(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式(I)：
【化１】
0006415545.tif 000017
(式中：
− R1及びR2は互いに独立して: Ｈ、ORa(ここで、RaはＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)を表すか、又はR1＝R2であり、＝Ｏ、＝NRb(ここで、RbはＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)、＝CRcRd(ここで、Rc及びRdは互いに独立してC1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)を表し、
− R3及びR4は互いに独立してＨ、C1〜C10-アルキル又はへテロアリール基を表し、
− R'3及びR'4は互いに独立してＨ、C1〜C10-アルキル又はへテロアリール基を表し、
− ＡはOH又は
【化２】
0006415545.tif 000018
を表す)
を有する化合物を含む、抑うつの治療及び/又は予防用(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療用ではない)組成物。
【請求項２】
前記抑うつが古典的治療に対して抵抗性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抑うつの初期治療として処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が次式(II)：
【化３】
0006415545.tif 000019
(式中：Ａ、R3、R4、R'3及びR'4は請求項１のものと同義である)
を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記化合物が次式(III)：
【化４】
0006415545.tif 000020
(式中：R3、R4、R'3及びR'4は請求項１のものと同義である)
を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が次式(IV)：
【化５】
0006415545.tif 000021
(式中：R3、R4、R'3及びR'4は請求項１のものと同義である)
を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
次式(V)：
【化６】
0006415545.tif 000022
を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記化合物が0.1mg/kg〜300mg/kg、特に10mg/kg〜125mg/kgの用量で慢性投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記化合物が30mg/kg〜275mg/kgの用量で急性投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
経口経路又は静脈内経路により投与される、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒト患者が患っている前記抑うつが、コントロール患者のものと比較して率で約35％減少した、特に血清中で測定される、脳由来神経栄養因子レベルを示し、及び/又は古典的マーカー、例えば該患者におけるカタラーゼの生理学的レベル及び/又は脂質過酸化チオバルビツール酸反応性物質(tBARS)のレベル及び/又はスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)のレベル及び/又は脂質過酸化(tBARS［例えば、チオバルビツール酸反応性物質］、オキシステロール)のレベル及び/又はグルタチオンレダクターゼ(GSR)のレベル及び/又は比GSH/GSSG(還元型グルタチオン/酸化型グルタチオン)のレベル及び/又はタンパク質酸化のレベル及び/又はグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)のレベル及び/又はカタラーゼのレベル及び/又は反応性酸素種(ONOO-、*OH、NO、H2O2、O2-)を用いて測定した酸化ストレスを示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
抗うつ剤様特性を有する化合物又は抗うつ薬、特に7,8 DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムからなる群より選択される抗うつ剤様特性を有する化合物又は抗うつ薬との組み合わされた、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
電気ショック療法、電気痙攣療法(ECT)、経頭蓋磁気刺激(TMS)、反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)、行動療法からなる群より選択される治療法の実施の間に投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
(i)少なくとも１つの、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、及び
(ii)少なくとも１つの抗うつ薬、特に、7,8 DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムからなる群より選択される抗うつ薬を、医薬的に許容されるビヒクルとの組合せで含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
抑うつの治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして
(i)少なくとも１つの、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、特に式Ｖ
【化７】
0006415545.tif 000023
の化合物、及び
(ii)少なくとも１つの抗うつ薬、特に、7,8 DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムからなる群より選択される抗うつ薬
を含んでなる製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑うつ障害の治療用及び/又は予防用の新規薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抑うつは世界中で相当に頻発している精神障害である。この障害には2010年時点で約298百万人(すなわち、世界人口の約4.3％)が罹患していると考えられている(Vosら，Lancet. 2012 Dec 15;380(9859):2163-9)。
気分障害は、大うつ病性障害、気分変調、双極性障害、及び種々の要因(例えば、ストレス性事象又は薬物乱用)で誘導される幾つかの他のに分類することができる。
米国国立精神衛生研究所によれば、大うつ病性障害は、労働をし、睡眠をとり、食事をとり、かつては快く感じた活動を楽しむ能力に干渉する複合症状で特徴づけられる一方、気分変調は、重症ではないが、より長期間持続する(少なくとも２年間持続し得る)症状を伴う慢性抑うつである(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV (DSM-IV))。
【０００３】
躁うつ病性障害としても知られる双極性抑うつ障害は、気分、エネルギー、活動レベル及び日々の課題を行う能力が異常シフトを引き起こす脳障害を規定する。双極性障害患者は、異常高揚状態のエピソード(躁病又は軽躁病エピソードとして知られる)とうつ病エピソードとが交互に起こる。双極性障害には幾つかのサブタイプがある：双極Ｉ型障害、双極II型障害、循環気質(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV (DSM-IV))。
大うつ病性障害又は気分変調としての抑うつ障害を、他の生理学的又は神経学的疾患に付随して出現することがある(例えば、女性の月経前不快気分障害の場合の)うつ状態と混同すべきでないことに留意しなければならない。
事実、うつ状態は、１週間未満でしか継続せず、原因である生理学的又は神経学的病理の除去により消滅するので、特別な抗うつ治療を必要としない。例えば、月経前不快気分障害におけるうつ状態は、抗うつ治療ではなくホルモン治療のみを必要とする。
【０００４】
今日まで、抑うつの病態生理学的機序の理解は不十分なままである(Krishnan and Nestler, Nature, 2008, 455:894-902)。疫学的、臨床的及び基礎的研究により、遺伝要素と環境要素との間の複雑な相互作用(対象者の生理学的及び心理学的経歴が特に重要な役割を演じる)の存在が明らかにされている(McEwen and Stellar, 1993, Arch Intern Med 153: 2093-2101；Jacobson and Cryan, 2007, Behav Genet 37: 171-213)。成人期の持続性又は反復性ストレスが、この病的状態を直接誘導し得るか、又は一部の患者において不適応変化(これが、脆弱性表現型を生じ、素因を有する患者を病気発症の増大したリスクに置く機序の引き金として作用し得る)を誘引し得る(de Kloetら，2005)。よって、心理学的ストレス性事象(例えば、親族の死亡、離婚、屈辱又は敗北、金銭的状態の悪化)により、神経生物学的システムが感作され、後年に、抑うつの発症に対する脆弱性状態がもたらされ得る。
【０００５】
酸化ストレスがストレス性事象の後に発生し得、抑うつを含む精神疾患と関連付けられ得ることが知られている(Hovattaら，2010, Neurosci. Res. 68: 261-275)。酸化ストレス経路は薬理学的介入の魅力的な標的を提供する。しかし、抑うつ障害に対する抗酸化治療の効力を調べた研究は少ない。脳グルタチオンを効果的に補給するグルタチオン前駆体であるＮ-アセチルシステイン(NAC)での治療は、双極性抑うつ患者においてうつ病スコアの強力な低下を誘導した(Berkら，Neuro Endocrinol Lett., 32(2): 133-40, 2011)。酸化ストレス関連機序を標的とすることが抑うつ障害の治療に有益であり得ることの確立にはより多くの研究が必要である。
【０００６】
現在、抑うつ障害の最もポピュラーな治療は、(脳神経伝達物質に主に働く)抗うつ剤、特に、モノアミン(セロトニン、ノルエピネフリン又はドーパミン)の投与である。
しかし、現在入手可能な抗うつ剤は抑うつ治療に対して有効性が十分でないことを示す臨床データが多くなっている(Favaら，The American Journal of Psychiatry, 2006, 163(7): 1161-72；Trivediら，New England Journal of Medicine, 2006, 354(12): 1243-52；Rushら，New England Journal of Medicine, 2006, 354(12): 1231-42)。入手可能な抗うつ剤で治療された患者の30％〜50％は肯定的な反応を示さないと報告されている(Ruheら，The Journal of Clinical Psychiatry, 2006, 67(12): 1836-55)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
結果として、より有効な抗うつ剤の開発が急務である。更に、脆弱な高リスク集団における抗うつの発症を予防する薬剤の開発が特に関心の的である。
