(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人体の外部表面に塗布された場合に、ケラチノサイトからの抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導することによって、前記人体の外部表面を病原菌から保護するための、０．１〜５重量％のナイアシンアミドを含む組成物。
【請求項２】
前記外部表面の免疫を改善させるための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外部表面が、皮膚、頭皮または口腔を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
非治療的使用のための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚におけるＡＭＰ（抗微生物ペプチド）の生成をトリガーするための、ナイアシンアミドの新たな使用に関する。これは、微生物による攻撃に対する、皮膚、頭皮および口腔の免疫を改善させるのに応用される。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、ウイルスおよび細菌のような侵入病原体から人体を保護する、一次防御ラインである。一次防御器官として、皮膚組織は、環境と常に持続的に接触したままであり、したがって、侵入病原体からの脅威および負荷と対峙し解決しなくてはならない。露出した皮膚表面は、病原性外来細菌によって負荷を受けるだけではなく、常在共生細菌と接触したままで相互作用している。外来および共生微生物からのこれらすべての負荷にもかかわらず、健康な皮膚は未感染のままであり、常在ミクロフローラの数も一定のままである。皮膚組織と微生物との間の相互作用におけるこの平衡は、皮膚が精緻な防御戦略を有し、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）がその重要な部分を形成することから、維持される。
【０００３】
ＡＭＰは、皮膚独自の防御システムの不可欠な部分を形成する。ＡＭＰは、昆虫および動物において最初に発見され、以来、それらの最初に発見されたＡＭＰは、有望な抗微生物薬とみなされている。ＡＭＰは、自然界に遍在しており、典型的には、侵入細菌、菌類、エンベロープウイルスおよび寄生虫に対して幅広い活性を呈する（Ｂｒａｆｆ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ，２００６。ＡＭＰは、概して短ペプチドであり、ヒトにおいては、約９０の異なるＡＭＰが存在すると報告されている。ＡＭＰは、概して、２つの主な物理的特色を有し、それらは、ａ）カチオン電荷およびｂ）かなりの割合の疎水性残基である。ＡＭＰのカチオン電荷は、負に帯電した微生物の細胞質膜に対する選択性を促進するのに対し、疎水性は、微生物種の細胞膜との相互作用を容易にする。
【０００４】
本発明者らは、皮膚におけるＡＭＰレベルを強化するルートを介して消費者に衛生的利益を提供するように取り組み続けている。本発明者らは、より皮膚に優しく、それにより、あまり不快でないと消費者が知覚する天然分子の使用を介して、これを提供することを望んでいる。この目標を実現するために、種々の活性物を試験し、広範囲の研究の後、皮膚におけるＡＭＰレベルを強化するための、ナイアシンアミドまたはビタミンＢ３の使用を見つけるに至った。
【０００５】
ナイアシンアミドまたはビタミンＢ３は、スキンケア用のいくつかの製品において使用される周知の皮膚美白活性物である。ナイアシンアミドは、セルライトの予防、皮膚炎を治療すること、および皮膚への水の吸収を改善させるためのような種々の他の特性を有することも報告されている（数例を挙げると、欧州特許第１０６３９６３号明細書、欧州特許第１０６３９９４号明細書、欧州特許第１０６３９６５号明細書において報告されている）。ナイアシンアミドは、尋常性座瘡、乾癬およびアトピー性皮膚炎のような多くの炎症性皮膚状態の治療においても使用される（Ｎｉｒｅｎ，Ｎ．Ｍ．（２００６）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｔｉｓ  ７７：１１−１６．）。
【０００６】
