(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法であって：（ａ）ウイルスベクター組成物と接触していない真核細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（ｂ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞における少なくとも１種の該バイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）に比べ（ｂ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な上方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を含む、方法。
【請求項２】
高感染多重度（ＭＯＩ）での有意な上方制御が、（ａ）と比較し２倍の上方制御である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）ウイルスベクター組成物と接触していない真核細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（ｅ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞における少なくとも１種の該バイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｆ）工程（ｅ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な下方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を更に含む、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
最適感染多重度（ＭＯＩ）での有意な下方制御が、（ｄ）と比較し１．５倍の下方制御である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｇ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｈ）工程（ｇ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）と比べ（ｇ）において、バイオマーカー（複数可）の有意な示差的発現が検出されるべきではない工程を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｊ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｋ）工程（ｊ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御が、検出されるべきである工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御が、高感染多重度（ＭＯＩ）での（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの下方制御よりも少なくとも１．５倍低い、請求項３又は４を引用する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予めウイルスベクター組成物及び対照ウイルスベクター組成物の力価決定の工程を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が集密に到達する前に、バイオマーカー発現レベルの測定が行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
真核細胞はレンチウイルスベクター組成物により形質導入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１又は複数の試薬及び対照ウイルスベクター組成物を備える、ウイルスベクター組成物の品質の評価に使用するためのキット。
【請求項１２】
ＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１又は複数の試薬を更に備える、請求項１１に記載のウイルスベクター組成物の品質の評価に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ウイルスベクターが介在する遺伝子治療及び組換え遺伝子発現の分野に関する。より特定すると、本発明は、遺伝子産物の特定のパネル(「バイオマーカー」)及びそれらの示差的発現パターン(「発現署名」)を利用する方法及び組成物に関し、ここで発現パターンは、ウイルスベクター組成物がいずれか所定の標的細胞、特にいずれか所定の真核細胞に及ぼす影響と相関している。本発明は、ウイルスベクターにより形質導入された細胞において示差的に発現され、且つウイルスベクター組成物の品質、すなわち純度及び／又は濃度を推定する際に有用である、バイオマーカーの特定のセットの同定を基にしている。この遺伝子パネルはまた、改善された治療効率を伴う、特定のアジュバント様式を設計する際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスベースのベクターは、遺伝物質を細胞へ送達するために通常使用される道具である。そのようなベクターは、当初、分子遺伝学実験のため及び遺伝子治療又はワクチンなどの治療上の使用のために、裸ＤＮＡをトランスフェクションする代替として開発された。ウイルスベクターは、以下の２つの大きなカテゴリーに分けられる：それら自身をレシピエントゲノムへ挿入する組込みベクター、及び通常染色体外遺伝子エレメントを形成する非組込みベクター。γ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）及びレンチウイルスベクター（ＬＶ）などの組込みベクターは、安定して受け継がれる。アデノウイルスベクター（ＡＤＶ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの非組込みベクターは、急速に分裂する細胞から、速やかに喪失される。
【０００３】
特に、レトロウイルスベクターは、およそ１５０ｎｍの流体力学的直径を有する、複雑な巨大分子構造を持つ、エンベロープ型ＲＮＡウイルスを含む、レトロウイルス科に属するウイルスから誘導される(Salmeenら、1975)。これらのウイルス粒子のサイズが大きいために、これらは、低い拡散率（１０〜８ｃｍ2／秒）を有し；それらの密度は、ショ糖勾配超遠心分離により決定すると、約１．１５〜１．１６ｇ／ｃｍ3である(Coffinら、1997)。これらは、タンパク質６０〜７０％、脂質３０〜４０％（産生細胞の細胞膜由来）、糖質２〜４％及びＲＮＡ１％で構成される(Andreadisら、1999)。レトロウイルス粒子は、脂質二重層膜により取り囲まれたタンパク質キャプシド内に含まれる、１本鎖プラスセンスＲＮＡの２個の同一コピーと、インテグラーゼ及び逆転写酵素からなる。この脂質二重層は、糖タンパク質突起により、スパイクされている。レトロウイルスベクターの等電点は非常に低いｐＨ値に生じるので、これらは広いｐＨ範囲において負帯電された粒子である。エンベロープタンパク質及び脂質二重層は恐らく、ウイルス表面での負帯電に大きく寄与しているであろう(Rimaiら、1975)。
【０００４】
ウイルスベースのベクターの使用は、創薬におけるインビトロ適用のための、インビボ及びエクスビボ臨床アッセイのための、遺伝子治療及び動物モデル開発のための、極めて重要な送達方法となり始めている。ＨＩＶ由来のベクターなどの、レンチウイルスベクターは、現在、静止状態の細胞又は増殖細胞の両方の、不死化細胞又は初代細胞を形質導入するそれらの能力のため、並びに生じるゲノム内の導入遺伝子の安定した組込みのために、インビトロ及びインビボの両方における遺伝子導入の好ましい道具である。これらの利点はそれらを、治療的状況に加え、機能ゲノム学の両方における貴重な道具としてのみではなく、ヒト使用のための関心対象の分子の作製についても貴重なものとしている。遺伝子治療におけるそのようなベクターの使用のためのそれらのベクターの恩恵は、副腎白質ジストロフィーの治療(N. Cartier、S. Hacein-Bey-Abinaら、2009)、又はヒトβ−サラセミアの治療(Marina Cavazzana-Calvoら、2010)において得られた最新の成功例により確認されている。
【０００５】
再生医療における最近の研究もまた、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の作製及び分化のために、ウイルスベースのベクターを使用する(Sommerら、2009)。粗ベクター組成物を使用し体細胞をｉＰＳへと初期化することが可能である(Takahashi K.及びYamanaka S.、2006)が、初期化のため精製され且つ濃縮されたベクター組成物の使用は、収率のより大きい増加並びにクローン性の生存及び品質に繋がる(Vallierら、2009)。更にウイルスベースのベクターは通常、創薬及び治療目的の組換えタンパク質の作製のための治療標的のバリデーションの一部として、細胞モデルを作製するために使用される。この状況において、ウイルスベースのベクターにより形質導入された細胞において誘導された変化を、巧く特徴付けすることは必須である。Banito Aらの論文(2009)により明らかにされたように、細胞初期化のような細胞操作は、遅く確率論的であり得、このことは、その効率及び安定性を制限する障壁が存在することを示唆している。ここで著者らは、老化をそのような障壁のひとつとして同定し、且つ異なる老化エフェクターの消失(ablation)は、初期化効率を改善することを示している。この目的のために、精製されたベクターは、ウイルスベースのベクター組成物の標的細胞に対する何らかの負の影響を避けることが可能になる。
【０００６】
ＨＩＶによる感染後に生じた細胞反応で、免疫細胞においてこのウイルスにより引き起こされた転写の変化を含むものが、広く研究されている(Giriら、2006)。対照的に、ＨＩＶ由来のレンチウイルスベクターにより引き起こされる転写の変化に関する研究は、ほとんどない。今日までこれらの研究は、形質導入のある段階、形質導入された細胞のゲノムへの組込みなどの影響に焦点を合わせている。いくつかの研究、すなわちZhaoらの論文(2004)及びMitchellらの論文(2003)は、レンチウイルスベクターに反応して誘導された発現プロファイルの全般的変化を特徴付けている。しかしこれらの研究は全て、特定の条件（導入遺伝子特異的細胞型）に焦点を合わせており、一般的結論をひきだすことはできない。特にレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの全般的影響及び毒性、並びにウイルスベクター組成物の濃度及び精製などの、製造プロセスパラメータの結果に関する研究、並びに形質導入された細胞の転写プロファイルに関する研究は行われていない。
【０００７】
特定のベクターの選択に影響を及ぼす要因としては、そのパッケージング能、その宿主範囲、その遺伝子発現プロファイル、その形質導入効率、及び特に反復した投与又は形質導入が必要とされる場合に問題である免疫応答を誘起するその能力が挙げられる。これらのパラメータの一部は、調節又は制御することができる。一つのパラメータ又は特に重要なものは、高度に濃縮され且つ高度に精製されたベクターの使用であり、これは効率的細胞の形質導入を可能にし、且つウイルスベクター組成物中の不純物に起因した特異的細胞反応を回避する。遺伝子治療の開発、インビボ及びエクスビボにおける臨床アッセイ、並びに創薬での適用は、真核細胞に対するウイルスベクター組成物の効果を測定又は検出する道具を有し、且つそのようなウイルスベクターの使用を通じ、ヒト使用のためのタンパク質の作製に関連した安全性を増大することに注目している。
【０００８】
現在まで、ウイルスベクター組成物の使用に関連した毒性の問題は、全般的に調べられず、解決もされていない。本発明は、ウイルスベクター組成物による形質導入時の細胞における潜在的有害作用に関連した、バイオマーカーと称される、転写署名の特徴付け及び選択に関する。本発明は、いずれかのプロセスにより得られたウイルスベクター組成物の安全性及び品質を特徴付けるようデザインされたアッセイに加え、そのようなウイルスベクター組成物により形質導入された遺伝子修飾された細胞を明らかにしている。導入遺伝子発現のレベルに影響を及ぼし得る形質導入効率に影響を及ぼすか又は干渉する遺伝子の同定及び調節は、形質導入プロセスを最適化するための目標とすることができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ウイルスベクター組成物の標的細胞への及び特に真核細胞への導入に反応した全般的細胞変化の特徴付けのための方法及び組成物に関する。そのような全般的変化は、ウイルスベクターそれ自身により誘導され、且つウイルスベクター組成物の純度又は濃度のレベルなどの、その中にウイルスベクターが認められる環境から生じ得る。以下に詳述するように、本発明の方法及び組成物は、遺伝子産物の特定のパネル（「バイオマーカー」）及びそれらの示差的発現パターン（「発現署名」）を利用し、ここでウイルスベクター組成物の品質に関連したこれらの発現パターンは、いずれか所定の形質導入された真核細胞に影響を及ぼす。
【００１０】
本発明は、改変された遺伝子発現プロファイルを検出することにより、及び該培養細胞における少なくとも1種のバイオマーカーの発現レベルの改変をスクリーニングすることにより、真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用を測定又は検出する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、バイオマーカーの特定のパネル及びそれらの発現署名を利用する方法及び組成物に関し、ここで発現署名は、ウイルスベクター組成物がいずれか所定の標的細胞、特に真核細胞に対して有し得る作用と相関している。本発明は、ウイルスベクターが形質導入された真核細胞において示差的に発現され且つウイルスベクター組成物の品質の予測において有用である、バイオマーカーの具体的セットの同定を基にしている。従って本発明は、ウイルスベクター組成物により形質導入された細胞における細胞反応を予測する方法を提供する。具体的には、ウイルスベクター組成物と接触された、標的細胞、特に真核細胞における細胞反応を検出する方法であって、（ｉ）ウイルスベクター組成物と接触していない真核細胞における１又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（ｉｉ）ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞における１又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｉｉｉ）工程（ｉ）におけるバイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｉｉ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の間のバイオマーカー発現レベルの変化は、細胞反応の指標となり、且つここで該細胞反応は、ウイルスベクター組成物の品質と相関している工程を含む方法が、提供される。工程（ｉｉｉ）において、発現の変化は、バイオマーカー発現の増加又は減少のいずれかであってよい。本発明の具体的実施態様において、（ｉ）と（ｉｉ）の間のバイオマーカー発現レベルの変化は、発現の１．３倍の増加又は発現の１．３倍の減少のいずれかである、発現におけるＦＣの最小絶対値１．３（倍数変化≧１．３）で確立される。このＦＣ値は、ウイルスベクター組成物の品質（濃度／精製）と、形質導入の条件、特にＭＯＩと相関している。
【００１２】
バイオマーカー発現とウイルスベクター形質導入の間の同定された相関は、ウイルスベクター組成物の品質を決定する方法を提供する。本発明の方法は、形質導入された細胞における１又は複数の予測ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベルの測定に頼っており、ここでこれらの予測ＲＮＡ転写物又はそれらの産物は、表２、表３、表４、表５、表６、表７又は表８の遺伝子からなる群から選択される１又は複数の遺伝子の転写物又は産物である。
【００１３】
本発明の実施態様において、ウイルスベクター組成物の標的細胞、特にウイルスベクター組成物により形質導入された真核細胞に対する影響が、評価される。本発明の具体的実施態様において、培養された細胞は、レンチウイルスベクターにより形質導入される。本発明の別の実施態様において、真核細胞は、不死化細胞、初代細胞又は幹細胞である。
【００１４】
本発明の一実施態様において、老化の生物学的プロセスに関与したバイオマーカーの発現レベルが、測定される。好ましい実施態様において、老化に関与したバイオマーカーは、ＳＡＳＰファミリーの一員である。より好ましい実施態様において、老化遺伝子は、表７から選択された１又は複数の遺伝子である。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、細胞周期に関連したバイオマーカーの発現レベルが、測定される。好ましい実施態様において、細胞周期バイオマーカーは、表２、表３、及び表４から選択された１又は複数の遺伝子である。
本発明の別の実施態様において、表８から選択されたバイオマーカーの発現レベルが、測定される。
【００１６】
本発明の別の実施態様において、本発明は、標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法であって、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカー並びに／又はＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む方法を更に提供する。
【００１７】
特定の実施態様において、本発明は、標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法であって：
（ａ）ウイルスベクター組成物と接触していない標的細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；
（ｂ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞における該少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する方法；並びに、
（ｃ）工程（ｂ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）に比べ（ｂ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な上方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を含む方法を提供する。
より特定すると、高ＭＯＩでの有意な上方制御は、（ａ）と比較し２倍の上方制御である。
【００１８】
本発明の方法は、
（ｄ）ウイルスベクター組成物と接触していない標的細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；
（ｅ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞における少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｆ）工程（ｅ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な下方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を更に含むことができる方法を、提供する。
【００１９】
より特定すると、最適ＭＯＩでの有意な下方制御は、（ｄ）と比較し１．５倍の下方制御である。
あるいは、工程（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に先行して、又は同時に実行され得ることに留意されたい。
【００２０】
本発明の方法は：
（ｇ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｈ）工程（ｇ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）と比べ（ｇ）において、バイオマーカー（複数可）の有意な示差的発現が検出されるべきではない工程を更に含むことができる。
【００２１】
本発明の方法は更に：
（ｊ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｋ）工程（ｊ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御が、検出されるべきである工程を更に含むことができる。
【００２２】
より特定すると、（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御は、高ＭＯＩでの（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの下方制御よりも少なくとも１．５倍低い。
【００２３】
本発明の方法は更に、予めウイルスベクター組成物及び対照ウイルスベクター組成物の力価決定の工程を含むことができる。
