(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の細胞においてミトコンドリアの機能を高めるための医薬組成物であって、単離された５’メチルセレノアデノシン、セレノアデノシルホモシステイン、及びロイシル−バリル−セレノメチオニル−アルギニン、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を有効な量で含み、この有効な量が、前記組成物にさらされていない細胞と比較した場合に、細胞におけるミトコンドリアの機能を高める、医薬組成物。
【請求項２】
セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、及びメチルセレノシステイン、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される単離された化合物を更に含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
１日あたり被検体に２５〜８００μｇのセレンを与えるような１日投薬量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
１日あたり被検体に２００〜５００μｇのセレンを与えるような１日投薬量である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物は経口投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物が担体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記組成物は、粉末、錠剤、丸薬、ゲル、シロップ、液体、小袋、糖衣錠、又は懸濁物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０１４年３月１４日に出願されており、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７８８，１３３号に対する優先権を主張し、この開示は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本出願は、セレン（例えば、セレンを豊富に含む酵母およびセレン含有化合物）を含む組成物、およびこれらを用い、ミトコンドリア機能不全を処置する方法に関する。特に、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）、これらの中に存在するセレン含有化合物および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物、およびこれらを使用し、ミトコンドリアの不調に関連する疾患および状態を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミトコンドリアとして知られる細胞小器官は、高等生物の細胞の主なエネルギー源である。ミトコンドリアは、多数の細胞呼吸、酸化および代謝のプロセスに直接的および間接的に生化学的制御を与える。これらには、電子伝達鎖（ＥＴＣ）活性が含まれ、酸化的リン酸化を引き起こし、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で代謝エネルギーを生成し、細胞内のカルシウムホメオスタシスにおいて、中心的なミトコンドリアの役割もその基礎となっている。
【０００４】
ミトコンドリアの呼吸は、内側のミトコンドリア膜で起こり、電子伝達系による電子の流れによって達成され、４種類の複合体（複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）と、ＡＴＰ合成のための部位（ＡＴＰシンターゼ）として機能するさらなる複合体（複合体Ｖ）とを含む。任意の複合体の活性の障害または低下は、電子の流れを破壊し、ミトコンドリアの呼吸機能不全を引き起こす場合がある（例えば、Ｓｃｈｉｌｄｇｅｎら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１／３９．６６６−６７５１０，１１；Ａｒｔｈｕｒら、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  ２００９；４：３７）。ミトコンドリアの代謝機能不全の分析は、酸素電極分析によってモニタリングされてもよい（例えば、Ｃｈａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５５；２１７：３８３−３９３を参照）。分析によって、ミトコンドリアの呼吸機能の詳細な理解が可能になる。ミトコンドリアの呼吸の不調（例えば、細胞死、活性酸素種の生成、酸化によるＤＮＡ損傷の増加、自食作用の増加、ミトコンドリアの膜電位の消失（例えば、異常な複合体Ｉの発現および／または活性を経る）および関連するＡＴＰ産生の減少を引き起こす）と、多くの疾患および状態（例えば、糖尿病、肥満、アルツハイマー病を含む加齢性神経変性、卒中、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化など）との関係が、広範囲にわたって示されている（例えば、Ｍｉｑｕｅｌら、Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  １９８０；１５：５７５−５９１；ＭｃＬｅａｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２００４；５６：１６３−１８４；Ｋｕｊｏｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；３０９：４８１−４８４；Ｇｕａｒｅｎｔｅ、Ｃｅｌｌ  ２００８；１３２：１７１−１７６；Ｌｏｐｅｚ−Ｌｌｕｃｈら、Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ２００８；４３：８１３−８１９；Ｓｈｉｇｅｎａｇａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９４；９１：１０７７１−１０７７８；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００４；１６５９：１１５−１２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１／３９．６６６−６７５１０，１１
【非特許文献２】Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  ２００９；４：３７
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５５；２１７：３８３−３９３
【非特許文献４】Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  １９８０；１５：５７５−５９１
【非特許文献５】Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２００４；５６：１６３−１８４
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；３０９：４８１−４８４
【非特許文献７】Ｃｅｌｌ  ２００８；１３２：１７１−１７６
【非特許文献８】Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ２００８；４３：８１３−８１９
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４；９１：１０７７１−１０７７８
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００４；１６５９：１１５−１２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、セレン（例えば、セレンを豊富に含む酵母、およびこの酵母から得られるか、またはこの酵母から誘導されるセレン含有化合物）を含む組成物、およびこれらを用い、ミトコンドリア機能不全を処置する方法に関する。特に、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）を含む組成物、これらの中に存在するセレン含有化合物および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物、およびこれらを使用し、ミトコンドリアの不調に関連する疾患および状態を処置する方法に関する。
【０００８】
従って、ある実施形態では、本出願は、単離されたセレン含有化合物を含む組成物であって、セレン含有化合物が、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイン、Ｎ−アセチルセレノシステイン−セレノホモシステイン、メチルチオセレノグルタチオン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイニルグリシン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン−システイニルグリシン、セレノメチル−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−システイン、グルタチオン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、ジ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−２，３  ＤＨＰ  セレノホモシステイン、グルタチオン−Ｎ−アセチルセレノホモシステイン、グルタチオン−セレノシステイニルグリシン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、セレノグルタチオン−チオ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−グルタチオン、セレノジグルタチオン、ジ−セレノグルタチオン、チオ−ジセレノグルタチオン、メチルデヒドロホモシステイン、セレノメチオニン、セレノホモランチオニン、Ｎ−アセチルセレノシスタチオニン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノランチオニン、エチルセレノアデノシン、Ｎ−プロピオニルセレノシスタチオニン、２，３−ＤＨＰ−セレノシスタチオニン、メチルセレノグルタチオン、γ−グルタモイルセレノシスタチオンおよびセレノグルタチオンから選択される、組成物を提供する。
【０００９】
本出願のある実施形態では、セレン含有化合物としては、限定されないが、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェネ−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシドおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１０】
ある実施形態では、組成物は、メチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェネ−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む。具体的な実施形態では、組成物は、メチルセレノアデノシン化合物を含む。ある実施形態では、１つ以上の化合物は、単離および／または精製される。ある実施形態では、組成物は、細胞におけるミトコンドリアの機能を高めるか、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるのに有用である。
【００１１】
本出願のある実施形態では、セレン含有化合物は、セレンを含有するペプチドを含む。セレンペプチドを含む化合物の例としては、限定されないが、ＭＶＡＥＡＥＫ、ＤＹＭＧＡＡＫ、ＹＭＧＡＡＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＮＱＡＡＭＮＰＳＮＴＶＦＤＡＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＭＶＳＥＡＥＫ、ＰＥＶＱＧＤＭＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＡＭＳＳＲ、ＶＱＧＳＶＩＧＩＤＬＧＴＴＮＳＡＶＡＩＭＥＧＫ、ＡＡＡＥＧＰＭＫ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＰＦＶＳＮＤＹＡＡＹＭＶＫ、ＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫ、ＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫ、ＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＶＥＴＧＶＩＫＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＡＡＡＴＡＡＭＴＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＷＭＧＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＡＭＰＱＫ、ＡＡＭＡＫ、ＨＶＧＤＭＥＩＲ、ＶＩＥＥＰＩＴＳＥＴＡＭＫ、ＶＬＱＡＬＥＥＩＧＩＶＥＩＳＰＫ、ＬＰＡＡＳＬＧＤＭＶＭＡＴＶＫ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＭＬＭＰＫ、ＴＭＧＡＫ、ＭＮＡＧＲ、ＴＹＥＮＭＫ、ＭＧＨＤＱＳＧＴＫ、ＧＥＡＩＭＡＰＫ、Ａｃ−ＭＮＶＦＧＫ、ＡＭＥＶＶＡＳＥＲ、ＩＶＭＲ、ＭＡ（Ｉ／Ｌ）Ｒ、ＡＭＸＡＫ、ＤＬＥＴＬＴＭＨＴＫ、ＬＶＭＲ、ＶＭＲ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＳＲＰＮＶＥＶＶＡＬＮＤＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫおよびＶＩＮＤ  ＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫが挙げられ、それぞれのペプチドフラグメントがセレン分子を含有し、およびミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態の処置または予防のための医薬の製造におけるこれらの使用。
【００１２】
本出願は、セレンを含む有効な量の組成物（例えば、本明細書に記載される）を被検体に投与することを含む、被検体においてミトコンドリア活性を高めるための方法も提供する。ある実施形態では、ミトコンドリア活性を高めることは、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を増加することを含む。ある実施形態では、ミトコンドリア活性を高めることは、ミトコンドリアの代謝を高めることを含む。ある実施形態では、ミトコンドリア活性を高めると、被検体（例えば、被検体の骨格筋、肝臓、皮質または卵巣の組織）において活性酸素種の産生が減る。ある実施形態では、ミトコンドリア活性を高めると、被検体（例えば、被検体の骨格筋および／または肝臓組織）において糖代謝が向上する。ある実施形態では、ミトコンドリア活性の増加は、ミトコンドリアの複合体Ｉの活性の増加を含む。ある実施形態では、ミトコンドリアの機能の増加は、被検体の骨格筋に存在するミトコンドリア中で起こる。ある実施形態では、ミトコンドリアの機能の増加は、被検体の肝臓に存在するミトコンドリア中で起こる。
【００１３】
ある実施形態では、セレンを含む組成物は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、セレノエーテル、ジペプチドおよび／またはトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールおよびセレンオキシドから選択される。ある実施形態では、セレンを含有する要素は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母から得られるか、またはこれらから誘導される。ある実施形態では、セレンを含有する要素は、ＳｅＣｙｓペプチドまたはＳｅＭｅｔペプチド、セレンを含有するアデノシル分子およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。具体的な実施形態では、セレン含有化合物は、メチルセレノアデノシンまたはロイシン−バリン−セレノメチオニン−アルギニンである。
【００１４】
ある実施形態では、細胞におけるミトコンドリアの機能を高める方法は、単離された５’  メチルセレノアデノシン、ＬＶＳｅ−ＭＲまたはこれらの組み合わせを含む有効量の組成物を投与することを含み、この有効な量は、組成物にさらされていない細胞と比較した場合に、細胞におけるミトコンドリアの機能を高める。
【００１５】
他の実施形態では、細胞においてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を増加させる方法は、５’メチルセレノアデノシンを含む有効な量の組成物を投与することを含み、この有効な量は、組成物にさらされていない細胞と比較した場合に、細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を高める。
【００１６】
ある実施形態では、被検体は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態を有するか、またはこれらのリスクを有する。本出願は、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態の種類よって制限されない。実際に、本出願の組成物および方法は、種々の疾患および状態（例えば、本明細書に開示されるもの）のための用途を見出す。ある実施形態では、被検体は、心筋症を有する。ある実施形態では、被検体は、サルコペニアを有する。ある実施形態では、被検体は、筋肉タンパク質が消失している。
【００１７】
本出願は、さらに、糖代謝を高めることが必要な被検体に、セレンを含む有効な量の組成物（例えば、本明細書に記載される）を投与することを含み、その投与によって、被検体においてミトコンドリア活性が増加する、被検体における糖代謝を高める方法を提供する。ある実施形態では、糖代謝の向上は、被検体の骨格筋で起こる。ある実施形態では、糖代謝の向上は、肝臓で起こる。
【００１８】
本出願は、セレンを含む治療に有効な量の組成物（例えば、本明細書に記載されるような）を被検体に投与することを含む、変更されたミトコンドリアの機能に関連する疾患または状態を有する被検体を処置する方法を提供し、この投与によって、被検体におけるミトコンドリア活性が増加し、被検体のこの疾患または状態を処置する。
【００１９】
本出願は、投与されるセレンを含む組成物によって制限されない。ある実施形態では、セレンを含む組成物は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む。ある実施形態では、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）から調製されるセレンを含有するフラクションの使用および投与を提供する。例えば、ある実施形態では、セレンを含む組成物は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクションを含む。他の実施形態では、セレンを含む組成物は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクションを含む。ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、セレンを豊富に含む酵母の抽出物（例えば、酸性条件で可溶性（例えば、第１のｐＨ（例えば、ｐＨ１．８５）で抽出および／または沈殿する可溶性セレン含有化合物のフラクション（例えば、可溶性セレノ糖タンパク質）、第２のｐＨ（例えば、ｐＨ３．０）で沈殿する第２のフラクション、第３のｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で沈殿する第３のフラクションおよび第４のｐH（例えば、ｐＨ６．０）で沈殿する第４のフラクション）を含む、単一の液体相を含む。
【００２０】
ある実施形態では、本出願は、セレン含有化合物（例えば、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）から得られるもの、またはこれらから誘導されるもの）またはこれらの誘導体の使用および投与を提供する。本出願は、利用される１つ以上のセレン含有化合物によって制限されない。ある実施形態では、１つ以上のセレン含有化合物は、セレノエーテル、ジペプチドおよび／またはトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールまたはセレンオキシド（またはこれらの誘導体）、本明細書に記載されるセレンを含有するタンパク質および／またはセレンを含有するペプチドである。
【００２１】
例えば、ある実施形態では、（例えば、本出願の方法で）被検体に投与される、セレンを含有する組成物を含む要素は、以下の１つ以上のものを含む。２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイン、Ｎ−アセチルセレノシステイン−セレノホモシステイン、メチルチオセレノグルタチオン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイニルグリシン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン−システイニルグリシン、セレノメチル−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−システイン、グルタチオン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、ジ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−２，３  ＤＨＰ  セレノホモシステイン、グルタチオン−Ｎ−アセチルセレノホモシステイン、グルタチオン−セレノシステイニルグリシン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、セレノグルタチオン−チオ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−グルタチオン、セレノジグルタチオン、ジ−セレノグルタチオン、チオ−ジセレノグルタチオン、メチルデヒドロホモシステイン、セレノメチオニン、セレノホモランチオニン、Ｎ−アセチルセレノシスタチオニン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノランチオニン、Ｎ−プロピオニルセレノシスタチオニン、２，３−ＤＨＰ−セレノシスタチオニン、メチルセレノグルタチオン、γ−グルタモイルセレノシスタチオン、またはセレノグルタチオン。
【００２２】
ある実施形態では、セレン含有化合物は、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、エチルセレノアデノシン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−  デスオキシ−アデノシン）、またはセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシドのうち、１つ以上を含む。
【００２３】
ある実施形態では、（例えば、本出願の方法で）被検体に投与される、セレンを含む組成物は、１つ以上のタンパク質またはペプチドフラグメントを含み、タンパク質またはペプチドの１つ以上のアミノ酸残基中に存在する１個以上の硫黄分子は、セレン分子で置換される。本出願は、特定のセレンを含有するタンパク質またはペプチドに限定されない。ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、１つ以上のペプチドフラグメントを含み、ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基中に存在する１個以上の硫黄分子は、以下のものからのセレン分子で置換される。ＭＶＡＥＡＥＫ、ＤＹＭＧＡＡＫ、ＹＭＧＡＡＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＮＱＡＡＭＮＰＳＮＴＶＦＤＡＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＭＶＳＥＡＥＫ、ＰＥＶＱＧＤＭＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＡＭＳＳＲ、ＶＱＧＳＶＩＧＩＤＬＧＴＴＮＳＡＶＡＩＭＥＧＫ、ＡＡＡＥＧＰＭＫ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＰＦＶＳＮＤＹＡＡＹＭＶＫ、ＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫ、ＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫ、ＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＶＥＴＧＶＩＫＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＡＡＡＴＡＡＭＴＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＷＭＧＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＡＭＰＱＫ、ＡＡＭＡＫ、ＨＶＧＤＭＥＩＲ、ＶＩＥＥＰＩＴＳＥＴＡＭＫ、ＶＬＱＡＬＥＥＩＧＩＶＥＩＳＰＫ、ＬＰＡＡＳＬＧＤＭＶＭＡＴＶＫ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＭＬＭＰＫ、ＴＭＧＡＫ、ＭＮＡＧＲ、ＴＹＥＮＭＫ、ＭＧＨＤＱＳＧＴＫ、ＧＥＡＩＭＡＰＫ、Ａｃ−ＭＮＶＦＧＫ、ＡＭＥＶＶＡＳＥＲ、ＩＶＭＲ、ＭＡ（Ｉ／Ｌ）Ｒ、ＡＭＸＡＫ、ＤＬＥＴＬＴＭＨＴＫ、ＬＶＭＲ、ＶＭＲ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＳＲＰＮＶＥＶＶＡＬＮＤＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫおよびＶＩＮＤＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫ。
【００２４】
ある実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）の別個のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む。ある実施形態では、本出願は、特定の使用のために調整された（例えば、組み合わせたとき、望ましいレベルの生体活性（例えば、刺激活性および／または阻害活性））を示す、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）のセレン含有化合物（例えば、単離されたセレン含有化合物、化学合成されたセレン含有化合物、または組み換えセレン含有化合物）の組み合わせを含む組成物を提供する。
【００２５】
例えば、ある実施形態では、筋肉組織におけるミトコンドリア活性（例えば、ＡＴＰの産生および／または呼吸）を高めるために、２以上のセレン含有化合物の組み合わせを含む第１の組成物が利用され、一方、２以上の異なるセレン含有化合物の組み合わせを含む第２の組成物（例えば、第１の組成物とは異なる生体活性を示す）は、肝臓組織におけるミトコンドリア活性を変えるために利用される。ある実施形態では、２以上のセレン含有化合物を含む組成物は、個人の特殊な遺伝子プロフィールに合わせて（例えば、特定の遺伝子またはタンパク質を標的とするために）カスタマイズされる。
【００２６】
酵母抽出物またはフラクションは、個人における特定の疾患または状態の処置に使用するために、同様の様式でカスタマイズすることができる。このような様式で、処置を必要とする個々の被検体に合わせたカスタム配合が開発される。ある実施形態では、本出願のセレンを含む組成物を投与される被検体は、ミトコンドリア機能不全に関連する状態または疾患を有するか、またはそのリスクがある。本出願は、ミトコンドリア機能不全のリスクがある被検体またはミトコンドリア機能不全を有する被検体の種類によって制限されない。実際に、当該技術分野では、限定されないが、遺伝子的にミトコンドリア機能不全になりやすい被検体を含む種々の被検体が、ミトコンドリア機能不全のリスクがあるか、またはミトコンドリア機能不全を有することがよく知られている。
【００２７】
ある実施形態では、被検体は、限定されないが、心筋症、サルコペニア、または筋肉タンパク質の消失を含む状態または疾患を有する。
【００２８】
一実施形態では、筋肉細胞のタンパク質含有量を増やす方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を筋肉細胞に投与することを含み、この有効な量が、筋肉細胞のタンパク質を増やす。他の実施形態では、サルコペニアを処置する方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を被検体に投与することを含み、この有効な量が、サルコペニアの症状を改善する。
【００２９】
ある実施形態では、心筋症を処置する方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を被検体に投与することを含み、この有効な量が、心筋症の症状を改善する。
【００３０】
別の態様では、本出願は、心筋の筋肉細胞、骨格筋の筋肉細胞および／または肝細胞において遺伝子発現を調整する（例えば、増加させるか、または低下させる）ための方法を提供する。
【００３１】
他の実施形態では、心筋の筋肉細胞において転写活性を調整する方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を心筋の筋肉細胞に投与することを含み、この有効な量が、心筋の筋肉細胞におけるＮＦＡＴｃ２／ｃ３および／またはＦｏｘｏ３の転写活性を調整するのに有効である。さらなる実施形態では、ＮＦＡＴｃ２／ｃ３の転写活性は、組成物にさらされていない筋肉細胞と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞において減少する。他の実施形態では、ＮＦＡＴｃ２／ｃ３のリン酸化は、組成物にさらされていない筋肉細胞と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞において増加する。ある実施形態では、Ｆｏｘｏ３転写活性は、組成物にさらされていない筋肉細胞と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞において増加する。
【００３２】
ある実施形態では、心筋の筋肉細胞における遺伝子発現を減少させる方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を心筋の筋肉細胞に投与することを含み、この有効な量が、Ｍｙｈ７、Ａｎｋｒｄ１、Ｌｃｎ２、ｐＳ６Ｋ１およびこれらの組み合わせの発現を減少させる。別の実施形態では、心筋の筋肉細胞において遺伝子発現を増加させる方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を心筋に投与することを含み、この有効な量が、組成物にさらされていない心筋の筋肉細胞と比較した場合に、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞においてＡｔｍ、Ｇａｄｄ４５ｇ、Ｇｓｋ３ｂ、ＵＣＰ２およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現を増加させる。
【００３３】
他の実施形態では、骨格筋の筋肉細胞において１つ以上の遺伝子の発現を減少させる方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を骨格筋の筋肉細胞に投与することを含み、この有効な量が、組成物にさらされていない心筋の筋肉細胞と比較した場合に、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞において、ミオスタチン、Ａｖｃｒ２ｂ、ｍＴＯＲ、Ｓ６Ｋ１、Ｇｓｋ３ｂ、Ｆｘｂｏ３２、Ｔｒｉｍ  ６３およびＮｒ２ｆ２の１つ以上またはすべての発現を減少させる。ある実施形態では、骨格筋の筋肉細胞において１つ以上の遺伝子の発現を増加させる方法は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物を骨格筋の筋肉細胞に投与することを含み、この有効な量が、組成物にさらされていない心筋の筋肉細胞と比較した場合に、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母と接触した心筋の筋肉細胞において、Ｐｒｋａａ２、Ｍｙｆ６、ＤｅｓおよびＰＧＣｌａの１つ以上またはすべての発現を増加させる。
【００３４】
他の実施形態では、Ｎｒ２Ｆ２からなる群から選択される遺伝子の発現は、セレンが不足する食事を摂取した動物の肝細胞における遺伝子発現と比較した場合に、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む食事を摂取した動物の肝細胞において増加する。
【００３５】
他の実施形態では、細胞においてミトコンドリアの機能を高める方法は、単離された５’メチルセレノアデノシン、ＬＶＳｅ−ＭＲまたはこれらの組み合わせを含む有効な量の組成物を投与することを含み、この有効な量が、組成物にさらされていない細胞と比較した場合に、細胞におけるミトコンドリアの機能を高める。他の実施形態としては、単離された５’メチルセレノアデノシンを含む有効な量の組成物を投与することを含み、この有効な量が、組成物にさらされていない細胞と比較した場合に、細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を高める、細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を増加させる方法が挙げられる。
【００３６】
本出願のさらなる実施形態では、メチルセレノアデノシン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される単離された化合物を含む、組成物が提供される。ある実施形態では、単離された化合物は、メチルセレノアデノシンである。他の実施形態では、この組成物は、細胞においてミトコンドリアの機能を高めるときの使用のためのものである。
【００３７】
ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物の量は、毒性を最低限にしつつ、ミトコンドリア機能不全および／またはミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態の進行を遅らせるか、止めるか、または逆行させるのを必要とする被検体において、ミトコンドリア機能不全および／またはミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態の進行を遅らせるか、止めるか、または逆行させるのに有効な量である。ある実施形態では、本出願のセレンを含む組成物（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）またはこの酵母の中に存在するか、またはこの酵母から誘導されるセレン含有化合物））が、１日あたり被検体に２５〜８００μｇのセレンを与えるような１日投薬量で投与される（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸが、それぞれの日に被検体に２５〜８００μｇのセレンを与えるような１日投薬量で投与される）。しかし、本出願は、そのようなものに制限されない。実際に、ある実施形態では、本出願のセレンを含む組成物は、１日あたり２５μｇ未満（例えば、２４、２３、２２、２１、２０またはこれより少ない）、または８００μｇを超える（例えば、８２５、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００またはもっと多い）セレンを被検体に与えるような１日投薬量として投与される。ある実施形態では、セレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））は、１日あたり２００〜５００μｇの１日投薬量で投与される。他の実施形態では、セレンは、１日あたり２００〜４００μｇの１日投薬量で投与される。ある実施形態では、１回分の投薬量のセレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））が、１日に１回投与される。他の実施形態では、２回、３回、４回またはもっと多くの投薬量が、それぞれの日に投与される。ある実施形態では、１日投薬量は、２５〜７５μｇのセレンである。他の実施形態では、１日投薬量は、２００μｇのセレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））である。
【００３８】
本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクション、および２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクションからなる群から選択されるセレンを含む組成物と、医薬的に許容される担体とを含む有効な量の医薬組成物を、ミトコンドリア機能不全を処置することが必要な被検体に投与することを含む、ミトコンドリア機能不全を処置する方法も提供する。
【００３９】
本出願は、有効な量の２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態を処置することが必要な被検体に投与する工程を含む、被検体においてミトコンドリア機能不全に関連する疾患または状態を処置する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、サンプルの完全な可溶化および本出願の一実施形態の個々のフラクションにおけるセレノメチオニンの決定を可能にする逐次抽出手順を示す。
【図２】図２は、アニオン交換ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳによるセレン（Ｓｅ）を豊富に含む酵母中のセレノメチオニンの決定を示す。挿入図は、ＳＥＣ−ＩＣＰ−ＭＳによる消化の終了の確認を示す（高分子量フラクションにＳｅが存在せず、カラムから定量的に回収）。
【図３】図３は、本出願の一実施形態のセレン化された酵母中に存在する水溶性および水不溶性のフラクションを得て、特定するための例示的な方法を示す。
【図４】図４は、セレン代謝物のＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ分析を示す。（ａ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＩＣＰ−ＭＳ；（ｂ）イオン対（ＨＦＢＡ）逆相ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ。
【図５】図５は、水抽出物（７６Ｓｅ−暗灰色の線、７７Ｓｅ−黒色の線、７８Ｓｅ  明灰色の線）のサイズ排除−ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、ＳＵＰＥＲＤＥＸペプチドカラムの後の水抽出物のサイズ排除−ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムを示す（７６Ｓｅ−暗灰色の線、７７Ｓｅ−黒色の線、７８Ｓｅ  明灰色の線）。
【図７】図７は、サンプルのＳＥＣペプチドクロマトグラムを示す。（ａ）水抽出物、（ｂ）分離されたピークＩ、（ｃ）トリプシンで消化されたピークＩ、（ｄ）プロテアーゼで消化された水抽出物；黒色の線−８０Ｓｅ、明灰色の線  ７８Ｓｅ、暗灰色の線−７７Ｓｅ。
【図８】図８は、（Ａ）図７Ａの水抽出物のペプチドクロマトグラム、（Ｂ）図７Ａに示されるＳＥＣカラムから５８分に溶出するピークの逆相（ＲＰ）クロマトグラムを示す。
【図９】図９は、Ｏｒｂｉｔｒａｐで接続した質量分光法および逆相クロマトグラフィーを利用した、図８Ｂに示すＳＥＣカラムから５８分に溶出するセレノ化合物の特定を示す。
【図１０】図１０は、溶出順序で存在するセレンを豊富に含む酵母の水溶性抽出物のサブフラクションの逆相ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムを示す。サブフラクション１〜１０が示される。
【図１１】図１１は、サンプルのサブフラクション８で特定されるセレンを含有するペプチドの質量分光法を示す。
【図１２】図１２は、トリプシン消化された物質のサブフラクションのクロマトグラムを示す。サブフラクション１〜１０が示される。
【図１３】図１３は、セレンを豊富に含む酵母からの水溶性抽出物のサブフラクションのトリプシン消化物中に見出されるセレンを含有するペプチドのリストを示す（ＭＷ−分子量、Ｚ−イオン化状態）。
【図１４】図１４は、（Ａ）全サンプルおよび（Ｂ）分離されたフラクションの逆相ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムのＳＥＬＰＬＥＸ中に存在するセレン含有化合物のカチオン交換ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳプロフィールを示す。
【図１５】図１５は、質量分光計およびＯｒｂｉｔｒａｐを利用し、ＳＥＬＰＬＥＸ中で特定されるセレン含有化合物のリストを示す。
【図１６】図１６は、酸性媒体（上部パネル）および塩基性媒体（底部パネル）で溶出した個々のＳＰＥフラクション中のセレン種の分子量（ＳＥＣ−ＩＣＰ  ＭＳ）プロフィールを示す。
【図１７】図１７は、酵母タンパク質抽出物のトリプシン消化物のＳＥＣフラクション化を示す。
【図１８】図１８は、個々のＳＥＣフラクションのプロフィールを示す。
【図１９】図１９は、サンプル  Ｌ０９−４５３１のブロットおよびＶＩ番およびＶＩＩ番のブロット片のＲＰ  ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムを示す。
【図２０】図２０は、ブロットサンプル抽出物（水不溶性）中に見出されるセレン含有化合物の例示的なＭＳスペクトルを示す。
【図２１】図２１は、ＨＰＬＣ分析、ブロットサンプルのＩＣＰＭＳ分析、ブロットサンプルのＭＳ／ＭＳ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）分析の前に、１Ｄゲル電気泳動、ブロット消化を用い、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性抽出物から特定されたセレンを含有するペプチドのリストを与える。
【図２２】図２２は、１３月齢のＰｏｌＧマウスにおける、Ｍｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１を含む拡張肥大型マーカー遺伝子を有する心臓肥大を示す。（Ａ）１３〜１４月齢のＰｏｌＧマウスからの拡張した心臓の大きさと、心筋細胞。写真は、Ｄａｉら（２０１０）から修正した。（Ｂ）１３月齢のＰｏｌＧ心臓における上昇したＭｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１の発現（黒色の棒グラフ）。発現レベルをＡｃｔｂ  ｍＰｖＮＡによって正規化し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表した。＊Ｐ＜０．０１、２月齢のＰｏｌＧ心臓（淡い色の棒グラフ）と比較したとき。
【図２３】図２３は、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によって、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたマウスからのマウス心筋における肥大型マーカーＭｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１の弱められた発現を示す。Ａ。リアルタイムＰＣＲによるコントロール（ＳＤ）、処置された（ＳＰ）若年および高齢のＰｏｌＧマウスにおけるＭｙｈ７  ｍＲＮＡの心臓での発現（上部パネル）と、ウェスタンブロット分析によるコントロール（ＳＤ）、処置された（ＳＰ）高齢のＰｏｌＧマウスにおけるＭｙｈ７タンパク質の心臓での発現（中央のパネル）。相対的なＭｙｈ７タンパク質の発現（それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂタンパク質によって正規化）を、底部のパネルに示す。Ｂ。コントロール（ＳＤ）、処置された（ＳＰ）若年および高齢のＰｏｌＧマウスにおけるＡｎｋｒｄ１  ｍＲＮＡの心臓での発現（上部のパネル）、コントロール（ＳＤ）、処置された（ＳＰ）高齢のＰｏｌＧマウスにおけるＡｎｋｒｄ１タンパク質の心臓での発現（中央のパネル）。定量的なＭｙｈ７タンパク質の発現（それぞれのサンプルにおいてＡｃｔｂタンパク質によって正規化）を底部パネルに示す。ＡおよびＢの両方について、データを、マウスの示された値の平均±ｓｅｍとして表す。同じ月齢のコントロールに対し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２４】図２４は、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与することによる、マウスの心臓におけるＮｆａｔシグナル伝達の制御を示す。Ａ。心臓肥大におけるＣｎ／Ｎｆａｔシグナル伝達の模式図。Ｎｆａｔ活性は、カルシニューリン、Ｓ６ＫおよびＧｓｋ３ｂを含む経路によって制御される。灰色の文字は、本出願の実施形態の開発中に行われる実験中に、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンによって制御されると特定された心臓内の分子標的を表す。Ｂ。１３月齢で、コントロール（ＳＤ）および処置された（ＳＰ）マウスからの心臓におけるＣｎ−Ａ、ｐＮｆａｔｃ２、Ｇｓｋ３ｂおよびｐＳ６Ｋ１のウェスタンブロット分析。Ｃ。ウェスタンブロットにおけるｐＮｆａｔｃ２、Ｇｓｋ３ｂおよびｐＳ６Ｋ１タンパク質レベルの定量分析（Ａｃｔｂまたはチューブリンによって正規化）。Ｃにおいて、データを、群あたり４匹のマウスの平均±ｓｅｍとして表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２５】図２５は、３７４日間、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを含む食事を投与されたＰｏｌＧマウスにおける抗−肥大遺伝子Ｆｏｘｏ３の心臓での発現の増加を示す。（Ａ）ｐｏｌＧ心臓において優勢なＦｏｘｏ３発現を示すＦｏｘｏファミリーメンバー遺伝子のＱＲＴ−ＰＣＲ、およびコントロール（ＳＤ）ＰｏｌＧマウスと比較して、処置された（ＳＰ）ＰｏｌＧマウスにおける心臓でのＦｏｘｏ３発現の増加。（Ｂ〜Ｃ）。セレン（ＳＰ）３７４日間処置後のｐｏｌＧマウスの心臓におけるＦｏｘｏ３タンパク質レベルの増加。ＡおよびＣにおいて、データを、マウスの示された値の平均±ｓｅｍとして表す。同じ月齢のコントロールに対し、ＳＤコントロールに対し、＊Ｐ＜０．０５。
