(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
2型トランスグルタミナーゼ（TG2）のコア領域内のエピトープと選択的に結合し、ヒトTG2のNε（γ-グルタミル）リジン イソペプチド結合によるリジンとグルタミンの架橋を阻害する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、抗体又はその抗原結合フラグメントが、下記アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント:
(a)KASQDINSYLT (LCDR1);
LVNRLVD (LCDR2);
LQYDDFPYT (LCDR3);
THAMS (HCDR1);
TISSGGRSTYYPDSVKG (HCDR2);及び
LISTY (HCDR3);又は
(b)KASQDINSYLT (LCDR1);
LTNRLMD (LCDR2);
LQYVDFPYT (LCDR3);
SSAMS (HCDR1);
TISSGGRSTYYPDSVKG (HCDR2);及び
LISPY (HCDR3);又は
(c)KASQDINSYLT (LCDR1);
RTNRLFD (LCDR2);
LQYDDFPYT (LCDR3);
SSAMS (HCDR1);
TISVGGGKTYYPDSVKG (HCDR2);及び
LISLY (HCDR3)。
【請求項２】
2型トランスグルタミナーゼ（TG2）のコア領域内のエピトープと選択的に結合し、ヒトTG2のNε（γ-グルタミル）リジン イソペプチド結合によるリジンとグルタミンの架橋を阻害する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで、抗体又はその抗原結合フラグメントが、下記アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント:
(a) 配列DVLMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIEHINGNTYLEWYLQKPGQSPKFLIYKVSNRFSG
VPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPFTFGGGTKLEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYRFTSYVMHWVKQKSGQGLEWIGYINPYNDGAKYNE
KFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARLSSDYWGQGTTLTVSSを含む重鎖可変領域；又は
(b) 配列DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSG
VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVGAEDLGVYYCLQVSHVPFTFGSGTKLEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGFINPYNDGTKYNE
KFKGKATLTSDKASTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARFSSGYWGQGTTLTVSSを含む重鎖可変領域；又は
(c) 配列DVLMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSRSIEHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKFLIYKVSNRFSG
VPDRFSGSGSGTDFTLRISSVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKLEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCRASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGARYN
EKFKGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARLSSDYWGQGTTLTVSSを含む重鎖可変領域；又は
(d) 配列QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVDYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFS
GSGSGTSYSLTISRMGAEDAATYYCQQWNSSPLTFGAGTKLELKを含む軽鎖可変領域、及び配列QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQSSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSR
ITISKDSSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSWTTAPFAFWGQGTLVTVSAを含む重鎖可変領域；又は
(e) 配列QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATFYCQQWSSSPLTFGAGTKLELKを含む軽鎖可変領域、及び配列QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK
SRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARSGTTAPFAYWGQGTLVTVSAを含む重鎖可変領域；又は
(f)配列QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVAANNYANWIQEKPDHLFTGLIAGTNKRAPGVP
ARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNYWVFGGGTKVTVLGを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYRFTDYNMHWVKQNLGKSLEWIGYINPKNGVIYYNQ
KFKGKATLTVNRSSNTAYMEIRSLTSEDSAVYYCATALTYWGQGTLVTVSAを含む重鎖可変領域；又は
(g) 配列DVVMTQTPLTLSVTFGQPASISCKSSQSLLYDNGKTYLHWLFQRPGQSPRRLIYLVSKLDSG
VPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPYTFGGGTKLEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMTWVKQAPGKGLKWMGWINTSSGVPTYA
DDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKSEDTATYFCARPEVAYWGQGTLVTVSAを含む重鎖可変領域。
【請求項３】
コア領域がヒトTG2のアミノ酸143〜473からなる、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体又はその抗原結合フラグメントが、
i）ヒトTG2のアミノ酸304〜326；又は
ii）ヒトTG2のアミノ酸351〜365；又は
iii）ヒトTG2のアミノ酸450〜467
を含む領域と全体又は一部において選択的に結合する、請求項１又は３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体又はそのフラグメントが、
(a)配列DITMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKILIYLVNRLVDGVP
SRFSGSGSGQDYALTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSTHAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGRSTYYPDSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARLISTYWGQGTLVTVSSを含む重鎖可変領域、又は
(b)配列DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKTLIYLTNRLMDGVP
SRFSGSGSGQEFLLTISSLQPEDFATYYCLQYVDFPYTFGQGTKVEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIIFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGRSTYYPDSV
KGRFTVSRDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISPYWGQGTLVTVSSを含む重鎖可変領域;又は
(c)配列EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWYQQKPGKAPKLLIYRTNRLFDGVPSRFSGSGSGTDFFFTISSLQPEDFGTYYCLQYDDFPYTFGGGTKLEIK又はDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKAPKSLIYRTNRLFDGVPSRFSGSGSGTDFFLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIKを含む軽鎖可変領域、及び配列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLISLYWGQGTLVTVSSを含む重鎖可変領域、を有する、
請求項１、３又は４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
インタクト抗体を含むか又は該抗体からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
Fvフラグメント；Fabフラグメント；及びFab様フラグメントからなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか又は該フラグメントからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項８】
一本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド結合Fvフラグメント、Fab’フラグメント、またはF(ab)2フラグメントである、請求項７記載の抗原結合フラグメント。
【請求項９】
IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合フラグメントが、TG1、TG3、TG13及び／又はTG7活性を阻害しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜９、又は１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントがTG2と結合した場合に、TG2との結合が阻害される又は低下する、抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜９、１１又は１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、更なる部分とを含む、化合物。
【請求項１４】
前記更なる部分が、容易に検出可能な部分、又は、直接的又は間接的細胞毒性部分である、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物を、医薬上許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤又は担体と混合して含む、医薬組成物／製剤。
【請求項１６】
1つ以上の更なる活性成分をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物／製剤。
【請求項１７】
組成物／製剤が、患者への静脈内、筋内又は皮下デリバリーのために製剤化される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物／製剤。
【請求項１８】
請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物；及び更なる薬剤を含む、部品のキット。
【請求項１９】
請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物を含む、それを必要とする個体におけるTG2酵素活性を低下又は阻害するための薬剤。
【請求項２０】
請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物を含む、セリアック病、異常な創傷治癒、瘢痕化、肥厚性瘢痕、眼の瘢痕化、炎症性腸疾患、黄斑変性症、乾癬、線維症関連疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性／神経系疾患、膠芽腫、悪性黒色腫、膵管腺癌、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン性大腸炎の治療及び／又は診断のための、薬剤。
【請求項２１】
前記線維症関連疾患が、肝線維症、肺線維症、間質性肺疾患、線維化肺疾患、心臓線維症、骨髄線維症、腎線維症、糸球体硬化症、又は尿細管間質性線維症である、請求項２０記載の薬剤。
【請求項２２】
前記神経変性／神経系疾患が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症1、2、3、6、7及び12、赤核淡蒼球（rubropallidal）萎縮症、又は、脊髄小脳麻痺である、請求項２０記載の薬剤。
【請求項２３】
TG2酵素活性を低下又は阻害するin vitro方法であって、請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物を、TG2を含むサンプルに投与することを含む、方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを発現することを含む、請求項１〜９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１３若しくは１４に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TG2阻害剤、並びにかかる阻害剤を提供及び使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2型トランスグルタミナーゼ（TG2；組織型トランスグルタミナーゼtTgとしても知られる）は、広範な9のメンバーのトランスグルタミナーゼファミリーの一部であり、該ファミリーには、血液凝固に重要な第XIIIa因子、並びにケラチノサイトの最終分化に関与するケラチノサイトトランスグルタミナーゼ（TG1）及び表皮トランスグルタミナーゼ（TG3）が含まれる。さらに、明確な役割が今日まで同定されていない4型TG〜7型TGなどの他のTGファミリーメンバーが存在する。
【０００３】
TG2は、ε（γ-グルタミル）リジン イソジペプチド結合の形成を触媒することにより、タンパク質架橋酵素として主に機能する。TG2発現の上昇により、異常なタンパク質架橋がもたらされ、該架橋は、様々なタイプの組織瘢痕化、複数の脳障害における神経原線維タングルの形成、及びいくつかの癌における化学療法抵抗性を含む複数の病状と関連する。TG2はまた、タンパク質を脱アミド化することができる。TG2はグリアジンを脱アミド化し、TG2/グリアジン複合体は、セリアック病における主要自己抗原である。さらに、TG2はGTP結合機能を有し、病理学的役割とは関連しないものの、GTPaseとして作用し得る。
【０００４】
TG2活性の上昇は、肝線維症［2］、肺線維症［3］、心臓線維症［4］及び腎線維症［5］をもたらす異常な創傷治癒［1］、並びにアテローム性動脈硬化症［6］と主に関連する。瘢痕化及び線維化のプロセスは、TG2合成の増加と関連し、最も重要なことには、間質腔へのTG2輸送の上昇と関連する。細胞の外に出ると、TG2は、ε（γ-グルタミル）リジン ジペプチド結合の組み込みにより［8］、フィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を架橋することができる［7］。これは、利用可能なECM成分の沈着を加速し得る一方、それと同時に、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase）（MMP）系によるタンパク質分解クリアランスに対し耐性を付与することが研究により示されている［9、10］。総合すると、これにより、ECMタンパク質の蓄積、ひいては瘢痕組織が生じる［9］。さらに、TG2は、瘢痕化プロセスにおける潜在型TGF-β1の活性化において新たな役割を有し［11］、インターロイキン-6［12］及び腫瘍壊死因子-α活性化経路［13］とも関連する。
【０００５】
in vitroでTG2を阻害すると、細胞外マトリックスレベルが低下する一方［14］、TG2ノックアウトマウス由来の細胞は、成熟ECMレベルがより低い［9］。慢性腎臓病モデルにおいて、汎TG阻害剤（pan TG inhibitors）をin vivoで適用すると、糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症の発症が低下し、腎機能が保持される［15、16］。同様の恩恵は、一側尿管結紮を受けたTG2ノックアウトマウスでみられる［17］。
【０００６】
TG2が形成に関与する、脳変性領域におけるタンパク質凝集体の存在により特徴付けられる神経変性疾患が複数存在する。最も特徴付けられるものは、ハンチントン舞踏病である。ハンチントンタンパク質（htt）は、伸長ポリグルタミンリピートをそのN末端ドメインに含む。野生型httが35未満の連続グルタミンを含む一方、疾患と関連するhttは、典型的には、40超の連続グルタミンを有し、これを優れたTG2基質にする。その後、不溶性凝集体が、ハンチントン病患者の線条体及び皮質に形成される。凝集体の頻度は疾患の重篤度とよく関連する。
【０００７】
アルツハイマー病は、凝集アミロイドβタンパク質からなる細胞外老人斑と、タンパク質tauの高度リン酸化形態からなる細胞内神経原線維タングルの存在により代表される。これらの斑は、多量のε（γ-グルタミル）リジン イソジペプチド結合を含む。
【０００８】
最後に、パーキンソン病の顕著な特徴は、罹患ニューロン細胞質における、レビー小体と称されるα-シヌクレイン凝集体の存在であり、これもやはり、ε（γ-グルタミル）リジン イソジペプチド結合を含む。上記タンパク質は全て、in vitroにおいて、TG2の良好な基質である。さらに、脳罹患領域は、同一患者の脳非罹患領域よりも高レベルのTG2タンパク質を含む。疾患関連凝集タンパク質に対するTG2基質特異性と、TG2発現レベルの増加との相関関係は、各疾患において、酵素的に活性なTG2が果たす役割を示唆する。
【０００９】
TG阻害剤は、神経変性疾患の複数の生物学的モデルにおいて治療効果を発揮することが示されている。COS-7細胞にα-シヌクレインとTG2とを同時にトランスフェクトした、パーキンソン病の細胞培養モデルでは、共有結合シヌクレイン凝集体（パーキンソン病におけるレビー小体を想起させる）が形成され、C277Sの不活性なTG2変異体が凝集形成を誘導できなかったことから、これは酵素的に活性なTG2に依存する。これらのコトランスフェクト細胞をシスタミンで処理すると、α-シヌクレイン凝集体の量、及び凝集体を含む細胞パーセンテージが有意に減少した。正常な長さを有するタンパク質及び伸長ポリグルタミンリピートタンパク質（ハンチントン病などの伸長CAG病の代表）を細胞株にトランスフェクトし、凝集体の形成を示した報告が他に2つ存在する。TG競合的阻害剤モノダンシルカダベリンでこれらの細胞株を処理すると、核フラグメント化の減少がもたらされた一方、シスタミンでの処理は、核フラグメント化の減少と、タンパク質凝集体形成の減少との両方をもたらす。汎TG阻害剤の一例は、1,3-ジメチル-2-[（2-オキソ-プロピル）チオ］イミダゾリウム クロリドであり、これは、Zedira GmbHから入手可能であり、複数の出版物においてNTU283又はr283と称される。
【００１０】
シスタミンは、ハンチントン病マウスモデルにおいて投与された場合に、in vivoで有益な治療効果を有する。シスタミン投与されたハンチントンR6/2マウスは、非処理コントロールと比較して、運動機能の改善、深刻な体重減少の低下、及び生存率の増加を示した。重要なことに、脳ホモジネートにおけるex vivoでのTG2活性は、シスタミン投与後、注入から少なくとも60分後に低下した。ハンチントン病の異なるマウスモデルYAC128株において、シスタミンは、線条萎縮（striatal atrophy）レベルを低下させることはできたが、動物の体重又は運動機能を改善することはできなかったことから、シスタミンの有益な効果は細胞及び組織レベルで示されたものの、疾患症状では示されなかった。
【００１１】
