(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）と抗原ポリペプチドとが自己集合してなることを特徴とする、ポリペプチドワクチンミセル。
【請求項２】
前記ＰＥＧ化リン脂質分子中のポリエチレングリコール親水ブロックが、分子量５００〜１００００のＰＥＧ分子であり、好ましくはＰＥＧが１５００〜３０００、最も好ましくはＰＥＧが２０００であることと、
前記抗原ポリペプチドが、長さが５〜１００個のアミノ酸からなる抗原ポリペプチド、好ましくは１０〜５０個アミノ酸からなる抗原ポリペプチド、最も好ましくは２０〜３０個アミノ酸からなる抗原ポリペプチドであることを特徴とする、
請求項１に記載のポリペプチドワクチンミセル。
【請求項３】
前記ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）と抗原ポリペプチドとのモル比が７２０：４〜１６０であり、好ましいモル比が１８０：４であることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチドワクチンミセル。
【請求項４】
前記ポリペプチドワクチンミセルが免疫アジュバントをさらに含み、前記免疫アジュバントが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）アジュバントを含み、好ましくはモノホスホリルリピドＡアジュバントであることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチドワクチンミセル。
【請求項５】
ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）、抗原ポリペプチド、免疫アジュバントのモル比率の範囲が７２０：４〜１６０：３〜８０であり、好ましいモル比が、１８０：４：３であることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチドワクチンミセル。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法であって、
揮発性有機溶媒、水または塩緩衝液でＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）、抗原ポリペプチド分子、アジュバント分子を溶解し、担体分子溶液、抗原ポリペプチド溶液、アジュバント溶液を調製する、ステップ（１）と、
ターゲットのポリペプチドワクチンミセルにおける各成分の割合に応じて、前記ステップ（１）で得た担体分子溶液、ワクチン溶液、アジュバント溶液を均一に混合する、ステップ（２）と、
前記ステップ（２）で得た混合溶液における全ての有機溶媒を除去し、担体分子、ワクチン分子およびアジュバント分子に、均一に分布した混合脂質膜を形成させる、ステップ（３）と、
前記ステップ（３）で得た混合脂質膜を生理食塩水で溶解し、インキュベーション条件下で脂質膜を均一に水和させた後、室温で一定時間静置し、ワクチンミセル溶液を得る、ステップ（４）と、
前記ステップ（４）または（２）で得たワクチンミセル溶液に除菌処理を行うステップであって、前記除菌処理は、好ましくは０．２２μｍの濾過膜でのろ過である、ステップ（５）とを含むことを特徴とする、調製方法。
【請求項７】
得たワクチンミセル溶液に一定量の凍結乾燥保護剤を添加した後、ワクチンミセル溶液を凍結乾燥させ、ワクチンミセルの凍結乾燥粉末を得る、ステップ（６）をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
前記ステップ（１）に記載の前記揮発性有機溶媒が、メタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、アセトン、氷酢酸などであるか、またはそれらの混合物であることと、
前記ステップ（３）に記載の前記有機溶媒を除去する方法が、減圧水浴及び加熱回転蒸発であることと、
前記ステップ（４）に記載の前記インキュベーション条件が、４０〜６０℃の水浴で２０〜６０分間のインキュベーション、好ましくは５５℃の水浴で３０分間のインキュベーションであることと、
前記ステップ（６）に記載の前記凍結乾燥保護剤が０．０５ｇ／ｍｌのマンニトール、ラクトース、ソルビトール、デキストランなどであることとを特徴とする、
請求項６または７に記載の調製方法。
【請求項９】
腫瘍の治療または予防に用いられるワクチンであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドワクチンミセルと、薬学的に許容しうる添加剤とからなる、ワクチン。
【請求項１０】
（１）請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドワクチンミセル、または請求項９に記載のワクチンと、
（２）抗癌治療において有効な抗癌治療薬物とを含む、腫瘍の治療または予防に用いられる複合製剤であって、
前記複合製剤が前記抗癌治療薬物の効果を効果的に向上させうることを特徴とする、複合製剤。
【請求項１１】
前記抗癌治療薬物が、アルキル化剤、ヌクレオチドアナログ、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、抗有糸分裂薬、白金誘導体薬、サイトカイン薬、モノクローナル抗体薬を含み、好ましくは白金誘導体またはモノクローナル抗体薬物であり、特に好ましくはシスプラチンまたはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の複合製剤。
【請求項１２】
ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）と抗原ポリペプチドとの集合により形成され、免疫アジュバントをさらに含む、ポリペプチドワクチンミセルであって、
前記ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）におけるポリエチレングリコール親水ブロックが、分子量２０００のＰＥＧ分子であることと、
前記抗原ポリペプチドが、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ、ＨＢＶ−ＰｒｏＳ、ＨＢＶ表面抗原などに由来する腫瘍関連抗原ポリペプチド、または、ＨＩＶ、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、Ｆｌｕなどのウィルスに由来する特異抗原であることと、
前記免疫アジュバントがモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）アジュバントであることと、
前記ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）、抗原ポリペプチド、免疫アジュバントのモル比率の範囲が７２０：４〜１６０：３〜８０であり、好ましいモル比が１８０：４：３であることとを特徴とする、ポリペプチドワクチンミセル。
【請求項１３】
腫瘍を治療または予防するためのワクチンであって、請求項１２に記載のポリペプチドワクチンミセルと薬学的に許容しうる添加剤とからなる、ワクチン。
【請求項１４】
（１）請求項１２に記載のポリペプチドワクチンミセル、または請求項１３に記載のワクチンと、
（２）抗癌治療において有効な、シスプラチンまたはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌治療薬物とを含む複合製剤であって、
前記抗癌治療薬物の治療効果を効果的に向上させうることを特徴とする、腫瘍を治療または予防するための複合製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬生物分野に属し、具体的には、ＰＥＧ化リン脂質を担体とするポリペプチドワクチンミセル、並びにその調製方法および応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノサイズ材料を担体として腫瘍治療性ワクチンを設計することは、腫瘍治療の新たな発想である。ナノサイズ材料担体でタンパク抗原を運ぶことで抗原の免疫原性を向上させうることが、従来の研究で示されている。この現象は、ナノサイズ材料の相対的に巨大な比表面積および複雑な構造に関連している可能性がある。同時に、ナノサイズ材料担体は、タンパク抗原に対してある程度の保護作用をもたらし、タンパク抗原が血液中のプロテアーゼおよび内系によって早急に分解されることを防ぎ、有利には、タンパク抗原に作用を発揮させる。また、タンパク抗原を運ぶナノサイズ材料担体は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ、ＤＣｓ）に取り込まれ、処理されることが容易である。これにより、ＤＣｓに大量のタンパク抗原を処理させ、提示させて、更なる有効な免疫反応を誘発させる。特定のナノサイズ材料で腫瘍特異性抗原および免疫アジュバントを取り込み、腫瘍治療性ワクチンを形成して、腫瘍患者に接種することで、患者の免疫システムを刺激し、腫瘍細胞を殺す免疫反応を発生させ、手術または放射線治療、化学治療の後に生体内に残存する腫瘍の病巣を減少させ、ひいては除去することが可能である。
【０００３】
