(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、腫瘍細胞および／または免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量する工程と、
前記ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体における、前記腫瘍細胞および前記免疫細胞の距離または相互作用する免疫細胞同士の距離を測定する工程と、
を含むことを特徴とする、診断または治療のための情報取得方法。
【請求項２】
前記診断または治療のための情報が、がんまたは免疫系が関係する疾患に係るものである、請求項１に記載の情報取得方法。
【請求項３】
ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、腫瘍細胞および／または免疫細胞に存在するタンパク質を染色する工程と、
前記ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体における、前記腫瘍細胞および前記免疫細胞の距離または相互作用する免疫細胞同士の距離を測定する工程と、
を含むことを特徴とする、診断または治療のための情報取得方法。
【請求項４】
さらに、前記ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体中あるいはヒトまたはヒト以外の細胞外小胞体、リンパ節、血液または体液の検体中にある、核酸、サイトカインまたは膜小胞関連タンパク質を定量する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項５】
前記ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体中にある前記核酸として、腫瘍細胞における前記タンパク質または免疫細胞における前記タンパク質の発現量を調節する、免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡまたは腫瘍細胞に含まれるｍｉＲＮＡを定量する工程を含む、請求項４に記載の情報取得方法。
【請求項６】
さらに、免疫スコアおよび／またはマイクロサテライト不安定検査を測定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【請求項７】
前記工程を実施するために蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の情報取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にがんまたは免疫系が関係する疾患の、診断または治療のための情報取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）を始めとする免疫チェックポイント関連抗体薬が開発され、関連論文の発表や臨床試験が盛んに行われている。免疫チェックポイント機構は、がん細胞が発現するＰＤ−Ｌ１と、免疫細胞（活性キラーＴ細胞等）が発現するＰＤ−１との相互作用、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路を介する機構であり、腫瘍周辺の微小環境においてがんの免疫逃避機構として作用していることが示されている。この知見に基づき、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路を阻害するため、抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の開発が進められていたところである。【０００３】
これは、抗がん剤開発の歴史において非常に画期的な出来事であると、多くの抗がん剤開発者が認識しており、分子標的薬の３極の１角を成すまでに成長している。近年、がん関連タンパク質をコードするがん関連遺伝子を３つに大別して、遺伝子パネルによる発現解析をする企業が多く現れており、たとえばがん関連遺伝子をＰａｔｈｗａｙ（パスウェイ系）遺伝子パネル、Ｉｍｍｕｎｅ（免疫系）遺伝子パネル、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ（転移系）遺伝子パネルという３つに分け、それぞれの遺伝子の発現解析を提供しているｎＣｏｕｎｔｅｒというサービスも現れている。ｎＣｏｕｎｔｅｒが提供するがん関連遺伝子発現パネルには、Ｐａｔｈｗａｙ遺伝子パネル、Ｉｍｍｕｎｅ遺伝子パネル、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ遺伝子パネルのそれぞれについて７７０の遺伝子をカバーしている。Ｉｍｍｕｎｅ遺伝子、Ｐａｔｈｗａｙ遺伝子およびＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ遺伝子の転写から生成するタンパク質は、それぞれ「がん細胞における免疫系タンパク質」、「がん細胞におけるパスウェイ系タンパク質」、「がん細胞における転移系タンパク質」として定義することができる。こさらにこれらの遺伝子には当然、変異遺伝子が存在するので、それに対応する変異タンパク質が存在しており、これらの遺伝子の変異遺伝子に対応する変異タンパク質も、免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に含むことができる。例えば、2016年にはＰＤＬ１変異タンパク質についての最初の報告が成されており（Nature. 2016 Jun 16;534(7607):402-6）、今後も有用ながん関連たんぱく質やその変異体の数が増えることが期待されている。【０００４】
このような遺伝子の解析結果を、抗がん剤開発の指標やエビデンスとして利用することにより、新たな免疫チェックポイント関連抗体薬を患者の下に届けようとする努力が続けられており、また既存の免疫チェックポイント関連抗体薬の効果を向上させるために、たとえば別領域のパスウェイ関連抗体薬を併用する療法についての臨床試験も進行している。【０００５】
上記ニボルマブは、これまでの免疫治療と異なり、奏効率が高く効果が長続きすることが特徴として挙げられる。これまでに手術切除困難で転移を認めるメラノーマ患者において奏功したことで、ＦＤＡで承認を受け、現在治療法として認定されている。さらに近年、非小胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の患者においても、上記抗体薬の効果が認められることが分かってきており、盛んに研究、治験が行われている。【０００６】
このような背景の元で、製薬会社はＰＤ−１抗体薬の投与基準として、ＰＤ−１タンパク質のリガンドであるＰＤ−Ｌ１タンパク質を対象としたコンパニオン診断薬の開発を進めており、メラノーマ患者のように末期に近い患者だけでなく、さらに適用を広げるよう様々な治験が進められている。その一方で、各社が用いる抗体が異なっていること、がん細胞に発現したＰＤ−Ｌ１をみるのか、浸潤リンパ球に発現したＰＤ−１をみるのかといった発現位置の対象が異なっていること、さらには従来の酵素法に基づく免疫染色法（ＤＡＢ法）では、発現率による評価が行われており、カットオフ値を何％に設定するのかといったことが診断薬の課題として挙げられ、様々な議論がなされている。【０００７】
さらに、免疫の機構は非常に複雑であり、ＰＤ−Ｌ１の発現量を評価しても、その他のＴ細胞等の情報を得ないことには、薬効との相関が得られないのではないかと考えられる。【０００８】
また近年では免疫細胞およびがん細胞におけるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の研究報告が多くなってきており、それら核酸の情報を取得することによっても有用な情報が得られてくることが期待される。たとえば、免疫細胞においてｍｉＲ−４７１７はＰＤ−１のＵＴＲ（非転写領域）に相互作用して翻訳を阻害することで、ＰＤ−１の発現を抑制することが報告されている（Oncotarget. 2015 Aug 7;6(22):18933-44）。【０００９】
ところで、近年ではタンパク質および／または核酸を標識するために、ナノサイズの蛍光粒子、例えば蛍光色素や量子ドットなどの蛍光体を樹脂等を母体として集積させた粒子（蛍光体集積粒子、Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）を用いる方法が提案され、実用化が進められている。蛍光体集積粒子を用いて目的とするタンパク質および／または核酸を標識し、蛍光物質に適合する励起光を照射すると、蛍光体集積粒子はタンパク質および／または核酸の分子数および位置を高い精度で示し、またそれらを輝度の高い輝点として観察することが可能であり、また褪色しにくいため比較的長時間にわたって観察や撮像が可能となる。例えば、国際公開ＷＯ２０１２／０２９７５２号パンフレット（特許文献１）、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット（特許文献２）などには、蛍光体集積粒子を用いて目的とするタンパク質の免疫染色を行う方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２／０２９７５２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】N Engl J Med. 2012 June 28; 366(26): 2443-2454
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、主にがんまたは免疫系が関係する疾患の、診断または治療のために利用することのできる、有用な情報を取得する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、ヒトまたはヒト以外の腫瘍（がん）組織由来の検体を使用して、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質の発現量、および／またはヒトまたはヒト以外の免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量すること、好ましくは蛍光体集積粒子のような蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色法により定量し、例えば目的とするタンパク質の細胞あたりの平均発現量や、タンパク質の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数（頻度）によって表されるヒストグラムなどから分かる情報を利用することで、上述したような有用な情報を取得することができることを見出すに至った。また、上記腫瘍細胞と上記免疫細胞の距離、または相互作用する免疫細胞同士の距離を測定したり、上記ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体中あるいはヒトまたはヒト以外の細胞外小胞体、リンパ節、血液または体液の検体中にある、核酸、サイトカインまたは膜小胞関連タンパク質を定量したりすることによって、さらに有用な情報を取得することができることも見出した。【００１４】