ハンチントンマウスに対するシスタミンの有益な治療効果はTG2阻害とは独立するという、おそらく最も説得力のある証拠が、R6/2ハンチントンマウスをTG2ノックアウトマウスと交配して、TG2の不在下、神経変性の影響を受けやすい株を創出することによってもたらされている。R6/2 TG2-/-マウスをシスタミンで処理した場合、運動機能の改善及び寿命の増加は、シスタミン処理したR6/2 TG2+/+マウスで見られた改善と統計的に異ならなかった。さらに、R6/1及びR6/2 TG2-/-マウスは、R6/1及びR6/2 TG2+/+マウスと比較して、神経タンパク質凝集体レベルの増加を示し、これにより、これらのモデルにおいて、タンパク質凝集メカニズムが、TG2アミド基転移活性とは独立することが示唆された。しかしながら、R6/2 TG2-/-マウスが、R6/2 TG2+/+マウスと比較して、運動機能障害発症の遅延と生存率の改善を示したことから、R6/2モデルにおいて、神経変性の病因にTG2が果たす役割が示唆されたことは注目に値する。
【００１２】
西ヨーロッパでは100人に1人が罹患するセリアック病にもTG2は大きく関与する。セリアックスプルーは、小麦、大麦及びライ麦で発見されたプロラミンと称されるタンパク質クラスにより引き起こされる、小腸のT細胞媒介性炎症障害である。これらのタンパク質は、その高プロリン及びグルタミン含量により、消化の間、天然の胃、膵臓及び腸内のプロテアーゼ、並びにペプチダーゼに対し抵抗性となる。その結果生じるペプチドフラグメントは、小腸へ達しても未消化のままで、腸固有層に接近し、そこでは、TG2による修飾後、それらがT細胞媒介性の免疫反応を刺激して、腸構造の炎症及び破壊を導き得る。腸のTG2は、プロラミンペプチドの特定のグルタミン残基をグルタミン酸残基に脱アミド化する。HLA-DQ2/8個体において、これらの修飾ペプチドは、MHCクラスII分子により、対応する自己反応性T細胞に提示される。プロラミンは高グルタミン含量（約30〜35％）を有するものの、これらグルタミン残基のうちほんの少ししかヒトTG2により標的とされない。TG2で処理したプロラミンのTG2基質特異性、DQ2結合親和性及びT細胞刺激能の間の優れた相関関係により、ペプチド脱アミド化がTG2により媒介され、疾患重篤度の決定に重要な役割を果たすことが強く示唆される。さらに、セリアック患者は、TG2-グリアジン複合体に反応する自己抗体を産生する。これらの抗TG2抗体は、小腸（ここでは、細胞外TG2と共局在化することが示される）と血液（ここでは、診断的疾患マーカーとして利用される）の両方で発見される。
【００１３】
セリアック病動物モデルの欠如にも関わらず、ex vivoでの実験により、TG2阻害が、セリアックスプルー患者に利益をもたらす可能性があることが示される。セリアック患者の小腸生検を、TG2処理した（脱アミド化される）又はTG2処理していない（脱アミド化されない）グルテン消化物のいずれかと培養すると、非脱アミド化グルテンペプチドよりもむしろ脱アミド化グルテンペプチドを優先的に認識する患者T細胞株の産生がともにもたらされた。また、セリアック生検の内因性TG2の活性をシスタミンで遮断することにより、得られたT細胞株の半分超が、シスタミンで処理していないコントロールと比較して増殖反応の低下を示した。細胞株は、非脱アミド化消化物に対して十分に反応しなかった。これらの結果から、セリアック腸生検のグルテン反応性T細胞集団は、非脱アミド化ペプチドとは対照的に脱アミド化グルテンペプチドを認識する方向に自然に偏っていること、これらの生検の内因性TG2活性は、in situでグルテンペプチドの脱アミド化をもたらし得ること、及びセリアック生検をTG2阻害剤で処理することにより、グルテン反応性T細胞の増殖反応が低下し得ることが示唆される。
【００１４】
別の研究により、汎TG阻害剤2-[（2-オキソプロピル）チオ］イミダゾリウム阻害剤が、セリアックスプルー患者及びコントロールの両方から採取した組織薄切片において、グルテンペプチドと内因性タンパク質とのin situ架橋を妨げ得ることが示された。より重要なことに、著者らは、インタクトなセリアック小腸生検を2-[（2-オキソプロピル）チオ］イミダゾリウムとともにインキュベーションすると、免疫優性グルテンペプチドの非脱アミド化形態により誘導されるT細胞活性化が妨げられたことを示した。対照的に、同じペプチドの脱アミド化バージョンとともに生検をインキュベートした場合、TG阻害は、T細胞活性化の制御に対し効果がなかった。これらの結果から、セリアック患者生検において、内因性TG2の阻害は、グルテンペプチド脱アミド化を妨げ得、従って、T細胞活性化を低下させ得ることが示唆される。
【００１５】
複数の観察により、TG2が特定タイプの癌の発生に役割を果たすという仮説が支持される。複数の研究により、TG2タンパク質が、癌、例えば、数例を挙げると膠芽腫、悪性黒色腫、膵管腺癌などにおいて、健常組織に対し癌組織で上方制御されることが示されている。TG2発現レベルに対し、特定の癌の化学療法抵抗性と転移能との正の相関関係が実証されている一方、特定の細胞タイプにおいては、TG2は細胞に対し抗アポトーシス作用を発揮し、一方で、TG2タンパク質発現レベルのsiRNA下方制御又はTG2阻害剤での処理により、これらの細胞をアポトーシスに対して感受性にすることが示されている。他方、特定タイプの癌においては、TG2発現が下方制御されるとの報告もある［18］。最近、TG2は、GPR56（高転移性癌細胞で下方制御されるタンパク質）に対する結合パートナーであることが示されており、これにより、TG2が、GPR56とのその相互作用を介して、腫瘍抑制タンパク質として作用し得ることが示唆される［18］。
【００１６】
現在、トランスグルタミナーゼ阻害剤は3つの主要なクラスに分類される：1）天然アミン基質と競合する、競合的アミン阻害剤（例、シスタミン及びスペルミン）；2）可逆的アロステリック阻害剤、例えば、GTP、及びチエノ[2,3-d］ピリミジン-4-オン アシルヒドラジド骨格を有する新たに発見された化合物クラス；及び3）2-[（2-オキソプロピル）チオ］イミダゾリウム誘導体（活性部位システインをアセチル化）、3-ハロ-4,5-ジヒドロイソオキサゾール（活性部位にて安定なイミノチオエーテルを形成）及びカルボベンジルオキシ-L-グルタミニル グリシンアナログ（挿入された広範な反応性部分を有する）を含む不可逆的阻害剤。
【００１７】
大半は上記実験系で使用され、有益な結果を示している。しかし、これら阻害剤は全て、トランスグルタミナーゼファミリー触媒コア内の保存された触媒三残基を標的としているため、いずれもTGアイソフォーム特異性を示さない。結果として、これらは全て、第XIIIa因子、TG1及びTG3を共に阻害するデメリットを潜在的に有しており、予想され得る副作用に起因して、事実上、ヒト疾患への適用が妨げられる。
【００１８】
国際公開第2006/100679号には、3人の成人セリアック患者から回収したサンプルから組換え技術により製造された、高い抗TG2抗体力価を有する、特異的抗TG2抗体が記載される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
多数の疾患状態とTG2との関連、及び非特異的阻害剤に由来する説得力のあるデータを考慮すると、最小のオフターゲット効果を有する、選択性が高く、有効性の高いTG2阻害剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本明細書において、明らかに以前に公開された文書の列挙又は考察は、その文書が当該技術分野の一部であるか又は共通の一般的知識であるという承認と必ずしも解釈されるべきではない。
【００２１】
第一の側面において、本発明は、2型トランスグルタミナーゼ（TG2）のコア領域内のエピトープと選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２２】
特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトTG2、ラットTG2及び／又はマウスTG2のコア領域内のエピトープと選択的に結合することが想定される。特に好ましい実施態様において、TG2はヒトTG2である。
【００２３】
ヒト、ラット及びマウスTG2の全長アミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号NM_004613、NM_019386.2及びNM_009373.3で見つけられる。これら配列のコーディング部分は以下のとおりである。
【００２４】
ヒトTG2ヌクレオチド配列：
【００２５】
【化１】
0006411998.tif 000002
【００２６】
ヒトTG2アミノ酸配列：
【００２７】
【化２】
0006411998.tif 000003
【００２８】
ラットTG2ヌクレオチド配列：
【００２９】
【化３】
0006411998.tif 000004
【００３０】
ラットTG2アミノ酸配列：
【００３１】
【化４】
0006411998.tif 000005
【００３２】
マウスTG2ヌクレオチド配列：
【００３３】
【化５】
0006411998.tif 000006
【００３４】
マウスTG2アミノ酸配列：
【００３５】
【化６】
0006411998.tif 000007
【００３６】
本発明者らは、ヒトTG2コアのアミノ酸143〜473を包含する組換えタンパク質でマウスを免疫することにより、TG2に対する抗体を産生させた。クローニングした任意の適した候補を用いてTG2特異性及び阻害についてハイブリドーマをスクリーニングした。これらからIgGを精製して有効性を算出し、ファージディスプレイによるヒトTG2ライブラリーのスクリーニングによって、ターゲットエピトープをマッピングした。
【００３７】
組換えTG2コアタンパク質を用いることによりTG2に対する抗体を産生するという本発明のアプローチはこれまで試されておらず、これにより、驚くべきことに、TG2に対して選択性が高く、且つ強力な阻害特性を示すTG2抗体の単離及び特性化がもたらされた。TG2抗体を産生するための以前の試みでは、トランスグルタミナーゼファミリーの他のメンバーと交差反応する、比較的非選択的な抗体の単離がもたらされており、従って、臨床用途のために有望な抗体を示さなかった。他方、本発明の抗体は、TG2活性により悪化するか又はTG2活性により媒介される疾患に対する臨床試験の有望な候補である。
【００３８】
本願のアプローチによって、以前に製造された抗体と比較して非常に効果的な抗体の産生がもたらされたことは驚きである。コア領域で免疫することにより、TG2の効果的阻害剤である抗体を産生可能であるとの保証は全くなかった。上記のように、効果的阻害剤である抗体は、医学の分野で効果的に使用されるために、TG2に対し十分に特異的でなくてよい。異なる（divergent）領域（特に、TG2の異なるトランスグルタミナーゼファミリーメンバー間でわずかに異なる（diverge）コア領域）に対する抗体が、TG2の効果的且つ選択的阻害剤であることは驚きである。
【００３９】
いずれの理論に拘束されることなく、ちょうど中心のコアをカバーする、より小さなタンパク質に対して抗体を産生することにより、全長タンパク質上に存在する好まれる免疫学的エピトープのいくつかが排除されるだけでなく、コアターゲティングが推し進められると考えられる。これにより、選択に利用可能な抗体の多様性が増加すると思われ、より広いコアの範囲が提供される。
【００４０】
ちょうどTG2コアで免疫することにより、酵素三次構造の大部分が除かれた（特に、2つのカルボキシ末端βバレルドメイン）。天然全長TG2分子内の、おそらくほとんど利用し得ないか又は免疫原性となり得ないエピトープのいくつかが、本明細書に記載のフォーマットでは、コア内のより魅力的なエピトープとなり得る可能性がある。本明細書に記載の抗体が直線状エピトープを認識した一方（すなわち、還元（reducing）SDS PAGEゲル上でTG2と結合する）、全長TG2を免疫原として用いて以前に単離した抗体の80％はコンフォメーション依存性であった。我々は、組換えコアドメインが酵素活性を保持しており、そのため、活性部位中又はその近くに位置する、以前はあまり好ましくなかったエピトープの暴露により、阻害抗体の単離がおそらく助けられたことを示すことができた。組換えコアタンパク質は、全長タンパク質と同じフォールディング特性を実証し得ないことを考慮すると、ヒトTG2に対する阻害抗体が、コアで免疫することにより産生されたことは興味深く、驚きである。
【００４１】
TG触媒コアは、TGファミリーのメンバー間で種にわたって高度に保存されている。これは、特異的低分子阻害剤の開発だけでなく抗体系阻害剤の開発も技術的に困難であり得ることを示唆する。それにも関わらず、本開示は、選択性が高い抗体を提供する。これは、いくらか不均一性のある、TG2触媒ドメイン内のいくつかの領域が存在するという事実を反映し得る可能性がある。従って、本発明の抗体は、これらの小さな差を利用し得る。本発明の抗体の驚くべき選択性は、TG2活性を効率的に妨げ得る治療法の開発を可能にし、従って、TG2活性により悪化するか又はTG2活性により引き起こされる状態であって、現在、満足のいく治療選択肢が存在しないものに対し、潜在的に効果的な治療を提供し得る。
【００４２】
比較として、国際公開第2006/100679号に記載された抗体（3人の成人セリアック患者由来のサンプルから組換え技術により製造された、高い抗TG2抗体力価を有する抗体）は、本発明者らが試験した場合に、有効性が低いものであることが証明された（実施例2）。本発明の抗体は、TG2に対する選択性及び阻害活性に関し、国際公開第2006/100679号のものよりも遥かに優れていた。例えば、本発明者らは、国際公開第2006/100679号の抗体のFabフラグメントを作製し、これを本発明の抗体と同じ濃度でTG2阻害アッセイに適用した。該試験におけるFabフラグメント量は、モルに関して、本発明の抗体の2倍であったが、それでも、それらはTG2活性の阻害を何ら示すことができなかった。我々の標準的なプトレシン取込みアッセイ（putrescine incorporation assay）において、国際公開第2006/100679号の全長抗体を阻害について試験した場合、TG2活性の阻害は何ら認められなかった。従って、本発明の方法及びそれらの方法により製造される抗体は、以前に記載されたものよりも優れている。
【００４３】
「抗体」により、我々は、実質的にインタクトな抗体分子、さらにはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここで、少なくとも1つのアミノ酸が、天然に存在するヒト抗体と比較して変異している）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、並びに抗原結合フラグメント及びその誘導体を含める。我々はまた、用語「抗体」及び「その抗原結合フラグメント」の意味の範囲内に、抗体及びその抗原結合フラグメントのバリアント、融合体（fusions）及び誘導体も含める。
【００４４】
用語「抗体」はまた、IgG、IgA、IgM、IgD及びIgEを含む全てのクラスの抗体を含む。従って、抗体は、IgG分子であってよく、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4分子などであってよい。好ましくは、本発明の抗体は、IgG分子であるか、又はその抗原結合フラグメント、又はそのバリアント、融合体若しくは誘導体である。より好ましくは、抗体はIgG2分子である。
【００４５】
本発明の抗体、組成物、使用及び方法は、定義する抗体及びその抗原結合フラグメントのバリアント、融合体及び誘導体、並びに前記バリアント若しくは誘導体の融合体を、かかるバリアント、融合体及び誘導体がTG2に対する結合特異性を有する限り、包含する。
【００４６】
抗体及びその抗原結合フラグメントは1つ以上のポリペプチド成分を含むので、本明細書で定義するような抗体及びその抗原結合フラグメントのバリアント、融合体及び誘導体は、組換えポリヌクレオチドを用いて、当分野で周知のタンパク質工学の方法及び部位特異的突然変異誘発法を用いて作製されてよい（例えば、Molecular Cloning：a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press（参照により本明細書に援用される）を参照）。
【００４７】
従って、本明細書で定義するような抗体又はその抗原結合フラグメントのバリアント、融合体及び誘導体は、抗体又はその抗原結合フラグメントのポリペプチド成分に基づいて作製されてよい。
【００４８】
「融合体（fusion）」により、我々は、任意の他のポリペプチドと融合した前記ポリペプチドを含める。例えば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）又はプロテインAなどのポリペプチドと融合されてよい。かかる融合体の例は、当業者に周知である。同様に、前記ポリペプチドは、オリゴヒスチジンタグ、例えばHis6などと融合されてよく、或いは抗体により認識されるエピトープ、例えば、周知のMycタグエピトープなどと融合されてよい。前記ポリペプチドの任意のバリアント又は誘導体との融合体もまた、本発明の範囲に含まれる。所望の特性を保持する、例えばTG2への結合特異性を有する融合体（又はそのバリアント若しくは誘導体）が好ましいことが理解されよう。
【００４９】
融合体は、所望の特徴を前記ポリペプチドに付与する更なる部分を含んでよく、或いは当該部分からなってよい；例えば、当該部分は、ポリペプチドを検出若しくは単離する、又はポリペプチドの細胞内取り込みを促進するのに有用であってよい。当該部分は、例えば、当業者に周知であるように、ビオチン部分（moiety）、放射性部分、蛍光部分、例えば、低分子フルオロフォア（small fluorophore）又は緑色蛍光タンパク質（GFP）フルオロフォアであってよい。当該部分は、当業者に公知であるように、免疫原性タグ、例えばMycタグであってよく、或いは当業者に公知であるように、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進することができる親油性分子又はポリペプチドドメインであってよい。
【００５０】
前記ポリペプチドの「バリアント」とは、1以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換（保存的又は非保存的のいずれか）が存在するポリペプチドを意味するが、ただし、かかる変化は、タンパク質の基本的特性、例えば、結合特性、熱安定性、特定のpH範囲における活性（pH安定性）などが有意に変化しないタンパク質をもたらすものである。この文脈における「有意に」とは、バリアントの特性が、元のタンパク質の特性と比較して、依然異なってよいものの不明瞭なものではないと当業者が言うことを意味する。従って、我々は、ポリペプチドのバリアントであって、かかる変化が前記ポリペプチドの活性を実質的に変化させないものも含める。特に、我々は、ポリペプチドのバリアントであって、かかる変化がTG2に対する結合特異性を実質的に変化させないものを含める。
【００５１】
「保存的置換」とは、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及びPhe、Tyrなどの組み合わせを意図する。
【００５２】
かかるバリアントは、タンパク質工学の方法及び部位特異的突然変異誘発法を用いて作製されてよい。
【００５３】
ポリペプチドバリアントは、本明細書で示すアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも75％の同一性、例えば、本明細書で特定するアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を有してよい。
【００５４】
2つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのGAPプログラムなどの適したコンピュータープログラムを用いて決定されてよく、同一性％は、配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されることが理解されよう。
【００５５】
或いは、アライメントは、Clustal Wプログラム（Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res. 22：4673-4680（参照により本明細書に援用される）に記載されるように）を用いて実施されてよい。
【００５６】
使用されるパラメータは以下のようなものであってよい：
-  Fastペアワイズ・アライメント・パラメータ：K-タップル（ワード）サイズ；1、ウィンドウサイズ；5、ギャップ・ペナルティ；3、トップダイアゴナル数；5。スコアリング法：x％。
-  マルチプル・アライメント・パラメータ：ギャップ・オープン・ペナルティ；10、ギャップ・エクステンション・ペナルティ；0.05。
-  スコアリング・マトリックス：BLOSUM。
【００５７】
或いは、BESTFITプログラムを用いて、局所配列アライメントを決定してよい。
【００５８】
本発明の方法又は使用で使用される抗体、抗原結合フラグメント、バリアント、融合体又は誘導体は、修飾又は誘導体化されている1つ以上のアミノ酸を含むか、又は該アミノ酸からなってよい。
【００５９】
1つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基（functional side group）との反応によって達成されてよい。かかる誘導化分子は、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化されて、アミンヒドロクロリド、p-トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するそうした分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル及びヒドラジドを形成してよい。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成してよい。また、化学的誘導体として、20の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むそうしたペプチドも含まれる。例えば：4-ヒドロキシプロリンはプロリンと置換されてよく；5-ヒドロキシリジンはリジンと置換されてよく；3-メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよく；ホモセリンはセリンと、オルニチンはリジンと置換されてよい。誘導体にはまた、必須活性が維持される限り、1つ以上の付加又は欠失を含むペプチドが含まれる。他に含まれる修飾には、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンと共に）、及び同様の末端修飾がある。
【００６０】
更に、ペプチド模倣化合物（peptidomimetic compounds）もまた有用であってよいことが当業者に理解されるだろう。従って、「ポリペプチド」とは、TG2コア領域内のエピトープと結合することができるペプチド模倣化合物を含む。用語「ペプチド模倣薬（peptidomimetic）」とは、治療剤として、特定のペプチドのコンフォメーション及び望ましい特徴を模倣する化合物をいう。
【００６１】
例えば、前記ポリペプチドは、アミノ酸残基がその中でペプチド（-CO-NH-）結合により連結している分子だけでなく、ペプチド結合がその中で反転している分子をも含む。かかるレトロ-インベルソペプチド模倣薬（retro-inverso peptidomimetics）は、当分野で公知の方法、例えば、Meziere et al.（1997）J. Immunol. 159, 3230-3237（参照により本明細書に援用される）に記載の方法などを用いて作製されてよい。このアプローチは、主鎖が関与する変化を含み、且つ側鎖の配向性に関係しない擬ペプチド（pseudo-peptides）を作製することを伴う。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含有するレトロ-インバースペプチド（retro-inverse peptides）は、タンパク質分解に対して遥かに抵抗性がある。或いは、前記ポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸残基が、通常のアミド結合の代わりに-y（CH2NH）-結合によって結合する、ペプチド模倣化合物であってもよい。
【００６２】
更にほかでは、アミノ酸残基の炭素原子間に間隔（spacing）を維持する適切なリンカー部分（linker moiety）を使用するならば、ペプチド結合は全くなくてもよく；リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布を有し、且つ実質的に同じ平面性を有することが有利であってよい。
【００６３】
前記ポリペプチドは、好都合には、外部タンパク質分解消化に対する感受性を減少させるのに役立つように、N末端又はC末端でブロックされてもよいことが理解されるだろう。
【００６４】
D-アミノ酸及びN-メチルアミノ酸などの種々の非コード化又は修飾アミノ酸はまた、哺乳動物ペプチドを修飾するのに使用されている。加えて、推定される生物活性コンフォメーションは、環化などの共有結合修飾によって、又はラクタムの取込み若しくは他のタイプの架橋によって安定化されてよく、例えば、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：2636及びThursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111：166（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００６５】
多くの合成ストラテジーの中で共通のテーマは、ペプチドベース骨格へのある種の環状部分（cyclic moiety）の導入である。環状部分はペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、これにより、特定の生物学的レセプターに対するペプチド特異性の増加が高頻度でもたらされる。このストラテジーの別の利点は、ペプチドへの環状部分の導入によってまた、細胞ペプチダーゼに対し感受性が低下したペプチドがもたらされ得ることである。
【００６６】
従って、本発明の方法及び使用に有用な例示的ポリペプチドは、末端システインアミノ酸を含むか、又は該アミノ酸からなる。かかるポリペプチドは、末端システインアミノ酸中のメルカプチド基のジスルフィド結合形成によるヘテロデチック（heterodetic）環状形態、又は末端アミノ酸間のアミドペプチド結合形成によるホモデチック（homodetic）形態で存在してよい。上記に示した通り、N-及びC-末端のシステイン間でのジスルフィド又はアミド結合を介した小分子ペプチドの環化は、タンパク質分解を減少させ、また構造剛性（rigidity）を増加させる（これにより、より高い特異性化合物が生じ得る）ことにより、直鎖ペプチド（linear peptides）でときどき観察される特異性及び半減期の問題を回避し得る。ジスルフィド結合によって環化したポリペプチドは、タンパク質分解（proteolytic degradation）に依然として感受性を有し得る遊離アミノ及びカルボキシ末端を有し、一方、N末端アミンとC末端カルボキシル間のアミド結合の形成により環化したペプチドは、従って、もはや遊離アミノ又はカルボキシ末端を含まない。すなわち、当該ペプチドは、C-N結合か又はジスルフィド結合のいずれかによって連結され得る。
【００６７】
本発明は、ペプチドの環化方法によって決して限定されるものではなく、その環状構造が、任意の適した合成方法によって達成されてよいペプチドも包含する。従って、ヘテロデチック結合は、ジスルフィド、アルキレン又はスルフィド架橋を介する形成を含んでよいが、これらに限定されない。ジスルフィド、スルフィド及びアルキレン架橋を含む、環状ホモデチックペプチド及び環状ヘテロデチックペプチドの合成方法は、米国特許第5,643,872号（参照により本明細書に援用される）に開示されている。環化方法の他の例は、米国特許第6,008,058号（参照により本明細書に援用される）で述べられ、開示されている。
【００６８】
環状安定化ペプチド模倣化合物の合成の更なるアプローチは、閉環メタセシス（RCM）である。この方法は、ペプチド前駆体を合成する工程、及びそれをRCM触媒と接触させてコンフォメーションが制限されたペプチドを生じさせる工程を伴う。適したペプチド前駆体は、2つ以上の不飽和C-C結合を含有してよい。この方法は、固相ペプチド合成技術を用いて実施してよい。この実施態様では、固体支持体に固定した前駆体をRCM触媒と接触させ、次いで生成物を固体支持体から切断してコンフォメーションが制限されたペプチドを生成する。
【００６９】
D. H. Rich in Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier（1986）（参照により本明細書に援用される）により開示される別のアプローチは、酵素阻害剤設計における遷移状態アナログ・コンセプトの適用によって、ペプチド模倣体（peptide mimic）を設計することである。例えば、スタリン（staline）の第二級アルコールが、ペプシン基質の切断しやすいアミド結合の4面体遷移状態を模倣することが知られている。
【００７０】
要約すれば、周知の通り、末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を低下させ、それ故、溶液中、特にプロテアーゼが存在し得る生体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチド環化はまた、環化によって形成される安定な構造のために、そして環状ペプチドの場合に観察される生物学的活性を考慮すると、有用な修飾である。
【００７１】
従って、一実施態様において、前記ポリペプチドは環状である。しかしながら、代替的実施態様において、前記ポリペプチドは直鎖状（linear）である。
【００７２】
「TG2のコア領域内のエピトープと選択的に結合する」とは、TG2コア領域中のエピトープと選択的に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。「選択的に結合することができる」には、他のタンパク質よりも、TG2コアと少なくとも10倍、より強力に、例えば、少なくとも50倍、より強力に、又は少なくとも100倍、より強力に結合する、かかる抗体由来の結合部分（binding moiety）を含む。結合部分は、生理学的条件下、例えばin vivoにて、TG2コア中のエピトープと選択的に結合することができてよい。
【００７３】
かかる結合特異性は、当分野で周知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫組織化学、免疫沈降、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリー（TG2若しくはTG2コア又はそのフラグメントを発現するトランスフェクト細胞を用いて）などにより決定されてよい。相対的結合強度を測定するための適した方法は、イムノアッセイ、例えば、結合部分が抗体であるイムノアッセイ（Harlow & Lane, “Antibodies：A Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York（参照により本明細書に援用される）を参照）を含む。或いは、結合は、競合アッセイを用いるか、又はBiacore（登録商標）分析（Biacore International AB, Sweden）を用いて評価してよい。
【００７４】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、TG2と独占的に結合することが好ましい。
【００７５】
抗体又はその抗原結合フラグメントの結合特異性は、構成重鎖及び軽鎖の可変領域内の相補性決定領域（CDR）の存在により与えられることが当業者に理解されるだろう。以下に記載するように、本明細書で定義する抗体及びその抗原結合フラグメントの特に好ましい実施態様において、TG2に対する結合特異性は、同定する1つ以上のCDRの存在により与えられる。例えば、AB-1 VL及びVHのCDR配列を含むか又は該配列からなってよい配列は、KASQDINSYLT、RTNRLFD、LQYDDFPYT、SSAMS、TISVGGGKTYYPDSVKG及びLISLYを含む。更なる例として、BB-7 VL及びVHのCDR配列を含むか又は該配列からなってよい配列は、KASQDINSYLT、LTNRLMD、LQYVDFPYT、SSAMS、TISSGGRSTYYPDSVKG及びLISPYを含む。DC-1 VL及びVHのCDR配列を含むか又は該配列からなってよい配列は、KASQDINSYLT、LVNRLVD、LQYDDFPYT、THAMS、TISSGGRSTYYPDSVKG及びLISTYを含む。本明細書で定義する抗体及びその抗原結合フラグメントは、表24Aで定義するように、CDR配列、又はCDR及びフランキング配列を含むか又は該配列からなることが好ましい。本明細書で定義する抗体及びその抗原結合フラグメントは、例示的抗体AB-1若しくはBB-7若しくはDC-1のCDR配列、又はCDR及びフランキング配列を含むか又は該配列からなることが最も好ましい（例えば、表24Aで定義するとおり）。
【００７６】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、元の抗体のTG2に対する結合特異性を保持することが好ましい。「結合特異性を保持する」とは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、本発明の例示的抗体、例えば、AB-1、AG-1、AG-9、AH-1、AH-3、BB-7、DC-1、EH-6、JE-12、IA-12、DF-4、DH-2、DD-6及び／又はDD-9（添付の実施例を参照）などとTG2への結合を競合することができることを意味する。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の配列を含む抗体と同じTG2エピトープに結合してよい：KASQDINSYLT、RTNRLFD、LQYDDFPYT、SSAMS、TISVGGGKTYYPDSVKG及びLISLY。
【００７７】
「エピトープ」とは、本明細書において、抗体が結合する分子の部位、すなわち、抗原の分子領域を意味することを意図する。エピトープは、例えば抗原のアミノ酸配列、すなわち一次構造によって決定される直鎖状エピトープであってよく、或いは抗原の二次構造（例えば、ベータシート又はアルファヘリックスへのペプチド鎖のフォールディングなど）又は三次構造（例えば、ヘリックス又はシートがフォールディング又は配置されて、三次元構造をもたらす方法など）によって定義される三次元的エピトープであってよい。
【００７８】
試験抗体が、第二の抗体と結合を競合することができるかどうかを決定するための方法は、当分野で周知であり（例えば、サンドウィッチELISA又はリバースサンドウィッチELISA技術など）、例えば、Antibodies：A Laboratory Manual, Harlow & Lane（1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2）（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００７９】
TG2コア領域中のエピトープに対し結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、元の抗体（例えば、実施例で提供する例示的抗体など）と同じ生物学的特性を1つ以上保持してよい。
【００８０】
上記で説明するように、TG2は、リジンとグルタミン残基との間のNε-（γ-グルタミル）リジン イソペプチド結合の形成を触媒する、カルシウム依存性多機能タンパク質である。TG2は、結合部位（例えば、フィブロネクチン）と酵素輸送に必要な配列とを含むN末端ベータサンドウィッチドメインを含む。これは、触媒コアドメインと連結する。当該ドメインの中心は、Cys 277、Asp 358及びHis 355からなる触媒三残基と、それに加えて複数の推定カルシウム結合部位（putative calcium binding sites）である。これは、第三のドメインであるベータバレル1（GTP結合部位が存在し、GTPase活性を有する酵素を運ぶ）と連結する。ベータバレル1はまた、細胞接着に使用されるインテグリン結合部位も含む。ベータバレル1は第四のTG2ドメインであるベータバレル2とともに、活性化に必要なTG2の立体構造変化に関与する。高カルシウム、低GTP環境では、バレル1及び2は、閉じてフォールディングされた不活性型から降りて、直鎖構造を有するTG2を運び、触媒コアを開いて活性化を可能にする（Pinkas et al（2007）PLoS Biol. Transglutaminase 2 undergoes a large conformational change upon activation. 5（12）：e327）。
【００８１】
「2型トランスグルタミナーゼ（TG2）のコア領域」とは、ベータサンドウィッチドメインとベータバレル1及び2とを除く、上記触媒三残基を含むTG2領域を含む。好ましくは、コア領域は、ヒトTG2のアミノ酸143〜473又はそのフラグメントを含むか又はそれからなる。
【００８２】
ヒトTG2のアミノ酸143〜473は、下記配列からなる：
【００８３】
【化７】
0006411998.tif 000008
【００８４】
従って、本発明の一実施態様において、コア領域は、ヒトTG2のアミノ酸143〜473からなってよい。従って、この実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ヒトTG2のアミノ酸143〜473により定義される領域内の任意のエピトープであり得る。従って、エピトープは、この配列のフラグメントであってよく、或いは当業者に理解されるように、一次アミノ酸構造では互いに隣接していないが、タンパク質の二次、三次又はさらには四次構造においては互いに局在し得る、このフラグメント内の様々なアミノ酸残基で構成され得る。
【００８５】
本発明の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトTG2のアミノ酸304〜326を含む領域と全体又は一部において選択的に結合してよい。この領域（ヒトTG2のアミノ酸304〜326）は、図5ではGroup 1と称され、アミノ酸配列AHDQNSNLLIEYFRNEFGEIQGDを含む。
【００８６】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトTG2のアミノ酸351〜365を含む領域と全体又は一部において選択的に結合してよい。この領域（ヒトTG2のアミノ酸351〜365）は、図5ではGroup 2と称され、アミノ酸配列YEGWQALDPTPQEKSを含む。
【００８７】
本発明のなお更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトTG2のアミノ酸450〜467を含む領域と全体又は一部において選択的に結合してよい。この領域（ヒトTG2のアミノ酸450〜467）は、図5ではGroup 3と称され、アミノ酸配列SEEREAFTRANHLNKLAEを含む。
【００８８】
本発明のいずれかの側面の好ましい実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、TG2活性、例えばヒトTG2活性を阻害する。
【００８９】
本発明の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
KASQDINSYLT；及び／又は
RTNRLFD；及び／又は
LQYDDFPYT；及び／又は
SSAMS；及び／又は
TISVGGGKTYYPDSVKG；及び／又は
LISLY。
【００９０】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
TCKASQDINSYLTWF；及び／又は
TLIYRTNRLFDGVP若しくはTLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF；及び／又は
YCLQYDDFPYTFG；及び／又は
FTLSSSAMSWVR若しくはCXAXXFTLSSSAMSWVR；及び／又は
WVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR若しくはWVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL；及び／又は
YCAKLISLYWG
（式中、Xは任意のアミノ酸である）。
【００９１】
直前の実施態様の配列は、例示的抗体AB-1（実施例1参照）、及びAB-1抗体のある特定のヒト化バリアントの軽鎖及び重鎖可変領域の相補性決定領域を含むと考えられる。更なる実施態様において、抗体は、アミノ酸配列
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXRTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT；又は
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF；又は
RTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXF；又は
FXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【００９２】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
TCKASQDINSYLTWF若しくはTCKASQDINSYLTWY；及び／又は
LLIYRTNRLFDGVP若しくはSLIYRTNRLFDGVP若しくはLLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF若しくはSLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF；及び／又は
YCLQYDDFPYTFG；及び／又は
FTFSSSAMSWVR若しくはCXAXXFTFSSSAMSWVR；及び／又は
WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR若しくは
WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL；及び／又は
YCAKLISLYWG
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【００９３】
従って、一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：KASQDINSYLT；及びRTNRLFD；及びLQYDDFPYT。
【００９４】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：SSAMS；及びTISVGGGKTYYPDSVKG；及びLISLY。
