(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子発現の調節に有効である、神経変性疾患の処置のための組成物であって、
Ｐｔ（ＩＩ）およびＰｔ（ＩＶ）から選択される白金中心を含み、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶから選択される式を有する、１以上の単離されたモノマー白金錯体またはその医薬的に許容しうる塩：
【化１】
0006382231.tif 000008
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから選択され、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；各Ｒ３は、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択され；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸から選択される］
を含む、上記組成物。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ３が、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
単離されたモノマー白金錯体が、１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
単離されたモノマー白金錯体が、（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
単離されたモノマー白金錯体が、シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
単離されたモノマー白金錯体が、１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
単離されたモノマー白金錯体が、（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該組成物がさらに、アジュバント、希釈剤、ビヒクルまたは医薬的に許容しうるキャリヤーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
以下の（１）〜（６）から選択される１以上の単離されたモノマー白金錯体を含む、神経変性疾患を処置するための組成物：
（１）  シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（２）  １，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（３）  １，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（４）  （トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（５）  （トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；および
（６）  医薬的に許容しうるそれらの塩。
【請求項１２】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子発現の調節に有効である、神経変性疾患を処置するための組成物であって、
ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離された白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルと、を含む、上記組成物。
【請求項１３】
神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、ならびに糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
静脈内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、眼内投与または経皮投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
癌療法の施行に付随する神経毒性を低減するための組成物であって、
ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離されたモノマー白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルと、を含む、上記組成物。
【請求項１６】
癌療法が化学療法薬である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
化学療法薬が、パクリタキセル、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、エリブリンメシル酸塩、イキサベピロン、シスプラチン＆オキサリプラチン、メトトレキサート、およびブスルファンから選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
癌療法が放射線療法である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
癌療法を同時に施行する、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１３年２月２２日出願の米国仮特許出願第６１／７６８０３６号に対する優先権を主張するものである。上記出願の全体を、本明細書中で参考として援用する。
【０００２】
本発明は、神経保護剤としてのホスファプラチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、いくつかの興味深い生物学的活性を、もっとも顕著には、強力な抗血管新生剤または抗血管形成剤および神経栄養因子として示す。色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の発現は、網膜および中枢神経系（ＣＮＳ）に由来する細胞に関するニューロンの分化および生存因子と関連付けられている。ＰＥＤＦは、小脳、海馬および脊髄を包含する領域からのニューロンに対し神経栄養効果を有する。神経毒性も、癌の処置のための化学療法薬の投与にしばしば関連づけられる。したがって、抗癌薬に付随する重度の神経毒性に起因して、積極的な癌の処置は限定される。ＰＥＤＦは、さまざまな神経疾患を処置するための遺伝子療法のための、ならびに、腫瘍および異常な血管新生に付随する他の疾患、例えば加齢性黄斑変性症を処置するための、魅力的な標的である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＥＤＦ発現を安定化することを対象とする従来技術の方法は、あまりうまくいっていない。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＥＤＦの安定な発現をもたらす組成物および方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
[0003]いくつかの態様において、本開示は、図１に示す一般式を有する白金（ＩＩ）および（ＩＶ）の１以上の単離された白金錯体を含む、神経変性疾患の処置のための組成物を提供する。これに関し、Ｒ１およびＲ２は、置換もしくは非置換の脂肪族アミンまたは置換もしくは非置換の芳香族アミンからそれぞれ独立して選択される中性単座配位子を表すか、あるいは、Ｒ１およびＲ２の両方に置き換わり、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択される、単一の中性二座配位子Ｒ３を表し、Ｒ１およびＲ２は、白金金属中心に配位しており、単座配位子では、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく、Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸およびアルファ−ヒドロキシ酸または白金金属中心に配位しているそれらの荷電種から選択される。特定の態様において、Ｒ１およびＲ２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。特定の態様において、Ｒ３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。特定の態様において、該化合物の医薬的に許容しうる塩を特許請求する。具体的には、該組成物は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、および糖尿病関連の末梢神経障害から選択される神経疾患の処置に有効であることができる。
【０００５】
[0004]いくつかの態様において、該組成物はさらに、治療的に有効な量の１以上の提供された錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、例えば、キャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを含む。具体的には、該組成物は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、および糖尿病関連の末梢神経障害から選択される神経疾患の処置に有効であることができる。
