(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に少なくとも６種の呼吸器感染症原因微生物のうちの１又は２以上が存在することを検出するため、又は前記試料中に前記呼吸器感染症原因微生物が存在しないことを検出するための定量的なユニプレックス方法であって、
Ａ）試料を検査カードにアプライするステップであって、前記検査カードが６つの個別のウェル：
１）（ｉ）核酸配列TAGGCAATGCWGC（配列番号１２４）からなる核酸配列を有する、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ Ａ及びＢ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１のプローブ；並びに
（ii）核酸配列GGGWGGWGAAGCWGGATTCTACC（配列番号１６５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１のフォワードプライマー１ｆ、及び核酸配列ACCTCTRTACTCTCCCATTATGCCTAG（配列番号１６６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１のリバースプライマー１ｒ；
を含む第１のウェル；
２）（ｉ）核酸配列TCYGGGAYGGGACCRACTA（配列番号１２５）からなる核酸配列を有する、ライノウイルスが存在すること又は存在しないことを検出するための第２のプローブ；並びに
（ii）核酸配列CGGCCCCTGAATGYGGCTAA（配列番号１６７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２のフォワードプライマー２ｆ、及び核酸配列GAAACACGGACACCCAAAGTA（配列番号１６８）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２のリバースプライマー２ｒ；
を含む第２のウェル；
３）（ｉ）核酸配列TCAGCACCAGACACACC（配列番号１２６）からなる核酸配列を有する、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第３のプローブ；並びに
（ii）核酸配列CATCAGGTAAYATCCCACAAAAYCAG（配列番号１６９）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３のフォワードプライマー３ｆ、及び核酸配列GTGAATATTAARGCACCTACACATAATAARA（配列番号１７０）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３のリバースプライマー３ｒ；
を含む第３のウェル；
４）（ｉ）核酸配列TCTGGTCATTGGRGCC（配列番号１２７）からなる核酸配列を有する、Ｂ型インフルエンザ（Ｆｌｕ Ｂ Ｑｕａｄ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第４のプローブ；並びに
（ii）核酸配列GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT（配列番号１７１）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４のフォワードプライマー４ｆ、及び核酸配列CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT（配列番号１７２）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４のリバースプライマー４ｒ；
を含む第４のウェル；
５）（ｉ）核酸配列CGCTCACTGGGCACGGT（配列番号１２８）からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザ（Ｆｌｕ Ａ ＣＤＣ ＤＣ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第５のプローブ；並びに
（ii）核酸配列GACCRATCCTGTCACCTCTGAC（配列番号１７３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第５のフォワードプライマー５ｆ、及び核酸配列AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA（配列番号１７４）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第５のリバースプライマー５ｒ；
を含む第５のウェル；
６）（ｉ）核酸配列AACTGRGTGTTCATTTTGT（配列番号１２９）からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５（Ｈ５ ＦＲＥＴ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第６のプローブ；並びに
（ii）核酸配列AGTGGRTACGCTGCAGAC（配列番号１７５）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第６のフォワードプライマー６ｆ、及び核酸配列GTTCAGCATTATAAGTCCAGACATCTAG（配列番号１７６）に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第６のリバースプライマー６ｒ；
を含む第６のウェル
を含むステップと、
Ｂ）前記試料中に存在する標的核酸を前記ウェル中のそれぞれのプライマーを使用して増幅させるステップと、
Ｃ）前記試料中に存在する核酸及び／又は増幅した標的核酸を前記ウェル中の前記プローブと接触させるステップと、
Ｄ）前記標的核酸及び／又は増幅した標的核酸が前記プローブのうちの配列番号１２４〜１２９の１又は２以上の核酸配列に結合した結合核酸複合体の存在を検出するステップであって、結合核酸複合体が存在することにより、前記６種の呼吸器感染症原因微生物のうちの１又は２以上由来の核酸が前記試料中に存在することが確認され、結合核酸複合体が存在しないことにより、前記６種の呼吸器感染症原因微生物の全て由来の核酸が前記試料中に存在しないことが確認されるステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
検査カードが、
７）（ｉ）配列番号１３０の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１）が存在すること又は存在しないことを検出するための第７のプローブ；並びに
（ii）配列番号１７７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第７のフォワードプライマー７ｆ、及び配列番号１７８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第７のリバースプライマー７ｒ；
を含む第７のウェル；
８）（ｉ）配列番号１３１の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２）が存在すること又は存在しないことを検出するための第８のプローブ；並びに
（ii）配列番号１７９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第８のフォワードプライマー８ｆ、及び配列番号１８０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第８のリバースプライマー８ｒ；
を含む第８のウェル；
９）（ｉ）配列番号１３２の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３）が存在すること又は存在しないことを検出するための第９のプローブ；並びに
（ii）配列番号１８１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第９のフォワードプライマー９ｆ、及び配列番号１８２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第９のリバースプライマー９ｒ；
を含む第９のウェル；
１０）（ｉ）配列番号１３３の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ４）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１０のプローブ；並びに
（ii）配列番号１８３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１０のフォワードプライマー１０ｆ、及び配列番号１８４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１０のリバースプライマー１０ｒ；を含む第１０のウェル；
１１）（ｉ）配列番号１３４の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトアデノウイルス＃２が存在すること又は存在しないことを検出するための第１１のプローブ；並びに
（ii）配列番号１８５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１１のフォワードプライマー１１ｆ、及び配列番号１８６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１１のリバースプライマー１１ｒ；を含む第１１のウェル；
１２）（ｉ）配列番号１３５の核酸配列からなる核酸配列を有する、タミフル感受性Ａ型インフルエンザＨ１ ２００９が存在すること又は存在しないことを検出するための第１２のプローブ；並びに
（ii）配列番号１８７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１２のフォワードプライマー１２ｆ、及び配列番号１８８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１２のリバースプライマー１２ｒ；を含む第１２のウェル；
１３）（ｉ）配列番号１３６の核酸配列からなる核酸配列を有する、タミフル抵抗性Ａ型インフルエンザＨ１ ２００９が存在すること又は存在しないことを検出するための第１３のプローブ；並びに
（ii）配列番号１８９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１３のフォワードプライマー１３ｆ、及び配列番号１９０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１３のリバースプライマー１３ｒ；を含む第１３のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む、請求項１に記載の定量的な方法。
【請求項３】
検査カードが、追加的な第７〜第１３のウェル及び対応する第７〜第１３の追加的なプローブのそれぞれを含む、請求項２に記載の定量的な方法。
【請求項４】
検査カードが、
１４）（ｉ）配列番号１３７又は２８６の核酸配列からなる核酸配列を有する、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ＃２）；（ＲＳＶ＃３）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１４のプローブ；並びに
（ii）配列番号１９１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１４のフォワードプライマー１４ｆ、及び配列番号１９２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１４のリバースプライマー１４ｒ；を含む第１４のウェル；
１５）（ｉ）配列番号１３８の核酸配列からなる核酸配列を有する、エンテロウイルスが存在すること又は存在しないことを検出するための第１５のプローブ；並びに
（ii）配列番号１９３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１５のフォワードプライマー１５ｆ、及び配列番号１９４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１５のリバースプライマー１５ｒ；を含む第１５のウェル；
１６）（ｉ）配列番号１３９の核酸配列からなる核酸配列を有する、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１６のプローブ；並びに
（ii）配列番号１９５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１６のフォワードプライマー１６ｆ、及び配列番号１９６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１６のリバースプライマー１６ｒ；を含む第１６のウェル；
１７）（ｉ）配列番号１４０の核酸配列からなる核酸配列を有する、第２群コロナウイルスＯＣ４３及びＨＫＵ１（ＧＰ２ＯＣ４３／ＨＫＵ１）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１７のプローブ；並びに
（ii）配列番号１９７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１７のフォワードプライマー１７ｆ、及び配列番号１９８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１７のリバースプライマー１７ｒ；を含む第１７のウェル；
１８）（ｉ）配列番号１４１の核酸配列からなる核酸配列を有する、第１群コロナウイルスＮＬ６３（ＧＰ１ ＮＬ６３）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１８のプローブ；並びに
（ii）配列番号１９９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１８のフォワードプライマー１８ｆ、及び配列番号２００の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１８のリバースプライマー１８ｒ；を含む第１８のウェル；
１９）（ｉ）配列番号１４２の核酸配列からなる核酸配列を有する、第１群コロナウイルス２２９Ｅ（ＧＰ１ ２２９Ｅ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第１９のプローブ；並びに
（ii）配列番号２０１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１９のフォワードプライマー１９ｆ、及び配列番号２０２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第１９のリバースプライマー１９ｒ；を含む第１９のウェル；
２０）（ｉ）配列番号１４３の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトアデノウイルスが存在すること又は存在しないことを検出するための第２０のプローブ；並びに
（ii）配列番号２０３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２０のフォワードプライマー２０ｆ、及び配列番号２０４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２０のリバースプライマー２０ｒ；を含む第２０のウェル；
２１）（ｉ）配列番号１４４の核酸配列からなる核酸配列を有する、ボカウイルスが存在すること又は存在しないことを検出するための第２１のプローブ；並びに
（ii）配列番号２０５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２１のフォワードプライマー２１ｆ、及び配列番号２０６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２１のリバースプライマー２１ｒ；を含む第２１のウェル；
２２）（ｉ）配列番号１４５の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザ（Ｆｌｕ Ａ Ｑｕａｄ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２２のプローブ；並びに
（ii）配列番号２０７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２２のフォワードプライマー２２ｆ、及び配列番号２０８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２２のリバースプライマー２２ｒ；を含む第２２のウェル；
２３）（ｉ）配列番号１４６の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＨ１ ２００９（Ｈ１ ｓｗ ２００９）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２３のプローブ；並びに
（ii）配列番号２０９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２３のフォワードプライマー２３ｆ、及び配列番号２１０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２３のリバースプライマー２３ｒ；を含む第２３のウェル；
２４）（ｉ）配列番号１４７の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＮ１ ２００９（Ｎ１ ＣＦＩ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２４のプローブ；並びに
（ii）配列番号２１１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２４のフォワードプライマー２４ｆ、及び配列番号２１２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２４のリバースプライマー２４ｒ；を含む第２４のウェル；
２５）（ｉ）配列番号１４８の核酸配列からなる核酸配列を有する、季節性Ａ型インフルエンザＨ１（季節性Ｈ１ ＣＦＩ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２５のプローブ；並びに
（ii）配列番号２１３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２５のフォワードプライマー２５ｆ、及び配列番号２１４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２５のリバースプライマー２５ｒ；を含む第２５のウェル；
２６）（ｉ）配列番号１４９の核酸配列からなる核酸配列を有する、季節性Ａ型インフルエンザＨ３（季節性Ｈ３ ＣＦＩ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２６のプローブ；並びに
