(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ) ＤＮＡ結合ドメインとしての、ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフまたは亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、及びＢ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれる第１ポリペプチド、及び光感受性ドメインとする第２ポリペプチドを含む原核細菌の組換光感受性転写因子のコード遺伝子と、
ｂ)前記第１ポリペプチドによって識別／結合される少なくとも１つの応答要素のプロモーター、またはプロモーター−応答要素、または応答要素−プロモーター、及び転写待ち核酸配列を含むターゲット転写ユニットと、を含み、
前記第２ポリペプチドは、アカパンカビ菌のＶＩＶＩＤのＬＯＶドメイン、オート麦フィトクロム１遺伝子のＡｓＬＯＶ２ドメイン、フシナシミドロのアウロクローム1のＡｕＬＯＶドメインおよびプソイドモナスのＰｐＳＢ１−ＬＯＶのＬＯＶドメインである、
原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項２】
前記第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間が直接に、または可操作性に連接可能であり、及び／または前記ターゲット転写ユニットにおける前記プロモーター、またはプロモーター−応答要素、または応答要素−プロモーターと転写待ち遺伝子との間が直接に、または可操作性に連接可能である、請求項１に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項３】
前記第１ポリペプチドは大腸菌ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン、λファージｃＩ抑制タンパクのＤＮＡ結合ドメイン、Ｌａｃ抑制タンパクＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン、Ｇａｌ４タンパクのＤＮＡ識別／結合ドメイン、テトラサイクリン抑制タンパクＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン、トリプトファン抑制タンパクＴｒｐＲのＤＮＡ識別／結合ドメインから選ばれる、請求項１に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項４】
ＲＮＡポリメラーゼの他の各成分を誘集することができる第３ポリペプチドが含まれ、前記第３ポリペプチドは第１、第２ポリペプチドと直接に、または結合ペプチドを介して連接される、請求項１に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項５】
前記第３ポリペプチドは大腸菌ω因子または大腸菌α因子から選ばれる、請求項４に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項６】
前記応答要素は前記第１ポリペプチドによって特異性識別／結合可能なＤＮＡ結合モチーフであり、ＬｅｘＡ結合要素、ｃＩ結合要素、ＬａｃＩ結合要素、Ｇａ１４結合要素及びＴｅｔＲ結合要素から選ばれる、請求項１に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項７】
前記プロモーターは大腸菌のｃｏｌＥプロモーター、ｓｕｌＡプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｕｍｕＤＣプロモーター、ｌａｃ最小プロモーター、Ｔ７バクテリオファージのＴ７プロモーター、λバクテリオファージのＯ１２プロモーター、枯草菌のｇｒａｃプロモーターから選ばれる、請求項１に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システム。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システムにおける前記組換光感受性転写因子のコード遺伝子および前記ターゲット転写ユニットを含む原核細菌の表現ベクター。
【請求項９】
前記組換光感受性転写因子におけるコード遺伝子のヌクレオチド配列が配列４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０９から選ばれ、アミノ酸配列が配列４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１１０から選ばれる、請求項８に記載の原核細菌の表現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の原核細菌の光誘起遺伝子表現システムを用いて原核細菌において遺伝子の表現を調整制御する方法であって、
ａ）原核細菌の表現ベクターに原核細菌の光誘起遺伝子の表現システムを構筑するステップと、
ｂ）調整制御される遺伝子を含む原核細菌細胞を導入するステップと、
ｃ）前記原核細菌細胞を光照射で誘起して、原核細菌細胞における調整制御されるヌクレオチドの表現をなさせるステップと、を含む遺伝子の表現を調整制御する方法。
【請求項１１】
さらに光源の選択及び光照射方法の選択を含み、前記光源がＬＥＤ灯、蛍光灯、レーザ及び白熱灯を含み、前記光照射方法は持続的な光照射または非持続的な光照射である、請求項１０に記載の遺伝子の表現を制御する方法。
【請求項１２】
光により走査、投影、空間において光金型により異なる位置における細胞の遺伝子の表現レベルを制御することを含む、請求項１０に記載の遺伝子の表現を制御する方法。
【請求項１３】
さらに印刷される投影フィルム、中性灰色フィルターを用いて空間において異なる位置における細胞の遺伝子の表現レベルを制御することを含む、請求項１０に記載の遺伝子の表現を制御する方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の前記原核細菌の表現ベクターまたはゲノムにおいて請求項１に記載の表現システムにおいて整合された光感受性転写因子の表現カセット内の原核細菌菌株、及び関係カタログが装入されている１つの試薬キット。
【請求項１５】
前記原核細菌の表現ベクターにおける転写待ち遺伝子は欠如される、請求項１４に記載の試薬キット。
【請求項１６】
請求項１に記載の原核細菌光誘起遺伝子表現システムの、原核細菌の生命活動の調整における使用であって、前記生命活動には細菌の移動と融解を含む、原核細菌の生命活動の調整における光誘起遺伝子表現システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物技術における遺伝工程または合成生物学分野に関し、具体的には遺伝子表現の調整制御分野に関し、より具体的には、原核細菌細胞における光感受性タンパクに基づく光誘起遺伝子表現システム及び該表現システムを用いて原核細菌細胞における遺伝子の表現を調整制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学分野において、遺伝子の表現を正確に制御することは、遺伝子の機能及び生命体の生命活動に対する研究にとっては非常に重要な意味を有する。真核細胞の複雑な遺伝子表現システムより原核細菌の遺伝子表現システムはわりに簡単である。原核細菌において非常に汎用されている大腸菌を例として、その遺伝子表現の第１ステップはＲＮＡポリメラーゼによる完成されたＤＮＡをＲＮＡに転写することである。大腸菌のＲＮＡポリメラーゼは５つのサブユニットによって組成され、その分子量が略４８０Ｋｄであり、α、β、β’σなどの４つの異なるポリペプチドを含み、そのうちのαが２つの分子を有するため、 ホロ酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）の組成はα２ββ’σである。αサブユニットがＲＮＡポリメラーゼの４量体コア（α２ββ’）の形成に関わり、βサブユニットがヌクレオシド３リン酸の結合部位を含み、β’サブユニットがテンプレートＤＮＡの結合部位を含み、またσ因子がＲＮＡ転写の開始のみに関わり、ＤＮＡチェーンの延長とは関係なかった。一旦転写を開始すると、σ因子が解放されており、またチェーンの延長はわりと４量体コア酵素（ｃｏｒｅ ｅｎｚｙｍｅ）によって触媒作用を及ばされる。従って、σ因子の役割はただ転写の開始信号を識別し、且つＲＮＡポリメラーゼをプロモーター部位に結合させるのみである。ＤＮＡ分子における開始信号、すなわち「 開始配列」はプロモーターと称される。大腸菌のプロモーター配列は主として−１０エリアと−３５エリアから構成されており、−１０エリアは転写開始点の上流の約１０ｂｐに位置され、６つの塩基のＴＡＴＡＴＡ保存配列を有し、またそれはＲＮＡポリメラーゼの緊密的な結合部位になっており、さらに転写開始点の上流の約３５ｂｐの位置に、６つの塩基のＴＴＧＡＣＡ保存配列を有しており、−３５エリアはＲＮＡポリメラーゼの全体識別の信号を提供しており、大腸菌のプロモーターの活性強さは主として−１０エリアと−３５エリアの塩基の構成及び同士の相互間隔の長さによって決まれる。単一のコア酵素とＤＮＡとの結合が可能であっても、主に塩基性タンパク質と酸性的核酸との間の非特異性静電引力からもたらしたため、ＤＮＡが依然としてダブルヘリックス形式を保持しており、またσサブユニットがＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間のアフィニティを改変できるため、酵素とプロモーターとの結合常数及び停留時間を大幅に増加する。従って、最初コア酵素はσサブユニットの参与によってＤＮＡ分子と接触して、非特異的複合体を形成しており、しかし酵素分子がＤＮＡチェーンに沿って滑動できるため、このような複合体が非常に不安定である。σサブユニットの作用下でホロ酵素全体はプロモーターを素早く見付けて、且つそれと結合して比較的に緩めな密閉型のプロモーター複合体を生成する。その時、酵素はＤＮＡと外部結合を形成し、その識別部位が約プロモーターの−３５部位のところにある。そしてＤＮＡ配座が変更されて活性化を呈して、開放型のプロモーター複合体を得、その時に酵素とプロモーターとが緊密に結合され、−１０部位においてＤＮＡ２重鎖を解けて、その中のテンプレート鎖を識別する。当該部位にＡ−Ｔ塩基ペアが豊富に含まれるため、ＤＮＡ鎖の切断に利する。また開放型の複合体が一旦形成されると、ＤＮＡは鎖切断を続けて、酵素が開始部位に移動される。よく汎用される他方の原核細菌はバシラス属菌で、それは１種のグラム陽性細菌である。大腸菌との異なることは、バシラス属菌に異なるプロモーター配列をそれぞれ識別するための多種のＲＮＡポリメラーゼとσ因子が含まれる。
【０００３】
原核細菌の遺伝子表現システムは主に二分されており、１つは組成型表現であり、すなわち誘起条件が必要としないままで目標タンパクより自動的に連続的に表現させる。もう１つは誘起表現システムである。誘起表現システムにおいて、異なる誘起物によってさらに二分されており、すなわち化学小分子誘起表現システムと物理方法での誘起表現システムである。化学小分子誘起表現システムにおいて、ＩＰＴＧはもっとも常用される１つの誘起剤である。ラクトースの類似物としてのＩＰＴＧが機能強い誘起剤の１種であり、細菌によって代謝できず、且つ十分に安定している。現在よく使われているいくつの表現ベクターの中、複数のＴ７プロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、ｇｒａｃプロモーターを有するもの誘起剤はすべてＩＰＴＧである。現在アラビノースとトリプトファンの誘起表現システムはますます汎用されており、小分子のアラビノースとトリプトファンは細胞に毒性のない、且つ緊密な調整制御を達成できる利点を持っている。Ｍｎ２+、Ｆｅ２+、Ｃｕ+などの金属イオンの化学感受性タンパクの発見は、研究者の視線が、金属イオンと、その相応しい感受性タンパクとの結合によりタンパク表現の方向を誘起することに引かれた。物理方法による誘起表現方法は通常温度の変化を利用してタンパク表現を誘起し、例えば大腸菌におけるＬａｃＩの温度感受性突然変異体が３０℃になる時にプロモーターを抑制する活性を有し、４２℃になる時に活性を失ったため、プロモーターを抑制する活性も失われる。紫外線（ＵＶ）で調整制御する「 ケージド」（ｃａｇｅｄ）という技術はもう１つの汎用される物理的誘起表現方法である（Ｋｅｙｅｓ,Ｗ．Ｍ．など、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３．２１（２）：５３−５５．を参照）[１]。
【０００４】
上述した原核細菌の誘起表現システムは比較的に汎用されても、幾つかの欠点を持っている。すなわち：１、細胞に対して誘起剤自体が比較的大きな毒性を有し、且つ価格が高すぎで（例えばＩＰＴＧ）、医療的目的とする組換タンパク質を調製することには適宜ではない。２、金属イオン誘起表現システムにおいては、金属イオン感受性タンパクが金属イオンを識別する特異性が強くなくて、同一族または同一周期の異なる金属イオンは同一の感受性タンパクにより結合されると、活性化になって転写されることができるため、原核細菌の細胞内部環境に存在される多種の金属イオンが転写に所定の干渉を与えられ、且つ原核細菌の細胞自体の酸化環境は低原子価イオンに酸化作用を発生させ、それによって、比較的に高い酸化環境が要求される金属イオンの活性化と転写が妨害される。３、温度誘起表現システムにおいては、外界温度の上昇は大腸菌における熱ショックタンパク質の活性化をもたらしており、いくつのタンパク質分解酵素が生成物の安定に影響を与え、数多くのターゲットタンパク質が高温の下で正しく折りたたまれないため、ＵＶ誘起による「 ケージド」技術は細胞に逆転てきない損害を与える可能性を有する。４、最も重要なのは、化学的誘起物は時間上のみにおいて遺伝子の表現を調整でき、空間レベルにおいて、ある細胞及び組織の遺伝子表現に対して特異的に調整制御できないことである。
【０００５】
但し、光というのは時間と空間においても操作しやすい誘起物であり、細胞にとっては前記毒性がなく、且つその取得は簡単である。ここ数年間において、複数の生物体内の生物時計を調整するシステムにおいて光調整可能なタンパク（光感受性タンパクとも称される）が発見されており、光照射はタンパク質の機能に対する重要な影響を与えられる。ここで、我々の発想としては、分子設計の方法で、自然に存在する転写因子を改造することによって、光感受性を有する人工的転写因子を合成し、さらにこれによって原核細菌の細胞において光調整制御遺伝子の表現システムを構築する。現在、原核細菌研究分野において関係レポートがまた少なくて、発表されたのは２つのシステムに係る。２００５年に、Ａｎｓｅｌｍ Ｌｅｖｓｋａｙａなどが光感受性タンパク質Ｃｐｈ１と大腸菌自体ＥｎｖＺ/ＯｍｐＲ複合信号通路による光調整制御タンパク質の表現システムを公開した［Ｌｅｖｓｋａｙａ, Ａ.等, Ｎａｔｕｒｅ, ２００５. ４３８(７０６７): ｐ. ４４１−２.][２]。暗中条件において、光感受性転写因子は自体リン酸化反応を発生してから、ＯｍｐＲが付属されるｏｍｐＣプロモーターに結合されることによって、ターゲット遺伝子の転写と表現を活性化する。遠赤光の照射下で、光感受性転写因子の自体リン酸化作用は抑制されて、ｏｍｐＣプロモーターと結合することができないため、ターゲット遺伝子の転写と表現を活性化することもできない。その後の何年間において、同一の研究チームが上述した光誘起表現システムを少し改良したが、複数色の光照射を用いて共にターゲットタンパク質の表現を調整する方法を得た。（Ｔａｂｏｒ, Ｊ.Ｊ.等、 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ, ２０１１. ４０５(２): ｐ. ３１５−２４，Ｔａｂｏｒ, Ｊ.Ｊ.等、Ｃｅｌｌ, ２００９. １３７(７): ｐ. １２７２-８１.][３, ４]を参照）またＫｅｉｔｈＭｏｆｆａｔの研究チームはもう１つの新たな組換光感受性転写因子ＹＦ１を開発し、それは枯草バシラス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＹｔｖＡ青光光感受性タンパクとダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からのＦｉｘＬタンパクに基づくものである（Ｍｏｇｌｉｃｈ, Ａ.等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ, ２００９. ３８５(５): ｐ. １４３３−４４，Ｏｈｌｅｎｄｏｒｆ, Ｒ.等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１２. ４１６, ５３４−５４２.] [５、 ６]を参照）。ＹＦ１に基づく光誘起遺伝子表現システムは青光照射がある場合にターゲットタンパクの表現が抑制され、逆に青光がない時にターゲット遺伝子が高いレベルで表現される。但し、このような２種類の原核細菌遺伝子表現システムは共に比較的大きな局限性を持っている。前者のシステムが非常に複雑で、光感受性転写因子と報告システムが必要とする外、さらにｈｏ１とｐｃｙＡという２つの遺伝子を導入しないと、 ヘム（ｈａｅｍ）をシステムの正常な稼動に必要とするフィコシアノビリン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎｏｂｉｌｉｎ）に転換することができないため、システム構築の仕事量を大幅にアップさせた。後者のシステムは青光照射下で依然として比較的多い表現の漏れがあり、誘起倍数も十何倍のみで、実際ターゲット遺伝子の表現量に対する非常に精確な調整制御ができないようになる。��述した欠陥は原核細菌においてこのような２つの光誘起表現システムの使用を制限し、いままで至って、上述したシステムに使われているＣｐｈ１とＹｔｖＡ光感受性タンパクの外、さらに周知のその他の光感受性タンパクは、フラビン物質を発色団とする光感受性タンパク（フラビンタンパク家族青光受容体とも呼ばれる）を挙げられ、それは１、光−酸素−電圧（ｌｉｇｈｔ−ｏｘｙｇｅｎ−ｖｏｌｔａｇｅ，ＬＯＶ）ドメイン含有の光受容体タンパク、例えば光感受性タンパク質、２、フォトリアーゼに類似する青色光受容タンパク質（ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ−ｌｉｋｅｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ）、３、近年において発見されたばかりのＦＡＤを利用する青光タンパク（ｂｌｕｅｌｉｇｈｔ ｕｓｉｎｇ ＦＡＤ,ＢＬＵＦ）という３種類に分けられている。
【０００６】
光感受性フィトクロムはＬＯＶドメインを含有する光受容体タンパク質に最も多くの１種類であり、多く研究されているのはフォトトロピン１（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ１）、ホワイトカラー−１（ＷＣ−１）、ホワイトカラー−２（ＷＣ−２）、ＰＹＰ（光感受性黄色タンパク、ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅｙｅｌｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐｈｙ３、ＶＩＶＩＤ等が挙げられる。光感受性フィトクロムは通常膜結合キナーゼタンパクが、青光照射下で自体リン酸化を発生し、キナーゼ活性を変更することによって相関する生理過程を制御する。光感受性フィトクロムの多くはそのＣ端がセリン／トレオニンキナーゼドメインで、Ｎ端がフラビン分子を結合する２つのＬＯＶドメインであり、青光照射する時にＬＯＶドメインとフラビン分子とが共有結合してフラビン−システイン付加生成物を生成することによって、フラビン結合ポケット空間構造変化を引き起こして、キナーゼドメインを有するＣ端がそのキナーゼ活性を変わることをもたらす。但し該当過程は完全に可逆である。いままで、原核生物細菌研究においてすでに樹立したもっとも成功的な光誘起表現システムはＶＩＶＩＤ光感受性タンパクに基づくものであった。Ｙａｎｇの研究チームは（Ｗａｎｇ, Ｘ.等、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２０１２. ｐ. ２６６−２６９.] [７]を参照）、アカパンカビのＶＩＶＩＤ青光光感受性タンパクを青光照射した後にホモ二量体を形成できる原理を利用して１つの原核光調整制御遺伝子表現のシステムを構築した。該システムにおいて、光感受性転写因子が３つまたは４つのポリペプチドから組成され、青光照射した後に組換光感受性転写因子の二量体化機能が変化し、二量体化された転写因子がターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列における応答要素と結合可能で、且つ該融合タンパクの第３ポリペプチドの転写活性化／阻止ドメインと原核細菌細胞自体その他の転写補助因子の募集を介して、共に該ターゲット転写ユニットにおけるプロモーターに働きをかけて、これによってターゲット遺伝子の転写と表現を調整（開始または抑制）する。該システム成分系は簡単で、且つ誘起が快速、誘起倍率が高く、逆転性がよく、時間と空間の特異性が高いなどの利点を備えたため、いままで最も優れた原核細菌細胞遺伝子の表現システムと認められる。しがし残念なことは、原核細菌と原核細菌細胞の転写と翻訳メカニズムが異なるため、該システムは原核細菌研究に汎用できない。それ以外に、ＭａｓａｙｕｋｉＹａｚａｗａ等（Ｙａｚａｗａ, Ｍ.等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ, ２００９. ２７(１０): ｐ. ９４１−５）[8]を参照）はシロイヌナズナのＦＫＦ１（ｆｌａｖｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ,ｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ, ｆ ｂｏｘ １）とＧＩ（ＧＩＧＡＮＴＥＡ）タンパクとの二者が青光により励起された後相互作用を発生できる原理を利用して、同様に１つの原核細菌遺伝子の表現を光で調整制御するシステムを構築したが、ただその低い誘起倍数とやや複雑なシステム成分系はその汎用化によく制限をかけた。
【０００７】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）からの青色光受容タンパク質は一番最初に分離されて得た植物青光光感受性タンパクであり、そのうち、多くの研究が行われたのは青色光受容タンパク質１（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ１，ＣＲＹ１）、青色光受容タンパク質２（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ ２，ＣＲＹ２）、植物の光感受性転写調整タンパク質Ａ（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ａ，ｐｈｙＡ）及び植物の光感受性転写調整タンパク質Ｂ(ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＢ，ｐｈｙＢ)等が挙げられ、その主な機能は昼と夜のリズム光照射を受けて植物の成長と運動を調整することである。青色光受容タンパク質のアミノ酸配列と発色団組成は光開裂可能なタンパク質によく似ている。数多くの青色光受容タンパク質の大きさは７０ｋＤ〜８０ｋＤであり、相対に保守的なＮ端ＰＨＲ（ ＤＮＡホトリアーゼと関連して）ドメインと、また長さの差異が比較的大きいＣ端という未知ドメインを含み、そのＰＨＲドメインは非共有結合でフラビンに結合できる。ある研究は、シロイヌナズナＣＲＹ２（すなわち青色光受容タンパク質２）とＣＩＢ１（青色光受容タンパク質２と相互作用するＨＬＨ）タンパク質二者が青光により励起された後相互作用を発生できることを利用して、１つの原核細菌細胞内部の光誘起表現システムを構築した（Ｋｅｎｎｅｄｙ, Ｍ.Ｊ., 等、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２０１０．７(１２)：９７３−９７５[９]を参照）。
【０００８】
ＢＬＵＦドメインを含む青光受容体タンパク及びＬＯＶドメインを含む光受容体タンパクが青色光受容タンパクとの異なるところは、前者は光照射で活性された後フラビン発色団と反応して共有結合生成物を生成しなく、その代わりに、発色団の構造変化を引き起こし黄色吸収光に１０ｎｍの赤方偏移を発生させる。ＢＬＵＦドメインを含む光受容体タンパクにおいて最も研究されるのはＡｐｐＡであり、これは紅色非硫黄細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）における１つの転写抑制性リプレッサであり、暗中条件下で、ＡｐｐＡが細胞における１種のＰｐｓＲ転写因子と結合してＡｐｐＡ−ＰｐｓＲ２複合物を形成することによって、ＰｐｓＲとＤＮＡとの結合が不可能となっており、強い青光線の照射によってＡｐｐＡは複合物から解離されて、ＰｐｓＲをリリースすることによって、四量体を形成して特定のＤＮＡ配列に結合し、それによって、相関する遺伝子の転写を抑制することに至る。（Ｐａｎｄｅｙ, Ｒ．等、ＦＥＢＳ Ｊ， ２０１２参照）[１０]。
【０００９】
Ｈａｉｆｅｎｇ Ｙｅなどの研究者は（Ｙｅ, Ｈ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２０１１. ３３２(６０３７): ｐ. １５６５−８）[１１]を参照）メラノプシン（ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ）と細胞内信号通路を利用して、１つの青光で励起される原核細菌細胞の光誘起表現システムを構築した。要は、メラノプシンはある種類のアマクリン細胞表面における１つの光感受性のプロテインである。青光があった場合、メラノプシンはカルシウムイオンが素早く細胞内に浸入することを引き起こし、一連の細胞内情報伝達系の反応を経由した後、カルシウム結合タンパク質（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）はセリントレオニンホスファターゼ活性を有するカルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）を活性化させることができ、カルシニューリンが転写因子ＮＦＡＴの 脱リン酸を行い、 脱リン酸化されたＮＦＡＴ転写因子が細胞核に進入してＮＦＡＴの特異性のプロモーターと結合した後、ターゲット遺伝子の転写と表現を開始する。該システムの最大欠点がシステム自体の複雑、且つ細胞内部における信号通路を参与したため、その安定性が弱くなり、なおかつ細胞の信号通路に対する影響によって細胞の正常な生命活動を妨害する恐れがある。
【００１０】
真核生物細胞よりも原核細菌の利点というのは繁殖が早く、育成コストが低く、異種タンパク質（はては細菌の総タンパク量の９０％以上にも達成できる）を効率よく表現できることである。このような利点から、大量的表現を目的とするタンパクの原核細菌細胞として、原核細菌はより適宜になる。但し上述したように、現在すでに原核細菌の遺伝子表現に汎用されているシステムには、化学誘起剤で調整制御方法が数多く採用されており、それらは誘起効果がよく、背景要求が低く、表現力が高いなど利点を持っていても、依然としてその多面作用を有するため、副作用も幅広くで、且つ潜在的な毒性を有する。最も重要なのは、化学誘起剤が空間レベルにおいて遺伝子の表現を正確的に調整制御できない。そして物理的な方法（例えば温度の使用）で遺伝子の表現を調整するシステムは現在少なくて、且つ温度の上昇に伴う副作用も沢山ある。光感受性タンパクに基づく少ないの遺伝子表現システムは、そのシステム自体の複雑、または誘起倍数が低いなどの原因でその汎用が限られている。
【発明の概要】
【００１１】
上述の纏めとして、我々がそれらのシステムの利点を統括してから、以前の研究者たちの欠陥を補うことによって生物医薬分野の研究において汎用できるように、原核細菌において１つのより優れた新たな光誘起遺伝子表現システムを創出可能であると思われる。ここで、厳密な研究を経て、時間と空間において共に遺伝子の表現を調整制御できる好適な遺伝子表現の調整制御機能を備えた１つの新型の原核細菌光誘起遺伝子表現システムを発明した。
【００１２】
そのため、本発明の第１の目的は新型の原核細菌の光誘起遺伝子表現システムを提供することにある。
本発明の第２の目的は前記光誘起遺伝子表現システムを用いて原核細菌細胞における遺伝子表現を調整する方法提供することにある。
本発明の第３の目的は前記原核細菌の光誘起遺伝子表現システムを含有する原核細菌の表現ベクターを提供することにある。
本発明の第４の目的は原核細菌の生命活動（例えば細菌の移動、融解など）において、前記光誘起遺伝子表現システムの用途を提供することにある。
本発明の第５の目的は前記原核細菌の光誘起遺伝子表現システムの表現ベクター、または関係遺伝子ゲノムにおいてゲノム表現システムにおける光感受性転写因子表現カセットの原核細菌菌株が装入される試薬キットを提供することにある。
【００１３】
本発明は原核細菌の光誘起遺伝子表現システムの提供に関し、ａ) ＤＮＡ結合ドメインとする第１ポリペプチド、光感受性ドメインとする第２ポリペプチドを含む組換光感受性転写因子のコード遺伝子と、ｂ)前記第１ポリペプチドによって識別／結合される少なくとも１つの応答要素のプロモーター、またはプロモーター−応答要素、または応答要素−プロモーター、及び転写待ち核酸配列を含むターゲット転写ユニットと、を含む。
【００１４】
本発明による原核細菌の光誘起遺伝子表現システムにおいて、組換光感受性転写因子は１つの組換光感受性ＤＮＡ結合タンパクであり、光照射の前後に該種の光感受性ＤＮＡ結合タンパクと関係ある応答要素との結合能力が顕著に変化され、それによって開始遺伝子プロモーターの転写と翻訳を直接に抑制、または開始する。
【００１５】
組換光感受性転写因子の第１ポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインを持ち、特異性的に応答要素を識別でき、ところが単独で応答要素上に結合できず、またはその結合能力が弱くて、第２ポリペプチドの補助さえこそあれば応答要素上に結合できる。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間が可操作性に連接可能である。
【００１６】
第１ポリペプチドはヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフまたは亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、及びＢ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれる。第２ポリペプチドは光感受性ドメインであり、通常フラビンを発色団とする光感受性タンパクから選ばれ、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間は直接連接可能で、または結合ペプチドを介して可操作性に連接も可能である。その結合ペプチドのアミノ酸の個数（例えば０〜１０個、またはより多くても）が変更可能である。
【００１７】
さらに第１ポリペプチドは大腸菌ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン、λファージｃＩ抑制タンパクのＤＮＡ結合ドメイン、Ｌａｃ抑制タンパクＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン、酵母Ｇａｌ４タンパクＤＮＡの結合ドメイン、テトラサイクリン抑制タンパクＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン、トリプトファン抑制タンパクＴｒｐＲのＤＮＡ識別／結合ドメイン、及びその短い切断体または／及びアミノ酸配列と８０％−９９％相同配列関係の突然変異体から選ばれる。
