(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体からの試料がＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする核酸の存在を呈するかどうかを判定するための診断キットであって、キットは少なくとも第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質のＦＧＦＲ１部分をコードする核酸の一部に相補的であると共に、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質のＴＡＣＣ１部分をコードする核酸の一部に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする核酸の逆鎖に相補的である、キット。
【請求項２】
前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質は、配列番号８８または１５０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６８を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６９を含む、請求項１または３に記載のキット。
【請求項５】
被験体からの試料がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする核酸の存在を呈するかどうかを判定するための診断キットであって、前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質はＴＡＣＣ３タンパク質のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３転写産物変異体１のチロシンキナーゼドメインを含み、キットは少なくとも第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＦＧＦＲ３部分をコードする核酸の一部に相補的であると共に、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＴＡＣＣ３部分をコードする核酸の一部に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする核酸の逆鎖に相補的である、キット。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、配列番号８５または８７のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、配列番号１５８、１５９、１６０または１６１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６２、１６６または１７０を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項９】
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６５、１６７または１７１を含む、請求項５または８に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする核酸が試料中に存在する場合にのみポリメラーゼ反応を刺激する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする核酸が試料中に存在する場合にのみポリメラーゼ反応を刺激する、請求項５〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記判定することが、選択的増幅を含む、請求項１または５に記載のキット。
【請求項１３】
ヒト被験体においてＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質の存在を検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）被験体の生体試料中に存在するＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする核酸があるか否かを検出することと、
を含み、
前記検出は、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質のＦＧＦＲ１部分をコードする核酸の一部に相補的であると共に、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質のＴＡＣＣ１部分をコードする核酸の一部に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする核酸の逆鎖に相補的であり、増幅を利用して検出する方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質が、配列番号８８または１５０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト被験体においてＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の存在を検出するための方法であって、前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質はＴＡＣＣ３タンパク質のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３転写産物変異体１のチロシンキナーゼドメインを含み、前記方法は、
（ａ）被験体の生体試料中に存在するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする核酸があるか否かを検出すること、
を含み、
前記検出は、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＦＧＦＲ３部分をコードする核酸の一部に相補的であると共に、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のＴＡＣＣ３部分をコードする核酸の一部に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする核酸の逆鎖に相補的であり、増幅を利用して検出する方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、配列番号８５または８７のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、配列番号１５８、１５９、１６０または１６１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６８を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６９を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６２、１６６または１７０を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１６５、１６７または１７１を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号８８のアミノ酸配列を含むＴＡＣＣ１のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ１タンパク質のチロシンキナーゼドメイン、または、配列番号８５または８７のアミノ酸配列を含むＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３タンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む、精製融合タンパク質。
【請求項２３】
ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３タンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むと共に配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、または配列番号１６１を含む、精製融合タンパク質。
【請求項２４】
ＴＡＣＣ１のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ１タンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むと共に配列番号１５０を含む、精製融合タンパク質。
【請求項２５】
ＴＡＣＣ１のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ１のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードすると共に配列番号８３を含む切断点を有する、または、ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードすると共に配列番号１０〜７３、８０、８２、１０８〜１１２、１１８〜１３２および１３４〜１４５のうちいずれか一つを含む切断点を有する、ｃＤＮＡ。
【請求項２６】
ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードすると共に配列番号９４のヌクレオチド配列を含む、ｃＤＮＡ。
【請求項２７】
ＴＡＣＣ１のＴＡＣＣドメインと融合したＦＧＦＲ１のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードすると共に配列番号１５１を含む、ｃＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年７月２４日出願の米国仮特許出願第６１／６７５，００６号への利益および優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの刊行物の開示は、参照によりそれらの全体が本出願に組み込まれる。
【０００３】
本特許開示は、著作権保護の対象である資料を含む。著作権保有者は、特許文書または特許開示が、米国特許商標庁の出願書または記録に見られる通りに何人によって複写されることにも異存はないが、それ以外はあらゆる著作権を保有する。
［政府支援］
【０００４】
本発明は、米国国立がん研究所によって授与された助成番号Ｒ０１ＣＡ１０１６４４およびＲ０１ＣＡ０８５６２８の下、政府支援と共に成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、脳腫瘍の最も一般的な形態であり、ヒト癌の中でも最も不治であり致死的である。現行の標準ケアとしては、手術、化学療法、および放射線療法が挙げられる。しかしながら、ＧＢＭの予後は依然として一様に不良である。利用可能な標的化療法はいくつかあるが、ＧＢＭを特異的に標的にするものはない。
【０００６】
ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物を持ち、ＦＧＦＲキナーゼ活性の標的化阻害の恩恵を受け得るＧＢＭ患者の目標集団は、全世界で毎年６，０００人の患者に相当すると見積もられる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＦＧＦＲ遺伝子のチロシンキナーゼドメインをＴＡＣＣ１またはＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインに接合する、ＧＢＭにおける遺伝子融合物の高度に発現した部類の発見に、少なくとも一部分において基づく。本発明は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物が、ＦＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の標的化阻害の恩恵を受け得る一部のＧＢＭ患者を特定するという発見に、少なくとも一部分において基づく。膠芽腫患者、および遺伝子融合関連の癌（上皮癌など）に苦しむ他の被験体におけるＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子の融合物の特定は、有用な治療標的である。
【０００８】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む精製融合タンパク質を提供する。一実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＲ４である。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【０００９】
本発明の一態様は、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）（ＴＡＣＣ）ドメインを含み、ＴＡＣＣドメインがチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する、精製融合タンパク質を提供する。一実施形態では、ＴＡＣＣタンパク質は、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、またはＴＡＣＣ３である。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１０】
本発明の一態様は、形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）タンパク質のＴＡＣＣドメインの５’側に融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む精製融合タンパク質を提供する。一実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＲ４である。別の実施形態では、ＴＡＣＣタンパク質は、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、またはＴＡＣＣ３である。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１１】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１が、ヒト染色体８ｐ１１に位置するＴＡＣＣ１のエクソン７〜１３の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体８ｐ１１に位置するＦＧＦＲ１のエクソン１〜１７の組み合わせを含み、ゲノム切断点が、ＦＧＦＲ１のエクソン１〜１７のうちのいずれの１つ、およびＴＡＣＣ１のエクソン７〜１３のうちのいずれの１つにおいても生じる、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１２】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２が、ヒト染色体１０ｑ２６に位置するＴＡＣＣ２の任意のエクソン１〜２３の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体１０ｑ２６に位置するＦＧＦＲ２の任意のエクソン１〜１８の組み合わせを含む、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１３】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６の組み合わせを含み、ゲノム切断点が、ＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６のうちのいずれの１つ、およびＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６のうちのいずれの１つにおいても生じる、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１４】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６の組み合わせを含み、ゲノム切断点が、ＦＧＦＲ３のイントロン１〜１６のうちのいずれの１つ、およびＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６のうちのいずれの１つにおいても生じる、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１５】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６の組み合わせを含み、ゲノム切断点が、ＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６のうちのいずれの１つ、およびＴＡＣＣ３のイントロン７〜１６のうちのいずれの１つにおいても生じる、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１６】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＴＡＣＣ３のエクソン８〜１６の組み合わせに対して５’側にスプライスされた、ヒト染色体４ｐ１６に位置するＦＧＦＲ３のエクソン１〜１６の組み合わせを含み、ゲノム切断点が、ＦＧＦＲ３のイントロン１〜１６のうちのいずれの１つ、およびＴＡＣＣ３のイントロン７〜１６のうちのいずれの１つにおいても生じる、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３核酸によってコードされた精製融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１７】
本発明の一態様は、上に記載の融合タンパク質をコードする合成核酸を提供する。
【００１８】
本発明の一態様は、配列番号７９、１５８、１５９、１６０、または１６１を含む、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号９０のアミノ酸７３０〜７５８から少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、かつ配列番号９２のアミノ酸５４９〜８３８から少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むゲノム切断点を有する、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２０】
本発明の一態様は、配列番号７８を含むゲノム切断点を有する、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２１】
本発明の一態様は、配列番号８５、８６、８７、または８９のうちのいずれか１つを含むゲノム切断点を有する、精製ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２２】
本発明の一態様は、配列番号１５０を含む精製ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２３】
本発明の一態様は、配列番号１４６のアミノ酸７４６〜７６２から少なくとも３個の連続したアミノ酸を含み、かつ配列番号１４８のアミノ酸５７２〜５９０から少なくとも３個の連続したアミノ酸を含むゲノム切断点を有する、精製ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２４】
本発明の一態様は、配列番号８８を含むゲノム切断点を有する、精製ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２５】
本発明の一態様は、配列番号９４を含むＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする、精製ＤＮＡを提供する。別の実施形態では、精製融合タンパク質は、他のヒトタンパク質を本質的に含まない。
【００２６】
本発明の一態様は、配列番号９１のヌクレオチド２４４３〜２５３０から少なくとも９個の連続したインフレームのヌクレオチドを含み、かつ配列番号９３のヌクレオチド１８００〜２８４７から少なくとも９個の連続したインフレームのヌクレオチドを含むゲノム切断点を有するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする、合成核酸を提供する。
【００２７】
本発明の一態様は、配列番号１〜７７のうちのいずれか１つを含むゲノム切断点を有するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質をコードする、合成核酸を提供する。
【００２８】
本発明の一態様は、配列番号１５１を含むＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする、合成核酸を提供する。
【００２９】
本発明の一態様は、配列番号１４７のヌクレオチド３１７８〜３２２８から少なくとも９個の連続したインフレームのヌクレオチドを含み、かつ配列番号１４９のヌクレオチド２０９２〜２７９４から少なくとも９個の連続したインフレームのヌクレオチドを含むゲノム切断点を有する、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする、合成核酸を提供する。
【００３０】
本発明の一態様は、配列番号８３を含むゲノム切断点を有する、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードする、合成核酸を提供する。
【００３１】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む精製融合タンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。別の実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質は、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は、配列番号７９、１５８、１５９、１６０、または１６１のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質の発現レベルまたは活性を被験体中で減少させるための組成物であって、融合タンパク質の阻害剤を含む薬学的に許容される担体の混合剤における組成物を提供する。一実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。別の実施形態では、阻害剤は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ポリペプチドの発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合遺伝子を特異的に標的にするｓｉＲＮＡ、または列挙された阻害剤の組み合わせを含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。他の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子は、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、または列挙された小分子の組み合わせを含む。
【００３３】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させることを必要とする被験体において、それを行うための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質の発現レベルまたは活性を被験体内で減少させるための治療量の化合物を被験体に投与することを含む。一実施形態では、方法は、被験体においてＦＧＦＲ融合分子の発現のレベルを判定するために、被験体から試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。一実施形態では、検出または判定することは、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。更なる実施形態では、方法は、融合タンパク質発現レベルまたは活性が、組成物の投与前の融合タンパク質発現レベルまたは活性と比較して減少しているかどうかを判定することにより、融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させることを含む。一実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。更なる実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。一実施形態では、融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させるための組成物は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ポリペプチドの発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合遺伝子を特異的に標的にするｓｉＲＮＡ、または列挙された阻害剤の組み合わせを含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。他の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子は、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、または列挙された小分子の組み合わせを含む。
【００３４】
本発明の一態様は、遺伝子融合関連の癌の治療を必要とする被験体においてそれを行うための方法であって、有効量のＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は上皮癌を含む。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。一実施形態では、方法は、被験体においてＦＧＦＲ融合分子の発現のレベルを判定するために、被験体から試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。一実施形態では、検出または判定することは、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。別の実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。別の実施形態では、阻害剤は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ポリペプチドの発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合遺伝子を特異的に標的にするｓｉＲＮＡ、または列挙された阻害剤の組み合わせを含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。他の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子は、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、または列挙された小分子の組み合わせを含む。
【００３５】
本発明の一態様は、固形腫瘍の成長を減少させることを必要とする被験体においてそれを行う方法であって、有効量のＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含み、阻害剤が固形腫瘍のサイズを減少させる、方法を提供する。一実施形態では、固形腫瘍は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。一実施形態では、方法は、被験体においてＦＧＦＲ融合分子の発現のレベルを判定するために、被験体から試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。一実施形態では、検出または判定することは、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。別の実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。別の実施形態では、阻害剤は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ポリペプチドの発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合遺伝子を特異的に標的にするｓｉＲＮＡ、または列挙された阻害剤の組み合わせを含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。他の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子は、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、ＬＹ２８７４４５５、または列挙された小分子の組み合わせを含む。
【００３６】
本発明の一態様は、被験体からの試料がＦＧＦＲ融合物の存在を呈するかどうかを判定するための診断キットであって、ＦＧＦＲ融合物またはその一部分と特異的にハイブリッド形成する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一組の核酸プライマーまたはインサイツハイブリッド形成プローブを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、または列挙されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを含む。一実施形態では、プライマーは、ＦＧＦＲ融合物が存在する場合にのみポリメラーゼ反応を刺激する。別の実施形態では、判定することは、遺伝子配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ融合物はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。他の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。
【００３７】
本発明の一態様は、被験体からの試料がＦＧＦＲ融合タンパク質の存在を呈するかどうかを判定するための診断キットであって、配列番号７９、８５、８６、８７、８８、８９、１５０、１５８、１５９、１６０、または１６１を含むＦＧＦＲ融合タンパク質に特異的に結合する抗体を含み、ＦＧＦＲ融合タンパク質が存在する場合にのみ抗体がタンパク質を認識するキットを提供する。一実施形態では、配列番号７９、８５、８６、８７、８８、８９、１５０、１５８、１５９、１６０、または１６１に向けられる抗体、およびそれらの配列番号を含むＦＧＦＲ融合物。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ融合物はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物である。一部の実施形態では、ＦＧＦＲタンパク質は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。他の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。
【００３８】
本発明の一態様は、ヒト被験体においてＦＧＦＲ融合物の存在を検出するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ヒト被験体から生体試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体などの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。一部の実施形態では、方法は、被験体の発現パターンに基づいて、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを更に含む。更なる実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む。別の実施形態では、被験体中に存在するＦＧＦＲ融合物があるか否かを検出することを含む。一実施形態では、検出することは、配列番号７９、８５、８６、８７、８８、８９、１５０、１５８、１５９、１６０、または１６１に向けられる抗体を使用するＥＬＩＳＡ、配列番号７９、８５、８６、８７、８８、８９、１５０、１５８、１５９、１６０、または１６１に向けられる抗体を使用するウエスタンブロット法、質量分析法、等電点電気泳動法、または列挙された方法の組み合わせによって、ＦＧＦＲ融合タンパク質レベルを測定することを含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ融合物はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物である。他の実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。他の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。
【００３９】
本発明の一態様は、ヒト被験体においてＦＧＦＲ融合物の存在を検出するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ヒト被験体から生体試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。他の実施形態では、検出または判定は、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、方法は、被験体の発現パターンに基づいて、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを更に含む。更なる実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、被験体においてＦＧＦＲ融合タンパク質をコードする核酸配列があるか否かを検出することを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１〜７７、８０〜８４、または９５〜１４５のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態では、検出することは、ハイブリッド形成、増幅、または配列決定技法を使用してＦＧＦＲ融合物を検出することを含む。更なる実施形態では、増幅は、配列番号１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、または１６９を含むプライマーを使用する。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ融合物はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物である。他の実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４である。他の実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３である。
【００４０】
本発明の一態様は、インビトロで発癌性形質転換を引き起こす方法を提供する。方法は、（ａ）ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ＤＮＡを用いてインビトロで培養した細胞を形質導入することと、（ｂ）細胞が、足場非依存性条件中で成長する能力、多層性の病巣を形成する能力、またはそれらの組み合わせを獲得するかどうかを判定することとを含む。
【００４１】
本発明の一態様は、インビボで発癌性形質転換を引き起こす方法を提供する。方法は、（ａ）ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合ＤＮＡを用いてインビトロで培養した細胞を形質導入することと、（ｂ）形質導入細胞をマウスに注射することと、（ｃ）腫瘍がマウス中で成長するかどうかを判定することとを含む。一実施形態では、注射することは、皮下または頭蓋内注射である。
【００４２】
本発明の一態様は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の発癌活性を減少させる化合物を特定する方法を提供する。方法は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ  ＤＮＡを用いてインビトロで培養した細胞を形質導入することと、（ｂ）効果的な期間中、細胞をリガンド源と接触させることと、（ｃ）細胞が、試験化合物がない中で培養した細胞と比較して、足場非依存性条件中で成長する能力、多層性の病巣を形成する能力、またはそれらの組み合わせを獲得するかどうかを判定することとを含む。
【００４３】
ＰＣＴ特許出願のための要件に従うため、本明細書で提示される図面の多くは、元々はカラーで作られた画像の白黒描写である。下の説明および実施例では、カラーの図および画像は、外観に関しては白黒で表される。元々のカラー版は、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２），３３７（６０９９）：１２３１−５中で見ることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅのウェブサイト上で利用可能な原稿のオンライン版中で利用可能である添付の補足情報を含む）。ＰＣＴの目的で、添付の「補足情報」を含むＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２），３３７（６０９９）：１２３１−５の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】ＴＣＧＡ中の遺伝子融合物に反復的に関与する遺伝子を示すグラフである。異なる試料にわたって少なくとも３つの遺伝子融合物に関与する遺伝子のみを示す。
【図１Ｂ】ＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。切断点上で整列する７６個のスプリットリード（それぞれ配列番号２〜７７）を示す。切断点での予測リーディングフレームを、赤の予測されるリーディングフレーム（左）および青のＴＡＣＣ３（右）の下のＦＧＦＲ３配列と共に、上部に示す（紫のＦＧＦＲ３ヌクレオチド配列（左）および緑のＴＡＣＣ３ヌクレオチド配列（右）、配列番号１）。配列番号１に対応する推定アミノ酸配列（配列番号７８）を、予測リーディングフレームの上に示す。
【図１Ｃ】ＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。左では、ＧＳＣおよびＧＢＭ由来のｃＤＮＡからのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３特異的ＰＣＲを示す。右では、サンガー配列決定クロマトグラムが、陽性試料における、切断点（配列番号８０）でのリーディングフレーム、および融合タンパク質（配列番号８５）の推定翻訳を示す。
【図１Ｄ】ＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号７９）。ＦＧＦＲ３またはＴＡＣＣ３に対応する残基を、それぞれ緑または赤（下線付）で示す。融合タンパク質は、ＦＧＦＲ３のチロシンキナーゼドメインを、ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインに接合する。
【図１Ｅ】ＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。ＴＡＣＣ３のイントロン７とのＦＧＦＲ３のエクソン１７のゲノム融合が示される。融合したｍＲＮＡ中で、ＦＧＦＲ３のエクソン１６は、ＴＡＣＣ３のエクソン８の５’側にスプライスされる。塗りつぶされた矢印は、ＧＳＣ−１１２３およびＧＢＭ−１１２３中で融合特異的ＰＣＲ産生物を生成する、融合ゲノムプライマーの位置を示す。
