(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−（Ｄ３−メチル）アミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドの中の何れかの一つであることを特徴とする２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩。
【請求項２】
前記薬学上に許容される塩は、無機酸塩と有機酸塩を含み、前記無機酸塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩または二硫化水素塩であり、前記有機酸塩は、ｐ-トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、マレイン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ぎ酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、ｐ-ブロモベンゼンスルホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、りんご酸塩または酢酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩。
【請求項３】
治療上有効な量の請求項１または２に記載の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩及び薬学上に許容される賦形剤を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項４】
更に他の薬物活性成分を含むことを特徴とする請求項３に記載の薬物組成物。
【請求項５】
前記他の薬物活性成分は、５−フルオロウラシル、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、パゾパニブ、アファチニブ、セツキシマブまたはベバシズマブであることを特徴とする請求項４に記載の薬物組成物。
【請求項６】
癌の治療に使用するための請求項１または２に記載の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩。
【請求項７】
前記癌は、卵巣がん、大腸がん、乳がん、膀胱癌、脳腫瘍、膵癌、星細胞腫、肝癌、神経膠腫、膠芽腫、黒色素細胞腫、前立腺がん、子宮頚部癌、胸腺癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃がん、肺がん、肝細胞癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、甲状腺髄様がん、神経膠腫、神経芽細胞腫、胆管癌、子宮内膜癌、腎臓腫瘍、腎臓癌、頭頚部癌、未分化大細胞型リンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫または中皮腫から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩。
【請求項８】
前記肺がんは、非小細胞肺がんから選ばれることを特徴とする請求項７に記載の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩。
【請求項９】
癌の治療に使用するための請求項３から５のいずれか一項に記載の薬物組成物。
【請求項１０】
前記癌は、卵巣がん、大腸がん、乳がん、膀胱癌、脳腫瘍、膵癌、星細胞腫、肝癌、神経膠腫、膠芽腫、黒色素細胞腫、前立腺がん、子宮頚部癌、胸腺癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃がん、肺がん、肝細胞癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、甲状腺髄様がん、神経膠腫、神経芽細胞腫、胆管癌、子宮内膜癌、腎臓腫瘍、腎臓癌、頭頚部癌、未分化大細胞型リンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫または中皮腫から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の薬物組成物。
【請求項１１】
前記肺がんは、非小細胞肺がんから選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、出願日が２０１４年８月１５日であり、出願番号が中国特許出願番号２０１４１０４０１６０４．７号の優先権を主張する。本願発明は、上記の中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
本発明は、２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その薬物組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＥＧＦＲは、ｅｒｂＢ受容体ファミリーの膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのメンバーである。成長因子リガンド（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ））と組み合わせた場合、受容体は、追加のＥＧＦＲ分子とホモ二量体化するか、または別のファミリーメンバー（例えば、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ｅｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、またはｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４））とヘテロ二量体化することができる。
【０００４】
ｅｒｂＢファミリーシグナル伝達の調節不全は、増殖、浸潤、転移、血管新生及び腫瘍細胞生存を促進し、そして、多くのヒト癌（肺がん、頭頸部がん及び乳がんを含む）に記載されている。したがって、ｅｒｂＢファミリーは、抗がん剤の開発の合理的な標的を代表して、現在、ゲフィチニブ、エルロチニブ及びラパチニブを含むＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ２を標的にする多くの薬剤は、臨床上で利用可能である。
【０００５】
２００４年に、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）におけるＥＧＦＲのの活性化突然変異は、ゲフィチニブ治療に対する応答に関するという報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年、第３０４巻、１４９７−１５００頁、および、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Jｏｕｒｎａｌｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４年、第３５０巻，２１２９−２１３９頁）があった。最も一般的なＥＧＦＲ活性化突然変異（Ｌ８５８Ｒ及びｄｅｌＥ７４６＿Ａ７５０）は、野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲに対する、小分子チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブとエルロチニブ）の親和力の増加、並びにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の親和力の低下をもたらす。最後に、ゲフィチニブまたはエルロチニブ治療に対する獲得抵耐性が生じ、例えば、ゲートキーパー残基Ｔ７９０Ｍの突然変異のため、臨床的薬剤耐性患者の５０％において、当該突然変異が検出されると報告されている。前記突然変異は、空間的にゲフィチニブまたはエルロチニブとＥＧＦＲとの結合を阻害すると考えられなく、ただＡＴＰに対する親和力をＷＴＥＧＦＲに対応するレベルに変更させている。
【０００６】
