(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ）−３，４−ジベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−カルボン酸リシン。
【請求項２】
式（Ｉ）
【化１】
0006382791.tif 000011
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、−アリール−ＮＨ２、−Ｃ１−８アルキル−Ｏ−アリール、−アリール−ＯＨ、Ｃ１−８アルキル−ＯＨ、−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、メチルオキシカルボニル−Ｃ１−８アルキル、カルボアルキルオキシ−アリール、アルキルカルバモイルアリール及び−(アミノ酸側鎖)よりなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＲＲ’、−アリール−ＮＲＲ’、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ１−８アルキル−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−アリール−ＯＲ、−アリール−ＣＯＯＲ、−アリール−ＣＯＲ、−アリール−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−アリール−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯ２Ｒ、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＮＲ、−ＣＨ(ＣＯ２Ｒ)−アミノ酸側鎖及びＣＨ(ＣＯＮＲＲ’)−アミノ酸側鎖よりなる群から選択され；
Ｒ３は、ＣＯＯＨであり；
Ｒ及びＲ’は、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール；−Ｃ１−８複素環アルキル；−Ｃ(Ｏ)ＣＨ−(アミノ酸側鎖)−ＮＨＴ、−ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴ及び−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴよりなる群から選択され、ここで、Ｔは、Ｈ及びＣ１−８アルキルから選択され；Ｒ及びＲ’は、互いに組み合わさって、シクロアルキルを形成でき；
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯ及びＣ１−６アルキルよりなる群から選択される１つ以上の部分によって置換されていてもよいが；
但し、（１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ）−３−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−カルボン酸を除く］の化合物又はその薬学的に許容できる塩；少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）：
【化２】
0006382791.tif 000012
［ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、−アリール−ＮＨ２、−Ｃ１−８アルキル−Ｏ−アリール、−アリール−ＯＨ、Ｃ１−８アルキル−ＯＨ、−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、メチルオキシカルボニル−Ｃ１−８アルキル、カルボアルキルオキシ−アリール、アルキルカルバモイルアリール及び−(アミノ酸側鎖)よりなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＲＲ’、−アリール−ＮＲＲ’、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ１−８アルキル−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−アリール−ＯＲ、−アリール−ＣＯＯＲ、−アリール−ＣＯＲ、−アリール−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−アリール−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯ２Ｒ、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＮＲ、−ＣＨ(ＣＯ２Ｒ)−アミノ酸側鎖及びＣＨ(ＣＯＮＲＲ’)−アミノ酸側鎖よりなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ’、ＣＨ２ＯＲ、ＣＨ２ＮＲＲ’、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＣＨ２ＮＲ−Ｆｍｏｃ、ＣＨ２ＮＲ−Ｂｏｃ及びＣＨ２ＮＲ−ＣＢｚよりなる群から選択され；
Ｒ及びＲ’は、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール；−Ｃ１−８複素環アルキル；−Ｃ(Ｏ)ＣＨ−(アミノ酸側鎖)−ＮＨＴ、−ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴ及び−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴよりなる群から選択され、ここで、Ｔは、Ｈ及びＣ１−８アルキルから選択され；Ｒ及びＲ’は、互いに組み合わさって、シクロアルキルを形成でき；
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯ及びＣ１−６アルキルよりなる群から選択される１つ以上の部分によって置換されていてもよい］である化合物又はその薬学的に許容できる塩の、
虚血再灌流に関係のある病態の治療のための、又は虚血再灌流を示唆する医療的処置での使用のための医薬を製造するための使用。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、−Ｃ１−８アルキル−フェニル、−Ｃ１−８アルキル−ＯＨ及び−Ｃ１−８アルキル−ＯＲよりなる群から選択され；
Ｒ２が、アリール及び−Ｃ１−８アルキル−アリールよりなる群から選択され；
Ｒ３が、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、及び−Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ’よりなる群から選択され；
Ｒ及びＲ’が、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、及び−Ｃ１−８アルキル−ＯＨよりなる群から選択され；Ｒ及びＲ’が、互いに組み合わさって、シクロアルキルを形成できる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１が、Ｈ、Ｍｅ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２ＯＨ、又はＣＨ２ＯＢｎであり；
Ｒ２が、Ｐｈ、ＣＨ２Ｐｈ、又はＣＨＰｈ２であり；
Ｒ３が、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、
【化３】
0006382791.tif 000013
又は
【化４】
0006382791.tif 000014