【図２Ａ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。具体的には、エキソーム配列決定解析によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。４つのＴＣＧＡのＧＢＭ試料におけるＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３遺伝子のゲノム切断点を整列させるスプリットリードを示す。ＴＣＧＡ−２７−１８３５に対しては、配列番号９５が切断点（太字）でのリーディングフレームを示す一方で、配列番号９６〜１０７はそれぞれゲノム切断点の整列を示す。ＴＣＧＡ−１９−５９５８に対しては、配列番号１０８が切断点（太字）でのリーディングフレームを示す一方で、配列番号１０９〜１１１はそれぞれゲノム切断点の整列を示す。ＴＣＧＡ−０６−６３９０に対しては、配列番号１１２が切断点（太字）でのリーディングフレームを示す一方で、配列番号１１３〜１３１はそれぞれゲノム切断点の整列を示す。ＴＣＧＡ−１２−０８２６に対しては、配列番号１３２が切断点（太字）でのリーディングフレームを示す一方で、配列番号１３３〜１４５はそれぞれゲノム切断点の整列を示す。
【図２Ｂ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。左では、ＧＢＭのｃＤＮＡ試料からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３に対するＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ特異的ＰＣＲのゲルを示す。右では、サンガー配列決定クロマトグラムが、陽性試料における、切断点（配列番号８１）でのリーディングフレーム、および融合タンパク質（配列番号８６）の推定翻訳を示す。
【図２Ｃ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。左では、ＧＢＭのｃＤＮＡ試料からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３に対するＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ特異的ＰＣＲのゲルを示す。右では、サンガー配列決定クロマトグラムが、陽性試料における、切断点（配列番号８２）でのリーディングフレーム、および融合タンパク質（配列番号８７）の推定翻訳を示す。
【図２Ｄ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。アトラスＴＣＧＡからの４つのＧＢＭ腫瘍におけるＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３の共外れ値の発現を、図中に示す。
【図２Ｅ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。ＣＮＶ解析は、同一の４つのアトラスＴＣＧＡのＧＢＭ試料におけるＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３の再構成された部分の微小増幅を示す。
【図２Ｆ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。左では、ＧＢＭのｃＤＮＡ試料からのＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１に対するＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ特異的ＰＣＲのゲルを示す。右では、サンガー配列決定クロマトグラムが、陽性試料における、切断点（配列番号８３）でのリーディングフレーム、および融合タンパク質（配列番号８８）の推定翻訳を示す。
【図２Ｇ】ＧＢＭ中のＦＧＦＲ遺伝子とＴＡＣＣ遺伝子との間の反復性遺伝子融合物を示す。左では、ＧＢＭのｃＤＮＡ試料からのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３に対するＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ特異的ＰＣＲのゲルを示す。右では、サンガー配列決定クロマトグラムが、陽性試料における、切断点（配列番号８４）でのリーディングフレーム、および融合タンパク質（配列番号８９）の推定翻訳を示す。
【図３Ａ】ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質の形質転換活性を示す。ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、Ｒａｔ１Ａの線維芽細胞における足場非依存性成長を誘導する。播種後１４日の３つ組の試料からの柔寒天コロニーの数を記録した。代表的な顕微鏡写真を示す。
【図３Ｂ】神経膠腫特異（ネスチン、Ｏｉｇ２、およびＧＦＡＰ）および増殖マーカ（Ｋｉ６７およびｐＨＨ３）に対する陽性を示す、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を注射したマウスからの腫瘍の免疫蛍光染色を示す、顕微鏡写真である。皮下腫瘍を、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞によって生成した。
【図３Ｃ】ｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３（ｎ＝８）またはｐＴｏｍｏ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｈｐ５３（ｎ＝７）（緑色の線、白黒画像中では「薄灰色」）、およびｐＴｏｍｏ−ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３（ｎ＝８、赤色の線、白黒画像中では「濃灰色」）を頭蓋内に注射したマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。曲線上の点は死亡を示す（ログランク検定、ｐ＝０．００００１、ｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３対ｐＴｏｍｏ−ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３）。
【図３Ｄ】悪性度の高い神経膠腫の組織学的特徴を示しているＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３によって生成された進行性腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色の代表的な顕微鏡写真を示す。注目すべきは、腫瘍細胞による正常な脳の高度の浸潤である。免疫蛍光染色は、神経膠腫および幹細胞マーカ（ネスチン、Ｏｌｉｇ２、およびＧＦＡＰ）、増殖マーカ（Ｋｉ６７およびｐＨＨ３）、ならびにＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３脳腫瘍中で広く発現していることを示す。Ｆ１−Ｔ１：ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、Ｆ３−Ｔ３−Ｋ５０８Ｍ：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ。
【図４Ａ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、紡錘体極に限局する、有糸分裂進行を遅延する、ならびに染色体分離欠損、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物の異数性構成的自己リン酸化を誘導することを示す。空レンチウイルスまたはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３もしくはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍを発現しているレンチウイルスで形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を、未処理のままにした（０）、または指示時間１００ｎＭのＦＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４で処理した。リンタンパク質および総タンパク質を、指示抗体を使用してウエスタンブロット法によって解析した。
【図４Ｂ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、紡錘体極に限局する、有糸分裂進行を遅延する、および染色体分離欠損を誘導することを示す。顕微鏡写真は、Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の共焦点顕微鏡解析を示す。Ｚスタック画像の最高強度の投影図は、代表的な有糸分裂細胞の紡錘体を被膜しているＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）を示す（上のパネル）。終期（下のパネル）では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は中心体に限局する。αチューブリン（緑色、白黒画像中では「灰色」）、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ、青色、白黒画像中では「薄灰色」）。
【図４Ｃ】ベクターまたはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３で形質導入した細胞に対する代表的な蛍光ビデオ顕微鏡法を示す。
【図４Ｄ】核膜破壊（ＮＥＢ）から後期開始まで、およびＮＥＢから核膜再構成（ＮＥＲ）までの時間の解析を表す箱髭図を示す。有糸分裂の期間を、微速度撮影顕微鏡法で各条件に対して５０個の有糸分裂を追うことによって、測定した。
【図４Ｅ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、紡錘体極に限局する、有糸分裂進行を遅延する、および染色体分離欠損を誘導することを示す。代表的な画像は、染色体不分離を持つ細胞を示す。矢印は、染色体不整列、遅滞染色体、および染色体橋を指す。
【図４Ｆ】ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＲａｔ１Ａにおける分離欠損の定量解析を示す。Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、Ｆ３−Ｔ３−Ｋ５０８Ｍ：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ。
【図５Ａ】対照、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているレンチウイルスで形質導入したＲａｔ１Ａ細胞の核型解析を示す。有糸分裂を停止した、およびＤＡＰＩを使用して核型を解析された細胞の染色体数の分布。各条件に対して１００個の中期細胞において染色体を数えて、細胞集団内の染色体数の倍数性および多様性を判定した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物は異数性を誘導する。
【図５Ｂ】代表的な核型を示す。
【図５Ｃ】対照またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているレンチウイルスで形質導入したヒト星状膠細胞の染色体数の分布を示す。各条件に対して１００個の中期細胞において染色体を数えて、細胞集団内の染色体数の倍数性および多様性を判定した。
【図５Ｄ】細胞集団内の染色体数の倍数性および多様性を判定するための、各条件に対して１００個の中期細胞における染色体数の定量解析を示す。（ｎ＝３、独立した実験）。
【図６Ａ】ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の阻害が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された異数性を是正することを示す。上のパネルは、対照またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３レンチウイルスで形質導入し、５日間ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＰＤ１７３４７０（１００ｎＭ）で処理したＲａｔ１Ａ細胞の核型解析である。下のパネルは、細胞集団内の染色体数の倍数性および多様性を、各条件に対して１００個の中期細胞における染色体数の定量解析によって判定したことを示す。
【図６Ｂ】ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の阻害が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された異数性を是正することを示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現している細胞におけるＰＤ１７３４７０による未成熟姉妹染色分体分離（ＰＭＳＣＳ）の是正。パネルは、代表的な中期スプレッドを示す。ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。
【図６Ｃ】姉妹染色分体接着が欠損した中期の定量解析を示す（ｎ＝３、ｐ＝０．００１、ＤＭＳＯで処理したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３対ＰＤ１７３４７０で処理したＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３）。
【図７Ａ】ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の阻害が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された腫瘍成長を抑制することを示す。指示レンチウイルスで形質導入し、増大する濃度のＰＤ１７３０７４で３日間処理したＲａｔ１Ａの成長率。細胞成長をＭＴＴアッセイによって判定した。データを平均±標準誤差として示す（ｎ＝４）。
【図７Ｂ】指示時間中、指示濃度のＰＤ１７３４７０で処理したＧＳＣ−１１２３の成長率を示す。細胞成長をＭＴＴアッセイによって判定した。データを平均±標準誤差として示す（ｎ＝４）。
【図７Ｃ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現抑制する成長阻害効果を示す。左では、ＧＳＣ−１１２３細胞の並行する培養物を３つ組で形質導入した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現しているＲａｔ１Ａ細胞を、非標的化ｓｈＲＮＡ（Ｃｔｒ）、またはＦＧＦＲ３を標的とするｓｈＲＮＡ配列（ｓｈ２、ｓｈ３、ｓｈ４）を発現しているレンチウイルスで形質導入した。感染から５日後、細胞を３つ組で２Ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種し、細胞を除いたトリパンブルーの数を指示時間記録した。ｓｈ−３およびｓｈ−４を発現しているレンチウイルスによる感染、最も効果的なＦＧＦＲ３発現抑制配列は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現している培養物の成長率を、空ベクターで形質導入したＲａｔ１Ａのものと比較可能なレベルまで戻した。値は平均±標準偏差である（ｎ＝３）。右側の図では、ＧＳＣ−１１２３細胞を、非標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−Ｃｔｒ）を発現しているレンチウイルス、またはＦＧＦＲ３を標的とするｓｈ３およびｓｈ４配列を発現しているレンチウイルスで形質導入した。ウエスタンブロット解析を、ＦＧＦＲ３抗体を使用して並行する培養物に実行し、ＦＧＦＴ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を検出した。βアクチンを装填対照として示す。
【図７Ｄ】ＦＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞によって生成された神経膠腫皮下異種移植片の腫瘍成長を抑制することを示す。腫瘍の確立（２００〜３００ｍｍ３、矢印）後、マウスを１４日間ビヒクルまたはＰＤ１７３０７４（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。値は平均腫瘍体積±標準誤差である（ｎ＝グループ当たり７マウス）。
【図７Ｅ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３で形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞の同所性移植を受けた神経膠腫を持つマウスのカプランマイヤー解析である。腫瘍生着後、マウスを２０日間ビヒクル（ｎ＝９）またはＡＺＤ４５４７（５０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝７）で処理した（ｐ＝０．００１）。
【図８】９個のＧＳＣ培養物から生成したＲＮＡ塩基配列解読データからの融合転写産物の特定に対する、ＴＸ融合パイプラインの概略図を示す。続きの図面は、８４個のＧＢＭのＴＣＧＡ腫瘍試料のＤＮＡエキソーム配列からの遺伝子融合物再構成の特定に対する、Ｅｘｏｍｅ−Ｆｕｓｅパイプラインの概略図を示す。
【図９Ａ】９個のＧＳＣのＲＮＡ塩基配列解読によって特定された融合転写産物の検証を示す。サンガー配列決定クロマトグラムは、陽性試料における、切断点でのリーディングフレーム、および融合タンパク質の推定翻訳を示す（右側）。左側は、実施したＲＴ−ＰＣＲのゲルを示す。（Ａ）ＰＯＬＲ２Ａ−ＷＲＡＰ５３。
【図９Ｂ】９個のＧＳＣのＲＮＡ塩基配列解読によって特定された融合転写産物の検証を示す。サンガー配列決定クロマトグラムは、陽性試料における、切断点でのリーディングフレーム、および融合タンパク質の推定翻訳を示す（右側）。左側は、実施したＲＴ−ＰＣＲのゲルを示す。（Ｂ）ＣＡＰＺＢ−ＵＢＲ４。
【図９Ｃ】９個のＧＳＣのＲＮＡ塩基配列解読によって特定された融合転写産物の検証を示す。サンガー配列決定クロマトグラムは、陽性試料における、切断点でのリーディングフレーム、および融合タンパク質の推定翻訳を示す（右側）。左側は、実施したＲＴ−ＰＣＲのゲルを示す。（Ｃ）ＳＴ８ＳＩＡ４−ＰＡＭ。
【図９Ｄ】９個のＧＳＣのＲＮＡ塩基配列解読によって特定された融合転写産物の検証を示す。サンガー配列決定クロマトグラムは、陽性試料における、切断点でのリーディングフレーム、および融合タンパク質の推定翻訳を示す（右側）。左側は、実施したＲＴ−ＰＣＲのゲルを示す。（Ｄ）ＰＩＧＵ−ＮＣＯＡ６。
【図９Ｅ】９個のＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定された融合転写産物を示す。ＰＯＬＲ２Ａ−ＷＲＡＰ５３融合物の切断点上で整列する５４個のスプリットリードを示す。切断点での予測されるリーディングフレームを、赤字のＰＯＬＲ２Ａ配列（左）および青字のＷＲＡＰ５３（右）と共に、上部に示す。続きのページでは、ＣＡＰＺＢ−ＵＢＲ４融合物の切断点上で整列する４８個のスプリットリードを示す。切断点での予測されるリーディングフレームを、赤字のＣＡＰＺＢ配列（左）および青字のＵＢＲ４（右）と共に、上部に示す。続きのページでは、ＳＴ８ＳＩＡ４−ＰＡＭ融合物の切断点上で整列する２９個のスプリットリードを示す。切断点での予測されるリーディングフレームを、赤字のＳＴ８ＳＩＡ４配列（左）および青字のＰＡＭ（右）と共に、上部に示す。続きのページでは、ＰＩＧＵ−ＮＣＯＡ６融合物の切断点上で整列する１７個のスプリットリードを示す（上部）。切断点での予測されるリーディングフレームを、赤字のＰＩＧＵ配列（左）および青字のＮＣＯＡ６（右）と共に、上部に示す。また（下部）、ＩＦＮＡＲ２−ＩＬ１０ＲＢ融合物の切断点上で整列する６個のスプリットリードを示す。切断点での予測されるリーディングフレームを、赤字のＩＦＮＡＲ２配列（左）および青字のＩＬ１０ＲＢ（右）と共に、上部に示す。
【図１０Ａ】ＧＳＣ、およびＧＢＭ試料における融合した転写産物の発現の解析および検証を示す。ＲＮＡ塩基配列解読データからの読み取り深度によって測定された発現。薄灰色の円弧は、共に融合した転写産物の予測される成分を示す。全体のリード深度（ｒｅａｄ  ｄｅｐｔｈ）（青色、白黒画像中では「灰色」）およびスプリットインサート深度（ｓｐｌｉｔ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｅｐｔｈ）（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）を、５０リードでの増分、および最大範囲１８００リードをもって、グラフ中で示す。特にＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３に対する融合事象に関与する遺伝子領域中の非常に高レベルの発現に注目されたい。
【図１０Ｂ】ＧＳＣ、およびＧＢＭ試料における融合した転写産物の発現の解析および検証を示す。上部のパネル、ＧＳＣ−１１２３中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合転写産物に含まれるＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３のｍＲＮＡ配列の非常に高い発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。下部のパネル、比較のため、ＧＳＣ−０１１４中のＰＯＬＲ２Ａ−ＷＲＡＰ５３融合物に含まれるＷＲＡＰ５３のｍＲＮＡの配列の発現も示す。
【図１０Ｃ】ＧＳＣ−１１２３およびＧＢＭ−１１２３中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質の発現を示す。ヒトＦＧＦＲ３のＮ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析は、ＧＳＣ−１１２３では〜１５０ｋＤタンパク質が発現するが、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３再構成を欠くＧＳＣ培養物ＧＳＣ−０３３１およびＧＳＣ−０１１４では発現しないことを示す。
【図１０Ｄ】ＧＳＣ、およびＧＢＭ試料における融合した転写産物の発現の解析および検証を示す。腫瘍ＧＢＭ−１１２３のＦＧＦＲ３抗体（上部パネル）、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３再構成を欠くＧＢＭ腫瘍を用いた免疫染色解析。ＦＧＦＲ３（赤色、白黒画像中では「薄灰色」）、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ、青色、白黒画像中では「灰色」）。写真は、低倍率（左）および高倍率（右）で撮影した。
【図１０Ｅ】ＦＧＦＲ３への３つの独特のペプチドマッピング（ＦＧＦＲ３ペプチド１、２、および３）、およびＴＡＣＣ３のＣ末端領域への３つのペプチドマッピング（ＴＡＣＣペプチド１、２、および３）を特定する、ＧＳＣ−１１２３からのモノクローナル抗ＦＧＦＲ３抗体によって免疫沈殿した〜１５０ｋＤの融合タンパク質のＭＳ／ＭＳ解析を示す。
【図１１Ａ】ＦＧＦＲ３のＮ末端（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質に含まれる）またはＴＡＣＣ３のＮ末端（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質に含まれない）を認識する抗体を用いたウエスタンブロット法によって解析された、対照レンチウイルス、またはＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているレンチウイルスで形質導入したＲａｔ１Ａ細胞を示す（図１１Ａ）。
【図１１Ｂ】Ｒａｔ１Ａ中のレンチウイルスで発現されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３と比較した、ＧＳＣ−１１２３中の内因性ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の定量的ウエスタンブロット解析を示す。
【図１１Ｃ】Ｒａｔ１Ａ中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍのウエスタンブロット解析を示す。αチューブリンを装填対照として示す。
【図１１Ｄ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合構成体（図１１Ｄ）、ＧＢＭ−１１２３のＦＧＦＲ３免疫染色（左上のパネル）、ＢＴＳＣ１１２３（右上のパネル）、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているレンチウイルスによって誘導されたマウスＧＢＭ（左下のパネル）、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物によって形質転換したマウス星状膠細胞の皮下異種移植片（右下のパネル）の発現解析を示し、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は赤色（白黒画像中では「薄灰色」）、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）は青色（白黒画像中では「灰色」）である。
【図１１Ｅ】図１１Ｄに示した腫瘍および細胞の培養物中のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３陽性細胞の定量化を示す。
【図１１Ｆ】ＧＢＭ１１２３における内因性発現と比較した、マウス星状膠細胞およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３誘導性マウスＧＢＭ（ｍＧＢＭ−１５およびｍＧＢＭ−１７）中の異所性ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の定量的ウエスタンブロット解析を示す。βアクチンを装填対照として示す。Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３。αチューブリンまたはβアクチンを装填対照として示す。
【図１２Ａ】ウエスタンブロット法を示す。空レンチウイルス、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているレンチウイルスで形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を、マイトジェン欠乏に陥らせ、未処理のままにした（時間０）、または指定時間５０ｎｇ／ｍｌの濃度にあるＦＧＦ−２で処理した。リンタンパク質および総タンパク質を、指示抗体を使用してウエスタンブロット法によって解析した。αチューブリンを装填対照として示す。
【図１２Ｂ】ウエスタンブロット法を示す。空レンチウイルス、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３もしくはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍを発現しているレンチウイルスで形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を、マイトジェン欠乏に陥らせ、未処理のままにした（時間０）、または指定濃度にあるＦＧＦ−１で１０分間処理した。リンタンパク質および総タンパク質を、指示抗体を使用してウエスタンブロット法によって解析した。βアクチンを装填対照として示す。
【図１２Ｃ】ウエスタンブロット法を示す。空レンチウイルス、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３もしくはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍを発現しているレンチウイルスで形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を、マイトジェン欠乏に陥らせ、未処理のままにした（時間０）、または指定濃度にあるＦＧＦ−８で１０分間処理した。リンタンパク質および総タンパク質を、指示抗体を使用してウエスタンブロット法によって解析した。βアクチンを装填対照として示す。
【図１２Ｄ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の有糸分裂限局を示す。図１２ＤはＦＧＦＲ３抗体を使用して免疫染色した、代表的なＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現している中期にあるＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−マウス星状膠細胞の最高強度投影の共焦点画像を示す（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、１つの紡錘体極の上部での非対称限局を示す。
【図１２Ｅ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の有糸分裂限局を示す。図１２ＥはＴＡＣＣ３抗体で免疫染色した、代表的なＴＡＣＣ３を発現している中期にあるＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−マウス星状膠細胞の最高強度投影の共焦点画像を示す（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）。ＴＡＣＣ３染色は紡錘体微小管と符号する。
【図１２Ｆ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の有糸分裂限局を示す。図１２ＦはＦＧＦＲ３抗体で免疫染色した、代表的なＦＧＦＲ３を発現している中期にあるＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−マウス星状膠細胞の最高強度投影の共焦点画像を示す（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）。ＦＧＦＲ３は、有糸分裂において特定の染色パターンを示さない。細胞を、αチューブリンを使用して免疫共染色し（緑色、白黒画像中では「薄灰色」）、有糸分裂紡錘体を可視化した。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色した（青色、白黒画像中では「灰色」）。画像を０．２５０μｍ間隔で得た。ＦＧＦＲ３またはＴＡＣＣ３の内因性レベルは、適用した実験条件下では検出不能であった。Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３。
【図１３Ａ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質が、染色体不分離、染色分体接着欠損、および紡錘体チェックポイント欠損を含むことを示す。ベクター対照またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；ＡＲＦ−／−星状膠細胞における染色体分離欠損に対する中期スプレッドの定量解析（上のパネル）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３またはベクター対照を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞における染色体分離欠損の顕微鏡画像解析。染色体不分離を持つ細胞の代表的な画像。矢印は、染色体不整列、遅滞染色体、および染色体橋を指す。
【図１３Ｂ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞（図１３Ｂ）およびＲａｔ１Ａ細胞（図１３Ｃ）における未成熟姉妹染色分体分離（ＰＭＳＣＳ）の代表的な画像を示す。左では、パネルは代表的な中期スプレッドを示す。右、姉妹染色分体接着が欠損した中期の定量解析。Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞中のＰＭＳＣＳを持つ有糸分裂の数を、３つの独立した実験において、各条件に対して少なくとも１００個の中期中で記録した。ＰＭＳＣＳを持つ有糸分裂の数を、Ｒａｔ１Ａ細胞の３つ組の試料中で記録した。
【図１３Ｃ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞（図１３Ｂ）およびＲａｔ１Ａ細胞（図１３Ｃ）における未成熟姉妹染色分体分離（ＰＭＳＣＳ）の代表的な画像を示す。左では、パネルは代表的な中期スプレッドを示す。右、姉妹染色分体接着が欠損した中期の定量解析。Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞中のＰＭＳＣＳを持つ有糸分裂の数を、３つの独立した実験において、各条件に対して少なくとも１００個の中期中で記録した。ＰＭＳＣＳを持つ有糸分裂の数を、Ｒａｔ１Ａ細胞の３つ組の試料中で記録した。
【図１３Ｄ】ノコダゾールを、指定のレンチウイルスで形質導入したＲａｔ１Ａ−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ細胞に指示期間添加したことを示すグラフである。各時点での有糸分裂指数を、各時点での有糸分裂におけるＨ２Ｂ−ＧＦＰ陽性細胞を定量化することによって判定した。データを平均および標準偏差として示す（ｎ＝３）。Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３。
【図１４Ａ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現しているレンチウイルスまたは空ベクターで形質導入したヒト初代星状膠細胞の成長曲線を示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物によって媒介される成長改変、およびＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を持つ細胞へのＲＴＫ阻害剤の特異的効果に対して解析を実施した。図１４ＡはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現しているレンチウイルスまたは空ベクターで形質導入したヒト初代星状膠細胞の細胞増殖を、感染から７日後にＭＴＴアッセイによって判定したことを示すグラフである（継代培養１）。値は平均±標準偏差である（ｎ＝４）。ｐ値：０．００３３。
【図１４Ｂ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現しているレンチウイルスまたは空ベクターで形質導入したヒト初代星状膠細胞の成長曲線を示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物によって媒介される成長改変、およびＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を持つ細胞へのＲＴＫ阻害剤の特異的効果に対して解析を実施した。図１４ＢはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現しているレンチウイルスまたは空ベクターで形質導入したヒト初代星状膠細胞の細胞増殖を、感染から６週間後にＭＴＴアッセイによって判定したことを示すグラフである（継代培養１０）。値は平均±標準偏差である（ｎ＝４）。ｐ値：０．００１８。
【図１４Ｃ】ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を発現している細胞へのＦＧＦＲ阻害剤による特異的成長阻害効果を示す。細胞成長をＭＴＴアッセイによって判定した。指示レンチウイルスで形質導入したＲａｔ１Ａ細胞を、指示濃度のＢＧＪ３９８（図１４Ｃ）またはＡＺＤ４５４７（図１４Ｄ）で３日間処理した。値は平均±標準誤差である（ｎ＝４）。
【図１４Ｄ】ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を発現している細胞へのＦＧＦＲ阻害剤による特異的成長阻害効果を示す。細胞成長をＭＴＴアッセイによって判定した。指示レンチウイルスで形質導入したＲａｔ１Ａ細胞を、指示濃度のＢＧＪ３９８（図１４Ｃ）またはＡＺＤ４５４７（図１４Ｄ）で３日間処理した。値は平均±標準誤差である（ｎ＝４）。
【図１４Ｅ】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物を発現抑制する成長阻害効果を示す。（左）ＧＳＣ−１１２３細胞を、非標的化ｓｈＲＮＡ（Ｃｔｒ）を発現しているレンチウイルス、またはＦＧＦＲ３を標的とするｓｈ３およびｓｈ４配列を発現しているレンチウイルスで３つ組で形質導入した。感染から５日後、細胞を３つ組で２Ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種し、細胞を除いたトリパンブルーの数を指示時間記録した。値は平均±標準偏差である（ｎ＝３）。（右）ウエスタンブロット解析を、ＦＧＦＲ３抗体を使用して、感染から５日後に収集した並行する培養物に実行し、ＦＧＦＴ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質を検出した。βアクチンを装填対照として示す。（＊＊：ｐ値＝＜０．００５、＊＊＊：ｐ値＝＜０．０００１）。
【図１５】ＰＤ１７３０７４、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、またはＡＺＤ４５４７で処理した細胞の生存プロットを示す。
【図１６】ＧＳＣの全トランスクリプトーム配列決定によって特定されたＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を示す。ヒストグラムは、切断点をスパンする正方向および逆方向配列各々の読み取り値の絶対度数を示す。
【図１７】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の形質転換活性を示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、Ｒａｔ１Ａ線維芽細胞における足場非依存性成長（上のパネル）およびＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−初代星状膠細胞における形質転換された表現型（下のパネル）を含む。
【図１８】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の形質転換活性を示す。ｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３（ｎ＝８）、ｐＴｏｍｏ−ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３（ｎ＝８）、およびｐＴｏｍｏ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｈｐ５３（ｎ＝７）を頭蓋内に注射したマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。曲線上の点は死亡を示す（ログランク検定、ｐ＝０．０２５、ｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３対ｐＴｏｍｏ−ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３）。
【図１９】ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の阻害が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された、異数性を是正し腫瘍成長を抑制することを示す。指示レンチウイルスで形質導入し、指示濃度のＰＤ１７３４７０で処理したＲａｔ１Ａの短期的成長阻害アッセイを示す。細胞を３日間処理した。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって判定した。エラーバーは平均±標準誤差を示す（ｎ＝４）。
