(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. セリウム(III)イオン、クエン酸、安定剤、酸化剤、および水を含む反応混合物を形成する工程、ここで該安定剤はニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択され；および
b. 該反応混合物中にセリウム-含有ナノ粒子の分散体を形成する工程、
を含むことを特徴とする、ナノ粒子分散液の製造方法。
【請求項２】
更に、前記反応混合物を加熱または冷却する工程をも含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記反応混合物の温度が、水の沸騰温度に等しいかまたはそれ未満である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記セリウム-含有ナノ粒子が酸化セリウムを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記セリウム-含有ナノ粒子が結晶性である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、立方フルオライト晶構造によって特徴付けられる、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記酸化剤が過酸化水素を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記セリウム-含有ナノ粒子が凝集されていない、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記セリウム-含有ナノ粒子の分散液が、12ヵ月を超える期間に渡り、粒子の凝集および沈降に対して安定である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記セリウム-含有ナノ粒子の分散液が-15mV〜-30mVの範囲のゼータ電位を持つ、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記セリウム-含有ナノ粒子が、10nm未満の流体力学的径により特徴付けられる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記セリウム-含有ナノ粒子の分散液が、疾患または酸化ストレス関連事象を予防または治療するための医薬組成物として使用される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患または酸化ストレス関連事象が虚血性発作、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症または虚血再灌流傷害である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
酸化セリウム、クエン酸、並びに、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤を含むことを特徴とする、ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互引照）
本件特許出願は、2013年4月25日付で出願された、「酸化ストレスを治療するための安定化されたナノセリア(STABILIZED NANOCERIA FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS)」と題する仮特許出願第61/854,507号に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の開示を、言及により全体としてここに組入れる。
【０００２】
本発明は、一般的にナノ医薬の分野における改良に関する。特に、本発明によれば、生体適合性材料を用いて製造されたセリウム-含有ナノ粒子、このようなナノ粒子の製造方法、および神経変性疾患等の疾病を治療し、または例えば虚血性発作（ischemic stroke）に起因する酸化ストレスによる合併症を治療するための、このようなナノ粒子の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
酸化ストレスは、多くのヒトの疾患に係る病理発生および特に神経変性疾患において主な役割を演じている。従って、特定のフリーラジカル種を減じることのできる酸化防止剤による治療は、理論的には組織の損傷を防ぎ、かつ生存および神経学的転帰両者を改善するかもしれない。生理学的環境におけるフリーラジカルは、しばしば、活性酸素種(ROS)または活性窒素種(RNS)の何れかとして分類し得る。フリーラジカルは、著しく反応性の化学種であり、また細胞内レベルにてタンパク質、脂質および核酸と容易に反応し、またそれによって酸化ストレスを引起す様々な疾患および事象、例えば虚血性発作等の進行の一因となる。
ナノ医薬におけるナノセリア使用の起源は、BaileyおよびRzigalinskiの独創性に富んだ重要な研究に端を発するものであり得、該研究においては、培養中の脳細胞に対する超微細な酸化セリウム粒子の適用が、Rzigalinskiにより「ナノ粒子および細胞の延命(Nanoparticles and Cell Longevity)」と題する論文、Technology in Cancer Research & Treatment 4(6), 651-659 (2005)において記載されているように、細胞の生存性を大いに高めることが観測された。より詳しくは、Rzigalinski等の、2003年9月4日付で出願された米国特許第7,534,453号に記載されているように、インビトロでのラット脳細胞の培養物が、逆ミセルマイクロエマルション技術により合成された、2〜10ナノメータ(nm)の大きさを持つ酸化セリウムナノ粒子で処置した場合に、約3〜4倍も長く生延びることが示された。過酸化水素または紫外線照射により発生させた、致死量のフリーラジカルに暴露された培養脳細胞は、該酸化セリウムナノ粒子によってかなりの保護が与えられた。加えて、該酸化セリウムナノ粒子は、低毒性(例えば、尾部静脈注射は、全く毒性作用を生じなかった)であるために、ハツカネズミの身体において比較的不活性であるものと報告された。インビボでの医療的利益は、全く報告されていなかったが、創傷、インプラント、関節炎、関節疾患、血管の疾患、組織の老化、発作および外傷性脳損傷に関連する低減された炎症性を包含する、これらセリアナノ粒子による治療に関する利益が主張された。
