(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）の反応性グリオーシスを治療するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはＬ−ＮＩＬであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびＣＮＳの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記薬剤。
【請求項２】
哺乳動物のＣＮＳの間質、脳の間質、および／または脊髄の間質からの老廃産物のクリアランスを促進するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはＬ−ＮＩＬであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびＣＮＳの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、ＣＮＳの老廃産物の蓄積を低減、減少、発生遅延、または阻止する、前記薬剤。
【請求項３】
老廃産物が、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、またはαシヌクレインである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
哺乳動物の外傷性脳損傷後の障害の発症を遅延または阻止するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはＬ−ＮＩＬであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびＣＮＳの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、脳の間質中のアミロイドβ（Ａβ）、タウ、および／またはαシヌクレインの蓄積を減少、低減、発生遅延、または阻止する、前記薬剤。
【請求項５】
哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるかまたは妨害するための、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害する薬剤であって、
ＡＶＰ（バソプレシン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、またはアンジオテンシンＩＩである、前記薬剤。
【請求項６】
グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害することが、ＣＮＳの間質を通る液体の流れを遮断するかまたはそれに対するバリアを設けることを含む、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
哺乳動物のＣＮＳにおける神経変性疾患の発症を遅延または阻止するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはＬ−ＮＩＬであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびＣＮＳの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記薬剤。
【請求項８】
神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはＨＩＶ関連認知症である、請求項７記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、同時係属中の２０１３年２月２１日出願の米国仮特許出願第６１／７６７，５４６号、表題：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｂｒａｉｎ−Ｗｉｄｅ  Ｐａｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｏｒ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒｅｏｎ；２０１３年８月５日出願の仮特許出願第６１／８６２，３２１号、表題：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｂｒａｉｎ−Ｗｉｄｅ  Ｐａｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｏｒ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒｅｏｎ；および２０１４年２月２０日出願の仮特許出願第６１／９４２，４４７号、表題：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｂｒａｉｎ−Ｗｉｄｅ  Ｐａｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｏｒ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒｅｏｎの優先権および利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する明示
[0002]開示する発明は、国立衛生研究所と第ＮＳ０７８３０４号、第ＮＳ０７８１６７号、および第ＮＳ０７３３７３号の契約をして、政府の支援を受けて行った。政府は、本発明に関して権利を有する。
１．技術分野
[0003]本発明は、哺乳動物の脳内のグリオ−血管経路の機能を測定するための方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の脳内の脳脊髄液−間質液（ＣＳＦ−ＩＳＦ）の交換を測定するための方法に関する。本発明はさらに、グリオ−血管経路の機能を促進または妨害することによって、哺乳動物の脳の疾患または障害を治療するための方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の脳内の脳脊髄液の分泌および流れを促進または増大させるための方法に関する。
２．発明の背景
【背景技術】
【０００３】
[0004]リンパ管構造は、血管構造に平行な第２の循環に相当し、後毛細管小静脈を介しては吸収されないその構成要素のタンパク質およびその他の溶質を有する間質液（ＩＳＦ）のクリアランスを担う。血管を有する組織の大部分では、リンパ系は、静水圧およびホメオスタシスの両方の維持にとって決定的に重要である。しかし、脳は、組織学的に特定可能なリンパ管を有さず、したがって、その他の末梢組織中には存在する、間質内溶質および液体のクリアランスのための別個の経路を欠いている。これは、驚くべきことであり、その理由は、神経細胞およびグリアの大きな代謝速度およびそれらの細胞外環境中の変化に対する高い感受性は、ＩＳＦおよび溶質の迅速なクリアランスの必要性を示唆するからである。
【０００４】
[0005]中枢神経系（ＣＮＳ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）が、脳からの溶質のクリアランスに関与すると考えられている。脈絡叢（choroid plexi）中で形成されたＣＳＦは、脳室およびくも膜下腔を通って流れ、その最終地点に達し、そこで、脳神経鞘に沿ってまたは鼻リンパ管を通って、硬膜静脈洞のくも膜絨毛を介して血流中に再吸収される。間質内溶質は、ＩＳＦの対流性バルク流によりクリアランスされて、ＣＳＦに達すると考えられており、ＩＳＦは、解剖学的または機能的に異なる構造を通ってではなく、脳組織を通って拡散性に進む。
【０００５】
[0006]脳および脊髄を含めた哺乳動物の中枢神経系における、機能しない毒性タンパク質の蓄積は、ヒトにおけるアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含めた多くの神経変性疾患と関連がある。しかし、老化する哺乳動物の脳内に毒素の蓄積をもたらすメカニズムは完全に分かってはいない。アルツハイマー病（ＡＤ）の場合、２つの顕著な特徴は、アミロイドβ（本明細書では、アミロイド−β、アミロイドベータ、またはＡβとも称する）毒素の細胞外沈着物である老人斑、および細胞内の神経原線維タングル（過リン酸化タウ）である。「アミロイドカスケード」仮説により、ＡＤにおける認知の低下および明確な発症の特徴は、これら毒素の異常な蓄積に関連することが示唆される（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．、「Ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ’ｓ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｃｏｂｗｅｂｓ」、Ｎｅｕｒｏｎ  ３２、ｎｏ．２（２００１）：１７７〜８０ページ；Ｈａｒｄｙ，Ｊ．、「Ａ  Ｈｕｎｄｒｅｄ  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｎｅｕｒｏｎ  ５２、ｎｏ．１（２００６）：３〜１３ページ）。
【０００６】
[0007]米国特許第６，６８９，０８５号（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、２００４年２月１０日）は、アルツハイマー病に属する成人発症型認知症を治療するための方法および装置を開示している。この方法によれば、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）の一部を除去するが、これは、その患者の身体の別の部分にＣＳＦを移すことによってなされる。また、米国特許第６，６８９，０８５号に開示されているのは、ＣＳＦを除去するためのシャントである。
【０００７】
[0008]本出願のセクション２またはその他のセクションにおける任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であると認めるものであるとみなしてはならない。
３．発明の概要
【発明の概要】
【０００８】
[0009]哺乳動物の脳および／または脊髄（まとめて、「中枢神経系」または「ＣＮＳ」）中のグリオ−血管経路（以下、「グリンファティック系」）の機能を測定するための方法であって：
中枢神経系の画像化を行うステップ；および
中枢神経系中の脳脊髄液−間質液（以下、「ＣＳＦ−ＩＳＦ」）の交換を測定するステップ、
を含み、それによって、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定する方法を提供する。
【０００９】
[0010]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
[0011]別の実施形態では、この方法は、中枢神経系の画像化を行うステップの前に画像化剤を投与するステップをさらに含む。
【００１０】
[0012]この方法の別の実施形態では、画像化剤を、くも膜下腔内に投与する。
[0013]この方法の別の実施形態では、画像化剤をくも膜下腔内に投与するステップが、画像化剤を腰椎または大槽髄腔内注入で投与するステップを含む。
【００１１】
[0014]この方法の別の実施形態では、画像化剤が、陰性または陽性（常磁性）のＭＲＩ造影剤であり、中枢神経系の画像化を行うステップが、中枢神経系のダイナミックまたは造影磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）を行うステップを含む。
【００１２】
[0015]この方法の別の実施形態では、少なくとも２つの異なる磁性造影剤またはＭＲＩ造影剤を投与し、異なる磁性造影剤を、脳組織中のそれらの動態的特徴を比較することができるように、Ｔ１（常磁性）またはＴ２（陰性造影剤）に対するそれらの作用の観点から適合させる。
【００１３】
[0016]この方法の別の実施形態では、画像化剤が、陽電子放出放射性核種トレーサーであり、脳および脊髄の画像化を行うステップが、中枢神経系の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャニングを行うステップを含む。
【００１４】
[0017]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、可溶性アミロイドβ（本明細書では、アミロイドベータまたはＡβとも称する）、タウ、機能性もしくは治療用のナノ粒子等のナノ粒子、化学療法剤、治療用に投与する毒性産物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、αシヌクレイン、低分子薬物、ウイルスベクター、抗体ベースの治療薬、リポソーム、または治療用ＲＮＡ構築物のクリアランスを測定するステップを含む。
【００１５】
[0018]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、治療剤のクリアランスを測定するステップを含む。
[0019]この方法の別の実施形態では、治療剤が、治療に使用するために投与する化学療法剤、機能性ナノ粒子、または毒性組成物である。
【００１６】
[0020]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、脳内の常磁性または陰性の造影剤の流入動態、実質における分布、および／またはクリアランスを解析するステップを含む。
【００１７】
[0021]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、下垂体陥凹、松果体陥凹、小脳および／または嗅球においてＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップを含む。
【００１８】
[0022]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップを含む。
【００１９】
[0023]この方法の別の実施形態では、シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップがそれぞれ、Ｔ１の短縮またはＴ２の変化を測定するステップを含む。
【００２０】
[0024]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、流入動態パラメータを計算するステップを含み、流入動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する。
【００２１】
[0025]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、造影ＭＲＩまたはＰＥＴの静止画像から動態パラメータを計算する単一のステップを含み、動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する。
【００２２】
[0026]別の実施形態では、この方法は、哺乳動物において神経変性疾患を発症するリスクを計算するステップをさらに含む。
[0027]この方法の別の実施形態では、神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、または混合型認知症である。
【００２３】
[0028]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、外傷性脳損傷に罹患しており、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を発症するリスクを計算するステップをさらに含む。
[0029]哺乳動物の中枢神経系に発症した神経変性疾患を治療する方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを、治療し、改善し、阻止し、減少させ、または低減させる方法を提供する。
【００２４】
[0030]一実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させるもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ、または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含み、それによって、哺乳動物の脳の間質中のアミロイドβ（Ａβ）、タウ、および／またはαシヌクレインの蓄積の減少、低減、発生遅延、または阻止をもたらす。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【００２５】
[0031]この方法の一実施形態では、反応性グリオーシスが、間質内の老廃物のクリアランスを減少させるかまたは阻止する。
[0032]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
【００２６】
[0033]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
[0034]この方法の別の実施形態では、神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはＨＩＶ関連認知症である。
【００２７】
[0035]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００２８】
[0036]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤、例えば、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００２９】
[0037]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する治療剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタン、もしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９；またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【００３０】
[0038]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、不眠治療にまたは睡眠補助薬として使用するための薬剤であり、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
[0039]抗ヒスタミン剤（例えば市販薬）：
[0040]ＡＬＬＥＧＲＡ（登録商標）（フェキソフェナジン）
[0041]ＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標）（ジフェンヒドラミン）
[0042]ＣＬＡＲＩＴＩＮ（登録商標）またはＴＡＶＩＳＴ（登録商標）（ロラタジン）
[0043]ＣＨＬＯＲ−ＴＲＩＭＥＴＯＮ（登録商標）（マレイン酸クロルフェニラミン）
[0044]ＤＩＭＥＴＡＮＥ（登録商標）（ブロムフェニラミン、フェニルプロパノールアミン）
[0045]ＺＹＲＴＥＣ（登録商標）（セチリジン）
[0046]非処方箋睡眠補助剤：
[0047]Ｕｎｉｓｏｍ  Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ  Ｓｌｅｅｐ−Ａｉｄ
[0048]Ｄｏｒｍｉｎ
[0049]Ｎｙｔｏｌ
[0050]Ｓｉｍｐｌｙ  Ｓｌｅｅｐ
[0051]Ｓｏｍｉｎｅｘ
[0052]Ｅｘｔｒａ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｔｙｌｅｎｏｌ  ＰＭ
[0053]塩酸ジフェンヒドラミン
[0054]Ｅｘｃｅｄｒｉｎ  Ｐ．Ｍ．
[0055]ベンゾジアゼピン系：
[0056]ＰＲＯＳＵＭ（登録商標）（エスタゾラム）
[0057]ＤＡＬＭＡＮＥ（登録商標）（フルラゼパム）
[0058]ＤＯＲＡＬ（登録商標）（クアゼパム）
[0059]ＲＥＳＴＯＲＩＬ（登録商標）（テマゼパム）
[0060]ＨＡＬＣＩＯＮ（登録商標）（トリアゾラム）
[0061]ＶＡＬＩＵＭ（登録商標）（ジアゼパム）
[0062]非ベンゾジアゼピン系：
[0063]イミダゾピリジン：ＡＭＢＩＥＮ（登録商標）、ＡＭＢＩＥＮ（登録商標）ＣＲ、ＩＮＴＥＲＭＥＺＺＯ（登録商標）（ゾルピデム）（優れている）
[0064]ＳＯＮＡＴＡ（登録商標）（ピラゾロピリミジン）（優れている）
[0065]メラトニン受容体刺激剤：
[0066]ＲＯＺＥＲＥＭ（登録商標）（ラメルテオン）
[0067]ＮＯＴＥＣ（登録商標）（抱水クロラール）
[0068]ＰＲＥＣＥＤＥＸ（登録商標）（塩酸デクスメデトミジン）
[0069]ＬＵＮＥＳＴＡ（登録商標）（エスゾピクロン）
[0070]バルビツレート：
[0071]ＮＥＭＢＵＴＡＬ（登録商標）（フェノバルビタール）
[0072]ＭＥＢＡＲＡＬ（登録商標）（メフォバルビタール）
[0073]Ａｍｙｔａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ（アモバルビタールナトリウム）
[0074]ＢＵＴＩＳＯＬ（登録商標）（ブタバルビタールナトリウム）
[0075]ＳＥＣＯＮＡＬ（登録商標）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｕｌｖｕｌｅｓ（セコバルビタールナトリウム）
[0076]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在（depolarization）またはＡＱＰ４の偏在（polarization）の喪失を阻止する薬剤である。
【００３１】
[0077]別の実施形態では、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である。
[0078]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【００３２】
[0079]哺乳動物の中枢神経系の反応性グリオーシスを治療する方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを、治療し、改善し、阻止し、減少させ、または低減させる方法を提供する。
【００３３】
[0080]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
[0081]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
【００３４】
[0082]この方法の別の実施形態では、反応性グリオーシスが、アクアポリン４（ＡＱＰ４）依存性のバルク流を減少させる。
[0083]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００３５】
[0084]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤、例えば、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００３６】
[0085]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する治療剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタン、もしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９；またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【００３７】
[0086]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である。
[0087]別の実施形態では、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である。
【００３８】
[0088]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【００３９】
[0089]哺乳動物の脳の間質および／または脊髄の間質（すなわちＣＮＳの間質）からの老廃産物のクリアランスを促進するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。この方法の一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する薬剤、例えば、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００４０】
[0090]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタン、もしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９、またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【００４１】
[0091]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である。
[0092]別の実施形態では、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である。
【００４２】
[0093]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
[0094]この方法の別の実施形態では、脳の老廃産物が、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、またはαシヌクレインである。
【００４３】
[0095]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００４４】
[0096]哺乳動物の中枢神経系を治療する方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含む方法を提供する。一実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ、または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【００４５】
[0097]この方法を使用して、哺乳動物の中枢神経系の老廃産物の蓄積を緩慢にする、遅延させる、低減させる、減少させる、または阻止する。この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
【００４６】
[0098]この方法の別の実施形態では、脳の老廃産物が、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、またはαシヌクレインである。
[0099]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００４７】
[00100]哺乳動物の中枢神経系（脳および／または脊髄）を治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるかまたは促進する薬剤を哺乳動物に投与し、それによって、例えば、哺乳動物のＣＮＳの間質中のアミロイドβ（Ａβ）、タウ、および／またはαシヌクレインの蓄積を減少させる、遅延させる、もしくは阻止するステップ、またはグリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【００４８】
[00101]この方法の一実施形態では、哺乳動物の脳が、脳損傷を受けている。一実施形態では、脳損傷が、外傷性脳損傷である。別の実施形態では、脳損傷が、びまん性虚血性損傷である。
【００４９】
[00102]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
[00103]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
【００５０】
[00104]この方法の別の実施形態では、処置を必要とする患者または対象が、高齢者または老人である。一実施形態では、高齢者または老人の患者または対象が、５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、または９０歳より高齢のヒトである。
【００５１】
[00105]この方法の別の実施形態では、治療剤が、アドレナリン作動性受容体アンタゴニストである。
[00106]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００５２】
[00107]哺乳動物のＣＮＳ（脳および／または脊髄）の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるかまたは妨害するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップを含む方法を提供する。
【００５３】
[00108]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
[00109]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
【００５４】
[00110]この方法の別の実施形態では、処置を必要とする患者または対象が、高齢者または老人である。一実施形態では、高齢者または老人の患者または対象が、５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、または９０歳より高齢のヒトである。
【００５５】
[00111]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップが、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００５６】
[00112]この方法の別の実施形態では、薬剤が、ブメタニド、ＡＱＰ４に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＡＶＰ（バソプレシン）のアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアゴニスト、またはＡＴ１受容体のアゴニストである。
【００５７】
[00113]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを減少させる（または妨害する）ステップが、哺乳動物の中枢神経系の間質を通る液体の流れを遮断するかまたはそれに対するバリアを設けるステップを含む。
【００５８】
[00114]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
【００５９】
[00115]また、哺乳動物の脳内において、脳脊髄液（ＣＳＦ）／間質液（ＩＳＦ）の交換と関連がある脳脊髄液（ＣＳＦ）の分泌の低減および／または流れの低減を修復および／または増大させるための装置も提供する。好ましい実施形態では、哺乳動物がヒトである。この装置は、機械的にポンピングするシステム（例えば、注入ポンプ）を含み、それによって、より迅速な、脳内のＣＳＦのクリアランスを促進する。一実施形態では、この装置は、人工（「模擬」）ＣＳＦも含み、ポンピングするシステムが、脳内に人工ＣＳＦをポンピングまたは注入する。
【００６０】
[00116]この装置の別の実施形態では、この装置は、限定されるものではないが、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、および混合型認知症を含めた、神経変性疾患と関連があるか、または外傷性脳損傷もしくは虚血性脳損傷と関連がある脳脊髄液（ＣＳＦ）の分泌の低減および／または流れの低減を修復および／または増大させる。
４．図面の簡単な説明
[00117]本発明を、添付図面を参照しながら本明細書に記載するが、図面中、類似した参照数字は、いくつかの図にわたり、類似した要素を表す。いくつかの事例では、本発明の様々な態様は、本発明を理解しやすくするために誇張、拡大、分離、または省略された状態で示される場合もあると理解されたい。
【００６１】
[00118]また、いくつかの事例では、当該技術分野において周知の方法により実施したクラスター分析データのコーディングを含め、データのカラーコーディングは、図面ではグレースケールに変換されていると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１−１】[00119]脳実質内へのくも膜下ＣＳＦの分布を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。（１Ａ）脳室およびくも膜下ＣＳＦの脳実質内への移動を、蛍光トレーサーを側脳室（ＬＶ）または大槽内注入した後に評価した図である。（１Ｂ〜１Ｇ）脳室内注入後３０分経過して、低分子量（Ａ５９４；分子サイズ、７５９ダルトン；赤色）、中分子量（ＴＲ−ｄ３；分子サイズ、３ｋＤ；青色）、および高分子量（ＦＩＴＣ−ｄ２０００；分子サイズ、２０００ｋＤ；緑色）のトレーサーについて、その脳実質内への移動を評価した図である。３Ｖは第３脳室；４Ｖは第４脳室を示す。（１Ｄおよび１Ｇ）脳室周囲腔から離れた組織にはトレーサーを認めないことを示した図である。挿入図は、同一視野における４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）標識を示す。
【図１−２】脳実質内へのくも膜下ＣＳＦの分布を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。（１Ｈ〜１Ｊ）大槽内注射後３０分経過したときの低分子量トレーサーの貫通量を示した図である。矢印頭部は、低濃度の傍血管における蓄積を示す。（１Ｋ〜１Ｍ）大槽内注射したＴＲ−ｄ３（暗青色）およびＦＩＴＣ−ｄ２０００（緑色）の分布を示した図である。併合部（水色）は、ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００の同時局在を示す。（１Ｎ）総脳容量（スライス面積の積分値）に占める割合（％）として数値化された、大槽内蛍光トレーサーの分布を示した図である。Ａ５９４は脳組織において最大の比率を占めた。ＴＲ−ｄ３は中間的な分布を示し、一方、ＦＩＴＣ−ｄ２０００は極めて限定的であった（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。（１Ｏ）［３Ｈ］マンニトール（分子サイズ、１８２ダルトン）または［３Ｈ］デキストラン−１０（分子サイズ、１０ｋＤ）を大槽内注射した後の、脳内放射性トレーサーの蓄積を示した図である。［３Ｈ］マンニトールと比較して、［３Ｈ］デキストラン−１０の脳内蓄積は有意に遅かった（各時点ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０００１）。スケールバーは１００ｍｍ。
【図２−１】[00120]マウス皮質内への傍動脈ＣＳＦの流動のｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像を示した図である。カラーコーディングは、グレースケールに変換されている。くも膜下ＣＳＦ内に大槽内注射したトレーサーの大脳皮質への流入を、閉鎖頭蓋窓を通じて二光子画像化法によりｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。（２Ａ）画像化装置を示す概略図である。画像化は、皮質表面下方０〜２４０ｍｍにおいて１分間隔で実施した。（２Ｂ）動脈内ＣＢ−ｄ１０により大脳の血管構造を可視化し、そして動脈（Ａ）および静脈（Ｖ）を形態学的に識別した図である。大槽内注射直後に、ＣＳＦトレーサーは、大脳表面動脈の外部に沿って移動したが、静脈にはあてはまらない。赤丸は細動脈；青丸は細静脈。（２Ｃ〜２Ｅ）時間経過と共に、トレーサーは貫通細動脈に沿って脳内に急速に移動したが、細静脈にはあてはまらないことを示す図である。低分子量トレーサー（ＴＲ−ｄ３、暗青色）は間質内に速やかに移動したが、一方、高分子量トレーサー（ＦＩＴＣ−ｄ２０００、緑色）は、傍血管腔に限定した。併合部（水色）は、ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００の同時局在を示す。スケールバーは、１００ｍｍ（２Ｂ〜２Ｅ）。
【図２−２】マウス皮質内への傍動脈ＣＳＦの流動のｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像を示した図である。カラーコーディングは、グレースケールに変換されている。くも膜下ＣＳＦ内に大槽内注射したトレーサーの大脳皮質への流入を、閉鎖頭蓋窓を通じて二光子画像化法によりｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。（２Ｆ〜２Ｈ）皮質表面動脈に沿って、高分子量トレーサー（ＦＩＴＣ−ｄ２０００）が、動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭ）周辺の直近にある傍血管腔（ＰＶＳ）内に存在したことを示す図である。血流（ＢＳ）は、経静脈注射したＴＲ−ｄ７０により規定される。基底膜（ＢＭ）の低レベル標識から、少量のＣＳＦトレーサーが基底膜に沿って移動することを示す。（２Ｉおよび２Ｊ）大槽内注射した高分子量トレーサー（ＦＩＴＣ−ｄ２０００）は、貫通細動脈周辺の傍血管腔（ＴＲ−ｄ７０）に沿って脳に進入したことを示す図である。（２Ｋおよび２Ｌ）ＧＦＡＰ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）レポーターを発現する、遺伝子組換えマウスにおけるグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性アストロサイトを示した図である。ＴＲ−ｄ２０００を含有する傍血管腔は、血管周囲のアストロサイトのエンドフィート（白）により囲まれている。スケールバーは、２０ｍｍ（２Ｆ〜２Ｉ）、および５ｍｍ（２Ｊ〜２Ｌ）。
【図３−１】[00121]ＣＳＦは傍血管経路に沿って脳の間質に進入し、クリアランスされることを示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。くも膜下ＣＳＦの流動の脳実質への経路を評価するために、Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスに蛍光トレーサーを大槽内注射し、動脈と静脈を直接区別できるようにした。（３Ａおよび３Ｂ）大槽内注射したＯＡ−６４７は、上行静脈（Ｔｉｅ２−ＧＦＰ＋／ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ−血管、黒矢印頭部）に沿ってではなく、貫通細動脈（Ｔｉｅ２−ＧＦＰ＋／ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ＋血管、白矢印頭部）に沿って大脳皮質に進入することを示す図である（緑色矢印はトレーサーの進入を表す）。（３Ｃ）ＣＳＦトレーサーは、傍血管腔（ＰＶＳ）および血管内皮細胞層と平滑筋細胞層の間の基底膜（ＢＭ）の両方に沿って移動することを示す図である。トレーサーの毛細血管に沿った移動は、基底板に沿って進む。（３Ｄ）大量のトレーサーが基底神経節および視床に認められ、大腹側貫通動脈に沿って進入することを示す図である。（３Ｅ）レンズ核線条体動脈周辺の詳細なトレーサー分布を示した図である。プロットは、白線に沿った強度投影図を表す。緑色はトレーサー；グレーは内皮ＧＦＰ；赤色は血管平滑筋。スケールバーは、１００ｍｍ（３Ａおよび３Ｄ）、２０ｍｍ（３Ｂ）、および４ｍｍ（３Ｃおよび３Ｅ）。
【図３−２】ＣＳＦは傍血管経路に沿って脳の間質に進入し、クリアランスされることを示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。くも膜下ＣＳＦの流動の脳実質への経路を評価するために、Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスに蛍光トレーサーを大槽内注射し、動脈と静脈を直接区別できるようにした。（３Ｆ〜３Ｈ）より長時間経過した時点（トレーサー流入０〜３０分と比較して＞１時間）では、ＯＡ−６４７（分子サイズ、４５ｋＤ）は、間質空間内に進入し、そして主に毛細血管（３Ｆ）および実質細動脈（３Ｇ）に沿って蓄積したことを示す図である。蓄積は、中間内側大脳静脈および外側腹側尾部鼻静脈（３Ｈ）に沿って最大であった。３Ｇ〜３Ｈのオレンジ色矢印は、間質内トレーサークリアランスについて認められた経路を表す。スケールバーは、５０ｍｍ（３Ｈ）、および２０ｍｍ（３Ｆおよび３Ｇ）。
【図４−１】[00122]傍血管アクアポリン４（ＡＱＰ４）は、脳間質経由のＣＳＦの流動を促進することを示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。（４Ａ）ＡＱＰ４（紫色）は、脳アストロサイト（白）内で特異的に発現し、その局在は血管周囲のエンドフィート（矢印頭部）に極めて偏っていることを示す図である。（４Ｂおよび４Ｃ）ＡＱＰ４−陽性の血管周囲アストロサイトのエンドフィートは、傍動脈ＣＳＦ流入経路周辺の直近に位置することを示す図である。プロットは４Ｂおよび４Ｃから得られた蛍光強度投影図を表し、白色の四角で示す。トレーサー（緑色）は、血管平滑筋（赤色）とアストロサイトのエンドフィート（紫色）の間に位置する傍血管腔（ＰＶＳ）内に局在している。（４Ｄ）毛細血管基底板（緑色）に沿ったトレーサーの移動は、血管周囲のＡＱＰ４陽性エンドフィート（紫色）により制限されていることを示す図である。（４Ｅ）くも膜下ＣＳＦの脳実質内への移動およびこれを通じた移動に対する、ＡＱＰ４媒介型の液流の寄与をｅｘ  ｖｉｖｏで評価した図である。トレーサー標識を定量化すると、注射後３０分経過したときの大槽内注射したトレーサーの脳内への移動は、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、野生型（ＷＴ）の対照と比較して有意に低下した（各時点ｎ＝４〜５、＊Ｐ＜０．０５）。スケールバーは、４０ｍｍ（４Ａ）、２０ｍｍ（４Ｄ）、および１０ｍｍ（４Ｂおよび４Ｃ）。
【図４−２】傍血管アクアポリン４（ＡＱＰ４）は、脳間質経由のＣＳＦの流動を促進することを示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。（４Ｆ）くも膜下ＣＳＦの脳実質内への移動およびこれを通じた移動に対する、ＡＱＰ４媒介型の液流の寄与をｅｘ  ｖｉｖｏで評価した図である。トレーサー標識を定量化すると、注射後３０分経過したときの大槽内注射したトレーサーの脳内への移動は、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、野生型（ＷＴ）の対照と比較して有意に低下した（各時点ｎ＝４〜５、＊Ｐ＜０．０５）。（４Ｇ）皮質内への低分子量（ＴＲ−ｄ３）（暗青色）および高分子量（ＦＩＴＣ−ｄ２０００）（緑色）大槽内トレーサーの流入をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した図である。大脳の脈管構造を動脈内ＣＢ−ｄ１０により可視化した（挿入図）。併合部（水色）は、ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００の同時局在を示す。（４Ｈ）高分子量トレーサー（緑色）の傍動脈腔に沿った移動［緑色の丸で示す対象部位（ＲＯＩ）内の平均蛍光強度により測定］は、ＷＴ対照動物と比較してＡｑｐ４−ｎｕｌｌでは有意な変化を認めなかったことを示す図である。（４Ｉ）低分子量トレーサーの貫通細動脈周辺の間質内への移動（青色２重丸で示すＲＯＩ内の平均蛍光強度により測定）は、ＷＴ対照と比較してＡｑｐ４−ｎｕｌｌでは認められず（１群当たりｎ＝６、＊Ｐ＜０．０１）、Ａｑｐ４遺伝子欠損は、大槽内注射したトレーサーの皮質実質を通じた移動に影響を及ぼすことを実証している。ＡＵは任意単位。スケールバーは、１００ｍｍ（４Ｇ）。
【図５−１】[00123]グリンファティック系は、間質内溶質および液の脳からのクリアランスを補助することを示した図である。（５Ａ）間質内溶質のクリアランスに関する役割を評価するために、線条内［３Ｈ］マンニトールの脳からの除去を測定した図である（詳細については図１４Ａを参照）。注射後最初の２時間において、線条内［３Ｈ］マンニトールのＡｑｐ４−ｎｕｌｌマウス脳からのクリアランスは、ＷＴ対照と比較して有意に低下した（＊Ｐ＜０．０１、各時点ｎ＝４）。
【図５−２】グリンファティック系は、間質内溶質および液の脳からのクリアランスを補助することを示した図である。（５Ｂ）グリンファティック経路を示す概略図である。このような脳網羅的経路では、ＣＳＦは傍動脈経路に沿って脳に進入するが、一方ＩＳＦは傍静脈経路に沿って脳からクリアランスされる。これらの流入経路とクリアランス経路の間で生じる対流性のバルクＩＳＦ流は、ＡＱＰ４−依存性のアストログリア水流により促進され、またこの流れは、脳実質からの間質内溶質および液のクリアランスを駆動する。ここから、溶質および液はくも膜下ＣＳＦ内に分散し得るが、これは後毛細血管脈管構造経由で血流に進入する、または流出静脈の壁を伝わって頚部リンパ管に到達する。
【図６−１】[00124]間質内Ａβは、傍血管経路に沿ってクリアランスされることを示した図である。間質内可溶性アミロイドＡβが、その他のトレーサーと同一の経路に沿ってクリアランスされるのかを評価するために、蛍光または放射能標識されたアミロイドβ１−４０をマウス線条体に注射した。（６Ａ）図１４Ａおよび１４Ｂに詳記するように、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０注射後１５分、３０分、または１時間経過して、全脳放射量を測定した図である。ＷＴ動物では、ｔ＝６０分において、Ｉ−アミロイドβ１−４０は、［３Ｈ］マンニトールまたは［３Ｈ］デキストラン−１０より急速にクリアランスされた。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、Ｉ−アミロイドβ１−４０のクリアランスは有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５、各時点ｎ＝４〜６）。（６Ｂ〜６Ｄ）Ｔｉｅ２−ＧＦＰマウスにＨｙＬｙｔｅ−５５５−アミロイドβ１−４０を注射した後１時間経過して、トレーサーは、毛細血管（６Ｄ、矢印）および大流出静脈（６Ｂおよび６Ｃ）に沿って蓄積したことを示す図である。図６Ｃの画像は、内皮性のＧＦＰ蛍光シグナルを有さない図６Ｂを表す。スケールバーは５０ｍｍ。
【図６−２】間質内Ａβは、傍血管経路に沿ってクリアランスされることを示した図である。間質内可溶性アミロイドＡβが、その他のトレーサーと同一の経路に沿ってクリアランスされるのかを評価するために、蛍光または放射能標識されたアミロイドβ１−４０をマウス線条体に注射した。（６Ｅ）ＣＳＦ内の可溶性Ａβが、脳実質を通じて再循環し得るのかを評価するために、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０を大槽内注射し、そして注射後１５分、３０分、および４５分経過して、（図８に示すように）脳内への放射性トレーサーの流入を評価した図である。１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０は、［３Ｈ］デキストラン−１０に匹敵するように脳に進入し、またＷＴ対照と比較してＡｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０の流入は有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５、各時点ｎ＝４〜６）。
【図７】[00125]脳実質内蛍光ＣＳＦトレーサー分布の定量に関する図である。大槽内にＡ５９４、ＴＲ−ｄ３、およびＦＩＴＣ−ｄ２０００注射を実施した後、動物を潅流固定し、そして１００μｍのビブラトーム切片に切り出した。落射蛍光顕微鏡検査法により、４倍でスライスを画像化し、モンタージュを作成した。トレーサーの分布範囲を評価するために、カラーチャンネルを分離し、画像のバックグラウンドを差し引き、一定の閾値を設定し、閾値を満たした面積を計算し、そして全スライス面積に占める割合（％）として表した。
【図８】[00126]くも膜下ＣＳＦの脳実質内進入量の測定に関する図である。くも膜下ＣＳＦの脳実質内進入量の測定を示す概略図である。３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉ−Ａβ１−４０を大槽内注射した。脳実質内の放射性トレーサー蓄積量を定量化するために、放射性トレーサー注射後１５分、３０分、または４５分経過して脳を採集した。脳をＳｏｌｕｅｎｅ中で可溶化し、次に全脳放射能を液体シンチレーション計数法により測定した。脳放射能の割合（Ｒ’Ｂｒａｉｎ）を、測定された全脳放射能（ＲＢｒａｉｎ）および注射した全放射能（ＲＩｎｊｅｃｔ）に基づき計算した。採集期間中、硬膜を脳から除去した。したがって、脳ホモジネートには、くも膜下ＣＳＦコンパートメント内に残留する放射性トレーサーは含まれない。
【図９−１】[00127]低分子量および高分子量トレーサーの傍動脈流入に関するｉｎ  ｖｉｖｏ画像である。カラーコーディングは、グレースケールに変換されている。異なる分子量を有する２つのデキストラン（ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００）の傍動脈経路に沿った移動、および皮質間質内への移動を、麻酔したマウスについて、閉鎖頭蓋窓内、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子レーザースキャニング顕微鏡検査法により画像化した。（９Ａ）大脳の脈管構造を動脈内カスケードブルーデキストラン−１０（ＣＢ−ｄ１０）により可視化し、また貫通細動脈（Ａ）および静脈（Ｖ）を形態学的に識別した図である（それぞれ赤丸および青丸）。（９Ｂ）傍動脈および傍静脈経路に沿った低分子量および高分子量トレーサーの移動を、貫通血管を中心とする円形のＲＯＩ内の平均蛍光強度を測定することにより評価した図である。周辺間質内へのトレーサーの移動を、貫通血管を中心とする二重丸型のＲＯＩ（赤色および青色の破線二重丸）における平均蛍光強度を測定することにより定義した。スケールバー：１００μｍ。
【図９−２】低分子量および高分子量トレーサーの傍動脈流入に関するｉｎ  ｖｉｖｏ画像である。カラーコーディングは、グレースケールに変換されている。異なる分子量を有する２つのデキストラン（ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００）の傍動脈経路に沿った移動、および皮質間質内への移動を、麻酔したマウスについて、閉鎖頭蓋窓内、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子レーザースキャニング顕微鏡検査法により画像化した。（９Ｃおよび９Ｄ）傍動脈および傍静脈経路に沿った低分子量および高分子量トレーサーの移動を、貫通血管を中心とする円形のＲＯＩ内の平均蛍光強度を測定することにより評価した図である。周辺間質内へのトレーサーの移動を、貫通血管を中心とする二重丸型のＲＯＩ（赤色および青色の破線二重丸）における平均蛍光強度を測定することにより定義した。（９Ｃ）低分子量トレーサーは、傍動脈腔（赤色実線）から傍動脈（赤色破線）および傍静脈（青色破線）間質内に速やかに移動した。曲線間で統計的有意差が認められない（Ｐ＝０．０５６、１群当たりｎ＝６）ことから、このトレーサーは傍動脈腔から外側に向かって比較的制限のない移動が可能であることが指摘される。（９Ｄ）高分子量トレーサーは、貫通細動脈に沿って皮質内に速やかに移動したが（赤色実線）、貫通細静脈に沿っては移動しない（青色実線；＊Ｐ＜０．０１、１群当たりｎ＝６）。貫通細動脈および静脈周辺組織内で測定されたトレーサー強度（それぞれ赤色破線および青色破線）は、傍静脈腔について認められた濃度と同じ低濃度に留まった。したがって、高分子量トレーサーは、傍動脈腔に主に限定して留まり、脳の間質内には速やかに進入しない。スケールバー：１００μｍ。
【図１０−１】[00128]ＣＳＦは傍静脈経路に沿って脳実質に進入しないことを示した図である。傍静脈と比較して、傍動脈のくも膜下ＣＳＦトレーサー流入を評価するために、ＯＡ−６４７をＴｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスに大槽内注射した。（１０Ａ）これらのマウスでは、すべての血管の内皮細胞はＧＦＰで標識され、一方、血管平滑筋細胞および周細胞はＤｓＲｅｄで標識されていることを示す図である。したがって動脈および細動脈（黒色矢印頭部）は際立った周辺領域のＤｓＲｅｄ標識の存在により容易に区別されるが、一方、静脈（白色矢印頭部）ではかかる標識を欠いている。ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウス由来の脳スライスを内皮マーカーＣＤ−３１で標識すると、動脈のＮＧ２−ＤｓＲｅｄ標識特異性が認められる（右）。（１０Ｂ）大脳皮質では、大槽内トレーサーは、ＤｓＲｅｄ＋貫通細動脈に沿って脳に進入するが、ＤｓＲｅｄ−静脈に沿っては進入しないことを示す図である。遠位側静脈の標識がときに認められるが、中間に位置する毛細血管床を経由する傍細動脈流入経路に一般的に由来する。スケールバー：１００μｍ（１０Ｂ）、５０μｍ（１０Ａ）。
【図１０−２】ＣＳＦは傍静脈経路に沿って脳実質に進入しないことを示した図である。傍静脈と比較して、傍動脈のくも膜下ＣＳＦトレーサー流入を評価するために、ＯＡ−６４７をＴｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスに大槽内注射した。（１０Ｃ〜１０Ｅ）腹側脳表面に沿った大型の血管は、同様のパターンを示すという図である。大型の貫通動脈周辺の傍血管腔（黒色矢印頭部、Ｄ）は、実質内への大流量のＣＳＦトレーサーを移動せしめるが、一方、トレーサーは、基底流出静脈に沿って実質内に多くは通過しない（白色矢印頭部、Ｅ）。スケールバー：１００μｍ（１０Ｃ）、２０μｍ（１０Ｄおよび１０Ｅ）。
【図１１−１】[00129]大槽内注射および実質内注射したトレーサーは、同一の傍静脈排液経路を共有することを示した図である。Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスにＯＡ−６４７を実質内注射した。（１１Ａおよび１１Ｂ）皮質内注射したトレーサーは、微小血管構造周囲に蓄積し、注射部位から外側に向かって、傍毛細血管経路および傍静脈（矢印頭部）経路に沿って最も急速に移動したことを示す図である。スケールバー：５０μｍ（１１Ｂ）、２０μｍ（１１Ａ）。
【図１１−２】大槽内注射および実質内注射したトレーサーは、同一の傍静脈排液経路を共有することを示した図である。Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重レポーターマウスにＯＡ−６４７を実質内注射した。（１１Ｃおよび１１Ｄ）線条内トレーサーも、毛細血管および細静脈周囲に同様に蓄積したことを示す図である。灰白質内に注射したトレーサーは、白質束から除去された（アスタリスク、Ｄ）。（１１Ｅ）実質内トレーサーは、主に内大脳および尾部鼻静脈に沿って脳からクリアランスされたが、皮質上行静脈および細静脈に沿った少なめのクリアランスも認められたことを示す図である。スケールバー：５０μｍ（１１Ｄおよび１１Ｅ）、２０μｍ（１１Ｃ）。