これまで、ナノサイズ材料を担体とする腫瘍ワクチンを設計する様々な手法が出現しているが、いくつかの重大な技術的障害が存在する。ウィルス（ｖｉｒｕｓｅｓ）、ウィルス様粒子（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）またはウィロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）を担体とする腫瘍ワクチン（１．Ａｒｌｅｎ  ＰＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ（ｖａｃｃｉｎｉａ）ａｎｄ  ＰＡＮＶＡＣ−Ｆ（ｆｏｗｌｐｏｘ）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ（ＮＣＩ  ０５−Ｃ−０２２９）．Ｃｌｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６；７：１７６-１７９．；２．Ｇｕｌｌｅｙ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｐｏｘｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ＰＳＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｓｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９）は、使用の初期に生体を刺激し、免疫反応を発生させうるが、ウィルスのタンパク成分自体が、有効な抗原であり、同時に組成の上で支配的なものであるので、誘発される免疫反応は、主にウィルス担体自体の抗原に対するものであって、ウィルス担体に運ばれる腫瘍特異性抗原に対するものではなく、免疫反応の効率を低下させる。特に腫瘍特異性抗原の抗原性が比較的弱い場合、この影響はより明らかである。治療性ワクチンの免疫治療効果を向上させるために、通常は複数回の免疫の実行が必要であり、この場合、前回の免疫によりウィルス担体自体に対する免疫反応（主に抗体反応）が誘発され、続く免疫治療の効果を大幅に低下させることになる。また、通常のウィルス、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルスなどを担体として設計されるワクチンは、患者の早期ウィルス感染によって発生しうる免疫保護により、ワクチンの免疫治療効果を顕著に低下させることがよくある。（Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｙａｎｇ  Ｙ．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００９；２０：２９３-３０１．）。
【０００４】
リポソームを担体とするナノワクチンは、担体自体が免疫原性を有さず、腫瘍特異性抗原の免疫効率を効果的に向上させうる。しかし、リポソーム担体は、サイズおよび成分により、皮下接種を経た後に、その粒子が効果的に拡散して排出リンパ節に入ることが不可能であり、ワクチン成分の一部が接種した部位に長期間留まる。そのため、免疫により発生する腫瘍抗原特異性の細胞毒性リンパ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬｓ）の大部分は、腫瘍成長部位ではなくワクチン接種部位に移動し、腫瘍の特異性に対する免疫反応を大幅に低下させる（Ｈａｉｌｅｍｉｃｈａｅｌ  Ｙなど、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ，ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３、１９（４）、４６５−７２．）。また、リポソームの調製における特徴により、得られる生成物は往々にして、均一性が劣り、粒子サイズの範囲がかなり大きく、かつ、バッチ間の再現性も通常レベルであり、品質管理の上で一定の難しさが存在する。
【０００５】
ミセル担体は、疎水ブロックと親水ブロックとを同時に含む両親媒性重合体分子が自己集合してなるナノ粒子である。ナノ粒子ミセルの集合は、重合体分子が、水溶液中で熱力学的に安定したシステムを自発形成することであり、このプロセスは、疎水断片の水溶液からの撤去および自発堆積重合が誘発する自由エネルギーの低下によって進む。低分子量の界面活性剤に比べて、両親媒性重合体の臨界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＣＭＣ）はさらに低い。これにより、重合体ミセルが溶液の希釈にさらに抗しうると同時に、疎水ブロックからなるミセルのコア構造は、緊密になり、生理環境において大量の体液に希釈された後に解離しにくく、安定性がより良好になる。両親媒性重合体分子の親水性ブロックには大体、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）が選択される。ポリエチレングリコールは、水溶性が良好であり、高い水和特性を備え、ミセル粒子のシェル領域がミセル粒子に十分な立体障害を提供できる。またそれは、生体適合性の良い、ＦＤＡに承認された広く使われている薬用添加剤である。両親媒性重合体分子の疎水ブロックの材料は、比較的豊富であり、ミセル担体の薬物充填効率および安定性を決める主な要因となる。化学構造の違いに基づいて、疎水ブロックにおける親油基は、ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）誘導体、ポリアミノ酸（ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ））誘導体、およびプルロニック類（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）という３種類に分別される。ポリエステル類のコアブロックでは、ポリ乳酸（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙ（ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ＰＣＬ）およびポリグリコール酸（ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））はいずれも、ＦＤＡに承認された優れた生体適合性を備える材料である。ポリアミノ酸類のコアブロックでは、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＡｓｐ）、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＧｌｕ）、ポリ−Ｌ−リシン（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬｙｓ）、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ＰＨｉｓ）などの材料が広く使用されている。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓは、ポリエチレンオキシド  −  ポリプロピレンオキシド  −  ポリエチレンオキシドからなるトリブロックコポリマーであり、ＰＥＯｍ−ＰＰＯｎ−ＰＥＯｍとも示されうる。
【０００６】
ＰＥＧ化リン脂質は新規な両親媒性重合体分子である。その親水ブロックはポリエチレングリコールであり、疎水ブロックはリン脂質分子である。ポリエチレングリコール分子は、共有結合によってリン脂質分子における窒素含有塩基と結合する。現在、取り込み材料としてのＰＥＧ化リン脂質が、小分子の化学治療薬物を取り込むことに主に用いられる。そのメリットは、以下の通りである。１）疎水コアのリン脂質が難溶性薬物を取り込むことができ、薬物の溶解能力を大幅に向上させること。２）親水シェルポリエチレングリコールが、ミセル中の薬物分子を、外部から吸着または分解されることから保護することができ、薬物が細網内皮系に取り込まれないようにすることに役立ちうると共に、薬物の循環時間を延長すること。３）薬物の放出を制御し、薬物の体内分布を最適化させることで、より良好な（免疫反応を誘発しえない）治療効果を実現すること。しかし、ＰＥＧ化リン脂質ミセルによるタンパク質またはポリペプチドの取り込みに関する研究は極めて少なく、ＰＥＧ化リン脂質で調製されるミセルを担体システムとする腫瘍治療性ワクチンの開発に関する研究は、国内外いずれにおいても報告されていない。
【０００７】
モノホスホリルリピドＡ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ、ＭＰＬＡ）は、比較的一般的な免疫アジュバント（構造を図９に示す）であり、サルモネラＲ５９５に由来するリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）を化学修飾することで得られる、新規な免疫アジュバントである。ＬＰＳに比べてＭＰＬＡは、免疫刺激能力は基本的にそのままであるが、エンドトキシンの毒性が大幅に低下するので、より安全かつ有効な免疫アジュバントとなり、また、臨床に移行する免疫アジュバントとして米国ＦＤＡに承認されている。ＬＰＳが作用を発揮する分子メカニズムと同様にＭＰＬＡも、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）４と相互作用することで、その下流の天然免疫に関連するシグナル伝達経路を活性化させ、天然免疫反応を活性化させ、インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子αの発現を促進する。それと同時に、樹状細胞を活性化させることで、後天性免疫反応をさらに活性化させる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、腫瘍を予防および治療することができるポリペプチドワクチンミセルに関する。
【０００９】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルは、ＰＥＧ化リン脂質（ＰＥＧ−ＰＥ）と抗原ポリペプチドとが自己集合してなり、前記ＰＥＧ化リン脂質は、ポリエチレングリコール（親水ブロック）が、共有結合によりリン脂質分子（疎水ブロック）の窒素含有塩基と結合して形成される化合物である。
【００１０】
本発明に記載のＰＥＧ化リン脂質分子におけるポリエチレングリコール親水ブロックは、分子量が５００〜１００００のＰＥＧ分子であり、好ましくはＰＥＧが１５００〜３０００、最も好ましくはＰＥＧが２０００である。
【００１１】
本発明に記載のワクチンミセルの粒子径は１０〜１００ｎｍ、好ましくは１０〜５０ｎｍ、最も好ましくは２０ｎｍである。
