(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光体（６）を有する試料（１２）の構造（１５）を空間的に高解像度で結像するための方法であって、
前記試料（１２）の測定領域（１３）内に、局所的最小値部（１４）を有する強度分布のルミネセンス阻止光（１０）が印加され、
前記試料（１２）の測定領域（１３）内に、蛍光体（６）を電子的基底状態（Ｓ０）から蛍光発光状態（Ｓ１）に励起するルミネセンス励起光（１）が印加され、
前記測定領域（１３）から検出されるルミネセンス光（２）が記録され、
当該記録されたルミネセンス光（２）が試料（１２）中の局所的最小値部（１４）の位置に割り当てられる、方法において、
前記蛍光体（６）の電子的基底状態（Ｓ０）をルミネセンス阻止光（１０）によって、前記蛍光体（６）が、妨害された電子的基底状態（Ｓ０）においては前記ルミネセンス励起光（１）に対して少なくとも５０％だけ低減された吸収横断面を有するように妨害する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ルミネセンス阻止光（１０）は、前記蛍光体（６）のルミネセンス励起スペクトルおよび／またはルミネセンス放射スペクトルの外の波長を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光体（６）の電子的基底状態（Ｓ０）は、分子の運動パルスおよび／または振動によって妨害される、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記運動パルスおよび／または振動は、ルミネセンス阻止光（１０）により励起されたすくなくとも１つの変調器ユニット（５）から発する、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの変調器ユニット（５）が、前記蛍光体（６）に空間的に割り当てられている、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの変調器ユニット（５）は、前記蛍光体（６）に化学的に結合している、ことを特徴とする請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ルミネセンス阻止光（１０）は、前記変調器ユニット（５）をシス−トランス異性化まで励起する、ことを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
妨害された電子的基底状態（Ｓ０）では、蛍光体（６）内の原子配列が妨害されている、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
電子的基底状態（Ｓ０）が妨害されている蛍光体（６）は、その周囲との熱平衡状態にない、ことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料（１２）の測定領域（１３）内には、前記蛍光体（６）の電子的基底状態（Ｓ０）がルミネセンス阻止光（１０）のパルスによって妨害されている場合にだけ、前記ルミネセンス励起光（１）のパルスが印加される、ことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定領域（１３）から放射されるルミネセンス光（２）が記録される時間は、前記蛍光体（６）の電子的基底状態（Ｓ０）がルミネセンス阻止光（１０）の先行のパルスによってまだ妨害されている間に終了される、ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、１０ｆｓから１０，０００ｆｓの範囲の長さを有する、ことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、５０ｆｓから５００ｆｓの範囲の長さを有する、ことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、測定領域において１ｐＪから１０００ｐＪの範囲のエネルギーを有する、ことを特徴とする請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、測定領域において５ｐＪから５００ｐＪの範囲のエネルギーを有する、ことを特徴とする請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、局所的最小値部（１４）の外にある測定領域（１３）における蛍光体（６）の電子的基底状態（Ｓ０）の妨害を飽和させる、ことを特徴とする請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ルミネセンス阻止光（１０）のパルスは、運動パルスおよび／または振動を発する少なくとも１つの変調器ユニット（５）の励起状態（Ｓ１）を飽和させる、ことを特徴とする請求項９から１５のいずれか一項または請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
同じ変調器ユニット（５）が、蛍光発光状態から波長の異なるルミネセンス光（２）を放射する種々の蛍光体（６）に結合されており、前記波長の異なるルミネセンス光（２）が別個に記録され、局所的最小値部（１４）の位置にある個々の蛍光体に割り当てられる、ことを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料（１２）には、測定領域（１３）から放射されるルミネセンス光（２）の記録の前に、局所的最小値部を有する強度分布の従来のＳＴＥＤ光（３）、ＧＳＤ光またはスイッチオフ光が印加される、ことを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度で結像するための方法に関するものであり、ここで、前記試料の測定領域内には、局所的最小値部を有する強度分布のルミネセンス阻止光が印加され、前記試料の測定領域内には、蛍光体を電子的基底状態から蛍光発光状態に励起するルミネセンス励起光が印加され、前記測定領域から検出されたルミネセンス光が記録され、当該記録されたルミネセンス光が、前記試料中の局所的最小値部の位置に割り当てられる。
