(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の反応混合物中でＲＮＡテンプレートから増幅ｃＤＮＡを生成する方法であって、当該方法が、
ＲＮＡテンプレートを用意する工程と、
ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、ｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることができる１以上のイノシン含有プライマーと、エンドヌクレアーゼＶと、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とを含む反応混合物を用意する工程と、
ＲＮＡテンプレートを上記反応混合物とインキュベートすることにより、ＲＮＡテンプレートを逆転写してｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を形成する工程と、
インキュベートを続けることにより、同じ反応混合物を使用して、ｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖のｃＤＮＡ鎖を増幅して増幅ｃＤＮＡを形成する工程と
を含んでおり、
当該方法がｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖を変性させずに等温条件下で実施される、方法。
【請求項２】
逆転写及び増幅が４０〜５０℃の温度で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡにハイブリダイズすることができるプライマーの少なくとも１つが、イノシン含有プライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びそれらの組合せを含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物が、ｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖のｃＤＮＡ鎖にアニーリングするための複数のフォワード及びリバースイノシン含有プライマーを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素又はＨＩＶ逆転写酵素の１つ以上から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
イノシン含有プライマーがホスホロチオエート結合を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記反応混合物が、１以上の伸長テンプレートを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼである、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
逆転写酵素が、減少したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
エンドヌクレアーゼＶが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列を有するタンパク質から選択される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記反応混合物が、１以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ｃＤＮＡの増幅速度を測定することによってＲＮＡテンプレートを定量する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に、本発明は、一般には等温条件下で所望のＤＮＡを増幅するために、逆転写酵素と、エンドヌクレアーゼと、ＤＮＡポリメラーゼとを使用することによって、単一の反応物中で、リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートから開始してデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を合成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、検体検出、センシング、法医学及び診断用途、ゲノム配列決定、全ゲノム増幅などに使用される核酸ベースアッセイで用いられることが多い。これらの用途は、高い特異性、感度、精度及びロバスト性を有する核酸増幅技術を必要とする。核酸増幅は、出発核酸物質が小量で存在する場合に特に重要である。
【０００３】
様々な技術が核酸を増幅するのに現在使用されており、それらのいくつかは、わずか数分子の核酸物資を用いて開始する。これらの技術としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自立配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が挙げられる。ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、続いてＤＮＡを増幅するために、いくつかの方法が現在利用可能である。ＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、続いてＤＮＡを増幅する現在の方法は、異なる条件下で２つの工程を含む。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、テンプレートＤＮＡ、プライマー対及びＤＮＡポリメラーゼを混ぜ合わせ、融解、アニーリング及び伸長工程を可能にする反復温度サイクルに供する。融解又は変性工程は、典型的には、高温で実施されるのでポリメラーゼの選択肢は好熱性ポリメラーゼに限定され、工程は、設備要求をさらに増大させ得る。それにより、等温条件下で鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン含有プライマーと、エンドヌクレアーゼＶとを使用する別の増幅方法は、核酸増幅を達成するための反応の熱サイクル要件、及び高温での反復加熱に耐えることができる熱安定なポリメラーゼの必要性を排除する。或いは、エンドＶ又はイノシン３’エンドヌクレアーゼと称されるエンドヌクレアーゼＶは、脱アミノ化又は別の方法で修飾された塩基、例えばイノシシを有するヌクレオチドを含有するＤＮＡを認識するＤＮＡ修復酵素である。エンドヌクレアーゼＶが、同じ鎖内のイノシンの３’側の２番目（又は３番目）のリン酸ジエステル結合を切断すると、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼが、ヌクレオチドを既存のＤＮＡ鎖の３’末端に付加すると、テンプレート方向に５’→３’伸長が起こって相補鎖が作られる。この伸長反応は、ＤＮＡ鎖のコピー数の純増加をもたらす既存鎖の置換を含み得る。
【０００５】
ＲＮＡテンプレートの増幅は、例えば、ＲＮＡ発現プロファイリングで必要とされる。この技術では、生物学的サンプル中のＲＮＡ分子の相対濃度を決定する。ロバストな検出及び分析を可能にするために、生物学的サンプル中のいくつかのＲＮＡ分子は、分析前にＲＮＡを増幅する必要性があるような比較的低濃度で存在し得る。ＰＣＲによってｍＲＮＡを増幅すると、異なる速度で異なる分子種のＲＮＡが生産されるので、結果が曖昧になってＲＮＡの定量が困難になり得る。加えて、分析は、３以上の工程及び異なる条件を必要とする。現在利用可能なＲＮＡ増幅技術は、非特異的な増幅反応に起因し得る高いバックグラウンドノイズに悩まされている。
【０００６】
ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを増幅するためのより良い方法及び組成物が望まれている。このような方法及び組成物は、理想的には、よりロバストで高感度で再現可能であるべきである。
【発明の概要】
【０００７】
方法の一実施形態は、ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とを含む第１の反応混合物を使用して、リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを逆転写してｃＤＮＡを形成すること；及び１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼとを含む第２の反応混合物を使用して、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成することを含む。方法は、ｃＤＮＡテンプレートを変性させずに等温条件下で実施される。
【０００８】
サンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを定量する方法の別の実施形態は、ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とを含む第１の反応混合物を使用して、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成すること；及び１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼとを含む第２の反応混合物を使用して、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成すること；増幅産物の合成速度を分析して、サンプル中に存在するＲＮＡテンプレートを定量することを含み、逆転写及び増幅は、ｃＤＮＡテンプレートを変性させずに等温条件下で達成される。
【０００９】
一実施形態では、サンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを定量する方法は、ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とを含む第１の反応混合物を使用して、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを形成すること；及び１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼとを含む第２の反応混合物を使用して、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成すること；及び核酸検出システムを使用して、増幅産物の存在を検出することを含む。逆転写及び増幅は、ｃＤＮＡテンプレートを変性させずに等温条件下で達成される。
【００１０】
さらに別の実施形態では、リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを増幅する方法は、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写すること；及びｃＤＮＡを変性させずに、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成することを含み、ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）と、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼとを含む単一の反応混合物中で、逆転写及び増幅が等温条件下で実施される。
【００１１】
リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートからデオキシ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのキットの一実施形態は、１以上のイノシン含有プライマー；及び逆転写酵素活性と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性と、プライマー又はその組合せのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼ活性とを含む１以上の酵素を含む。
【００１２】
ＲＮＡテンプレートからデオキシ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのキットの別の実施形態は、１以上のイノシン含有プライマーと、逆転写酵素活性及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む酵素と、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼとを含む。
【００１３】
ＲＮＡテンプレートからデオキシ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのキットの別の実施形態は、１以上のイノシン含有プライマーと、逆転写酵素活酵素と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼとを含む。