【００１８】
前記第２ポリペプチドはフラビン発色団を含む光感受性タンパクの光感受性ドメインとＬＯＶドメインを含む光感受性タンパクの光感受性ドメインから選ばれ、さらにアカパンカビ菌のＶＩＶＩＤのＬＯＶ２ドメイン、オート麦フィトクロム１遺伝子のＬＯＶ２ドメインＡｓＬＯＶ２、フシナシミドロ黄金色植物タンパク１のＬＯＶドメインＡｕＬＯＶ、 プソイドモナスのＬＯＶドメインＰｐＳＢ１−ＬＯＶ、及びその短い切断体またはアミノ酸配列と１５％−９９％配列相同、またはアミノ酸配列と３６％〜９９％配列類似の突然変異体から選ばれる。
【００１９】
本発明による原核細菌の光誘起遺伝子表現システムにおいて、ターゲット転写ユニットにおけるプロモーター−転写待ち核酸配列との間、またはプロモーター−応答要素−転写待ち核酸配列との間、または応答要素−プロモーター−転写待ち核酸配列との間にすべて直接に、または可操作性に連接可能である。
前記応答要素は前記第１ポリペプチドによって特異性識別／結合可能なＤＮＡ結合モチーフである。該応答要素は、ＬｅｘＡ結合要素、ｃＩ結合要素、ＬａｃＩ結合要素、Ｇａ１４及びＴｅｔＲ結合要素から選ばれる。
前記プロモーターは大腸菌のｃｏｌＥプロモーター、ｓｕｌＡプロモーター、ｒｅｃＣプロモーター、ｕｍｕＤＣプロモーター、ｌａｃ最小プロモーター、Ｔ７バクテリオファージのＴ７プロモーター、λバクテリオファージのＯ１２プロモーター、枯草菌のｇｒａｃプロモーターから選ばれる。
【００２０】
本発明による原核細菌の光誘起遺伝子表現システムによれば、組換光感受性転写因子はさらに付加のポリペプチドを含むことができ、例えばＲＮＡポリメラーゼのその他各成分を誘集する第３ポリペプチドである。前記第３ポリペプチドは第１、第２ポリペプチドと直接に、または結合ペプチドを介して連接可能である。第３ポリペプチドは大腸菌ω因子、大腸菌α因子、またはアミノ酸配列と３６％〜９９％類似の突然変異体から選ばれる。
【００２１】
さらに本発明は本発明の光誘起遺伝子表現システムを含む原核細菌の表現ベクターに関し、前記表現ベクターは単独で組換光感受性転写因子のコード遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターであってもよく、また単独でターゲット転写ユニットを含む原核細菌の表現ベクターであってもよい。前記ターゲット転写ユニットにおいて、プロモーターが含まれるが、転写待ち核酸配列が欠如され、またはプロモーター−応答要素が含まれるが、転写待ち核酸配列が欠如され、または応答要素−プロモーターが含まれるが、転写待ち核酸配列が欠如されており、または同時に組換光感受性転写因子のコード遺伝子とターゲット転写ユニットにおける原核細菌の表現ベクターとが含まれる。
【００２２】
前記表現ベクターにおける前記組換光感受性転写因子のコード遺伝子のヌクレオチド配列が配列４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０９から選ばれる。
【００２３】
さらに本発明は関係遺伝子ゲノムにおいて整合される本発明の光感受性遺伝子表現システムにおける光感受性転写因子の表現カセットの原核細菌菌株に関わる。
【００２４】
さらに本発明は本発明の光誘起遺伝子表現システムを用いて原核細菌細胞において遺伝子の表現を調整制御する方法にも関し、
ａ）原核細菌の表現ベクターに原核細菌の光誘起遺伝子の表現システムを構筑するステップと、
ｂ）調整制御される遺伝子を含む原核細菌細胞を導入するステップと、
ｃ）前記原核細菌細胞を光照射で誘起して、原核細菌細胞における調整制御されるヌクレオチドの表現をなさせるステップと、を含む。
【００２５】
本発明の原核細菌細胞において遺伝子の表現を調整制御する方法はさらに光源の選択及び光照射方法の選択を含み、前記光源がＬＥＤ灯、白熱灯、蛍光灯及びレーザを含み、然しそれらに限られず、前記光照射方法は光照射量、光照射時間、光照射強度及び光照射頻度の選定を含む。光により走査、投影、光金型などの方法により空間においてターゲット遺伝子の表現を制御することは同じように本発明の請求範囲に含まれる。
【００２６】
さらに本発明は１つの本発明の光誘起遺伝子表現システムを用いて原核細菌の生命活動、例えば移動と融解を調整制御する方法にも関わる。
【００２７】
さらに本発明は１つの試薬キットに関し、該１つの試薬キットには本発明の光誘起遺伝子表現システムの原核細菌（例えば大腸菌）の表現ベクターまたはゲノムにおいて請求項１に記載の前記表現システムにおいて整合された本発明の光誘起遺伝子表現システムにおける光感受性転写因子の表現カセットの原核細菌菌株、及び関係カタログが装入されている。本発明による試薬キットにおける原核細菌の表現ベクターに含まれるターゲット転写ユニットのうちの転写待ち核酸配列は欠如になってもよい。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
本発明は光感受性ポリペプチドに基づく原核細菌の光誘起遺伝子表現システムを提供し、時間及び空間においてターゲット遺伝子の原核細菌細胞における遺伝子表現を調整することに用いられる。本発明の光誘起遺伝子表現システムは少なくとも２つの部分に関し、第１部分は原核細菌細胞において表現できる組換光感受性転写因子融合タンパクのコードヌクレオチド配列であり、該融合タンパクが２つのポリペプチドによって構成され、そのうち、第１ポリペプチドがそのＤＮＡの識別／結合ドメインで、第２ポリペプチドが光感受性ポリペプチドであり、第２部分はプロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、またはプロモーター−応答要素−転写待ちヌクレオチド配列、または応答要素−プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列によって構成されるターゲット転写ユニットヌクレオチド配列であり、そのうち、応答要素が前記組換光感受性転写因子融合タンパクの第１ポリペプチドと識別／結合するＤＮＡヌクレオチド配列である。好ましくは、第１部分の２つのポリペプチドは相応されるタンパクの短い切断体の機能活性断片（即ちドメイン）を使用する。また遺伝子工程技術によって本発明の原核細菌の光誘起遺伝子表現システムの第１部分及び第２部分を１つの原核細菌の表現ベクターに構築またはそれぞれ２つの原核細菌の表現ベクターに構築することができる。具体的な使用過程において、普通の転換方法を用いて、前記２つの成分を原核細菌細胞において転換し、または普通の遺伝子ノックアウト方法を用いて、本発明の組換光感受性転写因子融合タンパクを表現するように第１部分を原核細菌細胞のゲノム上に整合する。適宜なピーク波長による光照射はその第２光感受性ポリペプチドの二量体化能力の変更をもたらすことができ、二量体化された光感受性ポリペプチドが本発明の第２部分ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素と結合させることができ、またＲＮＡポリメラーゼとプロモーター領域との結合を妨害することによってその下遊のターゲット遺伝子の転写と表現を直接抑制し、またはプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼのその他の成分を誘集することによって、下遊の遺伝子の転写と表現を開始することができる。
【００２９】
本発明から提供するこのような原核細菌の光誘起遺伝子表現システムは、細胞の損傷しない光照射を利用し、時間及び空間においてターゲットタンパク遺伝子の原核細菌細胞における表現を調整できる。
本発明によるこのような原核細菌の光誘起遺伝子表現システムは、異なる光照射の強さなどの光照射条件の差異を利用してターゲットタンパク遺伝子の原核細菌細胞における表現を調整できる。
本発明によるこのような原核細菌の光誘起遺伝子表現システムは、光でいくつのタンパクの表現を誘起することによって原核細菌の例えば運動、融解などの生命活動を制御することができる。使用する光は安価で、取得し易く、細胞に対する毒性がない。
【００３０】
本文に使用される用語の定義及びその説明
「宿主細胞」とは、本特許において原核細菌の細胞を特に指し、原始の、改造のないままの原核細菌細胞であってもよく、ゲノムが改造された商用の原核細菌の菌株であってもよい。例えば実験中によく使われるＢＬ２１、ＪＭ１０９(ＤＥ３)、ＤＨ５α、枯草菌ＷＢ８００などである。またはこのような商用菌株によってゲノムが改造して得られた原核細菌の菌株であってもよい。例えば本発明に述べるそのゲノムからｓｕｌＡ遺伝子、ＬｅｘＡ遺伝子をノックアウトして得たＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)大腸菌菌株で、またはそのゲノムにおいて本発明の組換光感受性転写因子ＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ::Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)を整合した大腸菌菌株であって、さらに本発明光誘起遺伝子表現システムと両立できるその他の宿主細胞であっても共によい。
【００３１】
「ターゲットタンパク」は、「興味のあるタンパク」とも呼ばれ、いずれの役立つタンパク、例えば予防または治療の目的、またはその他の用途に用いられて、大腸菌において表現することが必要とする役立つ生物タンパク質を指し、天然的または人工的に修飾され、または突然変異する役立つタンパク質が含まれる。
【００３２】
「レポータータンパク」はターゲットタンパクの１種で、その表現が測定されやすくて、役立つタンパク質を指す。本発明の光感受性ポリペプチドに基づく、光で誘起可能なターゲットタンパク遺伝子表現システムの効果を簡単に測定するため、赤色蛍光タンパク質(ｍＣｈｅｒｒｙ単量体蛍光タンパク質とも称される)、s−ガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)等既知の汎用されているレポータータンパクを選択してもよいが、本発明の光誘起可能なターゲットタンパク遺伝子表現システムはレポータータンパクの表現に限定しなく、いかなる役立つターゲットタンパクの表現に使用されることができる。
【００３３】
本文における「遺伝子」、タンパク質の「コードヌクレオチド配列」、「転写待ちヌクレオチド配列」の含意は同一で置き換えて使用されることができ、それらはコードターゲットタンパク遺伝子を指し、それが通常二重構成デゾキシリボ核酸ＤＮＡ二本鎖配列である。該種遺伝子は宿主細胞のゲノムＤＮＡ配列、または人工的に構築した表現ベクター、例として本発明におけるターゲット転写ユニット配列に含まれることができる。同様に、「レポーター遺伝子」はコードレポータータンパクの遺伝子を指す。
【００３４】
「転写」は本文において、原核細菌細胞においてＲＮＡポリメラーゼによってターゲット遺伝子を転写して該遺伝子情報の携わるＲＮＡを生成する過程を特定する。
【００３５】
「表現」、「ターゲットタンパク遺伝子表現」、「遺伝子表現」の本文における含意は同様または置き換えて使用されることができ、それらは、ターゲット遺伝子のＤＮＡ配列が転写されて、当該遺伝子情報の携わるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を生成することと、該ＲＮＡの携わる情報がライボソームにおいて翻訳されてターゲットタンパクを生成することとを指し、即ち、転写して情報ＲＮＡを生成することと翻訳されてターゲットタンパクを生成することのいずれも表現と呼ばれる。本文には前記２種類の意味を含み、主にターゲットタンパクの生成を指す。
【００３６】
「転写因子」または「転写因子の融合タンパク」の本文における含意は同様で、または置き換えて使用されることができ、原核細菌の転写因子を指し、通常それは１つのタンパク質で、天然的、または人工的に改造されたまたは人為に融合されるものであってもよく、ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素を識別／結合できるポリペプチドを含み、ターゲット転写ユニットにおける応答要素との結合及び相互作用によって、そのタンパク質は、自体で、またはＤＮＡポリメラーゼのその他成分を誘集することによってターゲットタンパク遺伝子の転写を調整することができる。転写因子はそれの異なる組成によって「転写活性化因子」または「転写抑制因子」に分けられ、２つは共に「転写因子」と呼ばれる。
【００３７】
「ターゲット転写ユニット」は、応答要素を含むプロモーター及びターゲットタンパク遺伝子によって構成される人造のＤＮＡ配列（プロテインではない）を指し、そのうち、応答要素は通常プロモーターの配列内部、またはプロモーターの３５エリアの上流、またはプロモーター１０エリアの下流に位置する。それらのターゲット遺伝子はプロモーターの下流に位置すると、相互に直接連接または操作性あるように（即ち若干のヌクレオチドを間隔してもよい）連接されることができる。
【００３８】
「応答要素」は転写因子が特異性的に識別／結合した１つのまたは複数のシス型ＤＮＡモチーフを指し、異なる転写因子は自体と対応する異なる応答要素を有し、転写因子にはこれらのＤＮＡモチーフと結合できる結合ドメインが含まれる。転写因子が自体と対応する応答要素と特異性的に結合すると、該応答要素が即にプロモーターに応答性を転送して、その時応答要素は自体で、またはＤＮＡポリメラーゼのその他成分を誘集することによってプロモーターの活性を抑制、または励起することができ、また相応するＲＮＡを生成するように下流ターゲット遺伝子の転写を妨害、または活性化させる。本発明において、応答要素は組換光感受性転写因子の第１ポリペプチドと特異性的に識別／結合できるＤＮＡモチーフ、例えばＬｅｘＡ識別／結合の応答要素が長さの１６ｂｐであるＤＮＡモチーフ（配列１１）を指す。
【００３９】
「プロモーター」はその下流遺伝子を開始及び案内してＲＮＡを生成させるＤＮＡ配列を指す。遺伝子表現の欠如できない重要な調整制御配列としてのプロモーターは天然遺伝子のプロモーターまたは人工で修飾されたプロモーターであってもよい。ｍＲＮＡの合成に非常に重要な原核細菌のプロモーターは相互間隔され、且つ保守度の高い２つのヌクレオチド配列によって構成される。転写開始点上流の５〜１０ｂｐのところに、そのある断片は６〜８つの塩基により組成され、ＡとＴエリア共に豊かに含まれるが、Ｐｒｉｂｎｏｗボックスと称され、またＴＡＴＡ結合タンパク質ボックスまたは−１０エリアとも称される。ソースの異なるプロモーターはそのＰｒｉｂｎｏｗボックスの塩基配列が少し変化ある。転写開始点上流の３５ｂｐの近辺に、１０ｂｐ断片により組成される１つのエリアがあり、それは−３５エリアと称される。転写の時大腸菌ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターを識別且つ開始する。−３５エリアはＲＮＡポリメラーゼのσサブユニットと結合し、−１０エリアはＲＮＡポリメラーゼのコア酵素と結合し、転写開始点の近辺に、ＤＮＡが融解され一本鎖を形成し、ＲＮＡポリメラーゼは、第１と第２ヌクレオチドからリン酸ジエステル結合を形成させた後、ＲＮＡポリメラーゼの作用で前に進められて、新たなＲＮＡ鎖を形成する。
【００４０】
「ベクター」、「表現ベクター」、「遺伝子表現ベクター」「組換遺伝子表現ベクター」または「プラスミド 」は本文において含意が同様でまたは置き換えて使用されることができ、原核細菌細胞において組換ターゲットタンパクを表現できるベクターを指す。
【００４１】
「転換」は、化学方法または物理方法によって、外因性プラスミドＤＮＡ分子を原核細菌細胞に進入させることを指す。具体的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋａ等（分子クローン実験マニュアル、第２版、冷泉港出版社（１９８９））、及びその他の関係テキストを参照できる。
【００４２】
本発明の光誘起原核細菌遺伝子の表現システムにおいて、第１部分の組換光感受性転写因子は、２種または３種の機能性ポリペプチド断片がペプチド結合を介して直接直列連接され、または短鎖ペプチドジョイントを介して直列連接して形成された融合タンパクである。適当な波長の光照射下で、該融合タンパクが本発明の第２部分のターゲット転写ユニットヌクレオチド配列の応答要素に結合でき、且つ自体により、または宿主細胞におけるＲＮＡポリメラーゼのその他成分を募集することによって、協力してプロモーターエリアに共同に作用し、それによって、ターゲット転写ユニットにおけるターゲットタンパク遺伝子の転写と表現を抑制または開始する。
本文において、「組換光感受性転写因子融合タンパク」と「組換光感受性転写因子」との含意が同様で、置き換えて使用されることができる。
本発明の組換光感受性転写因子は第１ポリペプチドを含有し、該ポリペプチドは前記ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素を特異性的に識別できるが、それと結合できずまたは当該結合能力が弱く、第２ポリペプチドからの協力のみを得て、同質二量化を発生したこそ応答要素と結合できることなっており、該当ポリペプチドはいかなる周知されるタンパク質ＤＮＡ識別／結合ドメインから引き出すことができる。好ましくは、アミノ酸配列がよりよく短いの、天然的、または合成的なＤＮＡ識別／結合ドメイン、またはその他類似物（例えば結合機能が留保され、延いては補強されたドメイン突然変異体または断片プロタミン）使用してもよい。本発明の第１ポリペプチドとして用いられるのは、ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフまたは亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、Ｂ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれる。本発明の第１ポリペプチドは、ＬｅｘＡタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメイン（配列２）、λファージｃＩ抑制タンパクｃＩタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメイン（配列４）、Ｌａｃ抑制タンパクＬａｃＩのＤＮＡ識別／結合ドメイン（配列６）、酵母Ｇａｌ４のＤＮＡ識別／結合ドメイン（配列８）、テトラサイクリン抑制タンパクＴｅｔＲのＤＮＡ識別／結合ドメイン（配列１０）など、及びその断片突然変異体または／とアミノ酸配列が８０％〜９９％の同族関係を持つ突然変異体を含み、但しこれらに限られない。さらに好ましくは、ＬｅｘＡタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインとｃＩタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインを使用する。
【００４３】
大腸菌細胞内に生存される１つの転写抑制因子であるＬｅｘＡタンパクは、細胞内の２０数種の遺伝子の転写を調整制御でき、同族関係二量体化された後、ＬｅｘＡの二量体はプロモーターにおける応答要素の１６個の塩基のＣＴＧＴ（Ｎ）８ＡＣＡＧの回文構造を識別／結合することによって、ＲＮＡポリメラーゼがその後の遺伝子に対する転写を抑制することができる。ＬｅｘＡタンパクは２０２個のアルミ酸を含み、そのうち１〜８７位置のものはそのＤＮＡ識別／結合ドメインである。８８〜２０２位置のアルミ酸はその二量体化ドメインで、ただ同族関係二量体化されたＬｅｘＡのみは相応する応答要素と特異性的に結合でき、但しＬｅｘＡ単体タンパクは不可能である。通常大腸菌細胞における
ＬｅｘＡは二量体化の形で生存され、細胞が内部、または外部からＳＯＳ信号の刺激を受けた時、二量体化されたＬｅｘＡは細胞内部のある酵素（例えばＲｅｃＡ）によって切断し分離され、且つ応答要素から解離されるため、本来ＬｅｘＡによって抑制した遺伝子を活性化させ、そして大腸菌がＳＯＳ信号を応える修復を開始する（[１２, １３][ Ｓｃｈｎａｒｒ, Ｍ.等、 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ, １９９１. ７３(４): ｐ. ４２３−３１，Ｌｉｔｔｌｅ, Ｊ.Ｗ.等、Ｃｅｌｌ, １９８２. ２９(１): ｐ. １１−２２.]を参照）。ＬｅｘＡに基づく)酵母ツーハイブリッド法は同じように遺伝子表現とタンパク質との相互作用についての研究に用いられる。例えばＣｌｏｎｅｔｅｃｈという会社が生産した酵母ツーハイブリッド法（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ＬｅｘＡ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）は該当システムに基づいたものである。
【００４４】
λファージｃＩ遺伝子コードの１つの転写抑制因子であるｃＩタンパクは、λ左λ右という２つの早期プロモーターの転写を抑制でき、それによって複製及び細胞融解可能のタンパクが生成できないことをもたらす。ｃＩタンパクは、２３６個のアルミ酸を含み、そのＮがＤＮＡ識別／結合ドメイン（１〜１０２位置のアルミ酸）であり、Ｃ端が二量体化ドメイン（１３２〜２３６位置のアルミ酸）である。ｃＩタンパク同族関係二量体は、ＰＬとＰＲという２つのオペロン配列の上に識別／結合されており、それぞれのオペロンにｃＩタンパクの３つの識別結合位置点が含まれ、それぞれＰＬのＯＬ１、ＯＬ２とＯＬ３、及びＰＲのＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３である。ｃＩとＯＲ１との結合能力は比較的に強くて、ＯＲ１の保守ＤＮＡ配列はＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡで、単体ｃＩタンパクは、このような結合能力をほとんど持たない。（Ｂｕｒｚ, Ｄ.Ｓ.等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３ (２８), ８３９９−８４０５ (１９９４)，Ｈｕ, Ｊ.Ｃ.等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０ (４９８６), １４００−１４０３ (１９９０)][１４, １５]を参照）。
【００４５】
Ｌａｃ抑制タンパクＬａｃＩが大腸菌乳糖オペロンシステムを特異性的に識別／結合し、それによって関連遺伝子の転写と表現を調整することができる。ＬａｃＩタンパクはＮ端のＤＮＡ識別／結合ドメイン（１〜６２位置のアルミ酸）、コアタンパク質ドメイン（６３〜３４０位置のアルミ酸）、及びＣ端四量体化ドメイン（３４１〜３５７位置のアルミ酸）を含む。その特異性識別／結合するＤＮＡ保存配列はＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴで、ただ二量化または四量化されたＬａｃＩのみはそれと結合でき、単体のＬａｃＩタンパクはほとんどこのような結合能力がない（Ｌｅｗｉｓ, Ｍ.等, Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６. ２７１ (５２５３), １２４７−１２５４、Ｆｒｉｅｄｍａｎ, Ａ.Ｍ.等、Ｓｃｉｅｎｃｅ, １９９５. ２６８(５２１８): ｐ. １７２１−７.を参照[１６, １７]）。
【００４６】
Ｇａｌ４が出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌の転写活性化タンパク（そのコード遺伝子がＧＡＬ４と表記する）であり、遺伝子プロモーターの上流応答要素−活性化モチーフＵＡＳＧ[要は長さが１７ｂｐの一部の配列５'−ＣＧＧＲＮＮＲＣＹＮＹＮＹＮＣＮＣＣＧ−３'（そのうちＲがプリンで、Ｙがピリミジンで、Ｎがデオキシリボヌクレオチドである）]を識別／結合できる。それはガラクトースにより誘導する遺伝子、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０とＭＥＬ１の転写と表現に介在可能とする。Ｇａｌ４のＮ末端はＤＮＡ識別／結合ドメインで、Ｃ末端は転写活性化結合ドメイン（ＡＤ）である。該ＤＮＡ識別／結合ドメインは、１つのジンククラスター（Ｚｉｎｃｃｌｕｓｔｅｒ）、すなわちＺｎ(２)−Ｃｙｓ(６) 二核クラスターを含み、それは同質の二量体を形成しないと応答要素を結合しその役割を立つことができない。（Ｋｒａｕｌｉｓ, Ｐ.Ｊ.等、 Ｎａｔｕｒｅ, １９９２. ３５６(６３６８): ｐ. ４４８−５０.，Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ, Ｒ.等、 Ｎａｔｕｒｅ, １９９２. ３５６(６３６８): ｐ. ４０８−１４.[１８, １９]を参照）。Ｇａｌ４／ＵＡＳに基づく酵母ツーハイブリッド法は遺伝子表現研究に用いられる１つの有効なツールである。例えば、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）により生産された哺乳動物ツーハイブリッド系（ＣｈｅｃｋＭａｔｅTM Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍ）は該Ｇａｌ４/ＵＡＳの使用したものである。
【００４７】
ＴｅｔＲ抑制タンパクは多くのグラム陰性細菌に存在する転写因子であり、特定ＤＮＡモチーフを結合することによって関連する遺伝子の転写を抑制する。ＴｅｔＲタンパクのＮ端がＤＮＡ識別／結合ドメインで、Ｃ端が二量体化ドメインである。単体ＴｅｔＲタンパクは同質二量体を形成することによって特性ＤＮＡ配列を含むオペロン上に識別／結合でき、但し単体ＴｅｔＲ自体はこのような結合力をほとんど持っていない〔Ｗｉｓｓｍａｎｎ, Ａ. 等, ＥＭＢＯ Ｊ,１９９１．１０ (１３), ４１４５−４１５２（１９９１），Ｒａｍｏｓ, Ｊ.Ｌ.等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ, ６９(２), ３２６−３５６（２００５）を参照〕 [２０, ２１]。
【００４８】
本発明の１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドはＬｅｘＡタンパクの１〜８７位置のアルミ酸で、すなわちそのＤＮＡ識別／結合ドメイン（その核酸とタンパク質の配列がそれぞれ配列１と配列２）であり、その自体が単独で応答要素（配列１１）と結合できない。他の１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドはｃＩタンパクの１〜１０２位置のアルミ酸で、すなわちそのＤＮＡ識別／結合ドメインの短い切断体（その核酸とタンパク質の配列がそれぞれ配列３と配列４）であり、単独で応答要素（配列１２）と結合できない。他の１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドはＬａｃＩタンパクの１〜６２位置のアルミ酸で、即ちそのＤＮＡ識別／結合ドメインの短い切断体（その核酸及びタンパク質の配列がそれぞれ配列５及び配列６）であり、単独で同じように応答要素（配列１３）と結合できない。もう１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドはＧａｌ４タンパクの１〜６５位置のアルミ酸で、即ちそのＤＮＡ識別／結合ドメインの短い切断体（その核酸及びタンパク質の配列がそれぞれ配列７及び配列８）であり、単独で同じように応答要素（配列１４）と結合できない。さらにもう１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドはＴｅｔＲタンパクの１〜６３位置のアルミ酸で、即ちそのＤＮＡ識別／結合ドメインの短い切断体（その核酸及びタンパク質の配列がそれぞれ配列９及び配列１０）であり、単独で同じように応答要素（配列１５）と結合できない。
【００４９】
本発明の光感受性遺伝子表現システムにおいて、組換光感受性転写因子における第２ポリペプチドが光感受性ポリペプチドで、フラビン類（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を発色団とする光感受性ドメイン、例えば光−酸素−電圧（ＬＯＶ）ドメインにおける光感受性タンパク、フォトリアーゼに類似する青色光受容タンパク質（ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ−ｌｉｋｅｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ）、ＦＡＤを利用する青光タンパク（ｂｌｕｅ ｌｉｇｈｔ ｕｓｉｎｇ ＦＡＤ,ＢＬＵＦ）から得る。好ましくは、ＬＯＶドメインの含有する光感受性タンパクを選んで、適当な波長の光によって照射された後、第２ポリペプチドの二量化能力が変ることにより、転写因子の二量化能力に変化を発生させ、二量化された転写因子が相応する応答要素に結合し、それによって、ターゲット遺伝子の表現レベルを直接に調整する。本発明は以下の複数種の好ましい光感受性タンパクまたはその機能性の活性短い切断体を含むが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明の１つの好適な第２ポリペプチドはアカパンカビ細胞のＶＩＶＩＤ（ＶＶＤ）タンパクの光感受性ドメイン及びその突然変異体である。ＶＶＤはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）細胞内において青光の細胞信号伝導通路を調整制御することに参与する光感受性タンパク質であり、青光照射下で、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ，ＦｌａｖｉｎＡｄｅｎｉｎｅ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とタンパク分子間の反応を発生して二量体を形成できる。全長ＶＩＶＩＤタンパクには１８６つのアミノ酸を含み、また光に対して敏感である１つのＬＯＶドメインのみを含む。研究によって、ＶＶＤタンパクがＮ端３６つのアミノ酸の短い切断体タンパク（ＶＶＤ３６）を欠如するため、その安定性が全長タンパク質よりよく、また青光により照射した後形成されたＶＶＤ３６二量体は、光照射しなくその単体形状を回復する半減期が１８０００ｓで、点突然変異Ｃ７１Ｖを含有するＶＩＶＩＤ３６二量体の能力がより強いことは分かった。（Ｚｏｌｔｏｗｓｋｉ, Ｂ.Ｄ.等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２００８. ４７(２７): ｐ. ７０１２−９，Ｓｃｈｗｅｒｄｔｆｅｇｅｒ, Ｃ. 等、ＥＭＢＯ Ｊ, ２００３. ２２(１８): ｐ. ４８４６−５５.を参照すること[２３, ２４]）。本発明の１つの好適な実施形態において、第２ポリペプチドが１つの点突然変異を含有する、前１〜３６つのアミノ酸を削除したＶＶＤ（Ｃ７１Ｖ）、ＶＶＤ(Ｎ５６Ｋ)、ＶＶＤ(Ｙ５０Ｗ)突然変異タンパク(その核酸配列がそれぞれ１６、１８、２０で、アミノ酸配列がそれぞれ１７、１９、２１である)である。本発明のもう１つのより好適な実施形態において、第２ポリペプチドが２つの点突然変異を含有する、前１〜３６つのアミノ酸を削除したＶＶＤ（Ｎ５６ＫＣ７１Ｖ）、ＶＶＤ（Ｉ５２ＡＣ７１Ｖ）、ＶＶＤ（Ｉ５２ＳＣ７１Ｖ）及びＶＶＤ（Ｎ５６ＲＣ７１Ｖ）の突然変異タンパク(その核酸配列がそれぞれ２２、２４、２６．２８で、アミノ酸配列がそれぞれ２３、２５、２７及び２９)である。
【００５１】
第２の好適な第２ポリペプチドは、オート麦（Ａｖｅｎａｓａｔｉｖａ）光感受性色素１遺伝子のＬＯＶ２ドメイン(ＡｓＬＯＶ２と略する。そのヌクレオチドとアルミ酸配列がそれぞれ３０、３１である)（Ｐｅｔｅｒ, Ｅ., Ｂ. 等、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ, ２０１０. １(８)： １２２、Ｈａｌａｖａｔｙ, Ａ.Ｓ. 等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２００７. ４６(４９): ｐ. １４００１−９.]を参照[２５, ２６]）である。オート麦細胞光感受性色素１のＮ端がＬＯＶ１及びＬＯＶ２光−酸素電圧（ｌｉｇｈｔ−Ｏ−ｖｏｌｔａｇｅＬＯＶ）ドメインであり、青光の照射下で共にフラビンモノヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＭＮ）と結合して付加生成物を生成できる。本発明はオート麦光感受性色素１のＬＯＶ２ドメインを第１ポリペプチドに連接して、光照射で転写因子の第１ポリペプチドと対応する応答要素との結合能力を制御できることを成功に導いた。本発明はＡｓＬＯＶ２第２ポリペプチドの転写因子ＬＡを含有し、暗中においてそれの対応する応答要素と結合し、ターゲット遺伝子の表現に至ることができ、光照射において、前記結合が衰弱されてターゲット遺伝子の表現レベルを上向き調整することに至る。