【背景技術】
【０００２】
このような方法では、測定領域から検出されたルミネセンス光の強度が、試料中の局所的最小値部の位置における蛍光体の濃度に対する尺度である。上記のステップを局所的最小値部の各位置に対して繰り返しながら、局所的最小値部を備える試料を走査することにより、試料中の蛍光体の分布が検出され、これにより蛍光体を有する構造が結像される。
【０００３】
ここで概念「蛍光体」とは、物質が励起された蛍光発光状態にあるときに、ルミネセンス光を測定信号として得ることができる任意の物質を表す。とりわけここには蛍光色素が含まれる。しかしルミネセンス光の放射の基礎となる過程は、蛍光でなくても良い。これは散乱、例えばラマン散乱であっても良く、このラマン散乱では、散乱光が検出される励起遷移状態が励起された蛍光発光状態と見做される。
【０００４】
試料の対象構造は、蛍光体を自発的に有することができる。すなわち自発発光することができる。しかし試料の対象構造は、蛍光体により人工的にマーキングすることもできる。蛍光体による構造の人工的なマーキングは、例えばいわゆる抗体着色により、すなわち蛍光体を免疫反応により結合することによって、または遺伝子工学的な変化によって行われる。この人工的なマーキングにより、対象構造を備える蛍光体が共通して発現される。
【０００５】
ここで状態、例えば電子的基底状態または蛍光体の励起された蛍光発光状態について述べる場合、これは、蛍光体、すなわち分子、錯体、空格子点、量子ドット等の蛍光発光能力のある最小単位の電子的状態である。
【０００６】
ここで光、例えばルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部について述べる場合、これにより、とりわけ干渉によって形成された強度分布のゼロ箇所が意味される。このようなゼロ箇所は、光のフォーカシングの際に回折限界によって可能であるよりも格段に小さい寸法を有することができる。ここでは、光の強度が実際にゼロに降下する真のゼロ箇所を取り扱うことができるが、光の強度が、理想的な光学的環境が欠けているため、実質的にだけゼロに降下するゼロ箇所も取り扱うことができる。ここで局所的最小値部の寸法について述べる場合、この寸法はとりわけ、それぞれの光が、この光により喚起される効果、例えばこの光により励起された遷移を引き起こすが、飽和には至らない体積の寸法に関連する。
【０００７】
従来の技術
独立特許請求項１の上位概念のステップを上記の順序で含む、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度に結像するための公知の方法は、ＧＳＤ（基底状態枯渇）ラスタ蛍光光顕微鏡法として公知である。この公知の方法では、蛍光体が、ＧＳＤ光の形のルミネセンス阻止光により、その電子的に励起された蛍光発光状態、例えば電子的に励起された一重項状態を介して暗状態に、例えば長寿命の三重項状態に遷移し、そこからは蛍光体はルミネセンス励起光によって蛍光発光状態に励起されない。ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の外ではどこでも、これが飽和まで行われる。すなわち、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の中でだけ蛍光体は、ルミネセンス阻止光の印加の後もその電子的基底状態で存在し、そこから蛍光体はルミネセンス励起光により蛍光発光状態に励起される。したがってルミネセンス励起光による励起後に蛍光体から放射されるルミネセンス光は、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部からだけ由来するものであり、したがって試料中の局所的最小値部の位置に割り当てることができる。
【０００８】
キーワード「ＧＳＤ」の下で公知の方法では、蛍光体のブリーチングの危険性が大きい。なぜなら蛍光体が、ルミネセンス阻止光により遷移される長寿命の暗状態でも、暗状態への遷移時に蛍光体がとる電子的に励起された蛍光発光状態でも、かなり高い程度で、例えば酸素と化学反応を起こす傾向があるからである。および／または蛍光体がルミネセンス阻止光またはルミネセンス励起光によってさらに電子的に励起され、それにより蛍光体の光化学的ブリーチングが生じる危険に曝されているからである。
【０００９】
独立特許請求項１の上位概念の方法ステップを上記の順序で有する、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度に結像するためのさらなる方法は、ＲＥＳＯＬＦＴ（可逆的飽和性光学蛍光遷移）ラスタ蛍光光顕微鏡法の変形として知られ、これはいわゆる切り替え可能な蛍光体を利用する。これらの蛍光体は、スイッチオフ光の形のルミネセンス阻止光により、第１の立体配座状態、すなわちこれらの蛍光体が蛍光体として作用する第１の原子構造から、これらの蛍光体が蛍光体として作用しない第２の立体配座状態に切り替えることができる。すなわちこの第２の立体配座状態においては、これらの蛍光体を、少なくとも第１の立体配座状態においては蛍光発光状態を励起するのに適切なルミネセンス励起光によって、蛍光体が測定信号として記録されるルミネセンス光を放射する蛍光発光状態に励起することができない。このような切り替えを、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の外ではどこでも飽和に至るまで行うために、第２の立体配座状態の寿命が十分に長ければ、比較的に小さな光強度しか必要としない。