（ii）配列番号２１５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２６のフォワードプライマー２６ｆ、及び配列番号２１６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２６のリバースプライマー２６ｒ；を含む第２６のウェル；
２７）（ｉ）配列番号１５０の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＨ５（Ｈ５ ＣＦＩ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２７のプローブ；並びに
（ii）配列番号２１７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２７のフォワードプライマー２７ｆ、及び配列番号２１８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２７のリバースプライマー２７ｒ；を含む第２７のウェル；
２８）（ｉ）配列番号１５１又は２５５の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＨ７（Ｈ７）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２８のプローブ；並びに
（ii）配列番号２１９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２８のフォワードプライマー２８ｆ、及び配列番号２２０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２８のリバースプライマー２８ｒ；を含む第２８のウェル；
２９）（ｉ）配列番号１５２の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＨ９（Ｈ９ ａ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第２９のプローブ；並びに
（ii）配列番号２２１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２９のフォワードプライマー２９ｆ、及び配列番号２２２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第２９のリバースプライマー２９ｒ；を含む第２９のウェル；
３０）（ｉ）配列番号１５３の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ａ型インフルエンザＨ９（Ｈ９ ｂ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第３０のプローブ；並びに
（ii）配列番号２２３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３０のフォワードプライマー３０ｆ、及び配列番号２２４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３０のリバースプライマー３０ｒ；を含む第３０のウェル；
３１）（ｉ）配列番号１５４の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１＃２）が存在すること又は存在しないことを検出するための第３１のプローブ；並びに
（ii）配列番号２２５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３１のフォワードプライマー３１ｆ、及び配列番号２２６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３１のリバースプライマー３１ｒ；を含む第３１のウェル；
３２）（ｉ）配列番号１５５の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ１＃３）が存在すること又は存在しないことを検出するための第３２のプローブ；並びに
（ii）配列番号２２７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３２のフォワードプライマー３２ｆ、及び配列番号２２８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３２のリバースプライマー３２ｒ；を含む第３２のウェル；
３３）（ｉ）配列番号１５６の核酸配列からなる核酸配列を有する、ライノウイルス＃２が存在すること又は存在しないことを検出するための第３３のプローブ；並びに
（ii）配列番号２２９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３３のフォワードプライマー３３ｆ、及び配列番号２３０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３３のリバースプライマー３３ｒ；を含む第３３のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の定量的な方法。
【請求項５】
検査カードが、追加的な第１４〜第３３のウェル及び対応する第１４〜第３３の追加的なプローブのそれぞれを含む、請求項４に記載の定量的な方法。
【請求項６】
検査カードが、
３４）（ｉ）配列番号１５７の核酸配列からなる核酸配列を有する、レジオネラ・ニューモフィラが存在すること又は存在しないことを検出するための第３４のプローブ；並びに
（ii）配列番号２３１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３４のフォワードプライマー３４ｆ、及び配列番号２３２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３４のリバースプライマー３４ｒ；を含む第３４のウェル；
３５）（ｉ）配列番号１５８の核酸配列からなる核酸配列を有する、肺炎マイコプラズマが存在すること又は存在しないことを検出するための第３５のプローブ；並びに
（ii）配列番号２３３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３５のフォワードプライマー３５ｆ、及び配列番号２３４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３５のリバースプライマー３５ｒ；を含む第３５のウェル；
３６）（ｉ）配列番号１５９の核酸配列からなる核酸配列を有する、肺炎クラミジアが存在すること又は存在しないことを検出するための第３６のプローブ；並びに
（ii）配列番号２３５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３６のフォワードプライマー３６ｆ、及び配列番号２３６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３６のリバースプライマー３６ｒ；を含む第３６のウェル；
３７）（ｉ）配列番号１６０の核酸配列からなる核酸配列を有する、Ｑ熱コクシエラが存在すること又は存在しないことを検出するための第３７のプローブ；並びに
（ii）配列番号２３７の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３７のフォワードプライマー３７ｆ、及び配列番号２３８の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３７のリバースプライマー３７ｒ；を含む第３７のウェル；
３８）（ｉ）配列番号１６１の核酸配列からなる核酸配列を有する、オウム病クラミジアが存在すること又は存在しないことを検出するための第３８のプローブ；並びに
（ii）配列番号２３９の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３８のフォワードプライマー３８ｆ、及び配列番号２４０の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３８のリバースプライマー３８ｒ；を含む第３８のウェル；
３９）（ｉ）配列番号１６２の核酸配列からなる核酸配列を有する、クラミドフィラ・アボルタスが存在すること又は存在しないことを検出するための第３９のプローブ；並びに
（ii）配列番号２４１の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３９のフォワードプライマー３９ｆ、及び配列番号２４２の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第３９のリバースプライマー３９ｒ；を含む第３９のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の定量的な方法。
【請求項７】
検査カードが、追加的な第３３〜第３９のウェル及び対応する第３３〜第３９の追加的なプローブのそれぞれを含む、請求項６に記載の定量的な方法。
【請求項８】
検査カードが、
４０）（ｉ）配列番号１６３の核酸配列からなる核酸配列を有する、大腸菌バクテリオファージＭＳ２（ＭＳ２ ＩＣ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第４０のプローブ；並びに
（ii）配列番号２４３の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４０のフォワードプライマー４０ｆ、及び配列番号２４４の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４０のリバースプライマー４０ｒ；を含む第４０のウェル；
４１）（ｉ）配列番号１６４の核酸配列からなる核酸配列を有する、ヒトリボヌクレアーゼＰ遺伝子（ＲＮＡ分解酵素Ｐ）が存在すること又は存在しないことを検出するための第４１のプローブ；並びに
（ii）配列番号２４５の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４１のフォワードプライマー４１ｆ、及び配列番号２４６の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列からなる第４１のリバースプライマー４１ｒ；を含む第４１のウェル
から選択される１又は２以上の追加的な対照ウェル及び対応する１又は２以上の追加的な対照プローブを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の定量的な方法。
【請求項９】
検査カードが、追加的な第４０のウェル又は第４１のウェル及び対応する第４０〜第４１の追加的なプローブの一方又は両方を含む、請求項８に記載の定量的な方法。    
【請求項１０】
検出の前に核酸増幅ステップを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の定量的な方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の定量的な方法において使用するための検査カードであって、複数のウェルを含み、少なくとも６つのウェルが設けられ、第１のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第１のプローブを含み、第２のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第２のプローブを含み、第３のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第３のプローブを含み、第４のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第４のプローブを含み、第５のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第５のプローブを含み、第６のウェルが請求項１〜１０に記載の本発明の第６のプローブを含む、前記検査カード。
【請求項１２】
追加的な第７〜第１３のウェルのうちの１又は２以上をさらに含み、前記ウェルがそれぞれの第７〜第１３のプローブを含有する、請求項１１に記載の検査カード。
【請求項１３】
追加的な第１４〜第３３のウェルのうちの１又は２以上をさらに含み、前記ウェルがそれぞれの第１４〜第３３のプローブを含有する、請求項１１又は１２に記載の検査カード。
【請求項１４】
追加的な第３４〜第３９のウェルのうちの１又は２以上をさらに含み、前記ウェルがそれぞれの第３４〜第３９のプローブを含有する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の検査カード。
【請求項１５】
追加的な第４０のウェル及び第４１のウェルの一方又は両方をさらに含み、前記ウェルがそれぞれの第４０のプローブ及び第４１のプローブを含有する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の検査カード。
【請求項１６】
プローブがそれぞれのウェルの表面に固定化されている、請求項１１〜１５のいずれかに記載の検査カード。
【請求項１７】
プローブが、それぞれのウェルの表面に吸着した凍結乾燥形態で存在する、請求項１６に記載の検査カード。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料を呼吸器感染症原因微生物の存在についてスクリーニングするための核酸産物、及び対応する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器感染症は、世界的にヒト疾患の最も一般的な原因の１つである（Murray and Lopez (1997) - Lancet, 349, pages 1269-1276を参照されたい）。障害をきたした個体（心臓系、肺系、免疫系）、高齢者及び乳児は特に、重篤な合併症を発症するリスクがある。歴史的に、呼吸器感染症の迅速な検査室診断が一連のマルチプレックス化されたリアルタイム（ＲＴ，Real-Time）ＰＣＲ  ＴａｑＭａｎアッセイによって実施されてきた。しかし、このマルチプレックス化された手法に付随する重要な問題は、並行してスクリーニングアッセイを調製し、実行し、モニターする必要があることである。これは、実施される各アッセイにより、単一のアッセイと比べて消耗費用が倍加し、これらのアッセイを実施するために使用する費用のかかる設備の摩損に関して追加的な運用負担がかかるので、望ましくない財政的負担を示す。前記マルチプレックス化された手法では、多数のアッセイを実施することに付随して追加的な時間及び人的資源の負担も課される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Murray and Lopez (1997) - Lancet, 349, pages 1269-1276
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、より効率的なスクリーニング系が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、単一の単離された試料中に多数の呼吸器感染症原因微生物が存在するかしないかを検出するための単純な１段階アッセイ（すなわちシングルプレックス形式）を実現することによって上記の問題のうちの１又は２以上を解決する。
【０００６】
より詳細には、本発明は、試料中に少なくとも６種の呼吸器感染症原因微生物のうちの１又は２以上が存在することを検出するため、又は前記試料中に前記微生物が存在しないことを検出するための方法であって、
Ａ）試料を検査カードにアプライするステップであって、前記検査カードが６つの個別のウェル：
１）核酸配列GGCAATGCWG（配列番号１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１のプローブを含む第１のウェル；
２）核酸配列GAYGGGACCR（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２のプローブを含む第２のウェル；
３）核酸配列CACCAGACAC（配列番号３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３のプローブを含む第３のウェル；
４）核酸配列GGTCATTGGR（配列番号４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４のプローブを含む第４のウェル；
５）核酸配列CACTGGGCAC（配列番号５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第５のプローブを含む第５のウェル；
６）核酸配列RGTGTTCATT（配列番号６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第６のプローブを含む第６のウェル
を含むステップと、
Ｂ）前記試料中に存在する核酸を前記ウェル中のプローブと接触させるステップと、
Ｃ）試料核酸が前記プローブのうちの１又は２以上に結合した結合核酸複合体の存在を検出するステップであって、
Ｄ）結合核酸複合体が存在することにより、前記６種の呼吸器感染症原因微生物のうちの１又は２以上由来の核酸が前記試料中に存在することが確認され、結合核酸複合体が存在しないことにより、前記６種の呼吸器感染症原因微生物の全て由来の核酸が前記試料中に存在しないことが確認されるステップと
を含む方法を提供する。
【０００７】
出願人が対処した１つの重要な先行技術の問題は、アッセイ条件の単一セット（すなわちシングルプレックス形式）において相互に適合する（すなわち正確な結合特異性を保持する）頑強なプローブのセットを提供することである。本発明の方法に伴う１つの特定の利点はスピードである。例として、本発明の方法は、通常２．５時間以内、好ましくは２時間又は１．５時間以内に完了する。対照的に、現行のマルチプレックスアッセイでは、通常少なくとも４〜５時間、通常少なくとも５時間かかる。
【０００８】
本発明のユニプレックス（別名シングルプレックス）アッセイ方法に伴う別の利点は、感度が増大し、それにより、単に試料中に特定の病原体が存在するかしないかを決定することに加えて、試料中の微生物（例えば、ウイルス負荷及び／又は細菌負荷）を定量的に検出することが可能になることである。
【０００９】
試料中の微生物（例えば、ウイルス及び細菌）を、各微生物標的についての負荷較正に供すことができる。これにより、試料中の各微生物の特異的な負荷を定量化することが可能になる。有利に、本発明のこの特徴により、多数の微生物が存在する試料中で優勢な微生物（複数可）を決定することが可能になる。例えば、本発明のユニプレックスアッセイ方法により、多数のウイルスが存在する試料中で優勢なウイルスを確認することが可能になる。さらに、本発明の方法により、試料中のウイルスを経時的に定量的に検出することが可能になり、これは、特定のウイルスのウイルス負荷が変動する場合に特に有用である。
【００１０】
さらに、現行の系では膜上で実施するハイブリダイゼーションを用いるが、本発明のアッセイ方法は、クローズド（例えば滅菌された）システムで行い、したがってコンタミネーションの可能性が低下し、これにより別の利点がもたらされる。