【００１２】
本発明に記載の抗原ポリペプチドは、長さが５〜１００個のアミノ酸からなるポリペプチド、好ましくは１０〜５０個のアミノ酸からなるポリペプチド、より好ましくは２０〜３０個のアミノ酸からなるポリペプチド、最も好ましくはＥ７ポリペプチドまたはＯＴ−１ポリペプチドである。
前記抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＭＵＣ−１、ＰＳＡ、ＨＢＶ−ＰｒｏＳ、ＨＢＶ表面抗原などに由来する腫瘍関連抗原ポリペプチド、または、ＨＩＶ、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、Ｆｌｕなどのウィルスに由来する特異抗原である。
【００１３】
本発明に記載のＥ７抗原ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）の腫瘍関連抗原であり、Ｎ末端に１つのパルミチン酸分子が連結され、そのＥ７４３  ６２配列は、パルミチン酸−ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤである。
【００１４】
本発明に記載のＯＴ−１ポリペプチドは、オボアルブミン（ＯＶＡ）に由来する１７個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、Ｈ−２Ｋｂ型マウスの特異性ＣＴＬにＯＶＡタンパクのエピトープ（ＯＶＡ２５７−２６４）を含む。アミノ酸配列構造は、パルミチン酸−ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＫＤである。
【００１５】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルは、生体免疫機能を調節する免疫アジュバントも含んでよく、前記免疫アジュバントは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、モノホスホリルリピドＡアジュバントを含み、好ましくはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）アジュバントである。
【００１６】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルにおいて、ＰＥＧ化リン脂質重合体分子、抗原ポリペプチド、免疫アジュバントの用量モル比率の範囲は７２０：４〜１６０：３〜８０であり、最も好ましいモル比は１８０：４：３である。
【００１７】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセル製剤は、溶液形式または凍結乾燥形式である。
【００１８】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法は、以下の通りである。
（１）ＰＥＧ−ＰＥ担体分子、抗原ポリペプチド分子、アジュバント分子を揮発性有機溶媒に溶解して、担体分子溶液、抗原ポリペプチド溶液、アジュバント溶液を調製する。
（２）一定の割合で、ステップ（１）で得られる担体分子溶液、抗原ポリペプチド溶液、アジュバント溶液を均一に混合する。
（３）ステップ（２）で得られる混合溶液中のすべての有機溶媒を除去し、担体分子、抗原ポリペプチド分子およびアジュバント分子に、均一に分布した混合脂質膜を形成させる。
（４）ステップ（３）で得られる混合脂質膜を、一定量の脱イオン水または生理食塩水で溶解し、インキュベーション条件下で脂質膜を均一に水和させた後に室温で一定時間静置して、ワクチンミセル溶液を得る。
（５）ステップ（４）で得られるワクチンミセル溶液を、０．２２ｍの濾過膜でろ過除菌する。
（６）必要に応じて、ステップ（５）で得られるワクチンミセル溶液に一定量の凍結乾燥保護剤を添加した後、ワクチンミセル溶液を凍結乾燥して、ワクチンミセル凍結乾燥粉末を調製する。
【００１９】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法のステップ（１）に記載されている揮発性有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、アセトン、氷酢酸などであるか、またはそれらの混合物である。
【００２０】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法のステップ（３）に記載されている有機溶媒を除去する方法は、好ましくは、減圧水浴及び加熱回転蒸発である。
【００２１】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法のステップ（４）に記載されているインキュベーション条件は、好ましくは、５５℃で３０分間の水浴インキュベーションである。
【００２２】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルの調製方法のステップ（６）に記載されている凍結乾燥保護剤は、好ましくは、濃度が０．０５ｇ／ｍｌであるマンニトール、ラクトース、デキストランなどである。
【００２３】
本発明はさらに、腫瘍を治療する薬物における前記ポリペプチドワクチンミセル製剤の応用に関し、前記腫瘍が非固体腫瘍および固体腫瘍を含み、前記応用は、具体的には、皮下注射または静脈注射の方式で、一定の投与量の前記ポリペプチドワクチンミセル製剤を患者に投与する。
【００２４】
本発明はさらに、腫瘍の予防における前記ポリペプチドワクチンミセル製剤の応用に関し、前記腫瘍が非固体腫瘍および固体腫瘍を含み、前記応用は、具体的には、皮下、筋肉、粘膜注射または静脈注射の方式で、一定の投与量の前記ポリペプチドワクチンミセル製剤を患者に投与することである。
【００２５】
本発明はさらに、抗腫瘍ワクチン製品に関し、前記ワクチン製品は、前記ポリペプチドワクチンミセルと薬学的に許容しうる添加剤とからなる。
【００２６】
本発明はさらに、腫瘍を治療するか、或いは腫瘍を予防する薬物の調製における、前記ポリペプチドワクチンミセルの応用に関し、前記腫瘍が非固体腫瘍および固体腫瘍を含む。
【００２７】
本発明はさらに、前記ポリペプチドワクチンミセルと他の抗腫瘍薬物との複合治療、具体的には、ポリペプチドワクチンミセルと、化学治療薬物、モノクローナル抗体薬、サイトカイン薬およびケモカイン薬物などを含む、他の抗腫瘍薬物との複合使用を行う、方法に関する。
【００２８】
本発明は、新規なポリペプチドワクチンミセルと、抗腫瘍治療において有効な一または複数の別の薬物との複合使用を提供することにより、治療の相乗効果を発現させ、生存率および治癒率を顕著に向上させる。
【００２９】
これに基づいて、本発明は、ポリペプチドワクチンミセルと、抗癌治療において有効な抗癌治療薬物（アルキル化剤、ヌクレオチドアナログ、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、抗有糸分裂薬、白金誘導体薬、サイトカイン薬、モノクローナル抗体薬を含むがそれらに限定されない）とを複合的に投与する、複合製剤の構想を提供する。
【００３０】
本発明に記載のポリペプチドワクチンミセルと他の抗癌治療薬物とは、同時に、分けて、或いは順番に投与可能であり、具体的なスキームは、実験／臨床結果に基づいて決定する必要がある。従って、本発明のもう１つの目的は、抗癌治療において、ポリペプチドワクチンミセルと、抗癌治療において有効な抗癌治療薬物とを含む前記複合製剤を、同時に、分けて、或いは順番に使用することである。例えば、実施例１１では、腫瘍治療性ワクチンミセルが、シスプラチンの治療の後に投与される。実施例１２では、腫瘍治療性ワクチンミセルとＰＤ−Ｌ１抗体とが同時に投与される。
【００３１】
好ましい一実施形態において、本発明に記載の複合製剤における抗癌治療薬物は、好ましくは白金誘導体、特に好ましくはシスプラチンである。
【００３２】
前記複合製剤におけるポリペプチドワクチンミセルは、好ましくは、ＭＰＬＡおよびＨＰＶ１６Ｅ７抗原ポリペプチドを含有するポリペプチドワクチンミセルである。
【００３３】
前記複合製剤は、最も好ましくは、ＭＰＬＡおよびＨＰＶ１６Ｅ７抗原ポリペプチドを含有するポリペプチドワクチンミセルと、抗癌治療薬物としてのシスプラチンとの複合製剤である。
【００３４】
上記のように、本発明による複合製剤は、癌症の治療に用いられうる。前記最も好ましい実施形態では、本発明の複合製剤が、ＨＰＶ１６感染に起因する子宮頸がんの治療に用いられる。
【００３５】
本発明による複合製剤の成分は、医学的に許容しうる任意の方式で投与されうる。これらの方式は、経口、非経口のもの、または局所治療法（例えば植え込み）を含む。経口は、錠剤、カプセル、懸濁液、エマルション、粉末剤、シロップなどを含む適当な経口形式で、複合製剤成分を投与することを含む。非経口投与は、皮下注射、静脈注射または筋肉注射で複合製剤成分を投与することを含む。
【００３６】
注射剤が好ましい投与手段であり、これにより、投与時間および投与量レベルを最大限に制御しうる。
【００３７】
本発明の複合製剤の好ましい投与方法および順序は、特定の薬物製剤、特定の癌症、治療される特定の病態の重篤程度、および治療される特定の患者の具体的状況に応じて変化しうる。当業者は、本発明による複合製剤の投与量の範囲を、患者の具体的状況に応じて決定できる。従って、投与量スキームは、特定の患者の条件、反応および関連治療に応じて、任意の通常の治療方式に用いられてよく、さらに、病態の変化および／または他の臨床事情に応じて調整される必要がある。
【００３８】
本発明に記載の子宮頸がんの治療に用いられる最も好ましい複合製剤において、前記複合製剤の調製に用いられる薬学的に許容しうる担体または賦形剤の技術は、当技術分野では既知である。例えば、前記賦形剤は通常、薬学的に許容しうる塩、緩衝剤、保存剤および／または適合しうる担体、またはそれらの組み合わせなどを含みうる。前記薬学的に許容しうる担体とは、ヒトを含む哺乳類への投与に適する、一または複数の適合しうる固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセルの物質を示す。
