(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を検査するための方法であって、
ａ．励起パルス周波数で連続して発生するパルスにて励起光を生成するステップと、
ｂ．前記励起光で試料領域を照明するステップと、
ｃ．検出光の各検出光子に対して、電気パルスおよびそれによる電気パルスシーケンスを生成する検出器を用いて、前記試料領域から発する検出光を検出するステップと、
ｄ．アナログ−デジタル変換器を用いて、サンプリング速度で前記電気パルスシーケンスをサンプリングすることによって、デジタルデータシーケンスを生成するステップと、を有する方法において、
前記励起光が、プライマリ光から分割され、前記励起光と異なる前記プライマリ光の部分が、前記プライマリ光の前記異なる部分の各検出パルス用のさらなる電気パルスおよびそれによるさらなる電気パルスのシーケンスを生成する励起検出器によって検出され、
ｅ．前記電気パルスおよび前記さらなる電気パルスが反対符号で重ね合わされ、重ね合わせ信号が、前記アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされて前記デジタルデータシーケンスを生成し、および／または
ｆ．前記電気パルスおよび前記さらなる電気パルスが反対符号でパワー結合器によって重ね合わされ、重ね合わせ信号が、前記アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされて前記デジタルデータシーケンスを生成することを特徴とする方法。
【請求項２】
ａ．前記サンプリング速度が、前記励起パルス周波数より高く、および／または
ｂ．前記サンプリング速度が、前記励起パルス周波数の５０倍を超えて高く、および／または
ｃ．前記サンプリング速度が、１ギガサンプル／秒より高く、３ギガサンプル／秒より高く、５ギガサンプル／秒であり、または５ギガサンプル／秒より高く、および／または
ｄ．前記サンプリングが、８ビットの分解能もしくは１０ビットの分解能で実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記励起パルス周波数が、５０ＭＨｚより高く、または８０ＭＨｚであり、および／または励起パルスの期間が、１０ｐｓ（ピコ秒）より短く、１ピコ秒より短く、または１００ｆｓ（フェムト秒）より短い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらなるデジタルデータシーケンスが、別のサンプリング速度で前記さらなる電気パルスのさらなるシーケンスをサンプリングする別のアナログ−デジタル変換器によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスを処理するために評価電子装置が用いられ、および／または前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスを処理するために、プログラマブル集積回路、またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（すなわちＦＰＧＡ）に基づいた評価電子装置が用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ．前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスが、データパケットに分割され、および／または
ｂ．前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスが、連続励起パルス間の時間間隔と少なくとも同じくらいの長さ、またはまったく同じ長さである測定期間をそれぞれ表すデータパケットに分割され、および／または
ｃ．前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスが、異なる試料位置、または画素とそれぞれ関連付けられるデータパケットに分割される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ．前記データパケットにさらなるデータが追加され、および／または
ｂ．各場合に前記データパケットに、特定の場合に検査される前記試料位置の場所および／または前記画素に関するさらなるデータ、および／またはタイムスタンプ、および／または連続番号および／または異なる番号が追加され、および／または
ｃ．前のデータパケットの終わりおよび／またはこれに続くデータパケットの初めが、各データパケットに添付される、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ．励起パルス数および／または検出光子数が、各データパケットから確認され、および／または
ｂ．単位時間当たりの前記励起パルス数および／または単位時間当たりの前記検出光子数が、前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスから確認される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．前記励起パルスおよび／または前記検出光子の瞬間が、データパケットから確認され、および／または