【図２０】指示レンチウイルスで形質導入し、指示濃度のＰＤ１７３４７０で４日間処理したヒト星状膠細胞の成長阻害アッセイである。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって判定した。エラーバーは平均±標準誤差を示す（ｎ＝４）。
【図２１】指示レンチウイルスで形質導入し、指示濃度のＰＤ１７３４７０で４日間処理したヒト星状膠細胞の成長阻害アッセイを示すグラフである。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって判定した。エラーバーは平均±標準誤差を示す（ｎ＝４）。
【図２２】短期的成長阻害アッセイにおけるＲａｔ１Ａ細胞の生存のグラフを示す。（上のグラフ）Ｒａｔ１Ａ細胞を、指示ｐｔｏｍｏ構成体で形質導入し、指示濃度のＰＤ１７３０７４で処理した。細胞を３日間処理した。細胞生存率をＭＴＴアッセイによって判定した。エラーバーは平均±標準誤差を示す（ｎ＝４）。下のパネルで、ウエスタンブロット写真を示す。
【図２３】ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の阻害が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された、異数性を是正し腫瘍成長を抑制することを示す。図は、対照またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３レンチウイルスで形質導入し、５日間ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＰＤ１７３４７０（１００ｎＭ）で処理したＲａｔ１Ａ細胞の核型解析を示す。
【図２４】神経膠腫を持つマウスの生存を、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３で形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞の頭蓋内注入の後に追跡したことを示す。腫瘍生着後、マウスを２０日間ビヒクルまたはＡＺＤ４５４７（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した（ビヒクルはｎ＝７、ＡＺＤ４５４７はｎ＝６、ｐ＝０．００１）。
【図２５】ピンク色（ＦＧＦＲ３、下線付）および青色（ＴＡＣＣ３、点線）でハイライトされる、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のアミノ酸配列における図１０Ｅからのペプチドの位置を示す。
【図２６】ＩＤＨ突然変異体およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３陽性ヒトＧＢＭのカプランマイヤー解析を示す。ログランク検定ｐ値：０．０１６９。
【図２７】空ベクター（上のパネル、左脇）またはキナーゼドメイン中にＫ５０８Ｍ突然変異を持つＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ、下のパネルの左脇）ではなく、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３（上のパネルＡ、右脇）またはＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１（下のパネルＢ、右脇）融合物を発現しているレンチウイルスで形質導入したＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−マウス星状膠細胞の皮下注射後に誘導された腫瘍異種移植片を示す写真である。
【図２８】ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物の構成的自己リン酸化を示す。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３またはＲａｓＶ１２誘導性マウスＧＢＭ由来のＢＴＳＣを、未処理のままにした、または指示時間５００ｎＭのＰＤ１７３０７４で処理した。リンタンパク質および総タンパク質を、指示抗体を使用してウエスタンブロット法によって解析した。βアクチンを装填対照として示す。
【図２９】最高強度投影として示される、代表的なＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−マウス星状膠細胞のＺスタック共焦点画像を示す。細胞を、ＦＧＦＲ３（赤色、白黒画像中では「濃灰色」）およびαチューブリン（緑色、白黒画像中では「薄灰色」）を使用して免疫染色した。ＤＮＡをＤＡＰＩで対比染色した（青色、白黒画像中では「灰色」）。画像を０．２５０μｍ間隔で得た。画像系列の座標を示す。Ｆ３−Ｔ３：ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３。
【図３０】進行中のＣＩＮおよび異数性を解説する、ＧＳＣ−１１２３の同一の培養からの２個の異なる細胞を示すＳＫＹ核型解析の実施例を示す。２０個の細胞の核型解析の詳細を、表６で報告する。
【図３１】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータのグラフ描写である。３個の膀胱尿路上皮癌腫がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す（黒色の四角）。赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す。
【図３２】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータのグラフ描写である。１個の乳癌腫がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す（黒色の四角）。赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す。
【図３３】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータのグラフ描写である。１個の大腸癌腫がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す（黒色の四角）。赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す。
【図３４】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータのグラフ描写である。１個の肺扁平上皮癌腫がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す（黒色の四角）。赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す。
【図３５】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータのグラフ描写である。１個の頭頸部扁平上皮癌腫がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す（黒色の四角）。赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
多形性膠芽腫（ＧＢＭｓ）は、成人における脳腫瘍の最も一般的な形態であり、頭蓋内腫瘍の１２〜１５％、および原発性脳腫瘍の５０〜６０％を占める。ＧＢＭはヒト癌の中で最も致死的な形態の１つである。成功を収めた癌の標的化療法の経歴は、血液悪性腫瘍における、および最近では上皮癌の一部の型における、反復性および発癌性遺伝子融合物の不活性化と大きく符号する。ＧＢＭはヒト癌のうち最も致死的かつ不治の形態の１つである。ＧＢＭにおける一般的な遺伝子改変に対する標的化療法は、恐らくそれらがＧＢＭの真に依存性である癌性タンパク質を根絶することに体系的に失敗したために、疾患の不良な臨床転帰を変えていない。発癌性遺伝子融合物の創出を招く反復性染色体再構成は、ＧＢＭにおいて見出されていない。
【００４６】
ＧＢＭは、ヒトにおいて治療することが最も難しい形態の癌の１つである（１）。今までのところ、ＧＢＭにおける重要である可能性のある発癌標的に対して試験された治療手段は、ある程度しか成功していない（２〜４）。発癌性融合タンパク質の産生につながる反復性染色体転座は、ヒト癌の病因における起因および依存事象と見られており、それ故、癌治療のための最も望ましい分子標的を提供する（５、６）。反復性および発癌性遺伝子融合物は、ＧＢＭにおいて見出されていない。染色体再構成は血液悪性腫瘍の特徴であるが、最近それらは一部の固体腫瘍（乳癌腫、前立腺癌腫、肺癌腫、および大腸癌腫）中でも発見されている（７、８）。腫瘍がこれらの再構成を持つ患者のための重要かつ成功している標的化療法的介入は、特に転座がキナーゼをコードする遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ）に関与する場合の、機能遺伝子融合物の発見から派生した（９、１０）。
【００４７】
ＧＢＭの特徴は、異数性につながる激しい染色体不安定性（ＣＩＮ）である（１１）。ＣＩＮおよび異数性は、癌の病因における初期事象である（１２）。有糸分裂の忠実度を標的にする遺伝子改変が、異数性を引き起こす有糸分裂中の染色体の不分離の原因である可能性があるということが提案されている（１３、１４）。
【００４８】
線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）は、タンパク質の線維芽細胞成長因子ファミリーの仲間と結合する膜貫通受容体である。ＦＧＦＲの構造は、３つのＩｇ様ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメイン、一重の膜貫通螺旋ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を持つ細胞内ドメインからなる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｔ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．（１９９３）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６０：１−４１）。
【００４９】
形質転換酸性コイルドコイルタンパク質（ＴＡＣＣ）は、ミニ紡錘体（ｍｉｎｉｓｐｉｎｄｌｅｓ）（Ｍｓｐｓ）／ＸＭＡＰ２１５タンパク質を中身体に動員することによって、有糸分裂中に微小管を安定化する。ＴＡＣＣは癌に関与している。
【００５０】
医学的見地から、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、その特定が本疾患において長らく延びている、ＧＢＭにおける最初の「真正な」発癌的に依存性のある遺伝子融合物を提供する。
［ＤＮＡおよびアミノ酸操作法、ならびにその精製］
【００５１】
本発明の態様の実践は、別に指示のない限り、当技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法を用いてもよい。そのような技法は、出版物中で十分に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００１），Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、具体的にはＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４および１５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃａｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【００５２】
当業者は、生化学的手法によってタンパク質を単離すること、または遺伝子工学的方法によって対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させることを含むがこれらに限定されない、いくつかの方法でタンパク質を得ることができる。
【００５３】
タンパク質は核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、および任意の型の対応するＲＮＡを含む）によってコードされた。例えば、それは遺伝子の組み換え核酸によってコードされ得る。本発明のタンパク質は、様々な起源から得ることができ、当技術分野で公知の様々な技法に従って産生され得る。例えば、タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、または天然源からの増幅によって得ることができる。タンパク質は、そのフラグメントまたは一部分であり得る。タンパク質をコードする核酸は組み換えＤＮＡ技術によって産生され得、そのような組み換え核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素技法、またはそれらの組み合わせを含む、従来技法によって調製され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む。例えば、本発明の融合タンパク質は、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含み、ＴＡＣＣドメインは、チロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する。ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１ポリペプチドの例は、配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を有する。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質の例は、配列番号９４に示されるヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされたポリペプチドである。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３ポリペプチドの例は、配列番号７９、１５８、１５９、１６０、または１６１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ＦＧＦＲ３遺伝子のジェンバンクＩＤは２２６１である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１３３（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０００１４２）、ＮＰ＿００１１５６６８５（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１６３２１３）、ＮＰ＿０７５２５４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２２９６５）を有する３つのアイソフォームが、ＦＧＦＧＲ３に対して挙げられる。
【００５５】
配列番号９０は、ＦＧＦＲ３アミノ酸配列、転写産物変異体１（ＮＰ＿０００１３３、８０６ａａ）である。
0006382194.tif 000002
【００５６】
配列番号９１は、ＦＧＦＲ３ヌクレオチド配列、転写産物変異体１（ＮＭ＿０００１４２、４３０４ｂｐ）である。
0006382194.tif 000003
0006382194.tif 000004
【００５７】
ＴＡＣＣ３遺伝子のジェンバンクＩＤは１０４６０である。配列番号９２は、ＴＡＣＣ３アミノ酸配列（ＮＰ＿００６３３３）（８３８ａａ）である。
0006382194.tif 000005
【００５８】
配列番号９３は、ＴＡＣＣ３ヌクレオチド配列（ＮＭ＿００６３４２）（２８４７ｂｐ）である。
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0006382194.tif 000007
【００５９】
配列番号９４は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３のヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000008
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【００６０】
ＦＧＦＲ１遺伝子のジェンバンクＩＤは２２６０である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１１６７５３４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６３）、ＮＰ＿００１１６７５３５（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６４）、ＮＰ＿００１１６７５３６（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６５）、ＮＰ＿００１１６７５３７（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６６）、ＮＰ＿００１１６７５３８（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６７）、ＮＰ＿０５６９３４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０１５８５０）、ＮＰ＿０７５５９３（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２３１０５）、ＮＰ＿０７５５９４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２３１０６）、ＮＰ＿０７５５９８（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２３１１０）を有する８つのアイソフォームが、ＦＧＦＲ１に対して挙げられる。
【００６１】
配列番号１４６は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１１６７５３４（８２０ａａ）を有する、アイソフォーム１０のＦＧＦＲ１アミノ酸配列である。
0006382194.tif 000010
0006382194.tif 000011
【００６２】
配列番号１４７は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１１７４０６３（５８９５ｂｐ）を有する、アイソフォーム１０のＦＧＦＲ１ヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000012
0006382194.tif 000013
【００６３】
配列番号１８５は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０７５５９８（８２２ａａ）を有する、アイソフォーム１のＦＧＦＲ１アミノ酸配列である。
0006382194.tif 000014
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【００６４】
配列番号１８６は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０２３１１０（５９１７ｂｐ）を有する、アイソフォーム１のＦＧＦＲ１ヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000016
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【００６５】
ＴＡＣＣ１遺伝子のジェンバンクＩＤは６８６７である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００６２７４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６３）、ＮＰ＿００１１６７５３５（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６４）、ＮＰ＿００１１６７５３６（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１７４０６５）を有する３つのアイソフォームが、ＴＡＣＣ１に対して挙げられる。
【００６６】
配列番号１４８は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００６２７４（８０５ａａ）を有する、アイソフォーム１のＴＡＣＣ１アミノ酸配列である。
0006382194.tif 000018
【００６７】
配列番号１４９は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００６２８３（７８０２ｂｐ）を有する、アイソフォーム１のＴＡＣＣ１ヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000019
0006382194.tif 000020
0006382194.tif 000021
【００６８】
配列番号１５０は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質のアミノ酸配列である。
0006382194.tif 000022
【００６９】
配列番号１５１は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000023
【００７０】
ＦＧＦＲ２遺伝子のジェンバンクＩＤは２２６３である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１３２（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０００１４１）、ＮＰ＿００１１３８３８５（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１３）、ＮＰ＿００１１３８３８６（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１４）、ＮＰ＿００１１３８３８７（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１５）、ＮＰ＿００１１３８３８８（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１６）、ＮＰ＿００１１３８３８９（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１７）、ＮＰ＿００１１３８３９０（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１８）、ＮＰ＿００１１３８３９１（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００１１４４９１９）、ＮＰ＿０７５２５９（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２２９７０）を有する８つのアイソフォームが、ＦＧＦＲ２に対して挙げられる。
【００７１】
配列番号１５２は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１３２（８２１ａａ）を有する、アイソフォーム１のＦＧＦＲ２アミノ酸配列である。
0006382194.tif 000024
【００７２】
配列番号１５３は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００１４１（４６５４ｂｐ）を有する、アイソフォーム１のＦＧＦＲ２ヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000025
0006382194.tif 000026
【００７３】
ＴＡＣＣ２遺伝子のジェンバンクＩＤは１０５７９である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿９９６７４４（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０６８６２）、ＮＰ＿９９６７４３（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０６８６１）、ＮＰ＿９９６７４２（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿２０６８６０）、ＮＰ＿００８９２８（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００６９９７）を有する４つのアイソフォームが、ＴＡＣＣ２に対して挙げられる。
【００７４】
配列番号１５４は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿９９６７４４（２９４８ａａ）を有するアイソフォームａのＴＡＣＣ２アミノ酸配列である。
0006382194.tif 000027
0006382194.tif 000028
【００７５】
配列番号１５５は、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿２０６８６２（９７０６ｂｐ）を有するアイソフォームａのＴＡＣＣ２ヌクレオチド配列である。
0006382194.tif 000029
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0006382194.tif 000031
0006382194.tif 000032
【００７６】
配列番号１５８は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−１融合タンパク質のアミノ酸配列である。太字の文字はＦＧＦ３タンパク質に対応する。
0006382194.tif 000033
【００７７】
配列番号１５９は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−２融合タンパク質のアミノ酸配列である。太字の文字はＦＧＦ３タンパク質に対応する。
0006382194.tif 000034
【００７８】
配列番号１６０は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−３融合タンパク質のアミノ酸配列である。太字の文字はＦＧＦ３タンパク質に対応する。
0006382194.tif 000035
【００７９】
配列番号１６１は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−４融合タンパク質のアミノ酸配列である。太字の文字はＦＧＦ３タンパク質に対応する。
0006382194.tif 000036
【００８０】
ＦＧＦＲ４遺伝子のジェンバンクＩＤは２２６４である。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００２００２（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿００２０１１）、ＮＰ＿０７５２５２（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿０２２９６３）、ＮＰ＿９９８８１２（対応するヌクレオチド配列ＮＭ＿２１３６４７）を有する３つのアイソフォームが、ＦＧＦＲ４に対して挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦＲ融合分子」は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシキナーゼドメインを含む融合タンパク質に対応するポリペプチドをコードする核酸（例えば、合成、精製、および／または組み換え）、または、ＴＡＣＣドメインがチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸であり得る。それはまた、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシキナーゼドメインを含む融合タンパク質、または、ＴＡＣＣドメインがチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含む融合タンパク質でもあり得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、（例えば、配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号８８に示される核酸配列を含む）ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、（例えば、配列番号７９、１５８〜１６０、もしくは１６１に示されるアミノ酸配列を含む、または、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５に示される核酸配列を含む）ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質（例えば、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、またはＴＡＣＣ３のフラグメントと融合したそのチロシンキナーゼドメインを含むＦＧＦＲ４のＮ末端フラグメント）を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１１６７５３４、ＮＰ＿００１１６７５３５、ＮＰ＿００１１６７５３６、ＮＰ＿００１１６７５３７、ＮＰ＿００１１６７５３８、ＮＰ＿０５６９３４、ＮＰ＿０７５５９３、ＮＰ＿０７５５９４、もしくはＮＰ＿０７５５９８に対応するアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ１含有融合物、または、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１１７４０６３、ＮＭ＿００１１７４０６４、ＮＭ＿００１１７４０６５、ＮＭ＿００１１７４０６６、ＮＭ＿００１１７４０６７、ＮＭ＿０１５８５０、ＮＭ＿０２３１０５、ＮＭ＿０２３１０６、もしくはＮＭ＿０２３１１０に対応するヌクレオチド配列を含むＦＧＦＲ１含有融合物を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１３２、ＮＰ＿００１１３８３８５、ＮＰ＿００１１３８３８６、ＮＰ＿００１１３８３８７、ＮＰ＿００１１３８３８８、ＮＰ＿００１１３８３８９、ＮＰ＿００１１３８３９０、ＮＰ＿００１１３８３９１、もしくはＮＰ＿０７５２５９に対応するアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ２含有融合物、または、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００１４１、ＮＭ＿００１１４４９１３、ＮＭ＿００１１４４９１４、ＮＭ＿００１１４４９１５、ＮＭ＿００１１４４９１６、ＮＭ＿００１１４４９１７、ＮＭ＿００１１４４９１８、ＮＭ＿００１１４４９１９、もしくはＮＭ＿０２２９７０に対応するヌクレオチド配列を含むＦＧＦＲ２含有融合物を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１３３、ＮＰ＿００１１５６６８５、もしくはＮＰ＿０７５２５４に対応するアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ３含有融合物、または、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００１４２、ＮＭ＿００１１６３２１３、もしくはＮＭ＿０２２９６５に対応するヌクレオチド配列を含むＦＧＦＲ３含有融合物を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００２００２、ＮＰ＿０７５２５２、もしくはＮＰ＿９９８８１２に対応するアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ４含有融合物、または、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００２０１１、ＮＭ＿０２２９６３、もしくはＮＭ＿２１３６４７に対応するヌクレオチド配列を含むＦＧＦＲ４含有融合物を含み得る。ＦＧＦＲ融合分子はまた、表７に挙げられる遺伝子のうちのいずれか１つによってコードされたタンパク質と融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインも含み得る。ＦＧＦＲ融合分子は、上記の例の変異体、例えばそれらのフラグメントを含み得る。
【００８２】
【表７】
0006382194.tif 000037
【００８３】
核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡ、合成または半合成ＤＮＡ、および任意の形態の対応するＲＮＡを含む、任意の型の核酸であり得る。ｃＤＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ鋳型から人工的に合成したＤＮＡの形態であり、遺伝子クローンを産生するために使用される。合成ＤＮＡには、ヒストンおよびメチル化を含むがこれらに限定されない、細胞核酸中に見出される修飾がない。例えば、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸は、そのようなタンパク質をコードする組み換え核酸を含み得る。核酸は、人工的に（配列を組立て、切断、結紮、または増幅することによってなど）創出された非自然発生的な核酸であってもよい。それは２本鎖または１本鎖であり得る。
【００８４】
本発明は、ＦＧＦＲ融合分子に相補的である核酸を更に提供する。相補的核酸は、厳しいハイブリッド形成条件下で上記の核酸配列とハイブリッド形成してもよい。厳しいハイブリッド形成条件の非限定的な例としては、３０℃超、３５℃超、４２℃を超過する温度、および／または約５００ｍＭ未満、もしくは２００ｍＭ未満の塩分濃度が挙げられる。ハイブリッド形成条件は、温度、塩分濃度、および／またはＳＤＳもしくはＳＳＣなどの他の試薬の濃度を変更することで当業者によって調製され得る。
【００８５】
本発明に従い、タンパク質変異体はアミノ酸配列修飾を含んでもよい。例えば、アミノ酸配列修飾は、置換、挿入、または欠失変異体の３つの種類のうちの１つ以上に当てはまる。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合と、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含んでもよい。挿入は、通常、例えば、約１〜４個の残基のアミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さい挿入となる。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異によって調製され、これによって、変異体をコードするＤＮＡが産生され、その後、組み換え細胞培養においてＤＮＡが発現される。
【００８６】
一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子は、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５に示される配列など、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列によってコードされたタンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列は、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５と、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。別の実施例では、ポリペプチドは、グリコシル化および／もしくはアセチル化、ならびに／または化学反応もしくは結合などによって修飾されてもよく、１つまたは複数の非天然または合成アミノ酸を含有してもよい。ＦＧＦＲ融合分子の例は、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドであるＦＧＦＲ融合分子は、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１と、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。別の実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子は、ＦＧＦＲ融合タンパク質のフラグメントであってもよい。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１のうちの少なくとも約８個の連続したアミノ酸のいずれの部分を含んでもよい。フラグメントは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１の、少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、少なくとも約４０個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約６０個のアミノ酸、少なくとも約７５個のアミノ酸を含み得る。フラグメントは、約８〜１００約アミノ酸の長さ、例えば、約１０〜１００アミノ酸、約１５〜１００アミノ酸、約２０〜１００アミノ酸、約３５〜１００アミノ酸、約４０〜１００アミノ酸、約５０〜１００アミノ酸、約７０〜１００アミノ酸、約７５〜１００アミノ酸、または約８０〜１００アミノ酸の、全ての可能なアミノ酸の長さを含む。フラグメントは、約１００〜８００アミノ酸の長さ、例えば、約１２５〜８００アミノ酸、約１５０〜８００アミノ酸、約１７５〜８００アミノ酸、約２００〜８００アミノ酸、約２２５〜８００アミノ酸、約２５０〜８００アミノ酸、約２７５〜８００アミノ酸、約３００〜８００アミノ酸、約３２５〜８００アミノ酸、約３５０〜８００アミノ酸、約３７５〜８００アミノ酸、約４００〜８００アミノ酸、約４２５〜８００アミノ酸、約４５０〜８００アミノ酸、約４７５〜８００アミノ酸、約５００〜８００アミノ酸、約５２５〜８００アミノ酸、約５５０〜８００アミノ酸、約５７５〜８００アミノ酸、約６００〜８００アミノ酸、約６２５〜８００アミノ酸、約６５０〜８００アミノ酸、約６７５〜８００アミノ酸、約７００〜８００アミノ酸、約７２５〜８００アミノ酸、約７５０〜８００アミノ酸、または約７７５〜８００アミノ酸の、全ての可能なアミノ酸の長さを含む。
【００８７】
化学合成。ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の化学的方法を使用して、全体的にまたは部分的に合成できる。代替的に、ポリペプチドは、固相法を使用した直接ペプチド合成によってなど、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生できる。タンパク質合成は、手動法を使用して、または自動化によって、どちらでも行うことができる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成できる。
【００８８】
任意に、ペプチドフラグメントを別々に合成し、化学的方法を使用して組み合わせて、完全長分子を産生してもよい。例えば、本発明の融合タンパク質を合成するために、これらの方法が利用できる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含み、ＴＡＣＣドメインはチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する。融合タンパク質の例は、配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１ポリペプチドである。融合タンパク質の例は、配列番号７９、１５８、１５９、１６０、または１６１を含むアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３ポリペプチドである。
【００８９】