【００３９】
前記非経口投与に適する薬物の組み合わせは、無菌形態で調合され、前記無菌組成物は、非毒性であり非経口的に許容されうる希釈剤または溶媒に溶解された、無菌の溶液または懸濁液でありうる。前記複合製剤では、活性成分の含有量が、投与手段および賦形剤などのような多くの要因により、大きく変化しうる。
【００４０】
例えば、前記複合製剤は、投与量が２５０μｇから２．５ｍｇまでの前記腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセル製剤と、１ｍｇから１，０００ｍｇまでの白金類誘導体、例えばシスプラチンとを含みうる。
【００４１】
本発明の別の一態様は、癌症に罹患したヒトを含む哺乳類を治療する、治療方法を提供するものである。前記方法は、前記哺乳類に対して、上記の前記ポリペプチドワクチンミセルと、相乗抗癌効果を発生させる、有効投与量の、アルキル化剤（シクロホスファミド、カルムスチンなど）、ヌクレオチドアナログ（メトトレキサート、フルオロウラシルなど）、代謝拮抗剤（ヒドロキシウレア、ユーエフティなど）、抗腫瘍抗生物質（アドリアマイシン、マイトマイシンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（ヒドロキシカンプトテシン、トポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド、テニポシドなど）、抗有糸分裂薬（パクリタキセル、ビノレルビンなど）、白金誘導体薬（シスプラチン、カルボプラチンなど）、サイトカイン薬（ＩＬ−２、ＩＦＮγなど）、モノクローナル抗体薬（Ｈｅｒ２モノクローナル抗体、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体など）等の薬物から選択される少なくとも１つの別の薬物とを含有する、複合製剤を投与することを含む。
【００４２】
本発明は特に、子宮頸がんを治療する治療方法を提供する。
【００４３】
本明細書で使用される「相乗抗癌効果」という用語は、有効投与量の前記腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルと、ヒトを含む哺乳類において相乗抗癌効果を発生させる、有効量の、アルキル化剤（シクロホスファミド、カルムスチンなど）、ヌクレオチドアナログ（メトトレキサート、フルオロウラシルなど）、代謝拮抗剤（ヒドロキシウレア、ユーエフティなど）、抗腫瘍抗生物質（アドリアマイシン、マイトマイシンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（ヒドロキシカンプトテシン、トポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド、テニポシドなど）、抗有糸分裂薬（パクリタキセル、ビノレルビンなど）、白金誘導体薬（シスプラチン、カルボプラチンなど）、サイトカイン薬（ＩＬ−２、ＩＦＮγなど）、モノクローナル抗体薬（Ｈｅｒ２モノクローナル抗体、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体など）等の薬物のうちの少なくとも１つである別の薬物との複合製剤を投与して、腫瘍の成長を抑制するか、腫瘍組織を減少させるか、或いは腫瘍を完全に消失させる効果を示す。
【００４４】
本明細書で用いられる「投与する」または「投与」という用語は、上記のように定義される非経口および／または経口の、および／または局所領域への投与を示す。本発明の方法において、腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルは、アルキル化剤（シクロホスファミド、カルムスチンなど）、ヌクレオチドアナログ（メトトレキサート、フルオロウラシルなど）、代謝拮抗剤（ヒドロキシウレア、ユーエフティなど）、抗腫瘍抗生物質（アドリアマイシン、マイトマイシンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（ヒドロキシカンプトテシン、トポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（エトポシド、テニポシドなど）、抗有糸分裂薬（パクリタキセル、ビノレルビンなど）、白金誘導体薬（シスプラチン、カルボプラチンなど）、サイトカイン薬（ＩＬ−２、ＩＦＮγなど）、モノクローナル抗体薬（Ｈｅｒ２モノクローナル抗体、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体など）等の抗癌薬物から選択される少なくとも１つの別の薬物と同時に投与されうるか、或いは、それらの薬物は、任意の順序で投与されうる。実際の好ましい方法および投与順序は、特に前記腫瘍治療性ワクチンミセル製剤が使用される場合には使用されるアルキル化剤、ヌクレオチドアナログ、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、抗有糸分裂薬、白金誘導体薬、サイトカイン薬、モノクローナル抗体薬の特定製剤、治療される特定の腫瘍の種類、および治療される特定の主体に応じて、変化しうる。
【００４５】
本発明に記載の抗癌治療は、ヒトを含む哺乳類の、例えば、子宮頸がん、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、白血病、および中枢神経系の腫瘍の治療に適しており、特に子宮頸がんおよび頭頸部癌の治療に適合する。
【００４６】
本発明に記載の腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルと、抗癌治療において有効な、アルキル化剤、ヌクレオチドアナログ、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、抗有糸分裂薬、白金誘導体薬、サイトカイン薬、モノクローナル抗体薬などの薬物のうちの少なくとも１つとの複合投与の効果は、明らかに増加する（相乗効果）が、それとともに毒性が増加することはない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｅ７ワクチンミセルの透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図２】Ｅ７ワクチンミセルの動的光散乱粒子径分析を示す。
【図３】リポソームに充填されたＥ７ワクチンに比べて、Ｅ７ワクチンミセルが効率的かつ迅速に皮下で拡散しうることを示す。
【図４】ワクチンミセルがリンパ節における樹状細胞およびマクロファージ細胞に効率的に貪食されうることを示す。
【図５Ａ−Ｂ】リポソームナノ粒子に比べて、ワクチンミセルが効率的にマクロファージ細胞を刺激し、炎症性サイトカインを分泌させうることを示す。
【図６】ワクチンミセルが効率的に樹状細胞を刺激して、成熟させ、活性化させうることを示す。
【図７】Ｅ７ワクチンミセルが腫瘍特異性抗原に対するＣＴＬ反応を効果的に発生させうることを示す。
【図８】Ｅ７ワクチンミセルが効果的に、腫瘍の成長速度を低下させ、腫瘍チャレンジマウスの生存期間を延長させうることを示す。
【図９】Ｅ７ワクチンミセルが腫瘍切除手術後の腫瘍再発を完全に予防しうることを示す。
【図１０】ＭＰＬＡ分子構造を示す。
【図１１】Ｅ７ワクチンミセルと化学治療薬物とを複合使用して腫瘍を治療することにより、腫瘍治癒率が明らかに向上することを示す。
【図１２】Ｅ７ワクチンミセルと治療性抗体抗ＰＤ−Ｌ１とを複合使用して腫瘍を治療することにより、治療効果が明らかに向上することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
実施例１  Ｅ７ワクチンミセルの調製
Ｅ７抗原ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に由来する腫瘍関連抗原であり、そのＮ末端に１つのパルミチン酸分子が連結されており、即ち、Ｅ７−２０ポリペプチドである。
Ｅ７４３  ６２配列：  パルミチン酸−ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤである。
【００４９】
ストック溶液の調合
（１）各チューブに１ｍｇずつ分配されたＥ７−２０に無水メタノール１ｍＬを添加し、濃度が１ｍｇ／ｍＬであるＥ７−２０ストック溶液を調合する。
（２）メタノールとクロロホルムを１：２で混合した溶液にＭＰＬＡ粉末を溶解させ、濃度が１ｍｇ／ｍＬであるＭＰＬＡストック溶液を調合する。
（３）ＰＥＧ−ＰＥ粉末３０ｍｇを秤量し、クロロホルム３ｍＬに添加して溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬであるＰＥＧ−ＰＥストック溶液を調合する。
【００５０】
１．ワクチンミセル溶液の調製  表１の配合に従いワクチンミセル１０ｍＬを調製する。
ステップ（１）  ＰＥＧ−ＰＥストック溶液５ｍＬ  を回転蒸発ボトルに取り、ＭＰＬＡストック溶液４００μＬ  および  Ｅ７−２０ストック溶液１ｍＬを精確に秤量して回転蒸発ボトルに添加し、やさしく振ってＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合する。
ステップ（２）  水浴加温条件下で真空回転蒸発機により有機溶媒を除去する（回転速度９０回転／分、水温４０℃）。有機溶媒の除去後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＭＰＬＡ、Ｅ７−２０に、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。
ステップ（３）  脱イオン水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明なＥ７ワクチンミセル溶液を得る。