【００５２】
本発明第３の好適な第２ポリペプチドは、フシナシミドロ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅａｌｇａｅ Ｖａｕｃｈｅｒｉａ ｆｒｉｇｉｄａ）アウロクローム1（ａｕｒｅｏｃｈｒｏｍｅ１）タンパクＣ端のＬＯＶドメイン(ＡｕＬＯＶと略し、その核酸及びタンパク質配列がそれぞれ配列３２及び配列３３である。)[ Ｔａｋａｈａｓｈｉ, Ｆ.等、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ Ｕ Ｓ Ａ, ２００７. １０４(４９)： １９６２５−１９６３０を参照。[２７]]である。本発明はＡｕＬＯＶ第２ポリペプチドを含有する組換転写因子ＬＡｕを光照射した後、その二量体化能力が増強されることによって、ターゲット遺伝子の表現レベルを下向き調整させた。
【００５３】
以上述べた数種の第２ポリペプチドのうち、ＶＶＤ及びＡｕＬＯＶは適当な波長光で照射すれば、それらにより構成された組換光感受性転写因子に二量化を増強させ、応答要素と結合することによって下遊遺伝子の転写を抑制することができる。一方、ＡｓＬＯＶ２により構成された組換光感受性転写因子が、暗中において二量化されて応答要素と結合し、これによって、下遊遺伝子の転写を抑制させる。
【００５４】
光感受性タンパクから、それぞれＶＩＶＩＤ(Ｎｃ＿ＶＶＤ)、ホワイトカラー−1（Ｎｃ＿Ｗｃ１）、ＦＫＦ１(Ａｔ＿ＦＫＦ１)、アウロクローム１（Ｖｆ＿Ａｕｒｅｏ１＿ＬＯＶ）、オート麦フォトトロピン１（Ａｓ＿ｐｈｏｔ＿ＬＯＶ１及びＡｓ＿ｐｈｏｔ＿ＬＯＶ２）から由来する６種の異なるＬＯＶドメインに対して、ＡｃｃｅｌｒｙＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．１を用いて相同関係を分析し、その結果は、前記複数種のタンパクの完全に同様であるアミノ酸が約１５％で、類似性の有する配列が約３６％である（図３６）ことを示した。
【００５５】
本発明の光感受性遺伝子表現システムにおいて、さらに組換光感受性転写因子は第３ポリペプチドを含むことができ、該ポリペプチドがＲＮＡポリメラーゼのその他成分を募集できる。本発明第３ポリペプチドとして用いられるのは、大腸菌のω因子から、またはα因子からのドメインであり、この２つのドメインがこの前の大腸菌の酵母ワンハイブリッド法において研究者よりすでに汎用されている（Ｄｏｖｅ, Ｓ.Ｌ.等、１９９８. １２(５): ｐ. ７４５−５４，Ｄｏｖｅ, Ｓ.Ｌ.等、Ｎａｔｕｒｅ, １９９７. ３８６(６６２５): ｐ. ６２７−３０.を参照[２８, ２９]）。第３ポリペプチドは第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを直接連接、または結合ペプチドを介して連接できる。
【００５６】
以上に説明したように、本発明の組換光感受性転写因子に含まれる２種または３種のポリペプチドの間にはそれぞれ複数種の選択を有してもよく、２種または３種のポリペプチドを融合タンパクに連接してなることはさらに複数種の組合選択を有してもよい。好ましくは、本発明は良好な活性の有する２種または３種のポリペプチドの機能ドメイン断片を選んで、またそれによってなるべく短い組換光感受性転写因子融合タンパクを調製する。原核細菌細胞においてターゲット遺伝子の表現に対する好適な調整制御能力を有するもの、即ち光照射及び暗中条件下でターゲット遺伝子の表現量の差異を大きくなさせる当該組換光感受性転写因子を選出することによって、ターゲット遺伝子の表現を調整するが、いずれの選択及び組合は、本発明の構想される光制御遺伝子表現性能を実現できる組換光感受性転写因子であれば、またその各種の組合は全て本発明の範囲に属する。
【００５７】
本発明の原核細菌の光誘起遺伝子表現システムにおいて、その第２部分のターゲット転写ユニットは、転写因子によって特異性的に識別／結合されたプロモーター−転写待ちヌクレオチド配列によって構成され、またはプロモーター−応答要素−転写待ちヌクレオチド配列−、または応答要素−プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列−によって構成される。そのうち、プロモーター−応答要素、または応答要素−プロモーターのヌクレオチド配列は本発明の異なる実施形態に選択された組換光感受性転写因子の第１ポリペプチドの異同によって異なる。言い換えれば、選定した第１ポリペプチドに基づいてそれに相応するプロモーター、またはプロモーター−応答要素、またはまたは応答要素−プロモーターを選択しなければならない。例えば、第１ポリペプチドがＬｅｘＡタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列１１」である。第１ポリペプチドがｃＩタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列１２」である。第１ポリペプチドがＬａｃＩタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列１３」である。第１ポリペプチドがＧａｌ４タンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列１４」である。第１ポリペプチドがＴｅｔＲタンパクのＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列１５」である。
【００５８】
本発明において、光誘起転写因子と相応する応答要素は通常プロモーターヌクレオチド配列の内部に含まれ、またはプロモーターの−１０エリアの下遊に位置され、それと結合された光誘起転写因子はＲＮＡポリメラーゼとプロモーターエリアとの結合を防止することによって、下遊ターゲット遺伝子の転写を下向き調整させる。本発明の具体的な実施形態において、プロモーターは大腸菌のｃｏｌＥプロモーター、ｓｕｌＡプロモーター、ｒｅｃＣプロモーター、ｕｍｕＤＣプロモーター、λバクテリオファージのＯ１２プロモーター、Ｔ７バクテリオファージのＴ７プロモーター、枯草菌のｇｒａｃプロモーター（相応する核酸配列がそれぞれ３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０）である。また応答要素がプロモーター−３５エリアの上流に位置されてもよく、光誘起転写因子の第３ポリペプチドを介してＲＮＡポリメラーゼのその他成分を募集することによって下遊遺伝子の転写を開始する。関係ある参考書類を分析して得たのは、該種のプロモーターはｌａｃ最小プロモーター（核酸配列が４１である）を含み、但しそれに限られず、そのうちの上流応答要素の個数が１〜５、またがさらに多くなってもよい。本発明の実施形態において、好ましくは、ｌａｃ最小プロモーターを選出する。
【００５９】
当業者に周知されたように、いわゆる「操作性に連接」は応答要素とプロモーターの間、または複数の応答要素の間に直接に連接する形ではなく、若干のヌクレオチドを隔断する可能で、その代わりに相互に協力して作用できるこそとすれば結構であると意味する。
【００６０】
本発明のターゲット転写ユニットプロモーターの下流が転写待ちのヌクレオチド配列であり、それはコードターゲットタンパクのＲＮＡのヌクレオチド配列を指す。上述のように、ターゲットタンパクは現在周知の、将来発見のいずれの役立つのタンパクであってもよい。本発明システムの効果の検証及びその測定しやすいため、本発明の実施例において、デモンストレーションのレポータータンパクとして、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ４２及び４３である）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ４４及び配列４５である）、ＥｒｏｌＳＨ基酸化酵素（その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列４６及び配列４７である）らは採用されており、但し本発明はそれらのレポータータンパクに限られない。
【００６１】
規範的な組換ＤＮＡ技術を使用することによって、本発明の光誘起遺伝子表現システムの第１部分及び第２部分を１つの原核細菌の表現ベクターに構築しまたはそれぞれ２つの原核細菌の表現ベクターに構築することができる。必要なターゲットタンパクを表現するように規範的な技術を使用してこのような表現ベクターを各種の原核細菌細胞に導入することができる。
【００６２】
本発明は前記２種または３種のポリペプチドによるそれぞれの組合の複数の組換光感受性転写因子遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターを提供する。本発明の１つの好適な実施形態において、ＬｅｘＡ(１−８７)とＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)の間の結合ペプチドと異なる組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)の遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターを提供する。すなわちｐＬＶ−Ｌ０、ｐＬＶ−Ｌ１、ｐＬＶ−Ｌ２、ｐＬＶ−Ｌ３、ｐＬＶ−Ｌ４、ｐＬＶ−Ｌ５、ｐＬＶ−Ｌ６、ｐＬＶ−Ｌ７、ｐＡＬＶ−Ｌ０、ｐＡＬＶ−Ｌ１、ｐＡＬＶ−Ｌ２、ｐＡＬＶ−Ｌ３、ｐＡＬＶ−Ｌ４、ｐＡＬＶ−Ｌ５、ｐＡＬＶ−Ｌ６、ＡｐＬＶ−Ｌ７（その組換光感受性転写因子がＬＶ−Ｌ０、ＬＶ−Ｌ１、ＬＶ−Ｌ２、ＬＶ−Ｌ３、ＬＶ−Ｌ４、ＬＶ−Ｌ５、ＬＶ−Ｌ６、ＬＶ−Ｌ７と略称し、該当ヌクレオチド配列がそれぞれ４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２で、アミノ酸配列がそれぞれ４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３）である。
【００６３】
もう１つの好適な実施形態において、そのうちのＶＶＤが単一点突然変異の組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＶ−Ｌ０ (Ｎ５６Ｋ) 、ｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｙ５０Ｗ)を提供し、その丸括弧のなかでＶＶＤの突然変異の遺伝子座が表示されており、このような２つの組換光感受性転写因子のコード核酸配列がそれぞれ６４、６６であり、アミノ酸配列がそれぞれ６５、６７である。本発明の他１つの好適な実施形態において、そのうちのＶＶＤにダブル突然変異の遺伝子座を含有する組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＶ−Ｌ０ (Ｎ５６ＫＣ７１Ｖ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０ (Ｉ５２Ａ Ｃ７１Ｖ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０ (ＩＳ２Ｓ Ｃ７１Ｖ)とｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｎ５６Ｒ Ｃ７１Ｖ) を提供し、当該４つのヌクレオチド配列がそれぞれ６８、７０、７２、７４であり、アミノ酸配列がそれぞれ６９、７１、７３、７５である。
【００６４】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＡｓＬＯＶ２（ＬＡと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ７６、７７である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＡを提供する。他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＡｓＬＯＶ（ＬＡｕと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ７８、７９である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＡｕを提供する。他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ｃＩ(１−１０２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ＣＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ８０、８１である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＣＶを提供する。
【００６５】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬａｃＩ(１−６２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ＬａＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ８２、８３である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬａＶを提供する。他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子Ｇａ１４(１−６５)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ＧＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ８４、８５である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＧＶを提供する。
【００６６】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＴｅｔＲ(１−６３)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ＴＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ８６、８７である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＴＶを提供する。他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）−α（ＬＶαと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ８８、８９である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＶαを提供する。
【００６７】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ω−ＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ωＬＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ９０、９１である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡωＬＶを提供する。他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ｃＩ(１−１０２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）−α（ＣＶαと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ９２、９３である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬＶαを提供する。
【００６８】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ω−ｃＩ(１−１０２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ωＣＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ９４、９５である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡωＣＶを提供する。
【００６９】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬaｃＩ(１−６２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）−α（ＬａＶαと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ９６、９７である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＬａＶαを提供する。
【００７０】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ω−ＬａｃＩ(１−６２)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ωＬａＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ９８、９９である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡωＬａＶを提供する。
【００７１】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子Ｇａ１４(１−６５)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）−α（ＧＶαと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ１００、１０１である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＧＶαを提供する。
【００７２】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ω−Ｇａ１４(１−６５)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ωＧＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ１０２、１０３である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡωＧＶを提供する。
【００７３】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＴｅｔＲ(１−６３)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）−α（ＴＶαと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ１０４、１０５である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡＴＶαを提供する。
【００７４】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ω−ＴｅｔＲ(１−６３)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）（ωＴＶと略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ１０６、１０７である）遺伝子を含む原核細菌の表現ベクターｐＡωＴＶを提供する。
【００７５】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０遺伝子及びターゲット転写ユニットｃｏ１Ｅ−ｍＣｈｅｒｒｙを含む原核細菌の表現ベクターｐＤ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ（そのうちｔｅｒ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ−ｔｅｒのヌクレオチド配列１０８である）を提供する。
【００７６】
他１つの実施形態において、組換光感受性転写因子ＬａｃＩ(１−６２,ｗｔ)−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)遺伝子（ＬａＶ（ｗｔ）と略称し、そのコード核酸とアミノ酸配列がそれぞれ１０９、１１０である）及びターゲット転写ユニットＰｇｒａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙを含む原核細菌の表現ベクターｐＨＴ０１−ＬａＶ(ｗｔ)−ＰｇｒａｃｍＣｈｅｒｒｙ（そのうちＬａＶ(ｗｔ)−ＰｇｒａｃｍＣｈｅｒｒｙのヌクレオチド配列１１１である）を提供する。
【００７７】
本発明は転写待ちヌクレオチド配列の欠如するターゲット転写ユニットの原核細菌の表現ベクターを提供し、転写待ちのヌクレオチド配列欠如はユーザーに必要な転写待ちヌクレオチド配列例えばターゲットタンパクのコード遺伝子を自由に選択させることが可能で、規範的なの組換ＤＮＡ技術によって転写待ちヌクレオチド配列を本発明の前記表現ベクターに挿入し、前記組換光感受性転写因子遺伝子を含有する表現ベクターと共同に原核細菌細胞を形質転換することによって、転写待ちヌクレオチド配列（遺伝子）の表現を調整する。本発明のいくつの実施形態において、原核細菌の表現ベクターのターゲット転写ユニットに欠如する転写待ちヌクレオチド配列は、それぞれＬｅｘＡが対応するｃｏｌＥ−転写待ちヌクレオチド配列、ＬｅｘＡが対応するｓｕｌＡ−転写待ちヌクレオチド配列、ＬｅｘＡが対応するＲｅｃＡ−転写待ちヌクレオチド配列、ＬｅｘＡが対応するｕｍｕＤＣ−転写待ちヌクレオチド配列、ＬｅｘＡが対応するＬｅｘＡ応答要素−ｌａｃ最小プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、ｃＩが対応するＰλＯ１２−転写待ちヌクレオチド配列、ｃＩが対応するｃＩ応答要素Ｏ１２−ｌａｃ最小プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、ｌａｃＩが対応するＴ７−ｌａｃＩ応答要素−転写待ちヌクレオチド配列、ｌａｃＩが対応するｌａｃＩ応答要素−ｌａｃ最小プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、Ｇａ１４が対応するＴ７−Ｇａ１４応答要素−転写待ちヌクレオチド配列、Ｇａ１４が対応するＧａ１４応答要素−ｌａｃ最小プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、ＴｅｔＲが対応するＴ７−ＴｅｔＲ応答要素−転写待ちヌクレオチド配列、ＴｅｔＲが対応するＴｅｔＲ応答要素−ｌａｃ最小プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列である。
【００７８】
さらに本発明はさまざまな組換光感受性転写因子の遺伝子をそれぞれ形質転換した原核細菌の表現ベクターまたはゲノムにおいてさまざまな光感受性転写因子の表現カセットを整合した原核細菌菌株を提供すると共に、プロモーター、またはプロモーター−応答要素、または応答要素−プロモーターを含み、但し転写待ちヌクレオチド配列の欠如する原核細菌の表現ベクターを提供する。ユーザーは規範的な組換ＤＮＡ技術によって、自体が選択した転写待ちヌクレオチド配列（ターゲットタンパク遺伝子）を該表現ベクターに挿入でき、その後改めて構築したベクターによってすでにさまざまな組換光感受性転写因子遺伝子が形質転換された原核細菌の表現ベクター、またはゲノムにおいてすでにさまざまな光感受性転写因子の表現カセットが整合された原核細菌菌株を形質転換し、且つ当該原核細菌細胞を培養し、それらに必要なターゲット遺伝子を表現し、または如何にしてターゲット遺伝子の表現を調整するかの研究に用いられる。
【００７９】
さらに本発明はさまざまな表現ベクター、または形質転換された当該ベクター、またはゲノムにおいてさまざまな組換光感受性転写因子の表現カセットが整合された原核細菌細胞を装入してある試薬キットも提供する。１つの実施形態において、該試薬キットにおける一部の容器にはそれぞれ１種または複数種の組換光感受性転写因子遺伝子の原核細菌の表現ベクターが装入されている。他１つの実施形態において、該試薬キットにおける一部の容器にはそれぞれ１種または複数種の組換光感受性転写因子遺伝子の原核細菌の表現ベクターが装入され、他一部の容器には、それぞれターゲット転写ユニット（そのうちプロモーター−転写待ちヌクレオチド配列が欠如、またはプロモーター−応答要素−転写待ちヌクレオチド配列が欠如、または応答要素−プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列が欠如）を含有する原核細菌の表現ベクターが装入される。なおもう１つの実施形態において、該試薬キットには一部の容器には組換光感受性転写因子の遺伝子をすでに形質転換した原核細菌の表現ベクター、またはゲノムにおいてさまざまな組換光感受性転写因子の表現カセットをすでに整合した原核細菌細胞が装入され、他一部の容器には、プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列、またはプロモーター−応答要素−転写待ちヌクレオチド配列、または応答要素−プロモーター−転写待ちヌクレオチド配列が欠如された原核細菌の表現ベクターが装入される。本発明の試薬キットはさらに相応する光照射制御設備、例えばＬＥＤ灯及びその制御装置を含んでもよい。本発明の全ての試薬キットには、キットにおける各部分、その使用目的及び使用方法を説明するように、相応する仕様書が装入され、且つ関係する参考書類のリストを提供する。
【００８０】
さらに本発明は光誘起遺伝子表現システムが原核細菌細胞において遺伝子表現を調整制御する方法を含み、
ａ)前記原核細菌の光誘起遺伝子表現システムを原核細菌の表現ベクターに構築するステップと、
ｂ）調整制御される遺伝子を含有する原核細菌細胞を導入するステップと、
ｃ）光照射で前記原核細菌細胞を誘起して、前記原核細菌細胞における調整制御されるヌクレオチドの表現をなさせるステップと、を含む。
【００８１】
光照射によって原核細菌細胞を誘起する方法は光源の選択及び光源の使用を含む。光源はＬＥＤ灯、白熱灯、蛍光灯、レーザを含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、光源は青色ＬＥＤ(４６０−４７０ｎｍ)を選択した。光照射方法は光照射量、光照射強度、光照射時間、光照射周波数及び走査、投影、光金型などの方法を用いて空間においてターゲット遺伝子の表現を制御することも本発明の範囲に含まれる。本発明の１つの実施形態において、光照射強度は０−０．１２５ｍＷ/ｃｍ２前後になっており、他１つの実施形態において、印刷の投影シートを光金型とし、空間において異なる位置における細胞のターゲット遺伝子の表現レベルを調整しており、なおもう１つの実施形態において、中性灰色フィルターを光金型とし、空間において異なる位置における細胞のターゲット遺伝子の表現レベルを調整する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は相互はぎＰＣＲ法についての説明図。
【図２】図２は相同的組換の連接についての説明図である。
【図３】図３は逆方向ＰＣＲ法の原理である。
【図４】図４はＴ７プロモーターで表現を行う、異なる結合ペプチドを含む組換光感受性転写因子の原核細菌表現ベクターの構築説明図である。上方が異なる結合ペプチド光感受性転写因子の融合タンパクの説明図で、下方がループ状表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＤｕｅｔ１である。
【図５】図５はＡｍｐプロモーターで表現を行う、異なる結合ペプチドを含む組換光感受性転写因子の原核細菌表現ベクターの構築説明図である。上方が異なる結合ペプチド光感受性転写因子の融合タンパクの説明図で、下方がループ状表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＤｕｅｔ１である。
【図６】図６は異なるＶＶＤ突然変異体、つまりＡｓＬＯＶ２とＡｓＬＯＶを第２ポリペプチドとする光感受性転写因子を含有する原核表現ベクターの構造説明図である。上方が各の光感受性転写因子融合タンパクの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＦＤｕｅｔ１である。
【図７】図７はｃＩ、ＬａｃＩ 、Ｇａｌ４、と和ＴｅｔＲを第１ポリペプチドとする光感受性転写因子を含有する原核表現ベクターの構造説明図である。上方が光感受性転写因子融合タンパクの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＦＤｕｅｔ１である。
【図８】図８はω因子を第３ポリペプチドとする光感受性転写因子を含有する原核表現ベクターの構造説明図である。上方が光感受性転写因子融合タンパクの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＦＤｕｅｔ１である。
【図９】図９はα因子を第３ポリペプチドとする光感受性転写因子を含有する原核表現ベクターの構造説明図である。上方が光感受性転写因子融合タンパクの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＣＤＦＤｕｅｔ１である。
【図１０】図１０はＬｅｘＡ、ｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲと対応する応答要素のターゲット転写ユニットを含有する原核表現ベクターの構造説明図である。上方が各ターゲット転写ユニットの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＲＳＥＴｂである。
【図１１】図１１はω因子またはα因子を、第３ポリペプチドとする光感受性転写因子が対応できるの、ＬｅｘＡ、ｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲと対応する応答要素含むターゲット転写ユニットにする原核表現ベクターの構造説明図である。上方が各ターゲット転写ユニットの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＲＳＥＴｂである。
【図１２】図１２はｃＩ抑制タンパクを間接な調整制御作用とする原核表現ベクターの構造説明図である。上方が各ターゲット転写ユニットの説明図で、下方がループ状の表現ベクターの説明図で、表現ベクターのバックボーンがｐＲＳＥＴｂである。
【図１３】図１３はＴ７プロモーターで、ことなる結合ペプチドの光感受性転写因子を表現するＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図１４】図１４はＡｍｐプロモーターで、ことなる結合ペプチドの光感受性転写因子を表現するＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図１５】図１５は光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０がＬａｃＺ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はＬａｃＺの相対表現レベルである。
