(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、
前記第一のポリペプチドが１つの軽鎖可変ドメインと２つのヒト軽鎖定常ドメインとを含み、Ｎ−からＣ−末端方向に、前記軽鎖可変ドメインが第１のヒト軽鎖定常ドメインと融合し、前記第１のヒト軽鎖定常ドメインは第２のヒト軽鎖定常ドメインと融合し、これによりＶＬ−ＣＬ−ＣＬキメラ軽鎖を形成し、
前記第二のポリペプチドが１つの重鎖可変ドメインと２つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインとを含み、Ｎ−からＣ−末端方向に、前記重鎖可変ドメインが第１のヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、前記第１のヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインは第２のヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、これによりＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ１キメラ重鎖を形成する、
抗体フラグメント。
【請求項２】
軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、
前記第一のポリペプチドが１つの軽鎖可変ドメインと１つのヒト軽鎖定常ドメインと１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインとを含み、Ｎ−からＣ−末端方向に、前記軽鎖可変ドメインが前記ヒト軽鎖定常ドメインと融合し、前記ヒト軽鎖定常ドメインはヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、これによりＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１キメラ軽鎖を形成し、
前記第二のポリペプチドが１つの重鎖可変ドメインと１つのヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインと、１つのヒト軽鎖定常ドメインとを含み、Ｎ−からＣ−末端方向に、前記重鎖可変ドメインが前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインはヒト軽鎖定常ドメインと融合し、これによりＶＨ−ＣＨ１−ＣＬキメラ重鎖を形成する、
抗体フラグメント。
【請求項３】
前記軽鎖可変ドメインが、非ヒト軽鎖可変ドメインまたは非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインから選択される、請求項１または２に記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインが、非ヒト重鎖可変ドメインまたは非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインから選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項５】
ヒト化軽鎖可変ドメインが、配列番号２５、２７及び２９に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、
請求項３に記載の抗体フラグメント。
【請求項６】
ヒト化重鎖可変ドメインが、配列番号１９、２１及び２３に示される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、
請求項４に記載の抗体フラグメント。
【請求項７】
前記ヒト軽鎖定常ドメインがヒトカッパ軽鎖定常ドメインである、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項８】
前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインがヒトガンマ重鎖ＣＨ１定常ドメインである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項９】
前記ヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインがヒトＩｇＧ１由来である、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体フラグメントが、前記軽鎖可変ドメインと前記重鎖可変ドメインとを含むＦａｂ分子よりもｉｎ  ｖｉｖｏで安定である、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントが肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）と特異的に結合する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍および／または転移が認められる患者の治療に使用する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
前記腫瘍および／または転移が、ＨＧＦＲのシグナル伝達および／または活性化の調節異常によるものである、請求項１３に記載の抗体フラグメント。
【請求項１５】
軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、
抗体フラグメント中の４つの定常ドメインのうち２つの定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、前記抗体フラグメント中の前記４つの定常ドメインのうち他の２つの定常ドメインが重鎖ＣＨ１定常ドメインであり、
前記抗体フラグメントが肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）と特異的に結合する、
抗体フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体フラグメントは一価抗体フラグメントである、
請求項１から１１及び１３から１５のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】
腫瘍および／または転移、好ましくはＨＧＦＲのシグナル伝達および／または活性化の調節異常による腫瘍および／または転移の治療で同時に、別個に、または逐次的に使用する併用製剤として、請求項１から１１及び１３から１６のいずれか１項に記載の抗体フラグメントと、ＨＧＦ阻害薬およびＨＧＦＲ阻害薬のうちの少なくとも１つとを含有する、製品。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの阻害薬が、抗ＨＧＦ抗体、ＨＧＦと競合する組換え分子、小分子ＨＧＦＲ阻害薬、抗ＨＧＦＲ抗体または阻害薬から選択される、請求項１７に記載の製品。
【請求項１９】
請求項１から１１及び１３から１６のいずれか１項に記載の抗体フラグメントをコードする、単離核酸。
【請求項２０】
請求項１から１１及び１３から１６のいずれか１項に記載の抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１から１１及び１３から１６のいずれか１項に記載の抗体フラグメントをコードする核酸を２つ以上含む、組成物。
【請求項２２】
腫瘍および／または転移、好ましくはＨＧＦＲのシグナル伝達および／または活性化の調節異常による腫瘍および／または転移が認められる患者の治療に使用する、請求項１９に記載の単離核酸、請求項２０に記載のベクターまたは請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、安定性が改善された新規な抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の新しい領域である標的療法では、形質転換表現型を維持する重要な遺伝子産物を特異的にブロックする薬理学的手段を用いる。現在、チロシンキナーゼ分子ＡＢＬに依存する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１）活性化に依存する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の亜群および結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療ならびにＢＲＡＦ依存性黒色腫の治療に癌標的療法が臨床で用いられている。
【０００３】
チロシンキナーゼ活性を有する受容体（ＲＴＫ）はいくつかの種類の腫瘍において過剰に活性化されることが多いため、注目すべき標的療法の候補である。ＲＴＫは、受容体の細胞外部分と相互作用したときに受容体誘導性細胞内シグナル伝達を攪乱させることができる抗体などの様々な種類の標的化分子および受容体の触媒活性を阻害する化学合成小分子によって阻害され得る。
【０００４】
様々なＲＴＫのなかでも、ｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子の産物、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／Ｍｅｔ）は、癌で活性化される最も重要な発癌遺伝子の１つとして浮上している。Ｍｅｔは、分裂促進、侵襲性および高アポトーシスのキューを含めた「浸潤性増殖」として知られる遺伝プログラムを制御している。このような生理学的シグナルを介して、Ｍｅｔは腫瘍により優れた適応性を与え、癌進行において選択的な障壁を克服させる。Ｍｅｔはさらに、腫瘍血管新生を促進する能力によって腫瘍増殖を維持する。この数年の間に、Ｍｅｔはほかにも、抗血管新生薬で治療した腫瘍が発現する侵襲性および従来の放射線療法に対する耐性の原因であることがわかった。さらに、一次形質転換表現型の長期間にわたる維持に関して遺伝的に選択されてきたあらゆる場合において、ＭＥＴ遺伝子の変化が形質転換の主要な原因の１つである可能性が考えられる。
【０００５】
上に挙げた研究結果はいずれも、ＨＧＦの競合阻害薬、化学的Ｍｅｔキナーゼ阻害薬、抗ＨＧＦ抗体および抗Ｍｅｔ抗体を含めた、Ｍｅｔシグナル伝達を阻害するのに適したいくつかの分子の開発を促すものとなっている。これらの分子の一部は、これまで研究目的でのみ検証されてきたものである。現時点で、中和抗ＨＧＦ抗体、抗Ｍｅｔ抗体および数種類の小分子について臨床試験が進行中である。
【０００６】
