(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが、グランザイムＢ認識部位を含み、
前記グランザイムＢ認識部位が、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）、ＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）、またはＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）であり、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、グランザイムＢによる切断後に発光が増加し、
前記非順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記グランザイムＢ認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを含む、キット。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ。
【請求項７】
細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ここで、前記細胞またはサンプルが、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記細胞またはサンプルを、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記活性グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項８】
細胞またはサンプル中において、細胞傷害性リンパ球から放出された活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害機能を決定するための方法であって、
ここで、前記細胞またはサンプルが、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質、および
ｉｉ）細胞傷害性リンパ球と接触させることと、
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記活性グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより細胞傷害性リンパ球から放出された前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項９】
前記細胞傷害性リンパ球が、患者もしくは患者由来の細胞傷害性Ｔリンパ球またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性グランザイムＢの検出が、前記細胞傷害性リンパ球の前記細胞傷害機能を決定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性グランザイムＢの検出が、細胞媒介性細胞傷害を示す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞又はサンプル中のグランザイムＢ活性の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ここで、前記細胞またはサンプルが、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢの調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記調節因子が、グランザイムＢの阻害剤またはグランザイムＢのエンハンサーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞集団の細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ここで、前記標的細胞集団が、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記標的細胞集団を、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質、細胞傷害を媒介する細胞、及び１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｂ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞から放出されたグランザイムＢが、前記標的細胞集団内で前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１５】
細胞またはサンプルの細胞過程内のグランザイムＢ活性を検出する方法であって、
ここで、前記細胞またはサンプルが、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記細胞またはサンプルを、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ中の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢ活性を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１６】
標的細胞集団を使用して細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ここで、前記標的細胞集団が、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、請求項３に記載のベクターによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、又は、請求項６に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを発現するものであり、
前記方法が、
ａ）前記標的細胞集団を、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質、細胞傷害を媒介する細胞、及び１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｂ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞から放出されたグランザイムＢが、前記標的細胞集団内の前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを切断および活性化し、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１１年５月１１日に出願された米国特許出願第１３／１０５，６４８号の一部継続であり、２０１０年５月１１日に出願された米国仮出願第６１／３３３，７０６号、および２０１１年４月１日に出願された米国仮出願第６１／４７０，８４５号の利益を主張し、そのそれぞれの内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願は、２０１１年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／５５８，７９６号の利益も主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生化学アッセイおよび試薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、修飾されたルシフェラーゼおよびそれらの使用に関する。本発明は、一般に、細胞媒介性細胞傷害の検出のための非放射性の方法に関する。本発明の方法を用いて、細胞傷害性リンパ球またはナチュラルキラー細胞、特に活性化された細胞傷害性リンパ球および活性化されたナチュラルキラー細胞による細胞媒介性細胞傷害を検出することができる。本発明の方法を、細胞アッセイにおいて用いて、β−アレスチン局在化などの細胞過程におけるグランザイムＢの活性を監視することができる。本発明は、新規のグランザイムＢ認識配列およびバイオセンサー、ならびにそれらを使用する方法も提供する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してアスキー形式で提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１２年１１月２日に作成された該アスキーコピーは、「ＷＯ００＿ＡＳＦＩＬＥＤ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」という名前で１５３，６７６バイトサイズである。
【背景技術】
【０００４】
ルシフェラーゼは、光の光子の同時放出を伴って、基質（例えば、ルシフェリンまたはコエレンテラジン）の酸化を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、鞘翅目節足動物および多数の海洋生物、ならびに細菌を含む、多くの種から単離されている。容易に検出可能であり、その活性を高い精度で定量化することができるため、ルシフェラーゼは、遺伝子発現およびタンパク質局在化の研究に広く用いられている。その発色団を形成するために最大３０分を要する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とは異なり、ルシフェラーゼ製品は、ポリペプチド鎖の合成の完了直後に検出することができる（基質および酸素も存在する場合）。また、酵素活性には翻訳後修飾の必要がなく、酵素は、補欠分子族、結合された補因子、またはジスルフィド結合を含まない。ルシフェラーゼは、多くの種および多種多様な細胞における有用なレポーターである。
【０００５】
ルシフェラーゼは、それらをバイオセンシングのためのレポーター分子、すなわち、システムの分子特性を明らかにする分子として特に有用にする、追加の特徴を有する。大部分の触媒反応は、ＡＴＰの２つの分子に対する加水分解のエネルギーより少ないか、または約７０ｋＪ／モルを生成する。しかしながら、ルシフェラーゼにより誘発された発光は、はるかに高いエネルギー含有量を有する。例えば、ホタルルシフェラーゼ（５６０ｎｍ）により触媒された反応は、２１４ｋＪ／モルのエネルギーを放出する。さらに、ルシフェラーゼは、化学エネルギーを光子に変換することにおいても非常に効率的であり、すなわち、高い量子収率を有する。したがって、ルシフェラーゼは、検出可能なシグナルを生成するために極めて効率的である。
【０００６】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞などのウイルス感染または形質転換した細胞に対する防御に必要な共通の細胞傷害経路を共有する、エフェクタリンパ球である。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した腫瘍および細胞の拒絶に重要な役割を果たす。それらは、開口放出を介して、アポトーシス、すなわちプログラム細胞死により標的細胞を死なせる、パーフォリンおよびグランザイムと呼ばれるタンパク質の小細胞質顆粒を、標的細胞中に放出することにより細胞を殺傷する。顆粒開口放出経路は、アポトーシスシステインプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を通じて動作する細胞死経路を強力に活性化するが、活性化されたカスパーゼの非存在下では、細胞死をももたらす。パーフォリンおよびグランザイムは、共同して標的細胞アポトーシスを誘導する。構造的に関連したセリンプロテアーゼのファミリーであるグランザイムは、標的細胞内のアポトーシスを誘発するために必須であるが、それらはパーフォリンにより適切に送達されることに依存する。
【０００７】
標的細胞タンパク質を特定のアスパラギン酸残基において切断する、グランザイムＢおよびグランザイムＢアイソフォームは、カスパーゼ媒介性ならびにカスパーゼ非依存性細胞死の強力な活性剤である。グランザイムＢの標的細胞への取り込みは、カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体を通じて、エンドサイトーシスにより（少なくとも一部が）媒介されると考えられる。グランザイムＢは主に、直接的なカスパーゼ処理よりもむしろ間接的にカスパーゼ活性化を引き起こす。ＢＣＬ−２ファミリーのプロアポトーシス「ＢＨ３のみ」メンバー、例えば、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）を直接活性化することによりこれを達成し、シトクロムｃなどのプロアポトーシスミトコンドリア仲介物質のサイトゾルへの漏出をもたらす。グランザイム媒介性アポトーシスのＢＩＤ非依存性経路も存在すると思われる。いくつかのウイルスは、強力なグランザイムＢ阻害剤をコードし、内因性グランザイムＢ阻害剤ＰＩ９は、いくつかの癌細胞により異常に出現され得る。
【０００８】
ＣＴＬおよびＮＫ細胞は、免疫系の重要なエフェクター細胞である。ＮＫ機能の構成要素には、ＮＫ数、顆粒数／含有量、免疫シナプス形成、シナプスに向かう分極、膜へのドッキング、プライミング、融合、およびグランザイムの送達が挙げられる。標的細胞損傷の測定は、歴史的に、ＣＴＬおよびＮＫ細胞機能の重要な手段であった。ＣＴＬ媒介性細胞傷害についての代表的な基準は、クロミウム放出アッセイ（「［５１Ｃｒ］放出アッセイ」）であった。［５１Ｃｒ］放出試験は、大部分の細胞内タンパク質に堅く結合する、［５１Ｃｒ］を持つ生細胞の標識を伴う。洗浄後、細胞を細胞傷害剤、例えば、エフェクター細胞でインキュベートする。標識タンパク質は、細胞傷害剤による細胞死の誘発により引き起こされる細胞膜の損傷および／または漏出に起因して、細胞媒質中に放出される。放射能が検出され、それにより細胞死を示す。［５１Ｃｒ］放出アッセイは、放射能の使用を伴い、かつ時間集約的であるため、細胞媒介性細胞傷害の測定のための非放射性高感度アッセイを提供する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、修飾された円順列置換（circularly-permuted）熱安定性ルシフェラーゼおよびリンカーを含む、バイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。リンカーは、熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を、熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合する。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、親円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して修飾される。リンカーは、細胞内の標的分子と相互作用することができるセンサー領域を含む。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の存在下で、親円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して、バイオセンサーの標的分子との相互作用後に強化された応答を有する。あるいは、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の非存在下で、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して、バイオセンサーの標的分子との相互作用後に強化された応答を有する。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼおよびリンカーを含む、バイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、該修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、配列番号２に対応する５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、４０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２、または５４３位において、少なくとも１つのアミノ酸の置換を有する。リンカーは、熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を、熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合する。リンカーは、細胞内の標的分子と相互作用することができるセンサー領域を有する。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の存在下で、親円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して、バイオセンサーの標的分子との相互作用後に強化された応答を有する。あるいは、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子の非存在下で、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して、バイオセンサーの標的分子との相互作用後に強化された応答を有する。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、未修飾の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して向上した発光または向上した安定性も有し得る。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル内の標的分子の存在または活性を検出するための方法に関し、サンプルを、標的分子のセンサー領域および修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチドと接触させることと、サンプル内の発光を検出することと、を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル内の標的分子の存在または活性を検出するための方法に関し、細胞を、標的分子のセンサー領域および修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチドと接触させることと、細胞内の発光を検出することと、を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示は、動物内の標的分子の存在または活性を検出するための方法に関し、動物を、標的分子のセンサー領域および修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと接触させることと、動物内の発光を検出することと、を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル内の標的分子の存在または活性を検出するための方法に関し、動物を、標的分子のセンサー領域を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体に固定化することと、標的分子を含むサンプルを固定化されたバイオセンサーに添加することと、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質を添加することと、発光を検出することと、を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル内のアポトーシスを検出するための方法に関し、サンプルを、アポトーシスに関与する分子のセンサー領域および修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチドと接触させることと、サンプル内の発光を検出することと、を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、本開示は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、および熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合するリンカーを含む、バイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、親円順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して修飾され、リンカーは、細胞内の標的分子と相互作用することができるセンサー領域を含み、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、バイオセンサーの標的分子との相互作用後に、ｉ）標的分子の存在下で、親円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ、またはｉｉ）標的分子の非存在下で、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも１つに対して、強化された応答を有し、リンカーは、グランザイムＢ認識部位を含み、標的分子は、グランザイムＢである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示は、非円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関し、ペプチドリンカーは、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断されるグランザイムＢ認識部位を含み、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、グランザイムＢによる切断後に発光が増加する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞またはサンプル内の活性グランザイムＢの存在および／または量を検出するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞またはサンプルを、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと接触させることであって、ポリヌクレオチドは、非順列置換（non-permuted）熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーであって、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断されるグランザイムＢ認識部位を含むペプチドリンカーと、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質とを含む、接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、サンプル内に存在する活性グランザイムＢは、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内のペプチドリンカーを切断することができ、それにより活性グランザイムＢの存在および／または量を検出する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞もしくはサンプルを、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと接触させることであって、ポリヌクレオチドは、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーであって、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断される配列を含むペプチドリンカーと、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と、細胞傷害性リンパ球（複数可）とを含む、接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、サンプル内に存在する活性グランザイムＢは、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内のペプチドリンカーを切断することができ、それにより活性グランザイムＢの存在および／または量を検出する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞傷害性リンパ球（複数可）は、患者もしくは患者由来の細胞傷害性リンパ球（複数可）またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態において、グランザイムＢの検出は、細胞傷害性リンパ球の細胞傷害機能を決定する。他の実施形態において、グランザイムＢの検出は、細胞媒介性細胞傷害を示す。