【００９５】
本発明の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【００９６】
【化８】
0006411998.tif 000009
【００９７】
又は
【００９８】
【化９】
0006411998.tif 000010
【００９９】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。これらの軽鎖可変領域は、例示的抗体AB-1で見られるものと一致する（図7及び18）。
【０１００】
或いは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列：
【０１０１】
【化１０】
0006411998.tif 000011
【０１０２】
又は
【０１０３】
【化１１】
0006411998.tif 000012
【０１０４】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。
【０１０５】
特に好ましい実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列：
【０１０６】
【化１２】
0006411998.tif 000013
【０１０７】
又は
【０１０８】
【化１３】
0006411998.tif 000014
【０１０９】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。これらの配列は、上記で提供するAB-1軽鎖配列のヒト化バリアントである。
【０１１０】
本発明の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列：
【０１１１】
【化１４】
0006411998.tif 000015
【０１１２】
又は
【０１１３】
【化１５】
0006411998.tif 000016
【０１１４】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。これらの重鎖可変領域は、例示的抗体AB-1で見られるものと一致する（図7及び18）。
【０１１５】
或いは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列：
【０１１６】
【化１６】
0006411998.tif 000017
【０１１７】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。
【０１１８】
特に好ましい実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列：
【０１１９】
【化１７】
0006411998.tif 000018
【０１２０】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この配列は、上記で提供するAB-1重鎖配列のヒト化バリアントである。
【０１２１】
従って、一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）アミノ酸配列
【０１２２】
【化１８】
0006411998.tif 000019
【０１２３】
又は
【０１２４】
【化１９】
0006411998.tif 000020
【０１２５】
又は
【０１２６】
【化２０】
0006411998.tif 000021
【０１２７】
又は
【０１２８】
【化２１】
0006411998.tif 000022
【０１２９】
又は
【０１３０】
【化２２】
0006411998.tif 000023
【０１３１】
又は
【０１３２】
【化２３】
0006411998.tif 000024
【０１３３】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び
ii）アミノ酸配列
【０１３４】
【化２４】
0006411998.tif 000025
【０１３５】
又は
【０１３６】
【化２５】
0006411998.tif 000026
【０１３７】
又は
【０１３８】
【化２６】
0006411998.tif 000027
【０１３９】
又は
【０１４０】
【化２７】
0006411998.tif 000028
【０１４１】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。
【０１４２】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
KASQDINSYLT；及び／又は
LTNRLMD；及び／又は
LQYVDFPYT；及び／又は
SSAMS；及び／又は
TISSGGRSTYYPDSVKG；及び／又は
LISPY。
【０１４３】
直前の実施態様の配列は、例示的抗体BB-7（図19参照）の軽鎖及び重鎖可変領域の相補性決定領域を含むと考えられる。更なる実施態様において、抗体は、アミノ酸配列
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXLTNRLMDXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXXXXXXXXXLQYVDFPYT；又は
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF；又は
LTNRLMDXXXXXXXXXXXXXXF；又は
FXXXXXXXXXXXXXXXXXLQYVDFPYT
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【０１４４】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：KASQDINSYLT；及びLTNRLMD；及びLQYVDFPYT。
【０１４５】
本発明のいずれかの側面の更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：SSAMS；及びTISSGGRSTYYPDSVKG；及びLISPY。
【０１４６】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１４７】
【化２８】
0006411998.tif 000029
【０１４８】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この軽鎖可変領域は、例示的抗体BB-7で見られるものと一致する（図19）。
【０１４９】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１５０】
【化２９】
0006411998.tif 000030
【０１５１】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この重鎖可変領域は、例示的抗体BB-7で見られるものと一致する（図19）。
【０１５２】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）アミノ酸配列
【０１５３】
【化３０】
0006411998.tif 000031
【０１５４】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び
ii）アミノ酸配列
【０１５５】
【化３１】
0006411998.tif 000032
【０１５６】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。
【０１５７】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが更に想定される：
i）アミノ酸配列
【０１５８】
【化３２】
0006411998.tif 000033
【０１５９】
又は
【０１６０】
【化３３】
0006411998.tif 000034
【０１６１】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び／又は
ii）アミノ酸配列
【０１６２】
【化３４】
0006411998.tif 000035
【０１６３】
又は
【０１６４】
【化３５】
0006411998.tif 000036
【０１６５】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。これらの配列は、抗体BB-7のヒト化バリアントと一致する（表23、24及び24A参照）。
【０１６６】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
KASQDINSYLT；及び／又は
LVNRLVD；及び／又は
LQYDDFPYT及び／又は
THAMS；及び／又は
TISSGGRSTYYPDSVKG；及び／又は
LISTY。
【０１６７】
直前の実施態様の配列は、例示的抗体DC-1（図20参照）の軽鎖及び重鎖可変領域の相補性決定領域を含むと考えられる。更なる実施態様において、抗体は、アミノ酸配列
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXLVNRLVDXXXXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT、又は
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXA；又は
LVNRLVDXXXXXXXXXXXXXXXA；又は
AXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【０１６８】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：KASQDINSYLT；及びLVNRLVD；及びLQYDDFPYT。
【０１６９】
本発明のいずれかの側面の更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：THAMS；及びTISSGGRSTYYPDSVKG；及びLISTY。
【０１７０】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１７１】
【化３６】
0006411998.tif 000037
【０１７２】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この軽鎖可変領域は、例示的抗体DC-1で見られるものと一致する（図20）。
【０１７３】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１７４】
【化３７】
0006411998.tif 000038
【０１７５】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この重鎖可変領域は、例示的抗体DC-1で見られるものと一致する（図20）。
【０１７６】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）アミノ酸配列
【０１７７】
【化３８】
0006411998.tif 000039
【０１７８】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び
ii）アミノ酸配列
【０１７９】
【化３９】
0006411998.tif 000040
【０１８０】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。
【０１８１】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが更に想定される：
i）アミノ酸配列
【０１８２】
【化４０】
0006411998.tif 000041
【０１８３】
又は
【０１８４】
【化４１】
0006411998.tif 000042
【０１８５】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び／又は
ii）アミノ酸配列
【０１８６】
【化４２】
0006411998.tif 000043
【０１８７】
又は
【０１８８】
【化４３】
0006411998.tif 000044
【０１８９】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。これらの配列は、表23、24及び24Aで提供するDC-1のヒト化バリアントと一致する。
【０１９０】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
KASQDINSYLT；及び／又は
XXNRLXD；及び／又は
LQYXDFPYT；及び／又は
XXAMS；及び／又は
TISXGGXXTYYPDSVKG；及び／又は
LISXY
（式中、Xは任意のアミノ酸である）。
【０１９１】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
（K/Q/R）ASQ（D/G）I（N/S/R）（S/N）YL（T/N/A）；及び／又は
（R/L/V/D/A）（T/V/A）（N/S）（R/N）L（F/M/V/E/Q）（D/T/S）；及び／又は
（L/Q）Q（Y/H）（D/V/N）（D/T）（F/Y）P（Y/L/W）T；及び／又は
（S/T）（S/H/Y）AMS；及び／又は
（T/A）IS（V/S/G）（G/S）G（G/R）（K/S）TYY（P/A）DSVKG；及び／又は
（L/D）（I/G）（S/G）（L/P/T/V）Y。
【０１９２】
本発明のいずれかの側面の更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１９３】
【化４４】
0006411998.tif 000045
【０１９４】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この軽鎖可変領域は、例示的抗体DD-9で見られるものと一致する（図25）。
【０１９５】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０１９６】
【化４５】
0006411998.tif 000046
【０１９７】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この重鎖可変領域は、例示的抗体DD-9で見られるものと一致する（図25）。
【０１９８】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）アミノ酸配列
【０１９９】
【化４６】
0006411998.tif 000047
【０２００】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び
ii）アミノ酸配列
【０２０１】
【化４７】
0006411998.tif 000048
【０２０２】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。
【０２０３】
本発明のいずれかの側面の更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０２０４】
【化４８】
0006411998.tif 000049
【０２０５】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この軽鎖可変領域は、例示的抗体DH-2で見られるものと一致する（図26）。
【０２０６】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０２０７】
【化４９】
0006411998.tif 000050
【０２０８】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。この重鎖可変領域は、例示的抗体DH-2で見られるものと一致する（図26）。
【０２０９】
従って、本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）アミノ酸配列
【０２１０】
【化５０】
0006411998.tif 000051
【０２１１】
を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び
ii）アミノ酸配列
【０２１２】
【化５１】
0006411998.tif 000052
【０２１３】
を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ。
【０２１４】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を有してよいことが想定される：
i）図18〜28のいずれかで提供されるVK配列のいずれかと一致するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の少なくとも1つ；及び／又は
ii）図18〜28のいずれかで提供されるVH配列のいずれかと一致するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の少なくとも1つ、
又はそのフラグメント、バリアント若しくは誘導体。
【０２１５】
上記に示すように、先の実施態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、上記で示すアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも75％の同一性、例えば、上記で特定するアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよいことが想定される。また、抗体又は抗原結合フラグメントは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の挿入、欠失、保存的置換及び／又は非保存的置換を含んでよいことも想定される。
【０２１６】
第二の側面において、本発明は、下記アミノ酸配列の1つ以上を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
KASQDINSYLT；及び／又は
XXNRLXD；及び／又は
LQYXDFPYT；及び／又は
XXAMS；及び／又は
TISXGGXXTYYPDSVKG；及び／又は
LISXY
（式中、Xは任意のアミノ酸である）。
【０２１７】
一実施態様において、本発明は、下記アミノ酸配列の1つ以上を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（K/Q/R）ASQ（D/G）I（N/S/R）（S/N）YL（T/N/A）；及び／又は
（R/L/V/D/A）（T/V/A）（N/S）（R/N）L（F/M/V/E/Q）（D/T/S）；及び／又は
（L/Q）Q（Y/H）（D/V/N）（D/T）（F/Y）P（Y/L/W）T；及び／又は
（S/T）（S/H/Y）AMS；及び／又は
（T/A）IS（V/S/G）（G/S）G（G/R）（K/S）TYY（P/A）DSVKG；及び／又は
（L/D）（I/G）（S/G）（L/P/T/V）Y。
【０２１８】
一実施態様において、本発明は、下記アミノ酸配列の1つ以上を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
KASQDINSYLT；及び／又は
RTNRLFD；及び／又は
LQYDDFPYT；及び／又は
SSAMS；及び／又は
TISVGGGKTYYPDSVKG；及び／又は
LISLY。
【０２１９】
一実施態様において、第二の側面の抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記アミノ酸配列の1つ以上を含んでよい：
TCKASQDINSYLTWF；及び／又は
TLIYRTNRLFDGVP、若しくはTLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF；及び／又は
YCLQYDDFPYTFG；及び／又は
FTLSSSAMSWVR、若しくはCXAXXFTLSSSAMSWVR；及び／又は
WVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR、若しくは
WVATISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL；及び／又は
YCAKLISLYWG
（式中、Xは任意のアミノ酸である）。
【０２２０】
先の実施態様の配列は、例示的抗体AB-1の軽鎖及び重鎖可変領域の相補性決定領域を含むと考えられる。
【０２２１】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXRTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXFXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT；又は
KASQDINSYLTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXF；又は
RTNRLFDXXXXXXXXXXXXXXXF；又は
FXXXXXXXXXXXXXXXXLQYDDFPYT
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【０２２２】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
TCKASQDINSYLTWF、若しくはTCKASQDINSYLTWY；及び／又は