ＦＧＦＲ融合分子の採集、精製、および検出。ＦＧＦＲ融合分子またはその変異体をコードする核酸などの核酸によってコードされたポリペプチドは、そのような核酸によってコードされたタンパク質またはポリペプチドを発現しているヒト細胞からの精製によって採集できる。非限定的な精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および分取用ゲル電気泳動法が挙げられる。
【００９０】
合成ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）などの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実質的に精製し得る。ＦＧＦＲ融合分子などの合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸解析または配列決定によって確認できる。
【００９１】
他の構造を使用して、本発明のポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に接合することもできる。そのような精製を促進するドメインとしては、固定化金属に対する精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリンに対する精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）で利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。開裂可能なリンカー配列（すなわち、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を精製ドメインと本発明の核酸によってコードされたポリペプチドとの間に含むことでも、精製を促進できる。例えば、当業者は、対象の核酸と併せてチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先行する６個のヒスチジン残基をコードする発現ベクターを使用してもよい。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによって精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ開裂部位は、例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ、ＦＧＦＲ含有またはＴＡＣＣ含有核酸によってコードされたポリペプチドを精製するための手法を提供する。
【００９２】
ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸を含有し、続いてそれを発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手順によって特定され得る。これらの手順としては、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成、ならびに、核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜、溶液、もしくはチップに基づく技術を含む、タンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技法が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸の存在は、それをコードする核酸のプローブまたはフラグメントを使用する、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成または増幅によって検出できる。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子の核酸フラグメントは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５の少なくとも約８個の連続したヌクレオチドのうちのいずれの部分を含んでもよい。別の実施形態では、フラグメントは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５の、少なくとも約１０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド、または少なくとも約３０個の連続したヌクレオチドを含み得る。フラグメントは、約８〜約１００ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約２０〜約１００ヌクレオチドの、全ての可能なヌクレオチドの長さを含み得る。核酸増幅ベースアッセイは、ＦＧＦＲ融合分子核酸をコードする配列から選択されるオリゴヌクレオチド、またはＦＧＦＲ融合分子核酸を使用して、タンパク質またはそのポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体を検出する。
【００９３】
ポリペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のどちらかを使用する、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸などの核酸によってコードされたポリペプチドの発現を検出および測定するためのプロトコールは、当業者に公知である。非限定的な例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸などの核酸によってコードされたペプチド上の２つの干渉しないエピトープに反応するモノクローナル抗体を使用する、２部位モノクローナルベースイムノアッセイが使用でき、または競合的結合アッセイを用いてもよい。
【００９４】
標識化および共役技法は当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用できる。ＦＧＦＲ融合分子などのタンパク質をコードする核酸配列に関係する配列を検出するために標識ハイブリッド形成またはＰＣＲプローブを産生する方法としては、標識ヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、またはＰＣＲ増幅が挙げられるがそれらに限定されない。代替的に、ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸などの核酸配列は、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクターにクローン化できる。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、標識ヌクレオチド、およびＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼの添加によってＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用できる。これらの手順は、様々な市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して実施できる。検出を容易にするために使用できる好適なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、および蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、および／または磁性粒子が挙げられる。
【００９５】
フラグメントは、ＦＧＦＲ融合タンパク質などのタンパク質のフラグメントであり得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子のフラグメントは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１のうちの少なくとも約８個の連続したアミノ酸のいずれの部分を含んでもよい。フラグメントは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１の、少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、少なくとも約４０個の連続したアミノ酸、少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、少なくとも約６０個の連続したアミノ酸、少なくとも約７０個の連続したアミノ酸、少なくとも約７５個の連続したアミノ酸、少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、少なくとも約８５個の連続したアミノ酸、少なくとも約９０個の連続したアミノ酸、少なくとも約９５個の連続したアミノ酸、少なくとも約１００個の連続したアミノ酸、少なくとも約２００個の連続したアミノ酸、少なくとも約３００個の連続したアミノ酸、少なくとも約４００個の連続したアミノ酸、少なくとも約５００個の連続したアミノ酸、少なくとも約６００個の連続したアミノ酸、少なくとも約７００個の連続したアミノ酸、または少なくとも約８００個の連続したアミノ酸を含み得る。フラグメントは、約８〜１００約アミノ酸の長さ、例えば、約１０〜約１００アミノ酸、約１５〜約１００アミノ酸、約２０〜約１００アミノ酸、約３５〜約１００アミノ酸、約４０〜約１００アミノ酸、約５０〜約１００アミノ酸、約７０〜約１００アミノ酸、約７５〜約１００アミノ酸、または約８０〜約１００アミノ酸の、全ての可能なアミノ酸の長さを含む。
［細胞トランスフェクション］
【００９６】
対象の核酸配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養できる。形質転換細胞によって産生されたポリペプチドは、使用された配列および／またはベクターに応じて、分泌または細胞内に含有され得る。ＦＧＦＲ融合分子をコードする核酸などの核酸配列を含有する発現ベクターは、核酸によってコードされた可溶性ポリペプチド分子の分泌を導くシグナル配列を含有するように設計できる。細胞トランスフェクションおよび培養方法を下でより詳細に説明する。
【００９７】
真核細胞発現ベクターを使用して、ベクターのヌクレオチド配列、例えばＦＧＦＲ融合分子をコードするものによってコードされたタンパク質を産生するために細胞をトランスフェクトできる。哺乳類細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することによって、発現ベクター（ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシキナーゼドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸、または、ＴＡＣＣドメインがチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸）を含有し得る。
【００９８】
宿主細胞株は、所望のやり方で、その挿入された配列の発現を調節する能力、または核酸によってコードされた発現されたポリペプチドを処理する能力に対して選択できる。そのようなポリペプチドの調節としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドの「前処理」形態を開裂する翻訳後処理も、適正な挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的な機序を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）から入手可能であり、異種タンパク質の適正な修飾および処理を確実にするために選択できる。
【００９９】
外因性核酸を、リポフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、または電気泳動法などの当技術分野で公知の様々な技法によって、細胞に導入してもよい。電気泳動法は、近似的な電圧および静電容量で実行することで、対象の細胞（神経膠腫細胞（細胞系ＳＦ１８８）、神経芽腫細胞（細胞系ＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−Ｆ、およびＳＨ−Ｎ）、星状膠細胞など）へのＤＮＡ構成体の侵入をもたらす。また他のトランスフェクション方法としては、修飾リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン沈殿、リポソーム融合、および受容体媒介遺伝子送達が挙げられる。
【０１００】
遺伝子操作される細胞は、様々な組織から採取された１次および２次細胞であってもよく、培養において維持および繁殖され得る細胞型を含んでもよい。１次および２次細胞の非限定的な例としては、上皮細胞、神経細胞、内皮細胞、神経膠細胞、線維芽細胞、筋細胞（筋芽細胞など）、ケラチン生成細胞、血液生成成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。
【０１０１】
脊椎動物組織は、パンチ生検、または対象の１次細胞型の組織起源を採取するための他の外科的方法など、当業者に公知の方法によって採取できる。一実施形態では、パンチ生検または切除（例えば吸引による）が、癌細胞（例えば、神経膠腫細胞、神経芽腫細胞など）の起源を採取するために使用できる。１次細胞の混合物は、外植、酵素消化法（例えば、プロナーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、およびキモトリプシンなどの酵素を使用する）などの当技術分野で容易に実践されている方法を使用して、組織から採取できる。生検方法はまた、それぞれ本明細書に参照により組み込まれる米国特許第７，４１９，６６１号およびＰＣＴ出願国際公開第２００１／３２８４０号に記載されている。
【０１０２】
１次細胞は、遺伝子操作された１次または２次細胞が投与される個体から採取できる。しかしながら、１次細胞はまた、受容者の他に、同一種の提供者から採取してもよい。細胞はまた、別の種（例えば、ウサギ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウマ、ウシ、トリ、またはブタ）から取得してもよい。また１次細胞としては、組織培養基質（例えば、フラスコまたは皿）に付着させて成長させたまたは懸濁液中で成長させた脊椎動物組織起源からの精製細胞、組織由来の外植片中に存在する細胞、初めて播種した前述の細胞型の両方、およびこれらの播種した細胞由来の細胞培養懸濁液が挙げられる。２次細胞は、培養基質から除去し、再播種または継代した、播種した１次細胞、および後続継代からの細胞であり得る。２次細胞は１回以上継代できる。これらの１次または２次細胞は、ＦＧＦＲ融合分子をコードする遺伝子を有する発現ベクターを含有し得る。
［細胞培養］
【０１０３】
様々な培養パラメータが、培養される宿主細胞に関して使用できる。哺乳類細胞に対して適切な培養条件は、当技術分野で公知であるか（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＷＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，５６（２）：２２１−２３４）、当業者によって判定され得る（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄｓ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）を参照されたい）。細胞培養条件は、選択される宿主細胞の型に従って異なり得る。市販の培地を利用してもよい。培地の非限定的な例としては、例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、ＲＰＭＩ−１６４０  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）、および様々な細胞型に対して処方される既知組成（ＣＤ）媒体、例えばＣＤ−ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１０４】
細胞培地は、必要に応じた、または所望の通りの適切な濃度または量の追加的な成分を含む補助的な成分または原料を用いて、必要に応じて補完することができる。細胞培地溶液は、次のカテゴリーのうちの１つ以上からの少なくとも１つの成分を提供する。（１）通常はグルコースなどの炭水化物の形態にあるエネルギー源、（２）全ての必須アミノ酸、および通常はシステインを加えた２０個のアミノ酸の基本セット、（３）低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機成分、（４）遊離脂肪酸または脂質、例えばリノール酸、および（５）微量元素が通常はマイクロモルの範囲の非常に低い濃度で必要とされ得る無機成分または天然元素として定義される場合は、微量元素。
【０１０５】
培地はまた、次のカテゴリーのうちの任意のものからの１つ以上の成分を用いて選択的に補完できる。（１）塩、例えば、マグネシウム、カルシウム、およびリン酸塩、（２）ホルモン、ならびに、血清、インスリン、トランスフェリン、および上皮成長因子などの他の成長因子、（３）タンパク質および組織加水分解物、例えば、精製ゼラチン、植物原料、または動物由来成分から採取され得るペプトンまたはペプトン混合物、（４）アデノシン、チミジン、ならびにヒポキサンチンなどのヌクレオチドおよび塩基、（５）ＨＥＰＥＳなどの緩衝液、（６）ゲンタマイシンまたはアンピシリンなどの抗生物質、（７）細胞保護剤、例えばプルロニックポリオール、および（８）ガラクトース。一実施形態では、可溶性因子を培地に添加してもよい。
【０１０６】
本発明と共に使用できる哺乳類細胞培養は、培養される細胞型に好適な培地において調製する。一実施形態では、細胞培地は、哺乳類起源の血清（例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ））で補完された、上で考察したもののうちのいずれの１つ（例えばＭＥＭ）であってもよい。別の実施形態では、培地は、宿主細胞の成長を持続する馴化培地であってもよい。
【０１０７】
３次元培養は、寒天（Ｇｅｙ’ｓ  Ａｇａｒなど）、ヒドロゲル（マトリゲルおよびアガロースなど、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５：２４６１−２４６６）または架橋されるポリマーからなされてもよい。これらのポリマーは、天然ポリマーおよびそれらの誘導体、合成ポリマーおよびそれらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含み得る。天然ポリマーは、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、両親媒性ポリマー、または中性ポリマーであってもよい。アニオン性ポリマーの非限定的な例としては、ヒアルロン酸、アルギン酸（アルギン酸塩）、カラギーナン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、およびペクチンが挙げられる。カチオン性ポリマーの一部の例としては、キトサンまたはポリリシンが挙げられるがこれらに限定されない。（Ｐｅｐｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．１８：１３４５−６０；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．４３：３−１２；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００１）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４４：６２−７３）。両親媒性ポリマーの例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、カルボキシメチルキチンが挙げられるがこれらに限定されない。中性ポリマーの非限定的な例としては、デキストラン、アガロース、またはプルランが挙げられる。（Ｐｅｐｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．１８：１３４５−６０；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．４３：３−１２；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，（２００１）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４４：６２−７３）。
【０１０８】
培養される細胞は、プラスミドなどの導入された発現ベクターを宿し得る。発現ベクター構成体は、形質転換、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、電気泳動、または感染によって導入できる。発現ベクターは、発現および産生に対してタンパク質をコードするコード配列、またはそれらの一部分を含有してもよい。産生されたタンパク質およびポリペプチドをコードする配列、ならびに適切な転写および翻訳制御因子を含有する発現ベクターは、当業者に公知であり実践される方法を使用して生成できる。これらの方法としては、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  ｉｎ  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載される、合成技法、インビトロでの組み換えＤＮＡ技法、およびインビボでの遺伝子組み換えが挙げられる。
［ＦＧＦＲ融合分子阻害剤］
【０１０９】
本発明は、対象においてＦＧＦＲ融合分子の発現レベルまたは活性を減少させる化合物の使用方法を提供する。加えて、本発明は、遺伝子融合関連の癌の処置に対する化合物を使用する方法を提供する。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は上皮癌である。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦＲ融合分子阻害剤」は、本発明のＦＧＦＲ融合分子と相互作用し、その活性および／またはその発現を調節する化合物を指す。例えば、化合物は、ＦＧＦＲ融合分子の活性または発現を減少させ得る。化合物は、ＦＧＦＲ融合分子の拮抗薬（例えば、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤）であってもよい。ＦＧＦＲ融合分子阻害剤の一部の非限定的な例としては、ペプチド（ＦＧＦＲ融合分子を含むペプチドフラグメント、または抗体もしくはそれらのフラグメントなど）、小分子、および核酸（ＦＧＦＲ融合分子を含む核酸に特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなど）が挙げられる。ＦＧＦＲ融合分子の拮抗薬は、ＦＧＦＲ融合タンパク質の活性の量または期間を減少させる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシキナーゼドメイン（例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ）を含むか、融合タンパク質は、ＴＡＣＣドメインがチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化する、チロシンキナーゼドメインを持つポリペプチドと融合した形質転換酸性コイルドコイル（ＴＡＣＣ）ドメインを含む。拮抗薬としては、タンパク質、核酸、抗体、小分子、またはＦＧＦＲ融合分子の活性を減少させる任意の他の分子が挙げられる。
【０１１１】
用語「調節する」は、本明細書で使用される場合、ＦＧＦＲ融合分子の活性または発現における変更を指す。例えば、調節は、タンパク質活性、結合特徴、または、ＦＧＦＲ融合タンパク質などのＦＧＦＲ融合分子の、任意の他の生物学的、機能的、または免疫学的特性を減少させる。
【０１１２】
一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤は、タンパク質自体と結合する、ＦＧＦＲ融合タンパク質のペプチドフラグメントであってもよい。
【０１１３】
例えば、ＦＧＦＲ融合ポリペプチドは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１のうちの少なくとも約８個の連続したアミノ酸のいずれの部分を含んでもよい。フラグメントは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１の、少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、少なくとも約４０個の連続したアミノ酸、少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、少なくとも約６０個の連続したアミノ酸、少なくとも約７０個の連続したアミノ酸、少なくとも約７５個の連続したアミノ酸、少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、少なくとも約８５個の連続したアミノ酸、少なくとも約９０個の連続したアミノ酸、少なくとも約９５個の連続したアミノ酸、少なくとも約１００個の連続したアミノ酸、少なくとも約２００個の連続したアミノ酸、少なくとも約３００個の連続したアミノ酸、少なくとも約４００個の連続したアミノ酸、少なくとも約５００個の連続したアミノ酸、少なくとも約６００個の連続したアミノ酸、少なくとも約７００個の連続したアミノ酸、または少なくとも約８００個の連続したアミノ酸を含み得る。フラグメントは、約８〜１００約アミノ酸の長さ、例えば、約１０〜約１００アミノ酸、約１５〜約１００アミノ酸、約２０〜約１００アミノ酸、約３５〜約１００アミノ酸、約４０〜約１００アミノ酸、約５０〜約１００アミノ酸、約７０〜約１００アミノ酸、約７５〜約１００アミノ酸、または約８０〜約１００アミノ酸の、全ての可能なアミノ酸の長さを含む。これらのペプチドフラグメントは、商業的に入手するか、液相もしくは固相合成方法によって合成できる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ＦＧＦＲ融合ペプチドフラグメントは、天然源から単離するか、遺伝子操作するか、化学的に調製できる。これらの方法は当技術分野で公知である。
【０１１４】
ＦＧＦＲ融合分子阻害剤は、本発明のＦＧＦＲ融合分子に対する抗体（モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ、または完全ヒト）またはその結合フラグメントなどのタンパク質であり得る。抗体フラグメントは、完全長形態の他に抗体の形態であってもよく、操作された抗体フラグメントに加えて、完全長の抗体内に存在する部分または成分を含む。抗体フラグメントとしては、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、Ｆｖ、および（Ｆａｂ´）２、三重特異性抗体、Ｆｃ、Ｆａｂ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、四重特異性抗体、２官能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域などが挙げられるがこれらに限定されない（Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６；Ｈｕｄｓｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５−４０２を参照されたい）。抗体は、商業的に入手でき、特注生成でき、または、当技術分野において確立された方法に従って対象の抗原に対して合成できる（各々その全体が参照によって本明細書に取り込まれる、米国特許第６，９１４，１２８号、第５，７８０，５９７号、第５，８１１，５２３号、Ｒｏｌａｎｄ  Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ（編集者），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ，（２０１０）２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ  Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編集者），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（２００９），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅｎｎｙ  Ｌｏ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（２００４）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。例えば、ＦＧＦＲ融合分子に向けられる抗体は、Ａｂｃａｍ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｂｇｅｎｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓなどから商業的に入手できる。ＦＧＦＲ融合分子に向けられるヒト抗対（モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはキメラ抗体など）は、ヒトにおける使用に有用な抗体治療薬であり得る。一実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１に対する。
【０１１５】
ＦＧＦＲ融合分子をコードするＲＮＡの阻害は、ＦＧＦＲ融合分子の発現を効果的に調節できる。阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡ、リボザイム、および、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または人工核酸であってもよいアンチセンス核酸からなる群から選択される。
【０１１６】
アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化ｍＲＮＡと結合すること、およびタンパク質翻訳を防ぐことによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止するように作用する。例えば、少なくとも１５個の塩基の、ＦＧＦＲ融合分子をコードするＤＮＡ配列の特異領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば従来的なリン酸ジエステル技法によって合成できる（Ｄａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１２（４）：ＲＡ６７−７４；Ｋａｌｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：１７３−９６；Ｌｕｔｚｅｌｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：２４３−５９）。アンチセンスヌクレオチド配列としては、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡは、約１５個〜約５０個の塩基対、例えば約２１個〜約２５個の塩基対を含有し、細胞内の発現された標的遺伝子もしくはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する、２本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、ワトソンクリック塩基対合相互作用によって共にアニールされた、センス鎖ＲＮＡおよび相補的アンチセンス鎖ＲＮＡを含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ分子内に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。標的ｍＲＮＡ内に含有される標的配列と「実質的に同一」とは、標的配列と約３％以下異なる核酸配列を指す。ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２個の相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含むか、２個の相補的部分が塩基対合され、かつ１本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合する、単一分子を含んでもよい。その全開示が参照によって本明細書に組み込まれる、ＭｃＭｎａｕｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：７３７−４７、およびＳｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｕ（２００６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２０：１２９３−９９も参照されたい。
【０１１８】
ｓｉＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの添加、欠失、置換、および／または改変によって改変された、天然ＲＮＡとは異なるＲＮＡであり得る。そのような改変としては、ｓｉＲＮＡの末端、またはｓｉＲＮＡの１つ以上の内在ヌクレオチドなどへの、ヌクレオチドではない物質の添加、またはｓｉＲＮＡにヌクレアーゼ消化に対する耐性をつける修飾、またはｓｉＲＮＡ中の１つ以上のヌクレオチドの、デオキシリボヌクレオチドでの置換が挙げられる。ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖は、３’側の突出を含むこともできる。本明細書で使用される場合、３’側の突出は、二重鎖ＲＮＡの３’側の末端から延在する少なくとも１個の不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）１〜約６ヌクレオチドの長さ、または１〜約５ヌクレオチドの長さ、または約１〜４ヌクレオチドの長さ、または約２〜約４ヌクレオチドの長さの、少なくとも１個の３’側の突出を含み得る。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはウリジル酸（「ｕｕ」）の３’側の突出を含み得る。
【０１１９】
ｓｉＲＮＡは、化学的または生物学的に産生するか、組み換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現できる（例えば、その全開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，５０４号および米国特許第７，４２２，８９６号を参照されたい）。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生および試験する例示的な方法は、その全開示が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｅｗｉｒｔｚに対する米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号、Ｈａｎｎｏｎらに対する米国特許第８，０７１，５５９号、およびＴｏｌｅｎｔｉｎｏらに対する米国特許第７，１４８，３４２号に記載される。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子を含むヒト核酸配列に向けられるｓｉＲＮＡは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５のうちのいずれの１つに対しても生成できる。別の実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子の切断点を含むヒト核酸配列に向けられるｓｉＲＮＡは、配列番号１〜７７、８０〜８２、８４〜１４４、または１４５のうちのいずれの１つに対しても生成できる。一実施形態では、ＦＧＦＲ３遺伝子を標的にするヘアピン配列は、配列番号１８３、１８４、または１８５を含む。
【０１２１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡは、Ｕ６プロモーターなどのプロモーターを含む。これらのＤＮＡを転写して、アンチセンスＲＮＡとして機能できるｓｉＲＮＡまたは線状ＲＮＡとして機能できる、細胞中の小型のヘアピンＲＮＡを産生できる。ＦＧＦＲ融合分子阻害剤は、標的ＲＮＡおよび／または遺伝子が阻害されるように、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の好適な組み合わせを含み得る。加えて、これらの形態の核酸は、１本、２本、３本、または４本鎖であってもよい。（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−４２９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４  ４９８、米国特許第６，５０９，１５４、米国特許出願公開第２００３／００２７７８３号、およびＰＣＴ国際公開第００／０４４８９５号、国際公開第９９／０３２６１９号、国際公開第００／０１８４６号、国際公開第０１／０２９０５８号、国際公開第００／０４４９１４号を参照されたい）。
【０１２２】
ＦＧＦＲ融合分子阻害剤は、本明細書に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質と結合し、その機能を妨害する小分子であり得る。小分子は、低い分子量を概して有する、多様な合成および天然物質である。それらは、天然源（例えば、植物、菌類、微生物など）から単離でき、ライブラリもしくはコレクションとして市販されているおよび／または入手可能であるか、合成できる。ＦＧＦＲ融合タンパク質を阻害する候補の小分子は、当技術分野で確立されている方法に従い、コンビナトリアルライブラリのインシリコでのスクリーニングまたはハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングによって特定できる（例えば、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｐｏｔｙｒａｉｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＡＣＳ  Ｃｏｍｂ  Ｓｃｉ．１３（６）：５７９−６３３、Ｍｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９８（１２）：４４２９−６８、Ｓｃｈｎｕｒ（２００８）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．１１（３）：３７５−８０、およびＪｈｏｔｉ（２００７）Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ．（３）：１６９−８５を参照されたい。）アスピリン、ペニシリン、および多くの化学療法薬などの最も従来的な医薬品は、小分子であり、市販されており、化学的に合成でき、または、下に記載の通り、ランダムもしくはコンビナトリアルライブラリから得ることができる（例えば、Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ５（１）：３２−６を参照されたい）。
【０１２３】