【００１１】
プローブ１〜６により、それぞれ、
１）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ  Ａ及びＢ）；
２）ライノウイルス；
３）ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）；
４）Ｂ型インフルエンザ（Ｆｌｕ  Ｂ  Ｑｕａｄ）；
５）Ａ型インフルエンザ（Ｆｌｕ  Ａ  ＣＤＣ  ＤＣ）；及び
６）Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ５（Ｈ５  ＦＲＥＴ）
を高感度で検出することが可能になる。
【００１２】
したがって、上で定義されている方法は、前記呼吸器感染症原因微生物のうちの任意の１又は２以上をユニプレックス（別名シングルプレックス）アッセイ形式で検出するための迅速なアッセイを提供する。同様に、前記方法は、前記呼吸器感染症原因微生物の全てが試料中に存在しないことを単一の（ユニプレックス）アッセイで確認するための迅速なアッセイを提供する。ユニプレックスアッセイとは、多数の個々の検出ウェルアッセイのそれぞれを同じアッセイ条件下で、及び／又は実質的に同時に実施することを意味する。使用時に、単一の試料を検査カードにアプライし、次いで、その試料を各検査ウェル中に投入する。
【００１３】
一実施形態では、該方法は、
７）核酸配列TTTCCAGGGG（配列番号７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第７のプローブを含む第７のウェル；
８）核酸配列CCGCAAGTCA（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第８のプローブを含む第８のウェル；
９）核酸配列TTGCCTGGTG（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第９のプローブを含む第９のウェル；
１０）核酸配列TAARGTAGGT（配列番号１０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１０のプローブを含む第１０のウェル；
１１）核酸配列CGGCRTCATY（配列番号１１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１１のプローブを含む第１１のウェル；
１２）核酸配列ATARTGRTAA（配列番号１２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１２のプローブを含む第１２のウェル；
１３）核酸配列ATAGTAATAA（配列番号１３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１３のプローブを含む第１３のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル、及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む検査カードを使用し、上記のものと同じ方法ステップを用いる。
【００１４】
一実施形態では、検査カードは、前記第７〜第１３のウェル（それに加えて、対応するプローブ）のうちの２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、又は７全てを含んでよい。
【００１５】
プローブ７〜１３により、それぞれ、
７）ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１）；
８）ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２）；
９）ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３）；
１０）ヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ４）；
１１）ヒトアデノウイルス＃２；
１２）Ａ型インフルエンザＨ１  ２００９タミフル感受性；及び
１３）Ａ型インフルエンザＨ１  ２００９タミフル抵抗性
を高感度で検出することが可能になる。
【００１６】
したがって、上で定義されている方法は、前記呼吸器感染症原因微生物のうちの任意の１又は２以上をユニプレックス形式アッセイで検出するための迅速なアッセイを提供する。同様に、前記方法は、前記呼吸器感染症原因微生物の全てが試料中に存在しないことをユニプレックス形式アッセイで確認するための迅速なアッセイを提供する。
【００１７】
一実施形態では、該方法は、
１４）核酸配列TACTGTGACA（配列番号１４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１４のプローブを含む第１４のウェル；
１５）核酸配列YRGCGGAACC（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１５のプローブを含む第１５のウェル；
１６）核酸配列TAACGAGTGT（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１６のプローブを含む第１６のウェル；
１７）核酸配列CGAATGAATG（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１７のプローブを含む第１７のウェル；
１８）核酸配列YTCTAAGCAT（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１８のプローブを含む第１８のウェル；
１９）核酸配列TTCTAAGCAT（配列番号１９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第１９のプローブを含む第１９のウェル；
２０）核酸配列GAGTAYCTSA（配列番号２０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２０のプローブを含む第２０のウェル；
２１）核酸配列ACTGCATCCG（配列番号２１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２１のプローブを含む第２１のウェル；
２２）核酸配列TGTCACCTCT（配列番号２２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２２のプローブを含む第２２のウェル；
２３）核酸配列AGTGTGTYAC（配列番号２３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２３のプローブを含む第２３のウェル；
２４）核酸配列GAATTTCTGG（配列番号２４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２４のプローブを含む第２４のウェル；
２５）核酸配列TTGCCGGATG（配列番号２５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２５のプローブを含む第２５のウェル；
２６）核酸配列CAGCAACTGT（配列番号２６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２６のプローブを含む第２６のウェル
２７）核酸配列TGCTCCAGAA（配列番号２７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２７のプローブを含む第２７のウェル；
２８）核酸配列TNGCCATTGY（配列番号２８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２８のプローブを含む第２８のウェル；
２９）核酸配列GTYCCGTGRA（配列番号２９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第２９のプローブを含む第２９のウェル；
３０）核酸配列CTGGARTCTG（配列番号３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３０のプローブを含む第３０のウェル；
３１）核酸配列CRACTGTGTC（配列番号３１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３１のプローブを含む第３１のウェル；
３２）核酸配列GTGTCACCGC（配列番号３２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３２のプローブを含む第３２のウェル；
３３）核酸配列GAYGGRACCR（配列番号３３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３３のプローブを含む第３３のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル、及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む検査カードを使用し、上記のものと同じ方法ステップを用いる。
【００１８】
一実施形態では、検査カードは、前記第１４〜第３３のウェル（それに加えて、対応するプローブ）のうちの２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６又は７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、１１若しくは１２以上、１２若しくは１３以上、１３若しくは１４以上、１４若しくは１５以上、１５若しくは１６以上、１６若しくは１７以上、１７若しくは１８以上、１８若しくは１９以上、１９若しくは２０以上、又は２０全てを含んでよい。前記１又は２以上の第１４〜第３０のウェル（それに加えて、対応するプローブ）は、前記１又は２以上の第７〜第１３のウェル（それに加えて、対応するプローブ）と組み合わせて、又はその代わりに使用することができる。
【００１９】
プローブ１４〜３０により、それぞれ、
１４）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ＃２）；（ＲＳＶ＃３）
１５）エンテロウイルス；
１６）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ）；
１７）第２群コロナウイルスＯＣ４３及びＨＫＵ１（ＧＰ２ＯＣ４３／ＨＫＵ１）；
１８）第１群コロナウイルスＮＬ６３（ＧＰ１  ＮＬ６３）；
１９）第１群コロナウイルス２２９Ｅ（ＧＰ１  ２２９Ｅ）；
２０）ヒトアデノウイルス；
２１）ボカウイルス；
２２）Ａ型インフルエンザ（Ｆｌｕ  Ａ  Ｑｕａｄ）；
２３）Ａ型インフルエンザＨ１  ２００９（Ｈ１  ｓｗ  ２００９）；
２４）Ａ型インフルエンザＮ１  ２００９（Ｎ１  ＣＦＩ）；
２５）季節性Ａ型インフルエンザＨ１（季節性Ｈ１  ＣＦＩ）；
２６）季節性Ａ型インフルエンザＨ３（季節性Ｈ３  ＣＦＩ）；
２７）Ａ型インフルエンザＨ５（Ｈ５  ＣＦＩ）；
２８）Ａ型インフルエンザＨ７（Ｈ７）；
２９）Ａ型インフルエンザＨ９（Ｈ９  ａ）；
３０）Ａ型インフルエンザＨ９（Ｈ９  ｂ）；
３１）ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１＃２）；
３２）ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ１＃３）；及び
３３）ライノウイルス＃２
を高感度で検出することが可能になる。
【００２０】
したがって、上で定義されている方法は、前記呼吸器感染症原因微生物のうちの任意の１又は２以上をユニプレックス形式アッセイで検出するための迅速なアッセイを提供する。同様に、前記方法は、前記呼吸器感染症原因微生物の全てが試料中に存在しないことをユニプレックス形式アッセイで確認するための迅速なアッセイを提供する。
【００２１】
一実施形態では、該方法は、１又は２以上の追加的なウェル、及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む検査カードであって、前記追加的なプローブが非定型肺炎の原因物質に結合する（したがって、それを検出する）検査カードを使用する。非定型細菌性呼吸器感染症に感染した患者は従来の抗生物質に応答せず、多くの場合、その患者の状態は増悪し、医療財源が流出する。非定型細菌性肺炎に関連する生物体の従来の同定検査（laboratory identification）は難しく、時間及び費用がかかり、したがって、本発明はこの点について劇的な改善をもたらす。したがって、この実施形態では、１又は２以上の追加的なプローブを使用して、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydophila psittaci）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumonia）、及びＱ熱コクシエラ（Coxiella burnettii）のうちの１又は２以上を検出する。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、
３４）核酸配列AATTGGCTTT（配列番号３４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３４のプローブを含む第３４のウェル；
３５）核酸配列GGAGAGTGTG（配列番号３５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３５のプローブを含む第３５のウェル；
３６）核酸配列CAGACGCTGG（配列番号３６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３６のプローブを含む第３６のウェル；
３７）核酸配列CGGCGTTTAT（配列番号３７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３７のプローブを含む第３７のウェル；
３８）核酸配列CTTGGTGTGA（配列番号３８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３８のプローブを含む第３８のウェル；
３９）核酸配列CTTGGTGTGA（配列番号３９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第３９のプローブを含む第３９のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル、及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む検査カードを使用し、上記のものと同じ方法ステップを用いる。
【００２２】
一実施形態では、検査カードは、前記第３４〜第３９のウェル（それに加えて、対応するプローブ）のうちの２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、又は６全てを含んでよい。前記１又は２以上の第３４〜第３９のウェル（それに加えて、対応するプローブ）は、前記第１４〜第３３のウェル（それに加えて、対応するプローブ）と組み合わせて、若しくはその代わりに、及び／又は前記１又は２以上の第７〜第１３のウェル（それに加えて、対応するプローブ）と組み合わせて、若しくはその代わりに使用することができる。
【００２３】
プローブ３４〜３９により、それぞれ、
３４）レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）；
３５）肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）；
３６）肺炎クラミジア（Chlamydiophilia pneumoniae）；
３７）Ｑ熱コクシエラ（Coxiella burnetti）；
３８）オウム病クラミジア（Chlamydiophilia psittaci）；及び
３９）クラミドフィラ・アボルタス（Chlamydiophilia abortus）
を高感度で検出することが可能になる。
【００２４】
したがって、上で定義されている方法は、前記呼吸器感染症原因微生物のうちの任意の１又は２以上をユニプレックス形式アッセイで検出するための迅速なアッセイを提供する。同様に、前記方法は、前記呼吸器感染症原因微生物の全てが試料中に存在しないことをユニプレックス形式アッセイで確認するための迅速なアッセイを提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明の方法では、１又は２以上の追加的な「対照」ウェル、及び、
４０）核酸配列AGATCAAGGT（配列番号４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４０のプローブを含む第４０のウェル；
４１）核酸配列ACCTGAAGGC（配列番号４１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４１のプローブを含む第４１のウェル
から選択される対応する１又は２以上の追加的な「対照」プローブを含む検査カードを使用し、上記のものと同じ方法ステップを用いる。
【００２６】
一実施形態では、検査カードは、前記第４０のウェル又は第４１のウェル（それに加えて、対応するプローブ）の一方又は両方を含んでよい。代替の「対照」プローブ／プローブ標的を用いることができる。前記「対照」プローブは、上記の実施形態のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【００２７】
対照プローブ４０〜４１により、それぞれ、
４０）大腸菌（Escherichia coli）バクテリオファージＭＳ２（ＭＳ２  ＩＣ）；及び
４１）ヒトリボヌクレアーゼＰ遺伝子（ＲＮＡ分解酵素Ｐ）
を高感度で検出することが可能になる。
【００２８】
１又は２以上の「対照」プローブが存在することにより、アッセイが他の点で正常に実施されていることを（実質的に同時に）確認することが可能になる。例えば、試料を、核酸を抽出する前に大腸菌バクテリオファージＭＳ２（ＭＳ２  ＩＣ）を用いてスパイクする。バクテリオファージＭＳ２プローブを使用して試料中のバクテリオファージＭＳ２核酸を検出することにより、ユニプレックスアッセイに伴う種々の段階が首尾よく完了したことを確認すること可能になる。バクテリオファージＭＳ２は、単に内部標準の１つの例を提供するものであり、任意の適切な代替物を本発明の方法と共に利用することができる。
【００２９】
一実施形態では、検査カードは、ヒトリボヌクレアーゼＰ遺伝子（ＲＮＡ分解酵素Ｐ）の検出を可能にするプローブを含む。試料中にヒトＲＮＡ分解酵素Ｐ核酸が存在することにより、ヒト生物材料が採取されたことが示される。あるいは、他のヒトゲノムマーカーをプローブ標的として使用し、それらの対応するプローブを検査カードに含めることができる。
【００３０】
