(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウイルスのプロテイナーゼによる切断に抵抗性のｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現するｅＩＦ４Ｇ遺伝子のゲノムエディティングを含むインビトロでの偶蹄類の細胞。
【請求項２】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子によって発現されるｅＩＦ４Ｇタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の偶蹄類の細胞。
【請求項３】
口蹄疫ウイルスに抵抗性であるゲノムエディティングされた偶蹄類の作出方法であって、
ａ．偶蹄類の細胞、初代細胞、又は偶蹄類の胚のゲノムにおける天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子をインビトロでエディティングするステップ、及び前記偶蹄類の細胞または初代細胞をクローニングするか又は母動物に前記胚を移植するステップであって、前記ｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、口蹄疫ウイルスのプロテイナーゼによる切断に抵抗性のｅＩＦ４Ｇアイソフォームを発現するようにエディティングされる、ステップ、又は
ｂ．外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の発現を偶蹄類の初代細胞又は偶蹄類の胚にインビトロで加えるステップ、及び前記初代細胞をクローニングするか又は母動物に前記胚を移植するステップであって、前記外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、口蹄疫ウイルスのプロテイナーゼによる切断への抵抗性によってタンパク質分解に抵抗するｅＩＦ４Ｇアイソフォームを発現する、ステップ、又は
ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む方法。
【請求項４】
前記初代細胞又は前記胚に：
ａ．前記天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子のある部位を特異的に切断する部位特異的ヌクレアーゼと、
ｂ．前記ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の少なくとも一部分を含む核酸鋳型であって、前記鋳型が前記天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の代替の対立遺伝子を提供し、前記代替の対立遺伝子が、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性のｅＩＦ４Ｇアイソフォームをコードする、核酸鋳型と
を導入するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスターを形成する規則的に間隔が置かれた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法により作製される偶蹄類。
【請求項７】
ｅＩＦ４Ｇ遺伝子にゲノムエディティングを含むゲノムエディティングされた偶蹄類であって、前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、口蹄疫ウイルスのプロテイナーゼによる切断に抵抗性となるように改変されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、偶蹄類。
【請求項８】
前記エディティングが、前記ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換を含む、請求項７に記載の偶蹄類。
【請求項９】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、口蹄疫ウイルス酵素のリーダープロテイナーゼ（Ｌｐｒｏ）による切断に抵抗性となるように改変されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、請求項７〜８のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１０】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、口蹄疫ウイルス酵素のウイルスコード３Ｃプロテアーゼ（３Ｃｐｒｏ）による切断に抵抗性のｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１１】
前記動物が第１の品種の動物であり、前記ゲノムエディティングが、動物の別の品種または種に見出されるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の対立遺伝子の移入によるものである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１２】
前記動物が第１の種の動物であり、前記ゲノムエディティングが、第２の種におけるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の対立遺伝子の移入によるものである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１３】
前記動物が前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子に関してホモ接合体である、請求項７に記載の偶蹄類。
【請求項１４】
創始動物である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１５】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子によって発現されるｅＩＦ４Ｇタンパク質をさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１６】
口蹄疫に抵抗性である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１７】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇタンパク質が、Ｌｐｒｏ及び／又はＣｐｒｏの結合を防ぐようにエディティングされる、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の偶蹄類。
【請求項１８】
口蹄疫の治療又は予防に使用するための、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性のｅＩＦ４Ｇタンパク質をコードする単離核酸を含む組成物。
【請求項１９】
単離核酸が、外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子を発現する核酸又は動物の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて改変されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する核酸である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
口蹄疫の治療又は予防に使用するための、請求項１８又は１９に記載の単離核酸を組み込んでいるベクターを含む組成物。
【請求項２１】
偶蹄類において口蹄疫を治療するための、又はそれを予防するための、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の単離核酸又はベクターの使用。
【請求項２２】
前記エディティングが、前記ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、前記ゲノムエディティングされた偶蹄類の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性となるようにエディティングされたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、請求項３〜５及び２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、前記ゲノムエディティングされた偶蹄類の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて、口蹄疫ウイルス酵素のリーダープロテイナーゼ（Ｌｐｒｏ）による切断に抵抗性となるようにエディティングされたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、請求項３〜５及び２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、前記ゲノムエディティングされた偶蹄類の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて、口蹄疫ウイルス酵素のウイルスコード３Ｃプロテアーゼ（３Ｃｐｒｏ）による切断に抵抗性となるようにエディティングされたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する、請求項３〜５及び２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ゲノムエディティングされた偶蹄類が第１の品種の動物であり、前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、その動物の別の品種に見出されるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の天然の対立遺伝子の移入によるものである、請求項３〜５及び２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲノムエディティングされた偶蹄類が第１の種であり、前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子が、別の種におけるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の対立遺伝子の移入によるものである、請求項３〜５及び２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ゲノムエディティングされた偶蹄類が前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子に関してホモ接合体である、請求項３〜５及び２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ゲノムエディティングされた偶蹄類が前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇ遺伝子によって発現される前記ｅＩＦ４Ｇタンパク質をさらに含む、請求項３〜５及び２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノムエディティングされた偶蹄類が口蹄疫に抵抗性である、請求項３〜５及び２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記エディティングされたｅＩＦ４Ｇタンパク質が、Ｌｐｒｏ及び／又はＣｐｒｏの結合を防ぐようにエディティングされる、請求項３〜５及び２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３６，８６０号明細書及び２０１２年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／６７７，９０４号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願は双方とも、本明細書における参照により本明細書によって援用される。
【０００２】
本技術分野は、遺伝子修飾動物及び関連技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に感染した偶蹄類動物は、急性水疱性疾患により急速に無能力化する。ウシ及びブタのＦＭＤ感染は、発熱、有痛性の水疱形成、跛行及び食欲不振を引き起こす。感染病原体の名前が示唆するとおり、脚の二次感染が起こることが多く、慢性跛行及び治癒の遅れが引き起こされ、同様に乳腺炎も、乳牛によく見られる続発症であり得る。疾患の急性期は約１週間続き、免疫応答の高まりを受けて弱まるが、なかでも抗体応答は、血流からのウイルスの排除においてその効率が極めて高いことに伴い、特に重要であるように思われる。幼若動物では、心筋の感染が循環不全を引き起こすため死亡が起こり得る。この疾患は伝染性が極めて高いため、たった一頭の動物の感染で群れ全体の殺処分及び埋却が必要となる。従ってＦＭＤＶは、ある面では、家畜化された農業動物の病原体のうち世界で最も重要なものと考えられている。２００１年の英国におけるＦＭＤの大発生では総計約１２０〜１４０億ドルの損失が生じており［１］、また十年以上前にカリフォルニア大学デービス校が行った推定によれば、カリフォルニア州に限られたＦＭＤの大発生であっても、対策費用並びに動物の移動及び販売の制限によって失われる取引に６０〜１４０億ドルの負担が生じる。ミルク及び他の製品、並びに食肉の販売が中止されることになり、生産者及び関連産業の従事者の仕事は失われるか又は著しく縮小されるであろう。他の国々はそれに比例した経済的影響を受ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ＦＭＤＶに抵抗性を有する動物が、本明細書に記載される。動物は最小限のヌクレオチド変化のみを伴い作製され、この変化は正確な位置に設けられ、動物のゲノムに他の変化は生じない。
【０００５】
本発明の実施形態は、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子にゲノム修飾を含む遺伝子修飾動物である。修飾には、例えば、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換が含まれ得る。ｅＩＦ４Ｇ遺伝子は、その動物の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて改変されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現し、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼ、例えば口蹄疫ウイルス酵素のリーダープロテイナーゼ（Ｌｐｒｏ）及び口蹄疫ウイルス酵素のウイルスコード３Ｃプロテアーゼ（３Ｃｐｒｏ）の一方又は両方による切断に抵抗性となるように改変され得る。動物は哺乳動物であってもよい。動物は、実験研究用動物（例えば、マウス、ラット、イヌ又は実験室で使用されるブタ種、例えばミニブタ）であってもよい。動物は、例えば、ブタ、魚、ウサギ、雌ウシ、ニワトリ、ヤギ、及びヒツジからなる群から選択される家畜動物であってもよい。ある場合には、動物は第１の品種の動物であり、ゲノム修飾は、その動物の別の品種に見出されるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の天然の対立遺伝子である。別の場合には、動物は第１の種の動物であり、ゲノム修飾は、第２の種（ヒト又は非ヒト動物）の別の品種におけるｅＩＦ４Ｇ遺伝子の対立遺伝子である。対立遺伝子は、一般には遺伝子全体ではなく、ＦＭＤＶプロテアーゼによる結合及びタンパク質分解を媒介するタンパク質部分をコードする遺伝子の一部分である。動物は、修飾されたｅＩＦ４Ｇ遺伝子に関してホモ接合体又はヘテロ接合体であり得る。動物は創始動物又は創始動物の子孫であってもよく、即ち、動物の新しい品種又は系統が作出されてもよい。動物は、修飾されたｅＩＦ４Ｇ遺伝子により発現されるｅＩＦ４Ｇタンパク質を含んでいてもよい。動物は口蹄疫に抵抗性であり得る。修飾ｅＩＦ４Ｇタンパク質は、Ｌｐｒｏ及びＣｐｒｏの一方、又はその両方の結合を防ぐように修飾され得る。
【０００６】
本発明の実施形態は、遺伝子修飾生物の作出方法であり、これは、初代細胞又は胚の天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子をインビトロで（又は胚の場合には子宮で）改変するステップと、初代細胞をクローニングするか又は母動物（サロゲート）に胚を移植するステップとを含み、ここでｅＩＦ４Ｇ遺伝子は、口蹄疫プロテアーゼによるタンパク質分解に抵抗するｅＩＦ４Ｇアイソフォームを発現するように改変されている。この方法は、天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子のある部位を特異的に切断する部位特異的ヌクレアーゼと、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の少なくとも一部分を含む核酸鋳型とを初代細胞又は胚にトランスフェクトするステップを含むことができ、ここで鋳型は天然ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の代替の対立遺伝子を提供し、前記代替の対立遺伝子が、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性であるｅＩＦ４Ｇアイソフォームをコードする。部位特異的ヌクレアーゼの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスターを形成する規則的に間隔が置かれた短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ、又は時にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と称されることもある）からなる群から選択されるヌクレアーゼベースの系である。