国際公開第１１１３３６９２号パンフレット（シダーズ・シナイ・メディカルセンター）は、病原体に対する先天性免疫応答におけるＣ／ＥＢＰｅの重要な役割を開示している。具体的には、官能性Ｃ／ＥＢＰｅの非存在下で、マウスは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を取り除くそれらの能力に重度の障害があることが示されている。好中球は特に影響を受け、黄色ブドウ球菌に対する感受性は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−→）による治療によって是正され得る。重要なことには、Ｃ／ＥＢＰＥの過剰発現誘導による、あるいはニコチンアミドまたはその類似体、誘導体もしくは塩の塗布による、Ｃ／ＥＢＰｅの活性増大は、黄色ブドウ球菌の免疫死滅を劇的に強化し、感染の寛解につながる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第１０６３９６３号明細書
【特許文献２】欧州特許第１０６３９９４号明細書
【特許文献３】欧州特許第１０６３９６５号明細書
【特許文献４】国際公開第１１１３３６９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｒａｆｆ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ，２００６
【非特許文献２】Ｎｉｒｅｎ，Ｎ．Ｍ．（２００６）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｔｉｓ  ７７：１１−１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、皮膚（皮膚それ自体であっても頭皮または口腔であってもよい）へのナイアシンアミドの塗布時に、微生物による攻撃に対して皮膚の免疫を改善させる際の重要なステップであることが公知であるＡＭＰの生成を活性物が誘導することを見出した。故に、消費者が取得する利益は、ナイアシンアミドを含む組成物の塗布により、将来攻撃し得る病原菌に対して皮膚が保護されることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、人体の外部表面に塗布された場合に、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導するためのナイアシンアミドの使用を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、人体の外部表面に塗布された場合に、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を予防的に誘導するためのナイアシンアミドも提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導することにより、頭皮に保護を提供するための方法であって、ナイアシンアミドを、人物の毛髪／頭皮に塗布するステップを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
これらおよび他の態様、特色および利点は、下記の詳細な説明および添付の請求項の読解から、当業者に明らかとなるであろう。誤解を避けるために、本発明の１つの態様の任意の特色を、本発明の任意の他の態様において利用してよい。語「を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、「からなる」または「から構成される」を必ずしも意味するわけではないことが意図されている。換言すれば、掲載されているステップまたは選択肢は、網羅的である必要はない。以下の説明に記される例は、本発明を明確にすることが意図されており、本発明をそれらの例自体に限定することは意図されていないことに留意されたい。同様に、別段の指示がない限り、すべての百分率は重量／重量百分率である。動作例および比較例におけるもの、または別段の明示がある場合を除いて、材料の量もしくは反応条件、材料の物理的特性および／または使用を示す、この説明におけるすべての数字は、語「約」によって修飾されているものとして理解すべきである。「ｘからｙまで」の形式で表現される数値範囲は、ｘおよびｙを含むと理解される。特定の特色について、複数の好ましい範囲が「ｘからｙまで」の形式で記述されている場合、異なる端点を合わせた範囲もすべて企図されていることを理解されたい。
【００１４】
「皮膚」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、とりわけヒトの外部表面を含むことになっており、皮膚、頭皮、毛髪および口腔を含む。使用は、洗い流さない製品またはすすぎ落とす製品にナイアシンアミドを組み込むことによるものであってよく、主として皮膚を美白するためであるが、外観、クレンジング、悪臭コントロールまたは全体的な美観を改善させることもできる、人体に塗布される任意の製品を含む。使用は、好ましくは、洗い流さない組成物への組み込みによるものである。組成物は、液体、ローション、クリーム、フォーム、スクラブ、ジェル、固形石鹸またはトナーの形態であってよく、あるいは、器具を用いて、またはフェイスマスク、パッドもしくはパッチを介して塗布されてよい。そのような組成物の非限定的な例は、洗い流さないスキンローションおよびクリーム、シャンプー、コンディショナー、シャワージェル、固形化粧石鹸、制汗剤、消臭剤、脱毛剤、口紅、ファンデーション、マスカラ、サンレスタナーならびにサンスクリーンローションを含む。