いくつかの観点から言うと、Ｍｅｔシグナル伝達を阻害することができる抗Ｍｅｔ抗体が好ましいと考えられる。抗体であれば特異性、安定性が高く、またその天然の設計により、一般に宿主による耐容性に優れている。この数年の間に、治療用の抗Ｍｅｔ抗体を作製する試みがいくつかなされている。しかし、抗Ｍｅｔ抗体の大部分がアゴニストとして働き、ＨＧＦの作用を模倣するため、多数の失敗が発表されてきた。これはほとんどの場合、抗体がその二価構造により、受容体二量体を安定化してＭｅｔをトランスリン酸化することが可能になり、その結果、Ｍｅｔが活性化されることに起因する。ある場合には、ＧＦ結合と競合し、治療効果の可能性を示すアゴニストの抗Ｍｅｔ抗体（５Ｄ５）が設計され、一価型（単腕５Ｄ５）に変換されている（１、２）。この分子は最近、腫瘍における高レベルのＭｅｔ発現を特徴とする非小細胞肺癌の亜群の患者のエルロチニブとの併用治療を対象にした第ＩＩＩ相臨床試験の段階に入った（３）。
【０００７】
モノクローナル抗体ＤＮ３０は、ヒトＭｅｔ受容体の細胞外部分に対するマウスＩｇＧ２Ａである（４）。この抗体は、Ｍｅｔ受容体細胞外領域の第四ＩＰＴドメインとナノモル以下の親和性で結合する。この抗体は最初、Ｍｅｔ仲介性の生体細胞応答のすべてではなく一部を促進することができるＭｅｔの部分アゴニストとして特徴付けられた。その後、これが受容体の「シェディング」機序を介して腫瘍の増殖および転移の阻害物質として作用し得ることが示された（５）。受容体のシェディングは、多様な増殖因子、サイトカイン、受容体および接着分子に作用するタンパク質分解の生理学的細胞機序である。Ｍｅｔのシェディングは明確に２つの段階で示される：まず、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ−１０が、膜貫通領域のすぐ上流にある特定の配列を認識するＭｅｔの細胞外ドメインを切断する；次いで、残りの膜貫通フラグメントが、膜からキナーゼ含有部分を切り離し、直ちにそれをプロテアソーム分解経路に向かわせる第二のプロテアーゼ（γ−セクレターゼ）の基質となる（６、７）。ＤＮ３０によって働くこの機序を増強することにより、細胞表面に露出するＭｅｔ受容体の数が減少する。これと同時に、細胞外間隙に可溶性の「デコイ」外部ドメインが放出される。この外部ドメインは、本物のＭｅｔとヘテロ二量体複合体を形成することによってインタクトの膜貫通受容体とリガンド結合で競合し、受容体のホモ二量体形成を阻害する。上に挙げた作用はいずれも、Ｍｅｔ仲介性のシグナル伝達を強力に阻害し、下流の生物学的作用を抑制する。
【０００８】
本発明者らは最近、ＤＮ３０抗Ｍｅｔモノクローナル抗体（ＤＮ３０  Ｆａｂ）の一価Ｆａｂフラグメントがいかなるアゴニスト活性も除去されて、かつシェディングを誘導する能力を維持しているため、強力なＭｅｔ阻害薬となることを示した（８）。ＤＮ３０−ＦａｂによるＭｅｔシェディングの誘導は選択的な抗体−抗原相互作用に依存するが、受容体活性化とは独立したものである。単に細胞表面からＭｅｔを除去することに基づくこの作用機序によって、ＤＮ３０−Ｆａｂは、ＨＧＦ依存性であるかどうかに関係なく過剰発現、変異または遺伝子増幅によって誘導されるあらゆる形態のＭｅｔ活性化に対して有効であり得ることから、他の阻害薬よりも極めて有利なものとなる。
【０００９】
組換えＤＮ３０−Ｆａｂは臨床応用に極めて魅力的なものではあるが、Ｆａｂの血漿中半減期が短い（そのほとんどが腎クリアランスに起因する）ため、その患者治療での使用が大幅に制限される。
【００１０】
現時点では、Ｆａｂフラグメントの薬理学的特性を改善するための最も固定化された技術は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしてその分子量を増大させることである。ＦａｂのＰＥＧ化が臨床でＦａｂを用いるほとんどの場合にたどる経路である。ポリマー鎖と抗体フラグメントとの共有結合は抗原結合特性を失わずに効率的に得られるものであるが、明瞭な工程ではなく、設定に多大な努力を要する。
【００１１】
Ｆａｂフラグメントの薬理学的特性を改善するのに用いられるまた別の技術には、欧州特許公開第１７１８６７７（Ａ）号に開示されているものがある。上記単腕型のモノクローナル抗体５Ｄ５を作製するのに用いられるこのような方法では、３つの異なる抗体鎖、軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）、重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）および重鎖（ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃ部分を同じ細胞内で産生させる。ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは野生型ではなく、特定の三次元構造を生じさせる変異が含まれている。一方のポリペプチドのＣＨ２−ＣＨ３領域には突出部分を形成する配列が組み込まれ、他方のポリペプチドのＣＨ２−ＣＨ３領域には、突出部分を挿入できるくぼみを形成する配列が含まれている（ノブ・イントゥ・ホール構造（Ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））。このような三次元構造が存在することにより、重鎖とＦｃフラグメントがジスルフィド結合を形成しながらも、ホモ二量体（すなわち、互いに連結した２つの重鎖と互いに連結した２つのＦｃ）の形成が全く排除されない好ましいヘテロ二量体の形成が可能になる。不必要なホモ二量体と必要なヘテロ二量体とを分離することが可能な精製が不可欠である。したがって、「単腕法」は極めて簡潔ではあるが、工程全体としては、組換え抗体の製造を複雑なものにし、その収率を低下させる段階をさらに必要とするため、煩雑なものとなる。
【００１２】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療に使用するにはＦａｂの血漿中半減期を増大させる別の解決方法が必要であると考えられる。
【発明の概要】
【００１３】
本開示の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が改善された抗体フラグメントを提供することである。
【００１４】
本発明によれば、上記目的は、本開示の不可欠な要素を形成すると理解される、のちの特許請求の範囲に具体的に記載される発明の内容によって達成される。
【００１５】
本開示の一実施形態は、軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む抗体フラグメントであって、２つの鎖定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、２つの定常ドメインが重鎖ＣＨ１定常ドメインであり、異なる組合せで可変ドメインと融合した、抗体フラグメントを提供する。
【００１６】
本開示のさらなる実施形態は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含むＦａｂ分子よりもｉｎ  ｖｉｖｏで安定な、上で定義される抗体フラグメントに関する。
【００１７】
また別のさらなる実施形態は、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／Ｍｅｔ）と特異的に結合する、上で定義される抗体フラグメントに関する。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
これより添付図面を参照しながら、単に説明を目的とする非限定的な例により本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】キメラＭｖＤＮ３０またはマウスＤＮ３０  Ｆａｂで処置したＭｅｔ依存性細胞のＭｅｔシェディングおよびダウンレギュレーションを示す図である。Ａ：ヒト胃癌細胞系ＳＮＵ−５；Ｂ：非小細胞肺癌細胞系Ｈ１９９３−ＮＣ１。ＤＮ３０  ｍＡｂ由来の２種類の抗体フラグメントを示される濃度で含む無血清培地で細胞を４８時間インキュベートした。抗Ｍｅｔ抗体を用いて細胞抽出物のウエスタンブロット分析を実施することにより総Ｍｅｔレベルを求めた。２つのＭｅｔバンドは、プロセシングを受けていない型の受容体（ｐ１９０Ｍｅｔ）および成熟型の受容体（ｐ１４５Ｍｅｔ）に対応する。抗Ｍｅｔ抗体を用いて訓化培地のウエスタンブロット分析を実施することによりＭｅｔシェディングを判定した。両分子とも効率的にＭｅｔのシェディング／ダウンレギュレーションを誘導する。
【図２】キメラＭｖＤＮ３０またはマウスＤＮ３０  Ｆａｂで処置したＭｅｔ依存性細胞の増殖アッセイを示す図である。Ａ：非小細胞肺癌細胞系ＥＢＣ−１；Ｂ：ヒト胃癌細胞系Ｈｓ７４６Ｔ。１０％ＦＣＳ培地の入った９６ウェルディッシュに細胞を播いた（１０００個／ウェル）。２４時間後、抗体の濃度を漸増させて細胞をさらに７２時間処置した。Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により細胞数を評価した。各点は３連の値の平均値であり、バーは標準偏差を表す。両分子とも、効率的にＭｅｔ依存性細胞の細胞増殖を阻害した。
【図３】新規なＤＮ３０由来分子の略図を示す図である。上：キメラ化ＤＮ３０  Ｆａｂ（ＭｖＤＮ３０）；中央：直列に重複した定常ドメインを有する二重定常ドメインＦａｂ（ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１）；下：相互に交換され重複した定常ドメインを有する二重定常ドメインＦａｂ（ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２）。ＶＨ：ＤＮ３０重鎖の可変ドメイン。ＶＬ：ＤＮ３０軽鎖の可変ドメイン。ＣＨ１：ヒトＩｇＧ１重鎖に由来する定常ドメイン１。ＣＬ：ヒトカッパ軽鎖に由来する定常ドメイン。ＳｔｒｅｐおよびＨｉｓタグ：タンパク質の精製および免疫検出を可能にするため配列に含めたもの。
【図４】新規なＤＮ−３０由来分子の分析を示す図である。示される精製タンパク質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）でゲルを染色した。いずれの分子も予想分子量のバンドを示した。
【図５】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０分子のＭｅｔとの結合を示す図である。ＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２（液相）とＭｅｔ−Ｆｃキメラ（固相）とのＥＬＩＳＡ結合分析。抗ｓｔｒｅｐＴＡＧ抗体により結合を明らかにした。Ｏ．Ｄ．：吸光度；Ａ．Ｕ．：任意単位。各点は３連の値の平均値であり、バーは標準偏差を表す。新規な分子は同じ高い親和性でＦｃ−Ｍｅｔと結合する。