さらに別の立体配座状態に遷移した蛍光体が、この別の立体配座状態からブリーチングするという重大な危険性がない。なぜなら、蛍光体はこの立体配座状態では、ルミネセンス阻止光とルミネセンス励起光に反応しないからである。ただし、切り替え可能な蛍光体がルミネセンス阻止光によってその第２の立体配座状態に、励起された電子状態を介して遷移もする。この励起された電子状態は、ルミネセンス阻止光の強度が高い場合、蛍光体の光化学的ブリーチングに対する出発点になり得る。この理由および別の理由から、２つの立体配座状態間で利用可能な切り替え過程の絶対数は、切り替え可能な蛍光体が多数ある場合には制限されている。とりわけ、蛍光体が必要に応じて活性である場合、すなわちルミネセンス可能光により、蛍光発光能力の無い第２の立体配座状態から蛍光発光能力のある第１の立体配座状態に切り替えられる場合には制限されている。さらにすでに述べた立体配座状態の長寿命とは、これら立体配座状態の間をアクティブに往復切り替えしても、キーワード「ＲＥＳＯＬＴ」の下で公知の切り替え可能な蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度に結像するための方法が比較的緩慢であることを意味する。最後に、試料中の構造をマーキングするのに適切な市販の切り替え可能な蛍光体の数は、とりわけ基本的に入手可能な多数の蛍光体と比較して制限されている。さらに、新規の安定した切り替え可能な蛍光体の開発にはコストが掛かる。
【００１０】
独立特許請求項１の上位概念の方法ステップを、冒頭に述べたのとは基本的に異なる順序で有する、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度に結像するための方法は、ＳＴＥＤ（誘導放出枯渇）ラスタ蛍光光顕微鏡法として公知である。ここでは試料の測定領域に、先ずルミネセンス励起光が印加され、このルミネセンス励起光が蛍光体を電子的基底状態から蛍光発光状態に励起する。次に試料の測定領域内には、局所的最小値部を有する強度分布のルミネセンス阻止光がＳＴＥＤ光の形で印加され、このＳＴＥＤ光は、励起された蛍光発光状態を誘導放出によって再び基底状態に緩和する。ルミネセンス阻止光が励起された蛍光発光状態を、最小値部の外ではどこでも誘導放出によって再び緩和した場合、引き続いて測定領域から放射されるルミネセンス光は、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部からだけ由来することができ、これにより試料中の局所的最小値部の位置に割り当てることができる。
【００１１】
キーワード「ＳＴＥＤ」の下で公知の方法では、蛍光体を有する試料の構造の結像の際に、実際に非常に高い位置解像度が達成される。しかしここで蛍光体が光化学的に甚だしく負荷され、したがってブリーチングする傾向が大きい。原因は、その強度分布のゼロ箇所の形の局所的最小値部を狭くするためには、絶対強度の高いルミネセンス阻止光を施与しなければならず、このルミネセンス阻止光が、すでに励起された蛍光発光状態にある蛍光体に印加されるからである。したがって、蛍光体をその基底状態に戻す所望の誘導放出の他に、別の過程、とりわけ進行してブリーチングに至る蛍光体の電子的励起もあり得る。誘導放出によりいったん緩和された蛍光体の新たな励起も、本来ルミネセンス阻止光のために設けられた光によって発生し得る。
【００１２】
独立特許請求項１の上位概念の特徴を備える、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度で結像するための公知の方法は全て、ルミネセンス阻止光が蛍光体を、ルミネセンス励起光の入射の前にその蛍光発光能力のある基底状態から、励起された電子状態を介して暗状態に遷移させるか、または励起された蛍光発光状態から基底状態に戻すことに基づくものである。したがっていずれの場合でも、蛍光体には強度の高いルミネセンス阻止光が印加され、蛍光体の光化学的ブリーチングの危険性と結び付いた励起された電子的状態が、ルミネセンス阻止光を用いる位置分解能の改善に関与する。とりわけ暗状態の寿命とルミネセンス阻止光の所要の強度との間には相間が存在すると思われる。この相間は、暗状態の寿命が長くなれば長くなるほど、さほど成立しなくなり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の基礎とする課題は、蛍光体が光化学的ブリーチングの危険性に曝されることが特に小さく、それでもなお、ルミネセンス阻止光の強度分布の最小値部を備える試料の走査の際に高い速度を許容する、蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度で結像するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この課題は、独立特許請求項１の特徴を備える方法によって解決される。本発明の方法の好ましい実施形態は、従属請求項に定義されている。
【００１５】
発明の説明
蛍光体を有する試料の構造を空間的に高解像度に結像するための方法であって、前記試料の測定領域に、局所的最小値部を有する強度分布のルミネセンス阻止光が印加され、前記試料の測定領域に、前記蛍光体を電子的基底状態から蛍光発光状態に励起するルミネセンス励起光が印加され、前記測定領域から検出されたルミネセンス光が記録され、当該記録されたルミネセンス光が、前記試料中の局所的最小値部の位置に割り当てられる方法において、前記蛍光体の電子的基底状態を前記ルミネセンス阻止光によって、前記蛍光体が、妨害された電子的基底状態においては少なくとも５０％だけ低減される吸収横断面を前記ルミネセンス励起光に対して有するように妨害する。ここでルミネセンス励起光に対する吸収横断面の判定の際の比較基準は妨害されない基底状態であり、この妨害されない基底状態では蛍光体が、ルミネセンス励起光に対して１００％の吸収横断面を有する。