ＥＧＦＲを標的とする従来の治療方法の耐性におけるこのような突然変異の重要性に鑑みて、突然変異したゲートキーパー遺伝子を含むＥＧＦＲを抑えることができる薬物は、癌の治療において特に有用であると考えられる。突然変異体形態のＥＧＦＲ（例えば、Ｌ８５８ＲＥＧＦＲ突然変異体、またはｄｅｌＥ７４６  Ａ７５０突然変異体またはＥｘｏｎ１９欠失ＥＧＦＲ突然変異体）及び/または耐性突然変異体形態のＥＧＦＲ（例えば、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ突然変異体）を活性化することに対して、ＷＴ  ＥＧＦＲの有利な性能特性、及び／または他の酵素に対する受容体の選択性が表現できる化合物に関して、まだ需要が存在し、前記選択性により、これらの化合物が特に治療剤として開発されることが有望になるようにする。
【０００７】
中国特許出願第２０１２８００３３７７３号には、式（ＩＩ）の化合物であるＡＺＤ９２９１が、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ突然変異体の腫瘍に有効であるが、それは、体内で容易に代謝されて脱メチル化して、肝臓代謝の負担を増加させ、肝臓毒性の誘発、代謝産物の毒性の増加、そして体内の薬物動態学的性質の半減期をより短くし、最終的に抗癌剤活性に影響することが開示されている。
【化１】
0006418622.tif 000002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、先行技術におけるＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ突然変異体阻害剤の阻害活性が理想的ではないこと、毒性が高いことなどの欠陥を克服するために、新規な２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その薬物組成物及びその用途が提供することを目的とする。本発明の２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体は、より高い水への溶解度、より高い浸透性、及び/またはより低い血漿タンパク質結合能力を有するとともに、より低い毒性特徴及びより高い抗腫瘍活性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩を提供し、
【化２】
0006418622.tif 000003
ここで、
Ｒ１は、メチル基、または１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基であり、
Ｒ２は、メチル基、または１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基であり、
Ｒ３は、メチル基、または１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基であり、
Ｒ４は、メチル基、または１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基であり、
Ｒ５は、メチル基、または１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基であり、
また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の中の少なくとも一つは、１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基である。
【００１０】
前記１〜３個の重水素原子で置換されたメチル基は、トリ重水素化メチルであることが好ましい。
【００１１】
前記式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩は、
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−(Ｄ３−メトキシ)−５−｛［４−(１−メチルインドール−３−イル)ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−（Ｄ３−メチル)アミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、
Ｎ−（２−｛２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド、及び、
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドの中の何れかの化合物であることが好ましい。
【００１２】
前記式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩の中において、前記薬学上に許容される塩は、無機酸塩と有機酸塩を含む。前記無機酸塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二硫化水素塩等である。前記有機酸塩は、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、マレイン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ぎ酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、りんご酸塩、酢酸塩等であり、メタンスルホン酸塩であることが好ましい。
【００１３】
また本発明は、薬物組成物を提供し、それは、治療上有効な量の前記式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩及び薬学上に許容される賦形剤を含む。
【００１４】
本発明において、前記薬物組成物は、様々なタイプの単位投薬剤形、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤及び注射剤（溶液及び懸濁剤）等に調整することができ、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤及び注射剤（溶液及び懸濁剤）等であることが好ましい。
【００１５】
錠剤形態の薬物組成物を成形させるために、本技術分野において既知である、広く使われる賦形剤を用いることができる。例えば、乳糖、白砂糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース及びケイ酸等のような担体と、水、エタノール、プロパノール、普通のシロップ、グルコース溶液、デンプン溶液、ゼラチン溶液，カルボキシメチルセルロース、シェラック、チルセルロース及びリン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等のような結合剤と、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天粉末及び昆布粉末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリエチレンソルビトールの脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリル、デンプン及び乳糖等のような崩壊剤と、白砂糖、グリセリルトリステアレート、ココナッツオイル及び水素化油のような崩壊防止剤と、第四級アミン塩基及びドデシル硫酸ナトリウム等のような吸着促進剤と、グリセリン、デンプン等のような湿潤剤と、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト及びコロイド状ケイ酸等のような吸着材と、及び純粋なタルク，ステアリン酸塩、ホウ酸粉末及びポリエチレングリコール等のような潤滑剤とを用いることができる。また、必要に応じて、通常のコーティング材料を選択して用いて糖衣錠、ゼラチン皮膜錠剤、腸溶性皮膜錠剤、皮膜錠剤、二層皮膜錠剤及び多層錠剤に製造することができる。
【００１６】
丸剤形態の薬物組成物を成形させるために、本技術分野において既知である、広く使われる賦形剤を用いることができ、例えば、乳糖、デンプン、ココナッツオイル、硬化植物油、カオリン及びタルカムパウダー等のような担体と、アラビアガムパウダー、トラガカント粉、ゼラチン及びエタノール等のような結合剤と、寒天及び昆布粉末等などのような崩壊剤とを用いることができる。
【００１７】
