(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）に属する植物由来の下記物理化学的性質を有し、かつ、免疫抑制の解除作用、付着性マクロファージ／単球の活性化作用、レトロウイルス逆転写酵素の阻害活性、及び／又は、抗ＨＩＶ活性を有する成分を含有する分離物。
物理化学的性質：
ａ）１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中で測定）の特徴的なスペクトル
４．４１ｐｐｍ（Ｈ−１（ｄ）  Ｊ１，２＝７Ｈｚ）、３．２３ｐｐｍ（Ｈ−２（ｄ，ｄ）  Ｊ２，３＝９Ｈｚ）、３．５ｐｐｍ（Ｈ−３（ｄ，ｄ）  Ｊ３，４＝９Ｈｚ）、３．７３ｐｐｍ（Ｈ−４（ｄ，ｄ，ｄ）Ｊ４，５ｅｑ＝４Ｈｚ）、３．３２ｐｐｍ（Ｈ−５ａｘ）、４．０６ｐｐｍ（Ｈ−５ｅｑ）５．２〜３．１ｐｐｍ（比較的低い強度の前記以外のスペクトル）、ここで、Ｈ−１、Ｈ−２他は、キシロースと対比したときの各水素原子の結合位置を意味する。
ｂ）１３Ｃ−ＮＭＲの特徴的なスペクトル
１０２．６ｐｐｍ（Ｃ−１）、７３．６ｐｐｍ（Ｃ−２）、７４．６ｐｐｍ（Ｃ−３）、７７．３ｐｐｍ（Ｃ−４）、６３．９ｐｐｍ（Ｃ−５）、ここで、Ｃ−１、Ｃ−２他は、キシランと対比したときの各炭素原子の位置を意味する。
ｃ）ＵＶ吸収スペクトル
[図２−４]に示されるＵＶスペクトルにおける吸収パターンを有する。
ｄ）分子量
エレクトロスプレーイオン化質量分析計の測定限界を超え、かつ、１０ＫＤａの透過膜を通過しない分子の大きさを有する。
【請求項２】
さらに、化学構造上、次の：
ｅ）  ブナノキ材由来のβ−１，４−キシランと関連する枝分かれの少ない直鎖状の反復構造単位を有し、
ｆ）  部分構造として脂肪酸残基が存在する、
ことを特徴とする、請求項１に記載の分離物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の分離物の生産方法であって、
工程１：バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）に属する植物由来の粉末を１０〜５０％（ｖ／ｖ）エタノール水に浸漬する工程、
工程２:工程１で得られる抽出液をセルロース吸着カラムクロマトグラフィーに吸着さ
せた後に蒸留水で添加する工程、
工程３：工程２で得られる赤紫色の画分を集める工程
を含んでなる、前記生産方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の分離物を有効成分として含んでなる抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）殺滅作用及び／又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）治療効果をもつ薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳの治療は、さまざまな理由から多大な困難を伴っている。第一の理由は、現存のＡＩＤＳ治療薬である核酸系逆転写酵素阻害薬（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、非核酸系逆転写酵素阻害薬（ｎｏｎｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、プロテアーゼ阻害薬（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、又はインテグラーゼ阻害薬（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）は、いずれも完全な抗レトロウイルス活性を有するものではなく、これらの薬剤を組み合せた高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）によってもＡＩＤＳの完全治癒を達成できないこと、更にＨＩＶはいずれの薬剤に対しても耐性を獲得できることである。
【０００３】
第二には、ＨＩＶがＣＤ４＋Ｔ細胞に対して細胞溶解作用を示すのみならず、ＨＩＶの構成成分特に表面抗原がヘルパーＴ（ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ，Ｔｈ）細胞にシグナルを伝達しにくいことである。その結果、ウイルスに持続感染した単球やマクロファージを殺すための抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）を十分に活性化するだけの量の抗体を産生することができなくなる。
【０００４】