すなわち、本発明は一つの側面において、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質の発現量を定量する工程、好ましくはさらに、例えば当該がん関連タンパク質の発現量を調節する、免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡの発現量を定量する工程を含むことを特徴とする、診断または治療のための情報の取得方法を提供する。本発明はもう一つの側面において、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量する工程、好ましくはさらに、例えば当該タンパク質の発現量を調節する、腫瘍細胞に含まれるｍｉＲＮＡの発現量を定量する工程を含むことを特徴とする、診断または治療のための情報の取得方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、所定の種類の細胞における所定の種類のタンパク質の発現量、好ましくはさらに所定の種類のｍｉＲＮＡの発現量を、蛍光体集積粒子等を用いて高い精度で定量するため、ＤＡＢのような発現率（特定の種類の細胞のうち、特定のタンパク質の発現が認められる細胞の割合）で評価する手法では分からなかった、がんまたは免疫系が関係する疾患の、診断または治療のための有用な情報を取得できるようになる。さらに、上記以外の情報（因子）を組み合わせることで、より詳細に患者の層別化が可能となり、様々な投薬基準を与えることが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明による、がんまたは免疫系が関係する疾患の診断または治療のための情報の取得方法（本明細書において、単に「本発明の情報取得方法」と称することがある。）は、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質の発現量を定量する工程、および免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量する工程の、少なくとも一方、好ましくは両方を含む。上記の腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質および免疫細胞におけるタンパク質を、本明細書において「目的タンパク質」と称することがある。
【００１７】
本発明の情報取得方法の好ましい実施形態においては、さらに、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体を使用して、目的タンパク質（腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質または免疫細胞におけるタンパク質）の発現量を調節する、免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡまたは腫瘍細胞に含まれるｍｉＲＮＡを定量する工程の、少なくとも一方、好ましくは両方を含む。上記の免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡまたは腫瘍細胞に含まれるｍｉＲＮＡ、あるいは目的に応じて選択されるその他の核酸を、本明細書において「目的核酸」と称することがある。
【００１８】
「がんまたは免疫系が関係する疾患」の種類や、「診断または治療のための情報」の内容は特に限定されるものではない。がん（腫瘍）細胞または免疫細胞に発現するタンパク質や核酸の定量によって、例えば、その疾患に罹患しているかどうか、疾患の進行（がんのステージ等）がどの程度であるか、といった診断に関する情報や、ある薬剤（特に分子標的薬）がその疾患に対してどの程度有効であるか、といった治療に関する情報が得られるものであれば、本発明の対象とする疾患となる。本発明において、例えば腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質の発現量を定量する場合は、主に腫瘍を対象とする実施形態となるが、免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量する場合は、腫瘍のみならず、その他の免疫系が関係する疾患も対象とする実施形態となる。
【００１９】
「腫瘍組織」は、ヒト（がん患者）の腫瘍由来であってもよいし、またヒト以外の動物の腫瘍由来であってもよい。
【００２０】
「腫瘍組織由来の検体」とは、腫瘍組織から採取される検体などの病変部や、採取された検体に含まれる腫瘍細胞を培養した細胞などであって、一般的には、免疫染色法により目的タンパク質の発現量を評価する場合などで慣用されているように、所定の手順に従って作製された標本スライドの形態をとる。
【００２１】
「腫瘍組織由来の検体」としては、実験動物の腫瘍組織由来の検体を用いることもできる。本明細書における「実験動物」は、一般的に担腫瘍動物と呼ばれているものであり、例えばマウスであれば、大きく自然誘発腫瘍マウス、培養がん細胞移植マウス、患者腫瘍組織移植マウスの3つに分類できる（下記表参照；Kohrt et al., Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology 00: 1-9, 2016）。
【００２２】
【表Ａ】
0006443581.tif 000002
【００２３】
「実験動物」はヒト（がん患者）から採取した腫瘍（がん）組織または腫瘍（がん）細胞、あるいは培養細胞株として確立されたヒト由来の腫瘍細胞が移植された第０世代の実験動物、およびそのような第０世代に移植された腫瘍組織または腫瘍細胞を起源とする、第ｎ−１世代の実験動物の体内で生長した腫瘍組織または増殖した腫瘍細胞が移植された第ｎ世代（ｎ≧１）の実験動物を包含する。このような実験動物は公知の手法を用いて作製することができる。
【００２４】
自然誘発腫瘍マウスとしては、発癌化合物を移植する古典的なモデルのほか、Genetic-engineered mouse modelやHuman KI mice（どちらも遺伝子ノックインしたマウスである）が挙げられる。培養がん細胞移植マウスとしては、Syngeneic murine model、CDX(Cell-line derived xenograft)モデルマウスなどが挙げられる。患者腫瘍組織移植モデルとしては、PDX（Patient derived xenograft）モデルマウスのほか、Immuno-avatarモデルマウス、造血リンパ系ヒト化（Hemato-lymphoid humanized）モデルマウス、Immune-PDXモデルマウスなどが挙げられる。このような様々な担腫瘍モデルマウスを作製することが可能であり、作製済みの担腫瘍モデルマウスを購入できる環境も整っている。一方、患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞を移植した担腫瘍モデルマウスは、より古典的であり作製が容易である。
【００２５】
（腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質）
「がん関連タンパク質」としては、代表的には「がん細胞における免疫系タンパク質」、「がん細胞におけるパスウェイ系タンパク質」、「がん細胞における転移系タンパク質」が挙げられる。それぞれに分類されるがん関連タンパク質には様々なものが知られており、診断または治療の目的に応じて適切なものを選択することができ、特に限定されるものではない。なお、ｎＣｏｕｎｔｅｒが提供するがん関連遺伝子発現パネルには、免疫系（Ｉｍｍｕｎｅ）遺伝子パネル、パスウェイ系（Ｐａｔｈｗａｙ）遺伝子パネル、転移系（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）遺伝子パネルのそれぞれについて７７０の遺伝子がカバーされており、それらの遺伝子がコードしているタンパク質は、それぞれがん細胞における免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に該当する。
【００２６】
「がん細胞における免疫系タンパク質」としては、例えば、免疫チェックポイントタンパク質であるＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲ−Ｌ、，４−１８８−Ｌ、ＣＸ４Ｄ−Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ８５、ＭＨＣ−ＩＩ、ＰＤＬ２、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４８、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４−１８８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ２４４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３などが挙げられる。
【００２７】
「がん細胞におけるパスウェイ系タンパク質」としては、例えば、がん細胞増殖因子あるいはがん細胞増殖因子受容体であるＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＨＧＦＲ、細胞表面抗原、血管増殖因子あるいは血管増殖因子受容体であるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２、インターフェロン、インターロイキン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦなどが挙げられる。
【００２８】
「がん細胞における転移系タンパク質」としては、例えば、ＡＣＴＧ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＰＣ、ＢＲＭＳ１、ＣＡＤＭ１、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＣＣＬ５、ＣＤ８２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ４、ＣＮＮ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＲ２、ＹＢＢ、ＤＣＣ、ＤＥＮＲ、ＤＬＣ１、ＥＧＬＮ２、ＥＧＬＮ３、ＥＩＦ４Ｅ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＴＶ４、ＦＧＦＲ４、ＧＳＮ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＨＫＤＣ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＵＮＫＩＬ１１、ＫＤＭ１Ａ、ＫＩＳＳ１、ＬＤＨＡ、ＬＩＦＲ、ＭＥＤ２３、ＭＥＴ、ＭＧＡＴ５、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＴ３、ＭＴＡ１、ＭＴＢＰ、ＭＴＯＲ、ＭＹＣＬ、ＭＹＨ１１、ＮＤＲＧ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ１、ＮＭＥ１、ＮＭＥ４、ＮＯＳ２、ＮＲ４Ａ３、ＰＤＫ１、ＰＥＢＰ４、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＦＢ４、ＰＧＫ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＴＧ１、ＲＢ１、ＲＯＲＢ、ＳＥＴ、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＮＲＰＦ、ＳＳＴＲ２、ＴＣＥＢ１、ＴＣＥＢ２、ＴＣＦ２０、ＴＦ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＰ５３、ＴＳＨＲ、ＭＭＰ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１０、ＨＩＦ１などが挙げられる。