TEMPOL(4-ヒドロキシ-2,2,6,6‐テトラメチルピペリジン-1-オキシル)は、抗酸化剤として知られ、女性に、乳腺線維嚢胞症、直腸痔核、歯周炎及び/又は歯肉炎、偏頭痛、周期性嘔吐症候群、帯状疱疹及び/又はヘルペス後神経痛、月経前不快気分障害の治療に薬剤として使用されている(US2012/0115905)。しかし、US 2012/0115905で報告された実験は、極めて特別な条件の一人の女性患者(この患者は、乳腺線維嚢胞症の病歴が長く、外科医に乳房切除を勧められるほどの重症であり、また重度の三叉神経痛に罹患していると以前に診断されていた)において実施されたものに過ぎない。よって、US 2012/0115905で報告されているのは断定的主張に過ぎず、肯定的なヒト臨床試験とはみなせず、何らかの意味ある結果としてさえみなすことはできない。
【０００８】
近年、BDNF(脳由来神経栄養因子)は、リスクを有する集団内の高リスク個体の診断に適切なバイオマーカーとして報告されている(Blugeotら，2011, J. Neurosci. 31(36): 12889-12899)。また、BDNF模擬体である7,8-DHFの脳室内投与により、神経解剖学的変化(例えば、海馬CA3の樹状突起退縮、扁桃核の樹状突起長の増大、抑うつプロフィールの発生)を予防できることが示されている。
しかし、BDNFが抑うつ障害の発症にどのように関与しているのかは不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する化合物を提供することである。
特に、本発明は、次式(I)：
【化１】
0006415545.tif 000002
(式中、
− R1及びR2は互いに独立して: Ｈ、ORa(ここで、RaはＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)を表すか、
又はR1＝R2であり、＝Ｏ、＝NRb(ここで、RbはＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)、＝CRcRd(ここで、Rc及びRdは互いに独立してC1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表す)を表し、
− R3及びR4は互いに独立してＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表し、
− R'3及びR'4は互いに独立してＨ、C1〜C10-アルキル、アリール又はへテロアリール基を表し、
− ＡはOH又は
【化２】
0006415545.tif 000003
を表す)
を有し、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療において薬剤として使用するものではない)化合物に関する。
【００１０】
本発明は、TEMPOLが心理学的ストレス性事象により誘導された神経解剖学的変化を回復させることができ、脆弱群におけるストレス性事象後の抑うつ表現型の発症を予防することができるという本発明者らが取得した驚くべき実験結果、すなわち、脆弱群における血清又は海馬のBDNFレベルが正常コントロールレベルを一貫して下回っているという結果に基づく。
本発明者らは、BDNFが、リスクを有する集団内の高リスク個体の診断に適切なバイオマーカーであるだけでなく、Nrf2活性の制御により酸化ストレスを調節することができること、及び上記式(I)の化合物による酸化ストレスの緩和が抑うつ障害を治療及び/又は予防し得ることを初めて確立した。
事実、本発明者らの実験は、BDNFがサイトゾルから核へのNrf2の移行を活性化し得ることを示す。核Nrf2は、抗酸化応答要素(ARE)に結合することで一連の抗酸化遺伝子及び解毒遺伝子をアップレギュレートすることによって酸化ストレスに対する応答に関与する(Singhら，2010, Free Radical Research 44(11): 1267-1288)。
【００１１】
用語「抑うつ」とは、大うつ病性障害及び気分変調、又は双極Ｉ型障害、双極II型障害、循環気質を含む双極性抑うつ障害であり得る抑うつ障害をいう。
本発明に関して、用語「抑うつ」及び「抑うつ障害」は互いに置換可能である。用語「双極性抑うつ」、「双極性抑うつ障害」及び「双極性障害」は互いに置換可能である。
用語「抑うつ状態」とは、１週間より短い期間継続し、抗うつ治療を受けないで消えることがある憂うつ気分をいう。
【００１２】
用語「月経前不快気分障害」とは、重度の月経前苦痛並びに関連する社会的及び情動的機能の低下により特徴付けられる女性疾患をいう。月経前不快気分障害の症状(例えば、抑うつ、不安、気分変動)は、ホルモンサイクルの間に起こるホルモンレベルの異常変動に関連付けられ得る。
月経前不快気分障害を患う女性の異常なホルモンレベルは、しばしば、憂うつ気分の起源である。しかし、抑うつ障害は、一般に、そして女性では、異常なホルモンレベル以外に起源を有することがある。
本発明においては、問題とする患者群から、月経前不快気分障害を患い、抑うつ状態を発現している女性は除外されると理解されるべきである。
しかし、患者群からは、月経前不快気分障害とは無関係に抑うつ障害を患う女性は除外されない。
【００１３】
用語「アルキル」とは、指定数の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の飽和炭化水素をいう。C1〜C10アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｎ-ヘキシル、ｎ-ヘプチル、ｎ-オクチル、ｎ-ノニル、ｎ-デシルを挙げることができるが、これらに限定されない。
用語「アリール」とは、未置換の芳香族系(例えば、フェニル)又は少なくとも１つのOH基、少なくとも１つの(C1〜C3)アルキル基により置換された芳香族系をいう。
用語「ヘテロアリール」とは、炭素原子と水素原子と窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１以上(好ましくは１〜３)のヘテロ原子とを含んでなる単環式又は多環式の芳香環をいう。本発明に関して、ヘテロアリール基としては、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジル、トリアジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、(1,2,3)-及び(1,2,4)-トリアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フェニル、イソオキサゾリル及びオキサゾリルを挙げることができるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は非置換であることも、１又は２の適切な置換基で置換されていることもできる。
【００１４】
本発明の１つの特定の実施形態は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療において薬剤として使用するものではない)上記式(I)の化合物に関する。
１つの特定の実施形態では、本発明は、古典的治療に抵抗性である抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
用語「古典的治療に抵抗性である抑うつ」は、患者において、連続３回の、抑うつ障害の古典的な治療的処置が不成功であることを意味する。
治療的処置は、抗うつ症状の半分が４週間以上の処置後にも維持されている場合、不成功と見なされる。
【００１５】
用語「古典的治療」は市販の抗うつ剤又は心理療法による治療を意味する。
例えば、古典的抗うつ剤は、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン...］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［例えば、トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムから選択できる。
抑うつの古典的治療に使用される心理療法は行動療法及び認知療法であり得る。
【００１６】
別の１つの特定の実施形態では、本発明は、抑うつの初期治療として処方される薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
用語「初期治療」は、抑うつ障害の治療のために患者に処方される最初の薬剤を意味する。これは、本発明の化合物が古典的治療と置き換わることを意図されていないことを意味する。
１つのより特定の実施形態では、本発明は、男性及び月経前不快気分障害でない女性の大うつ病性障害又は気分変調並びに男性及び女性の双極性抑うつの治療における薬剤として、及び/又は男性及び女性の抑うつの予防における薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
別の１つのより特定の実施形態では、本発明は、男性における大うつ病性障害又は気分変調及び男性及び女性における双極性抑うつ障害の治療及び/又は予防において薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
【００１７】
本発明の別の１つの特定の実施形態は、抑うつの予防における薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
１つのより特定の実施形態では、本発明は、感作ストレスを受けた個体において抑うつの予防に使用する上記式(I)の化合物に関する。
「感作ストレス」は、神経生物学的系を感作し、後年の抑うつの発症に対する脆弱性状態をもたらすストレス性事象を意味する。
感作ストレスを受けた後に、抑うつを発症し易い個体は、以下で、「感作された」又は「脆弱な」と呼ぶ。
１つの有利な実施形態では、本発明は、感作ストレスを受けた個体における抑うつの予防に使用する上記式(I)の化合物に関し、ここで、感作ストレスは、コントロール患者のレベルを約35％下回る率の前記個体におけるBDNFレベルで測定される。
【００１８】
本発明の１つの特定の実施形態では、化合物は、式中、
- R1はＨを表し、R2はＨ又はOHを表し、
- R3＝R4＝R'3＝R'4であり、R3、R4、R'3及びR'4はC1〜C10アルキルを表し、特にメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを表し、
- ＡはOH又は
【化３】
0006415545.tif 000004
を表す式(I)を有する。
【００１９】
本発明の別の１つの特定の実施形態は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用するものではない)化合物であって、下記式(II)：
【化４】
0006415545.tif 000005
(式中、Ａ、R3、R4、R'3及びR'4は上記と同義である)
を有する化合物である。
【００２０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、化合物は、式中、
- R3＝R4＝R'3＝R'4であり、R3、R4、R'3及びR'4はC1〜C10アルキルを表し、特にメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを表し、
- ＡはOH又は
【化５】
0006415545.tif 000006
を表す式(II)を有する。
【００２１】
１つの更なる特定の実施形態では、本発明は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用するものではない)化合物であって、下記の式(III)：
【化６】
0006415545.tif 000007
(式中、R3、R4、R'3及びR'4は上記と同義である)
を有する化合物に関する。
【００２２】
本発明の１つの好ましい実施形態では、化合物は、式中、R3＝R4＝R'3＝R'4であり、R3、R4、R'3及びR'4はC1〜C10アルキルを表し、特にメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを表す式(III)を有する。
【００２３】