【０００７】
ある実施形態は、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子にゲノム修飾を含むインビトロ細胞である。ｅＩＦ４Ｇ遺伝子は、その動物の野生型ｅＩＦ４Ｇタンパク質と比べて口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性となるように改変されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現し得る。細胞は、マウス、ラット、ウマ、ミニブタ、ブタ、魚、ウサギ、雌ウシ、ニワトリ、ヤギ、偶蹄類、有蹄類、及びヒツジからなる群から選択され得る。細胞は、修飾されたｅＩＦ４Ｇ遺伝子によって発現されるｅＩＦ４Ｇタンパク質をさらに含み得る。
【０００８】
本発明の実施形態は、口蹄疫ウイルス酵素のプロテイナーゼによる切断に抵抗性であるｅＩＦ４Ｇタンパク質などの、ｅＩＦ４Ｇタンパク質のいずれかのアイソフォームをコードする単離核酸を含む。
【０００９】
本発明の実施形態は、ＥＩＦ４Ｇタンパク質又はＦＭＤＶプロテアーゼが結合する前記タンパク質の一部分を発現する外来性遺伝子を含む細胞、生物、又は動物を含む。外来性遺伝子発現はＦＭＤＶウイルス結合に関して競合するため、天然タンパク質切断が減少する。或いは、プロテアーゼ抵抗性ＥＩＦ４Ｇの外来性遺伝子発現は、細胞が感染していながら継続的な細胞機能を提供する。ある実施形態は遺伝子修飾生物の作出方法であり、これは、外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子の発現を初代細胞又は胚にインビトロで加えるステップと、初代細胞をクローニングするか又は母動物に胚を移植するステップとを含み、ここで外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子は、口蹄疫プロテアーゼによるタンパク質分解に抵抗するｅＩＦ４Ｇアイソフォームを発現する。ある実施形態は、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子に対するゲノム修飾又は外来性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子を発現する核酸を含むインビトロ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インビボ全細胞内タンパク質の電気泳動プロファイルのラジオオートグラフィーである；下部にあるピコルナウイルス感染後の時間（時間単位）の関数として、細胞からの３５Ｓ標識全タンパク質をイメージングする；完全な細胞溶解（６．５時間後）は、宿主タンパク質の遮断及びピコルナウイルスタンパク質によるポリペプチド合成のほぼ全面的な乗っ取りの時間的経過を示している。５時間目の顕著なバンドは、Ｌｐｒｏによってポリタンパク質前駆体から切断されたウイルスタンパク質である（ゲルの上部の濃いバンド）。ゲルの下部近くの強いバンドは、非ポリアデニル化ｍＲＮＡに由来する、従ってｅＩＦ４Ｇに依存せず、且つウイルスプロテイナーゼ活性に感受性を有するヒストンである。
【図２】ＥＩＦ４ＧＩ遺伝子の一部を改変した実験結果を示す。ブタＥＩＦ４ＧＩの一部の配列をパネルＡに示す。野生型配列は、Ｌｐｒｏ切断部位（矢印）に対してマイナス３位及び２位にアスパラギン及びロイシン残基を有する。この例では、鋳型が提供されることにより、修飾ＥＩＦ４ＧＩをＬｐｒｏ切断に対して抵抗性にするためのアスパラギン酸及びフェニルアラニンによるマイナス３位及び２位残基の置換が誘導される。ＴＡＬＥＮの２つの対（上）は、野生型ＥＩＦ４ＧＩを切断して相同組換えを刺激するように設計された。パネルＢ）は、各ＴＡＬＥＮ対をトランスフェクトしたブタ線維芽細胞のサーベイヤー（Ｃｅｌ−Ｉ）アッセイの結果を示す。パネルＣ）は、相同組換え効率を決定するためのＲＦＬＰアッセイを示す。この図は、左ＴＡＬＥＮ  ＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＴ（配列番号１２）、右ＴＡＬＥＮ  ＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡ（配列番号１３）；左ＴＡＬＥＮ  ＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴ（配列番号１４）；右ＴＡＬＥＮ  ＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＣＣ（配列番号１５）；ＥＩＦ４ＧＩ遺伝子部分  ＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＣＣ（配列番号１６）；及びＨＤＲ  ＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＣＣ（配列番号１７）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、ＦＭＤＶに抵抗性の動物を作製する方法を説明する。動物は、その真核生物翻訳開始因子４Ｇタンパク質（ｅＩＦ４Ｇ）がＦＭＤＶプロテアーゼＬｐｒｏ及び３Ｃｐｒｏ（本明細書では、まとめてＦＭＤＶプロテアーゼと称される）の一方又は両方による切断に抵抗性となるように遺伝子修飾される。このプロテアーゼはＦＭＤＶによって作られるもので、ｅＩＦ４Ｇタンパク質を攻撃する。実施例には、ＦＭＤＶプロテアーゼの一つによる攻撃に抵抗するように修飾された家畜初代細胞の生成が含まれる。動物はこれらの細胞から、本発明者らにより創始動物の作製に有効であることが明らかにされた技法を用いてクローニングされ得る。修飾は、天然遺伝子の対立遺伝子の修飾によってＦＭＤＶプロテアーゼ抵抗性ｅＩＦ４Ｇタンパク質を発現する修飾対立遺伝子が作製されるように部位特異的な方法で作製され得る。
【００１２】
ＦＭＤＶ抵抗性
ＦＭＤＶは、ポリオウイルス、ライノウイルス（感冒）、及びＡ型肝炎を含む動物ウイルスのなかで最も小さいピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）のアフトウイルス属（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）に属する。複数のサブタイプを含む７種の血清型がある［２］。他のピコルナウイルスと同様に、ＦＭＤＶゲノムは、直接翻訳され得る（プラス鎖ゲノム）約８，５００ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、１００ＫＤａを上回る単一のポリタンパク質をコードする。ＦＭＤＶ  ＲＮＡのＮ末端領域には、２つのアイソフォームＬａｂ及びＬｂ（このうちＬｂが重要な産物である）を有するＬｐｒｏと称されるパパイン様プロテアーゼがコードされる［３］。Ｌｐｒｏはいずれも非常に小さく、且つ非常に特異的である。Ｌｐｒｏ配列は初めにＦＭＤＶポリタンパク質をその合成中に切断し、自らをポリタンパク質から遊離させる。次に遊離Ｌｐｒｏは、残りのポリタンパク質をさらに切断して、莫大な数の子孫ウイルスを産生する個々の機能性ポリペプチドにする。Ｌｐｒｏは他にいくつかの標的部位を有し、そのなかで最も重要な標的部位は、真核生物翻訳開始因子４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ）であるものと思われ［４、５］、これはＬｐｒｏによって切断されると、哺乳類細胞の４ｍＧキャップｍＲＮＡの開始を促進することができない。２つのアイソフォームｅＩＦ４ＧＩ及びｅＩＦ４ＧＩＩがあるｅＩＦ４Ｇは、キャッピングされ且つポリアデニル化されたあらゆるｍＲＮＡの５’末端及び３’末端の構造に結合するいくつかのｅＩＦ４  ＲＮＡ結合タンパク質を一つにまとめる足場タンパク質である。ある種のピコルナウイルス、例えばポリオウイルスでは、２ＡｐｒｏプロテアーゼがＬｐｒｏと同等の活性を有する。
【００１３】
ｅＩＦ４Ｇの正味の効果は、その５’末端に結合した７ｍＧキャップ結合ｅＩＦ４Ｅと、３’末端のポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）とを有する末端真核生物ｍＲＮＡを非共有結合的に架橋することである［６、７］。ｍＲＮＡの末端へのこれらの付加により、翻訳機構が完全にプロセシングされたｍＲＮＡと細胞中にある他の無数のＲＮＡ分子とを区別してタンパク質へのその翻訳を協調させることが可能となる。ｅＩＦ４Ｇタンパク質は、この決定的に重要な活性により、ウイルスタンパク質のみを産生するように細胞の翻訳機構を支配すべく進化してきたウイルスの侵入による切断の格好の標的となる［８〜１２］。切断されて２つ以上のペプチドになると、ｅＩＦ４ＧはｍＲＮＡの５’及び３’末端を架橋することができなくなり、宿主タンパク質合成が数時間にわたり止まる（図１）。プロテアーゼは、インターフェロン及びその調節因子［１３〜１６］、並びにウイルス、特に複製の過程において二本鎖ＲＮＡ中間体（又は最終）産物を有するウイルスに対する免疫応答に関わる核内因子κＢ［１７］などのタンパク質を標的化する副次的な活性を有する。切断されたｅＩＦ４ＧペプチドとＦＭＤＶ内部リボソーム開始部位との相互作用は、ＦＭＤＶ遺伝子の発現に重要であるものと思われる［１８〜２１］。
【００１４】
ピコルナウイルスゲノムはキャッピングされておらず、従ってそのコードされたポリタンパク質の翻訳開始にｅＩＦ４Ｇの助けは不要である。むしろ、ポリタンパク質前駆体の翻訳開始は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）で起こる。結果として、宿主細胞タンパク質のほとんど全ての合成が遮断され、タンパク質合成機構はほぼウイルスタンパク質の産生のみに利用可能なものとなる。この特徴は、ウイルス感染動物における急速な症状の拡散及び発現の鍵である。第２のプロテアーゼ、３Ｃｐｒｏがあり、これもまた、ｅＩＦ４Ｇ、ＰＡＢＰ及びＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａを攻撃する［２２］。しかしながら、３Ｃｐｒｏの活性は遅延性であり、概してＬｐｒｏと比べて宿主タンパク質合成の破壊において担う役割は少ない［１１、２３、２４］。Ｌｐｒｏ及び３Ｃｐｒｏのこれらの２つの特徴は、ウイルスの弱体化及び拡散に不可欠である。培養ＢＨＫ−２１細胞を使用したある研究では、Ｌｐｒｏを欠くＦＭＤＶがやや低い速度で複製したことが示されたが［２５］、Ｌｐｒｏを欠くＦＭＤＶは、ウシ及びブタに注入したとき顕著に非病原性であり、同舎の動物に拡散不能であった［２６、２７］。Ｌｐｒｏ欠損ウイルスは、全動物ではインターフェロン媒介性細胞防御に感受性を示したが、培養細胞ではそれを示さなかった［２７、２８］。
【００１５】
従ってピコルナウイルスの効果的な戦略は、ポリタンパク質を成熟タンパク質に切断するために必要なものと同じウイルスプロテアーゼを使用して、最大の弱点であるｅＩＦ４Ｇの架橋機能を攻撃することにより宿主タンパク質合成を不活性することである。これが行われることに伴い、ウイルスゲノムは、１）必須宿主タンパク質の合成が損なわれる、及び２）いくつかの宿主防御タンパク質がウイルスプロテアーゼの標的となるアミノ酸配列を有する、という理由で有意な細胞内免疫応答を誘導しない二本鎖の中間体を経て複製する。ウイルスは正常な細胞活性を壊滅させるため、細胞破壊性である；感染性ビリオンは、感染後４〜６時間で現れる。
【００１６】
本発明の実施形態は、ＦＭＤＶによって作られるプロテアーゼに抵抗するｅＩＦ４Ｇタンパク質をコードするｅＩＦ４Ｇ遺伝子を有する動物である。一つのＦＭＤＶ抵抗性の実施形態は、ｅＩＦ４Ｇタンパク質にＣｐｒｏ及び／又はＬｐｒｏ抵抗性を付与する唯１つのみ又は数個のみのｅＩＦ４Ｇ遺伝子におけるヌクレオチド特異的な変化を作製することである。動物ゲノムに対するかかる精密な遺伝子変化は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はクラスターを形成する規則的に間隔が置かれた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）などの部位特異的ヌクレアーゼで作製される。ＴＡＬＥＮはＺＦＮより汎用性の高いプラットフォームである［３４、３５］。ＣＲＩＳＰＲは新しい有効なツールである（Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｊａｎ  ３  ２０１３  ¶．１−７；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３：Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．８２３−８２６）。実施例２において、そのＥＩＦ４ＧがＦＭＤＶプロテアーゼ抵抗性遺伝子となるようにゲノム修飾されている初代細胞が記載される。このような細胞は、従来技術を使用したクローン動物の作製に用いられ得る。
【００１７】
動物の一実施形態は、動物のゲノムに抵抗性遺伝子を有する。代替的実施形態は動物に外来性遺伝子を加え、動物が一部又は全ての細胞でこの外来性遺伝子を発現する。外来性遺伝子はＦＭＤＶ活性に抵抗する。本発明の実施形態は、ＥＩＦ４Ｇタンパク質又はＦＭＤＶプロテアーゼが結合する前記タンパク質の一部分を発現する外来性遺伝子を含む細胞、生物、又は動物を含む。別の代替的実施形態は、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置く。例えば、使用時には、一群の動物がその飼料中に添加剤を与えられるなどして遺伝子が活性化され、抵抗性が作り出され得る。創始動物及び品種は、これらの特徴の１つ以上を伴い樹立され得る。
【００１８】
翻訳機能は保持するがプロテアーゼ消化に抵抗性であるｅＩＦ４ＧＩ及びｅＩＦ４ＧＩＩ配列中の特定のアミノ酸の置換により、宿主タンパク質合成は、ピコルナウイルス感染細胞において分解されない宿主ｍＲＮＡが多量に過剰であるため、引き続きウイルスタンパク質の合成を打ち負かすことができる［３６］。さらに、ｅＩＦ４Ｇ切断産物がないため、ＦＭＤＶ  ＲＮＡのＩＲＥＳ媒介性翻訳が減弱し得る［２０、２１］。この手法はＦＭＤＶ複製に対する抵抗性を提供し、プロテアーゼ感受性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子を含むゲノムにプロテアーゼ抵抗性ｅＩＦ４Ｇ遺伝子を単純に加えるのと比べて優れている［１９、３６］。この戦略には遺伝子導入は関わらない；むしろこれは、動物細胞における標準的な遺伝活性である遺伝子変換に相当する。
【００１９】
【表１】
0006446360.tif 000002
【００２０】
例として、表１に、Ｌｐｒｏが結合し、且つＬｐｒｏによって切断されるブタｅＩＦ４Ｇ遺伝子の一部分（ウシ及びヒツジと１００％の同一性）に関するアミノ酸配列型６６８〜６７９を示す。表１にはさらに、分解に対する抵抗性を生じさせ、且つＦＭＤＶ抵抗性を生み出すことが予想される１つ又は２つのアミノ酸の改変を示し、これらの改変は下線を引いて強調している。代替的なアミノ酸配列は、ｅＩＦ４Ｇタンパク質のアイソフォームである；様々なアイソフォームをコードする遺伝子は、互いに対立遺伝子である。アミノ酸６６８〜６７９は、ＮＭ＿００１２４６２５３から翻訳されるとおりの野生型（Ｗｔ）ブタＥＩＦ４ＧＩのものである。ＦＭＤＶ  Ｌｐｒｏプロテアーゼに対する抵抗性を付与する代替的なアイソフォームが、から予想される（ウイルスポリペプチド部位について記載するＳａｎｔｏｓら  ２００９を参照のこと；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８，７９４８）。アイソフォーム１は、この部位におけるヒトＥＩＦ４ＧＩＩとのアラインメントに基づく。ヒトＥＩＦ４ＧＩＩはここでは切断されず、機能性である。アイソフォーム２及び８も同様にヒトＥＩＦ４ＧＩＩとのアラインメントに基づく。従って残りのアイソフォームが、プロテアーゼを阻害し且つ正常な機能を維持するそれらの可能性に基づき選択される。当業者は、指示されるアイソフォームを作製するため核酸配列を容易に作り出すことができ、及び野生型遺伝子配列は容易に且つ公的に利用可能である。種々のアイソフォームをコードするため、コロニースクリーニングに役立つサイレントＲＦＬＰ突然変異と共に相同組換え（ＨＲ）鋳型を生成し得る。これらの鋳型は、ＥＩＦ４Ｇ１４．１  ＴＡＬＥＮ結合部位にわたる９０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを有し得る（図２）。各ＨＲ鋳型（典型的には約０．０２５〜約０．８ｎモル）が、ＥＩＦ４Ｇ１４．１  ＴＡＬＥＮ（典型的には約０．１〜約１０マイクログラム）と共に初期継代線維芽細胞に導入され、個々のコロニーが、突然変異対立遺伝子の移入についてスクリーニングされ得る。所望の対立遺伝子を組み込むコロニーから細胞が取り出され、創始動物のクローニングに使用され得る。