【図１６】図１６は光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０がその他の３つのＬｅｘＡと対応する応答要素を含む原核表現ベクターにおいてｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図１７】図１７はいくつのＶＶＤ突然変異体を第２ポリペプチドとする転写因子のＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図１８】図１８はｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲを第１ポリペプチドとする転写因子のＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図１９】図１９はＡｓＬＯＶ２とＡｓＬＯＶを第２ポリペプチドとする転写因子のＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２０】図２０はω因子を第３ポリペプチドとする転写因子のＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２１】図２１はα因子を第３ポリペプチドとする転写因子のＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ-)細胞の表現において、光照射はｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２２】図２２は異なる温度において、光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０がｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルに対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２３】図２３は光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０がｃＩ抑制タンパクを間接的な調整作用とする原核細菌表現ベクターにおいて、ｍＣｈｅｒｒｙ表現量に対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２４】図２４は光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０とターゲット転写ユニットを含む単一表現ベクターにおいて、光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２５】図２５は光感受性転写因子ＬａＶ（ｗｔ）とターゲット転写ユニットの原核表現プラスミドを検出するため、枯草バシラス属菌において、ｍＣｈｅｒｒｙ表現量に対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２６】図２６はＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ-,ＬｅｘＡ：：Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株自身の表現を測定するため、光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０はｍＣｈｅｒｒｙ表現量に対する調整である。横軸は同時形質転換プラスミド名称であり、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２７】図２７は組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０を表現する細胞において、光誘起のターゲット遺伝子表現における時間動力学過程とその逆転可能な過程である。横軸は光照射時間で、サンプルが該時間点において光照射から暗中条件に転移する過程を表し、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２８】図２８は組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０を表現する細胞において、光誘起のターゲット遺伝子表現における時間動力学過程とその逆転可能な過程である。横軸は光照射時間で、サンプルが該時間点において暗中から光照射条件に転移する過程を表し、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図２９】図２９は組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０を表現する細胞において、異なる光照射強さがターゲット遺伝子の表現レベルに対する調整である。横軸は光照射強さで、縦軸はｍＣｈｅｒｒｙの相対表現レベルである。
【図３０】図３０は印刷図案投影シートを使用して組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０の細胞に対して「撮影」して得た「Ｓｔｏｐ」図案である。左図が細胞培養プレート底部投影シートが貼られている写真で、右図がそのクローンが生成された後プレートに対する画像形成を行った蛍光画像である。
【図３１】図３１は組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０が細胞移動に対する調整を表現した白色光画像形成で、左側は暗中条件で、右側は光照射条件で、１、２、３は異なる同時形質転換プラスミドを表す。
【図３２】図３２は組換光感受性転写因子ＬＶ-Ｌ０が生物細胞融解に対する調整結果を表現したものであり、横軸は同時形質転換プラスミド名称で、縦軸は細胞融解の効率である。
【図３３】図３３はＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（タンパク質精製システム）のイオン交換カラムの溶離ピークレベル値図で、横軸は溶離チューブリンの番号で、縦軸は紫外線吸収値である。
【図３４】図３４はイオン交換カラムの溶離の後、一部のチューブリンの１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパクの電気泳動図である。
【図３５】図３５は整合した後最終タンパク溶液における１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパクの電気泳動図である。
【図３６】図３６は光感受性タンパクからの６つの異なるＬＯＶドメインに対する配列ホモロジー分析であり、そのうち黒色は１００％同一のアルミ酸配列を表し、深い灰色は配列ホモロジが比較的高い配列を表し、浅い灰色は配列ホモロジが中位の配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
以下、実施例によって本発明に対してさらに説明する。これらの実施例は本発明の説明のみに用いられるものであり、本発明の範囲に対していかなる制限をしない。実施例には主に当業者が周知している通常の遺伝子工学分子生物学クローニング方法を使用しており、例えば、ＪａｎｅＲｏｓｋａｍｓ等の「分子生物学実験参考マニュアル」とＪＯＳＥＰＨ ＳＡＭＢＲＯＯＫ、Ｄ. Ｗ. Ｒｕｓｓｅｌｌ作成、黄培堂等訳の「分子クロナル実験指南」（第３版、２００２年８月、科学出版社出版、北京）の中の部分内容を基づいた。当業者が下記実施例に基づいて、具体的な事情を応じて略修正と変更を行えれば本発明を成功に実施することは難しくないが、但しそれらの修正と変更はすべて本発明請求項の範囲内に含まれるべきである。
【００８４】
実施例に使用したｐＣＤＦＤｕｅｔ１プラスミドベクターがＮｏｖａｇｅｎ社から購入され、ｐＲＳＥＴｂ、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡプラスミドベクターがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される。ｐＫＤ３、ｐＫＤ４、ｐＣＰ２０、ｐＫＤ４６は華東理工大学鮑杰先生研究室から惜しみなく寄付される。ＰＣＲ法に使用される全てのプライマーが共に上海杰瑞生物工程技術有限公司によって合成、純化され且つ質量スペクトル法によって確認されたものである。本発明の実施例において構築された表現プラスミドの配列はすべて測定されたもので、配列測定が華大遺伝子公司によって完成される。本発明の各実施例に使用されるＴａｑＤＮＡポリメラーゼが東盛生物社から購入され、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが天根生化科技（北京）有限公司から購入され、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼがＴａＫａＲａ社から購入され、３種のポリメラーゼの購入する時は共に対応するポリメラーゼ緩衝液及びｄＮＴＰが添付贈与される。ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩなどの制限酵素、Ｔ４リガーゼ、Ｔ４ホスホリラーゼ（Ｔ４ＰＮＫ）がＦｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入され、購入する時に対応する緩衝液等が付加された。実施例において使用されるＣｌｏｎｅＥＺＰＣＲクローン試薬キット（中に相同的組換酵素が含まれる）は南京金斯瑞生物科技有限公司（前身が金思特科技（南京）有限公司）から購入される。特別な声明をしない限りに、無機塩類の化学試薬は全て中国医薬集団上海化学試剤公司から購入されたものである。カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、アンピシリン（Ａｍｐ）、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）及びＯＮＰＧ培地が共にＡｍｅｒｅｓｃｏ社から購入されており、３８４ウェル発光測定ホワイトプレート、３８４ウェル発光測定クラックプレートがＧｒｅｎｉｅｒ社から購入される。
【００８５】
実施例において使用されるＤＮＡ純化試薬キットがＢＢＩ社（カナダ）から購入され、一般プラスミドエクストラクションキットが天根生化科技(北京)有限公司から購入され、クローニング用大腸菌株Ｍａｃｈ１がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、ＪＭ１０９(ＤＥ３)表現菌株がＰｒｏｍｅｇａ社から購入され、ＢＬ２１(ＤＥ３)菌株がＮｏｖａｇｅｎ社から購入される。
【００８６】
実施例に用いられる主要機器とその購入先はそれぞれ：ＢｉｏｔｅｋＳｙｎｅｒｇｙ ２マルチモードリーダー（米国Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社）、Ｘ−１５Ｒ高速冷凍遠心機（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社）、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒテーブル型高速冷凍遠心機（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社）、ＰＣＲ増幅装置（ドイツＢｉｏｍｅｔｒａ社）、生体内画像形成システム（米国Ｋｏｄａｋ社）、光度計（日本和光社）であり、核酸電気泳動装置は上海申能博博彩公司から購入される。
【００８７】
本文における略語の意味が以下の通りである：ｈ＝時間、ｍｉｎ＝分間、ｓ＝秒、ｄ＝日、μＬ＝マイクロリットル、ｍＬ＝ミリリットル、Ｌ＝リットル、ｂｐ＝塩基対、ｍＭ＝ミリモル、μＭ＝マイクロモル。
２０種類のアルミ酸及びその略称は下記とおり：
【００８８】
【表１】
0006334527.tif 000002
【００８９】
本発明実施例において頻繁に使用される基礎分子生物学方法は下記とおり：
（一）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）：
【００９０】
【表２】
0006334527.tif 000003
【００９１】
増殖プロセス（ｂｐが増殖される断片のヌクレオチド数量を表す）は下記とおり：
【００９２】
【表３】
0006334527.tif 000004
【００９３】
２、長断片（>２５００ｂｐ）の増殖ＰＣＲ方法は下記とおり：
【００９４】
【表４】
0006334527.tif 000005
【００９５】
増殖プロセス（ｂｐが増殖される断片のヌクレオチド数量を表す）は下記とおり：
【００９６】
【表５】
0006334527.tif 000006
【００９７】
（二）エンドヌクレアーゼの酵素消化反応：
【００９８】
【表６】
0006334527.tif 000007
【００９９】
【表７】
0006334527.tif 000008
【０１００】
【表８】
0006334527.tif 000009
【０１０１】
（三）ＤＮＡ断片の５’リン酸化反応とその後の自体ループ反応：
微生物かた抽出されるプラスミドまたはゲノムの末端にすべてりん酸エステル基が含まれるが、しかしＰＣＲ生成物がないため、ＰＣＲ生成物の５’塩基にりん酸エステル基を加えて反応させる必要がある。ただその末端にりん酸エステル基ＤＮＡ分子のみが含まれるこそ連接反応が発生可能である。自体ループ化連接反応は線形化ベクターの３’端と５’端との連接反応を指す。 
【０１０２】
【表９】
0006334527.tif 000010
【０１０３】
【表１０】
0006334527.tif 000011
【０１０４】
（四）相互はぎＰＣＲ法
相互はぎＰＣＲ法は汎用されるの、２つの同一、または異なる遺伝子を連接させる方法である。例えば図１において、遺伝子ＡＤと遺伝子ＢＣとの連接を示した。まずそれぞれＡＤとＢＣを増殖するための２対のプライマーＡ、ＤとＣ、Ｄを設計し、プライマーＤとプライマーＣの５’末端に所定長さの相互補完の配列を含む。第１回において得た増殖生成物ＡＤとＢＣが回収を経てから第２回目のＰＣＲのテンプレートとする。
第２回目において通常のＰＣＲ法のプロセスによって１０回を増加し、ＰＣＲシステムは下記とおり：
【０１０５】
【表１１】
0006334527.tif 000012
【０１０６】
第２回目ＰＣＲ法を実施した後、プライマーＡとプライマーＢを加えて、引き続いて３０回を増殖してＡＤとＢＣとの連接する配列が得られる。
【０１０７】
（五）逆方向ＰＣＲ法
逆方向ＰＣＲ法は下記実施例において特定部位の突然変異、切断短縮型突然変異、挿入突然変異に用いられる１つの技術である。その基本原理についてはＴａｋａｒａ社のＭｕｔａＢＥＳＴ試薬キットの実験プロセスを参照する。図３に示されるように、対応する変異部分に逆方向ＰＣＲプライマーを設計し、そのうちの１つのプライマー５’末端に変異したヌクレオチド配列が含まれる。増殖された生成物はゲル切り出して浄化された後、５’末端リン酸化反応、そして自身ループ化反応を行ってから、形質転換受容性細胞に転換される。
【０１０８】
（六）形質転換受容性細胞の調製と転換
形質転換受容性細胞の調製法は：
１、シングルコロニー（例えばＭａｃｈ１）を選んで、５ｍＬ培地の培地に接種し、３７℃で振とう培養器において一夜培養し、
２、一夜振とう培養された菌液０．５−１ｍｌを取って５０ｍＬ培地の培地に改めて接種し、３７℃、２２０ ｒｐｍ/ｍｉｎで３〜５時間培養してＯＤ６００が０．５まで達成し、
３、 細胞を氷浴中で２時間に渡って予め冷やし、
４、４℃、４０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０ｍｉｎに渡って遠心分離を行い、
５、上澄み液を除去し、５ｍＬの予め冷やした再懸濁緩衝液で細胞を懸濁培養し、平均化された後、最終容積が５０ｍＬまでなるように再度再懸濁緩衝液を加え、
６、４５ｍｉｎで氷浴し、
７、４℃、４０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０ｍｉｎに渡って遠心分離を行い、５ｍＬの氷で予め冷やした保存緩衝液で細胞を再度懸濁培養し、
８、各エピコート試験管に１００μＬ菌液を注入し、−８０℃、または液体窒素で冷凍保存する。
そのうち、再懸濁緩衝液はＣａＣｌ２(１００ ｍＭ)、ＭｇＣｌ２(７０ ｍＭ)、ＮａＡｃ(４０ ｍＭ)である。
保存緩衝液は０．５ ｍＬＤＭＳＯ、１．９ ｍＬ８０％グリセリン、１ｍＬ１０×ＣａＣｌ２(１Ｍ)、１ ｍＬ１０×ＭｇＣｌ２ (７００ｍＭ)、１ ｍＬ１０×ＮａＡｃ (４００ ｍＭ)、４．６ ｍＬｄｄＨ２Ｏである。
【０１０９】
形質転換受容性細胞の転換法は：
１、１００μＬ形質転換受容性細胞を選んで、氷浴中で融解し、
２、適宜な容積を有する連接生成物を加えて、軽い吹き振とうによって均等に混合し、
３０ｍｉｎで氷浴を行う。通常加入した連接生成物の容積は形質転換受容性細胞の容積の十分の一により少なく設定し、
３、菌液を４２℃の水浴中において９０秒でヒートショックを行った後、素早く氷浴中に移行して５ｍｉｎで放置し、
４、５００μＬ培地を加えて、３７℃恒温振とう培養器において２００回転で１時間培養し、
５、４０００ｒｐｍ/ｍｉｎの菌液をで３ｍｉｎに渡って遠心分離を行い、２００μＬの上澄み液を留保し、菌株を均等に吹いてから、適宜な抗生物質を有する寒天平板の表面に均等に塗布し、その平板を３７℃恒温振とう培養器において一夜逆置き培養する。
【０１１０】
（七）大腸菌表現におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の測定方法
転換用大腸菌培養プレートにおいて対応する単クローンをそれぞれ選出して４８ウェルプレートに接種し培養を行い、各ウェルの培地が７００μＬで、各サンプルが６つ重複し、３０℃で一夜培養する。１：２００の比例で、各ウェルの培地が７００μＬ新鮮な培地を有する別の４８ウェルプレートに希釈する。下文に特別な表示がなければ、その培養条件はすべて３０℃とする。振とう培養器の回転数は２８０ｒｐｍで、光照射強さが０．１２５ ｍＷ/ｃｍ2である。１８時間の培養を経てから、４０００ｒｐｍ/２０ｍｉｎで遠心分離を行い、菌株を回収する。上澄み液を除去し、各ウェルに２００μＬＰＢＳ溶液を加えてから、振とう培養器で菌株を完全に再懸濁する。その後、各ウェルから５μＬを抽出して９６ウェル酵素標準プレートに注入し、１１５μＬ ＰＢＳを加えて十分に均等に混合し、Ｂｉｏ−ｔｅｋ社製多機能マイクロプレートリーダー用いてＯＤ６００値を読出する。そして読出されるＯＤ６００の値に基づいて各ウェルにおけるＯＤ６００の値を一致、すなわち０．５に調整する。調製した後各ウェルに１００μＬを抽出して９６ウェル蛍光タンパク質測定プレートに注入し、Ｂｉｏ−ｔｅｋ社製多機能マイクロプレートリーダー用いてＥｘ５９０/２０、Ｅｍ６４５/４０蛍光値を読出する。暗中におけるサンプルの場合、アルミ箔で包んで培養を行い、その他処理は上記と同一である。
【０１１１】
（八）β-ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）における活性の測定方法
転換用大腸菌培養プレートにおいて対応する単クローンをそれぞれ選出して４８ウェルプレートに接種し培養を行い、各ウェルの培地が７００μＬで、各サンプルが６つ重複し、３０℃で一夜培養する。１：２００の比例で、各ウェルの培地が７００μＬ新鮮な培地を有する２つの４８ウェルプレートに希釈して、それぞれ３０℃光照射と暗中において培養させ、青色光照射の強さが０．１２５ ｍＷ/ｃｍ２である。１８時間の培養を経てから、各ウェルから５μＬ菌液を抽出して９６ウェル培地プレートに注入し、且つ細胞を融解するように２０μＬ透過膜溶液を加えて、マイクロプレート振とう培養器で１ｍｉｎ振とうしてから細菌恒温培養器に入れて３７℃で１０ｍｉｎ間に静置する。各ウェルに１５０μＬの培地溶液を加えて反応を行い、３０秒で振とうした後、マイクロプレートリーダーによってＯＤ４２０動力学曲線を測定する。最終に得た曲線の傾斜率とＬａｃＺの酵素活性が正比になるものである。
ＬａｃＺの酵素活性測定用溶液のレシピは下記とおり：
培地溶液がＮａ２ＨＰＯ４６０ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４  ４０ｍＭ、ＯＮＰＧ１ｍｇ/ｍｌ、β-メルカプトエタノール２．７μＬ/ｍｌである。
透過膜溶液がＮａ２ＨＰＯ４１００ｍＭ、ＫＣｌ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４２ｍＭ、ＣＴＡＢ０．８ｍｇ/ｍｌ、デオキシコール酸ナトリウム０．４ｍｇ/ｍｌ、β-メルカプトエタノール ５．４μＬ/ｍｌである。
【０１１２】
（九）大腸菌におけるゲノムをノックアウトする方法
１、ｐＫＤ４６プラスミドがゲノムをノックアウトをしょうとするターゲット菌株中に転換し、アンピシリン抵抗性を有する培養プレートにおいて３０℃一夜培養し、
２、該プレートから単クローンを選出して５μＬ新鮮な培地とアンピシリン抵抗性を有する培地に入れて一夜培養し、
３、夜に渡って培養した試験管培養菌の１：１００の比で取った量を予め調製した５０ｍｌ２ｘＹＴ培地に入れ、３０℃で培養しＯＤ６００が０．２〜０．３前後になった時Ｌ−アラビノース（最終濃度が３０ｍＭになる）を加えて、３０℃で９０ｍｉｎ誘起培養を行い、
４、誘起される培地を氷の上に１時間置いてから、４℃４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎに渡って遠心分離を行った後、上澄み液を濾出し、予め冷やしたｄｄＨ２Ｏ再懸濁菌体２０ｍｌを取出し、再度４℃４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎに渡って遠心分離を行い、このように４回繰り返す。最後の１回に上澄み液を除去してから１．５ ｍｌｄｄＨ２Ｏの再懸濁菌体を加えて、そしてさまざまの１．５ｍｌのエピコート試験管に８０〜１００μＬをそれぞれ装入し、
５、ゲノムをノックアウトのための線形化遺伝子断片１０μＬを抽出して形質転換受容性溶液に入て、均等に混合してから電気回転カップに素早く投入し、それを電気回転機器に入れて電気回転を行った後、すぐに５００μＬを新鮮な培地を加えて、３７℃で１〜２時間細胞回復培養を行い、
６、４０００ｒｐｍ遠心分離を行い、相応する抵抗性を有する培養プレートに塗布し、３７℃で一夜培養し、翌日に鑑定を行う。
【０１１３】
（十）大腸菌ゲノムにおける抵抗性を除去する方法
１、ｐＣＰ２０を抵抗性遺伝子の除去待ちの菌株に転換し、３０℃一夜培養し、
２、転換プレートから単クローンを選出して新鮮な培地（無抵抗性）を有する培地エピコート試験管に入れて３７℃培養と８時間で熱誘起培養し、
３、エピコート試験管を４２℃の条件に移して夜に渡って培養し、ｐＣＰ２０プラスミドを除去し、エピコート試験管から少量の菌液を取って無抵抗性プレートに塗布し、３７℃で一夜培養し、
４、相応するプライマーを用いてプレートから生成したクローンに対して鑑定を行う。
【０１１４】
（十一）枯草菌ＷＢ８００の転換方法
１、３ｍｌ培地に枯草菌ＷＢ８００を接種し、一夜培養し、
２、翌日に該培養物２．６ｍｌを抽出して４０ｍｌ（培地＋０．５Ｍソルビトール）に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００＝０．８５〜０．９５まで培養し、
３、１０ｍｉｎで菌液をしてから、５０００ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して菌体を収集し、
４、予め冷やした誘電泳動培地（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％グルコース）５０ｍｌを用いて、再度懸濁菌体を吹いて、５０００ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上澄み液を除去し、このような洗浄を４回繰り返し、
５、１ｍｌの電気回転用培地において洗浄される菌体を均等に吹いて再懸濁してから、各エピコート試験管毎に１２０μｌを装入し、
６、６０μｌ形質転換受容性細胞に５０ｎｇＤＮＡ（１〜８μｌ）を加えて、氷上で２ｍｉｎ孵化してから、予め冷やした電気回転カップに入れて、１回誘電泳動し、
７、誘電泳動完了後、カップを出して且つ直に１ｍｌＲＭ（培地＋０．５Ｍソルビトール＋０．３８Ｍマンニトール）を入れて、３７℃、２００ｒｐｍで、３時間細胞回復を行い、プレートに塗布する。３７℃で一夜培養する。
溶液レシピ：
４０ｍｌ（培地＋０．５Ｍソルビトール）： ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、３．６ｇソルビトールｐＨ＝７．２で、
２００ｍｌ電気回転用培地（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％グルコース）１８ｇソルビトール、１８．５ｇマンニトール、２０ｇグルコース、
１０ｍｌＲＭ（０．５Ｍソルビトール、０．３８Ｍマンニトール）：０．９ｇソルビトール、０．７ｇマンニトールである。
５０ｍｌ遠心管２つ、０．２２μｍ濾過膜で除菌処理する。
【０１１５】
実施例１：ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−)、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−、ＣｈｅＺ−)、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−、ω−)、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ::Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)大腸菌菌株をそれぞれ構築する。
ｐＫＤ３プラスミドをテンプレートとし、下記のプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３とＰ４を用いて増殖してその両端にｓｕｌＡ遺伝子相同分枝を有し、ｓｕｌＡ遺伝子をノックアウトするための線形化断片を得、その核酸配列が１１２である。ＪＭ１０９(ＤＥ３)菌株においてｓｕｌＡ遺伝子のノックアウトを行い、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ::Ｃａｍ)中間菌株を取得する。下記のプライマーＰ５、Ｐ６、Ｐ７とＰ８を用いて、ｐＫＤ４プラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲ増殖を行うことによって、その両端にＬｅｘＡ遺伝子相同分枝を有し、ＬｅｘＡ遺伝子をノックアウトするための線形化断片を得、その核酸配列が１１３である。また下流プライマーを用いて、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ::Ｃａｍ)中間菌株においてＬｅｘＡ遺伝子のノックアウトを行い、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ::Ｃａｍ、ＬｅｘＡ::ｋａｎ) 菌株を取得する。そしてＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ::Ｃａｍ、ＬｅｘＡ::ｋａｎ)菌株におけるＣａｍ抵抗性とＫａｎ抵抗性遺伝子を除去して、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−)菌株を取得する。
【０１１６】
下記のプライマーＰ９、Ｐ１０、Ｐ１１とＰ１２を用いて、ｐＫＤ４プラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲ増殖を行うことによって、その両端にＣｈｅＺ遺伝子相同分枝を有し、ＣｈｅＺ遺伝子をノックアウトするための線形化断片を得、その核酸配列が１１４である。下記のプライマーＰ１３、Ｐ１４、Ｐ１５とＰ１６を用いて、ｐＫＤ４プラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲ増殖を行うことによって、その両端にω因子遺伝子相同分枝を有し、ω因子遺伝子をノックアウトするための線形化断片を得、その核酸配列が１１５である。またＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−)菌株に基づいてそれぞれＣｈｅＺとω因子遺伝子のノックアウトを行い、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−ＣｈｅＺ::ｋａｎ) とＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−ω::ｋａｎ)菌株を取得する。そしてその２つのゲノムにおけるｋａｎ抵抗性遺伝子を除去して、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−ＣｈｅＺ−)とＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ−ω−)菌株を取得する。
【０１１７】
ｓｕｌＡ遺伝子をノックアウトするための線形化断片のプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ１）：５’−ＴＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴ−３’、
上流プライマー１（Ｐ２）：５’−ＧＡＴＧＴＡＣＴＧＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴ−３’、
下流プライマー１（Ｐ３）：５’−ＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣ−３’、
下流プライマー１(Ｐ４)：５’−ＣＡＴＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＴ−３’ である。
【０１１８】
ＬｅｘＡ遺伝子をノックアウトするための線形化断片のプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ５）：５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ６）：５’−ＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴ−３’、
下流プライマー１（Ｐ７）：５’−ＡＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’、
下流プライマー２(Ｐ８)：５’−ＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣ−３’ である。
【０１１９】
ＣｈｅＺ遺伝子をノックアウトするための線形化断片のプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ９）：５’−ＧＧＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ１０）：５’−ＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＡＡ−３’、
下流プライマー１（Ｐ１１）：５’−ＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧＡＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’、
下流プライマー２(Ｐ１２)：５’−ＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＡＴＧ−３’ である。
【０１２０】