本発明の１つのより好ましい実施形態では、化合物は、下記式(V)：
【化７】
0006415545.tif 000008
を有する。
式(V)の化合物はEMPOLとも呼ぶ。
【００２４】
本発明の別の１つの更なる特定の実施形態は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用するものではない)化合物であって、下記の式(IV)：
【化８】
0006415545.tif 000009
(式中、R3、R4、R'3及びR'4は上記と同義である)
を有する化合物である。
【００２５】
本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の化合物は、式中、R3＝R4＝R'3＝R'4であり、R3、R4、R'3及びR'4はC1〜C10アルキルを表し、特にメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを表す式(IV)を有する。
式(I)の別の１つの化合物であるTEMPO(2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニル-1-オキシル)もまた、本発明において、抑うつの治療用及び/又は予防用薬剤として使用することができる。
【００２６】
本発明の別の１つの実施形態は、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する(ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用するものではない)化合物であって、0.1mg/kg〜300mg/kg、特に10mg/kg〜125mg/kgの用量で慢性投与される上記化合物、特に式(V)の化合物に関する。
「慢性投与」は、薬剤が７日間にわたる１つの実験セッションより多い実験セッションの間投与される薬剤投与パラダイムを定義する。
【００２７】
別の１つの実施形態では、本発明の化合物は30mg/kg〜275mg/kgの用量で急性投与される。
「急性投与」は、薬剤が24時間以内の１つの実験セッションの間に投与される(該実験セッション中に１回又は複数回)薬剤投与パラダイムを定義する。
化合物は経口経路又は静脈内経路での投与に適切な剤形に製剤化できる。
医薬組成物は医薬的に許容されるビヒクルも含むことができる。
活性物質として上記化合物、特に式(V)の化合物を含んでなる医薬組成物は、経口投与用に錠剤、ピル若しくはカプセルとして、又は静脈内投与用に溶液として製剤化できる。
医薬組成物は、経口投与用である場合には、充填剤、配合剤(blender)、流動促進剤、滑沢剤、崩壊剤、着香剤、着色剤、甘味剤及び吸収・吸着剤を含むことができる。
【００２８】
１つの特定の実施形態では、本発明の化合物、特に式(V)の化合物は、コントロール患者のレベルを約35％下回る率のBDNFレベルを有するヒト患者が患っている抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用されるが、ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療に使用されず、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用されない。
心理学的ストレス性事象後のBDNFレベルの、コントロール患者と比較したときの減少は、脆弱な高リスク集団のバイオマーカーである。
本発明の化合物、特に式(V)の化合物の投与は、酸化ストレスを効果的に緩和し、抑うつ障害を発症するリスクを効果的に低減することができる。
用語「コントロール患者」とは、人生において、いずれのタイプの抑うつ障害の病歴も有していない患者をいう。
BDNFレベルは、Blugeotら(2011, J. Neurosci. 31(36): 12889-12899)に記載の方法により、血清中又は海馬中で測定することができる。
【００２９】
１つの更なる特定の実施形態では、本発明の化合物、特に式(V)の化合物は、コントロール患者の血清中で測定したレベルを約35％下回る率の血清BDNFレベルを有するヒト患者が患っている抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用されるが、ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療に使用されず、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用されない。
別の１つの更なる特定の実施形態では、本発明の化合物、特に式(V)の化合物は、コントロール患者の海馬で測定した脳由来神経栄養因子(BDNF)レベルを約35％下回る率の海馬BDNFレベルを有するヒト患者が患っている抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用されるが、ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態の治療に使用されず、特に大うつ病性障害又は気分変調の女性の治療に使用されない。
【００３０】
本発明の１つの特定の実施形態は、抑うつの予防において薬剤として使用する上記定義の式(V)の化合物に関する。
１つの更なる特定の実施形態では、本発明は、感作ストレスを受けた個体の抑うつの予防において使用する上記式(V)の化合物に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、感作ストレスを受けた個体の抑うつの予防において使用する上記式(V)の化合物に関し、ここで、感作ストレスは、コントロール患者のレベルを約35％下回る率の前記個体におけるBDNFレベルで測定される。
【００３１】
本発明の別の１つの実施形態は、古典的マーカーにより、例えば患者におけるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及び/又は脂質過酸化(例えば、tBARS［チオバルビツール酸反応性物質］、オキシステロール．．．)及び/又はグルタチオンレダクターゼ(GSR)及び/又は比GDH/GSSG(還元型グルタチオン/酸化型グルタチオン)及び/又はタンパク質酸化及び/又はグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及び/又はカタラーゼ及び/又は反応性酸素種(ONOO-、*OH、NO、H2O2、O2-)の生理学的レベルにより測定される酸化ストレスを更に有するヒト患者が患っている抑うつ障害の治療及び/又は予防において薬剤として使用する上記化合物、特に式(V)の化合物に関する。
【００３２】
「酸化ストレス」は、酸化剤産生と抗酸化能とのバランスの欠陥に対応し、この欠陥は反応性酸素種(ROS)レベルの上昇及び脂質過酸化のような酸化的損傷に至る。
本発明において、上記分子の生理学的レベルは、血清、血漿、赤血球、脳脊髄液(CSF)又は脳組織で測定した分子レベルであり得る。
SOD、tBARS、オキシステロール、GSR、GPx、GSH/GSSG、タンパク質酸化又はROSのレベルは、任意の従来法により、特に下記実施例に記載の方法により測定することができる。当業者は、血清、血漿、赤血球、脳脊髄液(CSF)又は脳組織のこれら分子レベルは異なり得ること、並びに治療すべき患者のSOD、tBARS、オキシステロール、GSR、GPx、GSH/GSSG、タンパク質酸化又はROSのレベル及び正常コントロールのレベルを同じタイプの生物学的サンプルで測定することが好適であると理解する。
【００３３】
患者は、SOD、tBARS、オキシステロール、GSR、GPx、GSH/GSSG、タンパク質酸化又はROSの少なくとも１つの分子のレベルが正常コントロールのレベルと異なる場合、酸化ストレスを有すると考えられる。
好ましくは、所与の分子の正常コントロールは、当該アッセイを行った研究施設により規定される。
例えば、患者は、赤血球中のSODレベルが950〜1100U/gヘモグロビンより高い場合及び/又は赤血球中のGSRレベルが8.4〜8.87U/gヘモグロビンより高い場合及び/又は赤血球のGPxレベルが5.5〜19U/gヘモグロビンより高い場合及び/又は赤血球中のtBARSレベルが95〜105mmol/gヘモグロビンより高い場合、酸化ストレスを有すると考えられる。
【００３４】
本発明の別の１つの実施形態は、抗うつ剤様特性を有する化合物又は抗うつ薬、特に7,8-DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤、例えばシタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミンなど)、TCA(三環系抗うつ剤、例えばイミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリンなど)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤、例えばクロルジリン、モクロベミド、トロキサトンなど)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤、例えばベンラファキシン、デュロキセチン)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤、例えばブプロピオン)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤、例えばトラゾドン)、ドーパミン再取込み阻害剤(例えばアミネプチン)、リチウムからなる群より選択される抗うつ剤様特性を有する化合物又は抗うつ薬との組合せで、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する上記の化合物、特に式(V)の化合物に関する。
【００３５】
本発明は、電気ショック療法、電気痙攣療法(ECT)、経頭蓋磁気刺激(TMS)、反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)、行動療法からなる群より選択される治療法の実施の間に投与される、抑うつの治療及び/又は予防において薬剤として使用する上記の化合物、特に式(V)の化合物に関する。
別の１つの特定の実施形態では、本発明は、脆弱集団における抑うつの予防において薬剤として使用する上記式(I)の化合物に関する。
用語「脆弱集団」とは、ストレス性事象後に血清BDNF濃度の持続的低下を示す集団をいう。動物において、血清BDNFレベルの低下は、海馬容積及び神経新生の減少、CA3樹状突起退縮、スパイン密度低下及び扁桃体ニューロン肥大に関連する。
１つの更なる特定の実施形態では、本発明は、男性及び女性の抑うつ障害の予防において薬剤として使用する式(V)の化合物に関する。
【００３６】
発明の別の主題は、少なくとも１つの上記化合物、特に式(V)の化合物及び少なくとも１つの別の抗うつ薬を、医薬的に許容されるビヒクルとの組合せで含んでなる医薬組成物である。
特に、抗うつ薬は、7,8 DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［例えば、トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムからな群より選択される抗うつ剤である。
上記医薬組成物の１つの特定の実施形態では、本発明の化合物の重量比率は、50％〜85％であり、抗うつ薬の重量比率は15％〜50％である。
【００３７】