【図６】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０分子のアゴニスト活性を示す図である。Ａ５４９細胞を２４時間飢餓状態にした後、示される濃度の様々な分子により３７℃で１０分間刺激した。抗Ｍｅｔ抗体を用いた免疫沈降、次いで主要なリン酸化部位であるリン酸化Ｔｙｒ１２３４／１２３５Ｍｅｔ残基に特異的な抗Ｍｅｔ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＭｅｔ活性化を判定した（上）。同ブロットを抗Ｍｅｔ抗体で再検出した（下）。新規な分子はＭｅｔ受容体を有意に活性化しない。
【図７】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０分子のアゴニスト活性を示す図である。Ａ５４９細胞を２４時間飢餓状態にした後、示される濃度の様々な分子により３７℃で１０分間刺激した。リン酸化型に特異的な抗ＡＫＴまたは抗ＥＲＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＡＫＴおよびＥＲＫ−１、２の活性化を判定した。同ブロットを抗ビンキュリン抗体で再検出して（下）タンパク質負荷の対照とした。新規な分子はＭｅｔ依存性シグナル伝達を有意に活性化しない。
【図８】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０分子で処置した細胞のＭｅｔシェディングおよびダウンレギュレーションを示す図である。示される分子（５００ｎＭ）を含む無血清培地でＡ５４９細胞を７２時間インキュベートした。抗Ｍｅｔ抗体を用いて細胞抽出物のウエスタンブロット分析を実施することにより総Ｍｅｔレベルを求めた。２つのＭｅｔバンドは、プロセシングを受けていない型の受容体（ｐ１９０Ｍｅｔ）および成熟型の受容体（ｐ１４５Ｍｅｔ）に対応する。負荷対照として、無関係なタンパク質（アクチン）でフィルターを再検出した。抗Ｍｅｔ抗体を用いて訓化培地のウエスタンブロット解析を実施することによりＭｅｔシェディングを判定した。新規な分子は効率的にＭｅｔシェディングを誘導する。
【図９】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０分子によるＨＧＦ誘導性Ｍｅｔ活性化の阻害を示す図である。示される分子（１０００ｎΜ）を加えた無血清培地でＡ５４９細胞を２４時間インキュベートした後、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）により１０分間刺激した。主要なリン酸化部位であるリン酸化Ｔｙｒ１２３４／１２３５Ｍｅｔ残基に特異的な抗Ｍｅｔ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、全細胞溶解物のＭｅｔ活性化を判定した。同ブロットを抗Ｍｅｔ抗体で再検出た。抗リン酸ＡＫＴまたは抗リン酸ＥＲＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＡＫＴおよびＥＲＫ−１、２の活性化を判定した。同ブロットを抗ＡＫＴまたはＥＲＫ−１、２抗体で再検出した。タンパク質負荷の対照とするため、ほかにも抗ビンキュリン抗体でフィルターを再検出した。新規な分子はＨＧＦ誘導性Ｍｅｔ活性化およびＭｅｔ依存性シグナル伝達を強力に阻害する。
【図１０】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤＭｖＤＮ３０．２またはＭｖＤＮ３０で処置したＭｅｔ依存性細胞の足場依存性増殖を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：ヒト胃癌細胞系；Ｅ、Ｆ：非小細胞肺癌細胞系。５％ＦＣＳ培地の入った９６ウェルキャスターに細胞を播いた（１０００個／ウェル）。２４時間後、様々な分子の濃度を漸増させて細胞をさらに７２時間処置した。Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞数を評価した。プロットは、生存細胞の未処置対照に対する百分率を表す。各点は３連の値の平均値である。新規な分子はＭｅｔ依存性細胞の細胞増殖を効率的に阻害する。
【図１１】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２またはＭｖＤＮ３０で処置した細胞の足場依存性増殖を示す図である。１．５ｍＭのＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２またはＭｖＤＮ３０の存在下でＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた半固形培地（５％アガロース）または加えていない同培地にＡ５４９細胞を播いた。２１日後、テトラゾリウム塩でコロニーを染色した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈＯｆｆｌｉｎｅソフトウェアで各ウェル区画のピクセル数を計数することによりコロニーを定量化した。各点は３連の値の平均値である。新規な分子はＨＧＦ依存性の足場非依存性細胞増殖を効率的に阻害する。
【図１２】ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２およびＭｖＤＮ３０のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態プロファイルを示す図である。免疫不全マウスに単回用量（１００μｇ）のＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２またはＭｖＤＮ３０を腹腔内注射した。様々な時点で末梢血を採取した。治療分子の血清中濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。グラフは循環血中の分子の量を時間の関数で表している。試料は３連であり、バーは標準偏差を表す。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、それぞれ、本開示による抗体フラグメントの第一のポリペプチドの第一の実施形態のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。配列は軽鎖に由来するポリペプチド、ＶＬ−ＣＬ−ＣＬに対応する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、それぞれ、本開示による抗体フラグメントの第二のポリペプチドの第一の実施形態のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。配列は重鎖に由来するポリペプチド、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ１−タグに対応する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。Ｓｔｒｅｐおよびヒスチジンタグは大文字のイタリック体で表されている。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、本開示による抗体フラグメントの第一のポリペプチドの第二の実施形態のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。配列は軽鎖に由来するポリペプチド、ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−タグに対応する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。Ｓｔｒｅｐおよびヒスチジンタグは大文字のイタリック体で表されている。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、それぞれ、本開示による抗体フラグメントの第二のポリペプチドの第二の実施形態のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。配列は重鎖に由来するポリペプチド、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＬに対応する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。
【図１７】ＤＮ３０軽鎖可変ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。
【図１８】ＤＮ３０重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
これより、肝細胞増殖因子受容体と特異的に結合することができる抗体フラグメントに関して、非限定的な例により本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本明細書に記載される抗体フラグメントは他の標的抗原との特異的結合を特徴とする場合もあるため、この説明の範囲は決して上記標的抗原に限定されるものではないことは明らかである。
【００２２】
以下の説明では、実施形態が十分理解されるよう具体的な詳細が多数記載される。これらの実施形態は、１つまたは複数の具体的な詳細を用いなくても、また他の方法、成分、材料などを用いても実施することが可能である。他の場合には、これらの実施形態の態様が不明瞭になるのを避けるため、周知の構造、材料または操作について詳細な図示や説明はしない。
【００２３】
本明細書全体を通じて「一実施形態」または「ある実施形態」と言う場合、その実施形態に関連して記載される特定の特性、構造または特徴が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な箇所に「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句が記載されていても、必ずしも同じ実施形態すべてに言及しているとは限らない。さらに、特定の特性、構造または特徴を１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせる場合がある。
【００２４】
本明細書に記載される見出しは単に便宜上のものであり、実施形態の範囲または意味を表すものではない。
