(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の老化症状又は損傷を予防および処置するための化粧品組成物であって、それは原料の総重量の少なくとも８０重量％の大豆（グリシン・マックス  Ｌ．）及び原料の総重量の多くとも２０重量％のサッカロマイセス属の酵母のバイオマスを加水分解することによって得られる大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせから成るシステムを、生理学的に許容される媒体中に含み、前記大豆及び酵母のペプチド抽出物は、０．５〜５．５ｇ／Ｌの間の分子量が５ｋＤａ未満である前記ペプチド化合物を含むことを特徴とする、化粧品組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記大豆及び酵母のペプチド抽出物は、前記原料の総重量の９０重量％の前記大豆及び前記原料の総重量の１０重量％の前記酵母を加水分解することによって得られることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物であって、クリーム、水中油型エマルション、又は油中水型若しくは多相エマルション、溶液、懸濁液、マイクロエマルション、水性若しくは無水のゲル、血清、又はベシクル分散液、パッチ、スプレー、軟膏、軟膏剤、ローション、コロイド、ミルク、スティック又は粉末から選択される局所適用に適した形態で提供されることを特徴とする、組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の美容的使用であって、但し人間を手術、治療および診断する態様の使用を除き、テロメラーゼの量及び／又は活性を変更せずに細胞内のＴＲＦ２の量を増加させることによって、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復するための、美容的使用。
【請求項５】
請求項４に記載の美容的使用であって、前記皮膚細胞のＤＮＡにおける二重鎖切断を予防及び／又は修復するための、美容的使用。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の美容的使用であって、老化の皮膚兆候を予防及び／又は処置するための、美容的使用。
【請求項７】
請求項６に記載の美容的使用であって、ＵＶ照射によって誘発される光老化の皮膚徴候を予防及び／又は処置するための、美容的使用。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の美容的使用であって、しわ、深いしわ、小じわ、ひび割れ、皮膚及び皮下組織のたるみ、皮膚の弾力性の喪失及び弛緩、はり及び色合いの喪失、並びに皮膚萎縮を予防及び／又は処置するための、美容的使用。
【請求項９】
顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の局所適用を含む、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復するための美容処理方法であって、前記組成物は抗老化デイケアとして朝に適用され、及び／又は修復ナイトケアとして就寝時に適用され、但し人間を手術、治療および診断する態様の使用を除く、美容処理方法。
【請求項１０】
顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の局所適用を含む、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復するための美容処理方法であって、前記組成物は日焼け前のケアとして日光暴露前に適用され、及び／又は日焼け後のケアとして日光暴露後に適用され、但し人間を手術、治療および診断する態様の使用を除く、美容処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化粧品の分野に関する。本発明は、大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせから成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを含む化粧品組成物に関し、より具体的には、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷及び老化に伴う皮膚徴候を予防及び／又は処置することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
老化は、「通常」人間を構成する全ての細胞に影響を及ぼす生物学的プロセスである。これは、理学的観点から、皮膚細胞、毛髪、臓器等を問わず、人体の一般的な老化により表される。
【０００３】
老化は、特にテロメア短縮（複製老化）によって、又は生理的ストレス信号、例えば酸化ストレスなどへの急性的又は慢性的な暴露によって引き起こされることが科学的に実証されている。細胞老化、したがって人間の老化を制限するための手段の１つは、テロメア短縮に対抗すること、及び／又はＤＮＡに対する酸化ストレス作用を制限することから成る。
【０００４】
テロメアはＴＴＡＧＧＧ配列の繰り返し及び特定のタンパク質から形成されている。テロメアは染色体の末端に位置し、その安定性を提供している。テロメアに結合するタンパク質の中には、二本鎖テロメアＤＮＡに直接結合するＴＲＦ１及びＴＲＦ２のタンパク質（ＴＲＦ：テロメア結合因子）、又は一本鎖３’末端に結合するＰＯＴ１タンパク質がある。細胞分裂時に、ＴＴＡＧＧＧユニットは複製の間の過程で失われる。このテロメアの損失は逆転写酵素のテロメラーゼによって部分的に補われ、テロメラーゼは既存のテロメア末端において新たなテロメア反復の合成を行うことにより、最適な長さを確保している。
【０００５】
生じる問題は、このテロメラーゼの活性が体細胞において非常に弱いということであり、それにより各染色体複製においてテロメア短縮が生じる。
【０００６】