【００１４】
サンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを定量するキットの一実施形態は、１以上のイノシン含有プライマーと、逆転写酵素と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼと、核酸検出システムとを含む。
【００１５】
本発明のこれらの及び他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読めばより良く理解されよう。添付の図面中では、同様の文字は、図面を通して同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＲＮＡテンプレートから開始して、ｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖中間体を介するＤＮＡ合成スキームの例の概略図である。
【図２】図２は、ＲＮＡテンプレートから開始して、二本鎖ＤＮＡ中間体を介するＤＮＡ合成スキームの概略図である。
【図３】図３は、修飾塩基を有するプライマーと、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとを使用するＤＮＡ増幅機構の概略図である。
【図４】図４は、逆転写酵素の存在下又は非存在下で、ＲＮＡ又はｃＤＮＡテンプレートから開始して、テンプレートを変性させた場合又はテンプレートを変性させなかった場合のＤＮＡ増幅産物を示すゲル電気泳動の画像を提供する。
【図５】図５は、漸増濃度の２つの異なる逆転写酵素の存在下で、ＲＮＡテンプレートから開始したＤＮＡ増幅産物を示すゲル電気泳動の画像を提供する。
【図６】図６は、ＲＮａｓｅ  Ａの非存在下で、脾臓又は腎臓由来のＤＮＡ又はＲＮＡテンプレートのいずれかを用いて開始したｐ５３配列のＤＮＡ増幅産物を示すゲル電気泳動の画像である。
【図７】図７は、陰性対照としてＲＮａｓｅ  Ａで処理した脾臓又は腎臓由来のＤＮＡ又はＲＮＡテンプレートのいずれかを用いて開始したｐ５３配列のＤＮＡ増幅産物を示すゲル電気泳動の画像を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを増幅するための方法及びキットを対象とする。方法は、一般に、ＲＮＡテンプレートを逆転写し、続いて、得られたＤＮＡを単一の反応混合物中で増幅する工程を含む。本方法は、少数の細胞又は微量のＲＮＡサンプルから開始して、ＲＮＡサンプル又は遺伝子発現を分析するのに適切なＤＮＡを生産することを可能にする。より容易に定量又は調査される増幅ｃＤＮＡは、少量のＲＮＡテンプレートから生産される。方法は、逆転写酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、エンドヌクレアーゼＶと、イノシン（イノシン含有プライマー）ヌクレオチドを含有する１以上のプライマーとを利用し、熱サイクル装置を使用せずにＲＮＡ逆転写及びＤＮＡ増幅の両方を行う。
【００１８】
特許請求される本発明の主題をより明確かつ簡潔に説明及び指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。本明細書を通して、特定の用語の使用は非限定的な例とみなすべきである。
【００１９】
単数形で記載されたものであっても、文脈から明らかではない限り、複数形も含めて意味する。本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される概略的な文言は、それが関係する基本的機能の変化を生じることなく、許容範囲で変化し得る任意の量的表現を修飾するために適用され得る。したがって、「約」などの用語によって修飾された値は、明記された厳密な値に限定すべきでない。場合により、概略的な文言は、値を測定するための機器の精度に相当し得る。必要な場合には範囲が示されているが、これらの範囲は、その中に入るすべての部分範囲を含む。
【００２０】
本明細書で使用される「逆転写酵素」は、一般に、ＲＮＡを相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡに複製することができる酵素を指す。逆転写は、ＲＮＡテンプレートをＤＮＡにコピーする過程である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、合成用のテンプレートとしてＲＮＡ鎖を使用してＤＮＡ鎖を作ることができる酵素である。一例では、酵素は、最適には、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを生成する逆転写酵素活性を有し、酵素はＤＮＡポリメラーゼ活性を有しないか、又は最小限のＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。別の例では、酵素は、名目上のＤＮＡポリメラーゼ活性及び高い逆転写酵素活性を有する。逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼのいずれかは、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ鎖を生成し得る。逆転写酵素は、天然に存在する逆転写酵素でもよいし、又は上記所望の酵素活性を保持するその変異体もしくは断片でもよい。分子生物学の分野におけるルーチンな方法によって生産される任意の組換え操作された逆転写酵素であって、逆転写酵素活性を有する逆転写酵素は、本発明の実施に使用され得る。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、テンプレートとして核酸鎖を使用してＤＮＡ鎖をデノボ合成する酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成用のテンプレートとして既存のＤＮＡ又はＲＮＡを使用し、それが読み取るテンプレート鎖に沿ってのデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新たに合成されるＤＮＡ鎖は、テンプレート鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’−ヒドロキシル末端のみに遊離ヌクレオチドを付加し得る。それは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）からヌクレオシド一リン酸を成長中のオリゴヌクレオチド鎖の３’−ヒドロキシル基に転移することによって、オリゴヌクレオチドを合成する。これにより、新たな鎖が５’→３’方向に伸長する。ＤＮＡポリメラーゼは既存の３’−ＯＨ基のみにヌクレオチドを付加し得るので、ＤＮＡ合成反応を開始するために、ＤＮＡポリメラーゼは、最初のヌクレオシドを付加し得るプライマーを必要とする。適切なプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡのオリゴヌクレオチドを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼ、又は上述の活性を有する天然酵素の変異体であり得る。例えば、それは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、又はエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００２２】
本明細書で使用される「鎖置換核酸ポリメラーゼ」は、その核酸合成活性とは別に鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼを指す。すなわち、鎖置換核酸ポリメラーゼは、テンプレート鎖にアニーリングした相補鎖を置換する一方で、核酸テンプレート鎖の配列に基づいて（すなわち、テンプレート鎖を読み取って）核酸合成を継続し得る。鎖置換は、複数コピーの標的配列の合成をもたらすのに必要である。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、存在する場合には、合成鎖の分解をもたらし得るので、いくつかの例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。任意の天然に存在するＤＮＡポリメラーゼ、又はＤＮＡポリメラーゼ活性を保持するその変異体もしくは断片、又は所望の酵素活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性）を示す任意の組換え操作されたＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に開示される方法及びキットで使用し得る。組換えタンパク質、特に酵素、より具体的にはＤＮＡポリメラーゼを生産するための方法は、分子生物学の分野で周知かつルーチンである。
【００２３】
本明細書で使用される用語「エンドヌクレアーゼＶ」又は「エンドＶ」又は「イノシン３’エンドヌクレアーゼ」は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を指す。典型的には、エンドヌクレアーゼＶは、イノシンを含有するＤＮＡを認識するＤＮＡ修復酵素であり、それが、イノシンの３’側の２番目又は３番目のリン酸ジエステル結合を加水分解すると、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。エンドヌクレアーゼＶは、大腸菌からヒトに至る生物で見られ、イノシン類似体に対して３’側のＤＮＡにおけるニック形成を提供する反応において、任意のエンドヌクレアーゼＶ酵素を使用し得る。また、エンドヌクレアーゼＶは、キサンチン又はヒポキサンチンを含有するＤＮＡを認識し得、それが、キサンチン又はヒポキサンチン残基の３’側の２番目又は３番目のリン酸ジエステル結合を加水分解すると、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。使用されるエンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼ、又は酵素活性を保持するその変異体もしくは断片であり得る。分子生物学の分野における標準的な方法によって生産される任意の操作された組換えエンドヌクレアーゼであって、所望の酵素活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を示す操作された組換えエンドヌクレアーゼは、本発明の実施に使用され得る。当業者であれば、組換えタンパク質（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ又はエンドヌクレアーゼなどの酵素）を生産するための技能を有し、様々な分子生物学的技術によって、このような組換えタンパク質を作製し得ることを認識するであろう。
【００２４】
本明細書で使用される「プライマー」又は「プライマー配列」は、一般に、標的配列に相補的でありこれにアニーリングする直鎖状オリゴヌクレオチドを指す。非常に短いプライマー（例えば、５ヌクレオチド未満）は、ほとんどのハイブリダイゼーション条件下で熱力学的に安定な二本鎖を形成しないので、プライマーの長さの下限はハイブリダイズ能によって決定される。プライマーは、典型的には、８〜５０ヌクレオチドの長さで変化する。いくつかの実施形態では、プライマーは、約１５〜２５ヌクレオチドである。本明細書で使用されるプライマーは、プライマーの３’末端付近に（例えば、プライマーの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドに）配置された１以上のイノシンを含む。本明細書で使用される用語「フォワードプライマー」は、最後から２番目の３’位にイノシン又はイノシン類似体を含むプライマーであって、標的ＤＮＡの一方の特定鎖にアニーリングするプライマーを指す。本明細書で使用される用語「リバースプライマー」は、最後から２番目の３’位にイノシン又はイノシン類似体を含むプライマーであって、標的ＤＮＡの逆鎖にアニーリングするプライマーを指す。一般に、フォワードプライマー及びリバースプライマーは共に、それらの３’末端が両方ともそれらの５’末端よりも標的配列に近づくように、ＰＣＲプライマーと同様に標的ＤＮＡ配列に配向する。天然に存在するヌクレオチド、具体的にはグアニン、アデニン、シトシン及びチミン（以下、「Ｇ」、「Ａ」、「Ｃ」及び「Ｔ」）並びにヌクレオチド類似体は両方とも、本方法及び組成物のプライマーに使用され得る。
【００２５】