坐剤形態の薬物組成物を成形させるために、本技術分野において既知である、広く使われる賦形剤を用いることができ、例えば、ポリエチレングリコール，ココナッツオイル、高級アルコール，高級アルコールのエステル、ゼラチン及び半合成グリセリド等を用いることができる。
【００１８】
注射剤形態の薬物組成物を製造するために、溶液または懸濁剤を消毒した後（適当な塩化ナトリウム，グルコースまたはグリセリン等を添加するのが最適である）、血液などと浸透加圧した注射剤に製造される。注射剤に製造する時も、本技術分野において汎用されている担体を用いることができる。例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化イソステアリルアルコール及びポリエチレンソルビトールの脂肪酸エステル等を用いることができる。なお、通常の溶解剤、バッファー和鎮痛薬等も添加することができる。
【００１９】
本発明において、前記薬物組成物の中の活性成分の含有量に関しては、特に限定されておらず、非常に広い範囲内で選択することができ、一般的には、質量百分率の１０〜９０％であり、質量百分率は３０〜８０％であることが好ましい。
【００２０】
本発明において、前記薬物組成物の投薬方法は、特に限定されていない。患者の年齢、性別及び他の条件と症状によって、各種の剤形の製剤を選択して投薬することができる。例えば、錠剤、丸剤、溶液、懸濁剤、乳剤、顆粒剤またはカプセル剤は、経口投与し、注射剤は、単独に投薬するか、または注射用輸送液（例えば、グルコース溶液及びアミノ酸溶液）と混ぜて、静脈注射し、坐剤は、直腸まで投薬する。
【００２１】
前記薬物組成物は、また他の薬物活性成分を含むことができて、それが前記式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩と結合して使用することができる。前記他の薬物活性成分は、現在までに知られている、抗癌などの効果のある薬物活性成分であり、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、パゾパニブ、アファチニブ、セツキシマブまたはベバシズマブ等である。
【００２２】
本発明は、また前記式Ｉに示される２−（２，４，５−置換アニリン）ピリミジン誘導体、その溶媒和物、またはその薬学上に許容される塩、または前記薬物組成物が、癌の治療のための薬物の調製における用途を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
前記癌は、卵巣がん、大腸がん、乳がん、膀胱癌、脳腫瘍、膵癌、星細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、前立腺がん、子宮頚部癌、胸腺癌、肝癌、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃がん、肺がん、肝細胞癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、甲状腺癌、甲状腺髄様がん、神経膠腫、神経芽細胞腫、胆管癌、子宮内膜癌、腎臓腫瘍、腎臓癌、頭頚部癌、未分化大細胞型リンパ腫、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、多発性骨髄腫、黒色素細胞腫、中皮腫の中から選ばれ、肺がんであることが好ましく、非小細胞肺がんであることがより好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】１０ｍｇ／ｋｇ／日で連続的に１０日投薬して、実施例の化合物３ＢとＡＺＤ９２９１インビボ腫瘍を有するマウスに対して、腫瘍の成長阻害の試験結果である。
【図２】２５ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ９２９１（式（ＩＩ））と実施化合物３Ｂを胃内投与した後の平均濃度−時間曲線（ｎ＝６）である。
【図３】２５ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ９２９１と実施化合物３Ｂを胃内投与した後のラットの体内のインドール脱メチル化代謝産物の平均濃度−時間曲線（ｎ＝６）である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
実施例１Ａ
Ｎ−（２−｛２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド
【化３】
0006418622.tif 000004
氷冷条件下で、Ｎ１−（２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン（中間体１、２０ｇ）に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）（２００ｍＬ）と、水（２０ｍＬ）の中に６.９ｇの水酸化ナトリウムを添加した。攪拌してから、溶液の中に４.０５ｇの塩化アクリロイルを添加して、室温で３０分攪拌した後、その混合物を室温で１時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で検出反応が終了後、反応液に２００ｍＬの水と２０ｍＬのアンモニア水を加えて、固体が沈殿し、ろ過した。得られた固体を回収し、水で洗浄し、５０℃の温度で８時間乾燥させて、表題化合物（収率８６％）を得た。
【００２６】
ｌＨ−ＮＭＲ：２．７０（３Ｈ，ｓ），２．８４（３Ｈ，ｓ），３．３７（４Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），５．７６（１Ｈ，ｄ），６．２８（１Ｈ,ｄ），６．６６（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．２９（１Ｈ，ｔ），７．４４（１Ｈ，ｄ），７．５９（１Ｈ，ｄ），８．２５（２Ｈ，ｓ），８．８３（１Ｈ，ｓ），９．４５（１Ｈ，ｓ），９．５４（１Ｈ，ｓ）.
ＥＳＩ＋:［Ｍ＋Ｈ＋］５０３.２９
【００２７】
実施例１Ｂ
Ｎ−（２−｛２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
実施例１Ａで得られた２０.５ｇ（１.０当量）のＮ−（２−｛２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドを、５００ｍＬの三つ口フラスコに入れて、１２０ｍＬのエタノールと８０ｍＬの酢酸エチルの中で溶解させ、室温で４.１ｇ（１.０５当量）のメタンスルホン酸および４０ｍＬの酢酸エチルを滴下して加え、約１時間で終えた後、この温度で１.５〜２時間保温し、緩やかに室温まで冷却させ、ろ過した。ろ過後のケークは、酢酸エチル／エタノール溶液（２：１、ｖ／ｖ）で１回洗浄後、ろ過し、乾燥させて、１８.０ｇの生成物を得た（収率８３％）。
【００２８】
実施例２Ａ
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド
【化４】
0006418622.tif 000005
氷冷条件下で、Ｎ１−（２−［ジ（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン（中間体２、２０ｇ）に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）と水（２０ｍＬ）の中に６.９ｇの水酸化ナトリウムを添加した。攪拌してから、溶液の中に４.０５ｇの塩化アクリロイルを添加して、室温で３０分攪拌した後、その混合物を室温で１時間攪拌した。ＴＬＣ検出反応が終了後、反応液に２００ｍＬの水和２０ｍＬのアンモニア水を加えて、固体が沈殿し、ろ過した。得られた固体を回収し、水で洗浄し、５０℃の温度で８時間乾燥させて、表題化合物（収率８８％）を得た。
【００２９】
ｌＨ−ＮＭＲ：２．７２（３Ｈ，ｓ），３．３５（４Ｈ，ｓ），３．８８(３Ｈ，ｓ)，３.９２１（３Ｈ，ｓ），５．７８（１Ｈ，ｄ），６．２６（１Ｈ，ｄ），６．６７（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．２４（２Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｔ），７．４３（１Ｈ，ｄ），７．５８（１Ｈ，ｄ），８．２４（２Ｈ，ｓ），８．８４（１Ｈ，ｓ），９．４４（１Ｈ，ｓ），９.５５（１Ｈ，ｓ）.