ステップ（４）  室温で２時間静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく（少なくとも２週間保存可能）。
【００５１】
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【００５２】
２．ワクチンミセル凍結乾燥粉末の調製  配合およびステップ（１）〜（３）は同上である。
ステップ（４）  室温で２時間放置した後、マンニトール０．５ｇを精確に秤量し、凍結乾燥されるサンプル１０ｍＬに添加する。完全に溶解した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過してから、無菌アンプルに各アンプル１ｍＬになるように分配して、−８０℃で一晩置いて事前凍結する。
ステップ（５）  サンプルを３６時間真空冷凍結乾燥して（真空度０．１ｍｂａｒ）、凍結乾燥製剤を得る。
【００５３】
実施例２  脂肪酸化Ｅ７／ＯＴ−１抗原ミセルの封入率の測定
ローダミン蛍光修飾を備える脂肪酸化Ｅ７抗原ポリペプチドおよびＯＴ−１抗原ポリペプチド（パルミチン酸  −ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＫＤ）を合成する。遊離脂肪酸化抗原ポリペプチドは、水に溶解しえないので懸濁液を形成し、脂肪酸化抗原ポリペプチドがＰＥＧ−ＰＥミセルに充填された後に安定した溶液となる。これにより、遊離した抗原ポリペプチドとミセルに充填された  抗原ポリペプチドとの単離が行われ、次いで、溶液中のミセルに充填された抗原ポリペプチドの含有量の変化に基づいて、有効な抗原ポリペプチド封入率（封入率＝取り込まれた抗原の量／抗原の総量×１００％）を算出して得る。
【００５４】
表２および表３における配合割合に従って、異なる割合のポリペプチドを含むミセルを調製する。調製の工程および方法は、実施例１に記載のワクチンミセル溶液を調製するステップ方法と同じである。調製して得た異なる割合のワクチンミセル溶液を１４，０００ｇで３０分間高速遠心分離することで、非溶解状態の遊離した抗原ポリペプチドと、溶液中のミセルに取り込まれた抗原とを単離させる。ポリペプチドによって標識されたローダミン蛍光の、最大励起波長が５３５ｎｍであり、最大発光波長が５９０ｎｍである。蛍光分光光度法により溶液中の抗原含有量を検出し、次いで公式に基づいて、有効な抗原ポリペプチド封入率を算出して得る（その結果を表２、表３の第３行に示す）。ＰＥＧ−ＰＥと脂肪酸修飾ポリペプチドとの質量割合が１０：１以上である場合には、封入率は約１００％であることが分かる。
【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
実施例３  ポリペプチドワクチンミセルの物理特性評価
１、透過型電子顕微鏡によるＥ７ワクチンミセルの様態観察
実施例１で調製されるＥ７ワクチンミセル溶液を脱イオン水で希釈して、ＰＥＧ−ＰＥの濃度を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈する。１０μＬのサンプル溶液を取って、グロー放電で親水和処理された、炭素膜でコーティングされた銅メッシュの上に滴下する。３０秒吸着させた後、濾紙でサンプル溶液を吸収し、１０μＬの酢酸ウラニル（濃度が２％（ｗ／ｖ）である）を滴加して、３０秒染色させる。濾紙で染色液を吸収し、透過型電子顕微鏡（Ｔｅｃｔａｉ  ２０）でネガティブ染色されたミセルの様態を観察する。その結果を図１に示しており、透過型電子顕微鏡で観察されたワクチンミセルは、均一で球状のナノ粒子である。
【００５８】
２、動的光散乱法でのＥ７ワクチンミセルの粒子径分析
実施例１で調製されるＥ７ワクチンミセル溶液を脱イオン水で希釈して、ＰＥＧ−ＰＥの濃度を１ｍｇ／ｍＬまで希釈する。サンプルを均一に混合した後、２時間静置する。サンプル２０μＬを取って、脱イオン水で４回以上洗浄した石英キュベットに、気泡を発生させずに添加する。キュベットの透光部をレンズクリーニングペーパーで拭いて清潔にし、動的光散乱機（２７１−ＤＰＮ）のサンプルプールに入れて、２５℃の設定温度まで予熱する。設定された方法の各検出時間は１０秒であり、１０回の検出が１グループである。その結果を図２に示しており、動的光散乱分析は、ミセルの粒子径分布が１０ｎｍから２０ｎｍまでであることを示している。
【００５９】
実施例４、接種後の皮下拡散挙動の分析
１、サンプルの調製：
（１）ローダミンＥ７溶液の調製  
１０ｍｇ／ｍＬの、ローダミンに標識された脂肪酸化Ｅ７ポリペプチド（配列：パルミチン酸−ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ／ローダミンはアミノ酸Ｋに標識／吉爾生化有限会社にて合成）のＤＭＳＯストック溶液２０μＬを取り、１ｍＬになるように無菌水で定容し、濃度が０．２ｍｇ／ｍＬである蛍光ポリペプチド溶液を得る。
（２）ローダミンＥ７ミセルの調製
ＰＥＧ−ＰＥ粉末１０ｍｇを秤量し、試験管内でクロロホルム１ｍＬに溶解させる。ローダミンに標識された脂肪酸化Ｅ７ポリペプチドのメタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬをミセル中に取り、実施例１の方法に従って、やさしく振って均一に混合する。窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させ、真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。無菌生理食塩水１ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させて、薄紫色で均一かつ透明な溶液を得る。ここで、蛍光ポリペプチド濃度は０．２ｍｇ／ｍＬである。室温で２時間静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。
（３）リポソームローダミンＥ７の調製
ＤＰＰＣ７ｍｇ、コレステロール３ｍｇをそれぞれ取り、それぞれをクロロホルムに溶解させた後、試験管で混合する。ローダミンに標識された脂肪酸化Ｅ７ポリペプチドのメタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを取り、窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させ、真空乾燥装置に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加し、水和させ、５３℃の温水浴で３０分間を置き、その間に１分間超音波処理する。その後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ）押出装置で、孔径０．４μｍのポリカーボネート濾過膜を通して少なくとも１１回ろ過押出を行い、粒子径約４００ｎｍのリポソームを最終的に得る。ここで、蛍光ポリペプチド濃度は０．２ｍｇ／ｍＬである。
【００６０】
２、実験の組分けおよび結果
ヌードマウス９匹を、各群３匹、３群に分ける。前記複数種の製剤のサンプル１００μＬを、ヌードマウス肩の同じ位置にそれぞれ皮下注射する。注射の０、１、３、６、２４時間後と、４日、６日、７日後に、生体撮像でマウス体内の蛍光製剤の拡散状況を観察する。
【００６１】
その結果を図３に示しており、下記のことが分かる。
（１）脂肪酸化Ｅ７抗原が水溶液中に凝集形式で存在しているので、注射部位における皮下の局所的な滞留現象が明らかである。
（２）抗原ポリペプチドワクチンミセルは、皮下での拡散速度が速く、拡散の範囲がかなり広い。
（３）抗原ポリペプチドワクチンリポソームは、抗原ポリペプチドワクチンミセルに比べて、皮下局所でのリポソームの滞留時間が長く、拡散しにくい。
【００６２】
以上より、ミセルが、皮下投与する製剤形式により適合していることが説明される。
【００６３】
実施例５  排出リンパ節の分布
１、サンプルの調製：
（１）ＦＩＴＣに標識されたＰＥＧ−ＰＥミセルの調製：
ＰＥＧ−ＰＥ粉末１０ｍｇを秤量し、試験管内でクロロホルム１ｍＬに溶解させる。ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＥ（ＦＩＴＣに標識されたＰＥＧ−ＰＥ）のクロロホルムストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．６ｍＬを、ミセル中のＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＰＥ分子のＰＥＧ−ＰＥ分子全体に対するモル比が５％になるように取る。実施例１の方法に従い、やさしく振って均一に混合し、窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、明るい黄色の均一かつ透明な溶液を得る。室温で２時間静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。  
（２）ローダミンに標識されたリポソームの調製：
ＤＰＰＣ７ｍｇ、コレステロール３ｍｇをそれぞれ取り、それぞれをクロロホルムに溶解させた後、試験管で混合する。ローダミン−ＰＥ（ローダミンに標識されたＰＥ分子）のクロロホルムストック溶液（２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを、Ｒｈｏ−ＰＥの脂質分子全体に対する質量割合が１％になるように取る。窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させ、真空乾燥装置に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加して水和させ、５５℃の温水浴で３０分間置き、その間に１分間超音波処理する。その後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ）押出装置で、孔径がそれぞれ０．４μｍ、０．１μｍのポリカーボネート濾過膜を通して、少なくとも１１回ろ過押出を行い、粒子径が約１００ｎｍである単層リポソームを最終的に得る。