ＦＧＦＲ融合分子阻害剤の非限定的な例としては、ＦＧＦＲ阻害剤ＡＺＤ４５４７（各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７２（８），２０４５−５６を参照、またＰＣＴ出願国際公開第２００８／０７５０６８号を参照）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｇｎａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７０６６−７０８３を参照、また米国特許出願公開第２００８−０３１２２４８  Ａ１号を参照）、ＰＤ１７３０７４（各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｇｎａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５４：７０６６−７０８３を参照、またＭｏｈａｍｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：５８９６−５９０４を参照）、ＮＦ４４９（各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）カタログ番号４８０４２０、またＫｒｅｊｃｉ，（２０１０）ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５（２７）：２０６４４−２０６５３を参照）、ＬＹ２８７４４５５（各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．（１１）：２２００−１０を参照、またＰＣＴ出願国際公開第２０１０１２９５０９号を参照）、ＴＫＩ２５８（ドビチニブ）、ＢＩＢＦ−１１２０（インテダニブバルガテフ（Ｉｎｔｅｄａｎｉｂ−Ｖａｒｇａｔｅｆ））、ＢＭＳ−５８２６６４（ブリバニブアラニネート）、ＡＺＤ−２１７１（セジラニブ）、ＴＳＵ−６８（オランチニブ（Ｏｒａｎｔｉｎｉｂ））、ＡＢ−１０１０（マシチニブ）、ＡＰ−２４５３４（ポナチニブ）、およびＥ−７０８０（Ｅｉｓａｉ製）が挙げられる。ＦＧＦＲ融合分子阻害剤の非限定的な例としては、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＴＡＣＣ阻害剤ＫＨＳ１０１（Ｗｕｒｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ，１０７（３８）：１６５４２−４７）が挙げられる。
【０１２４】
本発明に有用なＦＧＦＲ融合分子阻害剤の構造式としては、
0006382194.tif 000038
が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
他のＦＧＦＲ阻害剤としては、
0006382194.tif 000039
が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
本発明に有用なＦＧＦＲ融合分子阻害剤の構造式としては、ＴＡＣＣ阻害剤ＫＨＳ１０１
0006382194.tif 000040
が挙げられるがこれらに限定されない。
［評価および治療的処置］
【０１２７】
本発明は、対象において固形腫瘍の成長を減少させる方法を提供する。腫瘍は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫と関連付けられるが、これらに限定されない。一実施形態では、方法は、対象から採取した試料においてＦＧＦＲ融合分子の存在を検出することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。更なる実施形態では、方法は、固形腫瘍のサイズを減少させる、有効量のＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む。
【０１２８】
本発明はまた、被験体において遺伝子融合関連の癌を治療または予防するための方法を提供する。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は上皮癌を含む。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。一部の実施形態では、上皮癌は、膀胱尿路上皮癌腫、乳癌腫、大腸癌、前立腺癌腫、肺扁平上皮癌腫、頭頸部扁平上皮癌腫、または記載の上皮癌の組み合わせを含む。一実施形態では、方法は、被験体から採取した試料におけるＦＧＦＲ融合分子の存在、遺伝子融合関連の癌を示している融合物の存在を検出すること、および遺伝子融合関連の癌に対する治療的処置を必要とする被験体にそれを投与することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。
【０１２９】
本発明はまた、ＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを構成的に活性化するポリペプチドと融合したＦＧＦＲタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含む融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させることを必要とする被験体において、それを行うための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、被験体から生体試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。一部の実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体と本発明の融合タンパク質の阻害剤との混合剤を含む治療量の組成物を、被験体に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、融合タンパク質発現レベルまたは活性を判定することを更に含む。別の実施形態では、方法は、融合タンパク質発現レベルまたは活性が、組成物の投与前の融合タンパク質発現レベルまたは活性と比較して減少しているかどうかを判定することにより、融合タンパク質の発現レベルまたは活性を減少させることを更に含む。一部の実施形態では、融合タンパク質はＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質である。
【０１３０】
主張する方法の各々における投与ステップは、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤（例えば、ＦＧＦＲ融合分子に特異的に結合する抗体またはそのフラグメント、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子、ＦＧＦＲ融合分子の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ、ＦＧＦＲ融合分子をコードする遺伝子を特異的に標的にするｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物）などの薬物投与を含んでもよい。一実施形態では、投与する治療用分子は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１のアミノ酸配列を含むＦＧＦＲ融合分子のポリペプチドを含み、そのようなタンパク質の発現を減少させる機能を呈することによって、遺伝子融合関連の癌を治療する。別の実施形態では、治療用分子の投与は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫と関連付けられる固形腫瘍のサイズを減少させる。
【０１３１】
別の実施形態では、投与する治療用分子は、ＦＧＦＲ融合分子を含むヒト核酸配列に向けられるｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５のうちのいずれの１つにも向けられる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１〜７７、８０〜８２、８４〜１４４、または１４５のうちのいずれの１つにも向けられる。更なる実施形態では、投与される治療用分子は、配列番号７９、８８、１５０、１５８〜１６０、または１６１に対する抗体またはその結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、投与される治療用分子は、ＡＺＤ４５４７、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８、ＰＤ１７３０７４、ＮＦ４４９、ＴＫ１２５８、ＢＩＢＦ−１１２０、ＢＭＳ−５８２６６４、ＡＺＤ−２１７１、ＴＳＵ６８、ＡＢ１０１０、ＡＰ２４５３４、Ｅ−７０８０、またはＬＹ２８７４４５５などの、ＦＧＦＲタンパク質に特異的に結合する小分子を含む。他の実施形態では、投与される治療用分子は、ＫＨＳ１０１などの、ＴＡＣＣタンパク質に特異的に結合する小分子を含む。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、所与の染色体座標での染色体再構成の検出を提供する。別の実施形態では、検出または判定は、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。
【０１３３】
一実施形態では、生体試料は、神経細胞、血清、骨髄、血液、末梢血、リンパ節、脳脊髄液、尿、唾液試料、口腔スワブ、血清試料、痰試料、涙液分泌物試料、精液試料、膣分泌物試料、胎児組織試料、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１３４】
ＦＧＦＲ融合分子、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、または任意の他のＦＧＦＲと、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、ＴＡＣＣ３、または任意の他のＴＡＣＣとの間の融合は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドレベルで判定できる。任意に、検出は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、確認に基づくアッセイ（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）、ハイブリッド形成アッセイ、配列決定アッセイ、対立遺伝子特異的増幅アッセイ、ミクロ配列決定アッセイ、融解曲線解析、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）アッセイ（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．，１０６（６）：６６３−８を参照）、またはそれらの組み合わせを行うことによって判定できる。一実施形態では、検出は、ＦＧＦＲ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、もしくは他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸、または、ＦＧＦＲ１、ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２、ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、もしくは他のＦＧＦＲもしくはＴＡＣＣ核酸）の全てもしくは一部分を配列決定することによって、またはＦＧＦＲ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、もしくは他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸、または、ＦＧＦＲ１、ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２、ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、もしくは他のＦＧＦＲもしくはＴＡＣＣ核酸）の全てもしくは一部分の選択的ハイブリッド形成もしくは増幅によって行われる。ＦＧＦＲ融合分子特異的増幅（例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸特異的増幅）は、融合特定ステップの前に実行できる。
【０１３５】
本発明は、遺伝子融合関連の癌に苦しむ被験体において染色体改変を検出する方法を提供する。一実施形態では、染色体改変は、本明細書に記載のインフレームの融合した転写産物、例えばＦＧＦＲ融合分子である。一部の実施形態では、染色体改変は、染色体転座、例えばＦＧＦＲ融合分子である。ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸などのＦＧＦＲ融合分子で占められる染色体領域における改変は、遺伝子座のコードならびに／または非コード領域における、任意の形態の、突然変異（複数可）、欠失（複数可）、再構成（複数可）、および／もしくは挿入の単独または様々な組み合わせ（複数可）であってもよい。突然変異は点突然変異を含み得る。挿入は、遺伝子座のコードまたは非コード部分における１個または複数の残基の添加を含み得る。挿入は、遺伝子座における１〜５０個の塩基対の添加を含み得る。欠失は、２個の残基から全遺伝子または遺伝子座までなど、遺伝子座のコードまたは非コード部分における１個、２個、またはそれ以上の残基のいずれの領域をも含み得る。欠失は、約５０個未満の連続した塩基対の、ドメイン（イントロン）または反復配列またはフラグメントなどのより小さい領域に影響し得るが、より大きい欠失も生じ得る。再構成は配列の逆位を含む。ＦＧＦＲ融合分子、例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸で占められる染色体領域における改変は、アミノ酸置換、ＲＮＡスプライスもしくは処理、産生物の不安定性、終止コドンの創出、発癌性融合タンパク質の産生、フレームシフト突然変異、および／または短縮ポリペプチド産生をもたらし得る。改変は、改変した機能、安定性、標的化、または構造を持つ、ＦＧＦＲ融合分子、例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸によってコードされるものの産生をもたらし得る。改変はまた、タンパク質発現における還元、または更に増加をも引き起こし得る。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子で占められる染色体領域における改変は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物などのＦＧＦＲ融合分子の産生をもたらす、染色体再構成を含んでもよい。この改変は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドレベルで判定できる。別の実施形態では、検出または判定は、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。一実施形態では、ＦＧＦＲ１転座を含む座標は、８番染色体３８，２６８，６５６〜３８，３２５，３６３を含む。別の実施形態では、ＦＧＦＲ２転座を含む座標は、１０番染色体１２３，２３７，８４４〜１２３，３５７，９７２を含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ３転座を含む座標は、４番染色体１，７９５，０３９〜１，８１０，５９９を含む。また別の実施形態では、ＦＧＦＲ４転座を含む座標は、５番染色体１７６，５１３，９２１〜１７６，５２５，１２６を含む。一実施形態では、ＴＡＣＣ１転座を含む座標は、８番染色体３８，６４４，７２２〜３８，７１０，５４６を含む。別の実施形態では、ＴＡＣＣ２転座を含む座標は、１０番染色体１２３，７４８，６８９〜１２４，０１４，０５７を含む。更なる実施形態では、ＴＡＣＣ３転座を含む座標は、４番染色体１，７２３，２１７〜１，７４６，９０５を含む。
【０１３６】
本発明は、遺伝子融合関連の癌を治療することを必要とする被験体においてそれを行うための方法を提供する。一実施形態では、方法は、被験体においてＦＧＦＲ融合分子の発現のレベルを判定するために、被験体から試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。別の実施形態では、検出または判定は、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。一部の実施形態では、方法は、被験体の発現パターンに基づいて、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを更に含む。更なる実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は上皮癌を含む。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。一部の実施形態では、上皮癌は、膀胱尿路上皮癌腫、乳癌腫、大腸癌、前立腺癌腫、肺扁平上皮癌腫、頭頸部扁平上皮癌腫、または記載の上皮癌の組み合わせを含む。
【０１３７】
一実施形態では、本発明は、被験体、例えば遺伝子融合関連の癌に苦しむ被験体においてＦＧＦＲ融合分子の改変したＲＮＡ発現の存在を検出する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体においてＦＧＦＲ融合分子の存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、被験体がＦＧＦＲ融合分子を発現するかどうかを判定するために、被験体から試料を採取することを含む。一部の実施形態では、試料を、抗体、プローブ、核酸プライマーなどの、ＦＧＦＲ融合分子と結合する作用剤を用いてインキュベートする。他の実施形態では、検出または判定は、核酸配列決定、選択的ハイブリッド形成、選択的増幅、遺伝子発現解析、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、検出または判定は、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、または他の抗体検出方法による、タンパク質発現解析を含む。一部の実施形態では、方法は、被験体の発現パターンに基づいて、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を投与するかどうかを評価することを更に含む。更なる実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を被験体に投与することを含む。改変したＲＮＡ発現としては、改変したＲＮＡ配列の存在、改変したＲＮＡスプライスもしくは処理の存在、または改変した量のＲＮＡの存在が挙げられる。これらは、全てもしくは一部のＲＮＡを配列決定すること、または全てもしくは一部のＲＮＡの選択的ハイブリッド形成もしくは選択的増幅を含む、当技術分野で公知の様々な技法によって検出できる。更なる実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸によってコードされるものなどのＦＧＦＲ融合分子の存在または発現を検出することを含み得る。改変したポリペプチド発現としては、改変したポリペプチド配列の存在、改変した量のポリペプチドの存在、または改変した組織分布の存在が挙げられる。これらは、配列決定および／または特異的リガンド（抗体など）との結合によるものを含む、当技術分野で公知の様々な技法によって検出できる。一実施形態では、検出することは、ノーザンブロット法、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５に向けられるリアルタイムＰＣＲおよびプライマー、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５を含むものなどのＦＧＦＲ融合分子を検出するためのハイブリッド形成、増幅、もしくは配列決定技法、またはそれらの組み合わせを使用することを含む。別の実施形態では、ＰＣＲプライマーは、配列番号１６２、１６３、１６４、または１６５を含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物などのＦＧＦＲ融合分子のスクリーニングに使用されるプライマーは、配列番号１６６、１６７、１６８、または１６９を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物のゲノム検出に使用されるプライマーは、配列番号１７０および１７１を含む。
【０１３８】
当技術分野で公知の様々な技法を使用して、ハイブリッド形成、配列決定、増幅、および／または特異的リガンド（抗体など）との結合を含むがこれらに限定されない、改変遺伝子もしくはＲＮＡ発現、もしくは核酸配列を検出または定量化することができる。他の好適な方法としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、オリゴヌクレオチドライゲーション、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット法（対ＤＮＡ）、ノーザンブロット法（対ＲＮＡ）、１本鎖立体配座解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光インシツハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、固定変性ゲル電気泳動法、変性ＨＬＰＣ、融解曲線解析、ヘテロ２本鎖解析、リボヌクレアーゼ保護、化学的または酵素的ミスマッチ開裂、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が挙げられる。
【０１３９】
これらの手段のうちの一部（ＳＳＣＡおよび一定勾配ゲル電気泳動（ＣＧＧＥ）など）は、改変配列の存在に起因する、核酸の電気泳動移動度における変化に基づく。これらの技法に従うと、改変配列は、ゲル上の移動度における変動によって可視化される。次にフラグメントを配列決定して、改変を確認する。一部の他の手段は、被験体からの核酸と、野生型または改変遺伝子もしくはＲＮＡに特異的なプローブとの間の特異的ハイブリッド形成に基づく。プローブは、懸濁液中にあるか、基質上に固定され得る。プローブを標識化することで、ハイブリッドの検出を促進できる。これらの手段の一部、例えば、ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ、およびＲＩＡは、ポリペプチドの配列または発現レベルを評価するのに適している。これら後者には、ポリペプチドに特異的なリガンドの使用、例えば特異的抗体の使用が求められる。
【０１４０】
ハイブリッド形成。ハイブリッド形成検出方法は、核酸配列改変（複数可）を検出する役割を果たす相補的核酸配列間の特異的なハイブリッドの形成に基づく。検出技法は、野生型または改変遺伝子もしくはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、続くハイブリッドの存在の検出を伴う。プローブは、懸濁液中にあるか、基質または支持物上に固定され得る（例えば、核酸アレイまたはチップ技術におけるように）。プローブを標識化することで、ハイブリッドの検出を促進できる。一実施例では、本発明に従うプローブは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５に向けられる核酸を含み得る。例えば、被験体からの試料を、ＦＧＦＲ融合分子をコードする遺伝子に特異的な核酸プローブと接触させてもよく、続いてハイブリッドの形成を評価してもよい。一実施例では、方法は、試料を、ＦＧＦＲ融合分子に特異的なプローブのセットと同時に接触させることを含む。また、様々な被験体からの様々な試料が、並行して研究され得る。
【０１４１】
本発明に従って、プローブは、ＦＧＦＲ融合分子に対応する遺伝子もしくはＲＮＡ、またはその標的化部分に相補的であり、かつそれと特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列であってもよい。有用なプローブは、遺伝子、ＲＮＡ、またはその標的化部分に相補的なものである。プローブは、８〜１０００ヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜８００、１５〜７００、または２０〜５００の１本鎖核酸を含み得る。より長いプローブも使用できる。本発明の有用なプローブは、ＦＧＦＲ融合分子に対応する遺伝子またはＲＮＡの領域と特異的にハイブリッド形成できる、８〜５００ヌクレオチドの長さの１本鎖核酸分子である。
【０１４２】
プローブの配列は、本明細書で提供されるＦＧＦＲ融合遺伝子の配列に由来し得る。ヌクレオチド置換、およびプローブの化学修飾を行うことができる。そのような化学修飾は、ハイブリッド（例えばインターカレート基）の安定性を増大させるため、またはプローブを標識化するために、達成され得る。標識の一部の例としては、放射能、蛍光、発光、および酵素標識化が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
核酸のハイブリッド形成に対する手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９３中に見出される。
【０１４４】
配列決定。配列決定は、自動シーケンサーを使用する当技術分野で公知の技法を使用して、実行できる。配列決定は、完全体のＦＧＦＲ融合分子上、またはその特異的ドメイン上に行うことができる。
【０１４５】
増幅。増幅は、核酸繁殖を開始させる役割を果たす相補的核酸配列間の特異的なハイブリッドの形成に基づく。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によってなど、当技術分野で公知の様々な技法に従って行うことができる。これらの技法は、市販の試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。当技術分野における有用な技法は、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、またはＰＣＲベース１本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）を含む。増幅は通常、反応を開始させるために、特異的核酸プライマーの使用を必要とする。例えば、ＦＧＦＲ融合分子に対応する配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、遺伝子座の標的化領域の側面に位置する遺伝子座の一部分と特異的にハイブリッド形成できる。一実施例では、増幅は、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５に向けられる、正方向および逆方向ＰＣＲプライマーを使用することを含む。ＦＧＦＲ融合分子（例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸）から配列を増幅させるために有用な核酸プライマーであるプライマーは、ＦＧＦＲ融合分子の一部分と特異的にハイブリッド形成する。特定の被験体においては、ＦＧＦＲ融合分子の存在は、遺伝子融合関連の癌を持つ被験体に一致する。一実施例では、増幅は、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、または１４５のヌクレオチド配列を含む、正方向および逆方向ＰＣＲプライマーを使用することを含み得る。
【０１４６】
非限定的な増幅方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０、およびＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１９９５，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７）、転写増幅（Ｋｗｏｈ（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：１１７３）、および、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：１８７４）、Ｑベータレプリカーゼ増幅（Ｓｍｉｔｈ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−１４９１）、自動Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １０：２５７−２７１）、および他のＲＮＡポリメラーゼの媒介による技法（例えば、ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ、また、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４を参照）が挙げられる。上で述べた全ての参照は、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１４７】
本発明は、核酸プライマーであって、遺伝子融合関連の癌を有する特定の被験体において、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）などのＦＧＦＲ融合分子の一部分に相補的であり、かつそれと特異的にハイブリッド形成し得るプライマーを提供する。一実施形態では、遺伝子融合関連の癌は、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫を含む。本発明のプライマーは、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の融合配列に特異的であり得る。そのようなプライマーを使用することによって、増幅産生物の検出は、ＦＧＦＲ１とＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２とＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３とＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ核酸とＴＡＣＣ核酸との融合物の存在を示す。本発明のプライマーの例は、約５〜６０ヌクレオチドの長さ、または約８〜約２５ヌクレオチドの長さの１本鎖核酸分子であってもよい。配列は、ＦＧＦＲ融合分子、例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ核酸の配列に直接由来できる。完全な相補性は高特異性を確実にするために有用であるが、特定のミスマッチは許容され得る。例えば、上で説明した通りの核酸プライマーまたは核酸プライマーの対は、被験体中で遺伝子融合関連の癌の存在を検出するための方法において使用できる。一実施形態では、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５、またはそれらの組み合わせを含むプライマーなどのプライマーは、ＦＧＦＲ融合分子を検出するために使用できる。別の実施形態では、ＰＣＲプライマーは、配列番号１６２、１６３、１６４、または１６５を含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物などのＦＧＦＲ融合分子のスクリーニングに使用されるプライマーは、配列番号１６６、１６７、１６８、または１６９を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物のゲノム検出に使用されるプライマーは、配列番号１７０および１７１を含む。
【０１４８】
特異的リガンド結合。本明細書で考察されるとおり、ＦＧＦＲ融合分子またはＦＧＦＲ融合分子の発現をコードする核酸も、それによってコードされるポリペプチドの配列または発現レベルにおける改変（複数可）に対するスクリーニングによって検出できる。特異的抗体などの、異なる型のリガンドが使用できる。一実施形態では、試料をＦＧＦＲ融合分子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、その後、免疫複合体の形成を判定する。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などの、免疫複合体を検出するための様々な方法が使用できる。
【０１４９】
例えば、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および実質的に同一の抗原特異性を有するそれらのフラグメントまたは誘導体であり得る。フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、またはＣＤＲ領域が挙げられる。誘導体としては、１本鎖抗体、ヒト化抗体、または多官能性抗体が挙げられる。ＦＧＦＲ融合分子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体は、そのようなポリペプチドと選択的に結合する抗体であり得る。一実施形態では、抗体を、ＦＧＦＲ融合分子（ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物など）によってコードされるポリペプチド、またはそのエピトープ含有フラグメントに対して産生する。他の抗原への非特異的結合は起こり得るが、標的ポリペプチドとの結合は、より高い親和性を伴って起こり、非特異的結合から容易に識別できる。一実施形態では、方法は、被験体からの試料をＦＧＦＲ融合分子に特異的な抗体と接触させること、および免疫複合体の存在を判定することを含み得る。任意に、試料は、ＦＧＦＲ融合分子に特異的な抗体で被膜された支持物に接触させることができる。一実施形態では、試料は、同時に、または並行して、または連続的に、異なる形態のＦＧＦＲ融合分子、例えば、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、または他のＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物に特異的な様々な抗体と接触させることができる。
【０１５０】
本発明はまた、ＦＧＦＲ融合分子の存在を被験体からの試料中で検出するための産生物および試薬を含む診断キットを提供する。キットは、被験体からの試料がＦＧＦＲ融合分子の発現の増大または減少を呈するかどうかを判定するのに有用であり得る。例えば、本発明に従う診断キットは、任意のプライマー、プライマーの任意の対、任意の核酸プローブ、および／もしくは任意のリガンド、またはＦＧＦＲ融合分子に特異的に向けられた任意の抗体を含む。本発明に従う診断キットは、ハイブリッド形成、増幅、または抗原抗体間免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコールを更に含み得る。一実施形態では、キットは、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５、またはそれらの組み合わせを含むＦＧＦＲ融合分子と特異的にハイブリッド形成し、ＦＧＦＲ融合分子からのポリメラーゼ反応を刺激し得る、核酸プライマーを含んでもよい。一実施形態では、配列番号８０〜８２、８４、９４〜１４４、もしくは１４５、またはそれらの組み合わせに向けられたプライマーなどのプライマーは、ＦＧＦＲ融合分子を検出するために使用できる。別の実施形態では、ＰＣＲプライマーは、配列番号１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、または１６９を含む。更なる実施形態では、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物などのＦＧＦＲ融合分子のスクリーニングに使用されるプライマーは、配列番号１６６、１６７、１６８、または１６９を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物のゲノム検出に使用されるプライマーは、配列番号１７０および１７１を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号７９、８５〜８９、１５０、１５８〜１６０、または１６１を含むＦＧＦＲ融合分子に特異的に結合する抗体であって、ＦＧＦＲ融合分子が存在する場合にのみタンパク質を認識する抗体を含む。
【０１５１】
診断方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。これらの方法は、被験体からの試料を利用して、ＦＧＦＲ融合分子の状態を評価する。試料は、核酸またはポリペプチドを含有する被験体由来のいかなる生体試料であってもよい。そのような試料の例としては、体液、組織、細胞試料、臓器、および組織生検が挙げられるがこれらに限定されない。試料の非限定的な例としては、血液、肝臓、血漿、血清、唾液、尿、または精液が挙げられる。試料は、従来技法に従って採取され、診断または保管のために直接使用できる。方法を行う前に試料を処理することで、試験に対する核酸またはポリペプチドの可用性を授けるまたは向上させることができる。処理としては、例えば、溶解（例えば、機械的、物理的、または化学的）、遠心分離が挙げられる。核酸および／またはポリペプチドは、従来技法によって事前精製もしくは濃縮でき、および／または複雑性を減少できる。核酸およびポリペプチドはまた、酵素または他の化学的もしくは物理的処処理を用いて処理して、そのフラグメントを産生し得る。一実施形態では、試料を、プローブ、プライマー、またはリガンドなどの試薬と接触させて、ＦＧＦＲ融合分子の存在を評価する。接触させることは、平板、管、ウェル、またはガラスなどの任意の好適な道具中で行うことができる。一部の実施形態では、接触させることは、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイなどの、試薬で被膜した基質上で行う。基質は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、またはポリマーを含む任意の支持物などの、固形または半固形基質であり得る。基質は、膜、玉、柱状、またはゲルなどの、様々な形態およびサイズであり得る。接触させることは、複合体が、試薬と試料の核酸またはポリペプチドとの間に形成されるのに好適ないかなる条件下でも成し得る。
［核酸送達方法］
【０１５２】
生存細胞への核酸の送達は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはレトロウイルス）などのベクターの使用によって、エクスビボ、インサイツ、もしくはインビボで、または物理的なＤＮＡ移入方法（例えば、リポソームもしくは化学処理）の使用によってエクスビボで、もたらし得る。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の移入に好適である非限定的な技法としては、リポソーム、電気泳動法、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿法が挙げられる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ３９２（６６７９）：２５（）を参照）。核酸、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の導入も、染色体外基質（一過性発現）または人工染色体（安定発現）を用いて達成できる。また、細胞を本発明の治療用組成物の存在化でエクスビボで培養して、そのような細胞に対する所望の効果、またはそのような細胞中の活性を急増または産生させ得る。処理した細胞は、その後、治療目的でインビボで導入できる。
【０１５３】