現在、皮膚老化、したがってその兆候を制限するために使用されている戦略の１つは、皮膚細胞のテロメラーゼ活性を増大させることから成る。しかしながら、これは前記細胞の不死化の危険性を伴い、それは不死化細胞が癌細胞と関連し得るために望ましくない。
【０００７】
出願人は、テロメアに関連するタンパク質、より具体的にはＴＲＦ２タンパク質の量を調節することで細胞老化の遅延を試みるために、別の経路を調査した。こうして、出願人は、皮膚細胞においてテロメアに関連するタンパク質の量を増加させるのに適した大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせから成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを開発した。
【０００８】
さらなるＴＲＦタンパク質調節化合物又はテロメア安定剤は、米国特許出願公開第２００２００７６７１９号、国際公開第９８３６０６６号、又は同第２００４０９２３９５号の特許出願に開示されているように以前に提案されている。
【０００９】
さらに、大豆又は酵母の抽出物の美容的使用は、皮膚に対する抗老化作用を有すると記載されており（仏国特許第２９１５３７８号、同第２９１５３８４号、同第２９１５３８１号、同第２８８７７７５号、同第２８８７７７２号、同第２８２６５７６号の特許出願）、また、大豆、麦芽及び酵母の水性抽出物を含む化粧品組成物は、皮膚の弾力を増加させると記載されている（韓国特許出願公開第２００３０４５４３７号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２００７６７１９号明細書
【特許文献２】国際公開第９８３６０６６号
【特許文献３】国際公開第２００４０９２３９５号
【特許文献４】仏国特許第２９１５３７８号明細書
【特許文献５】仏国特許第２９１５３８４号明細書
【特許文献６】仏国特許第２９１５３８１号明細書
【特許文献７】仏国特許第２８８７７７５号明細書
【特許文献８】仏国特許第２８８７７７２号明細書
【特許文献９】仏国特許第２８２６５７６号明細書
【特許文献１０】韓国特許出願公開第２００３０４５４３７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記で引用した文献のいずれも、本特許出願に開示されているような定義された濃度の大豆及び酵母のペプチド抽出物から成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システム、又は老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷及び皮膚兆候を予防及び／又は処置するための、このようなＴＲＦ２タンパク質活性化システムを含む化粧品組成物の使用を、開示又は示唆していない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に従って使用されるＴＲＦ２タンパク質活性化システムは、特に以下の利点を提供する：
【００１３】
−それは、皮膚細胞においてテロメアに関連するタンパク質（ＴＲＦ）、特にＴＲＦ２タンパク質の量を増加させる;
【００１４】
−それは、老化細胞表現型を有する細胞内のビメンチン細胞骨格タンパク質の増加及び凝集を制限する；
【００１５】
−それは、メチルグリオキサールで処理された皮膚生検材料において損傷の出現を制限する；
【００１６】
−それは、テロメラーゼの量及び／又は活性を変更せずにテロメアの劣化を制限する;及び
【００１７】
−そのため、それは、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷及び皮膚兆候を予防及び／又は処置する。
【００１８】
本発明は、第１に、原料の総重量の少なくとも８０重量％の大豆及び原料の総重量の多くとも２０重量％の酵母を加水分解することによって得られる大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせから成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを、生理学的に許容される媒体中に含む、化粧品組成物に関する。
【００１９】
本発明は、第２に、テロメラーゼの量及び／又は活性を変更せずにテロメアの劣化を制限するために細胞内のＴＲＦ２の量を増加させることによって、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復することを目的とした、本発明による組成物の美容的使用に関する。
【００２０】
最後に、本発明は、第３に、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への本発明による組成物の局所適用を含む、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復することを目的とした美容処理方法に関する。
【００２１】
本発明及びそれから生じる利点は、以下の説明及び非限定的な実施形態を読むことより、より明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は本発明を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
したがって、本発明は、種々の選択された原料、すなわち大豆及び酵母を加水分解することによって得られるペプチド抽出物の組み合わせから成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを、生理学的に許容される媒体中に含む、化粧品組成物に関する。
【００２４】
本発明による大豆ペプチド抽出物は、優先的に大豆（グリシン・マックス  Ｌ．（Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍａｘ  Ｌ．））の加水分解から得られ、さらに、本発明による酵母ペプチド抽出物は、優先的にサッカロマイセス属、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母のバイオマスの加水分解から得られる。
