(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１）に対して特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインであって、該免疫グロブリン単一可変ドメインが、以下の式（１）に示す４個のフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備えるアミノ酸配列を備える免疫グロブリン単一可変ドメイン：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
であって、ここで、
ＣＤＲ１は配列番号６７であり、ＣＤＲ２は配列番号１２７であり、かつＣＤＲ３は配列番号１８７である；
ＣＤＲ１は配列番号６８であり、ＣＤＲ２は配列番号１２８であり、かつＣＤＲ３は配列番号１８８である；
ＣＤＲ１は配列番号６９であり、ＣＤＲ２は配列番号１２９であり、かつＣＤＲ３は配列番号１８９である；
ＣＤＲ１は配列番号７０であり、ＣＤＲ２は配列番号１３０であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９０である；
ＣＤＲ１は配列番号７１であり、ＣＤＲ２は配列番号１３１であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９１である；
ＣＤＲ１は配列番号７２であり、ＣＤＲ２は配列番号１３２であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９２である；
ＣＤＲ１は配列番号７４であり、ＣＤＲ２は配列番号１３４であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９４である；
ＣＤＲ１は配列番号７５であり、ＣＤＲ２は配列番号１３５であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９５である；
ＣＤＲ１は配列番号７６であり、ＣＤＲ２は配列番号１３６であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９６である；
ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１３７であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９７である；
ＣＤＲ１は配列番号７８であり、ＣＤＲ２は配列番号１３８であり、かつＣＤＲ３は配列番号１９８である；
ＣＤＲ１は配列番号８０であり、ＣＤＲ２は配列番号１４０であり、かつＣＤＲ３は配列番号２００である；
ＣＤＲ１は配列番号８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１４１であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０１である；
ＣＤＲ１は配列番号８２であり、ＣＤＲ２は配列番号１４２であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０２である；
ＣＤＲ１は配列番号８３であり、ＣＤＲ２は配列番号１４３であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０３である；
ＣＤＲ１は配列番号８４であり、ＣＤＲ２は配列番号１４４であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０４である；
ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１４５であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０５である；
ＣＤＲ１は配列番号８６であり、ＣＤＲ２は配列番号１４６であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０６である；
ＣＤＲ１は配列番号８７であり、ＣＤＲ２は配列番号１４７であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０７である；
ＣＤＲ１は配列番号８８であり、ＣＤＲ２は配列番号１４８であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０８である；または
ＣＤＲ１は配列番号８９であり、ＣＤＲ２は配列番号１４９であり、かつＣＤＲ３は配列番号２０９である；
前記免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項２】
フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号３７〜４２、４４〜４８および５０〜５９（ＦＲ１）、配列番号９７〜１０２、１０４〜１０８および１１０〜１１９（ＦＲ２）、配列番号１５７〜１６２、１６４〜１６８および１７０〜１７９（ＦＲ３）、配列番号２１７〜２２２、２２４〜２２８および２３０〜２３９（ＦＲ４）のＦＲと９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項３】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号７〜１２、１４〜１８および２０〜２９からなる群から選択されたアミノ酸配列または配列番号７〜１２、１４〜１８および２０〜２９と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを備える、請求項１または２のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項４】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号７、８、９または１０から選択されたナノボディである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項５】
免疫グロブリン単一可変ドメインが検出可能な標識と融合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項６】
検出可能な標識が放射性核種である、請求項５に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項７】
免疫グロブリン単一可変ドメインが機能的部分と融合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項８】
機能的部分が治療活性剤である、請求項７に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを備えるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチド、および任意に医薬上許容し得る担体、アジュバントまたは希釈剤の少なくとも１つを備える、医薬組成物。
【請求項１２】
非侵襲的in vivo医療用イメージングにおいてコントラスト剤として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
癌の診断、予後診断および／または処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
癌治療のモニタリングに使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
免疫グロブリン単一可変ドメインが腫瘍の内部のＭＭＲ陽性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を特異的に標的とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチドを製造する方法であって、以下の工程を備える方法：
好適な宿主細胞または好適な発現システムにおいて、請求項１０に記載の核酸を発現すること；および任意に
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項９に記載のポリペプチドを単離するおよび／または精製すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）に対する免疫グロブリン単一可変ドメインと腫瘍学の分野におけるそれらの使用に関する。より具体的には、癌診断学・治療学の分野および疾患のモニタリングでの用途で、ヒトＭＭＲに対する、ナノボディを含む、免疫グロブリンの単一可変ドメインと腫瘍関連マクロファージのターゲティングおよびin vivoイメージングにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
非侵襲的分子イメージングは、無傷の生きた対象における自然な環境において細胞および分子事象を追跡することを目的とした有力な技術である。最も広義には、分子イメージングは、可視化用のコントラスト試薬で標識したトレーサー分子の投与を必要とする。主に放射性標識したトレーサーを、電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に基づくイメージング技術（Pysz et al. 2010, Clin Radiol 65: 500-16）と併用する。臨床では、癌イメージングの大部分は、現在も１８Ｆで放射標識したデオキシグルコースを使用した癌細胞における代謝の増加の検出に基づいて行われており（Coenen et al. 2010, Nucl Med Biol 37: 727-40）、一方９９ｍＴｃで標識したヒト血清アルブミンが、癌における流入領域リンパ節のリンパシンチグラフィーのマッピングのために使用されている（Kim et al. 2001, Int J Oncol 19: 991-6）。これらのトレーサーは有用であるが、疾患プロセスに関与する細胞の表面の特異的な分子または受容体を標的としていない。従って、疾患関連膜抗原を使用して、炎症または罹患組織のより特異的な分子キャラクタリゼーションを可能とするプローブが必要とされている。これらの特異的なマーカーは、疾患の表現型を定義するのに役立ち、モノクロナール抗体（ＭＡｂ）などの特異的な薬剤の標的となることが可能である。これと関連して、標的となる分子マーカーの選択が、基礎疾患プロセスに関する詳細な分子情報を得ることを可能とするかどうかを決定する重要な因子となろう。
【０００３】
悪性細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＦＤＡ認可Ｍａｂの数種が、癌の診断および処置に応用されており、最も一般的に使用されているＭａｂとして、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）特異的トラスツズマブ（Dijkers et al. 2010, Clin Pharmacol Ther 87: 586-92）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的アルシツモマブ（Hong et al. 2008, Biomark Insights, 3: 435-451）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）特異的カプロマブ（Aparici et al. 2012, Am J Nucl Med Mol Imaging, 2: 48-54）が挙げられる。悪性細胞上のＴＡＡを抗体部分の直接の標的とすることは臨床的に成熟した有力な手段ではあるが、腫瘍微小環境内に存在する非形質転換細胞も、本来遺伝的に不安定な形質転換細胞上のマーカーの代替または補足として、分子イメージング用の有益なバイオマーカーとなる可能性がある。実際、腫瘍は、形質転換（癌）細胞と非形質転換（間質）細胞の間の複雑な双方向相互関係を特徴とする臓器様構造とみなすべきであり、間質細胞は、腫瘍の開始、増殖および転移に多大に貢献する。従って、イメージング用にこれらの腫瘍関連間質細胞を標的とすることは、腫瘍の状態または治療への反応の更なる情報を提供できるであろう。
【０００４】
特に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、マウスモデルおよびヒト患者の両者において腫瘍間質の重要な成分である（Pollard 2004, Nat Rev Cancer 4: 71-8）。ＴＡＭは、血管新生、免疫抑制および浸潤および転移に影響を与えることで腫瘍の成長を促進することが可能である（Lin et al. 2006, Cancer Res 66: 11238-46）。マクロファージの適応性は、それらが暴露される腫瘍微小環境のin vivoセンサーとしての使用の可能性を示唆するものである。実際、腫瘍部位で、これらの細胞は異なる腫瘍微小環境に直面し、特化した機能および特徴的な分子特性を有する異なるＴＡＭサブセットを形成する（Laoui et al. 2011, Int. J. Dev. Biol., 55: 861-867）。例えば多くの乳房腫瘍では、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲまたはＭＨＣＩＩ）などのマーカーの発現差異や、血管新生促進性または免疫抑制性および腫瘍内の局在化（正常酸素／血管周囲腫瘍部位対低酸素領域）の相違に基づき少なくとも２つの特徴的なＴＡＭ亜集団が記載されている。特に、高ＭＭＲ発現ＴＡＭと腫瘍中の低酸素領域との関連（Movahedi et al. 2010, Cancer Res, 70: 5728-5739）は、画像誘導放射線治療への可能性を示唆するものである。
【０００５】
フルサイズのＭａｂは多数の欠点があり、今のところそれらの臨床における効果的な使用を制限している。Ｍａｂは、腫瘍などの中実の孤立した組織中への侵入が比較的困難な巨大分子である（Hughes et al. 2000, J. Clin. Oncol., 18: 363-370）。更に、非標的細胞上のＦｃ受容体に結合するため、完全なＭａｂは、身体における滞留時間が長く、バックグラウンド信号を増加させる可能性があるため、分子イメージング用途に好適とはいえない。実際、イメージング用としてのトレーサーの最も重要な特性は、標的との迅速な相互作用、非結合分子を身体から急速に除去すること、特に興味の対象となる部位のまわりでの非特異的蓄積が少ないことである。これらの要件を満たすために、薬物動態学で好ましい小さいサイズと特異性を組合わせる試みで、ｓｃＦｖ中のＦａｂなどの多数の抗体由来プローブ型が開発された（Kaur et al. 2012, Cancer Lett., 315: 97-111）。
【０００６】
サイズが小さく高親和性である抗原結合部分を作成するための新規のアプローチとしては、ラクダ科の動物で見つかった重鎖のみからなる抗体由来であり、ナノボディと命名された、単一ドメインＶＨＨ抗体断片の使用に焦点が当てられている（Hamers-Casterman et al. 2003, Nature 363: 446-448）。カルボキシ末端のヘキサヒスチジン端部を９９ｍＴｃで好適に標識したナノボディは、接種後数時間という速さで、非結合プローブの血中からの迅速な除去およびノイズに対する高シグナル比を示し、前臨床動物モデルにおけるＳＰＥＣＴに基づく分子イメージングにおいて確実な成果を示している（概説：Vaneycken et al. 2011, Curr Opin Biotechnol 22: 877-881）。特に、米国特許第２０１１０２６２３４８号では、自発的に癌腫を発症するマウスモデルにおけるＭＭＲ陽性ＴＡＭの標的のために９９ｍＴｃ標識マウス特異的抗ＭＭＲナノボディの有用性が示されている。これらの結果は、放射線の分布が低酸素などの局所的なリスク因子の関数となることで、画像誘導放射線治療における抗ＭＭＲナノボディの適用への可能性を示唆している（Bentzen 2005, Lancet Oncol, 6: 112-117）。更に、ＨＥＲ２腫瘍抗原を標的とするナノボディに関して既に記載されているように、腫瘍を効果的に標的とするナノボディは、治療性放射性核種を結合することにより、イメージングプローブから放射免疫療法用化合物へ変換可能である（D’Huyvetter et al. 2012, Contrast Media Mol. Imaging, 7: 254-264）。
【０００７】
しかしながら、診断、予後診断、処置および治療モニタリングの改良などの用途で、臨床および前臨床動物モデルの両者において使用可能な特異的なプローブが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明者等は、ヒト乳癌サンプルで例証されたように、ＭＭＲ陽性ＴＡＭがヒトのサンプルにおける腫瘍内低酸素ゾーンで検出可能であり、腫瘍間質でＭＭＲ陽性ＴＡＭ亜集団を標的とすることの臨床的重要性を示していることを見出した。従って、ヒトＭＭＲを特異的に認識する免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディを作成した。これらのナノボディのいくつかは、マウスＭＭＲと交差反応性があることが見出され、これは、同一の免疫グロブリン単一可変ドメインを前臨床疾患モデルと臨床設定の両方でテストすることを可能とし、診断的および／または治療的開発にとって有利である。
【０００９】
従って、本発明は、ヒトマクロファージマンノース受容体に対する、ナノボディなどの免疫グロブリン単一可変ドメイン、および腫瘍間質におけるＭＭＲ陽性ＴＡＭ亜集団の選択的in vivoターゲティングおよびイメージングでのそれらの使用を提供する。マウスモデルで例証されるように、前臨床動物モデルにおいてこれらの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを使用して、ＭＭＲ陽性ＴＡＭをin vivoで効率的に標的とすることが可能であることの証拠が示される。
【００１０】
従って、本発明の第１の側面は、ヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１）に対する、および／または特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインであって、免疫グロブリン単一可変ドメインが、以下の式（１）に示す４個のフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備えるアミノ酸配列を備える免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
式中、ＣＤＲ１は：
配列番号６７〜９６、
配列番号６７〜９６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号６７〜９６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される
ＣＤＲ２は：
配列番号１２７〜１５６、
配列番号１２７〜１５６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号１２７〜１５６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される
ＣＤＲ３は：
配列番号１８７〜２１６、
配列番号１８７〜２１６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号１８７〜２１６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００１１】
ある実施態様では、フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号３７〜６６（ＦＲ１）、配列番号９７〜１２６（ＦＲ２）、配列番号１５７〜１８６（ＦＲ３）、配列番号２１７〜２４６（ＦＲ４）のＦＲと８０％を超えるアミノ酸配列同一性を有する、上記免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。
【００１２】
より具体的には、本発明は、配列番号７〜３６または配列番号７〜３６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されたアミノ酸配列を備える免疫グロブリン単一可変ドメインを実現するものである。好ましい実施態様によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは配列番号７，８，９または１０から選択されたナノボディである。