【０００６】
[0005]本開示の他の態様は、神経変性疾患の処置を必要としている対象における神経変性疾患の処置方法に関する。そのような方法は、前記対象に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを投与することを含む。
【０００７】
[0006]本開示の他の態様は、図１に示す一般式を有する１以上の単離された白金錯体を含む抗血管形成組成物を対象する。これに関し、Ｒ１およびＲ２は、置換もしくは非置換の脂肪族アミンまたは置換もしくは非置換の芳香族アミンからそれぞれ独立して選択される中性単座配位子を表すか、あるいは、Ｒ１およびＲ２の両方に置き換わり、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択される、単一の中性二座配位子Ｒ３を表し、Ｒ１およびＲ２は、白金金属中心に配位しており、単座配位子では、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸およびアルファ−ヒドロキシ酸または白金金属中心に配位しているそれらの荷電種から選択される。
【０００８】
[0007]特定の態様において、Ｒ１およびＲ２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。特定の態様において、Ｒ３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。特定の態様において、該化合物の医薬的に許容しうる塩を特許請求する。いくつかの態様において、該組成物はさらに、治療的に有効な量の１以上の提供された錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、例えば、キャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを含む。
【０００９】
[0008]さらに他の態様において、本開示は、血管形成の阻害を必要としている対象における血管形成の阻害方法であって、前記対象に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
[0009]本開示の他の態様は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子の発現の調節を必要としている個体における該遺伝子の発現の調節方法を対象とする。そのような方法は、前記個体に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記錯体を投与することを含む。
【００１１】
[0010]本開示のさらに他の態様において、癌療法の施行に付随する神経毒性の低減を必要としている対象における前記神経毒性の低減方法であって、前記神経毒性の低減を必要としている個体に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記錯体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、癌療法は化学療法薬である。他の態様において、癌療法は放射線である。いくつかの態様において、癌療法は、錯体の少なくとも１つと同時に施される。
【００１２】
[0011]以下でより詳細に説明するように、本開示の組成物および方法は、ＰＥＤＦ発現の調節および安定化を介して神経変性疾患の処置を提供する。これに加えて、本開示の組成物および方法は、癌を含む非常に多くの疾患に関連する血管形成を阻害する。
【００１３】
[0012]本発明の上記および他の利点および目的を達成する方法を示すために、先に簡単に記載した本発明のより詳細な説明を、添付図面に例示する本発明の特定の態様を参照することにより行う。これらの図面は本発明の典型的な態様を示しているに過ぎず、したがって本発明の範囲を限定するものとみなすべきではないことを理解して、本発明を、添付図面の使用によって、追加的な特殊性および詳細について記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0013]  図１は、本発明の単離された白金（ＩＩ）および（ＩＶ）化合物の一般式を示す。
【図２】[0014]  図２は、本発明の代表的な白金（ＩＩ）および（ＩＶ）錯体、すなわち、（Ａ）Ｒ，Ｒ−トランス−１，２−シクロヘキサン−ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）、ＲＲＤ２としても知られる；（Ｂ）ｃ−Ｓ，Ｓ−トランス−１，２−シクロヘキサン−ジアミン（二水素ピロホスフェート白金（ＩＶ）、（Ｃ）Ｒ，Ｓ−シス−１，２−シクロヘキサン−ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；（Ｄ）Ｒ，Ｒ−トランス−１，２−シクロヘキサン−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）、ＲＲＤ４としても知られる；（Ｅ）Ｓ，Ｓ−トランス−１，２−シクロヘキサン−ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；および（Ｆ）Ｓ，Ｒ−シス１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；の構造を示す。
【図３】[0015]  図３Ａは、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における対照での１２時間処理後に免疫蛍光法により測定したＰＥＤＦタンパク質の発現を示す（左パネル）。右パネルはＤＡＰＩでの核染色を示す。図３Ｂは、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における２０μＭの化合物Ｉでの１２時間処理後に免疫蛍光法により測定したＰＥＤＦタンパク質の過剰発現を示す（左パネル）。右パネルはＤＡＰＩでの核染色を示す。図３Ｃは、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における２５μＭの化合物ＩＶでの１２時間処理後に免疫蛍光法により測定したＰＥＤＦタンパク質の過剰発現を示す（左パネル）。右パネルはＤＡＰＩでの核染色を示す。
【図４】[0016]  図４は、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における２０μＭおよび２５μＭの化合物ＩおよびＩＶでの３時間、６時間および１２時間の処理後にウェスタンブロッティングにより測定したＰＥＤＦタンパク質の過剰発現を示す。Ｂ−アクチン（対照として使用）を一番下のパネルに示す。
【図５ＡＢ】[0017]  図５Ａは、１０μＭのＲＲＤ４によるＨＵＶＥＣにおける血管新生（管形成）の阻害を示す。図５Ｂは、１μＭのＲＲＤ２によるＨＵＶＥＣにおける血管新生（管形成）の阻害を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１μＭのＲＲＤ２によるＨＵＶＥＣにおける血管新生（管形成）の阻害を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、１０μＭのＲＲＤ４によるＨＵＶＥＣにおける血管新生（管形成）の阻害を示す。ホスファプラチン化合物は３０分間処理の後にＨＵＶＥＣ管形成を阻害した。０．１％ゼラチンおよびマトリゲルで予めコーティングしてある９６ウェルプレート中にＨＵＶＥＣを播種した後、漸増濃度の化合物で処理したもの対未処理細胞。管形成を、処理中のさまざまな時間点で倒立顕微鏡により調べた（倍率４０×）。
【図６】[0018]  図６は、正常なヒト網膜色素上皮細胞の生存能力に対するホスファプラチン化合物１（本明細書中では“ＲＲＤ２”とよぶ）および化合物ＩＶ（本明細書中では“ＲＲＤ４”とよぶ）の効果を示す。ＡＲＰＥ１９細胞を漸増濃度（１〜１００μＭ）のＲＲＤ２およびＲＲＤ４で２４時間処理し、細胞の生存能力を、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0019]上記概要および以下の詳細な説明の両方とも代表的および説明的なものに過ぎず、特許請求するように、本発明を制限するものではないことを、理解すべきである。本出願では、特記しない限り、単数形の使用は複数形を包含し、“１つの(a)”または“１つの(an)”は“少なくとも１つ”を意味し、“または”の使用は“および／または”を意味する。さらに、“包含している(including)”という用語および他の形、例えば、“包含する(includes)”および“包含される(included)”の使用は、制限的ではない。また、“要素”または“成分”などの用語は、特記しない限り、１つの単位を含む要素または成分と、１より多くの単位を含む要素または成分の両方を網羅する。
【００１６】
[0020]本明細書中で用いられる節の見出しは、構成上の目的のために過ぎず、記載対象を限定するものと解釈すべきではない。本出願で引用するすべての文書または文書の一部、例えば、限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍および論文は、本明細書により、全体として本明細書中で任意の目的のために参考として明確に援用される。１以上の援用した文献および同様の材料において、ある用語が、本出願における該用語の定義と矛盾する様に定義されている場合、本出願が優先される。