プライマーに関して本明細書で使用される用語「融解温度」は、プライマー−ＤＮＡハイブリッドの５０％が遊離プライマー及びＤＮＡに解離する温度を指す。プライマーの融解温度は、プライマーの長さと共に増加する。プライマーの融解温度はまた、そのヌクレオチド組成に依存し得る。したがって、複数のＧ及びＣヌクレオチドを有するプライマーは、Ａ及びＴヌクレオチドのみを有するものよりも高い温度で融解するであろう。高い融解温度（例えば、６５℃超）及び非常に高い融解温度（例えば、８０℃超）では、いくつかのＤＮＡポリメラーゼは変性して失活するので、特定の実施形態では、このような高温は好ましくない場合がある。イオン強度もプライマーの融解温度に影響を与えるので、特に指示がない限り、本明細書で提供されるすべての融解温度の値は、ｐＨ７．７、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び５０ｍＭ  ＮａＣｌで決定される。
【００２６】
本明細書で使用される「増幅産物」は、核酸テンプレートから核酸増幅によって生成された増幅核酸を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「テンプレートＤＮＡ」又は「テンプレートＲＮＡ」は、所望の増幅標的である核酸を指す。例えば、テンプレートＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、テンプレートｃＤＮＡを使用して増幅産物を生産する。
【００２８】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド類似体」は、天然に存在するヌクレオチドと構造的に類似する化合物を指す。ヌクレオチド類似体は、改変されたリン酸骨格、糖部分、核酸塩基又はそれらの組合せを有し得る。一般に、改変された核酸塩基を有するヌクレオチド類似体は、とりわけ、異なる塩基対形成及び塩基スタッキング特性を付与する。改変されたリン酸−糖骨格を有するヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ））は、とりわけ、二次構造形成などの鎖特性を改変することが多い。
【００２９】
用語「アンプリコン」又は「増幅産物」は、一般に、ポリメラーゼ伸長と共役したイノシン含有プライマーにニックを入れるエンドヌクレアーゼによって駆動される標的ＤＮＡの増幅から生じる１つ以上の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ増幅産物を指す。アンプリコンは、例えば、単一のイノシン含有プライマー、対合イノシン含有プライマー、又はネスティッド対合イノシン含有プライマーを使用して生成され得る。アンプリコンは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡを含み得る。アンプリコンは、増幅産物の混合物（すなわち、混合アンプリコン集団）、増幅産物のいくつかの優位種（すなわち、複数の別個のアンプリコン）、又は増幅産物の単一の優位種（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、単一種のアンプリコンは、当技術分野で公知の技術、例えば親和性精製又は電気泳動を使用して混合集団から単離され得る。使用される反応スキームに応じて、アンプリコンは大部分が、一本鎖又は部分的もしくは完全に二本鎖のＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡであり得る。
【００３０】
本明細書で使用される用語「保存的変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、用語「保存的変異体」は、同一又は類似のアミノ酸配列をコードする核酸であって、縮重配列を含む核酸を指す。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンが指定されるあらゆるアミノ酸位置において、これらのコドンのいずれかが、対応するヌクレオチド配列を構築するのに互換的に使用され得る。それが配列内の唯一の改変であると仮定すると、このような核酸変異体は、同じタンパク質をコードするので保存的変異体である。当業者であれば、ＡＵＧ（すなわち、アミノ酸メチオニンの唯一のコドン）及びＵＧＧ（すなわち、アミノ酸トリプトファンの唯一のコドン）を除く核酸中の各コドンを保存的に改変して、機能的に同一のペプチド又はタンパク質を得ることができることを認識するであろう。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、単一のアミノ酸又は少数のアミノ酸（例えば、典型的には約１０アミノ酸未満）を変化させ、付加し、又は欠失させる、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する置換、欠失又は付加が「保存的変異」であり、変化が、化学的に類似のアミノ酸による１アミノ酸の置換をもたらすことを認識するであろう。
【００３１】
本明細書で使用される用語「相補的な」は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内のヌクレオチド間で正確に対合する能力を指す。例えば、水素結合によってＡはＴと対合し、ＧはＣと対合する。オリゴヌクレオチドの特定位置のヌクレオチドが、ＤＮＡ分子内の対応する位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチド及びＤＮＡはその位置で互いに相補的であると考えられる。それぞれ十分な数の対応する位置が、互いに水素結合したヌクレオチドを有する場合、オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ全体が互いに相補的であると考えられる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ｄＮＴＰ混合物」は、一般に、リン酸、糖及び有機塩基を含有する三リン酸形態のデオキシヌクレオチドであって、ＤＮＡ合成用のＤＮＡポリメラーゼが必要とする前駆体を提供するデオキシヌクレオチドの組合せを指す。ｄＮＴＰ混合物は、天然に存在する各デオキシヌクレオチド（すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及びチミン（Ｔ））を含み得る。いくつかの実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチドを合成類似体で代替してもよいし、又は合成類似体で補ってもよい；ただし、ｄＮＴＰ混合物中で、イノシンをＧで代替することもできないし、Ｇで補うこともできない。
【００３３】
本明細書で使用される用語「イノシン」は、ＤＮＡ内で出合った場合にエンドヌクレアーゼＶによって認識及び切断される正常塩基の類似体、特に、脱アミノ化塩基又は類似塩基を有する２’−デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドを指す。本明細書で使用される用語「イノシン類似体」は、２’−デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドを指し、塩基としては、例えば、ヒポキサンチン（すなわち、イノシン前駆体（ｉｎｏｓｉｎｅ  ｐｒｏｐｅｒ））、キサンチン、ウリジン、オキサニン（すなわち、オキサノシン）、他のＯ−１プリン類似体、Ｎ−６−ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７−デアザヒポキサンチン、他の７−デアザプリン及び２−メチルプリンが挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される用語「イノシン含有プライマー」は、１以上のイノシン又はイノシン類似体を含むプライマーを指す。
【００３５】
本明細書で使用される用語「還元剤」又は「複数の還元剤」は、ジスルフィドをメルカプタンに還元する薬剤を指す。適切な還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（βＭＥ）及び２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）などのチオール基を含有し得る。或いは、還元剤は、例えば、ホスフィン及びその誘導体、例えばトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含有し得る。
【００３６】
本明細書で使用される用語「一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質」（「ＳＳＢ」と略される）は、二本鎖ＤＮＡに対するものよりも高い親和性で、一本鎖ＤＮＡに非共有結合するタンパク質を指す。一本鎖結合タンパク質の適切な例としては、限定されないが、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｔ７遺伝子２．５タンパク質、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡ又はそれらの組合せが挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される用語「標的ＤＮＡ」は、本発明の方法又は組成物の１つ以上を使用して合成又は増幅され得る天然又は合成起源のＤＮＡ配列領域を指す。
【００３８】
本明細書で使用される用語「テンプレート」は、１つ以上の増幅産物又はアンプリコンを生産するためのＤＮＡポリメラーゼによって増幅される標的ＲＮＡ又はＤＮＡの部分を指す。
【００３９】
特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されている成分、特性、例えば分子量、反応条件などの量を表すすべての数字は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解すべきである。したがって、特に反対の指示がない限り、以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするのではなく、報告されている有効数字の数を考慮して通常の四捨五入法を適用することによって、各数値パラメータを少なくとも解釈すべきである。
【００４０】
一例では、方法は、ＲＮＡテンプレートを逆転写してｃＤＮＡを形成し、次いで、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成することを含む。ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＮＴＰ）とを含む第１の反応混合物を使用して、逆転写を達成してｃＤＮＡを生産する。前述のように、方法は、１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼ（例えば、エンドＶ）とを含む第２の反応混合物を使用して、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成することをさらに含む。ＲＮＡテンプレートを用いて開始し、ｃＤＮＡ増幅産物の生産をもたらす方法全体が、ｃＤＮＡを変性させずに等温条件下で実施される。
【００４１】
一実施形態では、逆転写及び増幅工程は、単一の反応混合物中で実施される。ＲＮＡテンプレートの増幅方法は、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、ｃＤＮＡを増幅してＤＮＡ増幅産物を生成すること含み、ｃＤＮＡを変性させずに増幅を進める。いくつかの実施形態では、逆転写及び増幅過程は、単一の反応混合物中、等温条件下で実施される。方法の１つ以上の態様では、単一の反応混合物は、逆転写工程（すなわち、工程１）及びＤＮＡ増幅（すなわち、工程２）に必要なすべての試薬を含む組成物を指す。上記単一の反応混合物は、ＲＮＡテンプレートと、逆転写酵素と、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１つ以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、修飾塩基を含有する１つ以上のプライマーであって、ｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる１つ以上のプライマー（例えば、イノシン含有プライマー）と、ｄＮＴＰと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるエンドヌクレアーゼとを含み得る。
【００４２】
方法のいくつかの実施形態では、逆転写及び増幅反応は、２つの別個の工程で連続して行われ得るか、又は同時に行われ得る。一態様では、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、テンプレートとして機能するｃＤＮＡを用いて増幅工程を進める。一実施形態では、増幅工程は、逆転写工程後に行われる。いくつかの他の実施形態では、方法を同時に実施する場合、ＲＮＡテンプレートの逆転写及びｃＤＮＡの増幅を同時に進める。１つ以上の実施形態では、ＲＮＡテンプレートから増幅を開始し、単一の反応混合物中、等温条件下で行う場合、単一の反応混合物は、逆転写及びＤＮＡ増幅に必要なすべての必要な試薬を含む。
