(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することができる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、および配列番号２５からなる群より選択されるか、または
（ｂ）（ａ）に完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特徴的である、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
トウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することができる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチド配列は配列番号１またはその完全相補体に対して少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であり、当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特徴的である、組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
トウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することができる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択されるか、または
（ｂ）（ａ）に完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡ内に含まれるコンストラクトに特徴的である、組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
該ＤＮＡ分子がトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に由来し、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９として寄託されている、請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
該試料がトウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、後代トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはコモディティートウモロコシ製品を含む、請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡまたはそこに含まれるコンストラクトとハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さのポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、該プローブが、配列番号１に示すトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトに特徴的である１つ以上の接合部セグメントに、該条件下で特異的にハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーション条件下での該ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションの検出が、該試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡまたはそこに含まれるコンストラクトに特徴的であり、該ＤＮＡプローブが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項７】
第１ＤＮＡ分子と、第１ＤＮＡ分子とは異なる第２ＤＮＡ分子とを含む、一対のＤＮＡ分子であって、該第１および第２ＤＮＡ分子は、それぞれ、ＤＮＡプライマーとして機能して、増幅反応においてトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１テンプレートＤＮＡを含有する試料と共に、一緒に使用した場合に、該試料中の該トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特徴的であるアンプリコンが作製されるように、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４の十分な長さの連続ヌクレオチドのポリヌクレオチドセグメントを含み、前記アンプリコンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。
【請求項８】
第１ＤＮＡ分子と、第１ＤＮＡ分子とは異なる第２ＤＮＡ分子とを含む、一対のＤＮＡ分子であって、該第１および第２ＤＮＡ分子は、それぞれ、ＤＮＡプライマーとして機能して、増幅反応においてトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１テンプレートＤＮＡを含有する試料と共に、一緒に使用した場合に、該試料中の該コンストラクトを含むＤＮＡに特徴的であるアンプリコンが作製されるように、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４の十分な長さの連続ヌクレオチドのポリヌクレオチドセグメントを含み、該アンプリコンが、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。
【請求項９】
試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴的であるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であって、
（ａ）該試料を請求項６に記載のＤＮＡ分子と接触させること；
（ｂ）該試料および該ＤＮＡ分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付すこと；および
（ｃ）トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴的である該ＤＮＡセグメントへの該ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションを検出すること
を含み、該検出ステップが該試料中の該トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１分子の存在に特徴的である、方法。
【請求項１０】
試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴的であるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であって、
（ａ）該試料を、請求項７に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させること；
（ｂ）ＤＮＡアンプリコンを作製するのに十分な増幅反応を行うこと；および
（ｃ）該反応中の該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出すること
を含み、該ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、該アンプリコンの存在の該検出が、該試料におけるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在に特徴的である、方法。
【請求項１１】
試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１内に含まれるコンストラクトに特徴的であるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であって、
（ａ）該試料を、請求項８に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させること；
（ｂ）ＤＮＡアンプリコンを作製するのに十分な増幅反応を行うこと；および
（ｃ）該反応中の該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出すること
を含み、該ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、該アンプリコンの存在の該検出が、該試料におけるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡ内に含まれる該コンストラクトの存在に特徴的である、方法。
【請求項１２】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子を含む、トウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１３】
グリホサート除草剤処置に対して耐性である、請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１４】
Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種の食物に入れて提供された場合に殺虫性である、請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１５】
該Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種が、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（ブラジリアンコーンルートワーム、ＢＺＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーンルートワーム複合体、ＢＣＲ）、およびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）からなる群より選択される、請求項１４に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１６】
該トウモロコシ植物がさらに、該イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物の任意の世代の後代植物と規定される、請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１７】
該トウモロコシ植物が、少なくとも片方はイベントＭＯＮ８７４１１を含む親から育種された雑種である、請求項１６に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１８】
該トウモロコシ植物が、ＤＡＳ−５９１２２−７；ＭＯＮ８９０３４；ＭＯＮ８８０１７；ＭＩＲ６０４；ＭＯＮ８７４２７；ＴＣ１５０７；５３０７；ＤＡＳ−０６２７５−８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；およびＭＩＲ１６２からなる群より選択されるトランスジェニックイベントをさらに含む、請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項１９】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子を含む、トウモロコシ種子。
【請求項２０】
検出可能な量の、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトにユニークなＤＮＡ分子を含むトウモロコシコモディティー製品であって、該分子が請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、トウモロコシコモディティー製品。
【請求項２１】
全粒または加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む動物用飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、コーンブラン、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシおよびトウモロコシ部分を使って生産された燃料製品からなる群より選択されるコモディティー製品とさらに規定される、請求項２０に記載のトウモロコシコモディティー製品。
【請求項２２】
ＤＮＡ増幅方法で試験した場合にテンプレートとして機能しうるＤＮＡを含むトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分であって、該テンプレートを使った該ＤＮＡ増幅方法を実行することで、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡまたはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的であるアンプリコンが作製され、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９として寄託されており、該アンプリコンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、トウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。
【請求項２３】
グリホサート除草剤に対して耐性なトウモロコシ植物を作製する方法であって、該トウモロコシ植物のゲノムにトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を提供することを含み、該トウモロコシ植物がイベントＭＯＮ８７４１１に関してホモ接合である近交系トウモロコシ植物であるか、または少なくとも片方はイベントＭＯＮ８７４１１を含む親トウモロコシ植物のＦ１雑種後代であり、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９として寄託されている、方法。
【請求項２４】
トウモロコシコモディティー製品を生産する方法であって、
（ａ）請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分を取得すること；および
（ｂ）前記トウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分からトウモロコシコモディティー製品を生産すること
を含む、方法。
【請求項２５】
圃場における雑草の生長を管理するための方法であって、圃場でイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物を生長させること、および雑草の生長を管理するために該圃場を有効量のグリホサートで処置することを含み、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９として寄託されている、方法。
【請求項２６】
該有効量のグリホサートが１エーカーあたり０．１２５ポンド〜６．４ポンドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
検出可能な量の請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、生きていない植物材料。
【請求項２８】
検出可能な量の請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子を含む微生物。
【請求項２９】
細菌および植物細胞からなる群より選択される、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３０】
（ａ）配列番号１２に示す組換えポリヌクレオチドと
（ｂ）配列番号１４に示す組換えポリヌクレオチドと
（ｃ）配列番号１６に示す組換えポリヌクレオチドと
を含むＤＮＡ分子であって、
該組換えポリヌクレオチド配列がホスホジエステル結合によって一つに連結されている、ＤＮＡ分子。
【請求項３１】
配列番号４を含むと規定される、請求項３０に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３２】
トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物が５０〜１００パーセントを構成するトウモロコシ植物の圃場を耕作することを含む、トウモロコシ植物の圃場を保護する方法であって、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９として寄託されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２０１２年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／６４４，３６８号の利益を主張し、当該仮特許出願は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
２３０キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定したサイズ）であって２０１３年５月６日に作成された「ＭＯＮＳ３０８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子申請により本願に添付して提出され、引用により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、トランスジェニックＺｅａ  ｍａｙｓイベント（ｅｖｅｎｔ）ＭＯＮ８７４１１に関する。本イベントは、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性のための二重の作用機序と除草剤グリホサート耐性とを提供する。また本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１に関係する植物、植物部分、植物種子、植物細胞、農産物、および方法にも関係し、本イベントにユニークなヌクレオチド分子であってＺｅａ  ｍａｙｓ植物のゲノムへのトランスジェニックＤＮＡの挿入に関連して作出されたヌクレオチド分子を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）は世界の多くの地域において重要な作物であり、望ましい形質を有するトウモロコシを作製するために、この作物には生物工学の方法が応用されてきた。植物における昆虫抵抗性または除草剤耐性トランスジーンの発現は、昆虫抵抗性および／または除草剤耐性という望ましい形質を植物に付与しうるが、そのようなトランスジーンの発現は、植物染色体に導入された個々の遺伝子の発現を駆動するカセットの配向および組成、ならびにトランスジーン挿入の染色体上の位置およびゲノム結果を含む、多くの異なる因子によって左右されうる。例えば、トランスジーンの染色体挿入部位の相違を除けば他の点では同一である個々のイベント間でも、トランスジーン発現のレベルおよびパターンにはばらつきが存在しうる。いくつかのイベントの間には、望ましくない表現型上または農学上の相違も存在しうる。したがって、そのイベントを商業的目的に適したものにするのに必要な望ましい形質ならびに最適な表現型上および農業上の特徴に関して優れた性質を有するイベントを選択するためには、多数の個別植物形質転換イベントを作製し、解析することが、しばしば必要になる。そのような選択は、多くの場合、相当量の農学的データ、表現型データ、および分子データを収集することができるように、大規模な分子キャラクタリゼーションと、複数年にわたって複数の立地においてさまざまな条件下で数多くのイベントを使って行われる温室試験および圃場試験とを必要とする。その結果得られたデータおよび観察記録は、次に、商業的に好適なイベントを選択することを目指して、科学者と農学者のチームによって解析されなければならない。そのようなイベントがひとたび選択されたら、次に、その望ましい形質を植物育種方法で他の遺伝的背景に遺伝子移入し、よって望ましい形質を持ちかつ具体的局所生長条件に適切に適応したいくつかの異なる作物品種を作製するために、そのイベントを使用することができる。
【０００５】
単一の形質転換イベントを含有するトランスジェニック植物を作るには、組換えＤＮＡコンストラクトの一部をトウモロコシ細胞のゲノム中に導入し、次に、そのトウモロコシ細胞を植物へと生長させる。イベントが最初に導入されたトウモロコシ細胞を再生することでＲ０世代を作製する。Ｒ０植物とＲ０植物からの後代植物を所望する任意の形質について試験することができるが、イベントの有効性は、形質転換イベントにおける挿入部位に対してシスおよび／またはトランスの因子による影響を受けうる。イベントによって付与される表現型は、ＤＮＡコンストラクトのサイズと設計による影響も受け、それは発現カセットにおける遺伝要素の組み合わせ、トランスジーンの数、発現カセットの数、ならびにそのような要素およびそのようなカセットの配置によって変動しうる。望ましい形質を伴うイベントの同定は、トランスジーン発現の植物発生的、日周的、時間的、または空間的パターンなどといった因子によって、または外因、例えば環境的植物生長条件、水利用可能性、窒素利用可能性、熱、もしくはストレスなどによって、さらに複雑になりうる。したがって、望ましい一組の表現型形質を付与するイベントが得られるかどうかは、容易には予測することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、既存のトランスジェニックトウモロコシ植物と比べて、そしてまた、並行して構築された新しいイベントと比べて、優れた性質および成績を呈するトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を同定した。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、連結された３つの発現カセットを含有し、これらのカセットは全体として、トランスジェニックイベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコシ植物に、コーンルートワーム抵抗性およびグリホサート除草剤耐性の形質を付与する。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、コーンルートワーム病害虫種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種を含む；とりわけ病害虫が、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（ブラジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）もしくはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーンルートワーム複合体（ＢＣＲ））、またはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）である場合）に対して、２つの作用機序を提供する。二重の作用機序は冗長性を与え、病害虫防除形質に対する抵抗性が発生する可能性を著しく低減する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
イベントＭＯＮ８７４１１は、試料中のイベントの存在を検出するのに役立つユニークな特異的ＤＮＡセグメントによって特徴づけられる。試料とは、実質的に純粋なトウモロコシＤＮＡである組成物またはトウモロコシＤＮＡを含有する組成物のどちらかを指すものとする。どちらの場合も試料は生物学的試料である。すなわち試料は生体物質、例えば限定するわけではないが、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノムから直接的にまたは間接的に取得されるまたは由来するＤＮＡなどを含有する。「直接的に」とは、当業者が、トウモロコシ細胞を破砕し（または破砕されたトウモロコシ細胞を含有するトウモロコシの試料を取得し）、検出を目的としてゲノムＤＮＡを露出させることによって、トウモロコシゲノムからＤＮＡを直接的に取得できることを指す。「間接的に」とは、当業者が、トウモロコシ細胞の破砕によるかまたは破砕されたトウモロコシ細胞を含有するトウモロコシの試料を取得することによる直接的な手段以外の手段で、ターゲットまたは特異的リファレンスＤＮＡ、すなわち、特定試料中のイベントＭＯＮ８７４１１の存在に特徴的であると本明細書に記載する新規でユニークな接合部セグメントを取得できることを指す。そのような間接的手段には、ターゲット配列に特異的に結合するように設計された特定プローブのターゲットとなるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡセグメントの増幅、または測定し、特徴づけることができるＤＮＡセグメントの増幅、すなわち、アガロースゲルやアクリルアミドゲルなどといった効率のよい何らかのマトリックスによるＤＮＡの他のセグメントからの分離によって測定することができる、またはアンプリコンの直接配列解析によって特徴づけることができるか、アンプリコンをベクターにクローニングし、そのベクター内に存在する挿入されたアンプリコンのダイレクトシークエンスによって特徴づけることができるＤＮＡセグメントの増幅などがあるが、それらに限定されるわけではない。あるいは、トウモロコシ染色体内の位置であって、トランスジェニックＤＮＡはその位置でトウモロコシ染色体に挿入されており、イベントＭＯＮ８７４１１を規定するために使用することができるような位置に対応するＤＮＡのセグメントを、さまざまな手段によってクローニングしてから、特定試料または特定トウモロコシゲノムにおけるその存在について同定し、特徴づけることもできる。そのようなＤＮＡセグメントは接合部セグメントまたは接合部配列と呼ばれ、挿入ＤＮＡとトウモロコシゲノムの間の接合点がそのセグメントに含まれている限り、任意の長さの挿入ＤＮＡと近接（隣接）トウモロコシ染色体ＤＮＡとであることができる。配列番号１２および配列番号２１ならびにこれらの配列のそれぞれの逆相補体は、そのようなセグメントを代表するものである。
