(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について医療装置のルーメンの構築物の材料を試験するための方法であって、前記方法は、
前記ルーメン中に液体培地を注入するステップと、
前記ルーメンに注入された前記液体培地を前記ルーメンの壁の構築物の材料と接触した状態でインキュベートするステップと、
前記インキュベート後に、回収された液体培地を提供するように、前記ルーメンから前記液体培地を回収するステップと、
少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体をコードする外来性ＤＮＡを含む少なくとも１つの細胞を回収された前記液体培地と接触させるステップと、
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について前記ルーメンを評価するために、前記細胞による少なくとも１つの前記Ｔｏｌｌ様受容体の発現における構築物の材料への前記接触の効果を評価するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記医療装置は、医療送達装置である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記液体培地は、水性培地である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの細胞は、細胞の集団である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記集団は、クローン集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記クローン集団は、ヒト胚性腎臓細胞のクローン集団である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つＴｏｌｌ様受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４、またはこれらの両方を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地は、細胞生育培地である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ルーメン内で前記インキュベートするステップおよび前記接触させるステップを同時に行なうステップを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インキュベートするステップは、前記液体培地を前記少なくとも１つの細胞の非存在下で前記ルーメンの前記壁と接触した状態でインキュベートするステップを含み、前記方法はさらに、前記インキュベートするステップの後かつ前記接触させるステップの前に、前記液体培地を前記ルーメンから取除くステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について医療装置のルーメンの構築物の材料を試験するための方法であって、前記方法は、
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について前記ルーメンを評価するために、
細胞の自然免疫応答における前記ルーメンの効果について、前記ルーメンが無傷のままである間のルーメンの構築物の材料を評価する第１のステップと、
細胞の少なくとも１つの他の特性における前記ルーメンの効果について、前記ルーメンが無傷のままである間のルーメンの構築物の材料を評価する第２のステップとを含み、前記少なくとも１つの他の特性は、細胞毒性、運動性、生存率、および代謝活性から選択される、方法。
【請求項１４】
前記医療装置は、医療送達装置である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記評価する第２のステップは、細胞の細胞毒性および細胞の代謝活性の両方に対する前記ルーメンの影響を評価するステップを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について医療装置のルーメンの構築物の材料を評価するための方法であって、前記方法は、
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について前記ルーメンを評価するために、
少なくとも１つの細胞を、前記ルーメンの壁の構築物の材料と接触した状態で前記ルーメン内でインキュベートされた液体培地と接触させるステップと、
前記少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの特性に対する前記接触させるステップの効果を評価するステップとを含み、前記少なくとも１つの特性は前記細胞の自然免疫応答を含む、方法。
【請求項１７】
前記医療装置は、医療送達装置である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの特性は、代謝活性を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記液体培地は、１時間より長い時間前記ルーメンの壁の構築物の材料と接触した状態でインキュベートされた、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体培地は、細胞生育培地を含む、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記評価するステップは、前記細胞による少なくとも１つのタンパク質の発現のレベルを決定するステップを含む、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの細胞は、細胞の集団である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞の集団は、細胞のクローン集団である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞の集団は、細胞の異種集団である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞の異種集団は、骨髄により提供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果についてアセンブリの部品により構成されたルーメンを試験するための方法であって、前記方法は、
ルーメンを介して送達された細胞におけるルーメンの潜在的効果について前記ルーメンを評価するために、
前記ルーメン内で液体培地をサンプルアセンブリの前記ルーメンの壁と接触した状態でインキュベートするステップを含み、前記サンプルアセンブリは、前記ルーメンを構成するようにサンプルの第２の部品に結合されたサンプルの第１の部品を含み、前記方法はさらに、
前記インキュベート後に、回収された液体培地を提供するように、前記ルーメンから前記液体培地を回収するステップと、
少なくとも１つの細胞を回収された前記液体培地に接触させるステップと、
前記細胞の少なくとも１つの特性に対する前記接触させるステップの効果を評価するステップとを含む、方法。
【請求項２７】
