】
結果を、図２６Ａ及び２６Ｂに示し、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ及びテセントリク（登録商標）は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合しなかった、このことは両方ともＡＤＣＣ活性がないことを示す。
【０１７８】
２．Ｃ１ｑ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号３２Ｒ−ＡＣ０４９から購入した）に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ、テセントリク（登録商標）の親和性及び結合動態を、フォルテバイオにより以下の通り特徴づけた：
【０１７９】
精製した抗体を、固定条件（２０μｇ／ｍＬ  抗体−ビオチン、３００秒）でフォルテバイオにより提供される標準的な方法及びキットを使用してビオチン−ストレプトアビジン結合によってストレプトアビジンコートされているＳＡチップにカップリングした。
次いでチップに、Ｃ１ｑを濃度２００ｎＭ（２倍希釈）で１２０秒間結合させ、その後ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中で１８０秒間インキュベートして解離させた。結合及び解離曲線を、Ｏｃｔｅｔソフトウェアにより分析した。結合定数評価に対する親和性の効果を最小限に抑えるために、結合及び解離相の開始に対応するデータセグメントだけを、フィッティングした。ＫＤ、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆの値を表９に示し、曲線を図２７Ａ及び２７Ｂに示す。
【表９】
0006432121.tif 000010
【０１８０】
結果は、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔが、Ｃ１ｑに対してテセントリク（登録商標）より低い動力学的親和性を有することを実証している。
【０１８１】
実施例１７：５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔのＣＤＣ活性
ＰＤＬ−１陽性腫瘍細胞ＨＣＣ１９５４（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２３３８から購入した）を、対応する培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ血清）で培養した。そして、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔを、１００００μｇ／ｍＬで開始して、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ヒト血清）で段階的に希釈した（５倍希釈を１０段階）。上述の腫瘍細胞をトリプシンで処理し、数本のチューブの細胞を採取し、対応する培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ヒト血清）に再懸濁し、次いで異なる希釈の抗体と共に９６ウェルプレートに添加して（１００００個の細胞／ウェル）、５時間インキュベートした。その後、ＣＣＫ８試薬（Ｄｏｎｇｒｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、カタログ番号ＣＫ０４、ロット：ＪＪ７４４から購入した）２０μＬを各ウェルに添加して、３時間インキュベートした。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｏｄｅｌ：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２）により４５０ｎｍで読み取った。ミトコンドリア内のデヒドロゲナーゼの活性は、ＨＣＣ１９５４細胞に対する抗体の細胞毒性を反映している。
【０１８２】
結果は、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔが、ＨＣＣ１９５４細胞に対してＣＤＣ効果がないことを実証している。
【０１８３】
実施例１８：大腸がんに対するｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍阻害効果
１．サンプル
５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ、テセントリク（登録商標）及びヒトＩｇＧを、Ｓｉｃｈｕａｎ  Ｋｅｌｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．より得た。
テセントリク（登録商標）を、Ｒｏｃｈｅから購入し、ヒトＩｇＧを、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｒｏｎｇｓｈｅｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入した。
【０１８４】
調製：３つのサンプルを、０．１％ＢＳＡを含有する生理食塩水で所望の濃度に希釈する。
【０１８５】
細胞及び動物
ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞を、マウス大腸がんＭＣ−３８細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、カタログＣＢＰ６０８２５から購入した）から得た。ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞の内生的マウスＰＤＬ−１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりノックアウトされており、ヒトＰＤＬ−１が、細胞にトランスフェクトされている。従って、ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞は、ヒトＰＤＬ−１タンパク質だけを発現することになる。
【０１８６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、７〜８週齢、雌を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入した。