【図２６】図２６は、ＰｏｌＧマウスにおけるｍＲＮＡレベルでのＡｔｍおよびＧａｄｄ４５ｇの発現の制御を示す。Ａ。ＰｏｌＧマウスにおける心臓Ａｔｍ発現の年齢に依存する減少と、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与によってこの減少がなくなることを示すＱＲＴ−ＰＣＲ。Ｂ。３７４日間、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレン投与による処置の後に、ＰｏｌＧマウスにおけるＧａｄｄ４５ｇ  ｍＲＮＡ発現の増加。データを、群あたり示された数のマウスの平均±ｓｅｍとして表す。棒グラフ中の異なる文字は、ＡＮＯＶＡ分析の後にＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定されるような、有意な差を表す。
【図２７】図２７は、ＱＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｌＧの心臓において、セレン処置によるＵｃｐｌ−３  ｍＲＮＡ発現の制御を示す。データを、群あたり示された数のマウスの平均±ｓｅｍとして表す。コントロールにおけるＵｃｐ２の発現と比較したとき、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２８】図２８は、ＰｏｌＧマウスにおける心臓でのＬｃｎ２発現の年齢依存性の増加と、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与することによる、年齢依存性の発現の増加の阻害を示すＱＲＴ−ＰＣＲを示す。データを、群あたり６匹のマウスの平均±ｓｅｍとして表す。棒グラフ中の異なる文字は、ＡＮＯＶＡ分析の後にＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定されるような、有意な差を表す。
【図２９】図２９は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ、ＳＥＬＰＬＥＸ）、またはセレンを追加していない食事（ＳＤ）を３ヶ月間供給された正常マウスからの骨格筋における全タンパク質レベルの上昇を示す。データを、群あたり示された数のマウスの平均±ｓｅｍとして表す。Ｐ＜０．０１。
【図３０】図３０は、セレノメチオニンの形態のセレンが追加されたコントロール食（ＳＭ）、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレンを追加したコントロール食（ＳＳ）、またはセレンを追加していない食事と比較した、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ）を３ヶ月間供給された正常なマウスの骨格筋におけるタンパク質合成のためのタンパク質の伸長に関与する遺伝子の発現の増加の存在を示す、マイクロアレイ分析から得たデータを示す。データを平均±ｓｄとして示す（ｎ＝６）。
【図３１】図３１は、セレノメチオニンの形態のセレンが追加されたコントロール食（ＳＭ）、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレンを追加したコントロール食（ＳＳ）、またはセレンを追加していない食事と比較した、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ）を３ヶ月間供給された正常なマウスの骨格筋におけるタンパク質合成に関与する分子（Ｇｓｋ３ｂ、ｍＴｏｒ、Ｓ６Ｋ１）の発現の減少の存在と、タンパク質合成（Ｐｒｋａａ２）のための鍵となるシグナル伝達分子の発現の増加の存在を示す、マイクロアレイ分析から得たデータを示す。データを平均±ｓｄとして示す（ｎ＝６）。
【図３２】図３２は、セレノメチオニンの形態のセレンが追加されたコントロール食（ＳＭ）、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレンを追加したコントロール食（ＳＳ）、またはセレンを追加していない食事と比較した、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ）を３ヶ月間供給された正常なマウスの骨格筋における萎縮遺伝子Ｔｒｉｍ６３およびＦｂｘｏ３２の発現の有意な減少を示す。データを平均±ｓｄとして示す（ｎ＝６）。
【図３３】図３３は、セレノメチオニンの形態のセレンが追加されたコントロール食（ＳＭ）、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレンを追加したコントロール食（ＳＳ）、またはセレンを追加していない食事と比較した、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ）を３ヶ月間供給された正常なマウスの骨格筋におけるＡｃｖｒ２ｂの発現の有意な減少を示す。データを平均±ｓｄとして示す（ｎ＝６）。
【図３４】図３４は、セレノメチオニンの形態のセレンが追加されたコントロール食（ＳＭ）、亜セレン酸ナトリウムの形態のセレンを追加したコントロール食（ＳＳ）、またはセレンを追加していない食事と比較した、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンを追加した食事（ＳＰ）を３ヶ月間供給された正常なマウスの骨格筋における分化した筋肉衛星（幹）の発現の上昇を示す。データを平均±ｓｄとして示す（ｎ＝６）。
【図３５】図３５は、本出願の実施形態の開発中に行われる実験中に開発された２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンを投与した被検体における全骨格筋のタンパク質質量の増加をもたらす、このセレンによって制御される経路のいくつかの非限定的な例を示す。
【図３６】図３６は、コントロール（実施例１、セレンの追加なし、実施例２、セレノメチオニンを追加）と比較して、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレン（実施例４）を投与したマウスの骨格筋におけるＭＡＰ２Ｋ２の発現の減少を示す。亜セレン酸ナトリウム（実施例３）は、マウスの骨格筋においてＭＡＰ２Ｋ２の発現も減少させた。
【図３７】図３７は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与された被検体が、皮質組織および腓腹組織におけるＦＴＯ遺伝子発現のレベルの顕著な減少を示したことを示す。実施例１は、コントロール（ＳＤ）マウスにおけるＦＴＯ発現を示し、実施例２は、セレノメチオニンを供給されたマウスにおけるＦＴＯ発現を示し、実施例３は、亜セレン酸ナトリウムを供給されたマウスにおけるＦＴＯ発現を示し、実施例４は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を供給されたマウスにおけるＦＴＯ発現を示す（ＳＥＬＰＬＥＸ）。
【図３８】図３８は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレン（ＳＰ）の投与によって、コントロール被検体（ＳＤ）と比較して、骨格筋におけるＰＧＣ１−αの発現の有意な増加およびＮｒ２Ｆ２の発現の有意な減少を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図３９】図３９は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレン（ＳＰ）の投与によって、コントロール被検体（ＳＤ）と比較して、肝臓におけるＰＧＣ１−αの発現の有意な減少およびＮｒ２Ｆ２の発現の有意な増加を示す。＊ｐ＜０．０５。
【図４０】図４０は、（Ａ）コントロール（Ｃ）、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）およびメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）存在下、３つの異なる呼吸状態（ＡＴＰ合成（ＩＩＩ状態）、複合体Ｉ依存性（ＮＡＤＨによる）最大呼吸能（状態Ｖｆｃｃｐ）および複合体ＩＩ（ＦＡＤＨによる）依存性最大呼吸能（Ｖｓｕｃｃ状態）で測定されたミトコンドリアの酸素消費速度（ＯＣＲ）パラメータを示す。（Ｂ）は、セレンを含有するペプチドＬＶＳｅ−ＭＲが、コントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（７．７％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（１３．３％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（９．６％）ことを示す。メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）は、ｏｘｙｔｈｅｒｍを用いたコントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（２９．９％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（１７．３％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（１５．３％）。
【図４１】図４１は、０、５０、５００および１０００パーツパービリオン（ＰＰＢ）のメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）存在下、ミトコンドリアの酵素活性（ＰＤＨＣ活性、複合体Ｉ活性および複合体ＩＶ活性）を示す。
【００４１】
（定義）
本明細書で使用される場合、用語「酵母」および「酵母細胞」は、細胞壁、細胞膜および細胞内要素を含む、菌界に分類される真核性微生物を指す。酵母は、特定の分類学上または系統学上の分類を生成しない。現在、約１，５００種が知られており、全酵母種の１％のみが記述されていると概算される。「酵母」という用語は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの同義語であることが多いが、酵母の系統学的多様性は、ＡｓｃｏｍｙｃｏｔａおよびＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａの両部門に位置することが示される。出芽酵母（「真の酵母」）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に分類される。ほとんどの酵母種は、出芽によって無性生殖的に繁殖するが、二体核分裂によって繁殖するものもある。酵母は、単細胞であるが、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続した出芽細胞の糸の生成によって多細胞となる種もある。酵母の大きさは、種に依存して大きく変動してもよく、典型的には、直径が３〜４μｍと測定されるが、ある種の酵母は、４０μｍを超える場合もある。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、すべて、共有結合性の「ペプチド結合」によって接続するアミノ酸の一次配列を指す。一般的に、ペプチドは、いくつかのアミノ酸、典型的には、２〜５０アミノ酸からなり、タンパク質より短い。「ポリペプチド」という用語は、ペプチドとタンパク質を包含する。ある実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、合成されたものであるが、他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組み換えられているか、または天然に存在する。合成ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的な手段によって作られる（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでは作られなかった）ペプチドである。
【００４３】
「サンプル」および「標本」という用語は、もっとも広い意味で用いられ、任意の供給源から得られるサンプルまたは標本を包含する。本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、動物（ヒトを含む）から得られる生体サンプルを指すために用いられ、流体、固体、組織および気体を包含する。本出願のある実施形態では、生体サンプルとしては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、漿液、尿、唾液、血液および血液産物（例えば、血漿、血清など）が挙げられる。しかし、これらの例は、本出願を用いる用途を見いだしているサンプルの種類を限定するものと解釈すべきではない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「セレンを豊富に含む酵母」および「セレン化された酵母」は、無機セレン塩を含有する培地で培養される任意の酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を指す。本出願は、使用されるセレン塩によって制限されない。実際に、種々のセレン塩が、本出願で有用であることが想定され、限定されないが、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルトまたはセレン酸コバルトが挙げられる。遊離セレノメチオニン（例えば、細胞または酵母と会合していない）を、セレンを豊富に含む酵母のためのセレン源として使用することもできる。酵母がこの形態のセレンを組み込むからである。培養中、セレンと硫黄の化学的類似性のために、酵母は、通常は細胞内の硫黄を含有する有機化合物に硫黄の代わりにセレンを組み込む。このような酵母調製物中のセレン含有化合物は、セレノメチオニンであり、ポリペプチド／タンパク質に組み込まれる形態で存在するだろう。このような調製物の中にセレノメチオニンの形態で存在する全細胞セレンの量は、さまざまであるが、１０〜１００％、２０〜６０％、５０〜７５％、６０〜７５％であってもよい。セレン化された酵母調製物中の残りの有機セレンは、主に、セレノメチオニン生合成のための経路の中間体で構成される。これらとしては、限定されないが、セレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノホモシステインおよびセレノ−アデノシルセレノメチオニンが挙げられる。最終的な産物中の残りの無機セレン塩の量は、一般的に、非常に少ない（例えば、２％未満）。しかし、この割合よりももっと多い（例えば、２％〜７０％）、またはもっと少ない（例えば、０．１〜２％）量を含む調製物も本出願によって想定されるため、本出願は、この割合に限定されない。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＳＥＬＰＬＥＸ」という用語は、酵母の成長速度にセレン塩が与える有害な影響を最低限にし、有機セレンを細胞有機材料に最適に組み込むことができる様式で、甘蔗廃糖蜜およびセレン塩の量を増やしつつ得られる流加培養で培養された、乾燥した成育不能なセレンを豊富に含む酵母（例えば、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３０６０のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、パリ、フランス）を指す。残留する無機セレンは、取り除かれ（例えば、精密な洗浄プロセスを用いる）、全セレン含有量の２％を超えない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「有機セレン」は、セレンで硫黄を置き換えた任意の有機化合物を指す。従って、有機セレンは、酵母によって生合成される任意のこのような化合物を指してもよく、または化学合成された遊離有機セレノ化合物を指してもよい。後者の例は、遊離セレノメチオニンである。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「無機セレン」は、一般的に、任意のセレン塩（例えば、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルトおよびセレン酸コバルト）を指す。他の種々の無機セレン源も存在する（例えば、Ｍｅｒｃｋインデックスに列挙されるもの）。セレン化された酵母は、限定されないが、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸コバルト、セレン酸コバルト、セレン酸、亜セレン酸、臭化セレン、塩化セレン、六フッ化セレン、酸化セレン、セレンオキシブロミド（ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｏｘｙｂｒｏｍｉｄｅ）、セレンオキシクロリド、セレンオキシフルオリド、硫化セレン、セレンテトラブロミド、セレンテトラクロリドおよびセレンテトラフルオリドを含む無機セレン源を用いて作られてもよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「セレン化合物」、「セレン含有化合物」および「セレンを含有する要素」という用語は、生体利用可能なセレン源を与えることができるセレンを含有する任意の化合物を指す。セレン化合物は、例えば、亜セレン酸およびセレン酸を含有する鉱物、および有機化合物、例えば、セレノエーテル、ジペプチドおよびトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノール、セレンオキシド、セレンを含有するタンパク質およびペプチド、セレンを含有する（例えば、硫黄原子が置き換わった）アミノ酸（例えば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパルテート、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタメート、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、ヒスチジン）、または二価または四価のセレン化合物、セレンを豊富に含む酵母またはそのフラクション、および本明細書に記載されるセレン含有化合物のような無機化合物を含んでいてもよい。セレン化合物は、酵母または植物抽出物に由来するものであってもよく、または商業的な合成から得られるものであってもよい。特定の実施形態では、セレン化合物は、血漿または細胞内の流体内で体内に簡単に吸収される生体利用可能なセレン源を与える。好ましい実施形態では、セレン含有化合物は、セレンを豊富に含む酵母、またはこの酵母中に存在するか、またはこの酵母から誘導されるセレンを含有する分子である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「酸化ストレス」という用語は、例えば、分子状酸素を利用する代謝プロセスの副生成物として生成する酸素ラジカル（例えば、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）、ヒドロキシラジカル（ＯＨ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））の細胞毒性効果を指す（例えば、Ｃｏｙｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：６８９−６９５（１９９３））。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「宿主」、「被検体」および「患者」という用語は、限定されないが、試験され、分析され、調べられ、診断され、または処置される、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、鳥類、魚、甲殻類など）を含む任意の動物を指す。本明細書で使用される場合、「宿主」、「被検体」および「患者」という用語は、特に示されていない限り、相互に置き換え可能に用いられる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生きた有機体の中で行われ、生物学的有機体の中で起こる試験および／または実験を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生きた有機体の外側の人工的な環境、および通常は有機体の中で起こるが、人工的な環境で起こるように作られた生物学的プロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、限定されないが、試験管および細胞培養を含んでいてもよい。
【００５３】
「ウェスタンブロット」、「ウェスタンイムノブロット」、「イムノブロット」および「ウェスタン」という用語は、膜支持体に固定されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの免疫学的分析を指す。タンパク質を、まず、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分割し、タンパク質を分離し、その後、このゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）にタンパク質を移す。次いで、固定されたタンパク質を、目的の抗原に対して反応性を有する抗体にさらす。抗体（すなわち、一次抗体）の結合は、一次抗体に特異的に結合する二次抗体の使用によって検出される。二次抗体は、典型的には、着色した反応生成物の生成によって抗原−抗体複合体の視覚化を可能にする酵素に接合するか、または発光酵素反応を触媒する（例えば、ＥＣＬ試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着測定法（またはＥＩＡ）を指す。多くのＥＬＩＳＡの方法および用途は、当該技術分野で公知であり、多くの参考文献に記載される（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｒａｐｌｅｙら（編集）、ｐｐ．５９５−６１７、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編集）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．１１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照）。それに加え、多くの市販のＥＬＩＳＡ試験システムが存在する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「リポーター試薬」、「リポーター分子」、「検出基質」および「検出試薬」は、抗原に結合した抗体の検出および／または定量化を可能にする試薬を参照して用いられる。例えば、ある実施形態では、リポーター試薬は、抗体に接合した酵素のための比色基質である。抗体−酵素接合体へ適切な基質を付加すると、比色シグナルまたは蛍光シグナルが生成する（例えば、目的の抗原に対して接合した抗体の結合の後）。他のリポーター試薬としては、限定されないが、放射性化合物が挙げられる。この定義は、検出システムの一部としてビオチンおよびアビジン系化合物（例えば、限定されないが、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジン）の使用を包含する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、ある反応（例えば、抗原に対する抗体の結合）が起こったことを示す任意の検出可能なプロセスを参照して一般的に使用される。放射性、蛍光分析または比色分析のための生成物／試薬の形態でのシグナルは、すべて本出願を用いた用途が発見されることが想定される。本出願の種々の実施形態では、シグナルは、定性的に評価され、一方、代替的な実施形態では、シグナルは、定量的に評価される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、試薬（例えば、抗体、抗原および他の試験要素）が接続する任意の固体または静止した材料を参照して用いられる。例えば、ＥＬＩＳＡ方法において、マイクロタイタープレートのウェルが固体支持体を与える。固体支持体の他の例としては、顕微鏡スライド、カバースリップ、ビーズ、粒子、細胞培養フラスコ、および多くの他の適切な物品が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「被検体における組織を特性決定する」という用語は、組織サンプルの１つ以上の特性の特定を指す。ある実施形態では、組織は、本明細書に詳細に記載される種々の遺伝子の発現の特定、またはその欠失によって特徴づけられる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を特異的に検出することができる試薬」という用語は、本明細書に詳細に記載される種々の遺伝子の発現を検出することができる試薬、または検出するのに十分な試薬を指す。適切な試薬の例としては、限定されないが、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ、および抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）が挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「有効な量」という用語は、有益な結果または望ましい結果を与えるのに十分な組成物（例えば、セレンを含むもの、例えば、ＳＥＬＰＬＥＸ）の量を指す。有効な量を１回以上投与、適用または投薬量で投与してもよく、特定の配合物または投与経路に制限することを意図していない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「投与」および「投与する」という用語は、薬物、プロドラッグまたは他の薬剤、または治療的な処置（例えば、本出願の組成物）を被検体に（例えば、被検体またはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞、組織および臓器に）与える作業を指す。ヒトの身体への例示的な投与経路は、目を介するもの（点眼）、口を介するもの（経口）、皮膚を介するもの（局所または経皮）、鼻を介するもの（経鼻）、肺を介するもの（吸入）、口腔粘膜を介するもの（頬側口腔）、耳、直腸、膣を介するもの、注射によるもの（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内など）などであってもよい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「併用投与」および「併用投与する」という用語は、少なくとも２つの薬剤（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸを含む組成物、またはこれに存在するか、またはこれらから存在する１つ以上のセレン含有化合物）と１つ以上の他の薬剤（例えば、治療薬）または治療を被検体に投与することを指す。ある実施形態では、２つ以上の薬剤または治療の併用投与は、同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／治療を、第２の薬剤／治療の前に投与する。当業者は、使用される種々の薬剤または治療の配合物および／または投与経路はさまざまであってもよいことを理解する。併用投与の適切な投薬量は、当業者によって簡単に決定することができる。ある実施形態では、薬剤または治療が併用投与される場合、それぞれの薬剤または治療は、それらを単独で投与するのに適切な量よりも低い投薬量で投与される。従って、併用投与は、特に、薬剤または治療の併用投与が、潜在的に有害な（例えば、毒性のある）薬剤の必要な投薬量を下げる実施形態および／または２つ以上の薬剤の併用投与によって、他の薬剤の併用投与を介して薬剤の１つの有益な効果に対する被検体の感作が生じる実施形態で望ましい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「処置」という用語または文法的に等価な語は、疾患の症状の向上および／または逆行を包含する。本出願のスクリーニング方法で使用されるとき、疾患に関連する任意のパラメータを向上させる化合物は、それによって、治療化合物であると特定されるだろう。本明細書で使用される場合、「疾患のリスクがある」という用語（例えば、肥大型心筋症、糖尿病、がんなどのリスクがある）は、特定の疾患（例えば、肥大型心筋症、糖尿病、がんなど）を経験しやすい被検体（例えば、ヒト）を指す。この疾患のかかりやすさは、遺伝的（例えば、遺伝性障害のような疾患を経験する特定の遺伝的傾向）であってもよく、または他の因子（例えば、高血圧、年齢、体重、環境条件、環境に存在する有害化合物への曝露など）に起因してもよい。従って、本出願は、任意の特定のリスクに限定されることを意図しておらず、本出願は、任意の特定の疾患に限定されることも意図していない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「疾患に悩まされる」（例えば、肥大型心筋症、糖尿病、がんなどに悩まされる）は、特定の疾患（例えば、肥大型心筋症、糖尿病、がんなど）を経験している被検体（例えば、ヒト）を指す。本出願は、任意の特定の徴候または症状にも、疾患にも限定されることを意図していない。従って、本出願は、任意の範囲（例えば、臨床症状未満から末期の疾患まで）の疾患を経験している被検体を包含することを意図しており、被検体は、特定の疾患に関連する兆候（例えば、徴候および症状）の少なくともいくつかを示す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「疾患」および「病的な状態」という用語は、生きている動物の正常な状態、または正常な機能の性能を妨害するか、または変える、その臓器または組織の任意の障害に関連する状況、徴候および／または症状を記述するために相互に置き換え可能に用いられ、環境因子（例えば、栄養失調、産業的な危険物質または天候）、特定の感染原因（例えば、虫、細菌またはウイルス）、臓器の固有の欠陥（例えば、種々の遺伝子異常）、またはこれらの因子と他の因子の組み合わせに対する応答であってもよい。
【００６６】
「化合物」という用語は、身体機能の疾患、疾病、病気または障害を処置または予防するために使用可能な任意の化学物質、医薬、薬物などを指す。化合物は、既知の治療化合物および潜在的な治療化合物の両方を含む。化合物は、本出願のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって治療薬であると決定することができる。「既知の治療化合物」は、このような処置で有効であることが（例えば、動物試験またはヒトへの投与による従来の経験によって）示された治療化合物を指す。言い換えると、既知の治療化合物は、疾患（例えば、神経変性疾患）の処置に効果的な化合物に限られない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、試薬と他の材料の組み合わせを参照して使用される。キットが、試薬（例えば、栄養物および薬物）および投与手段を含んでいてもよいことが想定される。「キット」という用語は、試薬および／または他の材料の特定の組み合わせに限定されることを意図していない。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「毒性がある」という用語は、毒性物質を投与する前の細胞または組織と比較して、被検体、同じ細胞または組織に対する任意の悪い影響または有害な影響を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性薬剤（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸを含む組成物、および／またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物）と、活性または不活性の担体の組み合わせを指し、これにより、組成物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断用途または治療用途に特に適したものになる。
【００７０】
「医薬的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、被検体に投与されたとき、実質的に有害反応、例えば、毒性反応、アレルギー反応または免疫学的反応を生じない組成物を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「局所的に」という用語は、本出願の組成物を皮膚または粘膜細胞および組織（例えば、歯槽、頬、舌、咀嚼器官、または鼻粘膜、および中空の臓器または体腔内の空洞の内側にある他の組織および細胞）の表面に適用することを指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水型または水／油型のエマルション）およびさまざまな種類の湿潤剤、任意の溶媒およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、ラウリル硫酸ナトリウム、等張性剤および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート）などを含め、任意の標準的な医薬担体を指す。組成物は、安定化剤および防腐剤も含んでいてもよい。例えば、担体、安定化剤およびアジュバント（例えば、本明細書に参考として組み込まれるＭａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９７５）を参照）。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される塩」という用語は、標的となる被検体（例えば、哺乳動物被検体、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞、組織または臓器）に生理学的に容認される本出願の化合物の（例えば、酸または塩基との反応によって得られる）任意の塩を指す。本出願の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導されてもよい。酸の例としては、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。他の酸（例えば、酒石酸）は、それ自体が医薬的に許容されるものではないが、本出願の化合物およびその医薬的に許容される酸付加塩を得るときの中間体として有用な塩の調製に使用されてもよい。
【００７４】
塩基の例としては、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４＋の化合物（ＷはＣ１−４アルキル）などが挙げられる。
【００７５】
塩の例としては、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フタル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（ＷはＣ１−４アルキル基）などのような適切なカチオンと化合物を生成する本出願の化合物のアニオンが挙げられる。治療用途のために、本出願の化合物の塩は、医薬的に許容されるものとして想定される。しかし、医薬的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、医薬的に許容される化合物の調製または精製における用途も見いだされるだろう。
【００７６】
治療用途のために、本出願の化合物の塩は、医薬的に許容されるものとして想定される。しかし、医薬的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、医薬的に許容される塩の調製または精製における用途も見いだされるだろう。
【００７７】
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように核酸と関連して使用される場合、その天然源に一般的に関連する少なくとも１つの要素または混入物質から特定され、分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、天然に見いだされるのと異なる形態または設定で存在する。対照的に、単離されていない核酸は、天然に存在する状態で発見される核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、近傍の遺伝子に近接した宿主細胞の染色体上に見いだされる。ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のＲＮＡ配列）は、多くのタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸としては、一例として、天然の細胞と異なる染色体位置に核酸が存在する所与のタンパク質を通常の状態で発現するか、または、その他の様式で天然に見いだされる核酸配列とは異なる核酸配列によってフランキングされる細胞中の核酸が挙げられる。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在していてもよい。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、タンパク質を発現するために利用され、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最小でもセンス鎖またはコード鎖を含有する（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよい）が、センス鎖および抗−センス鎖の両方を含有していてもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよい）。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「精製された」または「精製する」という用語は、サンプルからの要素（例えば、混入物質）の除去を指す。例えば、抗体は、混入する非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製され、抗体は、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって、サンプル中の標的反応性の免疫グロブリンの割合が増加する。別の例において、組み換えポリペプチドは、細菌宿主細胞中で発現し、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製され、それによって、組み換えポリペプチドの存在は、サンプル中で増加する。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「高速液体クロマトグラフィー」という用語および「ＨＰＬＣ」という用語は、化合物を分離するための液体クロマトグラフィーの形態を指す。化合物を溶解して溶液にする。カラムの上にサンプル混合物の栓を注入することによって化合物を分離する。ＨＰＬＣ装置は、移動相の容器、ポンプ、インジェクター、分離カラムおよび検出器を備える。屈折率、設定波長でのＵＶ−ＶＩＳ吸収、適切な波長で励起させた後の蛍光、または電気化学的応答の変化を定量的に検出することによって、カラム流出液中の検体の存在を記録する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「走査型電子顕微鏡」という用語および「ＳＥＭ」という用語は、ラスタ走査パターンで高エネルギーの電子線を用いて走査することによってサンプル表面を撮像する電子顕微鏡の一種を指す。電子は、サンプルを構成する原子と相互作用し、サンプルの表面形状、組成および他の特性（例えば、導電性）についての情報を含むシグナルを生成する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「固定剤」は、物質が分解するか、またはその他の様式で変化するのを防ぐために、その流れ中の物質を「固定」し、安定化し、またはその他の様式で保存するために、ある物質を別の物質に固定することができる化学物質を指す。多くは、固定剤は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）に使用され、サンプルを調製する。第１の固定剤：本明細書で使用される場合、「第１の固定剤」という用語は、ある物質を「固定」するために使用される第１の固定剤を指す。第２の固定剤：本明細書で使用される場合、「第２の固定剤」という用語は、ある物質を「固定」するために使用される第２の固定剤を指す。第３の固定剤：本明細書で使用される場合、「第３の固定剤」という用語は、ある物質を「固定」するために用いられる第３の固定剤を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「検体」という用語は、原子、分子、原子群および／または分子群、物質または化学構成要素を指す。検体は、それ自体を測定することができないが、検体の態様または特性（物理的、化学的、生物学的など）を、分析手順（例えば、ＨＰＬＣ）を用いて決定することができる。例えば、「チェア（ｃｈａｉｒ）」（検体の要素）自体を測定することができないが、チェアの高さ、幅などを測定することができる。同様に、マイコトキシンを測定することができないが、その濃度に関連するマイコトキシンの蛍光を測定することができる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、反応（例えば、抗原に対する抗体の結合）が起こったことを示す任意の検出可能なプロセスを参照して一般的に使用される。シグナルは、定性的および定量的に評価することができる。「シグナル」の種類の例としては、限定されないが、放射性シグナル、蛍光シグナルまたは比色生成物／試薬のシグナルが挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」という用語は、有機体に利用可能であるか、または全身循環に達する分子または要素のフラクションを指す。分子または要素を静脈内投与する場合、そのバイオアベイラビリティは１００％である。しかし、分子または要素を、他の経路（例えば経口）によって投与する場合、そのバイオアベイラビリティは、（不完全な吸収および第１の経路の代謝に起因して）減少する。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
電子移動連鎖（ＥＴＣ）に向かう電子の移動によって得られるエネルギーを使用し、ミトコンドリアマトリックスからのプロトンを膜間腔へと押し出し、ΔΨと呼ばれるミトコンドリアの内膜（ＩＭＭ）を通る電気化学的プロトン勾配を作り出す。この電気化学的プロトン勾配によって、ＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰアーゼ）が、酵素を通ってマトリックスに戻るＨ＋の流れを使用し、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）および無機リン酸塩からＡＴＰを生成する。４種類の膜に結合した複合体が、ミトコンドリア内で特定されている。それぞれ、内膜に埋め込まれた膜貫通構造である。これらの３種類は、プロトンポンプである。この構造は、脂質溶解性の電子キャリアと水不溶性の電子キャリアによって電気的に接続する。複合体Ｉ（ＮＡＤＨ補酵素Ｑレダクターゼ；Ｉと表示される）は、Ｋｒｅｂｓサイクルの電子キャリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）から電子を受け取り、これを補酵素Ｑ（ユビキノン；（ＵＱ））が受け渡しし、複合体ＩＩ（サクシネートデヒドロゲナーゼ；（ＩＩ））からの電子も受け取る。ＵＱは、複合体ＩＩＩ（チトクロムｂｃ１複合体；（ＩＩＩ））に電子を受け渡しし、これをチトクロムｃ（ｃｙｔ  ｃ）に受け渡しする。Ｃｙｔ  ｃは、複合体ＩＶ（チトクロムｃオキシダーゼ；（ＩＶ））に受け渡しし、電子および水素イオンを使用し、分子状酸素を水に還元する。
【００８６】
複合体Ｉ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシレダクターゼとも呼ばれる）において、２つの電子がＮＡＤＨから除去され、脂質可溶性担体であるユビキノン（Ｑ）に移動する。還元された生成物であるユビキノール（ＱＨ２）は、膜内に自由に拡散し、複合体Ｉが、膜を通って４つのプロトン（Ｈ＋）を移行させ、これによりプロトン勾配が生じる。複合体Ｉは、酸素への時期尚早の電子の漏れが生じるため、有害なスーパーオキシドの生成の主な部位の１つである主要部位の１つである。従って、複合体ＩＩＩと共に、電子伝達鎖によって作られる活性酸素種（主に、スーパーオキシドラジカル）のほとんどを生成する。遺伝子の突然変異とは別に、ミトコンドリア機能不全は、そのサブコンポーネントに対する活性酸素種（ＲＯＳ）によって引き起こされる損傷から主に生じると思われる（例えば、ＫｉｒｋｉｎｅｚｏｓおよびＭｏｒａｅｓ、２００１を参照）。実際に、このエージングプロセスと、ＲＯＳによって誘発される細胞損傷に由来する代謝性疾患（例えば、２型糖尿病）の発生には広い一致が存在する。ミトコンドリアは、細胞内のＲＯＳの主な発生元であり、この特徴は、ミトコンドリアがＲＯＳによって引き起こされる損傷およびいわゆる酸化ストレスを受ける最初の細胞小器官でもあることを意味している（例えば、Ｋａｎｅｔｏら、２０１２）。顕著な数のミトコンドリアの疾患が、複合体Ｉの機能不全または不十分性と特異的に関係がある。
【００８７】
電子の経路は、以下のように起こる。ＮＡＤＨは、１回の２電子工程で、フラビンモノヌクレオチドをＦＭＮＨ２に還元することによって、ＮＡＤ＋に酸化する。次いで、ＦＭＮＨ２は、セミキノン中間体を介し、２つの一電子工程で酸化される。従って、それぞれの電子は、ＦＭＮＨ２からＦｅ−Ｓクラスターへ、Ｆｅ−Ｓクラスターからユビキノン（Ｑ）へと移動する。第１の電子の移動によって、Ｑの遊離ラジカル（セミキノン）形態が得られ、第２の電子の移動によって、このセミキノン形態をユビキノール形態ＱＨ２に還元する。このプロセス中、４つのプロトンがミトコンドリアのマトリックスから膜間腔に移動する。
【００８８】
複合体ＩＩ（サクシネートデヒドロゲナーゼ）において、サクシネートに由来するさらなる電子がキノンプール（Ｑ）へと運ばれ、（ＦＡＤを介して）Ｑに運ばれる。複合体ＩＩは、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣおよびＳＤＨＤの４つのタンパク質サブユニットを含む。他の電子供与体（例えば、脂肪酸およびグリセロール３−ホスフェート）も、（ＦＡＤを介して）Ｑに電子を向かわせる。
【００８９】
複合体ＩＩＩ（チトクロムｂｃ１複合体）において、Ｑ−サイクルは、プロトンの非対称な吸収／放出によって、プロトン勾配に寄与する。Ｑｏ部位のＱＨ２から２個の電子が除去され、続けて、２分子のチトクロムｃの膜間腔の中に位置する水溶性電子キャリアに移動する。この２個の他の電子は、逐次、タンパク質を通ってＱｉ部位に向かい、この部位で、ユビキノンのキノン部分がキノールに還元される。プロトン勾配は、Ｑｏ部位での２個のキノール（４Ｈ＋４ｅ−）酸化によって作られ、Ｑｉ部位に１個のキノール（２Ｈ＋２ｅ−）を生成する（合計で６個のプロトンが移動する。２個のプロトンがキノンをキノールに還元し、４個のプロトンが、２個のユビキノール分子から放出される）。
【００９０】
複合体ＩＶ（チトクロムｃオキシダーゼ）において（チトクロムＡ３と呼ばれることもある）、チトクロムｃの４個の分子から４個の電子が除去され、分子状酸素（Ｏ２）に移動し、２個の水分子を生成する。同時に、４個のプロトンがミトコンドリアのマトリックスから除去され（しかし、膜を通過して移動するのは２個のみ）、これがプロトン勾配に寄与する。チトクロムｃオキシダーゼの活性は、シアニドによって阻害される。
【００９１】
電子伝達鎖および酸化的リン酸化は、内側のミトコンドリア膜にわたるプロトン勾配によって組み合わされる。ミトコンドリアのマトリックスからのプロトンの流れは、電気化学的勾配（プロトン勾配）を作り出す。この勾配は、Ｆ０Ｆ１ＡＴＰシンターゼ複合体によって用いられ、酸化的リン酸化によってＡＴＰを生成する。ＡＴＰシンターゼは、時に、電子伝達鎖の複合体Ｖと記載される。ＡＴＰシンターゼのＦｏ要素は、ミトコンドリアのマトリックスにプロトンの流れを戻すイオンチャンネルとして作用する。この流れは、電子キャリア（ＮＡＤ＋およびＱ）の酸化された形態の作成中に作られた自由エネルギーを放出する。自由エネルギーを使用してＡＴＰ合成を行い、複合体のＦｉ要素によって触媒される。
【００９２】