前記アセンブリは、細胞送達アセンブリであり、前記サンプルの第１の部品は、サンプルの第１の送達部品であり、前記サンプルの第２の部品は、サンプルの第２の送達部品である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、哺乳類細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの細胞は、細胞の集団である、請求項２６から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記集団は、クローン集団である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記クローン集団は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体をコードする外来性ＤＮＡを含むヒト胚性腎臓細胞のクローン集団である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体２、Ｔｏｌｌ様受容体４、またはこれらの両方を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記培地は、細胞生育培地である、請求項２６から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ルーメン内で前記インキュベートするステップおよび前記接触させるステップを同時に行なうステップを含む、請求項２６から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記インキュベートするステップは、前記液体培地を、前記少なくとも１つの細胞の非存在下で前記ルーメンの壁に接触した状態でインキュベートするステップを含み、前記方法はさらに、前記インキュベートするステップ後かつ前記接触させるステップの前に前記液体培地を前記ルーメンから取除くステップを含む、請求項２６から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの特性は、細胞毒性、代謝活性、運動性、生存率、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２６から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記インキュベートするステップは、少なくとも３０分間の時間である、請求項２６から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記インキュベートするステップは、３０分から４８時間の時間である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
経路を介して送達された細胞における経路の潜在的効果についての経路の評価を含むキット製造方法であって、前記方法は、
第１の送達部品の複数の単位を含む第１の装置ロットを製造するステップを含み、前記第１の送達部品の前記複数の単位の各々は、細胞の通過のための第１のルーメンを有し、前記方法はさらに、
第２の送達部品の複数の単位を含む第２の装置ロットを製造するステップを含み、前記第２の送達部品の前記複数の単位の各々は、細胞の通過のための第２のルーメンを有し、前記第１の送達部品は、細胞を通過させるための経路を有する送達アセンブリを設けるように前記第２の送達部品と連結可能であり、前記経路は、前記第１のルーメンおよび前記第２のルーメンを含み、前記方法はさらに、
前記第１の装置ロットをサンプリングし、前記第１の送達部品の第１の試験サンプル単位を得るステップと、
前記第２の装置ロットをサンプリングし、前記第２の送達部品の第２の試験サンプル単位を得るステップと、
前記第１の試験サンプル単位の１つと前記第２の試験サンプル単位の１つとを連結して、前記第１の試験サンプル単位の前記第１のルーメンと前記第２の試験サンプル単位の前記第２のルーメンとを含む経路を有するサンプル送達アセンブリを設けるステップと、
経路を介して送達された細胞における経路の潜在的効果について経路を評価するために細胞の少なくとも１つの特性に対する経路の効果について前記経路を評価するステップと、
前記第１の装置ロットからの前記第１の送達部品と前記第２の装置ロットからの前記第２の送達部品とをパッケージングするステップとを含む、方法。
【請求項４１】
前記評価するステップは、
前記経路に細胞を通過させるステップと、
前記通過させるステップの後に前記細胞を回収するステップと、
前記回収された細胞を前記細胞の少なくとも１つの特性に対する前記経路の効果について評価するステップとを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記評価するステップは、
液体培地を前記経路の壁と接触した状態でインキュベートして、処置された培地を形成するステップを含み、前記壁は、前記第１のルーメンからの壁部分および前記第２のルーメンからの壁部分を含み、前記評価するステップはさらに、
細胞を前記処置された培地と接触させるステップを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記パッケージングするステップの前に、前記サンプル送達アセンブリが、細胞の少なくとも１つの特性に対する前記影響に関する少なくとも１つの所定の基準を満たすことを決定するステップをさらに含む、請求項４０から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの特性は、細胞毒性、代謝活性、自然免疫応答、移入、生存率、おびこれらの任意の組合せから選択される、請求項４０から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの特性は、代謝活性を含む、請求項４０から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの特性は、自然免疫応答を含む、請求項４０から４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本発明は、「医療装置設計、製造および試験システム」と題され、２０１２年９月２６日に出願された米国仮特許出願連続番号第６１／７０５，６５０号の優先権の利益を主張し、この文献は、本明細書中にその全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
本発明は、概して、細胞送達のために用いられ得る医療装置に関し、特定の実施形態では、当該医療装置の送達経路を細胞に対する影響について試験することが可能であるシステムおよび方法に関する。
【０００３】