ｂ．前記励起パルスおよび／または前記検出光子の瞬間が、前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスから決定される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気パルスおよび／または前記デジタルデータシーケンスまたは前記さらなるデジタルデータシーケンスおよび／またはデータパケットが、デジタル的にフィルタリングされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．少なくとも１つの適応フィルタおよび／または調整可能フィルタが用いられ、および／または
ｂ．前記検出器および／またはパルス増幅器のアナログ電子装置の老朽化および／または熱的影響を補償する、少なくとも１つの適応フィルタおよび／または調整可能フィルタが用いられる、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料の励起状態の寿命を分析するために、前記試料領域における励起パルスの到達と、前記照明された試料領域からの検出光子の放射との間の時間差が決定され、前記試料を特定するため、および／または前記試料のＦＬＩＭ画像を生成するために使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
複数の算定された時間差の度数分布が算出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための機器。
【請求項１５】
試料を検査するための機器であって、前記機器は、励起光で試料領域を照明するために、励起パルス周波数で連続して発生するパルスで前記励起光を生成するための光源を有し、かつ前記試料領域から発する検出光を検出するための検出器を有し、
前記検出光の各検出光子に対して、前記検出器が電気パルス、およびそれによる電気パルスシーケンスを生成し、サンプリング速度で前記電気パルスシーケンスをサンプリングすることによってデジタルデータシーケンスを生成するアナログ−デジタル変換器が設けられ、
前記励起光が、プライマリ光から分割され、前記励起光と異なる前記プライマリ光の部分を検出する励起検出器であって、かつ各検出パルスに対してさらなる電気パルスおよびそれによるさらなる電気パルスシーケンスを生成する励起検出器が設けられ、
ａ．重ね合わせ装置が、前記電気パルスおよび前記さらなる電気パルスを反対符号で重ね合わせ、重ね合わせ信号が、前記アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされて前記デジタルデータシーケンスを生成することを特徴とする機器。
【請求項１６】
ｂ．前記アナログ−デジタル変換器が、前記電気パルスおよび前記さらなる電気パルスをサンプリングして前記デジタルデータシーケンスを生成することを特徴とする請求項１５に記載の機器。
【請求項１７】
ａ．前記サンプリング速度が、前記励起パルス周波数より高く、および／または
ｂ．前記サンプリング速度が、前記励起パルス周波数より５０倍以上高く、および／または
ｃ．前記サンプリング速度が、１ギガサンプル／秒より高く、３ギガサンプル／秒より高く、５ギガサンプル／秒であり、または５ギガサンプル／秒より高く、および／または
ｄ．前記サンプリングが、８ビットの分解能もしくは１０ビットの分解能で実行される、
請求項１５または１６に記載の機器。
【請求項１８】
前記励起パルス周波数が、５０ＭＨｚより高く、８０ＭＨｚであり、および／または励起パルスの期間が、１０ピコ秒より短く、１ピコ秒より短く、または１００フェムト秒より短い、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１９】
別のサンプリング速度で、前記さらなる電気パルスのさらなるシーケンスをサンプリングすることによって、さらなるデジタルデータシーケンスを生成するさらなるアナログ−デジタル変換器が設けられる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２０】
ａ．評価電子装置が、前記デジタルデータシーケンスまたはさらなるデジタルデータシーケンスを処理し、および／または
ｂ．プログラマブル集積回路、またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（すなわちＦＰＧＡ）に基づいた評価電子装置が、前記デジタルデータシーケンスまたはさらなるデジタルデータシーケンスを処理する、
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２１】
前記評価電子装置が、
ａ．前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスをデータパケットに分割し、および／または
ｂ．前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスを、連続励起パルス間の時間間隔と少なくとも同じくらいの長さ、またはまったく同じ長さである測定期間をそれぞれ表すデータパケットに分割し、および／または
ｃ．前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスを、異なる試料位置、または画素にそれぞれ関連付けられたデータパケットに分割する、
請求項２０に記載の機器。
【請求項２２】
前記評価電子装置が、
ａ．さらなるデータを前記データパケットに追加し、および／または
ｂ．特定の場合に検査される試料位置の場所および／または対応する画素に関するさらなるデータ、および／またはタイムスタンプ、および／または連続番号および／または異なる番号を、各場合にデータパケットに追加する、
