(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が非変異微生物に比べて強化され、かつシスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）の活性が非変異微生物に比べて弱化または不活性化された、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア（Escherichia）属微生物。
【請求項２】
前記エシェリキア属微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記エシェリキア属微生物は、さらにホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）の活性が弱化または不活性化されたものである、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記エシェリキア属微生物は、さらにホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase)の活性が非変異微生物に比べて強化された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記微生物にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylases）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（apartate semialdehyde dehydrogenase）で構成された群から選ばれた１種以上の酵素活性がさらに強化されたものである、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項６】
前記エシェリキア属微生物は、アスパラギン酸キナーゼ（Aspartate kinase）の活性が非変異微生物に比べて強化された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物を培養して培養物を得る段階を含む、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法。
【請求項８】
前記培養された微生物またはその培養物からＯ−アセチルホモセリンを回収する段階をさらに含む、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンの生産方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物を培養してＯ−アセチルホモセリンを蓄積する段階、および、蓄積したＯ−アセチルホモセリンから酵素反応を用いてＬ−メチオニンを生産する段階を含む、Ｌ−メチオニンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、０−アセチルホモセリンを高効率で生産する微生物及び上記微生物を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−アセチルホモセリンは、生体内必須アミノ酸の一種であるメチオニンの前駆体として作用する。メチオニンは、飼料及び食品添加剤だけでなく、輸液剤、医薬品の合成原料として使用される。
【０００３】
メチオニンは、化学合成と生物学的合成により製造される。最近では、発酵を経て製造したＬ−メチオニン前駆体から酵素転換反応によりＬ−メチオニンを生産する２段階工法（特許文献１）も公知となった。
【０００４】
上記２段階工法では、メチオニン前駆体としてＯ−サクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）とＯ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）が使用され、メチオニンを安価に大量生産するためにＯ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１３４３２号
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１３３５８４１号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０９０５３８１号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／０８７０３９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wanner BL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、Ｏ−アセチル−ホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、Ｏ−アセチル−ホモセリンを排出する活性を有するタンパク質を発掘することにより、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の一つの目的は、Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上した微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上した微生物を用いてＯ−アセチルホモセリンを効率的に生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の内膜タンパク質ＹｊｅＨの活性が強化された微生物は、Ｏ−アセチルホモセリン排出能が増進され、Ｏ−アセチルホモセリンの生産効率が向上するため、本発明の微生物はＯ−アセチルホモセリンを生産するのに広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明によるｙｊｅＨベクター（pBAC-YJEH  vector）の切断地図を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［発明を実施するための最良の形態］
本発明の一つの様態は、内膜タンパク質ＹｊｅＨの活性が非変異微生物に比べて強化された、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物を含む。
【００１２】
本発明で使用される用語「Ｏ−アセチルホモセリン」とは、微生物のメチオニン生合成経路上の特異的中間体物質であり、Ｌ−ホモセリンのアセチル誘導体を意味する。これは、ホモセリンとアセチル−ＣｏＡがホモセリンアセチルトランスフェラーゼによって反応が触媒されて生成されることが知られており、Ｃ６Ｈ１１ＮＯ４の化学式を有する。
【００１３】
本発明で使用される用語「Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物」とは、微生物が培地で培養される場合、生物体内でＯ−アセチルホモセリンを生産し、培地内にこれを分泌する能力を有する微生物を意味する。Ｏ−アセチルホモセリン生産能は種の改良により付与されたり増進され得る。具体的には、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物は、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物であってもよく、より具体的には、大腸菌であってもよい。一例としてリジン、トレオニン、イソロイシンまたはメチオニンを生産する大腸菌であってもよいが、これに限定されない。本発明で使用される用語「ＹｊｅＨ」とは、アミノ酸トランスポーター（amino acid transporter）に対するＡＰＣファミリーの一つであり、内膜に存在するタンパク質として知られており、アミノ酸トランスポーターとして作用することが予測されるが、正確な機能は未だ知られていない。よって、本発明者らはＹｊｅＨがＯ−アセチルホモセリンを特異的に排出することを初めて確認した。
【００１４】