【００１６】
本発明による方法では、ルミネセンス阻止光によって蛍光体は電子的基底状態から引き出されない。または他の電子的状態から電子的基底状態に戻されない。すなわち、蛍光体の電子的状態は変化されない。その代わりに蛍光体の既存の電子的基底状態が妨害される。この妨害は少なくとも、蛍光体が妨害された電子的基底状態においては妨害されない電子的基底状態よりも、最大で半分の確率でルミネセンス励起光により蛍光発光状態に励起されるように行われる。しかし典型的にはこの妨害は、妨害されない電子的基底状態において吸収横断面がその出発値の２０％、１０％、５％、３％、１％またはそれ以下にまでは低下しないように行われる。妨害は典型的には、蛍光体の基底状態における蛍光体の立体配置に関係するものであり、とりわけ蛍光体の原子核に関係する。この立体配置は、ルミネセンス励起光に対する蛍光体のアンテナ機能に影響する。または言い替えると、とりわけルミネセンス励起光の形の光の特に吸収と交互作用する蛍光体の能力に影響する。この理由からこの配列の妨害は、ルミネセンス励起光に対する吸収横断面を変化させる。
【００１７】
ルミネセンス励起光による蛍光体の励起を阻止する、蛍光体の基底状態の妨害の効果は、フランク−コンドンの原理によっても説明される。しかしここでは、この原理の基礎となる前提、例えばとりわけボルン−オッペンハイマー近似が、蛍光体の原子核の配列と電子雲の配列を含む妨害の際に損なわれてはならないことを見落とすべきである。フランク−コンドンの原理の見方では、妨害された基底状態について、蛍光体の蛍光発光励起された電子的状態の適切な副振動状態が欠けている。したがって蛍光発光励起された電子的状態の全ての副振動状態に対するフランク−コンドン因子が非常に小さく、小さな遷移確率にしか至らない。このことは、ルミネセンス励起光に対して本発明より低減された吸収横断面と同義である。
【００１８】
さらに蛍光体の妨害された基底状態の概念は、妨害された基底状態は、周囲との蛍光体の熱平衡状態ではないことを包含する。すなわち、妨害は蛍光体のエネルギーの上昇を伴い、妨害は、基底状態のより高い副振動状態に蛍光体を持ち上げることもできる。しかし妨害された基底状態において高められた蛍光体のエネルギーは、蛍光体の周囲での試料の一般的温度上昇には相当しない。むしろ妨害された基底状態のエネルギーは、その周囲の温度により規定される蛍光体の熱エネルギーよりも格段に高い。対応して、その周囲との蛍光体の熱平衡が再び現れると、本発明にしたがいルミネセンス阻止光により引き起こされる蛍光体の電子的基底状態の妨害が失われてしまう。そして、妨害のエネルギーが分散された領域における試料の小さな温度上昇だけが残る。このことは、本発明の方法の実施の際に第一に考慮すべきタイムスケールが、蛍光体がその周囲との熱平衡に戻る緩和時間によって設定されることを意味する。この緩和時間は、ここでは衝突緩和時間ないし振動緩和時間とも称される。なぜなら熱平衡は、典型的には隣接する分子への運動パルスおよび／または振動の伝達により形成されるからである。衝突緩和時間または振動緩和時間の典型的なオーダは、比較的に大きなフェムト秒（ｆｓ）範囲からピコ秒（ｐｓ）範囲までである。すなわち、数十フェムト秒から数ピコ秒である。典型的にはこの時間は、数百フェムト秒以下の範囲にある。
【００１９】
ルミネセンス阻止光によってもたらされるエネルギーによる試料の温度上昇が、ルミネセンス阻止光の強度分布からの局所的最小値部も含むまでに拡大する時間は、数桁だけ長くなり、ナノ秒（ｎｓ）範囲からマイクロ秒（μｓ）範囲である。したがってこの時間は、本発明の方法にとって付加的な重要な時間的制限とはならない。とりわけ本発明の方法では、強度分布の局所的最小値部の外でも、測定領域において試料の一般的温度上昇を達成しようとするのではなく、温度上昇は可及的に小さく維持される。
【００２０】
本発明の方法では、ルミネセンス阻止光がルミネセンス励起光スペクトルの外の波長を有し、好ましい一実施形態では蛍光体のルミネセンス緩和スペクトルの外でもある波長を有する。これにより、ルミネセンス阻止光を蛍光体の電子的基底状態の選択的妨害のために使用することができる。ここで波長は、所属の吸収横断面が、ルミネセンス励起スペクトル中のルミネセンス励起ないしルミネセンスルミネセンス緩和スペクトル中のルミネセンス緩和に対する最大吸収横断面の例えば最大で５％であるときに、ルミネセンス励起スペクトルないしルミネセンス緩和スペクトルの外にあると見做される。
【００２１】
蛍光体の電子的基底状態の妨害は、典型的には、運動パルスまたは振動の分子伝達により、例えば分子衝突により行われる。蛍光体に伝達された運動パルスまたは振動により、蛍光体の立体配置が妨害される。ここで立体配置の妨害は、第一に蛍光体の原子核の空間的配置に関連するが、原子核を取り囲む電子雲の妨害も伴う。
【００２２】
蛍光体の基底状態を妨害するための運動パルスまたは振動は、ルミネセンス阻止光により励起された少なくとも１つの変調器ユニットのとりわけ衝突緩和または振動緩和から由来することができる。すなわち、ルミネセンス阻止光は、少なくとも１つの変調器ユニットを例えばその電子的基底状態から電子的励起状態に励起し、この電子的励起状態は、衝突緩和または振動緩和により、すなわち運動パルスおよび／または振動の蛍光体への伝達の下で再び電子的基底状態に遷移する。
【００２３】
少なくとも１つの変調器ユニットは、とりわけ別個の分子または機能群とすることができる。したがって変調器ユニットは、アゾ色素、カロチン、シアニン、クマリン誘導体およびいわゆる光増感剤を含む非蛍光色素の群から選択することができる。具体的には、クリスタルバイオレットまたはメチレンブルーとすることができる。蛍光体は、構造的に類似の蛍光色素とすることができる。
【００２４】
