(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）のエタノール抽出物を含む、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための口腔ケア組成物であって、
前記病原性の口腔微生物が、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の群から選択される任意の１つ以上の微生物であって、
前記組成物が、カプセル、錠剤、洗口液、ゲル、ペースト、練り歯磨き、含浸デンタルフロス、チューインガムから選択される群の任意の１つである口腔送達システムに配合される口腔ケア組成物。
【請求項２】
前記微生物がアクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも０．８８ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項３】
前記微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも１．８２ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項４】
前記微生物がプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項５】
前記微生物がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも８．３３ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、アウレンチアシンＡ、カルダモミン、５−ヒドロキシ−７−メトキシ−６−メチルフラバノン、ケルセチン、３，５，７−トリヒドロキシフラバン又はこれらの化合物の誘導体から選択される化合物の任意の１つ以上を含有するか又は豊富に含む、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項７】
前記組成物が１つ以上の精油を含有する、請求項１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項８】
前記１つ以上の精油が、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）及びメンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）の群から選択される任意の１つ以上を含有する、請求項７に記載の口腔ケア組成物。
【請求項９】
前記組成物が１つ以上の他の植物抽出物を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上の他の植物抽出物が緑茶抽出物の形態である、請求項９に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油、及び濃縮緑茶抽出物を含有する、請求項１０に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１２】
潜在的に病原性の口腔微生物がプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）抽出物の濃度が少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油の濃度が少なくとも０．０５体積％であり、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油の濃度が少なくとも０．０５体積％である、請求項１１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１３】
潜在的に病原性の口腔微生物がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）抽出物の濃度が少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも４ｍｇ／ｍｌであり、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油の濃度が少なくとも０．０５体積％であり、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油の濃度が少なくとも０．０１体積％である、請求項１１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１４】
潜在的に病原性の口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）抽出物の濃度が少なくとも０．７８ｍｇ／ｍｌであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも０．７８ｍｇ／ｍｌであり、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油の濃度が少なくとも０．００２体積％であり、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油の濃度が少なくとも０．０００４体積％である、請求項１１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１５】
潜在的に病原性の口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を含み、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）抽出物の濃度が少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも４ｍｇ／ｍｌであり、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油の濃度が少なくとも０．０５体積％であり、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油の濃度が少なくとも０．０５体積％である、請求項１１に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１６】
潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害する口腔ケア組成物の製造における、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）のエタノール抽出物の使用であって、前記病原性の口腔微生物が、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の群から選択される任意の１つ以上の微生物である、使用。
【請求項１７】
アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の群から選択される任意の１つ以上の微生物である口腔微生物の成長を阻害することで歯周病を治療する口腔ケア組成物の製造における、ヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）のエタノール抽出物、メラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）精油、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）精油及び濃縮緑茶抽出物を含有する組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は口腔ケアに関する。具体的には、本発明は、口腔ケア組成物、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するためのヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）抽出物の使用、新規組成物の使用、歯周病を治療する方法における物質又は組成物の使用、アウレンチアシンＡ又はその誘導体の新規使用、並びに歯のエナメル質表面への微生物の付着及びそのような付着に対する組成物の効果を評価する新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルム（歯垢）は、口腔細菌生態系の変化の結果生じる微生物の広範な成長から形成される。バイオフィルムは、いったん確立すると、う蝕（虫歯）の形成又はさらに深刻な歯周病を招くことがある。ヒトのう蝕及び歯周病は、共同体の健康及び福祉に驚くべき影響を与える（非特許文献１）。経口感染による病気休暇、及び結果として生じる歯科治療の費用は、毎年数十億ドルの損失を生む（非特許文献１）。２００７年に、世界保健機構（ＷＨＯ）は、公衆衛生費の５〜１０％は歯科医療に関するものであると述べている。虫歯及び、それより少ないが歯周感染は、おそらくほとんどの人が一生取り組まなければならない最も高額な感染である（非特許文献２）。天然植物製品は、口腔ヘルスケアでもますます一般的な治療となりつつある。
【０００３】
農業関連産業で最も急速に成長している部門の１つは、天然植物製品で、２００２年だけで世界の売上高は２３０億ドルに達した。２００８年に、約８５，０００の医学的に有用な植物種が存在する；しかし、アフリカは住民の７５％がなお伝統的な生薬に頼っているにもかかわらず、市場の１％にしか寄与していない（非特許文献３）。
【０００４】
本発明人は、南アフリカ由来の在来植物であるヘテロピクシス・ナタレンシス（Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）について、ヒトに経口感染及び口腔疾患を引き起こす病原体に対抗する生物活性を評価した。ヘテロピクシス・ナタレンシス由来の生物有効成分の同定も試みた。
【０００５】
この研究の原理は、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）の４つの病原性微生物に対するＨ．ナタレンシスの抗菌活性を明らかにすることであった。Ｈ．ナタレンシスと精油のメラレウカ・アルテニフォリア（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）（ティーツリー）、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（コショウハッカ）及び濃縮緑茶抽出物との組み合わせの相乗効果を調査した。Ｈ．ナタレンシスの存在下の細菌付着も明らかにした。この研究では、バイオアッセイ誘導分画を用いてフラボノイドを単離した。
【０００６】
本明細書では、以下の文書を参照している：
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｍａｒａｎａｙａｋｅ，  ２００２