【０００８】
本明細書に記載する特異的配列は、イベントＭＯＮ８７４１１中に、またはそこに含まれるコンストラクト中に、ユニークに存在することができ、これらの配列の同定は、それが直接配列解析によるものであるか、そのような配列に結合したプローブを検出することによるものであるか、または本明細書に記載する特定アンプリコンのサイズと場合によっては組成とを観察することによるものであるかを問わず、それが特定トウモロコシの生殖質またはゲノム中に存在しかつ／またはトウモロコシＤＮＡを含有する特定生物学的試料中に存在するのであれば、そのような試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的である。隣接ゲノムセグメント（すなわち、挿入されたトランスジェニックＤＮＡに近接するＤＮＡ配列のトウモロコシゲノムセグメント）はわずかな変異を起こしやすいことが知られており、したがって少なくとも９９％またはそれ以上の同一性という限定は、トウモロコシゲノムごとのそのような異常または多型に関連している。ここで参照される特定の特徴的配列と比較してその全長にわたって完全に相補的なヌクレオチドセグメントは、本発明の範囲内にあるものとする。
【０００９】
本発明のヌクレオチドセグメントの、互いの相対的な、そしてトウモロコシゲノム内での位置を、図３に図解し、それぞれのヌクレオチド配列を配列番号１に示すように説明する。イベントＭＯＮ８７４１１を特徴づけ、試料中のイベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的であるヌクレオチドセグメントには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２が含まれる。試料中にこれらのヌクレオチド配列のうちの１つもしくは２つまたはそれ以上が存在することは、その試料がトウモロコシ組織を含有し、したがってトウモロコシＤＮＡを含有する場合には、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的である。
【００１０】
「由来」という単語の使用は、ある特定ＤＮＡ分子がトウモロコシ植物ゲノム中にあるか、トウモロコシ植物ＤＮＡ中に検出されうることを意味している。「検出されうる」とは、ある特定ＤＮＡセグメントが増幅され、ＤＮＡ配列解析によって、そのサイズおよび／または配列が特徴づけられるまたは解明されることが可能であることを指し、また、あるプローブがその特定ＤＮＡセグメント、すなわちターゲットＤＮＡセグメントに特異的に結合することができ、続いて、そのターゲットへのプローブの結合を検出できることも指す。本発明の特定ＤＮＡセグメントまたはターゲットＤＮＡセグメントは、挿入イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ内に存在する。
【００１１】
トウモロコシへの言及は、各実施形態が、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在に特徴的であると本明細書に記載するセグメントのうちの任意の１つ、２つまたはそれ以上に対応する検出可能な量のＤＮＡを含有する限り、トウモロコシ細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分およびトウモロコシ植物が本発明の範囲内であることを意味するものとする。トウモロコシ植物部分には、細胞；花粉；胚珠、莢（ｐｏｄ）；花および花の一部、例えば穂軸、絹糸、および雄穂；根組織；茎組織；および葉組織が含まれる。イベントＭＯＮ８７４１１の存在に特徴的であると本明細書に記載するＤＮＡのセグメントを検出可能な量で含有するトウモロコシから作られたコモディティー製品は、本発明の範囲内である。そのようなコモディティー製品には、全粒または加工トウモロコシ種子、トウモロコシまたはトウモロコシ副産物を含有する動物用飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、トウモロコシデンプン、コーンフレーク、コーンブラン、トウモロコシのバイオマスおよび茎葉、ならびにトウモロコシまたはトウモロコシ植物およびトウモロコシ植物部分から作られた場合の燃料製品および燃料副産物などを含めることができる。
【００１２】
トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のＤＮＡは、典型的には、本イベントを含有するトウモロコシ植物、トウモロコシ種子、およびトウモロコシ組織の各細胞および各染色体中に存在する。トウモロコシゲノムはメンデルの法則に従って後代に遺伝するので、トウモロコシ植物がホモ接合であるなら、各後代トウモロコシ植物および細胞は、親から後代へと生成される親染色体のそれぞれに、イベントＤＮＡを含有するであろう。しかし、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシゲノムがヘテロ接合親または雑種親である場合は、雑種親からの交配に関与する花粉の５０％および胚珠の５０％しかトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有せず、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有する後代の混合個体群をもたらすことになり、そのような雑種を使った交雑から生じる後代であって、後代に遺伝されたイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを有するもののパーセンテージは、約５０パーセントないし約７５パーセントにわたりうる。
【００１３】
本発明のＤＮＡ分子は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１挿入ＤＮＡにユニークであるか、トランスジェニック挿入ＤＮＡとその挿入ＤＮＡの一端に近接するトウモロコシゲノムＤＮＡとの間の２つの接合部にユニークでありうる。これらの分子は、それが、本明細書に記載する方法により、プローブ、プライマーを使って、また場合によってはＤＮＡ配列解析を使って解析される特定試料中に存在する場合、その試料におけるある量のイベントＭＯＮ８７４１１トウモロコシの存在に特徴的でありうる。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡにユニークであるそのようなＤＮＡ分子は、そのユニークＤＮＡ分子に特異的に結合するように設計されたプローブ核酸分子を使用し、続いてユニークＤＮＡへのそのようなプローブの結合を検出することによる方法や、プローブとして作用する少なくとも２つの異なるＤＮＡ分子（ただし、そのような分子の配列は、上述のプローブよりは特異性が多少低くてもよい）を使用する熱増幅方法による方法など、いくつかの方法で同定し、特徴づけることができる。適当なハイブリダイゼーション条件下で特定のターゲットＤＮＡをプローブまたはプライマーと接触させると標的ＤＮＡセグメントへのプローブまたはプライマーの結合が起こることになることは、当業者には理解される。
【００１４】
ＤＮＡのターゲットセグメントである本発明のＤＮＡ分子は増幅が可能であり、特定試料の増幅方法によって得られた該当する長さの１つ以上のアンプリコンとして検出される場合、それは、その試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的でありうる。そのようなＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２のそれぞれに示すヌクレオチド配列を有し、本明細書と下記の実施例においてさらに詳しく規定する。プライマー分子および／またはプローブは、対照を含む必要な試薬類と共にキットの形態で、使用説明書を同梱して提供することができる。
【００１５】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、それが微生物内にあるか、または微生物に由来する場合、本発明の範囲内であるとみなされる。微生物は、原核生物であるか真核生物であるかを問わず、あるいはＤＮＡをゲノムまたは染色体内に含有するか、染色体外ＤＮＡ構造、より一般的にはプラスミドまたはベクターと呼ばれるものに含有するかを問わず、任意の顕微鏡的細胞を包含するものとする。顕微鏡的生物には、平均的なヒトの視覚域を下回る、典型的には５０立方ミクロン未満の、より一般的には１０立方ミクロン未満の、細菌（原核生物）および、より高等な生物（真核生物）に対応する細胞が包含される。細菌は、配列番号１に示すように存在する各発現カセットのそれぞれを含む本発明の新規ＤＮＡセグメントの１つもしくは複数または全部を含有するベクターまたはプラスミドをおそらく含有するであろう、一般的な顕微鏡的微生物である。植物細胞、特にトウモロコシ植物細胞は、それらが本発明の新規ＤＮＡセグメントの任意の１つ、２つもしくはそれ以上または全部を含有する場合、本発明の範囲内である。
【００１６】
ここで使用されるプローブは、典型的には、本明細書において規定するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で機能して、特定のターゲットＤＮＡセグメント、すなわち、試料内に存在して、試料中のイベントＭＯＮ８７７４１  ＤＮＡの存在に特徴的である、ユニークなＤＮＡのセグメントと結合するのに十分な長さのＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントと特徴づけられる。そのようなプローブは、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡ中にのみ存在する単一の接合部または他の新規配列だけに結合するか、または２つ以上のそのような単一接合部セグメントに結合するように設計することができる。いずれにせよ、トウモロコシＤＮＡを含有すると疑われる特定試料中のＤＮＡ分子へのそのようなプローブの結合の検出は、その試料におけるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の存在に特徴的である。
【００１７】
プライマーは、典型的には、特定のＤＮＡターゲットセグメントを増幅する熱増幅反応において使用するための異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセグメントのペアとして提供される。ペア内の各プライマーは、増幅のために、目的のＤＮＡセグメント内またはその近くにある、かなり特異的なＤＮＡセグメントに結合するように設計される。プライマーは、それらが、次いで、１つ以上のアンプリコン（増幅されたターゲットＤＮＡセグメント）の作製をもたらす局在化した核酸配列重合の領域として働くような形で結合する。本発明において、特定の生物学的試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡのユニークなセグメントに結合するように設計されたプライマーであって、本明細書に記載の接合部セグメントの１つ以上を含有する特定のアンプリコンを増幅するものの使用、ならびにポリメラーゼ反応が完了または終結した時のそのようなアンプリコンの検出および／またはキャラクタリゼーションは、その特定試料におけるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の存在に特徴的である。当業者はこの増幅方法を熟知しており、ここで増幅の詳細を細かく説明する必要はない。
【００１８】
トウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ植物組織およびトウモロコシ種子は、配列番号１に示すように３’遠位端にある発現カセット中のイネＲｃｃ３プロモーターからのグリホサート非感受性ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ酵素の発現により、グリホサート除草剤の施用に対して非感受性である。そのような種子は圃場に播種することができる。発芽および苗条の出現の数日後に、雑草防除有効量のグリホサート除草剤を施用することができ、これは、圃場内の雑草の実質的に全てを排除するが、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシ植物の継続的生育は許すことになる。本植物は、ルートワームＤｉａｂｒｏｔｉｃａの全ての既知種のコーンルートワーム、例えば限定するわけではないが、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（ブラジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）またはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーンルートワーム複合体（ＢＣＲ））、およびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）による寄生に対して抵抗性でもある。Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種に対する抵抗性は、挿入トランスジェニックＤＮＡ内で作動的かつ共有結合的に連結された２つの異なるＤＮＡセグメントの発現に関連して生じる。すなわちｄｓＲＮＡは、配列番号１に示す挿入トランスジェニックＤＮＡの５’近位端にある発現カセット（図１に［Ｇ］配列番号１２の位置で図解するもの）から転写され、コーンルートワーム中の必須遺伝子を抑制のターゲットとする。また、コウチュウ毒性Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質は、ｄｓＲＮＡ［Ｇ］を発現するカセットと、配列番号１に示す挿入トランスジェニックＤＮＡの３’遠位端にあるカセット（図１に［Ｉ］配列番号１６によって図解するグリホサート耐性発現カセット）との間の中央にある発現カセット（図１に［Ｈ］配列番号１４の位置で示されるように配列番号１のほぼ中央にある）から発現される。ｄｓＲＮＡは、ｓｎｆ７と呼ばれる酵母オルソログ遺伝子を抑制のターゲットとし、ＣＡＭＶ  ｅ３５Ｓプロモーターから発現される。一方、Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＰＩＩＧプロモーターから発現される。これらのｄｓＲＮＡおよびＣｒｙ３Ｂｂタンパク質は、コーンルートワーム種にとっては毒性作用物質である。
【００１９】
ｄｓＲＮＡおよびＣｒｙ３Ｂｂ毒性作用物質の発現を駆動するプロモーターは分岐的に置かれているので、各毒性作用物質の各プロモーターからの発現は、２つのプロモーター間の中央にある点から離れていく。すなわち、各発現カセットの転写は反対の向きに進行し、一点には集まらない。グリホサート耐性ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ発現カセットは、Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質の発現を駆動するカセットの下流、すなわち配列番号１に示すように３’端に近い方、３’遠位側にある。Ｃｒｙ３ＢｂとＥＰＳＰＳの発現を駆動するカセットはタンデム配向の転写（Ｃｒｙ３ＢｂがＥＰＳＰＳの上流）を使ってそれぞれのタンパク質を生産し、同じ配向で、ただし各々別個のプロモーターから、それぞれ転写される。ｄｓＲＮＡ発現カセットとグリホサート耐性カセットを無傷のまま、トウモロコシゲノムへの挿入を意図したＤＮＡセグメントの遠位端に置いておき、Ｃｒｙ３Ｂｂカセットの配向をイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡ内に存在する設計とは反転または逆転させた、他の変異型コンストラクトを作製した。これらの変異型コンストラクトでは、Ｃｒｙ３Ｂｂの発現を駆動するのに、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＰＩＩＧプロモーターまたはイネＲｃｃ３プロモーターを利用した。
【００２０】
Ｃｒｙ３Ｂｂ発現カセットのこれらの変異型コンストラクト／配向だけを含有するトランスジェニックイベントを、イベントＭＯＮ８７４１１、ならびに現在市販されているイベントＭＯＮ８６３（Ｃｒｙ３Ｂｂ発現カセットだけを含有するもの）、ＭＯＮ８８０１７（ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ発現カセットに作動的に連結されたＣｒｙ３Ｂｂ発現カセットを含有するもの）、およびＤＡＳ−５９１２２−７（作動的に連結された３つの発現カセットを含有し、そのうちの２つが二重Ｂｔ毒素コンポーネントＣｒｙ３４およびＣｒｙ３５をタンデムに発現すると共に、１つがグルホシネート耐性を付与するもの）と比較した。以下に実施例で説明する結果は、イベントＭＯＮ８７４１１がＣｒｙ３Ｂｂタンパク質の根指向的発現に関して優れた性質を呈すること、そしてイベントＭＯＮ８７４１１を生成させるために使用したコンストラクトを使って作製したトランスジェニックイベントの多くは、他のコンストラクトを使って作製した他のイベントよりも、それぞれコーンルートワームの有効な防除を呈する可能性が高いことを示している。
【００２１】
イベントＭＯＮ８７４１１に対応するＤＮＡをそれぞれ含有する、本発明のトウモロコシ植物およびその部分、例えば種子は、本発明の範囲内である。そのような植物はコーンルートワームの寄生に対して抵抗性であり、除草剤グリホサートの施用に対して非感受性である。そのような植物には、ＭＯＮ８７４１１アレルを１つしか含有しない雑種、すなわちイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに対応する座位に関してヘテロ接合と特徴づけられるゲノムを含有する雑種が包含される。そのような雑種は、雑種強勢および他の農業上望ましいトウモロコシの性質を確保するために、望ましい生殖質を使った育種によって作製される。雑種はいくつもの方法によって作製することができるが、好ましい一方法では、イベントＭＯＮ８７４１１特異的アレルを、どちらの染色体でも、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡが挿入された座位に含有する第１近交系（ホモ接合）親を利用し、その第１近交系を、ＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有しない第２近交系と交配する。どちらの親近交系品種も、後代種子、すなわち雑種種子に望まれる１つ以上の有利な性質を有するであろう。
【００２２】
イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有する植物に何らかの追加形質を付与するトランスジェニック特性またはトランスジェニックアレルは、特に望ましい。そのようなトランスジェニックアレルとして、コーンルートワーム抵抗性を付与する他のトランスジェニックイベント、例えば限定するわけではないが、ＤＡＳ−５９１２２−７；ＭＩＲ６０４；および５３０７などのイベントが挙げられる。これらのイベントはそれぞれ追加のコーンルートワーム毒性作用物質を与える（ＤＡＳ−５９１２２−７は、ルートワーム毒性を呈するＰＳ１４９Ｂ１（Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５）およびグルホシネートに対する除草剤耐性を与え；ＭＩＲ６０４は、ルートワーム毒性を呈する修飾Ｃｒｙ３Ａａを与え；イベント５３０７は、ルートワーム毒性を呈するＦＲ８ａ遺伝子を与える）。これらのような追加のコーンルートワーム抵抗性形質を与えることにより、与えられたコーンルートワーム毒性作用物質のいずれか一つに対する抵抗性が発生する可能性を減少させうる。他の望ましい形質には、収量およびストレス抵抗性または耐性形質、窒素固定形質、水の使用を調整する形質、真菌寄生に対する抵抗性、ジカンバ（ＭＯＮ８７４２７）、グルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性、ならびに鱗翅類寄生に対する抵抗性などがある。鱗翅類寄生抵抗性形質は当技術分野において提供されており、これには、トランスジェニックトウモロコシイベント（およびそれぞれの鱗翅類活性タンパク質）ＭＯＮ８１０（Ｃｒｙ１Ａｂ）、ＭＯＮ８９０３４（Ｃｒｙ１Ａ．１０５およびＣｒｙ２Ａｂ）；ＴＣ１５０７（Ｃｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ１Ｆａ）；ＤＡＳ−０６２７５−８（ＴＣ−６２７５とも呼ばれる）（Ｃｒｙ１Ｆａおよびｂａｒ（グリホシネート耐性を与える））；ＭＩＲ１６２（Ｖｉｐ３Ａａ）、ＢＴ１７６（Ｃｒｙ１Ａｂ）；およびＢＴ１１（Ｃｒｙ１Ａｂ）などがある。これらの形質、特にイベントＭＯＮ８７４１１形質に対応する昆虫抵抗性形質、他の列挙したコーンルートワーム抵抗性形質、または鱗翅類抵抗性形質の何らかの組み合わせまたは全部を単一の植物に与えることに代わる選択肢は、これらをさまざまな組み合わせの種子ブレンドとして提供することであるだろう。この場合、ブレンド中の種子のうち、あるものは、ＭＯＮ８７４１１形質および列挙したコウチュウ抵抗性形質のみの何らかの組み合わせを含有し、地下でコーンルートワームの寄生を防止するように協同して作用する一方、ブレンド中の他の種子は鱗翅類抵抗性形質だけを含有し、地上でトウモロコシの鱗翅類寄生に対する抵抗性を付与する。このようにして、ブレンド中の種子は互いにとってのリフュージ（ｒｅｆｕｇｅ）になる。すなわち、コウチュウ防御種子および植物は鱗翅類抵抗性を付与する植物にとってのリフュージとして働き、逆もまた同じである。しかし典型的には、これらの形質は、次に述べるような何らかの形質の組み合わせまたはパッケージとして提供される。すなわち、ＭＯＮ８７４１１形質は、圃場の作物に病害虫抵抗性の完全なパッケージが提供されるように、鱗翅類抵抗性形質の１つ以上との交配により、単一の植物中に一緒に提供される。そして、わずかな割合の種子（おそらく１〜２０パーセントま���はその間の任意の数字、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９パーセント）には、除草剤耐性だけが付与されていて、それらは病害虫防御形質を欠き、圃場には、病害虫抵抗性形質を付与された種子と共にランダムに混植されるか、区画化された（別個の）作物群落として植え付けられ、それらが、地上でトウモロコシ植物を攻撃する病害虫にとっても地下でトウモロコシ植物を攻撃する病害虫にとっても、リフュージとして働くことになるだろう。
【００２３】
イベントＭＯＮ８７４１１に挿入されたコンストラクトにはＥＰＳＰＳ発現カセットに関連して特別な利点がある。第１に、このカセットの存在は、コンストラクトが挿入されているトランスジェニックイベントの選択を容易にする。第２に、このカセットは、イベントＭＯＮ８７４１１に対応する種子が植え付けられた圃場における雑草の防除を可能にする。そのようなＭＯＮ８７４１１植物が入っている圃場には、グリホサートに感受性である雑草の、圃場における生長を管理するために、有効量のグリホサートを散布することができる。グリホサートに感受性でない雑草については、上述のように、他の除草剤に対する耐性、例えばジカンバに対する耐性またはグルホシネートに対する耐性などをもたらす他のトランスジェニックイベントを、イベントＭＯＮ８７４１１と共に単一の雑種に導入することで、除草剤グリホサート、ジカンバ、またはグルホシネートのうちの２つ以上を施用することによる圃場の雑草を防除するための有効な手段を提供することができる。というのも、これらの除草剤のうちの２つ以上に対して耐性を呈する雑草が存在する可能性は考えがたく、上述の場合、トウモロコシ作物は、上述のような除草剤の併用施用に対して抵抗性を呈する雑種からなるだろうからである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノムにおけるトランスジェニックインサートの概略図：［Ａ］は、トウモロコシＬＨ２４４のゲノムに組み込まれたトランスジェニックＤＮＡインサートと挿入ＤＮＡに隣接する５’および３’ゲノムＤＮＡとの連続配列である配列番号１を表す；［Ｂ］および［Ｃ］は、それぞれイベントＭＯＮ８７４１１の５’および３’トランスジーン／ゲノムＤＮＡ接合部配列を形成する配列番号２および３の相対的位置に対応する；［Ｄ］は、ゲノムに組みこまれてイベントＭＯＮ８７４１１をもたらすトランスジェニックＤＮＡインサートの配列である配列番号４を表す；［Ｅ］は、それぞれトランスジェニック挿入ＤＮＡの末端と隣接ゲノムＤＮＡとの間の５’接合部をまたぐ配列番号５、配列番号６および配列番号７の相対的位置に対応する；［Ｆ］は、それぞれトランスジェニック挿入ＤＮＡの末端と隣接ゲノムＤＮＡとの間の３’接合部をまたぐ配列番号８、配列番号９および配列番号１０の相対的位置に対応する；［Ｇ］、［Ｈ］および［Ｉ］は、それぞれ、トウモロコシ植物ゲノムに挿入されてイベントＭＯＮ８７４１１をもたらすトランスジェニックＤＮＡコンストラクトに対応する３つの異なる発現カセットを表す；［Ｊ］および［Ｋ］は、イベントＭＯＮ８７４１１の接合部に対応するオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、およびＤＮＡアンプリコンを表す。