ＥＳＩ＋：［Ｍ＋Ｈ＋］５０６．３０
【００３０】
実施例２Ｂ
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
実施例２Ａから得られた２０.５ｇ（１.０当量）のＮ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドを、５００ｍＬの三つ口フラスコに入れて、１２０ｍＬのエタノールと８０ｍＬの酢酸エチルの中で溶解させ、室温で４.１ｇ（１.０５当量）のメタンスルホン酸および４０ｍＬの酢酸エチルを滴下して加え、約１時間で終えた後、この温度で１.５〜２時間保温させてから、緩やかに室温まで冷却させ、ろ過した。ろ過ケークは、酢酸エチル／エタノール溶液（２：１、ｖ／ｖ）で１回洗浄後、ろ過し、乾燥させて、黄色の固体を得た（収率８５％）。
【００３１】
実施例３Ａ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル)インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ］フェニル｝プロパ−２−エナミド
【化５】
0006418622.tif 000006
氷冷条件下で、Ｎ１−（２−ジメチルアミノエチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン（中間体３，２０ｇ）に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）と、水（２０ｍＬ）の中に６.９ｇの水酸化ナトリウムを添加した。攪拌してから、溶液の中に４.０５ｇの塩化アクリロイルを添加して、室温で３０分攪拌した後、その混合物を室温で１時間攪拌した。ＴＬＣ検出反応が終了後、反応液に２００ｍＬの水と２０ｍＬのアンモニア水を加えて、沈殿した固体をろ過した。得られた固体を回収し、水で洗浄し、５０℃の温度で８時間乾燥させて、表題化合物（収率８７％）を得た。
【００３２】
ｌＨ−ＮＭＲ：２．７０（３Ｈ，ｓ），２．８８（６Ｈ，ｄ），３．３５（４Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），５．７７（１Ｈ，ｄ），６．２７（１Ｈ，ｄ），６．６７（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｔ），７．４６（１Ｈ，ｄ），７．５９（１Ｈ，ｄ），８．２３（２Ｈ，ｓ），８．８５（１Ｈ，ｓ），９．４５（１Ｈ，ｓ），９.５５（１Ｈ，ｓ）.
ＥＳＩ＋:［Ｍ＋Ｈ＋］５０３．２９
【００３３】
実施例３Ｂ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル)インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ］フェニル｝プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
実施例３Ａから得られた２０.５ｇ（１.０当量）のＮ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドを、５００ｍＬの三つ口フラスコに入れて、１２０ｍＬのエタノールと８０ｍＬの酢酸エチルの中で溶解させ、室温で４.１ｇ（１.０５当量）のメタンスルホン酸および４０ｍＬの酢酸エチルを滴下して加え、約１時間で終えた後、この温度で１.５〜２時間保温させてから、緩やかに室温まで冷却させ、ろ過した。ろ過ケークは、酢酸エチル／エタノール溶液（２：１、ｖ／ｖ）で１回洗浄後、ろ過し、乾燥させて、黄色の固体が得らた（収率８１％）。
【００３４】
実施例４Ａ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド
【化６】
0006418622.tif 000007
氷冷条件の下で、Ｎ１−（２−ジメチルアミノエチル）−５−（Ｄ３−メトキシ）−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン（中間体４，２０ｇ）に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）と、水（２０ｍＬ）の中に６.９ｇの水酸化ナトリウムを添加した。攪拌してから、溶液の中に４.０５ｇの塩化アクリロイルを添加して、室温で３０分攪拌した後、その混合物を室温で１時間攪拌した。ＴＬＣ検出反応が終了後、反応液に２００ｍＬの水と２０ｍＬのアンモニア水を加えて、沈殿した固体をろ過した。得られた固体を回収し、水で洗浄し、５０℃の温度で８時間乾燥させて、表題化合物（収率８５％）を得た。
【００３５】
ｌＨ−ＮＭＲ：２．７０（３Ｈ，ｓ），２．８８（６Ｈ，ｄ），３．３５（４Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），５．７７（１Ｈ，ｄ），６．２７（１Ｈ，ｄ），６．６７（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．２５（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｔ），７．４６（１Ｈ，ｄ），７．５９（１Ｈ，ｄ），８．２３（２Ｈ，ｓ），８．８５（１Ｈ，ｓ），９．４５（１Ｈ，ｓ），９.５５（１Ｈ，ｓ）.
