(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、
（２）配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、または
（３）配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３；
を含み、
インフルエンザＢ型のＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに特異的に結合することができる、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
（１）配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２０に記載のＶＬ；
（２）配列番号２１に記載のＶＨおよび配列番号２２に記載のＶＬ；または
（３）配列番号２３に記載のＶＨおよび配列番号２４に記載のＶＬ；
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
以下の１以上の特徴を有する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
（１）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または二重特異性または多特異的抗体から選択される；
（２）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域は、ネズミ以外の種由来のものである；
（３）モノクローナル抗体は、タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５；及びＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０によって産生される抗体である；
（４）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統及びビクトリア系統のＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに特異的に結合することができる；
（５）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびインフルエンザＢ型ウイルスのビクトリア系統に対して赤血球凝集抑制活性を有する；
（６）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は中和活性を有し、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統及びインフルエンザＢ型ウイルスのビクトリア系統を中和することができる；
（７）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統の宿主細胞への侵入を阻害する；
（８）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞からインフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統の放出を阻害する；
（９）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞とインフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統の膜融合を阻害する；
（１０）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統に対して、ＡＤＣＣを引き起こす；及び
（１１）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統に対して、ＣＤＣを引き起こす。
【請求項４】
単鎖抗体は、ｓｃＦｖであり、且つ／又はキメラ抗体は、ヒトマウスキメラ抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
非ＣＤＲ領域は、ヒト抗体由来のものである、請求項３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の単離された核酸分子または請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、該細胞培養物からモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１０】
以下からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系：
１）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７で寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６；
２）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５で寄託されたハイブリドーマ細胞株７Ｇ６；
及び
３）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２で寄託されたハイブリドーマ細胞株ハイブリドーマ細胞系１１Ｂ１０。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、請求項６に記載の単離された核酸分子、請求項７に記載のベクター、又は請求項８に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１２】
検出可能なマーカーのついた又はつかない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片；及び
任意選択で
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識し、任意選択で、検出可能なマーカーで標識されている二次抗体
を含む、キット。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、試料中のインフルエンザＢ型ウイルスまたはそのＨＡタンパク質の存在またはレベルをインビトロで検出するための方法。
【請求項１４】
試料中のインフルエンザＢ型ウイルスまたはそのＨＡタンパク質の存在またはレベルを検出するための、または
被験体がインフルエンザＢ型ウイルスに感染しているかどうかを診断するためのキットの製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１５】
インフルエンザＢ型ウイルスは、インフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統から選択され、且つ／又は
試料は、対象からの排泄物、口腔または鼻分泌物である、
請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
対象は、ヒトである、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片並びに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
さらに、追加の医薬活性剤を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
追加の医薬活性剤は、抗インフルエンザ剤である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
インフルエンザＢ型ウイルスを含む試料を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、試料中のインフルエンザＢ型ウイルスの毒性をインビトロで中和する方法。
【請求項２１】
インフルエンザＢ型ウイルスはインフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統から選択される、請求項１３または２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象におけるインフルエンザＢ型ウイルスの感染または感染症に関連する疾患を予防または治療における使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
【請求項２３】
以下の１以上の特徴を有する、請求項２２に記載の医薬組成物：
（１）対象はヒトであり；
（２）インフルエンザＢ型ウイルスはインフルエンザＢ型ウイルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統から選択され；
（３）薬剤は、単独で使用されるか、または追加の薬学的に活性な薬剤と組み合わせて使用され、
（４）感染症に関連する疾患はインフルエンザである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および分子ウィルス学に関する、特にインフルエンザＢ型ウィルスの診断、予防及び治療分野に関する。特に、本発明は、インフルエンザＢ型ウィルス（略してＦｌｕＢと呼ばれる）に対する広域スペクトルのモノクローナル抗体、抗体を生成する細胞株及び抗体を含む組成物（例えば、診断薬および治療薬）に関する。加えて、本発明はまた、抗体の使用に関する。本発明による抗体は、インフルエンザＢ型感染及び／又は感染によって引き起こされる疾患（例えば、インフルエンザ）の診断、予防および／または治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
略して「ｆｌｕ」と呼ばれるインフルエンザは、インフルエンザウィルスによって引き起こされる呼吸器感染症であり、いくつかの呼吸器症状を伴う、疲労感、高熱及び筋肉痛で、臨床的に特徴づけられる。インフルエンザウィルスは、ヒトの健康への脅威であり、持続的かつ急速な抗原ドリフトは、季節性インフルエンザの普及を引き起こす。ヒトにおける共通の季節性インフルエンザウィルスは、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２及びインフルエンザＢ型ウィルスが挙げられる。ＷＨＯの統計によると、季節性インフルエンザは、少なくとも年間２５０，０００〜５００，０００人の死因となる（Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００８，  １１８：３２７３−３２７５）。さらに、インフルエンザの流行は依然として人類にとって重要な脅威である。インフルエンザウィルスが発見された以降、人間史上、インフルエンザの大流行は世界中で５回発生し、死亡者の数は数千万人となった。そのうち、１９１８年のスペインのインフルエンザパンデミックは、世界中で約２０〜５０百万人の死因になった。２０世紀に発生したインフルエンザパンデミックには、１９５７年のアジアインフルエンザ（Ｈ２Ｎ２）及び１９６８年の香港インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２）が挙げられ、どちらも深刻な公衆衛生上の脅威と人間の社会的パニックを引き起こした（ＸｕＲ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０、３２８：３５７−３６０）。２１世紀では、インフルエンザの流行はまだ停止していない。インフルエンザＡ型（２００９年パンデミックＨ１Ｎ１）の流行は２００９年にメキシコで発生し、すぐに世界中に広がり、再び人間社会に警鐘を鳴らした。ＷＨＯの統計によれば、２０１０年８月６日までに、確認された合計１８４４９の死亡例がグローバルに２００の以上の国と地域で報告された（ＷＨＯパンデミック（Ｈ１Ｎ１）２００９−更新１１２２０１０年８月６日）。インフルエンザウィルスの流行が終了すると、インフルエンザウィルスはしばしば季節性インフルエンザに進化し、流行し続け、流行過程における抗原ドリフトによって人間の健康に害であり続ける。また、人間はまた、高病原性鳥インフルエンザの脅威にさらされ、２００３年の「ＳＡＲＳ」以降、高病原性Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウィルスは、人類を脅かす最大の感染症の一つとなっている。２００３年以降、鳥インフルエンザウィルスＨ５Ｎ１に感染した人間の６００例は世界的に報告され、そのうち３５３例が死に、６０％近い死亡率となっている（ＷＨＯ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｈｕｍａｎ＿ａｎｉｍａｌ＿ｉｎｔｅｒｆａｃｅ／Ｈ５Ｎ１＿ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ＿ｔａｂｌｅ＿ａｒｃｈｉｖｅｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍl）。このような高い死亡率により、ウィルスが一度人間に広がったら、それは人間社会に致命的な打撃をもたらすことを危惧せざるえない。つまり、インフルエンザウィルスによって引き起こされるインフルエンザは、人間にとって深刻な感染症である。
【０００３】
インフルエンザウィルスは、オルソミクソウィルス科のインフルエンザウィルス属に属するエンベロープされた一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡウィルスである。そのゲノムはＲＮＡの８つのセグメントを含み、１０超のウィルスタンパク質をコードしている。抗原性および核タンパク質（ＮＰ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）の遺伝的特性の違いによると、インフルエンザウィルスは、インフルエンザＡ型ウィルス、インフルエンザＢ型ウィルス及びインフルエンザＣ型ウィルスに分類することができる（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２００５，  ３（８）：  ５９１−６００）。その中で、インフルエンザＡ型ウィルス（略してＦｌｕＡと呼ばれる）は、広い宿主範囲を持ち、高速で変異し、世界的パンデミック（大流行）を引き起こす可能性があり；（略してＦｌｕＢと呼ばれる）インフルエンザＢ型ウィルスは、ヒトおよびアザラシに感染することが出来、インフルエンザＡ型ウィルスと比較してより遅く変異し、そして、局所での小さなパンデミックを引き起こす可能性があり；（略してＦｌｕＣと呼ばれる）インフルエンザＣ型ウィルスは、最もゆっくり変異し、病原性が弱く、一般的に低い抵抗性を有する妊娠中の女性や子供にのみにしか感染することが出来ない。
【０００４】
インフルエンザＢ型ウィルスは最初１９４０年に単離された。１９８０年代から、インフルエンザＢ型ウィルスの流行は抗原性と遺伝子型の点では互いに全く異なる２つの系統、すなわち、ビクトリア系統とヤマガタ系統が優位を占めていた。１９８０年代には、流行は、ビクトリア系統が優位であり、そして１９９０年代には、流行はヤマガタ系統が優位であった。２０００年以降、流行は二系統の両方が優位であった（Ｊｕｍａｔ  ＭＲら、ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ，  ２０１４，  ７：  ８６３）。
【０００５】
インフルエンザの流行は、主にインフルエンザＡ型ウィルスによって引き起こされ、インフルエンザＢ型ウィルスもまた、インフルエンザの流行の重要な原因である。３つのインフルエンザすべての流行シーズンの中で、１つはインフルエンザＢ型ウィルスが猛威を振るい；インフルエンザＢ型ウィルスは、毎年感染した患者の多数に疾患および死をもたらす（Ｌｉｎ  ら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ，  ２００４，  １０３（１−２）：  ４７−５２）。インフルエンザＢ型ウィルスによって引き起こされる死亡率と罹患率はインフルエンザＡ型ウィルスＨ３Ｎ２サブタイプのそれより低く、Ｈ１Ｎ１サブタイプのそれよりも高い（ＤｒｅｙｆｕｓＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２，  ３３７（６１００）：１３４３〜８）。研究により以下のことが示されている：Ｂ型インフルエンザウィルスによって引き起こされる臨床症状は一般的にＡ型インフルエンザウィルスのそれと異ならない（Ｊｕｍａｔ  ＭＲら、ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ，  ２０１４，  ７：  ８６３）、そしてインフルエンザＢ型ウィルスによって引き起こされる重篤な症例の割合も、インフルエンザＡ型ウィルスのそれと全く異なっていなかった（Ｓｕ  Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，  ２０１４，  ５９  （２）：  ２５２−５）。簡単に言えば、近年では、より多くの研究によって、インフルエンザＢ型ウィルスの予防と治療に関する研究が臨床上で重要な意義があることを示している。
【０００６】
インフルエンザを防ぐための防御の第一線は中和抗体である。ワクチンによって誘導される中和抗体は、主にウィルスの表面上のタンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）を標的とする。ウィルスの表面上のＨＡタンパク質は三量体構造を有し、各ＨＡ単量体はＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインからなる。ＨＡ１は、三量体の上部に小球を形成し、受容体結合部位を含み、宿主細胞に感染するウィルスに不可欠な領域である。ＨＡ１はまた、重要な抗原部位を含み、生物中に防御中和抗体の生成を誘導することができ、したがってワクチン設計の重要な標的である（Ｗａｎｇ  Ｔ．Ｔ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９，  １６：  ２３３−２３４）。ＨＡ２は、三量体の基部に配置され、ステムの形状を有する融合ペプチドを含み、宿主細胞へのウィルスエンベロープの膜融合を媒介することができる。ＨＡ２に対するいくつかのモノクローナル抗体がインフルエンザウィルスの膜融合を阻害し、ウィルス中和効果を得ることができている（Ｗａｎｇ  Ｔ．Ｔ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９，  １６：  ２３３−２３４）。
【０００７】
インフルエンザウィルスは変動性が高く、特にＨＡ変異が最も速い。現在、伝統的なインフルエンザワクチンは主としてＨＡタンパク質に向けられており、インフルエンザワクチンは、ＨＡ遺伝子突然変異によって引き起こされるウィルス抗原ドリフトのために容易に無効になる。インフルエンザワクチンの効果を維持するために、毎年ＷＨＯは前年度の流行インフルエンザウィルス株の変異を監視する必要があり、毎年新しいワクチンの接種により流行インフルエンザウィルス株に対する友好的な抵抗性を保持するために、古いインフルエンザワクチン種の使用を継続するか或いは来年インフルエンザワクチンのための候補株として新しいインフルエンザウィルスワクチン株を樹立するかを決定する必要がある。したがって、ウィルス変異の影響を受けない「ユニバーサルワクチン」の開発は、新しいワクチンの開発のための研究の焦点となる。インフルエンザウィルスの表面上の糖タンパク質、すなわち「赤血球凝集素（ＨＡ）」は、インフルエンザワクチンおよびインフルエンザウィルスに対する免疫療法薬の開発の主な標的である。いわゆる「ユニバーサルワクチン」は、異なるウィルスの様々な変異体が共有する「高度に保存された中和エピトープ」を含むべきであり、そして異なるウィルス変異株による感染と戦うための「広域スペクトル中和抗体」の産出を誘導できなければならない。したがって、普遍的なインフルエンザワクチンおよび免疫療法薬を研究するための重要な方法は、ＨＡ上の高度に保存された中和エピトープを探すことである。
【０００８】
加えて、マウスで実証されているように、インフルエンザＢ型ウィルスに特異的なヒト化抗ＨＡモノクローナル抗体は効果的にインフルエンザウィルスに感染した実験マウスを治療することができた（ＹａｓｕｇｉＭ．ら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，  ２０１３，９（２））。臨床において、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、狂犬病ウィルスおよび呼吸器合胞体ウィルスなどのウィルスによる感染症の予防に有効である（ＳａｗｙｅｒＬ．Ａ．ら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２０００，４７：５７−７７）。１９１８年のスペインのインフルエンザでは、回復期段階の人の血清が治療に使用された（ＬｕｋｅＴ．Ｃ．ら、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．  ２００６，  １４５：５９９−６０９）。この情報は、抗体が抗ウィルス療法の代替方法およびツールとして使用できることを示唆している。
【０００９】