本発明はまた、抑うつ障害の治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして、少なくとも１つの上記化合物、及び少なくとも１つの別の抗うつ薬、特に、7,8 DHF(抗うつ剤様特性を有する化合物)、SSRI(選択的セロトニン再取込み阻害剤［例えば、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン...］)、TCA(三環系抗うつ剤［例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン...］)、MAOI(モノアミンオキシダーゼ阻害剤［例えば、クロルジリン、モクロベミド、トロキサトン...］)、SNRI(セロトニン-ノルエピネフリン再取込み阻害剤［例えば、ベンラファキシン、デュロキセチン］)、NDRI(ノルエピネフリン-ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、ブプロピオン］)、SARI(セロトニンアンタゴニスト及び再取込み阻害剤［例えば、トラゾドン］)、ドーパミン再取込み阻害剤［例えば、アミネプチン］、リチウムからなる群より選択される抗うつ薬を含む組合せ製品に関する。
【００３８】
より具体的には、組合せ製品は、抑うつ障害の治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして使用されるが、ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態に使用されない。
１つの特定の実施形態では、本発明は、抑うつ障害の治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして、式(V)の化合物及び少なくとも１つの別の上記抗うつ薬を含んでなる製品に関する。
具体的には、組合せ製品は、抑うつ障害の治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして使用されるが、ただし、月経前不快気分障害に関連する女性の抑うつ状態に使用されない。
より具体的には、組合せ製品は、抑うつ障害の治療及び/又は予防のための同時、別個の使用又は逐次投与用の組合せとして使用されるが、ただし、大うつ病性障害又は気分変調の女性に使用されない。
【００３９】
製品は、古典的治療に抵抗性である抑うつの治療及び/又は予防において、或いは抑うつの初期治療として処方される薬剤として、特に、男性及び女性の大うつ病性障害又は気分変調、及び男性及び女性の双極性抑うつの初期治療及び/又は予防のための薬剤として使用することができる。
より具体的には、製品は、抑うつ病、特に、男性及び月経前不快気分障害でない女性の大うつ病性障害又は気分変調、及び男性及び女性の双極性抑うつの治療及び/又は予防において使用することができる。
本発明は以下の図及び実施例において説明されるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１A、１B、１C、１D及び１Eは、アコニターゼ(酸化状態で活性が低減する酵素；図1A)、脂質過酸化(MDAは、Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)のキットを用いて測定される酸化ストレス状態のマーカーである；図1B)、スーパーオキシドジスムターゼ(スーパーオキシドイオンから過酸化水素への変換に関与する酵素であり、この酵素活性の増大は過酸化水素レベルの増加を意味する；図1C)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx；図1D)及びカタラーゼ(図1E)の測定により推定される酸化ストレス状態に対するTEMPOLの効果を示す。TEMPOLは、コントロール動物(Ｃ群)、非脆弱群(NV群；ストレスを受けたが回復力を有すると同定された動物)又は脆弱群(すなわち、前ストレス(anterior stress)にある；Ｖ群)の３群の動物において、288μmol/kg/日の用量で15日間全身経路で投与する。TEMPOLで処置された動物をビヒクルのみで処置された動物と比較する。統計分析の結果を表１に示す(* Ｃ群動物に対してＰ＜0.05、† 対応するTEMPOL処置群に対してＰ＜0.05)。図１A、１B、１C、１D及び１Eに関する実験は、社会的敗北の31日後に行う(図10Bを参照)。
【図２】図2A、2B及び2Cは、CA3ニューロンの先端樹状突起全長(図2A、2C)及び樹状突起スパイン数(図2B)により評価する海馬ニューロンの形態に対するTEMPOLの効果を示す。海馬ニューロンの形態変化は、抑うつ障害の誘引前に起こり、該障害の発症を感作する残留痕跡と考えられる。使用した技法はゴルジ染色法である(Biovalley社が販売するキット)。TEMPOLを15日間全身投与した(用量：288μmol/kg/日)。Ｃ：ビヒクルで処置したコントロール動物群；NV：ビヒクルで処置した非脆弱群；Ｖ：ビヒクルで処置した脆弱群；Ｖ＋TEMPOL：TEMPOLで処置した脆弱群。統計分析の結果を表１に示す(* Ｃ群動物に対してＰ＜0.05、† 対応するTEMPOL処置群に対してＰ＜0.05)。図2A、2B及び2Cに関する実験は、社会的敗北の31日後に行う(図10Bを参照)。
【図３】図3A及び3Bは抑うつ表現型に対するTEMPOLの効果を示す。抑うつ表現型は、強制水泳試験(Porsolt試験)により測定される「あきらめ」行動及び(快感の喪失を模擬し「無快感症」を反映し得る)甘水消費試験で評価する。TEMPOLを15日間全身投与した(用量：288μmol/kg/日)。統計分析の結果を表１に示す(* Ｃ群動物に対してＰ＜0.05、† 対応するTEMPOL処置群に対してＰ＜0.05)。図3A及び3Bに関する実験は、社会的敗北の53日後に行う(図10Bを参照)。
【図４−１】図4Aは酸化ストレスが抑うつに対する脆弱性に関与することを示す。図4Aに関する実験は社会的敗北の31日後に行う(図10Bを参照)。図4A：酸化還元攻撃に応答したアコニターゼ活性は、社会的敗北手順終了の31日後(D31)に、脆弱(Ｖ)と分類された動物において、非脆弱(NV)動物と比較して減少した。酸化還元の不均衡は、Ｖ群動物において脂質の酸化的損傷(脂質過酸化(MDA)の増大)を生じる(NV：ｎ＝７〜８；Ｖ：ｎ＝６〜８)。
【図４−２】図4Bは酸化ストレスが抑うつに対する脆弱性に関与することを示す。図4Bに関する実験は社会的敗北の31日後に行う(図10Bを参照)。図4B：NV群ラット及びＶ群ラットの海馬の二次元ゲル電気泳動での差別的タンパク質プロフィール並びに質量分析によるタンパク質スポットの同定。GO Term Finder(Boyleら，Bioinformatics, 20, 3710 ［2004］)を用いたデータセットのコンピュータ機能分析により、ROS応答に関与する酸化還元関連タンパク質を含む４つの主要な機能カテゴリーが示された(群あたりｎ＝４；２回実施)。
【図４−３】図4Cは酸化ストレスが抑うつに対する脆弱性に関与することを示す。図4Cに関する実験は社会的敗北の31日後に行う(図10Bを参照)。図4C：過酸化水素(H2O2)産生を触媒するスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の量及び活性は、Ｖ群動物でNV群動物より大きかった(NV：ｎ＝８；Ｖ：ｎ＝６)。H2O2の水への還元に関与するペルオキシレドキシン２(Prx2)は、Ｖ群動物において、ほとんどが不活性型たるPrx-スルフィン/スルホン(SO2/SO3)で存在し、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性には変化がない(NV：ｎ＝６〜８；Ｖ：ｎ＝５〜６)。統計分析の結果を表2Aに示す(* NV群動物に対してＰ＜0.05)。
【図５】図5A、5B、5C、5D、5E、5F及び5Gは、BDNFが酸化還元感受性Nrf2経路を制御することを示す。図5D、5E、5F及び5Gに関する実験は、社会的敗北の11日後に行う(図10Bを参照)。図5A：BDNF(100ng/ml)又は7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF、10μM)とのインキュベーションは、海馬HT22細胞において核Nrf2移行の顕著な増加を誘導した。BDNF及び7,8-DHFの作用は、周知の天然Nrf2活性剤であるケルセチン(Querc.、10μM)の作用と類似する(Hur and Gray, Curr Opin Chem Biol 15, 162 ［2011］)(ｎ＝４)。図5B：siRNAストラテジーによるBDNFノックダウンは、HT22海馬細胞において、コントロールsiRNAでのトランスフェクションより低いレベルの核へのNrf2移行をもたらした。図5C：慢性社会的ストレス(DF)の５日後に動物から摘出した海馬は、核内Nrf2レベルがコントロール海馬より低かった(Ｃ：ｎ＝６、DF：ｎ＝６)。Ｃ群及びDF群の動物では、7,8-DHF(10μM)に富むCSFでの海馬灌流は、核区画へのNrf2の顕著な移行を誘導した(Ｃ：ｎ＝６〜７；DF：ｎ＝６〜７)。図5D：DFの11日後(D11)、非脆弱(NV)動物と脆弱(Ｖ)動物とを血清BDNFレベルで区別することができる。図5E：核Nrf2レベルは、コントロール(Ｃ)群と比較して、Ｖ群ラットでのみ低く、NV群ラットでは有意に高かった(Ｃ：ｎ＝７；NV：ｎ＝７；Ｖ：ｎ＝６)。図5F：Ｖ群動物で減少し、NV群動物で増加したスルフィレドキシンmRNAレベルにより示されるように、Nrf2の機能的活性は改変された(Ｃ：ｎ＝７；NV：ｎ＝７；Ｖ：ｎ＝６)。図5G：Ｖ群動物において、ペルオキシレドキシン２(Prx2)は不活化し、Prx-スルフィン/スルフォン(SO2/SO3)に変換された(ｎ＝５；NV：ｎ＝６；Ｖ：ｎ＝５)。統計分析の結果を表3B1〜4に示す(* ビヒクル(Veh)、siRNAコントロール又はＣ群動物に対してＰ＜0.05；a NV群に対してＰ＜0.05；† 対応する7,8-DHF処置群に対してＰ＜0.05)。
【図６】図6A、6B、6C及び6Dは、ストレス後動物の非灌流海馬及び灌流海馬におけるBDNF、Nrf2/Keap1系及び酸化ストレスを示す。図6A、6B、6C及び6Dに関する実験は社会的敗北の５日後に行う(図10Bを参照)。図6A：慢性社会的敗北手順の５日後(D5)、敗北動物(DF)は、酵素量の変化を伴わないアコニターゼ活性の減少、高レベルの脂質過酸化(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ活性(SOD)の増大並びにグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性変化の欠如により示される酸化ストレスを示した(Ｃ：ｎ＝６〜９；DF：ｎ＝９〜12)。図6B：D5には、全ての動物(DF)は、血清BDNFレベルがコントロール(Ｃ)動物より低かった。図6C：敗北ラット(DF)及びコントロールラット(Ｃ)の非灌流海馬におけるNrf2レベル及びKeap1レベル。DF動物の海馬は、サイトゾルNrf2濃度の増加を示し、Keap1レベルは変化しなかった(Ｃ：ｎ＝６；DF：ｎ＝６)。図6D：敗北ラット(DF)及びコントロールラットの灌流海馬におけるNrf2レベル及びKeap1レベル。敗北ラット(DF)及びコントロールラット(Ｃ)の海馬を、人工脳脊髄液(CSF)又は7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF；10μM)に富む人工CSFで灌流した。7,8-DHF灌流(10μM)は、DF動物においてはサイトゾルNrf2濃度の減少を誘導し、コントロール動物(Ｃ)においては該濃度の低下傾向を誘導し、Keap1濃度に変化はなかった(Ｃ：ｎ＝６〜７；DF：ｎ＝６〜７)。統計分析の結果を表4B1〜3に示す(* Ｃ群動物に対してＰ＜0.05;† 対応する7,8-DHF処置群に対してＰ＜0.05)。
