(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項２】
１００℃、ｐＨ４．５の条件下でβ−グルカンに対する加水分解活性を有する、請求項１に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、１００℃、ｐＨ４．５の条件下でβ−グルカンに対する加水分解活性を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、グリコシド加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項６若しくは７に記載の形質転換体、又は請求項９に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸送用エネルギー供給に関わる懸念に加え、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素（リグノセルロース）は、セルロースやヘミセルロース（キシラン、アラビナン及びマンナンを含む）等の多糖類、リグニン、その他ペクチン等である。これらの多糖類は多様なグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロース等の単糖に加水分解され、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
【０００３】
複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類のうちセルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースはキシラン、アラビナン及びマンナン等を含み、その構成は植物の種類によって異なるが、例えば、広葉樹や草本等はキシランが主要な構成成分となっている。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）が必要とされる。
【０００４】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００５】
多くの耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物を分離、同定し、これら培養分離された微生物から遺伝子をクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。リグノセルロースの糖化に利用可能なエンドグルカナーゼは、菌類や細菌などから多数単離されており、一部は試薬として市販されている（例えば、特許文献１〜４及び非特許文献１〜５参照）。しかしながら、それらの多くは４０℃〜８０℃の中〜高温域が至適温度のエンドグルカナーゼであり、８０℃以上の超高温域において長時間活性を維持できる酵素は数少ない。これまでに報告されている８０℃以上に至適温度をもつ超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、アーキア由来（特許文献５、非特許文献６）、細菌由来のエンドグルカナーゼ (特許文献６、非特許文献７）等があるが、各種基質に対する分解特性は様々であり、基質依存的に至適温度が変化するとの報告もある。また、概して超高温域における熱安定性(酵素活性の半減期）は２〜３時間程度であり、それほど高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６１９０８９０号明細書
【特許文献２】米国特許第７０４９１２５号明細書
【特許文献３】米国特許第７０４１４８８号明細書
【特許文献４】特表２００７−５２９９９３号公報
【特許文献５】特開２００３−２１０１８２号公報
【特許文献６】米国特許第６８１２０１８号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Moloney et al.，Biochemical Journal，1985，vol. 225，p. 365-374.
【非特許文献２】Penttila et al.，Gene，1986，vol.45，p.253-263.
【非特許文献３】Petre et al., Biochhnie，1986，vol.68, p687-695.
【非特許文献４】Chhabra et al.，Applied and Environmental Microbiology，2002，vol.68，p.545-554.
【非特許文献５】Nurachman et al., American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2010，vol.6，p.268-274.
【非特許文献６】Huang et al.，Biochemical Journal, 2005, vol.385, 581-588.
【非特許文献７】Liebl et al.，Microbiology, 1996, vol.142, 2533-2542.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ＰＮＰＣ）を基質とした加水分解活性を示す新規な超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
［２］  β−グルカン、リケナン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド、カルボキシメチルセルロース、又はリン酸膨潤アビセルを基質とし得る、前記［１］の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
［３］  （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  前記ポリペプチドが、β−グルカン、リケナン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド、カルボキシメチルセルロース、又はリン酸膨潤アビセルを基質とし得る、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、グリコシド加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［６］若しくは前記［７］の形質転換体、又は前記［９］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のアミノ酸配列（配列番号１）とサーモフィラム・ペンデンス・ストレイン  Ｈｒｋ  ５のグリコシドハイドロラーゼ１２（ＧＨ１２）エンドグルカナーゼと推定されているアミノ酸配列（配列番号６）のアライメント図である。
【図２】実施例１において、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図３】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質の各基質に対する加水分解活性の測定結果を示した図である。
【図４】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質の、ＰＮＰＣを基質とした場合（ｐＨ５．５）及びβ−グルカンを基質とした場合（ｐＨ４．５）の各温度におけるグリコシド加水分解活性を計測した結果を示した図である。左縦軸はＰＮＰＣ加水分解活性のスケールを表し、右縦軸はβ−グルカン加水分解活性のスケールを表示する。
【図５】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質の、ＰＮＰＣを基質とした場合及びβ−グルカンを基質とした場合の各ｐＨにおけるグリコシド加水分解活性（９０℃）を計測した結果を示した図である。左縦軸はＰＮＰＣ加水分解活性のスケールを表し、右縦軸はβ−グルカン加水分解活性のスケールを表示する。
【図６】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質の熱安定性（耐熱性）の測定結果を示した図である。８０〜９９℃で一定時間プリインキュベーションした後のＰＮＰＣに対する加水分解活性の相対値（無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値、％）を、プリインキュベーションの時間ごとに示した図である。