【図１２】[00130]野生型マウスおよびＡｑｐ４−ｎｕｌｌマウスを対象として、トレーサーの傍血管蓄積およびＶｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔について行った可視化を示した図である。（１２Ａおよび１２Ｂ）大槽内注射したＦＩＴＣ−ｄ４０を、ＤＡＢ免疫組織化学検査法により可視化した図である。注射後５分経過すると、反応生成物が、野生型動物の貫通皮質血管（挿入図の矢印）に沿って明らかとなる（１２Ａ）。血管周囲の標識強度は、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物ではかなり弱めである（１２Ｂ）。挿入図は、高倍率での頭頂皮質内の標識を示す。（１２Ｃおよび１２Ｄ）貫通皮質細動脈周辺の近接する傍血管腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔、ＶＲＳ）内の高電子密度ＤＡＢ反応生成物を示す電子顕微鏡写真である。野生型動物（１２Ｃ）と比較して、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物（１２Ｄ）のＶＲＳは、超微細構造的には不変と思われる。（１２Ｅ）皮質表面下方約１０００μｍを可視化した、未注射のＡｑｐ４−ｎｕｌｌ動物のＶＲＳを示した図である。挿入図は、貫通血管周囲のＶＲＳの幅を示す（野生型動物の場合ｎ＝１０、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物の場合ｎ＝１１；数値は、平均値±ＳＥＭ）。ＥＮＤＯは内皮細胞；ＶＳＭは血管平滑筋細胞。スケールバー：５００μｍ（１２Ａおよび１２Ｂの挿入図）、１μｍ（１２Ｃ〜１２Ｅ）。
【図１３−１】[00131]動脈周囲のアストロサイトと静脈周囲のアストロサイトにおけるＡＱＰ４の差次的発現を示した図である。（１３Ａおよび１３Ｂ）ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウスの皮質内ＡＱＰ４に対する免疫蛍光標識を示した図である。貫通動脈は、血管平滑筋の高強度の周辺部ＤｓＲｅｄ標識により容易に区別されるが（１３Ａ、黒色矢印頭部）、一方、上行静脈は不定なＤｓＲｅｄ標識を示す（１３Ｂ、白色矢印頭部）。
【図１３−２】動脈周囲のアストロサイトと静脈周囲のアストロサイトにおけるＡＱＰ４の差次的発現を示した図である。（１３Ｃ）血管周囲エンドフィートにおけるＡＱＰ４免疫応答の定量に関する図であり、バックグラウンドＡＱＰ４強度に標準化されている。動脈周囲エンドフィートのＡＱＰ４発現量は、毛細血管周囲または静脈周囲のエンドフィートよりも有意に少なかった（＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ；３動物より動脈ｎ＝２４、静脈１９、および毛細血管４３）。（１３Ｄ）ＡＱＰ４免疫応答性を２０μｍの血管壁内で測定したとき（エンドフィートを除く）、動脈周囲のＡＱＰ４強度は、毛細血管レベル周辺と比較して有意に低下したことを示す図である（＊Ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。これは主として、血管周辺最大５０μｍまでＡＱＰ４免疫応答性標識の際立った欠損を示した貫通動脈の部分母集団（群全体の約４０％）に起因した（１３Ａに認められる）。
【図１４】[00132]間質内溶質の脳からのクリアランス測定に関する図である。（１４Ａ）間質内溶質の脳実質からのクリアランスに関する測定を示す概略図である。３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０を線条体内に注射した。実質からの放射性トレーサーのクリアランスを定量化するために、放射性トレーサー注射後、ｔ＝１時間または２時間時点で脳を採集した。脳を可溶化し、次に全脳放射能を液体シンチレーション計数法により測定した。測定された全脳放射能（ＲＢｒａｉｎ）および注射した全放射能（ＲＩｎｊｅｃｔ）に基づき、残留する脳放射能（Ｒ’Ｂｒａｉｎ）を計算した。脳採集時に硬膜を除去した。したがって、測定されたＲＢｒａｉｎ値には、くも膜下腔内に存在する放射性トレーサーは含まれない。（１４Ｂ）Ａｑｐ４遺伝子欠損が、実質内注射した３Ｈ−デキストラン−１０の脳からのクリアランスに与える効果を示した図である。野生型動物では、３Ｈ−マンニトールおよび３Ｈ−デキストラン−１０のいずれも、同一速度で脳からクリアランスされた。これは、バルク流媒介型輸送は［拡散（９）とは対照的に］分子量（４）とは独立である、という観察結果に一致する。Ａｑｐ４遺伝子欠損は、３Ｈ−マンニトールの場合と同様に、３Ｈ−デキストラン−１０の流出に影響を及ぼし（図５Ｂ）、脳実質からのそのクリアランス速度を顕著に低下させた（＊Ｐ＜０．０１、各時点ｎ＝４）。
【図１５−１】[00133]傍血管バルク流路および間質性のバルク流路を示した概略図である。（１５Ａ）傍動脈流入経路と間質コンパートメントとの間のバルク水流促進における、動脈周囲のアストログリアのエンドフィートＡＱＰ４の役割について、提示された案を示す概略図である。ＡＱＰ４の発現量が高いので、水は血管周囲のエンドフィートを自由に通過する。小型の溶質は、蛍光トレーサーＴＲ−ｄ３（ＭＷ３ｋＤ）を含め、結果として生じた浸透圧勾配に沿って、重複性のエンドフィートプロセス間の細胞間間隙を通じて間質内に至る。大型の溶質は、ＦＩＴＣ−ｄ２０００（ＭＷ２０００ｋＤ）を含め、この間隙を通過することができず、傍血管腔内に保持される。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、傍血管腔と間質との間の水流は低下し、付随的な溶質の間質内への移動も同様である。挿入図は、ＴＲ−ｄ３、ＦＩＴＣ−ｄ２０００［ｄＨ、水和直径（９）］、およびエンドフィート間の間隙（１７）の物理的な寸法を表す。
【図１５−２】傍血管バルク流路および間質性のバルク流路を示した概略図である。（５Ｂ）対流性のＩＳＦバルク流および間質内溶質のクリアランスについて、その維持におけるアストログリアＡＱＰ４の役割に関して提示された案を示す詳細な概略図である。傍動脈ＡＱＰ４および傍静脈ＡＱＰ４は、傍動脈流入経路と傍静脈クリアランス経路との間の水の自由な移動を可能にする。この対流性の水流は、間質内溶質およびトレーサー（例えば、３Ｈ−マンニトールおよび３Ｈ−デキストラン−１０等）をその経路に沿って押し流す。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、傍血管腔と間質との間の水流は低下し、間質内溶質のクリアランス不具合を引き起こす。挿入図は、３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、およびエンドフィート間の間隙の物理的な寸法を表す。
【図１６】[00134]標準化されたシグナル強度（平均値±ＳＤ）を、ＦＬＡＳＨ  ＭＲＩシーケンスにおけるフリップ角の関数としてプロットした図であり、常磁性造影剤（２１ｍＭジエチレントリアミンペンタアセテート（ＧＤ−ＤＴＰＡ）および０．１７ｍＭ  ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標））と０．９％ＮａＣｌとの容積比として規定される１：１９の希釈比において、３７℃にて測定する。標準化は、フリップ角につき強度をその最大値で除算することにより実施される。
【図１７】[00135]縦緩和時間（Ｔ１）を、３７℃における希釈比の関数としてプロットした図であり、希釈比は０．９％ＮａＣｌと常磁性造影剤との容積比により対数目盛で規定される。
【図１８−１】[00136]常磁性造影剤の傍血管流入を示した図である。（１８Ａ）造影剤投与前に、ラット脳内の重要な解剖学的構造を３次元可視化した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。解剖学的構造には、脳下垂体（水色）、海馬（緑色）、上丘（オレンジ色）、下丘（暗青色）、および松果腺（黄色）が含まれる。嗅動脈（ＯＡ）、不対の前大脳動脈（ａｚＡＣＡ）、不対の脳梁周囲動脈（ＡｚＰＡ）、中間内側前頭動脈（ＩＦＡ）、および後側部脈絡膜動脈複合体を可視化した。（１８Ｂ）２次元Ｔ１−重み付けＭＲＩであり、カラーコード化された解剖学的構造と共に示す図である。
【図１８−２】常磁性造影剤の傍血管流入を示した図である。（１８Ｃおよび１８Ｄ）低分子量常磁性造影剤、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ９３８Ｄ）の初期の流入を示す時系列図である。髄腔内注入されたＧｄ−ＤＴＰＡが大槽内に現れる時刻を「０」分と定義し（１８Ｃ）、流入プロセスの最初期の部分を後続するタイムフレーム内に示す（１８Ｄ）；そしてＧｄ−ＤＴＰＡが傍血管経路に沿って脳に進入することを示す。
【図１８−３】常磁性造影剤の傍血管流入を示した図である。（１８Ｅ）低分子量常磁性造影剤、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ９３８Ｄ）の初期の流入を示す時系列図である。髄腔内注入されたＧｄ−ＤＴＰＡが大槽内に現れる時刻を「０」分と定義し（１８Ｃ）、流入プロセスの最初期の部分を後続するタイムフレーム内に示す（１８Ｅ）；そしてＧｄ−ＤＴＰＡが傍血管経路に沿って脳に進入することを示す。（１８Ｆ）高分子量常磁性造影剤、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００ｋＤ）の初期の流入に関する動的時系列図であり、やはり脳内への輸送は傍血管であることを示す。２つの常磁性造影剤は、分子量が異なるにもかかわらず、類似した速度で傍血管導管を通過するのは明白であり、ＣＳＦバルク流によるこのプロセスの制御を裏付けることに留意されたい。
【図１８−４】常磁性造影剤の傍血管流入を示した図である。（１８Ｇおよび１８Ｈ）高分子量常磁性造影剤、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００ｋＤ）の初期の流入に関する動的時系列図であり、やはり脳内への輸送は傍血管であることを示す。２つの常磁性造影剤は、分子量が異なるにもかかわらず、類似した速度で傍血管導管を通過するのは明白であり、ＣＳＦバルク流によるこのプロセスの制御を裏付けることに留意されたい。
【図１８−５】常磁性造影剤の傍血管流入を示した図である。（１８Ｉおよび１８Ｊ）常磁性造影剤の傍血管輸送を示した図であり、内頚（ＩＣ）動脈、後交通（Ｐｃｏｍ）動脈、および外側眼窩前頭動脈に沿って、ウィリス動脈輪のレベルにおいて特に明瞭に示す。
【図１９】[00137]大脳基底槽に投与され、「グリンファティック経路」を通じて移動するＧｄ−ＤＴＰＡの動的ディスプレー（動画）から採られた静止画像である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ常磁性造影剤は、動画内では緑色／青色で表わされ、各タイムフレームを４．１／分で示した。ラット脳の重要な解剖学的構造を、小脳（褐色）、松果腺（黄色）、上丘（オレンジ色）、下丘（赤色）、脳下垂体（白）、および大基底動脈（赤色）を含め、３次元で示した（動画内のカラーコーディングは、この静止画像では示さない）。Ｇｄ−ＤＴＰＡが、大血管と関連した傍血管経路に沿って大脳基底槽から移動し、次に脳実質に進入し、そして脳から出て、篩板を経由して鼻腔内に進入することも認められた。Ｇｄ−ＤＴＰＡの移動を約４時間にわたり取得した。造影剤はなおもクリアランスされず、４時間経過時には松果体の陥凹、嗅球、および大脳基底槽において顕在した。
【図２０】[00138]大脳基底槽内に投与され、「グリンファティック経路」を通じて移動するＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の動的ディスプレー（動画）から採られた静止画像である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）常磁性造影剤は、動画内では緑色／青色で表わされ、各タイムフレームを４．１／分で示した。ラット脳の重要な解剖学的構造を、小脳（褐色）、松果腺（黄色）、上丘（オレンジ色）、下丘（赤色）、脳下垂体（白）、および大基底動脈（赤色）を含め、３次元で示した（動画内のカラーコーディングは、この静止画像では示さない）。Ｇｄ−ＤＴＰＡと同様に、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）も、傍血管導管に沿ってグリンファティック経路の最も近接した部分に進入した。しかし、脳間質腔へのアクセスをより容易に実現するより小分子の造影剤であるＧｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ９３８Ｄａ）とは対照的に、より大分子のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００，０００Ｄａ）は、傍血管コンパートメント内に選好的に留まった。
【図２１−１】[00139]グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、脳下垂体の陥凹（２１Ａ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。（２１Ａ）脳下垂体の陥凹への造影剤の取り込みは、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について概ね類似することが明白である。これより、グリンファティック経路の近接部分では、常磁性造影剤の輸送は、概ね分子サイズと独立であることが確認される。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１−２】グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、松果体の陥凹（２１Ｂ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。（２１Ｂ）松果体の陥凹への造影剤の取り込みは、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について概ね類似することが明白である。これより、グリンファティック経路の近接部分では、常磁性造影剤の輸送は、概ね分子サイズと独立であることが確認される。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１−３】グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、小脳（２１Ｃ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。（２１Ｃ）Ｇｄ−ＤＴＰＡの組織への取り込み量は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について小脳（２１Ｃ）において認められた取り込み量より有意に高いことも明白である。これより、くも膜下／近接する傍血管経路から脳間質内への移動およびこれを経由する造影剤の移動は、確かに分子サイズに依存することが確認される。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１−４】グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、嗅球（２１Ｄ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１−５】グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、水管（２１Ｅ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。（２１Ｅ）Ｇｄ−ＤＴＰＡの組織への取り込み量は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について水管（２１Ｅ）において認められた取り込み量より有意に高いことも明白である。これより、くも膜下／近接する傍血管経路から脳間質内への移動およびこれを経由する造影剤の移動は、確かに分子サイズに依存することが確認される。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２１−６】グリンファティック経路に沿ったＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の輸送を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（青く塗りつぶした丸）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（赤く塗りつぶした丸）の平均時間活性曲線（ＴＡＣ）を、橋核（２１Ｆ）について示す。各対象領域の場所を、各グラフの上側右隅にある矢状断面の脳のアイコンに示す。（２１Ｆ）Ｇｄ−ＤＴＰＡの組織への取り込み量は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について橋核（２１Ｆ）において認められた取り込み量より有意に高いことも明白である。これより、くも膜下／近接する傍血管経路から脳間質内への移動およびこれを経由する造影剤の移動は、確かに分子サイズに依存することが確認される。データは、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【図２２−１】[00140]ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ａ）解剖学的ランドマークを共に表示した、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）投与前の水管（Ａｑ）レベルにおけるＴ１−重み付け矢状正中切片の図である：ａｚＡＣＡ＝不対の前大脳動脈；ＢＣ＝大脳基底槽；ＢＡ＝基底動脈；Ｃｂ＝小脳；ＧＡ＝Ｇａｌｅｎ静脈；ＩＦＡ＝中間内側前頭動脈；Ｏｂ＝嗅球；ＯＡ＝嗅動脈；Ｐｉｎ＝松果腺；Ｐｉｔ＝脳下垂体。（２２Ｂ）ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットにおけるクラスター分析図である。クラスター分析データのカラーコーディングをグレースケールで表す。傍血管クラスターを対応するＭＲＩに重ね、赤色およびオレンジ色のクラスターが、大脳基底槽、松果体の陥凹と脳下垂体の陥凹、および主要動脈の直近に位置する組織の空間的な位置と一致することを示す。
【図２２−２】ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ｃ）同一のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットに由来する青色および緑色のクラスターの分布を示した図であり、これらのクラスターは実質の位置により多く認められることを示す。（２２Ｄ）すべてのクラスターを同時に示し、ＭＲＩに重ねた図である；傍血管導管内の赤色およびオレンジ色のクラスターは、「ゾーン１」として、緑色のクラスターは、「ゾーン２」として、および青色のクラスターは「ゾーン３」として分類する。
【図２２−３】ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ｅ）解剖学的ランドマークを共に表示した、Ｇｄ−ＤＴＰＡ投与前のラットに由来する、水管（Ａｑ）レベルにおけるＴ１−重み付けＭＲＩの図である。（２２Ｆ）Ｇｄ−ＤＴＰＡラット由来の傍血管、ゾーン１クラスターを示した図である。
【図２２−４】ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ｇ）Ｇｄ−ＤＴＰＡラットにおける緑色および青色のクラスター分布を示した図である。（２２Ｈ）４つのクラスターすべてを示した図である；赤色、緑色、および青色クラスターは、ゾーン１、２、および３としてそれぞれ分類される。
【図２２−５】ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ｉ）ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラット（２２Ｉ）に関する４つのクラスターそれぞれの時間活性曲線（ＴＡＣ）を、各クラスターの合計ボクセル数に加えて示した図である。
【図２２−６】ラット脳におけるＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のクラスターに基づく空間分布を示した図である。（２２Ｊ）Ｇｄ−ＤＴＰＡラット（２２Ｊ）に関する４つのクラスターそれぞれの時間−活性曲線（ＴＡＣ）を、各クラスターの合計ボクセル数に加えて示した図である。
【図２３−１】[00141]傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換の蛍光に基づく画像を示した図である。低分子量（テキサスレッド−デキストラン３、ＴＲ−ｄ３；ＭＷ３ｋＤ）および高分子量（ＦＩＴＣ−ｄ５００；ＭＷ５００ｋＤ）蛍光トレーサーを髄腔内に注射し、従来型およびレーザースキャニング共焦点蛍光顕微鏡検査法によりｅｘ  ｖｉｖｏで画像化した。（２３Ａ）注射後３０分における、傍血管（矢印頭部）ＣＳＦトレーサーの脳内への流入を示す全スライスのモンタージュを示す。（２３Ｂ）注射後３０分経過して血管内皮マーカーのイソレクチンＢ４（ＩＢ４）でカウンター標識した冠状スライスの図である。（２３Ｃ）ＣＳＦトレーサーは、流出静脈に沿ってではなく（２３Ｅ）、貫通動脈（矢印頭部）に沿って脳に進入することを示すハイパワー共焦点画像である。高分子量ＦＩＴＣ−ｄ５００は、傍血管腔に限定したままであるが、低分子量のＴＲ−ｄ３は、周辺の間質内に、およびこれを通じて速やかに移動することを示す。
【図２３−２】傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換の蛍光に基づく画像を示した図である。低分子量（テキサスレッド−デキストラン３、ＴＲ−ｄ３；ＭＷ３ｋＤ）および高分子量（ＦＩＴＣ−ｄ５００；ＭＷ５００ｋＤ）蛍光トレーサーを髄腔内に注射し、従来型およびレーザースキャニング共焦点蛍光顕微鏡検査法によりｅｘ  ｖｉｖｏで画像化した。（２３Ｆおよび２３Ｈ）注射後６０分（２３Ｆ）および１８０分（２３Ｈ）における、傍血管（矢印頭部）ＣＳＦトレーサーの脳内への流入を示す全スライスのモンタージュを示す。（２３Ｄ）ＣＳＦトレーサーは、流出静脈に沿ってではなく（２３Ｅ）、貫通動脈（矢印頭部）に沿って脳に進入することを示すハイパワー共焦点画像である。高分子量ＦＩＴＣ−ｄ５００は、傍血管腔に限定したままであるが、低分子量のＴＲ−ｄ３は、周辺の間質内に、およびこれを通じて速やかに移動することを示す。（２３Ｆ）注射後６０分経過して、低分子量のＴＲ−ｄ３は、脳の間質全体に拡散的に局在し、一方、高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００は、末端の毛細血管床に沿って認められる（Ｇ）。挿入図は、ＦＩＴＣ−ｄ５００による毛細血管標識範囲を示すスタック画像のｚ−投影図を表す。（２３Ｈ）注射後１８０分経過時点では、実質のトレーサー濃度は、注射後３０分および６０分と比較して低下しているが、髄腔内のトレーサーは、傍静脈クリアランス経路に沿って保たれる（２３Ｉ）。
【図２４】[00142]ラットを対象として造影ＭＲＩにより評価した、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換に関する脳網羅的なグリンファティック経路を示した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。ラットを対象として、造影ＭＲＩにより評価した、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換に関する脳全体のグリンファティック経路。大槽髄腔内に注射した後、造影剤は、特定の傍血管経路（黄色矢印）を辿り、脳実質に進入し、間質コンパートメントと交換する（オレンジ色の矢印および範囲）。動画シリーズの取得により、松果体（Ｐｉｎ）および脳下垂体（Ｐｉｔ）の陥凹における重要なＣＳＦ流入ノードが識別され、脳全体を通じて、グリンファティックＣＳＦ−ＩＳＦ交換の程度および速度に偏りを生じさせる、単純な動力学的パラメータの導出が可能となった。Ｃｂ：小脳；Ｏｂ：嗅球；ＢＡ：脳底動脈；ＯＡ：嗅動脈。
【図２５−１】[00143]マウスおよびラットを対象に、大槽内ＣＳＦトレーサーの流入およびクリアランスを評価した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。テキサスレッド結合デキストラン（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ；注射後ｔ＝３０分）を大槽内注射した後のマウス（２５Ａおよび２５Ｃ）およびラット（２５Ｂおよび２５Ｄ）脳に由来する代表的な、前方（２５Ａおよび２５Ｂ）および後方（２５Ｃおよび２５Ｄ）冠状スライスは、種間で類似したトレーサー分布を示す。
【図２５−２】マウスおよびラットを対象に、大槽内ＣＳＦトレーサーの流入およびクリアランスを評価した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。異なる脳領域：前方（２５Ｅおよび２５Ｆ）脳の皮質（青色）、白質（グレー）、海馬（マゼンタ）、および皮質下構造（赤色）において、組織の蛍光を評価した。（２５Ｆ）各領域内について平均蛍光強度を定量した図である（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５；皮質に対して＃＃Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【図２５−３】マウスおよびラットを対象に、大槽内ＣＳＦトレーサーの流入およびクリアランスを評価した図である。カラーコーディングはグレースケールに変換されている。異なる脳領域：後方（２５Ｇおよび２５Ｈ）脳の皮質（青色）、白質（グレー）、海馬（マゼンタ）、および皮質下構造（赤色）において、組織の蛍光を評価した。（２５Ｈ）各領域内について平均蛍光強度を定量した図である（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５；皮質に対して＃＃Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【図２６−１】[00144]分子量が、腰部髄腔内注射後のトレーサーの脳内流入に及ぼす効果を示した図である。（２６Ａおよび２６Ｂ）腰部髄腔内同時注射後、１２０分経過した時点で、高分子量のＦＩＴＣ結合デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ５００、ＭＷ５００ｋＤ）、および低分子量のテキサスレッド結合デキストラン（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）について、これらの貫通を示す冠状脳スライスの図である。ＦＩＴＣ−ｄ５００は、主として傍血管腔に限定されるが（２６Ｂ、矢印）、ＴＲ−ｄ３は、傍血管腔（２６Ａ、矢印）または軟膜表面（矢印頭部）から脳実質を通じて速やかに移動する。
【図２６−２】分子量が、腰部髄腔内注射後のトレーサーの脳内流入に及ぼす効果を示した図である。（２６Ｃおよび２６Ｄ）皮質、白質、皮質下構造、および海馬に解剖学的に細分化された、腰部髄腔内注射後の前方脳内への蛍光トレーサーの流入量を定量化した図である。（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１；皮質対白質＃＃Ｐ＜０．０１；皮質対海馬†Ｐ＜０．０５、††Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【図２６−３】分子量が、腰部髄腔内注射後のトレーサーの脳内流入に及ぼす効果を示した図である。（２６Ｅおよび２６Ｆ）皮質、白質、皮質下構造、および海馬に解剖学的に細分化された、腰部髄腔内注射後の後方脳内への蛍光トレーサーの流入量を定量した図である。（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１；皮質対白質＃＃Ｐ＜０．０１；皮質対海馬†Ｐ＜０．０５、††Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【図２７−１】[00145]大槽内および腰部髄腔内注射後のＣＳＦトレーサーの局在を示した図である。（２７Ａ〜２７Ｆ）大槽内注射後３０分経過時点におけるＦＩＴＣ結合デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ５００、ＭＷ５００ｋＤ）およびテキサスレッド結合デキストラン（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）の局在を示す。高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００は貫通動脈周辺の傍血管腔（矢印）に限定して残留し（２７Ａおよび２７Ｂ）、また末端の毛細血管床のレベルまで延在した（２７Ｃ〜２７Ｆ、矢印）。低分子量のＴＲ−ｄ３は、脳の間質内に急速に移動し、ニューロンの部分母集団により取り込まれた（矢印頭部）。ＧＦＡＰ：グリア線維酸性タンパク質（アストロサイトマーカー）；ＩＢ４：イソレクチンＢ４（血管内皮マーカー）。
【図２７−２】大槽内および腰部髄腔内注射後のＣＳＦトレーサーの局在を示した図である。（２７Ｇ〜２７Ｌ）トレーサーを腰部髄腔内注射した後１２０分経過して、高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００は、血管周囲腔（矢印）に蓄積したが、大槽内注射後に認められたほどには均一ではなかったことを示す。低分子量のＴＲ−ｄ３は、脳実質全体に速やかに移動した。ＧＦＡＰ：グリア線維酸性タンパク質（アストロサイトマーカー）；ＩＢ４：イソレクチンＢ４（血管内皮マーカー）。
【図２８】[00146]ＣＳＦ注入速度に応じて増加したＡβ４０およびイヌリンの脳外クリアランスについて示した図である。
【図２９】[00147]ＣＳＦ注入時間に応じて増加したＡβ４０（２９Ａ）およびイヌリン（２９Ｂ）の脳外クリアランスについて示した図である。
【図３０】[00148]ＣＳＦ注入後３０分（３０Ａ）および６０分（３０Ｂ）経過時点における、前頭皮質からのＡβ４０およびイヌリンの脳外クリアランスについて示した図である。
【図３１】[00149]実験装置の図である。３１Ａ．勾配磁場インサートを備えた９．４ＴマイクロＭＲＩ管装置。３１Ｂ．４００ＭＨｚに調整および適合させたＲＦサドルコイル。３１Ｃ．磁石の中心部に位置するＰＥＴ／ＭＲＩデバイス内に仰臥位で入れられるラット。モニタリングトレースを下に示す。
【図３２−１】[00150]髄腔内１８ＦＤＧは、脳全体のグリンファティック輸送の評価においてＤＴＰＡよりも優れることを示した図である。（３２Ａ）ＰＥＴ−ＭＲＩによるダイナミック画像化期間中に髄腔内Ｇｄ−ＤＴＰＡ−１８ＦＤＧ投与を受けたラットに由来する脳画像である。Ｔ−重み付けＭＲＩに示すＧｄ−ＤＴＰＡの分布では、大脳基底槽、小脳、および脳橋において高強度のシグナルを強調している。（３２Ｂ）時間経過と共に、脳橋、小脳、および皮質内のＧｄ−ＤＴＰＡに反応して生じたシグナル変化の時間活性曲線（ＴＡＣ）を示す。髄腔内投与の３分子に由来するＴＡＣの相違は、１８ＦＤＧのグリンファティック輸送が、Ｇｄ−ＤＴＰＡや１８Ｆと比較して急速であることを示唆している。グラフ３２Ｂ、３２Ｄ、および３２Ｆでは、脳橋＝上段プロット、小脳＝中段プロット、皮質＝下段プロット。
【図３２−２】髄腔内１８ＦＤＧは、脳全体のグリンファティック輸送の評価においてＤＴＰＡよりも優れることを示した図である。（３２Ｃ）３２Ａで示したラットから得られた対応する１８ＦＤＧ分布パターンは、脳全体に１８ＦＤＧ活性が幅広く分布していることを示しており、これは対応するＴＡＣに反映されている（３２Ｄ）。髄腔内投与の３分子に由来するＴＡＣの相違は、１８ＦＤＧのグリンファティック輸送が、Ｇｄ−ＤＴＰＡや１８Ｆと比較して急速であることを示唆している。グラフ３２Ｂ、３２Ｄ、および３２Ｆでは、脳橋＝上段プロット、小脳＝中段プロット、皮質＝下段プロット。
【図３２−３】髄腔内１８ＦＤＧは、脳全体のグリンファティック輸送の評価においてＤＴＰＡよりも優れることを示した図である。髄腔内１８Ｆ投与を受けたラット（３２Ｅ）、および対応するＴＡＣ（３２Ｆ）は、１８Ｆの取り込みは脳橋に限定しており、時間が経過しても皮質および小脳への取り込みは極めて限定的であることを示す。髄腔内投与の３分子に由来するＴＡＣの相違は、１８ＦＤＧのグリンファティック輸送が、Ｇｄ−ＤＴＰＡや１８Ｆと比較して急速であることを示唆している。グラフ３２Ｂ、３２Ｄ、および３２Ｆでは、脳橋＝上段プロット、小脳＝中段プロット、皮質＝下段プロット。
【図３３−１】[00151]老化した脳におけるグリンファティック傍血管ＣＳＦ流入障害を示した図である。（３３Ａ）傍血管ＣＳＦ流入を、麻酔したマウスの皮質において、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査法により評価した。大脳脈管構造を動脈内テキサスレッドデキストラン（７０ｋＤ、ＴＲ−ｄ７０）により規定し、また皮質動脈（矢印）と皮質静脈（矢印頭部）を形態学的に規定した。１０μｌの蛍光ＣＳＦトレーサー（ＦＩＴＣ結合デキストラン、４０ｋＤ；ＦＩＴＣ−ｄ４０）を大槽内に注射し、一方、傍血管トレーサー流入を、閉鎖頭蓋窓を作成して可視化した。（３３Ｂ）皮質表面下方１００μｍの皮質内への傍血管ＣＳＦ流入の定量化は、若年（２〜３月齢）の脳と比較して、老年（１２カ月）の皮質内への傍血管ＣＳＦ流入速度が有意に低下することを示す（１２カ月対２〜３カ月＊Ｐ＜０．０５；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；各郡ｎ＝４）。
【図３３−２】老化した脳におけるグリンファティック傍血管ＣＳＦ流入障害を示した図である。（３３Ｃおよび３３Ｄ）トレーサーが最初に大脳表面動脈に沿って皮質に進入するとき（Ｃ１〜Ｃ６）、次にトレーサーが貫通細動脈に沿って周辺間質内に移動する際の皮質表面下方１００μｍ（Ｄ１〜Ｄ６）において画像化した、ＣＳＦトレーサーの代表的な連続画像である。
【図３３−３】老化した脳におけるグリンファティック傍血管ＣＳＦ流入障害を示した図である。（３３Ｅおよび３３Ｆ）老年マウス（１２カ月）の皮質内にＣＳＦトレーサーが進入する際の代表的な連続画像は、最初に大脳表面脈管構造の傍血管腔に沿ったＣＳＦトレーサーの移動（Ｅ１〜Ｅ６）、ならびにその皮質間質内への移動（Ｆ１〜Ｆ６）が低速化していることを示す。
【図３４−１】[00152]老化した脳における脳全体のグリンファティック経路の機能障害を示した図である。麻酔したマウスの脳について、ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法によりグリンファティック経路の機能を評価した。（３４Ａ）２つの異なる蛍光ＣＳＦトレーサー（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３；オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）を大槽内に同時注射した図である。３０分後、動物を潅流固定し、ビブラトーム上で脳をスライスし、そして２チャンネル従来型蛍光顕微鏡検査法により冠状切片を画像化した。（３４Ｂ）ＣＳＦトレーサーの流入の定量化は、グリンファティック経路機能の加齢性障害を示しており、老年（１８カ月）マウスの脳では、若年（２〜３カ月）マウスの脳と比較して、低分子量のＴＲ−ｄ３および高分子量のＯＡ−６４７の流入のいずれも有意に障害を有していた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝５〜８）。中年（１０〜１２カ月）の脳内へのＣＳＦトレーサーの流入は、若年の脳と老年の脳との中間であった。
【図３４−２】]老化した脳における脳全体のグリンファティック経路の機能障害を示した図である。麻酔したマウスの脳について、ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法によりグリンファティック経路の機能を評価した。（３４Ｃ〜３４Ｅ）２〜３カ月（３４Ｃ）、１０〜１２カ月（３４Ｄ）、および１８カ月（３４Ｅ）の脳の間の蛍光ＣＳＦトレーサー流入の相違を示す代表的な画像であり、加齢と共に、特に軟膜表面からの距離の増加と共に、顕著なトレーサー流入障害を示す。
【図３５−１】[00153]部位特異的加齢性グリンファティック経路機能障害の図である。麻酔したマウス脳について、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー流入のｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像化法により評価した。低分子量（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）および高分子量（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）トレーサーを大槽内に注射し、３０分後に動物を潅流固定した。（３５Ａおよび３５Ｂ）矢状断面（３５Ａ）および冠状（３５Ｂ）のスライスについて、核染色剤ＤＡＰＩで対比染色し、これを対象として蛍光ＣＳＦトレーサーの流入を評価した。脳全体にわたるＣＳＦトレーサー流入の評価から、老年脳内の部位間で、加齢性のグリンファティック経路障害に対する易罹患性が顕著であることに加えて、若年脳内の部位間で、ＣＳＦ流入に相違が認められることが明らかになった。
【図３５−２】部位特異的加齢性グリンファティック経路機能障害の図である。麻酔したマウス脳について、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー流入のｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像化法により評価した。低分子量（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）および高分子量（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）トレーサーを大槽内に注射し、３０分後に動物を潅流固定した。（３５Ｃおよび３５Ｄ）矢状断面（３５Ｃ）および冠状（３５Ｄ）のスライスについて、核染色剤ＤＡＰＩで対比染色して、これを対象として蛍光ＣＳＦトレーサーの流入を評価した。脳全体にわたるＣＳＦトレーサー流入の評価から、老年脳内の部位間で、加齢性のグリンファティック経路障害に対する易罹患性が顕著であることに加えて、若年脳内の部位間で、ＣＳＦ流入に相違が認められることが明らかになった。
【図３５−３】部位特異的加齢性グリンファティック経路機能障害の図である。麻酔したマウス脳について、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー流入のｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像化法により評価した。低分子量（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）および高分子量（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）トレーサーを大槽内に注射し、３０分後に動物を潅流固定した。（３５Ｅ〜３５Ｇ）前方（３５Ｅ）の脳を、対象部位についていくつかのおおまかな部位に分割し、ＯＡ−６４７の流入を部位毎に評価した。一般的に、グリンファティック経路機能は、若年（２〜３カ月）の皮質と比較して、老年（１８カ月）の皮質で最も劇的な障害を有し、前方皮質（３５Ｆ）と比較して後方皮質（３５Ｉ）においてより多くの減弱が認められた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。比較の際、グリンファティックＣＳＦの皮質下部位への流入は、皮質において認められた流入と比較して割合的に少なかったが、この皮質下部位内の加齢性の障害は、同様に減衰した（３５Ｇ）。
【図３５−４】部位特異的加齢性グリンファティック経路機能障害の図である。麻酔したマウス脳について、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー流入のｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像化法により評価した。低分子量（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）および高分子量（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）トレーサーを大槽内に注射し、３０分後に動物を潅流固定した。（３５Ｈ〜３５Ｊ）後方（Ｈ）の脳を、対象部位についていくつかのおおまかな部位に分割し、ＯＡ−６４７の流入を部位毎に評価した図である。一般的に、グリンファティック経路機能は、若年（２〜３カ月）の皮質と比較して、老年（１８カ月）の皮質で最も劇的な障害を有し、前方皮質（３５Ｆ）と比較して後方皮質（３５Ｉ）においてより多くの減弱が認められた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。比較の際、グリンファティックＣＳＦの皮質下部位への流入は、皮質において認められた流入と比較して割合的に少なかったが、この皮質下部位内の加齢性の障害は、同様に減衰した（３５Ｊ）。
【図３６】[00154]老年の脳における間質内アミロイドβのクリアランス障害を示した図である。間質内溶質の老化した脳からのクリアランスを、放射性トレーサークリアランスアッセイ法により評価した。（３６Ａ）痕跡量の放射能標識１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンを、若年（２〜３カ月）、中年（１０〜１２カ月）、および老年（１８カ月）の麻酔したマウスの尾状核内に同時注射した。１時間後、動物を絶命せしめ、脳を採集し、そして脳組織内の残留放射能をγ粒子計数法および液体シンチレーション計数法により定量化した。（３６Ｂ）老年の脳では、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンの両方のクリアランス速度が、若年の脳におけるクリアランスと比較して有意に低下した。（若年に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝８）。１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンの中年の脳からのクリアランスは、若年の脳と老年の脳とのクリアランスの中間であった。
【図３７−１】[00155]老化した脳における大脳動脈の拍動低下を示した図である。大脳血管の拍動性を、麻酔したマウスについてｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査により評価した。（３７Ａおよび３７Ｂ）大脳の脈管構造を、蛍光テキサスレッド結合デキストラン（７０ｋＤ）を動脈内注射することにより可視化した。大脳の表面動脈と静脈（３７Ａ）、および貫通動脈と上行静脈（３７Ｂ）を形態学的に識別した。図３７Ｂの挿入図は、実験用に画像化したＸＹＺ容積の直交するＸＺとＹＺの投影図を示す。
【図３７−２】老化した脳における大脳動脈の拍動低下を示した図である。大脳血管の拍動性を、麻酔したマウスについてｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査により評価した。（３７Ｃおよび３７Ｄ）大脳の表面動脈と静脈、貫通動脈と上行静脈を、高周波数ラインスキャニングにより識別および画像化した。得られたＸ−ｔ（時間）プロットについて閾値を設けてコントラストを改善し、各心周期に起因する管腔径の変化を測定できるようにした。血管の「拍動性」と呼ばれるパラメータを規定するために、３秒間隔で血管径の変化を平均管腔径について積分した。（３７Ｅ）貫通動脈について測定された拍動性は、若年（２〜３カ月）の脳と比較して老年（１８カ月）の脳では低下した（１群当たりｎ＝２〜４）。脳血管ツリーのその他の要素には、明らかな相違は認められなかった。
【図３８−１】[00156]老化しても、皮質の細胞外容量分画に変化はないが、屈曲度は変化することを示した図である。拡散パラメータ（細胞外容量分画、α；屈曲度、λ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏの覚醒時皮質および麻酔時皮質について、ｉｎ  ｖｉｖｏテトラメチルアンモニア電気生理学検査により評価した（Ｘｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年も参照）。（３８Ａおよび３８Ｂ）老年（１８カ月）の脳および若年（２〜３月）の脳の間で、細胞外容量分画に相違は認められなかったが（３８Ａ）；老年の脳では、覚醒時脳と比較した睡眠時脳の細胞外腔の顕著な拡大が不変のままであった（３８Ｂ）（覚醒時対睡眠時＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝９〜２０）。
【図３８−２】老化しても、皮質の細胞外容量分画に変化はないが、屈曲度は変化することを示した図である。拡散パラメータ（細胞外容量分画、α；屈曲度、λ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏの覚醒時皮質および麻酔時皮質について、ｉｎ  ｖｉｖｏテトラメチルアンモニア電気生理学検査により評価した（Ｘｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年も参照）。（３８Ｃおよび３８Ｄ）若年皮質対老年皮質で、覚醒時または睡眠時のいずれにおいても屈曲度に全体的な相違は認められなかったが（３８Ｃ）、老化した脳では、屈曲度の数値について、睡眠時−覚醒時の関連性に変化が認められた（３８Ｄ）。若年の脳では、屈曲度の数値は、覚醒状態と睡眠状態の間で異ならなかった。対照的に、老年の脳では、睡眠が開始すると、これに伴い細胞外屈曲度が有意に増加した（覚醒時対睡眠時＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝９〜２０）。
【図３９−１】[00157]老年の脳における血管周囲のＡＱＰ４発現の変化を示した図である。皮質内ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現の変化を、免疫蛍光２重標識法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。（３９Ａおよび３９Ｂ）若年の脳（２〜３カ月）では、ＡＱＰ４の発現は、血管周囲のアストロサイトのエンドフィート（矢印）にほぼ排他的に限定されることを示す代表的な画像である。老化した皮質（１８カ月）では、ＡＱＰ４の局在が変化して、厳密には血管周囲ではない、微細なアストロサイトプロセス（矢印）を含むようになる。
【図３９−２】老年の脳における血管周囲のＡＱＰ４発現の変化を示した図である。皮質内ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現の変化を、免疫蛍光２重標識法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。（３９Ｃ）エンドフィートドメインにおけるＡＱＰ４発現量の定量化は、老年の脳では、血管周囲のＡＱＰ４発現について、大型の大脳血管周辺で若干の減少が認められたが、大脳の毛細血管周辺では認められないことを示している（１８カ月対２〜３カ月＊Ｐ＜０．０５；ｔ−検定；１群当たりｎ＝４）。（３９Ｄ）対照的に、ＡＱＰ４の局在は、老年の脳では劇的に変化する。若年の脳では、ＡＱＰ４の偏在は非常に顕著であり、低レベルのＡＱＰ４発現が、血管周囲のエンドフィートにおいてのみ保持される。老年の脳では、グローバルなＡＱＰ４発現がわずかに増加するが、大型の大脳血管の直近周辺部位において、ＡＱＰ４の大幅な増加が認められる。したがって、老年の脳では、大型の大脳血管周辺のＡＱＰ４について、その厳密な血管周囲の偏在が失われる一方、微小血管における偏在は、概ね不変のままである。
【図３９−３】老年の脳における血管周囲のＡＱＰ４発現の変化を示した図である。皮質内ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現の変化を、免疫蛍光２重標識法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。（３９Ｅ）かかる特異性は、反応性のアストログリオーシスのマーカーであるＧＦＡＰでは認められない。老年の脳では、血管周囲におけるＧＦＡＰの発現は、大型の大脳血管周辺および大脳の微小血管周辺のいずれにおいても有意に増加した（１８カ月対２〜３カ月＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｔ−検定；１群当たりｎ＝４）。（３９Ｆ）同様に、ＧＦＡＰの発現を空間的に評価すると、ＧＦＡＰ発現量の増加が皮質全体を通じてグローバルに認められ、大型の血管と微小血管の間においてＧＦＡＰ発現量の相違は認められない。
【図４０−１】[00158]ＡＱＰ４の発現および偏在における局所的相違を示した図である。ＡＱＰ４発現量の変化を、免疫蛍光２重標識法、レーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法、およびこれまでに定義された画像分析アプローチ（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年；Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年）により、前方および後方の脳スライス内の規定された対象領域全体にわたり評価した。（４０Ａ）２〜３カ月および１８カ月の脳について局所的な平均ＡＱＰ４免疫蛍光強度を表すカラー強度マップである。各部位についてＡＱＰ４発現量を定量化すると、若年の脳と老年の脳との間でＡＱＰ４発現量に有意な変化は認められない。
【図４０−２】ＡＱＰ４の発現および偏在における局所的相違を示した図である。ＡＱＰ４の偏在の変化を、免疫蛍光２重標識法、レーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法、およびこれまでに定義された画像分析アプローチ（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年；Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年）により、前方および後方の脳スライス内の規定された対象領域全体にわたり評価した。（４０Ｂ）ＡＱＰ４の「脱偏在」は、血管周囲で認められるＡＱＰ４免疫反応性以上のＡＱＰ４免疫蛍光を有する組織部位として規定される（より詳細な説明は、Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年に記載）。したがって、より高い数値は、血管周囲におけるＡＱＰ４の偏在の喪失、またはＡＱＰ４の「脱偏在」を反映する。カラー強度マップに示す通り、老年の脳でＡＱＰ４の偏在において顕著な喪失が生じた。偏在の有意な喪失は、皮質および皮質下構造全体を通じて明白であった（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。
【図４０−３】ＡＱＰ４の発現および偏在における局所的相違を示した図である。ＧＦＡＰ発現量の変化を、免疫蛍光２重標識法、レーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法、およびこれまでに定義された画像分析アプローチ（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年；Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年）により、前方および後方の脳スライス内の規定された対象領域全体にわたり評価した。（４０Ｃ）ＧＦＡＰ陽性アストロサイトプロセスのエリアカバー率に基づき、ＧＦＡＰ発現量を評価した。カラー強度マップでは、老年の脳におけるＧＦＡＰのカバー率の増加を示す。これらの変化は、皮質において最も顕著であったが、皮質下構造でも認められた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。
【図４１−１】[00159]ＡＱＰ４の偏在は、皮質グリンファティック経路機能の重要な決定要素であることを示した図である。反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の偏在、およびグリンファティック経路機能（大槽内注射したＣＳＦトレーサーの流入）の間の相互関係を、前方および後方の異なる脳部位全体を通じて評価した。オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−６４７（ＯＡ−６４７、ＭＷ４５ｋＤ）を、動物に大槽内注射した。３０分後に動物を固定し、脳をスライスした。前方と後方の脳スライスを、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰについて免疫蛍光２重標識法により標識した。前方と後方の脳全体にわたり、異なる対象部位において、ＯＡ−６４７の流入（４１Ａ）、ＡＱＰ４の発現（４１Ｂ）、ＡＱＰ４の脱偏在（４１Ｃ）、およびＧＦＡＰの発現（４１Ｄ）を評価した。（４１Ａ〜４１Ｄ）月齢２〜３カ月と月齢１８カ月の間で、グリンファティックＯＡ−６４７流入、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の脱偏在、およびＧＦＡＰの発現について、これらの相対的な増加量（赤色の数値）と減少量（青色の数値）を表すカラー強度マップの図である。これは、上記図４０Ａ〜４０Ｃのカラム形式で提示したデータの図式的表現である。
【図４１−２】ＡＱＰ４の偏在は、皮質グリンファティック経路機能の重要な決定要素であることを示した図である。反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の偏在、およびグリンファティック経路機能（大槽内注射したＣＳＦトレーサーの流入）の間の相互関係を、前方および後方の異なる脳部位全体を通じて評価した。オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−６４７（ＯＡ−６４７、ＭＷ４５ｋＤ）を、動物に大槽内注射した。３０分後に動物を固定し、脳をスライスした。前方と後方の脳スライスを、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰについて免疫蛍光２重標識法により標識した。前方と後方の脳全体にわたり、異なる対象部位において、ＯＡ−６４７の流入（４１Ａ）、ＡＱＰ４の発現（４１Ｂ）、ＡＱＰ４の脱偏在（４１Ｃ）、およびＧＦＡＰの発現（４１Ｄ）を評価した。（４１Ｅ〜４１Ｉ）各部位におけるＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の脱偏在、およびＧＦＡＰの発現について、これらの間の関連性を、２〜３カ月および１８カ月の数値をプーリングして評価し、次に対をなすＯＡ−６４７／ＡＱＰ４の発現、ＯＡ−６４７／ＡＱＰ４の脱偏在、およびＯＡ−６４７／ＧＦＡＰの発現の数値について線形回帰分析を行った。近似直線と共に最も強い関連性を各図に示し、また対応するｒ２値とＰ値（スロープがゼロではない場合）を提示する。（４１Ｅ）皮質では、ＡＱＰ４の偏在の変化がグリンファティック経路機能と最も強く関連し、ＡＱＰ４の偏在の喪失は、グリンファティックＣＳＦトレーサー流入障害と強い対応性を有した。（４１Ｆ）海馬内では、グリンファティック経路機能、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の偏在、またはＧＦＡＰの発現について、これらの間で強い関連性が明確には認められなかった。（４１Ｇ〜４１Ｊ）線条体、外側中隔核、視床、および視床下部内では、ＡＱＰ４の発現（偏在ではない）がグリンファティック経路機能と最も強く関連した。興味深いことに、これは正の相関であり、これらの部位内のＡＱＰ４の発現量の増加は、グリンファティックＣＳＦ流入量の増加と関連した。これらのデータは、血管周囲におけるＡＱＰ４の偏在は、大脳皮質における傍血管ＣＳＦ流入の重要な決定要素であるが、皮質下組織内では、グローバルなＡＱＰ４発現が、グリンファティック経路機能のより重要な決定要素であり得ることを実証している。