具体的には、上記ＹｊｅＨはエシェリキア属微生物に由来するものであってもよく、さらに具体的な例として、大腸菌由来のＹｊｅＨであってもよい。特に、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、相同性を有する配列として、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一またはそれに相応してＯ−アセチルホモセリンを排出する活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれることは自明である。また、遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同じアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本発明に含まれる。その例として、配列番号２の塩基配列が挙げられるが、これに限定されない。
【００１５】
本発明で使用される用語「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子のアミノ酸または塩基配列において、特定の比較領域で両配列を最大限に一致するように整列（align）させた後の配列間の塩基またはアミノ酸残基における同一性の程度を意味する。相同性が十分に高い場合は、該当する遺伝子の発現産物は同一または類似の活性を有することができる。上記配列同一性のパーセンテージは、公知となった配列比較プログラムを使用して決定することができ、一例として、ＢＬＡＳＴ（NCBI）、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（CLC bio）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（DNASTAR Inc）などが挙げられる。
【００１６】
本発明における用語「非変異微生物」とは、該当するタンパク質の活性の変異を導入していない微生物を意味し、該当するタンパク質の活性の変異を導入するベース菌株を意味する。これは、天然型であってもよく、変化型であってもよい。
【００１７】
本発明で使用される用語であるタンパク質活性の「強化」とは、微生物が保有しているタンパク質の活性状態を向上させることを意味する。タンパク質の活性の強化は、目的タンパク質の活性の強化のように、各タンパク質の活性を非変異微生物よりも強化し得るものであれば、限定されない。その例として、ｉ）各タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、ｉｉ）上記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、ｉｉｉ）各タンパク質の活性が強化されるように、染色体上の上記ポリヌクレオチド配列の変形、及びｉｖ）その組み合わせからなる群から選択される方法によって行うことができる。具体的には、各タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、上記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、各タンパク質をコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入したり、プロモーターに変異を与えた各タンパク質を導入する方法、５’−ＵＴＲ地域の塩基配列を改変する方法、及び各タンパク質をコードする塩基配列の変異体を導入する方法からなる群から選択される方法により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の具体的な一実施例では、コピー数を増加させたり、プロモーターの活性を強化することにより上記ＹｊｅＨの活性を非変異微生物よりも強化させたものであってもよい。具体的には、改良された活性を示すプロモーターを内膜タンパク質であるＹｊｅＨに導入してその活性を強化させたものであってもよい。本発明の具体的な例として、上記改良された活性を示すプロモーターには、ｙｊｅＨ自己プロモーターよりも活性が増加したプロモーターは制限なく含まれるが、これにはｙｊｅＨ自己プロモーターの遺伝子発現誘導活性よりも活性が高い遺伝子のプロモーター、またはｙｊｅＨ自己プロモーターなどの遺伝子変異により活性が増加した変異型プロモーターなどが制限なく含まれる。具体的には、本発明の改良された活性を示すプロモーターは、ｉｃｄプロモーター、ｐｒｏプロモーター及びｃｙｓｋプロモーターからなる群から選択されるものであってもよく、具体的には、上記ｉｃｄプロモーターは配列番号５１の塩基配列からなり、上記ｐｒｏプロモーターは配列番号５２の塩基配列からなり、上記ｃｙｓｋプロモーターは配列番号５３の塩基配列からなるものであってもよいが、それぞれの塩基配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有する塩基配列であってもよい。
【００１９】
本発明の具体的な様態として、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物は、さらにシスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）の活性が弱化または非活性化されたものであってもよい。具体的には、上記シスタチオニンシンターゼの活性が非変異微生物の活性より減少または非活性化されたものであってもよく、特にシスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子（metB）が欠損したものであってもよいが、これらに限定されない。上記ｍｅｔＢのアミノ酸配列は、公知となったデータベースから得ることができ、シスタチオニンシンターゼ活性を有するアミノ酸配列は、制限なしに含まれるが、その例として、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。上記配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号４の塩基配列がコードするタンパク質であってもよいが、これに限定されない。また、本発明の他の様態としてエシェリキア属微生物は、さらにホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）の活性が弱化または非活性化されたものであってもよい。具体的には、上記ホモセリンキナーゼの活性が非変異微生物の内在性の活性より減少または非活性化されるものであってもよく、特にホモセリンキナーゼをコードする遺伝子（thrB）が欠損したものであってもよいが、これに限定されない。上記ｔｈｒＢのアミノ酸配列は、公知となったデータベースから得ることができ、ホモセリンキナーゼ活性を有するアミノ酸配列は制限なく含まれるが、その例として、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。上記配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号６の塩基配列がコードするタンパク質であってもよいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明において、上記タンパク質の活性の「弱化」とは、ｉ）各タンパク質をコードする遺伝子の一部または全体の欠失、ｉｉ）上記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列の改変、ｉｉｉ）上記タンパク質の活性が弱化するように染色体上の上記遺伝子配列の改変及びｉｖ）その組み合わせからなる群から選択される方法によって行うことができるが、これに限定されない。
【００２１】
具体的には、本発明のタンパク質の「活性が弱化されたもの」とは、本来、微生物が天然またはものと菌株の状態で有している酵素の活性と比較したとき、その活性が減少したことを意味する。上記弱化は、上記酵素をコードする遺伝子の変異などにより酵素自体の活性が本来微生物が有している酵素の活性に比べて減少した場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が、天然型菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概念であり、これに限定されない。
【００２２】
上記「不活性化」とは、酵素をコードする遺伝子の発現が、天然型菌株に比べて全く発現しない場合、及び発現したとしても、その活性が存在しない場合を意味する。