【図７】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４タンパク質の熱崩壊温度Ｔｍの測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［超耐熱性エンドグルカナーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のエンドグルカナーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。これらのＯＲＦのうち、エンドグルカナーゼ触媒領域が確認できたＯＲＦ５２個について、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＣＭＣ加水分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からグリコシド加水分解活性を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼ（以下、「ＡＲ１９Ｍ−１１３−４」）を得た。ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。
【００１６】
後記実施例１＜１０＞に示すように、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）及びβ−グルカン（β−ｇｌｕｃａｎ）に対して特に高い加水分解活性を示し、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とＰＮＰＣにも高い分解活性を示し、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）に対しても加水分解活性を示す一方、キシラン（ｘｙｌａｎ）、キシログルカン（ｘｙｌｏｇｌｕｃａｎ）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、ＰＮＰＸ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）、ＰＮＰＬ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド）に対してはほとんど分解活性を示さない。すなわち、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、β−１，４結合グルカンにβ−１，３結合が部分的に混在する基質及びβ−１，４結合グルカンからなる基質に対して特異性の高い超耐熱性エンドグルカナーゼである。
【００１７】
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、好熱性アーキアのクレンアーキオータ門サーモフィラム・ペンデンス・ストレイン  Ｈｒｋ  ５（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓ  ｓｔｒ．  Ｈｒｋ  ５）のグリコシドハイドロラーゼ１２（ＧＨ１２）ファミリーに属するエンドグルカナーゼと推定されるタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＹＰ＿９２１０７９.１）（配列番号６）であり、その配列同一性（相同性）は全長では３５％、ＧＨ１２触媒領域については４１％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、ＧＨ１２ファミリーに属する新規なエンドグルカナーゼであることが明らかとなった。
【００１８】
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有する。実際に、後記実施例１＜１１＞に示すように、４０〜１３０℃の温度範囲内でＰＮＰＣ加水分解活性を示し、８５〜１２０℃の温度範囲内において強いＰＮＰＣ加水分解活性を示す。より詳細には、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のＰＮＰＣを基質としたｐＨ５．５におけるＰＮＰＣ加水分解活性は、４０〜１１０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１１５℃超では急激に低下する傾向にあった。また、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のβ−グルカンを基質としたｐＨ４．５におけるβ−グルカン分解活性は、６０〜１０５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１００℃超では急激に低下する傾向にあり、８０〜１００℃の温度範囲内において強いβ−グルカン分解活性を示す。
【００１９】
すなわち、大腸菌を宿主として発現させたＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、１１０℃、ｐＨ４．５〜６．５の条件下で高いグリコシド加水分解活性を有し、４０〜１３０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ４〜８の広いｐＨ範囲内でグリコシド加水分解活性を示す。また、後記実施例１＜１３＞に示すように、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の熱安定性（酵素活性の半減期）は、８０〜９０℃では２４時間以上、９５℃及び９９℃では約３５時間及び１２〜１３時間であり、超高温域での熱安定性が非常に高いエンドグルカナーゼである。
【００２０】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４に対しても、グリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２１】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有する、超耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２２】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２３】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２４】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、７０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、７５％以上１００％未満であることが好ましく、８０％以上１００％未満であることがより好ましく、８５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９０％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００２５】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２６】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２７】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをエンドグルカナーゼ触媒領域として有することにより超耐熱性エンドグルカナーゼが得られる。
【００２９】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、β−１，４結合グルカンにβ−１，３結合が部分的に混在する基質やβ−１，４結合からなるグルカンを基質とするものである。β−１，４結合グルカンにβ−１，３結合が部分的に混在する基質としては、β−グルカン、リケナン等が挙げられる。β−１，４結合からなるグルカンとしては、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、ＣＭＣ、ＰＳＡ、セロビオース等が挙げられる。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、β−グルカン、リケナン、ＰＮＰＣ、ＣＭＣ、又はＰＳＡを基質とし得るものが好ましく、β−グルカン、リケナン、ＰＮＰＣ、又はＣＭＣを基質とし得るものがより好ましい。