【非特許文献２】Ｌｏｅｓｃｈｅ，  １９８６
【非特許文献３】Ｍａｋｕｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献４】Ａｌｖｉａｎｏ，  Ｗ．Ｓ．，  Ａｌｖｉａｎｏ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｄｉｎｉｚ，  Ｃ．Ｇ．，  Ａｎｔｏｎｉｏｌｌｉ，  Ａ．Ｒ．，  Ａｌｖｉａｎｏ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｆａｒｉａｓ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｃａｒｖａｌｈｏ，  Ｍ．Ａ．Ｒ．，  Ｓｏｕｚａ，  Ｍ．Ｍ．Ｇ．，  Ｂｏｌｏｇｎｅｓｅ，  Ａ．Ｍ．  ２００８．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  ｆｏｌｋ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５３（６）：  ５４５−５５２．
【非特許文献５】Ｂａｓｓｏｎ，  Ａ．Ｅ．  ２００５．  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍａｎｕａｌ．
【非特許文献６】Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ，  Ｍ．，  ｖａｎ  Ｖｕｕｒｅｎ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｖｉｌｊｏｅｎ，  Ａ．Ｍ．  ２００８．  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍｏｋｅ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １１９：  ５０１−５０６．
【非特許文献７】Ｃｏｈｅｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｈｕｓｂａｎｄ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｙｏｄｅｒ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｇａｇｅ，  Ｊ．Ｗ．，  Ｒｏｌａｎｄ，  Ｇ．Ｅ．  １９９８．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ，  ＣＩ−９９０，  ａｎｄ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ＭＢＣ  ｔｅｓｔ，  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｎｄ  ｉｎ−  ｖｉｖｏ  ｔｉｍｅ−ｋｉｌｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ４１：  ６０５−６１４．
【非特許文献８】Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０．１  ，  ２０１１  ．  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ．
【非特許文献９】Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，  Ｘ．Ａ．，  Ｆｒａｎｃｏ，  Ｒ．，  Ｚａｍｕｄｉｏ，  Ａ．，  Ｂａｒｒａｄａｓ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｗａｔｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．，  Ｚａｂｅｌ，  Ｖ．，  Ｍｅｒｉｊａｎｉａｎ，  Ａ．  １９８０．  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｄａｌｅａ  ｓｃａｎｄｅｎｓ  ｖａｒ．  ｐａｕｃｉｆｏｌｉａ  ａｎｄ  Ｄａｌｅａ  ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，  １９：  １２６２−１２６３．
【非特許文献１０】Ｄｕ  Ｔｏｉｔ，  Ｒ．，  Ｖｏｌｓｔｅｅｄｔ，  Ｙ．，  Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｅｓ，  Ｚ．  ２００１．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔｓ，  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ａｓ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，  １６６：  ６３−６９．
【非特許文献１１】Ｅｌｏｆｆ，  Ｊ．Ｎ．  １９９８．  Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕｉｃｋ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｃａ，  ６４：  ７１  １−７１３．
【非特許文献１２】Ｆａｎｇ，  Ｊ．，  Ｐａｅｔｚ，  Ｃ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｂ．  ２０１１  ．  Ｃ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｒｉｃａ  ｇａｌｅ  ｓｅｅｄｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，  ３９（１）：  ６８−７０．
【非特許文献１３】Ｆｕｃｕｎｄｏ，  Ｖ．Ａ．  ａｎｄ  Ｂｒａｚ−Ｆｉｌｈｏ，  Ｒ．  ２００４．  Ｃ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  Ｐｉｐｅｒ  ｃａｒｎｉｃｏｎｎｅｃｔｉｖｕｍ  Ｃ．ＤＣ．（Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，  ３２：  １２１５−  −１２１７．
【非特許文献１４】Ｇａｆｎｅｒ，  Ｓ．，  Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒ，  Ｊ−Ｌ．，  Ｍａｖｉ，  Ｓ．，  Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ，  Ｋ．  １９９６．  Ａｂｓｔｒａｃｔ．  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈａｌｃｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｒｉｃａ  ｓｅｒｒａｔｅ．  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ６２（１）：  ６７−６９．
【非特許文献１５】Ｇｌａｕｅｒｔ，  Ａ．Ｍ．  １９７５．  Ｆｉｘａｔｉｏｎ，  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｉｎ：  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．
【非特許文献１６】Ｈａｙａｔ，  Ｍ．Ａ．  １９８１．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  １  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．
【非特許文献１７】Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，  Ｆ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｒ．Ｗ．Ｋ．，  Ｒａｂｉｅ，  Ａ．Ｂ．Ｍ．  ２０１０．  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｏｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２４：  ８１７−８２０．
【非特許文献１８】Ｇｕｎｄｉｄｚａ，  Ｍ．，  Ｄｅａｎｓ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ａ．Ｉ．，  Ｍａｖｉ，  Ｓ．，  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｇｒａｙ，  Ａ．Ｉ．  １９９３．  Ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ｆｒｏｍ  Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ  Ｈａｒｖ：  Ｉｔｓ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｔｏｃｏｎｔｉｔｕｅｎｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，  ６３：  ３６１−３６４．
【非特許文献１９】Ｈｓｉｅｈ，  Ｙ−Ｌ，  Ｆａｎｇ，  Ｊ−Ｍ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｙ−Ｓ．  １９９７．  Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｗｉｌｓｏｎｉａｎａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４７（５）：  ８４５−８５０．
【非特許文献２０】Ｍａｙｅｒ，  Ｒ．  １９８９．  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２９（４）：  １３４０−  １３４２．
【非特許文献２１】ＭｃＦａｒｌａｎｄ，  Ｊ．  １９０７．  Ｔｈｅ  ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ：  Ａｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｐｓｏｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  ４９：  １１７６．
