(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合ドメインおよびルーピング因子を有するポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ルーピング因子はＬＩＭドメイン結合１（Ｌｄｂ１）のフラグメントであり、前記Ｌｄｂ１のフラグメントは配列ＩＤ番号１のアミノ酸１〜２００からなり、前記ＤＮＡ結合ドメインは目的遺伝子のプロモーター中の標的配列に特異的に結合する核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子において、前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記ルーピング因子は共有結合またはアミノ酸リンカーにより連結される核酸分子。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分子において、前記Ｌｄｂ１はヒトである核酸分子。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分子において、前記ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガータンパク質または転写活性化物質エフェクタータンパク質を有する核酸分子。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分子において、前記プロモーター及び目的遺伝子は天然遺伝子座内に存在する核酸分子。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子において、前記プロモーターはグロビンプロモーターである核酸分子。
【請求項７】
請求項６記載の核酸分子において、前記グロビンプロモーターは胎児（ガンマ）遺伝子
プロモーターである核酸分子。
【請求項８】
請求項１記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分子を有するベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つの請求項８記載のポリペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を有する組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの請求項１記載の核酸分子および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を有する組成物。
【請求項１２】
細胞において目的遺伝子の発現をインビトロで調節する方法であって、前記細胞において請求項１記載の核酸分子を発現する工程を有する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記方法は前記細胞において第１および第２の核酸分子を発現する工程を有し、
前記第１の核酸分子は第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第１のルーピング因子を有する第１のポリペプチドをコードし、前記第１のルーピング因子はＬＩＭドメイン結合１（Ｌｄｂ１）のフラグメントであり、前記Ｌｄｂ１のフラグメントは配列ＩＤ番号１のアミノ酸１〜２００からなり、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは前記目的遺伝子のプロモーター中の標的配列に特異的に結合し、ならびに
前記第２の核酸分子は第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のルーピング因子を有する第２のポリペプチドをコードし、前記第２のルーピング因子はＬＩＭドメイン結合１（Ｌｄｂ１）またはそのフラグメントであり、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは前記目的遺伝子の遺伝子座調節領域中の標的配列に特異的に結合する方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記第２のルーピング因子はＬｄｂ１のアミノ酸１〜２００を有するＬｂｄ１のフラグメントである方法。
【請求項１５】
鎌状赤血球貧血またはベータサラセミアを治療するための請求項１１記載の組成物であって、前記ＤＮＡ結合ドメインはグロビンプロモーター中の標的配列に特異的に結合する組成物。
【請求項１６】
請求項１５記載の組成物において、前記ＤＮＡ結合ドメインは胎児（ガンマ）遺伝子プロモーター中の標的配列に特異的に結合する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年６月７日付で出願された米国特許仮出願第６１／６５６，９６１号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。前述の出願は本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号第５Ｒ３７ＤＫ０５８０４４号および第２ＲＯ１ＤＫ０５４９３７号による米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明に関し特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、遺伝子発現の分野に関する。より具体的には、本発明は、クロマチンルーピングにより遺伝子発現を制御する組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
本明細書を通して、いくつかの文献および特許文書を引用し、本発明が属する技術水準を説明する。これらの各引用文献は、それぞれ、参照することにより全体が記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
遺伝子活動は、数百キロベース以下で分離され得る、近位および遠位の調節要素の組合せによって制御される。長年の疑問は、これらの要素が如何にして機能的に相互作用して遺伝子発現を調節するのか、遺伝子特異性が如何にして達成されるのか、および如何にして近隣の無関係な遺伝子に対する望まれない効果が回避されるのかということであった。染色体構造捕捉（３Ｃ）およびその派生物の使用により、遠位染色体要素が並列してクロマチンループを形成し得ることが明らかにされ、それにより、１つの長期に亘るエンハンサー機能のメカニズムが提示された（Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２０３−２０６、Ｄｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１３０６−１３１１）。クロマチンルーピングは多数の遺伝子座で発見され、クロマチン繊維の広汎な組織化原理を反映する（Ｄｅａｎ，Ａ．（２０１１）Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０：３−１０、Ｋａｄａｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８９：１７−２５、Ｍｉｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，４：１０４６−１０５７、Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，２０：１２７−１３３、Ｓｅｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０：８４９−８５５）。ルーピングは遺伝子の完全な活性化の前に遺伝子において起こり得るが、転写の開始はさらなるループ化された相互作用と密接に関連する（Ｐａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３５：１９０−１９４、Ｓｐｉｌｉａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：１０１７−１０２７、Ｖｅｒｎｉｍｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２６：２０４１−２０５１）。しかしながら、転写伸長の薬理学的阻害剤を使用する研究に基づき、進行している転写は、予め形成されたクロマチンループを持続させるのに必ずしも必要ではないことが明らかとなった（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２２：２０−２５、Ｐａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ１６６１）。さらに、クロマチンルーピングは、活性遺伝子に限定されない。例えば、Ｋｉｔ遺伝子の抑制に際して、エンハンサー−プロモーターループの喪失は、遺伝子体における新たなループ形成を伴う（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２９：２３２−２４２）。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  国際公開第２００７／１２１３２６号
（特許文献２）  米国特許出願公開第２００５／００４８５２８号明細書
（特許文献３）  国際公開第２００５／０３９６１３号
（特許文献４）  米国特許第８，０３４，７６８号明細書
（特許文献５）  米国特許出願公開第２０１１／００１６５４０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの研究は、クロマチンループが非常に動的であり、活性遺伝子および抑制された遺伝子で生じることを示すが、これらの長期に亘る相互作用が転写開始における動的変化の原因または結果であるかどうかという問題は解決されないままである。  
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、目的遺伝子の発現を調節する組成物および方法が提供される。具体的には、ＤＮＡ結合ドメインおよびルーピング因子を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記ルーピング因子は、共有結合またはアミノ酸リンカーにより連結され得る。具体的な実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーポリペプチドまたは転写活性化物質様エフェクターポリペプチドを有する。前記ＤＮＡ結合ドメインは、目的遺伝子のプロモーター中の標的配列に特異的に結合してその発現を調節するように設計され得る。具体的な実施形態では、前記ルーピング因子は、ＬＩＭドメイン結合１（Ｌｄｂ１）またはそのフラグメントである。具体的な実施形態では、前記Ｌｄｂ１のフラグメントは、Ｌｄｂ１の自己会合ドメイン（例えば、Ｌｄｂ１のアミノ酸１〜約２００）を有する。前記核酸分子にコードされるポリペプチドもまた、本発明に包含される。また、前記核酸分子少なくとも１つを有する組成物およびベクターも本明細書において提示される。
【０００７】
本発明の別の観点によれば、細胞において目的遺伝子の発現を調節する方法が提供される。前記方法は、細胞において少なくとも１つの本発明の核酸分子を発現する工程を有する。前記核酸分子は、任意の手段（例えば、形質移入または（例えば、ウイルスベクターを介する）感染）により前記細胞へと導入され得る。本発明の方法は、前記細胞において第１および第２核酸分子を発現する工程をさらに有してもよく、前記第１および第２核酸分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびルーピング因子を有する第１および第２ポリペプチドをコードし、前記第１ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは目的遺伝子のプロモーター中の標的配列に特異的に結合し、前記第２ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは目的遺伝子の遺伝子座調節領域中の標的配列に特異的に結合する。
【０００８】
本発明の別の観点によれば、異常なタンパク質発現と関連する疾患または障害を抑制する、治療する、および／または予防する方法が提供される。具体的な実施形態では、前記方法は、本発明の少なくとも１つの核酸分子を被験体に投与する工程を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、β−グロビン遺伝子座のＺＦ標的化を示す図である。図１Ａは、親Ｇ１Ｅ細胞（中）および誘導されたＧＡＴＡ１−ＥＲを発現するＧ１Ｅ細胞（上および下）に由来するβ−グロビン遺伝子座を包含する抗ＧＡＴＡ１（上）および抗ＴＡＬ１（中および下）ＣｈＩＰ−ｓｅｑトラックを示す。ＴＡＬ１は、それらの占有パターンが実質的に同じであることから、Ｌｄｂ１の存在に関する信頼性のある指標である（Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。ＧＡＴＡ１の不在下では、ＴＡＬ１はβ−主要グロビンプロモーターから完全に失われたが、ＬＣＲからは失われなかった。図１Ｂは、Ｌ−ＺＦおよびＰ−ＺＦが、それぞれＬＣＲのＨＳ２（配列ＩＤ番号８１）およびβ−主要プロモーター（配列ＩＤ番号８２）を標的とすることを示す図である。ＺＦ結合部位の１８ヌクレオチド（大文字）および隣接するヌクレオチド（小文字）を含む、ＥＬＩＳＡ実験に使用されるＤＮＡ配列を示す。Ｇ１Ｅ細胞におけるＨＡタグ付Ｐ−ＺＦ（図１Ｃ）およびＬ−ＺＦ（図１Ｄ）の抗ＨＡ  ＣｈＩＰプロファイルを示した。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図２】図２は、β−グロビン遺伝子座に対するＬｂｄ１のＺＦ媒介標的化を示す図である。図２Ａ（上）は、ＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１複合体がＬｄｂ１を動員してクロマチンルーピングを促進する野生型シナリオの概略図を示す図である。図２Ａ（中）は、ＧＡＴＡ１の欠損がプロモーターにおけるＬｄｂ１の喪失、ルーピング障害、および転写活性化の減少をもたらすことを示す図である。図２Ａ（下）は、β−グロビンプロモーターへのＺＦ媒介Ｌｄｂ１繋留、ならびにルーピングおよび転写活性化を回復するその能力を示す図である。図２Ｂは、Ｐ−ＺＦおよびＬ−ＺＦがそれぞれβ−主要プロモーターおよびＬＣＲのＨＳ２を標的とすることを示す図である。図２Ｂ〜２Ｄは、Ｐ−Ｌｄｂ１（図２Ｂ）、Ｌ−Ｌｄｂ１（図２Ｃ）、およびＬ−Ｌｄｂ１＋Ｐ−Ｌｄｂ１（図２Ｄ）を発現する細胞における抗ＨＡ  ＣｈＩＰを示す図である。Ｌ−Ｌｄｂ１は、ＬＣＲのＨＳ２に選択的に結合する。Ｐ−Ｌｄｂ１は前記プロモーターに結合するが、ＬＣＲのＨＳ１、２、３とさらに会合し、εｙ遺伝子、βＨ１遺伝子、およびβｍｉｎ遺伝子、介在領域（ＩＶＲ１６）または不活性遺伝子（ＣＤ４）を含む他の領域とは会合しない。Ｎ≧３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図３】図３は、３Ｃの質管理を示す図である。図３Ａは、ＢＡＣ  ＤＮＡの代表的なゲル電気泳動を提示する図である。ＢＡＣ  ＤＮＡを精製し（レーン２）、ＢｇｌＩＩで消化し（レーン３）、Ｔ４リガーゼで連結して（レーン４）、前記３Ｃアッセイについて標準ＤＮＡとしてはたらくＢｇｌＩＩフラグメントのランダムライゲーション産物を生じた。図３Ｂは、代表的な３Ｃプライマーの直線性を、テンプレートとして段階希釈したＢＡＣ  ＤＮＡを使用して試験したことを示す図である。図３Ｃは、代表的な３Ｃプライマーの増幅産物をアガロースゲル電気泳動で解析してプライマーの特異性を検証したことを示す図である。図３Ｄは、代表的な３Ｃ実験のＨＳ２部位における消化効率を提示する図である。