ω因子遺伝子をノックアウトするための線形化断片のプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ１３）：５’−ＧＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ１４）：５’−ＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴ−３’、
下流プライマー１（Ｐ１５）：５’−ＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’、
下流プライマー２(Ｐ１６)：５’−ＧＣＡＡＴＡＧＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣ−３’ である。
【０１２１】
本発明の光感受性転写因子表現カセットＬＶ−Ｌ０を含むＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ::Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株を取得するため、プライマーＰ１７、Ｐ１８を用いてｐＡＬＶ−Ｌ０を増殖し、プライマーＰ１９、Ｐ２０、Ｐ２１とＰ２２を用いて、ｐＫＤ４プラスミドをテンプレートとし、ｋａｎ抵抗性遺伝子表現カセットを含むｋａｎ遺伝子断片を増殖し、ダブル酵素消化を経てから、同じくダブル酵素消化されたｐＡＬＶ−Ｌ０増殖線形化断片と連接して得たプラスミドはｐＡＬＶ−Ｌ０−ｋａｎと命名される。下記プライマーＰ２３、Ｐ２４、Ｐ２５とＰ２６を用いて、ｐＡＬＶ−Ｌ０−ｋａｎプラスミドにおけるＡｍｐ−ＬＶ−Ｌ０−ｋａｎを増殖し、その核酸断片が１１６である。ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−)菌株に基づいて遺伝子ノックアウトを行い、ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ::Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０−ｋａｎ)菌株を取得してから、ゲノムにおけるｋａｎ抵抗性を除去して、菌株ＪＭ１０９(ＤＥ３、ｓｕｌＡ−、ＬｅｘＡ::Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)を得る。
【０１２２】
増殖ｐＡＬＶ−Ｌ０ベクターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１７）：ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴ、
下流プライマー１（Ｐ１８）：ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡである。
【０１２３】
ｋａｎ抵抗性遺伝子を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１９）：ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣ、
下流プライマー１（Ｐ２０）：５’−ＣＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＴＣ、
下流プライマー２（Ｐ２１）：５’−ＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＡＣＴＣＡＴ−３’、
下流プライマー３（Ｐ２２）：５’− ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧ−３’である。
【０１２４】
ｐＡＬＶ−Ｌ０−ｋａｎプラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ２３）：ＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧ、
上流プライマー２（Ｐ２４）：ＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡ、
上流プライマー３（Ｐ２５）：ＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧ、
下流プライマー（Ｐ２６）：ＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣである。
【０１２５】
実施例２：Ｔ７プロモーターで表現を行い、異なる結合ペプチドを含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）原核細菌表現ベクターを構築する。
プライマーＰ２７、Ｐ２８を用いてＪＭ１０９(ＤＥ３)ゲノムにおいてＬｅｘＡの１−８７位のアミノ酸遺伝子断片を増殖する。プライマーＰ２９、Ｐ３０を用いてｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）プラスミド（本実験室にて収集、関係文章を参照：Ｗａｎｇ, Ｘ.等、 Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２０１２.）においてＶ３６（Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増殖する。そしてＰＣＲ法相互はぎを利用し、ＬｅｘＡ (１−８７)とＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）とを連接して、ＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を得る。プライマーＰ３１、Ｐ３２を用いてｐＣＤＦＤｕｅｔ１ベクターを増殖して得た線形化ベクターがＸｈｏＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片と連接し、構築して得たプラスミドはｐＬＶ−Ｌ０と命名され、そのうち組換光感受性転写因子ＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）の融合タンパク質遺伝子（融合タンパク質はＬＶ−Ｌ０と略称、そのヌクレオチドとアルミ酸配列がそれぞれ４８と４９である）が含まれる。ｐＬＶ−Ｌ０プラスミドに基づいて、プライマーＰ３３、Ｐ３４、Ｐ３５、Ｐ３６、Ｐ３７、Ｐ３８、Ｐ３９、Ｐ４０を用いて、ＬｅｘＡ (１−８７)とＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）との間の結合ペプチドを交換し、それぞれ異なる７種類の結合ペプチド（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７）を含む組換ＬｅｘＡ (１−８７) −ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）融合タンパク質遺伝子のベクター遺伝子を得、また図４に示されるように、それぞれｐＬＶ−Ｌ１、ｐＬＶ−Ｌ２、ｐＬＶ−Ｌ３、ｐＬＶ−Ｌ４、ｐＬＶ−Ｌ５、ｐＬＶ−Ｌ６とｐＬＶ−Ｌ７と命名される。各融合タンパク質のコードヌクレオチド配列はそれぞれ５０、５２、５４、５６、５８、６０と６２で、アルミ酸配列がそれぞれ５１、５３、５５、５７、５９、６１と６３である。
【０１２６】
ＬｅｘＡ (１−８７) 遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ２７）：５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ２８）：５’−ＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧ−３’ である。
【０１２７】
ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ２９）：５’−ＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ３０）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’、
【０１２８】
ＬｅｘＡ (１−８７)とＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）との間の結合ペプチドを交換するプライマーは下記とおり：
通用下流プライマー（Ｐ３３）：５’−ＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧ−３’、
結合ペプチド１上流プライマー（Ｐ３４）：５’−ＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド２上流プライマー（Ｐ３５）：５’−ＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド３上流プライマー（Ｐ３６）：５’−ＴＡＴＡＡＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド４上流プライマー（Ｐ３７）：５’−ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド５上流プライマー（Ｐ３８）：５’−ＧＡＡＣＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド６上流プライマー（Ｐ３９）：５’−ＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’、
結合ペプチド７上流プライマー（Ｐ４０）：５’−ＡＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ−３’である。
【０１２９】
実施例３：Ａｍｐプロモーターで表現を行い、異なる結合ペプチドを含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）原核細菌表現ベクターを構築する。
プライマーＰ４１、Ｐ４２を用いてｐＲＳＥＴｂプラスミドにおいてＰＣＲ法で増殖してＡｍｐプロモーターヌクレオチド断片を得、そのヌクレオチド配列は配列１３６であり、さらにプライマーＰ４３、Ｐ４４を用いてＰＣＲ法でｐＣＤＦｄｕｅｔ１プラスミドを増殖して、得た線形化断片がＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたＡｍｐプロモーター断片と連接し、ｐＡｍｐプラスミドベクターを得る。実施例２において構築したの、異なる結合ペプチドを含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）をプライマーＰ４５、Ｐ４６を用いて増殖した後、得た異なる結合ペプチドを含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＡｍｐプラスミドと連接し、それぞれ８種類の異なる結合ペプチド（Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、）を含む組換ＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）タンパク質遺伝子を融合するベクタープラスミドを得、それぞれｐＡＬＶ−Ｌ０、ｐＡＬＶ−Ｌ１、ｐＡＬＶ−Ｌ２、ｐＡＬＶ−Ｌ３、ｐＡＬＶ−Ｌ４、ｐＡＬＶ−Ｌ５、ｐＡＬＶ−Ｌ６とｐＡＬＶ−Ｌ７と命名される。図５に示されるように、各融合タンパク質のコードヌクレオチド配列はそれぞれ配列４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０と６２で、アルミ酸配列がそれぞれ４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１と６３である。
【０１３０】
増殖してＡｍｐプロモーターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ４１）：５’− ＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ４２）：５’− ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡ−３’ である。
【０１３１】
ｐＣＤＦｄｕｅｔ１プラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ４３）：５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ４４）：５’− ＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣ−３’ である。
【０１３２】
異なるＬｉｎｋｅｒを含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６（Ｃ７１Ｖ）断片をを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ４５）：５’− ＧＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ４６）：５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡ−３’ である。
【０１３３】
実施例４：異なるＶＶＤ突然変異体、ｐｈｏｔ１−ＬＯＶ２、ａｕｒｏｃｈｒｏｍｅを第２ポリペプチドとする光感受性転写因子を含む原核細菌表現ベクターを構築する。
まずプライマーＰ４７、Ｐ４８を用いてｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドに対してＰＣＲ法で突然変異を行い、ｐＡＬＶ−Ｌ０(ｗｔ)と命名される中間プラスミドを得る。さらにそれぞれプライマーＰ４９とＰ５０、Ｐ５１とＰ５２を用いてｐＡＬＶ−Ｌ０(ｗｔ) プラスミドに対してＰＣＲ法で突然変異を行い、またプライマーＰ５３とＰ５４、Ｐ５５とＰ５６、Ｐ５７とＰ５８、Ｐ５９とＰ６０を用いてｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドに対してＰＣＲ法で突然変異を行い、それぞれＶＶＤにおけるＮ５６ＫまたはＹ５０ＷまたはＮ５６ＫＣ７１ＶまたはＩ５２ＡＣ７１ＶまたはＩ５２ＳＣ７１ＶまたはＮ５６ＲＣ７１Ｖ点突然変異を含むＬｅｘＡ (１−８７)−ＶＶＤ３６タンパク質遺伝子を融合する原核細菌表現ベクターを構築し、それぞれｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｎ５６Ｋ）、ｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｙ５０Ｗ）、ｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｎ５６ＫＣ７１Ｖ）、ｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｉ５２ＡＣ７１Ｖ）ｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｉ５２ＳＣ７１Ｖ）とｐＡＬＶ−Ｌ０（Ｎ５６Ｒ Ｃ７１Ｖ）と命名される。図６に示されるように、各融合タンパク質のコードヌクレオチド配列はそれぞれ配列６４、６６、６８、７０、７２と７４で、アルミ酸配列がそれぞれ６５、６７、６９、７１、７３と７５である。
【０１３４】
ｐＡＬＶ−Ｌ０(ｗｔ)を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ４７）：５’− ＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ４８）：５’− ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣ−３’ である。
【０１３５】
ＶＶＤ３６(Ｎ５６Ｋ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ４９）：５’− ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ５０）：５’− ＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＴ−３’ である。
【０１３６】
ＶＶＤ３６(Ｙ５０Ｗ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ５１）：５’− ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧ
ＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ５２）：５’− ＣＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧ−３’ である。
【０１３７】
ＶＶＤ３６(Ｎ５６ＫＣ７１Ｖ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ５３）：５’− ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ５４）：５’− ＣＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧ−３’ である。
【０１３８】
ＶＶＤ３６(Ｉ５２ＳＣ７１Ｖ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ５５）：５’− ＴＣＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ５６）：５’− ＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧ−３’ である。
【０１３９】
ＶＶＤ３６(Ｉ５２ＡＣ７１Ｖ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ５７）：５’− ＧＣＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ５８）：５’− ＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧ−３’である。
【０１４０】
ＶＶＤ３６(Ｎ５６ＲＣ７１Ｖ) 突然変異体を構築するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ５９）：５’− ＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ６０）：５’− ＣＴＧＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＧＣ−３’である。
【０１４１】
フォトトロピン1(ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ１)のＬＯＶ２ドメイン（ＡｓＬＯＶ２と略称、そのｃＤＮＡは米国テキサス大学南西医療センターダラスキャンパスのＧａｒｄｎｅｒ試験室による無私の寄付である）を第２ポリペプチドとする光感受性転写因子表現ベクターを構築するため、まずプライマーＰ６１、Ｐ６２のｃＤＮＡにおいて増殖を行ってＡｓＬＯＶ２遺伝子断片を得るように設計し、そしてプライマーＰ６３、Ｐ６４を用いて、実施例３において構築されたｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドにおいて増殖を行ってＬｅｘＡ（１−８７）断片を得、相互はぎＰＣＲ法によってＡｓＬＯＶ２遺伝子断片とＬｅｘＡ（１−８７）断片を連接して、ＬｅｘＡ（１−８７）−ＡｓＬＯＶ２融合遺伝子断片を得、ＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドと連接してから構築される融合タンパク質を含むＬｅｘＡ（１−８７）−ＡｓＬＯＶ２プラスミドは、ｐＡＬＡ（融合タンパク質がＬＡと略称し、その核酸とアルミ酸配列は配列７６と配列７７を参照）と命名される。
【０１４２】
ＡｓＬＯＶ２遺伝子を増殖するプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ６１）：５’− ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ６２）：５’− ＡＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＣ−３’ である。
【０１４３】
ＬｅｘＡ（１−８７）遺伝子断片を増殖するプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ６３）：５’− ＧＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ６４）：５’− ＡＴＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＣＣＴＡＣ−３’である。
【０１４４】
オートクローム（ａｕｒｏｃｈｒｏｍｅ）のＬＯＶドメイン（ＡｕＬＯＶと略称、そのｃＤＮＡは日本滋賀県立命館大学ＨｉｒｏｎａｏＫａｔａｏｋａ試験室による無私の寄付である）を第２ポリペプチドとする光感受性転写因子表現ベクターを構築するため、まずプライマーＰ６５、Ｐ６６のｃＤＮＡにおいて増殖を行ってＡｕＬＯＶ遺伝子断片を得るように設計し、そして相互はぎＰＣＲ法によってＡｕＬＯＶ遺伝子断片と本実施例により得たＬｅｘＡ（１−８７）断片を連接して、ＬｅｘＡ（１−８７）−ＡｕＬＯＶ融合遺伝子断片を得、ＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドと連接してから構築される融合タンパク質を含むＬｅｘＡ（１−８７）−ＡｕＬＯＶプラスミドは、ｐＡＬＡｕ（融合タンパク質がＬＡｕと略称し、その核酸とアルミ酸配列は配列７８と配列７９を参照）と命名される。
【０１４５】
ＡｕＬＯＶ２遺伝子を増殖するプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ６５）：５’− ＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ６６）：５’− ＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＣ−３’である。
【０１４６】
実施例５：ｃＩ、ＬａｃＩ 、Ｇａｌ４、とＴｅｔＲを第１ポリペプチドとする光感受性転写因子の原核細菌表現ベクターを構築する。
ｃＩ（１−１０２）を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子の大腸菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ６７、Ｐ６８を用いて、λファージゲノムにおいてＰＣＲ法によってｃＩ（１−１０２）遺伝子断片を増殖し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＡＬＶ−Ｌ４と連接して、ｃＩを第１ポリペプチドとする組換光感受性転写因子を含むベクターを得、ｐＡＣＶと命名され、図７を参照、その相応する組換光感受性転写因子融合タンパク質がＣＶと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ配列８０と配列８１である。
【０１４７】
ｃＩ（１−１０２）を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ６７）：５’− ＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ６８）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＧ−３’である。
【０１４８】
ＬａｃＩ（１−６２）を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子の大腸菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ６９、Ｐ７０を用いて、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社による）におけるＬａｃＩをテンプレートとし、そのＤＮＡ結合ドメイン（１〜６２位置のアルミ酸）の遺伝子断片を増殖し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＡＬＶ−Ｌ４と連接して、得た中間ベクターがｐＡＬａＶ(ｗｔ)と命名される。さらにプライマーＰ７１、Ｐ７２を用いて、ｐＡＬａＶ(ｗｔ) ベクターに対してＰＣＲ法で増殖を行い、得た線形化ベクター断片をＴ４ＰＮＫでリンを加えて自体連接した後、ＬａｃＩ（１−６２）を第１ポリペプチドとする組換光感受性転写因子のベクターを得、ｐＡＬａＶと命名される。図７を参照、その相応する組換光感受性転写因子融合タンパク質がＬａＶと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ配列８２と配列８３である。
【０１４９】
ＬａｃＩ（１−６２）を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ６９）：５’− ＧＧＣＧＣＡＴ ＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ７０）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣ−３’である。
【０１５０】
ｐＡＬａＶベクターを構築するためプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ７１）：５’− ＣＧＴＴＴＣＣＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ７２）：５’− ＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＣＴＣ−３’である。
【０１５１】
Ｇａｌ４(１−６５)を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子の大腸菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ７３、Ｐ７４を用いて、ｐＢＩＮＧプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社による）をテンプレートとし、Ｇａｌ４(１−６５)ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子断片を増殖し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＡＬＶ−Ｌ４と連接して、得たＧａｌ４(１−６５)を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子のベクターがｐＡＧＶと命名される。図７を参照、その相応する組換光感受性転写因子融合タンパク質がＧＶと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ配列８４と配列８５である。
【０１５２】
Ｇａｌ４(１−６５)を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ７３）：５’− ＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ７４）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧ−３’である。
【０１５３】
ＴｅｔＲ(１−６３)を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子の大腸菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ７５、Ｐ７６を用いて、ＰＣＲ法で上海捷瑞生物有限公司によって全遺伝子合成のＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン遺伝子断片（１〜６３位置のアルミ酸の遺伝子断片）を増殖し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＡＬＶ−Ｌ４と連接して、得たＴｅｔＲ(１−６３)を第１ポリペプチドとする光感受性転写因子のベクターがｐＡＴＶと命名される。図７を参照、その相応する組換光感受性転写因子融合タンパク質がＴＶと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ配列８６と配列８７である。
【０１５４】
ＴｅｔＲ(１−６３)を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ７５）：５’− ＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＧ −３’、
下流プライマー（Ｐ７６）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＧ−３’である。
【０１５５】
実施例６：ω因子とα因子を光感受性転写因子の第３ポリペプチドとする原核細菌表現ベクターを構築する。
プライマーＰ７７、Ｐ７８を用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ゲノムにおいてω因子遺伝子断片を増殖し、プライマーＰ７７、Ｐ７９、Ｐ８０を用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ゲノムにおいてω因子遺伝子断片を増殖し、相互はぎＰＣＲ法によってω−ｌｉｎｋｅｒ遺伝子断片を得、プライマーＰ８１、Ｐ８２を用いて、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドをテンプレートとしてＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を増殖し、さらに相互はぎＰＣＲ法によって、ω−ｌｉｎｋｅｒとＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を一体に連接して融合タンパク遺伝子断片ω−ｌｉｎｋｅｒ−ＬＶ−Ｌ０（ωＬＶと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ配列９０と配列９１である）を得、ＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドと連接して、得たプラスミドがｐＡωＬＶと命名される。それぞれプライマーＰ８２とＰ８３、Ｐ８２とＰ８４、Ｐ８２とＰ８５、Ｐ８２とＰ８６を用いて、実施例５において構築されるｐＡＣＶ、ｐＡＬａＶ、ｐＡＧＶとｐＡＴＶプラスミドをテンプレートとして増殖してＣＶ遺伝子断片、ＬａＶ遺伝子断片、ＧＶ遺伝子断片とＴＶ遺伝子断片を得、ＳｐｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、本実施例において構築されるｐＡωＬＶプラスミドと連接して、得たプラスミドがそれぞれｐＡωＣＶ、ｐＡωＬａＶ、ｐＡωＧＶとｐＡωＴＶと命名される。図７を参照、それらの含まれる組換転写因子がそれぞれωＣＶ、ωＬａＶ、ωＧＶおよびωＴＶと略称し、それぞれのヌクレオチド配列はそれぞれ９４、９８、１０２、１０６で、アルミ酸配列はそれぞれ９５、９９、１０３、１０７である。
【０１５６】
ω因子遺伝子断片を増殖するプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ７７）：５’− ＧＣＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＣＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣ−３’、
下流プライマー２（Ｐ７８）：５’− ＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧ−３’である。
【０１５７】