細胞治療の分野は、幅広いさまざまな症状または傷害にわたって患者に改善された医療処置を提供するために、ここしばらく研究されてきた。研究ではいくらか見込みが示されているにもかかわらず、細胞治療の臨床実施は遅れている。確実に患者に有益となることが証明された細胞のタイプおよび投与形態の特定は難しく、臨床設定における失敗または単に孤発性の成功の理由はよくわかっていない。細胞は、物理的および化学的刺激の両方に感受性があることが知られているが、提案された治療の効果を減ずる有益または有益でない刺激の特定は、限定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多くの提案された臨床応用では、細胞は患者に非侵襲的に導入される必要があり、このような目的のために送達装置が必要とされる。しかしながら、細胞治療における細胞用の送達装置を開発または製造するときにどのような規格を考慮する必要があるかについての研究または理解はほとんど報告されていない。したがって、治療剤、すなわち細胞の生物学的感受性、ならびに医療送達装置の設計および製造の複雑性の両方を考慮するという非常に重要なニーズが当該分野に存在する。本発明は、その局面の少なくともいくつかにおいて、これらのニーズに対応する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本発明の一定の局面は、医療装置を生細胞に対する影響について試験するシステムおよび方法に関し、当該影響は、たとえば、治療目的でヒトまたは動物の患者に導入される際の細胞の能力に関する細胞特性に対する影響を含む。この影響は、一部の実施形態では、免疫応答、代謝活性、生存率（たとえば、曝露後の生細胞百分率など）、細胞毒性応答、増殖、望ましくない経路に下がる活性、コロニー形成の能力、および／または移入に関し得る。サンプル試験細胞は、医療送達装置の送達経路を介して通過され、回収され得る、または、医療装置の表面の存在下に置かれるおよび／もしくは医療装置の表面に接触され、回収され得る。次いで、回収された細胞は、細胞の特性を判定するために評価され得る。回収された細胞からの結果は、対照細胞からの対応する結果と比較され、医療送達装置または他の医療装置の細胞に対する潜在的な影響を判定し得る。これらの方法は、医療装置もしくはプロセス設計もしくは検証の一部として、および／または装置ロット認可の一部として使用され得る。特定の実施形態では、細胞ベースの試験は、細胞送達経路を構成するように互いに連結された少なくとも第１および第２の送達部品を含む部品アセンブリである医療送達装置に対して行われ得る。このように、エンドユーザにより使用される送達経路全体を、部品経路を別個に評価するのではなくまたはそれに加えて、細胞に対する影響について評価することができる。これは、別個の部品の曝露と経路全体の曝露との間に生じ得る細胞作用の潜在的な差異を説明するために用いられ得る。これらの差異は、たとえば、異なる材料もしくは表面特徴との接触、部品間の接続領域、または、送達経路全体を通過中の流動ストレスに起因し得る。
【０００６】
追加の実施形態ならびにそれらに関連付けられる特徴および利点は、本明細書中の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の製造方法の一実施形態の概略図である。
【図２】ＴＬＲ−２受容体を介したＮＦ−ＫＢ経路の活性化／抑制を図示するグラフである。ＴＬＲ−２受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を、陰性（ＲＰＭＩ）および陽性（ＰＡＭ３ＣＳＫ４）対照の存在下、さらに、銅、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）およびCook Advance 35LPバルーンカテーテルのルーメンと接触した状態でインキュベートされた培地の存在下で培養し、各々は、以下の実施例１にさらに説明するように、本明細書中ではＬＯＴ１として特定される第１の製造ロットからそれぞれ採取した３つの複写物を有する４つのサンプルの平均として示される。
【図３】以下の実施例１にさらに説明するように、図２を生成するために用いられたＬＯＴ１からの個々の複写物のＮＦ−ＫＢ活性化／抑制レベルを図示するグラフである。
【図４】ＴＬＲ−２受容体を介したＮＦ−ＫＢ経路の活性化／抑制を図示するグラフである。ＴＬＲ−２受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を、陰性（ＲＰＭＩ）および陽性（ＰＡＭ３ＣＳＫ４）対照の存在下、さらに、銅、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）およびCook Advance 35LPバルーンカテーテルのルーメンと接触した状態でインキュベートされた培地の存在下で培養し、各々は、以下の実施例１にさらに説明するように、本明細書中ではＬＯＴ２として特定される第２の製造ロットからそれぞれ採取した３つの複写物を有する４つのサンプルの平均として示される。
【図５】以下の実施例１にさらに説明するように、図４を生成するために用いられたＬＯＴ２からの個々の複写物のＮＦ−ＫＢ活性化／抑制レベルを図示するグラフである。
【図６】代謝活性および細胞毒性試験の目的で、適用条件の非存在下（対照）、ラテックスの存在下でインキュベートされた培地の存在下（陽性対照として使用）、または、ＬＯＴ１およびＬＯＴ２から採取した複写物３５ＬＰサンプルのルーメンでインキュベートされた培地の存在下で培養後のＵ９３７細胞の代謝活性および全細胞毒性応答を図示するグラフである（この代謝活性および細胞毒性試験のための複写物３５ＬＰサンプルは、上述のＴＬＲ試験から再利用されたサンプルに対して新しいサンプルである。各３５ＬＰ複写物からインキュベートされた培地を別個のアリコートに分割し、別個のアッセイに用いた）。
【図７】代謝活性および細胞毒性試験の目的で、適用条件の非存在下（対照）、ラテックスの存在下でインキュベートされた培地の存在下（陽性対照として使用）、または、ＬＯＴ１およびＬＯＴ２から採取した複写物３５ＬＰサンプルのルーメンでインキュベートされた培地の存在下で培養後のＵ９３７細胞の代謝活性および全細胞毒性応答を図示するグラフである（この代謝活性および細胞毒性試験のための複写物３５ＬＰサンプルは、上述のＴＬＲ試験から再利用されたサンプルに対して新しいサンプルである。各３５ＬＰ複写物からインキュベートされた培地を別個のアリコートに分割し、別個のアッセイに用いた）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
以下、本発明の原則の理解を促す目的で実施形態を参照し、これらの一部を図面に図示し、これらの実施形態を示すために特定の文言を用いる。しかしながら、これにより発明の範囲の限定を意図するものではないことが理解されるであろう。記載される実施形態における任意の変更およびさらなる改良、ならびに、本明細書中で説明されるような発明の原則の任意のさらなる適用が、通常、本発明に関する技術分野の当業者に想定され得るように包含される。
【０００９】
上に開示したように、本発明の局面は、患者に細胞を送達するために用いられ得る医療送達装置の送達経路（たとえば、個々の部品またはアセンブリとしてなど）を試験するため、および／または、細胞がたとえば接触もしくは近くに存在することによりそれに曝露される医療装置の他の領域もしくは表面を試験するための方法およびシステムに関する。特定の実施形態では、試験細胞は、場合によってはインキュベーション時間にわたって、医療装置のルーメンの壁もしくは他の表面、および／または、医療装置のルーメンの壁もしくは他の表面と接触した液体培地と接触される。次いで、試験細胞は、試験細胞の少なくとも１つ、好ましくは複数の特性に対する、壁もしくは他の表面接触、または液体培地接触の影響について評価される。この影響は、一部の実施形態では、免疫応答、代謝活性、生存率、細胞毒性応答、増殖、および／または移入に関係し得る。記載されるような方法およびシステムは、たとえば、製品設計もしくはプロセス入力、製品設計もしくはプロセス検証、および／または装置ロット発売基準についての規格を設けるために、カニューレ状送達装置または他の医療装置の開発、製造および／または分配において用いられることができる。さらに、当該方法およびシステムに従って生産される装置または製品、ならびに、これらを分配するための方法が記載される。