【図４】図４は、繋留されたＬｄｂ１またはそのＳＡドメインによるＧＡＴＡ１  ｎｕｌｌ細胞におけるβ−グロビン転写の活性化を示す図である。図４Ａは、Ｇ１Ｅ細胞においてエクソン２、ならびに指定されるＺＦおよびＺＦ−Ｌｄｂ１コンストラクトを発現する派生物に対するプライマー対を用いてＲＴ−ｑＰＣＲによって計測されるβ−主要ｍＲＮＡレベルを示す図である。図４Ｂは、誘導されたＧ１Ｅ−ＥＲ４細胞（Ｇ１Ｅ＋ＧＡＴＡ１）より得られたデータの隣に再度プロットした図４Ａのデータを示す図である。Ｐ−Ｌｄｂ１またはＬ−Ｌｄｂ１＋ＰＬｄｂ１により達成されるβ−主要発現は、ＧＡＴＡ１により誘導される発現のおよそ２０％に達することに留意されたい。図４Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される指定される赤血球遺伝子の相対的な発現を提示する図である。図４Ｄは、Ｌｄｂ１（ＳＡ、自己会合ドメイン、ＬＩＤ、ＬＩＭ相互作用ドメイン）の概略図、およびＬｄｂ１のＳＡドメインに融合された指定されるＺＦを発現するＧ１Ｅ細胞におけるβ−主要ｍＲＮＡレベルを提示する図である。β−アクチンに対して転写レベルを正規化した。Ｎ≧３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図５】図５Ａは、エクソン２／３接合部、５ＵＴＲおよび３ＵＴＲに対するプライマー対を用いてＲＴ−ｑＰＣＲによって計測されたＺＦ−Ｌｄｂ１発現細胞におけるβ−主要ｍＲＮＡレベルを示す図である。図５Ｂは、Ｌ−ＳＡ（上）、Ｐ−ＳＡ（中）、およびＬ−ＳＡ＋Ｐ−ＳＡ（下）を発現するＧ１Ｅ細胞における抗ＨＡ  ＣｈＩＰプロファイルを示す図である。Ｌ−ＳＡは、ＬＣＲのＨＳ２に選択的に結合する。Ｐ−ＳＡは前記プロモーターに結合し、さらにＬＣＲのＨＳ１、２、３と会合するが、εｙ遺伝子、βＨ１遺伝子、およびβｍｉｎ遺伝子、介在領域（ＩＶＲ１６）または不活性遺伝子（ｍＣＤ４）を含む他の領域とは会合しない。図５Ｃは、Ｇ１Ｅ細胞、ならびに指定されるＺＦコンストラクトおよびＺＦ−ＳＡコンストラクトを発現する派生物においてＲＴ−ｑＰＣＲによって計測された指定される遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。β−主要がＰ−ＳＡまたはＰ−ＳＡ／Ｌ−ＳＡ細胞において劇的に活性化されるのに対し、ＧＡＴＡ１で抑制された遺伝子（Ｇａｔａ２、Ｋｉｔ）および活性化された遺伝子（Ｅｒａｆ）のｍＲＮＡレベルは、ＺＦ−融合タンパク質発現によって大きく変化しなかった。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。β−アクチンに対してｍＲＮＡレベルを正規化した。
【図６】図６は、繋留されたＬｄｂ１自己会合ドメインによるクロマチンルーピングを示す図である。図６Ａ〜図６Ｄは、Ｇ１Ｅ細胞若しくはＧＡＴＡ１を発現する誘導されたＧ１Ｅ−ＥＲ４細胞、またはＰ−ＳＡ、Ｌ−ＳＡ、若しくはＬ−ＳＡ＋Ｐ−ＳＡを含有するＧ１Ｅ細胞において全遺伝子座交雑連鎖頻度（ｌｏｃｕｓ  ｗｉｄｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）を計測する３Ｃアッセイを提示する図である。マウスβ−グロビン遺伝子座を各グラフの上部に描く。Ｘ軸は、ゼロを表すεｙ遺伝子からの距離（ｋｂ）を示す。黒色バーは、アンカーとしてはたらくＨＳ２含有ＢｇｌＩＩフラグメントを表す。灰色バーは、解析したＢｇｌＩＩフラグメントを表す。Ｎ＝３（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｄ）、およびＮ＝２（図６Ｃ）。エラーバーは標準誤差を示す。
【図７】図７は、ＺＦ−ＳＡによるＰｏｌ  ＩＩ動員およびセリン５リン酸化の回復を示す図である。図７Ａは、アンプリコン（黒色バー）の位置を示す図である。Ｐｒｏｍ、プロモーター；番号はエクソンを示す。図７Ｂおよび図７Ｃは、Ｇ１Ｅ細胞またはＧＡＴＡ１若しくはＰ−ＳＡを発現するＧ１Ｅ細胞を使用し、総Ｐｏｌ  ＩＩ（図７Ｂ）、ｓｅｒ５ｐｈ（図７Ｃ）に対する抗体を用いたＣｈＩＰアッセイを提示する図である。ＧＡＴＡ１によって誘導されたプロモーターにおける総Ｐｏｌ  ＩＩ結合は一致したが、遺伝子体におけるＰｏｌ  ＩＩレベルはＰ−ＳＡ細胞において部分的にのみ回復され、転写伸長の不完全な救済と一致する（図４Ｂと比較）。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図８】図８は、Ｇ１Ｅ細胞またはＧＡＴＡ１若しくはＰ−ＳＡを発現する派生物を使用してＣＤＫ９に対する抗体（図８Ａ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ３に対する抗体（図８Ｂ）を用いたＣｈＩＰプロフィルを示す図である。
【図９】図９は、ＺＦ−ＳＡが初代初期前駆細胞におけるβ−グロビン発現を増強することを示す図である。図９Ａは、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ７１プロファイリングによるＥ１３．５胎児肝臓赤血球細胞のステージ分類を示す図である。図９Ｂは、ＺＦコンストラクトを用いて形質導入されたＦＡＣＳ精製Ｒ１細胞に由来するｍＲＮＡを、指定される遺伝子に対するプライマーを用いてＲＴ−ｑＰＣＲにより調査したことを示す図である。陰性対照（Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ）は、空ベクターを発現する細胞である。ＧＡＰＤＨに対して結果を正規化した。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂは、ｑＰＣＲにより計測した胎児肝臓細胞のＲ１〜Ｒ４集団における指定される遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。図１０Ｃは、Ｔｅｒ１１９およびＣＤ７１表面マーカーを使用するフローサイトメトリーによって計測された指定されるコンストラクトを発現するＲ１細胞の分化プロファイルを提示する図である。
【図１１】図１１は、ＺＦ−ＳＡタンパク質により誘導されるβ−グロビンのＬＣＲ依存を示す図である。図１１Ａは、ＬＣＲ欠失アレルはβ−主要Ｄハプロタイプのバックグラウンド上にあるが、野生型アレルはβ−主要Ｓハプロタイプのバックグラウンド上にあることを示す図である。図１１Ｂは、指定されるＺＦ−ＳＡタンパク質を発現するＷＴ／ΔＬＣＲまたはΔＬＣＲ／ΔＬＣＲ胎児肝臓に由来するＲ１細胞におけるアレル特異的ＲＴ−ｑＰＣＲによって計測されたβ−主要転写物レベルを示す図である。ＧＡＰＤＨに対して転写物レベルを正規化した。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図１２】図１２は、アレル特異的ｑＰＣＲを示す図である。図１２Ａは、それぞれ、アレル特異的プライマーβｍａｊ−Ｄおよびβｍａｊ−Ｓを使用してｑＰＣＲによって計測したＤおよびＳハプロタイプのβ−主要ｍＲＮＡレベルを示す図である。ＤハプロタイプまたはＳハプロタイプに由来するｃＤＮＡを、それぞれ１２９またはＢＬ６マウス系統より調製した。βｍａｊ−ＳプライマーはＢＬ６  ｃＤＮＡを特異的に増幅したが、１２９  ｃＤＮＡを増幅しなかった。対照的に、βｍａｊ−Ｄプライマーは、βｍａｊ−Ｓプライマーの約１０％の効率でＢＬ６  ｃＤＮＡを交差増幅した。Ｄ−ｃＤＮＡテンプレートとＳ−ｃＤＮＡテンプレートを混合することにより、アレル特異性をさらに調査した。観察されるｑＰＣＲシグナル（図１２Ｃ）は、アレル特異性ｑＰＣＲに関する予想と大部分が一致した（図１２Ｂ）。βｍａｊ−ＳシグナルはＤ  ｃＤＮＡ量の増加により変化を受けることなく、その増幅特異性を実証した。しかしながら、Ｓ  ｃＤＮＡ割合の増加は、最高約１０％の交差反応性の指標であるＤ特異性プライマーによる増強されたシグナルをもたらした。
【図１３】図１３Ａは、指定されるＺＦ−ＳＡタンパク質を発現するＷＴ／ΔＬＣＲ胎児肝臓に由来するＲ１細胞における指定される遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。ＺＦ−ＳＡ発現コンストラクトで形質導入した後、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を用いてＲ１細胞を６時間処理した。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。図１４Ｂおよび図１４Ｃは、Ｅｐｏ処理をせずに、指定されるＺＦ−ＳＡタンパク質を発現するＷＴ／ΔＬＣＲ胎児肝臓に由来するＲ１細胞におけるβ−主要グロビン（図１４Ｂ）または指定される対照遺伝子（図１４Ｃ）のＲＴ−ｑＰＣＲで計測したｍＲＮＡレベルを示す図である。ＧＡＰＤＨに対してｍＲＮＡレベルを正規化した。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表す。
【図１４】図１４は、機能的にクロマチンルーピングと転写活性化を統合する図式モデルを提示する図である。ＺＦタンパク質またはＧＡＴＡ１のいずれかによるβ−グロビンプロモーターへのＬｄｂ１の動員は、ＬＣＲ−プロモータールーピングを促進する。ＺＦＬｄｂ１による強制クロマチンルーピングは、ＰＩＣ集合、Ｐｏｌ  ＩＩ動員、Ｐｏｌ  ＩＩセリン５リン酸化（ＹＳＰＴＳＰＳ−配列ＩＤ番号８３）、および転写開始を効率的に回復する。ＧＡＴＡ１の不在下では、Ｐ−ＴＥＦｂの動員の減弱およびおそらくはさらなるＧＡＴＡ１補助因子が非効率的な転写伸長を説明する。したがって、クロマチンルーピングは、転写開始を引き起こし、完全な転写伸長とは独立して発生する可能性がある。
【図１５】図１５は、ヒトＬｄｂタンパク質のアミノ酸配列を提示する図である。図１５Ａは、配列ＩＤ番号１を提示し、図１５Ｂは配列ＩＤ番号２を提示する図である。
【図１６】図１６Ａは、成体細胞における胚性β−グロビンの再活性化に関する実験計画の概略図を示す図である。ＺＦタンパク質を、胚性β−グロビン、βｈ１のプロモーターを標的とするように設計した。ＧＡＴＡ１発現Ｇ１Ｅ細胞におけるＺＦ−ＳＡ融合タンパク質の発現は、βｈ１プロモーターにＳＡドメインを繋留し、発現抑制されたβｈ１遺伝子へとＬＣＲをリダイレクト（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）して、βｈ１転写を活性化すると考えられる。図１６Ｂは、空ベクターまたはＰ−ＳＡコンストラクトを発現したＧ１Ｅ細胞またはＧ１Ｅ＋ＧＡＴＡ１細胞においてＲＴ−ｑＰＣＲにより計測されたｍＲＮＡレベルのグラフを提示する図である。β−アクチンに対してデータを正規化した。
【図１７】図１７は、ＺＦ−Ｌｄｂ１融合タンパク質（ＧＦＰ＋）を発現する初代ヒト赤血球細胞におけるガンマグロビン産生の上昇を示すグラフを提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
クロマチンルーピングは、活性なプロモーターを伴う遠位エンハンサーと並列するが、それらの分子構造および転写との関連は不明のままである。赤血球細胞では、前記遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）とβ−グロビンプロモーターとが、転写因子ＧＡＴＡ１および会合した分子Ｌｄｂ１を必要とするクロマチンループを形成する。前記β−グロビン遺伝子座が緩和されて不活性であるＧＡＴＡ１  ｎｕｌｌ赤芽球において、β−グロビンプロモーターにＬｄｂ１を繋留するため人工ジンクフィンガー（ＺＦ）を採用した。意外なことに、Ｌｄｂ１またはその自己会合ドメインのみのβ−グロビンプロモーターに対する標的化は、ＧＡＴＡ１の不在下でβ−グロビン転写を実質的に活性化した。プロモーターが繋留されたＬｄｂ１は、前記ＬＣＲにおいて内因性Ｌｄｂ１複合体と相互作用してクロマチンループを形成し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの動員およびリン酸化を生じた。ＺＦ−Ｌｄｂ１タンパク質は、ＬＣＲを欠くアレルにおいて不活性であり、それらの活性が長期の相互作用に依存することを実証した。前記知見は、ＧＡＴＡ１媒介ループ形成の重大なエフェクターとしてＬｄｂ１を確立し、クロマチンルーピングが因果的に遺伝子調節の根底にあることを示す。
【００１１】
この点で、前記クロマチン繊維の高次組織化に関する重大な問題に対処するため、ＺＦ標的化戦略を採用した。Ｌｄｂ１のＳＡドメインの内因性β−グロビン遺伝子座に対する標的化は、ＧＡＴＡ１の喪失に関してかなりの程度補償し、Ｌｄｂ１がクロマチンルーピング形成の間ＧＡＴＡ１のエフェクターとしてはたらくことを強く示唆した。天然遺伝子座におけるＺＦ−ＳＡタンパク質による強制クロマチンルーピングは、強力な転写活性化を引き起こし、エンハンサーとプロモーターとの並列が因果的に遺伝子誘導の根底にあることを示した。
【００１２】
Ｐ−ＳＡのそれ自身による発現は、Ｐ−ＳＡおよびＬ−ＳＡの共発現と非常に類似する効果をもたらした。いくつかの独立した調査ラインは、Ｐ−ＳＡ発現細胞において、強制ループ形成がβ−グロビン活性化を説明することを実証する。第一に、３Ｃ実験は、前記ＳＡドメインの前記β−グロビンプロモーターへの繋留が、それらの空間配置および効率の両方に関してＧＡＴＡ１によって誘導されるものに非常に似たゲノムコンタクトを育成することを明確に示した。第二に、ＳＡドメインの動員は、Ｐｏｌ  ＩＩ動員、Ｐｏｌ  ＩＩのセリン５リン酸化、およびＨ３Ｋ４メチル化を含む、前記β−グロビンプロモーターにおけるいくつかのＬＣＲ依存性機能を完全に回復した。第三に、前記ＬＣＲの標的化された欠失は、プロモーターに結合したＬｄｂ１の量を減らすことなく、β−グロビン転写を劇的に減少した（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：２３５６−６４）。したがって、前記プロモーターへのＬｄｂ１またはそのＳＡドメインの繋留は、前記ＬＣＲの関与なく、かかる明白な効果を生じるとは考えられていない。第四に、β−グロビン発現のＰ−ＳＡおよびＰ−ＳＡ／Ｌ−ＳＡ誘導は、前記ＬＣＲに完全に依存し、根底にあるルーピング機構を確認した。Ｐ−ＳＡのループ形成を強力に誘導する能力は、おそらく、ＧＡＴＡ１の不在下であっても前記ＬＣＲにある内因性Ｌｄｂ１含有複合体と相互作用するその能力により説明される（図１Ａ；Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。対照的に、β−グロビンプロモーターとのＬｄｂ１会合は、完全にＧＡＴＡ１依存性であり、それゆえに、クロマチンルーピングおよび高レベルの転写の間、重大な律速段階を表す可能性がある。