【００２１】
表２は、様々な家畜種における様々なｅＩＦ４Ｇ遺伝子の配列供給源を示す。当業者は、これらの及び他の家畜ｅＩＦ４Ｇ遺伝子について容易に情報を入手し得る。
【００２２】
【表２】
0006446360.tif 000003
【００２３】
従って、本発明の実施形態は、ＦＭＤＶプロテイナーゼ、例えばＬｐｒｏ及び／又はＣｐｒｏに抵抗性のＥＩＦ４Ｇを含む。実施形態は、野生型の１つ以上の残基（アミノ酸又は核酸）に変化を有するアイソフォームを含み、またそれをコードする核酸配列も含む。１つ以上の改変された残基は、ＦＭＤＶプロテイナーゼが結合する位置にあっても、又はそれに対応する核酸配列にあってもよい。或いは、突然変異は、プロテイナーゼがタンパク質においてその切断を行う点にあってもよい。野生型と比べた変化の数は、典型的には、１〜約５０の変化を包含し得る；当業者は、例えば１〜５、１〜１０など、１〜５０におけるあらゆる範囲及び値が企図されることを直ちに理解するであろう。これらの変化は、ＥＩＦ４Ｇが正常な（即ち非ＦＭＤＶの）機能を果たすよう働き得るような変化である。ＥＩＦ４Ｇが改良された動物を含む動物は、口蹄疫に抵抗性となり得る。抵抗性の一つの形態は免疫であり、即ち動物は本質的にこの疾患に罹患しない。別の形態又は抵抗性は、動物が一度感染しても、より容易に回復することである。抵抗性の別の形態は、動物がそもそも（ウイルスが拡散することが困難である結果として）感染し難いことである。抵抗性の帰結としては、宿主におけるウイルス価が大幅に低下するという理由で、疾患が蔓延する可能性の低下を挙げることができる。
【００２４】
実施形態にはまた、遺伝子、タンパク質、タンパク質をコードする核酸、並びにかかる遺伝子及びタンパク質を含む細胞又は動物も含まれる。動物は家畜として、及びＦＭＤＶを調べるための研究動物として有用である。細胞は、家畜としての、又は研究動物としての動物の作製に有用であり、またＦＭＤＶ研究にも役立つ。ＦＭＤＶタンパク質分解に抵抗する細胞は、ＦＭＤＶライフサイクルの他の側面に干渉する薬物及び治療の試験に有用である。一つの理由は、これらの動物及び細胞がより長く生き延びるため、これらの他の介入の効果をアッセイし得ることである。別の理由は、他の治療法による試験の結果において、それらの作用機序がＦＭＤＶタンパク質分解であるか否かを速やかに決定し得ることである。遺伝子及びタンパク質は、それ自体で、ＦＭＤＶ検査及び効果のアッセイにさらに役に立つ。
【００２５】
遺伝子修飾動物
染色体修飾が単一対立遺伝子又は二対立遺伝子である動物が、マーカーを所定の位置に残し、それを動物から出して育てることを可能にする方法を用いるか、或いは動物にマーカーを置かない方法により作製され得る。例えば、本発明者らは、相同性依存型組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＤＲ）の方法を使用して、動物の染色体に対する変化、又はそこへの外来性遺伝子の挿入を作製している。部位特異的（ｓｉｓｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＣＲＩＳＰＲ、及びリコンビナーゼ融合タンパク質などのツール、並びに従来の方法が利用可能である。
【００２６】
遺伝子修飾との関連における用語の天然対立遺伝子は、修飾されている生物種と同じ生物種で天然に見出される対立遺伝子を意味する。用語の新規対立遺伝子は、非天然対立遺伝子を意味する。ヤギに置かれたヒト対立遺伝子は、新規対立遺伝子である。従って天然対立遺伝子は、異種交配することのできる種の範囲内に既に存在する種類のものである。また新規対立遺伝子は、異種交配することのできる種の範囲内に存在しないものである。種間の対立遺伝子の移動とは、動物のある種から別の種への移動を意味し、種内の移動とは、同じ種の動物間での移動を意味する。
【００２７】
従来の育種手法によるある品種から別の品種への対立遺伝子の移動には、品種間で多くの対立遺伝子を入れ替えることが関わる。減数分裂中の組換えでは、必ず品種間で遺伝子座が交換される。対照的に、部位特異的ヌクレアーゼ修飾された家畜及び他の動物は、細胞が有糸分裂のみの時点で細胞又は胚が修飾されるため、減数分裂期組換えイベントにより生じる遺伝子変化がない。結果として、ＴＡＬＥＮ修飾動物は、有性生殖によって作出された動物と容易に区別することができる。
【００２８】
本明細書における方法は、既存の動物のゲノムのエディティングを提供する。動物は一定の表現型を有し、例えば体細胞クローニングによる動物のクローニングが、当該の表現型を有効に維持する。クローニング中に細胞ゲノムに１つ又は複数の特定の変化を作製することにより、既知の表現型を改変することが可能になる。本明細書における方法は、或いは、未だ一定の形質を有する動物になるまでに発育していない胚のゲノムの改変を提供する。健全なジェネティクスを備える胚が、それでもなお、そのジェネティクスの遺伝的潜在能力の範囲内にある形質の全てを発現しないこともあり、即ち、動物は、その系統が育種される目的の形質を必ずしも発現するとは限らない。
【００２９】
本発明者らは、以前、修飾細胞のポリジーン集団からクローニングするときの効果的なクローニング効率を実証した（Ｃａｒｌｓｏｎら，２０１１）。しかしながら、加えてＴＡＬＥＮ媒介性ゲノム修飾、並びにリコンビナーゼ融合分子による修飾が、単一の世代での二対立遺伝子改変の達成をもたらす。例えば、ＳＣＮＴにより、且つ同系交配によりホモ接合性を生じさせることなしに、ノックアウト遺伝子に関してホモ接合体の動物を作製し得る。ブタ及びウシなどの家畜の妊娠期間及び繁殖年齢に至るまでの成熟は、研究及び生産の重大な障害である。例えば、クローニング及び繁殖によるヘテロ接合変異細胞（両性）からのホモ接合ノックアウトの生成は、ブタ及びウシについて、それぞれ１６ヶ月及び３０ヶ月を要する。
【００３０】
本発明者らは、以前、非トランスジェニック線維芽細胞と共に播種し、トランスポゾン共選択法（Ｃａｒｌｓｏｎら，２０１１，米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書）を用いて薬剤選択に供したとき、トランスジェニック初代線維芽細胞を効果的に拡大し、コロニーとして単離し得ることを示した。さらに（米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書を参照）、６つのＴＡＬＥＮ対で処理し、且つ標的部位にわたるＰＣＲ産物のサーベイヤー（ＳＵＲＶＥＹＯＲ）アッセイ又はダイレクトシーケンシングによりその遺伝子型を評価した細胞について、ピューロマイシン抵抗性コロニーが単離されたことが示された。概して、インデル陽性クローンの割合は、３日目の修飾レベルに基づき行った予想と同様であった。６つのＴＡＬＥＮ対のうち５つについて、二対立遺伝子ノックアウトクローンが同定され、インデル陽性細胞の最大３５％に存在した。特に、ＴＡＬＥＮ対の大部分に関する二対立遺伝子ノックアウトクローンの頻度は、各染色体の切断を独立したイベントとして扱った場合に予想される頻度を超える。
【００３１】
ＴＡＬＥＮ誘導相同組換えでは、連結された選択マーカーが不要となる。ＴＡＬＥＮを使用すると、相同性依存型修復（ＨＤＲ）によって特定の対立遺伝子を家畜ゲノムに正確に移入させることができる。パイロットスタディでは、特定の１１ｂｐ欠失（ベルジアン・ブルー対立遺伝子）（Ｇｒｏｂｅｔら，１９９７；Ｋａｍｂａｄｕｒら，１９９７）をウシＧＤＦ８遺伝子座に導入した（米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書を参照）。単独でトランスフェクトしたとき、ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮ対は標的遺伝子座で染色体の最大１６％を切断した。１１ｂｐ欠失を有するスーパーコイル相同ＤＮＡ修復鋳型をコトランスフェクトすると、所望のイベントに関する選択なしに３日目に最大５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）となった。スクリーニングした単離コロニーの１．４％に遺伝子変換が同定された。
【００３２】
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、遺伝子操作ツールである。遺伝子の不活性化は、ＴＡＬＥＮの多くの用途のうちの一つである。用語ＴＡＬＥＮは、本明細書で使用されるとき、広義であり、別のＴＡＬＥＮの助けなしに二本鎖ＤＮＡを切断することのできる単量体ＴＡＬＥＮを含む。用語ＴＡＬＥＮはまた、共同して同じ部位のＤＮＡを切断する働きをするように操作されるＴＡＬＥＮの対の一方又は両方のメンバーを指しても使用される。共同して働くＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの利き手を参照して、左ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮ）及び右ＴＡＬＥＮ（ｒｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮ）と称され得る。
【００３３】
Ｍｉｌｌｅｒら（Ｍｉｌｌｅｒら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１４３）は、ＴＡＬトランケーション変異体をＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することによる部位特異的ヌクレアーゼ構成のためのＴＡＬＥＮの作製を報告した。得られたＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核生物ＤＮＡ修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と相同性指向型修復とを介して不死化ヒト細胞に遺伝子修飾を誘導することが示された。ＴＡＬＥＮは、特異的結合用に操作することができる。ＭｉｌｌｅｒらのＴＡＬＥＮの改良が、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願公開第１３／５９４，６９４号明細書に記載されている。特異的結合とは、この用語が生物学の技術分野で一般に使用されるとおり、非標的組織と比べて比較的高い親和性で標的に結合する分子を指し、概して、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などの複数の非共有結合性の相互作用が関わる。具体的な結合相互作用が、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、特に結合タンパク質−受容体相互作用を特徴付ける。
【００３４】
ＴＡＬの暗号が報告されており（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、ここでは各ＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列における１つの塩基対の認識に関与する。残基は組み合わさってＤＮＡ配列を標的化し得る：（ａ）Ｃ／Ｇの認識にはＨＤ；（ｂ）Ａ／Ｔの認識にはＮＩ；（ｃ）Ｔ／Ａの認識にはＮＧ；（ｄ）Ｃ／Ｇ又はＡ／Ｔ又はＴ／Ａ又はＧ／Ｃの認識にはＮＳ；（ｅ）Ｇ／Ｃ又はＡ／Ｔの３０認識にはＮＮ；（ｆ）Ｔ／Ａの認識にはＩＧ；（ｇ）Ｃ／Ｇの認識にはＮ；（ｈ）Ｃ／Ｇ又はＴ／Ａの認識にはＨＧ；（ｉ）Ｔ／Ａの認識にはＨ；及び（ｊ）Ｇ／Ｃの認識にはＮＫ。端的には、ＴＡＬＥＮの結合標的部位が決定され、ヌクレアーゼとその標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子が作られる。結合すると、ヌクレアーゼがＤＮＡを切断し、細胞修復機構が切断末端に遺伝子修飾を作製するよう働くことができるようになる。用語ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むタンパク質を意味し、それ自体機能性である単量体ＴＡＬＥＮ並びに別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化が必要なその他の単量体ＴＡＬＥＮが含まれる。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同じであるときホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらすことができ、又は単量体ＴＡＬＥＮが異なるときヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらすことができる。
【００３５】
一部の実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮが用いられ得る。ＴＡＬＥＮは、典型的にはスペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し、ここでは２つのＴＡＬエフェクタードメインが各々ＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合し、得られた各ＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位がスペーサー配列によって分けられ、及び各ＴＡＬＥＮ単量体が認識部位に結合することによりＦｏｋＩが二量体化し、スペーサー内に二本鎖切断を作り出すことが可能になる。しかしながら単量体ＴＡＬＥＮもまた構築することができ、ここでは単一のＴＡＬエフェクターが、機能するのに二量体化する必要のないヌクレアーゼと融合する。一つのかかるヌクレアーゼは、例えば、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現するＦｏｋＩの単鎖変異体である。他の天然に存在する又は操作された単量体ヌクレアーゼもまた、この役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮに使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来してもよい。或いは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作されてもよい。操作された単鎖ＴＡＬＥＮは、操作されたＤＮＡ認識ドメインを１つしか必要としないため、構築及び展開がより容易であり得る。二量体ＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１つがＴＡＬエフェクター結合ドメイン、及び１つが別の種類の分子に由来する結合ドメイン）を使用して生成することができる。ＴＡＬＥＮは、スペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し得る。このヌクレアーゼ構成もまた、例えば１つのＴＡＬＥＮ単量体と１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体とから生成された標的特異的ヌクレアーゼに用いることができる。そのような場合、ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーによって隔てられ得る。２つの単量体が結合することにより、ＦｏｋＩが二量体化し、スペーサー配列内に二本鎖切断を作り出すことが可能となり得る。ジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ホメオドメイン、ｍｙｂリピート又はロイシンジッパーもまた、ＦｏｋＩと融合し、ＴＡＬＥＮ単量体と共に機能性ヌクレアーゼを作り出すパートナーとして働くことができる。
【００３６】
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して、他のタンパク質ドメイン（例えば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）に特定のヌクレオチド配列を標的化させることができる。例えば、ＴＡＬエフェクターを、限定なしに、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、又はリガーゼ）、転写活性化因子若しくはリプレッサー、又はヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するか若しくはそれを修飾するタンパク質のタンパク質ドメインに連結することができる。かかるＴＡＬエフェクター融合物の応用には、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作成又は修飾、ＤＮＡにおける部位特異的な挿入、欠失、又は修復の作製、遺伝子発現の制御、及びクロマチン構造の修飾が含まれる。
【００３７】
標的配列のスペーサーを選択し、又は変化させて、ＴＡＬＥＮの特異性及び活性を調節することができる。スペーサー長さの柔軟性は、スペーサー長さを選択することにより特定の配列を高い特異性で標的化し得ることを示している。さらに、異なるスペーサー長さについて活性にばらつきがあることが観察されており、スペーサー長さを選択することにより所望のレベルのＴＡＬＥＮ活性を達成し得ることが示される。
