(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−グルコシダーゼ。
【請求項２】
キシラナーゼ活性を有する、請求項１に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２又は３で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、キシラナーゼ活性も有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、又は請求項６若しくは７に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性β−グルコシダーゼ、当該耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源である。地球環境保全や化石燃料枯渇の観点から、植物バイオマスをエタノールなどのバイオ燃料や化成品の原料として用いるバイオリファイナリーが注目を浴びている。植物バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロースやヘミセルロース等の多糖類とリグニンから成るリグノセルロースである。例えば、多糖類はグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品の原料として利用される。
【０００３】
リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一のグリコシド加水分解酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされ、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）や他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。
【０００４】
セロビオハイドロラーゼによってセルロースが加水分解を受けると、主に、二糖のセロビオースが生成する。β−グルコシダーゼは、このセロビオースを単糖のグルコースに加水分解することから、リグノセルロースを最終的に単糖にまで分解するために必要不可欠な酵素の一つである。
【０００５】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００６】
多くの耐熱性酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物から遺伝子をクローニングしてＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。例えば、特許文献１には、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度７０℃、至適ｐＨ３．５〜４．０）が、特許文献２には、アクレモニウム・セルロリティカス由来の３種の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度５５℃、至適ｐＨ４．５〜５．１）が、特許文献３には、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobactor）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度８０℃、至適ｐＨ５〜６）が、非特許文献１には、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascas auranticus）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度８０℃、至適ｐＨ４．６）が、非特許文献２には、フェルビドバクテリウム・イスランジカム（Fervidobacterium islandicum）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度９０℃、至適ｐＨ６〜７）が、それぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４８０１８７２号公報
【特許文献２】特許第４６８９８０７号公報
【特許文献３】特開平１０−５２２７４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Neil et al.，Biochemical Journal，2001，vol.353，p.117−127.
【非特許文献２】Jabbour et al.，Applied Microbiology and Biotechnology，2012，vol.93，p.1947−1956.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を基質とした加水分解活性を示す新規な耐熱性β−グルコシダーゼ、当該耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性β−グルコシダーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］  （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−グルコシダーゼ。
［２］  キシラナーゼ活性を有する、前記［１］の耐熱性β−グルコシダーゼ。
［３］  （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２又は３で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  前記ポリペプチドが、キシラナーゼ活性も有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−グルコシダーゼ、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性β−グルコシダーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、又は前記［６］しくは前記［７］に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該耐熱性β−グルコシダーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−２２５−３のβ−グルコシダーゼ触媒領域のアミノ酸配列（配列番号１）とサーモトガ・ネポリタナ  ＤＳＭ ４３５９のβ−グルコシダーゼ（配列番号７）のアミノ酸配列のペアワイズアライメント図である。
【図２】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−２２５−３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図３】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２５−３タンパク質の各ｐＨにおけるＰＮＰＧ加水分解活性（７０℃又は８５℃）を計測した結果を示した図である。
【図４】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２５−３タンパク質の各温度におけるＰＮＰＧ加水分解活性（ｐＨ７．５又はｐＨ８．０）を計測した結果を示した図である。
【図５】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２５−３タンパク質の各基質に対するβ−グルコシダーゼ活性の測定結果を示した図である。
【図６】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２５−３タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［耐熱性β−グルコシダーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
【００１５】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１６】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知β−グルコシダーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１０４個を得た。これらのＯＲＦのうち、β−グルコシダーゼ触媒領域（触媒ドメイン）が確認できた３４個について、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＰＮＰＧ分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＮＰＧ分解活性を持つ耐熱性β−グルコシダーゼ（以下、「ＡＲ１９Ｇ−２２５−３」）を得た。ＡＲ１９Ｇ−２２５−３のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号３に、それぞれ表す。
【００１７】