運動パルスおよび／または振動を蛍光体に効率的に伝達するために、変調器ユニットが蛍光体に、可及的に直接空間的に割り当てられる。したがって、蛍光発光の中心の傍らでグリーンの蛍光プロテイン（ＧＦＰ）のバレル（Ｂａｒｒｅｌ）内に存在する水分子を変調器ユニットとして使用することができる。なぜなら、水分子は蛍光発光の中心に空間的に密に隣接しているからである。
【００２５】
さらに少なくとも１つの変調器ユニットを、蛍光体への結合を介して結合することも可能である。このような結合は、共有結合とすることができ、または化学的架橋を含むことができる。結合の形式に応じて、変調器ユニットは柔軟にまたは剛性に蛍光体に結合する。重要なことは、変調器ユニットの衝突緩和または振動緩和の結果、十分な運動エネルギーが、蛍光体の電子的基底状態の所望の妨害のために蛍光体に伝達されることである。
【００２６】
変調器ユニットは、これが結合された蛍光体に対して角度を付すことができる。すなわち変調器ユニットは、好ましくはπ共役電子システムを有し、このπ共役電子システムは、蛍光体のπ共役電子システムに対して少なくとも略直交する。そして変調器ユニットは、蛍光体において運動パルス伝達および／または振動伝達に対して使用可能な結合であるにもかかわらず、妨害されない蛍光体のルミネセンス特性を可及的に僅かしか妨害しない。
【００２７】
具体的には変調器ユニットを、ルミネセンス阻止光によりシス−トランス異性化にまで励起することができる。異性化の際に行われる変調器ユニットの原子団の転位は、蛍光体が変調器ユニットの転位した原子団に結合されている場合には、運動パルスとして結合された蛍光体にとりわけ効率的に伝達される。相対配置が異性化の際に変化する変調器ユニットの２つの原子団にも、それぞれ１つの蛍光体を結合することができる。ルミネセンス阻止光により励起された異性化が不安定であり、変調器ユニットが異性化の前に自発的にその出発状態に戻る場合でも、各結合された蛍光体に運動パルスが伝達され、これが蛍光体の基底状態を妨害する。
【００２８】
電子的基底状態が妨害されると、蛍光体におけるとりわけ原子配列、すなわち原子核の空間配置または立体配置が妨害される。ここで妨害は、蛍光体の蛍光発光能力の無い別の立体配座状態の方向での原子の振動も良い。しかしその場合、この別の立体配座状態には達しないか、またはこの立体配座状態は不安定である。いずれにしても、すでに述べたルミネセンス励起光と交互作用する蛍光体の能力が、妨害によって所期のように損なわれる。同様にすでに述べたように、このような妨害は、これが蛍光体の熱平衡に相当しないから、妨害が効率的に励起された場合には持続時間だけが制限される。対応して本発明の方法の方法ステップは、試料を空間的に高解像度に結像するための公知の方法と比較して、高速に連続して実施しなければならない。
【００２９】
とりわけ蛍光体の電子的基底状態がルミネセンス阻止光のパルスにより妨害されている場合にだけ、試料の測定領域にルミネセンス励起光のパルスを印加すべきである。すなわち、ルミネセンス励起光を、蛍光体の基底状態の妨害前にもこの妨害の消失後にも、試料に印加すべきではない。これによりルミネセンス励起光は、ルミネセンス阻止光の強度分布の最小値部の外では、実質的に基底状態の妨害された蛍光体にだけ当たり、したがって最小値部の外では蛍光発光状態に関連する励起は行われない。この条件が維持される場合、試料から記録されるルミネセンス光は、試料がルミネセンス励起光により印加されている間に記録されるか、または印加後に記録されるかに関係なく、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部からだけ由来する。
【００３０】
基底状態の妨害の所望の空間的分布がルミネセンス励起光による印加の際に実際に存在するようにするために、蛍光体は、妨害されたその基底状態からその周囲との熱平衡状態に再び戻っていてはならない。このことを保証するために、１０００ｆｓ、５００ｆｓまたはさらに短い時間を、ルミネセンス阻止光からルミネセンス励起光までの最大時間間隔のために維持することができる。これが不可能な場合、または大きなコストによってのみ可能となる場合、ルミネセンス励起光を、蛍光体の電子的基底状態が実際に妨害されている時間に制限すべきである。これにより本発明の方法の解像度上昇効果を最適に利用することができ、測定領域から放射されるルミネセンス光が記録される時間は、たとえルミネセンス励起光のパルスがまだ消失していなくても、蛍光体の電子的基底状態がルミネセンス阻止光の先行のパルスによってまだ妨害されている間にすでに終了される。妨害された基底状態の衝突緩和時間または振動緩和時間の領域において時間的分解能により検出されるルミネセンス光のこの種の「ゲート」によって、ルミネセンス阻止光の強度分布の最小値部を中心にする所望の空間的分布を有する蛍光体の電子的基底状態の妨害が存在していた時点で励起されたこのような蛍光体からのルミネセンス光だけを記録することができる。典型的には、放射されたルミネセンス光が本発明の方法において記録される制限された時間は、ルミネセンス励起光による蛍光体の継続的な励起が行われている間に終了し、ルミネセンス阻止光のパルスの後の遅くとも数ｐｓ後に、しばしば僅か約１ｐｓ後に終了する。
【００３１】
蛍光発光状態の典型的な寿命と比較すると、励起された蛍光体から基本的に得られるルミネセンス光の大部分を検出するためには、数ｐｓはかなり短く、したがって十分ではない。しかし、三重項基底状態から電子的に励起されて蛍光発光する三重項状態または光の散乱に関与する、例えばラマン散乱物質の発光遷移状態も含まれる他の蛍光発光状態は、格段に短い寿命を有することがある。光散乱物質の基底状態を本発明のルミネセンス阻止光により妨害する際に、その物質の散乱スペクトルが偏移され、または別のものに変化される。
【００３２】