【００１３】
上記免疫グロブリン単一可変ドメインが、放射性核種などの検出可能な標識に融合していることが特に実現される。上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、機能的部分、好ましくは治療活性剤と融合していてもよい。
【００１４】
上記免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれか１つ以上を備えるポリペプチド、ならびに上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドをコードする核酸も含まれる。
【００１５】
また、他の側面によると、本発明は上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたは上記ポリペプチド、および任意に医薬上許容し得る担体、アジュバントまたは希釈剤の少なくとも１つを備える医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の更なる側面は、非侵襲的in vivo医療用イメージングにおいてコントラスト剤として使用するため；癌の診断、予後診断および／または処置に使用するため；癌治療の有効性のモニタリングに使用するための、上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたは上記ポリペプチドに関する。免疫グロブリン単一可変ドメインおよび上述した使用は、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインが腫瘍内でＭＭＲ陽性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を特異的に標的とする特性に基づいている。
【００１７】
さらに、上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたは上記ポリペプチドを製造する方法を実現するものであり、該方法は以下の工程を備える：
−  好適な宿主細胞または好適な発現システムにおいて、上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドをコードする核酸配列を発現すること；および任意に
−  免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを単離するおよび／またはを精製すること。
本発明の目的は、以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒトＭＭＲのＰＥ−ＥＬＩＳＡ：選択された抗ヒトＭＭＲＮｂクローンの概要。ＯＤ４０５ｎｍが、無関係ミルクブロッキングタンパク質と比較して、特定の抗原に対して少なくとも３倍高かった場合、クローンとして選択した。
【００１９】
【図２】ヒトＭＭＲのＰＥ−ＥＬＩＳＡ：選択された抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂクローンの概要。ＯＤ４０５ｎｍが、無関係ミルクブロッキングタンパク質と比較して、特定の抗原に対して少なくとも３倍高かった場合、クローンとして選択した。
【００２０】
【図３】マウスＭＭＲのＰＥ−ＥＬＩＳＡ：選択された抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂクローンの概要。ＯＤ４０５ｎｍが、無関係ミルクブロッキングタンパク質と比較して、特定の抗原に対して少なくとも２倍高かった場合、クローンとして選択した。
【００２１】
【図４】多数の選択されたＮｂクローンの精製：Ａ．ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８ペリプラズム抽出物のＩＭＡＣ精製後のタンパク質画分を添加したクーマシー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１、カラム通過画分、レーン２、洗浄画分、レーン３および４、溶出画分、Ｍは分子量ラダーを示す。Ｂ．ＰＢＳ中でＳ７５ゲルろ過カラムを通過させたＩＭＡＣ精製Ｎｂ５．３８サンプルのクロマトグラム。実線はＯＤ２８０ｎｍを示し、点線は伝導率を示し、破線はｐＨを示す。画分３０の前後の主要Ｎｂピークにおける画分だけを更なる実験のために収集した。Ｃ．ゲルろ過後のタンパク質画分を添加したクーマシー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１（レーン１）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４（レーン２）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８（レーン３）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０（レーン４）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９（レーン５）。Ｍは分子量ラダーを示す。すべてのＮｂは、＞９５％純度であり、１３〜１５ｋＤａのサイズを有することが確認された。
【００２２】
【図５】組換えヒトおよびマウスＭＭＲに結合しているＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９の表面プラズモン共鳴センソグラム。ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９を、３５００ＲＵの組換えヒト（Ａ）またはマウス（Ｂ）ＭＭＲでコートしたＣＭ５センサーチップ上に３０μｌ／ｍｉｎで多様な濃度で注入した。ソノグラムは、８００ｓの間の会合および解離段階を示す。
【００２３】
【図６】ＭＭＲ特異的Ｎｂは、ex vivo単離マクロファージに発現したマウスＭＭＲに結合する。３ｘ１０６個の癌細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射することで、３ＬＬ−Ｒ腫瘍を誘発した。腫瘍成長の１５日後に、腫瘍を単離し、単一細胞懸濁液を調製して、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を、ＭＨＣＩＩ発現に関して更にゲートした。ヒストグラムは、ＭＨＣＩＩｌｏｗおよびＭＨＣＩＩｈｉｇｈＴＡＭに結合するＮｂにより規定されるＭＭＲ発現を示す。陰影を付けたヒストグラムは、ネガティブコントロールのＮｂＢＣＩＩ１０の結合を示す。抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）をポジティブコントロールとして使用した。
【００２４】
【図７】ＭＭＲ特異的Ｎｂは、誘導樹状細胞に発現したヒトＭＭＲに結合する。抗ｈＭＭＲＮｂは、ヒトｉＤＣ単一細胞懸濁液中のＣＤ１１ｃ＋サブセットに結合する。陰影を付けたヒストグラムは、ネガティブコントロールＮｂＢＣＩＩ１０の結合を示す。予期されるとおり、抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）は、ヒトＭＭＲに結合しない。
【００２５】
【図８】ＭＭＲノックアウトＣ５７／ｂｌ６マウスに対するＷＴでのＭＭＲＮｂの組織分布。抗ＭＭＲＮｂを９９ｍＴｃで標識し、Ｃ５７／ｂｌ６マウスの尾静脈に注射した（ｎ＝３）。３時間後、マウスを解剖し、主要な臓器における放射活性を測定した。ネガティブコントロールであるＮｂｃＡｂＢｃＩＩ１０の取り込み値を、一般的な非特異的Ｎｂ分布の測定値とした。抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）をポジティブコントロールとして使用した。
【００２６】
【図９】担３ＬＬ腫瘍Ｃ５７／ｂｌ６マウスにおけるＭＭＲＮｂの組織分布。３ＬＬ−Ｒ腫瘍は、３ｘ１０６個の癌細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射することにより誘発した。抗ＭＭＲＮｂを９９ｍＴｃで標識し、マウスの尾静脈に注射した（ｎ＝３）。３時間後、マウスを解剖し、主要な臓器における放射活性を測定した。ネガティブコントロールであるＮｂｃＡｂＢｃＩＩ１０の取り込み値を、一般的な非特異的Ｎｂ分布の測定値とした。抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）をポジティブコントロールとして使用した。
【００２７】
【図１０】担３ＬＬ腫瘍Ｃ５７／ｂｌ６マウスにおけるＭＭＲＮｂの腫瘍ターゲティング。３ＬＬ−Ｒ腫瘍は、３ｘ１０６個の癌細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射することにより誘発した。抗ＭＭＲＮｂを９９ｍＴｃで標識し、マウスの尾静脈に注射した（ｎ＝３）。３時間後、マウスを解剖し、解剖した腫瘍における放射活性を測定した。ネガティブコントロールであるＮｂｃＡｂＢｃＩＩ１０の取り込み値を、一般的な非特異的Ｎｂ分布の測定値とした。抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）をポジティブコントロールとして使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明を具体的な実施態様に関しておよび特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものと解釈すべきではない。記載の図面は単に模式的なものであり、限定するものではない。図面において、要素のいくつかのサイズは誇張されている可能性があり、図示の目的であって実際の比率で描かれていない。本明細書および請求の範囲で「備える」という用語が使用される場合、他の要素または工程を除外するものではない。「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの不定冠詞または定冠詞が単数名詞を言及するときに使用される場合、特に明記されない限りその名詞の複数を含むものである。また、本明細書および請求の範囲において第１、第２、第３などの用語は、同様の要素を区別するために使用されるものであり、必ずしも逐次的または時間的順序を記述しているものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であって、本明細書に記載する本発明の実施態様は、本明細書で記載または図示された以外の順番で実施可能であることを理解されたい。
【００２９】
本明細書で他に定義されない限り、本発明との関連で使用される科学的および技術的用語および語句は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載の、分子および細胞生物学、構造生物学、生物物理学、薬理学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法および技術は、本技術分野で周知の一般に使用されているものである。本発明の方法および技術は一般に、他に指示しない限り、本技術分野で周知であり、本発明の明細書を通して言及および記載される様々な一般的およびより専門的な文献に記載されている従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Rup, Biomolecular crystallography: principles, Practice and Applications to Structural Biology, 1st edition, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, an informa Business, N.Y. (2009); Limbird, Cell Surface Receptors, 3d ed., Springer (2004)を参照すること。
【００３０】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」という用語は本明細書では互換可能に使用されており、任意の長さのアミノ酸の高分子型を意味し、それらはコード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的修飾または誘導アミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
【００３１】
本明細書で使用される「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」という用語は互換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドの高分子型を意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似物が含まれる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を行うものである。限定するものではないが、ポリヌクレオチドの例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離した任意の配列のＤＮＡ、コントロール領域、単離した任意の配列のＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。核酸分子は直線状でも環状でもよい。
【００３２】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、比較の範囲で、配列が個々のヌクレオチド毎にまたは個々のアミノ酸毎に同一である程度を意味する。従って、「配列同一性率」の計算は、比較の範囲で２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両配列で起こる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較の範囲（すなわち、ウインドウサイズ）の全位置数で除算し、得られた結果に１００を掛けて配列同一性率を得ることにより行う。配列同一性率の決定は、手作業でまたは当該分野で入手可能なコンピュータープログラムを利用して行うことが可能である。有用なアルゴリズムの例としては、ＰＩＬＥＵＰ（Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989), BLAST and BLAST 2.0 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公開されている。
【００３３】
本明細書における「欠損」は、親ポリペプチドまたは核酸のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基が不在であるアミノ酸またはヌクレオチド配列のどちらかにおける変化として定義される。タンパク質の場合、欠損には、約２、約５、約１０、約２０程度、約３０程度または約５０程度以上のアミノ酸の欠損が含まれる。タンパク質またはその断片は、１つより多い欠損を含むことができる。
【００３４】
「挿入」または「追加」は、親タンパク質のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基の追加をもたらすアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。「挿入」は一般的にポリペプチドのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基の追加を意味し、一方「追加」は挿入であるか、あるいはＮまたはＣ末端または両末端に追加したアミノ酸残基を意味する。タンパク質またはその断片では、挿入または追加は通常約１、約３、約５、約１０、約２０程度、約３０程度または約５０程度以上のアミノ酸に関する。タンパク質またはその断片は、１つより多い挿入を含むことができる。
【００３５】
本明細書で使用される「置換」は、親タンパク質またはその断片のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれ１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを異なるアミノ酸またはヌクレオチド置き換えることによりもたらされる。タンパク質またはその断片は、タンパク質の活性に実質的に影響を与えない保存的アミノ酸置換を有するであろうことが理解される。保存的置換は、ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ，ｍｅｔ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；ｃｙｓ，ｍｅｔ；およびｐｈｅ，ｔｙｒ，ｔｒｐなどの特定の組合わせである。
【００３６】
本発明の第１の側面は、ヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１）に対するおよび／またはそれと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
【００３７】
本明細書で使用される「マクロファージマンノース受容体」（ＭＭＲ）という用語は当該技術分野では公知であり、最初に哺乳類組織マクロファージにおいて、後に樹状細胞および多様な内皮および上皮細胞において特定されたＩ型膜貫通タンパク質を意味する。マクロファージは、自然および獲得免疫反応において中心的な役割を果たす。それらはほとんどの臓器に存在して、感染病原体を内部に取り込み、通常は殺傷することでその侵入を阻止する。マクロファージ上の表面受容体の中で、マンノース受容体は微生物に一般的である多様な分子パターンを認識する。ＭＭＲは、Ｎ−およびＯ−グリコシル化された単一のサブユニットから構成され、５個のドメインからなる：末端硫酸化糖残基を認識するＮ末端システインリッチな領域；機能不明のフィブロネクチンＩＩ型ドメイン；完全なＭＲに匹敵する配位子への親和性を示すＣＲＤ４〜８を有する内因性糖タンパク質または病原体の外皮上のマンノース、フコースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基のＣａ２＋依存型認識に関与する一連の８個のＣ型レクチン様糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）；単一の膜貫通ドメイン；およびＭＲ媒介エンドサイトーシスおよびエンドソームにおけるソーティングに重要なモチーフを含む４５残基長細胞質側末端（Chieppa et al. 2003, J Immunol 171:4552-60）。特に、ヒトマクロファージマンノース受容体は、Ｍｒｃ１またはＣＤ２０６として公知である（受入番号ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００２４３８．２；受入番号タンパク質配列：ＮＰ＿００２４２９．１および配列番号１に示す）。
【００３８】
本発明は、最も広義には、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗体となる、ヒトＭＭＲ（配列番号１）の特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは立体構造特に制限されたりそれによって規定されるものではない。本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書に記載されるＭＭＲの天然または合成類似物、変異体、突然変異体、対立遺伝子のすべてと結合するであろうことが期待される。
【００３９】
本発明で言及されるヒトマクロファージマンノース受容体には、全長のヒトＭＭＲタンパク質の断片が含まれる。限定するものではないが、全長のヒトＭＭＲタンパク質の断片の例としては、特定のＭＭＲの外部ドメインが挙げられる。本明細書で使用される「外部ドメイン」とは、システインリッチであるＮ末端を含有し、その後にフィブロネクチンＩＩ型ドメインおよび８個の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）が続くＭＭＲの断片を意味する。８個のＣＲＤのすべては特によく保存されており、中でもＣＲＤ４が特記される。ヒトマクロファージマンノース受容体の外部ドメインは、ＮＰ＿００２４２９．１（配列番号１）により定義する、表７にも示す対応する全長マウスＭＭＲアミノ酸配列のＡＡ１９〜ＡＡ１３８３断片（配列番号５）として定義される。従って、好ましい実施態様によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒトマクロファージマンノース受容体の外部ドメイン（配列番号５）に特異的に結合する。