好都合なことに、標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法において、バイオマーカー発現レベルの測定は、これらの細胞が、集密(confluency)に到達する前に行われる。
好ましくは、これらの標的細胞は、真核細胞であり、且つレンチウイルスベクター組成物により形質導入される。
【００２４】
本発明はまた、形質導入された細胞の試料中のバイオマーカー発現のレベルを測定するためのキットも提供する。これらのキットは、本明細書に記載のバイオマーカーに対応する１又は複数の試薬、例えばバイオマーカーに特異的に結合する抗体、バイオマーカーに特異的な抗体に結合する組換えタンパク質、バイオマーカーにハイブリダイズする核酸プローブ又はプライマーなどを備えることができる。一部の実施態様において、キットは、例えばアレイ上に、本明細書に記載のバイオマーカーに対応する、複数の試薬を備えることができる。これらのキットは、検出試薬、例えば検出できるよう標識されている試薬を備えることができる。これらのキットは、ウイルスベクター組成物の品質を予測する際のキットの使用に関する、書面による指示書を備えることができ、且つ対照又は参照標準などの、他の試薬及び情報、洗浄液、解析用ソフトウェアなどを備えることができる。
【００２５】
好ましい実施態様において、キットは、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１又は複数の試薬を備える。
【００２６】
好都合なことに、該キットは、ＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１又は複数の試薬を更に備える。
好ましくは、該キットはまた、対照ウイルスベクター組成物を更に備えることができる。
【００２７】
本発明は更に、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカー、並びにＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーからなり、そして場合により偏在性遺伝子を伴うバイオチップを提供する。
【００２８】
本発明はまた、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーのプライマー、並びにＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーのプライマーを含んでなるＲＴ−ｑＰＣＲプレートを更に提供する。
【００２９】
本発明は更に、バイオマーカー組成物の品質を決定するための、真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用の測定及び検出について有用なバイオマーカー組成物に関する。本発明の好ましい実施態様において、真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用の測定及び検出について有用なバイオマーカー組成物は、表２、表３、表４、表５、表６、表７及び表８に存在する遺伝子又はポリペプチド中で選択された産物の少なくとも１種を含む。より好ましい実施態様において、このバイオマーカー組成物は、表３、表４、表７及び表８に存在する遺伝子又はポリペプチドの中で選択された産物の少なくとも１種を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】先行技術による一般的な血清を用いるベクター作製法。標的細胞の濃縮及び精製の必要要件に合致するために、異なる工程を連続して行う。工程Ｂ（バッチＢの入手に対応）は、先行技術を表す。
【図１Ｂ】ウイルスベクター組成物Ｂ及びＣを得るために使用したウイルスベクターの濃縮及び精製方法。標的細胞の濃縮及び精製の必要要件に合致するために、異なる工程を連続して行う（ＡからＤまでは、バッチＡからＤの入手に対応している）：不死化細胞（Ａ）、初代細胞及び幹細胞（Ｃ）並びにインビボ注入（Ｄ）。
【図１Ｃ】ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を内部に持つプラスミド、エンベロープを発現しているヘルパープラスミド、並びにｃＤＮＡを伴わない導入遺伝子発現プラスミド。
【００３１】
【図２Ａ】トランスクリプトミクス試験に使用したバッチＢ及びＣの力価のまとめ。トランスクリプトミクス試験に使用したバッチＢ及びＣのｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１の特徴決定。（１）形質導入単位（ＴＵ）は、ｑＰＣＲにより決定した。（２）ＰＰ／ＴＵ比を決定するために、物理的粒子数（ＰＰ）は、ＨＩＶ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡにより定量した。
【図２Ｂ】バッチＢ及びＣベクターによる形質導入後４８時間成長させた包皮細胞。レンチウイルスベクター（ｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１）を保有するエンプティカセットにより、ＭＯＩ４０又はＭＯＩ１５０での形質導入後４８時間の包皮細胞。ｒＬＶ−ＥＦ１のバッチＢ及びＣは、同じ粗収集物から誘導された。
【００３２】
【図３Ａ】ＭＯＩ１５０でのバッチＢにより形質導入された細胞、対、非形質導入細胞中の示差的プローブの散布図。散布図は、示差的に発現されたプローブを表し、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢにより形質導入された細胞において、ＦＣ絶対値≧１．５である。Ｘ軸は、非形質導入（ＮＴ）細胞の正規化された強度を表し、Ｙ軸は、形質導入された（Ｔ）細胞の正規化された強度を表す。非常に明るい灰色がかった線は、倍数変化の線であり、これは倍数変化値−２、１及び２を表す。
【図３Ｂ】非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でのバッチＣにより形質導入された細胞中の示差的プローブの散布図。散布図は、示差的に発現されたプローブを表し、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０のｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣにより形質導入された細胞において、ＦＣ絶対値≧１．５である。Ｘ軸は、非形質導入（ＮＴ）細胞の正規化された強度を表し、Ｙ軸は、形質導入された（Ｔ）細胞の正規化された強度を表す。非常に明るい灰色がかった線は、倍数変化の線であり、これは倍数変化値−２、１及び２を表す。
【００３３】
【図４】ベン図：非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞において下方制御されたプローブ、並びに非形質導入細胞に対しバッチＣにより形質導入された細胞において下方制御されたプローブ。ベン図は、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞における下方制御されたプローブ（ＦＣ≦−１．５）のリストと、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０のバッチＣにより形質導入された細胞における下方制御されたプローブ（ＦＣ≦−１．５）のリストの間の共通集合を示している。
【００３４】
【図５】非形質導入細胞に対する、ＦＣ≦−３を伴う、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞における、細胞周期プローブのプロファイルプロット。プロファイルプロットは、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞を非形質導入細胞と比べた場合に、ＦＣ≦−３を有する示差的プローブを表している。ベースライン変換を、データを表す前に、強度値に適用した。正規化された強度値を、下記の条件でプロットした：ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞、ＭＯＩ１５０でバッチＣにより形質導入された細胞、非形質導入細胞。
【００３５】
【図６Ａ】非形質導入細胞と比べた、ｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢによりＭＯＩ１５０により形質導入された細胞及びｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣによりＭＯＩ１５０により形質導入された細胞における、５種の細胞周期遺伝子の下方制御のＲＴ−ｑＰＣＲバリデーション。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣにより形質導入された細胞由来のＲＮＡ並びに非形質導入細胞由来のＲＮＡについて行った。ＲＴ−ｑＰＣＲ倍数変化は、２−ΔΔＣＴ法を用い、非形質導入細胞における値に対する各条件における閾値周期(threshold cycle)（Ｃｔ）値から算出し、これを、これらの３条件でプロットした（ＮＴ：非形質導入細胞、バッチＣ：ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣにより形質導入された細胞、バッチＢ：ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢにより形質導入された細胞）。
【図６Ｂ】５種の先に列記したバリデーションされた遺伝子に関する、ＲＴ−ｑＰＣＲ実験及びマイクロアレイ実験から得られた倍数変化値の比較。全ての倍数変化は、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ又はバッチＣにより形質導入された細胞における発現値、対、非形質導入細胞における発現値を比較し、算出した。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＭＯＩ１５０で形質導入に使用したバッチ、（３）２−ΔΔＣＴ法を用いＣｔ値から計算し且つ等価負値（−１／ＦＣ）へ変換した倍数変化値、（４）マイクロアレイ実験からの倍数変化値。
【００３６】
【図７Ａ】非形質導入細胞と比較した、血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（バッチＢ−Ｓ）。血清の存在下で産生されたレンチウイルスベクター（ｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１）を保有するエンプティカセットにより、ＭＯＩ４０又はＭＯＩ１５０で形質導入した４８時間後の包皮細胞。
【図７Ｂ】トランスクリプトミクス試験に使用したｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１のバッチＢ−Ｓの特徴決定。（１）形質導入単位（ＴＵ）は、ｑＰＣＲにより決定した。（２）ＰＰ／ＴＵ比を決定するために、物理的粒子数（ＰＰ）は、ＨＩＶ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡにより定量した。
【００３７】
【図８】ＭＯＩ１５０の血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（Ｂ−Ｓ）、対、非形質導入細胞中の示差的プローブの散布図。散布図は、示差的に発現されたプローブを表し、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において、ＦＣ絶対値≧１．５である。Ｘ軸は、非形質導入（ＮＴ）細胞の正規化された強度を表し、Ｙ軸は、形質導入された（Ｔ）細胞の正規化された強度を表す。非常に明るい灰色がかった線は、倍数変化の線であり、これは倍数変化値−２、１及び２を表す。
【００３８】
【図９】ＭＯＩ４０で血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（Ｂ−Ｓ）、対、非形質導入細胞中の示差的プローブの散布図。散布図は、示差的に発現されたプローブを表し、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ４０でｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において、ＦＣ絶対値≧１．５である。Ｘ軸は、非形質導入（ＮＴ）細胞の正規化された強度を表し、Ｙ軸は、形質導入された（Ｔ）細胞の正規化された強度を表す。非常に明るい灰色がかった線は、倍数変化の線であり、これは倍数変化値−２、１及び２を表す。
【００３９】
【図１０】ベン図：非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０で、血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（Ｂ−Ｓ）において調整されたプローブ、及び非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ４０で血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（Ｂ−Ｓ）において調整されたプローブ。ベン図は、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０のバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞における示差的に発現されたプローブ（ＦＣ絶対値≧１．５）のリストと、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ４０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞における示差的に発現されたプローブ（ＦＣ絶対値≧１．５）のリストの間の共通集合を示している。
【００４０】
【図１１】ＭＯＩ４０及び１５０で、血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞（Ｂ−Ｓ）において影響を受けたプローブ、並びにＭＯＩ４０及び１５０で、バッチＢ及びＣにより形質導入された細胞において示差的でないプローブを表す、プロファイルプロット。プロファイルプロットは、非形質導入（ＮＴ）細胞と比べ、ＭＯＩ４０及びＭＯＩ１５０でｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において示差的に発現されたプローブ、並びに非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ４０及びＭＯＩ１５０でｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びＣにより形質導入された細胞において示差的でないプローブを表している。「示差的でない」とは、ＦＣ絶対値が、＜１．３であることを意味する。ベースライン変換を、データを表す前に、強度値に適用した。Ｂ−４０：ＭＯＩ４０でバッチＢにより形質導入された細胞。Ｂ−１５０：ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞。Ｃ−４０：ＭＯＩ４０でバッチＣにより形質導入された細胞。Ｃ−１５０：ＭＯＩ１５０でバッチＣにより形質導入された細胞。ＮＴ：非形質導入細胞。Ｂ−Ｓ−４０：ＭＯＩ４０で血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞。Ｂ−Ｓ−１５０：ＭＯＩ４０で血清を用い得られたバッチＢにより形質導入された細胞。
【００４１】
【図１２】使用したｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターバッチの特徴決定（Ｂ、Ｃ、Ｂ−Ｓ及びＵＣ）。
【００４２】
【図１３】ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターにより形質導入された包皮線維芽細胞の写真。細胞は、形質導入の４８時間後に観察した。
【００４３】
【図１４】下記の条件で表された、図５において選択されたプローブ（ＮＴに対し、Ｂ−ＭＣＳ−ＭＯＩ１５０により、ＦＣ≦−３を有するよう下方制御された細胞周期遺伝子）：ＮＴ、Ｂ−ＧＦＰ−ＭＯＩ４０、Ｃ−ＧＦＰ−ＭＯＩ４０。
【００４４】
【図１５】非形質導入（ＮＴ）細胞に対する、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰバッチＢ及びＣによる形質導入後の、表３に対応するプローブの挙動を示す、プロファイルプロット。
【００４５】
【図１６】ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターによる形質導入後の、表４の１８種の遺伝子及びＭＫＩ６７（配列番号１２）に対応するプローブを表す、プロファイルプロット。
【００４６】
【図１７】ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクター（Ｂ、Ｂ−Ｓ及びＣ）による形質導入後の、表４の１８種の細胞周期遺伝子及びＭＫＩ６７（配列番号１２）を表す、プロファイルプロット。
【００４７】
【図１８Ａ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのいくつかの細胞周期遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１８Ｂ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのいくつかの細胞周期遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１８Ｃ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのいくつかの細胞周期遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１８Ｄ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのいくつかの細胞周期遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【００４８】
【図１９Ａ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのＣＸＣＬ２（配列番号１）遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１９Ｂ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのＣＸＣＬ２（配列番号１）遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１９Ｃ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのＥＲＥＧ（配列番号２）遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【図１９Ｄ】ＲＴ−ｑＰＣＲによるバイオマーカーとしてのＥＲＥＧ（配列番号２）遺伝子のバリデーション。ｍＲＮＡ相対定量値は、１条件につき３つの試料から算出した、平均±ＳＤとして表した。ＮＴと比較した各条件に関する倍数変化値は、差が有意である場合（対応のないｔ−検定、ｐ−値＜０．０５）は、各グラフのバーの上に記した。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、ウイルスベクターにより形質導入された細胞において、示差的に発現されるバイオマーカーの具体的セットを提供する。そのようなバイオマーカーは、以下に詳細に説明されるように、ウイルスベクター組成物の品質を予測するために設計された方法において使用することができる。
本出願において、用語は、別に正確に記す場合を除き、それらの通常の意味で使用される。
【００５０】
定義
用語「ウイルスベクター組成物」とは、非限定的に、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスから得られる任意のウイルス由来の組成物並びにそれらのウイルスベクターを含む全ての組成物を指す。本発明の好ましい実施態様において、ウイルスベクター組成物は、例えば、レンチウイルス（ＬＶ）ベクター及びγ−レトロウイルス（ＲＶ）ベクターを含む、エンベロープに囲まれたＲＮＡウイルスを含むレトロウイルス科に属するウイルスを基にしている。ウイルスベクター組成物は、当業者に公知の任意の方法を使用し作製されることができる。本発明の具体的実施態様において、本発明の方法を用いて試験されるべきウイルスベクター組成物は、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに説明されたプロセスなどのプロセスにより得ることができる。
【００５１】
用語「ウイルスベクター組成物の影響を測定又は検出する」とは、標的細胞又は真核細胞のウイルスベクター組成物との接触後の、バイオマーカーの発現を評価することを意味する。
【００５２】