【００１３】
前記ＳＡドメインが長期のクロマチン相互作用を誘導するのに十分であるという観察は、Ｌｄｂ１の自己会合が固定されたクロマチン領域を共に結ぶ主要な分子力であることを暗示する。重要なことに、前記ＳＡドメインは、遠位クロマチンフラグメントの間の相互作用を安定化するのにはたらく可能性のあるより高次の複合体の形成を可能とする多量体を形成することができる（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：１３３−１４４）。しかしながら、Ｌｄｂ１の前記ＳＡ欠失形態もまた活性であり、前記ＬＩＤドメインもまた、より低い効率にもかかわらず、前記内因性Ｌｄｂ１複合体を動員して長期の相互作用を促進可能であることを示唆した。
【００１４】
ＤＮＡに結合した因子の間の複数の接触は、おそらくは、クロマチンループを誘導するのに必須の特異性および親和性を提供するために必要である。さらに、前記クロマチン繊維の折りたたみは、複数のセグメント間の同時の相互作用を含む複雑なパターンで生じて、クロマチンハブと呼ばれるものを形成することができる。単純なタンパク質二量体は、そのような複雑な相互作用パターンを適合するのに不十分な可能性がある。一致して、ＺＦｓと多様な二量体化ドメイン（ｌｅｘＡ、ｐ６５ＮＦｋＢ、ｔｈｅ  Ａｒｇｅｎｔ（商標）ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）またはＧＡＧＡ因子のＰＯＺドメイン等の多量体を形成し得るタンパク質分子との融合は、効率的にβ−グロビン発現を活性化できなかった。そのため、Ｌｄｂ１は、ホモ多量体を形成することにより、またＬＭＯ２／ＴＡＬ１／Ｅ２Ａ複合体およびＧＡＴＡ１を含む多数の遺伝子特異的転写因子を参加させることにより、かかる相互作用を促進するように進化した可能性がある。実際、多様な生物および細胞系における研究により、広く使用され進化上保存されたＬｄｂ１に対するルーピング機能が示唆される（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，４：１１３２−１１３７；Ｍｏｒｃｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１１：２７２９−２７４０；Ｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０：２３７−２４９）。
【００１５】
クロマチンルーピングと遺伝子調節との間の因果関係は不明である。天然遺伝子座においてクロマチンの立体構造を操作することにより、エンハンサーのその標的遺伝子との並列が転写活性化をもたらすことが見出され、ルーピングが転写活性化に必須であることが示された。具体的には、前記ＬＣＲと前記β―グロビン遺伝子との強制会合は、前記ＬＣＲに帰する２つの機能である、前記プロモーターにおける開始前の複合体の形成およびセリン５リン酸化に反映されるＰｏｌ  ＩＩの初期伸長の発生を発揮するのに十分であった（Ｓａｗａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１７：１００９−１０１８；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：２３５６−６４）。一方、ＺＦ−Ｌｄｂ１タンパク質がクロマチンルーピングを完全に救済したが、部分的にのみ転写伸長を回復したという本観察は、ループ形成に完全な転写は必要ではないという考えに一致する（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２９：２３２−２４２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２２：２０−２５；Ｐａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ１６６１）。ＬＣＲのβ−グロビンプロモーターとの並列は、おそらくは、複合体形成の開始前および初期転写伸長に重大な閾値より上で、前記プロモーターにおける核調節因子の濃度を増加する（図１４）。
【００１６】
ＧＡＴＡ１  ｎｕｌｌ細胞におけるＬｄｂ１の動員は、クロマチンルーピングおよび転写開始を完全に救済したが、部分的に転写伸長を回復したにすぎず、ＧＡＴＡ１がＬｄｂ１およびクロマチンルーピングとは独立してさらなる機能に寄与することを示した。実際、Ｐ−ＴＥＦｂ複合体の動員および前記遺伝子に沿ったその分布の両方が、ＧＡＴＡ１の不在下で障害され、ＧＡＴＡ１が、おそらくは直接的な相互作用を介して（Ｂｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９：３５０５−３５１９；Ｅｌａｇｉｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：４８８４−４８９４）、または間接的にＢＥＴファミリーのタンパク質を介して（Ｌａｍｏｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０８：Ｅ１５９−１６８）Ｐ−ＴＥＦｂ制御に対して複数のレベルで影響を及ぼすことを示した。さらに、ＧＡＴＡ１は、多くの他の転写因子およびヒストン修飾因子と相互作用し、これらの欠損が非効率的な転写伸長を説明する可能性がある。
【００１７】
対照的に、これらの結果は、Ｌｄｂ１が、並行経路におけるよりもむしろＧＡＴＡ１の下流に機能することを示し、転写サイクルの異なる段階の間タンパク質機能を調べるこのシステムの有用性を強調する。より一般的な用語では、この研究は、階層順の転写因子の機能を確立するための新規な戦略を解説する。転写因子欠乏の背景について、可能性のある補助因子の選択された遺伝子への強制的な繋留を採用して、ループ形成、Ｐｏｌ  ＩＩ動員、Ｐｏｌ  ＩＩリン酸化、および生産性転写伸長等の前記転写サイクルにおける規定される段階に対するその寄与を計測することができる。このアプローチは、ノックダウンまたはノックアウトされ得る任意の核因子に広く適用可能である。
【００１８】
本研究のひとつの一般的な知見は、β−グロビンプロモーターにタグ付けされた単一のＺＦ−Ｌｄｂ１タンパク質が、内因性のＬＣＲに結合した因子と相互作用してクロマチンループを誘導し得ることである。ＺＦｓは、以前、活性化ドメインに連結されて遺伝子発現を活性化するのに成功した（Ｋｌｕｇ，Ａ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：２１３−２３１）。しかしながら、強力なエンハンサーまたはＬＣＲとの相互作用を促進するためのＺＦｓの使用は、より明白な転写効果をもたらすと予想される。実際、遺伝子転写を１０００倍を超えて活性化することができる既知の単一のＺＦタンパク質は存在しない。単一のＺＦコンストラクトによる強制ルーピングアプローチの別の利点は、特に治療適用の上では、単一の分子の効率の良い発現が、整合されたレベルでの２つの因子の共発現よりも容易なことである。
【００１９】
最後に、特異的なクロマチンループが抑制された遺伝子において生じる可能性があり（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２９：２３２−２４２）、別々のループ上へのエンハンサーおよびプロモーターの配置によりエンハンサーを孤立させて不活性にすることができる（Ａｍｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２４：３５８−３６７；Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：２０３９８−２０４０３）。そのため、転写活性化に加えて、強制クロマチンルーピングは、科学的または治療的な目的で遺伝子発現を抑制するために使用され得る。
【００２０】
本発明は、目的遺伝子（およびコードされるタンパク質）の発現を調節する組成物および方法を有する。具体的な実施形態では、本発明は、目的遺伝子の発現を調節する融合ポリペプチドを提供する。具体的な実施形態では、前記融合ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインおよびルーピング因子を有する。前記ＤＮＡ結合因子は、前記ルーピング因子に対してＮ末端であってもよい。前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記ルーピング因子は、互いに直接に連結されてもよく、またはリンカーを介して連結されてもよい。一般に、前記リンカーは、共有結合または２つのドメイン若しくはポリペプチドを共有結合的に付着する原子の鎖を有する化学的部分である。具体的な実施形態では、前記リンカーは、ポリペプチド（例えば、約１〜約５０アミノ酸、約１〜約２０アミノ酸、約１〜約１０アミノ酸、または約１〜約５アミノ酸）であってもよい。前記融合ポリペプチドは、少なくとも１つの親和性タグおよび／または少なくとも１つの核局在配列（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳまたはヌクレオプラスミンＮＬＳ）を有してもよい。具体的な実施形態では、前記親和性タグおよび／またはＮＬＳは、前記融合ポリペプチドのＮ末端に位置される。
【００２１】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、唯一のまたは希少な所定の標的ゲノム配列に特異的に結合し得る。前記ＤＮＡ結合ドメインは、任意の合成または既存の天然ＤＮＡ結合ドメインであってもよい。ＤＮＡ結合ドメインの例は、これに限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、および転写活性化物質様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む。具体的な実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質である。
【００２２】
前記ジンクフィンガータンパク質は、選択される任意の核酸配列を認識および結合するように操作され得る（例えば、Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：６３２−６３７；Ｋｌｕｇ，Ａ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：２１３−２３１；Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：６３２−６３７；Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７０２−７０８；Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：５８０９−５８１４；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，６０７，８８２号明細書；および米国特許第６，５３４，２６１号明細書；ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇ；ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／；Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５を参照されたい）。前記ジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を有してもよい。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、好適なリンカー配列を使用して共に連結されてもよい（例えば、リンカーは、１若しくはそれ以上のアミノ酸、具体的には約５若しくはそれ以上のアミノ酸長を有してもよい）。
【００２３】
前記ジンクフィンガータンパク質と同様に、前記ＴＡＬＥタンパク質は、協同して、所望の標的配列に結合する複数のＤＮＡ結合領域を含有する（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０３：１０５０３；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８；Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：１０７２０；Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５；Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：２５６）。ＴＡＬＥタンパク質は、既知の方法で所望の配列に結合するように操作され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号および国際公開第２０１０／０７９４３０号パンフレットを参照されたい）。
【００２４】
具体的な実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、目的遺伝子のプロモーター中の標的配列を特異的に認識して結合する。前記標的配列は、約１０〜約３０ヌクレオチド長、具体的には約１５〜約２１ヌクレオチド長であってもよい。具体的な実施形態では、前記プロモーターは、β−主要プロモーターまたは胎児（ガンマ）遺伝子プロモーター等のグロビンプロモーターである。マウスβ−主要グロビン遺伝子（Ｈｂｂ−ｂ１）の配列が遺伝子ＩＤ：１５１２９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８２２０．４）に提示され、ヒトβ−主要グロビン遺伝子（ＨＢＢ）は遺伝子ＩＤ：３０４３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５１８．４）に提示され、ヒト胎児ガンマグロビン遺伝子（ＨＢＧ１およびＨＢＧ２）が遺伝子ＩＤ：３０４７および３０４８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５５９．２およびＮＭ＿０００１８４．２）に提示される。標的化配列は、これらに限定されないが、図１Ｂに提示される配列または他の種における相当する配列を含む前記プロモーター領域内にあってもよい。具体的な実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインによって特異的結合される前記標的配列は、既知の転写結合部位ではなく、既知の転写結合部位への転写因子の結合を妨げない。
【００２５】