である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
式（Ｉａ）：
【化５】
0006382791.tif 000015
［ここで、
【表１】
0006382791.tif 000016
0006382791.tif 000017
である］又は式（Ｉｂ）：
【化６】
0006382791.tif 000018
［ここで、
【表２】
0006382791.tif 000019
0006382791.tif 000020
である］である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記病態又は医療的処置が、
・急性心筋虚血、
・中枢神経系（ＣＮＳ）虚血であって、頭蓋内動脈の大脳区域における血栓症若しくは塞栓症が原因となる又は心停止が原因となるものであって、一部の大脳動脈区域又は脳全体における血流の永久的又は一時的妨害を示唆するもの；
・他のすべての虚血性病態であって、血流の減少又は停止と、それに続く、酸素／栄養分の組織への流入の回復を特徴とするもの；
・大脳組織低酸素状態であって、通常の酸素化レベルが医療的介入よって回復し得る状態、例えば一酸化炭素中毒又は溺れ等；
・低酸素症、虚血又は外傷が原因となる他の組織の損傷であって、アポトーシス又はオートファジーによって死をもたらすことができ、重要な解剖学的及び機能的病変の発生に至るもの
から選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記病態又は医療的処置が、
・外科的処置であって、その手術が、一時的に閉鎖される特定の動脈区域を提供するものであり、例えば腎腫瘍焼灼術で行われるもの；
・移植を目的とする臓器、腎臓、心臓、肺、肝臓、腸等のための外植片、保存及び再移植プロトコル；
・慢性外傷性脳障害（ＣＴＥ）
から選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
請求項２に規定される式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む細胞培養媒体。
【請求項１０】
移植を目的とする外植された臓器の保存のための貯蔵媒体であって、請求項２に規定される式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つ含む貯蔵媒体。
【請求項１１】
請求項２に規定される式（Ｉ）の化合物の、適切な試薬で標識化されており、医学画像目的に有用なあらゆる処置で用いるための、インビトロ又はインビボでの組織及び器官の画像分析のための、虚血再灌流傷害の評価及び定量化のための、並びに薬剤の使用及び有効性を監視するための医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血再灌流に関係のある病態の治療に有用な化合物の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
虚血再灌流は、器官への血流の初期制限と、それに続く、灌流の回復及び附随する再酸素化とを特徴とする病的状態である。驚くかもしれないが、血流の回復及び再酸素化は、しばしば、組織損傷の増大及び深刻な炎症反応（「再灌流傷害」）と関連している。虚血再灌流傷害は、様々な病的状態で存在する（表１）。
【０００３】
【表１】
0006382791.tif 000002
【０００４】
ＭＯＤＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）：多臓器不全症候群
ＣＳＥ（Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）：四肢コンパートメント症候群
ＣＴＥ（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）：繰り返される打撃からの外傷が原因となる慢性外傷性脳障害（例えば、ボクサー、ラグビー選手等）
【０００５】
上述の虚血再灌流に関係のある病的状態は、細胞及び組織レベルでの一連の生化学的事象から生じる。血流が所定の区域、例えば冠状動脈の分岐で停止したとき、一連の生化学過程が、灌流されない組織の細胞内で起こる。完全な酸素欠乏に直面して、壊死するものもあるが、大部分は深刻な代謝不均衡になる。該代謝不均衡は、本質的に、細胞にとって有害な量の電子伝達鎖によって作られる低水準での、反応性酸素種（ＲＯＳ、スーパーオキシドアニオン、Ｏ２２−、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルが含まれる）の細胞内含有量の急激な増加を特徴とする。血流を回復させると（即ち再灌流）、血管形成術後に起こるように、フリーラジカルの量が更に増加し、広範囲に及ぶ細胞損傷を生じさせ、「虚血再灌流」状態を構成する。この状況は、本質的に大規模な酸化還元的衝撃であり、細胞内の様々な高分子（タンパク質、核酸、脂質）にとって直接的に有害であると共に、アポトーシスの固有経路の引き金を引くことができる。
【０００６】
実際、心筋梗塞では、最終病変の延長の最大８０％がアポトーシス死に関係しており、虚血再灌流状態の兆候を受けて数時間から数日で完了する。
【０００７】
生化学的観点から、強い代謝的衝撃は、ＡＳＫ−１キナーゼ等の酸化還元センサーとして作用する多くの分子を活性化する。このキナーゼは、還元したチオレドキシン及びグルタレドキシンとの結合によって不活性状態で維持される；その酸化は、それらのＡＳＫ−１からの脱離を決定し、結果として該キナーゼの機能的活性化が起こる。
【０００８】
上記過程の最初から関与する他の経路は、ＡＭＰキナーゼ及びＲｈｏＧＴＰａｓｅを含む。これらの系は、相乗的に作用し、相互に影響を及ぼすことができ、それ故に、アポトーシス過程を大きく増幅する。上述の代謝経路の下流にあるキナーゼの機能的に一貫したファミリーは、ＪＮＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ（ＭＡＰキナーゼ）タンパク質からなり、単一伝達鎖の鎖の共通節を表す。これらの分子は、細胞質及び細胞核基質を有しており、それらは一部分において共有され、オートファジー又はアポトーシスによる細胞死の過程への様々な経路に関与する。いくつか例を挙げると、ＪＮＫ及びｐ３８ＭＡＰＫは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２を結合してリン酸化させ、その抗アポトーシス潜在能力を不活性化しており、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出と、そのＡｐａｆ−１分子との組み合わせと、結果として起こるカスパーゼ−９の活性化が後に続く事象である。２つのＭＡＰキナーゼの重要な他の標的は、Ｂｅｃｌｉｎ−１及びｐ５３であり、両者はそれぞれが自己貧食及びアポトーシスの細胞死の開始に密接な関係がある。
【０００９】
先に報告した考察に基づいて、ＭＡＰキナーゼは、多くの臨床状況、特には虚血再灌流状態で起こる細胞損傷の発生に重要であると言われている。また、ｐ３８ＭＡＰＫ及びＪＮＫが共通の生化学的修飾因子、ＭＫＰ−１、ＭＡＰキナーゼ酵素ファミリーを特異的に不活性化させることができるホスファターゼを共有することに注目することは興味深い。
【００１０】
多くの研究によって、この陳述が直接的に実証されている；例えば、ｐ３８ＭＡＰＫのためのノックアウトマウスは、冠状動脈の分岐の閉鎖を受けて、心筋病変が正常対照と比べて大きく減少しており、これらキナーゼの組織損傷の発生における役割を強調する発見である。
【００１１】