核酸は、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用できる。多数のウイルスが遺伝子移入ベクターとして使用されており、それらは、パポバウイルス、例えば、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ  ６）：１５３３−６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６；Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６（７）：６１６−２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ  ａｎｄ  Ｋａｐｉｋｉａｎ（１９９２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６（７）：４４０７−１２；Ｑｕａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８９（７）：２５８１−４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ．６８（１）：１４３−５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（９）：２２３３−９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１（３）：２４１−５６）、ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（５）：５１８−２２）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｏｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ．８９（２）：２７９−８２）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：６７−９５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２（１−３）：９５−１０２；Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（１）：１１−９；Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１（４）：３３９−７１；Ｆｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０（１０）：２１８９−９９）、ならびに鳥類のレトロウイルス（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（４）：７４９−５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６（６）：３３９１−７）、マウス（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（７）：３２６２−７２；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５５（３）：５２１−６；Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（９）：１７３０−７；Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５４（２）：４０１−７；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６２（１１）：４３３７−４５）、およびヒト由来（Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８８（３）：１０４３−７；Ｈｅｌｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６４（１２）：６３１４−８；Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｖｉｒｏ��．６４（１１）：５２７０−６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ（１９９２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：２７３１−９）を含む。
【０１５４】
インビボでの遺伝子移入技法の非限定的な例としては、ウイルス（例えばレトロウイルス）ベクターを用いたトランスフェクション（その全体が参照によって組み込まれる米国特許第５，２５２，４７９号を参照）、およびウイルス外被タンパク質リポソーム媒介トランスフェクション（参照によって全体が組み込まれるがＤｚａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：２０５−２１０）が挙げられる。例えば、裸のＤＮＡのワクチンが、概して当技術分野で公知である。その全体が参照によって組み込まれる、Ｂｒｏｗｅｒ，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１３０４−１３０５を参照されたい。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照）、被験体に与えることができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むか、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる持続放出マトリクスを含み得る。代替的に、完全な遺伝子送達ベクターが、組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含んでもよい。
【０１５５】
核酸送達プロトコールおよび方法のレビューについては、全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３、米国特許第５，２５２，４７９号、第５，７４７，４６９号、第６，０１７，５２４号、第６，１４３，２９０号、第６，４１０，０１０号、第６，５１１，８４７号、および米国出願公開第２００２／００７７３１３号を参照されたい。追加的なレビューについては、全てその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１、Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）、Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０、Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．５０（２）：８７−９８、Ｉｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．４（５）：５６１−７１、Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（４）：２７２−８３、Ｗａｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．８（８）：５７３−８７、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｎ  Ｍｅｄ．３９（２）：１０８−１５、Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（２）：９９−１０７、Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １０（１）：３４−６４、およびＡｌｔａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１９３−２６０を参照されたい。
【０１５６】
ＦＧＦＲ融合核酸はまた、放出制御システムにおいて送達され得る。例えば、ＦＧＦＲ融合分子は、静脈内注射、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮貼布、リポソーム、または投与の他の様式を使用して投与できる。一実施形態では、ポンプが使用できる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。別の実施形態では、ポリマー物質が使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，（１９８３）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照、また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照）。また別の実施形態では、放出制御システムは、治療標的付近に置くことができるため、ごく少量の全身投与量しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照）。他の放出制御製システムは、Ｌａｇｎｅｒによるレビュー中で考察される（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２７−１５３３）。
［治療のための医薬組成物および投与］
【０１５７】
本発明の阻害剤は、投与に好適な医薬組成物、例えば、阻害剤、および薬学的に許容される担体に組み込むことができる。
【０１５８】
本発明のＦＧＦＲ融合分子または阻害剤は、１回（例えば、単回の注射または沈着として）被験体に投与できる。代替的にＦＧＦＲ融合分子または阻害剤は、約２〜約２８日間、または約７〜約１０日の間、１日１回または２回、それを必要とする被験体に投与できる。ＦＧＦＲ融合分子または阻害剤はまた、１年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはそれらの組み合わせの間、１日１回または２回、被験体に投与できる。その上、本発明のＦＧＦＲ融合分子または阻害剤は、別の治療薬と併用投与できる。投薬計画が複数回の投与を含む場合、被験体に投与するＦＧＦＲ融合分子または阻害剤の有効量は、投薬計画全体にわたって投与する遺伝子産生物の総量を含み得る。
【０１５９】
ＦＧＦＲ融合分子または阻害剤は、癌細胞、例えば、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫などの被験体の細胞にＦＧＦＲ融合分子または阻害剤を送達するのに好適な任意の手法によって、被験体に投与できる。例えば、ＦＧＦＲ融合分子または阻害剤は、細胞をトランスフェクトするのに好適な方法によって投与できる。真菌細胞のためのトランスフェクション方法は、当技術分野で公知であり、細胞の核または前核への核酸の直接注射、電気泳動法、リポソーム移入または親油性物質により媒介される移入、受容体媒介核酸送達、生物弾道（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または粒子加速、リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターにより媒介されるトランスフェクションを含む。
【０１６０】
本発明の組成物を製剤化および投与して、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、ネコ、またはウマ）などの被験体の体内で作用剤の作用部位との活性成分の接触を生み出す任意の手法によって、遺伝子融合関連の癌、例えば、多形性膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、または大腸癌腫と関連付けられる症状を緩和することができる。それらは、医薬品と併せての使用に対して利用可能な任意の従来手法によって、個々の治療用活性成分としてか、治療用活性成分の組み合わせにおいてかのどちらかで、投与できる。それらは単独で投与できるが、概して、選んだ投与経路、および標準的な薬務に基づいて選択した薬学的担体と共に投与する。
【０１６１】
ＦＧＦＲ融合分子または阻害剤の治療的に有効な投与量は、当業者に公知の多数の因子に依存し得る。ＦＧＦＲ融合分子阻害剤の投与量は、例えば、同一性、サイズ、および治療する被験体または試料の状態に応じて、更に、該当する場合には組成物を投与する経路、および、施術者が所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対するＦＧＦＲ融合分子阻害剤が有する効果に応じて、異なってもよい。当業者は、これらの量を容易に決定できる。本明細書に記載の治療的適用のうちのどれもが、そのような治療を必要とするいかなる被験体、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトなどの哺乳類にも適用できる。
【０１６２】
本発明に従う使用のための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来的なやり方で製剤化できる。本発明の治療用組成物は、全身および局所または限局投与を含む様々な投与経路のために製剤化してもよい。技法および製剤化は、概して、その全開示が参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（２０ｔｈ  Ｅｄ．，２０００）中に見出され得る。全身投与に対しては、筋内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が有用である。注射に対しては、本発明の治療用組成物は、液状溶液、例えば、ハンクス溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性のある緩衝液中で製剤化できる。加えて、治療用組成物は、固形状で製剤化でき、使用の直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形態も含まれる。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり発熱物質がないことを特徴とする。これらの医薬製剤化は、ヒトおよび動物への使用のための製剤化を含む。
【０１６３】
本発明に従って、薬学的に許容される担体は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含み得る。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は、当技術分野で公知である。活性化合物に適合する任意の従来型媒体または作用剤が使用できる。補助的活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０１６４】
ＦＧＦＲ融合分子阻害剤を含有する医薬組成物は、本明細書で考察される治療的効果のうちのいずれのためにも、薬学的に許容される担体と併せて投与できる。そのような医薬組成物は、例えば、ＦＧＦＲ融合分子に向けられる抗体もしくはその変異体、またはＦＧＦＲ融合分子の拮抗薬を含んでもよい。組成物は、単独で、または、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、および水を含むがこれらに限定されないいかなる無菌の生体適合性のある薬学的担体においても投与できる、安定化化合物などの、少なくとも１つの他の作用剤との組み合わせで投与できる。組成物は、単独で、または他の作用剤、薬剤、またはホルモンとの組み合わせで、投与できる。
【０１６５】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、本明細書で列挙される成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中にＦＧＦＲ融合分子阻害剤（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を必要量で組み込むこと、続いて濾過滅菌することによって、調製できる。概して、分散は、塩基分散、および本明細書で列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する、無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製できる。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、有用な調製方法の例は真空乾燥および凍結乾燥であり、それは、活性成分に加えて、予め無菌濾過したその溶液からの任意の追加的な所望の成分の粉末をもたらす。
【０１６６】
一部の実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子阻害剤は、経皮吸収のために活性化合物を徐々に放出する経皮送達システムを介して適用できる。透過促進剤を使用して、馴化培地における活性因子の経皮浸透を促進できる。経皮貼布は、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、および米国特許第４，９２１，４７５号で説明される。
【０１６７】
「皮下」投与は、皮膚の真下（すなわち、真皮の下）への投与を指してもよい。概して、皮下組織は、脂肪と、より大きい血管および神経を収納する結合組織との層である。この層のサイズは、体中で、および人によって、異なる。皮下層と筋層との間の界面は、皮下投与によって含むことができる。この投与様式は、組成物中に存在する因子が投与部位から移動または拡散できるように、皮下層が十分に薄い場合に実行可能であり得る。故に、皮内投与を利用する場合、投与する組成物のボーラス投与は皮下層付近に限局する。
【０１６８】
細胞凝集体（ＤＰまたはＤＳ凝集体など）の投与は、単独の経路に限定されず、複数の経路による投与を含んでもよい。例えば、例示的な複数の経路による投与としては、数ある中でも、皮内および筋内投与、または皮内および皮下投与の組み合わせが挙げられる。複数の投与は、連続的または同時的であってもよい。複数経路による他の適用様式は、当業者にとって明らかとなるであろう。
【０１６９】
他の実施形態では、この実施方法は、一部の被験体に対しては１回限りの処置となる。本発明の更なる実施形態では、複数の細胞療法移植が必要とされる。一部の実施形態では、移植に使用する細胞は、概して、被験体に特異的な遺伝子操作された細胞である。別の実施形態では、異なる種、または同種の別の個体から採取した細胞を使用してもよい。故に、そのような細胞の使用は、免疫抑制剤を投与して移植細胞の拒絶反応を防ぐことを必要とし得る。そのような方法はまた、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４１９，６６１号およびＰＣＴ出願国際公開第２００１／３２８４０号に記載されている。
【０１７０】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸引または摂取）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る。注射のための水など無菌希釈剤、無菌溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン４酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの、張性を調整するための作用剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの、酸または塩基を用いて調整できる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアル中に封入できる。
【０１７１】
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性である）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与に対して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および保管条件下で安定しており、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、薬学的に許容されるポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶剤または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが有用であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによって、もたらすことができる。
【０１７２】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、本明細書で列挙される成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶剤中に本発明の阻害剤（例えば、ポリペプチドもしくは抗体、または小分子）を必要量で組み込むこと、続いて濾過滅菌することによって、調製できる。概して、分散は、塩基分散、および本明細書で列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する、無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製できる。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、有用な調製方法の例は真空乾燥および凍結乾燥であり、それは、活性成分に加えて、予め無菌濾過したその溶液からの任意の追加的な所望の成分の粉末をもたらす。
【０１７３】
経口組成物としては、概して、不活性希釈液または可食性担体が挙げられる。それらは、ゼラチンカプセル剤に封入できるか、あるいは錠剤に圧縮できる。経口治療的投与の目的で、活性化合物は、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用できる。経口組成物はまた、液体担体を使用して調製でき、その後嚥下することができる。
【０１７４】
薬学的に相溶性のある結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、または類似の性質を持つ化合物のうちのいかなるものも含有することができる。微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤；もしくはハッカ、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの香味剤。
【０１７５】
また、全身投与は、経粘膜的または経皮的手法によることができる。経粘膜または経皮投与に対しては、バリアを通過するのに適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は、概して当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の使用によって達成できる。経皮投与に対して、活性化合物は、概して当技術分野で公知のように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１７６】
一部の実施形態では、投与されるＦＧＦＲ融合分子阻害剤の有効量は、少なくとも約０．０００１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０００７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．００７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８，０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９，５００μｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約１０，０００μｇ／ｋｇ体重である。
【０１７７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および物質が以下で説明されるが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および物質も、本発明の実践または試験で使用することができる。
【０１７８】
本明細書で言及される全ての出版物および他の参照文献は、各個別の出版物または参照文献が、その全体が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別的に示された場合と同程度に、その全体が参照によって組み込まれる。本明細書で引用される出版物および参考文献は、先行技術とは認められない。
【実施例】
【０１７９】
実施例を、本発明のより完全な理解を促進するために、以下に提供する。次の実施例は、本発明の作製および実践の例示的な様式を解説する。しかしながら、代替的方法を利用して同様の結果を得ることができるため、本発明の範囲は、これらの実施例において開示される具体的な実施形態には限定されず、それらは例解目的に過ぎない。
【０１８０】
実施例１：膠芽腫におけるＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子の形質転換および反復性融合物
【０１８１】
成功を収めた癌の標的化療法の経歴は、血液悪性腫瘍における、および最近では上皮癌の一部の型における、反復性、発癌性、および依存性遺伝子融合物の不活性化と大きく符号する。多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、ヒト癌の中で最も致死的な形態の１つである。ここでは、ＲＮＡ塩基配列解読からのインフレームの融合転写産物、および全エキソーム配列からのゲノム融合の検出に対する、統合的な遺伝子融合物発見パイプラインを開発した。ＦＧＦＲ遺伝子（ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ３）のチロシンキナーゼドメインをそれぞれＴＡＣＣ１またはＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインにインフレームで融合させる、ヒトＧＢＭへのパイプラインの適用は、反復性染色体転座を解明した。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の頻度は、ＧＢＭ９７個のうち３個である（３．１％）。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、星状膠細胞に導入されるか、レンチウイルスの媒介による成熟マウス脳への定位送達によって形質転換されるときに、強い発癌活性を示す。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、有糸分裂紡錘体極上に不正に限局し、構成的なチロシンキナーゼ活性を有し、有糸分裂進行の遅延をもって有糸分裂周期を調節不全にする。有糸分裂忠実度の障害は、染色分体接着欠損、紡錘体チェックポイント活性化不良、染色体不分離、および激しい異数性を引き起こす。ＦＧＦＲキナーゼの阻害は異数性を是正し、臨床研究中である特異的ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の経口投与は、腫瘍成長を停止させ、頭蓋内のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって開始された神経膠腫を宿すマウスの生存期間を延長する。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、ＦＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の標的化阻害の恩恵を受け得る一部のＧＢＭ患者を特定する。
【０１８２】
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、ヒトにおいて治療することが最も難しい形態の癌の１つである（Ｏｈｇａｋｉ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｈｕｅｓ，２００５）。今までのところ、ＧＢＭにおける重要である可能性のある発癌駆動体に対して試験された標的化治療手段は、ある程度しか成功していない（Ｌｏ，２０１０、Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。発癌性融合タンパク質の産生につながる反復性染色体転座は、ヒト癌の病因における起因および依存事象と見られており、それ故、癌治療のための最も望ましい分子標的を提供する（Ａｂｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍｉｔｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。反復性および発癌性遺伝子融合物をもたらす染色体再構成は血液悪性腫瘍の特徴であり、最近それらは一部の固体腫瘍（乳癌腫、前立腺癌腫、肺癌腫、および大腸癌腫）中でも発見されているが、それらはＧＢＭにおいては見出されていない（Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｐｒｅｎｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，２００９）。腫瘍がこれらの再構成を持つ患者のための重要かつ成功している標的化療法的介入は、特に転座がキナーゼをコードする遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ）に関与する場合の、機能遺伝子融合物の発見から派生した（Ｄｒｕｋｅｒ，２００９、Ｇｅｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，２０１０）。
【０１８３】
ＧＢＭの特徴は、異数性につながる激しい染色体不安定性（ＣＩＮ）である（Ｆｕｒｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＣＩＮおよび異数性は、癌の病因における初期事象である（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。有糸分裂の忠実度を標的にする遺伝子改変が、異数性を引き起こす有糸分裂中の染色体の不分離の原因である可能性があるということが提案されている（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ここでは、ヒトＧＢＭにおける反復性および発癌性遺伝子融合の第１の事例を説明する。もたらされる融合タンパク質は、有糸分裂細胞に限局し、染色体分離の正常な制御を妨害し、異数性を誘導する。ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療方針は、これらの染色体再構成を宿すＧＢＭ患者の標的化療法に対しても報告されている。
【０１８４】
ＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子の反復性融合物の特定。機能性融合タンパク質を生成し、かつ反復性である、ＧＢＭにおけるゲノム再構成を特定するために、発現される転写産物（ＲＮＡ塩基配列解読）の超並列対形成末端配列決定解析からインフレームの融合転写産物として発見された遺伝子対は、ヒトＧＢＭのゲノム解析からの融合遺伝子対としても明らかになり得る。この狙いのために、２つの相補的遺伝子融合物発見方法を考案し、２つのＧＢＭコホートに適用した。第１であるＴＸ−Ｆｕｓｅは、ＲＮＡ塩基配列解読から候補の融合転写物を発見するためのアルゴリズムである（図８）。第２であるＥｘｏｍｅ−Ｆｕｓｅは、全エキソームＤＮＡ配列からの融合遺伝子を検出する（図８）。融合転写物検出のための第１のステップとして、原発性ＧＢＭを持つ９人の患者から新たに単離した神経膠腫の幹様細胞（ＧＳＣ）の短期培養から、ＲＮＡ塩基配列解読データを生成した。無血清条件下での原発性ＧＢＭ腫瘍の培養は、その発達固有性を多分に失った血清培養した神経膠腫細胞系と比較すると、原発腫瘍プロファイルを厳密に映す表現型および遺伝子型を保持する細胞を選択する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。したがって、理論に束縛されるものではなく、通常はＧＢＭの最も攻撃的な特徴の原因である遺伝子融合物を神経膠腫が持つ場合、それらはＧＳＣ中で選択するべきである。ＲＮＡ塩基配列解読は、各ＧＳＣ培養に対して平均６０３０万個の対形成リードを生成し、そのうち８０％超が参照トランスクリプトームおよびゲノムにマップされた。ＴＸ−Ｆｕｓｅは、スプリットリードおよびスプリットインサートという２つの主要な証拠源を検出する（実験手順を参照）。９個のＧＳＣからのＲＮＡ塩基配列解読データセットへのＴＸ−Ｆｕｓｅの適用は、インフレームの融合転写物を生じさせる、５個の候補の再構成の発見に繋がった（その全ては染色体内であった）（表１）。
【０１８５】
【表１】
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【０１８６】
次に、ＴＣＧＡからの８４個のＧＢＭ試料からの対形成末端エキソームＤＮＡ配列のデータセットにＥｘｏｍｅ−Ｆｕｓｅを適用することによって、遺伝子融合物をもたらすゲノム再構成をＧＢＭ中で特定した（表２）。
【０１８７】
この解析によって、１４７個の対遺伝子融合を検出し、故に遺伝子融合事象は腫瘍ごとに平均１．７５個となる（表３）。
【０１８８】
遺伝子のＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ族を、ＦＧＦＲ再構成を宿す８個の腫瘍、およびＴＡＣＣ遺伝子に影響を及ぼす融合物を宿す７個の腫瘍を用いて、ゲノム融合物に反復的に関与するものの中でも著明に強化した（図１Ａ）。ＴＸ−ＦｕｓｅおよびＥｘｏｎ−Ｆｕｓｅの結果の比較解析によって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、ＴＸ−Ｆｕｓｅによるインフレーム転写産物、およびＥｘｏｍｅ−Ｆｕｓｅによるゲノム融合物のどちらとしても特定される唯一の融合対であることが明らかになった（表１、２、および３）。
【０１８９】
表２は、ＴＣＧＡからの８４個のＧＢＭのＥｘｏｍｅ−ｆｕｓｅ解析によって特定した反復性遺伝子融合物の融合切断点情報を示す。複数の接合が各融合候補中で存在し得るため、全ての切断点に対する情報を表示する。カラム定義としては、試料＝ＴＣＧＡ試料ＩＤ、正方向スプリットリード／逆方向スプリットリード／総スプリットリード（ｖｉｒｔＦｏｒＳｐｌｉｔＲｅａｄｓ／ｖｉｒｔＲｅｖＳｐｌｉｔＲｅａｄｓ／ｖｉｒｔＴｏｔＳｐｌｉｔＲｅａｄｓ）＝正方向／逆方向／総スプリットリード＃、スプリットインサート（ｓｐｌｉｔＩｎｓｅｒｔｓ）＝スプリットインサート＃、方向Ａ／方向Ｂ（ｄｉｒＡ／ｄｉｒＢ）＝遺伝子Ａ／Ｂにマップするスプリットリード部分の正（１）または逆（０）方向、方向ＡＢ＿メイト対（ｄｉｒＡＢ＿ｍａｔｅｐａｉｒ）＝スプリットリードのメイト対の方向、ｃｏｓｍｉｃＡ＋Ｂ＝ＣＯＳＭＩＣにおける遺伝子Ａ＋Ｂの記録された突然変異＃、を挙げる。
【表２】
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【表３】
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【０１９０】
上の表３は、ＴＣＧＡからのＧＢＭ８４個のＥｘｏｍｅ−ｆｕｓｅ解析からの反復性遺伝子融合対を示す。融合候補を、それらが少なくとも２つのスプリットインサート、および少なくとも２つのスプリットリードを有する場合に指名した。反復に対する一覧を更にフィルタリングするため、遺伝子のうちの１個が異なる試料にわたって少なくとも２個の融合物に関与する融合候補を留めた。
【０１９１】
ＴＸ−Ｆｕｓｅから明らかになった計算予測を実験的に立証するために、融合切断点をスパンするＰＣＲ産生物を配列決定し、５つのインフレーム融合予測の各々を立証した（図１および９）。図１Ｂで予測を示し、図１Ｃで、ＧＳＣ−１１２３におけるＴＡＣＣ３とのＦＧＦＲ３融合インフレームに関与する最高リードの支援による、融合物に対するｃＤＮＡ配列の立証を示す。同一のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合転写産物も、そこからＧＳＣ−１１２３培養を確立した原発性ＧＢＭ−１１２３腫瘍標本中で検出した（図１Ｃ）。増幅ｃＤＮＡは、残基５４９〜８３８のＴＡＣＣ３カルボキシ末端部分との残基１〜７５８のＦＧＦＲ３アミノ末端部分の融合によって生じた、１，０４８個のアミノ酸のタンパク質に対するオープンリーディングフレームを含有した（図１Ｄ）。ＦＧＦＲ３は、ＦＧＦリガンドとの結合後に細胞内シグナルを形質導入するＦＧＦＲ受容体チロシンキナーゼ（ＴＫ）族の仲間である（Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ，２０１０）。ＴＡＣＣ３は、ＴＡＣＣ１およびＴＡＣＣ２も含む、進化的に保存されたＴＡＣＣ遺伝子族に属する。ＴＡＣＣタンパク質の顕著な特徴は、ＴＡＣＣドメインとして知られる、Ｃ末端でのコイルドコイルドメインの存在である。ＴＡＣＣドメインを通して、ＴＡＣＣタンパク質は、中期中に有糸分裂紡錘体に限局し、微小管紡錘体ネットワークを安定化する（Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｒｏｙｌｅ，２０１１、Ｐｅｓｅｔ  ａｎｄ  Ｖｅｒｎｏｓ，２００８）。予測される融合タンパク質中で、ＦＧＦＲ３の細胞内ＴＫドメインを、ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインの上流に融合させた（図１Ｄ）。
【０１９２】
ＧＳＣ−１１２３におけるＲＮＡ塩基配列解読カバレッジからのエクソン特異的遺伝子発現解析によって、融合物に関与するＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３エクソンが、融合事象に含まれないｍＲＮＡ配列と比較して、高度に過剰発現することを実証した（図１０Ａ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、融合ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３エクソンの発現が、他のＧＳＣおよび正常な脳よりもＧＳＣ−１１２３において著しく高いことを示した（８０〜１３０倍、図１０Ｂ）。理論に束縛されるものではないが、機能的に重大な遺伝子再構成は、融合事象に関与する遺伝子の著明な過剰発現（外れ値）をもらたし得る（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質も、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学によって示される通り、ＧＳＣ−１１２３において、および原発腫瘍ＧＢＭ−１１２３において、多量に発現した（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。ウエスタンブロット上で、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質は〜１５０ｋＤのサイズで移動し、免疫沈殿、続く質量分析によって、ｃＤＮＡ翻訳予測と一致するＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３ペプチドの存在が明らかとなった（図１０Ｅ）。ＰＣＲを使用して、ゲノム切断点座標をＦＧＦＲ３エクソン１７およびＴＡＣＣ３イントロン７に入る４番染色体にマップすることで（ＦＧＦＲ３に対して＃１，８０８，９６６およびＴＡＣＣ３に対して＃１，７３７，０８０、ゲノムビルドＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）、その中で５’側ＦＧＦＲ３エクソン１６が３’側ＴＡＣＣ３エクソン８にスプライスされる転写産物を生じさせた。ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３のＤＮＡ接合は、ヒト癌中の他の染色体再構成に対して既に報告された結果と一致する観察結果である、１０塩基領域内のマイクロホモロジーを示す（Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）（図１Ｅ）。
【０１９３】
推測されるゲノム融合物の実験的立証は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３に集中した。Ｅｘｏｍｅ−Ｆｕｓｅによって、４個のＧＢＭ試料中で、ＦＧＦＲ３のイントロン１６（ＴＫドメインに対するコード領域の下流）およびＴＡＣＣ３のイントロン７〜１０（ＴＡＣＣドメインの上流）内で一定してスパンする切断点を持つＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を特定した（図２Ａ、表４および５）。４個の陽性ＴＣＧＡのＧＢＭ標本のうち２個が分子解析のためにＴＣＧＡ中心から利用可能であり（ＴＣＧＡ−２７−１８３５およびＴＣＧＡ−０６−６３９０）、サンガー配列決定によって、それらの各々が、予測ゲノム切断点と一致する、インフレームの融合転写産物を持つことを確認した（図２Ｂおよび２Ｃ）。故に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質のフレームは、ＴＡＣＣ３のＴＡＣＣドメインのＦＧＦＲ３上流のＴＫドメインの並置を一定してもたらす。ＧＳＣ−１１２３およびＧＢＭ−１１２３におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の多量の発現と一致して、ＴＣＧＡ腫瘍のｍＲＮＡ発現解析によって、４個のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３陽性ＧＢＭが、ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３の著明な共外れ値の発現を示すことを明らかにした（図２Ｄ）。反復性遺伝子融合物は、切断点領域の局所的なコピー数多型（ＣＮＶ）と関連付けることができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。それに基づき、ＴＣＧＡデータセットにおけるＳＮＰアレイの解析によって、４個全てのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３陽性ＧＢＭにおけるＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３遺伝子の微小増幅（ｍｉｃｒｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）事象の存在を明らかにした（図２Ｅ）。