【図４２−１】[00160]外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、血管周囲アストロサイトエンドフィートにおいてＡＱＰ４の偏った局在の喪失を引き起こすことを示した図である。（４２Ａ）中等度のＴＢＩを有するマウスモデルを示す概略図である。マウスをイソフルランで短時間麻酔し、糸でその門歯により懸架し、そして較正済の側頭部打撃をニューマチック制御式皮質打撃デバイスにより加える。動物を下敷パッドに落下させ、速やかに麻酔から覚醒させる。（４２Ｂおよび４２Ｃ）ＴＢＩ後２８日経過して、ＡＱＰ４の局在およびＧＦＡＰの発現を、免疫蛍光２重標識法およびレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。全スライスモンタージュに示す通り（４２Ｂおよび４２Ｃ）、反応性のアストログリオーシスが持続する部位は、ＴＢＩ後２８日間経過しても、同側の側頭皮質内に留まる。
【図４２−２】外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、血管周囲アストロサイトエンドフィートにおいてＡＱＰ４の偏った局在の喪失を引き起こすことを示した図である。（４２Ｄ〜４２Ｆ）ＴＢＩ後２８日経過して、ＡＱＰ４の局在およびＧＦＡＰの発現を、免疫蛍光２重標識法およびレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。高倍率対物レンズ下でＡＱＰ４の局在を評価すると、対照皮質（４２Ｄ）をＴＢＩ後の対側皮質（４２Ｅ）と比較したとき、ＡＱＰ４の局在は主に血管周囲のアストロサイトエンドフィート（矢印）に限定したままなので、ＡＱＰ４の偏在の明らかな変化は認められない。同側皮質（４２Ｆ）では、ＧＦＡＰ陽性反応性アストロサイトが示すＡＱＰ４の偏在の喪失は顕著であり、ＡＱＰ４の発現は、微細なプロセスと大脳血管周囲のプロセス（矢印）の間で均等に分布している。これらの所見は、ＴＢＩが血管周囲におけるＡＱＰ４の偏在の慢性的な喪失を引き起こすことを実証している。
【図４３−１】[00161]間質内溶質のグリンファティッククリアランスは、ＴＢＩ後慢性的障害を有することを示した図である。（４３Ａ）ＴＢＩ後１日、３日、７日、および２８日経過時点で、ＣＳＦトレーサー（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−５５５）の大槽内注射により傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換を評価した。（４３Ｂ〜４３Ｄ）Ｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像は、注射後３０分において評価した傍血管ＣＳＦ流入が、ＴＢＩ後７日経過して劇的に減少したことを示す。興味深いことに、片側性の外傷性損傷であるにもかかわらず、グリンファティック流入の減少が両側において認められた。
【図４３−２】間質内溶質のグリンファティッククリアランスは、ＴＢＩ後慢性的障害を有することを示した図である。（４３Ｅおよび４３Ｆ）Ｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像は、注射後３０分において評価した傍血管ＣＳＦ流入が、ＴＢＩ後７日経過して劇的に減少したことを示す。興味深いことに、片側性の外傷性損傷であるにもかかわらず、グリンファティック流入の減少が両側において認められた。（４３Ｇ）皮質内へのトレーサー流入の定量化は、ＴＢＩがＣＳＦ流入に及ぼす効果は損傷後７日目にピークに達するが、有意なグリンファティック機能障害は損傷後２８日間継続することを示す（対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝５〜１２匹の動物）。ＣＳＦ流入障害は、皮質において両側に認められるが、障害は、同側皮質において最大である。
【図４３−３】間質内溶質のグリンファティッククリアランスは、ＴＢＩ後慢性的障害を有することを示した図である。（４３Ｈ）ＴＢＩが皮質からの間質内溶質のクリアランスに及ぼす効果を、損傷後７日目に評価した。放射能標識３Ｈ−マンニトール（ＭＷ１８２Ｄａ）のクリアランス（４３Ｉ）、および１４Ｃ−イヌリン（ＭＷ約５ｋＤａ）のクリアランス（４３Ｊ）を、対側の前頭皮質内注入後６０分経過して測定した。野生型マウスでは、ＴＢＩは、３Ｈ−マンニトールおよび１４Ｃ−イヌリンの両方のクリアランスを有意に減少させる（Ｓｈａｍに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝６匹の動物）。Ａｑｐ４−／−マウスについて実施したクリアランス試験は、ＴＢＩ後の溶質クリアランス障害は、Ａｑｐ４遺伝子欠損により悪化することを実証した（ＷＴに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝６匹の動物）。これらのデータは、間質内溶質クリアランスを含むグリンファティック経路機能は、ＴＢＩ後に、顕著で慢性的な障害を有することを実証する。
【図４４】[00162]傍血管経路に沿って脳からクリアランスされた間質内タウの図である。（４４Ａ）組換えヒト単量体タウ（ｈタウ）を、大脳血管平滑筋および周細胞にＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質を発現するＮＧ２−ＤｓＲｅｄ遺伝子組換えマウスの皮質内に注射した。（４４Ｂ〜４４Ｅ）脳を経由する間質内ｈタウの移動を、注射後３０分経過して、免疫蛍光検査法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。ｈタウは、注射部位から拡散的に移動し（４４Ｂ）、毛細血管基底板に沿って蓄積した（４４Ｃ）。蛍光強度投影図は、周辺間質コンパートメントに関連するこれらの空間にｈタウが蓄積することを示す。（４４Ｄおよび４４Ｅ）注射後３０分経過して、ｈタウは脳間質経由で急速に移動して、第三脳室ルーフ内の大口径の内大脳静脈を取り巻く傍血管腔に到達した。これらのデータは、可溶性の間質内タウは、脳網羅的グリンファティック系の傍血管経路に沿って脳からクリアランスされることを実証している。
【図４５】[00163]ＡＱＰ４の免疫反応性は、Ａｑｐ４−／−マウスには存在しないことを示した図である。本試験で使用される抗ＡＱＰ４一次抗体の特異性を確保するために、本発明者らは、損傷後７日目に灌流したＡｑｐ４−／−マウスに由来する対照脳およびＴＢＩ処理脳の免疫標識を実施した。ＧＦＡＰの発現は、対照（４５Ａ）、対側ＴＢＩ（４５Ｂ）、および同側ＴＢＩ（４５Ｃ）の各皮質において容易に検出可能であったが、ＡＱＰ４の免疫反応性は検出不能であった。
【図４６】[00164]Ａｑｐ４遺伝子が欠損しても、ＴＢＩ病変容積は変化しないことを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損が外傷性病変容積に及ぼす効果を、ＴＢＩ後２８日目に採集された脳について評価した。（４６Ａおよび４６Ｂ）脳を連続的にスライスし、そして脳の構造をＨ＆Ｅ染色法により評価した。赤色矢印は、外傷性打撃部位および最大皮質損傷領域を示す。同側および対側の皮質領域を切片毎に測定し、次に皮質容積を導出するために、連続したスライスを積分した。（４６Ｃ）皮質容積を、対側容積に対する比として表した。野生型マウスとＡｑｐ４−／−マウスとの間で、同側病変容積に有意差は認められなかった。
【図４７−１】[00165]Ａｑｐ４遺伝子が欠損すると、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行を悪化させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。（４７Ａ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−脳を損傷後２８日目に採集し、リン酸化タウ（Ｐ−タウ）エピトープの存在について調べた。マウス遺伝子型（野生型とＡｑｐ４−／−）、損傷状態（ｓｈａｍとＴＢＩ）、および半球（対側（Ｃ）と同側（Ｉ））が、異なるタウリン酸化エピトープを標的とする様々なＰ−タウモノクロナール抗体による標識に及ぼす効果を示す代表的なブロットを提示する。総タウも測定し（Ｐａｎ−タウ）、すべてのＰ−タウレベルを、各生体試料内のＰ−タウレベルに標準化した。（４７Ｂ）すべてのエピトープの中でも、ＴＢＩは、Ｐ−タウ標識を、特に同側の側において増加させる傾向を有した。同様に、標識は、ＴＢＩ後の野生型マウスと比較して、ＴＢＩ後のＡｑｐ４−／−マウスにおいてより強い傾向を有した。特に、ｐＴｈｒ２３１およびｐＳｅｒ３９６Ｐ−タウエピトープを認識する抗体は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスにおいてＰ−タウ標識の有意な増加を示した（Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍに対して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１；野生型ＴＢＩに対して‡Ｐ＜０．０５；野生型ｓｈａｍに対して＊Ｐ＜０．０５；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；1元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。これらのデータは、グリンファティック経路機能は、ＴＢＩ単独の場合に認められた障害以上に障害を有すると、慢性的なタウ凝集が促進されることを実証している。
【図４７−２】Ａｑｐ４遺伝子が欠損すると、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行を悪化させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。（４７Ｃおよび４７Ｄ）すべてのエピトープの中でも、ＴＢＩは、Ｐ−タウ標識を、特に同側の側において増加させる傾向を有した。同様に、標識は、ＴＢＩ後の野生型マウスと比較して、ＴＢＩ後のＡｑｐ４−／−マウスにおいてより強い傾向を有した。特に、ｐＴｈｒ２３１およびｐＳｅｒ３９６Ｐ−タウエピトープを認識する抗体は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスにおいてＰ−タウ標識の有意な増加を示した（Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍに対して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１；野生型ＴＢＩに対して‡Ｐ＜０．０５；野生型ｓｈａｍに対して＊Ｐ＜０．０５；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；1元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。これらのデータは、グリンファティック経路機能は、ＴＢＩ単独の場合に認められた障害以上に障害を有すると、慢性的なタウ凝集が促進されることを実証している。
【図４７−３】Ａｑｐ４遺伝子が欠損すると、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行を悪化させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。（４７Ｅおよび４７Ｆ）すべてのエピトープの中でも、ＴＢＩは、Ｐ−タウ標識を、特に同側の側において増加させる傾向を有した。同様に、標識は、ＴＢＩ後の野生型マウスと比較して、ＴＢＩ後のＡｑｐ４−／−マウスにおいてより強い傾向を有した。特に、ｐＴｈｒ２３１およびｐＳｅｒ３９６Ｐ−タウエピトープを認識する抗体は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスにおいてＰ−タウ標識の有意な増加を示した（Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍに対して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１；野生型ＴＢＩに対して‡Ｐ＜０．０５；野生型ｓｈａｍに対して＊Ｐ＜０．０５；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；1元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。これらのデータは、グリンファティック経路機能は、ＴＢＩ単独の場合に認められた障害以上に障害を有すると、慢性的なタウ凝集が促進されることを実証している。
【図４８−１】[00166]グリンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後のタウ凝集を促進することを示した図である。（４８Ａ）Ａｑｐ遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−のマウスにＴＢＩを加え、リン酸化タウ（Ｐ−タウ）の蓄積を、損傷後２８日目に免疫蛍光検査法およびウェスタンブロット（図４７Ａ〜４７Ｆに提示）により評価した。（４８Ｂ〜４８Ｄ）ＡＴ８  Ｐ−タウ抗体（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５エピトープに対して特異的）およびニューロンマーカーＮｅｕＮによる２重標識は、野生型皮質では、Ｐ−タウ免疫反応性は認められないことを示した。Ａｑｐ４−／−皮質では、ニューロン体（矢印）内、および周辺神経突起（矢印頭部）内の両方で、顕著なＰ−タウ標識が認められた。これらのデータは、ＴＢＩ後のグリンファティック経路機能障害は、タウ凝集、およびニューロン内および神経外の両方においてＰ−タウの沈着を促進することを実証している。
【図４８−２】グリンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後のタウ凝集を促進することを示した図である。（４８Ｅおよび４８Ｆ）Ｐ−タウ染色の定量化により、ＴＢＩ後２８日目に、Ａｑｐ４−／−マウスの同側皮質内、および少なめではあるが基底線条体内で、Ｐ−タウ免疫反応性が顕在化したことを示した。これらのデータは、ＴＢＩ後のグリンファティック経路機能障害は、タウ凝集、およびニューロン内および神経外の両方においてＰ−タウの沈着を促進することを実証している。
【図４９−１】[00167]グリンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後の神経炎症を遷延させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損が、ＴＢＩ後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。（４９Ａ〜４９Ｃ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスにＴＢＩを加え、反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）およびマイクログリオーシス（Ｉｂａ１の発現）を、損傷後２８日目に免疫蛍光検査法により評価した。ＴＢＩ後、もっぱらＡｑｐ４−／−マウスの同側皮質に、ＧＦＡＰ−およびＩｂａ１−免疫反応性の顕著な上昇を認めた。
【図４９−２】リンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後の神経炎症を遷延させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損が、ＴＢＩ後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。（４９Ｄ〜４９Ｆ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスにＴＢＩを加え、反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）およびマイクログリオーシス（Ｉｂａ１の発現）を、損傷後２８日目に免疫蛍光検査法により評価した。ＴＢＩ後、もっぱらＡｑｐ４−／−マウスの同側皮質に、ＧＦＡＰ−およびＩｂａ１−免疫反応性の顕著な上昇を認めた。
【図４９−３】リンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後の神経炎症を遷延させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損が、ＴＢＩ後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。（４９Ｇおよび４９Ｈ）ＧＦＡＰ標識の定量化により、Ａｑｐ４−／−の皮質および基底線条体では反応性のアストログリオーシスが有意に増加するが、野生型マウスではそうではないことを示した（野生型に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。（４９Ｉ）海馬ではＧＦＡＰ免疫反応性に差異は認められなかった。
【図４９−４】リンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後の神経炎症を遷延させることを示した図である。Ａｑｐ４遺伝子欠損が、ＴＢＩ後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。（４９Ｊおよび４９Ｋ）Ｉｂａ１標識の定量化により、ミクログリアの活性化がＡｑｐ４−／−マウスの同側皮質および線条体で遷延するが、野生型マウスでは、損傷後２８日以内に消散したことを示した（対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。（４９Ｌ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスの両方で、Ｉｂａ１標識の増加が海馬のＣＡ３領域に認められた（対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。
【図５０−１】[00168]Ａｑｐ４遺伝子欠損は、外傷後の認知障害を悪化させることを示した図である。（５０Ａ）グリンファティック経路障害が外傷後の認知障害に及ぼす効果を、ＴＢＩを受けた野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスについて評価した。動物は損傷２日前に、そしてＴＢＩ後は毎週ベースライン行動試験を受けた。（５０Ｂ）オープンフィールド試験により大運動行動を評価した。ＴＢＩは、野生型マウスまたはＡｑｐ４−／−マウスのいずれにおいても、オープンフィールド試験成績を変化させなかった。（５０Ｃ）運動調整および学習をロータロッド試験により評価した。ＴＢＩは、野生型動物では、ロータロッド成績を有意に損ねることはなかったが、Ａｑｐ４−／−マウスでは、ＴＢＩは試験成績を有意に損ねた（Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍ対Ａｑｐ４−／−ＴＢＩ＊Ｐ＜０．０５；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝９〜１４の動物）。
【図５０−２】Ａｑｐ４遺伝子欠損は、外傷後の認知障害を悪化させることを示した図である。認知機能を、新規物体認識試験（５０Ｄ）およびバーンズ迷路試験（５０Ｅ）により評価した。両試験では、ＴＢＩは、野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスの両方について認識成績を損ねた（ＴＢＩ対ｓｈａｍ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝９〜１４匹の動物）。外傷後認知障害は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスで悪化した（野生型ＴＢＩ対Ａｑｐ４−／−ＴＢＩ＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝９〜１４）。
【図５１−１】[00169]血管周囲ＡＱＰ４の偏在に関する決定要素としてのＡＱＰ４−Ｍ１変異体に関する図である。（５１Ａ）Ａｑｐ４遺伝子は、２つの転写開始部位を有し、各部位において転写が開始すると、２つのＡＱＰ４  ｍＲＮＡ変異体：Ａｑｐ４遺伝子のエクソン０〜４を含むＡＱＰ４−Ｍ１、およびエクソン０を欠くＡＱＰ４−Ｍ２３が生じる。（５１Ｂ）ＡＱＰ４−Ｍ２３（生理的条件下、ＣＮＳにおいて支配的な形態）は、血管周囲ＡＱＰ４の充填を可能にする一方、ＡＱＰ４−Ｍ１はこれを阻止する；したがってＡＱＰ４−Ｍ１発現が増加すると、ＡＱＰ４の偏在は阻害される（Ｃｒａｎｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００９年；Ｆｕｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２００３年）。
【図５１−２】血管周囲ＡＱＰ４の偏在に関する決定要素としてのＡＱＰ４−Ｍ１変異体に関する図である。（５１Ｃ）ＡＱＰ４−Ｍ１の発現を、マウス同側皮質について、ＴＢＩ後３日目に、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物のエクソン０を特異的に標的とするＰＣＲプライマーを用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した。対照（ｓｈａｍ）皮質におけるＡＱＰ４−Ｍ１発現量と比較して、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＴＢＩにより約２倍増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｔ−検定；１群当たりｎ＝５）。（５１Ｄ）ＡＱＰ４−Ｍ１変異体のエクソン０を標的とするｓｉＲＮＡに基づくアプローチを用いれば、ＡＱＰ４−Ｍ１の発現は、培養された初代マウス皮質アストロサイトにおいて効果的にノックダウンすることが可能であった。３つのｓｉＲＮＡ２本鎖を、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物のエクソン０を標的とするように設計し、初代マウスアストロサイトにこれらのｓｉＲＮＡ２本鎖を６日間トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理後、ＡＱＰ４−Ｍ１発現をｑＰＣＲにより評価し、エクソン０を標的とするｓｉＲＮＡアプローチによりＡＱＰ４−Ｍ１の効果的なノックダウンが明らかとなった（ｓｉＡＱＰ４−Ｍ１対対照＃＃＃Ｐ＜０．００１；１元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ＝３）。Ａｑｐ４遺伝子プロモーターのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングでは、ＡＱＰ４−Ｍ１転写開始部位の上流にある転写（ＳＴＡＴ）−３の転写因子シグナルトランスジューサーおよびアクチベーターについて、２つの結合部位が明らかになった。したがって、本発明者らは、初代マウス皮質アストロサイトにおけるＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害が、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量を低減し得るのかを試験した。ＳＴＡＴ３特異的阻害剤ＳＴＡＴＴＩＣにより、初代アストロサイトを処理すると、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は有意に低下した（ＳＴＡＴＴＩＣ対対照＊＊Ｐ＜０．０１；１元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ＝３）。これらのデータは、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＴＢＩ後に増加したが、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物をｓｉＲＮＡの標的対象とすることにより、またはアストロサイト内でＳＴＡＴ３を阻害することにより抑えられることを実証している。これらの所見は、脳損傷後のＡＱＰ４の偏在喪失は、これらのアプローチを通じて防止し得る、という概念と一致する。
【図５２】[00170]グリンファティック経路機能は、拡散虚血性損傷後に障害を有することを示した図である。複数の微小梗塞を有するマウスモデル（Ｍ．Ｗａｎｇら、Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｉｃｒｏｉｎｆａｒｃｔｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年１２月１２日、第３２巻（５０）：１７９４８〜１７９６０頁）を用いて、拡散虚血性損傷の影響をｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像化法により評価した。（５２Ａ）動物に拡散虚血性損傷を加えた。３日後に、グリンファティック経路機能を、大槽内注射した蛍光ＣＳＦトレーサー（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ７０ｋＤ）の、閉鎖頭蓋窓を経由した大脳皮質内流入を画像化することにより評価した。（５２Ｂ〜５２Ｄ）皮質表面下１００μｍにて取得した代表的な二光子画像は、蛍光ＣＳＦトレーサーが、大槽内注射後２０分で皮質実質内に移動することを示している。（５２Ｅ）損傷後３日目の皮質表面下１００μｍにおけるシリアル二光子画像化法による蛍光強度の定量化は、対照動物では、ＣＳＦトレーサーは皮質に急速に進入し、注射から２０分以内にピークに達することを示している。同側皮質では、ＣＳＦトレーサーの流入は、事実上消滅したが、一方、対側皮質でさえも、ＣＳＦトレーサーの流入は、有意に障害を受ける。これらのデータは、血管周囲ＡＱＰ４の偏在の喪失を引き起こす拡散虚血性損傷（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年）によっても、グリンファティック経路機能は劇的に損なわれることを実証している。
【図５３】[00171]複数の微小梗塞を有するマウスモデルを用いて、拡散虚血性損傷の影響を、全スライス蛍光画像化法により評価した図である。（５３Ａ）対照脳では、ＣＳＦトレーサーは傍血管腔に沿って脳実質内に急速に移動する。（５３Ｂ）拡散虚血性損傷後、ＣＳＦの脳内への流入は、劇的に低下する。同側的には、ＣＳＦの実質内への移動は事実上消滅する。対側半球では、傍血管ＣＳＦ流入が存在するものの、周辺の間質空間と交換する際のその速度および程度は劇的に低下する。詳細については実施例６．６を参照。
【図５４】[00172]アンジオテンシンおよび活性な代謝物の生成に関するカスケードを示した図である。ＡＣＥはアンジオテンシン変換酵素である。ＮＥＰはネプリリシンである。ＡＴ１ＲおよびＡＴ２Ｒはそれぞれアンジオテンシン受容体１および２である。
【図５５】[00173]  Ａβ（５５Ａ）およびイヌリン（５５Ｂ）の脳外クリアランスは、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）により低下し、またロサルタン（１μＭ；ＡＴ１Ｒの阻害剤）により増加した。各グラフのバー１（１番目、左から右の順）（対照）、各グラフのバー２（アンジオテンシンＩＩ）、および各グラフのバー３（ロサルタン）、対照と比較して＊Ｐ＜０．０５。
【図５６】[00174]  大槽内注射したアンジオテンシンＩＩ（１μＭ、各グラフのバー２）、ロサルタン（１μＭ）（各グラフのバー３）、および腹腔内注射（ＩＰ）したロサルタン（１ｍｇ）（各グラフの４番目のバー）が存在したときの、Ａβ（５６Ａ）およびイヌリン（５６Ｂ）の脳内流入を示す図である。各グラフのバー１（１番目、左から右の順）（対照）。
【図５７】[00175]Ａβおよびイヌリンの脳外クリアランスは、バソプレシン（１μＭ）により低下することを示した図である。一連の棒グラフそれぞれにおいてバー１（左側）（対照）。一連の棒グラフそれぞれにおいてバー２（右側）（バソプレシン）。
【図５８】[00176]Ａβおよびイヌリンの脳外クリアランスは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（１μＭ）により低下することを示した図である。一連の棒グラフそれぞれにおいてバー１（左側）（対照）。一連の棒グラフそれぞれにおいてバー２（右側）（心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＡＮＰ）
【図５９】[00177]Ａβの脳外クリアランスは、アンジオテンシン（１−７）により、用量依存性の様式で増加することを示した図である。アンジオテンシン（１−７）の用量は、左から右の順で、１μＭ（バー１）、０．１μＭ（バー２）、および０．０１μＭ（バー３）。バー４（対照）。最高用量と比較して＊Ｐ＜０．０５。
【図６０】[00178]Ａβの脳外クリアランスは、アンジオテンシン（１−７）により、１ｎＭ（左側のカラム）、および１０ｎＭ（右側のカラム）において、１５分時点で、用量依存性の様式で増加することを示した図である。２用量を比較すると＊Ｐ＜０．０５。
【図６１】[00179]Ａβおよびイヌリンの脳外クリアランスは、Ａ７７９（アンジオテンシン（１−７）の阻害剤であり、アンジオテンシン（１−７）の効果を遮断する）が存在すると低下することを示した図である。これらの数値は対照と有意に異ならない。
【図６２】[00180]Ａβおよびイヌリンのクリアランスに対する用量依存性の効果を示した図である。
【図６３】[00181]Ａβおよびイヌリンの流入に対する用量依存性の効果を示した図である。
【図６４】[00182]Ａβの皮質からの脳外クリアランスは、大槽からのＣＳＦ排液により低下することを示した図である。左側バー１（ＣＳＦ排液）、右側バー２（対照）。
【図６５】[00183]。Ａβの脳外クリアランスは、睡眠妨害により低下することを示した図である。左側バー１（睡眠妨害）。右側バー２（対照）。Ｎ＝３。５．発明の詳細な説明
【発明を実施するための形態】
【００６３】
[00184]明確に開示するために、本発明の詳細な説明を、下記に記載するサブセクションに分けるが、これらには限定の意図はない。
[00185]５．１．脳内のグリオ−血管経路（グリンファティック系）の機能を測定するための方法
[00186]哺乳動物の脳および／もしくは脊髄（またはまとめて、中枢神経系もしくは「ＣＮＳ」）中のグリオ−血管経路（本明細書ではまた、「グリンファティック系」とも呼ぶ）の機能を測定するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、
中枢神経系の画像化を行うステップと、
中枢神経系中のＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップと
を含み、それによって、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック機能を測定する。
【００６４】
[00187]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。その他の実施形態では、哺乳動物は、家畜（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびヤギ）、または珍しい哺乳動物（例えば、動物園の哺乳動物）であり得る。
【００６５】
[00188]一実施形態では、この方法は、中枢神経系の画像化を行うステップの前に、画像化剤（本明細書ではまた、トレーサーとも呼ぶ）または造影剤を投与するステップをさらに含む。
【００６６】
[00189]画像化を用いるこの方法を使用して、ＣＳＦコンパートメントとＩＳＦコンパートメントとの間の交換を追跡することができる。画像化の技法は好ましくは、この交換プロセスを、脳および脊髄外のその他の交換とは別個に追跡する。したがって、画像化剤またはトレーサーは好ましくは、身体の末梢（全身）コンパートメント中には存在しない。
【００６７】
[00190]好ましい実施形態では、画像化剤を、くも膜下腔内に投与する。この方法の別の実施形態では、画像化剤をくも膜下腔内に投与するステップが、画像化剤を腰椎または大槽髄腔内注入で投与するステップを含む。画像化剤のくも膜下腔内への投与は、当該技術分野で周知である。
【００６８】
[00191]この方法の別の実施形態では、画像化剤（または造影剤）を、鼻腔内に、または眼に（例えば、点眼剤として眼を介して適用して）投与することができる。
[00192]その他の実施形態では、画像化剤（または造影剤）を、実質内または脳室内のいずれかに注入する薬物と共に同時投与することができる。同時投与のそのような方法は、当該技術分野で周知である。
【００６９】
[00193]この方法の別の実施形態では、中枢神経系の画像化を行うステップが、中枢神経系のダイナミックまたは造影磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）を行うステップを含む。画像化剤は、陰性または陽性（常磁性）の造影剤であり得る。ヒトおよび非ヒト霊長類の脳および脊髄を含めた、哺乳動物の脳および脊髄を画像化するためのＭＲＩ法は、当該技術分野で周知である。
【００７０】
[00194]この方法の別の実施形態では、画像化剤が、陽電子放出放射性核種トレーサーであり、中枢神経系の画像化を行うステップが、脳および／または脊髄の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャニングを行って、トレーサーのＣＳＦ−ＩＳＦの交換を追跡するステップを含む。哺乳動物の脳および脊髄を画像化するのに適切なＰＥＴスキャニングのプロトコールは、当該技術分野で周知である。ＰＥＴスキャニングのプロトコールは、トレーサーの移動を、最適化されたスキャニング条件下で追跡することができ、スキャニング条件は、当該技術分野の日常的な方法を使用して最適化することができる。
【００７１】
[00195]ＰＥＴスキャニングを画像化法として使用する、この方法の特定の実施形態では、ＰＥＴスキャニング中に対象または患者について使用する最初のベッドの位置を、注入部位がちょうど視界から外れるように調節することができる。こうすることにより、トレーサーの移動を最大限に見ることができる。注入部位は好ましくは、注入後にシールドして、ランダムなバックグラウンドの放出を低下させる。
【００７２】
[00196]この方法の別の実施形態では、中枢神経系の画像化を行うステップが、少なくとも２つの異なる磁性造影剤を投与するステップを含む。異なる磁性造影剤は、中枢神経系組織中のそれらの動態的特徴を比較することができるように、Ｔ１（常磁性）またはＴ２（陰性造影剤）に対するそれらの作用の観点から適合させることができる。特定の実施形態では、動態的特徴を、下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する方法を使用して比較および解析する。
【００７３】
[00197]別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、例えば、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、機能性もしくは治療用のナノ粒子等のナノ粒子、化学療法剤、治療用に投与する毒性産物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、αシヌクレイン、低分子薬物、ウイルスベクター、抗体ベースの治療薬、リポソーム、または治療用ＲＮＡ構築物のクリアランスを測定またはモニタするステップを含む。特定の実施形態では、下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する解析の技法を使用することができる。
【００７４】
[00198]別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、中枢神経系中の常磁性または陰性の造影剤の流入動態、実質における分布および／またはクリアランスを解析するステップを含む。特定の実施形態では、下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する解析の技法を使用することができる。
【００７５】
[00199]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、下垂体陥凹、松果体陥凹、小脳および／または嗅球においてＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップを含む。
【００７６】
[00200]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップを含む。そのようなデータ解析を、下記の例、例えば、実施例１〜３の開示に従って行うことができる。
【００７７】
[00201]この方法の別の実施形態では、シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップがそれぞれ、Ｔ１の短縮またはＴ２の変化を測定するステップを含む。実施例２は、Ｔ１の短縮および／またはＴ２の変化を測定するための方法を開示する。
【００７８】
[00202]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、流入動態パラメータを計算するステップを含み、流入動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する。
【００７９】
[00203]この方法の別の実施形態では、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、造影ＭＲＩまたはＰＥＴの静止画像から動態パラメータを計算する単一のステップを含み、動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する。
【００８０】
[00204]別の実施形態では、この方法は、哺乳動物において神経変性疾患を発症するリスクを計算するステップをさらに含む。神経変性疾患は、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、または慢性外傷性脳症であり得る。
【００８１】
[00205]神経変性疾患を発症するリスクを計算するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、当該技術分野で公知の診断テスト、例として、ＡＰＯＥ４対立遺伝子保有者の状況またはＣＳＦバイオマーカーの状況（例えば、アミロイドβ、タウ、αシヌクレイン）についての診断テスト等を使用することができる。
【００８２】
[00206]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、外傷性脳損傷に罹患している。この場合、この方法は、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を発症するリスクを、当該技術分野で周知の方法を使用して計算するステップをさらに含むことができる。
【００８３】
[00207]この方法の特定の（実施例２にも記載する）実施形態では、少なくとも１つの造影剤を投与する（例えば、注入する）ためのくも膜下腔内カテーテルを、哺乳動物患者（または対象）中に、当該技術分野で公知の適切な外科的方法を使用して挿入する。好ましくは、腰椎からくも膜下腔内へカテーテルを挿入し、造影剤を注入する。特定の実施形態では、その他の投与経路、例として、大槽内、脳室または実質内への挿入および注入を使用することができる。手術後、患者を、頭部を固定するデバイス中に置いて、ＭＲＩ画像化法を行うことができる。非侵襲性のＭＲＩ対応モニタ（例えば、パルスオキシメトリー、呼吸数および直腸温プローブ）を、対象がＭＲＩ画像化法を受ける間のバイタルサインを連続的にモニタするために置くことができる。画像化の間は、体温を好ましくは、綿密にモニタし、例えば、コンピュータ支援空気加熱システムを使用して維持する。くも膜下腔内カテーテルを、生理食塩水中に希釈した２つの常磁性ＭＲ造影剤を充填したライン（例えば、ＰＥ２０）に接続することができ、このラインは、シリンジおよび微量注入ポンプに取り付けられている。水分補給および追加麻酔を、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。
【００８４】
[00208]グリンファティック経路を造影ＭＲＩにより可視化するために、Ｔ１の短縮は２つの異なる常磁性造影剤を適合させることができる最初の濃度の影響を受け、その結果、注入部位から遠く離れた脳組織中で、時間の経過と共に生じる濃度の減少が比較可能となる。２つの常磁性造影剤がもたらすＴ１の作用を適合させるのが好ましく、その理由は、それらは、大槽に注入されると、脳全体のグリンファティック経路を通って移動し、時間の経過と共に進行性に希釈されるからである。
【００８５】
[00209]制御デバイス、例として、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ５．０ソフトウエア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により制御される制御コンソールに接続されたＭＲＩ機器を使用して、ＭＲＩ画像化法を行うことができる。高周波表面コイルを、受信機として使用することができ、巻きコイルを、送信機として使用することができる。ローカライザー解剖学的スカウトスキャンの後、３次元Ｔ１−重み付けＦＬＡＳＨシーケンス（ＴＲ＝１５ミリ秒、ＴＥ＝３．４ミリ秒、フリップ角：１５°、ＮＡ＝１、ＦＯＶ＝３．０×３．０×３．２ｃｍ、スキャニング時間＝４分５秒、２５６×１２８×１２８の獲得マトリックスサイズを、２５６×２５６×２５６に補間して、０．１２×０．１２×０．１３ｍｍの画像解像度を得る）を、矢状面または冠状面で獲得する。
【００８６】
[00210]画像強度を、当該技術分野で公知の方法を使用し、時系列を通して標準化することができる。スキャニングのプロトコールは、例えば、３回のベースラインスキャン、それに続く、継続的なＭＲＩ獲得の間の留置カテーテルを介する、くも膜下腔内への２つの常磁性造影剤の送達からなり得る。常磁性造影剤を、くも膜下腔内に、当該技術分野で公知の方法を使用して決定した適切な注入速度および適切な時間で送達することができる。くも膜下腔内への注入が完了したら、３次元ＭＲＩ獲得を、当該技術分野で公知の方法により決定した所望の長さの時間にわたり継続することができる。
【００８７】
[00211]一般的なＭＲＩ画像処理手順、例えば、頭部の動きの補正、強度の標準化、平滑化、およびボクセル毎のベースラインシグナル％への変換を、当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。獲得したＴ１−重み付けＭＲＩ画像を、ＤＩＣＯＭファイルとしてエクスポートし、３次元ＮＩｆｔｉ画像フォーマットに変換することができる。
【００８８】
[00212]頭部の動きが引き起こしたスキャン間の位置ずれを、各スキャンの剛体アライメントにより、時間平均化（平均）画像に補正することができる。
[00213]画像強度を、以下の式：ｉｍｇ標準化＝ｉｍｇオリジナル／ファントム×１０００を使用して、ボクセル強度を参照ファントムの平均強度で割り；それに続き、最大半量の等方性ガウス平滑化において、０．１ｍｍの全幅で割ることによって、時系列を通して標準化することができる。
【００８９】
[00214]次いで、以下の式：（Ｐ（Ｉ，ｊ，ｋ）＝（Ｉ（Ｉ，ｊ，ｋ）−ベース（Ｉ，ｊ，ｋ））／ベース（Ｉ，ｊ，ｋ）×１００）を使用して、全ての時系列の画像からベースラインの平均画像を減じ、それをベースラインの平均画像で割って、ボクセル強度が平均ベースライン画像に対するパーセント変化を示すようにすることができる。
【００９０】
[00215]事前選択した解剖学的領域において時間の経過と共にＴ１−重み付けＭＲＩ上で測定したシグナルの変化を使用して、常磁性造影剤の局部的な組織への取込みの時間「活性」曲線（ＴＡＣ）を得ることができる。Ｔ１−重み付け平均ベースライン画像および造影Ｔ１−重み付けＭＲＩを使用して、関心領域（ＲＯＩ）の配置を解剖学的に導くことができる。正中付近の矢状ＭＲＩから、ＲＯＩを、各半球において４つの矢状スライス上に描出することができ、ＰＭＯＤソフトウエア（ＰＭＯＤ３．３０７版、ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ、チューリッヒ、スイス）を使用して、解剖学的ＲＯＩのそれぞれからのシグナルを平均することができる。ＲＯＩとして、例えば、下垂体陥凹、松果体陥凹、嗅球、小脳、橋核、および／または水道を挙げることができる。各ＲＯＩについてのＴＡＣを、ＰＫＭｏｄモジュールを介して抽出することができる。各ＲＯＩのＴＡＣについての曲線下面積（ＡＵＣ）を、「台形則」を使用して計算することができる（さらなる詳細については、実施例２を参照）。各対象のＡＵＣを、その特定の研究のために使用した、対応する時間間隔の数で割ることによって、計算したＡＵＣを標準化することができ、これを、「平均曲線下面積（ｍＡＵＣ）」と呼び、（ｍＡＵＣ＝ＡＵＣ／（ｎ−１））に従って計算する。さらに、群内の各対象または患者に送達された常磁性造影剤の量の潜在的な差を最少化するために、下垂体陥凹のｍＡＵＣ（これは、主たる投入量および造影剤源に相当する）を使用して、その他の領域のｍＡＵＣを標準化することができる。続いて、平均ｍＡＵＣ比を、群または対象の間で、各解剖学的場所について、両側独立ｔ検定を使用して比較することができる。
【００９１】
[00216]クラスター分析を行って、ノンパラメトリックセグメント化を解析し、ＭＲＩ画像中のボクセルを類似の動態に基づいてグループ化することができ、これは、ｋ平均クラスターアルゴリズム（ＰＭＯＤ３．３０７版、ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ、チューリッヒ、スイス）を使用して、４つの矢状スライス上で、４次元Ｔ１−重み付けＭＲＩのそれぞれからの水道のレベルにおいて行うことができる。脳のみを含有する関心体積のマスクを、クラスター分析のために作り出すことができる。使用するクラスターの数（Ｋ）を、大血管、例として、脳底動脈（下垂体陥凹を含む）および嗅動脈複合体に隣接するボクセルを区分することができるＫにより決定した。これは、その都度、動物毎に行った。５０％パーセント閾値（すなわち、最も大きなシグナルの変化（ＴＡＣ値の２乗の和を使用した）を伴うピクセルの５０％のみ）を使用して、各解析を行った。傍血管流入導管の最も理想的な可視化をもたらすクラスターの数は、４であった。これら４つのクラスターを、視覚的に調べ、大血管に関するクラスターの位置を確認するために、対応する造影ＭＲＩおよび解剖学的ＭＲＩと共に同時記録した。各クラスターについてのボクセルおよびＴＡＣの数を抽出して、さらに処理した。
【００９２】
[00217]統計解析を、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、統計ソフトウエアパッケージ、例として、ＳＡＳ９．２版（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ、米国）およびＸＬＳＴＡＴ２０１１年版（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、ＮＹ、米国）を使用して行うことができ、＜０．０５のｐ値により、有意に異なることを説明する。全てのデータを、平均±ＳＤとして提示することができる。局部的な組織への取込みの差（例えば、目的の解剖学的領域の平均「曲線下面積」（ｍＡＵＣ）と下垂体陥凹の平均ｍＡＵＣとの間の平均比により示す差）を、独立した群についての両側ｔ検定を使用して比較することができる。
【００９３】
[00218]一実施形態では、以下のパラメータをＫ平均クラスター分析から導き出すことができる：１）３つの解剖学的帯域のそれぞれ中のボクセルの総数、２）各帯域の時間加重クラスター数（ボクセルの数×ＡＵＣ）、および３）帯域２と帯域３との時間加重クラスター総数対帯域１の時間加重クラスター総数の比。これらのパラメータのそれぞれの平均値の差を、独立した群についての両側ｔ検定を使用する比較群または対象間のクラスター分析から導き出すことができる。
【００９４】
[00219]５．２．発症した神経変性疾患を治療するための方法
[00220]哺乳動物の脳および／もしくは脊髄（またはＣＮＳ）中に発症した神経変性疾患を治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含む方法を提供する。
【００９５】
[00221]この方法の一実施形態では、反応性グリオーシスを低減させ、それによって、神経変性疾患の発症を遅延させるまたは阻止する。反応性グリオーシスは、間質内の老廃物のクリアランスを減少させるまたは阻止する。反応性グリオーシスは、アルツハイマー病等の神経変性疾患と関連があることが当該技術分野で公知である。また、グリオーシスの増加が、老化する哺乳動物の脳内でも観察される。反応性グリオーシスはまた、特定の自己免疫炎症性障害、特に、多発性硬化症とも関連がある。これはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している個体のＣＮＳ中においても観察されている。特定の実施形態では、ＣＮＳからの老廃産物の、グリンファティック系のクリアランスを増加させることを使用して、反応性グリオーシスおよびその神経変性の結果を、遅延させる、阻止する、減少させる、または低減させることができる。
【００９６】
[00222]反応性グリオーシスは、Ａｑｐ４依存性のバルク流を減少させ、細胞外空間の体積を低下させて、脳および脊髄からの、老廃産物を含めた、ＩＳＦの溶質のクリアランスを妨害する。
【００９７】
[00223]神経変性疾患は、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、または慢性外傷性脳症であり得る。
【００９８】
[00224]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。その他の実施形態では、哺乳動物が、家畜（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ）、または珍しい哺乳動物（例えば、動物園の哺乳動物）であり得る。哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象であり得る。
【００９９】
[00225]一実施形態では、この方法は、中枢神経系中のグリンファティック系の機能を、セクション５．１および下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する方法に従って測定するステップをさらに含む。
【０１００】
[00226]この方法の別の実施形態では、反応性グリオーシスを、低減させる、遅延させる、または阻止する。別の実施形態では、一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランス（本明細書ではまた、「グリンファティック系のクリアランス」とも呼ぶ）を増加させるまたは促進する治療剤を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１０１】
[00227]グリンファティック系のクリアランスの増加は、上記で論述したように、反応性グリオーシスの低減、発生遅延または阻止をもたらすことができる。したがってまた、哺乳動物の中枢神経系中の反応性グリオーシスを治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスの減少、阻止、低減または発生遅延をもたらす方法も提供する。
【０１０２】
[00228]一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する治療剤を哺乳動物に投与するステップを含む。特定の実施形態では、薬剤が、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子である。
【０１０３】
[00229]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する治療剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタンもしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９、またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【０１０４】
[00230]別の実施形態では、この方法は、哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングして、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進するステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【０１０５】
[00231]５．３．脳の間質からの脳の老廃産物のクリアランスを促進するための方法
[00232]哺乳動物の脳の間質および／または脊髄の間質からの老廃産物（例えば、脳、脊髄またはＣＮＳの老廃産物）のクリアランスを促進するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含み、それによって、脳の間質および／または脊髄の間質からの老廃産物のクリアランスを促進する方法を提供する。薬剤は、例えば、利尿剤であり得る。
【０１０６】
[00233]この方法の一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤、例えば、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１０７】
[00234]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタンもしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９、またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【０１０８】
[00235]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である。
[00236]別の実施形態では、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である。
【０１０９】
[00237]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。その他の実施形態では、哺乳動物が、家畜（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ）、または珍しい哺乳動物（例えば、動物園の哺乳動物）であり得る。哺乳動物が、例えば、処置を必要とする患者または対象であり得る。
【０１１０】
[00238]一実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、セクション５．１および下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する方法に従って測定するステップをさらに含む。
【０１１１】
[00239]この方法の別の実施形態では、脳、脊髄またはＣＮＳの老廃産物が、アミロイドβ（Ａβ）（例えば、可溶性Ａβ）、タウまたはαシヌクレインである。また、この方法は、当該技術分野で公知の脳の事実上のいかなる老廃産物のクリアランスを促進するのにも適切である。一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する治療剤を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１１２】