従って、複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシレダクターゼ）は、ミトコンドリアの呼吸鎖の最初の酵素である。糖と脂肪の酸化によって作られるＮＡＤＨからエネルギーを抽出し、ミトコンドリアの内膜を通る電位差または電圧にエネルギーを捕捉する。電位差を使用し、ＡＴＰの合成に力を与える。複合体Ｉが、細胞内のエネルギー生成の中心であるため、その不調によって、広範囲の神経筋疾患を引き起こす。これらのいくつかは、ミトコンドリアのゲノム中の突然変異に起因するものであるが、複合体の活性の低下、または活性酸素種の産生の増加を引き起こすものもある。
【００９３】
非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病（ＤＭ）は、膵臓β細胞の機能に起因して、インスリン分泌の不足と合わせ、骨格筋、肝臓および脂肪におけるインスリン抵抗性を特徴とする疾患である。インスリン抵抗性は、ＩＩ型糖尿病の中心となる特徴である。例えば、大多数のＩＩ型糖尿病は、インスリン抵抗性であることが知られている。同様に、ＩＩ型糖尿病の子孫におけるインスリン抵抗性は、この疾患の後期の進行の最も良い予測因子である（例えば、Ｗａｒｒａｍら、１９９０を参照）。インスリン抵抗性を下げる介入も、糖尿病の進行を妨げる。ミトコンドリアの機能は、膵臓β細胞からの正常なグルコース刺激によるインスリン分泌に必要である。
【００９４】
骨格筋および肝臓は、グルコースのホメオスタシスの維持における２つの鍵となるインスリン応答性の臓器である。インスリン抵抗性状態へのこれらの臓器の移行は、ＩＩ型糖尿病患者でみられる糖代謝のほとんどの変化を説明する（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ、２００５を参照）。これらの２つの臓器の中で、骨格筋は、インスリン抵抗性の進行から生じる結果という観点でもっと重要である。骨格筋は、毎日摂取するグルコースの８０〜９０％を処理または代謝することがわかっているからである（例えば、ＤｅＦｒｏｎｚｏら、１９８５を参照）。
【００９５】
ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）遺伝子が、前糖尿病および糖尿病の個人において、健康なコントロールと比較して、発現の減少を示すことが、ゲノムの幅広い発現分析によって示されている。これらの遺伝子は、多くの場合に、転写コアクチベーター増殖活性化受容体γコアクチベーター１−αの標的である（ＰＧＣ１−α、例えば、Ｍｏｏｔｈａら、２００３）。これらの研究において、ＯＸＰＨＯＳ遺伝子について典型的な発現の減少は中程度である（約２０％）が、非常に一貫性があり、遺伝子の８９％より多くが、正常な耐糖能を有する個人と比較して、耐糖能不良またはＩＩ型糖尿病のいずれかの個人において、低い発現を示している。
【００９６】
一般的に、筋肉内でのＯＸＰＨＯＳ活性を高める薬物または薬剤が、２型糖尿病のための価値ある治療薬として存在することが当該技術分野で理解され、認識される。この仮説を支持するために、ミトコンドリアの活性および数を増加させ、ＯＸＰＨＯＳ遺伝子発現を促進するため、有酸素運動が糖尿病を治療するための最良の非薬理学的介入であることが長年にわたって知られている。
【００９７】
２型糖尿病に加え、ミトコンドリア機能不全と関連する複数の疾患および状態が存在する。ミトコンドリアは、高等生物の細胞における主なエネルギー源であるため、ミトコンドリアは、広範囲の細胞呼吸、酸化および代謝のプロセスの直接的および間接的な生化学的制御を与える。これらは、電子伝達鎖（ＥＴＣ）活性を含み、酸化的リン酸化によってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態の代謝エネルギーを作り出し、細胞内カルシウムホメオスタシスにおいて中心的なミトコンドリアの役割も背後にある。
【００９８】
成長しつつある細胞のエネルギー生成におけるこれらの役割に加え、ミトコンドリア（または、少なくともミトコンドリアの要素）は、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）に関与し、これはアポトーシスとしても知られる（例えば、Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ  １９９４、７９：３５３−３６４；Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  １９９６、８６：１４７−１５７を参照）。正常な神経系の成長のため、また、免疫系の適切な機能のためにアポトーシスが必要である。さらに、いくつかの疾患の状態は、不十分または過剰なレベルのアポトーシスに関係があると思われる（例えば、それぞれ、がんおよび自己免疫疾患および卒中による損傷、および後者の場合には、アルツハイマー病における神経変性）。アポトーシスにおけるミトコンドリアの役割が示されている（例えば、ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１：１３０９−１３１２；Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ、１９９８、９４：６９５−６９８；およびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９７，３：６１４−６２０）。限定されないが、ＥＴＣの任意の工程での不足を含む、ミトコンドリア活性の変化または不足によって、細胞および組織が損傷を受ける可能性を有する反応性の高い遊離ラジカルの生成を引き起こす場合がある。これらの遊離ラジカルは、活性酸素種（ＲＯＳ）、例えば、スーパーオキシドラジカル、過酸化亜硝酸ラジカルおよびヒドロキシルラジカル、および細胞に対して毒性であり得る潜在的に他の反応性種を含んでいてもよい。例えば、酸素遊離ラジカルによって誘発される脂質の過酸化は、例えば、多くの変性疾患および虚血（例えば卒中）で見いだされるような、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷における十分に確立された病原的機構である。
【００９９】
遊離ラジカルが媒介する組織損傷に加えて、ミトコンドリア機能不全から生じる反応性遊離ラジカルに曝露する少なくとも２つの有害な結果が存在し、ミトコンドリア自体に有害な影響を与える。第１に、遊離ラジカルが介在する損傷が、ＥＴＣの１つ以上のタンパク質を不活性化させることがある。第２に、遊離ラジカルが介在する損傷によって、「透過性遷移」（ＰＴ）または「ミトコンドリアの透過性遷移」（ＭＰＴ）と呼ばれるミトコンドリアの崩壊が起こることがある。一般的に受け入れられるミトコンドリアの機能の理論に従って、本明細書に記載されるように、適切なＥＴＣの呼吸活性は、合わさった化学浸透圧性の機構による内側のミトコンドリア膜内の電気化学ポテンシャルの維持を必要とする。遊離ラジカルの酸化活性は、この膜電位を消散し、それによって、ＡＴＰ生合成を妨げ、命にかかわる生化学エネルギー源の生成を止める場合がある。それに加え、ミトコンドリアのタンパク質（例えば、チトクロムｃ）は、透過性遷移の後、ミトコンドリアから漏れ出すことがあり、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死として知られる、遺伝的にプログラムされた細胞の一連の自殺を誘発することがある。
【０１００】
ミトコンドリアに関連する疾患（例えば、機能不全のミトコンドリアによって引き起こされる）は、遊離ラジカル酸化以外の機構のミトコンドリアの膜化学ポテンシャルの消失に関係がある場合もあり、透過性遷移は、ミトコンドリア遺伝子の直接的または関節的な影響から生じる場合もある。遺伝子産物または関連する下流のメディエーター分子および／またはその他のミトコンドリア外遺伝子から、または他の既知または未知の原因から生じる場合もある。従って、ミトコンドリアの電位の消失は、変性疾患および加齢に関連する疾患／状態（例えば、がん、心血管系疾患および心不全、２型糖尿病、アルツハイマー病およびパーキンソン病、脂肪肝疾患、白内障、骨粗鬆症、筋消耗、睡眠障害および炎症性疾患、例えば、乾癬、関節炎および大腸炎）を含む、変更されたミトコンドリアの機能に関連する疾患の進行において重要な事象であろう。
【０１０１】
（心筋症）
核をコードするＤＮＡポリメラーゼｃ（ＰＯＬＧ）は、動物細胞のミトコンドリアの唯一の既知のＤＮＡポリメラーゼである。ヒトＰＯＬＧ遺伝子の突然変異は、眼筋麻痺、白内障、進行性筋力低下、パーキンソン症候群、早発卵巣不全、男性不妊、聴力損失（老人性難聴）および心機能不全を含め、種々の症状と関連する多くの疾患と関係がある（例えば、Ｋｕｊｏｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７．３（２）を参照）。ＰｏｌＧ（Ｄ２５７Ａ）マウスモデルは、１２週間で、ミトコンドリアでコードされる複合体の呼吸機能の進行性の低下を示し、酸素消費が低下し、ＡＴＰの産生が減少する（例えば、Ｋｕｊｏｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７．３（２）を参照）。ＰｏｌＧマウスは、１３〜１４月齢までに、拡張した心臓の大きさおよび心筋細胞によって示される顕著な心臓肥大を伴い、促進された心老化表現型を示すことが報告されている（例えば、Ｄａｉら、２０１０、Ｋｕｊｏｔｈら、２００５および図２５Ａを参照）。
【０１０２】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、心疾患の最も一般的な一遺伝子的な遺伝形態であり、３５歳より若い個人の突然の心臓死の最も一般的な原因である（例えば、Ｆｒｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０１２．９（２）：ｐ．９１−１００を参照）。ＨＣＭの基礎となる遺伝子の突然変異は、十分に特性決定されており、大部分の突然変異は、サルコメアタンパク質、例えば、ミオシン−７（心筋β−ミオシン重鎖；ＭＹＨ７）をコードする（例えば、Ｆｒｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０１２．９（２）：ｐ．９１−１００）。
【０１０３】
心臓アンキリン繰り返しタンパク質（ＣＡＲＰ）は、Ａｎｋｒｄ１遺伝子によってコードされ、ＡＮＫＲＤ１遺伝子およびＣＡＲＰ核因子の発現は、左室肥大、ヒト心不全、拡張型心筋症（ＤＣＭ）およびアドリアマイシン誘発性心筋症に関与する（例えば、Ｄｕｂｏｓｃｑ−Ｂｉｄｏｔら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１０２、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（０）：ｐ．Ｓ７３）。示されている表現型と一致して、心臓肥大マーカーＭｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１の年齢依存性の発現は、ＰＯＬＧ若年マウスと比較して、ＰＯＬＧ老年マウスの心臓組織で上昇している。
【０１０４】
従って、本出願の実施形態の開発中に行われる実験全体で作られた経験的データは、ＰｏｌＧマウス株が、心臓肥大について優れた実験モデルであることを決定した。例えば、ＰｏｌＧマウスが、心臓老化の生存動物モデルを与え、ひいては、心臓老化および肥大に関与する特定の分子の分析／試験を可能にすることが発見され、決定された（例えば、遺伝子およびタンパク質のレベルで）。さらに、ＰｏｌＧモデルによって、心臓老化および肥大に関与する特定の分子を変える（例えば、遺伝子およびタンパク質のレベルで）化合物の評価および特性決定が可能なことも発見した。従って、ある実施形態では、本出願は、１３〜１４月齢で拡張した心臓の大きさおよび心筋細胞によって示される顕著な心臓肥大を示すＰｏｌＧマウスを、１つの化合物にさらすことと、試験化合物存在下、（例えば、試験化合物が与えられない（例えば、コントロール物質が投与される）動物と比較して）心筋細胞の心臓の大きさの変化および／または肥大型心筋症に関与する分子の発現を検出することとを含む、（例えば、肥大型心筋症の処置および／または予防のための）試験化合物を特定する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「試験化合物」という用語は、身体機能の疾患、疾病、病気または障害を処置または予防するために使用可能な、または、他の方法でサンプルの生理学的状態または細胞状態を変えるために使用可能な、任意の化学物質、医薬、薬物などを指す。試験化合物は、既知の治療化合物および潜在的な治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本出願のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって治療薬であると決定することができる。「既知の治療化合物」は、このような処置で有効であることが（例えば、動物試験またはヒトへの投与による従来の経験によって）示された治療化合物を指す。言い換えると、既知の治療化合物は、疾患（例えば、神経変性疾患）の処置に効果的な化合物に限られない。ある実施形態では、試験化合物は、単一の薬物候補物質である。
【０１０５】
本出願は、セレン（例えば、セレンを豊富に含む酵母、およびこれらから得られるか、または誘導されるセレン含有化合物）を含む組成物、およびこれを用いて心筋症を処置し、阻害する方法を提供する。特に、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む）、これらの中に存在するか、および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物を含む組成物、およびこれを用いて被検体の心臓肥大を処置し、阻害する方法を提供する（例えば、心筋症のための治療薬または予防的処置として）。例えば、ある実施形態では、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、ＳＥＬＰＬＥＸ）、これらの中に存在するか、および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物を含む組成物、およびこれを使用し、肥大型タンパク質ミオシン重鎖β（Ｍｙｈ７）および／または心臓アンキリン繰り返しタンパク質（Ａｎｋｒｄ１）（例えば、心筋肥大のための治療薬または予防的処置として）の発現を阻害するか、または弱める方法を提供する。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、被検体に投与される場合、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンは、転写因子Ｆｏｘｏ３を制御し、Ｍｙｈ７分子およびＡｎｋｒｄ１分子の発現を阻害する（例えば、それによって、心筋肥大を阻害する）。
【０１０６】
本出願の実施形態の開発中に行った実験は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）が、被検体に投与されると、肥大型タンパク質ミオシン重鎖β（Ｍｙｈ７）および心臓アンキリン繰り返しタンパク質（Ａｎｋｒｄ１）の蓄積を阻害し、それによって、心筋の老化および肥大を阻害および／または予防することを発見し、示している。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、被検体に投与される場合、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンは、Ｎｆａｔシグナル伝達を制御する（例えば、Ｎｆａｔｃ２／３のリン酸化を増加させ、核Ｎｆａｔｃ２／３活性に関連する遺伝子転写を減少させる（例えば、それによって、肥大型タンパク質Ｍｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１の心臓での蓄積を阻害する））。
【０１０７】
本出願の実施形態の開発中に行ったさらなる実験は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンが、被検体に投与されると、ｐＳ６Ｋ１の心臓での発現を顕著に減少させる（例えば、それによって、心筋の老化および肥大を阻害および／または減少させる）ことを発見し、示している。
【０１０８】
Ａｔｍ／Ｇａｄｄ４５シグナル伝達は、骨格筋および心筋の両方において、細胞周期停止およびＤＮＡ修復の重要な経路である。コントロールおよびセレンで処置されたＰｏｌＧマウスからの心臓においてＡｔｍおよびＧａｄｄ４５の発現を特性決定するために、本出願の実施形態進行中に実験を行った。ＰｏｌＧマウス心臓において、年齢に依存するＡｔｍ発現の減少が発見された。しかし、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、ＰｏｌＧマウスにおけるＡｔｍ発現の年齢依存的な減少が止まった。それに加え、Ａｔｍの下流の標的である心臓Ｇａｄｄ４５の発現は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧマウスにおいて、顕著に上方制御された。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンは、被検体（例えば、高齢の被検体）に投与したとき、心臓組織におけるＡｔｍの年齢に関連する発現の減少を打ち消すか、および／または止まる（例えば、それによって、Ａｔｍの下流の分子（例えば、Ｇａｄｄ４５）の発現を強化するか、および／または高め、および／またはＤＮＡ損傷に対し、心筋細胞を保護することによって心臓の健康を向上させる（例えば、それによって、心筋肥大（例えば、高齢被検体において）を阻害および／または予防する））。
【０１０９】
ミトコンドリア（ＭＴ）中の脱共役タンパク質（Ｕｃｐ）は、熱発生およびミトコンドリアの電位または一体性の維持にとって重要である。Ｕｃｐ２の欠失は、ミトコンドリア中の活性酸素種（ＲＯＳ）の寿命が短くなり、産生量が増えることが示されている。本出願の実施形態の開発中に行われた実験は、Ｕｃｐ２が、心筋で発現する主要なＵｃｐであることを発見し、示している。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与は、Ｕｃｐ１またはＵｃｐ３の発現を変えないが、Ｕｃｐ２の発現は、セレンで処置されたＰｏｌＧマウスにおいて顕著に上昇した。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレン、被検体（例えば、高齢の被検体）に投与したとき、心臓でのＵｃｐ２の発現を上方制御する（例えば、それによって、活性酸素種の生成を制御する（例えば、それによって、ＤＮＡ損傷に対して心筋細胞を保護することによって、心臓の健康を向上させる（例えば、それによって、心筋肥大（例えば、高齢被検体において）を阻害および／または予防する））。
【０１１０】
Ｌｃｎ２は、心不全のバイオマーカーであり、心筋収縮にとって重要である。ヒトが年を取ったとき、心臓は、硬くなり、心筋細胞が拡張し、筋肉細胞の収縮性が低下し、両方とも、心不全および心臓肥大の原因を引き起こす。コントロールおよびセレンで処置されたＰｏｌＧマウスからの心臓におけるＬｃｎ２の発現を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。Ｌｃｎ２の顕著でめざましい増加が、高齢のＰｏｌＧ心臓において発見された。さらにもっと驚くべきことは、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与によって、コントロールと比較して、高齢ＰｏｌＧマウスにおけるＬｃｎ２発現の顕著な低下を引き起こしたことであった。これらの知見は、セレンで処置されたｐｏｌＧ心臓において、増加したｐＮｆａｔ２／３レベルに関し、本明細書に開示される他の知見を支持する（例えば、遺伝子転写におけるＮｆａｔ活性の不活性化）。それに加え、Ｌｃｎ２がＮｆａｔ標的であることが示されている。従って、機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレン、被検体（例えば、高齢の被検体）に投与したとき、心臓組織におけるＬｃｎ２の年齢に関連する発現の上昇を打ち消すか、および／または止まる（例えば、それによって、（例えば、それによって、心筋肥大（例えば、高齢被検体において）を阻害および／または予防する））。
【０１１１】
従って、好ましい実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその水溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）またはその水不溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載される））の形態でセレンを含み、被検体において（例えば、心臓肥大を予防的または治療的に処置するために）肥大型タンパク質の心臓での発現を減少させるために（例えば、セレンを含む組成物を摂取していないコントロール被検体における心筋の厚みおよび／または心筋の厚みに関与する分子の発現と比較して、セレンを含む組成物を投与された被検体における心臓肥大および／または心筋の厚みに関与する分子の発現を阻害するように）利用される組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその水溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）またはその水不溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載される））の形態でセレンを含み、心筋の肥厚化に関与する分子の発現を防ぐために（例えば、セレンを含む組成物を摂取していないコントロール被検体の心筋肥大の存在またはその重篤度と比較して、セレンを含む組成物が投与されたヒトまたは動物被検体の心臓肥大を防ぐように）被検体に投与するために利用される、組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本出願は、被検体において予防的または治療的に処置される心筋症の種類によって制限されない。実際に、本出願の組成物および方法は、限定されないが、肥大型心筋症（例えば、家族性肥大型心筋症、心筋梗塞、または心臓弁膜症（例えば、心臓弁の粘液腫性変性、乳頭筋機能不全またはリウマチ熱に関係する）に起因する）、拡張型心筋症、拘束型心筋症および不整脈源性右室異形成心筋症（ＡＲＶＣ）を含め、肥大型タンパク質の心臓での発現の減少から利益を受ける任意の心筋症の予防的および／または治療的な処置において用途が見出される。
【０１１３】
機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、好ましい実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその水溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）またはその水不溶性フラクション（例えば、本明細書に記載される）、またはその中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載される））の形態でセレンを投与すると、肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現を減少させ、それによって、心筋の老化および肥大を阻害および／または予防する。非限定的な一実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物を被検体に投与された、被検体における肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現の減少は、被検体における心臓核のＮｆａｔｃ２／３活性に関連する遺伝子転写の低下によって得られる。別の非限定的な実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物を被検体に投与された、被検体における肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現の減少は、被検体における心臓リボソームのタンパク質キナーゼ（ｐＳ６Ｋ１）発現および／または活性の低下によって起こる。
【０１１４】
ある実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物を被検体に投与された、被検体における肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現の減少は、被検体におけるｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  ０３（ｆｏｘｏ３）の心臓での発現および／または活性を高めることによって得られる。
【０１１５】
ある実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物を被検体に投与された、被検体における肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現の減少は、被検体における年齢に関連するリポカリン（ｌｉｐｃａｌｉｎ）−２（Ｌｃｎ２）の心臓での発現の上昇を低下させるか、またはなくすことによって起こる。
【０１１６】
本出願は、本出願の組成物および方法を投与された被検体の種類によって制限されない。実際に、種々の被検体は、限定されないが、心臓肥大の進行を遅らせることが求められる被検体、心臓肥大の進行を止めるべき被検体、心臓肥大の進行を逆行すべき被検体を含め、本出願の組成物の投与および方法からの利益が見出される。被検体において心臓肥大の進行を遅らせる非限定的な例は、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でのセレンを含む組成物の投与によって、被検体において（例えば、セレンを含む組成物を摂取していないコントロール被検体と比較して）肥大型タンパク質の心臓での発現を減少させるのに有効な量で、被検体において肥大型タンパク質（例えば、ベータ（β）−ミオシン重鎖および／またはアンキリン繰り返しタンパク質）の心臓での発現を減少させること
【０１１７】
被検体は、心臓肥大の徴候、症状または他の適応症を示してもよく、または心臓肥大の徴候、症状または他の兆候を示すリスクがある（例えば、遺伝的にかかりやすい）（例えば、心臓肥大の徴候、症状または他の兆候を現在は示していないが、心臓肥大に高いリスクがあり、遺伝的になりやすいと医学的に診断される）。他の実施形態では、被検体は、心筋症（例えば、肥大型心筋症（例えば、家族性肥大型心筋症、心筋梗塞、または心臓弁膜症（例えば、心臓弁の粘液腫性変性、乳頭筋機能不全またはリウマチ熱に関係する）等に起因する）、拡張型心筋症、拘束型心筋症および不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）を有しているか、またはこれらのリスクがある。
【０１１８】
遺伝子発現の変化は、処置された被検体と、処置されていない被検体のｍＲＮＡ発現レベルを比較することによって検出することができる。プライマーおよびプローブは、特定可能な配列に基づいて得ることができ、設計することができる。プライマーまたはプローブは、典型的には、約２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０または５ヌクレオチド、または５〜２００ヌクレオチドの整数である。プライマーまたはプローブは、以下に示す配列を有するタンパク質をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする。プライマーまたはプローブは、リポーター分子で検出可能に標識することができる。
【表１】
0006313418.tif 000002
【０１１９】
本明細書に開示される遺伝子のための核酸およびタンパク質の配列は、当業者によって決定することができる。例示的な配列を表１に示す。
【０１２０】
（サルコペニア）
サルコペニアは、加齢に関連する骨格筋の質量減少であり、筋肉の量および質が悪化し、動作が徐々にゆっくりとなり、強さおよび力が低下し、脆くなり、転倒に関連する傷害のリスクが高まることを特徴とする。サルコペニアは、四肢骨格筋の質量（ｋｇ／身長２（ｍ２））が、参照群の平均より２標準偏差未満であることであると定義される（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら（Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  １９９８；１４７：７５５−６３；１４９：１１６１を参照）。サルコペニアの有病率の概算値は、６０歳を超える成人で１３％〜２４％の範囲であり、８０歳以上のヒトでは、５０％より多い。成長ホルモンの分泌が、思春期中期から次第に低下していき、成長ホルモンは、筋肉質量を増やすことが知られている。成長ホルモンが不足する患者は、筋肉質量が低下し、脂肪質量が増加する。成長ホルモンの補充により、筋肉質量が増加し、脂肪質量の低下をもたらす。
【０１２１】
正常な機構は、筋肉組織の変性を最初に含み、衛星細胞の動員を含む。筋肉衛星細胞は、筋原性前駆細胞の別の系統であり、成熟筋線維の基底板と筋鞘の間に位置する（例えば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、１９９４；Ｇｒｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｙａｂｌｏｎｋａ−Ｒｅｕｖｅｎｉ、１９９３を参照）。再生サイクル中、衛星細胞は、活性化し、筋線維から再生部位に移動し、筋芽細胞を生成する。ほとんどの増殖する筋芽細胞は、筋管に分化する。筋管が成熟し、筋線維に組み込まれる。筋管に分化しない筋芽細胞は、筋線維に戻り、衛生細胞の集合を新しく生成する。
【０１２２】
筋肉再生サイクルは、ヒトおよび動物の寿命全体にわたって連続的に起こる（例えば、すり切れた筋肉組織または損傷を受けた組織を置き換える）。身体が老化するにつれて、筋肉の再生サイクルが非効率になる。サルコペニアは、筋肉の質量および性能の低下を引き起こし、正常な老化と関係がある。骨格筋が、老化中に自身を再生させることができるままであり、高齢の筋肉における未知の因子が、筋肉衛星細胞の活性化、増殖および分化を支持しない環境を作り出し、筋肉組織の正味の消失が生じる（例えば、Ｇｒｅｅｎｌｕｎｄ  ａｎｄ  Ｎａｉｒ、２００３を参照）。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＦ）およびメカノ（ＭＥＣＨＡＮＯ）成長因子（ＭＧＦ）を含むいくつかの成長因子は、衛星細胞の活性化を制御することによって、筋肉の再生に良い影響を与えることが示されている（Ｆｌｏｓｓら、１９９７；Ｍｉｌｌｅｒら、２０００、Ｇｏｌｄｓｐｉｎｋ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｄｇｅ；２００４）。
【０１２３】
本出願は、セレン（例えば、セレンを豊富に含む酵母およびこれらから得られるか、または誘導されるセレン含有化合物）を含む組成物、およびこれを用いてサルコペニアを処置し、阻害する方法を提供する。特に、本出願は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、ＳＥＬＰＬＥＸ）、これらの中に存在するか、および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物を含む組成物、および／または（例えば、サルコペニアの治療的および／または予防的処置として）これを用いて被検体における骨格筋の質量を維持する方法を提供する。本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）が、被検体に投与されると、骨格筋のタンパク質合成を向上させ、骨格筋におけるプロテアソームタンパク質の変性も阻害することを発見し、示している。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を被検体に投与すると、骨格筋の衛星（幹）細胞も活性化した。さらに、セレンを豊富に含む酵母を被検体に投与すると、カルシニューリンの発現を活性化し、骨格筋における肥大型遺伝子の発現を促進した。
【０１２４】
従って、好ましい実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（または、これらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物）の形態でセレンを含み、（例えば、セレンを含む組成物を摂取していないコントロール被検体の筋肉の質量と比較して、セレンを含む組成物が投与されたヒトまたは動物被検体において筋肉の質量を増加させるか、および／または維持するように）被検体においてサルコペニアを処置するために利用される組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。別の好ましい実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（または、これらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物）の形態でセレンを含み、（例えば、セレンを含む組成物を摂取していないコントロール被検体の筋肉の質量と比較して、セレンを含む組成物が投与されたヒトまたは動物被検体において筋肉の質量を増加させるか、および／または維持するように）被検体においてサルコペニアを予防するために利用される組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０１２５】
機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンが投与された被検体における全タンパク質の質量の増加は、タンパク質の合成の刺激および／またはタンパク質の分解の阻害に起因する。非限定的な一実施形態では、セレン（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこの中に存在するか、またはこれらから誘導されるセレン含有化合物の形態で）が投与された被検体における全タンパク質の質量の増加は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物が、Ｇｓｋ３および／またはＡｍｐｋの発現を制御し、ｍＴＯＲ／ＭＡＰＫ／Ｓ６Ｋｌのシグナル伝達を変え、従って、骨格筋におけるタンパク質合成を向上させる能力に起因する。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンは、肥大型遺伝子の発現（例えば、カルシニューリンおよびタンパク質伸長因子）を刺激し、それによって、タンパク質の合成を増加させ、骨格筋の萎縮と戦う。
【０１２６】
別の非限定的な実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物が被検体に投与された被検体における全タンパク質の質量の増加は、ミオスタチン／Ａｃｖｒシグナル伝達がタンパク質合成を阻害する効果を低下させることから得られる、タンパク質合成の向上によって得られる（例えば、それによってサルコペニアを阻害し、および／または骨格筋の肥大をもたらす）。ある実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物が被検体に投与された被検体における全タンパク質の質量の増加は、骨格筋の衛星細胞の活性化によって得られる。ある実施形態では、セレンを豊富に含む酵母および／またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物が被検体に投与された被検体における全タンパク質の質量の増加は、シグナル伝達分子であるカルシニューリンおよび／またはＮＦ  ＡＴの刺激によって得られる。
【０１２７】
機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、セレン（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態で）が投与された被検体におけるタンパク質の分解の阻害および骨格筋の萎縮の予防は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物が、ｍＴＯＲの発現を減らす結果、萎縮遺伝子Ｔｒｉｍ６３およびＦｂｘｏ３２の発現を減らす／弱め、および／またはＦｏｘｏ転写因子を含む活性を弱める能力に起因する。
【０１２８】
従って、ある実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む有効な量の組成物を、サルコペニアを処置することが必要な被検体（例えば、ヒトまたは動物被検体）に投与することを含む、サルコペニアを処置する方法を提供する。ある実施形態では、本出願は、被検体における骨格筋の衛星細胞の活性化を高める方法における、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母またはその中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物の使用を提供する。ある実施形態では、本出願は、被検体におけるタンパク質合成のミオスタチンおよび／またはＡｃｖｒの阻害を低下させる方法における、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母またはその中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物の使用を提供する。ある実施形態では、本出願は、被検体において（例えば、被検体の骨格筋の質量を増加させるために）（例えば、ミオスタチンおよび／またはＡｃｖｒ（例えば、Ａｃｖｒ２ｂ）の発現の下方制御によって）ミオスタチン／Ａｃｖｒのシグナル伝達を阻害する方法における、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母またはその中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む組成物の使用を提供する。
【０１２９】
遺伝子発現の変化は、処置された被検体と、処置されていない被検体のｍＲＮＡ発現レベルを比較することによって検出することができる。プライマーおよびプローブは、例示的な基準配列に基づいて得ることができ、設計することができる。プライマーまたはプローブは、典型的には、約２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０または５ヌクレオチド、または５〜２００ヌクレオチドの整数である。プライマーまたはプローブは、具体的には、以下に示す配列を有するタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズする。プライマーまたはプローブは、リポーター分子で検出可能に標識することができる。このような標識としては、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ、ビオチン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＲＯＸなどが挙げられる。
【０１３０】
ある実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む有効な量の組成物を被検体に投与することを含む、（例えば、被検体においてサルコペニアを処置するために）被検体において筋肉の質量を維持するか、または増加させる方法を提供する。
【０１３１】
本出願は、骨格筋の質量の維持および／または増加が求められる被検体の種類によって制限されない。上述のように、サルコペニアは、四肢の骨格筋量（ｋｇ／ｈｅｉｇｈｔ２  （ｍ２））が、若年の参照群の平均より２標準偏差未満であることであると定義される（ｔスコア）。ｔスコアは、典型的には、ｄｘａ（二重エネルギーＸ線吸収測定法）または同様の再現可能な測定によって、被検体の体軸の骨格筋の質量を測定することによって決定される。体軸の骨格筋の質量の測定を使用し、（本明細書に記載される被検体を処置する方法の使用の前、最中および／または後に）被検体の進行を経過観察し、処置が、骨格筋の質量低下を遅らせているか、予防しているか、または逆行させているかどうかを決定する。
【０１３２】
本出願の１つの目的は、サルコペニアの進行を遅らせること、進行を止めること、特に、進行を逆行させることを含め、サルコペニアを処置し、および／または阻害することである。サルコペニアの進行を遅らせる一例は、被検体のｔスコアが−１．５から−２に進むまでの時間の長さを変えること（例えば、このような進行が通常は５年かかる場合、本明細書で使用される処置が、この変化を１０年まで遅らせることができる）。部分的な逆行の例としては、ｔスコアを０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０以上の単位減らす（例えば、ｔスコアが−２から、ｔスコアが−１．９、−１．８、−１．７、−１．６、−１．５、−１．４、−１．３、−１．２、−１．１まで移動することなど）。サルコペニアを処置することは、サルコペニアの発生を遅らせることも含む。例えば、典型的な５０歳の男性が、５５歳までにサルコペニアの徴候が見られ始める場合には、本出願の処置は、発生を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはもっと長い年数遅らせることができる。従って、サルコペニアを処置することは、まだサルコペニアと診断されていないが、サルコペニアにかかりやすいか、またはかかりやすいと予想される被検体を処置することを含む。サルコペニアにかかりやすいか、またはかかりやすいと予想される被検体の非限定的な例としては、限定されないが、限定されないが、グルココルチコイドステロイドを含め、ホルモン治療を投与されている被検体、神経変性疾患を有する被検体、慢性感染を有する被検体、ＡＩＤＳを有する被検体、慢性炎症状態を有する被検体、およびがんを有する被検体も挙げられる。
【０１３３】
本出願の組成物および方法から利益を受ける他の被検体としては、筋肉質量の消失に悩まされているが、毎日の生活の行動を妨害する状態には悩まされておらず、および／または被検体が独立した生活をすることを妨害する（例えば、生活に介助を付けることがすぐに必要二成ると思われる患者）患者が挙げられる。
【０１３４】
例えば、本出願の組成物および方法から利益を受ける被検体としては、ｔスコアが、限定されないが、３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０、−０．１、−０．２、−０．３、−０．４、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、−０．９、−１．０、−１．１、−１．２、−１．３、−１．４、−１．５、−１．６、−１．７、−１．８、−１．９、−２．０、−２．１、−２．２、−２．３、−２．４、−２．５、−２．６、−２．７、−２．８、−２．９、−３．０、−３．１、−３．２、−３．３、−３．４、−３．５、−３．６、−３．７、−３．８、−３．９、−４．０、−４．１、−４．２、−４．３、−４．４、−４．５、−４．６、−４．７、−４．８、−４．９、−５．０、−５．１、−５．２、−５．３、−５．４、−５．５、−５．６、−５．７、−５．８、−５．９および−６．０の被検体が挙げられる。しかし、本出願は、そのようなものに限定されない。例えば、ある実施形態では、本出願の組成物および方法から利益を受ける被検体は、ｔスコアが３より大きい被検体、または−６．０より小さい被検体も含む。
【０１３５】
ある実施形態では、本出願の組成物および方法から利益を受ける被検体は、年齢が４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、またはもっと高齢の被検体を含む。しかし、本出願は、そのようなものに限定されない。例えば、ある実施形態では、本出願の組成物および方法から利益を受ける被検体は、４０歳より若い年齢の被検体（例えば、がんを有する被検体、神経変性疾患を有する被検体、慢性炎症性疾患を有する被検体など）を含む。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態でセレンを含む有効な量の組成物を、サルコペニアを処置することが必要な被検体（例えば、ヒトまたは動物被検体）に投与することを含む、サルコペニアを処置する方法を提供する。
【０１３７】
（肥満、２型糖尿病および関連する状態）
サルコペニアおよび肥満は、先進国において、平均余命および健康管理費用への影響が増しつつある、２つの、独立しているが内部でつながった状態である。筋肉質量の減少と、脂肪質量の増加の組み合わせは、「サルコペニア肥満」と呼ばれる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３を参照）。肥満は、脂肪質量の上昇と脂肪の蓄積を促進し、骨格筋へのアミノ酸の組み込みを抑制し、タンパク質合成を低下させるため、サルコペニアを悪化させる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３を参照）。次いで、骨格筋の質量は、全身のグルコース処理、インスリン感受性に基本的な役割を有するという点で、代謝の健康にとって重要であり、サルコペニアが肥満を悪化させる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３）。サルコペニアに加え、肥満は、多くは、例えば、ＩＩ型糖尿病、高血糖その他の他の代謝性疾患に関連する副作用である。遺伝的な病気のかかりやすさ、肥満に関連する分子の発現も、寄与因子であることが十分に理解される。
【０１３８】
肥満は、先進国において、平均余命および健康管理費用への影響が増しつつある（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３を参照）。肥満は、例えば、ＩＩ型糖尿病、高血糖代謝症候群、インスリン抵抗性などを含め、いくつかの代謝性疾患と関係がある。増加した肥満に関連する遺伝学および特定の遺伝子の発現が、これらの疾患に寄与する役割を果たすことが理解される。
【０１３９】
このような一例は、脂肪質量および肥満に関連する遺伝子（ＦＴＯ）であり、「肥満遺伝子」とも呼ばれる。ＦＴＯは、子供および成人において、ボディマス指数の上昇および肥満になりやすさに強く関係がある（例えば、Ｇｕｌａｔｉら、ＰＮＡＳ、２０１３．１１０（７）：ｐ．２５５７−２５６２を参照）。ＦＴＯ遺伝子は、広範囲に発現するが、脳において、海馬内、小脳および視床下部でｍＲＮＡレベルが特に高く、食物摂取、全身の代謝および肥満の制御に脳ＦＴＯが何らかの役割を果たしている可能性を示唆する（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００９を参照）。
【０１４０】
セレンの投与がＦＴＯの発現を変え得るかどうかを決定するために、さらなる本出願の実施形態の開発中に行われる実験を行った。実施例２に記載される動物モデルを利用し、皮質組織（発現差＝−１．７０）だけではなく、腓腹組織（発現差＝−３．３３）において、コントロール被検体と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与された被検体が、顕著に低下したレベルのＦＴＯ遺伝子発現を示すことが決定された。
【０１４１】