インフルエンザＡ型ウィルスのＨＡに対する広域スペクトルモノクローナル抗体および高度に保存されたエピトープは、多くの論文で報告されている。２００９年初頭、Ｔｈｒｏｓｂｙらによって、ＨＡ２を認識する広域スペクトル中和ヒト化モノクローナル抗体ＣＲ６２６１が、グループ１に属するすべてのインフルエンザウィルスＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、およびＨ９サブタイプを含む）を中和できたことが初めて報告された（ＴｈｒｏｓｂｙＭ．ら、ＰＬｏＳＯｎｅ．  ２００９，  ３：ｅ３９４２）。２０１１年には、ＣｏｒｔｉＤ．らはまた、同様の技術を使用して、１６Ｈ亜型のインフルエンザウィルスを中和できた、ＨＡ２に対するヒト化広域スペクトルモノクローナル中和抗体を得た（ＣｏｒｔｉＤら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１、３３３：８５０から８５６）。Ｙｏｓｈｉｄａらは、２００８年に、ＨＡ１に対する広域スペクトル中和モノクローナル抗体Ｓ１３９／１が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ１３亜型のいくつかのインフルエンザウィルス株を中和できることを報告した（ＹｏｓｈｉｄａＲら、ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．  ２００９，  ５：ｅ１０００３５０）。
【００１０】
インフルエンザＡ型ウィルスに比べて、インフルエンザＢ型ウィルスに関連する広域スペクトルモノクローナル抗体および高度に保存されたエピトープはほとんど文献に報告されていない。２０１２年までに、ＤｒｅｙｆｕｓＣらは、インフルエンザＢ型ウィルスの２つの系統をできる、ＨＡに対する３種のモノクローナル抗体、すなわち、ＣＲ８０３３、ＣＲ８０７１及びＣＲ９１１４を発見した（ＤｒｅｙｆｕｓＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２，  ３３７（６１００）：１３４３−８）。２０１３年、ＹａｓｕｇｉＭらはインフルエンザＢ型ウィルスの異なる系統に対する、別の広域スペクトル中和モノクローナル抗体５Ａ７を見出した（ＹａｓｕｇｉＭら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，  ２０１３，  ９（２））。
【００１１】
上記研究で得られたモノクローナル抗体のエピトープの大部分は、認識における免疫優性を有するＨＡ１ドメインの代わりに、（その主要な機能はインフルエンザウィルスの膜融合を媒介することである）ＨＡ２の融合ペプチドの近くに保存された領域に位置していた。これは、予防と治療において、これらの抗体とそれによって認識される保存されたエピトープの利用における不確実性を増加させる。いくつかの研究により、ＨＡ２を認識する中和モノクローナル抗体は、偽型ウィルスを中和する活性に比べて１００−１０００倍減少した中和活性を持っていることを示しており、その理由は、露出した天然のウィルスのＨＡ２エピトープを持つことが容易ではないということかもしれず、したがって、エピトープは、簡単にアクセスすることはできない（ＳｕｉＪ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９，  １６：２６５−２７３；  ＣｏｒｔｉＤ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１０，  １２０：１６６３−１６７３）。
【００１２】
ＨＡ２と比較して、インフルエンザウィルスのＨＡ１は三量体の上部に小球を形成し、中和エピトープの多くが含まれており、簡単にアクセス可能である。したがって、ＨＡ１に広域スペクトル中和エピトープを探すことは、非常に効果的な広域スペクトルインフルエンザワクチンおよび治療用抗体を開発する上で有益である。ＣｙｒｉｌｌｅＤｒｅｙｆｕｓらは、２０１２年、インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡ１ドメインを認識する唯一の広域スペクトルモノクローナル抗体ＣＲ８０３３を報告したが、モノクローナル抗体は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統に対してのみ血球凝集抑制活性を有していた（ＤｒｅｙｆｕｓＣ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２，  ３３７（６１００）：１３４３−８．）。それ故、インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡ１上のより高度に保存された中和エピトープを認識する、広域スペクトル中和モノクローナル抗体を開発し、そしてエピトープを正確に局在化させるために、広域スペクトルの治療用抗体およびインフルエンザＢウィルスに対する万能ワクチンの開発は、重要で有益な意義がある。インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡ１のより高度に保存されたエピトープを認識する、より広域のスペクトルモノクローナル抗体を開発する技術の必要性がある。
【発明の概要】
【００１３】
一般的に、当業者によって理解されるように、本願では、特に断らない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されているルーチン操作である。一方、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義および説明は以下のように提供される。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、一般に、２対のポリペプチド鎖（それぞれ軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κおよびλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしてそれぞれ定義するμ、δ、γ、αおよびεに分類することができる。軽鎖および重鎖では、可変領域は約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、重鎖は約３またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域ドメインＣＬから構成されている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）の超可変領域に分けることができ、比較的保守的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）によって間の空間が満たされる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序で３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されている：Ｎ末端からＣ末端にかけてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各重鎖／軽鎖対の可変領域は、（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ、抗原結合部位を形成する。種々の領域またはドメイン中のアミノ酸の分布は、ＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａら、  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３における定義に従う。用語「抗体」は、抗体を産生するための特定の方法によって制限されない。例えば、抗体には、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。
【００１５】
本明細書で使用される場合、抗体の用語「抗原結合断片」／特異全長抗体が特異的に結合する抗原に結合する能力を保持する全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、そしてまたは「抗原結合部分」としても知られている同じ抗原への結合について全長抗体と競合する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈ．  ７（Ｐａｕｌ，  Ｗ.編、第二版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））を参照とし、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または酵素によって生成され得、またはインタクトな抗体の化学的開裂。いくつかの条件の下で、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディおよび抗原と特異的に結合する能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１つのドメインからなる抗体断片を意味する。用語「Ｆｖ断片」とは、ＶＬおよび単一アームのＶＨドメインからなる抗体断片を意味する。用語「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインからなる抗体断片を意味する（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６  （１９８９））。用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインからなる抗体断片を意味します。用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋（複数可）を介して互いに連結された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
【００１７】
いくつかの条件下では、抗体の抗原結合断片は、単一のポリペプチド鎖を産生することを可能にするリンカーを介して、ＶＬ及びＶＨドメインが一緒になって一価の分子を形成する単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３  ４２６  （１９８８） 及び Ｈｕｓｔｏｎ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９  ５８８３  （１９８８）参照）。そのようなｓｃＦｖ分子、一般に、ＨＡの一般的な構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有する。先行技術における適切なリンカーは、反復したＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを使用することができる、およびその変異体を使用することもできる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８）。本発明において使用され得る他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：７２５−７３１；Ｃｈｏｉら、（２００１）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：  ９４−１０６；Ｈｕら、（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：３０５５−３０６１；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：４１−５６およびＲｏｏｖｅｒｓら、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌによって記載されている。
【００１８】
いくつかの条件下では、抗体の抗原結合フラグメントはダイアボディ、すなわちＶＨ及びＶＬドメインは単一のポリペプチド鎖上に発現されるとすることができる二価抗体である、しかし、使用されるリンカーは可能にするには短すぎ、同じ鎖上の二つのドメインの対形成、ドメインは、２つの抗原結合部位を生成するために別の鎖上の相補的なドメインと対にしなければならない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、およびＰｏｌｊａｋ Ｒ.Ｊ.ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１  １１２３  （１９９４））。
【００１９】
抗体の抗原結合断片（例えば、上述したような抗体断片）は、当業者に知られている従来の技術によって所定の抗体（本発明において提供される、例えば、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０）から得ることができる（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的または化学的切断方法）、完全な抗体がスクリーニングされるのと同じ方法で特異性についてスクリーニングされ得る。
【００２０】
確かに特定されない限り、用語「抗体」が記載されている場合、本発明においては、それは完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」は、一群の高度に相同な抗体分子、すなわち自然に起こり得る天然の変異を除いて全く同じ抗体分子の集団由来の抗体または抗体の断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対して高い特異性を有する。モノクローナル抗体と比較して、ポリクローナル抗体は一般に、抗原上の異なるエピトープを一般に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般に、Ｋｏｈｌｅｒらにより初めて報告されたハイブリドーマ技術で得られる（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５）だけでなく、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許４８１６５６７号参照）によって得ることができる。
【００２２】
例えば、モノクローナル抗体は以下のようにして調製することができる。最初に、マウスまたは他の適切な宿主動物を、免疫原（必要であれば、アジュバントが添加される）を注射することにより免疫する。免疫原またはアジュバントの注射手段は、一般に、皮下多点注射または腹腔内注射である。いくつかの既知のタンパク質（例えば、血清アルブミンまたは大豆トリプシン阻害剤）に対する免疫原の予備結合は、宿主における抗原の免疫原性を促進し得る。アジュバントは、フロイントアジュバントまたはＭＰＬ−ＴＤＭなどであり得る。動物の免疫後、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球が動物において産生される。また、リンパ球をインビトロ免疫によって得られてもよい。目的のリンパ球を回収し、適切な融合剤（例えばＰＥＧ）を用いて骨髄腫細胞に融合させ、ハイブリドーマ細胞を得る（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体: 原理と実践,  ｐｐ．５９−１０３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）。上記で調製したハイブリドーマ細胞を適切な培地に播種し、培地中で増殖させ、培養培地は、融合していない親ミエローマ細胞の増殖を阻害することができる１つ以上の物質を含む。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く親骨髄腫細胞の場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミン（ＨＡＴ培地）などの物質を培養培地に添加することによって、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖が阻害される。好ましいミエローマ細胞は、高い融合速度、抗体を分泌する安定した能力、ＨＡＴ培養培地に感受性であるなどがあるべきである。骨髄腫細胞の最初の選択は、ＭＯＰ−２１およびＭＣ−１１マウス腫瘍由来細胞株（ＴＨＥ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．  ＵＳＡ）およびＳＰ−２／０またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．  ＵＳＡ）などのネズミ骨髄腫である。加えて、また、ヒト骨髄腫及びヒト−マウス異種骨髄腫細胞株は、ヒトモノクローナル抗体を調製するために使用され得ることが報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：  ３００１  （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）。ハイブリドーマ細胞の増殖のための培養培地は、特異的抗原に対するモノクローナル抗体の生成を検出するために使用される。以下の方法を使用して、ハイブリドーマ細胞で産生されたモノクローナル抗体の結合特異性、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を決定することができる。例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７：  ２２０  （１９８０）に記載されているスキャチャード解析を用いて、モノクローナル抗体の親和性を決定することができる。ハイブリドーマで産���された抗体の特異性、親和性および反応性を決定した、関心のある細胞株はＧｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実践,  ｐｐ．５９−１０３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６で説明した限界希釈法によりサブクローニングしてもよい。適切な培養培地は、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０等であってもよい。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物体内の腹水腫瘍の形態で増殖し得る。プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーなどの免疫グロブリンを精製するための従来の方法を用いることにより、サブクローン細胞によって分泌されたモノクローナル抗体を細胞培養物、腹水または血清から単離することができる。
【００２３】
モノクローナル抗体は、遺伝子工学組換え技術により得ることができる。具体的にはモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子に特異的に結合する核酸プライマーは、ＰＣＲ増幅に使用され、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ分子は、ハイブリドーマ細胞から単離することができる。得られたＤＮＡ分子は、発現ベクターに挿入され、宿主細胞（例えば大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または免疫グロブリンを産生しない他の骨髄腫細胞）に、それらをトランスフェクトし、抗体を得るのに適した条件下で培養し、組換え発現によって対象の抗体を得る。
【００２４】
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖および／または重鎖の一部が抗体由来（特定の種に由来し得るか、または特異的な抗体のタイプまたはサブタイプに属する）であり、その軽鎖および／または重鎖の他の部分は、別の抗体由来（同じまたは異なる種に由来し得るか、または同一または異なる抗体型またはサブタイプに属する）であり、目的の抗原に結合する活性を今だ維持している抗体を指す（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎラ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  ６８５１−６８５５  （１９８４））。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のすべてのＣＤＲ領域またはＣＤＲ領域の一部が、非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置換された抗体または抗体断片であり、ドナー抗体は、予想される特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）抗体であってもよい。さらに、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸は、特性をさらに改善または最適化するために、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基または別の抗体のアミノ酸残基によって置換されてもよい。ヒト化抗体に関するより詳細な内容に関しては、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；  Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３−５９６  （１９９２）；及びＣｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：  ３９７−４０２  （２０００）を参照されたい。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「中和抗体」とは、目的のウィルスの毒性（細胞に感染する能力など）を排除又は著しく低減することができる抗体又は抗体断片を指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の一部分を指します。「エピトープ」は「抗原決定基」としても知られている。エピトープまたは抗原決定基は、一般に、アミノ酸、炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に、特定の三次元構造および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、一般的に、ユニークな立体構造中の、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の連続または非連続アミノ酸を含み、それは「線状」または「立体配座」であってもよい。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇ．  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編集．（１９９６）を参照されたい。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体配座的エピトープでは、相互作用部位がタンパク質に互いに分離されているアミノ酸残基上にまたがる。