【００２９】
（免疫細胞におけるタンパク質）
「免疫細胞におけるタンパク質」としては、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ５７、ＣＤ２２６、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（ＣＤ２７５）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＬＡＧ-３（ＣＤ２２３）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＧＩＴＲＬ、ガレクチン−９（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＰＤ−Ｌ２、ＫＬＲＧ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｒ−ＣａｄｈｅｒｉｎおよびＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＤＡＣ、ＣＸＣＲ４、ＦＬＴ−３、ＴＩＧＩＴが挙げられる。
【００３０】
腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質や核酸の発現量の定量、および／または免疫細胞におけるタンパク質や核酸の発現量の定量により得られる情報としては、例えば、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織に由来する検体（標本スライド）における、（ｉ）目的タンパク質、好ましくはさらに目的核酸の細胞あたりの平均発現量、（ｉｉ）目的タンパク質、好ましくはさらに目的核酸の組織の単位面積あたりの発現量、（ｉｉｉ）目的タンパク質、好ましくはさらに目的核酸の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラム、（ｉｖ）目的タンパク質、好ましくはさらに目的核酸の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表される曲線、などに関する情報が挙げられる。これらの情報は、いずれか一つだけでなく、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
（ｉ）目的タンパク質の細胞あたりの平均発現量を定量する場合、例えば、検体（標本スライド）を蛍光ナノ粒子により免疫染色すると共に、形態観察用染色剤（例えばエオジン）によって細胞の形状が特定できるように染色する。蛍光ナノ粒子に対応する所定の波長を有する励起光を照射しながら行われる、暗視野における観察および撮像により、目的タンパク質を標識した蛍光ナノ粒子が輝点として表れている画像を取得する。一方で、明視野における観察および撮像により、細胞の形状を表すように染色されている画像を取得する。これらの２枚の画像を、画像処理により重ねあわせると、画像全体に含まれる、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質を表す輝点数を計測することができる。目的タンパク質の発現量として、輝点数をその指標値として用いてもよい。また、複数の蛍光ナノ粒子が１つの輝点を形成している場合もあるので、ある１つの輝点の明るさ（輝度、蛍光強度）を、別途測定しておいた蛍光ナノ粒子１つあたりの明るさで割ることにより、その輝点に含まれる蛍光ナノ粒子の数を算出することができ、その粒子数を目的タンパク質の発現量の指標値として用いてもよい。画像に含まれる全ての細胞について輝点数または粒子数を求めることにより、細胞当たりの平均発現量を定量することが可能である。
【００３２】
（ｉ）において、免疫染色にかえて核酸染色を行なうことにより、目的核酸の細胞あたりの平均発現量を定量することができる。
【００３３】
（ｉｉ）目的タンパク質または目的核酸の組織の単位面積あたりの発現量を求める場合、（ｉ）と同様にして求めた輝点数または粒子数の、画像中の特定の領域にある組織に含まれる細胞についての総和を求めた後、その組織の面積で割るようにすればよい。
【００３４】
（ｉｉｉ）目的タンパク質または目的核酸の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムを作成する場合、まず、（ｉ）と同様にして、画像全体に含まれる、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質または目的核酸を表す輝点数または粒子数を求める。そして、横軸に細胞あたりの目的タンパク質の発現量を所定の数ごとに区切ってとり（例えば、本明細書に記載した実施例で行っているように、１〜３００個までを２０個ごとに分けて、０個区分を含めた１６の範囲に区切り）、それぞれの区切りに対応する細胞数（頻度）を計測して縦軸にとることにより、ヒストグラムを作成することができる。
【００３５】
（ｉｖ）目的タンパク質または目的核酸の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表される曲線を作成する場合、まず、（ｉ）と同様にして、画像全体に含まれる、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質または目的核酸を表す輝点数または粒子数を求める。そして、細胞あたりの目的タンパク質または目的核酸の発現量を連続的に（ヒストグラムのように区切らずに）横軸にとり、それぞれの発現量に対応する細胞数（頻度）を計測して縦軸にとることにより、曲線を作成することができる。
【００３６】
上記（ｉｉｉ）のヒストグラムおよび（ｉｖ）の曲線からは、分布（ヒストグラムまたは曲線の形状、ピークの数）がどのようになっているか、平均値または中央値、分散（ＣＶ）がどのような値か、また特にヒストグラムの場合、細胞あたりの輝点数または粒子数が最大の区切りがどの程度の細胞数（頻度）になっているか、などの情報を得ることができる。そのような情報と、薬効や安定性などの試験結果と照らし合わせることにより、例えば、薬効や安定性などがどのような情報と最も関連しているか、換言すれば薬効や安定性などを予測する際にはどのような情報に基づくのが最も妥当か、といったことを分析し、把握することができる。
【００３７】
「定量する」とは、目的とするタンパク質または核酸の発現量などを、「定性的」ではなく「定量的」な手法を用いて特定することをいう。
「定性的」な手法とは、タンパク質または核酸の発現量や発現細胞数等と相関しているものの、それらの数またはそれと密接に関連する指標値を直接的に取り扱うのではなく、所定の範囲内にある数または指標値をまとめて一つのスコアで表し、そのようなスコアは数個程度、例えば２〜５個程度であり、典型的には観察者の主観的・経験的な要素に依拠する手法をいう。例えば、乳がん細胞等の細胞膜に発現するＨＥＲ２タンパク質を対象とし、ＤＡＢ染色を用いるＩＨＣ法であって、がん細胞の膜における染色性およびその染色強度（染色パターン）に基づいて、３＋（強く完全な細胞膜の陽性染色があるがん細胞＞３０％である場合：陽性）、２＋（弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色があるがん細胞≧１０％、または強い完全な細胞膜の陽性染色があるがん細胞≧１０％〜≦３０％である場合：equivocal）、１＋（ほとんど識別できないほどかすかな細胞膜の染色があるがん細胞≧１０％で、がん細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている場合：陰性）および０（細胞膜に陽性染色がない、あるいは細胞膜の陽性染色があるがん細胞＞１０％である場合（細胞膜に限局する陽性染色は判定対象外）：陰性）のように４段階のスコアで評価する方法（「HER2検査ガイド第三版」，トラスツズマブ病理部会作成，2009年9月より）は「定性的」な手法に該当する。また、非特許文献１（20527ページ、Figure 3）で用いられている、ＩＨＣ法による染色像に基づいてタンパク質の発現量を４段階のスコアで表す手法も「定性的」な手法に該当する。
【００３８】
一方、「定量的」な手法とは、タンパク質または核酸の発現量や発現細胞数またはそれらと密接に関連する指標値を直接的に取り扱い、典型的には装置を用いた客観的な測定結果に依拠する手法をいう。代表的には、蛍光ナノ粒子、すなわち、量子ドット（集積化していないもの）、または蛍光色素や量子ドットなどの蛍光体を樹脂等を母体として集積させた粒子（蛍光体集積粒子、Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）のように、直径がナノサイズの粒子を用いて、目的タンパク質や核酸等を標識し、定量する手法が用いられる。中でも、本明細書において後述する、また実施例でも採用されている、蛍光体集積粒子を用いて行われる定量方法（本明細書において「ＰＩＤ法」と称することがある。）は、本発明で用いる「定量的」な手法として特に好適である。しかしながら、本発明において用いることのできる「定量的」な手法はＰＩＤ法などの蛍光ナノ粒子を用いる手法に限定されるものではなく、それと同程度の精度を有するその他の手法であってもよい。
【００３９】
ＰＩＤ法の基本的な実施形態は、国際公開ＷＯ２０１２／０２９７５２号パンフレット（特許文献１）、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット（特許文献２）、またはその他の特許文献または非特許文献により公知である。本発明でも、例えば標本スライドを用いて病理診断を行う場合に準じた実施形態で、ＰＩＤ法を実施することができる。
【００４０】
なお、「ヒストグラム」は、細胞あたりの目的タンパク質または核酸の発現量を所定の数ごとに区切り、それぞれの区切りに対応する細胞数（頻度）をもって表されているが、もともとはタンパク質または核酸の発現量（輝点数または粒子数）および発現細胞数を計測し、それらの数を直接的に取り扱った上で、グラフ化されたものであるから、ヒストグラムは「定性的」ではなく「定量的」な手法を用いて得られる情報に分類される。
【００４１】