かくして、ＨＩＶキャリアにおいては、恒常的に抗体産生が抑制され、ＨＩＶの播種が持続する。かかるＨＩＶの免疫不全惹起作用メカニズムの理解に基づいて、ＨＩＶ持続感染細胞を傷害するキラー（ｋｉｌｌｅｒ）細胞を活性化することを意図した。本発明は、ＨＩＶ感染細胞からの未成熟な非感染性のウイルス粒子及びＨＩＶの表面抗原の放出促進による抗体産生応答レベルの上昇を介してＡＤＣＣを増強させる（逆も同じ）ことによってＨＩＶ持続感染細胞に対する細胞傷害活性をもつキラー細胞を活性化し、その結果、ＨＩＶを生体から完全に除去してＡＩＤＳの完全治癒を達成し得る物質を提供することを目的としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＡＩＤＳの治療が困難であることは、その理由を背景技術として前述したとおりである。本発明は、ＨＩＶに対して顕著な殺滅効果を発揮することによって、有効性かつ安全性が高く、ＡＩＤＳの完全治癒を達成し得る安価な薬剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、目的とする薬剤の起源を植物に求め、候補植物の採取、候補成分の抽出・精製、特定、試験管内抗ＨＩＶ活性、及びＨＩＶ関連レトロウイルス感染動物モデルにおける感染治療効果について、必要な検討を行った。
【発明の効果】
【０００７】
試験管内試験及び動物を用いた生体内試験のいずれにおいても、候補成分はＨＩＶ又は関連レトロウイルスの増殖を抑制することによって優れた治療効果を示し、しかも安全性が高く安価であることから、抗ＨＩＶ薬又はＡＩＤＳ治療薬として有用性をもつものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】イムノヴィル混合体（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒ  Ｏ，Ｉｍｍ）、並びにその成分イムノヴィル（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒ，Ｉｍｍ）Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの電気泳動パターンを示す図である。
【図２】Ｉｍｍ  Ａの物理化学的分析結果を示す図である。
【図３】Ｉｍｍ  Ａ塩酸加水分解物の物理化学的分析結果を示す図である。
【図４】試験管内においてシクロホスファミド（ＣＰ）によって抑制されたモルモット腹腔由来付着性マクロファージ（ｇＭφ）の活性がＩｍｍによって解除されることを示す図及び顕微鏡写真である。
【図５】Ｉｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，及びＤを注射されたマウス生体内でマクロファージ（Ｍφ）及び単球（Ｍｏ）が活性化されることを示す顕微鏡写真である。
【図６】試験管内におけるＩｍｍ及びアジドチミジン（ＡＺＴ）の抗ＨＩＶ１活性を示す図である。
【図７】サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶｍａｃ）で感染させたタイワンザル（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｉｓ）に対するＩｍｍ治療の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の起源となるものはバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）植物のさまざまな種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であり、例としてＰｙｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ  Ｒｅｈｄｅｒ，Ｐｙｒｕｓ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａ  Ｎａｋなどを挙げることができる。これらを含めてバラ科ナシ属の多数の種が世界中に広く分布しており、容易に入手可能である。
【００１０】
候補植物から有効成分を抽出して分離・精製し、化学構造の解析及び抗ＨＩＶ活性に関する試験管内試験並びに動物生体内試験によって抗ＨＩＶ薬又はＡＩＤＳ治療薬を実現した。
【００１１】
以下本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
ナシ属植物の乾燥樹皮又は根の粉末３６ｋｇを全量２００ｌの１０〜５０％（ｖ／ｖ）エタノール水で数回に分けて抽出した。この抽出液を５５℃で減圧濃縮して濃縮液とし、
必要に応じて凍結乾燥して５３９ｇの粗抽出物を得た。
【００１３】
凍結乾燥した粗抽出物中の有効成分の生物学的活性は数年間安定である。
【実施例２】
【００１４】
生物学的活性をもつイムノヴィル（Ｉｍｍ）並びにＩｍｍの各成分を分離・精製するために、上記の粗抽出物又は凍結乾燥粉末の濃厚液１００ｍｌをセルロース・カラム（直径９０ｍｍ×長さ７６０ｍｍ）に吸着させた後に蒸留水で展開するセルロース吸着カラムクロマトグラフィーを行った。生物学的活性を有する赤紫色の画分を集めて、減圧濃縮し、凍結乾燥を行ってＩｍｍ５３９ｇを得た。セルロースカラムクロマトグラフィーの反復実施を通して、Ｉｍｍは４成分、即ちＩｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，に分離された。各Ｉｍｍ成分は、同等の生物学的活性を有していた。