請求項２１に記載の機器。
【請求項２３】
前記評価電子装置が、
ａ．前記励起パルス数および／または前記検出光子数を各データパケットから決定し、および／または
ｂ．単位時間当たりの前記励起パルス数および／または単位時間当たりの前記検出光子数を、前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスから決定する、
請求項２１または２２に記載の機器。
【請求項２４】
前記評価電子装置が、
ａ．前記励起パルスおよび／または前記検出光子の瞬間を前記データパケットから決定し、および／または
ｂ．前記励起パルスおよび／または前記検出光子の瞬間を前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスから決定する、
請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２５】
前記電気パルスおよび／または前記デジタルデータシーケンスおよび／または前記さらなるデジタルデータシーケンスおよび／または前記データパケットを、フィルタが、デジタル的にフィルタリングする、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２６】
前記フィルタが、
ａ．適応フィルタおよび／または調整可能フィルタであり、および／または
ｂ．前記検出器および／またはパルス増幅器のアナログ電子装置の老朽化および／または熱的影響を補償する、適応フィルタおよび／または調整可能フィルタである、
請求項２５に記載の機器。
【請求項２７】
評価電子装置が、前記試料領域における励起パルスの到達と、前記照明された試料領域からの検出光子の放射との間の時間差を決定する、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２８】
前記評価電子装置が、複数の算定された時間差の度数分布を算出する、請求項２７に記載の機器。
【請求項２９】
ａ．前記励起光を異なる試料位置に導くための、および／または試料を走査するための走査装置が設けられ、および／または
ｂ．前記励起光を異なる試料位置に導くための、および／または試料を走査するための走査装置が設けられ、制御装置が、前記走査装置の特定の位置に関する位置情報を含むデータおよび／または信号を供給する、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３０】
前記機器が、走査顕微鏡、または共焦点走査顕微鏡の一部である、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３１】
請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の機器を含む走査顕微鏡。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用、および／または請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の機器の使用、および／または試料の励起状態の寿命を測定するための、または蛍光寿命を測定するための請求項３１に記載の走査顕微鏡の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を検査するための方法と、その方法を実行するための機器に関する。
【０００２】
本発明は、さらに、試料を検査するための機器であって、励起パルスで試料領域を照明するために、励起パルス周波数で連続して発生するパルスで励起光を生成するための光源を有し、かつ試料領域から発する検出光を検出するための検出器を有する機器に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体試料の特性または動的挙動を調査するために、多くの用途は、試料から発する検出光を後で分析するために、生体試料が照明光にさらされることを必要とする。例えば、励起光を用いて蛍光染料を光学的に励起し、試料から発する蛍光の特性を後で調査するようにすることが多い。いくつかの調査方法は、試料を照明するために、連続光ビームの代わりにパルス光を用いることを要求する。かかる使用の例が、励起状態の寿命を測定することである。すなわち、例えば、放射光パルスの時間遅延を電子的に測定するために、短い光パルスで蛍光染料を励起することが可能である。例えば特許文献１は、試料における励起状態の寿命を分析するための顕微鏡を説明している。その顕微鏡には、励起光を生成するための少なくとも１つの光源と、試料から発する検出光を受信するための少なくとも１つの検出器と、が含まれる。顕微鏡は、光源が、パルス励起光を放射する半導体レーザを含み、かつパルス繰り返し率を試料の特定の寿命特性に適合させるための調整装置が設けられることを特徴とする。
【０００４】
１つまたは複数の蛍光染料でラベル付けされた試料における励起状態の寿命を分析することによって、試料の特性に関する重要な情報を取得することができる。特に、試料領域の組成および環境に関する情報など、分析されている試料領域に関する情報を、蛍光寿命結像顕微鏡法（ＦＬＩＭ）の助けを借り、複数の蛍光染料を用いることによって取得することができる。例えば、細胞生物学において、試料領域におけるカルシウム濃度は、蛍光染料の寿命を測定することによって、間接的に推測することができる。
【０００５】