【００２５】
抗体は、重鎖および軽鎖がともに複数のＩｇドメインからなり、それぞれ独立して折り畳まれた複雑な四量体である。抗体の時代の初期には酵素処理により、抗体が、元の構造および抗原結合性を保持する複数のフラグメントに由来する可能性があることが示された。
【００２６】
その後、タンパク質工学技術を用いて様々な操作された抗体フラグメントが多数作製された。分子設計により、新たな抗体フラグメントは、それぞれ特定の特性（すなわち、結合力が増大している、多価である、多特異性である、ＡＤＣＣが欠如している、キメラ化されているなど）を特徴とするものとなる。
【００２７】
しかし、これまでの研究で、抗体フラグメントのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するべく腎クリアランスの問題に取り組んだものはない。
【００２８】
この目的に向けて、本発明者らは、軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む組換え抗体フラグメントであって、２つの鎖定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、２つの定常ドメインが重鎖ＣＨ１定常ドメインであり、異なる組合せで可変ドメインと融合した、組換え抗体フラグメントを開発した。
【００２９】
一実施形態では、本明細書に開示される抗体フラグメントは、上記軽鎖可変ドメインと上記重鎖可変ドメインとを含むＦａｂ分子よりもｉｎ  ｖｉｖｏで安定である。
【００３０】
一実施形態では、抗体フラグメントは、腎クリアランスが減少しているため、ヒト患者に投与した場合に上記軽鎖可変ドメインと上記重鎖可変ドメインとを含むＦａｂ分子よりもｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が長い。
【００３１】
上記抗体フラグメントを「二重定常ドメインＦａｂ」（ＤＣＤ−Ｆａｂ）と命名した。
【００３２】
好ましい実施形態では、本開示は、軽鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第一のポリペプチドと、重鎖可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む抗体フラグメントであって、２つの定常ドメインがヒト軽鎖定常ドメインであり、２つの定常ドメインがヒト重鎖ＣＨ１定常ドメインであり、異なる組合せで可変ドメインと融合した、抗体フラグメントに関するものであり、この抗体フラグメントは上記軽鎖可変ドメインと上記重鎖可変ドメインとを含むＦａｂ分子よりもｉｎ  ｖｉｖｏで安定であり、かつ肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ／Ｍｅｔ）と特異的に結合する。
【００３３】
一実施形態では、軽鎖可変ドメインはそのＣ末端で１つの軽鎖定常ドメインと融合し、その軽鎖定常ドメインはそのＣ末端で１つの軽鎖定常ドメインと融合している。
【００３４】
別の実施形態では、軽鎖可変ドメインはそのＣ末端で軽鎖定常ドメインと融合し、その軽鎖定常ドメインはそのＣ末端で１つの重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合している。
【００３５】
一実施形態では、重鎖可変ドメインはそのＣ末端で１つの重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、その重鎖ＣＨ１定常ドメインはそのＣ末端で１つの重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合している。
【００３６】
別の実施形態では、重鎖可変ドメインはそのＣ末端で重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、その重鎖ＣＨ１定常ドメインはＣ末端で軽鎖定常ドメインと融合している。
【００３７】
一実施形態では、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドに含まれる定常ドメインは、抗体フラグメント内で互いに結合する際にジスルフィド架橋を形成することができる。
【００３８】
さらなる好ましい実施形態では、本開示は、上で定義される抗体フラグメントであって、抗原特異性が、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインとしてＤＮ３０軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインまたはＤＮ３０モノクローナル抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト化軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを用いることによって得られる、抗体フラグメントに関する。ＤＮ３０モノクローナル抗体は国際公開第２００７／０９０８０７（Ａ）号に開示されている。
【００３９】
本発明の抗体フラグメントは概略的には治療用抗体である。例えば、本発明の抗体はアンタゴニスト抗体、遮断抗体または中和抗体であり得る。
【００４０】
一態様では、本発明は、疾患を有する対象にその疾患の治療する、または疾患の進行を遅延させるのに有効な有効量の本発明の抗体フラグメントを投与して、その疾患を治療する、または疾患の進行を遅延させる方法を提供する。
【００４１】
一実施形態では、疾患は腫瘍または腫瘍転移である。
【００４２】
別の実施形態では、疾患は、肝細胞増殖因子受容体のシグナル伝達および／または活性化の調節異常によるものである。
【００４３】
本発明の抗体フラグメントは、ＨＧＦ／ＨＧＦＲシグナル伝達経路内の異常による病的状態の治療または予防に適している。
【００４４】
一実施形態では、本発明の抗体はＨＧＦＲアンタゴニストである。
【００４５】
一実施形態では、抗体フラグメントは、異種非ヒト配列、ヒト配列またはヒト化配列（例えば、フレームワークおよび／または定常ドメイン配列）に移植した非ヒトドナーに由来する抗原結合配列を含む。一実施形態では、非ヒトドナーはマウスである。
【００４６】
一実施形態では、抗原結合配列は、抗ＨＧＦＲマウス抗体のＣＤＲおよび／または可変ドメイン配列をすべて含む。
【００４７】
好ましい一実施形態では、マウス軽鎖可変ドメインがそのＣ末端で１つのヒトカッパ軽鎖定常ドメインと融合し、そのヒトカッパ軽鎖定常ドメインはそのＣ末端で１つのヒトカッパ軽鎖定常ドメインと癒合している。別の実施形態では、マウス軽鎖可変ドメインはそのＣ末端でヒトカッパ軽鎖定常ドメインと融合し、そのヒトカッパ軽鎖定常ドメインはそのＣ末端で１つのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合している。一実施形態では、マウス重鎖可変ドメインがそのＣ末端で１つのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、そのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインはそのＣ末端で１つのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合している。別の実施形態では、マウス重鎖可変ドメインはそのＣ末端でヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインと融合し、そのヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１定常ドメインはそのＣ末端でヒトカッパ軽鎖定常ドメインと融合している。
【００４８】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、抗ＨＧＦＲマウス抗体のＣＤＲ配列、より好ましくはＤＮ３０のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインと、２つの定常ドメインとを含む第一のポリペプチドを含み、２つの定常ドメインは、ともに軽鎖定常ドメインであるか、１つが軽鎖定常ドメイン、１つが重鎖ＣＨ１定常ドメインである。一実施形態では、２つの定常ドメインはヒト定常ドメインである。
【００４９】
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、抗ＨＧＦＲマウス抗体のＣＤＲ配列、より好ましくはＤＮ３０のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、２つの定常ドメインとを含む第二のポリペプチドを含み、２つの定常ドメインは、ともに重鎖ＣＨ１定常ドメインであるか、１つが重鎖ＣＨ１定常ドメイン、１つが軽鎖定常ドメインである。一実施形態では、２つの定常ドメインはヒト定常ドメインである。
【００５０】
本発明は、最も好ましい実施形態では、ヒトＨＧＦＲと結合するヒト化抗体フラグメントを提供し、この抗体はＨＧＦ／ＨＧＦＲ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するのに有効であり、かつｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）にＤＮ３０モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列（配列番号１９、２０、２１）および実質的にヒトコンセンサス配列、例えば、ヒト重鎖サブグループの実質的にヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基ならびにｉｉ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）にＤＮ３０モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列（配列番号２５、２６、２７）およびヒト軽鎖ΚサブグループＩ（ＶΚＩ）のヒト実質的にコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基を含む。
【００５１】
一実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号１２で記述される軽鎖可変ドメイン配列（ＤＮ３０軽鎖可変ドメイン）を軽鎖可変ドメインとして含む第一のポリペプチドと、配列番号４で記述される重鎖可変ドメイン配列（ＤＮ３０重鎖可変ドメイン）を重鎖可変ドメインとして含む第二のポリペプチドとを含む。