【００１０】
本明細書における実施形態は、医療装置を試験するために有用である。特定の実施形態では、流動可能な材料、特に、液体、ゲルまたはペーストなどの細胞を含有する流動可能な材料の送達のためのルーメンまたは他の経路を規定する医療送達装置を試験することができる。このような被試験送達装置または他の医療装置は、一体型構造であっても、複数の部品のアセンブリであることもできる。送達装置は、被試験ルーメンを有するカテーテル、被試験ルーメンを有するカテーテルハブ、被試験ルーメンを有する針、被試験ルーメンを有する針ハブ、および被試験バレルを有するシリンジのうち１つ以上を含み得る。カテーテルは、たとえば、バルーンカテーテルに具現化されるように、拡大可能な部分を有してもよい。これらの装置の一部またはすべては、互いにまたは他の装置と相互に接続可能であり、これらのための改造を有し得る。例示的には、これらの装置は、標準的なルア−ロック機構、プレス嵌めまたは他の摩擦嵌め、または任意の他の好適な接続機構において、互いにねじ切りされた接続を設けるように構成されて、細胞調剤に接触する、これを通過させるまたは保持し得る流動可能な材料の送達のための全体的な経路または別の装置領域を設けるアセンブリを構成し得る。試験され得るさらに他の医療装置は、たとえば、バッグまたはバイアルなど、細胞を保存する、または保持するための装置を含む。たとえば、細胞を保存する、または保持するように構成される当該装置の内部領域は、本明細書中の開示に従って試験されることができる。
【００１１】
医療送達装置または他の医療装置部品は、任意の好適な材料または材料の組合せを含むように作られ得る。当該装置には、典型的には、ポリマー材料および金属材料が含まれる。好適なポリマー材料としては、たとえば、酢酸セルロース、硝酸セルロース、シリコーン、架橋ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリアミド、スチレンイソブチレン−スチレンブロックコポリマー（Ｋｒａｔｏｎ）、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、高分子量ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリ乳酸またはポリグリコール酸またはこれらのコポリマー、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸吉草酸、または、他の生分解性ポリマー、またはこれらの特定されたポリマーの任意の混合物またはコポリマーが含まれる。好適な金属としては、ステンレス鋼、ニチノール、ＭＰ３５Ｎ、金、タンタル、白金または白金イリジウム、ニオビウム、タングステン、インコネル、ニッケル、チタン、ステンレス鋼／チタン複合体、コバルト、クロム、コバルト／クロム合金、マグネシウム、アルミニウム、または他の生体適合性金属および／またはこれらの複合体または合金が含まれる。医療装置ルーメンの壁または他の送達経路は、これらの、または他の、好適な材料の任意の１つまたは組合せを含み得る。
【００１２】
本発明の局面によれば、サンプルは、当該サンプルを、医療装置の壁、たとえば、使用中に細胞または細胞調剤と接触することが予想される医療装置送達経路または他の医療装置領域を規定する壁と何らかの形で接触させることによって、試験用に調製される。一部の実施形態では、サンプル材料は、それが経路の壁または他の医療装置領域と接触される際に細胞を含むことになる。当該細胞調剤と経路または他の医療装置領域との接触は、任意の好適なインキュベーション時間行われればよく、当該接触は、いくつかの局面では、送達経路または他の医療装置領域の典型的なケースまたは最悪のケースの使用から予想されるよりも長いインキュベーション時間である。これは、経路または他の領域を試験する際に安全面要因を含む助けをし得る。経路の壁または他の領域と接触した状態でのサンプルのインキュベーションは、静的条件、流動条件、またはこれらの両方の条件下で行なわれてもよい。静的接触戦略の例は、経路の壁または他の領域の構築物の材料、たとえば、ポリマー材料、および／またはこのような構築物の材料から浸出し得る任意の材料などに対する細胞の感受性について試験するときに求められ得る。細胞調剤と経路または他の領域との流動接触の例は、すぐ上に述べた例の他、最終的に経路から患者内に送達されるまたは装置領域に付着せずに残る細胞の数または用量に影響を及ぼす可能性のあるような、流動条件下での細胞の経路壁または他の壁への付着の傾向についての試験を含む。流動条件が使用されるとき、最悪のケースの試験が行なわれ得る。これは、送達経路または他の装置領域の使用中に臨床的に使用される最低の予想流動速度の流動速度における最悪のケースの遅い流動試験を含み得る。経路壁または他の領域壁に付着する傾向のあり得る細胞については、これは、医療装置の経路または他の領域から放出される細胞の用量に関連する試験に組込まれ得る。最悪のケースの速い流動試験は、経路または領域の臨床使用中に適用されることが予想される最大流動速度以上の流動速度で行なわれ得る。細胞は、高速流動中に発生され得るせん断力または他の力に対して感受性があり得るため、この最悪のケースの試験は、たとえば、送達経路または他の装置領域の、経路または他の領域から一旦放出された細胞の能力特性に対する任意の影響についての試験において用いられ得る。
【００１３】
上述のように、試験される送達経路または他の領域は、単一の装置、またはアセンブリ形態で設けられる装置の組合せから規定され得る。このようなアセンブリでは、装置の各々におけるルーメンまたは通路または領域は、典型的には、互いに流動的に結合し、全体的なルーメンまたは通路または領域を構成する。このような全体的な経路または領域の物理的パラメータは、それぞれの結合された装置の各個々の経路のみでなく、結合のための領域および任意の空隙、棚部、直径の変化、または装置の結合領域で生じる他の物理的変動によっても決定される。これらの結合領域における潜在的な凹凸は、細胞が、たとえば、経路または領域表面における凹凸内に捕捉されるまたは付着することによってなど、たとえば、予期される送達条件下ですらも、細胞が経路または他の領域内に保持される傾向に影響を及ぼし、さらに、細胞が曝露される流動条件にも影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、経路または他の領域は、シリンジバレル、カテーテル、および針の少なくとも２つ、さらに場合によっては、これらの部品の３つのすべてを含むアセンブリによって規定される。さらに他の送達装置または装置部品は、単独またはアセンブリのいずれかで用いられ得ることが理解されるであろう。さらに、特定の実施形態では、装置または装置のアセンブリによって規定される送達経路または他の領域は、臨床使用中に予想される方法で操作されることができる。この操作は、臨床使用中に予想されるたとえば屈折形状などの予想される形状に送達経路を物理的に位置付ける、たとえばガイドワイヤなどの別の装置との接触、または、経路もしくは他の領域と試験細胞との接触前に、患者における使用中に予想されるような生物学的成分で送達経路を条件付けするために、たとえば、血液または血液フラクションへの曝露など、臨床使用中に予想される経路または他の領域の材料または培地への曝露を含み得る。