用語「バイオマーカー」又は「生物学的マーカー」とは、生物学的状態の指標を意味する。正常な生物学的プロセス、病理発生プロセス、又は治療的介入に対する薬学的反応の指標として、客観的に測定し且つ評価することは、特徴的である。本明細書に使用される「バイオマーカー」は、具体的生物学的特性の分子指標であり、且つ本明細書において使用される場合、細胞内でのそれらの示差的発現（存在、非存在、参照に比しての過剰発現又は過小発現）が、ウイルスベクター組成物の品質を予測するような核酸分子（例えば、遺伝子若しくは遺伝子断片）又はそれらの発現産物（例えば、ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ポリペプチド若しくはペプチド断片若しくはそれらのバリアント）である。本明細書において使用される「発現産物」は、転写されたセンス若しくはアンチセンスＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、又はポリヌクレオチド配列に対応するか若しくはそれから誘導された翻訳されたポリペプチドである。バイオマーカーの「パネル」は、バイオマーカーの２種以上の組合せの選択である。
【００５３】
本発明のウイルスベクター組成物を特徴付けるためのバイオマーカーは、表２、表３、表４、表６、表７及び表８に列挙されたものを含む。そのようなマーカーは、ウイルスベクター組成物の細胞への形質導入により調節されることが知られている遺伝子を含む。１又は複数のこれらのバイオマーカー、又は最大全てのバイオマーカーは、本発明の方法において任意の組合せで一緒に使用することができる。
【００５４】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ分子、及びｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子、又は関心対象のＤＮＡ若しくはＲＮＡ任意の断片を含むことが意図されている。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、並びに例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡを含む一本鎖又は二本鎖のいずれかの型のそれらのポリマーを指す。この用語は、天然起源及び合成起源の両方の核酸分子に加え、未変性の核酸分子のセンス又はアンチセンス鎖のいずれか、若しくは両方を表す、線状、環状、又は分岐した配置の分子を包含している。そのような核酸は、精製されないか、精製されるか、又は例えばビーズ若しくはカラムマトリクスなどの合成物質に結合されることができることは理解される。この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、且つ天然に生じるヌクレオチドに似た様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類縁体を含む核酸も包含している。別に指定しない限りは、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、多型、対立遺伝子、及び相補的配列に加え、明示的に示された配列をも暗に包含している。用語核酸は、遺伝子により、又は完全分子と機能的に同等であるように選択されるそれらの断片によりコードされた、遺伝子、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡと、互換的に使用される。
【００５５】
従って本発明は、バイオマーカー、例えば核酸分子及びそれらの発現産物を含有する組成物、又は該バイオマーカーを検出する手段を提供し、ここでこれらのバイオマーカーは、ウイルスベクターにより形質導入された細胞において、形質導入されない細胞と比べ、示差的に発現されることがわかっている。
【００５６】
本発明のバイオマーカーをコードしている核酸配列は、公に入手可能であり（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋにおいてアクセス可能）、当業者に公知であり、且つそれらの全体が本明細書中に組み込まれている。以下に詳述するように、そのような核酸配列を使用し、形質導入された細胞におけるバイオマーカー発現のレベルを測定するアッセイにおいて使用するための、プローブ又はプライマーを設計することができる。
【００５７】
本発明のバイオマーカーは、本明細書に記載の核酸分子及びそれらの発現産物の実質的に同一の相同体及びバリアント、例えば本発明のバイオマーカーと機能的に同等のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、例えば１個又は複数のヌクレオチドの置換、付加若しくは欠失を有する配列を含む分子、例えば対立遺伝子バリアント又はスプライシングバリアント又は種バリアント、あるいは遺伝暗号の縮重のために本明細書の表２、表３、表４、表６、表７又は表８において言及された核酸分子及びポリペプチドとは異なる分子を含む。
【００５８】
本発明の実践において使用するための他の核酸は、ハイブリダイゼーション技術の使用により発現を検出するために、本明細書に記載のものと十分な相同性を有する核酸を含む。そのようなポリヌクレオチドは好ましくは、本明細書に記載のようにバイオマーカー配列と約９５％又は９５％、約９６％又は９６％、約９７％又は９７％、約９８％又は９８％、若しくは約９９％又は９９％の同一性を有する。本発明の実践において使用するためのその他のポリヌクレオチドはまた、約５５〜約６５℃若しくはそれ以上での、ハイブリダイゼーションに関して約３０％ｖ／ｖ〜約５０％のホルムアミド及び約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩のストリンジェントな条件、並びに洗浄条件に関して約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩、あるいはそれと同等の条件下で、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力を基に説明することができる。
【００５９】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、そのポリマーの長さとは関わりなく、アミノ酸のポリマーを指す。従ってペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。同じくこの定義には、１又は複数のアミノ酸アナログを含むポリペプチド、置換された連結を伴うポリペプチドに加え、天然に生じるもの及び天然に生じないものの両方の当該技術分野において公知のその他の改変も含まれる。
【００６０】
用語「培養細胞」とは、一般にそれらが自然にある環境ではなく、制御された条件下で成長した真核細胞を意味し、初代細胞、細胞株及びトランスジェニック細胞を含む。培養細胞は、ウイルスベクター組成物により形質導入されてもよく、されなくてもよい。用語「標的細胞」とは、本発明の方法、又は本発明のキットにより、バイオマーカーの発現に関し試験する細胞を意味する。標的細胞は、同じ型、同じ培養条件で、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは不死化細胞、初代細胞又は幹細胞である。例えば標的細胞は、包皮細胞である。
【００６１】
特に標的細胞は、許容細胞又は非許容細胞であることができる。用語「許容細胞」は、４０以下の値の最適感染多重度（ＭＯＩ）で、ウイルスベクター組成物により形質導入される標的細胞である。用語「非許容細胞」は、４０より大きい値の最適ＭＯＩで、ウイルスベクター組成物により形質導入される標的細胞である。
感染多重度（ＭＯＩ）は、ウイルス学において頻用される用語であり、これは感染時に細胞１個につき付着されるビリオン数を指す。
【００６２】
用語「最適ＭＯＩ」とは、標的細胞を形質導入するのに適したＭＯＩを意味する。最適ＭＯＩは、レポーター遺伝子を発現しているレンチウイルスベクターなどの、レポーター遺伝子を発現しているウイルスベクターを使用し、標的細胞に対するＭＯＩの範囲により決定される。レポーター遺伝子は、ＧＦＰなどの蛍光レポーター遺伝子又はルシフェラーゼなどの発光レポーター遺伝子であるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
最適ＭＯＩは、非限定的に、下記のようないくつかの判定基準を基に、当業者により決定されることができる：
−レポーター遺伝子発現レベルを持つ形質導入された細胞の割合、
−形質導入された細胞の生存能、及び／又は
−レポーター遺伝子発現レベル。
形質導入された細胞の割合及びレポーター遺伝子発現レベルは、当業者に公知の方法により決定される。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、最適ＭＯＩは、形質導入された細胞の最高の割合に相当するＭＯＩ、形質導入されない細胞の生存能と比べ形質導入された細胞の生存能が検出可能で且つ交換不能であるのに十分なレポーター遺伝子発現レベルに相当するＭＯＩにより決定される。
例えば、包皮線維芽細胞（「包皮細胞」とも称される）などの、線維芽細胞に関する最適ＭＯＩは、４０である。
【００６５】
用語「トランスフェクション」とは、細胞へ核酸を計画的に導入するプロセスを指す。この用語は厳密に、真核細胞における非ウイルス方法について使用される。トランスフェクションは、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖ発現プラスミドが、産生細胞にトランスフェクションされ、上清中にウイルスベクターを得る場合の、ウイルスベクターの作製プロセスにおいて使用される。
【００６６】
用語「形質導入」は、細胞へ核酸を計画的に導入するプロセスである。この用語は、真核細胞におけるウイルスベースの方法について使用される。ウイルスベクターは、産生細胞から収集され、且つ真核細胞と接触され、最終的に形質導入された細胞を得る。
【００６７】
用語「倍数変化」又は「ＦＣ」は、ウイルスベクター組成物により形質導入された細胞の発現レベル、対、形質導入されない細胞の、又はウイルスベクター組成物の異なるバッチにより形質導入された細胞の発現レベルの間の比を表す。
【００６８】
用語「細胞老化」とは、老化細胞を増殖細胞から区別する特徴的形態学的及び生理学的特性のセットを伴う、安定した細胞周期停止に加え、静止期細胞又は最終分化細胞の停止を指す(Kosarら、2011)。
用語「ＳＡＳＰ」は、「老化関連分泌表現型」を意味し、細胞老化を受けている細胞により分泌されるタンパク質のセットと定義される。
【００６９】
用語「細胞周期」は、有糸（細胞）分裂の間の細胞内の一連の事象を意味する。細胞周期は、便宜上以下の５つの期に分けられる：Ｇ０（ギャップ）；Ｇ１（第一のギャップ）；Ｓ（合成期、この期間にＤＮＡが合成され複製される）；Ｇ２（第二のギャップ）；及び、Ｍ（有糸分裂）。
【００７０】
本発明は、標的細胞又は真核細胞における少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルの改変をスクリーニングすることにより、該標的細胞、好ましくは真核細胞に対する、ウイルスベクター組成物の作用を評価又は測定する新規方法を提供する。本発明の方法は、ウイルスベクター組成物が、培養された細胞に対し影響を有するかどうかを確立することにより、ウイルスベクター組成物の品質を評価するために使用することができる。標的細胞又は真核細胞は、ウイルスベクター組成物を作製するためにトランスフェクションされた培養細胞、又はウイルスベクター組成物により形質導入された培養細胞であることができる。これらのバイオマーカーは、細胞核酸及び／又は細胞タンパク質、あるいはそれらの選択された断片であることができる。その目標は、ウイルスベクターにより運搬される導入遺伝子よりもむしろ、ウイルスベクター組成物それ自身が、培養細胞に影響を及ぼし、ここで該影響は、ウイルスベクター組成物の濃度及び純度により左右され得るかどうかを決定することである。実際現時点まで、標的細胞又は真核細胞の生存能及び／又は毒性に対するウイルスベクター組成物の作用を比較する方法を、当業者は欠いている。
【００７１】
更にウイルスベクター組成物は、異なる濃度及び力価を有することができる。この組成物の力価は、培養細胞に適用される感染多重度（ＭＯＩ）を決定するので、組成物の非常に重要なパラメータである。力価決定は、いくつかの要因、すなわち測定技術及びデータ処理に左右される。通常比較的高いＭＯＩの使用が、高い形質導入レベルに到達するための筋道であるが、ある研究者らは、形質導入効率を改善するために、ベクターシュードタイピング又は形質導入プロトコールの最適化に焦点をあてている(Janssensら、2003)。しかし、そのようなバッチＢ−Ｓは細胞毒性を誘導するので(Selvaggiら、1997；Reiser, 2000；Baekelandtら、2003)、この型の生成物Ｂ−Ｓによる形質導入効率の結果は常に、形質導入レベルと得られる標的細胞に対する毒性の間で均衡している。更に公開された古典的技術により濃縮されたレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの別の欠点は、形質導入された幹細胞、特に造血幹細胞に関して、形質導入後に下流の分化経路を進めることができないことである。従って本発明は、形質導入された細胞に対する、異なるＭＯＩでの、ウイルスベクター組成物の作用を決定する方法を提供する。本発明は、所与のウイルスベクター組成物に対応するＭＯＩの範囲を決定すること、及び同じく細胞の形質導入に使用されるプロトコールを最適化することを可能にする。特に本発明のバイオマーカーの使用は、細胞周期停止又は細胞老化時に、形質導入された細胞に対し有害な又は望ましくない作用を誘導せずに効率的に形質導入することができるような、好適な範囲のＭＯＩを規定することを可能にする。
【００７２】
ウイルスベクター組成物に対する形質導入された細胞の細胞反応の基礎となる機序を研究するために、形質導入された細胞において示差的に発現されるバイオマーカーの発見を基にしたモデルシステムが開発され、ここでバイオマーカー発現のパターンは、ウイルスベクター組成物（ｃＤＮＡを欠くウイルスベクター）の品質と相関している。従って本発明は、その発現がウイルスベクター組成物との接触後に改変される、数多くのバイオマーカーの同定及びバリデーションを基にしている。本発明は、培養された真核細胞に対するウイルスベクター組成物の影響を測定するための信頼できるバイオマーカーを同定するために、異なるウイルスベクター組成物（濃度／純度のレベルが異なる）及び異なるＭＯＩ値により作製されたデータを基にしている。特に形質導入された細胞遺伝子の発現レベルの差異は、形質導入されない細胞遺伝子、対、ｃＤＮＡを欠くウイルスベクターにより形質導入された細胞の発現レベルの間で比較される。バイオマーカーとして同定された一部の遺伝子は、形質導入されない細胞と比べた、ウイルスベクター組成物により形質導入された細胞における発現レベルの量のマイクロアレイ実験及び／又はＲＴ−ｑＰＣＲ定量により、再試験される。これらのバリデーション実験に関して、ウイルスベクター組成物の力価決定に、特に注意が払われる。例えばウイルスベクター組成物は、異なる時点で３回力価決定される。
【００７３】
本発明は、本発明のウイルスベクター組成物により形質導入された標的細胞、好ましくは真核細胞において上方制御又は下方制御される分子に対応するバイオマーカーのプロファイルに関与している。好ましい本発明の実施態様において、形質導入されない細胞と形質導入された細胞の間のバイオマーカー発現レベルの変化は、発現の１．３倍の増加又は発現の１．３倍の減少のいずれかである、発現におけるＦＣの最小絶対値１．３（倍数変化≧１．３）で確立される。このＦＣ値は、ウイルスベクター組成物の品質及び形質導入の条件、特にＭＯＩと相関している。バイオマーカーのプロファイルは、本発明に従い形質導入された細胞の生物学的に特異的状態を特徴付けるのに有用である。このプロファイルは、表２、表３、表４、表６、表７及び表８のバイオマーカーを含む。
【００７４】
形質導入前細胞と形質導入後細胞の間の遺伝子発現レベルの比較は、過剰発現された遺伝子及び過小発現された遺伝子で構成された遺伝子発現署名を同定した。従って本発明は、ウイルスベクター組成物の品質を評価する方法を提供する。本発明の方法は、形質導入されない細胞におけるＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベルに対して、あるいはＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の参照セットに対して正規化された、形質導入された細胞における１種又は複数の予測ＲＮＡ転写物又はそれらの発現産物の発現レベルの測定に頼っており、ここで予測ＲＮＡ転写物は、表２、表３、表４、表６、表７、表８に列挙された遺伝子からなる群から選択される１種又は複数の遺伝子の転写物である。個々のバイオマーカーは、ウイルスベクター組成物の品質を評価するのに有用であるが、本明細書に提唱されるようなバイオマーカーの組合せは、バイオマーカー組成物の品質のより正確な決定を可能にする。
【００７５】
試料中のバイオマーカーの発現レベルは、好適な「対照」又は「参照」試料との比較により決定されてよい。例えば、ウイルスベクターにより形質導入された細胞におけるマーカーの相対発現レベルは、ウイルスベクターにより形質導入されない細胞における同じマーカーの発現レベルを参照することにより決定されてよい。マーカーの発現レベルが、参照のそれよりもより大きいか又はより小さい場合は、マーカー発現は、各々、「増加」又は「減少」していると称すことができる。加えて対照又は参照と、本試料の間で発現レベルを一定に維持することは可能である。
【００７６】
用語「有意な」変化（上方制御又は下方制御）は、意味があるとして当業者に解釈されるのに十分な程重要な発現レベルの変化である。特に発現レベルの変化は、形質導入された細胞の発現レベルが、誤差限界を考慮しても、形質導入されない細胞における発現レベルに相当しない場合に、有意である。好ましい本発明の実施態様において、形質導入されない細胞と形質導入された細胞の間のバイオマーカー発現レベルの有意な変化は、発現の１．３倍の増加又は発現の１．３倍の減少のいずれかである、発現のＦＣ最小絶対値１．３（倍数変化≧１．３）で確立される。このＦＣ最小絶対値１．３は、バイオチップによる最初の分析について考察された。バリデーション実験に関して、ベンジャミーニ−ホッホベルグ多重検定補正及び補正されたｐ−値＜０．０５で、独立したｔ−検定が行われた。倍数変化（ＦＣ）の絶対値≧１．５を伴うプローブは、上方制御又は下方制御されたプローブについて示差的に発現される場合に、保持された。
【００７７】
そのような方法における分析のための試料は、任意の標的細胞、好ましくは真核細胞又は真核細胞抽出物であることができる。そのような真核細胞は、細胞株、培養細胞、初代細胞、幹細胞を含む。
【００７８】
以下に詳述するように、細胞内のバイオマーカーの発現は、任意の好適な手段により評価することができる。例えば発現は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて評価することができる。あるいは、ＲＮＡ転写物は、リアルタイムＰＣＲを用いて測定することができるか、又はＲＮＡがコード遺伝子に対応する場合は、好適な抗体を用いタンパク質産物を検出することができる。これらの方法及び他の方法により遺伝子の発現レベルを決定する方法は、当該技術分野において公知である。
【００７９】
簡潔に興味を引くために、本出願人は、本発明の方法における使用に適した遺伝子産物の可能な全ての組合せを明白に列挙するものではない。それにもかかわらず、あらゆるそのような組合せが企図され、且つ本発明の範囲内であることは理解されるべきである。対照細胞又は参照細胞、例えば形質導入されない細胞と、形質導入された細胞の間で示差的に発現されることがわかっている表２、表３、表４、表６、表７又は表８に列挙された遺伝子産物の任意の組合せが、分析に特に有用であり得ることは、明確に想起される。
【００８０】
特定の実施態様において、本発明は、標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法であって：
（ａ）ウイルスベクター組成物と接触していない標的細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；
（ｂ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞における少なくとも１種の該バイオマーカーの発現レベルを測定する方法；並びに、
（ｃ）工程（ｂ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）に比べ（ｂ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な上方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を含む方法を更に提供する。
【００８１】
「導入遺伝子」により、関心対象の任意の核酸がより明確に意図される。導入遺伝子は、レポーター遺伝子（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ・・・）、任意の遺伝子又は遺伝子部分（複数可）の組合せ、又は関心対象の配列、例えばｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）などであるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
用語「不充分な」品質とは、試験されるウイルスベクター組成物が、形質導入されない細胞と比べ、形質導入された細胞の一部の特徴を改変することを意味する。改変された特徴の例は、非形質導入細胞と比べた形質導入された細胞の増殖及び／又は生存能であるが、これらに限定されるものではない。特にウイルスベクター組成物が、特許出願ＷＯ２０１３／０１４５３７に記載された方法により得られるような、タンジェント流(tangential)限外濾過及びダイアフィルトレーションにより濃縮及び精製された、血清を使わずに作製されたウイルスベクター組成物などの、濃縮及び精製されたウイルスベクター組成物である場合には、これらの特徴は改変されない。