LLIYRTNRLFDGVP、若しくはSLIYRTNRLFDGVP、若しくはLLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF、若しくはSLIYRTNRLFDGVPXXFSGSGSGQDFF；及び／又は
YCLQYDDFPYTFG；及び／又は
FTFSSSAMSWVR、若しくはCXAXXFTFSSSAMSWVR；及び／又は
WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISR、若しくは
WVSTISVGGGKTYYPDSVKGRFTISRXNXXXXL；及び／又は
YCAKLISLYWG
（式中、Xは任意のアミノ酸である）
を含んでよい。
【０２２３】
従って、一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記CDRを含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：KASQDINSYLT；及びRTNRLFD；及びLQYDDFPYT。
【０２２４】
更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記CDRを含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい：SSAMS；及びTISVGGGKTYYPDSVKG；及びLISLY。
【０２２５】
更なる実施態様において、第二の側面の抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０２２６】
【化５２】
0006411998.tif 000053
【０２２７】
又は
【０２２８】
【化５３】
0006411998.tif 000054
【０２２９】
又は
【０２３０】
【化５４】
0006411998.tif 000055
【０２３１】
又は
【０２３２】
【化５５】
0006411998.tif 000056
【０２３３】
又は
【０２３４】
【化５６】
0006411998.tif 000057
【０２３５】
又は
【０２３６】
【化５７】
0006411998.tif 000058
【０２３７】
を含む軽鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。
【０２３８】
第二の側面のなお更なる実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列
【０２３９】
【化５８】
0006411998.tif 000059
【０２４０】
又は
【０２４１】
【化５９】
0006411998.tif 000060
【０２４２】
又は
【０２４３】
【化６０】
0006411998.tif 000061
【０２４４】
又は
【０２４５】
【化６１】
0006411998.tif 000062
【０２４６】
を含む重鎖可変領域を少なくとも1つ有してよい。
【０２４７】
本発明はまた、第二の側面で具体化されるような軽鎖可変領域の少なくとも1つと、第二の側面で具体化されるような重鎖可変領域の少なくとも1つとを有する抗体又はその抗原結合フラグメントも提供する。
【０２４８】
疑義を回避するために、第二の側面の抗体又はその抗原結合フラグメントは、第一の側面と関連して提供される任意のアミノ酸配列を含んでよい。従って、第二の側面の抗体又はその抗原結合フラグメントは、図18〜28、又は表14〜24及び24Aのいずれかに例示されるような任意のVK及び／若しくはVK領域、又はその任意のバリアント、フラグメント若しくは誘導体を含んでよい。
【０２４９】
さらに、本発明のいずれかの側面の抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の任意のヒト化又はキメラ抗体であるか又はそれを含んでよく、特に、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表14〜24及び24Aで提供される配列のいずれかを含むか又はそれからなってよい。
【０２５０】
第二の側面及び関連する実施態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、上記で示すアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも75％の同一性、例えば、上記で特定するアミノ酸配列の1つ以上と少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよいことが想定される。また、抗体又は抗原結合フラグメントは、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の挿入、欠失、保存的置換及び／又は非保存的置換を含んでよいことも想定される。
【０２５１】
本発明のいずれかの側面の好ましい実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、インタクト抗体を含むか又は該抗体からなってよい。或いは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、インタクト抗体から実質的になってよい。「実質的になる（consist essentially of）」とは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、TG2に対する結合特異性を呈するのに十分な、インタクト抗体の一部からなることを意味する。
【０２５２】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、天然に存在しない抗体であってよい。当然ながら、抗体が天然に存在する抗体であれば、それは、単離された形態（すなわち、天然で見られるものとは異なる）で提供される。
【０２５３】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか又は該フラグメントからなってよい：Fvフラグメント；Fabフラグメント；及びFab様（Fab-like）フラグメント。更なる実施態様において、Fvフラグメントは、一本鎖Fvフラグメント又はジスルフィド結合Fvフラグメントであってよい。なお更なる実施態様において、Fab様フラグメントは、Fab’フラグメント又はF（ab）2フラグメントであってよい。
【０２５４】
抗体の可変重鎖（VH）及び可変軽鎖（VL）ドメインは抗原認識に関与し、この事実は初期のプロテアーゼ消化実験によって初めて認識された。さらなる確認は、齧歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。齧歯類起源の可変ドメインを、生成した抗体が齧歯類の元となる抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト起源の定常ドメインと融合してよい（Morrison et al（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855）。
【０２５５】
抗原特異性は可変ドメインによって与えられ、定常ドメインとは独立なものであり、このことは、全てが1つ以上の可変ドメインを含む抗体フラグメントの細菌発現を伴う実験から公知である。これらの分子は、Fab様分子（Better et al（1988）Science 240, 1041）；Fv分子（Skerra et al（1988）Science 240, 1038）；VH及びVLパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合した一本鎖Fv（ScFv）分子（Bird et al（1988）Science 242, 423；Huston et al（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879）、及び単離されたVドメインを含むか又は該ドメインからなる単一ドメイン抗体（dAb）（Ward et al（1989）Nature 341, 544）を含む。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的なレビューは、Winter & Milstein（1991）Nature 349, 293-299に見出される。
【０２５６】
従って、「抗原結合フラグメント」とは、TG2と結合することができる、抗体の機能性フラグメントを含む。
【０２５７】
例となる抗原結合フラグメントは、Fvフラグメント（例えば、一本鎖Fv及びジスルフィド結合Fvなど）及びFab様フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、及びF（ab）2フラグメントなど）からなる群から選択されてよい。
【０２５８】
本発明の一実施態様において、抗原結合フラグメントはscFvである。
【０２５９】
抗体全体よりも抗体フラグメントを使用する利点は、数倍存在する。当該フラグメントのより小さなサイズは、固形組織の良好な浸透など、改良された薬理学的特性を導き得る。さらに、Fab、Fv、ScFv及びdAb抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントは、E. coliで発現でき、且つそれから分泌され得、かくして大量の前記フラグメントの容易な生産が可能である。
【０２６０】
抗体及びその抗原結合フラグメントの改変（modified）されたバージョン、例えば、ポリエチレングリコール又は他の適したポリマーの共有結合により改変されたバージョンもまた本発明の範囲内に含まれる。
【０２６１】
抗体又はその抗原結合フラグメントは組換え分子であることが特に好ましい。
【０２６２】
抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は当分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のin vivo産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86：3833-3837；Winter et al., 1991, Nature 349：293-299）、又は培養細胞株によるモノクローナル抗体分子の生成を使用するいくつかの方法のうちのいずれか1つにより生成されてよい。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン・バーウイルス（EBV）-ハイブリドーマ技術（Kohler et al., 1975. Nature 256：4950497；Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81：31-42；Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：2026-2030；Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62：109-120）を含むが、これらに限定されない。
【０２６３】
好都合には、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントであって、該抗体が組換え抗体である（すなわち、組換え手段により生成される）ものを提供する。
【０２６４】
本発明のいずれかの側面の特に好ましい実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であってよい。
【０２６５】
選択された抗原に対する適したモノクローナル抗体は、公知技術、例えば「Monoclonal Antibodies：A manual of techniques」、H Zola (CRC Press、1988）及び「Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications」、J G R Hurrell (CRC Press、1982）（参照により本明細書に援用される）に開示されるものなどにより調製されてよい。本発明の例となるモノクローナル抗体、及びそれらを製造するたの適した方法は、以下の実施例で提供する。
【０２６６】
抗体フラグメントはまた、当分野で周知の方法(例えば、Harlow & Lane、1988、「Antibodies：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（参照により本明細書に援用される）を参照）を用いて得ることができる。例えば、本発明の抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解により、又はフラグメントをコードするDNAのE.coli若しくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現系）における発現により調製され得る。或いは、抗体フラグメントは、従来の方法により、抗体全体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。
【０２６７】
本発明のいずれかの側面の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又はヒト化抗体であってよい。
【０２６８】
ヒトの治療又は診断のために、ヒト化抗体が使用されてよいことが当業者に理解されるだろう。非ヒト（例えば、マウス（murine））抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する最小部分を有する、遺伝子操作されたキメラ抗体又は抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット又はウサギなどの相補性決定領域由来の残基で置き換えられている抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、移入された相補性決定領域又はフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、相補性決定領域の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体の相補性決定領域に対応し、そしてフレームワーク領域の全て又は実質的に全てが関連するヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にはヒト抗体に由来する、抗体定常領域の少なくとも一部（例えばFc領域など）も含む（例えば、Jones et al., 1986. Nature 321：522-525；Riechmann et al., 1988, Nature 332：323-329；Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2：593-596（参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２６９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（しばしば移入残基（imported residue）と称される）は、典型的には移入された可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、記載されるように（例えば、Jones et al., 1986, Nature 321：522-525；Reichmann et al., 1988. Nature 332：323-327；Verhoeyen et al., 1988, Science 239：1534-1536l；米国特許第4,816,567号（参照により本明細書に援用される）を参照）、ヒト相補性決定領域を、対応する齧歯動物の相補性決定領域と置き換えることにより実施され得る。従って、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり、ここで、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種からの対応する配列で置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域残基及び場合によりいくつかのフレームワーク残基が、齧歯動物抗体における類縁部位由来の残基で置き換えられているヒト抗体であってよい。
【０２７０】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当分野で公知の様々な技術を用いて同定され得る（例えば、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227：381；Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222：581；Cole et al., 1985, In：Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77；Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147：86-95, Soderlind et al., 2000, Nat Biotechnol 18：852-6及び国際公開第98/32845号（参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２７１】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」には、標準的な20個の遺伝的にコードされたアミノ酸及びそれらの対応する「D」型立体異性体（天然の「L」型と比較して）、オメガアミノ酸、他の天然に存在するアミノ酸、非従来型のアミノ酸（例えば、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸など）、並びに化学的に誘導化されたアミノ酸が含まれる。
【０２７２】
アミノ酸が、「アラニン」又は「Ala」又は「A」など、具体的に列挙される場合、該用語は、別段明確に述べられていない限り、L-アラニンとD-アラニンの両方を意味する。他の非従来型アミノ酸もまた、所望の機能特性がポリペプチドによって保持されている限り、本発明のポリペプチドの適切な構成要素であり得る。示されるペプチドについて、各コードされるアミノ酸残基は、適宜、従来のアミノ酸の慣用名に相当する1文字表記によって表される。
【０２７３】
一実施態様において、本明細書で定義するようなポリペプチドは、L-アミノ酸を含むか又は該アミノ酸からなる。
【０２７４】
適した抗体が得られれば、例えば、ELISA、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロットなどによって、抗体の結合特異性又は生物学的活性などの活性についてそれらを試験してよい。生物学的活性は、その特定の特徴を読み取る異なるアッセイで試験してよい。
【０２７５】
更なる側面において、本発明は、第二の側面及び第二の側面の関連する実施態様に従う抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０２７６】
従って、一実施態様において、本発明は、ヌクレオチド配列：
i）
【０２７７】
【化６２】
0006411998.tif 000063
【０２７８】
及び／又は
ii）
【０２７９】
【化６３】
0006411998.tif 000064
【０２８０】
を含むか又は該配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８１】
更なる実施態様において、本発明は、図18〜28のいずれかに列挙する核酸配列のいずれかを含むか又はそれからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８２】
従って、一実施態様において、本発明は、ヌクレオチド配列：
i）
【０２８３】
【化６４】
0006411998.tif 000065
【０２８４】
及び／又は
ii）
【０２８５】
【化６５】
0006411998.tif 000066
【０２８６】
を含むか又は該配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８７】
更なる実施態様において、本発明は、ヌクレオチド配列：
i）
【０２８８】
【化６６】
0006411998.tif 000067
【０２８９】
及び／又は
ii）
【０２９０】
【化６７】
0006411998.tif 000068
【０２９１】
を含むか又は該配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９２】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、TG2活性を阻害することが好ましい。従って、本発明の抗体は、TG2酵素活性を阻害し、ひいてはそれが、Nε-（γ-グルタミル）リジン イソペプチド結合を用いてリジンとグルタミン残基を架橋するよう機能することを妨げることが好ましい。TG2の酵素活性は完全に無効化されることが好ましいが、当該阻害は、有用な治療的又は非治療的な結果を提供するのに部分的阻害で十分である場合には、この部分的阻害であってよいことが想定される。当業者ならば、阻害の程度が、所望の結果を達成するのに効果的であるかどうかを決定することができるだろう。
【０２９３】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、TG2阻害に特異的であることが好ましい。従って、抗体又はその抗原結合フラグメントは、TG1、TG3、TG13及び／又はTG7活性を阻害しないことが好ましい。TG2活性を効果的に阻害するが、TG1、TG3、TG13及び／又はTG7活性を有意に阻害しないように十分に選択的である抗体が、医学の分野で特に有用であり得ることが想定される。従って、抗体は、TG2活性を独占的に阻害することが好ましい。