本発明のアッセイ方法は、核酸増幅ステップを含んでよく、その場合、本発明の各プローブを（フォワード及びリバース）プライマーの対と組み合わせて使用し、前記プライマー対が協同して標的核酸のひと続きが増幅され、次いでこれが検出ステップの間にプローブにより（それに結合することによって）認識される。例として、プライマー１ｆ（フォワード）及び１ｒ（リバース）は第１のプローブと協調し、使用時には３つの核酸配列全てが第１のウェルに含まれている。同じことがプライマー２ｆ及び２ｒと第２のプローブの組合せ（第２のウェル中）〜プライマー４１ｆ及び４１ｒと第４１のプローブの組合せ（第４１のウェル中）に当てはまる。
【００３１】
一実施形態では、該方法は、
４２）核酸配列GTGCARTTYG（配列番号３３８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４２のプローブを含む第４２のウェル；
４３）核酸配列YGCYTCGGAR（配列番号３３９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４３のプローブを含む第４３のウェル；
４４）核酸配列CTTGTGGANC（配列番号３４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４４のプローブを含む第４４のウェル；
４５）核酸配列CATTCCATTC（配列番号３４１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４５のプローブを含む第４５のウェル；
４６）核酸配列WGTGTTTGCA（配列番号３４２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４６のプローブを含む第４６のウェル；
４７）核酸配列ACCACGGGAT（配列番号３４３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４７のプローブを含む第４７のウェル
４８）核酸配列GTCCTCGCTG（配列番号３４４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４８のプローブを含む第４８のウェル；
４９）核酸配列GCCCGCGACG（配列番号３４５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む核酸配列を有する第４９のプローブを含む第４９のウェル
から選択される１又は２以上の追加的なウェル、及び対応する１又は２以上の追加的なプローブを含む検査カードを使用し、上記のものと同じ方法ステップを用いる。
【００３２】
プローブ４２〜４９により、それぞれ、
４２）アデノウイルス
４３）ＡＤＰ１７アデノウイルス；
４４）パレコウイルス；
４５）Ｂ型インフルエンザウイルス；
４６）Ｂ型インフルエンザウイルス；
４７）結核菌（Mycobacterium tuberculosis）；
４８）結核菌；
４９）マイコバクテリア（一般的な）
を高感度で検出することが可能になる。
【００３３】
したがって、上で定義されている方法は、前記呼吸器感染症原因微生物のうちの任意の１又は２以上をユニプレックス形式アッセイで検出するための迅速なアッセイを提供する。同様に、前記方法は、前記呼吸器感染症原因微生物の全てが試料中に存在しないことをユニプレックス形式アッセイで確認するための迅速なアッセイを提供する。
【００３４】
プライマー１ｆは、AAGCWGGATTCTACC（配列番号４２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１ｒは、TCCCATTATGCCTAG（配列番号４３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００３５】
プライマー２ｆは、CCTGAATGYGGCTAA（配列番号４４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２ｒは、CGGACACCCAAAGTA（配列番号４５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００３６】
プライマー３ｆは、ATCCCACAAAAYCAG（配列番号４６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３ｒは、CTACACATAATAARA（配列番号４７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００３７】
プライマー４ｆは、GATGTCCATCAAGCT（配列番号４８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４ｒは、TARAGCAATAGGTCT（配列番号４９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００３８】
プライマー５ｆは、CCTGTCACCTCTGAC（配列番号５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー５ｒは、TGGACAAAKCGTCTA（配列番号５１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００３９】
プライマー６ｆは、GGRTACGCTGCAGAC（配列番号５２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー６ｒは、AGTCCAGACATCTAG（配列番号５３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４０】
プライマー７ｆは、ATACTCAGAGACCCA（配列番号５４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー７ｒは、ATAYTGTTGCATAGC（配列番号５５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４１】
プライマー８ｆは、TGCTCCTGATCARCC（配列番号５６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー８ｒは、TCCCACCATRGCATA（配列番号５７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４２】
プライマー９ｆは、TATCCTCAGAGATCC（配列番号５８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー９ｒは、ACATACTGTTGCATG（配列番号５９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４３】
プライマー１０ｆは、CTTGTACAGGARATG（配列番号６０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー６ｒは、TCCCACCATRGCATA（配列番号６１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４４】
プライマー１１ｆは、RGTSGAYCCCATGGA（配列番号６２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１１ｒは、SGGYGTRCGSAGGTA（配列番号６３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４５】
プライマー１２ｆは、AGTCAAATCAGTCGA（配列番号６４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１２ｒは、CCCTGCAYACACATG（配列番号６５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４６】
プライマー１３ｆは、AGTCAAATCAGTCGA（配列番号６６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１３ｒは、CCCTGCAYACACATG（配列番号６７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４７】
プライマー１４ｆは、CATCTGYTTAACAAG（配列番号６８）又はGGARACATACGTGAA（配列番号２６０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１４ｒは、AAGAIACTGATCCTG（配列番号６９）又はATTGTAYTGAACAGC（配列番号２６１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４８】
プライマー１５ｆは、CCTGAATGYGGCTAA（配列番号７０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１５ｒは、CGGACACCCAAAGTA（配列番号７１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４９】
プライマー１６ｆは、TTATCCAAAATGTGA（配列番号７２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１６ｒは、GCATCACCGGATGAT（配列番号７３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５０】
プライマー１７ｆは、TTATCCTAARTGTGA（配列番号７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１７ｒは、ATCACCACTRCTAGT（配列番号７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５１】
プライマー１８ｆは、TTATCCCAAATGTGA（配列番号７６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１８ｒは、AGCRTCACCAGAAGT（配列番号７７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５２】
プライマー１９ｆは、CTATCCTAAGTGTGA（配列番号７８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１９ｒは、TGCATCACCAGAAGT（配列番号７９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５３】
プライマー２０ｆは、KCNTACATGCACATC（配列番号８０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２０ｒは、GGGRTTYCTRAACTT（配列番号８１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５４】
プライマー２１ｆは、CAGGAARTGACGTAT（配列番号８２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２１ｒは、TGTTCACTCGCCGGA（配列番号８３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５５】
プライマー２２ｆは、MGAGGTCGAAACGTA（配列番号８４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２２ｒは、CACGGTGAGCGTRAA（配列番号８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５６】
プライマー２３ｆは、TGTAGACACAGTACT（配列番号８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２３ｒは、ATGCTTGTCTTCTAG（配列番号８７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５７】
プライマー２４ｆは、ATCAGTTGGCTAACA（配列番号８８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２４ｒは、AGCCACTGCCCCATT（配列番号８９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５８】
プライマー２５ｆは、GCCCCCCTACAATTG（配列番号９０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２５ｒは、ATTCTGGGTTTCCTA（配列番号９１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５９】
プライマー２６ｆは、TGTTGAACGCAGCAA（配列番号９２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２６ｒは、GCAACTAGTGACCTA（配列番号９３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６０】
プライマー２７ｆは、ATGATGCMATMAAYT（配列番号９４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２７ｒは、CCATTGGAGTTTGAC（配列番号９５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６１】
プライマー２８ｆは、CTTCGGGGCRTCATG（配列番号９６）又はYAGYGGITACAARGA（配列番号２６２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２８ｒは、CYGCATGTTTCCRTT（配列番号９７）又はAIRAARCATGAYGCC（配列番号２６３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６２】
プライマー２９ｆは、IGGYYACCARTCAAC（配列番号９８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２９ｒは、YARCATYCCATTGTG（配列番号９９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６３】
プライマー３０ｆは、YGAYCARTGCATGGA（配列番号１００）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３０ｒは、GGCRACAGTIGAATA（配列番号１０１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６４】
プライマー３１ｆは、GGATGGAACCGTYAA（配列番号１０２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３１ｒは、TTGTTGTGACCTCAT（配列番号１０３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６５】
プライマー３２ｆは、RGCTTTCAGACAAGA（配列番号１０４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３２ｒは、GACCGCATGATTGAC（配列番号１０５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６６】
プライマー３３ｆは、CCTGAATGYGGCTAA（配列番号１０６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３３ｒは、CGGACACCCAAAGTA（配列番号１０７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６７】
プライマー３４ｆは、ATGCAAGACGCTATG（配列番号１０８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３４ｒは、GTCTTTCATTTGCTG（配列番号１０９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６８】
プライマー３５ｆは、GTGGCAGTTGGGTCA（配列番号１１０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３５ｒは、CTTGATCCGCCCACA（配列番号１１１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００６９】
プライマー３６ｆは、TATAAAGGCGTTGCT（配列番号１１２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３６ｒは、GATGGTCGCAGACTT（配列番号１１３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７０】
プライマー３７ｆは、CATCGTTCCCGGCAG（配列番号１１４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３７ｒは、GTTTACTAATCCCCA（配列番号１１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７１】
プライマー３８ｆは、TGGGAAGGTGCTTCA（配列番号１１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３８ｒは、CGCGGATGCTAATGG（配列番号１１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７２】
プライマー３９ｆは、TGGGAAGGTGCTTCA（配列番号１１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３９ｒは、TCCTGCGCGGATGCT（配列番号１１９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７３】
プライマー４０ｆは、CTCTCCGTATTCACG（配列番号１２０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４０ｒは、GACCCCACGATGAC（配列番号１２１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７４】
プライマー４１ｆは、TTGGACCTGCGAGCG（配列番号１２２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４１ｒは、GCTGTCTCCACAAGT（配列番号１２３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７５】
プライマー４２ｆは、KCNTACATGCACATC（配列番号８０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４２ｒは、GGGRTTYCTRAACTT（配列番号８１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７６】
