(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦＲ１自己抗体の検出に用いる組成物であって、それは次の３つの抗原ポリペプチドを含む：
Ｈ−ＤＥＧＶＹＨＣＫＡＴＮＱＫＧＳＶＥＳＳＡＹＬＴＶＱＧＴＳＤＫＳＮＬＥ−ＯＨ；
Ｈ−ＤＬＫＬＳＣＴＶＮＫＦＬＹＲＤＶＴＷＩＬＬＲＴＶＮＮＲＴＭＨＹＳＩ−ＯＨ；
Ｈ−ＥＳＧＬＳＤＶＳＲＰＳＦＣＨＳＳＣＧＨＶＳＥＧＫＲＲＦＴＹＤＨＡＥＬ−ＯＨ。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、その特徴は、組成物における各抗原ポリペプチドの比率は１：１：１であることにある。
【請求項３】
個体におけるＶＥＧＦＲ１自己抗体を検出する方法であって、それは以下のことを含む：請求項１に記載の３つの抗原ポリペプチドを等比率で混合し、次いでマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）で活性化される９６ウエルプレートをコーティングし、４℃で一晩インビトロ培養し、プレートを洗浄し、次いで複数回に分けてサンプルを添加して分析を行う。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、それにおいて、複数回に分けてサンプルを添加して分析するプロセスは以下のことを含む：検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、また２つの陰性対照ウェルと２つの陽性対照ウェルを設置し、分析液を用いて血漿を希釈し、またペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトＩｇＧを希釈し、プレートを洗浄し、ウェルごとに１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びペルオキシダーゼからなる混合液を添加し、室温避光２０〜３０分とし、ウェルごとに反応停止液の１０％硫酸溶液（１０％Ｈ２ＳＯ４）を５０μｌ添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値（ＯＤ値）を検出し、検出波長は４５０ｎｍであり、参照波長は６３０ｎｍである。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ１自己抗体の検出における請求項１又は２に記載の組成物の使用。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の組成物で生産される検出キットのセットであって、その特徴は、３つの抗原ポリペプチドを医療用非金属包装材で真空個別包装した後に、１例ずつ取って検出キットのセットに組み合わせて使用に備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の技術分野に属し、ＶＥＧＦＲ１抗原ポリペプチドに関する。該抗原ポリペプチドを用いてヒト血漿中のＶＥＧＦＲ１抗体レベルの検出に用いる特異試薬を調製することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究では、健康者集団の血液中の腫瘍関連抗体の発見と測定は標的療法を指導する価値があることが分かる。例えば、臨床にて広く応用されているトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）及びベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）は上皮成長因子受容体２型（ＨＥＲ２）と血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を標的とするものであり、臨床では末期腫瘍の治療における重要な手段となっている。しかし、副作用が大きすぎるため、この２つのモノクローナル抗体は第三選択薬としてしか用いることができない。したがって、腫瘍に対する局所治療後の移転と再発の防止に用いることができ、且つ副作用が小さい新規な手段の開発は現在、早急に解決しなければならない問題である。免疫治療の分野においてこの難題の解決方法を探す際に、新規な腫瘍の免疫治療方法を得るには、新規性のある、標的技術に関する実用的な解決手段を見つけなければならないという技術的問題に直面している。
【０００３】