ルミネセンス阻止光のパルスの持続時間は、このパルスにより伝達されるエネルギーが十分であり、蛍光体の基底状態の所望の妨害を引き起こす限り、一次近似で取るに足らないものである。したがって基本的にルミネセンス阻止光を連続的に印加することもできよう。しかしこのことは試料への不所望な熱付与と結び付いており、このことは、ルミネセンス阻止光の強度分布の最小値部の外でだけ蛍光体の電子的基底状態を局所的に妨害することをますます困難にするであろう。これは、蛍光色素からの蛍光光放射は温度上昇とともに低下するという既知の現象である。試料の一般的な温度上昇は、妨害されていない、すなわち熱平衡状態にある基底状態での試料の吸収横断面も縮小することとなる。したがって本発明では好ましくは、ルミネセンス阻止光が短いパルスで印加される。このパルスは、典型的には１０ｆｓから１０００ｆｓの間、しばしば５０ｆｓから５００ｆｓの間の長さであり、具体的には約３００ｆｓの長さとすることができる。このような短いパルスにより、制限されたエネルギーだけが試料に伝達され、このエネルギーは試料の走査の際にも、試料の基本的な温度上昇を引き起こさずに散逸することができる。ルミネセンス阻止光の一パルス当たりで、回折限界により決定される寸法の測定領域に、蛍光体の基底状態の本発明による妨害のためにもたらすべきエネルギーは、１ｐＪから１０，０００ｐＪの範囲が典型的であり、しばしば５ｐＪから５００ｐＪの間である。このエネルギーであれば、たとえルミネセンス阻止光によりもたらされたエネルギーが試料から再び放出されなくても、測定領域内に生じる試料の温度上昇は小さい。
【００３３】
好ましくは、ルミネセンス阻止光のパルスは、このパルスが、強度分布の局所的最小値部の外にある測定領域において蛍光体の電子的基底状態の妨害を飽和させるような強度を有する。すなわち、電子的基底状態の妨害は少なくとも、測定領域内であれば局所的最小値部の外ではどこでも、ルミネセンス励起光に対する吸収横断面が少なくとも５０％だけ低減されるような大きさである。
【００３４】
実際にはルミネセンス阻止光のパルスは、これが、衝突緩和または振動緩和により緩和された少なくとも１つの変調器ユニットの励起状態を飽和させるように選定することができる。変調器ユニットを十分な厚さで設けることにより、蛍光体の所望の基底状態の所望の妨害をも、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の外であればどこでも保証することができる。
【００３５】
本発明の方法により、最小のコストで、種々の、すなわち波長の異なるルミネセンス光を放射する種々の蛍光体を有する種々の構造を同時に結像することができる。そのためには、全体を同じ励起阻止光により励起することのできる同じ変調器ユニットが種々の蛍光体に結合されており、波長の異なるルミネセンス光を別個に記録し、個々の蛍光体を、励起阻止光の強度分布の局所的最小値部の位置に割り当てれば基本的に十分である。励起阻止光の強度分布の局所的最小値部は、変調器ユニットが結合された全ての蛍光体に対して、ルミネセンス光が由来することのできる試料の体積を規定する。種々の蛍光体がその蛍光発光状態において、それぞれの蛍光体に整合された種々の波長のルミネセンス励起光により励起される場合であっても問題は無い。なぜならここでは、種々の蛍光体を有する種々の構造を同時に結像する場合に通常はしばしば必要であるように、種々の強度分布の局所的最小値部を、遮蔽のために施与することが必要ないからである。
【００３６】
本発明の方法の別の一改善実施形態では、測定領域から放射されるルミネセンス光の記録の前に、試料に付加的に、局所的最小値部を有する強度分布の従来のルミネセンス阻止光が印加される。このルミネセンス阻止光は、蛍光体の吸収スペクトル内に入っており、励起された電子的励起状態の関与の下で蛍光体の蛍光発光を阻止する。付加的な従来のルミネセンス阻止光は、試料からのルミネセンス光を検出することのできる空間領域を、公知のＳＴＥＤ原理、ＧＳＤ原理またはＲＥＳＯＬＦＴ原理にしたがいさらに限定する。すなわち従来のルミネセンス阻止光は、ＳＴＥＤ光、ＧＳＤ光またはスイッチオフ光とすることができ、後者は切り替え可能な蛍光体を前提とする。しかしここでは蛍光体のブリーチングの危険性がないか、またはＳＴＥＤ、ＧＳＤないしＲＥＳＯＬＦＴに対して典型的な蛍光体のブリーチングの危険性よりも格段に小さなものしか発生しない。なぜなら、従来のルミネセンス阻止光の高い強度は、その基底状態が妨害されている蛍光体にしか当たらず（または少なくとも大部分に当たり）、電子的に励起されていて、したがって光化学的ブリーチングの傾向のある状態の蛍光体には当たらないからである。本発明の方法のこの実施形態において、強度の比較的に小さな従来のルミネセンス阻止光は、その強度分布の局所的最小値部の近傍で作用する。そしてこの強度分布は、蛍光体の光化学的ブリーチングの大きな危険性とは結び付いていない。
【００３７】
最後に説明した本発明の方法の変形例は、ルミネセンス阻止光による基底状態の妨害によって、ＳＴＥＤ法、ＧＳＤ法、ないしＲＥＳＯＬＦＴ法でのＳＴＥＤ光、ＧＳＤ光またはスイッチオフ光の高強度の領域においては蛍光体が保護領域に遷移し、この保護領域では、ＳＴＥＤ光、ＧＳＤ光ないしスイッチオフ光の高い強度により光化学的にブリーチングされる通常の危険性ほどの強い危険性を蛍光体は受けない、と解釈することもできる。この有利な作用は、本発明によるルミネセンス阻止光が、まず最初に蛍光体の基底状態を、この基底状態を電子的に励起することなく妨害し、しかし部分的に従来のルミネセンス阻止光として、すなわちＳＴＥＤ光、ＧＳＤ光またはスイッチオフ光として作用し、このように１つの波長による２つのやり方で本発明の方法の位置分解能が高められる場合にも基本的に達成される。
【００３８】