【００２８】
本明細書で使用する「エピトープペプチド」という用語は、エピトープとして作用する抗原上のペプチド断片を指す。いくつかの条件下で、エピトープペプチドのみが、エピトープに対する抗体によって特異的に認識／結合され得る。他のいくつかの条件下では、エピトープペプチドは、エピトープは、抗体によって特異的に認識することができるように担体タンパク質に融合されなければならない。本明細書中で使用される場合、用語「担体タンパク質」は、エピトープペプチドの担体として作用することができるタンパク質、すなわち、エピトープペプチドが、タンパク質の特定の位置（例えば、内部、Ｎ末端またはＣエピトープペプチドを提示することができ、したがって、抗体または免疫系によって認識することができる。そのような担体タンパク質は、例えば、ＨＰＶＬ１タンパク質（その中にエピトープペプチドが１３０位〜１３１位のアミノ酸の間に挿入されていてもよく、またはタンパク質の４２６位〜４２７位のアミノ酸に挿入されていてもよい、Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ，  Ｋ．ら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｃａｐｓｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｏｐｓ  ［Ｊ］．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００１，  ８２：  ２７９９−２８０４；Ｖａｒｓａｎｉ，  Ａ．ら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  （ＨＰＶ−１６）  Ｌ１  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌ２  ｍｉｎｏｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ＨＰＶ−６  ａｎｄ  ＨＰＶ−１６  ［Ｊ］．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００３，  ７７：  ８３８６−８３９３参照）、ＨＢＶコア抗原（タンパク質の７９〜８１位のアミノ酸がエピトープププチドと置換されていてもよい、Ｋｏｌｅｔｚｋｉ，  Ｄ．ら、ＨＢＶ  ｃｏｒｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｔｈｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｕｍａｌａ  ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ［Ｊ］．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９９，  ３８０：  ３２５−３３３参照）、ウッドチャック肝炎ウィルスコアタンパク質（タンパク質の７９〜８１位のアミノ酸がエピトープププチドと置換されていてもよい、Ｓａｂｉｎｅ  Ｋｏｎｉｇ,  Ｇｅｒｔｒｕｄ  Ｂｅｔｅｒａｍｓ  及び  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｎａｓｓａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８，  ７２（６）：４９９７参照）、及びＣＲＭ１９７タンパク質（エピトープペプチドは、タンパク質またはその断片のＮ末端またはＣ末端に連結されていてもよい）を含む。任意に、リンカー（例えば、可撓性又は剛性リンカー）は、それぞれの折り畳みを促進するために、エピトープペプチドと担体タンパク質との間で使用されてもよい。
【００２９】
抗体は、当業者に知られている従来の技術によって同じエピトープへの結合の競合性に応じてスクリーニングされ得る。例えば、競合または交差競合についての研究により、互いに抗原（例えば、インフルエンザウィルスＨＡタンパク質）に結合することについて競合または交差競合する抗体を得ることができる。それらの交差競合に基づく、同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループット法は、国際特許出願ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。したがって、インフルエンザウィルスＨＡタンパク質上の同じエピトープに結合するために、本発明（例えば、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０）に記載のモノクローナル抗体と競合する抗体およびその抗原結合断片（すなわち、抗原結合部位）は、当業者に公知の慣用技術により得られる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「単離された」という用語は、人工的手段による自然状態から得られる状態を指す。一定の「単離された」物質又は成分が天然に存在している場合、その天然の環境の変化、又は物質が自然環境、またはその両方から単離されているので、それが可能である。例えば、ある特定の非単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然に特定の動物の生体内に存在し、天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ばれる。用語「単離された」は、分離された物質の活性に影響を与えない、混合された人工または合成された物質や他の不純な物質を排除するものではない。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指し、大腸菌（株）は、これに限定しないが、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株に由来している。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、その中に挿入されたポリヌクレオチドを有することができる核酸ビヒクルを意味する。ベクターがその中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞内で発現する実施遺伝物質要素を有することができる。ベクターは、当業者によく知られているように、これに限定しないが、プラスミド、ファージ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、λファージやＭ１３ファージおよび動物ウィルスなどのファージが含まれる。ベクターとして使用することができる動物ウィルスとしては、これらに限定されないが、レトロウィルス（レンチウィルスを含む）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス（例えば、単純ヘルペスウィルス）、ポックスウィルス、バキュロウィルス、パピローマウィルス、(ＳＶ４０などの)パポバウィルスが挙げられる。ベクターは、発現を制御するための複数の要素、これらに限定されないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素およびレポーター遺伝子が含まれる。加えて、ベクターは、複製起点を含むことができる。
【００３３】
本明細書で使用される、用語「宿主細胞」は、ベクターが導入可能な細胞、これらに限定されないが、大腸菌または枯草菌などの原核細胞、例えば酵母細胞又はアスペルギルスのような真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞又はＳｆ９のような昆虫細胞、及び線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はヒト細胞のような動物細胞が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸の間の一致度をいう。比較のための２つの配列が特定の部位で同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットを有する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々は、特定の部位でのアデニンを有する、または２つのポリペプチドの各々は、特定の部位にリジンを有する）、２つの分子が、その部位で同一である。２つの配列間の同一性百分率は、これら２つの配列が共有する同一部位の数の、部位の総数に対する比較×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０の部位のうち６が一致した場合、６０％の同一性を示す。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６つ中３つの部位が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、最大の同一性を生成する方法で行われる。そのようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらの方法（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３，  １９７０）に基づくものであるＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社）などのコンピュータプログラムを用いて行うことができる。二つのアミノ酸配列間の百分率同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び４のギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．  Ｍｅｙｅｒｓ及び  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ４：１１−１７  （１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することができる。加えて、二つのアミノ酸配列間の同一性の百分率は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを利用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及び  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３  （１９７０））によって決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に影響を与えたり、変更しないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該技術分野で公知の標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸、例えば、対応するアミノ酸残基に物理的又は機能的に類似するアミノ酸（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する）に置換する置換が挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されている。アミノ酸の保存的置換を同定するための方法は当技術分野において知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：  １１８０−１１８７  （１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、タンパク質工学１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：  ４１２−４１７  （１９９７）、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」は、生物に特異的な抗体または感作リンパ球の形成を刺激する能力を指す。それは、特定の免疫細胞を刺激して、抗体および感作リンパ球のような免疫学的エフェクター物質を最終的に生成する、抗原の特性を指すだけでなく、抗原で生物を刺激した後、抗体または感作Ｔリンパ球が生物の免疫系に形成する特異的な免疫応答をも指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が、正常宿主における免疫応答の発生を誘導することができるかどうかは、３つの因子、抗原の性質、宿主の反応性、および免疫化手段に依存する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」は、抗体とそれが指示する抗原との間の反応のように、非ランダム様式で２つの分子の結合を指す。いくつかの実施形態では、特異的に抗原（又は抗原に特異的な抗体）に結合する抗体は、約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ以下未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＫＤ」は特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、抗原に対する抗体の結合親和性を記述するために使用される。解離平衡定数が小さいほど、より密接に抗体が抗原に結合し、抗原に対する抗体の高い親和性がる。一般的に、抗体（本発明によれば、例えば、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０）は約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ以下未満のＫＤで、抗原（例えば、インフルエンザウィルスのＨＡタンパク質）に結合し、ＫＤは例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定される。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」と用語「ＭＡｂ」は、同じ意味を有し、互換的に使用される。用語「ポリクローナル抗体」および用語「ＰＡｂ」は同じ意味を有し、互換的に使用される。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は同じ意味を有し、互換的に使用される。また、本発明において、アミノ酸は、一般に、単一文字コード又は３つの文字コードで表されている。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａで表すことができる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリドーマ」及び用語「ハイブリドーマ細胞株」は、互換的に使用することができる。用語「ハイブリドーマ」と用語「ハイブリドーマ細胞株」が言及されている場合、彼らはまた、サブクローン及びハイブリドーマの子孫細胞が含まれる。たとえば、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０が記載される場合、それはまた、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０のサブクローンおよびその子孫細胞を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」は、当技術分野で周知である、担体および／または薬理学的および／または生理学的に被験体と活性剤に適合性する賦形剤を指し（例えば、レミントンの薬学、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編、第１９版編、ペンシルベニア州：マック・パブリッシング社、１９９５参照）、および、これに限定しないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバントおよびイオン強度増強剤が含まれる。例えば、ｐＨ調整剤はこれに限定しないが、リン酸緩衝液を含み；界面活性剤はこれに限定しないが、カチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤を含み、例えば、これらに限定されないが、Ｔｗｅｅｎ−８０が挙げられ；イオン強度増強剤は、これに限定しないが、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用する用語「アジュバント」は、それが生物に抗原と共に送達されるか、事前に生物に送達されると、抗原と抗原に対する免疫応答を増強するか、生物において免疫応答のタイプを変更することができる、非特異的免疫賦活剤を指す。様々なアジュバントがあるが、これに限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、コリネ細菌パルブム、リポ多糖類、サイトカインなどが挙げられる。フロイントアジュバントは現在、動物実験で最も一般的に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、より一般的な臨床試験で使用されている。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質ワクチン」は、任意にアジュバントを含む、ポリペプチドベースのワクチンを指す。ワクチン中のポリペプチドは、遺伝子工学技術または化学合成の方法によって得ることができる。本明細書で使用する場合、用語「核酸ワクチン」は、任意にアジュバントを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡベースのワクチン（例えば、プラスミド、発現プラスミドなど）を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、期待される効果を達成するのに十分な量、又は少なくとも部分的に期待される効果を達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、インフルエンザウィルス感染又はインフルエンザウィルス感染に関連する疾患）を予防するのに有効な量は、疾患（例えば、インフルエンザウィルス感染又はインフルエンザウィルス感染に関連する疾患）の発症を予防、抑制、または遅延させるための有効な量を指す。疾患を治療するために有効な量は、疾患及び疾患を有する患者における合併症を治癒または少なくとも部分的にブロックするために有効な量を指す。そのような有効量は、当業者の能力の範囲内で決定できる。例えば、治療的使用のための有効量は、治療すべき疾患の重篤度、年齢、体重及び性別のような患者の一般的状態、薬剤の投与手段、同時に使用する治療法などに依存する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「ヤマガタ系統」と「インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統」は、ＨＡタンパク質の抗原性と進化的関係においてインフルエンザＢ型の代表的な株ウィルスＢ／ヤマガタ／１６／１９８８と同じ進化分岐に属するインフルエンザＢ型ウィルスを指し、以下の例示的な株：Ｂ／ハルビン／７／１９９４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ｂ／アモイ／８９１／２０６、Ｂ／アモイ／７５６／２００７、Ｂ／アモイ／１１４７／２００８、Ｂ／アモイ／Ｎ６９７／２０１２が含まれる。用語「ヤマガタ系統」と「インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統」は同じ意味を有し、互換的に使用することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「ビクトリア系統」と「インフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統」は、ＨＡタンパク質の抗原性と進化的関係においてインフルエンザＢ型の代表的な株ウィルスＢ／ビクトリア／２／１９８７と同じ進化分岐に属するインフルエンザＢ型ウィルスを指し、これに限定しないが、以下の例示的な株：Ｂ／香港／３３０／２００１、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／アモイ／３０４３／２００６、Ｂ／アモイ／１６５／２００７、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８、Ｂ／ブリスベン／３３／２００８、Ｂ／アモイ／１３４６／２００８、Ｂ／アモイ／Ｎ６３９／２０１０、およびＢ／アモイ／Ｎ６７８／２０１２が含まれる。用語「ビクトリア系統」と「インフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統」は同じ意味を有し、互換的に使用することができる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「ヘマグルチニン」と「ＨＡのタンパク」は、インフルエンザウィルスゲノムの断片４によってコードされ、ウィルス膜表面に存在し、小胞体で合成され、そして約７６ｋＤの分子量を持つ抗原性糖タンパクを指す。ＨＡのタンパク質は、ＨＡ１ポリペプチド（分子量４７ｋＤで、本明細書で「ＨＡ１ドメイン」とも呼ばれる）とＨＡ２ポリペプチド（分子量２９ｋＤで、本明細書で「ＨＡ２ドメイン」とも呼ばれる）に加水分解され、そしてそれらは、ジスルフィド結合を介して接続され、典型的なタイプＩ型膜タンパク質構造を有するＨＡ分子を形成する。ヘマグルチニンは、免疫原性を有し、そして抗−ヘマグルチニン抗体がインフルエンザウィルスを中和するために使用することができる。ヘマグルチニンは、当業者に知られており、そのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのような様々な公共のデータベースに見出すことができる。ＨＡ１ポリペプチド／ドメインは、ＨＡタンパク質の一番上に球を形成し、ウィルスのレセプター結合部位を含み、宿主細胞の膜上のシアル酸受容体に結合でき、およびそれによって細胞へのウィルスの侵入を媒介する。ＨＡ２のポリペプチド／ドメインは、宿主細胞へのウィルスエンベロープの膜融合を支援することができ、そして宿主細胞へのウィルスの侵入に重要な役割を果たしている。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「赤血球凝集阻害活性」は、赤血球表面上のシアル酸受容体へのインフルエンザウィルスのＨＡタンパク質の結合によって引き起こされる血液凝固を阻害する、抗体またはその抗原結合断片の機能的活性を指す。血球凝集阻害活性を有する抗体またはその抗原結合断片は、細胞受容体へのウィルスの結合を阻害することができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「中和活性」は、抗体またはその抗原結合断片が、ウィルス上の抗原タンパク質に結合し、それによって標的ウィルスの病原性（例えば、細胞に感染する能力を）を減少または阻害する、機能的活性を指す。中和活性を有する抗体またはその抗原結合断片は、ウィルスによる細胞の感染および／または子孫ウィルスの成熟および／または子孫ウィルスの放出を阻害できる。