【００３８】
用語ヌクレアーゼには、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが含まれる。用語エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間における結合の加水分解（切断）の触媒能を有する任意の野生型又は変異型酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、及びＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、長さ約１２〜４５塩基対（ｂｐ）、より好ましくは１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を典型的に有するとき、レアカットエンドヌクレアーゼもまた含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は化学的エンドヌクレアーゼであってもよい。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的又はペプチド性切断因子（ｃｌｅａｖｅｒ）が核酸のポリマーか、或いは特定の標的配列を認識する別のＤＮＡにコンジュゲートし、それにより切断活性が特定の配列を標的化する。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のＤＮＡ配列と結合することが知られる、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される。かかる化学的エンドヌクレアーゼは、本発明に係る用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。かかるエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００３９】
ＴＡＬＥＮ又は他のツールによって作製される遺伝子修飾は、例えば、挿入、欠失、外来性核酸断片の挿入、及び置換からなるリストから選択され得る。用語「挿入」は、染色体への文字通りの挿入又は修復用鋳型としての外来性配列の使用のいずれかを意味して広義に使用される。一般には、標的ＤＮＡ部位が同定され、その部位に特異的に結合し得るＴＡＬＥＮ対が作成される。ＴＡＬＥＮは細胞又は胚へと、例えばタンパク質、ｍＲＮＡとして、又はＴＡＬＥＮをコードするベクターにより送達される。ＴＡＬＥＮがＤＮＡを切断して二本鎖切断が作製され、次にこれが修復されることで、多くの場合にインデルが作り出され、又は染色体に挿入されるか、或いは修飾配列による切断の修復用鋳型として働く同伴する外来性核酸に含まれる配列又は多型が組み込まれる。この鋳型駆動型の修復は、染色体を変化させるのに有用なプロセスであり、細胞染色体に有効な変化を提供する。
【００４０】
用語の外来性核酸は、その核酸が天然で細胞中にある核酸配列と同じであるか、それとも異なるかに関わらず、細胞又は胚に加えられる核酸を意味する。用語の核酸又は核酸断片又は核酸配列は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの一部分が含まれる。細胞又は胚は、例えば、家畜、偶蹄類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、及び魚からなる群から選択され得る。用語の家畜は、食品又は生物学的材料用の商品として育てられる家畜化された動物を意味する。用語の偶蹄類は、各足に通常２本又は時に４本のこともある偶数の指を有する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄の哺乳動物を意味し、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、及びヤギが含まれる。
【００４１】
一部の実施形態は、遺伝子修飾された家畜及び／又は偶蹄類を作製する組成物又は方法を含み、これは、家畜及び／又は偶蹄類の細胞又は胚にＴＡＬＥＮ対を導入するステップであって、それにより細胞又は胚のＤＮＡに対してＴＡＬＥＮ対が特異的に結合する部位に遺伝子修飾を作製するステップと、その細胞から家畜動物／偶蹄類を産生するステップとを含む。細胞又は胚に対しては、例えば接合子、胚盤胞、又は胚への直接注入が用いられ得る。或いは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又はベクターを導入するための多くの公知の技法のいずれかを用いてＴＡＬＥＮ及び／又は他の因子が細胞に導入されてもよい。遺伝子修飾動物は胚又は細胞から、公知の方法、例えば妊娠宿主への胚の移植、又は様々なクローニング法によって作製され得る。語句「細胞のＤＮＡに対する、ＴＡＬＥＮが特異的に結合する部位での遺伝子修飾」などは、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合するとＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼによって切断される部位に遺伝子修飾が作製されることを意味する。ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮ対が結合するところを正確に切断するのでなく、むしろ２つの結合部位の間にある規定の部位で切断する。
【００４２】
一部の実施形態は、動物のクローニングに使用される細胞の組成物又は処理を含む。細胞は、家畜及び／又は偶蹄類細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、又は幹細胞であってもよい。例えば、実施形態は、遺伝子修飾を生じさせる組成物又は方法であり、これは、培養物中の複数の初代細胞を、ＴＡＬＥＮタンパク質又は１つ若しくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露するステップを含む。ＴＡＬＥＮは、タンパク質として導入されるか、又は核酸断片として導入され、例えばベクター中のｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列によりコードされ得る。
【００４３】
細胞の遺伝子修飾には、レポーターの挿入も含まれ得る。レポーターは、例えば、蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質であってもよい。レポーターは、選択マーカー、例えば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（ｎｅｏ）、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、又はキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＸＧＰＲＴ）であってもよい。レポーター、選択マーカー、及び／又は１つ以上のＴＡＬＥＮ用のベクターは、例えば本明細書に詳述されるとおりの、プラスミド、トランスポゾン、トランスポザーゼ、ウイルス、又は他のベクターであってもよい。
【００４４】
ＴＡＬＥＮは複数のＤＮＡ部位を指向し得る。これらの部位は、数千個又は何千個もの塩基対によって隔てられているものであり得る。ＤＮＡは細胞機構により再結合することができ、それにより、それらの部位の間にある領域全体の欠失が生じ得る。実施形態は、例えば、１〜５メガベース又は染色体の５０％〜８０％、又は約１００〜約１，０００，０００塩基対の距離を隔たっている部位を含む；当業者は、明示的に記載される範囲内にあるあらゆる範囲及び値、例えば、約１，０００〜約１０，０００塩基対又は約５００〜約５００，０００塩基対が企図されることを直ちに理解するであろう。或いは、外来性ＤＮＡの挿入のため、又は部位間のＤＮＡの鋳型駆動型修復のため、外来性ＤＮＡが細胞又は胚に加えられてもよい。複数の部位における修飾を用いることで、遺伝子修飾された細胞、胚、偶蹄類、及び家畜を作製し得る。
【００４５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合することにより生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが複合的なゲノム内にあるユニーク配列を標的化することが可能になる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを改変することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において用いられ得る。
【００４６】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは約３０アミノ酸を有し、安定な構造に折り畳まれている。各フィンガーは主としてＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。鍵となる位置にあるアミノ酸残基が、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸を、残りのアミノ酸を維持して必要な構造を保ちながら変化させることができる。いくつかのドメインをタンデムに連結することにより、さらに長いＤＮＡ配列との結合が達成される。非特異的ＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）及びメチラーゼ（Ｍ）などの他の機能をＺＦＰと融合させて、それぞれのＺＦＮ、ジンクフィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ、及びジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子修飾動物の作製にジンクフィンガー及びジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料及び方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１００２３１５９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１０２８１３０６号明細書に記載される。
【００４７】
クラスターを形成する規則的に間隔が置かれた短いパリンドロームリピート
クラスターを形成する規則的に間隔が置かれた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）は、細菌／古細菌適応免疫防御から誘導される。ＣＲＩＳＰＲ活性には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への侵入ウイルス又はプラスミドＤＮＡからの「スペーサー」の組込み、スペーサー−リピート単位からなる低分子ガイドＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現及びプロセシング、並びにスペーサーと相補的な核酸の切断が関わる。ヌクレアーゼＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡと一致する配列を探して切断する。正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が３’末端にも存在する場合にのみ、Ｃａｓ９はＤＮＡを切断する。ゲノム操作ツールとして、ｇＲＮＡ指向性Ｃａｓ９切断の特異性は極めて有用である。
【００４８】
例えば、ＤｉＣａｒｌｏら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（５）（２０１３））は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成要素のＣａｓ９遺伝子及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を標的化するデザイナーゲノムが、酵母の標的化された内在性ゲノム遺伝子座においてロバストで特異的なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ活性を示したことを報告した。構成的Ｃａｓ９発現及び一過性のｇＲＮＡカセットを使用すると、標的化された二本鎖切断により、一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの相同組換え比率がそれぞれ５倍及び１３０倍に増加したことが示された。加えて、Ｃａｓ９を構成的に発現する細胞におけるｇＲＮＡプラスミド及びドナーＤＮＡの同時形質転換により、ドナーＤＮＡ組換え頻度がほぼ１００％になった。用語ＣＲＩＳＰＲは、本明細書では、これらの技術を用いる遺伝子操作ツールを指して使用される。
【００４９】
またＣｏｎｇらが、ＣＲＩＳＰＲ系及び関連するＣａｓ９ヌクレアーゼを低分子ＲＮＡに指向させることにより、ヒト及びマウス細胞において内在性ゲノム遺伝子座に正確な切断を誘導できたことを報告した。Ｃａｓ９はまたニッキング酵素にも変換され、最小限の変異原活性による相同性指向型修復を促進した。最後に、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることが可能で、哺乳類ゲノム内のいくつかの部位を同時にエディティングすることが可能であったことから、ＣＲＩＳＰＲ技術が容易にプログラム可能であること、及び幅広い適用性を有することが実証された。
【００５０】
ベクター及び核酸
ノックアウトを目的として、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、又は他の目的で、様々な核酸が偶蹄類細胞又は他の細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語の核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似体、及び二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）である核酸が含まれる。核酸類似体を塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することにより、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度が向上し得る。塩基部分の修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、並びにデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジン及び５−ブロモ−２’−ドキシシチジン（ｄｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）が含まれる。糖部分の修飾には、２’−Ｏ−メチル糖又は２’−Ｏ−アリル糖を形成するリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾が含まれる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸か、又はデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格によって置換されており、且つ４塩基が維持されているペプチド核酸が生じるように修飾することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７；及びＨｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照のこと。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）、又はアルキルリン酸トリエステル骨格で置換することができる。
【００５１】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域はブタ調節領域であってもよく、又は他の種由来であってもよい。本明細書で使用されるとき、作動可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にし又は促進するような方法で調節領域を核酸配列に対して位置させることを指す。
【００５２】
任意の種類のプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定なしに、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び特定の刺激に応答性又は非応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写物の選択発現をもたらすことができ、例えばヒトインスリンプロモーターが含まれる。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝実質細胞又は心臓組織における選択発現をもたらすことができ、それぞれアルブミン又はαミオシン重鎖プロモーターが含まれ得る。他の実施形態では、顕著な組織特異性又は時間的特異性のない核酸分子の発現を促進するプロモーターが用いられ得る（即ち、構成的プロモーター）。例えば、β−アクチンプロモーター、例えばニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧｓプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、又は３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用し得るとともに、ウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターも使用し得る。一部の実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Ｘｕら（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３；及びＫｉｗａｋｉら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照のこと。