【００２５】
好ましくは、大豆は予備発酵を受けず、酵母は凍結乾燥される。
【００２６】
本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムを得るために、大豆ペプチド及び酵母ペプチドの加水分解物を個別に得て、その後、組み合わせて本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物が形成されてもよい。
【００２７】
好ましくは、大豆及び酵母の加水分解は、例えば実施例１の方法に従って、同時に起こる。
【００２８】
使用する方法に関係なく、本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムの特性は、大豆及び酵母のペプチド抽出物が、原料の総重量の少なくとも８０重量％の大豆、及び原料の総重量の多くとも２０重量％の酵母を加水分解することによって得られる限り、保持される。
【００２９】
一例として、相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムは、原料の総重量の８５〜９２重量％の大豆、及び原料の総重量の８〜１５重量％の酵母を加水分解することによって得られる大豆及び酵母のペプチド抽出物から成る。優先的に、本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムは、原料の総重量の９０重量％の大豆、及び原料の総重量の１０重量％の酵母を加水分解することによって形成される。
【００３０】
本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムを形成する大豆及び酵母のペプチド抽出物は、その物理化学的特性及びそのペプチド化合物について定性的かつ定量的に分析される；ペプチド、アミノ酸及びタンパク質断片は、当業者に周知の従来技術に従って測定される。
【００３１】
本発明による好ましい大豆及び酵母のペプチド抽出物は、基本的に低分子量のペプチド化合物を含む。すなわち、有利には、低分子量のペプチドのみを含有する。優先的に、それは５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチド化合物を基本的に含む。すなわち、有利には、本発明による好ましい大豆及び酵母のペプチド抽出物は、分子量が５ｋＤａ未満のペプチド化合物のみを含む。
【００３２】
また、本発明の有利な一実施形態によれば、大豆及び酵母のペプチド抽出物は、乾燥抽出物重量で１６〜１８ｇ／Ｌの間のペプチド化合物を含み、優先的に、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、乾燥抽出物重量で０．５〜５．５ｇ／Ｌの間のペプチド化合物を含有するように希釈される。
【００３３】
ＴＲＦ２タンパク質活性化システム及び生理学的に許容される媒体を含む本発明による化粧品組成物は、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への局所適用に適した形態で提供される。
【００３４】
本発明による生理学的に許容される媒体は、特に、例えば、毒性、不適合性、不安定性、又はアレルギー反応などの危険性を伴わずに、人間の皮膚又は皮膚付属器と接して使用するのに適した媒体を意味する。
【００３５】
本発明の有利な一実施形態によれば、ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを形成する大豆及び酵母のペプチド抽出物は、予め、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリコールエトキシレート、ジグリコールプロポキシレート、環状ポリオール、ワセリン、植物油又はこれらの溶媒の混合物などの、当業者によって従来から使用されている１つ又は複数の生理学的に許容される溶媒に可溶化される。
【００３６】
本発明のさらに有利な一実施形態によれば、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、リポソームなどの化粧品担体中に可溶化されるか、又は有機ポリマーパウダー、無機基材、例えばタルク及びベントナイト上に吸着され、より一般的には任意の生理学的に適した担体中に可溶化されるか、又はそれに結合する。
【００３７】
好ましくは、局所的に適用することを目的とした本発明による組成物は、クリーム、水中油型エマルション、又は油中水型若しくは多相エマルション、溶液、懸濁液、マイクロエマルション、水性若しくは無水のゲル、血清、又はベシクル分散液、パッチ、スプレー、軟膏、軟膏剤、ローション、コロイド、ミルク、スティック又は粉末の形態で提供される。
【００３８】
本発明の有利な一実施形態によれば、大豆及び酵母のペプチド抽出物は、最終組成物の総重量に対して、約０．０００１％〜２０％の間の濃度で、優先的には約０．０５％〜５％の間の濃度で、より優先的には約１％〜３％の間の濃度で、本発明による化粧品組成物中に存在する。
【００３９】
より優先的には、本発明による化粧品組成物はさらに、少なくとも１つのさらなる活性剤を含有する。これは、限定されるものではないが、以下の種類の成分を含む：さらなるペプチド活性剤、植物抽出物、治癒剤、抗老化剤、抗しわ剤、緩和剤、抗ラジカル剤、抗ＵＶ剤、皮膚の高分子合成又はエネルギー代謝を刺激する薬剤、保湿剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔薬、皮膚の分化、色素沈着、又は色素脱失を調節する薬剤、爪又は毛髪の成長を刺激する薬剤等。優先的には、抗シワ分野において活性を有する薬剤、例えば抗ラジカル剤若しくは酸化防止剤、又は皮膚の高分子合成を刺激する薬剤、又はエネルギー代謝を刺激する薬剤、が使用される。より具体的には、活性剤は、ビタミン、植物ステロール、フラボノイド、ＤＨＥＡ及び／若しくはそれらの前駆体のいずれか、若しくはそれらの化学的若しくは生物学的誘導体のいずれか、メタロプロテイナーゼ阻害剤、又はレチノイドから選択される。