このような酵素活性の弱化または不活性化は、当該分野においてよく知られている様々な方法を用いて達成することができる。上記方法の例として、上記酵素の活性が除去された場合を含み、上記酵素の活性が減少するように突然変異した遺伝子であって、染色体上の上記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；上記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；上記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を、活性が弱いか、または存在しない配列と交換する方法；上記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；上記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して上記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；上記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加し、２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法及び該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例により特に制限されるものではない。
【００２３】
具体的には、酵素をコードする遺伝子の一部または全体を欠失させる方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在性の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子と交換することによって行うことができる。このような遺伝子の一部または全体を欠失させる方法の一例として、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００２４】
上記において「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には、１〜３００個、好ましくは１〜１００個、さらに好ましくは１〜５０個であってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２５】
上記において「相同組換え（homologous recombination）」とは、互いに相同性を有する遺伝子鎖の座位での連結、交換によって起こる遺伝子組換えを意味する。
上記発現調節配列を改変する方法は、上記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに弱い活性を有する核酸配列に交換することによって行うことができる。上記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
さらに、染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、上記酵素の活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより配列上の変化を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性が存在しないように改良された遺伝子配列に交換することによって行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の具体的な一実施例では、上記シスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子（metB）及び／またはホモセリンキナーゼをコードする遺伝子（thrB）を相同組換えを用いて欠損させることにより、各タンパク質の活性を弱化させた。
【００２８】
また、本発明の具体的な様態として、エシェリキア属微生物は、さらにホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）の活性が非変異微生物に比べて強化されたものであってもよい。具体的には、上記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの活性が非変異微生物の活性より増加するものであってもよく、特に活性が強化されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｍｅｔＡ遺伝子が導入されたものであってもよい。上記変異型ｍｅｔＡ遺伝子は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸をグルタミン酸で置換し、１１２番目のアミノ酸をヒスチジンで置換したものをコードする遺伝子であってもよく、特に、配列番号８の塩基配列からなるものであってもよいが、これに限定されない。上記変異型ｍｅｔＡは、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの活性が野生型よりも活性が強化されたアミノ酸配列は制限なく含まれるが、その例として、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。このような変異型ｍｅｔＡ遺伝子の製造及びその活用、上記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ強化菌株などに関する内容の一例が特許文献２に開示されており、該特許の明細書全体は、本発明の参考資料として含むことができる。
【００２９】
また、本発明の具体的な様態でエシェリキア属微生物は、さらにアスパラギン酸キナーゼ（Aspartate kinase、EC 2.7.2.4）の活性が非変異微生物に比べて強化されたものであってもよい。具体的には、上記アスパラギン酸キナーゼの活性が非変異微生物の内在性の活性より増加するものであってもよいが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の具体的な一実施例では、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を極大化するために、さらにホモセリンの生合成経路を強化することを試みた。具体的には、プラスミドを用いてアスパラギン酸キナーゼ（aspartate kinase）とホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（homoserine O-acetyltransferase）を導入させ、上記のようにホモセリン生合成経路を強化した菌株にＹｊｅＨをさらに強化させてＯ−アセチルホモセリンの生産能における変化を測定した。その結果、生合成経路とｙｊｅＨを同時に強化させることにより、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能はさらに向上し、特にｃｙｓｋプロモーターを用いてＹｊｅＨ活性を強化した結果、約９３％（2.8g/L−＞5.4g/L）程度の生産能が増加することを確認した（表５）。
【００３１】
また、本発明の具体的な一実施例では、既存のＯ−アセチルホモセリンの高収率菌株のＹｊｅＨ活性を強化することにより、さらに生産能が向上し得るか否かについての確認を行った。より具体的には、既存の野生型Ｗ３１１０由来のＮＴＧ変異（mutation）を通じてトレオニン生産能力を有する菌株を用いることにより、Ｏ−アセチルホモセリンを生産する菌株であるＫＣＣＭ１１１４６Ｐ（特許文献４）をベースとし、これに内在性のｙｊｅＨ遺伝子のプロモーターを発現誘導活性の高いプロモーターに交換してＯ−アセチルホモセリンの生産量を確認した。その結果、既に高収率のＯ−アセチルホモセリン生産能を有している菌株においてＹｊｅＨの活性を強化することにより、生産能をさらに増加させ得ることを確認し、特にｃｙｓｋプロモーターを用いてＹｊｅＨ活性を強化した場合には、約１４％（14.2g/L−＞18.2g/L）程度の生産能が増加することを確認した（表７）。
【００３２】
本発明で使用される遺伝子や、これらがコードするタンパク質配列及びプロモーター配列などは、公知となったデータベースから得られ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得ることができるが、これに限定されない。
【００３３】