【００５２】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害などの疾患の治療的処置および／または予防的処置のための薬物の調製における本発明の抗体フラグメント（例えば、本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメント）の使用を提供する。
【００５３】
一態様では、本発明は、対象のＨＧＦＲ活性化の調節異常による病的状態を治療する方法を提供し、上記方法は、対象に有効量の本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメントを投与することにより上記状態を治療することを含む。
【００５４】
一態様では、本発明は、ＨＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する方法を提供し、上記方法は、上記細胞と本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメントとを接触させることにより上記細胞の増殖の阻害を引き起こすことを含む。
【００５５】
一態様では、本発明は、ＨＧＦＲを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供し、上記方法は、上記哺乳動物に有効量の本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメントを投与することにより上記哺乳動物を効果的に治療することを含む。
【００５６】
一態様では、本発明は、ＨＧＦＲの発現または活性の増大による細胞増殖性障害を治療または予防する方法を提供し、上記方法は、このような治療を必要とする対象に有効量の本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメントを投与することにより上記細胞増殖性障害を効果的に治療または予防することを含む。
【００５７】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法を提供し、上記腫瘍の増殖は、少なくとも部分的にはＨＧＦＲの増殖促進作用に依存し、上記方法は、腫瘍細胞と有効量の本発明のＨＧＦＲアンタゴニスト抗体フラグメントとを接触させることにより上記腫瘍を効果的に治療することを含む。腫瘍細胞は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、中枢神経系癌、腎癌、肝細胞癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部腫瘍細胞、乳頭癌（例えば、甲状腺）、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫／膠芽腫（例えば、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、未分化乏突起神経膠芽細胞腫、未分化乏突起神経膠芽細胞腫）、白血病細胞から選択され得る。一実施形態では、本発明の方法で標的となる細胞は過剰増殖性および／または過形成細胞である。一実施形態では、本発明の方法で標的となる細胞は異形成細胞である。さらに別の実施形態では、本発明の方法で標的となる細胞は転移性細胞である。さらなる実施形態では、本発明の方法で標的となる細胞は、腫瘍および／または転移を維持する微小環境に属するＨＧＦＲ発現細胞である。
【００５８】
本発明の方法は追加の治療段階をさらに含み得る。例えば、一実施形態では、方法は、標的となる腫瘍細胞および／または腫瘍組織に放射線治療を実施するか、これを化学療法薬に曝露する段階をさらに含む。別の実施形態では、標的となる腫瘍細胞および／または腫瘍組織を本発明のアンタゴニスト抗体フラグメントに加えて、ＨＧＦ阻害薬（すなわち、抗ＨＧＦ抗体）をはじめとする抗ＨＧＦＲ化合物（すなわち、小分子キナーゼ阻害薬）で治療する。さらなる実施形態では、標的となる腫瘍細胞および／または腫瘍組織を本発明のアンタゴニスト抗体フラグメントに加えて、形質転換表現型の維持に関連する他の標的を特異的に攻撃する分子（すなわち、抗ＥＧＦＲ分子）で治療する。
【００５９】
ＨＧＦＲの活性化は重要な生物学的過程であり、その調節が解除されると多数の病的状態を引き起こす。したがって、本発明の方法の一実施形態では、標的となる細胞（例えば、癌細胞）は、同じ組織を起源とする正常細胞に比してＨＧＦＲの活性化が増強された細胞である。一実施形態では、本発明の方法が標的細胞の細胞死または細胞増殖停止を引き起こす。例えば、本発明のアンタゴニスト抗体フラグメントと接触させることにより、細胞がＨＧＦＲ経路を介してシグナル伝達することができなくなり、細胞死または細胞増殖停止がもたらされ得る。
【００６０】
本発明はこのほか、化学療法薬、薬物、増殖阻害薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）または放射性同位元素（すなわち、ラジオコンジュゲート）などの細胞毒性薬とコンジュゲートした抗体フラグメントを含む、イムノコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
【００６１】
癌治療において、非コンジュゲート薬剤を全身投与すると、除去しようとする腫瘍細胞のみならず正常細胞にも許容できないレベルの毒性がもたらされ得る場合に、細胞毒性薬または細胞分裂阻害薬、すなわち、腫瘍細胞を殺滅するかその増殖を阻害する薬物の局所送達に抗体−薬物コンジュゲートを使用することにより、腫瘍への薬物部分の標的化送達および腫瘍での細胞内蓄積が可能になる。
【００６２】
本発明の抗体フラグメントを含む治療用製剤は、所望の純度の抗体フラグメントと、生理的に許容される担体、補形剤または安定剤とを混合することにより、水溶液、凍結乾燥をはじめとする乾燥製剤の形態で保管用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。許容される担体、補形剤または安定剤は、用いる用量および濃度では被投与者に対して無毒なものであり、緩衝剤；抗酸化剤；保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類、二糖類をはじめとする炭水化物；キレート剤；糖；塩形成対イオン；金属錯体および／または非イオン性界面活性剤がこれに含まれる。
【００６３】
本明細書の製剤はほかにも、治療する特定の適応症に必要であれば、２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性をもつ活性化合物を含有してもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わさって適切に存在する。
【００６４】
このほか有効成分を、特にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている技術によって調製されるマイクロカプセルに封入してもよい。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。
【００６６】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、本発明の抗体フラグメントを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このようなマトリックスは造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
【００６７】
本発明の抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの治療法で使用し得る。本発明は、従来の一価抗体よりも優れた特性をもつ抗体フラグメントの使用に基づく様々な方法を提供する。
【００６８】
本発明は、例えば治療剤、予防剤および診断剤として、様々な目的で使用することができる。
【００６９】
本発明の抗体フラグメントは、治療に単独で使用することも、他の組成物と併用することもできる。例えば、本発明の抗体フラグメントを別の抗体、化学療法薬（１つまたは複数）（化学療法薬のカクテルを含む）、その他の細胞毒性薬（１つまたは複数）、抗血管新生剤（１つまたは複数）、サイトカインおよび／または増殖阻害薬と共投与し得る。上に挙げたような併用療法には併用投与（２つ以上の薬剤が同じまたは別個の製剤に含まれる投与）および個別投与があり、個別投与の場合、本発明の抗体の投与を１つまたは複数の補助療法の実施の前および／または後に実施することができる。
【００７０】
本発明の抗体フラグメント（および補助療法薬）は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与および鼻腔内投与ならびに局所治療に必要であれば病巣内投与を含めた任意の適切な手段によって投与される。抗体フラグメントは、特に抗体の用量を減らしながらパルス注入によって適切に投与される。投与は、部分的には投与が短期間投与であるのか慢性投与であるのかに応じて、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射による経路であり得る。本発明の抗体フラグメントはこのほか、局所投与または全身投与するウイルスベクター（すなわち、レンチウイルスベクター）による遺伝子導入を用いて送達することができる。
【００７１】
本発明の抗体フラグメントは、適正な医療行為と合致する方法で製剤化、調薬および投与される。これに関連して考慮される因子としては、治療する具体的な障害、治療する具体的な哺乳動物、個々に患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画をはじめとする医師に知られている因子が挙げられる。抗体は、必ずしもというわけではないが、任意選択で、現時点で問題の障害を予防または治療するために使用している１つまたは複数の薬剤とともに製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害または治療の種類および上に挙げたその他の因子によって決まる。このような他の薬剤は一般に、上で用いたものと同じ用量および投与経路で、またはこれまで用いられた用量の約１〜９９％で用いられる。
【００７２】