【００４０】
さらに、添加剤、例えば溶媒、希釈剤、着色剤、日焼け止め剤、セルフタンニング剤、顔料、充填剤、防腐剤、臭気吸収剤、増粘剤、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、香料、酸化防止剤、フィルム形成剤、キレート剤、金属イオン封鎖剤、調整剤が、本発明による組成物に添加され得る。
【００４１】
いずれの場合でも、当業者は、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物から成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを含む組成物の有利な特性の追求を妨げないように、これらの添加剤及びその割合を選択することを確保する。これらの添加剤は、例えば組成物の総重量の０．０１％〜２０％の間であり得る。本発明による組成物がエマルションである場合、油相は、組成物の総重量に対して５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％を示し得る。組成物に使用される乳化剤及び共乳化剤は、当該分野で従来から使用されているものから選択される。例えば、それらは組成物の総重量に対して、０．３重量％〜３０重量％の範囲の割合で使用され得る。
【００４２】
本発明による化粧品組成物、より具体的には、原料の総重量の少なくとも８０重量％の大豆及び原料の総重量の多くとも２０重量％の酵母を加水分解することによって得られる大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせから成る相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムは、（遺伝子発現の直接的又は間接的な調節により）ＴＲＦタンパク質のタンパク質合成を増加させることによって、又はメッセンジャーＲＮＡ転写産物の安定化などのさらなる生物学的プロセスによって、皮膚細胞内のテロメアと結合するＴＲＦタンパク質（ＴＲＦ２及び／又はＰＯＴ１）、好ましくはＴＲＦ２の量を増加させる。
【００４３】
原料の総重量の少なくとも８０重量％の大豆及び原料の総重量の多くとも２０重量％の酵母を加水分解することによって得られる大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせは、原料の総重量と同じ総重量の大豆１００％のペプチド抽出物と比較して、培養中のケラチノサイト及び線維芽細胞におけるＴＲＦ２発現の増加に関して活性化システムの有効性を約２０％増加させることができるという点で、ＴＲＦ２タンパク質活性化システムは相乗作用を有している。
【００４４】
こうして、本発明のさらなる目的は、テロメラーゼの量及び／又は活性を変更せずにテロメアの劣化を制限するために（細胞不死化の危険性が存在しないため、これは重要である）、細胞内のＴＲＦ２の量を増加させることによって、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復することを目的とした、本発明による組成物の美容的使用に関する。
【００４５】
人間における細胞のＤＮＡ損傷は毎日修復されるが、それは完全ではない。そのため、修復されなかった損傷は長年にわたって蓄積される。したがって、この損傷を予防及び修復することが極めて重要である。
【００４６】
皮膚細胞のＤＮＡ損傷の予防は、ＤＮＡ損傷の発生を制限するための皮膚細胞に対する本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムの保護的役割によって表される。
【００４７】
皮膚細胞のＤＮＡ損傷の修復は、以前の皮膚細胞の損傷に対する本発明によるＴＲＦ２タンパク質活性化システムの修復的役割によって表される。
【００４８】
本発明による皮膚細胞は表皮及び真皮、特にケラチノサイト及び線維芽細胞の細胞を意味する。
【００４９】
本発明による皮膚細胞のＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ塩基間の光化学反応、例えばシクロブタンピリミジンダイマーの形成などによって引き起こされる損傷、ＤＮＡの二重鎖切断、又は環境によって生じやすい外部攻撃後のあらゆる他のＤＮＡ損傷を意味する。
【００５０】
一例として、外部攻撃には、汚染などの攻撃、酸化ストレスを引き起こす攻撃、例えば太陽への過剰暴露と関連するＵＶ照射、特にＵＶＢ照射、又は刺激物質、例えば界面活性剤、防腐剤若しくは香料がある。
【００５１】
本発明による化粧品組成物は、優先的に、損傷後の皮膚細胞のＤＮＡにおける二本鎖切断の発生を予防及び／又は修復するために用いられる。実際に、皮膚細胞の損傷後、特にＵＶ照射又は酸化ストレスによる損傷後、前記皮膚細胞のＤＮＡは二本鎖切断で表される損傷を受けやすい。本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物の組み合わせによって形成される相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムは、この種の損傷に関するそのＤＮＡ保護作用を実証した。
【００５２】
本発明による化粧品組成物はまた、老化の皮膚徴候及びＵＶ照射によって誘発される光老化の皮膚徴候を予防及び／又は処置するために使用される。
【００５３】
本発明による光老化は、太陽への長時間かつ累積した暴露によって引き起こされる皮膚の早期老化を意味する。
【００５４】
本発明による老化及び光老化の皮膚兆候としては、限定されるものではないが、老化によって引き起こされる皮膚上の目に見えるあらゆる兆候が挙げられる。これは、特に、しわ、深いしわ、小じわ、ひび割れ、皮膚及び皮下組織のたるみ、皮膚の弾力性の喪失及び弛緩、はり及び色合いの喪失、並びに皮膚萎縮を指す。
【００５５】
本発明による化粧品組成物は、優先的に、しわ、深いしわ、小じわ、ひび割れ、皮膚及び皮下組織のたるみ、皮膚の弾力性の喪失及び弛緩、はり及び色合いの喪失、並びに皮膚萎縮を予防及び／又は処置することを目的とするものである。