ＶＥＧＦＲ１は血管内皮細胞増殖因子受容体１型とも呼ばれ、がん細胞の発現における特異的タンパク質の一つとして知られている。研究を重ねたところ、肝臓がん、肺がん、腎臓がん、腸がん及び乳がんなど多くのヒト固形腫瘍では、ＶＥＧＦＲ１を大量発現できることが判明した。ＶＥＧＦＲ１エピトープのポリペプチドは主に腫瘍細胞の表面にあり、直接、対応する抗体による腫瘍の殺傷における標的とすることができるため、学界では、臨床におけるＶＥＧＦＲ１関連抗体の応用は、最も早く実現化できる、副作用が小さい新規な抗がん治療手段となる可能性が極めて高いとしている。現在、バイオ技術分野における方法は、組換タンパク質を抗原とするＶＥＧＦＲ１関連抗体の検出とスクリーニングのみであり、それにおいてキャリアの構築、トランスフェクション、発現、スクリーニング、精製など複雑なプロセスを経なければならない。しかし、タンパク質立体構造は複雑であり、線形エピトープを露出させにくく、そのため組換タンパク質で検出される抗体は特異性に劣り、腫瘍細胞膜の表面における抗原標的と結合できないものは非常に多くあり、したがって、低レベルの定性的検出しか行うことができない。これに基づき腫瘍を予防治療するための実用的手段を得ることができない。また、ＥＬＩＳＡ法における高感度によりタンパク質精製技術の安定性が強く求められており、そのため検出要件に適合する組換タンパク質はコストが高くなる。国内外では、ＶＥＧＦＲ１関連抗体の検出とスクリーニングの効果的な手段に関する報告はまだなかった。
【０００４】
本発明は線形ＶＥＧＦＲ１エピトープのポリペプチドを的確に設計し、上記技術的難題を効果的に解決し、特異性に優れる検出試薬を調製することができる。設定したプロセス基準に基づいて健康献血者の血漿における免疫標識物−ＶＥＧＦＲ１抗体の濃度指標値を検出することにより、正確で、操作しやすく、コストが適切なＶＥＧＦＲ１抗体の検出、選別、定性的・定量的応用に対する一括解決手段を得ることができる。したがって、本発明の技術は健康な人体における天然ＶＥＧＦＲ１抗体を利用して新規で、副作用が小さい腫瘍の免疫的治療方法を開発するために、確固たる基礎を作ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はＶＥＧＦＲ１自己抗体の検出に用いる線形抗原ポリペプチドを提供し、それによりＶＥＧＦＲ自己抗体の検出に用いる特異試薬を調製することを目的とし、また、対応する好ましい操作プロセスを設計する。本発明は３つのＶＥＧＦＲ１線形抗原ポリペプチドを設計し、それらのアミノ酸配列は表１に示されるとおりである。
【０００６】
【表１】
0006423092.tif 000002
【０００７】
周知のように、抗原と抗体の結合はエピトープと抗体結合部位との間にのみ発生し、両者は立体構造と立体配置において完全な相補的関係にあるほど、抗原と抗体の結合が安定的になり、特異性と結合の効率が高くなる。ターゲットの抗体及びその結合部位の構造は最も重要な要素であるため、エピトープのみによってタンパク質抗原全体と抗体との結合状態及び親和性を決めることができる。
【０００８】
そのため、本発明はＶＥＧＦＲ１タンパク質の生物学的特性に基づき、複数のエピトープについて免疫情報学的予測とシミュレーションを行い、抗原性に関連する各パラメータを分析することで、立体構造と立体配置においてターゲットの抗体と完全な相補的関係にある上記３つの線形ポリペプチド抗原のアミノ酸配列を設計する。
【０００９】
大量の研究資料により、ＶＥＦＧＲ１は腫瘍関連抗原であり、多くの固形腫瘍において発現されることを証明できる。したがって、ＶＥＦＧＲ１抗体は天然の抗腫瘍抗体とすることができる。人体にて免疫的モニタリングの機能を果たして腫瘍の形成と進行を防止する。本発明の技術はこの天然の抗腫瘍抗体に対する定量的検出という空白を埋め、血漿・バイオ製品会社による新製品の開発及び臨床における腫瘍の予防・治療のための新しい手段の開発のために、重要な道具を提供する。例えば、血漿・バイオ製品会社は本発明の技術を利用して血漿をスクリーニングし、それによりＶＥＦＧＲ１抗体を多く含んでいるガンマグロブリンを調製し、臨床における腫瘍の予防と治療に用いることができる；臨床では早期腫瘍患者に対する局所治療の後に（手術又は放射線治療の後など）、本発明の技術でのスクリーニングにより得られるＶＥＦＧＲ１抗体を多く含んでいる血漿を直接注入ことで、免疫的モニタリング機能を高め、腫瘍の再発と移転を予防することもできる。これは本発明の技術の応用上の価値である。
【００１０】
表１に示される３つの抗原ポリペプチドはＥＬＩＳＡ法による血漿ＶＥＦＧＲ１自己抗体の検出において高濃度の製品を使用しなければならず、純度９５％以上の製品が好ましい。次に、本分野にて通用する「サンドイッチ法比較検証モード」を用いて技術的検証を行って本発明での実現可能な技術的効果を説明する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願は表１に示される３つの抗原ポリペプチドで血漿免疫標識物−ＶＥＦＧＲ１自己抗体を検出する方法を提供し、それは次のステップを含む：