【課題を解決するための手段】
【００５０】
本発明者は、驚くべきことに、実験的研究の多くを行うことによって、高度に保存された中和エピトープがインフルエンザＢ型ウィルスの表面抗原ＨＡタンパク質のＨＡ１ドメイン中に存在しており、これらのエピトープを認識する抗体はインフルエンザウィルスの異なる系統のＨＡタンパク質、特にインフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統のＨＡタンパク質に結合に結合し、広域スペクトルウィルス結合反応性と広いスペクトルのウィルス中和能力を示すことを見出した。それ故、本発明の抗体は、インフルエンザＢ型ウィルスの感染又は感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の診断、予防及び治療に特に適している。
【００５１】
一態様において、本発明は、以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（１）配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３；
（２）配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３；そして  
（３）配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３；
および／または、
以下から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（４）配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、
（５）配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、そして  
（６）配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３。
【００５２】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は以下から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む：
（１）配列番号１９に記載のＶＨ；
（２）配列番号２１に記載のＶＨ；そして
（３）配列番号２３に記載のＶＨ。
【００５３】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は以下から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む：  
（１）配列番号２０に記載のＶＬ；
（２）配列番号２２に記載のＶＬ；そして
（３）配列番号２４に記載のＶＬ。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は
（１）配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、
（２）配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、または
（３）配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む。
【００５５】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は
（１）配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２０に記載のＶＬ；
（２）配列番号２１に記載のＶＨおよび配列番号２２に記載のＶＬ；または
（３）配列番号２３に記載のＶＨおよび配列番号２４に記載のＶＬを含む。
【００５６】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）、または二重特異性または多特異的抗体から選択される。
【００５７】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は非ＣＤＲ領域を含み、非ＣＤＲ領域は、ネズミ以外の種由来、例えばヒト抗体由来のものである。
【００５８】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０産生する抗体であり、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０は、タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５及びＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２としてそれぞれ寄託されている。
【００５９】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスの少なくとも２系統のＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに特異的に結合することができる。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統及びビクトリア系統のＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインおよびに特異的に結合することができる。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびインフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統に対して赤血球凝集抑制活性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は中和活性を有し、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統及びインフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統を中和することができる。
【００６０】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、以下の活性の１つ以上を有する：（ａ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の宿主細胞への侵入を阻害すること；（ｂ）宿主細胞から少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の放出を阻害すること；（ｃ）宿主細胞と少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の膜融合を阻害すること；（ｄ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）に対して、ＡＤＣＣを引き起こすこと；及び（ｅ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）に対して、ＣＤＣを引き起こすこと。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つの上記活性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、５つの活性すべてを有する。いくつかの好ましい実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は。前記５つの活性によって、インフルエンザＢ型ウィルスを中和し、それによってＦｌｕＢの感染を予防及び治療する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または好ましくは少なくとも９９％、インフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質と、以下からなる群から選択されるモノクローナル抗体との結合をブロックできる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する：
（１）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７を有する、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６によって産生されたモノクローナル抗体；
（２）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５を有する、ハイブリドーマ細胞株７Ｇ６によって産生されたモノクローナル抗体；そして  
（３）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２を有する、ハイブリドーマ細胞株１１Ｂ１０によって産生されたモノクローナル抗体。
【００６２】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルスのＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに特異的に結合することができる。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統及びビクトリア系統のＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに特異的に結合することができる。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびインフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統に対して赤血球凝集抑制活性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は中和活性を有し、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびインフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統を中和することができる。
【００６３】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の活性の１つ以上を有する：（ａ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の宿主細胞への侵入を阻害すること；（ｂ）宿主細胞から少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の放出を阻害すること；（ｃ）宿主細胞と少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）の膜融合を阻害すること；（ｄ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）に対して、ＡＤＣＣを引き起こすこと；及び（ｅ）少なくとも２系統のインフルエンザＢ型ウィルス（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統）に対して、ＣＤＣを引き起こすこと。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つの上記活性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、５つの活性すべてを有する。いくつかの好ましい実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は。前記５つの活性によって、インフルエンザＢ型ウィルスを中和し、それによってＦｌｕＢの感染を予防及び治療する。
【００６４】
そのようなモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０によって認識されるものと同一か立体的に重複し、その結果少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または好ましくは少なくとも９９％、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６または１１Ｂ１０と、ＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインとの結合を減少できる。
【００６５】
抗体:ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、ハーロウおよびデビッド・レーン編（１９８８）に記載された方法のような従来の方法は、ある特定のテストすべき抗体が、公知のモノクローナル抗体と抗原（例えば、インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡタンパク質）の結合を減少させる能力を有するか決定するために用いることができる。例示的な方法は：抗原をマイクロウェルプレートにプレコーティングし、連続希釈に供された試験される非標識抗体及び特定の濃度の既知の標識された抗体をプレコートされたマイクロウェルプレートに添加してインキュベーションし、そして洗浄後、予備被覆マイクロウェルプレートに、特定の濃度でモノクローナル抗体インキュベーションを実施し、その後、洗浄した後、異なる希釈度の試験する抗体の存在下、プレートに結合した既知の抗体の数を決定する、を含む。試験する抗体の、抗原への結合することについての既知の抗体と競合する能力が強いほど、既知の抗体の抗原に結合する能力は弱く、そしてプレートに結合する既知の抗体の数が小さくなる。一般的に、抗原は９６ウェルマイクロプレートに予めコーティングされ、そして放射性標識法又は酵素標識法が、試験されるモノクローナル抗体の既知の標識されたモノクローナル抗体をブロックする能力を決定するために用いられる。
【００６６】
当技術分野で公知の方法によって、本発明に係るモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を製造するのに用いることが出来る（Ｓｃｈｕｌｍａｎ  ＪＬら、Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｙ，  １９８６，  ２２：１４３−９）。抗イディオタイプ抗体は、イディオタイプ抗体を調製するための抗体のイディオタイプに特異的に認識／結合する抗体であり（すなわち、イディオタイプ抗体を調製するための抗体の可変領域のイディオタイプは、抗原エピトープとして使用される）、イディオタイプ抗体を調製するための抗体によって認識される抗原エピトープを刺激／再構築できる。本発明に係るモノクローナル抗体はまた、このような抗イディオタイプ抗体を調製するために使用することができ、得られた抗イディオタイプ抗体はまた、本発明の範囲に含まれる。したがって、１つの態様では、本発明はさらに、本発明によるモノクローナル抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００６７】
本発明はまた、本発明によるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ハイブリドーマ細胞から単離することができ、または遺伝子工学、組換え技術または化学合成の方法によって得ることができる。
【００６８】
したがって、別の態様において、本発明は、抗体の以下から選択される重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する：
（１）配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３；  
（２）配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３；又は  
（３）配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３。  
【００６９】
いくつかの好ましい態様において、重鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載されたアミノ酸配列を有する。
【００７０】
いくつかの好ましい態様において、核酸分子は配列番号２５、配列番号２７または配列番号２９に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００７１】
別の態様において、本発明は、抗体の以下から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する：
（１）配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、
（２）配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３、又は  
（３）配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３。
【００７２】
いくつかの好ましい態様において、軽鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４に記載されたアミノ酸配列を有する。
【００７３】
いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００７４】
別の態様において、本発明は、上で定義した通りの重鎖可変領域をコードする核酸配列及び上で定義した通りの軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００７５】
別の態様において、本発明は、上記で定義された本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００７６】
別の態様において、本発明は、上記で定義した単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ等である。
【００７８】
別の態様において、本発明はまた、本発明に係る単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、これに限定しないが、大腸菌細胞のような原核細胞、および酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞のような真核細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞、等）が挙げられる。本発明に係る細胞は、２９３Ｔ細胞のような細胞株であってもよい。
