(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナス科に属する植物であって、前記植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ前記抵抗性形質は、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する植物と比較して、遺伝子の減少した発現もしくは転写、または前記遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を有する、少なくとも２つの遺伝子の組み合わせによりコードされており、ここで、
植物がジャガイモであって、フィトフトラ抵抗性がフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号１および配列番号２に記載のタンパク質または配列番号１および配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、または
植物がペチュニアであって、フィトフトラ抵抗性がフィトフトラ・ニコチアナエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）に対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号３および配列番号４に記載のタンパク質または配列番号３および配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、または
植物がトマトであって、フィトフトラ抵抗性がフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号５および配列番号６に記載のタンパク質または配列番号５および配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、
植物。
【請求項２】
ナス科に属する植物であって、前記植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ前記抵抗性形質は、２つの遺伝子の組み合わせの発現、もしくは翻訳を下方制御することによって、またはフィトフトラ感受性の植物において前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を減少させることによって得られ、ここで、前記２つの遺伝子は、配列番号１および２、もしくは配列番号３および４、もしくは配列番号５および６、またはそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質の組み合わせをコードする、植物。
【請求項３】
ナス科に属する植物がジャガイモ、ペチュニアおよびトマトからなる群から選択される、請求項２に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物であって、当該抵抗性が２つの遺伝子の組み合わせによりコードされている植物に関する。本発明は、さらに、ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物を提供するこれらの遺伝子の使用、当該遺伝子自体および当該遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体フィトフトラは、植物損傷卵菌類（ミズカビ）の属であり、そのメンバーの種は、世界的に作物に大規模な経済的損失、ならびに自然生態系に環境破壊を引き起こし得る。当該属は、１８７５年にハインリッヒ・アントン・ド・バリーによって最初に記載された。これまでに約１００種が記載されてきたが、推定１００−５００の未発見のフィトフトラ種が存在していると疑われている。
【０００３】
フィトフトラ病原体は、ほとんど双子葉植物の病原体であり、かつ一般的に、宿主特異的寄生体である。フィトフトラの多くの種は、経済的にかなり重要な植物病原体である。フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）は、アイルランドの大飢饉（１８４５−１８４９）を引き起こしたジャガイモ胴枯れ病の感染性の病原体であり、かつ未だにトマトおよびジャガイモを含むナス科作物の最も破壊的な病原体のままである。ダイズの根および茎の腐敗病原体のフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）は、また、農産業に対する長年の問題を引き起こしてきた。一般的に、この属に起因する植物病は、化学的にコントロールすることが困難であり、かつ従って抵抗性品種の増加は主要な管理戦略である。他の重要なフィトフトラ病は：フィトフトラ・カクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）−これは、シャクナゲ、ツツジに影響を与えるシャクナゲ根腐れを引き起こし、かつ、広葉樹の木においてブリーディング癌腫病（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｃａｎｋｅｒ）を引き起こし；フィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）−これは、キュウリおよびカボチャなどのウリ科の果実に感染し、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）−これは、ヒノキ科クロベ属の常緑樹（ａｒｂｏｒｖｉｔａｅ）、ツツジを含む木質観賞植物に影響を与えるシナモン根腐れを引き起こし、フィトフトラ・フラガリエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）−これは、イチゴに影響を与える赤根腐れを引き起こし；フィトフトラ・ケルノヴィアエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｋｅｒｎｏｖｉａｅ）−オークおよびトキワガシ（ｈｏｌｍ  ｏａｋ）を含む他の木および低木でも発生する、ブナおよびシャクナゲの病原体、ココアブラックポッド病（ｃｏｃｏａ  