【００８３】
より具体的には、該ウイルスベクター組成物の作製方法は：
−ウイルスベクターがベースとしたＲＮＡウイルスゲノムにおける欠失を相補するように改変された産生細胞をトランスフェクションし、且つウイルスベクター粒子の生成を可能にするのに適した条件下で、産生細胞を培養する工程であって、ここで該トランスフェクション後の培養が、無血清培地において行われる工程；
−該ウイルスベクター粒子を含有する上清を収集する工程；並びに
−上清を、タンジェント流限外濾過及びダイアフィルトレーションにより精製する工程であって、この限外濾過が、好ましくはポリスルホン中空繊維カートリッジ上で操作される工程：を含む。
【００８４】
特にこのウイルスベクター組成物作製方法は、酪酸ナトリウム誘導の工程を含まない。
好都合なことに、この上清収集は、特定の時間間隔で、３〜６回で構成される多工程により実行される。上清の収集に続けて、遠心分離により清澄化される。
本作製方法は、イオン交換クロマトグラフィー工程を更に含んでよい。
【００８５】
この作製方法は、細胞無血清培地に存在する粗ウイルスベクター組成物と比べ、最初のタンパク質夾雑物を２％未満、及び最初のＤＮＡ夾雑物を１０〜３０％、好ましくは１０％未満含有する精製されたウイルスベクター組成物を得ることを可能にする。
【００８６】
特に、該ウイルスベクター組成物は、細胞生存能に影響を及ぼすことなく、標的細胞、特に真核細胞を形質導入することが可能であり、並びに／又は、細胞増殖、生存能、及び／又は幹細胞などの細胞の分化する能力若しくは初代細胞の多能性細胞へ初期化される能力に、ほとんど作用しないか若しくは作用を有さない。
【００８７】
より特定すると、前述の作製方法により得られるウイルスベクター組成物において、物理的粒子数／形質導入単位（ＰＰ／ＴＵ）は、通常１００：１〜９００：１までの間で、好ましくは１００：１〜６００：１までの間で、より好ましくは１００：１〜４００：１までの間で構成される。
標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する現存する方法において、高ＭＯＩでの有意な上方制御は、（ａ）と比較し２倍の上方制御が好ましい。
好都合なことに、少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルは、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により測定することができる。
【００８８】
用語「高ＭＯＩ」は、最適ＭＯＩよりも非常に高いＭＯＩを意味する。高ＭＯＩは、レポーター遺伝子発現するレンチウイルスベクターなどの、レポーター遺伝子発現するウイルスベクターを使用し、幅のあるＭＯＩにより決定される。レポーター遺伝子は、ＧＦＰなどの蛍光レポーター遺伝子又はルシフェラーゼなどの発光レポーター遺伝子であるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
好ましくは、高ＭＯＩは：
−非許容細胞に関して、最適ＭＯＩの少なくとも３倍、
−許容細胞に関して少なくとも４倍：に相当している。
例えば、包皮線維芽細胞などの線維芽細胞に関する高ＭＯＩは、少なくとも１２０、例えば１５０である。
【００９０】
標的細胞への導入遺伝子伝達のためのウイルスベクター組成物の品質を評価する方法は：
（ｄ）ウイルスベクター組成物と接触していない標的細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；
（ｅ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞における少なくとも１種の該バイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｆ）工程（ｅ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの有意な下方制御は、ウイルスベクター組成物の品質が不充分であることの指標となる工程を、更に含むことができる。
【００９１】
より特定すると、最適ＭＯＩでの有意な下方制御は、（ｄ）と比較し１．５倍の下方制御である。
好都合なことに、少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルは、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により測定することができる。
【００９２】
本発明の方法は：
（ｇ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞におけるＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに
（ｈ）工程（ｇ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ａ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ａ）と比べ（ｇ）においてバイオマーカー（複数可）の有意な示差的発現が、検出されるべきではない工程を更に含むことができる。
このバイオマーカー（複数可）の有意な示差的発現は、高ＭＯＩであっても検出されない。
【００９３】
用語「対照ウイルスベクター組成物」は、高度に濃縮され且つ精製されたウイルスベクター組成物を意味する。これは、単独の又は連続するタンジェント流限外濾過ダイアフィルトレーションにより、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーにより得ることができるが、これらに限定されるものではない。好ましい本発明の実施態様において、対照ウイルスベクター組成物は、特許出願ＷＯ２０１３／０１４５３７（例えば、このＰＣＴ出願の「バッチＣ」参照）及び／又は前述のものに説明された製造プロセスなどにより得られる。
【００９４】
本発明の方法は：
（ｊ）対照ウイルスベクター組成物と接触した後の標的細胞におけるＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｋ）工程（ｊ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｄ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御が、検出されるべきである工程を更に含むことができる。
【００９５】
より特定すると、（ｄ）に比べ（ｊ）におけるバイオマーカー発現レベルの潜在的下方制御は、高ＭＯＩでの（ｄ）に比べ（ｅ）におけるバイオマーカー発現レベルの下方制御よりも少なくとも１．５倍低い。
【００９６】
本発明の方法は、予めウイルスベクター組成物及び対照ウイルスベクター組成物の力価決定の工程を、更に含むことができる。
一般にウイルスの、及び特にレンチウイルスベースのベクターの力価は、力価決定に使用される方法及び細胞によって左右される。遺伝子組込み及び遺伝子発現への細胞の進入から形質導入経路の工程を達成することが可能であるベクター粒子の定量は、ベクターそれ自身及び細胞の特徴によって決まる。
【００９７】
ベクター力価決定に使用される細胞に関して、全ての細胞型の許容度は同等ではないことが明らかにされているので、標的細胞は直ちに許容状態にあることを確保することは重要である。別の点は、形質導入効率は、任意の導入遺伝子及びベクターに関して信頼できる量で経時的に容易にモニタリングされなければならないことである。従って各力価決定実験において、標準ＧＦＰ発現するレンチウイルスベクターは、前述の材料及び方法に従うベクターの連続希釈物による、ＨＣＴ１１６形質導入後、ＦＡＣＳ（形質導入単位の数値／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表される）及びｑＰＣＲ（組み込まれたゲノムの数／ｍｌ（ＩＧ／ｍｌ）で表される）の両方により、有効単位に関して定量される。両方の結果は、形質導入に有効な粒子の相対数をもたらすが、それらの各絶対値は、ＰＣＲそれ自身及び増幅に使用される標的配列に応じて決まり、同じ力価を生じない。これらのデータは、標準化された方法が存在しない機能的力価を基にこれらの異なるアプローチを正確に比較することは困難であり得ることを示している。従って現在の方法において対照ウイルスベクター組成物を含むことは、興味深い。従って該対照ウイルスベクター組成物は、好ましくは既知の力価及び規定の標的細胞型を伴う参照バッチである。
【００９８】
並行して、総粒子の決定が、ゲノムＲＮＡを含まないもの及び／又はエンベロープタンパク質を欠いているものであっても、Ｐ２４  ＥＬＩＳＡキットにより定量され、総ベクター粒子が概算される。両方の力価は、総粒子を反映している物理的粒子数ＰＰと、実際の形質導入能をもたらす生物学的力価の間の比を決定するために有用である。この比は、ベクターの純度及び完全性の概算をもたらす。ベクターの完全性又は感染度を反映するために、別の比が使用され、これは１ｎｇのＰ２４当たりのＩＧの数（Ｐ２４の１ｎｇは１０７  ＰＰに相当する）として表される。
【００９９】
好都合なことに、本発明の方法は、細胞が集密に到達する前に、バイオマーカー発現レベルの測定を行う。
好ましくは、標的細胞は、真核細胞であり、且つレンチウイルスベクター組成物により形質導入される。
【０１００】
本発明の実践において前述のバイオマーカーの（増加した、減少した）発現レベルを決定するために、当該技術分野において公知の任意の方法を利用することができる。一つの好ましい本発明の実施態様において、本明細書に記載のバイオマーカーに特異的な「プローブ」又は「プライマー」とハイブリダイズするＲＮＡの検出をベースにした発現が使用される。「プローブ」又は「プライマー」は、相補配列（標的）を含む第二のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対する塩基対であることができる、規定された配列の１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。得られるハイブリッド分子の安定性は、生じる塩基対形成の程度によって決まり、且つプローブと標的分子の間の相補性の程度、及びハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー度などのパラメータにより影響される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー度は、温度、塩濃度、及びホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータにより影響され、且つ当業者に公知の方法により決定される。
【０１０１】
本明細書に記載の核酸のバイオマーカーに特異的なプローブ又はプライマー、又はそれらの一部は、プローブ又はプライマーが使用される目的及び条件に応じて決まり、少なくとも８ヌクレオチドから５００を超えるヌクレオチドまでの任意の整数で、長さが変動してよい。本明細書に記載の核酸のバイオマーカーに特異的なプローブ又はプライマーは、本明細書に記載の核酸バイオマーカーに対し、２０〜３０％よりも大きい配列同一性、又は少なくとも５５〜７５％の配列同一性、又は少なくとも７５〜８５％の配列同一性、又は少なくとも８５〜９９％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を有することができる。プローブ又はプライマーは、例えば増幅により、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから、又はクローニングされたＤＮＡセグメントから誘導されることができ、且つ単独の個体由来の単独の遺伝子の全て又は一部を表しているゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列のいずれかを含むことができる。プローブ又はプライマーは、化学的に合成されてもよい。
【０１０２】
プローブ又はプライマーは、本明細書に記載のように高ストリンジェンシー条件下で、核酸バイオマーカーとハイブリダイズすることができる。本明細書において使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複合混合物中などにおいて、第一の核酸配列（例えばプローブ）が、第二の核酸配列（例えば標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、且つ異なる環境においては異なるであろう。ストリンジェントな条件は、約５〜１０℃であるように選択されてよい。具体的な配列に関しては、規定されたイオン強度ｐＨで、熱融解点（Ｔｍ）よりも低い。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度の下で）であることができる（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍで、平衡状態でプローブの５０％は占拠される）。ストリンジェント条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、並びに温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド以上）については少なくとも約６０℃である条件であることができる。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、又は、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、加えて０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄。
【０１０３】
プローブ又はプライマーは、当業者に公知の方法により、放射性又は非放射性のいずれかにより、検出可能に標識することができる。「検出可能に標識」とは、例えばオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、遺伝子若しくはそれらの断片、又はｃＤＮＡ分子などの分子の存在を印付けし且つ同定するための任意の手段を意味する。分子を検出可能に標識する方法は、当該技術分野において周知であり、且つ放射性標識（例えば32Ｐ又は35Ｓなどの同位体による）、並びに非放射性標識、例えば酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを使用する）、化学発光標識、蛍光標識（例えば、フルオレセインを使用する）、生物発光標識、又はプローブに結合されたリガンドの抗体検出などを含むが、これらに限定されるものではない。同じくこの定義には、間接的手段により検出可能に標識される分子、例えば、後で観察又はアッセイすることができる第二の部分（フルオレセイン標識されたストレプトアビジンなど）に結合される、第一の部分（ビオチンなど）と結合される分子も含まれる。標識はまた、ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも含む。
【０１０４】
プローブ又はプライマーは、例えば核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（例えばＲＴ−ＰＣＲ）による核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析、制限断片多型（ＲＦＬＰ）解析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、及び当業者に公知の他の方法などの、核酸ハイブリダイゼーションが関与するバイオマーカー検出法において使用することができる。
好ましいバイオマーカー検出法は、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）である。
【０１０５】
バイオマーカー発現を決定する核酸ベースのアッセイを使用する好ましい実施態様は、本明細書において同定された１種又は複数のバイオマーカー配列の、非限定的に、アレイとしての固形基板を含む固形支持体上への、又はビーズ若しくは当該技術分野において公知のビーズベース技術への、固定による。あるいは、当該技術分野において公知の溶液ベースの発現アッセイも使用することができる。固定された配列（複数可）は、本明細書に記載のようにポリヌクレオチドの形であってよく、その結果このポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列（複数可）に対応するＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズすることが可能であろう。
【０１０６】
固定されたポリヌクレオチド（複数可）を使用し、形質導入された細胞及び形質導入されない細胞の試料中のバイオマーカー発現署名を決定することができる。固定されたポリヌクレオチド（複数可）は、試料由来の対応する核酸分子に特異的にハイブリダイズするのに(及び、他の核酸分子への検出可能な又は有意なハイブリダイゼーションを排除するのに)十分であることのみ必要とされる。
【０１０７】
ただ１種の又は数種のバイオマーカーが分析される実施態様において、細胞から分離された試料由来の核酸は、好適なプライマーの使用により、優先的に増幅され、その結果分析されるべき遺伝子のみが、その細胞中で発現される他の遺伝子から夾雑するバックグラウンドシグナルを減少するように増幅される。あるいは、複数の遺伝子が分析されるか又は非常にわずかな細胞（若しくは１個の細胞）が使用される場合、試料由来の核酸は、固定されたポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前に、全体的に増幅されてよい。当然ＲＮＡ、又はそれらのｃＤＮＡ対応物は、当該技術分野において公知の方法により、増幅せずに、直接標識し使用することができる。
【０１０８】
バイオチップを、本発明の実践において使用することができる。
特に本発明は、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカー、並びにＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーからなり、そして場合により偏在性遺伝子を伴うバイオチップを提供する。
【０１０９】
このバイオチップは、本明細書に記載の結合されたプローブ又は多数のプローブを含む固形基板を備えることができる。これらのプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列にハイブリダイズすることが可能であってよい。プローブは、基板上の空間的に規定された位置に結合されてよい。１つの標的配列につき２個以上のプローブを使用することができ、これは重複しているプローブ又は特定の標的配列の異なる部分に対するプローブのいずれかである。プローブは、最初に合成され、引き続きバイオチップへ結合されるか、又はバイオチップ上に直接合成されるかのいずれかであってよい。
【０１１０】
固形基板は、プローブの結合又は会合に適した離れた個別の部位を含むように修飾されることができ且つ少なくとも１種の検出方法に適している物質であってよい。基板の代表例は、ガラス及び修飾されたか若しくは機能化されたガラス、プラスチック（アクリル系、ポリスチレン及びスチレンと他の物質のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＪなどを含む）、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はケイ素及び修飾されたケイ素を含むシリカベースの物質、炭素、金属、無機ガラス及び無機プラスチックを含む。これらの基板は、感知できるように蛍光を発しなくとも、光学的に検出することができる。
【０１１１】
バイオマーカー発現はまた、タンパク質のレベルの存在、増加、又は減少の検出を基に測定することができるか、又は活性も使用することができる。抗体ベースの検出方法は、当該技術分野において周知であり、且つ非限定的例として、サンドイッチアッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイに加え、ウェスタンブロット及びフローサイトメーターベースのアッセイを含む。そのような検出方法において使用するための抗体は、表２、表３、表４、表６、表７及び表８のバイオマーカーに特異的に結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。
【０１１２】
好ましくは、そのような検出方法において使用するための抗体は、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカー、並びに／又はＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーに特異的に結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む。
【０１１３】
そのような抗体に加え、それらの断片（非限定的にＦａｂ断片を含む）は、検出可能なシグナルを生じる他のポリペプチドの排除のために、そのようなポリペプチドに特異的に結合するそれらの能力により、細胞中のそのようなバイオマーカーを検出するように機能する。同じ能力を有する組換え抗体、合成抗体、及びハイブリッド抗体も、本発明の実践において使用することができる。