増殖してω−ｌｉｎｋｅｒ遺伝子断片を得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ７９）：５’− ＣＡＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ８０）：５’− ＣＧＴＴＡＡＣＧＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＡＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧ−３’である。
【０１５８】
ＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ８１）：５’− ＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ８２）：５’− ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡ−３’である。
【０１５９】
ＣＶ、ＬａＶ、ＧＶとＴＶ遺伝子断片を増殖するためのプライマーはそれぞれ下記とおり：
上流プライマー（Ｐ８３）：５’− ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣ−３’、
上流プライマー（Ｐ８４）：５’− ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡ−３’、
上流プライマー（Ｐ８５）：５’− ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣ−３’、
上流プライマー（Ｐ８６）：５’− ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＧＣ−３’である。
【０１６０】
α因子を第３ポリペプチドとする光誘起転写因子を含む原核細菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ８７、Ｐ８８を用いて、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドを増殖し、ＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を得、プライマーＰ８７、Ｐ７９、Ｐ８９を用いて、相互はぎＰＣＲ法により増殖して、ＬＶ−Ｌ０−ｌｉｎｋｅｒ遺伝子断片を得、プライマーＰ９０、Ｐ９１を用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ゲノムにおいてα因子遺伝子断片を増殖し、そして相互はぎＰＣＲ法によって、ω−ｌｉｎｋｅｒとＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を一体に連接して融合タンパク遺伝子断片ＬＶ−Ｌ０−ｌｉｎｋｅｒ遺伝子断片とα因子遺伝子断片を一体に連接し、ＬＶ−Ｌ０−ｌｉｎｋｅｒ−α（ＬＶαと略称し、そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ８８、８９である）を得、該遺伝子断片がＮｄｅＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、実施例３において構築されるｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドと連接して、得たプラスミドがｐＡＬＶαと命名される。
【０１６１】
それぞれプライマーＰ８８とＰ９２、Ｐ８８とＰ９３、Ｐ８８とＰ９４、Ｐ８８とＰ９５を用いて、実施例５において構築されるｐＡＣＶ、ｐＡＬａＶ、ｐＡＧＶとｐＡＴＶプラスミドをテンプレートとして増殖してＣＶ遺伝子断片、ＬａＶ遺伝子断片、ＧＶ遺伝子断片とＴＶ遺伝子断片を得、ＮｄｅＩとＳｐｅＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、本実施例において構築されるｐＡＬＶαプラスミドと連接して、得たプラスミドがそれぞれｐＡＣＶα、ｐＡＬａＶα、ｐＡＧＶαとｐＡＴＶαと命名される。図９を参照、それらの含まれる組換転写因子がそれぞれＣＶα、ＬａＶα、ＧＶαおよびＴＶαと略称し、それぞれのヌクレオチド配列はそれぞれ９２、９６、１００、１０４で、アルミ酸配列はそれぞれ９３、９７、１０１、１０５である。
【０１６２】
ＬＶ−Ｌ０遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ８７）：５’− ＧＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣ−３’、
下流プライマー２（Ｐ８８）：５’− ＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡ−３’である。
増殖してＬＶ−Ｌ０−ｌｉｎｋｅｒ遺伝子断片を得るためのプライマーは下記とおり：
下流プライマー（Ｐ８９）：５’− ＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡ−３’である。
【０１６３】
増殖してα因子遺伝子断片を得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ９０）：５’− ＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧ−３’、
下流プライマー２（Ｐ９１）：５’− ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’である。
【０１６４】
ＣＶ遺伝子断片、ＬＶ遺伝子断片、ＧＶ遺伝子断片とＴＶ遺伝子断片を増殖するためのプライマーはそれぞれ下記とおり：
上流プライマー（Ｐ９２）：５’− ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣ−３’、
上流プライマー（Ｐ９３）：５’− ＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡ−３’、
上流プライマー（Ｐ９４）：５’− ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣ−３’、
上流プライマー（Ｐ９５）：５’− ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧＡＧＣ−３’である。
【０１６５】
実施例７：それぞれＬｅｘＡ、ｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲの対応する応答要素を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築する。
ＬｅｘＡを第１ポリペプチドとする本発明組換光感受性転写因子がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質とＬａｃＺβ-ガラクトシダーゼ遺伝子転写に対する調整制御効果を測定するため、ＬｅｘＡと対応する応答要素と蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築した。まず下記プライマーＰ９６、Ｐ９７、Ｐ９８、Ｐ９９、Ｐ１００を用いて、相互はぎＰＣＲ法によって増殖し、ｃｏｌＥプロモーター断片を得、プライマーＰ１０１、Ｐ１０２を用いて、ｐＵ５−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（本実験室収集したもの、関係書類を参照：Ｗａｎｇ, Ｘ.等, Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２０１２.）において、ＰＣＲ法によって増殖し、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を得、プライマーＰ１０３、Ｐ１０４を用いて、ｐＢＡＤ/ＨｉｓＡプラスミドにおいて、ＰＣＲ法によって増殖し、ｒｒｎＢ 転写ターミネータ断片を得てから、このような３つの断片を相互はぎＰＣＲ法によって増殖し、ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｒｒｎＢ遺伝子断片を得る。
【０１６６】
プライマーＰ１０５、Ｐ１０６を用いて、ｐＲＳＥＴｂベクターに対して増殖を行い、得た線形化断片がＢａｍＨとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｒｒｎＢ遺伝子断片と連接して、得た中間プラスミドがプライマーＰ１０７、Ｐ１０８を用いて増殖して、得た線形化断片がＫｐｎＩとＮｈｅＩでのダブル酵素消化を経てから、プライマーＰ１０９、Ｐ１１０を用いて増殖して得たの、同じくダブル酵素消化されたｒｒｎＢ遺伝子断片と連接して、ＬｅｘＡと対応する応答要素と蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを得、そのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は１１７である。
【０１６７】
プライマーＰ１１１、Ｐ１１２を用いて、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ゲノムにおいてＬａｃＺ遺伝子を増殖し、プライマーＰ１１３、Ｐ１１４を用いて、ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを増殖し、得たＬａｃＺ遺伝子断片とｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ線形化増殖断片が共にＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩでのダブル酵素消化を経てから連接して、ＬｅｘＡと対応する応答要素とＬａｃＺβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターｐＢ−ｃｏｌＥ−ＬａｃＺを得、そのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は１１８である。
【０１６８】
下記プライマーＰ１１５とＰ１１６、Ｐ１１７とＰ１１８、Ｐ１１９とＰ１２０を用いて、ＪＭ１０９(ＤＥ３) 菌株のゲノムにおいて増殖してｓｕｌＡ、ＲｅｃＡとｕｍｕＤＣプロモーター遺伝子断片を得、相互はぎＰＣＲ法によって、それぞれ本実施例において増殖して得たｍＣｈｅｒｒｙ断片を連接して、ｓｕｌＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲｅｃＡ−ｍＣｈｅｒｒｙとｕｍｕＤＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ断片を得、そしてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経てから、同じくダブル酵素消化されたｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドベクターと連接して、その他３種類のＬｅｘＡと対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターｐＢ−ｓｕｌＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ｕｍｕＤＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ＲｅｃＡ−ｍＣｈｅｒｒｙを得、図１０に示されるように、その対応するターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列はそれぞれ１１９、１２０、１２１である。
【０１６９】
増殖してｃｏｌＥプロモーター断片を得るプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ９６）：５’− ＧＡＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ９７）：５’− ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’、
下流プライマー１（Ｐ９８）：５’− ＴＡＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＴ−３’、
下流プライマー２（Ｐ９９）：５’− ＴＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣ−３’、
下流プライマー３（Ｐ１００）：５’− ＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣ−３’である。
【０１７０】
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１０１）：５’− ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１０２）：５’− ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’である。
【０１７１】
ｒｒｎＢ 転写ターミネータを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１０３）：５’− ＣＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１０４）：５’− ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧ−３’である。
ｐＲＳＥＴｂプラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１０５）：５’− ＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１０６）：５’− ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣ−３’である。
【０１７２】
中間プラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１０７）：５’− ＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１０８）：５’− ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡ−３’である。
【０１７３】
ｒｒｎＢ 転写ターミネータを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１０９）：５’− ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１１０）：５’− ＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡ−３’である。
【０１７４】
ＬａｃＺ遺伝子を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１１１）：５’− ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１１２）：５’− ＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣ−３’である。
【０１７５】
ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１１３）：５’− ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１１４）：５’− ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＴ−３’である。
【０１７６】
ｓｕｌＡプロモーター配列を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１１５）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１１６）：５’− ＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＧ−３’である。
ＲｅｃＡプロモーター配列を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１１７）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＡＣＴＴＧＡＴＡＣＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１１８）：５’− ＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＧＧＧ−３’である。
【０１７７】
ｕｍｕＤＣプロモーター配列を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１１９）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１２０）：５’− ＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＡＡＴＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＡ−３’である。
【０１７８】
ｃＩを第１ポリペプチドとする本発明組換光感受性転写因子がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子転写に対する調整制御効果を測定するため、ｃＩと対応する応答要素と蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築した。プライマーＰ１２１、Ｐ１２２、Ｐ１２３、Ｐ１２４、Ｐ１２５を用いて、相互はぎＰＣＲ法によって、ＰλＯ１２プロモーター断片を得、プライマーＰ１２６、Ｐ１２７を用いて、ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドにおいてｍＣｈｅｒｒｙ断片を増殖し、その後相互はぎＰＣＲ法によってＰλＯ１２プロモーター遺伝子断片とｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を一体に連接し、得たＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片がＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経てから、同じくダブル酵素消化されたｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターと連接して、ｃＩと対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターｐＢ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙを得、図１０に示されるように、そのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は１２２である。
【０１７９】
ＰλＯ１２プロモーターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ１２１）：５’− ＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ１２２）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＴＧ−３’である。
下流プライマー１（Ｐ１２３）：５’− ＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴ−３’、
下流プライマー２（Ｐ１２４）：５’− ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧ３’、
下流プライマー３（Ｐ１２５）：５’− ＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣ−３’である。
【０１８０】
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１２６）：５’− ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１２７）：５’− ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’である。
【０１８１】
ＬａｃＩを第１ポリペプチドとする本発明組換光感受性転写因子がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子転写に対する調整制御効果を測定するため、ＬａｃＩと対応する応答要素と蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築した。プライマーＰ１２８、Ｐ１２９を用いて、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１ベクターから、Ｔ７プロモーター−ｌａｃオペロン核酸断片を増殖し、ＢａｍＨＩとＳｐｅＩでのダブル酵素消化を経てから、同じくダブル酵素消化されたｐＢ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙベクターと連接して、中間ベクターｐＢ−Ｔ７ｌａｃｏｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ(ｗｔ)を得る。そしてそれぞれプライマーＰ１３０とＰ１３１、Ｐ１３２とＰ１３３、Ｐ１３４とＰ１３５を用いて、それぞれｐＢ−Ｔ７ｌａｃｏｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ(ｗｔ) プラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲ法によって増殖を行い、得た線形化ベクター断片がＴ４ＰＮＫでリンを加えて自体連接した後、それぞれＬａｃＩ、Ｇａｌ４およびＴｅｔＲと対応する応答要素を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを得、それぞれｐＢ−Ｔ７ｌａｃｏｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−Ｔ７ｇａｌｏｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−Ｔ７ｔｅｔｏｐ−ｍＣｈｅｒｒｙと命名され、図１０に示されるように、その対応するターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は１２３、１２４、１２５である。
【０１８２】
Ｔ７プロモーター−ｌａｃオペロン核酸断片を増殖するプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１２８）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ−３’、
下流プライマー（Ｐ１２９）：５’− ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ−３’である。
【０１８３】
増殖してＬａｃＩと対応する応答要素を含むターゲット転写ユニットベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１３０）：５’− ＣＴＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１３１）：５’− ＣＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’である。
【０１８４】
増殖してＧａ１４と対応する応答要素を含むターゲット転写ユニットベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１３２）：５’− ＧＴＣＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１３３）：５’− ＡＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡ−３’である。
【０１８５】
増殖してＴｅｔＲと対応する応答要素を含むターゲット転写ユニットベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１３４）：５’− ＴＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１３５）：５’− ＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡ−３’である。
【０１８６】
実施例８：ＬｅｘＡ、ｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲを第１ポリペプチドとし、ω因子、またはα因子を第３ポリペプチドとする組換光感受性転写因子が対応される、ＬｅｘＡまたはｃＩまたはＬａｃＩまたはＧａｌ４またはＴｅｔＲと対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築する。
ω因子とα因子を第３ポリペプチドとする組換光感受性転写因子が対応されるターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを構築するため、プライマーＰ１３６、Ｐ１３７、Ｐ１３８を用いて、増殖してｌａｃ最小プロモーター核酸断片を得、プライマーＰ１３９、Ｐ１４０を用いて、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを増殖し、得た線形化断片がＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｌａｃ最小プロモーター核酸断片と連接して、得た中間ベクターがｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙと命名される。
【０１８７】
プライマーＰ１４１とＰ１４２、Ｐ１４３とＰ１４４、Ｐ１４５とＰ１４６、Ｐ１４７とＰ１４８、Ｐ１４９とＰ１５０を用いて、ｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、得た線形化ベクター断片がＴ４ＰＮＫで末端リンを加えて自体連接した後、それぞれＬｅｘＡ、ｃＩ、ｌａｃＩ、Ｇａｌ４およびＴｅｔＲを第１ポリペプチドとし、ω因子、またはα因子を第３ポリペプチドとする組換光感受性転写因子が対応される、ＬｅｘＡまたはｃＩまたはＬａｃＩまたはＧａｌ４またはＴｅｔＲと対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターを得、それぞれｐＢ−ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ｏ１２−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ｌａｃｏｐ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ｇａｌｏｐ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ及びｐＢ−ｔｅｔｏｐ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙと命名され、図１１に示されるように、それらのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は１２６、１２７、１２８、１２９と１３０である。
【０１８８】
ｌａｃ最小プロモーター核酸断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ１３６）：５’− ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴ−３’、
上流プライマー２（Ｐ１３７）：５’− ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＣＡ−３’、
下流プライマー（Ｐ１３８）：５’− ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣ−３’である。
【０１８９】
ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１３９）：５’− ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１４０）：５’− ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣ−３’である。
【０１９０】
ＰＣＲ法でｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、ＬｅｘＡが対応される原核細菌表現ベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１４１）：５’− ＧＴＴＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＣＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１４２）：５’− ＣＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡ−３’である。
【０１９１】
ＰＣＲ法でｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、ｃＩが対応される原核細菌表現ベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１４３）：５’− ＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１４４）：５’− ＧＴＣＡＡＣＡＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡ−３’である。
【０１９２】
ＰＣＲ法でｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、ＬａｃＩが対応される原核細菌表現ベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１４５）：５’− ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１４６）：５’− ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡ−３’である。
【０１９３】
ＰＣＲ法でｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、Ｇａ１４が対応される原核細菌表現ベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１４７）：５’− ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１４８）：５’− ＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡ−３’である。
【０１９４】