【００５３】
誘導性プロモーターの例は、核酸の転写調節に使用することのできるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−オンプロモーター系である。この系では、変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）が単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインと融合され、テトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）が作り出され、これはｔｅｔ又はドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって調節される。抗生物質の非存在下では転写は最小限である一方、ｔｅｔ又はｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性の系としては、エクジソン系又はラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは昆虫脱皮ホルモンであり、その産生は、エクジソン受容体とウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物とのヘテロ二量体によって制御される。発現は、エクジソン又はムリステロンＡなどのエクジソンの類似体で処理することにより誘導される。誘導性系を惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【００５４】
核酸コンストラクトにおいて有用となり得るさらなる調節領域としては、限定はされないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、又はイントロンが挙げられる。かかる調節領域は必須ではないが、ｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことにより発現を増加させ得る。かかる調節領域を必要に応じて核酸コンストラクトに含めることで、細胞における核酸の最適な発現を達成することができる。しかしながら、かかる追加的なエレメントなしに十分な発現が達成されることもある。
【００５５】
シグナルペプチド又は選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトが用いられ得る。シグナルペプチドを使用して、コードされるポリペプチドが特定の細胞部位（例えば細胞表面）を指向するようにし得る。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（ｎｅｏ）、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。かかるマーカーは、培養下で安定な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００５６】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列には、例えばＣｒｅ又はＦｌｐなどの、リコンビナーゼ認識配列が隣接し得る。例えば、選択可能なマーカーにはｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される３４ｂｐの認識部位）又はＦＲＴ認識部位が隣接してもよく、これによりコンストラクトからその選択可能なマーカーを切り出すことができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術のレビューに関するＯｒｂａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、及びＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照のこと。選択可能なマーカー遺伝子によって分断されたＣｒｅ活性化可能又はＦｌｐ活性化可能導入遺伝子を含むトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を含むトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子のプロモーター駆動発現は、遍在性であっても、或いは組織特異的であってもよく、これがＦ０動物（例えばブタ）においてマーカーの遍在的又は組織特異的発現をもたらし得る。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカーで分断された導入遺伝子を遍在的に発現するブタを、Ｃｒｅ又はＦｌｐを組織特異的な形で発現するブタと交配することによるか、又はマーカーで分断された導入遺伝子を組織特異的な形で発現するブタを、Ｃｒｅ又はＦｌｐリコンビナーゼを遍在的に発現するブタと交配することにより達成され得る。導入遺伝子の制御された発現又はマーカーの制御された切り出しにより、導入遺伝子の発現が可能となる。
【００５７】
一部の実施形態では、外来性核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、続くコードされたポリペプチドの操作を容易にするように（例えば位置特定又は検出を容易にするように）設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列において、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかに位置するように挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００５８】
核酸コンストラクトは、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般には、核酸コンストラクトが緩衝液中３７℃でＳ−アデノシルメチオニン及びＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと共にインキュベートされ得る。コンストラクトを１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと共に３７℃で１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によってアッセイすることにより、過剰メチル化を確認することができる。
【００５９】
核酸コンストラクトは、例えば、卵母細胞又は卵などの生殖細胞、前駆細胞、成体又は胚性幹細胞、始原生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎細胞、膵島細胞、β細胞、肝細胞、又は皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞を含めた任意の種類の胚、胎仔、又は成体偶蹄類細胞に、様々な技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞を感染させることのできる組換えウイルス、又はリポソームの使用、又は核酸を細胞に送達する能力を有する他の非ウイルス性の方法、例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、若しくはリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。
【００６０】
トランスポゾン系では、核酸コンストラクトの転写単位、即ち外来性核酸配列に作動可能に連結された調節領域に、トランスポゾンの逆方向反復が隣接する。いくつかのトランスポゾン系、例えば、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（米国特許第６，６１３，７５２号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照）；フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）（Ｍｉｓｋｅｙら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；ミノス（Ｍｉｎｏｓ）（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓら（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙら（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；及びパスポート（Ｐａｓｓｐｏｒｔ）が、マウス、ヒト、及びブタ細胞を含め、細胞に核酸を導入するために開発されている。スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンは特に有用である。トランスポザーゼは、同じ核酸コンストラクトで外来性核酸としてコードされるタンパク質として送達されてもよく、別個の核酸コンストラクトに導入されてもよく、又はｍＲＮＡ（例えば、インビトロで転写及びキャッピングされるｍＲＮＡ）として提供されてもよい。
【００６１】
外来性核酸の発現を維持し、且つ宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するため、インスレーターエレメントもまた核酸コンストラクトに含めることができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照のこと。典型的には、インスレーターエレメントは転写単位の両側に隣接し、トランスポゾンの逆方向反復に対して内側にある。インスレーターエレメントの非限定的な例としては、マトリクス付着領域（ＭＡＲ）型インスレーターエレメント及び境界型インスレーターエレメントが挙げられる。例えば、米国特許第６，３９５，５４９号明細書、同第５，７３１，１７８号明細書、同第６，１００，４４８号明細書、及び同第５，６１０，０５３号明細書、及び米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照のこと。
【００６２】
核酸はベクターに組み込まれ得る。ベクターは、担体から標的ＤＮＡに移るように設計された任意の特異的なＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、又はベクター系と称されることもあり、これは、ゲノム又は他の標的とされるＤＮＡ配列、例えばエピソーム、プラスミド、又はさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントへのＤＮＡ挿入をもたらすのに必要な一組の構成要素である。動物における遺伝子デリバリーに使用されるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス及び組込みファージウイルス）、及び非ウイルスベクター（例えばトランスポゾン）は、２つの基本的な構成要素を有する：１）ＤＮＡ（又はｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）を含むベクター、及び２）トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、又はその他の、ベクター及びＤＮＡ標的配列の両方を認識し且つ標的ＤＮＡ配列にベクターを挿入するインテグラーゼ酵素。ベクターは、ほとんどの場合に、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含み、ここで発現制御配列は、別のＤＮＡ配列又はｍＲＮＡのそれぞれ転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【００６３】
多くの異なる種類のベクターが知られている。例えば、プラスミド及びウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターが知られている。哺乳類発現プラスミドは、典型的には複製起点、好適なプロモーター及び任意選択のエンハンサーを有し、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列も有する。ベクターの例としては、プラスミド（これはまた、別の種類のベクターの担体にもなり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、修飾ＨＩＶ−１、ＳＩＶ又はＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶ又はＭｏＭＬＶ）、及びトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ））が挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語の核酸は、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成の（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、並びに天然に存在する及び化学的に修飾された核酸、例えば、合成塩基又は代替的な骨格を含めた、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指す。核酸分子は二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）であってよい。用語のトランスジェニックは、本明細書では広義に使用され、遺伝子操作技術を使用して遺伝物質が改変されている遺伝子修飾された生物又は遺伝子操作された生物を指す。従って、ノックアウト偶蹄類は、外来性遺伝子又は核酸が動物又はその子孫で発現するか否かに関わらず、トランスジェニックである。
【００６５】
遺伝子修飾動物
動物は、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、又はリコンビナーゼ融合タンパク質、若しくは公知の様々なベクターを含む他の遺伝子操作ツールを使用して修飾され得る。動物を遺伝子修飾する材料及び方法は、２００９年１１月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１２／０２２２１４３号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２２００３７号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／０２５１３９５号明細書（これらは、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される）にさらに詳述される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。用語のトランス作用性は、異なる分子から標的遺伝子に（即ち分子間で）作用する過程を指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含むＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（又はマイクロＲＮＡ又は他の拡散性分子）をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同じ染色体上にあってもよいが、活性は、中間タンパク質又はそれをコードするＲＮＡを介する。ドミナントネガティブを用いた遺伝子の不活性化には、概して、トランス作用エレメントが関わる。用語のシス調節又はシス作用は、タンパク質又はＲＮＡをコードしない作用を意味する；遺伝子不活性化との関連において、これは概して、遺伝子のコード部分、又は機能性遺伝子の発現に必要なプロモーター及び／又はオペレーターの不活性化を意味する。
【００６６】