【００１５】
ナイアシンアミドは、以下に記す通りの構造を有する。
【化１】
0006446065.tif 000002
【００１６】
本発明において使用するためのナイアシンアミドは、好ましくは、ケラチノサイトからのＡＭＰの分泌を誘導する。このようにして分泌されたＡＭＰは、体の外部表面の免疫の改善を提供する。外部表面は、皮膚、頭皮または口腔を含む。
【００１７】
本発明により、皮膚表皮における主な細胞であるケラチノサイトを、ナイアシンアミドが活性化させて、本発明の利益を提供する、すなわち抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導することを見出した。これにより、ナイアシンアミドは、病原菌に対する保護シールドを増進させる。したがって、ナイアシンアミドは、体の独自の防御を増進させることによって、感染に対する保護を体に提供する。換言すれば、活性物は、病原菌保護に備えて体表面を整える。これの利点は、病原菌に対する長期にわたる保護、例えば最大２４時間の保護を提供することである。
【００１８】
本発明のようにナイアシンアミドが使用されている組成物は、下記の好ましい特色を含み得る。ナイアシンアミドは、好ましくは、組成物の、０．１から５重量％、より好ましくは０．５から５重量％、さらに一層好ましくは０．５から３重量％、最適には１．０から３．０重量％で存在する。組成物は、好ましくは、化粧的に許容され得る基剤を含む。化粧的に許容され得る基剤は、好ましくは、クリーム、ローション、ジェルまたはエマルションである。
【００１９】
パーソナルケア組成物は、異なる化粧的に許容され得る乳化または非乳化システムおよびビヒクルを使用して調製され得る。好ましい化粧的に許容され得る基剤は、１から２５％の脂肪酸を含む。さらなる好ましい態様は、０．１から１０％の石鹸の包含を提供する。非常に好適な基剤はクリームである。バニシングクリームがとりわけ好ましい。バニシングクリーム基剤は、概して、５から２５％ｗ／ｗの脂肪酸および０．１から１０％ｗ／ｗの石鹸を含む。バニシングクリーム基剤は、高く評価されているマット感を皮膚に与える。Ｃ１２からＣ２０脂肪酸はバニシングクリーム基剤においてとりわけ好ましく、さらに一層好ましいのは、Ｃ１４からＣ１８脂肪酸である。最も好ましい脂肪酸は、ステアリン酸である。脂肪酸は、パルミチン酸およびステアリン酸の混合物であってもよい。組成物中における脂肪酸は、より好ましくは、組成物の５から２０％ｗ／ｗの範囲内の量で存在する。バニシングクリーム基剤中における石鹸は、ナトリウム塩またはカリウム塩のような脂肪酸のアルカリ金属塩を含み、最も好ましいのは、ステアリン酸カリウムである。バニシングクリーム基剤中における石鹸は、概して、組成物の０．１から１０％、より好ましくは０．１から３％ｗ／ｗの範囲内の量で存在する。パーソナルケア組成物は、バニシングクリームとして配合される場合、好ましくは、６０から８５％、より好ましくは６５から８０％ｗ／ｗの水を含む。水は、概して、本発明のように調製された多くの組成物中に存在し、概して、組成物の４０から８５重量％で存在する。
【００２０】
本発明の組成物は、皮膚美白剤および１または複数のＵＶサンスクリーンのような他の任意選択の原料を含み得る。本発明による組成物は、他の希釈剤を含んでもよい。希釈剤は、組成物が皮膚に塗布された場合にそれらの分布を容易にするように、組成物中に存在する他の材料のための分散剤または担体として作用する。水以外の希釈剤は、液体または固体皮膚軟化剤、溶媒、湿潤剤、増粘剤および粉末を含み得る。
【００２１】
組成物は、消臭剤として送達されていてもよい。消臭剤が意味するのは、パーソナル消臭利益、例えば、制汗活性物を含有してもしなくてもよい、腋窩領域における塗布に使用される、スティック型、ロールオン式または噴射剤媒体中の製品である。
【００２２】
消臭剤組成物は、概して、堅固な固体、軟らかい固体、ジェル、クリームおよび液体の形態であってよく、組成物の物理的特徴に適切な塗布器を使用して分注される。
【００２３】