本発明の融合ポリペプチドのルーピング因子は、クロマチンループの形成における補助因子であってもよく、二量体または多量体を形成してもよい。具体的な実施形態では、前記ルーピング因子は、ＬＩＭドメイン結合タンパク質（ＬｄｂまたはＮＬＩまたはＣＬＩＭ；ヒトについてはＬｄｂ１タンパク質：遺伝子ＩＤ：８８６１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０６８７８（図１５Ｂ；配列ＩＤ番号２）、ＮＰ＿００３８８４．１（図１５Ａ；配列ＩＤ番号１））またはそれらのフラグメントである。前記Ｌｄｂは、任意の種由来であってもよい。具体的な実施形態では、前記Ｌｄｂタンパク質は、ヒトＬｄｂ１またはヒトＬｄｂ２、具体的にはＬｄｂ１である。具体的な実施形態では、前記ルーピング因子は、前記自己会合ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３８８４．１のアミノ酸１〜２００であり、これはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０６８７８のアミノ酸３７〜２３７に等しい）を有するＬｄｂ１のＮ末端フラグメントである（すなわち、その全長未満）。Ｌｄｂ１の前記Ｎ末端フラグメントは、Ｌｄｂ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３８８４．１）のアミノ酸１〜約１５０、１〜約１７５、１〜約２００、１〜約２２５、１〜約２５０、１〜約２７５、１〜約３００、１〜約３２５、または１〜約３５０を有してもよい。別の実施形態では、前記ルーピング因子は、前記自己会合ドメインを欠くＬｄｂ１のＣ末端フラグメント（すなわち、その全長未満）である。Ｌｄｂ１の前記Ｃ末端フラグメントは、Ｌｄｂ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３８８４．１）のアミノ酸１〜約１５０、１〜約１７５、１〜約２００、１〜約２２５、１〜約２５０、１〜約２７５、１〜約３００、１〜約３２５、または１〜約３５０を欠損してもよい。本発明の融合ポリペプチドにおける前記Ｌｄｂ１のアミノ酸配列は、上述の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、８５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を有し得る。
【００２６】
前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子もまた、本発明により包含される。前記ＤＮＡ結合ドメインおよびルーピング因子をコードする核酸配列は、好ましくは制御可能に（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）連結され、インフレームである。本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。前記核酸分子は、任意の簡便なベクター、具体的には発現ベクター中に維持されてもよい。異なるプロモーターを利用して、前記核酸配列が発現される細胞に応じて前記核酸配列の発現を駆動してもよい。また、形質転換された細胞の選択を可能とするため、抗生物質耐性マーカーがこれらのベクターに含まれる。本発明の核酸分子をコードする融合ポリペプチドは、一本鎖でもよく、二本鎖であってもよい、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのフラグメントを含む。
【００２７】
本発明の組成物および方法は、ルーピング因子およびＤＮＡ結合ドメインを有する第２融合ポリペプチドをさらに有してもよい。具体的な実施形態では、第２融合ポリペプチドのルーピング因子は、第１融合ポリペプチドのルーピング因子と同じである。第２融合ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、ＬＣＲ内の標的配列に特異的に結合し得る。前記標的配列は、約１０〜約３０ヌクレオチド長、具体的には約１５〜約２１ヌクレオチド長であってもよい。具体的な実施形態では、第２融合ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、前記ＬＣＲの高感受性領域２（ＨＳ２）に結合する。遺伝子ＩＤ：１５１２８は、Ｈｂｂ−ａｒヘモグロビン、活性化領域（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の配列を提示し、遺伝子ＩＤ：３８７２８１は前記ＬＣＲＢ遺伝子座調節領域、ベータ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の配列を提示する。タグ付けされた配列は、これらに限定されないが、図１Ｂに提示される前記ＨＳ２配列または他の種における相当する配列を含む前記ＬＣＲ領域内にあってもよい。第１および第２融合ポリペプチド（またはこれをコードする核酸）は、同時におよび／または順に投与されてもよい。具体的な実施形態では、第１および第２融合ポリペプチドは、同じベクター中の別々の核酸分子によってコードされる。代替的には、第１および第２融合ポリペプチドは、別々のベクター中の別々の核酸分子によってコードされる。第１および第２融合ポリペプチドをコードする単一の核酸分子、または第１および第２融合ポリペプチドをコードする別々の核酸分子、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を有する組成物は、本発明に包含される。
【００２８】
目的タンパク質の発現の増加が本出願を通して記載される一方、本発明の融合タンパク質もまた目的タンパク質の発現を抑制するために使用され得る。例えば、前記Ｋｉｔサイトカインの遺伝子座は、細胞の成熟の間その抑制により明確に設定される。したがって、前記Ｋｉｔサイトカイン遺伝子座に特異的なＤＮＡ結合ドメインを有する融合ポリペプチドは、ループ化されたクロマチン構成を再構築して発現を抑制することができる。例えば、前記ＤＮＡ結合ドメインの標的配列は、３つの特性評価された調節要素（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２９：２３２−４２）のうちの少なくとも１つにあってもよい。本発明の融合ポリペプチドもまた、遺伝子の誤った機能的調節要素に対してクロマチンループを強制し、それらの発現を調節するために使用され得る。また、前記融合ポリペプチドは、複数の調節配列が機能的にまたは物理的に互いに相互作用する（例えば、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、および組換え）ＤＮＡに関与する他のプロセスを調節するために使用され得る。
【００２９】
とりわけ、遺伝子座調節領域等の一部の複合体調節要素は、高い程度の組織および／または発生段階特異性を提供する。したがって、クロマチンルーピングの発生を、このような状況において、時間的に正確で組織特異的な遺伝子調節を達成するために使用することができ、それにより、所望のレベルおよび／または特異性を欠く従来の遺伝子治療に対してより優れた遺伝子調節を提供する。
【００３０】
本発明によれば、被験体において疾患または障害を抑制する（例えば、軽減するまたは遅延する）、治療する、および／または予防する組成物および方法が提供される。具体的な実施形態では、前記方法は、それを必要とする被検体に本発明の融合ポリペプチド（複数の場合がある）をコードする少なくとも１つの核酸分子を投与する工程を有する。前記疾患は、遺伝子調節機構が攪乱される（例えば、増加されるまたは減少される）任意の疾患であってもよい。前記融合ポリペプチドは、その後、発現を調節するため目的遺伝子のプロモーターを対象としてもよい。前記疾患または障害は、先天性障害であってもよい。具体的な実施形態では、前記疾患はベータサラセミア、鎌状赤血球貧血および他の溶血性貧血である。具体的な実施形態では、前記ＤＮＡ結合ドメインは、胎児（ガンマ）遺伝子または胚性β−グロビンプロモーター等のグロビンプロモーターに特異的に結合する。別の実施形態では、前記疾患はがんであり、本発明の融合ポリペプチドが、クロマチンループの形成によってがん遺伝子の発現を抑制する。
【００３１】
本発明の具体的な実施形態では、前記融合タンパク質をコードするベクターが前記被検体へと輸送される。具体的な実施形態では、前記核酸分子は、ウイルスベクターを介して被験体へと輸送される。ウイルスベクターは、これに限定されず、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター；マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含む。前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、任意のプロモーターの制御下にあってもよい。具体的な実施形態では、前記プロモーターは、細胞型特異的（例えば、造血幹細胞／造血前駆細胞）である。
【００３２】
少なくとも１つの融合ポリペプチドまたは少なくとも１つの前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を有する組成物が、本発明に包含される。上記に説明するように、かかる組成物は、治療的に有効な量で疾患または障害の治療ためにそれを必要とする患者に投与され得る。
【００３３】
本発明の薬剤および組成物は、任意の好適な経路、例えば、注射（例えば、局所（直接）または全身投与用）、経口、経肺、局所、経鼻または他の投与様式により投与され得る。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、局所、吸入、経皮、肺内、動脈内（ｉｎｔｒａａｒｅｔｅｒｉａｌ）、直腸内、筋肉内、および鼻腔内の投与を含む、任意の好適な手段により投与され得る。具体的な実施形態では、前記組成物は静脈内投与される。一般に、前記組成物の薬学的に許容可能な担体は、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体から成る群から選択される。前記組成物は、様々な緩衝剤内容物（例えば、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、ならびに洗浄剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）および充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含むことができる。また、前記組成物を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合体化合物の微粒子製剤、またはリポソームへと組み込むことができる。かかる組成物は、本発明の医薬組成物の成分の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼす可能性がある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい。本発明の医薬組成物を、例えば、液体形態で調製することができ、または乾燥粉末形態（例えば、後の再構成用に凍結乾燥される）に調製することができる。
【００３４】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、前の段落で例示される医薬製剤の所望の投与経路に適切であり得る任意のおよび全ての溶媒、分散媒質等を含む。薬学的に活性な物質に対するかかる媒質の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒質および薬剤が投与される前記分子と不適合性でない限り、医薬製剤におけるその使用が熟慮される。
【００３５】
好適な医薬製剤の選択は、選択される投与方法に依存する。例えば、本発明の分子は、静脈内注射によって投与され得る。この例では、医薬製剤は、血液と適合性の媒質中に分散された分子を有する。静脈内注射用の医薬製剤は、当該技術分野で既知である。十分な量の前記分子がそれらの標的細胞に到達して生物学的効果を与えることを確実にするための手段が講じられる。
【００３６】
薬学的担体との本質的な混合剤における有効成分として本発明の分子を含有する医薬組成物は、従来の薬学的調剤技術に従って調製されてもよい。前記担体は、投与に望ましい製剤の形態、例えば、静脈内、に応じて幅広い形態をとり得る。注射可能な懸濁剤が調製されてもよく、この場合、適切な液体担体である懸濁剤等が採用され得る。
【００３７】
本発明の医薬製剤は、投与しやすさおよび用量の均一性のため用量単位形態で製剤化され得る。本明細書で使用される用量単位形態は、治療を経る患者に適切な医薬製剤の物理的に個別の単位を指す。各用量は、選択される薬学的担体と関係して所望の効果を生じるように計算された有効成分の量を含有しなければならない。適切な用量単位を決定する手法は当業者によく知られている。用量単位は、患者の体重に比例して増加または減少し得る。具体的な病理学的状態の緩和のための適切な濃度は、当該技術分野で既知の用量濃度曲線の計算（ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）により決定され得る。本発明の分子の投与に関する適切な用量単位は、動物モデルにおける前記分子の毒性を評価することにより決定され得る。様々な濃度の医薬製剤が移植されたヒト腫瘍を有するマウスに投与され得、最小用量および最大用量は、治療の結果としての腫瘍サイズの著しい減少および副作用の結果に基づいて決定され得る。また、適切な用量単位は、他の標準的な治療法と組合せた治療有効性を査定することにより決定され得る。
【００３８】
本発明の分子を有する医薬製剤は、適切な間隔、例えば、病理学的症状が軽減されるかまたは緩和されるまで少なくとも１日に２回若しくはそれ以上で投与されてもよく、その後、前記用量は維持レベルまで減少されてもよい。具体的な場合の適切な間隔は、通常、患者の状態に依存するであろう。
【００３９】
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００４０】
本明細書で使用される「プロモーター」の用語は、転写開始部位の上流または５’に位置され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびトランス作動性転写因子の認識および結合に関与して転写を開始する、ポリヌクレオチド配列を指す。典型的には、プロモーターは、特定の遺伝子またはそれに制御可能に会合若しくは連結された遺伝子の転写および発現を調節する５’調節要素である。
【００４１】
「遺伝子座調節領域」は、連結された遺伝子の高レベルの発現を与える、長期ｃｉｓ作動性調節要素である。遺伝子座調節領域は、部分的にクロマチン構造を制御し、そのようにして遺伝子クラスターの転写を制御する、ＤＮＡのセグメントである。
【００４２】
「特異的に結合する」の用語は、生物学的分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識および結合しない、目的のポリペプチドまたは化合物の標的（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または化合物）への結合を指す。例えば、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ゲノム中の他のヌクレオチド配列を通常除外し、特定のヌクレオチド配列に特異的に結合し得る。
【００４３】