[00240]また、哺乳動物の脳内において、脳脊髄液（ＣＳＦ）／間質液（ＩＳＦ）の交換と関連がある脳脊髄液（ＣＳＦ）の分泌の低減および／または流れの低減を修復するおよび／または増大させるための装置も提供する。好ましい実施形態では、哺乳動物がヒトである。この装置は、機械的にポンピングするシステム（例えば、注入ポンプ）を含み、それによって、より迅速な、脳内のＣＳＦのクリアランスを促進する。一実施形態では、この装置はまた、人工（「模擬」）ＣＳＦも含み、ポンピングするシステムが、脳内に人工ＣＳＦをポンピングまたは注入する。セクション６．４（実施例４）を参照。
【０１１３】
[00241]この装置の別の実施形態では、この装置は、これらに限定されないが、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症および混合型認知症を含めた、神経変性疾患と関連があるまたは外傷性脳損傷もしくは虚血性（例えば、びまん性虚血性）脳損傷と関連がある脳脊髄液（ＣＳＦ）の分泌の低減および／または流れの低減を修復するおよび／または増大させる。
【０１１４】
[00242]５．４．脳の老廃産物の蓄積を緩慢にする、遅延させる、または阻止するための方法
[00243]哺乳動物の中枢神経系中の老廃産物の蓄積を緩慢にする、遅延させる、または阻止するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、中枢神経系からの老廃産物のクリアランスを増加させる方法を含む。
【０１１５】
[00244]一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する治療剤を哺乳動物に投与するステップを含む。
[00245]特定の実施形態では、アドレナリン作動性受容体アンタゴニストが、治療剤である。アドレナリン作動性受容体アンタゴニストは、当該技術分野で周知である。また、脳室−腹腔シャントの外科的埋込みも治療剤と併用して、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進することができる。
【０１１６】
[00246]この方法の一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤、例えば、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１１７】
[00247]その他の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、例として、トルバプタン、コニバプタンもしくはＶＰＡ−９８５；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、例として、アナンチン；アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、例として、ロサルタン；ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、例として、ＰＤ１２３３１９、またはＡＴ１受容体のアンタゴニスト、例として、バルサルタンである。
【０１１８】
[00248]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である。
[00249]別の実施形態では、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である。
【０１１９】
[00250]別の実施形態では、この方法は、哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングして、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進するステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
【０１２０】
[00251]この方法の一実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。その他の実施形態では、哺乳動物が、家畜（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ）、または珍しい哺乳動物（例えば、動物園の哺乳動物）であり得る。哺乳動物が、例えば、処置を必要とする患者または対象であり得る。
【０１２１】
[00252]一実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、セクション５．１および下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する方法に従って測定するステップをさらに含む。
【０１２２】
[00253]この方法の別の実施形態では、脳の老廃産物が、アミロイドβ（Ａβ）（例えば、可溶性Ａβ）、タウまたはαシヌクレインである。または、この方法は、当該技術分野で公知の脳の事実上のいかなる老廃産物の蓄積を緩慢にする、遅延させる、または阻止するのにも適切である。
【０１２３】
[00254]特定の実施形態では、哺乳動物の脳の間質中のアミロイドβ（Ａβ）、タウおよび／またはαシヌクレインの蓄積の減少、低減、発生遅延、または阻止をもたらすための方法を提供する。この方法は、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１２４】
[00255]５．５．哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるまたは妨害するための方法
[00256]哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるまたは妨害するための方法を提供する。そのような方法を、治療用の薬物または化合物のクリアランスに、例えば、脳腫瘍の治療に使用することができる。
【０１２５】
[00257]治療剤または調節剤は、当該技術分野で公知のいずれか、例えば、治療用もしくは機能性のナノ粒子、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、免疫調節剤、抗体ベースの治療薬、ウイルスベクター、リポソーム、またはＲＮＡベースの治療用構築物であり得る。
【０１２６】
[00258]一実施形態では、この方法は、グリンファティック系のクリアランスを減少させる（または妨害する）ステップを含む。
[00259]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、セクション５．１および下記の例、例えば、実施例１〜３に開示する方法に従って測定するステップをさらに含む。
【０１２７】
[00260]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを減少させる（または妨害する）ステップが、グリンファティック系のクリアランスを減少させるまたは妨害する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む。特定の実施形態では、薬剤が、ブメタニド、ＡＱＰ４に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＡＶＰ（バソプレシン）のアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアゴニスト、またはＡＴ１受容体のアゴニストであり得る。
【０１２８】
[00261]この方法の別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを減少させる（または妨害する）ステップが、哺乳動物の中枢神経系の間質を通る液体の流れを遮断するまたはそれに対するバリアを設けるステップを含む。
【０１２９】
[00262]
[00263]５．６．方法の治療における使用
[00264]実質の液体の流れのパターンを決定するための、本明細書に開示する方法を、治療におけるいくつかのアプローチに利用することができる。第１に、脳内のバルク流の効率を改善して、可溶性Ａβ、タウまたはαシヌクレイン等の脳の老廃産物のクリアランスを改善させ、こうすることにより、それらの分解または全身循環中への再取込みのいずれかを潜在的に加速させることができる。
【０１３０】
[00265]反対に、溶質のクリアランスの妨害は、例えば、脳の癌または腫瘍の治療のための抗悪性腫瘍剤および免疫調節剤等の治療剤の脳からの除去を緩慢にすることができる。
【０１３１】
[00266]また、バルク流は、ＣＮＳの免疫特権を損なわずに脳実質の免疫監視を促進することもできる。くも膜下ＣＳＦ中のリンパ球および抗原提示細胞の両方が、傍静脈バルク流出によりＣＳＦに送達される間質内の抗原を検出することができる。また、傍血管経路は、遊走する細胞およびそれらの誘導分子のための経路として働くこともでき、したがって、腫瘍細胞の遊走をモニタするための潜在的な手段となる。さらに、傍血管経路は、細胞の遊走のための導管となる場合があり、そのような遊走をモニタすることもできる。
【０１３２】
[00267]以下の実施例を例証のために提供するが、これらには限定の意図はない。
６．実施例
【実施例１】
【０１３３】
[00268]６．１．傍血管経路は、脳の実質を通るＣＳＦの流れ、およびアミロイドβを含めた、間質内溶質のクリアランスを促進する
[00269]脳は、リンパ循環を欠くので、細胞外タンパク質を代替のメカニズムによりクリアランスしなければならない。脳脊髄液（ＣＳＦ）は脳の細胞外溶質のためのシンクとして機能するが、脳の間質からの溶質が、実質からＣＳＦにどのように移動するのかは不明である。本実施例により、くも膜下ＣＳＦの相当な部分が脳の間質内空間を通って循環することが示されている。本実施例は、小さな蛍光トレーサーのｉｎ  ｖｉｖｏにおける二光子画像法に基づいて、ＣＳＦが貫通動脈を囲む傍血管空間に沿って実質に入ること、および脳の間質液が傍静脈排液経路に沿ってクリアランスされることを示している。アストロサイト中の水チャネルのアクアポリン−４（ＡＱＰ４）を欠く動物では、このシステムを介するＣＳＦの流入が緩慢になり、間質内溶質のクリアランスが約７０％低減することが示され、このことは、これらの解剖学的な流入経路と流出経路の間の液体のバルク流がアストロサイトの水の輸送により支援されることを示唆する。アルツハイマー病を引き起こすと考えられているペプチドであるアミロイドβに蛍光タグを付けたものがこの経路に沿って輸送されたこと、およびＡｑｐ４遺伝子の欠失が可溶性アミロイドβのクリアランスを抑制したことから、この経路によりアミロイドβが中枢神経系から除去されることが示唆される。また、静脈に沿う流れを介するクリアランスは、神経変性状態に関与するタンパク質の細胞外レベルを調節することもでき、その機能障害は、可溶性タンパク質の誤った蓄積に寄与する。
【０１３４】
[00270]緒言
[00271]リンパ管構造は、血管構造に平行な第２の循環に相当し、後毛細管小静脈を介しては吸収されないその構成要素のタンパク質およびその他の溶質を有する間質液（ＩＳＦ）のクリアランスを担う（１、２）。血管を有する組織の大部分では、リンパ系は、静水圧およびホメオスタシスの両方の維持にとって決定的に重要である。しかし、脳は、組織学的に特定可能なリンパ管を有さず、したがって、その他の末梢組織中には存在する、間質内溶質および液体のクリアランスのための別個の経路を欠く（３〜５）。これは、驚くべきことであり、その理由は、神経細胞およびグリアの大きな代謝速度およびそれらの細胞外環境中の変化に対する高い感受性は、ＩＳＦおよび溶質の迅速なクリアランスの必要性を示唆するからである。
【０１３５】
[00272]中枢神経系（ＣＮＳ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）が、脳からの溶質のクリアランスに関与すると考えられている（６）。脈絡叢（choroid plexi）中で形成されたＣＳＦは、脳室およびくも膜下腔を通って流れ、その最終地点に達し、そこで、脳神経鞘に沿ってまたは鼻リンパ管を通って、硬膜静脈洞のくも膜絨毛を介して血流中に再吸収される（３、７、８）。間質内溶質は、ＩＳＦの対流性バルク流によりクリアランスされて、ＣＳＦに達すると考えられており、ＩＳＦは、解剖学的または機能的に異なる構造を通ってではなく、脳組織を通って拡散性に進む（３，４，９）。本明細書では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける二光子画像法およびその他の技法を使用して、脳の間質中へのおよびそこを通るくも膜下ＣＳＦの流れを研究した。
【０１３６】
[00273]材料および方法
[00274]動物
[00275]全ての実験が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにより承認された。別段の記載がない限り、８〜１２週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を実験に使用した。
【０１３７】
[00276]血管周囲のアストロサイトのエンドフィートを可視化するために、ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＧＦＡＰＧＦＰ）１４Ｍｅｓ／Ｊ（ＧＦＡＰ−ＧＦＰ、ＪＡＸ）マウスを使用した。これらのマウスは、緑色蛍光タンパク質をアストロサイト特異的ＧＦＡＰプロモーターの制御下で過剰発現する。
【０１３８】
[00277]ＮＧ２−ＤｓＲｅｄおよびＴｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄを使用して、内因性蛍光により、動脈／細動脈と静脈／細静脈とを対比させてそれらを同定した：動脈および細動脈は、内皮ＧＦＰおよび血管平滑筋ＤｓＲｅｄを発現し、静脈および細静脈は、内皮ＧＦＰを発現するが、血管平滑筋ＤｓＲｅｄを欠く。
【０１３９】
[00278]ＣＳＦトレーサーの流入および流出の傍血管経路を定義するために、トランスジェニック２重レポーターマウスを生成した。Ｔｇ（ＴＩＥ２ＧＦＰ）２８７Ｓａｔｏ／Ｊ（Ｔｉｅ２−ＧＦＰ、ＪＡＸ）を、ＮＧ２ＤｓＲｅｄＢＡＣ（５４）（ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ、ＪＡＸ）と交雑させた。Ｔｉｅ２−ＧＦＰマウスは、緑色蛍光タンパク質を内皮特異的Ｔｉｅ２プロモーター下で過剰発現し、一方、ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウスは、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄをＮＧ２プロモーターの制御下で発現する。ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウスを最初は、ＮＧ２陽性グリア細胞を研究するために生成したが、成体動物はまた、脳の周皮細胞および血管平滑筋細胞中にもＤｓＲｅｄを発現する。Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ動物中では、（内皮細胞層中の）全ての血管がＧＦＰで標識される。毛細血管（図３Ｆ）、静脈（図３Ｈ）および細静脈（図３Ｇ）は、低いレベルの点状のＤｓＲｅｄを（周皮細胞および散在性の血管平滑筋細胞中に）発現し、一方、動脈（図３Ｄ〜Ｅ）および細動脈（図３Ａ〜Ｃ）は、ＤｓＲｅｄ標識の濃密な円周のパターンを示す。このことにより、動脈および細動脈と、静脈および細静脈とを容易に識別することができ（図３Ａ、図１０Ａ〜Ｅ）、追加の組織化学的標識の必要はない。
【０１４０】
[00279]Ａｑｐ４−／−（Ａｑｐ４欠損）マウスを、記載に従って生成した（５３）。これらの動物は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上に戻し交雑したＡｑｐ４遺伝子のグローバルノックアウトである。
【０１４１】
[00280]麻酔
[00281]全ての実験で、ケタミン（０．１２ｍｇ／ｇ、腹腔内）とキシラジン（０．０１ｍｇ／ｇ、腹腔内）との組合せを用いて、動物に麻酔を施した。
【０１４２】
[00282]統計
[00283]全ての図で、データを、平均±ＳＥＭとして提示する。全ての統計を、ソフトウエアＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。＜０．０５のＰ値を、有意とみなした。各データセットの統計処理を、下記に記載する。
【０１４３】
[00284]ＣＳＦトレーサー
[00285]全ての蛍光ＣＳＦトレーサーを、０．５％の濃度の人工ＣＳＦ中で構成した。これには、ＡＬＥＸＡ−５９４ヒドラジド（Ａ５９４）、ＦＩＴＣ−デキストラン２０００（ＦＩＴＣ−ｄ２０００）、テキサスレッド−デキストラン３（ＴＲ−ｄ３）、テキサスレッド−デキストラン２０００（ＴＲ−ｄ２０００）、卵白アルブミンコンジュゲートＡＬＥＸＡ−６４７（ＯＡ−６４７）（全て、インビトロジェン製）が含まれる。ＨｉＬｙｔｅ５５５コンジュゲートアミロイドβ１−４０（Ａｎａｓｐｅｃ）を、０．１％の濃度の人工ＣＳＦ中で構成した。放射標識３Ｈ−マンニトール（１５〜３０Ｃｉ／ミリモル、パーキン・エルマー）を、人工ＣＳＦ中に０．１μＣｉ／μｌで溶解させた。放射標識３Ｈ−デキストラン１０（１００〜５００ｍＣｉ／ｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、人工ＣＳＦ中に０．０１μＣｉ／μｌで溶解させた。放射標識１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０（２２００Ｃｉ／ミリモル、パーキン・エルマー）を、０．００５μＣｉ／μｌ（２．３ナノモル／Ｌ）の人工ＣＳＦ中に溶解させた。
【０１４４】
[00286]脳室−大槽の灌流
[00287]麻酔を施したマウスを、定位固定枠中に固定し、３３ＧＡ鋼鉄針を、小さな穿頭孔から右側脳室中に定位的に挿入した（十字縫合に対して、０．９５ｍｍ外側、２．３５ｍｍ腹側、および０．２２ｍｍ尾側）。第２の３０ＧＡ針を、大槽に挿入した。脳室−大槽の閉塞灌流を、連結型シリンジポンプ（Ｍｉｃｒｏ４、ＷＰＩ）を用いて、人工ＣＳＦ中に溶解させたトレーサーを外側脳室中に注入し、大槽からＣＳＦを２００ｎｌ／分の等しい速度で引き出すことによって行った。
【０１４５】
[00288]脳の実質中へのトレーサーの分布を評価するために、動物を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて経心腔的に灌流し、一晩後固定し、１００μｍ切片を、ビブラトーム上で切断し、ＤＡＰＩを有するＰＲＯＬＯＮＧ  Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ（インビトロジェン）を用いてマウントした。トレーサーの脳室コンパートメントからの浸透を、落射蛍光顕微鏡法またはレーザー走査型共焦点顕微鏡法によりｅｘ  ｖｉｖｏにおいて画像化した。
【０１４６】
[00289]大槽内へのトレーサーの注入
[00290]麻酔を施したマウスを、定位固定枠中に固定し、３０ＧＡ針を、大槽に挿入した。大槽内への注入のために、１０μｌのＣＳＦトレーサーを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて２μｌ／分の速度で５分にわたり注入した。
【０１４７】
[00291]大槽髄腔から脳の実質中へのトレーサーの移動を可視化するために、動物を、大槽内へのトレーサーの注入の３０分後から６時間後までの間に灌流固定した。１００μｍのビブラトーム切片を、上記に従って切断し、マウントし、トレーサーの移動を、落射蛍光顕微鏡法またはレーザー走査型共焦点顕微鏡法によりｅｘ  ｖｉｖｏにおいて画像化した。
【０１４８】
[00292]脳に入るくも膜下ＣＳＦの絶対比を評価するために（図８）、放射標識３Ｈ−マンニトール（１０μｌ中に１．０μＣｉ）または３Ｈ−デキストラン−１０（１０μｌ中に０．１μＣｉ）のいずれかを最初に、麻酔を施した動物中に大槽内注入した。１５、３０または４５分後、動物を迅速に断頭し、頭蓋骨を開き、硬膜を除去し、脳を収集した。脳を、２ｍｌのＳｏｌｕｅｎｅ（シグマ）中、４５℃で一晩可溶化した。１０ｍｌのＨｉｏｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒ液体シンチレーションカクテル（パーキン・エルマー）を添加し、放射活性をＭｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  シンチレーション・カウンター（ベックマン・コールター）中で測定した。脳の放射活性を、大槽内への放射性トレーサーの注入の直前にシンチレーションバイアル中に直接加えた１０μｌの一定分量中に検出された総放射活性に対して標準化し、総注入放射活性の％として表現した。３Ｈ−マンニトールおよび３Ｈ−デキストランの脳内の蓄積を、両側分散分析およびボンフェローニの事後検定により比較した。３Ｈ−マンニトールのおよその最大流入を、蓄積曲線を単相の関連関数に適合させることによって決定し、次いで、最良適合曲線についてのプラトー値を決定した（３９．９６±５．５５％、Ｒ２＝０．３５９７）。
【０１４９】
[00293]ｅｘ  ｖｉｖｏにおける蛍光画像法
[00294]トレーサーの脳内への浸透を、落射蛍光顕微鏡法によりｅｘ  ｖｉｖｏにおいて評価した。切片全体の多重チャネルモンタージュを、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）のＶｉｒｔｕａｌ  Ｓｌｉｃｅモジュールを用いて獲得した。これには、別個のＤＡＰＩ、緑色および赤色の放出チャネルが含まれた。照射レベルを、無注入対照切片に基づいて決定し、次いで、研究全体を通して一定に維持した。
【０１５０】
[00295]固定切片中へのトレーサーの移動を定量化するために、切片の画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）中で解析した（図７）。各切片について、色チャネルを分割し、切片全体の関心領域（ＲＯＩ）を、ＤＡＰＩチャネルに基づいて定義した。各トレーサーに対応する色チャネルから、切片領域外のＲＯＩに基づくバックグラウンドを減じた。平均切片蛍光強度を計算し、次いで、切片を、（２５５中の）７５のピクセル強度で一様に閾値化し、閾値化領域を、全切片領域の％として表現した。動物１匹当たりおよそ１０〜１４個の切片を、この様式で画像化し、切片間の平均蛍光強度およびトレーサー被覆度を、各動物内で平均して、単一の生物学的複製を生成した。蛍光強度またはトレーサーの分布に対するトレーサーのサイズの作用を、片側分散分析およびチューキーの事後検定により評価して、個々のトレーサー間の差を決定した。トレーサーの脳内への流入に対するＡｑｐ４遺伝子の欠失の作用を、両側分散分析およびボンフェローニの事後検定により評価して、個々の時点における差を決定した。
【０１５１】
[00296]固定したビブラトーム切片中へのおよびそれらを通るトレーサーの移動を、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（オリンパス）ソフトウエアを用いるレーザー走査型共焦点顕微鏡法（ＦＶ５００、オリンパス）により、強拡大してさらに画像化した。画像を、ＵＣＳＤプラグインセットを備えたＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を用いて処理した。
【０１５２】
[00297]ｉｎ  ｖｉｖｏにおける二光子レーザー走査顕微鏡法
[00298]ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化のために、麻酔を施した動物に、挿管し、小型の動物用人口呼吸器（ＣＷＥ）を使用して、約１００回の呼吸／分および０．３〜０．４ｍｌの１回換気量で室内空気による人工呼吸を行った。体温を、温度制御型加温パッドを用いて３７℃に保った。開頭手術（直径３ｍｍ）を、十字縫合に対して１ｍｍ外側および０．５ｍｍ後側の皮質上で行った。硬膜を、処置せず残し、開頭部を、ＣＳＦで覆い、カバースリップを用いて密封した。平均動脈圧をモニタし、動脈血ガスの値を測定するために、大腿動脈をカニューレ処置した。生理的範囲（ｐＯ２＝８０〜１５０ｍｍＨｇ、ｐＨ７．２５〜７．５）内の血液ガスを有するマウスのみを、本研究に含めた。血管構造を可視化するために、０．１ｍｌのＢＢＢ不透過性カスケードブルー−デキストラン１０（ＭＷ：１０ｋＤ）またはテキサスレッド−デキストラン７０（ＭＷ：７０ｋＤ；いずれも、生理食塩水中の１％、インビトロジェン）を、画像化の直前に動脈内注入した。
【０１５３】
[00299]Ｍａｉ  Ｔａｉレーザー（ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ）を、共焦点走査システム（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ３００、オリンパス）および正立顕微鏡（ＩＸ５１Ｗ、オリンパス）に取り付けて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化のために、記載に従って使用した（５５）。２０倍（０．９ＮＡ）の水浸レンズを使用して、皮質を表面から約２５０μｍの深さまで画像化した。励起波長は、カスケードブルーでは８００ｎｍであり、ＧＦＰ、ＦＩＴＣおよびテキサスレッドでは８７０ｎｍであった。ＧＦＰ、ＦＩＴＣおよびテキサスレッドについては、放出を、５７５〜６４５ｎｍで収集した。最初に、大脳の血管構造を、５１２×５１２ピクセルのフレームで、表面から２４０μｍの深さまで、５μｍのｚ−ステップで画像化した。ＣＳＦトレーサーの大槽内への注入の後に、皮質中へのトレーサーの移動を、２重チャネル（ＦＩＴＣおよびテキサスレッド）を用いて行って、５１２×５１２ピクセルの画像を獲得した。皮質を、表面から表面下２４０μｍまで、２０μｍのｚ−ステップで、実験を継続する間１分間隔で繰り返しスキャンした。画像解析を、ＵＣＳＤプラグインセットを備えたＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）を用いて行った。画像化したら、貫通細動脈と貫通細静脈とを、形態に基づいて識別した。すなわち、表在動脈は、表在静脈の表面を通り、皮質の深さの浅いところではより少ない分枝を示す。皮質表面下１００〜１２０μｍの撮像面を選択して、大槽内へのトレーサーの浸透の解析を行った。血管に沿うトレーサーの移動を定義するために、直径２５ピクセルの円形ＲＯＩを定義し、これは、３つの貫通細動脈および上行細静脈を囲んだ。傍血管脳組織中へのトレーサーの移動を定義するために、１５０ピクセルの外径および５０ピクセルの内径を有するドーナツ状ＲＯＩを定義した（したがって、傍血管ＲＯＩは除かれた）。貫通細動脈および上行細静脈上に、これらの中心を置いた。これらのＲＯＩ内の平均ピクセル強度を、各時点で測定した。各動物内の各時点において、傍細動脈ＲＯＩおよび傍静脈ＲＯＩを別個に平均して、単一の生物学的複製についての値を得た。貫通細動脈もしくは上行静脈に沿ったまたは傍細動脈脳組織および傍静脈脳組織中へのトレーサーの移動を比較する場合、両側分散分析を使用し、それに続き、ボンフェローニの事後検定を使用した。同じ検定を使用して、傍血管空間に沿ったまたは傍血管脳組織中へのトレーサーの移動に対するＡｑｐ４遺伝子の欠失の作用を評価した。
【０１５４】
[00300]実質内へのトレーサーの注入
[00301]間質液および溶質の脳からのクリアランスの経路および速度を評価するために、蛍光標識トレーサーおよび放射標識トレーサーを、脳の実質中へ定位的に注入した。麻酔を施した動物を、定位固定枠中に固定し、３３ＧＡ針を、小さな穿頭孔から脳内へ、以下の座標において挿入した：皮質内注入（十字縫合に対して、０．２２ｍｍ尾側、２．０ｍｍ外側、１．７５ｍｍ腹側）、線条体内注入（十字縫合に対して、０．２２ｍｍ尾側、２．５ｍｍ外側、３．５ｍｍ腹側）、視床内注入（十字縫合に対して、１．８２ｍｍ尾側、１．２５ｍｍ外側、３．７５ｍｍ腹側）。針の挿入の後、３０分を経過させて、針の跡が膨んで閉じるのを待った。１．０μｌの（人工ＣＳＦ中に溶解させた）トレーサーを、１７ｎｌ／分の速度で注入した。
【０１５５】
[00302]実質内の蛍光トレーサー（ＯＡ−６４７）の分布を評価する場合、動物を、注入後に、１〜３時間灌流固定し、ビブラトーム切片を、レーザー走査型共焦点顕微鏡法により画像化した。線条体内注入後の脳からのＨｉＬｙｔｅ−５５５−アミロイドβ１−４０のクリアランス経路を定義するために、固定したビブラトーム切片を、レーザー走査型共焦点顕微鏡法により画像化した。
【０１５６】
[00303]間質内溶質の脳からのクリアランスの絶対速度を評価する場合、３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０を、線条体中に注入した（図１４Ａ〜Ｂ）。１５分、３０分、１時間、または２時間後に、動物を迅速に断頭し、脳を収集した。脳を、上記に従って可溶化し、脳内に存在する放射活性を、液体シンチレーション分光法により測定した。全ての放射活性の値を、それぞれの実質内への注入の直前に取り込まれた１μｌの注入標準物質に対して標準化した。３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉアミロイドβ１−４０の脳からのクリアランスに対するＡｑｐ４遺伝子の欠失の作用を、両側分散分析およびボンフェローニの事後検定を用いて評価して、個々の時点における差を決定した。
【０１５７】
[00304]免疫蛍光法
[00305]浮遊免疫蛍光法を、１００μｍのＰＦＡ固定ビブラトーム切片上で行った。切片を、３％のロバ正常血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて室温で１時間ブロックし、一次抗体と共に４°Ｃで一晩インキュベートし、２次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。一次抗体は、ラット抗ＣＤ３１（内皮マーカー；１：２００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー；１：５００、ミリポア）、およびウサギ抗ＡＱＰ４（１：５００、ミリポア）を含んだ。２次抗体は、Ｃｙ２コンジュゲートロバ抗ラット、Ｃｙ５コンジュゲートロバ抗マウス、およびＣｙ３コンジュゲートロバ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を含んだ。
【０１５８】
[00306]包埋後の光学顕微鏡および電子顕微鏡による細胞化学的評価
[00307]野生型マウスおよびＡｑｐ４欠損マウスにＦＩＴＣ−ｄ４０を注入し、５分後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％ホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを用いる経心臓灌流により固定した。脳を、一晩後固定し、ビブラトームにより１００μｍの冠状切片に切断した。記載に従って、浮遊切片を、ＨＲＰコンジュゲート抗フルオレセイン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ＡＢ６６５６、５μｇ／ｍｌ）と共に（４°Ｃで）２４時間インキュベートし、次いで、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）−ペルオキシダーゼ処理を行って、フルオレセイントレーサーを可視化した（５６）。光学顕微鏡法により、切片の画像を獲得した後、頭頂葉皮質の領域を、解体し、Ｄｕｒｃｕｐａｎ中に包埋した（５６）。超薄切片（約９０ｎｍ）を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔウルトラミクロトーム上で切断した。最後に、切片を、対比染色し、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  １２透過型電子顕微鏡中で調べた。デジタル画像を、２６０００倍の公称倍率で記録した。
【０１５９】
[00308]電子顕微鏡による形態学的解析
[00309]野生型マウス（ｎ＝３）およびＡｑｐ４欠損マウス（ｎ＝４）を、０．１Ｍリン酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒドおよび１％ホルムアルデヒドを用いる経心臓灌流により固定した（ｐＨ７．４、９ｍｌ／分で２５分間）。脳を、一晩後固定してから、３００〜５００μｍの冠状切片を解体し、Ｄｕｒｃｕｐａｎ中に包埋した（５５）。超薄切片を、上記の記載に従って切断し、対比染色し、調べた。貫通血管のデジタル画像を、４２００倍の公称倍率で記録した。Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ空間の最大幅を、貫通血管の周囲で、軟膜表面からの８０μｍの最小深さにおいて測定した（範囲：野生型マウスおよびＡｑｐ４欠損マウスのそれぞれについて、１６６〜４１５μｍおよび８３〜３６６μｍ）。
【０１６０】
[00310]結果
[00311]脳室ＣＳＦは、わずかに脳の実質に入る
[00312]最初に、ＣＳＦが脳室コンパートメントから脳に入るかどうかを、異なる分子量の蛍光トレーサーを、麻酔を施したマウスの外側脳室中に注入することによって評価した（図１Ａ）。３０分間の連続注入の後、トレーサーの脳の実質中への移動を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、固定したビブラトーム切片の蛍光画像法により評価した［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４ヒドラジド（Ａ５９４）：分子サイズ、７５９ダルトン；テキサスレッド−デキストラン−３（ＴＲ−ｄ３）：分子サイズ、３ｋＤ；フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン−２０００（ＦＩＴＣ−ｄ２０００）：分子サイズ、２０００ｋＤ］。少量のＡ５９４およびＴＲ−ｄ３が、側脳室および第三脳室の脳室上皮を横断した（図１Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ）。しかし、トレーサーは、脳室周囲直近の領域から遠く離れた部位では観察されなかった（図１ＤおよびＧ）。
【０１６１】
[00313]くも膜下ＣＳＦは、迅速に脳の実質に入る
[00314]次に、くも膜下コンパートメントからのＣＳＦが脳の実質に入るかどうかを、蛍光標識トレーサーおよび放射標識トレーサーの両方を大槽に注入することによって評価した（図１Ａ）。注入の３０分後、蛍光トレーサーの分布は、トレーサーを脳室中に注入した後に観察されたパターンとは根本的に異なった（図１ＢおよびＥと比較した図１ＨおよびＫ）。傍血管空間に沿って脳に入った分子量の大きいＦＩＴＣ−ｄ２０００（分子サイズ、２０００ｋＤ）は、そこに限局し、周囲の間質内空間には入らなかった（図１ＫおよびＬ）。ＴＲ−ｄ３（分子サイズ、３ｋＤ）は、傍血管空間中に集中したが、また、傍血管空間（図１ＫおよびＬ）からも軟膜表面（図１Ｍ）からも間質に入った。ＴＲ−ｄ３は、主に血管に沿う形で局在化するＦＩＴＣ−ｄ２０００よりも広範に分布した。分子量のより小さいＡ５９４（分子サイズ、７５９ダルトン）は、脳の間質全体を通して迅速に移動し、ごく少量が傍血管空間内に集中した（図１ＨおよびＪ）。Ａ５９４およびＴＲ−ｄ３の両方は、軟膜表面から脳内へ緩慢かつ一様に移動した（図１Ｈ、ＫおよびＭ）。次いで、異なる分子量のトレーサーの実質における分布を、画像解析により定量化した（図７）。Ａ５９４は、注入してから３０分以内に事実上脳の全体積に浸透し、一方、分子量のより大きいトレーサーの浸透は、より限局的であることが証明された（図１Ｎ）。
【０１６２】
[00315]これらの知見は、大槽内への放射性トレーサーの注入により確認された。注入してから４５分以内に、注入した［３Ｈ］マンニトール（分子サイズ、１８２ダルトン；図８）の約４０％を、脳内に検出することができた（図１０）。より大きなトレーサー（［３Ｈ］デキストラン−１０；分子サイズ、１０ｋＤ）は、脳内により緩慢に蓄積した（図１０）。水は、マンニトールの１／１０の分子量を有することから、［３Ｈ］マンニトールの蓄積が反映するＣＳＦの流動（くも膜下の総ＣＳＦの約４０％）は、ＣＳＦの脳の実質中への本当の移動を過小評価している可能性が高い。くも膜下ＣＳＦの脳内への浸透を評価したことがある以前の研究では、イヌリン（分子サイズ、約５ｋＤ）、アルブミン（分子サイズ、６６ｋＤ）、およびデキストラン（分子サイズ、３〜２０００ｋＤ）等のトレーサーを使用している（１０、１１）。本実施例の知見は、分子量のより大きいトレーサーは脳の実質から選択的に排除されることを示しており、このことから、以前の研究は、より大きなトレーサーに基づく解析により、脳内への「逆行性」のくも膜下ＣＳＦの流れを体系的に過小評価している可能性があることが示唆される。
【０１６３】
[00316]ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化により、血管に沿うＣＳＦの流入が明らかになる
[00317]次に、二光子レーザー走査顕微鏡法を使用して、脳の実質中へのくも膜下ＣＳＦの流入の経路および動態をリアルタイムで可視化した。麻酔を施したマウス中の頭蓋の閉窓を通して画像化する（図２Ａ）ことによって、大槽内に注入した蛍光デキストランの大脳皮質中への移動を可視化した。大脳の血管構造を、血液脳関門（ＢＢＢ）不透過性蛍光デキストラン（ＣＢ−ｄ１０）を用いて（静脈内から）標識し、貫通動脈および貫通静脈を、形態学的に同定した（図２Ｂ）。
【０１６４】
[00318]注入後、トレーサーは、血管平滑筋細胞を直接囲み（図２Ｆ〜Ｊ、ならびに図３ＣおよびＥ）、血管周囲のアストロサイトのエンドフィートに隣接する（図２ＫおよびＬ、ならびに図４Ｂ〜Ｄ）経路を通って、皮質表面動脈および貫通細動脈の外側に沿って脳に迅速に入った（図２ＢおよびＣ、ならびに図９Ａ〜Ｄ）。ＣＳＦの動脈に沿うこの移動は、ＦＩＴＣ−ｄ４０（分子サイズ、４０ｋＤ）の流入として、大槽内への注入から約３５分超が経過してから、皮質表面、皮質表面下６０ｍｍおよび１２０ｍｍにおいて認められた。トレーサーが、くも膜下ＣＳＦを介してではなく、表在動脈の周縁部に沿って迅速に移動することは、Ｗｅｌｌｅｒが記載する大脳の表在動脈の周囲の、傍血管鞘の存在と一貫性を示す（１２）。これらの傍血管空間は、くも膜下腔につながっているが、明確に異なるチャネルを、動脈の脈動により駆動される、実質中へのＣＳＦの迅速な傍動脈バルク流にもたらす（１３〜１５）。
【０１６５】
[00319]ＴＲ−ｄ３（分子サイズ、３ｋＤ）およびＦＩＴＣ−ｄ２０００（分子サイズ、２０００ｋＤ）を注入すると、両方が、それらのそれぞれの分子量が大きく異なるにもかかわらず、皮質の貫通動脈に沿って傍血管空間に迅速に入った（図９ＣおよびＤ）。このことから、それらの移行は傍血管空間を通るＣＳＦのバルク流を介して生じることが示唆された（４、１６）。対照的に、傍血管空間からの周囲組織中への移動は、ＦＩＴＣ−ｄ２０００とＴＲ−ｄ３との間で異なった。ＴＲ−ｄ３は、間質に容易に入り、一方、より大きなＦＩＴＣ−ｄ２０００は、傍血管空間に限局的に留まった（図２Ｃ〜Ｅ、および図９Ｂ〜Ｄ）。最近の研究により、アストロサイトのエンドフィートが、マウスの大脳の微小循環の表面領域のほとんどを覆い、したがって、実質への接近は、重なるエンドフィート間の約２０ｎｍの間隙によってのみもたらされることが示された（１７）。このことから、血管周囲のアストロサイトのエンドフィートは、ふるいとして機能することができ、それによって、溶質が血管に沿って間質中にサイズ依存性に入るのに関与することが示唆される。水および小さな溶質は、傍血管空間からバルク流により脳の間質に自由に入ることができるが、分子量の大きな溶質［ＦＩＴＣ−ｄ２０００；水和の直径（ｄＨ）：＞３２ｎｍ（９）］は排除され、一方、より小さな溶質［例えば、卵白アルブミンおよびＴＲ−ｄ３；それぞれ、ｄＨ＝２〜３ｎｍおよび６．１ｎｍ（９）］は、エンドフィートをサイズおよび構造に依存して通る（図２Ｅおよび図９Ｂ〜Ｄ）。
【０１６６】
[00320]血管に沿うＣＳＦの流入およびクリアランスは、脳全体を通して生じる
[00321]ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化により、くも膜下ＣＳＦが動脈に沿って皮質中に流入することが示された。しかし、二光子画像法では、脳のより深部の構造を通るトレーサーの流動を画像化することができないので、次に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるアプローチを使用して、脳全体を通して血管に沿うＣＳＦの流入およびクリアランスをマッピングした。中等度の分子量のトレーサーである卵白アルブミンコンジュゲートＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＯＡ−６４７；分子サイズ、４５ｋＤ）の分布を、Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ２重トランスジェニックレポーターマウスの固定したビブラトーム切片中で解析し、このマウス中では、動脈と静脈とを容易に識別することができた（図１０Ａ）。大槽内への注入の直後に、トレーサーは、内向きに貫通動脈および細動脈に沿って迅速に移動して、脳全体を通して末端の毛細血管床に達し（図３Ａ）、最も大きな流入が、基底核および視床の大腹側貫通動脈に沿って生じた（図３Ｄおよび図１０Ｃ〜Ｅ）。トレーサーは、早期の時点（注入後、＜１０分）では、静脈の周囲に観察されなかった。その後の時点（＞１時間）では、大槽内注入したトレーサーは、毛細血管および実質の細静脈に沿って蓄積した（図３ＦおよびＧ）。トレーサーは脳から、主として２つの傍静脈経路、すなわち、内側内大脳静脈および外側−腹側の尾側鼻静脈に沿って出た（図３Ｈ）。皮質、線条体または視床中に直接注入した実質内のトレーサーは、同じ共通の解剖学的経路に沿ってクリアランスされ、内大脳静脈に向かって後側−内側にまたは外部の莢膜に沿って後側−外側−腹側に移動し、その後、実質から尾側鼻静脈に沿って出た（図１１Ａ〜Ｅ）。これらの結果から、脳の実質を通って移動するＩＳＦおよびＣＳＦは、同じ傍静脈排液経路に沿ってクリアランスされることが示された。
【０１６７】
[00322]アストログリアの水の輸送は、実質中へのＣＳＦの流動を支援する。アストログリアのアクアポリン−４（ＡＱＰ４）水チャネルの局在化は、血管周囲のエンドフィートに極めて偏っており（図４Ａ）、血管周囲のエンドフィートは、ＣＳＦの流入の傍動脈経路とＩＳＦのクリアランスの傍静脈経路とを結び付けた（図４Ｂ〜Ｄ）。これらのアストロサイトの水チャネルは、これらの傍血管空間と間質との間の液体の移動のために、抵抗の低い経路を提供し、傍血管バルク流と間質内バルク流とを連結し、対流性の流通を維持し（３、９）、これは、脳の実質から生じた間質内溶質のクリアランスを駆動する。このことを研究するために、液体の流動に対する実質の抵抗をＡｑｐ４遺伝子のグローバルノックアウトにより増加させた場合、間質を通るＣＳＦの流動が変化するかどうかを決定した。ＣＳＦトレーサーの流入を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて画像化すると、脳の実質中へのトレーサーの移動は、Ａｑｐ４欠損では野生型の対照マウスと比較して顕著に低下した（図４ＥおよびＦ、ならびに図１２ＡおよびＢ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化により、これらの知見が確認された。大槽内への注入の後、傍細動脈流入経路に沿ったＦＩＴＣ−ｄ２０００の移動が、Ａｑｐ４欠損マウスで顕著には緩慢にならず（図４ＧおよびＨ）、このことから、傍動脈流入経路（Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ空間）の近位セグメントを通るバルク流は、Ａｑｐ４欠失によっては損なわれないことが示された。対照的に、傍血管空間から周囲の間質中へのＴＲ−ｄ３の移動は、Ａｑｐ４欠損マウスにおいて有効に消滅した（図４ＧおよびＩ）。Ａｑｐ４欠損マウスにおいては、皮質の貫通細動脈周囲の傍血管空間は、皮質の深さを通して超微細構造的に正常であり（図１２Ｃ〜Ｅ）、大槽内に注入したＦＩＴＣ−ｄ４０を、電子顕微鏡法により、Ａｑｐ４欠損の傍血管空間の内部にも野生型マウスの傍血管空間内にも検出することができる（図１２ＣおよびＤ）ことが確認された。
【０１６８】
[00323]ＡＱＰ４発現の差は、これらのＣＳＦの流入の傍動脈経路およびＩＳＦのクリアランスの傍静脈経路に沿ったバルク流の偏りに寄与し得る。したがって、ＮＧ２−ＤｓＲｅｄ動物（これらにおいては、静脈と動脈とを識別することができる）におけるＡＱＰ４の免疫反応性を評価して、動脈周囲、静脈周囲および毛細血管周囲のエンドフィートのＡＱＰ４発現の相対量を定義した。静脈周囲および毛細血管周囲のエンドフィートは、ＡＱＰ４発現の点で異ならなかったのに対して、動脈周囲のエンドフィートは、顕著に低下したＡＱＰ４免疫反応性を示した（図１３Ａ〜Ｃ）。動脈および静脈の周りの非エンドフィートＡＱＰ４発現を、毛細血管の周りの発現と比較すると、動脈周囲の発現の低下が明らかとなった（図１３Ａ、ＢおよびＤ）。この効果は大部分、大幅に低下したＡＱＰ４免疫反応性を示す貫通動脈の亜集団に起因した（図１３ＡおよびＤ）。
【０１６９】
[00324]アストログリア水輸送は、実質からのバルクＩＳＦ溶質クリアランスを促進する
[00325]このデータは、アストログリア水流は、くも膜下ＣＳＦの脳間質内への移動およびこれを経由する移動を促進することを実証している。この経実質ＣＳＦの流動に対する１つの考え得る機能として、脳間質からの液および溶質のクリアランスが挙げられる。
【０１７０】
[00326]これについて、Ａｑｐ４遺伝子欠損が、放射能標識された［３Ｈ］マンニトールの脳実質からのクリアランスに及ぼす効果を検査することにより試験した（図１４Ａ）。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、脳間質からの［３Ｈ］マンニトールのクリアランスは、野生型動物のクリアランスと比較して約７０％低下した（図５Ａ）。野生型マウスでは、［３Ｈ］デキストラン−１０（マンニトールより５５倍大きな分子サイズを有する）のクリアランス速度は、［３Ｈ］マンニトールのクリアランス速度に等しく（図１４Ｂ）、拡散よりはむしろバルクＩＳＦ流が、これらの間質送達されたトレーサーのクリアランスに関与することが確認された（４，９）。［３Ｈ］デキストラン−１０のクリアランスも、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスで有意に低下した（図１４Ｂ）。本事例は、アストログリアＡＱＰ４は、間質内溶質の脳実質からのクリアランスを駆動するバルクＩＳＦ流を支援することを実証している。ＡＱＰ４は、健康な若年の脳の間質内に存在する間質内アミロイドβの可溶性アミロイドβ（Ａβ）の傍血管クリアランスを促進するが、但し間質内Ａβ濃度は、アミロイドプラーク負荷と関連する（１８）。
【０１７１】
[00327]ＡＱＰ４−依存性ＩＳＦバルク流が、可溶性Ａβの脳からのクリアランスに寄与するのかを評価した。１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０を線条体内に注射した後、化合物は脳から急速にクリアランスされた（図６Ａ）。ＢＢＢ（１９）を通過するＡβの受容体媒介型の流出と同様に、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０の脳からのクリアランス速度は、特異的な流出受容体を欠く［３Ｈ］マンニトールまたは［３Ｈ］デキストラン−１０の速度を上回った（図１４Ａ〜Ｂ）。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０のクリアランス速度は、野生型対照の速度と比較して約５５％低下した（図６Ａ）。これから示唆されることとして、大部分の可溶性Ａβは、局所的にＢＢＢを通過するのではなく、グリア血管クリアランス系に沿ってバルク流により除去されることが挙げられる。この結論の裏付けとして、蛍光剤でタグ化されたＡβは、線条体に注射したときに、脈管構造に沿って急速に移動し、微小血管構造、ならびに大口径内大脳静脈および尾部鼻静脈に沿って蓄積することが認められた（図６Ｂ〜Ｄ）。
【０１７２】
[00328]可溶性ＡβはＣＳＦ中にも存在し、脈絡叢を通過する輸送（２０）、ならびにバルクＣＳＦターンオーバー（２１）により、そこからクリアランスされ得る。したがって、ＣＳＦコンパートメント内の可溶性Ａβ１−４０は、脳実質経由で再循環するのかという疑問が提起された。大槽内１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０注射後、脳１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０濃度は、［３Ｈ］デキストラン−１０と同様の様式で増加した（図６Ｅ、図１Ｏと比較）。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０のバルク流入は、野生型と比較して有意に低下した（図６Ｅ）。このデータから示唆されることとして、間質内の可溶性Ａβは、グリア血管経路に沿ってクリアランスされるが、ＣＳＦコンパートメント内の一部のＡβは、これと同一の経路に沿って脳を通じて再循環する可能性があることが挙げられる。
【０１７３】
[00329]図７は、脳実質内蛍光ＣＳＦトレーサー分布の定量を示す。大槽内にＡ５９４、ＴＲ−ｄ３、およびＦＩＴＣ−ｄ２０００注射を実施した後、動物を潅流固定し、そして１００μｍのビブラトーム切片に切り出した。落射蛍光顕微鏡法により、４倍でスライスを画像化し、モンタージュを作成した。トレーサーの分布範囲を評価するために、カラーチャンネルを分離し、画像のバックグラウンドを差し引き、一定の閾値を設定し、閾値を満たした面積を計算し、そして全スライス面積に占める割合（％）として表した。
【０１７４】
[00330]図８は、くも膜下ＣＳＦの脳実質内進入量の測定を示す。くも膜下ＣＳＦの脳実質内進入量の測定を示す概略図である。３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉ−Ａβ１−４０を大槽内注射した。脳実質内の放射性トレーサー蓄積量を定量化するために、放射性トレーサー注射後１５分、３０分、または４５分経過して脳を採集した。脳をＳｏｌｕｅｎｅ中で可溶化し、次に全脳放射能を液体シンチレーションカウント法により測定した。脳放射能の割合（Ｒ’Ｂｒａｉｎ）を、測定された全脳放射能（ＲＢｒａｉｎ）および注射した全放射能（ＲＩｎｊｅｃｔ）に基づき計算した。採集期間中、硬膜を脳から除去した。したがって、脳ホモジネートには、くも膜下ＣＳＦコンパートメント内に残留する放射性トレーサーは含まれない。
【０１７５】
[00331]図９Ａ〜Ｄは、低分子量および高分子量トレーサーの傍動脈流入に関するｉｎ  ｖｉｖｏ画像を示す。異なる分子量を有する２つのデキストラン（ＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００）の傍動脈経路に沿った移動、および皮質間質内への移動を、麻酔したマウスについて、閉鎖頭蓋窓内、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子レーザースキャニング顕微鏡検査法により画像化した。（Ａ）大脳の脈管構造を動脈内カスケードブルーデキストラン−１０（ＣＢ−ｄ１０）により可視化し、また貫通細動脈（Ａ）および静脈（Ｖ）を形態学的に識別した（それぞれ赤丸および青丸）。（Ｂ〜Ｄ）傍動脈および傍静脈経路に沿った低分子量および高分子量トレーサーの移動を、貫通血管を中心とする円形のＲＯＩ内の平均蛍光強度を測定することにより評価した。周辺間質内へのトレーサーの移動を、貫通血管を中心とする二重丸型のＲＯＩ（赤色および青色の破線二重丸）における平均蛍光強度を測定することにより定義した。（Ｃ）低分子量トレーサーは、傍動脈腔（赤色実線）から傍動脈（赤色破線）および傍静脈（青色破線）間質内に速やかに移動した。曲線間で統計的有意差が認められない（Ｐ＝０．０５６、１群当たりｎ＝６）ことから、このトレーサーは傍動脈腔から外側に向かって比較的制限のない移動が可能であることが指摘される。（Ｄ）高分子量トレーサーは、貫通細動脈に沿って皮質内に速やかに移動したが（赤色実線）、貫通細静脈に沿っては移動しない（青色実線；＊Ｐ＜０．０１、１群当たりｎ＝６）。貫通細動脈および静脈周辺組織内で測定されたトレーサー強度（それぞれ赤色破線および青色破線）は、傍静脈腔について認められた濃度と同じ低濃度に留まった。したがって、高分子量トレーサーは、傍動脈腔に主に限定して留まり、脳の間質内には速やかに進入しない。スケールバー：１００μｍ。
【０１７６】
[00332]図１０Ａ〜Ｅは、ＣＳＦは傍静脈経路に沿って脳実質に進入しないことを示す。傍静脈と比較して、傍動脈のくも膜下ＣＳＦトレーサー流入を評価するために、ＯＡ−６４７をＴｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄダブルレポーターマウスに大槽内注射した。（Ａ）これらのマウスでは、すべての血管の内皮細胞はＧＦＰで標識され、一方、血管平滑筋細胞および周細胞はＤｓＲｅｄで標識されている。したがって動脈および細動脈（黒色矢印頭部）は際立った周辺領域のＤｓＲｅｄ標識の存在により容易に区別されるが、一方、静脈（白色矢印頭部）ではかかる標識を欠く。ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウス由来の脳スライスを内皮マーカーＣＤ−３１で標識すると、動脈のＮＧ２−ＤｓＲｅｄ標識特異性が認められる（右）。（Ｂ）大脳皮質では、大槽内トレーサーは、ＤｓＲｅｄ＋貫通細動脈に沿って脳に進入するが、ＤｓＲｅｄ−静脈に沿っては進入しない。遠位側静脈の標識が時に認められるが、中間に位置する毛細血管床を経由する傍細動脈流入経路に一般的に由来する。（Ｃ〜Ｅ）腹側脳表面に沿った大型の血管は、同様のパターンを示す。大型の貫通動脈周辺の傍血管腔（黒色矢印頭部、Ｄ）は、実質内への大流量のＣＳＦトレーサーを移動せしめるが、一方、トレーサーは、基底流出静脈に沿って実質内に多くは通過しない（白色矢印頭部、Ｅ）。スケールバー：１００μｍ（Ｂ、Ｃ）、５０μｍ（Ａ）、２０μｍ（Ｄ〜Ｅ）。
【０１７７】
[00333]図１１Ａ〜Ｅは、大槽内注射および実質内注射したトレーサーは、同一の傍静脈排液経路を共有することを示す。Ｔｉｅ２−ＧＦＰ：ＮＧ２−ＤｓＲｅｄダブルレポーターマウスにＯＡ−６４７を実質内注射した。（Ａ〜Ｂ）皮質内注射したトレーサーは、微小血管構造周囲に蓄積し、注射部位から外側に向かって、傍毛細血管経路および傍静脈（矢印頭部）経路に沿って最も急速に移動した。（Ｃ〜Ｄ）線条内トレーサーも、毛細血管および細静脈周囲に同様に蓄積した。灰白質内に注射したトレーサーは、白質束から除去された（アスタリスク、Ｄ）。（Ｅ）実質内トレーサーは、主に内大脳および尾部鼻静脈に沿って脳からクリアランスされたが、皮質上行静脈および細静脈に沿った少なめのクリアランスも認められた。スケールバー：５０μｍ（Ｂ、Ｄ〜Ｅ）、２０μｍ（Ａ、Ｃ）。
【０１７８】
[00334]図１２Ａ〜Ｅは、野生型マウスおよびＡｑｐ４−ｎｕｌｌマウスを対象として、トレーサーの傍血管蓄積およびＶｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔について行った可視化を示す。（Ａ〜Ｂ）大槽内注射したＦＩＴＣ−ｄ４０を、ＤＡＢ免疫組織化学検査法により可視化した。注射後５分経過すると、反応生成物が、野生型動物の貫通皮質血管（挿入図の矢印）に沿って明らかとなる（Ａ）。血管周囲の標識強度は、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物ではかなり弱めである（Ｂ）。挿入図は、高倍率での頭頂皮質内の標識を示す。（Ｃ〜Ｄ）貫通皮質細動脈周辺の近接する傍血管腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔、ＶＲＳ）内の高電子密度ＤＡＢ反応生成物を示す電子顕微鏡写真である。野生型動物（Ｃ）と比較して、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物（Ｄ）のＶＲＳは、超微細構造的には不変と思われる。（Ｅ）皮質表面下方約１０００μｍを可視化した、未注射のＡｑｐ４−ｎｕｌｌ動物のＶＲＳである。挿入図は、貫通血管周囲のＶＲＳの幅を示す（野生型動物の場合ｎ＝１０、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物の場合ｎ＝１１；数値は、平均値±ＳＥＭ）。ＥＮＤＯは内皮細胞；ＶＳＭは血管平滑筋細胞。スケールバー：５００μｍ（ＡおよびＢの挿入図）、１μｍ（Ｃ〜Ｅ）。
