(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光線（Ｆ）に対する試料（１６）中に含まれる分析物の相対位置を調節する調節方法であって、
前記光線（Ｆ）での前記試料（１６）の前記分析物の照射と、
回折パターンを確定するための、前記試料（１６）の前記分析物によって散乱した前記光線の透過像の、撮像装置（３８）による撮影と、
前記回折パターンの少なくとも１つの特性に従った前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置の変更と
を含み、
前記光線（Ｆ）は、光源（２８）から生じて伝播軸（Ｚ）に沿って伝播し、前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の位置の変更は、
前記光線（Ｆ）の前記伝播軸（Ｚ）上に前記試料（１６）の前記分析物を位置合わせするステップ、
前記伝播軸（Ｚ）に沿った前記光源（２８）と前記試料（１６）の前記分析物との間の距離を変更して、前記試料（１６）の前記分析物によって回折された前記光線から得られる回折パターンが該回折パターンの光スポットの中心にあるようにするステップ、
前記試料（１６）の前記分析物が前記光線（Ｆ）を隠すまで前記伝播軸（Ｚ）に沿った前記光源（２８）と前記試料（１６）の前記分析物との間の距離を調整するステップ、
前記光源（２８）からの前記光線（Ｆ）の励起に応答して前記試料（１６）の前記分析物が発する放射線を最大化するために、前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置を変更するステップ
の少なくとも１つを含む調節方法。
【請求項２】
請求項１に記載の調節方法において、各ステップは、前記回折パターンの特性に応じて適用され、該特性は各ステップで異なる調節方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の調節方法において、回折パターンを確定するための前記試料（１６）の前記分析物によって散乱した前記光線の透過像の、撮像装置（３８）による撮影と、前記回折パターンの少なくとも１つの特性に応じた前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置の変更とを数回行う調節方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調節方法において、前記特性は、前記回折パターンの形態又は前記透過像における前記光線（Ｆ）によって形成されたスポットに関する前記回折パターンの位置である調節方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の調節方法において、
前記光線（Ｆ）の照射に応答して前記試料（１６）の前記分析物が発する放射線から得られる分析信号の分析装置（３２）による取得と、
前記取得した分析信号の少なくとも１つの特徴を最適化するための、前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置の変更と
をさらに含む調節方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の調節方法において、前記撮像装置（３８）は、レンズを用いない撮像装置（３８）である調節方法。
【請求項７】
光線（Ｆ）によって試料（１６）の分析物を分析する分析方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の調節方法を適用することによる、前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置の調節と、
前記光線（Ｆ）の照射に応答して前記試料（１６）の前記分析物が発する放射線を分析する装置（３２）による分析と
を含む分析方法。
【請求項８】
請求項７に記載の分析方法において、
減衰手段（３０）での前記光線（Ｆ）の減衰と、
前記光線（Ｆ）に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置の調節と、
前記光線（Ｆ）の減衰の停止と、
前記分析装置（３２）による分析と
を連続的に含む分析方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の分析方法において、
前記撮像装置（３８）によって確定された回折パターンからの前記試料（１６）の前記分析物の特徴の判定
をさらに含む分析方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの分析物を含む試料を保持することが可能な試料ホルダー（１８）であって、
回折パターンを確定するために前記試料の分析物によって散乱した光線の透過像を撮影することが可能な撮像装置（３８）と、
前記回折パターンの少なくとも１つの特性に応じて前記試料の前記分析物の相対位置を変更することが可能な、光線に対する試料の前記分析物の相対位置を調節するユニットとを備え、
前記光線は、光源（２８）から生じて伝播軸（Ｚ）に沿って伝播し、前記ユニットは、前記光線に対する前記試料（１６）の前記分析物の位置の変更を、
前記光線の前記伝播軸（Ｚ）上に前記試料（１６）の前記分析物を位置合わせすること、
前記伝播軸（Ｚ）に沿った前記光源（２８）と前記試料（１６）の前記分析物との間の距離を変更して、前記試料（１６）の前記分析物によって回折された前記光線から得られる回折パターンが該回折パターンの光スポットの中心にあるようにすること、
前記試料（１６）の前記分析物が前記光線を隠すまで前記伝播軸（Ｚ）に沿った前記光源（２８）と前記試料（１６）の前記分析物との間の距離を調整すること、
前記光源（２８）からの前記光線の励起に応答して前記試料（１６）の前記分析物が発する放射線を最大化するために、前記光線に対する前記試料（１６）の前記分析物の相対位置を変更すること
の少なくとも１つを含んで行う試料ホルダー。
【請求項１１】
請求項１０に記載の試料ホルダー（１８）において前記撮像装置（３８）は、レンズを用いない撮像装置である試料ホルダー。