【００７９】
別の局面において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収すること含む、本発明によるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法を提供する。
【００８０】
別の局面において、本発明は、以下から選択されるハイブリドーマ細胞系を提供する：
１）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７で寄託されたハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６；
２）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５で寄託されたハイブリドーマ細胞株７Ｇ６；
及び
３）タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２で寄託されたハイブリドーマ細胞株ハイブリドーマ細胞系１１Ｂ１０。
【００８１】
本出願において実証されるように、モノクローナル抗体１２Ｇ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１９に記載されており（その例示的な核酸配列は、配列番号２５に記載されている）、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０の記載されている（その例示的な核酸配列は、配列番号２６に記載されている）。
【００８２】
モノクローナル抗体１２Ｇ６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１〜３であり；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４〜６である。
【００８３】
本出願において実証されるように、モノクローナル抗体７Ｇ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２１に記載されており（その例示的な核酸配列は、配列番号２７に記載されている）、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２２の記載されている（その例示的な核酸配列は、配列番号２８に記載されている）。
【００８４】
モノクローナル抗体７Ｇ６の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７〜９であり；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０〜１２である。
【００８５】
本出願において実証されるように、モノクローナル抗体１１Ｂ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２３に記載されており（その例示的な核酸配列は、配列番号２９に記載されている）、そして軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２４の記載されている（その例示的な核酸配列は、配列番号３０に記載されている）。
【００８６】
モノクローナル抗体１１Ｂ１０の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３〜１５であり；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１６〜１８である。
【００８７】
別の態様において、本発明は、上記に記載された、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体、単離された核酸分子、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物を提供する。
【００８８】
別の態様において、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はまた検出可能なマーカーを含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、キットは、さらに本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体を含む。好ましくは、前記二次抗体は検出可能なマーカーを含む。当業者によく知られている、そのような検出マーカーは、これに限定しないが、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、発色物質、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）等が挙げられる。
【００８９】
別の態様において、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、サンプル中のインフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質の存在又はレベルを検出するための方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、さらに検出マーカーを含む。別の好ましい実施形態では、方法は、さらに、本発明によるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を検出するための検出マーカーを担持する二次抗体を使用することを含む。この方法は、診断目的のために使用することができる（例えば、サンプルは、患者からの試料であることを特徴とする）または非診断目的のために（例えば、サンプルは細胞サンプルではなく、患者からの試料である）。いくつかの好ましい実施形態では、インフルエンザＢ型ウィルスはインフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統から選択される。
【００９０】
別の態様において、本発明は、対象が感染しているかどうかを診断するための方法であって、発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を用いて、対象からの試料中のインフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質の存在又はレベルを検出することを含む方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、前記検出マーカーを含む。別の好ましい実施形態では、方法は、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を検出する検出マーカーを担持する二次抗体を用いることを含む。好ましくは、インフルエンザＢ型ウィルスはインフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統から選択される。
【００９１】
別の態様において、本発明は、試料中のインフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質の存在またはレベルを検出するためのキットの製造における、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。好ましくは、インフルエンザＢ型ウィルスはインフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統から選択される。
【００９２】
いくつかの好ましい実施形態では、試料は、これに限定されないが、対象（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）からの排泄物、口腔および鼻分泌物が挙げられる。
【００９３】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および／又は配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む抗体であり；好ましくは配列番号１９に記載のＶＨ及び／又は配列番号２０のＶＬを含み；より好ましくはモノクローナル抗体１２Ｇ６である。
【００９４】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および／又は配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む抗体であり；好ましくは配列番号２１に記載のＶＨ及び／又は配列番号２２のＶＬを含み；より好ましくはモノクローナル抗体７Ｇ６である。
【００９５】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３、および／又は配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む抗体であり；好ましくは配列番号２３に記載のＶＨ及び／又は配列番号２４のＶＬを含み；より好ましくはモノクローナル抗体１１Ｂ１０である。
【００９６】
抗体またはその抗原結合断片を用いて、試料中の標的ウィルスまたは抗原（例えば、インフルエンザウＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質）の存在またはレベルを決定するための一般的な方法は当業者に知られている。いくつかの好ましい実施形態では、方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、放射免疫検出、蛍光免疫アッセイ、イムノクロマトグラフィー、拮抗法及び類似の検出方法が挙げられる。
【００９７】
いくつかの好ましい実施形態では、検出方法は以下の工程含む：（ｉ）抗体またはその抗原結合断片が標的ウィルスまたは抗原（すなわち、インフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質）に結合し、抗体またはその抗原結合断片およびインフルエンザＢ型ウィルスまたはＨＡタンパク質の複合体を形成する条件下で、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を、試験される試料と接触させ、そして（ｉｉ）複合体の存在を決定し、試料がインフルエンザＢ型ウィルスまたはそのＨＡタンパク質を含むかどうかを決定する。
【００９８】
いくつかの好ましい実施形態では、検出方法は、以下のステップを含むことができる：（ｉ）固体支持体上に一次抗体を吸着する；（ｉｉ）インフルエンザＢ型ウィルスまたはＨＡタンパク質を含有する疑いのある試験試料を支持体に添加する；（ｉｉｉ）支持体に、マーカーを担持する二次抗体を添加する；そして（ｉｖ）インフルエンザＢ型ウィルスまたはＨＡタンパク質が、試料中に存在するかどうかを決定するために、マーカーの存在を検出する。
【００９９】
また、競合法又はサンドウィッチ法の原理に基づき、前記検出方法は、標的抗原または抗体を検出するために使用することができる。
【０１００】
競合法は、試料中の抗原と、既知量の、本発明に係るモノクローナル抗体にの結合について試料中の抗原と競合にある標識抗原との定量的関係を比較するために用いられる。競合法による免疫測定法は、一般的に、未知の量の標的抗原を含む試料と予め決定された量の標識された標的抗原を、既知の物理または化学的手段により、本発明のモノクローナル抗体がコーティングされた固体支持体に添加し；そしてその後、一定期間のインキュベーションの後、支持体を洗浄し、そして支持体上に結合したマーカーの量またはレベルを決定することを含む。
【０１０１】
サンドイッチ法において、試料中の標的抗原は、コーティングされたモノクローナル抗体と標識されたモノクローナル抗体の間に挟まれ、およびその後、標識されたマーカーの量またはレベルを決定することによって、抗原の存在を定量的に決定することができる。例えば、サンドイッチ法による免疫測定法は、未知量の標的抗原を含む試料を、本発明に係るモノクローナル抗体が物理または化学的手段によりその上にコーティングされている固体支持体に添加し、反応させる；次に、標識された本発明に係るモノクローナル抗体を添加して反応させる；そして一定期間のインキュベーションの後、支持体を洗浄し、支持体上に結合したマーカーの量またはレベルを決定することを含む。
【０１０２】
マーカーは、放射性同位体、酵素、酵素の基質、例えばイソルミノールおよびアクリジニウムエステル等の発光物質、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光物質、ラテックス粒子や金コロイドなどの発色物質であってよい。例えば、標識として使用する酵素としては、これらに限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。適切な酵素基質としては、これらに限定されないが、例えば２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ルミノール、過酸化水素、ｏ−フェニレンジアミン−過酸化水素（ペルオキシダーゼ向け）、パラ−ニトロフェニルＬのリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル１，２−ジオキセタン（アルカリホスファターゼ向け）、Ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（ベータガラクトシダーゼ向け）が挙げられる。標識として使用する蛍光標識としては、これらに限定されないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、フィコエリスリン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、トルイレン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、［５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン］、塩化ダンシル、フィコエリトリン、蛍光ランタニド錯体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、などが挙げられる。放射性同位体は、これらに限定されないが、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１０３】
他のマーカーには、これらに限定されないが、量子ドットラベル、発色団標識、親和性リガンド標識、電磁スピン標識、重原子標識、エピトープタグ（ＦＬＡＧまたはＨＡエピトープなど）、および複合体を形成することが可能な結合対（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチンまたは抗原／抗体複合体（例えば、ウサギのＩｇＧと抗ウサギＩｇＧ））が挙げられる。
【０１０４】
抗原または抗体にマーカーを結合するための方法は当技術分野で知られており、これらに限定されないが、マレイミド法（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９７６），  ７９，  ２３３）、ビオチン活性化法（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （１９７８），  １００，  ３５８５）、疎水性結合方法、エステル活性化方法またはイソシアネート法（「酵素イムノアッセイ技術」医学書院によって１９８７年に出版）が挙げられる。
【０１０５】
別の態様において、本発明は本発明に係る、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片或いは抗イディオタイプ抗体及び、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、以下から選択される：
（１）配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むモノクローナル抗体；好ましくは、配列番号１９に記載のＶＨ及び／又は配列番号２０に記載のＶＬを含み；より好ましくは、タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５２７を有する、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６によって産生されたモノクローナル抗体；
（２）配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むモノクローナル抗体；好ましくは、配列番号２１に記載のＶＨおよび／又は配列番号２２に記載のＶＬ含み；より好ましくは、タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３５を有する、ハイブリドーマ細胞株７Ｇ６によって産生されたモノクローナル抗体；そして  
（３）配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する    ＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むモノクローナル抗体；好ましくは、配列番号２３に記載のＶＨ及び／又は配列番号２４に記載のＶＬ含み；より好ましくは、タイプ・カルチャー・コレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１４３２を有する、ハイブリドーマ細胞株１１Ｂ１０によって産生されたモノクローナル抗体。
【０１０６】
いくつかの好ましい実施形態において、医薬組成物は、追加の薬学的に活性な薬剤（例えば、Ｍ２タンパク質イオンチャネル阻害剤（例えば、アマンタジンおよびリマンタジン）およびノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビル）のような抗インフルエンザ剤）をさらに含む。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、インフルエンザＢ型ウィルスを含む試料を本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に接触させることを含む、試料中のインフルエンザＢ型ウィルスの毒性を中和するための方法を提供する。
【０１０８】
この方法は、治療目的のために又は非治療目的で使用することができる（例えば、試料は、患者または患者からの試料の代わりに、細胞試料である）。好ましくは、インフルエンザＢ型ウィルスは、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統から選択される。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、試料中のインフルエンザＢ型ウィルスの毒性を中和するための医薬組成物の製造における、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。別の態様において、試料中のインフルエンザＢ型ウィルスの毒性を中和するための、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、対象におけるインフルエンザＢ型ウィルスによる感染又は感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防または治療用の医薬組成物の製造における、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片或いは抗イディオタイプ抗体の使用を提供する。別の態様において、本発明は対象におけるインフルエンザＢ型ウィルスによる感染又は感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防または治療のための、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片或いは抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、対象におけるインフルエンザＢ型ウィルスによる感染又は感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防または治療法であって、それを必要とする対象に、予防上または治療上有効な量の、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片或いは抗イディオタイプ抗体、或いは本発明に係る医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１１２】
いくつかの好ましい実施形態において、対象は哺乳動物、例えばヒトである。
【０１１３】
本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗原結合断片或いは抗イディオタイプ抗体、或いは本発明に係る医薬組成物を任意の適切な経路によって対象に投与することができる。このような経路は、これらに限定されないが、経口、頬側、舌下、局所、非経口、直腸、膣内、又は鼻腔ルートが挙げられる。
【０１１４】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナルは抗体配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むこのような抗体であり；好ましくは、配列番号１９に記載のＶＨ及び／又は配列番号２０に記載のＶＬを含み；より好ましくは、モノクローナル抗体１２Ｇ６である。