【００４０】
本明細書で使用される、「特異的に認識する」または「特異的に結合する」または単に「特異的な」という用語は、免疫グロブリン単一可変ドメインが、異なる抗原の均質な混合物に存在するある特定の抗原に優先的に結合する能力を意味し、必ずしも高親和性（本明細書で更に定義される）を含意するものではない。ある実施態様では、特異的な結合相互作用は、サンプル中の望ましい抗原と望ましくない抗原を、ある実施態様では約１０倍〜１００倍以上（例えば、約１０００倍または１０，０００倍）で区別するであろう。「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「優先的に結合する」という用語およびそれらの文法上の等価物は、本明細書では互換可能に使用される。
【００４１】
本明細書で使用される「親和性」という用語は、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合して、抗原および免疫グロブリン単一可変ドメインの平衡をそれらの結合で生成する複合体の存在の方へ移行させる程度を意味する。従って、例えば、抗原および抗体（断片）が比較的等しい濃度で結合している場合、高親和性の抗体（断片）は利用可能な抗原に結合して平衡を得られる複合体の濃度が高くなる方へ移行させるであろう。一般に、抗体（断片）および抗原標的間の親和性を記載するために解離定数が使用される。典型的には、解離定数は１０−５Ｍ未満である。好ましくは、解離定数は１０−６Ｍ未満であり、より好ましくは１０−７Ｍ未満である。最も好ましくは、解離定数は１０−８Ｍ未満である。
【００４２】
特定の抗原または抗原決定基（例えばエピトープ）に特異的に結合可能であり、および／またはそれへの親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインは、該抗原または抗原決定基に「対する」または「抗体となる」と表現する。本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの異なる抗原または抗原決定基（ヒトＭＭＲおよびマウスＭＭＲなどの２つの異なる種の哺乳動物からのマクロファージマンノース受容体など）の両方に特異的であるならば、これら異なる抗原または抗原決定基に「交差反応性」があると表現する。
【００４３】
本発明によれば、１つの種からのヒトマクロファージマンノース受容体に対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の種からのマクロファージマンノース受容体と交差反応性を示すことも示さないこともありえると理解されるであろう。例えば、ヒトＭＭＲ、特にヒトＭＭＲ（配列番号１）に対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、疾患の動物モデルに頻繁に使用される１つ以上の他の種の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ）からのＭＭＲと交差反応性を示すことも示さないこともありえる。そのような交差反応性があると、そのような疾患モデルにおいて免疫グロブリン単一可変ドメインのテストを可能とするので、診断的および／または治療的開発に有利であり得ることは当業者には明らかであろう。
【００４４】
限定するものではないが、非ヒトＭＭＲの例としては、マウスＭＭＲ（異名：ＭＲＣ１またはＣＤ２０６；受入番号ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００８６２５．２；受入番号タンパク質配列：ＮＰ＿０３２６５１．２、配列番号３）が挙げられる。また、限定するものではないが、非ヒトＭＭＲの断片の例としては、ＮＰ＿０３２６５１．２（配列番号３）で規定される対応する全長マウスＭＭＲアミノ酸配列のＡＡ１９〜ＡＡ１３８８断片（配列番号６）で規定されるマウスマクロファージマンノース受容体の外部ドメインが挙げられる。ＢＬＡＳＴｐによる配列比較で容易に測定できるように、マウスマンノース受容体の推定アミノ酸配列は、ヒトマンノース受容体と全体で８２％の相同性を有する（Altschul et al. 1990, J Mol Biol 215: 403-10）。
【００４５】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン（典型的には２個の免疫グロブリン可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成している従来の免疫グロブリンまたはそれらの断片とは異なる）の上に存在して形成されている分子を定義する。しかしながら、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインから形成される、従来の免疫グロブリンの断片を含むことは明らかであろう。
【００４６】
一般に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、４個のフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）および３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）、好ましくは以下の式（１）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）による、またはその任意の好適な断片（通常、少なくとも１個の相補性決定領域を形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含有するであろう）を備えるアミノ酸配列を有するであろう。
【００４７】
４個のＦＲおよび３個のＣＤＲを備える免疫グロブリン単一可変ドメインは当業者には公知であり、限定するものではないが、例えば（Wesolowski et al. 2009, Med Microbiol Immunol 198: 157-174）に記載されている。
【００４８】
免疫グロブリン単一可変ドメインの典型的な例としては、単一の抗原結合ユニットの形成が可能である限り限定するものではないが、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬドメイン配列）またはその好適な断片、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨドメイン配列またはＶＨＨドメイン配列）またはその好適な断片が挙げられる。従って、好ましい実施態様によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬドメイン配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨドメイン配列）；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列または重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、または単一ドメイン抗体すなわち「ｄＡＢ」またはｄＡｂ、またはナノボディ（本明細書で定義される）、または他の免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれらの任意の１つの任意の好適な断片であってもよい。単一ドメイン抗体の一般的な説明は、以下の書籍：「単一ドメイン抗体（Single domain antibodies）」、Molecular Biology, Eds. Saerens and Muyldermans, 2012, Vol 911の方法が参照される。
【００４９】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、一般に、４個の「フレームワーク配列」すなわちＦＲおよび３個の「相補性決定領域」すなわちＣＤＲ（上記で定義）を備えると考えられる単一のアミノ酸鎖を備える。免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域も、それらの抗原への結合へ貢献可能であることが明らかである（Desmyter et al 2002, J Biol Chem 277: 23645-50; Korotkov et al. 2009, Structure 17: 255-65）。ＣＤＲ配列（従ってＦＲ配列においても）の記述は、Ｖ−ドメインおよびＶ様ドメインに対するＩＭＧＴ固有番号に基づいて行うことが可能である（Lefranc et al. 2003, Develop Comparat Immunol 27: 55-77）。あるいは、ＦＲおよびＣＤＲ配列の記述は、Riechmann and Muyldermans 2000, J Immunol Methods 240: 185-195の文献でラクダ科のＶＨＨドメインに適用されたように、Ｋａｂａｔ番号を使用して行うことも可能である。
【００５０】
結合ドメイン部分としての免疫グロブリン単一可変ドメインは、最も広義には、特定の生物源や特定の調製方法に限定されないということに留意すべきである。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、サメ、ラクダ科の可変ドメインなどの異なる起源の可変ドメインを含むものである。具体的な実施態様によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、サメ抗体（いわゆる免疫グロブリン新規抗原受容体すなわちＩｇＮＡＲ）由来であり、より具体的には軽鎖のない天然の重鎖サメ抗体由来であり、ＶＮＡＲドメイン配列として知られている。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ラクダ科抗体由来である。より好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖のない天然の重鎖ラクダ科抗体由来であり、ＶＨＨドメイン配列またはナノボディとして知られている。
【００５１】
本明細書で使用される「ナノボディ」（Ｎｂ）という用語は、単一ドメイン抗原結合断片である。特に、天然の重鎖抗体由来単一可変ドメインを意味し、当業者には公知である。ナノボディは、通常ラクダ科にみられる（軽鎖のない）重鎖だけの抗体由来であり（Hamers-Casterman et al. 1993, Nature 363: 446-448; Desmyter et al. 1996, Nat Struct Biol 803-811）、従ってしばしばＶＨＨ抗体またはＶＨＨ配列と呼ばれる。ラクダ科には、旧世界ラクダ科（Camelus bactrianus, Camelus dromedarius）および新世界ラクダ科（例えば、Lama paccos, Lama glama, Lama guanicoe, Lama vicugna）が含まれる。Nanobody（登録商標）およびNanobodies（登録商標）はAblynx NV（ベルギー）の登録商標である。ＶＨＨまたはナノボディの更なる説明は、書籍「単一ドメイン抗体（Single domain antibodies）」、Molecular Biology, Eds. Saerens and Muyldermans, 2012, Vol 911，特にVincke and Muyldermans (2012)の章の方法、更に、限定するものではないが、一般的な技術背景として言及される特許公報のリスト、例えばVrije Universiteit BrusselのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、ＷＯ９６／３４１０３；Unilever社のＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Ablynx N .V.によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５、およびAblynx N .V.による他の特許申請公報が参照可能である。
【００５２】
Ｎｂの小さなサイズと独特の生物物理特性が、稀であったり隠れたエピトープの認識およびタンパク質標的の間隙や活性部位との結合において、従来の抗体断片よりも優れたものとしてている。更に、Ｎｂは、多重特異性および多価抗体（本明細書で更に定義される）として設計することあるいはレポーター分子に付加することが可能である（Conrath et al. 2011, Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-2812）。Ｎｂは安定しており、胃腸管系において生存し、容易に製造可能である。従って、Ｎｂは、創薬および治療など多くの用途で使用可能であるが、精製、機能研究およびタンパク質の結晶化のための多目的で価値の高いツールとしても使用可能である（Saerens et al. 2008, Curr Opin Pharmacol 8: 600-608）。
【００５３】
本発明のナノボディは、一般に、式（１）（上記に定義した）による４個の「フレームワーク領域」すなわちＦＲおよび３個の「相補性決定領域」すなわちＣＤＲを備えるとされる単一アミノ酸鎖を備える。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、ナノボディにおける可変領域を意味し、抗原標的に特異的に結合可能なアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域が、特定の抗原決定基構造に対するナノボディの塩基特異性を示す。そのような領域は「超可変領域」とも呼ばれる。ナノボディは３個のＣＤＲ領域を有し、それぞれ他のものに対して隣接していない（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と名付ける）。ＦＲおよびＣＤＲ配列の記述は、しばしばＶドメインおよびＶ様ドメインのＩＭＧＴ固有番号に基づいている（Lefranc et al. 2003, Develop Comparat Immunol 27: 55-77）。あるいは、ＦＲおよびＣＤＲ配列の記載は、Riechmann and Muyldermans 2000, J Immunol Methods 240: 185-195の文献でラクダ科のＶＨＨドメインに適用されるようにＫａｂａｔ番号を使用して行うことが可能である。当業者に周知であろうように、ナノボディは、例えばＷＯ０８／０２００７９、７５ページ、表Ａ−３（参照により本明細書に取り込まれる）に記載されるように、特に１つ以上のフレームワーク配列（Ｋａｂａｔ番号による）に１つ以上のラクダ科の特徴的な残基が存在することで特徴付けることが可能である。
【００５４】
ある実施態様では、本発明は、ヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１）に対する、および／または特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインであって、免疫グロブリン単一可変ドメインが、以下の式（１）に示す４個のフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備えるアミノ酸配列を備える免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
式中、ＣＤＲ１は：
配列番号６７〜９６、
配列番号６７〜９６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号６７〜９６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される
ＣＤＲ２は：
配列番号１２７〜１５６、
配列番号１２７〜１５６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号１２７〜１５６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される
ＣＤＲ３は：
配列番号１８７〜２１６、
配列番号１８７〜２１６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
配列番号１８７〜２１６と１，２または３個のアミノ酸の差異を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００５５】
より具体的には、本明細書の上記免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）は、配列番号３７〜６６（ＦＲ１）、配列番号９７〜１２６（ＦＲ２）、配列番号１５７〜１８６（ＦＲ３）、配列番号２１７〜２４６（ＦＲ４）のＦＲと８０％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。
【００５６】
限定するものではないが、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインの例としては、本明細書に記載するように、抗ヒトおよび交差反応性抗ヒト／抗マウスＭＭＲナノボディ、例えば表１における特に配列番号８，１０〜２９；表２における特に配列番号７，９，２０〜３６が挙げられる。具体的な実施態様では、本発明のナノボディは、本明細書に記載のような相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ備え、例えば配列番号６７〜９６、１２７〜１５６、１８７〜２１６（表６参照）から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲが挙げられる。好ましくは、本発明のナノボディは、上記式（１）によるものであり、配列番号６７〜９６、１２７〜１５６、１８７〜２１６からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を備える。好ましくは、配列番号６７からなるＣＤＲ１、配列番号１２７からなるＣＤＲ２、配列番号１８７からなるＣＤＲ３または配列番号６７、配列番号１２７、配列番号１８７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを有する式（１）によるアミノ酸配列を備えるナノボディが提供される。より具体的には、ナノボディは配列番号７〜３６またはその機能的断片を含む群から選択することができる。本明細書で使用される「機能的断片」または「好適な断片」は、例えばＣＤＲループの１つを備えることができる。好ましくは、該機能的断片はＣＤＲ３を備える。より具体的には、該ナノボディは配列番号７〜３６のいずれか、好ましくは配列番号７，８，９，１０、最も好ましくは配列番号７からなる。
【００５７】
本明細書で使用されるナノボディという用語は、最も広義には、特定の生物源や特定の調製方法に限定されるものではないことに留意すべきである。例えば、本発明のナノボディは、一般に以下の方法によって得ることが可能である：（１）天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離すること；（２）天然のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現すること；（３）天然のＶＨＨドメインを「ヒト化」すること、またはそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸を発現すること；（４）任意の動物種、特にヒトなどの哺乳類種から天然のＶＨドメインを「ラクダ化」すること、またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現すること；（５）「ドメイン抗体」または当該分野で記載される「Ｄａｂ」を「ラクダ化」すること、またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現すること；（６）自体公知のタンパク質、ポリペプチドまたは他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技術を使用すること；（７）自体公知の核酸合成技術を使用してナノボディをコードする核酸を調製し、その後得られた核酸を発現すること；および／または（８）前記の１つ以上の任意の組合わせ。