【請求項１２】
光学系（１０）であって、
試料の分析物に光線（Ｆ）を照射することが可能な光源（２８）と、
請求項１０又は１１に記載の試料ホルダー（１８）と
を含む光学系。
【請求項１３】
請求項１２に記載の光学系（１０）において、前記調節ユニットは、
前記光線（Ｆ）の伝播方向（Ｚ）に沿って前記光源（２８）を並進させる手段と、
前記光線（Ｆ）の前記伝播方向（Ｚ）に対して垂直な平面内で前記試料ホルダー（１８、４２）を変位させる手段と
を備える光学系。
【請求項１４】
請求項１３に記載の光学系（１０）において、
前記光源（２８）及び
分析装置（３２）
を含むアセンブリー（１４）をさらに含み、
前記光源（２８）を並進させる手段が、前記光線（Ｆ）の前記伝播方向（Ｚ）に沿って前記アセンブリーを変位させることができる光学系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光線に対する試料の分析物の相対位置を調節する方法に関する。本発明は、光線によって試料の分析物を分析する方法にも関する。本発明は、関連の試料ホルダー及び光学系にも関する。
【背景技術】
【０００２】
分光分析の分野では、光プローブを備えた分析装置が用いられる。光プローブが分析物の励起を可能にすることで、プローブの励起に応答して分析物から生じた信号を収集することができる。信号の、したがって分析の品質は、できる限り正確な分析物上の光プローブの位置合わせを示唆する。これは、分析物の寸法が小さい、例えば約１マイクロメートルである場合に細心の注意を要する。
【０００３】
位置合わせを行うために、光プローブを顕微鏡構造と組み合わせた分析装置を含むシステムが、特許文献１から知られている。このシステムは、分析物を白色光線によって照射する撮像モードと、分析物を光プローブによって照射する分析モードとで動作するよう構成されている。分析物上の位置合わせは、白色光線で、対物レンズを用いて顕微鏡構造の倍率を増加させて確保される。
【０００４】
しかしながら、このシステムでは比較的長い位置合わせ時間が強いられる。さらに、位置合わせが保証されるのは、光プローブからの光線の位置が撮像モード及び分析モードの両方で同一である場合だけである。これには、位置合わせ不良を防止するために光プローブからの光線の位置の定期的な確認が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願第２０１２／００４０３３０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、光線に対する分析物の相対位置をより高速で調節する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、この目的は、光線に対する試料中に含まれる分析物の相対位置を調節する調節方法によって達成される。本調節方法は、光線での試料の分析物の照射と、回折パターンを確定するための、試料の分析物によって散乱した光線の透過像の撮像装置による撮影と、回折パターンの少なくとも１つの特性に従った光線に対する試料の分析物の相対位置の変更とを含み、
光線は、光源から生じて伝播軸に沿って伝播し、光線に対する試料の分析物の位置の変更は、
光線の伝播軸上に試料の分析物を位置合わせするステップ、
伝播軸に沿った光源と試料の分析物との間の距離を変更して、試料の分析物によって回折された光線から得られる回折パターンが回折パターンの光スポットの中心にあるようにするステップ、
試料の分析物が光線を隠すまで伝播軸に沿った光源と試料の分析物との間の距離を調整するステップ、
光源からの光線の励起に応答して試料の分析物が発する放射線を最大化するために、光線に対する試料の分析物の相対位置を変更するステップ
の少なくとも１つを含む。
【０００８】
特定の実施形態によれば、調節方法は、個別に又は任意の技術的に可能な組み合わせで得られる以下の特徴の１つ又は複数を含む：
各ステップは、回折パターンの特性に応じて適用され、特性は各ステップで異なる。
回折パターンを確定するための試料の分析物によって散乱した光線の透過像の撮像装置による撮影と、回折パターンの少なくとも１つの特性に応じた光線に対する試料の分析物の相対位置の変更とは、数回行われる。
特性は、回折パターンの形態又は透過像における光線によって形成されたスポットに関する回折パターンの位置である。
本方法は、光線の照射に応答して試料の分析物が発する放射線から得られる分析信号の分析装置による取得と、取得した分析信号の少なくとも１つの特徴を最適化するための、光線に対する試料の分析物の相対位置の変更とをさらに含む。
撮像装置は、レンズを用いない撮像装置である。
【０００９】
本発明は、光線によって試料の分析物を分析する分析方法にも関する。本分析方法は、前述の調節方法を適用することによる光線に対する試料の分析物の相対位置の調節と、光線の照射に応答して試料の分析物が発する放射線の分析装置による分析とを含む。
【００１０】
特定の実施形態によれば、調節方法は、個別に又は任意の技術的に可能な組み合わせに従って得られる以下の特徴の１つ又は複数を含む。
本方法は、減衰手段での光線の減衰と、光線に対する試料の分析物の相対位置の調節と、光線の減衰の停止と、分析装置による分析とを連続的に含む。
本方法は、撮像装置によって確定された回折パターンからの試料の分析物の特徴の判定をさらに含む。
【００１１】
本発明は、少なくとも１つの分析物を含む試料を保持することが可能な試料ホルダーにも関する。試料ホルダーは、回折パターンを確定するために試料の分析物によって散乱した光線の透過像を撮影することが可能な撮像装置と、回折パターンの少なくとも１つの特性に応じて試料の分析物の相対位置を変更することが可能な、光線に対する試料の分析物の相対位置を調節するユニットとを備え、
光線は、光源から生じて伝播軸に沿って伝播し、ユニットは、光線に対する試料の分析物の位置の変更を、
光線の伝播軸上に試料の分析物を位置合わせすること、
伝播軸に沿った光源と試料の分析物との間の距離を変更して、試料の分析物によって回折された光線から得られる回折パターンが回折パターンの光スポットの中心にあるようにすること、