【０１１５】
いくつかの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号７〜９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号１０〜１２に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むこのような抗体であり；好ましくは、配列番号２１に記載のＶＨおよび／又は配列番号２２に記載のＶＬ含み；より好ましくは、モノクローナル抗体７Ｇ６である。
【０１１６】
いくつかの好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は配列番号１３〜１５に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ  ＣＤＲ１〜３及び／又は配列番号１６〜１８に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むこのような抗体であり；好ましくは、配列番号２３に記載のＶＨ及び／又は配列番号２４に記載のＶＬ含み；より好ましくは、モノクローナル抗体１１Ｂ１０である。
【０１１７】
本発明で提供される薬剤および医薬組成物は単独で又は追加の医薬活性剤と組み合わせて使用することができる（例えば、Ｍ２タンパク質のイオンチャネルの阻害剤（例えば、アマンタジン及びリマンタジン）およびノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビル）のような抗インフルエンザ剤）。
【発明の効果】
【０１１８】
従来技術と比較すると、本発明に係るモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、有意な有益な効果を有する。具体的には、本発明に係るモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、インフルエンザＢ型ウィルスの少なくとも２系統（例えば、ヤマガタ亜型とビクトリア亜型）のＨＡタンパク質に特異的に結合することができ、広域スペクトルウィルス結合反応性と広いスペクトルのウィルス中和能を示し、したがって対象におけるインフルエンザＢ型ウィルスの感染又は感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の治療又は予防において、特に有意な利点を有する。
【０１１９】
本発明の実施形態は、以下の図面および実施例を参照して詳細に示されている。しかし、以下の図面および実施例は本発明の範囲を限定する目的のためでなく、単に本発明を説明するためのみに使用されることが、当業者には理解される。以下の図面の詳細な説明および好ましい実施形態によれば、本発明の様々な目的および利点は、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、アミノ酸モノクローナル抗体１２Ｇ６（図１Ａ）、７Ｇ６（図１Ｂ）および１１Ｂ１０（図１Ｃ）によって認識されるエピトープ中のキーとなるアミノ酸部位の三次元構造を示す。図１Ａにおいて、ＨＡの受容体結合部位は緑色にマークされ、及びモノクローナル抗体１２Ｇ６によって認識されるアミノ酸部位は赤でマークされている。結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６によって認識されるキーとなるエピトープアミノ酸が、ＨＡの１５６位、１７６位及び１８３位であることを示す。図１Ｂにおいて、ＨＡの受容体結合部位は緑色にマークされ、及びモノクローナル抗体７Ｇ６によって認識されるアミノ酸部位は赤でマークされている。結果は、モノクローナル抗体７Ｇ６によって認識されるキーとなるエピトープアミノ酸が、ＨＡの１５６位、１６５位及び１８０位であることを示す。図１Ｃにおいて、ＨＡの受容体結合部位は緑色にマークされ、及びモノクローナル抗体１１Ｂ１０によって認識されるアミノ酸部位は赤でマークされている。結果は、モノクローナル抗体１１Ｂ１０によって認識されるキーとなるエピトープアミノ酸が、ＨＡの１８０位であることを示す。
【０１２１】
【図２】図２は、モノクローナル抗体７Ｇ６及び１１Ｂ１０を用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、ウィルス  Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）（図２Ａ）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（ビクトリア）（図２Ｂ）、Ａ／ブリスベーン／２０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（図２Ｃ）、およびＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（図２Ｄ）を検出し、横対数座標がモノクローナル抗体の希釈倍数が表し、縦座標がＥＬＩＳＡの結果（ＯＤ４５０）表す。結果は、モノクローナル抗体７Ｇ６及び１１Ｂ１０の両方がインフルエンザＢ型ウィルスの２つの系統、Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）およびＢ／マレーシア／２００４分の２５０６（ビクトリア）に強い結合反応性を有するものの、インフルエンザＡ型ウィルス、Ａ／ブリスベーン／２０／２００７（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）とは特異的反応性を持たないことを示す。
【０１２２】
【図３】図３は、インフルエンザＢ型ウィルス、Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ＦＬ０４−ＭＡ）およびＢ／ブリスベン／６０／２００８（ＢＲ６０−ＭＡ）に感染したマウスにおける、モノクローナル抗体１２Ｇ６の保護効果を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス感染対照群（インフルエンザＢ型ウィルス対照）と治療グループ（１２Ｇ６−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８ウィルス感染対照群（インフルエンザＢ型ウィルス対照）および治療群（１２Ｇ６−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。結果は、有意な体重減少は、２つのウィルス感染対照群のマウスで観察されたものの、有意な体重変動は、全実験中陰性対照群のマウスでは観察されなかったことを示す。Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス対照群のすべてのマウスは感染後８日で死亡した、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８のウィルス対照群のすべてのマウスは感染後１０日で死亡した。２種のインフルエンザＢ型ウィルスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体１２Ｇ６の注入による介入により、１００％の治療有効性をもって、感染したマウスの体重を回復することが出来、１４日間感染したマウスは正常に生存することが出来た。
【０１２３】
【図４】図４は、インフルエンザＢ型ウィルス、Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ＦＬ０４−ＭＡ）およびＢ／ブリスベン６０／２００８（ＢＲ６０−ＭＡ）に感染したマウスにおける、モノクローナル抗体７Ｇ６の保護効果を示す。図４Ａ及び図４Ｂは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス感染対照群（インフルエンザＢウィルス対照）と治療グループ（７Ｇ６−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。図４Ｃ及び図４Ｄは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８ウィルス感染対照群（インフルエンザＢウィルス対照）および治療群（７Ｇ６−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。結果は、有意な体重減少は、２つのウィルス感染対照群のマウスで観察されたものの、有意な体重変動は、全実験中陰性対照群のマウスでは観察されなかったことを示す。Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス対照群のすべてのマウスは感染後８日で死亡した、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８のウィルス対照群のすべてのマウスは感染後５日で死亡した。２種のインフルエンザＢ型ウィルスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体７Ｇ６の注入による介入により、１００％の治療有効性をもって、感染したマウスの体重を回復することが出来、１４日間感染したマウスは正常に生存することが出来た。
【０１２４】
【図５】図５は、インフルエンザＢ型ウィルス、Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ＦＬ０４−ＭＡ）およびＢ／ブリスベン６０／２００８（ＢＲ６０−ＭＡ）に感染したマウスにおける、モノクローナル抗体１１Ｂ１０の保護効果を示す。図５Ａ及び図５Ｂは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス感染対照群（インフルエンザＢウィルス対照）と治療グループ（１１Ｂ１０−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。図５Ｃ及び図５Ｄは、陰性対照群（ＰＢＳ−ＮＣ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８ウィルス感染対照群（インフルエンザＢ型ウィルス対照）および治療群（１１Ｂ１０−１０ｍｇ／ｋｇ）それぞれのマウスの生存率と体重変化を示す。結果は、有意な体重減少は、２つのウィルス感染対照群のマウスで観察されたものの、有意な体重変動は、全実験中陰性対照群のマウスでは観察されなかったことを示す。Ｂ／フロリダ／０４／２００６ウィルス対照群のすべてのマウスは感染後８日で死亡した、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８のウィルス対照群のすべてのマウスは感染後８日で死亡した。２種のインフルエンザＢ型ウィルスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの用量での抗体１１Ｂ１０の注入による介入により、１００％の治療有効性をもって、感染したマウスの体重を回復することが出来、１４日間感染したマウスは正常に生存することが出来た。
【０１２５】
【図６】図６は、インフルエンザＢ型ウィルスＢ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）またはＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）に感染したＭＤＣＫ細胞の免疫蛍光分析の結果を示す（ここで、ＭＤＣＫ細胞に感染させる前に、インフルエンザＢ型ウィルスは、モノクローナル抗体１２Ｇ６、Ｂ／フロリダ／４／２００６ウィルスに対するポリクローナル抗血清（Ｂ／ＦＬ．抗血清）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４ウィルスに対するポリクローナル抗血清（Ｂ／Ｍａｌ．抗血清）またはＰＢＳ（抗体なし対照）で、それぞれインキュベーションされている）。
【０１２６】
【図７】図７は、インフルエンザＢ型ウィルスＢ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）またはＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）に感染したＭＤＣＫ細胞のギムザ染色による染色の結果を示す（ここで、ウィルス感染後、ＭＤＣＫ細胞は、０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌの抗体１２Ｇ６とインキュベートされている）。
【０１２７】
【図８】図８は、ＭＤＣＫ細胞の培養上清および細胞溶解物中のＮＰタンパク質を検出するための免疫ブロットアッセイの結果を示す（ここで、ＭＤＣＫ細胞はインフルエンザＢ型ウィルスＢ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）またはＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）に感染しており、感染後、培養培地中（抗体を含まない対照）或いは、所与の濃度のモノクローナル抗体１２Ｇ６（２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ又は０．０２μｇ／ｍｌ；培養培地中に希釈）或いは所定の濃度の陰性対照抗体（２０μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌ；培養培地中に希釈）と共にインキュベーションされた）。
【０１２８】
【図９】図９は、モノクローナル抗体１２Ｇ６および陰性対照抗体（抗ＨＩＶモノクローナル抗体５Ｇ６）によって引き起こされる、インフルエンザウィルス  Ｂ／マサチューセッツ／０２／２０１２（ヤマガタ）及びＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）に対するＡＤＣＣ（図９Ａ）およびＣＤＣ（図９Ｂ）の解析結果を示す。
【０１２９】
配列情報
本発明に含まれる配列情報は以下の表１に提供される。
【表１−１】
0006423550.tif 000002
【表１−２】
0006423550.tif 000003
【表１−３】
0006423550.tif 000004
【表１−４】
0006423550.tif 000005
【表１−５】
0006423550.tif 000006
【０１３０】
生物学的材料の寄託の説明
本発明は、タイプカルチャーコレクション中国センター（ＣＣＴＣＣ、ウーハン大学、ウーハン、中国）に寄託された以下の生物学的材料に関する：
ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６は、ＣＣＴＣＣ番号：Ｃ２０１５２７の寄託番号で、２０１５年４月１０日に寄託された；
ハイブリドーマ細胞系７Ｇ６は、ＣＣＴＣＣ番号：Ｃ２０１４３５の寄託番号で、２０１４年３月２６日に寄託された；そして 
ハイブリドーマ細胞株１１Ｂ１０は、ＣＣＴＣＣ番号：Ｃ２０１４３２の寄託番号で、２０１４年３月２６日に寄託された。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
本発明を以下の実施例（本発明の範囲を限定するものではない）を参照して説明する。
【０１３２】
他に示されない限り、本発明において使用される分子生物学的実験方法および免疫学的アッセイは、ＳａｍｂｒｏｏｋＪら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編集、１９８９およびＦＭＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ、１９９５に従い実質的実行され；制限酵素は、製品の製造業者によって推奨される条件下で使用される。実施例において具体的な条件が記載されていない場合、実施例は、従来の条件または製造業者により推奨される条件に従って実施される。製造業者が示されていない試薬または装置は、市販されている従来の製品である。当業者であれば、これらの実施例は本発明を説明するために使用されているが、本発明の範囲を限定するものではないことを理解する。
【実施例１】
【０１３３】
実施例１：インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡタンパク質に対するモノクローナル抗体の調製
１．ウィルス抗原の調製
ＭＤＣＫ細胞に、Ｂ／アモイ／８９１／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア）、Ｂ／アモイ／Ｎ６９７／２０１２（ヤマガタ）及びＢ／アモイ／３０４３／２００６（ビクトリア）の４株のインフルエンザＢウィルスを接種した。細胞を３７℃で２日間インキュベートした後、上清を回収して増幅されたウィルスを得た。生ウィルスを収集し、４℃で０．０３％ホルマリンで不活性化した。不活性化されたウィルスは、ＨＡ滴定を行い、不活化ウィルスの力価を決定した（注：ＨＡ滴定の特定の手順については、ＷＨＯ運用ガイドラインを参照）。Ｂ／アモイ／８９１／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア）、Ｂ／アモイ／Ｎ６９７／２０１２（ヤマガタ）、Ｂ／アモイ／３０４３／２００６（ビクトリア）は、発明者の研究室で分離されたインフルエンザＢ型ウィルスの株であった。
【０１３４】
２．実験マウス：
６週齢、ＳＰＦグレードのメスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、実験動物センター、アモイ大学によって提供された。
【０１３５】
３．ハイブリドーマの調製：
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、標準的なインビボ免疫法及びＰＥＧ融合法によって得られた。詳細については、Ｈａｒｌｏｗら編、「抗体実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８８を参照されたい。簡単なプロセスは以下のとおりである。
【０１３６】
３．１  マウスの免疫化：
不活性化されたウィルスの力価を１２８ＨＡに調整し、次いでマウスを逐次免疫により免疫化した。要約すると、まず、ウィルスＢ／アモイ／８９１／２００６（ヤマガタ）をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と等量混合して乳化させた後、各マウスについて４００μｌの量で、一次免疫用多点筋肉注射によりマウスの肢に投与した。Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア）、Ｂ／アモイ／Ｎ６９７／２０１２（ヤマガタ）、Ｂ／アモイ／３０４３／２００６（ビクトリア）を別々に混合し、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させた後、それぞれ、一次免疫後１４日、２８日及び４２日に追加免疫のためにマウスに投与した。最後に、一次免疫化後５６日で、追加免疫がマウス脾臓に行われた（ここで、免疫原はそれぞれのマウスに対して、上記ウィルスの１００μｌずつの混合物であった）。免疫３日後、マウスの脾臓を融合実験のために採取した。
【０１３７】
３．２  細胞融合：
脾臓を粉砕して脾臓細胞懸濁液を得た後、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と指数増殖期で混合した。細胞融合は、ＰＥＧ１５００の存在下で行った。融合細胞を４００ｍｌ融合培地に再懸濁し、次いで、培養のために２０枚の９６ウェルプレートに播種した。融合培養培地は、ＨＡＴおよび２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０完全スクリーニング培地であった。
【０１３８】
３．３  ハイブリドーマのスクリーニング：
融合した細胞を９６ウェルプレートで１０日間培養した後、細胞の上清を赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイおよびＥＬＩＳＡのために採取した。検出のためのウィルスは、Ｂ／アモイ／８９１／２００６（ヤマガタ）およびＢ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア）であった。ＨＩアッセイでは、陽性ウェルに分泌される抗体は、インフルエンザＢ型ウィルスおよび赤血球の凝集を阻害することができなければならない；ＥＬＩＳＡでは、陽性ウェル中に分泌された抗体は、ポリスチレンプレート上にコーティングされたインフルエンザＢ型ウィルスと特異的に反応することができなければならない。陽性クローンは、３回のクローニングに供し、安定的に抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株を得た。最終的に、１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０を含む、インフルエンザＢ型ウィルスのＨＡタンパク質に対する４１のハイブリドーマ細胞株が得られた。
【０１３９】
３．４  ハイブリドーマの培養：
４１の安定なハイブリドーマ細胞株を、ＣＯ２インキュベーター中で増幅培養に供した後、２４ウェルプレートに９６ウェルプレートから移し、その後５０ｍＬの細胞ボトルにさらに培養しました。次いで、細胞ボトルから回収した細胞は、マウスの腹腔に注射した。７〜１０日後、モノクローナル抗体を含む腹水をマウスの腹腔から採取した。