【実施例３】
【００１５】
第１−１図及び第１−２図に示すように、イムノヴィル（Ｉｍｍ）はキャピラリー電気泳動フィンガープリントのピークの位置と吸光度の違いによってＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの５画分に分けられる。フリー・フロー電気泳動（ｆｒｅｅ  ｆｌｏｗ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を利用することによって、Ｉｍｍ成分分離を連続的にしかも安価に行うことが出来る。これらの５つのＩｍｍ成分のなかでＩｍｍ  Ｅはメチル−α−マンノピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ−α−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）と同定されたので、本特許範囲から除外した。
【実施例４】
【００１６】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び質量分析法（ＭＳ）による解析から、Ｉｍｍ  Ａ（１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが得られた（第２−１図、第２−２図、第２−３図）。重水（Ｄ２Ｏ）中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、５つのメタンプロトンが４．４１ｐｐｍ（Ｈ−１），３．２３ｐｐｍ（Ｈ−２），３．５０ｐｐｍ（Ｈ−３），３．７３ｐｐｍ（Ｈ−４）および３．３２ｐｐｍ（Ｈ−５ｅｑ）で、また１つのメチレンが３．３２ｐｐｍ（Ｈ−５ａｘ）で、各々酸素１原子に結合していることを示した。そのほかに比較的強度の低いシグナルが５．２ｐｐｍから３．１ｐｐｍの領域に認められた。観察されたシグナルのスピン結合定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）は各々次の通りであった。Ｈ−１（ｄ）Ｊ１，２＝７Ｈｚ，Ｈ−２（ｄ，ｄ）Ｊ２，３＝９Ｈｚ，Ｈ−３（ｄ，ｄ）Ｊ３，４＝９Ｈｚ，Ｈ−４（ｄ，ｄ，ｄ）Ｊ４，５ｅｑ＝４Ｈｚ。これらの大きなスピン結合定数は、ヘキソース環（ｈｅｘｏｓｅ  ｒｉｎｇ）の中のすべてのプロトンがアキシアル結合（ａｘｉａｌ  ｂｏｎｄ）をしていることを示した。
【００１７】
（１）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、５つの炭素シグナル、即ち４つのメタンシグナルを１０２．６ｐｐｍ（Ｃ−１），７３．６ｐｐｍ（Ｃ−２），７４．６ｐｐｍ（Ｃ−３），７７．３ｐｐｍ（Ｃ−４）に、また１つのメチレンシグナルを６３．９ｐｐｍ（Ｃ−３）に、各々示した。上述の結果は、（１）にキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）が存在することを示唆している。（１）の３Ｎ−塩酸による加水分解物の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを第３−１図及び第３−２図にそれぞれ示す。主要な加水分解物は、α−キシロースとβ−キシロースの混合物であった。
【００１８】
（１）のキシロース部分のアノマー配置（ａｎｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）上で観察されたＨ−１の大きなスピン結合定数（Ｊ１，２＝７Ｈｚ）及びＣ−１の１０２．６ｐｐｍでの化学シフト（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ）は、β−配置（β−ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）であることを明確に示している。
【００１９】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルに見られる（１）のＣ−４の化学シフトは、グリコシド結合
による下方シフト（７７．３ｐｐｍ）である。
【００２０】
この７７．３ｐｐｍのシグナルは、Ｓｉｇｍａ社から購入したブナノキ材（ｂｅｅｃｈ