ＥＳＩ＋:［Ｍ＋Ｈ＋］５０３.２９
【００３６】
実施例４Ｂ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
実施例４Ａから得られた２０.５ｇ（１.０当量）のＮ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドを、５００ｍＬの三つ口フラスコに入れて、１２０ｍＬのエタノールと８０ｍＬの酢酸エチルの中で溶解させ、室温で４.１ｇ（１.０５当量）のメタンスルホン酸および４０ｍＬの酢酸エチルを滴下して加え、約１時間で終えた後、この温度で１.５〜２時間保温させてから、緩やかに室温まで冷却させ、ろ過した。ろ過ケークは、酢酸エチル／エタノール溶液（２：１、ｖ／ｖ）で１回洗浄後、ろ過し、乾燥させて、黄色の固体が得られた（収率８８％）。
【００３７】
実施例５Ａ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−（Ｄ３−メチル）アミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド
【化７】
0006418622.tif 000008
反応物がＮ１−（２−ジメチルアミノエチル）−５−メトキシ−Ｎ１−（Ｄ３−メチル）−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール-３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミンである点を除き、調製方法は、Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドと同じである。収率は７０％であった。
ＥＳＩ＋：［Ｍ＋Ｈ＋］５０３.２９
【００３８】
実施例５Ｂ
Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−（Ｄ３−メチル）アミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
反応物が、実施例５Ａで調製して得られたＮ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−（Ｄ３−メチル）アミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドである点を除き、調製方法は、Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩と同じである。黄色の固体で、収率は７９％であった。
【００３９】
実施例６Ａ
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド
【化８】
0006418622.tif 000009
反応物がＮ１−（２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミンである点を除き、調製方法は、Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミド（化合物２Ａ）と同じである。
ＥＳＩ＋:[Ｍ＋Ｈ＋]５０９.３４
【００４０】
実施例６Ｂ
Ｎ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩
反応物が、実施例６Ａから調整して得られたＮ−（２−｛２−ジ（Ｄ３−メチル）アミノエチル−メチルアミノ｝−４−メトキシ−５−｛［４−（１−（Ｄ３−メチル）インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドである点を除き、調製方法は、Ｎ−（２−｛２−ジメチルアミノエチル−メチルアミノ｝−４−（Ｄ３−メトキシ）−５−｛［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）プロパ−２−エナミドメタンスルホン酸塩と同じである。黄色の固体で、収率は５９％であった。
【００４１】
実施例７
中間体１：Ｎ１−（２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン（中間体１）
Ｎ‘−（２−［メチル（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−２−メトキシ−Ｎ’−メチル−Ｎ−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミン（４４ｇ）、鉄（３１ｇ）とＮＨ４Ｃｌ（１.９ｇ）を、エタノール（１２０ｍＬ）と水（４０ｍＬ）の中の混合物で３.５時間加熱還流させた。ＳＣＸカラムのイオン交換クロマトグラフィーでこの粗生成物の精製を行った。アンモニア・メタノールによりカラムから溶出させ、真空で濃縮を行うことで、ベージュ色の表題化合物（９０％）を得た。
【００４２】
中間体２：Ｎ１−（２−［ジ（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン
中間体３：Ｎ１−（２−ジメチルアミノエチル）−５−メトキシ−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン
中間体３の調製は、中間体１の調製方法を参照し、中間体８と、２，４−ジクロロピリミジンを反応させて、３−（２−クロロピリミジン−４−イル）−１−（Ｄ３−メチル）インドールを得、得られた生成物を、ｐ−トルエンスルホン酸の条件の下で、４−フルオロ−２−メトキシ−５−ニトロアニリンと反応させて、Ｎ−（４−フルオロ−２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−４−（［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−アミンを得、得られた生成物を、さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＩＰＥＡ）存在下で、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ’−メチルエタンと反応させて、Ｎ’−（２−［ジメチルアミノ］エチル）−２−メトキシ−Ｎ’−メチル−Ｎ−［４−（［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミンを得、得られた生成物を鉄粉、塩化アンモニウムにより還元させて中間体３を得た。
【００４３】
中間体４：Ｎ１−（２−ジメチルアミノエチル）−５−（Ｄ３−メトキシ）−Ｎ１−メチル−Ｎ４−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］ベンゼン−１，２，４−トリアミン