【図７】図7A、7B及び7Cは、D11の脆弱群、非脆弱群及びコントロール群の動物における酸化ストレスを示す。図7A：BDNFレベルの長期追跡。これにより、慢性社会的敗北(CSD)の11日後(D11)に、非脆弱(NV)群動物及び脆弱(Ｖ)群動物の最初の同定に至った。全てのストレス負荷動物において観察される、慢性社会的敗北終了５日後(D5)の血清BDNF濃度の低下の後、血清BDNFレベルは、ストレス負荷集団の58％については、D11に基礎値に復帰した(これらラットを抑うつに対して非脆弱［NV］(すなわち、最初のストレス性事象から回復した)と呼んだ)一方；ストレス負荷集団の42％については、D11で血清BDNFは低いままであった(これらラットを抑うつに対して脆弱［Ｖ］(すなわち、最初のストレス性事象により感作されたまま)と呼んだ)。D11に脆弱と同定された動物は、D31(すなわち、慢性社会的敗北終了の31日後)に脆弱のままであった(BDNFレベルが低かった)。* コントロール(Ｃ群)動物と比較してＰ＜0.05；a 非脆弱(NV群)動物と比較してＰ＜0.05。図7B：鍵となる時点(非脆弱(NV群)ラット及び脆弱(Ｖ群)ラットを同定した、慢性ストレスの11日後)に、Ｖ群ラットでのみ酸化ストレスが持続していた(SOD活性及び脂質過酸化［MDA］の持続的増大並びにアコニターゼ活性の低減)。血清BDNF濃度がコントロール値に復帰した動物(NV群動物)では、酸化ストレスは消失していた。アコニターゼの量及び２つの酵素(GPx；カタラーゼ)の活性は、Ｖ群動物(ｎ＝６)、NV群動物(ｎ＝６〜８)及びコントロール(Ｃ)群動物(ｎ＝６)で類似していた。図7Bに関する実験は社会的敗北の11日後に行う(図10Bを参照)。図7C：サイトゾルNrf2濃度は、コントロール(Ｃ)群と比べて、Ｖ群ラットでのみ高いままであり、NV群動物では有意に低く、Keap1レベルに変化はなかった(Ｃ：ｎ＝７；NV：ｎ＝７；Ｖ：ｎ＝６)。統計分析の結果を表5C1、2に示す(* Ｃ群動物に対してＰ＜0.05；a NV群動物に対してＰ＜0.05)。図7Cに関する実験は社会的敗北の11日後に行う(図10Bを参照)。
【図８】図8A及び8Cは、コントロール(Ｃ)群、非脆弱(NV)群又は脆弱(Ｖ)群におけるコルチコトロピン軸活性に対するTEMPOLの効果を示す。コントロールとしての医薬用ビヒクル(Veh)もまたＣ群、NV群又はＶ群に投与する(Ｃ＋Tempol：ｎ＝６；NV＋Tempol：ｎ＝９；Ｖ＋Tempol：ｎ＝７；Ｃ＋Veh.：ｎ＝７；NV＋Veh.：ｎ＝７；Ｖ＋Veh.：ｎ＝８)。統計分析の結果を表６に示す(* Vehで処置したＣ群群に対してＰ＜0.05；a Vehで処置したNV群に対してＰ＜0.05；† 対応するTEMPOL処置群に対してＰ＜0.05)。コルチコトロピン軸活性は、コルチコステロンレベル(図8A)及び副腎重量(図8B)により測定する。
【図９】図9は、コントロール(Ｃ)群、非脆弱(NV)群又は脆弱(Ｖ)群における血清BDNFレベルに対するTEMPOLの効果を説明する。コントロールとしての医薬用ビヒクル(Veh)もＣ群、NV群又はＶ群に投与する(Ｃ＋Tempol：ｎ＝10；NV＋Tempol：ｎ＝10；Ｖ＋Tempol：ｎ＝９；Ｃ＋Veh.：ｎ＝16；NV＋Veh.：ｎ＝19；Ｖ＋Veh.：ｎ＝14)。統計分析の結果を表７に示す(* 基礎レベルに対してＰ＜0.05)。
【図１０】図10Aは感作パラダイムの実験計画である。図10Bは、社会的敗北及び慢性軽度ストレスの実験計画の概要であり、脆弱集団及び非脆弱集団における血清BDNFレベルと抑うつプロフィールとの関係性を示す。
【図１１】図11A、11B、11C及び11Dは、SSPパラダイムを受けた動物(NV群及びＶ群の動物)並びにコントロールラット(Ｃ群、社会的敗北の履歴が無い動物)における、D57(SSP手順の終了時)での、強制水泳試験(FST)の不動時間(図11A)、甘水消費(図11B)、HPA軸活性(血清コルチコステロンレベル(図11C)及び副腎重量(図11D))の測定値による抑うつ様プロフィールの評価を示す。D35(すなわち、第２のストレス事象［CMS］の適用前)に低いBDNFレベルを示すラット(第１のストレス事象により感作されたままの動物を意味する)は、CMS手順の適用後(D57)に、FSTにおける有意に長い不動時間、有意に低い甘水消費、HPA軸の活性亢進(コルチコステロンレベル及び副腎重量の増大)により反映される抑うつ様行動を示した。D35に正常BDNFレベルを示すラット(すなわち、非感作動物)は、第２のストレス性事象(CMS)の適用後に抑うつ様行動を発現しなかった。* コントロール(Ｃ群)動物と比較してＰ＜0.0；† 非脆弱(NV)群動物と比較してＰ＜0.05。
【図１２−１】図12A、12B及び12Cは、Nrf2遺伝子欠損マウス(無Nrf2マウス；Nrf2-/-)における酸化ストレス及びNrf2-/-マウスに対するTEMPOLの効果を示す。図12A：Nrf2遺伝子欠損マウス(無Nrf2マウス；Nrf2-/-)(ｎ＝６)は、高レベルの脂質過酸化(細胞の酸化ストレスの適切な古典的マーカー)を示した。* Nrf2+/+マウス(野生型)に対してＰ＜0.05。図12Bは、Nrf2+/+マウス及びNrf2-/-マウス(ｎ＝５〜６マウス)におけるCA3先端樹状突起構造に対する４週間のTEMPOL(Tp)処置の効果を示す。図12C：Nrf2+/+マウス及びNrf2-/-マウスにおけるCA3樹状突起構造を説明する顕微鏡写真。
【図１２−２】図12Dは、Nrf2遺伝子欠損マウス(無Nrf2マウス；Nrf2-/-)における酸化ストレス及びNrf2-/-マウスに対するTEMPOLの効果を示す。図12Dは、３週間のCMSの前後での、TEMPOL(Tp)で処置したか又はしていないNrf2-/-マウスのFSTにおける不動時間、甘水消費［Nrf2+/+マウス及び無Nrf2マウスにおいてそれぞれ6.6ml/日及び7.4ml/日］及びHPA軸活性による抑うつ様表現型の評価を、TEMPOL(Tp)で処置したか又はしていないNrf2+/+マウスのものと比較して示す(ｎ＝６〜９マウス)。* Nrf2+/+マウスに対してＰ＜0.05；† 対応する処置群に対してＰ＜0.05。
【実施例】
【００４１】
実施例
１．材料及び方法
動物
雄性Sprague-Dawleyラット(体重290〜310ｇ)を同じ飼育業者(Centre d'Elevage R. Janvier, 53940 Le Genest-St-Isle, France)から入手し、侵入ラットとして使用した。ラットは、研究施設に到着すると、規則的間隔で配置され、各々にろ過空気が供給される温度制御された防音区画を備える時間生物学的研究用動物施設(Enceinte Autonome d'Animalerie, A110SP, Thermo Electron Corporation, Saint Herblain, France)に収容した。Sprague-Dawleyラットを４日間一緒に収容後、実験開始14日前に個別ケージ(ｌ：45cm；ｗ：25cm；ｈ：17cm)に移した。雄性野生型Groningen(WTG)ラットを、コンフロンテーションエンカウンター(confrontation encounter)の居住ラットとして使用した(de Boerら，2003)。全ての動物を制御環境条件下で飼育した(22±１℃、60%相対湿度、7:00に点灯する12/12時間の明暗サイクル、餌及び水は自由摂取)。動物及びそのケアを含む手順は、国内の及び国際的な法及び政策を遵守する所内ガイドライン(Council directive #87-848(1987年10月19日)；Ministere de l'Agriculture et de la Foret, Service Veterinaire de la Sante et de la Protection Animale, authorizations #75-1178 to J.J.B.)に則って行った。全ての測定は処置群を知らない者が行った。
【００４２】
社会的敗北手順
社会的敗北手順(CSD)(D-3〜D0)は、以前に記載されたように行った(Beckerら，2001；Blugeotら，2011を参照)。
簡潔には、この手順は、居住ラット及び侵入ラットの同じペアを４日間毎日条件付けセッションに供することを含んでいた。45分間の条件付けセッションは２つの連続期間に分けられた。期間Ｉ(30分間)の間、侵入ラットを、居住ラットのホームケージ内の保護ケージに個別に入れた。保護ケージにより、居住ラットとの無制限の視覚的、聴覚的及び嗅覚的接触は可能となったが、密接な身体的接触は防止された。期間II(15分間)の間、居住ラットが存在するままで保護ケージを取り外して、侵入ラットとの身体的対面を可能とするか(３〜４回の〜10秒間の対面。各対面の間、侵入動物(敗北動物)は居住ラットに常に屈服した)、或いは居住ラットを取り出すとともに保護ケージを取り外して、侵入ラットが居住ラットのホームケージ全体にアクセスできるようにした(コントロール侵入個体)。したがって、コントロール侵入個体は、居住ラットに身体的攻撃を受けることも、敗北することもなかった。
【００４３】
血清BDNFアッセイ
血液サンプル(200μl)を、種々の時点(D-4、D5、D11、D31の昼頃)で覚醒ラットから採集した。これらサンプルは尾静脈から採取し、エッペンドルフチューブに集めた。サンプルを遠心分離して血清を分離した。血清をBDNF分析まで−20℃で保存した。BDNF濃度は、1:25の希釈率で、市販のBDNFアッセイ(Promega Corporation)を用い、96ウエルプレート(Corning Costar(登録商標) EIAプレート)において製造業者の指示書に従い測定した。
別の血清BDNFアッセイも行った。覚醒ラットの血液サンプル(200μl)を、異なる時点(D-4、D9、D35、D57の昼頃)で尾静脈からエッペンドルフチューブに採集した。遠心分離後、血清を分離し、BDNF分析まで−20℃で保存した。BDNF濃度は、1:25の希釈率で、市販のBDNFアッセイ(Promega Corporation)を用い、96ウエルプレート(Corning Costar(登録商標) EIAプレート)において製造業者の指示書に従い測定した。
【００４４】
海馬BDNF
ラットを屠殺して、脳を急いで取り出した。両側の海馬を急いで切り出し−80℃で保存した。分析時にサンプルを秤量し、BDNFをSzapacsら(2004, J Neurosci Methods 140: 81-92)に記載されるように抽出した。新たに調製したプロテアーゼ阻害剤(200μM PMSF、0.3μMアプロチニン及び10μMロイペプチン)を含む２ミリリットルの溶解緩衝液(100mM PIPES、500mM NaCl、0.2％ Triton X-100、0.1％ NaN3、２％ BSA及び２mM EDTA)を各サンプルに加えた。次いで、サンプルを１秒間隔のパルスで15秒間超音波処理した。追加の１mlの溶解緩衝液を加え、サンプルを再び超音波処理した。全てのホモジネートを16,000×ｇにて４℃で30分間遠心分離し、上清を取り出し、アッセイまで−20℃で凍結させた。BDNF濃度は、1:10の希釈率で、上記の市販のBDNFアッセイを用いて測定した。
【００４５】
タンパク質のプロファイリング及び同定