本発明の有利なさらなる形態は、特許請求の範囲、明細書および図面から得られる。明細書中に挙げた特徴および複数の特徴の組み合わせの利点は、単なる例であり、択一的にまたは累積的に作用することができ、その際に必然的に本発明の実施形態の利点が達成されなければならないという必要はない。これにより、添付された特許請求の範囲の対象が変更されることなく、当初出願書類および特許の開示内容に関して、以下が当てはまる：さらなる特徴は図面から得られる。本発明の種々の実施形態の特徴の組み合わせ、または種々の特許請求の範囲の特徴の組み合わせも同様に、特許請求の範囲の選択された引用関係を逸脱しても可能であり、ここにおいて示唆される。このことは、別個の図面またはそれらの説明に示された特徴に対しても当てはまる。これらの特徴は、種々の特許請求の範囲の特徴とも組み合わせることができる。同様に特許請求の範囲に挙げられた特徴は、本発明のさらなる実施形態に対して省略することができる。
【００３９】
特許請求の範囲および明細書に挙げられた特徴は、それらの数に関しては、副詞「少なくとも」を明示的に使用する必要なく、正確にその数または述べた数よりも多数で存在すると理解すべきである。したがって例えば１つのエレメントについて述べる場合、正確に１つのエレメント、２つのエレメント、またはそれ以上のエレメントが存在すると理解すべきである。これらの特徴は別の特徴により補充することができ、またはそれぞれ成果が得られる個別の特徴であって良い。
【００４０】
特許請求の範囲に含まれる参照符号は、特許請求の範囲により保護される対象の範囲を制限するものではない。参照符号は、特許請求の範囲を容易に理解できるようにするためだけのものである。
【００４１】
以下、本発明を、図面に示された好ましい実施例に基づきさらに詳細に説明し、記述する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】蛍光色素のエネルギースペクトルを、一重項状態における蛍光体に対する例として示す図である。
【図２】２つの変調器ユニットが結合された１つの蛍光体を示す概略図である。
【図３】蛍光発光の中心を備える複数の変調器ユニットが１つの共通のバレル内に配置された１つの蛍光体を示す概略図である。
【図４】一重項状態にある一変調器ユニットのエネルギースペクトルを示す図である。
【図５】本発明の方法の個別のステップを示す図である。
【図６】図５に示された方法の主要ステップの時間経過図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
図１に示された蛍光色素のエネルギースペクトルは一重項状態にあり、種々の副振動状態を備える電子的基底状態Ｓ０と蛍光発光励起された電子的状態Ｓ１とを含む。励起光１により蛍光色素は、その基底状態Ｓ０からその励起状態Ｓ１に励起することができる。この状態Ｓ１は基底状態Ｓ０に自然に崩壊し、その際にルミネセンス光２、ここで具体的には蛍光光が放射される。しかし励起状態Ｓ１は、ルミネセンス光２の放射前にＳＴＥＤ光３によって所期のように過疎化することができる。このＳＴＥＤ光は、励起光１およびルミネセンス光２とは別の波長を有しており、蛍光色素をその励起状態Ｓ１から、ＳＴＥＤ光３と同じ波長の光４の誘導放射の下で、その基底状態Ｓ０に戻す。励起光１もルミネセンス光２とは別の波長、とりわけ比較的に短い波長を有することができ、したがってルミネセンス光２を、その波長を介して他の全ての光から分離することができる。
【００４４】
励起光１を吸収する吸収横断面、すなわち励起光１が蛍光色素をその基底状態Ｓ０から励起された電子的状態Ｓ１に励起させる確率は、蛍光色素がエネルギーの低い基底状態Ｓ０の副振動状態にあるか否かに依存している。したがって吸収横断面は、蛍光色素の強い温度上昇と、基底状態Ｓ０の比較的に高い副振動状態の占有と共に減少する。しかし本発明の方法では、熱平衡状態にある蛍光色素の一般的温度上昇が引き起こされない。むしろ、蛍光阻止光またはルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の外にある蛍光色素が、１つまたは複数の運動パルスおよび／または振動の直接的伝達によって妨害され、これにより蛍光色素は、その電子的基底状態Ｓ０に留まるが、励起光１に対する吸収横断面は格段に低減される。このことは、それぞれの衝突と励起光１に対する吸収横断面の相応の低減とによる個々の蛍光色素の振動または震動エネルギーの上昇として解釈することができるこのエネルギー上昇は、周囲の温度に基づく蛍光色素の熱エネルギーを格段に上回る。本発明の方法においてルミネセンス阻止光による印加の終了後に、周囲との蛍光色素の熱平衡が再び生じると、励起光１に対する吸収横断面を低減するその基底状態の妨害が再び消失してしまう。周囲との熱平衡状態にある蛍光色素の残った僅かな温度上昇は、確かにある程度の時間、ルミネセンス阻止光の強度分布の局所的最小値部の箇所に局所的最小値部を有することがまだできるが、しかしもはや局所的最小値部の内および外において、ルミネセンス励起光に対して有意に異なる吸収横断面を引き起こさない。位置的分解能の上昇のためには、蛍光色素の衝突励起直後の熱不平衡状態だけが利用可能である。
【００４５】
これまで例として説明した蛍光色素である蛍光体においてこの衝突励起を引き起こすために、変調器ユニット５を蛍光体６に結合することができる。この変調器ユニットは、ルミネセンス阻止光を吸収し、運動パルスおよび／または振動に変換する。これが図２に示されている。ここでは２つの変調器ユニット５が結合７を介して９０°だけ角度が付されて蛍光体６に結合され、それらのπ共役電子システムは蛍光体６のπ共役電子システムに対して実質的に直交している。変調器ユニット５の数は、２より小さくても大きくても良い。結合の形式も同様に異なっていて良い。蛍光体６の蛍光発光する特性を損なわず、変調器ユニット５から発する運動パルスおよび／または振動を効率的に蛍光体６に伝達する結合が理想的である。具体的には、例えばアゾ発光団のようにルミネセンス阻止光によりシス−トランス異性化まで励起することができる化合物が、蛍光体の基底状態を本発明により妨害する運動パルスを各結合された蛍光体６に伝達するために変調器ユニット５として適する。ここでは２つの蛍光体を変調器ユニットの２つの原子団に結合することができ、これらの原子団は異性化の際に相対的に互いに取り巻く。