【００５８】
ナノボディの好ましいクラスの１つは、マクロファージマンノース受容体、好ましくはヒトマクロファージマンノース受容体に対する天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。更に本明細書に記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は、一般に、任意の好適な自体公知の技術を使用して、ラクダ科の種を所望のＭＭＲで好適に免疫化すること（すなわち、所望のＭＭＲに対する免疫応答および／または重鎖抗体を高めるため）、該ラクダ科から好適な生物サンプルを得ること（血液サンプルまたはＢ細胞の任意のサンプルなど）、該サンプルからＭＭＲに対するＶＨＨ配列を作成することにより作成または得ることが可能である。そのような技術は、当業者には明白であろう。あるいは、そのようなＭＭＲに対する天然のＶＨＨドメインは、ラクダ科ＶＨＨ配列のナイーブライブラリーから、例えばそのようなライブラリーをＭＭＲまたはその少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基またはエピトープを使用して１つ以上の自体公知のスクリーニング技術によりスクリーニングすることにより得ることが可能である。そのようなライブラリーおよび技術は、例えばＷＯ９９３７６８１、ＷＯ０１９０１９０、ＷＯ０３０２５０２０およびＷＯ０３０３５６９４に記載される。
【００５９】
あるいは、例えばＷＯ００４３５０７に記載されるランダム突然変異誘発および／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によりナイーブＶＨＨライブラリーから得たＶＨＨライブラリーなどの、ナイーブＶＨＨライブラリー由来の改良した合成または半合成ライブラリーを使用してもよい。所望のＭＭＲに対するＶＨＨ配列を得るための更に他の技術は、任意の好適な自体公知の技術を使用して、重鎖抗体を発現可能な遺伝子導入哺乳動物を好適に免疫化すること（すなわちＭＭＲに対する免疫応答および／または重鎖抗体を高めるため）、該遺伝子導入哺乳動物から好適な生物サンプル（血液サンプルまたは任意のＢ細胞サンプルなど）を得ること、該サンプルからＭＭＲに対するＶＨＨ配列を作成することが含まれる。例えば、この目的のために、ＷＯ０２０８５９４５およびＷＯ０４０４９７９４記載の重鎖抗体を発現するマウスおよび更なる方法および技術を使用することが可能である。
【００６０】
従って、本発明には、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインを作成する方法が含まれる。限定するものではないが、例としては、ヒトマクロファージマンノース受容体（本明細書に記載）に対するまたはそれと特異的に結合するナノボディを作成する方法であって、
（ｉ）ＭＭＲ、特にヒトＭＭＲ（例えば配列番号１または２）またはその断片（例えば配列番号５）で、動物を免疫化する；および
（ｉｉ）ヒトＭＭＲに特異的に結合するナノボディに関してスクリーニングする
を備える方法が提供される。
【００６１】
ＭＭＲで動物を免疫化するために、ＭＭＲは、宿主細胞においてＭＭＲの組換え型を発現することおよび親和性クロマトグラフィーおよび／または抗体に基づく方法を使用してＭＭＲを精製することを含む従来の方法を使用して製造・精製できる。任意の好適な動物、例えば、温血動物、特にウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシ、サメまたはブタなどの哺乳動物やニワトリまたはシチメンチョウなどの鳥類を、免疫応答を作成するのに好適な従来公知の任意の技術を使用して免疫化できる。ＭＭＲに特異的に結合するナノボディに関するスクリーニングは、限定するものではないが、例えば、表面上に重鎖抗体を発現する細胞（例えば、好適に免疫化したラクダ科から得たＢ細胞）または表面でｇｅｎＩＩＩおよびナノボディの融合を示すバクテリオファージのセット、集合またはライブラリーをスクリーニングすること、ＶＨＨ配列またはナノボディ配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーをスクリーニングすること、またはＶＨＨ配列またはナノボディ配列をコードする核酸配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーをスクリーニングすることにより行うことができ、それらはすべて自体公知の方法で行うことができ、それらの方法は任意に更に、例えば限定されずに、親和性成熟化の工程、所望のアミノ酸配列を発現する工程、結合および／または所望の抗原（この場合、ＭＭＲ）に対する活性に関してスクリーニングする工程、所望のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定する工程、１つ以上のヒト化置換を導入する工程、好適な多価および／または多重特異的フォーマットでフォーマットする工程、所望の生物および／または生理的特徴（すなわち、従来公知の好適なアッセイを使用して）に関してスクリーニングする工程、および／または任意の好適な順序で上記の１つ以上の工程の任意の組合わせなどの１つ以上の他の好適な工程を備えてもよい。
【００６２】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの特に好ましいクラスは、天然のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、該天然のＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の４本鎖抗体からのＶＨドメインの対応する位置におこる１つ以上のアミノ酸残基で置換することにより「ヒト化」されたアミノ酸配列を有するナノボディを備える。これは、本明細書の更なる記述とヒト化に関する従来技術に基づいて、当業者には明らかであろう自体公知の方法で行うことが可能である。再び、本発明のそのようなヒト化ナノボディは、任意の好適な自体公知の方法で得ることが可能であり（すなわち、上記の（１）〜（８）項目に示すように）、従って出発物質として天然のＶＨＨドメインを備えるポリペプチドを使用して得たポリペプチドに厳密に限定されるものではないことに留意すべきである。対応する天然のＶＨＨドメインと比較して、ヒト化ナノボディは、免疫原性の低下などいくつかの利点がある。そのようなヒト化には、一般に、天然のＶＨＨの配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒトＶＨ３ドメインなどのヒトＶＨドメインの同一の位置にあるアミノ酸残基で置換することが含まれる。ヒト化置換は、得られるヒト化ナノボディが、本明細書で定義するナノボディの好ましい性質を依然保持するように選択すべきである。当業者は、一方でヒト化置換により提供される好ましい特性と他方で天然のＶＨＨドメインの好ましい特性との、所望のまたは好適なバランスを最適化または達成するヒト化置換またはヒト化置換の好適な組合わせを選択することが可能であろう。
【００６３】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの他の特に好ましいクラスは、天然のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、従来の４本鎖抗体からの天然のＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置にある１つ以上のアミノ酸残基で置換することにより「ラクダ化」されたアミノ酸配列を有するナノボディを備える。そのような「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ−ＶＬインターフェースを形成および／またはそこに存在するアミノ酸位置、および／または本明細書で定義する所謂ラクダ科の特徴的な残基に挿入される（例えばＷＯ９４０４６７８、ＷＯ０８／０２００７９参照）。好ましくは、ラクダ化ナノボディを作成または設計するための出発物質または出発点として使用するＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列であり、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかしながら、そのような本発明のラクダ化ナノボディは、任意の好適な自体公知の方法で得ることが可能であり（すなわち、上記の（１）〜（８）項目に示すように）、従って出発物質として天然のＶＨドメインを備えるポリペプチドを使用して得たポリペプチドに厳密に限定されるものではないことに留意すべきである。
【００６４】
例えば、「ヒト化」および「ラクダ化」の両者は、それぞれ天然のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供し、その後、新規ヌクレオチド配列がそれぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」ナノボディをコードするように自体公知の方法で該ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変更することにより行うことが可能である。その後、所望の本発明のナノボディを提供するように、この核酸を自体公知の方法で発現することが可能である。あるいは、それぞれ天然のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ナノボディのアミノ酸配列をそれぞれ自体公知のペプチド合成技術を使用して設計し、その後新規に合成することが可能である。また、それぞれ天然のＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ナノボディをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ自体公知の核酸合成技術を使用して設計し、その後新規に合成することが可能であり、その後得られた核酸を自体公知の方法で発現し、本発明の所望のナノボディを提供することが可能である。天然のＶＨ配列または好ましくはＶＨＨ配列から出発して、本発明のナノボディおよび／またはそれをコードする核酸を得るための他の好適な方法および技術は、当業者には明白であり、例えば本発明のナノボディまたはヌクレオチド配列またはそれらをコードする核酸を提供するように、好適な方法で１つ以上の天然のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列および／またはＣＤＲ配列などの）、１つ以上の天然のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列またはＣＤＲ配列などの）、および／または１つ以上の合成または半合成配列を組合わせることを備えることができる。
【００６５】
本明細書で定義する本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの天然または合成類似物、突然変異体、変異体、対立遺伝子、相同体および相同分子種（本明細書では、「変異体」と総称する）もまた、本発明の範囲内である。限定するものではないが、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびＣＤＲ配列の組み合わせのいくつかの特に好ましい例を表６に記載するが、それらは好ましいけれども限定するものではない多数の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン中に存在するＣＤＲ配列を示す。従って、本発明の１つの実施態様では、「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語には、最も広義には、変異体、特に配列番号７〜３６（表１、表２参照）のナノボディの変異体が含まれる。一般に、そのような変異体において、本明細書で定義する本発明のナノボディと比較して１つ以上のアミノ酸残基が置換、欠損および／または付加されていてもよい。そのような置換、挿入または欠損は、１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲ、特に配列番号７〜３６のナノボディのＣＤＲの変異体、配列番号６７〜９６（ＣＤＲ１）、配列番号１２７〜１５６、配列番号１８７〜２１６（ＣＤＲ３）（表６）に対応する該ＣＤＲ中に存在することができる。本明細書で使用される変異体は、任意のフレームワーク領域および任意の相補性決定領域が、参照配列における対応する領域と、少なくとも８０％同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性、より好ましくは９０％同一性、更により好ましくは９５％同一性または、更により好ましくは９９％同一性を示す配列であり（すなわちＦＲ１＿変異体に対してＦＲ１＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＣＤＲ１＿変異体に対してＣＤＲ１＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＦＲ２＿変異体に対してＦＲ２＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＣＤＲ２＿変異体に対してＣＤＲ２＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＦＲ３＿変異体に対してＦＲ３＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＣＤＲ３＿変異体に対してＣＤＲ３＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＦＲ４＿変異体に対してＦＲ４＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、それはＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを利用して電子工学的に測定可能である（Altschul et al. 1990, J Mol Biol 215: 403; Higgins & Sharp 1989, CABIOS 5: 151）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information（http://www/ncbi.nlm.nih.gov/）に公開されている。免疫グロブリン単一可変ドメインのそのような変異体は、向上した効力または他の所望の特性を有するので特に利点があるであろう。
【００６６】
限定するものではないが例としては、置換は、例えば保存的置換（本明細書に記載）であっても、および／またはアミノ酸残基が他のＶＨＨドメインの同一位置に天然で存在する他のアミノ酸残基と置換されていてもよい。従って、本発明のナノボディの特性を向上させるか、または本発明のナノボディの所望の特性または所望の特性のバランスまたは組み合わせを少なくとも過剰に（すなわちナノボディがその目的とする用途にもはや好適ではない程度に）損なわない任意の１つ以上の置換、欠損または挿入またはそれらの任意の組み合わせが、本発明の範囲に含まれるものである。当業者は、一般に、本明細書の開示に基づいて、あるいは限られた数の可能な置換を導入し得られたナノボディの特性へのそれらの影響を決定するなどの任意に限定された程度の通例の実験の後、好適な置換、欠損または挿入またはそれらの好適な組み合わせを決定・選択することが可能であろう。
【００６７】
特に好ましい実施態様によれば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディの変異体は、１，２または３個のＣＤＲにおける１，２または３個のアミノ酸の置換、欠損または挿入を有することができる；より具体的には表６に示すように（ｉ）ＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２またはＣＤＲ１およびＣＤＲ３またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３。より好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディの変異体が、１，２または３個のＣＤＲにおける１，２または３個のアミノ酸の保存的置換（本明細書で定義する）を有することができる；具体的には表６に示すように（ｉ）ＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、またはＣＤＲ１およびＣＤＲ３、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３。
【００６８】
更に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを発現するために使用する宿主生物によっては、そのような欠損および／または置換は、当業者の能力の範囲内で、１つ以上の翻訳後の修飾部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が除去されるような方法で設計してもよい。あるいは、置換または挿入は、（本明細書に記載のように）官能基の付加のための１つ以上の部位を導入する、例えば部位特異的ペグ化を可能とするように設計することができる。
【００６９】
修飾の例、ならびに修飾可能な免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはナノボディ配列内のアミノ酸残基の例（すなわち、タンパク質骨格上、好ましくは側鎖上）、そのような修飾を導入するために使用可能な方法および技術、そのような修飾の使用の可能性および利点は、当業者には明らかであろう。例えば、そのような修飾には、１つ以上の官能基、残基または部分、特に１つ以上の所望の特性または機能を本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインへ付与する１つ以上の官能基、残基または部分を本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの中または上に導入すること（例えば共有結合によって、または他の好適な方法で）を含むことができる。そのような官能基およびそれらを導入する技術の例は当業者には明らかであり、一般に、上記の一般的な背景技術に記載したすべての官能基および技術および医薬タンパク質の修飾用、特に抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体など）の修飾用の自体公知官能基および技術を含むことができ、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)が参照できる。
【００７０】
そのような官能基は、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接（例えば、共有結合で）または任意に好適なリンカーまたはスペーサーを介して結合することができるが、これも当業者には明らかであろう。医薬タンパク質の半減期を増加させるおよび／または免疫原性を低下させるために最も広く使われている技術の１つは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧなど）などの好適な薬理学的に許容される高分子の付加である。一般に、抗体および抗体断片（限定されるものではないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖなど）に従来使用されているペグ化などの任意の好適な形態のペグ化が使用可能である；例えばChapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)およびＷＯ０４０６０９６５が参照できる。タンパク質のペグ化用の多様な試薬が、例えば米国のNektar Therapeutics社などから市販されている。好ましくは、部位特異的なペグ化が、特にシステイン残基（例えばYang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)参照）を介して使用される。例えば、この目的のために、当業者に自体公知のタンパク質工学の技術を使用して、ＰＥＧを、本発明のナノボディ中に天然に存在するシステイン残基に付加してもよく、本発明のナノボディを、ＰＥＧの付加のために１つ以上のシステイン残基を好適に導入するように修飾してもよく、またはＰＥＧの付加のために１つ以上のシステイン残基を備えるアミノ酸配列を本発明のナノボディのＮおよび／またはＣ末端に融合してもよい。