【表４】
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【表５】
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【０１９４】
ＦＧＦＲ３遺伝子とＴＡＣＣ３遺伝子とは、ヒト染色体４ｐ１６上で４８−Ｋｂ離れて位置する。ＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ族の他の仲間は、染色体８ｐ１１上で対になったＦＧＦＲ１およびＴＡＣＣ１、ならびに染色体１０ｑ２６上で対になったＦＧＦＲ２およびＴＡＣＣ２との、ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３の近接した物理的連関を保持する。理論に束縛されるものではないが、祖先ＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子は物理的に連結し、このタンデム遺伝子クラスターが少なくとも２回複製されて、哺乳類の進化を特徴付けるＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、ＦＧＦＲ２−ＴＡＣＣ２、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の対が生成された（Ｓｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＦＧＦＲ遺伝子間の高度に保存されたＴＫドメイン、およびＴＡＣＣ遺伝子間のＴＡＣＣドメインは、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３再構成におけるそれらの一定した融合と共に、染色体内ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合の他の組み合わせがヒトＧＢＭ中に存在するのかという問いを引き起こした。
【０１９５】
８８個の原発性ＧＢＭのパネルからのｃＤＮＡを、それぞれ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、およびＦＧＦＲ３のＴＫドメインのアミノ末端コード領域を結合する上流ＰＣＲプライマーと、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、およびＴＡＣＣ３遺伝子のＴＡＣＣドメインのカルボキシ末端コード領域と結合する下流プライマーとの対を使用してスクリーニングした。スクリーニングによって、ＧＢＭ−１１２３事例を含む合計９７個のＧＢＭのうちの３個（３．１％）に対応する２個の追加的な事例（ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１を宿すもの、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を宿すもの）において、染色体内ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を特定した。ＧＢＭ−５１中のＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１融合切断点がＦＧＦＲ１のインフレームのエクソン１７をＴＡＣＣ１のエクソン７に接合させることで、ＦＧＦＲ１のＴＫドメインがＴＡＣＣ１のＴＡＣＣドメインの上流に融合した新規タンパク質をもたらした（図２Ｆ）。同一の構造を、ＦＧＦＲ３のエクソン１６がＴＡＣＣ３のエクソン１０にインフレームで接合したＧＢＭ−２２において再び保存した（図２Ｇ）。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物を宿す腫瘍のうちのどれもＩＤＨ１またはＩＤＨ２遺伝子における突然変異を有さず、故に、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ陽性ＧＢＭが、ＩＤＨ突然変異を持つ患者からの独立した患者部分群を特徴付けることを示した（表６）（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ再構成を宿す７個のＧＢＭの各々において創出された、ＴＡＣＣドメインへのＦＧＦＲ−ＴＫの恒常的な連結は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質が、脳における発癌に対して重要な機能的結果を生み得ることを示す。
【０１９６】
【表６】
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【０１９７】
ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の形質転換活性。ＧＢＭにおけるＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の機能的重要性を試験するために、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３のｃＤＮＡをＧＳＣ−１１２３からクローニングし、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１、キナーゼ活性のないＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質（ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ）、野生型ＦＧＦＲ３、および野生型ＴＡＣＣ３を発現している組み換えレンチウイルスを調製した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３レンチウイルスを用いたＲａｔ１Ａ線維芽細胞およびＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞の形質導入によって、ＧＳＣ−１１２３中に存在するものに匹敵するレベルでの融合タンパク質の発現をもたらした（図１１）。ＧＢＭ細胞中に蓄積するＦＧＦＲ−ＴＡＣＣタンパク質の内因性レベルを非形質転換細胞中で再構成して、それがインビトロおよびインビボで発癌性形質転換を開始するのに十分であるかどうかを判定した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１を発現しているが、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、または空レンチウイルスは発現していないＲａｔ１Ａ細胞は、柔寒天中の足場非依存性条件下で成長する能力を獲得した（図３Ａ）。原発性Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞における同一のレンチウイルスの形質導入、その後の免疫不全マウスへの皮下注射によって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１を発現している星状膠細胞のみが腫瘍を形成したことを明らかにした。腫瘍は、融合タンパク質を発現している星状膠細胞を注射したマウスの１００％において現れ、Ｋｉ６７、リン酸化ヒストンＨ３、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＯｌｉｇ２に対して強い陽性を持つ神経膠腫様の病変であった（図３Ｂ）。
【０１９８】
次に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質が、免疫担当動物の脳へと直接少数の細胞に形質導入したときに、発癌性であるかどうかを判定した。脳腫瘍が癌遺伝子のレンチウイルス形質導入およびマウス脳中のｐ５３の不活性化によって開始される、先述のマウス神経膠腫モデルを使用した（Ｍａｒｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。標的の成熟ＮＳＣに、成熟マウス海馬を、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３タンパク質を発現している精製レンチウイルス、およびｐ５３（ｐＴｏｍｏ−ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３）に対抗するｓｈＲＮＡを用いて定位的に形質導入した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３で形質導入した８匹のマウスのうち７匹（８７．５％）が、２４０日以内に悪性脳腫瘍にかかった（図３Ｃ）。ＧＢＭにおいて最も頻繁な機能獲得型変異を発現しているレンチウイルス（構成的に活性なＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｐＴｏｍｏ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｈｐ５３）、またはｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３制御レンチウイルスで形質導入したマウスのうちのどれも、死亡、または脳腫瘍の臨床徴候を発症しなかった（図３Ｃ）。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３腫瘍は、正常な脳を侵す強い傾向を持つ高悪性度の神経膠腫であり、神経膠腫幹細胞マーカであるネスチンおよびＯｌｉｇ２、ならびに神経膠マーカであるＧＦＡＰに対して陽性の染色を示した。それらはまた、Ｋｉ６７およびリン酸化ヒストンＨ３に対して高く陽性である故に、急速な腫瘍成長を示した（図３Ｄ）。異種移植片および頭蓋内腫瘍モデルにおけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の発現は、ヒトＧＳＣおよ腫瘍における内因性タンパク質の発現に匹敵した（図１１Ｄ、１１Ｅ、および１１Ｆ）。
【０１９９】
これらのデータは、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質が２個の独立した細胞モデルにおいて形質転換活性を処理し、かつこの活性が個々のＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子の過剰発現の結果ではないことを示す。これらはまた、成熟マウス脳へのＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の直接的形質導入が、悪性神経膠腫の効果的な発達を引き起こすことを示す。
【０２００】
ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物は、有糸分裂進行を妨げ、染色体の不分離および異数性を誘導する。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物が発癌を活発にする機序を解明するために、それが下流ＦＧＦＲシグナル伝達を活性化するかどうかを調査した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、リガンドであるＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、またはＦＧＦ−８の存在下または不在下で、ＦＧＦＲの下流（ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴ）の正準なシグナル伝達事象を過剰活性化できなかった（Ｗｅｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃ）。しかしながら、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は、ＦＧＦＲ関連ＴＫ活性ＰＤ１７３０７４（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）またはＫ５０８Ｍ突然変異の特異的阻害剤によって共に消失したそのＴＫドメインおよびアダプタータンパク質ＦＲＳ２の、構成的リン酸化を示した（図４Ａ）。故に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３は発癌性形質転換に不可欠な構成的キナーゼ活性を増大させるが、この異常活性の下流シグナル伝達はＦＧＦＲの下流の正準なシグナル伝達事象とは異なる。融合タンパク質の限局を活発にすることによって、ＴＡＣＣドメインは完全に新規のＴＫ依存機能を創出できる。ＴＡＣＣドメインは、有糸分裂紡錘体へのＴＡＣＣタンパク質の限局に不可欠である（Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｒｏｙｌｅ，２０１１、Ｐｅｓｅｔ  ａｎｄ  Ｖｅｒｎｏｓ，２００８）。共焦点画像は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、高い頻度で２つの極のうちの１つに向かう非対称を示し、細胞が有糸分裂の後半段階（終期および細胞質分裂）に進行するに連れて中心体に移転する、中期の紡錘体極上に折れ曲がりかつそれを包み込む弓形構造を設計したことを示した（図４Ｂおよび１２Ｄ）。逆に、ＴＡＣＣ３の限局は、紡錘体微小管に限定されず、中心体に移転しない（図１２Ｅ）。野生型ＦＧＦＲ３は、有糸分裂における離散限局パターンを欠いた（図１２Ｆ）。
【０２０１】
ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の有糸分裂限局は、それが有糸分裂の忠実度に影響を与え、娘細胞への２倍体染色体内容の正確な送達を混乱させる故に、異数性を生成し得ることを示す。個々の細胞の有糸分裂進行を、ベクターで形質導入した、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現し、かつヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを共発現している細胞中で、微速度撮影顕微鏡法によって観察した。核膜破壊から後期開始までの平均時間は、対照細胞と比較すると、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現している細胞において増加した。有糸分裂の遅延は、細胞質分裂を完了することにおける困難によって更に悪化した（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０２０２】
次に、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質の発現が染色体分離の欠損を誘導するかどうかを判定した。有糸分裂の定量解析によって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３またはＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１を発現している細胞が、対照細胞よりも３〜５倍増加した染色体分離欠陥を呈することを明らかにした。融合タンパク質によって引き起こされた最も頻発した有糸分裂異常は、染色体の中期中の不整列、染色体の後期での遅滞、および、娘細胞において細胞質分裂を害し小核を生成した染色体橋であった（図４Ｅ、４Ｆ、および１３Ａ）。中期後期間の移行における異常は頻繁に、有糸分裂細胞が紡錘体毒での処理後に中期停止を維持できないことにつながる。対照であるＦＧＦＲ３またはＴＡＣＣ３を発現している細胞では３％未満であったのに対して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現している細胞の１８％超は、未成熟分離した姉妹染色分体を示した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。したがって、融合タンパク質を発現している細胞は、ノコダゾール処理の後、中期で効果的に停止できない（図１３Ｄ）。
【０２０３】
上の発見は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合タンパク質の発現が異数性を誘発し得ることを示す。核型解析によって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３が、空ベクター、ＦＧＦＲ３、またはＴＡＣＣ３で形質導入した細胞と比較して、異数性の割合を２．５倍超増加させ、かつ染色体数の広域分布を持つ細胞の蓄積を招いたことを明らかにした（図５Ａ）。それに基づき、ＧＳＣ−１１２３は染色体の異数性様式数（４９）を含有し、６０％の中期スプレッドが様式から逸脱することを特徴とする染色体数の広域分布を明示した（表７）。
【０２０４】
【表７】
0006382194.tif 000055
【０２０５】
次に、異数性が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の直接的な結果であるのかどうか、およびヒト２倍体神経細胞において誘導されるかどうかを判定した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３レンチウイルスを用いた形質導入の６日後に解析した原発性ヒト星状膠細胞は、異数性率の５倍の増加、および染色体数の著しく広範な分布を呈した（図５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄ）。異数性が細胞適応度に有害であることに一致して、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の急激な発現は、ヒト星状膠細胞の増殖能を損なった。しかしながら、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を発現しているヒト星状膠細胞の連続培養は、対照細胞のものを圧倒する増殖能の漸進的増大を招いた（図１４Ａ、１４Ｂ）。故に、中枢神経系からの原発性正常ヒト細胞におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の急激な発現は、より遅滞した増殖によって明示される急激な適応度損失を持つ、ＣＩＮおよび異数性を引き起こす。
【０２０６】
また、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって引き起こされたＣＩＮおよび異数性が、ＦＧＦＲ３のＴＫ活性を必要とするかどうか、および是正され得るかどうかを判定した。ＰＤ１７３０７４での処置によって、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって引き起こされた異数性を８０％超取り返し、対照細胞に特有である染色体数の狭域分布を回復し、かつ接着欠損を大きく是正した（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）。これらの発見は共に、ＦＧＦＲおよびＴＡＣＣ遺伝子の再構成によって引き起こされたＣＩＮおよび異数性が可逆性であることを示し、特異的ＦＧＦＲキナーゼ阻害がＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質を発現している腫瘍細胞における有益な治療方針であり得ることを示唆する。
【０２０７】
ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合タンパク質は、ＧＢＭにおける新たな治療標的である。駆動体遺伝子改変によって、癌遺伝子依存の状態をそれらを宿す癌細胞において引き起こし、それを治療的に活用できる。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物がＦＧＦＲ−ＴＫ活性に依存性を与えるかどうかを問うために、細胞成長を、ＰＤ１７３０７４、ＡＺＤ４５４７、またはＢＧＪ３９８（後者２つは臨床研究中であるＦＧＦＲ−ＴＫの高度に特異的な阻害剤である）の存在下で解析した（Ｇａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｇｕａｇｎａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。３つの薬剤の各々が濃度＜１０ｎＭでＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１を発現している細胞の成長を阻害した一方で、それらは、ベクター、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、およびＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ変異体で形質導入した細胞においては、１μＭの濃度では効果がなかった（図７Ａ、１４Ｃ、および１４Ｄ）。これらの発見は、融合タンパク質を持つ細胞に向けたＦＧＦＲキナーゼ阻害に対する特異性の度合いの高まりを浮き彫りにする。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３転座を自然に宿すＧＳＣ−１１２３細胞の成長も、ナノモル濃度のＦＧＦＲ−ＴＫ阻害剤によって消失した（図７Ｂ）。ＦＧＦＲ３のｓｈＲＮＡによる融合遺伝子の標的化は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３の発現抑制効率に比例的に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３を異所的に発現している細胞およびＧＳＣ−１１２３の成長を阻害した（図７Ｃおよび１４Ｅ）。
【０２０８】
最後に、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３形質転換星状膠細胞の神経膠腫異種移植片を持つマウスのＰＤ１７３０７４での処置が、腫瘍成長を阻害するかどうかどうかを判定した。腫瘍細胞の注射から１２日後、全ての動物中で皮下腫瘍が存在した。マウスを無作為に２つのコホートに分け、ＰＤ１７３０７４またはビヒクルで処理した。ＰＤ１７３０７４は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３神経膠腫の強力な成長阻害を導いた（図７Ｄ）。より解剖学的に関連性のあるモデルを使用した臨床的に意義深いＦＧＦＲ−ＴＫ阻害剤の有効性を確認するために、臨床研究中の化合物であるＡＺＤ４５４７  ＦＧＦＲ（Ｇａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を、頭蓋内のルシフェラーゼを発現しているＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３によって活発化される神経膠腫の異種移植片に対して使用した。生着期間の後、腫瘍を持つ動物をＡＺＤ４５４７かビヒクルかのどちらかで処理した。ＡＺＤ４５４７の経口投与は、生存を著明に延長した（図７Ｅ）。総合して、データは、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ再構成を宿すＧＢＭにおけるＦＧＦＲ阻害剤に基づく臨床試験への強い理論的根拠を提供する。
【０２０９】
考察
【０２１０】
本研究は、反復性、発癌性、および依存性の遺伝子融合物が、一部のＧＢＭ患者を特定することを証明した。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の機能的特性化は、融合タンパク質の構成的に活性なＦＧＦＲ−ＴＫおよびＴＡＣＣドメインが共に発癌に不可欠であることを示す。ＦＧＦＲキナーゼの有糸分裂細胞へのＴＡＣＣ依存不正限局は、有糸分裂紡錘体極への構成的に活性なＴＫの異常な区画化をもたらす故に、融合タンパク質によって誘起された、有糸分裂忠実度の障害、染色体の不分離、および異数性に対する機構的説明を提供する。
【０２１１】
理論に束縛されるものではないが、有糸分裂中に染色体分離を制御する遺伝子の突然変異は、ＧＢＭを含む大半の固形腫瘍に特有であるＣＩＮおよび異数性の高率を説明し得る（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。候補遺伝子の突然変異による不活性化のいくつかの例が、ヒト癌において報告されている（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら、有糸分裂忠実度の制御に偶然に関与する機能獲得型変異は説明されていない。このことは、ＣＩＮを引き起こす発症機序が優性形質として振る舞うという、細胞融合実験からの伝統的な観察結果と対立し、ＣＩＮ表現型が遺伝子不活性化ではなくむしろ機能獲得事象に起因することを示す（Ｌｅｎｇａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，１９９８）。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合は、ＣＩＮの開始に対する新規の機序であり、ヒト癌における異数性の原因である優性突然変異の性質についての糸口を提供する。
【０２１２】
正常なヒト星状膠細胞における融合タンパク質によって引き起こされる有糸分裂欠損および異数性細胞集団の急速な出現は、ＦＧＦＲ−ＴＫ活性の短期的な阻害後の異数性の是正と併せて、異数性がＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物による腫瘍誘導において重要事象であることを示す。異数性の誘導それ自体が細胞適応度に有害である（Ｓｈｅｌｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ａｍｏｎ，２０１１）。本格的な腫瘍形成は、異数性と、成長優位を与え異数性の有害作用に対して細胞を保護する遺伝子病変との間の連携を必要とする（Ｃｏｓｃｈｉ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋ，２０１２、Ｈｏｌｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，２００９、Ｗｅａｖｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，２００９）。したがって、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物の強力な腫瘍開始活性は、新規の癌性タンパク質が、核型改変を確実にすることで有糸分裂忠実性の喪失を補う成長促進シグナル伝達機能を有することを示す（Ｓｈｅｌｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ａｍｏｎ，２０１１）。
【０２１３】
ＧＢＭにおける一般的な遺伝子改変に対する標的化療法は、恐らくそれらがＧＢＭの真に依存性である癌性タンパク質を根絶することに体系的に失敗したために、疾患の不良な臨床転帰を変えていない。高度に特異的な抗腫瘍効果、およびＦＧＦＲ−ＴＡＣＣによって活発化されるＧＢＭのＦＧＦＲ−ＴＫ阻害によって促される異数性の是正は、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ再構成を宿す患者におけるＦＧＦＲ阻害剤に基づく臨床試験への強い理論的根拠を提供する。ここで報告する計算的遺伝子融合物発見パイプラインによって、ＦＧＦＲ族の遺伝子がＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ再構成を越える追加的な遺伝子融合に関与する、他のＧＢＭ事例を検出した。したがって、３．１％という頻度は、ＦＧＦＲ−ＴＫ阻害の恩恵を受け得るＧＢＭ患者の目標集団を過小評価している可能性が高い。
【０２１４】
実験手順
【０２１５】
ＧＳＣの細胞培養および単離ならびに維持。Ｒａｔ１Ａのマウス星状膠細胞Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−、およびヒト星状膠細胞を、１０％のＦＢＳで補完したＤＭＥＭ中で培養した。ＧＳＣの単離および培養を記載の通りに行った（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＰＤ１７３０７４、ＡＺＤ４５４７、またはＢＪＧ３９８を用いたインビトロでの処理のために、ベクター対照、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物、またはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍに感染させた細胞を、９６個のウェルプレートに蒔き、増大する濃度のＦＧＦＲ阻害剤で処置した。７２〜１２０時間後、臭化３−（４，５−ジメチチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイを使用して、成長率を測定した。データを平均±ＳＤとして表す。解離神経膠腫球を感染から５日後に１２個のウェルプレートにおいて２×１０４細胞／ウェルで播種することによって、ＦＧＦＲ３ｓｈＲＮＡレンチウイルスに感染させたＧＳＣ−１１２３における増殖率を判定した。３通りの独立した感染から採取した３通りの培養におけるトリパンブルー色素排除法によって、生存細胞の数を判定した。細胞数を隔日で記録した。
【０２１６】
ＤＮＡ、ＲＮＡ調製、ゲノムおよびリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。
【０２１７】
ＲＮＡ塩基配列解読によって検出した対形成末端リード配列のマージン内に設計された正方向および逆方向プライマーの組み合わせを用いたゲノムおよびＲＴ両方のＰＣＲを使用して、融合転写産物の検証を行った。ＤＮＡ、ＲＮＡ調製、およびｑＲＴ−ＰＣＲを、記載の通りに行った（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＧＢＭコホート内の新規の融合転写産物を特定するために、ＰＣＲプライマーの対を、ＦＧＦＲ遺伝子のＴＫドメインの上流、およびＴＡＣＣ遺伝子のコイルドコイルドメインの内部または下流で結合するように設計した。発現した融合転写産物変異体を直接配列決定に供して、配列およびフレームを確認した。プライマー配列を下に挙げる。
【０２１８】
皮下異種移植片および薬剤処置。異なるレンチウイルス構成体で形質導入したＲａｔ１ＡまたはＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞（５×１０５）を、３０μｌのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を合わせた１５０μｌのＰＢＳ中で懸濁し、無胸腺ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の脇腹に皮下注射した。ＦＧＦＲ阻害剤を用いた実験のために、Ｉｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞由来の〜２００〜３００ｍｍ３の皮下腫瘍を持つマウスに、０．０５Ｍの乳酸緩衝液（ｐＨ５）または等体積の乳酸緩衝液中の５０ｍｇ／ｋｇのＰＤ１７３０７４を経口強制飼養によって無作為に与えた。４日間連続、その後２日間の休止からなる３周期の間、処置を行った。腫瘍の直径をキャリパーで測定し、腫瘍の体積を、式０．５×長さ×幅２を使用して見積もった。データを平均±ＳＥとして表す。マウスは、対照群中の腫瘍が最大許容サイズに達したときに死亡した。
【０２１９】
同所性移植および薬剤処置。ルシフェラーゼを発現しているベクターを持つＩｎｋ４Ａ；Ａｒｆ−／−星状膠細胞を、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３レンチウイルスで形質導入した。２μｌの生理食塩水中の１×１０３細胞を、定位フレーム（ブレグマに対する座標：前側部０．５ｍｍ、外側部１．１ｍｍ、腹側部３．０ｍｍ）および２６ゲージのハミルトンシリンジを使用して、生後４〜６週の雄の無胸腺ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスの尾状核被殻に注射した。注射から６日後、マウスをＸｅｎｏｇｅｎ  ＣＣＤ装置を使用する生物発光画像法にかけ、１％のＴｗｅｅｎ８０中の５０ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ４５４７（処置群）、または等体積のビヒクル中のＤＭＳＯ（対照群）を経口強制飼養によって無作為に与えた。２日の間隔を空けた１０日間の２周期中、ＡＺＤ４５４７を毎日投与した。マウスは、毎日監視され、神経症状が現れたときに死亡した。ＤＮＡ  Ｓｔａｔｖｉｅｗソフトウェアパッケージ（ＡｂａｃｕｓＣｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して、カプランマイヤー曲線を生成した。ログランク解析をカプランマイヤー生存曲線に行い、統計的有意性を判定した。
【０２２０】
レンチウイルスの頭蓋内注射。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−ｓｈｐ５３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｓｈｐ５３、またはｓｈｐ５３ｐＴｏｍｏレンチウイルスの頭蓋内注射を、ＩＡＣＵＣ委員会の指針に従って、生後４週のＣ５７／ＢＬ／６Ｊマウスにおいて行った。手短に、ＰＢＳ（１×１０９／ｍｌ）中の１．８μｌの精製レンチウイルス粒子を、定位フレーム（ブレグマに対する座標：後側部１．４５ｍｍ、外側部１．６５ｍｍ、腹側部２．４ｍｍ）および２６ゲージのハミルトンシリンジを使用して、歯状回に注射した。マウスは、毎日監視され、神経症状が現れたときに死亡した。マウス脳を、病理組織学的に、および免疫蛍光染色法によって解析した。
【０２２１】
組織学および免疫染色法。脳腫瘍に対する組織調製および免疫組織化学、ならびに免疫蛍光染色法を、以前に記載の通りに行った（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。免疫染色法および免疫ブロット法で使用した抗体を、下に列挙する。
【０２２２】
クローニングおよびレンチウイルス産生。レンチウイルス調製および感染を記載の通りに行い（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、更なる実験手順中で詳説する。
【０２２３】
核型解析。培養した細胞を、更なる実験手順で詳説する通り、核型解析に対して採集する前に９０分間コルセミド（２０ｎｇ／ｍｌ）処理した。少なくとも１００個の中期にある細胞を、染色体数に対して観察した。姉妹染色分体の大部分がもはや関連していない細胞において、ＰＭＳＣＳの数を記録した。ウェルチの是正を伴う対応のない両側ｔ検定を、平均解析の比較のために行った。
【０２２４】
免疫蛍光法および生細胞顕微鏡法。ＰＨＥＭ（６０ｍＭのＰｉｐｅｓ、２７ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ７．０）中の４％のＰＦＡで固定した細胞に、免疫蛍光顕微鏡法を行った。１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して、細胞を透過化した。有糸分裂紡錘体を、抗αチューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）によって可視化した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８／−５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に共役した２次抗体を使用した。複数の抗体での全て染色を、連続的なやり方で行った。ＤＮＡをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって染色した。蛍光顕微鏡法をＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  ＭＰ顕微鏡上で行った。
【０２２５】
全トランスクリプトーム（ＲＮＡ塩基配列解読）およびエキソーム配列決定からの遺伝子融合物の特定。ＲＮＡ配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製ＨｉＳｅｑ２０００を使用して、９人のＧＢＭ患者から単離したＧＳＣ培養から摘出した総ＲＮＡから行い、試料当たり約６０３０万個の対形成リードを産生した。変更したモットのトリミング、３２の初期シード長、２の最大編集距離、および１の最大ギャップ数を用いたグローバルアラインメントソフトウェアＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，２００９）を使用して、平均で４３１０万個のリードをＲｅｆＳｅｑトランスクリプトームに適当にマップし、残りは、試料あたり８６０万個をｈｇ１９ゲノムにマップした。残り１４．３％の対形成リード（適当な正方向−逆方向（Ｆ−Ｒ）配向で、期待されたインサートサイズ内で、および最小のソフトクリップで、トランスクリプトームまたはゲノムのどちらにもマップされなかったもの（リードの最後でマップされなかった部分）を含む）を、遺伝子融合物解析に適切であると見なした。
【０２２６】
ＴＸ−Ｆｕｓｅと呼ばれる新規の計算的パイプラインを構築し、それは、遺伝子融合物の存在の証拠の２つのソースである、１．メイト対の各リードが全て切断点の１側面にマップするスプリットインサート、および２．切断点をスパンする個々のスプリットリードを特定する。スプリットインサートはＢＷＡマッピングから容易に検出される。一方で、スプリットリードについては、より小さいヌクレオチド伸展の精密整列が要求される。そのために、パイプラインは、２０のワードサイズ、９５％の同一性カットオフ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｃｕｔｏｆｆ）、１０−４の期待カットオフ（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｃｕｔｏｆｆ）、およびソフトフィルタリング（ｓｏｆｔ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）での局所整列パッケージＢＬＡＳＴを用いて、未加工の対形成リードをＲｅｆＳｅｑトランスクリプトームに対抗してマップする。この手順から、リード対における適当なＦ−Ｒ配向を前提として、予測される融合転写産物におけるコード化フレームの維持を確実にするためにフィルタリングした、可能性のあるスプリットリードの一覧を取得する。パラロガス遺伝子対から生成された偽陽性候補も、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ＤａｔａｂａｓｅおよびＥｎｓｅｍｂｌＣｏｍｐａｒａ  ＧｅｎｅＴｒｅｅｓを使用して、スクリーニングで排除した（Ｖｉｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。候補一覧中の偽遺伝子には、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）のデータベースからの一覧を使用して注釈を付け（Ｓｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、低い優先順位とした。各残りの遺伝子融合物候補に対しては、仮想基準を予測融合転写産物に基づいて創出し、１６のワードサイズ、８５％の同一性カットオフ、８５％を超えるクエリカバレッジ、および１０−４の期待カットオフでのＢＬＡＳＴを使用して、全てのマップされていないリードを再マップし、スプリットリードおよびインサートの最終集計を取得した。更に、遺伝子融合に関わっている各遺伝子の成分が高度に発現したことを裏付けるために、仮想基準の塩基当たりの配列決定深度を算出した。
【０２２７】