【０１７９】
[00335]図１３Ａ〜Ｄは、動脈周囲のアストロサイトと静脈周囲のアストロサイトにおけるＡＱＰ４の差次的発現を示す。（Ａ〜Ｂ）ＮＧ２−ＤｓＲｅｄマウスの皮質内ＡＱＰ４に対する免疫蛍光標識である。貫通動脈は、血管平滑筋の高強度の周辺ＤｓＲｅｄ標識により容易に区別されるが（Ａ、白色矢印頭部）、一方、上行静脈は不定なＤｓＲｅｄ標識を示す（Ｂ、黒矢印頭部）。（Ｃ）血管周囲エンドフィートにおけるＡＱＰ４免疫応答の定量に関し、バックグラウンドＡＱＰ４強度に標準化されている。動脈周囲エンドフィートのＡＱＰ４発現量は、毛細血管周囲または静脈周囲のエンドフィートよりも有意に少なかった（＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ；３動物より動脈ｎ＝２４、静脈１９、および毛細血管４３）。（Ｄ）ＡＱＰ４免疫応答性を２０μｍの血管壁内で測定したとき（エンドフィートを除く）、動脈周囲のＡＱＰ４強度は、毛細血管レベル周辺のレベルと比較して有意に低下した（＊Ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。これは、主として血管周辺最大５０μｍまでＡＱＰ４免疫応答性標識の際立った欠損を示した貫通動脈の部分母集団（群全体の約４０％）に起因した（Ａに認められる）。
【０１８０】
[00336]図１４Ａ〜Ｂは、間質内溶質の脳からのクリアランス測定に関する。（Ａ）間質内溶質の脳実質からのクリアランスに関する測定を示す概略図である。３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、または１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０を線条体内に注射した。実質からの放射性トレーサーのクリアランスを定量化するために、放射性トレーサー注射後、ｔ＝１または２時間時点で脳を採集した。脳を可溶化し、次に全脳放射能を液体シンチレーションカウント法により測定した。測定された全脳放射能（ＲＢｒａｉｎ）および注射した全放射能（ＲＩｎｊｅｃｔ）に基づき、残留する脳放射能（Ｒ’Ｂｒａｉｎ）を計算した。脳採集時に硬膜を除去した。したがって、測定されたＲＢｒａｉｎ値には、くも膜下腔内に存在する放射性トレーサーは含まれない。（Ｂ）Ａｑｐ４遺伝子欠損が、実質内注射した３Ｈ−デキストラン−１０の脳からのクリアランスに与える効果に関する。野生型動物では、３Ｈ−マンニトールおよび３Ｈ−デキストラン−１０のいずれも、同一速度で脳からクリアランスされた。これは、バルク流［拡散（９）とは対照的に］−媒介型輸送は分子量（４）とは独立である、という観察結果に一致する。Ａｑｐ４遺伝子欠損は、３Ｈ−マンニトールの場合と同様に、３Ｈ−デキストラン−１０の流出に影響を及ぼし（図１４Ｂ）、脳実質からのそのクリアランス速度を顕著に低下させた（＊Ｐ＜０．０１、各時点ｎ＝４）。
【０１８１】
[00337]図１５Ａ〜Ｂは、傍血管バルク流路および間質性のバルク流路を示す概略図である。（Ａ）概略図は、傍動脈流入経路と間質コンパートメントとの間のバルク水流促進における、動脈周囲のアストログリアのエンドフィートＡＱＰ４の役割について、提示された案を示す。ＡＱＰ４の発現量が高いので、水は血管周囲のエンドフィートを自由に通過する。小型の溶質は、蛍光トレーサーＴＲ−ｄ３（ＭＷ３ｋＤ）を含め、結果として生じた浸透圧勾配に沿って、重複性のエンドフィートプロセス間の細胞間間隙を通じて間質内に至る。大型の溶質は、ＦＩＴＣ−ｄ２０００（ＭＷ２０００ｋＤ）を含め、この間隙を通過することができず、傍血管腔内に保持される。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、傍血管腔と間質との間の水流は低下し、付随的な溶質の間質内への移動も同様である。挿入図は、ＴＲ−ｄ３、ＦＩＴＣ−ｄ２０００［ｄＨ、水和直径（９）］およびエンドフィート間の間隙（１７）の物理的な寸法を表す。（Ｂ）対流性のＩＳＦバルク流および間質内溶質のクリアランスについて、その維持におけるアストログリアＡＱＰ４の役割に関して提示された案を示す詳細な概略図である。傍動脈ＡＱＰ４および傍静脈ＡＱＰ４は、傍動脈流入経路と傍静脈クリアランス経路との間の水の自由な移動を可能にする。この対流性の水流は、間質内溶質およびトレーサー（例えば、３Ｈ−マンニトールおよび３Ｈ−デキストラン−１０等）をその経路に沿って押し流す。Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、傍血管腔と間質との間の水流は低下し、間質内溶質のクリアランス不具合を引き起こす。挿入図は、３Ｈ−マンニトール、３Ｈ−デキストラン−１０、および内部エンドフィート間の間隙の物理的な寸法を表す。
【０１８２】
[00338]考察
[00339]この事例では、脳網羅的経路は、マウスの液輸送について識別され、これには、くも膜下ＣＳＦの脳間質への傍動脈流入、その後の大口径流出静脈に沿ったＩＳＦのクリアランスが含まれる。これらの流入経路と流出経路との間に生じる間質性のバルク流は、アストロサイトを経由する水の移動に依存し、またこの系を経由する継続的な液の移動は、おそらく可溶性Ａβ１−４０を含む間質内溶質の脳からのクリアランスに対する重要な寄与因子である。このバルク流のグリア水流に対する依存性、およびその間質内溶質クリアランスにおけるリンパ機能の従属性に照らし、この系は「グリンファティック」経路と命名された（図５Ｂおよび図１５Ａ〜Ｂ）。
【０１８３】
[00340]ＣＳＦコンパートメントと末梢リンパ管との間の関連性は、十分に立証されている（８）。哺乳動物では、ＣＳＦ内に注射された放射能標識アルブミンの約５０％が、篩板を経由して頚部リンパ管に流出するが、残りは硬膜静脈洞のくも膜顆粒を経由して血流にクリアランスされる（２２〜２４）。このよく知られた排液パターンは、ＣＳＦが傍血管腔に沿って脳のＩＳＦと交換することにより、ＣＳＦは「リンパ的」機能を担うという概念を当初もたらした（６、２５）。ここに報告する発明者らの所見と一致して、ラットにおける試験から、脳の間質に注射されたトレーサーの７５％程度が、くも膜下ＣＳＦに排除され、全ＣＳＦ生成量の約１１％を占めることが実証された（２６）。この事例では、主要なクリアランス経路として、傍静脈経路、特に内側内大脳静脈および尾部鼻静脈周辺の経路を識別するが、これは傍動脈シースをトレーサークリアランス経路として識別するいくつかの試験とは対照的である（２６、２７）。実質内注射後のこのような傍動脈標識は、主として注射に起因して実質内圧力が局所的に高まることによるアーチファクトであり、溶質流出に関する自然の経路を反映しない。実質内注射では、傍動脈腔は、注射部位近傍にトレーサーを蓄積した。観察をこの部位に限定すると、トレーサー流出は傍動脈流出経路に沿って主に生ずる、と誤って結論付けられるおそれがある。しかし、注射部位から最も離れた場所では、トレーサーの蓄積は、大口径流出静脈周辺で最大であった（図３Ｈおよび図１１Ｅ）。
【０１８４】
[00341]このような結果から、ネコのくも膜下腔に大槽内注射した西洋ワサビペルオキシダーゼ（分子サイズ、４０ｋＤ）が、傍動脈経路に沿って脳内に急速に移動したとする、Ｒｅｎｎｅｌｓらの基本的な観察（１５、２８）が部分的に確認される。この所見は、Ｃｓｅｒｒとその共同研究者らにより反論され、くも膜下ＣＳＦの傍血管流入は、「低速であり、方向が不定」であったと結論付けた（１１、２９）。本明細書の所見では、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像化法（図２Ａ〜Ｌおよび９Ａ〜Ｄ）、遺伝子組換えダブルレポーターマウスを用いたｅｘ  ｖｉｖｏ分析（図１Ａ〜Ｏ、３Ａ〜Ｈ、１０Ａ〜Ｅ、および１１Ａ〜Ｅ）、および定量的放射性トレーサー実験（図１Ｏ）を含め、この結論に異議を唱える。これらの瑕疵のある所見に対する１つの考え得る理由として、過去の試験ではより高分子量のトレーサーが選択されたことが挙げられる。Ｉｎ  ｖｉｖｏ（図２Ｂ〜Ｅおよび９Ａ〜Ｄ）、およびｅｘ  ｖｉｖｏ画像、ならびに放射性トレーサー流入データ（図１Ｏ）は、くも膜下腔から脳実質内へのトレーサー流入は分子量に依存することを実証している。くも膜下ＣＳＦの脳実質内への移動を評価する過去の試験では、イヌリン（分子サイズ、約５ｋＤ）、アルブミン（分子サイズ、６６ｋＤ）、およびデキストラン（通常２０００ｋＤ）が、ＣＳＦトレーサーとして一般的に用いられる（３、１０、１１、２９）。これらの所見に基づけば、これらの試験では、くも膜下ＣＳＦが脳間質内に流入する範囲および速度を過小評価した。その他の方法論的差異も寄与するもの思われる。Ｐｕｌｌｅｎらは、サンプル収集のために大槽流出チューブを大気に対して開放したままにする開放脳室大槽（open ventriculo-cisternal）および大槽−大槽（cisterno-cisternal）潅流法を用いた（２９）。Ｉｃｈｉｍｕｒａらは、観察部位において傍血管腔およびくも膜下腔にトレーサーを直接加圧注射した（１１）。実験では（データ図示せず）、Ｃｓｅｒｒとその共同研究者らが用いた試験法と同様に、硬膜に穴を開けると（１１、２９）、傍血管トレーサーの流動は事実上消滅することが判明し、これから示唆されることとして、くも膜下腔および傍血管腔の水力学的完全性の維持が、傍血管バルク流の維持に重要であることが挙げられる。
【０１８５】
[00342]傍血管経路機能におけるＡＱＰ４の役割
[00343]これらのデータから示唆されることとして、ＡＱＰ４−依存性アストログリア水流は、脳内の傍動脈ＣＳＦ流入を、傍静脈ＩＳＦクリアランスと結びつけることが挙げられる。ＡＱＰ４は、細胞外傷性浮腫の進行期間中における脳組織内への水の取り込み、ならびに血管原性浮腫後の水のクリアランスと関係している（３０、３１）。これらの観察所見から示唆されることとして、血管周囲のＡＱＰ４は、くも膜下ＣＳＦの傍動脈腔から脳の間質への流入、ならびに後続する対流性のバルク流を経由するＩＳＦのクリアランスを促進することが挙げられる（３、４）。バルク流ＣＳＦが移動する場合、それは大槽内注射したＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ２０００のｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像化法を用いて、直接、傍動脈経路に沿って認められた。これらの薬剤のいずれも、柔膜動脈の壁に沿って急速に移動し、周辺のくも膜下コンパートメント内のＣＳＦと混合せずに、Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔に進入した（図２Ｂ）。Ｗｅｌｌｅｒにより実施された軟膜血管の超微細構造解析と一致して（１２）、これは、これらの血管が貫通する表面動脈の周りの傍血管腔、およびＶｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔は、バルク流によりＣＳＦが脳実質に急速に進入する、物理的にも機能的にも異なるサブコンパートメントを備えることを示す。このＣＳＦ流は、動脈の脈拍により駆動される可能性がある（１３〜１５）：傍動脈腔内へのＣＳＦ流入の方向性は、おそらく傍動脈経路と傍静脈経路との間の異なるパルス圧力を反映する。
【０１８６】
[00344]血管周囲のアストロサイトエンドフィートは、大脳の微小血管構造を完全に網羅することができるが、重複性のプロセスの間にわずか２０ｎｍの間隙を有し、間質との直接的な流通を提供する（１７）。これは、傍血管コンパートメントと間質コンパートメントとの間の液流および溶質流に対して高抵抗バリアを設ける。毛細血管に面するエンドフィートの表面積の約５０％を占めるＡＱＰ４（３２）は、これらコンパートメント間の水の移動に対して低抵抗経路を構成する。グリア経由の水の移動は、おそらく傍動脈バルク流の静水圧により駆動されているが、特定のアストログリア溶質トランスポータ経由またはエンドフィート間の細胞間間隙を通じて、傍血管腔から間質内への溶質流を駆動すると考えられる。このＡＱＰ４の役割は、Ａｑｐ４遺伝子欠損が傍血管腔と周辺間質の間のＴＲ−ｄ３の移動に及ぼす効果により裏付けられる。エンドフィートの篩分け効果（溶質のｄＨが２０ｎｍに近づくと、その移動が制限される）が、トレーサーが間質内へ貫通する際の、この貫通に対する分子量の効果を説明し得る（図１５Ａ〜Ｂ）。
【０１８７】
[00345]くも膜下ＣＳＦは間質に進入し、ＩＳＦと混合するが、両者は任意の関連する溶質（可溶性Ａβを含む）と共に、内大脳静脈および尾部鼻静脈の両方を含む特定の傍静脈経路に沿ってクリアランスされる。これらの静脈は、ガレン大静脈および直静脈洞（内大脳静脈）および横静脈洞（尾部鼻静脈）内に直接流出する（３３）。傍動脈流入経路の場合と同様に、微小血管構造の周りのアストログリアエンドフィート、およびこれらの大流出静脈に局在するＡＱＰ４は、水および付随する溶質の傍静脈コンパートメント内への流出に対して低抵抗経路を提供する。これは、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌ動物では、バルク流依存性の間質内溶質のクリアランスは、約７０％低下したという観察所見に一致する。これら傍静脈腔と硬膜静脈洞との間の関連性は、くも膜下腔内における動脈の拍動と組み合わさって、傍血管ＣＳＦバルク流およびＩＳＦクリアランスを駆動する、動静脈の流体静力学的勾配を引き起こす、低圧シンクを提供し得る。この状況において、動脈と比較して静脈を取り囲む、血管周囲のＡＱＰ４がより多く発現すれば、ＩＳＦに対して低抵抗クリアランス経路を維持するのに役立つ可能性がある。これは、Ａｑｐ４遺伝子欠損マウスは、野生型動物と比較して、脳実質内において肥大化した細胞外空間を呈する（３４）という観察所見により裏付けられるが、この所見は、そのようなマウスにおける実質バルクＩＳＦ流出に対してより高い抵抗を相殺する代償性の現象を表している可能性がある。ａ−シントロフィン（３５）、ｍｄｘ（３６）、およびＡｑｐ４（３７）ノックアウトマウスを含む、血管周囲アストロサイトＡＱＰ４が誤った場所に局在化した、または存在しないマウスでは、エンドフィートの膨張および血管周囲アストロサイトに対するその他の病理学的変化が認められる。このような変化は、血管周囲エンドフィートにおける足場形成の異常調節と関連し、Ａｑｐ４遺伝子欠損が間質性のバルク流および溶質のクリアランスに与える、すでに認められた効果を説明し得る。しかし、後続する電子顕微鏡試験では、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスのＢＢＢまたは血管周囲アストロサイトエンドフィートのいずれにおいても明らかな超微細構造的変化は報告されず（３８、３９）、また本分析でも、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスの傍血管腔は、皮質の深さ方向において構造的に変化のないことが実証された（図１２Ａ〜Ｅ）。
【０１８８】
[00346]この事例は、間質内溶質は、ＡＱＰ４依存性バルク流により傍静脈経路に沿ってクリアランスされることを実証しているが、これらの経路は、必ずしも頭蓋からの溶質クリアランスに関する最終経路ではない可能性がある。過去の試験から、かかる最終クリアランスについて２つの経路が最も有望と思われる。第１に、脳の微小血管構造および大型の流出静脈に沿った溶質の移動は、血液脳関門（ＢＢＢ）における特異的輸送機構に溶質が速やかにアクセスできるようにする。第２の可能性として、溶質が内大脳静脈および尾部鼻静脈に沿ってその関連する洞に流出すると、それはくも膜顆粒経由で血流にクリアランスされ（２２〜２４）、ＢＢＢにおける特異的輸送経路と相互作用しない、またはその飽和を引き起こした間質内溶質に出口経路を提供することが挙げられる。
【０１８９】
[00347]傍血管経路および疾患
[00348]Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスにおいてこの経路が途絶すると、溶質クリアランスに不具合が生じたという所見は、神経毒性沈着物の誤った蓄積が疾患の発症に寄与する神経変性疾患にとって、臨床的意義を有する。Ｂａｌｌらは、実質内注射したＡβは、傍血管経路に沿ってクリアランスされることを報告したが（４０）、一方、可溶性Ａβ傍血管クリアランスの不具合の原因として、アルツハイマー病における細胞外Ａβ凝集物形成および疾患進行が示唆された（４１）。本事例では、脳実質内に注射した蛍光剤でタグ化された可溶性Ａβ１−４０は、その他の蛍光トレーサーと同じ傍血管経路に沿ってクリアランスされ、また放射能標識されたＡβ１−４０の間質からのクリアランスは、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスにおいて実質的に低下した。アルツハイマー病と反応性グリオーシスとが関連し、また老化した脳ではグリオーシスの増加が認められることから、これは重要である（４２〜４４）。神経病理学的条件下で反応性アストロサイト内のＡＱＰ４発現および局在に変化が生ずると（４５）、間質性のバルク流異常、およびこれに起因するＡβ等の神経毒性溶質のクリアランス不具合の原因となり得る。
【０１９０】
[00349]可溶性Ａβ１−４０は、匹敵する大きさのデキストラン分子より急速に脳の間質から排除されたが、これから示唆されることとして、バルク流依存性クリアランスを伴う特定のＢＢＢ  Ａβ流出受容体の間で相互作用（４６、４７）が生じ得ることが挙げられる。特定の解剖学的傍血管経路（深部静脈系を含む）に沿ったＡβのクリアランスから、経内皮的Ａβ流出は脳の脈管構造全体にわたり均一ではないはずであり、特定の専門化したクリアランス血管において生じ得るという可能性が提起される。傍静脈クリアランス経路に沿って移動する可溶性Ａβは、脳室（内大脳静脈）内、またはくも膜下腔（尾部鼻静脈）内のいずれかのＣＳＦコンパートメントに再進入する。脳室経路は、ＣＳＦコンパートメントからのＡβクリアランスに寄与し得る構造である脈絡叢に、直接的な経路を提供する（４８）。水相からプラーク（主にＡβ１−４２）内に隔離されたＡβは、バルク流により経内皮流出または脈絡膜流出の遠隔部位のいずれにもクリアランスされず、またはＣＳＦ経由のバルククリアランスによりクリアランスされない。
【０１９１】
[00350]このような実質液の流れパターンから、いくつかの治療アプローチのための経路がもたらされる。第１に、ＡＱＰ４依存性バルク流の効率が改善すれば、可溶性Ａβのクリアランス改善が可能となり、その分解またはその体循環内への再取り込みを加速させる可能性がある。反対に、溶質のクリアランスを妨害すると、抗腫瘍薬や免疫モジュレーター等の治療薬が脳から除去される速度を低下させることができる。ＡＱＰ４−依存性のバルク流は、ＣＮＳの免疫特権を損なわずに脳実質の免疫監視を促進することもできる。くも膜下ＣＳＦ内のリンパ球および抗原提示細胞（４９）は、いずれも傍静脈バルク流出によりＣＳＦに送達された間質内抗原を検知し得る。確かに、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスでは、脳内リポ多糖類注射後に、神経炎症の減少が認められる（５０）。この末梢免疫反応の減弱は、Ａｑｐ４−ｎｕｌｌマウスにおいて、くも膜下ＣＳＦコンパートメント内の抗原蓄積が減少した結果であり得る。これらの傍血管経路は、移動性細胞およびそのガイダンス分子のための経路として機能することも可能であり、したがって腫瘍細胞の移動に道が開ける可能性を示す（５１）。更に、傍血管経路は、成人脳実質における細胞の新生と移動のための血管周囲のニッチと分子的に異なるが機能的に重複する、細胞移動のための導管となり得る（５２）。
【０１９２】
[00351]この経路は、齧歯類の脳では、液および溶質のホメオスタシスにとって重要であるものの、ヒトにおける間質内溶質のクリアランスにとっても極めて重要である。すべての溶質は、液流と同一速度で移動媒体と共に搬送されるので、バルク流の１つの特徴は、単純な拡散と比較して、溶質の移動が分子サイズと独立していることが挙げられる（４、４６）。対照的に、単純な拡散では、拡散速度は分子サイズに依存するので、大きな溶質ほど、脳実質から直近のＣＳＦコンパートメントにクリアランスされるのに長い時間を必要とする（１６、４６）。したがって、尿素（分子サイズ、６０ダルトン）が脳内で１ｃｍ拡散するのに５．４時間を必要とするのに対し、アルブミン（分子サイズ、６６．５ｋＤ）は１０９時間を必要とする。これらの数値に基づき、Ｃｓｅｒｒは、間質内溶質、特に拡散では効率的にクリアランスすることができないペプチドやタンパク質等のより大きな分子を効率的にクリアランスする場合、脳が大きいほど、バルク流への依存性は高まると仮定した（１６）。したがって、ヒトの脳では、傍血管経路およびＡＱＰ４−依存性バルク流が、齧歯類の脳の場合よりも脳の機能に本質的に重要であり得る。この可能性を評価するために、ヒトを対象とする間質内溶質移動の評価用として、本事例で用いられたものより非侵襲的なアプローチ、例えば磁気共鳴潅流画像化法を実施例２で用いた。
【０１９３】
[00352]実施例１で引用した参考文献
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【実施例２】
【０１９４】
[00353]６．２．造影ＭＲＩにより取得された、老廃物クリアランスに関する脳網羅的傍血管経路
[00354]実施例１にて上記したグリンファティック系は、脳からの溶質および老廃物の効率的なクリアランスを促進する、脳脊髄液（ＣＳＦ）と間質液（ＩＳＦ）との交換のための脳網羅的傍血管経路である。ＣＳＦは、傍動脈チャンネルに沿って脳に進入してＩＳＦと交換し、次に傍静脈経路に沿って脳からクリアランスされる。可溶性アミロイドβのクリアランスは、グリンファティック経路機能に依存するので、このクリアランス系の不具合は、アミロイドプラークの沈着およびアルツハイマー病の進行の原因となり得る。この事例は、グリンファティック経路機能は、臨床的に重要な画像化技法を用いて測定可能であることを実証している。髄腔内に常磁性造影剤を投与した後、ダイナミック造影ＭＲＩを、ラット脳全体にわたりＣＳＦ−ＩＳＦ交換を視覚化するのに用いた。グリンファティック経路機能の特性について、傍動脈ＣＳＦ流入、および分子サイズ依存性のＣＳＦ−ＩＳＦ交換の可視化を含め特徴付けた。全脳画像化法は、脳下垂体陥凹および松果腺陥凹における２つの重要な流入ノードの識別を可能にしたが、一方、ダイナミックＭＲＩ画像化法は、グリンファティックＣＳＦ−ＩＳＦ交換および脳からの溶質クリアランスを特徴付けるためのキネティックパラメータの定義を可能にした。ＭＲＩアプローチは、この事例において、生きているヒトの脳を対象としてアルツハイマー病への罹患のしやすさ、およびその進行を評価する方法で利用可能であることを実証した。
【０１９５】
[00355]諸言
[00356]古典的なモデルでは、脳脊髄液（ＣＳＦ）は、脳室の脈絡叢により活発に分泌され、バルク流または拍動流により脳室系を通じて移動し、ルシュカ孔およびマジャンディ孔を通じて第４脳室からくも膜下腔内に流出する。くも膜下腔から、ＣＳＦは、硬膜静脈洞のくも膜顆粒経由で、または脳神経シースに沿って頭蓋腔外を通過することにより血流に再吸収され、頚部リンパ管を通じて除去されると考えられる（１、２）。このＣＳＦカラムに沿った液の移動は、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）により一般的に測定される。位相造営磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）は、ＣＳＦ流の動力学の可視化を可能にし、また交通性と非交通性の水頭症、正常圧水頭症、およびくも膜嚢腫の評価で臨床的に用いられる（３）。造影磁気共鳴脳槽造影法も、自発的頭蓋内圧低下症またはＣＳＦ鼻漏を治療する際にＣＳＦの漏出を識別するのに利用可能である（４、５）。
【０１９６】
[00357]実施例１は、ＣＳＦ分泌および再吸収の教科書モデルとは反対に、大部分のくも膜下ＣＳＦは、傍血管腔に沿い脳実質を通じて再循環し、また間質液（ＩＳＦ）と交換することを実証している。これらの傍血管経路に沿った、および間質を通じた液体の流れは、アストロサイトのアクアポリン−４（ＡＱＰ４）水チャンネルを通じた経グリア水移動により支援を受け、また可溶性アミロイドβを含む間質内溶質の脳実質からの効率的なクリアランスを促進する。実施例１で、「グリンファティック」系と呼ばれるこの経路について説明したが、それはｉｎ  ｖｉｖｏ二光子およびｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法に基づく。Ｅｘ  ｖｉｖｏ脳スライス分析から示唆されたこととして、この経路は、間質内溶質および老廃物の効率的なクリアランスを促進する脳網羅的な解剖学的系に該当することが挙げられるが、しかし蛍光に基づく画像化手段の限界から、脳網羅的ＣＳＦ−ＩＳＦ流動力学の三次元（３Ｄ）方式による直接的な評価は不可能であった。
【０１９７】
[00358]本試験では、造影ＭＲＩを、生きたラット脳を対象として脳網羅的くも膜下ＣＳＦ−ＩＳＦ交換を視覚化するのに用いた。初期の試験（実施例１）に記載した経路の特徴を、くも膜下ＣＳＦトレーサーの傍動脈経路に沿ったバルク流依存性の流入、ならびにトレーサーの脳実質内への移動およびこれを通じた移動を含め確認した。解剖学的流入「ノード」および脳実質からのクリアランス経路を識別するために、ＭＲＩに固有の３次元的性質を、脳全体にわたりＣＳＦ−ＩＳＦ交換経路を経時的にマップ化するクラスター分析を含め、様々な処理手段と併用して用いた。脳容積全体にわたり常磁性造影剤の流入およびクリアランスを説明するキネティックパラメータを規定した。実施例１で示したように、この経路は可溶性アミロイドβの脳実質からのクリアランスを担うという重要な役割に照らし、この造影ＭＲＩ定量アプローチは、アルツハイマー病（ＡＤ）への罹患のしやすさおよびその疾患進行を評価するまったく新しい戦略のための基準を設けることができる。
【０１９８】
[00359]方法
[00360]外科的調製
[00361]メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃｓ、体重：２２０〜２８０ｇ）を用いた。麻酔するため、導入チャンバーを用いて動物を酸素中３％のイソフルランで催眠し、次に４０ｍｇ／ｋｇフェノバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ（登録商標）ナトリウム溶液、ＯＶＡＴＩＯＮ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、米国）を腹腔内注射した。動物は、全実験期間を通じて自発呼吸に任せた。外科手技期間中の適切な酸素供給（Ｏ２飽和度＞９７％）、呼吸（１分間当たり、５０〜６５回の呼吸数）、および正常体温（３６．５℃〜３７．５℃）を確保するために、非侵襲的モニタ（パルスオキシメトリー、呼吸数および直腸温度プローブ、ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、ＮＹ）を配置した。液の投与および補足麻酔用として、２４−ゲージカテーテルを尾部静脈に挿入した。動物を定位固定フレーム（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フレーム＃９）に配置し、そして頭部を５０度曲げた。短時間の外科手技では、Ｏ２：空気が１：１の混合気中で送達されたイソフルラン（０．８〜１．２％）で麻酔を補足した。
【０１９９】
[00362]環椎後頭膜を正中線背面頸部切開により露出させ、小規模の切開を行って下部硬膜を露出させた。通常の生理食塩水で充填されたポリエチレンカテーテル（長さ６ｃｍ、０．２８ｍｍ  ＩＤ×０．６１ｍｍ  ＯＤ、（Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ））を、２３−ゲージ針を用いて小規模な硬膜切開術を行って髄腔内に１ｍｍ進入させ、そして超強力接着剤で固定、密閉した。皮膚の切開をカテーテルの周りで閉鎖した。
【０２００】
[00363]ＭＲＩ画像化プロトコール
[00364]手術後、ラットを仰向けに裏返し、頭部固定デバイスおよび補助酸素送達用の鼻マスクが取り付けられた特別注文のアクリル製クレードルに配置した。動物の頭部を、３．０ｃｍの特別注文の無線周波数（ｒｆ）レシーバーコイルの最上部に配置した。動物がＭＲＩ画像検査を受けている間バイタルサインを継続的にモニタリングするために、非侵襲式、ＭＲＩ適合モニタ（パルスオキシメトリー、呼吸数、および直腸温度プローブ、ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、ＮＹ）を再配置した。画像検査では、コンピュータ支援型エアヒーティングシステム（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、ＮＹ）を用いて画像検査期間中、体温を３６．５〜３７．５℃内に厳密に維持した。髄腔内カテーテルを、１ｃｃシリンジと微量注入ポンプ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＡＳ５０  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）に取り付けられ、０．９％ＮａＣｌで稀釈した常磁性ＭＲ造影剤が充填された長尺ＰＥ２０ラインと連結した。尾部静脈カテーテルを、メンテナンスハイドレーション（０．９％ＮａＣｌ、４ｃｃ／ｋｇ／ｈｒ）用として用い、また補足麻酔（Ｎｅｍｂｕｔａｌ（登録商標）、５〜１０ｍｇ／ｋｇ静注）を、呼吸数のガイドに従い２時間毎に実施した。
【０２０１】
[00365]２つの異なる常磁性造影剤を実験用に用いた：Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）、（ジエチレントリアミンペンタアセテート（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）、分子量（ＭＷ）９３８Ｄ、Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｙｎｅ、ＮＪ  ０７４７０）、およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐ（ポリマー性Ｇｄ−キレート、ＭＷ２００ｋＤａ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）。造影ＭＲＩ（Ｔ１短縮効果）によりグリンファティック経路を視覚化するために、注射部位から遠く離れた脳組織内に経時的に生み出される濃度低下が同等であるように、２つの異なる常磁性造影剤が釣り合う初期濃度を最初に規定した。換言すれば、２つの常磁性造影剤が大槽内に注射された後、それらは脳網羅的なグリンファティック経路を通じて移動し、経時的に稀釈が進行するので、両造影剤により誘発されるＴ１効果が一致することが重要である。これを実現するために、ファントム実験を実施した。
【０２０２】
[00366]すべての画像化プロトコールを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｃｏｎｓｏｌｅとインターフェース接続し、Ｐｒａｖｉｓｉｏｎ  ５．０ソフトウエアにより管理された９．４Ｔ／２０  ＭＲＩ装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上で実施した。特別注文の３ｃｍ表面無線周波数コイルをレシーバーとして用い、また直径１６ｃｍのボリュームコイル（Ｂｒｕｋｅｒ）をトランスミッターとして用いた。ローカライザー解剖学的スカウトスキャンの後、３次元Ｔ１−重み付けＦＬＡＳＨシーケンス（ＴＲ＝１５ｍｓｅｃ、ＴＥ＝３．４ｍｓ、フリップ角１５°、ＮＡ＝１、ＦＯＶ＝３．０×３．０×３．２ｃｍ、スキャニング時間＝４分５秒、０．１２×０．１２×０．１３ｍｍの画像分解能を実現する２５６×２５６×２５６に内挿された２５６×１２８×１２８のアクイジションマトリックスサイズ）を矢状断面または冠状面で取得した。すべての実験では、動物の頭部近傍に配置した、６０ｍＭ（０．９％ＮａＣｌで稀釈した１：８の容積比）Ｇｄ−ＤＴＰＡファントムを、画像強度の時系列標準化に用いた。スキャニングプロトコールは、３回のベースラインスキャンと、後続するＭＲＩ取得継続期間中に行われる留置カテーテル経由の髄腔内常磁性造影剤（０．１７ｍＭ  ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）および２１ｍＭ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ）送達から構成された。合計８０μｌの常磁性造影剤を注入速度１．６μｌ／分で髄腔内に送達した（総注入時間：５０分）。髄腔内注入終了後、３次元ＭＲＩ取得は、３．９時間にわたり継続した。実験終了時に、Ｎｅｍｂｕｔａｌの過量投与により動物を安楽死させた。
【０２０３】
[00367]データ処理
[00368]一般的なＭＲＩ画像処理手順は、頭部動き補正、強度標準化、スムージング、およびベースラインシグナルのボクセル毎の％変換から構成された。ＳＰＭ８（ｆｉｌ．ｉｏｎ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｓｐｍのワールドワイドウェブ）をこれに用いた。第１に、取得したＴ１−重み付けＭＲＩ画像をＤＩＣＯＭファイルとしてエクスポートし、３次元ＮＩｆｔｉ画像フォーマットに変換した。第２に、頭部の移動により引き起こされたスキャン間の位置ずれを、各スキャンを時間平均化（平均）画像に剛体アライメントすることにより補正した。第３に、下記の表現：ｉｍｇ＿ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＝ｉｍｇ＿ｏｒｉｇｉｎａｌ／ｐｈａｎｔｏｍｏｍ＊１０００を用いて、ボクセル強度を参照ファントムの平均強度で除算し；これに続き０．１ｍｍ半値全幅での等方性ガウス平滑化により、画像強度を時系列で標準化した。最後に、下記の表現：（Ｐ（Ｉ，ｊ，ｋ）＝（Ｉ（Ｉ，ｊ，ｋ）−ｂａｓｅ（Ｉ，ｊ，ｋ））／ｂａｓｅ（Ｉ，ｊ，ｋ）＊１００）を用いて、全時系列画像をベースライン平均画像で減算および除算して、ボクセル強度が、平均ベースライン画像に対するパーセンテージ変化を表すことを確実にした。
【０２０４】
[00369]Ｔ１−重み付けＭＲＩ上で経時的に測定された、事前に選択された解剖学的エリア内のシグナル変化を、常磁性造影剤の局所的組織の取り込みについて、時間−「活性」曲線（ＴＡＣ）を得るのに用いた。Ｔ１−重み付け平均化ベースライン画像、ならびに造影Ｔ１−重み付けＭＲＩを、関心領域（ＲＯＩ）の配置を解剖学的に誘導するのに用いた。正中線近傍の矢状断面ＭＲＩから、各半球内の４つの矢状断面スライスについてＲＯＩを描写し、また解剖学的ＲＯＩそれぞれに由来するシグナルを、ＰＭＯＤソフトウエアを用いて平均化した（ＰＭＯＤバージョン３．３０７、ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｔｄ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）。ＲＯＩには、脳下垂体陥凹、松果体陥凹、嗅球、小脳、橋核、および水管が含まれた。各ＲＯＩのＴＡＣをＰＫＭｏｄモジュールにより抽出した。ＲＯＩのＴＡＣそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を、「台形規則」を用いて計算した。各動物のＡＵＣを、（ｍＡＵＣ＝ＡＵＣ／（ｎ−１））として計算される「平均曲線下面積（ｍＡＵＣ）」と呼ばれる特別な試験で用いた対応する時間間隔の数で除算することにより、計算して得たＡＵＣを標準化した。更に、群内の各動物に送達される常磁性造影剤の量に差異が生じる可能性を最小限に抑えるために、脳下垂体陥凹のｍＡＵＣ（造影剤の主要なインプットおよびソースに該当する）を、その他領域のｍＡＵＣを標準化するのに用いた。その後、平均ｍＡＵＣ比を、解剖学的場所毎に、両側独立ｔ−検定を用いて２群間で比較した。
【０２０５】
[00370]クラスター分析
[00371]類似したキネティクスに基づいて、ＭＲＩ画像内のボクセルをグループ化するために、ノンパラメトリックセグメンテーションを、ｋ−平均法クラスターアルゴリズム（ＰＭＯＤ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３０７、ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）を用いて、４次元Ｔ１−重み付けＭＲＩそれぞれに由来する水管レベルにおいて、４つの矢状断面スライスについて実施した。脳のみを含む関心体積マスクをクラスター分析用に作成した。使用するクラスターの数（Ｋ）を、大血管、例えば脳底動脈（脳下垂体陥凹を含む）や嗅動脈複合体等に隣接するボクセルを区分することができるＫにより決定した。これを、動物毎、インタラクティブに実施した。各分析を、５０％パーセンタイル閾値（すなわち、シグナル変化が最も大きいものの５０％に相当するピクセルのみ）を用いて実施した（２乗したＴＡＣ値の合計を用いた）。傍血管流入導管の最も理想的な可視化を実現したクラスターの数は、４クラスターであった。大血管と比較してクラスターの位置を検証するために、４つのクラスターを、対応する造影および解剖学的ＭＲＩにより目視的に検査し、同時登録した。クラスター毎のボクセル数およびＴＡＣを、更に処理するために抽出した。
【０２０６】
[00372]蛍光髄腔内トレーサーの画像化
[00373]より高い分解能で髄腔内トレーサーのラット脳内への移動を評価するために、固定化した脳スライスにおいて、フルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン（ＭＷ５００ｋＤ、ＦＩＴＣ−ｄ５００）、およびテキサスレッド結合デキストラン（ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）のｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法を実施した。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ約１ｋＤ）およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００ｋＤ）の分子量に概ね対応するように、ＦＩＴＣ−ｄ５００およびＴＲ−ｄＴ３を選択した。髄腔内注射を、上記で詳記したように実施した。人工的なＣＳＦに溶解した０．１％のＦＩＴＣ−ｄ５００とＴＲ−ｄＴ３からなる混合物を注射した。注射後３０分、６０分、および１８０分経過して、動物を４％パラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流し、脳を取り出し、そして４℃で一晩事後固定化した。１００μｍの矢状断面ビブラトーム切片を切り出し、ＤＡＰＩ（インビトロジェン）を含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ試薬でマウントした。冠状切片のサブセットを、ビオチン化されたＧｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂｒａｎｄｅｉｒａｅａ）ＳｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩイソレクチンＢ４（ＩＢ４、血管内皮マーカー；１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、４℃で一晩、更にカウンター標識した。２次検出を、Ｃｙ５結合ストレプトアビジン（１：２５０、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて実施した。モーター駆動式ステージとＭｉｃｒｏｌｕｃｉｄａソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）を備えた、対物レンズの倍率が１０倍の従来型の落射蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いて、３−チャンネル全スライスモンタージュを作成した。高倍率画像化法を、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（オリンパス）により、４０倍の対物レンズ倍率で実施した。
【０２０７】
[00374]統計の概要
[00375]すべてのデータを、平均値±ＳＤとして提示する。統計分析を、ＳＡＳバージョン９．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ、米国）およびＸＬＳＴＡＴバージョン２０１１（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、ＮＹ、米国）を用いて実施し、ｐ値＜０．０５のとき、有意に異なるものと説明される。Ｇｄ−ＤＴＰＡラットとＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットとの間において、局所的組織の取り込みに認められる差異（解剖学的対象部位の平均「曲線下面積（ＡＵＣ）」（ｍＡＵＣ）と脳下垂体陥凹の平均ｍＡＵＣとの間の平均の比により表される）を、両側ｔ−検定を用いて独立した群について比較した。Ｋ−平均法クラスター分析から、下記のパラメータを導出した：１）３つの解剖学的ゾーンそれぞれにおけるボクセル総合計数、２）各ゾーンの時間−重み付けクラスター数（＃ボクセル＊ＡＵＣ）、および３）ゾーン１’の時間−重み付けクラスター数に対する、ゾーン２’および３’の総時間−重み付けクラスター数の比。Ｇｄ−ＤＴＰＡラットとＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットとの間におけるクラスター分析に由来するこれらのパラメータそれぞれの平均値について、その差異を、両側ｔ−検定を用いて独立した群について比較した。
【０２０８】
[00376]ファントムＭＲＩ実験
[00377]異なる濃度の２つの造影剤（すなわち、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧｄ−Ｃｈｅｌａｔｅ  ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐ）からなるファントムを調製し、そのＴ１を、３７℃において計算した。ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐを製造業者の指示に従い調製した。また、凍結乾燥品を再構成するために、１ｃｃの滅菌０．９％ＮａＣｌを３３ｍｇのＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐを含有する各バイアルに注入し、０．１６５ｍＭの溶液を得た。Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）注射物は、１−デオキシ−１（メチルアミノ）Ｄ−グルシトールジハイドロジェン［Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］グリシナト（５−）］ガドリナイト（２−）（２：１）の０．５Ｍの溶液であるが、この溶液０．０１ｍｌを、０．９％滅菌ＮａＣｌ０．２３ｍｌで稀釈し、２０．８ｍＭ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ溶液を得た。未希釈、再構成後のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐおよび２０．８ｍＭ  Ｇｄ−ＤＴＰＡが、異なる濃度のファントムを作成したときの最初の溶液に該当した。したがって、Ｇｄ−ＴＰＡファントムは、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０，１：３２０、１：６４０、および１：１２８０の容積比が得られるように、２０．８ｍＭのＧｄ−ＤＴＰＡを０．９％滅菌ＮａＣｌで連続的に希釈して調製した。同様に、再構成後のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）Ｐ溶液から、Ｇｄ−ＤＴＰＡの場合と同一の容積比（１：９〜１：１２７９）を用いてファントムを調製した。各ファントム（所与の希釈物０．５ｍｌ）を、動物試験の場合と同一のＭＲパラメータを用いて３７℃でスキャンした：２ＤシングルスライスＦＬＡＳＨシーケンス、（ＴＲ＝１５ｍｓｅｃ、ＴＥ＝３．８ｍｓ、ＮＡ＝５）、および２６フリップ角（２°〜８０°）。Ｔ１を、以下のように表される標準スポイルドグラジエントエコーシーケンス（ＦＬＡＳＨ）により計算した：
【０２０９】
【数１】
0006382232.tif 000002
【０２１０】
式中、Ｓ０、ＴＲ、ＴＥ、Ｔ１、
【０２１１】
【数２】
0006382232.tif 000003
【０２１２】
、Ｔ１、θは、プロトン密度、反復時間、エコー時間、横緩和時間、縦緩和時間、およびフリップ角をそれぞれ意味する。ＭＡＴＬＡＢ７．１に組み込まれたＮｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄ  ｓｉｍｐｌｅｘアルゴリズムを近似手順で採用した。図１６（容積比１：２０）は、２つの造影剤についてフリップ角の範囲において検出されたシグナル変化を表す。図１７では、計算したＴ１を、０．１（１：１０の比）〜０．０１（１：１００の比）の範囲で、常磁性造影剤濃度の関数としてプロットする。図１７から分かるように、２つの異なる造影剤のＴ１は、濃度が低下しても幅広い範囲で同等である。これらの実験に基づき、０．１６５ｍＭのＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）および２０．８ｍＭのＧｄ−ＤＴＰＡは、実験開始（髄腔内注入開始）時にはほぼ同等のＴ１効果もたらすものとみなされた。
【０２１３】
[00378]結果
[00379]本試験に含まれるすべてのラットは、６時間の画像化実験期間中、生理学的に安定な状態に留まり、呼吸数は５０〜６０回／分、Ｏ２−飽和度は約９８〜１００％、心拍数は約３００〜３７０拍動／分、および体温は３６．５〜３７．５℃の範囲であった。いくつかの主要な解剖学的構造、例えば嗅球、海馬、松果腺、上丘、下丘、脳下垂体、および小脳等を識別することができたが、灰白質の造影は、常磁性造影剤投与前に得られた３次元ＦＬＡＳＨ  Ｔ１−重み付けシーケンスに限定された（図１８Ａ〜Ｂ）。後外側脈絡膜動脈複合体に加えて、より大型の動脈、例えば嗅動脈、不対の前大脳動脈、不対の脳梁周囲動脈、中間内側前頭動脈等は、正中線近傍矢状断面において容易に可視化された（図１８ＡおよびＢ）。
【０２１４】
[00380]常磁性造影剤の傍血管流入
[00381]実施例１は、マウスでは、ＣＳＦはくも膜下腔から傍動脈チャンネルに沿ってＶｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ腔経由で脳に急速に進入し、間質液コンパートメントと交換することを実証している。脳実質へのかかる広範な「逆行性」のＣＳＦの流動は、ＣＳＦ分泌および再吸収に関する古典的なモデルに対峙する（１、２）。この事例では、第１の目標は、異なる常磁性造影剤を髄腔内に送達した後に、ＣＳＦの脳への傍血管流入が造影ＭＲＩにより観察可能であるか調べることであった。
【０２１５】
[00382]図１８Ａ〜Ｊは、２匹の代表的なラットについて、初期注入期間における低分子量Ｇｄ−ＤＴＰＡ（図１８Ｃ〜Ｅ）、および高分子量ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（図１８Ｆ〜Ｈ）の流入を示す。ダイナミック時系列Ｔ１−重み付けＭＲＩより、時間依存性の解剖学的傍血管流入経路が明らかであるが、これには下記の経路が含まれる：１）大槽内への常磁性造影剤の到達（図１８ＣおよびＦ）、および脳底動脈に沿った輸送（図１８ＤおよびＧ）、２）脳下垂体陥凹におけるコントラストの出現（図１８ＤおよびＧ）、３）嗅動脈複合体に沿った、および嗅球内への継続的輸送（図１８ＥおよびＨ）、および４）後脈絡膜動脈複合体を経由する（図１８Ａ）松果体陥凹への輸送。
【０２１６】
[00383]Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について、グリンファティック系を経由する輸送を取り込むダイナミック時系列動画では、小分子およびより大分子の脳網羅的分布に差異があることを明確に示している（データは提示せず；図１９および２０に示した動画からの静止画像）。例えば、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）により誘発されたシグナル変化が現れ、傍動脈／傍血管導管に沿って選択的に留まり、そして実質の取り込みは希薄となるが、一方、低分子量Ｇｄ−ＤＴＰＡ造影剤は脳実質への拡散性のアクセスをかなり多く保持する（データは提示せず）。また、２つの常磁性造影剤の分子量は異なるものの、傍血管導管経由の通過は、コントラストが大槽内に現れる時刻（図１８ＣおよびＦで「０」と定義した）から、概ね類似していることも明白である。松果体陥凹に現れる常磁性造影剤の量に関して若干の変動が存在し、またＧｄ−ＤＴＰＡで注射を受けた２動物では、松果体陥凹においてシグナル変化は認められなかった。しかし、グリンファティック経路に沿った流入の傍血管的性質は、高強度シグナルが後交通動脈の出口を縁取るウィリス動脈輪レベルにおいて最も明白であり（図１８Ｉ）、ならびに外側眼窩前頭動脈に沿った（図１８Ｊ）流入の場合も同様である。
【０２１７】
[00384]ダイナミック時系列に基づけば、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の分子量は２桁以上異なるが、概ね類似した速度で傍血管導管を通過するとみられることは明白である（図１８Ｃ〜Ｈ）。松果体陥凹を経由する場合、造影剤の移動は緩慢であるように思われ、２時間を超えるウォッシュアウト後も、一般的にこの槽内に残留する（データ提示せず）。傍血管造影剤の移動は、薬剤の分子量に基づいた場合、明確には異ならなかったという観察所見は、分子サイズとは独立であることが公知であるバルク流媒介型の液輸送と一致する（７）。造影ＭＲＩを用いたこれらのデータから、くも膜下腔から脳実質内へのＣＳＦのバルク流は、主に傍動脈経路に沿って生ずるという実施例１の第１の基本的な所見が確認される。
【０２１８】
[00385]分子サイズが脳網羅的Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）輸送に与える効果
[00386]実施例１では、低小分子量および高分子量トレーサーのいずれも、近接する傍動脈流入経路に沿って移動可能であるが、傍動脈腔から周辺の脳間質内へのアクセスは分子サイズに基づき限定されることが実証された。特に、より低分子量のトレーサー、例えばＴＲ−ｄ３（ＭＷ３ｋＤ）またはＡＬＥＸＡ６４７結合オボアルブミン（ＭＷ４５ｋＤ）等は速やかに間質内に通過したが、一方、より高分子量のトレーサー、例えばＦＩＴＣ結合２０００ｋＤデキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ２０００、ＭＷ２０００ｋＤ）等は、傍血管腔に限定して残留した。大脳の微小循環を完全に鞘に収める重複性のアストロサイトエンドフィート（８）は、より高分子量の物質が間質からアクセスするのを制限するように働くと推察された。これらの所見に基づき、脳の間質により良好にアクセスする結果として、より大きなＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００ｋＤ）分子と比較して、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ９３８Ｄａ）は、より大きな総脳組織容積においてシグナル変化（Ｔ１の短縮）を誘発するはずであると予測された。この仮説を、異なる定量的画像処理法を用いて試験した。
【０２１９】
[00387]常磁性造影剤の総「時間−曝露」を、造影剤の取り込みが経時で明確に可視化された、大型の傍血管流入導管近傍の重要な解剖学的部位において最初に測定した。特に、ＲＯＩを、最も近接するグリンファティック流入導管（すなわち、脳下垂体陥凹および松果体陥凹）と、「実質」ＲＯＩ、例えば橋核、小脳、嗅球、および水管等に細分化した。これらの細分領域内の相対的なキネティクスを比較するために、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）に関する平均ＴＡＣを計算し、図２１Ａ〜Ｆにプロットした。脳下垂体陥凹内では、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）により誘発されたシグナル強度変化の平均的なタイムコースは、全試験期間を通じて概ね同一であった（図２１Ａ）。類似した所見が、松果体陥凹について認められた（図２１Ｂ）。これより、くも膜下腔および近接する傍血管チャンネルとして定義されるグリンファティック経路の近接部分においては、造影剤のアクセスおよび流動は、概ね分子サイズとは独立していることが確認される。対照的に、小脳（図２１Ｃ）、水管（図２１Ｅ）、および橋核（図２１Ｆ）内のＧｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）に関する平均ＴＡＣから、流入速度、ピーク到達時間、および流出速度について、明白な薬剤内差異があることが実証された。いずれの場合にも、高分子量ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）のこれら領域内への見かけの流入は、Ｇｄ−ＤＴＰＡの流入に著しく劣後した。例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡが注入されたラットでは、小脳内平均取り込み量は、注射後約９０分でピークに達したが、一方、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）が注入されたラットでは、平均小脳組織取り込み量は、注射後約１２０分で見かけのプラトーに到達した。
【０２２０】
[00388]輸送および取り込み速度を反映する平均ＡＵＣ値（ｍＡＵＣ）も、これらの各領域において、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について計算した。脳下垂体陥凹では、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について導出したｍＡＵＣ値は、それぞれ１時間間隔当たり７４３±２６６％のシグナル変化、および１時間間隔当たり６８５±２１７％のシグナル変化であった（ｐ値＝０．４５）。脳下垂体陥凹を通過する常磁性造影剤の総量は、１群当たり内のラット間で変動するので、群内および群間での常磁性造影剤の組織取り込み量を比較する際の変動を最小限に抑えるために、すべての局所的ｍＡＵＣを脳下垂体陥凹（グリンファティック経路の最も近接した部分、および造影剤送達の主要な「ソース」に該当する）のｍＡＵＣに標準化した。表１は、局所的ｍＡＵＣ比分析の結果を示し、またＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）と比較したとき、小脳、水管、および橋核において、Ｇｄ−ＤＴＰＡの組織取り込み量は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の同取り込み量より有意に高かったことを示す。
【０２２１】
[00389]