【００１７】
[0021]さらに詳細に述べなくても、当業者なら、本明細書中の記載を用いて、本発明をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。本明細書中に記載する態様は、例示として解釈すべきであり、形はどうあれ、どんなものであれ、本開示の残りの部分を制約するものとして解釈すべきでない。好ましい態様を示し記載したが、当業者なら、本発明の精神および教示から逸脱することなく、その多くの変動および修正を加えることができる。したがって、保護の範囲は、上記記載により限定されず、請求項の対象のすべての等価物を含め、請求項によってのみ限定される。
【００１８】
[0022]本明細書中で引用するすべての特許、特許出願および公開物の開示内容を、本明細書により、本明細書中に記載するものと一致し、これを補足する手順上または他の詳細を提供する範囲において、本明細書中で参考として援用する。
【００１９】
[0023]本明細書中に記載する化合物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患、および他の神経変性疾患を含む神経変性状態の予防および／または処置に有用である。
【００２０】
[0024]これに加えて、本明細書中に記載する化合物はまた、腫瘍血管形成の予防のほか、異常な血管新生に付随する疾患、例えば加齢性黄斑変性症の処置に有用である。
[0025]さらに、本明細書中に記載する化合物は、化学療法に関連する神経毒性の処置または予防にも有用である。
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）
[0026]色素上皮由来因子は、最初に培養胎児網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞で発見された５０ｋＤａの細胞外分泌糖タンパク質であり（Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９８９）、ニューロンの保護に大いに関与する。ＰＥＤＦはセリンプロテアーゼ阻害物質（ＳＥＲＰＩＮ）ファミリーに属する。しかしながら、プロテアーゼ阻害物質である他の大部分のＳＥＲＰＩＮとは対照的に、ＰＥＤＦは、公知のプロテアーゼのいずれに対しても阻害作用を示さないと思われる。ＰＥＤＦは網膜色素上皮細胞により産生され、最初に網膜内および硝子体において高濃度で検出された（Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＰＥＤＦのｍＲＮＡは、ほとんどの組織、正常細胞タイプ（ニューロン細胞および非ニューロン細胞）および腫瘍に見いだされる。このタンパク質は、多くのヒト器官にも豊富に存在する。
神経保護因子としてのＰＥＤＦ
[0027]ニューロン細胞におけるＰＥＤＦタンパク質の発現の安定化は、例えば、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病および末梢神経障害などの神経変性疾患の処置として、ニューロン細胞の生存を潜在的に増大させることができる。脊椎動物の神経系の成長および発達に影響を及ぼすタンパク質神経栄養因子、すなわちニューロトロフィンは、中枢神経系および末梢における多様なニューロン群の分化、生存および機能の促進に重要な役割を果たすと考えられる。ＰＥＤＦタンパク質がさまざまな外因性および内因性傷害に対しニューロンの多大な保護をもたらす優れた能力は、数十年に及ぶ研究から明らかになった。このタンパク質は、虚血によって誘発される網膜症（Ｓｔｅｌｌｍａｃｈ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２００１）、糖尿病性網膜症、および他の神経学的障害（Ｙａｂｅ，Ｔ  Ｓａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を予防することが示されている。角膜の神経支配および神経再支配は、角膜創傷の治癒において非常に重要であることが示されている。このコンテクストでは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるグルタミン酸輸送の特異的欠損に基づく培養モデルを用いて、ＰＥＤＦが脊椎運動ニューロンを保護する能力が示されている。これに加えて、ＰＥＤＦの処理は、培養物中のニワトリ胚脊(embryonic chick)椎運動ニューロンの生存を用量依存的に著しく増大させて、培養された運動ニューロンの神経突起伸長を促進するほか、ｉｎ  ｖｉｖｏでの軸索切断された運動ニューロンの死滅を防止する。グルタミン酸塩の公知の神経毒性は、プログラム細胞死における重要な機序であると考えられ、したがって、さまざまな神経変性障害に関連する。ＰＥＤＦ発現は、小脳顆粒細胞においてグルタミン酸によって誘発されるアポトーシスを阻害することが示されている。これは、転写因子ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化によって媒介されることが示されている；しかしながら、ＰＥＤＦは抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＭｎ−ＳＯＤを調節しなかった。ＰＥＤＦのこの神経保護特性は、血管形成の阻害におけるその役割と無関係である（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
抗血管形成因子としてのＰＥＤＦ
[0028]ＰＥＤＦは、眼血管新生の異常な血管成長の強力な阻害物質として示されている（Ｓｔｅｌｌｍａｃｈ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ，２００１）。ＰＥＤＦアンギオスタチンは、以前の十分に研究されている抗血管形成因子と比較して、哺乳類の眼における血管新生のより良好な阻害物質として実証されている。さらに、低酸素条件下では、ＶＥＧＦ分泌が多く、ＰＥＤＦ発現が少ないことが観察されている。ＰＥＤＦの硝子体内注射は、光に暴露したラットにおいて、形態学的および機能的な悪化からの網膜光受容体の保護効果を有することが示されている。ラットにおいて虚血によって誘発された網膜症を含む他のモデルでは、ＶＥＧＦレベルはＰＥＤＦレベルより高度に増大することが見いだされた。これに関し、ＶＥＧＦ−ＰＥＤＦ比は、観察される網膜血管新生と相関しており、網膜血管新生に寄与する可能性がある血管形成の刺激物質と阻害物質のバランスが損なわれたことが示唆された。
【００２１】
[0029]さらに、転移性癌患者は、減少または欠失したＰＥＤＦタンパク質を有することが実証されている。結腸直腸、肺、卵巣、乳房および他の癌を含むさまざまな転移性癌の不良な予後は、ＰＥＤＦの段階的損失と直接関連づけられている。その神経向性および神経保護性の役割に加え、ＰＥＤＦはまた、脂質代謝（Ｃｈｕｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）および肝細胞再生（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃａｓｔｉｌｌｅｊｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）を含むさまざまな経路に調節因子として関わっている。さらに、アルツハイマー病をもたらすアミロイド斑の形成に大きく関与するペプチドであるアミロイドベータは、ＰＥＤＦのｍＲＮＡレベルを低下させることが示されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。その卓越した神経保護的および抗血管形成的役割に起因して、ＰＥＤＦは、黄斑変性（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）および神経変性（Ｙａｂｅ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ  ２０１０）を含むさまざまな疾患および転移を処置するための遺伝子療法で標的にされている。残念ながら、ＰＥＤＦ遺伝子は不安定なので、そのような戦略はある程度しか成功を収めていない。例えば、ＰＥＤＦ導入遺伝子の発現は、細胞培養では安定であることが見いだされているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現はマウスモデルにおいて数時間以内に失われた（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、ＰＥＤＦ遺伝子の脳への送達は、依然として主要課題である。
ホスファプラチン
[0030]ホスファプラチンは、ホスフェートが結合している白金（ＩＩ）および白金（ＩＶ）配位化合物であり、米国特許公報第７７００６４９号、第８４４５７１０号および第８０３４９６４号ならびに米国特許出願第１３／７０１３１３号に記載されており、本明細書中で参考により完全に援用する。また、安定なモノマー白金（ＩＩ）および（ＩＶ）ピロホスフェート錯体の合成および単離方法は、米国特許公報第７７０６４９号および第８０３４６９４号ならびに米国特許出願第１３／７０１３１３号に記載されており、本明細書中で参考により完全に援用する。
【００２２】