２型糖尿病を有する被検体において、ＦＴＯ発現の増加と、ミトコンドリアの酸化機能の低下とに強い関係が存在する（例えば、Ｂｒａｖａｒｄら、２０１１を参照）。セレンを豊富に含む酵母から特定され、単離されたいくつかのセレン含有化合物は、複合体ＩまたはＩＩに依存する基質を用い、増加したミトコンドリアＡＴＰ合成能力、および最大呼吸能の増加と共に、顕著に優れたミトコンドリアの生体エネルギー生成能を有することを発見した。従って、本出願は、ある実施形態では、セレンを含む有効な量の組成物（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクション、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母の抽出物（例えば、酸性条件で可溶性）、可溶性セレノ糖タンパク質、セレン含有化合物（例えば、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）から得られるか、またはこれらから誘導されるもの、またはこれらの誘導体、単離されたセレン含有化合物、または合成されたセレン含有化合物（例えば、セレノエーテル、ジペプチドおよび／またはトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールまたはセレンオキシド（またはその誘導体）、本明細書に記載されるセレンを含有するタンパク質および／またはセレンを含有するペプチド（例えば、実施例１）を、被検体に投与する（例えば、それによって、ミトコンドリアのＡＴＰ産生を高め、ミトコンドリアの呼吸を増加させ、糖代謝を増加させ、および／または肥満に関連する分子（例えば、ＦＴＯ）の発現を低下させる）ことを含む、被検体（例えば、糖尿病を有する被検体、および／または肥満被検体）を処置する方法を提供する。
【０１４２】
セレンを被検体に投与すると、被検体の肝臓および／または骨格筋においてＯＸＰＨＯＳ活性を変えることができるかどうか（例えば、２型糖尿病の治療薬として）を観察するために、本出願の実施形態の開発中に実験も行った。本出願の実施形態の開発中に作られた経験的データは、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、コントロール被検体と比較して、骨格筋におけるＰＣＧ１−αの発現を顕著に高めることが発見された。
【０１４３】
ＰＧＣ１−αは、筋骨格においてミトコンドリア活性を高める、強力な転写コアクチベーターである。しかし、骨格筋以外の組織において高いレベルのＰＧＣ１−αの発現は、被検体において悪い影響および／または有害な影響を有する場合がある。例えば、肝臓において、ＰＧＣ１−αは、骨格筋において機能を果たす役割以外の異なる役割を果たす。特に、肝臓においてＰＧＣ１−αレベルが上昇すると、糖新生を増加させ（グルコース産生；例えば、ＬｉａｎｇおよびＷａｒｄ、２００６を参照）、インスリン感受性の不全を伴い、特に望ましくない事象が糖尿病被検体で起こり、グルコースを代謝に使用することができない。
【０１４４】
予測できないことだが、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与によって、コントロール被検体と比較して、肝臓組織においてＰＧＣ１−αの顕著な減少が発見された。この発見は、驚くべきことに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、コントロール被検体と比較して、骨格筋におけるＰＧＣ１−αの発現が顕著に向上したという観察に基づいていた。従って、ある実施形態では、本出願は、被検体の肝臓におけるＰＧＣ１−αの発現を同時に下げつつ（例えば、それによって、（例えば、ＯＸＰＨＯＳを高めることによって）糖代謝および骨格筋での処理が向上した被検体を与え、肝臓でのグルコース産生を抑制し）、被検体の骨格筋におけるＰＣＧ１−αの発現を高める方法で使用するための、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物（例えば、実施例１に記載される）を含む組成物を提供する。
【０１４５】
ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ（ＣＯＵＰ転写因子２）は、Ｎｒ２Ｆ２（核受容体サブファミリー２グループＦメンバー２）としても知られ、ＰＧＣ１−αの推定直接阻害剤である（例えば、Ｌｉｎら、２０１１を参照）。実験を行い、セレンを含む組成物が投与された被検体におけるＮｒ２Ｆ２の発現を分析した。ここでも再び、驚くべきことに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、コントロール被検体と比較して、骨格筋におけるＮｒ２Ｆ２発現が顕著に減少したことを発見し、一方、コントロールと比較して、肝臓組織においてＮｒ２Ｆ２の顕著な上昇があった。従って、本出願は、被検体の複数の組織（例えば、骨格筋組織および肝臓組織）におけるグルコースホメオスタシスを制御するときに使用するための、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはこれらの１つ以上の水溶性フラクション、またはこれらの１つ以上の水不溶性フラクション、またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物（実施例１を参照））の形態でセレンを含む組成物の有用性に関する最初の証拠を与える。
【０１４６】
従って、本出願は、ある実施形態では、被検体の肝臓におけるＰＧＣ１−αの発現を同時に下げつつ（例えば、それによって、糖代謝および骨格筋での処理が向上した被検体を与え、肝臓でのグルコース産生を抑制し）、被検体の骨格筋におけるＰＣＧ１−αの発現を高める、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む有効な量の組成物（またはこれらの１つ以上の水溶性フラクション、またはこれらの１つ以上の水不溶性フラクション、またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物）を投与することを含む、被検体（例えば、２型糖尿病を有する被検体）を（治療的または予防的に）処置する方法を提供する。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、被検体の骨格筋において糖代謝／処理が向上し、同時に、被検体の肝臓においてグルコース産生を抑制されることは、被検体に投与したとき、セレンが被検体の骨格筋におけるＮｒ２ｆ２の発現を低下させ（例えば、それによって、骨格筋におけるＰＧＣ１−α発現を高め）、被検体の肝臓におけるＮｒ２ｆ２の発現を高める（例えば、それによって、肝臓におけるＰＧＣ１−αの発現が減少する）能力によって起こる。
【０１４７】
本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の投与によって、肝臓特異的なミトコンドリア活性を優先的に、差次的に制御することができ、一方、亜セレン酸セレンまたはセレノメチオニンを投与すると、顕著に有効性が低いことも提供する。従って、本出願は、被検体に対するセレン（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、亜セレン酸ナトリウムなど）の投与を使用し、グルコースを燃やす（ＯＸＰＨＯＳ）遺伝子の肝臓特異的な発現および／または糖代謝を誘起し／高めてもよいことを提供する。従って、ある実施形態では、本出願は、セレン（例えば、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む）、またはこれらの１つ以上の水溶性フラクション、またはこれら１つ以上の水不溶性フラクション、またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物、亜セレン酸ナトリウムなど）を、肝臓におけるグルコース利用を増加させることが必要な被検体（例えば、２型糖尿病被検体）に投与することによる、被検体の肝臓におけるグルコース利用を増加させる方法を提供する。
【０１４８】
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、本明細書に記載されるセレン組成物が投与された被検体の肝臓におけるＯＸＰＨＯＳ遺伝子発現の増加が、コントロールと比較して、中程度ではあるが顕著な発現の増加（約２０〜２５％）を示したことを示した。この増加は、インスリン抵抗性の糖尿病被検体においてみられる、示され、対応する遺伝子発現の減少に従ったものである（例えば、Ｍｏｏｔｈａら、２００４を参照）。従って、ある実施形態では、本出願の組成物および方法は、被検体において２型糖尿病を処置するために利用される（例えば、機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、本出願は、肝臓特異的なミトコンドリア活性を高める（例えば、２型糖尿病被検体で観察されるミトコンドリア活性の低下を回復させる）組成物および方法を提供する。
【０１４９】
実施例１で特定される特定のセレン含有化合物が、生体活性を有するかどうかを決定するために（例えば、セレン含有化合物が生体活性を示すかどうか、および／またはセレン含有化合物が、酵母細胞および／または他のものとの内部での混ぜ合わせ、セレンを含有しない細胞要素の制限から単離され、精製された場合に、もっと大きな（またはもっと小さな）生体活性を有するかどうかを決定するために）、さらに、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。実施例１においてセレンを豊富に含む酵母から特定された多くの最も豊富に含むセレン含有化合物および分子を合成した。
【０１５０】
この実験の１つの着目点は、セレンを豊富に含む酵母中に存在する全セレンの２５％までを占める、実施例１に記載されるような水溶性抽出物である。水溶性抽出物からのセレン含有化合物は、被検体によって消費され、腸管を通ると、セレンを豊富に含む酵母から最初に放出／消化されることが想定された。上の実施例１にも記載されるように、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレンを含有するタンパク質は、コンピュータを用いる予測モデリングを用いて特定された。さらに、実験は、消化酵素（例えば、トリプシン）の作用によって放出されるセレンを含有する小さいペプチドを特定した。
【０１５１】
分析および特性決定のために複数のセレン含有化合物を作成した。効果がある場合には、個々のセレン含有化合物が、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能を有するという潜在的な効果を決定するために、単離されたミトコンドリアを用い、セレン含有化合物を直接的に試験した。いくつかのセレン含有化合物は、すべての３つの状態の呼吸において、ミトコンドリア活性の正の増加を示し、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能プロフィールが増加した。従って、本出願は、セレン含有化合物（例えば、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）、メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）、セレノアデノシルホモシステイン（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ６Ｏ５Ｓｅ））および実施例１で特定される他の化合物）、被検体のミトコンドリア活性／生体エネルギー生成能を調整するときに使用するための、これらを含む組成物（例えば、これを必要とする被検体（例えば、２型糖尿病被検体））の特定および特性決定を提供する。
【０１５２】
例えば、ある実施形態では、本出願は、（例えば、実施例１（例えば、状態または疾患（例えば、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、代謝症候群、慢性炎症（例えば、肝臓、脂肪組織など）、脂肪肝など）の処置のための医薬の製造において使用するための））本明細書に記載されるセレン含有化合物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。ある実施形態では、本出願は、本明細書に（例えば、実施例１に）記載するセレン含有化合物を被検体に投与し、ミトコンドリア活性（例えば、骨格筋特異的または肝臓特異的なミトコンドリア活性（例えば、被検体において糖代謝を高める））を高めることを含む、ミトコンドリア活性を高めることが必要な被検体を処置する方法を提供する。ある実施形態では、本出願は、本明細書に（例えば、実施例１に）記載するセレン含有化合物を被検体に投与し、ミトコンドリア活性（例えば、骨格筋特異的または肝臓特異的なミトコンドリア活性を高めることを含む、被検体（例えば、糖尿病被検体）を処置する方法を提供する。機構の理解は、本出願を実施するのに必要ではないが、本出願は、特定の作用機序に限定されず、ある実施形態では、被検体におけるミトコンドリア活性（例えば、骨格筋特異的または肝臓特異的なミトコンドリア活性）を高めることは、ミトコンドリア内のＡＴＰ合成を高めることによって起こる。ある実施形態では、被検体においてミトコンドリア活性（例えば、骨格筋特異的または肝臓特異的なミトコンドリア活性）を高めることは、呼吸能（例えば、最大呼吸能（例えば、複合体ＩまたはＩＩに依存する基質を用いる））の増加によって起こる。
【０１５３】
別の驚くべき知見は、ミトコンドリアと共にインキュベートしたとき、特定のセレン含有化合物が、ミトコンドリアの活性を高める特性を示すが、多くの他のセレン含有化合物が特定され、特性決定される場合とは異なるという事実であった。例えば、いくつかのセレン含有化合物は、ミトコンドリア活性に対して負の影響を示した。特に、驚くべきことに、全体的な構造の中でいくつかの類似部分を共有するいくつかのセレン含有化合物は、ミトコンドリア活性を変える能力について、非常に異なる生物学的特性を示すことがわかった。例えば、グルタミルセレノシステイン（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２４Ｏ１０Ｓｅ２）（１０番）は、全体的な構造が、ＡＴＰ合成が１７．３％増加したメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）と類似しており、それほど大きく異ならないにもかかわらず、ＡＴＰ合成をほぼ１９％まで減少させた（ＩＩＩ状態）。セレンを豊富に含む酵母中に存在するこれら２種類のセレン含有化合物間で、ミトコンドリア活性に対する影響が３６％より多く変化している。
【０１５４】
本出願のセレンを含有する組成物のいくつかが、ミトコンドリア複合体Ｉの活性を高める能力を示すという事実に起因して、セレン含有化合物によって、損傷を与える活性酸素種（ＲＯＳ）を除去することでミトコンドリアの刺激を起こすかどうかを決定するために、実験を行った。従って、セレン含有化合物の酸化防止能を評価するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。
【０１５５】
セレン含有化合物のいくつかが酸化防止能を有する／示すことを発見した。さらに、セレン含有化合物のいくつかが、酸化防止能を有し／示し、この能力は、相加的、または軽度に相乗的であり、軽度に拮抗性であり、または相乗的である（例えば、酸素ラジカル捕捉能の観点で）。
【０１５６】
本出願の実施形態の開発中に作られたデータおよび情報は、固有で予想されない知見である。特に、本出願は、ミトコンドリア機能不全または不十分さ（例えば、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病性心筋症などに関する）の処置（例えば、予防的および／または治療的な処置）のための新しい組成物および方法を提供する。ある実施形態では、本出願は、望ましい特異的なミトコンドリア活性を高める能力を含む組成物を生成するように合わされた、２以上のセレン含有化合物（例えば、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物）を含む組成物を提供する。
【０１５７】
例えば、ある実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）の別個のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む。ある実施形態では、本出願は、特定の使用のために調整された（例えば、組み合わせたとき、望ましいレベルの生体活性（例えば、刺激活性および／または阻害活性））を示す、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）のセレン含有化合物（例えば、単離されたセレン含有化合物、化学合成されたセレン含有化合物、または組み換えセレン含有化合物）の組み合わせを含む組成物を提供する。
【０１５８】
例えば、ある実施形態では、筋肉組織におけるミトコンドリア活性（例えば、ＡＴＰの産生および／または呼吸）を高めるために、２以上のセレン含有化合物の組み合わせを含む第１の組成物が利用され、一方、２以上の異なるセレン含有化合物の組み合わせを含む第２の組成物（例えば、第１の組成物とは異なる生体活性を示す）は、肝臓組織におけるミトコンドリア活性（例えば、ＡＴＰ産生および／または糖代謝）を変えるために利用される。ある実施形態では、本出願は、セレン含有化合物（例えば、実施例１に特定される）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。ある実施形態では、本出願は、ＰＤＨＣ酵素活性を高め、および／またはミトコンドリア複合体Ｉ活性を高めることが必要な被検体（例えば、ＩＩ型糖尿病被検体）に、セレン含有化合物（例えば、実施例１に記載される）を含む有効な量の組成物（例えば、医薬組成物）を投与し、ミトコンドリア複合体Ｉおよび／またはＰＤＨＣ活性を増加させ（例えば、それによって、被検体（例えば、骨格筋および／または肝臓）におけるミトコンドリア呼吸を高めることを含む、被検体においてＰＤＨＣ酵素活性を高め、および／またはミトコンドリア複合体Ｉ活性を高める方法を提供する。
【０１５９】
ある実施形態では、セレンを含む医薬的に有効な量の組成物（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、２％以下の無機セレンを含む水溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母、２％以下の無機セレンを含む水不溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母、セレンを豊富に含む酵母の抽出物（例えば、酸性条件で可溶性）、可溶性セレノ糖タンパク質、セレン含有化合物（例えば、セレンを豊富に含む酵母（例えば、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母）から得られるもの、またはこれらから誘導されるもの、またはこれらの誘導体、単離されたセレン含有化合物または合成されたセレン含有化合物（例えば、セレノエーテル、ジペプチドおよび／またはトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールまたはセレンオキシド（またはこれらの誘導体）、本明細書に記載されるセレンを含有するタンパク質および／またはセレンを含有するペプチド（例えば、実施例１）を単独で、または別の薬剤と組み合わせて、肥満またはインスリン抵抗性に関連する状態を有する被検体に投与することを含む、処置方法が本明細書に提供される。ある実施形態では、投与によって、その状態の１つ以上の症状が減少するか、またはなくなり、その状態の１つ以上の症状の重篤度が上がるのを防ぎ、および／またはさらなる疾患または状態が減少するか、防ぐか、またはなくなることの１つ以上が生じる。
【０１６０】
特定の実施形態では、インスリン抵抗性は、被検体の脂肪細胞、肝細胞または筋肉細胞で起こる。特定の実施形態では、インスリン抵抗性によって、被検体の糖代謝が損なわれる。さらなる実施形態では、本出願のセレンを含有する組成物を投与すると、被検体（例えば、脂肪細胞、肝臓および／または骨格筋による）において糖代謝が上昇する。ある実施形態では、糖代謝の上昇は、ミトコンドリアのＡＴＰ合成、ミトコンドリアの呼吸、および／またはインスリン受容体シグナル伝達の上昇によって引き起こされる。
【０１６１】
特定の実施形態では、本出願のセレンを含有する組成物を投与すると、被検体の体脂肪が減少する（例えば、被検体の脂肪細胞の大きさおよび／または数が減少する）。特定の実施形態では、投与によって、被検体は、少なくとも１０ポンド（例えば、１０、１５、２０、３５、６０、１００、２００ポンド以上）減る。ある実施形態では、投与によって、被検体の体重が少なくとも５％（例えば、少なくとも７％、１０％、２０％、３０％、５０％、７５％以上）低下する。ある実施形態では、処置される状態は、肥満である。他の実施形態では、処置される状態は、糖尿病（例えば、ＩＩ型、またはＩ型とＩＩ型の両方）である。さらなる実施形態では、処置される状態は、インスリン抵抗性である。
【０１６２】
ある実施形態では、被検体は、状態（例えば、肥満、糖尿病およびインスリン抵抗性）を経験しているか、または経験するリスクがある。ある実施形態では、処置によって、糖代謝の増加、体脂肪の減少、体脂肪が増加しないこと、インスリン受容体のシグナル伝達を増加すること、ミトコンドリア活性の上昇／向上、肝臓の慢性炎症の低下または予防、脂肪組織の慢性炎症の低下または予防、脂肪肝の低下または予防、代謝エネルギー消費の促進、循環脂肪酸の減少、および／またはコレステロールの減少といった転帰を生じる。
【０１６３】
本明細書に提供される方法および医薬的に許容される組成物によって処置され得る状態および疾患の状態としては、限定されないが、肥満、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、代謝症候群、インスリン抵抗性症候群、脂質代謝状態および脂肪肝疾患（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）（脂肪肝疾患（ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれる）が挙げられる。脂肪肝疾患は、脂肪肝単独（脂肪症）から炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）であってもよい。
【０１６４】
（生殖能力）
本明細書に提供される方法および医薬的に許容される組成物によって処置され得る状態および疾患の状態としては、限定されないが、肥満、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、代謝症候群、インスリン抵抗性症候群、脂質代謝状態および脂肪肝疾患（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）（脂肪肝疾患（ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれる）が挙げられる。脂肪肝疾患は、脂肪肝単独（脂肪症）から炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）であってもよい。
【０１６５】
高齢出産（３５歳以上）で子供をもつ近年の社会情勢は、健康管理サービスの需要への影響が高まりつつある。生殖能力の低下に加え、３５歳を超えた女性は、出産時合併症および先天異常のリスクが高い（例えば、Ｎｏｄａら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２０１２．８６（１）：ｐ．１−８を参照）。米国で行われた研究は、高齢出産は、死産に関連する最もよくあるリスク因子の１つであり、高い割合で産科の介入があるにもかかわらず、高齢出産年齢の女性は、早産、帝王切開および低出産体重（ＬＢＷ）の率が高いと結論づけられている（例えば、Ｎｏｄａら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２０１２．８６（１）：ｐ．１−８を参照）。
【０１６６】
さらに、前から存在している母体の医学的状態（例えば、肥満および糖尿病）は、高齢出産に伴って増加する。妊娠に関連する母体の合併症（例えば、子癇前症および妊娠糖尿病）（例えば、Ｈｏｑｕｅ、Ｍ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ：Ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ．２０１２を参照）。肥満によって、女性の排卵を減らすだけではなく、規則的に排卵する女性の妊娠の機会も顕著に低下する。母体肥満のマウスモデルは、卵母細胞のミトコンドリアにおける紡錘異常の高い発生率および活性酸素種（ＲＯＳ）生成の増加も示した（例えば、Ｍｉｌｌｓら、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１．２１（４）：ｐ．１０７−１１１）。卵母細胞が糖尿病の母体においてさらされる毒性状態（例えば、ＲＯＳの増加）は、顕著なミトコンドリア損傷を誘発する（例えば、Ｓｈａｕｍ、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３を参照）。さらに、マウス糖尿病モデルは、顆粒膜細胞のアポトーシスの増加および卵母細胞の成熟不全を示した（例えば、Ｓｈａｕｍ、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３を参照）。これらの動物モデルおよび他の動物モデルの研究は、肥満および糖尿病における卵母細胞機能不全の役割を強調している。
【０１６７】
肥満、糖尿病および生殖能力の関係は、３５歳を超える女性における、進行中の肥満の発生、糖尿病の罹患、出産日の遅れがあるときに特に関心が高い（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２００５．１４６（５）：ｐ．２４４５−５３を参照）。
【０１６８】
近年のデータは、老化プロセスに対するミトコンドリア、点突然変異の蓄積およびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の欠失の中心的な役割を示唆している。機能不全のミトコンドリアおよびその後のＡＴＰの産生の低下は、卵母細胞の質を損なう主な因子の１つである（例えば、Ｂｅｎｔｏｖら、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ２０１３．９９（１）を参照）。ミトコンドリアの複製および膨張の間、卵母細胞は、ミトコンドリアの集合を顕著に増幅し、最大数のミトコンドリアおよび任意の細胞のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピーを含む。
【０１６９】
不十分な卵巣を有する女性の卵母細胞は、正常な卵巣プロフィールよりも少ないｍｔＤＮＡコピー数を含むことが報告されている。興味深いことに、雌のｍｔＤＮＡ−ミューテータマウス（ＰＯＬＧ、本明細書に記載される）は、生殖能力が顕著に低下している高齢出産年齢の個人の表現型と同様の時期尚早な表現型特徴を発現し、数ヶ月間雄にさらされていても２０週齢を超えても妊娠することができなかった（例えば、Ｙｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１０．３：ｐ．６７２−８０を参照）。これらの研究および他の研究は、加齢による生殖機能の低下は、卵母細胞の優先的な選択の結果ではなく、加齢プロセスの影響であり、もっと具体的には、ミトコンドリアの機能に加齢が与える影響であることを示した。
【０１７０】
高レベルの活性酸素種ＲＯＳは、ｍｔＤＮＡの損傷と強い関係があり、細胞ＲＯＳの約９０％が、複合体ＩおよびＩＩＩでミトコンドリアによって作られる。
【０１７１】
濾胞液中のＲＯＳのレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精の成功を予測するために使用することができ、腹膜液中の高レベルのＲＯＳは、任意の他の明らかな原因を有さない女性の不妊の原因ではないかと疑われている（例えば、Ｔｒｉｆｕｎｏｖｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４．４２９（６９９０）：ｐ．４１７−４２３を参照）。それに加え、ベースラインの全酸化防止能（ＴＡＣ）のレベルは、卵母細胞がうまく受精した小胞において、高くなっていることが示されている（例えば、Ｃｕｐｔａら、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ、２０１１．２３（５）：ｐ．６７３−８０を参照）。
【０１７２】
従って、ある実施形態では、本出願は、生殖能力（例えば、卵母細胞（例えば、高齢の卵母細胞）において）を高め、および／または維持する組成物および方法を提供する。ある実施形態では、セレンを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるセレン含有化合物）を、生殖能力を維持するか、または高めるのに有効な量で、処置を必要とする被検体（例えば、妊娠したいと望む被検体）に投与する。本出願は、さらに、ある実施形態では、生殖能力を維持し、および／または高めるための医薬または栄養補助物質の製造におけるセレンを含む組成物（例えば、本明細書に記載される）の使用も提供する。ある実施形態では、本出願の組成物および方法は、（例えば、活性酸素種の減少および／または全酸化防止能の増加（例えば、ミトコンドリア内）によって）卵母細胞の質、量および／または機能を向上させるために利用される。
【０１７３】
従って、本出願は、細胞内のミトコンドリアの機能不全によって引き起こされる徴候または症状を示す疾患を含め、本出願の組成物および方法を利用して種々のミトコンドリア疾患を処置することができることを提供する。ミトコンドリア疾患の例としては、限定されないが、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび卒中様事象（ＭＥＬＡＳと呼ばれる）、慢性進行性外眼筋麻痺、赤色ぼろ線維に関連するミオクローヌス癲癇；Ｆｕｋｕｈａｒａ症候群、Ｌｅｂｅｒ病、Ｌｅｉｇｈ脳症およびＰｅａｒｓｏｎ病が広く知られている。
【０１７４】
ある実施形態では、本出願は、被検体における骨格筋の代謝または骨格筋のエネルギーホメオスタシス、または肝臓の代謝または肝臓のエネルギーホメオスタシスを制御する方法を提供する。このような方法では、セレンを含む有効な量の組成物（例えば、本明細書に記載される）は、上の処置が必要な被検体に投与される。被検体において骨格筋の代謝または骨格筋のエネルギーホメオスタシスを制御するための方法は、ミトコンドリア活性（例えば、本明細書に記載されるような）を調整するセレンを含む組成物（例えば、本明細書に記載される）を、上の処置が必要な被検体に投与することを含む。（例えば、化学療法薬（例えば、がんおよび／または自己免疫疾患を処置するために用いられる）を用いて処置している間および／処置した後、肝臓および／または筋肉の活性に対する特定の薬物の影響を調整するために、本出願の組成物および方法を使用してもよい。本出願の組成物および方法を使用し、健康上の問題の性能（例えば、身体の性能）を高めてもよい。
【０１７５】
ある実施形態では、セレンを含む組成物（例えば、本明細書に記載される）は、（例えば、ミトコンドリア機能不全に関連する状態または疾患を（例えば、予防的または治療的に）処置するために）被検体のミトコンドリアの機能および／または活性を高めるために、ミトコンドリアの機能および／または活性を高めることが必要な被検体に投与される。ある実施形態では、本明細書に記載するセレンを含む組成物を投与すると、被検体におけるミトコンドリアの細胞死が減る。ある実施形態では、本明細書に記載するセレンを含む組成物を投与すると、被検体における活性酸素種の生成が減る。ある実施形態では、本明細書に記載するセレンを含む組成物を投与すると、被検体における低酸素症に関連する徴候、症状または状態を減らす。ある実施形態では、本明細書に記載するセレンを含む組成物を投与すると、被検体においてミトコンドリアのＡＴＰ産生を増やす。ある実施形態では、本明細書に記載するセレンを含む組成物を投与すると、被検体におけるミトコンドリアの呼吸を増加させる。
【０１７６】
本出願の組成物および方法を用いて処置することができる心血管系疾患としては、心筋症または心筋炎；例えば、突発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬物誘発型心筋症、虚血心筋症および高血圧性心筋症が挙げられる。また、本明細書に記載する組成物および方法を用いて処置または予防することができるのは、大血管のアテローム性障害（大血管疾患）、例えば、動脈、冠状動脈、頸動脈、脳血管動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈および膝窩動脈である。処置または予防が可能な他の血管疾患としては、網膜小動脈、糸状体小動脈、神経の脈管、心臓小動脈および眼の関連する毛細血管床、腎臓、心臓および中枢神経系および末梢神経系に関連するものが挙げられる。
【０１７７】
同様の様式で、本出願の組成物および方法を使用し、筋肉の疾患を（例えば、予防的および／または治療的に）処置してもよい。筋肉の疾患としては、限定されないが、筋萎縮症およびミオパシーが挙げられる。
【０１７８】
本出願の組成物および方法を利用し、インスリン抵抗性障害を処置してもよい（例えば、インスリン抵抗性によって引き起こされるか、またはインスリン抵抗性が寄与する任意の疾患または状態）。例としては、限定されないが、糖尿病、肥満、代謝症候群、インスリン抵抗性症候群、症候群Ｘ、インスリン抵抗性、高い血圧、高血圧、高コレステロール血、脂質異常症、高脂肪血症、脂質異常症、卒中を含むアテローム性疾患、環状動脈疾患または心筋梗塞、高血糖、高インスリン血症および／または高プロインスリン血症、耐糖能障害、インスリン分泌遅延、糖尿病合併症（肝動脈心疾患を含む）、狭心症、鬱血性心不全、卒中、痴呆における認知機能、網膜症、末梢神経障害、腎障害、糸球体腎炎、糸球体硬化、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化、妊娠合併症、女性の性に関わる健康問題（例えば、月経不順、不妊症、不規則排卵、多嚢胞卵巣症候群（ＰＣＯＳ））、脂肪異栄養症、コレステロール関連障害、例えば、胆石、胆嚢炎および胆石症、痛風、閉塞型睡眠時無呼吸および呼吸問題、骨関節炎および骨損失の予防および処置、例えば、骨粗鬆症が挙げられる。
【０１７９】
本出願は、被検体に投与されるセレンの種類によって制限されない。セレン源は、合成源または天然源であってもよく、セレンは、有機または無機であってもよい。本明細書に記載され、被検体において処置が求められる標的に依存して、複数の形態のセレンを独立して、または互いに組み合わせて使用してもよい。好ましい実施形態では、被検体は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（例えば、ＳＥＬＰＬＥＸ）の形態でセレンを投与される。ある実施形態では、本出願は、セレン含有化合物（例えば、セレンを豊富に含む酵母から得られるか、またはこれらから誘導される）またはこれらの誘導体の使用および投与も提供する。ある実施形態では、本出願は、セレンを豊富に含む酵母から調製されるセレンを含有するフラクションの使用および投与を提供する。例えば、ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクションを含む。ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクションを含む。
【０１８０】
ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、第１のｐＨ（例えば、ｐＨ１．８５）で抽出および／または沈殿されるセレンを豊富に含む酵母の抽出物（例えば、酸性条件で可溶性（例えば、可溶性セレン含有化合物のフラクション（例えば、可溶性セレノ糖タンパク質）、第２のｐＨ（例えば、ｐＨ３．０）で沈殿する第２のフラクション、第３のｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で沈殿する第３のフラクション、および第４のｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）で沈殿した第４のフラクション））を含む単一の液体相を含む。ある実施形態では、被検体に投与されるセレンを含む組成物は、２０１２年６月２８日に公開された米国特許公開第２０１２０１６４２３４Ａ１号に記載されるように調製されたセレンを豊富に含む酵母の抽出物（その全体が本明細書に参考として組み込まれる）を含む。
【０１８１】
ある実施形態では、本出願は、１つ以上のセレン含有化合物（例えば、セレノエーテル、ジペプチドおよび／またはトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールおよびセレンオキシド（またはその誘導体）、セレンを含有するタンパク質および／またはセレンを含有するペプチド、これらを含む組成物、これらを用いる方法（例えば、本明細書に記載されるようなヒトおよび／または動物の使用）（実施例１を参照）を提供する。
【０１８２】
例えば、ある実施形態では、（例えば、本出願の方法で）被検体に投与される、セレンを含む組成物は、以下の１つ以上を含む。２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイン、Ｎ−アセチルセレノシステイン−セレノホモシステイン、メチルチオセレノグルタチオン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイニルグリシン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン−システイニルグリシン、セレノメチル−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−システイン、グルタチオン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、ジ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−２，３  ＤＨＰセレノホモシステイン、グルタチオン−Ｎ−アセチルセレノホモシステイン、グルタチオン−セレノシステイニルグリシン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、セレノグルタチオン−チオ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−グルタチオン、セレノジグルタチオン、ジ−セレノグルタチオン、チオ−ジセレノグルタチオン、メチルデヒドロホモシステイン、セレノメチオニン、セレノホモランチオニン、Ｎ−アセチルセレノシスタチオニン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノランチオニン、エチルセレノアデノシン、Ｎ−プロピオニルセレノシスタチオニン、２，３−ＤＨＰ−セレノシスタチオニン、メチルセレノグルタチオン、γ−グルタモイルセレノシスタチオン、セレノグルタチオン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド。ある実施形態では、本出願は、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物を特定する方法（例えば、実施例１に記載される方法）を提供する。
【０１８３】
ある実施形態では、（例えば、本出願の方法で）被検体に投与される、セレンを含む組成物は、１つ以上のタンパク質またはペプチドフラグメントを含み、タンパク質またはペプチドの１つ以上のアミノ酸残基中に存在する１個以上の硫黄分子は、セレン分子で置換される。本出願は、特定のセレンを含有するタンパク質またはペプチドに限定されない。好ましい実施形態では、（例えば、本出願の方法で）被検体に投与される、セレンを含む組成物は、１つ以上のペプチドフラグメントを含み、ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基中に存在する１個以上の硫黄分子は、以下のものからのセレン分子で置換される。ＭＶＡＥＡＥＫ、ＤＹＭＧＡＡＫ、ＹＭＧＡＡＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＮＱＡＡＭＮＰＳＮＴＶＦＤＡＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＮＦＴＰＥＱＩＳＳＭＶＬＧＫ、ＭＶＳＥＡＥＫ、ＰＥＶＱＧＤＭＫ、ＥＬＱＤＩＡＮＰＩＭＳＫ、ＡＭＳＳＲ、ＶＱＧＳＶＩＧＩＤＬＧＴＴＮＳＡＶＡＩＭＥＧＫ、ＡＡＡＥＧＰＭＫ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＰＦＶＳＮＤＹＡＡＹＭＶＫ、ＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫ、ＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫ、ＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＶＥＴＧＶＩＫＰＧＭＶＶＴＦＡＰＡＧＶＴＴＥＶＫ、ＡＡＡＴＡＡＭＴＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＷＭＧＫ、ＳＩＶＰＳＧＡＳＴＧＶＨＥＡＬＥＭＲ、ＡＭＰＱＫ、ＡＡＭＡＫ、ＨＶＧＤＭＥＩＲ、ＶＩＥＥＰＩＴＳＥＴＡＭＫ、ＶＬＱＡＬＥＥＩＧＩＶＥＩＳＰＫ、ＬＰＡＡＳＬＧＤＭＶＭＡＴＶＫ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＡＧＭＴＴＩＶＲ、ＭＬＭＰＫ、ＴＭＧＡＫ、ＭＮＡＧＲ、ＴＹＥＮＭＫ、ＭＧＨＤＱＳＧＴＫ、ＧＥＡＩＭＡＰＫ、Ａｃ−ＭＮＶＦＧＫ、ＡＭＥＶＶＡＳＥＲ、ＩＶＭＲ、ＭＡ（Ｉ／Ｌ）Ｒ、ＡＭＸＡＫ、ＤＬＥＴＬＴＭＨＴＫ、ＬＶＭＲ、ＶＭＲ、ＬＴＧＭＡＦＲ、ＳＲＰＮＶＥＶＶＡＬＮＤＰＦＩＴＮＤＹＡＡＹＭＦＫおよびＶＩＮＤＡＦＧＩＥＥＧＬＭＴＴＶＨＳＬＴＡＴＱＫ。
【０１８４】
本出願の種々の実施形態での用途が見出されるセレン含有化合物の他の形態は、米国特許第６，９１１，５５０号、第６，１９７，２９５号、第５，２２１，５４５号、６および第６，５７６，２３３号、および米国特許出願第２００１００４３９２５号、第２００５００６９５９４号および第２００５００８９５３０号に記載され、その全体が本明細書で参考として組み込まれる。
【０１８５】
ある実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）の別個のセレン含有化合物（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む。ある実施形態では、本出願は、特定の使用のために調整された（例えば、組み合わせたとき、望ましいレベルの生体活性（例えば、刺激活性および／または阻害活性））を示す、２以上（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、または５０以上）のセレン含有化合物（例えば、単離されたセレン含有化合物、化学合成されたセレン含有化合物、または組み換えセレン含有化合物）の組み合わせを含む組成物を提供する。例えば、ある実施形態では、筋肉組織におけるミトコンドリア活性（例えば、ＡＴＰの産生および／または呼吸）を高めるために、２以上のセレン含有化合物の組み合わせを含む第１の組成物が利用され、一方、２以上の異なるセレン含有化合物の組み合わせを含む第２の組成物（例えば、第１の組成物とは異なる生体活性を示す）は、肝臓組織におけるミトコンドリア活性を変えるために利用される。ある実施形態では、２以上のセレン含有化合物を含む組成物は、個人の特殊な遺伝子プロフィールに合わせて（例えば、特定の遺伝子またはタンパク質を標的とするために）カスタマイズされる。酵母抽出物またはフラクションは、個人における特定の疾患または状態の処置に使用するために、同様の様式でカスタマイズすることができる。このような様式で、処置を必要とする個々の被検体に合わせたカスタム配合が開発される。
【０１８６】
ある実施形態では、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから得られる１つ以上のセレン含有化合物の形態で、この形態で、または栄養物質（例えば、促進する、例えば、健康を増進するか、または生活を向上させる、処方箋のいらない組成物）と共に、セレンを含む組成物を提供する。
【０１８７】
さらなる実施形態では、本出願は、１つ以上のセレンの形態（例えば、上述のような）を、単独で、または、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、抗糖尿病薬、脂肪酸（例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））など）と組み合わせて含む医薬組成物を提供し、限定されないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水を含め、任意の滅菌の生体適合性の医薬担体で投与してもよい。
【０１８８】
本出願の方法は、被検体（例えば、糖尿病を有する被検体および／または肥満被検体）を（例えば、予防的または治療的に）処置するときの用途が見出される。セレン（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）を含む組成物を、医薬的に許容される担体（例えば、生理学的食塩水）中、被検体（例えば、患者）に静脈内投与してもよい。化合物の細胞内送達のための標準的な方法を使用してもよい（例えば、リポソームによる送達）。このような方法は、当業者によく知られている。セレンを含む組成物は、静脈内投与、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内）投与に有用である。
【０１８９】
医学分野でよく知られているように、任意の被検体への投薬量は、患者の大きさ、体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、同時に投与される他の薬剤との相互作用を含め、多くの因子によって変わってもよい。
【０１９０】
従って、本出願のある実施形態では、セレンを含む組成物および／または配合物を、単独で被検体に投与してもよく、または、セレンの他の形態、薬物、低分子との組み合わせで、または賦形剤または他の医薬的に許容される担体と混合した医薬組成物で投与してもよい。本出願の一実施形態では、医薬的に許容される担体は、医薬的に不活性である。本出願の別の実施形態では、セレンを含む組成物を、単独で、糖尿病および／または肥満の個々の被検体に、これらのリスクがある被検体に、またはこれらに悩まされる被検体に投与してもよい。
【０１９１】
セレンを含む組成物（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから誘導されるセレン含有化合物を単独で、または１つ以上の他の形態のセレンと組み合わせて）を、毎日消費するための栄養ドリンクまたは食品（例えば、ＥＮＳＵＲＥ、ＰＯＷＥＲＢＡＲなど）、マルチビタミン、栄養製品、食品などに加えてもよい。
【０１９２】
処置によって変えられることが求められる標的に依存して、医薬組成物を配合し、全身に投与してもよく、または局所的に投与してもよい。配合および投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．）の最新版に見出されるだろう。適切な経路は、例えば、経口投与または経粘膜投与、および非経口送達（筋肉内、皮下、骨髄内、髄腔内、心室内、静脈内、腹腔内、または経鼻投与を含む）を含んでいてもよい。
【０１９３】
注射の場合、本出願のセレンを含む組成物（例えば、医薬組成物）を、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性のバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、または生理学的な緩衝化生理食塩水で配合してもよい。組織または細胞への投与の場合、透過する特定の障壁に適した透過剤を配合剤に使用する。このような透過剤は、一般的に当該技術分野で公知である。
【０１９４】
他の実施形態では、本出願の医薬組成物は、経口投与に適した投薬量で、当該技術分野で周知の医薬的に許容される担体を用いて配合される。このような担体は、医薬組成物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして、また、処置される患者によって経口または経鼻摂取のために配合することができる。