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、高スループットで、例えば、多重ウェルプレートで行われる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本開示は、グランザイムＢ活性の１つ以上の調節因子についてスクリーニングするための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞またはサンプルを、１つ以上の試験薬、ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと接触させることであって、ポリヌクレオチドは、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーであって、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断されるグランザイムＢ認識部位を含むペプチドリンカーと、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質とを含む、接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、サンプル内に存在する活性グランザイムＢは、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内のペプチドリンカーを切断することができ、それにより活性グランザイムＢの調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、調節因子は、グランザイムＢの阻害剤またはエンハンサーである。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、エンハンサーは、小分子、ペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、高スループットで、例えば、多重ウェルプレートで行われる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングするための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、標的細胞を、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーであって、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断される配列を含むペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることと、標的細胞および／または細胞傷害を媒介する細胞を、１つ以上の試験薬と接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、細胞傷害を媒介する細胞から放出されたグランザイムＢは、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内のペプチドリンカーを切断することができ、それにより細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、調節因子は、グランザイムＢの阻害剤またはエンハンサーである。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、エンハンサーまたは阻害剤は、小分子、ペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞傷害を媒介する細胞は、細胞傷害性リンパ球（複数可）またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、高スループットで、例えば、多重ウェルプレートで行われる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞過程内のグランザイムＢ活性を検出するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞またはサンプルを、１つ以上の試験薬と接触させることであって、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーであって、グランザイムＢまたはグランザイムＢアイソフォームにより認識および切断される配列を含むペプチドリンカーと、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質とを含む、接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、サンプル内に存在する活性グランザイムＢは、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内のペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢ活性を検出する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、高スループットで、例えば、多重ウェルプレートで行われる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本開示は、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドに関する。円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、非順列熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは、グランザイムＢにより認識および切断される配列を含む。他の実施形態において、本開示は、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関し、ペプチドリンカーは、グランザイムＢにより認識および切断される配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む細胞に関し、ペプチドリンカーは、グランザイムＢにより認識および切断される配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む細胞に関し、ペプチドリンカーは、グランザイムＢにより認識および切断される配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本開示は、非円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関し、ペプチドリンカーは、カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７アイソフォームにより認識および切断される配列を含み、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７による切断後に発光が増加する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングするための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、標的細胞集団を、ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと接触させることであって、ポリヌクレオチドは、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を結合するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードし、ペプチドリンカーは、カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７アイソフォームにより認識および切断される配列、および円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を含む、接触させることと、標的細胞および／または細胞傷害を媒介する細胞を、１つ以上の試験薬と接触させることと、細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、細胞傷害を媒介する細胞は、カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７を活性化することができ、活性化されたカスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７は、ペプチドリンカーを切断し、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼを活性化することができ、それにより細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、調節因子は、細胞傷害機能の阻害剤またはエンハンサーである。いくつかの実施形態において、阻害剤はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、エンハンサーまたは阻害剤は、小分子、ペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、高スループットで、例えば、多重ウェルプレートで行われる。
【００２５】
本発明の他の態様は、詳細な説明および添付の図面を考慮することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ内のアミノ酸置換、Ｉ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ、およびＳ１９３Ｐの位置を示す。
【図２Ａ−Ｂ】ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）処理による処理後の変異型０１：Ａ−０５および対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤについて正規化されたＲＬＵ（図２Ａ）、ならびに２時間後および１０時間後の倍率誘導（応答）（図２Ｂ）を示す。
【図３Ａ−Ｂ】ＴＲＡＩＬによる処理後の、対応する開始配列ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤと比較して、変異型ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３、およびＦＣ７：４９について正規化されたＲＬＵ（図３Ａ）ならびに２時間後および１０時間後の倍率誘導（応答）（図３Ｂ）を示す。
【図４】カスパーゼ−３／７バイオセンサー（ＣＢＳ）の性能に対するリンカーの効果を示す。
【図５】ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８およびＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８バイオセンサーを用いた、３７℃での経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性の動態プロファイルを示す。
【図６】ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８およびＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８バイオセンサーを用いた、経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性の倍率応答を示す。
【図７Ａ−Ｄ】ＦＦ−ＣＰ３５９カスパーゼ８（図７Ａ）、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８（図７Ｂ）、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８（図７Ｃ）、およびＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３（図７Ｄ）バイオセンサーを用いた、３７℃での経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性の動態プロファイルを示す。
【図８】ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８、およびＦＦ−ＣＰ３５９−カスパーゼ８バイオセンサーを用いた、経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性の倍率応答を示す。
【図９】ＴＥＶプロテアーゼバイオセンサーが、ＣＨＯ細胞内で共発現したＴＥＶを検出することを示す。
【図１０Ａ−Ｄ】様々な時点においてＴＲＡＩＬで処理されたときに様々な熱安定性バイオセンサーを発現するＤ５４−ＭＧ細胞の発光（光子数／秒）（図１０Ａ）、倍率誘導（図１０Ｂ）、ベースライン、処理後２、４、および６時間における平均光子数／秒（図１０Ｃ）、およびレポーター発現を示すウェスタンブロット（図１０Ｄ）を示す。
【図１１Ａ−Ｃ】８ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬで処理されたＤ５４−ＭＧレポーター異種移植ヌードマウスの発光（光子数／秒）（図１１Ａ）、倍率誘導（図１１Ｂ）、ならびにベースラインおよび処理後６時間における平均光子数／秒（図１１Ｃ）を示す。
【図１２Ａ−Ｄ】ＴＲＡＩＬで処理されたＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ３を安定して発現する脛骨内移植ＭＤＡ−ＭＢ２３１０１８３３細胞についての前処理値と比較して正規化されたデータ（図１２Ａ）、各時点について計算されたＺ因子（図１２Ｂ）、指定された時点で撮られた代表的な画像（図１２Ｃ）、およびＴＲＡＩＬで処理された異種移植試験動物の倍率誘導（図１２Ｄ）を示す。
【図１３Ａ−Ｄ】ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｆｏｃｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ（図１３Ａ）およびＴｉｍＴｅｃ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ（図１３Ｃ）内の化合物から化合物処理（最大）したときの相対発光、ならびにＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｆｏｃｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ（図１３Ｂ）およびＴｉｍＴｅｃ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ（図１３Ｄ）について得られたデータのヒートマップを示す。
【図１４】精製処理中の様々な段階でのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を示す。
【図１５】対照（ＭＭＰ−２センサーからのバックグラウンド）を超える倍率増加を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】ＳｅｎｓｏＬｙｔｅアッセイ（図１６Ａ）および倍率誘導（図１６Ｂ）を用いるＭＭＰ−２タンパク質の発光を示す。
【図１７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析により検出されたカスパーゼ−３によるＣＢＳ−ＨＴの切断を示す。
【図１８Ａ−Ｂ】ＣＢＳのＨａｌｏＬｉｎｋ樹脂（図１８Ａ）またはマイクロタイタープレート（図１８Ｂ）への固定化の図を示す。
【図１９】無細胞環境内で発現したプロテアーゼバイオセンサーの発光を示す。
【図２０】大腸菌内で発現したプロテアーゼバイオセンサーの発光を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】ＣＡ−ＴＡＭで標識されたサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図２１Ａ）、および精製されたプロテアーゼバイオセンサーの発光（図２１Ｂ）を示す。
【図２２】固体支持体に固定化されたプロテアーゼバイオセンサーの発光を示す。
【図２３】ＮＫ９２細胞およびＤＥＶＤ構築体を用いて、３７℃でＢｉｏｔｅｋ  Ｒｅａｄｅｒにより測定された動態データを示す。
【図２４】室温でＶｅｒｉｔａｓリーダーにより測定されたＮＫ９２細胞およびＤＥＶＤ構築体の発光を示す。
【図２５】Ｖｅｒｉｔａｓリーダーにより測定された対照と比較した、グランザイムＢ構築体の基底シグナル（すなわち、エフェクターなし）の発光を示す。
【図２６Ａ−Ｅ】ＤＥＶＤ構築体（図２６Ａおよび図２６Ｅ）、グランザイムＢ切断可能Ｄ＋構築体（図２６Ｂおよび図２６Ｄ）、およびグランザイムＢの負の対照（Ｄ−）構築体（図２６Ｃ）の動態データを示す。
【図２７Ａ−Ｂ】Ｐ１４マウスからの活性化細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、抗原特異的認識を通じて、マウスＥＬ４標的細胞内のカスパーゼ３／７およびグランザイムＢ（Ｃ＋）バイオセンサーを誘発することを示す。
【図２８Ａ−Ｂ】カスパーゼ３／７バイオセンサー（ＤＥＶＤ）が、グランザイムＢの標的細胞およびパーフォリン中への送達に依存することを示す。
【図２９】グランザイムＢバイオセンサー（Ｃ＋）が、グランザイムＢの標的細胞中への送達に依存することを示す。
【図３０Ａ−Ｂ】グランザイムＢ切断部位を持つ構築体が、グランザイムＢ酵素の濃度の増加に伴って、発光の容量依存的増加を有することを示す。
【図３１】グランザイムＢの送達が、健常な対照（ＷＴ／ＷＴ）および両アレルパーフォリン変異（ＭＵＴ／ＭＵＴ）を持つ患者からのＩＬ−２活性化ＮＫ細胞株内の発光を誘導したことを示す。
【図３２Ａ−Ｂ】カスパーゼ３／７バイオセンサー、ならびに一次ＮＫおよびＮＫ９２細胞を持つグランザイムＢバイオセンサーの使用を示す。
【図３３】パーフォリン依存性殺傷の阻害が、グランザイムＢによりグランザイムＢバイオセンサーの活性化を阻止する。
【図３４】ＮＫが、ＩＬ−２での長期培養後にグランザイムＢバイオセンサーからの発光を活性化することができることを示す。
【図３５】臍帯由来のＩＬ−１５刺激細胞が、グランザイムＢを放出し、グランザイムＢバイオセンサーを含む標的細胞からの発光を活性化することができることを示す。
【図３６Ａ−Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ標的細胞内のカスパーゼ３／７バイオセンサーおよびグランザイムＢバイオセンサーの使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の任意の実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その出願において、以下の説明に記載される、または以下の図面に示される、構成の詳細および構成要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態であることができ、様々な方法で実施または実行することができる。
【００２８】
本発明の方法に関する以下の説明において、処理工程は、他に規定のない限り、室温（約２２℃）および大気圧で行われる。本明細書において列挙される任意の数値範囲は、下限値から上限値までのすべての値を含むことも特に理解される。例えば、濃度範囲または有益な効果範囲が、１％〜５０％であると述べられる場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などの値が、本明細書において明示的に列挙されることが意図される。同様に、配列同一性の範囲が、例えば６０％〜１００％未満の間であると示される場合、６５％、７５％、９０％などが、本明細書において明示的に列挙されることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの単なる例示であり、最低値から最高値までのすべての可能な数値が、本出願において明示的に述べられるものと見なされる。
【００２９】
「熱安定性ルシフェラーゼ」という用語は、対応する野生型ルシフェラーゼと比較して、所定の温度（例えば、２２℃）で強化された安定性を有するルシフェラーゼを含む。本明細書に開示される例示の実施形態の場合、「ＴＬ」という用語は、Ｐｐｅ２の熱安定性変異型を指し、Ｐｐｅ２は、フォツリスペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）からのルシフェラーゼである。しかしながら、当業者は、ＴＬについて述べられる場合、任意の熱安定性ルシフェラーゼが用いられ得ることを認識するであろう。例えば、フォティナスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）からのルシフェラーゼ、ならびにルキオラクルキアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ルキオララテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、ピロコエリアミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍｉｙａｋｏ）、ランピリスノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）、フォツリスペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、フェンゴデス種（Ｐｈｅｎｇｏｄｅｓ  ｓｐ．）、ルキオラミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、およびフォティナスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）からのルシフェラーゼが用いられてもよい（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１３３９：３９−５２（１９９７）参照）。
【００３０】
「ＣＰ」という用語は、円順列置換（circularly-permuted）を指す。例えば、「ＴＬ−ＣＰ」は、フォツリスペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）からのＰｐｅ２ルシフェラーゼの円順列置換熱安定性変異型を指す。用語「ＤＥＶＤ：ＤＤ」は、リンカー、すなわち、ＤＥＶＤカスパーゼ３／７認識部位および該ＤＥＶＤカスパーゼ認識部位のＣ末端側上にある３つのアミノ酸、ＧＳＬを含む、円順列置換ルシフェラーゼのＮ末端およびＣ末端を接続するアミノ酸配列を指す。
【００３１】
「バイオセンサー」という用語は、標的分子と相互作用することができる、センサー領域を含むアミノ酸配列を指す。標的分子がセンサー領域と相互作用するとき、系の分子特性が解明される。
【００３２】
「カスパーゼ−３／７バイオセンサー」および「ＣＢＳ」という用語は、カスパーゼ−３／７認識部位と円順列置換されたフォツリスペンシルバニカからのＰｐｅ２ルシフェラーゼの熱安定性変異型を含むバイオセンサー、すなわち、修飾されたＴＬフラグメントの間の接合部において、カスパーゼ−３／７認識部位、ＤＥＶＤを含むものを指す。例えば、「ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ」は、配列番号２に対して３５８位において円順列置換されたＣＢＳを指し、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端およびＣ末端を接続するＤＥＶＤ：ＤＤリンカーを含む。「ＣＢＳ変異型」という用語は、ＣＢＳに対して１つ以上のアミノ酸置換を持つＣＢＳを指す。
【００３３】
置換残基を識別するために本出願全体で用いられるアミノ酸付番は、フォツリスペンシルバニカからの野生型Ｐｐｅ２ルシフェラーゼのポリペプチド配列、すなわち配列番号２、またはフォツリスペンシルバニカポリペプチド配列、すなわち配列番号４からのＰｐｅ２ルシフェラーゼの熱安定性変異型内の位置に対して特定される。さらに、配列番号４内に示されるもの以外の変異体を用いることができる。
【００３４】
「カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位」という用語は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７アイソフォームのいずれかにより認識および切断されるペプチド配列を指す。例えば、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位は、ＤＥＶＤＧ（配列番号５５）を含んでよい。
【００３５】
「グランザイムＢ認識部位」という用語は、グランザイムＢアイソフォームにより認識および切断されるペプチド配列を指す。例えば、グランザイムＢ認識部位は、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）またはＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）を含んでもよい。
【００３６】
「標的分子」という用語は、バイオセンサー、例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、Ｇタンパク質連結受容体、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、酵素共因子、イオン（例えば、カルシウムイオン、ｐＨセンサーとして用いるための水素イオン）、抗体、ペプチド、またはバイオセンサーに系の分子特性を解明させる糖と相互作用する、目的の分子を指す。
【００３７】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一性」という用語は、同一であるか、または任意の数の配列比較アルゴリズムを用いるか、または手動整列および目視検査により測定されるように、比較ウィンドウまたは指定領域上の最大対応について比較および整列されるときに、同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