疾患の予防または治療には、しかるべき容量の本発明の抗体フラグメント（単独で使用する、または化学療法薬などの他の薬剤と併用する場合）は、治療の対象となる疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体フラグメントを予防または治療のいずれの目的で投与するのか、これまでに受けた治療法、患者の病歴および抗体に対する反応ならびに主治医の裁量によって決まる。抗体フラグメントは一回で、または一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば、１つまたは複数の別個の投与によるものであるか、持続注入によるものであるかに関係なく、抗体約１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇが患者に投与する初期量の候補である。１つの典型的な１日量は、上に挙げた因子に応じて約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲となり得る。数日間以上にわたる反復投与では、状態に応じて、所望の疾患症状の抑制が認められるまで治療を維持する。１つの例示的な抗体フラグメントの用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となり得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはその任意の組合せ）のうちの１つまたは複数の用量を患者に投与し得る。このような用量を間欠的に、例えば（例えば、患者に約２〜約２０用量、例えば約６用量の抗体が投与されるように）毎週または３週間毎に投与し得る。初回負荷用量を多くして投与した後、用量を減らして１回または複数回投与してもよい。例示的な投与レジメンでは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量の抗体を投与した後、毎週、約２ｍｇ／ｋｇの維持量の抗体を投与する。しかし、他の投与レジメンでも有用である。この治療法の進行は従来の技術およびアッセイにより容易に監視される。
【００７３】
結果
キメラＤＮ３０  Ｆａｂの作製ならびにその生化学的および生物学的特性の特徴付け
治療効果の可能性のある他のモノクローナル抗体と同様に、ＤＮ３０はマウスで作製されたものである。したがって、これを治療目的で直接ヒトに用いることは、マウス分子がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）により認識され、免疫を介して抗体活性が除去されるため、適切ではない。抗体のマウス定常領域をヒト免疫グロブリン由来の配列に置き換えれば（抗体のキメラ化）、ＨＡＭＡ応答を大幅に低下させることができる。現時点では、キメラ化したｍＡｂおよびＦａｂが臨床で用いられている。本発明者らは、古典的な分子生物学的技術を用いてＤＮ３０  Ｆａｂの重鎖および軽鎖の定常ドメインをヒト免疫グロブリン由来の定常ドメインに置き換えた。つまり、軽鎖定常ドメインを天然のヒト抗体に多くみられるヒトカッパ型ドメインに置き換え、重鎖ＣＨ１定常ドメインをヒトＩｇＧ１由来の相同ドメインに置き換えた。この組合せは有効である。それは、キメラ化したＤＮ３０  Ｆａｂ（ＭｖＤＮ３０）が高い親和性でＭｅｔと結合し、Ｍｅｔシェディングを誘導してＭｅｔ依存性細胞の増殖を阻害するが、この特性は対応するマウス分子のものと重複するからである（図１および図２）。
【００７４】
二重定常ドメインＦａｂの分子設計
本発明者らは、ＭｖＤＮ３０配列を鋳型として用いて軽鎖および重鎖それぞれの定常ドメインを重複させた（二重定常ドメイン−Ｆａｂ）。この新規な操作された分子は予測分子量が７５ｋＤである。本発明者らは２種類の異なるＤＣＤ−Ｆａｂを作製した。１つ目の分子では、ヒト定常ドメインを直列に重複させることによりＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ１キメラ重鎖およびＶＬ−ＣＬ−ＣＬキメラ軽鎖を生じさせた。２つ目の分子では、末端のドメインを相互に交換することによりＶＨ−ＣＨ１−ＣＬキメラ重鎖およびＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１キメラ軽鎖を生じさせた（図３）。これに対応する二量体組換え分子をＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２と命名した。この新規な分子をコードするｃＤＮＡを発現プラスミドにクローン化した後、真核細胞に発現させた。配列のＣ末端に挿入されたＳｔｒｅｐタグにより細胞培養上清からタンパク質を精製した。図４は、分子量の大きさが正確な精製組換え分子の還元性条件下でのＳＤＳ−Ｐａｇｅを示している。
【００７５】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２は高い親和性でＭｅｔと結合する。
精製したＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２をＭｅｔ受容体との結合能について特徴付けた。この目的に向けて、本発明者らは固相にＭｅｔ外部ドメイン、液相にＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。抗ｓｔｒｅｐタグ抗体を用いて結合を明らかにした（図５）。この分析から、３種類のＤＮ３０由来の一価分子が同程度の親和性（ＭｖＤＮ３０、Ｋｄ＝０．１４１±０．０３ｎＭ；ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、Ｋｄ＝０．１３３±０．０２ｎＭ；ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２、Ｋｄ＝０．１３０±０．０３ｎＭ）でＭｅｔと結合することがわかった。
【００７６】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭｅｔリン酸化を誘導しない。
本発明者らは、新規なＤＮ３０由来分子がＭｅｔアゴニスト活性を示すかどうかをＭｅｔリン酸化アッセイで試験した。これはＡ４５９ヒト肺癌細胞を用いて分析したものであり、急性リガンド刺激に応答したＭｅｔ活性化を判定する標準的なシステムである。実際、Ａ５４９細胞は生理学的レベルのＭｅｔを発現し、基本条件下では不活性であるが、ＨＧＦまたはリガンド模倣分子によって活性化される傾向がある（４、１０）。ＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の量を漸増させて細胞を１５分間刺激した。このほか、陽性対照として細胞をＨＧＦおよびＤＮ−３０  ｍＡｂで刺激した。抗リン酸Ｍｅｔ抗体を用いたイムノブロッティングによりＭｅｔ活性化を判定した。図６に示される通り、新規な分子は有意なアゴニスト活性を示さなかった。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１にはアゴニスト活性が全くみられず、ＭｖＤＮ３０と区別できなかった。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２は最小限の残留アゴニスト活性を保持していたが、ＤＮ３０  ｍＡｂまたはＨＧＦと比較していずれもごくわずかなものであった。本発明者らはほかにも、Ｍｅｔの下流エフェクターとして作用する分子の活性化を検討した。ＨＧＦによる刺激が細胞外シグナル制御キナーゼ１および２（ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２）とＡＫＴ／タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）の活性化をともに誘導したのに対して、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭｖＤＮ３０と同じく、上記シグナル伝達物質のリン酸化状態に影響を及ぼさなかった（図７）。
【００７７】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭｅｔシェディングを誘導する。
本発明者らはほかにも、ＭｖＤＮ３０由来の新規な分子が受容体シェディングおよびダウンレギュレーションを促進する能力を維持しているかどうかを検討した。Ａ５４９細胞をＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２およびＭｖＤＮ３０とインキュベートした。４８時間後、Ｍｅｔの細胞外部分に対するモノクローナル抗体を用いたイムノブロッティングにより、訓化培地中のＭｅｔ外部ドメインの有無を分析した。このほか、同じ抗体を用いて、細胞溶解物についてＭｅｔの細胞内レベルを測定した。この解析から、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２がともに効率的にＭｅｔシェディングを誘導し、Ｍｅｔのダウンレギュレーションを促進することにより、細胞外間隙に可溶性Ｍｅｔ外部ドメインが放出され、細胞内のＭｅｔレベルが低下することが明らかになった（図８）。したがって、新規なＭｖＤＮ３０由来分子は、ＭｖＤＮ３０のように親ＤＮ−３０  ｍＡｂのアンタゴニスト特性とアゴニスト特性が完全に分離した。
【００７８】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＨＧＦ誘導性のＭｅｔリン酸化および下流のシグナル伝達を阻害する。
本発明者らは、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２がＨＧＦ誘導性のＭｅｔリン酸化および下流のシグナル伝達を阻害することができるかどうかを検討した。Ａ５４９細胞をＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２およびＭｖＤＮ３０と２４時間インキュベートした後、ＨＧＦにより１５分間刺激した。抗リン酸Ｍｅｔ抗体を用いたイムノブロッティングによりＭｅｔ活性化を判定した。図９に示される通り、２種類の操作された分子はＭｖＤＮ３０と同じく、効率的にＭｅｔ受容体をダウンレギュレートし、そのリン酸化のレベルを大幅に低下させた。これによりＡＫＴおよびＥＲＫ−１、２の活性化が阻害された（図９）。
【００７９】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭＥＴ依存性の足場非依存性細胞増殖を阻害する。
【００８０】