【００５６】
最後に、本発明の最後の目的は、顔又は身体の皮膚の少なくとも一部への本発明による組成物の局所適用を含む、老化に伴う皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防及び／又は修復することを目的とした美容処理方法に関し、組成物は抗老化デイケアとして朝に適用され、及び／又は修復ナイトケアとして就寝時に適用される。デイケアとして適用する場合、組成物は、特に、皮膚細胞のＤＮＡ損傷の発生を制限することにより、環境攻撃、すなわちＵＶ照射、特にＵＶＢ照射から皮膚を保護する。ナイトケアとして、組成物は、より具体的には、日中のあらゆる皮膚損傷に対する修復的役割を有している。
【００５７】
本発明による美容処理方法のさらに有利な実施形態では、組成物は日焼け前のケアとして日光暴露前に適用され、及び／又は日焼け後のケアとして日光暴露後に適用される。そのため、組成物は、特に皮膚細胞のＤＮＡ損傷を予防する優れた日焼け前のケア、及び／又は日光暴露後には、より具体的には皮膚のあらゆるＤＮＡ損傷を修復するための日焼け後のケアを構成する。
【００５８】
以下の実施例は、本発明による相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムの有効性を説明かつ実証するが、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００５９】
本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物を得る方法：
本発明による相乗的ＴＲＦ２タンパク質活性化システムを得るために、予め粉砕した大豆の原料の総重量の９０重量％を、酵母バイオマスの原料の総重量の１０重量％と混合する。原料混合物を１：６０の重量比、すなわち、６０ｋｇの水に１ｋｇの原料混合物の重量比で水溶液中に入れる。溶液のｐＨを７〜７．５の間の値に調整する。ｐＨを調整した後、２％のブロメライン及び２％のＰＯＬＹＣＬＡＲ（登録商標）１０（不溶性ポリビニルピロリドン−ＰＶＰＰ）を反応混合物に添加する。次いで、反応混合物を５５℃で２時間加熱し、そして８０℃で２時間不活性化させる。濾過工程を用いて、２０〜２５ｇ／Ｌの乾物、１９〜２２ｇ／Ｌのタンパク質及び２〜３ｇ／Ｌの糖から成る濾液を回収する。
【００６０】
この濾液のタンパク質の性質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証する。この分析について、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｅ−ｃａｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲルを使用する。中間体の大豆及び酵母のペプチド抽出物を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料調製緩衝液中で変性還元条件下にて１０分間７０℃に加熱する。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ溶液を内側容器に添加し、電気泳動中に還元されたタンパク質が再酸化されるのを防止する。ペプチド化合物の泳動は、分子量マーカーとしてＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２標準を用いて、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ泳動緩衝液により行う。ペプチド化合物の染色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｒ２５０を用いて行う。得られたペプチドプロファイルは、６ｋＤａ未満の分子量分布を示している。
【００６１】
次いで、上記で得られた中間体の大豆及び酵母のペプチド抽出物を、（最大０．２μｍの）減少した空隙率のＳｅｉｔｚ−Ｏｒｉｏｎフィルタープレスを用いて連続した濾過により精製することで、はっきりと透明な溶液が得られる。この工程では、大豆及び酵母の抽出物は、２０−２２ｇ／ｋｇの乾燥重量、１８−２０ｇ／Ｌのペプチド化合物含有量、及び１−２ｇ／Ｌの糖含有量によって特徴付けられる。
【００６２】
次いで、この溶液を接線流濾過を用いて５ｋＤａを超える分子量を有するペプチド化合物を除去することにより精製する。このために、大豆及び酵母の溶液を、１０ｋＤａ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２カセットを備えたＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ホルダーを介して圧力下で送り出す。この最初の濾液を回収して、さらに５ｋＤａ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２カセットを介して後に濾過する。
【００６３】
精製終了時に、はっきりと透明な淡黄色の大豆ペプチド及び酵母ペプチドの植物抽出物が得られる。これは、１８−２０ｇ／ｋｇの乾燥重量、１６−１８ｇ／Ｌのペプチド化合物含有量、及び０．３〜０．５ｇ／Ｌの間の糖含有量によって特徴付けられる。
【００６４】
その後、滅菌濾過工程を実施することで、３０％のグリセロール中で２．３５ｇ／Ｌのペプチド化合物に希釈された、本発明による最終的な大豆及び酵母のペプチド抽出物が得られる。
【実施例２】
【００６５】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物が複製老化により老化した線維芽細胞に与える影響の研究