それ故に、虚血再灌流に関係のある病態の治療のため、又は虚血再灌流に関与する医療的処置での使用のために有用な薬理学的アプローチをＭＡＰキナーゼファミリーの活性を修飾することが可能な化合物の使用によって達成できることが最新技術である。
【００１２】
特許ＷＯ２００４０００３２４は、３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体が、ヒトニューロトロフィンのアゴニストとして活性があり、それ故に、ニューロトロフィン機能、特にはＮＧＦ機能がデフォルトで示唆される疾患：
神経細胞のアポトーシスを含めた、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ニューロパシー、低酸素症、虚血又は外傷が原因となる神経損傷等の、中枢神経系の神経変性障害；
加齢に関連した免疫不全等の、ＮＧＦのバイオアベイラビリティの低下と関連している後天性免疫不全；
心筋梗塞、脳卒中又は末梢血管疾患等の、血管新生刺激が有利であると判明する疾患；
様々な原因論の角膜炎、緑内障、網膜の変性又は炎症性状態等の、特定の眼の疾患
の治療のための医薬組成物の調製に有用であることを示し、（１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ）−３−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−７−カルボン酸は、非特許文献１においてスピロ−β−ラクタムの合成のための中間体として記載されている。
【００１３】
(１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ)−３−(ｐ−メトキシベンジル)−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸化合物は、非特許文献２においてペプチド模倣物として記載されている。
【００１４】
(１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ)−３−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７カルボン酸化合物及び(１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ)−３−(ｐ−フェニル)−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７カルボン酸化合物は、非特許文献３においてメタロプロテアーゼの阻害剤として記載された。
【００１５】
(１Ｒ，５Ｓ，７Ｒ)−３−エチル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸化合物の合成は、非特許文献４に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００４０００３２４
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】A. Trabocchi, et al. Eur. J. Org. Chem. 2007, 4594-4599
【非特許文献２】Antonio Guarna, et al J. Org. Chem. 1999, 64, 7347-7364
【非特許文献３】C. Mannino et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 14 (2006) 7392-7403
【非特許文献４】Reymond, J-L.; et al. Tetrahedron Asymmetry 1990, 1(10), 729-736
【発明の概要】
【００１８】
本発明の目的は、虚血再灌流に関係のある病態の治療のための、又は虚血再灌流に関与する医療的処置、特に限定されるものではないが、ＭＡＰキナーゼファミリーの活性において不適当な変動を特徴とするものでの使用のための化合物を提供することにある。
【００１９】
本発明の目的は、式（Ｉ）の化合物である。
【化１】
0006382791.tif 000003
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、−アリール−ＮＨ２、−Ｃ１−８アルキル−Ｏ−アリール、−アリール−ＯＨ、Ｃ１−８アルキル−ＯＨ、−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、メチルオキシカルボニル−Ｃ１−８アルキル、カルボアルキルオキシ−アリール、アルキルカルバモイルアリール及び−(アミノ酸側鎖)よりなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＲＲ’、−アリール−ＮＲＲ’、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ１−８アルキル−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−アリール−ＯＲ、−アリール−ＣＯＯＲ、−アリール−ＣＯＲ、−アリール−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−アリール−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯ２Ｒ、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＮＲ、−ＣＨ(ＣＯ２Ｒ)−アミノ酸側鎖及びＣＨ(ＣＯＮＲＲ’)−アミノ酸側鎖よりなる群から選択され；
Ｒ３は、ＣＯＯＨであり；
Ｒ及びＲ’は、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール；−Ｃ１−８アルキル−複素環；保護基、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ−(アミノ酸側鎖)−ＮＨＴ、−ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴ及び−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴよりなる群から選択され、ここで、Ｔは、Ｈ及びＣ１−８アルキルから選択され；
先に説明したアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯ及びＣ１−６アルキルよりなる群から選択される１つ以上の基によって置換でき；
但し、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−エチル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−(ｐ−メトキシベンジル)−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸及び(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−(ｐ−フェニル)−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸化合物は除かれる。
【００２０】
制御されていないＭＡＰキナーゼ酵素の活性化から生じる発症メカニズムを明らかにすることを目的としている研究の過程で、虚血再灌流によって決定される臨床状態においては、予想外にも驚くほどに、ｐ３８ＭＡＫＰ又はＪＮＫの活性化の効果的な制御が、上述した一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタンの特定の誘導体、及び特許ＷＯ２００４０００３２４の主題である化合物の集合体に属する他の類似化合物のインビトロ及びインビボでの投与から得られることを見出した。