【０１１４】
好ましい実施態様において、バイオマーカー発現はまた、ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定することもできる。本発明はまた更に、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーのプライマー、並びにＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーのプライマーを備えるＲＴ−ｑＰＣＲプレートを提供する。
ＥＲＥＧ（配列番号２）及びＣＸＣＬ２（配列番号１）のためのＲＴ−ｑＰＣＲプレートにおいて使用することができるプライマーの例は、表１０に示している。
【０１１５】
本発明は、ウイルスベクター組成物の品質を評価するために使用することができる標的細胞バイオマーカーの同定及びバリデーションを基にしている。好ましい実施態様において、バイオマーカーは、表２、表３、表４、表６、表７、表８に列挙されたそれらの遺伝子から選択される。以下に詳述するように、３種のバイオマーカーファミリーが同定された：（ｉ）老化に関連したバイオマーカー、（ｉｉ）細胞周期に関連したバイオマーカー、及び（ｉｉｉ）ウイルスベクター組成物の品質に関連することがわかった他のバイオマーカー。
【０１１６】
これらのバイオマーカーを同定するために、遺伝子発現を、下記のように得られた異なるウイルスベクター組成物を用いて決定した。産生細胞は、当業者に周知の標準技術に従い、図１Ｃに説明されたようなプラスミド構築体によりトリトランスフェクションした。そのような技術は、例えば、リン酸カルシウム技術、ＤＥＡＥデキストラン技術、電気穿孔法、浸透圧ショックを基にした方法、微量注入法又はリポソームの使用を基にした方法を含む。本発明の具体的実施態様において、これらの細胞は、カルシウム沈澱法を用いてトランスフェクションされ得る。そのような方法は、２９３Ｔ細胞が選択された産生細胞である場合に好ましいが、同等の細胞を使用することもできる。
【０１１７】
トランスフェクション後、これらの細胞は、バッチＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの作製のために、無血清培地においてインキュベーションされる（図１Ｂ）。バッチＢ−Ｓは、１０％血清と共に作製される（図１Ａ）。細胞は、ウイルス粒子の効率的生成を可能にするのに十分な時間インキュベーションされる。トランスフェクション後のインキュベーション時間は、例えば、使用されるウイルスベクターの種類及び選択された産生細胞株を含む要因の組合せによって決まる。本発明の具体的実施態様において、インキュベーション後複数の収穫を行うことができる。例えば、４以上のベクター収穫を行うことができる。最も生産的なインキュベーション条件を決定するために、小型バッチ実験を行い、ウイルス粒子の最高の力価及び最も純粋なバッチを生じる最適化された条件が決定される。
【０１１８】
ウイルスベクター粒子を含有する最初の培養上清は、本明細書においてバッチＡと称される。バッチＢは、清澄化後の収穫物に対し、遠心分離既製ユニット(ready-to-use unit)を使用する、限外濾過による濃縮工程などの、通常使用される先行技術の濃縮方法（図１Ａ）により得られる。ウイルスベクター組成物を得る方法は、ウイルスベクター粒子の更なる精製のための、バッチＡ生成物のタンジェント流限外濾過ダイアフィルトレーション工程を更に含んでよい。そのような限外濾過ダイアフィルトレーション工程は、そこで静水圧が半透膜に対し液体を強制的に通す膜濾過型である。膜カットオフ値よりも高い分子量の懸濁された固形物及び溶質は保持されるが、水及び膜カットオフ値よりも低い分子量の溶質は、膜を通過する。限外濾過技術は、ポリスルホン中空繊維カートリッジを使用する、タンジェント流フロー限外濾過により実行される。そのような技術は、ベクターの完全性及び生存能を維持することを確証するために、圧力のモニタリング及び適合を可能にする。そのような工程は、ベクター粒子の濃縮を供し、更には収集されたバッチからの宿主細胞のタンパク質及び核酸などの最初の夾雑物を除去するための精製工程として働く。そのようなバッチは、バッチＣと称される。
【０１１９】
更に別の本発明の実施態様において、タンジェント流限外濾過及び／又はダイアフィルトレーション工程後に、ウイルスベクター組成物を得る方法は、ウイルスベクター粒子を更に濃縮及び精製するために実行されるイオン交換クロマトグラフィー工程を更に含むことができる。そのようなバッチは、本明細書においてバッチＤと称される。
【０１２０】
バイオマーカーは、例えば、バッチＢ（プロセスＢにより得られた）、バッチＣ（プロセスＣにより得られた）、バッチＢ−Ｓ（血清を用いプロセスＢにより得られた）、バッチＵＣ若しくはＵＣ−Ｓ（血清の存在下得られ且つ超遠心分離により濃縮された）により形質導入された又は形質導入されない（ＮＴ）ヒト包皮線維芽細胞などの、細胞の核酸を標的化するマイクロアレイ実験を分析することにより、同定される。
【０１２１】
本発明の具体的実施態様において、細胞老化に関与した遺伝子は、ウイルスベクター組成物の品質を決定するのに有用なバイオマーカーとして同定される。老化は、静止状態とは異なり、成長因子に反応しない、細胞周期停止の恒久的状態である(Youngら)。培養された線維芽細胞の複製消耗に関して当初説明されたように、老化は、多量の細胞ストレス時に時期尚早に起こり得ることが示された。細胞老化は、過剰な細胞外又は細胞内ストレスに対する反応として、培養物中及びインビボにおいて起こる。ＤＮＡ損傷反応の誘導及びＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ遺伝子座のクロマチンリモデリングは、老化誘導の背後にある２つの機序である。Liら(2009)は、初期化時の細胞培養条件は、Ｉｎｋ４／Ａｒｆ遺伝子座の発現を増強することを明らかにし、更に増殖及び効果的初期化を可能にするための、この遺伝子座のサイレンシングの重要性を強調した。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃなどの因子の組合せを過剰発現するための高度に精製されたベクター懸濁液を使用することによる老化の制限は、ｉＰＳ細胞作製効率に対し突出した陽性作用を有し、初期化のキネティックス及び出現するｉＰＳ細胞コロニーの数の両方を増大することができる。
【０１２２】
本発明は、標的細胞に対するウイルスベクター組成物の影響を評価するための、老化表現型に関与した遺伝子の使用を開示している。本発明の好ましい実施態様において、細胞老化表現型に関与したバイオマーカーは、表５又は表６に列挙している。
【０１２３】
老化表現型は、細胞増殖の停止に限定されない。老化細胞は、代謝活性があり且つタンパク質発現及び分泌において広範な変化を受けている、潜在的に持続性の細胞であり、最終的には老化関連分泌表現型又はＳＡＳＰを顕在化する(Coppeら、2010)。ＳＡＳＰは、可溶性因子及び不溶性因子のいくつかのファミリーを含む。ＳＡＳＰ因子は、可溶性シグナル伝達因子（インターロイキン、ケモカイン、及び増殖因子）、分泌型プロテアーゼ、及び分泌された不溶性タンパク質／細胞外マトリクス成分であることができる(Coppeら、2010)。老化細胞は、組織の微小環境における変化を誘導することができる変更された分泌活性を顕在化し、細胞挙動に対するその制御を緩和し且つ腫瘍形成を促進する(Coppeら、2010)。細胞培養において、細胞周期停止は、典型的には老化に繋がり、その理由はこの細胞は、血清、栄養素、癌遺伝子などにより過剰刺激されるからである(Blagosklonny, 2011)。本発明は、ウイルスベクター組成物と接触した標的細胞に対するそのような組成物の影響を評価するための、ＳＡＳＰに関与した遺伝子の使用を開示している。好ましい本発明の実施態様において、ＳＡＳＰに関連したバイオマーカーは、表７に列挙されたものを含む。
【０１２４】
本発明の具体的実施態様において、細胞周期に関与した遺伝子は、ウイルスベクター組成物の品質を決定するのに有用なバイオマーカーとして同定されている。細胞分裂は、主にＤＮＡ複製及び複製された染色体の２個の個別の細胞への分配により特徴付けられる、２つの連続するプロセスからなる。最初細胞分裂は、２つの段階に分けられる：有糸分裂（Ｍ）期、すなわち核分裂のプロセス；及び、２つのＭ期の間の間期。有糸分裂の段階は、前期、中期、後期及び終期を含む。顕微鏡下で、間期細胞は、サイズは単純に成長するが、異なる技術は、間期が、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期を含むことを明らかにした。ＤＮＡ複製は、Ｓ期と称される間期の特定の部分で起こる。Ｓ期には、その間に細胞がＤＮＡ合成の準備をするＧ１と称されるギャップが先行し、またＳ期には、その間に細胞が有糸分裂の準備をするＧ２と称されるギャップが続く。Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及びＭ期は、標準の細胞周期の従来の分け方である。Ｇ１の細胞は、ＤＮＡ複製にコミットメントされる前に、Ｇ０と称される休息状態に侵入する。Ｇ０にある細胞は、ヒト体内における成長も増殖もしない細胞の大半を説明する。本発明は、ウイルスベクター組成物と接触した標的細胞に対するそのような組成物の影響を評価するための、細胞周期に関与した遺伝子の使用を開示している。好ましい本発明の実施態様において、細胞周期に関連したバイオマーカーは、表２、表３、表４に列挙されたものを含む。より好ましい本発明の実施態様において、修飾のスクリーニングは、表４に列挙された細胞周期に関連したバイオマーカーの少なくとも１種の発現レベルについて認められる。
【０１２５】
本発明は更に、標的細胞における発現レベルが、使用されるウイルスベクター組成物の品質、すなわち濃縮及び精製に応じて調節されるバイオマーカークラスを開示している。異なる品質を有し且つ異なるプロセスにより得られたウイルスベクター組成物の影響が、新規バイオマーカークラスを選択するために調べられた。これらのウイルスベクター組成物は、図１Ａ及び１Ｂに説明されたプロセスにより得られた。好ましい本発明の実施態様において、表８に列挙された遺伝子の使用は、ウイルスベクター組成物と接触した標的細胞に対するそのような組成物の影響を評価するために使用することができる。
【０１２６】
本発明はまた、形質導入された細胞の試料中のバイオマーカー発現のレベルを測定するキットを提供する。これらのキットは、本明細書に記載のバイオマーカーに対応する１種又は複数の試薬、例えばバイオマーカーに特異的に結合する抗体、バイオマーカー特異的抗体に結合する組換えタンパク質、バイオマーカーとハイブリダイズする核酸プローブ又はプライマーなどを備えることができる。一部の実施態様において、これらのキットは、例えばアレイ上に、本明細書に記載のバイオマーカーに対応する複数の試薬を備えることができる。これらのキットは、検出試薬、例えば検出可能に標識される試薬を備えることができる。これらのキットは、ウイルスベクター組成物の品質を予測する際に、キットの使用に関する文書による指示書を備えることができ、並びに対照又は参照標準、洗浄液、解析ソフトウェアなどの他の試薬及び情報を備えることができる。
【０１２７】
本発明は、ウイルスベクター組成物により形質導入された真核細胞における核又は細胞反応をスクリーニング又は検出する方法であって、（ｉ）ウイルスベクター組成物と接触していない真核細胞における１種又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；（ｉｉ）該ウイルスベクター組成物と接触した後の真核細胞における１種又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程；並びに、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）における該バイオマーカー（複数可）発現を、工程（ｉ）におけるバイオマーカー（複数可）発現と比較する工程であって、ここで（ｉ）と（ｉｉ）の間のバイオマーカー発現レベルの変化は、細胞反応を示し、且つここで該細胞反応は、ウイルスベクター組成物の品質と相関している工程を含む方法を、開示している。好ましい本発明の実施態様において、発現された１種又は複数のバイオマーカーは、ウイルスベクター組成物と接触された真核細胞内で発現された核酸である。
【０１２８】
別の本発明の実施態様において、発現された１種又は複数のバイオマーカーは、ウイルスベクター組成物と接触された真核細胞内で発現されたポリペプチドである。
本発明の具体的実施態様において、バイオマーカーは、老化の生物学的プロセスに関与した遺伝子である。好ましくは、老化に関与したバイオマーカーは、ＳＡＳＰファミリーの遺伝子である。より好ましくは、バイオマーカーは、表７から選択される。
【０１２９】
本発明の具体的実施態様において、バイオマーカーは、細胞周期ファミリーの遺伝子である。特に、バイオマーカーは、表２、表３、表４から選択された遺伝子である。より特定すると、バイオマーカーは、表８に列挙された遺伝子から選択される。
本発明の別の実施態様において、バイオマーカーは、表２、表３、表４、表７及び／又は表８から選択される。
【０１３０】
本発明の一実施態様において、ウイルスベクター組成物は、真核細胞へ形質導入される。本発明の別の実施態様において、真核細胞は、レンチウイルスベクター組成物により形質導入される。本発明の具体的実施態様において、真核細胞は、不死化細胞、初代細胞又は幹細胞である。
【０１３１】
本発明は、請求項１に記載の真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用を測定又は検出する方法であって：
（ｉ）該細胞を、関心対象のウイルス組成物と接触させる工程；
（ｉｉ）該培養された細胞におけるバイオマーカー発現のレベルを測定する工程；並びに
（ｉｉｉ）任意に該細胞における核の改変又は細胞質発現に特異的なバイオマーカーを特徴付ける工程：を含む方法を、開示している。
【０１３２】
本発明は、ウイルスベクター組成物の形質導入に関連したバイオマーカーの発現を測定するキットであって、表２、３、４、５、６、７又は８のバイオマーカーの認識に対応する１種又は複数の試薬を備えているキットを、開示している。好ましくは、この試薬は、表２、３、４、５、６、７又は８のバイオマーカーをコードしている核酸の認識に対応している。より好ましくは、この試薬は、表２、３、４、５、６、７又は８のポリペプチドの認識に対応している。
【０１３３】
好ましい実施態様において、キットは、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１種又は複数の試薬を備える。
好都合なことに、該キットは、ＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）及びＴＴＫ（配列番号２１）からなる群から選択される少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベルを測定することができる１又は複数の試薬を更に備える。
好ましくは、該キットは、対照ウイルスベクター組成物を更に備えることもできる。
【０１３４】
本発明は、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８に存在する遺伝子又はポリペプチドの中から選択された生成物の少なくとも１種を含む、真核細胞に対するウイルスベクター組成物の作用の測定又は検出に有用なバイオマーカー組成物を開示している。好ましくは、このバイオマーカー組成物は、表３、表４、表７、表８に存在する遺伝子又はポリペプチドの中から選択された生成物の少なくとも１種を含む。
図面及び表を参照し、下記実施例が示される。
【０１３５】
【表１】
0006334525.tif 000002
表１。ＲＴ−ｑＰＣＲバリデーションに使用したプライマー。試験した遺伝子及びＧＡＰＤＨ参照遺伝子（それらの各遺伝子記号により表した）の各々に関して、フォワードプライマー及びリバースプライマーの配列を示している。
【０１３６】
【表２−１】
0006334525.tif 000003
【表２−２】
0006334525.tif 000004
【表２−３】
0006334525.tif 000005
【表２−４】
0006334525.tif 000006
【表２−５】
0006334525.tif 000007
【表２−６】
0006334525.tif 000008
【表２−７】
0006334525.tif 000009
【表２−８】
0006334525.tif 000010
【表２−９】
0006334525.tif 000011
【表２−１０】
0006334525.tif 000012
【表２−１１】
0006334525.tif 000013
【表２−１２】
0006334525.tif 000014
【表２−１３】
0006334525.tif 000015
【表２−１４】
0006334525.tif 000016
【表２−１５】
0006334525.tif 000017
【表２−１６】
0006334525.tif 000018
【表２−１７】
0006334525.tif 000019
【表２−１８】
0006334525.tif 000020
【表２−１９】
0006334525.tif 000021
【表２−２０】
0006334525.tif 000022
【表２−２１】
0006334525.tif 000023
【０１３７】
表２。非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でｃＤＮＡを欠くｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞において下方制御された細胞周期遺伝子。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジーセンター）からの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）遺伝子オントロジー（ＧＯ）「有糸分裂細胞周期のＭ期」カテゴリー、（６）ＧＯ「Ｇ１期」カテゴリー、（７）ＧＯ「Ｇ２期」カテゴリー、（８）ＧＯ「Ｓ期」カテゴリー、（９）ＧＯ「有糸分裂細胞周期のＧ１／Ｓ転移」カテゴリー、（１０）ＧＯ「有糸分裂細胞周期のＧ２／Ｍ転移」カテゴリー、（１１）ＧＯ「有糸分裂細胞周期のＭ／Ｇ１転移」カテゴリー。遺伝子は、非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞における倍数変化を増加する値により、選別される。
【０１３８】
【表３】
0006334525.tif 000024
【０１３９】
表３。「細胞周期」遺伝子オントロジーカテゴリーにおいて注記された遺伝子であり、且つ非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞において上方制御された遺伝子。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩからの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  Ｐｒｏｔｅｉｎからのタンパク質配列寄託番号。遺伝子は、倍数変化を減少する値により、選別される。
【０１４０】
【表４】
0006334525.tif 000025
【０１４１】
表４。「細胞周期」遺伝子オントロジーカテゴリーにおいて注記された遺伝子であり、且つ非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ４０及び１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢにより形質導入された細胞において下方制御された遺伝子、及びＭＯＩ４０ではなくＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣにより形質導入された細胞において下方制御された遺伝子。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩからの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  Ｐｒｏｔｅｉｎからのタンパク質配列寄託番号。
【０１４２】
【表５−１】
0006334525.tif 000026
【表５−２】
0006334525.tif 000027
【表５−３】
0006334525.tif 000028
【表５−４】
0006334525.tif 000029
【０１４３】
表５。公衆にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ６１５と称される「老化及び自己貪食」経路の一部であるか、又は老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）として特徴付けられるとして文献から抽出されるかのいずれかである、細胞老化に関連した遺伝子のリスト。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＳＡＳＰの一部の遺伝子、（３）「老化及び自己貪食」Ｗｉｋｉｐａｔｈｗａｙに含まれる遺伝子、（４）Ｃｏｐｐｅらの文献（２０１０）からＳＡＳＰに関連するとして抽出された遺伝子、（５）Ｙｏｕｎｇらの文献（２００９）からＳＡＳＰに関連するとして抽出された遺伝子。［本発明者らが、使用した遺伝子の最新のリストの給源として単にＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙを引用する場合、本発明者らの遺伝子を表中に列挙する。本発明者らは、今後の検索に関しては、Ｗｉｋｉｐａｔｈｗａｙにのみ頼ることはできない。本明細書に引用するものはいずれも、出願日時点で恒久的なものである。］。
