(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する脂肪酸誘導体。
【化１】
0006292072.tif 000004
【請求項２】
シカクマメの種子に納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理する工程からなるヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する請求項１の式（１）で示される脂肪酸誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する脂肪酸誘導体及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸はグルコサミンから生合成される糖質であり、吸湿性と弾力性に優れ、関節、骨や皮膚の構成成分として柔軟性を与えている。ヒアルロン酸は分子量が数１０万という高分子であることからその生合成については解明されていなかった。
【０００３】
しかし、近年、ヒアルロン酸はヒアルロン酸合成酵素により合成され、細胞膜に結合し分泌されることがわかってきた。ヒアルロン酸は過剰に与えられた場合、分解する酵素があるため、塗布については、生理的な意味は少なく、体内で生合成される能力を増加させることが優れた治療法である。
【０００４】
体内でのヒアルロン酸合成を促進させる方法としてグルコサミンを摂取することは一つの良い方法であるが、肝心の合成酵素が誘導されない場合には、効果は期待できない。
【０００５】
ヒアルロン酸の産生を促進させる発明としては、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進剤の発明があり、化学合成された低分子の発明がある（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
また、ヒアルロン酸産生能増強剤およびその用途の発明があるものの、その構造は特定されていない（例えば、特許文献２参照。）。
【０００７】
さらに、ヒアルロン酸生成促進剤を含有する退行性関節炎治療剤の発明がある。
【０００８】
ここでは有機化合物が提示されている（例えば、特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５４８７２２７号
【特許文献２】特許第４８７６３３４号
【特許文献３】特許第４５８０２４２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
既存の物質によるヒアルロン酸合成酵素誘導作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
【００１１】
そこで、副作用が弱く優れたヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示されるヒアルロン酸合成酵素誘導作用を有する脂肪酸誘導体に関するものである。
【００１３】
【化１】
0006292072.tif 000002
【００１４】
上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明はヒアルロン酸合成酵素誘導作用を有する請求項１の式（１）で示される脂肪酸誘導体の製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１５】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１６】
請求項１に記載の脂肪酸誘導体はヒアルロン酸合成酵素誘導作用に優れている。
【００１７】
請求項２に記載の製造方法によれば、効率良く脂肪酸誘導体を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
ヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する脂肪酸誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。
【００２０】
【化２】
0006292072.tif 000003
【００２１】
前記の式（１）のように脂肪酸の１分子、フルクトース１分子とガラクトース１分子が結合している。
【００２２】
この誘導体の脂肪酸とはシス型の二重結合を１つ有する不飽和脂肪酸の一つであり、炭素数は１８である。
【００２３】
脂肪酸の二重結合はＣ末端から３位に有しており、シス型である。フルクトース及びガラクトースはいずれもＤ型である。
【００２４】
脂肪酸のカルボキシル基はフルクトースの４位の水酸基とエステル結合している。
【００２５】
フルクトースの１位の水酸基はガラクトースの４位とエステル結合している。すなわち、１，４結合になる。
【００２６】
ガラクトースの１位はフリーである。この水酸基は還元作用を呈し、この構造体を安定に維持することから好ましい。
【００２７】
このフルクトースとガラクトースのその他の水酸基はすべてフリーである。
【００２８】
この誘導体は脂肪酸部分が細胞膜に浸透しやすく、細胞内に入りやすいことから好ましい。また、核膜にも浸透していくことから好ましい。
【００２９】
さらに、この誘導体のフルクトースとガラクトースの水酸基は還元作用があることから細胞を還元して抗酸化作用を呈することから細胞が酸化物質から防御されて好ましい。
【００３０】
また、この誘導体は水溶性と油溶性を示し、細胞膜を通過した後、細胞質の水溶性部分を通過し、核膜も通過してＤＮＡに到達でき、遺伝子に直接作用できることから好ましい。
【００３１】
この誘導体はヒアルロン酸合成酵素の遺伝子のプロモーター部位に反応してヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の転写を増加させる。特に、脂肪酸とフルクトースとの結合部位がプロモーターを活性化する。
【００３２】
また、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の増幅を促進し、遺伝子の増加をもたらすことから好ましい。
【００３３】
すなわち、この誘導体はヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の増幅と転写という２つの部分でヒアルロン酸合成酵素を誘導する。２つのメカニズムがあることから加齢状態や病的状態にある細胞にも反応してヒアルロン酸合成酵素を誘導することから好ましい。
【００３４】
この誘導体の成分は全て天然由来であり、その安全性は確認されている。この誘導体は化学的な手法で化学合成ができるものの、脂肪酸を多く含むシカクマメ、大豆、ナタネ、ヒマワリの種子などを発酵して得ることは天然物由来であり、安全性が高いことから好ましい。
【００３５】
さらに、この脂肪酸誘導体の過剰量と人が接触した場合、または飲んだ場合には、体内のエステラーゼや加水分解酵素などの酵素により分解されて、脂肪酸、糖質に分解されることから安全性が高い。