本発明の情報取得方法は、好ましい実施形態の一例において、上述したような２つの工程以外にも、（ａ）ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体における、腫瘍細胞および免疫細胞の距離を測定する工程；（ａ’）ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体における、相互作用する免疫細胞同士の距離を測定する工程；（ｂ）ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体中あるいはヒトの細胞外小胞体、リンパ節、血液または体液（唾液等）の検体中にある、核酸たとえばＤＮＡやＲＮＡ関連物質（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇＲＮＡなど）、サイトカイン、または膜小胞関連タンパク質を定量する工程；（ｃ）免疫スコアおよび／またはマイクロサテライト不安定検査を測定する工程；からなる群から選ばれる１つ以上の工程を含む。これらの工程を、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いて行うことも、本発明の好ましい実施形態の一例である。
【００４２】
（ａ）のように、腫瘍細胞および免疫細胞の距離を測定することにより、腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用が実際にどの程度起きているのかを評価することができる。例えば、後述するような画像処理において測定することのできる、腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質（ＰＤ−Ｌ１等）に結合した蛍光標識（ＰＩＤの輝点等）と、免疫細胞に特異的に発現するタンパク質（ＣＤ８等）に結合した蛍光標識との距離を、それらの細胞間の距離とみなすことができる。この工程を実施する場合、同一の検体（組織切片等）に対して、前者の蛍光標識のための免疫染色処理および後者の蛍光標識のための免疫染色処理を行えばよく（二重免疫染色）、互いを区別するために異なる波長の蛍光を発する蛍光標識を用いることが適切である。
【００４３】
（ａ）のように、腫瘍細胞及び免疫細胞の距離を測定するにあたっては、腫瘍細胞および／または免疫細胞に特異的に発現するタンパク質の代わりに腫瘍細胞および／または免疫細胞に特異的に発現する核酸に結合した蛍光標識の輝点を用いてもよい。
【００４４】
（ａ）において、腫瘍細胞、および／または免疫細胞に特異的に発現するタンパク質を用いる代わりに、相互作用する免疫細胞同士、例えばＴ細胞および樹状細胞のような２種類の免疫細胞のそれぞれに特異的に発現するタンパク質および／または核酸を用いることで、（ａ’）のようにそれらの免疫細胞同士の距離を測定することができ、それぞれの細胞の相互作用が実際にどの程度起きているのかを評価することができる。
【００４５】
（ｂ）について、検体中の核酸、たとえばＲＮＡ関連物質の例としては、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ１９７、ｍｉＲ２００、ｍｉＲ５１３、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１４３、ｅｘｏｓｏｍａｌ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−２７ｂ）、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１２２などのｍｉＲＮＡが挙げられ；サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−βが挙げられ；膜小胞関連タンパク質の例としては、ＨＳＰ、ＧＡＰＤＨ、ケラチン、チューブリン、アクチン、ビメンチン、フィブリン、フィブロネクチン、アネキシン、フロチリン、ガレクチン、α−エノラーゼが挙げられる。
【００４６】
（ｂ）の定量の対象とする核酸（遺伝子）またはタンパク質（サイトカイン、膜小胞関連タンパク質）は、腫瘍組織内または腫瘍細胞近傍、つまり腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質の発現量および／または免疫細胞におけるタンパク質の発現量を定量するためのヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体（組織切片を載置した標本スライドなど）に、腫瘍細胞および／または免疫細胞と一緒に存在するものであってもよいし、腫瘍細胞および／または免疫細胞とは別に、細胞外小胞体、リンパ節、血液、体液等の検体中に存在するものであってもよい。
【００４７】
本発明における（ｂ）の好ましい実施形態の一例として、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体中にある、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質または免疫細胞におけるタンパク質の発現量を調節する、免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡまたは腫瘍細胞に含まれるｍｉＲＮＡを目的核酸とする実施形態が挙げられる。ｍｉＲＮＡは近年、様々なタンパク質の発現量の調節に関与していることが知られつつある。例えば、腫瘍細胞に含まれる特定のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ４７１７等）は、それと相互作用する免疫細胞で発現する特定のタンパク質の、ｍＲＮＡの非転写領域（ＵＴＲ）に結合し、当該タンパク質の発現を抑制することがある。逆に、免疫細胞に含まれるｍｉＲＮＡが、それと相互作用する腫瘍細胞で発現するがん関連タンパク質の発現を抑制することもある。そのような特定のｍｉＲＮＡが細胞に多く含まれている場合や、特定のｍｉＲＮＡを含む細胞と、それと相互作用する細胞との距離が近い場合は、特定のタンパク質の発現量は抑制されやすいと推測することが可能である。したがって、免疫細胞に含まれる特定のｍｉＲＮＡまたは腫瘍細胞に含まれる特定のｍｉＲＮＡの定量は、それ単独でおこなってもある程度有用な情報を取得することができるが、それぞれ腫瘍細胞における特定のがん関連タンパク質または免疫細胞における特定のタンパク質の発現量の定量と組み合わせて行うことで、より有用な診断または治療のための情報を取得することができるようになる。
【００４８】
（ｂ）のタンパク質が標本スライド上にある場合は、適切な１次抗体などを用いることによって、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質および／または免疫細胞におけるタンパク質と同様の免疫染色法によって定量することができ、血液等の液状の検体中にある場合も、そのような場合に適した公知の手法に従って定量することができる。一方、（ｂ）の核酸も、適切なプローブなどを用いることによって、標本スライド上にある場合はＦＩＳＨ法に準じた手法で定量することができ、血液等の液状の検体中にある場合も、そのような場合に適した公知の手法に従って定量することができる。また、それらのタンパク質および核酸を蛍光標識して定量する場合も、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質や核酸の発現量および／または免疫細胞におけるタンパク質や核酸と同様に、蛍光ナノ粒子を用いることができ、特に蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いることが好ましい。
【００４９】
（ｃ）について、免疫スコアとは、各種免疫パラメータの測定値の組み合わせから、さまざまな疾患に対する免疫力を割り出す手法であり、一般的には個々人の免疫力を測定値の組み合わせから割り出したスコアである。免疫パラメータとしては、Ｔ細胞数、ＣＤ４＋/ＣＤ８＋ Ｔ細胞比、ナイーブＴ細胞数、ナイーブ/メモリーＴ細胞数比、ＣＤ８＋/ＣＤ２８＋ Ｔ細胞比、Ｂ細胞数、ＮＫ細胞数、Ｔ細胞増殖係数などがあげられる。また、マイクロサテライト不安定検査（ＭＳＩ検査）とは、遺伝性大腸がんのひとつである「リンチ症候群（Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer: 遺伝性非ポリポーシス性大腸がん: HNPCC）」の補助診断として行われる検査であり、平成１８年度の診療報酬改定で「悪性腫瘍遺伝子検査」として保険請求が可能となっている。ＤＮＡの複製の際に生じる塩基配列の間違いを修復する機能の低下により、マイクロサテライト反復配列が腫瘍組織において非腫瘍（正常）組織と異なる反復回数を示す現象の頻度をＰＣＲ法などで測定する検査である。免疫スコアおよびマイクロサテライト不安定検査は定型試験であり、公知の手法に従って行うことができるが、蛍光ナノ粒子、好ましくは蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いても、輝点計測による定量化手法によって実施は可能である。
以下、検体中の目的生体物質を定量するための手法、代表的には蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色法について、さらに詳細に説明する。
【００５０】
＜抗体＞
一次抗体には、前述したような目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＰＤ−Ｌ１（発現タンパク質）を目的生体物質とする場合は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＣＤ８を目的生体物質とする場合は抗ＣＤ８抗体を用いることができる。
【００５１】
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
【００５２】
一次抗体は、特定の生体物質（抗原）を特異的に認識して結合する能力を有するものであれば、天然の全長の抗体でなく、抗体断片または誘導体であってもよい。すなわち、本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)'2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片およびキメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体などの誘導体が包含される。
【００５３】
＜蛍光ナノ粒子＞
本発明において用いられる蛍光ナノ粒子としては、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発することができる「蛍光体集積粒子」（ＰＩＤ）が好ましい。
【００５４】
なお、本明細書における「蛍光体」は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する、つまり「蛍光」を発する物質であって、二次抗体と直接的、あるいは間接的に結合させることのできる物質を指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。
【００５５】
＜蛍光体集積粒子＞