【００３０】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他のグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。
【００３１】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくともｐＨ５．５の条件下で、ＰＮＰＣ加水分解活性を、９０〜１１０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、８０〜１２０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、７０〜１３０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましく、４０〜１３０℃の温度範囲内で示すことがよりさらに好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼのＰＮＰＣを基質とした場合の至適温度は、ｐＨ５．５の条件下で、９０〜１２０℃の範囲内にあることが好ましく、１００〜１２０℃の範囲内にあることがより好ましく、１０５〜１１５℃の範囲内にあることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくともｐＨ４．５の条件下で、β−グルカンを基質とした分解活性を、９０〜１００℃の温度範囲内で示すことが好ましく、８０〜１０５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、７０〜１３０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましく、６０〜１１０℃の温度範囲内で示すことがよりさらに好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼのβ−グルカンを基質とした場合の至適温度は、ｐＨ４．５の条件下で、８５〜１０５℃の範囲内にあることが好ましく、９０〜１０５℃の範囲内にあることがより好ましい。
【００３３】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの至適ｐＨは、反応温度や基質に依存して変化するものの、ｐＨ４．０〜７．０の範囲内にある。例えば、基質がＰＮＰＣの場合の９０℃における至適ｐＨは５．５〜７．０の範囲内にあり、基質がβ−グルカンの場合の９０℃における至適ｐＨは４．０〜５．０の範囲内にある。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、少なくともｐＨ４．５〜６．５の範囲内においてグリコシド加水分解活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜８．０の範囲内においてグリコシド加水分解活性を示すものがより好ましい。
【００３４】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等を有していてもよい。
【００３５】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のグリコシド加水分解酵素が有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼには、公知のグリコシド加水分解酵素に対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３６】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことも好ましい。セルロース結合モジュールは、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとエンドグルカナーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３７】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００３８】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた超耐熱性エンドグルカナーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００３９】
また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該超耐熱性エンドグルカナーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００４０】
［超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼをコードする。当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００４１】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
【００４２】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４３】
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４４】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４５】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４６】
配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子」ということがある。）の全長若しくはエンドグルカナーゼ触媒領域を含む部分領域（配列番号１中の１１３位のプロリン（Ｐ）から２８１位のトレオニン（Ｔ）までの１６９アミノ酸残基からなる部分領域をコードする領域）を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４７】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性は、７０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、７５％以上１００％未満であることが好ましく、８０％以上１００％未満であることがより好ましく、８５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９０％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９５％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００４８】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４９】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００５０】
本発明に係るポリヌクレオチドは、エンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００５１】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５２】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００５３】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５４】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５５】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた超耐熱性エンドグルカナーゼを生産し得る。