【０１９５】
本出願で使用するのに適した医薬組成物としては、活性成分（例えば、セレンを豊富に含む酵母またはセレン含有化合物）が、意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。例えば、好ましい実施形態では、有効な量の医薬組成物は、ミトコンドリア活性（例えば、ＡＴＰの産生および／または呼吸）を高める量の２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、またはこれらの中に存在するか、またはこれらから誘導されるセレン含有化合物を含む。特に、本明細書に提供される本開示の観点で、有効な量の決定が、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９６】
活性成分に加え、医薬組成物は、活性化合物を医薬的に使用可能な調製剤に処理しやすくする賦形剤および補助剤を含む、適切な医薬的に許容される担体を含有してもよい。経口投与のために配合された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形態であってもよい。
【０１９７】
本出願の医薬組成物は、それ自体が知られている様式で（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠生産、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスによって）製造されてもよい。
【０１９８】
非経口投与のための医薬配合物としては、水溶性形態での活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪族油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてもよい。場合により、懸濁物は、適切な安定化剤、または高度に濃縮された溶液を調製するために化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。
【０１９９】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物と、固体賦形剤とを合わせ、場合により、得られた混合物を粉砕し、顆粒混合物を処理し、所望な場合、適切な補助剤を加えた後、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質フィラー、例えば、糖類（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモなど由来のデンプン；セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース；アラビアガムおよびトラガカントを含むガム類；タンパク質、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンである。所望な場合、崩壊剤または可溶化剤、例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはこれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）を加えてもよい。
【０２００】
糖衣錠コアは、適切なコーティング（例えば、濃縮糖溶液）を用いて与えられ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。生成物の特定のため、または活性化合物の質を特性決定するために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。
【０２０１】
経口で使用される医薬製剤としては、ゼラチンで作られるプッシュフィット型カプセル、軟質のゼラチンで作られる密閉されたカプセル、コーティング、例えば、グリセロールまたはソルビトールが挙げられる。プッシュフィット型カプセルは、フィラーまたはバインダー、例えば、ラクトースまたはデンプン、潤滑剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、場合により、安定化剤と混合した活性成分を含有していてもよい。柔らかいカプセルでは、活性化合物を、適切な液体（例えば、安定剤を含むか、または含まない、脂肪族油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）で溶解または懸濁してもよい。
【０２０２】
単独で、または医薬的に許容される担体に配合した本出願のセレンを含有する組成物を調製し、適切な容器に入れ、所定の状態を処置するためのラベルを付けてもよい。セレンを含む組成物または配合物の場合、ラベルに示された状態は、糖尿病および／または肥満、およびミトコンドリア活性（例えば、骨格筋および／または肝臓ミトコンドリア活性）の刺激から利益を受ける他の疾患または状態の予防的処置または治療的処置に関連する状態の処置を含んでいてもよい。
【０２０３】
医薬組成物は、塩として与えられてもよく、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含め、多くの酸を用いて作られてもよい。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性溶媒または他のプロトン性溶媒に可溶性が高い傾向がある。他の場合には、好ましい調製物は、使用前にバッファーと合わせてｐＨ４．５〜５．５のｐＨ範囲にする、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のスクロース、２％〜７％のマンニトール中、凍結乾燥した粉末であってもよい。
【０２０４】
本出願の方法で使用される任意の化合物について、治療に有効な投薬量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、好ましくは、投薬量は、望ましい循環濃度範囲を達成するように、動物モデル（特に、マウスモデル）に合うように配合することができる。
【０２０５】
有効な量（例えば、治療に有効な投薬量）は、被検体において糖尿病および／または肥満に関連する徴候、症状および／または状態を改善または防ぐ量を指す。このような化合物の毒性および治療効能は、例えば、ＬＤ５０（集合の５０％が死に至る投薬量）およびＥＤ５０（集合の５０％に対して治療に有効な投薬量）を決定するために、細胞培養物または実験動物中、標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の投薬量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよびさらなる動物試験から得たデータを、ヒトで使用するための投薬量範囲を配合するときに使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、またはまったくないＥＤ５０を含む循環血濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態、患者の感度、投与経路に依存して、この範囲内で変動する。
【０２０６】
実際の投薬量は、被検体によって、または処置される患者の観点で、医師によって選択されてもよい。投薬量および投与は、十分なレベルの活性部分を与えるか、または、望ましい影響（例えば、被検体における遺伝子発現の改変）を維持するように調整される。考慮してもよいさらなる因子としては、疾患の状態の重篤度；患者の年齢、体重および性別；食事、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、治療に対する認容性／応答が挙げられる。長期間作用する医薬組成物を、特定の配合物の半減期および排泄速度に依存して、３〜４日おき、１週間に１回、または２週間に１回投与してもよい。従って、本出願は、本出願の組成物が被検体に投与される期間の長さによって制限されない。ある実施形態では、被検体は、本出願の組成物を、３〜１２ヶ月（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間）投与される／摂取する。しかし、本出願は、この時間枠に制限されない。ある実施形態では、被検体は、本出願の組成物を、３ヶ月未満（例えば、１ヶ月または２ヶ月）、または１２ヶ月より長く（例えば、１５、１８、２１または２４ヶ月間、２．５年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはもっと長く）、投与する／摂取する。
【０２０７】
ある実施形態では、本出願のセレンを含む組成物（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）またはこの酵母の中に存在するか、またはこの酵母から誘導されるセレン含有化合物））が、１日あたり被検体に２５〜８００μｇのセレンを与えるような１日投薬量で投与される（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸが、それぞれの日に被検体に２５〜８００μｇのセレンを与えるような１日投薬量で投与される）。本出願は、そのようなものに制限されない。実際に、ある実施形態では、本出願のセレンを含む組成物は、１日あたり２５μｇ未満（例えば、２４、２３、２２、２１、２０またはこれより少ない）、または８００μｇを超える（例えば、８２５、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００またはもっと多い）セレンを被検体に与えるような１日投薬量として投与される。ある実施形態では、セレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））は、１日あたり２００〜５００μｇの１日投薬量で投与される。他の好ましい実施形態では、セレンは、１日あたり２００〜４００μｇの１日投薬量で投与される。ある実施形態では、１回分の投薬量のセレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））が、１日に１回投与される。他の実施形態では、２回、３回、４回またはもっと多くの投薬量が、それぞれの日に投与される（例えば、朝に１回および夜に１回投与、または４〜６時間毎に１回投与）。例えば、ある実施形態では、セレンは３回に分けて、４回以上に分けて、２回に分けて、または２回未満に分けて投与する。ある実施形態では、１日投薬量は、２５〜７５μｇのセレンである。他の実施形態では、１日投薬量は、２００μｇのセレン（例えば、有機セレン（例えば、セレン化された酵母（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸ）））である。ある実施形態では、投薬量は、特定の年齢の被検体に投与するように配合される（例えば、５０歳より若い、５０歳より上、７０歳より若い、７０歳より上、８０歳より若い、８０歳より上など）。
【０２０８】
本出願の医薬組成物を、局所処置が望ましいか、または全身処置が望ましいか、処置される領域に依存して、多くの様式で投与してもよい。投与は、局所（眼を含む、膣および直腸への送達を含め、粘膜に対する）、肺（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送による、ネブライザによる；気管内、経鼻、表皮および経皮）、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または注入；または頭蓋内、例えば、髄腔内または心室内への投与が挙げられる。セレンを含む組成物および配合物は、特に、経口投与に有用であると考えられる。
【０２０９】
局所投与のための医薬組成物および配合物としては、経皮パッチ、ゲル、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼薬、坐剤、スプレー、液体および散薬が挙げられるだろう。従来の医薬担体、水性粉末または油性基剤、増粘剤などを使用してもよい。
【０２１０】
経口投与のための組成物および配合物としては、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、小袋または錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい場合がある。
【０２１１】
非経口、髄腔内または心室内投与のための組成物および配合物は、滅菌水溶液を含んでいてもよく、バッファー、希釈剤および他の適切な添加剤、例えば、限定されないが、浸透向上剤、担体化合物および他の医薬的に許容される担体または賦形剤も含有していてもよい。
【０２１２】
従って、ある実施形態では、本出願の医薬組成物としては、限定されないが、溶液、エマルションおよびリポソームを含有する配合物が挙げられる。これらの組成物を、種々の要素から作成してもよく、限定されないが、あらかじめ作成した液体、自己乳化する固体および自己乳化する半固体が挙げられる。
【０２１３】
本出願の医薬配合物は、簡便には、単位投薬形態で存在していてもよく、医薬産業で周知の従来の技術に従って調製されてもよい。このような技術は、活性成分と、医薬担体または賦形剤との会合をもたらす工程を含む。一般的に、配合物を、活性成分と液体担体を均一かつ密に会合させるか、または固体担体を精密に分割するか、またはその両方を行い、次いで、必要な場合、生成物を成形することによって調製する。
【０２１４】
従って、ある実施形態では、本出願の組成物を、任意の多くの可能な投薬形態、例えば、限定されないが、錠剤、カプセル、液体、シロップ、軟質ゲル、坐剤および浣腸に配合してもよい。本出願の組成物を、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁物として配合してもよい。水性懸濁物は、さらに、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁物の粘度を高める物質を含んでいてもよい。懸濁物は、安定化剤も含有していてもよい。
【０２１５】
本発明の一実施形態では、医薬組成物を配合し、フォームとして使用してもよい。医薬フォームとしては、配合物、例えば、限定されないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ジェリー、リポゾームが挙げられる。基本的に同様の性質であるが、これらの配合物は、最終製品の要素および一貫性でさまざまである。
【０２１６】
本出願の組成物は、さらに、医薬組成物で従来みられる他の付属成分を含んでいてもよい。従って、例えば、組成物は、さらなる物質、適合性の物質、医薬的に活性な物質、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔または抗炎症剤を含んでいてもよく、または、本出願の組成物の種々の投薬形態を物理的に配合するように有用なさらなる物質（例えば、染料、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤）を含んでいてもよい。しかし、このような物質は、添加する場合、本出願の組成物の要素の生体活性を過度に阻害すべきではない。配合物は、滅菌されていてもよく、所望な場合、補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、香味剤、および／または配合物の核酸と悪い相互作用を起こさない芳香族物質などと混合してもよい。
【０２１７】
ある実施形態では、本出願は、（ａ）１つ以上の形態のセレン（例えば、ＳＥＬ−ＰＬＥＸおよび／またはこれらの中に存在するか、および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物）、（ｂ）１つ以上の他の薬剤（例えば、抗糖尿病薬、酸化防止剤など）を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、２つ以上の合わせた薬剤を一緒に使用してもよく、または逐次使用してもよい。
【０２１８】
本出願は、本明細書に記載されるセレンを含む化合物と、１つ以上のさらなる活性薬剤（例えば、抗糖尿病薬、酸化防止剤など）を含む、併用投与を含む方法も含む。実際に、本出願のさらなる態様は、本出願のセレンを含む組成物を併用投与することによる、従来の治療薬および／または医薬組成物を向上させるための方法を提供する。併用投与手順において、薬剤を同時に、または逐次投与してもよい。一実施形態では、本明細書に記載される化合物を、他の活性薬剤（例えば、βブロッカー）の前に投与する。医薬配合物および投与態様は、上述のいずれかであってもよい。それに加え、２つ以上の併用投与される薬剤は、それぞれ、異なる態様または異なる配合物を用いて投与されてもよい。
【０２１９】
併用投与される１つ以上の薬剤は、処置される状態の種類によって変わる。例えば、処置される状態が肥満である場合、さらなる薬剤は、抗肥満薬または重量低下薬などであってもよい。処置される状態が、糖尿病の予防または処置である場合、さらなる薬剤は、当該技術分野で既知の抗糖尿病薬のいずれかであってもよい。併用投与されるさらなる薬剤は、限定されないが、現時点で臨床使用されるものを含め、当該技術分野でよく知られている任意のものであってもよい。
【０２２０】
本出願のある実施形態では、酸化防止剤を、本出願のセレンを含有する組成物または配合物と併用投与する。本出願は、利用される酸化防止剤の種類に制限されない。実際に、限定されないが、アルキル化ジフェニルアミン、Ｎ−アルキル化フェニレンジアミン、フェニル−α−ナフチルアミン、アルキル化フェニル−α−ナフチルアミン、ジメチルキノリン、トリメチルジヒドロキノリン、ヒンダードフェノール、アルキル化ヒドロキノン、ヒドロキシル化チオジフェニルエーテル、アルキリデンビスフェノール、チオプロピオン酸塩、金属ジチオカルバメート、１，３，４−ジメルカプトチアジアゾール、油溶性銅化合物、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ４３８、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ４３８Ｌ、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ６４０、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ６３５、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ６８０、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ＡＭＳ、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ＡＰＡＮ、Ｎａｕｇａｒｄ  ＰＡＮＡ、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ＴＭＱ、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ５３１、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ４３１、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ＢＨＴ、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ４０３、ＮＡＵＧＡＬＵＢＥ  ４２０、アスコルビン酸、トコフェロール、α−トコフェロール、スルフヒドリル化合物、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−システイン、リポ酸、ジヒドロリポ酸、ラクトフェリン、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビルポリペプチド、ブチル化ヒドロキシトルエン、レチノイド、レチノール、パルミチン酸レチニル、トコトリエノール、ユビキノン、フラボノイド、イソフラボノイド、ゲニステイン、ジアゼイン、レスベラトロル、ブドウ種子、緑茶、マツ樹皮、プロポリス、ＩＲＧＡＮＯＸ、抗原Ｐ、ＳＵＭＩＬＩＺＥＲ  ＧＡ−８０、β−カロテン、リコピン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびビタミンＡを含め、種々の酸化防止剤が、本出願で有用であると考えられる。
【実施例】
【０２２１】
本出願の特定の好ましい実施形態および態様を示し、さらに説明するために以下の実施例が与えられ、と解釈すべきではない。
【０２２２】
（実施例１）
（セレンを豊富に含む酵母中のセレン含有化合物の特定および特性決定）
セレン（Ｓｅ）は、ヒトおよび動物の食事の必須元素である。多くの国で、セレンを含む食品および餌の補助物質において、低濃度のＳｅへの関心が高まっている（例えば、Ｒａｙｍａｎ、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、９２（２００４）、ｐ．５５７）。セレン（Ｓｅ）を豊富に含む培地中で成長した酵母を、ヒトおよび動物の栄養補助のための有機Ｓｅ源として使用してもよい。追加されるＳｅの最も一般的な形態は、セレン酸塩および／または亜セレン酸塩存在下で成長した酵母であり、３０００ｍｇ  Ｓｅ／ｋｇまで蓄積することができる。１９７４年から市場で入手可能なＳｅを豊富に含む酵母の魅力は、比較的費用が安く、セレノタンパク質合成の前駆体として作用するセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）の含有量が多いことに起因する。Ｓｅを豊富に含む酵母は、Ｓｅ種形成という観点で特性決定することが長い間困難であった天然産物である。ＳｅＭｅｔ濃度について報告されている値の変動；Ｓｅ種という観点で大きな組成の変動；特定されているＳｅ化合物の合計と、全Ｓｅ濃度との相違を含め、多くの問題が解決しないまま残っている。
【０２２３】
その不十分な特性決定から、欧州連合は、指令２００２／４６／ＥＣの許可された食品補助物質からＳｅ酵母を除外している。
【０２２４】
従って、本出願の実施形態の開発中に、セレンを豊富に含む酵母のＳｅメタボロームおよびプロテオームを特性決定するために、実験を行った。従って、本明細書に記載されるように、本出願は、特定および特性決定（例えば、生体活性）が今までに不明のままであった、Ｓｅを含有する代謝物およびタンパク質の特定および特性決定を与える。
【０２２５】
（全Ｓｅの決定および同位体組成）
市販の酵母サンプルは、通常は、１０００ｐｐｍまたは２０００ｐｐｍのＳｅを含有し、最大値は３０００ｐｐｍを超えている。Ｓｅを豊富に含む酵母は、通常の乾燥した食品酵母と、外観、香りおよび臭気という点で区別することができないと言われている（例えば、Ｓｃｈｒａｕｚｅｒ、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、７８（２００６）、ｐ．１０５を参照）が、異なる調製物の形態は異なっている場合がある。品質の悪いＳｅを豊富に含む酵母サンプルは、Ｓｅ０およびセレニドの生成の結果として、赤みがかった色または褐色がかった色である。
【０２２６】
Ｓｅを豊富に含む酵母中のＳｅの合計量の決定は、単純であろう。例えば、酵母を、ホットプレート上、またはマイクロ波による加熱を用い、ＨＮＯ３とＨ２Ｏ２の混合物を用いて消化する。その後、Ｓｅ含有量を、ヒドリド生成（ＨＧ）原子吸光法（ＡＡＳ）または原子蛍光分光法（ＡＦＳ）によって決定することができる。しかし、消化の終了（溶解していない炭素）は必須であり、そうでない場合は、低い結果および／または一貫しない結果が得られる。ある実施形態では、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用し、セレン含有化合物（例えば、溶解した炭素の耐性がもっと大きい）を特性決定する。しかし、ＩＣＰ−ＭＳを使用するとき、使用される同位体が最適化される（例えば、最も豊富に存在する８０Ｓｅ同位体は、古い四重極装置と共に働くには適しておらず、四重極特性決定と共に使用することができない）。好ましい実施形態では、衝突気体としてＨ２を用いる衝突セルを取り付けた装置を使用し、７７Ｓｅと７８Ｓｅの＜＜Ｍ＋１＞＞干渉の生成を起こさせる。さらに好ましい実施形態では、Ｈｅが衝突気体として使用される。ＣＲＭ  ＳＥＬＭ−１の使用は、品質管理／保証のために使用されてもよい。
【０２２７】
Ｓｅを豊富に含む酵母は、プレミックス（Ｓｅとして３〜５ｐｐｍ）および餌（Ｓｅとして０．３〜０．ｐｐｍ）の活性要素として使用されることが多い。しかし、プレミックスサンプルの重大な不均質性は、市場ではありふれたことであり、サンプル全体の消化、またはバッチ処理間の一貫性は、不可能なほど困難である。例えば、ＨＮＯ３−Ｈ２Ｏ２混合物を用いたホットプレートでの溶出後の固体残渣は、Ｓｅを含有していないことが一般的である。従って、ある実施形態では、ＩＣＰ−ＭＳ分析を使用する（例えば、プレミックスサンプルの完全な消化が不可能であるか、または矛盾する場合）。さらに、ＨＧ−ＩＣＰ−多重検出−ＭＳ（ＨＧ−ＭＣ−ＩＣＰ−ＭＳ）によるＳｅ同位体組成の正確な決定は、異なる製造業者から得たＳｅを豊富に含む酵母において、同位体比（δ８２／７７Ｓｅ、δ８２／７６Ｓｅおよびδ８２／７４Ｓｅ）に顕著な変動があることがわかっている（例えば、Ｆａｒら、Ｊ  Ａｎａｌ  Ａｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２５（２０１０）１６９５を参照）。同位体比の変動の由来に関する知識および理解は、わかりにくい（Ｓｅの異なる供給源または異なる生体技術で生化学的組み込みの間の異なる同位体フラクション化）。
【０２２８】
（ＳｅＭｅｔの決定）
正確な記載であるか否かにかかわらず、全ＳｅＭｅｔ濃度は、従来から、Ｓｅを豊富に含む酵母の「有機」特徴の指標と呼ばれている。ＳｅＭｅｔは、タンパク質の一構成要素であり、ほとんどは水に不溶性である。従って、ＳｅＭ含有量は、タンパク質からの放出によって決定されている。従って、ある実施形態では、本出願は、酵母タンパク質を完全に分解してアミノ酸にする、ＳｅＭｅｔを特性決定する方法を提供する。ある実施形態では、本出願は、ＳｅＭＥｔの分解を防ぐ、ＳｅＭｅｔを特性決定する方法を提供する（例えば、Ｓｅの消失または酸化が生じる）。
【０２２９】
この分野の多くの結果は、水抽出物中に存在するＳｅＭｅｔについて言及されており、多くは、Ｓｅを豊富に含む酵母中のＳｅＭｅｔレベルについての混乱が原因であった。この混乱は、アミノ酸分析に使用されるカノニカル酸の消化条件（閉じたアンプル中、１２０℃での６Ｎ  ＨＣｌ消化）が激しすぎ、制御された様式でＳｅＭｅｔを保護することができないというという事実によって大きくなることもある。ＳｅＭｅｔを回収するために２つの手順を利用することができる。１つは、還流状態でのメタンスルホン酸を用いた１６時間消化に基づき、他方は、プロテアーゼを用いた複数のタンパク質分解消化に基づく（例えば、Ｍｅｓｔｅｒら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、３８５（２００６）ｐ１６８）。従って、ある実施形態では、本出願は、ＳｅＭｅｔ含有量の決定という観点で、保持時間およびＳｅの存在が、サンプル中に存在するＳｅ−Ｍｅｔの特定および純度の確認に必要なパラメータであることを提供する。ある実施形態では、逆相（ＲＰ）またはアニオン交換（ＡＥ）ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳクロマトグラフィー分析を利用し、サンプル中のセレン種を特性決定する。
【０２３０】
（サンプルの消化）
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、市場に存在する市販の酵母製品が、形態および質感という観点で異なっており、（例えば、参照物質の分析に基づき）予想されるよりもかなり少ないＳｅＭｅｔが回収される場合があることが示される。それに加え、本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、プロテアーゼのバッチごとの変動の存在があること（例えば、それによって、抽出収率の再現性の悪さが生じる）がわかっている。従って、ある実施形態では、本出願は、低い回収率の危険性を最低限にする工程および方法を提供する。例えば、ある実施形態では、新たに調製した非常に活性なプロテアーゼのみを用いる。さらなる実施形態では、抽出を複数回（例えば、３回）行い、それぞれの時間に新しい部分の酵素を用いる。好ましい実施形態では、最終的な抽出／抽出物は、１％未満のＳｅを含有する。さらなる実施形態では、サンプルの完全な可溶化は、酵素分解によって得られる。ある実施形態では、酵素分解によるサンプルの完全な可溶化が不可能な場合、セルラーゼとヘミセルラーゼとカオトロピック剤の混合物を用いた逐次抽出を使用し、それぞれの抽出物において、ＳｅＭｅｔが存在しないことを確認する。本出願は、抽出物中のＳｅＭｅｔが存在しないことを確認する方法に限定されない（例えば、Ｅｎｃｉｎａｒら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｔａ、５００（２００３）、１７１を参照）。分析結果を補助するために、抽出物質収支の方法およびデータを使用してもよい。本出願の一態様のサンプル可溶化の一例を図１に示す。
【０２３１】
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、一連の市販の酵母から、消化されていないタンパク質分解残基を特定し、特性決定し、さらに、セルラーゼ−ペクチナーゼ混合物を用いたさらなる処置の後、残留ＳｅＭｅｔの存在がわかった。あるサンプルについて、残留ＳｅＭｅｔは、全Ｓｅの１０％までを占めていたが、典型的な値は、約３〜５％であった。ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた残基の処理、その後、タンパク質分解消化によって、ＳｅＭｅｔの収率がさらに増加し、典型的には、２〜８％になり、１つのサンプルは１５％まで高くなった。残渣（例えば、ＣＳ２で抽出可能なＳｅ０）の存在は、品質が悪い酵母であることの指標であった。
【０２３２】
（ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ分析）
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、酵素分解後に得られる溶液中に存在するセレン含有化合物を特定し、特性決定した（例えば、ＳｅＭｅｔを含有するが、酸化されたＳｅＭｅｔ、ＳｅＣｙｓの異なる形態、異なるＳｅ代謝物および不完全に消化されたタンパク質も含むものとして）。不完全に消化されたタンパク質の存在によって、全ＳｅＭｅｔ濃度が低く概算されることが決定された。不完全に消化されたタンパク質は、微細なスラリー中（例えば、それによってカラムフィルタの上に留まる）または溶液の状態で存在すると特定された。従って、ある実施形態では、（例えば、高分子量化合物が存在しないこと、Ｓｅの溶出が完全であることを確認するために）サイズ排除ＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳによる消化を分析することを含む検証工程を利用する（例えば、図２の挿入図を参照）。
【０２３３】
標準的な添加方法を用い、ＡＥ−ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ（図２を参照）またはＲＰ−ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳによって、ＳｅＭｅｔを定量することができる。（例えば、Ｓｅ含有種のカラム吸収に起因する消失が最低限になるように）クロマトグラフィーの固定相の選択は重要である。しかし、セレノ化合物（例えば、セレノタンパク質、セレノアミノ酸、セレノペプチドなど）の特定、定量化および分析は、物質収支、定量化のために使用したピークの前後のその溶出を除外するか、または加えることを伴う場合がある。これにより、セレン含有化合物（例えば、ＳｅＭｅｔ）の特定および定量化は、複雑な作業となった。同位体の希釈定量化は、（例えば、不完全な消化および不完全に消化されたＳｅＭｅｔを含有する種の保持が、不正確な結果の主な原因であったため）、加えたスパイクが、サンプル中のＳｅＭｅｔと同じ様式で挙動しそうにないため、サンプルの適切な特性決定であると考えることができない。
【０２３４】
別のよくある誤差の原因は、酸化されたＳｅＭｅｔの発生に起因するものである。ＳｅＭｅｔの一部は、別個のＳｅＭｅｔＯｘピークとして現れ、ＳｅＭｅｔ濃度が低く概算される。この手順中のＳｅＭｅｔの酸化は、レドックス試薬（例えば、ジチオスレイトール）を加えることによって防がれるか、または逆行させることができるが、元々存在するＳｅＭｅｔオキシドは、ＳｅＭｅｔに変換することはできない。
【０２３５】
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、ＩＣＰ−ＭＳを、（単一または複数の）反応モニタリングモードで使用されるトリプル四重極ＭＳと置き換えると、代替例を与え、平衡での他のＳｅＭｅｔ形態（例えば、ｏｘ−ＳｅＭｅｔ）の量の選択性および信頼性を上げることを示した。
【０２３６】
（プレミックスおよび餌におけるＳｅＭｅｔの決定）
プレミックス、動物の餌および補助錠剤中のＳｅＭｅｔの決定は、Ｓｅを豊富に含む酵母よりももっと困難である。ＳｅＭｅｔの放出は、プロテアーゼ阻害剤として作用し得るいくつかの添加剤の存在によって妨害される。ＳｅＭｅｔの酵素抽出の前に、これらの添加剤を除去するために、抽出工程が推奨される。ある実施形態では、動物の餌中のＳｅＭｅｔ濃度は、少なすぎて抽出物中で直接決定することができず、前もって濃縮が必要である。酵素による消化物の凍結乾燥によって、残留する酵素を同時に前濃縮し、その結果、マトリックスが、その後のＲＰ−ＨＰＬＣまたはＡＥ−ＨＰＬＣを妨害する。従って、本出願は、凍結乾燥およびＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳの前に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による低分子Ｓｅフラクションの単離を提供する。
【０２３７】
（水溶性Ｓｅを含有する化合物および代謝物の分析）
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、Ｓｅを豊富に含む酵母が、Ｓｅ−代謝プロフィール（セレノメタボローム）によって特性決定可能であることを示し、このプロフィールは、酵母株および発酵パラメータに特徴的である。セレノメタボロームは、市場で入手可能な調製物および製造プロセスの再現性に由来するフィンガープリントとして機能し得る。本明細書に記載されるように、本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、セレノメタボロームが、（例えば、治療活性および／または抗治療特性（例えば、毒性）を示す）１つ以上のＳｅ含有化合物を含有することを提供する。セレン化された酵母中に存在するＳｅ含有化合物の水溶性および水不溶性のフラクションを両方とも得て、特定するための本出願の一実施形態の例示的な手順を、図３に示す。
【０２３８】
水での抽出によって、Ｓｅが１５〜２５％回収されることが決定された。ＳＥＣ−ＩＣＰ−ＭＳによって得られる典型的なクロマトグラム（１００％回収）を図４Ａに示す。水抽出物は、約５％の水不溶性タンパク質を含有し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラムの空隙に溶出する高分子量の物質、または複数のセレン化された（１−７）ＳＩＰ１８、モノセレン化されたＨＳＰ１２またはＹＭＺ  タンパク質を含む、低分子量の物質（５〜１５ｋＤａ）を含んでいた。これらのタンパク質は、もっぱらＳｅＭｅｔとして存在するＳｅを含有する。
【０２３９】
従って、本出願は、低分子量（＜１５００Ｄａ）の化合物／代謝物の形態で存在する残留する水溶性Ｓｅが、酵母のセレノメタボロームを構築することも提供する。本出願の実施形態を進行中に行われる実験の前に、これらの代謝物の特定および特性決定は、非常に困難な作業であった（例えば、これらの代謝物は、エレクトロスプレー三重極ＭＳを用いたＣａｓｉｏｔらによる第１の正式なＳｅ−アデノシル−Ｓｅ−ホモシステインの「ｄｅ  ｎｏｖｏ」特定のため、一般的に不明なままである（例えば、Ｃａｓｉｏｔら、Ａｎａｌ  Ｃｏｍｍｕｎ、３６（１９９９）、ｐ７７）を参照）。例えば、Ｓｅ種形成という観点で水抽出物の複雑さは、特性決定されており、図４ｂに示されている。示されているように、２５を超える異なるピークが観察され、それぞれのピークは、他の強くない任意の数のピークを隠している可能性がある（例えば、それぞれのピークは、１つ以上の異なるＳｅ含有化合物を表す）。
【０２４０】
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、多次元精製技術、次いで酵母におけるセレノメタボロームの知識を大きく増やすＭＳの進化における特定の利点を利用している（図４を参照）。特に、もっと多くのスキャン内ダイナミックレンジを与えるＦＴ軌道イオン捕捉装置の利用可能性、正確な質量決定の可能性、多段階のフラグメント化の可能性を利用し、Ｓｅメタボロームの特定および特性決定（例えば、それぞれのセレン含有化合物（例えば、代謝物、ペプチド、タンパク質、核酸、および／またはそれぞれの前駆体）の特定、個々の化合物の生物学的特性の特性決定、およびこれらの組み合わせ（例えば、本明細書に記載されるような）が容易になる。
【０２４１】
セレンを豊富に含む酵母（Ｓｅを豊富に含む酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を得て、これを特性決定した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）から得られたＬＣＭＳグレードの化学物質を使用した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｇｕｙａｎｃｏｕｒｔ、フランス）を用い、水を精製した。ある例示的な手順では、Ｓｅを豊富に含む酵母中の全セレン濃度は、２３９９μｇ／ｇ（±４０）であった。０．２ｇのサンプルを、超音波浴中、水５ｍＬで１時間抽出した。抽出物を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理した。上澄みを凍結乾燥させ、必要な場合には、−２０℃で保存した。水抽出物中の全セレン濃度は、７５６μｇであり、これは、全セレンの約３０％を占めていた。セレンを豊富に含む酵母のさらなる抽出を並行して行い、濃度が約１７０〜７５０μｇ（全セレンの約５〜３０％に対応する）である水抽出物も製造した。
【０２４２】
次いで、水抽出物を用いてサイズ排除−ＩＣＰ  ＭＳを行った。サイズ排除クロマトグラフィー−ＩＣＰ−ＭＳは、ＡＧＩＬＥＮＴ  １２００  ＨＰＬＣシステム（ＡＧＩＬＥＮＴ、東京、日本）に、Ｓｃｏｔｔスプレーチャンバおよび衝突セルを取り付けたＡＧＩＬＥＮＴ  ７５００ｃｅ  ＩＣＰ質量分析計を接続したものを用いて行った。液体クロマトグラフィーは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＵＰＬＣポンプ（ＤＩＯＮＥＸ、Ｐａｒｉｓ、フランス）を用いて行った。カラムの出口を、ＥＳＩイオン源を備えたＬＴＱ３０  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）に接続し、Ｓｃｏｔｔスプレーチャンバおよび衝突セルを取り付けたＡＧＩＬＥＮＴ  ７７００  ＩＣＰ−ＭＳに接続した。
【０２４３】
５種類の別個の水抽出物のサイズ排除−ＩＣＰ  ＭＳクロマトグラムを図５に示す（７６Ｓｅ−暗灰色の線、７７Ｓｅ−黒色の線、７８Ｓｅ  淡灰色の線）。Ｓｅを豊富に含む酵母抽出物のクロマトグラム（図５、底部パネル）は、ＳＥＬＰＬＥＸ（ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）を用いて得られる典型的なパターンを示す。それに加え、以前の研究から未知の相対的に強度が高い遅く溶出する（約６６分）ピークが現れた。残りのサンプルのプロフィール（図１、上側パネル）は、Ｓｅｌ−Ｐｌｅｘのものとは顕著に異なっており、互いに似ている。非常に豊富に含まれる幅広いピークが強く出ており、明らかに多くの種を含有しており、クロマトグラムの初期に溶出している。この観察の結果として、いくつかのサンプル（図５、上部から２番目のパネル、底部のパネル）を、もっと適切な分離範囲（ＳＵＰＥＲＤＥＸペプチドカラム）を有するサイズ排除カラムを用いたさらなる特性決定のために選択した（それぞれ、図６のＡとＢ）。以前のクロマトグラム（図５、上部から２番目のパネル）に存在する幅広いピークは、２つに分離され、それぞれの２〜３のショルダーピークを有し、分子量が５〜１．５ｋＤａの範囲のセレノ化合物が非常に多く存在することを示している。図５の底部パネルに示されるサンプルも、約２５分に遅く溶出するピークも有することがさらに特定された。
【０２４４】
（水溶性フラクションからのセレン含有化合物の特性および特性決定）
上述の一連の実験は、元々の酵母が存在しない処理されたサンプル中にセレン含有化合物の大きなフラクション（約１．５〜５ｋＤａ）の存在を特定した。従って、このフラクションを特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。
【０２４５】
目的のフラクション（任意に「ピークＩ」と呼ぶ）を、サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）からハートカットし（図７Ａを参照）、凍結乾燥によってあらかじめ濃縮した。図７Ｂに示されるように、これにより、処理されていない酵母中に存在する他のＳｅ−化合物を含まない目的のインタクトなフラクションの回収が可能になった。サンプルのＳＥＣペプチドクロマトグラムは、以下のとおりであった。（ａ）水抽出物、（ｂ）分離されたピークＩ、（ｃ）トリプシンで消化されたピークＩ、（ｄ）プロテアーゼで消化された水抽出物。黒色の線−８０Ｓｅ、淡灰色の線  ７８Ｓｅ、暗灰色の線−７７Ｓｅを図７に示す。
【０２４６】
逆相ＨＰＬＣによって目的のフラクションをさらにフラクション化するいくつかの試みは失敗した。試験したＲＰ−ＨＰＬＣカラムからの回収は、非常に低く、分離が悪かった。従って、フラクションをさらに特性決定し、その中に含まれる要素を特定すべく、このフラクションのタンパク質分解酵素消化（トリプシンおよびプロテアーゼＸＩＶ）を試みた。図７Ｃに示されるように、トリプシン（アルギニン残基およびリジン残基で開裂）によって、混合物中のＳｅ化合物の平均分子量が小さくなった。従って、本明細書に記載されるように、ある実施形態では、本出願は、逆相ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳおよび／またはＯｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳを用いたセレン含有化合物の単離および／または特性決定の前に、Ｓｅｌを豊富に含む酵母の１つ以上の水溶性フラクションが、タンパク質分解によって消化された（例えば、トリプシン、プロテアーゼＸＩＶ、または他の酵素を用いて）ことを提供する。
【０２４７】
例えば、図７Ｄに示されるように、ペプチドのプロテアーゼ消化は、ほとんどがセレノメチオニンを与える（図７Ｄ、約２７分の背の高い黒い線）。約２５分より前に溶出する他のセレン含有化合物も存在する。
【０２４８】
図７Ａに示されるＳＥＣカラムから５８分に溶出するピークを単離し、精製し、特性決定するために、本出願の実施形態の開発中にさらなる実験を行った。５８分のサイズ排除クロマトグラム溶出時間に存在する化合物を特定するために（図７Ａ）、このピークを分離し、濃縮した。逆相クロマトグラフィーのための溶出プロセスを最適化した。図７Ａに示されるＳＥＣカラムから５８分に溶出するピークのＲＰクロマトグラム（図８Ａにも示される）は、まさに１個の鋭い十分に分割されたピークを示す（図８Ｂを参照）。次に、このセレノ化合物を特定するために、質量分光法を含むさらなる分析を行った。逆相クロマトグラフィーをＯｒｂｉｔｒａｐと接続した。質量３４６．０４０２５のセレノ化合物は、Ｓｅ−メチル−Ｓｅ−アデノシンであると特定された（図９を参照）。
【０２４９】
セレンを豊富に含む酵母から単離された水溶性フラクション中のセレン含有化合物をさらに特定し、特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。
【０２５０】
水溶性セレン含有化合物の約７０％を含有する、上述のＳｅを豊富に含む酵母からの水抽出物（全セレンの約３０％を占める７５６μｇを含有する）を使用した。抽出物を濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに注入し、１０個のサブフラクション（図２Ａに示される第１の広いピークから始まる）を均一な時間間隔で集めた。再び、これらのフラクションは、生の酵母水性抽出物に存在しない種を表す。それぞれのフラクションを２個の別個のサンプルに分割し、片方のサンプルをフラクション演出のために使用し、他のサンプルをトリプシン消化のために処理する。
【０２５１】
最初に、ＲＰ  ＣＩ  ８カラムを用い、ＩＣＰ  ＭＳを用いてサンプルを分析した（図１０を参照）。ＵＰＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ分析のために解像度は十分であった。
【０２５２】
サンプルを分析し、セレンパターンを有するサブフラクション８について得られた１７０化合物のリストは、以下の表１に与えられる。それに加え、表５は、これらの化合物の例示的なスペクトルを与える。消化されていないフラクション中で特定されたすべてのペプチドは、質量が１〜３．４ｋＤａの範囲であった。特定されるセレン含有化合物は、これらを誘導する元々のタンパク質よりかなり小さかった。図１１は、サンプルのサブフラクション８において特定されたセレンを含有するペプチドのリストを与える。従って、ある実施形態では、本出願は、１つ以上のセレン含有化合物（例えば、以下に記載される表２、図１１、図１３および図１５に特定される）、これらを含む組成物、およびこれらを用いる方法（例えば、本明細書に記載されるようなヒトおよび／または動物の使用）。
【表２】
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表２．サブフラクション８に見出されるセレン含有化合物の質量リスト
【０２５３】
サブフラクションをさらに特性決定するために、実験も行った。特に、サブフラクションの酵素（例えば、トリプシン）消化を行った後、逆相クロマトグラフィーおよび質量分光法を利用して分析した（例えば、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳ）（図１２）。ＵＰＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳ分析から、多くのセレンを含有するペプチドの存在がわかった。セレンを含有するペプチドおよびセレンを含有するそれぞれのペプチドを誘導するタンパク質の属性を決定し、図１３に示す。
【０２５４】
（セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクション中のセレン含有化合物および／または代謝物のさらなる分析）
中間の分子量（約３００〜１０００Ｄａ）の水溶性有機セレン化合物を、特定および特性決定のためにさらに標的とした。固有のセレノメタボロームは、理論的に、異なる供給源からの酵母のフィンガープリントを構築する（例えば、市販製品の構成組成に関する情報を与える）。
【０２５５】
（水抽出の後、フラクション化）