後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、ＰＮＰＧに対し高い加水分解活性を示し、キシラン（Ｘｙｌａｎ）及びリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）に対しても若干の分解活性を示す。この基質特異性から、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３はβ−グルコシダーゼ活性を有しており、若干のキシラナーゼ活性をも有するグリコシド加水分解酵素であることが示唆される。
【００１８】
なお、本発明及び本願明細書において、β−グルコシダーゼ活性とは、β−グルコシド結合を含むグルカンを基質とし、前記基質を加水分解することにより単糖を生成する活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、キシラナーゼ活性とは、キシランを基質とし、キシランを加水分解する活性（キシラン加水分解活性）を意味する。
【００１９】
また、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、サーモトガ・ネポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ） ＤＳＭ ４３５９のβ−グルコシダーゼＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＡＣＭ２２９５８．１）（配列番号７）であり、その配列同一性（相同性）はわずか５５％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、新規なβ−グルコシダーゼであることが明らかとなった。
【００２０】
ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有する。実際に、後記実施例１＜８＞に示すように、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、５０〜１００℃の温度範囲内でβ−グルコシダーゼ活性を示し、７０〜９０℃の温度範囲内においても強いβ−グルコシダーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３のβ−グルコシダーゼ活性は、５０〜８５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、９０℃超では急激に低下する傾向にあった。
【００２１】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３に対しても、β−グルコシダーゼ活性をはじめとするグリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２２】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有する、耐熱性β−グルコシダーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３）、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２４】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２５】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、７０％以上１００％未満であることが好ましく、７５％以上１００％未満であることがより好ましく、８０％以上１００％未満であることがさらに好ましい。中でも、前記（Ｃ）のポリペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。
【００２６】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２７】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２９】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性（β−グルコシダーゼ活性）を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをβ−グルコシダーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性β−グルコシダーゼが得られる。
【００３０】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、ＰＮＰＧを基質とする。当該耐熱性β−グルコシダーゼは、ＰＮＰＧ以外のその他のβグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＸ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）；リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；キシラン；アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、ＰＳＡ、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、ＰＮＰＧに加えて、ＰＮＰＸ、ＰＳＡ、及びキシランからなる群より選択される１種以上を基質とするものが好ましい。
【００３１】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくともｐＨ７．５の条件で、ＰＮＰＧを基質とする加水分解活性（β−グルコシダーゼ活性）を、７０〜９０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、６０〜９０℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、５０〜１００℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの至適温度は、７０〜９０℃の範囲内にあることが好ましく、８０〜９０℃の範囲内にあることがより好ましく、８０〜８７℃範囲内にあることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ６．０〜８．５の範囲内にある。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜９．０の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜９．５の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものがより好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられ、キシラナーゼ活性が好ましい。
【００３４】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−グルコシダーゼが有する、β−グルコシダーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼには、公知のβ−グルコシダーゼに対し、β−グルコシダーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３５】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとβ−グルコシダーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３６】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００３７】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた耐熱性β−グルコシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００３８】
また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該耐熱性β−グルコシダーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００３９】
［耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼをコードする。当該耐熱性β−グルコシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００４０】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
【００４１】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号２又は３で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４２】
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４３】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４４】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号３で表される塩基配列であってもよく、配列番号２又は３で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４５】