【図２】ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）をターゲットとする２つの植物内保護物質（ＰＩＰ）カセットおよび１つの除草剤耐性カセットを含む、最高３つの異なるカセットを発現するように工学的に操作された、１１の異なるＤＮＡコンストラクト（４１７、４１６、４１８、４１９、４０２、４０３、４０４、４２３、４０５、４０６、および８９０）の図解。２つのＰＩＰカセットは、（ａ）Ｄｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ２４０マー逆方向反復用の発現カセット、および（ｂ）Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質用の発現カセットを含む。図示したコンストラクトのそれぞれは、これらの発現カセットをさまざまな順序および配向で含む。コンストラクト４０５および４０６は除草剤耐性カセットを含有せず、コンストラクト８９０はＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ２４０マー逆方向反復用の単一発現カセットだけを含む。３つのコンストラクトは、左境界（ＬＢ）から右境界（ＲＢ）までに、全部で１６の遺伝要素、すなわち［１］ＬＢ；［２］Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９  ３’ＵＴＲ；［３］２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ逆方向反復遺伝子；［４］トウモロコシＤｎａＫイントロン；［５］ＣａＭＶ  ３５Ｓリーダー；［６］ｅＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；［７］トウモロコシＰＩＩＧプロモーター；［８］コムギＬｈｃｂ１リーダー；［９］イネＡｃｔ１イントロン；［１０］ｃｒｙ３Ｂｂ  ＯＲＦ；［１１］コムギＨｓｐ１７  ３’ＵＴＲ；［１２］イネＴｕｂＡ（プロモーター、リーダー、イントロン）；［１３］ＣＴＰ；［１４］ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ；［１５］イネＴｕｂＡ  ３’ＵＴＲ；および［１６］ＲＢを含む。
【図３】［Ａ］〜［Ｎ］および［ａａ］〜［ｍｍ］は、作動的に連結された要素および隣接トウモロコシゲノム、ならびにそれらがトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１ゲノム中のトランスジェニックＤＮＡ挿入位置内に存在する時の、それらの互いの相対的な位置を図解している。以下の説明では、配列番号１に示す要素のそれぞれについて、組成、機能および位置を特定する。  ［Ａ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１〜５００は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中でトランスジェニック挿入ＤＮＡに近接しているトウモロコシゲノムＤＮＡに対応し、この例では、これを随意にトランスジェニック挿入ＤＮＡの５’端に割り当てている。  ［Ｂ］配列番号１に示すヌクレオチド位置８０７〜１４３９は、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットＥ９  ３’転写終結およびポリアデニル化シグナルの逆相補配列に対応する。  ［Ｃ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１４６９〜２０９８は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種の食物に入れて提供された場合に、Ｓｎｆ７タンパク質をコードする酵母遺伝子のＤｉａｂｒｏｔｉｃａ種オルソログを抑制のターゲットとするように設計された、２４０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡと１５０ヌクレオチドのヘアピン構造に折りたたまれるＲＮＡ分子として発現するように設計された、逆相補配列に対応する。Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｎｆ７オルソログ遺伝子の一部分に対応する第１の２４０ヌクレオチドセグメントは、配列番号１に示すヌクレオチド位置１４６９〜１７０８に与えられ、第１セグメントの逆相補体に対応する第２の２４０ヌクレオチドセグメントは、配列番号１に示すヌクレオチド位置１８５０〜２０９８に示されており、第１セグメントと第２セグメントは配列番号１に示すヌクレオチド位置１７０９〜１８５８にある１５０ヌクレオチドのスペーサーによって作動的に連結されている。  ［Ｄ］配列番号１に示すヌクレオチド位置２１３５〜２９３８は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｄｎａＫ遺伝子に由来するイントロンの逆相補配列に対応する。  ［Ｅ］配列番号１に示すヌクレオチド位置２８３９〜３２９８は、カリフラワーモザイクウイルス強化３５Ｓプロモーター配列の逆相補体および非翻訳５’リーダー配列に対応する。このプロモーター、付随の非翻訳リーダー、イントロン要素［Ｄ］ならびに転写終結およびポリアデニル化要素［Ｂ］は、トウモロコシ植物細胞における要素［Ｃ］の発現を調節する。  ［Ｆ］配列番号１に示すヌクレオチド位置３５８６〜４５３４は、Ｚｅａ  ｍａｙｓの物理的障害誘導タンパク質（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（Ｚｍ．ＰＩＩＧ）由来のプロモーター配列に対応する。このプロモーター、付随の非翻訳リーダー［Ｇ］、イントロン要素［Ｈ］ならびに転写終結およびポリアデニル化要素［Ｊ］は、要素［Ｉ］の発現を調節する。このプロモーターは、プロモーター［Ｅ］に対して、各プロモーター（［Ｅ］と［Ｆ］）が各々の要素（［Ｃ］および［Ｉ］）の分岐発現を駆動するような配向にある（図２のブロック矢印を参照されたい；図２では、矢印が、表示した各プロモーターからの発現の方向に、それぞれのプロモーター（［Ｅ］および［Ｆ］）を表現している）。  ［Ｇ］配列番号１に示すヌクレオチド位置４５４１〜４６０１は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ集光複合体ｂ１遺伝子（Ｔａ．Ｌｈｃｂ１）由来の非翻訳５’リーダー配列に対応する。  ［Ｈ］配列番号１に示すヌクレオチド位置４６１８〜５０９７は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａアクチン−１遺伝子（Ｏｓ．Ａｃｔ１）由来のイントロン配列に対応する。  ［Ｉ］配列番号１に示すヌクレオチド位置５１０７〜７０６８は、Ｃｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒性タンパク質（ｃｒｙ３Ｂｂ）をコードするヌクレオチド配列に対応する。コードされているＣｒｙ３Ｂｂタンパク質は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ（コーンルートワーム）種の食物に入れて提供された場合に殺虫性である。  ［Ｊ］配列番号１に示すヌクレオチド位置７０８８〜７２９７は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ熱ショックタンパク質１７（ＨＳＰ１７）転写終結およびポリアデニル化シグナルの配列に対応する。  ［Ｋ］配列番号１に示すヌクレオチド位置７３４６〜９５２６は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａαチューブリン−３遺伝子（ＴｕｂＡ−３）由来の連続プロモーター−リーダー−イントロン配列に対応する。このプロモーターは、付随のリーダーおよびイントロン、ならびに転写終結およびポリアデニル化要素［Ｍ］と共に、要素［Ｌ］の発現を調節する。  ［Ｌ］配列番号１に示すヌクレオチド位置９５３１〜１１１２６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ細胞質ターゲティングペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＣＴＰ；ヌクレオチド位置９５３１〜９７５８）の配列、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＰ４由来のＥＰＳＰＳの配列（ヌクレオチド位置９７５９〜１１１２６）に対応する。この配列がトウモロコシ植物細胞中で転写され、タンパク質に翻訳されると、ＣＴＰがＥＰＳＰＳに作動的に連結される。イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物細胞中で発現すると、このＣＴＰ−ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートに対する耐性を提供する。  ［Ｍ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１１３４〜１１７１５は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａαチューブリン−３遺伝子（ＴｕｂＡ−３）転写終結およびポリアデニル化シグナルの配列に対応する。  ［Ｎ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１７４９〜１２２４８は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中でトランスジェニック挿入ＤＮＡに近接しているトウモロコシゲノムＤＮＡに対応し、この例では、これを随意にトランスジェニック挿入ＤＮＡの３’端に割り当てている。  ［ａａ］配列番号１に示すヌクレオチド位置５０１〜８０６は、４１７コンストラクトのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピン左境界配列のうち、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサートの随意に割り当てられた５’端において、ゲノムに近接している部分に対応する。配列番号１に示す［ａａ］の５’端は要素［Ａ］の３’端に連結されて、配列番号５  、配列番号６、配列番号７、および配列番号２１に包含されるユニークな５’トランスジェニック挿入ＤＮＡ／トウモロ���シゲノム接合部を形成する。要素［ａａ］の３’端は要素［Ｂ］の５’端に連結されて、配列番号４１に包含されるトランスジェニック挿入ＤＮＡ内のユニークな接合部を形成する。  ［ｂｂ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１４４０〜１４６８は、要素［Ｂ］と［Ｃ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｂｂ］の５’端は要素［Ｂ］の３’端に連結され、要素［ｂｂ］の３’端は要素［Ｃ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４２に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｃｃ］配列番号１に示すヌクレオチド位置２０９９〜２１３４は、要素［Ｃ］と［Ｄ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｃｃ］の５’端は要素［Ｃ］の３’端に連結され、要素［ｃｃ］の３’端は要素［Ｄ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４３に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｅｅ］配列番号１に示すヌクレオチド位置３２９９〜３５８５は、要素［Ｅ］と［Ｆ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｅｅ］の５’端は要素［Ｅ］の３’端に連結され、要素［ｅｅ］の３’端は要素［Ｆ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４４に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｆｆ］配列番号１に示すヌクレオチド位置４５３５〜４５４０は、要素［Ｆ］と［Ｇ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｆｆ］の５’端は要素［Ｆ］の３’端に連結され、要素［ｆｆ］の３’端は要素［Ｇ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４５に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｇｇ］配列番号１に示すヌクレオチド位置４６０２〜４６１７は、要素［Ｇ］と［Ｈ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｇｇ］の５’端は要素［Ｇ］の３’端に連結され、要素［ｇｇ］の３’端は要素［Ｈ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４６に包含される接合部を形成するが、この接合部はイベントＭＯＮ８７４１１にユニークではない。  ［ｈｈ］配列番号１に示すヌクレオチド位置５０９８〜５１０６は、要素［Ｈ］と［Ｉ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｈｈ］の５’端は要素［Ｈ］の３’端に連結され、要素［ｈｈ］の３’端は要素［Ｉ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４７に包含される接合部を形成するが、この接合部はイベントＭＯＮ８７４１１にユニークではない。  ［ｉｉ］配列番号１に示すヌクレオチド位置７０６９〜７０８７は、要素［Ｉ］と［Ｊ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｉｉ］��５’端は要素［Ｉ］の３’端に連結され、要素［ｉｉ］の３’端は要素［Ｊ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４８に包含される接合部を形成するが、この接合部はイベントＭＯＮ８７４１１にユニークではない。  ［ｊｊ］配列番号１に示すヌクレオチド位置７２９８〜７３４５は、要素［Ｊ］と［Ｋ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｊｊ］の５’端は要素［Ｊ］の３’端に連結され、要素［ｊｊ］の３’端は要素［Ｋ］の５’端に連結され、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４９に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｋｋ］配列番号１に示すヌクレオチド位置９５２７〜９５３０は、要素［Ｋ］と［Ｌ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｋｋ］の５’端は要素［Ｋ］の３’端に連結され、要素［ｋｋ］の３’端は要素［Ｌ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号５０に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｌｌ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１１２７〜１１１３３は、要素［Ｌ］と［Ｍ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｌｌ］の５’端は要素［Ｌ］の３’端に連結され、要素［ｌｌ］の３’端は要素［Ｍ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号５１に包含されるユニークな接合部を形成する。  ［ｍｍ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１７１６〜１１７４８は、４１７コンストラクトのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリン右境界配列のうち、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサートの随意に割り当てられた３’端において、ゲノムに近接している部分に対応する。配列番号１に示す［ｍｍ］の５’端は要素［Ｍ］の３’端に連結され、要素［ｍｍ］の３’端は要素［Ｎ］の５’端に連結されて、配列番号５２に包含されるユニークなトランスジェニック挿入ＤＮＡ／トウモロコシゲノム接合部を形成する。
【図４】コーンルートワーム毒性作用物質の発現を駆動する分岐プロモーターの効力が、コーンルートワーム毒性作用物質の発現を駆動するタンデム配向のプロモーターを持つベクターと比べて高いことを示すために試験したベクターの図解。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１中の、挿入トランスジェニックＤＮＡに隣接（近接）する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレオチド）、挿入トランスジェニックＤＮＡ（１１，２４８ヌクレオチド）、および挿入トランスジェニックＤＮＡに隣接（近接）する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレオチド）を表す。
配列番号２は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（２６３ヌクレオチド）とを表す。
配列番号３は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（１５ヌクレオチド）と挿入ゲノムＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレオチド）とを表す。
配列番号４は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド配列であり、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入ゲノムＤＮＡ（１１２４８ヌクレオチド）を表す。
配列番号５は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５０ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（２６３ヌクレオチド）とを表す。
【００２６】
配列番号６は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する’５ゲノムＤＮＡのセグメント（１１０ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（２６３ヌクレオチド）とを表す。
配列番号７は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（１４５ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（２６３ヌクレオチド）とを表す。
配列番号８は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡのセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（３４ヌクレオチド）とを表す。
配列番号９は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡのセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（９０ヌクレオチド）とを表す。
配列番号１０は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡのセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（２５５ヌクレオチド）とを表す。
【００２７】
配列番号１１は、酵母Ｓｎｆ７にオルソロガスなＥＳＣＲＴ−ＩＩＩ複合体サブユニットをコードするＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム）由来のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、逆方向反復ＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作された組換え遺伝子を含むＤＮＡ発現カセットのアンチセンス鎖を表すヌクレオチド配列である。逆方向反復ＤＮＡセグメントは位置６６３〜９０２と位置１２９２〜１０５３とに対応する。これらの逆方向反復ＤＮＡ配列は配列番号１１のヌクレオチド位置１５１〜３９０のヌクレオチド配列に対応する。
配列番号１３は、配列番号１２に示すＤＮＡから転写されるリボヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、コーンルートワーム毒性Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質をコードし発現するように工学的に操作された組換え遺伝子を含むＤＮＡ発現カセットのセンス鎖を表すヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、配列番号１４の位置１５２２〜３４８０に対応するポリヌクレオチドのアミノ酸配列翻訳であって、コーンルートワーム毒性Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質を表す。
【００２８】
配列番号１６は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質をコードし発現するように工学的に操作された組換え遺伝子を含むＤＮＡ発現カセットのセンス鎖を表すヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、配列番号１６の位置２１８６〜３７８１に対応するポリヌクレオチドのアミノ酸配列翻訳であって、除草剤グリホサートに対して非感受性を呈するＥＰＳＰＳタンパク質を表す。
配列番号１８は、ＳＱ２７０１１と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置４６２〜４９０に対応するヌクレオチド配列と同一である。
配列番号１９は、ＰＢ３５５２と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置５０２〜５１５に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。ＰＢ３５５２は、一対の熱増幅プライマー、例えばＳＱ２７０１１およびＳＱ９０８５と組み合わせて使用するために、６−カルボキシフルオレセイン成分（６−ＦＡＭ（商標））で５’標識し、クエンチャー成分で３’標識することができ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有する生物学的試料中のイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在を検出するために、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＤＮＡ増幅方法で使用することができる。
配列番号２０は、ＳＱ９０８５と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置５１６〜５４１に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００２９】
配列番号２１は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置４６２〜５４１に対応する。この配列を呈するアンプリコンは、一対の熱増幅プライマー、例えばＳＱ２７０１１およびＳＱ９０８５を使って作製することができる。
配列番号２２は、ＳＱ２７０６６と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置１１７１０〜１１７２８に対応するヌクレオチド配列と同一である。
配列番号２３は、ＰＢ１１３００と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置１１７３１〜１１７５５に対応するヌクレオチド配列と同一である。ＰＢ１１３００は、６−カルボキシフルオレセイン成分（６−ＦＡＭ（商標））で５’標識し、クエンチャー成分で３’標識することができる。こうして標識されたＰＢ１１３００は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイでイベントＭＯＮ８７４１１を検出するために、一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ２７０６６およびＳＱ２６９７７と組み合わせて使用することができる。