【００３８】
本明細書において、「細胞」、「細胞株」、および「宿主細胞」という用語は、同義的に用いられ、そのような指定は、これらの指定の子孫または可能な子孫を含む。「形質転換細胞」という用語は、本発明の核酸分子が中に（またはその原種の中に）導入される細胞を指す。任意で、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子によりコードされたタンパク質またはポリペプチドを生産することができる安定して形質転換された細胞株を形成するように、適切な細胞株の中に導入されてもよい。そのような細胞株を構築するためのベクター、細胞、および方法は、当該技術分野においてよく知られている。「形質転換体」または「形質転換細胞」という語は、転換の回数に関係なく、本来の形質転換細胞に由来する一次形質転換細胞を含む。すべての子孫は、意図的な変異または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ含有量が精密に同一でなくてもよい。それでもなお、本来の形質転換細胞内でスクリーニングされるものと同一の機能性を有する変異体子孫は、形質転換体の定義内に含まれる。
【００３９】
本明細書において、「異種」核酸配列またはタンパク質は、参照配列に対して、異なる源を有する、例えば、外来種を起源とする配列を指し、または同一種からの場合は、本来の形態から実質的に修飾されてもよい。「相同性」という用語は、２つ以上の配列間の相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があってもよい。
【００４０】
「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸配列」という用語は、本明細書において、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の生産に必要なコーディング配列を含む、核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指す。コードされたポリペプチドは、全長ポリペプチド、そのフラグメント（全長未満）、または融合ポリペプチドを生じる、全長ポリペプチドもしくはそのフラグメントのいずれかと別のポリペプチドとの融合であってもよい。
【００４１】
タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子のコーディング領域を含む核酸配列を意味するか、または言い換えれば、核酸配列は、遺伝子産物をコードする。コーディング領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ形態で存在してもよい。ＤＮＡ形態で存在するとき、オリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってよい。エンハンサー／プロモーター、スプライス接合部、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御要素は、転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写物の適正な処理を許可するために必要な場合、遺伝子のコーディング領域の近位に配置されてもよい。他の対照または調節要素としては、限定されないが、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびエンハンサー要素が挙げられる。
【００４２】
本明細書において、「親」は、本発明のさらなる操作により変異型を生成するために用いられる、開始アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。例えば、野生型フォツリスペンシルバニカＰｐｅ２ルシフェラーゼ（配列番号２）、フォツリスペンシルバニカからのＰｐｅ２ルシフェラーゼの熱安定性変異型（例えば、配列番号４）、またはフォツリスペンシルバニカからのＰｐｅ２ルシフェラーゼの円順列置換熱安定性変異型（例えば、配列番号６）を開始配列として用いて、本発明において記載される変異型を生成することができる。さらに、配列番号４または６内に示されるもの以外の変異型を親配列として用いることができる。
【００４３】
「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、任意のアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、天然に存在するタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントの変異型もコードしてよく、それが由来する天然に存在する（天然型または野生型）タンパク質のアミノ酸配列対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、コレオプテランルシフェラーゼは、配列番号２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ホタルルシフェラーゼは、配列番号２もしくは４のうちの１つ、または配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、もしくは７４が基づくルシフェラーゼに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４４】
本明細書において、「純粋」とは、対象の種が、存在する優勢種である（すなわち、組成物中の任意の他の個別種よりもモルベースで多く存在する）ことを意味し、一実施形態において、実質的に精製された分画は、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む。一般に、「実質的に純粋な」組成物は、該組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超を含み、一実施形態では、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％超を含む。一実施形態において、対象種は、本質的に均一に精製され（従来の検出方法により、組成物中で汚染種を検出することができない）、該組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。
【００４５】
核酸は、異なる種の変異を含むことが知られている。「置換」は、親配列からの１つ以上の塩基位置（複数可）におけるヌクレオチドの配列内の変更を指す。変異は、核酸配列が親配列（例えば、野生型）と異なるか、または置換終止コドンを有するように、１つ以上の塩基の挿入または欠失を指してもよい。
【００４６】
「応答性」という用語は、バイオセンサーと標的分子との相互作用に起因する、発光の変化、例えば、発光の増加または減少を指す。
【００４７】
本明細書において、「サンプル」は、細胞、動物、細胞溶解物、またはインビトロ  転写／翻訳混合物を指し得る。
【００４８】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡのフラグメントが挿入またはクローン化され得る核酸分子を指し、それらを用いてＤＮＡ断片（複数可）を細胞中に転送することができ、細胞内の複製を可能にする。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどに由来してもよい。
【００４９】
「野生型」という用語は、本明細書において、天然に存在する源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物を指す。遺伝子または遺伝子産物は、天然に存在するか、または合成することができる。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「野生型」形態は、任意に指定される。これに対して、「変異体」または「変異型」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、配列および／または機能特性の修飾（すなわち、変更された特徴）を呈する遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する変異体および合成変異体は、単離することができ、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、それらが特徴を変化させたという事実により識別されることが知られている。
【００５０】
発光は、適切な条件下、例えば、ルシフェリンなどの好適な基質の存在下でのルシフェラーゼポリペプチドの光出力を指す。光出力は、ルシフェリン基質の添加時に開始し得る、発光反応の開始時に、光出力の即時またはほぼ即時測定として測定され得る（「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と呼ばれる場合がある）。様々な実施形態における発光反応は、例えば、原核または真核発現系内の細胞からの溶解物を含む溶液中で行われる。他の実施形態において、発現は、インビトロ系内で発生するか、またはルシフェラーゼタンパク質は、細胞外媒質中に分泌され、後者の場合、溶解物を生産する必要がないようにする。他の実施形態では、ルシフェラーゼは、全細胞（複数可）またはインビトロ、例えば、動物内で発現する。いくつかの実施形態において、反応は、ルシフェラーゼタンパク質を含む反応チャンバ（例えば、９６−ウェルプレートなどの多重ウェルプレートのウェル）中に適切な材料、例えば、ルシフェリンを注入することにより開始される。反応チャンバは、例えば、照度計または光電子増倍管を用いて、光出力を測定することができる読取装置内に配置されてもよい。ルシフェラーゼが全細胞（複数可）または動物内で発現するとき、反応は、ルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリンの投与により開始される。全細胞（複数可）の場合、この投与は、ルシフェラーゼ基質の細胞媒質中への添加を含んでもよい。動物の場合、ルシフェラーゼ基質の投与は、注入または経口投与を含んでよく、例えば、該基材の動物の食餌または水への混入を含み得る。光出力または蛍光は、例えば、同一反応チャンバ、細胞（複数可）、または動物内で数秒、数分、数時間などの期間に経時的に測定されてもよい。光出力または蛍光は、経時的平均、シグナルの減衰半減期、一定期間にわたるシグナルの合計、またはピーク出力として報告されてもよい。蛍光は、撮像、例えば、インビボ撮像を介して検出することもできる。
【００５１】
強化された応答は、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーが標的分子と相互作用する前後の差異的活性を含む。ＴＬ−ＣＰバイオセンサーの基底活性は、バイオセンサーが標的分子と相互作用する前、アッセイ時間（０）における活性として定義される。誘導活性は、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーが標的分子と相互作用した後、しばらく後の時点（ｔ）における活性として定義される。活性の応答または倍率増加は、基底活性に対する誘導活性の比率である。
【００５２】
強化された発光は、比較により得られた測定値の好適な比較により決定されるように、増加した光出力を含む。本明細書において開示されるように、ＴＬ−ＣＰバイオセンサー配列に対する１つ以上の好適なアミノ酸置換は、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーポリペプチドを生産し、強化された発光を呈する。親熱安定性ルシフェラーゼヌクレオチド配列からのヌクレオチド配列における変化は、アミノ酸置換をもたらすこと、および／またはタンパク質発現を強化することにより、強化された発光に寄与し得る。
【００５３】
強化されたシグナル安定性は、例えば、経時的なシグナルの減衰半減期により測定されるように、ルシフェラーゼからのシグナルが発光を継続する期間の増加を含む。
【００５４】
強化されたタンパク質安定性は、増加した熱安定性（例えば、上昇温度での安定性）および化学的安定性（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、洗剤などの変性剤の存在下での安定性）を含む。
【００５５】
ルシフェラーゼバイオセンサーは、前述されており、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５／０１５３３１０号を参照されたい。センサー領域は、円順列置換ルシフェラーゼ中にクローン化され、ルシフェラーゼバイオセンサーが標的分子と相互作用するときに、標的分子と接触していないルシフェラーゼバイオセンサーに対して、強化または増加した発光が生成されるようにする。あるいは、センサー領域は、円順列置換ルシフェラーゼ中にクローン化され、ルシフェラーゼバイオセンサーが標的分子と相互作用するときに、標的分子と接触していないルシフェラーゼバイオセンサーに対して、減少した発光が生成されるか、または発光が生成されないようにする。センサー領域は、プロテアーゼの活性、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰなどの環状ヌクレオチドの結合、カルシウム、他のイオン、または抗体の存在もしくは濃度、１つ以上のＧタンパク質結合受容体リガンドの存在もしくは濃度、ｐＨの変化、ホスファターゼもしくはキナーゼまたは他の酵素の活性、結合タンパク質もしくは当業者に知られているペプチドもしくは糖などの目的の分子を検出するために有用であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、特定の宿主内の発現のために最適化される。本明細書において、最適化は、コドン最適化、ならびに真核細胞においては、Ｋｏｚａｋ配列および／または１つ以上のイントロンの導入を含む。したがって、核酸分子は、コドンの３０％、３５％、４０％、または４５％超、例えば、５０％、５５％、６０％超で未修飾ルシフェラーゼをコードする野生型核酸配列のそれとは異なるコドン組成を有してよい。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態において、異なるコドンとは、哺乳類においてより頻繁に用いられるものであり、一方別の実施形態において、異なるコドンとは、植物においてより頻繁に用いられるものである。特定の種類の哺乳類、例えば、ヒトは、別の種類の哺乳類とは異なる組の好ましいコドンを有してよい。同様に、特定の種類の植物は、別の種類の植物とは異なる組の好ましいコドンを有してよい。本発明のいくつかの実施形態において、異なるコドンの大部分は、所望の宿主細胞内の好ましいコドンであるものであり、そのような最適化された配列は、ルシフェラーゼに対するシグナルの強度を高めることができる。哺乳類（例えば、ヒト）および植物に対して好ましいコドンは、当業者に知られている（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＮＡＲ  １８：２３６７（１９９０）；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．ＮＡＲ  １７：４７７（１９８９）；ＷＯ０２／１６９４４）。
【００５８】
いくつかの実施形態において、対応する野生型ルシフェラーゼは、コレオプテラン種、例えば、ルキオラクルキアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）、ルキオララテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）、ピロコエリアミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍｉｙａｋｏ）、ランピリスノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）、フォツリスペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、フェンゴデス種（Ｐｈｅｎｇｏｄｅｓ  ｓｐ．）、ルキオラミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、およびフォティナスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）に由来する。（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ；１３３９：３９−５２（１９９７）参照）。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、ＴＬ間の接合部において、アミノ酸ＤＥＶＤを含むカスパーゼ−３認識部位を含む。カスパーゼ−３との相互作用時に、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、認識部位において切断され、２つのＴＬフラグメントがより好ましく、より高い活性の配座を形成するのを可能にする。他の実施形態において、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、他のプロテアーゼに対する認識部位、例えば、カスパーゼ−８認識部位（ＬＥＴＤＧ、配列番号１５）、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位（ＥＮＬＹＦＱＳ、配列番号１６）、またはＭＭＰ−２認識部位（ＰＬＧＭＷＳＲ、配列番号７５）を含む。
【００６０】
修飾されたＴＬ−ＣＰバイオセンサーのアミノ酸配列は、対応する未修飾ＴＬ−ＣＰバイオセンサー（親）、例えば、ルシフェラーゼ配列内で１つ以上の置換を持つ変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列とは異なる。いくつかの実施形態において、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、対応する未修飾熱安定性ルシフェラーゼ（親ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列に対して円順列置換され、順列置換は、修飾に耐える部位（残基）または領域内で起こる。いくつかの実施形態において、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼに対して修飾される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＴＬ−ＣＰバイオセンサーは、１つ以上の別個の（単離された）異種アミノ酸配列を有し、それらのうちの少なくとも１つは、標的分子と直接または間接的に相互作用し、得られるＴＬ−ＣＰバイオセンサーが、標的との相互作用、例えば、生物発光活性が、標的分子との相互作用後に変更される前および／または後、例えば、光強度、色、もしくは動態プロファイルの変更前後に生物発光活性を有する限り、例えば、未修飾の熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端および／またはＣ末端を含む、修飾に耐える部位（複数可）または領域（複数可）内に１つ以上のアミノ酸の欠失を任意に含んでよい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明のＴＬ−ＣＰは、未修飾の熱安定性ルシフェラーゼなどの対応する熱安定性ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して円順列置換される、アミノ酸配列を含み、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼ内に新たなＮ末端およびＣ末端を生じ、それらのうちの少なくとも１つは、修飾に耐える部位または領域内で起こり、標的分子と直接または間接的に相互作用するアミノ酸配列を含むセンサー領域を導入することにより、機能性を有するように設計される。他の実施形態において、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、他の修飾を含み、限定されないが、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端またはＣ末端に対する内的挿入および／または欠失、例えば、対応する未修飾熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端およびＣ末端における、もしくはその付近、例えば、対応する未修飾熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端の残基１〜約１０もしくは約３０、またはそれらの間の任意の整数に対応する、および／またはＣ末端の最後の残基もしくは最後の約３０残基、例えば、最後の１５残基、もしくは１〜３０の間の任意の整数の残基に対応する残基での別の挿入および／または欠失が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、熱安定性甲虫ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（例えば、配列番号２または４のうちの１つ）の残基、例えば、残基７、３７、４７、７５、８３、１０７、１２１、１４４、１６０、１７４、１８８、１９８、２０５、２２５、２３３、２４２、２５５、２６８、３０８、３１６、３５８、３７７、４０３、４３５、４９０、もしくは５４０において、または残基２〜１２、残基３２〜５３（例えば、残基３２〜４３もしくは残基４２〜５２）、残基７０〜８８（例えば、残基７０〜８０もしくは残基７８〜８８）、残基１０２〜１２６（例えば、残基１０２〜１１２もしくは残基１１６〜１２６）、残基１３９〜１６５、残基１８３〜２０３、残基２２０〜２４７（例えば、残基２２８〜２３８）、残基２６２〜２７３、残基３０３〜３１３、残基３５３〜４０８、残基４８５〜４９５、あるいは残基５３５〜５４６に対応する領域内で円順列置換されてよい。残基の付番は、未修飾（天然）ホタルルシフェラーゼのそれに基づいている。対応する位置は、例えば、配列整列プログラムを用いてルシフェラーゼ配列を整列させることにより識別されてよい。修飾に耐えるルシフェラーゼ内の残基または領域は、ルシフェラーゼを円順列置換するための部位、または挿入のための部位として用いられてもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼおよびリンカーを含む、バイオセンサーをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、熱安定性ルシフェラーゼは、熱安定性などの向上した特性を授与するアミノ酸置換を含む、フォツリスペンシルバニカルシフェラーゼＰｐｅ２（配列番号１および２）のバージョンに基づいている（配列番号３および４）。リンカーは、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に結合する。リンカーは、細胞内の標的分子と相互作用することができるセンサー領域を有する。修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、未修飾の熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに対して、バイオセンサーと標的との相互作用後に強化された応答を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、細胞内の標的分子との相互作用後に強化された応答を有する。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、配列番号２の５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、４０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２、もしくは５４３位に対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＴＬ−ＣＰは、熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端およびＣ末端を接続するセンサー領域を含むリンカーを有し、該センサー領域は、標的分子（例えば、プロテアーゼまたはキナーゼ）と直接相互作用する、アミノ酸配列（例えば、プロテアーゼ認識部位またはキナーゼ部位）を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、標的分子と相互作用するアミノ酸配列には、少なくとも１つのリンカーが隣接し（例えば、ペプチドリンカーなどの各末端で隣接し）、それらのリンカーは、同一であっても異なってもよく、標的分子との相互作用時の発光および／または応答を任意に向上させる。いくつかの実施形態において、標的分子と相互作用するアミノ酸配列は、Ｎ末端において少なくとも１つのリンカーが隣接し、標的分子との相互作用時の発光および／または応答を任意に向上させる。いくつかの実施形態において、リンカーは、以下の配列のうちの少なくとも１つを有する。
【００６８】
ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２３）
【００６９】
ＧＳＳＳＤＳＤＳＳＡＧＳ（配列番号２４）
【００７０】
ＧＳＮＤＳＳＧＧＳＥＧＧ（配列番号２５）
【００７１】
ＧＳＮＧＧＦＤＳＳＥＧＧ（配列番号２６）
【００７２】
ＧＳＩＲＷＳＧＬＳＧＧＤ（配列番号２７）
【００７３】
ＧＳＲＧＧＳＶＹＳＥＧＧ（配列番号２８）