中間体２〜中間体４の調製方法は、中間体１と同じである。用いる反応物が、各中間体に対応する反応物であり、中間体２の反応物は、Ｎ’−（［ジ（Ｄ３−メチル）アミノ］エチル）−２−メトキシ−Ｎ’−メチル−Ｎ−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミンであり、中間体３の反応物は、Ｎ’−（２−［ジメチルアミノ］エチル）−２−メトキシ−Ｎ’−メチル−Ｎ−［４−（１−［Ｄ３−メチルインドール］−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミンであり、中間体４の反応物は、Ｎ’−（ジメチルアミノエチル）−２−（Ｄ３−メトキシ）−Ｎ’−メチル−Ｎ−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミンである点のみが異なっている。
【００４４】
中間体５：Ｎ’−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシ−Ｎ’−（Ｄ３−メチル）−Ｎ−［４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−イル］−５−ニトロベンゼン−１，４−ジアミン
５００ｍＬの三つ口フラスコに、１９０ｍＬのＤＭＡ、１６.９ｇのＮ,Ｎ’−ジメチル−Ｎ’−（Ｄ３−メチル）−エタン、２３.１ｇのＤＩＰＥＡを添加して、室温で３０分間攪拌してから、４７ｇのＮ−（４−フルオロ−２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−アミン（中間体６）を加えた。その後、この固液懸濁物を８５℃まで昇温させ、２〜３時間反応させてから、ＴＬＣと質量分析モニタリング反応の終了後、降温する前に、ろ過した。濾液の中に３００ｍＬのアセトニトリルを加えて、５℃程度に降温させた。生じた大量の紅色の沈殿をろ過し、５０℃で減圧乾燥して、５１ｇの生成物を得た（収率９０％）。精製することなく、次の段階の反応に用いた。
【００４５】
中間体６：Ｎ−（４−フルオロ−２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−４−（１−メチルインドール−３−イル）ピリミジン−２−アミン
機械的攪拌を設置した１Ｌの三つ口フラスコの中に、５００ｍＬの１,４−ジオキサン、３０ｇの３−（２−クロロピリミジン−４−イル）−１−メチルインドール（中間体７）を加えて、攪拌しながら、３０ｇのｐ−トルエンスルホン酸と４６ｇの４−フルオロ−２−メトキシ−５−ニトロアニリンを加えた。得られた固液混合懸濁物を９５−１０２℃まで昇温させ、３時間反応させて、ＴＬＣモニタリング反応の終了後、６０℃まで降温させた。希釈された濃アンモニア水を滴下して、ｐＨを調製したあと、再びに１０〜１５℃まで降温して、３０分間攪拌してから、ろ過した。ろ過ケークは、５％の炭酸水素ナトリウム溶液で一回洗浄し、再び冷たいエタノールで一回洗浄し、ろ過してから、５０℃で乾燥させて、４７ｇの生成物を得た（収率７４％）精製することなく、次の段階の反応に用いた。
【００４６】
中間体７：３−（２−クロロピリミジン−４−イル）−１−メチルインドール
１Ｌの三つ口フラスコの中に、４０ｇの２，４-ジクロロピリミジン、２００ｍＬのＤＭＥを加えて、攪拌して溶解させてから、１０〜１５℃まで降温させ、バッチで速やかに４５ｇの無水塩化第二鉄を加え、３５℃の温度を超えないように維持させ、各バッチで添加終了後、１５分間の攪拌を維持した。５２.８ｇの１−メチルインドールを、前記反応体系の中に点滴してから、再び緩やかに５０℃まで昇温させ、一晩攪拌させ、ＴＬＣモニタリングに基づいて完全に反応させた。５〜１０℃まで降温させ、緩やかに約３００ｍＬのメタノール水溶液（１：２、ｖ／ｖ）を滴下した。生じた大量の粘性の固体沈殿をろ過した。ろ過ケークは、メタノールで２回洗浄し、ろ過してから、５０℃で減圧乾燥させた（収率８５％）。
【００４７】
中間体８：１−（Ｄ３−メチル）インドール
５ｇのインドールを２０ｍＬのジクロロメタンに溶かして、０.５ｇの炭酸カリウムを加え、氷浴の下で２ｍＬのヨードメタン−ｄ３ジクロロメタン溶液を点滴し、室温で３時間反応させ、ＴＬＣ検出反応を終了させた。亜硫酸ナトリウム溶液を加えて、抽出し、スピンドライを行って、生成物を得た（収率９５％）。
【００４８】
効果の実施例１
Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  Ｒ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社コード＃ＤＹＣ１０９５）に記載された方法に従って、細胞溶解物の中の内在性ｐ−ＥＧＦＲの細胞リン酸化の測定を行った。本明細書は、前記文献の全文を引用する。
【００４９】
テスト１：Ｅｘｏｎ１９欠失ＥＧＦＲ（単一突然変異体の活性化）細胞のリン酸化試験
ヒト肺細胞系ＰＣ９（Ｅｘｏｎ１９欠失ＥＧＦＲ）（中国薬科大学から購入）を、１０％のウシ胎児血清と２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０の中に保持させた。細胞を、５％のＣＯ２のある加湿インキュベーターの中で、３７度で成長させた。４０μＬの細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ黒色の透明底面の３８４ウェルプレート中の増殖培地に播種（１００００細胞／ウェル）し、３７度、５％のＣＯ２の中で一晩増殖させた。Ｅｃｈｏ５５５音響投与量（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｏｓｅｄ）を用いて、１００％のＤＭＳＯに段階的に希釈した試験化合物を、細胞に添加した。プレートを、更に２時間インキュベートし、培地を穏やかに混合した後、４０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。Ｇｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートを、捕捉抗体で覆い、続いて、３％のＢＳＡでブロックした。続いて、ブロッキング溶液を除去し、１５μＬの溶解液をＧｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートに移動して、２時間培養した。プレートを穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬの検出抗体を添加し、２時間培養した。穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、１時間培養した。２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ停止液をプレートに添加し、３５２ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで蛍光を読み取った。各試験化合物について得られたデータを適当なソフトウェアパッケージに入力して、曲線適合分析を実施した。ＩＣ５０値は、このデータに基づいて、５０％の効果を得るために必要な化合物の濃度を計算することによって決定した。