ｂｌａｃｋ  ｐｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）種の１つのフィトフトラ  メガカリャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｋａｒｙａ）は、侵襲的であり、かつおそらくアフリカでの最大のココア作物の損失の原因であり；フィトフトラ・パルミヴォラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｌｍｉｖｏｒａ）−これは、ココナッツおよびビンロウ（ｂｅｔｅｌ  ｎｕｔｓ）で果実腐れを引き起こし、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）、フィトフトラ・ケルシナ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｑｕｅｒｃｉｎａ）−これらは、オークの死を引き起こし、ならびにフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）−これは、ダイズ根腐れを引き起こす、である。
【０００４】
フィトフトラは時々、真菌様の生物を指すが、異なる界：クロムアルベオラータ（Ｃｈｒｏｍａｌｖｅｏｌａｔａ）（過去にはストラメノパイラ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌａ）および以前はクロミスタ（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ））に分類される。フィトフトラは、形態学的には真菌類と非常に類似しているが、進化史は全く別個である。真菌（ｆｕｎｇｉ）とは対照的に、クロムアルベオラータは、動物よりも植物と近縁関係にある。真菌の細胞壁は主にキチンで作られる一方、クロムアルベオラータの細胞壁はほとんどセルロースで構成されている。倍数性レベルはこれらの２つの群間で異なっており；フィトフトラは、生活の栄養（増殖性、非生殖性の）期では二倍体の（対の）染色体を有し、真菌は、この状態においてほとんどいつも半数体である。生化学的経路もまた異なり、とりわけ高度に保存されている。
【０００５】
フィトフトラは、有性的にまたは無性的に生殖し得る。多くの種において、性的構造（ｓｅｘｕａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）は観察されていない、または研究室の接合において観察されただけである。同株性（ｈｏｍｏｔｈａｌｌｉｃ）種において、性的構造は単一培養において生じる。異株性（ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃ）種は、Ａ１およびＡ２と称される接合株を有する。接合する時、蔵精器（ａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ）を通過する蔵卵器（ｏｏｇｏｎｉｕｍ）（底着（ａｍｐｈｉｇｙｎｙ））、または蔵卵器の近位の（下）半分に付着する蔵精器（側着（ｐａｒａｇｙｎｙ））いずれかによって、蔵精器は蔵卵器に配偶子を導入し、ついで結合体（ｕｎｉｏｎ）が卵胞子を生産する。ほとんどの真菌類とは異なり、動物のように、減数分裂は配偶子性であり、かつ体細胞の核は二倍体である。無性（有糸分裂）胞子型は厚壁胞子および遊走子を生産する胞子嚢である。厚壁胞子は通常、球状であり着色されており、かつ生存構造としての役割において援助するための肥厚細胞壁を有してもよい。胞子嚢は、ｓｕｂｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｙｐｈａｅによって保持されてもよく（非早落性）、または分散構造として作用する風もしくは水の張力によって容易に落ちてもよい（早落性）。また、胞子嚢は遊走子を放出してもよく、これは宿主植物に向かって泳ぐために使用する２つの異なる鞭毛を有する。
【０００６】
ナス科、またはナス属（ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅｓ）は、経済的に重要な顕花植物の科である。当該科は、薬草から木までに及び、かつ多くの重要な農作物、薬用植物、香辛料、雑草、および観賞植物を含む。科の多くのメンバーは、強力なアルカロイドを含有し、かついくつかはきわめて有毒である。
【０００７】
当該科はキク類群双子葉類（モクレン綱）のナス目に属する。ナス科は、生息地、形態および生態の大きな多様性を有する約９８属および約２，７００種からなる。
【０００８】
当該科は、南極大陸を除く全ての大陸で存在している世界的な分布を有する。当該種の最も大きな多様性は、南アメリカおよび中央アメリカで見つかっている。ナス科は、一般的に収集されたまたは栽培された多くの種を含む。おそらく、当該科の経済的に重要な属のほとんどはナス属であり、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、実際には当該科の別の一般的な名称は“ジャガイモ科”）、トマト（ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ならびにナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）もしくはナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））を含有する。別の重要な属カプシクム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）は、トウガラシ（ｃｈｉｌｌｉ  ｐｅｐｐｅｒｓ）およびシシトウガラシ（ｂｅｌｌ  ｐｅｐｐｅｒｓ）の両方を生産する。
【０００９】