配列番号２又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子」ということがある。）の全長若しくはβ−グルコシダーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２又は３で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４６】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２又は３で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
【００４７】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４８】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００４９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、β−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００５０】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド（β−グルコシダーゼ）を発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５１】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００５２】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５３】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５４】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性β−グルコシダーゼを生産し得る。
【００５５】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５６】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５７】
［耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性β−グルコシダーゼを発現させる。
【００５８】
形質転換体によって生産された耐熱性β−グルコシダーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００５９】
形質転換体から耐熱性β−グルコシダーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性β−グルコシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性β−グルコシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性β−グルコシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００６０】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性β−グルコシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性β−グルコシダーゼを簡便に精製することができる。
【００６１】
すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性β−グルコシダーゼを抽出し精製することを含む。
【００６２】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６３】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性β−グルコシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記β−グルコシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６４】
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６５】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
【００６６】
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６７】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、６０〜９０℃、ｐＨ５．０〜９．０で反応を行うことが好ましく、７０〜９０℃、ｐＨ５．０〜９．０で反応を行うことがより好ましく、７０〜９０℃、ｐＨ６．０〜８．５で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００６８】
セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。当該その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００６９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７０】
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性β−グルコシダーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
７０〜９０℃で活性を示す新規耐熱性β−グルコシダーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００７１】
採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち５μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、β−グルコシダーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。
温泉土壌サンプルＡＲ１９について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７２】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）を、ＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計１０４，０９６，３１６ｂｐあり、このデータセットをグリコシド加水分解酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２，７６６,３３２個のうち２，３０８，６７９個のリードが、平均で１，０２７ｂｐのコンティグにアセンブルされ（計１０１，３７２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１８７，９７０ｂｐであった。
【００７３】
＜３＞  β−グルコシダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２００９／４／１３）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、前記ローカルデータベース中にエントリーされたＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ＿３＿Ｃ、Ｅｘｏ−１，４−ｂｅｔａ  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １、  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ３、Ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅのいずれかにヒットしたＯＲＦ配列をβ−グルコシダーゼの候補配列として収集した。
【００７４】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集されたβ−グルコシダーゼの候補配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、隠れマルコフモデルを応用した配列相同性検索アルゴリズムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。
【００７５】