【０００４】
しかし、これらの特別なナノセリア粒子に係る多くの問題点が、その後Rzigalinski等によってWO 2007/002662において開示された。この逆ミセルマイクロエマルション技術により製造されるナノセリアは、以下のような幾つかの問題を被る：(1) 粒度が、上記報告された2〜10ナノメータ(nm)という範囲に十分に制御されず、これがバッチ間の変動性を高くしているという問題；(2) 上記方法において使用される、例えばドキュセートナトリウムまたは(AOT)とも呼ばれるナトリウムビス(エチルヘキシル)スルホサクシネート等の界面活性剤の最終製品へのテーリング(tailing)が、有害な応答を引起すという問題；(3) 界面活性剤のテーリング量の制御不能性が、これらナノ粒子が生物学的媒体に配置された際に、凝集に係る問題をもたらし、これが低下された効力および送達性を結果するという問題；および(4) 経時のセリウムの原子価状態(+3/+4)の不安定性の問題。従って、該逆ミセルマイクロエマルション技術により製造される酸化セリウムナノ粒子は、バッチ毎に著しく変動し、また哺乳動物細胞に対して、望まれる以上に高い毒性を示した。
別法として、Rzigalinski等は、WO 2007/002662において、少なくとも3つの商業的供給元から得た、高温技術により合成されたナノセリアの生物学的効力を記載している。酸化セリウムナノ粒子のこれら新たな起源は、バッチ同志の活性における優れた再現性を与えることを報告した。これは、更に、源とは関係なしに、小さなサイズ、狭い粒度分布、および低い凝集率を持つ酸化セリウム粒子が、最も有利であることをも報告した。サイズに関連して、この開示は、粒子が細胞内部に取込まれる態様において、該細胞内に取込まれる粒子の好ましい粒度範囲が約11nm〜約50nm、例えば約20nmであることを、具体的に教示している。粒子が、細胞外から該細胞にその効果を及ぼす態様において、これら細胞外粒子の該好ましい粒度範囲は、約11nm〜約500nmである。
【０００５】
これら発明者等(Rzigalinski等)は、また送達に対して、該ナノ粒子が有利なことに非凝集形状にあったことをも報告している。これを実現するために、彼らは、約10質量％の原液が、超高純度水または超高純度水を用いて調製した標準的な生理食塩水中で超音波処理し得ることを報告した。しかし、他の者が言及しているように、高温技術により合成したナノセリア(例えば、商業的供給元から得た)の超音波処理された水性分散液が、著しく不安定であり、また迅速に(即ち、数分以内に)沈降して、これら源由来のナノセリアの水性分散液を投与する際に、実質的な変動性を引起すことを、われわれは観測している。
Hardas等の論文Toxicological Sciences 116(2), 562-576 (2010)は、Masui等によるJ. Mater. Sci. Lett. 21, 489-491 (2002)の直接的2-段階水熱製造法により調製されたナノセリアの水性分散液に係る生体分布および毒性学的効果について報告しており、ここで該分散液にはクエン酸ナトリウムが生体適合性安定剤として含まれている。高解像度のTEMは、この形状のナノセリアが、鋭い端部および4〜6nmという狭い粒度分布を持つ、結晶性多面体型粒子形態を有していることを明らかにした。これらシトレートで安定化されたセリアナノ粒子分散液は、7.35という生理的pHにおいて2ヵ月を超える期間に渡り安定であることが報告された。従って、投与前の超音波処理は必要とされなかった。
しかし、全く意外なことに、彼らは、以前に研究された商業的供給元から得たナノセリア[アルドリッチケミカル社(Aldrich  Chemical Co.)、カタログNo.639648]と比較して、この型の、シトレートで安定化されたナノセリアが、より毒性が強く、また脳内には見られず、しかも海馬および小脳に対する酸化ストレス作用を殆ど示さなかった。
【０００６】
DiFrancesco等は、同一の出願人に譲渡された、2007年9月4日付で出願された、「二酸化セリウムナノ粒子の製法(METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES)」と題するPCT/US2007/077545において、生体適合性安定剤、例えばクエン酸(CA)、乳酸、酒石酸、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、およびこれらの組合せの存在下での、低pH(<4.5)における過酸化水素によるセリウム(III)イオンの酸化を記載している。具体的には、該安定剤である乳酸および乳酸とEDTAとの組合せが、3〜8nmの範囲の平均粒度を持つナノセリアの安定な分散液を直接生成することが示されている。
Reed等は、同一の出願人に譲渡された、2013年3月15日付出願の、「酸化ストレスを治療するためのナノセリア(NANOCERIA FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS)」と題するUS2013/0337083において、クエン酸(CA)とEDTAとの組合せを用いて調製したナノセリアにより処置されたマウスに対する海馬細胞温存の相乗的な増加を記載しており、ここでモル比：CA/EDTAは3.0〜0.1の範囲にある。疾患進行の改善および運動行動テストにおける改善は、結果として慢性進行性多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症および虚血再灌流傷害のハツカネズミモデルをもたらした。
前に記載された如く、セリウム-含有ナノ粒子の生体適合性分散液、特にクエン酸またはシトレートイオンにより安定化されたこれら分散液を調製するための様々な方法が報告されている。しかし、例えば酸化ストレス関連疾患および事象、例えば虚血性発作の作用を処置するために使用される、クエン酸安定化セリウム-含有ナノ粒子分散液のフリーラジカル掃去能力における更なる改善に対する要求が残されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一局面によれば、ナノ粒子分散液の製造方法が提供され、該方法は、セリウム(III)イオン（cerous ion）、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤、酸化剤、および水を含む反応混合物を形成する工程、場合により該反応混合物を加熱または冷却する工程、およびこれにより該反応混合物中でセリウム-含有ナノ粒子の分散体を形成する工程を含む。