本発明の上記各タンパク質及びプロモーターをコードする遺伝子は、上記各配列番号で記載した塩基配列だけでなく、上記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より一層具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって、実質的に上記各酵素と同一または相応する効能を示す酵素をコードする遺伝子配列であれば、制限なく含む。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００３４】
また、本発明の上記各タンパク質を構成するアミノ酸は、上記各配列番号で記載したアミノ酸配列だけでなく、相同性を有する配列であって、実質的に各アミノ酸配列と同一または相応するタンパク質の活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれることは自明である。
【００３５】
上述のように、様々な遺伝的背景と様々なＯ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物に基づいてＹｊｅＨの活性を増加させることにより、Ｏ−アセチルホモセリン生産能が一貫して増加する効果が確認された。これは、ＹｊｅＨが生産過程において、特定の中間体の生成を促進することによって起こり得るが、内膜タンパク質であり、アミノ酸トランスポーターファミリーの一種であるＹｊｅＨの特性を考慮したとき、最終物であって、アミノ酸の一種であるＯ−アセチルホモセリンの排出能を増加させて細胞内の反応を促進することによって成されるのもと予測される。
【００３６】
もう一つの様態として、本発明は、本発明に係るＯ−アセチルホモセリン生産能を有するエシェリキア属微生物を培養して培養物を得る段階を含む、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法を提供する。
【００３７】
本発明の微生物の培養に使用される培地及びその他の培養条件は、通常のエシェリキア属微生物の培養に使用される培地であれば特に制限なく、いずれも使用することができるが、具体的には、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸、及び／またはビタミンなどを含有した通常の培地内において、好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。
【００３８】
本発明における上記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物；糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのアルコール；有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのアミノ酸などが含まれるが、これに限定されない。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を使用することができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（即ち、還元糖に変換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適正量の炭素源を制限なく様々に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用したり、２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３９】
上記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源を使用することができる。これらの窒素源は、単独で使用したり、２種以上を組み合わせて使用することができるが、これに限定されない。
【００４０】
上記リン源としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、またはこれに対応するナトリウム−含有塩などを含むことができる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを使用することができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン、及び／または適切な前駆体などが含まれることができる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加することができ、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に適切な方法で添加して培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。
【００４２】
培養物の温度は２７℃〜３７℃であることができ、より具体的には、３０℃〜３５℃であってもよいが、これに限定されない。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで継続することができ、具体的には、１０時間〜１００時間であってもよいが、これに限定されない。
【００４３】
本発明の上記Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法は、上記培養された微生物またはその培養物からＯ−アセチルホモセリンを回収する段階をさらに含むことができる。
上記Ｏ−アセチルホモセリンを回収する段階は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培養液から目的とするＯ−アセチルホモセリンを回収することができる。
【００４４】
上記回収段階は、精製工程を含むことができる。
このように回収されたＯ−アセチルホモセリンは、本発明者らにより開発された２段階工法（特許文献３）、即ち、第２段階の工程によりメチオニンを生産することができる。
【００４５】
第２段階の工程は、上記Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株により生産されたＯ−アセチルホモセリンとメチルメルカプタンを基質として用いてＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（Oacetylhomoserine sulfhydrylase）活性を有する酵素または上記酵素をを含む菌株を用いた酵素反応によりＬ−メチオニン及び有機酸を生産する工程を含む。
【００４６】
より具体的には、本発明は、上記方法で蓄積されたＯ−アセチルホモセリンを基質として用いてＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼなどの酵素反応を用いることによってＬ−メチオニンを生産する方法を提供する。
【００４７】
上記２段階の工程でＯ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニン前駆体として使用する場合、具体的には、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium sp.）、ヒフォモナス属（Hyphomonas sp.）に属する微生物菌株、より具体的には、レプトスピラメエリ（Leptospira meyeri）、シュードモナス・アウロゲノサ（Pseudomonas aurogenosa）、ハイフォモナス・ネプチュニウム（Hyphomonas Neptunium）、クロモバクテリウム・ビオラセム（Chromobacterium Violaceum）に属する微生物菌株由来のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを用いることができる。
【００４８】
上記反応は、下記の通りである。
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン＜＝＞酢酸＋メチオニン
このようなさらなるメチオニン生産工程については、特許文献３に開示されており、上記特許の明細書全体は、本発明の参考資料として含むことができる。
【００４９】
［発明を実施するための形態］
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００５０】
実施例１：Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する菌株の作製
１−１．野生型大腸菌におけるｍｅｔＢ遺伝子欠損
Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株を製作するためにエシェリキア属微生物中、代表的な微生物である大腸菌を使用した。そのために、野生型大腸菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）を、アメリカ生物資源センター（American Type Culture Collection、ATCC）から入手して使用した。まず、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンのシスタチオンへの生産経路を遮断するためにシスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子（配列番号４）を欠損させた。
【００５１】
具体的には、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損のためにＦＲＴ  １段階のＰＣＲ欠損（FRT one step PCR deletion）の方法を用いた（非特許文献１）。配列番号１３及び１４のプライマーＴＫｄを用いてｐＫＤ３ベクター（非特許文献１）を鋳型としたＰＣＲ反応を行って欠損カセット（deletion cassette）を製作した。この時、ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で１分間の延長（extension）過程を３０回繰り返して行った。
【００５２】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡフラグメントはｐＫＤ４６ベクター（非特許文献１）に予め形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株に電気穿孔（electroporation）を用いて導入した。電気穿孔のためにｐＫＤ４６に形質転換されたＷ３１１０菌株は、１００ｕｇ／Ｌのアンピシリン（ampicilin）と５ｍＭのアラビノース（L-arabinose）が含まれたＬＢ培地を用いて３０℃でＯＤ６００＝０．６に到達するまで培養させた後、滅菌蒸留水で２回、１０％のグリセロール（glycerol）で１回洗浄して使用した。この時、電気穿孔は２５００Ｖで行った。回収された菌株を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコール（chloramphenichol）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００５３】
これから選別された菌株を鋳型として同一のプライマー（配列番号１３及び１４）を用いて上記と同一の条件でＰＣＲを行った後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．２Ｋｂで観察されることを確認することにより、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。欠損が確認された菌株は、再びｐＣＰ２０ベクター（非特許文献１）で形質転換させてＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を選別し、上記菌株からクロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。
【００５４】
このように製作及び選抜されたシスタチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＢ遺伝子が欠損した菌株をＷ３−Ｂと命名した。
１−２．ｔｈｒＢ遺伝子の欠損
上記実施例１−１から得られたＷ３−Ｂ菌株からＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させるために、上記菌株にホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするｔｈｒＢ遺伝子（配列番号６）を欠損させた。ｔｈｒＢ遺伝子を欠損させるために、上記実施例１−１に開示されたｍｅｔＢ遺伝子の欠損時と同様のＦＲＴ  １段階のＰＣＲ欠損（FRT one step PCR deletion）の方法を用いた。
【００５５】
まず、ｔｈｅＢ欠損カセットを製作するためにｐＫＤ４ベクター（非特許文献１）を鋳型としたＰＣＲ反応を行って欠損カセット（deletion cassette）を製作した。具体的には、配列番号１５及び１６のプライマーを用い、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は７２℃で１分間行い、これを３０回繰り返して行うＰＣＲ反応を行った。
【００５６】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．６ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡフラグメントをｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−Ｂ菌株に電気穿孔を用いて導入した。回収された菌株を５０μｇ／Ｌのカナマイシン（kanamycin）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００５７】
上記過程を経て選別された菌株を直接鋳型として配列番号１５及び１６のプライマーを用いて上記と同一の条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Ｋｂと確認される菌株を選別することによりｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株は、再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換させてＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０ｂｐに小さくなった最終ｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を製作し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。このように製作及び選別されたホモセリンキナーゼをコードするｔｈｒＢ遺伝子が欠損した菌株は、Ｗ３−ＢＴ菌株と命名した。
【００５８】
このようなｍｅｔＢ及びｔｈｒＢ欠失菌株などに関する一例は、特許文献３または特許文献１に開示されており、上記特許の明細書全体は、本発明の参考資料として含むことができる。
【００５９】
１−３．ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ｍｅｔＡ遺伝子導入株の製作
上記実施例１−２で得られた菌株にホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）の活性を強化するために、菌株に強化された活性を有するホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｍｅｔＡ遺伝子（配列番号８）を導入することを試みた。
【００６０】
その際、まず、活性が強化された変異型ｍｅｔＡ遺伝子を製造するために、野生型菌株であるＷ３１１０菌株の染色体を鋳型としてｍｅｔＡ遺伝子を配列番号１７及び１８のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅及び得た。上記ＰＣＲに使用した上記配列番号１７及び配列番号１８のプライマーは、アメリカ国立衛生研究所ジジーンバンク（NIH Gene Bank）に登録されているＮＣ＿０００９１３の大腸菌染色体塩基配列に基づいて、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶ部位及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有するように作製した。
【００６１】