１、操作する前に、各抗原ポリペプチドを６５％〜７０％の酢酸で５ｍｇ／ｍｌの貯蔵液に溶解し、次いで等体積で混合して−２０℃（誤差は２℃以内）の冷蔵庫に入れて保存する；
２、操作する際に、まず表１に示される３つの抗原ポリペプチドの等比混合液を被覆液で１０〜５０マイクログラム／ｍｌに希釈し、該被覆液は塩化ナトリウム０．１５ＭとＥＤＴＡ１０Ｍを含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、ｐＨは７．０〜７．４である；
３、次いでマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）で活性化される９６ウエルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）をコーティングし、４℃で一晩インビトロ培養した後に、洗浄液でプレートを３回洗浄し、前記洗浄液は０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、ｐＨは７．０〜７．４である；
４、次いで複数回に分けてサンプルを添加し、次のとおり分析を行う：
ａ、検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、他に２つの陰性対照ウェル（ＮＣ、参照物は血漿ＶＥＦＧＲ１抗体を含まない陰性対照液であり、それによりＶＥＦＧＲ１自己抗体を含まない陰性環境における表１に記載の本発明の３つの抗原ポリペプチドの指標値を得ることができ、目的は、本発明の組成物はＶＥＦＧＲ１自己抗体を含まない場合に、陽性結果を示さないことを証明することである）及び２つの陽性対照ウェル（ＰＣ、参照物はＶＥＦＧＲ１抗体標準品を含んだ陽性対照液であり、それによりＶＥＦＧＲ１抗体標準品の基準含有量レベルの場合の、表１に記載の本発明の３つの抗原ポリペプチドの指標値を得ることができ、目的は本発明の組成物はＶＥＦＧＲ１自己抗体を含んだ環境において陽性結果を示せることを証明し、さらに基準値として検出される血漿サンプルの指標値の比較に用いることである）を設置する；
ｂ、分析液を用いて検出対象の血漿サンプルを１：２００で希釈し、前記分析液は抗原コーティング液と同じであり、即ち塩化ナトリウム０．１５ＭとＥＤＴＡ１０ｍＭを含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、ｐＨは７．０〜７．４であり、ウェルごとに１００μｌ添加し、２５℃で１−２時間インビトロ培養し、次いでプレートを３回洗浄する；
ｃ、前記分析液を用いて上記ｂステップ（塩化ナトリウム０．１５ＭとＥＤＴＡ１０ｍＭを含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍ、ｐＨは７．０〜７．４）に従って操作した後に、ペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトＩｇＧ（血漿中の検出対象物質は特異性抗体であるか否かを検出するために使用する）を希釈し、抗体の機能保証範囲は１：１００００〜１：５００００であり、ウェルごとに１００μｌ添加し、２５℃で１−２時間インビトロ培養する；
ｄ、前記洗浄液（０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．１％のＴＷＥＥＮ−２０を含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍ、ｐＨは７．０〜７．４）を用いてプレートを３回洗浄した後に、ウェルごとに１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びペルオキシダーゼからなる混合液を添加し、室温避光２０〜３０分とする；
ｅ、ウェルごとに反応停止液の１０％硫酸溶液（１０％Ｈ2ＳＯ4 ）を５０μｌ添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値（ＯＤ値）を検出し、検出波長は４５０ｎｍであり、参照波長は６３０ｎｍである。検出プロセスは反応停止液添加後の１０分以内に終了させなければならない。これに基づき個体の血漿ＶＥＧＦＲ１自己抗体レベルを定量的に分析することができる。
５、母集団からの無作為抽出を行う際に、各個体の検出データについて分析して、サンプル陽性率（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｒａｔｉｏ、ＰＳＲ）で血漿中のＶＥＧＦＲ１自己抗体の相対的レベルを確定することができる。ＰＳＲの算出方法は次のとおりである：ＰＳＲ＝［ＶＥＧＦＲ１  ＯＤ値−ＮＣ  ＯＤ値］／［ＰＣ  ＯＤ値−ＮＣ  ＯＤ値］。次いで正規化四分法（Ｑ−Ｑ）を用いてグラフを作成する。