ＰＣＲ法でｐＢ−ｌａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを増殖し、ＴｅｔＲが対応される原核細菌表現ベクターを得るためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１４９）：５’− ＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１５０）：５’− ＣＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＡＣＡＡ−３’である。
【０１９５】
実施例９：ｃＩ抑制タンパクを間接調整制御役とする原核細菌表現ベクターを構築する。
ｃＩ抑制タンパクを間接調整制御役とする原核細菌表現ベクターを構築するため、下記プライマーＰ１５１、Ｐ１５２を用いて、実施例７において得たｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖し、そしてプライマーＰ１５３、Ｐ１５４を用いて、ｐＲＳＥＴｂプラスミドを増殖し、得た線形化断片がＫｐｎＩとＢｇｌＩＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片と連接して、中間ベクターｐＢ−ｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを得た。
【０１９６】
下記プライマーＰ１５５、Ｐ１５６を用いて、ｃｏｌＥプロモーター断片を増殖し、下記プライマーＰ１５７、Ｐ１５８を用いて、λファージゲノムにおいてｃＩ遺伝子断片（そのヌクレオチド配列とアルミ酸配列はそれぞれ１３１、１３２である）を増殖し、相互はぎＰＣＲ法によって、ｃｏｌＥプロモーター断片とｃＩ遺伝子断片を連接して、得たｃｏｌＥ−ｃＩ遺伝子断片がＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＢｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドと連接して、中間プラスミドｐＢｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩを得る。
【０１９７】
プライマーＰ１５９、Ｐ１６０、Ｐ１６１、Ｐ１６２、Ｐ１６３を用いて、相互はぎＰＣＲ法によって、ＰλＯ１２プロモーター断片を得、プライマーＰ１６４、Ｐ１６５を用いて、ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドからｍＣｈｅｒｒｙ断片を増殖し、プライマーＰ１６６、Ｐ１６７を用いて、ｒｒｎＢ転写ターミネータ断片を増殖し、相互はぎＰＣＲ法によって、ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｒｒｎＢ遺伝子断片を得る。
【０１９８】
プライマーＰ１６８、Ｐ１６９を用いて、本実施例において構築したｐＢ−ｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを増殖し、得た線形化断片がＳａｃＩとＸｈｏＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｒｒｎＢ断片と連接して、間接調整制御役のプラスミドｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙを得、図１２に示されるように、そのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は配列１３３である。
【０１９９】
ｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１５１）：５’− ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１５２）：５’− ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’である。
【０２００】
ｐＲＳＥＴｂプラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１５３）：５’− ＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＡＡＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１５４）：５’− ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡ−３’である。
【０２０１】
ｃｏｌＥプロモーターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１５５）：５’− ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１５６）：５’− ＴＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡ−３’である。
【０２０２】
ｃＩ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１５７）：５’− ＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１５８）：５’− ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧ−３’である。
【０２０３】
ＰλＯ１２プロモーターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー１（Ｐ１５９）：５’− ＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧ−３’、
上流プライマー２（Ｐ１６０）：５’− ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＴＧ−３’、
下流プライマー１（Ｐ１６１）：５’− ＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴ−３’、
下流プライマー１（Ｐ１６２）：５’− ＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧ−３’、
下流プライマー１（Ｐ１６３）：５’− ＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＣ−３’である。
【０２０４】
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１６４）：５’− ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１６５）：５’− ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’である。
【０２０５】
ｒｒｎＢ転写ターミネータ断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１６６）：５’− ＣＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１６７）：５’− ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧ−３’である。
【０２０６】
ｐＢ−ｒｒｎＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１６８）：５’− ＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１６９）：５’− ＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣ−３’である。
【０２０７】
ＣｈｅＺとＳＲＲｚ遺伝子クラスターを報告遺伝子とするｃＩ間接調整制御役プラスミドを増殖するため、それぞれプライマーＰ１７０とＰ１７１、Ｐ１７２とＰ１７３を用いて、ＪＭ１０９(ＤＥ３) ゲノム及びλファージゲノムにおいてＣｈｅＺ遺伝子とＳＲＲｚ遺伝子クラスターを増殖し、得た遺伝子断片がＳｐｅＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、本実施例において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドと連接・転換して、間接役プラスミドｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ＣｈｅＺとｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ＳＲＲｚを得、図１２に示されるように、それらのターゲット転写ユニットのヌクレオチド配列は配列１３４，１３５である。
【０２０８】
ＣｈｅＺ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１７０）：５’− ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１７１）：５’− ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＡＡ−３’である。
【０２０９】
ＳＲＲｚ遺伝子クラスターを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１７２）：５’− ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＣ−３’、
下流プライマー（Ｐ１７３）：５’− ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＡＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡ−３’である。
【０２１０】
該当原核細菌光誘起遺伝子表現システムを用いて大量に表現可能のＥｒｏ１スルフヒドリル酸化酵素を構築するため、Ｅｒｏ１を報告遺伝子とするｃＩを含む間接調整制御役プラスミドを構築すべきである。プライマーＰ１７４とＰ１７５を用いて、ＢＹ４７４１醸造酵母菌株ゲノムにおいてＥｒｏ１(５６−４２４) 遺伝子断片を増殖し、ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、本実施例において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドと連接・転換して、間接役プラスミドｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−Ｅｒｏ１を得、Ｅｒｏ１(５６−４２４)タンパクのヌクレオチド配列とアルミ配列は配列４６、４７を如く。
【０２１１】
Ｅｒｏ１(５６−４２４) 遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流端プライマー（Ｐ１７４）：５’− ＣＣＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＣ−３’、
下流端プライマー（Ｐ１７５）：５’− ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＣ−３’である。
【０２１２】
実施例１０：光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現プラスミドシステムを構築する。
光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現プラスミドシステムを構築するため、プライマーＰ１７６、Ｐ１７７を用いて、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０プラスミドをテンプレートとし、増殖してＡｍｐ−ＬＶ−Ｌ０ヌクレオチド配列断片を得、ＳａｃＩとＥｃｏＲＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたの、実施例９において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドと連接して、得た中間プラスミドがｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０と命名される。そして該プラスミドをＫｐｎＩとＸｏｈＩでのダブル酵素消化を経て、ｔｅｒ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０−ｔｅｒヌクレオチド断片を回収する。プライマーＰ１７８、Ｐ１７９を用いて、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１プラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲ法で増殖し、得た線形化断片をＫｐｎＩとＸｏｈＩでのダブル酵素消化を経て、回収されたｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０−ｔｅｒヌクレオチド断片と連接し、得た光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現プラスミドがｐＤ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶと命名され、そのうちのｔｅｒ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０−ｔｅｒヌクレオチド配列は配列１０８である。
【０２１３】
Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０ヌクレオチド断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１７６）：５’− ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１７７）：５’− ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡ−３’である。
【０２１４】
ｐＣＤＦＤｕｅｔ１プラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１７８）：５’− ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴ−３’、
下流プライマー（Ｐ１７９）：５’− ＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣ−３’である。
【０２１５】
他１つの光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現プラスミドを構築するため、まずプライマーＰ１８０、Ｐ１８１を用いて、実施例５において構築したｐＡＬａＶ（ｗｔ）プラスミドをテンプレートとし、増殖してＬａｃＩ(１−６２,ｗｔ)−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)ヌクレオチド配列断片を得、そしてプライマーＰ１８２、Ｐ１８３を用いて、バキッルス・スプティーリスｐＨＴ０１プラスミドを増殖し、注入技術を用いて得た線形化断片をＬａｃＩ(１−６２,ｗｔ)−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)ヌクレオチド配列断片と連接し、中間プラスミドｐＨＴ０１−ＬａＶ(ｗｔ)を得る。プライマーＰ１８４、Ｐ１８５を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩでのダブル酵素消化を経て、同じくダブル酵素消化されたｐＨＴ０１−ＬａＶ(ｗｔ) プラスミドと連接し、得た光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現プラスミドはｐＨＴ０１−ＬａＶ(ｗｔ)−Ｐｇｒａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙと命名される。そのうちのＬａＶ(ｗｔ)−Ｐｇｒａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙヌクレオチド配列は１１１である。
【０２１６】
ＬａｃＩ−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ)ヌクレオチド断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１８０）：５’− ＡＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡ−３’、
下流プライマー（Ｐ１８１）：５’− ＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡ−３’である。
【０２１７】
ｐＨＴ０１プラスミドを増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１８２）：５’− ＣＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’、
下流プライマー（Ｐ１８３）：５’− ＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＡＧＧＣＣ−３’である。
【０２１８】
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子断片を増殖するためのプライマーは下記とおり：
上流プライマー（Ｐ１８４）：５’− ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’、
下流プライマー（Ｐ１８５）：５’− ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’である。
【０２１９】
実施例１１：光感受性転写因子は大腸菌細胞においてターゲット遺伝子表現に対する調整。
実施例において構築する複数の光感受性転写因子を含むプラスミドと、ｍＣｈｅｒｒｙを報告遺伝子とする報告プラスミドとを共に対応する菌株に転換し、光照射により刺激した後、異なる光感受性転写因子はターゲット遺伝子表現に対する調整制御効果を測定する。
【０２２０】
まず、光照射により刺激した後、異なるリンカーポリペプチドを含むＬｅｘＡ(１−８７)−ＶＶＤ３６(Ｃ７１Ｖ) 光感受性転写因子のターゲット遺伝子表現に対する調整制御を測定し、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙと実施例２において構築したｐＬＶ−Ｌｎ(ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７)を用いて、共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。その中、光照射は細菌成長及びタンパク質表現に対する影響を観察するため、ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙと共に転換するｐＣＤＦＤｕｅｔ１は光感受性転写因子を含まず空ベクター同士の対照である。その結果によれば、光感受性転写因子を含まれないサンプルは、暗中と光照射に関わらず、その表現量が共に高いレベルを維持しているため、光照射自体が細菌タンパク質の表現に対する影響が少ないと表明する。但し前述異なるリンカーポリペプチドを含む光感受性転写因子は、光誘起を経てその細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの表現量が大幅に降下され、暗中組の対照サンプルの蛍光値より顕著に低くて、光調整制御の下で大腸菌細胞におけるターゲット遺伝子表現を調整可能になることを表明した。具体的に、ｐＬＶ−Ｌ０光照射組のターゲット遺伝子表現量は暗中組の１／１３になり、ｐＬＶ−Ｌ４光照射組のターゲット遺伝子表現量は暗中組の１／３２になり、その他の異なるリンカーポリペプチドを含む組換光感受性転写因子は同様にｍＣｈｅｒｒｙ表現を光照射で抑制する比較的に好ましい効果を有する（図１３を参照）。
【０２２１】
光感受性転写因子を表現するプロモーターはＴ７原来の背景表現からＡｍｐプロモーターに転換した効果を測定するため、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌｎ(ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７)と、実施例５において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、具体的な実施形態における基礎分子生物学方法（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。その中、光照射は細菌成長及びタンパク質表現に対する影響を観察するため、ｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙと共に転換するｐＣＤＦＤｕｅｔ１は光感受性転写因子を含まず空ベクター同士の対照である。出願人の実験結果によれば、Ｔ７の原来の背景表現に対して、代わりにＡｍｐプロモーターを用いた後、すべてのサンプルは共によりよい光照射抑制効果が現れる。具体的に、ｐＬＶ−Ｌ０光照射組のサンプルはその対照暗中組サンプルより１５０倍抑制効果が現れ、ｐＬＶ−Ｌ４も５０倍強の抑制効果が現れる（図１４を参照）。
【０２２２】
組換光感受性転写因子はＬａｃＺ遺伝子表現に対する調整制御効果を測定するため、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ＬａｃＺプラスミドと、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、具体的な実施形態における（八）の方法によって、サンプルの光照射前後のＬａｃＺ表現量の差異を測定する。出願人の実験結果によれば、暗中条件下のサンプルより、光照射後のＬａｃＺ表現レベルが１２６倍にも低減した（図１５を参照）。
【０２２３】
その他３種類のＬｅｘＡと対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターの効果を測定するため、実施例７において構築したｐＢ−ｓｕｌＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ｕｍｕＤＣ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢ−ＲｅｃＡ−ｍＣｈｅｒｒｙという３つのプラスミドと、ｐＬＶ−Ｌ０と、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株にそれぞれ転換し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１空ベクターを対照とし、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、ｃｏｌＥプロモーターに対して、代わりにｓｕｌＡ、ｕｍｕＤＣ、ＲｅｃＡという３つのプロモーターが対応される光感受性転写因子は光照射下における反応が大幅に弱まり、具体的に、ｓｕｌＡとｕｍｕＤＣの光抑制ｍＣｈｅｒｒｙの表現効果は３倍になれず、してＲｅｃＡの表現効果は５倍のみになる（図１６を参照）。
【０２２４】
第２ポリぺプチドをＶＶＤ突然変異体とする光感受性転写因子は前のＬＶ−Ｌ０の光誘起遺伝子よりその表現効果よいか否かを測定するため、実施例４において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｎ５６Ｋ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｙ５０Ｗ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｎ５６Ｋ Ｃ７１Ｖ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｉ５２Ａ Ｃ７１Ｖ)、ｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｉ５２Ｓ Ｃ７１Ｖ)とｐＡＬＶ−Ｌ０(Ｎ５６Ｒ Ｃ７１Ｖ)およびｐＬＶ−Ｌ０と、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株にそれぞれ転換し、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、その他の突然変異体に対して、代わりにＶＶＤ(Ｃ７１Ｖ)和ＶＶＤ(Ｎ５６Ｋ Ｃ７１Ｖ)の効果がさらにより高い抑制倍数を有し、光照射条件の下でＶＶＤ(Ｃ７１Ｖ)サンプルのｍＣＨｅｒｒｙ表現量がより低いことを考えて、後続の試験において光感受性転写因子の第２ポリぺプチドとして、ＶＶＤ(Ｃ７１Ｖ) 突然変異体を選択する（図１７を参照）。
【０２２５】
ｃＩ、ＬａｃＩ、Ｇａｌ４とＴｅｔＲを第１ポリぺプチドとする光感受性転写因子は光照射条件の下でターゲット遺伝子表現に対する調整を測定するため、実施例５において構築したｐＡＣＶ、ｐＡＬａＶ、ｐＡＧＶとｐＡＴＶプラスミドと、実施例７において構築した対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子の含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株にそれぞれ転換し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１空ベクターを対照とし、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、光照射条件の下で組換光感受性転写因子ＣＶはｍＣｈｅｒｒｙ表現量を暗中条件下の半分に降下させることができ、その他の３つの組換光感受性転写因子ＬａＶ、ＧＶとＴＶは光照射条件の下でｍＣｈｅｒｒｙ表現量を暗中条件下の６０％〜７０％に降下させることをもたらし、両者が共に光で調整制御可能なものである（図１８を参照）。
【０２２６】
ｐｈｏｔ1−ＬＯＶ２、ａｕｒｏｃｈｒｏｍｅを第２ポリぺプチドとするＬＯＶドメインの光感受性転写因子は光刺激条件の下でターゲット遺伝子表現に対する調整を測定するため、実施例４において構築したｐＡＬＡとｐＡＬＡｕと、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株にそれぞれ転換し、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、ＡｓＬＯＶ２を第２ポリぺプチドとする組換光感受性転写因子は暗中条件下でより強い抑制効果を有し、また光照射条件の下でＡｕｌＯＶを第２ポリぺプチドとする組換光感受性転写因子はｍＣｈｅｒｒｙ表現量に対してより高い抑制倍数が現れる（図１９を参照）。
【０２２７】
ω因子を第３ポリぺプチドとする光感受性転写因子は光刺激条件の下でターゲット遺伝子表現に対する調整を測定するため、実施例６において構築したｐＡωＬＶ、ｐＡωＣＶ、ｐＡωＬａＶ、ｐＡωＧＶとｐＡωＴＶプラスミドと、実施例８において構築した対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株にそれぞれ転換し、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、組換光感受性転写因子ωＬＶは光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ５倍の表現量を活性化でき、ωＣＶとωＧＶは光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ２倍近いの表現量を活性化でき、ωＬａＶとωＴＶは同じように一定の光照射による活性化能力を持っている（図２０を参照）。
【０２２８】
α因子を第３ポリぺプチドとする光感受性転写因子は光刺激条件の下でターゲット遺伝子表現に対する調整を測定するため、実施例６において構築したｐＡＬＶα、ｐＡＣＶα、ｐＡＬａＶα、ｐＡＧＶαとｐＡＴＶαプラスミドと、実施例８において構築した対応する応答要素とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲット転写ユニットの原核細菌表現ベクターと、を共にＢＬ２１(ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−, ω−)菌株にそれぞれ転換する。具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、組換光感受性転写因子ＬＶαは光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ４倍の表現量を活性化でき、ＣＶα、ＬａＶαとＧＶαは光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ２倍近いの表現量を活性化でき、ＴＶαは同じように一定の光照射による活性化能力を持っている（図２１を参照）。
【０２２９】
異なる培養温度は光感受性転写因子のターゲット遺伝子表現に対する調整効果を測定するため、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、それぞれ１８℃、２５℃、３０℃と３７℃という４つの温度において培養を行い、１８℃の場合、光照射または暗中条件にも関わらず、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｍＣｈｅｒｒｙ表現に対する抑制が共に大きくて、また３７℃に場合、状況が逆転され、光照射または暗中条件にも関わらず、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｍＣｈｅｒｒｙ表現に対するいかなる影響を与えないため、このような２種類の温度においてＬＶ−Ｌ０はｍＣｈｅｒｒｙ表現に対して光照射による調整制御能力を備えない。しかも２５℃と３０℃において、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｍＣｈｅｒｒｙ表現に対するよりよい光照射抑制効果を持つため、細菌成長速度の面を考慮入れて、今後の測定は共に３０℃温度条件で行うことを選択する（図２２を参照）。
【０２３０】
ｃＩ抑制タンパクを間接調整制御役とする原核細菌表現ベクターにおいて光感受性転写因子の光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量差異を測定するため、実施例９において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ｍＣｈｅｒｒｙベクターと、実施例３におけるｐＡＬＶ−Ｌ０と、を共にＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１空ベクターを対照とし、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０は光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ５０倍強の表現量を活性化でき、ＣＶα、ＬａＶαとＧＶαは光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ２倍近いの表現量を活性化できるため、ｃＩタンパクを間接調整制御モデルにおいて活用することは光照射によるｍＣｈｅｒｒｙの表現量を調整制御する好ましい能力を有すると表明した（図２３を参照）。
【０２３１】