【００７１】
好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびタンパク質のために、分子量が５０００を超える、例えば１０，０００を超え、２００，０００未満、例えば１００，０００未満、例えば２０，０００〜８０，０００の範囲のＰＥＧを使用する。他の、通常より好ましくない修飾には、発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞によっては、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化が、通常は翻訳と同時のおよび／または翻訳後の修飾の一部として含まれる。免疫グロブリン単一可変ドメインの半減期を増加させる他の技術には、二機能的構築物（例えば、標的ＭＭＲに対する１つのナノボディおよびアルブミンなどの血清タンパク質に対する１つのもの）への操作またはペプチド（例えば、アルブミンなどの血清タンパク質に対するペプチド）と免疫グロブリン単一可変ドメインの融合への操作を含んでもよい。
【００７２】
更に他の修飾は、標識ナノボディの目的とする用途により、１つ以上の検出可能な標識または他のシグナル発生基または部分を導入することを含んでもよい。付加、使用および検出するのに好適なラベルおよび技術は、当業者には明白であり、その例としては、限定するものではないが、蛍光ラベル（ＩＲ染料８００、ＶｉｖｏＴａｇ８００、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンおよびＥｕまたはランタン系列の他の金属などの蛍光金属など）、燐光ラベル、化学発光ラベルまたは生物発光ラベル（ルミノール、イソルミノール、サーモマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサレートエステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびその類似物などの）、ラジオアイソトープ、金属、金属キレート剤または金属カチオン、またはin vivo、in vitroまたはin situ診断およびイメージングでの使用に特に好適な他の金属または金属カチオン、並びに発色団および酵素（リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエスレラーゼなど）が挙げられる。
【００７３】
他の好適なラベルは当業者には明らかであり、その例としては、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出可能な部分が挙げられる。本発明のそのような標識ナノボディおよびポリペプチドは、特定のラベルの選択によって、例えばin vitro、in vivoまたはin situアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」などの自体公知のイムノアッセイなど）並びにin vivo診断およびイメージング用途に使用することができる。当業者には明らかなように、他の修飾は、例えば上記の金属または金属カチオンの１つをキレートするキレート基の導入を含むことができる。好適なキレート基の例としては、限定することなく、２，２’，２’’−（１０−（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡ）、２，２’−（７−（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１，４−ジイル）二酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。更に他の修飾には、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの特定の結合対の一部分である官能基の導入を含むことができる。そのような官能基は、本発明のナノボディを、結合対の他の半部に結合している、他のタンパク質、ポリペプチドまたは化学物質への結合のため、すなわち結合対の形成による結合のために使用してもよい。例えば、本発明のナノボデはビオチンと抱合し、アビジンまたはストレプトアビジンと抱合した他のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に結合することができる。例えば、そのような抱合ナノボディは、例えば検出可能なシグナル発生剤がアビジンまたはストレプトアビジンに抱合した診断的システムにおいてレポーターとして使用できる。そのような結合対は、例えば本発明のナノボディを医薬用途に好適な担体などの担体へ結合するためにも使用することができる。限定するものではないが、１つの例としては、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)に記載されたリポソーム製剤がある。そのような結合対も、治療活性剤を本発明のナノボディに結合するために使用することができる。
【００７４】
従って、好ましい実施態様によると、本発明に使用される免疫グロブリン単一可変ドメインは、検出可能な標識と直接またはリンカーを介して結合または融合している。好ましくは、検出可能な標識は、ラジオアイソトープ、特にin vivo核イメージングなどの医療用途に好適な放射性トレーサーである。限定する目的ではないが、例としては、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ジルコニウム８９（８９Ｚｒ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、フッ素１８（１８Ｆ）、銅６４（６４Ｃｕ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、および動物、特にマウス、ウサギまたはヒトに使用可能な任意の他のラジオアイソトープが挙げられる。具体的な実施態様では、検出可能な標識は９９ｍＴｃである。
【００７５】
他の好ましい実施態様では、本発明で使用する免疫グロブリン単一可変ドメインは、機能的部分、特に治療活性剤と、直接またはリンカーを介して結合または融合している。本明細書で使用される「治療活性剤」とは、疾患（本明細書で更に記載される）の処置上の治療効果（すなわち、治癒または安定化効果）を有するまたは有する可能性のある任意の分子を意味する。
【００７６】
好ましくは、治療活性剤は疾患改良剤であり、毒素または細胞障害性薬物またはプロドラッグを細胞障害性薬物に変換可能な酵素または放射性核種または細胞障害性細胞などの細胞障害性薬剤、または非細胞障害性剤であってもより。更により好ましくは、治療活性剤は、疾患に対して治癒効果を有する。限定するものではないがそのような部分の具体的な例は、例の項に記載する。１つの具体的な実施態様によれば、治療活性剤は細胞障害性剤ではない。
【００７７】
本明細書で使用される「リンカー分子」または「リンカー」とは、１〜２００個のアミノ酸長のペプチドであり、必須ではないが典型的には、不定形かつ可動であるよう選択または設計される。例えば、特定の二次構造を作らないアミノ酸を選択することが可能である。あるいは、安定な三次構造を作らないようなアミノ酸を選択することも可能である。あるいは、アミノ酸リンカーがランダムコイルを形成してもよい。そのようなリンカーとしては、限定するものではないが、Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕまたは天然タンパク質における不定形領域と頻繁に関連する他のアミノ酸を多く含む合成ペプチドが挙げられる（Dosztanyi, Z., Csizmok, V., Tompa, P., & Simon, I. (2005). IUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics (Oxford, England), 21(16), 3433-4.）。
【００７８】
従って、具体的な実施態様によれば、アミノ酸（ＡＡ）リンカー配列は、０〜２００個のＡＡ、０〜１５０個のＡＡ、０〜１００個のＡＡ、０〜９０個のＡＡ、０〜８０個のＡＡ、０〜７０個のＡＡ、０〜６０個のＡＡ、０〜５０個のＡＡ、０〜４０個のＡＡ、０〜３０個のアミノ酸、０〜２０個のＡＡ、０〜１０個のアミノ酸、０〜５個のアミノ酸のペプチドである。限定するものではないが、好適なリンカー配列例としては、（ＧＳ）５（ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ；配列番号２４８）、（ＧＳ）１０（ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ；配列番号２４９）、（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２５０）、ラマＩｇＧ２ヒンジ（ＡＨＨＳＥＤＰＳＳＫＡＰＫＡＰＭＡ；配列番号２５１）またはヒトＩｇＡヒンジ（ＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＡＳ；配列番号２５２）リンカーが挙げられる。短鎖リンカーの配列の例としては、限定するものではないが、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが挙げられる。
【００７９】
いくつかの用途では、リンカー分子が１つ以上の特定の配列モチーフを含むか、またはそれからなることが有利であろう。例えば、検出可能な標識または部分が遊離可能なようにタンパク質切断部位をリンカー分子の中に導入することが可能である。有用な切断部位は従来公知であり、ＩＥＧＲ配列（配列番号２５３）を有するＸａ因子切断部位、ＬＶＰＲ配列（配列番号２５４）を有するトロンビン切断部位、ＤＤＤＤＫ配列（配列番号２５５）を有するエンテロキナーゼ切断部位、またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号２５６）などのプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【００８０】
あるいは、タンパク質修飾用の酵素化学的方法を用いて免疫グロブリン単一可変ドメインを検出可能な標識または部分に結合する場合、リンカー部分は、酵素またはin vivoまたはin vitroで共有結合分子を生成するために使用する合成化学によっては、異なる化学物質に存在していてもよい（Rabuka 2010, Curr Opin Chem Biol 14: 790-796参照）。
【００８１】
ある実施態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは「多価」型であり、２つ以上の一価免疫グロブリン単一可変ドメインを化学的または組換えＤＮＡ技術によって結合することにより形成される。限定するものではないが、多価構築物の例としては、「二価」構築物、「三価」構築物、「四価」構築物などが挙げられる。多価構築物内に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。他の具体的な実施態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは「多重特異的」型であり、少なくとも１つが異なる特異性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを結合して形成される。限定するものではないが、多重特異的構築物の例としては「二重特異的」構築物、「三重特異的」構築物、「四重特異的」構築物などが挙げられる。これを更に説明すると、任意の多価または多重特異的な（本明細書で定義する）本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、同一抗原の２つ以上の異なるエピトープ、例えばＭＭＲ外部ドメインの２つ以上の異なる部分に対して好適に抗体となることができる；または２つ以上の異なる抗原、例えばＭＭＲおよび１つ以上の他のマーカーに対して抗体となることができる。好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満などの親和性で、ＭＭＲ（本明細書に記載）に結合するものである。本発明の多価または多重特異的免疫グロブリン単一可変ドメインは、所望のＭＭＲとの結合活性の増加および／または選択性の向上、および／またはそのような多価または多重特異的免疫グロブリン単一可変ドメインの使用により得られるであろう任意の他の所望の特性または所望の特性の組み合わせを有する（あるいは操作されるおよび／または選択される）ことができる。
【００８２】
更なる側面では、本発明は、本発明に記載の任意の免疫グロブリン単一可変ドメインを備えるポリペプチドを、一価、多価または多重特異的のいずれかの形態で提供する。従って、一価、多価または多重特異的ナノボディを備えるポリペプチドも、非限定的な例として本明細書に含まれる。
【００８３】
本発明の他の側面は、上記の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディ、またはポリペプチドをコードする核酸配列に関する。更に、本発明は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を備える発現ベクター、ならびにそのような発現ベクターを発現する宿主細胞も想到する。好適な発現システムは、細菌または酵母における恒常的および誘導性発現システム、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現システム、または昆虫または哺乳動物細胞における一過性形質転換が挙げられる。好適な宿主細胞には、大腸菌、乳酸菌、酵母、分裂酵母、ピキア酵母などが含まれる。好適な動物宿主細胞には、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などが含まれる。ナノボディのクローニング、発現および／または精製は、当業者に公知の技術に従って行うことができる。
【００８４】
更に他の側面では、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと、医薬上許容し得る担体、アジュバントまたは希釈剤の少なくとも１つとを含む医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、治療上有効量の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと、医薬上許容し得る担体、アジュバントまたは希釈剤の少なくとも１つとを含む。
【００８５】
「担体」または「アジュバント」、特に「医薬上許容し得る担体」または「医薬上許容し得るアジュバント」は、任意の好適な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントであり、それだけでは、組成物を受け取る個体に害のある抗体の産生を誘発せず、または予防を誘発しない。従って、医薬上許容し得る担体は、本質的に無毒性かつ非治療的であり、当業者に公知である。好適な担体またはアジュバントは、典型的には以下の非限定的リストに含まれる化合物を１つ以上を含む：タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子などの大きな代謝の遅い高分子。担体またはアジュバントの非限定的な例としては、リンゲル液、デキストロース液またはハンクス液が挙げられる。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性溶液も使用することができる。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、緩衝液および防腐剤など、等張性および化学的安定性を向上する物質などの添加剤を少量含むこともできる。
【００８６】
本明細書で使用される「治療上有効量」、「治療上有効用量」および「有効量」という用語は、所望の結果を達成するために必要な量を意味する。本明細書で使用される「医薬上許容し得る」とは、生物学的または他の点で望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、その物質を、任意の望ましくない生物的効果を起こさずに、あるいはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用せずに、前記化合物と一緒に個体に投与することができるものである。
【００８７】
上記免疫グロブリン単一可変ドメインのいくつかは、診断的、予後診断的および／または治療的有用性を有することができる。より具体的には、本発明は、癌の診断、予後診断、予防および／または処置における使用のため、ならびに治療の効果をモニタリングまたは評価するための本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインも想到する。
【００８８】
本明細書で使用される「診断する」という用語または文法上の同意語は、対象が特定の疾患または障害に罹患しているかどうかを決定することを意味する。本明細書で使用される「予後診断する」または文法上の同意語は、対象が特定の疾患または障害を発症するリスクを有するかどうかを決定することを意味する。
【００８９】
本明細書で使用される「癌を予防する」という用語は、疾患の発症を阻害または逆行させる、疾患の初期兆候を阻害するまたはを逆行させる、疾患の臨床症状の出現を阻害することを意味する。本明細書で使用される「癌を処置する」または「癌を有する対象または個体を処置する」には、疾患を実質的に阻害すること、疾患の進行を実質的に遅延または逆行させること、疾患の臨床症状を実質的に寛解させること、または疾患の臨床症状の発現を実質的に予防することが含まれる。特に、それには、癌細胞の複製の阻害、癌の転移の阻害、腫瘍サイズの減少、身体における癌性細胞の数の減少、および／または癌の症状の寛解または緩和が含まれる。処置は、死亡率および／または罹患率に減少があれば治療的であるとみなされ、予防的にまたは治療的に行うことができる。多様な対象または個体が処置可能である。一般に「対象」は、哺乳動物または哺乳類であり、これらの用語は広義には哺乳綱の生物を記述するために使用され、肉食動物目（例えば、イヌおよびネコ）、ゲッシ目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）が含まれる。多くの実施態様において、対象はヒトであろう。
【００９０】
本明細書で使用される「癌」という用語は、例えば腎癌、カポジ肉腫、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺腺癌、咽頭有棘細胞癌、胃腸または胃癌などの細胞疾患を含む任意の腫瘍性疾患を意味する。
【００９１】
従って、本発明は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれから誘導した医薬組成物の医薬的有効量を、それを必要とする対象に投与することそ備える、癌を予防および／または処置する方法にも関する。
【００９２】
具体的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象において腫瘍成長または腫瘍転移を阻害する方法であって、固形腫瘍の低酸素または正常酸素領域などの異なる腫瘍内領域に関連したＴＡＭ亜集団を選択的に標的とすることを備える方法に関する。具体的な実施態様としては、上記方法は、対象に、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたは医薬組成物またはポリペプチド、特に毒素または細胞障害性薬剤またはプロドラッグを細胞障害性薬剤に変換することが可能な酵素または放射性核種に融合、または細胞障害性細胞などと結合した免疫グロブリン単一可変ドメインの医薬的有効量を投与することを備える（例の項参照）。
【００９３】