配列番号２４は、ＳＱ２６９７７と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置１１７５６〜１１７８４に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
配列番号２５は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチド配列であり、配列番号１の位置１１７１０〜１１７８４に対応する。この配列を呈するアンプリコンは、一対のプライマー、例えばＳＱ２７０６６およびＳＱ２６９７７で増幅することができ、イベントＭＯＮ８７４１１に特徴的である。
【００３０】
配列番号２６は、ＤＮＡコンストラクト＃４１７を表すヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、ＤＮＡコンストラクト＃４１６を表すヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、ＤＮＡコンストラクト＃４１８を表すヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、ＤＮＡコンストラクト＃４１９を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、ＤＮＡコンストラクト＃４０２を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、ＤＮＡコンストラクト＃４０３を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、ＤＮＡコンストラクト＃４０４を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、ＤＮＡコンストラクト＃４２３を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、ＤＮＡコンストラクト＃４０５を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、ＤＮＡコンストラクト＃４０６を表すヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号３６は、ＤＮＡコンストラクト＃８９０を表すヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、イベントＭＯＮ８７４１１の野生型アレルを表すＬＨ２４４トウモロコシ植物のヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列を呈するアンプリコンは一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ２７０１１およびＳＱ２６９７７で作製することができ、イベントＭＯＮ８７４１１の野生型アレルに特徴的である。
配列番号３８は、ＳＱ２０２２１と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、ＰＢ１００６５と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ＰＢ１００６５は、ＶＩＣ（商標）で５’標識し、クエンチャー成分で３’標識することができる。こうして標識されたＰＢ１００６５は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイでトウモロコシの内在性遺伝子のセグメントの存在を検出するために、一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ１００６５およびＳＱ２０２２２と組み合わせて使用することができる。
配列番号４０は、ＳＱ２０２２２と呼ばれる合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号４１〜５２は、配列番号１の領域のヌクレオチド配列であり、各配列番号は、図３に関する簡単な説明で詳述した介在配列と発現カセット要素とによって形成される接合部を包含する。
【００３２】
詳細な説明
本発明者らは、既存のトランスジェニックトウモロコシ植物と比べて優れた性質および成績を呈するトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を同定した。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、作動的に連結された３つの発現カセットを含有し、これらのカセットは全体として、トランスジェニックイベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコシ植物に、コーンルートワーム抵抗性およびグリホサート除草剤耐性の形質を付与する。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、コーンルートワーム病害虫種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種を含む；とりわけ病害虫がＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ（ブラジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）もしくはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーンルートワーム複合体（ＢＣＲ）、またはＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）である場合）に対して、２つの作用機序を提供する。当技術分野では、他に、一つずつ付与されるさまざまな実施形態を与えるトランスジェニックトウモロコシイベント、例えばＭＯＮ８６３（Ｃｒｙ３Ｂｂ殺虫性毒素タンパク質の発現によってコーンルートワームに対する抵抗性の形質を付与するもの）、またはトウモロコシイベントＭＯＮ８８０１７（Ｃｒｙ３Ｂｂ殺虫性毒素タンパク質の発現によるコーンルートワームに対する抵抗性の形質とグリホサート非感受性ＥＰＳＰＳの発現によるグリホサート除草剤に対する抵抗性の形質とを付与するもの）やトウモロコシイベントＤＡＳ  ５９１２２−７（Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５とも呼ばれる二元Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素ＰＳ１４９Ｂ１の発現によるコーンルートワームに対する抵抗性の形質と除草剤グルホシネートに対する耐性の形質とを付与するもの）の場合のように、２つ以上の形質を与えるトランスジェニックトウモロコシイベントも言及されている。他に、トウモロコシイベントＭＯＮ８８０１７またはＤＡＳ  ５９１２２−７によって付与される形質を、ルートワームの生存にとって不可欠なコーンルートワーム遺伝子を抑制のターゲットとするｄｓＲＮＡの発現によってもたらされるコーンルートワーム抵抗性の形質を付与するトランスジェニックトウモロコシイベント（ＵＳ７，９４３，８１９）と交配することによる組み合わせも開示されている。そのような組み合わせには、トウモロコシゲノム内の複数の異なる座位および複数の染色体上に位置するこれら複数の形質を、まとめて単一のトウモロコシ植物に導入し、これらの形質を、何百とはいわないまでも何十という異なるトウモロコシ生殖質品種に、雑種として維持することの必要に関連する課題がつきまとう。そのような課題の解決策は、これらの形質の���み合わせを、まとめて単一の座位に含めることであるだろう。本発明者らは、ここに、この課題に対するそのような解決策の一つを、共有結合で連結された３つの発現カセットをトウモロコシゲノム内の単一の座位に併せもつトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の形態で提供するものであり、これらの発現カセットは、トランスジェニックイベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコシ植物に、コーンルートワーム抵抗性およびグリホサート除草剤耐性の形質を付与する。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の使用により、トウモロコシ栽培者は、ａ）２つの異なるコーンルートワーム抵抗性作用機序を用意することによる、コーンルートワーム幼虫に起因する経済的損失からの保護、およびｂ）広スペクトル雑草防除のためにトウモロコシ作物にグリホサート含有農業用除草剤を施用することができることという、大きな利益を得る。加えて、コーンルートワーム耐性形質とグリホサート耐性形質をコードするトランスジーンは同じＤＮＡセグメント上で連結されており、ＭＯＮ８７４１１のゲノム中の単一座位に見いだされるので、それが育種効率の強化をもたらし、また育種個体群およびその後代においてトランスジーンインサートを追跡するために分子マーカーを使用することを可能にする。
【００３３】
トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、プラスミドコンストラクトｐＭＯＮ１２０４１７による近交系トウモロコシ系統のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロセスによって作製された。このプラスミドコンストラクトは、連結された植物発現カセットを、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳタンパク質、ならびにＣｒｙ３Ｂｂタンパク質、およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞がコーンルートワームの食物に入れて提供された時にコーンルートワームの細胞において必須遺伝子を抑制のターゲットとするｄｓＲＮＡのトウモロコシ植物細胞における発現に必要な調節遺伝要素と共に含有する。トウモロコシ細胞を完全なトウモロコシ植物に再生させ、植物の個体群から、植物発現カセットの完全性ならびにグリホサートおよびコーンルートワーム幼虫食害に対する抵抗性を示す個々の植物を選択した。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中に存在する連結された植物発現カセットをそのゲノムに含有するトウモロコシ植物は、本発明の一態様である。
【００３４】
トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡを詳細な分子解析によって特徴づけた。これらの解析には、インサート数（トウモロコシゲノム内の組み込み部位の数）、コピー数（１つの座位内のＴ−ＤＮＡのコピー数）、およびトランスジェニック挿入ＤＮＡの完全性が含まれた。トウモロコシゲノムに挿入されてイベントＭＯＮ８７４１１を生じさせる連結された３つの発現カセットを含有するプラスミドコンストラクトは、トウモロコシゲノムにも、トウモロコシの他のベクターもしくはトランスジェニックイベントにも、それ以外にも、自然に出現することは知られていない複数のセグメント（いくつかの発現カセットを製作または構築するために使用された要素間の接合部配列）を含有する（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２に示す配列）。加えて、イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入トランスジェニックＤＮＡを生じさせる形質転換イベントは、ここに、トウモロコシゲノム中の単一座位への挿入であって、挿入ＤＮＡとトウモロコシゲノムＤＮＡとの間に、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシゲノムだけにユニークたりうる十分な長さを有する、２つの新しい座位または接合部配列（追加の接合部配列）をもたらすものであると特徴づけられる。これらの接合部配列は、トウモロコシ細胞、組織、種子および植物または植物製品（コモディティー製品）におけるイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在を検出するのに役立つ。イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシ細胞、種子、植物部分または植物組織を含有するか含有すると疑われる生物学的試料中のこれらさまざまな接合部セグメントの存在を同定するために開発されたＤＮＡ分子プローブおよびプライマー対を、本明細書に記載する。データは、イベントＭＯＮ８７４１１が単一のＴ−ＤＮＡ挿入を持ち、挿入されたトランスジェニックＤＮＡが１コピーであることを示している。トウモロコシゲノムへの植物形質転換プラスミドからのトランスジェニックＤＮＡ導入に使用されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ左および右境界領域の一部分以外の形質転換ベクターｐＭＯＮ１２０７１４からの追加要素は、イベントＭＯＮ８７４１１中に同定されていない。最後に、試料中の上記イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在に特徴的である特異的アンプリコンを作製する熱増幅とＤＮＡ配列解析とを行って、随意に割り当てられた５’および３’インサート−植物ゲノム接合部を決定し、インサート内の要素の構成を確認し、トウモロコシ植物イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入トランスジーンＤＮＡの全ＤＮＡ配列（配列番号１）を決定した。
【００３５】
トランスジェニックイベントＭＯＮ８７４１１の作製に使用したコンストラクトを使って数十のトランスジェニックイベントを作製した。また、異なるコンストラクトを作製し、それらを使って、何十という他のトランスジェニックトウモロコシイベントを作製し、それらをＭＯＮ８７４１１および類似のイベントと比べた。これらのイベントを全て、トランスジェニックトウモロコシ植物イベント組織をコーンルートワーム幼虫の食物に入れて提供する食物バイオアッセイにおいて、コーンルートワームの防除に関する効力について試験した。さまざまなイベントにコーンルートワーム抵抗性形質を付与する原因となる２つの異なる発現カセットの発現の配向は、これらの抵抗性形質を発現するトウモロコシイベント細胞をコーンルートワーム幼虫の食物に入れて提供した時にコーンルートワーム防除をもたらすイベントの効力にとって、決定的に重要であることが決定された。２つの異なるプロモーターＣＡＭＶ  ｅ３５ＳおよびＺｍ．ＰＩＩＧは、ｅ３５ＳプロモーターからｄｓＲＮＡコーンルートワーム保護物質を発現し、ｅ３５Ｓプロモーターに近接しかつ同プロモーターから分岐しているＺｍ．ＰＩＩＧプロモーターからＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒性タンパク質を発現する発現カセットを含有するトウモロコシイベントの、驚くべき優れた効力をもたらすことが観察された。これらのプロモーターがこの特定の配向にあると、効力を呈するトランスジェニックイベントの割合が著しく改善された。
【００３６】
本明細書に別段の注記がある場合を除き、用語は、関連技術分野における通常の技能を有する者による従来の用法に従って理解されるものとする。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら「Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ」第５版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：ニューヨーク、１９９１）およびＬｅｗｉｎ「Ｇｅｎｅｓ  Ｖ」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、１９９４）に見いだすこともできる。本明細書において使用する用語「トウモロコシ」はＺｅａ  ｍａｙｓを意味し、ＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物と交配することができる全ての植物品種を包含する。本明細書において使用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「を含むが、それらに限定されるわけではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【００３７】
本発明は、少なくとも３つの発現カセット、すなわち、酵母ｓｎｆ７遺伝子にオルソロガスなコーンルートワーム必須遺伝子を抑制するように設計されたコーンルートワーム毒性量のｄｓＲＮＡを発現する第１発現カセット、コーンルートワーム毒性量のＣｒｙ３Ｂｂδ−エンドトキシンを発現する第２発現カセット、およびグリホサート阻害に対して非感受性であるグリホサート耐性酵素ＣＰ４  ＥＰＳＰＳを発現する第３発現カセットを含有するＤＮＡコンストラクトで形質転換された、トランスジェニック植物を提供する。本明細書において開示する方法に従って、本明細書に開示するＤＮＡコンストラクトで形質転換されたトウモロコシ植物は、ＣＲＷに対して抵抗性であり、グリホサート除草剤の施用に対して耐性である。連結された農業形質は、育種個体群内にこれらの形質をまとめて維持することを容易にし、単一のコーンルートワーム阻害遺伝子だけを含有する植物または育種素材として組み合わされた同じコーンルートワーム阻害遺伝子（Ｃｒｙ３ＢｂおよびｄｓＲＮＡ）を含有する植物よりも高いコーンルートワーム効力を呈する。
【００３８】
トランスジェニック「植物」は、異種ＤＮＡ、すなわち目的のトランスジーンを含むポリ核酸コンストラクトによる植物細胞の形質転換、植物細胞のゲノムへのトランスジーンの挿入によって得られる植物の個体群の再生、および特定ゲノム位置への挿入を特徴とする特定植物の選択によって作製される。「イベント」という用語は、異種ＤＮＡを含む最初の形質転換体植物およびその形質転換体の後代を指す。「イベント」という用語は、イベントと別の植物との間の有性異系交雑によって作製される、異種ＤＮＡを含む後代も包含する。反復親への反復戻し交雑後でも、形質転換親イベントからの挿入ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡは、交雑の後代において、同じ染色体位置に存在する。「イベント」という用語は、挿入ＤＮＡと挿入ＤＮＡにじかに近接する隣接ゲノム配列とを含む最初の形質転換体からのＤＮＡであって、挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば最初の形質転換体および自殖によって得られる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統との有性交雑の結果として目的のトランスジーンを含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に導入されると予想されうるものも指す。本発明は、ＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックイベントトウモロコシ植物、その後代、およびそこに含まれるＤＮＡ組成物に関する。
【００３９】
「プローブ」は、従来の検出可能ラベルまたはレポーター分子、例えば放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素が取り付けられている単離された核酸である。そのようなプローブはターゲット核酸の鎖に、本発明の場合であればＭＯＮ８７４１１からのゲノムＤＮＡの鎖に、それがＭＯＮ８７４１１植物からであるか、ＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含む試料からであるかを問わず、相補的である。本発明のプローブには、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ターゲットＤＮＡ配列に特異的に結合し、そのターゲットＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができる、ポリアミドおよび他のプローブ材料も含まれる。
【００４０】
ＤＮＡプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的ターゲットＤＮＡ鎖にアニールすることでプライマーとターゲットＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し、次にポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって、ターゲットＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離されたポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマー対またはＤＮＡプライマーセットは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来のポリ核酸増幅方法によるターゲット核酸配列の増幅に役立つ２つのＤＮＡプライマーを指す。
【００４１】
ＤＮＡプローブおよびＤＮＡプライマーは、一般的には、長さが１１ポリヌクレオチド以上、多くの場合、１８ポリヌクレオチド以上、２４ポリヌクレオチド以上、または３０ポリヌクレオチド以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でターゲット配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さであるように選択される。本発明のプローブおよびプライマーは、好ましくは、ターゲット配列との完全な配列類似性を有するが、ターゲット配列とは異なるプローブであって、ターゲット配列にハイブリダイズする能力を保っているものを、従来の方法で設計することもできる。
【００４２】
本明細書に開示する隣接ゲノムＤＮＡおよびインサート配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法、例えば当該ＤＮＡ分子の再クローニングおよび配列決定などによって、開示されたＤＮＡ配列を確認（そして必要であれば修正）するために使用することができる。
【００４３】
本発明の核酸プローブおよびプライマーはストリンジェントな条件下でターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイズする。試料中のトランスジェニック植物からのＤＮＡの存在を同定するには、従来の任意の核酸ハイブリダイゼーション法または増幅方法を使用することができる。ポリ核酸分子（核酸セグメントともいう）またはそのフラグメントは、一定の状況下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズする能力を有する。本明細書では、２つのポリ核酸分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成する能力を有するのであれば、それら２つの分子は互いに特異的にハイブリダイズする能力を有するという。ある核酸分子がもう一つの核酸分子の「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」であるといわれるのは、それらが完全な相補性を呈する場合である。本明細書では、一方の分子の全てのヌクレオチドが他方の分子のヌクレオチドに相補的である場合に、それらの分子は「完全な相補性」を呈するという。２つの分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールした状態を保つことができるほど十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、それら２つの分子は「最低限に相補的」であるという。また、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールした状態を保つことができるほど十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、それらの分子は「相補的」であるという。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＨａｙｍｅｓら「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ（１９８５））に記載されている。したがって完全な相補性からの逸脱は、その逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げるものでない限り、許容される。ある核酸分子がプライマーまたはプローブとして役立つには、使用する特定溶媒および特定塩濃度において安定な二本鎖構造を形成することができるように、配列が十分に相補的でありさえすればよい。
【００４４】