【非特許文献２２】Ｍｕａｎｄａ，  Ｆ．Ｎ．，  Ｓｏｕｌｉｍａｎｉ，  Ｒ．，  Ｄｉｃｋｏ，  Ａ．  ２０１１．  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ａｄｓｃｅｎｄｅｎｓ  ｌｅａｖｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ４：  １００−１０７．
【非特許文献２３】Ｍｕｃｈｕｗｅｔｉ，  Ｍ．，  Ｎｙａｍｕｋｏｎｄａ，  Ｌ．，  Ｃｈａｇｏｎｄａ，  Ｌ．Ｓ．，  Ｎｄｈｌａｌａ，  Ａ．Ｒ．，  Ｍｕｐｕｒｅ，  Ｃ，  Ｂｅｎｈｕｒａ，  Ｍ．  ２００６．  Ｔｏｔａｌ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｚｉｍｂａｂｗｅ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ４１  ：  ３３−３８．
【非特許文献２４】Ｍｕｓｔａｆａ，  Ｋ．Ａ．，  Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｐｅｒｒｙ，  Ｎ．Ｂ．，  Ｗｅａｖｅｒｓ，  Ｒ．Ｔ．  ２００３．  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ｒｏｔａｍｅｒｓ  ｏｆ  ２’，４’，６’−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−３’−ｆｏｒｍｙｌｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ，  ａｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｒｅｃｕｒｖｕｍ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５９：  ６１１３−６１２０．
【非特許文献２５】Ｓｏｎｇ，  Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｅｏｎｇ，  Ｂ．Ｌ．  ２００７．  Ｔｅａ  ｃａｔｅｃｈｉｎｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｌｔｅｎａｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５（３）：  ４９７−５０６．
【非特許文献２６】Ｖａｎ  Ｖｕｕｒｅｎ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｖｉｌｊｏｅｎ，  Ａ．Ｍ．，  Ｏｚｅｋ，  Ｔ．，  Ｄｅｍｉｒｃｉ，  Ｂ．，  Ｂａｓｅｒ，  Ｋ．Ｈ．Ｃ．  ２００７．  Ｓｅａｓｏｎａｌ  ａｎｄ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｐｙｘｉｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ，  ７３：  ４４１−４４８．
【非特許文献２７】Ｖａｎ  Ｗｙｋ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｇｅｒｉｃｋｅ，  Ｎ．  ２０００．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．  Ｄｅｎｔａｌ  ｃａｒｅ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２．  Ｐｅｒｆｕｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３．  Ｉｎ：  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｂｒｉｚａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｒｅｔｏｒｉａ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ，  ｐｐ．  １１９−２２８．
【非特許文献２８】Ｖａｎ  Ｗｙｋ，  Ｂ．  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｗｙｋ，  Ｐ．  １９９７．  Ｆｉｅｌｄ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｒｅｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ａｆｒｉｃａ．  Ｓｔｒｕｉｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ，  ｐｐ．  １９８−５００．
【非特許文献２９】Ｖｉｌｅｌａ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｌａｎｄｓ，  Ｌ．Ｃ．，  Ｍｅｅｈａｎ，  Ｂ．，  Ｋｕｂｏｗ，  Ｓ．  ２００６．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−８  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ＣＦＴＲ−  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ６：  １６５１−１６６４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、口内で潜在的に病原性の口腔細菌のコロニー形成を防止できる天然製品の必要性に対処することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための口腔ケア組成物に関し、前記組成物はヘテロピクシス・ナタレンシスの抽出物を含む。
【００１０】
病原性口腔微生物は、アクチノマイセス・イスラエリイ、ストレプトコッカス・ミュータンス、プレボテラ・インターメディア及びカンジダ・アルビカンスの群から選択される任意の１つ以上の微生物を包含してもよい。
【００１１】
病原性口腔微生物がアクチノマイセス・イスラエリイである一実施形態では、口腔ケア組成物中の抽出物の濃度は、少なくとも０．８８ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００１２】
病原性の口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンスである別の実施形態では、口腔ケア組成物中の抽出物の濃度は、少なくとも１．８２ｍｇ／ｍｌであってもよい。このような実施形態では、組成物は、Ｓ．ミュータンスの歯のエナメル質表面への菌膜形成及びグルカン結合を阻害し得る。
【００１３】
病原性口腔微生物がプレボテラ・インターメディアである更なる実施形態では、口腔ケア組成物中の抽出物の濃度は、少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００１４】
病原性口腔微生物がカンジダ・アルビカンスである一実施形態では、口腔ケア組成物中の抽出物の濃度は少なくとも８．３３ｍｇ／ｍｌである。
【００１５】
ヘテロピクシス・ナタレンシスの抽出物は、アルコール抽出物の形態であってもよい。より具体的には、抽出物は、エタノール抽出物であってもよい。別の実施形態において、抽出物は水抽出物であってもよい。
【００１６】
抽出物は、以下の構造を有する群及びその誘導体から選択される化合物の任意の１つ以上を包含するか又は豊富に含む：
【００１７】
【化１】
0006323781.tif 000002
【００１８】
【化２】
0006323781.tif 000003
【００１９】
【化３】
0006323781.tif 000004
【００２０】
【化４】
0006323781.tif 000005
【００２１】
【化５】
0006323781.tif 000006
【００２２】
抽出物は、アウレンチアシンＡ、カルダモミン、５−ヒドロキシ−７−メトキシ−６−メチルフラバノン、ケルセチン、３，５，７−トリヒドロキシフラバン又はこれらの化合物の誘導体から選択される化合物の任意の１つ以上を包含するか豊富に含んでもよい。
【００２３】
抽出物は、Ｈ．ナタレンシスの葉及び小枝を含む着生植物材料を収集する工程；
前記植物材料を空気乾燥する工程；
前記植物材料を粉末状に粉砕する工程；
前記粉末をアルコールと混合することによって抽出する工程；
抽出物を少なくとも１回濾過する工程；及び
溶媒を蒸発して抽出物を保持する工程
を含む方法によって調製されてもよい。
【００２４】
本方法は、抽出物を乾燥して、乾燥アルコール抽出物を作製する更なる工程を包含してもよい。
【００２５】
口腔ケア組成物は、１つ以上の精油を包含してもよい。１つ以上の精油は、メラレウカ・アルテニフォリア及びメンタ・ピペリタのいずれか１つ又は両方を包含してもよい。
【００２６】
口腔ケア組成物は、別の植物抽出物を包含してもよい。一実施形態において、植物抽出物は、緑茶抽出物の形態でもよい。緑茶抽出物は、濃縮緑茶抽出物の形態でもよい。
【００２７】
一実施形態において、口腔ケア組成物は、メラレウカ・アルテニフォリア精油、メンタ・ピペリタ精油、及び濃縮緑茶抽出物を包含してもよい。
【００２８】
微生物がプレボテラ・インターメディアである一実施形態において、ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物の濃度は少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであってもよく、濃縮緑茶抽出物の濃度は少なくとも２ｍｇ／ｍｌであってもよく、メンタ・ピペリタ精油の濃度は少なくとも０．０５体積％であってもよく、メラレウカ・アルテニフォリア精油の濃度は少なくとも０．０５体積％であってもよい。
【００２９】
微生物がカンジダ・アルビカンスである一実施形態において、ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物の濃度は少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであってもよく、濃縮緑茶抽出物の濃度は少なくとも４ｍｇ／ｍｌであってもよく、メンタ・ピペリタ精油の濃度は少なくとも０．０５体積％であってもよく、メラレウカ・アルテニフォリア精油の濃度は少なくとも０．０１体積％であってもよい。
【００３０】
微生物がストレプトコッカス・ミュータンスである一実施形態において、ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物の濃度は少なくとも０．７８ｍｇ／ｍｌであってもよく、濃縮緑茶抽出物の濃度は少なくとも０．７８ｍｇ／ｍｌであってもよく、メンタ・ピペリタ精油の濃度は少なくとも０．００２体積％であってもよく、メラレウカ・アルテニフォリア精油の濃度は少なくとも０．０００４体積％であってもよい。