【００４３】
特定の態様では、逆転写工程は、一本鎖ｃＤＮＡ、二本鎖ｃＤＮＡ、ＲＮＡ：ｃＤＮＡヘテロ二本鎖又はそれらの組合せを生成する。イノシン含有プライマーは、任意の形態のテンプレートｃＤＮＡ、例えば一本鎖、二本鎖又はヘテロ二本鎖のｃＤＮＡに結合することができ、テンプレートｃＤＮＡの増幅を開始することができるので、イノシン含有プライマーを増幅反応で使用することは有利である。イノシン含有プライマーは、プライマー：テンプレートハイブリッドを形成し、ヌクレアーゼは、イノシン残基の隣のプライマーの３’ＤＮＡにおいてニックを形成する。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼはニックの入った鎖に結合し、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始する。１つ以上の例示的な実施形態を図３に示し、以下にさらに詳細に説明する。
【００４４】
上述のように、方法は、ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡテンプレートに逆転写することを含み、逆転写は逆転写酵素を必要とする。逆転写酵素の例示的な実施形態としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴ）、及びトリ骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴ）が挙げられる。逆転写酵素のいくつかは、増加した熱安定性を有し、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ又はＳＳＩＩ（商標）逆転写酵素は約４２℃でｃＤＮＡを合成する。いくつかの実施形態では、逆転写酵素（例えば、ＳＳ  ＩＩ（商標））は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合する。逆転写酵素は、特異性及び高収量の全長産物を提供する。
【００４５】
１つ以上の実施形態では、逆転写酵素のいくつかは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有し得る（例えば、ＭＭＬＶ  ＲＴ）。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡのリン酸ジエステル結合を特異的に加水分解してＲＮＡテンプレートを分解し、３’−ＯＨ及び５’−Ｐ末端産物を生成する傾向がある。一本鎖核酸、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性に対して耐性である。特定の態様では、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を減少させるように、逆転写酵素を突然変異させる（例えば、ＳＳＩＩ（商標）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）））。ＳＳＩＩ（商標）逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を減少させるように突然変異させたＭＭＬＶ逆転写酵素の突然変異型である。減少したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素の利点は、テンプレートＲＮＡの優れた安定性を提供することである。逆転写酵素がよりＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有するいくつかの実施形態では、この酵素はテンプレートＲＮＡを分解する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、反応混合物中のＤＮＡポリメラーゼの１つ以上は、同程度の逆転写酵素活性を有する。これらの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、実質的な逆転写活性を有する場合に逆転写酵素として機能する。逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼである。しかしながら、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、効率的な逆転写酵素ではない。例えば、図４の６５℃及び９５℃のレーン５には、ＲＮＡ及びＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物由来の増幅産物が示されておらず、これは、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼが効率的な逆転写酵素ではないという見解を明確に裏付けている。図４はゲルの画像を示しており、表示「不活性化」又は「変性」は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶを含む酵素混合物を追加する前に、約６５℃又は９５℃の温度で、テンプレートＲＮＡ又はｃＤＮＡテンプレート及びプライマーの混合物を加熱する工程を指す。
【００４７】
ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズするプライマーは、本明細書では「ＲＮＡプライマー」として互換的に使用される。同様に、ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズするプライマーは、本明細書では「ＤＮＡプライマー」として互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡテンプレートの逆転写又はｃＤＮＡテンプレートの増幅は、ＤＮＡプライマー又はＲＮＡプライマーのいずれかを使用して開始し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡプライマーは、イノシン含有プライマー、オリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの組合せを含む。方法のいくつかの態様では、逆転写に用いられるプライマーは、約８〜約２５ヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、ＲＮＡプライマーは、２０ヌクレオチドを含む。いくつかの他の実施形態では、ＲＮＡプライマーはＲＮＡのポリＡテイルに相補的であり得、プライマーは、ポリＡテイルにアニーリングし得る。前述のように、本明細書ではＲＮＡを指すＲＮＡのポリＡテイルは、複数のアデノシン一リン酸を含み、ＲＮＡの尾部（又は末端）に位置する。いくつかの他の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡテンプレートの特定の配列に相補的であるように設計され得る。代替的な実施形態では、ＲＮＡプライマーは、ＲＮＡテンプレートのランダム配列に結合するように設計されたランダムプライマーである。テンプレートＲＮＡに対するプライマーのアニーリング温度は、逆転写反応がｃＤＮＡの生産をもたらす範囲内にあるように選択される。１つ以上の態様では、イノシンを含むオリゴヌクレオチドプライマーが逆転写に使用される。代替的な実施形態では、ＲＮＡプライマーはまた、イノシンの代わりにキサンチンを含み得る。
【００４８】
逆転写は、典型的には、２０℃〜７０℃の範囲内の温度の等温条件下で実施される。いくつかの実施形態では、逆転写は室温（例えば、約３０℃）で実施される。一実施形態では、逆転写は、例えば、約４５℃の温度で実施される。逆転写温度の選択は、逆転写酵素などの様々な酵素の機能性に依存し得る。一実施形態では、逆転写は、約４２℃でＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを合成するＳＳＩＩ（商標）逆転写酵素を用いる。さらなる実施形態では、単一の反応混合物中でＲＮＡテンプレートの逆転写及びｃＤＮＡの増幅が行われるので、ＤＮＡポリメラーゼ又はエンドヌクレアーゼの効率がかなり高いと思われ得るような、最適反応温度を選択する。いくつかのＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼは、約３５〜５０℃でかなり高い効率を有するので、逆転写及びＤＮＡ重合反応の両方を実施するための最適温度は、約４５℃であるように選択され得る。
【００４９】
テンプレートｃＤＮＡ及びＤＮＡ増幅反応用の試薬を用いて、ＤＮＡ重合反応を開始する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、イノシン含有プライマーと、エンドヌクレアーゼを含み、反応は、典型的には、同じ温度（例えば、等温条件）で実施される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、逆転写反応工程は、単一の反応混合物中でＤＮＡ増幅反応と同時に行われる。代替的な実施形態では、逆転写反応工程を行ってｃＤＮＡを生産し、増幅反応混合物を同じ温度条件でｃＤＮＡに別個に追加して増幅産物を生産する。１つ以上の異なる検出方法を使用して複数のＲＮＡ種を同定することができるので、均一なサンプル中の複数のＲＮＡ種を調査するいくつかの例では、等温条件下でＲＮＡテンプレートからＤＮＡを増幅する方法が適切であり得る。いくつかの実施形態では、逆転写反応工程を行ってｃＤＮＡを生産し、増幅反応混合物を増幅用のｃＤＮＡに別個に追加し、逆転写及び増幅を２つの異なる温度条件で行う。複数のＲＮＡ種を複合反応でｃＤＮＡに変換し、次いで、ｃＤＮＡ産物を別個の増幅反応物に分けてＤＮＡ増幅産物を形成し、逆転写及び増幅を２つの異なる温度条件で行うので、サンプル中の複数のＲＮＡ種を調査するいくつかの例では、方法が適切であり得る。この例は、最初のサンプル中の異なるＲＮＡ種の存在を決定する。
【００５１】
例示的なＤＮＡ増幅方法は、イノシン含有プライマーをテンプレートＤＮＡにアニーリングしてプライマー：テンプレートＤＮＡハイブリッドを形成することを含む。増幅反応は、ヌクレアーゼを使用して、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにおいて、プライマー：テンプレートＤＮＡハイブリッドにニックを入れることをさらに含む。ヌクレアーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で機能し、ＤＮＡポリメラーゼは、ニックの入ったＤＮＡテンプレートに結合し、ＤＮＡ鎖を置換し、反応混合物中のｄＮＴＰを用いて別のＤＮＡ鎖を合成して、ＤＮＡテンプレート（又はｃＤＮＡ）の一部に相補的な１以上の増幅産物を生産する。
【００５２】
ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを増幅するための方法は、例えば、イノシンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、イノシンをテンプレートＤＮＡの特定位置に導入することを含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、イノシン残基の３’側のＤＮＡから開始して、プライマー：ＤＮＡテンプレートハイブリッドからＤＮＡを合成する。次いで、エンドヌクレアーゼＶは、イノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを形成して、ＤＮＡポリメラーゼがニックの入ったＤＮＡテンプレートに結合するのを可能にする。次いで、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換と同時に、テンプレートＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成する。エンドヌクレアーゼＶが、イノシン残基の３’側のＤＮＡにおいて繰り返しニック形成することにより、ＤＮＡポリメラーゼがニックの入ったテンプレートに繰り返し結合して、標的ＤＮＡに対する相補鎖を繰り返し作ることが可能になる。いくつかの他の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、イノシンではなくキサンチンを含む。これらの実施形態では、エンドヌクレアーゼＶは、キサンチン又はヒポキサンチン残基の３’側のＤＮＡにニックを形成し、それにより、ＤＮＡポリメラーゼがニックの入ったＤＮＡテンプレートに結合することが可能になる。
【００５３】