試料の分析物が光線を隠すまで伝播軸に沿った光源と試料の分析物との間の距離を調整すること、
光源からの光線の励起に応答して試料の分析物が発する放射線を最大化するために、光線に対する試料の分析物の相対位置を変更すること
の少なくとも１つを含んで行う。
【００１２】
特定の実施形態によれば、撮像装置は、レンズを用いない撮像装置である。
【００１３】
本発明は、試料の分析物に光線を照射することが可能な光源と、前述の試料ホルダーとを含む光学系にも関する。
【００１４】
特定の実施形態によれば、光学系は、個別に又は任意の技術的に可能な組み合わせに従って得られる以下の特徴の１つ又は複数を含む。
調節ユニットは、光線の伝播方向に沿って光源を並進させる手段と、光線の伝播方向に対して垂直な平面内で試料ホルダーを変位させる手段とを備える。
光源及び分析装置を含むアセンブリーであり、光源を並進させる手段が、光線の伝播方向に沿ってアセンブリーを変位させることができる。
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は、ごく一例として添付図面を参照して与えられる本発明の実施形態の以下の説明を読めば明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施形態による例示的な光学系の図である。
【図２Ａ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第１実施形態中に観察された回折パターンである。
【図２Ｂ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第１実施形態中に観察された回折パターンである。
【図２Ｃ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第１実施形態中に観察された回折パターンである。
【図２Ｄ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第１実施形態中に観察された回折パターンである。
【図２Ｅ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第１実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ａ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ｂ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ｃ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ｄ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ｅ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図３Ｆ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第２実施形態中に観察された回折パターンである。
【図４Ａ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第３実施形態中に観察された回折パターンである。
【図４Ｂ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第３実施形態中に観察された回折パターンである。
【図４Ｃ】本発明による位置合わせ方法の１ステップの第３実施形態中に観察された回折パターンである。
【図５】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図６】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図７】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図８】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図９】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１０】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１１】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１２】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１３】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１４】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１５】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１６】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１７】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１８】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図１９】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図２０】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図２１】本発明による位置合わせ方法の適用時に観察された回折パターンである。
【図２２】図５〜図２１に対応する記録されたラマンスペクトルを示すグラフである。
【図２３】本発明による方法において、複数の回折パターンを観察された分析物の種及び撮像位置にそれぞれ関連付けた表である。
【図２４】本発明の第２実施形態による例示的な光学系の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１に示す光学系１０は、光学テーブル１２上に配置される。光学テーブル１２は、光学系の良好な安定性を確保することができる。