[0031]ピロホスフェートが配位している白金−（ＩＩ）および−（ＩＶ）化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験（Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）およびＳｃｉｄマウスおよびヌードマウスを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ実験（Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）の両方により実証されているように、多様なヒト癌に対し優れた抗腫瘍活性を示す。さらに、これらの化合物は、現在癌の化学療法として用いられている他の白金化学療法薬に比べ、低下した毒性を示す。有効な抗癌剤としてのさまざまなホスファプラチンの有用性は文献に報告されているが、それらの神経変性疾患における治療薬としての可能性、化学療法薬に付随する神経毒性を低下させる可能性、または抗血管形成剤としての可能性は、評価または確立されていない。
【００２３】
[0032]本開示は、さまざまな用量の図１に記載するさまざまなホスファプラチン化合物を投与することにより、神経保護に関与する遺伝子、例えばＰＥＤＦ遺伝子の発現および転写を調節して、ＰＥＤＦタンパク質を安定に発現させることを対象とする。とりわけ、一般式Ｉ〜ＩＶ（図１）を有する化合物でヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）を含むさまさまな細胞を処理すると、ＰＥＤＦ遺伝子の２〜５倍の過剰発現がもたらされた。この過剰発現は、濃度と時間の両方に依存していた。例えば、２０および２５μＭの濃度の図２に示すホスファプラチン化合物Ａ（ＲＲＤ２とよぶ）およびＤ（ＲＲＤ４とよぶ）での３〜２４時間にわたるヒト卵巣細胞の処理は、時間依存性の過剰発現をもたらした。化合物Ｉは１２時間処理後に最大のＰＥＤＦタンパク質発現を示したが、化合物ＩＩの場合、免疫蛍光実験から示されるように、タンパク質の発現は１２時間を超えて増大し続ける。１２時間処理の例を図３に示す。ＰＥＤＦの過剰発現の誘因は、多数の細胞機序に依存する。例えば、ＰＥＤＦの受容体因子は、とりわけ、ホスホリパーゼ２、コラーゲン、インテグリン、ＴＲＡＩＬであることが公知である。神経保護作用の媒介におけるＰＥＤＦの重要な役割を前提として、本開示は、神経変性疾患の処置に有効な組成物、および、神経変性疾患の処置を必要としている対象にホスホプラチン(phosphoplatin)化合物を投与することを含む、神経変性疾患の処置方法も対象とする。これに加えて、本開示は、癌患者における化学療法薬の投与に付随する神経毒性の低減方法も対象とする。さらに、本開示は、血管形成および血管新生の防止を必要としている個体における血管形成および血管新生の防止方法を開示する。これらのホスファプラチン化合物が血管形成血管新生を防止する能力を、ＨＵＶＥＣ細胞において管が形成しないことを示す実験により実証する。これらの実験の詳細を実施例４に詳しく記載する。
【００２４】
[0033]したがって、本明細書中でより詳細に開示する本開示の一観点は、神経変性疾患の処置のための組成物を提供する。いくつかの態様において、該組成物は、図１に示す一般式を有する白金（ＩＩ）および（ＩＶ）の１以上の単離された白金錯体を含む。これに関し、Ｒ１およびＲ２は、置換もしくは非置換の脂肪族アミンまたは置換もしくは非置換の芳香族アミンからそれぞれ独立して選択される中性単座配位子を表すか、あるいは、Ｒ１およびＲ２の両方に置き換わり、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択される、単一の中性二座配位子Ｒ３を表し、Ｒ１およびＲ２は、白金金属中心に配位しており、単座配位子では、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸およびアルファ−ヒドロキシ酸または白金金属中心に配位しているそれらの荷電種から選択される。特定の態様において、Ｒ１およびＲ２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。特定の態様において、Ｒ３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。特定の態様において、該化合物の医薬的に許容しうる塩を特許請求する。いくつかの態様において、該組成物はさらに、治療的に有効な量の１以上の提供された錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、例えば、キャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを含む。
【００２５】
[0034]一態様において、単離された白金錯体は、１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である。他の態様において、単離されたモノマー白金錯体は、（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である。さらに他の態様において、単離されたモノマー白金錯体は、シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。さらに他の態様において、単離されたモノマー白金錯体は、１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。いくつかの態様において、単離されたモノマー錯体は、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。一態様において、該組成物は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠から選択される神経疾患の処置に有効であることができる。
【００２６】
[0035]他の態様において、本開示は、神経変性疾患の処置を必要としている対象における神経変性疾患の処置方法を提供する。そのような方法は、前記対象に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを投与することを含む。関連する態様において、本明細書中に開示する方法は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、ならびに糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠から選択される神経疾患の処置に有効であることができる。
【００２７】
[0036]本開示の他の観点は、抗血管形成組成物に関する。いくつかの態様において、該組成物は、図１に示す一般式を有する白金（ＩＩ）および（ＩＶ）の１以上の単離された白金錯体を含む。これに関し、Ｒ１およびＲ２は、置換もしくは非置換の脂肪族アミンまたは置換もしくは非置換の芳香族アミンからそれぞれ独立して選択される中性単座配位子を表すか、あるいは、Ｒ１およびＲ２の両方に置き換わり、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択される、単一の中性二座配位子Ｒ３を表し、Ｒ１およびＲ２は、白金金属中心に配位しており、単座配位子では、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸およびアルファ−ヒドロキシ酸または白金金属中心に配位しているそれらの荷電種から選択される。特定の態様において、Ｒ１およびＲ２は、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される。特定の態様において、Ｒ３は、エチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される。特定の態様において、該化合物の医薬的に許容しうる塩を特許請求する。
【００２８】
[0037]いくつかの態様において、単離された白金錯体は１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である。他の態様において、単離されたモノマー白金錯体は（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である。さらに他の態様において、単離された白金錯体はシス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。さらに他の態様において、単離された白金錯体は１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。いくつかの態様において、単離された錯体はトランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である。特定の態様において、該組成物はさらに、アジュバント、希釈剤、ビヒクル、または医薬的に許容しうるキャリヤーを含む。
【００２９】
[0038]他の態様において、本開示は、血管形成の阻害を必要としている対象における血管形成の阻害方法を提供する。そのような方法は、前記対象に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを投与することを含む。関連する態様において、本明細書中に開示する方法は、加齢性黄斑変性症または糖尿病関連の網膜症に関連する血管形成、あるいは腫瘍に付随する血管形成の阻害に有効であることができる。