このようにして得たＰＣＲ産物とｐｃｊ１が含まれているｐＣＬ１９２０プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶ、及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで処理することによりクローニングした。クローニングされたプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、スペクチノマイシン（spectinomycin）５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ平板培地に培養し、形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを得た。このようにして得たプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡと命名した。
【００６２】
上記で得たｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡに基づいてｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Stratagene社、アメリカ）を用いて変異型ｍｅｔＡ遺伝子を製造した。具体的には、ｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡプラスミドを鋳型として、配列番号１９及び２０のプライマーを用いてホモセリンアセチルトランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換した（Ｇ１１１Ｅ）。このようにして製造されたＧ１１１Ｅ  ｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＬ）と命名した。
【００６３】
また、上記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸をグリシンからグルタミン酸に置換し、さらに１１２番目のアミノ酸をロイシンからヒスチジンに置換するために、配列番号２１及び２２のプライマーを用いた。これにより、１１１番目のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に、１１２番目のアミノ酸がロイシンからヒスチジンに置換されたｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＨ）と命名した。
【００６４】
次に、上記作製した変異型ｍｅｔＡ遺伝子を菌株内に導入して置換するための交換カセットを作製するために、ｐＫＤ３ベクターを鋳型とし、配列番号２７、２８のプライマーを用いて変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は７２℃で２分間行い、これを３０回行うＰＣＲ反応を行った。交換カセットのｍｅｔＡ（ＥＨ）の部分は、ｐＣＬ−Ｐｃｊ１−ｍｅｔＡ（ＥＨ）を鋳型とし、配列番号２３、２４プライマーを用い、ｍｅｔＡ野生型の部分は、配列番号２５、２６プライマーを用いてそれぞれのＰＣＲ産物を得た。３つのＰＣＲ産物を配列番号２３、２６プライマーを用いてクロラムフェニコールマーカー部分を含むｍｅｔＡ（ＥＨ）の交換カセットを製作し、ｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させた上記実施例１−２で製作されたＷ３−ＢＴ菌株に電気穿孔を用いて導入した。導入が確認された菌株は、再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換させてＬＢ培地で培養し、クロラムフェニコールマーカーが除去され、ｍｅｔＡ遺伝子がｍｅｔＡ（ＥＨ）と交換された菌株をＷ３−ＢＴＡと命名した。
【００６５】
このようなホモセリンアセチルトランスフェラーゼ強化菌株などに関する一例は、特許文献２号または特許文献４に開示されており、上記特許の明細書全体は、本発明の参考資料として含むことができる。
【００６６】
１−４．ｐｐｃ、ａｓｐＣ及びａｓｄ遺伝子２コピーを含む菌株の作製
上記実施例１−３で作製したＷ３−ＢＴＡ菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能を増加させるために、既知の生合成経路の強化戦略を導入した。ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸の生合成に関与するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、オキサロ酢酸からアスパラギン酸の生合成に関与するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びβ−アスパラチルホスフェートからホモセリンの生合成に関与するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate-semialdehyde dehydrogenase）、即ち、ｐｐｃ遺伝子、ａｓｐＣ遺伝子及びａｓｄ遺伝子を２コピーで増幅させた菌株の製作を試みた。
【００６７】
よって、配列番号２９、３０、３１、及び３２のプライマーを用いてｐｐｃ遺伝子を２コピーに増幅し、配列番号３３及び３４のプライマーを用いてａｓｐＣ遺伝子を２コピーに増幅し、ａｓｄ遺伝子は、配列番号３５、３６、３７及び３８のプライマーを用いてそれぞれの遺伝子を２コピーに増幅させた。
【００６８】
上記プロセスを通じてＷ３−ＢＴＡ菌株をもとにＯ−アセチルホモセリン生合成経路が強化された菌株をＷ３−ＢＴＡ２ＰＣＤ（＝ＷＣＪＭ）と命名した。
このようなホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ強化菌株などに関する一例は、特許文献３または特許文献１に開示されており、上記特許の明細書全体は、本発明の参考資料として含むことができる。
【００６９】
１−５．フラスコ培養実験
上記実施例１−３及び１−４で製作された菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために三角プラスト培養を行った。ＬＢ培地にＷ３１１０、Ｗ３−ＢＴＡ、ＷＣＪＭ菌株を接種して３３℃で一晩培養した後、シングルコロニーを３ｍＬのＬＢ培地に接種した後、３３℃で５時間培養し、再び２５ｍＬのＯ−アセチルホモセリン生産培地を含む２５０ｍＬの三角フラスコに２００倍希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養してＨＰＬＣ分析を通じてＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。これに使用した培地組成は下記表１にまとめた。
【００７０】
【表１】
0006375391.tif 000002
【００７１】
上記培地を用いて３０時間培養したＨＰＬＣ分析を通じてＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した結果は、下記表２にまとめた。
【００７２】
【表２】
0006375391.tif 000003
【００７３】
上記表２から確認できるように、野生型Ｗ３１１０ではＯ−アセチルホモセリンが全く生成されないが、Ｗ３−ＢＴＡ菌株ではＯ−アセチルホモセリンが０．９ｇ／Ｌが生成され、生合成経路が強化したＷＣＪＭ菌株では１．２ｇ／Ｌが生成された。
【００７４】
実施例２：Ｏ−アセチルホモセリン生産能を増加させる膜タンパク質の同定
本発明者らは、Ｏ−アセチルホモセリン排出能及びＯ−アセチルホモセリン生産能との関連性が開示されたことのないｙｊｅＨ（配列番号１）を適用してみた。
【００７５】
菌株においてｙｊｅＨ遺伝子を強化するために、ｙｊｅＨ遺伝子をｂａｃベクターにクローニングし、ｂａｃベクターにあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素部位を用いて行った。使用したｂａｃベクターはｅｐｉｃｅｎｔｒｅのｃｏｐｙｃｏｎｔｒｏｌ  ＢＡＣ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Cat.No. CCBAC1H-Hind III）を用いた。
【００７６】