【０２２２】
【表１】
0006382232.tif 000004
【０２２３】
[00390]ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）と比較して、Ｇｄ−ＤＴＰＡの脳組織の取り込み量、および分布パターンを分析する第２のノンパラメトリックアプローチとして、各動物に由来する、水管レベルの一連の正中線矢状断面スライス４片についてクラスター分析を実施した。この分析結果を図２２Ａ〜Ｊに示す。４つのクラスター（Ｋ＝４）を、血管周囲導管を最適に可視化するのに用いた。クラスターが異なれば、関連する解剖学的エリアも異なったが、当該エリアとして傍血管エリアと直に関連する組織（ゾーン１）、ゾーン１直近の組織（ゾーン２）、およびゾーン２に隣接する最も遠位において標識されたボクセル（ゾーン３）が挙げられる。クラスターの分布パターンおよび対応するゾーンを図２２Ａ〜Ｊに示す。ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットでは、傍血管ゾーン１は、赤色およびオレンジ色のクラスター（図２２Ｂ）を含み、また緑色および青色のクラスターはゾーン２およびゾーン３をそれぞれ含み、そして嗅球および脳下垂体陥凹や松果体陥凹に隣接した組織等のより低速の実質グリンファティック経路を表す（図２２Ｃ、Ｄ）。ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットに由来する４つのクラスターのＴＡＣは、緑色および青色のクラスターと比較したとき、最も近接した傍血管導管（赤色およびオレンジ色のクラスター）は、最も大きなシグナル変化（ベースラインから＞３００％のシグナル変化）によって表されることを示し、更にこれらは、最も小さなコンパートメントに該当することを示している（図２２Ｉ）。
【０２２４】
[00391]Ｇｄ−ＤＴＰＡラットを分析対象としてクラスター分析した結果、３つの主要な解剖学的ゾーンにわたり分布するクラスターが同様に得られたが、しかし、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）と比較すると、全体的により多くの脳組織が含まれた。図２２Ａ〜Ｊに示す通り、Ｇｄ−ＤＴＰＡラットでは、赤色のクラスターは、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）について認められた場合と同様に傍血管導管に位置する（図２２ＢおよびＦを比較）。また、緑色のクラスターは、嗅球や小脳等のより深部の組織エリアと関連する（図２２Ｇ）。しかし、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）とは対照的に、Ｇｄ−ＤＴＰＡラットの青色のクラスターボクセルには、小脳および橋核のほとんどが含まれ（図２２Ｇ〜Ｈ）、これから示唆されることとして、高分子量のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）は、低分子量のＧｄ−ＤＴＰＡほど容易に脳間質腔にアクセスすることができないことが挙げられる。Ｇｄ−ＤＴＰＡラットに由来する４つの異なるクラスターのＴＡＣを図２２Ｊに示す。傍血管赤色クラスターのピーク到達時間は約９０分であり、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットの傍血管赤色クラスターについて認められた同時間と類似している。換言すれば、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の傍血管輸送は、共通する類似したキネティクスを有する。
【０２２５】
[00392]Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットについてクラスター分析し、その定量結果を表２に示す。
[00393]
【０２２６】
【表２】
0006382232.tif 000005
【０２２７】
[00394]表２は、分析に含まれる、正中線矢状断面の脳スライス４片に由来する各クラスターの平均総ボクセル数、クラスター／ゾーン毎の３つの異なるクラスター／ゾーンＴＡＣのＡＵＣ＊ボクセル数の計算結果について示す。表２から分かるように、ゾーン１（傍血管エリア）に割り当てられたボクセルの数は、Ｇｄ−ＤＴＰＡラットおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットについて類似した範囲内にある。しかし、Ｇｄ−ＤＴＰＡラットでは、ゾーン３（図２２Ｄ中の青色のボクセル）の平均総ボクセル数は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（図２２Ｈ中の青色のボクセル；ｐ値＜０．０５）について認められた数より有意に高い。
【０２２８】
[00395]２群内のクラスター間の関連性を更に比較するために、ゾーン２の総時間−重み付けクラスター数と第１ゾーンの同クラスター数（ゾーン２＃ボクセル＊ＡＵＣ／ゾーン１＃ボクセル＊ＡＵＣ）の比、およびゾーン３の総時間−重み付けクラスター数と第１のゾーンの同クラスター数の比（ゾーン３＃ボクセル＊ＡＵＣ／ゾーン１＃ボクセル＊ＡＵＣ）を計算した。これらの比は、試験期間全体を通じて、傍血管領域（ゾーン１）を通過する造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標））と実質のボクセル（ゾーン２および３）を通過する同造影剤との間の関連性を表す。これらの比は、造影剤が、近接するグリンファティック流入経路（赤色および／またはオレンジ色のクラスター）からより深部にある脳の間質（緑色および青色のクラスター）に移行する際に、それを可能にする相対的難易度を定量化する手段を表す。表２から分かるように、Ｇｄ−ＤＴＰＡラットについて得られたゾーン３＃ボクセル＊ＡＵＣ／ゾーン１＃ボクセル＊ＡＵＣ比の平均値は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）ラットについて得られた平均値より有意に高い（ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）：０．２５±０．２２に対して、Ｇｄ−ＤＴＰＡ：０．８９±０．５６；ｐ＝０．０２７、ｔ−検定）。したがって、このノンパラメトリッククラスター分析から、低分子量Ｇｄ−ＤＴＰＡおよび高分子量ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）は、近接するグリンファティック経路（くも膜下コンパートメントおよび初期の傍血管コンパートメントを含む）に対して概ね同等のアクセスを享受するが、高分子量ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の脳間質腔へのアクセスは、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して劇的に低下していることがはっきり確認される。
【０２２９】
[00396]グリンファティック経路機能の蛍光に基づく画像化
[00397]ラットに造影剤を髄腔内注射したときに、シグナル変化（Ｔ１短縮）を示す脳実質容積は、マウスを対象として蛍光に基づく画像化法によって検出される蛍光ＣＳＦトレーサーの脳実質内への貫通よりも著しく限定された（実施例１）。この差異は、脳実質全体に分散したときに、Ｔ１−重み付けＭＲＩが低濃度の造影剤により誘発されたシグナル変化を検出する感度が相対的に劣る（蛍光に基づく画像化法と比較して）ことに加え、髄腔内に送達される造影剤の総量の差異に由来した。これを試験するため、蛍光デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ５００およびＴＲ−ｄ３；それぞれＭＷ５００ｋＤおよび３ｋＤ）を、ＭＲＩ試験で用いられるプロトコールと同一のプロトコールにより同時注射し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査法により、トレーサーの脳への貫通経路と範囲を評価した。
【０２３０】
[00398]従来型の落射蛍光顕微鏡検査法により低倍率（４倍）で画像検査すると、全体的な蛍光トレーサー分布は、ＭＲＩ画像化試験の所見と概ね一致した。トレーサー注入後３０〜６０分経過して、高強度の蛍光標識が、脳全体にわたり軟膜表面下方に認められた（図２３Ａ、Ｆ）。トレーサー強度は、腹側脳表面に沿って、また松果体陥凹周辺部に沿って最大であったが、これは松果体陥凹は脳内に延在し、海馬溝と連結しているためである。これらの場所では、ＣＳＦトレーサーの組織内への通過は、分子サイズに主に依存し、例えば低分子量のＴＲ−ｄ３はくも膜下腔から実質に速やかに進入したが、一方、高分子量のＦＴＩＣ−ｄ５００は、軟膜表面を貫通しなかった（図２３Ａ、Ｆ）。
【０２３１】
[00399]注射後３０分の時点で、脳への傍血管ＣＳＦ流入は明白であった（図２３Ａ〜Ｂ）。実施例１に認められるように、傍血管流入は、静脈に沿う（図２３Ｅ）のではなく、むしろ貫通動脈周辺の空間に沿って（図２３Ｃ〜Ｄ）ほぼ排他的に生じた。これには、腹側脳表面に始まる大口径動脈に加えて、より小型の貫通皮質動脈が含まれた。Ｇｄ−ＤＴＰＡとＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）との間で、その分布に差異が認められたことと整合して、脳全体にわたるＴＲ−ｄ３およびＦＩＴＣ−ｄ５００の分布は顕著に異なった。注射後３０分の時点で、ＦＩＴＣ−ｄ５００は傍血管腔に限定して残留し、また周辺の実質には進入しなかった。対照的に、ＴＲ−ｄ３は、傍血管腔から周辺実質内に速やかに広がり、近傍のニューロンにより取り込まれた（図２３Ｃ〜Ｄ）。
【０２３２】
[00400]Ｇｄ−ＤＴＰＡにより、実質内で誘発されたシグナル変化は、注射後６０〜８０分間でピークに達し（図２１Ｃ〜Ｄ）、次に造影剤が脳実質からクリアランスされるにつれて減退した。注射後３０〜６０分間、脳網羅的ＴＲ−ｄ３の蛍光が、トレーサーが近接する軟膜表面および傍血管経路から広がって、実質全体に拡散的に分布するにつれて増加したようであった（図２３Ａ、Ｆ）。ＦＩＴＣ−ｄ５００は、脳全体を通じて毛細血管床内に延在する傍血管腔に限定して残留した（図２３Ｇ）。注射後１８０分の時点で、脳の蛍光強度は、３０分および６０分における数値から減退したが（図２３Ｈ）、しかしトレーサーは松果体陥凹近傍の周辺傍静脈経路内に存続した（図２３Ｉ）。
【０２３３】
[00401]考察
[00402]実施例１より、グリンファティック経路は可溶性アミロイドβの脳間質からのクリアランスに対する重要な寄与因子であることが実証され、このクリアランスの不具合は、アミロイドプラークの沈着およびＡＤの進行に寄与することが提唱された。これらの所見に照らし、ヒト脳全体を通じてグリンファティック経路機能を測定するこの系の抑制がＡＤの発症および進行に寄与するのかを評価する予後臨床検査法の開発には大きな価値が存在する。この実施例は、グリンファティック経路機能は、脳網羅的ＣＳＦ−ＩＳＦ交換を視覚化するための臨床的に重要な画像化技法である造影ＭＲＩを用いて測定可能であることを実証している。同技法は、髄腔内投与後、造影剤はバルク流により傍動脈経路を通じて急速に移動して、脳下垂体陥凹、嗅球、および松果体陥凹の主要な流入ノードに到達することを実証する。更に、脳実質の異なる領域におけるシグナル変化（Ｔ１短縮）について行ったパラメトリックおよびノンパラメトリックデータ分析から、造影剤の間質内へ移動のおよびこれを通じた移動は、常磁性造影剤分子の分子量に大きく依存することが明確に実証される。脳全体にわたるＣＳＦ−ＩＳＦ交換の速度を反映するグリンファティック系機能を特徴付けるために、ダイナミック時系列造影ＭＲＩ画像から、キネティックパラメータを策定および規定した。
【０２３４】
[00403]実施例１より、くも膜下ＣＳＦは、貫通動脈周辺の傍血管チャンネルに沿って脳実質に急速に進入することが実証された。本所見から、外部脳表面動脈、例えば脳底動脈、ウィリス動脈輪の交通動脈、および嗅動脈等は、より広範なくも膜下腔および最終的に大脳内で、ＣＳＦのための高速輸送経路を構成することが実証される。解剖学的に、これらのＣＳＦ輸送経路は、Ｗｅｌｌｅｒとその共同研究者らによる、電子顕微鏡試験に記載されている軟膜の傍血管鞘に対応する可能性がある（９〜１１）。低分子量（＜１ｋＤ）および高分子量（約２００ｋＤ）の造影剤は、いずれもこれらの傍動脈腔を通じて同等速度で移動したが、これから示唆されることとして、バルク流はこれらの経路に沿ったＣＳＦの流動輸送を駆動することが挙げられる（７、１２、１３）。髄腔内蛍光標識トレーサーのラット脳への流入を分析し、これより、表面動脈周辺のバルク流経路は、周辺のより小型の貫通動脈と連続しており、また脳の間質内への、およびこれを通じてＣＳＦが急速に流入するのための直接的な経路を提供することが確認された。これらの傍動脈バルク流路は、溶質および老廃物の脳の間質からのクリアランスを促進する脳網羅的な系の主要な構成要素を含む。
【０２３５】
[00404]傍血管腔と間質との間でＣＳＦとＩＳＦとの交換が行われるが、その交換は、脳微小血管構造をほぼ完全に網羅するように延在する血管周囲のアストロサイトエンドフィート全体にわたって生じる（８）。その結果、エンドフィート全体にわたり、特定の分子輸送経路（例えば、イオントランスポーターまたはチャンネル等）を欠く溶質はその代わりに、間質腔へのアクセスを確保するために、重複性のエンドフィートプロセス間の約２０ｎｍの間隙を通過しなければならない。実施例１では、ＴＲ−ｄ３（水和径（ｄＨ）＝６．１ｎｍ（１４））等の小型のトレーサーは、間質内に、およびこれを通じて速やかに通過することが認められたが、一方、ＦＩＴＣ−ｄ２０００（ｄＨ＞３２ｎｍ（１４））等の大型のトレーサーは、傍血管腔に主に限定して残留した。この実施例では、これらの所見は、蛍光に基づく画像化法を用いてラットで確認された。更に、２つの異なる大きさの造影剤、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ約１ｋＤ）、およびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（ＭＷ２００ｋＤ）の髄腔内投与が、ダイナミック造影ＭＲＩによりトレーサーサイズの類似した効果を実証するのに用いられた。例えば、異なる解剖学的場所において２つの造影剤のＴＡＣを比較すると、高分子量のＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）は、低分子量のＧｄ−ＤＴＰＡよりも劇的に低下した速度で脳実質に進入した（赤色および青色の曲線を比較、図２１Ａ〜Ｆ）。更に、独立したクラスター分析から、両トレーサーは、傍血管腔に速やかにアクセスできたが、Ｇｄ−ＤＴＰＡがアクセス可能な脳容積は、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）がアクセスできる容積よりも顕著に大きいことがはっきりと明示された（青色のゾーン３を比較、図２２Ｄ、Ｈ）。Ｇｄ−ＤＴＰＡとＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）との間で、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換パターンに認められた差異は、分子サイズの差異に起因し得るが、その他の可能性も存在する。例えば、その他の内因性の分子特性、例えば形状、静電力、サイズ（回転半径）、立体構造、または物理的／化学的相互作用等は、２つの造影剤分子に認められたＣＳＦ−ＩＳＦ交換パターンの相違に寄与する可能性がある。
【０２３６】
[00405]この実施例の実験プロトコールにおける、蛍光に基づく画像化法と造影ＭＲに基づく画像化法との間の１つの明らかな差異として、髄腔内注射後、脳実質全体にわたり、低分子量造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）を検出する能力を欠いていることが挙げられる。これは、マウスを対象に低分子量蛍光ＣＳＦトレーサーを用いた、実質の広範囲に広がる標識とは対照的である（実施例１）。これらの差異が、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換における種間の差異の反映ではなかったことを確認するために、ラット脳スライスを対象として、同様の大きさの蛍光ＣＳＦトレーサー（ＦＩＴＣ−ｄ５００（５００ｋＤ）をＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）（２００ｋＤ）と、およびＴＲ−ｄ３（ＭＷ３ｋＤ）をＧｄ−ＤＴＰＡ（ＭＷ約１ｋＤ）と比較）を、これ以外のＭＲＩ実験で用いた同一の注射プロトコールを用いて髄腔内注射した後に、ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法を実施した。この蛍光に基づく画像化法から、低分子量ＣＳＦトレーサーのラット脳実質全体を通じた浸透、および高分子量トレーサーの傍血管腔への限局性が確認された。したがって、ＴＲ−ｄ３と同様にＧｄ−ＤＴＰＡは、脳実質全体にわたり実際に移動する。しかし、より広い実質内で、現行の髄腔内注入プロトコールに基づき実現したＧｄ−ＤＴＰＡ造影剤濃度は、簡潔に言えば、検出可能なシグナル変化（Ｔ１短縮）を誘発するほど十分に高くはなかった。
【０２３７】
[00406]これらの限界にもかかわらず、ＭＲＩ固有の３次元的性質は、脳全体を通じて、傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換経路全体の可視化を可能にし、脳下垂体陥凹、嗅動脈、および松果体陥凹におけるＣＳＦの脳内への流入について、その重要なノードを規定し、またＣＳＦ−ＩＳＦ交換を、多くの解剖学的に異なる場所において同時に評価できるようにした（図２４）。ダイナミック画像取得法により、所与の造影剤分子について、ＣＳＦトレーサーの傍血管腔および間質腔内への流入およびこれらからのクリアランスに関するキネティクスを測定し、また特徴付けることが可能であった。例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ注射後のくも膜下脳下垂体陥凹および松果体陥凹について得られたＴＡＣは、類似した流入プロファイルを示すが、一方松果体陥凹からの流出は、脳下垂体陥凹の流出と比較して顕著に低速化した（図２１ＡおよびＢを比較）。同様に、小脳および水管について得られたＴＡＣは、類似した流入キネティクスを示すが、一方、造影剤の水管からのクリアランスは小脳領域と比較して長期化した（図２１ＣおよびＥを比較）。松果体陥凹および水管からのクリアランスの長期化に関する１つの考え得る説明として、これらの解剖学的領域は、主要なＩＳＦクリアランス部位を構成し、したがって造影剤の見かけの保持期間が長期化する（その他の領域から造影剤を蓄積することによる）ことが挙げられる。
【０２３８】
[00407]ダイナミック時系列データ分析は、低分子量（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）造影剤と高分子量（ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標））造影剤との間のＣＳＦ−ＩＳＦ交換の本質的な比較も可能にした。この場合、脳下垂体陥凹内では、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の流入およびクリアランスは、実質的に同一であるが（赤色と青色の曲線を比較する、図２１Ａ）、一方、実質の橋核では、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の当該領域への移動およびこれを通じた移動は、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して劇的に低下する（赤色と青色の曲線を比較、図２１Ｆ）ことに留意することが特に重要である。第２のアプローチであるクラスター分析を用いれば、２つの造影剤の間で、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換について、その空間的な分布パターンを水管レベルで評価することができる。ゾーン３が占める未処理の脳容積（最も遠位のコンパートメントに対応する）、またはゾーン３＃ボクセル＊ＡＵＣ／ゾーン１＃ボクセル＊ＡＵＣ比の標準化された平均値（傍血管腔から脳実質内へのトレーサーの通過を反映する）を比較すると、ＧａｄｏＳｐｉｎ（商標）の脳の間質への、およびこれを通じた通過は、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して劇的に制限されている（表２）。したがって、髄腔内造影剤投与後のダイナミック造影ＭＲＩは、脳全体にわたるグリンファティックＣＳＦ−ＩＳＦ交換のキネティクスおよび空間的な分布の両方を特徴付けるアプローチを提供する。
【０２３９】
[00408]実施例１では、グリンファティック経路は、例えばＡＤ病因の重要な駆動因子として幅広く考えられているペプチドである可溶性アミロイドβ等の間質内溶質のクリアランスに対する重要な寄与因子であることが実証される（１５、１６）。実施例１は、グリンファティック経路機能の不具合は、アミロイドβプラークの沈着およびＡＤの進行の原因となり得ることを示す。本実施例で議論される研究は、ラットを対象に造影ＭＲＩによりグリンファティック経路機能について評価するが、同研究は、ヒト脳を対象としてグリンファティック経路機能を評価し、またその不具合がヒトにおいてもＡＤの進行の原因となるのかを評価するための実験的下地を提供する。これを実現するために、グリンファティック経路機能を測定するための、安全で、最小限度で侵襲的な画像化法が必要であった。
【０２４０】
[00409]造影ＭＲ脳槽造影法が、自発性頭蓋内圧低下症およびＣＳＦ鼻漏について治療を受けている患者のＣＳＦ漏出を視覚化するために現在、臨床的に用いられており（４、５）、また本試験で利用されたＧｄ−ＤＴＰＡが、この目的のためにすでに臨床承認を経ている。現行の大槽を経由する注射経路、および必要とされるスキャン時間（＞２時間）は臨床的に重要でないが、実施例３では、脳内のグリンファティック経路機能を評価するのに、シングルショット髄腔内腰部注射がふさわしいことが実証される。
【０２４１】
[00410]本実施例から、ラットでは、臨床的に許容され得るこのアプローチは、グリンファティック経路機能を視覚化および評価するのに利用可能であり、脳全体にわたる傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換のキネティクスおよび解剖学的分布パターンの評価を可能にすることが実証される。このアプローチは、ＡＤへの罹患のしやすさおよび疾患進行を評価するまったく新しい予後方策の基準を提供し得る。
【０２４２】
[00411]実施例２で引用した参考文献
1.  Brown, P.D., Davies, S.L., Speake, T., and Millar, I.D. 2004. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience 129:957-970.
2.  Praetorius, J. 2007. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch 454:1-18.
3.  Battal, B., Kocaoglu, M., Bulakbasi, N., Husmen, G., Tuba Sanal, H., and Tayfun, C. 2011. Cerebrospinal fluid flow imaging by using phase-contrast MR technique. Br J Radiol 84:758-765.
4.  Schick, U., Musahl, C., and Papke, K. 2010. Diagnostics and treatment of spontaneous intracranial hypotension. Minim Invasive Neurosurg 53:15-20.
5.  Aydin, K., Terzibasioglu, E., Sencer, S., Sencer, A., Suoglu, Y., Karasu, A., Kiris, T., and Turantan, M.I. 2008. Localization of cerebrospinal fluid leaks by gadolinium-enhanced magnetic resonance cisternography: a 5-year single-center experience. Neurosurgery 62:584-589; discussion 584-589.
6.  Example 1
7.  Cserr, H.F., Cooper, D.N., Suri, P.K., and Patlak, C.S. 1981. Efflux of radiolabeled polyethylene glycols and albumin from rat brain. Am J Physiol 240:F319-328.
8.  Mathiisen, T.M., Lehre, K.P., Danbolt, N.C., and Ottersen, O.P. 2010. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia 58:1094-1103.
9.  Pollock, H., Hutchings, M., Weller, R.O., and Zhang, E.T. 1997. Perivascular spaces in the basal ganglia of the human brain: their relationship to lacunes. J Anat 191 ( Pt 3):337-346.
10.  Weller, R.O. 2005. Microscopic morphology and histology of the human meninges. Morphologie 89:22-34.
11.  Zhang, E.T., Inman, C.B., and Weller, R.O. 1990. Interrelationships of the pia mater and the perivascular (Virchow-Robin) spaces in the human cerebrum. J Anat 170:111-123.
12.  Groothuis, D.R., Vavra, M.W., Schlageter, K.E., Kang, E.W., Itskovich, A.C., Hertzler, S., Allen, C.V., and Lipton, H.L. 2007. Efflux of drugs and solutes from brain: the interactive roles of diffusional transcapillary transport, bulk flow and capillary transporters. J Cereb Blood Flow Metab 27:43-56.
13.  Abbott, N.J. 2004. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochem Int 45:545-552.
14.  Sykova, E., and Nicholson, C. 2008. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev 88:1277-1340.
15.  Hardy, J. 2009. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem 110:1129-1134.
16.  Hardy, J., and Selkoe, D.J. 2002. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297:353-356.
【実施例３】
【０２４３】
[00412]６．３．臨床的に重要なＣＳＦトレーサー髄腔内注射を利用するグリンファティック経路機能の評価
[00413]この実施例では、腰部髄腔内造影剤送達は、ヒトを対象としてグリンファティック経路機能を評価するために、ダイナミック核イメージング法と併用して利用可能である、臨床的に有用なアプローチであることを示す。
【０２４４】
[00414]概要
[00415]アルツハイマー病（ＡＤ）等の神経変性疾患は、ニューロンの機能障害および喪失の原因と考えられている内因性のペプチドおよびタンパク質の凝集と関連する。上記実施例１および２で実証されるように、グリンファティック系は、アミロイドβを含む間質内溶質の脳からのクリアランスに対する重要な寄与因子である。このような所見から示唆されることとして、グリンファティック経路機能変化を測定することが、神経変性疾患への罹患のしやすさまたはその進行を評価するための重要な兆候となり得ることが挙げられる。しかし、ヒトを対象としたグリンファティック経路機能を評価する臨床的に許容されるアプローチはまだ未開発である。
【０２４５】
[00416]テキサスレッド結合デキストラン−３（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）およびＦＩＴＣ結合デキストラン−５００（ＦＩＴＣ−ｄ５００、ＭＷ５００ｋＤ）を大後頭孔または腰椎に髄腔内注射した後、３０分、６０分、１２０分、および１８０分経過時点において、ラットおよびマウスの冠状スライスについて時系列化ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光顕微鏡検査を実施した。次に、両注射経路に沿ったトレーサー移動をマップ化するために、異なる脳領域（皮質、白質、皮質下構造、および海馬）内のトレーサー含有量を前方および後方ラット脳において定量化した。
【０２４６】
[00417]大槽内および腰部髄腔内の両注射後、低分子量のＴＲ−ｄ３は血管周囲経路に沿って脳に進入し、そして脳実質と広範に置換したが、これはマウスにおけるグリンファティック経路の初期の特徴に一致する。より高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００は、主に血管周囲腔に限定して残留した。腰部髄腔内注射では、大槽内注射と比較してピーク蛍光強度の低下および遅延が認められた。
【０２４７】
[00418]背景
[00419]アルツハイマー病（ＡＤ）等の致命的な神経変性疾患は、ニューロンの進行性喪失、感覚および運動障害、および重度の認知機能低下により特徴付けられる。可溶性アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの細胞外沈着および高リン酸化タウの神経原線維濃縮体内蓄積は、ＡＤの病態生理学に関係すると考えられているが（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２年、Ｓｍａｌｌ  ａｎｄ  Ｄｕｆｆ、２００８年、Ｍａｃｃｉｏｎｉら、２０１０年）、一方、ハンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むその他の神経変性疾患では、類似のミスフォールドタンパク質が凝集する（Ｂｒｕｉｊｎら、１９９８年、Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、１９９９年、ＲｏｓｓおよびＰｏｉｒｉｅｒ、２００４年）。ＡＤの場合、アミロイド沈着は、可溶性Ａβの脳からのクリアランスに生じた加齢性の不具合に起因すると広く考えられている（ＤｅａｎｅおよびＺｌｏｋｏｖｉｃ、２００７年）。神経を画像化するアプローチは、アミロイドプラークの沈着およびプラーク負荷を検出するために今日幅広く利用可能であるものの（Ｎｏｒｄｂｅｒｇら、２０１０年）、Ａβクリアランス効率を直接測定できるようにするアプローチはまだ存在しない。Ａβクリアランス効率の変化を検出できれば、ＡＤおよびその他の神経変性疾患への罹患のしやすさおよびその進行の評価における大いなる進歩となろう。
【０２４８】
[00420]実施例１では、大部分のくも膜下ＣＳＦは、傍血管腔に沿って脳実質を通じて再循環し、傍静脈経路経由でクリアランスされる前に脳実質の脳間質液（ＩＳＦ）と交換することが実証された。この経路に沿ったＣＳＦの継続的な循環は、可溶性Ａβを含む細胞外溶質の脳からのクリアランスを促進する。この脳網羅的経路は、アストロサイトのアクアポリン−４水チャンネルを経由するアストログリア水輸送が、ＣＳＦ−ＩＳＦ交換および溶質クリアランスの円滑化を担うという重要な役割に基づき、「グリンファティック系」と呼ばれている（実施例１）。これらの所見がもたらす１つの示唆として、グリンファティック経路機能に生じた変化は、ＡＤの前臨床段階で認められるＡβクリアランス不具合の原因となり得るが、一方、臨床的母集団を対象とするグリンファティック経路機能を測定する方法は、ＡＤ疾患への罹患のしやすさおよびその進行の評価を可能にし得ることが挙げられる。
【０２４９】
[00421]グリンファティック系の初期の特徴付けでは、マウスを対象として脳網羅的経路をマップ化し、溶質クリアランス効率を定量化するために、大槽内注射したＣＳＦトレーサーのｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査法およびｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法が利用された。これらのアプローチは、蛍光に基づく画像化法の光学的限界およびヒトへの大槽内注射と関連する複雑性を前提とすれば、臨床応用にそぐわない（Ｋｅａｎｅ、１９７３年）。臨床現場では、ダイナミック核イメージング手段、例えば陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）および磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）等が、自発性頭蓋内圧低下症（ＳＩＨ）および外傷後ＣＳＦ鼻漏または耳漏の診断において、ＣＳＦの流動をモニタリングするのに日常的に用いられている（Ｂｕｒｎｓ、２００８年、Ｄａｅｌｅら、２０１１年）。これらの画像化手段は、トレーサー分布について、空間的、時間的に高分解能を有する脳の時系列化三次元（３Ｄ）描写を可能にする。実施例２のフォローアップ前臨床試験では、ラットのグリンファティック経路機能を測定するために、ガドリニウムベースの造影剤の髄腔内注射を大槽内に行った後、造影磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）を利用し奏功した。
【０２５０】
[00422]大槽内注射とは対照的に、放射性トレーサーの腰部髄腔内注射は、ＳＩＨと関連した硬膜性の漏出、偽髄膜瘤、および脳表ヘモジデリン沈着症（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００２年、Ｈｏｘｗｏｒｔｈら、２０１２年）、ならびに外傷または腫瘍の場面における脊髄の完全性（Ｋａｐｉｌａ、１９８７年、Ａｄａｍｓら、１９８８年）を診断するのに、コンピュータ断層撮影法／ミエログラフィー、およびデジタル差分ミエログラフィーと共に現在用いられる。腰部髄腔内注射は、麻酔薬を送達する際に、日常の実践法で更に用いられ（Ｐｏｐｐｉｎｇら、２０１２年）、したがって造影剤にとって理想的な送達経路を提供するが、同造影剤は、次にヒトを対象としてグリンファティッククリアランスを評価するダイナミック造影ＭＲＩと併用して利用され得る。本前臨床試験では、腰部髄腔内ＣＳＦトレーサー送達は、脳のグリンファティック経路機能の評価を可能にするのかを評価する。ラット脳を対象として、大槽内および腰部髄腔内注射した蛍光トレーサーの流入キネティクスならびに実質内分布を比較する。データより、両経路を経由して注射したＣＳＦトレーサーは、実施例１において、マウスを対象にこれまでに行ったグリンファティック経路の特徴付けと整合するように傍血管腔を通じて脳に進入し、実質と交換することが実証される。これは、腰部髄腔内注射は、ヒトを対象とするグリンファティック機能を評価するための、臨床的に有望な造影剤送達経路であることを示す。
【０２５１】
[00423]方法
[00424]外科的な調製
[00425]メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２３０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、米国）をすべての実験で用いた。飼料および水を適宜与えつつ、ラットを標準検査室条件下で飼育した。すべての実験は、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ大学の動物資源に関する大学委員会による承認を受け、また国立衛生研究所のガイドラインに基づき実施した。ラットをイソフルラン（３％）で最初催眠し、次にペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。補足的なペントバルビタールナトリウムを必要に応じて投与した。大槽内注射の場合、麻酔したラットを定位固定フレームに固定し、大後頭孔を外科的に露出させ、そして３０ＧＡ針を大槽内に挿入した。腰部注射の場合、腰部脊柱を露出させ、Ｌ２−３椎弓切除を実施し、そして３０ＧＡ針をくも膜下腔に挿入した。
【０２５２】
[00426]トレーサー注射
[00427]本試験では、２つの異なる蛍光トレーサーを用いた：高分子量の固定可能型フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合デキストラン（５００ｋＤ、ＦＩＴＣ−ｄ５００；インビトロジェン）、および低分子量の固定可能型テキサスレッド結合デキストラン（３ｋ、ＴＲ−ｄ３；インビトロジェン）。トレーサーを０．２５％の濃度に人工ＣＳＦ内で構成した。大槽内および腰部注射の場合、３０分間注射群についてトレーサーを１．６μｌ／分の速度で注入し、一方、注射時間が６０分以上の場合、総容量が７０μｌになった時点で注射を止めた。注射開始後ｔ＝３０分、６０分、または１２０分の時点で、ラットをヘパリン添加した氷冷ＰＢＳで、その後４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中、４℃で一晩事後固定化し、そして５０μｍの冠状切片をビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）上で切り出し、そしてＤＡＰＩを含むＰＲＯＬＯＮＧ  Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ（インビトロジェン）でマウントした。
【０２５３】
[00428]免疫蛍光検査
[00429]浮動性免疫蛍光標識を、分離した一連の５０μｍスライスについて実施した。大槽内注射の場合、各動物、６０分時点に由来するスライス８片を用いた。腰部注射の場合、各動物、１２０分時点に由来するスライス８片を用いた。各注射経路を経由するＣＳＦトレーサー流入のピークに対応したので、これらの時点を選択した。スライスを、３％の通常のロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中にて、室温で１．５時間ブロックし、マウス抗−グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイトマーカー；１：１０００、ミリポア）中で、またはビオチン化されたＧｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂｒａｎｄｅｉｒａｅａ）ＳｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＩイソレクチンＢ４（Ｉｂ４、血管内皮マーカー；１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中にて、一晩、４℃でインキュベートした。２次検出を、マウス−抗ＧＦＡＰについて、Ｃｙ５結合ロバ抗マウス２次抗体（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、およびＩｂ４についてＣｙ５結合ストレプトアビジン（１：２５０、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて実施した。スライスを、２次抗体溶液中にて、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、すべてのスライスを、ＤＡＰＩを含むＰＲＯＬＯＮＧ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ（インビトロジェン）でマウントした。
【０２５４】
[00430]蛍光画像化
[00431]トレーサーの脳内への移動を、従来型の蛍光顕微鏡検査により測定した。全スライス３−チャンネルモンタージュを、１動物当たりスライス８片について、４倍の倍率で、Ｍｉｃｒｏｌｕｃｉｄａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）のＶｉｒｔｕａｌ  Ｓｌｉｃｅモジュールを用いて、モーター駆動式ステージを備えたアップライト型蛍光顕微鏡（オリンパス）上で作成した。これには、分離式のＤＡＰＩ、緑色（ＦＩＴＣ用）および赤色（テキサスレッド用）発光チャンネルが含まれた。ゲインおよび露出設定を未注射の対照スライスに基づき決定し、画像化セッション全体を通じて一定に維持した。実施例１に記載するように、スライス内のスライス蛍光（蛍光トレーサーの蓄積）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて定量化した。解剖学的脳対象領域（ＲＯＩ）を、皮質、白質（脳梁、内包および外包を含む）、皮質下構造（線条体、視床、視床下部）、および海馬について、ＤＡＰＩ発光チャンネルに基づき設定した。各チャンネルのバックグラウンド蛍光を、一様に差し引き、領域毎に平均ピクセル強度を測定した。脳実質全体にわたる高分子量および低分子量ＣＳＦトレーサー分布を、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（オリンパス）により高倍率で評価した。免疫蛍光標識スライスを対物レンズ倍率４０倍で画像化した。
【０２５５】
[00432]統計分析
[00433]すべての数値を平均値±ＳＥＭとして表した。個々の時点における差異を評価するために、ボンフェローニの事後検定を用いて２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、各時点においておよび注射経路について強度を比較した（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。「Ｐ」値＜０．０５は有意とみなした。
【０２５６】
[00434]結果および考察
[00435]実施例１のマウス試験では、二光子ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法を、「グリンファティック」系と呼ばれる、ＣＳＦの脳実質ＩＳＦとの交換を可能にする脳網羅的傍血管経路の存在を実証するのに用いた。これらの傍血管経路に沿ったＣＳＦ−ＩＳＦ交換は、アストログリアのアクアポリン−４水チャンネルに支援を受け、またこの経路を通じた液の移動は、可溶性Ａβを含む間質内溶質の脳からのクリアランスを促進した。本試験の目的は、グリンファティック経路機能が蛍光ＣＳＦトレーサーを腰部髄腔内注射した後でも同様に評価可能であるのかを評価することであった。マウスを対象に実施された実施例１とは対照的に、本試験では、成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを対象にグリンファティック流の特徴付けを行った。ラットを対象としてグリンファティックの流動に特徴付けを行うこの選択により、ヒト治療法の前臨床モデルとして当該技術分野で認められている齧歯類モデルについてグリンファティック機能の理解が深まる一方、腰部髄腔内注射の実施をより容易にするモデルへの移行も実現する。大槽内ＣＳＦトレーサー注射を、これまでに用いた注射経路（実施例１）と直接比較できるように並行して実施した。大槽内トレーサー注射による、マウスおよびラットを対象としたＣＳＦ−ＩＳＦ交換の画像化。
【０２５７】
[00436]大槽注射後の、髄腔内ＣＳＦ蛍光トレーサー（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）のラット脳実質内への移動について、特徴付けを行った。図２５Ａ〜Ｈでは、マウスおよびラットを対象として大槽内ＣＳＦトレーサーの流入およびクリアランスを評価した。テキサスレッド結合デキストランを大槽内注射した後の（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ；注射後ｔ＝３０分）、マウス脳由来（図２５Ａ、Ｃ）およびラット脳由来（図２５Ｂ、Ｄ）の代表的な前方（図２５Ａ〜Ｂ）および後方（図２５Ｃ〜Ｄ）冠状切片を示し、トレーサー分布は種間で類似することが明らかとなった。（図２５Ｅ〜Ｈ）組織蛍光を、異なる脳領域において評価した：前方脳（図２５Ｅ〜Ｆ）および後方脳（図２５Ｇ〜Ｈ）の皮質（青色）、白質（グレー）、海馬（マゼンタ）、および皮質下構造（赤色）。図２５ＦおよびＨは、各領域内の平均蛍光強度の定量結果を示す（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５；皮質に対して＃＃Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【０２５８】
[00437]図２５Ａ〜Ｄは、注射後３０分（蛍光強度がピークに達する時点）で固定され、ブレグマの０ポイントに対して１．１ｍｍおよび１．０ｍｍ前方、および１．５ｍｍおよび０．４ｍｍ後方でそれぞれ採取した、マウスおよびラット脳スライスに由来する代表的画像を示す。マウスを対象とした過去の試験（実施例１）と整合して、大槽内注射したＴＲ−ｄ３が、軟膜表面を横断し、また傍血管経路に沿った（図２５Ｂ、Ｄ）両経路でラット脳実質内に急速に移動することが認められ、脳の間質と広く置換した。異なる脳領域内へのトレーサーの移動を定量化するために、前方（図２５Ｅ〜Ｆ）および後方（図２５Ｇ〜Ｈ）の４対象領域を、皮質、白質、皮質下構造、および海馬（図２５Ｅ、Ｇは対象領域を示す）を含め定義した。全ｅｘ  ｖｉｖｏスライス内、または皮質、白質、もしくは皮質下構造内のＴＲ−ｄ３蛍光分析により、大槽内注射したＣＳＦトレーサーの流入は、注射後約３０分でピークに達し、それ以後の時点で、トレーサーが脳組織からクリアランスされるに従い、減衰を始めたことが明らかになった（図２５Ｆ、Ｈ；各時点ｎ＝３〜４匹の動物）。
【０２５９】
[00438]４つの異なる解剖学的領域間のトレーサークリアランス分析から示唆されたこととして、トレーサーの皮質下構造からのクリアランスは、皮質より迅速であったことが挙げられる（図２５Ｆ、Ｈ；皮質対皮質下＊Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ）。これは、皮質下領域は腹側脳表面から大口径貫通動脈に沿った最も大きなくも膜下ＣＳＦの流入を享受する（実施例１）、というこれまでの観察所見と整合する。更に、これらの領域は、内大脳静脈に沿って内側へと流出する傍静脈クリアランス経路に最も近接している。前方トレーサーの流動と後方トレーサーの流動を比較したとき、注射後３０分におけるピーク値および３０分〜１２０分の間のクリアランス速度のいずれも、前方脳と比較して後方脳の方が低かった（図２５Ｆ、Ｈを比較）。これらの観察所見は、前方貫通動脈に沿ったグリンファティックの流動は、その速さと量の両方において中間外側動脈、例えば中間大脳動脈等の分岐に沿った流動を上回った、ラットにおけるＭＲＩ所見と整合する（実施例２）。前方脳および後方脳の両方において、白質内のＴＲ−ｄ３蛍光強度は、すべての時点で皮質よりも有意に低かったが（図２５Ｆ、Ｈ；皮質に対して＃＃Ｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ）、一方、白質からのトレーサークリアランス速度は、その他の脳領域とは、一貫して異なるようには見えなかった。白質の蛍光強度変化は、灰白質と比較して白質の組織自己蛍光レベルが低いことに起因する可能性がある。あるいは、これは、過去の試験で認められたように、ＣＳＦトレーサーが皮質下白質内を貫通するレベルが低いことを反映する可能性がある（実施例１）。
【０２６０】
[00439]腰部髄腔内注射後のラットＣＳＦ−ＩＳＦ交換の画像化
[00440]図２６Ａ〜Ｆは、腰部髄腔内注射後の分子量が脳内へのトレーサー流入に及ぼす効果を示す。図２６Ａ〜Ｂは、腰部髄腔内同時注射後１２０分を経過した時点で、高分子量のＦＩＴＣ結合デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ５００、ＭＷ５００ｋＤ）、および低分子量のテキサスレッド結合デキストラン（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）の貫通を示す冠状脳スライスを表す。ＦＩＴＣ−ｄ５００は、主として傍血管腔に限定されるが（図２６Ｂ、矢印）、一方、ＴＲ−ｄ３は、傍血管腔（図２６Ａ、矢印）または軟膜表面（矢印頭部）から脳実質を通じて速やかに移動する。図２６Ｃ〜Ｆは、皮質、白質、皮質下構造、および海馬に解剖学的に細分化された、腰部髄腔内注射後の前方（図２６Ｃ〜Ｄ）および後方（図２６Ｅ〜Ｆ）脳内への蛍光トレーサーの流入量の定量を示す（皮質対皮質下構造＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１；皮質対白質＃＃Ｐ＜０．０１；皮質対海馬†Ｐ＜０．０５、††Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；各時点ｎ＝３〜４）。
【０２６１】
[00441]大槽内注射したＴＲ−ｄ３（図２５Ｆ、Ｈ）と比較して、腰部経路により送達されるＣＳＦトレーサーの流入は有意に遅延し、後方脳では注射後６０分で、また前方脳では注射後１２０分でピークに達した（図２５Ｆ、Ｈを図２６Ｃ、Ｅと比較する）。このＣＳＦトレーサー流入遅延のキネティクスは、２つの因子に起因する可能性がある。第１に、腰部注射部位から大槽までの距離は約３２ｍｍであった。第２に、脊髄くも膜下内のＣＳＦバルク流の主たる方向は、頭側から尾部方向であり（ＥｎｚｍａｎｎおよびＰｅｌｃ、１９９１年）、注入期間中、ＣＳＦトレーサーは、脳室内のＣＳＦ分泌に起因して生み出されたバルクＣＳＦ流に逆らって中間に位置する距離を横切らなければならないことが示唆される。蛍光ＣＳＦトレーサー流入の遅延に加えて、トレーサーが脳内に流入する全体的な流量は、大槽内注入と比較して腰部注入後では顕著に低下した。この差異は、脊柱に沿って生ずる末梢神経根経由のＣＳＦ再吸収の結果である可能性が最も高かった（Ｅｄｓｂａｇｇｅら、２００４年）。ＣＳＦトレーサーを腰部くも膜下腔内に注入し、これが脳に向かって吻側に移動すると、一部分が自然のＣＳＦクリアランス経路に沿って各脊椎分節沿いに失われ、その結果、脳網羅的なグリンファティック系への流入口を形成する脳周辺の大槽腔遠隔部へのトレーサーの送達が減少する（実施例１および２）。流入量およびキネティクスに認められるこれらの差異にもかかわらず、腰部および大槽内注射後のトレーサー分布は類似したパターンに従い、また脳実質全体に及んだ（図２５Ｂ、Ｄ、および図２６Ａを比較する）。これらの所見から、脳実質内への、およびこれを通じた蛍光髄腔内トレーサーの流入は、腰部経路経由で注射した後、容易に可視化され得ることが実証される。
【０２６２】
[00442]ラット腰部髄腔内トレーサーの流入は分子量とは独立している。
[00443]ＣＳＦは、バルク流プロセスを通じて脳室およびくも膜下コンパートメント経由で移動する（Ｃｓｅｒｒ、１９７１年、Ａｂｂｏｔｔ、２００４年、Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ、２００７年）。バルク流下では、溶媒の移動は、受動的拡散による溶質の移動よりも一般的に速いので、バルク流依存性の移動は、分子量とは概ね独立している（Ｃｓｅｒｒ、１９７１年）。髄腔内腰部トレーサーの脳実質への流入速度が、分子サイズに依存するのかを評価するために、高分子量の蛍光ＦＩＴＣ−ｄ５００（ＭＷ５００ｋＤ）、および低分子量のＴＲ−ｄ３（ＭＷ３ｋＤ）を同時注射した。この試験から得られた代表的な画像を図２６Ａ〜Ｂに示す。ＦＩＴＣ−ｄ５００およびＴＲ−ｄ３の脳実質内への移動を、前方および後方皮質、白質、皮質下構造、および海馬内で定量化すると、低分子量および高分子量のトレーサーのタイムコースまたは流入量のいずれについても、それらの間で有意差は認められなかった（図２６Ｃ〜Ｆ）。この所見は、蛍光トレーサーは腰部注射部位から脳くも膜下腔および傍血管腔に、単純な拡散によるのではなく、バルク流経由で移動することと一致する（Ｃｓｅｒｒ、１９７１年）。
【０２６３】
[00444]髄腔内ＣＳＦトレーサー流入の傍血管経路
[00445]マウスを対象とした過去の試験では（実施例１）、あらゆるサイズのＣＳＦトレーサーは、傍血管腔に沿って脳内に急速に移動したが、ＦＩＴＣ−ｄ２０００（ＭＷ２０００ｋＤ）等の高分子量のトレーサーは、傍血管腔にトラップされるようになり、脳の間質内に、およびこれを通じて自由に移動できないことが認められた。最近行われた１試験によれば、アストロサイトのエンドフィートのプロセスは、大脳の微小循環を完全に網羅する；傍血管腔とより広い脳の間質との間の唯一の経路は重複性のアストログリアエンドフィート間にある約２０ｎｍの間隙を経由する（Ｍａｔｈｉｉｓｅｎら、２０１０年）。血管周囲のアストロサイトエンドフィートは、大型の溶質が傍血管腔から脳の間質内に移動するのを制限する篩として機能するものと推察された（実施例１）。
【０２６４】
[00446]本実施例では、小型（ＴＲ−ｄ３）および大型（ＦＩＴＣ−ｄ５００）の蛍光ＣＳＦトレーサーについて、その傍血管流入経路と周辺の脳の間質との間の交換を評価するのに、共焦点顕微鏡を利用した。大槽内注射した動物および腰部注射した動物に由来するスライスを、注射後３０分および１２０分経過して、それぞれ固定した。これらの時点は、各注射経路について認められたピーク流入値に相当した（図２６Ａ〜Ｆおよび２７Ａ〜Ｌ）。
【０２６５】
[00447]図２７Ａ〜Ｌは、大槽内および腰部髄腔内注射後のＣＳＦトレーサーの局在を示す。図２７Ａ〜Ｌは、大槽内注射後３０分経過時点におけるＦＩＴＣ結合デキストラン（ＦＩＴＣ−ｄ５００、ＭＷ５００ｋＤ）およびテキサスレッド結合デキストラン（ＴＲ−ｄ３、ＭＷ３ｋＤ）の局在を示す。高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００は貫通動脈周辺の傍血管腔（矢印）に限定して残留し（図２７Ａ〜Ｂ）、また末端の毛細血管床レベルまで延在した（図２７Ｃ〜Ｆ、矢印）。低分子量のＴＲ−ｄ３は、脳の間質内に急速に移動し、またニューロンの部分母集団により取り込まれた（矢印）。図２７Ｇ〜Ｌは、トレーサーを腰部髄腔内注射した後１２０分経過して、高分子量のＦＩＴＣ−ｄ５００が血管周囲腔内に蓄積したが（矢印）、大槽内注射後に認められた時ほどには均一ではないことを示す。低分子量のＴＲ−ｄ３は、脳実質全体に速やかに移動した。ＧＦＡＰ：グリア線維酸性タンパク質（アストロサイトマーカー）；ＩＢ４：イソレクチンＢ４（血管内皮マーカー）。
【０２６６】
[00448]大槽内注射の後、ＦＩＴＣ−ｄ５００は軟膜表面を覆い、そして傍血管経路に沿って深部の脳組織内に分布し、末端の毛細血管床レベルまで延在した（図２７Ａ〜Ｆ）。ＦＩＴＣ−ｄ５００は、目立つほど傍血管腔から周辺の間質内に移動しなかった。腰部注射後にＦＩＴＣ−ｄ５００の分布を評価したとき、高分子量のトレーサーも、同様に傍血管腔に限定して残留したが（図２７Ｇ〜Ｌ）、しかし全体的な蛍光強度は、大槽内注射と比較して低下した。大槽内および腰部の両注射後に、低分子量のトレーサーは傍血管腔周辺の間質内に速やかに移動した（図２７Ａ〜Ｌ）。これらのデータから、ラットを対象に大槽内および腰部髄腔内の両注射を行った後、高分子量蛍光トレーサーは傍血管腔に沿って脳内に移動するが、この空間に限定して残留することが実証される。低分子量のＣＳＦトレーサーは、対照的に、脳の間質内に、およびこれを通じて移動することができる。