「親和性タグ」の文言は、目的のタンパク質の検出および／または精製に影響を与えるために使用することができるタグを指す場合がある。親和性タグ（精製タグおよびエピトープタグを含む）は、当該技術分野でよく知られており（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）、これに限定されるものではないが、ポリヒスチジンタグ（例えば、６ｘＨｉｓ）、ポリアルギニンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡタグ、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇ（商標）エピトープ（後のビオチン化のため）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、抗体エピトープ（例えば、抗体によって認識および結合されるアミノ酸の配列）、ｃ−ｍｙｃエピトープ、およびヘム結合ペプチドを含む。
【００４４】
本明細書で使用される「核局在配列」の用語は、付着したポリペプチドを細胞核へと局在化または輸送することを可能とするアミノ酸配列を指す。
【００４５】
「ベクター」は、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）がそれに付着される／挿入されて、前記配列または要素の複製および／または発現を生じさせる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルス等の核酸分子である。
【００４６】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合、直鎖または環状形態のいずれかのその相補配列の分子を指す。核酸分子の議論では、具体的な核酸分子の配列または構造が、５’から３’方向で配列を提示する通常の規定に従って、本明細書に記載され得る。本発明の核酸に関して、時に「単離された核酸」の用語が使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、その起源である生物の天然に生じるゲノムにおいてすぐに隣接する配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクター等のベクターに挿入された、または原核生物細胞若しくは真核生物細胞若しくは宿主生物のゲノムＤＮＡに統合されたＤＮＡ分子を有してもよい。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、生物学的手段若しくは合成手段により直接的に産生された分子、およびその産生の間に存在する他の成分から分離された分子をさらに表してもよい。
【００４７】
「薬学的に許容可能な」は、動物、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦の規制機関若しくは州政府による承認を指すか、または米国薬局方または他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを指す。
【００４８】
「担体」は、例えば、それと共に本発明の活性剤が投与される、希釈剤、アジュバント、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤（ａｕｘｉｌｌｉａｒｙ  ａｇｅｎｔ）またはビヒクルを指す。薬学的に許容可能な担体は、水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油等の無菌の液体であり得る。水または食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液は、とりわけ注射可能な溶液の担体として採用されることが好ましい。好適な薬学的担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒ．に記載される。
【００４９】
本明細書で使用される「予防」の用語は、被験体が疾患を生じる状態を発症する可能性において、疾患を生じる状態を発症するリスクにある被験体の予防的治療を指す。
【００５０】
本明細書で使用される「治療」の用語は、患者の状態の（例えば、１若しくはそれ以上の兆候における）改善、状態の進行の遅延等を含む、疾患に悩まされる患者に利益を与える任意の種類の治療を指す。
【００５１】
本明細書で使用される「宿主」、「被験体」および「患者」の用語は、ヒトを含む任意の動物を指す。
【００５２】
本発明の様々な実施形態を解説するため以下の実施例が提示される。実施例は、本発明を限定することを何ら意図するものではない。
【実施例１】
【００５３】
クロマチンループを確立し、維持する分子機構は完全には理解されていない。これらの問題への基礎的な洞察は、強力な遠位エンハンサー、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、および標的β−グロビンプロモーターの間の長期の染色体相互作用が記載される、第１遺伝子クラスターの間にある哺乳類β−グロビン遺伝子座の研究から生じた（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：６２３−６２６；Ｔｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１０：１４５３−１４６５）。機構研究は、造血制限因子ＧＡＴＡ１およびその補助因子ＦＯＧ１（Ｖａｋｏｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１７：４５３−４６２）、ＫＬＦ１（ＥＫＬＦとしても知られる）（Ｄｒｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１８：２４８５−２４９０）、およびより広く発現されるタンパク質であるＬｄｂ１（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２８：８１０−８２２）を含む、ＬＣＲ−β−グロビン相互作用を確立する遺伝子特異的転写因子を定義した。これらの因子のいずれかの機能的な破壊は、ＬＣＲ−β−グロビン相互作用の減少およびβ−グロビン転写の減弱と関連した。しかしながら、これら全てのタンパク質の間の物理的な相互作用が報告され（Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３３６８−３３７６）、それらが直線経路でまたは並行経路で機能するのかどうかを区別することを困難にしている。さらに、ルーピングの喪失が転写の喪失の根底にあるのか、またはその逆であるのか、これらの研究においていまだ解決されていない問題である。
【００５４】
ＧＡＴＡ１は、正常な赤血球分化およびβ−グロビン発現に必須のジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質である（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８：８７７−８８５；Ｐｅｖｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２５７−２６０；Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：４４６−４５１）。ＧＡＴＡエレメントは、β−グロビンプロモーターおよびＬＣＲに存在し、ＧＡＴＡ１およびその補助因子はこれらの部位の並列に関わることを示唆する。ＧＡＴＡ１機能の機構の理解は、前記ＧＡＴＡ１  ｎｕｌｌ前赤芽球細胞株Ｇ１Ｅの使用により多いに助けられてきた。エストラジオールにより誘導可能な種類のＧＡＴＡ１（ＧＡＴＡ１−ＥＲ）のこれらの細胞（Ｇ１Ｅ−ＥＲ４）への導入は、ＬＣＲ−β−グロビンルーピングと組み合せてβ−グロビン遺伝子転写のエストラジオール依存性活性化をもたらす（Ｖａｋｏｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１７：４５３−４６２）。転写補助因子Ｌｄｂ１（ＮＬＩとも呼ばれる）は、ＤＮＡを直接的に結合しないが、ＴＡＬ１、ＬＭＯ２、Ｅ２ＡおよびＧＡＴＡ１を含む多成分性複合体を介してＥ−ｂｏｘエレメントまたはＧＡＴＡエレメントへと動員される。ＧＡＴＡ１およびＬｄｂ１は、高度に重複するゲノム占有パターンを呈するが、とりわけ、Ｌｄｂ１の会合は、β−グロビン遺伝子座等のＧＡＴＡ１が転写活性化因子として機能する部位を強く好む（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９：２１７２−２１８４；Ｋａｓｓｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０：１０６４−１０８３；Ｓｏｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２４：２７７−２８９；Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２１：１６５９−１６７１）。いくつかの観察が、Ｌｄｂ１がＧＡＴＡ１のルーピング機能の重大なエフェクターであるかもしれないことを示唆する。第一に、Ｌｄｂ１のノックダウンは、ＬＣＲ−β−グロビンルーピングを損なう（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２８：８１０−８２２）。第二に、Ｌｄｂ１のショウジョウバエホモログであるＣｈｉｐは、長期エンハンサー作用に必要とされる（Ｍｏｒｃｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１１：２７２９−２７４０）。第三に、ＧＡＴＡ１のように、Ｌｄｂ１は、β−グロビンプロモーターとＬＣＲを同時に占有し、したがって、この２つを物理的に連結することにより機能する可能性がある（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２８：８１０−８２２；Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。第四に、Ｌｄｂ１は、ループ形成におけるその役割が根底に存在し得る、ホモ二量体、およびさらに高次のオリゴマーを形成することができる（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：１３３−１４４；Ｊｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：５６８８−５６９８）。
【００５５】
プラスミドコンストラクトを使用する原核生物細胞、また同じく真核生物細胞における以前の研究は、調節要素の間の強制ルーピングにより遺伝子発現に影響を与えることに成功した（Ｍａｒｅｎｄｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，２３：１２６−１３３；Ａｍｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２４：３５８−３６７；Ｍａｈｍｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２１：１７７５−１７８１；Ｎｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０６：２０２２２−２０２２７；Ｐｅｔｒａｓｃｈｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３：３７４３−３７５０）。しかしながら、変更されたクロマチン配置および相対的に短いゲノム距離を有するプラスミドの使用は、本来のゲノム遺伝子座における長期クロマチン相互作用に関する推測を制限する可能性がある。ここに、その本来の環境における内因性遺伝子座でのクロマチンルーピングを調節する戦略が開発された。これは、強制クロマチンループが転写を活性化し得るかどうかを特定すること、クロマチンルーピングにおける転写調節因子の階層の調査、ならびに結果として続く分子および機能的な結果を規定することを可能とした。本研究に対して、転写因子ＧＡＴＡ１を欠損し、そのためＬＣＲ−β−グロビンループを確立してβ−グロビンを転写できないことから、Ｇ１Ｅ赤血球細胞を使用した。前記β−グロビンプロモーターへのＬｄｂ１動員は完全にＧＡＴＡ１依存性であるのに対し、前記Ｔａｌ１／Ｌｄｂ１複合体の実質的な量は、ＧＡＴＡ１の不在下でなおもＬＣＲに関連している（図１；Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。したがって、ＧＡＴＡ１による前記プロモーターへのＬｄｂ１の動員は、転写開始に必要なループを形成するための前記ＬＣＲの前記プロモーターとの並列における重大な律速段階を表す可能性がある（図２Ａ）。この仮説を、ジンクフィンガー（ＺＦ）標的化アプローチを使用してＧ１Ｅ細胞において前記β−グロビンプロモーターにＬｄｂ１を繋留することにより試験した（図２Ａ）。とりわけ、プロモーターが結合したＺＦ−Ｌｄｂ１は、ＧＡＴＡ１回復により達成されるのと同程度までＧ１Ｅ細胞においてクロマチンループを誘導することができた。ＺＦ−Ｌｄｂ１コンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）の動員およびＰｏｌ  ＩＩセリン５リン酸化（Ｓｅｒ５ｐｈ）を完全に回復し、β−グロビン転写を部分的に救済した。ＬＣＲの欠失に関してヘテロ接合体の赤血球細胞における遺伝学的実験は、前記ＺＦ−Ｌｄｂ１タンパク質が長期ルーピング機構を介して機能したことを確認した。これらの結果は、調節領域の強制並列が転写を活性化し、クロマチンルーピングの間ＧＡＴＡ１の重大な律速エフェクターとしてＬｄｂ１を確立することを明らかにする。
【００５６】
実験手法
人工ジンクフィンガーの設計
それぞれ６つのＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメインを含有し、前記β−主要プロモーターまたはマウスＬＣＲのＤＮａｓｅ１高感受性領域２のいずれかのうちにある１８〜１９ｂｐの部位を標的化するＺＦｓを設計し、以前に記載される２フィンガー単位（Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：６３２−６３７）より構築した。
【００５７】
細胞培養
Ｇ１ＥおよびＧ１Ｅ−ＥＲ４細胞を記載されるように培養した（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：１６４２−１６５１）。指定される場合、Ｇ１Ｅ−ＥＲ４細胞を１００ｎＭノエストラジオール（Ｅ２）で２１時間（３Ｃアッセイ）または２４時間（ＲＴ−ｑＰＣＲおよびＣｈＩＰアッセイ）で処理し、ＧＡＴＡ１−ＥＲを活性化した（図中、Ｇ１Ｅ＋ＧＡＴＡ１で示される）。
【００５８】
初代赤芽球の単離