β−グルコシダーゼの候補配列と推定されたＯＲＦ１０４個のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものをカウントした。ＧＨ触媒ドメイン領域のカバー率が７０％未満の配列及びＰｆａｍとの相同性が確認できなかった配列は、ＧＨ不明に分類した。表１に示すように、ＧＨ１ファミリーに属するβ−グルコシダーゼＯＲＦが１０個得られた。一方、ＧＨ３ファミリーに属するＯＲＦ配列は１９個、ＧＨ３１ファミリー、ＧＨ４３ファミリーに属するＯＲＦがそれぞれ、４個と１個得られた。これらβ−グルコシダーゼ触媒ドメイン配列の存在が確認できた３４個のＯＲＦついては、不完全長配列を含むすべてのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。ソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａによるＯＲＦ予測では、メチオニン（Ｍ）以外の開始コドン（Ｌ，Ｖ）を予測することがあり、表１の完全長ＯＲＦ数にはこれらも含まれる。表１中、括弧内はメチオニンを開始コドンとする完全長ＯＲＦ数を表している。メチオニン以外の開始コドンを持つ遺伝子も存在することが報告されているが、表１の結果からはその比率が多いことから、誤判定を多く含むと考えられた。開始コドンがメチオニンでないＯＲＦについては、配列の３’末端にメチオニンのコドン配列（ＡＴＧ）を付加するようにプライマーを設計した。
【００７６】
【表１】
0006286745.tif 000002
【００７７】
＜５＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５は、４４２アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号２）であった。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５は、２位のグルタミン（Ｑ）から最後の４４２位のセリン（Ｓ）までの４４１アミノ酸がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １の触媒領域をコードしていると推測された。
【００７８】
図１に、遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−２２５−３のβ−グルコシダーゼ触媒領域のアミノ酸配列とサーモトガ・ネポリタナ  ＤＳＭ ４３５９のβ−グルコシダーゼＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＡＣＭ２２９５８．１）のアミノ酸配列のペアワイズアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において類似アミノ酸残基(similar)を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。ギャップを含む４５０アミノ酸残基の中、２５１アミノ酸残基が同一であり、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５のβ−グルコシダーゼ触媒領域は、サーモトガ・ネポリタナ  ＤＳＭ ４３５９のβ−グルコシダーゼＡと５５％の配列同一性を示していた。
【００７９】
＜６＞  遺伝子クローニング
配列番号６で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＴＴＴ−３’：配列番号４で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号５で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。なお、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２又は３で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号５で表される塩基配列は、配列番号２又は３で表される塩基配列の１３０９〜１３２９位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。
【００８０】
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５から１個の遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−２２５−３を得た。β−グルコシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｇ−２２５−３の塩基配列は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２５（配列番号２）と同様に１，３２９ｂｐを含み、予測されたＯＲＦとは１塩基異なっていた。すなわち、７２９位の塩基が、予測されたＯＲＦ（配列番号２）ではチミン（Ｔ）であったのに対して、クローニングされた遺伝子（配列番号３）ではシトシン（Ｃ）であった。ただし、コードするアミノ酸配列（配列番号１）は、両者に違いが見られなかった。
【００８１】
β−グルコシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｇ−２２５−３（以下「ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子」という）がコードするポリペプチド（ＡＲ１９Ｇ−２２５−３）は、４４２アミノ酸からなり、シグナルペプチドは検出されなかった。ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、２位のグルタミンから４４２位のセリンまでの４４１アミノ酸（Ｑ２−Ｓ４４２）がＧＨ１ファミリーに属するβ−グルコシダーゼ触媒領域のアミノ酸配列を示すポリペプチドであった。
【００８２】
＜７＞  遺伝子発現及びβ−グルコシダーゼ酵素タンパクの精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標）  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８３】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のβ−グルコシダーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８４】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、それぞれＡｎｙｋＤ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔｒａｉｎ−Ｆｒｅｅ  プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は０．１３ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、９８℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は１０μＬをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、画像撮影システムＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により、タンパク質のバンドを可視化した。
【００８５】
図２に、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号１）から予想される質量５０．３ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００８６】
＜８＞  ＰＮＰＧを基質としたβ−グルコシダーゼ活性のｐＨ及び温度依存性
β−グルコシダーゼ活性測定には、ＰＮＰＧを基質として用いた。ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を水で溶かし、所定の終濃度となるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたＰＮＰＧ基質溶液は、全て当該方法により調製したＰＮＰＧ水溶液を用いた。
【００８７】
ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｇ−２２５−３）のＰＮＰＧ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を１ｍｇ／ｍＬに調整し、さらにそれを１２．５倍に水で希釈し０．０８ｍｇ／ｍＬとした精製酵素溶液を用いた。
【００８８】
精製酵素のＰＮＰＧ加水分解活性の測定は、１３．６ｍＭのＰＮＰＧ水溶液を１４７μＬと、０．２Ｍ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０、５．０、６．０、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０）を５０μＬと、精製水を１μＬと、精製酵素溶液を２μＬと、からなる混合液を、温度７０℃又は８５℃で１５分間反応させた（基質終濃度：１０ｍＭ）。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と精製酵素溶液は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応中はいずれの混合液もサーモミキサー（エッペンドルフ社）を用いて所定の温度とした。反応終了後は、各混合液に対して等量の０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて撹拌することにより反応を停止させた後、それを遠心し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量は、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、予め作成していたｐ−ニトロフェノール量と４２０ｎｍの吸光度の検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値を求めた。