遺伝子融合物候補の初期パネルの反復を確立するために、遺伝子融合物発見パイプラインを修正して、８４個の対形成リードエキソームＤＮＡ配列決定の有効なデータセット内の融合物に対するプローブがＴＣＧＡからのＧＢＭ試料に適合する、ＥＸｏｍｅ−Ｆｕｓｅを作り出した。遺伝子融合物特定への感受性を増大するために、スプリットインサートに対しては２４、スプリットリードに対しては１６のワードサイズのＢＬＡＳＴ、およびスプリットインサート発見を使用して、ＢＷＡによってマップされていないリードを、各融合物候補に関わっている遺伝子対に整列させた。ＤＮＡ中で検出した切断点が、転写されたＲＮＡ中の結果としての切断点を直接的に示し得ないことから、スプリットインサート配向に制限は課さなかった。スプリットリードに対しては、そのメイトと同一の遺伝子にマップしたスプリットリードの成分がＦ−Ｒ方向性を維持したことのみを求めた。
【０２２８】
ＴＣＧＡのＧＢＭ試料からの共外れ値発現およびＣＮＶ分析。Ｔｏｍｌｉｎｓら（Ｔｏｍｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）は、マイクロアレイデータセットからの外れ値の遺伝子発現が、候補の発癌性遺伝子融合物を特定することを報告した。Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、融合パートナーにおける遺伝子内複製数異常に対する「切断点原理」を提案した。２つの原理（外れ値発現および遺伝子内ＣＮＶ）を組み合わせて、Ａｔｌａｓ−ＴＣＧＡからのＧＢＭ試料における候補遺伝子融合物を特定した。ゲノムおよび発現データセットを、２０１１年１２月１日に利用可能であった、ＴＣＧＡデータタイプ、プラットフォーム、および解析も入手可能であるＴＣＧＡパブリックデータポータルからダウンロードした（２００８）。特定のデータソースは次の通りである（データレベルおよびデータタイプに従う）。発現データ、「レベル２」８４個の試料のプローブセット当たりの正常化シグナル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＴ＿ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）；複製数データ、「レベル１」４個のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物陽性試料（腫瘍および適合した正常な対照）のプローブ当たりの未加工シグナル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０）。
【０２２９】
遺伝子発現解析を、まずＲ３を使用して行った。中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出し、その後、次の式、Ｚｉ，ｊ＝０．６７４５（ｘｉ，ｊ‐平均（ｘｉ））／ＭＡＤｉ＞３．５（Ｉｇｌｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｈｏａｇｌｉｎ，１９９３）。試料を、対象の遺伝子の両方（例えば、ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３）が外れ値行動（共外れ値）を示した場合に、ＥＣＦＳ（発現候補融合物試料）として特定した。次に、ｐｅｎｎＣＮＶを使用して、ＥＣＦＳをＣＮＶに対して解析した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。腫瘍試料をそれらの正常対照と対にしてログ比率値を取得し、ＶＥＧＡアルゴリズムを使用してより正確なセグメンテーションを取得した（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２３０】
核型解析。コルセミド処理した細胞をトリプシン処理し、２００×ｇで７分間遠心分離させ、細胞ペレットを、温めた低張液中で再懸濁し、３７℃で１３分間インキュベートした。その後、膨張した細胞を遠心分離させ、ペレットを８ｍｌのカルノア固定液（３：１、メタノール：氷酢酸）中で再懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離し、カルノア固定液中で２回洗浄した。最後の遠心分離後、細胞を、０．５〜１ｍｌの新たに調製した固定液中で再懸濁して、乳白色の細胞懸濁液を産生した。最終細胞懸濁液の液滴を、清潔なスライド上に置き、空気乾燥させた。スライドをＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で中期を解析した。
【０２３１】
クローニングおよびレンチウイルス産生。レンチウイルス発現ベクター、ｐＬＯＣ−ＧＦＰ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３を使用して、ＦＧＦＲ３、ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ、およびＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１をクローニングした。ｐＴｏｍｏ−ｓｈｐ５３は、Ｉｎｄｅｒ  Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｄｉｎｏｒａｈ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ−Ｍｏｒｖｉｎｓｋｉ（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）の贈与品であった。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３−Ｋ５０８Ｍ変異体を、Ｐｈｕｓｉｏｎ製の特定部位突然変異誘発キット（ＮＥＢ，ＵＳＡ）を使用して生成した。ＦＧＦＲ３に対抗するＭＩＳＳＩＯＮ  ｓｈＲＮＡｓクローン（ｐＬＫＯ．１レンチウイルス発現ベクター）をＳｉｇｍａから購入した。ＦＧＦＲ３遺伝子を標的化するヘパリン配列は以下である。
【０２３２】
５′−ＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴ−３′（＃ＴＲＣＮ０００００００３７２；Ｓｈ＃２）（配列番号１８２）
【０２３３】
５′−ＧＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧ−３′（＃ＴＲＣＮ００００４３０６７３；Ｓｈ＃３）（配列番号１８３）
【０２３４】
５′−ＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡ−３′（＃ＴＲＣＮ０００００００３７４；Ｓｈ＃４）（配列番号１８４）
【０２３５】
ゲノムおよびｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ。総ＲＮＡを、製造業者の使用説明に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することにより、細胞から摘出した。５００ｎｇの総ＲＮＡを、製造業者の使用説明に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、逆転写した。逆転写後に取得したｃＤＮＡを、ｑＰＣＲのための鋳型として使用した。反応を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘを使用することによって、Ｒｏｃｈｅ４８０熱循環器を用いて行った。特異的ｍＲＮＡの相対量を１８Ｓに正規化した。結果を、３通りの増幅の平均±ＳＤとして示す。
【０２３６】
使用したプライマー：
ｈＦＧＦＲ３−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＧＴＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１６２）
ｈＦＧＦＲ３−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１６３）
ｈＴＡＣＣ３−ＲＴ−ＦＷ２：５’−ＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１６４）
ｈＴＡＣＣ３−ＲＴ−ＲＥＶ２：５’−ＡＧＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡＡ−３’（配列番号１６５）
ｈＷＲＡＰ５３−ＲＴ−ＦＷ１：５’−ＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１８０）
ｈＷＲＡＰ５３−ＲＴ−ＲＥＶ１：５’−ＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１８１）
【０２３７】
ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ融合物のスクリーニングに対して使用したプライマー：
ＦＧＦＲ３−ＦＷ１：５’−ＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１６６）
ＴＡＣＣ３−ＲＥＶ１：５’−ＡＡＡＣＧＣＴＴＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１６７）
ＦＧＦＲ１−ＦＷ１：５’−ＡＴＧＣＴＡＧＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡ−３’（配列番号１６８）
ＴＡＣＣ１−ＲＥＶ１：５’−ＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡ−３’（配列番号１６９）
【０２３８】
ＧＢＭ−１１２３およびＧＳＣ−１１２３におけるＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物のゲノム検出に対して使用したプライマー：
ゲノムＦＧＦＲ３−ＦＷ１：５’−ＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣ−３’（配列番号１７０）
ゲノムＴＡＣＣ３−ＲＥＶ１：５’−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＡＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴ−３’（配列番号１７１）
【０２３９】
ＲＮＡ塩基配列解読によって検出した融合物を立証するために使用したプライマー：
ＰＯＬＲ２Ａ−ＦＷ１：５’−ＣＧＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１７２）
ＷＲＡＰ５３−ＲＥＶ１：５’−ＴＧＴＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１７３）
ＰＩＧＵ−ＦＷ１：５’−ＧＡＡＣＴＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＡＴ−３’（配列番号１７４）
ＮＣＯＡ６−ＲＥＶ１：５’−ＧＣＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＡ−３’（配列番号１７５）
ＳＴ８ＳＩＡ４−ＦＷ１：５’−ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１７６）
ＰＡＭ−ＲＥＶ１：５’−ＧＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１７７）
ＣＡＰＺＢ−ＦＷ：５’−ＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴ−３’（配列番号１７８）
ＵＢＲ４−ＲＥＶ１：５’−ＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴ−５’（配列番号１７９）
【０２４０】
共焦点顕微鏡画像法。固定化した細胞の免疫蛍光法のために、画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  ＭＰおよび６０×１．３の油浸対物レンズを使用して、０．２５μｍのＺ軸光学離間で記録し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して解析した。精細胞解析に対しては、ｐＬＮＣＸ−Ｈ２Ｂレトロウイルスに感染させ、レンチウイルスベクターまたはＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合物で形質導入したＲａｔ１Ａ細胞を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中でガラス底皿に蒔き、３７℃および５％のＣＯ２／９５％の空気でのＮｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ  ＭＰ  ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎを使用した微速度撮影顕微鏡法によって監視した。１μｍのＺ軸光学離間での画像を、４分ごとに８時間記録した。初期の前期から細胞質分裂までの未処理の有糸分裂の画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して処理した。核膜破壊（ＮＥＢ）の時点を、クロマチンの円滑な出現の喪失を示す第１のフレームとして定義し、後期は、極に向かう染色体の移動が明らかになるときに第１のフレームであった。核膜再構成（ＮＥＲ）を、核脱凝縮を示す第１のフレームとして定義した。
【０２４１】
箱髭図を、少なくとも５０個の記録した細胞からの連続画像から算出した。ウェルチの是正を伴う対応のない両側ｔ検定を、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア（ＡｂａｃｕｓＣｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して、平均解析の比較のために行った。
【０２４２】
0006382194.tif 000056
【０２４３】
参考文献
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Ｆｕｒｎａｒｉ，Ｆ．Ｂ．，Ｆｅｎｔｏｎ，Ｔ．，Ｂａｃｈｏｏ，Ｒ．Ｍ．，Ｍｕｋａｓａ，Ａ．，Ｓｔｏｍｍｅｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｅｇｈ，Ａ．，Ｈａｈｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｌｉｇｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｏｕｉｓ，Ｄ．Ｎ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｇｌｉｏｍａ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｐａｔｈｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２１，２６８３−２７１０．
Ｇａｖｉｎｅ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｏｏｎｅｙ，Ｌ．，Ｋｉｌｇｏｕｒ，Ｅ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｐ．，Ａｌ−Ｋａｄｈｉｍｉ，Ｋ．，Ｂｅｃｋ，Ｓ．，Ｒｏｏｎｅｙ，Ｃ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｔ．，Ｂａｋｅｒ，Ｄ．，Ｍｅｌｌｏｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＡＺＤ４５４７：Ａｎ  Ｏｒａｌｌｙ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ，Ｐｏｔｅｎｔ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２，２０４５−２０５６．
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Ｍａｒｕｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔａｓｈｉｒｏ，Ａ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ−Ｍｏｒｖｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｓｃａｄｅｎｇ，Ｍ．，Ｓｏｄａ，Ｙ．，Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．（２００９）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｕｓｅ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，１１０−１１６．
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Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｔ．，Ｄｉａｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｌ．Ａ．，Ｆａｉｒ，Ｊ．，Ｅｌｋａｈｌｏｕｎ，Ａ．Ｇ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｂ．Ｔ．，Ｔｏｒｅｔｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｎ．，Ｌａｄａｎｙｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＧ２  ｃａｕｓｅｓ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１０３９−１０４３．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｖａｒｅｌａ，Ｉ．，Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，Ｅ．Ｄ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｒｏｙ，Ｃ．，Ｅｄｋｉｎｓ，Ｓ．，Ｍｕｄｉｅ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，１００５−１０１０．
Ｓｔｉｌｌ，Ｉ．Ｈ．，Ｖｉｎｃｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｋ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ，ＴＡＣＣ３，ｍａｐｓ  ｉｎ  ４ｐ１６，ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ａｎｄ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５８，１６５−１７０．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａｋｈｏｕｍ，Ｓ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｄ．Ａ．（２０１０）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２０，Ｒ２８５−２９５．
Ｔｏｍｌｉｎｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌａｘｍａｎ，Ｂ．，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｃａｏ，Ｘ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｍｅｎｏｎ，Ａ．，Ｊｉｎｇ，Ｘ．，Ｃａｏ，Ｑ．，Ｈａｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｃｒｅａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＥＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５９５−５９９．
Ｔｏｍｌｉｎｓ，Ｓ．Ａ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｅｒｎｅｒ，Ｓ．，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｅｈｒａ，Ｒ．，Ｓｕｎ，Ｘ．Ｗ．，Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，Ｓ．，Ｃａｏ，Ｘ．，Ｔｃｈｉｎｄａ，Ｊ．，Ｋｕｅｆｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ２  ａｎｄ  ＥＴＳ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，６４４−６４８．
Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ，Ｒ．（２０１０）．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １０，１１６−１２９．
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｎｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒａｎｄｅｓ，Ａ．Ａ．，Ｒａｍｐｌｉｎｇ，Ｒ．，Ｋｏｕｗｅｎｈｏｖｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｋｒｏｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ａ．Ｆ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｐ．Ｍ．，Ｆｒｅｎａｙ，Ｍ．，Ｃａｍｐｏｎｅ，Ｍ．，Ｂａｕｒａｉｎ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｏｒ  ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：ＥＯＲＴＣ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｕｐ  ｓｔｕｄｙ  ２６０３４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７，１２６８−１２７４．
Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｓ．，Ｐｒｅｎｓｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｃａｏ，Ｑ．，Ｈａｎ，Ｂ．，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｏｎｎａｌａ，Ｒ．，Ｃａｏ，Ｘ．，Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｒｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１００５−１０１１．
Ｗｅａｖｅｒ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｄ．Ｗ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８５，９３５−９３７．
Ｗｅｓｃｈｅ，Ｊ．，Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｕｇｓｔｅｎ，Ｅ．Ｍ．（２０１１）．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４３７，１９９−２１３．
Ｙａｎ，Ｈ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｊｉｎ，Ｇ．，ＭｃＬｅｎｄｏｎ，Ｒ．，Ｒａｓｈｅｅｄ，Ｂ．Ａ．，Ｙｕａｎ，Ｗ．，Ｋｏｓ，Ｉ．，Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ，Ｉ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｒｉｇｇｉｎｓ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．ＩＤＨ１  ａｎｄ  ＩＤＨ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０，７６５−７７３．
Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｄ，Ｄ．Ａ．，Ｌｉｍ，Ｗ．Ｋ．，Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｙ，Ｍ．，Ｃａｒｒｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．，Ｃａｒｄｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ，Ｆ．，Ａｌｄａｐｅ，Ｋ．，Ｃａｌｉｆａｎｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｈｅ  Ｎ−Ｍｙｃ−ＤＬＬ３  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  Ｈｕｗｅ１  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｂｒａｉｎ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １７，２１０−２２１．
Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｈｅｎｇ，Ｊ．Ｉ．，Ｇｕａｒｄａｖａｃｃａｒｏ，Ｄ．，Ｊｉａｎｇ，Ｒ．，Ｐａｇａｎｏ，Ｍ．，Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ，Ｆ．，Ｉａｖａｒｏｎｅ，Ａ．，ａｎｄ  Ｌａｓｏｒｅｌｌａ，Ａ．（２００８）．Ｔｈｅ  ＨＥＣＴ−ｄｏｍａｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  Ｈｕｗｅ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎ−Ｍｙｃ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０，６４３−６５３．
（２００８）．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，１０６１−１０６８．
Ｉｇｌｅｗｉｃｚ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｈｏａｇｌｉｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）．Ｈｏｗ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ａｎｄ  ｈａｎｄｌｅ  ｏｕｔｌｉｅｒｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．：ＡＳＱＣ）．
Ｌｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．（２００９）．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４−１７６０．
Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ，Ｓ．，Ｃｅｒｕｌｏ，Ｌ．，Ｖｉｇｌｉｅｔｔｏ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｍ．（２０１０）．ＶＥＧＡ：ｖａｒｉａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，３０２０−３０２７．
Ｓｅａｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｕｓｈ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．（２０１１）．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ：ｔｈｅ  ＨＧＮＣ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，Ｄ５１４−５１９．
Ｔｏｍｌｉｎｓ，Ｓ．Ａ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｅｒｎｅｒ，Ｓ．，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｅｈｒａ，Ｒ．，Ｓｕｎ，Ｘ．Ｗ．，Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，Ｓ．，Ｃａｏ，Ｘ．，Ｔｃｈｉｎｄａ，Ｊ．，Ｋｕｅｆｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ２  ａｎｄ  ＥＴＳ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，６４４−６４８．
Ｖｉｌｅｌｌａ，Ａ．Ｊ．，Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｊ．，Ｕｒｅｔａ−Ｖｉｄａｌ，Ａ．，Ｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｉｒｎｅｙ，Ｅ．（２００９）．ＥｎｓｅｍｂｌＣｏｍｐａｒａ  ＧｅｎｅＴｒｅｅｓ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ａｗａｒｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９，３２７−３３５．
Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｈａｄｌｅｙ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｇｌｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．，Ｇｒａｎｔ，Ｓ．Ｆ．，Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｕｃａｎ，Ｍ．（２００７）．ＰｅｎｎＣＮＶ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７，１６６５−１６７４．
Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｓ．，Ｐｒｅｎｓｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｃａｏ，Ｑ．，Ｈａｎ，Ｂ．，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｏｎｎａｌａ，Ｒ．，Ｃａｏ，Ｘ．，Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｒｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１００５−１０１１．
【０２４４】
実施例２−ＧＢＭにおける融合物
【０２４５】
【表８】
0006382194.tif 000057
【０２４６】
【表９】
0006382194.tif 000058
【０２４７】
【表１０】
0006382194.tif 000059
【０２４８】
【表１１】
0006382194.tif 000060
【０２４９】
実施例３−他の癌における融合物
【０２５０】
発明者は、ヒト膠芽腫の３．１％がＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３およびＦＧＦＲ１−ＴＡＣＣ１遺伝子融合物を宿すことを、実施例１において以前に報告した。ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿す腫瘍は、ＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３遺伝子の再構成部分の高度に特異的な焦点性微小増幅事象の存在によって特定される（図２Ｅ）。したがって、これらの微小増幅事象は、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物の存在に対する独特の指標として使用し得る。Ａｔｌａｓ−ＴＣＧＡプロジェクトから生成したＳＮＰアレイのコピー数多型（ＣＮＶ）の解析から、ヒト腫瘍の他の型もＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物を宿すかどうかが問われた。この解析は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｅｗｅｒｓソフトウェアを使用して可視化した分割ＣＮＶデータを使用して行った。解析によって、図３１〜３５で示す次の腫瘍が、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物の存在を示すＦＧＦＲ３およびＴＡＣＣ３の焦点性微小増幅事象を見せることを明らかにした（図３１〜３５において、赤色は増幅（Ａ）を示し、青色は欠失（Ｄ）を示す；図３１：膀胱尿路上皮癌腫；図３２：乳癌腫；図３３：大腸癌腫；図３４：肺扁平上皮癌腫；図３５：頭頸部扁平上皮癌腫）。
【０２５１】
総合して、これらのデータは、膠芽腫において初めて報告されたものと同一のＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３遺伝子融合物が、いくつかの他の型のヒト腫瘍においても生じることを示す。したがって、膠芽腫および他の上皮癌（本明細書で考察されるヒト腫瘍など）に関しては、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物の特定が、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合物を阻害する薬剤を用いた処置のための新たな診断および治療標的も提供する。
【図１Ａ】
0006382194.tif 000061
【図１Ｂ−１】
0006382194.tif 000062
【図１Ｂ−２】
0006382194.tif 000063
【図１Ｂ−３】
0006382194.tif 000064
【図１Ｂ−４】
0006382194.tif 000065
【図１Ｃ】
0006382194.tif 000066
【図１Ｄ】
0006382194.tif 000067
【図１Ｅ】
0006382194.tif 000068
【図２Ａ−１】
0006382194.tif 000069
【図２Ａ−２】
0006382194.tif 000070
【図２Ｂ】
0006382194.tif 000071
【図２Ｃ】
0006382194.tif 000072
【図２Ｄ】
0006382194.tif 000073
【図２Ｅ】
0006382194.tif 000074
【図２Ｆ】
0006382194.tif 000075
【図２Ｇ】
0006382194.tif 000076
【図３Ａ】
0006382194.tif 000077
【図３Ｂ】
0006382194.tif 000078
【図３Ｃ】
0006382194.tif 000079
【図３Ｄ】
0006382194.tif 000080
【図４Ａ】
0006382194.tif 000081
【図４Ｂ】
0006382194.tif 000082
【図４Ｃ】
0006382194.tif 000083
【図４Ｄ】
0006382194.tif 000084
【図４Ｅ】
0006382194.tif 000085
【図４Ｆ】
0006382194.tif 000086
【図５Ａ】
0006382194.tif 000087
【図５Ｂ】
0006382194.tif 000088
【図５Ｃ】
0006382194.tif 000089
【図５Ｄ】
0006382194.tif 000090
【図６Ａ】
0006382194.tif 000091
【図６Ｂ】
0006382194.tif 000092
【図６Ｃ】
0006382194.tif 000093
【図７Ａ】
0006382194.tif 000094
【図７Ｂ】
0006382194.tif 000095
【図７Ｃ】
0006382194.tif 000096
【図７Ｄ】
0006382194.tif 000097
【図７Ｅ】
0006382194.tif 000098
【図８−１】
0006382194.tif 000099
【図８−２】
0006382194.tif 000100
【図９Ａ】
0006382194.tif 000101
【図９Ｂ】
0006382194.tif 000102
【図９Ｃ】
0006382194.tif 000103
【図９Ｄ】
0006382194.tif 000104
【図９Ｅ−１】
0006382194.tif 000105
【図９Ｅ−２】
0006382194.tif 000106
【図９Ｅ−３】
0006382194.tif 000107
【図９Ｅ−４】
0006382194.tif 000108
【図９Ｅ−５】
0006382194.tif 000109
【図９Ｅ−６】
0006382194.tif 000110
【図９Ｅ−７】
0006382194.tif 000111
【図９Ｅ−８】
0006382194.tif 000112
【図１０Ａ】
0006382194.tif 000113
【図１０Ｂ】
0006382194.tif 000114
【図１０Ｃ】
0006382194.tif 000115
【図１０Ｄ】
0006382194.tif 000116
【図１０Ｅ−１】
0006382194.tif 000117
【図１０Ｅ−２】
0006382194.tif 000118
【図１０Ｅ−３】
0006382194.tif 000119
【図１０Ｅ−４】
0006382194.tif 000120
【図１０Ｅ−５】
0006382194.tif 000121
【図１１Ａ】
0006382194.tif 000122
【図１１Ｂ】
0006382194.tif 000123
【図１１Ｃ】
0006382194.tif 000124
【図１１Ｄ】
0006382194.tif 000125
【図１１Ｅ】
0006382194.tif 000126
【図１１Ｆ】
0006382194.tif 000127
【図１２Ａ】
0006382194.tif 000128
【図１２Ｂ】
0006382194.tif 000129
【図１２Ｃ】
0006382194.tif 000130
【図１２Ｄ】
0006382194.tif 000131
【図１２Ｅ】
0006382194.tif 000132
【図１２Ｆ】
0006382194.tif 000133
【図１３Ａ】
0006382194.tif 000134
【図１３Ｂ】
0006382194.tif 000135
【図１３Ｃ】
0006382194.tif 000136
【図１３Ｄ】
0006382194.tif 000137
【図１４Ａ】
0006382194.tif 000138
【図１４Ｂ】
0006382194.tif 000139
【図１４Ｃ】
0006382194.tif 000140
【図１４Ｄ】
0006382194.tif 000141
【図１４Ｅ】
0006382194.tif 000142
【図１５】
0006382194.tif 000143
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【配列表】
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