【００３０】
[0039]本開示の他の観点は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子の発現の調節を必要としている個体における前記遺伝子の発現の調節方法を提供する。そのような方法は、前記個体に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記錯体を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを投与することを含む。関連する態様において、本明細書中に開示する方法は、ＰＥＤＦ遺伝子発現を調節して神経栄養的、神経細胞栄養的、グリア静止的(gliastatic)または抗血管形成的効果を媒介するのに有効であることができる。具体的には、該方法は、眼の血管形成または血管新生の阻害に有効であることができる。一般に、眼血管形成は、加齢性黄斑変性症または糖尿病性黄斑浮腫により引き起こされる可能性がある。血管新生は、腫瘍関連の血管新生であることができる。
【００３１】
[0040]本開示の追加的態様において、癌療法の施行に付随する神経毒性の低減を必要としている対象における前記神経毒性の低減方法を提供する。そのような方法は、前記神経毒性の低減を必要としている個体に、治療的に有効な量の少なくとも１つの上記錯体を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルを投与することを含む。一態様において、施行される癌療法は化学療法である。具体的には、化学療法薬は、パクリタキセル、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、エリブリン、メシル酸塩、イキサベピロン、シスプラチン、オキシプラチン(oxiplatin)、メトトレキサート、ブスルファン、および多くの他のものから選択される。他の態様において、施行される癌療法は放射線である。関連する態様において、癌療法および少なくとも１つの錯体は同時に施される。
【００３２】
[0041]本明細書中で用いる“神経変性疾患”は、神経系の灰白質または白質またはその両方の変性が生じる疾患をさす。したがって、そのような疾患は、糖尿病性神経障害、老年性認知症、アルツハイマー病、軽度認識障害（ＭＣＩ）、認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉認知症、パーキンソン病、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん重積状態、非動脈炎性視神経症、椎間板ヘルニア形成、ビタミン欠乏症、クロイツフェルト・ヤコブ病などのプリオン病、毛根管症候群、さまざまな疾患、例えば、限定されるものではないが、尿毒症、ポルフィリン症、低血糖症、シェーグレン・ラルソン症候群、急性感覚性ニューロパチー、慢性失調性ニューロパチー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性多血症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン異常症に付随する末梢神経障害、さまざまな薬物（例えばメトロニダゾール）および毒素（例えば、アルコールまたはオルガノホスフェート）の合併症、シャルコー・マリー・ツース病、毛管血管拡張性運動失調、フリードライヒ失調症、アミロイド多発神経障害、副腎脊椎神経障害、巨大軸索神経障害、レフサム病、ファブリー病およびリポタンパク血症であることができる。
【００３３】
[0042]本明細書中に開示する処置方法は、個々の患者の臨床状態、投与部位および投与方法、投与スケジューリング、患者の性別、年齢、体重および他の因子を考慮して、適正な医療行為に従って施行される。したがって、本明細書中の処置のための治療的に“有効な量”は、当分野で公知の検討事項により決定される。該量は、改善、例えば、限定されるものではないが、より迅速な回復か、あるいは、症状およびの当業者が治療的に“有効な量”の適した尺度として選択することができる他の指標の改善または排除を達成するのに、有効でなければない。
【００３４】
[0043]本開示の処置方法では、本明細書中に開示する錯体をさまざまな方法で投与することができる。それらは、錯体として投与することができ、これらの錯体の優れた溶解性を活用して水溶液で単独投与するか、活性構成成分として、医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて投与することができることに、留意すべきである。これらの錯体は、経口、皮下または非経口、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、扁桃内、および鼻腔内のほか、くも膜下および注入技術により投与することができる。錯体の埋め込みも有用である。処置される患者は温血動物、とりわけ、ヒトを含む哺乳類である。医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルならびに埋め込みキャリヤーは、一般に、本発明の活性構成成分と反応しない不活性で非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入材料をさす。
【００３５】
[0044]投与は、単回投与または数日間にわたる複数回投与であることができる。一般に、処置は、疾患経過の長さおよび薬物の有効性および処置されている患者の種に対応する長さを有する。
【００３６】
[0045]本開示の錯体を非経口投与する場合、それらは一般に単位用量の注射剤形（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化される。注射に適した医薬製剤としては、無菌の水溶液または懸濁液、および注射可能な無菌の溶液または分散中に再構成するための無菌粉末が挙げられる。キャリヤーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適した混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒であることができる。
【００３７】
[0046]適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散物の場合は必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。非水性ビヒクル、例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油または落花生油、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルも、組成物の溶媒系として用いることができる。これに加えて、抗菌性保存剤、酸化防止剤、キレート化剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性、無菌性および等張性を高めるさまざまな添加剤を、加えることができる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗菌物質および抗真菌物質、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確実にすることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを包含することが望ましい。注射可能な医薬剤型の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により、もたらすことができる。しかしながら、本開示に従って、用いられる任意のビヒクル、希釈剤または添加剤は、本錯体に適合するものでなければならない。
【００３８】
[0047]注射可能な無菌溶液は、本発明の実施に利用される錯体を、必要に応じてさまざまな他の構成成分と一緒に必要量の適切な溶媒に組み込むことにより、調製することができる。
【００３９】
[0048]本発明の医薬製剤は、さまざまなビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤などの任意の適合性キャリヤーを含有する注射可能な製剤として、患者に投与することができ；あるいは、本発明で利用される錯体は、徐放性皮下埋込み物の形で、または、モノクローナル抗体、ベクター性送達(vectored delivery)、イオン泳動、ポリマーマトリックス、リポソームおよび小球体などの標的送達システムの形で、患者に非経口投与することができる。他の多くのそのような埋込み物、送達システムおよびモジュールが、当業者に周知である。
【００４０】
[0049]上記開示内容から、当業者なら、本開示の方法およびシステムは、多数の追加的態様を有することができることを理解するであろう。ここで、本開示のより具体的な態様、およびそのような態様を裏付ける実験結果について記載する。しかしながら、出願人は、以下の開示内容が、例示を目的としているに過ぎず、決して特許請求する本発明の範囲を限定するものではないことを指摘しておく。
【実施例】
【００４１】
実施例１
ヒト癌細胞におけるＰＥＤＦ遺伝子の過剰発現