【００１２】
表１に記載の３つ抗原ポリペプチドは実際に応用する際に、便利な検出キットのセットに生産することができる。非金属材料で真空密封包装することが可能であり、４℃の環境において６か月以上保存することができる。そのため、本出願は表１に記載の３つの抗原ポリペプチドを含んだ検出キットをさらに提供する。要するに、３つの抗原ポリペプチドからなる混合液でコーティングする、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）で活性化される９６ウエルプレートを４５℃のオーブンにて乾燥させた後、非金属の包装材で真空密封包装し、各試薬を１例ずつ取って便利な検出キットのセットに組み合わせる。好ましくは、３つの抗原ポリペプチドはいずれも純度９５％以上の製品である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度の四分位数の分布図である。図中において、横軸はＰＳＲ値で示される血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度であり、縦軸は血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度の四分位数の分布範囲であり、零点に対応するＰＳＲ値は中位数である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
具体的な実施例
１．サンプルの収集：健常成人１２１例（男性６５例、女性５６例）の血漿サンプルを収集する。前記血漿サンプルの提供者はいずれも臨床健診にていかなる腫瘍もかからないと確定した個体である。操作する前にすべての血漿サンプルをともに−８０℃の条件下で保存し、確認したところ、保存期間は２年を超えておらず、繰り返し凍結融解された血漿サンプルがなかった（凍結融解回数は３回以下）ことが判明した。
【００１５】
２．サンプルの検出：４℃の環境下で血漿サンプルを解凍し、本実験にて使用する表１に記載の３つの抗原ポリペプチドはイギリスのＳＥＶＥＲＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ，Ｌｉｍｉｔｅｄにより合成され、純度は９５％である。具体的には次のステップを行う：
（１）操作する前に、各抗原ポリペプチドを６７％の酢酸で５．７ｍｇ／ｍｌの貯蔵液に溶解し、次いで等体積で混合して−２０℃の冷蔵庫に入れて保存する；
（２）操作する際に、まず３つの抗原ポリペプチドの混合液を被覆液で２８．５マイクログラム／ｍｌに希釈し、該被覆液は塩化ナトリウム０．１５ＭとＥＤＴＡ１０Ｍを含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、測定したところ、ｐＨは７．２である；
（３）次いでマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）で活性化される９６ウエルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）をコーティングし、４℃で一晩１６．５時間インビトロ培養した後に、洗浄液でプレートを３回洗浄し、前記洗浄液は０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、測定したところ、ｐＨは７．３である；
（４）次いで複数回に分けてサンプルを添加し、次のとおり分析を行う：
ａ、検出される血漿サンプルをダブルウェル設置し、他に２つの陰性対照ウェル（ＮＣ、参照物はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の提供するＶＥＦＧＲ１抗体を含まないヒト血漿陰性対照液）及び２つの陽性対照ウェル（ＰＣ、参照物は同じく、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の提供するヒト血漿ＶＥＦＧＲ１抗体標準品の陽性対照液）を設置する；
ｂ、分析液を用いて血漿を１：２００で希釈し、前記分析液は抗原コーティング液と同じであり、塩化ナトリウム０．１５ＭとＥＤＴＡ１０ｍＭを含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍであり、測定したところ、ｐＨは７．２である。ウェルごとに１００μｌ添加し、２５℃で１．５時間インビトロ培養する；