０．２ｇの酵母（ＳＥＬ−ＰＬＥＸ、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  ＫＹ）を、超音波浴中、水５ｍＬで１時間抽出した。抽出物を遠心分離処理し（２７００ｇ、１０分）、デカンテションし、凍結乾燥し、冷凍庫で保存した。次いで、粉末を０．１５ｍＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、遠心分離処理した（１４０００ｇ、１５分）。上澄みをＳＵＰＥＲＤＥＸペプチドカラム（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）でフラクション化し、１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）を用い、０．７ｍＬ  ｍｉｎ−１で溶出を行った。溶出物を２０〜３０分の間集め、凍結させ、凍結乾燥させた。凍結乾燥物を水０．１５ｍＬに溶解し、さらなる分析の前に−２０℃で保存した。
【０２５６】
（ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳ分析）
ＳＥＣから凍結乾燥したサンプルを水にあらかじめ溶解しておき、これをバッファーAで２０倍に希釈し、１０μｌの小分け分をカチオン交換ＰＲＰ−Ｘ２００  ＳＣＸカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ×１０μｍ；Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）に注入した。勾配溶出をギ酸アンモニウム（バッファーＡ：２０％メタノール（ｐＨ３）中の１ｍＭアンモニウムおよび１０ｍＭギ酸、バッファーＢ：２０％メタノール（ｐＨ６）中、１００ｍＭアンモニウムおよび１１０ｍＭギ酸）で作成し、０．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で運んだ。溶出物をその一部（３０％）をＥＳＩ−ＭＳに供給し、残り（７０％））を廃棄するような様式でポストカラムで分割した。プログラムは以下のとおりであった。０〜８分、３％  Ｂまで、８〜１５  ３％  Ｂ、１５〜２０  １０％  Ｂまで、２０〜２５  １００％  Ｂまで、２５〜３８  １００％  Ｂ、３８〜４０  １００％  Ａまで、４０〜５２  １００％Ａ  ４．１．３。
【０２５７】
（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ特定）
精製されたＳｅを含有するフラクションのカチオン交換ＨＰＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳオンライン分析を、ＰＲＰ−Ｘ２００  ＳＣＸカラムを用いて行った。勾配溶出は、ＩＣＰ  ＭＳ分析と同じ様式で作られた。５μｌのサンプルを、あらかじめ希釈することなく分析に使用した。イオン源をポジティブイオンモードで操作した。最適な設定は以下のとおりであった。イオン源の電圧、２．６０ｋＶ；キャピラリー温度、２８０℃；加熱源の温度、１２０℃；シースガス流、２０；補助ガス流、５；Ｓ−レンズＲＦレベル、６１％；解像度、１０００００。１００〜１０００ｍ／ｚ範囲で質量スペクトルを得て、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  ２．１ソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。この装置を、カフェイン、ｎ−ブチルアミン、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（ＭＲＦＡ）、Ｕｌｔｒａｍａｒｋ  １６２１およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の混合物を５０％アセトニトリルと０．１％ギ酸溶液に溶解したものを用いて質量を較正した。
【０２５８】
使用するＩＣＰ  ＭＳおよびＥＳＩ  ＭＳの両方の検出システムと適合するという観点で、クロマトグラフィー条件を最適化した。セレン含有化合物のカチオン交換ＨＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳプロフィールから、大量のピークの存在がわかった（図１４Ａを参照）。分離したフラクションの逆相ＩＣＰ−ＭＳクロマトグラムを作成するために、実験も行った（図１４Ｂを参照）。
【０２５９】
その後、同じカラムをＯｒｂｉｔｒａｐと接続し、セレン含有化合物／代謝物を特定し、特性決定した（図１４を参照）。
【０２６０】
セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン種をフラクション化し、特定するために、さらなるサンプルの調製工程を利用した。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸカラムを利用する）をＩＣＰ−ＭＳの前に利用し、それぞれのフラクションをサイズ排除ＩＣＰ  ＭＳを用いて集めた（例えば、図７Ａまたは８Ａにもに示されるそれぞれのピークを包含するフラクションを集め、分析することができる）。フラクションの分析を、本明細書に記載される手順に従って行った（例えば、二峰性逆相／親水性イオン相互作用液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーハイブリッド四重極捕捉／Ｏｒｂｉｔａｌ  ｔｒａｐ質量分光法など）を行った。上の方法を用い、さらなるセレン含有化合物を、セレンを豊富に含む酵母（ＳＥＬＰＬＥＸ）中で特定し、以下のものが含まれていた。２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイン、Ｎ−アセチルセレノシステイン−セレノホモシステイン、メチルチオセレノグルタチオン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−システイニルグリシン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン−システイニルグリシン、セレノメチル−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−システイン、グルタチオン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、ジ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノグルタチオン、セレノグルタチオン−セレノシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン−２，３  ＤＨＰセレノホモシステイン、グルタチオン−Ｎ−アセチルセレノホモシステイン、グルタチオン−セレノシステイニルグリシン、γ−グルタモイルセレノシステイン−γ−グルタモイルシステイン、γ−グルタモイルシステイン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、グルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、ジ−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−２，３−ＤＨＰ−セレノホモシステイン、セレノグルタチオン−チオ−２，３−ＤＨＰ−セレノシステイン、セレノグルタチオン−γ−グルタモイルセレノシステイン、セレノグルタチオン−グルタチオン、セレノジグルタチオン、ジ−セレノグルタチオン、チオ−ジセレノグルタチオン、メチルデヒドロホモシステイン、セレノメチオニン、セレノホモランチオニン、Ｎ−アセチルセレノシスタチオニン、デヒドロキシ  ５’−メチルセレノアデノシン、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、２，３−ＤＨＰ−セレノランチオニン、エチルセレノアデノシン、Ｎ−プロピオニルセレノシスタチオニン、２，３−ＤＨＰ−セレノシスタチオニン、メチルセレノグルタチオン、γ−グルタモイルセレノシスタチオン、セレノグルタチオン、セレノ（ヒドロキシル）−セレノフェン−（３’−デオキシ−アデノシン）、Ｎ−アセチルシステイン−セレノホモシステイン、アリルセレノアデノシルホモシステイン、セレノ−アデノシルホモシステイン、セレノ−ヒドロキシアデノシルホモシステイン、セレノアデノシン、セレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシド、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシド、エチルセレノアデノシン、セレノ−（ヒドロキシ）−セレノフェン−（３’−デスオキシ−アデノシン）、アデノシル−ヒドロキシセレンオキシドおよびセレノ−アデノシル−Ｓｅ（メチル）−セレンオキシドが挙げられる。従って、ある実施形態では、本出願は、１つ以上のセレン含有化合物（例えば、セレノエーテル、ジペプチドおよびトリペプチドを含有するＳｅＣｙｓの接合体、セレノールおよびセレンオキシド（例えば、上のリストで与えられる）またはその誘導体）、これを含む組成物、これを用いる方法（例えば、本明細書に記載されるようなヒトおよび／または動物の使用）を提供する。
【０２６１】
（水不溶性化合物および代謝物の特定および特性決定）
ＳＥＬ−ＰＬＥＸによって調製したフラクション中の８０〜９０％のセレンは、水に不溶性のセレン含有化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸など）の形態で存在することが決定された。従って、化合物を特定し、特性決定および／または定量するために、これらの化合物（例えば、最大量の化合物の抽出物（例えば、これらから誘導されるインタクトまたは要素）を抽出することができる方法を開発するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。それに加え、エレクトロスプレーおよび／またはＯｒｂｉｔｒａｐによる分析による化合物の化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、分子など）のイオン化（例えば、有効なイオン化）を可能にする精製プロセスを作成するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。従って、以下に記載されるように、ネイティブ化合物の５０％より多い量を抽出することができる方法を開発した。固相抽出フラクションを観察した。しかし、単離された化合物の純度が低く、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳによる分析からは何の情報も得られなかった。有用な情報を作成する他のプロセスを特定した。さらなるＨＰＬＣ精製工程を行うか、または行わずに、サイズ排除ＬＣフラクションを企て、情報の入った結果を得た。
【０２６２】
（セレン種の抽出）
サンプル中に存在するほとんどのセレン化合物／種（サンプルに依存して、全Ｓｅの約７０〜９５％）は、水不溶性であり、質量分光法による分析の前に、溶液を移動するために特別に設計した手順を必要とした。１２の別個の方法を試験し、比較し、抽出物の収率（サンプル中の全Ｓｅに対する、抽出物の全セレンの比率）を得た。ヨードアセトアミドを用いた誘導体化と合わせて４％  ＳＤＳを用いたタンパク質の抽出に基づいた手順について、約５５％の最大回収率を得た。ＳＥＬＰＬＥＸサンプルについて、最適化を行い、水溶性種は、全Ｓｅの約１５％を表す（結果を以下の表３に示す）。
【表３】
0006313418.tif 000009
【０２６３】
抽出されたタンパク質をアセトンで沈殿させ、トリプシンで消化した。質量分光分析の前に、消化された抽出物の精製が必要であった。特に、トリプシン消化物の精製を最適化した。試験される手順は、酸性条件および塩基性条件での固相抽出（以下の表４を参照）、分取サイズ排除クロマトグラフィーを含んでいた。
【表４】
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表４．セレン化された酵母化合物のトリプシン消化物の固相抽出（ＳＰＥ）精製に使用された溶出条件。
【０２６４】
得られた結果を以下の表５にまとめており、個々のフラクションで溶出するＳｅの割合を示す。
【表５】
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【０２６５】
個々のフラクション中のセレン化合物／種の分子量分布を、ＳＥＣ−ＩＣＰ  ＭＳによって特定し（図１５を参照）、溶出の終了を、元の消化物について得られたプロフィールと、プロフィールの合計を比較することによって確認した（図１６を参照）。残念なことに、ＳＰＥ精製されたフラクションの純度は、エレクトロスプレーＭＳ分析に不十分であることがわかった。最後に、分取サイズ排除クロマトグラフィーを選択し（図１７を参照）、もっと時間を消費するが、有用な材料を与える。図１８は、個々のＳＥＣフラクションのプロフィール。この手順によって、セレノメチオニンの後に溶出する低分子Ｓｅフラクションの除去を可能にした（例えば、その後の分析には関係がなかった）。
【０２６６】
個々のＳＥＣフラクションをＵＰＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳによって分析した。いくつかのセレン化されたペプチドを特定した。イオン交換ＨＰＬＣフラクション化を利用し、属性を確認することができる。
【０２６７】
従って、ある実施形態では、本出願は、（例えば、ヨードアセトアミドを用いた誘導体化と合わせて４％  ＳＤＳを用いたタンパク質の抽出、アセトンを用いた沈殿、酵素消化（例えば、トリプシンを用いた）、酸性条件および塩基性条件での固相抽出を利用する精製、分取サイズ排除クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣフラクション化を用いた分析および水不溶性セレン含有化合物および代謝物の特性決定の特定のためのＵＰＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳ）のような工程を含む方法を提供する。
【０２６８】
（１Ｄゲル電気泳動による水不溶性セレン含有化合物の分析）
上述のように最適化され、記載されたＳＤＳ抽出は、ＳＥＬＰＬＥＸからのフラクションを作成するために非常に効果的であると特定された。高濃度の界面活性剤と適合性の分離方法（１Ｄゲル電気泳動）を作成した。レーザーアブレーションスキャニングによって、セレンタンパク質含有量が高いゲルの部分を特定することができ、その後にハートカットし、酵素（例えば、トリプシン）消化が行われた。ＵＰＬＣ−ＩＣＰ  ＭＳとＵＰＬＣ−ＥＳ  ＭＳ／ＭＳを合わせることによって、トリプシン消化物を分析した。このプロセスによって、グリセリルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３に由来する化合物の大部分を特定することができた。本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、ＳＥＬＰＬＥＸ中に見出されるタンパク質グリセリルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３（３５ｋＤａ）を、バッチ処理中、存在する不溶性タンパク質の８０％より多くを占める１０〜１５ｋＤａのタンパク質／ペプチド混合物に分解することを特定した。本出願の実施形態を進行中に作られ、本明細書に提示されたデータは、水不溶性セレン含有化合物のフラクションについて最初に特定し、特性決定される。
【０２６９】
（水抽出）
０．１ｇのサンプルを秤量し、超音波浴中、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５ｍＬで１時間の間に２回洗浄した。上澄みを遠心分離処理によって分離し、分析前に凍結乾燥させた。さらなる分析のために残渣を採取した。
【０２７０】
（水不溶性タンパク質の抽出）
水抽出の後の残渣を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー中、４％ＳＤＳ溶液５ｍＬで洗浄した。サンプルを２分間、超音波プローブを使用して２回超音波処理し、その後、超音波浴中、０．２Ｍ  ＤＴＴ５０μｌを１時間で加えた。サンプルを遠心分離処理し、上澄みを分析のために採取した。
【０２７１】
（ゲル電気泳動）
それぞれのサンプルについて、電気泳動前後で、タンパク質内容物についてＳＤＳ抽出物を分析し、４回の並行分析を行った（４種類の異なる濃度で、ゲルにサンプルを導入した）。後でブロット膜に移すために、ゲルを２個ずつ調製した。
澄みを分析のために採取した。
【０２７２】
（ＨＰＬＣ分析の前のブロットの消化）
ＬＡ  ＩＣＰ  ＭＳによる分析に基づき、ＨＰＬＣ  ＩＣＰ  ＭＳおよびＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって分析するゲルサンプル（サンプルＬ０９−４５３１および００８７−１６）が選択された。図６および図７に示され／記載されるような目に見えるバンドに従ってブロットを切断した（上述）。ブロット片を別個の管に入れ、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００／ＣＡＮ／トリスバッファーで抽出し、ＩＡＭおよびＤＴＴで誘導体化し、トリプシンで消化した。
【０２７３】
（ブロットサンプルのＩＣＰ  ＭＳ分析）
分析すべき２つのブロット株が選択された。１つの酵母と１つのサンプルをｐＨ３で消化するために調製した。勾配溶出プログラムおよび水／メタノール／ギ酸溶液を溶出液として用い、Ｃ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  カラムを用いて分析した（図１９を参照）。サンプルＬ０９−４５３１について切断した７個のバンドから、２つの代表的なクロマトグラムを図１９に示し、Ｏｒｂｉｔｒａｐを用いた分析に使用した。
【０２７４】
（ブロットサンプルのＭＳ／ＭＳ分析）
全質量スペクトルを得た。セレン含有化合物の特定のための検索は、以下のように行われた。Ｍｅｔ  Ｗｏｒｋｓソフトウエアを使用し、セレンパターンを有する、１個、２個および３個の電荷を有する化合物を探した。偽陽性の特定をなくすべく、化合物のリストを手動で調べた。化合物のリストを特定し、確認したら、選択された質量について、ＭＳ２スペクトルを得るために、Ｏｒｂｉｔｒａｐを用いた２回目の測定を行った。記載されている方法に従って特定された５種類のセレン含有化合物のＭＳスペクトル（および配列決定が行われた）を図２０に示す。酵母サンプルのブロットを１０箇所に分けた。１０箇所すべてをＩＣＰ  ＭＳを用いて分析した。サンプル６から興味深いクロマトグラムを得て、これは、３５ｋＤａの質量バンドに対応していた。クロマトグラムは、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３に由来するペプチドを特定した以前のブロットから得られたものと非常によく似ていた。従って、本出願は、ｐＨ３での水不溶性抽出物を調製すると、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３の消化を引き起こすことを提供する。
【０２７５】
ＭＳ２分析シーケンシングを手動で行った。配列データを得て、オンラインプロテオームデータベース（ＵＮＩＰＲＯＴ、ＢＬＡＳＴなど）と比較し、検討することによって特性決定した。図２１は、記載される方法によって特定されるセレンを含有するペプチドのリストを与える。特定されたそれぞれのセレンを含有するペプチドが、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼから誘導されたことが結論づけられた。従って、ある実施形態では、本出願は、１つ以上のセレン含有化合物（例えば、図２０および２１に特定された）、これらを含む組成物、これらを用いる方法（例えば、本明細書に記載されるようなヒトおよび／または動物の使用）を提供する。
【０２７６】
（実施例２）
（セレンを含有する組成物は、心筋の筋肉細胞肥大および老化を阻害する）
（材料および方法）
（動物および処置）
Ｃ５７／ＢＬ６の遺伝子バックグラウンドがあり、ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγのドメインをコードするエキソヌクレアーゼにおいてホモ接合突然変異を発現する雄ＰｏｌＧ（Ｄ２５７Ａ）マウスをＤｒ．Ｔｏｍａｓ  Ａ．Ｐｒｏｌｌａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって得た。マウスを１匹ずつケージに入れ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にあるＳｈａｒｅｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに維持した。温度および湿度を一定レベルに維持した。部屋の光を、明と暗の１２時間ずつのサイクルを与えるように制御した。暗室に４℃で保存しておいた水および実験用の餌を自由に摂取できる状態でマウスに与えた。新しい餌を供給器に１週間に２回加えた。
【０２７７】
離乳直後に、マウスをランダムに３つの処置群の１つに割り当てた。１つのマウス群は、セレン濃度が０．０１ｍｇ／ｋｇ未満の基本食（ＳＤ）を与え、第２の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンを２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態で加えた食事を与えた（（ＳＰ）、ＳＥＬＰＬＥＸ、ＡＬＬＴＥＣＨ、Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）。ＳＰ食の最終的なセレン濃度は、１ｐｐｍであった。原子吸光分析法（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｏｗｅｒ、Ｈｙｎｅｓ、２００４）によって、食事プレミックス中のセレン濃度を評価した。実験食において、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製であった。基本ＳＤ食は、１５ｇ／１００ｇの合計脂肪分、５３８．６ｇ／ｋｇのスクロース、３００ｇ／ｋｇのＴｏｒｕｌａ酵母、１４０ｇ／ｋｇのトウモロコシ油、３．０ｇ／ｋｇのＤＬメチオニン、１５．４ｇ／ｋｇの鉱物ミックス（食事基準、ｇ／ｋｇで、炭酸カルシウム、２．０２；塩化ナトリウム、２．６；クエン酸カリウム（一水和物）、７．７；硫酸カリウム、１．８２；酸化マグネシウム、０．８４；クエン酸第二鉄、０．２１；炭酸マグネシウム、０．１２；炭酸亜鉛、０．０５６；クロム硫酸カリウム、０．０１９；炭酸第二銅、０．０１１；ヨウ化カリウム、０．０００４）、３．０ｇ／ｋｇのビタミンミックス（食事基準、ｍｇ／ｋｇで、重酒石酸コリン、２８００；ナイアシン、３０；パントテン酸カルシウム、１６；ピリドキシン  ＨＣｌ、７；チアミン  ＨＣｌ、６；リボフラビン、６；葉酸、２；ビオチン、０．２；ビタミンＢ−１２（０．１％  マンニトン、２５；ｄｌ−α−トコフェリルアセテート（５００ｕｇ）、１００；ビタミンＡパルミテート（５００，０００ｕ／ｇ）、８；コレカルシフェロール（５００，０００ｕ／ｇ）、０．４；フィロキノン、３）を含んでいた。
【０２７８】
それぞれの処置群から、６日後に６匹のマウスを、４００日後に６匹のマウスを殺した（それぞれＰＯＬＧ−若年、ＰＯＬＧ−老年と呼ぶ）。頸椎脱臼によって両マウス群を殺し、組織を集めた。少なくとも２匹ずつ実験を行った。
【０２７９】
（組織の調製）
交差組織遺伝子発現試験のために、心臓、肝臓および腓腹筋の標本を集め、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。脳特異的な発現試験のために、大脳皮質を周囲の脳組織から分離し、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。
【０２８０】
（ＲＮＡ抽出）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、凍結した組織サンプルを均質化し、ＲＮＥＡＳＹ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、この企業によって推奨されるプロトコルで、全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を用い、単離されたＲＮＡの一体性および純度を評価し、さらに、ＡＧＩＬＥＮＴ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＧＩＬＥＮＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて確認した。精製されたＲＮＡを、ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用い、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）を用い、製造業者が推奨する手順に従って、二本鎖ｃＤＮＡをビオチン標識されたｃＲＮＡに変換した。ビオチン標識されたｃＲＮＡ、およびＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて洗浄し、加熱（９４℃で３５分）によってフラグメント化した。
【０２８１】
（マイクロアレイおよびバイオインフォマティクス経路分析）
標識されたｃＲＮＡを、マウスゲノムＭＧ−４３０  ２．０  ＧＥＮＥＣＨＩＰアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズし、その後、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）染色し、最後に、ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）でスキャンした。ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ  ＧＸ  １２．５（ＡＧＩＬＥＮＴ）を使用し、マイクロアレイデータを検証し、正規化し、統計処理を行い、遺伝子発現パターンの分析を行った。簡単にいうと、まず、アレイのプローブセットの強度を平均標的強度５００に調整し、その後、この試験のすべてのサンプルのメジアンにベースラインを変換し、正規化を行った。マイクロアレイのＰｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈ（ＰＭ）およびＭｉｓ−Ｍａｔｃｈ（ＭＭ）プローブ設計に基づき、ＭＡＳ５によってバックグラウンド補正を行った。結果をミスリーディングする可能性を最低限にするために、低シグナル強度のプローブセットに、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＭＡＳ５アルゴリズムによってサンプルに「Ａｂｓｅｎｔ」とラベルを付け、さらなる分析から除外した。差次的に発現した遺伝子を、ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ方法を用いてフィルタリングし、Ｐ＜０．０５であり、対応するシグナル強度の発現差（ＦＣ）＞１．２またはＦＣ＜−１．２である遺伝子は、有意に差があると定義された。
【０２８２】
改変された転写プロフィールによって表される生物学的題材を解剖するために、２つの独立した経路分析手法を適用した。第１に、遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）を行い、この分析は、有意に変更された生体プロセスおよびシグナル伝達経路を特定するための規定された遺伝子セットの有意な変化の決定を行う食事による方法であった（例えば、Ｋｉｍ  ＆  Ｖｏｌｓｋｙ、２００５を参照）。少なくとも１０、最大で１０００の遺伝子を含み、レベル３以下を有する遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームのみを分析した。食事のＳｅ状態に関連する転写改変を特性決定するファンクショナルクラスターをさらに特定するために、有意に変更された遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（ＩＰＡ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ネットワーク、ファンクション、既知のパスウェイにさらにグループ分けした。フィッシャーの正確確率検定を用い、遺伝子と、所与のネットワーク、生物学的ファンクションまたは既知のパスウェイとの関係の有意性を決定した。
【０２８３】
（リアルタイムＰＣＲ分析）
Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの前もって設計したＴＡＱＭＡＮプローブおよびプライマー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用い、製造業者が推奨する手順に従って、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂレベルによってデータを正規化し、サンプルの数の平均±ｓｅｍとして表した。
【０２８４】
（全タンパク質の決定）
電子天秤を用いて心臓組織の重量を決定し、次いで、記載されているように均質化した（例えば、Ｌａｎら、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、１９９８．５８（１）：ｐ．１９７−２０６）。Ｐｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、この均質物のタンパク質レベルを決定した。それぞれのサンプル中の全タンパク質レベルを、組織の重量によって正規化した。
【０２８５】
（ウェスタンブロット分析）
ウェスタンブロット分析のために、ＳＤで処置されたＰｏｌＧマウスまたはＳＰで処置されたＰｏｌＧマウスからの等量の心臓タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離を行い、次いで、すでに記載されているように、ＰＶＤＦ膜に移した（例えば、Ｌａｎら、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、１９９８．５８（１）：ｐ．１９７−２０６；Ａｄｈｉｋａｒｉら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０１０．１９（３）：ｐ．３９７−４１０）；Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８．３１９（５８６３）：ｐ．６１１−３を参照）。次いで、膜ブロットを、５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水で固定し、その後、Ｍｙｈ７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ａｎｋｒｄ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＧＳＫ３β（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｆｏｘｏ３ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、カルシニューリンＡ（Ａｂｅａｍ）、リン酸化ＮＦＡＴｃ２、リン酸化ＮＦＡＴｃ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ａｃｔｂまたはβ−チューブリン（Ｌｉ−ＣＯＲ）に対する特異的抗体と共にインキュベートした。Ａｍｅｒｓｈａｍの増強化学発光ウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または蛍光標識した二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）を用い、膜ブロットのポジティブシグナルを検出した。これらのシグナルの画像を、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃ  Ｉｍａｇｅシステムを用いて記録した。Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  ｓｔｕｄｉｏソフトウエアまたはＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いてタンパク質バンド密度を決定し、次いで、それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂまたはβ−チューブリンレベルによって正規化した。データは、図の説明に示されるサンプルの数の平均±ｓｅｍとして表している。実験を少なくとも２回繰り返した。
【０２８６】
（統計分析）
リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析のために、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、２群間の統計的な差を決定し、一方、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、複数の群の差を決定した。０．０５未満のｐ値は、有意であるとした。
【０２８７】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、高齢ＰｏｌＧマウスの心筋において、Ｍｙｈ  ７およびＡｎｋｒｄ１の発現を阻害する）
核コードされたＤＮＡポリメラーゼｃ（ＰＯＬＧ）は、動物細胞ミトコンドリアで唯一知られているＤＮＡポリメラーゼである。ヒトＰＯＬＧ遺伝子の突然変異は、眼筋麻痺、白内障、進行性筋力低下、パーキンソン症候群、早発卵巣不全、男性不妊、聴力損失（老人性難聴）および心機能不全を含め、種々の症状に関連する多くの疾患と関係がある（例えば、Ｋｕｊｏｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７．３（２）を参照）。ＰｏｌＧ（Ｄ２５７Ａ）マウスモデルは、１２週目にミトコンドリアにコードされる複合体の呼吸機能の漸進的な低下を示し、酸素消費量の低下およびＡＴＰ産生の低下が起こった（例えば、Ｋｕｊｏｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７．３（２）を参照）。ＰｏｌＧマウスが、１３〜１４月齢までに拡張した心臓の大きさおよび心筋細胞によって示される顕著な心臓肥大を伴う促進された心臓老化表現型を示す（例えば、Ｄａｉら、２０１０、Ｋｕｊｏｔｈら、２００５および図２２Ａ）。
【０２８８】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、心臓疾患の最も一般的な一遺伝子的な遺伝形態であり、３５歳より若い個人の突然心臓死の最も一般的な原因である（例えば、Ｆｒｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０１２．９（２）：ｐ．９１−１００を参照）。ＨＣＭの基本である遺伝子突然変異は、十分に特性決定されており、突然変異の大部分は、サルコメアタンパク質、例えば、ミオシン−７（心筋β−ミオシン重鎖として知られる；ＭＹＨ７）をコードする（例えば、Ｆｒｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２０１２．９（２）：ｐ．９１−１００を参照）。
【０２８９】
心臓アンキリン繰り返しタンパク質（ＣＡＲＰ）は、Ａｎｋｒｄ１遺伝子によってコードされ、ＡＮＫＲＤ１遺伝子およびＣＡＲＰ核因子の発現は、左室肥大、ヒト心不全、拡張型心筋症（ＤＣＭ）およびアドリアマイシン誘発性心筋症に関与する（例えば、Ｄｕｂｏｓｃｑ−Ｂｉｄｏｔら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１０２、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（０）：ｐ．Ｓ７３を参照）。示されている表現型と一致し、心臓肥大マーカーＭｙｈ７およびＡｋｎｒｄｌの年齢依存型の発現は、ＰＯＬＧ若年マウスと比較したとき、ＰＯＬＧ高齢マウスの心臓組織で増加した（図２２Ｂを参照）。
【０２９０】
セレンの投与が、肥大型分子の発現を変えることができるかどうかを決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。肥大型マーカーミオシン重鎖β（Ｍｙｈ７）および心臓アンキリン繰り返しタンパク質（Ａｎｋｒｄ１）の発現が、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含むセレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスにおいて下方制御されたことが観察された。この観察結果を確認するために、定量リアルタイム（ＱＲＴ）−ＰＣＲを行い、Ｍｙｈ７の発現（図２３Ａ、上部パネル）およびＡｎｋｒｄ１の発現（図２３Ｂ、上部パネル）は、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含むセレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスで有意に下方制御された。Ｍｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスにおける心臓Ｍｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１のタンパク質レベルは、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧマウスと比較したとき、有意に低かった（図２３Ａ−Ｂ、底部パネルを参照）。従って、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）は、被検体に投与されると、肥大型タンパク質Ｍｙｈ７およびＡｎｋｒｄ１の蓄積を阻害する（例えば、それによって、心筋の老化および肥大を阻害および／または予防する）。
【０２９１】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、ＰｏｌＧ高齢マウスにおけるＮＦＡＴｓ、Ｇｓｋ３βおよびＳ６Ｋのリン酸化およびタンパク質レベルを制御することによって心臓肥大を誘発することが知られているシグナル伝達経路を変える）
カルシニューリン−ＮＦＡＴシグナル伝達は、病的な心臓肥大および心不全で活性化される（例えば、Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４．６３（３）：ｐ．４６７−４７５を参照）。カルシニューリンは、元々、トランスジェニックマウスの心臓の中で、その過剰発現に基づき、肥大型シグナル伝達因子として関係があった。カルシニューリンの活性化された変異体を発現するマウスは、顕著な肥大型応答（心臓の大きさが２〜３倍の大きさ）を示し、２〜３ヶ月以内にすみやかに拡張型心不全に進行した（例えば、Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４．６３（３）：ｐ．４６７−４７５を参照）。Ｃｎ作用の主な機構は、サイトゾルにおいて、活性化されたＴ細胞（ＮＦＡＴ）の核因子の脱リン酸化を刺激することであり、核の中のリン酸化されていないＮＦＡＴが上昇する。核の中で、ＮＦＡＴファミリーメンバーが、Ｔ細胞における種々の免疫応答遺伝子の転写誘発に関与する（図２４Ａを参照）。４種類のカルシニューリン制御されたＮＦＡＴ転写因子（ＮＦＡＴｃ１〜ｃ４）は、それぞれ、カルシニューリンによってのみ活性化され、心筋中で発現する（例えば、Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４．６３（３）：ｐ．４６７−４７５を参照）。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンが、Ｃｎの発現を減らし、そのため、（例えば、心臓肥大を防ぐか、または小さくするように）Ｃｎ／ＮＦＡＴシグナル伝達を変えるかどうかを決定するために、従って、さらなる実験を行った。
【０２９２】
ウェスタンブロット分析を行い、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスの心臓において、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧマウスと比較したとき、カルシニューリン−Ａ（ＣＮ−Ａ）のタンパク質レベルと、４つのＮＦＡＴサブユニットのリン酸化状態（ＮＦＡＴＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）を比較した。図２４Ｂに示されるように、ＰｏｌＧ高齢マウスにおけるＣｎ−Ａレベルは変化しなかった。しかし、リン酸化ＮＦＡＴｃ２（ｐＮＦＡＴｃ２）のレベルは、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧマウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスにおいて上昇した（図２４Ｂおよび２４Ｃ）。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンが投与された被検体において、リン酸化ＮＦＡＴｃ３のレベル上昇も検出され、一方、リン酸化ＮＦＡＴｃ１およびＣ４は、検出されなかった。
【０２９３】
ＮＦＡＴｃｌのＮ末端制御ドメインを直接リン酸化するため、カルシニューリンの作用およびＮＦＡＴの核シャットリングは、ＧＳＫ３Ｐによって拮抗する（例えば、Ｃｒａｂｔｒｅｅら、２００２を参照）。ＧＳＫ３β発現の上昇によって、心臓ミオサイト肥大型成長が低下し、心臓において構成的または誘発可能なＧＳＫ３β発現が生成したトランスジェニックマウスにおいて、活性化されたカルシニューリンに対する応答において、心臓肥大が低下した（例えば、Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４．６３（３）：ｐ．４６７−４７５を参照）。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンの投与が、心臓のＧＳＫ３βレベルに対して与える影響を確定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。図２４Ｂおよび図２４Ｃに示されるように、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスが、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、ＧＳＫ３βの心臓での発現が有意に上昇したことが発見された。
【０２９４】
最近の試験は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴｏｒ）の阻害およびＳ６Ｋの欠損によって、雄マウスにおいて後者のみが観察された場合であっても、マウスの寿命を延ばすことができることが示されている（例えば、Ｓｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９．３２６（５９４９）：ｐ．１４０−４）；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９．４６０（７２５３）：ｐ．３９２−５を参照）。Ｓ６Ｋは、他の細胞においてＧＳＫ３β活性を阻害することが報告されている（例えば、Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｍｅ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００１．２（１０）：ｐ．７６９−７６を参照）。従って、リン酸化Ｓ６Ｋ（ｐＳ６Ｋ１）、ｍＴｏｒ、およびタンパク質合成ｐ４Ｅ−ＢＰおよびＰＩ３Ｋのシグナル伝達分子ｐＰＤＫｌおよびｐＡｋｔにおけるその下流の標的のタンパク質レベルが、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスにおいて変化するかどうかを試験するために、実験を行った。ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態のセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスにおいて、ｐＳ６Ｋ１レベルは、有意に低下したが、ｍＴＯＲも、他のリン酸化ＰＤＫｌ／Ａｋｔ／４Ｅ−ＢＰも有意な低下はみられなかった（図２４Ａおよび２４Ｂを参照）。
【０２９５】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、Ｆｏｘｏ３の発現を強化するが、Ｆｏｘｏ１またはＦｏｘｏ４の発現は強化しない）
最近の試験は、フォークヘッド転写因子（Ｆｏｘｏ）ファミリー遺伝子Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３およびＦｏｘｏ４は、心臓肥大および／または酸化ストレスに対する生存にとって重要であった（例えば、Ｎｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６．１１４（１１）：ｐ．１１５９−６８；Ｓｅｎｇｕｐｔａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１１．２８６（９）：ｐ．７４６８−７８を参照）。
【０２９６】
従って、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与し、Ｆｏｘｏファミリー転写因子に対する影響があるかどうかを決定するために、実験を行った。リアルタイムＰＣＲを利用し、ＰＯＬＧマウスの心臓組織において分析されたそれぞれのＦｏｘｏ遺伝子の発現における年齢に依存する上方制御または下方制御が存在しないことが決定された。さらに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスにおいて、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、Ｆｏｘｏ１またはＦｏｘｏ４の発現になんら有意な影響はなかったが、Ｆｏｘｏ３の発現が有意に増加した（ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方で）（図２５を参照）。Ｆｏｘｏ３ヌル変異マウスにおいて、心臓肥大が示されたが、Ｆｏｘｏ４ヌル変異マウスでは示されなかった（例えば、Ｎｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００６．１１４（１１）：ｐ．１１５９−６８）。従って、本出願は、心臓における転写活性を正に制御するためのＦｏｘｏ３機能の発現の増加を提供する。
【０２９７】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与し、高齢ＰｏｌＧマウスにおいて、心臓のＡｔｍ／Ｇａｄｄ４５ｇシグナル伝達を制御する）
Ａｔｍ／Ｇａｄｄ４５シグナル伝達は、細胞周期停止およびＤＮＡ修復の重要な経路である［１３、１４］。ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスの心臓におけるＡｔｍおよびＧａｄｄ４５の発現を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。ＱＲＴ−ＰＣＲを利用し、ＰｏｌＧマウスの心臓において、Ａｔｍの発現が年齢依存的に減少した（図２６Ａを参照）。興味深いことに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、ＰｏｌＧ高齢マウスの心臓においてＡｔｍ発現の年齢依存的な減少が止まった（図２６Ａを参照）。それに加え、Ａｔｍ／Ｔｒｐ５３の下流の標的（ｐ５３、細胞周期停止およびＤＮＡ修復のためのよく知られた腫瘍抑制因子である）である心臓Ｇａｄｄ４５の発現は、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与されたＰｏｌＧ高齢マウスにおいて有意に上方制御された（図２６Ｂを参照）。
【０２９８】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、心筋細胞におけるミトコンドリアＵｃｐ２を制御する）