[0050]５％ＣＯ２ガスが継続的に供給されている３７℃のインキュベーター内で、ヒト卵巣癌細胞株Ａ２７８０（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、０．２５単位／ｍＬのインスリンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ）を補足したＲＰＭＩ培地１６４０を用いることにより、１００ｍｍ３プレート中で単層培養した。該細胞を、それぞれ５μＭおよび１３μＭのＲＲＤ２およびＲＲＤ４のいずれかで３回繰り返して２４時間処理した。該細胞を０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡにより収集し、遠心分離した。その後、細胞のペレットをＰＢＳに再び懸濁させ、ＰＢＳで３回洗浄し、ペレット化した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）をハンドブックのプロトコルに従って用いて、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの量を２６０ｎｍの吸光度において分光光度法で測定し（１Ａｂｓ２６０＝４０ｕｇ／ｍＬ）、ＲＮＡの性質Ａ２６０：Ａ２８０比を１．８〜２．０で測定した。各実験に関し、ＲＴ２ファーストストランドキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて０．９μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、製造元のプロトコルに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機を備えるＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）ＰＡＨＳ−０２４Ｃヒト血管形成アレイ上で分析した。各ウェルについて閾値サイクル（Ｃｔ）およびベースラインを計器のソフトウェアにより決定し、得られたＣｔ値を、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒａｒｒａｙｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ．ｐｈｐ）を用いて解析した。フォールド調節(fold regulation)を決定するためのハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチンおよび／またはＧＡＤＰＨを用いた。
【００４２】
[0051]２段階ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによりＰＥＤＦに関する個々の遺伝子発現を評価した。最初に、ＲＮＡの単離および精製を上記のように行った。ＲＴ２ファーストストランドキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用い、合計２μｇの全ＲＮＡを用いて鋳型を一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。第２段階において、合成されたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲマスターミックス検出および内在性コントロールβ−アクチンおよび／またはＧＡＤＰＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）と一緒に用いられるｑＲＴ−ＰＣＲ  ＲＴ２  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（ＰＥＤＦ）に付した。処理細胞および未処理細胞からのｃＤＮＡ試料を包含するすべてのＰＣＲ反応を、３回繰り返して行った。定量的リアルタイムＰＣＲ反応を、ＳｔｅｐＯｎｅ  ＰＣＲ機、４８ウェルシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）で、製造元のプロトコルに従って実施した。ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア  ｖ２．１を用いて結果を得た。ｍＲＮＡ発現レベルにおける相対的差異を示すために、２−ΔΔＣｔ法を用いた。
【００４３】
[0052]表１：内在性コントロールβ−アクチンおよび／またはＧＡＤＰＨに対しΔΔＣｔ法により算出した、ＲＲＤ２およびＲＲＤ４で処理した後のＰＥＤＦの発現のフォールド変化(fold change)。
【００４４】
【表１】
0006382231.tif 000002
【００４５】
実施例２
[0053]免疫蛍光法により決定した、ホスファプラチンにより媒介されたＰＥＤＦタンパク質発現
[0054]前処理を行ったカバースリップを含有する６ウェルプレートに、２．０ｍＭのＬ−グルタミンを含有し、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ユタ州）、および０．２５単位／ｍＬの組み換え型ヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，メリーランド州）を補足した２．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，メリーランド州）中の５００〜１０００細胞のＡ２７８０ヒト卵巣癌細胞株を播種した。８０％の集密度に達している細胞を、さまざまな時間間隔（３、６、１２または２４時間）でホスファプラチン化合物のＲＲＤ２およびＲＲＤ４で処理した。各カバースリップをＰＢＳで３回洗浄し、細胞を、室温において新たに調製した４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。その後、固定細胞をＰＢＳで３回洗浄した。これらの細胞を透過処理し、３７℃において７．５％ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％トリトン−Ｘ１００で６０分間ブロッキングした後、該細胞をＰＢＳで２回洗浄した。カバースリップを、３７℃において７．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％トリトン中の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ：セルピンＦ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１としても知られる）マウス一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，マサチューセッツ州）の１：３００希釈物で１２〜１５時間にわたり処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。該カバースリップを、３７℃の暗所において７．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％トリトン−Ｘ１００中の１：５０００希釈での二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ−Ｇｒｅｅｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）と一緒に１時間にわたりインキュベートした。その後、該カバースリップをＰＢＳでさらに３回洗浄した。これに加えて、いくつかの処理でベータ−アクチンを染色し、３７℃の暗所において７．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％トリトン−Ｘ１００中のファロイジン（ローダミン）（赤）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）（７ｕＬ／ｍＬ）で１時間にわたり染色した。その後、湿ったカバースリップを、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（青）を含有するＵｌｔｒａｃｒｕｚマウント媒体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州）を用いて顕微鏡スライド上にマウントし、続いて、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  Ｎ  ６０Ｘ  １．４２ＮＡ油浸対物レンズを用いるＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ−１０００倒立ステージ(inverted stage)共焦点顕微鏡で像を収集し、ＦｌｕｏＶｉｅｗソフトウェアにより処理した。ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における２０μＭおよび２５μＭの化合物ＩおよびＩＶでの１２時間処理の後、ＰＥＤＦタンパク質の過剰発現または上方調節(upregulate)（左パネル）が見いだされた（図３Ａ〜３Ｃ）。
実施例３
ウェスタンブロットによるタンパク質発現