海馬を、８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％の3-(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、20mMジチオトレイトール、1.2Ｍスペルミン及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む尿素系可溶化緩衝液中でガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離(15,000×ｇ、15分間)で明澄化し、−80℃で保存した。適用前に、全てのサンプルを、１％両性電解質を補充した可溶化緩衝液中で希釈した。サンプル(125μgタンパク質をロード)を、能動再水和(50Ｖ、10時間)によりIPGストリップ(pH４〜７、Biorad, France)にアプライし、PROTEAN IEF Cells(Bio-Rad)において合計〜16kVhに関して集束させた。等電点電気泳動法(IEF)後、ストリップを、直ちに、６Ｍ尿素、30％グリセロール及び２％ SDS中、50mM Tris-HCl(pH8.8)を用いて２×10分間平衡化させた。第１の平衡化にはDTT(２％)を含ませ、第２の平衡化にはヨードアセトアミド(2.5％)を含ませた。第２次元の解析は、12％ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PAGEであった。タンパク質をクーマシーブルーG250で染色し、ゲルをOdyssey(登録商標)赤外線撮像システムで撮像し、ImageMaster 2D Eliteソフトウェアバージョン4.01(Amersham Biosciences)で分析した。示差発現を表すスポットをゲルから切り出し、還元工程及びアルキル化工程が省略されている以外は他(Brouillardら，2005)に記載されているような標準的なゲル内トリプシン消化手順に供した。MALDI-TOF MS分析のためには、ペプチド粉末を0.5％トリフルオロ酢酸に再懸濁し、MALDI標的にスポットし、マトリクス(70％ ACN 0.1％ TFA中10mg/mlの-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸)と等量で混合した後、AB/Sciex 5800 TOF/TOF質量分析計で分析した。標準ペプチド溶液Cal Mix1及びCal Mix2(Applied Biosystems)を用いて外部較正を行った。Data Explorer 4.9ソフトウェア(Applied Biosystems)により抽出したモノアイソトピックペプチド質量値を、オンラインのMascot検索エンジン(www.matrixscience.com)を用いるUniProtKB/Swiss-Protデータベースにおける検索に基づくタンパク質同定に使用した。検索は以下の設定で行った：消化酵素としてトリプシン、切断が一箇所で見られないことを許容、30ppmの許容範囲、不変修飾としてカルバミドメチル及び可変修飾としてメチオニン酸化。明確な同定に使用した基準は、統計的に有意なMowseスコアであった(Ｐ＜0.05)。
【００４６】
酸化還元パラメータ
動物を断頭し、左海馬を氷冷緩衝液(20mM Hepes pH7.2、１mM EGTA、210mMマンニトール、70mMスクロース)中でホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し、上清を分析用に保持した。直ちに、カタラーゼ及び総SODの活性を、市販キット(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)を製造業者の指示に従って用いて測定した。SOD及びカタラーゼの比活性は、それぞれ単位/mg海馬及びnmol生成ホルムアルデヒド/分/mg海馬組織として表す。
右海馬を、氷冷緩衝液(Tris-HCl 50mM pH7.5、150mM NaCl、１mM EDTA)中でホモジナイズし、TBARS及びグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)アッセイに使用した。
TBARSアッセイ用には、プロテアーゼ阻害剤(50μl/ml)、DOC(１％)、SDS(0.1％)及びTriton(登録商標) X-100(0.5％)を氷冷緩衝液中で直ちに加えた。GPxアッセイ用には、0.1Ｍジチオトレイトールを氷冷緩衝液中に直ちに加えた。ホモジネートを遠心分離し、上清を分析用に保持した。脂質過酸化は、市販のアッセイキット(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)を製造業者の指示書に従って用いるTBARS産生の測定により評価した。TBARS濃度はMDA標準曲線から算出し、規格化した。ホモジネート中の総GPx活性は、キット製造業者(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)の指示に従って測定した。GPx比活性は、nmolの消費NADPH/分/mgの海馬組織として表す。敗北動物、脆弱動物、非脆弱動物及びコントロール動物の間で海馬重量に差は観察されなかった。
【００４７】
アコニターゼ活性
ラットを断頭により屠殺し、右海馬を急いで取り出し、氷冷緩衝液(５mM Tris-HCl pH7.5、210mMマンニトール、70mMスクロース、１mM EDTA及び2.3mMクエン酸ナトリウム)中でホモジナイズした。ホモジネートを急いで遠心分離し(14,000×ｇ、10分間、４℃)、ペレットを液体窒素で直ちに凍結して-80℃で保存した。アコニターゼ活性は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.05％BSA、２mMクエン酸ナトリウム、２mM MnCl2、0.4mM NADP＋、0.85単位のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及び10〜20μgのタンパク質抽出物を含む1.0mlの反応混合液中、340nm及び25℃での線形吸光度変化をモニターすることにより分光光度的に測定した(Gardnerら，1994)。アコニターゼ活性に関連する吸光度変化は、時間及びタンパク質濃度に関し線形であった。１ミリ単位のアコニターゼ活性は、１mgあたりで毎分あたりに、１ナノモルのD-イソシトレートの生成を触媒する酵素の量と定義した。
【００４８】
核及びサイトゾル抽出物
海馬を、氷冷緩衝液Ａ(10mM Hepes、150mM NaCl、１mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤カクテル［５μl/ml］及びホスファターゼ阻害剤カクテル［10μl/ml］)中でホモジナイズし、次いでNonidet P-40(0.5％)を加えた。氷上で10分間後、ホモジネートを遠心分離した(1,200×ｇ、10分間、４℃)。上清をサイトゾル画分として保存した。ペレットを氷冷緩衝液Ａで洗浄し、1,200×ｇにて４℃での10分間の遠心分離により沈降させた。核の収量及び完全性をギムザ染色及び顕微鏡観察により検証した。核を氷冷緩衝液Ｂ(20mM Hepes、420mM NaCl、1.2mM MgCl2、0.2mM EDTA、25％グリセロール、0.5mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテル［５μl/ml］及びホスファターゼ阻害剤カクテル［10μl/ml］)に再懸濁した。サンプルを、超音波処理(15秒間、４℃)し、５分間ごとに20分間ボルテックスした。細胞質画分及び核画分を20,000×ｇにて４℃で30分間遠心分離した。上清を急いで液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。細胞核抽出物及びサイトゾル抽出物に類似のプロトコルを用いた。
【００４９】
ウェスタンブロッティング
40μgの核タンパク質又はサイトゾルタンパク質(細胞実験については20μg)を、12％ポリアクリルアミドゲルでのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。バンドを、標準の手順により、免疫ブロッティング用ニトロセルロース又はPVDFメンブレン(Invitrogen, France)へ転写した。次の抗体希釈物を用いた：Nrf2に対するウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, France)については1:250希釈物、Keap1に対するウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology)については1:500希釈物及びアコニターゼ２に対するウサギポリクローナル抗体(Gene Tex, France)については1:5000希釈物。蛍光IRDye(登録商標) 800CW二次抗体(ScienceTec, Paris, France)については1:10,000希釈物を用いた。メンブレンを、GAPDHに対するマウスモノクローナル抗体又はβ-アクチンに対するマウスモノクローナル抗体(それぞれ1:10,000希釈物及び1:1,000の希釈物；Sigma-Aldrich, France)及びScienceTec社のIRDye(登録商標) 680CW二次抗体(1:10,000)でもプローブして、タンパク質ローディングについて補正した。画像は、Odyssey(登録商標)赤外線撮像システム(LI-COR Biosciences)で取得した。タンパク質バンドを、Odyssey(登録商標)ソフトウェア(バージョン3.0、LI-COR Biosciences)を用いて定量した。SOD１、Prx2及びPrxSO2/SO3の分析には、次の抗体希釈物を用いた：SODに対するウサギポリクローナル抗体(Euromedex)については1:1000希釈物、ペルオキシレドキシンSO2/SO3に対するウサギポリクローナル抗体(Abcam)については1:2000希釈物、ペルオキシレドキシン２に対するウサギポリクローナル抗体(Abcam)については1:1000希釈物。西洋ワサビペルオキシダーゼ接合二次抗体を使用し、メンブレンをECL Plus検出試薬(Pierce, Rockford, IL)を用いて発色させた。画像をデジタルカメラ式撮像システム(ChemiDoc, Biorad)で取得してQuantity Oneソフトウェア(Bio-Rad)で分析した。
【００５０】
リアルタイム-qPCR
* RNA抽出：トータルRNAを、NucleoSpin RNA II精製キット(Macherey-Nagel, France)を製造業者の推奨に従って用いて凍結海馬から単離した。RNAの量及び濃度を、NanoDrop分光計(Thermo Fisher Scientific, Labtech, France)を用いる吸光度測定から評価した。
* RT-qPCR．リアルタイムPCR分析には、一本鎖cDNA合成(20μlの反応物あたり0.6μgのトータルRNA)を、高能力cDNA逆転写キット(Applied Biosystems, France)を用いて行った。各サンプルのリアルタイムPCR増幅を、ABgene ABsolute QPCR ROX Mix(ABgene)を用いてABI Prism 7300(Applied Biosystems)で３連で行った。Assay-on-Demand GeneTaqManPCRプローブ(Applied Biosystems)を標的遺伝子たるスルフィレドキシン(Rn01536084-g1*)及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(Rn99999916-S1)に使用した。平均閾値サイクル値の差分(ΔCt)を、ハウスキーピング遺伝子(GAPDH)の発現に関して測定し、規格化した。同一動物から切り出した他方の海馬は、ウエスタンブロット分析に使用した。
【００５１】
海馬HT-22細胞
細胞を、10％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルべッコ改変イーグル培地(DMEM)中、５％ CO2を含む大気下で37℃に維持した。幾つかの実験では、培地(無血清)に、BDNF(100ng/ml)、7,8-ジヒドロキシフラボン(10μM)又はケルセチン(10μM)を30分間加えた後、細胞を細胞成分分画に供して核抽出物及びサイトゾル抽出物を得た。
細胞培養及びsiRNAノックダウン
BDNFノックダウンは、BDNFを標的するSilencer(登録商標) Select siRNA又はコントロールとしての非標的化Silencer(登録商標) Select siRNAを用いて行った。siRNAトランスフェクションは、リポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen)を製造業者のフォワードプロトコルに従って用いることにより、50nMの最終濃度で行った。簡潔には、16μLのリポフェクタミンRNAiMAXを800μlのopti-MEM中で400pmolのsiRNAと混合して、75cm2フラスコにプレートした2.5×106細胞をトランスフェクトした。細胞を無血清DMEMで培養し、トランスフェクションの48時間後に採取した。
【００５２】
ゴルジ染色