【００６４】
２．試験方法
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス２７匹を、各群９匹、３群に分け、それぞれの両肩にＦＩＴＣワクチンミセルおよびローダミンリポソームワクチンそれぞれ５０μＬを皮下注射する。ブランク対照としては生理食塩水を注射する。注射の１、２、３日後に、各群からそれぞれ３匹のマウスを取り、両腋窩の排出リンパ節を１．５ｍＬのＥＰチューブ内に分離する。眼科用ストレートはさみでリンパ節を細かく切断した後、チューブごとに消化液（７．５ｍｌ  ＲＭＰＩ１６４０培地、２％ウシ胎児血清、０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ、４０Ｕ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）２００μＬを添加し、３７℃で３０分間の消化の後に、各チューブに完全培地４ｍＬを添加して中和する。７０μｍのスクリーンクロス、および５００ｇで５分間の遠心分離を経て細胞が回収され、ＦＡＣＳ緩衝剤で５×１０５細胞／ｍＬに再懸濁される。細胞懸濁液を、明細書の割合に従ってＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ抗体に添加し、４℃で３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄して、フローサイトメトリー分離技術により、蛍光陽性のリンパ節のＤＣ細胞の割合を分析する。
【００６５】
結果および結論：リポソームに比べてミセルは、リンパ節の樹状細胞により多く貪食されうる。また、接種の２日後にリンパ節内のミセルを貪食する樹状細胞の割合が最大に達しており、リポソームよりもミセルの方が、リンパ節の樹状細胞を標的として作用すること（図４）を示している。
【００６６】
実施例６  ＭＰＬＡミセルのインビトロでのマクロファージ細胞刺激の実験
サンプルの調製：
（１）実施例１に記載の方法よるＥ７ワクチンミセル溶液の調製：ＰＥＧ−ＰＥストック溶液１ｍＬ  を試験管内に取る。ＭＰＬＡストック溶液１００μＬおよびＥ７−２０ストック溶液２００μＬを精確に秤量して試験管に添加し、やさしく振ってＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合する。窒素でブロードライして有機溶媒を除去した後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＭＰＬＡ、Ｅ７−２０に、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明な溶液を得る。ここで、ＭＰＬＡ濃度は１００μｇ／ｍＬである。
（２）（１）と同じ方法によるＭＰＬＡミセル溶液の調製：ＰＥＧ−ＰＥ粉末１０ｍｇを取り、それぞれクロロホルムに溶解させた後に試験管で混合する。ＭＰＬＡストック溶液１００μＬを別途取り、当該試験管の中に添加して、均一に混合した後、窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去し、生理食塩水４ｍＬを添加して水和させ、５３℃の温水浴で３０分間置く。
（３）（１）と同じ濃度のＭＰＬＡ対照：ＭＰＬＡストック溶液１００μＬを試験管に取り、窒素で有機溶媒をブロードライする。真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加して水和させ、５３℃の温水浴で３０分間置き、その間に５〜１０分間超音波処理することで、１００μｇ／ｍＬであるＭＰＬＡ懸濁液が調製される。
（４）フィルム水和法および押出法でＭＰＬＡリポソームを調製する調製方法：ＤＰＰＣ７ｍｇ、コレステロール３ｍｇをそれぞれ取り、それぞれをクロロホルムに溶解させた後、試験管で混合する。また、ＭＰＬＡストック溶液１００μＬ  を取り、当該試験管に添加して均一に混合した後、窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加して水和させ、５５℃の温水浴で３０分間置き、その間に１分間超音波処理して、脂質膜を溶解させる。その後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ）押出法で、孔径がそれぞれ０．４μｍ、０．１μｍのポリカーボネート濾過膜を通して少なくとも１１回ろ過し、約１００ｎｍの単層リポソームを最終的に得る。
（５）脂質含有量が（４）と同じ空のリポソームの調製方法：ＤＰＰＣ７ｍｇ、コレステロール３ｍｇをそれぞれ取り、ぞれぞれをクロロホルムに溶解させた後、試験管で混合する。窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させ、真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１ｍＬを添加して水和させ、５５℃の温水浴で３０分間置き、その間に１分間超音波処理して、脂質膜を脱離させる。その後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ）押出機で、孔径がそれぞれ０．４μｍ、０．１μｍのポリカーボネート濾過膜を通して少なくとも１１回ろ過し、約１００ｎｍの単層リポソームを最終的に得る。
【００６７】
マウス単球マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（中国科学院細胞バンクから購入）を、高品質のウシ胎児血清１０％を含むＤＭＥＭ培地を用いて、二酸化炭素５％、温度３７℃の培養条件で培養する。細胞を、細胞数が３×１０５／ｍＬ、ウェルごとの培地が１ｍＬになるように、１２ウェルプレートに接種し、プレートに一晩付着させた後に処理を行う。
【００６８】
処理方式（１）：生理食塩水をブランク対照とし、ＭＰＬＡ、ワクチンミセル、ＭＰＬＡミセルを実験群とする。各実験群におけるＭＰＬＡの最終作用濃度は１００ｎｇ／ｍＬである。各対照群における担体量または溶媒量は、対応する実験群に一致する。細胞を２時間処理した後に培地上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、培地上清中の、細胞外に分泌された細胞ＴＮＦ−αおよび他のサイトカインの濃度を検出する。その結果を図５Ａに示す。
【００６９】
処理方式（２）：生理食塩水をブランク対照とし、空のミセルおよび空のリポソームを担体対照群とし、ＭＰＬＡ、ＭＰＬＡミセル、ＭＰＬＡリポソームを実験群とする。各実験群におけるＭＰＬＡの最終作用濃度は１００ｎｇ／ｍＬである。各対照群における担体量または溶媒量は、対応する実験群に一致する。細胞を３時間処理した後、培地上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、培地上清中の、細胞外に分泌された細胞ＴＮＦ−αおよび他のサイトカインの濃度を検出する。その結果を図５Ｂに示す。
【００７０】
結果および結論：ＭＰＬＡはＴＬＲ４受容体のリガンドであり、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの分泌量は、マクロファージ細胞がＭＰＬＡに活性化される度合いを反映している。ＭＰＬＡミセルとワクチンミセルとは、ほぼ同一の細胞活性化能力を備え（図５Ａ）、ＭＰＬＡに比べて、より高度にマクロファージ細胞を活性化させうるが、リポソームは、ＭＰＬＡの刺激作用を向上させえない。ＭＰＬＡミセルは、ＭＰＬＡのアジュバントがマクロファージ細胞を活性化させる効率を向上させた（図５Ｂ）。
【００７１】
実施例７  ポリペプチドワクチンミセルのインビトロでの樹状細胞刺激実験
骨髓誘導樹状細胞（ＢＭＤＣ）を得る方法：６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス１匹から、大腿骨、脛骨の骨髓を無菌ＰＢＳに取り、吹き付けた細胞懸濁液を７０μｍスクリーンクロスに通してろ過する。赤血球を解離させ、ＰＢＳで１〜２回洗浄した後、細胞を、細胞数がシャーレあたり２×１０６／１０ｍＬになるように、１００ｍｍ（または９０ｍｍ）シャーレに播種する。培地成分は、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭβ−メルカプトエタノール、ｒｍＧＭ−ＣＳＦ（組み換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）２００Ｕ／ｍＬであり、培養条件は、二酸化炭素５％、温度３７℃である。３日目に培地１０ｍＬを補充し、６日目に１０ｍＬを交換する。８日間の誘導を経てから全ての浮遊細胞を回収し、フローサイトメトリー分離技術により分析し鑑別する。ＣＤ１１ｃ（樹状細胞表面マーカー分子）をＤＣ細胞マーカーとし、ＤＣ細胞の純度は９０％以上である。
【００７２】
実施例６のサンプル調製方法に従い、ＰＥＧ−ＰＥが空のミセル、ＭＰＬＡ懸濁液、ＭＰＬＡミセル、ワクチンミセル溶液を調製する。ここで、ＭＰＬＡ濃度はいずれも１００μｇ／ｍＬである。８日間培養された骨髓誘導樹状細胞を回収し、細胞数が５×１０５／ｍＬ、１ウェルごとの培地の総量が１ｍＬになるように、２４ウェルプレートに接種する。接種後そのまま、調製されたサンプルで処理する。溶媒生理食塩水をブランク対照群とし、空のミセルを担体対照とし、ＭＰＬＡ、ＭＰＬＡミセルおよびワクチンミセルを実験群とする。各実験群におけるＭＰＬＡの最終作用濃度は１００ｎｇ／ｍＬである。各対照群における担体量または溶媒量は、対応する実験群に一致する。２４時間の処理を経た後に細胞の培地上清および細胞を回収する。ＥＬＩＳＡにより培地上清中の細胞外に分泌された細胞ＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度を検出し、フローサイトメトリー分離技術により成熟ＤＣの表面マーカーが発現する度合いを分析する。