【００１４】
送達経路または他の領域試験は、行なわれる試験に好適な温度で行なわれる。経路または他の領域は、経路または他の領域との試験のために開発されるべきサンプルの接触中に冷却される、加熱される、または室温（たとえば、約２２から２５℃）に保持され得る。細胞調剤がサンプル中に含まれる場合、一部の試験は、約生理温度（約３７℃）で、および／または、たとえば約１０分から５時間、または約３０分から約３時間の好適な接触時間接触ステップを行なう。送達経路または他の領域をこのような温度に加熱するために、たとえば、インキュベータまたは水浴を含む、任意の好適な構成が用いられ得る。他のサンプル接触について、たとえば、サンプルを開発するための細胞の非存在下では、たとえば、室温または冷温などの生理温度より低い温度が使用されることもあり得る。
【００１５】
発明の特定の実施形態では、細胞の非存在下でのサンプルが、送達経路または他の装置領域と接触される。このサンプルは、細胞培養培地からなり得る。上述のように、サンプル接触の条件は、流動条件、静的条件、または組合された流動条件および静的条件下であり得る。有利には、細胞の非存在下での試験のためのサンプルを開発する際には、たとえば、試験レジメンに十分な安全面要因を設けるために、送達経路または他の領域内での長い滞留時間が利用され得る。
【００１６】
細胞の非存在下でのサンプル滞留時間は、異なり得る。特定の実施形態では、サンプル滞留時間は、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、または少なくとも約２時間、たとえば、約３０分から約４８時間の範囲、または約１時間から約２４時間の範囲、または約１時間から５時間の範囲である。一部の局面では、細胞の非存在下でのサンプル滞留時間は、約１０時間を上回り、たとえば、約１０時間から４８時間の範囲である。このインキュベーション時間は、細胞がそれに対して感受性があり得る、送達経路およびそれを規定する壁によって放出され得る任意の不純物または他の浸出助剤でサンプルを条件付けするのに十分となり得る。細胞を含有しないサンプルがこのように条件付けされた後、それは送達経路から回収され、次いで、試験細胞と接触した状態での試験で使用され得る。この点では、当該細胞を含有しないサンプルまたは細胞含有サンプルについては上述されており、送達経路から回収されたサンプル量は、一部の局面では、複数のアリコートに分割されて同一または異なる性質の複数の試験で使用可能な程度に十分に多い量となり得る。
【００１７】
上に説明したようにまたは好適に開発されたサンプルは、送達経路が細胞に対して影響を及ぼし得るかどうかを判定するために評価される。たとえば、代謝活性、生存率、運動性、増殖、コロニー形成、または自然免疫もしくは獲得免疫に対する影響を含む免疫影響を含む、幅広いさまざまな細胞毒性が試験され得る。これらのまたは他の細胞毒性についてのさまざまな試験が知られており、使用可能である。細胞に対する影響についてのアッセイは、定質的または定量的な性質であり得、たとえば、タンパク質の発現またはＤＮＡ要素の転写について評価し得る。このような発現または転写アッセイは、タンパク質またはＤＮＡ要素の選択された１つまたは群について試験し得る、または、一部の場合には、細胞についての発現もしくは転写プロファイル全体に関与する。このようなアッセイは、生菌（たとえば、蛍光活性化細胞選別など）を利用し得る、または、発現もしくは転写試験において調製されるものなどの細胞抽出液を利用し得る。さらに、用量試験においては、送達経路を通過中に生じる細胞数の損失を判定するために、細胞調剤が送達経路を通過する前後に細胞数または推定が与えられ得る。
【００１８】
これらの試験または他の判定試験の各々は、当該技術分野で周知のように、好適な対照を利用することができ、典型的には利用する。対照は、陽性対照、陰性またはヌル対照であり得る。
【００１９】
本明細書中に記載される試験方法は、広範囲のさまざまな装置設計、開発または製造目的で用いられ得る。例示的には、装置設計においては、本明細書中に記載される試験の１つ以上が、意図される送達装置についての物理的パラメータおよび／または構造物の材料パラメータの選択および試験において用いられ得る。これらの点において、本明細書中に記載される試験は、設計または検証入力として用いられ得る。さらに、装置開発中、本明細書中に記載されるような試験は、装置またはその製造プロセスのための設計入力または検証のための規格として用いられ得る。さらに、本明細書中に記載されるような試験は、商業用分配のための装置の製造中に用いられ得る。一局面では、本明細書中に記載されるような試験は、ロット発売基準として用いられ得る。このような実施形態では、製造された装置のロットは、ロット発売基準と呼ばれる、本明細書中に記載されるような試験が完了するまで単離されるまたは隔離され得る。試験の通過後、装置は分配のために発売され、エンドユーザに分配され得る。
【００２０】
ここで図１を参照して、本発明のキット製造方法の一実施形態が開示される。当該方法において、キットの製造ロット１６が生産されるべきである。このためには、送達アセンブリの第１の部品の第１のロット１２が、送達アセンブリの第２および第３の部品のロット１３およびロット１４とともに、それぞれ製造される。サンプル部品１２ａから１２ｃがロット１２から採取され、サンプル部品１３ａから１３ｃがロット１３から採取され、サンプル部品１４ａから１４ｃがロット１４から採取される。これらのサンプルは、それぞれ他のロットからのサンプルの１つと対をなし、サンプル送達アセンブリ１２１３１４ａ、１２１３１４ｂ、および１２１３１４ｃを作成する。これらのそれぞれのサンプルアセンブリは、それぞれ、示されるように、試験Ａ、試験Ｂ、および試験Ｃに供される。これらの試験は、たとえば、ロット１６において製造されるキットについてのロット発売要件の一部であり得る。試験Ａ、試験Ｂおよび試験Ｃは、本明細書中に記載されるような細胞関連試験の任意の１つまたは組合せを含み得る。さらに、開示されるようなサンプルアセンブリの試験に加えて、ロット１２、１３および１４からの個々の装置が単独で試験され得る。サンプルアセンブリ１２１３１４ａからｃが、判定ステップ１５おけるように、試験ａ、ｂおよびｃをそれぞれ通過すると、ロット１２からの装置１２ｄ〜ｌ、ロット１３からの装置１３ｄ〜ｌ、およびロット１４からの装置１４ｄ〜ｌが示されるようにパッケージング１７によりパッケージングされ、随意的に末端が殺菌され得る。追加の潜在的なサンプリングステップにおいて、キットロット１６からのキットのサンプルを採取し、開封し、それぞれの部品を組合せて追加のサンプルアセンブリを作ってもよく、これらを本明細書中に記載される方法の任意の１つまたは組合せを用いて細胞関連試験に供することもできる。その後、ロット１６からのキットは、エンドユーザへの分配のために発売され得る。
【００２１】