【０１４４】
【表６】
0006334525.tif 000030
【０１４５】
表６。非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において示差的に発現されるが、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞において示差的に発現されない遺伝子である、細胞老化関連遺伝子（公にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ６１５と称されるヒト「老化及び自己貪食経路」の一部であるか、又は文献から抽出されたＳＡＳＰ遺伝子リストの一部のいずれかである（表５））。「示差的でない」とは、ＦＣ絶対値が＜１．３であることを意味する。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩからの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  Ｐｒｏｔｅｉｎからのタンパク質配列寄託番号。
【０１４６】
【表７】
0006334525.tif 000031
【０１４７】
表７。１０種の細胞老化関連バイオマーカー。これらの遺伝子は、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において示差的に発現されるが、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞において示差的に発現されない遺伝子であるとして、表６から選択された。「示差的でない」とは、ＦＣ絶対値が＜１．３であることを意味する。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩからの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  Ｐｒｏｔｅｉｎからのタンパク質配列寄託番号、（６）から（１１）形質導入されない対照条件と比べ、各形質導入された条件における倍数変化値。ＮＤ：統計学的に示差的でない。ＦＣ  Ｂ−Ｓ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｃ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＣにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０でバッチＢにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｃ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０でバッチＣにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ−Ｓ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０  でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。
【０１４８】
【表８】
0006334525.tif 000032
【０１４９】
表８。高品質ベクターにより影響を受けない遺伝子の選択。（１）ＨＵＧＯ遺伝子記号、（２）ＮＣＢＩからの遺伝子説明、（３）Ａｇｉｌｅｎｔプローブ識別子、（４）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡからの核酸配列寄託番号、（５）ＮＣＢＩデータベースＲｅｆＳｅｑ  Ｐｒｏｔｅｉｎからのタンパク質配列寄託番号、（６）から（１１）形質導入されない対照条件と比べ、各形質導入された条件における倍数変化値。ＮＤ：統計学的に示差的でないことを意味する。ＦＣ  Ｂ−Ｓ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｃ対ＮＴ  ＭＯＩ１５０：Ｍ非形質導入細胞に対する、ＯＩ１５０でバッチＣにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０でバッチＢにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｃ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０でバッチＣにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。ＦＣ  Ｂ−Ｓ対ＮＴ  ＭＯＩ４０：非形質導入細胞に対する、ＭＯＩ４０  でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞の間で得られた倍数変化。
【０１５０】
【表９】
0006334525.tif 000033
【０１５１】
表９。ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ  ＭＯＩ４０によるバイオマーカーとしての表４の細胞周期遺伝子のバリデーション。
【０１５２】
【表１０】
0006334525.tif 000034
【０１５３】
表１０。バリデーション実験に使用したプライマーの配列。
【実施例】
【０１５４】
下記の実施例は、本発明のより良い理解を助けるために提供されるが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１５５】
材料及び方法
プラスミド構築。３種のプラスミドを使用し、組換えビリオン又は組換えレトロウイルスを作製した。第一のプラスミドは、ウイルスのｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子をコードしている核酸を提供する（図２Ａ）。これらの配列は、先に考察したように、各々、グループ特異的抗原及び逆転写酵素（並びに成熟及び逆転写に必要な酵素インテグラーゼ及びプロテアーゼ）をコードしている。第二のプラスミドは、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧ）などの、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）をコードしている核酸を提供する（図２Ｂ）。第三のプラスミドは、ウイルスの生活環に必要なシス−作用性ウイルス配列を提供する（図２Ｃ）。この第三のプラスミドはまた、標的細胞へ形質導入されるべき異種核酸配列のクローニング部位も含む。導入遺伝子としてのＧＦＰを伴う、好適なベクターの概略図は図２Ｃに示すが、これは、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡなどの関心対象の遺伝子又は配列により置き換えることができる。
【０１５６】
ウイルスベクター作製プロセス。細胞株及び培養条件。ウイルスベクターを、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株を用いて作製した。ヒト結腸癌腫（ＨＣＴ１１６；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）接着細胞株を、感染粒子の定量に使用した。全ての細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）により提供され、且つ１０％ＦＣＳ；１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミン（ＰＡＡ社）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社、パイスレイ、英国）において、空気中５％ＣＯ2の加湿大気下で、３７℃で培養した。ウイルスベクター上清の作製のためには、ＤＭＥＭに、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミン（ＰＡＡ社）のみを補充した。
【０１５７】
ウイルスベクター作製。ウイルスベクター作製は、１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（６３２０ｃｍ2、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）において行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ；１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミン（ＰＡＡ社）を補充したＤＭＥＭ中に、９．５×１０3個生存細胞／ｃｍ2で播種し、空気中５％ＣＯ2の加湿大気内で、３７℃で配置した。播種の４日後、上清を廃棄し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミン（ＰＡＡ社）を補充したＦＣＳを含まない新鮮なＤＭＥＭと交換し、その後細胞をトランスフェクションした。
【０１５８】
トリトランスフェクション混合物を、下記の３種のプラスミドにより構成した：ｐＥＮＶ、ｐＧａｇＰｏｌ（各々、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４４８７及びＣＮＣＭ  Ｉ−４４８８で、ＣＮＣＭコレクションに寄託された細菌宿主に含まれたウイルスＤＮＡ構築体）、及びｐＬＶ−ＥＦ１（寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４４８９でＣＮＣＭコレクションに寄託された細菌宿主に含まれたものから誘導されたウイルスＤＮＡ構築体）。この最終濃度は、滅菌水を用い、４０ｍｇ／ｍｌに調節した。その後ＣａＣｌ2（２．５Ｍ）を、柔軟なチェッキング(soft checking)下で、最終濃度５００ｍＭに達するまで、プラスミド−水混合物中に滴下した。次に得られた混合物を、等容量のＨｅｐｅｓ緩衝塩類溶液（ＨＢＳ  ２×）へ滴下し、室温で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、このトランスフェクション混合物を、細胞培養培地へ添加し、空気中５％ＣＯ2の加湿大気内で、３７℃で２４時間インキュベーションした。
【０１５９】
トランスフェクションの２４時間後、上清を廃棄し、新鮮な補充しないＤＭＥＭと交換し、細胞を空気中５％ＣＯ2の加湿大気内で３７℃でインキュベーションした。培地交換後、上清を数回収集した（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。若干量の新鮮且つ非補充培地を添加し、細胞を空気中５％ＣＯ2の加湿大気中で３７℃でインキュベーションし、その後更に収穫した。
【０１６０】
各収穫物を、３０００ｇで、５分間の遠心分離により清澄化し、その後細孔サイズ０．４５μｍの滅菌フィルターユニット（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して精密濾過した。その後収穫物の全てのセットをプールし、バッチＡ（粗ウイルスベクター組成物）を得るための粗収穫物に供した。
【０１６１】
ウイルスベクター濃縮及び精製。本発明のバイオマーカーを同定するために使用されるウイルスベクター組成物は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれているＰＣＴ出願ＷＯ２０１３／０１４５３７に説明されたように、中央ユニットでの超遠心分離若しくは遠心分離のいずれかを基にした標準及び常用の濃縮プロセス（バッチＢの入手に対応する）、又は無血清作製プロセス（バッチＡの入手に対応する）に関連した濃縮及び／若しくは精製プロセス（Ｃ及びＤ）により得られる。別のバッチＵＣ（又はＵＣ−Ｓ）は、血清の存在下で得られ、バリデーション実験のために作製し、且つ超遠心分離により濃縮した。異なるバッチは、未精製から限外濾過及びクロマトグラフィーを基にした数回の精製工程まで及ぶ、異なる精製戦略に対応した。粗収穫物の濃縮及び精製は、最初にポリスルホン中空繊維カートリッジを使用するタンジェント流限外濾過により行った。その後上清を、ＤＭＥＭ又はＴＳＳＭ緩衝液に対する連続モードのダイアフィルトレーションにおいて、２０倍ダイア容積で、ダイアフィルトレーションした。一旦ダイアフィルトレーションを行ったならば、残余分を回収し、使い捨て限外濾過ユニットにおいて更に濃縮した。次に中空繊維濾過（ＨＦＦ）の残余分を、最終濃度（７２Ｕ／ｍｌ）のベンゾナーゼ(Benzonase)（２５０Ｕ／μｌ））、及び最終濃度１μＭのＭｇＣｌ2（１．０ｍＭ）の添加により、ベンゾナーゼ処理し、その後３７℃で２０分間インキュベーションした。
【０１６２】
ＨＦＦ後の物質を、ＡＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用し、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ７５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）使い捨て膜上での、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）により、更に精製することができる。このイオン交換膜は、５倍カラム容量の非補充ＤＭＥＭ（又はＴＳＳＭ）により、２ｍｌ／分で、平衡化される。その後ウイルス上清を、サンプリングループを使用し、２ｍｌ／分でこの膜上に装加した。フロースルーを収集した。下記のフロー段階勾配を、ＡＫＴＡシステムに適用することができる：０Ｍ、０．５Ｍ、１．２Ｍ及び２Ｍ  ＮａＣｌ。溶出ピック（１．２Ｍ  ＮａＣｌ段階勾配で収集）を、直ちに、下記の緩衝液中に、１０×希釈し：２０ｍＭトリス＋１．０％ｗ／ｖショ糖＋１．０％ｗ／ｖマンニトール、ｐＨ７．３、且つ限外濾過使い捨てユニット上で更に濃縮した。
【０１６３】
ウイルスベクター組成物。ウイルスベクター組成物を、その全体が引用により本明細書中に組み込まれているＰＣＴ出願ＷＯ２０１３／０１４５３７に記載された方法により入手した。得られる組成物は：
−バッチＡの中央ユニットでの遠心分離後に得られたバッチＢ；
−バッチＡのタンジェント流限外濾過ダイアフィルトレーション後に得られたバッチＣ；
−１０％ウシ胎仔血清（ＢＩＯＷＥＳＴ社）存在下で作製されたバッチＡのタンジェント流限外濾過ダイアフィルトレーション後に得られたバッチＣ−Ｓ。このバッチは図１３のためのみに使用した；
−血清を使わずにバッチＢと同じプロセスにより、１０％ウシ胎仔血清（ＢＩＯＷＥＳＴ社）の存在下で得られたバッチＢ−Ｓ；
−１０％ウシ胎仔血清（ＢＩＯＷＥＳＴ社）の存在下得られ、超遠心分離により濃縮されたバッチＵＣ又はＵＣ−Ｓ。
これらのバッチを得るために使用したプロセスは、図1A及び1Bに説明している。
【０１６４】
ｑＰＣＲを使用する機能的粒子の定量。形質導入単位力価決定アッセイを、下記のように行った。ＨＣＴ１１６細胞を、９６−ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞１２５００個、並びに１０％ＦＣＳ；１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％ウルトラグルタミンを補充したＤＭＥＭ（完全培地）２５０μＬに播種した。２４時間後、各ベクター試料に関して及び内部標準としての既知のｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ（寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４４８９で、ＣＮＣＭコレクションに寄託された細菌宿主に含まれたウイルスＤＮＡ構築体）に関して、完全培地により５回連続希釈した。これらの細胞を、ポリブレン（登録商標）（Ｓｉｇｍａ社）８μｇ／ｍＬの存在下での、これらの連続希釈により、形質導入した。各試料シリーズに関して、非形質導入細胞の１個のウェルを、対照として加えた。形質導入後３日目に、細胞を、トリプシン処理し、各細胞ペレットを、ＰＢＳ  ２５０μＬ中により溶かし、ゲノムＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲに供した。結果を、細胞浮遊液１００μＬを用い、予めＦＡＣＳにより力価決定した既知のｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ内部標準に対して正規化した。力価は、陽性細胞の割合を考慮し、標準条件を用い、その力価がＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ  ＩＩ）により予め決定されている内部標準を使用し、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍＬ）で表される。
【０１６５】
ｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイによる物理的粒子の定量。ｐ２４コア抗原を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から提供されるＨＩＶ−１  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキットにより、ウイルス上清について直接検出した。このキットは、供給業者により特定されたように使用した。捕獲された抗原は、ＨＩＶ−１  ｐ２４に対するビオチニル化ポリクローナル抗体と複合させ、引き続きストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）複合体と複合させた。得られた複合体を、捕獲されたｐ２４の量と正比例して黄色を呈するオルト−フェニレンジアミン−ＨＣｌ（ＯＰＤ）とのインキュベーションにより検出した。各マイクロプレートウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定し、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原標準曲線の吸光度に対して較正した。ｐ２４  １ｐｇは、１０4個の物理的粒子に相当することが分かっているので、１ｍｌ当たりの物理的粒子により表されたウイルス力価を、ｐ２４量から算出した。
【０１６６】
マイクロアレイ分析のためのエンプティカセットベクターの作製。ｃＤＮＡを欠くレンチウイルスベクター（ｒＬＶ−ＥＦ１）を、マイクロアレイ試験のために異なる純度で作製した。ｒＬＶ−ＥＦ１ベクターのバッチＢ及びバッチＣを、同じ粗収穫物から精製した。血清を含むＢバッチを作製するために、追加の作製を１０％ウシ胎仔血清（ＢＩＯＷＥＳＴ社）の存在下で行い、これを以後Ｂ−Ｓバッチと称する。
【０１６７】
ＧＦＰ発現しているレンチウイルスベクターの作製。ＧＦＰ発現しているレンチウイルスベクターの独立したバッチＢ、Ｃ、Ｂ−Ｓを、作製した。
低品質の濃縮されたベクターの別の型を提供するために、超遠心分離法を使用し、１０％血清の存在下で作製されたベクターを濃縮した（バッチＵＣ又はＵＣ−Ｓ）。
【０１６８】
包皮細胞の培養。ヒト包皮線維芽細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（番号ＣＲＬ−２０９７）から入手し、且つ１０％ウシ胎仔血清（ＢＩＯＷＥＳＴ社）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ社）及び２ｍＭグルタミン（ＰＡＡ社）を補充したＥＭＥＭ（アール最小必須培地、ＧＩＢＣＯ社）において培養した。細胞を、５％ＣＯ2の存在下３７℃で維持し、且つ５０００個細胞／ｃｍ2で、週２回継代した。
【０１６９】
トランスクリプトミクス解析のための包皮細胞の形質導入。ヒト包皮線維芽細胞を、形質導入の２４時間前に、Ｔ２５−フラスコ中に５０００個細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、最終容量５ｍＬ中、ポリブレン（登録商標）（Ｓｉｇｍａ社）４μｇ／ｍＬの存在下で、ｒＬＶ−ＥＦ１ベクターのバッチＢ、Ｃ及びＢ−Ｓを使用し、ＭＯＩ４０及び１５０で、４つ組で形質導入した。非形質導入対照は、ポリブレン（登録商標）４μｇ／ｍＬのみを受け取った。およそ１６時間後、形質導入上清を除去した。細胞を、形質導入後５４時間でトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、ペレットを−８０℃で保存した。形質導入後４８時間に写真撮影した。
【０１７０】
ヒト包皮線維芽細胞を、ヒト包皮線維芽細胞を、形質導入の２４時間前に、６ウェル−マルチプレート中に５０００個細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、最終容量５ｍＬ中、ポリブレン（登録商標）（Ｓｉｇｍａ社）４μｇ／ｍＬの存在下で、ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターのバッチＢ、Ｃ、Ｂ−Ｓ及びＵＣ（又はＵＣ−Ｓ）を使用し、ＭＯＩ４０及び１５０で、４つ組で形質導入した。非形質導入対照は、ポリブレン（登録商標）４μｇ／ｍＬのみを受け取った。およそ１６時間後、形質導入上清を除去した。細胞を、形質導入後５４時間でトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、ペレットを−８０℃で保存した。形質導入後４８時間に写真撮影した。