[0055]２０μＭのＲＲＤ２および２５μＭのＲＲＤ４で３、６および１２時間にわたり処理したヒト卵巣癌細胞（８０〜９０％の集密度で６０ｍｍ３プレートに約１×１０６細胞）株をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬのＲＩＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）またはＭＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）で直接処理することにより、全タンパク質を抽出した。タンパク質抽出試料（５０μｇ）を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上にブロットした。該ブロットを、ＴＢＳＴ［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０］で洗浄し、４℃において５％の脱脂乳および１％のＢＳＡで一晩ブロッキングし、５％の脱脂乳および１％のＢＳＡを含むＴＢＳＴ中の１：５００希釈でのマウス抗ＰＥＤＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）一次抗体と一緒に、４℃において一晩インキュベートした。その後、該膜をＴＢＳＴで洗浄し、一次抗体を、室温において、１：２５００希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて１．５時間にわたり検出した。ブロットを、増強した化学発光（ＥＣＬ）で展開し、Ｘ線フィルムに露光した。該ＰＶＤＦ膜をストリッピング溶液で１．５時間ストリッピングし、ローディングを決定するためにマウス抗β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）一次抗体で再び精査した。実質的に、ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）における２０μＭおよび２５μＭの化合物ＩおよびＩＶでの３時間、６時間および１２時間の処理の後、ＰＥＤＦタンパク質発現は上方調節された（図４）。
実施例４
ホスファプラチンによるＨＵＶＥＣ細胞の血管新生の阻害：ＨＵＶＥＣ管形成アッセイ
[0056]０．１％ゼラチンおよび４０ｕＬのマトリゲルで予めコーティングしてあり、２０％加熱不活性化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ユタ州）、１００μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，メリーランド州）および内皮マイトジェン（Ｂｉｏｍｅｄｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，マサチューセッツ州）を補足した培地１９９（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，メリーランド州）中の漸増濃度のホスファプラチン化合物、ＲＲＤ２およびＲＲＤ４で処理した９６ウェルプレート中に、２００００細胞のＨＵＶＥＣを播種して、内皮細胞管形成アッセイを実施した。簡潔にまとめると、マトリゲルを４℃で一晩解凍し、０．１％ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレートを冷やし、４０μＬのマトリゲルを各ウェル中にコーティングした。その後、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。該９６ウェルプレートに２×１０４細胞のＨＵＶＥＣを播種した。２４時間の細胞付着の後、各ウェルを、３７℃および５％ＣＯ２において漸増濃度のＰｔ化合物で一晩（８〜１０時間）処理した。その後、形成した毛管／管形成構造を倒立顕微鏡により記録し、定量した。細胞は、１．５７５ｍｍの全視覚範囲で計数した。
【００４６】
[0057]内皮細胞管形成におけるＲＲＤ２およびＲＲＤ４の抗血管形成挙動をさらに調べるために、われわれは、ＨＵＶＥＣをさまざまな濃度のＲＲＤ２およびＲＲＤ４（図２の化合物ＡおよびＤ）でマトリゲル上に処理した。３０分のインキュベーション後、倍率４０×の倒立顕微鏡で管様構造をモニタリングした。濃度０．５μＭにおいて、化合物ＡおよびＤは両方とも、非常に短いインキュベーション期間において、マトリゲル上でのアッセイでＨＵＶＥＣ細胞管形成能力のそれぞれ８５％超〜９０％を阻害することを示した（図５Ａ〜５Ｄ）。３０分の処理期間後、管形成の証拠はみられなかった。
実施例５
細胞生死判別アッセイ
[0058]Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて、培養物中の生存細胞数をＡＴＰの定量により決定した（Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）。簡潔にまとめると、ＡＲＰＥ１９細胞、すなわち正常ヒト網膜色素上皮細胞株を、１ウェルあたり１００００〜３００００細胞で９６ウェルプレートに播種し、２４時間放置して付着させた。その後、該細胞を、１〜１００μＭの範囲のさまざまな濃度のＲＲＤ２またはＲＲＤ４で２４時間処理した。検出試薬を製造元のプロトコルにより調製し、等体積のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を細胞培養物の各ウェルに加え、０．２５〜１秒に設定した積分時間で発光を読み取った。Ｇｌｏ  ｔｉｔｅｒ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙは、１ウェルあたり０〜５００００細胞の線形範囲を有する。各濃度を３回繰り返して行った。
【００４７】
[0059]いずれの試験ホスファプラチンも、高用量（１００μＭ）での２４時間処理の後であっても、ＡＲＰＥ１９網膜細胞の生存能力に影響を及ぼさなかった（図６）。これらの結果は、ＲＲＤ２およびＲＲＤ４化合物は両方とも、さまざまなヒト癌細胞株、すなわち、卵巣癌、結腸癌および前立腺癌においてサブマイクロモル（＜１μＭ）濃度で顕著な抗癌特性を示すが、正常細胞の生存能力に影響を及ぼさないことを示した。これらの結果は、ホスファプラチンによる癌細胞の選択的標的化を確証している。
【００４８】
[0060]さらに詳細に述べなくても、当業者なら、本明細書中の記載を用いて、本発明をその最大限の範囲まで利用することができると考えられる。本明細書中に記載する態様は、例示として解釈すべきであり、形はどうあれ、どんなものであれ、本開示の残りの部分を制約するものとして解釈すべきでない。好ましい態様を示し記載したが、当業者なら、本発明の精神および教示から逸脱することなく、その多くの変動および修正を加えることができる。したがって、保護の範囲は、上記記載により限定されず、請求項の対象のすべての等価物を含め、請求項によってのみ限定される。本明細書中で引用するすべての特許、特許出願および公開物の開示内容を、本明細書により、本明細書中に記載するものと一致し、これを補足する手順上または他の詳細を提供する範囲において、本明細書中で参考として援用する。
（１）  以下を含む、神経変性疾患の処置のための組成物：
Ｐｔ（ＩＩ）およびＰｔ（ＩＶ）から選択される白金中心を含み、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶから選択される式を有する、１以上の単離されたモノマー白金錯体：
【数１】
0006382231.tif 000003
これに関し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから選択され、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；各Ｒ３は、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択され；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸；または医薬的に許容しうるそれらの塩から選択され；そして、該組成物は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子発現の調節に有効である。
（２）  Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される、（１）に記載の組成物。
（３）  Ｒ３がエチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、（１）に記載の組成物。
（４）  単離されたモノマー白金錯体が１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、（１）に記載の組成物。
（５）  単離されたモノマー白金錯体が（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、（１）に記載の組成物。
（６）  単離されたモノマー白金錯体がシス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１）に記載の組成物。
（７）  単離されたモノマー白金錯体が１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１）に記載の組成物。
（８）  単離されたモノマー白金錯体がトランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１）に記載の組成物。
（９）  神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠からなる群より選択される、（１）に記載の組成物。