１つ以上の実施形態では、増幅反応用のプライマーは、修飾ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）を含有するプライマーから選択される。いくつかの実施形態では、異なる位置にイノシン又はキサンチン残基を含むプライマーが、ＤＮＡ増幅に使用される。一実施形態では、イノシン又はキサンチン残基は、プライマーの５’末端から少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド又は少なくとも１０ヌクレオチドに位置し得る。これらの実施形態では、イノシンはグアノシンの代わりであり、シトシン又はチミン塩基の反対側にあるが、イノシンは「ユニバーサル塩基」と考えられるので、任意の塩基の反対側に配置し得る。特定の実施形態では、イノシンヌクレオチドは、プライマーの最後から２番目の３’ヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、イノシンは、プライマーの最後の３’ヌクレオチドであり得る。代替的な実施形態では、イノシンは、プライマーの最後から２番目の３’位及び最後の３’位の両方に存在し得、ヌクレアーゼは、イノシン由来の２つのヌクレオチドにニックを入れるので、両方のイノシンが、増幅反応中にプライマー配列内で保持され得る。
【００５４】
１つ以上の実施形態では、第１、第２又は両方の反応混合物は、ｃＤＮＡとアニーリングするための複数のフォワード及びリバースイノシン含有プライマーを含む。いくつかの実施形態では、イノシン含有プライマーは、当技術分野で認識されている合成技術を使用して合成され得る。プライマー設計ソフトウェアを用いて、核酸にアニーリングすることができる単一のプライマー又は複数のプライマーを設計し、それにより、ポリメラーゼ媒介性の伸長を容易にすることができる。１０℃〜５０℃の範囲内の温度で反応を進める実施形態では、プライマーの融解温度は、一般に、約５０ｍＭの塩において約４５℃である。本出願の他の態様は、比較的短いプライマー（例えば、１０ｍｅｒ〜２０ｍｅｒ；より具体的には１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒ又は１６ｍｅｒ）が用いられ得る。他の実施形態では、イノシン含有プライマーは、約５〜１００、５〜３０又は５〜２０ヌクレオチド長である。
【００５５】
特定の実施形態では、プライマー内において、標的ＤＮＡ中のＣ又はＴに相補的な位置にイノシン残基が配置されるように、イノシン含有プライマーを設計する。いくつかの実施形態では、イノシンは、プライマーの最後から２番目の３’塩基として配置される。温度及びイオン強度などの反応条件は、標的ＤＮＡに対するプライマーのアニーリング効率に影響を与えるので、プライマー中のイノシンの位置は、特定の反応条件にしたがって調整され得る。一般に、エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡにニックを入れた後、プライマーが標的ＤＮＡにアニーリングしたままの状態になるように、イノシン残基は、プライマーの５’末端から離れて配置される。したがって、イノシンの５’側のプライマーセグメントは、一般に、選択された反応条件の温度にほぼ等しい融解温度を有する。２つのテンプレートのＧが連続している場合、２つのイノシンが、最後から２番目の３’残基及び最後の３’残基の両方としてプライマー中に現れ得る。ＧＧ、ＡＡ、ＧＡ、ＡＧ及びそれらの２つ以上の組合せも、同様に十分に機能する。
【００５６】
複数のプライマーをいくつかの反応混合物中に含め得る。プラス及びマイナスＤＮＡ鎖の両方が生成される実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む対合プライマーを反応混合物中に含め得る。複数の対合プライマーを含めることにより、反応混合物中の個別の核酸産物の相対的割合を改善し得る。各プライマーが直列で、元の標的核酸上で互いに隣り合って又は互いの近くにハイブリダイズするように、ネスティッドプライマーを前のアンプリコンの３’末端又はその付近に結合するように設計し得る。複数のネスティッドプライマーを使用する実施形態では、通常は１０μＬの容量に約１ｎｇ〜１μｇの濃度の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を反応混合物中に含めて、忠実度を増加させ、バックグラウンドを減少させ得る。ＳＳＢは、当技術分野で公知の様々なＳＳＢのいずれかから選択され得、試薬条件との適合性、及び反応混合物中で使用される他の酵素との協同的相互作用に基づいて最適に選択され得る。
【００５７】
方法の１つ以上の実施形態は、以下の特徴の１つ以上を示し得るＤＮＡポリメラーゼを用いる：鎖置換活性；ニックから鎖置換を開始する能力；及び低い一本鎖ＤＮＡ分解活性。前述のように、ＤＮＡ重合は、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド三リン酸を使用してＤＮＡを合成することを含む。ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチド三リン酸を使用して、相補的なテンプレートＤＮＡ鎖に基づいてプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加し、元のテンプレートＤＮＡに相補的な新たなＤＮＡ鎖を作る。１つ以上の実施形態では、増幅産物は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得、テンプレート鎖の末端に伸長することが多い。
【００５８】
典型的には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチヌクレオチドを３’→５’の方向に切出修復することによって、この酵素が合成ＤＮＡを校正することを可能にする。いくつかの実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは異なり、増幅は、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼを用いる。エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼは、校正の非存在下において、イノシンの３’側のＤＮＡにおける繰り返しニック形成を維持するのに使用され、イノシンの切出を防止して、修飾塩基の使用を可能にする。いくつかの実施形態では、プライマーをチオエート塩基で修飾して、エキソヌクレアーゼ活性による分解を防止し得る。１つ以上の実施形態では、イノシン含有プライマーは、ホスホロチオエート結合を含む。ホスホロチオエート結合を使用して、３’→５’エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼが増幅中のプライマーからイノシンを除去するのを防止し得る。本発明の方法及びキットで使用されるＤＮＡポリメラーゼが、校正３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、ホスホロチオエート結合が存在することが望ましい。方法で使用される酵素のいずれかがヌクレアーゼ活性を有する場合、又はヌクレアーゼが使用テンプレートに混入している場合にも、これが有利であろう。しかしながら、ヌクレアーゼ耐性結合はプライマー内の任意の位置に位置し得るが、特定の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、イノシンの５’側又は３’側に直接付加される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。ＤＮＡポリメラーゼは、エンドヌクレアーゼによって形成されるニックに結合し、３’→５’方向からＤＮＡを合成するので、ＤＮＡポリメラーゼを前方に移動させ、相補鎖を合成するために鎖置換活性が必要とされる。１つ以上の実施形態では、方法に有用な例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないが、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ（−）クレノウ、ΔＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＣＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ２、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００６０】
前述のように、いくつかの実施形態では、方法は、プライマー中に存在するイノシン又はキサンチン残基の３’末端にニックを形成するエンドヌクレアーゼを含む。１つ以上の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＶである。一実施形態では、エンドヌクレアーゼＶは、イノシンヌクレオチドの３’側の２つのヌクレオチドにおいてＤＮＡに特異的にニックを入れるヌクレアーゼである。標的ＤＮＡが二本鎖である場合、ニックはイノシンと同じ鎖上に生じる。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーと共同して、エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの増幅をもたらす。最初に、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長して、ヌクレアーゼのためのニック部位を作る。ニック形成は、ＤＮＡポリメラーゼのための開始部位を作って一本鎖ＤＮＡ産物を置換する一方で、二本鎖プライマー伸長産物を再形成する。このサイクルを繰り返して、テンプレートの下流部分に相補的な複数の一本鎖ＤＮＡを合成する。
【００６１】
本明細書で使用されるエンドヌクレアーゼＶが、イノシンを含有するＤＮＡを認識し、イノシンの３’側の２番目又は３番目のリン酸ジエステル結合を加水分解すると、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。任意のエンドヌクレアーゼＶ酵素は、イノシン類似体に対して３’側のＤＮＡにニックを入れる。いくつかの実施形態では、野生型エンドヌクレアーゼＶ（例えば、配列番号１）が、本発明の方法で用いられ得る。代替的な実施形態では、配列番号２又は配列番号３として本明細書で提供される変異体を使用して、イノシン含有標的ＤＮＡにニックを入れ得る。また、１つ以上の実施形態では、エンドヌクレアーゼＶが、キサンチン又はヒポキサンチンを含有するＤＮＡを認識し、キサンチン又はヒポキサンチン残基の３’側の２番目又は３番目のリン酸ジエステル結合を加水分解すると、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。標的核酸を熱変性しない実施形態では、本明細書で用いられるエンドヌクレアーゼＶ変異体は、比較的低い温度、例えば８５℃未満又は２０℃〜８０℃で最大活性を有する。
【００６２】
単一のフォワードプライマーを用いると、各分子の相補コピーの合成速度は比較的一定であり、時間と共にコピー数が着実に直線的に増加する。逆方向の第２のプライマーを追加する場合、フォワードプライマーから一定距離のテンプレートＤＮＡにアニーリングし、増幅過程が加速される。フォワード及びリバースプライマーを互いに比較的近くに（すなわち、約１ｋｂ未満離して）配置して、エンドヌクレアーゼＶ切断部位によって規定されるその５’末端にフォワードアンプリコンをコピーするのに必要な時間を最小限にし、それにより、キネティクスを増加させ、テンプレートＤＮＡからのアンプリコンを生成するのに必要な総時間を減少させ得る。他の成分のヌクレアーゼ又はポリメラーゼの量が限定的になると、反応速度が最大に達する。また、さらなるネスティッドプライマーを使用して、増幅速度をさらに増加させ得る。いくつかの実施形態では、ニック形成反応は、プライマー配列の増幅産物への複製を排除するので、増幅産物をさらに増幅するためには、１つ以上のネスティッドプライマーが必要とされる。
【００６３】
増幅の反応温度は、アンプリコン生産過程中に変化し得、２０℃〜７０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、反応温度は、４０〜５０℃に保持され得る。一実施形態では、反応温度は、４５℃に保持され得る。
【００６４】
代替的な実施形態では、方法は、増幅用の１以上の伸長テンプレートを用いる。伸長テンプレートは、プロモーター配列又は制限エンドヌクレアーゼ部位特異的配列などの特定の配列である。アンプリコンの３’末端が伸長テンプレートにアニーリングするように、伸長テンプレートを設計し得る。伸長テンプレートがアンプリコンに相補的なもの、及びアンプリコンに相補的ではないものの２つの配列ストレッチを含有し、ハイブリダイゼーションにより、非相補的プライマー配列の５’オーバーハングが作られる場合、ＤＮＡポリメラーゼによってアンプリコンの３’陥凹末端がさらに伸長されるであろう。この伸長反応を用いて、特定のＤＮＡ配列を最内側のアンプリコンの３’末端に組み込み得る。また、この伸長反応を使用して、５’オーバーハングから配列を置換し得る。
【００６５】