ｗｏｏｄ）のβ−１，４−キシラン（ｘｙｌａｎ）のそれと一致した。ミニカウレルパ（Ｃａｕｌｅｒｐａ  ｂｒａｃｈｙｐｕｓ）由来のβ−１，３−キシランのＣ−３シグナルは、８８．９ｐｐｍにある（Ｔｏｈｒｕ  Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０（８），１２２２−１２２８，１９９６）。従って、（１）は発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）に置換基のあるブナノキ材由来のβ−１，４−キシランと関連する枝分れの少ない直鎖状の反復構造単位をもつキシロポリサッカライド（ｘｙｌｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）であり、反復構造単位の違いによってＩｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄに分別される。
【００２１】
第２−３図に示すように、Ｉｍｍ  Ａの分子量はエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ＥＳＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）の測定限界を超えるために測定不能であるが、Ｉｍｍ  Ａは１０ＫＤａの透過膜を通過しないので、その分子量は１０，０００以上である。
【００２２】
Ｉｍｍ  Ａの紫外線スペクトル（第２−４図）からは、分子内に発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）が存在することが明らかになった。骨格部分から遊離した発色団は、著しく不安定である。
【００２３】
Ｗｈａｔｍａｎ  ３ＭＭペーパークロマトグラフィー（展開液はｎ−ブタノール：エタノール：水〔３：１：３〕の上層液）により、Ｉｍｍ  Ａの３Ｎ−塩酸加水分解物から発色団の１つ、Ｉｍｍ  ｃｈｒｏｍ  Ａ（１）、を分離した。その１Ｈ−，１３Ｃ−，ＨＳＱＣ−，およびＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトル分析による１Ｈ−１３Ｃ相互関係の試験結果からは、発色団のシグナルが、１６０ｐｐｍでのカルボニル基のシグナルが欠けていることを除けば、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）に類似していることが示された。
多数の−ＣＨ２シグナルもまた脂肪酸残基が部分構造として存在していることを示した。
【００２４】
第５図に示されるデータによれば、Ｉｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、互いに類似する多糖部分構造、物理化学的性質および生物学的活性を有する。これらの物質は、単に反復単位の数と分枝の位置、それに少数の糖と発色団部分だけが異なると考えられる。
【実施例５】
【００２５】
試験管内での細胞性免疫に及ぼす効果
【００２６】
この実験ではＲ７１／２Ｇ培地（７．５％〔ｖ／ｖ〕モルモット血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地）で培養したモルモット腹腔由来の付着性マクロファージ（ｇＭφ）をエフェクター（キラー）細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ〔ｋｉｌｌｅｒ〕ｃｅｌｌｓ）として用いた。シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＰ）を免疫抑制剤として、ニワトリ赤血球（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ，ｃＲＢＣ）を標的細胞として、各々用いた。
【００２７】
実験系は次の４つの反応系から成る。（１）ｇＭφ＋ｃＲＢＣ、（２）ｇＭφ＋Ｉｍｍ＋ｃＲＢＣ、（３）ｇＭφ＋ＣＰ＋ｃＲＢＣ、（４）ｇＭφ＋ＣＰ＋Ｉｍｍ＋ｃＲＢＣ。なおイムノヴィル（Ｉｍｍ）は目的とする免疫反応修飾剤の候補物質として用いた。
【００２８】
体重２００〜２５０ｇのモルモットの腹腔内にチオグリコール酸培地（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌを注入し、２０時間後にＲＰＭＩ１６４０培地を用いて腹腔由来付着性マクロファージ（ｇＭφ）を回収してＲ７１／２Ｇ培地に浮遊させ
、この浮遊液を１３枚の１２ウエル（Ｗｅｌｌ）Ｆａｌｃｏｎマイクロプレートの各ウエルに０．９ｍｌずつ分注した。グループ１にはプレート１枚を、グループ２から４まではプレート３枚ずつを、各々使用した。第４−１図及び第４−２図に示されているように、ＣＰを最終濃度が１、１０及び１００μｇ／ｍｌになるようにグループ２から４までのプレートの各ウエルに添加した。即ち、グループ２、３及び４では各ウエルをそれぞれ１、１０及び１００μｇ／ｍｌのＣＰ溶液で満たした。５％ＣＯ２定温器（３５−３７℃）中で２０時間培養した後、全マイクロプレートの各ウエルの培地を新鮮なＲ７１／２Ｇ培地に取り換えた。次いでＩｍｍを各プレートの第１レーンから第４レーンまで（１レーン当り３ウエル）最終濃度がそれぞれ０、１、１０及び１００μｇ／ｍｌになるように添加した。