本明細書で使用される「ＴＡＭ亜集団」は、参照により本明細書に取り込まれる、Movahedi et al. 2010, Cancer Res 70: 5728-39の５７３３ページの表１に記載される分子マーカーの発現差異により特徴付けられ、腫瘍環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の特徴的なサブセットを意味する。例えば、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）は、主に腫瘍の低酸素領域に存在するＴＡＭ亜集団上に特異的に発現する分子マーカーの１つである。具体的な実施態様によれば、ＴＡＭ亜集団は、ＭＨＣＩＩｌｏｗまたはＭＨＣＩＩｈｉとして定義することが可能である。好ましい実施態様において、ＴＡＭ亜集団はＭＨＣＩＩｌｏｗとして定義される。更により好ましい実施態様では、ＴＡＭ亜集団はＭＭＲ陽性ＴＡＭ亜集団として定義される。「ＭＭＲ陽性ＴＡＭ」という用語は、それらの表面に高量のマクロファージマンノース受容体を発現し主に腫瘍の低酸素領域に存在する腫瘍関連マクロファージを意味し、それとは対照的に「ＭＭＲ陰性ＴＡＭ」はマクロファージマンノース受容体を発現しないか少ししか発現せず、主に腫瘍の正常酸素領域に存在する（Movahedi et al. 2010, Cancer Res 70: 5728-39も参照）。
【００９４】
免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または医薬組成物は、当業者の知識内の任意の好適な方法により投与できる。上記免疫グロブリン単一可変ドメインまたはその医薬上許容し得る塩の投与は、経口、吸入または非経口投与であってもよい。具体的な実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、髄腔内または脳室内投与で送達される。この活性化合物は単独で投与してもよく、好ましくは医薬組成物として調剤されてもよい。免疫グロブリン単一可変ドメインにより認識される抗原を発現する疾患または障害を処置するのに効果的な量は、処置する障害の性質および重度、および哺乳動物の体重などの通常の因子に依存する。しかしながら、単位用量は、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはその医薬上許容し得る塩が、通常０．０１〜５０ｍｇの範囲であり、例えば０．０１〜１０ｍｇまたは０．０５〜２ｍｇとなる量である。単位用量は、１日の全用量が通常０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であるように、一般的には１日に１回、あるいは２回以上、例えば１日２、３または４回、より一般的には１日１〜３回、体重７０ｋｇの成人の好適な１日の全用量は、０．０１〜５０ｍｇ、例えば０．０１〜１０ｍｇ、より一般的には０．０５〜１０ｍｇとなるように投与される。
【００９５】
免疫グロブリン単一可変ドメインまたはその医薬上許容し得る塩は、単位用量経口、非経口または吸入組成物などの単位用量組成物の形態で投与することが大変好ましい。そのような組成物は、混合により調製され、経口、吸入または非経口投与用に好適に適応され、例えば、錠剤、カプセル剤、経口液製剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、用時溶解粉体、注射および注入液または懸濁剤または座薬またはアエロゾルであってもよい。経口投与用錠剤およびカプセル剤は通常単位用量で提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、潤滑剤、崩壊剤、着色料、調味料、湿潤剤などの従来の賦形剤を含有する。錠剤は従来公知の方法によりコーティングすることができる。好適に使用できる充填剤としては、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の同様の剤が挙げられる。好適な崩壊剤としては、澱粉、ポリビニルピロリドン、およびデンプングリコール酸ナトリウムなどの澱粉誘導体が挙げられる。好適な潤滑剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。好適な医薬上許容し得る湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。これらの固形経口組成物は、混合、充填、錠剤化などの従来の方法により調製できる。混合操作を繰り返すことによって、大量の充填剤を用いるこれらの組成物中に活性な薬剤を分布させることができる。そのような操作はもちろん従来技術である。経口液製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル剤の形態であってもよく、または水や他の好適な媒体に溶解して使用する乾製剤として提供することもできる。そのような液製剤は、懸濁剤などの従来の添加剤を含有してもよく、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは水素化食用油脂、乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアカシア；非水媒体（食用油脂を含んでもよい）、例えば、アーモンドオイル、分画したヤシ油、グリセリンエステルなどの油性エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸、必要に応じて従来の調味料または着色剤が挙げられる。経口製剤には、腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒剤などの従来の持続放出製剤も含まれる。
【００９６】
吸入用組成物は、好ましくは、鼻吸入剤またはアエロゾルまたはネブライザー用溶液、吹送法用微細粉末として、単独またはラクトースなどの不活性担体と併用で、気道への投与用として提供される。そのような場合、活性化合物の粒子は、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば２〜５ミクロンなどの１〜５ミクロンの直径を有することが好適である。好ましい吸入用量は、０．０５〜２ｍｇ、例えば０．０５〜０．５ｍｇ、０．１〜１ｍｇまたは０．５〜２ｍｇの範囲であろう。非経口投与用には、本発明の化合物と減菌媒体を含む流体単位用量形態を用意する。活性化合物は、媒体および濃度によっては、懸濁または溶解のいずれかが可能である。非経口溶液は通常、前記化合物を媒体に溶解し、好適なバイアルまたはアンプルに充填・密封する前に、フィルター滅菌することにより調製される。局所麻酔剤、防腐剤および緩衝薬剤などのアジュバントを媒体に溶解することも有利である。
【００９７】
安定性を高めるために、組成物は、バイアルに充填し凍結後に、水を真空下で除去することも可能である。非経口懸濁液も、前記化合物を、媒体に溶解させる代わりに懸濁させ、減菌媒体に懸濁する前にエチレンオキサイドに接触させて滅菌すること以外は実質的に同様に調製される。活性化合物の均一な分布を促進するために界面活性剤または湿潤剤を組成物に添加することが有利である。適宜、少量の気管支拡張薬、例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリンおよびエフェドリンなどの交感神経刺激アミン；テオフィリンおよびアミノフィリンなどのキサンチン誘導体およびプレドニゾロンなどのコルチコステロイドおよびＡＣＴＨなどの副腎皮質刺激薬を添加することができる。慣例として、組成物は、通常該当する医療用処置における手書きまたは印刷した使用説明書と共に提供されるであろう。これらのすべての薬物は、ヒトまたは獣医学での使用を意図することができる。
【００９８】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインおよびそれを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患または障害によって、自体公知の任意の好適なin vitroアッセイ、細胞アッセイ、in vivoアッセイおよび／または動物モデルまたはそれらの任意の組み合わせを用いてテストすることが可能である。
【００９９】
具体的な実施態様では、本発明の癌に対する治療方法は、放射線照射、化学療法または手術などの従来公知の任意の他の癌治療と組合わせて使用できることは明白であろう。
【０１００】
非侵襲的腫瘍イメージングに使用可能な信頼できる低酸素トレーサーは、現在入手不能か限定されている。そのようなトレーサーが入手可能であることは、放射線療法医が標的腫瘍領域（正常酸素に対して低酸素）に依存した放射線量に適応することを可能とするので、放射線療法の分野における重要な進歩を意味するであろう。低酸素／正常酸素環境に存在する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）サブセットの同定は、腫瘍における低酸素／正常酸素部位の非侵襲的イメージングのために使用可能なマクロファージ特異的バイオマーカーの同定を可能とする。例えば、ＭＭＲは、低酸素ＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭ上に優先的に発現されるので、そのようなマーカーとなる。サイズが小さく、腫瘍浸透度が高いので、免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にナノボディは、非侵襲的イメージング用として理想的なフォーマットである。低酸素ＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭに優先的に発現するマーカーに対して産生された免疫グロブリン単一可変ドメインは、腫瘍における低酸素のイメージングに使用可能である。ヒトＭＭＲに対する（または、ヒト／マウスＭＭＲに対して交差反応性のある）免疫グロブリン単一可変ドメインは、ここで使用可能である。
【０１０１】
イメージング用トレーサー（例えば、近赤外蛍光またはＮＩＲＦトレーサー）と結合したＴＡＭサブセット特異的免疫グロブリン単一可変ドメインの他の用途としては、限定するものではないが、（ｉ）予後診断値であってもよい、任意の腫瘍内のＴＡＭまたはＴＡＭサブセットの量を正確に定量すること、（ｉｉ）本明細書で請求するＴＡＭ特異的治療などの、ＴＡＭの量および／または活性化状態について治療効果を評価すること、（ｉｉｉ）腫瘍内の低酸素／正常酸素領域を可視化することが含まれる。
【０１０２】
従って、更なる側面では、本発明は、非侵襲的in vivo医療用イメージングにおけるコントラスト剤として使用するための免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。好ましい実施態様では、ＭＭＲ陽性腫瘍関連マクロファージを腫瘍内の標的とする本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを使用した核イメージングが想到される。ある具体的な実施態様では、本発明は、ＭＭＲ陽性ＴＡＭの相対的割合および／またはＭＭＲ陽性ＴＡＭの相対的割合の時間に関する増加のモニタリングにおける使用のための免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０１０３】
本明細書で使用される「医療用イメージング」という用語は、臨床目的（例えば疾患診断、予後診断または治療モニタリング）または医療科学（例えば解剖学および生理学の研究）のために、生物体の内部（または部分および／またはその機能）を可視化するために使用される技術および方法を意味する。医療用イメージング方法の例としては、血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）などの侵襲的技術ならびに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波法（ＵＳ）および核イメージングなどの非侵襲的技術が挙げられる。核イメージングの例としては、電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）と単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。
【０１０４】
本発明には、対象における腫瘍細胞のin vivoイメージング方法であって：
−  検出可能な標識に融合した本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインを対象に投与する工程を含む方法も含まれる。
【０１０５】
本明細書で使用される「腫瘍細胞」または単に「腫瘍」とは、腫瘍環境において存在する異なる細胞タイプを含む、全体としての腫瘍組織を意味する。腫瘍細胞としては、癌細胞だけでなく非形質転換宿主細胞または腫瘍関連間質細胞も含まれる。腫瘍関連間質細胞の例としては、骨髄系細胞、特に腫瘍関連マクロファージが挙げられる。
【０１０６】
好ましくは、上記方法は、更に以下の工程の１つ以上を備える：
−  固形腫瘍の低酸素領域に結合したＭＭＲ陽性ＴＡＭを選択的に標的とするおよび／または可視化する工程；
−  ＭＭＲ陽性ＴＡＭの相対的割合を決定し、任意にＭＭＲ陽性ＴＡＭの相対的割合への癌治療の効果を評価する工程。
【０１０７】
更に、他の側面では、本発明は、癌に罹患しているまたは罹患している疑いのある対象において、癌を診断するまたは癌の病原力を予後診断する方法であって、以下の工程を備える方法を想到する：
−  本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを対象に投与する工程、
−  対象にけるＭＭＲ陽性ＴＡＭの存在および／または相対的割合を決定する工程、
−  ＭＭＲ陽性ＴＡＭの相対的割合に基づいて対象にける癌を診断するまたは癌の病原力を予後診断する工程。
【０１０８】
ある実施態様では、該方法は、（ｉ）癌細胞を有するまたは癌細胞を有すると疑われる該個体からのサンプルを提供する工程；（ｉｉ）該サンプルにおけるＭＭＲ陽性ＴＡＭの存在および／または相対的割合を決定する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の結果に基づいて、該個体が良い／予後を有すると分類する、または該個体が癌を有すると診断する工程を備える。
【０１０９】
サンプルは、腫瘍生検または細針吸引生検などの任意の臨床関連組織サンプルまたは血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、尿または乳頭滲出液などの体液サンプルを含んでもよい。サンプルは、ヒトから、または獣医学関連では反芻動物、ウマ、ブタまたはヒツジなどの非ヒト動物から、またはネコやイヌなどの家庭ペット動物から得ることができる。サンプルは、パラフィン包埋組織切片であってもよい。癌組織には、原発性腫瘍組織ならびに臓器特異的または組織特異的転移組織が含まれると理解される。
【０１１０】
本発明の関連では、癌に罹患しているまたは罹患していると疑われる個体を予後診断するということは、癌を有する個体の生存確率、または腫瘍組織または細胞の浸潤性または転移性挙動（すなわち悪性進行）に関連する再発リスクの予測を意味する。本明細書で使用される「良い予後」とは、所望の転帰を意味する。例えば、癌において、良い予後とは、癌の初期診断から２，３，４，５年またはそれ以上の期間内における再発または転移が予期されないことであってもよい。「悪い予後」とは、望ましくない転帰を意味する。例えば、癌では、悪い予後は、癌の初期診断から２，３，４，５年またはそれ以上の期間内における再発または転移が予期されることであろう。癌の悪い予後とは、腫瘍が比較的進行性であることを意味し、一方良い予後とは腫瘍が比較的進行性でないことを意味することができる。
【０１１１】
本明細書で使用される「決定する」、「測定する」、「評価する」および「アッセイする」という用語は互換的に使用され、定量的および定性的に決定することの両方が含まれる。特に、ＴＡＭ亜集団、特にＭＭＲ陽性ＴＡＭの存在および／または相対的割合を決定する方法は、例えばフローサイトメトリーを使用したものが当業者には公知であり、その詳細は限定するものではないが、例えば米国特許第２０１１０２６２３４８号およびMovahedi et al. 2010, Cancer Res 70: 5728-39に記載されており、それらは参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１２】
さて、抗体ベース標的用腫瘍特異的マーカーを見つけることが未だ困難な作業であることはよく知られている。これは、間質抗原が通常腫瘍に限定されていないので、腫瘍間質を標的とする場合に特に困難となる。このことは、診断および治療応用の両方においてこれらのツールの有用性を妨害するかもしれない。従って、しばしば、腫瘍におけるフリーの結合部位と競合することなく腫瘍外結合部位をブロックすることが望まれるであろう。
【０１１３】
好ましい実施態様によると、癌のin vivoイメージング、診断／予後診断または処置のための上記方法はいずれも、本発明による一価標識免疫グロブリン単一可変ドメインと、同一の標的（マクロファージマンノース受容体）に対する非標識二価形態の免疫グロブリン単一可変ドメインのとを同時投与して腫瘍外結合部位をブロックする追加の工程を含むことができる。好ましい実施態様によると、非標識二価形態の抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが同一標的（マクロファージマンノース受容体）に対するものである限り、２つの同一のまたは２つの異なる免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。本明細書で使用される「非標識」とは、検出可能な標識、特に本明細書で既に定義したラジオアイソトープまたはラジオ活性トレーサーが存在しないことを意味する。他の修飾（本明細書で既に定義した）が存在しないことを除外するものではないことは明らかであろう。
【０１１４】
本発明の他の側面は、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを製造する方法であって、以下の工程を含む該方法に関する：
−  好適な宿主細胞または発現システムにおいて、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現する工程；および任意に
−  該免疫グロブリン単一可変ドメインまたは該ポリペプチドを単離および／または精製する工程。
【０１１５】
好適な発現システムとしては、細菌または酵母における恒常的および誘導性発現システム、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびレンチウイルスなどのウイルス発現システム、昆虫または哺乳動物細胞における一過性形質転換が挙げられる。好適な宿主細胞としては、大腸菌、乳酸菌、酵母、分裂酵母、ピキア酵母などが挙げられる。好適な動物宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などが挙げられる。免疫グロブリン単一可変ドメインのクローニング、発現および／または精製は、当業者に公知の技術によって行うことが可能である。
【０１１６】
以下の例は、本発明の好ましい特徴を更に十分に説明するものであり、本発明を限定するものでは決してない。本明細書の教示にアクセスできる当業者は、本発明の範囲内でさらなる変更および実施態様が可能であることが理解できるであろう。従って、本発明は本明細書に添付の請求項によってのみ限定されるものである。以下に開示される出発物質および試薬のすべては、当業者には公知であり、上市されているかあるいは公知の技術を使用して調製可能である。
【０１１７】
例
例で用いる材料および方法
マウスおよび株化細胞
ナイーブ動物における体内分布実験用雌Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスは、Harlan社より購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ＭＭＲ−欠損マウスは、Etienne Pays（Universite Libre de Bruxelles）により提供された。動物実験のすべては、機関審査委員会に承認され、そのガイドラインに則って行われた。Ｃ５７ＢＬ／６ルイス肺癌細胞の３ＬＬ−Ｒクローンを、側腹部に皮下注射（ｓｃ）した（３ｘ１０６細胞）。接種１２〜１４日後に、担３ＬＬ−Ｒ腫瘍マウスをイメージングした。
【０１１８】
抗ヒトＭＭＲおよび抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディの作成