【００７４】
ＧＳＳＥＧＳＳＤＦＧＧＤ（配列番号２９）
【００７５】
ＧＳＩＶＶＳＣＳＳＥＧＧ（配列番号３０）
【００７６】
ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ（配列番号３１）
【００７７】
ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＣ（配列番号３２）
【００７８】
ＧＳＳＧＣＴＧＤＡＧＧＳ（配列番号３３）
【００７９】
ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＱＣ（配列番号３４）
【００８０】
ＧＳ  Ｓ／Ｎ  Ｓ／Ｄ／Ｇ  Ｄ／Ｓ／Ｇ  Ｓ／Ｆ  Ｄ／Ｇ  Ｓ／Ｇ  Ｓ  Ａ／Ｅ  Ｇ  Ｓ／Ｇ（配列番号３５）
【００８１】
Ｇ  Ｓ  Ｉ／Ｒ／Ｓ  Ｒ／Ｇ／Ｅ  Ｗ／Ｇ  Ｓ  Ｇ／Ｖ／Ｓ  Ｌ／Ｙ／Ｄ  Ｓ／Ｆ  Ｇ／Ｅ  Ｇ  Ｄ／Ｇ（配列番号３６）
【００８２】
Ｇ  Ｓ  Ｉ／Ｎ／Ｓ  Ｖ／Ｗ／Ｇ  Ｖ／Ｄ／Ｃ  Ｓ／Ｔ  Ｃ／Ｇ  Ｓ／Ｃ／Ｄ  Ｓ／Ａ  Ｅ／Ｒ／Ｇ  Ｇ／Ｅ  Ｇ／Ｓ（配列番号３７）
【００８３】
Ｇ  Ｓ  Ｉ／Ｓ  Ｖ／Ｇ／Ａ  Ｖ／Ｇ  Ｓ／Ｃ  Ｇ／Ｄ  Ｇ／Ｄ／Ｓ  Ｓ／Ａ  Ｇ／Ｅ  Ｇ／Ｅ  Ｇ／Ｎ（配列番号３８）
【００８４】
Ｇ  Ｓ  Ｉ／Ｎ／Ｓ  Ｖ／Ｗ／Ｇ／Ａ  Ｖ／Ｄ／Ｃ／Ｇ  Ｓ／Ｔ／Ｃ  Ｃ／Ｇ  Ｓ／Ｃ／Ｄ  Ｓ／Ａ  Ｅ／Ｒ／Ｇ  Ｇ／Ｅ  Ｇ／Ｓ（配列番号３９）
【００８５】
ＧＳＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ（配列番号４０）
【００８６】
ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥ（配列番号４１）
【００８７】
ＧＳＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ（配列番号４２）
【００８８】
ＧＳＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ（配列番号４３）
【００８９】
ＮＷＤＳＧＣＳＲＥＧ（配列番号４４）または
【００９０】
ＩＡＧＣＧＤＡＧＥＧ（配列番号４５）
【００９１】
「スラッシュ（／）」マークは、「／」の前または後のアミノ酸が、その位置で用いられてよいことを示す。本発明のバイオセンサー内で用いられるリンカーは、アミノ酸配列であり、バイオセンサー内のその存在は、そのバイオセンサーの活性を実質的に減少させず、例えば、リンカー（複数可）を欠く対応するバイオセンサーに対して、活性を１０倍超、例えば、わずか４倍、またはわずか２倍も減少させない、および／または本発明のバイオセンサー内で用いられるリンカーの存在は、リンカー（複数可）を欠く対応するバイオセンサーもしくはリンカー（複数可）ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２３）を有する対応するバイオセンサーに対して、または両方の対応するバイオセンサーに対して、発光またはその標的との相互作用に対す応答を増加させる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、本発明のセンサー領域に対するＮ末端に位置し、標的分子、例えば、検出される分子と直接または間接的に相互作用することができる。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、本発明のバイオセンサー内のそのペプチド配列に対するＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、検出される標的分子と直接または間接的に相互作用することができる、ペプチド配列に対するＮ末端およびＣ末端に位置する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、標的分子の非存在下で、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、対応する親（未修飾）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性未満であり、例えば、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発光活性は、約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、５０％、７０％以上であるが、対応する親（未修飾）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのそれの１００％未満であり、その修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、任意で検出可能である。他の実施形態において、標的の非存在下で、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、親（未修飾）円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性と実質的に同じであるか、またはそれ以上であり、例えば、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、親（未修飾）円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのそれの約１．５倍、例えば、少なくとも２倍、３倍、または５倍以上である。標的分子の存在下で、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、検出可能に変更される。例えば、標的分子の存在下での修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの活性内の検出可能な変更は、標的の非存在下での修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性に対して、少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％または１００％、および最大２倍、４倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍以上の変更である。したがって、親（未修飾）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーではないが、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内に存在するセンサー領域と相互作用する、標的分子の物理的近接は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性を変更、例えば、減少、排除、または増加させる。いくつかの実施形態において、標的の存在下での本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発光シグナルは、標的分子の存在下での対応する親（未修飾）円順列置換熱安定性ルシエフェラーゼバイオセンサールシフェラーゼの発光シグナルに対して増加する。
【００９４】
本発明は、円順列置換バイオセンサーを含み、そのルシフェラーゼ配列は、本来の（野生型）Ｎ末端もしくはＣ末端、または両方において、残基の欠失を含んでよく、例えば、Ｎ末端において１〜３個以上の残基の欠失およびＣ末端において１〜６個以上の残基、ならびに標的分子と相互作用するか、または翻訳語修飾（センサー）により影響されるセンサー領域を含んでもよい。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、未修飾円順列置換された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのアミノ酸配列と同じであるか、または実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列が、全体的ではないかもしれないが、大部分が同じであり、それが関連する配列の機能活性を保持することを意味する。一般に、２つのアミノ酸配列は、少なくとも８０％が同一である場合、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％以上の同一性を有する場合、実質的に同じであるか、または実質的に相同性である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、修飾は、限定されないが、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ（例えば、コレステロールエステラーゼ）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、および同様物を含む、加水分解酵素の認識部位の導入であってもよい。例えば、加水分解酵素としては、限定されないが、ペプチド結合に作用する酵素（ペプチド加水分解酵素）、例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼおよびトリペプチジル−ペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、および未知の触媒機構のエンドペプチダーゼが挙げられる。例えば、本発明の修飾された熱安定性甲虫ルシフェラーゼは、エンテロキナーゼ切断部位、カスパーゼ切断部位、コロナウイルスプロテアーゼ部位（ＳＴＬＱ−ＳＧＬＲＫＭＡ、配列番号４６）、キナーゼ部位、ＨＩＶ−１プロテアーゼ部位（ＳＱＮＹ−ＰＩＶＱまたはＫＡＶＲＬ−ＡＥＡＭＳ、それぞれ配列番号４７および配列番号４８）、ＨＣＶプロテアーゼ部位（ＡＥＤＶＶＣＣ−ＳＭＳＹＳ、配列番号４９）（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２００３参照）、ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位（例えば、ＱＴＳＩＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲＫＭＡＦＰＳ、配列番号５０またはＶＲＱＣＳＧＶＴＦＱＧＫＦＫＫＩＶＫＧＴ、配列番号５１）、グランザイムＢ部位、ライノウイルスプロテアーゼ部位、例えば、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ部位、プロホルモン転換酵素部位、インターロイキン−１６転換酵素部位、ＣＭＶ組立部位、リーシュマンジシン部位、炭疽菌致死因子、ボツリヌス神経毒軽鎖プロテアーゼ部位、アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位（ＶＫＭ−ＤＡＥＦ、配列番号５６）、前立腺特異的抗原配列、トロンビン部位、レニンおよびアンジオテンシン転換酵素部位、カテプシンＤ部位、マトリックスメタロプロテイナーゼ部位、ｕＰＡ部位、プラスミン部位、カチオンの結合部位、例えば、カルシウム結合ドメイン、カルモデュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、マルトース結合タンパク質ドメイン、またはビオチン結合ドメインを含んでよい。別の実施形態において、本発明の修飾された熱安定性甲虫ルシフェラーゼは、抗体などのリガンドまたはカルシウムなどの金属により認識される配列を含んでもよい。
【００９６】
本発明はまた、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する安定した細胞株を含み、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸分子を含む、発現カセットを含み、および／または宿主細胞内で本発明の核酸分子を発現することができるベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、または欠陥ウイルス粒子）を含む。一実施形態において、発現カセットは、核酸配列に操作可能に連結されたプロモーター、例えば、構造的または調節可能なプロモーターを含む。一実施形態において、発現カセットは、誘導可能なプロモーターを含む。本発明の発現カセットまたはベクターを含む、宿主細胞、例えば、植物または脊椎細胞、例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、または齧歯類（例えば、ウサギ、ラット、フェレット、もしくはマウス）細胞を含む哺乳類細胞などの原核細胞または真核細胞、および本発明の核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞、または修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを含むキットも提供される。
【００９７】
例えば、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクターは、サンプル、例えば、細胞、細胞溶解物、インビトロ転写／翻訳混合物、または上清と混合され、該サンプル中の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの活性は、例えば、１つ以上の時点において任意に、または標的を有しないか、もしくは異なる量の標的を有する対照サンプルに対して、検出もしくは決定される。例えば、経時的および／または対照（例えば、特定量の標的分子を有する細胞）に対するサンプル中の発光活性の変更は、サンプル中の標的分子の存在もしくは量、または実験条件に関連する標的分子の量の変化を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、プロモーター、例えば、調節可能もしくは構成的プロモーターを含むベクター、および環状ヌクレオチドと相互作用するセンサー領域を含む、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードする核酸配列と接触する。いくつかの実施形態において、形質転換細胞は、プロモーターが、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘導する条件下で培養され、発光の存在または量が決定される。他の実施形態において、標的分子と相互作用するセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および標的分子を有する疑いがあるサンプルは混合され、発光の量が決定される。
【００９８】
本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、未修飾の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、例えば、機能的レポーターとして、細胞または動物（例えば、マウス）内の様々な条件および／または標的分子を測定または検出することができない用途に用いられてもよい。例えば、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクター、または該修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、細胞、動物、細胞溶解物、インビトロ転写／翻訳混合物、または上清に導入され、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、例えば、１つ以上の時点において、および対応する未修飾の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに対して検出または決定される。経時的、および／または対照（例えば、対応する未修飾の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを有する細胞）に対する細胞、動物、細胞溶解物、インビトロ転写／翻訳混合物、または上清混合物中の発光活性の変更は、プロテアーゼの存在を示す。例えば、本発明は、重度の急性呼吸器症候群と関連付けられたウイルスを検出する方法を含む。本方法は、生物学的サンプル、例えば、生体組織または流体を修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと接触させることを含む。バイオセンサーは、ウイルスのプロテアーゼに対するアミノ酸認識配列を含む。サンプルの存在下で、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が変更されたか否かが検出または決定され、それによりサンプルがウイルスを含むか否かを示す。
【００９９】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル中の標的分子の存在または活性を検出する方法を提供し、サンプルを、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および該修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と接触させることと、発光を測定することと、を含む。いくつかの実施形態において、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子のセンサー領域を含む。センサー領域は、限定されないが、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位、またはヌクレオチド結合部位を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、プロテアーゼ、キナーゼ、抗体、金属、イオン、環状ヌクレオチド、またはヌクレオチドである、標的分子の存在または活性を検出してもよい。実施形態において、プロテアーゼは、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ、またはＭＭＰ−２であってもよい。実施形態において、サンプルは、細胞、動物、細胞溶解物、またはインビトロ転写／翻訳混合物であってもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、試験化合物を添加することを含み、該試験化合物は、標的分子の活性を変化（例えば、増加、排除、または増加）させ得る。実施形態において、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質は、ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体であってもよい。
【０１００】
本発明は、目的の分子の存在を検出する方法も提供する。例えば、細胞は、プロモーター（例えば、調節可能なプロモーター）を含むベクター、および目的の分子と相互作用する挿入／センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列と接触する。一実施形態において、形質転換細胞は、プロモーターが、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘導する条件下で培養され、該修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出可能な活性が決定される。別の実施形態において、動物（例えば、マウス）は、プロモーター（例えば、調節可能なプロモーター）を含むベクター、および目的の分子と相互作用する挿入／センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列、または本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する形質転換細胞と接触する。次に、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出可能な活性が決定される。
【０１０１】
本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、標的分子、すなわち目的の分子と相互作用するアミノ酸配列を含むか、またはそうでなければ対応する未修飾の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに対する条件に敏感である。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの相互作用または活性に対する一定条件下で、目的の分子との変更された相互作用または変更された活性を有する、変異型の修飾された円順列置換ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、１つ以上の変異型ポリヌクレオチドが選択される。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを分子のライブラリと接触させることと、１つ以上の分子が、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内のセンサー領域と相互作用するか否かを検出または決定することと、を含む方法を提供する。
【０１０２】
本発明は、サンプル内に存在する標的分子または目的の分子の量を調節することができる薬剤（「試験」薬）についてスクリーニングする方法も提供する。「調節」は、生物活性または過程（例えば、酵素活性）の機能特性を強化または阻害するいずれかの能力を指す。このような強化または阻害は、シグナル変換経路の活性化などの特定イベントの発生に付随し得る、および／または特定の細胞タイプにおいてのみ表され得る。「調節因子」は、薬剤（天然に存在するか、または天然に存在しない）、例えば、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子）、小分子、細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に哺乳類）細胞もしくは組織などの生物物質から製造された抽出物、または任意の他の薬剤を指す。調節因子は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに含めることにより、生物過程（複数可）（例えば、アゴニスト、部分アゴニスト、またはアンタゴニスト）の（直接的または間接的）阻害剤または活性剤としての潜在的な活性について評価される。調節因子の活性（複数可）は、既知であるか、未知であるか、または部分的に既知であり得る。そのような調節因子は、本発明の方法を用いてスクリーニングすることができる。「試験薬」または「試験化合物」という用語は、推定調節因子として本発明の１つ以上のスクリーニング方法により試験される薬剤または化合物を指す。通常、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、および１０．０μＭなどの様々な所定濃度がスクリーニングに用いられる。対照は、試験薬もしくは化合物の非存在下、標的を調節することが知られている薬剤もしくは化合物との比較、または試験薬もしくは化合物との接触前、接触中、および／または接触後のサンプル（例えば、細胞、組織、もしくは有機体）との比較で、シグナルの測定値を含むことができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本方法は、プロテアーゼ活性を調節する薬剤または化合物をスクリーニングすることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、アポトーシスを調節することができる薬剤または化合物を識別する方法が提供される。カスパーゼファミリーのプロテアーゼは、アポトーシスと関連付けられている。したがって、カスパーゼファミリーのプロテアーゼを含むことが疑われるサンプルを、カスパーゼ活性を調節することが疑われる薬剤または化合物、およびカスパーゼにより切断可能な切断部位を有する修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと接触させることを含む。修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、試験薬または化合物との接触前後にサンプル内で検出される。薬剤との接触後の活性の増加は、薬剤または化合物がアポトーシスを阻害したことを示し、減少は、薬剤がアポトーシスを活性化したことを示す。
【０１０４】
したがって、本発明は、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内に存在する認識配列の切断を調節する薬剤または化合物を識別し、その活性を検出するために有用なスクリーニングシステムを提供する。これにより、プロテアーゼ活性の調節因子を迅速にスクリーニングすることが可能になる。本明細書に記載のスクリーニングシステムの利用は、プロテアーゼ、例えば、カスパーゼファミリープロテアーゼを調節（例えば、阻害もしくは活性化）する薬剤または化合物を識別するための高感度かつ迅速な手段を提供する。特に、本発明は、センサー領域が、目的の酵素の切断部位であるアミノ酸配列を含む、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを検討する。したがって、目的の分子はプロテアーゼであり、挿入はプロテアーゼの切断認識配列を含むペプチドを含む。プロテアーゼの切断認識配列は、タンパク質分解的切断中にプロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。したがって、本発明は、サンプルをプロテアーゼのセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと接触させ、ルシフェラーゼ活性の変化を測定することによって、サンプル中のプロテアーゼの量を決定する方法を提供する。本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、特に、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞内または動物の体内でのプロテアーゼの活性を監視するために用いることができる。