本明細書にいう実質的に相同な配列とは、比較しようとしている核酸配列の相補体に高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。例えば約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃の２．０×ＳＳＣで洗浄などといった、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件は当業者に知られているか、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９））の６．３．１−６．３．６に見いだすことができる。例えば洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度を、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度と塩の両方を変動させるか、または温度もしくは塩濃度のどちらか一方を一定に保った上で、他方の変数を変化させることができる。好ましい一実施形態では、本発明のポリ核酸が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２１、２５、４１、４２、４３、４４、４５、４９、５０、５１、または５２に示す核酸分子もしくはその相補体またはどちらかのフラグメントの１つ以上に、中等度にストリンジェントな条件下で、例えば約２．０×ＳＳＣおよび約６５℃で、特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい実施形態では、本発明の核酸が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２１、２５、４１、４２、４３、４４、４５、４９、５０、５１、または５２に示す核酸分子もしくはその相補体またはどちらかのフラグメントの１つ以上に、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の一態様では、好ましい本発明のマーカー核酸分子が、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０；または配列番号１２、または配列番号１４、または配列番号１６、または配列番号２１、または配列番号２５、または配列番号４１、または配列番号４２、または配列番号４３、または配列番号４４、または配列番号４５、または配列番号４９、または配列番号５０、または配列番号５１、または配列番号５２に示す核酸配列もしくはその相補体またはどちらかのフラグメントを有する。ターゲットＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られているいくつもの方法で検出することができ、例えば限定するわけではないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タグを挙げることができる。
【００４５】
特定増幅プライマー対を使った（例えばＰＣＲによる）ターゲット核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」とは、ＤＮＡ熱増幅反応において、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合して、好ましくはユニークな増幅産物、アンプリコンを作製するターゲット核酸配列だけに、プライマー対がハイブリダイズすることを許す条件である。
【００４６】
「（ターゲット配列）に特異的」という用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ターゲット配列を含む試料中のターゲット配列だけにハイブリダイズすることを示す。
【００４７】
本明細書にいう「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、ポリ核酸テンプレートの一部であるターゲットポリ核酸分子に向けられたポリ核酸増幅方法の産物を指す。例えば、有性交雑の結果生じたトウモロコシ植物が、本発明のＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物からのトランスジェニック植物ゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するには、ＭＯＮ８７４１１植物ＤＮＡの存在に特徴的であるアンプリコンを作製するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、ＭＯＮ８７４１１を含む植物のゲノム中の挿入異種ＤＮＡ（トランスジーンＤＮＡ）の挿入部位に近接するＤＮＡ配列に由来するプライマーと、挿入異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含むプライマー対を使ったポリ核酸増幅方法に付すことができる。特徴的アンプリコンは、植物ゲノムＤＮＡに特徴的でもある長さとＤＮＡ配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の長さを合わせたもの＋１ヌクレオチド塩基対から、好ましくは＋約５０ヌクレオチド塩基対、より好ましくは＋約２５０ヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは＋約４５０ヌクレオチド塩基対またはそれ以上に及びうる。あるいは、プライマー対は、インサートポリヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンが作製されるように、挿入異種ＤＮＡの両側にあるゲノム配列に由来することもできる（例えば配列番号１のゲノム部分から単離されたフォワードプライマーと、イベントＭＯＮ８７４１１ゲノム中の本明細書に特定する接合部配列を含むＤＮＡ分子を増幅する配列番号１のゲノム部分から単離されたリバースプライマー）。挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列から、ある距離に位置し、この距離は１ヌクレオチド塩基対から約２０００ヌクレオチド塩基対までに及ぶことができる。「アンプリコン」という用語を使用する場合、ＤＮＡ熱増幅反応中に形成されうるプライマー二量体は、特に除外される。
【００４８】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当技術分野において知られるさまざまなポリ核酸増幅方法のいずれかによって達成することができる。増幅方法は当技術分野では知られており、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびに「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９０）に記載されている。２２ｋｂ（キロベース）までのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ増幅方法が開発されている（Ｃｈｅｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：５６９５−５６９９，  １９９４）。本発明を実施する際には、これらのＤＮＡ増幅方法および当技術分野で知られている他のＤＮＡ増幅方法を使用することができる。イベントＭＯＮ８７４１１からの異種ＤＮＡインサートの配列または隣接ゲノムＤＮＡ配列は、ＡＴＣＣに寄託された、受託番号がＰＴＡ−１２６６９である、イベントＭＯＮ８７４１１を含む種子、またはその種子から生長させた植物から、当該ＤＮＡ分子を、ここに提供する配列に由来するプライマーを使って増幅した後、ＰＣＲアンプリコンまたはそのクローン化ＤＮＡフラグメントの標準的なＤＮＡ配列決定によって、検証（そして必要であれば修正）することができる。
【００４９】
ＤＮＡ増幅方法に基づくＤＮＡ検出キットには、ターゲットＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、適当な反応条件下で特徴的アンプリコンを増幅する、ＤＮＡプライマー分子が含まれる。本キットは、アガロースゲルベースの検出方法、または当技術分野で知られているいくつもの特徴的アンプリコン検出方法を提供しうる。配列番号１に示すトウモロコシゲノム領域の任意の部分および配列番号１に示す挿入トランスジェニックＤＮＡの任意の部分に相同または相補的なＤＮＡプライマーを含むキットは、本発明の一目的である。ＤＮＡ増幅の技術分野の当業者であれば、開示されたＭＯＮ８７４１１のトランスジーン／ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）から、ＤＮＡプライマーとして役立つＤＮＡ分子を選択することができる。
【００５０】
これらの方法によって作製された特徴的アンプリコンは、多数の技法によって検出することができる。そのような技法の一つが遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４１６７−４１７５，  １９９４）であり、ここでは、近接する隣接ゲノムＤＮＡ配列と挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドはマイクロタイタープレートのウェルに固定化される。（挿入配列中の１プライマーと、近接する隣接ゲノム配列中の１プライマーとを用いる）関心領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、それを、ＤＮＡポリメラーゼと、予想される次の塩基に特異的な標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）とを使った１塩基伸長反応のテンプレートとして、役立たせることができる。読出しは、蛍光に基づくか、ＥＬＩＳＡに基づくことができる。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および１塩基伸長の成功により、トランスジーン／ゲノム配列の存在を示す。
【００５１】
もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅによって記載されたパイロシーケンシング技法である（Ｉｎｎｏｖ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｔｅｃｈ．  ００：１８−２４，  ２０００）。この方法では、近接ゲノムＤＮＡおよびインサートＤＮＡ接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドを関心領域からの一本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列中の１プライマーと、隣接ゲノム配列中の１プライマー）にハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰが個別に加えられ、組込みがもたらす光シグナルが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および１塩基または多塩基伸長の成功により、トランスジーン／ゲノム配列の存在を示す。
【００５２】
Ｃｈｅｎらが記載する蛍光偏光（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ９：４９２−４９８，  １９９９）は、本発明のアンプリコンを検出するために使用することができる一方法である。この方法では、ゲノム隣接および挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドを関心領域からの一本鎖ＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ中の１プライマーと、隣接ゲノムＤＮＡ配列中の１プライマー）にハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。１塩基伸長がｄｄＮＴＰの組込みをもたらす。組込みは、蛍光計を使用して偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および１塩基伸長の成功により、トランスジーン／ゲノム配列の存在を示す。
【００５３】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）は、製造者が提供する説明書では、ＤＮＡ配列の存在を検出し定量する方法と記載され、よく理解されている。簡単に述べると、ゲノム隣接およびインサートＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列中の１プライマーと、隣接ゲノム配列中の１プライマー）を耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルさせる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上の消光成分からの蛍光成分の切断と放出をもたらす。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功により、トランスジーン／ゲノム配列の存在を示す。
【００５４】
Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，  １９９６）に記載されているように、配列検出用の分子ビーコンが記述されている。簡単に述べると、隣接ゲノムおよびインサートＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造により、プローブは、蛍光成分と消光成分とを極めて接近した状態に保つ二次構造を含むことになる。ＦＲＥＴプローブとＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列中の１プライマーと、隣接ゲノム配列中の１プライマー）を耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルさせる。ＰＣＲ増幅の成功に続いて、ターゲット配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、プローブ二次構造の解除および蛍光成分と消光成分との空間的分離をもたらす。その結果、蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功により、隣接／トランスジーンインサート配列の存在を示す。
【００５５】
本明細書に開示する組成物とＤＮＡ検出の技術分野において周知の方法とを使って、ＤＮＡ検出キットを開発することができる。キットは試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの同定に役立ち、ＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシ植物を育種するための方法に応用することができる。キットには、プライマーまたはプローブとして役立ち、かつ本明細書に記載の配列番号１の少なくとも適用可能部分に相同または相補的な、ＤＮＡ分子が含まれる。これらのＤＮＡ分子はＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ）で使用するか、ポリ核酸ハイブリダイゼーション法、すなわちサザン解析、ノーザン解析においてプローブとして使用することができる。
【００５６】
接合部配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群からの配列によって表すことができる。例えば接合部配列は、随意に、配列番号５および配列番号８として提供されるヌクレオチド配列によって表すことができる。あるいは接合部配列は、随意に、配列番号６および配列番号９として提供されるヌクレオチド配列によって表すこともできる。あるいは接合部配列は、随意に、配列番号７および配列番号１０として提供されるヌクレオチド配列によって表すこともできる。これらのヌクレオチドはホスホジエステル結合によってつながれ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中では、組換え植物細胞ゲノムの一部として存在する。トウモロコシ植物、種子、または植物部分に由来する試料における配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２の１つ以上の同定は、そのＤＮＡがトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１から得られたことを決定づけ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１からのＤＮＡを含有する試料における存在に特徴的である。したがって本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２として提供されるヌクレオチド配列の少なくとも１つを含有するＤＮＡ分子を提供する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２として提供される配列の少なくとも１つを含むのに十分なトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの任意のセグメントは、本発明の範囲内である。加えて、この段落内に記載した配列のいずれかに相補的な配列を含む任意のポリヌクレオチドも、本発明の範囲内である。
【００５７】
本発明は、試料中の、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含むトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在を検出するためのプライマーまたはプローブとして使用することができる例示的ＤＮＡ分子を提供する。そのようなプライマーまたはプローブはターゲット核酸配列に特異的であり、したがって、本明細書に記載する発明の方法によるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１核酸配列の同定に役立つ。
【００５８】
「プライマー」は、典型的には、熱増幅を伴う特異的アニーリングまたはハイブリダイゼーション法において使用するために設計された高純度の単離ポリヌクレオチドである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの熱増幅では、アンプリコンを作製するために、一対のプライマーをトウモロコシゲノムＤＮＡの試料などのテンプレートＤＮＡと共に使用することができ、そのような反応から作製されたアンプリコンは、プライマーがテンプレートにハイブリダイズした２つの部位の間にあるテンプレートＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有するであろう。本明細書にいう「アンプリコン」とは、増幅技法を使って合成されたＤＮＡの一片またはフラグメントである。本発明のアンプリコンは、配列番号２１または配列番号２５として提供される配列の少なくとも１つを含む。プライマーは、典型的には、相補的ターゲットＤＮＡ鎖にハイブリダイズしてプライマーとターゲットＤＮＡ鎖のハイブリッドを形成するように設計され、プライマーの存在は、ターゲットＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用するプライマーの伸長（すなわち、伸びているヌクレオチド分子への追加ヌクレオチドの重合）を開始するための、ポリメラーゼによる認識点である。本明細書にいうプライマー対とは、プライマー対の個々のメンバーによる結合のターゲットとした位置に挟まれたポリヌクレオチドセグメントを典型的には熱増幅反応でまたは他の従来の核酸増幅方法で線形に増幅するための、二本鎖ヌクレオチドセグメントの反対の鎖に結合する２つのプライマーの使用を指すものとする。この応用に役立つプライマー対は、第１ＤＮＡ分子および第１ＤＮＡ分子とは異なる第２ＤＮＡ分子を含むべきであり、この場合、両者はそれぞれ、ＤＮＡプライマーとして機能して、熱増幅反応においてトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１由来のテンプレートＤＮＡと共に、一緒に使用した場合に、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特徴的であるアンプリコンが作製されるように、十分な長さを持つ、ＤＮＡ配列の連続ヌクレオチドである。プライマーとして役立つ例示的ＤＮＡ分子を、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４として提供する。
【００５９】
「プローブ」は、ターゲット核酸の鎖に相補的な、単離された核酸である。プローブには、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ターゲットＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミドおよび他のプローブ材料も含まれ、そのような結合の検出は、特定試料における当該ターゲットＤＮＡ配列の存在を診断、識別、決定、検出、または確認するのに役立ちうる。プローブは、従来の検出可能ラベルまたはレポーター分子、例えば放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素に取り付けることができる。プローブとして役立つ例示的ＤＮＡ分子を配列番号１９および配列番号２３として提供する。
【００６０】
プローブおよびプライマーは、ターゲット配列との完全な配列同一性を有しうるが、ターゲット配列とは異なるプライマーおよびプローブであって、ターゲット配列に優先的にハイブリダイズする能力を保っているものを従来の方法によって設計することもできる。ある核酸分子がプライマーまたはプローブとして役立つには、使用する特定溶媒および特定塩濃度において安定な二本鎖構造を形成することができるように、配列が十分に相補的でありさえすればよい。従来の核酸ハイブリダイゼーション法または増幅方法はいずれも、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１由来のトランスジェニックＤＮＡの存在を同定するために使用することができる。プローブおよびプライマーは長さが一般に少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、もしくは少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上である。そのようなプローブおよびプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でターゲットＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＨａｙｍｅｓら「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ（１９８５））に記載されている。
【００６１】
本明細書に開示するＤＮＡ分子またはそのフラグメントを単離し操作するには、熱増幅方法を含めて、当業者に周知のいくつもの方法を使用することができる。ＤＮＡ分子またはそのフラグメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使ってよく実施されているように、そのフラグメントを化学的手段で直接合成することなど、他の技法によって取得することもできる。
【００６２】
したがって、ここに提供するＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、とりわけ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の同定、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む植物品種または雑種の選択、試料中のトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在の検出、およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１またはイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分の存在および／または不在に関する試料のモニタリングに役立つ。
【００６３】
本発明はトウモロコシ植物、後代、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、穂または絹糸組織、雄穂組織、根組織、茎組織、および葉組織など）、およびコモディティー製品を提供する。これらの植物、後代、種子、植物細胞、植物部分、およびコモディティー製品は、検出可能な量の本発明のポリヌクレオチド、すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２として提供される配列の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドなどを含有する。本発明の植物、後代、種子、植物細胞、および植物部分は１つ以上の追加トランスジーンも含有しうる。そのような追加トランスジーンは、望ましい形質、例えば限定するわけではないが、増加した昆虫抵抗性、増加した水利用効率、増加した収量成績、増加した乾燥抵抗性、増加した種子品質、改良された栄養品質、および／または増加した除草剤耐性などを付与するタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする任意のヌクレオチド配列であることができ、ここで、望ましい形質は、そのような追加トランスジーンを欠くトウモロコシ植物を基準として測定される。
【００６４】