【００１８】
光学系１０は、アセンブリー１４、試料１６、及び試料ホルダー１８を含む。
【００１９】
アセンブリー１４は、略Ｔ字形を有する本体２０を含むことにより、第１ブランチ２２及び第２ブランチ２４を画定する。第１ブランチ２２は、Ｘ軸と平行な方向に沿って延びる。Ｘ軸は、図１の平面に属し、試料１６の平面と平行である。第２ブランチ２４は、Ｚ軸と平行な方向に沿って延びる。Ｚ軸は、試料１６に対して垂直な軸である。
【００２０】
Ｘ軸と平行な方向は、説明の続きでは左右方向であり、Ｚ軸と平行な方向は鉛直方向である。両方の軸Ｘ及びＺに直交する付加的な軸はＹとする。軸Ｙと平行な方向は、横断方向と称する。
【００２１】
アセンブリー１４には、鉛直方向並進手段２６が設けられる。
【００２２】
鉛直方向並進手段２６は、鉛直方向に沿って本体２０の全体を変位させることができる。鉛直方向並進手段２６は、本体２０と試料１６との間の距離の変更を可能にする。
【００２３】
図１の例によれば、鉛直方向並進手段は電動ステージである。
【００２４】
アセンブリー１４の第１ブランチ２２は、光源２８と、可変光学濃度３０の形態での光源２８の減衰手段３０とを含む。
【００２５】
光源２８は、光線を発することができる。
【００２６】
光源２８は、図１の例によればレーザー光源である。
【００２７】
例えば、光源２８は、レーザー又は発光ダイオードである。発光ダイオードは、発光ダイオードの頭字語ＬＥＤでも表される。
【００２８】
したがって、概して、光源の減衰手段３０は、光線に対する分析物の位置決めを進める際に試料に対する入射光線の強度を減らすよう位置決めされる。この減衰手段３０は、分析装置３２による分析物の分析を進める際には動作停止される。減衰手段３０は、例えば可動の光学濃度である。
【００２９】
可変光学濃度３０は、光学濃度の出力において光源２８からのレーザー光線の強度を制御することを可能にする。
【００３０】
可変光学濃度３０は、後退位置と展開位置との間で可動である。光学濃度３０が後退位置にある場合、光学濃度３０は光源２８が発した光線を減衰しないが、光学濃度３０が展開位置にある場合、光学濃度３０はこの光線を減衰する。
【００３１】
第２ブランチ２４は、分析装置３２、スプリッター板３４、及び光学素子３６を含む。
【００３２】
分析装置３２は、例えば、ラマン分光型の分析を行うことができる。
【００３３】
光学濃度３０が後退位置にある場合、分析装置３２は、光源２８、スプリッター板３４、及び集束光学素子３６を含む光プローブ３７（図示せず）を含む。
【００３４】
分析装置３２は、このとき、上記光プローブ３７が発生させた光線に応答して分析物が発した信号を分析することができる。
【００３５】
換言すれば、光源２８が励起光線を生成して、試料１６の分析物からの応答信号の放出を可能にし、当該応答信号は、続いて分析装置３２によって分析される。
【００３６】
光学濃度３０が展開位置にある場合、光源２８が発生させた光線を、分析手段３２での分析物の分析前に分析物を最適に位置決めするための光線として用いるのに十分なほど（通常は１０分の１〜１，０００分の１に）減衰させる。
【００３７】
分析装置３２は、概して、分析物が発した信号の集光を可能にする集光光学素子（色消しレンズ）を備える。分析装置３２は、本体２０に固定されてもよく、又は光学系１０の外側に遠ざけられていてもよい。このような場合、分析物が発した信号は、本体２０に固定された光学的結合、例えば光ファイバーによって装置３２へ向けて誘導される。このような光学的結合手段は、この場合は分析装置３２の一部とみなされる。
【００３８】
スプリッター板３４は、光源２８が発した光線を反射して光学素子３６が収集した光を分析装置３２へ透過するようレイアウトされる。
【００３９】
さらに、スプリッター板は、光源２８が発した光線に対して４５°及び透過光線から４５°に位置決めされる。この結果として、スプリッター板が反射した光線は、光プローブ３７からの光線と位置合わせされる。
【００４０】
光学素子３６は、試料１６へ向けて光を送り、試料１６から光を収集することができる。
【００４１】
図１の例によれば、光学素子３６は顕微鏡対物レンズである。
【００４２】
試料１６は、基板上にある分析物を含む。
【００４３】
基板は、４００ナノメートル（ｎｍ）〜７００ｎｍの範囲の透過率が３０％以上である媒体である。
【００４４】
例えば、基板はスライドガラスである。
【００４５】
例として、分析物は、微粒子又はマイクロメートルサイズの粒子の凝集体である。例として、粒子は生物又は無機粒子である。
【００４６】
生物は、真核細胞又は原核細胞（例えば、菌類、赤血球、白血球又は血小板、細菌又は細菌コロニー）及び非細胞生物（特にウイルス及びプリオン）を含む。
【００４７】
場合によっては、細胞は単離されるか又は有機組織に含まれる。
【００４８】
生物は、概して１０ミクロン（μｍ）以下の寸法を有する。好ましくは、本発明で考慮される生物は、１μｍ以下の寸法を有する。
【００４９】
試料ホルダー１８は、レンズを用いない撮像装置３８、左右方向並進手段４０、及び横断方向並進手段４２を含む。
【００５０】
レンズを用いない撮像装置３８は、光検出器アレイ４４を含む。
【００５１】
概して、レンズを用いない撮像という用語は、光検出器アレイを分析物の前に配置して、光検出器と分析物との間の拡大光学素子に頼らない画像形成を指す。
【００５２】
光検出器アレイ４４は、試料１６の分析物を透過した回折パターンを確定することができ、回折パターンは、試料１６に含まれる１つ又は複数の分析物による弾性散乱波の像に対応する。この回折像は、光源２８からの光線での試料１６の照射中に光検出器アレイ４４で形成される。
【００５３】
光検出器アレイ４４は、鉛直軸Ｚに対して垂直な平面内のイメージセンサーである。
【００５４】
光検出器アレイ４４は画素化イメージセンサー、例えばＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）センサーである。
【００５５】
代替形態によれば、光検出器アレイ４４はＣＣＤ（電化結合素子）センサーである。