多くの用途が、個々の光子を検出することを必要とし、それにより、個々の場合に依存して、検出光子の数か、または励起パルスと検出光子の１つとの間の時間間隔を決定する。
【０００６】
光子を数えるために使用される検出器は、各検出光子に対して、電気パルスを放射する。これらの電気パルスを分析するために必要とされる電子装置は、時間測定カードなどのＰＣプラグインカードの形態であることが多く、市販されている。しかしながら、高コストとは別に、かかる時間測定カードは、非常に長い不感時間という欠点を有し、その結果、それは、試料の励起時に、第１の検出パルス（第１の検出光子）の到達だけを検出することができ、その後、かなりの期間にわたって「ブラインド」になる。結局、試料から発する検出光に含まれる情報のかなりの部分は、ユーザから隠されたままである。しかしながら、測定を実行できるように、ユーザは、間断なく到達する光子の確率が低いレベルに、励起パワーを低減すること以外に選択肢を有しない。しかし、そうなら、使用可能な結果を得るために、非常に長い期間にわたって測定を行わなければならない。
【０００７】
たとえ検出器が、間断なく到達する光子を記録することに一般に適していても、それが生成する電気信号の曲線形状は、個別パルスの重ね合わせに似ており、それは、ほとんどの場合に、これまでに周知の電子評価装置を過度に働かせる。
【０００８】
さらに、励起パルスの高繰り返し率およびしたがって一測定期間内における頻繁な測定は、不可能である。達成可能な測定速度は、実際には、市販のパルスレーザにおける通常の繰り返し率よりはるかに低い。この理由で、例えばＦＬＩＭ画像を生成するための十分なデータを収集するには、通常、非常に長い時間が必要とされる。
【０００９】
さらに、例えば光子計数またはＦＬＩＭ用途などの様々な用途用に、異なる評価電子装置が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＤＥ １０ ２００４ ０１７ ９５６ Ａ１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、より短い期間に、より正確な測定結果を取得可能にする方法を提供することである。
【００１２】
この目的は、以下のステップ、
ａ．励起パルス周波数で連続して発生するパルスで励起光を生成するステップと、
ｂ．励起光で試料領域を照明するステップと、
ｃ．検出光の各検出光子に対して電気パルスおよびそれによって電気パルスシーケンスを生成する検出器を用いて、試料領域から発する検出光を検出するステップと、
ｄ．アナログ−デジタル変換器を用いて、サンプリング速度で電気パルスシーケンスをサンプリングすることによって、デジタルデータシーケンスを生成するステップと、を有する方法において、
励起光が、プライマリ光から分割され、励起光と異なるプライマリ光の部分が、プライマリ光の異なる部分の各検出パルス用のさらなる電気パルスおよびそれによるさらなる電気パルスのシーケンスを生成する励起検出器によって検出され、
ｅ．電気パルスおよびさらなる電気パルスが反対符号で重ね合わされ、重ね合わせ信号が、アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされてデジタルデータシーケンスを生成し、および／または
ｆ．電気パルスおよびさらなる電気パルスが反対符号でパワー結合器によって重ね合わされ、重ね合わせ信号が、アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされてデジタルデータシーケンスを生成することを特徴とする方法によって達成される。
【００１３】
したがって、本発明のさらなる目的は、より短い期間で、より正確な測定結果を取得可能にする機器を提供することである。
【００１４】
このさらなる目的は、検出光の各検出光子に応じて、検出器が、電気パルスおよびそれによって電気パルスシーケンスを生成するということと、サンプリング速度で電気パルスシーケンスをサンプリングすることによって、デジタルデータシーケンスを生成するアナログ−デジタル変換器が設けられることと、励起光が、プライマリ光から分割され、励起光と異なるプライマリ光の部分を検出する励起検出器であって、かつ各検出パルスに対してさらなる電気パルスおよびそれによるさらなる電気パルスシーケンスを生成する励起検出器が設けられることと、
ａ．重ね合わせ装置が、電気パルスおよびさらなる電気パルスを反対符号で重ね合わせ、重ね合わせ信号が、アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされてデジタルデータシーケンスを生成することと、を特徴とする、最初に言及したタイプの機器によって達成される。
【００１５】
信号処理制御装置がまた、第１の光子の到達後に発生するがしかし同じ励起パルスに関連付けられることになる光子事象を検出できる場合にのみ、第１の光子の到達の瞬間後の情報が取得可能であることが、とりわけ本発明の実現である。これは、アナログ測定信号をデジタル数字のシーケンスに直ちに変換することによって達成可能であることがまた発見された。
【００１６】
特に、有利なことに、本発明によって、市販のパルスレーザの繰り返し周波数に対応する、８０ＭＨｚ以上の繰り返し周波数における周期的な反復測定が可能になる。さらに、試料の寿命特性に関する一層正確な情報を取得することができる。なぜなら、十分な励起パワーがあるならば、特に高データ処理速度によって、第１の光子の到達時間だけでなく、ほぼ全ての光子事象が、どの時点においても検出可能になるからである。これは、光子が短い時間間隔内で検出器に到達する場合でさえ事実である。