【００３６】
この脂肪酸誘導体は土壌においては微生物により分解されやすく、環境に対する負担もなく、蓄積性もないことから好ましい。
【００３７】
この脂肪酸誘導体は細胞膜を通過し、さらに、核膜を通過して遺伝子に働くことから、その作用が直接的で効率的であることから好ましい。
【００３８】
この脂肪酸誘導体はヒアルロン酸合成酵素を誘導し、ヒアルロン酸合成酵素の量を増加させる。増加したヒアルロン酸合成酵素はヒアルロン酸を生合成し組織の中及び組織外にヒアルロン酸を増やすことから好ましい。
【００３９】
得られた脂肪酸誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とする脂肪酸誘導体を分離精製することは、目的とする脂肪酸誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
【００４０】
医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。利用目的としては骨粗しょう症、骨折対策、美容分野である。
【００４１】
経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００４２】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００４３】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００４４】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００４５】
食品製剤としてヒアルロン酸合成酵素誘導と美容、骨粗しょう症、抗老化を目的とした健康食品、美容食品などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００４６】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、ヒアルロン酸の産生と皮膚の健康を維持する目的として飼料やサプリメントとして利用される。
【００４７】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
【００４８】
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００４９】
得られた化粧料はヒアルロン酸合成酵素誘導によりシワの改善やタルミの防御、アトピー性皮膚炎の皮膚バリア形成に利用される。
【００５０】
次に、シカクマメの種子に納豆菌を添加して発酵させた発酵液をさらにベニコウジ菌で発酵させ、さらに、プロテアーゼ処理する工程からなるヒアルロン酸合成酵素誘導作用を呈する式（１）で示される脂肪酸誘導体の製造方法について説明する。
【００５１】
ここでいう脂肪酸誘導体とは前記の式（１）で示される誘導体である。すなわち、３位にシス型の２０結合を１つ有する不飽和脂肪酸１分子とフルクトース１分子とガラクトース１分子からなる。
【００５２】
この脂肪酸誘導体の脂肪酸は天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。
【００５３】
この誘導体は細胞の遺伝子に直接作用し、ヒアルロン酸合成酵素誘導作用を発揮する。
【００５４】
この製造方法とはシカクマメの種子、大豆粉末と納豆菌を添加して発酵させた発酵液を、さらに、ベニコウジ菌により発酵させた後に、プロテアーゼ処理する工程からなる。
【００５５】
原料となる物質はシカクマメの種子、大豆粉末、納豆菌、ベニコウジ菌とプロテアーゼである。
【００５６】
シカクマメは四角豆ともいわれ、学名Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓである。マメ科シカクマメ属の植物で種子は食用として利用されている。日本では沖縄で栽培されうりずん豆、琉球四角豆といわれる。
【００５７】
シカクマメの種子には脂肪酸、糖質が含有されていることからこの誘導体の原料として利用することは好ましい。
【００５８】
シカクマメの種子は日本、中国なとのアジア、ブラジル産などの南米産、アメリカ産などいずれの国の由来でも良い。また、低農薬や減農薬で生産されたものは好ましい。このうち、沖縄産のうりずん豆は品質が高いことから好ましい。
【００５９】
シカクマメの種子は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。
【００６０】
３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。
【００６１】
シカクマメの種子は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌の繁殖を防御できることから好ましい。
【００６２】
用いる納豆菌は学名バチルス  サブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。
【００６３】
この納豆菌はシカクマメの種子からなる脂肪酸と糖質を同時に発酵させることにより脂肪酸と糖質が結合する。
【００６４】
前記の発酵に関するそれぞれの添加量はシカクマメの種子の乾燥粉末１重量に対して納豆菌は０．００２〜０．０７重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００６５】
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００６６】
また、この発酵は３９〜４３℃に加温され、発酵は２日間から１０日間行われる。目的とする脂肪酸誘導体をＨＰＬＣやＴＬＣにより定量することならびに、菌体の増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは好ましい。
【００６７】
得られたバチルス発酵液は引き続き、ベニコウジ菌によって発酵される。このベニコウジ菌による発酵により脂肪酸誘導体が分離され、吸収も促進される。
【００６８】
用いるベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｃ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。有限会社紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵効率に優れている。
【００６９】
前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物１重量に対してベニコウジ菌は０．０００１〜０．００８重量が好ましい。ベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。
【００７０】
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。