【００５６】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ヒートショック法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５７】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５８】
［超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法］
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる。
【００５９】
形質転換体によって生産された超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００６０】
形質転換体から超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出又は精製する方法は、超耐熱性エンドグルカナーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の超耐熱性エンドグルカナーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００６１】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に超耐熱性エンドグルカナーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の超耐熱性エンドグルカナーゼを簡便に精製することができる。
【００６２】
すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出し精製することを含む。
【００６３】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６４】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６５】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６６】
［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによりセルロースやへミセルロースを加水分解して、オリゴ糖を産生することによってリグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
【００６７】
ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６８】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該超耐熱性エンドグルカナーゼがグリコシド加水分解活性を示す条件であればよい。例えば、４０〜１３０℃、ｐＨ４．０〜８．０で反応を行うことが好ましく、８０〜１３０℃、ｐＨ４．０〜８．０で反応を行うことがより好ましく、８０〜１００℃、ｐＨ４．０〜７．０で反応を行うことがさらに好ましく、９０〜１０５℃、ｐＨ４．５〜６．５で反応を行うことがよりさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００６９】
リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００７０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
［実施例１］温泉土壌からの新規超耐熱性エンドグルカナーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
７０〜９９℃で活性を示す新規超耐熱性エンドグルカナーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００７２】
採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４及びイルミナ社製Ｈｉｓｅｑ２０００を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。４５４シーケンサーには抽出されたＤＮＡ５μｇを用い、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーには、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて増幅した産物を用いて、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。Ｈｉｓｅｑ２０００によるシーケンスでは、イルミナ社製のｃＢｏｔを用いてＤＮＡライブラリー及び試薬をフローセルに流し込み、ＤＮＡ１分子から、自動的に同一配列をもつクラスターをフローセル内に形成させた。Ｈｉｓｅｑ２０００を用いて１０１ｂｐのペアエンドシーケンスを行い、メタゲノムシーケンスデータを得た。
温泉土壌サンプルＡＲ１９について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、４５４シーケンサーにおいては平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐを得、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーにおいては平均リード長９２．６５ｂｐのペアエンドで、総リード数８９４，２３８，０９６個、総ゲノム解読量８３，１１２，１６８，７５５ｂｐを得、合計して８４．２Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７３】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサー及びＨｉｓｅｑ２０００シーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、ＣＬＣｂｉｏ社製のＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖｅｒ５．５．１）を用いてクオリティーフィルタリング及びＤｅｎｏｖｏアセンブリングを行った。クオリティーフィルタリング後には、４５４シーケンサーで得られたリードの総リード長は１，０８４，４００，５７６ｂｐとなり、Ｈｉｓｅｑ２０００シーケンサーで得られた塩基配列データの総リード長は８１，３２３，６９２，５６３ｂｐとなった。アセンブリング後には、５００ｂｐ以上の長さを持つコンティグの数は９６７，９２５個、総全長は４１９，７８７，６０３ｂｐとなり、このうち最大コンティグ長は２８７，６４１ｂｐであった。
【００７４】
＜３＞  エンドグルカナーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｍｅｔａｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
【００７５】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
【００７６】
８４．２Ｇｂｐ長のメタゲノムＡＲ１９シーケンスデータから、Ｍｅｔａｇｅｎｅにより６０２，５８９個のＯＲＦが予測され、完全長のＯＲＦは２５１，１４６個であった。ＢＬＡＳＴＰによる相同性検索から、エンドグルカナーゼ配列として３１２個のＯＲＦがヒットした。 この３１２個のＯＲＦの中、ＨＭＭＥＲによるドメイン検索により、５２個がエンドグルカナーゼ遺伝子と予測され、２６０個はカバー率が７０％未満又はｐｆａｍデータベースにヒットしない配列であった。完全長ＯＲＦはＭｅｔａｇｅｎｅにて、開始コドンおよび終止コドンがともに判定出来ているものである。
【００７７】
エンドグルカナーゼ遺伝子と予測されたＯＲＦ５２個のＧＨファミリー分類を表１に示す。表１に示すように、メタゲノムＡＲ１９から、ＧＨ５ファミリーに属するエンドグルカナーゼ完全長ＯＲＦ２１個と、ＧＨ８ファミリーに属する完全長ＯＲＦ２個と、ＧＨ９ファミリーに属する完全長ＯＲＦ６個と、ＧＨ１２ファミリーに属する完全長ＯＲＦ４個とが得られた。エンドグルカナーゼ遺伝子と推定された全ての完全長ＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨ１２ファミリーに属しエンドグルカナーゼ配列を持つＯＲＦであるＡＲ１９Ｍ−１１３からエンドグルカナーゼ遺伝子が単離された。