増殖／生存をＭｅｔシグナル伝達に依存する細胞、いわゆるＭＢＴ依存性細胞に限り、Ｍｅｔ阻害薬によって足場依存性増殖を阻害することができる。本発明者らは、ＭＢＴ依存性腫瘍細胞をすべて含むパネル（ＧＴＬ−１６、ＳＮＵ−５、Ｈｓ７４６Ｔ、ＭＫＮ−４５（以上、ヒト胃癌細胞）およびＨ１９９３、ＥＢＣ−１（以上、ヒト肺癌細胞）を分析した。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の濃度を漸増させながら対数増殖期の細胞をインキュベートした。アッセイにはＭｖＤＮ３０を陽性対照として含めた。７２時間後、発光によるＡＴＰアッセイを用いて細胞増殖を測定した。ＭｖＤＮ３０由来分子はともに全種類のＭＢＴ依存性細胞の増殖を用量依存性に阻害した（図１０）。この２種類の分子の阻害特性は、試験した全細胞についてＭｖＤＮ３０の阻害特性と同程度のものであった。
【００８１】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２は足場非依存性細胞増殖を阻害する。
本発明者らは、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２がＡ５４９細胞の足場依存性増殖を阻害する能力を試験した。細胞をＨＧＦとインキュベートするものとしないものに分けて半固形培地に播き、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２およびＭｖＤＮ３０の単回投与により処置した。２週間後、細胞コロニーを染色し定量化した。このアッセイでも、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭｖＤＮ３０の場合とほぼ同じようにＨＧＦ依存性のコロニー形成を減少させた（図１１）。
【００８２】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２はＭｖＤＮ３０に比して改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態プロファイルを示す。
本発明者らは、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の薬物動態特性をＭｖＤＮ３０と比較して検討した。免疫不全マウスに単回用量の上記分子を腹腔内注射により送達した。送達後、様々な時点で処置マウスの末梢血を採取した。血清試料にＥＬＩＳＡを実施して被験分子の循環血中濃度を求めた。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の方がＭｖＤＮ３０よりも高い循環血中レベルに達した。さらに、両分子とも半減期の増大を示し、循環血中に存在する時間が長くなり、生物学的に利用可能な時間が長くなっている。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２のクリアランスはＭｖＤＮ３０に比して大幅に改善されており（ＭＶＤＮ３０と比較したクリアランスの減少は、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２がそれぞれ９．６倍および１３．７倍である）（図１２および表１）。
【００８３】
【表１】
0006382842.tif 000002
【００８４】
材料および方法
細胞培養
ＥＢＣ−１ヒト肺癌細胞およびＭＫＮ−４５胃癌細胞系をＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から入手した。ＧＴＬ−１６ヒト胃癌細胞を記載されている通りにＭＫＮ−４５細胞から誘導した（１１）。他のすべての細胞系をＡＴＣＣ−ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社（Ｓｅｓｔｏ  Ｓａｎ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。ＤＭＥＭで維持したＨｓ７４６Ｔ細胞系、ＩＭＤＭで維持したＳＮＵ−５以外の全細胞系をＲＰＭＩで維持した。細胞培地に１０％（ＳＮＵ−５では２０％）ウシ胎仔血清および２ｍＭグルタミンを添加した（培地、血清およびグルタミンはＳｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製）。
【００８５】
タンパク質工学
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２は重鎖と軽鎖とからなる。
【００８６】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１の重鎖（配列番号１および２）は、直列で反復するヒト免疫グロブリンＧ１のＣＨ１ドメイン（配列番号５および６）と融合した野生型ＤＮ３０  ＦａｂのＶＨドメイン（２；配列番号３および４）に対応する。Ｃ末端には精製および検出のためにＳＴＲＥＰタグ（ＳＴ、配列番号７）およびポリヒスチジンタグ（ＨＴ、配列番号８）が付加されている。構造全体は（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ１−ＳＴ−ＨＴに対応する。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１の重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１４Ａおよび図１４Ｂに報告する。
【００８７】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１の軽鎖（配列番号９および１０）は、直列で反復するヒト免疫グロブリンカッパのＣＬドメイン（配列番号１３および１４）と融合した野生型ＤＮ３０  ＦａｂのＶＬドメイン（配列番号１１および１２）に対応する。構造全体は（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＶＬ−ＣＬ−ＣＬに対応する。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１の軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂに報告する。
【００８８】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の重鎖（配列番号１５および１６）は、ヒト免疫グロブリンＧ１のＣＨ１ドメイン（配列番号５および６）にヒト免疫グロブリンカッパのＣＬ領域（配列番号１３および１４）を付加したものと融合した野生型ＤＮ３０  ＦａｂのＶＨドメイン（配列番号３および４）に対応する。構造全体は（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＬに対応する。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１６Ａおよび図１６Ｂに報告する。
【００８９】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の軽鎖（配列番号１７および１８）は、ヒト免疫グロブリンカッパのＣＬドメイン（配列番号１３および１４）にヒト免疫グロブリンＧ１のＣＨ１（配列番号５および６）、ＳＴＲＥＰタグ（ＳＴ、配列番号７）およびポリヒスチジンタグ（ＨＴ、配列番号８）を付加したものと融合した野生型ＤＮ３０  ＦａｂのＶＬドメイン（配列番号１１および１２）に対応する。構造全体は（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−ＳＴ−ＨＴに対応する。ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１５Ａおよび図１５Ｂに報告する。
【００９０】
ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２をコードするｃＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）サービス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により化学的に合成した。ＤＮ３０  Ｆａｂの軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ図１７および図１８に報告する。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ともにＣＤＲ領域に下線が施され、重鎖可変ドメインのＣＤＲは配列番号１９〜２４で記述されるアミノ酸およびヌクレオチド配列を有し、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは配列番号２５〜３０で記述されるアミノ酸およびヌクレオチド配列を有する。
【００９１】
構築物はいずれも５'末端にＢａｍＨＩ部位、３'末端にＮｏｔＩ部位を含むよう操作した。ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＵＰＥＸ発現ベクターにサブクローン化した（Ｕ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。中規模のＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の作製をＵ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ社に外注し、ＨＥＫ（ヒト腎臓上皮）細胞内への一過性トランスフェクションにより実施した。ＳＴＲＥＰタグおよびポリヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製した。精製したタンパク質を０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたＰＢＳ中に保存し、４℃で保管した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件および非還元条件の両方で実施した後、クーマシー染色することにより純度を測定した。
【００９２】
免疫沈降およびウエスタンブロッティング
ＤＯ−２４抗Ｍｅｔ  ｍＡｂ（４）を用いて、記載されている通りに免疫沈降を実施した（１２）。以下の抗体：Ｍｅｔの細胞外部分に位置するドメインを認識する抗ヒトＭｅｔ  ｍＡｂクローンＤＬ−２１（４）；抗リン酸化チロシンｍＡｂクローン４Ｇ１０  ｍＡｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ならびに抗ホスホＭｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）、抗ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、抗Ａｋｔ、抗ホスホＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）および抗ＥＲＫポリクローナルＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