【００５０】
テスト２：Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ（二重突然変異体）細胞リン酸化試験
ヒト肺細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５（中国薬科大学から購入）を、１０％のウシ胎児血清と２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０の中に保持させる。細胞を、５％のＣＯ２のある加湿インキュベーターの中で、３７度で成長するようにする。４０μＬの細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ黒色の透明底面の３８４ウェルプレート中の中の増殖培地に播種（１００００細胞／ウェル）し、３７度、５％のＣＯ２の中で一晩増殖させた。Ｅｃｈｏ５５５音響投与量（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｏｓｅｄ）を用いて、１００％のＤＭＳＯに段階的に希釈した試験化合物を、細胞に添加した。プレートを、更に２時間インキュベートし、培地を穏やかに混合した後、４０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。Ｇｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートを、捕捉抗体で覆い、続いて、３％のＢＳＡでブロックした。続いて、ブロッキング溶液を除去し、１５μＬの溶解液をＧｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートに移動して、２時間培養する。プレートを穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬの検出抗体を添加し、２時間培養した。穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、１時間培養した。２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ停止液をプレートに添加し、３５２ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで蛍光を読み取った。各試験化合物について得られたデータを適当なソフトウェアパッケージに入力して、曲線適合分析を実施した。ＩＣ５０値は、このデータに基づいて、５０％の効果を得るために必要な化合物の濃度を計算することによって決定した。
【００５１】
テスト３：野生型ＥＧＦＲ細胞リン酸化試験
ヒト結腸細胞系ＬｏＶｏ（中国薬科大学から購入する）を、３％のストリッピングされた（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎児血清と２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０に保存した。細胞を、５％のＣＯ２のある加湿インキュベーターの中で、３７度で成長させた。４０μＬの細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ黒色の透明底面の３８４ウェルプレート中の増殖培地に播種（１００００細胞／ウェル）し、３７度、５％のＣＯ２の中で一晩増殖させた。Ｅｃｈｏ５５５音響投与量（ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｏｓｅｄ）を用いて、１００％のＤＭＳＯに段階的に希釈した試験化合物を、細胞に添加した。プレートを、更に２時間インキュベートし、培地を穏やかに混合した後、４０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。Ｇｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートを、捕捉抗体で覆い、続いて、３％のＢＳＡでブロックした。続いて、ブロッキング溶液を除去し、１５μＬの溶解液をＧｒｅｉｎｅｒ黒色高接着性３８４ウェルプレートに移動して、２時間培養した。プレートを穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬの検出抗体を添加し、２時間培養した。穏やかに混合し、ＰＢＳで洗浄した後、２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光ペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、１時間培養した。２０μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ停止液をプレートに添加し、３５２ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで蛍光を読み取った。各試験化合物について得られたデータを適当なソフトウェアパッケージに入力して、曲線適合分析を実施した。ＩＣ５０値は、このデータに基づいて、５０％の効果を得るために必要な化合物の濃度を計算することによって決定した。
【００５２】
本特許出願の実施例における検出データ（μＭ）を以下の表に示し、検出データは、一定の桁の有効桁数で示されているが、示したデータが正確な有効桁数の数で確定されたと判断してはならない。
【００５３】
表１は、テスト１〜テスト３から得られた各化合物のＩＣ５０値である。
【表１】
0006418622.tif 000010
【００５４】
実施例と対照結果を比較すると、＊Ｐ＜０.０５は、顕著な差があり、＊＊Ｐ＜０.０１は、非常に顕著な差がある。
【００５５】
結果からみると、全ての実施例化合物と、対照薬ＡＺＤ９２９１は、単一突然変異と二重突然変異体細胞に対して、かなり活性を有し、野生型ＥＧＦＲ細胞に対しては、より良好な選択性を有し、先行技術に比べて、顕著な進歩性を有している。
【００５６】
テスト４：ヒト肝臓ミクロソームにおける化合物の安定性の評価
実施例１Ｂ〜６Ｂから調製して得られた化合物の肝臓ミクロソームの安定性をＡＺＤ９２９１と比較した。
【００５７】