光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現ベクターの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量差異を測定するため、実施例１０において構築したｐＤ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｍｐ−ＬＶプラスミドをＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に転換し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ１空ベクターを対照とし、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を対照する。出願人の実験結果によれば、光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む単一表現ベクター自体は組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０を表現することができ、且つベクター自体に含まれるターゲット転写ユニットにおけるｍＣｈｅｒｒｙ表現量を好適に調整制御することもでき、且つ２つプラスミドを同時に転換する面倒が省略されたため、より重要な汎用見通しが見られる（図２４を参照）。
【０２３２】
光感受性転写因子とターゲット転写ユニットを含む枯草菌プラスミドの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量差異を測定するため、実施例１０において構築したｐＨＴ０１−ＬａＶ(ｗｔ)−Ｐｇｒａｃ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを枯草菌ＷＢ８００に転換し、ｐＨＴ０１ベクターを空ベクター対照とし、それぞれ光照射と暗中条件下でｍＣｈｅｒｒｙ表現量を測定する。出願人の実験結果によれば、枯草菌の内部において、組換光感受性転写因子ＬａＶ(ｗｔ)は光照射条件の下でｍＣｈｅｒｒｙ表現を抑制し、その抑制倍数が３倍に近い（図２５を参照）。
【０２３３】
ＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ:: Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株自体の光感受性転写因子はｍＣｈｅｒｒｙ表現量に対する調整制御効果を測定するため、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ:: Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株に転換し、ｐＲＳＥＴｂベクターを対照とし、具体的な実施形態における（七）の方法によって、サンプルの光照射前後のｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を測定する。出願人の実験結果によれば、外因性投与プラスミドで組換光感受性転写因子を表現する必要がなくて、その菌株自体の光感受性転写因子は光照射条件下でｍＣｈｅｒｒｙ表現を抑制することができ、その抑制倍数が５倍にも近い（図２６を参照）。
【０２３４】
実施例１２：光照射誘起のターゲット遺伝子の表現特徴。
光照射誘起の光感受性転写因子がターゲット遺伝子表現を調整する時間動態学及び可逆性あるか否かを測定するため、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０を実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、をＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ:: Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株に共に転換し、転換プレートから単クローンを選んで４８ウェルプレートに入れて培養を行い、全部で６組に分け、各組が４ウェルで、３０℃光照射により一夜培養する。翌日に１：１００の比例で新鮮な培地を含む２つの４８ウェルプレートに希釈し、それぞれＡ、Ｂプレートと表記する。Ａプレートは光照射下で培養を行って、それぞれ３、５、７時間において単点サンプリングでｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を測定し、且つ毎回の単点サンプリングを行う時、そのうちの１組のサンプルを光照射から暗中条件に転換し（つまりＢプレートの残ったウェルに入れる）て培養し、最後の時間点まで行う。Ｂプレートは暗中条件の下で培養を行って、それぞれ３、５、７時間において単点サンプリングでｍＣｈｅｒｒｙ表現量の差異を測定し、且つ毎回の単点サンプリングを行う時、そのうちの１組のサンプルを暗中から光照射条件に転換し（つまりＡプレートの残ったウェルに入れる）て培養し、最後の時間点まで行う。最後各時間点におけるｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルの平均値を作図し、出願人の実験結果によれば、最初光照射条件に置かれるサンプルにとっては、その表現量が大幅に抑制されており、また暗中条件に置かれる場合、ｍＣｈｅｒｒｙ表現に対する抑制効果が徐々に弱まり、その表現量が次第に強くなり、図に表れる曲線はその徐々に上昇する傾向を表す（図２７を参照）。
【０２３５】
最初暗中条件に置かれるサンプルにとっては、そのｍＣｈｅｒｒｙ表現が抑制されおらず、高い表現量を有し、しかし光照射条件に移転される場合、ｍＣｈｅｒｒｙの表現が徐々に抑制され、図に本来曲線の上昇傾向が次第に緩められ、最後水平レベルまで至る（図２８を参照）。これらの結果によって、組換光感受性転写因子がターゲット遺伝子表現に対する調整制御は１つの逆にできるものと発見した。
【０２３６】
光照射誘起の光感受性転写因子が異なる光照射量においてターゲット遺伝子表現に対する調整作用を測定するため、ｍＣｈｅｒｒｙを例として、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、をＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ:: Ａｍｐ−ＬＶ−Ｌ０)菌株に共に転換する。転換プレートから単クローンを選んで４８ウェルプレートに入れて培養を行い、全部で６組に分け、各組が４ウェルで、３０℃光照射により一夜培養する。翌日に１：１００の比例で新鮮な培地を含む６つの４８ウェルプレートに希釈し、そのうちの５つは光照射下で培養を行い、光照射の強度はそれぞれ０．１２５ｍＷ/ｃｍ２、０．０６３ ｍＷ/ｃｍ２、０．０３１ ｍＷ/ｃｍ２、０．０１６ｍＷ/ｃｍ２、と０．００９ ｍＷ/ｃｍ２（日本和光社製の光度計によって該当光照射の強度を測定する）であり、他の１つは暗中条件下で培養を行う。１８時間後ｍＣｈｅｒｒｙ表現レベルを測定する。その結果によれば、組換光感受性転写因子のｍＣｈｅｒｒｙ表現に対する調整制御は光の強さによるもので、光強さの徐々に強くなることに連れて、そのｍＣｈｅｒｒｙ表現に対する抑制効果も顕著に向上し続けることと発見した。それと同時に、たとえ非常に弱い光があっても組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０から優れる調整制御作用を演じさせることができると発見した（図２９を参照）。
【０２３７】
光感受性転写因子が空間においてターゲット遺伝子表現に対する調整を研究するため、ｍＣｈｅｒｒｙを報告遺伝子として、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、実施例７において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ報告プラスミドと、をＪＭ１０９(ＤＥ３,ｓｕｌＡ−，ＬｅｘＡ−)菌株に共に転換する。転換プレートから単クローンを選んで５ｍｌ新鮮な培地を含む試験管に入れて、光照射下で一夜培養を行い、翌日に４０００ ｒｐｍで遠心分離により菌類収集を行い、また２００μｌ新鮮な培地を用いて再懸濁して、そのＯＤ６００値を測定する。そして１％寒天、０．５％ペプトン、０．２５％酵母抽出粉と０．５％塩化ナトリウムを含む固体培地を調製し、高温高圧で滅菌して４５℃前後まで冷却させてから、上述再懸濁した菌類及びその対応する抵抗性を加えた後、固体培地における菌類の最初のＯＤ６００値が０．０３であることを確保し、平均にスロッシングして直径９０ｍｍの培養皿に入れる。培地が凝固になってから、図案「中止（Ｓｔｏｐ）」を例として、黒い背景に白い文字の形で「中止」図案を刷り出して、光度計で測定して黒い背景の光線透過率は透明位置より１／３０低くなることを発見する。適宜な大きさを有する印刷図案を培養皿の裏に貼り付ける。光照射で２４時間培養した後、Ｋｏｄａｋ社のＩｎ−Ｖｉｖｏイメージングシステムによって撮影（その励起波長が６００ｎｍ、発光波長６７０ｎｍである）し、４×４ビニングで、露光時間が３０秒である。ＬＶ−Ｌ０光照射後、ｍＣｈｅｒｒｙの表現量を降下させたため、その結果を見れば、左側は出願者が設計した図案で、右側において内縁の丸が細胞の蛍光画像であり、その細胞の蛍光画像は刷り出した図案とほぼ一致になり、これは我々が細胞を「撮影」することと見なされてもよく（図３０を参照）、上述は空間においてターゲット遺伝子表現を調整する非常によい応用案例である。
【０２３８】
実施例１３：光感受性転写因子の大腸菌移動能力に対する調整
光感受性転写因子が大腸菌細胞泳動能力に対する調整を測定することは、１種類の特殊な半固体培地において行われるものである。１％トリプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．２５％寒天を含む半固体培地を調製し、高温高圧で滅菌して５０℃以下まで冷却させてから、対応する抵抗性を加えた後均一に混合し、直径９０ｍｍの培養皿を利用プレートに転換し、各プレートに上述培地１０ｍｌを入れて、室温で１時間置かれて冷却を待つ。実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、実施例９において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ＣｈｅＺプラスミドと、をＪＭ１０９(ＤＥ３, ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−,ＣｈｅＺ−)菌株に共に転換する。転換プレートから単クローンを選んで試験管に入れて、暗中で一夜培養を行い、翌日に１：２００の比例で新鮮な培地に希釈して続けて暗中培養を行う。ＯＤ６００値が０．１〜０．２になった時、２μｌ菌液を吸い上げ上述転換される半固体培地を有するプレートに滴下し、３０℃において光照射で培養する。暗中条件の対照用サンプルはスズ箔によって包まれた後、同一の環境において培養を行う。４８時間後、Ｋｏｄａｋ社のＩｎ−Ｖｉｖｏイメージングシステムによってプレートを撮影する。その結果を見れば、暗中条件下で光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｃＩの表現に対する抑制作用が発生されないため、大量のｃＩはＣｈｅＺの表現を緊密に抑制でき、またＣｈｅＺを含まない細菌が位置移動も発生されなく、具体的に周辺に拡散するリングが形成しないように呈する。逆に、光照射条件下で、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｃＩの表現を抑制し、これによってＰλＯ１２プロモーターの活性化に影響されずにＣｈｅＺの表現が実現され、そうなると、細菌は位置移動を発生し、最初の細菌プラークから四周へ拡散するように呈する（図３１を参照）。
【０２３９】
実施例１４：光感受性転写因子での大腸菌融解に対する調整
光感受性転写因子での大腸菌融解に対する調整を研究するため、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、実施例９において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｃＩ−ＰλＯ１２−ＳＲＲｚプラスミドと、をＪＭ１０９(ＤＥ３, ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に共に転換する。転換したプレートから単クローンを選んで試験管に入れて、３０℃暗中で一夜培養を行い、翌日に１：１００の比例で新鮮な培地に希釈して続けて暗中培養を行う。ＯＤ６００値が０．４〜０．６になった時、１ｍＭイソプロピル-β−Ｄ−ガラクトピラ ノシド （ＩＰＴＧ）を加えて、暗中条件でゲノムにおけるＬａｃＺの表現を誘起する。１．５時間の誘起を経てから、サンプルを光照射条件に移してＳＲＲｚ遺伝子クラスターの表現を誘起し、６時間の培養を経てから４０００ｒｐｍで遠心を行い、それぞれ上澄み液と沈殿した菌体におけるＬａｃＺの活性化のデータを測定し、上澄み液におけるＬａｃＺの活性化は上澄み液と沈殿した菌体におけるＬａｃＺの総体活性化に占めるパーセンテージを算出する。対照として、暗中サンプルがいつまでも暗中条件に置かれるほか、その他の取り扱う方法は光照射条件下のサンプルと一致する。その結果から見れば、光照射条件下で、組換光感受性転写因子ＬＶ−Ｌ０はｃＩの表現を抑制できるため、ＰλＯ１２プロモーターの活性化が影響されないようにし、またＳＲＲｚ遺伝子クラスターのＳ、ＲとＲｚ遺伝子が高いレベルで表現されるため、７５％の細菌融解を達成させ、それによって細胞内部のβ-ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）が培地に釈放することができ、また暗中条件下でただ１０％のみの細菌が融解される。（図３２を参照）。
【０２４０】
実施例１５：該当原核細菌光誘起遺伝子表現システムを用いてＥｒｏｌスルフヒドリル酸化酵素を大量に表現する
細菌の繁殖が速くて、培養コストが低く、且つ人々に必要とされる外因性タンパク質を大量に表現できるため、我々が該当原核細菌光誘起遺伝子表現システムを用いてＥｒｏｌスルフヒドリル酸化酵素を大量に表現することを選択した。実施例９において構築したｐＢ−ｃｏｌＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰλＯ１２−Ｅｒｏ１プラスミドと、実施例３において構築したｐＡＬＶ−Ｌ０と、をＪＭ１０９(ＤＥ３, ｓｕｌＡ−,ＬｅｘＡ−)菌株に共に転換する。転換したプレートから単クローンを選んで５ｍｌ新鮮な培地を含む試験管に入れて一夜培養を行い、翌日に１００ｍｌの新鮮な培地を含むコニカルフラスコ中に移して３７℃で２級レベル培養を行う。ＯＤ６００値が０．８になった時、再度５００ｍｌ新鮮な培地を含むコニカルフラスコ（合わせて９個）中に移して２５℃で暗中培養を行う。
【０２４１】
ＯＤ６００値が０．６になった時、青光ＬＥＤにより光照射下で培養を行い、１８時間を経てから４０００ｒｐｍ遠心を菌類収集し、上澄み液を除去し、バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）Ａ（０．０２ Ｍりん酸ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、０．５ Ｍ塩化ナトリウム、そのｐＨが７．２）を用いて菌体を再懸濁する。再懸濁された菌体を超音波処理で砕け、その砕ける条件は、能率Ｐ＝４０％、１秒超の場合４秒で中止し、各循環が３００秒で合わせて５つの循環を行う。１００００ｒｐｍで４℃低温により３０ｍｉｎ遠心分離してから上澄み液を濾出する。
【０２４２】
ＧＥＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ (５ｍＬ) の事前用意したアフィニティーカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ）を用いて遠心分離された上澄み液に対してローディングバッファーを行い、ローディングバッファーのプロセスは、ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ使用→ぜん動ポンプで流速を１ ｍＬ/ｍｉｎに制御し、まず脱イオン水によりアフィニティーカラムにおけるエチルアルコール洗い出し→５０ｍｌバッファーＡでカラムバランスを取り→ローディングバッファー、超音波処理してから遠心して約１００ｍｌの上澄み液を得、流速は同様に１ｍｌ／ｍｉｎとする。
【０２４３】
タンパク質精製装置ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅによってグラジエント溶離を行い、溶離の主なステップは下記とおり（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）：
（１）まず１０ｍｌローディングバッファーＡにより溶離を行い、
（２）そして５０ｍｌの溶離液に徐々にバッファーＢ（０．０２ Ｍりん酸ナトリウム、５００ ｍＭイミダゾール、０．５ Ｍ塩化ナトリウム、そのｐＨが７．２）の含有量を加えて、つまり０％バッファー〜１００％バッファーＢになるように、
（３）２０ｍｌの１００％バッファーＢを用いてアフィニティーカラムにおけるすべてのタンパクを洗浄し、
（４）残った２０ｍｌの溶離液において、バッファーＢの含有量を徐々に低減させ、つまり１００％バッファー〜０％バッファーＢになるように、
（５）５０ｍｌ脱イオン水を用いてアフィニティーカラムを洗浄し、
（６）２０ｍｌの２０％エチルアルコールを用いてアフィニティーカラムを洗浄する。
【０２４４】
ＥｘＰＡＳｙというウエブサイトを検索してＥｒｏｌの等電点が４．８であると分かった。陰イオン交換カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行う。まずアフィニティカラムにより浄化されたＥｒｏ１タンパク溶液を取り、ＨｉｔｒａｐＴＭ ＱＦＦ５ ｍＬアフィニティーカラムを用いてイオン交換と浄化を行い、その実験のプロセスは、浄化されたＥｒｏ１タンパクを近接しクロマトグラフィーを行い→バッファーＡ（２０ｍ Ｍりん酸ナトリウム、１０ｍ Ｍ塩化ナトリウム、そのｐＨが７．２）を用いて１０希釈し→１ ｍＬ/ｍｉｎの流速でＨｉｔｒａｐＴＭ ＱＦＦ５ｍＬアフィニティーカラムに対してローディングバッファーを行い→５０ｍｌバッファーＡに対して雑質を洗浄→ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒタンパク質精製システムを用いてグラジエント溶離を行う。グラジエント溶離ステップは主に下記とおり（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）：
（１）まず１０ｍｌローディングバッファーＡにより溶離を行い、
（２）そして２５ｍｌの溶離液に徐々にバッファーＢ（２０ｍＭりん酸ナトリウム、５００Ｍ塩化ナトリウム、そのｐＨが７．２）の含有量を加えて、つまり０％バッファー〜１００％バッファーＢになるように、
（３）２０ｍｌの１００％バッファーＢを用いてアフィニティーカラムにおけるすべてのタンパクを洗浄し、
（４）残った２０ｍｌの溶離液において、バッファーＢの含有量を徐々に低減させ、つまり１００％バッファー〜０％バッファーＢになるように、
（５）５０ｍｌ脱イオン水を用いてアフィニティーカラムを洗浄し、
（６）２０ｍｌの２０％エチルアルコールを用いてアフィニティーカラムを洗浄する。
【０２４５】
ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒタンパク質精製システムを用いてアフィニティーカラムを溶離する結果は図３３に示される。部分の試験管を取って１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って浄化効果を鑑定し（図３４を参照）、そのうちいくつかの浄化効果のよい試験管を選択して合弁する。最終に合弁される液体に対して再度１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってタンパクの電気泳動純度を鑑定し、その結果から見て、得たＥｒｏｌのタンパク質の純度が高くて、９６％まで達した（図３５を参照）。またＢｒａｎｄｆｏｒｄ氏のタンパク質鑑定方法により鑑定を行って結局２５ｍｇのものを得た。
【０２４６】
理解すべきなのは、本明細書の実施例または実験材料と方法に表示される成分使用量、反応条件などの数字、または本明細書に使われるその他パラメータは特別な明記が無い限り、皆近似値であるため、実際に取得しょうとする結果に応じて変更することができる。且つそのようなパラメータは本発明の保護範囲を制限するものではなく、通常の操作技術により得た好適なもののみである。別途定義がない限り、本文に使用される専門用語と科学技術用語は同様に当業者が自明な意味を持っている。また、本文の記載内容と類似または均等的方法及び材料はすべて本発明において応用することができる。本明細書に説明された比較的に好適な実験方法と材料はサンプルのみとして例挙される。本明細書から提起されるすべての文献はすべて参考として全文の引用とする。またさらに理解すべきなのは、本発明の上記内容を見た後、当業者は本発明に対してさまざまな変更または修正することができ、またそれらの変更または修正は、同様すべて本発明の添付される請求項に限定する範囲内に属する。
【０２４７】
参考文献：
1.      Keyes, W.M. and A.A. Mills, Inducible systems see the light. Trends Biotechnol, 2003. 21(2): p. 53-5.
2.      Levskaya, A., et al., Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature, 2005. 438(7067): p. 441-2.
3.      Tabor, J.J., A. Levskaya, and C.A. Voigt, Multichromatic control of gene expression in Escherichia coli. J Mol Biol, 2011. 405(2): p. 315-24.
4.      Tabor, J.J., et al., A synthetic genetic edge detection program. Cell, 2009. 137(7): p. 1272-81.
5.      Moglich, A., R.A. Ayers, and K. Moffat, Design and signaling mechanism of light-regulated histidine kinases. J Mol Biol, 2009. 385(5): p. 1433-44.
6.      Ohlendorf, R., et al., From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. J Mol Biol, 2012. 416(4): p. 534-42.
7.      Wang, X., X. Chen, and Y. Yang, Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods, 2012.
8.      Yazawa, M., et al., Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol, 2009. 27(10): p. 941-5.
9.      Kennedy, M.J., et al., Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods, 2010. 7(12): p. 973-5.
10.     Pandey, R., et al., An extended model for the repression of photosynthesis genes by the AppA/PpsR system in Rhodobacter sphaeroides. FEBS J, 2012.
【０２４８】
11.     Ye, H., et al., A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science, 2011. 332(6037): p. 1565-8.
12.     Schnarr, M., et al., DNA binding properties of the LexA repressor. Biochimie, 1991. 73(4): p. 423-31.
13.     Little, J.W. and D.W. Mount, The SOS regulatory system of Escherichia coli. Cell, 1982. 29(1): p. 11-22.
14.     Burz, D.S., et al., Self-assembly of bacteriophage lambda cI repressor: effects of single-site mutations on the monomer-dimer equilibrium. Biochemistry, 1994. 33(28): p. 8399-405.
15.     Hu, J.C., et al., Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions.Science, 1990. 250(4986): p. 1400-3.
16.     Lewis, M., et al., Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science, 1996. 271(5253): p. 1247-54.
17.     Friedman, A.M., T.O. Fischmann, and T.A. Steitz, Crystal structure of lac repressor core tetramer and its implications for DNA looping.Science, 1995. 268(5218): p. 1721-7.
18.     Kraulis, P.J., et al., Structure of the DNA-binding domain of zinc GAL4. Nature, 1992. 356(6368): p. 448-50.
19.     Marmorstein, R., et al., DNA recognition by GAL4: structure of a protein-DNA complex. Nature, 1992. 356(6368): p. 408-14.
20.     Wissmann, A., et al., Amino acids determining operator binding specificity in the helix-turn-helix motif of Tn10 Tet repressor. EMBO J, 1991. 10(13): p. 4145-52.
【０２４９】
21.     Ramos, J.L., et al., The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(2): p. 326-56.
22.     Hong, M., et al., Structural basis for dimerization in DNA recognition by Gal4. Structure, 2008. 16(7): p. 1019-26.
23.     Zoltowski, B.D. and B.R. Crane, Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry, 2008. 47(27): p. 7012-9.
24.     Schwerdtfeger, C. and H. Linden, VIVID is a flavoprotein and serves as a fungal blue light photoreceptor for photoadaptation. EMBO J, 2003. 22(18): p. 4846-55.
25.     Peter, E., B. Dick, and S.A. Baeurle, Mechanism of signal transduction of the LOV2-Jalpha photosensor from Avena sativa.Nat Commun, 2010. 1: p. 122.
26.     Halavaty, A.S. and K. Moffat, N- and C-terminal flanking regions modulate light-induced signal transduction in the LOV2 domain of the blue light sensor phototropin 1 from Avena sativa. Biochemistry, 2007. 46(49): p. 14001-9.
27.     Takahashi, F., et al., AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(49): p. 19625-30.
28.     Dove, S.L. and A. Hochschild, Conversion of the omega subunit of Escherichia coli RNA polymerase into a transcriptional activator or an activation target. Genes Dev, 1998. 12(5): p. 745-54.
29.     Dove, S.L., J.K. Joung, and A. Hochschild, Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.Nature, 1997. 386(6625): p. 627-30.
【図１】
0006334527.tif 000013
【図２】
0006334527.tif 000014
【図３】
0006334527.tif 000015
【図４】
0006334527.tif 000016
【図５】
0006334527.tif 000017
【図６】
0006334527.tif 000018
【図７】
0006334527.tif 000019
【図８】
0006334527.tif 000020
【図９】
0006334527.tif 000021
【図１０】
0006334527.tif 000022
【図１１】
0006334527.tif 000023
【図１２】
0006334527.tif 000024
【図１３】
0006334527.tif 000025
【図１４】
0006334527.tif 000026
【図１５】
0006334527.tif 000027
【図１６】
0006334527.tif 000028
【図１７】
0006334527.tif 000029
【図１８】
0006334527.tif 000030
【図１９】
0006334527.tif 000031
【図２０】
0006334527.tif 000032
【図２１】
0006334527.tif 000033
【図２２】
0006334527.tif 000034
【図２３】
0006334527.tif 000035
【図２４】
0006334527.tif 000036
【図２５】
0006334527.tif 000037
【図２６】
0006334527.tif 000038
【図２７】
0006334527.tif 000039
【図２８】
0006334527.tif 000040
【図２９】
0006334527.tif 000041
【図３０】
0006334527.tif 000042
【図３１】
0006334527.tif 000043
【図３２】
0006334527.tif 000044
【図３３】
0006334527.tif 000045
【図３４】
0006334527.tif 000046
【図３５】
0006334527.tif 000047
【図３６】
0006334527.tif 000048
【配列表】
0006334527000001.app