【０２９４】
更なる側面において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記側面のいずれかに従う抗体がTG2（例えば、ヒトTG2）と結合した場合に、TG2（例えば、ヒトTG2）との結合が阻害される又は低下する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０２９５】
従って、本発明は、TG2の領域内のエピトープと選択的に結合し、その結果、前記側面のいずれかの抗体の結合と競合し、妨害し得る、任意の抗体を含む。
【０２９６】
更なる側面において、本発明は、前記側面のいずれかに従う抗体又はその抗原結合フラグメントと、更なる部分（further moiety）とを含む化合物を提供する。
【０２９７】
一実施態様において、更なる部分は、直接的又は間接的な細胞毒性部分（cytotoxic moiety）であってよい。
【０２９８】
「直接的な細胞毒性」とは、当該部分が、それ自体で細胞毒性を示すものであるという意味を含む。「間接的な細胞毒性」とは、当該部分が、それ自体では細胞毒性を示さないものの、例えば、更なる分子に対するその作用によって又はそれに対する更なる作用によって、細胞毒性を誘導し得るものであるという意味を含む。
【０２９９】
細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、比較的非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸、直接的若しくは間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、治療用ポリペプチドをコードする核酸分子、又は放射性原子を含む群から選択されてよいが、これらに限定されない。放射性原子は、リン-32、ヨウ素-125、ヨウ素-131、インジウム-111、レニウム-186、レニウム-188又はイットリウム-90のいずれか一つであってよいことが想定される。
【０３００】
抗癌剤などの細胞毒性化学療法剤は以下を含む：ナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤、例えば、メクロレタミン（HN2）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）及びクロラムブシル；エチレンイミン及びメチルメラミン（methylmelamines）、例えばヘキサメチルメラミン（hexamethylmelamine）、チオテパ；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（BCNU）、ロムスチン（CCNU）、セムスチン（メチル-CCNU）及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；及びトリアゼン、例えばデカルバジン（decarbazine）（DTIC；ジメチルトリアゼノイミダゾール-カルボキサミド）；葉酸アナログを含む代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート（アメトプテリン）；ピリミジンアナログ、例えば、フルオロウラシル（5-フルオロウラシル；5-FU）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；FUdR）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）；並びにプリンアナログ及び関連阻害剤、例えば、メルカプトプリン（6-メルカプトプリン；6-MP）、チオグアニン（6-チオグアニン；TG）及びペントスタチン（2’-デオキシコホルマイシン）。ビンブラスチン（VLB）及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイドを含む天然生成物；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン（マイトマイシンC）；L-アスパラギナーゼなどの酵素；及びインターフェロンアルフェノーム（alphenomes）などの生物学的応答調節物質。シスプラチン（シス-DDP）及びカルボプラチンなどの白金配位複合体を含む種々雑多な製剤（miscellaneous agent）；ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（N-メチルヒドラジン、MIH）などのメチルヒドラジン誘導体；並びにミトタン（o,p’-DDD）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤（adrenocortical suppressant）；タキソール及びアナログ／誘導体；並びにホルモン作動薬／拮抗薬、例えばフルタミド及びタモキシフェン。
【０３０１】
様々なこれらの薬剤（agent）は、予め抗体及び他の標的部位デリバリー剤に結合されており、それにより、これらの薬剤を含む本発明の化合物は、当業者によって容易に作製され得る。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション（Bauminger & Wilchek（1980）Methods Enzymol. 70, 151-159（参照により本明細書に援用される））を用いて、ドキソルビシンを含む種々の薬剤を抗体にコンジュゲートしてもよい。
【０３０２】
細胞毒性ペプチド又はポリペプチド部分（moiety）は、細胞死をもたらす任意の部分を含む。細胞毒性ペプチド及びポリペプチド部分は、当分野で周知であり、例えば、リシン（ricin）、アブリン、緑膿菌外毒素、組織因子などを含む。それらを抗体などの標的化部分に連結するための方法も当分野で公知である。細胞毒性剤としてのリシンの使用は、Burrows & Thorpe（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000（参照により本明細書に援用される）に記載されており、局所的血液凝固及び腫瘍の梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ran et al（1998）Cancer Res. 58, 4646-4653及びHuang et al（1997）Science 275, 547-550に記載されている。Tsai et al（1995）Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたアブリンA鎖について記載しており、これは参照により本明細書に援用される。他のリボソーム不活性化タンパク質が、細胞毒性剤として、国際公開第96/06641号に記載されている。緑膿菌外毒素はまた、細胞毒性ポリペプチド部分として使用されてよい（例えば、Aiello et al（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461（参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０３０３】
特定のサイトカイン、例えば、TNFα及びIL-2などもまた、細胞毒性剤として有用であり得る。
【０３０４】
特定の放射性原子もまた、十分な用量でデリバリーされる場合、細胞毒性を示し得る。従って、細胞毒性部分は、使用時に、細胞毒性を示すように十分な量の放射能を標的部位にデリバリーする放射性原子を含んでよい。適した放射性原子は、リン-32、ヨウ素-125、ヨウ素-131、インジウム-111、レニウム-186、レニウム-188若しくはイットリウム-90、又は十分なエネルギーを放射し、近隣の細胞、オルガネラ若しくは核酸を破壊する任意の他の同位体を含む。好ましくは、本発明の化合物中の放射性原子の同位体及び密度は、4000 cGyより大きい（好ましくは、少なくとも6000、8000又は10000 cGy）放射線量が、標的部位、好ましくは標的部位の細胞及びそのオルガネラ、特に核にデリバリーされる程度である。放射性原子は、公知の方法で抗体に結合してよい。例えば、EDTA又は別のキレート剤は、抗体に結合されてよく、またそれを使用して、111In又は90Yに結合させてよい。チロシン残基は、125I又は131Iで標識してよい。
【０３０５】
細胞毒性部分は、適した間接的な細胞毒性ポリペプチドであってよい。特に好ましい実施態様において、間接的な細胞毒性ポリペプチドは、酵素活性を有し、比較的非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬に変換可能なポリペプチドである。標的化部分（targeting moiety）が抗体である場合、この種の系は、ADEPT（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）と称されることが多い。当該系は、標的化部分が酵素部分を患者体内の所望の部位（すなわち、例えば、腫瘍に関連した新しい血管組織などのMRを発現する部位）に位置づけ、酵素が当該部位に局在化されるだけの時間が経過後、酵素に対する基質であるプロドラッグを投与し、触媒作用の最終産物が細胞毒性化合物であることを必要とする。当該アプローチの目的は、所望の部位での薬剤の濃度を最大化し、正常組織内での薬剤の濃度を最小化することである（Senter, P.D. et al（1988）“Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846；Bagshawe（1987）Br. J. Cancer 56, 531-2；及びBagshawe, K.D. et al（1988）“A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites” Br. J. Cancer. 58, 700-703を参照）。
【０３０６】
細胞毒性物質は、任意の既存の抗癌薬、例えば、アルキル化剤；DNAに挿入される薬剤；ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンシンテターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオシドキナーゼ若しくはトポイソメラーゼなどの任意の鍵酵素を阻害する薬剤；又は任意の他の細胞構成物質と相互作用することによって細胞死を引き起こす薬剤などであってよい。エトポシドは、トポイソメラーゼ阻害剤の例である。
【０３０７】
報告されたプロドラッグシステムは以下を含む：E. coli β-グルクロニダーゼによって活性化されるフェノールマスタードプロドラッグ（Wang et al, 1992及びRoffler et al, 1991）；ヒトβ-グルクロニダーゼによって活性化されるドキソルビシンプロドラッグ（Bosslet et al, 1994）；コーヒー豆α-ガラクトシダーゼによって活性化される更なるドキソルビシンプロドラッグ（Azoulay et al, 1995）；コーヒー豆α-D-ガラクトシダーゼによって活性化されるダウノルビシンプロドラッグ（Gesson et al, 1994）；E. coli β-D-ガラクトシダーゼによって活性化される5-フルオロウリジンプロドラッグ（Abraham et al, 1994）；及びカルボキシペプチダーゼAによって活性化されるメトトレキサートプロドラッグ（例えば、メトトレキサート-アラニン）（Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992及びVitols et al, 1995）。これら及び他のものは表1に含まれる。
【０３０８】
【表１−１】
0006411998.tif 000069
【０３０９】
（この表の出典はBagshawe（1995）Drug Dev. Res. 34, 220-230（ここから、これらの様々なシステムについての完全な参照が得られ得る）である；タキソール誘導体はRodrigues, M.L.  et al（1995）Chemistry & Biology 2, 223に記載される）。
【０３１０】
本発明の酵素部分の一部を形成するのに適した酵素は、以下を含む：エキソペプチダーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼG、G1及びG2（グルタミン酸化マスタードプロドラッグについて）、カルボキシペプチダーゼA及びB（MTXを基にしたプロドラッグについて）、並びにアミノペプチダーゼ（2-α-アミノシルMTCプロドラッグについて）；エンドペプチダーゼ、例えば、トロンボリシン（トロンビンプロドラッグについて）；加水分解酵素、例えば、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）又はスルファターゼ（例えば、アリールスルファターゼ）（リン酸化又は硫酸化されたプロドラッグについて）；アミダーゼ、例えば、ペニシリンアミダーゼ及びアリールアシルアミダーゼ；ラクタマーゼ、例えば、β-ラクタマーゼ；グリコシダーゼ、例えば、β-グルクロニダーゼ（β-グルクロノミドアントラサイクリンについて）、α-ガラクトシダーゼ（アミグダリンについて）、及びβ-ガラクトシダーゼ（β-ガラクトースアントラサイクリンについて）；デアミナーゼ、例えば、シトシンデアミナーゼ（5FCについて）；キナーゼ、例えば、ウロキナーゼ及びチミジンキナーゼ（ガンシクロビルについて）；レダクターゼ、例えば、ニトロレダクターゼ（CB1954及びアナログについて）、アゾレダクターゼ（アゾベンゼンマスタードについて）及びDT-ジアホラーゼ（CB1954について）；オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ（グルコースについて）、キサンチンオキシダーゼ（キサンチンについて）、及びラクトペルオキシダーゼ；DL-ラセマーゼ、触媒抗体及びシクロデキストリン。
【０３１１】
プロドラッグは、細胞毒性薬に比べて、比較的非毒性である。典型的には、それは、適したin vitro細胞毒性試験で測定されるように、10％未満の毒性、好ましくは1％未満の毒性を有する。プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分（moiety）は、化合物の残りから単離される際に活性を示す可能性が高いが、あくまで（a）それが化合物の残りと組み合わされ、且つ（b）化合物が標的細胞に結合され、近接され、又はその中に内在化される場合にそれが活性を示すことが必要である。
【０３１２】
化合物の各部分がポリペプチドである場合、二つの部分は、ポリペプチドを架橋するための従来の方法のいずれか、例えば、O'Sullivan et al（1979）Anal.  Biochem.  100, 100-108に一般的に述べられている方法などによって、一緒に連結されてよい。或いは、化合物は、組換えDNA技術によって融合化合物として生産されてよく、それにより、DNA長は、お互い隣り合うか、又は化合物の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分けられた、本発明の化合物の二つの部分をコードするそれぞれの領域を含む。考えうるところでは、化合物の二つの部分は、全体的又は部分的に重なってよい。
【０３１３】
細胞毒性部分は、放射線増感剤であってよい。放射線増感剤は、フルオロピリミジン、チミジンアナログ、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、3-アミノベンザミド、3-アミノベンゾジアミド、エタニキサドール、ピモニダゾール、及びミソニダゾール（例えば、McGinn et al（1996）J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203；Shewach & Lawrence（1996）Invest. New Drugs 14, 257-263；Horsman（1995）Acta Oncol. 34, 571-587；Shenoy & Singh（1992）Clin. Invest. 10, 533-551；Mitchell et al（1989）Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836；Iliakis & Kurtzman（1989）Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241；Brown（1989）Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993；Brown（1985）Cancer 55, 2222-2228を参照）を含む。
【０３１４】
また、細胞内への遺伝子デリバリー、例えば、p53遺伝子又はサイクリンDのデリバリーなどは、それらを放射線増感し得る（Lang et al（1998）J. Neurosurg. 89, 125-132；Coco Martin et al（1999）Cancer Res. 59, 1134-1140）。
【０３１５】
更なる部分は、放射線照射時に細胞毒性となるか又は細胞毒性部分を放出するものであってよい。例えば、ボロン-10放射性同位体は、適切に照射されると、細胞毒性であるα粒子を放出する（例えば、Goldenbergに対するUS 4,348,376；Primus et al（1996）Bioconjug. Chem. 7, 532-535を参照）。
【０３１６】
同様に、細胞毒性部分は、フォトフリンなどの光力学的療法において有用なものであってよい（例えば、Dougherty et al（1998）J. Natl. Cancer Inst. 90, 889-905を参照）。
【０３１７】
細胞毒性部分は、直接又は間接的に細胞毒性を示す核酸分子であってよい。例えば、核酸分子は、標的部位での局在化時に細胞の中に入り、細胞死を導くことができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。従って、オリゴヌクレオチドは、必須遺伝子の発現を妨げるもの、或いはアポトーシスを引き起こす遺伝子発現の変化を導くのであってよい。
【０３１８】
適したオリゴヌクレオチドの例として、bcl-2に向けたもの（Ziegler et al（1997）J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036）、並びにDNAポリメラーゼα及びトポイソメラーゼIIα（Lee et al（1996）Anticancer Res. 16, 1805-1811）が挙げられる。
【０３１９】
ペプチド核酸は、慣習的な核酸の代わりに有用であってよい（Knudsen & Nielsen（1997）Anticancer Drugs 8, 113-118を参照）。
【０３２０】
本発明の化合物の一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメント、及び細胞毒性部分は、融合されたポリペプチドであってよい。従って、本発明はさらに、かかる化合物をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０３２１】
更なる実施態様において、更なる部分は、容易に検出可能な部分（detectable moiety）であってよい。容易に検出可能な部分は、ヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、テクネチウム（technitium）-99m、ガドリニウム、マンガン、又は鉄のいずれか一つの適した量を含んでよいことが想定される。
【０３２２】
「容易に検出可能な部分」とは、該部分が、本発明の化合物の患者への投与後に標的部位に位置する場合に、典型的には、非侵襲的に、体外、及びその位置する標的部位の外から検出され得るものであることを意味する。従って、本発明のこの実施態様の化合物は、イメージング及び診断に有用である。
【０３２３】
典型的には、容易に検出可能な部分は、イメージングに有用な放射性原子であるか又は該原子を含む。適した放射性原子として、シンチグラフィー研究のためのテクネチウム-99m又はヨウ素-123が挙げられる。他の容易に検出可能な部分として、例えば、核磁気共鳴イメージング（MRI）のためのスピンラベル、例えば、再びヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、ガドリニウム、マンガン又は鉄などが挙げられる。明らかに、本発明の化合物は、分子が容易に検出可能であるために、適切な同位体原子（atomic isotope）を十分に有さなければならない。
【０３２４】
放射性又は他のラベルは、公知の方法で本発明の化合物に組み込まれてよい。例えば、抗体がポリペプチドであれば、それは生合成されてよく、或いは例えば水素の代わりにフッ素-19を伴う、適切なアミノ酸前駆体を使用して、化学的アミノ酸合成によって合成されてよい。99mTc、123I、186Rh、188Rh及び111Inなどのラベルは、例えば、抗体のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム-90はリジン残基を介して結合され得る。IODOGEN法（Fraker er al（1978）Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57）を用いて、ヨウ素-123を組み込むことができる。参考文献（“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, J-F Chatal, CRC Press, 1989）には、他の方法について詳細に記載されている。