【００７３】
結果：樹状細胞は、生体における、ワクチンの主たるエフェクタ細胞である。樹状細胞の表面のＣＤ８０（樹状細胞活性化マーカー分子）分子の発現およびＴＮＦ−α、ＩＬ−６などのサイトカインの分泌は、樹状細胞の活性化の度合いを反映している。実験は、ＭＰＬＡミセルがＭＰＬＡに比べて、より効果的に樹状細胞を活性化できることを証明している（図６）。
【００７４】
実施例８  Ｅ７ワクチンミセルによる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性化実験
サンプルの調製：
（１）、実施例１の方法に従い、Ｅ７ワクチンミセル溶液を調製する。得られたワクチンミセルにおける成分は、ＰＥＧ−ＰＥの濃度が２．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＰＬＡ濃度が２５μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０濃度が５０μｇ／ｍＬである。
（２）担体に充填されないＭＰＬＡとＥ７−２０とを混合した対照群を調製する。ＭＰＬＡストック溶液１００μＬと、Ｅ７−２０ストック溶液２００μＬとを取り、試験管で均一に混合する。窒素で有機溶媒をブロードライし、真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水４ｍＬを添加し、５５℃の温水浴で３０分間置いて脂質膜を水和させ、その間に、断続的に５〜１０分間超音波処理することで、ＭＰＬＡ濃度が２５μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０濃度が５０μｇ／ｍＬである懸濁液が調製される。
（３）フィルム水和法および押出し方法により、リポソームワクチンを調製する。調製方法は以下の通りである。ＤＰＰＣ７ｍｇ、コレステロール３ｍｇをそれぞれ秤量し、それぞれをクロロホルムに溶解させた後、試験管で混合する。また、ＭＰＬＡストック溶液１００μＬ  、Ｅ７−２０ストック溶液２００μＬを取り、当該試験管に添加して均一に混合した後、窒素でブロードライしてそれに均一のフィルムを形成させ、真空乾燥装置内に一晩置いて、有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水４ｍＬを添加して水和させ、５５℃の温水浴で３０分間置いて、その間に３分間を超音波処理して脂質膜を溶解させる。その後、Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ）押出法で、孔径がそれぞれ０．４μｍ、０．１μｍのポリカーボネート濾過膜を通して、少なくとも１１回ろ過する。約１００ｎｍの単層リポソームを最終的に得る。
【００７５】
対照とするのは、（２）前記担体なしのＭＰＬＡ＋Ｅ７−２０、（３）前記リポソームワクチンである。
【００７６】
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを各群３匹、３群に分け、ワクチン接種方式は、１匹あたり１００μＬの皮下多点注射を採用する。生理食塩水溶液をブランク対照群とし、他の実験各群へのＭＰＬＡの投与量は１２５μｇ／ｋｇ、Ｅ７の投与量は２５０μｇ／ｋｇであり、ミセルとリポソームとの二剤型製剤に含まれる脂質の投与量は１２．５ｍｇ／ｋｇである。６日後に、マウスのリンパ節を分離し、７０μｍスクリーンクロスを通し、リンパ節の詳細数が１×１０７／ｍＬになり、丸底の９６ウェルプレートにおいてウェルごとに１００μＬになるように調整する。ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＦＡ）３μｇ／ｍＬおよびＥ７４９−５７（アミノ酸配列がＲＡＨＹＮＩＶＴＦである）５μｇ／ｍＬを添加し、共に６時間をインキュベートしてから細胞を回収して、細胞濃度を１×１０６に調整する。まずＣＤ８抗体を添加して、２０分間染色する。染色後の細胞を、４％パラホルムアルデヒドにより４℃で３０分間固定し、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００に１０分間通した後、細胞内染色を行い、ＩＦＮγ抗体を添加して２０分間インキュベートする。フローサイトメトリー分離技術により、リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞における特異性を活性化させるＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の占めるパーセンテージを分析する。
【００７７】
結果：ポリペプチドワクチンミセルは、リポソームワクチンに比べて、より強い特異性ＣＴＬ反応を引き起こす（図７）。
【００７８】
実施例９  ポリペプチドワクチンミセルの免疫治療効果の評価実験
サンプルの調製：
（１）実施例１の方法に従い、Ｅ７ワクチンミセル溶液１０ｍＬを調製する。ここで、各成分の濃度はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：５ｍｇ／ｍＬ、ＭＰＬＡ：４０μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０：１００μｇ／ｍＬである。
（２）（１）と同じ濃度のＭＰＬＡ／ＰＥＧ−ＰＥミセル１０ｍＬを調製する。  ＰＥＧ−ＰＥストック溶液５ｍＬを回転蒸発ボトルに取る。ＭＰＬＡストック溶液４００μＬを精確に秤量し、回転蒸発ボトルに添加してやさしく振り、ＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合し、真空回転蒸発機で有機溶媒（クロロホルムおよびメタノール）を除去する。回転速度は９０ｒ／分、水浴は４０℃である。有機溶媒を排出した後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＭＰＬＡに、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明な溶液を得る。室温で２時間を静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。
（３）（１）と同じ濃度のＥ７／ＰＥＧ−ＰＥミセル１０ｍＬを調製する。ＰＥＧ−ＰＥストック溶液５ｍＬ  を回転蒸発ボトルに取る。Ｅ７−２０ストック溶液１ｍＬを精確に秤量し、回転蒸発ボトルに添加してやさしく振り、ＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合し、真空回転蒸発機で有機溶媒（クロロホルムおよびメタノール）を除去する。回転速度は９０ｒ／ｍｉｎ、水浴は４０℃である。有機溶媒を排出した後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＥ７−２０に、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。生理食塩水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明な溶液を得る。室温で２時間を静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。
【００７９】
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス３０匹を取り、肩部の皮下にＴＣ−１細胞を、１匹あたり５×１０４個接種する。腫瘍接種後８日目に、腫瘍の平均サイズに応じて、各群５〜６匹になるように４群に分ける。８日目に、マウスの、腫瘍が成長しているのと同じ側の遠位端部に、各群のワクチンを皮下接種する。生理食塩水をブランク対照とし、実験群はワクチンミセルであり、かつ、２つの対照群は、ＭＰＬＡ／ＰＥＧ−ＰＥミセルおよびＥ７／ＰＥＧ−ＰＥミセルである。皮下に免疫接種される注射投与量は１匹あたり１００μＬであり、投与量はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：２５ｍｇ／ｋｇ、ＭＰＬＡ：２００μｇ／ｋｇ、Ｅ７−２０：５００μｇ／ｋｇである。同じ方式で、１１、１５、１８日目に１回ずつ接種する。８日目から４０日目まで腫瘍体積をモニターするとともに、マウスの生存期間を記録する。
【００８０】
結果：ブランク対照群に比べて、３つの治療群は全て、腫瘍の成長に対して一定の抑制作用を有する。Ｅ７ワクチンミセル群の効果が最も顕著であり、そのうち２匹マウスには、腫瘍消失現象が認められる。マウスの生存期間の記録が示すように、ＭＰＬＡ／ＰＥＧ−ＰＥミセル群およびＥ７／ＰＥＧ−ＰＥミセル群の２つの対照群とブランク対照群には、生存期間の顕著な差異が見られないが、Ｅ７ワクチンミセル群は、マウス生存期を顕著に延長し、腫瘍の成長を効果的に制御しうる（図８）。
【００８１】
実施例１０  ワクチンミセルの手術後の腫瘍再発予防の評価実験
サンプルの調製：
（１）実施例１の方法に従い、Ｅ７ワクチンミセル溶液１０ｍＬを調製する。ここで、各成分の濃度はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：５ｍｇ／ｍＬ、ＭＰＬＡ：４０μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０：１００μｇ／ｍＬである。
（２）（１）と同じ濃度であるＭＰＬＡ／ＰＥＧ−ＰＥミセル１０ｍＬを調製する
ＰＥＧ−ＰＥストック溶液５ｍＬを回転蒸発ボトルに取る。ＭＰＬＡストック溶液４００μＬを精確に秤量し、回転蒸発ボトルに入れてやさしく振り、ＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合する。
真空回転蒸発機で有機溶媒（クロロホルムおよびメタノール）を除去する。回転速度は９０ｒ／ｍｉｎ、水浴は４０℃である。有機溶媒を排出した後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＭＰＬＡに、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。