つまり、グループ２からグループ４までは第１レーンがＣＰコントロールであり、プレート１の第１レーンがｇＭφコントロールである。０．５％ＣＯ２定温器中で再度２０時間培養した後、各ウエルの培養液を０．２％ｃＲＢＣ浮遊液（ＰＲＭＩ  １６４０培地）に取り換えた。さらに２〜６時間培養した後、ｃＲＢＣ浮遊液を吸引して除き、ウエルに付着した細胞にＬｉｕ染色を施した。３００個またはそれ以上の数のｇＭφ中の活性ｇＭφの百分比を光学顕微鏡下で計測し、その結果を第４−１図に示した。この図におけるＣ及び０のデータからは、新鮮培地に取り換えてＣＰを除去した２回目の２０時間培養後でもｇＭφの活性は回復しないこと、及びＩｍｍがＣＰの１／１０の濃度でＣＰの抑制効果を解除することが示される。
【００２９】
第４−３図からも、ＩｍｍがＣＰによる免疫抑制を解除して個々のｇＭφのキラー細胞活性を増強する効果を有することが示された。
【実施例６】
【００３０】
マウス生体内におけるＭφ／Ｍｏ活性に及ぼす効果。
【００３１】
第１日及び第２日の朝に、マウスの尾静脈内にそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇ体重及び１００ｍｇ／ｋｇ体重のＣＰを注射した。第２日から第５日までの午後に、１０ｍｇ／ｋｇ体重のイムノヴィル混合体（Ｉｍｍ０）、Ｉｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，又はＤ，もしくは２０ｍｇ／ｋｇ体重のアジドチミジン（ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ＡＺＴ）を各群２匹のマウスの尾静脈内に注射した。第６日の午後に、各マウスの腹腔内にＲ７１／２Ｇ培地１０ｍｌを注入し、Ｍφ／Ｍｏを回収した。沈んだ細胞が豊富な試験管下層部の液を採取し、その０．４ｍｌを２４ウエル平底Ｆａｌｃｏｎマイクロプレートの２つのウエルに注入した。５％ＣＯ２定温器中で６時間培養した後、ｃＲＢＣ浮遊液（０．５％）０．１０ｍｌを各ウエルに加え、６時間又は一夜培養した。次いで浮遊細胞（ｃＲＢＣ）を吸引して除去し、ウエルをＲＰＭＩ１６４０培地で静かに洗い、ＲＰＭＩ１６４０培地０．４ｍｌ及びＬｉｕ  Ｓｔａｉｎ  Ｂ液５μｌを加えてウエルに付着したマウスのＭφを染色した（ｃＲＢＣは染色されない）。この付着細胞を光学顕微鏡下で観察、撮影した。ＣＰによる免疫抑制はＩｍｍ（混合物）及びＩｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄによって解除され、第５図に示されるようにＭφ／Ｍｏの活性も増強された。その一方、ＡＺＴにはこのような効果は見られなかった。
【実施例７】
【００３２】
マウス脾臓由来単核性キラー細胞の活性に及ぼす効果。
【００３３】
８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹をＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ各群に分けた。Ａ群のマウスには生理食塩水０．２ｍｌを第６日まで連日静脈内注射した。Ｂ群マウスにはＣＰ２００ｍｇ／ｋｇ体重を第１日に、ＣＰ１００ｍｇ／ｋｇ体重を第２日に、その後は連日生理食塩水を、各々注射した。Ｃ群にはＩｍｍ１０ｍｇ／ｋｇ体重を連日注射した。Ｄ群にはＣＰをＢ群と同様に、またＩｍｍをＣ群と同様に各々注射した。第７日に全マウスの脾臓を摘出し、フィコール−イソパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ）遠心法により脾臓
由来単核細胞を分離した。
【００３４】
Ｙａｃ−１細胞（２×１０６／ｍｌ）を、５１Ｃｒ−標識クロム酸塩１μｃ／ｍｌを含むＲ２０Ｃ培地中で６０分間（３７℃）標識した。
【００３５】
マウス脾臓由来単核細胞（キラー細胞）３×１０６個及び５１Ｃｒ−標識クロム酸塩で標識したＹａｃ−１細胞６×１０６個をＲ２０Ｃ培地１．０ｍｌに共に浮遊させ、３７℃で１５０分間保温し、２５０ｘｇで１０分間遠心分離した。その上清液０．５ｍｌを採取し、測定用容器中で乾燥した。
【００３６】
容器にトルエン−ＰＰＯ−ＰＯＰＯＰをシンチレーターとして加え、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
【００３７】
キラー細胞による放射能の放出は、ＣＰによって阻止されたが、この阻止はＩｍｍによって解除された。
【実施例８】
【００３８】
赤血球凝集活性。
【００３９】