【００５６】
光検出器アレイ４４は、図示はしないがマイクロレンズをさらに含み、各マイクロレンズは対応の画素の上に位置決めされる。このようなマイクロレンズは、光検出器アレイ４４に組み込まれる。これらのマイクロレンズは、収率の向上を可能にし、試料１６と光検出器アレイ４４との間に位置決めされた拡大光学素子を形成しない。
【００５７】
結果として、光検出器アレイ４４は、試料１６から短距離に配置されつつ試料１６の像を形成することができる。短距離とは、数センチメートル（ｃｍ）未満、好ましくは１ｃｍ未満、優先的には５ｍｍ未満、より優先的には１ｍｍの距離を意味する。
【００５８】
レンズを用いない撮像装置３８は、左右方向並進手段４０上に位置決めされる。左右方向並進手段４０は、横断方向並進手段４２上に位置決めされる。
【００５９】
左右方向並進手段４０は、Ｘ軸と平行な方向に沿ったアセンブリー１４に対する試料ホルダー１８の位置の変化を可能にする。
【００６０】
左右方向並進手段４０は電動ステージである。
【００６１】
横断方向並進手段４２は、Ｙ軸と平行な方向に沿ったアセンブリー１４に対する試料ホルダー１８の位置の変化を可能にする。
【００６２】
横断方向並進手段４２は電動ステージである。
【００６３】
したがって、左右方向並進手段４０及び横断方向並進手段４２は、図１に直交する平面内で試料１６の位置を変更することができる。それゆえ、試料ホルダー１８は、光源２８が生成した光線に直交する平面内で変位し得る。
【００６４】
次に、分析プローブ３７の光線Ｆによって試料１６の分析物を分析する方法に関して、光学系１０の動作を説明する。
【００６５】
本方法は、光線Ｆに対する試料１６の分析物の相対位置の調節を含む。この相対位置の調節の例を、続いて説明する。
【００６６】
本方法は、この場合、試料１６の分析物に光源２８からの光線を照射するステップを含む。
【００６７】
この照射ステップでは、光線Ｆを減衰手段によって減衰させる。
【００６８】
光源２８が発した光線Ｆは、試料１６の分析物によって散乱する。
【００６９】
レンズを用いない撮像装置３８は、続いて、以下でＦＤとする回折パターンを確定するために、試料１６の分析物が散乱させた光線の透過像を撮影する。
【００７０】
本方法は、回折パターンＦＤの少なくとも１つの特性に応じて、光線Ｆに対する試料１６の分析物の相対位置を変更するステップを含む。
【００７１】
光線Ｆに対する試料１６の相対位置を変更するステップは、光線Ｆに対して分析物を位置決めして、分析物が光線Ｆの軸に対して相対的に位置合わせされるようにするステップを含む。位置決めとは、
光線Ｆに対して垂直な平面内での試料１６の分析物の位置合わせ、
光線Ｆの伝播軸に沿った光源２８と試料１６の分析物との間の距離の変更
を意味する。
【００７２】
概して、位置決めは、これらのステップの１つ又はそれらの組み合わせを含む。
【００７３】
概して、位置合わせは、伝播軸に対して垂直な平面内で光線Ｆに対する分析物の位置を変更して、分析物が光線の伝播軸上に位置決めされるようにすることからなる。
【００７４】
分析物とアセンブリー１４との間の鉛直方向Ｚに沿った距離が十分に大きい場合、光線Ｆは、透過像に光スポットを発生させ、そこでいくつかの回折パターンが識別され得る。伝播軸上の中心合わせは、このとき、分析を望む分析物に対応する回折パターンＦＤにおける関心の回折パターンを選択すること、及び上記光スポットの中心にこの回折パターンを配置することからなる。これは、上記光スポットに対する関心の回折パターンの位置に基づく粗い中心合わせである。結果として、位置合わせステップは、回折パターンＦＤの次の特性の使用に基づく：上記光スポットに対する関心の回折パターンの位置。
【００７５】
分析物とアセンブリー１４との間の鉛直方向Ｚに沿った距離を減らした場合、回折パターンＦＤにおいて、光線Ｆによって形成された光スポットが分析物によってもたらされた回折パターンに対応する。続いて、回折パターンＦＤの別の基準である回折パターンＦＤの形態に基づいて、位置合わせの微調整を進める。形態とは、回折パターンの形状又は強度分布を意味する。
【００７６】
実際には、非対称の回折パターンＦＤは、光源２８からの光線Ｆと試料１６の分析物とが左右Ｘ方向及び横断Ｙ方向に沿って位置合わせされていないことを示す。
【００７７】
特に、回折パターンＦＤは、回折パターンの形状が対称でない場合に対称でないが、散乱強度の分布が対称でない場合にも対称でない。
【００７８】
例として、観察された回折パターンＦＤが、回折パターンＦＤの上部に向かうほど強い強度を有するリング状のエアリースポットであると仮定すると、これは、試料１６を回折パターンＦＤの底部に向かって変位させなければならないことを示す。試料１６の変位が十分であれば、このときエアリースポットは全方向で同じ強度を有するリング状で観察される。
【００７９】
試料１６の分析物の変位は、左右方向並進手段４０及び横断方向並進手段４２によって施される。
【００８０】
試料１６の分析物を位置決めするステップの最後に、光源２８の光線Ｆを方向Ｘ及びＹに沿って分析物上で位置合わせする。
【００８１】
好ましくは、位置合わせは、関心の分析物を選択すること及びこれを大まかに位置決めすることを可能にする粗い中心合わせと、それに続く細かい中心合わせとを含む。
【００８２】
代替的に、位置合わせは、これらの中心合わせ動作の一方のみ又は両方、例えば細かい中心合わせを含む。
【００８３】
試料１６の分析物を位置合わせするステップの適用を説明するために、次に３つの実施例を記載する。
【００８４】
図２Ａ〜図２Ｅに対応する第１実施例では、分析物は、表皮ブドウ球菌と称する単一細菌である。ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクションの頭字語）分類では、表皮ブドウ球菌は１４９９０番で示される。表皮ブドウ球菌は円形である。
【００８５】
種々の図２、すなわち図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、及び図２Ｅは、細菌に対する光源２８の光線Ｆの種々の位置で得られた回折パターンを表す。図２Ａ〜図２Ｅのそれぞれにおいて、鉛直方向に沿ったアセンブリー１４の位置を、方向Ｘ及びＹの少なくとも一方に沿った細菌に対する光源２８の光線Ｆの位置のみが変わるよう設定する。