１つ以上の実施形態では、伸長テンプレートの５’末端は、ステムのいずれかのアーム上に位置する蛍光色素及びクエンチャーと共に、ヘアピンループを含有し得、そして、エネルギー移動によって、蛍光色素は大部分がクエンチされ得る。鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによってアンプリコンの３’陥凹末端から伸長すると、ステム−ループ構造が二本鎖になり、色素及びクエンチャーがさらに分離されて、クエンチ又は生成する検出可能なシグナルの一部又は全部が排除される。２つ以上の独立した増幅過程を同時にモニタリングし得るように、伸長テンプレートの配列及びクエンチ色素の色によって、このシグナルを多重化し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、伸長テンプレートの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の相補体を含み得る。したがって、伸長テンプレートがアンプリコンにハイブリダズし、続いて、ＤＮＡポリメラーゼによってアンプリコンの３’末端がプロモーター領域に伸長することによって、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成され得る。ＲＮＡポリメラーゼを反応に含める実施形態では、アンプリコンは、一本鎖ＲＮＡポリメラーゼテンプレートとして転写され得る。すべての実施形態では、本方法によって生産される核酸は、定性的又は定量的に決定され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを増幅する方法は、増幅産物の合成速度を分析して、サンプル中に存在するＲＮＡテンプレートを定量することをさらに含む。いくつかの代替的な実施形態では、方法は、核酸検出システムを使用して増幅産物を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸検出システムは、ゲル電気泳動、インターカレート色素、蛍光標識、酵素結合標識、抗体媒介標識及び放射性標識又はピロリン酸塩の定量を含む。
【００６８】
蛍光標識検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識検出などの従来の核酸検出システムのいずれかを使用して、ＤＮＡ増幅産物（増幅配列）を検出し得る。開示される方法の重要な特徴は、サイクルではなく連続的な等温複製で増幅が行われることである。これによって増幅の複雑性が低下し、アウトプットとかなり一致するようになる。鎖置換は、単一の連続的な等温反応において、複数コピーの核酸配列又はサンプルを迅速に生成することを可能にする。次いで、開示される方法を使用して生産したＤＮＡを任意の目的に、又は任意の所望の他の方法で使用し得る。
【００６９】
増幅核酸の検出及び定量を支援するために、検出標識を増幅核酸に直接組み込んでもよいし、又は検出分子にカップリングしてもよい。本明細書で使用される検出標識は、増幅核酸と直接的又は間接的に結合することができる任意の分子であって、測定可能かつ検出可能なシグナルを直接的又は間接的にもたらす分子である。核酸に組み込むための、又は核酸プローブにカップリングするための多くのこのような標識が当業者に公知である。使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体及びリガンドである。
【００７０】
適切な蛍光標識の例としては、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）並びにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が挙げられる。
【００７１】
標識ヌクレオチドは、合成中の増幅産物に直接組み込まれ得るので、別の形態の検出標識である。増幅ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれ得る検出標識の例としては、ヌクレオチド類似体、例えばＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）、ＢｒＵＴＰ、及びビオチン又は適切なハプテン、例えばジゴキシゲニンで修飾されたヌクレオチドが挙げられる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ及びシアニン−５−ｄＵＴＰである。ＢｒｄＵｒｄは、ＤＮＡのヌクレオチド類似体検出標識に一般的に使用され、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、ＲＮＡのヌクレオチド類似体検出に一般的に使用される。直接標識のために、フルオレセイン、Ｃｙ３及びＣｙ５をｄＵＴＰに連結し得る。Ｃｙ３．５及びＣｙ７は、ビオチン又はジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジン又は抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用可能である。
【００７２】
続いて、当技術分野で周知の高感度法を使用して、増幅核酸に組み込まれる検出標識、例えばビオチンを検出し得る。例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して、ビオチンを検出し得る。これをビオチンに結合させ、続いて、適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム、３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．ｓｕｐ．３，７］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によって検出する。増幅ＲＮＡの検出に使用するための検出標識は、アクリジニウムエステル標識ＤＮＡプローブである。非ハイブリダイズプローブはアルカリで破壊され得るので、アクリジニウムエステル標識検出プローブにより、洗浄せずに増幅ＲＮＡを検出することが可能になる。
【００７３】
検出プローブは、増幅核酸上の検出タグに相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的部分は、検出プローブと検出タグとの間の特異的かつ安定的なハイブリダイゼーションを助ける任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好ましく、検出プローブの相補的部分が１６〜２０ヌクレオチド長であることが最も好ましい。検出プローブは、上記検出標識のいずれかを含有し得る。ビオチン及び蛍光分子を増幅産物の分析又は定量に使用し得る。分子ビーコンは、蛍光部分で標識された検出プローブであり、検出プローブがハイブリダイズした場合にのみ、蛍光部分が蛍光を発する。非ハイブリダイズ検出プローブはシグナルを生成しないので、このようなプローブを使用することにより、標識の検出前に、非ハイブリダイズプローブを除去する必要性が排除され、これは多重アッセイで特に有用である。
【００７４】
アドレスプローブも増幅産物の定量に使用し得る。アドレスプローブは、プライマー上のアドレスタグに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的部分は、アドレスプローブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定的なハイブリダイゼーションを助ける任意の長さであり得る。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好ましく、アドレスプローブの相補的部分が１２〜１８ヌクレオチド長であることが最も好ましい。アドレスプローブは、単一の相補的部分又は複数の相補的部分を含有し得る。好ましくは、アドレスプローブを固体支持体に直接的に、又はスペーサー分子を介してカップリングする。アドレスプローブ及び固体支持体のこのような組合せは、固体検出器の好ましい形態である。
【００７５】
これらの検出標識の２つ以上を組合せた分子も検出標識として考えられる。公知の検出標識のいずれかと、開示されるプローブ又はタグとを併用し、開示される方法を使用して増幅核酸を検出し得る。検出標識によって生成されるシグナルを検出及び測定するための方法も当業者に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーションカウント又は直接的な可視化によって検出可能され得る；蛍光分子は、蛍光分光光度計を用いて検出され得る；リン光性分子は、分光光度計を用いて検出してもよいし、又はカメラを用いて直接可視化してもよい；酵素は、その酵素によって触媒される反応の生成物を検出又は可視化することによって検出され得る；抗体は、その抗体にカップリングされた二次検出標識を検出することによって検出され得る。本明細書で使用される検出分子は、増幅核酸と相互作用する分子であって、１つ以上の検出標識がカップリングされた分子である。
【００７６】
末端リン酸標識リボヌクレオチドを使用する実施形態では、ホスファターゼを使用して、定性的又は定量的アッセイで色を生成し得る。このような実施形態では、ｄＮＴＰ又はデオキシヌクレオシド四リン酸の末端リン酸メチルエステルを使用することによって、脱リン酸化から末端リン酸を保護し得る。
【００７７】
１つ以上の実施形態では、ＲＮＡテンプレートは、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源、バクテリオファージ起源又は合成起源から単離される。１つ以上の実施形態では、特定の核酸配列（例えば、ＲＮＡ）を含有すると疑われるか、又はこれを含有することが公知のサンプルが様々な供給源から得られ得る。サンプルは、例えば、生物学的サンプル、食品、農業サンプル又は環境サンプルであり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、様々な生物学的被験体に由来する。生物学的被験体は、原核生物起源又は真核生物起源を含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的被験体は、ウイルスを含む。１つ以上の実施形態では、生物学的被験体由来の核酸サンプルは、生体組織、全細胞、細胞分画、細胞培養物又は体液又は浸出液（例えば、血液、血漿、血清又は尿、乳、脳脊髄液、胸膜液、リンパ液、涙、痰、唾液、便、肺吸引物、咽喉又は生殖器スワブなど）に由来し得る。
【００７８】
１つ以上の実施形態では、増幅すべき核酸（又は標的核酸）はサンプル中に存在し、サンプルは溶液中に分散していてもよいし、又は固体支持体（例えば、ブロット、アレイ、マイクロタイター又はウェルプレート）上に固定化されていてもよい。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションに利用可能な標的核酸を作製するために、サンプルを前処理し得る。いくつかの実施形態では、標的核酸が二本鎖形態で存在する場合、核酸を変性させずに二本鎖核酸を増幅する。これらの実施形態では、プライマーは、ハイブリダイゼーションのために一本鎖、二本鎖又はヘテロ二本鎖形態などの核酸形態のいずれかに結合し、続いて核酸を合成する能力を有する。
【００７９】
本方法に有用なヌクレオチドとしては、デオキシリボ（「ｄＮＴＰ」）及びリボヌクレオチド（「ｒＮＴＰ」）の両方が挙げられる。ｄＮＴＰ混合物は、ＤＮＡ合成用のＤＮＡポリメラーゼが必要とするデオキシヌクレオチドの組合せを提供する。ｄＮＴＰ混合物は、天然に存在する各デオキシヌクレオチド塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ））を含み得る。いくつかの実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチドを合成類似体で代替してもよいし、又は合成類似体で補ってもよい；ただし、ｄＮＴＰ混合物中で、デオキシイノシン三リン酸をｄＧＴＰで代替することもできないし、ｄＧＴＰで補うこともできない。
【００８０】
いくつかの実施形態では、合成反応は、６〜９の反応ｐＨをもたらす緩衝液中で実施される。いくつかの実施形態では、ｐＨは７．７である。当技術分野で認識されている核酸合成反応用の緩衝液（例えば、トリス緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液）のほとんどが用いられ得る。
【００８１】
一般に、特定のアンプリコン生産方法では、ＤＮＡの安定性を高める緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）が使用され得る。しかしながら、標的ＤＮＡの熱変性を用いるいくつかの特定のアンプリコン生産方法については、トリス：ホウ酸、ＨＥＰＥＳ及びＭＯＰＳ緩衝液は好ましくない場合がある。
【００８２】