【００７８】
【表１】
0006315807.tif 000002
【００７９】
＜５＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３は、３０９アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号２）であった。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ  ４．１を使った解析によれば、シグナルペプチドは予想されなかった。また、モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３は、１１３位のプロリン（Ｐ）から２８１位のトレオニン（Ｔ）までの１６９アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １２の触媒ドメインをコードしていると推測された。当該ＯＲＦと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、好熱性アーキアのクレンアーキオータ門サーモフィラム・ペンデンス・ストレイン  Ｈｒｋ  ５のＧＨ１２エンドグルカナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＹＰ＿９２１０７９.１）であった。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、全長で３５％、ＧＨ１２触媒領域については４１％であったため、当該ＯＲＦは新規な配列であると確認された。
【００８０】
図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のアミノ酸配列とサーモフィラム・ペンデンス・ストレイン  Ｈｒｋ  ５のＧＨ１２エンドグルカナーゼのアミノ酸配列（配列番号６）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において類似アミノ酸残基(similar)を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
【００８１】
＜６＞  遺伝子クローニング
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＣＴＡＴＧＧＡ−３’：配列番号３で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の９０７〜９３０位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００８２】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３から遺伝子クローンＡＲ１９Ｍ−１１３−４を得た。エンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の塩基配列は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｍ−１１３（配列番号２）と完全に同一であり、３０９アミノ酸残基からなるポリペプチド（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）（配列番号１）をコードしていた。
【００８３】
＜７＞  遺伝子発現及びエンドグルカナーゼ酵素タンパクの精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標）  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に付属するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８４】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のＣＭＣ加水分解活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８５】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は１μｇをそれぞれ泳動させた。
【００８６】
図２に、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号１）から予想される質量３５．１ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００８７】
＜８＞  ９０℃以下におけるグリコシド加水分解活性測定（ＰＮＰＣ加水分解活性）
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のグリコシド加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用い、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を基質として用いた。
【００８８】
９０℃以下でのＰＮＰＣ加水分解活性測定は、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と４０ μＬの精製水、１０μＬの精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）と１００ μＬの４ｍＭ  ＰＮＰＣ水溶液からなる混合液を、３０〜９０℃で１０分間反応させることにより行った。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応はいずれの混合液もエッペンドルフ社のサーモミキサーを用いて所定の温度とした。反応終了後は、等量の２００ｍＭ  炭酸ナトリウム水溶液を加えて５分間遠心し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて４２０ｎｍによって吸光度を計測し、ｐ−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００８９】
この結果、前記＜７＞で得られた精製酵素は、４０〜９０℃において、ＰＮＰＣを基質とした加水分解活性があることが確認された。
【００９０】
＜９＞  ９５℃以上におけるグリコシド加水分解活性測定（ＰＮＰＣ加水分解活性）
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のグリコシド加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用い、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を基質として用いた。
【００９１】
９５℃以上でのＰＮＰＣ加水分解活性測定は、ガラスバイアルとゴム栓、アルミシール（日電理化硝子社製）を使用して行った。反応に用いたガラスバイアル容器は、酵素タンパク質吸着抑制のため、予め１．５質量％ＢＳＡ溶液で内部をコーティング処理したものを用いた。反応は１５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と１２０ μＬの精製水、３０μＬの精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）と３００ μＬの４ｍＭ  ＰＮＰＣ水溶液からなる混合液を、９５〜１３０℃で１０分間反応させることにより行った。全ての計測において、精製酵素の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。反応は酵素溶液を入れたゴム栓をしたバイアル容器を反応温度で５分間保温したところへ別チューブで１００℃、５分間保温した基質溶液を加え、直ちにバイアルとゴム栓をアルミシールで密封状態にすることで反応開始とした。反応はいずれの混合液もＩＫＡ社のホットマグネットスターラーで１０分間反応温度にて静置させることにより行った。反応終了後は、前記＜８＞と同様にして酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９２】