野生型胎児肝臓赤血球細胞をＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得た。ΔＬＣＲ／ΔＬＣＲマウス（１２９系）が記載された（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：３８７−３９３）。ΔＬＣＲ／ｗｔマウスを作製するため、ΔＬＣＲ／ΔＬＣＲ雄性動物を野生型雌性マウス（ＢＬ６系）と繁殖させた。Ｅ１３．５胎児肝臓細胞を回収し、ＰＥ複合抗ＣＤ７１抗体およびＡＰＣ複合抗Ｔｅｒ１１９抗体で染色し、ＦＡＣＳによりソーティングした。Ｒ１（Ｔｅｒ１１９−、ＣＤ７１−／ｌｏｗ）集団を単離し、所望のレトロウイルスで感染させ、１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％グルタミン、１０ｎｇ／ｍＬ  ｍＩＬ３、２０ｎｇ／ｍＬ  ｍ／ｈ  ＩＬ６、５０ｎｇ／ｍＬ  ｍＳＣＦ、およびＰｅｐｒｏｔｅｃｈによる１０ｎｇ／ｍＬ  ｍ／ｈ  ＦＬＴ３Ｌで補填されたＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＤＭ含有増殖培地で２４時間培養した。指定される場合、細胞を、１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％グルタミン、５０ｕｇ／ｍＬアスコルビン酸、２００ｕｇ／ｍＬホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、および２Ｕ／ｍＬエリスロポエチンＡＬＦＡ（Ｅｐｏｇｅｎ）で補填されたＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＤＭで培養することにより分化誘導させた。
【００５９】
３Ｃアッセイ
３Ｃアッセイを、以下の修正を伴って、記載されるように行った（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２９：２３２−２４２；Ｖａｋｏｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１７：４５３−４６２）。１×１０７細胞を室温にて１０分間１．５％ホルムアルデヒドで架橋し、続いてグリシンクエンチング、細胞溶解、Ｂｇｌ  ＩＩ消化およびＴ４ライゲーションを行った。３Ｃライゲーション産物を、定量的ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより三連で定量した。プローブおよびプライマーをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計し、段階希釈およびゲル電気泳動により試験して特異的で線形の増幅を確認した（図３Ｂ、図３Ｃ）。消化効率を、ＢｇｌＩＩ消化部位を含有するまたはそれを欠くゲノム領域を増幅するプライマー対を用いてＳｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲによりモニターした（図３Ｄ）。１２９起源の全マウスβ−グロビン遺伝子座を含有するＢＡＣクローン（ＳｏｕｒｃｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン番号ＢＭＱ４３３Ｉ１０）をＢｇｌＩＩで消化し、再度連結してＢｇｌＩＩフラグメントのランダムライゲーション産物を生じた（図３Ａ）。前記ＤＮＡを段階希釈し、全ての３Ｃ産物が正規化される標準曲線を作成するため使用した。β−グロビン遺伝子座での３Ｃシグナルを、４つの介在領域に由来するもの、または代替的には対照遺伝子座ＥＲＣＣ３のそれに対してさらに正規化し、いずれも同様の結果を生じた。
【００６０】
クロマチン免疫沈降
ＣｈＩＰを記載されるように行った（Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。以下の抗体を使用した：ｐａｎ−Ｐｏｌ  ＩＩ（ｓｃ−８９９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＤＫ９（ｓｃ−４８４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｓｅｒ５ｐｈ（ＭＳ−１３４Ｒ，Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（０７−４７３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＨＡモノクローナル抗体はクローン１２ＣＡ５であった。ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲプライマー配列は補遺に列挙される。
【００６１】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
１０５〜１０６細胞からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮａｓｅを含まないグリコーゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加してＲＮＡ沈殿を補助した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してランダムヘキサマーにより逆転写反応を行った。ｃＤＮＡ試料をＳｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲにより定量した。アニーリング温度６２℃（従来のｑＰＣＲについてはデフォルト設定で６０℃）でアレル特異的ｑＰＣＲを行った。β−アクチンまたはＧＡＰＤＨに対してデータを正規化し、いずれも同様の結果を生じた。
【００６２】
レトロウイルス感染
Ｇ１Ｅ細胞のレトロウイルス感染を記載されるように行った（Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。単離された初代胎児肝臓細胞について、スピン感染条件を、室温にて１時間の２，０００ｒｐｍに修正し、感染後すぐに新たな培地に細胞を交換した。
【００６３】
プラスミド
個別のジンクフィンガータンパク質コード配列を、Ｎ末端に３つのＨＡタグおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するＭｉｇＲ１レトロウイルスベクターへとクローニングした。全長Ｌｄｂ１またはＬｄｂ１のアミノ酸１〜２００を含有するＳＡドメインをインフレームで前記ＺＦのＣ末端にクローニングした。Ｐ−ΔＳＡをＬｄｂ１の最初の２５６アミノ酸を欠失することにより生じた。
【００６４】
ＣｈＩＰ  ｑＰＣＲプライマー
ＨＳ３
フォワード５’−ＣＴＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列ＩＤ番号３）
リバース５’−ＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＴ−３’（配列ＩＤ番号４）
ＨＳ２
フォワード５’−ＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴ−３’（配列ＩＤ番号５）
リバース５’−ＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴ−３’（配列ＩＤ番号６）
ＨＳ１
フォワード５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＴＡＡ−３’（配列ＩＤ番号７）
リバース５’−ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＴＣＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号８）
εｙプロモーター
フォワード５’−ＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号９）
リバース５’−ＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＴＣＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号１０）
βｈ１プロモーター
フォワード５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ−３’（配列ＩＤ番号１１）
リバース５’−ＡＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡ−３’（配列ＩＤ番号１２）
βｍａｊプロモーター
フォワード５’−ＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号１３）
リバース５’−ＧＴＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＣＣＴＴＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号１４）
βｍａｊエクソン２
フォワード５’−ＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号１５）
リバース５’−ＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号１６）
βｍａｊイントロン２
フォワード５’−ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号１７）
リバース５’−ＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧ  −３’（配列ＩＤ番号１８）
βｍａｊ  ３ＵＴＲ
フォワード５’−ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡ  −３’（配列ＩＤ番号１９）
リバース５’−ＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡ  −３’（配列ＩＤ番号２０）
βｍａｊ−１ｋｂ
フォワード５’−ＧＴＡＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号２１）
リバース５’−ＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号２２）
βｍｉｎプロモーター
フォワード５’−ＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣ−３’（配列ＩＤ番号２３）
リバース５’−ＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＡＧＡＡＧ−３’（配列ＩＤ番号２４）
ＩＶＲ１６
フォワード５’−ＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣ−３’（配列ＩＤ番号２５）
リバース５’−ＴＡＧＡＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＡＴＴＧＧ−３’（配列ＩＤ番号２６）
ｍＣＤ４
フォワード５’−ＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号２７）
リバース５’−ＧＧＴＡＡＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＴＴＴ−３’（配列ＩＤ番号２８）
【００６５】
転写物ｑＰＣＲプライマー
βｍａｊ  ５  ＵＴＲ
フォワード５’−ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号２９）
リバース５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＧＴＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号３０）
βｍａｊエクソン２
フォワード５’−ＡＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号１５）
リバース５’−ＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣ−３’（配列ＩＤ番号１６）
βｍａｊ−Ｄ
フォワード５’−ＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴ  −３’（配列ＩＤ番号３１）
リバース５’−ＣＣＡＴＣＧＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＣ  −３’（配列ＩＤ番号３２）
βｍａｊ−Ｓ
フォワード５’−ＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧ−３’（配列ＩＤ番号３３）
リバース５’−ＧＣＣＡＴＣＧＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＴ  −３’（配列ＩＤ番号３４）
βｍａｊイントロン２
フォワード５’−ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＡＴＣ−３’（配列ＩＤ番号１７）
リバース５’−ＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧ  −３’（配列ＩＤ番号１８）
βｍａｊエクソン２／３
フォワード５’−ＡＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧ  −３’（配列ＩＤ番号３５）
リバース５’−ＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＴＡ  −３’（配列ＩＤ番号３６）
βｍａｊ  ３ＵＴＲ
フォワード５’−ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡ  −３’（配列ＩＤ番号１９）
リバース５’−ＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡ  −３’（配列ＩＤ番号２０）
βｈ１
フォワード５’−ＡＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＣＴＧ  −３’（配列ＩＤ番号３７）
リバース５’−ＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＣＣＡ  −３’（配列ＩＤ番号３８）
Ｈｂａ
フォワード５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧ  −３’（配列ＩＤ番号３９）
リバース５’−ＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴ  −３’（配列ＩＤ番号４０）
Ｓｌｃ４ａ１
フォワード５’−ＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＡ−３’（配列ＩＤ番号４１）
リバース５’−ＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＡ−３’（配列ＩＤ番号４２）
Ａｌａｓ２
フォワード５’−ＣＣＡＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＧＣ  −３’（配列ＩＤ番号４３）