ヒト線維芽細胞を特定の培地中で培養し、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物を１％〜３％の濃度で毎日適用し、長期培養を維持する（１７継代超）。ビメンチンの免疫蛍光検出実験を、６及び１７継代培養の細胞において実施する。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて１０分間透過処理し、かつ１％のＢＳＡ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ社）で１５分間インキュベートする。抗ビメンチン抗体（Ｔｅｂｕ社  サンタクルーズ）をその後に添加して、１：２００希釈で周囲温度にて２時間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８マーカーと結合したロバ抗マウスＩｇＧ抗体を１：１０００希釈で添加し、周囲温度で１時間インキュベートする。最後に、切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてマウントし、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ、倍率４０倍）で観察する。
【００６６】
結果／結論：
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理した老化線維芽細胞は、未処理の老化線維芽細胞よりも少ないビメンチンを発現することが観察される。一方で、ビメンチンの増加及び凝集は、老化現象に伴う細胞骨格の変化と関連している。従って、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物を用いた処理により、線維芽細胞の老化によるビメンチンの増加及び凝集を制限することができると結論付けられる。
【実施例３】
【００６７】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物がメチルグリオキサールを用いてインビトロで老化させた生検モデルに与える影響の研究
ヒトの皮膚生検材料を、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）を用いた処理によってインビトロで人為的に老化させる。このために、ヒト皮膚生検材料の６ｍｍパンチを、特定の培養培地中で気液界面にてインキュベートする。次いで、それらを５ｍＭ又は１０ｍＭのＭＧＯ（Ｓｉｇｍａ社）で処理し、ＭＧＯは生検材料の表面及び培養培地中に堆積する。生検材料をその後：
【００６８】
−条件１：２０μＬの１×ＰＢＳ、又は
−条件２：２０μＬの１％の実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物、又は
−条件３：２０μＬの３％の実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物、
のいずれかで処理する。
【００６９】
生検材料を固定し、パラフィン中に包含して、次いでミクロトームを用いて４μｍの切片に切断する。ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）免疫標識をすでに切断した切片において実施し、その形態及び構造を（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡、４０倍レンズを用いて）顕微鏡で観察することにより調査する。
【００７０】
結果／結論：
対照条件１、すなわち、本発明によるペプチド抽出物を添加しない条件下では、ＭＧＯは、皮膚生検材料、より具体的にはその構造に著しい損傷を引き起こしたことが観察される。より多くの損傷が１０ｍＭの量のＭＧＯで観察されるため、生じた損傷は用量依存性である。
【００７１】
生検材料を実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理すると、前記生検材料の構造の損傷は、対照条件下よりもはるかに少ないことが観察される。実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物の保護効果は、１％用量よりも３％用量においてより少ない損傷が観察されることから、用量依存性であることが観察される。
【００７２】
したがって、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、著しい損傷及び早期老化を引き起こすストレスを細胞構造が受けたときに、前記構造に対して保護効果を有していたと結論付けられる。
【実施例４】
【００７３】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理したヒト線維芽細胞におけるｓｉＲＮＡを用いたＴＲＦ２タンパク質発現の研究
本発明によるペプチド抽出物のヒト線維芽細胞集団におけるＴＲＦ２の過剰発現に対する有効性を定量化するために、ＴＲＦ２をコードする遺伝子をｓｉＲＮＡ（サイレンサーＲＮＡ）を用いて「消失」させた。
【００７４】
プロトコル：
線維芽細胞を６０％コンフルエントになるまで６ウェルプレート中で培養する。培養培地は、以下に記載の条件下で、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物を１％添加して新しくする。その後、１０ｎＭの最終含有量を有するＴＲＦ２  ｓｉＲＮＡ及びトランスフェクション剤を含む予め生成した１００μＬの混合物を、各ウェルに一滴ずつ慎重に添加する。細胞培養プレートを５％のＣＯ２で３７℃にて７２時間インキュベートする。培養培地を２日ごとに新しくする。４つの条件を設定した：
【００７５】
−条件１：ｓｉＲＮＡを含まず、かつ活性剤を含まない対照
−条件２：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、活性剤を含まない細胞
−条件３：活性剤で処理されるが、トランスフェクトされない細胞
−条件４：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、かつ活性剤で処理された細胞
【００７６】