【００８６】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｄ、及び図２Ｅは、細菌上の光源２８の光線Ｆの位置合わせ不良を示す。
【００８７】
図２Ａ及び図２Ｂでは、試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に対して中心が左上に見られる干渉縞の存在が観察される。これは、細菌が試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に対して左上に位置することを示す。
【００８８】
図２Ｄ及び図２Ｅでは、試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に対して中心が右に見られる干渉縞の存在が観察される。これは、細菌が試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に対して右に位置することを示す。
【００８９】
図２Ｃは、細菌が試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に位置する場合に相当する。実際には、均一で同心状の強度を有する干渉縞が観察される。
【００９０】
図２Ｃの中心合わせされた場合に達するために、図２Ａで観察されるように細菌が偏心している場合から始めて、試料１６を方向Ｘ及び／又は方向Ｙに沿って変位させるべきである。この場合、試料１６を、（Ｘ方向に沿って）右に向かって０．４マイクロメートル、（Ｙ方向に沿って）下方に０．４マイクロメートル変位させた。
【００９１】
図３Ａ〜図３Ｆに対応する第２実施例では、分析物は、枯草菌と称する単一細菌である。ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクションの頭字語）分類では、枯草菌は２３８５７番で示される。枯草菌は棒状の形状である。
【００９２】
種々の図３、すなわち図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆは、細菌に対する光源２８からの光線Ｆの種々の位置で得られた回折パターンを表す。図３Ａ〜図３Ｆのそれぞれにおいて、鉛直方向に沿ったアセンブリー１４の位置を、方向Ｘ及びＹの少なくとも一方に沿った細菌に対する光源２８からの光線Ｆの位置のみが変わるよう設定する。
【００９３】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｄ、及び図２Ｅに関して説明した理由と同様の理由で、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｅ、及び図３Ｆは、細菌上の光源２８からの光線Ｆの位置合わせ不良を示す。実際には、観察された干渉縞は、均一な強度を有さず完全に同心状ではない。
【００９４】
これに対して、図３Ｄは、細菌が試料１６上の光線Ｆのスポットの中心に位置する場合に相当する。実際には、均一で同心状の強度を有する干渉縞が観察される。
【００９５】
この第２実施例では、図３Ｄの中心合わせされた構成に達するために、図３Ａで観察されたように細菌が偏心している構成から変わるように、試料１６を（Ｘ方向に沿って）右に向かって０．８マイクロメートル変位させた。この第２実施例では、試料１６をＹ方向に沿って変位させなかった。
【００９６】
図４Ａ〜図４Ｃに対応する第３実施例では、分析物は、大腸菌細菌の成長によって得られた細菌微小コロニーである。ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクションの頭字語）分類では、大腸菌は２３８５７番で示される。大腸菌細菌は、ゲロース栄養培地で６時間培養した。得られた微小コロニーの直径は１５０ミクロンである。
【００９７】
種々の図４、すなわち図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃは、細菌に対する光源２８からの光線Ｆの種々の位置で得られた回折パターンを表す。図４Ａ〜図４Ｃのそれぞれにおいて、鉛直方向に沿ったアセンブリー１４の位置を、方向Ｘ及びＹの少なくとも一方に沿った細菌に対する光源２８からの光線Ｆの位置のみが変わるよう設定する。
【００９８】
第３実施例では、図４Ｂに示すパターンが得られる場合に、光源２８からの光線Ｆが微小コロニー上で中心合わせされているとみなす。実際には、観察された回折リングの強度は対称に分布している。対照的に、図４Ａ及び図４Ｃは、偏心構成に相当する。
【００９９】
この第３実施例では、図４Ｂの中心合わせされた構成に達するために、図４Ａで観察されたようにコロニーが偏心している構成から変わるように、試料１６を（Ｘ方向に沿って）右へ１１マイクロメートル変位させた。この第３実施例では、試料１６をＹ方向に沿って変位させなかった。位置合わせは、光線に対して関心の分析物を中心合わせするように、鉛直方向並進手段２６を用いてアセンブリー１４を鉛直方向に沿って変位させることを意味する。
【０１００】
光線Ｆの伝播軸に沿った光源２８と試料１６の分析物との間の位置合わせ及び距離の変更は、こうして同時に確保されるので、位置合わせの終わりに、関心の回折パターンの位置が回折パターンＦＤ上の上記光スポットに対して中心合わせされる。
【０１０１】
さらに、位置合わせは、反復して、反復毎に光線に対して垂直な平面内での粗い中心合わせを変更することによって特に達成される。
【０１０２】
実施される分析のタイプに従って、試料１６と支持体１４との間の距離を調整して、光源２８が発生させる光線Ｆのサイズが分析物のサイズと一致するか又はそれよりも小さいようにすることも有用である。実際には、試料１６の平面における光線Ｆの断面は、対物レンズ３６と試料１６との間の距離に従って変わる。この断面を分析物の寸法に、又はそれよりも小さな寸法に調整することによって、分析物の周辺の照射が回避される。この場合、分析物に非特異的な寄生信号の放出が回避される。