ホオズキ属は、いわゆるグラウンドチェリー（ｇｒｏｕｎｄｃｈｅｒｒｉｅｓ）、ならびにトマティーヨ（ｔｏｍａｔｉｌｌｏ）（フィサリス・フィラデルフィカ（Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃａ））、ケープグーズベリー（Ｃａｐｅ  ｇｏｏｓｅｂｅｒｒｙ）およびチャイニーズランタン（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｌａｎｔｅｒｎ）を生産する。クコ属は、ボクストロン（ｂｏｘｔｈｏｒｎｓ）およびウルフベリー・リシウム・バルバルム（ｗｏｌｆｂｅｒｒｙ  Ｌｙｃｉｕｍ  ｂａｒｂａｒｕｍ）を含有する。タバコ属は、とりわけ、タバコを生産する植物を含有する。いくつかの他の重要なナス科のメンバーは、ペチュニア、ブロワリア（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）およびリシアンサス（Ｌｙｃｉａｎｔｈｅｓ）などの多くの観賞植物、向精神アルカロイドの供給源であるチョウセンアサガオ、マンドラゴラ（マンドレーク）ならびにベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）（デッドリーナイトシェード）を含む。特定の種は、医薬用途、向精神薬効果または有毒なものとして広く知られている。
【００１０】
タバコ（タバコ亜科（Ｎｉｃｏｔｉａｎｏｉｄｅａｅ））およびペチュニア（ペチュニア亜科（Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅａｅ））を除いて、経済的に重要な属のほとんどは、ナス亜科に含有される。最後に述べるが重要でないということではなく、ナス科はタバコおよびペチュニアなどの、細胞、分子および遺伝子レベルの基本的な生物学的疑問の研究において重要なモデル生物の多くを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ナス科の多くの植物メンバーの経済的な重要性およびこの科の多くのメンバーにおける植物病原体であるフィトフトラの破壊的影響を考慮すると、とりわけ、本発明の目的は、フィトフトラ抵抗性植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
とりわけ、上記目的は添付の請求項に概説される植物、使用、タンパク質および遺伝子を提供することにより、本発明によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明を、さらに、図を参照して下記の実施例で例示する：
【図１】図１は、フィトフトラ・インフェスタンスによる感染後のコントロールジャガイモ植物の切断葉アッセイを示し、全ての葉はフィトフトラ・インフェスタンスに感染している。
【図２】図２は、フィトフトラ・インフェスタンスによる感染後の、配列番号７＆８が発現抑制されたジャガイモ植物の切断葉アッセイを示し、各葉は独立した植物由来である。図２ａは、配列番号７＆８の両方を発現抑制する、中央の構築物で発現抑制された植物由来の葉を示す。図２ｂは、キメラに発現抑制された植物由来の葉を示す。
【図３】図３は、フィトフトラ・インフェスタンスに感染している植物の割合を示し、第一の棒グラフは（約１０％が部分的に）感染したコントロール群を示し、第二の棒グラフは（約１０％が部分的に感染した）配列番号７のみが発現抑制された植物を示し、第三の棒グラフは配列番号７および８の両方がそれぞれの配列の中央の部分において発現抑制された植物を示し（約５０％がクリーン）、第四の棒グラフは配列番号７および８の両方が５’末端で発現抑制された植物を示す（約４０％がクリーン）。
【図４】図４は、フィトフトラ・ニコチアナエの接種後の生存ペチュニア植物の割合を示し、第一の棒グラフは野生型コントロール植物を示し（０％生存）、第二の棒グラフは配列番号９の変異体を示し（２０％が生存植物）、第三の棒グラフは配列番号１０の変異体を示し（２０％が生存植物）、かつ第四の棒グラフは二重変異体、すなわち配列番号９および１０の両方を示す（４５％が生存植物）。
【図５】図５は、フィトフトラ・インフェスタンスの病害検査からのトマト植物の葉を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
具体的に、上記目的はとりわけ、第一の態様によれば、ナス科に属する植物によって達成され、ここで、本発明の植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ本発明の抵抗性形質は、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する植物と比較して、本遺伝子の減少した発現もしくは減少した転写、または本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を有する、少なくとも２つの遺伝子の組み合わせによってコードされている。
【００１５】
この本発明の第一の態様の好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、ジャガイモ、ペチュニア、トマト、ナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）、タバコおよびコショウ、より好ましくはジャガイモ、ペチュニアおよびトマトからなる群から選択される。
【００１６】
この第一の態様の特に好ましい実施形態によれば、本発明はジャガイモに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号１および配列番号２に記載のタンパク質、または配列番号１および配列番号２と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１７】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はペチュニアに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・ニコチアナエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）に対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号３および配列番号４に記載のタンパク質、または配列番号３および配列番号４と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１８】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はトマトに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号５および配列番号６に記載のタンパク質、または配列番号５および配列番号６と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１９】