プライマー４３ｆは、ITACATGCAYATCKC（配列番号２６７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４３ｒは、GGCRAAYTGCACCAG（配列番号２６８）又はGGCAAACTGCACGAG（配列番号２６９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７７】
プライマー４４ｆは、AGATGGCGTRCCATA（配列番号２７２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４４ｒは、ACTAGAGGATGGCTG（配列番号２７３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７８】
プライマー４５ｆは、GCTATGAACACAGCA（配列番号２７６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４５ｒは、TTGGACGTCTTCTCC（配列番号２７７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００７９】
プライマー４６ｆは、GATGTCCATCAAGCT（配列番号４８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４６ｒは、TARAGCAATAGGTCT（配列番号４９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８０】
プライマー４７ｆは、GTAACACGTGGGTGA（配列番号２８０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４７ｒは、ACCGCTAAAGCGCTT（配列番号２８１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８１】
プライマー４８ｆは、TTCGTCRTACGCAAT（配列番号２８４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４８ｒは、GGTCGGGACGGTGAG（配列番号２８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８２】
プライマー４９ｆは、TTCGTCRTACGCAAT（配列番号２８４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４９ｒは、GGTCGGGACGGTGAG（配列番号２８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００８３】
生体試料は、通常、患者から取得した試料（すなわち、エクスビボの試料及び／又は単離された試料）である。一実施形態では、核酸抽出ステップを試料上で実施することができる。従来の核酸抽出プロトコールは当技術分野で周知である。次いで、抽出された核酸試料を、ウェルのそれぞれ（したがって、前記ウェル中のプローブのそれぞれ）と接触するように検査カードにアプライする。
【００８４】
本発明の核酸「ハイブリダイゼーション反応」（一緒に作動するプローブ及びプライマーを含む）ステップは、通常、５０〜７０℃（例えば、５５〜６５℃又は５６〜６４℃又は５７〜６３℃又は５８〜６２℃又は５９〜６１℃又はおよそ６０℃）の温度で実施する。通常、前記温度を１０〜３０秒（例えば、１５〜２５秒又は１７〜２３秒又は１９〜２１秒又はおよそ２０秒）の間保持する。本発明の方法に核酸増幅ステップが含まれる場合、前記「ハイブリダイゼーション反応」（開始時に過剰に添加したプローブ及びプライマーを含む）ステップは、増幅ステップの各サイクルに含まれることが好ましい。
【００８５】
核酸増幅ステップを用いる場合、このステップは、通常、９０〜１００℃（例えば、９２〜９８℃又は９４〜９６℃又はおよそ９５℃程度）の温度で０．１〜１０秒（例えば、０．５〜５秒又は０．７〜２秒又はおよそ１秒）の典型的な時間にわたって、その後、温度を５０〜７０℃（例えば、５５〜６５℃又は５７〜６３℃又は５９〜６１℃又はおよそ６０℃）に低下させて１０〜３０秒（例えば、１５〜２５秒又は１７〜２３秒又は１９〜２１秒又はおよそ２０秒）にわたって実施する。核酸増幅ステップを用いる場合、前記ステップは、通常、３５〜５５サイクル（例えば、４０〜５０サイクル又は４４〜４６サイクル又はおよそ４５サイクル）を含む。通常、逆転写ステップを最初に４０〜６０℃（例えば、４５〜５５℃又は４８〜５２℃又はおよそ５０℃）の温度で３〜７分（例えば、４〜６分又はおよそ５分）にわたって用いる。
【００８６】
一実施形態では、該方法を、Applied Biosystems 7900HT（ハイスループット）計器で実施することができる。例として、前記計器では、例えば、単一の検査カード上に存在する８つの個別のカラムによって８つの異なる試料を並行して分析することを可能にする３８４ウェル検査カード（別名プレート）ＲＴ−ＰＣＲプラットフォームを使用することができる。図１を参照されたい。各カラムは、４８の個々の標的ウェルを含んでよく、それにより、各試料を（実質的に同時に）４８種の異なる呼吸器感染症原因微生物（２種の「対照」ウェルの４６種の呼吸器感染症原因微生物を使用することが有効である）についてスクリーニングすることが可能になる。代替の装置及び系（対応する検査カードを含む）が市販されており、本発明に関して同等に適用される。
【００８７】
一実施形態では、該方法は、ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲを使用する。
【００８８】
使用時に、試料（通常、抽出した核酸試料）を２倍〜５倍濃縮緩衝液（例えばＰＣＲ緩衝液；反応混合物とも称される）と混合する。例えば、Ｘμｌの試料を、同じ体積（Ｘμｌ）の２倍濃縮緩衝液と混合する。次いで、試料（緩衝液を含む）を検査カード（そして各ウェル）にアプライする。通常、０．１〜５０μｌ、又は０．５〜３０μｌ、又は０．５〜２０μｌ、又は０．５〜１０μｌ、又は１〜５μｌの範囲の体積が送達される。およそ０．５μｌ、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ又は５μｌの試料（緩衝液を含む）が各ウェルに送達されることが好ましい。
【００８９】
円柱状配置のウェルを含む検査カード（例えば、図１を参照されたい）の場合では、試料（緩衝液を含む）を単に各カラムの上部にあるリザーバーにアプライし、次いで、検査カードを遠心分離機で回転させて試料とそれに加えて試薬ミックス（上で識別された体積の範囲）を各カラム中に形づくられたウェルのそれぞれに送達することができる。AB7900HT系の場合では、各ウェルは、通常４８ウェルを含み、したがって、試料は遠心性送達によって前記４８ウェルのそれぞれにアプライされる。より詳細には、最大８つの試料を、各カラムの上部にある８つのリザーバーにそれぞれ添加することができる（例えばフィンピペットを用いて）。図１に関して、小さなポッドは個別のアッセイウェルを示し、今度はそれに対応するプローブ（及び場合によって対応するプライマー）が含まれる。例示されている検査カードは、チャネル当たり４８ウェル（ポッドとも称される）が存在する構成を示し、使用時には、各ウェルは、通常、円柱状チャネルの下への遠心性送達によって最終的な反応体積１μｌを受ける。
【００９０】
各ウェルは、本発明の１種類の特定のプローブ型（及び場合によって対応するプライマー対）を含む。一実施形態では、前記プローブは、そのウェル中に凍結乾燥形態で存在する。したがって、液体試料がウェル表面にアプライされたら、凍結乾燥したプローブ（対応するプライマー対を含んでもよい）の水分が元に戻り始め、それにより、液体媒体内で検出ステップを進行させることが可能になる。
【００９１】
本発明のウェルは、前記ウェルにおいて実施されるアッセイに関連する液体体積（試料とそれに加えて緩衝液／反応混合物）よりもわずかに多くが保持されるように設計する。各ウェルは、単一のウェル中に単一のプローブ型を置き、それにより、該方法によって特異的な標的微生物が存在するかしないかを検出することを可能にするために、個別のものである。試料を検査カードにアプライした後、プローブ（複数可）を含有するウェルの全てを、１又は２以上のフィルム／シートを使用することによって密閉し、それにより、液体（及び潜在的にプローブ）がウェル間を偶発的に移動することを防止することができる。本発明のウェルは、検査カードと同じ水平面に位置づけることができるが、同等に、前記平面の上又は下に位置づけることもできる。
【００９２】
標準のマルチプレックス反応構成のバッテリーと比較して、本発明は、どちらの反応構成操作においても時間及び資源の節約をもたらし、また、多数の計器からのデータを照合することを可能にする。
【００９３】
本発明は、上記の方法において使用するための検査カードも提供する。一実施形態では、検査カードはプラスチック材料製である。使用者を補助するために、検査カードは、例えば、通常、正常使用中に使用者によって保持される実質的に水平な位置にある時に、カード（アプライされた試料を含む）の重量を支持するために十分な剛性を有するべきである。
【００９４】
検査カードは、複数のウェル（遠心性送達による試料のアプライを可能にするために円柱状に配置されていてもよい）を含み、少なくとも６つのウェルが設けられ、第１のウェルは本明細書において定義されている本発明の第１のプローブを含み、第２のウェルは本明細書において定義されている本発明の第２のプローブを含み、第３のウェルは本明細書において定義されている本発明の第３のプローブを含み、第４のウェルは本明細書において定義されている本発明の第４のプローブを含み、第５のウェルは本明細書において定義されている本発明の第５のプローブを含み、第６のウェルは本明細書において定義されている本発明の第６のプローブを含む。各ウェルは、通常、（複数の）ただ１種の本発明の特異的なプローブのみを含む。例として、一実施形態では、第１のプローブは第１のウェル中に存在し（通常、他のウェルのいずれにも存在しない）、第２のプローブは第２のウェル中に存在し（通常、他のウェルのいずれにも存在しない）、他のプローブも同様である。
【００９５】
各プローブには、その対応するプライマー対が付随していてもよい。したがって、第１のウェルは、第１のプローブに加えて、対応する第１のフォワードプライマー及びリバースプライマーの対を含んでよい。各ウェルは、通常、（複数の）ただ１種の本発明の特異的なプライマー対のみを含む。例として、一実施形態では、第１のプライマー対（及び第１のプローブ）は第１のウェル中に存在するが、通常、他のウェルのいずれにも存在せず、第２のプライマー対（及び第２のプローブ）は第２のウェル中に存在するが、通常、他のウェルのいずれにも存在せず、他のプライマー対も同様である。あるいは、単一のウェル中に２種以上のプローブ（及び場合によってその対応するプライマー対）が存在してもよい。
【００９６】
各プローブは、そのそれぞれのウェルの中に固定化することができる。前記固定化は恒久的なもの（例えば共有結合による連結を介するもの、任意の市販の化学的架橋試薬によって導入されたものであってよい）であっても、一過性のもの（例えば水素結合などの非共有結合を介するもの、又はイオン結合を介するもの）であってもよい。例えば、第１のプローブを第１のウェル中に固定化することができ、第２のプローブを第２のウェル中に固定化することができ、他のプローブも同様である。それぞれのプローブを固定化することにより、検査カードの取り扱いが容易になり、貯蔵安定性が改善され、また、ウェル間をプローブが移動するリスクが最小限になる。プローブは、ウェル中に存在する表面に、例えばウェルの壁などに単純に吸着させることによってウェル中に固定化することが好ましい。したがって、一実施形態では、プローブを含有する溶液を調製し、ウェルの表面にアプライし、次いで、ウェルの表面で乾燥させる。ウェル表面にアプライする前に、プローブを含有する溶液に従来の安定化化合物（例えば糖）を加えることができる。
【００９７】
検査カードは、本明細書に記載の第７のウェル〜第１３のウェル（それぞれ第７〜第１３のプローブを含む）から選択される１又は２以上の追加的なウェルを含んでよい。例えば、カードは、第７のウェル〜第１３のウェル（それぞれ第７〜第１３のプローブを含む）のそれぞれを含んでよい。
【００９８】
検査カードは、その代わりに又はそれに加えて、本明細書に記載の第１４のウェル〜第３３のウェル（それぞれ第１４〜第３３のプローブを含む）から選択される１又は２以上の追加的なウェルを含んでよい。例えば、カードは、第１４のウェル〜第３３のウェル（それぞれ第１４〜第３３のプローブを含む）のそれぞれを含んでよい。
【００９９】
上記の検査カード実施形態のそれぞれは、非定型微生物（例えば細菌）性呼吸器感染症原因物質を検出するための１又は２以上のウェルをさらに含んでよい。この実施形態では、検査カードは、本明細書に記載の第３４のウェル〜第３９のウェル（それぞれ第３４〜第３９のプローブを含む）から選択される１又は２以上の追加的なウェルをさらに含んでよい。例えば、カードは、第３４のウェル〜第３９のウェル（それぞれ第３４〜第３９のプローブを含む）のそれぞれを含んでよい。
【０１００】
上記の検査カード実施形態のそれぞれは、１又は２以上の「対照」ウェルをさらに含んでよい。この実施形態では、検査カードは、本明細書に記載の第４０のウェル及び第４１のウェル（それぞれ第４０のプローブ及び／又は第４１のプローブを含む）の一方又は両方をさらに含んでよい。
【０１０１】
定義の節
少なくとも８０％の配列同一性への言及は、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及び１００％の配列同一性（本明細書で提示されている核酸配列の各々及び／又は本明細書で提示されている配列番号の各々に対する）を包含する。
【０１０２】
本明細書全体を通して使用されているヌクレオチドについての１文字の参照コードは、
Ａ  アデニン
Ｃ  シトシン
Ｇ  グアニン
Ｔ  チミン
Ｕ  ウラシル
Ｉ  イノシン
Ｘ  イノシン
Ｒ  グアニン又はアデニン
Ｙ  チミン又はシトシン
Ｋ  グアニン又はチミン
Ｍ  アデニン又はシトシン
Ｓ  グアニン又はシトシン
Ｗ  アデニン又はチミン
Ｂ  アデニンではない
Ｄ  シトシンではない
Ｈ  グアニンではない
Ｖ  チミンではない
Ｎ  任意の核酸塩基
を意味する。
【０１０３】
本明細書で提示されている全ての核酸配列は５’から３’（左から右）の方向で示されている。
【０１０４】
本発明のプローブは、問題の標的呼吸器感染症原因微生物上に存在するそれらの標的核酸配列とハイブリダイズするように設計する。結合条件は、高レベルの特異性がもたらされる、すなわち、プローブのハイブリダイゼーションが「ストリンジェントな条件」下で起こるようなものであることが好ましい。通常、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度及びｐＨにおける特異的な配列についての熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（定義済みのイオン強度及びｐＨの下で）標的（又は相補）配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。この点について、ｐＨ７、約０．０２Ｍ以下の塩濃度での本発明のプローブのＴｍは、例えば、６０℃超、例えば、約７０℃などである。
【０１０５】
予備混合された緩衝溶液が市販されており（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.社のEXPRESSHYB Hybridisation Solution）、ハイブリダイゼーションは、製造者の説明書に従って実施することができる。
【０１０６】
本発明のプローブは、自己相補性及び二量体形成（プローブ−プローブ結合）を最小限にするためにスクリーニングし、ヒトＤＮＡとの相同性が最小になるように選択する。選択プロセスは、通常、候補プローブ配列をヒトＤＮＡと比較し、相同性が５０％を超える場合はそのプローブを棄却することを含む。この選択プロセスの目的は、プローブと混入しているヒトＤＮＡ配列とのアニーリングを減少させ、したがって、アッセイの特異性の改善を可能にすることである。
【０１０７】
本明細書に記載のプローブはいずれも、タグ及び／又は標識を含んでよい。タグ及び／又は標識は、例えば、（互いに独立して）本明細書に記載のプローブの中央に向かって、又はその５’末端若しくは３’末端に向かって、又は５’末端若しくは３’末端に、例えば５’末端に位置してよい。
【０１０８】
したがって、タグ付け／標識されたプローブと標的核酸のハイブリダイゼーション後に、タグ／標識が標的核酸に結びつく。あるいは、増幅ステップを用いる場合、プローブは本発明の方法の間にプライマーとしての機能を果たし得、したがって、プライマーが伸長するにしたがってタグ／標識を増幅産物中に組み入れることができる。
【０１０９】
適切な標識の例としては、検出可能な標識、例えば、放射標識又は蛍光又は着色分子、酵素マーカー又は発色マーカーなど、例えば、プローブがハイブリダイズすると目に見える色の変化を生じる色素が挙げられる。例として、標識は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン、Alexa 532又はCy3であってよい。プローブは、Fam標識（例えば５’Fam標識）、及び／又は副溝結合物質（ＭＧＢ，minor groove binder）を含有することが好ましい。標識は、写真フィルム又はＸ線フィルムに露光することによってなどで直接検出されるレポーター分子であってよい。あるいは、標識は直接検出可能ではないが、間接的に、例えば、二相系で検出することができるものであってよい。間接的な標識検出の例は、抗体と標識の結合である。
【０１１０】
適切なタグの例としては、「相補体／抗相補体対」が挙げられる。「相補体／抗相補体対」という用語は、適切な条件下で、非共有結合的に結びついた安定な対を形成する、同一でない部分を意味する。適切なタグの例としては、ビオチン及びストレプトアビジン（又はアビジン）が挙げられる。例として、ビオチンタグはストレプトアビジンを使用して捕捉することができ、ストレプトアビジンは、ビーズ（例えば磁気ビーズ）又は膜などの基材又は支持体上にコーティングされていてよい。同様に、ストレプトアビジンタグはビオチンを使用して捕捉することができ、ビオチンはビーズ（例えば磁気ビーズ）又は膜などの基材又は支持体上にコーティングされていてよい。他の例示的な相補体／抗相補体対としては、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対などが挙げられる。別の例は、相補配列に結合する核酸配列タグである。後者は、それ自体を予め標識することもでき、別々に標識された表面（例えば、ビーズ）に付着させることもできる。後者の実施形態の例は周知のLuminex（登録商標）ビーズ系である。他の例示的なタグと捕捉分子の対としては、受容体／リガンド対及び抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対が挙げられる。後で相補体／抗相補体対を解離することが望ましい場合には、相補体／抗相補体対の結合親和性は、例えば、１０９Ｍ−１未満である。