Ｋａｈｎチューブに分注した０．４％（ｖ／ｖ）ニワトリ赤血球（ｃＲＢＣ）生理食塩水浮遊液２ｍｌに様々な濃度でＩｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，又はコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）を添加した。この反応液を十分に混和し、室温に２時間放置し、赤血球凝集反応を観察した。試験薬剤はすべて同等の凝集活性を示したが、コンカナバリンＡによる赤血球凝集は強固であり、強く振っても再浮遊しなかった。これに対して、Ｉｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄによって凝集した赤血球は振り動かすと均一に再浮遊し、また再凝集も起こった。このことから、Ｉｍｍ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄが血栓を形成することなく安全に静脈内に注射できることが示唆された。
【実施例９】
【００４０】
Ｉｍｍの体液性免疫増強効果
【００４１】
正常マウス及びＣＰで免疫抑制したマウス１６匹を使用した。各群４匹のマウスについて、ｃＲＢＣ（抗原）で免疫した後の溶血素（抗体）産生能に及ぼすＩｍｍの効果を調べた。
【００４２】
第１日に、０．４％（ｖ／ｖ）ｃＲＢＣ浮遊液０．０５ｍｌをマウスの尾静脈内に注射した。第１群のマウスには第１日から第５日まで生理食塩水０．０５ｍｌを毎日静脈内注射した（正常対照群）。
【００４３】
第２群のマウスには、Ｉｍｍ０．０２ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を毎日静脈内注射した。
【００４４】
第３群のマウスには、第１日にＣＰ４．０ｍｇ（２００ｍｇ／ｋｇ体重）を、第２日にＣＰ２．０ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を、第３日から第５日までは生理食塩水０．０５ｍｌを、各々静脈内注射した（免疫反応抑制対照群）。
【００４５】
第４群のマウスには、第３群と同様に第１日及び第２日にＣＰを、さらに第１日から第５日までイムノヴィル（Ｉｍｍ）０．２ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を、各々静脈内注射し、血清中の溶血素価即ち抗体価に及ぼすＩｍｍの効果を調べた。
【００４６】
第６日に、すべてのマウスからエーテル麻酔下で血液を採取し、血清中の溶血素価（抗ｃＲＢＣ抗体価）を測定した。
【００４７】
９６ウエル（８×１２ウエル）のＦａｌｃｏｎ平底マイクロプレートの第１レーンの第１ウエルにマウス血清（８倍希釈）１００μｌを添加し、次に第１２ウエルまで２倍希釈系列をつくった。そのうえで、各ウエルに補体として正常モルモット血清（８倍希釈）５０μｌを添加し、最終補体濃度が１単位／ｍｌになるようにした。
【００４８】
５％ＣＯ２定温器中、３７℃で６時間保温した後、光学顕微鏡下で溶血を観察した。完全溶血を起したマウス血清の最大希釈倍数を溶血素価（抗体価）とした。ＩｍｍはＣＰによる溶血素価の低下即ち抗体産生抑制を完全に解除した。
【実施例１０】
【００４９】
Ｉｍｍの逆転写酵素阻害効果。
【００５０】
反応液５０μｌの組成は次の通りである。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ポリ  Ａ−γ−オリゴ−ｄＴ  ０．１単位、逆転写酵素（マウス白血球ウイルス〔ＭｕＬＶ〕由来又はトリ骨髄芽球症ウイルス〔ＡＭＶ〕由来）５単位、ウシ血清アルブミン６０μｇ，３Ｈ−ｄＴＴＰ  ０．５ｍＭ／μｃ、およびさまざまな濃度のＩｍｍ。３７℃で１時間保温した後、反応液  ２５μｌをＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／ｃガラスミクロファイバーフィルターに滴下した。未反応の３Ｈ−ｄＴＴＰを５％ＴＣＡ−０．０１Ｍ  ピロリン酸塩液で充分洗い出し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。非特異カウント（ＭｕＬＶ由来逆転写酵素の場合８５ｃｐｍ、ＡＭＶ由来逆転写酵素の場合１１５ｃｐｍ）を差し引いた。
【００５１】
この結果から、Ｉｍｍの両レトロウイルス逆転写酵素に対する阻害活性は、強力で濃度依存的であり、しかも逆転写酵素の由来によって大差があることが示された。
【実施例１１】
【００５２】
Ｉｍｍの抗ＨＩＶ１活性。
【００５３】
２０％（ｖ／ｖ）コウシ血清並びに組換え型インターロイキン２（ｒＩＬ−２）４０単位／ｍｌ及びインゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｐ）５μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒ２０Ｃ培地）に浮遊したヒト静脈血由来単核細胞の浮遊液（１×１０７細胞）０．８ｍｌを栓付きＧｒｅｉｎｅｒチューブに分注した。これにＩｍｍ（４０μｇ／ｍｌ及びその４倍希釈系列）又は対照薬としてＡＺＴ（１００μｇ／ｍｌ及びその１０倍希釈系列）０．１ｍｌを加えた後、ＨＩＶ１１００ＴＣＩＤを接種した後、５％ＣＯ２通気下、３６−３７℃で２１日間培養した。