ミトコンドリア（ＭＴ）の脱共役タンパク質は、熱発生およびＭＴの電位または一体性の管理にとって重要である（例えば、Ｓｅｎａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１２．４８（２）：ｐ．１５８−６７；Ｋｒａｕｓｓら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００５．６（３）：ｐ．２４８−６１を参照）。Ｕｃｐ２の欠損は、ＭＴにおいて寿命を短くし、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が増えることが示された（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ、２００９．２９６（４）：ｐ．Ｅ６２１−７；Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｃｕｒｒ  Ａｇｉｎｇ  Ｓｃｉ、２０１０．３（２）：ｐ．１０２−１２を参照）。ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスにおけるＵｃｐ１、２およびＵｃｐ３の発現を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。ＱＲＴ−ＰＣＲを利用し、ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰＯＬＧ高齢マウスにおいて、Ｕｃｐ２が有意に上昇したことが発見された（図２７を参照）。
【０２９９】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、心不全マーカーであり、心筋の収縮性にとって重要な分子であるリポカリン２（Ｌｃｎ２）の発現を下方制御する。）
Ｌｃｎ２は、心不全のバイオマーカーであり、心筋の収縮性にとって重要である（例えば、Ｙａｎｇら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．４（１）：ｐ．６０−７１；Ｘｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８７（７）：ｐ．４８０８−１７）を参照）。
【０３００】
ヒトが年を取ったとき、心臓は、硬くなり、心筋細胞が拡張し、筋肉細胞の収縮性が低下し、両方とも、心不全の主な要因である。ＳＤコントロール食を投与されたＰｏｌＧ高齢マウスと比較したとき、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスの心臓組織におけるＬｃｎ２発現を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。ＱＲＴ−ＰＣＲを利用し、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたＰｏｌＧ高齢マウスにおいて、Ｌｃｎ２の発現の有意で顕著な増加が発見された（図２８を参照）。この観察結果は、Ｌｃｎ２がＮＦＡＴ標的であるため、増加したｐＮＦＡＴ２／３レベルに関し、本明細書に開示される他の知見と一致している（例えば、遺伝子転写におけるＮＦＡＴ活性の不活性化）（図２４を参照）（例えば、Ｇａｕｄｉｎｅａｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、２０１２．１２５（Ｐｔ  １９）：ｐ．４４７５−８６を参照）。
【０３０１】
（実施例３）
（セレンを含有する組成物は、サルコペニアを緩和する）
（材料および方法）
（動物および処置）
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１匹ずつケージに入れ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にあるＳｈａｒｅｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに維持した。温度および湿度を一定レベルに維持した。部屋の光を、明と暗の１２時間ずつのサイクルを与えるように制御した。水および実験用の餌を自由に摂取できる状態でマウスに与えた。実験食（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによって製造）を暗室に４℃で保存し、新しい餌を供給器に１週間に２回加えた。
【０３０２】
１つのマウス群は、セレン濃度が０．０１ｍｇ／ｋｇ未満の基本食（ＳＤ）を与え、第２の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンを亜セレン酸ナトリウム（ＳＳ）の形態で加えたものを与えた。第３の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンをセレノメチオニン（ＳＭ）の形態で加えたものを与え、第４の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンを２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態で加えたものを与えた（（ＳＰ）、ＳＥＬＰＬＥＸ、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）。最終的なセレン濃度は、それぞれのＳＳ、ＳＭ、ＳＰ食で、１ｐｐｍであった。食事プレミックス中のセレン濃度を、原子吸光分析法によって評価した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｏｗｅｒ、Ｈｙｎｅｓ、２００４）。実験食において、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製であった。基本ＳＤ食は、１５ｇ／１００ｇの合計脂肪分、５３８．６ｇ／ｋｇのスクロース、３００ｇ／ｋｇのＴｏｒｕｌａ酵母、１４０ｇ／ｋｇのトウモロコシ油、３．０ｇ／ｋｇのＤＬ  メチオニン、１５．４ｇ／ｋｇの鉱物ミックス（食事基準、ｇ／ｋｇで、炭酸カルシウム、２．０２；塩化ナトリウム、２．６；クエン酸カリウム（一水和物）、７．７；硫酸カリウム、１．８２；酸化マグネシウム、０．８４；クエン酸第二鉄、０．２１；炭酸マグネシウム、０．１２；炭酸亜鉛、０．０５６；クロム硫酸カリウム、０．０１９；炭酸第二銅、０．０１１；ヨウ化カリウム、０．０００４）、３．０ｇ／ｋｇのビタミンミックス（食事基準、ｍｇ／ｋｇで、重酒石酸コリン、２８００；ナイアシン、３０；パントテン酸カルシウム、１６；ピリドキシン  ＨＣｌ、７；チアミン  ＨＣｌ、６；リボフラビン、６；葉酸、２；ビオチン、０．２；ビタミンＢ−１２（０．１％  マンニトン、２５；ｄｌ−α−トコフェリルアセテート（５００ｕｇ）、１００；ビタミンＡパルミテート（５００，０００ｕ／ｇ）、８；コレカルシフェロール（５００，０００ｕ／ｇ）、０．４；フィロキノン、３）を含んでいた。
【０３０３】
上に記載した食（ＳＤ、ＳＭ、ＳＳまたはＳＰ）を３ヶ月間投与した後、組織を集める前に、頸椎脱臼によってマウスを殺した。
【０３０４】
（組織の調製）
交差組織遺伝子発現試験のために、心臓、肝臓および腓腹筋の標本を集め、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。脳特異的な発現試験のために、大脳皮質を周囲の脳組織から分離し、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。
【０３０５】
（ＲＮＡ抽出）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、凍結した組織サンプルを均質化し、ＲＮＥＡＳＹ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、この企業によって推奨されるプロトコルで、全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を用い、単離されたＲＮＡの一体性および純度を評価し、さらに、ＡＧＩＬＥＮＴ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＧＩＬＥＮＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて確認した。
精製されたＲＮＡを、ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用い、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）を用い、製造業者が推奨する手順に従って、二本鎖ｃＤＮＡをビオチン標識されたｃＲＮＡに変換した。ビオチン標識されたｃＲＮＡ、およびＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて洗浄し、加熱（９４℃で３５分）によってフラグメント化した。
【０３０６】
（マイクロアレイおよびバイオインフォマティクス経路分析）
標識されたｃＲＮＡを、マウスゲノムＭＧ−４３０  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズし、その後、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）染色し、最後に、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）でスキャンした。
【０３０７】
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １２．５（ＡＧＩＬＥＮＴ）を使用し、マイクロアレイデータを検証し、正規化し、統計処理を行い、遺伝子発現パターンの分析を行った。簡単にいうと、まず、アレイのプローブセットの強度を平均標的強度５００に調整し、その後、この試験のすべてのサンプルのメジアンにベースラインを変換し、正規化を行った。マイクロアレイのＰｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈ（ＰＭ）およびＭｉｓ−Ｍａｔｃｈ（ＭＭ）プローブ設計に基づき、ＭＡＳ５によってバックグラウンド補正を行った。結果をミスリーディングする可能性を最低限にするために、低シグナル強度のプローブセットに、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＭＡＳ５アルゴリズムによってサンプルに「Ａｂｓｅｎｔ」とラベルを付け、さらなる分析から除外した。差次的に発現した遺伝子を、ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ方法を用いてフィルタリングし、Ｐ＜０．０５であるとき、遺伝子は、有意に差があると定義された。
【０３０８】
改変された転写プロフィールによって表される生物学的題材を解剖するために、２つの独立した経路分析手法を適用した。第１に、遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）を行い、この分析は、有意に変更された生体プロセスおよび食事によるシグナル伝達経路を特定するための規定された遺伝子セットの有意な変化の決定を行うコンピュータによる方法であった（例えば、Ｋｉｍ  ＆  Ｖｏｌｓｋｙ、２００５を参照）。少なくとも１０、最大で１０００の遺伝子を含み、レベル３以下を有する遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームのみを分析した。食事のＳｅ状態に関連する転写改変を特性決定するファンクショナルクラスターをさらに特定するために、有意に変更された遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（ＩＰ  Ａ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ネットワーク、ファンクション、既知のパスウェイにさらにグループ分けした。フィッシャーの正確確率検定を用い、遺伝子と、所与のネットワーク、生物学的ファンクションまたは既知のパスウェイとの関係の有意性を決定した。
【０３０９】
（全タンパク質の決定）
電子天秤を用いて腓腹組織の重量を決定し、次いで、記載されているように均質化した（例えば、Ｌａｎら、１９９８）。Ｐｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、この均質物のタンパク質レベルを決定した。それぞれのサンプル中の全タンパク質レベルを、組織の重量によって正規化した。データを、サンプルの数の平均±ｓｅｍとして示す。実験を２回繰り返した。
【０３１０】
（統計分析）
Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、２群間の統計的な差を決定し、一方、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、複数の群の差を決定した。０．０５未満のｐ値は、有意であるとした。
【０３１１】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、骨格筋タンパク質の増加を示す）
セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与したとき、骨格筋の組成および／または質量に影響を与えるかどうかを観察するために、セレンを追加しなかった食事を摂取したマウス（ＳＤ）に対し、マウスの全骨格筋タンパク質は、セレンを豊富に含む酵母（ＳＰ）の形態でセレンを追加した食事を摂取し、３ヶ月にわたって監視した。図２９に示されるように、骨格筋の全タンパク質は、ＳＤ食を投与されたマウスと比較して、ＳＰ食を投与されたマウスにおいて、有意に上昇した。このデータは、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの追加が、骨格筋の全タンパク質の増加を高めた。
【０３１２】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、筋肉衛星細胞の熟成および／または産生および骨格筋の再生を活性化する）
栄養シグナルに応答して成熟筋肉細胞を産生するための筋肉衛星（幹）細胞の活性化が起こらないことは、サルコペニアの一因である（例えば、Ｒｙａｌｌら、２００８）。活性化された衛星マーカー遺伝子、筋原因子６（Ｍｙｆ６）およびデスミン（Ｄｅｓ）の発現を測定することによって、セレンで処置された被検体と、コントロール被検体とで、骨格筋における筋肉衛星（幹）細胞の活性化を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。これらの活性化された衛星マーカー遺伝子の発現が、コントロールと比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（ＳＰ）およびセレン酸ナトリウム（ＳＳ）の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において、有意に上方制御されたことが発見された（図３４を参照）。従って、本出願は、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレン含有化合物）の形態のセレンが、筋肉衛星細胞の成熟を促進し（例えば、成熟筋肉細胞を生成し）、それによって、サルコペニアを弱める。
【０３１３】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、骨格筋においてタンパク質合成を制御するシグナル経路を変える）
（ｍＴＯＲ／Ｓ６ＫおよびＭＡＰＫ／Ｓ６Ｋのシグナル伝達）
ｍＴＯＲによるシグナル伝達は、成長（質量の蓄積）および増殖のような細胞挙動を正および負の両方に制御することができるいくつかの主要な細胞機能に影響を与える（例えば、Ｌａｐｌａｎｔｅ、Ｃｅｌｌ．２０１２、１４９（２）：２７４−９３）。タンパク質合成は、ｍＴＯＲによって制御される最もよく特性決定されたプロセスの１つである。ｍＴＯＲによるＳ６Ｋの活性化は、ｍＴＯＲシグナル伝達経路によってタンパク質合成のための重要な工程である（例えば、Ｌａｐｌａｎｔｅ、Ｃｅｌｌ．２０１２、１４９（２）：２７４−９３を参照）。ｍＴＯＲ経路によってＳ６Ｋの活性化に加えて、タンパク質合成は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ２が介在する経路によってＳ６Ｋを活性化することによっても刺激を受けることができる（例えば、Ｋｅｎｅｓｓｅｙ  ａｎｄ  Ｏｊａｍａａ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００６、２８１（３０）２０６６６−２０６７２）。分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ２（ＭＡＰ２Ｋ２）は、ＭＡＰＫ１／ＥＲＫ２経路を活性化する酵素であり、ヒトにおいて、ＭＡＰ２Ｋ２遺伝子によってコードされる（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００７、１７７３（８）：１１５０−６０を参照）。次いで、ＭＡＰＫは、ＲＳＫを活性化し、その後、リボソームタンパク質Ｓ６Ｋをリン酸化する（例えば、Ｐｅｎｄｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ、２００４．２４（８）：ｐ．３１１２−３１２４を参照）。タンパク質合成と関連する経路の負の制御因子は、ＧＳＫ３βである。ＧＳＫ３βの阻害は、タンパク質合成に関与する真核生物開始因子（ｅＩＦ２Ｂ）を遮断しする。ＧＳＫ３Βの不活性な形態の発現は、骨格筋管の肥大の顕著な増加を誘発することが示されており、心臓における野生型ＧＳＫ３βの過剰発現は、心臓の大きさの３０％減少を誘発する（例えば、Ｓａｎｔｒｉ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）２００８；２３：１６０−７０を参照）。
【０３１４】
コントロールと比較して、セレンを豊富に含む酵母（ＳＰ）の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋においてｍＴＯＲの遺伝子発現レベルの有意な減少が観察された（図３１を参照）。セレンを豊富に含む酵母（ＳＰ）の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において、ＭＡＰ２Ｋ２遺伝子発現のさらにもっと顕著な減少が観察され、ＳＤ食を投与されたマウスと比較した場合、−３．０３倍の変化を示している（図３６）。
【０３１５】
２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（ＳＥＬＰＬＥＸ）を投与すると、コントロールと比較したとき、Ｓ６Ｋの発現を下方制御するという知見（例えば、図３１を参照）は、ＳＥＬＰＬＥＸが、マウスの骨格筋のｍＴＯＲおよびＭＡＰＫ２Ｋの発現を減少させるという発見と相関関係があった。しかし、ＳＥＬＰＬＥＸが、ＳＥＬＰＬＥＸを投与されたマウスの腓腹組織においてＧＳＫ３β発現を有意に下方制御したという知見は、驚くべきことに、ＧＳＫ−３βの不活性化が、タンパク質合成を刺激し得ると考えられる。これらの結果は、筋肉内でタンパク質合成を促進することが知られている遺伝子（例えば、ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫ２ＫおよびＳ６Ｋ）の下方制御にもかかわらず、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはその中に存在する１つ以上のセレンを含有する組成物）が、他の経路によって、全骨格筋タンパク質を増加させる（例えば、骨格筋の質量）。
【０３１６】
Ａｍｐｋ（ｍＴｏｒ阻害剤）は、タンパク質合成にも関与する（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら、２００８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００８）。Ｓ６ｋおよびｍＴＯＲの発現の減少と一致して、Ｐｒｋａａ２（Ａｍｐｋのサブユニット）の発現の上昇は、コントロールと比較して、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において観察された（図３１を参照）。従って、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはセレン含有化合物、その要素）のセレンの形態でのセレンを、本明細書に記載されるように利用し、被検体の骨格筋の質量が増加する。
【０３１７】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、骨格筋の質量の生成におけるカルシニューリンの発現を上方制御する）
（カルシニューリン／ＮＦＡＴネットワーク）
活性化されたＴ細胞（ＮＦＡＴ）シグナル伝達のカルシニューリン／核因子は、運動およびカルシウムシグナル伝達に応答して骨格筋の質量の増加と関連する鍵となる経路である。（例えば、Ｇｌａｓｓ、２００３を参照）。肥大型遺伝子を制御するカルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達分子の発現を特性決定するために、本出願の実施形態を実施中に実験を行った。カルシニューリンの触媒サブユニットをコードする遺伝子の発現（Ｐｐｐ３ｃおよびＰｐｐ３ｃｃおよびカルシニューリンＢサブユニットＰｐｐ３ｒｌ）は、コントロールと比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において、すべて有意に上昇した（以下の表６を参照）。それに加え、Ｐｐｐ３ｒ２（カルシニューリンＢの他のサブユニット）の発現が増加する傾向も観察された（以下の表６を参照）。
【表６】
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表６．セレンを追加していないコントロール食と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（ＳＰ）の形態のセレンを追加した食事を用いて３せえ与えた正常なマウスの骨格筋におけるカルシニューリンの増加
【０３１８】
タンパク質レベルの増加および骨格筋の成長に寄与するタンパク質伸長因子（Ｅｅｆｌａｌ、Ｅｅｆｌｂ２、Ｅｅｆｌｅｌ、Ｅｅｆｌｇ、Ｅｅｆ２）をコードする複数の遺伝子が、コントロールと比較して、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において上方制御された（図３０を参照）。
【０３１９】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、骨格筋におけるタンパク質合成を阻害するシグナル伝達ネットワークを変える）
（ミオスタチン／Ａｃｖｒ  ２ｂネットワーク）
ミオスタチンおよびその受容体であるアクチビンＡは、筋萎縮を制御する別の重要な経路である。Ａｃｖｒ２ｂ（筋線維に特異的）の遺伝的除去は、衛星細胞活性化がない状態でさえ、筋肥大を誘発するのに十分である（例えば、Ｌｅｅら、ＰＮＡＳ  ２０１２を参照）。それに加え、ミオスタチン／Ａｃｖｒ２ｂ複合体は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を破壊することによって、タンパク質合成を阻害する（例えば、ＳａｋｕｍａおよびＹａｍａｇｕｃｈｉ、Ｊ  Ａｇｉｎｇ、２０１２を参照）。
【０３２０】
従って、コントロール食を投与された被検体と、セレンを含む食事を投与された被検体とで、骨格筋におけるＡｃｖｒ発現を特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。Ａｃｖｒ２ｂ発現が、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与された被検体において、有意に下方制御されたことが決定された（図３３を参照）。
【０３２１】
（セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、萎縮性遺伝子発現を下方制御し、骨格筋におけるタンパク質変性を阻害する）
三部分モチーフ含有６３（Ｔｒｉｍ６３）およびユビキチンＥ３リガーゼアトロジン−１（Ｆｂｘｏ３２）のような萎縮遺伝子の発現増加が、サルコペニアにおけるタンパク質変性を引き起こすことが示されている（例えば、Ｓａｋｕｍａ  ａｎｄ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、２０１２を参照）。従って、セレンを含有する実験食を投与された被検体と、セレンが不足する食事を投与された被検体において、骨格筋の萎縮遺伝子発現を特性決定するために、本出願の実施形態の実施中に実験が行われた。Ｔｒｉｍ６３およびＦｂｘｏ３２の両方が、コントロールと比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与されたマウスの骨格筋において、下方制御したことが発見された（図３２を参照）。Ｔｒｉｍ５３およびＦｂｘｏ３２の発現の減少は、コントロールと比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを２年投与された正常なマウスからの骨格筋でも示された。
【０３２２】
従って、ある実施形態では、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレン（または、セレン含有化合物、その要素）を、骨格筋萎縮を阻害するために本明細書に記載するように利用する。
【０３２３】
（実施例４）
（セレンを含む組成物を投与すると、肥満に関連する分子の発現を有意に弱める）
サルコペニアおよび肥満は、先進国において、平均余命および健康管理費用への影響が増しつつある、２つの、独立しているが、内部でつながった状態である。筋肉質量の減少と、脂肪質量の増加の組み合わせは、「サルコペニア肥満」と呼ばれる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３）。肥満は、脂肪質量の上昇と脂肪の蓄積を促進し、骨格筋へのアミノ酸の組み込みを抑制し、タンパク質合成を低下させるため、サルコペニアを悪化させる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３を参照）。次いで、骨格筋の質量は、全身のグルコース処理、インスリン抵抗性に基本的な役割を有するという点で、代謝の健康にとって重要であり、サルコペニアが肥満を悪化させる（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３）。サルコペニアに加え、肥満は、多くは、例えば、ＩＩ型糖尿病、高血糖その他の他の代謝性疾患に関連する副作用である。遺伝的な病気のかかりやすさ、肥満に関連する分子の発現も、寄与因子であることが十分に理解される。肥満は、先進国において、平均余命および健康管理費用への影響が増しつつある（例えば、Ｐａｒｒ、Ｅ．、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、２０１３．７４：ｐ．１０９−１１３を参照）。
【０３２４】
脂肪質量および肥満に関連する遺伝子（ＦＴＯ）は、一般的に、「肥満遺伝子」と呼ばれ、子供および成人において、ボディマス指数の上昇および肥満になりやすさに強く関係がある（例えば、Ｇｕｌａｔｉら、ＰＮＡＳ、２０１３．１１０（７）：ｐ．２５５７−２５６２を参照）。ＦＴＯ遺伝子は、広範囲に発現するが、脳において、海馬内、小脳および視床下部でｍＮＡレベルが特に高く、食物摂取、全身の代謝および肥満の制御に脳ＦＴＯが何らかの役割を果たしている可能性を示唆する（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００９を参照）。
【０３２５】
セレンの投与がＦＴＯの発現を変え得るかどうかを決定するために、さらなる本出願の実施形態の開発中に行われる実験を行った。
【０３２６】
実施例３に記載される動物モデルを利用し、皮質組織（発現差＝−１．７０）だけではなく、腓腹組織（発現差＝−３．３３）において、ＳＤ食が投与された被検体と比較して、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンが投与された被検体が、顕著に低下したレベルのＦＴＯ遺伝子発現を示すことが決定された（図３６および図３７を参照）。
【０３２７】
（実施例５）
（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を投与したときの、骨格筋  対  肝臓でのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲｇ）コアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ−１α）の発現の逆相関）
（材料および方法）
（動物および処置）
雄Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスを１匹ずつケージに入れ、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にあるＳｈａｒｅｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに維持した。温度および湿度を一定レベルに維持した。部屋の光を、明と暗の１２時間ずつのサイクルを与えるように制御した。水および実験用の餌を自由に摂取できる状態でマウスに与えた。実験食（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによって製造）を暗室に４℃で保存し、新しい餌を供給器に１週間に２回加えた。
【０３２８】
１つのマウス群は、セレン濃度が０．０１ｍｇ／ｋｇ未満の基本食（ＳＤ）を与え、第２の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンを亜セレン酸ナトリウム（ＳＳ）の形態で加えたものを与えた。第３の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンをセレノメチオニン（ＳＭ）の形態で加えたものを与え、第４の群は、ＳＤ食と同じであるが、１．０ｍｇ／ｋｇのセレンを２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態で加えたものを与えた（（ＳＰ）、ＳＥＬＰＬＥＸ、ＡＬＬＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）。最終的なセレン濃度は、それぞれのＳＳ、ＳＭ、ＳＰ食で、１ｐｐｍであった。食事プレミックス中のセレン濃度を、原子吸光分析法によって評価した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｐｏｗｅｒ、Ｈｙｎｅｓ、２００４）。実験食において、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製であった。基本ＳＤ食は、１５ｇ／１００ｇの合計脂肪分、５３８．６ｇ／ｋｇのスクロース、３００ｇ／ｋｇのＴｏｒｕｌａ酵母、１４０ｇ／ｋｇのトウモロコシ油、３．０ｇ／ｋｇのＤＬ  メチオニン、１５．４ｇ／ｋｇの鉱物ミックス（食事基準、ｇ／ｋｇで、炭酸カルシウム、２．０２；塩化ナトリウム、２．６；クエン酸カリウム（一水和物）、７．７；硫酸カリウム、１．８２；酸化マグネシウム、０．８４；クエン酸第二鉄、０．２１；炭酸マグネシウム、０．１２；炭酸亜鉛、０．０５６；クロム硫酸カリウム、０．０１９；炭酸第二銅、０．０１１；ヨウ化カリウム、０．０００４）、３．０ｇ／ｋｇのビタミンミックス（食事基準、ｍｇ／ｋｇで、重酒石酸コリン、２８００；ナイアシン、３０；パントテン酸カルシウム、１６；ピリドキシン  ＨＣｌ、７；チアミン  ＨＣｌ、６；リボフラビン、６；葉酸、２；ビオチン、０．２；ビタミンＢ−１２（０．１％  マンニトン、２５；ｄｌ−α−トコフェリルアセテート（５００ｕｇ）、１００；ビタミンＡパルミテート（５００，０００ｕ／ｇ）、８；コレカルシフェロール（５００，０００ｕ／ｇ）、０．４；フィロキノン、３）を含んでいた。
【０３２９】
組織を集める前に、頸椎脱臼によってマウスを殺した。
【０３３０】
（組織の調製）
交差組織遺伝子発現試験のために、心臓、肝臓および腓腹筋の標本を集め、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。脳特異的な発現試験のために、大脳皮質を周囲の脳組織から分離し、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。
【０３３１】
（ＲＮＡ抽出）
ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、凍結した組織サンプルを均質化し、ＲＮＥＡＳＹ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、この企業によって推奨されるプロトコルで、全ＲＮＡを抽出した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ）を用い、単離されたＲＮＡの一体性および純度を評価し、さらに、ＡＧＩＬＥＮＴ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＧＩＬＥＮＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて確認した。
【０３３２】
精製されたＲＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用い、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて、二本鎖ｃＤＮＡに変換した。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｎｅ−Ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）を用い、製造業者が推奨する手順に従って、二本鎖ｃＤＮＡをビオチン標識されたｃＲＮＡに変換した。ビオチン標識されたｃＲＮＡ、およびＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて洗浄し、加熱（９４℃で３５分）によってフラグメント化した。
【０３３３】
（マイクロアレイおよびバイオインフォマティクス経路分析）
標識されたｃＲＮＡを、マウスゲノムＭＧ−４３０  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズし、その後、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）染色し、最後に、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）でスキャンした。
【０３３４】
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １２．５（ＡＧＩＬＥＮＴ）を使用し、マイクロアレイデータを検証し、正規化し、統計処理を行い、遺伝子発現パターンの分析を行った。簡単にいうと、まず、アレイのプローブセットの強度を平均標的強度５００に調整し、その後、この試験のすべてのサンプルのメジアンにベースラインを変換し、正規化を行った。マイクロアレイのＰｅｒｆｅｃｔ  Ｍａｔｃｈ（ＰＭ）およびＭｉｓ−Ｍａｔｃｈ（ＭＭ）プローブ設計に基づき、ＭＡＳ５によってバックグラウンド補正を行った。結果をミスリーディングする可能性を最低限にするために、低シグナル強度のプローブセットに、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＭＡＳ５アルゴリズムによってサンプルに「Ａｂｓｅｎｔ」とラベルを付け、さらなる分析から除外した。差次的に発現した遺伝子を、ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ方法を用いてフィルタリングし、Ｐ＜０．０５であり、対応するシグナル強度の発現差（ＦＣ）＞１．２またはＦＣ＜−１．２である遺伝子は、有意に差があると定義された。
【０３３５】
改変された転写プロフィールによって表される生物学的題材を解剖するために、２つの独立した経路分析手法を適用した。第１に、遺伝子セットエンリッチメントのパラメトリック解析（ＰＡＧＥ）を行い、この分析は、有意に変更された生体プロセスおよびシグナル伝達経路を特定するための規定された遺伝子セットの有意な変化の決定を行うコンピュータによる方法であった（例えば、Ｋｉｍ  ＆  Ｖｏｌｓｋｙ、２００５を参照）。少なくとも１０、最大で１０００の遺伝子を含み、レベル３以下を有する遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームのみを分析した。食事のＳｅ状態に関連する転写改変を特性決定するファンクショナルクラスターをさらに特定するために、有意に変更された遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア（ＩＰ  Ａ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ネットワーク、ファンクション、既知のパスウェイにさらにグループ分けした。フィッシャーの正確確率検定を用い、遺伝子と、所与のネットワーク、生物学的ファンクションまたは既知のパスウェイとの関係の有意性を決定した。
【０３３６】
（リアルタイムＰＣＲ分析）
Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの前もって設計したＴＡＱＭＡＮプローブおよびプライマー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用い、製造業者が推奨する手順に従って、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。それぞれのサンプルにおいて、Ａｃｔｂレベルによってデータを正規化し、サンプルの数の平均±ｓｅｍとして表した。
【０３３７】
（統計分析）
リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析のために、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、２群間の統計的な差を決定し、一方、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、複数の群の差を決定した。０．０５未満のｐ値は、有意であるとした。
【０３３８】
（背景）
骨格筋および肝臓は、グルコースのホメオスタシスの維持における２つの鍵となるインスリン応答性の臓器である。インスリン抵抗性状態へのこれらの臓器の移行は、ＩＩ型糖尿病患者でみられる糖代謝のほとんどの変化を説明する（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ、２００５を参照）。これらの２つの臓器の中で、骨格筋は、インスリン抵抗性の進行から生じる結果という観点でもっと重要である。骨格筋は、毎日摂取するグルコースの８０〜９０％を処理または代謝することがわかっているからである（例えば、ＤｅＦｒｏｎｚｏら、１９８５を参照）。
【０３３９】
ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）遺伝子が、前糖尿病および糖尿病の個人において、健康なコントロールと比較して、発現の減少を示し、顕著な数のＯＸＰＨＯＳ遺伝子が、転写コアクチベーターＰＧＣ１−αによって制御されることが示されている（例えば、Ｍｏｏｔｈａら、２００３を参照）。これらの研究において、ＯＸＰＨＯＳ遺伝子について典型的な発現の減少は中程度である（約２０％）が、非常に一貫性があり、遺伝子の８９％より多くが、正常な耐糖能を有する個人と比較して、耐糖能不良またはＩＩ型糖尿病のいずれかの個人において、低い発現を示している。ＯＸＰＨＯＳ分子発現の重要性の裏付けとして、有酸素運動（糖尿病を処置するための最良の非薬理学的介入である）は、ミトコンドリアの数を増やし、ＯＸＰＨＯＳ分子発現を促進する。
【０３４０】
従って、被検体へのセレンの投与が、被検体の肝臓および／または骨格筋におけるＯＸＰＨＯＳ活性を変えることができるかどうか（例えば、ＩＩ型糖尿病のための治療として）について観察するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。本出願の実施形態の開発中に作られた経験的データは、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると（Ｔｒｔ）、コントロール被検体（Ｃｏｎ）と比較して、骨格筋におけるＰＣＧ１−αの発現を顕著に高めることが発見された（図３８を参照）。
【０３４１】
本明細書に記載されるように、ＰＧＣ１−αは、筋骨格においてミトコンドリア活性を高める、強力な転写コアクチベーターである。しかし、骨格筋以外の組織において高いレベルのＰＧＣ１−αの発現は、被検体において悪い影響および／または有害な影響を有する場合がある。例えば、肝臓において、ＰＧＣ１−αは、骨格筋において機能を果たす役割以外の異なる役割を果たす。特に、肝臓においてＰＧＣ１−αレベルが上昇すると、糖新生を増加させ（グルコース産生；例えば、ＬｉａｎｇおよびＷａｒｄ、２００６を参照）、インスリン感受性の不全を伴い、特に望ましくない事象が糖尿病被検体で起こり、グルコースを代謝に使用することができない。
【０３４２】
従って、被検体へのセレンの投与によって、非骨格筋組織におけるＰＧＣ１−αの発現に関する活性があるかどうかを観察するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。予測できないことだが、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与（Ｔｒｔ）によって、コントロール被検体（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、肝臓組織においてＰＧＣ１−αの顕著な減少が発見された（図３９を参照）。この発見は、驚くべきことに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると、コントロール被検体と比較して、骨格筋におけるＰＧＣ１−αの発現が顕著に向上したという観察に基づいていた。従って、本出願は、被検体の肝臓におけるＰＧＣ１−αの発現を同時に下げつつ（例えば、それによって、（例えば、ＯＸＰＨＯＳを高めることによって）骨格筋でのグルコース処理が向上した被検体を与え、肝臓でのグルコース産生を抑制し）、被検体の骨格筋におけるＰＣＧ１−αの発現を高める方法で使用するための、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物を含む組成物を提供する。
【０３４３】
２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を含む組成物が、被検体の異なる組織における同じ分子（例えば、ＰＧＣ１−α）の発現について、このようなまったく異なる影響を有する能力をさらに特性決定し、確認するために、実験を行い、セレンを含む組成物が投与された被検体におけるＣＯＵＰ転写因子２（核受容体サブファミリー２グループＦメンバー２（Ｎｒ２Ｆ２）としても知られる）の発現を分析した。Ｎｒ２Ｆ２は、ＰＧＣ１−αの推定直接阻害剤である（例えば、Ｌｉｎら、２０１１を参照）。
【０３４４】
ここでも再び、驚くべきことに、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の形態でセレンを投与すると（Ｔｒｔ）、コントロール被検体（Ｃｏｎ）と比較して、骨格筋におけるＮｒ２Ｆ２発現が顕著に減少したことを発見し（図３８を参照）、一方、コントロールと比較して、肝臓組織においてＮｒ２Ｆ２の顕著な上昇があった（図３９参照）。このデータは、被検体の複数の組織（例えば、骨格筋組織および肝臓組織）におけるグルコースホメオスタシスを制御するときに使用するための、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母（またはこれらの１つ以上の水溶性フラクション、またはこれらの１つ以上の水不溶性フラクション、またはこれらの中に存在するセレン含有化合物またはこれらから誘導される１つ以上のセレン含有化合物）の形態でセレンを含む組成物の有用性に関する最初の証拠を与える。
【０３４５】
（実施例６）
（セレンを豊富に含む酵母の形態でのセレンの投与は、グルコース利用に寄与する分子の発現を向上させる）
実施例２に記載する動物モデルを利用し、実験を行い、セレンを含む組成物が投与された被検体の肝臓における酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）を制御する分子の発現を分析した。２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の投与によって、肝臓特異的なミトコンドリア活性を優先的に、差次的に制御することができ、一方、亜セレン酸セレンまたはセレノメチオニンを投与すると、顕著に有効性が低いことを発見した。特に、２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母を投与されたマウスが、ＡＴＰシンターゼ；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送、ＶＩサブユニットＡ；チトクロムｃオキシダーゼ、サブユニットＶａ；チトクロムｃ−１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス１０；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス１；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス３；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス４；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス  ａａｓｅ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１ベータサブコンプレックス４；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１ベータサブコンプレックス８；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１ベータサブコンプレックス１０；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓ−タンパク質４；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）Ｆｅ−Ｓ−タンパク質６；およびサクシネートデヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットＣの発現において有意な増加を示し、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送リソソーム、ＶＩサブユニットＨ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス４；およびジンクフィンガーＣＣＨＣドメイン含有２の発現は有意な減少も示すことが観察された。
【０３４６】