当該技術分野において公知の様々な技法を用いて核酸コンストラクトを動物に導入することにより、創始動物を産生して動物系統を作製することができ、核酸コンストラクト（又は遺伝子のノックアウト）がゲノムに組み込まれる。かかる技法には、限定なしに、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１）、胚の電気穿孔（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、及び体細胞、例えば卵丘若しくは乳腺細胞、又は成体、胎仔、若しくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換と、続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０−８１３；及びＷａｋａｙａｍａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４）が含まれる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、及び体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム修飾されている動物は、その生殖系列細胞を含め、その細胞の全てが遺伝子修飾を有する動物である。その遺伝子修飾がモザイクである動物を産生する方法が用いられる場合、動物は同系交配されてもよく、ゲノム修飾されている子孫が選択され得る。例えば、その細胞が胚盤胞期に修飾される場合、モザイク動物の作製にクローニングが用いられてもよく、又は単一の細胞が修飾されるときにはゲノム修飾が行われ得る。修飾されており、従って性的に成熟しない動物は、用いられる具体的な手法に応じて、修飾に関してホモ接合体又はヘテロ接合体であってよい。特定の遺伝子がノックアウト修飾により不活性化される場合、通常はホモ接合性が必要となり得る。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉又はドミナントネガティブ戦略により不活性化される場合、ヘテロ接合性が適していることが多い。
【００６７】
典型的には、前核マイクロインジェクションでは、核酸コンストラクトが受精卵に導入される；精子頭部及び卵からの遺伝物質を含む前核が原形質内に見えることに伴い、１つ又は２つの細胞受精卵が使用される。前核期受精卵はインビトロ又はインビボ（即ち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）で得ることができる。インビトロ受精卵は、以下のとおり産生することができる。例えば、屠殺場でブタ卵巣を収集し、輸送中は２２〜２８℃に維持することができる。卵巣を洗浄し、卵胞吸引のため単離することができ、及び４〜８ｍｍの範囲の卵胞を、１８ゲージ針を使用して、且つ真空下で、５０ｍＬコニカル遠心管に吸引することができる。卵胞液及び吸引された卵母細胞を、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）を含むプレフィルターに通してリンスすることができる。卵丘の凝集塊に取り囲まれた卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬシステイン、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、１０％ブタ卵胞液、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｃＡＭＰ、各１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を補足したＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ、Ｖｅｒｏｎａ、ＷＩ）に、３８．７℃及び５％ＣＯ２の加湿空気下約２２時間置くことができる。続いて、卵母細胞を新鮮なＴＣＭ−１９９成熟培地に移し（この培地はｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ又はｈＣＧを含まない）、さらに２２時間インキュベートすることができる。０．１％ヒアルロニダーゼ中で１分間ボルテックスすることにより、成熟卵母細胞をその卵丘細胞から剥がし取ることができる。
【００６８】
ブタについては、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ５ウェル受精用ディッシュ中の５００μｌ  Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）において受精させることができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）に備え、採取したばかりの又は凍結された雄ブタ精液を洗浄し、４×１０５精子となるようにＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地に再懸濁することができる。コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によって精子濃度を分析することができる。最終的なインビトロ授精を、雄ブタに応じて、１０μｌ容量において約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度で実施することができる。全ての受精卵母細胞を、５．０％ＣＯ２雰囲気下３８．７℃で６時間インキュベートする。授精６時間後、予定接合子をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地中に移すことができる。この系は、１０〜３０％の多精子受精率で、ほとんどの雄ブタにわたり常に２０〜３０％の胚盤胞を産生することができる。
【００６９】
線状化した核酸コンストラクトを前核の１つに注入することができる。次に、注入された卵をレシピエント雌に（例えばレシピエント雌の卵管内に）移植し、レシピエント雌において発育させてトランスジェニック動物を産生することができる。詳細には、インビトロ受精胚を１５，０００×ｇで５分間遠心して脂質を沈降させ、前核の可視化を可能にすることができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注入器を使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚分割及び胚盤胞形成の速度及び質を記録することができる。
【００７０】
胚は、非同期レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、１００〜２００個（例えば１５０〜２００個）の胚を、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して卵管の膨大部−峡部接合部に置くことができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
【００７１】
体細胞核移植では、上記に記載する核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄類細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞又はウシ細胞）、例えば、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、又は顆粒膜細胞を除核卵母細胞に導入し、複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍で部分的に透明帯を切開し、次に切開範囲で細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭く斜めに切られた先端を有する注入ピペットを使用して、第２減数分裂で停止した除核卵母細胞にトランスジェニック細胞を注入する。ある種の慣例では、第２減数分裂で停止した卵母細胞が卵と呼ばれる。ブタ又はウシ胚の産生後（例えば、卵母細胞を融合して活性化させることによる）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１２５６−１２５８及び米国特許第６，５４８，７４１号明細書を参照のこと。ブタについては、レシピエント雌は、胚移植後約２０〜２１日で妊娠を検査することができる。他の家畜も同等のプロセスを有する。
【００７２】
標準的な育種技法を用いることにより、最初のヘテロ接合体創始動物から、外来性核酸に関してホモ接合体の動物を作出することができる。しかしながらホモ接合性が必須でないこともある。本明細書に記載される修飾動物ブタを、目的の他の動物と繁殖させることができる。
【００７３】
一部の実施形態では、目的の核酸及び選択可能なマーカーを別個のトランスポゾンに提供し、胚又は細胞のいずれかに等量ではなしに提供することができ、ここで選択可能なマーカーを含むトランスポゾンの量は、目的の核酸を含むトランスポゾンよりはるかに過剰（５〜１０倍過剰）である。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞又は動物は、選択可能なマーカーの存在及び発現に基づき単離することができる。トランスポゾンは正確な且つ関係付けのない形でゲノムに組み込まれるため（独立した転移イベント）、目的の核酸と選択可能なマーカーとが遺伝的に関係付けられることはなく、標準的な育種を用いた遺伝的分離によって容易に分けることができる。従って、公衆安全の観点からある種懸念される問題である、後続の世代における選択可能なマーカーの保持に制約されないトランスジェニック動物を産生することができる。
【００７４】
トランスジェニック動物の生成後、標準的な技法を用いて外来性核酸の発現を評価することができる。初期スクリーニングは、サザンブロット解析によってコンストラクトの組込みが行われたかどうかを決定することにより達成することができる。サザン解析の説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹの第９．３７〜９．５２節を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法もまた初期スクリーニングにおいて用いることができる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅する手法又は技法を指す。一般には、目的の領域の末端又はその外側からの配列情報を用いることにより、配列が増幅しようとする鋳型の逆ストランドと同一の又は類似したオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。ＰＣＲを使用すると、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡの配列を含め、ＤＮＡ並びにＲＮＡの特定の配列を増幅することができる。プライマーは、典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長にも及び得る。ＰＣＲについては、例えばＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載される。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製法、又は核酸配列ベース増幅によって増幅することもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２，１；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；及びＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２を参照のこと。胚盤胞期には、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション及びスプリンカレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲによる分析のために、胚を個別に処理することができる（例えば、ＤｕｐｕｙらＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照のこと）。
【００７５】
トランスジェニック動物の組織においてポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から採取した組織試料のノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、酵素結合免疫吸着アッセイなどのイムノアッセイ、及び逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技法を用いて評価することができる。
【００７６】
創始動物、動物系統、形質、及び繁殖
創始動物は、クローニング及び本明細書に記載される他の方法により産生され得る。創始動物は、接合子又は初代細胞がホモ接合性の修飾を受ける場合のように、遺伝子修飾に関してホモ接合体であり得る。同様に、ヘテロ接合体の創始動物もまた作製され得る。創始動物はゲノム修飾されていてもよく、即ち、そのゲノムにおける細胞の全てが修飾を受けていてもよい。創始動物は、ベクターが胚における複数の細胞のうちの１つに、典型的には胚盤胞期に導入されたときに起こり得るように、修飾に関してモザイクであってもよい。モザイク動物の子孫を試験することにより、ゲノム修飾されている子孫を同定し得る。有性生殖することができる、又は生殖補助技術により生殖できる動物であって、異種又はホモ接合体の子孫が一貫して修飾を発現する動物のプールが作り出されたとき、動物系統が樹立される。
【００７７】
家畜においては、多くの対立遺伝子が、生産形質、体型形質、作業性）形質、及び他の機能形質などの様々な形質に関係付けられることが知られている。当業者は、これらの形質を観察し及び定量化することに慣れているであろう、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒら，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、繁殖形質、母性形質、及び耐病性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質には、組換え遺伝子産物の発現が含まれる。
【００７８】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、１つ又は複数のＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーヌクレアーゼをリコンビナーゼ又はＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質と共に投与することを含む。実施形態はまた、リコンビナーゼ融合タンパク質、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書にあるとおりのＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合物の投与により、細胞染色体に二本鎖切断を作成することも含む。
【００７９】
リコンビナーゼは核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見つけ出す。ＴＡＬＥＮ−リコンビナーゼ実施形態の実施形態は、リコンビナーゼを、鋳型として働く核酸配列と組み合わせることを含む。鋳型配列は、ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬＥＮ対による切断の標的となる部位と実質的な相同性を有する。本明細書に記載されるとおり、鋳型配列は、対立遺伝子の配置、インデルの作成、外来性ＤＮＡの挿入により、又は他の変化を伴い、天然ＤＮＡに変化を提供する。ＴＡＬＥＮは細胞又は胚に、本明細書に記載される方法によってタンパク質、ｍＲＮＡとして置かれるか、又はベクターを使用することにより置かれる。リコンビナーゼは鋳型配列と組み合わさってフィラメントを形成し、細胞内に置かれる。リコンビナーゼ及び／又はリコンビナーゼと組み合わさる鋳型配列は、細胞又は胚に、タンパク質、ｍＲＮＡとして置かれても、又はリコンビナーゼをコードするベクターで置かれてもよい。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書の開示が、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。用語のリコンビナーゼは、細胞において、２つの比較的長いＤＮＡ鎖の間における比較的短いＤＮＡ断片の接合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼには、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、及びＦＬＰが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ切断及び組換えの開始を活性部位セリンに頼るＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断の修復を助けるＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡ及び酵母Ｒａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは実験用酵素であり、実験室試験において、ＨＩＶにより挿入されたＤＮＡを感染細胞から取り除くことに成功している。この酵素は、ＨＩＶマーカー（これはｌｏｘＰ部位が結合せず、従ってＣｒｅ−Ｌｏｘ組換えの試みを許容しない）の同定を目的として、選択的突然変異によりＣｒｅリコンビナーゼから誘導された。ＦＬＰは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドから誘導されるフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰ又はＦｌｐ）を指す。