【０１７１】
ＲＮＡ抽出。総ＲＮＡ試料を、ＴＲＩＺｏｌ（登録商標）プラスＲＮＡ精製システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の指示に従い使用し、細胞ペレットから抽出した。総ＲＮＡ濃度及び純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて決定した。ＲＮＡ品質及び完全性は、アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）によりチェックし、アジレントマイクロアレイの必要要件に合わせた。
【０１７２】
ＤＮＡマイクロアレイ実験。マイクロアレイ実験を、Ｂｉｏｃｈｉｐｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｐｏｌｅ、ツールーズ大学、ＩＮＳＡ、ＵＰＳ、ＩＮＰ、ＣＮＲＳ及びＩＮＲＡ（ツールーズ、仏国）で、製造業者のプロトコールに従い行った。簡単に述べると、品質管理チェックのための一色ＲＮＡスパイク−インキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）からの外来性ＲＮＡの希釈物を添加した後、総ＲＮＡ  １００ｎｇをｃＲＮＡへ変換し、アジレント低投入量迅速増幅キットを用い、増幅し、且つシアニン３標識した。シアニン３標識したｃＲＮＡ  １６５０ｎｇを、２７９５８種の遺伝子を標的化している４４０００プローブ（長さ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドからなる）を含むアジレント全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ４ｘ４４Ｋバージョン２へ、１０ｒｐｍで、６５℃で１７時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズされたアレイを洗浄し、アジレント高解像度スキャナＧ２５０５Ｃ上で走査し、その画像をＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  １０．１０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて解析した。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＱＣレポートを基にした品質管理の後、１条件につき複製物３又は４を保持した。ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰによるバリデーション実験に関して、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎバージョン１１．５を使用した。
【０１７３】
マイクロアレイデータの統計解析。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎからの生データセットを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）ＧＸ  １２ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）へインポートし、且つ７５パーセンタイル法を用いて正規化した。その後Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎデータをインポートした場合には、プローブを、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）に帰属したフラッグ値によりフィルタリングした（各プローブに関して、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）デフォルトパラメータを使用し、下記のフラッグの一つが影響された：「検出された」、「検出されない」、又は「損なわれる(compromised)」）。少なくとも１つの条件において６０％を超える複製物において検出されたプローブ及び「損なわれない」プローブを、保持した（検出されないか又は損なわれたスポットは除去）。全ての試料の中央値へ、強度値のベースライン変換を、プロファイルプロットの代表について適用した。これは、各プローブに関して、全ての試料からの対数でまとめた値(log summarized value)の中央値を計算し、且つ各試料から減算することを意味する。各条件と対照条件の間で示差的に発現されたプローブを同定するために、独立したｔ−検定を、ベンジャミーニ−ホッホベルグ多重検定相関により、補正したｐ−値＜０．０５で行った。倍数変化（ＦＣ）の絶対値≧１．５を伴うプローブを、上方制御されたプローブ及び下方制御されたプローブの両方について示差的に発現されたとして保持した。
【０１７４】
マイクロアレイデータ機能解析。Ａｇｉｌｅｎｔ社により提供され且つＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）に含まれた注釈は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）の「テクノロジー」と称され、２６６５２バージョン２０１２．１．１０と命名されるデータベースを基にしている。各プローブに関して、他のデータの中でも、遺伝子記号、説明、遺伝子オントロジー用語、ＲｅｆＳｅｑ  ＲＮＡ寄託番号を含む、異なる型の注釈が提供される。プローブは、同じ遺伝子のいくつかの代替転写物を標的化することができるが、ただ一つのＲｅｆＳｅｑ転写物が各プローブに関連付けられることは留意すべきである。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）ＧＸ  １２に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）選択肢を使用し、ヒト全ゲノムと比べ、示差的に発現されたプローブのリストにおいて表された最も有意な生物学的プロセス（補正されたｐ−値＜０．１）を決定した。パスウェイ分析を使用し、関心対象の実体間の直接の関係を認めた。これは、「単実験分析(Single Experiment Analysis)」アルゴリズムによりＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  （登録商標）において行った。選択されたヒトパスウェイ給源は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）ＧＸ  １２にデフォルトで含まれるＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙｓにおいて参照されるキュレートされた(curated)パスウェイであった。ｐ−値＜０．０５及び最小数５個の遺伝子のパスウェイを、保持した。
【０１７５】
相対定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）。各試料由来の総ＲＮＡの合計１μｇを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びオリゴ（ｄＴ）12-18を、製造業者の指示に従い使用し、逆転写した。その後ｃＤＮＡ生成物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のためのＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘｅｓ及びＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（ベルギー）により合成された特異的プライマーと混合した。ＧＡＰＤＨを、内部対照として使用し、転写物レベルを正規化した。全てのプライマーを、プライマー３ソフトウェアバージョンＶ．０．４．０を用いて設計し、それらの特徴を表１にまとめている。リアルタイムＰＣＲを、少なくとも２つの独立した試料から、２つ組で、ＳｔｅｐＯｎｅ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて実行し、２−ΔΔＣＴ法により相対量を算出した(Livakら、2001)。バリデーション実験のために、表１０に列記した追加のプライマーを使用し、ＲＴ−ｑＰＣＲを、３つの独立した試料から、２つ組で行った。遺伝子の示差的発現の有意性を評価するために、対応のないスチューデントｔ−検定を行い、各条件間でΔΔＣｔ値を比較し、ｐ−値カットオフは０．０５であった。
【０１７６】
結果
候補バイオマーカーの同定
高度に精製されたウイルスベクター組成物、対、通常に濃縮されたウイルスベクター組成物により形質導入された培養細胞の増殖に対する影響。純度レベルに従い且つ任意の導入遺伝子から独立したウイルスベクター形質導入作用を評価するために、包皮線維芽細胞を、同じ粗収穫物（バッチＡ）に由来し、且つそれらの特徴を図１Ａにまとめた、２つのｒＬＶ−ＥＦ１（ｃＤＮＡを欠く）組成物であるバッチＢ及びバッチＣ（前記）により、ＭＯＩ４０及び１５０で形質導入した。細胞は、図２Ｂに示したように、形質導入後４８時間で観察した。
【０１７７】
わずかな成長の遅延が、非形質導入細胞と比べ、バッチＢにより形質導入された細胞によりＭＯＩ４０で、認められたが、同じＭＯＩでバッチＣ形質導入後は、成長の差は認められなかった。
【０１７８】
従って、通常のＭＯＩ（ＭＯＩ４０は、通常包皮形質導入に使用される）が、高度に精製されたウイルスベクター組成物（バッチＣ）は、形質導入された細胞の成長に関して目視できる作用を誘導しなかったのに対し、通常に濃縮されたウイルスベクター組成物（バッチＢ）は、形質導入された細胞の成長に対し負の影響をもたらすように見える。
【０１７９】
ＭＯＩ１５０では、非形質導入細胞と比べ、バッチＢにより形質導入された細胞において、強力な増殖停止が認められたが、バッチＣによっては、本発明者らは中等度の成長の遅延のみを認めた。
【０１８０】
高度に精製されたウイルスベクター組成物、対、通常に濃縮されたウイルスベクター組成物により形質導入された細胞のトランスクリプトミクス細胞に対する影響。例のように、通常に濃縮されたウイルスベクター組成物とは、血清を用い得られたバッチＢ（Ｂ−Ｓ）を意味する。転写レベルでの基礎となる変化を調べるために、これらの細胞を、形質導入後５４時間で収集した。この５４時間の形質導入後遅延は、非形質導入細胞に対し形質導入された細胞において成長の遅延が明らかにされた時点と、非形質導入細胞が集密に到達した時点の間（データは示さず）であるとして、予備試験から適切であると決定した。ＲＮＡは、抽出し、且つほぼ全てのヒト転写物の定量を可能にする、アジレント全ヒトゲノムマイクロアレイを実行するために使用した。
【０１８１】
ＭＯＩ１５０で認められた転写の変化。最初に、ＭＯＩ１５０で、ｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びｒＬＶ−ＥＦ１バッチＣにより形質導入された細胞由来のＲＮＡレベルを、非形質導入細胞由来のＲＮＡと比較した。統計解析後、１．５倍以上上方制御又は下方制御されたプローブを、各比較のために保持した。
【０１８２】
図３Ａ及び３Ｂに示すように、非形質導入細胞と比べ、１０２７のプローブの数が、バッチＢ形質導入後、形質導入された細胞において示差的に発現され、且つ９０６プローブの数が、バッチＣ形質導入後、形質導入された細胞において示差的に発現された。下方制御されたプローブは、上方制御されたプローブのほぼ２倍と数が多かった（バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞について、各々、７０３及び６５０の下方制御されたプローブ）。
【０１８３】
ＭＯＩ１５０で下方制御された遺伝子の比較は、バッチＢにより形質導入された細胞のトランスクリプトーム又はバッチＣにより形質導入された細胞のトランスクリプトームにおいて特異的に影響されるバッチ特異的遺伝子のセットを除いて、下方制御された遺伝子の大半は、非形質導入細胞トランスクリプトームのトランスクリプトームに対する、バッチＢにより形質導入された細胞のトランスクリプトームの分析、並びに非形質導入細胞トランスクリプトーム（ｔｒ）のトランスクリプトームに対するバッチＣにより形質導入された細胞のトランスクリプトームの分析で共通であることを示した。図４のベン図に示したように、５６０の下方制御されたプローブは、これら２つの下方制御されたプローブのリストの共通集合を表している。従って非形質導入細胞のトランスクリプトームに対し、バッチＢ又はＣにより形質導入された細胞のトランスクリプトームにおいて共通に影響された、５６０のプローブのプールが存在する。
【０１８４】
これらの５６０のプローブに関するＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）による遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析は、細胞周期遺伝子は、２３９のプローブ（「細胞周期」ＧＯカテゴリーに含まれる１００４のヒト遺伝子の中で識別可能な２０４の遺伝子を表す）により有意に過剰発現されたことを明らかにした。これらの遺伝子は、増大するＦＣ値により選別し、表２に表している。数多くの他のＧＯ用語は、有意に過剰提示され、その大半は細胞周期に結びつけられた。特に各細胞周期相及び転移に対応する全てのＧＯカテゴリーは、有意に影響された。
【０１８５】
５６０の共通の下方制御されたプローブの分析を更に進めるために、このリストに関して、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）を用い、パスウェイ解析を行った。最初に得られたヒトパスウェイは、その発現レベルが影響を受けた遺伝子３７を伴う、２０１２年７月の時点で公にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ１７９と称されるヒト「細胞周期」パスウェイであった。「Ｇ１からＳへの細胞周期制御」（２０１２年７月の時点で公にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ４５と称される）、「有糸分裂Ｇ２−Ｇ２／Ｍ期」（２０１２年７月の時点で公にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ１８５９と称される）及び「有糸分裂Ｍ−Ｍ／Ｇ１期」（２０１２年７月の時点で公にアクセス可能なＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ１８６０と称される）のヒトパスウェイも、有意に影響を受けた。従って全ての細胞周期相は、大きな下方制御により影響を受けるように見える。Ｇ２−Ｍチェックポイントでの細胞周期停止は、ｐ２１の上方制御に関連したＣＤＣ２５Ｃ、サイクリンＢ１及びＣＤＣ２（ＨＵＧＯ遺伝子命名法）の下方制御により確認された(Chiuら、2011)。他の妨害物は確認される必要がある。
【０１８６】
ＧＯカテゴリー「細胞周期」において注釈された遺伝子の中で、増殖マーカーＭＫＩ６７（配列番号１２）は、高度に下方制御され、非形質導入細胞のトランスクリプトームに対する、各々、バッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞のトランスクリプトームについて、平均ＦＣ値は−８．６及び−５．６であった（平均ＦＣ値は、この遺伝子を表している３プローブの値から得た）。これらの値は、バッチＢ形質導入をバッチＣ形質導入と比較した後より顕著である、観察された増殖遅延と相関している。
【０１８７】
類似のＦＣ差異が、２つの条件の間で（すなわち、バッチＢとバッチＣ）、ほぼ系統的に観察され、図５に図示したように、非形質導入細胞における転写レベルに対するバッチＣにより形質導入された細胞における転写レベルと比べ、非形質導入細胞における転写レベルに対するバッチＢにより形質導入された細胞における転写レベルについて、これらの遺伝子は、平均３０％より低いＦＣを伴った。この知見は、ＦＣ値≦−３を有する、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞において影響を受けたプローブの選択を基にしている。このＦＣ差異は、この選択の５つの遺伝子を除いて、少なくとも１０％であった。細胞周期遺伝子の下方制御は、非形質導入細胞に対するバッチＣにより形質導入された細胞における転写レベルと比べ、非形質導入細胞に対するバッチＢにより形質導入された細胞における転写レベルにおいて、より顕著であった。
【０１８８】
驚くことに、「細胞周期」としてＧＯにおいて注釈された以下の６遺伝子は、非形質導入細胞と比べ、これら２つのバッチ（すなわちバッチＢとバッチＣ）により上方制御された：ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＣＤＫＮ１Ａ、ＭＤＭ２、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＴＧＦＢ２、ＣＤＨ１３、ＲＡＳＳＦ２（表３に示す）。ｐ２１タンパク質をコードしているＣＤＫＮ１Ａは、細胞周期阻害因子に相当すること、及び、その過剰発現は、非形質導入細胞に対するバッチＣにより形質導入された細胞よりも、非形質導入細胞に対するバッチＢにより形質導入された細胞においてより強力であることも注目される。
【０１８９】
ＭＯＩ４０で観察された転写変化。次に、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ及びＣにより形質導入された細胞由来のＲＮＡレベルを、非形質導入細胞のＲＮＡと比較した。統計解析後、１．５倍以上に上方制御又は下方制御されたプローブを、各比較のために保持した。
【０１９０】
非形質導入細胞に対しｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢ又はＣによりＭＯＩ１５０で、細胞周期遺伝子の下方制御された２３９プローブの中で、わずかに３１プローブ（２８遺伝子を表す）が、非形質導入細胞に対しバッチＢによりＭＯＩ４０でも過小発現され、かつその中で１０プローブが、非形質導入細胞に対しバッチＣにより同じＭＯＩで下方制御された。ＦＣは、ＭＯＩ４０では−１．５〜−２の間に含まれたのに対し、ＭＯＩ１５０では−１．５〜−１９の間に含まれ、このことは細胞周期に対する影響は、ＭＯＩ４０と比べＭＯＩ１５０で極めて強いことを示している。
【０１９１】
最後に、バッチＢによってのみＦＣ値≦−１．５で影響を受けた１８の細胞周期遺伝子が存在し、ＦＣは、ＭＯＩ４０でのバッチＣに関するカットオフ値−１．５を上回っている。これらの遺伝子は以下であり：ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＡＳＰＭ（配列番号３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５）、ＣＥＮＰＦ（配列番号６）、ＣＫＳ１Ｂ（配列番号７）、Ｅ２Ｆ８（配列番号８）、ＥＲＣＣ６Ｌ（配列番号９）、ＦＡＭ８３Ｄ（配列番号１０）、ＫＩＦＣ１（配列番号１１）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＮＵＳＡＰ１（配列番号１４）、ＯＩＰ５（配列番号１５）、ＰＲＣ１（配列番号１６）、ＲＲＭ２（配列番号１７）、ＳＧＯＬ１（配列番号１８）、ＳＰＣ２５（配列番号１９）、ＴＯＰ２Ａ（配列番号２０）、ＴＴＫ（配列番号２１）（表４）；これらはウイルスベクターとの細胞接触に反応し影響を受けた最初の細胞周期遺伝子に対応しており、それらの脱調節は、低い品質のベクターバッチにより、高度に精製されたベクターバッチと比べ、早期に生じる。従って、そのような遺伝子は、標的細胞の細胞周期に対するウイルスベクター組成物の影響の早期マーカーとして使用することができる。
【０１９２】
定量的ＰＣＲバリデーション。本実施例は、ＲＴ−ｑＰＣＲによる細胞周期遺伝子過小発現の後続の技術的バリデーションを説明している。マイクロアレイ実験から得られた示差的発現値を確認するために、５つの細胞周期遺伝子（ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＥ２Ｆ８（配列番号８）、ＭＫＩ６７（配列番号１２）、ＮＥＫ２（配列番号１３）、ＡＵＲＫＢ（配列番号４）、ＣＥＮＰＡ（配列番号５））のセットを、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞において１０倍以上過小発現されたプローブの中で、選択した。ＲＴ−ｑＰＣＲを、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でバッチＢ及びバッチＣにより形質導入された細胞由来のＲＮＡについて行った。結果は、図６Ａ及び６Ｂに表しているが、これはこれらの遺伝子の過小発現、及びより強力な下方制御が、バッチＣ形質導入に比べ、バッチＢ形質導入から生じたことを確認した。
【０１９３】
血清を用い作製されたウイルスベクターバッチの細胞トランスクリプトームに対する影響。血清を用いウイルスベクター組成物を作製した後のベクター培地組成物の作用を評価するために、プロセスBを使用し、rLV-EF1ベクター(cDNAを欠く)を10％血清の存在下で作製し、濃縮し、バッチB-Sを生じ、その特徴を図7Bにまとめた。このバッチを、ＭＯＩ４０及びＭＯＩ１５０での包皮細胞の形質導入に使用した。
【０１９４】