抗ＴＲＦ２抗体を用いて従来のプロトコルに従って実施される従来の免疫移動技術（ウェスタンブロット）を用いて、ＴＲＦ２発現の定量化を観察する。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした線維芽細胞におけるペプチドによって提供される埋め合わせを分析するために、遺伝子がｓｉＲＮＡによって消失していない未処理の線維芽細胞に対して比較を実施する。
【００７７】
結果／結論：
条件１と３の間では、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物の添加により、対照と比較して１７％のＴＲＦ２タンパク質発現の増加が生じたことが観察される。条件１と２の間では、ｓｉＲＮＡがＴＲＦ２タンパク質発現に及ぼす影響が効果的に観察される：実際には、ＴＲＦ２タンパク質発現は２６％減少する。しかしながら、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に活性剤を添加すると、ＴＲＦ２発現は回復し、ｓｉＲＮＡの存在に起因する減少は対照条件と比較してわずか１８％である。
【００７８】
結論として、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、処理された線維芽細胞におけるＴＲＦ２タンパク質発現の減少（特異的ｓｉＲＮＡによって誘導される減少）に対して埋め合わせをすることが可能である。
【実施例５】
【００７９】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理したヒトケラチノサイトにおけるｓｉＲＮＡを用いたＴＲＦ２タンパク質発現の研究
本発明によるペプチド抽出物のケラチノサイト集団におけるＴＲＦ２発現レベルの調節に対する有効性を定量化するために、ＴＲＦ２をコードする遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて「消失」させた。
【００８０】
プロトコル：
培養中のヒトケラチノサイトを、必要に応じて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号：１３７７８−０７５）を用いて、特異的ＴＲＦ２  ｓｉＲＮＡ（特注ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ社）を２５ｎＭの最終濃度で用いて処理し、かつ必要に応じて、成分を１％の最終濃度で用いて４８時間処理する。
【００８１】
４つの条件を設定した：
【００８２】
−条件１：ｓｉＲＮＡを含まず、かつ活性剤を含まない対照
−条件２：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、活性剤を含まない細胞
−条件３：活性剤で処理されるが、トランスフェクトされない細胞
−条件４：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、かつ活性剤で処理された細胞
【００８３】
次いで、細胞を洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドで周囲温度にて１０分間固定する。細胞核の透過化を、周囲温度で１０分間０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いたインキュベーションにより実施する。非特異的部位を１％のＢＳＡを３０分間適用してブロックする。ＴＲＦ２に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、参照番号：ａｂ１３５７９）、続いて、蛍光色素と結合した抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号：Ａ２１２０２）の存在下で、細胞をインキュベートする。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡）で観察する。
【００８４】
条件ごとに３つの画像を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６．３ソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を用いて分析かつ定量化する。その後、スチューデントｔ検定を用いて、これらのデータに対して統計分析を行う。
【００８５】
結果／結論：
条件１と３の間では、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物の添加により、対照と比較して３４．４％のＴＲＦ２タンパク質発現の増加が生じたことが観察される。条件１と２の間では、ＴＲＦ２  ｓｉＲＮＡがＴＲＦ２タンパク質発現に及ぼす影響が効果的に観察される：実際には、ＴＲＦ２タンパク質発現は３２．５％減少する。しかしながら、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に活性剤を添加すると、ＴＲＦ２発現は回復し、トランスフェクトされた未処理の細胞と比較して７５．５％の増加が観察される。
【００８６】
結論として、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、処理されたケラチノサイトにおけるＴＲＦ２タンパク質発現の減少（特異的ｓｉＲＮＡによって誘導される減少）に対して埋め合わせをすることが可能である。
【実施例６】
【００８７】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理し、かつ人為的な老化誘導により老化させたヒト線維芽細胞におけるＴＲＦ２タンパク質発現の研究
本発明によるペプチド抽出物のＴＲＦ２発現レベルの調節に対する有効性を定量化するために、線維芽細胞集団における人為的な老化誘導を、ＦＯＸＯ３ａ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡで細胞を４８時間処理することによって実施した。
【００８８】
プロトコル： 