【００８０】
同様にリコンビナーゼ活性をプロセシングするＲｅｃＡの真核生物相同体が、Ｒａｄ５１タンパク質であり、最初は酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において同定された。Ｂｉｓｈｏｐら，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９−５６及びＳｈｉｎｏｈａｒａら，（１９９２）Ｃｅｌｌ：４５７−７０  Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７２，３２２４−３２３４．  Ｂａｓｉｌｅら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３２３５−３２４６。植物Ｒａｄ５１配列については、米国特許第６，５４１，６８４号明細書；同第６，７２０，４７８号明細書；同第６，９０５，８５７号明細書及び同第７，０３４，１１７号明細書に記載される。ＲｅｃＡと相同な別の酵母タンパク質は、Ｄｍｃ１タンパク質である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）以外の生物におけるＲｅｃＡ／Ｒａｄ５１相同体について記載されている。Ｍｏｒｉｔａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６５７７−６５８０；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４：２３９−２４３；Ｈｅｙｅｒ（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２２３−２３３；Ｍａｅｓｈｉｍａら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６０：１９５−２００；米国特許第６，５４１，６８４号明細書及び同第６，９０５，８５７号明細書。
【００８１】
本明細書では、「ＲｅｃＡ」又は「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる続く伸長のため、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをその相同標的上に適切に位置決めする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のため、二重鎖核酸のトポロジーを調製する能力；及び、（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチド又はＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を見つけ出してそれと結合する能力、のうちの本質的に全て又はほとんどを備えるＲｅｃＡ様組換えタンパク質を指す。最も良く特徴付けられているＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものである；このタンパク質の当初の対立形質に加え、いくつかの変異ＲｅｃＡ様タンパク質、例えばＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物が、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、及び植物を含めて、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質には、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２及びＤＭＣ１が含まれる。組換えタンパク質の実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。或いは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌供給源由来のＲｅｃＡタンパク質又は別の生物由来の相同組換えタンパク質であってもよい。
【００８２】
核タンパク質フィラメント、又は「フィラメント」が形成されてもよい。用語のフィラメントは、リコンビナーゼとの構造の形成に関連して、当該技術分野の当業者に知られている用語である。次にそのように形成された核タンパク質フィラメントを、例えば、別の核酸と接触させるか又は細胞に導入することができる。核タンパク質フィラメントであって、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列と核酸とを含むフィラメントの形成方法は、当該技術分野において周知されている。例えば、Ｃｕｉら（２００３）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７４−１８４及び米国特許第４，８８８，２７４号明細書；同第５，７６３，２４０号明細書；同第５，９４８，６５３号明細書及び同第７，１９９，２８１号明細書を参照のこと（これらの開示は、リコンビナーゼを核酸と結合させて核タンパク質フィラメントを形成する例示的な技法を開示する目的で、参照により援用される）。
【００８３】
一般に、リコンビナーゼ活性を有する分子は、線状の一本鎖核酸に接触される。線状の一本鎖核酸はプローブであってもよい。かかる一本鎖核酸の調製方法は公知である。反応混合物は、典型的にはマグネシウムイオンを含有する。場合により、反応混合物は緩衝され、場合によりまたＡＴＰ、ｄＡＴＰ又は非加水分解性ＡＴＰ類似体、例えばγ−チオ−ＡＴＰ（ＡＴＰ−γ−Ｓ）又はγ−チオ−ＧＴＰ（ＧＴＰ−γ−Ｓ）も含有する。反応混合物はまた、場合によりＡＴＰ生成系も含有する。二本鎖ＤＮＡ分子を、フィラメント形成の前に、或いはその最中に、（例えば、熱又はアルカリによって）変性させることができる。リコンビナーゼと核酸とのモル比の最適化は、当該分野の技術の範囲内である。例えば、種々のリコンビナーゼ濃度の系列を一定量の核酸に添加することができ、アガロース又はアクリルアミドゲルにおける移動度によってフィラメント形成をアッセイすることができる。結合したタンパク質がポリヌクレオチドの電気泳動移動度を減速させるため、核酸移動度の減速によってフィラメント形成が明らかとなる。移動度の減速に伴う最大減速度、又は最大核酸移動量のいずれかを使用して、最適なリコンビナーゼ：核酸比を指示することができる。タンパク質−ＤＮＡ会合もまた、ポリヌクレオチドがニトロセルロースに結合する能力を測定することにより定量化できる。
【００８４】
ポリペプチド
ある場合には、ペプチドと本明細書に示される配列との同一性パーセントの決定が必要となり得る。そのような場合、同一性パーセントは、ペプチド、又はペプチドの一部分の残基の数の点で計測される。例えば９０％の同一性のポリペプチドが、より大きいペプチドの一部分であることもあり得る。実施形態には、本明細書に示される配列の指示される同一性及び／又は保存的置換を有するかかるポリペプチドが含まれる。
【００８５】
単離されているという用語は、ポリペプチドに関連して本明細書で使用されるとき、天然に存在しない対応物を有するか（例えば、ペプチドミメティクス）、又は化学的に合成された、従って実質的に他のポリペプチドに汚染されていないか、又は天然では共存するほとんどの細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、又は細胞成分から分離又は精製されたポリペプチドを指す。
【００８６】
研究ツール及び調査
本明細書における細胞及び胚の修飾方法は、幅広い研究ツールに適用することができる。細胞又は胚それ自体もまた、研究に有用である。例えば、伝統的な育種プログラムは、しばしば、繁殖させる動物の遺伝子成分を理解することに多く頼っている。望ましい形質を有する動物は、品種育成のため繁殖される。これらの形質は、動物の遺伝子及び遺伝子の組み合わせに大きく依存する。遺伝子を細胞又は胚に入れると、又はそれらの遺伝子を修飾すると、遺伝子がどのように相互作用して目的とする形質を生み出すかに関する価値ある情報が提供される。細胞又は胚は好適な時間にわたり培養され、次に試験され得る。胚は、任意の意味のある発生段階に達する前に破壊されるが、それにもかかわらず有用な洞察を提供する。
【００８７】
１．本明細書に記載される修飾に関して細胞又は動物をスクリーニングするためのスクリーニングテストを提供する。明らかなことだが、スクリーニングした生物の条件を理解することは、研究プロセスの次のステップを決定するのに有用である。さらに、口蹄疫に曝露された群れの場合、群れの中のどの動物が遺伝的に疾患に対して抵抗性であるか、及びどれが抵抗性でないかを知ることが有用である。スクリーニングは、例えばＤＮＡを調べること、又はプロテアーゼ抵抗性ｅＩＦ４Ｇタンパク質の存在について調べることを含み得る。ある実施形態は、口蹄疫に対する抵抗性の存在をスクリーニングする試験又は方法であり、これは、修飾ｅＩＦ４Ｇ遺伝子及び／又は修飾ｅＩＦ４Ｇタンパク質を含むかどうかを決定するため細胞、胚、又は動物を調べるステップを含む。例えば、細胞、又は生物の１つ以上の細胞を破壊して、前記遺伝子又は前記タンパク質、又はその両方の発現を決定することができる。
【００８８】
参考文献
以下の参考文献は、全て本明細書によって参照により本明細書に援用される。本書に示される特許及び特許出願もまた、本明細書によって参照により本明細書に援用される。矛盾が生じた場合には、本明細書が優先する。１．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｉｎ  ２００１．  Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．，  ２００２．  ２１：  ｐ．  ６５７−６８７．  ２．  Ｇｒｕｂｍａｎ，  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂ．  Ｂａｘｔ，  Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ２００４．  １７：  ｐ．  ４６５−４９３．  ３．  Ｃａｏ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９９５．  ６９：  ｐ．  ５６０−５６３．  ４．  Ｇｌａｓｅｒ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｔ．  Ｓｋｅｒｎ，  Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｅＩＦ４Ｇ  ｂｙ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  Ｌ  ａｎｄ  ２Ａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２０００．  ４８０：  ｐ．  １５１−１５５．  ５．  Ｇｒａｄｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４ＧＩＩ  ｗｉｔｈｉｎ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ−ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００４．  ７８：  ｐ．  ３２７１−３２７８．  ６．  ｎｔｏｎ，  Ｔ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅＩＦ４Ｇ．  Ｊ．  ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７．  ２８２：  ｐ．  １６９５−１７０８．  ７．  Ａｉｔｋｅｎ，  Ｃ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｌｏｒｓｃｈ，  Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｓｔｒｕｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０１２．  １９：  ｐ．  ５６８−５７６．  ８．  Ｋｅｒｅｋａｔｔｅ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ２Ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：  ａｎｏｔｈｅｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｈｏｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｈｕｔｏｆｆ？  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９９９．  ７３：  ｐ．  ７０９−７１７．  ９．  Ｆｏｅｇｅｒ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａ���ｅ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｔｏ  ｅＩＦ４ＧＩ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．，  ２００５．  ２７２：  ｐ．  ２６０２−２６１１．  １０．  Ｐｒｅｖｏｔ，  Ｄ．，  Ｊ．Ｌ．  Ｄａｒｌｉｘ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｏｈｌｍａｎｎ，  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅＩＦ４Ｇ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．，  ２００３．  ９５：  ｐ．  １４１−１５６．  １１．  Ｌｌｏｙｄ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，  ２００６．  １１９：  ｐ．  ７６−８８．  １２．  Ｔｒｕｎｉｇｅｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．  Ａｒａｎｄａ，  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ａｄｖ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，  ２００９．  ７５：  ｐ．  １２０−１５９．  １３．  ｄｅ  ｌｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｔ．，  Ｔｈｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００６．  ８０：  ｐ．  １９０６−１９１４．  １４．  Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｖｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｄｅｌａｙｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２０１２．  ８６：  ｐ．  ４４７７−４４８７．  １５．  Ｗａｎｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ａｃｔｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２０１１．  ８５：  ｐ．  ３７５８−３７６６．  １６．  Ｗａｎｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｓＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３／７  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  ２０１０．  ３９９：  ｐ．  ７２−７８．  １７．  ｄｅ  ｌｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｔ．，  Ｆ．  Ｄｉａｚ−Ｓａｎ  Ｓｅｇｕｎｄｏ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｇｒｕｂｍａｎ，  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００７．  ８１：  ｐ．  １２８０３−１２８１５．  １８．  Ｂｏｒｍａｎ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｌＦ４Ｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｐｐｅｄ，  ｕｎｃａｐｐｅｄ，  ａｎｄ  ＩＲＥＳ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍＲＮＡｓ．  ＲＮＡ，  １９９７．  ３：  ｐ．  １８６−１９６．  １９．  