【０１０５】
本発明のアッセイを用いて、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断するプロテアーゼの活性を変更する薬剤または化合物を識別する薬物をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、アッセイは、プロテアーゼを含むインビトロサンプル上で行われる。既知量のプロテアーゼを含むサンプルを、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーおよび試験薬と混合する。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量を上記のように決定する。試験薬の存在下でのプロテアーゼ１モル当たりの活性量を、試験薬の非存在下でのプロテアーゼ１モル当たりの活性と比較する。差は、試験薬がプロテアーゼの活性を変化させることを示す。したがって、変化は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の減少をもたらすプロテアーゼ活性の増加、または修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の増加もしくは維持に対応するプロテアーゼ活性の減少であってもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、薬剤がプロテアーゼ活性を変化させる能力が決定される。このアッセイにおいて、細胞は、プロテアーゼ活性を調節することが疑われる薬剤または化合物により条件付けられるか、またはそれと接触する。培養物中の細胞（複数可）を溶解し、プロテアーゼ活性を測定する。例えば、既知量または未知量のプロテアーゼを含む溶解した細胞サンプルを、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと混合する。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量を、対照または未処理のサンプルおよび処理された溶解細胞サンプル中の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の程度を決定することにより、上記のように決定する。活性または阻害は、サンプル中１マイクログラムまたはミリグラム当たりのタンパク質に基づいて算出することができる。したがって、プロテアーゼ活性の調節は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の減少をもたらすプロテアーゼ活性の増加、または修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の増加もしくは維持に対応するプロテアーゼ活性の減少を含む。典型的に、差は、絶対量のプロテアーゼ活性を生じるように、標準測定値に対して較正される。プロテアーゼの活性または発現を阻害または阻止する試験薬は、未処理の対照と比較して、処理された細胞内の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の増加により検出することができる。
【０１０７】
他の実施形態において、薬剤または化合物がプロテアーゼ活性をインビボで変更する能力が決定される。インビボアッセイにおいて、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする発現ベクターにより一過性または安定的に形質転換された細胞は、異なる量の試験薬または試験化合物に曝露され、細胞内のルシフェラーゼ活性に対する試験薬または試験化合物の影響を決定することができる。典型的に、差は、絶対量のプロテアーゼ活性を生じるように、標準測定値に対して較正される。プロテアーゼの活性または発現を阻害または阻止する試験薬は、未処理の対照と比較して、処理された細胞内の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の増加により検出することができる。
【０１０８】
他の実施形態において、薬剤または化合物が動物の体内のプロテアーゼ活性を変化させる能力が決定される。全動物アッセイにおいて、動物（例えば、マウス）には、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が注入されてよく、動物は、異なる量の試験薬または試験化合物に曝露される。いくつかの実施形態において、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞は、動物に移植されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質を動物に注入する。いくつかの実施形態では、基質を動物の細胞に注入する。次に、動物内のルシフェラーゼ活性に対する試験薬または試験化合物の影響を決定することができる。
【０１０９】
本開示はまた、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを固体支持体、例えば、粒子、樹脂、カラム、固体表面（例えば、プレート、スライド、またはウェル底）などに固定化する方法も提供する。次に、固定化されたバイオセンサーを用いて、目的の分子の存在または活性を検出することができる。いくつかの実施形態において、精製された形態であるか、または細胞溶解物、例えば、大腸菌細胞溶解物内で発現したかのいずれかである、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、固体支持体、例えば、樹脂または固体表面、および検出された目的の分子の上に固定化することができる。目的の分子は、分子の精製された形態であり得るか、または細胞溶解物内で発現し得る。次に、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出可能な活性が決定される。
【０１１０】
いくつかの態様において、本開示は、サンプルを、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼの基質と接触させることと、サンプル内の発光を検出することと、を含む、サンプル内のアポトーシスを検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、アポトーシスに関与する分子のセンサー領域を含む。
【０１１１】
いくつかの態様において、本開示は、細胞媒介性細胞傷害についての非放射性アッセイための組成物および方法を提供する。本開示は、細胞傷害性リンパ球、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびサイトカイン活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により媒介される細胞傷害を検出または決定するための組成物および方法を提供する。本開示は、グランザイムＢ活性を検出するための新規のグランザイムＢ認識配列および生物発光バイオセンサーも提供する。本開示は、本明細書に記載される生物発光バイオセンサーを用いて、細胞ベースのアッセイにおいてグランザイムＢ活性を検出する方法をさらに含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、新規または既知のグランザイムＢ認識配列を含む生物発光プロテアーゼバイオセンサーを用いる。いくつかの実施形態において、本方法は、グランザイムＢ認識配列を含む生物発光プロテアーゼバイオセンサーを標的細胞に形質転換することと、形質転換された標的細胞を細胞傷害性リンパ球、例えば、ＮＫ細胞で共インキュベートすることと、発光を検出することと、を含む。グランザイムＢが形質転換された標的細胞に良好に転送された場合、認識配列を介してバイオセンサーを切断し、発光が生成される。標的細胞の例としては、例えば、Ｋ５６２細胞、ＥＬ４細胞、またはＪｕｒｋａｔ細胞などの腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細胞内細菌または寄生原虫に感染した細胞、および移植された腎臓、心臓、肺などの同種移植片が挙げられる。
【０１１３】
他の実施形態において、本発明の方法を用いて、患者または患者由来のＣＴＬもしくはＮＫ細胞を試験して、それらの細胞傷害機能を決定することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、グランザイムＢ認識配列を含む生物発光プロテアーゼバイオセンサーを、標的細胞、例えば、腫瘍細胞中に形質転換することと、形質転換された標的細胞を患者または患者由来のＣＴＬもしくはＮＫ細胞を用いて共インキュベートすることと、発光を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、患者または患者由来のＣＴＬもしくはＮＫ細胞は、細胞傷害機能をほとんど有しないか、または未知の細胞傷害機能を有する。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明の方法を用いて、細胞の細胞傷害機能の阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはエンハンサー（例えば、小分子）についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、阻害剤またはエンハンサーについてのスクリーニングは、多重ウェル形式、例えば、９６−、３８４−、または１５３６−ウェルで行うことができる。
【０１１５】
本開示は、新規のグランザイムＢ認識配列も提供する。いくつかの実施形態において、新規のグランザイムＢ認識配列は、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）またはＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）である。
【０１１６】
本開示は、細胞媒介性細胞傷害の検出のためのプロテアーゼバイオセンサーも提供する。プロテアーゼバイオセンサーは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／１０５，６４８号に記載されるように、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼおよびペプチドリンカーを含むバイオセンサーをコードする。ペプチドリンカーは、目的の分子と相互作用することができるセンサー領域を含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼバイオセンサーセンサー領域は、グランザイムＢ認識配列を含む。いくつかの実施形態において、グランザイムＢ認識配列は、新規の認識配列、例えば、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）またはＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）である。他の実施形態において、グランザイムＢ認識配列は、既知の認識配列、例えば、ＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）である。
【０１１７】
本開示は、細胞過程におけるグランザイムＢ活性、例えば、β−アレスチン局在化を検出するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、本発明のグランザイムＢバイオセンサーを用いて、細胞過程におけるグランザイムＢ活性を決定する。
【０１１８】
本発明のアッセイにおいて使用するための材料および組成物は、理想的にはキットの調製に適している。そのようなキットは、１つ以上の容器手段、例えば、バイアル、管、および相当物などを含む搬送手段を備え、容器手段のそれぞれは、本方法で用いられる別個の要素のうちの１つを含む。容器のうちの１つは、本発明の修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーまたはポリヌクレオチドを（例えば、ベクターの形態で）含む。第２の容器は、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質を含んでもよい。
【０１１９】
本発明は、以下の非限定例によりさらに説明される。
【実施例】
【０１２０】
実施例Ｉ：細胞内の応答性が増加した修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの生成
【０１２１】
カスパーゼ−３バイオセンサー（ＣＢＳ）は、アミノ酸３５８位で円順列置換された（ＣＰ）、カスパーゼ−３認識部位を有する、熱安定性フォツリスペンシルバニカルシフェラーゼ（ＴＬ）、すなわち、ＴＬフラグメントの間の接合部にアミノ酸ＤＥＶＤを含むカスパーゼ−３認識部位を含むものである。開始テンプレートとして用いられた特異的ＣＢＳは、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤと呼ばれる。このＣＢＳのアミノ酸配列は、Ｍ／ＴＬ残基３５８〜５４４／ＳＤＥＶＤＧＳＬ／ＴＬ残基４〜３５４／Ｖ（配列番号６）として表すことができる。ＣＰ  ＴＬ内のアミノ酸位は、非ＣＰ  ＴＬ配列のそれに相関する（添付の付録に提供される）。カスパーゼ−３で処理すると、ＣＢＳは、認識部位で切断され、２つのＴＬフラグメントがより好ましい高活性の構造を形成することを可能にする。
【０１２２】
ＣＢＳの利用性は、カスパーゼ−３による切断前後の差異的活性である。ＣＢＳの基礎活性は、カスパーゼ−３が認識部位において切断する時間を有する前のアッセイ時間（０）における活性として定義される。誘導活性は、ＣＢＳがカスパーゼ−３により切断された後、しばらく後の時点（ｔ）における活性として定義される。活性における応答または倍率増加は、基礎活性に対する誘導活性の比率である。ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ内の置換は、誤りを起こしやすい変異型ＰＣＲベースシステムＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７（５）：２０２９（２０００））を用いて、製造者の指示に従って、誘導に対する応答性が強化されたＣＢＳ変異型を開発するために生成された。
【０１２３】
得られるライブラリは、大腸菌内で発現し、組み換えカスパーゼ−３（データ図示せず）による前処理を行う場合と行わない場合のルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。次に、最適なシグナルおよび応答特性を有するＣＢＳ変異型を、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）処理に対する応答を測定する動態アッセイによりＨＥＫ２９３細胞内で評価した（Ｗｉｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３（１９９５）；Ｎｉｌｅｓ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１４：１３７（２００８））。ＴＲＡＩＬは、細胞死受容体の活性化を介してアポトーシスを誘導して、活性カスパーゼ−８を形成し、順にプロカスパーゼ３を活性化してカスパーゼ−３を生産する。活性カスパーゼ−３の出現には、ＣＢＳ変異型が切断および活性化されるときの発光の増加が付随する必要がある。つまり、９６ウェルプレート内に１５，０００細胞／ウェルで載置されたＨＥＫ２９３細胞は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ内にアミノ酸置換を持つ様々なＣＢＳ変異型をコードするプラスミドＤＮＡを含むＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴＩ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いて一過性に形質転換された。同一のプラスミドは、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの構成的発現のための遺伝子も搬送し、形質転換対照として作用した。細胞を２ｍＭルシフェリンにより３７℃で２時間前処理した。細胞を１μｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬで処理し、３７℃で１０時アッセイした。発光を連続して経時的に監視した（発光計：Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ）１秒積分時間）。複製ウェル内の細胞を、ＴＲＡＩＬの添加時、すなわち、時間（０）に溶解し、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。次にすべてのバイオセンサーデータを、レニラルシフェラーゼ発光（Ｄｕａｌ−ＧｌｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、形質転換効率について正規化した。
【０１２４】
例示のＣＢＳ変異型は、限定されないが、表１に列挙されるものを含む。表１は、クローン名で識別された、ＴＲＡＩＬ処理に対して改善された応答を示す、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤの変異型を列挙する。表１に列挙される改善を、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ  ＣＢＳに対して正規化する。「基底（ＢＡＳＡＬ）」は、ＴＲＡＩＬ添加時、すなわち、時間（０）における正規化されたバイオセンサー発光を表し、「誘導（ＩＮＤＵＣＥＤ）」は、ＴＲＡＩＬ添加の約１０時間後における正規化されたバイオセンサー発光を表し、「応答（ＲＥＳＰＯＮＳＥ）」は、倍率誘導、すなわち、基底活性に対する誘導活性の比率を表す。
【０１２５】
当該技術分野において既知の標準配列決定法を用いて、各クローン内のアミノ酸置換を識別した（表１参照）。アミノ酸の位置は、変異型の２位の親ＴＬ（例えば、Ｐｒｏ）に基づき（＝ＴＬ３５８）、したがって、ＤＥＶＤのＮ末端に対する残基は、ＴＬ残基３５８〜５４４（Ｇｌｙ）を表し、ＤＥＶＤのＣ末端に対する残基は、ＴＬ残基４（Ｌｙｓ）−３５４（Ｇｌｙ）を表す（例えば、図１参照）。各アミノ酸置換は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ配列ではなく、親ＴＬ内のアミノ酸位置に対応する位置により示され、それにより数値位置に続く第１の文字は、親ＴＬ内の対応するアミノ酸を表す。アミノ酸が別のアミノ酸と置換される場合、第２の文字は、アミノ酸置換を表す。アミノ酸が終止コドンと置換される場合、置換は「終止（ＳＴＯＰ）」により示される。
表１：対応するＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤを超えるＣＢＳ変異型の応答性の倍率改善のまとめ
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１２６】
実施例ＩＩ：熱安定性ルシフェラーゼカスパーゼ−３内の変異の特定の組み合わせに関する評価
【０１２７】
追加のＣＢＳ変異型は、オリゴベースの部位特異的変異誘発キットＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｋｕｎｋｅｌ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８２（２）：４８８（１９８５））を用い、製造者の指示に従って生成した。最も改善された応答を持つ実施例Ｉからの変異型内で識別されたアミノ酸置換、特にクローン１２：Ｂ−１０、０１：Ａ−０５、０４：Ｃ−０３、０１：Ｅ−１１、１６：Ｄ−１２、０１：Ｄ−０２、および０７：Ｂ−０２を組み合わせ、ＨＥＫ２９３細胞内で実施例Ｉと同様に評価した。追加のＣＢＳ変異型を生成するために用いられるアミノ酸置換は、配列番号２に対応する１９３ＬＰ（“１９３ＳＰ”）、２９７ＳＩ、３２９ＲＱ、４７１ＩＴ、５０３ＳＧ、５０７ＴＩ、５２３ＫＩ、５３３ＶＡ、および５３６ＱＲであった。例示のＣＢＳ変異型は、限定されないが、表２に列挙されるものを含む。表２は、クローン（「新（ＮＥＷ  ＃）」）、カラムのＸにより示されるクローン内で見出されたアミノ酸置換（アミノ酸置換１９３ＳＰ、２９７ＳＩ、３２９ＲＱ、４７１ＩＴ、５０３ＳＧ、５０７ＴＩ、５２３ＫＩ、５３３ＶＡ、および５３６ＱＲを示す）、対応する開始ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤを超える基底、誘導、および応答の改善を識別する。
表２：対応するＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤを超える特定アミノ酸置換の組み合わせを持つＣＢＳ変異型の応答性の倍率改善のまとめ
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１２８】
試験した置換の組み合わせの多くは、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤまたは表１に開示された変異型と比較して、応答性の増加を示した。４つのＣＢＳ変異型、すなわち０１：Ａ−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３、およびＦＣ７：４９に特に注目した（図１および表３参照）。図１は、４つのアミノ酸置換Ｉ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ、およびＳ１９３Ｐの位置を示し、これらの変異型を親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ配列に組み込み、その位置を円順列置換部位に対して修正した（表３も参照）。図１の上の図は、一次アミノ酸配列の配列順序番号に基づく置換の位置を示す。図１の下の図は、親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤに基づくコドン指定点を示す。ヌクレオチド変化は、以下のとおりである。４７１：ａｔａ＞ａｃａ、５０３：ａｇｔ＞ｇｇｔ、５０７：ａｃａ＞ａｔａ、１９３：ｔｃｇ＞ｃｃｇ。
表３：クローン０１：１−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３、およびＦＣ７：４３内で見出されるアミノ酸置換のまとめ
【表３】
0006421977.tif 000006
【０１２９】
改善されたＣＢＳ変異型０１：Ａ−０５、ＦＣ７：２４、ＦＣ７：４３、およびＦＣ７：４９内の生細胞におけるＴＲＡＩＬに対する応答（それぞれ「１Ａ５」、「２４」、「４３」、および「４９」）を、図２Ａ〜Ｂおよび３Ａ〜Ｂにおいて、１０時間の期間で親ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ（「ＴＬ−ＣＰ」）と比較した。変異型０１：Ａ−０５は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤと比較して、それぞれＴＲＡＩＬ処理の２時間および１０時間後に２倍および約４．８倍優れた応答を有した（図２Ａおよび２Ｂ）。２時間後に、変異型ＦＣ７：２４およびＦＣ７：４９は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤおよび変異型４３より約２倍優れた応答を有した（図３Ａおよび３Ｂ）。１０時間後に、変異型ＦＣ７：２４およびＦＣ７：４９は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤより約３．２〜３．７倍優れた応答を有したが（図３Ａおよび３Ｂ）、変異型ＦＣ７：４３は約２．２倍優れた応答を有した。これらのデータは、ＣＢＳバイオセンサーが、これら４つのアミノ酸置換Ｉ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ、およびＳ１９３Ｐのうちの１つ以上を組み込むことにより改善された応答を有するように生成することができる。
【０１３０】
実施例ＩＩＩ
【０１３１】
追加のＣＢＳ変異型は、ＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ（配列番号５２）、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ（配列番号５３）、ＳＤＥＶＤＧＳＬ（配列番号５４）、またはＤＥＶＤＧ（配列番号５５）などの異なるリンカー配列を有するように生成した。ＣＢＳ変異型は、ＨＥＫ２９３細胞内で実施例Ｉと同様に評価した。例示のＣＢＳ変異型としては、限定されないが、図４に列挙されるものが挙げられる。次に、すべてのバイオセンサーデータを、実施例Ｉと同様に、レニラルシフェラーゼ発光を用いて形質転換効率について正規化した。図４は、「Ｌｉｎｋｅｒ」を含むリンカー配列によりクローンを識別し、ＴＲＡＩＬ添加時、すなわち、時間（０）（「基底（ｔ＝０）」）、ＴＲＡＩＬ添加から約１０時間後（「誘導（１０時間）」）および倍率誘導、すなわち基底活性に対する誘導活性の比率（「応答（１０時間）」）におけるＲＬＵ内の発光を示す。２つの実験に共通するリンカークローンは、＃２である（すなわち、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ）。数値の差は、実験間の典型的な変動である。リンカー＃３は、「ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤ：ＤＤ」と称されるものと同一のクローン内で見出されたリンカーである。