【００２１】
それ故に、上述した式（Ｉ）の化合物（Ｒ３＝ＣＯＯＨ）は、薬剤用としてであれば、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−エチル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−(ｐ−メトキシベンジル)−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸、(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸及び(１Ｓ，５Ｒ，７Ｓ)−３−(ｐ−フェニル)−ベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸化合物も含めて、本発明の目的である。
【００２２】
従って、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン誘導体化合物もまた本発明の目的である：
【化２】
0006382791.tif 000004
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、−アリール−ＮＨ２、−Ｃ１−８アルキル−Ｏ−アリール、−アリール−ＯＨ、Ｃ１−８アルキル−ＯＨ、−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、メチルオキシカルボニル−Ｃ１−８アルキル、カルボアルキルオキシ−アリール、アルキルカルバモイルアリール及び−(アミノ酸側鎖)よりなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ１−８アルキル−ＮＲＲ’、−アリール−ＮＲＲ’、−Ｃ１−８アルキル−ＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＣＯＯＲ、−Ｃ１−８アルキル−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ１−８アルキル−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−アリール−ＯＲ、−アリール−ＣＯＯＲ、−アリール−ＣＯＲ、−アリール−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−アリール−Ｎ(Ｒ)Ｃ(Ｏ)Ｒ’、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯ２Ｒ、−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＮＲ、−ＣＨ(ＣＯ２Ｒ)−アミノ酸側鎖及びＣＨ(ＣＯＮＲＲ’)−アミノ酸側鎖よりなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−複素環、−Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ’、ＣＨ２ＯＲ、ＣＨ２ＮＲＲ’、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＣＨ２ＮＲ−Ｆｍｏｃ、ＣＨ２ＮＲ−Ｂｏｃ及びＣＨ２ＮＲ−ＣＢｚよりなる群から選択され；
Ｒ及びＲ’は、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−８アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、−Ｃ１−８アルキル−アリール；−Ｃ１−８アルキル−複素環；保護基、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ−(アミノ酸側鎖)−ＮＨＴ、−ＮＨ−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴ及び−ＣＨ(アミノ酸側鎖)ＣＯＯＴよりなる群から選択され、ここで、Ｔは、Ｈ及びＣ１−８アルキルから選択され；
先に説明したアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯ及びＣ１−６アルキルよりなる群から選択される１つ以上の基によって置換でき；
虚血再灌流に関係のある病態の治療のための、又は虚血再灌流に関与する医療的処置、特に限定されるものではないが、ＭＡＰキナーゼファミリーの活性において不適当な変動を特徴とするものでの使用のためのものである。
【００２３】
特に、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体は、意外にも予測できないほどに、Ｔｒｋ受容体を発現する幾つかの細胞型（具体的には心筋細胞、神経系細胞、腎実質細胞等）においてＭＫＰ−１タンパク質の顕著な増加を決定する；この事象は、例えばホスファチジルイノシトール−３キナーゼ／タンパク質キナーゼＢ経路等の、他の代謝経路の顕著な活性化がない場合で達成され、サイトゾル内のカルシウムレベルの増加につながる。自己分泌生存因子、ＮＧＦを奪われたヒト記憶Ｂリンパ球は、ｐ３８ＭＡＰＫの強い活性化を受け、細胞のアポトーシス死が続く。この損傷は、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体を加えることで大きく減少し、ＭＫＰ−１レベルの顕著な増加と、ｐ３８ＭＡＰＫの強い調節とをもたらす；その結果として、細胞は、プログラム死から守られる。同様に、深刻な低酸素条件（ｐＯ２＜０．１％）下で３０分間培養され、次いで正常の酸素レベルにされた心筋細胞は、顕著な酸化還元的衝撃を受け、ｐ３８−ＭＡＰＫの活性化、カスパーゼ及びアポトーシスの活性化を特徴とする。それにもかからわず、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体が低酸素状態の前又はその直後に投与されると、酸化還元的変化の強さは変わらないが、ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化が大きく減少し、アポトーシスが制御される；実際、同じ培養では、ＭＫＰ−１タンパク質レベルにおいて同様の顕著な増加が記録される。上述の研究は、制御されていないＭＡＰキナーゼファミリータンパク質の活性化の結果を軽減する点で取り組まれた生物学的アプローチの可能性を実証しており、それは、虚血再灌流を特徴とする多くの臨床状態、特にはＭＡＰキナーゼファミリーの活性において不適当な変動が生じるものにおいて、潜在的に有用である。
【００２４】
これらの予期せぬ発見は、これらすべての虚血再灌流に関係する病態（ここでは、血流のあらゆる減少又は停止から虚血状態が生じ、それに続いて、酸素／栄養分の組織への流入が回復する）における一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体の薬理学的使用の確認を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＮＧＦ又は本発明に従う模倣物（式（Ｉ）の化合物）を用いてインキュベートした時のＰＣ１２細胞上でのＴｒｋＡ受容体の自己リン酸化のウエスタンブロッティングを示す。
【図２】ＰＣ１２細胞において、本発明に従う模倣物（式（Ｉ）の化合物）によってＭＫＰ−１タンパク質の発現における増加を誘発させる評価のウエスタンブロッティングを示す。