【０１４０】
４．モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体を含む腹水を５０％硫酸アンモニウム溶液で沈殿させた。得られた沈殿物をＰＢＳに溶解し、ＡＫＴＡシステムのプロテインＡカラムで精製し、精製したモノクローナル抗体を得た。精製したモノクローナル抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。
【実施例２】
【０１４１】
実施例２：インフルエンザＢ型ウィルスの異なるＨＡ系統のＨＡタンパク質を認識する広域スペクトルモノクローナル抗体の同定
インフルエンザＢ型ウィルスの代表的な株は、異なる領域から異なる時点で単離され、異なる変異型を示すものが選択され、対照としてインフルエンザＡ型の代表的な株が選択された。ＨＩアッセイを使用して、インフルエンザＢ型ウィルス変異株の異なる系統と、前記４１モノクローナル抗体の交差反応性を決定した。ＨＩアッセイについては、ＷＨＯオペレーションガイドラインを参照してください。インフルエンザウィルス株とモノクローナル抗体の反応性により、３つの広域スペクトルモノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０が同定され、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタとビクトリア系統を同時に認識する（すなわち、インフルエンザＢ型ウィルスの異なるＨＡ系統のＨＡタンパク質を認識する）ことができた（表２）。
【０１４２】
モノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０は、ヤマガタ系統のインフルエンザＢ型ウィルスとのビクトリア系統のインフルエンザＢ型ウィルスに特異的に反応性し、そして異なるＨＡ系統との良好な広域スペクトルの反応性を示した。モノクローナル抗体７Ｇ６は、早期の段階で発見された未系統のインフルエンザＢ型ウィルス、ヤマガタ系統のインフルエンザＢ型ウィルスおよびビクトリア系統のインフルエンザＢ型ウィルスと反応できた。アッセイに用いたすべてのインフルエンザＢ型ウィルスのうち、モノクローナル抗体７Ｇ６は、Ｂ／ハルビン／７／１９９４（ヤマガタ系統）およびＢ／五大湖／１７３９／１９５４の２つのウィルス株を除いたすべてに反応し、非常に広い示す反応性スペクトル示した。
【０１４３】
モノクローナル抗体１２Ｇ６および１１Ｂ１０は、早期に発見された未系統インフルエンザＢ型ウィルスの一部、ヤマガタ系統のインフルエンザＢ型ウィルスの一部およびビクトリア系統のインフルエンザＢウィルスの一部と特異的に反応出来た。ウィルスのヤマガタ系統とビクトリア系統の場合、モノクローナル抗体１１Ｂ１０は、モノクローナル抗体１２Ｇ６よりも広い反応性スペクトルを有し；一方、早期に発見された未系統インフルエンザＢ型ウィルスの場合、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、モノクローナル抗体１１Ｂ１０より広い反応性スペクトルを有した。
【０１４４】
結果として、モノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６，１１Ｂ１０はいくつかのウィルス株との反応性が若干異なっていたが、いずれもインフルエンザＢ型ウィルスの異なるＨＡ系統を認識する特異性を有する広スペクトルモノクローナル抗体であった。
【０１４５】
【表２】
0006423550.tif 000007
【実施例３】
【０１４６】
実施例３．モノクローナル抗体を１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０の中和活性の分析
中和活性／力価は、モノクローナル抗体が防止や病気の治療の可能性を持っているかどうかを評価するための重要な指標である。この実施例では、マイクロウェル中和アッセイを使用して、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０のインフルエンザＢ型ウィルスの異なる系統の代表的な株に対する中和活性を測定した（方法はＨｕｌｓｅ−ＰｏｓｔらＰＮＡＳ．  ２００５，  １０２：  １０６８２−７を参照）。実験結果を表３に示す．３つのモノクローナル抗体（１２Ｇ６、７Ｇ６および１１Ｂ１０）は、早期に発見された未系統インフルエンザＢ型ウィルス、ヤマガタ系統のインフルエンザＢ型ウィルス及びビクトリア系統のインフルエンザＢ型ウィルスに対して広域交差中和活性を有していた。モノクローナル抗体７Ｇ６の中和活性は、ＨＩ活性と実質的一致していた。モノクローナル抗体７Ｇ６は、２つのウィルス、すなわち、Ｂ／ハルビン／７／１９９４（ヤマガタ系統）および／Ｂ／五大湖／１７３９／１９５４を除くすべての試験されたインフルエンザＢ型ウィルスに中和活性を有し、比較的広い活性スペクトルと非常に強い反応性示した。モノクローナル抗体１１Ｂ１０の中和活性スペクトルはＨＩ活性スペクトルよりもわずかに広かった。特に、モノクローナル抗体１１Ｂ１０は、１９６２年から２０１２年の間のほとんどすべてのインフルエンザＢ型ウィルスを中和することができた（Ｂ／ハルビン／７／１９９４以外）。モノクローナル抗体１２Ｇ６の中和活性スペクトルは、ＨＩ活性スペクトルとは全く異なっており、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、１９４０年から２０１２年の間の、すべてのインフルエンザＢ型ウィルスを中和することができ、非常に強く、非常に広いスペクトル中和活性を示した。
【０１４７】
【表３】
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【実施例４】
【０１４８】
実施例４  モノクローナル１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０のキー（主要）エピトープアミノ酸の同定
この実施例では、モノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０を使用して、エスケープ突然変異を有するインフルエンザＢウィルス株を誘導およびスクリーニングした。スクリーニングされたエスケープウィルスは、プラーク精製、増幅培養、遺伝子検索、シークエンシング及びエスケープ変異部位の構造的局在化に供し、モノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６及び１１Ｂ１０によって認識されるエピトープが存在する領域、並びに認識されたキーエピトープアミノ酸が決定された。
【０１４９】
１．材料と方法：
（１）親ウィルス：Ｂ型インフルエンザウィルス、Ｂ／シンガポール／３／１９６４（ビクトリア系統）及びＢ／アモイ／１３４６／２００８をエスケープ突然変異スクリーニングのための親ウィルスとして選択した。
（２）モノクローナル抗体：精製１２Ｇ６，７Ｇ６，１１Ｂ１０
（３）エスケープスクリーニング方法：１０５ＴＣＩＤ５０親ウィルスを均一、単一のモノクローナル抗体と混合した。モノクローナル抗体の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであり、総体積が１ｍｌであった。前記ウィルスモノクローナル抗体複合体を室温で４時間インキュベートし、次いで９６ウェルプレートにプレコートしたＭＤＣＫ細胞に感染させるために使用した。２時間ウィルスモノクローナル抗体複合体で細胞をインキュベートした後、複合体は除去され、５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む維持培地を添加し、そして細胞を４８時間３７℃でさらに培養した。培養上清を血球凝集アッセイに行いた。陽性であると判断されたウェルのウィルスが、エスケープウィルスであった。３サイクルのプラーククローニングの後、安定したエスケープウィルス株が得られた。
（４）エスケープウィルス株のエスケープ変異部位の局在：得られたエスケープウィルス株は、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ウィルスの構造遺伝子を得た、得られた構造遺伝子を配列決定し、親ウィルスの構造遺伝子と比較し、エスケープ突然変異および突然変異部位を同定した。
（５）ＨＡの立体構造におけるキーエピトープアミノ酸の局在：Ａ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）ウィルスのＨＡ蛋白質（ＰＤＢ番号：４ＦＱＪ）の３Ｄ構造のファイルは、ＰＤＢデータベースからダウンロードした。３ＤプロッティングソフトウェアＰｙｍｏｌを使用して、ＨＡの受容体結合部位および１２Ｇ６，７Ｇ６，１１Ｂ１０によって認識される重要なエピトープアミノ酸部位をＨＡの３Ｄ構造に局在化させた。
【０１５０】
２．結果と分析
エスケープ突然変異の結果は、すべてのエスケープ突然変異部位が、インフルエンザＢ型ウィルスＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインをコードする遺伝子に存在することを示した。
【０１５１】
特に、モノクローナル抗体１２Ｇ６のエスケープ突然変異の結果（表４）は、エスケープ突然変異部位が、Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア系統）のＨＡタンパク質（配列番号：３９）の位置１５６，１７６および１８３（シグナルペプチドからの番号付け、以下同様）のアミノ酸残基を含むことを示した。１５種のエスケープウィルス株はＢ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア系統）ベースのウィルスエスケープスクリーニングによって得られたものであり、４つのウィルス株は、ＨＡの１５６位（Ｇ１５６Ｗ）に変異を有しており、４つウィルス株は、ＨＡの１７６位（Ｐ１７６Ｑ）に変異を有しており、そして７つのウィルス株は、ＨＡの１８３位（Ｔ１８３Ｋ）に変異を有していた。前記３つのアミノ酸部位はモノクローナル抗体１２Ｇ６により認識されるキーエピトープアミノ酸として同定され、そしてＨＡの立体構造におけるその局在は、図１Ａに示された。
【０１５２】
【表４】
0006423550.tif 000009
【０１５３】
モノクローナル抗体７Ｇ６のエスケープ突然変異の結果（表５）は、エスケープ突然変異部位が、Ｂ／シンガポール／３／１９６４のＨＡタンパク質（配列番号：４０）の１５６、１６５および１８０位のアミノ酸残基を含むことを示した。Ｂ／シンガポール／３／１９６４に基づくウィルスエスケープスクリーニングにより、１６種のエスケープウィルス株が得られ、その中で６種のウィルス株がＨＡの１５６位に変異を有し（Ｇ１５６Ｗ）、４種のウィルス株がＨＡの１６５位に変異を有し（Ｋ１６５Ｅ）、そして６種のウィルス株はＨＡの１８０位に突然変異を有していた（Ｎ１８０Ｔ）。前記３つのアミノ酸部位はモノクローナル抗体７Ｇ６によって認識されるキーエピトープアミノ酸として同定され、そしてＨＡの立体構造におけるその局在は、図１Ｂに示された。
【０１５４】
【表５】
0006423550.tif 000010
【０１５５】
モノクローナル抗体１１Ｂ１０のエスケープ突然変異の結果（表６）は、エスケープ突然変異部位が、Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア系統）のＨＡタンパク質（配列番号：３９）の１８０位のアミノ酸残基を含むことを示した。Ｂ／アモイ／１３４６／２００８（ビクトリア系統）ベースのウィルスエスケープスクリーニングにより、４種のエスケープウィルス株が得られ、全てはＨＡの１８０位に突然変異を有していた（Ｎ１８０Ｋ）。これは、ＨＡタンパク質の１８０位のアミノ酸がモノクローナル抗体１１Ｂ１０によって認識されるキーエピトープのアミノ酸であり、そのＨＡの立体構造における局在化は、図１Ｃに示された。
【０１５６】
【表６】
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【０１５７】
実験結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０が類似のエピトープを認識し、それらが認識するエピトープが全てインフルエンザウィルスＨＡタンパク質のＨＡ１ドメインに存在し、空間構造において受容体結合部位（ＲＢＳ）に近いことを示した。
【実施例５】
【０１５８】
実施例５．モノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６および１１Ｂ１０の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の分離および配列分析
約１０７個のハイブリドーマ細胞を半付着により培養した。接着した細胞を吹き込みにより懸濁させ、新しい４ｍｌ遠心管に移した。１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、細胞沈殿物を集め、１００μｌの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４５）に再懸濁し、次いで新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）８００μｌを添加し、逆混合により穏やかに混合し、次いで１０分間静置した。クロロホルム２００μｌを添加し、１５分間激しく振とうし、１０分間放置した後、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移し、等量のイソプロパノールを添加し、混合し、１０分間放置した後、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、７５％エタノール６００μｌを添加して洗浄した後、４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿物を真空下、６０℃で５分間乾燥させた。透明な沈殿物を７０μｌのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏに溶解し、そして２本のチューブに回収した。１つのチューブに、１μＬの逆転写プライマー（ＭＶＪｋＲ（５’−ＣＣＧＴＴＴＧＫＡＴＹＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＳＣＣ−３’）（配列番号：３１））を添加し、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅を行い、もう１つのチューブに、転写リバースプライマー（ＭＶＤＪｈＲ（５’−ＣＧＧＴＧＡＣＣＧＷＧＧＴＢＣＣＴＴＧＲＣＣＣＣＡ−３’）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２））を添加し、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅を行った。各チューブに、１μｌのｄＮＴＰ（ＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を添加し、チューブを７２℃の水浴に１０分間入れ、直ちに氷浴中で５分間置いた。１０μｌの５ｘ逆転写バッファー、１μｌのＡＭＶ（１０Ｕ／μｌ、プロメガ）、および１μＬのＲｎａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ、プロメガ）を添加した。混合物をよく混合した後、ＲＮＡを４２℃でｃＤＮＡに逆転写した。
【０１５９】
抗体の可変領域の遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により分離した。プライマーセット（表７に示される）及び別の２つの設計および合成された下流プライマーＭＶＪｋＲ（配列番号３１）及びＭＶＤＪｈＲ（配列番号３２）（ＳｈａｎｇＨａｉＢｏｙａＣｏｍｐａｎｙによって合成された）が用いられた。ＭＶＪｋＲは、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅のための下流プライマーであり、そしてＭＶＤＪｈＲは重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅のための下流プライマーであった。鋳型は、前の工程で合成された２つのｃＤＮＡであった。ＰＣＲ条件は：９４℃  ５分；（９４℃４０秒、５３℃１分、７２℃５０秒）ｘ３５サイクル；７２℃１５分であった。目的の断片を回収し、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングし、次にＳｈａｎｇＨａｉＢｏｙａＣｏｍｐａｎｙに配列決定のために送った。Ｂｌａｓｔ整列により、抗体可変領域をコードする遺伝子配列を決定し、対応するアミノ酸配列を決定した。
【０１６０】
上記の方法によって、抗体可変領域をコードする遺伝子は、ハイブリドーマ細胞株１２Ｇ６、７Ｇ６、１１Ｂ１０からクローン化し、そしてモノクローナル抗体の相補的決定基領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔの方法（（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，  Ｗｕ  ＴＴ，  Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ，  Ｃｏｅｌｌｅｒ  Ｋ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｕ．Ｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  １９９１）を参照することにより決定した。結果を表８ａ〜８ｂに示す。
【０１６１】
【表７】
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【表８】
0006423550.tif 000013
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【実施例６】
【０１６２】
実施例６．インフルエンザＢ型ウィルスの検出のためのモノクローナル抗体７Ｇ６および１１Ｂ１０の適用
１．材料と方法
（１）インフルエンザウィルスの調製：一定量の、以下のインフルエンザウィルス株：Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（ビクトリア）、Ａ／ブリスベン／２０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）を、０．０３％ホルマリンで４℃で不活性化した。不活化ウィルスを、超遠心分離にショ糖密度勾配遠心分離にかけ、そして４℃で、３時間２５２００ｒｐｍで遠心分離した。ウィルス沈殿物を４℃で一晩、１×ＰＢＳ溶解した。超遠心分離したウィルスをＨＡ滴定によって決定し、ウィルス溶液の力価を測定した。
（２）モノクローナル抗体：上記で調製したモノクローナル抗体７Ｇ６および１１Ｂ１０；モノクローナル抗体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。
（３）ＥＬＩＳＡ実験：
超遠心分離したウィルスの力価を１２８ＨＡに適合させ、そして９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートにウェルあたり２００μｌプレコートした。次いで、９６ウェルプレートをブロッキング液でブロッキングした。試験されるモノクローナル抗体は、初期濃度として０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして２倍勾配希釈を１５回行った。希釈したモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートウェル当たり１００μｌの体積で、３０分間３７℃でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄溶液（ＰＢＳＴ）で５回洗浄し、それから１００μｌのＨＲＰ標識二次抗体を加え、そして得られた混合物を３０分間３７℃でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、発色剤を添加し、２０分間発色させた。吸収値Ａ４５０はその後、ＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
【０１６３】
２．結果と分析
ＥＬＩＳＡの結果は図２に示す。図２に示すように、モノクローナル抗体７Ｇ６及び１１Ｂ１０は、インフルエンザＢ型ウィルスの２つのＨＡ系統（すなわち、ヤマガタ及びビクトリア）との強い結合反応性を有したが（Ｂ／フロリダ／０４／２００６（ヤマガタ）及びＢ/マレーシア／２５０６／２００４（ビクトリア）、インフルエンザＡ型ウィルスの代表的な株（例えば、Ａ／ブリスベン／２０／２００７（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１））と特異的な反応性を有さなかった。
結果は、広域スペクトルモノクローナル抗体７Ｇ６および１１Ｂ１０を使用して、インフルエンザＢ型ウィルスの少なくとも２つのＨＡ系統を特異的に検出することができることを示した。
【実施例７】
【０１６４】
実施例７．インフルエンザウィルス感染の治療のためのモノクローナル抗体１２Ｇ６、７Ｇ６および１１Ｂ１０の適用