【００５４】
３日毎に遠心（２５０ｘｇ，５分）して細胞を沈殿させ、培地を同じ組成の新鮮な培地と取り換えた。ＨＩＶ１抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を調べるために、細胞をマウス抗ＨＩＶ１Ｐ２４ＩｇＧ抗体及びウサギ抗マウスＩｇＧ１蛍光抗体で順次染色した。ＨＩＶ１Ｐ２４ｇａｇ遺伝子を発現した細胞の百分率、即ち間接蛍光抗体法で検出される蛍光発色細胞の比率を顕微鏡下で計測した。抗ＨＩＶ１活性をＩｍｍとＡＺＴとの間で比較した。
【００５５】
ＩｍｍとＡＺＴの抗ＨＩＶ１活性はほぼ同等であった。
【実施例１２】
【００５６】
ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８株感染サルにおける治療試験。
【００５７】
９匹のタイワンザル（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｉｓ）を３グループに分け、各グループ３匹のサルについてウイルス感染及び治療試験を行った。サルには１日２回サル用飼料とサツマイモを与えて飼育した。
【００５８】
感染用のウイルス液
【００５９】
非特異免疫反応を避けるため、組換え型インターロイキン２（ｒＩＬ−２）４０単位／ｍｌ及びインゲンマメレクチン（ＰＨＡ−Ｐ）５μｇ／ｍｌを含むＲ２０Ｍ培地（２０％サル血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地）を用いてサルの静脈血由来の単核細胞（ｍＰＢＭＣ）を培養した。ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８株を接種した後、ｍＰＢＭＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）を５％ＣＯ２定温器中、３６−３７℃で２１日間培養した。培養液は３日毎に新鮮な培養液と取り換えられた。
【００６０】
ｍＰＢＭＣを遠心分離して集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、小量のＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊し、凍結融解を数回繰り返して細胞を破壊した。遠心分離して濃厚なウイルス浮遊液を遠心上清として集め、これをタイワンザル（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｉｓ）の静脈内接種に用いた。
【００６１】
Ｒ２０Ｃ培地に浮遊したヒト静脈血由来の付着性単核細胞に１０倍希釈ＳＩＶｍａｃ液０．１ｍｌを接種し、Ｒ２０Ｃ培地を３日毎に新鮮なものと交換しながら５％ＣＯ２通気下、３６〜３７℃で２１日間培養した。自家製のサル抗ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８抗血清及びマウス抗サル蛍光標識免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１−フルオレセインイソチオシアネート〔ＦＩＴＣ〕）液で順次染色する間接蛍光抗体法によりＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８原液のウイルス感染価を計測した。サル感染用のＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８ウイルス液０．１ｍｌのウイルス感染価は、１×１０７ＴＣＩＤ（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ，組織培養感染量）であった。
【００６２】
ヒト静脈血由来付着性単核細胞（Ｍφ／Ｍｏ）をＲ２０Ｃ培地中で大量培養し、ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８を感染させた後、３日毎に新鮮なＲ２０Ｃ培地と交換した。このウイルス保有Ｍφ／Ｍｏを標的細胞として用い、サル抗ＳＩＶｍａｃ血清の抗体価を測定した。Ｍφ／Ｍｏ培養フラスコを氷冷水に浸して剥離させた細胞を遠心分離して集めた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳに浮遊してＭφ／Ｍｏ濃厚浮遊液を調製し、これを多数の８ウエル蛍光抗体（ＦＡ）スライドグラスに塗布した。このスライドグラスを室温で風乾し、冷アセトンで１０分間固定し、再び風乾した後、使用時まで−２０℃の冷蔵庫に保存した。
【００６３】
サル血清の蛍光抗体（ＦＡ）価の測定。
【００６４】
標的細胞（Ｍφ／Ｍｏ）をＰＢＳで倍数希釈したサル血清で覆い、３７℃で３０分間放置した後、血清希釈液を除き、スライドをＰＢＳに入れて静かに攪拌する操作を３回繰り返した。次いで、風乾した標的細胞に適切な濃度のマウス抗サルＩｇＧ１−ＦＩＴＣ液を被せて染色した後、３７℃で３０分間対比染色を行った。室温で風乾したスライドグラスをフルオレセインが含まれていないグリセリンで覆ってカバーグラスを被せ、紫外線顕微鏡下で白色の明るい蛍光を発する標的細胞の有無を観察した。