D11及びD31に、非灌流脳を急いで取り出し、Blugeotら(2011)が以前に記載したように、FD Rapid Golgistainキット(FD NeuroTechnologies)で処理した。組織学的定量：各ラットで選択したニューロンについて、先端CA3樹状分岐の樹状突起全長を、AxioVision 4.7ソフトウェア及びZeiss Imager M1顕微鏡を用いて測定した。測定用に、ラットあたり３〜５の海馬ニューロンを、実験動物の素性を知らない研究者が選択した。樹状突起のトレーシングをSholl分析により定量した(Sholl, 1953)。樹状突起と同心円との交点の数を計数し、細胞体からの距離の関数としてプロットした。樹状突起スパインの密度は、1000×の分解能で、放線線維層に位置する15μmの３〜４つのセグメント中の先端樹状突起スパインの数を計数することにより推定した。スパイン密度は、先端樹状突起の15μm長あたりのスパイン数として表した。
感作パラダイム(SSP)
Sprague-Dawleyラットを慢性社会的敗北(CSD)に供した後、４週間後に、３週間の慢性軽度ストレスに供した(SSPラット)。慢性軽度ストレスプロトコル(CMS)は以前に記載されたとおりに行った(Blugeotら，2011を参照)。コントロールラットは、３週間のCMSに曝されていないコントロールの(CSDに供されていない)侵入ラットである(Ｃ群ラット)。実験計画を図10A及び図10Bにまとめる。
【００５３】
慢性軽度ストレスプロトコル
CMSプロトコルは、Willnerら(1992)により記載されたものに由来する。簡潔には、種々の軽度ストレスを、３週間にわたって毎日与えた。簡潔には、月曜日から金曜日まで毎朝、動物を小ケージ(10×16×15cm)に１時間置いた。午後には、動物を10分間揺らすか(月曜日及び木曜日)、水(水位２cm)を含む小ケージに入れるか(火曜日)又は別のケージに４時間入れた(水曜日及び金曜日)。毎晩、ケージを(45°)傾けるか(火曜日及び木曜日)又は濡れた床敷を入れた(水曜日及び金曜日)。土曜日及び日曜日には、ラットを、３時間ごとに30分間の逆転暗/明サイクルに供した。
強制水泳試験(FST)
SSPパラダイム終了の４日後(D52)、FST実験を08:00〜11:30の間に行った。実験は、Beckerら(2008, Mol. Psychiatry 13, 1079)及びBlugeotら(2011)が記載したとおりに行った。不動時間をストップウオッチで測定した。ラットは、浮遊し、鼻孔を水面上に維持するに必要な動作のみを行っている時、不動とみなした。処置を知らない熟練実験者が動物を観察し、不動時間を測定した。各セッション終了時に室温及び水温を確認した。各ラットを１回の水泳セッションにのみ供した。
【００５４】
甘水消費
実験は、Beckerら(2008)及びBlugeotら(2011)が記載したとおりに行った。スクロース及び水の摂取量を毎日9:00a.m.に測定した。毎週の甘水消費をコントロール値(条件付けセッション開始の１週間前に測定)のパーセンテージとして表わした。甘水消費はスクロースに対する嗜好性を示唆した。コントロール期間中、ラットは、淡水(約15ml/日)より有意に多い甘水(約30ml/日)を飲んだので、スクロースに対する嗜好性を示した。淡水摂取量は甘水消費が減少したときも変化しなかった(約15ml/日)。
薬剤及び処置
288μmol/kg/日の用量で投与したTempol(4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン 1-オキシル)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)は、蒸留水に溶解し、ALZET浸透圧ミニポンプにより送達した(2002, Charles River Laboratories, France)。Tempol又は蒸留水を満たしたポンプを、社会的敗北手順完了の11日後(D11)に、イソフルラン浅麻酔下で、侵入ラットの背中に皮下移植し、15日間留置した。
【００５５】
統計分析
SOD活性、TBARS、アコニターゼの活性又は量、グルタチオンペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性、CA3ニューロンの先端樹状突起長及び海馬CA3樹状突起スパインの差は、一元配置分散分析(ANOVA)で検証した。血清BDNF濃度は、反復測定について一元配置ANOVAにより分析した。ストレス効果及び処置効果は二元配置ANOVAにより検証した。全てのデータを平均±SEMとして示す。ANOVAにより有意な効果が明らかになった場合、post-hoc Bonferroni検定を行い、差が真に統計学的に有意であるかどうかを決定した。
海馬の灌流
海馬を切り出し、８片に切り分けて灌流用組織チャンバ内に置き、１×溶液(136mM NaCl、16.2mM NaHCO3、5.4mM KCl、1.2mM NaH2PO4、2.2mM CaCl2、1.2mM MgCl2及び５mMグルコース)からなる人工脳脊髄液(aCSF、１×)又は7,8-DHF(10-5Ｍ)を含む１×aCSFに懸濁した。この溶液のpHは、O2/CO2混合物(95.5％/4.5％)での曝気により7.3に調整した。灌流は、１ml/４分間の流量で８つのサーモスタット制御(37℃)のチャンバに均等に行った(Benolielら，1992)。１時間後、組織を採集し、細胞成分分画に供して核抽出物及びサイトゾル抽出物を得た。
HPA軸活性
ラットの屠殺時(D57)、体幹血管からの血液を冷却試験管に採集し、放射性トレーサーとして［125I］コルチコステロンを用いるRIA(ICN Biomedicals, Orsay, France)によりコルチコステロンを定量した(Andreら，2005)。副腎を取り出し、付着している脂肪が残らないように切り取り、秤量した。臓器重量は体重に対する相対量で表す(mg副腎/100g体重)。昼頃に、静かな別室で、ラットを一匹ずつ断頭により屠殺した。ラット間でベンチを洗浄した。
【００５６】
無Nrf2マウス(Nrf2遺伝子欠損マウス)の研究
無Nrf2マウスを、CNRS TAAM UPS44(Orleans)の雄性及び雌性のストックマウスを交互に用いてC57BL/6 J背景で７世代戻し交配した。得られた野生型(Nrf2+/+)ラット及びNrf2-/-マウスを遺伝型決定し、実験開始時に６週齢の雄性マウスのみを使用した。先ず、マウスにおける酸化ストレスのレベルを、脂質過酸化の測定により評価した。脂質過酸化は、市販のアッセイキット(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)を製造業者の指示に従って用いてTBARS生成を測定することにより評価した。TBARS濃度は、MDA標準曲線から算出し、規格化した。
無Nrf2マウスの抑うつ様表現型を調べるため、無力行動、無快感症及びHPA亢進(コルチコステロン及び副腎重量)を、慢性軽度ストレス(CMS)プロトコルの前後で評価した。マウス海馬の神経解剖学的形態はゴルジ染色手順を用いて推定した。288μmol/kg/日の用量(Wilcox, 2010)で投与したTempol(4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン 1-オキシル)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)は、蒸留水に溶解し、ALZET浸透圧ミニポンプにより送達した(1004, Charles River Laboratories, France)。Tempol又は蒸留水を満たしたポンプを、イソフルラン浅麻酔下で、ラットの背中に皮下移植し、４週間留置した。CMS手順の間には、ALZET浸透圧ミニポンプをCMSの１週間前に移植し、当該手順の終了まで留置した。
【００５７】
２．結果
酸化ストレスは抑うつに対する脆弱性に関与する
個体の酸化ストレスを反映するROSレベルは、CSDの31日後(D31)に、低血清BDNFレベルの動物(Ｖ群)及び正常血清BDNFレベルの動物(NV群)における(ROSに高度に感受性である)細胞内アコニターゼ活性の測定により決定した。Ｖ群動物は、(類似のタンパク質レベルにもかかわらず)アコニターゼ活性レベルの低下−ROS上昇を反映する−及び脂質過酸化(MDA)によって証明されるように酸化ストレスを示した。
プロテオミクス分析を使用して、酸化還元不均衡に関与する酸化還元関連タンパク質を同定する。二次元電気泳動タンパク質プロファイリングにより、NV群動物とV群動物との間で幾つかの豊富なタンパク質スポットについて発現に差があることが示された。このことが、質量分析による11の独特なタンパク質の同定に繋がった(図4B)。
【００５８】
これらのうち、Cu-Znスーパーオキシドジスムターゼ(Cu-Zn SOD)及びペルオキシレドキシン(Prx)は、ROS(スーパーオキシド(O2・-)及び過酸化水素(H2O2)を含む)の調節に直接関与する酵素の同質な機能的サブセットを構成する。サイトゾルCu-Zn SODは、O2・-からのH2O2産生を触媒する誘導性酵素(Wassmann S.ら，Hypertension, 44, 381［2004］)である(図4C)。高H2O2濃度は有害であるので、解毒酵素(例えば、ペルオキシレドキシン(Prx)、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx))はH2O2を水に還元する(図4C)。したがって、これらは、H2O2蓄積及びその後の高傷害性ヒドロキシルラジカル(巨大分子に対する酸化的損傷(複数回の脂質過酸化を含む)の原因である)への変換を制限する。酸化ストレスレベルの増大(Biliciら，J. Affect. Disord. 64, 43 (2001))と一致して、SODの量及び活性の両方がＶ群においてNV群動物と比較して増大し(図4C)、より高いH2O2産生を導いた(これは低下させる必要がある)。GPx及びカタラーゼのレベルには影響はないが、Prx2はＶ群動物で過剰酸化された(図4C)。Prx2(海馬ニューロンで強力に発現する厳密に調節される酵素)は、酸化還元活性過酸化性システインを用いてH2O2を還元し、その結果システインスルホン酸(Cys-SOH)の生成を生じ、Cys-SOHは、その後ジスルフィド結合の形成により還元される(Bell and Hardingham, Antioxid. Redox. Signal 14, 1467 (2011))。過酸化によるPrx2の触媒的不活化は、スルフィン酸型(Prx-SO2H)の生成をもたらし、スルフィド結合の形成を防止し(Phalenら，J. Cell. Biol. 175, 779 (2006))、よってH2O2蓄積を助ける(Wooら，Science 300,653 (2003))。Ｖ群動物におけるアコニターゼ活性の低下及び脂質過酸化の上昇は、H2O2のPrx2依存性蓄積と一致する。
【００５９】
BDNFは酸化還元感受性Nrf2経路を制御する
海馬HT-22細胞を使用して、BDNFがNrf2移行を双方向で制御することができることを証明した。第１に、天然Nrf2活性化剤たるケルセチンが核へのNrf2移行(図5A)及びNrf2サイトゾル画分の対応する減少を誘導することが確認された。環境のBDNF又は選択的TrkBレセプターアゴニストと定義される(Jangら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2687 (2010))7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)での富化は、Nrf2に対して類似する効果を生じた(図5A)一方、Keap1レベルには影響がなかった。HT-22細胞はTrkBレセプターを欠いているので(Rosslerら，J. Neurochem. 88, 1240 (2004))、Nrf2移行は、おそらく、内在化後の7,8-DHF及びおそらくBDNFの細胞内作用に起因する。siRNAでのBDNFノックダウンは、Nrf2移行を50％近く低下させ(図5B)、サイトゾルにおけるNrf2蓄積をもたらした。このことは、BDNFのサイトゾル画分が核へのNrf2の持続性移行を働かせて、基礎レベルの抗酸化剤を産生させることを示唆する。