本発明における蛍光体集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体（たとえば蛍光色素）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。この場合、母体（たとえば樹脂）と蛍光物質は、互いに反対の電荷を有する置換基ないし部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
【００５６】
蛍光体集積粒子を形作る母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができ、無機物としてはシリカ、ガラスなどを例示することができる。
【００５７】
・半導体集積ナノ粒子
半導体集積ナノ粒子とは、蛍光体としての半導体ナノ粒子が、上記に記載した母体の中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する。半導体ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、たとえば、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、またはＩＶ族元素を含有するもの、たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。また、半導体が母体に内包されている場合、母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
【００５８】
・蛍光色素集積ナノ粒子
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記に記載した母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。また、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。
＜蛍光体集積粒子＞
【００５９】
蛍光体集積粒子（他の文献において「蛍光物質集積ナノ粒子」と呼ばれることもある。）は、公知の方法（たとえば特開２０１３−５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。
【００６０】
より具体的には、たとえば、シリカを母体とし、その中に蛍光物質が内包されている蛍光物質内包シリカ粒子は、無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質と、テトラエトキシシランのようなシリカ前駆体とが溶解している溶液を、エタノールおよびアンモニアが溶解している溶液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。
【００６１】
一方、樹脂を母体とし、蛍光物質を樹脂粒子の表面に吸着させるか、樹脂粒子中に内包させるかした蛍光物質集積樹脂粒子は、それらの樹脂の溶液ないし微粒子の分散液を先に用意しておき、そこに無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光物質を添加して撹拌することにより作製することができる。あるいは、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を進行させることにより、蛍光物質集積樹脂粒子を作製することもできる。たとえば、母体となる樹脂としてメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー、たとえばメラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミン）と、有機蛍光色素と、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤（酸など）とを含有する反応混合物を加熱し、乳化重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素集積樹脂粒子を作製することができる。また、母体となる樹脂としてスチレン系共重合体のような熱可塑性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料と、有機蛍光色素と（樹脂の原料モノマーとして、あらかじめ有機蛍光色素を共有結合などで結合させたモノマーを用いるようにしてもよい）、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）を含有する反応混合物を加熱し、ラジカル重合法またはイオン重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素集積樹脂粒子を作製することができる。
【００６２】
蛍光体集積粒子に集積させる蛍光物質としては、上述したような半導体ナノ粒子、蛍光色素のほか、たとえば、Ｙ2Ｏ3、Ｚｎ2ＳｉＯ4等を母体とし、Ｍｎ2+，Ｅｕ3+等を賦活剤とする「長残光蛍光体」を挙げることができる。
【００６３】
蛍光体集積粒子（特に上記のような製造方法によって得られる蛍光色素を集積した樹脂粒子）の平均粒径は、病理標本の免疫染色（または核酸染色）に適した粒径であれば特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、通常は１０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数は、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。このような条件を満たす蛍光体集積粒子は、製造条件を調整することにより製造することができる。たとえば、乳化重合法により蛍光体集積粒子を作製する場合は、添加する界面活性剤の量によって粒径を調節することができ、一般的に、蛍光体集積粒子の母体原料の量に対する界面活性剤の量が相対的に多ければ粒径は小さくなり、その量が相対的に少なければ粒径は大きくなる傾向にある。
【００６４】
なお、蛍光体集積粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影して蛍光体集積粒子の断面積を計測し、その断面形状を円と仮定したときに、その断面積に相当する円の直径として算出することができる。複数の蛍光体集積粒子からなる集団の平均粒径および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光体集積粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
【００６５】
＜免疫染色剤の構成＞
目的生体物質を蛍光標識するための免疫染色剤に含まれる蛍光ナノ粒子としては、前述したように「蛍光体集積粒子」が好ましい。免疫染色剤は、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光体が間接的に、つまり抗原抗体反応やアビジン・ビオチン反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。
【００６６】
プローブおよび蛍光ナノ粒子が間接的に連結される免疫染色剤の一例として、［目的生体物質に対す一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］〜［蛍光ナノ粒子（蛍光体集積粒子）］が挙げられる。ここで、"…"は抗原抗体反応により結合していることを表し、"〜"が示す結合の態様としては特に限定されず、例えば、共有結合，イオン結合，水素結合，配位結合，物理吸着または化学吸着等が挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。例えば、無機物と有機物とを結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基，アミノ基，エポキシ基，アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン，グリシドキシプロピルトリエトキシシラン，アミノプロピルトリエトキシシラン，ポリエチレングリコール鎖を有するシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。
【００６７】
蛍光ナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光物質を内包したシリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質を内包したシリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を、蛍光物質を内包したシリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride；Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００６８】
必要により有機分子修飾された蛍光物質を内包したシリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合し得る部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基に選択的に反応する部位とメルカプト基に選択的に反応する部位との両方を有するｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate；Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質を内包したシリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基とを結合させることで、抗体が結合した蛍光物質を内包したシリカナノ粒子が得られる。
【００６９】
蛍光物質を内包したポリスチレン粒子に生体物質認識部位（生体物質を特異的に認識可能な部位、例；ビオチン、アビジン、抗体等）を結合させる場合、蛍光物質が蛍光色素の場合であっても、半導体ナノ粒子の場合であっても、同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基など官能基を有するポリスチレンナノ粒子に半導体ナノ粒子または蛍光有機色素を含浸することにより、官能基を有する蛍光物質集積ポリスチレン粒子を得ることができ、以降ＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体が結合した蛍光物質集積ポリスチレン粒子ができる。
【００７０】
プローブおよび蛍光体が間接的に連結される免疫染色剤の他の一例として、［目的生体物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］−［ビオチン］／［アビジン］−［蛍光体（蛍光ナノ粒子）］（ここで、"…"は抗原抗体反応により結合していることを表し、"−"は必要に応じてリンカー分子を介していてもよい共有結合により結合していることを表し、"／"はアビジン・ビオチン反応により結合していることを表す。）という様式によって連結される、３つの分子からなる複合体が挙げられる。
【００７１】