本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモロコシ植物に由来するトウモロコシ植物、後代、種子、植物細胞、および植物部分、例えば花粉、胚珠、穂または絹糸組織、雄穂組織、根または茎組織、および葉を提供する。イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ種子の代表試料は、ブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ＡＴＣＣ寄託機関は、イベントＭＯＮ８７４１１を含む種子に、特許寄託物名（Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−１２６６９を割り当てている。
【００６５】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子をそのゲノム中に含んでなる微生物を提供する。そのような微生物の一例はトランスジェニック植物細胞である。本発明の植物細胞などの微生物は、例えば限定するわけではないが、（ｉ）科学的探求または工業的研究のための研究ツールとしての使用；（ｉｉ）後続の科学的研究に使用するか工業製品として使用することができる内在性または組換え糖質、脂質、核酸、もしくはタンパク質産物または小分子を生産するための培養における使用；および（ｉｉｉ）農業上の研究または生産に使用することができるトランスジェニック植物または植物組織培養物を作製するための現代的植物組織培養技法による使用など、多くの工業的応用に役立つ。トランスジェニック植物細胞などの微生物の作製および使用では、現代的微生物学技法および人間の介入を利用して、人造のユニークな微生物が作製される。この過程で、組換えＤＮＡが植物細胞のゲノムに挿入されて、自然界に存在する植物細胞とは別個のユニークなトランスジェニック植物細胞が作製される。次に、このトランスジェニック植物細胞は現代的微生物学技法を使って細菌および酵母細胞と同様に培養することができ、未分化な単細胞状態で存在することができる。トランスジェニック植物細胞の新しいまたは改変された遺伝子組成および表現型は、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの組込みが生み出す技術的効果である。トランスジェニック植物細胞などの本発明の微生物には、（ｉ）細胞のゲノムに組換えＤＮＡを組み込むことによってトランスジェニック細胞を作製した後、この細胞を使って、同じ異種ＤＮＡを保持するさらなる細胞を派生させる方法；（ｉｉ）組換えＤＮＡを含有する細胞を現代的微生物学技法を使って培養する方法；（ｉｉｉ）培養細胞から内在性または組換え糖質、脂質、核酸、またはタンパク質産物を生産し、精製する方法；および（ｉｖ）現代的植物組織培養技法をトランスジェニック植物細胞と共に使って、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織培養物を作製する方法が含まれる。
【００６６】
本発明の植物は、トランスジーンを含むイベントＤＮＡを後代に伝えることができる。本明細書にいう「後代」には、祖先植物に由来するイベントＤＮＡを含み、かつ／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む、任意の植物、種子、植物細胞、および／または再生可能な植物部分が包含される。植物、後代、および種子は、トランスジーンに関してホモ接合でもヘテロ接合でもよい。後代は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有植物によって生産された種子から、および／またはトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有植物からの花粉で受精させた植物によって生産された種子から、生長させることができる。
【００６７】
後代植物を自家受粉（「自殖」ともいう）させて純粋種系統の植物、すなわちトランスジーンに関してホモ接合である植物を生成させることができる。適当な後代の自殖により、両方の付加された外因性遺伝子に関してホモ接合である植物を作製することができる。
【００６８】
あるいは、後代植物を異系交雑して、例えば別の無関係な植物と交配して、品種または雑種種子または植物を作製してもよい。他の無関係な植物はトランスジェニックでも非トランスジェニックでもよい。したがって本発明の品種または雑種種子または植物は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の特異的かつユニークなＤＮＡを欠く第１の親を、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む第２の親と交雑し、その結果としてトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の特異的かつユニークなＤＮＡを含む雑種を得ることによって、派生させることができる。各親は、交雑または交配が本発明の植物または種子、すなわち、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のＤＮＡおよび／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含有するアレルを少なくとも１つは有する種子をもたらす限り、雑種または近交系／品種であることができる。したがって、２つの異なるトランスジェニック植物を交雑して、独立して分離する２つの付加された外因性遺伝子を含有する雑種次代を作製することができる。例えば、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性とグリホサート耐性とを持つイベントＭＯＮ８７４１１トウモロコシを、異なるトランスジェニックトウモロコシ植物と交雑させて、両方のトランスジェニック親の特徴を有する雑種または近交系植物を作製することができる。その一例は、コーンルートワーム寄生に対して抵抗性でありかつグリホサートに対して耐性であって少なくとも１つ以上の追加形質を有する後代植物または種子をもたらす、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性およびグリホサート耐性を持つイベントＭＯＮ８７４１１と、１つ以上の追加形質、例えば除草剤耐性および／または昆虫防除を有するトウモロコシ植物との交雑であるだろう。栄養生殖と同様、親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との異系交雑も考えられる。さまざまな形質および作物のために一般に使用される他の育種方法の説明は、例えばＦｅｈｒ「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ、ウィスコンシン州マディソン（１９８７）など、いくつかある参考文献の１つに見いだすことができる。
【００６９】
本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分を提供する。本明細書にいう「植物部分」とは、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物に由来する材料から構成される植物の任意の部分を指す。植物部分には、花粉、胚珠、穂または絹糸、雄穂、根または茎組織、繊維、および葉などがあるが、これらに限定されるわけではない。植物部分は、生育可能、生育不能、再生可能、および／または再生不能であることができる。
【００７０】
本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物に由来し、かつ検出可能な量の、イベントＭＯＮ８７４１１に特異的な核酸を含有する、コモディティー製品を提供する。本明細書にいう「コモディティー製品」とは、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシ植物、全粒または加工トウモロコシ種子、１つ以上の植物細胞および／または植物部分に由来する材料を含有する任意の組成物または製品を指す。コモディティー製品は消費者に販売することができ、生育可能であっても生育不能であってもよい。生育不能コモディティー製品には、発芽不能トウモロコシ種子；加工トウモロコシ種子、トウモロコシ種子部分、およびトウモロコシ植物部分；飼料または食品、油、荒粉、細粉、フレーク、ふすま、バイオマス、および燃料製品用に加工されたトウモロコシ種子およびトウモロコシ植物部分などがあるが、これらに限定されるわけではない。生育可能コモディティー製品には、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物、およびトウモロコシ植物細胞などがあるが、これらに限定されるわけではない。したがって、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物は、通例トウモロコシから得られる任意のコモディティー製品を製造するために使用することができる。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを含有するトウモロコシ植物に由来するそのようなコモディティー製品はいずれも、その存在がトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を決定づける１つ以上の特異的かつユニークなＤＮＡ分子を少なくとも検出可能な量で含有し、具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むポリヌクレオチドを、検出可能な量で含有しうる。本明細書に開示する検出方法を含めて、任意の標準的なヌクレオチド分子検出方法を使用することができる。コモディティー製品は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの特徴的配列を有するＤＮＡ分子が、コモディティー製品中に、いくらかでも検出可能な量で存在するのであれば、本発明の範囲内である。
【００７１】
それゆえに、本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物部分（花粉、胚珠、穂または絹糸、雄穂、根または茎組織、および葉など）、およびコモディティー製品は、とりわけ、農業上の目的でトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む種子および／または植物部分を生産するために植物を生長させること、植物育種および研究目的でトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む後代を生産すること、工業的応用および研究的応用のために微生物学技法と共に使用すること、および消費者への販売に有用である。
【００７２】
本発明は、グリホサート除草剤およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を使って雑草を防除するための方法および植物を生産するための方法を提供する。圃場において雑草を防除するための方法が提供され、これは、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有品種または雑種植物を圃場に植え付けること、およびＭＯＮ８７４１１含有植物に被害を与えることなく圃場における雑草を防除する目的で圃場に除草有効量のグリホサートを施用することからなる。そのようなグリホサート除草剤の施用は出芽前、すなわちＭＯＮ８７４１１含有種子が植え付けられた後、かつＭＯＮ８７４１１含有植物が出芽する前の任意の時点であってもよいし、出芽後、すなわちＭＯＮ８７４１１含有植物が出芽した後の任意の時点であってもよい。圃場において雑草を防除するためのもう一つの方法が提供され、それは、圃場における雑草を防除するために有効量のグリホサート除草剤を施用すること、そして次に、その圃場にイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物を植え付けることからなる。そのようなグリホサート除草剤の施用は植え付け前、すなわちＭＯＮ８７４１１含有種子が植え付けられる前であり、植え付け前の任意の時点で、例えば限定するわけではないが、植え付けの約１４日前〜植え付けの約１日前に行うことができるだろう。本発明は、ＭＯＮ８７４１１を含むグリホサート耐性トウモロコシ植物の種子を圃場に植え付け、雑草を殺すのに十分な出芽後有効量のグリホサート除草剤を圃場に施用し、その圃場から種子を収穫することによって、雑草種子を本質的に含まないトウモロコシ種子を生産するための方法も提供する。圃場で使用するためのグリホサートの除草有効量は、１栽培期で１エーカーあたり約０．１２５ポンドから１エーカーあたり約６．４ポンドまでの範囲のグリホサートからなるはずである。一実施形態では、１栽培期で１エーカーあたり合計約１．５ポンドのグリホサートが施用される。１栽培期で複数回のグリホサート施用、例えば２回の施用（植え付け前施用と出芽後施用または出芽前施用と出芽後施用など）または３回の施用（植え付け前施用、出芽前施用および出芽後施用など）を使用してもよい。
【００７３】
本発明のイベントＭＯＮ８７４１１に特異的かつユニークなＤＮＡ配列を含む昆虫および除草剤耐性トウモロコシ植物を生産するための方法が提供される。これらの方法で使用されるトランスジェニック植物はトランスジーンに関してホモ接合でもヘテロ接合でもよい。これらの方法によって生産される後代植物は品種植物でも雑種植物でもよく；トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有植物によって生産された種子および／またはトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有植物からの花粉で受精させた植物によって生産された種子から生長させることができ；トランスジーンに関してホモ接合でもヘテロ接合でもよい。次に、後代植物を自家受粉させて純粋種系統の植物、すなわちトランスジーンに関してホモ接合である植物を生成させるか、あるいは異系交雑して、例えば別の無関係な植物と交配して、品種または雑種種子または植物を生産してもよい。
【００７４】
試料中の、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物に由来するＤＮＡの存在を検出する方法を提供する。一方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ配列決定にとって適当な条件下で、ＤＮＡ試料を、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特異的なＤＮＡ配列を作製する能力を有する少なくとも１つのプライマーと接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡシークエンス反応を行うこと、そして次に（ｉｖ）ヌクレオチド配列が、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトに特異的なヌクレオチド配列、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される１つを含むことを確認することからなる。もう一つの方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅にとって適当な条件下で、ＤＮＡ試料を、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡからアンプリコンを作製する能力を有するプライマー対と接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うこと、そして次に（ｉｖ）アンプリコン分子を検出し、かつ／またはアンプリコンのヌクレオチド配列がイベントＭＯＮ８７４１１に特異的なヌクレオチド配列、例えば配列番号２１および配列番号２５からなる群より選択される１つを含むことを確認することからなる。アンプリコンは、イベントＭＯＮ８７４１１に特異的なもの、例えば配列番号２１または配列番号２５を含むアンプリコンなどであるべきである。アンプリコン中の、イベントＭＯＮ８７４１１に特異的なヌクレオチド配列の検出は、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮＡの存在を決定づけ、かつ／またはその存在に特徴的である。ＤＮＡ増幅にとって適当な条件下でイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡからアンプリコンを作製する能力を有するプライマー対の例を、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２０、および配列番号２２として提供する。当業者は他のプライマー対を容易に設計することができ、それらは配列番号２１または配列番号２５を含むアンプリコンを作製するであろう。この場合、そのようなプライマー対は、インサートに隣接するゲノム領域内にある少なくとも１つのプライマーと、インサート内にある第２のプライマーとを含む。試料中の、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物由来のＤＮＡの存在を検出するもう一つの方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ試料を、イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブと接触させること、（ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブとＤＮＡ試料とをハイブリダイ���させること、そして次に（ｉｖ）プローブとターゲットＤＮＡ試料の間のハイブリダイゼーションを検出することからなる。イベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブの配列の例を、配列番号１９または配列番号２３として提供する。当業者は他のプローブを容易に設計することができ、それらは、例えば限定するわけではないが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、および配列番号２５に提供する配列など、インサートに隣接するゲノムＤＮＡの少なくとも１つのフラグメントと、インサートＤＮＡの少なくとも１つのフラグメントとを含むであろう。ＤＮＡ試料へのプローブハイブリダイゼーションの検出は、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮＡの存在に特徴的である。あるいは、ハイブリダイゼーションの不在は、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮＡの不在に特徴的である。
【００７５】
試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡを同定するのに役立ち、適当なイベントＤＮＡを含有するトウモロコシ植物を育種するための方法に応用することもできる、ＤＮＡ検出キットが提供される。そのようなキットには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２のフラグメントを含むＤＮＡプライマーおよび／またはプローブが入っている。そのようなキットの一例は、試料中の、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在および／または不在を検出するのに役立つＤＮＡプローブとして機能するために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２の十分な長さの連続ヌクレオチドのＤＮＡ分子を、少なくとも１つは含む。イベントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモロコシ植物に由来するＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むであろう。試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在および／または不在を決定、検出、または診断するのに役立つＤＮＡプローブとしての使用にとって十分なＤＮＡ分子が、配列番号１９および配列番号２３として提供される。当業者は他のプローブを容易に設計することができ、それらは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２の十分な数の連続核酸、例えば少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０連続ヌクレオ��ドを含むべきであり、イベント由来のＤＮＡを同定するためにトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに十分にユニークであるべきである。もう一つのタイプのキットは、試料中のトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１由来のＤＮＡの存在および／または不在を検出するのに役立つアンプリコンを作製するのに役立つプライマー対を含む。そのようなキットでは、ターゲットＤＮＡ試料を本明細書に記載のプライマー対と接触させ、次に配列番号２１および配列番号２５からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むアンプリコンを作製するのに十分な核酸増幅反応を行い、次にアンプリコンの存在および／または不在を検出することを含む方法が使用されるであろう。そのような方法は、ターゲットＤＮＡ試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮＡの存在を決定づける、すなわちその存在に特徴的であるであろう、アンプリコンまたはそのフラグメントを配列決定することも含みうる。当業者は他のプライマー対も容易に設計することができ、それらは、限定するわけではないが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２に提供する配列の十分な数の連続核酸、例えば少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０連続ヌクレオチドを含むべきであり、イベント由来のＤＮＡを同定するためにトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡに十分にユニークであるべきである。
【００７６】
本発明のキットおよび検出方法は、とりわけ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の同定、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む植物品種または雑種の選択、試料中のイベントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモロコシ植物に由来するＤＮＡの存在の検出、およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物またはイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分の存在および／または不在に関する試料のモニタリングに役立つ。
【００７７】
トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１からの異種ＤＮＡインサート、接合部配列、または隣接配列の配列は、ここに提供する配列に由来するプライマーを使って、イベントからそのような配列を増幅した後、アンプリコンまたはクローン化ＤＮＡの標準的ＤＮＡ配列決定を行うことによって、検証（そして必要であれば修正）することができる。
【００７８】
本発明の一定の好ましい実施形態の例を実証するために以下に実施例を挙げる。以下の実施例において開示する技法は、本発明の実施においてよく機能することを本発明者らが見いだしたアプローチを表し、したがってその実施にとって好ましい形態の例を構成するとみなしうることは、当業者には理解されるはずである。しかし当業者は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、ここに開示する具体的実施形態に多くの変更を加えても、なお同様の結果を得ることが可能であることも、本開示に照らして、理解するはずである。
【００７９】
寄託情報
イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ種子の代表試料の寄託は、ブダペスト条約に従って、２０１２年３月１４日に、郵便番号２０１１０米国バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１に住所を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）になされ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９が割り当てられている。本願の係属中、特許商標庁長官および長官が権限を有すると決定した者は、請求により、本寄託物を利用することが可能である。特許の発行後は直ちに、公衆に対する利用可能性に関する全ての制約が、取消不能に取り除かれるであろう。寄託物は、３０年間、または最後の請求後５年間、または特許の有効期間中は、そのいずれが長くても、受託機関に維持され、その期間中は必要に応じて補充されるであろう。
［実施例］
【実施例１】
【００８０】
この実施例では、４１７と呼ばれるコンストラクトの設計および選択ならびにさまざまなＤＮＡコンストラクトの工学的操作および評価を説明する。表１にこれらのＤＮＡコンストラクトを試験基準および結果によって表にする。