ｃ、前記洗浄液（０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍ、測定したところ、ｐＨは７．２）を用いてプレートを３回洗浄した後に、分析液を用いてペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社提供）を希釈し、抗体の機能保証範囲は１：２８５０００であり、ウェルごとに１００μｌ添加し、２５℃で１．５時間インビトロ培養する；
ｄ、前記洗浄液（０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．１％のＴＷＥＥＮ−２０を含んだリン酸塩緩衝液０．１Ｍ、測定したところ、ｐＨは７．２程度）を用いてプレートを３回洗浄した後に、ウェルごとに１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びペルオキシダーゼからなる混合液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社提供）を添加し、室温避光２５分とする；
ｅ、ウェルごとに反応停止液の１０％硫酸溶液（１０％Ｈ2ＳＯ4 ）を５０μｌ添加し、次いでマイクロプレートリーダーを用いて光学濃度値（ＯＤ値）を検出し、検出波長は４５０ｎｍであり、参照波長は６３０ｎｍである。反応停止液添加後の１０分以内に検出を終了させる。
【００１６】
３．結果の分析：次に実験結果に基づき、実験対象の集団にについてＶＥＧＦＲ１自己抗体の分布をさらに比較分析する。前記検出にて得られるデータに基づいて分析を行う際、サンプル陽性率（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｒａｔｉｏ、ＰＳＲ）で血漿中のＶＥＧＦＲ１自己抗体レベルを確定する。ＰＳＲの算出式は次のとおりである：ＰＳＲ＝［ＶＥＧＦＲ１  ＯＤ値−ＮＣ  ＯＤ値］／［ＰＣ  ＯＤ値−ＮＣ  ＯＤ値］。さらに正規化四分法（Ｑ−Ｑ）を用いて下図を作成する。図中において、横軸はＰＳＲ値で示される血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度であり、縦軸は血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度の四分位数の分布範囲であり、零点に対応するＰＳＲ値は中位数である。
【００１７】
図１に示されるように、血漿ＶＥＧＦＲ１抗体濃度の中位数はＰＳＲ＝１．５３、変動係数Ｓ＝１．６５、尖度係数Ｋ＝４．６３であり、統計学的に顕著な有意である（ｗ＝０．８９、ｐ＜０．０００１）。正規分布近似曲線における右向きの反曲点の最大値を閾値（ｃｕｔ−ｏｆｆ＝３．８）とし、即ち健常成人１２１例の血漿サンプルのうち、ＶＥＧＦＲ１を多く含んでいるのは８例であり、本実施例では該閾値以上と検出される人数の割合は６．６％である。本実施例から、無作為抽出する健常成人集団の血漿ＶＥＧＦＲ１抗体の含有量は歪んだ分布を示し、そのうち、８例の血漿サンプルは臨床的応用価値が大きな、天然ＶＥＧＦＲ１自己抗体を多く含んだ貴重な血液源である。
【００１８】
本実施例において、並行陰性対比試験により本発明にて結果の誤報告がなかったことを証明でき、上図の横軸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の提供するヒト血漿ＶＥＧＦＲ１抗体標準品の陽性対照液を参照物とする個体ごとの血漿サンプルＰＳＲの算出値を示し、またこれに基づいてマークして上図を得る。分かりやすさのために、ＶＥＧＦＲ１自己抗体濃度（ＰＳＲ値）を４つの区間に分布させることもでき、下表においては、本実施例における各抗体濃度区間に入っている人数の割合を示している。
【００１９】
【表２】
0006423092.tif 000003
【００２０】
上記具体的な実施例において、国際的な大手生化学試薬会社Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの提供するヒト血漿ＶＥＦＧＲ１抗体陰性対照液と陽性標準品対照液を使用し、サンドイッチ法比較試験の結果により、本発明にて設計する３つ線形抗原ポリペプチドは血漿中のＶＥＦＧＲ１自己抗体と特異的結合することができ、即ち３つの線形抗原ポリペプチドのアミノ酸配列は立体構造と立体配置においてＶＥＦＧＲ１抗体タンパク質と有効な相補的関係にあり、それにより異なる個体の血漿ＶＥＦＧＲ１自己抗体レベルを定量的に測定することができる。それにより、実用的な血漿ＶＥＦＧＲ１自己抗体の検出手段を得ることができる。また、本発明にて３つの線形抗原ポリペプチドを設計する際に使用する合成手段はシンプルでかつコストが適切であるため、臨床における天然ＶＥＦＧＲ１自己抗体大量含有の血漿による腫瘍治療の応用を実現化するために理論的・実践的基礎を作る。
【図１】
0006423092.tif 000004
【配列表】
0006423092000001.app