二次抗体−ビオチン結合体（ビオチン修飾二次抗体）は、所望の抗体（タンパク質）にビオチンを結合させることのできる公知の手法に基づいて、たとえば市販されているビオチン標識試薬（キット）を利用して作製することができる。また、あらかじめ所望の抗体にビオチンが結合されているビオチン修飾二次抗体自体が市販されていれば、それを利用してもよい。
【００７２】
蛍光ナノ粒子−アビジン結合体（アビジン修飾蛍光体）も、蛍光体にアビジンを結合させることのできる公知の手法に基づいて、たとえば市販されているアビジン標識試薬（キット）を利用して作製することができる。この場合のアビジンは、ビオチンとの間でアビジンよりも高い結合力が働く、ストレプトアビジンやニュートラアビジンなどの改良型であってもよい。
【００７３】
蛍光体−アビジン結合体の作製方法の具体例を挙げれば次の通りである。蛍光ナノ粒子が樹脂を母体とする蛍光体集積粒子である場合、その樹脂が有する官能基と、アビジン（タンパク質）が有する官能基とを、必要に応じて分子の両末端に官能基を有するＰＥＧ等のリンカー分子を介することにより、結合させることができる。たとえば、メラミン樹脂であればアミノ基等の官能基を利用することができるし、アクリル樹脂、スチレン樹脂等であれば、側鎖に官能基（たとえばエポキシ基）を有するモノマーを共重合させることにより、その官能基自体またはその官能基から変換された官能基（たとえばアンモニア水を反応させることにより生成するアミノ基）を利用することができるし、さらにはそれらの官能基を利用して別の官能基を導入することもできる。また、蛍光ナノ粒子がシリカを母体とする蛍光体集積粒子または無機半導体ナノ粒子である場合、シランカップリング剤で表面修飾することにより所望の官能基を導入することができ、たとえばアミノプロピルトリメトキシシランを用いればアミノ基を導入することができる。一方、アビジンに対しては、たとえばＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）をアビジンのアミノ基と反応させることにより、チオール基を導入することができる。そして、アミノ基との反応性を有するＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよびチオール基との反応性を有するマレイミド基をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の両端に有するクロスリンカー試薬を利用することにより、アミノ基を有する蛍光体と、チオール基が導入されたアビジンとを連結することができる。
【００７４】
二次抗体〜蛍光ナノ粒子結合体は、所望の抗体（タンパク質）に所望の蛍光色素を結合させることのできる公知の手法に基づいて、たとえば市販されている蛍光標識試薬（キット）を利用して作製することができる。また、あらかじめ所望の抗体に所望の蛍光ナノ粒子が結合されている二次抗体〜蛍光ナノ粒子結合体自体が市販されていれば、それを利用してもよい。
【００７５】
―組織切片の染色方法−
（免疫染色方法）
以下、本発明において、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体、典型的には組織切片（標本スライド）を使用して、腫瘍細胞におけるがん関連タンパク質および／または免疫細胞におけるタンパク質の発現量、さらに必要に応じてそこに含まれるサイトカインおよび／または膜小胞関連タンパク質を定量するために用いることのできる、蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色法の一例について説明する。
【００７６】
組織切片（本明細書において、単に「切片」ともいい、例えば病理切片等の切片も包含する用語として用いる。）およびそれを載置した標本スライドの作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
【００７７】
（１．標本作製工程）
（１−１．脱パラフィン処理）
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００７８】
次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００７９】
水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００８０】
（１−２．賦活化処理）
公知の方法に倣い、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
【００８１】
次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００８２】
（２．免疫染色工程）
免疫染色工程では、生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を蛍光ナノ粒子用希釈液に分散させ、組織切片に載せ、目的とする生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる蛍光免疫染色用溶液ないしそれを調製するための蛍光ナノ粒子用希釈液およびその他の成分については前述した通りであり、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
【００８３】
たとえば、免疫染色剤が、［一次抗体（プローブ）］…［二次抗体］−［ビオチン］／［アビジン］−［蛍光ナノ粒子（蛍光体集積粒子等）］（ "…"は抗原抗体反応により結合していることを表し、"−"は必要に応じてリンカー分子を介していてもよい共有結合により結合していることを表し、"／"はアビジン・ビオチン反応により結合していることを表す。）という複合体である場合、最初に一次抗体の溶液に病理標本を浸漬する処理（１次反応処理）、次に二次抗体−ビオチン結合体の溶液に病理標本を浸漬する処理（２次反応処理）、最後に本発明に係る蛍光ナノ粒子用希釈液に分散させたアビジン−蛍光ナノ粒子の溶液（蛍光免疫染色用溶液）に病理標本である組織切片を浸漬する処理（蛍光標識処理）を行えばよい。
【００８４】
免疫染色工程を行う上での条件、たとえば１次反応処理、２次反応処理および蛍光標識処理それぞれにおける、所定の溶液（試薬）に病理標本である組織切片を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
【００８５】
上述したような１次反応処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。本発明では、このような１次反応処理前にブロッキング剤を添加する処理（ブロッキング処理）を行った場合であってもなお、蛍光標識処理で用いる蛍光免疫染色用溶液（ないしその調製に用いる蛍光ナノ粒子用希釈液）に所定の２種類のタンパク質を所定の量で配合することにより、バックグラウンドノイズの低減等の本発明の作用効果を発揮することができる。
【００８６】
（３．標本後処理工程）
免疫染色工程を終えた病理標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
【００８７】
固定化・脱水処理は、病理標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた病理標本を透徹液（キシレン等）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた病理標本を封入液に浸漬すればよい。これらの処理を行う上での条件、たとえば病理標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
【００８８】
（４．任意工程）
本発明では、もしも必要であれば、明視野において細胞、組織、臓器等の形態を観察することができるようにするための、形態観察染色工程を含めることができる。形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。また、細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
【００８９】
（５．評価工程）
（５−１．観察・撮影）
観察・撮影工程では、所望の倍率における顕微鏡の同一視野において、免疫染色工程に用いられた目的生体物質を蛍光標識している蛍光体に対応した励起光に対応した励起光それぞれを病理標本に照射し、それらの蛍光体から発せられた蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光の照射は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。免疫染色像の撮影は、たとえば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。
【００９０】
（５−２．画像処理・シグナル計測）
画像処理・計測工程では、目的生体物質に関して撮影された免疫染色像について、画像処理に基づき、目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルに対応する蛍光標識シグナルを計測し、細胞膜の領域内にある前記目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルを特定する。蛍光標識シグナルは、蛍光の輝点数として扱うことが好ましい。
【００９１】
画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、免疫染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和を算出したり、所定の輝度以上の輝点の数を計測したりする処理、特に、上述した実施形態を行うための処理を半自動的に、迅速に行うことができる。
【００９２】
また、輝点は蛍光ナノ粒子１個に由来するので、大きさが一定であり顕微鏡観察で認識できる。大きさが一定値（例；観測される蛍光ナノ粒子の平均値）より大きなシグナルは凝集輝点と判断する。この輝点と凝集輝点は、ソフトウェアを用いて半自動的に迅速に区別することができる。
【００９３】
（核酸染色法）
本発明において、ヒトまたはヒト以外の腫瘍組織由来の検体、あるいは細胞外小胞体、リンパ節、血液または唾液等の体液の検体中にある、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ関連物質）、すなわち目的核酸を定量する場合、上述した免疫染色法と同様の蛍光ナノ粒子を用いて、ＦＩＳＨ法に準じて、目的核酸を特異的に染色することができる。すなわち、本発明で実施することのできる核酸染色法は、前述した蛍光ナノ粒子用希釈液と、プローブと、該プローブに結合可能または結合した蛍光ナノ粒子と、を含有する核酸染色用溶液を用いて目的核酸を染色する方法である。
目的核酸は、染色体（特定の遺伝子をコードする領域）のようなＤＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ−ＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。
【００９４】
（目的核酸）