【０３２５】
更なる側面において、本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０３２６】
典型的な原核生物ベクタープラスミドは、以下である：Biorad Laboratories（Richmond, CA, USA）から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322及びpBR329；Pharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能なpTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及びpRIT5；Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA 92037, USA）から入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46Aである。
【０３２７】
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能なpSVLである。誘導性の哺乳動物発現ベクターの例は、pMSGであり、これもPharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能である。
【０３２８】
有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406及びpRS413-416であり、通常、Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA 92037, USA）から入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405及びpRS406は、酵母組み込みプラスミド（Yeast Integrating plasmids）（Yips）であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2及びURA3を組み込む。プラスミドpRS413-416は、酵母セントロメアプラスミド（Yeast Centromere plasmids）（YCps）である。
【０３２９】
当業者に周知の方法を用いて、コーディング配列と、例えば、適切な転写又は翻訳コントロールとを含む発現ベクターを構築できる。
【０３３０】
なお更に、本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０３３１】
多くの発現系が公知であり、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターでトランスフォームされた細菌（例えば、E.coli及びBacillus subtilis）；例えば酵母発現ベクターでトランスフォームされた酵母（例えば、Saccaromyces cerevisiae）；例えばウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）でトランスフォームされた昆虫細胞系；例えばウイルス性又は細菌性発現ベクターでトランスフェクトされた植物細胞系；例えばアデノウイルス発現ベクターでトランスフェクトされた動物細胞系を用いる系を含む。
【０３３２】
ベクターは、たとえ別の非原核細胞タイプにおける発現に用いられる場合であっても、原核生物における増殖のために、Col E1 oriなどの原核性レプリコンを含み得る。ベクターはまた、それで形質転換された、E.coliなどの細菌性宿主細胞において、遺伝子の発現（転写及び翻訳）を指示することができる原核性プロモーターなどの適切なプロモーターを含み得る。
【０３３３】
プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合と転写を起こすことを可能にする、DNA配列により形成される発現コントロールエレメントである。例となる細菌性宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のDNAセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクターに典型的に備えられている。
【０３３４】
適した宿主細胞中のポリヌクレオチドを発現させて、本発明の抗体又は化合物を産生してよい。従って、当該ポリヌクレオチドは、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正（modified）された公知技術に従って、発現ベクターを構築するために使用してよく、これは次いで、本発明の抗体又は化合物の発現及び産生に適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。かかる技術は、米国特許第4,440,859号；4,530,901号；4,582,800号；4,677,063号；4,678,751号；4,704,362号；4,710,463号；4,757,006号；4,766,075号；及び4,810,648号に開示されるものを含み、これらは全て参照により本明細書に援用される。
【０３３５】
ポリヌクレオチドは、適切な宿主に導入するための多岐にわたる他のDNA配列と連結されてよい。この付随するDNAは、宿主の性質、宿主へのDNAの導入方法、及びエピソームでの維持又は組み込みのいずれが所望されるか、によって決まるだろう。
【０３３６】
一般に、ポリヌクレオチドは、プラスミドなどの発現ベクターに、適切な配向及び発現に正しい読み枠で挿入される。必要であれば、DNAは、所望の宿主に認識される適切な転写及び翻訳制御コントロールヌクレオチド配列と連結されてもよいが、かかるコントロールは、発現ベクターにおいて一般的に利用可能である。従って、DNA挿入は、適切なプロモーターに作動可能に（operatively）連結されてよい。細菌性プロモーターは、E.coli lacI及びlacZプロモーター、T3及びT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPR及びPLプロモーター、phoAプロモーター及びtrpプロモーターを含む。真核性プロモーターは、CMV最初期(immediate early)プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、並びにレトロウイルスLTRのプロモーターを含む。他の適したプロモーターが、当業者に公知であろう。この発現構築物は、転写開始及び終結のための部位、並びに転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位も含むことが望ましいだろう（Hastingsら、1998年4月23日に公開された国際特許出願第98/16643号）。
【０３３７】
次いで、ベクターは、標準的な技術を介して宿主に導入される。一般に、宿主の全てがベクターによってトランスフォームされるわけではなく、それゆえ、トランスフォームされた宿主細胞を選別する必要があるだろう。一つの選択技術は、任意の必要なコントロールエレメントと共に、形質転換された細胞において選択可能な特性をコードするDNA配列マーカーを発現ベクターに組み込むことを伴う。これらのマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418又はネオマイシン耐性（真核細胞培養のため）、及びテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子（E.coli及び他の細菌における培養のため）を含む。或いは、かかる選択可能な特性の遺伝子は、別のベクター上にあり得、これを用いて、所望の宿主細胞を共トランスフォーム(co-transform)する。
【０３３８】
次いで、本発明の組換えDNAによってトランスフォームされた宿主細胞を、本明細書で開示する教示を考慮して、当業者に公知の適切な条件下、十分な時間培養し、ポリペプチドの発現をさせ、次いでこれを回収することができる。
【０３３９】
抗体又は化合物は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製に用いられる。
【０３４０】
なお更に、本発明は、本発明の外因性ポリヌクレオチド又はベクターを細胞株に組み込むことから生じる、本発明の前記いずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明の化合物を生成する安定宿主細胞株を提供する。
【０３４１】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。細菌細胞は、原核宿主細胞が好ましく、典型的には大腸菌（Escherichia coli）の株であり、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USAから入手可能なE. coli株DH5、Rockville, MD, USAのAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能なRR1（No ATCC 31343）などである。好ましい真核宿主細胞は、酵母及び哺乳動物細胞を含み、好ましくは、マウス、ラット、サル又はヒト線維芽細胞株由来のものなどの脊椎動物細胞である。酵母宿主細胞は、YPH499、YPH500及びYPH501を含み、これらは、通常、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞は、ATCCからCCL61として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ATCCからCRL 1658として入手可能なNIH Swissマウス胚細胞NIH/3T3、及びATCCからCRL 1650として入手可能なサル腎臓由来のCOS-1細胞を含む。
【０３４２】
形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、栄養培地における、その細胞培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一）培養物、又はモノクローナル培養物由来の培養物も企図する。
【０３４３】
更なる側面において、本発明は、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明に従うポリヌクレオチド、又は本発明に従う化合物を、医薬上許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤又は担体と混合して含む医薬組成物／製剤を提供する。
【０３４４】
「医薬上許容される（pharmaceutically acceptable）」とは、製剤が滅菌され、パイロジェンフリーであることを含む。適した医薬担体は、製薬技術分野において周知である。担体は、本発明の化合物と適合可能であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。典型的には、担体は、滅菌され、パイロジェンフリーである水又は食塩水（saline）である；しかし、その他の許容される担体を用いてよい。
【０３４５】
一実施態様において、本発明の医薬組成物／製剤は、更なる活性成分、すなわち、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント以外の治療的活性剤をさらに含んでよい。1つ以上の追加の活性剤は、必要に応じて、標的疾患に対する医薬組成物／製剤の有効性を増加させ得ることが想定される。一実施態様において、更なる活性成分は、組織瘢痕化の低下、神経原線維タングルの低下、及び／又は化学療法に対する耐性の低下に関与する薬剤から選択される治療剤であってよい。
【０３４６】
好ましい実施態様において、医薬組成物／製剤は、患者への静脈内、筋内又は皮下デリバリーのために製剤化されてよい。
【０３４７】
医薬組成物／製剤は、上記及び更に下記の様々な状態を治療するのに有効な量の本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを含むことが好ましい。
【０３４８】
本発明の更なる側面は、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明に従うポリヌクレオチド、又は本発明の化合物；及び1つ以上の更なる薬剤、を含む部品のキット（kit of parts）を提供する。更なる薬剤は、上記更なる活性成分のいずれか一つ、又は任意の他の適した薬剤であってよいことが想定される。
【０３４９】
なお更なる側面において、本発明は、医学の分野で使用するための、治療上有効量の、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットを提供する。
【０３５０】
TG2は明らかに多機能酵素であり、核安定化及び輸送［28、29］、エンドサイトーシス［30、31］、GTPaseシグナリング［32〜34］、アポトーシス［35、36］、細胞接着［37〜39］、細胞骨格完全性（integrity）［28、29］及びECM安定化［9］を含む様々な細胞機能と関連づけられる。低分子阻害剤は、一般に、細胞外スペース及び細胞内部へのアクセスがフリーであることから、これらの機能の全てを妨げ得る。抗体は細胞へ侵入できず、それ自体としては、TG2の細胞内の役割が、in vivo投与されたTG2特異的抗体による影響を受けないだろう。
【０３５１】
重要なことに、TG2の病理学的役割の大部分、例えば、組織の瘢痕化及び線維症、セリアック病並びに癌におけるその役割などは、細胞外であると思われる。従って、医学の分野においてTG2と選択的に結合する抗体を用いることは、治療の所望しない副作用へと変化し得る所望しない細胞内効果を予防する、さらなる選択性の度合いをもたらし得る。
【０３５２】
従って、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、従来利用可能な薬物を超える臨床的利点を提供し得、例えば、TG2がECMタンパク質を架橋する線維性及び瘢痕化疾患、グリアジンが細胞外スペースで脱アミド化されるセリアック病、及び細胞接着が防御因子（protective factor）であると思われる癌における化学療法抵抗性においてTG2をブロックするという臨床的利点を提供し得る。さらに、本発明の小さな抗体フラグメント、例えばFabフラグメントは、血液脳関門を通過し、脳においてTG2を阻害し、TG2の関与を伴う神経学的病変に対し効果的な治療を潜在的に提供し得る。
【０３５３】
従って、本発明の更なる側面は、それを必要とする個体におけるTG2酵素活性の低下又は阻害に使用するための、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットを提供する。
【０３５４】
本発明はさらに、それを必要とする個体においてTG2酵素活性を低下又は阻害するための医薬の製造における、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットの使用を提供する。
【０３５５】
本発明はまた、それを必要とする個体におけるTG2酵素活性を低下又は阻害する方法であって、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はそのバリアント、融合体若しくは誘導体、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットを該個体に投与する工程を含む、方法も提供する。
【０３５６】
本発明の更なる側面は、セリアック病、異常な創傷治癒（abnormal wound healing）、瘢痕化、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、眼の瘢痕化（ocular scarring）、炎症性腸疾患、黄斑変性症、グレーブス眼症、薬物性（drug-induced）麦角中毒、乾癬、線維症関連疾患（例えば、肝線維症、肺線維症、例えば、間質性肺疾患及び線維化肺疾患（fibrotic lung disease）、心臓線維症（cardiac fibrosis）、皮膚線維症、骨髄線維症、腎線維症、例えば、糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症（tubulointerstitial fibrosis））、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性／神経系疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症1、2、3、6、7及び12、赤核淡蒼球（rubropallidal）萎縮症、脊髄小脳麻痺（spinocerebellar palsy））、及び／又は癌（例えば、膠芽腫（glioblastoma）、例えば、リ・フラウメニ症候群における膠芽腫及び散発性膠芽腫、悪性黒色腫、膵管腺癌、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン性大腸炎（collagenous colitis））の治療及び／又は診断に使用するための、治療上有効量の、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットを提供する。
【０３５７】
本発明はまた、セリアック病、異常な創傷治癒、瘢痕化、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、眼の瘢痕化、炎症性腸疾患、黄斑変性症、グレーブス眼症、薬物性麦角中毒、乾癬、線維症関連疾患（例えば、肝線維症、肺線維症、例えば、間質性肺疾患及び線維化肺疾患、心臓線維症、皮膚線維症、骨髄線維症、腎線維症、例えば、糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症）、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性／神経系疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症1、2、3、6、7及び12、赤核淡蒼球（rubropallidal）萎縮症、脊髄小脳麻痺）、及び／又は癌（例えば、膠芽腫、例えば、リ・フラウメニ症候群における膠芽腫及び散発性膠芽腫、悪性黒色腫、膵管腺癌、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン性大腸炎）を治療及び／又は診断するための医薬の製造における、治療上有効量の、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットの使用も提供する。
【０３５８】
本発明はまた、患者において、セリアック病、異常な創傷治癒、瘢痕化、強皮症、ケロイド及び肥厚性瘢痕、眼の瘢痕化、炎症性腸疾患、黄斑変性症、グレーブス眼症、薬物性麦角中毒、乾癬、線維症関連疾患（例えば、肝線維症、肺線維症、例えば、間質性肺疾患及び線維化肺疾患、心臓線維症、皮膚線維症、骨髄線維症、腎線維症、例えば、糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症）、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性／神経系疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症1、2、3、6、7及び12、赤核淡蒼球（rubropallidal）萎縮症、脊髄小脳麻痺）、及び／又は癌（例えば、膠芽腫、例えば、リ・フラウメニ症候群における膠芽腫及び散発性膠芽腫、悪性黒色腫、膵管腺癌、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科癌、カポジ肉腫、ハンセン病、コラーゲン性大腸炎）を治療及び／又は診断する方法であって、治療上有効量の、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の化合物、医薬組成物／製剤、若しくは部品のキットを該患者に投与することを含む、方法も提供する。
【０３５９】
「治療」には、対象／患者の治療的及び予防的治療の両方が含まれる。用語「予防的」は、個体において状態又は障害（例えば、線維症関連障害）の発症又は進行の可能性を予防するか又は減少させるかのいずれかである、本明細書に記載の抗体、医薬、化合物、組成物又はキットの使用を包含するために使用される。
【０３６０】
患者はヒトであることが好ましいが、治療から恩恵を受け得る任意の他の哺乳動物であってもよい。例えば、患者は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、サル又は類人猿であってよい。
【０３６１】
本明細書で使用する場合、「治療上有効量」、又は「有効量」、又は「治療上有効」は、所定の条件及び投与計画について治療上の効果をもたらす量を意味する。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわち担体又は投与ビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定の量である。さらに、宿主の活動（activity）、機能及び反応における臨床的に有意な欠損を低下又は予防するのに十分な量を意味することが意図される。或いは、治療上有効量は、宿主、例えば哺乳動物などにおいて臨床的に有意な状態の改善を生じるのに十分である。