【０１３２】
実験ＩＶ：カスパーゼ−８を検出するための変異体熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの評価
【０１３３】
本発明の変異体熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを細胞内のカスパーゼ−８活性を検出することができるか否かを評価するために、カスパーゼ−８切断部位ＬＥＴＤＧ（配列番号１５）を含むバイオセンサーを生成した。２つの異なるバイオセンサーＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ−８およびＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−８を用いた。対照として、ホタル（フォティナスピラリス、Ｐｐｙ）ルシフェラーゼバイオセンサーＦＦ−ＣＰ２３４−カスパーゼ−８（Ｍ／Ｐｐｙ残基２３４−５４４／ＬＥＴＤＧ／Ｐｐｙ残基４−２３０／Ｖ）、ＦＦ−ＣＰ３５９−カスパーゼ−８（Ｍ／Ｐｐｙ残基３５９−５４４／ＬＥＴＤＧ／Ｐｐｙ残基４−３５５／Ｖ）、およびＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤを用いた。表４は、バイオセンサーの配列詳細を提供する。
表４
【表４】
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【０１３４】
すべてのバイオセンサーをＨｅＬａ細胞に形質転換した。細胞を（１０，０００細胞／ウェル）で９６−ウェル組織培養プレートに載置した。表４に記載されるように、細胞への形質転換のためにバイオセンサーＤＮＡを調製した。各バイオセンサーについて３０回の１０μＬ  反応を設定した。１６５０μＬのＤＭＥＭを４９．５μＬのＬＴＩと混合することにより、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）ＬＴＩ（ＬＴＩ、Ｍｉｒｕｓ）形質転換マスター混合物を調製した。マスター混合物を、室温で１５分間インキュベートした。次に３００μＬのマスター混合物を各バイオセンサーＤＮＡに添加し（３０回の反応に十分な量、０．１μｇ／反応）および室温でさらに１５分間インキュベートした（表５）。１０μＬのバイオセンサーＤＮＡ形質転換マスター混合溶液を、適切なウェル内の細胞に添加した。次に、細胞を３７℃で一晩、５％ＣＯ2でインキュベートした。
表５
【表５】
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【０１３５】
一晩のインキュベーション後、媒質を細胞から除去し、ＣＯ2独立媒質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８０４５０８８）および２ｍＭルシフェリンＥＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６５５１）と置換した。細胞を、ルシフェリンＥＦで２時間、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ発光計内で事前に平衡化し、２０分毎に生物発光を読み取った。インキュベーション後、１μｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬを用いて、ＣＯ2  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）内で、または化合物なし（対照、媒質＋１０％ＦＢＳのみ）のいずれかで細胞を誘導した。細胞を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ発光計内で５００＋分間３７℃で再度インキュベートし、２０分毎に生物発光を測定した。
【０１３６】
図５〜８は、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ８およびＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ８バイオセンサーが、ＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８の活性を検出できることを示す。図５および７は、３７℃での経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の動態プロファイルを識別する。図６および８は、経時的なＴＲＡＩＬによるカスパーゼ８活性化の倍率応答を識別する。活性化の倍率誘導は、ＴＲＡＩＬを含むサンプルのシグナルを所定の時点でのＴＲＡＩＬを含まないシグナルで割ることによって算出した。図７および８は、ＴＬ−ＣＰ３５８−ＤＥＶＤにより測定される、Ｔｒａｉｌによるカスパーゼ３の誘導ならびにカスパーゼ８の誘導を示す。
【０１３７】
実施例Ｖ：ＴＥＶプロテアーゼ変異体熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性化
【０１３８】
本発明の変異体熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、細胞内のＴＥＶプロテアーゼ活性を検出することができるか否かを評価するために、ＴＬ−ＣＰ２３３バイオセンサー、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ（配列番号７８）を含むＴＬ−ＣＰ２３３−ＴＥＶを生成した。ＴＬ−ＣＰ２３３−ＴＥＶは、Ｍ／ＴＬ残基２３３〜５４４／ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ  ＴＬ残基４〜２３３／Ｖ（配列番号６１および６２）として表すことができるアミノ酸配列を有する。対照として、ホタル（フォティナスピラリス、Ｐｐｙ）ルシフェラーゼバイオセンサーＦＦ−ＣＰ２３５−ＴＥＶ（Ｍ／Ｐｐｙ残基２３４〜５４４／ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ／Ｐｐｙ残基４〜２３３／Ｖ、配列番号６３および６４）、ＦＦ−ＣＰ２６９−ＴＥＶ（Ｍ／Ｐｐｙ残基２６９〜５４４／ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ／Ｐｐｙ残基４〜２６８／Ｖ、配列番号６５および６６）、ならびにＦＦ−ＣＰ３５９−ＴＥＶ（Ｍ／Ｐｐｙ残基３５９〜５４４／ＧＳＳ−ＥＮＬＹＦＱＳ−ＳＳＧ／Ｐｐｙ残基４〜３５５／Ｖ、配列番号６７および６８）を用いた。すべての形質転換について、ＣＭＶプロモーターから構成的に発現したＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＦＢ７５４）を形質転換した（ｐＦ９ａ−ＢＦＢ７５４）。この構築体は、形質転換の効率性制御として使用するためのレニラルシフェラーゼも共発現する。
【０１３９】
バイオセンサーおよびＴＥＶプロテアーゼ構築体のそれぞれは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で形質転換した。細胞を、１５，０００細胞／ウェルで９６−ウェル組織培養プレートに載置した。表６に従って形質転換溶液を調製した。各センサーを、ＴＥＶプロテアーゼまたは担体ベクター（ｐＦ９ａヌル）のいずれかと共形質転換した。
表６
【表６】
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【０１４０】
細胞を３７℃で一晩２４時間、５％ＣＯ2でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞を媒質および５ｍＭルシフェリンＥＦで２時間平衡化した。次に生物発光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ発光計内で３７℃で測定した。形質転換の効率性の制御のために、結果をレニラに対して正規化した。
【０１４１】
ＴＥＶ認識配列（ＦＦ−ＣＰ２３３−リードスルー、ＦＦ−ＣＰ２３３−ＲＴ）を含まないバイオセンサーは、ＴＥＶプロテアーゼにより活性化されないが、他のバイオセンサーは、ＴＥＶプロテアーゼにより活性化された（図９）。
【０１４２】
実施例ＶＩ：神経膠腫細胞内のアポトーシスの分子撮像
【０１４３】
本発明の変異体熱安定性バイオセンサーを用いて細胞内の細胞死を検出することができることを実証するために、熱安定性カスパーゼ３バイオセンサー、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ３（「２３３」、配列番号１７および１８）、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３（「３５８Ｖ２」配列番号５および６）、ならびに変異体熱安定性カスパーゼ３バイオセンサー１Ａ５（「３５８Ｖ３」、配列番号７および８）、２４（「３５８Ｖ４」、配列番号９および１０）、４３（「３５８Ｖ５」、配列番号１１および１２）、ならびに４９（「３５８Ｖ６」、配列番号１３および１４）を、神経膠腫細胞株Ｄ５４−ＭＧ内で安定して発現させ、細胞をＴＲＡＩＬで処理し、発光を測定してカスパーゼ３の活性を検出した。
【０１４４】
熱安定性バイオセンサーを安定して発現する細胞を導出するために、Ｄ５４−ＭＧ細胞をバイオセンサーで形質転換させた。バイオセンサーを、ＰＣＲ増幅を介して、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｐＥＦベクターにサブクローン化し、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位における複数のクローニング部位に挿入した。形質転換は、６−ウェル組織培養皿内で、３μＬのＦｕｇｅｎｅ６形質転換試薬（Ｒｏｃｈｅ）および１μｇのプラスミドＤＮＡを用いて行った。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐグルタミン（１００Ｘ、Ｇｉｂｃｏ）、および２００μｇ／ｍＬジェネチシン（Ｇ４１８）を含むＲＰＭＩ媒質（Ｇｉｂｃｏ）内に４８時間載置した。当該技術分野において既知の標準技術を用いて、形質転換から約１０日後に単一クローンを選択した。つまり、媒質を細胞から除去し、細胞をＰＢＳで丁寧に洗浄した。丸いフィルター紙をトリプシンに浸し、単一コロニー上に載置した。添付の細胞を含むフィルター紙を除去し、２４−ウェル組織培養皿中に載置した。ルシフェラーゼ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７４５１）を用いるウェスタンブロット法、および生物発光（ＰＢＳ中で再構築された１００μｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリンを媒質に直接添加して検出した）によりレポーター発現について、選択から約２〜３週間後に各個別のクローンを試験した。細胞死を検出する際に用いるために、同様の生物発光活性（最高倍率）およびレポーター発現（ウェスタンブロットにより決定）を持つクローンを選択した。
【０１４５】
細胞死を検出するために、安定したＤ５４−ＭＧ細胞を、１０，０００細胞／ウェルで９６−ウェルアッセイプレート中に播種し、３７℃で２４時間、５％ＣＯ2でインキュベートした。一晩インキュベートした後、細胞を２００ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬおよび１００μｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。生細胞生物発光を２、４、および６時間で撮像した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ照度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ＴＲＡＩＬ処理前後の異なる時点で光子数を計測した。レポーター発現およびＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを、ルシフェラーゼおよびカスパーゼ−３に対して、ウェスタンブロット法によりさらに検出した。
【０１４６】
図１０は、ＴＲＡＩＬにより処理時に、様々な熱安定性バイオセンサーを安定した発現するＤ５４−ＭＧ細胞が、生物発光活性において１００〜２００倍の誘導をもたらしたことを実証する。熱安定性バイオセンサーの異なるバージョンを発現するＤ５４−ＭＧ細胞は、未処理であるか、または２００ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬで処理して、指示された時点で撮像し、光子数／秒を指定された時点で記録した（図１０Ａ）。未処理または２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＲＡＩＬで処理された熱安定性バイオセンサーの異なるバージョンを発現するＤ５４−ＭＧ細胞の倍率誘導は、値（光子／秒）をベースライン（時間、０時間）に対して正規化することにより算出した（図１０Ｂ）。異なるバイオセンサーバージョンにより達成された倍率変化に加えて、ベースライン、処理後２時間、４時間、および６時間の平均光子数／秒を図１０Ｃに示す。図１０Ｄは、ルシフェラーゼおよびカスパーゼ−３に対する、ウェスタンブロット法によるレポーター発現およびＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの検出を示す。
【０１４７】
実施例ＶＩＩ：変異体熱安定性バイオセンサーの使用
【０１４８】
細胞死をインビボで検出するための変異体熱安定性バイオセンサーの使用を実証するために、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ３（「２３３」、配列番号１７および１８）、ＴＬ−ＣＰ３５８−カスパーゼ３（「３５８Ｖ２」配列番号５および６）、１Ａ５（「３５８Ｖ３」、「３−Ｓ」、配列番号７および８）、４３（「３５８Ｖ５」、「５−Ｒ」、配列番号１１および１２）、または４９（「３５８Ｖ６」、「６−Ａ］、配列番号１３および１４）のいずれかを安定して発現するＤ５４−ＭＧ細胞をヌードマウスに移植した。
【０１４９】
フランク異種移植マウスモデルを確立するために、上に列挙した（実施例ＶＩに記載されるように）バイオセンサーのうちの１つを安定して発現する２×１０6Ｄ５４−ＭＧ細胞をヌードマウスに皮下的に移植した。８ｍｇ／ｋｇ  ＴＲＡＩＬによる処理は、電子デジタルキャリパー測定により測定されるように、腫瘍が約１００ｍｍ3  に到達したときに開始した。インビボ生物発光検出の場合、２％イソフルオラン／空気混合物を用いてマウスを麻酔にかけ、単回投与（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＤ−ルシフェリンを腹腔内注入した。ＩＶＩＳ撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＴＲＡＩＬ処理前および６時間後（図１１Ａ）に光子数／秒を取得した。処理後の値をマウス当たりの処理前の値に対して正規化することにより、倍率誘導（図１１Ｂ）を算出した。
【０１５０】
データは、ＴＲＡＩＬ処理時に、マウス異種移植モデルにおいて、１００倍の生物発光活性化が見られたことから、本発明の変異体熱安定性バイオセンサーが、極めて敏感であることを実証する。Ｄ５４−ＭＧレポーター異種移植されたヌードマウスを、８ｍｇ／ｋｇのＴＲＡＩＬで処理した。光子数／秒を、処理の前後に取得した（図１１）。倍率誘導は、処理後の値をマウス当たりの処理前の値に対して正規化することにより算出した（図１１Ｂ）。図１１Ｃは、異なるバイオセンサーバージョンにより達成された倍率変化に加えて、ベースラインおよび処理後６時間における平均光子数／秒を表す表を示す。
【０１５１】
実施例ＶＩＩＩ：胸骨転移における細胞死の撮像
【０１５２】
動物内の細胞死を検出するための熱安定性カスパーゼ−３バイオセンサーの使用を実証するために、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３バイオセンサー（グリオーマ細胞について実施例ＶＩに記載されるように導出された）を安定して発現する１００，０００ＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞（「１８３３」、乳癌細胞株）を、ヌードマウスの脛骨に移植した。ＭＲＩにより腫瘍増殖を追跡し、腫瘍が５〜１５ｍｍ3に達したときにＴＲＡＩＬ処理を開始した。
【０１５３】
インビボ生物発光検出の場合、２％イソフルオラン／空気混合物を用いてマウスを麻酔にかけ、単回投与（１５０ｍｇ／ｋｇ）のＤ−ルシフェリンを腹腔内注入した。ＩＶＩＳ撮像システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＴＲＡＩＬ処理前および６時間後、または図１２Ａ〜Ｄに示されるように光子数／秒を取得した。処理後の値をマウス当たりの処理前の値に対して正規化することにより、倍率誘導（図１１Ｂ）を算出した。
【０１５４】
図１２Ａにおいて、ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３を安定して発現する脛骨内移植されたＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞を、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）で処理し、毎時間１０分間連続して撮像した。倍率誘導は、データを処理前の値に対して正規化することにより算出した。図１２Ｂにおいて、Ｚ因子は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．４：６７−７３．１９９９）に記載されるように、すべての時点について算出し、０．８２の平均Ｚ因子が高スループットスクリーニングのためのアッセイ適合性に十分であった。図１２Ｃは、指定された時点で撮られた光子／秒でＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞を安定して発現する脛骨内移植されたＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３の代表的な画像を示す。図１２Ｄは、ＴＲＡＩＬで処理された試験した異種移植動物の倍率誘導を示す。このデータは、マウスモデル内で動的かつ経時的に細胞死を撮像するための熱安定性バイオセンサーの有用性を強調する。
【０１５５】
実施例ＩＸ：高スループットスクリーニングにおける熱安定性カスパーゼバイオセンサーの実用性
【０１５６】
高スループットスクリーニングのための熱安定性バイオセンサーの実用性を実証するために、実施例ＶＩＩＩからのＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３を安定して発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３（「１８３３」）細胞を用いて、ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＢｉｏｆｏｃｕｓおよびＴｉｍ  Ｔｅｃキナーゼ阻害剤ライブラリ内の化合物をスクリーニングした。
【０１５７】
ＴＬ−ＣＰ２３３−カスパーゼ−３  ＭＤＡ−ＭＢ２３１／１８３３細胞を、９６−ウェルプレート内に１０，０００細胞／ウェルで播種した。播種から４８時間後、媒質を、１％ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ｃＡＭＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１２９０）を含むＣＯ2独立媒質に変え、０〜２３時間、最終濃度１０μＭの化合物とともにインキュベートした。合計でＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ内の４８３化合物およびＴｉｍ  Ｔｅｃコレクションから８０キナーゼ阻害剤を試験した。媒質および化合物ライブラリの添加は、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｄｉｓｐｅｎｓｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。相対発光は、化合物処理されたウェルの値を未処理のウェルに対して正規化することにより算出した。（図１３Ａおよび１３Ｃ）図１３Ａは、ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｆｏｃｕｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ内の化合物からの化合物処理（最大）時の相対発光を示す。図１３Ｃは、Ｔｉｍ  Ｔｅｃキナーゼ阻害剤ライブラリ内の化合物からの化合物処理（最大）時の相対発光を示す。４以上に達する最大値は、有意と見なした。Ｍａｔｌａｂソフトウェアの生物情報ツールボックスを用いてヒートマップを生成し、経時的なバイオセンサー活性化の相関を示す。（図１３Ｂおよび１３Ｄ）Ｚ因子は、実施例ＶＩＩＩに前述されるように算出した。
【０１５８】
熱安定性バイオセンサーの繰り返し撮像能力に起因して、様々な薬物に応答するアポトーシスの動態を撮像することができる。これにより、それ以外は化学療法抵抗性の１８３３乳癌細胞株内の興味深い細胞死誘導化合物の識別を可能にした。
【０１５９】
実施例Ｘ：ＭＭＰ−２センサーの精製
【０１６０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックスの主要タンパク質化合物の分解に関与する、亜鉛酵素の同種群である。５つの主要ＭＭＰは、ヒトにおいて識別され、結合組織の代謝および破壊に関与している。これらは、マトリックスの大部分を形成するＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲンを加水分解する線維芽細胞型および好中球型間質コラゲナーゼを含む。線維芽細胞コラゲナーゼは、天然のＶＩＩ型およびＸ型コラーゲンも加水分解する。ＭＭＰは、線維芽細胞型および好中球型コラゲナーゼが、それぞれＭＭＰ−１およびＭＭＰ−８として指定される数値コードにより参照される場合がある。７２−ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）は、線維芽細胞および腫瘍細胞を増殖させることにより生産されるが、別個の９２−ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）は、好中球、マクロファージ、およびある形質転換細胞により生産される。
【０１６１】
本明細書で用いられるＭＭＰ−２センサー（配列番号６９および７０）は、１Ａ５変異型骨格およびヒトＭＭＰ−２認識部位、ＰＬＧＭＷＳＲ（配列番号７５）を含む。さらに、ＭＭＰ−２センサーは、２つの精製タグ：ＴＥＶプロテアーゼ部位（精製されたＭＭＰ−２センサーからＧＳＴタグを除去するための）によりセンサー領域から分離されたセンサーのＮ末端上のＧＳＴタグ、およびセンサーのＣ末端上の５ｘＨＱ（ＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱ、配列番号７９）タグを含む。
【０１６２】
ＭＭＰ−２センサーの精製は、ＨｉｓおよびＧＳＴ精製を用いて、以下のように行った。
【０１６３】
１．ＭＭＰ−２センサーを含む大腸菌  ＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）の２〜５ｍＬ培養物を、３７℃で攪拌しながらＬＢ／アンピシリン内で増殖させた。
【０１６４】
２．各培養物を、０．０５％ラムノースおよび０．０５％グルコースを用いて、１ＬのＬＢ中で１：１００に希釈した。
【０１６５】
３．２５℃で１８〜２０時間インキュベートした。
【０１６６】
４．細胞を５０００ｇで５分間の遠心分離により採取し（１Ｌを２つの５００ｍＬ分割量に分ける）、細胞ペースト重量を決定して、−２０℃で一晩載置した。
【０１６７】
５．２つの細胞ペーストのうちの１つを、３０ｍＬ溶解緩衝液で再懸濁した（８．５ｍＬ／ｇ細胞ペースト、５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイニダゾール、およびＮａＯＨによりｐＨ８．０）。１ｍｇ／ｍＬのリゾチームを添加し、再懸濁液を氷上で、定期的に反転させながら３０分間インキュベートした。
【０１６８】
６．溶解液をパワー６．０で２分間音波処理した（５秒オン、５秒オフ）。１００μlのサンプルを「合計」サンプルとして保存した。
【０１６９】
７．溶解液を１６，０００ｇで２０分間回転させた。１００μlのサンプルを「可溶性」サンプルとして保存した。
【０１７０】
８．６ｍＬの溶解物当たり１ｍＬの５０％Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、溶解緩衝液中で前洗浄）（合計５ｍＬ）を添加し、４℃で１時間混合した。