対照的に、亜セレン酸ナトリウムを投与されたマウスは、ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送、ＶＩサブユニットＡ；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送、ＶＩサブユニットＡ；チトクロムｃオキシダーゼ、サブユニットＶａ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス１０；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス１；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１ベータサブコンプレックス１０；およびサクシネートデヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットＣの発現において有意な増加を示し、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送リソソーム、ＶＩサブユニットＨ；およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）１アルファサブコンプレックス４の発現の有意な減少も示した。
【０３４７】
セレノメチオニンを投与されたマウスは、ＡＴＰシンターゼおよびチトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶａの発現において有意な増加を示し、ＡＴＰａｓｅ阻害因子１；ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送リソソーム、ＶＩサブユニットＨ；およびＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋輸送、ＶＩサブユニットＡの発現の有意な減少も示した。
【０３４８】
（実施例７）
（単離されたセレン含有化合物は、ミトコンドリア活性を制御する）
任意の複雑な生体混合物において、混合物中に存在する分子群が、相加的に作用しない場合もあり、相乗的に作用する場合があるか、または最終的な調製物の活性を減らすように拮抗的に作用する場合もあり得る。例えば、本明細書に記載される２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母の生体活性は、混合物中のセレン種／セレンを含む化合物の一部またはすべての影響の合計に起因するだろう。
【０３４９】
上の実施例１に記載されるように、セレンを豊富に含む酵母のＳｅメタボロームおよびプロテオームを特性決定するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。Ｓｅを含む化合物（例えば、分子、代謝物およびタンパク質／ペプチド）の特定および特性決定が実施例１に提供され、特定および特性決定は、現在、不明なままである。
【０３５０】
従って、実施例１で特定された具体的なセレン含有化合物が、１または複数の生体活性を有するかどうかを決定するために（例えば、セレン含有化合物が生体活性を示すかどうか、および／またはセレン含有化合物が、酵母細胞および／または他のものとの内部での混ぜ合わせ、セレンを含有しない細胞要素の制限から単離され、精製された場合に、もっと大きな（またはもっと小さな）生体活性を有するかどうかを決定するために）、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。実施例１においてセレンを豊富に含む酵母から特定された多くの最も豊富に含むセレン含有化合物および分子を合成するか、または得た。この実験の１つの着目点は、セレンを豊富に含む酵母中に存在する全セレンの２５％までを占める、実施例１に記載されるような水溶性抽出物である。水溶性抽出物からのセレン含有化合物は、被検体によって消費され、腸管を通ると、セレンを豊富に含む酵母から最初に放出／消化されることが想定された。上の実施例１に記載されるように、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレンを含有するタンパク質は、コンピュータを用いる予測モデリングを用いて特定された。さらに、実験は、消化酵素（例えば、トリプシン）の作用によって放出される小さいセレンを含有するペプチドを特定した。
【０３５１】
分析および特性決定のために、セレン含有化合物の９個のパネルを得た。このパネルは、以下のセレン含有化合物を含んでいた。ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ１６Ｈ３３Ｎ６Ｏ４Ｓｅ）（５番）；ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）；ＬＴＧＳｅ−ＭＡＦＲ（Ｃ３５Ｈ５９Ｎ１０Ｏ９Ｓｅ）（７番）；セレノグルタチオニンダイマー（Ｃ２０Ｈ３２Ｎ６０Ｏ１２Ｓｅ２）（８番）；メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）；グルタミルセレノシステイン（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２４Ｏ１０Ｓｅ２）（１０番）；酵母ｐＨ６．０（２５番）；（３倍）グルタチオン、酸化されたもの（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た）（２８番）；およびグルタミルシステイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た）（３０番）。
【０３５２】
使用されるセレン含有化合物（およびそれぞれについて任意に割り当てられた数字）は、以下の通りであった。（１番）Ｌ−セレノシスチン（Ｃ６Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｓｅ２）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号５４５９９６から購入した（純度９７％）。
【０３５３】
（２番）Ｌ−セレノホモシスチン（Ｃ８Ｈ１６Ｎ２Ｏ４Ｓｅ２）。合成スキームおよび方法論は、以下の通りであった。
【化１】
0006313418.tif 000013
【０３５４】
Ｌ−（＋）−セレノメチオニン（１．９６ｇ、１０．０ｍＭ）の液体アンモニア（８０ｍＬ、６０ｇ）溶液に、−７８℃（ドライアイス−アセトン浴）で、攪拌しつつ、溶液が１５分間青色のままになるまで、小さな金属ナトリウム片（０．５７５ｇ、２５．０ｍＭ）を８０分以内で注意深く加えた。溶液を−７８℃でさらに５０分間攪拌し、固体塩化アンモニウム（３．０ｇ、５６ｍＭ）を加え、ナトリウムアミドを中和した。反応混合物を空気に開放し、周囲温度まで一晩かけてゆっくりと加温した。得られた黄色固体を１００ｍＬの水と混合し、１Ｎ  ＨＣｌ（６．０ｍｌ）を加えることによって、ｐＨ約９．０を６．７に調節した。メタノール（５０ｍＬ）を加え、午前９時（１１年０４月２８日）から午前９時（１１年０４月２９日）まで、空気を流しつつ混合物を激しく攪拌した。淡黄色沈殿を濾過によって集め（１．６５２ｇ、収率９１．２％）、セレノメチオニン（Ｒｆ＝０．８）が混入していないきれいなセレノホモシスチン（Ｒｆ＝０．５２）のために構築した。ＴＬＣ：ＳｉＯ２；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＮＨ４ＯＨ／１８：２：０．２）。５％ＫＭｎＯ４を用いて処置し、加熱した後に、黄色のスポット。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝４３３。ＮＭＲ、４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中１Ｎ  ＤＣｌ、δ＝０．０ｐｐｍ（Ｍｅ３Ｓｉ−ＣＤ２ＣＤ２ＣＯ２Ｎａ）：５．２３８ｂｒ．Ｓ  すべてＮＤ３＋，７．１３Ｈ／Ｄ；４．２５９ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ−１；３．０５８ｄｔ，Ｊ＝３．２＆６．４Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ−３；２．４４６ｄｐ，Ｊ＝６．４＆１３．６＆６．４，２Ｈ，Ｃ−２（光学的に活性）。
【０３５５】
（３番）メチルセレノ−Ｌ−システイン（Ｃ４Ｈ９ＮＯ２Ｓｅ）を塩酸塩としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（カタログ番号Ｍ６６８０、純度９５％）。（４番）Ｌ−セレノメチオニン（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓｅ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（カタログ番号Ｓ３１３２、純度９８％）。（５番）Ｂｉｏｍａｔｉｋ、ウィルミントン、デラウェア）によって合成されるか、またはこれから得られる、ＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ１６Ｈ３３Ｎ６Ｏ４Ｓｅ。（６番）Ｂｉｏｍａｔｉｋ、ウィルミントン、デラウェア）によって合成されるか、またはこれから得られる、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ２Ｓｅ）。（７番）Ｂｉｏｍａｔｉｋ、ウィルミントン、デラウェア）によって合成されるか、またはこれから得られる、ＬＴＧＳｅ−ＭＡＦＲ（Ｃ３５Ｈ５９Ｎ１０Ｏ９Ｓｅ）。（８番）Ｂｉｏｍａｔｉｋ、ウィルミントン、デラウェア）によって得られる、セレノグルタチオンダイマー（Ｃ２０Ｈ３２Ｎ６Ｏ１０Ｓｅ２）。合成スキームおよび方法論は、以下の通りであった。
【化２】
0006313418.tif 000014
【０３５６】
（ＭＯＢ−セレノシステイン（６６５−７１）の合成）
セレノシスチン３．３４１ｇ（１０Ｍｍｏｌ）を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍＬに溶解し（氷浴、Ａｒ０、３０分、溶液が黄色に着色）、その後、完全に変色するまで、水素化ホウ素ナトリウム１．３５ｇ（３０Ｍｍｏｌ）を何回かに分けて加えた。強力に磁気攪拌しつつ、この反応混合物に２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ｍＬ）を加え、未希釈のｐ−メトキシベンジルクロリド７．８３１ｇ（５０Ｍｍｏｌ）を氷で冷却しつつ加える。攪拌し、冷却し、Ａｒ０流を４時間維持する。この時間の後に、約７．０ｍＬの濃塩酸を加え、反応混合物のｐＨを８．５に調節する。生成する白色沈殿を濾別し、１０ｍＬで２回、１０ｍＬのエチルエーテルで５回洗浄する。高減圧下、生成物をＰ２Ｏ５の上で２０時間乾燥させ、８．２９ｇのアモルファス白色沈殿を得て、これをさらに精製することなく、合成の次の段階に使用する。
【０３５７】
（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅ（ＭＯＢ）ＣｙｓＯＨ（６５５−７２）の合成）
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＮＨＳエステル６．５５ｇ（１６．３５７Ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶かし、この溶液を磁気攪拌しつつ、水１２．５ｍＬとトリエチルアミン２．３ｍＬ（１６．５Ｍｍｏｌ）の混合物中のＭＯＢ−セレノシステイン４．６８ｇ（１６．２５Ｍｍｏｌ）の懸濁物に周囲温度（２２℃）で加え、効率よく攪拌しつつ５０時間放置する。この時間の後、混合物を氷浴で冷却し、濃塩酸１．４ｍＬと水８．６ｍＬの混合物を１滴ずつ加える。過剰量の溶媒を減圧ロータリーエバポレーションによってＴ＜２５℃で除去し、溶液を２０ｍＬの水（ｐＨ６．５）で希釈し、５０ｍＬのエチルエーテルで３回、５０ｍＬの酢酸エチルで３回、５０ｍＬのジクロロメタンで３回抽出する。溶液を乾燥するまで蒸発させ、９．２ｇの未精製生成物が得られ、これをさらに精製することなく、合成の次の段階に使用する。
【０３５８】
（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅ（ＭＯＢ）Ｃｙｓ−ＮＨＳエステル（６５５−７５）の合成）
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅ（ＭＯＢ）ＣｙｓＯＨ  ９．２ｇ（１６．０Ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．８４１ｇ（１６．０Ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン１３０μＬを、無水エチルエーテル２００ｍＬに溶解／懸濁する。次いで、ジシクロヘキシルジカルボイミド３．４０４ｇ（１６．５Ｍｍｏｌ）の無水エチルエーテル１００ｍＬの溶液を、滴下漏斗によって（空気を平衡状態にしつつ）、周囲温度（２２℃）で溶液によく攪拌しながら加える。攪拌しつつ、反応物を２４時間放置し、生成する白色沈殿を濾別し、２０ｍＬの無水エチルエーテルで３回洗浄し、捨てる。濾液を濃縮し、１２．９５ｇの黄色粘性油状物を得て、これをさらに精製することなく、合成の次の段階に使用する。
【０３５９】
（完全に保護されたセレノグルタチオン（スキームを参照、６５５−７７）の合成）
上の工程からのすべてのＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅ（ＭＯＢ）Ｃｙｓ−ＮＨＳエステル１２．９７ｇ（約１６．Ｍｍｏｌ）、グリシン塩酸−Ｏ−ｔＢｕエステル３．２ｇ（１９．１Ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン４．２ｍＬを無水エチルエーテル１３０ｍＬに溶解し、攪拌しつつ、周囲温度（２２℃）で週末の間放置する。生成した白色沈殿（塩酸トリエチルアミン）を濾過によって分離し、無水エーテル２５ｍＬで２回、フィルタ上で洗浄した。ロータリーエバポレーターによって濾液を減圧下で濃縮し、油状物１２．９ｇを得て、これをトルエン：酢酸エチル：アセトニトリル（７：２：１）の溶媒混合物１１ｍＬで希釈し、同じ溶媒混合物４００ｍＬ中の３５０ｍＬのＳｉＯ２の懸濁物から調製したＳｉＯ２ＬＣカラム（５０ｃｍ床）の上部に適用した。最初の５００ｍＬの溶出液に、低極性不純物が集められた。５：２：１のトルエン：酢酸エチル：アセトニトリル５００ｍＬを用い、次いで、同じ溶媒の４：２：１混合物４００ｍＬを用いてカラムを溶出することによって、生成物を集めた。溶媒の４：２：１混合物中、生成物のＲｆ０．５５。５％のＫＭｎＯ４にプレートを浸漬することによって、スポットが現れた（黄色）。生成物を含有するすべてのフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下で濃縮し、最後に、高減圧下で乾燥させ、ＭＷ＝６８６．７ｍ／ｅの４，６５８ｇの生成物を得て、これは、Ｃ３１Ｈ４９Ｎ３Ｏ９Ｓｅのセレノグルタチオンの式について計算された値と完全に一致していた。
【０３６０】
（セレノグルタチオンダイマー（６５５−８３）の合成）
上の工程から得られた油状のＬＣで精製された生成物を、チオアニソール３０ｍＬとトリフルオロ酢酸５０ｍＬの混合物に溶解した。得られた溶液を攪拌し、５時間で６０℃まで加熱した。この時間の後、気体の発生が止まった。次いで、混合物を周囲温度で一晩攪拌する。次の朝に、Ｔ＜３７℃で減圧下、ロータリーエバポレーションを用いてトリフルオロ酢酸を除去する。油状残渣の約１．５ｍＬ部分を、機械的に非常に十分に攪拌した４００ｍＬの無水エチルエーテルに加える。沈殿を、無水エチルエーテル５０ｍＬで４回洗浄しつつ、上澄みを捨て、最終的に、高減圧下で乾燥させる。得られた白色沈殿（３．１６ｇ）を分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋なセレノグルタチオダイマー（ＭＷ５９４．８７）ｍ／ｅを１．１ｇ得た。
【０３６１】
（９番）メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）。合成スキームおよび方法論は、以下のとおりであった。
【化３】
0006313418.tif 000015
【０３６２】
磁気攪拌を取り付け、氷冷却浴に入れた、無水エチルアルコール２０ｍＬが入った２００ｍＬの丸底フラスコに、水素化ホウ素ナトリウム（２２７ｍｇ、６．０ｍＭ、Ａｒ下）を入れる。冷却し、攪拌し、Ａｒを流しつつ、シリンジから、ジメチルジセレニド（１９０ｕＬ、３７６ｍｇ、２．０ｍＭ）を加える。黄色がかった溶液の変色の後、固体の５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン（１，１４３ｇ、４．０ｍＭ）を加える。５−Ｃｌ−Ａｄｅは、エチルアルコールにほとんど溶けない。１００ｍＬのさらなるエチルアルコールを加え、沈殿を溶解した。混合物の室温での攪拌をさらに４日間続けた。ＭＳを使用し、変換を監視した。５日後に約７５％の転化率を達成した。溶媒を蒸発させ、生成物３．２２ｇ（約２０％のＳＭを含む）を集め、逆相（Ｃ−８）分取クロマトグラフィーによって精製し、１．１ｇの純粋な生成物を得て、その分子量を質量分光法によって確認した。
【０３６３】
（１０番）グルタミルセレノシステインダイマー（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２Ｏ１０Ｓｅ２）合成スキームおよび方法論は、以下のとおりであった。
【化４】
0006313418.tif 000016
【０３６４】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ（６３９−３７）の合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（２．７１２ｇ、９．０ｍＭ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０４７ｇ、９．１ｍＭ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（１．８８８ｇ、９．１５ｍＭ）を、無水エチルエーテル３００ｍＬに懸濁／溶解し、ジメチルエチルベンジルアミン５０ｕＬをシリンジから反応混合物に加えた。室温での攪拌を２４時間維持した。混合物を濾過し、沈殿をエチルエーテル２０ｍＬで３回洗浄した。濾液を濃縮し、高減圧下で乾燥させ、白色結晶生成物（３．６ｇ、収率１００％）を得た。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝４２３．１７；ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ：５．１５２  ２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＮＨ；４．２５５  １Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．４Ｈｚ；２．８３８  ４Ｈ，ｂｒ  ｓ；２．７３４  １Ｈ，ｄｄｄ（？）７ライン；２．６７３  １Ｈ，ｄｄｄ（？）７ライン；２．２７２  １Ｈ，ｏｃｔｅｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ；２．０２１  １Ｈ，ｍ；１．４７８  ９Ｈ，ｓ；１．４５０  ９Ｈ，ｓ。
【０３６５】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｃｙｓ−ＯＨダイマー（６３９−３９）の合成）
セレノシスチン（１．５ｇ、４．４９ｍＭ）を水（２５ｍＬ）に溶解／懸濁する。磁気的に攪拌し、混合物を氷浴で冷却し、混合物にトリエチルアミン（１．３２４ｍＬ、０．９６１ｇ、９．５ｍＭ）を加えた。調製し、激しく攪拌し、冷却した反応混合物に、Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ（３．６ｇ、８．９９ｍＭ）の１，４−ジオキサン５０ｍＬを一滴ずつ加えた。室温で一晩攪拌しつつ、反応混合物を放置する。溶液から黄色沈殿の一部を分離し、濾別した。濾液を減圧下で蒸発させ、高減圧下で乾燥させ、白色固体（５．３８８ｇ）を得た。この材料をメチルアルコール８ｍＬに溶解し、２：１→１：２／ＡｃＯＥ  ＭｅＯＨ＋０．５％  ＡｃＯＨを用い、ＳｉＯ２クロマトグラフィーに入れた。Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｃｙｓ−ＯＨダイマー（１．２１２ｇ、ＫＯＨ／高減圧乾燥の後）を、単一のフラクションとして分離した（Ｒｆ＝０．３２、１：１／ＡｃＯＥｔＭｅＯＨ＋０．５％  ＡｃＯＨ）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝９０９．１１；ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ  Ｖａｒｉａｎ，ＤＭＳＯ  ｄ６，ｐｐｍ：７．６５８  １Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＮＨ；７．２０６  １Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＮＨ；４．２０  １Ｈ，ｍ；３．７５９  １Ｈ，ｍ；３．４５５  １Ｈ，ＡＢＸ２のＡ部分；３．４０４  ＡＢＸ２のＢ部分；２．１８  ２Ｈ，ｂｒ  ｐｅｎｔ；１．８７７  １Ｈ，ｍ；１．７５  １Ｈ，ｍ；１．３９１  ９Ｈ，ｓ；１．３７９  ９Ｈ，ｓ。
【０３６６】
（Ｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｃｙｓ−ＯＨダイマー（６３９−４６）の合成）
ＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２：チオアニソール：Ｈ２Ｏ／４７：４７：３：３の混合物（２５ｍＬ）を、固体のＮ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｃｙｓ−ＯＨダイマー（１．２１ｇ）に室温で加える。得られた溶液を室温で３．５時間攪拌し、水（５０ｍＬ）に注ぐ。水（上側）層を分離し、５０ｍＬのエチルエーテルで５回洗浄する。水層を４０℃未満の温度で減圧蒸発させ、ＮａＯＨペレットで高減圧乾燥させた。Ｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅ−Ｃｙｓ−ＯＨダイマー（０．７１７ｇ、収率９９．８％）。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）＝５９２．９２。
【０３６７】
（１１番）セレノアデノシルホモシステイン（Ｃ１４Ｈ２０Ｎ６Ｏ５Ｓｅ）。合成スキームおよび方法論は、以下のとおりであった。
【化５】
0006313418.tif 000017
【０３６８】
（５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン（６３９−６２））
オーブンで乾燥させた２Ｌの４ッ口フラスコに、滴下漏斗、スターラー、気体注入口／出口および熱電対を取り付け、これにアデノシン８９Ｇ（０．３６６ｍｏｌｅ、１ｅｑ．）、無水ピリジン５９．３ＭＬ（５８Ｇ、１．８３３ｍｏｌｅ、２ｅｑ．）および１Ｌ無水アセトニトリルを入れる。反応設定物を氷／塩浴に入れる。最初に攪拌し、溶液の温度が３℃未満に下がったら、塩化チオニルの添加を非常にゆっくりと始める（強く発熱する！）。塩化チオニルの添加中、反応混合物の温度を５℃未満に４時間より長く維持する必要がある（この時点で、溶液は、黄色であり、白色から黄色の沈殿が底部にある）。次いで、反応物を周囲温度で一晩放置する。次の朝、焼結したガラスフィルタを用いて膨大な沈殿を濾別し、フィルタ上で、体積１００ＭＬの乾燥アセトニトリルを用いて３回洗浄し、その間に、沈殿の色が白色に変化する。次いで、濡れた沈殿を、メタノール８００ＭＬと水１６０ＭＬの混合物が入った２Ｌの反応フラスコに移し、その中で、機械的に攪拌し、水浴で冷却しつつ、８０ＭＬの濃水酸化アンモニウム溶液を１滴ずつ加える。混合物を周囲温度で４５分間攪拌し、生成する白色沈殿を、減圧濾過によって液体から分離する。減圧ロータリーエバポレーターを用いて濾液を乾燥するまで濃縮し、沈殿を約５６０ＭＬの熱水から結晶化させ、氷浴で冷却し、第１の結晶の塊を濾別し、凍結乾燥させる。次いで、この濾液を、第１の濾液のロータリーエバポレーションから得られる固体結晶化の溶媒として使用し、第２の生成物の塊を得て、これも凍結乾燥させる（２日）。両方の結晶の塊を、最後に、減圧デシケーター中、五酸化リンで２日間乾燥させる。８４Ｇの白色結晶、収率８０．５％が得られる。ＭＳ（２８６−Ｍ＋Ｈ）、ｍｐ．１８７℃。
【０３６９】
（セレノアデノシルホモシステイン（６５５−４０））
熱電対、大きな冷却フィンガー（出口にバブルメーターを備える）、アンモニア気体注入口（フラスコの底部に達する）および磁気攪拌棒を取り付けた２Ｌの３ッ口フラスコに、９．８０６Ｇ（５０ｍＭ、１ｅｑ．）のＬ−セレノメチオニンを入れ、ＣＯ２−アセトン冷却浴を含む２．５Ｌのデュアル容器に入れる。Ａｒをフラスコに流した後、固体のＣＯ２をアセトン浴および冷却フィンガーに加える。フラスコ内部の温度が−３５℃未満に落ちたら、無水アンモニア（気体）を流し始め、液体アンモニアの量が、容積で８００ＭＬに達したら、気体の流れを止める。この時点で、青色から紫色の溶液の着色が約３０秒間続くまで、小さな金属ナトリウム片を、十分に攪拌した溶液に加える。全部で２．６４５Ｇ（１１５ｍＭ、２．３ｅｑ．）のナトリウムを４５分以内に加える。攪拌および冷却を３０分以上維持する。この時点で、すべての要素は溶液になっている。無水５’−クロロ−５’−デオキシアデノシン１４．８５６Ｇ（５２ｍＭ、１．０４ｅｑ．）を一度に加え、反応混合物を攪拌しながら放置し、Ａｒを一晩ゆっくりと流す。次の朝（すべてのアンモニアがなくなった場合）、３５０ＭＬの無水メタノールを、フラスコ中に存在する白色固体に加える。フラスコを油浴に入れ、還流コンデンサを取り付け、Ａｒ気体流を維持し、温浴をその後の２４時間で５０℃まで加熱する。この時点で、１ＭＬの溶液を、数滴の０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ３．５まで酸性化し、質量分光計を用い、基質の存在についてサンプルを分析する。５％未満である場合、混合物を１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ３．５まで酸性化し、塩から濾過し、減圧ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで濃縮し、未精製生成物を、水−エタノール混合物からの結晶化によって精製することができる。第１の塊のセレノアデノシルホモシステイン１５．９８Ｇ（収率７４％）は、約９５％できれいであり、さらに精製することなく生物学的試験に使用することができる。
【０３７０】
（３９番）γ−グルタミル−メチルセレノシステイン（Ｃ９Ｈ１６Ｎ２Ｏ５Ｓｅ）。合成スキームおよび方法論は、以下のとおりであった。
【化６】
0006313418.tif 000018
【０３７１】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ（６５５−９０）の合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（３０３ｍｇ、１．０Ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２１ｍｇ、１．０５Ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２２７ｍｇ、１．１Ｍｍｏｌ）を、無水エチルエーテル１５ｍＬに懸濁／溶解し、ジメチルエチルベンジルアミン１０ｕＬをシリンジから反応混合物に加えた。周囲温度（２２℃）での攪拌を４８時間維持した。混合物を濾過し、沈殿をエチルエーテル１０ｍＬで１０回洗浄した。濾液を濃縮し、高減圧下で乾燥させ、白色結晶性生成物を得た（５７０ｍｇ、収率約９０％）。ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）＝４２３．１７。
【０３７２】
（Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＭｅＳｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ（６５５−９０）の合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＳｕ（５７０ｍｇ、０．９Ｍｍｏｌ）、メチルセレノシステイン（１７５ｍｇ、０．８Ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５２ｍｇ、２０９μＬ、１．５Ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン６ｍＬと水２ｍＬの混合物に加えた。反応混合物の磁気攪拌を１００時間維持した。この時間の後、１．２１Ｎ  ＨＣ１（１．６５ｍＬ）を加え、反応後混合物をエチルエーテル２０ｍＬで３回抽出し、抽出物を減圧ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで濃縮し、ワックス状生成物６４９ｍｇを得て、これを分取ＨＰＬＣに入れた。生成物２８３ｍｇを集めた（収率７５．６％）。質量スペクトルから、生成物の分子量と、１個のＳｅ原子の存在を確認した。Ｃ１８Ｈ３２Ｎ２Ｏ７Ｓｅについての計算された分子量＝４６８．４２。実測値４６９．２４ｍ／ｅ（Ｍ＋Ｈ＋）および４９１．２４ｍ／ｅ（Ｍ＋Ｎａ＋）。
【０３７３】
（γ−グルタミル−メチルセレノシステイン（６５５−９２）の合成）
Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｌ−Ｇｌｕ−ＭｅＳｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ２８３ｍｇ（０．６Ｍｍｏｌ）、チオアニソール２ｍＬおよびトリフルオロ酢酸５ｍＬの混合物を磁気攪拌しつつ、油浴中、６３℃で６時間加熱し、周囲温度（２２℃）で一晩放置した。この後、激しく攪拌したエチルエーテル（２０ｍＬ）に、反応混合物を加えた（１滴ずつ）。生成した沈殿をエチルエーテル２０ｍＬで２回洗浄し、クリーム状の沈殿１３８．３ｍｇを得て、次いで、これを分取ＨＰＬＣで精製した。
【０３７４】
（２５番）米国特許公開第２０１２０１６４２３４Ａ１号に記載されるように調製された、セレンを豊富に含まない酵母の抽出物、ｐＨ６．０。（２８番）（３倍）グルタチオン、酸化されている。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。（３０番）グルタミルシステイン。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。
【０３７５】
セレン含有化合物を以下の図４０および表７の番号によって特定する。
【０３７６】
潜在的な効果があるとすれば、個々のセレン含有化合物が、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能を有するかどうかを決定するために、セレン含有化合物を、単離されたミトコンドリアを用いて直接試験した。ラット脳から単離されたミトコンドリアを、（ａ）ミトコンドリアを軟組織（例えば、脳）から単離することの容易さ、（ｂ）脳組織が、グルコースおよび酸素の需要が大きいことを含む多くの理由のために、この目的のために選択した。以下のように実験を行った。低濃度（５０ｐｐｂ）、中濃度（５００ｐｐｂ）および高濃度（１ｐｐｍ）の範囲の種々の濃度のセレン含有化合物を試験した。中程度の範囲でミトコンドリアに対して観察可能な毒性がないことに基づき、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能を用いてスクリーニング／活性アッセイを行うために、一次転帰の測定として、５００ｐｐｂ（５ｕＭ）の濃度を利用した。成ラットの脳フィコールを精製したミトコンドリアを単離し、個々のセレン含有化合物を用い、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ流量分析機に入れる前に、３個ずつ３７℃で３０分インキュベートした。ＡＴＰ合成（ＩＩＩ状態）、複合体Ｉ依存性（ＮＡＤＨによって機能する）最大呼吸能（ＶＦＣＣＰ状態）および複合体ＩＩ（ＦＡＤＨによって機能する）依存性最大呼吸能（Ｖｓｕｃｃ状態）の３つの状態について、ＯＣＲ（酸素消費率）パラメータを測定した。Ｈｏｒｓｅアッセイは、記載されるように行われたことを参照のこと（例えば、Ｓａｕｅｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１年５月１５日；１９８（１）：３６−４３；Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃを参照）。
【０３７７】
ミトコンドリアの生体エネルギー生成能の結果を図４０に与える。９種類の化合物のうち２種類（セレンを含有するペプチドＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）およびメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番））が、３種類すべての呼吸状態で正の増加を示し、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能の増加を示したことが観察された（図４０Ａを参照、同数の単離されたミトコンドリアを、コントロールとしてセレン含有化合物を使用せずにインキュベートした）。特に、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）は、コントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（１０．３％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（２１．２％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（７．６％）。メチルセレノアデノシンは、コントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（１７．３％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（１５．６％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（２５％）。
【０３７８】
ｏｘｙｔｈｅｒｍ（Ｃｌａｒｋ型電極）を利用し、セレンを含有するペプチドＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）およびメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）の生体活性を分析した（例えば、ＣｈａｎｃｅおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９５５、２１７、３８３−３９３；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．３６、３５３−３５６を参照）。Ｏｘｙｔｈｅｒｍ分析によって、ミトコンドリアおよび細胞の呼吸を含む広範囲の用途にわたり、酸素取り込みまたは放出の測定値を決定した。この実験のために、６０μｇのミトコンドリアタンパク質を、化合物ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）またはメチルセレノアデノシン（５００ｐｐｂ）、またはこれらの対応する等価な濃度のそれぞれのコントロール（それぞれＬＶＭＲおよびメチルチオアデノシン）と共に、３０分間インキュベートした後、Ｏｘｙｔｈｅｒｍチャンバに注入した。それぞれの化合物存在下で、ミトコンドリア活性（測定され、Ｏ２（ｎｍｏｌ）／分／ミトコンドリアのタンパク質（ｍｇ）での変化％として観察されるミトコンドリアの呼吸速度として表される）を測定した。図４０Ｂに示されるように、セレンを含有するペプチドＬＶＳｅ−ＭＲは、コントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（７．７％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（１３．３％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（９．６％）。メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）は、コントロールと比較して、ＩＩＩ状態を増加させ（２９．９％）、ＶＦＣＣＰ状態を増加させ（１７．３％）、Ｖｓｕｃｃ状態を増加させた（１５．３％）。
【０３７９】
従って、本出願は、被検体（例えば、ミトコンドリア活性／生体エネルギー生成能の調整を必要とする被検体（例えば、２型糖尿病被検体））においてミトコンドリア活性／生体エネルギー生成能の調整に使用するためのセレン含有化合物（例えば、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）、メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）および上の実施例１で特定された他の化合物）、およびこれらを含む組成物を提供する。
【０３８０】
本出願の実施形態の開発中に作られたデータおよび情報は、固有で新しい知見である。特に、本出願は、ミトコンドリア機能不全または不十分さ（例えば、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病性心筋症などに関連する）の処置（例えば、予防的および／または治療的な処置）のための新しい組成物および方法を提供する。
【表７】
0006313418.tif 000019
表７  セレニウム含有化合物は、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能に影響を与える（ラット脳から精製されたミトコンドリア５μｇ／ウェル）。
【０３８１】
別の驚くべき知見は、ミトコンドリアと共にインキュベートしたとき、特定のセレン含有化合物（例えば、ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）およびメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番））が、ミトコンドリア活性を高める特性を有するという事実であり、特定され、特性決定された多くの他のセレン含有化合物には、この事実はあてはまらなかった。例えば、表７に示されているように、セレン含有化合物のうち３種類（例えば、ＬＴＧＳｅ−ＭＡＦＲ（Ｃ３５Ｈ５９Ｎ１０Ｏ９Ｓｅ）（７番）；グルタミルセレノシステイン（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２４Ｏ１０Ｓｅ２）（１０番）；および酵母ｐＨ６．０（２５番）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ装置を用いて評価すると、ミトコンドリア活性に対して負の影響を示した。
【０３８２】
特に、驚くべきことに、全体的な構造の中でいくつかの類似部分を共有するいくつかのセレン含有化合物が、ミトコンドリア活性の活性化に関し、非常に異なる結果を示すことがわかった。例えば、グルタミルセレノシステイン（Ｃ１６Ｈ２６Ｎ２４Ｏ１０Ｓｅ２）（１０番）は、その全体構造が、ＡＴＰ合成を１７．３％増加させるメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）と類似しており、大きく異ならないのに、ＡＴＰ合成をほぼ１９％減少させ（ＩＩＩ状態）、セレンを豊富に含む酵母中に存在するこれら２種類のセレン含有化合物間で、ミトコンドリア活性に対する影響が３６％より多く変化している（表７を参照）。従って、ある実施形態では、本出願は、組み合わせて望ましい特定のミトコンドリア活性を高める能力を含む組成物を生成する、２以上のセレン含有化合物を含む組成物（例えば、セレンを豊富に含む酵母の水溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母の水不溶性フラクション、セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物および／またはこれらから誘導されるセレン含有化合物）を提供する。
【０３８３】
（実施例８）
（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母中に存在する単離されたセレン含有化合物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体の活性およびミトコンドリアの複合体Ｉの活性を有意に高める）
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、（例えば、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能を用いて）セレンを豊富に含む酵母中に存在するセレン含有化合物が、単離された場合、エネルギー代謝を正に調整する（例えば、ミトコンドリアの呼吸および／またはミトコンドリアのＡＴＰ産生を増加させる）ことができる生体活性を示すことを発見し、特性決定した（実施例１および７を参照）。例えば、本明細書に記載されるように、セレン含有化合物ＬＶＳｅ−ＭＲ（Ｃ２２Ｈ４４Ｎ７Ｏ５Ｓｅ）（６番）およびメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｃ３Ｓｅ）（９番）は両方とも、濃度５００ｐｐｂで、ミトコンドリアの生体エネルギー生成能プロフィールを顕著に高めることができた。
【０３８４】
従って、本出願の実施形態の開発中にさらなる実験を行い、セレンを豊富に含む酵母から単離および／または誘導されたセレン含有化合物がミトコンドリア活性を変える能力をさらに特性決定した。例えば、メチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ３Ｓｅ）（９番）を用いたさらなる実験を以下に記載する。
【０３８５】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨＣ）の活性およびミトコンドリアの複合体Ｉの活性を測定するために、フィコール勾配方法を用い、皮膚のミトコンドリアを成ＳＤラットから単離した。４種類の濃度範囲（０、５０、５００および１０００ＰＰＢ）でメチルセレノアデノシンを試験した。９６ウェル蛍光プレートリーダーにおいて、標準的な技術を用い、１００μＬアッセイシステムで個々の化合物とミトコンドリア（６０μｇのミトコンドリアタンパク質／ウェル）とを一緒にインキュベートしつつ、すべてのアッセイを３個ずつ行った。
【０３８６】
０、５０、５００および１０００パーツパービリオン（ＰＰＢ）のメチルセレノアデノシン（Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｃ３Ｓｅ）（９番）またはコントロール化合物メチルチオアデノシン（３１番）のいずれか存在下でのミトコンドリアの酵素活性を図４１に示す。化合物９番（０〜１０００ＰＰＢ）は、その濃度に依存して、メチルセレノアデノシンが存在しない状態でのＰＤＨＣ酵素活性がないことと比較して、ＰＤＨＣ酵素活性を約３０〜５７％有意に向上させた（濃度１０００ＰＰＢでｐ＜０．０５）。試験濃度で複合体ＩＶ酵素活性の変化がないことが検出された。メチルチオアデノシンは、ＰＤＨＣ、複合体Ｉまたは複合体ＩＶの活性を変えなかった。
【０３８７】
これらの実験は、メチルセレノアデノシンが、ミトコンドリアの複合体ＩおよびＰＤＨＣの活性を高めることを示した。従って、ある実施形態では、本出願は、セレン含有化合物（例えば、実施例１で特定されるもの）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。ある実施形態では、本出願は、ＰＤＨＣ酵素活性を高め、および／またはミトコンドリアの複合体Ｉの活性を高めることが必要な被検体（例えば、ＩＩ型糖尿病被検体）に、セレン含有化合物（例えば、実施例１に記載されるもの）を含む有効な量の組成物（例えば、医薬組成物）を投与し、被検体（例えば、骨格筋および／または肝臓）においてミトコンドリアの複合体Ｉおよび／またはＰＤＨＣの活性を高める（例えば、それによってミトコンドリアの呼吸を増加させる）ことを含む、被検体におけるＰＤＨＣ酵素活性を高め、および／またはミトコンドリアの複合体Ｉの活性を高める方法を提供する。
【０３８８】
（実施例９）
（２％以下の無機セレンを含む、セレンを豊富に含む酵母中に存在する単離されたセレン含有化合物は、抗酸化能およびミトコンドリア活性を有意に高める）
本出願の実施形態の開発中に行われる実験は、セレンを豊富に含む酵母中に存在するか、またはこれらから誘導される特定の単離されたセレン含有化合物が、ミトコンドリア活性を高める（例えば、ＡＴＰの産生の向上、ミトコンドリアの複合体Ｉの活性および／またはＰＤＨＣ活性の向上）ことを発見し、特性決定した（実施例１、６〜８を参照）。従って、（例えば、ミトコンドリア活性に対して望ましい影響を示すセレン化合物を特定するために）本明細書に開示され、記載されるセレン含有化合物をさらに特性決定する（例えば、化合物の生体特性があれば（例えば、刺激活性、阻害活性、相乗的な活性、アンタゴニスト活性など）、その活性を特定する）ために、さらなる実験を行った。
【０３８９】
本出願のセレンを含有する組成物のいくつかが、ミトコンドリア複合体Ｉの活性を高める能力を示すという事実に起因して、セレン含有化合物によって、損傷を与える活性酸素種（ＲＯＳ）を除去することでミトコンドリアの刺激を起こすかどうかを決定するために、実験を行った。従って、セレン含有化合物の酸化防止能を評価するために、本出願の実施形態の開発中に実験を行った。
【０３９０】
従って、キットに基づく酸化防止剤アッセイ（酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ））を利用し、酸化防止能を有する／示す本出願のセレン含有化合物を特定した。使用するＯＲＡＣアッセイキット（ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）において、トロロックスの酸化防止特性は、ある範囲の物質の酸化防止能が関連するものについて標準である。従って、ＯＲＡＣの結果は、一般的に、トロロックス当量（ＴＥ）と呼ばれる。行ったアッセイにおいて、ケルセチン（既知の強力な酸化防止剤）が、内部参照標準として含まれていた。
【０３９１】
簡単にいうと、トロロックスアッセイキットを用い、製造業者の指示に従って、セレン含有化合物（例えば、実施例１で特定されたもの）のサンプルを分析した。化合物を単一で、または組み合わせて（０．０５〜５μΜの濃度で）試験し、潜在的な相乗効果、拮抗効果または純粋な添加効果があるか調べた。代表的な結果を表８に示す。
【表８】
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表８：種々のセレン含有化合物の酸化防止活性
【０３９２】
表８のデータが示すように、いくつかのセレン含有化合物が、酸化防止能を有する／示すことを発見した（例えば、正のＴＥ値）。さらに、いくつかのセレン含有化合物は、相加的または軽度に相乗的な（例えば、組み合わせにおける９番と４番）；軽度に拮抗的な（組み合わせにおいて２６番と３９番）、または相乗的な（組み合わせにおいて３番と２６番）酸化防止能を有する／示す（例えば、酸素ラジカル捕捉能の観点で）。３番と２６番の組み合わせの場合には、その増加は、これらの化合物の効果が単に相加的であった場合より約７０％大きかった。
【０３９３】
本明細書で述べられるすべての刊行物および特許は、本明細書に参考として組み込まれる。本出願の記載されている方法および組成物の種々の改変および変形は、本出願の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本出願を具体的な好ましい実施形態と組み合わせて記載したが、請求されている本出願が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、関連分野の当業者に明らかである本出願を行うための上述の態様の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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