ポリメラーゼ酵素は、典型的には、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２又はそれらの組合せ）を必要とする。したがって、特定の実施形態では、１つ以上の二価陽イオンを反応混合物に追加し得る。ＭｇＣｌ2を、２ｍＭ〜６ｍＭの濃度範囲で反応混合物に追加し得る。高濃度（例えば、１０ピコモル超、２０ピコモル超又は３０ピコモル超）の１つ以上のイノシン含有プライマーを反応混合物に追加する場合、より高濃度のＭｇＣｌ2が望ましい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、界面活性剤（例えば、洗剤）を反応混合物に追加し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００又はそれらの組合せから選択される洗剤である。いくつかの実施形態では、０．０５％ＮＰ−４０及び０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を反応混合物に追加する。反応混合物の第１成分を導入する前に、界面活性剤を反応チューブにアプライし得る。或いは、反応成分と共に界面活性剤を反応混合物に追加し得る。いくつかの具体的な実施形態では、反応緩衝液は、２５ｍＭトリス：ホウ酸；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．０１％Ｔｗｅｅｎ；及び２０％エチレングリコールを含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの１つ以上のブロッキング剤を反応混合物に追加して、反応容器（例えば、プラスチック製マイクロ遠心チューブ又はマイクロタイタープレート）の表面に結合させることにより、逆転写酵素、ヌクレアーゼ又はポリメラーゼとの反応に利用可能な標的核酸の相対量を増加させ得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の還元剤（例えば、ＤＴＴ、βＭＥ、ＴＣＥＰ又はＭＥＡ）を反応混合物に追加して、反応ミックス中の酵素の酸化を軽減し、生産されるアンプリコンの品質及び収量を改善し得る。
【００８６】
１つ以上の実施形態では、ＲＮＡテンプレートを増幅するためのキットは、１以上のイノシン含有プライマーと、１以上の酵素とを含み、酵素は、逆転写酵素活性と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性と、プライマー及びその組合せのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼ活性とを含む。
【００８７】
１つ以上の実施形態では、ＲＮＡテンプレートは、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源、バクテリオファージ起源又は合成起源から単離される。増幅すべきＲＮＡテンプレートは、様々な供給源又は様々な生物学的サンプルから単離され得る。標的核酸を含有するか、又はこれを含有すると疑われる生物学的被験体から、生物学的サンプルを得ることができる。生物学的サンプルはまた、疾患細胞を含有する生物学的被験体の領域由来のサンプルを含む。生物学的サンプルは、真核生物起源のもの、例えば、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類、好ましくは哺乳動物、例えばラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット又はウサギ又は霊長類、例えばチンパンジー又はヒトであり得る。或いは、生物学的サンプルは、原核生物起源又はウイルス起源又はバクテリオファージ起源のものであり得る。
【００８８】
キットの一実施形態では、１以上の酵素は逆転写酵素活性を有し、１以上の酵素は鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、１以上の酵素は、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの他の実施形態では、１以上の酵素は、逆転写酵素活性及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する。いくつかの他の実施形態では、１以上の酵素は、逆転写酵素活性と、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性と、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼ活性とを有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、キットは、逆転写酵素活性と、エキソヌクレアーゼ欠損鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ活性とを有する酵素を含み得る。例えば、ΔＴｔｓは、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。例えば、米国特許第５，７４４，３１２号を参照のこと。キットの１つ以上の実施形態は、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ（−）クレノウ、ΔＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの組合せから選択されるＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００８９】
一実施形態では、キットは、エンドヌクレアーゼＶを含む。いくつかの具体的な実施形態では、エンドヌクレアーゼＶは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又はそれらの保存的変異体の配列を有するタンパク質から選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、キットは、ｄＮＴＰ、緩衝液、ＳＳＢ、還元剤、変性剤、ブロッキング剤、界面活性剤及びそれらの組合せをさらに含む。ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰを含むｄＮＴＰの濃度は、約１００μＭ〜１００，０００μＭの範囲内である。キットは、トリス、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳから選択される緩衝液をさらに含み得る。キットは、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びそれらの組合せから選択される１つ以上の界面活性剤を含み得る。
【００９１】
１つ以上の実施形態では、キットは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択される１つ以上の還元剤をさらに含む。
【００９２】
キットは、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、Ｔ７遺伝子２．５タンパク質、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡ及びそれらの組合せから選択される一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をさらに含み得る。キットは、アルブミンを含むブロッキング剤を含み得る。キットは、Ｉ型トポイソメラーゼから選択され得る１以上のトポイソメラーゼをさらに含み得る。
【００９３】
ＲＮＡ増幅の例示的な実施形態を図１によって概略的に表す。図１は、ＲＮＡテンプレートを逆転写し、続いてＤＮＡを増幅することによるｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖の形成を示す。図１に示されているように、イノシン含有プライマーなどのヌクレオチド類似体含有プライマーがｃＤＮＡテンプレートに結合して、ヘテロ二本鎖からＲＮＡを置換すると、増幅反応が開始する。フォワードプライマーがｃＤＮＡテンプレートに結合した後、エンドヌクレアーゼがイノシン含有フォワードプライマーの３’側にニックを形成し、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡの相補鎖を合成する。ＤＮＡの相補鎖を生産する過程は、伸長と称される。このニック形成とそれに続く伸長が繰り返し周期的に起こり、それにより、テンプレート鎖の増幅産物が生産される。この工程の後、テンプレートＤＮＡの３’又は５’末端に結合して、同じ機序で増幅産物の形成をもたらすＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６を含む複数のフォワード及びリバースプライマーを使用して、複数の増幅反応を行う。
【００９４】
図２は、ＲＮＡテンプレートから開始するＤＮＡ増幅の別の例示的な実施形態を概略図で示す。この実施形態では、ＲＮＡテンプレートを逆転写し、続いてＤＮＡを増幅することによって、ｃＤＮＡを生成する。ＤＮＡポリメラーゼ及び少なくともプライマーを使用して相補鎖を合成することによって、一本鎖ｃＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成する。図２に示されているように、イノシン含有プライマーがｃＤＮＡテンプレートに結合して、相補的ＤＮＡ鎖を置換すると、増幅反応が開始する。エンドヌクレアーゼと、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６を含むイノシン含有フォワード及びリバースプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを使用して、複数の増幅反応を進めて増幅産物を生成する。
【００９５】
図３は、ニック形成及び鎖置換増幅反応を概略的に示すものであり、ここでは、修飾塩基を含有するプライマー、例えばイノシン含有プライマーがｃＤＮＡテンプレートに結合すると、増幅反応が開始する。フォワードプライマーがｃＤＮＡテンプレートに結合した後、エンドヌクレアーゼがイノシン含有フォワードプライマーにニックを形成し、プライマー鎖上にニックが形成される。次いで、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端のニックに結合し、テンプレートＤＮＡの相補鎖を５’から３’方向に合成するこの工程の後、複数のフォワード及びリバースプライマーを使用して、複数のニック形成及び増幅反応を行って増幅産物を形成する。
【００９６】
さらなるプライマー又は他のオリゴヌクレオチド、さらなる酵素、さらなるヌクレオチド、染色、色素又は他の標識成分を用いることによって、図３に示されている基本的な方法を変更し得る。したがって、例えば、ジデオキシの配列決定、各テンプレート分子用の多配列決定産物の生産のために、場合により、色素標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを追加することによって、単一のプライマーによる増幅を使用し得る。ｍＲＮＡサンプルから配列タグ付オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて作られた二本鎖ｃＤＮＡから、標識プローブを作製し得る。単一のプライマーは、同定及び／又は単離を容易にするタグ配列の相補体であり得る。
【００９７】
複数の対合プライマーを用いた増幅は、迅速かつ大規模な増幅を容易にするものであり、特定の配列の存在を検出するために、サンプル中に存在する配列の量を定量するために、又はサイズ測定のための電気泳動、制限酵素消化、配列決定、ハイブリダイゼーションもしくは他の分子生物学的技術などの方法による分析用の多量の配列を生産するために有用である。
【実施例１】
【００９８】
変性条件にかかわらず、ＲＮＡテンプレートから開始するＤＮＡ増幅
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）からＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｌｅｅｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを入手した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃからオリゴを入手した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から購入したＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ（ＳＳ  ＩＩ）逆転写酵素及び付属の緩衝液と共に配列番号１のオリゴを使用して、製造業者の説明書にしたがって、全脾臓ＲＮＡからｃＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖を調製した。
【００９９】
【表１】
0006382189.tif 000002
【０１００】