【０２６７】
[00449]結論
[00450]この前臨床試験から、３つの所見が実証される。
[00451]第１に、グリンファティック傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換を、ラット大槽内に蛍光ＣＳＦトレーサーを注射した後に評価したとき、脳内のトレーサー分布およびキネティクスは、マウスを対象としたこの傍血管経路の初期の特徴付けと一般的に一致する（実施例１）。
【０２６８】
[00452]第２に、脳内でのＣＳＦ−ＩＳＦの交換は、大槽内の経路に加えて、腰部経由で蛍光ＣＳＦトレーサーを注射した後、速やかに評価可能であることが認められた。
[00453]第３に、腰部髄腔内注入後、傍血管経路に沿った蛍光ＣＳＦトレーサーの移動は、バルク流に依存し、一方、蛍光トレーサーのこれら傍血管腔から周辺の脳の間質への移動およびこれを通じた移動は、トレーサーの大きさにより制限されることが判明した。
【０２６９】
[00454]実施例１は、脳網羅的傍血管経路について記載し、これに沿ったＣＳＦとＩＳＦの交換は、アミロイドβを含む間質内溶質の脳からのクリアランスを促進する。これらの提示所見から示唆されることとして、グリンファティック経路によるアミロイドβクリアランスの不具合は、アミロイドプラーク沈着の発現およびＡＤ進行の原因となることが挙げられる。これが正しい場合、患者のグリンファティック経路機能を臨床的に測定することができれば、ＡＤへの罹患のしやすさおよびその進行を評価する有効なアプローチを提供することになる。
【０２７０】
[00455]初期のグリンファティック経路の特徴付けを臨床現場に反映させるために、グリンファティック経路機能を評価するための臨床的に重要な画像化手段が利用可能である。実施例２の分析から、グリンファティック系は、造影ＭＲＩとこれに続く大槽内ガドリニウムベースの造影剤注射を用いて、ラットで評価可能であることが実証される。しかし、大槽内注射は、外傷性の組織損傷を含む医原性の合併症の可能性が高いことから臨床現場でほとんど用いられない（Ｋｅａｎｅ、１９７３年）。対照的に、腰部髄腔内送達経路は、ＣＴ−ミエログラフィー用の放射性トレーサー（Ａｄａｍｓら、１９８８年、Ｈｏｘｗｏｒｔｈら、２０１２年）、脊髄麻酔薬、および術後鎮痛薬（ＨｏｎｇおよびＬｅｅ、２００５年、ＧｅｈｌｉｎｇおよびＴｒｙｂａ、２００９年）、ならびに化学療法剤（Ｋｅｒｒら、２００１年）を投与するために日常的に採用されている。本実施例では、グリンファティック経路機能は、臨床的に重要な本経路を経由するトレーサー注射を用いて有効に評価可能であることが実証された。
【０２７１】
[00456]実施例３で引用した参考文献
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【実施例４】
【０２７２】
[00457]６．４．老化した脳から毒素を除去するための脳脊髄液（ＣＳＦ）分泌の復元または強化
[00458]脳脊髄液（ＣＳＦ）分泌、および脳脊髄液（ＣＳＦ）／間質液（ＩＳＦ）交換と関連した流れが正常であれば、代謝および毒素の老廃副産物は脳から除去される。この実施例は、老化した脳における脳脊髄液（ＣＳＦ）分泌の低下、および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）／間質液（ＩＳＦ）交換と関連した流れの低下を復元または強化することに関連する。これを実現するために、機械式ポンピングシステムをより迅速なクリアランスを促進するのに用いた。
【０２７３】
[00459]ヒト患者では、ＣＳＦ注入は、例えば側脳室またはくも膜下腔経由で実施される。アルツハイマー病（ＡＤ）は、このアプローチの主要な用途である。現在のところ、この致命的疾患の進行を遅らせる、または停止させる治療は存在しない。
【０２７４】
[00460]背景
[00461]哺乳動物の脳内に毒性の機能障害性タンパク質が蓄積すると、それはヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む多くの神経変性疾患と関連する。しかし、老化した脳内に毒素の蓄積を引き起こすメカニズムは、完全には知られていない。アルツハイマー病（ＡＤ）の場合、アミロイドβ（Ａβ）毒素の細胞外沈積である老人斑、および細胞内の神経原線維濃縮体（高リン酸化型タウ）が、２つの特徴として挙げられる。「アミロイドカスケード」仮説から示唆されることとして、ＡＤにおける認知機能低下および顕著な病原的特徴は、これら毒素の異常な蓄積と関連することが挙げられる（Ｓｅｌｋｏｅ、２００１年；Ｈａｒｄｙ、２００６年）。
【０２７５】
[00462]Ａβは、脳内の神経細胞を含む身体内の多くの細胞によりアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型のタンパク質から産生され、これは、プロテアーゼ、β−セクレターゼ、およびγ−セクレターゼにより切断されてＡβを生成する（Ｓｅｌｋｏｅ、２００１年）。正常な個体では、これらの毒素は低濃度で脳内に存在するが、ＡＤでは、これが蓄積し、その存在はＡＤ病因を開始させる主要なイベントである（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２年）。少数の症例では（＜１％）、Ａβの蓄積は、その過剰生成に起因するが（早期発症型のＡＤ）、一方、大部分の症例では、Ａβの蓄積は脳からの不完全なクリアランスに起因する（後期発症型のＡＤ）（Ｔａｎｚｉ、２００５年；Ｔａｎｚｉら、２００４年；Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａら、２０１０年）。脳内でＡβの濃度が高まると、神経毒性のＡβオリゴマー形成、ならびにシナプス性、神経炎性、およびニューロン性の進行性機能障害が生じる（ＭａｓｔｅｒｓおよびＳｅｌｋｏｅ、２０１２年）。Ａβペプチドは、脳実質および脈管構造におけるアミロイドβの主要な構成成分である（脳アミロイド血管障害）。老人斑から抽出されたＡβは、主にペプチドＡβ１−４０（Ａβ４０）およびＡβ１−４２（Ａβ４２）であるが、一方、血管アミロイドは、主にペプチドＡβ１−３９およびＡβ４０である。脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳内に存在するＡβの主要な可溶性の形態はＡβ４０である。可溶性Ａβは、ＣＳＦおよび脳間質液（ＩＳＦ）内で循環し、遊離ペプチドとして存在し得る、および／または異なる結合タンパク質（担体）、例えばアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）、アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ）、トランスチレチン、アルブミン、およびα２−マクログロブリン（α２Ｍ）等と関連し得る（Ｄｅａｎｅら、２００９年）。脳Ａβ濃度低下を唯一の根拠とする療法は、臨床試験ではこれまでのところ不成功に終わっている（Ｈａｒｄｙ、２００９年）。
【０２７６】
[00463]Ａβは、細胞の取り込みおよび分解、ＩＳＦバルク流、および血液脳関門（ＢＢＢ）−媒介型輸送を含む様々な経路を通じて脳ＩＳＦから取り除かれる（Ｄｅａｎｅら、２００９年）。グリンファティック系−ＣＳＦ／ＩＳＦ交換の巨視的な脳網羅的経路−は、Ａβを含む神経毒性の代謝副産物のクリアランスを促進する。グリンファティック系は、脳ＩＳＦの対流性の流れを制御し、また末梢リンパ系と同様に機能する。グリンファティック系は、主要な３経路を含む：（１）動脈周囲腔経由のＣＳＦ、（２）脳実質経由のアストロサイトアクアポリン４（ＡＱＰ４）依存型対流性脳ＩＳＦ流、および（３）静脈周囲のクリアランスによる流出。しかし、ＣＳＦは、貫通動脈に沿って急速に、また特異的に脳実質に進入するので、グリンファティック系は、必須化合物を脳網羅的に送達し、ならびに毒性化合物を除去するための流通経路としても機能し得る。また、グリンファティック系は、結合型および遊離型を含むすべての形態のＡβを脳から除去するメカニズムでもあり得る。
【０２７７】
[00464]老化した脳およびＡＤでは、ＣＳＦ分泌が低下している（Ｓｅｒｏｔら、２００３年）。ＣＳＦ分泌の低下は、齧歯類の脳ではＡβおよびタウの蓄積と関連する（Ｃｈｉｕら、２０１２年；Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、２０１０年）。軽度から重度のＡＤ患者を対象として、シャント経由でＣＳＦの継続的な排液を行っても、効果は得られなかった（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、２００８年）。
【０２７８】
[00465]この事例から、グリンファティック系を経由するＣＳＦの流れおよびＣＳＦ／ＩＳＦ交換を復元または強化し、また機械式ポンプまたは注入システムを使用すれば、毒性物質の脳からの除去が増加、強化、または復元され、したがって老化した脳におけるニューロン機能の喪失を防止し得ることが実証される。この系は、必須物質の脳への送達も復元し得る。グリンファティック系は、脳を網羅する基本的な系であるので、毒性物質の脳内蓄積と関連した多くの疾患に応用される。
【０２７９】
[00466]この事例では、人工ＣＳＦを、機械式注入システムを用いて、大槽内に低速度（０．１μＬ／分）で注入し、そして異なる時点（１５分、３０分、および６０分）における外因性の１２５Ｉ−Ａβおよび１４Ｃ−イヌリンの回収量を、その脳内注射後、ＣＳＦ注入前に測定した。ＡβはＡＤ関連ペプチドを代表するため、１２５Ｉ−Ａβを用い、またイヌリンは不活性分子であり、分子のバルク流に関するマーカーであるため、１４Ｃ−イヌリンを用いた。
【０２８０】
[00467]第２シリーズの実験では、ＣＳＦ注入速度は異なり（０．１μＬ／分、０．５μＬ／分、および１．０μＬ／分）、また１２５Ｉ−Ａβと１４Ｃ−イヌリンの回収量を、脳内注射後３０分経過して測定した。グリンファティック系は脳網羅的プロセスであることを示すために、１２５Ｉ−Ａβおよび１４Ｃ−イヌリンを２つの脳領域、尾状核および前頭皮質内に注射した。マウスにおけるＣＳＦ分泌の正常な速度は０．３７μＬ／分である（Ｏｓｈｉｏら、２００３年）。得られたデータから、グリンファティック系を経由するＣＳＦの流れおよびＣＳＦ／ＩＳＦ交換を復元または強化すれば、毒性物質の脳からの除去が復元されることが実証され、これから示唆されることとして、グリンファティック系を経由するＣＳＦの流れおよびＣＳＦ／ＩＳＦ交換を増加させることにより、老化した脳におけるニューロン機能喪失を遅延、抑制、減少させ、または防止することができることが挙げられる。
【０２８１】
[00468]方法
[00469]脳クリアランス試験
[00470]手短に述べると、麻酔したマウス（ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ））の右側尾状核被殻または前頭皮質内にステンレススチールガイドカニューレを定位固定的に埋め込んだ。尾状核被殻の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方０．９ｍｍ、側方１．９ｍｍ、および脳表面下方２．９ｍｍであった。前頭皮質の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方０．７ｍｍ、側方３．０ｍｍ、および脳表面下方１．３ｍｍであった。手術後、動物を回復するまで放置した。相当の慢性プロセスが生ずる前に実験を実施したが、報告に従い、大型の分子に対するＢＢＢの修復の時間を設けた（Ｄｅａｎｅら、２００４年）。
【０２８２】
[00471]トレーサー混合物の注射
[00472]１４Ｃ−イヌリン（０．０５μＣｉ、バルク流に対して不活性な分子）と共に、１２５Ｉ−標識Ａβ４０（１０ｎＭモノマー）を含有する模擬的なＣＳＦ（０．５μＬ）を、機械式注入システムを用いて５分間にわたり、脳ＩＳＦ内に微量注入した。かかる注入システムは、当該技術分野において周知されている。
【０２８３】
[00473]組織サンプリング
[00474]実験終了時に、放射能分析およびトリクロル酢酸（ＴＣＡ）分析用に、当該技術分野において公知の標準法を用いて脳を取り出し、調製した。
【０２８４】
[00475]放射能分析
[00476]ガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｚａｒｄ  γカウンター、パーキン・エルマー）内で１２５Ｉ−放射能を測定した。１４Ｃ−カウント計測の場合、サンプルを組織可溶化剤（パーキン・エルマー）０．５ｍｌ、一晩可溶化し、その後シンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ）５ｍｌを添加し、そして液体シンチレーション・カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２１００ＴＲ、パーキン・エルマー）内で分析した。
【０２８５】
[00477]計算
[00478]クリアランスパラメータの全計算を、本明細書ですでに開示された、およびＤｅａｎｅら、２００４年により開示された標準法を用いて実施した。手短に述べると、微量注射後、脳内に残留する放射能の割合（％）を、脳内回収率％＝１００×（Ｎｂ／Ｎｉ）として求めたが、但し式中、Ｎｂは実験終了時に脳内に残留する放射能であり、Ｎｉは脳ＩＳＦに注射した放射能であり、すなわち１４Ｃ−イヌリンの場合はｄ．ｐ．ｍ．、およびトリクロル酢酸（ＴＣＡ）−沈殿可能な１２５Ｉ−放射能の場合はｃ．ｐ．ｍ．である。イヌリンを代謝的に不活性な極性分子として用いたが、これはＢＢＢを通過して輸送されることも、また脳により保持されることもない；そのクリアランス速度は、ＩＳＦのバルク流の指標を提供する。
【０２８６】
[00479]結果
[00480]１２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを尾状核内注射した後に、ＣＳＦ注入速度が、これらの脳内回収率に及ぼす効果
[00481]１２５Ｉ−Ａβ４０（１０ｎＭ）および１４Ｃ−イヌリン（０．０５μＣｉ）を含有する少量（０．５μＬ）の模擬的なＣＳＦを尾状核に最初微量注射し、そして速やかにＣＳＦを大槽内に、０．１μＬ／分、０．５μＬ／分、または１．０μＬ／分で３０分間注入した。実験終了時に、脳を取り出し、放射能を分析した。図２８は、脳内に残留するＡβ４０およびイヌリンの濃度が、ＣＳＦ注入速度に応じて漸減したことを示す。脳のＡβ４０およびイヌリンクリアランスはＣＳＦ注入速度に応じて増加した。
【０２８７】
[00482]１２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを尾状核内注射した後に、ＣＳＦ注入が、これらの脳内回収率に及ぼす効果
[00483]図２９Ａ〜Ｂは、０．１μＬ／分のＣＳＦ注入速度の場合、Ａβ４０（図２９Ａ）およびイヌリン（図２９Ｂ）の尾状核内注射後、脳内に残留するそれらの濃度は、注入時間に応じて漸減したことを示す。したがってＡβ４０（Ａ）およびイヌリン（Ｂ）の脳クリアランスは、ＣＳＦ注入時間に応じて増加した。
【０２８８】
[00484]１２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを前頭皮質内注射した後に、ＣＳＦ注入時間が、これらの脳内回収率に及ぼす効果
[00485]図３０Ａ〜Ｂは、Ａβ４０およびイヌリンを前頭皮質内に注射し、そして０．１μＬ／分の速度で大槽内ＣＳＦ注入した後に、３０分（図３０Ａ）、および６０分（図３０Ｂ）経過したときの脳内に残留するＡβ４０およびイヌリンの濃度を示す。ＣＳＦ注入は、Ａβおよびイヌリンの脳からのクリアランスを高める。したがって、ＣＳＦのＣＳＦコンパートメント内注入は、毒性物質の老化した脳からのクリアランスを改善、増加、または復元するのに利用可能である。老化した脳内およびアルツハイマー病に罹患した個体の脳内では、ＣＳＦ分泌速度は低下するので、この流れおよびＣＳＦ／ＩＳＦ交換を復元することは、Ａβの蓄積を低減し、認知機能低下および／またはニューロン機能障害の発現を遅延、減少または防止するのに利用可能である。このアプローチは、あらゆる年齢依存性神経障害に適用される可能性を秘める。
【０２８９】
[00486]実施例４で引用した参考文献
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【実施例５】
【０２９０】
[00487]６．５．髄腔内２−デオキシ−２−（１８Ｆ）フルオロ−Ｄ−グルコース（１８ＦＤＧ）と併用した陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて、老廃物クリアランス機能に関する脳網羅的傍血管経路を評価する方法
[00488]この実施例では、常磁性造影剤および２つの異なる１８Ｆ−標識放射性同位体の髄腔内投与と併用したダイナミック一体型ＭＲＩ−ＰＥＴ画像化法を用いて、生きている齧歯類の脳内のグリンファティック輸送をマッピングする方法について示す。特定の実施形態では、そのような方法は、グリンファティック経路を経由する老廃物の臨床アリーナ内へのクリアランスを評価するのに用いられる。
【０２９１】
[00489]この実施例は、ヒトを対象としてこの技法を実施するのに利用可能である臨床プロトコールについても記載する。
[00490]６．５．１  ダイナミック一体型ＭＲＩ−ＰＥＴにより画像化した齧歯類脳内グリンファティック輸送
[00491]Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２〜３月齢のメス）をフェノバルビタールで麻酔し、そして腰部髄腔内カテーテルを留置した。９．４ＴマイクロＭＲＩ（ｒｅｆ）と併用したラット脳用の特注ＭＲＩ−適合型ＰＥＴスキャナーを用いて画像検査を実施した。９．４ＴマイクロＭＲＩ装置内で用いられるＰＥＴカメラは、別途詳細に記載されている（Ｒｅｆ）。手短に述べると、それは初期ＲａｔＣａｐ検出器（ｒｅｆ）の改変型であり、非磁性材料を用いて設計されている（ｒｅｆ）。ＰＥＴリング（ＩＤ３８ｍｍおよびラット頭部に合わせて調整）は、薄い反射性フォイルを用いて組み立てられ、マッチング非磁性Ｓ８５５０ＡＰＤアレイに連結した２．２２×２．２２×５ｍｍ３ルテチウムオキシオルトシリケート（ＬＳＯ）結晶の４×８アレイからなる１２個のディテクターブロックから構成される（ｒｅｆ）。ＰＥＴデータを、光ファイバー経由で外部の（ＰＣＩ）に基づくデータ取得ボードに転送する（ｒｅｆ）。ＰＥＴ／ＭＲＩ同時画像化用として、ＰＥＴリング内部に収まる特別注文のボリュームＲＦコイルを用いた。すべての実験で用いた９．４ＴマイクロＭＲＩは、超伝導水平中空磁石（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ９４／２０、４００  ＭＨｚ、Ｍａｇｎｅｘ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、これをＢｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｃｏｎｓｏｌｅにインターフェース接続し、Ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ５．０ソフトウエア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により制御する。磁石は、能動的遮蔽型併用式ＲＴ−ｓｈｉｍおよび２００ｍＴ／ｍの最大勾配磁場強度を生成し得る勾配磁場システム（Ｂ−ＧＡ  １２Ｓ）を備える。９．４Ｔ磁石は、磁石の中空部全長にわたり延在する特別設計のプラスチックサポート管も装備し、これはノイズ低減性の同心円状フォームライナー（この形状は、画像検査期間中に勾配磁場により生み出される振動に起因するノイズを低減する）により、勾配磁場とは隔離されている。サポート管は、ＰＥＴ−ＭＲＩ画像化で用いられる２つのその他のプラスチック管装置を収納するのに十分な大きさを有する；１つの管は、ＰＥＴリング内にＲＦコイルを固定するのに用いられ、また他方の管は、動物を磁石の中心に位置するＰＥＴ−ＭＲＩデバイス内に正確に配置するのに用いられる（図３１Ａ〜Ｃ）。
【０２９２】
[00492]Ｇｄ−ＤＴＰＡおよび１８Ｆでタグ化された同位体からなる混合物を髄腔内注入（総容量：６０μｌ）する期間中およびその後に、ラットを背臥位で画像検査した。ダイナミックＭＲＩおよびＰＥＴ画像を同期させて取得した；３次元Ｔ１−重み付けＦＬＡＳＨシーケンス（ＴＲ＝１５ｍｓｅｃ、ＴＥ＝３．８ｍｓ、ＮＡ＝１、ＦＯＶ＝３．０×３．０×３．２ｃｍ、スキャニング時間＝４．１分、画像分解能０．１２×０．１２×０．１３ｍｍ）、およびｓｉｎｇｌｅｓ  ｌｉｓｔｍｏｄｅ、空間的分解能１．２ｍｍでのＰＥＴ取得を含む。Ｇｄ−ＤＴＰＡ（２０．８ｍＭの人工ＣＳＦ溶液）と混合した２つの異なる１８Ｆでタグ化された同位体を試験した：ｉ）０．５ｍＣｉ［１８Ｆ］フッ化物、およびｉｉ）０．５ｍＣｉ  ２−デオキシ−２−（１８Ｆ）フルオロ−Ｄ−グルコース（１８ＦＤＧ）。ＭＲＩデータをこれまでの記載に従い再構成した（ｒｅｆ）。ＰＥＴデータを、反復、期待値最大化による最大尤度（ＭＬＥＭ）アプローチを用いて再構成し、これには、減衰およびライブタイムについて最終補正が含まれた。ＰＥＴ−ＭＲＩ画像の融合を実行、標準化し、そしてセグメント化されたラット脳アトラステンプレート（ＰＭＯＤ）に登録した。
【０２９３】
[00493]実験結果を図３２Ａ〜Ｆに示し、髄腔内１８ＦＤＧは、図３２Ｄに示すような脳網羅的グリンファティック経路を通じて急速に移動することが実証され、１８ＦＤＧの時間−活性曲線は脳主要領域についてほぼ同一であることを示す。対照的に、ＤＴＰＡおよび１８Ｆは、若干の「制限」を受けつつグリンファティック経路を通じて移動する。これらのデータは、髄腔内投与された１８ＦＤＧは、グリンファティック経路機能について迅速で、定量的、および過渡的な推定を提供し得る、という原理証明を提供する。髄腔内投与された１８ＦＤＧのこれらの特性は、１８ＦＤＧを臨床応用にとって理想的なものにしている。
【０２９４】
[00494]６．５．２  ヒト脳におけるグリンファティック輸送を評価する臨床プロトコール
[00495]前臨床データセクション（上記セクション６．５．１）で提示したアプローチを、以下のようにヒトに変換した。段階的なトライアルを実施する。第1ステップでは、放射性核種槽造影を受けるヒト患者に髄腔内注射した（日常的な方法を使用）１１１−Ｉｎ  ＤＴＰＡの脳の取り込みについて、ＳＰＥＴ−ＣＴを併用して試験する。第２ステップでは、ヒト患者を対象として髄腔内注射した１８ＦＤＧを同様に試験する。この目的のために髄腔内１８ＦＤＧを使用する長所として、下記事項が挙げられる：
[00496]グリンファティック経路を経由する取り込みおよび輸送が、ＤＴＰＡと比較してかなり迅速に生ずる；これは試験を促進する。
【０２９５】
[00497]１８ＦＤＧがヒト患者を対象とする脳槽造影法に有効な場合、それは、複数の臨床現場、例えば正常圧水頭症（ＮＰＨ）、脳脊髄液（ＣＳＦ）漏出の評価、およびＡＤ罹患リスクを有する患者を対象としたグリンファティック老廃物クリアランスの評価で診断的に利用可能である。
【実施例６】
【０２９６】
[00498]６．６．脳網羅的グリンファティック経路機能は、老化した脳では障害を有する。
[00499]この実施例では、脳網羅的グリンファティック経路機能が、老化した脳では障害を有することを示す。
【０２９７】
[00500]図３３Ａ〜Ｆ。グリンファティック傍血管ＣＳＦ流入は、老化した脳では障害を有する。（Ａ）傍血管ＣＳＦ流入を、麻酔したマウスの皮質において、ｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査により評価した。大脳脈管構造を動脈内テキサスレッドデキストラン（７０ｋＤ、ＴＲ−ｄ７０）により規定し、また皮質動脈（矢印）および皮質静脈（矢印頭部）を形態学的に規定した。１０μｌの蛍光ＣＳＦトレーサー（ＦＩＴＣ結合デキストラン、４０ｋＤ；ＦＩＴＣ−ｄ４０）を大槽内に注射し、一方、傍血管トレーサー流入を、閉鎖頭蓋窓を作成して可視化した。（Ｂ）皮質表面下方１００μｍの皮質内への傍血管ＣＳＦ流入を定量化すると、若年（２〜３月齢）の脳と比較して、老年（１２カ月）の皮質内への傍血管ＣＳＦ流入速度は有意に低下することを示す（１２カ月対２〜３カ月＊Ｐ＜０．０５；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。（Ｃ〜Ｄ）ＣＳＦトレーサーが最初に大脳表面動脈に沿って皮質に進入するときの（Ｃ１〜Ｃ６）、次に貫通細動脈に沿ってＣＳＦトレーサーが周辺間質内に移動する際の、但しこの場合皮質表面下方１００μｍにて画像化した（Ｄ１〜Ｄ６）、ＣＳＦトレーサーの代表的な連続画像。（Ｅ〜Ｆ）最初に大脳表面脈管構造の傍血管腔に沿ったＣＳＦトレーサーの移動（Ｅ１〜Ｅ６）、ならびにその皮質間質内への移動（Ｆ１〜Ｆ６）が低速化していることを示す、ＣＳＦトレーサーが老年マウス（１２カ月）の皮質内に進入する際の代表的な連続画像。これらのデータから、グリンファティック経路機能は老年のマウス皮質において劇的に低下していることが実証される。
【０２９８】
[00501]図３４Ａ〜Ｅ。脳網羅的グリンファティック経路機能は、老化した脳では障害を有する。麻酔したマウス脳について、ｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像化法により、グリンファティック経路機能を評価した。（Ａ）２つの異なる蛍光ＣＳＦトレーサー（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３；オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）を大槽内に同時注射した。３０分後、動物を潅流固定し、ビブラトーム上で脳をスライスし、そして２チャンネル従来型蛍光顕微鏡検査により冠状切片を画像化した。（Ｂ）ＣＳＦトレーサー流入量の定量化により、若年（２〜３カ月）マウスの脳と比較して老年（１８カ月）マウスの脳では、低分子量のＴＲ−ｄ３および高分子量のＯＡ−６４７の流入のいずれも、有意に障害を有したことから、グリンファティック経路機能について加齢性の障害が明らかにされた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝５〜８）。中年（１０〜１２カ月）の脳内へのＣＳＦトレーサーの流入は、若年の脳と老年の脳との中間であった。（Ｃ〜Ｅ）２〜３カ月（Ｃ）、１０〜１２カ月（Ｄ）、および１８カ月（Ｅ）の脳について、それらの間の蛍光ＣＳＦトレーサー流入の相違を示す代表的な画像から、加齢と共に、特に軟膜表面からの距離の増加と共に、顕著なトレーサー流入障害を示す。
【０２９９】
[00502]図３５Ａ〜Ｊ。部位特異的加齢性グリンファティック経路機能障害。麻酔したマウス脳について、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー流入のｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像化法により評価した。低分子量（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ３ｋＤ、ＴＲ−ｄ３）、および高分子量（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ６４７、ＭＷ４５ｋＤ、ＯＡ−６４７）トレーサーを大槽内に注射し、そして３０分後に動物を潅流固定した。矢状断面（Ａ、Ｃ）および冠状（Ｂ、Ｄ）のスライスについて、核染色剤ＤＡＰＩで対比染色し、これを対象として蛍光ＣＳＦトレーサーの流入を評価した。脳全体にわたるＣＳＦトレーサー流入の評価から、老年脳内の部位間で、加齢性のグリンファティック経路障害に対する易罹患性が顕著であることに加えて、若年脳内の部位間で、ＣＳＦ流入に相違が認められることが明らかになった。（Ｅ〜Ｊ）前方（Ｅ）および後方（Ｈ）の脳の両方を、対象部位についておおまかな部分に分割し、ＯＡ−６４７の流入を部位毎に評価した。一般的に、グリンファティック経路機能は、若年（２〜３カ月）の皮質と比較して、老年（１８カ月）の皮質で最も劇的な障害を有し、前方皮質（Ｆ）と比較して後方皮質（Ｉ）においてより多くの減弱が認められた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。比較の際、グリンファティックＣＳＦの皮質下部位内への流入は、皮質において認められた流入と比較して割合的に少なかったが、一方、この皮質下部位内の加齢性の障害は同様に減衰した（Ｇ、Ｊ）。
【０３００】
[00503]図３６Ａ〜Ｂ。老年の脳における間質内アミロイドβのクリアランス障害。
[00504]間質内溶質の老化した脳からのクリアランスを、放射性トレーサークリアランスアッセイ法により評価した。（Ａ）痕跡量の放射能標識１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンを、若年（２〜３カ月）、中年（１０〜１２カ月）、および老年（１８カ月）の麻酔したマウスの尾状核内に同時注射した。１時間後、動物を絶命せしめ、脳を採集し、そして脳組織内の残留放射能をガンマ粒子カウント法および液体シンチレーションカウント法により定量化した。（Ｂ）老年の脳では、１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンの両方のクリアランス速度は、若年の脳におけるクリアランスと比較して有意に低下した（若年の脳に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝８）。１２５Ｉ−アミロイドβ１−４０および１４Ｃ−イヌリンの中年の脳からのクリアランスは、若年の脳と老年の脳とのクリアランスの中間であった。これらのデータから、間質内アミロイドβクリアランス機能を含むグリンファティック経路機能は、老化した脳では顕著に低下していることが実証される。
【０３０１】
[00505]図３７Ａ〜Ｅ。大脳動脈の拍動は、老化した脳では低下する。
[00506]大脳血管の拍動性を、麻酔したマウスについてｉｎ  ｖｉｖｏ二光子顕微鏡検査により評価した。（Ａ〜Ｂ）大脳の脈管構造を蛍光テキサスレッド結合デキストラン（７０ｋＤ）を動脈内注射することにより可視化した。大脳の表面動脈と静脈（Ａ）、および貫通動脈と上行静脈（Ｂ）を形態学的に識別した。（Ｂ）の挿入図は、実験用に画像化したＸＹＺ容積の直交するＸＺとＹＺの投影図を示す。（Ｃ〜Ｄ）大脳の表面動脈と静脈、貫通動脈と上行静脈を、高周波数ラインスキャニングにより、識別および画像化した。得られたＸ−ｔ（時間）プロットについて閾値を設けてコントラストを改善し、各心周期に起因する管腔径の変化を測定できるようにした。血管の「拍動性」と呼ばれるパラメータを規定するために、血管径の変化を３秒間隔で平均管腔径について積分した。（Ｅ）貫通動脈について測定された拍動性は、若年（２〜３カ月）の脳と比較して老年（１８カ月）の脳では低下した（１群当たりｎ＝２〜４）。脳血管ツリーのその他の要素には、明らかな相違は認められなかった。これらのデータから、グリンファティック経路機能の駆動力の１つである、動脈の拍動性が老化した脳では低下していることが実証される。
【０３０２】
[00507]図３８Ａ〜Ｄ。老化しても、皮質細胞外容量分画に変化がないが、屈曲度は変化する。
[00508]拡散パラメータ（細胞外容量分画、α；屈曲度、λ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏの覚醒時皮質および麻酔時皮質について、これまでの記載に従い、ｉｎ  ｖｉｖｏテトラメチルアンモニア電気生理学により評価した（Ｘｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３年、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。（Ａ〜Ｂ）老年（１８カ月）と若年（２〜３カ月）との脳の間で、細胞外容量分画に相違は認められなかった（Ａ）；一方、覚醒時脳と比較して睡眠時脳では、細胞外腔の顕著な拡大が、老年の脳では不変のままであった（Ｂ）（覚醒時対睡眠時＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝９〜２０）。（Ｃ〜Ｄ）若年皮質に対して老年の皮質を比較した場合、覚醒時または睡眠時の屈曲度のいずれにおいても全体的な相違は認められなかったが（Ｃ）、老化した脳では、屈曲度の数値について、睡眠時−覚醒時の関連性に変化が認められた（Ｄ）。若年の脳では、屈曲度の数値は、覚醒状態と睡眠状態との間で異ならなかった。対照的に、老年の脳では、睡眠が開始すると、これに伴い細胞外屈曲度が有意に増加した（覚醒時対睡眠時＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝９〜２０）。これらのデータから、脳細胞外空間の構成（物質的および空間的の両方において）は、老年の脳で変化しており、これが老化した脳に認められるグリンファティック経路機能障害の原因であり得ることが実証される。
【０３０３】
[00509]図３９Ａ〜Ｆ。老年の脳における血管周囲のＡＱＰ４発現の変化。
[00510]皮質内ＡＱＰ４およびＧＦＡＰの発現の変化を、免疫蛍光２重標識法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。（Ａ〜Ｂ）代表的な画像から、若年の脳（２〜３カ月）では、ＡＱＰ４の発現は、血管周囲のアストロサイトエンドフィートにほぼ排他的に限定されることを示す（矢印）。老化した皮質（１８カ月）では、ＡＱＰ４の局在が変化して、厳密には血管周囲に該当しない、微細なアストロサイトプロセス（矢印頭部）を含むようになる。（Ｃ）エンドフィートドメインにおけるＡＱＰ４発現量を定量化すると、老年の脳では、血管周囲のＡＱＰ４発現について、大型の大脳血管周辺で若干の減少が認められたが、大脳の毛細血管周辺では認められないことを示す（１８カ月対２〜３カ月＊Ｐ＜０．０５、ｔ−検定；１群当たりｎ＝４）。（Ｄ）対照的に、ＡＱＰ４の局在は、老年の脳では劇的に変化する。若年の脳では、ＡＱＰ４の偏在は非常に顕著であり、低レベルのＡＱＰ４発現が、血管周囲のエンドフィートにおいてのみ保持される。老年の脳では、グローバルなＡＱＰ４発現がわずかに増加するが、一方、大型の大脳血管の直近周辺部位において、ＡＱＰ４の大幅な増加が認められる。したがって、老年の脳では、大型の大脳血管周辺のＡＱＰ４について、その厳密な血管周囲の偏在が失われる一方、微小血管における偏在は、概ね不変のままである。（Ｅ）かかる特異性は、反応性のアストログリオーシスのマーカーであるＧＦＡＰでは認められない。老年の脳では、血管周囲におけるＧＦＡＰの発現は、大型の大脳血管周辺および大脳の微小血管周辺のいずれにおいても有意に増加した（１８カ月対２〜３カ月＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｔ−検定；１群当たりｎ＝４）。（Ｆ）同様に、ＧＦＡＰの発現を空間的に評価すると、ＧＦＡＰ発現量の増加が皮質全体を通じて認められ、また大血管と微小血管との間において、ＧＦＡＰ発現量の相違は認められない。
【０３０４】
[00511]図４０Ａ〜Ｃ。ＡＱＰ４の発現量および偏在における局所的相違。
[00512]ＡＱＰ４発現量（Ａ）、ＡＱＰ４の偏在（Ｂ）、およびＧＦＡＰの発現量（Ｃ）の変化を、免疫蛍光２重標識法、レーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法、およびこれまでに定義された画像分析アプローチ（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年；Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年）により、前方および後方の脳スライス内の規定された対象領域全体にわたり評価した。（Ａ）カラー強度マップは、２〜３カ月および１８カ月の脳について局所的な平均ＡＱＰ４免疫蛍光強度を表す。各部位についてＡＱＰ４発現量を定量化すると、若年の脳と老年の脳との間でＡＱＰ４発現量に有意な変化は認められない。（Ｂ）ＡＱＰ４の「脱偏在」は、血管周囲で認められるＡＱＰ４免疫反応性以上のＡＱＰ４免疫蛍光を有する組織部位として定義する（より詳細な説明は、Ｒｅｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２０１３年に記載）。したがって、より高い数値は、血管周囲におけるＡＱＰ４の偏在喪失、またはＡＱＰ４の「脱偏在」を反映する。カラー強度マップに示す通り、老年の脳でＡＱＰ４の偏在につき、顕著な喪失が生じた。偏在の有意な喪失は、皮質および皮質下構造全体を通じて明白であった（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。（Ｃ）ＧＦＡＰの発現量を、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトプロセスのエリアカバー率に基づき評価した。カラー強度マップでは、老年の脳におけるＧＦＡＰカバー率の増加を示す。このような変化は、皮質において最も顕著であったが、皮質下構造でも認められた（２〜３カ月に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４）。
【０３０５】
[00513]図４１Ａ〜Ｉ。ＡＱＰ４の偏在は、皮質グリンファティック経路機能の重要な決定要素である。
[00514]反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の偏在、およびグリンファティック経路機能（大槽内注射したＣＳＦトレーサーの流入）の間の相互関係を、前方および後方の異なる脳部位全体を通じて評価した。オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−６４７（ＯＡ−６４７、ＭＷ４５ｋＤ）を、動物に大槽内注射した。３０分後に動物を固定し、脳をスライスした。前方および後方の脳スライスを、ＡＱＰ４およびＧＦＡＰについて免疫蛍光２重標識法により標識した。前方および後方の脳全体にわたり、異なる対象部位において、ＯＡ−６４７の流入（Ａ）、ＡＱＰ４の発現（Ｂ）、ＡＱＰ４の脱偏在（Ｃ）、およびＧＦＡＰの発現（Ｄ）を評価した。（Ａ〜Ｄ）カラー強度マップは、月齢２〜３カ月と月齢１８カ月の間で、グリンファティックＯＡ−６４７流入、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の脱偏在、およびＧＦＡＰの発現について、これらの相対的増加量（赤色の数値）と減少量（青色の数値）を表す。これは、上記図４０Ａ〜Ｃのカラム形式で提示したデータの図形表現である。（Ｅ〜Ｉ）各部位におけるＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の脱偏在、およびＧＦＡＰの発現の間の関連性を、２〜３カ月および１８カ月の数値をプーリングして評価し、次に対をなすＯＡ−６４７／ＡＱＰ４の発現、ＯＡ−６４７／ＡＱＰ４の脱偏在、およびＯＡ−６４７／ＧＦＡＰの発現の数値について線形回帰分析を行った。近似曲線と共に最も強い関連性を各図に示し、また対応するｒ２およびＰ値（スロープがゼロでない場合）を提示する。（Ｅ）皮質では、ＡＱＰ４の偏在の変化がグリンファティック経路機能と最も強く関連し、ＡＱＰ４の脱偏在は、グリンファティックＣＳＦトレーサー流入障害と強い対応性を有した。（Ｆ）海馬内では、グリンファティック経路機能、ＡＱＰ４の発現、ＡＱＰ４の偏在、またはＧＦＡＰの発現の間で強い関連性は明確には認められなかった。（Ｇ〜Ｉ）線条体、外側中隔核、視床、および視床下部内では、ＡＱＰ４の発現（偏在ではない）がグリンファティック経路機能と最も強く関連した。興味深いことに、これは正の相関であり、これらの部位内のＡＱＰ４の発現量の増加は、グリンファティックＣＳＦ流入量の増加と関連した。これらのデータから、血管周囲におけるＡＱＰ４の偏在は、大脳皮質における傍血管ＣＳＦ流入の重要な決定要素であるが、一方、皮質下組織では、グローバルなＡＱＰ４発現が、グリンファティック経路機能のより重要な決定要素であり得ることが実証される。
【０３０６】
[00515]図４２Ａ〜Ｆ。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、血管周囲アストロサイトのエンドフィートにおいてＡＱＰ４の偏った局在の喪失を引き起こす。
[00516]（Ａ）中等度のＴＢＩを有するマウスモデルを示す概略図。マウスをイソフルランで短時間麻酔し、糸でその門歯により懸架し、そして較正済の側頭部打撃をニューマチック制御式皮質打撃デバイスにより加える。動物を下敷パッドに落下させ、速やかに麻酔から覚醒させる。（Ｂ〜Ｆ）ＴＢＩ後２８日経過して、免疫蛍光２重標識法およびレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により、ＡＱＰ４の局在およびＧＦＡＰの発現を評価する。全スライスモンタージュに示す通り（Ｂ〜Ｃ）、反応性のアストログリオーシスが持続する部位は、ＴＢＩ後２８日間経過しても、同側の側頭皮質内に留まる。高倍率対物レンズ下でＡＱＰ４の局在を評価すると、対照皮質（Ｄ）をＴＢＩ後の対側皮質（Ｅ）と比較したとき、ＡＱＰ４局在は主に血管周囲のアストロサイトエンドフィート（矢印）に限定したままなので、ＡＱＰ４の偏在の明らかな変化は認められない。同側皮質（Ｆ）では、ＧＦＡＰ−陽性反応性アストロサイトが示すＡＱＰ４の偏在の喪失は顕著であり、ＡＱＰ４の発現は、微細なプロセスと大脳血管周囲のプロセス（矢印）との間で均等に分布している。これらの所見は、血管周囲のＡＱＰ４の偏在について、ＴＢＩがその慢性的な喪失を引き起こすことを実証している。
【０３０７】
[00517]図４３Ａ〜Ｊ。間質内溶質のグリンファティッククリアランスは、ＴＢＩ後慢性的障害を有する。
[00518]（Ａ）傍血管ＣＳＦ−ＩＳＦ交換を、ＴＢＩ後１日、３日、７日、および２８日経過時点での、ＣＳＦトレーサー（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−５５５）の大槽内注射により評価した。（Ｂ〜Ｆ）Ｅｘ  ｖｉｖｏ全スライス蛍光画像検査から、注射後３０分において評価した傍血管ＣＳＦ流入は、ＴＢＩ後７日経過して劇的に減少したことを示す。興味深いことに、片側性の外傷性損傷であるにもかかわらず、グリンファティック流入の減少が両側において認められた。皮質内へのトレーサー流入の定量（Ｇ）から、ＴＢＩがＣＳＦ流入に及ぼす効果は損傷後７日目にピークに達するが、しかし有意なグリンファティック機能障害は損傷後２８日間継続することを示す（対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝５〜１２匹の動物）。ＣＳＦ流入障害は、皮質において両側に認められるが、障害は、同側皮質において最大である。（Ｈ）ＴＢＩが皮質からの間質内溶質のクリアランスに及ぼす効果を、損傷後７日目に評価した。放射能標識３Ｈ−マンニトール（ＭＷ１８２Ｄａ）のクリアランス（Ｉ）、および１４Ｃ−イヌリン（ＭＷ約５ｋＤａ）のクリアランス（Ｊ）を、対側の前頭皮質内注入後６０分経過して測定した。野生型マウスでは、ＴＢＩは、３Ｈ−マンニトールおよび１４Ｃ−イヌリンの両方のクリアランスを有意に減少させる（Ｓｈａｍに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝６匹の動物）。Ａｑｐ４−／−マウスについて実施したクリアランス試験から、ＴＢＩ後の溶質クリアランス障害は、Ａｑｐ４遺伝子欠損により悪化することが示唆された（ＷＴに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝６匹の動物）。これらのデータから、間質内溶質クリアランスを含むグリンファティック経路機能は、ＴＢＩ後に、顕著で慢性的な障害を有することが実証される。
【０３０８】
[00519]図４４Ａ〜Ｅ。傍血管経路に沿って脳からクリアランスされた間質内タウ。
[00520]Ａ）組換えヒト単量体タウ（ｈタウ）を、大脳血管平滑筋および周細胞においてＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質を発現するＮＧ２−ＤｓＲｅｄ遺伝子組換えマウスの皮質内に注射した。（Ｂ〜Ｅ）脳を経由する間質内ｈタウの移動を、注射後３０分経過して、免疫蛍光検査とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査により評価した。ｈタウは、注射部位から拡散的に移動し（Ｂ）、毛細血管基底板に沿って蓄積した（Ｃ）。蛍光強度投影図は、周辺間質コンパートメントに関連するこれらの空間にｈタウが蓄積することを示す。（Ｄ〜Ｅ）注射後３０分経過して、ｈタウは脳間質経由で急速に移動して、第三脳室ルーフ内の大型の内大脳静脈を取り巻く傍血管腔に到達した。これらのデータは、可溶性の間質内タウは、脳網羅的グリンファティック系の傍血管経路に沿って脳からクリアランスされることを実証している。
【０３０９】
[00521]図４５Ａ〜Ｃ。ＡＱＰ４の免疫反応性は、Ａｑｐ４−／−マウスには存在しない。
[00522]本試験で使用される抗−ＡＱＰ４一次抗体の特異性を確保するために、発明者らは、損傷後７日目に灌流したＡｑｐ４−／−マウスに由来する対照脳およびＴＢＩ処理脳の免疫標識を実施した。ＧＦＡＰの発現は、対照（Ａ）、対側ＴＢＩ（Ｂ）、および同側ＴＢＩ（Ｃ）の各皮質において容易に検出可能であったが、ＡＱＰ４の免疫反応性は検出不能であった。
【０３１０】
[00523]図４６Ａ〜Ｃ。Ａｑｐ４遺伝子が欠損しても、ＴＢＩ病変容積は変化しない。
[00524]Ａｑｐ４遺伝子欠損が外傷性病変容積に及ぼす効果を、ＴＢＩ後２８日目に採集された脳について評価した。（Ａ〜Ｂ）脳を連続的にスライスし、そして脳の構造をＨ＆Ｅ染色法により評価した。赤色矢印は、外傷性打撃部位および最大皮質損傷領域を示す。同側および対側の皮質領域を切片毎に測定し、次に皮質容積を導出するために、連続したスライスを積分した。皮質容積を、対側容積（Ｃ）に対する比として表す。野生型マウスとＡｑｐ４−／−マウスとの間で、同側病変容積に有意差は認められなかった。
【０３１１】
[00525]図４７Ａ〜Ｆ。Ａｑｐ４遺伝子が欠損すると、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行を悪化させる。
[00526]Ａｑｐ４遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。（Ａ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−脳を損傷後２８日目に採集し、そしてリン酸化タウ（Ｐ−タウ）エピトープの存在について調べた。マウス遺伝子型（野生型とＡｑｐ４−／−）、損傷状態（ｓｈａｍとＴＢＩ）、および半球（対側（Ｃ）と同側（Ｉ））が、異なるタウリン酸化エピトープを標的とする様々なＰ−タウモノクロナール抗体による標識に及ぼす効果を示す代表的なブロットを提示する。総タウも測定し（Ｐａｎ−タウ）、すべてのＰ−タウレベルを、各生体試料内のＰ−タウレベルに標準化した。（Ｂ〜Ｆ）すべてのエピトープの中でも、ＴＢＩは、Ｐ−タウ標識を、特に同側の側において増加させる傾向を有した。同様に、標識は、ＴＢＩ後の野生型マウスと比較して、ＴＢＩ後のＡｑｐ４−／−マウスにおいてより強い傾向を有した。特に、ｐＴｈｒ２３１およびｐＳｅｒ３９６Ｐ−タウエピトープを認識する抗体は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスにおいてＰ−タウ標識の有意な増加を示した（††Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍに対して†Ｐ＜０．０５、†††Ｐ＜０．００１；野生型ＴＢＩに対して‡Ｐ＜０．０５；野生型ｓｈａｍに対して＊Ｐ＜０．０５；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；1元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。これらのデータから、グリンファティック経路機能は、ＴＢＩ単独の場合に認められる以上の障害を有するとき、慢性的なタウ凝集が促進されることが実証される。
【０３１２】
[00527]図４８Ａ〜Ｆ。グリンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後のタウ凝集を促進する。
[00528]（Ａ）Ａｑｐ遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、ＴＢＩ後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−のマウスにＴＢＩを加え、リン酸化タウ（Ｐ−タウ）の蓄積を、損傷後２８日目に免疫蛍光検査法およびウェスタンブロット（図４７Ａ〜Ｆに提示）により評価した。（Ｂ〜Ｄ）ＡＴ８  Ｐ−タウ抗体（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５エピトープに対して特異的）およびニューロンマーカーＮｅｕＮによる２重標識から、野生型皮質では、Ｐ−タウ免疫反応性は認められないことが示された。Ａｑｐ４−／−皮質では、ニューロン体（矢印）内、および周辺神経突起（矢印頭部）内の両方で、顕著なＰ−タウ標識が認められた。（Ｅ〜Ｆ）Ｐ−タウ染色の定量から、ＴＢＩ後２８日目に、Ａｑｐ４−／−マウスの同側皮質内、および少なめではあるが基底線条体内で、Ｐ−タウ免疫反応性が顕在化したことが明らかにされた。これらのデータから、ＴＢＩ後のグリンファティック経路機能障害は、タウ凝集、およびニューロン内および神経外の両方においてＰ−タウの沈着を促進することが実証される。
【０３１３】
[00529]図４９Ａ〜Ｌ。グリンファティック経路機能障害は、ＴＢＩ後の神経炎症を遷延させる。
[00530]Ａｑｐ４遺伝子欠損が、ＴＢＩ後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。（Ａ〜Ｆ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスにＴＢＩを加え、反応性のアストログリオーシス（ＧＦＡＰの発現）およびマイクログリオーシス（Ｉｂａ１の発現）を、損傷後２８日目に免疫蛍光検査法により評価した。ＴＢＩ後、もっぱらＡｑｐ４−／−マウスの同側皮質に、ＧＦＡＰ−およびＩｂａ１−免疫反応性の顕著な上昇を認めた。（Ｇ〜Ｈ）ＧＦＡＰ標識の定量から、Ａｑｐ４−／−の皮質および基底線条体では、反応性のアストログリオーシスが有意に増加するが、野生型マウスではそうではないことが実証された（野生型に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。（Ｉ）海馬では、ＧＦＡＰ免疫反応性に差異は認められなかった。（Ｊ〜Ｋ）Ｉｂａ１標識の定量から、ミクログリアの活性化がＡｑｐ４−／−マウスの同側皮質および線条体で遷延するが、野生型マウスでは、損傷後２８日以内に消散することが示された（対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。（Ｌ）野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスの両方で、Ｉｂａ１標識の増加が海馬のＣＡ３領域に認められた（対側構造に対して＃Ｐ＜０．０５；２元配置ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝４匹の動物）。
【０３１４】
[00531]図５０Ａ〜Ｅ。Ａｑｐ４遺伝子欠損は、外傷後の認知障害を悪化させる。
[00532]（Ａ）グリンファティック経路障害が外傷後の認知障害におよぼす効果を、ＴＢＩを受けた野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスについて評価した。動物は損傷２日前に、そしてＴＢＩ後は毎週ベースライン行動試験を受けた。（Ｂ）オープンフィールド試験により大運動行動を評価した。ＴＢＩは、野生型マウスまたはＡｑｐ４−／−マウスのいずれにおいても、オープンフィールド試験成績を変化させなかった。（Ｃ）運動調整および学習をロータロッド試験により評価した。ＴＢＩは、野生型動物では、ロータロッド成績を有意に損ねることはなかったが、Ａｑｐ４−／−マウスでは、ＴＢＩは試験成績を有意に損ねた（Ａｑｐ４−／−ｓｈａｍ対Ａｑｐ４−／−ＴＢＩ＊Ｐ＜０．０５；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝９〜１４の動物）。認知機能を、新規物体認識試験（Ｄ）およびバーンズ迷路試験（Ｅ）により評価した。両試験では、ＴＢＩは、野生型マウスおよびＡｑｐ４−／−マウスの両方について認識成績を損ねた（ＴＢＩ対ｓｈａｍ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、１群当たりｎ＝９〜１４匹の動物）。外傷後認知障害は、野生型動物と比較してＡｑｐ４−／−マウスで悪化した（野生型ＴＢＩ対Ａｑｐ４−／−ＴＢＩ＊＊Ｐ＜０．０１；２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ；１群当たりｎ＝９〜１４）。
【０３１５】
[00533]図５１Ａ〜Ｄ。血管周囲ＡＱＰ４の偏在に関する決定要素としてのＡＱＰ４−Ｍ１変異体。
[00534]（Ａ）Ａｑｐ４遺伝子は、２つの転写開始部位を有し、各部位において転写が開始すると、２つのＡＱＰ４  ｍＲＮＡ変異体：Ａｑｐ４遺伝子のエクソン０〜４を含むＡＱＰ４−Ｍ１、およびエクソン０を欠くＡＱＰ４−Ｍ２３が生じる。（Ｂ）ＡＱＰ４−Ｍ２３（生理的条件下、ＣＮＳにおいて支配的な形態）は、血管周囲ＡＱＰ４の充填を可能にする一方、ＡＱＰ４−Ｍ１はこれを阻止する；したがってＡＱＰ４−Ｍ１発現が増加すると、ＡＱＰ４の偏在は阻害される（Ｃｒａｎｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００９年；Ｆｕｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、２００３年）。（Ｃ）ＡＱＰ４−Ｍ１の発現を、マウス同側皮質について、ＴＢＩ後３日目に、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物のエクソン０を特異的に標的とするＰＣＲプライマーを用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した。対照（ｓｈａｍ）皮質におけるＡＱＰ４−Ｍ１発現量と比較して、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＴＢＩにより約２倍増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｔ−検定；１群当たりｎ＝５）。（Ｄ）ＡＱＰ４−Ｍ１変異体のエクソン０を標的とするｓｉＲＮＡに基づくアプローチを用いれば、ＡＱＰ４−Ｍ１の発現は、培養された初代マウス皮質アストロサイトにおいて効果的にノックダウンすることが可能であった。３つのｓｉＲＮＡ２本鎖を、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物のエクソン０を標的とするように設計し、初代マウスアストロサイトにこれらのｓｉＲＮＡ２本鎖を６日間トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理後、ＡＱＰ４−Ｍ１発現をｑＰＣＲにより評価し、エクソン０を標的とするｓｉＲＮＡアプローチによりＡＱＰ４−Ｍ１の効果的なノックダウンが明らかとなった（ｓｉＡＱＰ４−Ｍ１対対照＃＃＃Ｐ＜０．００１；１元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ＝３）。Ａｑｐ４遺伝子プロモーターのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングでは、ＡＱＰ４−Ｍ１転写開始部位の上流にある転写（ＳＴＡＴ）−３の転写因子シグナルトランスジューサーおよびアクチベーターについて、２つの結合部位が明らかになった。したがって、発明者らは、初代マウス皮質アストロサイトにおけるＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害が、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量を低減し得るのかを試験した。ＳＴＡＴ３−特異的阻害剤ＳＴＡＴＴＩＣにより、初代アストロサイトを処理すると、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は有意に低下した（ＳＴＡＴＴＩＣ対対照＊＊Ｐ＜０．０１；１元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ＝３）。これらのデータから、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＴＢＩ後に増加したが、ＡＱＰ４−Ｍ１発現量は、ＡＱＰ４−Ｍ１転写物をｓｉＲＮＡの標的対象とすることにより、またはアストロサイト内でＳＴＡＴ３を阻害するにより抑えられることが実証される。これらの所見は、脳損傷（例えば外傷性脳損傷または虚血性脳損傷等）後のＡＱＰ４の偏在喪失は、これらのアプローチを通じて防止し得る、という概念と一致する。