目的核酸は、発明の目的、すなわち診断または治療のために情報を取得しようとする疾患に応じて、所望の核酸を選択することができる。例えば、がんまたは免疫系が関係する疾患等に係る、腫瘍細胞または免疫細胞に特異的に発現する生体分子（タンパク質）をコードした遺伝子を有する染色体（その遺伝子の部分）を目的酢酸としてもよいし、それ以外の染色体または非染色体の（例えば細胞外小胞体、リンパ節、血液、体液等の中に遊離している）核酸を目的核酸としてもよい。また、核酸は、染色体のようなＤＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ−ＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。
【００９５】
（プローブ）
プローブは、上述したような目的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部または全部を含む配列（プローブ配列）を有する核酸分子である。プローブとしての核酸分子は、目的核酸と相補鎖を形成できるもの、つまり目的核酸と相補的な塩基配列を有するものであればよく、ＤＮＡであってもよいしＲＮＡであってもよい。また、核酸分子は、目的核酸と同様の天然の塩基からなる核酸であってもよいし、ＰＮＡ、ＬＮＡ（又はＢＮＡ:Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよいし、天然の核酸と人工核酸とが連結した核酸分子であってもよい。
【００９６】
（プローブの調製）
目的核酸に対するプローブは、公知の方法にしたがって作製することが可能であり、市販品として入手することもできる。プローブの塩基長、塩基配列、ＧＣ含量は、ハイブリダイゼーションさせる際の条件を考慮し、適切なストリンジェンシーを有するものとなるよう調製することができる。
【００９７】
（プローブと蛍光ナノ粒子との結合）
プローブと蛍光ナノ粒子との結合は、核酸染色法（例；ＦＩＳＨ）に支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。このプローブと蛍光ナノ粒子の結合は、プローブに蛍光ナノ粒子を直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
【実施例】
【００９８】
［作製例１］赤色ＰＩＤ染色剤作製工程
（ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の作製）
５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社、Cat.#89882）に通して、ＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Maleimide-PEG2-Biotin」（サーモサイエンティフィック社、製品番号21901）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾２次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾２次抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した溶液を、ビオチン修飾２次抗体の溶液とした。【００９９】
（ストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製）
テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１」（シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持ながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られたナノ粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、上述のように平均粒子径を測定したところ、平均粒子径１５２ｎｍであった。このようにして作製されたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を次の手順で表面修飾し、実施例１〜３における蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）として使用した。【０１００】
得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。【０１０１】
次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて上記表面アミノ化処理を行なった粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-［（N-maleimidopropionamido）-dodecaethyleneglycol］ester）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光体集積メラミン粒子を得た。【０１０２】
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をN-succinimidyl S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光体集積メラミン粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。【０１０３】
上記の蛍光体集積メラミン粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合蛍光体集積メラミン粒子を作製した。【０１０４】
［作製例２］緑色ＰＩＤ染色剤作製工程
上記（ストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製）の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１」（シグマアルドリッチ社）に代えてＦＩＴＣを用い、平均粒子径１５９ｎｍのＦＩＴＣ色素集積メラミン樹脂ナノ粒子を作製した。得られた粒子の表面修飾は、上記の手順に従い、ストレプトアビジンに代えて抗ＣＤ８ウサギモノクローナル抗体「ＳＰ１６」を用いることで、抗体結合ＦＩＴＣ集積メラミン樹脂粒子を作製し、実施例３における蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）として使用した。【０１０５】
［実施例１］ＰＤ−Ｌ１の発現量の評価
標本作製工程
(標本の前処理)
USBiomax社の肺組織アレイスライド「LC241b」（６名の患者に由来する腫瘍組織および正常組織の切片が２枚ずつと、組織マーカーの切片が１枚、合計２４枚の切片が積載されているスライドグラス）を購入した。標本は脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。【０１０６】
（免疫染色の１次反応処理）
目的生体物質ＰＤ−Ｌ１に係る第１免疫染色用の１次反応処理は、ＢＳＡを１Ｗ／Ｗ％含有するＰＢＳを用いて、抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ「ＳＰ１４２」Spring Bioscience（SBS）社）を０．０５ｎＭの濃度で含有するよう１次反応処理液を調製して用いた。この１次反応処理液に標本前処理工程で作製した標本を浸漬し、４℃で１晩反応させた。【０１０７】
（免疫染色の２次反応処理）
前記「ＰＩＤ染色剤の作製」の項で作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の溶液を、さらにＢＳＡを１Ｗ／Ｗ％含有するＰＢＳを用いて６μｇ／ｍＬに希釈した２次反応処理液を調製した。１次反応処理を終えた標本をＰＢＳで洗浄した後、この２次反応処理液に浸漬し、室温で３０分間反応させた。【０１０８】
（免疫染色の標識処理−１：ＤＡＢ標識）
２次反応処理を終えた標本をＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Thermo-Fisher社、21130）を浸漬し、室温で６０分間反応させた。その後標本をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine）溶液に１分浸漬した。【０１０９】
（免疫染色の標識処理−２：ＰＩＤ蛍光標識）
前記「ＰＩＤ染色剤の作製」の項で作製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド色素集積メラミン樹脂粒子を、カゼイン（組成＝α−カゼイン（シグマ社ｃ６７８０）：５０Ｗ／Ｗ％、β−カゼイン（シグマ社ｃ６９０５）：５０Ｗ／Ｗ％）とＢＳＡの含有率をそれぞれ１％、３％に調整した蛍光ナノ粒子用希釈液を用いて、０．０２ｎＭに希釈した蛍光標識反応処理液をそれぞれ調製した。２次反応処理を終えた標本をこの蛍光標識処理液に浸漬し、室温で３時間反応させた。【０１１０】
なお、ＤＡＢ標識処理とＰＩＤ蛍光標識処理は、別々の肺組織アレイスライド（それぞれに積載されている組織切片のセットの内容は同一であり隣接切片）に対して行った。下記のＤＡＢ発現率および蛍光輝点数の結果として表１に示したデータは、対応する同一の患者の組織についてのものであり、それぞれ２枚の組織切片の数値の平均値である。【０１１１】
（標本の後処理）
免疫染色を終えた標本に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行う透徹処理を行った。最後に、標本に封入剤「エンテランニュー」（メルク社）を載せて、カバーガラスを被せる封入処理を行い、観察に用いる標本とした。【０１１２】
評価工程
（ＰＤ−Ｌ１発現率）
ＤＡＢ標識の処理を経て得られた標本を顕微鏡観察し、N Engl J Med. 2012 June 28; 366(26): 2443-2454（非特許文献１）の記載に準じ、観察した細胞の個数に対する染色された細胞の個数の比率として、ＰＤ−Ｌ１発現率を算出した。【０１１３】
（蛍光輝点数）
蛍光の発光の観察には蛍光顕微鏡「ＢＸ−５３」（オリンパス株式会社）を用い、免疫染色像（４００倍）の撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ７３」（オリンパス株式会社）を用いた。【０１１４】
まず、目的生体物質ＰＤ−Ｌ１の蛍光標識に用いたテキサスレッド色素に対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の免疫染色像を撮影した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５〜６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２〜６９２ｎｍに設定した。蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、例えば４０００μ秒に設定した。【０１１５】
このような免疫染色像の撮影は、同一視野において行った後、視野を変えて同じ操作を繰り返し、１標本につき合計５視野ずつ行った（第１〜第５視野）。