【００３１】
病原性口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンス、プレボテラ・インターメディア及びカンジダ・アルビカンスを包含する一実施形態において、ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物の濃度は少なくとも３．１３ｍｇ／ｍｌであってもよく、濃縮緑茶抽出物の濃度は少なくとも４ｍｇ／ｍｌであってもよく、メンタ・ピペリタ精油の濃度は少なくとも０．０５体積％であってもよく、メラレウカ・アルテニフォリア精油の濃度は少なくとも０．０５体積％であってもよい。
【００３２】
口腔ケア組成物は、カプセル、錠剤、洗口液、ゲル、ペースト、練り歯磨き、含浸デンタルフロス、チューインガム等から選択される群の任意の１つを包含する口腔送達システムに配合されてもよい。
【００３３】
本発明は、口腔ケア組成物の製造における、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物の使用にも関する。病原性口腔微生物は、アクチノマイセス・イスラエリイ、ストレプトコッカス・ミュータンス、プレボテラ・インターメディア及びカンジダ・アルビカンスの群から選択される任意の１つ以上の微生物を包含してもよい。
【００３４】
本発明はさらに、組成物の抗酸化活性による歯周病治療のための口腔ケア組成物の製造における、ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物、メラレウカ・アルテニフォリア精油、メンタ・ピペリタ精油及び濃縮緑茶抽出物を包含する組成物の使用に関する。
【００３５】
さらに、歯周病を治療する方法に使用するための、記載の口腔ケア組成物を含む物質又は組成物が提供される。
【００３６】
本発明は、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための更なる口腔ケア組成物まで拡大し、前記組成物はアウレンチアシンＡ又はその誘導体を包含する。
【００３７】
本発明は、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するためのアウレンチアシンＡ又はその誘導体の使用も提供する。
【００３８】
本発明はさらに、歯周病を治療する方法に使用するための、アウレンチアシンＡ又はその誘導体を含む物質又は組成物を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、
調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程；
調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程；及び
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってエナメル質上の微生物のコロニー形成を測定する工程
を包含する、歯のエナメル質表面への微生物の付着及びそのような付着に対する組成物の効果を評価する方法にまで広がる。
【００４０】
一実施形態では、調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程及び調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程は、同時に起こってもよい。
【００４１】
別の実施形態において、調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程は、調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程の前に起こる。
【００４２】
調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程及び微生物の添加は、ある時間が経過した後で起こってもよい。
【００４３】
調製したエナメル質ブロックは、ヒトから歯を抜去し、その歯を滅菌し、歯冠を除去し、歯冠をブロック体に切断することによって得ることができる。
【００４４】
本発明を、単なる例として以下の図及び表を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１ａ】図１ａは、刺激時唾液に曝露してエナメル質上に菌膜を形成した抜去歯のエナメル質表面の画像を示す；
【図１ｂ】図１ｂは、通常の菌膜に類似したコーティングがエナメル質上に形成できるか否かを明らかにするため、本発明に従って、炭水化物含有成長培地（ＣＡＳＯ）において植物抽出物に曝露したエナメル質表面を示す（処理１）。この画像は、植物抽出物による歯のエナメル質表面のコーティングを示す；
【図１ｃ】図１ｃは、細菌細胞の表面への付着を防止する化学物質Ｒｅｐｅｌｃｏｔｅ（登録商標）でコーティングされたエナメル質表面の画像を示す。エナメル質は「菌膜」がエナメル質上に形成できるか否かを明らかにするために、炭水化物培地に曝露した；
【図２】図２は、ビタミンＣによるＤＰＰＨの阻害率を示す；
【図３】図３は、ケルセチンによるＤＰＰＨの阻害率を示す；
【図４】図４は、ヘテロピクシス・ナタレンシスによるＤＰＰＨの阻害率を示す。
【図５】図５は、濃縮緑茶抽出物（ＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標））によるＤＰＰＨの阻害率を示す；
【図６】図６は、Ｈ．ナタレンシス（３．１２５ｍｇ／ｍｌ）、Ｍ．アルテニフォリア（０．０５体積％）、Ｍ．ピペリタ（０．０５体積％）及び濃縮緑茶抽出物（ＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標））（２．５ｍｇ／ｍｌ）の相乗的編成によるによるＤＰＰＨの阻害率を示す。上記の各濃度を、１００％の初期濃度とした。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、以下の詳細な説明及び科学研究によってより容易に理解されると考えられ、これは本発明を限定することを意図するものでなく、単に本発明の実施形態を例示するものである。
【００４７】
材料及び方法
【００４８】
植物材料
Ｈ．ナタレンシスの葉及び小枝を含む着生植物部分を収集した。植物は、プレトリア大学の植物園から１月に収集した。証拠標本を作製し、プレトリア大学のＨ．Ｇ．Ｗ．Ｊ．Ｓｃｈｗｅｌｃｈｅｒｄｔ  Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ（ＰＲＵ）（ＰＲＵ  ０９６４０５）で同定した。
【００４９】
抽出物の調製
植物材料は、室温（２５℃）で空気乾燥し、Ｊａｎｋｅ＆Ｋｕｎｋｅｌ（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ（ドイツ））粉砕機を用いて微粉末に粉砕した。この粉末材料を、４００ｍｌのエタノール（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））と共に振盪することによって抽出した（Ｌａｂｃｏｍ  ｓｈａｋｅｒ）。試料を、真空濾過器（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））を用いてＷｈａｔｔｍａｎ  Ｎｏ．１（直径１１０ｍｍ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））濾紙で濾過した。この過程を、数回繰り返した。溶媒をＢＵＣＨＩ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｌａｂｏｔｅｃ（ＰＴＹ）Ｌｔｄ．Ｈａｌｆｗａｙ  Ｈｏｕｓｅ（南アフリカ））を用いて、減圧下、４０℃で蒸発させた。抽出物を室温でさらに乾燥し、その後抗菌試験を実施した。
【００５０】
抗菌活性
【００５１】
微生物菌株
本研究に使用した微生物には、アクチノマイセス・イスラエリイ（ＡＴＣＣ１００４９）、プレボテラ・インターメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）、ストレプトコッカス・ミュータンス（ＡＴＣＣ２５１７５）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ１０２３１）並びにポリエン及びアゾール耐性のカンジダ・アルビカンス菌株（１０５１６０４）が挙げられる。細菌は、カゼインペプトン・ソイミールペプトン寒天培地（ＣＡＳＯ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））上で、Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標）Ａ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ（ドイツ））を用いた嫌気ジャー内の嫌気性条件下で、３７℃で７２時間培養した。アクチノマイセス・イスラエリイ及びＳ．ミュータンスには、１％ショ糖添加ＣＡＳＯ寒天（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））を用いた。Ｃ．アルビカンスの薬剤脆弱性及び薬剤耐性菌株は、サブローブドウ糖４％寒天培地（ＳＤＡ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））上で、３７℃で７２時間培養した。継代培養は、２週間毎に実施した。細菌試験用微生物を、それぞれのブロス中に、濁度がマクファーランド濁度標準液１（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））に相当するまで懸濁することによって、接種材料を調製した。酵母試験用微生物は、滅菌蒸留水に、濁度がマクファーランド濁度標準液１（ＭｃＦａｒｌａｎｄ，１９０７）に相当するまで懸濁した。
【００５２】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定