組成物は、幅広い他の任意選択の成分を含み得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ  ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２は、本発明の組成物において使用するのに好適な、スキンケア業界において一般に使用されている多種多様な非限定的な化粧用および医薬用原料について記述している。例は、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加物、緩衝剤、着色剤、増粘剤、ポリマー、収斂剤、香料、湿潤剤、乳白剤、コンディショナー、角質除去剤、ｐＨ調整剤、保存剤、天然抽出物、精油、皮膚センセート（ｓｅｎｓａｔｅｓ）、皮膚鎮静剤および皮膚治癒剤を含む。
【００２４】
組成物は、シャンプー、洗い流さないクリーム、ローション、トニックまたはセラムのような任意の公知の形式で配合され、より好ましい形式は、シャンプー、クリームまたはローションである。
【００２５】
本発明のまた別の態様は、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導することにより、頭皮に保護を提供するための方法であって、ナイアシンアミドを、人物の毛髪／頭皮に塗布するステップを含む、方法に関する。ナイアシンアミドは、好ましくは、抗微生物ペプチドの分泌を誘導するための治療量で塗布される。
【００２６】
ＡＭＰの分泌による頭皮への保護は、好ましくは、フケのような頭皮関連の問題に対する頭皮への拡張保護またはより長期にわたる保護につながる。ナイアシンアミドの使用は、代替として、ＡＭＰ分泌強化による優れたフケコントロールを提供する。さらに、この機構を介して、頭皮には、優れたフケコントロールおよびある特定の事例においては再発性フケに対する抵抗が与えられる。
【００２７】
故に、ナイアシンアミドの塗布によるＡＭＰの分泌強化は、保護／防御強化、フケに対するレジステンス（ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）および先進的な栄養的利益を提供する。本発明の利益は、フケまたは頭皮の乾燥および痒みに悩んでいる人々によって知覚され得る。
【００２８】
好ましい態様によれば、本発明によるナイアシンアミドの使用は、好ましくは、非治療的である。
【００２９】
ここで、下記の非限定的な例により、本発明についてさらに記述する。
【００３０】
［実施例］
［実施例１から６］
ナイアシンアミドはＬＬ−３７遺伝子発現を誘導するがプソリアシン発現を変化させないことを証明するための実施例
表１に示されている通りの下記の試料を、プソリアシン発現に対するそれらの効果および発現されたプソリアシンＡＭＰ（ＬＬ−３７）を測定するために調製した。
【表１】
0006446065.tif 000003
【００３１】
それぞれの遺伝子発現に使用した材料およびそれを測定するために使用した手順を以下に記す。
【００３２】
材料
正常ヒト新生児表皮初代ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）、ケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ）および成長サプリメント、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＡＴＣＣ株１０５３６）、大腸菌０５５：Ｂ５株由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、１×リン酸緩衝食塩液、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ナイアシンアミド、無菌カップ（両端はオープンバレル形状であり、開口端面積は２．２７ｃｍ２であり、ロッドは、ハードテフロン（付録１）、ヴァセリン原料（付録２）、プソリアシン（Ｓ１００Ａ７）（サイクレックス）およびＬＬ−３７ＥＬＩＳＡキット（ハイカルト）からできている丸型先端である、マッコンキー寒天培地、ＴＳＡ培地（ユニリーバ研究報告書番号：ＢＬ１１００８６）。
【００３３】
ヒト初代皮膚ケラチノサイトの刺激
新生児包皮から調製したヒト初代ケラチノサイトを（ロンザインディア）から入手し、定義された成長サプリメント（インビトロジェン）を加えた無血清ケラチノサイト成長培地中で培養した。ケラチノサイトを、１２および２４ウェル組織培養プレート（ＢＤファルコン）中で培養し、６０〜７０％の集密で細胞を処理した。ケラチノサイト刺激は、成長サプリメントを加えたＫＧＭ中で実施し、すべての実験を第３から５代継代の間に行った。
【００３４】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＮＨＥＫを、１２ウェルプレート（ＢＤ、ファルコン）中、ウェル当たり６×１０４細胞で培養した。２４時間のインキュベーション後、５０％の培地を新鮮培地で置きかえた。３日目に、細胞を、異なる濃度のナイアシンアミドで新鮮培地とともに１６〜１８時間処理した。細胞をＲＬＴ緩衝液（キアゲン）中に採取し、試料を、ＲＮＡ単離に使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【００３５】