同じ機序が、抑うつに対する脆弱性の実験モデルにおいて機能していることが確証された。CSDの５日後(D5)に、全ての敗北動物は、種々のストレスモデルにおける抗酸化的変化と一致した酸化ストレス(図6A)、低BDNFレベル(図6B)及び核Nrf2レベルの低下(図5C)により特徴付けられ、より高いサイトゾルNrf2レベル及び変化のないKeap1レベル(図6C)と関連付けられた。7,8-DHFでの海馬の灌流は、敗北動物及びコントロール動物で核へのNrf2移行を同レベルで誘導し(図5C)、サイトゾルNrf2レベルの低下を伴い、Keap1レベルは変化しなかった(図6D)。TrkB活性化の関与を排除することはできないが、7,8-DHF灌流の効果は、HT-22細胞に見出されるNrf2/Keap1複合体に対する細胞内作用と一致する。血清BDNFレベルは脳内レベルを反映するので、この結果は、低レベルのBDNFがNrf2移行の低下をもたらし、よって適切な抗酸化防御を活性化できず、酸化ストレスを生じるという提案と一致するものである。
【００６０】
このスキームを、重要な時点であるCSDの11日後(D11)に検定した。長期の血清BDNF測定により、D11でＶ群及びNV群と同定された動物は、D31までＶ群及びNV群のままであることが示された(図7A)。Ｖ群動物では、BDNFレベル及びNrf2移行は、D5と同様に減少したままであり(図5D、E)、酸化ストレスのマーカーはD5とD31とで類似していた(図7B)。NV群動物では、対照的に、酸化状態は基礎レベルに復帰した(図7B)。このことは、防御機構の活性化を示唆する。したがって、核Nrf2移行の増加(図5E；サイトゾルNrf2は低下、図7C)に続き、スルフィレドキシンが増加した(図5F)。Ｖ群動物では、逆に、スルフィレドキシンが減少した(図5F)。Prx2は、Ｖ群動物では過剰酸化された一方、NV群動物では、おそらくはスルフィレドキシンの増加を介して、正常な触媒的に活性な形態に復帰した(図5G)。
まとめると、これらの結果は次のスキームを示す。CSDエピソードは、H2O2蓄積に至るPrx2の不活性化に一部起因して、酸化促進条件をもたらす。NV群動物では、ベースラインBDNFへの復帰により、正常なNrf2機能が可能になり、防御機構が活性化され、正常な酸化還元状態へ復帰する。Ｖ群動物では、継続的に低いBDNFレベルが、適切なNrf2移行及び防御機構、特にPrx2活性及びH2O2クリアランスを回復するスルフィレドキシンの活性化を妨げる。
【００６１】
酸化ストレス状態に対するTEMPOLの効果
浸透圧ミニポンプによるTEMPOLでの慢性処置は、鍵となる時点(脆弱［Ｖ群］ラットが酸化状態及び神経解剖学的変化を示したときである、慢性ストレス性事象の11日後［D11］)に開始し、15日間継続した。抗酸化剤TEMPOLでの慢性処置は、アコニターゼ活性不全、脂質過酸化及びSOD機能不全の欠如により示されるように、Ｖ群動物において酸化ストレスを減少させた(グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)活性に対しては軽度効果を有し、カタラーゼ活性には影響しなかった)(Ｃ：ｎ＝５〜６；NV：ｎ＝６〜８；Ｖ：ｎ＝５〜６)。このことは、抑うつに対する脆弱性における酸化ストレスの重要な役割を浮き彫りにする(図1A、１B、１C、１D、1E)。
海馬ニューロンの形態に対するTEMPOLの効果
酸化ストレスは、Ｖ群動物におけるCA3錐体細胞の特徴たる樹状突起退縮及びスパイン密度低下に関連する(図2A、2B)。NV群動物では、神経解剖学的変化はD31に完全に回復する(図2A、2B)。TEMPOLでの処置は、NV群動物とＶ群動物の両方において、樹状構造及びスパイン密度をコントロールレベルにまで完全に回復させた(図2A、2B)。非脆弱動物と同定されたラット及びコントロール動物に適用したこの処置は、ビヒクル処置の非脆弱動物及びコントロール動物に匹敵するように、海馬ニューロンの全長を増大させる傾向がある(図2A)。処置Ｖ群動物はいずれも、D31で適用した３週間のCMSに応答して抑うつ様プロフィールを示さない。
【００６２】
抑うつ表現型に対するTEMPOLの効果
図3A及び3Bは、抗酸化剤たるTEMPOLでの慢性処置が、D11に脆弱と同定された動物(Ｖ、ｎ＝７)において、CSDプロトコル終了の31日後に適用された３週間の慢性軽度ストレスの後に、ビヒクル処置Ｖ群動物(ｎ＝９)で観察された強制水泳試験での不動時間の増大及び甘水消費の減少を防いだことを示す。
TEMPOLはCMSの前に投与されたが、CMSにより生じる抑うつ様プロフィールは消失した(図3A、3B)。したがって、早期のTEMPOL処置は、神経解剖学的変化及び抑うつに対する脆弱性状態の進展を防止した。このことは、この脆弱性が、実際、持続的な酸化還元不均衡により誘導された残留痕跡に依存性であることを確証する。
【００６３】
統計分析
表１：
【表１】
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表１のＡは、二元配置ANOVAに基づく、アコニターゼ、TBARS、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性、CA3ニューロンの先端樹状突起長並びに海馬CA3樹状突起スパインに対する社会的敗北ストレス及びTEMPOL処置の効果の統計分析に対応する。不動時間、甘水消費に対するSSPストレス及びTEMPOLの効果の統計分析は、二元配置ANOVAに基づく。
【００６４】
表２：
【表２】
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表２のＡは、一元配置ANOVAに基づく、D31でのアコニターゼ活性、TBARS、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性並びにペルオキシレドキシン(Prx)SO2/SO3に対する社会的敗北ストレスの影響の統計分析に対応する。
【００６５】
表３：
【表３】
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【００６６】
表３のB1は、一元配置ANOVAに基づく、HT-22細胞内の核Nrf2濃度に対するBDNF、7,8-ジヒドロキシフラボン(DHF)及びケルセチン又はsiRNA BDNFの効果の統計分析に対応する。一元配置ANOVAに基づく、核Nrf2レベルに対する社会的敗北の影響の統計分析。
表3のB2は、二元配置ANOVAに基づく、核Nrf2レベルに対する社会的敗北ストレス及び7,8-DHF灌流の効果の統計分析に対応する。
表3のB3は、反復測定値についての一元配置ANOVAに基づく、血清BDNFレベルに対する社会的敗北の影響の統計分析に対応する。
表3のB4は、一元配置ANOVAに基づく、D11での核Nrf2、スルフィレドキシン遺伝子発現及びペルオキシレドキシン(Prx)に対する社会的敗北ストレスの影響の統計分析に対応する。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
表4のB1は、一元配置ANOVAに基づく、D5でのアコニターゼ(活性及び量)、TBARS、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性に対する社会的敗北ストレスの影響の統計分析に対応する。
表4のB2は、一元配置ANOVAに基づく、非灌流海馬におけるサイトゾルNrf2レベル及びサイトゾルKeap1レベルに対する社会的敗北ストレスの影響の統計分析に対応する。
表4のB3は、二元配置ANOVAに基づく、サイトゾルNrf2及びKeap1レベルに対する社会的敗北ストレス及び7,8-DHF灌流の効果の統計分析に対応する。
【００６９】
【表５】
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【００７０】
表5のC1は、反復測定値についての一元配置ANOVAに基づく、血清BDNFレベルに対する社会的敗北の影響の統計分析に対応する。
表5のC2は、一元配置ANOVAに基づく、D11でのアコニターゼ(活性及び量)、TBARS、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)及びカタラーゼの活性、サイトゾルNrf2レベル及びサイトゾルKeap1レベルに対する社会的敗北ストレスの影響の統計分析に対応する。
【００７１】
【表６】
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表6のＤは、二元配置ANOVAに基づく、コルチコステロンレベル及び副腎重量に対する社会的敗北ストレス及びTEMPOL処置の効果の統計分析に対応する。
【００７２】
【表７】
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表7のＤは、反復測定値についての一元配置ANOVAに基づく、血清BDNFレベルに対するグループ効果の統計分析に対応する。
【００７３】
コルチコトロピン軸活性に対するTEMPOLの効果
TEMPOL及びビヒクルは、コントロール動物、脆弱動物及び非脆弱動物に投与した。コルチコトロピン軸活性に対するTEMPOLの効果は、コルチコステロンレベル(ng/ml)及び副腎重量により評価した。結果は、TEMPOLでの処置が、脆弱動物において、ビヒクルで処置した脆弱動物と比較して、コルチコステロンレベル及び副腎重量の増加を防止したことを説明する(図8A、8B)。
BDNFレベルに対するTEMPOLの効果
TEMPOLでの処置は、脆弱動物において、ビヒクルで処置した脆弱動物と比較して、血清BDNFレベルの回復を誘導した(図９)。
【００７４】
Nrf2遺伝子欠損マウス(無Nrf2マウス；Nrf2-/-)に対するTEMPOLの効果
TEMPOL及びビヒクルは、高酸化ストレス状態を示す無Nrf2マウス(図12A)及びNrf2+/+マウス(野生型)に投与した。
無Nrf2マウスは、CA3錐体細胞において樹状突起退縮を示したが、これは４週間のTEMPOL処置によりで防止された(図12B及び12C)。
無Nrf2マウスは、抑うつ様表現型を示さなかった(FSTにおける不動時間、甘水消費及びHPA軸活性により推定された)(図12D)。しかし、３週間のCMSに曝されたとき、無Nrf2マウスのみが抑うつ様表現型(無力行動、無快感症及びHPA亢進)を発現した。抑うつ様表現型は、慢性TEMPOL処置により予防される(図12D)。
図12A、12B、12C及び12Dは、Nrf2遺伝子のノックアウトが、抑うつに対する脆弱性の永続状態(この状態は、CMSの後に現れることがあり、脆弱ラットと共通の表現型形質を有する)を生じ、Tempol処置により防止されることを示す。よって、酸化ストレスを生じるNrf2機能の変化は、抑うつに対する脆弱性を誘導するに必要十分である。
【００７５】
研究施設における最近のデータにより、強烈なストレス性事象が誘導した持続性酸化ストレスは、抑うつに対する脆弱性状態をもたらすことが確立された。したがって、TEMPOLでの処置が、「リスクを有する」集団、すなわち強烈なストレス性事象の数ヶ月後に抑うつを発症するように感作された集団において効果的であり得る。よって、この処置は、抑うつの発症を予防し得る。リスクを有する集団を決定するために、血清BDNFレベルが適切な予測的生物学的マーカーとして同定された(Blugeotら，2011)。慢性的な強烈ストレスに曝された250人が関与した長期研究において、血清BDNFレベルの持続的低下が「リスクを有する」対象者の同定を可能にすることが確証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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