本発明の二局面においては、酸化ストレス関連疾患および事象、例えば虚血性発作を治療する方法が提供され、該方法は、疾患または事象の発症前、その間またはその後に、クエン酸と、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤との混合物の存在下で調製された、セリウム-含有ナノ粒子を投与することを含む。
本発明の三局面においては、セリウム、クエン酸およびニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤を含有するナノ粒子が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
具体的に示されあるいは説明されていない要素は、当業者には周知の様々な形態をとることができるものと理解すべきである。本発明は、特許請求の範囲によって規定される。
本件出願において、ナノ粒子という用語は、100nm未満の平均径を持つ粒子を含む。本開示の目的にとって、特に述べない限り、ナノ粒子の径とは、その流体力学的径を言い、これは動的光散乱技術によって決定され、また分子状吸着物質および該粒子の同伴する溶媒和シェルを含む。あるいはまた、幾何学的粒子径は、透過型電子顕微鏡(TEM)による分析によって見積もることができる。
本件出願において、様々なセリウム-含有材料が、「酸化セリウム」または「ニ酸化セリウム」として名目上説明される。これら材料中に存在する実際の酸化物系アニオン(oxidic anions)が、酸化物アニオンまたは水酸化物アニオン、またはこれらの混合物、例えば水和酸化物相(例えば、オキシヒドロキシド)を含む可能性があることは、化学分野の当業者には理解されている。更に、組成物が、多価カチオンの固溶体で構成されている可能性があり、また非化学量論的固体と呼ばれていることは公知である。従って、多数の酸化状態を持つ金属カチオンで構成される酸化物相については、バルク相内に存在する酸化物系アニオンの全量は、荷電の中性性が維持されているような、存在する該金属カチオンの様々な酸化状態(例えば、Ce3+およびCe4+)の特定の量によって決定されるであろうことが分かっている。名目上金属二酸化物として記載される非-化学量論的な相に関連して、これは化学式：MO2-δで具体的に示され、ここにおいて該値δ(デルタ)は変動し得る。酸化セリウム、CeO2-δに関連して、該値δ(デルタ)は、典型的に約0.0〜約0.5の範囲にあり、前者はセリウム(IV)酸化物、CeO2を意味し、後者はセリウム(III)酸化物、CeO1.5(あるいはまたCe2O3を意味する)を示す。あるいはまた、該δ(デルタ)の値は、セリウム(IV)酸化物(CeO2)に対する存在する酸素空孔の量を意味する。存在する各酸素ジアニオン空孔に対して、2つのセリウム(III)イオン(Ce3+)が存在して、荷電の中性性を維持している。
【０００９】
本発明の一局面においては、ナノ粒子分散液を製造する方法が提供され、該方法は、セリウム(III)イオン、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤(キレート化剤)、酸化剤を含有する反応混合物を形成する工程、場合により該反応混合物を加熱または冷却する工程およびこれによって該反応混合物中でセリウム-含有ナノ粒子分散体を形成する工程を含む。
少なくとも一つの態様によれば、クエン酸対上記安定剤のモル比は約0.1:0.9〜約0.9:0.1、例えば約0.25:0.75〜約0.75:0.25、または約0.4:0.6〜約0.6:0.4の範囲であり得る。少なくとも一つの態様において、該クエン酸および安定剤は、約0.5:0.5のモル比で存在する。
本発明の一態様においては、ナノ粒子分散液の製造方法が提供され、該方法は、セリウム(III)イオン、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤、酸化剤、および水を含有する反応混合物を形成する工程、場合により該反応混合物を加熱または冷却する工程、および該ナノ粒子を単離することなしに、該反応混合物中でセリウム-含有ナノ粒子分散体を直接形成する工程を含む。
【００１０】
様々な態様において、上記酸化剤は、分子状酸素(または空気からなる周囲雰囲気)よりも一層酸化性の高い化合物を含む。他の態様において、該酸化剤は、標準水素電極に対して-0.13Vを超える水性半-電池還元電位を持つ。少なくとも一つの態様において、該酸化剤は、アルカリ金属またはアンモニウム過塩素酸塩、塩素酸塩、次亜塩素酸塩または過硫酸塩；オゾン、パーオキサイドまたはこれらの組合せである。少なくとも一つの態様においては、2-電子酸化剤、例えば過酸化水素を使用する。少なくとも一つの態様によれば、過酸化水素はセリウム(III)イオンのモル量の1/2を超える量で存在する。更に別の態様において、存在する該酸化剤の量は、存在するセリウムイオンまたは他の金属イオンの量との関連で広い範囲で変動する。
少なくとも一つの態様においては、分子状酸素が、上記反応混合物に通される。
様々な態様において、上記反応混合物の温度は周囲温度を超えるかまたはそれ未満である。少なくとも一つの態様において、該反応混合物は、20℃を超える温度または20℃に等しいかまたはそれ未満の温度まで加熱されまたは冷却される。様々な態様において、該反応混合物は約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃または約90℃を超える温度まで加熱されまたは冷却される。もう一つの態様において、該反応混合物は、水の沸騰温度に等しいかまたはそれ未満の温度まで加熱されまたは冷却される。
【００１１】
様々な態様において、上記形成されたナノ粒子は、アモルファス、半-結晶性または結晶性である。ここにおいて使用する場合、用語「結晶性」とは、特に述べない限り、少なくとも幾分かの結晶構造を持つ、即ち半-結晶性または結晶性の何れかのナノ粒子を説明するのに使用される。少なくとも一つの態様において、該形成されたナノ粒子は、立方フルオライト晶構造により特徴付けられる。少なくとも一つの態様によれば、該形成されたナノ粒子は、酸化セリウム結晶構造により特徴付けられる。
少なくとも一つの態様において、上記形成されたナノ粒子の結晶化度は、上記反応混合物の加熱により高められる。
少なくとも一つの態様によれば、上記形成されたナノ粒子は、上記反応混合物の加熱により脱水または脱ヒドロキシル化される。
様々な態様において、上記セリウム-含有ナノ粒子分散液は、実質的に非凝集ナノ粒子、90％を超える非凝集ナノ粒子、95％を超える非凝集ナノ粒子、98％を超える非凝集ナノ粒子、および完全に非凝集ナノ粒子を含む。