【０１０３】
分析物に対する光線Ｆのサイズの調整は、光線Ｆに対する試料１６の分析物の相対位置を変更するステップによって得られる。
【０１０４】
この場合、相対位置を変更するステップは、観察された分析物が光源２８からの光線Ｆを隠すまで、鉛直軸Ｚに沿った分析物とアセンブリー１４との間の距離を変更するステップも含み、これはすなわち、拡散スポット以外の回折パターンを識別することが不可能なときであり、またこのスポットがその中心で最小の光強度を有するときである。
【０１０５】
したがって、レンズを用いない撮像装置３８は、試料１６の平面内での光線Ｆのサイズの調整を可能にする。
【０１０６】
分析物に対する光線Ｆのサイズのこの調整は、光線Ｆの励起に応答して試料１６の分析物が発する放射線を最大化するために光線Ｆに対する試料１６の分析物の相対位置を変更するステップを適用することによって完了することができる。
【０１０７】
本方法は、より大きな振幅の光線Ｆの励起を発生させるために光線Ｆの減衰を停止するステップも含む。
【０１０８】
本方法は、続いて、光線Ｆによる照射に応答して試料１６の分析物が発する放射線から得られる分析信号を分析装置３２によって取得するステップを含み、光源２８は、このとき減衰手段３０によって減衰されない。
【０１０９】
分析装置３２により生成された信号の観察により、取得された分析信号の特徴を少なくとも最適化するために分析物と装置１４との間の距離を変更することが可能となる。
【０１１０】
この特徴は、例えば、強度、信号対雑音比、又はスペクトル分解能である。
【０１１１】
このステップの終わりに、光線Ｆに対する試料１６の分析物の相対位置が調節される。
【０１１２】
本方法は、続いて、光線Ｆの照射に応答して試料１６の分析物が発する放射線から得られる分析信号を分析装置によって分析するステップを含む。
【０１１３】
ラマンプローブ３７の光線Ｆによって試料１６の分析物を分析する方法を適用する例を、図５〜図２２に関して示す実験によって説明する。
【０１１４】
図５〜図２１の画像は、光検出器アレイ４４からの回折パターンの画像である。図５〜図２１はそれぞれ、アセンブリー１４と試料１６との間の鉛直距離に対応する。
【０１１５】
図示の実験では、試料ホルダー１６がセレウス菌と称する単一細菌を含む。
【０１１６】
図１９は、図１３で観察された最大ラマン信号に対応するので、アセンブリー１４と試料１６との間の基準距離２３ｍｍに対応する。
【０１１７】
それぞれ、図５は、基準距離に対して４３．９２２ミリメートル（ｍｍ）を超えるアセンブリー１４と試料１６との間の鉛直距離に対応し、図６は、１０．９２２ｍｍを超える距離に対応し、図７は、３．２２２ｍｍを超える距離に対応し、図８は、２．１２２ｍｍを超える距離に対応し、図９は、１．０２２ｍｍを超える距離に対応し、図１０は、７２２μｍを超える距離に対応し、図１１は、２５２μｍを超える距離に対応し、図１２は、１６２μｍを超える距離に対応し、図１３は、７７μｍを超える距離に対応し、図１４は、５６μｍを超える距離に対応し、図１５は、４５μｍを超える距離に対応し、図１６は、３０μｍを超える距離に対応し、図１７は、２１μｍを超える距離に対応し、図１８は、２．６μｍを超える距離に対応し、図２０は、５．０μｍ未満の距離に対応し、図２１は、１０．３μｍ未満の距離に対応する。
【０１１８】
図５〜図１２では、レンズを用いない撮像装置３８で得られた回折パターンが、試料１６の複数の分析物の観察を可能にする。レンズを用いない撮像装置３８による試料１６の観察は、このとき、異なる分析物を含めて全体的に見ることを可能にする。
【０１１９】
距離が基準距離に対して２５２μｍ未満である場合、単一分析物の回折パターンがレンズを用いない撮像装置３８で観察される。
【０１２０】
したがって、支持体１４に対する試料１６の位置を変更することで、関心の分析物の選択及び光線Ｆの軸に対する関心の分析物の位置合わせが可能になる。
【０１２１】
図５〜図１２は、結果として前述の粗い中心合わせを説明するものである。
【０１２２】
図１３〜図１７では、最大鉛直距離から最小鉛直距離まで、レーザーが照射した領域のサイズが細菌のサイズよりも大きなサイズから細菌のサイズと等しくなる（図１７の場合、光線が細菌によって隠される）まで減少することが順次観察される。
【０１２３】
レーザー光線及び細菌が、このときＺ方向に沿って位置合わせされる。
【０１２４】
このラマン分析という特定の場合に、最適な調整は、回折パターンが隠される位置から、観察されたラマンスペクトルに応じてアセンブリー１４と分析物との間の鉛直方向に沿った距離を調整することによって達成される。より具体的には、鉛直方向に沿った最適な距離は、関心の該当区域におけるピークが最も分解され最強である距離に相当する。図１８〜図２１は、分析信号に基づくこの調整を示す。
【０１２５】
図１８〜図２１に示す例では、分析装置３２はラマン分光計である。距離の調整は約数ミクロンである。この場合、鉛直距離をラマンスペクトルに従って調整することで、細菌が発した信号に対応する関心のスペクトル領域（すなわち、１，０００ｃｍ−１〜１，７００ｃｍ−１のシフト）でより多くのピークを検出するようにする。最適値は、図１９（又は図１８）に示すものであり、実際には、これらの図では、ラマンスペクトルが関心領域により十分に分解されたピークを含む。さらに、細菌の周辺からの寄生信号が大幅に低減する。したがって、測定は関心の分析物により特異的なものとなる。
【０１２６】
図１０、図１１、図１６〜図２１の種々の位置で得られたスペクトルを図２２に示す。告知の通り、２００ｃｍ−１〜９２５ｃｍ−１の波長域が、試料１６の石英のスペクトルシグネチャに対応するので考慮されない場合、１，０００ｃｍ−１〜１，７００ｃｍ−１及び２，８５０ｃｍ−１〜３，０００ｃｍ−１の波長域それぞれで図１９（又は図１８）に対応するラマン信号が最大振幅信号であることが観察される。
【０１２７】
したがって、本方法は、観察対象の分析物上のプローブの位置合わせを得ることを実際に可能にする。
【０１２８】
記載した実験は、いくつかの異なる細菌、特に大腸菌及び枯草菌で、また細胞及び表皮ブドウ球菌ＳＥ９で再現に成功した（図２３参照）。