【００８９】
次に、精製したＡＲ１９Ｇ−２２５−３のＰＮＰＧ加水分解活性の温度依存性を調べた。
精製酵素のＰＮＰＧ加水分解活性の測定は、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに代えてｐＨ７．５又はｐＨ８．０の０．２Ｍ  リン酸バッファーを用い、反応温度を５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９℃で行った以外は、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３のＰＮＰＧ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた場合と同様にして、酵素反応を行った後、反応後の混合液の上清の４２０ｎｍの吸光度を測定し、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。
【００９０】
計測結果を図３及び４に示す。図３は、横軸をｐＨとして、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−２２５−３の７０℃又は８５℃における各ｐＨにおけるＰＮＰＧ加水分解活性を計測した結果を示した図であり、図４は、横軸を温度として、各温度におけるＰＮＰＧ加水分解活性（ｐＨ７．５又はｐＨ８．０）を計測した結果を示した図である。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
【００９１】
精製酵素ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、温度範囲７５〜９０℃において高いＰＮＰＧ加水分解活性を示した（図４）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ７．５及び８．０において８５℃であった。酵素反応温度を９５℃以上にした時、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−２２５−３のＰＮＰＧ加水分解活性は急激に減少した。
【００９２】
精製酵素ＡＲ１９Ｇ−２２５−３は、反応温度７０〜８５℃、ｐＨ５〜９の範囲において高いＰＮＰＧ加水分解活性を示した（図３）。最適ｐＨは反応温度に依存して変化し、７０℃でｐＨ７．８１（実測値）、８５℃でｐＨ７．７７（実測値）であった。精製酵素ＡＲ１９Ｇ−２２５−３では、反応温度８５℃、ｐＨ９．１３〜９．５０の範囲内においては、低レベルのＰＮＰＧ加水分解活性が認められた。
【００９３】
＜９＞  ＡＲ１９Ｇ−２２５−３の基質特異性
ＡＲ１９Ｇ−２２５−３遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｇ−２２５−３）に対して、様々なセルロース基質及びヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を１ｍｇ／ｍＬに調整し、さらにそれを１２．５倍に水で希釈し０．０８ｍｇ／ｍＬとした精製酵素溶液を用いた。また、基質として、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＳＡ、Ｘｙｌａｎ（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００９４】
具体的には、まず、反応液として、５０μＬのｐＨ８．０のリン酸バッファーと、２μＬの精製酵素溶液と、基質水溶液と、精製水と、からなる混合液を調製した。混合液に添加する基質溶液の濃度と量及び精製水の量は、ＰＮＰＧを基質とする場合には、１３．６ｍＭのＰＮＰＧ水溶液を１４７μＬと精製水を１μＬとし、ＰＮＰＸを基質とする場合には、１３．６ｍＭのＰＮＰＸ水溶液を１４７μＬと精製水を１μＬとし、ＣＭＣを基質とする場合には、１質量％のＣＭＣ水溶液を１００μＬと精製水を４８μＬとし、ＰＳＡを基質とする場合には、ＰＳＡを１００μＬと精製水を４８μＬとし、Ｘｙｌａｎを基質とする場合には、１質量％のＸｙｌａｎ水溶液を１００μＬと精製水を４８μＬとした。
次いで、各混合液を、７０℃又は８５℃で１５分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。基質溶液と精製酵素溶液は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。また、ＣＭＣ、ＰＳＡ、及びＸｙｌａｎを基質とした場合には、反応中、基質の沈殿を防ぐため、サーモミキサー（エッペンドルフ社）により混合液に１４００ｒｐｍの振動を加えた。
【００９５】
ＰＮＰＧ又はＰＮＰＸを基質とした反応においては、反応終了後は、前記＜８＞のＡＲ１９Ｇ−２２５−３のＰＮＰＧ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた場合と同様にして、反応後の混合液の上清の４２０ｎｍの吸光度を測定し、加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。ＣＭＣ、ＰＳＡ、又はＸｙｌａｎを基質とした反応においては、反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線（Ｘｙｌａｎを基質とした場合は、キシロースで作成した検量線）を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９６】
各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値を求めた。測定結果を図５に示す。この結果、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３はＰＮＰＧに対し高い加水分解活性を示し、ＰＳＡ及びＸｙｌａｎ（特に、８５℃）対しても若干の分解活性を示した。これらの結果から、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３はβ−グルコシダーゼであり、若干のキシラナーゼ活性も持つことが示された。
【００９７】
＜１０＞  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるβ−グルコシダーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
【００９８】
計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ８．０）を５μＬ、精製水を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。
【００９９】
図６には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｇ−２２５−３酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図６の上段グラフは実測データであり、図６の下段グラフには、図６の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図６の下段グラフのＹ軸に示した「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」の極大値として定義した。
【０１００】
ＡＲ１９Ｇ−２２５−３の蛍光強度曲線は、５０℃付近と８５℃付近の２か所に蛍光強度の微分値の極小点が見られた。ＡＲ１９Ｇ−２２５−３酵素タンパク質が、６０℃から８０℃の範囲内においても酵素活性を示すことから、５０℃付近の極小点はタンパク質分子の何らかの構造変化があることを示唆しているが、熱崩壊を示すものではなく、実際の熱崩壊温度は８５℃付近の極小点が示していると考えられた。以上より、ＡＲ１９Ｇ−２２５−３の熱崩壊温度（Ｔｍ）は８５．２℃であると推定された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくとも８５℃、ｐＨ７．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性β−グルコシダーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
0006286745.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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