抗ヒトマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）および抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディ（Ｎｂ）は、前述と同様の方法で免疫ファージライブラリーから単離した（Saerens et al. 2008, Current Opin Pharmacol 8: 600-608; Saerens et al. 2004, J Biol Chem 279: 51965-72; Saerens et al. 2008, Immunol Methods 329: 138-50）。しかしながら、交差反応性Ｎｂを作成するために、交互免疫化スケジュールを行った。アルパカ（Vicugna pacos）を、１００μｇのヒトＭＭＲ（R&D Systems社＃２５３４）、その１週間後１００μｇのマウスＭＭＲ（R&D Systems社＃２５３５）で免疫化した。この交互スケジュールを合計６週間維持し、両タンパク質は注射前にＧｅｒｂｕアジュバントと混合した。免疫化後、血液を採取し、末梢血リンパ球を単離した。製品の使用説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen社）を使用してｍＲＮＡをこれらの細胞から抽出し、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴ（Invitrogen社）で逆転写した。可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする遺伝子配列を、リーダー配列特異的ＣＡＬＬ００１（５’−ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧ−３’；配列番号２５７）およびＣＨ２エクソン特異的ＣＡＬＬ００２（５’−ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ−３’；配列番号２５８）プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。１％アガロースゲル分離後、６００ｂｐ断片ＶＨＨ−ＣＨ２断片をゲルから単離し、フレームワーク−１およびフレームワーク−４領域にそれぞれ特異的なネステッドプライマーＡ６Ｅ（５’−ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ−３’；配列番号２５９）およびＰＭＣＦ（５’−ＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ−３’；配列番号２６０）を使用して再び増幅した。これらのＰＣＲ断片は、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化した後に、ｐＨＥＮ４の変異体（Arbabi Ghahroudi et al. 1997, FEBS Lett 414: 521-6）であるファージミドベクターｐＭＥＣＳに連結した。ｐＭＥＣＳは、ＨＡタグのみの融合の代わりに、ＮｂのＣ末端でＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ；配列番号２６１）および６ｘヒスチジンタグ融合をコードすることがｐＨＥＮ４と異なっている。連結した物質で、新たに調製した大腸菌ＴＧ１細胞を形質転換し、アンピシリン添加ＬＢプレートに播種した。コロニーをプレートからこすり落とし、洗浄、グリセロール（５０％最終濃度）添加ＬＢ培地にて−８０℃で保存した。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージ感染を用いて、ＶＨＨライブラリーをファージ上に発現した。特定のナノボディファージを、マイクロタイタープレート（Nunc社）のウェルにコートした抗原のin vitroセレクションを数回続けて行うことにより濃縮した。
【０１１９】
ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂの単離には、ヒトおよびマウスＭＭＲを交互に使用してスクリーニングを行った。結合したファージ粒子を１００ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１．０）で溶出し、すぐに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和し、大腸菌ＴＧ１細胞の感染に使用した。個々のコロニーを採取し、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して組換えナノボディ−Ｍ１３タンパク質を発現させた。その後、各クローンのペリプラズム抽出物がヒトＭＭＲ認識するかどうかを、ネガティブコントロールとして非特異的抗原をコートしたウェルを用いＥＬＩＳＡによりテストした。ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂも、同様の方法でマウスＭＭＲに対してスクリーングし、ヒトおよびマウス抗原の両方と反応するクローンのみを交差反応性Ｎｂとして収集した。各ＥＬＩＳＡは、ｐＨ＝８．８の１００ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液中で１μｇ／ｍｌのＭＭＲでコートしたプレート上で行った。コート後、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋２％脱脂粉乳（Nestle社）（ＰＢＳＭ）で２時間ブロックする。その後、ＰＥ抽出物をプレート上で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、その後ＰＢＳＭ中で０．５μｇ／ｍｌのマウス抗ＨＡタグ抗体（１６Ｂ１２、Covance社）を１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＭ中で１．５μｇ／ｍｌのアルカリフォスファターゼをプレートに１時間添加して抗マウス抗体（Sigma社）に抱合し、その後ＰＢＳＴで洗浄する。最後に、ＥＬＩＳＡをＡＰ−緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのトリスｐＨ＝９．５）中２ｍｇ／ｍｌのアルカリ性リン酸塩化基質（Sigma社）を使用して展開し、４０５ｎｍにおける吸光度シグナルを測定する。
【０１２０】
抗ヒトＭＭＲおよび抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディの発現および精製
ＥＬＩＳＡで陽性であったクローンのｐＭＥＣＳ−Ｎｂプラスミドで、大腸菌ＷＫ６細胞を形質転換した。これらの細胞はタグコドンで翻訳を中止し、従ってファージタンパク質融合なしにＮｂを発現する。組換えＶＨＨの産出は、振とうフラスコ中で６００ｎｍにおける吸光度が０．６〜０．９に到達するまで０．１％グルコースおよびアンピシリン添加Terrific Broth中で細菌を増殖させることにより行った。ＶＨＨ発現を、１ｍＭのＩＰＴＧで２８℃で１６時間誘発する。細胞をペレット化した後、ペリプラズムタンパク質を浸透圧ショックにより抽出した。このペリプラズム抽出物をニッケル−ニトリロ三酢酸（Thermo Scientific社）に添加し、洗浄後、結合しているタンパク質をＰＢＳ中５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。溶出画分は、Vivaspin２遠心濃縮機（Sartorius社）で透析した。タンパク質の最終純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。最終収量は、ＶＨＨの吸光係数計算理論値を用いて２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により求めた。
【０１２１】
ＨＡタグは、フローサイトメトリーによるナノボディの検出に有用であるが、隣接するＨｉｓタグ上の９９ｍＴｃラベリングと干渉することが示されている。従って、９９ｍＴｃラベルが関与する実験においては、ナノボディは、ｐＨＥＮ６ｃベクターへ再クローン化した。これにより、ＨＡタグが除去され、ナノボディのＣ末端６ｘＨｉｓタグだけを融合する。更に、ペリプラズムの発現およびＩＭＡＣ精製後、９９ｍＴｃラベリングを含む実験に使用するナノボディを、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でSuperdex 75 HR 10/30（Pharmacia社, Gaithersburg, MD）によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による追加の精製工程に供した（図４Ｂおよび４Ｃ）。
【０１２２】
表面プラズモン共鳴
親和性解析は、BIAcore T100（GE Healthcare社）でＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ランニングバッファー（０．１５ＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０を添加した１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を使用して行った。ＭＲＲをアセテートバッファー５０ｍＭ（ｐＨ５，０）中でＣＭ５チップ上に固定化し、２１００ＲＵのMMRをコートしたチップを得た。同チップ上の第二のチャネルを、同様の方法で活性化／不活性化し、ネガティブコントロールとして使用した。ＭＭＲナノボディを、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で１〜２０００ｎＭの範囲の１１の異なる濃度中の分析物として使用した。グリシン−ＨＣｌ５０ｍＭ（ｐＨ２．０）を溶出に使用した。動態および平衡パラメーター（ｋｄ、ｋａ、ＫＤ）値は、BIAcore T100評価ソフトウェア２．０２（GE Healthcare社）を使用してすべての濃度のセンソグラムを合わせたものから計算した。
【０１２３】
細胞調製およびフローサイトメトリー
フローサイトメトリー染色に使用するナノボディは、オリジナルのｐＭＥＣＳファージベクターから産出し、従って各ナノボディはＣ末端ＨＡおよび６ｘＨｉｓタグを有する。
【０１２４】
抗ＭＭＲナノボディのマウスＭＭＲへの特異的な結合を調べるために、３Ｅ６癌細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射することによりに３ＬＬ−Ｒ腫瘍を誘発した。１５日間腫瘍を増殖した後で、腫瘍を単離し、切り刻み、１０Ｕ／ｍｌコラゲナーゼタイプＩ、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼタイプＩＶおよび３０Ｕ／ｍｌＤＮアーゼＩ（Worthington社）と共に２５分間（３７℃）インキュベートした。密度勾配（Axis-Shield社）を使用して、組織デブリと死んだ細胞を除去した。ナノボディを、試験管ごとに１０μｇ／ｍｌずつ、１Ｅ６細胞へ付加した。抗ＭＭＲナノボディまたはコントロールナノボディと共に少なくとも１時間インキュベートした後、細胞を氷冷したハンクスバッファー塩溶液（ＨＢＳＳ）バッファー（０．７４ｇ／ｌのＥＤＴＡおよび０．５％（ｖ／ｖ）の熱失活したウシ胎児血清を含有する）で２回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのAlexa Fluor 488結合抗ＨＡタグモノクロナール抗体（クローン１６Ｂ１２、Invitrogen社）と共にインキュベートした。細胞表面染色に使用した市販の抗体は、Alexa Fluor 647結合抗マウスＬｙ６Ｃモノクロナール抗体（クローンＥＲ−ＭＰ２０、AbD Serotec社）、PerCP-Cy5.5結合抗マウスＭＨＣＩＩモノクロナール抗体（クローンＭ５／１１４．１５．２、Biolegend社）、フィコエリスリン結合抗マウスＬｙ６Ｇモノクロナール抗体（クローン１Ａ８、BD Biosciences社）であった。ＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭは多量のＭＭＲを発現するので、フローサイトメトリー測定用に、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−腫瘍関連マクロファージをさらにＭＨＣＩＩ発現でゲートした。抗ＭＭＲナノボディの結合プロファイルを記録した。
【０１２５】
ナノボディのヒトＭＭＲへの結合を調べるために、ヒト未熟樹状細胞を使用した。健康なヒトドナー単球由来の凍結保存した未熟樹状細胞由来を、Dr. Karine Breckpot（Vrije Universiteit Brussel, Jette, Belgium）の厚意により入手した。未熟樹状細胞を調製するために、末梢血単核球を白血球除去により血液から除去し、単球をプラスチック製のＮｕｎｃｌｏｎ皿に接着させることにより分離した（Nunc社、Biotech Line, Slangerup, Denmark）。非接着性細胞を除去した後、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Invitrogen社）および１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Gentaur社）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で６日間単球から分化することにより未熟樹状細胞をin vitroで産生した。細胞は６日目に収集し、カウントし、１Ｅ７細胞数／バイアルで分注した。細胞を、８５％の自己血清、１０％のＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich社）および５％のGlucosteril 40%（Fresenius社, Albertslund, Denmark）中で凍結保存した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を氷上で解凍し、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Invitrogen社）および１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Gentaur社）を添加し、前もって冷却したＲＰＭＩ１６４０培地中で常温で１時間以上インキュベートした。その後、１０％正常ウサギ血清を添加して、抗体の非特異的Ｆｃ媒介結合を阻止した。３０分後、ナノボディを試験管につき１０μｇ／ｍｌで２Ｅ５細胞に添加した。抗ＭＭＲナノボディまたはコントロールナノボディと共に少なくとも１時間インキュベートした後、細胞を１％正常ウサギ血清を添加した氷冷ＨＢＳＳバッファーで２回洗浄し（Eppendorf社製５８１０−Ｒ遠心分離機、８分、１４００ｒｐｍ、４℃）、０．５μｇ／ｍｌのAlexa Fluor 488結合抗ＨＡタグモノクロナール抗体（クローン１６Ｂ１２、Invitrogen社）と共にインキュベートした。アロフィコシアニン抱合体（ＡＰＣ）結合抗ヒトＣＤ１１ｃモノクロナール抗体（クローンＢ−ｌｙ６、BD Biosciences社）を使用して、ＣＤ１１ｃ染色を行った。染色した細胞を１％正常ウサギ血清添加氷冷ＨＢＳＳバッファーでもう一度洗浄し（Eppendorf社製５８１０−Ｒ遠心分離機、８分、１４００ｒｐｍ、４℃）、フローサイトメトリーで分析した。
【０１２６】
ナノボディラベリングおよび９９ｍＴｃ標識したナノボディのin vitroキャラクタリゼーション
ナノボディのヘキサヒスチジン端部を、９９ｍＴｃで標識した。標識化のために、１ｍＬの９９ｍＴｃＯ４−（０．７４〜３．７ＧＢｑ）を、４．５ｍｇのボラノ炭酸ナトリウム、２．８５ｍｇの四ホウ酸ナトリウム十水和物、８．５ｍｇの酒石酸ナトリウム二水和物および７．１５ｍｇの炭酸ナトリウムを含有するｐＨ１０．５のＩｓｏｌｉｎｋキット（Mallinckrodt Medical BV社）に添加して［９９ｍＴｃ（Ｈ２０）３（ＣＯ）３］＋を合成した。バイアルを沸騰する水浴中で１００℃で２０分間インキュベートした。調製したばかりの［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を５分間常温まで放冷し、１２５μＬの１ＭＨＣｌでｐＨ７〜８まで中和した。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を、５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ一価ナノボディまたは２ｍｇ／ｍｌ二価ナノボディに、ｐＨ８の５０μＬの炭酸緩衝液と共に添加した。混合物を水浴中５２℃で９０分間インキュベートした。標識化効率は、移動相としてのアセトン中で即時薄層クロマトグラフィーにより求め、ラジオクロマトスキャナ（ＶＣＳ−２０１；Veenstra社）を使用して分析した。標識化収率が９０％未満のときは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で前もって平衡化し、存在しうる凝縮物を除去するために０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通過させたＮＡＰ−５カラム（GE Healthcare社）により９９ｍＴｃ−ナノボディ溶液を精製した。
【０１２７】
ピンホールＳＰＥＣＴマイクロＣＴイメージング方法
マウスに、過剰量の濃縮一価または二価未標識ナノボディと共にあるいはそれなしに、４５〜１５５ＭＢｑ（約５〜１０μｇ）の９９ｍＴｃ−ナノボディを１００〜２００μｌ静脈内注射した。ピンホールＳＰＥＣＴ測定の１０〜１５分前に、マウスを、１８．７５ｍｇ／ｋｇのケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｍｉｎｅ１０００（登録商標）、CEVA社、ブリュッセル、ベルギー）と０．５ｍｇ／ｋｇのメデトミジン塩酸塩（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）、Pfizer社、ブリュッセル、ベルギー）の混合物で麻酔した。
【０１２８】
マイクロＣＴイメージングの後に、別のイメージングシステムでピンホールＳＰＥＣＴを行った。マイクロＣＴは、デュアルソースＣＴスキャナ（Skyscan 1178、Skyscan社、アールツェラール、ベルギー）使用して、６０ｋＶおよび６１５ｍＡで解像度８３μｍで行った。全身スキャン時間は２分であった。画像再構成は、フィルタ補正逆投影法（Ｎｒｅｃｏｎ、Skyscan社、アールツェラール、ベルギー）を使用して行った。全身ピンホールＳＰＥＣＴは、２台のマルチピンホールコリメータ（各コリメータに３個の１．５ｍｍのピンホール、２００ｍｍ焦点距離、回転半径８０ｍｍ）を搭載したデュアルヘッドガンマカメラ（ｅ．ｃａｍ１８０Siemens Medical Solutions社、ＩＬ、米国）を使用して注射後（ｐ．ｉ．）６０分または１８０分経過後に行った。画像は、１０秒間に６４回の投影で１２８ｘ１２８個のマトリックスとして全イメージング時間が１４分、３６０度にわたって取得した。ＳＰＥＣＴ画像は、３個のピンホール形状用に修正し、６個の５７Ｃｏ標識に基づいたＣＴとの融合用に自動的に再配向させた逐次再構成アルゴリズム（ＯＳＥＭ）を使用して再構成した。
【０１２９】
画像分析
画像再生・数値化は、ＡＭＩＤＥ医療用画像データ解析ソフトウェアを使用して行った。楕円形状の関心領域（ＲＯＩ）を、腫瘍および主要な臓器の周辺にとった。取り込み量を、注入した活性カウント数で除算し、ＲＯＩサイズに標準化して組織のカウント数として計算した（％ＩＡ／ｃｍ３）。高解像度画像３Ｄ再構成を、ＯｓｉｒｉＸイメージングソフトウェアを使用して求めた。
【０１３０】
体内分布分析
マイクロＣＴ／ＳＰＥＣＴ取得の３０分後に、マウスを致死量のペントバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ；CEVA社）で屠殺した。腫瘍、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、リンパ節、骨、心臓および血液を取り除き重さを測定し、放射活性を自動γカウンター（Cobra II Inspector５００３；Canberra-Packard社）を使用して測定した。組織および臓器の取り込み量を、崩壊に関して補正した、組織１グラムに対する注入した活性の百分率（％ＩＡ／ｇ）として計算した。
【０１３１】
統計
統計的有意性を、マイクロソフトエクセルまたはグラフパッドプリズム４．０ソフトウェアを使用してスチューデントｔ検定により決定した。差異は、Ｐ≦０．０５のとき有意であるとみなした。幾何平均および信頼区間は、マイクロソフトエクセルを用いて決定した。