まず、ｙｊｅＨ遺伝子を得るために、配列番号９及び１０のプライマーを用いて変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は６８℃で１分間行い、これを３０回行うＰＣＲ反応を行った。その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで一晩３７℃で処理した後、再度精製した後、Ｔ４リガーゼ（ligase）を用いてｙｊｅＨとＢＡＣベクターをクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、クロラムフェニコール（chloramphenichol）５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地で形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを得た。製作されたプラスミドをＯ−アセチルホモセリン生産株であるＷ３−ＢＴＡ及びＷＣＪＭに菌株を導入してＯ−アセチルホモセリンの生産能に対するフラスコ評価を行った。
【００７７】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで一晩３７℃で処理した後、再度精製した後、Ｔ４リガーゼ（ligase）を用いてｙｊｅＨとＢＡＣベクターをクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、クロラムフェニコール（chloramphenichol）５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地で形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを得た。製作されたプラスミドをＯ−アセチルホモセリン生産株であるＷ３−ＢＴＡ及びＷＣＪＭに菌株を導入してＯ−アセチルホモセリンに対する生産能のフラスコ評価を行った。
【００７８】
具体的には、それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ平板培地に、一晩中培養した菌株のシングルコロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種した後、これを３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地を含む２５０ｍＬの三角フラスコで２００倍希釈して３３℃、２００  ｒｐｍの培養器で３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析を通じてＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果を整理すると、下記表３の通りである。
【００７９】
【表３】
0006375391.tif 000004
【００８０】
上記表３から確認できるように、ＷＣＪＭにｙｊｅＨプラスミドの導入は、空ベクターが入ったコントロール菌株よりもＯＤがさらに高く、ブドウ糖の消耗も向上した。Ｏ−アセチルホモセリンは、２．３ｇ／Ｌが生産されてｙｊｅＨを導入することによりＯ−アセチルホモセリン生産能が向上することを確認した。
【００８１】
実施例３：ｙｊｅＨプロモーター強化プラスミド製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
３−１．ｙｊｅＨプロモーター強化プラスミドの製作
実施例２で作製したプラスミドを基本として、内在性のｙｊｅＨプロモーターよりも発現誘導活性の強い３つのプロモーターに交換する実験を行った。
【００８２】
具体的には、ｐｒｏ、ｃｙｓｋまたはｉｃｄプロモーターを用いてＰＣＬベクターにプロモーター強化菌株を作製した。ＰＣＬベクターのｓｍａＩ制限酵素部位を用いて製作し、ｉｃｄプロモーター（配列番号５１）は、配列番号３９及び４０のプライマー、ｐｒｏプロモーター（配列番号５２）は、配列番号４１及び４２のプライマー、ｃｙｓｋプロモーター（配列番号５３）は配列番号４３及び４４のプライマーを用いてＰＣＲで増幅して作製した。製作されたプラスミドをＷＣＪＭに導入してフラスコからＯ−アセチルホモセリンの生産能を評価した。
【００８３】
具体的には、それぞれの菌株をＬＢ平板培地に塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した、ＬＢ固体培地に一晩培養した菌株を、上記で示した２５ｍｌの力価培地に接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養し、その結果を表４に示した。
【００８４】
【表４】
0006375391.tif 000005
【００８５】
上記表４から確認できるように、ｐＣＬ−Ｐｃｙｓｋ−ｙｊｅＨプラスミドが導入された菌株の場合、自己プロモーターよりもＯＤが減少したが、速い糖の消耗速度を示し、Ｏ−アセチルホモセリン４．４ｇ／Ｌが生産されて生産能が最も高かった。
【００８６】
３−２．生合成経路遺伝子及びプロモーター強化プラスミド製作
Ｏ−アセチルホモセリンの生産能を極大化させるためにホモセリンまでの生合成経路を強化させるプラスミドを作製した。アスパラギン酸キナーゼ（aspartate kinase）とホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（homoserine O-acetyltransferase）とｙｊｅＨをＰＣＬベクターにクローニングするために既存に製作されたｐＣＬ−ｔｈｒＡ−ｍｅｔＸプラスミドを用いた。
【００８７】
具体的には、ｙｊｅＨ遺伝子を得るために、配列番号１１及び１２のプライマーを用いて変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は６８℃で１分間行い、これを３０回行うＰＣＲ反応を行った。
【００８８】
その結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．２ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡとプラスミドを制限酵素ｋｐｎＩに一晩３７℃で処理した後、再度精製した後、Ｔ４リガーゼを用いてｙｊｅＨとｐＣＬベクターをクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ平板培地で形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを得た。製作されたプラスミドをＯ−アセチルホモセリン生産株であるＷＣＪＭに導入してＯ−アセチルホモセリンの生産能に対するフラスコ評価を行った。製作されたプラスミドは計３種であり、実施例３−１で製作されたプロモーターの３種を用いた。３種のプラスミドはＷＣＪＭ菌株に入れ、実施例３−１と同様の方法でフラスコの評価を進め、その結果は下記表５の通りである。
【００８９】
【表５】
0006375391.tif 000006
【００９０】
上記表５から確認できるように、生合成経路とｙｊｅＨを同時に強化させた結果、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能はさらに向上し、その順序は先に記載したものと同様にｐＣ２−Ｐｃｙｓｋ−ｙｊｅＨプラスミドが導入された菌株の場合、自己プロモーターよりもＯＤが減少したが、速い糖の消耗速度を示し、Ｏ−アセチルホモセリンが５．４ｇ／Ｌ生産され、生産能が最も高かった。
【００９１】
実施例４：内在性のｙｊｅＨプロモーター強化菌株の製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
４−１．内在性のｙｊｅＨ強化菌株の製作及び評価
Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株であるＷＣＪＭの内在性のｙｊｅＨ遺伝子の活性を強化させた菌株を製作するためにプロモーターを置換する実験を行った。本発明のＷＣＪＭ菌株にはｙｊｅＨが１コピー存在し、この遺伝子を強化させるためにｙｊｅＨのコピー数を増やす代わりにプロモーターを強化する方法で菌株を作製した。
【００９２】
具体的には、交換のためのプロモーターは、上記実施例３で活性を確認したｉｃｄ、ｃｙｓＫ及びｐｒｏプロモーター（Ｐｉｃｄ、Ｐｃｙｓｋ及びＰｐｒｏ）を選定し、上記で明示されたＦＲＴ  １段階のＰＣＲ欠損（FRT one step PCR deletion）の方法を用いた（非特許文献１）。ｉｃｄプロモーターは配列番号４５及び４６のプライマー、ｃｙｓｋプロモーターは配列番号４７及び４８のプライマー、ｐｒｏプロモーターは、配列番号４９及び５０のプライマーを用い、ｐＫＤ４ベクターを鋳型にしてＰＣＲ反応で挿入カセットを製作した。上記ＰＣＲは、変性段階は９４℃で３０秒、アニーリング段階は５５℃で３０秒、延長段階は７２℃で１分間行い、これを３０回行った。