幅広いさまざまな細胞のタイプの任意の１つまたは任意の組合せが、本発明の試験方法のためのサンプルおよび／または医療送達装置からの送達のための標的細胞タイプとして用いられ得る。たとえば、細胞は、皮膚細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肺細胞、腸間膜細胞、または脂肪細胞であり得る。脂肪細胞は、大網脂肪、腹膜前脂肪、腎周囲脂肪、心膜脂肪、皮下脂肪、胸脂肪、または副睾丸脂肪由来であり得る。特定の実施形態では、細胞は、間質細胞、幹細胞、またはこれらの組合せを含む。本明細書中に用いられる「幹細胞」という用語は、広義の意味で用いられ、従来の幹細胞、脂肪由来幹細胞、前駆細胞、プレ前駆細胞、予備細胞などを含む。例示的な幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、筋肉前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ球系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞などを含む。使用可能な追加の例示的な細胞は、肝細胞、上皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ニューロン、心筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、膵臓胞状細胞、ランゲルハンス島、骨細胞、筋芽細胞、随伴細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、胆汁上皮細胞、およびこれらの細胞タイプの任意の前駆細胞を含む。
【００２２】
本明細書中に特定された細胞の任意の混合物、または他の混合物も利用し得る。特定の実施形態では、天然の細胞混合物、またはこれらのフラクションが用いられ得る。これらの実施形態の例は、末梢血またはこれらのフラクションの使用、骨髄またはこれらのフラクションの使用、臍帯血またはこれらのフラクションの使用を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、細胞は、内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）である、またはこれらを含む。本発明における使用のために好適なＥＰＣは、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣｓ）、特に、高い増殖能を有するＥＣＦＣである。好適なこのような細胞は、たとえば、２００５年２月９日に出願された米国特許出願連続番号第１１/０５５，１８２号を公開する、２００５年１２月１日に公開された米国特許出願公開第２００５０２６６５５６号、および、２００７年８月１３日に出願された米国特許出願番号第１１／８３７，９９９号を公開する、２００８年１月１日に公開された米国特許出願公開第２００８００２５９５６号に記載され、これらの文献の各々は、その全体が本明細書中に参照により援用される。このようなＥＣＦＣ細胞は、クローン集団であり得る、および／または、ヒトまたは他の動物の臍帯血から得られ得る。さらに、または代替的に、内皮コロニー形成細胞は、次の特徴を有する：（ａ）細胞表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、およびＣＤ１４４を発現する；および／または（ｂ）ＣＤ４５およびＣＤ１４を発現しない；および／または（ｃ）アセチル化ＬＤＬを摂取する；および／または（ｄ）単一細胞から平板培養されると、少なくとも２０００個の細胞の少なくとも二次コロニーに再播種する；および／または（ｅ）ＨｅＬａ細胞により発現されるレベルの少なくとも３４％である高レベルのテロメラーゼを発現する；および／または（ｆ）０．８より大きい核対細胞質比を示す；および／または（ｇ）約２２ミクロン未満の細胞直径を有する。これらの特徴（ａ）から（ｇ）の一部の任意の組合せまたはすべてが本発明において用いられるＥＣＦＣを特徴付けてもよい。
【００２４】
他の実施形態では、細胞は、筋肉由来細胞である、またはこれらを含み、筋肉由来筋芽細胞および／または筋肉由来幹細胞を含む。好適なこのような幹細胞およびこれらを得るための方法は、たとえば、米国特許第６，８６６，８４２号および米国特許第７，１５５，４１７号に記載され、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。筋肉由来細胞は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ミオＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、および／またはＢｃｌ−２を発現し得、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカの発現を欠如し得る。
【００２５】
さらに他の実施形態では、細胞は、脂肪組織由来の幹細胞である、またはこれらを含む。好適なこのような細胞およびこれらを得るための方法は、たとえば、米国特許第６，７７７，２３１号および米国特許第７，５９５，０４３号に記載され、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。細胞集団は、脂肪由来の幹細胞および新生細胞を含み得、これらは間質血管フラクション細胞と呼ばれることもあり、幹細胞、内皮前駆細胞、白血球、内皮細胞、および血管平滑筋細胞を含む混合集団であり得、これらは成人由来であり得る。特定の形態では、細胞は、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、または筋肉細胞の２つ以上に分化し得る脂肪由来細胞を含み得る。
【００２６】
試験において用いられる細胞は、遺伝子非組換または遺伝子組換細胞のいずれかであり得る。遺伝子組換細胞は、タンパク質または他の関心の物質をコードする発現可能なＤＮＡを含むように組換えられた細胞を含み得る。次いで、細胞は、細胞送達経路がタンパク質または他の関心の物質の発現に対して何らかの影響（たとえば、抑制または活性化を含む）を及ぼすかどうかを判定するために試験において用いられ得る。例示的には、細胞は、たとえば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、もしくはＴＬＲ−７などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）など、免疫応答に関与するタンパク質または他の物質をコードする外来性ＤＮＡを含むようにトランスフェクションまたはその他の方法により遺伝子組換えされ得る。次いで、これらのＴＬＲ組換細胞は、送達経路が細胞によるＴＬＲ発現に対して影響を及ぼすかどうかを判定するために、本明細書中に記載されるように、試験において用いられ得る。
【００２７】
特定の実施形態では、本明細書中に記載されるように単一の部品またはアセンブリであり得る医療送達装置送達経路または他の医療装置領域は、たとえば、本明細書中に開示されるもののいずれか、たとえば２つ以上、または３つ以上の異なる細胞タイプまたは調剤など、複数の異なる細胞タイプまたは調剤の存在下で試験される。さらに、各異なる細胞タイプまたは細胞調剤タイプについて、医療送達装置送達経路または他の医療装置領域の、たとえば、本明細書中に開示されるもののいずれかなどの細胞の複数の特性（たとえば、２つ以上、または３つ以上の特性）に対する影響が試験され得る。