この結果、前記＜７＞で得られた精製酵素は、９５〜１３０℃においても、ＰＮＰＣを基質とした加水分解活性があることが確認された。
【００９３】
＜１０＞  ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の基質特異性
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜８＞又は＜９＞で用いた精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を用いた。また、基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、キシログルカン（Ｔａｍａｒｉｎｄ由来、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、β−グルカン（大麦由来）、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＬ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００９４】
具体的には、まず、反応液として、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と、１０μＬの精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）と、４０μＬの精製水とからなる混合液を７０℃又は９０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに同様に保温した１００μＬの各基質溶液（ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、キシログルカン、β−グルカン、リケナン、及びラミナリンは１質量％水溶液、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＣ、及びＰＮＰＬは４ｍＭ水溶液）を添加し、得られた混合液を７０℃又は９０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。反応中、不溶性基質の沈殿を防ぐため、サーモミキサー（エッペンドルフ社製）により混合液に１４００ｒｐｍの振動を加えて撹拌した。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。
【００９５】
反応終了後、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＣ、又はＰＮＰＬを基質とした反応においては、前記＜８＞のＡＲ１９Ｍ−１１３−４のＰＮＰＣ加水分解活性を調べた場合と同様にして、反応後の混合液の上清の４２０ｎｍの吸光度を測定し、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、キシログルカン、β−グルカン、リケナン、又はラミナリンを基質とした反応においては、反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍによって吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。ただし、キシランの加水分解によって生成した還元糖量については、キシランで作成した検量線を用いて求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９６】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。測定結果を図３に示す。この結果、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、リケナン及びβ−グルカンに対して特に高い加水分解活性を示し、ＣＭＣとＰＮＰＣにも高い分解活性を示し、ＰＳＡに対しても加水分解活性を示した。一方、その他の基質に対してはほとんど分解活性を示さなかった。また、加水分解活性を示した基質全てにおいて、７０℃より９０℃で高い分解活性が見られた。以上より、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンから成る基質に対して特異性の高い超耐熱性エンドグルカナーゼであることが示された。
【００９７】
＜１１＞  ＰＮＰＣ及びβ−グルカンを基質とした加水分解活性の温度依存性
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のグリコシド加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、既知エンドグルカナーゼにおいて基質による温度特性の差異が報告されていたため、ＰＮＰＣと、基質特異性解析において最も高い活性が認められた大麦由来β−グルカン（Ｓｉｇｍａ社製）とを用いた。
【００９８】
精製したＡＲ１９Ｍ−１１３−４のＰＮＰＣ加水分解活性の温度依存性の測定のうち、反応温度を３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は９０℃とした場合は、前記＜８＞と同様に行い、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
また、反応温度を９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、又は１３０℃とした場合は、前記＜９＞と同様に行い、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９９】
精製したＡＲ１９Ｍ−１１３−４のβ−グルカン加水分解活性の温度依存性の測定のうち、反応温度を３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、又は９０℃とした場合は、ｐＨ４．５ の２００ｍＭ  酢酸バッファーと基質として１質量％  β−グルカン水溶液を用いた以外は、前記＜８＞と同様にして酵素反応を行い、前記＜１０＞と同様にして加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
また、反応温度を９５、１００，１０５、１１０、１１５、又は１２０℃とした場合は、ｐＨ４．５ の２００ｍＭ  酢酸バッファーと基質として１質量％  β−グルカン水溶液を用いた以外は、前記＜９＞と同様にして酵素反応を行い、前記＜１０＞と同様にして加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１００】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図４に示す。図４は、横軸を温度として、ＰＮＰＣを基質とした場合（ｐＨ５．５）及びβ−グルカンを基質とした場合（ｐＨ４．５）の各温度における精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のグリコシド加水分解活性を計測した結果を示した図である。図４において、左縦軸はＰＮＰＣ加水分解活性のスケールを表し、右縦軸はβ−グルカン加水分解活性のスケールを表示する。
【０１０１】
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、温度範囲４０〜１３０℃においてＰＮＰＣ加水分解活性を示し、最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ５．５で１１０℃であった。また、β−グルカン基質については、温度範囲４０〜１２０℃において加水分解活性を示し、最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．５で１００℃であった。以上の結果より、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４エンドグルカナーゼは、基質により温度特性が異なることが確認されたが、いずれも１００℃以上が至適温度であった