リバース５’−ＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣ−３’（配列ＩＤ番号４４）
Ｋｌｆ１
フォワード５’−ＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＧＡ−３’（配列ＩＤ番号４５）
リバース５’−ＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡ−３’（配列ＩＤ番号４６）
Ｇａｔａ１
フォワード５’−ＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号４７）
リバース５’−ＧＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡＧＴＧＣＡＴ−３’（配列ＩＤ番号４８）
Ｇａｔａ２
フォワード５’−ＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号４９）
リバース５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣＡＣＴ−３’（配列ＩＤ番号５０）
Ｋｉｔ
フォワード５’−ＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣ−３’（配列ＩＤ番号５１）
リバース５’−ＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号５２）
Ｇａｐｄｈ
フォワード５’−ＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴ−３’（配列ＩＤ番号５３）
リバース５’−ＧＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴ−３’（配列ＩＤ番号５４）
β−アクチン
フォワード５’−ＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣ  −３’（配列ＩＤ番号５５）
リバース５’−ＴＡＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＡＴ  −３’（配列ＩＤ番号５６）
【００６６】
３Ｃプローブおよびプライマー
β−グロビン遺伝子座（上から下に配列ＩＤ番号５７〜６９）
ＬＣＲ−ＨＳ２プローブ  ５’−ＦＡＭ／ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  Ａ／３’−ＴＡＭＳｐ
アンカー（ｒＨＳ２）    ５’−ＣＡＧＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＡ−３’
Ｉ（ｒＨＳ１）          ５’−ＧＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＴＴＡＣＣＴＡＧＴＡＣＡＧ  −３’
ＩＩ（ｒβｈ１εｙ）    ５’−ＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧ−３’
ＩＩＩ（ｒβｈ１）      ５’−ＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＧ−３’
ＩＶ（ｒβｍａｊ）      ５’−ＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴ−３’
Ｖ（ｒβｍａｊ−ｆｒａｇ２）  ５’−ＣＡＧＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＡ−３’
ＶＩ（ｒＩＶＲ３）      ５’−ＡＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＴＴＧＡＴＴＣＣ−３’
ＶＩＩ（ｒβｍｉｎ）    ５’−ＧＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＡＡＣＡＴＴ−３’
ＶＩＩＩ（ｒＩＶＲ２）  ５’−ＣＣＡＡＧＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡ−３’
Ｘ（ｒＩＶＲ１）        ５’−ＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＣＣＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＡＡ−３’
ＸＩ（ｒ３ＨＳ１）      ５’−ＡＣＴＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡ−３’
ＸＩＩ（ｒ３ＯＲ）      ５’−ＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＡＣＧＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＡＴＧ−３’
【００６７】
ＥＲＣＣ３遺伝子座（上から下に配列ＩＤ番号７０〜７２）
ＥＲＣＣ３プローブ
５’−ＦＡＭ／ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣ／３’−ＴＡＭＳｐ
ｒＥＲＣＣ３＿３              ５’−ＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＴＡＴＧ−３’
ｒＥＲＣＣ３＿５              ５’−ＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＧＧＡＴ−３’
【００６８】
３Ｃ消化効率に関するプライマー
ＨＳ２  ＢｇｌＩＩ  ｃｕｔ  ＃１
フォワード５’−ＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣ  −３’（配列ＩＤ番号７３）
リバース５’−ＣＡＧＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＡ  −３’（配列ＩＤ番号７４）
【００６９】
ＨＳ２  ＢｇｌＩＩ  ｕｎｃｕｔ  ＃１
フォワード５’−ＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴ−３’（配列ＩＤ番号７５）
リバース５’−ＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴ−３’（配列ＩＤ番号７６）
【００７０】
ＨＳ２  ＢｇｌＩＩ  ｃｕｔ  ＃２
フォワード５’−ＧＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧ  −３’（配列ＩＤ番号７７）
リバース５’−ＴＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＴＡＧＡＴＣＡ  −３’（配列ＩＤ番号７８）
【００７１】
ＨＳ２  ＢｇｌＩＩ  ｕｎｃｕｔ  ＃２
フォワード５’−ＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴ  −３’（配列ＩＤ番号７９）
リバース５’−ＴＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴ  −３’（配列ＩＤ番号８０）
【００７２】
結果
Ｌｄｂ１の内因性β−グロビン遺伝子座に対するジンクフィンガー媒介標的化
可能性のあるルーピング因子を内因性β−グロビン遺伝子座へと繋留する戦略として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて予め選択されたゲノム部位の標的化に使用されて成功していることから（Ｋｌｕｇ，Ａ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：２１３−２３１）、人工ジンクフィンガータンパク質（ＺＦ）を選択した。β−主要プロモーター（Ｐ−ＺＦ）およびＬＣＲのＤＮａｓｅ１高感受性領域２（ＨＳ２）（Ｌ−ＺＦ）を、これらが物理的にごく近くにあることが以前に見出されたことから（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：６２３−６２６．；Ｔｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１０：１４５３−１４６５）、標的とするようにＺＦｓを合成した（図２Ｂ）。６つのジンクフィンガーを、ゲノム配列の１８塩基対を標的とするようにタンデムに連結した（Ｋｌｕｇ，Ａ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：２１３−２３１）。前記ＺＦｓへの接近を容易にするが、既知の転写因子結合部位との干渉を回避するため、標的配列をＤＮａｓｅＩ高感受性領域内で選択した（図１Ｂ）。前記ＺＦｓのそれらの指定されるＤＮＡ配列への結合を、以前に記載されるＥＬＩＳＡ系アッセイ（Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：６３２−６３７）を使用して特性評価した。ＺＦｓをＨＡタグおよび核局在配列（ＮＬＳ）に融合し、Ｇ１Ｅ細胞へと導入した後、それらのクロマチン結合プロファイルをクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により調査した（図１Ｃ、図１Ｄ）。好適な結合特性を有するＺＦｓをＬｄｂ１に融合し、ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＩＲＥＳＹＦＰカセットを含有するレトロウイルスベクター中に導入した。Ｇ１Ｅ細胞の感染により、ＧＦＰ／ＹＦＰ陽性細胞集団を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により精製し、抗ＨＡ  ＣｈＩＰに供した。Ｐ−ＺＦは、Ｇ１Ｅ細胞において前記β−グロビンプロモーターに強力に結合したことが特定された（図１Ｃ）。Ｌｄｂ１のＰ−ＺＦとの融合（Ｐ−Ｌｄｂ１）は、β−グロビンプロモーターへの強力な結合を維持したが、前記ＬＣＲの複数のＨＳｓにおいて低レベルで検出可能でもあった（図２Ｂ）。前記Ｌｄｂ１部分の不在下で、このＺＦは、低効率でこれらのＬＣＲ部位に結合し（図１Ｃ）、Ｐ−Ｌｄｂ１と前記ＬＣＲとの関連が、大部分において前記ＬＣＲでの内因性Ｌｄｂ１複合体との相互作用に起因することを示した（Ｔｒｉｐｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：２１９１−２２０１）。さらに、Ｌ−Ｌｄｂ１（Ｌｄｂ１に融合したＬ−ＺＦ）は、ＨＳ２には結合するが、β−グロビンプロモーターには結合しないことが見出され（図２Ｃ）、ＧＡＴＡ１の不在下における内因性Ｌｄｂ１複合体の欠損と一致した（図１Ａ）。最後に、Ｌ−Ｌｄｂ１およびＰ−Ｌｄｂ１を共発現する細胞は、前記ＬＣＲおよびβ−主要プロモーターにおいて同等のＣｈＩＰシグナルを生じた（図２Ｄ）。赤芽球および線維芽細胞においていくつかのＺＦタンパク質を比較するＣｈＩＰの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるネイキッドＤＮＡ配列へのＺＦｓの結合特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの結合効率を完全には予測しないことを明らかにしたことは、注目すべきことである。それにもかかわらず、Ｌｄｂ１を前記β−グロビン遺伝子座へと標的化することができるＺＦ対が特定された。
【００７３】
Ｌｄｂ１のβ−グロビン遺伝子座への繋留は、ＧＡＴＡ１不在下における転写を活性化する
ＬＣＲプロモータールーピングは、赤血球の発生を通して高レベルのグロビン遺伝子発現に必要とされる。したがって、プロモーターにおよび／またはＬＣＲに繋留されたＬｄｂ１が、Ｇ１Ｅ細胞においてβ−グロビン転写を誘導するかどうかを調査した。Ｇ１Ｅ細胞はＧＡＴＡ１を欠くことから、前記β−グロビンプロモーターにはＬｄｂ１がなく、これに対して、前記ＬＣＲは、Ｅ−ｂｏｘエレメントに結合したＴＡＬ１複合体によって媒介される相当量のＬｄｂ１を維持した（図１Ａ、図２Ａ）。意外なことに、Ｐ−Ｌｄｂ１の発現は、ＧＡＴＡ１の回復により達成されたもののおよそ２０％に達する（Ｇ１Ｅ−ＥＲ４細胞）（図４Ｂ）、１０００倍を超えるβ−グロビン転写を活性化した（図４Ａ）。Ｌ−Ｌｄｂ１単独またはＬｄｂ１部分を含まないＺＦｓは、ほとんど活性を呈しなかった（図４Ａ）。Ｐ−Ｌｄｂ１およびＬ−Ｌｄｂ１の共発現は、Ｐ−Ｌｄｂ１それ自身と比較してβ−グロビン発現をさらに活性化することができなかった（図４Ａ）。高レベルのβ−グロビン発現は前記ＬＣＲを必要とすることから（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５：３８７−３９３）、これらの結果は、プロモーターに結合したＬｄｂ１が、おそらくは内因性Ｌｄｂ１を介して、前記ＬＣＲとの長期の接触を促進して転写を活性化するのに十分であることを示す。β−グロビン発現の計測を、前記β−グロビン転写物を対象とする複数のプライマー対を用いて確認した（図５Ａ）。さらに、ＺＦ−Ｌｄｂ１発現の効果は遺伝子特異的であり、いくつかの追加のＧＡＴＡ１活性化（Ｋｌｆ１、Ｅｒａｆ、βＨ１）遺伝子および抑制（Ｇａｔａ２、Ｋｉｔ）遺伝子の発現が変化しなかったことから、単純に一般的な分化誘導の結果ではない（図４Ｃ）。β−グロビン転写のＺＦ−Ｌｄｂ１融合タンパク質による強力な活性化は、β−グロビン転写に必須であるＧＡＴＡ１の不在下で生じたことから特に注目すべきである。
【００７４】
ＺＦ−Ｌｄｂ１による実質的なβ−グロビン転写活性化は、ＬＣＲが欠失される場合にβ−グロビン転写が正常の約１％まで減少することから、ＬＣＲルーピング機構を強く暗示する（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５：３８７−３９３）。さらに、β−グロビンプロモーターにおけるＬｄｂ１占有は、ＬＣＲの不在下で正常であり（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：２３５６−６４）、プロモーター結合したＬｄｂ１単独では前記ＬＣＲを伴わないβ−グロビン転写に不十分であることを示す。ＺＦ−Ｌｄｂ１融合タンパク質によるβ−グロビン活性化は重要であるが、それらの効果はＧＡＴＡ１のものと一致せず、クロマチンルーピングに加えてＧＡＴＡ１が発揮する機能と一致した。
【００７５】
Ｌｄｂ１自己会合ドメインの繋留はβ−グロビン活性化に十分である