キアゲン製のＲＮイージーミニキットを使用し、製造業者の説明書に従って、全ＲＮＡを単離した。純度およびＲＮＡ濃度は、ナノドロップ（サーモサイエンティフィック）機器を使用して確認した。ＲＮＡ試料を１％アガロースゲルにロードし、ＵＶトランスイルミネーター（バンガロールジニー（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ  Ｇｅｎｉｅ）、インド）を使用して、抽出物の品質を観察した。ＲＮＡ試料をアリコートし、−７０℃で貯蔵した。アイスクリプトｃＤＮＡ合成キット（バイオ・ラッド、米国）を使用することにより、全ＲＮＡのアリコート（２５０から５００ｎｇ）を使用して、ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡ合成プログラムは、６５℃で５分間、続いて、２５℃で５分間であった。ｃＤＮＡ合成は４２℃で３０分間行い、最後の変性を８５℃で５分間、続いて、４℃で除去するまで行った。  
リアルタイムＰＣＲは、製造業者（バイオ・ラッド、米国）の説明書のように、熱制御されたクロモ４マシン（バイオ・ラッド、米国）を使用するＳＹＢＲグリーン法を使用して行った。５μｌのｃＤＮＡの１：１０希釈試料および１．５ｐｍｏｌｅの特定のプライマーを、各反応において、標準化されたＰＣＲプログラム（すなわち、９４℃で５分間、続いて、５０サイクルの「９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を使用することによって使用し、２−ΔΔＣＴ法を使用することによって結果を分析した。
【００３６】
プソリアシンおよびＬＬ−３７ＥＬＩＳＡ
初代ケラチノサイトを、１２ウェルプレート（ＢＤファルコン）に播種した。６０から７０％の密集度において、細胞を異なる濃度のナイアシンアミドで７２時間処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞培養上清を、ＥＬＩＳＡに使用するまで−７０℃で貯蔵した。すべてのＥＬＩＳＡ試薬および試料を、アッセイ前に室温にした。細胞培養上清試料を、使用前に５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００μｌの細胞培養上清の未希釈試料を、サイクレックス製のＥＬＩＳＡキットを使用することにより、プソリアシンレベルを確認するために使用した。臨床試料を希釈緩衝液中で１：２５に希釈し、ＥＬＩＳＡによってプソリアシンレベルを確認するために希釈試料から１００μｌを使用した。ＬＬ−３７の事例においては、ＥＬＩＳＡ（ハイカルトバイオテック）によってＬＬ−３７レベルを確認するために、インビトロから１００μｌの未希釈試料および臨床試料を使用した。
【００３７】
ナイアシンアミドで１８時間処理したケラチノサイトにおけるプソリアシンおよびＬＬ−３７ＡＭＰの遺伝子発現。１８時間後に初代ケラチノサイトにおけるプソリアシンおよびＬＬ−３７ＡＭＰの遺伝子発現をトリガーするためにポジティブコントロールとして使用したＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ）は、上述した手順を使用する研究であった。結果を、倍数変化の観点から、以下の表２に記す。
【表２】
0006446065.tif 000004
【００３８】
上記の表２中のデータは、ナイアシンアミドは非常に高濃度（１．２２ｍｇ／ｍｌ）であってもプソリアシン遺伝子発現を誘導することができなかったが、驚くべきことに、ナイアシンアミドはＥＬＩＳＡ技術を使用して検出されたプソリアシンＡＭＰの分泌を誘導できたことを示す。
【００３９】
［実施例７から１２］
皮膚におけるプソリアシンおよびＬＬ−３７の分泌誘導を証明するための、ナイアシンアミドを含有するスキンローションを用いるインビボ実験
インビトロ実験からの所見を裏付けるために、健康なヒトボランティアに対するナイアシンアミドの効果をインビボで試験した。ボランティアに、ナイアシンアミド（３％）を加えたおよび加えていないローションを、１日２回、前腕に塗布するように求めた。７日間の塗布後、その箇所をＰＢＳ中で抽出し、プソリアシンおよびＬＬ−３７ＡＭＰの検出のためにＥＬＩＳＡを実施した。
【００４０】
インビボ研究手順
大腸菌培養調製物
大腸菌（１０５３６）のグリセロールストックを、３０ｍｌのＴＳＢ培地中に接種し、培養物を、シェーカーインキュベーター内、３７℃で終夜インキュベートした。終夜、培養物をＴＳＡスラント上で二次培養し、３７℃で終夜インキュベートし、次いで、スラントを４℃で貯蔵した（１５日に一度、スラントを新たに調製した）。