【０１２９】
提案した位置合わせ方法は、集光対物レンズを変えるステップを示唆しない。時間的利益が得られると共に、機器としてもソフトウェアレベルでも用いられる光学系１０の単純化が得られる。
【０１３０】
本方法は、分析物の位置決め（すなわち、光線Ｆに対する分析物の位置合わせ及び試料１６の平面上の光線Ｆのサイズの調整）のために、またアセンブリー１４の外側に位置する光学素子を用いずに分析物を分析するために、同じ光源２８を用いることを可能にする。
【０１３１】
位置合わせは、光源２８を例えば光学濃度３０によって減衰させた場合に有利に達成され、続いて分析が減衰なしで実行される。
【０１３２】
これにより、オプションの光学素子の位置合わせの確認を伴わずに、光源２８から及びプローブからの光線の適切な位置合わせが保証される。この結果として、光学系１０の堅牢性が向上する。したがって、光学系１０は、現場で輸送され得るシステムで用いることができる。
【０１３３】
図示の方法は、ソフトウェア処理によって、また並進手段２６、４０、４２のサーバー制御を用いて容易に自動化することができる。
【０１３４】
この方法では、光源２８からのプローブ光線及び分析装置３２は、試料１６を固定したままで鉛直位置合わせステップ中に一緒に移動する。鉛直方向に沿って位置が変更されるのが試料１６である従来のシステムと比べて、左右Ｘ方向及び横断Ｙ方向に沿って光線を位置合わせし直すステップが、鉛直方向Ｚに沿った試料の新たな位置それぞれでこうして回避される。
【０１３５】
代替形態によれば、光検出器アレイ４４で得られた回折パターンＦＤは、試料１６に含まれる分析物の予備分類を行うためにも用いられる。
【０１３６】
回折パターンは、分析物のサイズ、形状にアクセスすることを実際に可能にする。
【０１３７】
この情報は分析物の識別を特に可能にする。
【０１３８】
図２３は、複数の回折パターンそれぞれを、観察された分析物及び撮像装置３８で撮像するための距離に対応する光源２８と試料１６との間の鉛直距離と表で関連付けたものである。
【０１３９】
第１種はセレウス菌、第２種は枯草菌、第３種は大腸菌である。
【０１４０】
図２３の表において、各種に３つの異なる距離（位置１、位置２、及び位置３）から得た３つの回折パターンを関連付ける。
【０１４１】
回折パターンの形状が関連の分析物に従って異なることが実際に観察され、これが回折パターンの観察からの分析物の識別を可能にする。
【０１４２】
本方法は、いかなるタイプの分析装置３２にも適用される。例として、図１に関して示した光学系１０を、反射回折、蛍光、又は自家蛍光等の他の撮像装置と共に用いることもできる。
【０１４３】
光学系の第２実施形態も図２４に示す。
【０１４４】
光学系１０は、図１の光学系と同じ要素を含む。
【０１４５】
光学系１０は、分析装置３２とスプリッター板３４との間に位置決めされたミラー１００も含む。
【０１４６】
ミラー１００は平面ミラーである。
【０１４７】
ミラー１００は、スプリッター板３４を透過した光線を反射する第１位置と、透過光線と相互作用しない第２位置との間で可動である。
【０１４８】
光学系１０は、光線をフィルタリングすることができる蛍光フィルター１０２も含む。
【０１４９】
フィルター１０２は、ミラー１００が第１位置にある場合にミラー１００及びスプリッター板３４によって反射された光線をフィルタリングするよう位置決めされる。
【０１５０】
光学系１０は、レンズを用いる撮像装置１０４も含む。
【０１５１】
図２４の例によれば、レンズを用いる撮像装置１０４は、拡大光学素子１０６及びカメラ１０８を備える。
【０１５２】
拡大光学素子１０６は、アセンブリー１４に取り付けられた第１顕微鏡対物レンズ１１０と、エクステンダーリング１１４によってカメラ１０８に取り付けられた第２顕微鏡対物レンズ１１２とを含む。
【０１５３】
拡大光学素子１０６は、光線を拡大してそれをカメラ１０８の光検出器に集束させることができる。
【０１５４】
この実施形態では、光学系１０は、蛍光撮像に用いられる。
【０１５５】
フィルター１０２がない場合、光学系１０は、回折反射撮像の実施に用いられる。
【０１５６】
フィルター１０２がない場合、白色光での試料１６の照射によって、光学系１０は、反射回折による撮像の実施及び直接空間における白色光撮像の実施の両方に用いられる。
【０１５７】
この光学系１０は、光学系１０の第１実施形態で提案した位置合わせ方法の適用も可能にする。
【０１５８】
結果として、提案した実施形態では、試料１６で２つの連続した異なる分析を行うために単一の位置合わせを実施することが可能である。
【０１５９】
さらに、レンズを用いない撮像装置３８に関して種々の実施形態を提示してきたが、フーリエ空間での観察を可能にする限り、レンズを用いる撮像装置３８で本方法を適用することもできる。実際には、本発明によれば、技術水準の場合のような直接空間ではなくフーリエ空間で観察された特性を用いた、分析物の位置合わせが提案される。こうして得られる調節方法は、技術水準の調節方法よりも素早く適用される。
【図１】
0006382848.tif 000002
【図２Ａ】
0006382848.tif 000003
【図２Ｂ】
0006382848.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006382848.tif 000006
【図２Ｅ】
0006382848.tif 000007
【図３Ａ】
0006382848.tif 000008
【図３Ｂ】
0006382848.tif 000009
【図３Ｃ】
0006382848.tif 000010
【図３Ｄ】
0006382848.tif 000011
【図３Ｅ】
0006382848.tif 000012
【図３Ｆ】
0006382848.tif 000013
【図４Ａ】
0006382848.tif 000014
【図４Ｂ】
0006382848.tif 000015
【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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