この第一の態様のさらに別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はナス科に属する植物に関し、本発明の植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ本発明の抵抗性形質は、２つの遺伝子の組み合わせの活性を下方制御することによって、またはフィトフトラ感受性の植物において本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を減少させることによって得られ、ここで、本発明の２つの遺伝子は、配列番号１および２、もしくは配列番号３および４、もしくは配列番号５および６、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質の組み合わせをコードする。
【００２０】
さらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、ジャガイモ、ペチュニアおよびトマトからなる群から選択される。
【００２１】
フィトフトラ抵抗性植物を提供するための本発明の遺伝子の有利な性質を考えると、本発明は、第二の態様によると、ナス科に属する植物におけるフィトフトラ抵抗性を提供するための、配列番号１および２、もしくは配列番号３および４、もしくは配列番号５および６、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質の組み合わせをコードする遺伝子の使用に関する。
【００２２】
さらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する植物におけるフィトフトラ抵抗性を提供するための本発明の使用は、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する植物と比較して、本発明の遺伝子の減少した発現もしくは減少した転写、または本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を含む。
【００２３】
この第二の態様のさらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、ジャガイモ、ペチュニアおよびトマトからなる群から選択される。より好ましくは、本発明のフィトフトラ抵抗性は、ジャガイモおよび／もしくはトマトにおけるフィトフトラ・インフェスタンス、またはペチュニアにおけるフィトフトラ・ニコチアナエである。
【００２４】
本発明のタンパク質および遺伝子の性質を提供するフィトフトラ抵抗性を考えると、本発明は、第三の態様によれば、植物にフィトフトラ抵抗性を提供するのに適したタンパク質および遺伝子に関する。具体的には、本発明は、この第三の態様によれば、配列番号１、２、３、４、５、６、ならびにそれらと少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に関する。
【００２５】
この第三の態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、ならびにそれらと少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、コーディング配列、もしくはｃＤＮＡ配列をコードする遺伝子に関する。好ましくは、本発明のコーディング配列、またはｃＤＮＡ配列をコードする遺伝子は、単離された配列である。
【実施例１】
【００２６】
実施例１（ジャガイモ）
ジャガイモ配列番号７および８を標的とするＲＮＡｉ構築物
３つの異なるＲＮＡｉ構築物を作製し、それらは以下を保有する／標的とする：
１．配列番号７の５’末端：コーディング配列−１５９−２００に相当する（開始から−１５９は、５’ｕｔｒ中にあることを意味する）。
２．配列番号７および８の５’末端のキメラ：コーディング配列４−１９９＋１−２０４に相当する。
３．配列番号７の中央部分（配列番号８の中央に高度に相同）：コーディング配列３３４−７４３に相当する。
【００２７】
ゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅し、次いでｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。キメラな構築物のため、２つのフラグメントを相補的な突出末端を有するプライマー、続いて伸長および増幅を用いて結合し、融合したフラグメントを作製した。ゲートウェイＬＲ反応を用いて、ＲＮＡｉベクターｐＫ７ＧＷｉＷＧ２（Ｋａｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７）にフラグメントを導入して、ヘアピン構造を有する逆方向反復を作製した。ｐＫ７ＧＷｉＷＧ２ベクターは、細菌の選択ためにストレプトマイシンを必要とし、かつジャガイモ形質転換のために使用されたアグロバクテリウム株（ＬＢＡ４４０４）は、既にストレプトマイシン選択マーカーを保有しているので、完全なＲＮＡｉ（ヘアピン）カセットを、様々な植物形質転換ベクター、ｐＧｒｅｅｎ００２９（細菌ならびに植物選択マーカー＝カナマイシン）（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２）に導入した。最終的な構築物は、イントロンを形成するヘアピン−ループがスプライスアウトされた後に、発現抑制を誘導するｄｓＲＮＡを形成するヘアピンＲＮＡにより駆動される３５Ｓ−プロモーターの安定した発現を可能にする。少なくとも６つの独立したＴ１形質転換体を各構築物について維持した。