培養中のヒト線維芽細胞を、必要に応じて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号：１３７７８−０７５）を用いて、特異的ＦＯＸＯ３ａ  ｓｉＲＮＡ（ＨＳＳ１７７１７６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５ｎＭの最終濃度で用いて処理し、かつ必要に応じて、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物を１％の最終濃度で用いて４８時間処理する。
【００８９】
４つの条件を設定した：
【００９０】
−条件１：ｓｉＲＮＡを含まず、かつ活性剤を含まない対照
−条件２：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、活性剤を含まない細胞
−条件３：活性剤で処理されるが、トランスフェクトされない細胞
−条件４：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、かつ活性剤で処理された細胞
【００９１】
次いで、細胞を洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドで周囲温度にて１０分間固定する。細胞核の透過化を、周囲温度で１０分間０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いたインキュベーションにより実施する。非特異的部位を１％のＢＳＡを３０分間適用してブロックする。ＴＲＦ２に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、参照番号：ａｂ１３５７９）、続いて、蛍光色素と結合した抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号：Ａ２１２０２）の存在下で、細胞をインキュベートする。次いで、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡）で観察する。
【００９２】
条件ごとに３つの画像を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６．３ソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を用いて分析かつ定量化する。その後、スチューデントｔ検定を用いて、これらのデータに対して統計分析を行う。
【００９３】
結果／結論：
条件１と３の間では、実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物の添加により、対照と比較して２２％のＴＲＦ２タンパク質発現の増加が生じたことが観察される。条件１と２の間では、ＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡがＴＲＦ２タンパク質発現に及ぼす影響が効果的に観察される：実際には、ＴＲＦ２タンパク質発現は１８．９％減少する。しかしながら、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に活性剤を添加すると、ＴＲＦ２発現は回復し（条件４）、トランスフェクトされた未処理の細胞（条件２）と比較して２６％の増加が観察される。
【００９４】
結論として、本発明による大豆及び酵母のペプチド抽出物は、ＦＯＸＯ３ａ特異的ｓｉＲＮＡによって人為的に誘導されたＴＲＦ２タンパク質発現の減少に対して埋め合わせをすることが可能である。
【実施例７】
【００９５】
実施例１の大豆及び酵母のペプチド抽出物で処理したヒト線維芽細胞におけるＤＮＡ保護の研究
コメットアッセイは、細胞レベルでＤＮＡに生じた損傷を定量化するのに適した試験である。
【００９６】
プロトコル：
ヒト線維芽細胞を培養し、３継代〜１６継代の間に実施例１のペプチド抽出物を１％の濃度で用いて１日１回処理する。次いで、これらに５０ｍＪ／ｃｍ２の量でＵＶＢ放射線を照射し、その後、３０分間線維芽細胞培地での培養に戻す。
【００９７】
対照培養物は、実施例１のペプチド抽出物で処理せずに調製する。
【００９８】
次いで、細胞をトリプシン処理することによりその基板から分離し、細胞を濃縮して計数する。
【００９９】
次いで、定義済みの数の細胞（２５，０００細胞）を０．７５％の低融点アガロースゲルに含め、その後、予め１％のアガロースでコーティングしたガラススライド上に沈着させる。次いで、スライドを溶解液に４℃で１時間３０分の間浸漬させ、その後、アルカリ溶液に４℃で２０分間浸漬させる。こうして、細胞は溶解してＤＮＡは変性する。スライドを電気泳動溶液に浸した後、電界（２０Ｖ−２５０ｍＡ）を印加する。このようにして、変性したＤＮＡは４℃でアガロースゲルでの泳動を経る。蛍光ＤＮＡ染料（２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム）を適用することにより、顕微鏡でＤＮＡを観察することが可能となる。損傷ＤＮＡ、すなわち、様々なサイズの複数の断片に断片化されたＤＮＡは拡散して泳動し、「彗星」の形で出現する。
【０１００】
定量化ソフトウェアを用いて平均テールモーメントを決定し、それはＤＮＡ損傷が増加するにつれて増加する。
【０１０１】
結果：
線維芽細胞が実施例１のペプチド抽出物で処理され、かつＵＶＢ照射を受けたとき、テールモーメントは１３．９であり、一方で照射及び未処理の条件下では４９である。したがって、算出されたテールモーメントは、照射された対照条件と比較して７１．６％減少した（統計的に高度に有意な減少）。すなわち、図１に示すように、ＵＶＢ照射を受けた細胞のＤＮＡは、対照条件下よりも実質的に少ない損傷を受けた。
【０１０２】
結論：
１％の実施例１のペプチド抽出物は、非常に有意にＵＶＢ照射を受けた正常ヒト線維芽細胞のＤＮＡを保護した。
【実施例８】
【０１０３】
日焼け止めクリーム組成
【０１０４】
【表１】
0006337402.tif 000002
0006337402.tif 000003
0006337402.tif 000004
【図１】
0006337402.tif 000005