【００１７】
満足な精度および満足な時間分解能を達成するために、特定の一実施形態は、サンプリング速度が、励起パルス周波数より著しく高いことが好ましいと規定する。特に、サンプリング速度が、励起パルス周波数の５０倍を超えて高いことを規定してもよい。例えば、サンプリング速度が、１ギガサンプル／秒より高く、特に３ギガサンプル／秒より高く、特に５ギガサンプル／秒より高いと規定してもよい。
【００１８】
特定の一実施形態において、サンプリング速度は、約５ギガサンプル／秒である。有利なことに、サンプリングは、８ビットの分解能または１０ビットの分解能で実行してもよい。さらに高いサンプリング速度および／またはサンプリング分解能が可能であることは自明である。しかしながら、この目的のために必要とされるアナログ−デジタル変換器は、非常に高い電力消費および一般に高い費用を伴う。
【００１９】
特定の一実施形態は、励起パルス周波数が、５０ＭＨｚより高く、特に約８０ＭＨｚに等しいこと、および／または励起パルス周波数の期間が、１０ピコ秒より短く、特に１ピコ秒より短く、特に１００フェムト秒より短いことを規定する。この実施形態によって、標準の商用レーザの励起パルス周波数において、各光パルスを完全に利用することが可能になる。
【００２０】
ほとんどの用途にとって、約８０ＭＨｚの励起パルス周波数を有するパルス光源の使用と同様に、８ビットの分解能で５ギガサンプル／秒のサンプリング速度を有するアナログ−デジタル変換器の使用が、非常に満足な測定結果につながることが分かった。
【００２１】
方法の特定の実際的な一インプリメンテーションは、（例えば、パルスレーザの）プライマリ光（primary light）で構成された励起光が分割されることと、励起光と異なるプライマリ光の部分が、各検出パルス用のさらなる電気パルスおよびそれによってさらなる電気パルスのシーケンスを生成する励起検出器によって検出されることと、を規定する。さらなる励起検出器によって生成されたさらなる電気パルスは、特に、さらなる測定用のパワー基準または時間基準として用いてもよい。
【００２２】
この目的のために、例えば、電気パルスおよびさらなる電気パルスが、特に反対符号で重ね合わされること、ならびに重ね合わせ信号が、アナログ−デジタル変換器によってサンプリングされてデジタルデータシーケンスを生成することを規定してもよい。重ね合わせ装置、特にパワー結合器を、重ね合わせ用に用いてもよい。しかしながらまた、同じアナログ−デジタル変換器を用いて異なる方法で電気パルスおよびさらなる電気パルスをサンプリングして、デジタルデータシーケンスを生成することもまた基本的に可能である。１つの単一アナログ−デジタル変換器が用いられる場合に、ある分解能が、一般に、振幅の点で失われる。しかしながら、一方では電気パルスおよび他方ではさらなる電気パルス用の２つの異なるアナログ−デジタル変換器の基本的に可能な使用の場合に発生する可能性がある時間変動は回避される。
【００２３】
しかしながら、特に、信号高さの点における優れた分解能が問題となるいくつかの用途において、さらなるデータシーケンスが、検出光から生じる電気パルスシーケンスをサンプリングするアナログ−デジタル変換器を用いずに、さらなる電気パルスのさらなるシーケンスをサンプリングすることによって、より正確に言えば別のサンプリング速度を有する別のアナログ−デジタル変換器を用いることによって生成される場合には有利である。別のサンプリング速度は、サンプリング速度とちょうど同じであってもよい。しかしながらまた、異なるアナログ−デジタル変換器のサンプリング速度が、互いに異なることを規定してもよい。特に、よりコスト効率の良い実施形態を、さらなるアナログ−デジタル変換器用に用いてもよい。なぜなら、一般に、サンプリングされるさらなるシーケンスには、十分に離間された電気パルスが含まれるからである。
【００２４】
デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスを処理するために評価電子装置を用いるのが好ましい。非常に信頼ができて迅速な一実施形態は、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスが、プログラマブル集積回路、特にフィールドプログラマブルゲートアレイ（要するにＦＰＧＡ）に少なくとも部分的に設計が基づいた評価電子装置を用いて処理されることを規定する。
【００２５】
特に、データの並列処理を可能にするために、有利な特定の一実施形態は、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスをデータパケットに分割することを規定する。
【００２６】
特に有利な方法において、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスは、データパケット、すなわち、例えば、連続励起パルス間の時間間隔と少なくとも同じ長さ、特に正確に同じ長さである測定期間をそれぞれ表すデータパケットに分割してもよい。かかる実施形態は、各特定の励起パルスの光学的励起によって引き起こされる検出光から生じる測定データを、データパケットと正確に関連付けることができるようにするという特定の利点を有する。
【００２７】