固相にＭｅｔ−Ｆｃキメラを使用したＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）により、液相のＦＬＡＧ標識組換え抗体の濃度を漸増させてＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２の結合を測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ｓｔｒｅｐＴＡＧ  ＩＩ抗体（ＩＢＡ、Ｏｌｉｖｅｔｔｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて結合を明らかにした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、データを分析しフィットさせた。Ｍｅｔ−ＦｃキメラはヒトＩｇＧ由来のＦｃドメインとＭｅｔ細胞外部分がインフレームで融合した融合タンパク質である。
【００９４】
Ｍｅｔ活性化の分析
記載されている通りに、サブコンフルエントのＡ５４９ヒト肺癌細胞を無血清培地で４８時間インキュベートした後、示される濃度の組換えＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または精製したＤＮ−３０  ｍＡｂ、ＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２により１０分間刺激した（１３）。刺激後、記載されている通りに直ちに細胞を溶解させ処理した（１２）。抗Ｍｅｔ抗体（ＤＯ−２４）により細胞抽出物を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗リン酸化チロシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。同ブロットを抗Ｍｅｔ抗体（ＤＬ−２１）で再検出して、免疫沈降したＭｅｔの量を正規化した。
【００９５】
ＨＧＦ誘導性Ｍｅｔリン酸化の阻害では、Ａ５４９細胞を無血清培地中、ＭｖＤＮ３０、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２で２４時間処置した後、上記の通りにＨＧＦにより刺激した。細胞単層をレムリ緩衝液および等量の全タンパク質で溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアクリルアミドゲルで分離し、抗ホスホＭｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した。
【００９６】
Ｍｅｔシェディングの分析
サブコンフルエントのＡ５４９単層をＰＢＳで２回洗浄した後、無血清培地中、示される濃度のＤＮ−３０  ＦＡｂまたはｍＡｂとインキュベートした。４８時間後、訓化培地を回収し、細胞をレリム緩衝液で洗浄した。抗Ｍｅｔ  ＤＬ−２１  ｍＡｂを用いたウエスタンブロッティングにより、全細胞溶解物５０μｇ中および細胞培養上清５０μｌ中のＭｅｔタンパク質レベルを測定した。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物学的アッセイ
細胞増殖の分析では、１０％ＦＢＳを含有する培地の入った９６ウェルディッシュに細胞を播いた（１，０００細胞／ウェル）。２４時間後、培地を、示される濃度のＤＮ３０由来の分子と５％ＦＣＳ抗体を含有する新鮮な培地と交換した。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を製造業者の指示に従って用いて細胞数を評価した。Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ２０３０装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）でＣｈｅｍｏ−ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを測定した。
【００９８】
足場依存性増殖のアッセイでは、２％ＦＢＳと０．５％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（ＢＭＡ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ）を含有する培地の入った４８ウェルディッシュに細胞を播いた（５００細胞／ウェル）。３日毎に培地に抗体（１．５μＭ）およびＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。２１日間培養した後、テトラゾリウム塩（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）でコロニーを染色し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈＯｆｆｌｉｎｅソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によりスコア化した。
【００９９】
薬物動態分析
成体の免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（体重１８〜２２ｇ、平均２０ｇ）にＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１、ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２またはＭｖＤＮ３０を１００μｇ腹腔内注射した。様々な時間（ＭｖＤＮ３０では、送達の１０分、２０分および３０分後、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１６時間、２４時間、４８時間後；ＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．１およびＤＣＤ−ＭｖＤＮ３０．２では、送達の３０分後、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１４４時間後）に末梢血を採取した。上の結合アッセイの節に記載したＥＬＩＳＡを実施し、様々な精製分子の段階希釈によって得られた標準曲線の直線部分に試料の吸光度値を内挿することによって、治療分子の濃度を評価した。各時点を少なくとも３匹のマウスの平均値とした。
【０１００】
参考文献
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４）Ｐｒａｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｓｓｅｃｔ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＨＧＦ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（１９９８）；１１１：２３７−４７．
５）Ｐｅｔｒｅｌｌｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈａｍｐｅｒｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（２００６）；１０３：５０９０−５．
６）Ｆｏｖｅａｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．（２００９）；２０：２４９５−５０７．
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８）Ｐａｃｃｈｉａｎａ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｃｙ  ｕｎｌｅａｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮ−３０  ａｎｔｉ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２０１０）；２８５：３６１４９−５７．
９）Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＪＭ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔｏ  ｗａｔｃｈ  ｉｎ  ２０１１．ＭＡｂｓ．（２０１１）；３：７６−９９．
１０）Ｍｉｃｈｉｅｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ＨＧＦ−ＭＳＰ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００２）；２０：４８８−４９５．
１１）Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．ｐ１４５，Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８８  ８：３５１０−３５１７．
１２）Ｌｏｎｇａｔｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ１２３４−１２３５  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＭＥＴ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９４  ９：４９−５７．
１３）Ｖｉｇｎａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．"Ａｃｔｉｖｅ"  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  ６８：９１７６−９１８３
【図１】
0006382842.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006382842.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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