【０１７１】
９．サンプルを７００ｒｐｍの卓上遠心分離器で２分間回転させた。１００μlのサンプルを、上清を破棄した「フロースルー」サンプルとして保存した。
【０１７２】
１０．樹脂を４０ｍＬ溶解緩衝液中で洗浄して、４℃で５分間混合し、７００ｒｐｍの卓上遠心分離器で２分間回転させて、上清を破棄した。
【０１７３】
１１．次に樹脂を４０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液）中で洗浄し、７００ｒｐｍの卓上遠心分離器で２分間回転させて、上清を破棄した。
【０１７４】
１２．１０ｍＬの洗浄緩衝液を添加および混合し、上清を空のカラムに添加した。
【０１７５】
１３．カラムを５０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、１００μＬの樹脂を除去して保存した。
【０１７６】
１４．センサーを、１０ｍＬ溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液）を用いてカラムから溶出し、０．５ｍＬの分画を回収して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて直接測定した。
【０１７７】
１５．１００μＬの樹脂を除去して保存し、溶出分画を複合して、複合された分画を溶解緩衝液中で１０ｍＬに希釈した。
【０１７８】
１６．複合された分画を、ＧＳＴ結合／洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ）中で透析した（１Ｌで１時間、２回）。
【０１７９】
１７．透析されたタンパク質を、ＧＳＴ結合／洗浄緩衝液中で前洗浄した５ｍＬのグルタチオン−セファロース樹脂スラリー（ＧＥ、カタログ番号１７−０７５６−０１）に添加し、４℃で１時間インキュベートした。
【０１８０】
１８．樹脂混合物を７００ｒｐｍの卓上遠心分離器で２分間回転させ、１００μＬを「フロースルー」として保存して、上清を破棄した。
【０１８１】
１９．樹脂を空のカラムに添加し、５０ｍＬのＧＳＴ結合／洗浄緩衝液で洗浄して、１００μＬを除去した。
【０１８２】
２０．溶出緩衝液を用いてタンパク質を溶出した（１０ｍＭ還元グルタチオンを含む１×ＰＢＳ緩衝液）。０．５ｍＬ分画を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて直接測定した。１００μＬの樹脂を除去および保存した。
【０１８３】
２１．保存された分画（「合計」、「可溶性」、「フロースルー」（ｈｉｓ）、溶出前のＨｉｓ樹脂、溶出後のＨｉｓ樹脂、透析後のサンプル、フロースルー（ＧＳＴ）、溶出前のＧＳＴ樹脂、溶出後のＧＳＴ樹脂、およびＧＳＴ分画）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した（図１４）。
【０１８４】
２２．ＧＳＴ分画を複合し、ストレージ緩衝液中で透析した（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール）。
【０１８５】
精製されたＭＭＰ−２センサーがＭＭＰ−２を検出できることを実証するために、精製されたＭＭＰ−２センサー（１．３ｍｇ／ｍＬ）を、図１５に記載されるように、緩衝液中で希釈した（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、および０．０５％  Ｂｒｉｊ３５）。活性化されたＭＭＰ−２（１０ｎｇ／μＬ、Ａｎａｓｐｅｃ）を、図１５に記載されるように、希釈されたＭＭＰ−２センサーに添加した。最終反応混合物の総容積は、５０μＬであった。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って調製し、５０μＬを混合物に添加した。発光をＧｌｏＭａｘ  ＭｕｌｔｉＰｌｕｓ発光計上で即時に読み取った。
【０１８６】
図１５は、対照（ＭＭＰ−２センサーからのバックグラウンド）を超える倍率増加を示す。結果は、本発明による精製されたＭＭＰ−２センサーを用いて、わずか０．７５ｎｇのタンパク質を検出できることを実証する。
【０１８７】
精製されたＭＭＰ−２センサーの感度をさらに実証するために、蛍光性ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ  ５２０ＭＭＰ−２アッセイ（Ａｎａｓｐｅｃ）もちいて、ＭＭＰ−２タンパク質を検出した。アッセイは、製造者の指示に従って行った。蛍光は、Ｔｅｃａｎ蛍光計上でＥｘ４９０ｎｍ／Ｅｍ５２０ｎｍで検出した。図１６Ａ〜Ｂは、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅアッセイを用いて、１．５ｎｇ  ＭＭＰ−２タンパク質の検出を報告する。
【０１８８】
実施例ＸＩ：ＣＢＳの無細胞発現
【０１８９】
本発明のプロテアーゼバイオセンサーが、無細胞環境内で外因性プロテアーゼにより効果的かつ効率的に切断され得ることを実証するために、ＣＢＳ変異型１Ａ５を小麦胚芽抽出物内で発現させ、それを用いてカスパーゼ−３を検出した。
【０１９０】
ＣＢＳ変異型１Ａ５を、ベクターｐＦＮ１９Ｋ  Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１８４１）にクローン化して、ＣＢＳ−Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）（ＣＢＳ−ＨＴ）融合タンパク質を生成した（配列番号７１および７２）。２０μＬ（８μｇ）のＣＢＳ−ＨＴベクターを、３０μｌのＴｎＴ（登録商標）ＳＰ６高収率小麦胚芽発現系（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｌ３２６１）に添加し、２５℃で９０分間インキュベートした。
【０１９１】
ＣＢＳ−ＨＴカスパーゼ−３切断反応の場合、ある容量の発現反応を、カスパーゼ−３を含む等容量の大腸菌溶解物またはＣ（３）溶解緩衝液（０．８Ｘ  ＦａｓｔＢｒｅａｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ８５７Ａ）１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、０．８ｍｇ／ｍＬリゾチーム、３Ｕ／μＬ  ＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ６１０Ａ））のいずれかを用いてインキュベートし、室温で６０分間インキュベートした。カスパーゼ−３を含む大腸菌溶解物を、組み換えカスパーゼ−３を過剰発現するＫＲＸ細胞から調製した。つまり、ＫＲＸ細胞をｐＴＳ１ｋ：カスパーゼ−３（Ｔ／Ｓ）で形質転換させた。スターター培養物（５０ｍＬ、ＬＢブロス）を単一コロニーから接種し、攪拌しながら（２７５ｒｐｍ）３７℃で１７〜２２時間増殖させた。スターター培養物を、新鮮な媒質中に希釈し（１：５０）、さらに３時間増殖を継続した。次に、インキュベーション温度を２５℃に下げ、１５分後、カスパーゼ−３の発現をラムノースの添加により開始した（０．２％最終濃度）。２時間後、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＬ  Ｃ（３）溶解緩衝液中に再懸濁し、周囲温度（すなわち、２２〜２４℃）で１０分間インキュベートした。溶解物を遠心分離により除去し（２０，０００×ｇ、４℃で２０分間）、カスパーゼ−３ソースとして使用した。
【０１９２】
カスパーゼ−３によるＣＢＳ−ＨＴの切断は、２つの異なる方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析および発光検出により検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の場合、切断反応サンプルを、最初に発光マーカーＣＡ−ＴＡＭを用いて標識した（クロロアルカン−ＴＡＭＲＡリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ８２５Ａ）。２０μｌのサンプルを（１：１００で緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％）中に希釈した）２０μＬのＣＡ−ＴＡＭに添加し、室温で３０分間インキュベートした。このサンプルに、４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液（１２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）、１％  ＳＤＳ、２５．２％グリセロール、１．５ｍＭブロモフェノールブルー、１００ｍＭ  ＤＴＴ）を添加した。得られた溶液を６５℃で３０分間インキュベートした。１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に負荷した。対照として、０．６０、０．１５、および０．０３ｍｇ／ｍＬのＨＴ：ＧＳＴ（Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）−ＧＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ４４９Ａ）融合もゲルの上に負荷した（図１７）。電気泳動後、ＣＡ−ＴＡＭ標識された種を、蛍光撮像により検出した（ｅｘ：５３２、Ｅｍ：５８０、図１７）。発光を介した検出の場合、４０μＬの切断反応サンプルを６０μＬ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））および１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬に添加した。発光を前述されるように検出した（表７）。
表７
【表７】
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【０１９３】
実施例ＸＩＩ：ＣＢＳの固定化
【０１９４】
無細胞環境内で発現したときの本発明のプロテアーゼバイオセンサーが、固体支持体上に固定化されたときに活性を維持することを実証するために、小麦胚芽抽出液（実施例ＸＩ）中で発現したＣＢＳ−ＨＴ融合を、固体支持体（樹脂およびプレート）に固定化し、カスパーゼ−３を検出するために用いた。
【０１９５】
樹脂への固定化の場合（図１８Ａ）、ＨａｌｏＬｉｎｋ樹脂（２５％スラリー、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１９１２）を最初に、ＨＴＰＢ緩衝液で平衡化した（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）。１容量のスラリーからの樹脂を遠心分離により回収し（１０００ｘｇで５分）、ストレージ緩衝液を除去した。樹脂ペレットを２容量のＨＴＰＢ中に再懸濁し、混合した。合計３回のＨＴＰＢ洗浄のためにこの過程を繰り返した。実施例ＸＩ（無細胞発現反応）からの１００μＬのＣＢＳ−ＨＴ融合を、２５μＬの洗浄された樹脂（ＨＴＰＢ中の５０％スラリー）と混合し、４℃で混合しながら一晩インキュベートした。インキュベーションは、周囲温度で２時間継続させた。インキュベーション後、樹脂を洗浄して結合されていないＣＢＳを除去した。樹脂を２つの５０μＬ分割量に分け、各分割量をＨＴＰＢで３回洗浄した。最終樹脂ペレットを５０μＬのＨＴＰＢ中に再懸濁した。
【０１９６】
ＣＢＳカスパーゼ−３切断反応の場合、２０μｌの洗浄された樹脂を、カスパーゼ−３を含む２０μＬの大腸菌溶解物、またはＣ（３）溶解緩衝液（実施例ＸＩと同様）のいずれかと混合し、周囲温度で３０分間インキュベートした。６０μｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）をサンプルに添加した後、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏアッセイ試薬を添加した。発光を前述されるように検出した（表８および図１９）。
表８
【表８】
0006421977.tif 000011
【０１９７】
プレートに固定化するために（図１８Ｂ）、ＣＢＳ−ＨＴ融合タンパク質を固定化するためのＨａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）リガンドを含むマイクロタイタープレートを調製した。つまり、アミン−ＰＥＧ２０００−ＣｌアルカンＨａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）リガンド（０．２５ｍＭ（最終濃度を含有する重炭酸塩緩衝液ｐＨ８．５（１００μＬ）、ＰＢＩ３９６１、およびメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ2（０．７５ｍＭ最終濃度）を、ＮＨＳマイクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、５０ｍＭのエタノールアミンを添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートして、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで再度３回洗浄した。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを各ウェルに含むプレートを４℃で保管した。アッセイのために、ウェルを２００μｌ  ＨＰＴＢで３回洗浄した。５０μｌ  ＣＢＳ−ＨＴ無細胞発現反応（実施例ＸＩ）をウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを２００μｌ  ＰＢＳＩ（０．０５％ＩＧＥＰＡＬを含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄した。カスパーゼ−３を含む１００μＬの大腸菌溶解物、またはＣ（３）溶解緩衝液（上記）を添加し、プレートを室温で混合しながら６０分間インキュベートした。次にウェルを１００μｌ  ＰＢＳＩで洗浄した。１００μＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬を添加し、発光を前述のように検出した（表９）。
表９
【表９】
0006421977.tif 000012
【０１９８】
実施例ＸＩＩＩ：大腸菌内のＣＢＳ発現
【０１９９】
本発明のプロテアーゼバイオセンサーが、大腸菌内で発現および機能可能であることを実証するために、ＣＢＳ変異型１Ａ５を大腸菌内で発現させ、それを用いてカスパーゼ−３を検出した。
【０２００】
ＣＢＳ変異型１Ａ５を、Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）（ＣＢＳに対するＣ末端）および５ｘＨＱタグ（ＣＢＳに対するＮ末端）を含む、細菌発現ベクター（ｐＦＮＡ：ＨＱ（５ｘ）：ＣＢＳ：ＨＴ（７）、配列番号７３および７４）中にクローン化した。融合タンパク質は、大腸菌内で以下のように発現した。大腸菌（ＫＲＸ）をベクターで形質転換した。スターター培養物（５０ｍＬ、ＬＢブロス）を単一コロニーから接種し、攪拌しながら（２７５ｒｐｍ）３７℃で１７〜２２時間増殖させた。スターター培養物を誘導媒質（５００ｍＬ、０．０５％グルコースおよび０．０２％ラムノースを含むＬＢブロス）中に希釈し（１：５０）、攪拌しながら（２７５ｒｐｍ）２５℃でさらに１７〜２２時間増殖を継続させた。培養物を２つの２５０ｍＬ分割量に分け、細胞を遠心分離により回収した（５，０００ｘｇ、４℃で２０分間）。１つの細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＬ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ＸＦａｓｔＢｒｅａｋ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭグルタミン酸、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０Ｕ／ｍＬ  ＲＱ１  ＤＮａｓｅ、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｂｅｃｋｔｏｎ／Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、カタログ番号５４４７７９））中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを音波処理した（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ−３０００、合計４分、５秒オン、５秒休止、パワー設定５）。粗溶解物を遠心分離により除去し（２０，０００ｘｇ、４℃で２０分間）、上清（除去された溶解物）をＣＢＳ源として用いた。カスパーゼ−３切断反応の場合、２０μｌの除去された溶解物を、カスパーゼ−３を発現する２０μＬの大腸菌溶解物（実施例ＸＩＩ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。６０μＬ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を添加した後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬を添加した。発光を前述されるように検出した（図２０）。
【０２０１】
実施例ＸＩＶ：大腸菌からのＣＢＳの精製
【０２０２】
大腸菌から本発明の機能的プロテアーゼバイオセンサーを精製する能力を実証するために、実施例ＸＩＩＩ内で発現したＣＢＳを、ＨｉｓＬｉｎｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ８８２１））カラムクロマトグラフィーを、製造者の指示に従って用いて精製した。つまり、２５ｍＬの除去された溶解物を、ＮａＣｌ中で０．５Ｍ（最終濃度）にし、結合緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化された２ｍＬの沈降したＨｉｓＬｉｎｋ樹脂に適用した。樹脂を１２ｍＬの結合緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０００ｍＭイミダゾール）で洗浄した。１．７５ｍＬの分画を回収した。
【０２０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析の場合、サンプルをＣＡ−ＴＡＭで標識し、前述のように解析した（図２１Ａ）。カスパーゼ−３切断反応の場合、２０μｌの各サンプルを、カスパーゼ−３を発現する２０μＬの大腸菌溶解物（実施例ＸＩＩ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。６０μＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を添加した後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬を添加した。発光を前述されるように検出した（表１０および図２１Ｂ）。
表１０
【表１０】
0006421977.tif 000013
【０２０４】
実施例ＸＶ：ＣＢＳを発現した大腸菌の固定化
【０２０５】
大腸菌内で発現したプロテアーゼバイオセンサーが、固体支持体に固定化され得る一方で、プロテアーゼを検出する能力を維持できることを実証するために、精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴ（５ｘＨＱタグ：ＣＢＳ：Ｈａｌｏタグ）をＨａｌｏＬｉｎｋ樹脂およびＨａｌｏＬｉｎｋプレート上に固定化し、カスパーゼ−３による活性化について解析した。ＨａｌｏＬｉｎｋ樹脂上の固定化の場合、１００μＬの精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴを３０μＬの沈降したＨａｌｏＬｉｎｋ樹脂（前述されるようにＨＴＰＢで事前に平衡化された）に添加し、周囲温度で２時間インキュベートした。樹脂を３００μＬのＨＴＰＢで３回洗浄し、最終樹脂ペレットを３００μＬのＨＴＰＢ中で再懸濁した。５０μＬの洗浄樹脂を、カスパーゼ−３を含む５０μＬの大腸菌溶解物、または５０μＬのＣ（３）溶解緩衝液に添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬を添加し、発光を前述のように検出した（表１１および図２２）。
【０２０６】
ＨａｌｏＬｉｎｋプレート上の固定化の場合、１００μＬの精製されたＨＱ：ＣＢＳ：ＨＴを、固定化されたＨａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）リガンド（実施例ＸＩＩ）を含むμタイタープレートに添加した。プレートを室温で２時間混合しながらインキュベートした。次にプレートを１Ｘ  ＰＢＳＩ（０．０５％  ＩＧＥＰＡＬを含む１Ｘ  ＰＢＳ）中で３回洗浄し、（前述のように調整された）カスパーゼ−３を含む１００μＬの大腸菌を用いて室温で３０分間インキュベートした。１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ試薬を添加し、発光を前述されるように検出した（表１１および図２２）。
表１１
【表１１】
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【０２０７】
実施例ＸＶＩ−異なる標的細胞を有するＮＫ９２細胞の動態研究
【０２０８】
本発明のグランザイムＢバイオセンサーを用いて細胞媒介性細胞傷害を検出できることを実証するために、３つのグランザイムＢ認識部位のうちの１つ、または４つの対照認識部位のうちの１つを含むプロテアーゼバイオセンサーを生成した。
【０２０９】
グランザイムＢ切断部位の設計：
【０２１０】
１．既知のグランザイムＢ標的タンパク質に対するプロテアーゼ部位の検索
【０２１１】
２．対応する非切断性対照配列を同様に形成する。
【０２１２】
部位Ｂ（ＢＩＤ）：ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）および負の対照ＩＥＡＡ（配列番号８３）（ｇｒＢおよびカスパーゼ１０）
【０２１３】
部位Ｃ（Ｃａｓｐ３）：ＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）および負の対照ＩＥＴＡ（配列番号８４）（ｇｒＢおよびカスパーゼ８）
【０２１４】
部位Ｄ（ＤＤＰＫ）：ＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）および負の対照ＶＧＰＡ（配列番号８５）（ｇｒＢ特異的）
【０２１５】
構築体を標的細胞（Ｋ５６２細胞）内で発現させ、ＮＫエフェクター細胞を用いて共インキュベートした。発光を検出した。Ｋ５６２標的細胞を以下のベクターのうちの１つで形質導入した。
【０２１６】
ｉ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＧＲＩＥＡＤＳＥ：グランザイムＢセンサーＢ（「Ｂ＋」）
【０２１７】
ｉｉ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＩＥＡＡ：負の対照センサーＢ（「Ｂ−」）
【０２１８】
ｉｉｉ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＧＩＥＴＳＤＧ：グランザイムＢセンサーＣ（「Ｃ＋」）
【０２１９】
ｉｖ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＩＥＴＡ：負の対照センサーＣ（「Ｃ−」）
【０２２０】
ｖ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＫＳＶＧＰＤＦＧ：グランザイムＢセンサーＤ（「Ｄ＋」）
【０２２１】
ｖｉ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＩＶＧＰＡ：負の対照センサーＤ（「Ｄ−」）または
【０２２２】
ｖｉｉ）ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−３０Ｆ−ＤＥＶＤ：正の対照センサー（「ＤＥＶＤ」）
【０２２３】
グランザイムＢセンサーまたは対照のセンサーを発現する細胞は、Ｇ４１８を用いて選択した。一旦選択されると、グランザイムＢセンサーまたは対照センサー標的細胞を、ＮＫ９２エフェクター細胞を用いてインキュベートした。次に、細胞を共インキュベートし、ルシフェラーゼ検出試薬を添加した、Ｖｅｒｉｔａｓ照度計上で発光を検出した。ＤＥＶＤ構築体は、アポトーシスのすべての誘導剤により活性化するため、正の対照として、カスパーゼ３／７のアポトーシス基質として用いた。
【０２２４】
正の対照が対照エフェクター細胞株ＮＫ９２と共働する能力を確立するために、Ｋ５６２細胞を、カスパーゼ３／７切断されたホタル（「ＤＥＶＤ」）バイオセンサー構築体により形質転換した。Ｇ４１８中の希釈を限定することにより、安定した形質転換体が得られた。ルシフェリン（２％）で３０分間インキュベートした後、Ｋ５６２細胞を９６−ウェル丸底白色プレートのウェルに３０，０００細胞／ウェルで添加した。次に、ＮＫ９２細胞を、漸減するエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率（５０：１〜０．１：１）でウェルに添加した。プレートを２００ｘｇで５分間遠心分離した後、３７℃で３分毎に合計６０分間、Ｂｉｏｔｅｋ照度計上で発光を測定した。図２３は、インキュベーションから６分後の発光シグナルの増加、および約４０〜４５分におけるシグナルの平坦域を示す。発光シグナルの増加は、０．７５：１程度に低いＥ／Ｔ比で確認することができる。対照Ｋ５６２標的単独では、低い基底シグナルを有した。ＤＥＶＤバイオセンサー構築体を発現するＮＫ９２およびＫ５６２細胞を、５％  ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で、それぞれ９０分、１４０分、および１８０分間共インキュベートした。プレートを室温で１０分間冷却し、Ｖｅｒｉｔａｓプレートリーダー上で発光を測定した。図２４は、標的単独と比較して、すべての異なるＥ／Ｔ皮質で発光シグナルの誘導を示す。３７℃でより長い（１８０分）インキュベーションほど、より高い発光シグナルを生じた。図２３および２４は、正の対照が対照エフェクター細胞株ＮＫ９２と共働する能力を示す。