【００２８】
本明細書の局面のさらなる理解を促す目的で以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示的であって、限定的な性質でないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【００２９】
自然免疫応答アッセイ
本実施例は、細胞自然免疫応答に対するカテーテルルーメンの影響についての評価のための細胞ベースアッセイを説明する。具体的には、本明細書においては、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を発現する遺伝子組換え細胞を用いて、細胞におけるＴＬＲ２またはＴＬＲ４発現を活性化または抑制する能力についてカテーテルルーメンを評価した。
【００３０】
材料
異なるＴＬＲプラスミド−２、−４、または−７が安定にトランスフェクトされたヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞（ＴＬＲ４細胞にはＣＤ１４およびＭＤ−２も同時トランスフェクトされた）をInvivoGen社（カリフォルニア９２１２１、サンディエゴ）から入手した。
【００３１】
Cook Advance 35LPカテーテルをクックメディカル社（Cook Medical）、インディアナ州、ブルーミントンから入手した。
【００３２】
ＨＥＫ−２９３細胞用の培養培地をInvivoGen社（カリフォルニア９２１２１、サンディエゴ）から入手した。
【００３３】
陽性対照として用いた他の試験材料は、銅およびＰＶＣの管状材料であった。用いた銅製管状材料は、インディアナ州、ブルーミントンのクライドルファーの金物店（Kleindorfer's Hardware Store）から購入した厚さ１／８”の軟性冷却管状材料であった（製造業者：ケンブリッジ−リーインダストリーズ社（Cambridge-Lee Industries, Inc.）、製造業者注記：ＡＳＴＭ  Ｂ２８０およびＮＦＰＡ  ９９に従って洗浄した）。ＰＶＣ管状材料は、クックポリマーテクノロジー社（Cook Polymer Technology）により製造された８．０  ＦＲ  白であった（材料化合物＃１１０１１、クックポリマープロジェクト＃Ｄ−４５２０、押出成型２０００年）。ＤＭＥＭ（陰性対照）をInvivoGen社から入手し、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（陽性対照）をImgenex社から入手した。
【００３４】
方法
試験培地：ＨＥＫ−２９３細胞培養培地を、３５ＬＰカテーテルおよび他の試験材料と接触した状態で室温（２０から２２℃）で１６時間インキュベートした。ＬＯＴ１と呼ばれる第１の装置ロットから採取された３５ＬＰカテーテルについては、インキュベーション時間中、約１ｍＬの量の培養培地でガイドワイヤルーメンを完全に満たした。他のサンプルについては、この量は、銅（２ｍｌ）およびＰＶＣ（１．２ｍｌ）管の内径および長さのために異なったが、インキュベーション時間および温度は同一のままであった（インキュベーションプロセスを説明する）。インキュベーション時間後、条件付けされた培養培地のサンプルをＦＡＣＳ管内に回収し、いずれも細胞アッセイにおいて即座に使用した。
【００３５】
細胞培養：ＨＥＫ−２９３、ＴＬＲ−２トランスフェクト細胞を４０，０００細胞／ウェルの濃度で平板培養し、ＴＬＲ４トランスフェクト細胞を別個の９６ウェルプレートで１０，０００細胞／ウェルの濃度で平板培養した。細胞株販売者の資料に指示されるように、特定の培地補充物を各細胞株に添加した。すべての細胞毒性指標細胞を細胞培養インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）で２４時間インキュベートした。このインキュベーション時間後、細胞培地を取除き、装置に曝露した培地と取替えた。標準細胞培地を陰性対照として用いた。Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１０ｎｇ）およびＬＰＳ（１００μｇ）をそれぞれＴＬＲ２およびＴＬＲ４トランスフェクト細胞用の陽性対照として用いた。
【００３６】
ＮＦｋｂ活性化／抑制アッセイ：装置または陽性対照により修飾された細胞培養培地での２４時間のインキュベーション時間後、１５μＬアリコートの細胞培地上清を１８５μＬ／ウェル量のQuick-Blue発色基質を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。この基質を用いて、分泌型胚性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）酵素活性のレベルを定量化した。ＴＬＲ細胞株は、ＴＬＲ受容体と装置から浸出した夾雑物との相互作用の結果として生じるＴＬＲ関連シグナル伝達の量に依存して異なるレベルで胚性ＡＰ酵素形態を分泌する。ＴＬＲ型受容体の表面刺激によるＡＰ−１およびＮＦ−ｋＢタンパク質の両方の活性化により、ＡＰ−１およびＮＦ−ｋＢは、ＳＥＡＰレポータ遺伝子の転写を制御するプロモータ領域上の特異的結合部位に結合する。これにより、ＳＥＡＰ酵素の細胞培養培地内への産生および排出の増加が得られる。
【００３７】
ＡＰ基質発色反応をＣＯ２インキュベータ内で３７℃で３時間進行させた。吸光度をＯＤ６５５で測定するように設定したモレキュラーデバイスSpectra Max 250比色定量プレートリーダを用いて、ＡＰ関連基質発色の存在を評価した。ＴＬＲ細胞培養液からこの初めの１５μＬの細胞培養液上清を取除いた後、細胞培養プレートをさらに２４時間インキュベータ内に設置し直して、４８時間の時点も確保した。このとき、さらに１５μＬアリコートの細胞培養液上清を各ＴＬＲ細胞培養液から取出し、１８５μＬ／ウェルのQuick-Blue ＡＰ発色基質を含有する別の９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。次いで、この基質反応をＣＯ２インキュベータ内で３７℃で３時間インキュベートした。モレキュラーデバイスSpectra Max 250比色定量プレートリーダによりＯＤ６５０でQuick-Blue ＡＰ発色基質を再度測定し、ＳＥＡＰ産生の相対的レベルを定量化した。再度、ＳＥＡＰレポータ酵素分泌のレベルを、浸出した装置−管状材料夾雑物によるＴＬＲ型受容体刺激の度合いと相関付ける。結果を図１および図２（ＴＬＲ２試験）ならびに図３および図４（ＴＬＲ４試験）に示す。それぞれ平均化複写物値および個々の複写物値を示す図１および図２に示されるように、ＴＬＲ２は、陰性対照（ＲＰＭＩ）と比べて陽性対照（ＰＡＭ３ＣＳＫ４）において活性化された。試験品では、銅、ＰＶＣおよび３５ＬＰで条件付けされた培地サンプルは、すべて陰性対照と比べてＴＬＲ２を抑制し、３５ＬＰで条件付けされたサンプルは、銅およびＰＶＣより低い程度で抑制した。
【００３８】
図３および図４に示されるＴＬＲ４についての結果は、ＴＬＲ２についての結果と同様であった。ＴＬＲ４は、陰性対照（ＲＰＭＩ）と比べて陽性対照（ＬＰＳ）において活性化された。試験品では、銅、ＰＶＣおよび３５ＬＰで条件付けされた培地サンプルは、すべて陰性対照と比べてＴＬＲ４を抑制し、３５ＬＰで条件付けされたサンプルは、銅およびＰＶＣより低い程度で抑制した。