細胞は、図７Ａに示したように、形質導入後４８時間で観察した。非形質導入細胞と比べ、バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞の成長は停止した。この成長停止は、ＭＯＩ４０と比べ、より高いＭＯＩ（ＭＯＩ１５０）においてより強力であった。驚くべきことに、凝集がバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において認められ、その容積はＭＯＩと共に増加した。これらの細胞を、ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイハイブリダイゼーションのために、形質導入後５４時間で収集した。驚くべきことに、トリプシン処理の間に、バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞は、バッチＢ若しくはＣにより形質導入された細胞又は非形質導入細胞よりも、剥離がより困難であった。アジレント全ヒトゲノムマイクロアレイを使用し、中等度又はより高いＭＯＩにより、バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞のＲＮＡレベルを、非形質導入細胞のＲＮＡと比較した。統計解析後、１．５倍以上上方制御又は下方制御されたプローブを、各比較のために保持した。
【０１９５】
非形質導入細胞に対するＭＯＩ１５０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において認められた転写変化。図８に示したように、１０１９プローブが、非形質導入細胞と比べ、ＭＯＩ１５０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において有意に示差的であった。このリストに関するＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）パスウェイ解析は、ヒト「老化及び自己貪食」Ｗｉｋｉｐａｔｈｗａｙ（ＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙデータベースにおいてＷＰ１２６７と称す）は、下記の１０の示差的遺伝子により有意に影響を受けたことを明らかにした：ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＢＭＰ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＸＣＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＨＭＧＡ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１Ｂ、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＢ２（その他の影響を受けたパスウェイ：細胞周期、ＭＡＰキナーゼ、接着斑・・・・）。
【０１９６】
老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）に関連したが、Ｗｉｋｉｐａｔｈｗａｙの老化及び自己貪食パスウェイには含まれなかった多くの相補的遺伝子を、試験のために選択した。このリストは、文献のデータから抽出した（Ｃｏｐｐｅら、２０１０及びＹｏｕｎｇら、２００９）。「老化及び自己貪食」パスウェイ及び文献からの細胞老化に関連した遺伝子の規定された関連リストは、表５に示している。
【０１９７】
最後に、パスウェイ「老化及び自己貪食」に属するか又はＳＡＳＰに関連した２０の遺伝子（ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＡＲＥＧ、ＢＭＰ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２（配列番号１）、ＥＲＥＧ（配列番号２）、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＨＭＧＡ１、ＩＣＡＭ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１Ｂ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ３、ＮＲＧ１、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＳＥＲＰＩＮＢ２及びＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、表は示さず）を選択し、その理由は、これらは非形質導入細胞と比べ、バッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において示差的に発現されるように見えたからである。更にいくつかのコラーゲン遺伝子が下方制御され、ＰＴＧＳ２遺伝子が上方制御され；これらの遺伝子も、老化の生物学的プロセスに参加している(Coppeら、2010)。
【０１９８】
先に同定したパスウェイ「老化及び自己貪食」に属するか又はＳＡＳＰに関連した２０の遺伝子の中で、１０の遺伝子（ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＡＲＥＧ、ＢＭＰ２、ＥＲＥＧ（配列番号２）、ＨＭＧＡ１、ＩＣＡＭ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＮＲＧ１、ＰＬＡＴ及びＰＬＡＵＲ）は、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０で、バッチＢ又はＣにより形質導入された細胞において影響されなかった。「影響されない」とは、ＦＣ絶対値が＜１．３であることを意味する。
【０１９９】
６の他の遺伝子（ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＣＯＬ１Ａ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２（配列番号１）、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＩＧＦ１及びＰＬＡＵ）も、非形質導入細胞に対し、バッチＢ又はＣにより形質導入された細胞において影響を受けたが、細胞老化時に変化が生じるので反対の様式では影響を受けなかった。最後に１６の遺伝子が、ＭＯＩ１５０で、他のバッチと比べ、バッチＢ−Ｓに対する反応のみ、細胞老化の出現に特徴的な発現プロファイルを示す。これらの１６の遺伝子は、表５に示している。
【０２００】
非形質導入細胞に対するＭＯＩ４０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞において認められた転写変化。ＭＯＩ４０でＢ−Ｓバッチにより示差的に発現されたプローブを試験した。図９に示したように、２８４１プローブが、形質導入されない対照と比べ、有意に示差的に発現された。図１０に示したように、１０１９の示差的プローブの中で、６３１のプローブが、より高いＭＯＩで依然示差的であった。
【０２０１】
血清を用い作製されたベクターに関連したプローブを同定するために、形質導入されない条件に対し、バッチＢ−Ｓにより（両ＭＯＩで）形質導入された細胞において示差的に発現されたプローブ、並びにバッチＢ及びＣにより（両ＭＯＩで）形質導入された細胞において示差的でないプローブを選択した。対応する２３５の遺伝子セットを、図１１に示したプロファイルプロットに表している。「示差的でない」とは、ＦＣ絶対値が＜１．３であることを意味する。
【０２０２】
この２３５の遺伝子のリストの中で、ウイルスベクターと接触した細胞における老化表現型の出現の早期バイオマーカーを同定するために、細胞老化関連遺伝子を選択した。１０の細胞老化関連遺伝子のリストを入手し、これらは形質導入されるべき細胞に対するウイルスベクター組成物の負の影響を明らかにするバイオマーカーの候補であることができる。これらの遺伝子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＩＧＦ１、ＰＬＡＵ、ＢＭＰ２、ＥＲＥＧ（配列番号２）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＮＲＧ１、ＰＬＡＴ及びＰＬＡＵＲである（より詳細には表７）。
【０２０３】
高品質ベクターにより影響されない遺伝子の制限リストの選択。本実施例は、バッチＣ（両ＭＯＩ）により影響を受けず、且つ他のバッチにより影響を受ける遺伝子の選択を明らかにしている。示差的に発現された遺伝子のほとんどは、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でバッチＢにより形質導入された細胞において、及び非形質導入細胞に対し、バッチＣにより形質導入された細胞において、普通に発現されるが、わずかな遺伝子は、異なる発現パターンを示す。
【０２０４】
低品質ベクター組成物と接触された細胞において特異的に影響を受ける遺伝子を選択するために、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ４０及び１５０で、バッチＣにより示差的に発現されず（ＦＣ選択−１．２〜１．２）且つバッチＢにより形質導入された細胞において示差的に発現されるプローブを、選択した。対応する選択は、１つの遺伝子を生じた：ＣＸＣＬ２（配列番号１）。他の２つの遺伝子は、ＭＯＩ４０でのＮＴに対するＢの低下したＦＣ値（１．３〜１．５の間の絶対値）以外は、同じプロファイルを共有した：ＦＯＸＱ１及びＺＮＦ５４７（ＡｇｉｌｅｎｔプローブＩＤ：Ａ＿３３＿Ｐ３３５２８２２、ＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡ寄託番号：ＮＭ＿１７３６３１、ＲｅｆＳｅｑタンパク質寄託番号：ＮＰ＿７７５９０２）。
【０２０５】
興味深いことに、ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＦＯＸＱ１は、非形質導入細胞に対し、ＭＯＩ１５０でバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞を比較した場合にも示差的であったが、逆の展開を伴い(opposite evolution)、これらは、非形質導入細胞に対しバッチＢ−Ｓにより形質導入された細胞で過剰発現されたが、非形質導入細胞に対しバッチＢにより形質導入された細胞では過小発現された。
【０２０６】
別の遺伝子は、興味深い発現プロファイルを示している：ＭＡＰ３Ｋ８。対応するプローブは、非形質導入細胞に対しバッチＢにより形質導入された細胞を比較した場合、ＭＯＩ４０で統計学的に有意に示差的ではなかったので、これは最初は選択されなかったが、ＦＣ値−１．２に対応する強度値で試験した場合にわずかに差が認められ、結果的により高いＭＯＩで認められた下方制御の傾向を確認した。この遺伝子は、両ＭＯＩで、非形質導入細胞に対しバッチＢ及びＢ−Ｓにより形質導入された細胞において下方制御され、且つバッチＣにより形質導入された細胞においては示差的ではなかった。
【０２０７】
表８に示した、これら３つの遺伝子（ＨＵＧＯ遺伝子命名法に従いＣＸＣＬ２（配列番号１）、ＦＯＸＱ１及びＭＡＰ３Ｋ８）は、高品質ベクター形質導入により影響を受けないが、低品質ベクターバッチにより細胞を形質導入する場合に、それらの発現は特異的に影響されるので、従って、本発明の実践における使用のためのバイオマーカーである。
【０２０８】
候補バイオマーカーのバリデーション。レンチウイルスベクターのバッチ品質に左右される候補バイオマーカー反応をバリデートするために、独立した実験を行った。包皮線維芽細胞を、ＭＯＩ４０及び１５０で、以下の５種のｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ組成物により形質導入し：バッチＢ、バッチＣ、バッチＣ−Ｓ、バッチＢ−Ｓ及びバッチＵＣ（又はＵＣ−Ｓ）（前述）、それらの特徴は図１２にまとめている。これらのバッチは、条件間の比較を最も正確にするために、徹底して特徴付けた。細胞は、図１３に示したように、形質導入後４８時間観察した。ＭＯＩ４０で、非形質導入細胞と比べ、バッチＢ形質導入された細胞による成長の遅延が確認されたのに加え、バッチＣでは認められる遅延は存在しなかった。血清を用い作製された他のバッチは全て、バッチＢ同様、細胞増殖遅延を誘導した。従ってバッチＢによる増殖速度は、バッチＢ−Ｓによるものよりも優れ、並びにバッチＣによるものは、バッチＣ−Ｓによるものよりも優れていた。ＭＯＩ１５０では、細胞増殖に影響を及ぼさない唯一のバッチは、バッチＣであった。強力な増殖停止が、非形質導入細胞と比べ、バッチＢ形質導入された細胞において認められ、このことは先の結果を確認した。バッチＢ−Ｓ及びＵＣも、強力な成長遅延を誘導した。バッチＣ−Ｓにより認められた細胞増殖に対する影響は、バッチＢ、Ｂ−Ｓ及びＵＣによるものよりも低く、バッチＣによるよりも極わずかにより強力であった。
【０２０９】
形質導入された細胞のトランスクリプトームに対する影響。転写レベルでの基礎となる変化を調べるために、これらの細胞を、形質導入後５４時間で収集した。ＲＮＡを抽出し、且つ後続のバリデーション実験に使用した。
【０２１０】
ＭＯＩ４０で認められた転写変化。バッチＢ、Ｃ及びＢ−Ｓベクターにより、ＭＯＩ４０により形質導入された細胞由来のＲＮＡ、並びにＮＴ細胞由来のＲＮＡを使用し、アジレント全ヒトゲノムマイクロアレイを行った。ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰバッチＢ、Ｃ及びＢ−Ｓにより形質導入された細胞由来のＲＮＡレベルを、非形質導入細胞由来のＲＮＡと比較した。統計解析後、１．５倍以上上方制御又は下方制御されたプローブを、各比較のために保持した。
【０２１１】
細胞周期遺伝子カテゴリー。Ｂ対ＮＴ及びＣ対ＮＴに関して下方制御されたプローブの中で、細胞周期プローブが依然優性であり、Ｃ対ＮＴについて４９６の下方制御されたプローブのうち２０９プローブ、及びにＢ対ＮＴついて５９１下方制御されたプローブのうち２３６であった。
【０２１２】
ＮＴに対し、ＭＯＩ１５０で、ｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢによりＦＣ≦−３で下方制御されたとして、図５において先に選択された細胞周期遺伝子に対応するプローブは、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰバッチＢ及びバッチＣにより依然下方制御された（図１４及び表９）。４つのプローブを除き、下方制御は、バッチＣによるよりもバッチＢによるほうが強力であり、これは高度に精製されないベクターバッチによる細胞周期に対するより強力な影響を確認している。
【０２１３】
同様に、表３に対応する細胞周期を上方制御する遺伝子は、図１５及び表９に示したように、ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターバッチＢ又はバッチＣによっても依然上方制御された。この上方制御は、これら２つのバッチにより１．６−倍の上方制御を示すＣＤＫＮ１Ａ以外は、ＮＴと比べ、バッチＣよりもバッチＢのほうがより強力である。
【０２１４】
候補バイオマーカーとして表４において選択された１８の細胞周期遺伝子は、ＮＴと比べ、ＭＯＩ４０でｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰバッチＢ並びにバッチＣベクターによる形質導入後に下方制御を示す（ＮＢ：ＲＲＭ２（配列番号１７）は、ＮＴに対しバッチＣにより、−１．３  ＦＣで唯一下方制御された）。図１６に示されたプロファイルプロットは、バッチＣと比べ、バッチＢによる、これらの遺伝子のより強力な下方制御を確認している。増殖マーカーＭＫＩ６７（配列番号１２）も、図１６に示され、これはＮＴと比べ、バッチＣによるよりもによるバッチＢによるより顕著な下方制御を示し、このことは先の結果を確認している。
【０２１５】
Ｂ−Ｓバッチによる細胞周期遺伝子挙動。図１７に示されたプロファイルプロットに示したように、表４の１８の細胞周期遺伝子及びＭＫＩ６７（配列番号１２）の下方制御は、バッチＣと比べ、バッチＢ−Ｓによるものと類似している（１つの遺伝子ＲＲＭ２（配列番号１７）を除く、これはバッチＢ及びＢ−Ｓにより同じ割合で下方制御され、バッチＣによる影響とは似ていなかった）。
【０２１６】
本発明者らは、この最後の知見は、血清由来の増殖因子の存在に関連付けられ、この因子はベクターと一緒に(conjointly)濃縮され、且つバッチＣにより形質導入された細胞に加え、例え細胞が成長しない場合であっても、細胞周期遺伝子の下方制御を妨害すると仮定することができる。
【０２１７】
ＲＴ−ｑＰＣＲバリデーション。ＲＴ−ｑＰＣＲを、下記の３つの目的により、ＭＫＩ６７（配列番号１２）及びＥ２Ｆ８（配列番号８）細胞周期遺伝子において行った：
１／独立したｍＲＮＡ定量技術により、マイクロアレイ上でバッチＢ、Ｃ及びＢ−Ｓに関するＭＯＩ４０で得られた示差的遺伝子発現のバリデーション、
２／別の低品質バッチ：ＵＣバッチによる形質導入後の、これらの遺伝子の特異的挙動のバリデーション、
３／ＭＯＩ１５０でのこれら２つの遺伝子の下方制御の確認。
【０２１８】
図１８に示されるように、これらの２遺伝子に関して、ＭＯＩ４０で、バッチＣに比べバッチＢによるより強力な下方制御が確認され、ＮＴと比べた各々のＦＣは、ＭＫＩ６７（配列番号１２）について−４．６〜−２．４、及びＥ２Ｆ８（配列番号８）について−３．１〜−１．７であった。マイクロアレイの結果と一致して、この下方制御は、バッチＣよりもバッチＢ−Ｓによりより高いことはなかった（ＦＣはＭＫＩ６７（配列番号１２）及びＥ２Ｆ８（配列番号８）について各々、−２．９及び−１．７）。ＵＣバッチは、このＭＯＩでＢバッチと同じ下方制御レベルを生じた（ＦＣはＭＫＩ６７（配列番号１２）について−４．７及びＥ２Ｆ８（配列番号８）について−３．０）。
【０２１９】
ＭＯＩ１５０で、これら２つの遺伝子に関する下方制御は、各条件においてより強力であったが、バッチＢとバッチＣの間の下方制御の比は、依然同じに維持された（およそ２倍）。Ｂ−Ｓバッチは、バッチＣと同等又はこれよりもより低い下方制御を生じ、これはマイクロアレイで得られたＦＣと一致した。ＵＣバッチによる下方制御は、バッチＢとＣのレベルの間の中間レベルに達している。
【０２２０】
結論すると、本発明者らは、形質導入に反応する早期反応遺伝子であり、且つその下方制御は同じＭＯＩで、高度に精製されたベクターによるよりも、血清を用いずに作製された低品質ベクターによるものがより強力であるような細胞周期遺伝子のセットを、同定し且つバリデーションした。しかし確実に、血清増殖因子による細胞周期遺伝子活性化を通じた補償機構のために、これらの遺伝子は、高度に精製されたベクターによるよりも、血清を用い作製された低品質バッチと同様に挙動するので、これらの遺伝子は独自の品質バイオマーカーとして使用することはできない。
【０２２１】
バッチ特異的挙動を示す遺伝子。表６からの１６遺伝子の中で、以下のわずかに２つが、この独立した実験において、バッチ品質に従い異なる挙動を示すものとしてバリデーションされた：ＣＸＣＬ２（配列番号１）及びＥＲＥＧ（配列番号２）。
ＲＴ−ｑＰＣＲバリデーションにおいて使用したプライマーの配列は、表１０に示している。
【０２２２】
ＣＸＣＬ２（配列番号１）は、ＭＯＩ４０でのＢ−Ｓバッチによる形質導入後に、有意に上方制御された（ＦＣ  Ｂ−Ｓ対ＮＴ：１．９）が、これはバッチＣによっては下方制御された（ＦＣ  Ｃ対ＮＴ：−１．７５）。同じ試料に関するＲＴ−ｑＰＣＲバリデーション実験（図１９）は、バッチＣによる下方制御を確認し、且つＮＴと比べＢ−Ｓによるわずかな上方制御を示すが、これは統計学的に有意ではない。しかしＵＣバッチは、ＮＴと比べ、１．６倍の上方制御を示す。
【０２２３】
ＭＯＩ１５０で、図１９Ｂに示したＲＴ−ｑＰＣＲ結果は、ベクターバッチ品質に左右されるこの遺伝子の特異的挙動を確認している。実際、低品質バッチのみＣＸＣＬ２（配列番号１）の上方制御を誘導するが、高度に精製されたバッチＣは、この遺伝子のわずかな下方制御を誘起する（ＮＴに対するＦＣ：１．４）。注目されるように、ＭＯＩ４０では示差的発現を誘導しないＢバッチ（わずかな下方制御さえ伴う）は、ＭＯＩ１５０で強力な上方制御を生じる。このことは、ｒＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰベクターと比べ、ＭＯＩ４０及び１５０でＣＸＣＬ２（配列番号１）下方制御を誘導したｒＬＶ−ＥＦ１バッチＢにより認められた異なる結果は、より低いＭＯＩに起因するであろうということを説明することができる。最後に、高いＭＯＩでのＣＸＣＬ２（配列番号１）上方制御は、低品質ベクター  バッチに特異的であるように見える。
【０２２４】
ＥＲＥＧ（配列番号２）は、マイクロアレイにおいて、バッチＢ（ＮＴに対するＦＣ：１．５）及びバッチＢ−Ｓ（ＮＴに対するＦＣ：１．４）により、わずかな上方制御を示し、且つバッチＣにより影響を受けない。ＲＴ−ｑＰＣＲバリデーションは、ＭＯＩ１５０実験から得られたＲＮＡにより行った（図１９Ｃ）。強力且つわずかに過剰な発現が、バッチＢ及びＢ−Ｓにより確認された（各々、ＮＴに対するＦＣ：３．０及び２．９）が、バッチＣ形質導入後には影響が存在しないことが確認された。ＵＣバッチは有意な過剰発現を誘導しないことは注目することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
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