【図３】血清欠乏に６時間さらされ、次いで模倣物（式（Ｉ）の化合物）又は組み換えヒトＮＧＦに３０分間さらされたＰＣ１２細胞におけるｐ３８ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化レベルのＷＢでの決定を示す。
【図４】模倣化合物（式（Ｉ）の化合物）の存在又は不在下で、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）にさらされた細胞のサンプルを、標準コントロール状態で培養された細胞と比較して、分析することによって、示された抗体を用いてＷＢで得られたバンドの強度値を報告する。
【図５】示された時間の間、模倣化合物（式（Ｉ）の化合物）の存在又は不在下において右側腎門の一方的結紮を受けた動物の右側腎臓に対して（左側腎臓がコントロールとしての役目を果たした）、壊死性損傷（上部パネル）又はアポトーシス性損傷（下部パネル）の２４時間での組織学的評価を示す。
【００２６】
上記図面において、模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）は、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体であり、具体的に、
Ｍｉｍｅｔｉｃ１は、化合物６５に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ２は、化合物８３に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ３は、化合物１９に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ４は、化合物２０に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ５は、化合物３８に対応している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に従う化合物の更なる特徴及び利点を以下の記載において詳細に説明する。
【００２８】
【化３】
0006382791.tif 000005
そこで、本発明の更なる目的は、虚血再灌流に関係のある病態を治療するための、上述の一般式（Ｉ）のアザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体を活性成分として少なくとも１つ含む医薬組成物である。
【００２９】
特に、先に定義されるような虚血再灌流に関係のある病態としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・急性心筋虚血
・中枢神経系（ＣＮＳ）虚血であって、頭蓋内動脈の血栓症若しくは塞栓症が原因となる又は心停止が原因となるものであって、一部の大脳動脈区域又は脳全体における血流の永久的又は一時的妨害にかかわるもの
・外科的処置であって、その手術が、一時的に閉鎖される特定の動脈区域を提供するものであり、例えば腎腫瘍焼灼術で行われるもの
・移植を目的とする臓器、腎臓、心臓、肺、肝臓、腸等のための外植片、保存及び再移植プロトコル
・他のすべての虚血性病態であって、血流の減少又は停止と、それに続く、酸素／栄養分の組織への流入の回復を特徴とするもの
・大脳組織低酸素状態、例えば一酸化炭素中毒又は溺れ等であって、通常の医療的介入を受けて通常の酸素化レベルを回復できるもの
・低酸素症、虚血又は外傷が原因となる他の組織の損傷であって、アポトーシス又はオートファジーによって死をもたらすことができ、重要な解剖学的及び機能的病変の発生に至るもの
・慢性外傷性脳障害（ＣＴＥ）
【００３０】
本発明の更なる目的は、一般式（Ｉ）のアザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体を少なくとも１つ含む細胞培養媒体である。
【００３１】
本発明の更なる目的は、移植を目的とする外植された臓器の保存のための貯蔵媒体であって、前述の媒体は、一般式（Ｉ）のアザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体を少なくとも１つ含む。
【００３２】
また、本発明の目的は、適切な試薬（造影剤、放射性同位体、蛍光剤等）で標識化された一般式（Ｉ）のアザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体であって、医学画像の目的に有用な処置のいずれかで用いるための、インビトロ又はインビボでの組織及び器官の画像分析のための、虚血再灌流傷害の評価及び関連性のための、並びに、特には医薬品の使用及び有効性を監視するためのものである。
【００３３】
本発明において、「アミノ酸側鎖」の表現は、天然に存在するＬ若しくはＤアミノ酸側鎖の基又は天然では珍しく若しくは存在しないアミノ酸の基を意味する。
【００３４】
他に規定がなければ、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル及び複素環の用語は、以下のように理解されるべきである：
・アルキルＣ１−８、アルケニルＣ１−８及びアルキニルＣ２−８は、それぞれが単一結合のみ、少なくとも１つの二重結合、少なくとも１つの三重結合を持つ、線状、枝分かれアルキルラジカルである。本発明に従うアルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルが挙げられる。本発明に従うアルケニル基の例としては、限定されるものではないが、＝ＣＨ２、エテニル、プロペニル、１−ブテニル、ｃｉｓ−２−ブテニル、ｔｒａｎｓ−２−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ペンテニル、ｃｉｓ−２−ペンテニル、ｔｒａｎｓ−２−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニルが挙げられる。本発明に従うアルキニル基の例としては、限定されるものではないが、エチニル、プロピニル、１−ブテニル、２−ブチニル、１−ペンテニル、３−メチル−１−ブチニルが挙げられる。
・「シクロアルキル」の用語は、炭素原子を含有する環を指し、一般には三員から八員、好ましくは五員から六員である。シクロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ノルボルナニル、カンファニル、アダマンタニルが挙げられる。
・「アリール」の用語は、１つ以上の不飽和環を含有する基を示し、それぞれの環は、五員から八員、好ましくは五員又は六員である。アリール基の例としては、限定されるものではないが、フェニル、ビフェニル及びナフチルが挙げられる。
・「複素環」の用語は、１つ以上のヘテロ原子、好ましくは１つ以上のＮ原子を含有する飽和又は芳香族複素環を指す。複素環の例としては、限定されるものではないが、ピリジン、イミダゾール、ピロール、インドール、トリアゾール、ピロリジン、ピペリジンが挙げられる。
【００３５】
本発明において、フルオレニルメトキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、カルボキシベンジル、ベンジル、フェニル及びアセチルは、それぞれが一般用語Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、Ｂｎ、Ｐｈ及びＡｃを用いて示される。
【００３６】