少なくとも一つの態様において、上記非凝集ナノ粒子は結晶性であり、あるいはまた単粒子微結晶または個々の微結晶と呼ばれる。
様々な態様において、上記形成されたナノ粒子は、100nm未満、20nm未満、10nm未満、5.0nm未満、3.0nm未満または約2.0nm未満の流体力学的径を持ち、かつ約1.0nmを超える流体力学的径を持つ。
少なくとも一つの態様において、セリウムを含むナノ粒子が提供される。他の態様においては、酸化セリウム、水酸化セリウムまたはセリウムオキシヒドロキシドを含むナノ粒子が提供される。
【００１２】
少なくとも一つの態様によれば、セリウム、クエン酸およびニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸からなる群から選択される安定剤を含むナノ粒子が提供される。
様々な態様において、上記形成されたナノ粒子分散液は、約-30mV〜約+30mVの範囲のゼータ電位によって特徴付けられる。少なくとも一つの態様において、該ナノ粒子分散液のゼータ電位は、約-15mV〜約-30mVの範囲にある。
他の態様において、上記ナノ粒子のゼータ電位は、上記ナノ粒子分散液のpHを調節し、安定剤の型およびその量を調節し(例えば、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレングリコール四酢酸またはジエチレントリアミン五酢酸の含有率を飽和被覆度(saturation coverage)未満に)、またはこれら両者を調節することにより変更される。
少なくとも一つの態様において、上記の形成されたナノ粒子分散液は、過剰量のイオンまたは副生物の塩を除去するために洗浄される。様々な態様において、該ナノ粒子分散液は、そのイオン導電率が、単位センチメートル当たり約15ミリシーメンス(mS/cm)未満、約10mS/cm未満、約5mS/cm未満または約3mS/cm未満まで低下されるように洗浄される。様々な態様において、該形成されたナノ粒子分散液は、透析または透析濾過によって洗浄される。
少なくとも一つの態様によれば、上記の形成されたナノ粒子分散液は、過剰量の溶媒または過剰量の水を除去するために濃縮される。様々な態様において、該ナノ粒子分散液は透析濾過または遠心分離により濃縮される。
様々な態様において、前記分散液中のナノ粒子の濃度は、約0.05重量モル(molal)を超え、約0.5重量モルを超え、または約2.0重量モルを超える(与られた分散液中に約35％の固形分)。
【００１３】
様々な態様において、上記ナノ粒子の粒度分布は、実質的に単峰性である。他の態様において、該ナノ粒子のサイズは、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満または約5％未満の変動係数(COV)を持ち、ここで該COVは平均値で割った標準偏差として定義される。
様々な態様において、上記セリウム-含有ナノ粒子の分散液は、例えば3か月を超え、6ヵ月を超え、9ヵ月を超え、12ヵ月を超え、および16ヵ月を超える期間に渡って、透明な（clear）液状外観を維持することによって立証されるように、粒子の凝集および沈降に対して安定である。
様々な態様において、上記反応混合物は、バッチ式反応器、連続式反応器またはコロイドミル内で形成される。少なくとも一つの態様において、該連続式反応器は、連続攪拌タンク式反応器またはプラグフロー反応器である。
少なくとも一つの態様においては、ミキサを使用して、上記反応体を攪拌し、かつ混合することができる。様々な態様においては、攪拌子、マリンブレードプロペラ、ピッチブレードタービンまたはフラットブレードタービンを含むミキサが使用される。少なくとも一つの態様において、上記反応混合物を強制的にスクリーンに通す、高剪断ミキサが使用され、ここで該スクリーンの孔サイズは、1mmの数分の一乃至数mmの範囲で変動する。
生理的なpHは、典型的に約7.2〜約7.4の範囲にある。
【００１４】
如何なる理論にも拘泥しないが、炎症および酸化ストレス関連疾患(例えば、ROS媒介疾患)の治療のための、提案された酸化セリウムの使用は、一部には酸化セリウムがフリーラジカルの接触的な掃去剤として機能し得るとの確信に基いている。Ce3+およびCe4+の混合原子価状態にあるセリウムの存在およびその容易な相互変換性は、酸化セリウムが、接触的または自己再生的様式で、フリーラジカルをより毒性の低い種に還元および/または酸化することを可能とし得る。レドックス反応が、組織-損傷性のフリーラジカルを中和する酸化セリウムナノ粒子(CeNPs)表面上で起こり得る。例えば、超酸化物アニオン(O2−)を分子状の酸素に酸化し、ペルオキシニトライトアニオン(ONOO-)を生理的に良性の種に酸化し、およびヒドロキシルラジカル(・OH)をヒドロキシドアニオンに還元することが望ましいものと考えられている。このことは、順に、例えば酸化ストレス関連疾患および事象を治療するのに一般に利用し得る犠牲的酸化防止剤に比較して、大幅に減じられた投与計画を可能とするかもしれない。
少なくとも一つの態様において、投与された本発明のナノセリア粒子は、細胞膜を介して細胞内に取込まれ、また細胞質内にまたは様々な細胞内小器官、例えば核およびミトコンドリア内に存在する。他の態様において、本発明のナノセリア粒子は、血管内または間質性空間内に存在し、そこで該粒子は、フリーラジカルを排除しまたは自己免疫応答を減じることにより、酸化ストレスおよび炎症を減じることができる。少なくとも一つの態様において、血液脳関門(BBB)または血液脳脊髄液関門(BCFB)または眼血液関門(BOB)の崩壊に起因する中枢神経系の免疫系侵襲は、本発明のナノセリア粒子によって調節される。
【００１５】
もう一つの態様において、本発明のナノセリア粒子は、哺乳動物の血液脳関門を横断することのできる粒子である。様々な態様において、本発明のナノセリア粒子は、哺乳動物の血液脳関門を横断し、また脳実質組織内に、約100nm未満、約50nm未満、約20nm未満、約10nm未満、約5nm未満のサイズを持つ凝結体または凝集体として存在する。少なくとも一つの態様において、本発明のナノセリア粒子は、哺乳動物の血液脳関門を横断し、また脳実質組織内に、約3.5nm未満のサイズの独立した非凝集ナノ粒子として存在する。