【００８１】
ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）をターゲットとするＲＮＡベースの植物内保護物質（ＰＩＰ）をトウモロコシ内で発現するように、ＤＮＡコンストラクトを工学的に操作した。ＲＮＡ転写産物のバリエーションを、ＷＣＲのターゲット遺伝子の相違（グループ１）、ＲＮＡの長さの相違（グループ２）、中立的ＲＮＡキャリアの有無（グループ２）、二次構造の相違（グループ４）、およびＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏのターゲットセグメントの相違（グループ２および３）について試験した。複数トランスジーンのバリエーション、例えばＲＮＡ転写産物＋ＷＣＲ活性タンパク質（グループ３および５）、および２つのＷＣＲターゲットをターゲットとする２つのＲＮＡ転写産物（グループ１および４）も試験した。使用した発現カセットおよび要素の数および配置のバリエーションも試験した（全てのグループ）。
【００８２】
［表１］４５のＤＮＡコンストラクトをトウモロコシ植物に安定に形質転換した。１つのＤＮＡコンストラクトにつき複数の形質転換イベントからの後代植物を評価した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【００８３】
グループ２のＤＮＡコンストラクトを一例として用いると、さまざまな長さのＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ（２７ｎｔ長から４２９ｎｔ長まで）のターゲティングを試験するために、７つのＤＮＡコンストラクトを工学的に操作した。各ＤＮＡコンストラクトを作製し、植物細胞を形質転換し、植物を取得し、近交系をグロースチャンバー効力バイオアッセイで評価した。結果は逆方向反復ＲＮＡ（ＩＲ）の長さとＷＣＲ活性の間の相関関係を示した（表２、（Ｂ）列および（Ｈ）列）。
【００８４】
［表２］ＩＲの長さとＷＣＲ活性の間の相関関係
【表２】
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【００８５】
（Ｂ）列は、トウモロコシ植物中で逆方向反復ＲＮＡ（ＩＲ）二次構造として発現するように工学的に操作されたＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏターゲットＲＮＡのさまざまな長さを示している。（Ｃ）列は、形質転換されたトウモロコシ胚の数を示している。（Ｄ）列は、苗条を発生させたトウモロコシ胚の数を示している。（Ｅ）列は、土壌で生育可能な再生トウモロコシ植物（世代Ｒ０と呼ぶ）の数を示している。（Ｆ）列は、形質転換イベント中に１コピーのインサートＤＮＡを内包すると予想されるＲ０植物の数を示している。（Ｇ）列は、単一形質転換イベントを内包すると予想され、かつ多施設グロースチャンバーバイオアッセイ用に十分な種子を生産したＲ０植物の数を示している。（Ｈ）列は、ＷＣＲ活性を評価するために計画された植物グロースチャンバー研究の結果を示している。「＋＋＋＋＋」は平均ＲＤＲが０．５ＲＤＲ未満であったことを示す。「＋＋」は平均ＲＤＲが０．５ＲＤＲ〜２．０ＲＤＲであったことを示す。「−」は、平均ＲＤＲが約２．０ＲＤＲであったことを意味し、これはグロースチャンバー効力研究では陰性対照に匹敵した。
【００８６】
†ＤＮＡコンストラクト＃４７４と同じ２７マーであるが、中立的な１５０マーＩＲに埋め込まれている。グロースチャンバーで生長させた植物におけるＷＣＲ活性を評価するために、１コンストラクトあたり１０〜２０のイベントのそれぞれについて６〜８体の植物を、ピート鉢で生長させた。植物を、インサートＤＮＡの存在およびトランスジーンの発現について、葉組織と根組織の両方で試験した。次に、トランスジーンの発現が確認された植物を、ＷＣＲ卵を寄生させた大きな鉢に植え替えた。非トランスジェニックトウモロコシ系統ＬＨ５９およびＬＨ２４４を陰性対照として含めた。イベントＭＯＮ８８０１７（Ｃｒｙ３Ｂｂを発現するもの）を含有する植物を陽性対照として含めた。生長するトウモロコシ植物の根損傷を４週間後に評価した。根損傷評点（ｒｏｏｔ  ｄａｍａｇｅ  ｒａｔｉｎｇ）（ＲＤＲ）を３点尺度で評価し、０ＲＤＲを根損傷なし、３ＲＤＲを最大根損傷とした。
【００８７】
研究結果から、グループ５のＤＮＡコンストラクトは、（ａ）２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲ用の発現カセットおよび（ｂ）Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質用の発現カセットを含有するように設計した（図２）。２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲを選択した理由は、（ａ）同じ２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲを発現する植物がＣＲＷ活性の阻害に何度も成功していたこと（グループ２〜４）、（ｂ）長さが１００ｎｔより大きいセグメントではＷＣＲ抵抗性の発生確率が減少すること、および（ｃ）２４０ｎｔより大きいセグメントではトウモロコシゲノムに無傷で導入することが困難になるであろうことであった。各発現カセット中の異なる調節遺伝要素およびＤＮＡコンストラクトにおける各発現カセットの異なる配置を試験するために、ＤＮＡコンストラクトを設計した。グループ５のＤＮＡコンストラクトには、グリホサート耐性発現カセットを伴うコンストラクトとグリホサート耐性発現カセットを伴わないコンストラクト；および２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲだけを発現するグループ３からの対照コンストラクトも含めた。各ＤＮＡコンストラクトを設計し、植物細胞を形質転換し、植物を取得し、近交系をグロースチャンバー効力バイオアッセイで評価した（表３（Ｃ）〜（Ｈ））。
【００８８】
［表３］グループ５のＤＮＡコンストラクトの形質転換からの植物作製数
【表３】
0006315481.tif 000005
【００８９】
表３の（Ｈ）列に示すように、「＋＋＋＋＋」は、平均すると、発生全体を通してトランスジェニック植物に最も高い持続的遺伝子発現と、発生中に最も高いＷＣＲ阻害と、自家受精世代および交雑世代において最も高いＷＣＲ阻害を与えたＤＮＡコンストラクトを表す。「＋＋＋＋」は、平均すると、トランスジェニック植物にＷＣＲ阻害を与えるが、「＋＋＋＋＋」植物と比べると遺伝子発現量は少ないＤＮＡコンストラクトを表す。「＋＋＋」は、平均すると、トランスジェニック植物に与えられるＷＣＲ阻害が「＋＋＋＋」植物および「＋＋＋＋＋」植物と比べて低いＤＮＡコンストラクトを表す。そこで、ＤＮＡコンストラクト＃４１７をさらなる解析に進めた。このコンストラクトは、左境界（ＬＢ）から右境界（ＲＢ）までに、３つの発現カセットに編成された１６の遺伝要素を有する。このコンストラクトを図２に示し、配列を配列番号２６に記載する。ベクターコンポーネントは、次のとおりである。
【００９０】
［１］ＬＢ：配列番号２６の位置１〜４４２の逆相補体に対応する。この要素はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピン左境界配列に相当する。
［２］Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９  ３’ＵＴＲ：配列番号２６の位置４８６〜１１１８の逆相補体に対応する。Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（エンドウ）のリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットＥ９（ｒｂｃＳ−Ｅ９）遺伝子転写産物からの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する。
［３］２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ逆方向反復遺伝子：配列番号２６の位置１１４８〜１７７７の逆相補体に対応する。この遺伝子は、互いに全く同一に逆相補的に一致する２つの２４０マーリボヌクレオチドセグメントを、１５０リボヌクレオチドの中立的セグメントによって分離された状態で含有するＲＮＡに転写されて、逆方向反復ＲＮＡ（ＩＲ）を形成する。２４０ｂｐセグメントの配列は酵母Ｓｎｆ７にオルソロガスなＷＣＲ遺伝子と一致する。
［４］トウモロコシＤｎａＫイントロン：配列番号２６の位置１８１４〜２６１７の逆相補体に対応する。この要素は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）の熱ショックタンパク質７０遺伝子からのエクソン１の１０ヌクレオチド、イントロン１、およびエクソン２の１１ヌクレオチドからなる。エクソン２の１１ヌクレオチドには開始メチオニン残基を除去する修飾が加えられている。
［５］ＣａＭＶ  ３５Ｓリーダー：配列番号２６の位置２６１８〜２６２６の逆相補体に対応する。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ  ＲＮＡ転写産物からの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）であって、その遺伝子のｍＲＮＡ転写開始点の＋１位置から始まるものに相当する。
【００９１】
［６］ｅＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター：配列番号２６の位置２６２７〜３２３８の逆相補体に対応する。−９０〜−３５０領域の重複を含有するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）のプロモーターに相当する。
［７］トウモロコシＰＩＩＧプロモーター：配列番号２６の位置３２６５〜４２１３に対応する。この遺伝要素は、Ｚｅａ  ｍａｙｓの物理的障害誘導タンパク質（ＰＩＩＧ）遺伝子のプロモーターに相当する。
［８］コムギＬｈｃｂ１リーダー：配列番号２６の位置４２２０〜４２８０に対応する。この遺伝要素はＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）の集光複合体ｂ１（Ｌｈｃｂ１）遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する。
［９］イネＡｃｔ１イントロン：配列番号２６の位置４２９７〜４７７６に対応する。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）のアクチン１（Ａｃｔ１）遺伝子からのエクソン１の１２ヌクレオチド、イントロン１、およびエクソン２の７ヌクレオチドの連続配列からなる。
［１０］Ｃｒｙ３Ｂｂ  ＯＲＦ：配列番号２６の位置４７８６〜６７４７に対応する。ネイティブＢｔ  Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質コード遺伝子と比べて修飾Ｈ２３１Ｒ、Ｓ３１１Ｌ、Ｎ３１３Ｔ、Ｅ３１７Ｋ、およびＱ３４９Ｒを呈するように工学的に操作された非天然殺虫性Ｃｒｙ３Ｂタンパク質のコード領域に相当する。このヌクレオチド配列はイベントＭＯＮ８８０１７に含まれるｃｒｙ３Ｂｂ遺伝子配列と一致する。
【００９２】
［１１］コムギＨｓｐ１７  ３’ＵＴＲ：配列番号２６の位置６７６７〜６９７６に対応する。この遺伝要素は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）からの熱ショックタンパク質１７（ＨＳＰ１７）遺伝子の３’ＵＴＲに相当する。
［１２］イネＴｕｂＡ（プロモーター、リーダー、イントロン）：配列番号２６の位置７０２５〜９２０５に対応する。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）のαチューブリン遺伝子（ＴｕｂＡ−３）からの連続するプロモーター、リーダー、イントロン、およびエクソン２の４ヌクレオチドに相当する。
［１３］ＣＴＰ：配列番号２６の位置９２１０〜９４３７に対応する。Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）からのＮ末端ＣＴＰをコードする工学的に操作されたコード領域に相当する。この要素は、最後のＧＡＧコドン（グルタミン酸）がＴＧＣ（システイン）に修飾されている点で、ネイティブ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０６６１３）とは異なる。
［１４］ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ：配列番号２６の位置９４３８〜１０８０５に対応する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＣＰ４からのＥＰＳＰＳの工学的に操作されたコード領域に相当する。第２コドンがセリンをコードするものからＣＴＴ（ロイシン）へと修飾されている点と、４つのサイレント置換とが、ネイティブＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子とは異なる。
［１５］イネＴｕｂＡ  ３’ＵＴＲ：配列番号２６の位置１０８１３〜１１３９４に対応する。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）からのαチューブリン遺伝子（ＴｕｂＡ−３）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する。
［１６］ＲＢ：配列番号２６の位置１１４１３〜１１７４３に対応する。Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのノパリン右境界配列に相当する。
【実施例２】
【００９３】
この実施例では、形質転換と多数のトランスジェニックイベントからのイベントＭＯＮ８７４１１の選択を説明する。
【００９４】
トウモロコシ系統ＬＨ２４４の穀粒から胚を摘出し、ＤＮＡコンストラクト＃４１７を内包する組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。同時培養した胚を選択および生長培地に移して、発生中の苗条を伴うトランスジェニックカルス組織を生成させた。発生中の苗条を、小植物に発生させるための発根培地に移した。小植物を土壌で全Ｒ０植物に再生させた。こうして回収したＲ０植物を、導入されたコンストラクトＤＮＡが１コピーであるものについてスクリーニングした。表３に示すように、推定１コピーのイベントが、７１のユニークなＲ０形質転換体に得られた。各Ｒ０形質転換体を育苗条件下に置くことで、後代Ｒ１種子を生産した。４４のイベントを先に進めた。４４のＲ０植物のそれぞれによって生産されたＲ１種子を少なくとも８つは土壌に植え付け、Ｒ１植物を生長させてＲ２種子を生産した。１つのイベントにつき１つのＲ１植物を選択して、各々のイベントを含有する各系統を継続させ、その１つのＲ１植物からの種子を、（ａ）自家受精（Ｒ３，４， …， Ｎ）または（ｂ）他のトウモロコシ系統、例えばトウモロコシ系統９３ＩＤＩ３との交雑受精によって、以後の試験のために増やした。ＤＮＡコンストラクト＃８９０（表３の行１１）の形質転換からのイベントに相当する植物も再生して、本実施例において後述する後続の圃場試験のための比較対照とした。
【００９５】
Ｃｒｙ３Ｂｂ発現を含む表現型に基づいて、４４イベントのうち、２５イベントを選択して、先に進めた。これら２５イベントに相当するＲ１植物をさらに、実施例１に記載のグロースチャンバー効力方法でＷＣＲ阻害について評価し、インサートＤＮＡの多重遺伝要素のコピー数についても評価した。４つのイベントは２コピー以上のＰｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９  ３’ＵＴＲ遺伝要素を呈し、他の４つのイベントに相当するＲ１植物が０．８ＲＤＲを上回る根損傷評点を呈したので、２５イベントのうちの１７イベントを先に進めた。
【００９６】
残り１７のイベント、すなわち「Ａ」、ＭＯＮ８７４１１、および「Ｃ」〜「Ｑ」を含む後代植物をさらに、分子成績および圃場内成績について、並行して解析した（表４および表５参照）。
【００９７】
［表４］ＤＮＡ形質転換ベクター＃４１７からのインサートＤＮＡを内包する１７のトランスジェニックトウモロコシイベントの分子解析
【表４】
0006315481.tif 000006
【００９８】
イベントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換ベクターのバックボーンＤＮＡセグメントについて、また意図したインサートＤＮＡの全ての部分の単コピー数について、スクリーニングした（表４（Ａ）列および（Ｂ）列）。７つのイベント（ＭＯＮ８７４１１、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を、Ａｇｒｏ媒介挿入中に起こるアグロバクテリウム左境界および右境界のニック部位変異を除けば形質転換ベクター＃４１７と同一である挿入ＤＮＡの配列について解析したところ、イベントＤはこの配列解析に不合格だった（表４（Ｃ）列）。これら７つのイベントを、植物発生全体および数世代を通したＣｒｙ３Ｂｂタンパク質およびＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲ  ＲＮＡの持続的植物発現についても評価したところ、７つのイベント全てが持続的植物発現に関する合格基準を満たした（表４（Ｄ）列）。７つのイベントのそれぞれをゲノム挿入部位特徴（すなわち中立的挿入部位）、例えばＤＮＡの置換、重複および反復、内在性遺伝子との近さ、内在性遺伝子の中断、およびＱＴＬへの近さ、ならびにバイオテクノロジー形質について解析したところ、イベントＥ、Ｆ、およびＧはこの解析に不合格だった（表４、（Ｆ）列）。Ｃｒｙ３ＢｂをコードするまたはＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲ  ＲＮＡを生産する２つのＲＮＡ転写産物の予想されるサイズが、イベントからのＲＮＡ中に存在するかどうかを決定するために、イベントＭＯＮ８７４１１、Ａ、Ｃ、およびＤを含有する植物組織でノーザンブロットを行ったところ、評価したイベントの全てがこの基準に合格した（表４（Ｇ）列）。
【００９９】
これら１７のイベントを農学的圃場試験、昆虫効力圃場試験およびグリホサート耐性効力圃場試験で評価した。その結果を表５に要約する。表５の列見出しは圃場試験のタイプ（「農学」、「昆虫」、または「グリホサート」）を表し、イベントと比較／対比された対照を列挙し、イベント雑種を生成させるために使用した遺伝的近交系も列挙している。（Ａ）〜（Ｃ）列に要約した圃場試験は、（Ｄ）〜（Ｈ）列に要約した圃場試験の１暦年前に、また（Ｉ）列に要約した圃場試験の２年前に植え付けられた。
【０１００】
［表５］形質転換ベクター＃４１７で生成したイベントの農学的圃場試験、昆虫効力圃場試験、およびグリホサート効力圃場試験からの結果
【表５】
0006315481.tif 000007
【０１０１】
イベントを各圃場試験において対照と比べた。各圃場試験に関するデータは、複数の立地にわたる反復試験区で平均した。ＬＨ２４４は形質転換系統に関する対照である。ＤＮＡベクター「＃８９０」は、２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ  ＩＲだけを発現するイベントを作製するために使用した。コウチュウ抵抗性およびグリホサート耐性をトウモロコシ植物に与える市販イベントＭＯＮ８８０１７を対照として使用した。「ＲＮ近交系」は第Ｎ世代の後代を示している。圃場試験で評価した雑種イベントは、評価対象であるイベントからの片親（ＭＯＮ８７４１１、またはＡ〜Ｑ）と、表５（Ｃ、Ｇ、またはＨ列）に示す片親との交雑から収穫された種子から生長させた。具体的に述べると、表５において、列、Ｒ２近交系×９３ＩＤＩ３は、評価対象であるイベントのＲ２近交系を近交系トウモロコシ９３ＩＤＩ３と交雑して雑種種子を作ったことを示している。同様に、表５のＧ列およびＨ列において、Ｒ４近交系×ＭＯＮ８９０３４は、評価対象であるイベントのＲ４近交系後代を、イベントＭＯＮ８９０３４を含有する植物と交雑して雑種種子を作ったことを示している。「ＮＡ」は、この試験イベントに関するデータを入手できなかったことを示す。「＝」は、対照と比べて形質が等価であることを表す。「−」は、対照と比べた形質ヒットを表す。「＋」は、対照と比べた成績の向上を表す。「ＲＤＲ」は根損傷評点である。「‡」は、当該イベントが苗床で生長させた植物において表現型異型を呈したことを、同時期の温室研究が示したことを表す。「†」は、当該イベントがＷＣＲ効力を与えなかったことを、同時期の温室研究が示したことを表す。
【０１０２】
農学的圃場試験を北アメリカおよび南アメリカにある複数の立地で行い、表５のＡ列、Ｂ列、Ｄ列、およびＩ列に要約するように、結果を全ての立地にわたって平均した。これらの農学的圃場試験では、トウモロコシ穀粒を、完全乱塊（ＲＣＢ）法で、１立地あたり１イベントあたり三重の試験区に植え付けた。各複製試験区は１００個の穀粒からなった。試験保守は、穀粒生産量を最適化し、天然ＷＣＲ圧を排除するように計画した。以下の標準的な農学的圃場試験評点の１つ以上を収集した：５０％花粉飛散までの積算成長度日（ｄｅｇｒｅｅ  ｕｎｉｔｓ  ｔｏ  ５０％  ｓｈｅｄ）（ＧＤＵ）、育種家スコア（Ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ  ｓｃｏｒｅ）（ＢＲ）、実生の活力（ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｖｉｇｏｒ）（ＳＤＶ）、茎倒伏（ｓｔａｌｋ  ｌｏｄｇｉｎｇ）（ＳＴＬＣ）、根倒伏（ｒｏｏｔ  ｌｏｄｇｉｎｇ）（ＲＴＬＣ）、成熟植物の穂高（ｅａｒ  ｈｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｌａｎｔｓ）（ＥＨＴ）、成熟植物の草高（ｐｌａｎｔ  ｈｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｌａｎｔｓ）（ＰＨＴ）、穀粒水分（ｇｒａｉｎ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ）（ＭＳＴ）、および穀粒試験重量（ｇｒａｉｎ  ｔｅｓｔ  ｗｅｉｇｈｔ）（ＴＷＴ）、表現型異型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｏｆｆ−ｔｙｐｅｓ）、および穀粒収量（ｇｒａｉｎ  ｙｉｅｌｄ）。近交系イベントと雑種イベントをどちらも評価した。結果を表５のＡ、Ｂ、Ｄ、およびＩ列に要約する。１立地あたり１対照あたり三重の試験区に適当な対照を含めた。評点を全ての立地にわたる試験区で平均した。データを分散分析に付し、平均を５％確率水準の最小有意差（ＬＳＤ（０．０５）で分離した。
【０１０３】
北アメリカにある複数の立地にわたって平均したＷＣＲ損傷についての解析を含む昆虫効力圃場試験の結果を表５のＣ列およびＨ列に要約する。これらの効力圃場試験では、トウモロコシ穀粒が、ＲＣＢ法で、１立地あたり１イベントあたり三重の試験区に植え付けられ、各複製試験区は２５個の穀粒からなった。試験イベントは雑種植物として提示された。適当な対照を１立地あたり１対照あたり三重の試験区に含めた。トウモロコシの試験区がそのＶ２生長段階に到達したら、１試験区あたり５つの植物に、１植物あたり３，３３０卵の割合で、ＷＣＲ卵を寄生させた。Ｖ１０生長段階中に、１試験区あたり５つの被害植物の根を掘り起こし、洗浄し、０ＲＤＲを根損傷なし、３ＲＤＲを最大根損傷とする、０〜３の根損傷評点（ＲＤＲ）に基づいて、食害を評価した。試験イベントと対照植物のＲＤＲを、全ての立地における全ての試験区にわたる植物で平均した。各昆虫効力圃場試験の陰性対照植物は、それぞれ１．７ＲＤＲおよび１．５ＲＤＲの平均ＲＤＲを呈した。各昆虫効力圃場試験の市販品査照標準は、それぞれ０．２５ＲＤＲおよび０．２０ＲＤＲの平均ＲＤＲを呈した。ＤＮＡコンストラクト＃８９０からのイベントを含有する植物は、約０．３５〜０．５０ＲＤＲの範囲のＲＤＲを呈した。ＤＮＡコンストラクト＃４１７からのイベントは、一貫して、平均ＲＤＲスコアが０．２５ＲＤＲの経済的被害閾値未満である植物を与えた。
【０１０４】
北アメリカにある複数の立地で行われたグリホサート除草剤処置に対する生育耐性（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を評価する効力圃場試験の結果を表５のＦ列およびＧ列に要約する。これらの効力圃場試験について、個々の試験に使用したグリホサート施用レジメンを表６（表５のＦ列に対応）および表７（表５のＧ列に対応）に提示する。
【０１０５】
［表６］除草剤圃場試験処置
【表６】
0006315481.tif 000008
「ｌｂｓ  ａｅ」はポンド（酸換算）を示す。「Ａ」はエーカーを示す。
【０１０６】
［表７］除草剤圃場試験処置
【表７】
0006315481.tif 000009
「ｌｂｓ  ａｅ」はポンド（酸換算）を示す。「Ａ」はエーカーを示す。
【０１０７】