【実施例２】
【００３９】
代謝活性および細胞毒性アッセイ
本実施例は、細胞の代謝活性に対するカテーテルルーメンの影響について、または、カテーテルルーメンの細胞に対する潜在的な細胞毒性についての評価のための細胞ベースアッセイを説明する。具体的には、本明細書中では、これらの目的のためにＵ９３７細胞を用いた。
【００４０】
材料
Ｕ９３７細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）から入手した。
【００４１】
２つの異なる装置ロット（ＬＯＴ１およびＬＯＴ２と呼ばれる）からのCook Advance 35LPバルーンカテーテルをクックメディカル社（Cook Medical）、インディアナ州、ブルーミントンから入手した。
【００４２】
Ｕ９３７細胞用の培養培地をＡＴＣＣから入手した。これらの細胞を培養するために、ＡＴＣＣにより処方されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃａｔ＃３０−２００１）および１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンに全濃度１０％のウシ胎児血清を添加することによって、ＡＴＣＣ完全生育培地を調製した。細胞は、３７℃の湿潤化雰囲気内で９５％大気、５％ＣＯ２で培養した。
【００４３】
市販のラテックス管状材料（陽性対照）を入手した。
方法
試験培地：約１ｍＬのＵ９３７細胞培養培地を、３５ＬＰカテーテルおよびラテックス（陽性対照）と接触した状態でヒト生理温度（３７℃）で４８時間インキュベートした。３５ＬＰカテーテルについては、約１ｍＬの量の培養培地をルーメン内に注入することによって、各カテーテルのガイドワイヤルーメンを完全に満たし、その後、ルーメンをパラフィルムにより各端部で固定し、カテーテルを４８時間３７℃インキュベータでインキュベートした。インキュベーション時間後、条件付けされた培養培地のサンプルを１５ｍｌ円錐管に回収し、代謝活性および細胞毒性アッセイにおいて即座に使用した。
【００４４】
始原細胞培養：Ｕ９３７細胞を１ｍＬ当たり約５×１０５細胞でＴ７５細胞培養フラスコ内で継代７代目または８代目に培養した。この細胞を５０ｍｌ円錐管内に吸引後、細胞を室温で５分間３００×ｇで遠心分離した。この後、上清を取除き、ペレットを新しい培地に１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度となるように再懸濁させた。１×１０６細胞を与えるアリコートをキャップ付き１２×７５ｍｍポリスチレン管内に吸引し、管を室温で５分間３００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、培地を吸引し、管をラックに立て、ペレットをほぐした。１ｍＬの装置に曝露された処置培地またはラテックス管に曝露された処置培地をそれぞれの管内のペレットに添加し、未処置培地を対照管およびスタウロスポリン用の管に添加した。次いで、細胞を約５時間のインキュベーション時間２４ウェルプレートに移し、その後、２つの異なるアッセイを行った。
【００４５】
Presto Blueアッセイ：Presto Blueアッセイ（代謝活性）は、スタウロスポリンがウェルに添加された５時間後に測定されるように設定した。対照ウェルからの細胞を用いて、次の細胞培養培地、すなわち、培地のみ（ブランク）、３１，３００個の細胞、６２，５００個の細胞、１２５，０００個の細胞、２５０，０００個の細胞、および５００，０００個の細胞により標準曲線を作成した。９０μｌの各標準群および処置群を９６ウェルプレートに３組入れ、その後、１０μｌのPresto Blue試薬を全ウェルに添加した。プレートを覆い、３７℃インキュベータ内に３０分間設置した。このインキュベーション後、プレートを蛍光プレートリーダで測定した。
【００４６】
細胞生存率／細胞毒性アッセイ：各処置ウェルから２００μｌの細胞をキャップ付き１２×７５ｍｍポリスチレン管内にピペットで２組移した。ＦＡＭ−ＦＬＩＣＡアポトーシス検出プローブをＤＭＳＯで１５０倍ストック濃縮液に希釈した。使用前に１：７．５希釈液を調製して、２０倍作業液を得た。未染色細胞を除いて約１０μｌのこの作業液を各管に添加し、その後、管を４５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間後、未染色細胞を含む各管に２ｍＬの１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を添加した。次いで、管を室温で５分間３００×ｇで遠心分離した。次いで、培地を吸引し、管をラックに立て、ペレットをほぐした。上記工程を繰返して２回目の洗浄を行った。最後に、未染色細胞を含む各管に２００ミクロリットルの１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を添加し、測定前に氷上にセットした。
【００４７】
結果を図６（代謝活性）および図７（細胞毒性）に示し、これらは、行ったアッセイおよびそれらの改良が、選択される許容基準と比べて、カテーテルルーメンの細胞の代謝活性に対する影響または細胞の潜在的な細胞毒性についての評価に好適であることを示す。
【００４８】
本発明を説明する文脈（特に、以下の請求項の文脈）における単数形（"a"、"an"および"the"）の使用および類似の記載は、特に明細書中に記載がない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するとして解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、特に記載がない限り、その範囲内の各別個の値に個別に言及する速記法としての役割を果たすことを意図するに過ぎず、各別個の値は、それが明細書中に個別に記載されているかのように明細書中に組込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、特に明細書中に記載がない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順で実施することができる。本明細書に示される任意およびすべての例、または例示的な文言（たとえば「など」）の使用は、特に記載がない限り、発明をよりよく解説することを意図するに過ぎず、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。いずれの明細書中の文言も、任意の非クレーム要素が発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【００４９】
本発明を図面および上記の説明で詳細に例示および記載したが、図面および上記の説明は、限定的でなく、例示的な性質であるとしてみなされるべきであり、好ましい実施形態のみを示しかつ説明しており、発明の趣旨の範囲内であるすべての変更および改良が保護されることが望まれることを理解されるべきである。さらに、明細書中で引用されるすべての引用文献は、当業者のレベルを示し、これらの全体が参照により本明細書中で援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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