少なくとも一つの態様において、本発明のナノセリア粒子を含む医薬組成物は、具体的には酸化ストレス関連疾患および事象の予防および/または治療を意図するものであり、該酸化ストレス関連疾患および事象は、数ある中で、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋委縮性側索硬化症(ALS)、運動失調症、フリードライヒ運動失調症、自閉症、強迫性障害、注意欠陥多動障害、偏頭痛、発作、外傷性脳損傷、癌、炎症、自己免疫疾患、狼瘡、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、狭窄症、再狭窄、粥状動脈硬化症、メタボリックシンドローム、内皮機能不全、血管痙攣、糖尿病、老化、慢性疲労、冠動脈性心疾患、心線維症、心筋梗塞、高血圧症、狭心症、プリンツメタル狭心症、虚血症、血管形成、低酸素症、克山病、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠乏症、ソラマメ中毒症、虚血性再灌流障害、リウマチ様および変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患(例えば、肺気腫および気管支炎)、アレルギー、急性呼吸窮迫症候群、慢性腎疾患、腎移植、腎炎、電離放射性損傷、日焼け、皮膚炎、黒色腫、乾癬、黄班変性症、網膜変性症、白内障形成を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
様々な態様によれば、本発明のナノセリア粒子を含有する医薬組成物は、具体的には、例えばミトコンドリア機能不全、リソソームおよびプロテアソーム機能不全、核酸(例えば、RNAおよびDNA)の酸化、チロシンのニトロ化、リン酸化媒介シグナル伝達カスケードの喪失、アポトーシスの開始、脂質過酸化および膜脂質環境の破壊を含むが、これらに限定されない酸化ストレス関連細胞性病理の予防および/または治療を意図している。
様々な態様において、本発明のナノセリア粒子を含有する医薬組成物は、ヒトまたはヒト以外の対象、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまたは齧歯目の動物等を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物等に投与される。あるいはまた、該投与の対象は鳥類、昆虫、爬虫類、両生類、または任意のコンパニオンアニマルまたは農業動物等であり得る。
【００１７】
様々な態様において、本発明のナノセリア粒子は注射、輸液または移植を含む局所的、経腸または腸管外投与法により、対象に対してインビボにて投与される。より詳しくは、本発明のナノセリア粒子を、以下の経路の何れかによって投与することが、具体的には意図されている：耳介(耳)、頬、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管、静脈洞内(endosinusial)、気管内、腸内、表皮、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、動脈内、胆管内、気管支内、滑液嚢内、心臓内、軟骨内、尾側内、空洞内、腔内、大脳内、小脳延髄槽内、角膜内、イントラコルナル-歯科(intracornal-dental)、心臓内、イントラコーポラス(intracorporus)海綿体、皮内、円板内、腺管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、髄質内、髄膜内、筋肉内、眼球内、卵巣内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、洞内、髄腔内、髄液嚢内、腱内、精巣内、鞘内、胸郭内、小管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、脈管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内持続点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン導入、灌注、経咽頭、経鼻、経鼻胃、密封包帯技術、経眼、経口、経口咽頭、腸管外、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、経直腸、経呼吸(吸入)、球後、柔組織、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所的、経皮的、経乳房、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、膣、および任意の他のまたは指定されていない経路。
その他の態様において、本発明のナノセリア粒子は、医療デバイスまたは人工器官、例えばカニューレ、カテーテルまたはステント内またはその表面上に保持され、それにより局所的または全身的に、短期または長期の何れかに渡り炎症を減じる。
【００１８】
様々な態様において、本発明のナノセリア粒子は、当分野において公知の任意の適当な形状で送達され、該形状は、懸濁剤、ゲル剤、錠剤、腸溶被覆錠剤、担持リポソーム、散剤、坐剤、注入剤、ロゼンジ、クリーム、ローション、軟膏、または吸入薬を含むが、これらに限定されない。
様々な態様において、本発明のナノセリア粒子は、例えば水、塩、緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、砂糖、ヒトまたは牛血清アルブミン、脂質、薬剤、着色剤、香味量、バインダ、ガム、界面活性剤、フィラーまたは当分野において公知の任意の賦形剤を含むが、これらに限定されない他の製薬上許容される物質と併用される。
少なくとも一つの態様において、本発明のナノセリア粒子を含むビヒクルは、投与前に滅菌される。
他の態様において、細胞または細胞培養物は、1または複数の本発明のナノセリア粒子と接触させられる。接触は、インビトロまたは体外法により細胞または細胞培養物を暴露することによって行うことができ、ここで後者の方法は、処理された1または複数の該細胞を、対象内に、例えば初めに該1または複数の細胞を得た対象内に再導入することを含む。様々な態様において、該細胞は性質において原核または真核生物性である。少なくとも一つの態様において、該処理された細胞は、例えば抗原、抗体およびワクチン等であるがこれらに限定されない生物製剤として一般的に知られている、製薬工業において使用されるタンパク質の製造において用いられる。もう一つの態様において、該処理された細胞は発酵工程において利用される。
【実施例】
【００１９】
本発明は、更に以下の実施例により例証されるが、これらの実施例は、本発明を如何様にも限定するものではない。
ナノ粒子散乱およびサイズ評価