生理食塩水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明な溶液を得る。室温で２時間静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。
（３）（１）と同じ濃度であるＭＰＬＡを含まないＥ７／ＰＥＧ−ＰＥミセル１０ｍＬを調製する。
ＰＥＧ−ＰＥストック溶液５ｍＬを回転蒸発ボトルに取る。Ｅ７−２０ストック溶液１ｍＬを精確に秤量し、回転蒸発ボトルに添加してやさしく振り、ＰＥＧ−ＰＥ溶液と均一に混合する。
真空回転蒸発器で有機溶媒（クロロホルムおよびメタノール）を除去する。回転速度は９０ｒ／ｍｉｎ、水浴は４０℃である。有機溶媒を排出した後、ＰＥＧ−ＰＥおよびＥ７−２０に、均一に分布したフィルムを形成させる。真空乾燥装置内に一晩置いて、残った有機溶媒および水分を完全に除去する。
生理食塩水１０ｍＬを添加し、５３℃の水浴で３０分間インキュベートして脂質膜を水和させ、外観が均一で無色透明な溶液を得る。室温で２時間静置した後、０．２２μｍ濾過膜でろ過除菌してから、４℃で保存して準備しておく。
【００８２】
手術後の腫瘍再発予防を評価する動物実験：
（１）雌のＣ５７ＢＬ／６マウス２０匹を取って２群に分け、肩部に５０，０００ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種する。
（２）接種の２１日後に腫瘍サイズが５００ｍｍ３になった時点で、外科手術を行って腫瘍を切除し、創傷を縫合する。ポビドンヨードで局所皮膚に消毒処理を行う。
（３）腫瘍切除後の免疫予防群に、ワクチンミセル１００μＬを皮下接種する。投与量はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：２５ｍｇ／ｋｇ、ＭＰＬＡ：２００μｇ／ｋｇ、Ｅ７−２０：５００μｇ／ｋｇである。他方の群は、生理食塩水を用いるブランク対照群とする。
（４）同じ方式で７日目および１４日目にそれぞれもう１回ずつ接種し、マウスの腫瘍出現状況を記録する。
（５）４２日目に、両群の腫瘍が再発しないマウスに２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞を再度皮下接種して、マウスの腫瘍出現状況を記録する。
【００８３】
結果および結論：ブランク対照群に比べて、ワクチンミセルの接種は、腫瘍を手術で切除した後の腫瘍再発に対する完全な抑制作用を有する。その結果は図９に示すようなものであり、ワクチンミセルは、手術で切除した後の腫瘍再発を完全に抑制しうる。手術の４２日後に腫瘍細胞の接種を追加的に継続した場合、投与群では、手術の７０日後であっても、腫瘍の成長が完全に抑制されうる。
【００８４】
実施例１１  腫瘍治療性ワクチンミセルと化学治療薬物との複合使用による腫瘍の治療
サンプルの調製：
実施例１の方法に従い、Ｅ７ワクチンミセル溶液１０ｍＬを調製する。ここで各成分濃度はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：５ｍｇ／ｍＬ、ＭＰＬＡ：４０μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０：１００μｇ／ｍＬである。
【００８５】
腫瘍治療性ワクチンミセルと化学治療薬物との複合使用による腫瘍治療の動物実験（投与スキームを図１１Ａに示す）：
（１）雌のＣ５７ＢＬ／６マウス３０匹を取って２群に分け、肩部に約２０，０００個ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種する。
（２）接種の１４日後に腫瘍サイズが１００ｍｍ３になった時点で、マウスを各群１０匹、合計２群に組分けする。両群のマウスの平均腫瘍サイズがほぼ同じである。腫瘍が大きすぎるマウス、および小さすぎるマウスは除外され、用いられない。
（３）両群のマウスにシスプラチン治療を３回行う。１回の治療ごとにシスプラチン溶液を尾静脈に注射し、注射投与量は５ｍｇ／ｋｇである。５日おきに化学治療注射を１回行う。
（４）３回目の化学治療が終わった当日に、腫瘍治療性ワクチンミセル複合治療群のマウスに腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセル１００μＬを皮下接種する。投与量は、Ｅ７ワクチンミセル中のＥ７−２０ポリペプチド投与量が５００μｇ／ｋｇである。他方の群は生理食塩水をブランク対照群とする。
（５）同じ方式で、７日目および１４日目にそれぞれもう１回接種し、マウスの腫瘍体積および体重の変化状況を記録する。
（６）最終回の免疫治療の１００日後に、複合治療群中の腫瘍が消失したマウスに、５×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を再度皮下接種して、マウスの腫瘍出現状況を記録する。
【００８６】
結果および結論：化学治療だけの対照群に比べて、腫瘍治療性ワクチンミセルと化学治療薬物との複合使用は、腫瘍に対して一層有効な治療効果を有する（図１１Ｂ）。６０％を上回るマウスで、腫瘍が完全に消失している（図１１Ｃ）。また、治療の１００日後に大量の腫瘍細胞の接種を追加的に継続した場合でも、複合治療群では、腫瘍の成長が完全に抑制されうる。
【００８７】
実施例１２  腫瘍治療性ワクチンミセルと治療性抗体との複合使用による腫瘍の治療
サンプルの調製：
実施例１の方法に従い、腫瘍治療性Ｅ７ワクチンミセル溶液１０ｍＬを調製する。ここで、各成分の濃度はそれぞれ、ＰＥＧ−ＰＥ：２．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＰＬＡ：２５μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０：５０μｇ／ｍＬである。
【００８８】
対照ワクチン：担体充填なし  ＭＰＬＡ：２５μｇ／ｍＬ、Ｅ７−２０：５０μｇ／ｍＬ
【００８９】
腫瘍治療性ワクチンミセルと化学治療薬物との複合使用による腫瘍の治療の動物実験（投与スキームを図１２Ａに示す）：
（１）雌のＣ５７ＢＬ／６マウス８０匹を取って２群に分け、肩部に２０，０００個ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種する。
（２）９日後に腫瘍のサイズ（平均約５０ｍｍ３）を測定し、各群１０匹の６群に分ける。２群のマウスの平均腫瘍サイズはほぼ同じである。腫瘍が大きすぎるマウス、および小さすぎるマウスは除外され、用いられない。
（３）実験の組分けは以下の通りである。
治療されない対照群：組分け後０、５、１０日目にそれぞれ、生理食塩水１００μＬを皮下注射する。
腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセル群：腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルで３回免疫する。組分け後０、５、１０日目にそれぞれ、１００μＬの皮下免疫を行う。
腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルとＣｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ同型対照抗体治療との複合対照群：腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルで３回免疫治療する。組分け後０、５、１０日目にそれぞれ、１００μＬの皮下免疫を行う。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ同型対照抗体の治療は２回であり、５、１０日目にそれぞれ、マウス１匹につき１回あたり２００μｇを腹腔注射する。
抗体治療群：αＰＤ−Ｌ１抗体治療を２回行う。５、１０日目にそれぞれ、マウス１匹につき１回あたり２００μｇを腹腔注射する。
対照ワクチンと抗体治療との複合対照群：ＭＰＬＡ／Ｅ７−２０の免疫治療を３回行う。組分け後０、５、１０日目にそれぞれ、１００μＬを皮下免疫する。αＰＤ−Ｌ１抗体治療は２回であり、５、１０日目にそれぞれ、マウス１匹につき１回あたり２００μｇを腹腔注射する。
腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルとαＰＤ−Ｌ１抗体治療との複合治療群：腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルの免疫治療を３回行う。組分け後０、５、１０日目にそれぞれ、１００μＬを皮下免疫する。αＰＤ−Ｌ１抗体治療は２回であり、５、１０日目にそれぞれ、マウス１匹につき１回あたり２００μｇを腹腔注射する（前者は同型対照抗体であるため重複せず）。
（４）腫瘍体積および体重を週２回測定し、マウスの生存率を記録する。
【００９０】
結果および結論：腫瘍治療性ワクチンミセルのみ及び各対照群と比べて、腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルと治療抗体との複合使用は、腫瘍に対して一層有効な治療効果を有し（図１２Ｂ）、４０％を上回るマウスの腫瘍が完全に消失した。これに対して、腫瘍治療性ポリペプチドワクチンミセルを採用する治療群では、２０％のマウスの腫瘍が完全に消失するが、αＰＤ−Ｌ１抗体を単独で採用する治療群では、マウスの腫瘍は消失しない（図１２Ｃ）。
【００９１】
最後に、上記の実施例は、当業者による本発明の性質の理解を支援するためのみ用いられるものであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではないことに、留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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