本発明によれば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール及び複素環基は、１つ以上の基で置換でき、好ましくはハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸、カルボニル及びＣ１−６アルキルよりなる群から選択される１つ以上の部分で置換できる。「ハロゲン」の用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。
【００３７】
Ｒ３＝ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物の中でも、
Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８アルケニル、−Ｃ１−８アルキル−フェニル、−Ｃ１−８アルキル−ＯＨ及び−Ｃ１−８アルキル−ＯＲよりなる群から選択され；
Ｒ２が、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリールよりなる群から選択されるものが好ましい。
【００３８】
特に好適には、Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、−Ｃ１−８アルキル−フェニル、−Ｃ１−８アルキル−ＯＨ及び−Ｃ１−８アルキル−ＯＲよりなる群から選択され；
Ｒ２が、アリール、−Ｃ１−８アルキル−アリールよりなる群から選択されるものである。
【００３９】
虚血再灌流から生じる医学的状態で用いるための式（Ｉ）の化合物の中では、Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル、−Ｃ１−８アルキル−フェニル、−Ｃ１−８アルキル−ＯＨ及び−Ｃ１−８アルキル−ＯＲよりなる群から選択され；
Ｒ２が、アリール及び−Ｃ１−８アルキル−アリールよりなる群から選択され；
Ｒ３が、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲＲ’よりなる群から選択され；
Ｒ及びＲ’が、互いに等しいか又は異なり、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、−Ｃ１−８アルキル−ＮＨ２、−Ｃ１−８アルキル−ＯＨよりなる群から選択され；Ｒ及びＲ’が、互いに組み合わさって、シクロアルキルを形成できる化合物が好ましい。
【００４０】
特に好ましくは、以下の化合物である。
Ｒ１が、Ｈ、Ｍｅ、＝ＣＨ２、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＢｎであり；
Ｒ２が、Ｐｈ、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨＰｈ２であり；
Ｒ３が、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、
【化４】
0006382791.tif 000006
である。
【００４１】
以下に示す表１〜２に報告される本発明に従う一般式（Ｉ）の化合物１〜９６は、ＭＫＰ−１タンパク質の顕著な増加を決定するというそれらの活性が理由で特に興味のある結果である；それ故に、それらは、本発明に従う医薬組成物の調製に好適に用いられる化合物である。
【００４２】
【表２】
0006382791.tif 000007
0006382791.tif 000008
【００４３】
【表３】
0006382791.tif 000009
0006382791.tif 000010
【００４４】
先に挙げた化合物１〜４、１１〜３０、４９〜５２及び５９〜７８は、J. Org. Chem. 1999, 64, 7347、Organic Letters, 2000, 2, 3987-3990、Bioorganic &Med Chem 2001, 9, 1625-1632、Eur. J. Org. Chem. 2002, 873-880、国際特許出願ＷＯ２００１０６４６８６、及び国際特許出願ＷＯ２００４０００３２４に記載されている；また、Ｒ３がＣＯＯＨとは異なる式（Ｉ）の化合物の調製方法についても、これら文献に記載されている。
【００４５】
化合物５は、J. Org. Chem. 1999, 64, 7347において挙げられている。
【００４６】
Ｒ３がＣＯＯＨに等しい式（Ｉ）の化合物６〜１０、３１〜４８、５３〜５８及び７９〜９６は新規である。
【００４７】
Ｒ３＝ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物は、Ｒ３＝ＣＯＯＭｅである式（Ｉ）の化合物から、溶媒としての線状又は環状エーテルの存在下、水中でのＮａＯＨによる加水分解によって調製できる。そのナトリウム塩は、水に溶け難く、有機溶媒を除去してから濾過により単離できる。Ｒ３＝ＣＯＯＮａである式（Ｉ）の化合物の酸性化によって、これらは、含水ＨＣｌによる処理で、対応するＲ３＝ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物に転換できる。
【００４８】
上記一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体は、遊離の形態で又は薬学的に許容できる塩の形態で、通常の医薬品調製方法を受けて、医薬組成物の調製に使用できる。
【００４９】
これら医薬組成物は、通常に処方でき、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤及び／又は希釈剤を含むことができる。これらの製剤の投与は、あらゆる通常経路で実行でき、溶液又は懸濁液の形態での、非経口経路、経口、点眼、経鼻、局所等がある。
【００５０】
本発明に従う式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体の製剤には、タブレット、カプセル、ピル、ペレット、溶液、分散液、懸濁液、リポソーム製剤、ミクロスフェア、ナノスフェア、クリーム及び軟膏、乳濁液及びエアロゾルが含まれ、その活性化合物の制御された又は遅らせた放出を可能にする形でも調製できる。
【００５１】
これら医薬組成物は、活性成分又はアジュバントとして上記式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ、又はその混合物を、場合により、病的状態に従って選択される他の活性成分又はアジュバントと組み合わせて、含むことができる。
【００５２】
以前に示された病変での使用に加えて、上記一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体及びその混合物、延いてはそれらを含有する組成物は、培養媒体及び移植を目的とする外植された臓器の保存のための貯蔵手段の調製に使用できる。
【００５３】
本発明の限定されない具体例を提供するため、以下に示す例を報告する。
【実施例】
【００５４】
例１
参考例
(１Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ)−３，４−ジベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸ナトリウム（Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＮａ)の式（Ｉ）の化合物）の調製
ＴＨＦ中における式（Ｉ）の化合物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＭｅ)］の溶液に、ＮａＯＨ水溶液を滴下して加える。約２時間後、減圧溶媒を完全に蒸発させ、その残留物に水を加え、磁気撹拌下で１時間放置する。結果として生じる固体を濾過し、乾燥させ、式（Ｉ）の化合物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＮａ)］を得る。