【００２８】
フィトフトラ・インフェスタンスアッセイの詳細
Ｔ１（第一世代トランスジェニック）植物から切断葉を採取し、次いで湿った綿−ウールまたはオアシスにおいて葉柄付きで１００％ＲＨでトレーに置いた。フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐ．ｉｎｆ）培養物（ライ−スクロース−アガープレート）からＰ．ｉｎｆ遊走子／胞子嚢を採取し、次いで１０ｅ３の胞子嚢（１０ｅ５／ｍｌ）を含有する１０μｌ液滴の胞子懸濁液を中央脈（ｍｉｄｖｅｉｎ）の両側に滴下した。トレーを１８Ｃでインキュベートした。葉の感染率を、１１日目に、１．完全に感染／過剰生育、２．部分的に感染（１０−５０％の領域）、および３．クリーン（＜１０％の領域）としてスコア化した。
【００２９】
図１および２において示されるように、図２ａの二重に発現抑制された（配列番号７＆８）植物は、５０％のみが感染していることを示し、図２ｂの二重に発現抑制された（キメラな）植物は、６０％のみが感染していることを示す一方で、図１のコントロール群は、全ての植物が感染したことを示す。図３に示されたように、配列番号７および配列番号８の両方が発現抑制された植物の４０−５０％はクリーンであり、一方で、発現抑制された配列番号７のみを有する植物は、その植物の１０％のみが、部分的に感染をスコアしている。従って、配列番号７および８の両方を発現抑制することは、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性を提供する。
【実施例２】
【００３０】
実施例２（ペチュニア）
トランスポゾン挿入株をコレクション／ライブラリー（Ｖａｎｄｅｎｂｕｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５４）から同定した。２ｄＴｐｈ１トランスポゾン挿入アレルは配列番号９で、かつ３ｄＴｐｈ１トランスポゾン挿入アレルは配列番号１０で見出された。いくつかの交雑を行い、二重変異を生成した。
【００３１】
フィトフトラ・ニコチアナエアッセイの詳細
植物を標準的な用土で、個別に鉢植えし、２３Ｃで生育させた。
Ｐ．ニコチアナエ（Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）の胞子を培養物（リマ−マメ−アガーまたはＶ８−アガープレート）から採取し、次いで１０ｅ４（アッセイ  Ｓｅｐｔ）胞子を含有する、２ｍｌの胞子懸濁液を各植物の土壌に滴下した。植物崩壊（ｐｌａｎｔ  ｃｏｌｌａｐｓｅ）を定期的に監視した。
【００３２】
図４で示されるように、二重変異、すなわち配列番号９および配列番号１０の両方に変異を有する植物は、４５％の生存植物の割合を有し、一方で単一変異体（配列番号９または配列番号１０における変異体）の生存植物の割合は２０％のみである。
【実施例３】
【００３３】
実施例３（トマト）
配列番号１１および１２の両方の過剰発現を提供するため、または配列番号１１および１２の両方の発現抑制を提供するためのいずれかのために、２つの構築物でトマト植物を形質転換した。
トマト配列番号１１を発現抑制する構築物を、配列番号１１のＣＤＳの中央の部分と同一の３００ｂｐフラグメントのゲートウェイクローニングを用いて生成した。
配列：
ＴＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＴ
使用プライマー：
Ｓ．  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＡｔｔＢ１−Ｆ    ａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｔｔｇｇｇｔｇａａｃａａｇｇａｃａａｃａ
Ｓ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＡｔｔＢ２−Ｒ    ａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔａａａａｃｇａａｇｃｃａｃｔｇａｃａｔｃｃ
生成したエントリーベクターを、ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ１２バイナリーベクターにゲートウェイクローニングした。次いで、トマトのための標準的な手順に従ったアグロバクテリウム形質転換。発現抑制する構築物は、配列中の類似性により配列番号１１および１２の両方を発現抑制することができた。
【００３４】
形質転換されたトマト植物からの子孫を、フィトフトラ・インフェスタンス単離株ＵＳ１１の接種による病害検査に供した。接種後７日に、植物を、視覚的規模で１−９まで葉をスコア化することによって視覚的に分析した、ここで、１は感受性を意味し、かつ９は抵抗性を意味する。感受性に関するコントロールとして、植物ＴＳ３３、ＴＳ１９およびＯＴ９を用いた。抵抗性に関するコントロールとして、抵抗性と知られる野生系統ＬＡ１２６９を用いた。植物当たり８つの葉を測定した。下記の表は、植物当たり８つの葉からの平均スコアを提供する。
【表１】
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表中では、配列番号１１および１２を過剰発現する植物が、単離株ＵＳ１１に対して感受性であることが示されている。発現抑制された植物は、感受性コントロールＬＡ１２６９より有意に高いスコアを提供する。例えば、植物５５６−０１−０８は、８．５の平均スコアを有する。この植物の試料は図５のボックスＧ１０に示され、ボックスＤ８で示された抵抗性コントロール植物ＬＡ１２９６と同様に感染していない。従って、配列番号１１および１２の両方を発現抑制することは、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性を提供する。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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