Ｚｈａｏ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅＩＦ４Ｇ−１  ｖａｒｉａｎｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ２Ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００３．  ２７８：  ｐ．  ４４４９−４４５７．  ２０．  Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｑｕｉｎｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｅ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ，  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅＩＦ４Ｇ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ  ＩＲＥＳ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  ＲＮＡ，  ２０００，  ６：  ｐ．  １３８０−１３９２．  ２１．  Ｓａｌｅｈ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４Ｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００１．  ８２：  ｐ．  ７５７−７６３．  ２２．  Ｈｉｎｔｏｎ，  Ｔ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ  ａｎｄ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００２．  ８３：  ｐ．  ３１１１−３１２１．  ２３．  Ｂｅｌｓｈａｍ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｇ．Ｍ．  ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，  ａｎｄ  Ｎ．  Ｒｏｓｓ−Ｓｍｉｔｈ，  Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｅＩＦ４Ａ  ａｎｄ  ｅＩＦ４Ｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２０００．  ７４：  ｐ．  ２７２−２８０．  ２４．  Ｓｔｒｏｎｇ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．  Ｂｅｌｓｈａｍ，  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４ＧＩ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３Ｃｐｒｏ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖ���ｒｏｌ．，  ２００４．  ８５：  ｐ．  ２９５３−２９６２．  ２５．  Ｐｉｃｃｏｎｅ，  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １９９５．  ６９：  ｐ．  ５３７２−５３８２．  ２６．  Ｍａｓｏｎ，  Ｐ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １９９７．  ２２７：  ｐ．  ９６−１０２．  ２７．  Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ，  Ｊ．，  Ｐ．Ｗ．  Ｍａｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｇｒｕｂｍａｎ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  ｂｙ  ｌｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｅａｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ１２  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １９９８．  １６：  ｐ．  １５１６−１５２２．  ２８．  Ｃｈｉｎｓａｎｇａｒａｍ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｋｏｓｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｇｒｕｂｍａｎ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ２００１．  ７５：  ｐ．  ５４９８−５５０３．  ２９．  Ｆａｂｉａｎ，  Ｍ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｎ．  Ｓｏｎｅ
ｎｂｅｒｇ，  Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：  ａ  ｌｏｏｋ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｈｏｏｄ  ｏｆ  ｍｉＲＩＳＣ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｓｔｒｕｃ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０１２．  １９：  ｐ．  ５８６−５９３．  ３０．  Ｄｒａｋｅ，  Ｊ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｍｏｎｇ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９９．  ９６：  ｐ．  １３９１０−１３９１３．  ３１．  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，  Ｊ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｋ．  Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ，  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｆｉｔｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．，  ２００５．  １：  ｐ．  ｅ１１．  ３２．  Ｆｒｅｉｓｔａｄｔ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｊ．Ａ．  Ｖａｃｃａｒｏ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．  Ｅｂｅｒｌｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｊ．，  ２００７．  ４：  ｐ．  ４４．  ３３．  Ｌｅｅ，  Ｓ．Ｗ．，  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｃａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２．  ３３７：  ｐ．  １８８．  ３４．  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｆ．，  Ｓ．Ｃ．  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｂ．  Ｈａｃｋｅｔｔ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｆｉｎｇｅｒｓ  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮｓ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ，  ２０１２．  １：  ｐ．  ｅ３．  ３５．  Ｔａｎ，  Ｓ．，  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ａｎｉｍａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ａｄｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０１２．  ８０：  ｐ．  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）．  ３６．  Ｌａｍｐｈｅａｒ，  Ｂ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ，  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｇ  ｒｅｎｄｅｒｓ  ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ２Ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９６．  ３５：  ｐ．  １５７２６−１５７３３．  ３７．  Ａ．Ｍ．  ＧＥＵＲＴＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｒａｔｓ  ｖｉａ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  ３２５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００９）．  ３８．  Ｉ．Ｄ．  ＣＡＲＢＥＲＹ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  １８６  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （２０１０）．  ３９．  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｊ．  Ｒ．  Ｇａｒｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  ”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉ���ｎ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｗｉｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（５）：  １１２５−１１３７．  ４０．  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｗ．  Ｔａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｉｎ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ．”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９（４３）：  １７３８２−１７３８７．  ４１．  Ｇｕｓｃｈｉｎ，  Ｄ．  Ｙ．，  Ａ．  Ｊ．  Ｗａｉｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  ”Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６４９：  ２４７−２５６．  Ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｌｓｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｅｒｅｉｎ：  ＵＳ  ２０１０／０１４６６５５，  ＵＳ  ２０１０／０１０５１４０，  ＵＳ  ２０１１／００５９１６０，  ＵＳ  ２０１１／０１９７２９０，  ＵＳ  ２０１０／０１４６６５５，  ＵＳ  ２０１１／０１９７２９０，  ＵＳ  ２０１２／０２２２１４３  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．  ６１／６６２，７６７
【実施例】
【００８９】
材料及び方法は、ＴＡＬＥＮの作製を含め、特に指示されない限り概して２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書に記載されるとおりである。これらのプロセスは、初代細胞において対立遺伝子を変化させるのに有効であることが実証されており、次にこの初代細胞を使用することにより、それらの対立遺伝子を有してその子孫に受け継ぐ遺伝子修飾された創始動物が作製される。
【００９０】
実施例１
図２を参照すると、ブタＥＩＦ４ＧＩの一部がパネルＡに示される。野生型配列はＬｐｒｏ切断部位（矢印）と比べてマイナス３位及び２位にアスパラギン及びロイシン残基を有する。この例では、ＨＤＲ鋳型がマイナス３位及び２位の残基をアスパラギン酸及びフェニルアラニンに置き換えることで、修飾ＥＩＦ４ＧＩをＬｐｒｏ切断に対して抵抗性にする。野生型ＥＩＦ４ＧＩを切断して相同組換えを刺激するように２対のＴＡＬＥＮ（上）を設計した。パネルＢ：各ＴＡＬＥＮ対をトランスフェクトしたブタ線維芽細胞のサーベイヤー（Ｃｅｌ−Ｉ）アッセイ。パネルＣ：相同組換え効率を決定するためのＲＦＬＰアッセイ。
【００９１】
初期継代（２代未満）の初代ブタ線維芽細胞においてトランスフェクションを実施した。トランスフェクションで使用するため７０〜９０％コンフルエンスで線維芽細胞を回収した。２マイクログラムのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ  ｓｓＥＩＦ４Ｇ１４．１又はｓｓＥＩＦ４Ｇ１４．２を、０．２ｎモルの９０ｍｅｒ相同オリゴヌクレオチド（５’−ｃｃｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｃｇｔｃｃｔｔｔｇｃｃｇａｃｔｔｃｇｇｃｃｇａｃｃａｇｃｃｃｔｔａｇｃ  ａａｃｃｇｔｇｇｇｃｃｃｃｃａａｇｇｇｇｔｇｇｇｃｃａｇｇｔｇｇｇｇａｇｃｔｇｃｃ）（配列番号１８）と共に、以下の設置でＮＥＯＮヌクレオフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して５００，０００個の線維芽細胞にトランスフェクトした：１パルス、１８００ｖ；２０ｍｓ幅及び１００μｌティップ。トランスフェクト細胞を３日間摂氏３０度で培養した後、サーベイヤーアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔａｎら２０１２）によりインデル解析を行い、ＥａｇＩを使用して定量ＲＦＰＬ解析を行った。産物を１０％ＰＡＧＥゲルで分離し、デンシトメトリーにより切断産物を測定する。Ｇｕｉｓｃｈｉｎら（Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｗａｉｔｅら２０１０）に記載されるとおりパーセントＮＨＥＪを計算したものを、以下に示す。パーセント相同組換えは、切断された産物の密度の合計を全産物の合計で除すことにより計算した。
【００９２】
将来、ＥＩＦ４ＧＩに対するさらなるＬｐｒｏ切断部位突然変異が同じ方法によって導入され得る。
【００９３】
実施例２
コロニー単離については、細胞を計数し、１〜２０細胞／ｃｍ２の密度範囲で１０ｃｍディッシュ上に播き得る。細胞は、直径３〜４ｍｍの個々のコロニーが存在するまで、１０〜１５日間培養し得る。個々のコロニーをｐ−２００ピペッターで穏やかな吸引下に吸引し、５００μｌの成長培地を含む２４ウェルプレートのウェルに吐き出し得る（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｇａｒｂｅら２０１１）。明確に画定されたコロニー（約１０〜３０／プレート）を含むプレートをコロニー吸引用に選択し、複数のコロニーから細胞が吸引される可能性を抑え得る。コロニーが２４ウェルディッシュにおいて７０〜９０パーセントコンフルエントに達したところで、ＲＦＰＬ分析用に一部を回収し、残りを凍結保存し得る。目的の特徴の獲得に成功したことが決定されたコロニーから細胞を取り出し、それをクローニングに使用して創始動物を作製し得る。
【００９４】
上記の具体的な実施形態は例示を目的とするもので、限定することは意図していない。さらなる実施形態が、本明細書に記載される広義の概念の範囲内にある。加えて、本発明は特定の実施形態に関連して記載されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく形態及び詳細に変更を加え得ることを認識するであろう。本明細書における文献の参照による援用はいずれも、本明細書の明示的な開示に反する主題が援用されないように限定される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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