大量のデータゆえに、かなりの費用でリアルタイムにおいてデータを分析することだけが可能であることが多い。データを取得するための非同期分析は、基本的に可能である。この目的のために、有利な一アプローチは、データを並行して分析することに備え、かつ例えば、特定の画素における、特定の試料位置に関する他の追加のデータ、またはデジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスが分割されて行くデータパケットに関連付けられるか、もしくは追加される追加タイムスタンプに備える。
【００２８】
特に、特定の場合に検査されている試料位置の場所および／または対応する画素に関するさらなるデータ、および／またはタイムスタンプ、および／または連続番号および／または異なる番号が、各場合にデータパケットに追加されることを規定してもよい。評価をより単純で、かつより信頼できるようにするために、特に、各データパケットはまた、前のデータパケットの終わりおよび／またはそれに添付された続くデータパケットの初めを有してもよい。
【００２９】
非同期分析は、特に並列構造において、特に評価電子装置であって、その設計が、ＦＰＧＡネットワークにおける、しかしまた接続されたＰＣシステムにおける例えばプログラマブル集積回路、特にフィールドプログラマブルゲートアレイ（要するにＦＰＧＡ）にか、または評価プロセッサのクラスタに基づいた評価電子装置において実行してもよい。また、分析がグラフィックカードの処理装置において行われることを規定してもよい。特に、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスおよび／またはデータパケットは、評価に先立って一時的に記憶してもよい。
【００３０】
例えば、ＦＬＩＭ画像を生成するために、励起パルス数および／または検出光子数を、各データパケットから確認すること、および／または単位時間当たりの励起パルス数および／または単位時間当たりの検出光子数を、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスから確認することを規定してもよい。
【００３１】
特定の一実施形態において、励起パルスおよび／または検出光子の瞬間は、データパケットから確認される。特に、励起パルスおよび／または検出光子の瞬間が、デジタルデータシーケンスおよび／またはさらなるデジタルデータシーケンスから決定されることを規定してもよい。本発明による方法、本発明による装置が、それぞれ、ＦＬＩＭ技術の分野で用いられる場合に、最も正確で可能な修正瞬間を各検出光パルスと関連付けることが有利である。この目的のために、有利な一実施形態は、記録された測定曲線の重心の瞬間または測定曲線の極値が、さらなる評価用に決定および使用されることを規定する。これは、例えば、高次多項式に対する近似を作成することによってか、またはスプライン補間を実行することによって行ってもよい。ニューラルネットまたは同様の適切な分類の使用もまた考えられる。
【００３２】
特に正確な一実施形態において、電気信号および／またはデータシーケンスおよび／またはさらなるデータシーケンスおよび／またはデータパケットは、フィルタリングされて、特に、検出器、および／またはパルス増幅器のアナログ電子装置の周波数依存性を補償する。特に、データシーケンスおよび／またはさらなるデータシーケンスおよび／またはデータパケットのデジタルフィルタリングを実行してもよい。これによって、ＡＣ電圧結合法でしばしば用いられるパルス増幅器を補償することが可能になり、その結果、高速パルスが発生した場合に、ゆっくりした補償ドリフトが出力信号に刻印される。
【００３３】
特に柔軟な特定の一実施形態は、少なくとも１つの適応および／または調整可能フィルタを用いることに備える。特に、検出器および／またはアナログ電子装置の老朽化および／または熱的影響を補償する少なくとも１つの適応および／または調整可能フィルタを用いることを有利に規定してもよい。
【００３４】
特に、ＦＬＩＭ分析に関して、試料領域における励起パルスの到達と、照明された試料領域からの検出光子の放射との間の時間差を決定することを同様に各場合に有利に規定してもよい。特に、特定の精度を達成するために、複数の算定された時間差の度数分布を算出することを有利に規定してもよい。
【００３５】
本発明による方法を実行するために特に設計された装置が、特に有利である。
【００３６】
本発明による機器の有利で例示的な一実施形態は、励起光を異なる試料位置に導くための、および／または試料を走査するための走査装置を特徴とする。特に、励起光を異なる試料位置に導くための、および／または試料を走査するための走査装置を設けてもよく、制御装置が、走査装置の特定の位置に関する位置情報を含むデータおよび／または信号を供給する。これらのデータを用いて、一方では励起光ビームを試料に対して位置付けてもよく、他方では、特に、生成されたデータシーケンスおよび／またはデータパケットを後で識別および／または分析するために生成されたデータシーケンスおよび／またはデータパケットに追加してもよい。
【００３７】
有利な一実施形態において、本発明による機器は、走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡の一部である。また、特に有利なのは、本発明による機器を有する走査顕微鏡であり、それはまた、任意選択的に改良するか、または続いて増設されてもよい。
【００３８】