上記粒子分散液の簡単な定性的特徴付けは、赤色レーザー式ペンライトにより照明された場合の、純粋溶媒サンプル由来の散乱量に対する、該分散液により示されたチンダル散乱の度合いを評価することにより行われる。該ナノ粒子分散液の粒度に関する定量的な評価は、クォーツキュベットを備えている、ブルックヘブン90プラス粒度解析装置(Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer)(米国、N.Y.州、ホルツビル(Holtzville, New York, U.S.A.)のブルックヘブンインスツルメンツ社(Brookhaven Instruments Corp.)製)を用いた、動的光散乱(DLS)によって行った。報告されたDLSサイズは、対数正規数加重パラメータである。
ナノ粒子電荷の評価
該ナノ粒子電荷の定量的評価は、マルバーンインスツルメンツ(Malvern Instruments)からのゼータサイザーナノZS(Zetasizer Nano ZS)を用いて、ゼータ電位を測定することにより行われた。
【００２０】
実施例1：セリウムおよびクエン酸を用いたナノ粒子の製造
磁気攪拌子を含む800mLのガラスビーカーに、500mLの高純度(HP)水を導入した。次に、この水を約70℃まで加熱し、またその中に4.83gのクエン酸(CA)を溶解させた。水酸化アンモニウム(28-30%)を、該溶液のpHを約8.5に調節するために添加した。該反応容器の温度を約80℃まで高めた。10.0gの量のCe(NO3)3.6(H2O)を、30mLのHP水に溶解させ、この溶液を、数分間かけて該攪拌された反応混合物に徐々に添加した。このようにして、等モル量のCAおよびCeを、該反応混合物に添加した。次に、4.8mLの50% H2O2(H2O2対セリウムのモル比：3.0)を含有する50mLの溶液を、数分間かけて、セリウム(III)イオンおよびクエン酸を含む上記等モル反応混合物に徐々に添加した。得られる反応生成物を覆い、次いで更に1時間加熱したところ、結果的に透明な黄色の懸濁液が得られた。攪拌しつつ冷却した後、該直接的に形成されたナノ粒子分散液を、イオン導電率が約10mS/cm未満となるまで透析濾過することにより洗浄して、過剰の塩を除去した。
上記最終的な生成物としての分散液は、低強度レーザー(LASER)ビームで照明した場合に、このものが十分に分散されたコロイド粒子を含んでいることを意味する、高い割合のチンダル散乱を示す、透明な黄色液体であった。動的光散乱による粒度分析は、平均流体力学的径が7.8nmであることを示した。X-線回折(XRD)スペクトルの解析は、立方フルオライト晶構造によって特徴付けられるCeO2(PDF # 34-394、セリアナイト)と等構造の主結晶相の存在を示した。平均結晶サイズが2.0nmであることが、シェラー(Scherrer)法を利用した(220)ピーク幅の分析により決定された。
【００２１】
実施例2：セリウム、クエン酸およびDCTAを用いたナノ粒子の製造
磁気攪拌子を含む600mLのガラスビーカーに、500mLの高純度(HP)水を導入した。2.41gの量のクエン酸(CA)を該反応混合物に添加した。4.264gの量の1,2-ジアミノシクロヘキサン四酢酸一水和物(DCTA)を、溶解を助けるための約6mLの水酸化アンモニウムと共に、水に溶解し、また該反応混合物に添加した。水酸化アンモニウム(28-30%)を、該溶液のpHを約8.5に調節するために添加した。10.0gの量のCe(NO3)3.6(H2O)を添加した。モル比率CA/DCTA/Ceは、0.5/0.5/1.0であった。次に、4.8gの50% H2O2(H2O2対セリウムイオンのモル比：3.0)を含有する10mLの溶液を上記セリウム、クエン酸およびDCTA溶液混合物に徐々に添加した。得られる反応生成物を、次に80℃にて1時間加熱した。攪拌しつつ冷却した後、該直接的に形成されたナノ粒子分散液を、イオン導電率が約10mS/cm未満となるまで透析濾過することにより洗浄して、過剰の塩を除去した。
冷却後、上記最終的な生成物としての分散液は、低強度レーザービームで照明した場合に、このものが十分に分散されたコロイド粒子を含んでいることを意味する、高い割合のチンダル散乱を示す、透明な淡橙色の液体であった。動的光散乱による粒度分析は、流体力学的径が2.6nmであり、多分散性が0.227であることを示した。X-線回折(XRD)スペクトルの解析は、立方フルオライト晶構造によって特徴付けられるCeO2(PDF # 34-394、セリアナイト)と等構造の主結晶相の存在を示した。平均結晶サイズが1.9nmであることが、シェラー(Scherrer)法を利用した(220)ピーク幅の分析により決定された。
【００２２】
実施例3：セリウム、クエン酸およびNTAを用いたナノ粒子の製造
磁気攪拌子を含む600mLのガラスビーカーに、500mLの高純度(HP)水を導入した。2.41gなる量のクエン酸(CA)を該反応混合物に添加した。3.129gの量の2,2’,2”-ニトリロ三酢酸(NTA、CAS No. 139-13-9)を、溶解を助けるための水酸化アンモニウムと共に、水に溶解し、また該反応混合物に添加した。水酸化アンモニウム(28-30%)を、該溶液のpHを約8.5に調節するために添加した。10.0gなる量のCe(NO3)3.6(H2O)を添加した。モル比率CA/NTA/Ceは0.5/0.5/1.0であった。次に、4.8gの50% H2O2(H2O2対セリウムイオンのモル比：3.0)を含有する10mLの溶液を上記のセリウム、クエン酸およびNTA溶液混合物に徐々に添加した。次いで、該反応生成物を80℃にて1時間加熱した。攪拌しつつ冷却した後、該直接的に形成されたナノ粒子分散液を、イオン導電率が約10mS/cm未満となるまで透析濾過することにより洗浄して、過剰の塩を除去した。
上記最終的な生成物としての分散液は、低強度レーザービームで照明した場合に、このものが十分に分散されたコロイド粒子を含んでいることを意味する、高い割合のチンダル散乱を示す、透明な黄色液体であった。動的光散乱による粒度分析は、流体力学的径が2.8nmであり、多分散性が0.264であることを示した。
【００２３】
実施例4：セリウム、クエン酸およびEDTAを用いたナノ粒子の製造