【０２２５】
グランザイムＢバイオセンサー、Ｂ＋、Ｃ＋、Ｃ−、Ｄ＋、およびＤ−を、Ｋ５６２細胞中に形質転換し、Ｇ４１８選択を用いて選択した。カスパーゼ３／７バイオセンサー形質転換細胞（Ｋ５６２−ＤＥＶＤクローン＃６、「Ｋ５６２−ＤＥＶＤ＃６」）を、上記と同じ方法で処理し、比較とした。細胞を採取し、２％ルシフェリン基質中で再懸濁して、９６−ウェル丸底白色プレートのウェルに、１ウェル当たりそれぞれ２ｘ１０5、１ｘ１０5、および５ｘ１０4  個の細胞を等分した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、室温で１０分間冷却した。発光をＶｅｒｉｔａｓプレートリーダー上で読み取った。図２５は、Ｋ５６２−ＤＥＶＤ＃６およびＫ５６２−Ｄ−（Ｋ５６２−Ｄ＋構築体細胞の負の対照）標的細胞が、他のグランザイムＢ構築体標的細胞よりも高い基底発光を有する（すなわち、エフェクターを含まない）ことを示す。図２５は、ＮＫ９２エフェクター細胞を含むグランザイムＢセンサーを発現する標的細胞の共インキュベーションは、ＮＫ細胞シグナル伝達が起こるときに発光の生成をもたらすことも示す。さらに、データは、生成された発光が、わずか３０，０００標的細胞／ウェル内で容易に検出され、９６ウェルプレート内の標的細胞に対するエフェクターの比が６：１であることを実証する。
【０２２６】
Ｋ５６２−ＤＥＶＤ＃６、グランザイムＢ切断可能な（Ｄ＋）構築体、およびグランザイムＢ負の対照（Ｄ−）構築体標的細胞を検討した。形質転換Ｋ５６２標的細胞（図２６Ａおよび２６ＥのＫ５６２−ＤＥＶＤクローン＃６、図２６Ｂおよび２６ＤのＫ５６２−Ｄ＋親株、図２６ＣのＫ５６２−Ｄ−親株）を、２％ルシフェリン基質を用いて、３７℃で５％ＣＯ2インキュベーター内で３０分間インキュベートした。細胞を９６−ウェル丸底白色プレートのウェルに３０，０００細胞／ウェルで等分した。次に、エフェクターＮＫ９２細胞の滴定を、様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比（１２：１〜０．７５：１）でウェルに添加した。プレートを２００ｘｇで５分間遠心分離し、Ｂｉｏｔｅｋ照度計内で３７℃でインキュベートした。発光を３分毎に合計１２０分間測定した。図２６Ａ〜Ｃは、エフェクターＮＫ９２細胞が添加されたときのＫ５６２−ＤＥＶＤ＃６（図２６Ａ）およびＫ５６２−Ｄ＋標的細胞（図２６Ｂ）内の発光シグナルの誘導を示すが、Ｋ５６２−Ｄ−標的細胞内の発光シグナルの誘導はなかった（図２６Ｃ）図２６Ｄおよび２６Ｅは、図２３に示される結果と同様に、インキュベーションから６分後に発光シグナルの増加を示し、約４０〜４５分でシグナルの平坦域を示す。また図２６Ｄおよび２６Ｅは、発光シグナルの増加が、わずか０．７５：１という低いＥ／Ｔ比および対照で見られ得ることを示す。Ｋ５６２標的細胞単独は、低い基底シグナルを有した。
【０２２７】
実施例ＸＶＩＩ
【０２２８】
上記のグランザイムＢバイオセンサーを、ＥＬ４標的細胞（ＡＴＣＣ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いて、マウス細胞傷害Ｔ細胞（ＣＴＬ）をエフェクターとして使用して試験し、センサーが異なる標的細胞およびエフェクター細胞と共働するか否かを決定した。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＰ１４マウス（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．を通じて入手可能）からの脾臓細胞を、インビトロで、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）ｇｐ３３ペプチドを用いて、３日間（図２７Ａ）または２日間（図２７Ｂ）刺激した後、それぞれＩＬ−２内で２日または３日間拡張させた。ＣＴＬエフェクター細胞を単離し、２％  ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ｃＡＭＰ試薬を用いて事前にインキュベートされたＥＬ４標的細胞を１ウェル当たり２０，０００個含むプレートに、１２：１のエフェクター／標的比で添加した。プレートを２００ｘｇで５分間遠心分離し、発光をＢｉｏｔｅｋ照度計で３７℃で６０分間測定した。図２７Ａおよび２７Ｂに示されるように、Ｐ１４マウスからの活性化されたＣＴＬ細胞は、マウスＥＬ４細胞内で抗原特異的認識を通じて、カスパーゼ３／７（ＤＥＶＤ）およびグランザイムＢ（Ｃ＋）バイオセンサーを誘起した。
【０２２９】
実施例ＸＶＩＩＩ
【０２３０】
上記のグランザイムＢセンサーを試験して、センサーがグランザイムおよび／またはパーフォリン依存性であるか否かを決定した。グランザイムＢノックアウト、パーフォリンノックアウト、およびＪｉｎｘマウスを用い、それらはＬｙｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  １１８：６１８−６２６（２０１１）に記載されている。マウス（３匹のグランザイムＢノックアウトマウス、３匹のパーフォリンノックアウトマウス、３匹のＪｉｎｘマウス、および５匹の野生型マウス）を、ＬＣＭＶに感染させた（Ｌｙｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  １１８：６１８−６２６（２０１１）を参照）。感染後７日目に、脾臓細胞を採取し、上記のように形質転換されたｇｐ３３−パルスされたＥＬ４標的細胞を、カスパーゼ３／７バイオセンサーまたはグランザイムＢバイオセンサーを用いて１２：１の比で共インキュベートした。ｇｐ３３ペプチドは、優勢ＬＣＭＶエピトープであり、それを用いて抗原をエフェクターＴ細胞に提示した。発光を３７℃でＧｌｏｍａｘ照度計を用いて９０分間測定した。図２８Ａおよび２８Ｂは、カスパーゼ３／７バイオセンサーが、グランザイムＢの標的細胞への送達およびパーフォリンに依存することを示す。図２９は、グランザイムＢバイオセンサー（Ｃ＋）が、グランザイムＢの標的細胞への送達に依存することを示す。
【０２３１】
グランザイムＢセンサー（Ｄ＋）を発現するＮＫ９２およびＫ５６２細胞を用いて、パーフォリン依存性殺傷の阻害が、グランザイムＢシグナルを遮断するか否かを決定した。ＮＫ９２細胞を、コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）、ブレフェルジン（ＢＦＡ）、または対照（ＤＭＳＯ）を用いてインキュベートした。発光シグナルを、Ｖｅｒｉｔａｓ照度計上で、６０分の共インキュベーション後に、様々なＥ／Ｔ比で３７℃で測定した。図３３は、シグナルの分泌顆粒／パーフォリン依存が生成されたことを示す。
【０２３２】
実施例ＸＩＸ
【０２３３】
活性化および特異性を確認するために、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（「ＧｚＢ１」）、ＫＳＶＧＰＤＦＧ（「ＧｚＢ５」）、ＧＩＥＴＤＳＧ（「ＧｚＢ３」）、またはＤＥＶＤＧ（「ＧＬＳ−ＤＥＶＤ」）認識および切断部位をコードするバイオセンサー構築体は、ＧＲＩＥＡＡＳＥ（「ＧｚＢ２」）、ＫＳＶＰＰＡＦＧ（「ＧｚＢ６」）、ＧＩＥＴＡＳＧ（「ＧｚＢ４」）をコードする非切断性対照構築体と一緒に、インビトロで発現させ、マウスまたはヒトグランザイムＢで処理した（表１２を参照）。バイオセンサー構築体は、小麦胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｌ４１４０）およびＦｌｕｏｒｏｔｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｌ５００１）内で、製造者の推奨するプロトコルに従って３０℃で２時間転写および翻訳した。ヒトグランザイムＢ（Ｅｎｚｏ  ＢＭＬ−ＳＥ２３８）またはマウスグランザイムＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ９２７８）を、アッセイ緩衝液中で連続的に希釈した（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）。連続的に希釈した酵素を、１：１で無細胞発現抽出物と混合し、サンプルを３７℃で１時間インキュベートさせた。１時間後、１０μＬの反応混合物を、新しいプレートに３重に移した後、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５００）を注入し、ＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ  Ｐｌｕｓ照度計上で発光を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ、０．５秒積分時間）。図３０Ａおよび３０Ｂは、グランザイムＢ切断部位を持つ構築体が、酵素濃度の増加に伴って用量依存性の発光の増加を示したが、Ｐ１アスパラギン酸残基を欠失するか、またはカスパーゼ−３／７切断部位（ＤＥＶＤＧ）を含む対照構築体は、用量依存性の発光の増加を示さなかったことを示す。
表１２
【表１２】
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【０２３４】
実施例ＸＸ
【０２３５】
健常な対照患者（ＷＴ／ＷＴ）および両アレルパーフォリン変異（Ｍｕｔ／Ｍｕｔ）を有する患者から得たヘルペスサイミリウイルス（ＨＳＶ）変換されたＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、様々なＥ／Ｔ比で、グランザイムＢバイオセンサーＢ＋、Ｃ＋、Ｃ−、Ｄ＋、およびＤ−を含むＫ５６２標的細胞と共インキュベートし、Ｇ４１８を用いて選択した。細胞を採取し、２％ルシフェリン基質中で再懸濁して、９６−ウェル底プレートのウェルに、１ウェル当たりそれぞれ２ｘ１０5、１ｘ１０5、および５ｘ１０4個の細胞を等分した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、室温で１０分間冷却した。発光をＶｅｒｉｔａｓ照度計プレートリーダー上で読み取った。図３１は、グランザイムＢ送達が、健常な対照患者（ＷＴ／ＷＴ）および両アレルパーフォリン変異（ＭＵＴ／ＭＵＴ）を有する患者から得たＩＬ−２活性化ＮＫ細胞株内の発光を誘導したことを示す。図３１は、生成された発光シグナルのパーフォリン依存を示す。
【０２３６】
実施例ＸＸＩ
【０２３７】
健常なドナー（ｎ＝５）からのＰＢＭＣ細胞を、高用量ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）を用いて４〜８日間培養した。４、５、６、および８日目に、細胞を様々なＥ／Ｔ比で、グランザイムＢバイオセンサーＤ＋で形質転換されたＫ５６２標的細胞と、３７℃で６０分間共インキュベートした。図３４は、ＩＬ−２への長期曝露後のグランザイムＢバイオセンサーからの発光を活性化できることを示す。
【０２３８】
実施例ＸＸＩＩ
【０２３９】
ヒトＣＤ３４細胞を臍帯血（健常ドナー）から単離し、ＩＬ−１５および幹細胞因子（ＳＣＦ）内の間質細胞（ＭＳ５）上で５週間培養した後、グランザイムＢバイオセンサーＤ＋を発現するＫ５６２細胞に対する細胞傷害性を試験した。発光を、上述のようにＢｉｏｔｅｋ照度計で３７℃で測定した。図３５は、臍帯由来のＩＬ−１５刺激細胞が、グランザイムＢを放出して、それをグランザイムＢバイオセンサーを含む標的細胞に送達し、バイオセンサーからの発光を活性化することが可能であることを示す。
【０２４０】
実施例ＸＸＩＩＩ
【０２４１】
図３２Ａ〜Ｂは、一次ＮＫおよびＮＫ９２細胞を有する、カスパーゼ３／７バイオセンサーおよびグランザイムＢバイオセンサーの使用を示す。図３６Ａ〜Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞内のカスパーゼ３／７バイオセンサーおよびグランザイムＢバイオセンサーの使用を示す。
【０２４２】
すべての発行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明は、その所定の実施形態に関連して説明したが、多くの詳細は、例示の目的で記載されており、本発明は、追加の実施形態の影響を受け易いこと、および本明細書の詳細の一部は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変動し得ることは、当業者に明らかとなるであろう。
【０２４３】
したがって、本発明は、特に、標的分子に対して強化された応答を有する、修飾された円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを提供する。本発明の様々な特徴および利益は、以下の請求項に記載されている。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含み、
前記ペプチドリンカーが、グランザイムＢ認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較したときに、グランザイムＢによる切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
〔２〕前記グランザイムＢ認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、前記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３〕前記グランザイムＢ認識部位が、ＧＲＩＥＡＤＳＥ（配列番号８０）、ＫＳＶＧＰＤＦＧ（配列番号８１）、またはＧＩＥＴＤＳＧ（配列番号８２）である、前記〔１〕または〔２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
〔５〕前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに操作可能に連結される、前記〔４〕に記載のベクター。
〔６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを含む、細胞。
〔７〕前記〔６〕に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
〔８〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされた円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。
〔９〕細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー内の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１０〕細胞またはサンプル中の活性グランザイムＢの存在または量のうちの少なくとも１つを検出するための方法であって、
ａ）前記細胞またはサンプルを、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質、および
ｉｉｉ）細胞傷害性リンパ球と接触させることと、
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより細胞傷害性リンパ球から放出された前記活性グランザイムＢの存在または量を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１１〕前記細胞傷害性リンパ球が、患者もしくは患者由来の細胞傷害性Ｔリンパ球またはサイトカインで活性化されたナチュラルキラー細胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記グランザイムＢの検出が、前記細胞傷害性リンパ球の前記細胞傷害機能を決定する、前記〔１０〕または〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記グランザイムＢ活性の検出が、細胞媒介性細胞傷害を示す、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕グランザイムＢ活性の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、  ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢの調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔１５〕前記調節因子が、グランザイムＢの阻害剤である、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記調節因子が、グランザイムＢのエンハンサーである、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１８〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔１５〕および〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕細胞の細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、  ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｃ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞から放出された前記グランザイムＢが、前記標的細胞内で前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの前記ペプチドリンカーを切断することができ、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔２０〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能の阻害剤である、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能のエンハンサーである、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２３〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔２０〕および〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記スクリーニングが、多重ウェル形式で行われる、前記〔１４〕〜〔２３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２５〕細胞過程内のグランザイムＢ活性を検出する方法であって、
ａ）細胞またはサンプルを、
ｉ）１つ以上の試験薬、
ｉｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクター、または前記〔８〕に記載の円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、および
ｉｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、および
ｂ）前記細胞またはサンプル内の発光を検出することであって、前記グランザイムＢが、前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー中の前記ペプチドリンカーを切断することができ、それによりグランザイムＢ活性を検出する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔２６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチド。
〔２７〕前記〔２６〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔２８〕前記〔２６〕に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
〔２９〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを含む、キット。
〔３０〕非順列置換熱安定性ルシフェラーゼの本来のＮ末端およびＣ末端を連結するペプチドリンカーを含む、円順列置換熱安定性ルシフェラーゼをコードする、ポリヌクレオチドであって、
前記ペプチドリンカーが、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７アイソフォームのうちの少なくとも１つにより認識および切断される、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位を含み、
前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼが、切断されていない円順列置換熱安定性ルシフェラーゼと比較して、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７による切断後に発光が増加する、ポリヌクレオチド。
〔３１〕前記カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位には、ペプチドリンカーが隣接する、前記〔３０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３２〕前記カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７認識部位が、ＤＥＶＤＧである、前記〔３０〕および〔３１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３３〕前記〔３０〕〜〔３２〕に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
〔３４〕前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに操作可能に連結される、前記〔３３〕に記載のベクター。
〔３５〕細胞傷害機能の１つ以上の調節因子についてスクリーニングする方法であって、
ａ）標的細胞集団を、
ｉ）円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする、前記〔３０〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または前記〔３３〕もしくは〔３４〕に記載のベクター、または前記〔３０〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または前記〔３３〕もしくは〔３４〕に記載のベクター、および
ｉｉ）前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの基質と接触させることと、
ｂ）前記標的細胞集団および／または細胞傷害を媒介する細胞を１つ以上の試験薬と接触させることと、および
ｂ）前記標的細胞集団内の発光を検出することであって、前記細胞傷害を媒介する細胞が、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７のうちの少なくとも１つを活性化することができ、前記少なくとも１つの活性化されたカスパーゼ−３またはカスパーゼ−７が、前記標的細胞集団内の前記円順列置換熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断および活性化し、それにより前記細胞傷害機能の調節因子を識別する、発光を検出することと、を含む、方法。
〔３６〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能の阻害剤である、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡである、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３８〕前記調節因子が、前記細胞傷害機能のエンハンサーである、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３９〕前記エンハンサーまたは阻害剤が、小分子、ペプチドまたはタンパク質である、前記〔３６〕および〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕前記スクリーニングが、多重ウェル形式で行われる、前記〔３５〕〜〔３９〕のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
0006421977.tif 000025
【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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