【０１８７】
２．手順
各マウスに、ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞１×１０５個を皮下接種し、無作為に群分けして、腫瘍接種（Ｄ０）の２日目から２日に１回（Ｑ２Ｄ）サンプルを腹腔内注射（ＩＰ）した。注射用量は、ヒトＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）及びテセントリク（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ）であった。各群は、０．１ｍＬ／１０ｇ体重の注射体積のマウス１０匹であった。
【０１８８】
３．実験的指標
腫瘍成長に対する薬物の影響を、Ｔ／Ｃ％又は腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（％）により示す。
【０１８９】
腫瘍直径を、ノギスで週２回測定した。腫瘍体積（Ｖ）を：
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２として算出した、式中、ａ及びｂはそれぞれ長さ及び幅を表す。
Ｔ／Ｃ％＝Ｔ／Ｃ×１００であり、Ｃは対照群の腫瘍体積又は腫瘍重量を表し、Ｔは処置群の腫瘍体積又は腫瘍重量を表す。
【０１９０】
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（％）＝（Ｃ ― Ｔ）／Ｃ×１００であり、Ｃは対照群の腫瘍体積又は腫瘍重量を表し、Ｔは、処置群の腫瘍体積又は腫瘍重量を表す。
【０１９１】
４．結果
下記表１０に示す。
【表１０】
0006432121.tif 000011
【０１９２】
ＭＣ−３８／Ｈ−１１の皮下異種移植片に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ  １．５、５及び１５ｍｇ／ｋｇのＴＧＩ率は、平均腫瘍体積により算出してそれぞれ６３．９％、７５．８％及び６８．６％であった。各群における腫瘍サイズの個体変動が非常に大きかったことを考えると、腫瘍成長阻害計算に腫瘍体積中央値を使用することは合理的であった。この条件下で、ＴＧＩ率は、１００％、１００％及び１００％であった。参照薬物テセントリク（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＴＧＩ９３．８％（腫瘍体積中央値で算出した）を有した。腫瘍重量中央値により算出した場合、ＭＣ−３８／Ｈ−１１に対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）のＴＧＩは、１００％、１００％及び１００％であった。テセントリク（登録商標）のＴＧＩは、９３．７％であった。腫瘍体積中央値と腫瘍重量中央値で算出されるＴＧＩには、高い整合性があり、腫瘍体積による計算の信頼性を示している。５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍成長を阻害するだけでなく、腫瘍化も阻害した。実験の終了時（Ｄ２７）に、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ  １．５、５、１５ｍｇ／ｋｇの腫瘍出現率は、それぞれ４０％、４０％及び４０％であった。テセントリク（登録商標）群の腫瘍出現率は、５０％であった。全ての薬物は、担腫瘍マウスにおいて有意な体重減少なく、また他の症候が観察されることもなくよく寛容される。テセントリク（登録商標）と比較して、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）は、大腸がん細胞ＭＣ−３８／Ｈ−１１皮下移植モデルに対してより強い抗腫瘍効果を有した。
【０１９３】
実施例１９：肺がんに対するｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍阻害効果
動物モデルの方法：ＮＯＧマウスに、非小細胞肺がん細胞ＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２８６８から購入した）を皮下接種した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したら、次いでマウスに活性化したヒトＰＢＭＣを静脈内注射して、投与前にヒト免疫系を模倣した。
【０１９４】
投薬計画：１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射、２日毎に１回、合計４回。腫瘍体積を、投与後週２回測定した。マウスを、３つの群に分けた：対照（ＩｇＧ）、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ及びテセントリク（登録商標）、各群６匹のマウス）。
【０１９５】
腫瘍成長曲線を、図２８に示す。
【０１９６】
結果は、５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ群の腫瘍体積が、４日目からテセントリク（登録商標）群及びＩｇＧ対照群より明らかに小さいことを示した。５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｍｔ群の腫瘍成長は、ほぼ完全に阻害された。対照的に、テセントリク（登録商標）群及びＩｇＧ対照群において腫瘍は、継続的に成長した。結果は、本発明の抗体が、テセントリク（登録商標）より強いｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有することを実証した。
【０１９７】
本発明の特定の実施形態について詳述してきたが、当業者であれば理解することができよう。開示された全ての詳細により、様々な修正及び置き換えをこれらの詳細に対して作製することができ、それらはなお本発明の保護範囲内にある。本発明の完全な範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物により与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【配列表】
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