【００４１】
スラントからの大腸菌培養物をＴＳＡプレート上で二次培養し、３７℃で終夜インキュベートした。終夜成長させた、大腸菌のプレート培養物を、６から７ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ）中に懸濁した。分光光度計を使用して培養物の密度を１ＯＤ６２０に調整し、臨床研究に使用した。
【００４２】
抽出物のカップスクラブ法
この技術は、ＡＳＴＭ法、Ｅ２７５２−１０（抗菌性の残効性の評価のための標準ガイド）に含まれる。カップおよびロッドはテフロンで構成されており、カップの面積は２．８４ｃｍ２である。カップは皮膚上に緩衝液を保持するために使用し、ロッドは、スクラビングのため、皮膚ＡＭＰおよび／または皮膚からの残留細菌のより良好な回収のために使用した。スクラビングの持続時間は１分であった。抽出された試料を、分析（付録１）のために１．５ｍｌのエッペンドルフ管中に収集した。
【００４３】
プソリアシンおよびＬＬ−３７ＡＭＰの推定ならびにカップスクラブ法によるヒト皮膚からの残留大腸菌の計数
１０μｌの大腸菌の１ＯＤ６２０培養物を、前腕の印を付けた領域に２．２７ｃｍ２面積で塗布した（クリーム、基剤クリームおよびナイアシンアミドクリームが塗布されていない箇所）。培養物を各箇所に均一に広げた。１５分間の接触時間後、１ｍｌのＰＢＳ中、カップスクラブ法によって試料を抽出した。試料を無菌微量遠心管中に収集した。
【００４４】
抽出された試料のうち、８００μｌを使用して、標準的な微生物法（スプレッドプレート法により、マッコンキー寒天プレート上で、１００μｌの、未希釈、−１および−２希釈試料を平板培養した）により、残留大腸菌を計数した。残りの２００μｌの試料を使用して、標準化されたキットを使用するＥＬＩＳＡにより、プソリアシンおよびＬＬ−３７レベルを分析した。純試料を使用して、試料中におけるＬＬ−３７のレベルを確認した。プソリアシンの事例においては、試料を希釈緩衝液（キットとともに提供されたもの）中で１：２５に希釈し、分析のために１００μｌの希釈試料を使用した。
【００４５】
インビボ研究設計
１．  ボランティアに、毎朝入浴後に研究施設に来るように求めた。
【００４６】
２．  マーカーペンおよび定規を使用して、内側前腕の６．２５ｃｍ２面積（２．５×２．５ｃｍ）の領域に印を付けた。手首（手のひらの基部から５ｃｍ）を除いて、前腕の３つの領域に印を付け印を付けた。（ぼやけてきたらまたは消えたら領域に印を付けるために、各ボランティアに１本のマーカーペンを与えた）。
【００４７】
３．  ６２．５ｍｇの配合物のアリコートを無菌容器（３５ｍｍのプラスチック丸皿）内で秤量し、ボランティアに与えた。
【００４８】
４．  ボランティアに、前腕の輪郭を描いた箇所に配合物（６２．５ｍｇ／６．２５ｃｍ２領域）を塗布するように求めた。（塗布の順序は、基剤配合物、続いて、活性物を含有する配合物であった）。配合物を約３０秒間ずつ、その領域に広げた。
【００４９】
５．  各配合物の塗布後、指を滅菌ティッシュペーパーで拭った。
【００５０】
６．  ６２．５ｍｇの配合物の同様のアリコートを、無菌の３５ｍｍのプラスチックペトリ皿内で秤量し、パラフィルムで密閉し、夜（就寝前）に塗布するために各ボランティアに与えた。
【００５１】
７．  ７日間研究では、ステップ３から６を７日間繰り返した。１日間研究の事例においては、評定を２日目に行った。
【００５２】
８．  ８日目に、ボランティアに、前腕を洗わずに、朝、研究施設に来るように求めた。
【００５３】
９．  ボランティアの前腕を、非抗菌性石鹸（ラックス石鹸）を用い、（治験責任医師が）洗った。
【００５４】
１０．  過剰な水を、滅菌ティッシュペーパーを使用するパッティングドライによって除去した。
【００５５】
１１．  ボランティアに、前腕に触れないで６時間待機するように求めた。
【００５６】
１２．  テンプレートを使用して、各クリーム塗布箇所上の２．２７ｃｍ２の円形領域に印を付け、１×１０８から１×１０９細胞／ｍｌに対応する１０μｌの大腸菌１０５３６培養物を各円形領域に添加し、均一に広げた。
【００５７】
１３．  １５分間の接触時間後、１ｍｌの１×ＰＢＳを使用するカップスクラブ法によって大腸菌を回収した。抽出の持続時間は１分であった。
【００５８】
１４．  試料を、マッコンキー寒天上でのスプレッドプレート法により、細菌数について分析した。
【００５９】
種々の実験における前腕領域内の大腸菌の残留ログを、以下の表３および表４にまとめる：
【表３】
0006446065.tif 000005