Ｅｌｏｆｆ（１９９８）が記載した９６ウェルマイクロプレートを用いた微量希釈法を使用して、研究中の微生物に対する粗抽出物のＭＩＣ及びＭＢＣ値を得た。１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ）に溶解した抽出物を、細菌についてはブロス（Ａ．イスラエリイ及びＳ．ミュータンスは強化培地）、カンジダ種については滅菌水に、段階希釈した；９６ウェルプレートに３７℃で４８時間培養した微生物を添加した。抽出物の最終濃度は１２．５〜０．１０ｍｇ／ｍｌの範囲で、陽性対照の５％クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＸ）（Ｄｅｎｔａｌ  Ｗａｒｅｈｏｕｓｅ、Ｓａｎｄｔｏｎ（南アフリカ））の最終濃度は１２．５〜３．８×１０−４ｍｇ／ｍｌの範囲であった。実績のある抗真菌薬であるアムホテリシンＢ（Ｄａｖｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇａｕｔｅｎｇ）を、０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．５×１０−３ｍｇ／ｍｌの範囲で、カンジダアッセイに含めた。溶媒ＤＭＳＯの最高濃度（２．５％）は、被験微生物に無毒であることが確認された。アクチノマイセス・イスラエリイ及びＳ．ミュータンスは、３７℃、嫌気性条件下で、２４時間インキュベートした；Ｐ．インターメディアは、３７℃、嫌気性条件下で、４８時間インキュベートした；Ｃ．アルビカンスは、３７℃で、既に添加したｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（南アフリカ））と共に、湿潤好気性条件下で２４時間インキュベートした。
【００５３】
細菌の成長を示すため、５０μｌの（０．２ｍｇ／ｍｌ）ＩＮＴをマイクロプレートウェルに添加し、３７℃、嫌気性条件下で、２０〜６０分、赤色を呈するまでインキュベートした。ＭＩＣは、ＩＮＴの変色を阻害する最低濃度と定義した。ＭＢＣは、ＭＩＣアッセイでインキュベーション後に成長を示さなかったウェルから、５０μｌの懸濁液を、１５０μｌの新鮮なブロスに添加することによって決定した。この懸濁液を３７℃で２８時間（Ｐ．インターメディアについては４８時間）、嫌気性条件下で再度インキュベートした。ＭＢＣは、微生物の発育を１００％阻害した抽出物の最低濃度として決定した（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００５４】
細胞毒性の測定
Ｖｅｒｏ細胞及びＨＥｐ−２細胞（Ｈｉｇｈｖｅｌｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｇａｕｔｅｎｇ）を入れたマイクロタイタープレートを用いて、結果が優れた上位４種類のエタノール抽出物の細胞毒性を、Ｂａｓｓｏｎ（２００５）の方法に従って試験した。細胞毒性は、ＸＴＴ（３’−［１−（フェニルアミノ−カルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス−［４メトキシ−６−ニトロ］ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物）法により、細胞増殖キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて測定した。１００μｌのＶｅｒｏ及びＨＥｐ−２細胞（１×１０５ｍｌ）をマイクロプレートに播き、２４時間インキュベートして、細胞をプレートの底に付着させた。抽出物で希釈系列を作製し、様々な濃度（４００〜３．１μｇ／ｍｌ）をマイクロプレートに添加して、７２時間インキュベートした。ＸＴＴ試薬を最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌに添加し、細胞を１〜２時間インキュベートした。陽性薬剤対照の塩酸ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（南アフリカ））及びアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（南アフリカ））を、濃度範囲０．７８〜０．０１μｇ／ｍｌでアッセイに含めた。インキュベーション後、色の吸光度を、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｐｏｗｅｒ−Ｗａｖｅ  ＸＳ，Ｗｅｌｔｅｖｒｅｄｅｎ  Ｐａｒｋ（南アフリカ））を用いて分光光度定量（６９０ｎｍを基準波長として、４９０ｎｍにおける光学密度を測定）した。アッセイは、トリプリケートで実施した。
【００５５】
相乗作用アッセイ
Ｈ．ナタレンシスの葉及び小枝を含む着生植物部分を収集した。植物は、プレトリア大学の農園から１月に収集した。証拠標本を作製し、プレトリア大学のＨ．Ｇ．Ｗ．Ｊ．Ｓｃｈｗｅｌｃｈｅｒｄｔ  Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ（ＰＲＵ）（ＰＲＵ  ０９６４０５）で同定した。メラレウカ・アルテニフォリア精油（Ｈｏｌｉｓｔｉｃ  Ｅｍｐｏｒｉｕｍ  ｃｃ，Ｇａｕｔｅｎｇ（南アフリカ））、メンタ・ピペリタ精油（Ｈｏｌｉｓｔｉｃ  Ｅｍｐｏｒｉｕｍ  ｃｃ，Ｇａｕｔｅｎｇ（南アフリカ））、及びＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）（Ｃｈｅｍｐｕｒｅ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ，Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ（南アフリカ））も、本発明の研究用に購入した。
【００５６】
Ｈ．ナタレンシス植物材料は、室温（２５℃）で空気乾燥し、標準的なフードプロセッサを用いて微粉末に粉砕した。粉末にした材料を、加圧下（１００ｂａｒ）及び５０℃の調節温度で、ＢＵＣＨＩ高速抽出装置Ｅ−９１６（ＢＵＣＨＩ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ（スイス））内で、エタノール（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））で抽出した。溶媒をＧｅｎｅｖａｃ  ＥＺ−２  ｐｌｕｓ（Ｇｅｎｅｖａｃ  ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（英国））内で、低沸点で蒸発させ、その後抽出物に抗菌試験を実施した。
【００５７】
本研究に使用した微生物には、プレボテラ・インターメディア（ＡＴＣＣ２５６１１）、ストレプトコッカス・ミュータンス（ＡＴＣＣ２５１７５）及びカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ１０２３１）が挙げられる。細菌は、カゼインペプトン・ソイミールペプトン寒天培地（ＣＡＳＯ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））に１％のショ糖（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））を添加し、Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標）Ａ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））を用いた嫌気ジャー内の嫌気性条件下で、３７℃で４８時間培養した。カンジダ・アルビカンスは、サブローブドウ糖４％寒天培地（ＳＤＡ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））上で、３７℃で４８時間培養した。継代培養は、２週間毎に実施した。濁度がマクファーランド濁度標準液１（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））に相当するまで各ブロスで懸濁することによって、接種材料を調製した（ＭｃＦａｒｌａｎｄ，１９０７）。
【００５８】
Ｈ．ナタレンシス、Ｍ．アルテニフォリア精油、Ｍ．ピペリタ精油及びＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）の組み合わせの効果を明らかにするため、各成分のＭＩＣを、最初に、Ｅｌｏｆｆ（１９９８）の抗菌マイクロプレート法を用いて測定した。Ｈ．ナタレンシスのエタノール抽出物の原液を、２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ）で調製した；一方で、ＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）を蒸留水に溶解した。この原液を、細菌については強化カゼインペプトン・ソイミールペプトン培地（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ）、カンジダについてはサブローブドウ糖４％ブロス（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ）に段階希釈した；９６ウェルプレートに、３７℃で４８時間培養した微生物のマクファーランド濁度標準液１接種材料を添加した。抽出物及びＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）の最終濃度は０．１０〜１２．５ｍｇ／ｍｌで、陽性対照の１．２５体積％クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＸ）（Ｄｅｎｔａｌ  Ｗａｒｅｈｏｕｓｅ，Ｓａｎｄｔｏｎ（南アフリカ））の最終濃度は４．７７×１０−６〜０．３１体積％の範囲であった。精油は１０％のＴｗｅｅｎ（８０）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ  Ｗａｄｅｖｉｌｌｅ（南アフリカ））に溶解した。試験した精油の最終濃度は１．６×１０−５〜１．２５体積％であった。溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５％）及びＴｗｅｅｎ８０（２％）の最も高濃度は、試験した微生物に対して無毒であることが見出された。接種したプレートを、３７℃の嫌気性及び好気性条件下でそれぞれ２４時間培養した後、呈色指示薬ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（Ｌａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を添加した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅの変色を阻止した最低濃度と定義した。
【００５９】
試料の相乗活性を、改良チェッカーボード法を用いて測定した。このプロセスを、各被験微生物について、４種類の薬剤の全ての組み合わせで繰り返した。
【００６０】
抗付着性
【００６１】
サイトカインアッセイ