（１０）  該組成物がさらに、アジュバント、希釈剤、ビヒクルまたは医薬的に許容しうるキャリヤーを含む、（１）に記載の組成物。
（１１）  以下を含む、神経変性疾患を処置するための組成物：
以下から選択される１以上の単離されたモノマー白金錯体
（ｉ）シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｉ）１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｉｉｉ）１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｖ）（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｖ）トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；および
（ｖｉ）医薬的に許容しうるそれらの塩。
（１２）  神経変性疾患の処置方法であって、神経変性疾患の処置を必要としている対象に、ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および（１）に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離された白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを含む、治療的に有効な量の組成物を投与することを含み、該組成物が、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子発現の調節に有効である、前記処置方法。
（１３）  神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病関連の末梢神経障害、糖尿病に付随する脚および足の潰瘍、ならびに糖尿病関連の神経障害により誘発される疼痛および不眠からなる群より選択される、（１２）に記載の方法。
（１４）  投与が、静脈内、経口、皮下、筋肉内、眼内または経皮投与である、（１２）に記載の方法。
（１５）  以下を含む、抗血管形成組成物：
Ｐｔ（ＩＩ）およびＰｔ（ＩＶ）から選択される白金中心を含み、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶから選択される式を有する、１以上の単離されたモノマー白金錯体：
【数２】
0006382231.tif 000004
これに関し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して、置換または非置換の脂肪族または芳香族アミンから選択され、Ｒ１およびＲ２の一方がＮＨ３である場合、Ｒ１およびＲ２の他方はＮＨ３ではなく；各Ｒ３は、置換または非置換の脂肪族または芳香族ジアミンから選択され；Ｓは、独立して、水酸化物、酢酸、酪酸、およびアルファ−ヒドロキシ酸；または医薬的に許容しうるそれらの塩から選択され；そして、該組成物は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子発現の調節に有効である。
（１６）  Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、アミン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、シクロヘキサンアミン、アニリン、ピリジン、および置換ピリジンから選択される、（１５）に記載の組成物。
（１７）  Ｒ３がエチレンジアミンおよびシクロヘキサンジアミンから選択される、（１５）に記載の組成物。
（１８）  単離されたモノマー白金錯体が１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、（１５）に記載の組成物。
（１９）  単離されたモノマー白金錯体が（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）である、（１５）に記載の組成物。
（２０）  単離されたモノマー白金錯体がシス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１５）に記載の組成物。
（２１）  単離されたモノマー白金錯体が１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１５）に記載の組成物。
（２２）  単離されたモノマー白金錯体がトランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）である、（１５）に記載の組成物。
（２３）  該組成物がさらに、アジュバント、希釈剤、ビヒクルまたは医薬的に許容しうるキャリヤーを含む、（１５）に記載の組成物。
（２４）  以下を含む抗血管形成組成物：
以下から選択される１以上の単離されたモノマー白金錯体
（ｉ）シス−ジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｉ）１，２−エタンジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｉｉｉ）１，２−エタンジアミン−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；
（ｉｖ）（トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）；
（ｖ）トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン）−トランス−ジヒドロキソ（二水素ピロホスファト）白金（ＩＶ）；および
（ｖｉ）医薬的に許容しうるそれらの塩。
（２５）  さらに、アジュバント、希釈剤、ビヒクルまたは医薬的に許容しうるキャリヤーを含む、（２４）に記載の組成物。
（２６）  血管形成の阻害方法であって、血管形成の阻害を必要としている対象に、治療的に有効な量の、ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離された白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを投与する、ことを含む、前記方法。
（２７）  血管形成の阻害を必要としている対象が、加齢性黄斑変性症または糖尿病関連の網膜症を有する、（２６）に記載の方法。
（２８）  血管形成が腫瘍に関連する、（２６）に記載の方法。
（２９）  投与が、静脈内、経口、皮下、筋肉内、眼内または経皮投与である、（２６）に記載の方法。
（３０）  色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）遺伝子の発現の調節を必要としている個体における前記遺伝子の発現の調節方法であって、前記個体に、治療的に有効な量の、ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離されたモノマー白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを投与する、ことを含む、前記方法。
（３１）  ＰＥＤＦ遺伝子発現の調節が、神経栄養的、神経細胞栄養的、グリア静止的、または抗血管形成的なものである、（３１）に記載の方法。
（３２）  ＰＥＤＦ遺伝子発現の調節が眼の血管形成または血管新生を阻害する、（３１）に記載の方法。
（３３）  眼血管形成が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）により引き起こされる、（３２）に記載の方法。
（３４）  癌療法の施行に付随する神経毒性の低減を必要としている対象における前記神経毒性の低減方法であって、前記神経毒性の低減を必要としている個体に、治療的に有効な量の、ジアミン（二水素ピロホスファト）白金（ＩＩ）および請求項１に記載の錯体から選択される少なくとも１つの単離されたモノマー白金錯体と、少なくとも１つの医薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルとを投与する、ことを含む、前記方法。
（３５）  癌療法が化学療法薬である、（３５）に記載の方法。
（３６）  化学療法薬が、パクリタキセル、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、エリブリンメシル酸塩、イキサベピロン、シスプラチン＆オキサリプラチン、メトトレキサート、およびブスルファンから選択される、（３５）に記載の方法。
（３７）  癌療法が放射線療法である、（３４）に記載の方法。
（３８）  癌療法を同時に施行する、（３４）に記載の方法。
参考文献
【００４９】
【数１】
0006382231.tif 000005
【００５０】
【数２】
0006382231.tif 000006
【００５１】
【数３】
0006382231.tif 000007
【図１】
0006382231.tif 000009
【図２】
0006382231.tif 000010
【図３】
0006382231.tif 000011
【図４】
0006382231.tif 000012
【図５ＡＢ】
0006382231.tif 000013
【図５Ｃ】
0006382231.tif 000014
【図５Ｄ】
0006382231.tif 000015
【図６】
0006382231.tif 000016