植物１００体の各試験区を、各処置の最後の散布の７〜１０日後に、作物被害について評定した。作物被害評点には萎黄病、奇形、および平均低草高を含めた。これらはいずれもグリホサート除草剤に対する低い耐性を示す。各試験区を、ＰＨＴ、ＥＨＴ、５０％花粉飛散までの日数（Ｄ５０Ｐ）、５０％絹糸出現までの日数（Ｄ５０Ｓ）、ＴＷＴ、ＭＳＴ、および収量についても評定した。イベントは近交系植物および雑種植物として提供され、イベントＭＯＮ８８０１７と比べられた。イベント「Ａ」、ＭＯＮ８７４１１、「Ｄ」、「Ｅ」、および「Ｇ」は、作物被害、ＰＨＴ、ＥＨＴ、Ｄ５０Ｐ、Ｄ５０Ｓ、ＴＷＴ、ＭＳＴ、および収量評点に関して、イベントＭＯＮ８８０１７と等価であった。他のイベントおよび市販のＭＯＮ８８０１７イベントと比べたイベントＭＯＮ８７４１１の有意なＲＤＲ優位性を加味したこれらの結果に基づいて、イベントＭＯＮ８７４１１を選択した。
【実施例３】
【０１０８】
この実施例ではイベントＭＯＮ８７４１１の分子キャラクタリゼーションを説明する。葉組織の試料を（Ｒ０）ＭＯＮ８７４１１植物から採取した。イベントＭＯＮ８７４１１中のトランスジェニック挿入部位に対応するゲノムＤＮＡの配列決定を行ったところ、ベクター＃４１７に対応する形質転換ベクター中の配列と比べて相違は認められなかった。
【０１０９】
隣接配列を、トウモロコシＢ７３リファレンスゲノム（Ｒｅｆ  Ｂ７３）を含むトウモロコシゲノムリファレンス配列にマッピングした。イベントＭＯＮ８７４１１は物理的に第９染色体上にあると決定された。左隣接／インサートＤＮＡ接合部における隣接配列の末端は、位置ＺＭ＿Ｂ７３＿ＣＲ０９：３９２６１７９７に対応する。右隣接／インサートＤＮＡ接合部における隣接配列の末端は、位置ＺＭ＿Ｂ７３＿ＣＲ０９：３９２６１９１５に対応する。イベントＭＯＮ８７４１１の隣接配列を、ゲノム重複、反復、および内在性遺伝子について解析した。いずれも検出されなかった。
【０１１０】
イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入ＤＮＡの配列解析により、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ左境界（随意にインサートの５’端と設定した）の２６３ヌクレオチドだけ、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ右境界（随意にインサートの３’端と設定した）の１５ヌクレオチドだけが、イベントＭＯＮ８７４１１のゲノム挿入部位にある挿入ＤＮＡに保たれていることが確認された。
【０１１１】
イベントＭＯＮ８７４１１の挿入ＤＮＡに隣接するゲノム配列と、ＬＨ２４４からの野生型アレルにおける挿入部位の対応ゲノム領域とを、比較解析した。この解析により、ＬＨ２４４ゲノムＤＮＡの１１８塩基対セグメントが、イベントＭＯＮ８７４１１の生成過程で、形質転換ベクター＃４１７の挿入ＤＮＡによって置き換えられることが決定された。
【実施例４】
【０１１２】
この実施例では、トウモロコシ試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定するのに役立つ方法を説明する。ゲノムＤＮＡとイベントＭＯＮ８７４１１の挿入ＤＮＡの随意に割り当てられた５’端との間に形成され、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号２１に包含される、ユニークな接合部（すなわち左接合部）を同定することを目的として、一対のプライマーおよびプローブを設計した。オリゴヌクレオチドフォワードプライマーＳＱ２７０１１の配列（配列番号１８）は、配列番号１および配列番号２の位置４６２〜４９０、配列番号７の位置１０７〜１３５、配列番号６の位置７２〜１００、配列番号５の位置１２〜４０、および配列番号２１の位置１〜２９に対応するヌクレオチド配列と同一である。オリゴヌクレオチドリバースプライマーＳＱ９０８５の配列（配列番号２０）は、配列番号１および配列番号２の位置５１６〜５４１、配列番号７の位置１６１〜１８６、配列番号６の位置１２６〜１５１、配列番号５の位置６６〜９１、配列番号４の位置１６〜４１、および配列番号２１の位置５５〜８０に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。オリゴヌクレオチドプローブＰＢ３５５２の配列（配列番号１９）は、配列番号１および配列番号２の位置５０２〜５１５、配列番号７の位置１４７〜１６０、配列番号６の位置１１２〜１２５、配列番号５の位置５２〜６５、配列番号４の位置２〜１５、および配列番号２１の位置４１〜５４に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。ＰＣＲプライマーＳＱ２７０１１（配列番号１８）およびＳＱ９０８５（配列番号２０）は、イベントＭＯＮ８７４１１の左接合部にあるユニークなゲノム／インサートＤＮＡの７９ヌクレオチドアンプリコンを増幅する。これと同じプライマー対を、蛍光標識（すなわち６ＦＡＭ（商標）蛍光ラベル）されたプローブＰＢ３５５２（配列番号１９）と共に、試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定するためのＥｎｄｐｏｉｎｔ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。
【０１１３】
ゲノムＤＮＡとイベントＭＯＮ８７４１１の挿入ＤＮＡの随意に割り当てられた３’端との間に形成され、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号２５に包含される、ユニークな接合部（すなわち右接合部）を同定することを目的として、一対のプライマーおよびプローブを設計した。オリゴヌクレオチドフォワードプライマーＳＱ２７０６６の配列（配列番号２２）は、配列番号１の位置１１７１０〜１１７２８、配列番号４の位置１１２１０〜１１２２８、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の位置４５〜６３、および配列番号２５の位置１〜１９に対応するヌクレオチド配列と同一である。オリゴヌクレオチドリバースプライマーＳＱ２６９７７の配列（配列番号２４）は、配列番号１の位置１１７５６〜１１７８４、配列番号８の位置９１〜１１７、配列番号９および配列番号１０の位置９１〜１１９、配列番号３の位置２３〜５１、および配列番号２５の位置４７〜７５に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１１３００の配列（配列番号２３）は、配列番号１の位置１１７３１〜１１７５５、配列番号４の位置１１２３１〜１１２４８、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の位置６６〜９０、配列番号３の位置１〜２２、および配列番号２５の位置２２〜４６に対応するヌクレオチド配列と同一である。ＰＣＲプライマーＳＱ２７０６６（配列番号２２）およびＳＱ２６９７７（配列番号２４）は、イベントＭＯＮ８７４１１の右接合部にあるユニークなゲノム／インサートＤＮＡの７５ヌクレオチドアンプリコンを増幅する。これと同じプライマー対を、蛍光標識（すなわち６ＦＡＭ（商標）蛍光ラベル）されたプローブＰＢ１１３００（配列番号２３）と共に、試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定するためのＥｎｄｐｏｉｎｔ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。
【０１１４】
試料中のイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡにユニークであってその存在を検出するのに役立つ配列番号１内の配列を増幅しかつ／またはその配列にハイブリダイズするように、ＳＱ２７０１１、ＳＱ９０８５、ＰＢ３５５２、ＳＱ２７０６６、ＳＱ２６９７７、およびＰＢ１１３００に加えて、他のプライマーおよび／またはプローブも設計できることは、当業者には明らかなはずである。
【０１１５】
分子解析および配列解析に基づいて、イベント同定アッセイのためのＰＣＲアッセイをイベントＭＯＮ８７４１１用に開発した。標準的な分子生物学実験実務に従って、標準的ＰＣＲアッセイまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイのいずれかのパラメータを、試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を検出するために使用したプライマー対とプローブ（すなわち６ＦＡＭ（商標）などの蛍光タグで標識されたプローブ）の各セット（ＳＱ２７０１１、ＳＱ９０８５、および／もしくはＰＢ３５５２、またはＳＱ２７０６６、ＳＱ２６９７７、および／もしくはＰＢ１１３００）で最適化した。一般に、最適化されたパラメータには、プライマー濃度、プローブ濃度、テンプレートＤＮＡの量、ＰＣＲ増幅サイクルパラメータが含まれた。ＰＣＲ反応用の対照には、トウモロコシゲノム中の内部対照単コピー遺伝子に特異的なプライマー（ＳＱ２０２２１（配列番号３８）およびＳＱ２０２２２（配列番号４０））および／またはプローブ（ＰＢ１００６５（配列番号３９））（ＶＩＣ（商標）などの蛍光タグで標識されたプローブ）を含めた。内部対照プローブとして使用するかまたはＰＣＲアッセイ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標））における内部対照として使用するためのアンプリコンを増幅するために使用することができるトウモロコシゲノム中の単コピー遺伝子に特異的な他のＰＣＲプライマーを設計する方法は、当業者にはわかるであろう。次のそれぞれについてＤＮＡを葉組織から抽出した：［１］解析対象である葉試料；［２］陰性対照（非トランスジェニックトウモロコシＤＮＡ）；［３］陰性水対照（テンプレートなし）；および［４］陽性対照ＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡ。標準的ＰＣＲアッセイからのアンプリコンの検出は、ＤＮＡゲル電気泳動によって可視化され、、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイの場合は蛍光検出によって可視化されるであろう。
【０１１６】
接合性アッセイは、あるイベントを含む植物がそのイベントＤＮＡについてホモ接合であるか、すなわち染色体対の各染色体上の同じ場所に外因性ＤＮＡを含むか、それともあるイベントＤＮＡに関してヘテロ接合であるか、すなわち外因性ＤＮＡを染色体対の一方の染色体上にのみ含むか、それともそのイベントＤＮＡについてヌル、すなわち野生型であるかを決定するのに役立つ。イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ植物の接合性は、熱増幅（ＰＣＲ）方法によって、またはＥｎｄｐｏｉｎｔ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）方法によって、決定することができる。例えばＰＣＲ増幅の場合は、プライマー対ＳＱ２７０１１（配列番号１８）およびＳＱ２６９７７（配列番号２２）が、イベントＭＯＮ８７４１１インサートに隣接するゲノムＤＮＡ内でハイブリダイズする。このプライマー対は、イベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡが試料中に存在すれば、１１３２３ヌクレオチド長のアンプリコンを生成させることになる。試料中のトウモロコシＤＮＡがイベントＭＯＮ８７４１１に由来していない場合は、これと同じプライマー対が、約１５０ヌクレオチド長しかないアンプリコンを生成することになる。ＤＮＡゲル電気泳動において、１１３２３ｂｐの単一バンドは、試料中のＤＮＡがホモ接合ＭＯＮ８７４１１イベントであることを示し、約１５０ｂｐの単一バンドは試料中のＤＮＡがＭＯＮ８７４１１イベントからのものではないことを示し、１１３２３ｂｐのバンドと約１５０ｂｐのバンドの両方の存在は、試料中のＤＮＡがＭＯＮ８７４１１イベントに関してヘテロ接合であるトウモロコシ植物からのものであることを示す。
【０１１７】
イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ植物の接合性を決定するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを開発することができる。このアッセイのために、３つまたは４つのプライマーと２つのプローブとが設計され、この際、［１］第１プライマー対と第１プローブは試料中のイベントＭＯＮ８７４１１  ＤＮＡの存在の検出に関して特異的であり、［２］第１プライマー対とは異なる第２プライマー対と、第１プローブとは異なる第２プローブは、野生型トウモロコシＤＮＡの存在（すなわちイベントＭＯＮ８７４１１を含有しない試料）の検出に関して特異的である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）または類似のアッセイでは、第１プローブだけからの蛍光シグナルが、イベントＭＯＮ８７４１１に関してホモ接合である植物を示し、それに特徴的であり、第１プローブと第２プローブの両方からの蛍光シグナルが、イベントＭＯＮ８７４１１に関してヘテロ接合である植物を示し、それに特徴的であり、第２プローブだけからの蛍光シグナルが、野生型アレルに関してホモ接合である（すなわちイベントＭＯＮ８７４１１に関してヌルである）植物を示し、それに特徴的である。
【実施例５】
【０１１８】
この実施例では、現行の市販品（ＭＯＮ８８０１７およびＤＡＳ−５９１２２−７）および陰性対照植物と比べた時の、イベントＭＯＮ８７４１１を含む植物の、コーンルートワーム損傷からの優れた保護を説明する。イベントＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ−５９１２２−７、および陰性対照をそれぞれ１３５体の植物で比較する効力圃場試験を行った。根損傷評点（ＲＤＲ）を収集した。ＲＤＲが経済的被害レベル（０．２５ＲＤＲ）未満である植物のパーセンテージを表８に示す。
【０１１９】
表８は、イベントＭＯＮ８７４１１を含有する植物のうち、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈したのは、約４％だけであったことを示している。対照的に、ＭＯＮ８８０１７を含有する市販植物の２２％は、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈した。また、ＤＡＳ−５９１２２−７を含有する市販植物の２０％は、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈した。また、陰性対照植物の９６％は、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈した。これらのデータからの結論は、イベントＭＯＮ８７４１１は、市販品ＭＯＮ８８０７１およびＤＡＳ−５９１２２−７ならびに陰性対照と比べて、コーンルートワーム損傷からの保護を提供するのに、明らかに優れているというものである。
【０１２０】
［表８］≦０．２５ＲＤＲを呈する植物のおよそのパーセンテージによる効力圃場試験の結果
【表８】
0006315481.tif 000010
試験には各試験イベントにつき１３５体の植物を含めた。
【０１２１】
コーンルートワームの極端な寄生圧でのイベントＭＯＮ８７４１１の成績を試験するために、効力温室試験を行った。この試験では次のイベントを評価した：イベントＭＯＮ８７４１１、ｄｓＲＮＡだけを発現するＤＮＡベクター＃８９０による形質転換からのイベント、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ−５９１２２−７、および陰性対照。これら高圧効力試験のために、評価対象であるトウモロコシ植物を温室中の鉢で生長させた。極端な寄生圧は、Ｖ２生長段階で１鉢あたり約２，０００個のＷＣＲ卵、次に１〜１／２週間の間隔でさらに４回、１回あたり１鉢あたり約１，０００個のＷＣＲ卵により、各ポットに合計で約６，０００個のＷＣＲ卵を加える、各鉢植え植物の逐次的寄生によって達成した。ＶＴ生長段階で植物の根を取り出し、洗浄し、ＲＤＲについて評定した。全１３体（Ｎ＝１３）の陰性対照植物からの根は最大根損傷、すなわち３ＲＤＲの絶対ＲＤＲを呈した。これらの結果は、イベントＭＯＮ８７４１１が、コーンルートワームの防除に関して、入手可能な他のトウモロコシイベントより優れていることを例証している（表９）。
【０１２２】
［表９］高コーンルートワーム寄生圧下での根損傷評点（ＲＤＲ）（Ｎ＝評価した植物の数）
【表９】
0006315481.tif 000011
【０１２３】
コーンルートワームトランスジェニックイベントの効力の一つの尺度は、温室で栽培された植物の鉢植え土壌からの成体甲虫の出現を決定することによる。鉢で生長させたイベントＭＯＮ８７４１１植物の土壌からの成体コーンルートワーム甲虫の出現を決定するために、上述したものと同様に、ＷＣＲ卵を寄生させた土壌が入っている鉢で１０〜１５体の植物を発芽させた。生長期間中は常に各トウモロコシ植物をメッシュ袋で覆って、出現した成体甲虫があれば全て入るようにした。
【０１２４】
上記地上成体甲虫の計数を、植物出芽の６、１２、および１８週間後に行い、試験の最後に、根をＲＤＲについて評価した。イベントＭＯＮ８７４１１を含有する植物を陰性対照植物および他のコーンルートワーム防御トランスジェニックイベントと比べた。イベントＭＯＮ８７４１１植物を鉢植えした土壌からの出現が観察された甲虫の数は、他のコーンルートワーム防御トランスジェニックイベントと比べて有意に少ないという結果になり、コーンルートワーム損傷から保護するイベントＭＯＮ８７４１１の優れた性質が例証された。
【実施例６】
【０１２５】
この実施例では、それぞれ異なるコーンルートワーム毒性作用物質の発現を駆動するトウモロコシ細胞中の２つの異なるプロモーターの配向が、コーンルートワーム幼虫の食物に入れて提供された場合に効力を呈するトランスジェニックイベントの割合を、著しく改善しうることを例証する。
【０１２６】
トウモロコシ細胞を、４つの異なる植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１２０４１７、ｐＭＯＮ１２０４３４、ｐＭＯＮ１２０４１６、またはｐＭＯＮ１２０４１９のうちの１つで形質転換してトランスジェニックイベントを取得し、それをトランスジェニックトウモロコシ植物に再生させた。
【０１２７】
図４に関して、植物形質転換ベクターはいずれも、３つの発現カセット１、２、および３を含み、それらは一端をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ左境界（ＬＢ）で、また他端をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ右境界（ＲＢ）で区切られている。コーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡは、４つのベクターのいずれにおいても、カセット１から、強化カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ｅ３５Ｓ）プロモーターによって発現する。ベクターｐＭＯＮ１２０４１７、ｐＭＯＮ１２０４３４中のコーンルートワーム毒素タンパク質Ｃｒｙ３Ｂｂは、カセット２から、Ｚｍ．ＰＩＩＧプロモーターによって発現する。ベクターｐＭＯＮ１２０４１６、ｐＭＯＮ１２０４１９中のコーンルートワーム毒素タンパク質Ｃｒｙ３Ｂｂは、カセット２から、Ｏｓ．Ｒｃｃ３プロモーターによって発現する。４つのベクターのいずれにおいても、グリホサート除草剤耐性を付与するタンパク質ＣＴＰ−ＥＰＳＰＳ  ＣＰ４は、カセット３から、Ｏｓ．ＴｕｂＡ３プロモーターによって発現する。４つのベクターのいずれにおいても、カセット１とカセット３は同じ相対的配向にある。図４に関して、ブロック矢印は各カセットのそれぞれにおけるプロモーターからの発現の向きを示している。
【０１２８】
ベクターｐＭＯＮ１２０４１７およびｐＭＯＮ１２０４３４におけるカセット２の相対的配向は、プロモーターからの発現の向きを示すブロック矢印（図４）によって図解されるように、逆である。ｐＭＯＮ１２０４１７におけるカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質の発現は、カセット１から発現するコーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現の向きからは分岐している。ｐＭＯＮ１２０４３４におけるカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質の発現は、カセット１からのコーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現と同じ配向にある。
【０１２９】
ベクターｐＭＯＮ１２０４１６とｐＭＯＮ１２０４１９におけるカセット２の相対的配向は、プロモーターからの発現の向きを示すブロック矢印（図４）によって図解されるように、逆である。ｐＭＯＮ１２０４１６におけるカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質の発現は、カセット１から発現するコーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現の向きからは分岐している。ｐＭＯＮ１２０４１９におけるカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質の発現は、カセット１からのコーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現と同じ配向にある。
【０１３０】
表１０からわかるように、トランスジェニックトウモロコシ植物からの組織をコーンルートワームのＤｉａｂｒｏｔｉｃａ種の食物に入れて与えると、コンストラクトｐＭＯＮ１２０４１７またはｐＭＯＮ１２０４１６（コーンルートワーム毒性コンポーネントの分岐発現）のどちらかを使った形質転換によって生成した植物は、コンストラクトｐＭＯＮ１２０４３４またはｐＭＯＮ１２０４１９（タンデム配向または同じ配向の発現）のどちらかを使った形質転換によって生成した植物と比べると、殺虫活性に関して、より有効であった（表１０）。表１０のデータによって示されるとおり、ベクターｐＭＯＮ１２０４１７およびｐＭＯＮ１２０４１６を使った形質転換から生成した有効なイベントの割合は、ベクターｐＭＯＮ１２０４１６およびｐＭＯＮ１２０４１９からの有効なイベントの割合と比べて、有意に大きかった。例えば、分岐プロモーターがコーンルートワーム毒性コンポーネントの発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４１７から生成したイベントの場合、４３イベントのうちの１１イベント、すなわちほぼ２５％のイベントが、ルートワームの有効な防除を呈した。対照的に、プロモーターがコーンルートワーム毒性コンポーネントのタンデム配向での発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４３４から生成したイベントについては、有効なイベントが得られなかった。分岐プロモーターがコーンルートワーム毒性コンポーネントの発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４１６から生成したイベントについては、２７イベントのうちの１７イベント、すなわち約６３％のイベントが、ルートワームの有効な防除を呈した。対照的に、プロモーターがコーンルートワーム毒性コンポーネントのタンデム配向での発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４１９から生成したイベントについては、有効なイベントが約１８．５％しか得られなかった。これらのデータは、２つの異なるコーンルートワーム毒性作用物質の発現を分岐した向きにそれぞれ駆動する２つの異なるプロモーターを持つ植物形質転換ベクターからトランスジェニックトウモロコシ植物を生成させ、そのトランスジェニックトウモロコシ植物をコーンルートワーム幼虫の食物に入れて提供すれば、有効イベント数が著しく改善され、効力を呈するトランスジェニックイベントの割合が改善されることを実証している。
【０１３１】
［表１０］４つの植物形質転換ベクターから得られたＲ０イベントの数および有効イベントの数を示す結果
【表１０】
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【実施例７】
【０１３２】
強化された農学的性質、殺虫特性、または除草剤特性を含むトウモロコシ植物またはその植物部分を作製するために、イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ植物を、潜在的に任意の他のトウモロコシイベントまたはそれらの組み合わせを含有するトウモロコシ植物と交雑し、表現型を評価することで、その結果生じる後代植物の性質を決定することができる。限定でない一例として、ＭＯＮ８７４１１を次の１つ以上の組み合わせを含むトウモロコシ植物と交雑することができる：ＤＡＳ−５９１２２−７；ＭＩＲ６０４；ＭＯＮ８９０３４；ＭＯＮ８７４１１；ＭＯＮ８７４２７；ＴＣ１５０７；５３０７；ＤＡＳ−０６２７５−８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；およびＭＩＲ１６２。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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