抗体による感染症の受動免疫療法は、抗ウィルス治療の潜在的に有効な経路である。これは、本発明のモノクローナル抗体は、異なる時間に異なる領域から単離されたインフルエンザＢ型ウィルス少なくとも２つのＨＡ系統（例えば、ヤマガタ、ビクトリア）に対して高い中和活性を有することが、先の実施例におけるマイクロウェルでインビトロ中和アッセイによって実証された。本発明によるモノクローナル抗体は、インフルエンザＢ型ウィルスの少なくとも２つのＨＡ系統（例えば、ヤマガタ及びビクトリア）に対する広い中和反応性スペクトラム及び高い中和力価によって特徴付けられた。さらに、インビボで本発明のモノクローナル抗体の抗ウィルス効果を実証するために、本発明のモノクローナル抗体は、インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統およびビクトリア系統による感染に対する抗ウィルス治療効果を、ヤマガタ系統及びビクトリア系統のインフルエンザＢ型ウィルスに感染したＢＡＬＢ／ｃマウスに基づき、動物バイオセーフティ研究所で検証した。実験は以下に従った。
【０１６５】
（１）材料および方法
動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、ＳＰＦ、６−８週齢、メス、重さ約２０ｇ。
モノクローナル抗体：１２Ｇ６，７Ｇ６，１１Ｂ１０
インフルエンザＢ型ウィルスのマウス適応系統：
インフルエンザＢ型ウィルスのヤマガタ系統のマウス適応株：Ｂ／フロリダ／０４／２００６、略してＦＬ０４−ＭＡと呼ばれる。
インフルエンザＢ型ウィルスのビクトリア系統のマウス適応株：Ｂ／ブリスベン／６０／２００８、略してＢＲ６０−ＭＡと呼ばれる。
麻酔薬：イソフルラン
動物群：マウスを１日前に動物バイオセーフティ研究所に送り、Ｇ１、Ｇ２、．．．．．等と指定されたケージあたり５匹のマウスを有する群に分けた；各マウスの体重を記録し、レジメンを表９に示す。
ウィルス感染：ヤマガタ系統ウィルスＢ／フロリダ／０４／２００６を１０５  ＴＣＩＤ５０／μｌに事前に希釈し、ビクトリア系統ウィルスＢ／ブリスベン／６０／２００８を１０６ＴＣＩＤ５０／μｌに予め希釈し、そして５０μｌ／マウスの用量でマウスに接種した。接種前に、マウスをイソフルランで麻酔し、次いで鼻腔を介してウィルスを接種することにより感染させた。
ＭＡｂの介入：ウィルス感染後２４時間（ｄｐｉ．１）は、抗体処置群のマウスは、一定の投与量、すなわち１０ｍｇ／ｋｇで抗体を注入された。注入量は１００μｌであった。
観察：ウィルス感染後１−１４日、体重、生存、および対応する行動症状を毎日記録した。
【０１６６】
【表１０】
0006423550.tif 000017
【０１６７】
（２）結果と分析
マウスはヤマガタ系統のインフルエンザＢ型ウィルスＦＬ０４−ＭＡとビクトリア系統のインフルエンザＢ型ウィルスＢＲ６０−ＭＡに別々に１週間の致死量で感染させた。感染後１日目に、抗体を治療群のマウスの尾静脈に注射した。モノクローナル抗体の治療効果は、体重を測定し、各群のマウスの生存率を計算することによって決定した。実験結果を図３−５に示した。
図３−５の実験結果は、ネガティブコントロール群のマウスでは、実験全体で有意な体重変動は観察されなかった；有意な体重減少は、二つのウィルスに感染した対照群で観察された。ＦＬ０４−ＭＡウィルス対照群の全てのマウスは８日、感染後に死亡し；ＢＲ６０−ＭＡウィルス対照群の全てのマウスは感染５〜１０日後に死亡した。前記２種のインフルエンザＢ型ウィルスの場合、１０ｍｇ／ｋｇの用量での１２Ｇ６、７Ｇ６、１１Ｂ１０抗体注入による介入は、感染マウスの体重回復につながった（図３Ｂ、３Ｄ、図４Ｂ、図４Ｄ、図５Ｂ、及び図５Ｄ）。さらに、ウィルス感染の１〜１４日後にマウスの生存が観察された。その結果、１０ｍｇ／ｋｇの用量のモノクローナル抗体１２Ｇ６，７Ｇ６，１１Ｂ１０は、ウィルスに感染したマウスを通常１４日間生存させることができ、治療有効性は１００％に達した（図３Ａ、３Ｃ、４Ａ、４Ｃ、５Ａおよび５Ｃ）。この結果は、本発明による広域スペクトルモノクローナル抗体が、インフルエンザＢ型ウィルスの２つのＨＡ系統による感染およびそれによって引き起こされる疾患を効果的に予防および治療することができることを示した。
【実施例８】
【０１６８】
実施例８．モノクローナル抗体１２Ｇ６の機能
１．モノクローナル抗体１２Ｇ６は、宿主細胞へのＢ型インフルエンザウィルスの侵入を阻害することができる。
（１）材料および方法
ウィルス：Ｂ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）；
ＨＡ特異的抗体：モノクローナル抗体１２Ｇ６、Ｂ／フロリダ／４／２００６ウィルスに対するポリクローナル抗血清、およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４ウィルスに対するポリクローナル抗血清；
インフルエンザＢ型ウィルスＮＰタンパク質に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清；
ＧＡＭ−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体、緑色蛍光）；
細胞：ＭＤＣＫ細胞；
モノクローナル抗体１２Ｇ６（１０μｇ／ｍｌ）、Ｂ／フロリダ／４／２００６のウィルスに対するポリクローナル抗血清、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４のウィルスに対するポリクローナル抗血清、及びＰＢＳ（抗体を含まない対照）を別々にインフルエンザＢ型ウィルスの二系統とともに１時間３７℃でインキュベートした。次いで、インキュベートした混合物を、９６ウェルプレートで培養した単層ＭＤＣＫ細胞に加え、細胞をさらに１６〜１８時間培養した。培養後、細胞を培地で３回洗浄した。次に、市販のキットを用いて細胞をＤＡＰＩ染色（青色蛍光）に付した。細胞を、インフルエンザＢ型ウィルスのＮＰタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清（第一抗体）及びＧＡＭ−ＦＩＴＣ（二次抗体として、緑色蛍光）を用いて免疫蛍光分析を行った。
【０１６９】
（２）結果と分析
結果は図６に示された。結果として、ＰＢＳをインキュベーションに使用した場合、試験したインフルエンザＢ型ウィルスの２系統の両方がＭＤＣＫ細胞に入る可能性があることが示した（細胞は、緑色蛍光を示した）。Ｂ／フロリダ／４／２００６ウィルスに対するポリクローナル抗血清をインキュベーションに使用した場合、Ｂ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）はＭＤＣＫ細胞に進入できなかった（細胞は青色の蛍光を示した)；一方、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）はＭＤＣＫ細胞に入ることができた（細胞は、緑色蛍光を示した）。Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４ウィルスに対するポリクローナル抗血清をインキュベーションに使用した場合、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）はＭＤＣＫ細胞に侵入できなかった（細胞は青色蛍光を示した）、Ｂ／フロリダ／４／２００６はＭＤＣＫ細胞に入る可能性がある（細胞は緑色の蛍光を示した）。モノクローナル抗体１２Ｇ６をインキュベーションに使用した場合、インフルエンザＢ型ウィルスの２系統のいずれもＭＤＣＫ細胞に入り得なかった（細胞は青色蛍光を示した）。結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６が、インフルエンザＢ型ウィルスの２系統の宿主細胞への侵入を阻害し得ることを示した。
【０１７０】
２．モノクローナル抗体１２Ｇ６は、インフルエンザＢ型ウィルスの細胞へ膜融合を阻害できる。
（１）材料および方法
ウィルス：Ｂ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）；
ＨＡ特異的抗体：モノクローナル抗体１２Ｇ６；
実験用試薬：ギムザ染色、１０ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｍ３６７１−２５０Ｇ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ３３７５、ｐＨ５．５）およびＴＰＣＫトリプシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｔ１４２６）；
細胞：ＭＤＣＫ細胞；
感染多重度ＭＯＩ＝０．３で、ＭＤＣＫ細胞を、それぞれ、Ｂ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）およびＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）によって感染させた。２４時間後、細胞を培地で３回洗浄し、残余のウィルスを除去した。２．５ｍｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫトリプシンを、その後、細胞に添加した。１５分間３７℃でのインキュベーション後、細胞を培養培地で３回洗浄して、残余のトリプシンを除去した。後に、所定の濃度（０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）の抗体１２Ｇ６を細胞に添加し、そして３０分間３７℃でインキュベートした。抗体溶液をそれから除去し、細胞を２分間３７℃で、１０ｍＭ  ＭＥＳおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．５）中でインキュベートした（アロステリズムは酸性条件下で容易にＨＡタンパク質に起こり、それによって、ウィルスエンベロープの細胞膜へ融合を促進する。３回の培養培地で洗浄した後（洗浄後、ウィルス／細胞培養環境は、酸性から中性になった）、ウィルスに感染した細胞は、３時間３７℃でさらに培養した。その後、細胞を固定し、ギムザ染色で染色し、細胞内での膜融合の有無を観察した。抗体が細胞膜へのウィルスエンベロープの融合を阻害することができる場合は、膜融合の結果である合胞体を染色後に観察することができない。逆に、抗体がウィルス膜の細胞膜への融合を阻害できない場合、膜融合の結果である合胞体を、染色後に観察することができる。
【０１７１】
（２）結果と分析
実験結果を図７に示した。結果として、抗体１２Ｇ６細胞をインキュベーションに使用しなかった場合（例えば、０μｇ／ｍｌ抗体）、試験したインフルエンザＢ型ウィルスの２つの系統の両方が、ＭＤＣＫ細胞の膜融合をもたらし得た（すなわち、多くの合胞体が出現した）。５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌの抗体１２Ｇ６を場合、ＭＤＣＫ細胞の膜融合は有意に阻害された（すなわち、合胞体の数は有意に減少した）、２０μｇ／ｍｌの抗体は５μｇ／ｍｌの抗体よりも強い阻害を示した。さらに、１００μｇ／ｍｌの抗体１２Ｇ６をインキュベーションに使用した場合、ＭＤＣＫ細胞の膜融合は完全に阻害された（すなわち合胞体が出現しなかった）。結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、インフルエンザＢ型ウィルスの２系統の細胞への膜融合を阻害することができ；そしてモノクローナル抗体１２Ｇ６の阻害活性は用量依存的であることを示した。
【０１７２】
３．モノクローナル抗体１２Ｇ６は、宿主細胞からのインフルエンザＢ型ウィルスの放出を阻害することができる。
（１）材料および方法
ウィルス：Ｂ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）；
ＨＡ特異的抗体：モノクローナル抗体１２Ｇ６、および陰性対照抗体（抗ＨＩＶ  ｍＡｂ  ５Ｇ６）；
インフルエンザＢウィルスのＮＰタンパク質に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清；
ＧＡＭ−ＨＲＰ；
細胞：ＭＤＣＫ細胞；
ＭＤＣＫ細胞を、４００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。４時間後、過剰量のインフルエンザＢ型ウィルスを細胞に添加して細胞を感染させた。感染の３時間後、ウィルス溶液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄して遊離ウィルスを除去した。細胞培養プレートには、培養液（抗体を含まない対照）、または所定濃度のモノクローナル抗体１２Ｇ６（２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌまたは０．０２μｇ／ｍｌ；培地に希釈）または所定の濃度の陰性対照抗体（２０μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌ；培地に希釈）を加えた。３７℃でさらに１６〜１８時間インキュベートした後、細胞上清および細胞溶解物をそれぞれ回収し、インフルエンザＢ型ウィルスのＮＰタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清（一次抗体）及びＧＡＭ−ＨＲＰ（二次抗体）を用いて、イムノブロットアッセイを行った。
【０１７３】
（２）結果と分析
実験結果を図８に示した。結果として、インフルエンザＢ型ウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞を、抗体とインキュベートしないか又は陰性対照抗体とインキュベートした場合、有意な量のＮＰタンパク質が培養上清および細胞溶解物に検出することができた。これは、インフルエンザＢ型ウィルスの２つの系統がＭＤＣＫ細胞で増殖することができ、宿主細胞からインフルエンザＢ型ウィルスが放出され、そして陰性対照抗体は、宿主細胞からインフルエンザＢ型ウィルスの放出を阻害することができなかったことを示した。対照的に、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、インフルエンザＢ型ウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞をインキュベートするために使用した場合、ＮＰタンパク質は細胞溶解物中で検出することができたが、モノクローナル抗体１２Ｇ６の濃度の増加とともに培養上清中のＮＰタンパク質の量が減少した。モノクローナル抗体１２Ｇ６の濃度が２μｇ／ｍｌに達したとき、ＮＰタンパク質は培養上清中に全く検出されず、インフルエンザＢ型ウィルスの放出が完全に阻害されたことを示した。これらの結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、宿主細胞からインフルエンザＢ型ウィルスの系統の放出を阻害でき、モノクローナル抗体１２Ｇ６の阻害活性は用量依存的であることを示した。
【０１７４】
４．モノクローナル抗体１２Ｇ６は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有する。
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２０１３  Ｍａｙ，  ８７（１０）：５８３１−４０に記載された方法によって、モノクローナル抗体１２Ｇ６のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を測定した。
（１）材料および方法
ウィルス：Ｂ／マサチューセッツ／０２／２０１２様（ヤマガタ）、およびＢ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア）；
ＨＡ特異的抗体：１２Ｇ６、及び陰性対照抗体（抗ＨＩＶ  ｍＡｂ  ５Ｇ６）；
細胞：ＭＤＣＫ細胞、およびマウスＮＫ細胞；
細胞染色用試薬：ＰＫＨ−６７（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ番号：ＰＫＨ６７ＧＬ；一般に使われている細胞膜色素として）、及び７−ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：００−６９９３−５０；核酸色素として、死んだ細胞を同定するため）；
マウスＮＫ細胞単離キット（ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ  ｍｏｕｓｅ、製造元：ＭＡＣＳ、カタログ番号：１３０−０９６−８９２）を用いて、マウスの脾臓（すなわち、エフェクター細胞）からＮＫ細胞を単離し、使用した。感染の多重度ＭＯＩ＝１０で、ＭＤＣＫ細胞（すなわち、標的細胞）を、インフルエンザＢ型ウィルスに感染させた。３時間後、１ｘ１０５細胞／ｍＬの細胞濃度で、１００μｌの細胞を９６ウェルプレートに播種した。１時間培養した後、ＭＤＣＫ細胞の膜を、ＰＫＨ−６７色素で染色した。染色後、試験される抗体を所定の濃度に希釈し（２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌ）、そして５０μｌ／ウェルの容量で培養プレート中の細胞に添加し、次いで、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ＡＤＣＣアッセイのために、エフェクター細胞（１００μｌ）を培養プレート中の細胞に、エフェクター細胞と標的細胞の比が、５０：１になるように、添加し；ＣＤＣアッセイのために、１００倍希釈したモルモット血清（１００μｌ）を補体として、培養プレート中の細胞に添加した。培養プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、色素７−ＡＡＤを、１μｌ／ウェルの量で添加し、そして得られた混合物を５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をフローサイトメーターで分析し、そして死んだ標的細胞の割合を算出した。加えて、バックグラウンドコントロールとして、抗体を使用しなかった条件の下で実験を繰り返し、エフェクター細胞とインキュベートした、感染した標的細胞の自発的溶解率を表した。加えて、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（抗体の代わりに試験される）を陽性対照として、実験を繰り返し、エフェクター細胞とインキュベートした、感染した標的細胞の最大溶解率を表した。
【０１７５】
これらの細胞の蛍光染色状態は以下のようであった：生きたエフェクター細胞、蛍光なし；死んだエフェクター細胞、７−ＡＡＤ染色（遠赤色光）；生きた標的細胞、ＰＫＨ−６７染色（緑色）；死んだ標的細胞、ＰＫＨ−６７および７−ＡＡＤ二重染色（遠赤色光と緑色の光）。以下のようにＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を算出した。
ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性＝（テストグループにおける死んだ標的細胞の百分率−バックグラウンド対照群における死んだ標的細胞の百分率）／（陽性対照群における死んだ標的細胞の百分率−バックグラウンド対照群における死んだ標的細胞の百分率）＊１００％
【０１７６】
（２）結果と分析
実験結果は図９に示された。結果として、陰性対照抗体をインキュベーションのために使用した場合、ＮＫ細胞やモルモット血清の存在下で、ウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞で明らか溶解が発生しなかった。これは、陰性対照抗体が、２つの系統のインフルエンザＢ型ウィルスに対してＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発しないことを示した。対照的に、抗体１２Ｇ６は、インキュベーションのために使用した場合、ＮＫ細胞またはモルモット血清の存在下でのウィルス感染ＭＤＣＫ細胞で、明らかな溶解が発生した。そして、用いた抗体の濃度の増加と共に、ＭＤＣＫ細胞の溶解が促進された。これらの結果は、モノクローナル抗体１２Ｇ６は、試験した２つの系統のインフルエンザＢ型ウィルスに対してＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発でき；モノクローナル抗体１２Ｇ６の活性は用量依存的であることを示した。
【０１７７】
結果は、抗体１２Ｇ６は、以下の複数の機能活性を有することを示した：宿主細胞へのウィルスの侵入を阻害することができる；細胞へのウィルスの膜融合を阻害することができる；宿主細胞からのウィルスの放出を阻害することができる；および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びウィルスに対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発することができる。抗体１２Ｇ６は、上記５つの活性により、インフルエンザＢ型ウィルスを中和することができ、それによってインフルエンザＢ型ウィルスによる感染を予防及び治療できる。
【０１７８】
本発明の特定の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者は、全ての開示された教示に従い、種々の修正および変更を行うことが出来、そのような修正および変更は本発明の範囲内であることを理解するであろう。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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