【０３１６】
[00535]図５２Ａ〜Ｅ。グリンファティック経路機能は、拡散虚血性損傷後に障害を有する。
[00536]複数の微小梗塞を有するマウスモデル（Ｍ．Ｗａｎｇら、Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｉｃｒｏｉｎｆａｒｃｔｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年１２月１２日、第３２巻（５０）：１７９４８〜１７９６０頁）を用いて、拡散虚血性損傷の影響をｉｎ  ｖｉｖｏ二光子画像化法により評価した。（Ａ）動物に拡散虚血性損傷を加えた。３日後に、グリンファティック経路機能を、大槽内注射した蛍光ＣＳＦトレーサー（テキサスレッド結合デキストラン、ＭＷ７０ｋＤ）の、閉鎖頭蓋窓を経由した大脳皮質内流入を画像化することにより評価した。（Ｂ〜Ｄ）皮質表面下１００μｍにて取得した代表的な二光子画像は、蛍光ＣＳＦトレーサーが大槽内注射後２０分で皮質実質内に移動することを示す。（Ｅ）損傷後３日目に、シリアル二光子画像化法により皮質表面下１００μｍにて蛍光強度を定量し、これにより、対照動物では、ＣＳＦトレーサーは皮質に急速に進入し、注射から２０分以内にピークに達することを示す。同側皮質では、ＣＳＦトレーサーの流入は事実上消滅したが、一方、対側皮質でさえも、ＣＳＦトレーサーの流入は、有意に障害を受ける。これらのデータから、血管周囲のＡＱＰ４の偏在の喪失を引き起こす拡散虚血性損傷（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年）によっても、グリンファティック経路機能は劇的に損なわれることが実証される。
【０３１７】
[00537]５３Ａ〜Ｂ。グリンファティック経路機能は、拡散虚血性損傷後に障害を受ける。
[00538]最近記載された（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１２年）複数の微小梗塞を有するマウスモデルを用いて、拡散虚血性損傷の影響を、全スライス蛍光画像化法により評価した。動物に拡散虚血性損傷を加えた。３日後、グリンファティック経路機能を、ＣＳＦトレーサー（オボアルブミン結合ＡＬＥＸＡ−６４７、ＯＡ−６４７、ＭＷ４５ｋＤ）の大槽内注射により評価した。トレーサー注射後３０分経過して、動物を固定し、脳をスライスし、そしてＣＳＦトレーサー流入を従来型の蛍光顕微鏡検査法により評価した。（Ａ）対照脳では、ＣＳＦトレーサーは傍血管腔に沿って脳実質内に急速に移動する。（Ｂ）拡散虚血性損傷後、ＣＳＦの脳内への流入は、劇的に低下した。同側においてには、ＣＳＦの実質内への移動は事実上消滅する。対側半球では、傍血管ＣＳＦ流入が存在するものの、周辺の間質空間と交換する際のその速度および程度は劇的に低下する。
【実施例７】
【０３１８】
[00539]６．７．グリンファティック系：老化した脳およびアルツハイマー病における脳網羅的クリアランスの標的
[00540]本明細書に開示するように、老化した脳において、脳間質液（ＩＳＦ）の対流性の流れおよび脳脊髄液（ＣＳＦ）／ＩＳＦの交換を制御する脳の正常なメカニズムを調節することにより、毒性物質または老廃物質の脳からのクリアランスを増加させると、代謝の老廃副産物およびアルツハイマー病（ＡＤ）等の神経変性疾患と関連した毒素が除去される。
【０３１９】
[00541]本実施例で開示するように、アミロイド−β等の物質について、その脳からのクリアランスを強化するために、脳のレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）を調節する方法が提供される。アルツハイマー病は、この方法により治療される１つの主要な標的である。現在のところ、この致命的疾患の進行を遅らせるまたは停止させる治療法は存在しない。
【０３２０】
[00542]この実施例では、当該技術分野で公知のＡＶＰ（バソプレシン）拮抗薬（例えば、トルバプタン、コニバプタン、またはＶＰＡ−９８５）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）拮抗薬（例えば、アナンチン）、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬（例えば、ロサルタン）、ＡＴ２Ｒ受容体拮抗薬（例えば、ＰＤ１２３３１９）、またはＡＴ１受容体拮抗薬（例えば、バルサルタン）は、グリンファティッククリアランスを増加または促進するのに利用可能であることも示す。
【０３２１】
[00543]背景
[00544]脳内に毒性の機能障害性タンパク質が蓄積すると、それはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む多くの神経変性疾患と関連する。しかし、老化した脳内に毒素の蓄積を引き起こすメカニズムは、完全には知られていない。アルツハイマー病（ＡＤ）の場合、アミロイドβ毒素（Ａβ）の細胞外沈積である老人斑、および細胞内の神経原線維濃縮体（高リン酸化型タウ）が、２つの特徴として挙げられる。「アミロイドカスケード」仮説から示唆されることとして、ＡＤにおける認知機能低下および顕著な病原的特徴は、これら毒素の異常な蓄積と関連することが挙げられる（Ｓｅｌｋｏｅ、２００１年；Ｈａｒｄｙ、２００６年）。
【０３２２】
[00545]Ａβは、脳内の神経細胞を含む身体内の多くの細胞によりアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型のタンパク質から産生され、これは、プロテアーゼ、β−セクレターゼ、およびγ−セクレターゼにより切断されてＡβを生成する（Ｓｅｌｋｏｅ、２００１年）。正常な個体では、これらの毒素は低濃度で脳内に存在するが、ＡＤでは、これが蓄積し、その存在はＡＤ病因と関連する主要なイベントである（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２年）。少数の症例では（＜１％）、Ａβの蓄積は、その過剰生成に起因するが（早期発症型のＡＤ）、一方、大部分の症例では、Ａβの蓄積は脳からの不完全なクリアランスに起因する（後期発症型のＡＤ）（Ｔａｎｚｉ、２００５年；Ｔａｎｚｉら、２００４年；Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａら、２０１０年）。脳内でＡβの濃度が高まると、神経毒性のＡβオリゴマー形成、進行性のシナプス喪失、およびニューロン機能障害が生じる（ＭａｓｔｅｒｓおよびＳｅｌｋｏｅ、２０１２年）。Ａβペプチドは、脳実質および脈管構造におけるアミロイドβの主要な構成成分である（脳アミロイド血管障害、ＣＡＡ）。老人斑から抽出されたＡβは、主にペプチドＡβ１−４０（Ａβ４０）およびＡβ１−４２（Ａβ４２）であるが、一方、血管アミロイドは、主にペプチドＡβ１−３９およびＡβ４０である。脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳内に存在するＡβの主要な可溶性の形態はＡβ４０である。可溶性Ａβは、ＣＳＦおよび脳間質液（ＩＳＦ）内で循環し、遊離ペプチドとして存在し得る、および／または異なる結合タンパク質（担体）、例えばアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）、アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ）、トランスチレチン、アルブミン、およびα２−マクログロブリン（α２Ｍ）等と関連し得る（Ｄｅａｎｅら、２００９年）。脳Ａβ産生量低下を唯一の根拠とする療法は、臨床試験ではこれまでのところ不成功に終わっている（Ｈａｒｄｙ、２００９年）。
【０３２３】
[00546]Ａβは、細胞の取り込みおよび分解、ＩＳＦ対流性の流れ、および血液脳関門（ＢＢＢ）−媒介型輸送を含む様々な経路を通じて脳ＩＳＦから取り除かれる（Ｄｅａｎｅら、２００９年）。本明細書で開示するように、グリンファティック系は、ＣＳＦ／ＩＳＦ交換の巨視的な脳網羅的経路であり、Ａβを含む代謝副産物のクリアランスを促進する。グリンファティック系は、脳ＩＳＦの対流性の流れの基礎をなし、アストロサイトおよび末梢リンパ系と同様の機能により媒介される。グリンファティック系は、主要な３経路からなる：（１）くも膜下腔由来のＣＳＦは、傍動脈腔経由で脳に再度進入する、（２）アストロサイトアクアポリン４（ＡＱＰ４、アストロサイトに固有の水チャンネル）は、脳実質を通じて対流性の脳ＩＳＦ流を駆動する、および（３）傍静脈クリアランスによる流出。しかし、ＣＳＦは、貫通動脈に沿って急速に脳実質に進入するので、グリンファティック系は、必須化合物を脳網羅的に送達し、ならびに毒性化合物を除去するための流通経路としても機能し得る。また、グリンファティック系は、結合型および遊離型を含むすべての形態のＡβを脳から除去し得る好適なメカニズムでもあり得る。
【０３２４】
[00547]周辺における液のバランス
[00548]周辺では、血漿容積および塩組成（塩化ナトリウム）および血圧が、ホルモン（アルドステロンおよびバソプレシン）、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）、および交感神経系を含む相互作用系により維持される。これらのメカニズムは、十分に立証されている（Ｄｉｎｈら、２００１年；Ｚｕｃｋｅｒ、２００２年；Ｐｅｒｓｓｏｎ、２００３年；Ｂｕｒｎｉｅｒ、２００３年；Ａｒｎｏｌｄら、２０１３年；Ｏｈｓｈｉｍａら、２０１３年）。血漿容積が低下すると、腎臓からのレニン放出を引き起こし、次にタンパク質分解作用により血漿中の前駆体アンジオテンシノーゲン（肝臓で生成）からアンジオテンシンＩ（デカペプチド）への開裂が生じる。アンジオテンシンＩは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）により、アンジオテンシンＩＩに更にプロセシングされる。更に、カスケードは、アンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩの系列と、対照的な生物学的作用を有するアンジオテンシン（１−７）を含むその他の活性な代謝物に分岐する（図５４）。アンジオテンシン変換酵素２は、アンジオテンシンＩからアンジオテンシン（１−９）への、およびアンジオテンシンＩＩからアンジオテンシン（１−７）への変換を触媒する。その他の酵素、例えばカテプシンおよびネプリリシン等も、ＲＡＳの活性な代謝物からなるカスケードにおいて役割を演ずる可能性がある。アンジオテンシンＩＩは、２つのクラスの薬理学的Ｇタンパク質共役受容体である、アンジオテンシン１受容体（ＡＴ１Ｒ）およびアンジオテンシン２受容体（ＡＴ２Ｒ）に作用するが、一方アンジオテンシン（１−７）は、最近識別されたｍａｓ受容体に作用する。アンジオテンシンＩＩは、アルドステロンの副腎皮質からの分泌を刺激するが、アルドステロンはナトリウムを、主に腎臓による排泄を低減することにより、血漿内に保持する。アンジオテンシンＩＩも血管収縮を引き起こす（潅流圧を維持する）。同時に、バソプレシンは脳下垂体後葉から分泌され、腎臓による水の排泄を低減することにより、水の保持を促進する。全体として、これらのメカニズムは、血圧、血漿（細胞外容積）容積、および血漿塩濃度を維持する。血漿容積が増加すると逆のことが生ずる。アンジオテンシンＩＩとは対照的に、アンジオテンシン（１−７）は、Ｍａｓと呼ばれる受容体に作用することにより血管拡張を引き起こす（Ｓａｎｔｏｓら、２００３年）。
【０３２５】
[00549]ＡＴ２受容体に対するアンジオテンシンＩＩの作用も血管拡張を引き起こす。したがって、アンジオテンシンＩＩとアンジオテンシン（１−７）との間のバランスが、ＲＡＳの結果を調節する。アンジオテンシン変換酵素２は、アンジオテンシンＩおよびアンジオテンシンＩＩのアンジオテンシン（１−７）への変換において主要な役割を演ずるので、このＲＡＳ効果のバランス調節における１つの重要な酵素は、同酵素であると考えられている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００６年）。
【０３２６】
[00550]脳内レニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）。
[00551]脳内ＲＡＳは、周辺のＲＡＳとは独立していると考えられている（Ｍｏｇｉら、２０１２年；Ｏｈｓｈｉｍａら、２０１３年）。脳は、これらの立証済みのメカニズムを統合して血圧、血漿容積、および塩組成を制御する際に主要な役割を演ずる。更に、ＢＢＢにより、脳はそれ自体の液環境を、おそらく血漿容積および塩組成の制御と同様の方式で制御し得る（ＩＳＦ／ＥＣＦの容積および組成）。更に、ＲＡＳは塩と水のバランスと関係しない、神経保護、学習、および炎症等のその他の役割を有する。アンジオテンシン２受容体およびＭａｓ受容体が活性化すると、血管拡張、神経保護、認知、抗増殖効果、および降圧効果をもたらす（Ｓｕｄｉｌｏｖｓｋｙら、１９８７年；Ｗａｎｇら、２００７年）。老化およびＡＤでは、脳内ＲＡＳは増強されると考えられている（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１０年；Ｓａｖａｓｋａｎら、２００１年）。アンジオテンシン変換酵素濃度は、ＡＤの尾状核および皮質で上昇し（Ａｒｒｅｇｕｉら、１９８２年）、ＡＤリスクに影響を及ぼす可能性がある（Ｈｅｍｍｉｎｇら、２００５年；Ｈａｊｊａｒら、２０１２年；Ｓａａｖｅｄｒａら、２０１２年；ＡｂｄＡｌｌａら、２０１３年）。
【０３２７】
[00552]脳では、アストロサイトは、アンジオテンシノーゲンすなわちアンジオテンシンＩの前駆体、およびアンジオテンシン（１−７）への変換に関わるアンジオテンシン変換酵素２の主要な供給源である（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２００６年）。アストロサイトは、アンジオテンシン１受容体も有する。したがって、アストロサイトは、脳のＩＳＦ容積および塩を制御する重要な役割を演ずる可能性がある。更に、最近発明者らは、ノルアドレナリン受容体（α１、α２、およびβ）を遮断すると、グリンファティック系を経由する、Ａβおよびイヌリンの脳からのクリアランスが増加することを明らかにした（Ｘｉｅら、２０１３年）。ノルアドレナリンは、活性化した交感神経系およびアドレナリン作動系の神経伝達物質であり、アンジオテンシノーゲンをアンジオテンシンＩに変換する酵素、レニンの活性を高める（Ｍｉｃｈａｅｌら、２００１年；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９７９年；Ｍａｃｏｖａら、２００９年）。したがって、覚醒時（覚醒状態）に脳アドレナリン作動系（青斑核）の活動が高まると、ＲＡＳ活性が増加し得る。これは、覚醒時のグリンファティック系を経由するクリアランス量低下と関連する（Ｘｉｅら、２０１３年）。アドレナリン作動系を遮断すると、睡眠時と同様に、脳からの物質のクリアランス量増加と関連する（Ｘｉｅら、２０１３年）。
【０３２８】
[00553]したがって、ＲＡＳは、グリンファティック系を経由するＩＳＦ物質のクリアランスを制御する上で主要な役割を演じる可能性がある。しかし、ＩＳＦ内に存在する物質のクリアランスにおけるＲＡＳの役割は不明である。
【０３２９】
[00554]脳内ＲＡＳは、周辺ＲＡＳの場合と同様に脳のＩＳＦ液を保存し、またその作用を遮断すると、グリンファティック系によるＩＳＦのクリアランスが増加する。
[00555]ＲＡＳは基本的な脳網羅的系であるので、Ａβを含む脳内毒性物質の蓄積と関連した多くの疾患に応用できる。この仮説を、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシン（１−７）、アンジオテンシンＩ受容体の遮断薬（ロサルタン、バルサルタン）、およびアンジオテンシン（１−７）受容体（Ａ７７９）の遮断薬を用いて、１２５Ｉ−Ａβ１−４０（Ａβと呼ぶ）および対流性のＩＳＦ流によってのみクリアランスされる分子である１４Ｃ−イヌリン（イヌリンと呼ぶ）のクリアランスについて試験した（Ｘｉｅら、２０１３年）。外因性の１２５Ｉ−Ａβおよび１４Ｃ−イヌリンのクリアランスに対するＲＡＳの役割を、その前頭皮質内注射後、３０分の時点において調べた（Ｘｉｅら、２０１３年）。これら分子の脳への流入に対するＲＡＳの役割を、これら分子をくも膜下腔（大槽）内に注射することにより調べ、そして３０分後に脳内濃度を測定した。Ａβは、ＡＤと関連したペプチドに、またイヌリンは不活性分子およびＩＳＦ内の分子の対流性の流れのマーカーに該当した。データは仮説を裏付ける。
【０３３０】
[00556]方法
[00557]脳クリアランス試験：手短に述べると、麻酔したマウス（ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ））の右側尾状核被殻または前頭皮質内にステンレススチールガイドカニューレを定位固定的に埋め込んだ。前頭皮質の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方０．７ｍｍ、側方３．０ｍｍ、および脳表面下方１．３ｍｍであった。手術後、動物を回復するまで放置した。相当の慢性プロセスが生ずる前に実験を実施したが、但し報告に従い、大型の分子に対するＢＢＢの修復の時間を設けた（Ｄｅａｎｅら、２００４年）。放射能標識された分子を注射する前の１０分間、薬物を事前注射した。
【０３３１】
[00558]トレーサー混合物の注射：１４Ｃ−イヌリン（０．０５μＣｉ、バルク流に対して不活性な分子）と共に、１２５Ｉ−標識Ａβ４０（１０ｎＭモノマー）を含有する模擬的なＣＳＦ（０．５μＬ）を、５分間にわたり脳ＩＳＦ内に微量注入した。
【０３３２】
[00559]組織サンプリング：実験終了時に、放射能分析およびＴＣＡ分析用に、脳を取り出し、調製した。
[00560]放射能分析：γカウンター（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｚａｒｄ  γカウンター、パーキン・エルマー）内で１２５Ｉ−放射能を測定した。１４Ｃ−カウント計測の場合、サンプルを組織可溶化剤（パーキン・エルマー）０．５ｍｌ、一晩可溶化し、その後シンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ）５ｍｌを添加し、そして液体シンチレーション・カウンター（ベックマン・コールターカウンター）内で分析した。
【０３３３】
[00561]計算：クリアランスパラメータの全計算を、上記のように、またはルーチン法により（Ｄｅａｎｅら、２００４年；Ｘｉｅら、２０１３年）実施した。手短に述べると、微量注射後、脳内に残留する放射能の割合（％）を、脳内回収率％＝１００×（Ｎｂ／Ｎｉ）として求めたが、但し、式中Ｎｂは実験終了時に脳内に残留する放射能であり、またＮｉは脳ＩＳＦに注射した放射能であり、すなわち１４Ｃ−イヌリンの場合ｄ．ｐ．ｍ．、およびＴＣＡ−沈殿可能な１２５Ｉ−放射能の場合ｃ．ｐ．ｍ．である。イヌリンを、代謝的に不活性な極性分子として用いたが、これはＢＢＢを通過して輸送されることがなく、また脳により保持されることもない；そのクリアランス速度は、ＩＳＦの対流性バルク流の指標を提供する。群毎に３〜６匹のマウスが存在し、またデータを平均値±ＳＥＭとして表した。ｔ−検定を用いて判断する場合、Ｐ＜０．５は統計的に有意とみなした。
【０３３４】
[00562]結果
[00563]Ａ．薬理学的介入
[00564]１）  １２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを前頭皮質内注射した後に、アンジオテンシンおよびロサルタンがこれらの脳内回収率に与える効果
[00565]１２５Ｉ−Ａβ４０（１０ｎＭ）および１４Ｃ−イヌリン（０．０５μＣｉ）を含有する少量（０．５μＬ）の模擬的なＣＳＦを前頭皮質に微量注射した。実験終了時（３０分）に、脳を取り出し、放射能を分析した。図５５Ａは、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）を含む脳内に残留するＡβ４０濃度は増加したことを示す。対照的に、アンジオテンシン１受容体拮抗薬であるロサルタン（１μＭ）は、Ａβの回収を低下させた。図５５Ｂは、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）を含む脳内に残留するイヌリン濃度も増加したことを示す。対照的に、ロサルタン（１μＭ）は、イヌリンの回収を低下させた。したがって、アンジオテンシンＩＩは、対流性のＩＳＦ流を経由するクリアランスを低下させた。
【０３３５】
[00566]２）  １２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを大槽内注射した後に、アンジオテンシンおよびロサルタンがこれらの脳内流入に及ぼす効果
[00567]１２５Ｉ−Ａβ４０（１０ｎＭ）および１４Ｃ−イヌリン（０．０５μＣｉ）を含有する少量（５μＬ）の模擬的なＣＳＦを大槽内に１μＬ／分で微量注射した。実験終了時（３０分）に、脳を取り出し、放射能を分析した。図５６Ａは、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）を含む脳では、これに流入するＡβ４０量は低下したことを示す。対照的に、ロサルタンを大槽内（１μＭ）または腹腔内（ＩＰ；１ｍｇ）に注射すると、Ａβの流入量は増加した。図５６Ｂは、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）を含む場合、イヌリン流入量も減少したことを示す。対照的に、ロサルタンはイヌリン流入量を増加させた。
【０３３６】
[00568]３）  １２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを前頭皮質内注射した後に、バソプレシンンがこれらの脳内回収率に与える効果
[00569]図５７は、身体内の水分を保持するホルモンであるバソプレシン（１μＭ）を前頭皮質内に注射すると、Ａβおよびイヌリンの両方について、対照と比較して脳からのクリアランスが低下したことを示す。
【０３３７】
[00570]４）  １２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを前頭皮質内注射した後に、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）がこれらの脳内回収量に及ぼす効果
[00571]図５８は、身体の水分およびナトリウムを低減するペプチドである心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）（１μＭ）は、前頭皮質内に注射したとき、Ａβおよびイヌリンのクリアランスを低下させたことを示す。ＡＮＰ分泌は、覚醒状態において認められるような交感神経活性化の増大を含め、様々な因子により刺激を受ける。
【０３３８】
[00572]５）  １２５Ｉ−Ａβ４０および１４Ｃ−イヌリンを前頭皮質内に注射した後に、アンジオテンシン（１−７）（Ａ７）がこれらの脳内回収率に及ぼす効果
[00573]アンジオテンシン（１−７）は、神経保護効果を有し、またアンジオテンシンＩＩの作用を妨害することが明らかにされている。頭皮質内に事前注射したアンジオテンシン（１−７）が、Ａβおよびイヌリンの脳からのクリアランスに及ぼす効果について調べた。図５９は、Ａβのクリアランスは用量に応じて漸増したことを示す。
【０３３９】
[00574]感度を改善するために、測定時点を減らした。１５分の時点を用いると、アンジオテンシン（１−７）濃度が１０ｎＭと１ｎＭとの間でより大きな変化が認められた（図６０）。
【０３４０】
[00575]アンジオテンシン（１−７）の効果を確認するために、受容体を遮断することによりこのリガンドをアンタゴナイズする遮断薬Ａ７７９を用いた。最初に、Ａ７７９（１μＭ）を大槽内に１０分間注射し、次に、Ａβおよびイヌリンの前頭皮質からのクリアランスを、Ａ７７９（１μＭ）およびアンジオテンシン（１−７）（１０ｎＭ）の存在下で求めた。図６１は、アンジオテンシン（１−７）の効果は遮断薬により妨害されたことを示す。
【０３４１】
[00576]６）  一酸化窒素（ＮＯ）を遮断したときのグリンファティック経路に及ぼす効果。
[00577]一酸化窒素（ＮＯ）は、多くのホルモン、神経伝達物質の効果を媒介する際に重要な役割を演じ、またＲＡＳと相互作用するので、グリンファティック系におけるＮＯの役割を調べた。
【０３４２】
[00578]誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の選択的阻害剤であるＬ−ＮＩＬを用いた。図６２は、Ｌ−ＮＩＬはＡβおよびイヌリンのクリアランスに対して用量依存性の効果を有することを示す。Ｌ−ＮＩＬが１ｍＭのとき、クリアランスは増加した。
【０３４３】
[00579]Ａβおよびイヌリンの流入についても、Ｌ−ＮＩＬに応じて用量依存性の増加が認められた（図６３）。
[00580]Ｂ．グリンファティック系の機械的混乱
[00581]最初に、大槽にカニューレを挿入し、ＣＳＦを連続的に流出させた。前頭皮質からＡβのクリアランスを行った１０分後に、３０分間測定した。図６４は、ＣＳＦの大槽からの流出期間中、Ａβの皮質からのクリアランスは低下したことを示す。したがって、ＣＳＦ流を脳から迂回させると、その傍動脈腔を経由する脳内への再循環を低下させ、また実質を通じた対流性の流れを低下させる可能性があり、これは次にクリアランスを減少させる。
【０３４４】
[00582]Ｃ．睡眠妨害
[00583]Ａβおよびイヌリンのクリアランスは、睡眠状態下で増加する（Ｘｉｅら、２０１３年も参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。睡眠妨害がクリアランスに変化をもたらすか、その変化を立証するために、穏やかに取り扱いつつ、６ＡＭ（点灯）より６時間マウスから睡眠を奪った。次に、Ａβのクリアランスを覚醒下で測定した。図６５は、Ａβのクリアランスは睡眠妨害期間中、低下したことを示す。
【０３４５】
[00584]したがって、グリンファティッククリアランスを増加させるには、特定の実施形態では、以下を含む、但しこれらに限定されない、不眠治療にまたは睡眠補助薬として用いられる薬剤が、日常的で臨床的に許容される方法を用いて対象または患者に投与され得る：
[00585]抗ヒスタミン薬（例えば、店頭薬）：
[00586]ＡＬＬＥＧＲＡ（登録商標）（フェキソフェナジン）
[00587]ＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標）（ジフェンヒドラミン）
[00588]ＣＬＡＲＩＴＩＮ（登録商標）またはＴＡＶＩＳＴ（登録商標）（ロラタジン）
[00589]ＣＨＬＯＲ−ＴＲＩＭＥＴＯＮ（登録商標）（マレイン酸クロルフェニラミン）
[00590]ＤＩＭＥＴＡＮＥ（登録商標）（ブロムフェニラミン、フェニルプロパノールアミン）
[00591]ＺＹＲＴＥＣ（登録商標）（セチリジン）
[00592]非処方箋睡眠補助剤：
[00593]Ｕｎｉｓｏｍ  Ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ  Ｓｌｅｅｐ−Ａｉｄ
[00594]Ｄｏｒｍｉｎ
[00595]Ｎｙｔｏｌ
[00596]Ｓｉｍｐｌｙ  Ｓｌｅｅｐ
[00597]Ｓｏｍｉｎｅｘ
[00598]Ｅｘｔｒａ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｔｙｌｅｎｏｌ  ＰＭ
[00599]塩酸ジフェンヒドラミン
[00600]Ｅｘｃｅｄｒｉｎ  Ｐ．Ｍ．
[00601]ベンゾジアゼピン系：
[00602]ＰＲＯＳＵＭ（登録商標）（エスタゾラム）
[00603]ＤＡＬＭＡＮＥ（登録商標）（フルラゼパム）
[00604]ＤＯＲＡＬ（登録商標）（クアゼパム）
[00605]ＲＥＳＴＯＲＩＬ（登録商標）（テマゼパム）
[00606]ＨＡＬＣＩＯＮ（登録商標）（トリアゾラム）
[00607]ＶＡＬＩＵＭ（登録商標）（ジアゼパム）
[00608]非ベンゾジアゼピン系：
[00609]イミダゾピリジン：ＡＭＢＩＥＮ（登録商標）、ＡＭＢＩＥＮ（登録商標）ＣＲ、ＩＮＴＥＲＭＥＺＺＯ（登録商標）（ゾルピデム）（優れている）
[00610]ＳＯＮＡＴＡ（登録商標）（ピラゾロピリミジン）（優れている）
[00611]メラトニン受容体刺激剤：
[00612]ＲＯＺＥＲＥＭ（登録商標）（ラメルテオン）
[00613]ＮＯＴＥＣ（登録商標）（抱水クロラール）
[00614]ＰＲＥＣＥＤＥＸ（登録商標）（塩酸デクスメデトミジン）
[00615]ＬＵＮＥＳＴＡ（登録商標）（エスゾピクロン）
[00616]バルビツレート：
[00617]ＮＥＭＢＵＴＡＬ（登録商標）（フェノバルビタール）
[00618]ＭＥＢＡＲＡＬ（登録商標）（メフォバルビタール）
[00619]Ａｍｙｔａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ（アモバルビタールナトリウム）
[00620]ＢＵＴＩＳＯＬ（登録商標）（ブタバルビタールナトリウム）
[00621]ＳＥＣＯＮＡＬ（登録商標）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｕｌｖｕｌｅｓ（セコバルビタールナトリウム）
[00622]実施例７で引用した参考文献
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【実施例８】
【０３４６】
[00623]６．８．脳からのアミロイドβクリアランスにおけるアクアポリン４（ＡＱＰ４）による調節
[00624]内因性膜タンパク質のアクアポリンファミリーのメンバーは、多くの細胞の原形質膜において、水選択的チャンネルとして機能する。アクアポリン４（ＡＱＰ４）は、脳に見出される主要なアクアポリンである。この実施例では、ＡＱＰ４はアミロイドβの脳からのクリアランスを調節することを示す。いずれにせよ、ＡＱＰ４の活性化はアミロイドβの脳からのクリアランスを促進し得る、またはＡＱＰ４を阻害するとアルツハイマー病の遺伝子組換えマウスモデルにおいてアミロイドβの沈着を悪化させ得る。この実施例で開示される結果に基づき、アルツハイマー病を含む神経変性疾患は、ＡＱＰ４の血管周囲の偏在を促進する薬物である、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１により、治療、改善、または予防可能である。
【０３４７】
[00625]アルツハイマー病を含む神経変性疾患は、ペプチドおよびタンパク質が毒性の凝集物およびプラークに誤って凝集することにその特徴を有し、細胞外タンパク質またはペプチドのクリアランスに年齢または外傷に関連する不具合が生ずることに一部起因する。細胞外タンパク質およびペプチドの脳からのクリアランスは、ＡＱＰ４の血管周囲の局在；すなわち老化した脳および損傷を受けた脳で失われるような偏在に依存する。細胞外コンパートメントから上記溶質のクリアランスを維持し、ＡＱＰ４の血管周囲の偏在を維持することが、神経変性の発現および進行を予防または遅延させるために利用可能である。
【０３４８】
[00626]現在のところ、老化した脳内におけるＡＱＰ４の偏在喪失を防止する治療アプローチは存在しない。むしろ、このような凝集を取り扱う現行アプローチは、その構成成分の生成を防止することまたは凝集物を標的として破壊することに向けられている。前者の場合、これらの構成成分は、多くの場合正常な機能に必要な生理学的に活性な化合物であるので有害であり得るが、一方、凝集物を標的とする場合、ニューロンの喪失を防止する病理学的プロセスにおいて遅きに失する可能性がある。「正常な」ＡＱＰ４の偏在、およびこのような構成成分のクリアランスを維持することにより、疾患の発現およびニューロン喪失の前に凝集を防止する。
【０３４９】
[00627]ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ、ＮＪ  ０８５６０）、およびその誘導体は、外傷性脳損傷後のＡＱＰ４の偏在について、その喪失を防止することが公知である一方、ＡＱＰ４の偏在を維持し得るその他の薬物はまだ報告されていない。１つの実施形態では、神経変性プロセスの初期にＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１で治療することにより、タンパク質およびペプチドの凝集は、その産生に関わる細胞プロセスを変える必要なく、予防可能である。
【０３５０】
[00628]これらの経路に沿ったアミロイドβのクリアランスは、ＡＱＰ４の偏在に依存する。拡散虚血性損傷、ならびに軽度および中等度の外傷性脳損傷のモデルでは、血管周囲のＡＱＰ４局在は、脳損傷後に一様に失われる。老化したマウスおよびヒトの脳のいずれにおいても、血管周囲のＡＱＰ４の偏在は失われる。これは、間質内アミロイドβのクリアランス不具合を伴う。血管周囲のＡＱＰ４の偏在が失われると、間質内アミロイドβおよびタウのクリアランス不具合の原因となる。この偏在を維持する治療アプローチは、アミロイドβまたはタウの凝集発現、ならびに下流の神経変性プロセスを予防する上で有効であり得る。
【０３５１】
[00629]ＡＱＰ４の活性化が、アミロイドβの脳からのクリアランスを促進するのか、またはＡＱＰ４の阻害は、アルツハイマー病の遺伝子組換えのマウスモデルにおいてアミロイドβの沈着を悪化させるのかを判定するために概念証明試験を実施する。
【０３５２】
[00630]ＪＮＪ−１７２９９４２５およびＪＮＪ−１７３０６８６１は、老化した脳または外傷性脳損傷後の若年脳におけるＡＱＰ４の偏在喪失を予防し得るのかを試験する。
[00631]ＪＮＪ−１７２９９４２５は、外傷性損傷後に、血管周囲のエンドフィートにＡＱＰ４を保持することにより、ＡＱＰ４機能を改善する可能性がある。老化した脳および神経変性の脳においてＡＱＰ４の誤った局在を防止すれば、アミロイドβおよびタウの凝集を予防し得る。したがってＡＱＰ４−標的型化合物のＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１は、老化した脳においてアミロイドβおよびタウのクリアランスを維持し、それらの凝集を予防する上で有効であり得る。
【０３５３】
[00632]本明細書に記載するデバイスのサンプルを下記の番号付きパラグラフに記載する：
[00633]１．  哺乳動物の中枢神経系（脳および／または脊髄）中のグリオ−血管経路（以下、「グリンファティック系」）の機能を測定するための方法であって：
[00634]中枢神経系の画像化を行うステップ；
[00635]中枢神経系中の脳脊髄液−間質液（以下、「ＣＳＦ−ＩＳＦ」）の交換を測定するステップ、
を含む前記方法。
【０３５４】
[00636]２．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ１の方法。
[00637]３．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ１の方法。
【０３５５】
[00638]４．  中枢神経系の画像化を行うステップの前に、画像化剤を投与するステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
[00639]５．  画像化剤をくも膜下腔内に投与する、パラグラフ４の方法。
【０３５６】
[00640]６．  画像化剤をくも膜下腔内に投与するステップが、画像化剤を腰椎または大槽髄腔内注入で投与するステップを含む、パラグラフ５の方法。
[00641]７．  パラグラフ４の方法であって、
[00642]画像化剤が、陰性または陽性（常磁性）の造影剤であり、中枢神経系の画像化を行うステップが、中枢神経系のダイナミックまたは造影磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）を行うステップを含む、前記方法。
【０３５７】
[00643]８．  少なくとも２つの異なるＭＲＩ造影剤を投与し、異なるＭＲＩ造影剤を、脳組織中のそれらの動態的特徴を比較することができるように、Ｔ１（常磁性）またはＴ２（陰性造影剤）に対するそれらの作用の観点から適合させる、パラグラフ７の方法。
【０３５８】
[00644]９．  パラグラフ４の方法であって、
[00645]画像化剤が、陽電子放出放射性核種トレーサーであり、
[00646]脳および脊髄の画像化を行うステップが、中枢神経系の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャニングを行うステップを含む、前記方法。
【０３５９】
[00647]１０．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、機能性もしくは治療用のナノ粒子等のナノ粒子、化学療法剤、治療用に投与する毒性産物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、αシヌクレイン、低分子薬物、ウイルスベクター、抗体ベースの治療薬、リポソーム、または治療用ＲＮＡ構築物のクリアランスを測定するステップを含む、パラグラフ１の方法。
【０３６０】
[00648]１１．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、治療剤のクリアランスを測定するステップを含む、パラグラフ１の方法。
[00649]１２．  治療剤が、治療用途で投与する化学療法剤、機能性ナノ粒子、または毒性組成物である、パラグラフ１１の方法。
【０３６１】
[00650]１３．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、脳内の常磁性または陰性造影剤の流入動態、実質における分布、および／またはクリアランスを解析するステップを含む、パラグラフ７の方法。
【０３６２】
[00651]１４．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、下垂体陥凹、松果体陥凹、小脳および／または嗅球においてＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップを含む、パラグラフ１の方法。
【０３６３】
[00652]１５．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップを含む、パラグラフ１の方法。
【０３６４】
[00653]１６．  シグナルの変化のパラメトリックまたはノンパラメトリックなデータ解析を行うステップがそれぞれ、Ｔ１の短縮またはＴ２の変化を測定するステップを含む、パラグラフ１５の方法。
【０３６５】
[00654]１７．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、流入動態パラメータを計算するステップを含み、流入動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する、パラグラフ１の方法。
【０３６６】
[00655]１８．  ＣＳＦ−ＩＳＦの交換を測定するステップが、造影ＭＲＩまたはＰＥＴの静止画像から動態パラメータを計算する単一のステップを含み、動態パラメータが、ＣＳＦ−ＩＳＦの交換速度を反映する、パラグラフ１の方法。
【０３６７】
[00656]１９．  哺乳動物において神経変性疾患を発症するリスクを計算するステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
[00657]２０．  神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはＨＩＶ関連認知症である、パラグラフ１９の方法。
【０３６８】
[00658]２１．  哺乳動物が、外傷性脳損傷に罹患しており、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を発症するリスクを計算するステップをさらに含む、パラグラフ１の方法。
[00659]２２．  哺乳動物の中枢神経系（脳および／または脊髄）に発症した神経変性疾患を治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記方法。
【０３６９】
[00660]２３．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ２２の方法。
[00661]２４．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ２２の方法。
【０３７０】
[00662]２５．  神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはＨＩＶ関連認知症である、パラグラフ２２の方法。
【０３７１】
[00663]２６．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ２２の方法。
[00664]２７．  グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む、パラグラフ２２の方法。
【０３７２】
[00665]２８．  薬剤が、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子である、パラグラフ２７の方法。
【０３７３】
[00666]２９．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、またはＡＴ１受容体のアンタゴニストである、パラグラフ２７の方法。
【０３７４】
[00667]３０．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、不眠治療にまたは睡眠補助薬として使用するための薬剤である、パラグラフ２７の方法。
[00668]３１．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ２７の方法。
【０３７５】
[00669]３２．  ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である、パラグラフ３１の方法。
【０３７６】
[00670]３３．  グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む、パラグラフ２２の方法。
[00671]３４．  哺乳動物の中枢神経系の反応性グリオーシスを治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記方法。
【０３７７】
[00672]３５．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ３４の方法。
[00673]３６．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ３４の方法。
【０３７８】
[00674]３７．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ３４の方法。
[00675]３８．  グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む、パラグラフ３４の方法。
【０３７９】
[00676]３９．  薬剤が、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子である、パラグラフ３８の方法。
【０３８０】
[00677]４０．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、またはＡＴ１受容体のアンタゴニストである、パラグラフ３８の方法。
【０３８１】
[00678]４１．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、不眠治療にまたは睡眠補助薬として使用するための薬剤である、パラグラフ３８の方法。
[00679]４２．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ３８の方法。
【０３８２】
[00680]４３．  ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である、パラグラフ４２の方法。
【０３８３】
[00681]４４．  グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む、パラグラフ３４の方法。
[00682]４５．  哺乳動物の中枢神経系の間質（脳の間質および／または脊髄の間質）からの老廃産物のクリアランスを促進するための方法であって：
[00683]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ；または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップ、を含む前記方法。
【０３８４】
[00684]４６．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ４５の方法。
[00685]４７．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ４５の方法。
【０３８５】
[00686]４８．  脳の老廃産物が、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、またはαシヌクレインである、パラグラフ４５の方法。
[00687]４９．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ４５の方法。
【０３８６】
[00688]５０．  哺乳動物の中枢神経系を治療するための方法であって、哺乳動物の中枢神経系のグリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、哺乳動物の中枢神経系の老廃産物の蓄積の低減、減少、発生遅延、または阻止をもたらす、前記方法。
【０３８７】
[00689]５１．  哺乳動物の中枢神経系のグリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが：
[00690]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ；または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む、パラグラフ５０の方法。
【０３８８】
[00691]５２．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ５０の方法。
[00692]５３．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ５０の方法。
【０３８９】
[00693]５４．  処置を必要とする患者または対象が、高齢者または老人である、パラグラフ５３の方法。
[00694]５５．  高齢者または老人の患者または対象が、５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、または９０歳より高齢のヒトである、パラグラフ５４の方法。
【０３９０】
[00695]５６．  老廃産物が、可溶性アミロイドβ（Ａβ）、タウ、またはαシヌクレインである、パラグラフ５０の方法。
[00696]５７．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ５０の方法。
【０３９１】
[00697]５８．  哺乳動物の脳を治療するための方法であって、
[00698]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ；または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップ、を含み、それによって、哺乳動物の脳の間質中のアミロイドβ（Ａβ）、タウ、および／またはαシヌクレインの蓄積の減少、低減、発生遅延、または阻止をもたらす、前記方法。
【０３９２】
[00699]５９．  哺乳動物の脳が、外傷性脳損傷を受けている、パラグラフ５８の方法。
[00700]６０．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ５８の方法。
【０３９３】
[00701]６１．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ５８の方法。
[00702]６２．  処置を必要とする患者または対象が、高齢者または老人である、パラグラフ５８の方法。
【０３９４】
[00703]６３．  高齢者または老人の患者または対象が、５０歳、６０歳、７０歳、８０歳、または９０歳より高齢のヒトである、パラグラフ６２の方法。
[00704]６４．  治療剤が、アドレナリン作動性受容体のアンタゴニストである、パラグラフ５８の方法。
【０３９５】
[00705]６５．  薬剤が、Ｓｔａｔ−３阻害剤、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の軸分子であることが当該技術分野で公知の分子である、パラグラフ５８の方法。
【０３９６】
[00706]６６．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＶＰ（バソプレシン）のアンタゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアンタゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアンタゴニスト、またはＡＴ１受容体のアンタゴニストである、パラグラフ５８の方法。
【０３９７】
[00707]６７．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、不眠治療にまたは睡眠補助薬として使用するための薬剤である、パラグラフ５８の方法。
[00708]６８．  グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ５８の方法。
【０３９８】
[00709]６９．  ＡＱＰ４の脱偏在またはＡＱＰ４の偏在の喪失を阻止する薬剤が、ＪＮＪ−１７２９９４２５またはＪＮＪ−１７３０６８６１である、パラグラフ６８の方法。
【０３９９】
[00710]７０．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ５８の方法。
[00711]７１．  哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるかまたは妨害するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップを含む、前記方法。
【０４００】
[00712]７２．  哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ７１の方法。
[00713]７３．  哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ７１の方法。
【０４０１】
[00714]７４．  グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップが、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む、パラグラフ７１の方法。
【０４０２】
[00715]７５．  薬剤が、ブメタニド、ＡＱＰ４に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＡＶＰ（バソプレシン）のアゴニスト、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のアゴニスト、アンジオテンシンＩＩのアゴニスト、ＡＴ２Ｒ受容体のアゴニスト、またはＡＴ１受容体のアゴニストである、パラグラフ７１の方法。
【０４０３】
[00716]７６．  脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ１の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ７１の方法。
[00717]７７．  グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップが、哺乳動物の中枢神経系の間質を通る液体の流れを遮断するかまたはそれに対するバリアを設けるステップを含む、パラグラフ７１の方法。
【０４０４】
[00718]本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、当業者には、本明細書に記載する形態に加えて、本発明の様々な変更形態が上記説明から明白となろう。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０４０５】
[00719]本開示の実施形態は、特定の実施例および特性を参照しながら、具体的に提示され、記載されているが、詳細な様々な変更は、本開示の精神および範囲から逸脱せずに、文書による説明および図面に支持され得る特許請求の範囲により定義される通りに、本明細書において有効であり得るものと、当業者には理解される。更に、代表的な実施形態が所定の数の要素を参照しながら記載されている場合、当該代表的な実施形態は、所定の数を下回るまたは上回る数の要素を利用しながら実施可能であると理解される。
【０４０６】
[00720]本明細書で引用したすべての参照文献は、本明細書に参照によりその全体が、また個々の出版物、特許、または特許出願それぞれが、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれるように、特別におよび個別に提示されたかのように、同一限度においてすべての目的のために組み込まれる。
【０４０７】
[00721]あらゆる出版物の引用は、出願日前のその開示を目的とし、また過去の発明によっても、本発明は先行日付のかかる出版物に対して権利を主張する資格を有さないという承認であると、そのような引用を解釈すべきでない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３−１】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４７−３】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図４９−３】
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【図４９−４】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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