【０１０２】
＜１２＞  ＰＮＰＣ及びβ−グルカンを基質とした加水分解活性のｐＨ依存性
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｍ−１１３−４）のグリコシド加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素（約１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、ＰＮＰＣと大麦由来β−グルカン（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【０１０３】
ＰＮＰＣ加水分解活性は、 ５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と４０μＬの精製水、１０μＬの精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）と１００μＬの４ｍＭ  ＰＮＰＣ水溶液からなる混合液を、９０℃で１０分間反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＣ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０４】
同様に、β−グルカン加水分解活性は、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と４０μＬの精製水、１０μＬの精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）と１００μＬの１質量％ β−グルカン水溶液からなる混合液を、９０℃で１０分間反応させた以外は前記＜８＞と同様にして酵素反応を行い、前記＜１０＞と同様にして加水分解によって生成した還元糖量を求め、β−グルカン加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０５】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。計測結果を図５に示す。図５は、横軸をｐＨとして、各ｐＨにおける精製酵素ＡＲ１９Ｍ−１１３−４のＰＮＰＣを基質とした場合及びβ−グルカンを基質とした場合のグリコシド加水分解活性（９０℃）を計測した結果を示した図である。図５において、左縦軸はＰＮＰＣ加水分解活性のスケールを表し、右縦軸はβ−グルカン加水分解活性のスケールを表示する。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
【０１０６】
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、ｐＨ４〜８の範囲において、ＰＮＰＣ加水分解活性を示し、至適ｐＨはｐＨ５．５〜６．５（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値ｐＨ５．７３〜６．７１）付近であった。また、β−グルカン基質を用いた場合は、同様にｐＨ４〜８の範囲において加水分解活性を示したが、至適ｐＨは９０℃でｐＨ４．５（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値ｐＨ４．６５）であった。
【０１０７】
＜１３＞  ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の熱安定性
ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の熱安定性（耐熱性）を調べるため、１時間〜４０時間プリインキュベーションを行い、各温度における酵素タンパク質のＰＮＰＣ加水分解活性を計測した。
【０１０８】
測定には、前記＜８＞又は＜９＞で用いた精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を用いた。精製酵素溶液のプリインキュベーションは、精製酵素１０μＬと、精製水４０μＬと、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬからなる混合液（ｐＨ５．５）を、８０〜９９℃の各温度で０、１、２、４、８、１６、２４、又は４０時間保温することにより行った。精製酵素のＰＮＰＣ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と４ｍＭ  ＰＮＰＣ水溶液をそれぞれ別々に９０℃で５分間加温した後、前記混合液と等量のＰＮＰＣ水溶液を加え、９０℃で１０分間反応させた以外は、前記＜８＞と同様にして行なった。酵素の加水分解によって生成した生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＣ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１０９】
計測結果を図６に示す。酵素活性は、無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。酵素活性が無処理区の５０％に低下するプリインキュベーション時間を半減期Ｔｈａｌｆとした。ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、プリインキュベーション温度８０〜９０℃の場合、計測時間内にＰＮＰＣ加水分解活性が失われることはなく、半減期Ｔｈａｌｆは２４時間以上であった。９５℃及び９９℃では、半減期Ｔｈａｌｆはそれぞれ約４０時間及び１２〜１３時間であった。
【０１１０】
＜１４＞  熱崩壊温度Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）測定
タンパク質の熱安定性に関わる指標として、熱変性温度又は熱崩壊温度Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）がしばしば使われる。一定時間の予備加温（プリインキュベーション）により酵素活性が無処理区の５０％に減少するプリインキュベーション温度はタンパク質の熱崩壊温度Ｔｍにほぼ等しく、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の熱崩壊温度Ｔｍを求めた。
具体的には、基質無添加条件下での３０分間の予備加熱により、ＰＮＰＣ加水分解活性が５０％に減少する温度Ｔ５０を指標として、ＡＲ１９Ｍ−１１３−４の熱安定性を調べた。各データはロジスティック関数による近似を行い、近似曲線が相対活性値５０％となる温度をＴ５０とした。
【０１１１】
測定には、前記＜８＞又は＜９＞で用いた精製酵素溶液（０．０２ｍｇ／ｍＬ）を用いた。精製酵素溶液のプリインキュベーションは、１０μＬの精製酵素溶液と、４０μＬの精製水と、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファーからなる混合液（ｐＨ５．５）を、８０〜１３０℃の各温度で３０分間保温することにより行った。ＰＮＰＣ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と４ｍＭ  ＰＮＰＣ水溶液をそれぞれ別々に９０℃で５分間加温した後、前記混合液と等量のＰＮＰＣ水溶液を加え、９０℃で１０分間反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行った。酵素の加水分解によって生成した生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＣ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【０１１２】
計測結果を図７に示す。酵素活性は、無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ＡＲ１９Ｍ−１１３−４は、Ｔ５０＝１０４．４℃であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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