本発明の他の目的、利点、特徴および可能な用途は、図面を参照する例示的な実施形態の以下の説明から導き出し得る。この文脈において、説明または図示される特徴の全ては、単独または任意の有用な組み合わせにおいて、かつそれらが特許請求の範囲またはその先行例において組み合わされる方法にかかわらず、本発明の主題を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明による機器を特徴とする走査顕微鏡の例示的な実施形態を示す。
【図２】非常に低い励起パワーおよび高い励起パワーにおける励起光および検出光の時間−パワープロファイルの表現である。
【図３】素早く連続的な光子事象の場合における励起光および検出光の時間−パワープロファイルの表現を示す。
【図４】例示的な実施形態の概略図である。
【図５】別の例示的な実施形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
図１は、本発明による機器を特徴とする走査顕微鏡１の例示的な実施形態を示す。走査顕微鏡１は、共焦点走査顕微鏡として設計されている。
【００４１】
走査顕微鏡１は、励起光を生成するためのパルスレーザ３として、励起パルス周波数で連続して発生する励起パルスを放射する光源２を有する。具体的には、パルスレーザ３は、第１のビームスプリッタ５に当たるプライマリ光ビーム４を生成する。第１のビームスプリッタ５において、プライマリ光ビーム４は、測定ビーム６および励起光ビーム８に分割される。
【００４２】
励起光ビーム８は、照明ピンホール１０を通過し、その後、メインビームスプリッタ１１に到達する。
【００４３】
メインビームスプリッタ１１は、ジンバル搭載走査ミラー１３を含む走査装置１２に励起光ビーム８を導く。続いて、励起光ビーム８は、走査光学系１４、チューブ光学系１５、および顕微鏡対物レンズ１６を介して、試料１７に到達する。試料１７において、試料領域が、励起光にさらされ、それによって、試料領域に存在する蛍光染料が光学的に励起される。
【００４４】
試料１７から発した検出光１８は、励起ビーム８がメインビームスプリッタ１１から試料１７へと移動したのと同じ光路に沿って、しかし反対方向にメインビームスプリッタ１１に到達する。次に、検出光１８は、メインビームスプリッタおよび下流の検出ピンホール１９を通過し、最後に検出器２０に到達し、検出器２０は、検出光１８の各検出光子用に、電気パルスおよびそれによって電気パルスシーケンスを生成する。それらは、評価および制御装置９、すなわち、アナログ−デジタル変換器（この図では示さず）を有する電子評価回路を含み、かつアナログ−デジタル変換器が電気パルスシーケンスをサンプリングし、サンプリング速度が励起パルス周波数より高いという点においてデジタルデータシーケンスを生成する評価および制御装置９に送られる。
【００４５】
測定ビーム６は、励起検出器７に導かれる。励起検出器７は、励起光ビーム８と異なる、プライマリ光ビーム４の部分を検出し、かつプライマリ光４の異なる部分の各検出パルス用に、別の電気パルスおよびそれによってさらなる電気パルスのシーケンスを生成する。それらは、同様に、評価および制御装置９、すなわち、別のアナログ−デジタル変換器が、励起パルス周波数より高いサンプリング速度でサンプリングするという点において、さらなる電気パルスからさらなるデジタルデータシーケンスを生成する評価および制御装置９に送られる。
【００４６】
走査装置１２は、走査ミラー１３の特定の位置に関する情報をデータの形態で評価および制御装置９に送る。制御装置９は、この情報を、第１のアナログ信号および第２のアナログ信号から得られたそれぞれのデータと相関させるが、特定のデータシーケンスおよび／またはデータパケットがどの試料位置に属するかを推測可能にする方法で相関させる。
【００４７】
図２の上半分には、非常に低い励起パワーにおいて、励起光８のパワーに比例するパワーのさらなる電気パルス２４のシーケンス、および検出光子によってそれぞれ生成される電気パルス２３のシーケンスが示されている。ほんの少数の電気パルス２３、したがってわずかな光子事象が、低放出確率ゆえに捕捉および検出可能であり、それが、励起光の低いパワーによることが分かる。一般に、かかる測定状況は、先行技術の機器によって扱うことができる。これは、図の下半分に示す状況（高励起パワー）には必ずしも当てはまらない。
【００４８】
高励起パワーの場合に、放出確率が非常に高いので、一励起パルス２４が、いくつかの検出光子およびしたがっていくつかの電気パルス２３を引き起こすことさえ可能である。図の下半分は、連続電気パルス２３間の時間間隔が、そのパルス期間より大きい場合における測定曲線の形状を示す。
【００４９】
しかしながらまた、時間的に密に隣接する２つの検出パルスが検出されることが起こり得る。次に、測定曲線の曲線形状は、個別信号の重ね合わせに本質的に由来する。これは、図３に示されている。有利なことに、本発明によって、かかる事象さえも記録および分析することが可能になる。
【００５０】
評価および制御装置９は、励起パルスと実質的に同期して生成されるさらなる電気パルス２４の瞬間２７、および検出光子の電気パルスから生じる電気パルス２３の瞬間２９を記録する。これは、例えば、記録された曲線形状の重心を決定することによって、または高次多項式の近似によって達成してもよい。
【００５１】