【０１１１】
本発明のプローブは異なる標識又はタグを用いて標識することができ、それにより、本発明の方法において使用する際に各プローブを別々に同定することが可能になる。
【０１１２】
核酸タグを本発明のプローブに（例えば、プローブの５’末端の定義済みの結合領域に）付着させるために任意の従来の方法を用いることができる。あるいは、本発明の核酸プローブ（核酸タグを予め付着させた）は、商業的な提供者によって構築されたものであってよい。
【０１１３】
試料は、例えば、糞便又は血液、痰、鼻及びのどのスワブ、気管支肺胞洗浄液、気管吸引液、鼻咽頭吸引液、肺組織試料、脳脊髄液、考古学的試料などの臨床試料であってよい（又は、臨床試料に由来してよい）。試料は、ヒト組織／試料又はそれに由来する試料（例えば、核酸抽出試料）であることが好ましい。
【０１１４】
増幅ステップを用いる場合、このステップは、当技術分野で公知の方法及びプラットフォーム、例えば、ＰＣＲ（例えば、「Fast DNA Polymerase」、Life Technologies社製を使用して）、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ブロックベースＰＣＲ（block-based ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、ガラス毛細管、ループ媒介性等温増幅（Loop-Mediated Isothermal Amplification：ＬＡＭＰ）を含む等温増幅方法、ローリングサークル増幅、転写媒介性増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介性増幅、鎖置換増幅、等温多置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅、及び環状ヘリカーゼ依存性増幅などを用いて行うことができる。
【０１１５】
用いる場合には、増幅は、任意の増幅プラットフォームを用いて行うことができる。そのように、アッセイのこの実施形態の利点は、独立しており、いかなる特定の計器にも縛られないプラットフォームであることである。
【０１１６】
一実施形態では、一般的な増幅ステップ（例えば、検出前）を用いて、試料中に存在する標的核酸の量を増加させることができる。この実施形態では、通常ＰＣＲ増幅プライマーを使用して、本発明のヌクレオチド標的を含有する標的／相補的核酸のおよそ１００〜４００塩基対領域を増幅する。適切なポリメラーゼ及びＤＮＡ前駆体（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の存在下で、フォワードプライマー及びリバースプライマーが５’から３’の方向に伸長し、それにより、標的核酸の個々の鎖と相補的な新しい核酸鎖の合成が開始される。それにより、プライマーによって標的核酸配列の増幅が駆動され、それにより、前記標的核酸配列を含む増幅産物が生成する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のプローブがプライマーとしての機能を果たす増幅ステップを用いることができる。この実施形態では、プローブ（プライマーとして働く）はそれらの３’末端から（すなわち５’から３’）の方向に伸長する。生じた増幅産物は、通常、標的／相補的核酸の１００〜４００塩基対領域を含む。この実施形態は、上記のものなどの一般的な増幅ステップと併せて用いることができる。
【０１１８】
検出ステップは、任意の公知の手段によって行うことができる。この点について、プローブ又は増幅産物はタグ付け及び／又は標識されていてよく、したがって、検出方法は、前記タグ及び／又は標識を検出することを含んでよい。
【０１１９】
一実施形態では、プローブ（複数可）はタグ及び／又は標識を含んでよい。したがって、一実施形態では、タグ付け／標識されたプローブと標的核酸のハイブリダイゼーションの後に、タグ／標識が標的核酸と結びつく。したがって、一実施形態では、アッセイは、タグ／標識を検出し、タグ／標識の存在と感染性微生物の核酸の存在を相関させることを含んでよい。
【０１２０】
一実施形態では、タグ及び／又は標識は、プローブ（複数可）の伸長の間に組み入れることができる。その際には、増幅産物（複数可）がタグ付け／標識され、したがって、アッセイは、タグ／標識を検出し、タグ／標識の存在と増幅産物の存在、したがって感染性微生物の核酸の存在を相関させることを含む。
【０１２１】
例として、一実施形態では、増幅プロセスの一部として増幅産物にタグ／標識を組み入れることができ（例えば、ビオチン−ｄＮＴＰなどのタグ付け／標識されたｄＮＴＰによって）、アッセイは、検出可能なタグ／標識（例えば、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光標識）を含む前記タグと相補的な結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）の使用をさらに含んでよい。このように、増幅産物に検出可能なタグ／標識（例えば、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光標識）を組み入れる。
【０１２２】
一実施形態では、プローブ（複数可）及び／又は増幅産物（複数可）は、増幅産物（複数可）の捕捉を可能にするためにさらなるタグ／標識（相補体成分として）を含んでよい。
【０１２３】
例として、抗相補体捕捉成分を前記さらなるタグ／標識（相補体成分）と結合させ、それによりプローブ（複数可）及び／又は増幅産物（複数可）の捕捉を可能にする「相補体／抗相補体」対合を用いることができる。適切な「相補体／抗相補体」パートナーの例は本明細書で以前記載されており、例えば、核酸配列の相補的な対、相補的な抗体−抗原対などである。抗相補体捕捉成分は、基材又は固体支持体に付着させる（例えば、コーティングする）ことができる。適切な基材／支持体の例としては、膜及び／又はビーズ（例えば、磁気ビーズ若しくは蛍光ビーズ）が挙げられる。捕捉方法は当技術分野で周知である。例えば、Luminex（登録商標）ビーズを用いることができる。あるいは、ビーズ（それに加えて、捕捉されるタグ付け／標識された増幅産物）は当技術分野で公知の従来の技法を用いて容易に濃縮し、試料から分離することができるので、磁気ビーズの使用が有利であり得る。
【０１２４】
固定化により、抗相補体捕捉成分（又はプローブ）に物理的な位置がもたらされ、捕捉成分／プローブを所望の場所に固定し、及び／又はプローブの回収若しくは分離を容易にするために役立ち得る。支持体は、例えばガラス又はプラスチック製の剛性固体支持体、例えばビーズ（例えば、蛍光ビーズ又は磁気ビーズ）などであってよい。あるいは、支持体は、ナイロン膜又はニトロセルロース膜などの膜であってよい。３Ｄマトリックス、例えば、ポリアクリルアミド又はＰＥＧゲルも、本発明と共に用いるために適した支持体である。支持体／プラットフォームへの固定化は、種々の従来の手段によって実現することができる。例として、ナイロン膜などの支持体への固定化は、ＵＶ架橋によって実現することができる。あるいは、ビオチンで標識された分子を、ストレプトアビジンをコーティングした基材に結合させることができ（逆もまた同じである）、アミノリンカーを用いて調製した分子をシラン処理した表面に固定化することもできる。固定化の別の手段は、例えば３’末端又は５’末端のポリＴ尾部又はポリＣ尾部によるものである。前記固定化技法は、本発明のプローブ成分（及び、存在する場合にはプライマー対成分）にも同等に当てはまる。
【０１２５】
一実施形態では、本発明のプローブは、核酸配列タグ／標識（例えば、各プローブに、標的／相補的核酸に結合するプローブの５’末端の定義済みの配列に付着させた）を含む。より詳細には、プローブのそれぞれに異なる核酸配列タグ／標識が設けられ、前記タグ／標識のそれぞれが、ビーズの表面に存在する相補的な核酸配列に（特異的に）結合する。異なるタグ／標識のそれぞれは、独自に同定可能なビーズ上に位置するその相補配列対応物に結合する（他のタグの相補配列対応物のいずれにも結合しない）。この点について、ビーズは、例えば、特定の波長における蛍光によって独自に同定可能である。したがって、使用時に、本発明のプローブは標的核酸（試料中に存在する場合）に結合する。その後、結合したプローブ（のみ）を１又は２以上の標識されたｄＮＴＰ（例えば、ビオチン−ｄＣＴＰなどのビオチンで標識されたｄＮＴＰ）の存在下で（３’方向に）伸長させることができる。
【０１２６】
伸長したプライマーを、伸長したプライマーに組み入れられたばかりの標識されたｄＮＴＰに結合する、標識されたｄＮＴＰ（例えば、ストレプトアビジンで標識されたＲ−フィコエリトリンなどのストレプトアビジンで標識されたフルオロフォア）に対する結合パートナー対応物と接触させることができる。その後、標識された伸長したプライマーを、独自に同定可能なビーズ上に存在するそれらの核酸対応物と結合させることによって同定することができる。次いで、後者を「呼び出し」（例えば、波長の放出によって存在するビーズの種類を決定するために）、プライマー伸長の性質（したがって、存在する標的／相補的核酸の種類）を決定することができる。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
第１のプローブは、TAGGCAATGCWGC（配列番号１２４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１２８】
第２のプローブは、TCYGGGAYGGGACCRACTA（配列番号１２５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１２９】
第３のプローブは、TCAGCACCAGACACACC（配列番号１２６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３０】
第４のプローブは、TCTGGTCATTGGRGCC（配列番号１２７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３１】
第５のプローブは、CGCTCACTGGGCACGGT（配列番号１２８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３２】
第６のプローブは、AACTGRGTGTTCATTTTGT（配列番号１２９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３３】
第７のプローブは、ATARTTTCCAGGGGCAAA（配列番号１３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３４】
第８のプローブは、CCATCCGCAAGTCAATG（配列番号１３１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３５】
第９のプローブは、ATAGTTGCCTGGTGCGAA（配列番号１３２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３６】
第１０のプローブは、CTGATAARGTAGGTGCTT（配列番号１３３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３７】
第１１のプローブは、CGCGGCRTCATYGA（配列番号１３４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３８】
第１２のプローブは、CCTCATARTGRTAATTAG（配列番号１３５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１３９】
第１３のプローブは、CCTCATAGTAATAATTAG（配列番号１３６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４０】
第１４のプローブは、ATGGTACTGTGACAATGC（配列番号１３７）又はCACGARGGCTCCACRTAC（配列番号２８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４１】
第１５のプローブは、TCTGYRGCGGAACCGACT（配列番号１３８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４２】
第１６のプローブは、AGCTAACGAGTGTGCG（配列番号１３９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４３】
第１７のプローブは、CTTGCGAATGAATGYGC（配列番号１４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４４】
第１８のプローブは、TTGGGYTCTAAGCATGTTA（配列番号１４１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４５】
第１９のプローブは、TTAGGTTCTAAGCATGTCA（配列番号１４２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４６】
第２０のプローブは、CYTCGGAGTAYCTSAGYCC（配列番号１４３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４７】
第２１のプローブは、TCAGACTGCATCCGGTCT（配列番号１４４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４８】
第２２のプローブは、TCYTGTCACCTCTGAC（配列番号１４５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１４９】
第２３のプローブは、ACAGAGTGTGTYACTGT（配列番号１４６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５０】
第２４のプローブは、TTGGAATTTCTGGCCC（配列番号１４７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５１】
第２５のプローブは、CGTTGCCGGATGGA（配列番号１４８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５２】
第２６のプローブは、CCTACAGCAACTGTTACC（配列番号１４９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５３】
第２７のプローブは、CATTGCTCCAGAAWAT（配列番号１５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５４】
第２８のプローブは、TTCTNGCCATTGYAA（配列番号１５１）又はTGGTTTAGCTTCGGG（配列番号２５５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５５】
第２９のプローブは、CAATGTYCCTGTRACACA（配列番号１５２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５６】
第３０のプローブは、AARCTGGARTCTGARG（配列番号１５３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５７】
第３１のプローブは、CCTTCRACTGTGTCTCC（配列番号１５４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５８】
第３２のプローブは、CACTGTGTCACCGCTCA（配列番号１５５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１５９】
第３３のプローブは、TCYGGGAYGGRACCRACTA（配列番号１５６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６０】
第３４のプローブは、CGCTCAATTGGCTTTAACC（配列番号１５７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６１】
第３５のプローブは、CGTGGAGAGTGTGTG（配列番号１５８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６２】
第３６のプローブは、CAACAGACGCTGGCG（配列番号１５９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６３】
第３７のプローブは、TGTCGGCGTTTATTGG（配列番号１６０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６４】
第３８のプローブは、CTACTTGGTGTGAYGC（配列番号１６１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６５】
第３９のプローブは、CTACTTGGTGTGAYGC（配列番号１６２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６６】
第４０のプローブは、TCGATAGATCAAGGTGCCT（配列番号１６３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６７】
第４１のプローブは、TTCTGACCTGAAGGCTCTG（配列番号１６４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６８】
第４２のプローブは、CTGGTGCARTTYGCCCG（配列番号２４７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１６９】
第４３のプローブは、CAGGAYGCYTCGGARTACCT（配列番号２４８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７０】
第４４のプローブは、CCAYGCTTGTGGANCTTATGC（配列番号２４９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７１】
第４５のプローブは、TTYCCCATTCCATTCATTGT（配列番号２５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７２】
第４６のプローブは、CCCWGTGTTTGCAGTRGA（配列番号２５１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７３】
第４７のプローブは、TAGGACCACGGGATGCA（配列番号２５２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７４】