この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いた。【０１１６】
免疫染色像におけるＰＤ−Ｌ１を蛍光標識したテキサスレッド色素集積メラミン樹脂粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。これをカウントすることで、免疫反応の評価指標とした。【０１１７】
実施例１の結果を表１に示す。従来のＤＡＢ標識で測定したＰＤ−Ｌ１発現率による評価と、本発明のＰＩＤ標識で測定した１細胞あたりの粒子数による評価には相関性があることが示された。したがって、ＰＩＤ法を利用することにより、がん細胞に発現しているがん関連タンパク質の発現量を高い精度で定量することができ、がんの診断または治療のために利用することのできる情報を取得できることが分かる。【０１１８】
【表１】
0006443581.tif 000003
【０１１９】
［実施例２］ＣＤ８の発現量の評価
標本前処理工程において、オートクレーブ処理時間を５分としたこと、抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体「ＳＰ１４２」に代えて抗ＣＤ８ウサギモノクローナル抗体「ＳＰ１６」１μｇ／ｍＬ濃度（Genetex社Code GTX79429）社を用いたこと以外は、実施例１と同様に染色および評価を実施した。【０１２０】
実施例２の結果を表２に示す。従来のＤＡＢ標識で測定したＣＤ８発現率による評価と、本発明のＰＩＤ標識で測定した細胞あたりの粒子数による評価には相関性があることが示された。したがって、ＰＩＤ法を利用することにより、免疫細胞に発現している所定のタンパク質の発現量を高い精度で定量することができ、免疫系が関係する疾患（がんも含む）の診断または治療のために利用することのできる情報を取得できることが分かる。【０１２１】
【表２】
0006443581.tif 000004
【０１２２】
［実施例３］ＣＤ８発現Ｔ細胞とＰＤ−Ｌ１発現がん細胞との距離の評価
上記「免疫染色の標識処理−２：ＰＩＤ蛍光標識」の手順に従って、がん細胞のＰＤ−Ｌ１に対して赤色ＰＩＤの染色を施した標本スライドを、作製例２で得られた抗体結合ＦＩＴＣ色素集積メラミン樹脂粒子の０．０２ｎＭ溶液に浸漬し、室温で３時間反応させることで、免疫細胞のＣＤ８に対して緑色ＰＩＤの染色を施した。その後、上記（標本の後処理）以下の記載と同様に、輝点の観察を実施し、赤色輝点と緑色輝点との距離を測定した。【０１２３】
細胞間距離の結果を表３に示す。ＰＤ−Ｌ１を発現するがん細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞（活性キラーＴ細胞）の距離を、輝点間距離として定量化できることも明らかとなった。したがって、ＰＩＤ法に基づき所定のタンパク質の発現量を定量する実施形態により、がん細胞および免疫細胞それぞれの所定のタンパク質の発現量を定量するとともに、それらの細胞間の距離も測定することができ、複合的な情報を取得できることが分かる。【０１２４】
なお、免疫スコアおよびＭＳＩ検査はともに定型試験であり、外注によって行ったので、その結果を表３に合わせて示す。免疫スコアおよびＭＳＩ検査の試験結果を、実施例１および２で得られた試験結果と対比すると、本発明による輝点計測結果は、上記の通り発現率と相関しているとともに、免疫スコア（前述の８項目）およびＭＳＩ検査とある程度相関していることが明らかになった。さらに、本発明による輝点間距離の結果は、免疫スコア（前述の８項目）およびＭＳＩ検査に対してより高い相関を示している。したがって、ＰＩＤ法に基づき所定のタンパク質の発現量や細胞間距離を定量することのできる本発明は、さらにさまざまな免疫チェックへの適応を可能とし、がんの診断のために利用することのできる、従来よりも複合的な情報を取得できると推測された。【０１２５】
【表３】
0006443581.tif 000005
【０１２６】
［参考例１］ｍｉＲ１９７の発現量の評価
実施例１と同様に前処理を行った肺組織アレイスライド「ＬＣ２４１ｂ」を用いて、腫瘍細胞において発現するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１９７の染色および評価を行った。【０１２７】
（核酸染色の１次反応処理）
目的生体物質ｍｉＲ１９７に係る第１核酸染色用の１次反応処理は、ＩＱＦＩＳＨ  ＦＦＰＥ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、フルオレセイン標識蛍光プローブ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７−３ｐ；ＥＸＩＱＯＮ社６１１３３９−３１０）、を１００ｎｇ／μＬの濃度で含有するよう１次反応処理液を調製して用いた。この１次反応処理液に標本前処理工程で作製した標本を浸漬し、８０℃で１０分反応させ、さらに４℃で１晩反応させた。【０１２８】
（核酸染色の２次反応処理）
ビオチン標識抗フルオレセイン抗体は、Ｖｅｃｔｏｒ社  ＢＡ−０６０１の溶液を、さらにＢＳＡを１Ｗ／Ｗ％含有するＰＢＳを用いて６μｇ／ｍＬに希釈した２次反応処理液を調製した。１次反応処理を終えた標本をＰＢＳで洗浄した後、この２次反応処理液に浸漬し、室温で３０分間反応させた。【０１２９】
（核酸染色の増幅反応処理）
Ｇｅｎｐｏｉｎｔ（商標、Ｄａｋｏ）の、ストレプトアビジン／ＨＲＰ一次酵素試薬４０μＬに浸漬し、室温で１５分反応させたあと、ＴＢＳＴで洗浄し、ビオチン化したチラミド溶液を用いてさらに室温で１５分反応させた。【０１３０】
（免疫染色の標識処理−１：ＤＡＢ標識）
増幅反応処理を終えた標本をＴＢＳで洗浄した後、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ（商標、Ｄａｋｏ）の、ストレプトアビジン／ＨＲＰ二次酵素試薬４０μＬに浸漬し、室温で１５分反応させたあと、ＴＢＳＴで洗浄し、ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine）溶液に１分浸漬し、水で洗浄を行った。【０１３１】
（核酸染色の標識処理−２：赤色ＰＩＤ蛍光標識）
前記作製例１で作成したストレプトアビジン結合テキサスレッド色素集積メラミン樹脂粒子を、カゼイン（組成＝α−カゼイン（シグマ社ｃ６７８０）：５０Ｗ／Ｗ％、β−カゼイン（シグマ社ｃ６９０５）：５０Ｗ／Ｗ％）とＢＳＡの含有率をそれぞれ１％、３％に調整した蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．１ｎＭに希釈した蛍光標識反応処理液をそれぞれ調製した。２次反応処理を終えた標本をこの蛍光標識処理液に浸漬し、室温で１時間反応させ、PBSで洗浄を行った。【０１３２】
ＤＡＢ標識処理とＰＩＤ蛍光標識処理を終えた標本に対して、実施例１と同様の手法を用いて標本の後処理および評価を行った。その結果を表４に示す。【０１３３】
【表４】
0006443581.tif 000006
【０１３４】
このような核酸染色を行うことで、がん細胞の遺伝子の発現量を定量することができる。がん（腫瘍）細胞に含まれるｍｉＲＮＡの核酸の定量は、上記の参考例１に示したように単独で行っても診断または治療のための一定程度の情報を取得することもできる。
さらに、miR181cなど、miRNAがエクソソームをキャリアとして細胞間を移動するという現象が近年報告されており（Nat Commun. 2015 Apr 1;6:6716. doi: 10.1038/ncomms7716）、したがって上記のような手法を用いることで、さまざまなｍｉＲＮＡがダイナミックに移動している情報を得ることもできると考えられる。【０１３５】
［実施例４］ｍｉＲ１９７発現がん細胞とＣＤ８発現Ｔ細胞との距離の評価
上記「核酸染色の標識処理：赤色ＰＩＤ蛍光標識」の手順に従ってがん細胞のｍｉＲ１９７に対して赤色ＰＩＤの染色を施した標本スライドを、実施例３と同様の方法で、作製例２で得られた抗体結合ＦＩＴＣ集積メラミン樹脂粒子溶液に反応させることで、免疫細胞のＣＤ８に対して緑色ＰＩＤの染色を施した。その後、実施例１の標本の後処理移行の記載と同様に、輝点の観察を実施し、赤色輝点と緑色輝点との距離を測定した。【０１３６】
実施例３と同様に、ｍｉＲＮＡ１９７を発現するがん細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞（活性キラーＴ細胞）との距離を、輝点間距離として定量化できることが明らかになった。このようにして、免疫細胞のタンパク質の発現量を定量するとともに（実施例２）、がん細胞の核酸（ｍｉＲＮＡ）の発現量を定量し（参考例１）、さらにそれらを発現している細胞間の距離も測定する（参考例２）ことは、本発明の好ましい実施形態ということができる。また同様の手法を用いて、がん細胞におけるタンパク質を発現している細胞と免疫細胞における核酸を発現している細胞との距離についても同様に明らかにすることが出来る。【０１３７】
［実施例５］患者腫瘍組織移植マウス
肺がん患者１名から採取した組織検体をＳｏｆｉａＢｉｏ社から購入し、Ｉｍｍｕｎｅ−ＰＤＸモデルマウスを作成した。２ｍｍ角のがん組織を皮下へ移植し、１か月後に約３００ｍｍ3まで成長したがん組織を採取して、ＦＦＰＥ組織スライドを作成した。【０１３８】
実施例１、２、３と同様に染色した結果、次のような結果を得ることができ、したがって患者腫瘍組織移植モデルマウスを用いた代替え試験系においても、ＰＩＤ法を利用することにより、免疫細胞に発現している所定のタンパク質の発現量を高い精度で定量することができ、免疫系が関係する疾患（がんも含む）の診断または治療のために利用することのできる情報を取得できることが分かる。【０１３９】
【表５】
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【０１４０】
[実施例６］培養がん細胞移植マウス
乳房へ発がん物質(３−メチルコラントレン（３−ＭＣＡ））を導入して作成した自然誘発腫瘍マウスから採取した腫瘍組織を移植に用いる以外は、実施例４と同様の手法を用いてがんＦＦＰＥ組織スライドを作成した。【０１４１】
上記で作成したスライドを、1次抗体を抗ヒトＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ「ＳＰ１４２」）から抗マウスＰＤ−Ｌ１ウサギ抗体（品番ＰＢ９９９４、Boster Immunoleader社）へ、抗ヒトＣＤ８ウサギモノクローナル抗体「ＳＰ１６」から抗マウスＣＤ８ウサギ抗体「品番ＳＴＪ２０１８０、Ｓｔ  Ｊｏｎｅｓ  ｌａｂ」へ変更する以外は、実施例1、2、3と同様に染色した。【０１４２】
その結果次のような結果を得ることができ、したがって患者腫瘍組織移植モデルマウスを用いた代替え試験系においても、ＰＩＤ法を利用することにより、免疫細胞に発現している所定のタンパク質の発現量を高い精度で定量することができ、免疫系が関係する疾患（がんも含む）の診断または治療のために利用することのできる情報を取得できることが分かる。【０１４３】
【表６】
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