磁気攪拌子を含む600mLのガラスビーカーに、500mLの高純度(HP)水を導入した。2.41gなる量のクエン酸(CA)を該反応混合物に添加した。4.497gの量のエチレングリコール四酢酸(EGTA、CAS No. 67-42-5)を、溶解を助けるための水酸化アンモニウムと共に、水に溶解し、また該反応混合物に添加した。水酸化アンモニウム(28-30%)を、該溶液のpHを約8.5に調節するために添加した。10.0gなる量のCe(NO3)3.6(H2O)を添加した。モル比率CA/EGTA/Ceは0.5/0.5/1.0であった。次に、4.8gの50% H2O2(H2O2対セリウムイオンのモル比：3.0)を含有する10mLの溶液を上記のセリウム、クエン酸およびEGTA溶液混合物に徐々に添加した。次いで、該反応生成物を70℃にて1時間加熱した。攪拌しつつ冷却した後、該直接的に形成されたナノ粒子分散液を、イオン導電率が約10mS/cm未満となるまで透析濾過することにより洗浄して、過剰の塩を除去した。
上記最終的な生成物としての分散液は、低強度レーザービームで照明した場合に、このものが十分に分散されたコロイド粒子を含んでいることを意味する、高い割合のチンダル散乱を示す、透明な橙色の液体であった。動的光散乱による粒度分析は、流体力学的径が8.5nmであり、多分散性が0.393であることを示した。
【００２４】
実施例5：セリウム、クエン酸およびDTPAを用いたナノ粒子の製造
磁気攪拌子を含む600mLのガラスビーカーに、500mLの高純度(HP)水を導入した。2.89gなる量のクエン酸(CA)を該反応混合物に添加した。3.606gの量のジエチレントリアミン五酢酸(DTPA、CAS No. 67-43-6)を該反応混合物に添加した。水酸化アンモニウム(28-30%)を、該溶液のpHを約8.5に調節するために添加した。10.0gなる量のCe(NO3)3.6(H2O)を添加した。モル比率CA/DTPA/Ceは0.6/0.4/1.0であった。次に、4.8gの50% H2O2(H2O2対セリウムイオンのモル比：3.0)を含有する10mLの溶液を上記のセリウム、クエン酸およびDTPA溶液混合物に徐々に添加した。次いで、該反応生成物を80℃にて1時間加熱した。攪拌しつつ冷却した後、該直接的に形成されたナノ粒子分散液を、イオン導電率が約10mS/cm未満となるまで透析濾過することにより洗浄して、過剰の塩を除去した。
上記最終的な生成物である分散液は、低強度レーザービームで照明した場合に、このものが十分に分散されたコロイド粒子を含むことを意味する、高い割合のチンダル散乱を示す、透明な赤色の液体であった。動的光散乱による粒度分析は、流体力学的径が2.4nmであり、多分散性が0.212であることを示した。X-線回折(XRD)スペクトルの解析は、立方フルオライト晶構造によって特徴付けられるCeO2(PDF # 34-394、セリアナイト)と等構造の主結晶相の存在を示した。平均結晶サイズが2.1nmであることが、シェラー(Scherrer)法を利用した(220)ピーク幅の分析により決定された。
【００２５】
上記最終製品としての分散液のサンプルは、暗所において、周囲温度および圧力にて、16か月を超える期間に渡り、該液体の透明度における如何なる変化も、また粒子の流体力学的径および多分散性における如何なる変化も無しに保存された。
虚血性発作のハツカネズミモデルにおける安定化されたナノセリアの評価
セリウム-含有ナノ粒子(例えば、ナノセリア)の酸化ストレスを減じる能力を、Estevez, AY等により「虚血のマウス海馬脳スライスモデルにおける酸化セリウムナノ粒子のニューロン保護メカニズム(Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia)」と題する文献：Free Radic. Biol. Med. (2011)51(6):1155-63 (doi:10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)において記載された、虚血のインビトロマウス海馬脳スライスモデルの改良において評価した。
成体(月齢2-5か月)のCD1マウスを、迅速な断頭によって殺し、その脳を素速く取出し、冷却されたコリン-ベースのスライス処理溶液内に配置した。該スライス処理溶液は、24mMのコリン重炭酸塩、135mMのコリンクロリド、1mMのキヌレン酸、0.5mMのCaCl2、1.4mMのNa2PO4、10mMのグルコース、1mMのKCl、および20mMのMgCl2を含んでいた(315mOsm)。厚み400μmの横断海馬スライスを、ライカVT1200ビブラトーム(Leica VT1200 Vibratome)[ドイツ、ベツラーのライカマイクロシステムズ(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)]を用いて、前部-尾部軸(-1.2〜-2.8mm前項)に沿って裁断し、また調節された人工脳脊髄液(aCSF)中で1時間に渡り回復させた。該人工脳脊髄液(pH 7.4、300mOsm)は、124mMのNaCl、3mMのKCl、2.4mMのCaCl2、1.3mMのMgSO4、1.24mMのK3PO4、26mMのNaHCO3、10mMのグルコースを含み、また5% CO2、95% O2ガスで通気された。海馬スライスは培養皿内に配置され、ヌエール(NuAire)加湿インキュベータ(米国、MN州、プリマスのヌエール(NuAire, Plymouth, MN, USA))内で、5% CO2、37℃にて48時間までの期間に渡り保存された。
【００２６】
虚血による酸化ストレスを、低血糖で、酸性および低酸素性のaCSF(グルコースおよびpHを、夫々2mMおよび6.8に低下させ、かつ該溶液を、84% N2、15% CO2、および1% O2で通気した)中に、上記脳スライスを37℃にて30分間配置することにより誘発させた。スクロースを添加して、該溶液の重量オスモル濃度を約295mOsmに維持した。
上記実施例1-5において記載したようにして製造した、セリウム-含有ナノ粒子の水性分散液を、1mLのaCSFまたは媒体(5.8μMに等価)当たり1μgという放出体積で、適合用量(matched doseage)にて、該虚血事象の発現時点において投与し、またこの実験の残り全体を通して該媒体中に維持した。コントロールスライスには、等体積のビヒクルコントロールが与えられた。蒸留水のみ、食塩溶液、Na-シトレート溶液、PBS、およびこれらの組合せを包含する、様々な送達用ビヒクルが、ここに記載した如く製造された酸化セリウムナノ粒子について使用されたが、同様な成功をもたらした。