上清中のＩＬ−８の濃度を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た固相酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，ＯｐｔＥＩＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８セット、カタログ番号５５５２４４）を用いて測定した。細胞をプレコートＴ−７５フラスコ内の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養し、コンフルエントになるまで２〜３日毎にリフィードした。続いて、コンフルエントな接着性単層を、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）−トリプシン−ＥＤＴＡで処理した後にプラスチック表面から外し、２４ウェルプレートに播種し、２４時間後に処理を行った。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で３回洗い、１ｍｌの抗生物質不含培地を細胞に添加した後、この細胞を、過去に細胞培養研究で確認された非細胞毒性濃度のＨ．ナタレンシスで処理した。
【００６２】
植物抽出物が口腔上皮細胞からのＩＬ−８放出に影響を及ぼすか否かを明らかにするため、抽出物を、１２．５〜２００μｇ／ｍｌの様々な濃度で細胞に添加した。時間依存研究を実施した。植物抽出物をＨＥｐ−２細胞に添加し、１時間後にＡ．イスラエリイを添加した。植物抽出物及びＡ．イスラエリイをＨＥｐ−２細胞に一緒に添加し、最後にＡ．イスラエリイをＨＥｐ−２細胞に添加し、植物抽出物を１時間後に添加した。ヘテロピクシス・ナタレンシス抽出物を各ウェルにデュプリケートで添加した。Ａ．イスラエリイ及びＨＥｐ−２細胞のみの陰性対照を含めた。プレートは、３７℃で、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートした。
【００６３】
上記の処理の後、上清を回収して、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて放出されたＩＬ−８を測定した。簡単に述べると、９６ウェルプレートに１００μｌの捕捉用抗体（抗ヒトＩＬ−８モノクロナール抗体）をコーティングして一晩インキュベートし、Ｔｗｅｅｎ−２０の０．０５％ＦＢＳ溶液で３回洗浄し、非特異的結合をブロックするために１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳでコーティングした。既知濃度のＩＬ−８（標準）及び処理後に細胞によって放出されたＩＬ−８含有試料（上清）を、アリコートとして適切なウェルに添加し、２時間インキュベートして、ウェルからデカンテーションした。吸引洗浄を５回行った。ビオチン化（生体高分子を標識するために、生体高分子にビオチン残基を付加すること）抗ヒトＩＬ−８モノクロナール抗体及びストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体を添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、抗ＩＬ−８及び酵素試薬混合物に存在する酵素（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン−ペルオキシド色素原）のための基質を含有する溶液を添加し、プレートを３０分間インキュベートした。２Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液を用いて反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｐｏｗｅｒ−Ｗａｖｅ  ＸＳ，Ｗｅｌｔｅｖｒｅｄｅｎ  Ｐａｒｋ（南アフリカ））を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。続いて、この吸光度を用いて、標準曲線からＩＬ−８濃度を計算した（Ｖｉｌｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００６４】
超微細構造
植物抽出物がヒトの歯のエナメル質へのＳ．ミュータンスの付着に影響するか否かを明らかにするため、時間依存研究を実施した。最初に、Ｈ．ナタレンシス抽出物を、ＭＩＣ濃度の１．８２ｍｇ／ｍｌ及びＭＩＣ値以下の０．９１ｍｇ／ｍｌで、調製したエナメル質断片に添加し、１時間後にＳ．ミュータンスを添加した。２番目に、植物抽出物及びＳ．ミュータンスを一緒にエナメル質断片に添加した。最後にＳ．ミュータンスをエナメル質断片に添加し、１時間後に植物抽出物を添加した。植物抽出物は、各ウェルにデュプリケートで添加した。  陽性対照は、細菌の付着を防止する化学物質でコーティングしたエナメル質断片からなった。Ｓ．ミュータンス及びエナメル質断片のみの陰性対照を含めた。プレートを一晩インキュベートした。
【００６５】
収集した歯は、本研究以外の目的でヒト患者から抜歯したものであった。プレトリア大学の抜歯診療所を訪れた各患者は、患者向け医薬品情報及びインフォームド・コンセント・フォームに記入及び署名しなければならない。非う蝕性の最近抜去したヒトの歯を、歯科診療所から収集した。歯周部又は歯科矯正の理由から抜去された歯のみを使用した。ヒトの歯の取扱い及び実験室研究に関する倫理及び安全指針を厳守した。歯は、抜去直後に流水ですすいだ。その後、超音波浴の蒸留水に入れ、固着していない生体材料がすべて除去されるまで、清浄な蒸留水中で１５分間超音波処理し、４℃で保管した。歯冠を、Ｉｓｏｍｅｔ１１−１１８０低速鋸（Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｌｔｄ．，Ｌａｋｅ  Ｂｌｕｆｆ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（米国））にダイアモンドウエハーブレードを用いて、常時水洗下で、セメントエナメル境にて水平方向に切り出すことによって除去した。歯冠をさらにブロック体に切断した；この試料を滅菌リンゲル液（Ｍｅｒｃｋ  ＳＡ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ．，Ｈａｌｆｗａｙ  Ｈｏｕｓｅ（南アフリカ））に入れ、１２５℃で１５分間滅菌した。
【００６６】
残りの手順は無菌条件下で実施した。無菌性は、陽圧無菌気流実験室で、無菌計器並びに手袋及びマスクを使用して実施した全実験の間維持した。滅菌の前に、生物付着を防止する駆散性表面を作製して陽性対照として使用するために、試料として使用するエナメル質ブロックの一部を洗浄、乾燥し、２％のジメチルジクロロシランの１，１，１−トリクロロエタン溶液（Ｒｅｐｅｌｃｏｔｅ（登録商標）−Ｓａａｒｃｈｅｍ−Ｈｏｌｐｒｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃ（Ｐｔｙ．）Ｌｔｄ．，４０  Ｆｒａｎｓｅｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｃｈａｍｄｏｒ，Ｋｒｕｇｅｒｓｄｏｒｐ）でコーティングした。
【００６７】
すべての試料を、１ｍｌのＣＡＳＯブロスを含有する２４ウェルの組織培養プレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした。処理１として、１ｍｌの各種植物抽出物を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、１％マクファーランド濁度標準液−１細菌懸濁液を添加した。処理３として、この細菌懸濁液をエナメル質ブロックに添加して１時間インキュベートし、その後各種植物抽出物を添加した。処理２として、各種植物抽出物及び１％マクファーランド濁度標準液−１細菌懸濁液を同時に添加し、プレートを記載の通り振盪培養器内で２４時間及び４８時間の間、嫌気的にインキュベートした。試験生物を有するエナメル質ブロック１つを陽性対照として使用し、すべての試料を、陽性対照と同様に走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）用に調製した。
【００６８】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用調製
２４時間及び４８時間の時点で、異なる濃度の植物抽出物を含有する組織培養ウェルの各々から１点のＳＥＭ用試料を採取し、エナメル質上での微生物のコロニー形成を明らかにした。試料は、Ｇｌａｕｅｒｔ（１９７５）及びＨａｙａｔ（１９８１）による生物学的ＳＥＭ評価の標準方法に従って調製した。
【００６９】
活性化合物の精製
乾燥したエタノール抽出物（６０ｇ）を、極性を高くするヘキサン：酢酸エチルのグラジエント（酢酸エチル０％〜１００％）で溶出液として使用して、シリカカラム（１０×７０ｃｍ）で分画した。２９の画分を採取し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）特性が類似した画分は合わせた（ＴＬＣプレートは、ヘキサン：酢酸エチル（７：３）；ヘキサン：酢酸エチル（８：２）；ジクロロメタン：メタン（９９．５：０．５）及びジクロロメタン：メタン（９９：１）を溶出液として展開した。酸性バニリン；３．５％硫酸メタノール溶液中バニリン０．３４％；を検出に使用した）。１３の主要画分（１Ｂ〜１３Ｂ）が得られ、そのＡ．イスラエリイに対する抗菌活性を試験した（表１）。
【００７０】
表１：画分の平均最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）
【００７１】
【表１】
0006323781.tif 000007
【００７２】
抗菌性の結果及び予備的なＴＬＣプレートの結果に基づき；画分７Ｂ（２ｇ）、９Ｂ（３ｇ）、１１Ｂ（０．８ｍｇ）及び１２Ｂ（１ｇ）を別々にＳｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（南アフリカ））を用いてクロマトグラフ分析した。画分７Ｂは、ジクロロメタン：メタン（９９．５：０．５）を用いてクロマトグラフ分析した。６４の副画分を採取し、ＴＬＣプレートにスポットし、ジクロロメタン：メタン（９９：１）で展開した。純化合物１が得られた。画分９Ｂは、１００％エタノールを用いてクロマトグラフ分析した。９１の副画分を採取し、ＴＬＣプレートにスポットし、ジクロロメタン：メタン（９９．５：０．５）で展開した。純化合物２及び３が得られた。画分１１Ｂは、ジクロロメタン：メタン（９９：１）を用いてクロマトグラフ分析した。５４の副画分を採取し、ＴＬＣプレートにスポットし、ジクロロメタン：メタン（９９：１）で展開した。純化合物４が得られた。画分１２Ｂは、ジクロロメタン：メタン（９９：１）を用いてクロマトグラフ分析した。７１の副画分が採取され、ＴＬＣプレートにスポットし、ジクロロメタン：メタン（９９：１）で展開した。純化合物５が得られた。
【００７３】
抗酸化アッセイ
エビデンスは、歯周病とフリーラジカル生成の増大及び唾液の抗酸化活性低下の両方による酸化剤−抗酸化剤間の不均衡との間の関係を示唆している。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、歯周組織の破壊に関係する（Ａｌｖｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００７４】
ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル水和物）は、架橋を形成する窒素原子に不対価電子を有する安定なフリーラジカルである。このフリーラジカルは、別の分子から電子引抜を起こして自らの軌道を完成する連鎖反応を開始することができる。このＤＰＰＨラジカルの捕捉能力を明らかにするために試料を試験する際、この遊離価電子はＤＰＰＨアッセイの基礎を形成する。
【００７５】
改良抗酸化アッセイを用いた（ｄｕ  Ｔｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｍ．ピペリタ及びＭ．アルテニフォリアの２％原液、アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ，Ａｓｔｏｎ  Ｍａｎｏｒ（南アフリカ））及びＨ．ナタレンシスの溶液の２ｍｇ／ｍｌ原液、ケルセチンの１ｍｇ／ｍｌ原液、ＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）の５００μｇ／ｍｌ原液、並びにＨ．ナタレンシス（３．１２５ｍｇ／ｍｌ）、Ｍ．アルテニフォリア（０．０５体積％）、Ｍ．ピペリタ（０．０５体積％）及びＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）（２．５ｍｇ／ｍｌ）の相乗的編成を用意した。
【００７６】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートで、２０μｌの各試料を２００μｌのｄＨ２Ｏに添加（ケルセチンは例外で、２００μｌのＥｔＯＨに添加）し、段階希釈を実施した。その後、エタノール（４０μｇ／ｍｌ）に溶解した９０μｇ／ｍｌのＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ，Ａｓｔｏｎ  Ｍａｎｏｒ（南アフリカ））を全てのウェルに添加した。全ての試料を、トリプリケートで調製した。ビタミンＣを陽性対照として使用し、抽出物対照及びブランク対照も実施した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで５１５ｎｍの吸光度を測定した（ｄｕ  Ｔｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００７７】
結果及び考察
【００７８】
Ｈ．ナタレンシスのエタノール抽出物によるＭＩＣは、Ｓ．ミュータンス及びＡ．イスラエリイに対してそれぞれ１．８２ｍｇ／ｍｌ及び０．８８ｍｇ／ｍｌであった。この植物は、ＨＥｐ−２細胞に対して中程度の毒性を示し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は３３．６６±０．０４μｇ／ｍｌであった（表２）。
【００７９】
表２：選択した植物のエタノール抽出物の口腔微生物に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）
【００８０】
【表２】
0006323781.tif 000008
【００８１】
相乗作用アッセイ
ＭＩＣ値の低下については改良チェッカーボード法を使用した。この方法は、被験薬剤及びその阻害ポテンシャルに関して多数の濃度変数を与えた。
【００８２】
表３：統計分析使用後の試験薬剤単独及び併用時の最小発育阻止濃度の比較
【００８３】
【表３】
0006323781.tif 000009
【００８４】
試験微生物の各々に対して併用したときに、各薬剤単独のＭＩＣ値は低下する（表３）。したがって、薬剤を併用したときに全体的な阻害活性の増大があると言える。
【００８５】
サイトカインアッセイ
植物自体はＩＬ−８放出を誘発しない（図には示していない）が、ＩＬ−８の読取値は、４．６ｐｇ／ｍｌにおいて、細菌及び細胞のみの陰性対照の値よりも高いことから、Ｈ．ナタレンシスとＡ．イスラエリイとの間にＩＬ−８の放出を誘発するマイナスの相互作用があると思われる。Ｈ．ナタレンシスは０．８８ｍｇ／ｍｌでＡ．イスラエリイの成長を阻害し、３．３２（ｍｇ／ｍｌ）で静菌性である；Ｈ．ナタレンシスはＡ．イスラエリイの付着機構を妨害するようには見えず、したがって別の方法で微生物に作用するはずである。
【００８６】
図１ａ、ｂ及びｃは、歯のエナメル質表面に形成した菌膜の比較を示す。
【００８７】
単離化合物の同定
化合物の同定は、１Ｈ及び１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び分極移動による無歪増強（ＤＥＰＴ）によって実施した。単離化合物のアクチノマイセス・イスラエリイに対するＨＥｐ−２細胞でのＭＩＣ、ＭＢＣ及びＩＣ５０を表４に示す。
【００８８】
表４：アクチノマイセス・イスラエリイに対するＨＥｐ−２細胞での単離化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）及び５０％発育阻害濃度（ＩＣ５０）
【００８９】
【表４】
0006323781.tif 000010
【００９０】
画分９Ｂ  副画分２〜５、副−副画分４
化合物２及び３は、環Ｂの置換形式が異なり、環Ｃは非置換であるカルコンと認識された。化合物３を１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルデータに基づいて同定した。化合物３は、７．７２（２Ｈ  ２，６）、７．４５（３Ｈ，３，４，５）に非置換環Ｃの１Ｈ  ＮＭＲシグナルを示した。さらに、８．０５及び７．７３（１Ｈ，それぞれｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ）にトランスアルケンのシグナル、６．０８，６．０２（それぞれｓ，Ｈ３’及び５’）に２つの芳香族プロトンのシグナルを、３．９７のメトキシのシグナルに加えて示した。
【００９１】
１３Ｃ  ＮＭＲデータは、１９３．０ｐｐｍのカルボニル基を含む１６の炭素シグナルを示した。ＤＥＰＴ−１３５は、１０のプロトン化炭素を示し、その１つはδＣ５６．４のメトキシ基及び１４２．６及び１２８．４のカルボニル基に隣接する２つのα，β二重結合である；他のシグナルは、環Ｂ及び環Ｃの両方の芳香族炭素に帰属された。
【００９２】
【化６】
0006323781.tif 000011
カルダモミン
【００９３】
所与のデータから、化合物２として、カルダモミン又はカルダモニンの構造が化合物２として確認された。カルダモミンは２’，４’，６’−トリヒドロキシカルコンの２’−Ｍｅエーテル誘導体で、過去にソウズク（Ａｌｐｉｎｉａ  ｋａｔｓｕｍａｄａｉ）、テムクンチ（Ｂｏｅｓｅｎｂｅｒｇｉａ  ｐａｎｄｕｒａｔａ）、コンプトニア・ペレグリナ（Ｃｏｍｐｔｏｎｉａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）、ミリカ・ペンシルバニカ（Ｍｙｒｉｃａ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、ピペル属（Ｐｉｐｅｒ  ｓｐ．）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐ．）及びリュウケツジュ（Ｄｒａｃａｅｎａ  ｄｒａｃｏ）から単離されている。カルダモミンは、炎症性メディエータを阻害し、したがって抗炎症活性であることが明らかにされており、抗腫瘍活性も証明されている（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１）。
【００９４】
画分７Ｂ  副画分２６  副−副画分３０
１Ｈ  ＮＭＲは、δΗ１３．５１ｐｐｍにＣ−６’のキレート化ヒドロキシルの低磁場シグナル；７．４０（ｓ，３Ｈ）、７．６７（ｓ，２Ｈ）に一置換ベンゼン環のシグナル、６．３１に芳香族プロトンの別の一重線シグナル、８．０２、７．７９（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ）に２本の二重線、２．０９に低磁場メチル基及び３．６７にメトキシ基を示す。
【００９５】
１３Ｃ  ＮＭＲデータは１７本のシグナルを示す；２本のメチル（６０．９，７．２）、１２７．１（Ｃ−２，６）、１２８．３（Ｃ−３，５）、１２５．９（Ｃ−４）、１４２．０（Ｃ−７）、１２９．６（Ｃ−８）及び９８．６（Ｃ−３）に８本のメチン並びに１９１．９（Ｃ−９）にカルボニル、加えて７本の四級炭素。
【００９６】
上記のデータは、環Ｂが酸素化されていないカルコン誘導体の存在を示す。環Ａは芳香族プロトンのシグナルを１本だけ示し（δΗ６．３１）、これはＣ−１’（１０７．３）及びＣ−３’（１１０．１）への異核多重結合相間（ＨＭＢＣ）を示す。ヒドロキシルプロトン（δΗ１３．５１）はＣ−１’及びＣ−５’Ｈ−５’／Ｃ６’，Ｃ１’，Ｃ３’及びＣ４’との相関関係を示す。この関係は、環Ａの２’−メトキシ，４’，６’ジヒドロキシの置換形式を確立し得る。化合物（１）は、２’，４’，６’−トリヒドロキシ−３’−メチルカルコンの２’−Ｍｅエーテル誘導体（より一般的にはアウレンチアシンＡとして知られる）と同定された。
【００９７】
【化７】
0006323781.tif 000012
アウレンチアシンＡ
【００９８】
アウレンチアシンＡは、過去にディディモカルパス・オーレンティアクム（Ｄｉｄｙｍｏｃａｒｐｕｓ  ａｕｒｅｎｔｉａｃｕｍ）、コンプトニア・ペレグリナ（Ｃｏｍｐｔｏｎｉａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）、ダレア・スカンデンス変種パウシフォリア（Ｄａｌｅａ  ｓｃａｎｄｅｎｓ  ｖａｒ．ｐａｕｃｉｆｏｌｉａ）（メキシコで医学的価値）を含むダレア（Ｄａｌｅａ）属、ミリカ・ペンシルバニカ（Ｍｙｒｉｃａ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）から単離されており、ドラセナ（Ｄｒａｃａｅｎａ）属からも単離されている（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１）。ミリカ・セラッテ（Ｍｙｒｉｃａ  ｓｅｒｒａｔｅ）から単離されたアウレンチアシンＡは、クラドスポリウム・ククメリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｒｉｕｍ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長を阻害する（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｇａｆｎｅｒ  ｅｆ  ａｌ．，１９９６）。
【００９９】
画分９Ｂ  副画分２−５、副−副画分２