Ｌｄｂ１は、より高次の分子複合体の集合を媒介するＮ末端自己会合（ＳＡ）ドメインを含有し、そのルーピング機能を説明する可能性があり（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３：７５８５−７５９９；Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：１３３−１４４）、ＬＭＯ２およびその会合したＧＡＴＡ１／ＴＡＬ１／Ｅ２Ａマルチタンパク質複合体への結合を与えるＣ末端ＬＩＭ相互作用ドメイン（ＬＩＤ）を含有する。前記ＳＡドメインが転写活性化に十分であるかどうかを調査するため、Ｌ−ＺＦおよびＰ−ＺＦと融合してＧ１Ｅ細胞へと導入した。Ｐ−ＳＡおよびＬ−ＳＡは、Ｌ−ＳＡがＨＳ２を占有した全長Ｌｄｂ１融合コンストラクトと非常によく似たゲノム結合プロファイルを示したのに対し、Ｐ−ＳＡはβ−グロビンプロモーターに結合し、さらにＬＣＲに結合した（図５Ｂ）。意外なことに、Ｐ−ＳＡ単独の発現またはＬ−ＳＡおよびＰ−ＳＡの共発現は、全長Ｌｄｂ１融合タンパク質がしたのと実質的に同じレベルまでβ−グロビン遺伝子転写を活性化した（図４Ｄ、図５Ｃ）。さらに、ＺＦ−ＳＡの効果は遺伝子特異的であり、赤血球遺伝子発現を全体的に変更しなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、Ｌｄｂ１自己会合ドメインはβ−グロビン転写を誘導するのに十分であることを示し、ＬＣＲとβ−グロビンプロモーターとの間の強制並列が転写活性化の根底にあるという考えをさらに支持する。
【００７６】
Ｌｄｂ１の残りのタンパク質が、より高次のタンパク質複合体を核形成することによってクロマチンルーピングに参加し得る可能性も検討した。この目的を達成するため、ＳＡドメインを欠損する（Ｐ−ΔＳＡ）が核局在配列およびＬＩＤドメインを無傷で残すＺＦ−Ｌｄｂ１融合タンパク質を作製した。Ｐ−ΔＳＡは、Ｐ−ＳＡよりも著しく低い程度であっても、β−グロビン転写を誘導することができた（図５Ｄ）。最も適した条件および発現レベルのもとであっても、活性化はＰ−ＳＡで観察されたものの５０％を超えることはなかった（図５Ｄ）。これは、ＳＡドメインがルーピングに必要とされるより高次の複合体の核形成において最も効率的であることを実証する。それにもかかわらず、これらの結果は、Ｌｄｂ１が全く別のドメインを介してそのパートナータンパク質を結合してクロマチンループを生じる可能性とも一致する。
【００７７】
Ｌｄｂ１自己会合ドメインの繋留がＬＣＲプロモータールーピングを誘導する
ＺＦ−Ｌｄｂ１またはＺＦ−ＳＡによるβ−グロビン転写の強力な誘導は、ＬＣＲの不在下ではβ−グロビン転写が非常に低いことから、ＬＣＲの関与、ひいてはクロマチンルーピングを暗示する（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５：３８７−３９３）。したがって、ＺＦ−ＳＡコンストラクトの発現がＬＣＲをβ−グロビン遺伝子と並列させてクロマチンループを形成するかどうかを３Ｃアッセイにより調査した（図３）。アンカー領域としてＨＳ２を使用することにより、親Ｇ１Ｅ細胞において、一般的に距離の増加と共に３Ｃシグナルは減弱したことが見出された（図６Ａ；Ｖａｋｏｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１７：４５３−４６２）。具体的には、ＨＳ２とβグロビンとの間には相互作用は存在しない。ＧＡＴＡ１の回復により、β−主要グロビン遺伝子を有する２つの隣接するフラグメントを含む相対的に近くのＨＳ２が顕著に増加した（図６Ａ）。ＧＡＴＡ１依存性ＨＳ２−β−グロビンクロマチンループの指標である、介在セグメントまたは下流セグメントとのＨＳ２の相互作用は低いままであった（Ｖａｋｏｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１７：４５３−４６２）。その後、ＺＦ−ＳＡタンパク質を発現するＧ１Ｅ細胞におけるβ−グロビン遺伝子座のクロマチン立体構造を測定した。驚くべきことに、Ｐ−ＳＡ単独の発現は強力なＨＳ２−β−グロビンクロマチンループを生じたのが、Ｌ−ＳＡは生じず、ＧＡＴＡ１によって誘導されるクロマチン立体構造を再現した（図６Ｂ、図６Ｃ）。そのため、ＳＡドメインのβ−グロビンプロモーターへの動員は、おそらくは内因性のＬＣＲに結合したＬｄｂ１との相互作用を介するＬＣＲとの並列に十分である（図１Ａ、図２Ａ、図５Ｂ）。Ｐ−ＳＡおよびＬ−ＳＡの共発現が、Ｐ−ＳＡ単独と同様の効率でＨＳ２のβ−グロビン遺伝子との並列を引き起こした（図６Ｄ）。Ｌ−ＳＡに比べてＨＳ２におけるＰ−ＳＡの占有が低レベルである場合、Ｐ−ＳＡはＬ−ＳＡおよびＰ−ＳＡの組合せ、またはＧＡＴＡ１と同様に活性であったことが見出されたのは意外であった。ＤＮＡと間接的に会合したタンパク質は効率的に架橋されていないことから、ＬＣＲにおけるＰ−ＳＡに関するＣｈＩＰシグナルは、Ｐ−ＳＡの量を低く表す場合がある。さらに、内因性Ｌｄｂ１を介するＬＣＲにおける複数の領域とのＰ−ＳＡの会合は、おそらく、ループ形成を促進するためその能力に追加する。それにもかかわらず、強制ＬＣＲ−β−グロビンクロマチンルーピングは、β−グロビン転写の活性化とよく相関した。
【００７８】
総合すると、これらの結果は、Ｌｄｂ１のＳＡドメインのβ−グロビンプロモーターへの繋留は、ＧＡＴＡ１により生じるものと同一でない場合には、類似するＬＣＲ−β−グロビンクロマチンループを産生するのに十分であることを示す。これは、Ｌｄｂ１がクロマチンルーピングの間のＧＡＴＡ１の本質的な律速エフェクターであることを示す。より一般的には、ＬＣＲのプロモーターとの並列は、強力な遺伝子活性化を引き起こす。
【００７９】
ＺＦ−ＳＡ発現はＬＣＲ依存性機能をもたらす
β−グロビンＬＣＲ機能のうちの２つの主な機能は、β−グロビンプロモーターへのＰｏｌ  ＩＩの動員およびそのＣ末端ドメインのセリン５におけるＰｏｌ  ＩＩリン酸化の刺激であり、初期転写伸長と関連する修飾である（Ｓａｗａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１７：１００９−１０１８）。したがって、ＺＦ−ＳＡタンパク質がＬＣＲ−β−グロビン接触を促進することによってβ−グロビン転写を活性化する場合、それらは、Ｐｏｌ  ＩＩ動員およびセリン５リン酸化（Ｓｅｒ５ｐｈ）を刺激すると予想される。ＺＦ−ＳＡ融合タンパク質がＬＣＲ依存性機能を回復した程度を調査するため、Ｓｅｒ５ｐｈ  Ｐｏｌ  ＩＩに対する抗体、またはＰｏｌ  ＩＩのリン酸化状態にかかわらずＰｏｌ  ＩＩに反応する抗体を用いたＣｈＩＰを行った。とりわけ、Ｐ−ＳＡの発現は、ＧＡＴＡ１発現により達成されたものと同様の効率でＰｏｌ  ＩＩのβ−グロビンプロモーターへの動員を引き起こした（図７Ａ、図７Ｂ）。対照的に、遺伝子体におけるＰｏｌ  ＩＩレベルは、ＧＡＴＡ１発現細胞において見出されたもののおよそ２５％〜３０％に達し、β−グロビンｍＲＮＡ産生のレベルとよく対応した（図４Ｂ）。これは、ＧＡＴＡ１発現細胞と比較した場合、伸長複合体Ｐ−ＴＥＦｂのβ−グロビンプロモーターおよび遺伝子体への動員の減少と一致する（抗ＣＤＫ９  ＣｈＩＰにより計測される、図８Ａ）。Ｐ−ＳＡ発現細胞におけるβ−グロビン遺伝子で見出されたＳｅｒ５ｐｈ  Ｐｏｌ  ＩＩの量は、ＧＡＴＡ１発現細胞で観察されたものと差がなかった（図７Ｃ）。転写開始のさらなる計測として、ヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）のレベルを測定し、Ｐ−ＳＡがＧＡＴＡ１により産生されるのと同じレベルまでこのマークを回復したことを見出した（図８Ｂ）。同様の結果がＰ−ＳＡおよびＬＳＡを共発現する細胞において得られた。これらの結果は、ＬＣＲの２つの機能、すなわち、β−グロビンプロモーターへのＰｏｌ  ＩＩ動員およびＰｏｌ  ＩＩセリン５リン酸化が、Ｐ−ＳＡの発現によって完全に回復されたことを実証し、ＬＣＲのβ−グロビンプロモーターとの並列がＰ−ＳＡの活性の根底にあるという考えに対してさらなる支持を与える。転写伸長の完全な回復の失敗は、ＧＡＴＡ１およびＰ−ＴＥＦｂ複合体の動員および活性化を含む可能性のある、追加のルーピング非依存性機能を発揮するＧＡＴＡ１の補助因子の欠損により説明され得る（Ｂｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９：３５０５−３５１９；Ｅｌａｇｉｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ  １１２：４８８４−４８９４）。
【００８０】
初代赤芽球におけるＺＦ−ＳＡ融合タンパク質によるβ−グロビン転写の早発性誘導
ＺＦ融合タンパク質が初代赤血球前駆細胞において機能し、β−グロビン発現を活性化するかどうかを調査した。Ｅ１３．５野生型胎児肝臓に由来する初代赤血球前駆細胞の成熟段階を、フローサイトメトリーを用いてモニターし、細胞表面マーカーＴｅｒ１１９およびＣＤ７１の発現を計測した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：３９３８−３９４６）。細胞は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の成熟段階を進み（図９Ａ）、最終的に豊富なβ−グロビンを産生する（図１０Ａ）。ＺＦ−ＳＡタンパク質の発現について、Ｔｅｒ１１９−、ＣＤ７１−／ｌｏｗ細胞（図９Ａ中、Ｒ１集団）を精製し、初期前駆細胞とした。この段階で、β−グロビン遺伝子はまだ高活性ではないが、細胞はＧＡＴＡ１およびＫＬＦ１を含む必須の調節因子を低レベルで発現する（図１０Ｂ）。ＺＦ−ＳＡ融合タンパク質を発現するレトロウイルスによる感染に続き、細胞を前駆状態に保持するためサイトカインＩＬ−３、ＩＬ６およびＳＣＦを含有する限定培地で細胞を培養した。意外なことに、Ｐ−ＳＡのみまたはＰ−ＳＡ／Ｌ−ＳＡの発現は、早期にβ−グロビン転写を活性化するが、Ｌ−ＳＡ単独では活性化しなかった（図９Ｂ）。対照に対する活性化倍率は、Ｇ１Ｅ系とは対照的に初代赤芽球は転写因子が豊富にあり、完全な成熟の前であってもより高レベルのβ−グロビンを産生することから、Ｇ１Ｅ系で観察されるものほど顕著ではなかったことに留意されたい。それにもかかわらず、これらの結果は、同じＺＦ融合タンパク質の組合せがβ−グロビン発現を活性化できるという点で、基本的にはＧ１Ｅ細胞の結果と酷似していた。前記効果は、他の調査された赤血球細胞がそれらの活性を変更されなかったことから、β−グロビン遺伝子座に特異的であった（図９Ｂ）。さらに、ＺＦ−ＳＡ発現は、ＣＤ７１およびＴｅｒ１１９表面マーカーを使用するフローサイトメトリーによって測定される赤血球の成熟を非特異的に促進しなかった（図１０Ｃ）。全体として、これらの結果は、ＺＦ−ＳＡ融合コンストラクトは、初代赤血球細胞においてβ−グロビンの転写を活性化し得ることを示す。
【００８１】
β−グロビン転写のＺＦ−ＳＡ融合タンパク質誘導はＬＣＲ依存性である
ＳＡドメインのβ−グロビン遺伝子座に対する標的化は、ＨＳ２のβ−グロビン遺伝子との並列、Ｐｏｌ  ＩＩ動員、およびＰｏｌ  ＩＩセリン５リン酸化を回復し、転写活性化はＬＣＲ−β−グロビンルーピングによることを強く示唆した。これらの観察による予測は、ＬＣＲを欠損するアレルは、ＺＦ−ＳＡ融合タンパク質に反応しないであろうということである（図１１Ａ）。代替的に、単純にＳＡ誘導性転写因子により生じたβ−グロビン転写がβ−グロビンプロモーターに集合する場合、ＺＦ−ＳＡはＬＣＲとは独立して転写を活性化しなければならない。この差異は、Ｐ−ＳＡ単独の発現により発揮されるβ−グロビン転写に対する陽性効果の観点から特に重要である。これらの可能性を決定的に区別するため、ＺＦ−ＳＡの機能を、ＬＣＲの欠失に関してヘテロ接合体（ΔＬＣＲ／＋）であるマウス由来のＥ１３．５胎児肝臓赤芽球において調査した（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５：３８７−３９３）。ΔＬＣＲアレル上のβ−主要遺伝子はＤハプロタイプであるのに対し、野生型アレル上のβ−主要遺伝子はＳハプロタイプである。これらのアレルの転写物の間の一塩基多型を区別するアレル特異的ｑＰＣＲアッセイを開発し（図１２）、理想的な内部的に制御された実験設定を提供した。次に、ΔＬＣＲ／＋Ｒ１細胞を、ＺＦ−ＳＡタンパク質を発現するウイルスベクターにより形質導入し、エリスロポエチンに６時間暴露して赤血球の成熟を促進した。アレル特異的ＲＴ−ｑＰＣＲは、野生型アレル（βｍａｊ−Ｓ）がＰ−ＳＡと共にＬ−ＳＡを発現するか、またはＰ−ＳＡを単独で発現する細胞において活性化されたことを実証した（図１１Ｂ、左枠）。Ｌ−ＳＡは、陰性対照としてはたらくＳＡを欠損するＺＦｓと同様のわずかな活性を有したか、または活性を全く有しなかった。極めて対照的に、ΔＬＣＲアレル上のβ−主要遺伝子（βｍａｊ−Ｄ）は低レベルで発現され、Ｐ−ＳＡ／Ｌ−ＳＡタンパク質またはＰ−ＳＡタンパク質に対して非常にわずかな反応しか示さなかった（図１１Ｂ、中枠）。ＺＦ融合タンパク質発現の効果は、エリスロポエチンの存在下または不在下と本質的に同じであり、他の調査された赤血球遺伝子のいずれもがそれらの活性を変更されなかったことから、β−グロビン遺伝子座に特異的であった（図１３）。Ｄ−アレル特異的プライマーによりもたらされた残存シグナルは、Ｄ−アレルからの転写に起因するものではなかったが、Ｓ−アレルｃＤＮＡとの交差ハイブリダイゼーションの結果であった。これは、シグナルのおよそ１０％がＳ−アレルｃＤＮＡとの交差反応性に由来するＤ−アレル特異的プライマーによりもたらされたことを示す、テンプレート混合実験により実証された（図１２）。実際、ホモ接合体（ΔＬＣＲ／ΔＬＣＲ）Ｒ１細胞をＰＳＡで形質導入すると、β−グロビン活性化はバックグラウンドに近く、ΔＬＣＲ／ｗｔ細胞においてＤ特異的プライマーにより得られた低シグナルは、実際には交差ハイブリダイゼーションによるものであったことを確立した（図１２Ｂ、右枠）。総合すると、前記結果は、ＺＦ−ＳＡタンパク質の活性が完全にＬＣＲの存在に依存性であり、したがって、長期クロマチンルーピングに依存性であることを明確に説明する。
【実施例２】
【００８２】
本発明の方法がβ−グロビン遺伝子座の発生リプログラミングに適していることを、ここにデータで示す。具体的には、成体マウス赤血球細胞における胚性グロビン（ｂＨ１）遺伝子に対して「ルーピング」因子を標的化することにより、胚性グロビン遺伝子発現の実質的な活性化がもたらされた。実際、図１６は、ＬＣＲ−βｈ１クロマチンループの強制が成体細胞において発現抑制されたβｈ１遺伝子を再活性化したことを示す。達成されたレベルは、総グロビン合成の約２４％である。この発現レベルは治療上適切であり、したがって、かかる方法はβ−サラセミアおよび鎌状細胞疾患の治療に有用であろうことを示す。
【００８３】
また、図１７は、ルーピング因子（Ｌｄｂ１）に融合された人工ジンクフィンガーがヒト胎児（ガンマ）グロビンプロモーターに対して標的化された実験の結果を示す。ＺＦ−Ｌｄｂ１融合タンパク質（ＧＦＰ＋）を発現する初代ヒト赤血球細胞は、総グロビン合成の最高約６５％に達するガンマグロビン産生の上昇を呈する。
【００８４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が上に記載され具体的に例示されるものの、本発明はかかる実施形態に限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲および趣旨から離れることなく、それらに様々な修飾を行ってもよい。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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