【００７１】
また、この発酵は３８〜４４℃に加温され、発酵は１日間から１０日間行われる。
【００７２】
この発酵の工程によって脂肪酸と糖質の結合が安定化する。
【００７３】
プロテアーゼはタンパク質を分解し、ペプチドやアミノ酸を生成する加水分解の酵素であり、食用としても利用されている。アマノ製薬のプロテアーゼＮは酵素活性が高いことから好ましい。
【００７４】
前記の発酵物にプロテアーゼを添加して加温することによりタンパク質が分解されて目的とする脂肪酸誘導体が取り出しやすくなる。
【００７５】
発酵物の１重量に対してプロテアーゼの添加量は０．００２〜０．０６重量が好ましい。加温温度は３９〜４５℃が好ましい。加温時間は１時間から８時間が好ましい。
【００７６】
前記のプロテアーゼ処理した分解物は加熱され、含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、プロテアーゼを失活でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。
【００７７】
また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。
【００７８】
前記の反応物から、目的とする脂肪酸誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００７９】
例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とする脂肪酸誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００８０】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００８１】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００８２】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００８３】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００８４】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００８５】
これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００８６】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜３５倍量が好ましく、４〜２５倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００８７】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００８８】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００８９】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００９０】
脂肪酸誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とする脂肪酸誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００９１】
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られる脂肪酸誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。この場合、脂肪酸誘導体のオイルが得られる。
【００９２】
また、この脂肪酸誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
【００９３】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００９４】
沖縄県で減農薬栽培されたシカクマメであるウリズン豆の種子を用いた。種子を採取した後、水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、シカクマメの種子の乾燥粉末粉砕物を１ｋｇ得た。
【００９５】
シカクマメの種子の粉砕物をオートクレーブに供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。
【００９６】
これを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク）に入れ、滅菌された水道水１０ｋｇを添加し、攪拌した。
【００９７】
これとは別に納豆素本舗製の粉末納豆菌の１０ｇを小型発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた培養液を用意した。
【００９８】
前記の前培養した納豆菌の溶液を前記のシカクマメの種子の乾燥粉末を入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４１〜４２℃の温度範囲で加温し、発酵させた。発酵は４日間行った。
【００９９】
発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。
【０１００】
このバチルスによる発酵物１ｋｇに対して紅麹本舗製のベニコウジ菌の１０ｇを添加し、３７℃で７日間発酵させた。
【０１０１】
得られた発酵物１ｋｇに対してアマノ製薬のプロテアーゼＮを１０ｇ添加し、４１〜４２℃で３時間加温した。
【０１０２】
この処理物を１００℃で加温した。さらに、エタノールを添加して目的とする脂肪酸誘導体含有エキス５６６ｇを得た。
【０１０３】
前述の脂肪酸誘導体含有エキスの３００ｇに５％エタノール含有精製水１Ｌを添加し、ダイアイオン（三菱化学製）５００ｇを５％エタノール液に懸濁して充填したカラムに供した。
【０１０４】
これに３Ｌのエ％エタノール液を添加して清浄し、さらに、７０％エタノール液を１Ｌ添加して目的とする脂肪酸誘導体を溶出させ、精製した。精製された脂肪酸誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これを脂肪酸誘導体の検体１とした。
【０１０５】
以下に、脂肪酸誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
【０１０６】
上記のように得られた検体１をエタノールに溶解し、濾過後、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。
【０１０７】
さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。構造解析の結果、検体１から脂肪酸とフルクトースとガラクトースが１分子ずつ検出された。また、脂肪酸１分子にフルクトースがエステル結合し、これにガラクトースがエステル結合していた。さらなる構造解析によりこの脂肪酸誘導体の構造が同定された。
【０１０８】
すなわち、脂肪酸１分子のカルボキシル基にフルクトースの４位の水酸基が結合し、フルクトースの１位とガラクトースの４位が結合していた。
【０１０９】
脂肪酸は炭素数１８で３位にシス型の二重結合を有していた。
【０１１０】
以下にヒト皮膚表皮細胞を用いた確認試験について述べる。
（試験例２）
【０１１１】
ＴＯＹＯＢＯより購入したヒト皮膚由来表皮角化細胞を用いた。培養液としては、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した、１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。
【０１１２】
これに、前記の実施例１で得られた検体１及び対照としてＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）の０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。なお、溶媒対照として生理食塩液（大塚製薬）を用いた。
【０１１３】
細胞を剥離後、細胞数を計数した後、細胞懸濁液を調製し、細胞内の遺伝子を採取した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
【０１１４】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により表皮角化細胞数が溶媒対照群に比して平均値として３０９％に増加した。ＥＧＦでは１７０％の増加であり検体１の方が優れていた。
【０１１５】
ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子解析については表皮細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを採取した。これを逆転写した。つまり、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  キットを用いて実施した。ＰＣＲサイクル数は２５サイクルとした。
【０１１６】
これをヒアルロン酸合成酵素の遺伝子ＨＡＳ３とハイブリッドさせてｍＲＮＡ量を測定した。
【０１１７】
すなわち、得られた ｃＦＮＡをエチジウムブロミド含有２％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離して測定した。
【０１１８】
その結果、検体１によりヒアルロン酸合成酵素の遺伝子は溶媒対照群に比して５６１％に増加した。ＥＧＦでは２７７％となり、検体１による増加が著しかった。なお、細胞には障害はなく、安全性が確認された。
【０１１９】
さらに、検体を添加した細胞の培養液を採取してヒアルロン酸放出量を測定した。
【０１２０】
定量には、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＢＰ）によるＥＬＩＳＡを用いた。９６穴ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートにＨＢＰをコーティングし, 標準溶液および検体処理の細胞培養液を添加した. 室温にて２時間放置した。
【０１２１】
これをペルオキシダーゼ標識した抗体（アルドリッチ製）を反応させてサンドイッチ解析した。
【０１２２】
これに基質のＴＭＢ溶液を添加して４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準ヒアロルン酸（和光純薬）から求めた検量線にあてはめてヒアルロン酸量を定量した。
【０１２３】
この結果、検体１では溶媒対照に比して４５２％のヒアルロン酸量となった。一方、ＥＧＦでは溶媒対照に比して２１７％のヒアルロン酸量となった。検体１の方が優れていた。
【０１２４】
以下にヒト骨細胞を用いたヒアルロン酸合成酵素誘導の確認試験について述べる。
（試験例３）
【０１２５】
株式会社タカラバイオより購入したヒト骨芽細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）を用いた。専用の培養液に懸濁し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。増殖期にある骨芽細胞を選んで用いた。
【０１２６】
骨芽細胞をトリプシン含有ＰＢＳ液にて剥離し、培養液に懸濁した。この細胞１０００個を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに骨抑制毒素としてアクリルアミド溶液（和光純薬）を添加した。
【０１２７】
さらに、前記の実施例１で得られた検体１及び対照としてＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）のそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。
【０１２８】
４８時間培養後、細胞を剥離後し、細胞数をトリパンブルー色素排除法により顕微鏡下、計数した後、細胞懸濁液を調製した。  この細胞内のヒアルロン酸合成酵素の遺伝子解析及び培養液のヒアルロン酸量を前述の方法により定量した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
【０１２９】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により骨芽細胞数が溶媒対照群に比して平均値として２９４％に増加した。ＦＧＦでは１９６％の増加であり検体１の方が優れていた。
【０１３０】
ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子量については検体１により溶媒対照群に比して３８９％に増加した。ＦＧＦ添加では２１０％となり、検体１による増加が著しかった。
【０１３１】
ヒアルロン酸量については検体１により溶媒対照群に比して３１１％に増加した。ＦＧＦ添加では１９８％となり、検体１による増加が著しかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明で得られる脂肪酸誘導体はヒアルロン酸を増加させることにより、骨や皮膚の細胞の組織を保護し、組織を保護することから国民の健康維持に貢献する。
【０１３３】
本発明で得られる脂肪酸誘導体はヒアルロン酸を増加させることにより皮膚を改善する作用を有することから、化粧料として炎症やアトピー、肌トラブルに悩む方の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。
【０１３４】
本発明で得られる脂肪酸誘導体は骨を保護する医薬品や食品としても利用できることから、医薬品や食品業界の発展に寄与する。