【００９３】
上記実験の結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、２．５ｋｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡフラグメントはｐＫＤ４６ベクター（非特許文献１）を予め形質転換させたＷＣＪＭ菌株に電気穿孔した。電気穿孔のためにｐＫＤ４６で形質転換されたＷＣＪＭ菌株は、１００μｇ／Ｌのアンピシリン（ampicilin）と５ｍＭのアラビノース（l-arabinose）が含まれたＬＢ培地を用い、３０℃でＯＤ６００＝０．６まで培養させた後、滅菌蒸留水で２回、１０％のグリセロール（glycerol）で１回洗浄して使用した。電気穿孔は２５００Ｖで行った。回収された菌株を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコール（chloramphenichol）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００９４】
上記選別された菌株を鋳型とし、ｉｃｄプロモーターは配列番号４５、４６のプライマー、ｃｙｓｋプロモーターは配列番号４７、４８のプライマー、ｐｒｏプロモーターは配列番号４９、５０のプライマーを用いて上記と同一の条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが２．５Ｋｂと観察されることを確認することにより、ｙｊｅＨ内在性のプロモーターが、それぞれの外来プロモーターと交換されたことを確認した。交換されたことが確認された菌株は、再びｐＣＰ２０ベクター（PNAS(2000)vol97:P6640-6645）で形質転換させ、ＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲにより１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが１Ｋｂと小さくなった最終的なプロモーターの交換菌株を製作し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。このように製作された菌株をそれぞれのプロモーターにより、ｉｃｄプロモーター交換菌株はＷＣＪＭ−ＰＩＹ、ｃｙｓｋプロモーター交換菌株はＷＣＪＭ−ＰＣＹ、ｐｒｏプロモーター交換菌株はＷＣＪＭ−ＰＰＹと命名した。上記ｙｊｅＨプロモーター交換菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能を測定するためにフラスコ培養評価を進め、その結果を表６に示した。
【００９５】
【表６】
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【００９６】
上記表６から確認できるように、染色体内において、内在性のｙｊｅＨプロモーターを発現活性が強いプロモーターに交換してｙｊｅＨ遺伝子発現を強化した結果、プラスミドを導入して形質変換した上記実施例３の結果に比べて（５コピー）Ｏ−アセチルホモセリン生産能は急激な変化を示さなかったが、生産菌株であるＷＣＪＭに比べた菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能が増加することを確認した。
【００９７】
４−２．Ｏ−アセチルホモセリン高収率菌株におけるｙｊｅＨプロモーター強化菌株の製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
従来、野生型Ｗ３１１０由来のＮＴＧ  ｍｕｔａｔｉｏｎによりトレオニンを生産する能力を有する菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株を作製する方法が知られている（特許文献４）。この際、製作された高収率のＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株は、韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１１４６Ｐとして寄託されている。
【００９８】
上記受託番号ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株は、フラスコ培養時、グルコース４０ｇ／Ｌを消尽し、約１５〜１６ｇ／ＬのＯ−アセチルホモセリンを生産する、高収率のＯ−アセチルホモセリン生産能を有している。そこで、本発明者らは、既にＯ−アセチルホモセリン高生産能を有している上記菌株をもとに、本発明のｙｊｅＨ遺伝子を強化させてＯ−アセチルホモセリン生産能をさらに増進し得るか否かを確認してみた。
【００９９】
具体的には、ｙｊｅＨ遺伝子のプロモーターを発現誘導活性の高いプロモーターと交換し、これは、上記実施例４−１と同様の方法を用いて行った。このように製作したＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株のｙｊｅＨプロモーター交換菌株は、それぞれのプロモーターによって、ｉｃｄプロモーター交換菌株をＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＩＹ、ｃｙｓｋプロモーター交換菌株をＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＣＹ、ｐｒｏプロモーター交換菌株をＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＰＹと命名した。
【０１００】
上記ｙｊｅＨプロモーター交換菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能を測定するためにフラスコ培養評価を行った。具体的には、ＬＢ培地にＫＣＣＭ１１１４６Ｐ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＩＹ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＣＹ、またはＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＰＰＹ菌株を接種して３３℃で一晩培養した後、シングルコロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３３℃で５時間培養し、再度２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地が添加された２５０ｍＬの三角フラスコに２００倍希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。上記実験した結果を整理すると、下記表７の通りである。
【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
上記表７で確認できるように、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株でＯ−アセチルホモセリンが１４．２ｇ／Ｌ生成され、プロモーター交換株の場合、ＰＣＹが１８．２ｇ／ＬでＯ−アセチルホモセリンの生産量が最も高くなり、ＰＩＹとＰＰＹの場合も、本来の菌株よりもＯ−アセチルホモセリンの生産量が増加した。
【０１０３】
本発明者らはＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株ベースのｙｊｅＨ強化菌株においてＯ−アセチルホモセリンの生産が増加することを確認し、上記菌株を「ＣＡ０５−４００８」と命名した後、ブダペスト条約下に２０１３年１１月２２日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１４８４Ｐが与えられた。
【０１０４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【０１０５】
【表８】
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【図１】
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【配列表】
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