【表４】
0006446065.tif 000006
【００６０】
上記の表３中のデータは、ナイアシンアミドを含む組成物が、使用１日後であっても細菌を低減させることができることを示し、一方、表４は、この効果が長期間（７日間塗布）にわたって維持されることを示す。
【００６１】
［実施例１３］
ナイアシンアミドによる誘導によって分泌された抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の種類および量を決定するための実験
ケラチノクテ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｔｅ）細胞においてナイアシンアミドの結果として誘導されたＡＭＰを決定するために、下記の手順を使用した。
【００６２】
１．  初代ケラチノサイトを、１２ウェルプレートに、１ｍｌのＫＧＭ完全培地とともに播種した。（第４継代では６０，０００細胞／ウェルで播種した）。
【００６３】
２．  プレートをＣＯ２インキュベーター内で４８時間インキュベートした。
【００６４】
３．  ４８時間のインキュベーション後、細胞を、ナイアシンアミド１ｍｇ／ｍｌ濃度でおよびそれを用いずに、２連のウェルで処理した（処理には新鮮培地を使用した）。
【００６５】
４．  ７２時間のインキュベーション後、細胞培養上清を１．５ｍｌのエッペンドルフ管にそれぞれ移した。
【００６６】
５．  次いで、試料を２０ｋＤａ遮断フィルタに通過させて、高分子量タンパク質を除去した。
【００６７】
６．  ２０ｋＤａ未満のタンパク質を含有する溶出試料を、１５ｍｌの無菌遠心分離管に移した。
【００６８】
７．  次いで、冷アセトン（ＨＰＬＣグレード）を溶出試料に添加した（１ｍｌの試料：４ｍｌのアセトン）。
【００６９】
８．  管を−２０℃に２４時間移して、タンパク質を沈殿させた。
【００７０】
９．  ２４時間後、管を、１４０００ｇで４０分間、４℃にて遠心分離した。
【００７１】
１０．  上清を廃棄し、質量分析を使用して、タンパク質ペレットをタンパク質について分析した。
【００７２】
種々のＡＭＰの分泌のレベル増大についてのデータを、表５において一覧にする。ＡＭＰの分泌のレベル増大は、セクレトームにおけるペプチドの存在度の相対的測定であるＰＳＭ値（ペプチド・スペクトル・マッチ・スコアリング関数（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｍａｔｃｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ））によって測定する。
【表５】
0006446065.tif 000007
【００７３】
表５中のデータは、ナイアシンアミドの使用の結果として、種々のＡＭＰの有意に高いレベルの分泌があることを示す。
【００７４】
［実施例１４〜１７］
感染に対して自身を防御する皮膚の能力についてのヒトボランティア研究
下記のプロトコールを使用する実験を行った：
１．  ボランティアに、使用するためのラックス（商標）石鹸を与え、研究開始前の７日間、前腕にいかなる他の石鹸も保湿剤も使用しないように求めた。
【００７５】
２．  ボランティアに、ヴァセリン（商標）ヘルシーホワイト基剤クリームおよびナイアシンアミド（１％、２％および３％）を配合したヴァセリン（商標）ヘルシーホワイトを前腕の種々の箇所に塗布するように求めた。
【００７６】
３．  ボランティアに、１日に２回１日間、朝の入浴後および夜の就寝直前、ステップ１を繰り返すように求めた。ボランティアに、夜の配合物の塗布後、前腕を洗わないように求めた。
【００７７】
４．  ２日目に、治験責任医師が非抗菌性固形石鹸を用いて前腕を洗い、ボランティアに、制御された条件（２４±２℃および４５％±５％ＲＨ）下で６時間待機するように求めた。
【００７８】
５．  ６時間の待機後、約１０６の大腸菌を前腕の各箇所に別個に塗布した。皮膚への大腸菌の接触時間は、１５分であった。
【００７９】
６．  １５分後、カップ−ロッド法を使用して試料を前腕から抽出した。
【００８０】
７．  標準的な微生物法を使用して、大腸菌を数えた。
【００８１】
種々の処理の大腸菌数についてのデータを、表６にまとめる。
【表６】
0006446065.tif 000008
【００８２】
表６中のデータは、ナイアシンアミドの使用が、侵入細菌に対する皮膚の遺伝免疫を増進することを示す。
【００８３】
故に、本発明は、人体の外部表面に塗布された場合に、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）の分泌を誘導するためのものである、これまで公知でなかったナイアシンアミドの新たな使用を提供する。