【０１３２】
複数の比較がなされる場合（９〜１０の異なる臓器）、スチューデントｔ検定のｐ値は、Ｈｏｌｍ法によって補正した（Holm 1979, Scand J Stat 6: 65-70）。Ｒ環境（Ihaka and Gentleman 1996, J Comput Graph Stat 5: 299-314）およびhttp://CRAN.Rproject.org/package=multtestより入手可能なマルチテストパッケージ（Pollard et al. 2011）を統計分析および数値に使用した。スチューデントｔ検定の有意性および多重検定の補正は、０．０５と設定した。
【０１３３】
例１
ヒト腫瘍における腫瘍促進ＴＡＭ用マーカーとしてのＭＭＲの重要性
ヒト腫瘍における腫瘍促進ＴＡＭ用マーカーとしてのＭＭＲの重要性をテストするために、ヒト乳癌サンプル（VUB − UZ Brussel社）のパラフィン包埋切片におけるＭＭＲおよびＣＤ６８（ヒトマクロファージマーカーとして）の発現を評価した。同一の標本の連続したスライドおよび単一のスライド上の１つの二重染色に関する免疫組織化学を用いて、腫瘍および腫瘍領域内の線維化巣の両方においてＣＤ６８陽性マクロファージの存在を実証することができた。ＭＭＲ用の免疫染色により、線維化巣に見られるマクロファージがＭＭＲを共発現することがはっきりと示されてる（データー示さず）。腫瘍領域内の線維化巣が低酸素およびより悪い予後のマーカーであることは知られているので（Colpaert et al. 2003, Breast Cancer Res Treat 81: 137-47）、ＭＭＲ＋マクロファージの存在は、マウス腫瘍に関して既に示されたと同様に（米国特許第２０１１０２６２３４８号）、ヒト腫瘍における極度の低酸素の指標としても機能しうるものであろう。結論として、これらの研究は、ヒト乳癌サンプルにおいて、ＭＭＲ＋ＴＡＭが明らかに検出され、腫瘍内低酸素のマーカーであり悪い予後と相関していることが知られている線維化巣において濃縮されていることを示した。
【０１３４】
例２
抗ヒトＭＭＲＮｂの選択
抗ヒトＭＭＲナノボディを作成した（材料および方法の欄参照）。ヒトＭＭＲに対する抗ヒト／抗マウスＭＭＲファージバンクの４回のパニング操作の後、１回のパニング操作でｈＭＭＲ反応性ファージが１００倍まで濃縮することが観察された。従って、すべての操作から１８８個のコロニーをＰＥ発現用に選択した。これらのＰＥ抽出物を、どのクローンがｈＭＭＲと効果的に反応するかを決定するためにＰＥ−ＥＬＩＳＡに使用した。これらの結果に基づいて、合計１００個のクローンを選択した（図１）。更に、選択されたクローンのＤＮＡおよびタンパク質配列を決定し（表１）、二重クローンまたは未熟停止クローンを処分した。
【０１３５】
例３
抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂの選択
次に、抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディを作成した（材料および方法の欄参照）。抗ヒト／抗マウスＭＭＲファージバンクを、合計４回の操作でヒトおよびマウスＭＭＲで交互にスクリーニングし、２回目のパニング操作から１００倍まで濃縮したｈＭＭＲ／ｍＭＭＲ反応性ファージを得た。従って、２回目および３回目で得た１８８個のコロニーを、ＰＥ発現用に選択した。これらのＰＥ抽出物を、どのクローンがＭＭＲと効果的に反応するかを決定するためにＰＥ−ＥＬＩＳＡに使用し、ｈＭＭＲに関するＥＬＩＳＡの後クローンを選択した（図２）。その後、これらのクローンをマウスＭＭＲへの結合に関してスクリーニングした（図３）。両方の抗原と反応したクローンのみ（４２）を、真の交差反応性Ｎｂとして保存した。これらのクローンの配列を決定し（表２）、ＣＤＲ３領域に基づいてファミリーに分別した。
【０１３６】
例４
抗ヒトまたは抗ヒト／マウスＭＭＲＮｂの代表的なセットの作成
代表的なクローンのセットを、大腸菌におけるＮｂ産生用に選択した：（１）抗ヒトＮｂ：ＮｂｈＭＭＲｍ１．３３、ＮｂｈＭＭＲｍ１０．１９、ＮｂｈＭＭＲｍ２３．３０、ＮｂｈＭＭＲｍ２．１５、ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈＭＭＲｍ５．３８、ＮｂｈＭＭＲｍ１２．６、ＮｂｈＭＭＲｍ１１．５、ＮｂｈＭＭＲｍ１５．４３、ＮｂｈＭＭＲｍ１６．９５；（２）抗ヒト／マウスＮｂ：ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ６．７１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２４．３１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２０．５２、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２２．８４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１９．５２、ＮｂｈＭＭＲｍ２１．２２、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．９３、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１５．４９、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１７．７２、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１０．７９、ＮｂｈｍＭＭＲｍ７．６７、ＮｂｈＭＭＲｍ４．８３。各クローンは、２リットルの培養物で増殖した。発現および浸透圧ショックの後、得られた抽出物を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製した。得られた５ｍｌの溶出ＮｂをＰＢＳに透析した後、ナノドロップを使用して濃度を求め、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で純度を評価した。ナノボディはすべて大腸菌培養物１Ｌ中０．７〜９ｍｇのＮｂで生成した（表３）。
【０１３７】
例５
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ヒトまたは抗ヒト／マウスＭＭＲＮｂの代表的セットの動態速度定数の決定
選択したＮｂの組換えｈＭＭＲおよび組換えｍＭＭＲ抗原への結合特性および親和性を表面プラズモン共鳴を使用して更に詳細に調べた。結合センソグラムを各Ｎｂに関して記録し（例えば図５におけるＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９）、動態と平衡パラメーター（ｋｄ、ｋａ、ＫＤ）値を算出した（表４、表５）。マウスまたはヒトｒＭＭＲへの結合に関してこのＳＰＲ分析により得られた結果は、すべてではないがほとんどがＰＥ−ＥＬＩＳＡにより得られた結果と一致している。
【０１３８】
動態および平衡パラメーター（ｋｄ、ｋａ、ＫＤ）値に基づいて、交差反応性抗ｈｍＭＭＲＮｂの中から５個を更なる分析用に選択した（表４および表５に太線で示す）。これら５個のＮｂ（ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０およびＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９）はやや低い解離速度定数を示したが、そのためそれらはin vivoイメージング用として好適である。これらのナノボディの対応するＫＤ値６８ｎＭ〜２ｎＭの範囲であった。表４および表５のデータから、Ｎｂが好ましいＭＭＲ抗原を有することが明確に示された：ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８およびＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は、ｍＭＭＲＡｇと比較してｈＭＭＲＡｇに対してより高い親和性を有する。１回目の免疫およびパニング操作はｈＭＭＲ抗原を使用して行ったが、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０は、ｈＭＭＲＡｇと比較してｍＭＭＲＡｇに対してよく結合することが対照的である。
【０１３９】
例６
抗ヒトまたは抗ヒト／マウスＭＭＲＮｂの代表的なセットの細胞上に発現するＭＭＲへの結合のフローサイトメトリーによる決定
選択された５個のＮｂの、細胞上に発現したＭＭＲへの結合特異性を確認するために、フローサイトメトリー分析を行った。
【０１４０】
ＴＡＭが、ＭＭＲの発現において異なった分子的および機能的に特徴的なサブセットを含むという既に報告された発見、すなわちＭＭＲはＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭ上で高度に発現されており、一方ＭＭＲの発現はＭＨＣＩＩｈｉｇｈＴＡＭ上ではより少ない（Movahedi et al., 2010）ということを利用して、細胞に発現したマウスＭＭＲへの結合を、前臨床マウス腫瘍モデル由来の腫瘍関連マクロファージに関して決定した。図６に示すように、ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０およびＮｂｈＭＭＲｍ３．４９では、抗ｍＭＭＲＮｂクローン１の変化に比べて、蛍光強度における明らかな変化がＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭに関して検出できた。驚くべきことに、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８のＴＡＭへの結合は検出できなかった。
【０１４１】
選択されたＮｂのヒトＭＭＲへの結合特異性を検討するために、ヒト未熟単球由来樹状細胞を生成し、ＣＤ１１ｃ＋細胞に関してゲートした。図７に示すように、ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８およびＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９の未熟樹状細胞上に発現したｈＭＭＲへの結合が明らかに検出され、一方ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０では、蛍光強度における有意な変化は検出できなかった。
全体的にみて、フローサイトメトリー分析では、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８がヒトＭＭＲ上に発現した細胞に結合することが示唆されているが、マウスＭＭＲには結合しない。対照的に、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０は、元の抗マウスＭＭＲクローン１への結合と同様のパターンを有し、マウスへは結合するがヒトＭＭＲへは結合しない。ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４およびＮｂｈＭＭＲｍ３．４９は、細胞上に発現したマウスおよびヒトＭＭＲの両方に結合する。
【０１４２】
例７
担３ＬＬ腫瘍マウスにおける抗ヒトまたは抗ヒト／マウスＭＭＲナノボディの代表的なセットを用いた組織分布実験
次の工程において、選択された抗ヒトＭＭＲＮｂがＭＭＲ発現細胞のin vivoターゲティングに使用できるかどうかを評価した。ヒト未熟樹状細胞上のフローサイトメトリー分析によりＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０がヒトＭＭＲに結合しないことが明らかとなったので、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０は今回分析しなかった。ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１およびＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９が同一のＣＤＲ３ループを共有するが、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１と比較してＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は組換えＭＭＲへの親和性が良く、これら２個のナノボディのなかで、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９をin vivoターゲティング用に選択した。ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４およびＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８もこの例の使用のために選択した。フローサイトメトリー分析によれば、後者はマウスＭＭＲに結合しなかったので、それは組織における特異的結合および蓄積を除外するために使用することができるであろう。
【０１４３】
選択されたナノボディを９９ｍＴｃで標識し、担３ＬＬ腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。注射の３時間後、マウスを解剖し、主な臓器のおける放射線活性を測定した。図８に示すように、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４およびＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は、肺、脾臓、肝臓などの臓器に高い取り込み量を有し、ポジティブコントロール抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）と同様の組織分布パターンを示した。ここで、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９および抗マウスＭＭＲナノボディクローン１と比較して、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４はこれらの臓器においてより高い取り込み量を示した。対照的に、ネガティブコントロールであるＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８およびＮｂｃＡｂＢｃＩＩ１０は、主に腎臓においてトレーサーの高い取り込み量を示し、腎クリアランスを示唆している。ＭＭＲナノボディをＭＭＲノックアウトマウスにも接種したところ、肝臓と脾臓における取り込み量が１％ＩＡ／ｇ以下に低下した（図８）。これらのデータは、肝臓や脾臓などの臓器におけるＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９および抗マウスＭＭＲナノボディクローン１の蓄積は、ＭＭＲ発現に関連しており、従ってこれらの内臓において発現する内因性ＭＭＲへの特異的なターゲティングを反映している。
【０１４４】
図９および図１０に示すように、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は、ポジティブコントロールである抗マウスＭＭＲナノボディクローン１（配列番号２４７）と同様の腫瘍ターゲティング能力を有する。驚くべきことに、肝臓や脾臓などの臓器における内因性ＭＭＲへのターゲティングの向上を示したＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４の腫瘍ターゲティング能力は、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９や抗マウスＭＭＲナノボディクローン１と比較してより低かった。
【０１４５】
表１
ファージディスプレイから単離した単一のＮｂクローンからのＰＥ抽出物のヒトＭＭＲ上のＥＬＩＳＡ後に選択した抗ヒトＭＭＲのＮｂ。ここに厳密に示すＮｂ配列に追加して、すべてのクローンがＨＡおよび６ｘＨｉｓタグ（ＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ；配列番号２６２）を含有するＣ末端伸長部を有する。ＦＲおよびＣＤＲは、表６に別途示した。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２】
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【０１４８】
表２
ファージディスプレイから単離した単一のＮｂクローンからのＰＥ抽出物のヒトＭＭＲおよびマウスＭＭＲ上のＥＬＩＳＡ後に選択した抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂ。ここに厳密に示すＮｂ配列に追加して、すべてのクローンがＨＡおよび６ｘＨｉｓタグ（ＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ；配列番号２６２）を含有するＣ末端伸長部を有する。ＦＲおよびＣＤＲは、表６に別途示した。
【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
【表４】
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【０１５１】
表３
抗ヒトＭＭＲおよび抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂの産生収率および物理化学特性。すべてのＮｂが大腸菌培養物１Ｌにつき０．７〜９ｍｇで産生した。Ｔ．Ｂ．Ｄ．：未決定。表に示すアミノ酸（Ａ．Ａ．）の数および分子量（ＭＷ）は、ＨＡおよび６ｘＨｉｓタグを含む。
【０１５２】
【表５】
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【０１５３】
【表６】
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【０１５４】
表４
マウスＭＭＲに対する抗ＭＭＲナノボディのＳＰＲ動態および平衡パラメーター
Ｎｂ：ナノボディ；ＳＥ：標準誤差；ＮＢ：結合なし．
【表７】
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【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
表５
ヒトＭＭＲに対する抗ＭＭＲナノボディのＳＰＲ動態および平衡パラメーター
Ｎｂ：ナノボディ；ＳＥ：標準誤差；ＮＢ：結合なし．
【表９】
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【０１５７】
【表１０】
0006411333.tif 000011
【０１５８】
表６
ＭＭＲ特異的ナノボディのＣＤＲ
【表１１】
0006411333.tif 000012
【０１５９】
【表１２】
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【０１６０】
【表１３】
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【０１６１】
【表１４】
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【０１６２】
【表１５】
0006411333.tif 000016
【０１６３】
【表１６】
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【０１６４】
表７
ヒトおよびマウスマクロファージマンノース受容体のアミノ酸配列
【表１７】
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【０１６５】
【表１８】
0006411333.tif 000019
【０１６６】
【表１９】
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【０１６７】
【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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