m.p. 311.2-313.4℃(dec.) [α]D21 + 34.3 (c 1.02, DMSO)
【００５５】
例２
(１Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ)−３，４−ジベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸メチル（Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＭｅ)の式（Ｉ）の化合物）の調製
微量のＤＭＦを含有するメタノール中における化合物Ｉ［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝ＣＯＯＮａ］の懸濁液に、４０℃を超えることなく、塩化チオニルを加える。３０分後、減圧下で溶媒を除去し、その残留物をトルエンで取り込み、その溶媒を再度減圧下で除去する。
粗残留物をトルエンに溶解させ、その溶液を、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、このようにして、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２、Ｒ３＝ＣＯＯＭｅの化合物Ｉを黄色オイルの形態で得る。
【００５６】
例３
(１Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ)−３，４−ジベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸（Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＨ)の式（Ｉ）の化合物）の調製
Ｈ２中における式（Ｉ）の化合物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＮａ)］の懸濁液に、ｐＨが２になるまで、１ＮのＨＣｌをゆっくりと加える。その生成物を、一定のｐＨに維持しながら、ジクロロメタンで抽出し、その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させる。濾過及び蒸発後、式（Ｉ）の化合物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＨ)］を白色固体として得る。
【００５７】
例４
(１Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，７Ｓ)−３，４−ジベンジル−２−オキソ−６，８−ジオキサ−３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン−７−カルボン酸リシン（Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯ−)リシン＋の式（Ｉ）の化合物）の調製
イソプロパノール中における式（Ｉ）の化合物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯＨ)］の溶液に、６５〜７０℃に維持しつつ、Ｌ−リシンの当量水溶液を迅速に加える。それを氷浴中で冷却し、その生成物を、冷イソプロパノールにより洗浄した後で、濾過により回収する。式（Ｉ）の化合物生成物［ここで、Ｒ１＝Ｒ２  ＰｈＣＨ２  Ｒ３＝(ＣＯＯ−)リシン＋］を得る。[α]D25 + 29.3 (c 1.0, H2O)
【００５８】
以下の例おいて、その結果は、図１〜５にもグラフで表されているが、ここで、模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）は、一般式（Ｉ）の３−アザビシクロ[３．２．１]オクタン誘導体を意味しており、具体的に、
Ｍｉｍｅｔｉｃ１は、化合物６５に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ２は、化合物８３に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ３は、化合物１９に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ４は、化合物２０に対応しており、
Ｍｉｍｅｔｉｃ５は、化合物３８に対応している。
【００５９】
例５
ＴｒｋＡ受容体の自己リン酸化及びその過程に関与するチロシンの定義
連続的なＰＣ１２褐色細胞腫ラット系統の細胞を、２４ウェルプレートにおいて、血清がないまま、５％グルタミン、抗生物質を補充した、ＲＰＭＩ１６４０培地中、４×１０５／ｍｌの濃度にて６時間培養させた。続いて、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるＮＧＦ、或いは最終濃度が１０μｍである式（Ｉ）の化合物を、これら培養液に加えた。２０分後、このようにして、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、２５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭβ−グリセロホスファート、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン）中に溶解させた。チロシン４９０、６７４／６７５又は７８５のリン酸化形態に特異的な抗体を用いた、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）技術による生化学分析のためである。
【００６０】
その結果の分析は、ＮＧＦがチロシンすべてのリン酸化を常に引き起こしたが、式Ｉの化合物は、異なる組み合わせで、研究したチロシンの１つのリン酸化を引き起こし、他のものでは引き起こさなかったことを確立することを可能にする（図１）。そのグラフは、示されたチロシン（Ｙ４９０、Ｙ６７４／６７５、Ｙ７８５）のリン酸化値を示しており、それぞれの抗ホスホチロシン抗体によって生じるＷＢで観察されたバンドの全ＴｒｋＡタンパク質に関するバンドに対する強度比として表される。模倣物はＹ４９０のリン酸化を非常に強く引く起こすが他のチロシンに対してはほとんど引き起こしていないことが明らかである。模倣物によって引き起こされたＹ４９０のリン酸化レベルは、Ｙ６７４／６７５及びＹ７８５のものとは異なり、コントロールよりも有意に高い（ｐ＜０．０１）。
【００６１】
ヒトＴｒｋＡ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを安定に導入されたＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞のクローンを用いて、同じ実験を繰り返し行い、同様な結果を得た。
【００６２】
例６
式（Ｉ）の化合物がＭＫＰ−１タンパク質発現の増加を誘発する能力の評価
ＰＣ１２細胞を、例５に記載した通りに、血清がないまま、培養し、次いで、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるＮＧＦ、又は最終濃度が１０μｍである式（Ｉ）の化合物で３０分間処理した；次いで、その細胞を溶解し、ＭＫＰ−１タンパク質に特異的な抗体を用いたＷＢによって分析した。その結果は、模倣物が、ＭＫＰ−１の合成における増加を、ＮＧＦで観察されたものと同程度に、誘発可能であったことを示す（図２）。そのゲルは、模倣化合物又は組み換えヒトＮＧＦで処理されたＰＣ１２細胞におけるＭＫＰ−１タンパク質の早期誘導（２０分）を示す。そのグラフは、ゲルバンドの、デンシトメトリーによって行われた、定量的決定を示し、ＭＫＰ１バンドの密度のβ−アクチンに対する比として表される。ＮＧＦ又は模倣物によって引き起こされたＭＫＰ−１タンパク質レベルは、コントロールよりも有意に高い（ｐ＜０．００１）。