試験システム：本発明の化合物の代謝安定性は、男女性混合した肝臓ミクロソーム（江陰斉氏生物科学技術有限会社）によって、１ｍＭのＮＡＤＰＨで試験した。サンプルは、質量分析計で分析を行った。ＨＲＭＳを用いて、標準曲線を実行することなく、ピーク面積応答比率（試験化合物または対照物に対応するピーク面積を分析物内部標準のピーク面積で割ったもの）を決定した。全ての可能な代謝産物を検出するために、適切なｍ／ｚ範囲でＨＲＭＳスキャンを実施した。
【００５８】
試験条件：この試験は、１回のインキュベーション（Ｎ＝１）で行う。試験化合物を、３７度で、０.５ｍｇ／ｍＬの肝臓ミクロソームタンパク質を含むＰＢＳ緩衝液中でインキュベートした。補因子ＮＡＤＰＨ（Ｒｏｃｈｅ）の添加により反応を誘発させ、０、８、１６、２４、３２、４８時間後にサンプリングし、陽性対照（５μＭテストステロン、Ａｌｄｄｉｎ）を並行してインキュベートし、０、８、１６、２４、３２、４８時間後にサンプリングした。
【００５９】
コントロール試験：対照化合物テストステロンを並行に試験して、（肝臓）ミクロソームの酵素活性を確認した。最後の時点後、蛍光アッセイを用いて、ＮＡＤＰＨが反応混合物に添加されることを確認した。対照物のＴ１／２は、許容可能な内部標準を満たしている。
【００６０】
分析方法:
液体クロマトグラフィーカラム:Ｔｈｅｒｍｏ  ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８  ３０×２.０ｍｍ、３μｍ、ガードカラムＭ．Ｐ．あり、緩衝液：２５ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ３.５；
水相（Ａ）：９０％の水、１０％の緩衝液；
有機相（Ｂ）：９０％のアセトニトリル、１０％の緩衝液；
流速：３００μＬ／分
オートサンプラ：注射体積１０μＬ
グラデーションプログラム:
【表２】
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【００６１】
ヒト肝臓ミクロソーム中の安定性結果は下記のとおりである：
【表３】
0006418622.tif 000012
【００６２】
結果からみると、対照化合物ＡＺＤ９２９１と比較すると、半減期は、４８時間以上(ＡＺＤ９２９１の半減期は、２４時間である)であり、これは、医学的用量を減らし、投薬の時間間隔を増加させる可能性があることを示している。
【００６３】
テスト５：ＮＣＩ−Ｈ１９７５を移植したヌードマウスの体内の効果評価
ＮＣＩ−Ｈ１９７５を移植したヌードマウスに、一組に毎日一回で、３.６μｇ／ｇ（化合物／ヌードマウス重量）を投薬し、別の一組に、毎日一回で、７.２μｇ／ｇを投薬し、連続的に１０日間投薬した後、腫瘍の大きさの変化を観察した。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
試験結果からみると、高い用量で、実施例化合物がＡＺＤ９２９１全てがより良い腫瘍成長の阻害作用を示した。低い用量で、ＡＺＤ９２９１は、腫瘍増殖を阻害する活性が非常に低いが、実施例化合物の低い用量での腫瘍成長を阻害する活性が、ＡＺＤ９２９１より明らかな利点がある。
【００６６】
テスト６：
腫瘍ヌードマウスを二組に分けて、各組に三匹（雌マウス）ずつ分け，実施例化合物３ＢとＡＺＤ９２９１を投与し、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、連続的に１０日間投与し、通常のように給水給食した。投薬方法は、胃内投与である。腫瘍成長阻害試験結果を、図１に示した。
【００６７】
効果実施例２
試験に必要な主な設備、装置：
【表５】
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【００６８】
２  試験方法
２.１  試験動物のグループ化：
ＳＤラットは、２４匹、雌雄各半である。ランダムで４組をグループ化し、各組は、６匹であり、雌雄各半である。
各組は、それぞれ（１）胃内投与試験組（化合物３Ｂ）ＮＯ.１〜３雄，ＮＯ.４〜６雌
（２）胃内投与対照組（ＡＺＤ９２９１）ＮＯ.７〜９雄，ＮＯ.１０〜１２雌である。
【００６９】
２.２  試験試薬と投薬方法：
胃内投与：
２５ｍｇ／ｋｇの化合物３Ｂを、５ｍｇ／ｍｌの溶液に調整し、生理食塩水に溶解し、約１０ｍｌにし、試験開始前に調製する。
【００７０】
２５ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ９２９１を、５ｍｇ／ｍｌの溶液に調整し、生理食塩水に溶解し、約１０ｍｌにし、試験開始前に調製する。
【００７１】
２.３  試験プロセス
１．ラットを１週間飼育し、投与前に１２時間絶食させる
２．ラットをグループ化し、体重を測定する
３．２５ｍｇ/ｋｇの投薬化合物３ＢとＡＺＤ-９２９１をそれぞれ胃内投与し、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間の時点で眼窩から血液を２００μＬ採取した。
４．血液サンプルに対して、遠心分離を行い、上清液を取り、処理してから、分析した。テスト結果は、図２及び図３の通りである。
【００７２】
図２からわかるように、本発明の化合物３Ｂは、良好な薬物動態パラメータを有し、即ち、本発明の化合物が、短い時間内で高い血漿濃度に達することができ、長い時間内では、高い血漿濃度に継続されることができることで、本発明の化合物が、高い浸透性と良好な体内安定性を有することを実現し、図３からわかるように、本発明の化合物は、対照薬物に対して、同じ時間で代謝生成物が少なくて、肝臓の代謝負担を減少させ、薬物の副作用を低減させて、より持続的な薬効能を有する。
【００７３】
本技術分野の技術者にとっては、本公開は、前記に説明した実施例に限定されなく、その必要な属性を逸脱しない範囲では、他の特定の形態で実現することができる。したがって、全ての方面において全部限定性ではなく、説明性とし、前記実施例ではなく、添付した請求項に対して参考になる実施例であり、引用文献は、ただ付加した請求項に対し、前記具体例に対するものではなく、並びに請求項の均等の意味と範囲内に含まれる全ての変化が、これにより予期の通り含まれることである。
【００７４】
本明細書に挙げられたすべての特許、特許出願及び参考文献は、ここでその内容全部を引用することで参照されている。一致しない場合は、定義を含む本公開が、説得力を有する。
【００７５】
以上では、本発明の具体的な実施方法に関して記述したが、本技術分野の技術者は、これらは単に例示として説明することであり、本発明の原理と実質を逸脱しない前提の下で、これらの実施方法に対して様々な変更または修正を行うことができることを理解すべきである。また、本発明の保護範囲は、添付された請求項によって限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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