図４は、個々のコンポーネントがボックスとして明確に表されている例示的な実施形態を概略的に示す。試料１７が、パルスレーザ３の形態をした光源２からの励起光８であって、その励起パルスが、８０ＭＨｚの励起パルス周波数で連続して発生する励起光８によって照明される。試料１７から発する検出光１８は、検出器２０によって検出される。検出光１８の各検出光子用に、検出器１８は、電気パルス２３およびそれによって電気パルス２３のシーケンスを生成する。電気パルス２３のシーケンスは、第１の増幅器２１に伝達され、増幅され、続いて第１のアナログ−デジタル変換器３１、すなわち５ギガサンプル／秒のサンプリング速度で電気パルス２３のシーケンスをサンプリングすることによってデジタルデータシーケンスを生成する第１のアナログ−デジタル変換器３１に導かれる。
【００５２】
励起光８は、プライマリ光から分割される。励起光８と異なるプライマリ光の部分２２は、励起検出器、すなわち、さらなる電気パルスおよびそれによってプライマリ光の異なる部分の各検出パルス用のさらなる電気パルス２４のシーケンスを生成する励起検出器によって検出される。電気パルス２４のシーケンスは、さらなる増幅器３０に伝達され、増幅され、かつ続いてさらなるアナログ−デジタル変換器３２に導かれ、このアナログ−デジタル変換器３２は、５ギガサンプル／秒のサンプリング速度で電気パルス２４のさらなるシーケンスをサンプリングすることによって、さらなるデジタルデータシーケンスを生成する。
【００５３】
第１のデジタルデータシーケンスおよびさらなるデジタルデータシーケンスは、続いて相関ユニット３３に送られ、相関ユニット３３は、デジタルデータシーケンスおよびさらなるデジタルデータシーケンスを、データパケット、すなわち、各場合に、連続励起パルス間の時間間隔と正確に同じ長さである測定期間を表すデータパケットに分割する。これは、まさに各励起パルスの光学的励起によって引き起こされた検出光から生じる測定データが、励起パルスに簡単に関連付けられるという特定の利点を有する。さらに、相関ユニット３３において、特定の場合に検査されている試料位置の場所に関する、制御ユニット３４によって利用可能にされたさらなるデータ、タイムスタンプと同様に、連続番号が、各場合にデータパケットに追加される。特に、前のデータパケットの終わりおよび／または続くデータパケットの初めを、さらに追加してもよい。それによってデータパケットの時間系列がいつでも再構成可能であるという特定の利点が、ここで導き出される。
【００５４】
続いて、それぞれのパルスの数およびそれらの瞬間２７、２９と同様に、それらの間の時間間隔が、分析ユニット３５において決定される。最後に、例えばデータパケット当たりのそれぞれのパルス数、その度数分布、およびパルス計数などの分析結果が、メモリユニット２５に記憶される。
【００５５】
図５は、分かりやすくするために、個々のコンポーネントが同様にボックスとして示されたさらなる例示的な実施形態の概略図である。この変形は、次の点で、図４に示す別形とは異なる。すなわち、電気パルス２４のシーケンスおよび電気パルス２３のさらなるシーケンスが、特定の場合に、別個のアナログ−デジタル変換器によってサンプリングされず、相関を容易にするために重ね合わせ装置２８によって反対符号で最初に相互に重ね合わされる。続いて、重ね合わせ信号が、アナログ−デジタル変換器２６に供給され、デジタルデータシーケンスを生成する。重ね合わせ装置２８は、パワー結合器として設計されている。図４に示す装置と比較して、ある振幅分解能が、一般には実際にここで失われる。しかしながら、一方では電気パルスおよび他方ではさらなる電気パルス用の２つの異なるアナログ−デジタル変換器の基本的に可能な使用の場合に発生し得る時間変動が回避される。
【００５６】
図４に示す装置と同様に、デジタルデータシーケンスは、続いて、デジタルデータシーケンスをデータパケットに分割する相関ユニット３３に伝達され、データパケットは、それぞれ、連続励起パルス間の時間間隔と正確に同じ長さの測定期間をそれぞれに表す。
【００５７】
相関ユニット３３において、特定の場合に検査されている試料位置の場所に関する、制御ユニット３４によって利用可能にされたさらなるデータ、タイムスタンプと同様に、連続番号が、各場合に個別データパケットに追加される。それぞれのパルスの数およびそれらの瞬間２７、２９と同様に、それらの間の時間間隔が、続いて、分析ユニット３５において決定される。最後に、例えば、データパケット当たりのそれぞれのパルス数、その度数分布、およびパルス計数などの分析結果が、メモリユニット２５に記憶される。
【符号の説明】
【００５８】
１  走査顕微鏡
２  光源
３  パルスレーザ
４  プライマリ光ビーム
５  第１のビームスプリッタ
６  測定ビーム
７  励起検出器
８  励起ビーム
９  評価および制御装置
１０  照明ピンホール
１１  メインビームスプリッタ
１２  走査装置
１３  走査ミラー
１４  走査光学系
１５  チューブ光学系
１６  顕微鏡対物レンズ
１７  試料
１８  検出光
１９  検出ピンホール
２０  検出器
２１  第１の増幅器
２２  プライマリ光ビーム４の異なる部分
２３  電気パルス
２４  さらなる電気パルス
２５  メモリユニット
２６  アナログ−デジタル変換器
２７  さらなる電気パルス２４の瞬間
２８  重ね合わせ装置
２９  電気パルス２３の瞬間２９
３０  さらなる増幅器
３１  第１のアナログ−デジタル変換器
３２  さらなるアナログ−デジタル変換器
３３  相関ユニット
３４  制御ユニット
３５  分析ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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