化合物は、分光データからＣ−フラボノイドであることが明らかとなった。１Ｈ  ＮＭＲはＨ２の５．４４（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ）にシグナルを示した。２つのＨ−３プロトンは２．６４（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ）及び３．０４（ｄｄ，１６．６，１４．２Ｈｚ）に現れた。６．３５（ｓ）のシグナルはＨ−８に帰属され、７．４０及び７．５３のシグナルは一置換環Ｂに帰属され、メチル（Ｃ−６に結合）は２．０４に現れ、メトキシ基は３．７６に現れる。１３Ｃ  ＮＭＲ及びＤＥＰＴ−１３５は６１．０及び８．０に２本のメチルシグナル、４５．９にメチレン基、並びに７９．３（Ｃ２）、１００．０（Ｃ８）、１２６．６，１２９．１及び１２９．２に環Ｂの５本のメチンシグナルを示す。四級炭素の他のシグナルは、Ｃ−４（１８８．０）、Ｃ−７（１６３．４）、Ｃ−５（１６２．９）、Ｃ−９（１  １６．５）、Ｃ１’（１４０．４）及びＣ−６（１  １３．７）に属する。
【０１００】
【化８】
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５−ヒドロキシ−７−メトキシ−６−メチルフラバノン
【０１０１】
上記のデータから、化合物（３）の構造は５−ヒドロキシ−７−メトキシ−６−メチルフラバノンと確認された。  過去にギョリュウバイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）（オーストラリア及びニュージーランドで伝統的な薬として使用される）、レプトスペルマム・リカーバム（Ｌｅｐｔｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｒｅｃｕｒｖｕｍ）、パイパー・カルニコネクティバム（Ｐｉｐｅｒ  ｃａｒｎｉｃｏｎｎｅｃｔｉｖｕｍ）、タイワントガサワラ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｗｉｌｓｏｎｉａｎａ）（台湾で建設用木材として使用される）、ミリカ・ゲイル（Ｍｙｒｉｃａ  ｇａｌｅ）の種子（果実はビール添加物、精油は防虫剤）から単離され、ピチログランマ・トリアングラリス（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ  ｔｒｉａｎｇｕｌａｒｉｓ）の微量成分である（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１  ；Ｆａｃｕｎｄｏ  ＆  Ｂｒａｚ−Ｆｉｌｈｏ，２００４；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍａｙｅｒ，１９８９；Ｍｕｓｔａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１０２】
画分１２Ｂ  副画分５６、副−副画分７０
１Ｈ  ＮＭＲは、６．８０（ｍ）に５本の芳香族シグナル、５．９２、５．８４（それぞれｂｒ．ｓ）に２本のメタカップリングプロトン、４．５５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．３６（ｍ）［Ｃ−２，Ｃ−３］にジェミナルヒドロキシ基の２つのプロトンを、２．８４（ｄｄ，Ｊ＝１６．１，４．８Ｈｚ）及び２．４９（ｄｄ，Ｊ＝１６．１，８．４Ｈｚ）のメチレンプロトンに加えて示す。
【０１０３】
この化合物は、［α］Ｄ値によって２種類の可能性がある。
【０１０４】
【化９】
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３，５，７−トリヒドロキシフラバン
【０１０５】
上記の１Ｈ  ＮＭＲデータから、化合物５の構造は３，５，７−トリヒドロキシフラバンと確認された。この化合物には２種類の変異体、すなわち（２Ｒ，３Ｒ）体及び（２Ｒ，３Ｓ）体がある。（２Ｒ，３Ｒ）体はジステニンとして知られ、過去にデンステッティア・ジステンタ（Ｄｅｎｎｓｔａｅｄｔｉａ  ｄｉｓｔｅｎｔａ）から単離されているが、（２Ｒ，３Ｓ）体は３−オキシコアブラゲニン（Ｏｘｙｋｏａｂｕｒａｇｅｎｉｎ）として知られ、過去にコアブラツツジ（Ｅｎｋｉａｎｔｈｕｓ  ｎｕｄｉｐｅｓ）の葉から単離されている（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１）。
【０１０６】
画分１１  副画分１０
この化合物は、周知のフラボノイドであるケルセチンと同定された。１Ｈ  ＮＭＲは、７．８２（ｂｒ．ｓ，Ｈ−２’）、７．７０（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−６’）、６．９９（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５’）、６．５２（ｂｒ．ｓ，Ｈ−８）及び６．２６（ｂｒ．ｓ，Ｈ−６）の典型的なケルセチンシグナルを示した。
【０１０７】
【化１０】
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ケルセチン
【０１０８】
上記のデータから、化合物（４）は３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロキシフラボン（より一般的にはケルセチンとして知られる）と確認された。この化合物は、過去にムギワラギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、トウダイグサ属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）及びカルウィンスキア属（Ｋａｒｗｉｎｓｋｉａ  ｓｐｐ．）等の多数の植物種、特に果実から単離されている。この化合物は、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）のほぼすべての種に存在し、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、クロウメモドキ科（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ）及びトケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）に存在する（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１１；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｍｕａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１０９】
抗酸化アッセイ
ＤＰＰＨ阻害（ＤＰＰＨが無色に変わる箇所）のパーセンテージを、図２〜６に示すように、グラフから決定した。
【０１１０】
Ｍｕｃｈｕｗｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）が実施した研究では、Ｈ．ナタレンシスの葉及び小枝の７０％エタノール抽出物は、濃度３２．２６μｇ／ｍｌで、２９．６５％の阻害率を有した。本研究では、同じ濃度で、はるかに高い阻害率（＞９０％）が得られた。
【０１１１】
メラレウカ・アルテニフォリア及びＭ．ピペリタは、試験した最高濃度（０．１体積％）でＤＰＰＨ阻害を示さなかった。ＩＣ５０は、試験した試料によって５０％のＤＰＰＨが阻害された／無色に変化した濃度であり、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（米国））を用いて計算した。
【０１１２】
表５：被験試料による５０％のＤＰＰＨ阻害
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
ヘテロピクシス・ナタレンシス、ケルセチン及びＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）は全て、陽性対照であるビタミンＣ（１．９８±０．００６μｇ／ｍｌ）よりも低いＩＣ５０値を示した。Ｔｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によると、等モルベースで、ビタミンＣ及びＥよりもフラボノイドの方が高い抗酸化活性及びフリーラジカル捕捉活性を示した。ケルセチンはフラボノイドであり、Ｈ．ナタレンシスは数種類の他のフラボノイドを含有することがわかっていることから、これは、この２点の試料がビタミンＣよりも優れた抗酸化活性を示す理由を説明する可能性がある。相乗組成物のＩＣ５０値は、１００％が組み合わせて試験した最高値を表すように与えられ、すなわちＨ．ナタレンシスは３．１２５ｍｇ／ｍｌ、Ｍ．アルテニフォリア及びＭ．ピペリタは０．０５％、ＴＥＡＶＩＧＯ（登録商標）は２．５ｍｇ／ｍｌである。相乗的組み合わせの各個別成分の推定ＩＣ５０値も与えられる。
【０１１５】
結論
【０１１６】
ヘテロピクシス・ナタレンシスはグラム陽性微生物のＡ．イスラエリイ及びＳ．ミュータンス並びにグラム陰性菌のＰ．インターメディアに対する対抗活性を示した。ヘテロピクシス・ナタレンシスは中程度の細胞毒性を示した。Ａ．イスラエリイと上皮細胞ＨＥｐ−２との相互作用を防止するためにＨ．ナタレンシスの抽出物を利用した場合に、サイトカインＩＬ−８レベルは低下しなかった。ヘテロピクシス・ナタレンシスは、Ｓ．ミュータンスの歯のエナメル質表面に対する菌膜形成及びグルカン結合を妨害する。Ｈ．ナタレンシスの葉及び小枝のエタノール抽出物から過去に単離された５種類の化合物を、初めて同定した。該５種類の化合物は、アウレンチアシンＡ（１）、カルダモミン（２）、５−ヒドロキシ−７−メトキシ−６−メチルフラバノン（３）、ケルセチン（４）及び３，５，７−トリヒドロキシフラバン（５）と同定された。化合物１及び４のＭＩＣは、Ａ．イスラエリイに対してそれぞれ０．０６２５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌであることが見出された。化合物２及び５は、１ｍｇ／ｍｌ以下でＡ．イスラエリイに対する活性を示さなかった。抗酸化性アッセイから、ヘテロピクシス・ナタレンシスはそれ自体が顕著な抗酸化活性を示すことがわかり、相乗組成物ではさらに優れた活性を有すると思われた。したがって、この植物抽出物は、酸化剤と抗酸化剤の不均衡による歯周病の防止に役立つ可能性がある。相乗作用アッセイで、Ｈ．ナタレンシス抽出物をメラレウカ・アルテニフォリア精油、メンタ・ピペリタ精油及び濃縮緑茶抽出物と併用したときに、阻害活性の全体的増大があることが示された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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