第４８のプローブは、AAGTTGTCCTCGCTGCCACTC（配列番号２５３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７５】
第４９のプローブは、CAGTGCCCGCGACGGACG（配列番号２５４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７６】
プライマー１ｆは、GGGWGGWGAAGCWGGATTCTACC（配列番号１６５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１ｒは、ACCTCTRTACTCTCCCATTATGCCTAG（配列番号１６６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７７】
プライマー２ｆは、CGGCCCCTGAATGYGGCTAA（配列番号１６７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１ｒは、GAAACACGGACACCCAAAGTA（配列番号１６８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７８】
プライマー３ｆは、CATCAGGTAAYATCCCACAAAAYCAG（配列番号１６９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３ｒは、GTGAATATTAARGCACCTACACATAATAARA（配列番号１７０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１７９】
プライマー４ｆは、GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT（配列番号１７１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４ｒは、CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT（配列番号１７２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８０】
プライマー５ｆは、GACCRATCCTGTCACCTCTGAC（配列番号１７３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー５ｒは、AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA（配列番号１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８１】
プライマー６ｆは、AGTGGRTACGCTGCAGAC（配列番号１７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー６ｒは、GTTCAGCATTATAAGTCCAGACATCTAG（配列番号１７６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８２】
プライマー７ｆは、GCYCCTTTYATATGTATACTCAGAGACCCA（配列番号１７７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー７ｒは、TGTTCTTCCAGTTACATAYTGTTGCATAGC（配列番号１７８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８３】
プライマー８ｆは、AAGTGYATGACTGCTCCTGATCARCC（配列番号１７９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー８ｒは、TTGCCAATRTCTCCCACCATRGCATA（配列番号１８０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８４】
プライマー９ｆは、GCTCCTTTYATCTGTATCCTCAGAGATCC（配列番号１８１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー９ｒは、TGATCTTCCCGTCACATACTGTTGCATG（配列番号１８２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８５】
プライマー１０ｆは、GGTTATAAGACAATTTCTTGTACAGGARATG（配列番号１８３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１０ｒは、TTTGCAATRTCTCCCACCATRGCATA（配列番号１８４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８６】
プライマー１１ｆは、ATGACTTTTGARGTSGAYCCCATGGA（配列番号１８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１１ｒは、GCCGAGAASGGYGTRCGSAGGTA（配列番号１８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８７】
プライマー１２ｆは、AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA（配列番号１８７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１２ｒは、CAGTTATCCCTGCAYACACATG（配列番号１８８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８８】
プライマー１３ｆは、AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA（配列番号１８９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１３ｒは、CAGTTATCCCTGCAYACACATG（配列番号１９０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１８９】
プライマー１４ｆは、GAAGGGTCMAACATCTGYTTAACAAG（配列番号１９１）又はGGGCAAATATGGARACATACGTGAA（配列番号２５６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１４ｒは、GCTWGTGGGAARAAAGAIACTGATCCTG（配列番号１９２）又はTCTTTTTCTARGACATTGTAYTGAACAGC（配列番号２５７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９０】
プライマー１５ｆは、CGGCCCCTGAATGYGGCTAA（配列番号１９３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１５ｒは、GAAACACGGACACCCAAAGTA（配列番号１９４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９１】
プライマー１６ｆは、ATGGGTTGGGATTATCCAAAATGTGA（配列番号１９５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１６ｒは、AGCAGTTGTAGCATCACCGGATGAT（配列番号１９６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９２】
プライマー１７ｆは、ATGGGTTGGGATTATCCTAARTGTGA（配列番号１９７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１７ｒは、GCAGTAGTTGCATCACCACTRCTAGT（配列番号１９８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９３】
プライマー１８ｆは、ATGGGTTGGGATTATCCCAAATGTGA（配列番号１９９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１８ｒは、GCTGTACTAGCRTCACCAGAAGT（配列番号２００）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９４】
プライマー１９ｆは、ATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGA（配列番号２０１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー１９ｒは、GCTGTAGTTGCATCACCAGAAGT（配列番号２０２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９５】
プライマー２０ｆは、GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC（配列番号２０３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２０ｒは、GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT（配列番号２０４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９６】
プライマー２１ｆは、CACKCCCAGGAARTGACGTAT（配列番号２０５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２１ｒは、CCAGAGATGTTCACTCGCCGGA（配列番号２０６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９７】
プライマー２２ｆは、GAGTCTTCTAACMGAGGTCGAAACGTA（配列番号２０７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２２ｒは、GGGCACGGTGAGCGTRAA（配列番号２０８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９８】
プライマー２３ｆは、TCAACAGACACTGTAGACACAGTACT（配列番号２０９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２３ｒは、GTTTCCCGTTATGCTTGTCTTCTAG（配列番号２１０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０１９９】
プライマー２４ｆは、ATGGCATCAGTTGGCTAACA（配列番号２１１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２４ｒは、ACAGCCACTGCCCCATT（配列番号２１２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２００】
プライマー２５ｆは、GGAATAGCCCCCCTACAATTG（配列番号２１３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２５ｒは、AATTCGCATTCTGGGTTTCCTA（配列番号２１４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０１】
プライマー２６ｆは、CCTTTTTGTTGAACGCAGCAA（配列番号２１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２６ｒは、CGGATGAGGCAACTAGTGACCTA（配列番号２１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０２】
プライマー２７ｆは、GCCGAATGATGCMATMAAYT（配列番号２１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２７ｒは、CGCACCCATTGGAGTTTGAC（配列番号２１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０３】
プライマー２８ｆは、TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATG（配列番号２１９）又はGTNAAACTGAGYAGYGGITACAARGA（配列番号２５８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２８ｒは、AATRGTGCACYGCATGTTTCCRTT（配列番号２２０）又はGGCIAGAAGIAIRAARCATGAYGCC（配列番号２５９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０４】
プライマー２９ｆは、TGCATIGGYYACCARTCAAC（配列番号２２１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー２９ｒは、GTTGCACAYARCATYCCATTGTG（配列番号２２２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０５】
プライマー３０ｆは、AATGTGAYGAYCARTGCATGGA（配列番号２２３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３０ｒは、GAGATGAGGCRACAGTIGAATA（配列番号２２４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０６】
プライマー３１ｆは、ATTCAGACAGGATGGAACCGTYAA（配列番号２２５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３１ｒは、GATACTAAGCTTTGTTGTGACCTCAT（配列番号２２６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０７】
プライマー３２ｆは、ACCCGATTRGARGCTTTCAGACAAGA（配列番号２２７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３２ｒは、CTGTTGRGACCGCATGATTGAC（配列番号２２８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０８】
プライマー３３ｆは、CGGCCCCTGAATGYGGCTAA（配列番号２２９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３３ｒは、GAAACACGGACACCCAAAGTA（配列番号２３０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２０９】
プライマー３４ｆは、AAAGGCATGCAAGACGCTATG（配列番号２３１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３４ｒは、TGTTAAGAACGTCTTTCATTTGCTG（配列番号２３２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１０】
プライマー３５ｆは、CCTTTCGTGGCAGTTGGGTCA（配列番号２３３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３５ｒは、ACTGAGCTTGATCCGCCCACA（配列番号２３４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１１】
プライマー３６ｆは、CAAGGGCTATAAAGGCGTTGCT（配列番号２３５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３６ｒは、CATGATAATTGATGGTCGCAGACTT（配列番号２３６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１２】
プライマー３７ｆは、AATTTCATCGTTCCCGGCAG（配列番号２３７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３７ｒは、GCCGCGTTTACTAATCCCCA（配列番号２３８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１３】
プライマー３８ｆは、GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA（配列番号２３９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３８ｒは、CTGCGCGGATGCTAATGG（配列番号２４０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１４】
プライマー３９ｆは、GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA（配列番号２４１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー３９ｒは、GTAGTATCCTGCGCGGATGCT（配列番号２４２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１５】
プライマー４０ｆは、TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACG（配列番号２４３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４０ｒは、GTACGGGCGACCCCACGATGAC（配列番号２４４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１６】
プライマー４１ｆは、AGATTTGGACCTGCGAGCG（配列番号２４５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４１ｒは、GAGCGGCTGTCTCCACAAGT（配列番号２４６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１７】
プライマー４２ｆは、GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC（配列番号２０３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４２ｒは、GCCACIGTGGGRTTYCTRAACTT（配列番号２０４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１８】