表１は、配列番号１〜１２のオリゴを含有し、「Ｉ」はイノシンを表し、「＊」はオリゴ配列中のホスホロチオエート結合を表す。１μｌのミックスが１０ｐｍｏｌの各オリゴ（オリゴミックス）を含有するように、配列番号１〜１２の各オリゴの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）溶液を用いて、反応混合物（ミックス）を調製した。１０×変性緩衝液は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）の組合せであった。１０×反応緩衝液は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ塩化マグネシウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ硫酸マンガン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２．５ｍＭ  ｄＡＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２．５ｍＭ  ｄＣＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２．５ｍＭ  ｄＧＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２．５ｍＭ  ｄＴＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１００ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）の組合せであった。酵素希釈緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０及び５０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ）であった。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）の大きな断片は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ製であった。突然変異型大腸菌エンドヌクレアーゼＶ（エンドＶ；Ｙ７６Ａ）は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ製であった。さらなる試薬は、２５％ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）及び９９．５％エチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。
【０１０１】
単一の等温増幅反応物を最終容量１０μｌで調製した。この総容量のうちの５μｌは変性ミックスからであり、５μｌは反応混合物からであった。
【０１０２】
変性ミックスは、２００ｎｇの全脾臓ＲＮＡ又は１μｌの完全ｃＤＮＡ反応物のいずれかを含有していた。０．５μｌの１０×変性緩衝液、０．５μｌの２５％ホルムアミド及び１μｌのオリゴミックスを変性ミックスに追加し、最終容量を水で５μｌに調整した。テンプレート対照（ＮＴＣ）を含めなかった場合には、容量のｃＤＮＡ又は全ＲＮＡを水（ＧＩＢＣＯ（登録商標））で代替した。
【０１０３】
各酵素ミックスは、４０単位のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、１μｇの大腸菌一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ−ＵＳＢ）及び２５５ｎｇのエンドＶ（Ｙ７６Ａ）から構成されていた。酵素ミックスの最終容量を酵素希釈緩衝液で１μｌに調整した。次いで、酵素ミックス（１μｌ）を、１μｌの１０×反応緩衝液、２μｌのエチレングリコール及び１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）と混ぜ合わせて反応混合物を調製した。
【０１０４】
この実施例では、それぞれが６つの反応物を含有する２つの同一セットを準備した。反応物１は、非テンプレート対照（ＮＴＣ）であり、反応物２は、Ｂｓｔ  ＤＮＡＰと共に１μｌのｃＤＮＡを含有しており、反応物３は、Ｂｓｔ  ＤＮＡＰと共に２００ｎｇのＲＮＡを含有しており、反応物４は、Ｂｓｔ  ＤＮＡＰ及びＳＳ  ＩＩと共に２００ｎｇのＲＮＡを含有しており、反応物５は、７５ｍＭ  ＫＣｌを追加したＢｓｔ  ＤＮＡＰと共にＲＮＡを含有しており、反応物６は、７５ｍＭ  ＫＣｌを追加したＢｓｔ  ＤＮＡＰ及びＳＳ  ＩＩと共にＲＮＡを含有していた。
【０１０５】
【表２】
0006382189.tif 000003
【０１０６】
６５℃で５分間加熱し、続いて２２℃に冷却することによって、一方の変性ミックスサンプルセットを処理した。９５℃で２分間加熱し、次いで２２℃に冷却することによって、他方の変性ミックスサンプルセットを変性させた。冷却後、各サンプルをボルテックス及び微量遠心した。
【０１０７】
別の変性ミックス及び反応ミックスを４５℃で３０秒間予熱してから、５μｌの反応ミックスを５μｌの変性ミックスと混合した。反応物を４５℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、３μｌの各反応物を６μｌのＧｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、９５℃で２分間熱変性し、氷上でクエンチした。５マイクロリットルの各変性サンプルを１０％アクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の別のウェルにロードし、製造業者の説明書にしたがって電気泳動を実施した。
【０１０８】
０．４５μｇの１０ｂｐＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｌａｎｅ  Ｍ）を含有する１レーンがゲルに含まれていた。ブロモフェノールブルー色素がゲル下端から約２ｃｍになるまで電気泳動を継続した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：５００希釈ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ）中でゲルを１５分間染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）９４１０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でイメージングした。
【０１０９】
図４はゲルの画像を示しており、増幅用のテンプレートとしてｃＤＮＡを使用した反応物２、並びに増幅用のテンプレートとして全ＲＮＡを使用し、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＳＳＩＩ逆転写酵素と混合した反応物４の両方において、予測サイズのバンドが見られる。レーン２及び４のバンドは、９５℃における初期変性の有無が同じであり、これは、単一のチューブ内でＲＮＡテンプレートから開始した場合に等温増幅法が機能したことを実証している。ＲＮＡテンプレートから開始する一段階反応では等温増幅を行うが、この場合、９５℃における変性の前又は後に、ＳＳＩＩ（商標）ＲＴを使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。レーン１、３、５及び６では、増幅産物が示されなかった。ＮＴＣのように、レーン１においていかなる増幅産物も存在しなかったのは、反応混合物がいかなるテンプレートも持っていなかったためと予想される。反応混合物がＲＮＡ及びＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌを含有していたレーン３において増幅産物が存在しなかったことから、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌの存在下ではＲＮＡがｃＤＮＡに変換されず、したがって、酵素Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌはいかなる逆転写酵素活性も有しないと判断される。レーン５は、逆転写酵素の非存在下では増幅産物がないことを示しており、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌは、７５ｍＭ  ＫＣｌの存在下であってもＲＮＡを逆転写することができなかった。ＲＮＡ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌ、ＳＳＩＩ及び７５ｍＭ  ＫＣｌの存在下で反応を実施したレーン６では、最低濃度の増幅産物が示された。レーン６の反応混合物は、７５ｍＭ  ＫＣｌを反応物６に追加した点のみ、レーン４の反応混合物と異なる。ＫＣｌを使用して逆転写反応を最適化するのが理想的だが、より高濃度のＫＣｌは、エンドヌクレアーゼＶに対する阻害効果を有し、それにより、反応全体を阻害すると思われる。
【実施例２】
【０１１０】
様々な逆転写酵素を使用する逆転写
実施例１のように、開始ＲＮＡテンプレートの変性を９５℃で行って等温増幅反応物を調製し、分析した。この実施例では、逆転写酵素活性及びＲＮＡｓｅ  Ｈ活性の両方を含有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）、又はＳＳ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ（低下したＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）のいずれかの漸増量を増幅反応物に追加した。示されている場合、反応物は、１２．５、２５、５０又は１００単位のＭＭＬＶ又はＳＳ  ＩＩのいずれかを含有していた。図５に示されているように、いずれかのＲＴａｓｅを含有する増幅反応物は予想サイズの断片を合成したが、これは、ＲＮＡを逆転写し続いて増幅する単一の複合反応において、標的ｍＲＮＡの増幅に成功したことを示している。
【実施例３】
【０１１１】
変性を用いない、単一の反応混合物中でのＲＮＡの等温増幅
増幅前に開始ＲＮＡテンプレートを変性させない以外は実施例１のように、等温増幅反応物を調製し、分析した。（陰性対照として、ＲＮＡを排除するために）ＲＮａｓｅ  Ａで３０分間前処理して、又は前処理せずに、２００ｎｇの全ＲＮＡ（脾臓又は腎臓由来）を別個に増幅した。オリゴミックスは、実施例１で先に使用したのと同じものであり、ｃＤＮＡ：ＲＮＡテンプレートから開始して正しい産物サイズを増幅した。増幅前に、ＲＮａｓｅ  Ａを不活性化しなかった。５０単位のＳＳ  ＩＩをすべての反応物に含めた。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
表３は、配列番号１３〜２４のオリゴを含有し、「Ｉ」はイノシンを表し、「＊」はオリゴ配列中のホスホロチオエート結合を表す。増幅の陽性対照としてｐ５３を増幅するように設計した様々なプライマーセット（配列番号１３〜２４のオリゴ）を使用して同一条件下で、ヒトゲノムＤＮＡを増幅した。増幅対照は、１）テンプレートなし／酵素なし（ＮＥ）及び２）テンプレートなし／＋酵素（ＮＴＣ）を含んでいた。図６は、ＲＮａｓｅ  Ａ処理せずに、脾臓ＲＮＡ及び腎臓ＲＮＡの両方から出発物質としてＲＮＡ増幅した場合の予想サイズのバンドを示す。図６は、腎臓から単離されたＲＮＡテンプレート由来の増幅産物が、脾臓から単離されたＲＮＡテンプレートと比較して少量であることを示しており、腎臓におけるｐ５３  ｍＲＮＡのコピー数が予想通り少ないことを立証している。加えて、図６は、ＲＮａｓｅ  Ａ処理の有無にかかわらず、逆転写酵素が反応物中に存在する場合であっても、ＤＮＡ増幅により予想サイズの断片が生成されることを示している。図７は、ＲＮａｓｅ  Ａ処理したＲＮＡテンプレートの増幅産物を示す。増幅前にテンプレートをＲＮａｓｅ  Ａ処理すると予想増幅産物が示されず、これは、増幅が単一のチューブ内でＲＮＡテンプレートから起こることを示唆している。この実験の結果は、１）単一のチューブの増幅反応の成功には、出発材料の熱変性が必要ではないこと、及び２）単一のチューブ内でＤＮＡ又はＲＮＡから増幅するための単一増幅法を本発明の増幅で使用し得ることを実証している。
【０１１４】
本明細書では、本発明の特定の特徴のみを例示及び説明したが、当業者であれば多くの改変及び変更を想到するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の思想に含まれるこのような改変及び変更のすべてを包含するものであると理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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