【００６５】
蛍光を発する細胞を生じるサル血清の最大希釈倍数をその血清の蛍光抗体（ＦＡ）価と定めた。
【００６６】
ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８感染サルでの治療試験。
【００６７】
体重４−５ｋｇの雄性タイワンザル（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｉｓ）９匹を１グループ３匹ずつ３グループに分けた。ウイルス原液２．０ｍｌを静脈内に感染させてから３日後に、グループ１のサル（Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６）に対して第１ラウンドのＩｍｍ（５ｍｇ／ｋｇ体重）治療を開始した。投与法は、毎週６日間、１日１回Ｉｍｍ投薬後に１日休薬し、これを１２週間続けるというやり方である。更にウイルス感染から４０週後に、１２週間（第４０週から第５２週まで）の第２ラウンドＩｍｍ治療を行った。グループ２のサル（Ｍ７，Ｍ８，Ｍ９）に対しては、１ラウンドのみの１２週間治療をウイルス感染から４０週後（第４０週から第５２週まで）に開始した。グループ３の無治療対照グループのサル（Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３）に対しては、５２週間の治療期間を通してＩｍｍ（５％グルコース溶液）の代りに５％グルコース液のみを静脈内に注射した。
【００６８】
治療実験におけるＩｍｍの有効性。
【００６９】
ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８感染後、２週間毎に血液２ｍｌずつを採取し、血清中のＦＡ価を測定した。この測定は１００週間にわたって実施し、第７図にその結果を示した。グループ３（無治療対照グループ）のサル（Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３）では、ＳＩＶｍａｃ感染第１２週にＦＡが検出され、第２４週にはＦＡ価が８０に達し、このレベルが１００週間以上持続した。この感染パターンは、ヒトのＨＩＶ１感染の場合と同一であった。グループ１（２ラウンドＩｍｍ治療）のサル（Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６）では、同じく感染後第１２週にＦＡが検出され、第２４週にＦＡ価は１６０〜３２０のピーク値に達した。しかしその後ＦＡ価は徐々に低下し、第６０週以降は検出されなくなったことから、サル生体内にＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８が最早存在しないことすなわち完全治癒が達成されたことが示される。第２４週以降に見られたＦＡの下降速度については、第４０週から第５２週まで施された第２ラウンドＩｍｍ治療によっても特に加速される様子が見られず、従って完全治癒の達成は第１ラウンドのＩｍｍ治療のみで可能であることが示唆された。
【００７０】
グループ２のサルは、１ラウンドのみのＩｍｍ治療の実施がウイルス感染第４０週に開始されたので、治療開始時には既にキャリアであったことになる。上昇していたＦＡ価は第６０週からは更に上昇して第６４週には３２０〜６４０のピーク値に達した。その後ＦＡ価は徐々に低下し、第９６週に消失した。グループ間で血清のＦＡ価の消長を比較した結果から、ＩｍｍはＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８感染サルを完全治癒させること、従ってヒトにおけるＡＩＤＳも治癒させ得ることが示された。
【００７１】
ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８の回収
【００７２】
感染第１００週にすべてのサルから血液２ｍｌを採取し、ヘパリン（５単位／ｍｌ）を加えて静置し、得られた各静脈血由来単核細胞の豊富な血漿画分をヒト静脈血由来の付着性Ｍφ／Ｍｏに感染させた。ＳＩＶｍａｃ  Ｌ２８は、グループ３のサル（Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３）の血漿からは回収されたが、グループ１のサル（Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６）及びグループ２のサル（Ｍ７，Ｍ８，Ｍ９）の血漿からは回収されなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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