【００６３】
例７
（細胞ストレスによって活性化された）ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の脱リン酸化を誘発する能力の評価
ＰＣ１２細胞を、例５に記載した通りに、血清がないまま、培養し、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるＮＧＦ、又は最終濃度が１０μｍである式Ｉの化合物で３０分間処理した；次いで、その細胞を溶解し、酵素のリン酸化形態に特異的な抗体を用いたＷＢによって分析した。その結果は、模倣物が、天然のニューロトロフィンとして、ｐ３８ＭＡＰＫの顕著な脱リン酸化を常に誘発したことを示す。
【００６４】
図３は、血清欠乏に６時間さらされ、次いで模倣物（式（Ｉ）の化合物）又は組み換えヒトＮＧＦに３０分間さらされたＰＣ１２細胞におけるｐ３８ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化レベルのＷＢでの決定を示す。ゲルにタンパク質を充填した均一性コントロール、β−アクチンによる規準化を報告する（図３）。
【００６５】
例８
マウス心筋細胞に関する虚血再灌流のインビトロモデルの活性の評価
新生仔マウス又はＨＬ１細胞（マウス心房筋細胞）の連続培養物から得られる、マウス心筋細胞を、２４ウェルプレートにおいて、５％グルタミン、抗生物質及び１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、濃度４×１０５／ｍｌにて、コンフルエンスの状態に至るまで、三重反復試験で培養した。次いで、一部のプレートを、酸素分圧が０．５％に等しい人工的空気雰囲気を含有するインキュベーター内に３７℃にて３０分間置き；細胞の他のシェアを、ネガティブコントロールとして、通常の状態で培養した。
【００６６】
重度の低酸素における培養期間が経過して、培養物の一部を直ちにＲＩＰＡ緩衝液での細胞溶解にさらして、生化学分析に必要な材料を得た。一方、他のものは、再酸素化／再灌流の効果を評価するため、模倣物の１つが５μｍの濃度で存在した状態又は不在の状態で通常大気中にて培養され、次いで、上記の通りに溶解した；通常大気中で培養された対照細胞からライセートを並行して得た。次いで、３つ組のライセート（低酸素、低酸素／再灌流、対照）をＷＢで処理し、膜を得、リン酸化又は非リン酸化形態でのｐ３８ＭＡＰＫタンパク質に特異的な抗体、ＭＫＰ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬと、標準化対照としてのアクチンとにさらされた。画像取得のための更なる処理の後、実験結果の定量的評価を行った（図４）。
【００６７】
そのグラフは、模倣化合物の存在又は不在下で、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）にさらされた細胞のサンプルを、標準コントロール状態で培養された細胞と比較して、分析することによって、示された抗体を用いてＷＢで得られたバンドの強度値を示す。模倣物で処理されたサンプルにおいては、ＭＫＰ−１タンパク質合成の明白な誘導と、その結果として生じるｐ３８ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化の減衰とがある。同一条件下で、ＮＧＦは類似の結果を生じさせる。
【００６８】
通常大気中で培養された対照と比較して、虚血段階でのｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の明白なリン酸化過程があったことは明らかである；この活性化は、再灌流状態をシミュレートする手順である通常大気への連続３時間の暴露の後、更に増大した。ｐ３８ＭＡＰＫリン酸化率での増加現象は、模倣物への暴露によって大いに制御された。更に、ｐ３８ＭＡＰＫ酵素に特異的なホスファターゼであるＭＫＰ−１タンパク質の顕著な増加がキナーゼ自体の不活性化に関与すると考えられることは、処理された同一培養物において明らかである。
【００６９】
例９
酸素反応性種（ＲＯＳ）の高存在によって引き起こされるアポトーシス現象を制御する上での式（Ｉ）の化合物の有効性評価
例９で記載されるように処理された、処理有りの又は無しの、低酸素で培養された細胞の他のアリコートに対して、酸素反応性種（ＲＯＳ）の高存在によって引き起こされるアポトーシス現象を制御する上での模倣物の有効性を評価するための実験を行った。それは、虚血によって次々に引き起こされ、再灌流によって悪化する。再灌流期間の終わりで、細胞を、フルオレセインで標識化されたアネキシンＶで１０分間染色し、洗浄し、特定の緩衝液で再懸濁させ、フローサイトメトリーで分析し、色素に対して陽性でありそれ故にアポトーシス過程の発達の活性段階にある細胞を強調させた。先に報告された結果と類似して、ＮＧＦ又は式Ｉの模倣化合物で処理した培養物は、ＭＫＰ−１の合成増大を引き起こすことが可能であり、アポトーシスを起こした細胞がコントロールよりもずっと低い割合であることを示した。このデータは、一部の模倣物が虚血再灌流又はその言葉の広い意味での代謝ストレスによって引き起こされるプログラム細胞死を制御する能力を確認する。
【００７０】
例１０
臓器虚血再灌流のインビボモデルにおける化合物Ｉの効果の評価
ある臓器における虚血再灌流によって引き起こされるアポトーシス現象を制御する上での式（Ｉ）の模倣物の有効性を実証する目的で、マウスの温式腎臓虚血化モデルを用いた。要するに、齢８週である６匹のＣ５７ＢＩ６雄マウスに、その臓器をそのまま状態で保ちながら（「温」虚血）、締め付けによる腎門の一方的閉鎖を受けさせた；この状態を４０分間維持し、その終わりで血流を回復させた。その動物の３匹に、ＭＫＰ−１タンパク質合成におけるインビボ増加を誘発可能な式（Ｉ）の模倣物の１つを、体重１ｋｇ当たり１ｍｇの投与量で注射し、一方、残りの動物には、コントロールとして、その化合物を可溶化するのに使用される緩衝液を同体積で注射した。次いで、その動物を２４時間監視し、次いで安楽死させた。次いで、虚血化臓器と、コントロールとしての対側臓器の両方を、組織学的検査のために用意し、虚血再灌流によって引き起こされる壊死性及びアポトーシス性の損傷の強度を決定する目的で、組織学的損傷の段階付けを行うために典型的に用いられるスケールの使用によって両方を評価した。組織学的調製物の広範囲分析によると、コントロール臓器においては、糸球体構造と管状構造に対して、壊死性及びアポトーシス性の両方で、顕著なレベルの細胞損傷が強調された。一方、模倣物で処理された動物から得られた臓器においては、アポトーシス性損傷の強度の顕著な低下が明らかであり、壊死性損傷のレベルは、コントロール臓器のものと同程度であった（図５）。壊死性損傷は模倣物による処理によって実質的に変化しておらず、アポトーシス性損傷が該化合物の薬理学的活性によって、統計的に有意なレベルで（ｐ＜０．００１）、強く調節されることが明らかである。これらの観察は、インビボ虚血再灌流でさえも、アポトーシス性損傷の調節における特定の式１の模倣物の有効性を確認するものであり、それ故に、移植を目的とする臓器を治療するためのその使用を、その保存状態の向上を得る目的で、広げることを促す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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