30分間に及ぶ酸化ストレス(虚血状態)への暴露後、上記生きた脳のスライス(テストおよびコントロール)を、培地およびミリポアインサート(Millipore inserts(米国、MA州、ビラーリカのミリポア(Millipore, Billerica, MA, USA))を含有する35mmの培養皿内に配置することにより、器官培養液中で24時間に渡りインキュベートした。培地は50％最小必須培地[米国、UT州、ローガンのハイクロンサイエンティフィック(Hyclone Scientific, Logan UT, USA)]、25%のウマ血清、25%のハンクス(Hank’s)平衡塩溶液(28mMのグルコース、20mMのHEPESおよび4mMのNaHCO3を補充)、50U/mLのペニシリン、および50μl/mLのストレプトマイシンを含んでおり、pHは7.2であった。
【００２７】
細胞死の程度を、蛍光イメージング技術を用いて、上記酸化傷害の後24時間測定した。上記テスト条件(即ち、セリウム-含有ナノ粒子を投与した)において観察された各群の脳スライスは、ビヒクルのみの投与を除き、あらゆる点において同等に処理された同様な群のコントロール脳スライスと一致していた。即ち、各観察日において、月齢-一致かつ性別-一致の同腹子から取出した二群の解剖学的に一致する脳スライスを、該テスト条件(即ち、セリウム-含有ナノ粒子を投与)またはコントロール(ビヒクルのみ)の何れかに付した。蛍光イメージングの測定中に、その光の強度、画像取得期間、および画像収集タイミングは、該テスト条件およびビヒクルコントロール脳スライスに対して同等であった。結果を、該テスト条件における蛍光の、実験シーケンスにおける同一の時間点において撮像された該一致させたコントロールスライスにおける蛍光に対する比として表した。
酸化傷害後の24時間の時点において、対をなす(コントラストおよびテスト)脳スライスを、0.81μMの生体排除染料のサイトックスグリーン(SYTOXTM Green)(米国CA州、カールバッドのインビトロゲン(Invitrogen, Carlbad, CA, USA)社)を含む培地内で20分間インキュベートし、引続き15-20分間培地中で洗浄して、組込まれなかった染料を除去した。サイトックスグリーンは、DNAおよびRNAと結合する蛍光染料である。しかし、これは、完全な生きた細胞内では、その細胞膜により細胞核から排除される。従って、これは生体染料として作用し、かつ細胞膜が透過性となっており、結果的に該染料が該細胞内に侵入する、死細胞および瀕死の細胞のみを染色する。染色しかつ洗浄した後、脳スライスを、落射蛍光付属品および150-Wのキセノン光源[米国、NY州、ハイランドミルズのオプティキップ(Optiquip, Highland Mills, NY, USA)]を備えた、ニコン(Nikon) TE 2000-U[米国、NY州、メルビルのニコンインスツルメンツ(Nikon Instruments, Melville, NY, USA)]顕微鏡のステージに移した。コントロールaCSF溶液を、60-mLの注射器に装入し、95% O2/5% CO2で平衡化させ、またサーボ-制御された注射器ヒータブロック、ステージヒータ、およびインライン灌流ヒータ[米国、CT州、ハンデンのワーナーインスツルメンツ(Warner Instruments, Hamden, CT, USA)]を用いて37℃に加熱した。該脳の切片を、加温され、95% O2/5% CO2で平衡化されたaCSFで、1mL/分の割合にて連続的に灌流した。5分後、各コントロールおよびテスト脳スライスの海馬形成に係る画像を、同一条件(即ち、光の強度、暴露時間、カメラ取得パラメータ)の下で、4xプランフロア(Plan Flour)対物レンズ[ニコンインスツルメンツ(Nikon Instruments)]を使用して集めた。サイトックスグリーンの蛍光は以下のようにして測定した。即ち、短期間(620ms)、該組織を480±40nmにて励起させ、505nmのロングパスダイクロイックミラー[米国、VT州、ベニントンのクローマテクノロジー(Chroma technology, Bennington, VT, USA)]を用いて、プローブから放出される蛍光(535±50nm)を濾波し、増幅させ、かつ冷却されたCCDゲインEMカメラ[ハママツ(Hamamatsu) CCD EM C9100、米国、NJ州、ブリッジウォータ(Bridgewater, NJ, USA)]を用いて測定した。そのディジタル画像は、コンピクスシンプルPCI6.5ソフトウエア(Compix SimplePCI 6.5 software)[米国、PA州、クランベリータウンシップのCイメージングシステムズ(C Imaging Systems, Cranberry Township, PA, USA)]により取得し、かつ処理した。
【００２８】
該サイトックスグリーンの装入に起因する光強度は、計算された領域内における死細胞または瀕死細胞数を反映した。該光強度測定は、上記コンピクスシンプルPCI6.5ソフトウエアを用いて自動的に行い、それにより対象とする領域の選択における実験者バイアスを排除した。
細胞死における減少は、上記テスト条件(即ち、ナノセリア処理)に対する、アンモン角場(多形層(oriens layer)、地層の放射状および網状分子層(stratum radiatum and lacunosum moleculare))由来のサイトックスグリーンによる蛍光に関する光強度の、同一の日にスライスされかつ虚血性酸化ストレスに暴露され、またその虚血発作の24時間後に蛍光撮影された、月齢-一致かつ性別-一致の同腹子の脳から取出された解剖学的に一致する海馬切片に係る上記コントロール(未処置)に対する比として報告されている。
クエン酸安定剤のみを用い、またクエン酸およびDCTA、NTA、EGTAまたはDTPAの一つを含有する生体適合性安定剤の混合物を用いて、実施例1-5に記載の如く製造したセリウム-含有ナノ粒子を、5.8μMという処置濃度を用いて、虚血発作のマウス海馬脳スライスモデルにおいて評価した。ナノ粒子安定剤の関数としての、一般的に回避率(sparing)と呼ばれる、細胞死における減少(コントロールに対する％減少率)に係る結果を以下の表1に与える。
【００２９】
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【００３０】
上記表1に示された結果は、上記セリウム-含有ナノ粒子を、クエン酸(CA)とNTA、EGTAまたはDTPAの何れかとの組合せを用いて製造した場合に、回避率における改善(即ち、細胞死におけるより顕著な減少)が起こったことを示している。
【００３１】
本発明を、様々な特定の態様を参照することにより説明してきたが、記載された発明の概念に係る精神および範囲内で、多数の変更を行うことが可能であるものと理解すべきである。従って、本発明は、これら記載された態様に限定されるものではなく、寧ろ特許請求の範囲により規定される完全な範囲を持つものであることを意図する。