プライマー４３ｆは、CARTGGKCITACATGCAYATCKC（配列番号２６４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４３ｒは、GCRCGGGCRAAYTGCACCAG（配列番号２６５）又はGCGCGGGCAAACTGCACGAG（配列番号２６６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２１９】
プライマー４４ｆは、GGTGGYAGATGGCGTRCCATA（配列番号２７０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４４ｒは、TCTRACAAACTTACTAGAGGATGGCTG（配列番号２７１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２０】
プライマー４５ｆは、ATGGTYTCAGCTATGAACACAGCA（配列番号２７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４５ｒは、TGCCAGYTTTTGGACGTCTTCTCC（配列番号２７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２１】
プライマー４６ｆは、GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT（配列番号１７１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４６ｒは、CAGCTTGCTTGCTTARAGCAATAGGTCT（配列番号１７２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２２】
プライマー４７ｆは、CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGA（配列番号２７８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４７ｒは、CTCATCCCACACCGCTAAAGCGCTT（配列番号２７９）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２３】
プライマー４８ｆは、GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT（配列番号２８２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４８ｒは、GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG（配列番号２８３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２４】
プライマー４９ｆは、GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT（配列番号２８２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、プライマー４９ｒは、GAGTGCTAGGTCGGGACGGTGAG（配列番号２８３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０２２５】
配列相同性／同一性
パーセント同一性を決定するためには、これだけに限定することなく、全体的な方法、局所的な方法及びハイブリッド方法、例えば、セグメントアプローチ方法などを含めた種々の配列アラインメント方法のいずれを用いてもよい。パーセント同一性を決定するためのプロトコールは、当業者の力量の範囲内の常套的な手順である。全体的な方法では、分子の初めから終わりまで配列をアラインメントし、個々の残基対のスコアを合計することによって、及びギャップペナルティを課すことによって最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、以下のものが挙げられる。CLUSTAL W、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照されたい；及び反復改良、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい。局所的な方法では、入力配列の全てに共有される１又は２以上の保存されたモチーフを同定することにより、配列をアラインメントする。非限定的な方法としては、例えば、以下のものが挙げられる。Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照されたい；ギブスサンプリング（Gibbs sampling）、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993)を参照されたい；Align-M、例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照されたい。このように、パーセント配列同一性は従来の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。
【０２２６】
上でもたらされた特定の配列のバリアントは、その代わりに、バリアント配列と上でもたらされた特定の参照配列の間で異なるヌクレオチドの数を列挙することによって定義することができる。したがって、一実施形態では、配列は、上でもたらされた特異的な配列とは２ヌクレオチド以下の位置、例えば、１ヌクレオチド以下の位置が異なるヌクレオチド配列を含んでよい（又はそれからなってよい）。保存された置換が好ましい。
【０２２７】
例として、バリアントプローブ配列は、定義済みの第１のプローブ（GGCAATGCWG；配列番号１）に対する、GGCAATGCIG（配列番号２８７）；GGCAATGCAG（配列番号２８８）；GGCAATGCTG（配列番号２８９）；AGGCAATGCW（配列番号２９０）又はGCAATGCWGCWCC（配列番号２９１）から選択される核酸配列を含んでよい。
【０２２８】
バリアントプローブ配列のさらなる例は、定義済みの第２のプローブ（GAYGGGACCR；配列番号２）に対する、GAYGGRACCR（配列番号２９２）；GAYRGGACCR（配列番号２９３）；GATGGGACCR（配列番号２９４）；GACGGGACCR（配列番号２９５）；GAYGGGACCG（配列番号２９６）；GAYGGGACCA（配列番号２９７）；AYGGGACCRA（配列番号２９８）；GGAYGGGACC（配列番号２９９）；GAYGGGACCI（配列番号３００）；又はGAIGGGACCR（配列番号３０１）を含む。
【０２２９】
バリアント配列の例は、定義済みの核酸配列（CACCAGACAC；配列番号３）を含むと定義される第３のプローブに対する、ACCAGACACA（配列番号３０２）；GCACCAGACA（配列番号３０３）；CACIAGACAC（配列番号３０４）；CACCAGAIAC（配列番号３０５）；CACCWGACAC（配列番号３０６）；CACCAGACWC（配列番号３０７）；又はCACCARACAC（配列番号３０８）も含む。
【０２３０】
バリアントのさらなる例は、定義済みの核酸配列（GGTCATTGGR；配列番号４）を含む第４のプローブに対する、GGTCATYGGR（配列番号３０９）；GGTCATTGGG（配列番号３１０）；GGTCATTGGA（配列番号３１１）；GTCATTGGRG（配列番号３１２）；TGGTCATTGG（配列番号３１３）；GGTCATCGGR（配列番号３１４）；RGTCATTGGR（配列番号３１５）；AGTCATTGGR（配列番号３１６）；GGTIATTGGR（配列番号３１７）；又はGGTCATTIGR（配列番号３１８）を含む。
【０２３１】
バリアントプローブ配列のさらなる例は、定義済みの核酸配列（CACTGGGCAC；配列番号５）を有する第５のプローブに対する、ACTGGGCACG（配列番号３１９）；TCACTGGGCA（配列番号３２０）；CRCTGGGCAC（配列番号３２１）；CGCTGGGCAC（配列番号３２２）；CACTGGGIAC（配列番号３２３）；CAITGGGCAC（配列番号３２４）；CACTGGRCAC（配列番号３２５）；CACTRGGCAC（配列番号３２６）；又はCACYGGGCAC（配列番号３２７）も含む。
【０２３２】
定義済みの第６のプローブ（RGTGTTCATT；配列番号６）に対するバリアントプローブ配列の例は、GRGTGTTCAT（配列番号３２８）；GTGTTCATTT（配列番号３２９）；AGTGTTCATT（配列番号３３０）；GGTGTTCATT（配列番号３３１）；RGTGTTIATT（配列番号３３２）；RGTRTTCATT（配列番号３３３）；RGTGTTCAWT（配列番号３３４）；RGTGTWCATT（配列番号３３５）；RGTGTTCWTT（配列番号３３６）；又はRGIGTTCATT（配列番号３３７）を含む。
【０２３３】
上記の配列（及び上で定義されたその配列バリアント）の断片、例えば、本明細書に記載の定義済みの配列の１０塩基対、９塩基対、８塩基対、７塩基対、６塩基対、５塩基対、４塩基対、３塩基対、２塩基対又は１塩基対を含む断片も使用することができる。
【実施例１】
【０２３４】
Ｈ５パネル検証
我々のアッセイの正確度を確認するために、４１ウェルを含有する検査カードを調製し、ウェルには、それぞれ、それぞれの第１〜第４１のプローブをローディングした。
【０２３５】
検査カードを公知のＨ５インフルエンザウイルス技能パネルで検証した。用いたプロトコールは以下のステップを含む：５０℃で５分（ＲＴ）；９５℃で２０秒；９５℃で１秒×４５；及び６０℃で２０秒。
【０２３６】
表１（以下を参照されたい）を参照すると、予測されるＣｔ結果が左側の列に示されており、検査カードの結果が右端の列に示されている。リアルタイムＰＣＲアッセイでは、陽性反応を蛍光シグナルの蓄積によって検出する。Ｃｔ値（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値と交差する（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）ために必要なサイクルの数と定義される。
【０２３７】
検査カードの結果は、全ての検体について正確に呼び出された。特に、検査カードプローブにより、検体Ｇ＊におけるタミフル抵抗性／感受性混合物が正確に呼び出され、２つのＨ５Ｎ１分離株が３つの関連性のあるプローブ全てを用いて正確に呼び出された。また、検査カードプローブにより、全ての検体が季節性Ｈ１／Ｈ３及びＨ１ｖ２００９に正確に亜型分類された。他のプローブ結果は全て陰性であった。
【０２３８】
【表１】
0006421037.tif 000002
【実施例２】
【０２３９】
Ｆｌｕ  Ａ／Ｂパネル検証
我々のアッセイの正確度を確認するために、実施例１の通り、４１ウェルを含有する検査カードを調製し、ウェルに、それぞれ、我々のそれぞれの第１〜第４１のプローブをローディングした。
【０２４０】
ｆｌｕ  Ａ／Ｂウイルス技能パネルで検査カードを検証した。表２（以下を参照されたい）を参照すると、予測されるＣｔ結果が左側の列に示されており、検査カードの結果が右端の列に示されている。再度、アレイにより、パネル内の検体のそれぞれが正確に呼び出された。
【０２４１】
【表２】
0006421037.tif 000003
【実施例３】
【０２４２】
トリＨ５インフルエンザの疑いがある患者由来の検体を、従来のマルチプレックス検査と並行して、本発明に従って分析した
オーストラリア、タスマニアの６０歳の退職した教師が妻と一緒に２０１１年８月２６日に香港に旅行した。彼は香港に５日間滞在した後、続けてＵＫに、２０１１年８月３１に到着した。彼は２０１１年９月４日に病院を訪れたが、病気とはみられなかったので家に帰った。彼は、さらに具合が悪くなったので２０１１年９月８日に再度受診した。呼吸器検体（痰及び鼻／のどのスワブ）を２０１１年９月８日に取得した。
【０２４３】
２０１１年９月１０日土曜日に、検体を本発明に従って検査し（アッセイは合計２時間で完了した）、検査カードの結果は以下に示されている。
プローブ２２（Ｆｌｕ  Ａ  Ｑｕａｄ）＝２６．３
プローブ５（Ｆｌｕ  Ａ  ＣＤＣ）＝２３．７
プローブ２６（Ｈ３）＝２２．７
陽性対照：プローブ４０（ＭＳ２ファージ）＝３２．０；プローブ４１（ＲＮＡ分解酵素Ｐ）＝２２．６
検査カード上の他のプローブは全て明白に陰性であった。
検査カードの結果：Ｈ５陰性、輸入季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザ
【０２４４】
並行して、従来のマルチプレックスアッセイを実施し（アッセイは合計４〜５時間で完了した）、結果が以下に提供される：
Ｆｌｕ  Ａ  Ｑｕａｄ＝２６．４
Ｆｌｕ  Ａ  ＣＤＣ＝１７．９
Ｈ３  ＣｆＩ＝１９．７
常套的なマルチプレックスの結果：Ｈ５陰性、輸入季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザ
【０２４５】
これらのデータにより、本発明のシングルプレックス検査カードアッセイは、アッセイ結果の送達において、はるかに速く（２倍以上の速さ）、さらにはより正確であった（より高いＣｔ値）ことが確認される。さらに、本発明のシングルプレックスアッセイカード手法により、従来のマルチプレックス手法よりもはるかに包括的なスクリーニング（検査する異なる病原体の数に関して）が可能になる（全て、はるかに短い時間枠で）。
【実施例４】
【０２４６】
第２のトリＨ５の疑いがある症例を、従来のマルチプレックス検査と並行して、本発明に従って分析した
最近北ソマリア、ジブチ及びドバイを旅行した５０歳の女性が、１０／１１／１１に両側性肺炎（挿管を必要とする）の急性症例でＬｏｎｄｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌを訪れた。検体（鼻／のどのスワブ）を本発明に従って検査し（全アッセイ時間＝２時間）、検査カードの結果は以下に示されている。
プローブ３（ｈＭＰＶ）＝３１．０−これは検体において検出された唯一のウイルス実体であった
陽性対照：プローブ４０（ＭＳ２ファージ）＝３１．０：プローブ４１（ＲＮＡ分解酵素Ｐ）＝２９．４
カード上の他のプローブは全て明白に陰性であった。
結果：トリＨ５インフルエンザウイルス陰性、患者はｈＭＰＶ感染を有する
【０２４７】
並行したマルチプレックスの結果（アッセイ時間＝４〜５時間）
ｈＭＰＶ＝２５．０
結果：トリＨ５インフルエンザウイルス陰性、ｈＭＰＶ感染が確認された。
【０２４８】
これらのデータにより、本発明のシングルプレックス検査カード手法が従来のマルチプレックス検査よりも優れていることが証明され（より高いＣｔ値）、それよりも速く結果がもたらされ、それにより、結果が数時間早く送達され、患者が追加的なウイルス性病原体及び細菌性病原体についてスクリーニングされたことが確認される。
【実施例５】
【０２４９】
本発明の性能を、分子診断パネルについての品質管理を使用して評価した。
検査カードの性能を十分に評価するために、市販の外部の分子診断についての品質管理（ＱＣＭＤ, Quality Control for Molecular Diagnostics）パネル（ｗｗｗ．ｑｃｍｄ．ｏｒｇ）をさまざまな異なる病原体に対して検査し、それにより、検査カードの結果の品質、性能及び頑強性について国際的なベンチマークがもたらされた。
【０２５０】
ＱＣＭＤ２０１１  レジオネラ・ニューモフィラ  ＤＮＡ  ＥＱＡプログラム  １００％正確
ＱＣＭＤ２０１０  パラインフルエンザウイルス  ＲＮＡ  ＥＱＡプログラム  １００％正確
ＱＣＭＤ２０１０  ライノウイルス及びコロナウイルス  ＲＮＡ  ＥＱＡプログラム  １００％正確
ＱＣＭＤ２０１１  エンテロウイルス  ＲＮＡ  ＥＱＡプログラム  １１／１２が正確
ＱＣＭＤ２０１０  アデノウイルス  ＤＮＡ  ＥＱＡプログラム  ６／８が正確
ＱＣＭＤ２０１０  メタニューモウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス  １０／１２が正確
ＱＣＭＤ２０１１  肺炎クラミジア及び肺炎マイコプラズマ  ９／１１が正確
【０２５１】
これらのデータにより、本発明のシングルプレックス検査カード手法により、従来のマルチプレックスアッセイよりもはるかに短い時間枠で結論づけられたが（２時間対４〜５時間）、それに匹敵する感度及び性能の両方がもたらされたことが確認される。
【実施例６】
【０２５２】
種々のウイルスについて陽性である２１６の臨床検体を使用した、本発明と従来のマルチプレックス呼吸器アッセイの比較的な一対一評価。
アッセイカードの結果が下に示されている。
３０のＲＳＶ陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
１４のＦｌｕ  Ｂ陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致（検体は２種の同時感染、ｈＭＰＶ及びＲＳＶを含んだ）
５４のＦｌｕ  Ａ陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致（検体はタミフル抵抗性分離株、及びＦｌｕ  Ｂ同時感染を含んだ）
１０のボカウイルス陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致（８／１０がアッセイカードでは同時感染であることが見出された、高ボカウイルスウイルス負荷−Ｃｔ値の範囲１５〜２６）
３１のヒトパラインフルエンザウイルス陽性検体（１型〜４型）  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
１７のアデノウイルス陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
２２のライノウイルス陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
１１のエンテロウイルス陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
１１のコロナウイルス陽性検体  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
１６のヒトメタニューモウイルス  常套的なマルチプレックスアッセイと１００％一致
【０２５３】
これらのデータにより、重ねて本発明のシングルプレックス検査カード手法が高度に特異的であり感度が高いだけでなく頑強であり、正確な病原体のみが検出されることが確認される。具体的には、検査カードで偽陽性は観察されなかった。唯一の偽陰性の結果は単一のコロナウイルス検体を用いたものであり、我々の常套的なリアルタイムマルチプレックスアッセイではＣｔ＞３２であり、アレイカードでは検出されなかった。検査カードを使用して同時感染も正確に同定された。３１の既知の陰性検体もカードによって処理し、標的のいずれについても偽陽性の結果は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
なし
【図１】
0006421037.tif 000004
【配列表】
0006421037000001.app