【００４６】
図３は、蛍光発光の中心８が変調器ユニット５と共にバレル９により密に取り囲まれた蛍光体６を示す。この種の配置関係は、例えば緑蛍光発光するプロテインの場合に得られ、ここでは変調器ユニット５は水分子である。この水分子は、ルミネセンス阻止光により、振動緩和または衝突緩和によって崩壊する状態に励起することができる。ここで変調器ユニット５から発する運動パルスと振動は、蛍光体６ないしその蛍光発光の中心８に伝達され、図１の励起光１に対するその吸収横断面を縮小する。
【００４７】
図４は、変調器ユニット１の一重項状態におけるエネルギースペクトルを示す。ルミネセンス阻止光１０によって、変調器ユニット１が基底状態Ｓ０から励起された電子状態に、例えばそのＳ１またはＳ２状態に遷移される。とりわけ比較的高いＳ２状態への遷移の励起のために必要なエネルギーは、ＵＶ領域の波長により、すなわち蛍光体６の吸収および放射スペクトルの外の波長により得ることができる。励起されたＳ１またはＳ２状態は、振動緩和または衝突緩和１１により非常に高速に基底状態Ｓ０に崩壊して戻る。ここで変調器ユニット５が適切に結合されている場合には、運動パルスおよび／または振動が蛍光体６に伝達され、その基底状態を所望のように妨害する。
【００４８】
図５は、本発明の方法のステップを示す。図５（ａ）によれば、試料１２の測定領域１３内にルミネセンス阻止光１０が印加される。ここでルミネセンス阻止光１０の強度分布は、測定領域１３の中心にゼロ箇所の形態の局所的最小値部１４を有する。すなわち、局所的最小値部１４の外ではどこでもルミネセンス阻止光１０が蛍光体６の基底状態を妨害するが、局所的最小値部１４内では妨害しない。ここではこの基底状態により、試料１２の中の構造１５がマークされている。図５（ｂ）による次のステップでは、試料１２の測定領域１３内に励起光１が印加される。励起光１は、例えば蛍光色素である蛍光体６を励起することができるが、図１のルミネセンス阻止光１０の局所的最小値部１４内でだけ（または少なくとも主にその中でだけ）励起する。そして図５（ｄ）による次のステップでは、測定領域１３から記録されたルミネセンス光２を局所的最小値部１４に割り当てることができる。なぜならルミネセンス光は、この局所的最小値部１４内の蛍光体６からしか（または少なくとも主にそれからしか）由来することができないからである。
【００４９】
図５（ｃ）には、付加的な任意選択の方法ステップが示されている。この方法ステップでは、ステップ（ｄ）の前に試料１２の測定領域１３内に付加的にＳＴＥＤ光３が印加される。このＳＴＥＤ光も同様に局所的最小値部１６を測定領域１３の中心に有する。この局所的最小値部１６が局所的最小値部１４よりもさらに小さければ、これにより図５（ｄ）にしたがってルミネセンス光２の空間的割り当てをさらに強く限定することができ、これにより構造１５を結像する際の空間的分解能がさらに高められる。
【００５０】
図５に示したステップは、局所的最小値部１４ないし１６による試料の走査の際に、試料中の局所的最小値部の全ての位置に対して繰り返される。これにより試料中の蛍光体６の分布が検出され、蛍光体によりマークされた構造１５が結像される。
【００５１】
図５に示したルミネセンス阻止光１０とＳＴＥＤ光３の強度分布は純粋に例示である。これらの強度分布は、任意の他の形状を取ることができる。すなわち局所的最小値部１４ないし１６に隣接する任意の強度経過を有することができ、例えばこの強度経過はＳＴＥＤ蛍光光顕微鏡法から公知である。
【００５２】
図６は、ルミネセンス阻止光１０のパルスの時間的シーケンス、蛍光体の基底状態の生じた妨害１７、励起光１の後続のパルス、および試料からのルミネセンス光が記録される時間Δｔを示す。ここでは実線により励起光１の短いパルスが示されている。この短いパルスは妨害１７の開始後に初めて始まり、妨害１７の消失前にすでに終了する。この場合、時間Δｔは、Ｓ／Ｎ比が減衰するまでさらに拡張することができ、位置分解能がこれにより損なわれることはない。これに対して破線により励起光１の比較的長いパルスが示されている。この長いパルスも妨害１７の開始後に初めて始まるが、妨害１７の消失後に初めて終了する。それでもなお試料のルミネセンス光をルミネセンス阻止光１０の強度分布の局所的最小値部からだけ記録するために、時間Δｔは、ルミネセンス阻止光１０のパルス後の所定時間後に終了する。この時間は、蛍光体基底状態の妨害が、図５の局所的最小値部の外ではまだ消失しないように選択される。したがって時間Δｔは、典型的にはルミネセンス阻止光１０のパルスの終了の後、数ｐｓ、しばしば僅か約１ｐｓ後に終了する。
【符号の説明】
【００５３】
１  励起光
２  ルミネセンス光
３  ＳＴＥＤ光
４  誘発光
５  変調器ユニット
６  蛍光体
７  結合
８  蛍光発光の中心
９  バレル
１０  ルミネセンス阻止光
１１  衝突緩和または振動緩和
１２  試料
１３  測定領域
１４  局所的最小値部
１５  構造
１６  局所的最小値部
１７  妨害
Ｓ０  基底状態
Ｓ１  励起状態
Δｔ  時間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
0006315290.tif 000007
【図５（ｃ）】
0006315290.tif 000008
【図５（ｄ）】
0006315290.tif 000009
【図６】
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