【０３６２】
本発明の薬剤（すなわち、抗体、その抗原結合フラグメント、バリアント、融合体又は誘導体）、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットは、注射可能な徐放ドラッグデリバリーシステムを使用してデリバリーされてよい。これらは、注射の頻度を低減することに特化して設計される。かかるシステムの例は、組換えヒト成長ホルモン（rhGH）を分解性ミクロスフェア中にカプセル化するNutropin Depotであり、これは、一旦注射されると、rhGHを持続時間にわたって徐放する。好ましくは、デリバリーは、筋肉内（i.m.）及び／又は皮下（s.c.）及び／又は静脈内（i.v.）で実施される。
【０３６３】
本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットは、必要とされる部位に直接薬物を放出する外科的移植装置（surgically implanted device）によって投与され得る。例えば、Vitrasertは、CMV網膜炎を治療するために、眼に直接ガンシクロビルを放出する。この毒性剤を疾患部位へ直接適用することにより、薬物の有意な全身性副作用を伴わない有効な治療がなされる。
【０３６４】
好ましくは、本発明の医薬、及び／又は医薬組成物／製剤は、活性成分の、日用量又は単位、1日の副用量（daily sub-dose）又はその適切な画分を含有する単位用量である。
【０３６５】
本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物及びキットは、通常、任意の非経口経路により、活性成分を含む医薬組成物の形態で、任意選択で非毒性の有機若しくは無機の酸又は塩基、付加塩の形態で、医薬上許容できる剤形で投与される。治療されるべき障害及び患者、並びに投与経路に応じて、組成物は、異なる用量で投与されてよい。
【０３６６】
ヒト治療においては、本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットは、単独で投与され得るが、一般には、意図される投与経路及び標準の薬務との関連で選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合して投与されるだろう。
【０３６７】
本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットは、非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内又は皮下に投与され得、或いはそれらは、注入技術によって投与されてもよい。それらは、滅菌水溶液（他の物質、例えば、血液と等張な溶液を作製するのに十分な塩又はグルコースを含有してよい）の形態で使用するのが最適である。水溶液は、必要があれば、適切に緩衝化されるべきである（好ましくは、pH＝3〜9）。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に行われる。
【０３６８】
非経口投与に適した医薬及び医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでよい水性及び非水性の滅菌注射溶液；並びに、懸濁化剤及び増粘剤を含んでよい水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。医薬及び医薬組成物は、単回投与又は複数回投与容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルで提示してもよく、また、使用直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存してもよい。即時注射溶液及び懸濁液は、上述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。
【０３６９】
ヒト患者への非経口投与においては、本発明の薬剤、医薬及び医薬組成物の日用量レベルは通常、1日あたり、成人1名あたり1 μg〜10 mgであり、単回又は分割用量で投与されるだろう。医師は、いずれの場合でも、任意の個別の患者に最適となる実用量を決定することになり、またそれは、特定の患者の年齢、体重及び応答に応じて変化することになる。上記用量は、平均的症例に典型的なものである。当然のことながら、用量範囲の拡大又は縮小に値する個別例があり得、それらは本発明の範囲内に含まれる。
【０３７０】
典型的には、本発明の医薬、医薬組成物／製剤、及びキットは、本発明の薬剤をおよそ2 mg/mlと150 mg/mlとの間の濃度、又はおよそ2 mg/mlと200 mg/mlとの間の濃度で含有するだろう。好ましい実施態様において、本発明の医薬、医薬組成物／製剤、及びキットは、本発明の薬剤を10 mg/mlの濃度で含有するだろう。
【０３７１】
一般に、ヒトにおいては、本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットの非経口投与が好ましい経路であり、最も簡便である。
【０３７２】
獣医学用途においては、本発明の薬剤、医薬、化合物、医薬組成物／製剤、及びキットは、通常の獣医学診療に従う適切に許容できる製剤として投与され、獣医は、特定の動物にとって最適なものとなる投与計画及び投与経路を決定することになる。
【０３７３】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合部分（moiety）の医薬上許容される酸又は塩基付加塩を含む医薬組成物／製剤を含む。本発明に有用な上記塩基化合物の医薬上許容される酸付加塩を調製するために使用する酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、特に、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩［すなわち、1,1'-メチレン-ビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエート)］などの塩を形成するものである。
【０３７４】
医薬上許容される塩基付加塩はまた、本発明に従う薬剤（すなわち、抗体又はその抗原結合フラグメント）の医薬上許容される塩形態を製造するために使用されてよい。
【０３７５】
本来酸性である本発明の薬剤の医薬上許容される塩基性塩を製造するために、試薬として使用してよい化学塩基は、かかる化合物と非毒性の塩基性塩を形成するものである。かかる非毒性の塩基性塩は、特に、例えば、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン(例えば、カルシウム及びマグネシウム)などのかかる医薬上許容されるカチオンから誘導されたもの、アンモニウム又は水溶性アミンの付加塩、例えばN-メチルグルカミン-(メグルミン)、並びに医薬上許容される有機アミンの低級アルカノールアンモニウム及び他の塩基性塩を含むが、これらに限定されない。
【０３７６】
本発明の薬剤及び／又はポリペプチド結合部分は、貯蔵のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で再構成されてよい。任意の適切な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーク乾燥）及び／又は再構成技術が使用できる。当業者であれば、凍結乾燥及び再構成が様々な程度の抗体活性損失をもたらし得ること（例えば、通常の免疫グロブリンでは、IgM抗体はIgG抗体よりも大きな活性損失を有する傾向がある）、及び補償するために使用レベルは上方調整しなければならない場合があることを理解するだろう。一実施態様において、凍結乾燥（フリーズドライ）したポリペプチド結合部分は、再水和した際にその活性（凍結乾燥前）の約20％以下（no more than）、又は約25％以下、又は約30％以下、又は約35％以下、又は約40％以下、又は約45％以下、又は約50％以下を失う。
【０３７７】
好ましくは、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量が、抗体又はその抗原結合フラグメントの約0.0001 mg/kg〜50 mg/kgの間である、抗体、化合物、医薬組成物／製剤、キット、使用又は方法を提供する。
【０３７８】
当業者に理解されるように、化合物の正確な量は、その比活性（specific activity）に応じて変化してよい。適切な投薬量は、必要とされる希釈剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性組成物の所定の量を含有してよい。本発明の組成物を製造するための方法及び使用では、治療上有効量の活性成分が提供される。治療上有効量は、当分野で周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者特性に基づいて、通常の技量を有する医学又は獣医学従事者によって決定され得る。
【０３７９】
本発明の更なる側面は、TG2酵素活性を低下又は阻害するin vitro方法であって、本発明のいずれかの側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明に従うポリヌクレオチド、又は本発明の化合物若しくはキットを、TG2を含むサンプルに投与することを含む、方法を提供する。
【０３８０】
「サンプル」は、適切な供給源、例えば哺乳動物供給源などから得られた任意のサンプルであってよい。例えば、サンプルは、TG2を含む組織又は細胞サンプルであってよい。例となる組織は、患者の脳、消化管、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、眼、心臓、血管、リンパ節、脊椎、及び骨格又は平滑筋から得られた組織を含む。
【０３８１】
本発明はまた、それを必要とする個体におけるTG2酵素活性を低下又は阻害する方法であって、本発明のいずれかの側面に従う抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドの有効量を該個体に投与することを含む、方法を提供する。
【０３８２】
更なる側面は、それを必要とする個体においてTG2酵素活性を低下又は阻害するための医薬の製造における、本発明のいずれかの側面に従う抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０３８３】
本発明はまた、TG2酵素活性を低下又は阻害するin vitro方法であって、本発明のいずれかの側面に従う抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを、TG2を含むサンプル、例えば、TG2を含む組織又は細胞サンプルに投与することを含む、方法を提供する。
【０３８４】
なお更なる側面において、本発明は、本発明の第二の側面に従う抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は本発明の第二の側面に従う抗体若しくは抗原結合フラグメントを含む本発明の化合物を製造する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを発現させるか又は本発明の安定宿主細胞株を培養することを含む、方法を提供する。
【０３８５】
更なる側面において、本発明は、トランスグルタミナーゼタンパク質と選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する方法であって、トランスグルタミナーゼコア領域／触媒ドメインを含むがトランスグルタミナーゼバレル又はサンドウィッチドメインを含まないポリペプチドと選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する工程を含む、方法を提供する。
【０３８６】
更なる側面において、本発明は、本発明の第一若しくは第二の側面に従う抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本発明の第一若しくは第二の側面に従う抗体若しくは抗原結合フラグメントを含む本発明の化合物を選択する方法であって、ヒトTG2のアミノ酸143〜473のポリペプチド配列又はそのフラグメント、からなるポリペプチド配列と選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する工程を含む、方法を提供する。
【０３８７】
一実施態様において、該方法は、抗体ファージディスプレイを用いて実施してよい。抗体又はその抗原結合フラグメントが、トランスグルタミナーゼタンパク質の触媒活性を阻害する阻害抗体であることが好ましい。
【０３８８】
更なる側面において、本発明は、トランスグルタミナーゼタンパク質と選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
i）トランスグルタミナーゼコア領域／触媒ドメインを含むがトランスグルタミナーゼバレル又はサンドウィッチドメインを含まないポリペプチド、又はそのフラグメント；及び任意選択で
ii）アジュバント
を含む化合物を非ヒト動物に投与することを含む、方法を提供する。
【０３８９】
トランスグルタミナーゼコア領域／触媒ドメインを含むがトランスグルタミナーゼバレル又はサンドウィッチドメインを含まないポリペプチドは、上記触媒三残基を含み、且つ任意選択でトランスグルタミナーゼタンパク質のGTP結合部位も含んでよいことが想定される。
【０３９０】
一実施態様において、該方法は、トランスグルタミナーゼタンパク質への選択的結合に基づき、抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する工程をさらに含んでよい。
【０３９１】
更なる側面において、本発明は、トランスグルタミナーゼタンパク質と選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する方法であって、ヒトTG2のアミノ酸143〜473のポリペプチド配列又はそのフラグメント、からなるポリペプチド配列と選択的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する工程を含む、方法を提供する。
【０３９２】
なお更なる側面において、本発明は、本発明のいずれかの側面に従う抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
i）ヒトTG2のアミノ酸143〜473のポリペプチド配列又はそのフラグメント、からなるポリペプチド配列；及び任意選択で
ii）アジュバント
を含む化合物を非ヒト動物に投与することを含む、方法を提供する。
【０３９３】
一実施態様において、該方法は、TG2、例えばヒトTG2などへの選択的結合に基づいて、抗体又はその抗原結合フラグメントを選択する工程をさらに含んでよい。
【０３９４】
更なる側面において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントを製造又は選択する前記方法のいずれかにより得ることができる抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０３９５】
「アジュバント」には、本発明のポリペプチドに対するレシピエントの免疫応答を増強する、任意の薬理学的又は免疫学的薬剤が含まれる。免疫学的アジュバントは、標的抗原に対する免疫系の応答を刺激するためにワクチンに添加されるが、それ自体では免疫を与えない。アジュバントの例として、オイルエマルション、無機化合物、例えばアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）、有機化合物、例えばスクアレン（Squalene）、ウイロゾーム、又は当業者に理解されるように、任意の他の適した化合物若しくは化合物類が挙げられる。
【０３９６】
更なる側面において、本発明は、
i）ヒトTG2のアミノ酸143〜473のポリペプチド配列；
ii）ヒトTG2のアミノ酸304〜326のポリペプチド配列；
iii）ヒトTG2のアミノ酸351〜365のポリペプチド配列；
iv）ヒトTG2のアミノ酸450〜467のポリペプチド配列；又は
そのフラグメント、誘導体若しくはポリペプチド模倣体
からなる単離されたポリペプチドを提供する。
【０３９７】
本発明はまた、直前の側面のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０３９８】
本発明は、実質的に、本説明及び図面を参照して本明細書に記載するように、TG2活性と関連する状態の治療に使用するための抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０３９９】
本発明はまた、実質的に、本説明及び図面を参照して本明細書に記載するように、抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０４００】
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「and」及び「the」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「単数形の抗体(an antibody)」への言及は、複数のかかる抗体を含み、「単数形の投与量(the dosage)」への言及は、1以上の投与量及び当業者に公知のその等価物への言及などを含む。
【０４０１】
本明細書で言及する全ての文献は、参照により本明細書に援用される。
【０４０２】
以下の非限定的な図面及び実施例を参照することにより、本発明をより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０４０３】
【図１】ヒトTG2組換えタンパク質の生成。A：TG2触媒コアcDNAを、pCIineo-hTG2ベクターからPCRにより生成し、pET 21aプラスミドに挿入した。E. coliでの増幅後、これをNhe I及びHind IIIで消化して、TG2コアcDNAを切り離し、1％アガロースゲル上に流した（レーン3）。100 bpラダー（レーン1）及びλ DNA分子量マーカー（レーン2）を参照することにより、バンドを区分した。B：pET21a TG2コアベクターを用いて、E. coli株BL21-CodonPlus（DE3）-RIPLを形質転換した。IPTGを用いて、発現を4時間誘導した。TG2コアタンパク質は不溶体を形成し、遠心分離により溶解物からこれを回収した。これらを再度可溶化し、37 kDaのHisタグTG2コアをニッケルカラムで精製した。プレシジョンプラス（precision plus）分子量マーカー（レーン1）を参照して、SDS-PAGEにより10 ngを分離し、ウエスタンブロットし、CUB7402抗TG2抗体でプローブした（レーン2）。
【図２】マウスにおけるrh TG2コアタンパク質に対する免疫学的応答。A：4匹の触媒コア免疫化マウスから試験血（test bleeds）を、初回免疫から45日後及び2回目のブーストから10日後に採取した。血清を段階希釈し、固定化TG2コアタンパク質に対してELISAにより反応性を確認した。B：ヒトrh TG2及びrh TG2触媒コアドメインに対してスクリーニングすることにより反応性をさらに確認した。20、40、80 ngのタンパク質をSDS PAGEにより分画し、PVDFメンブレン上にウエスタンブロットした。1：1000希釈した血清でこれをイムノプローブした。抗マウスγ鎖特異的HRPを用いて抗体結合を明らかにした。サイズの参照のために、プレシジョンプラス分子量マーカーを用いた。
【図３】TGファミリーメンバーに対するハイブリドーマ反応性。A：組換えTG（100 ng/ウェル）でコーティングしたプレートを用いてELISAを実施して、109のハイブリドーマ上清におけるTGタイプの特異性を決定し、これにより、TG2に対する良好な反応性が示された。抗マウスγ鎖特異的HRPを用いて抗体結合を明らかにした。スクリーニングしたそれらのランダムセレクションにより、交差反応性を示したEF4、CG9及びFD8を含むことが示される。B：選択した9のハイブリドーマをダブルクローニング（double cloned）した。IgGを精製し、100 ngの各TGでコーティングしたプレートでのELISAを用いて、組換えヒトTG1、TG2、TG3、TG7及び第XIIIa因子に対して、0.1 μg/mlでの反応性について試験した。データは、3つの別個のELISAから得られた平均OD値±SEMを表す。第XIIIa因子は、グラフ上、TG13として示す。
【図４】TG2に対して阻害活性を有するハイブリドーマの同定。TG2に対して特異性を有する32のハイブリドーマウェルの馴化培地（conditioned media）を、3Hプトレシン取込みアッセイを用いて、100 ngのrhTG2の活性に対するその効果についてスクリーニングした。化学的汎TG2阻害剤である1,3-ジメチル-2-[（2-オキソ-プロピル）チオ］イミダゾリウム クロリドを阻害のためのポジティブコントロールとして使用した。RPMI（非馴化培地）をネガティブコントロールとして使用した。Quarkバイオテクノロジーにより実施（piloted）されるTG2阻害抗体（500 ng）を比較のために含めた。データは、2連で実施した少なくとも3回の実験から、30分間で取り込まれた平均CPM±SEMを表す。グレーで示すバーは、有意なTG2阻害（p＜0.05）を示す。
【図５】阻害抗体エピトープのマッピング。各阻害モノクローナル抗体をELISAプレートに結合し、ヒトTG2ファージライブラリーに対してパンニングした。抗体と結合したファージをレスキューし、増幅し、さらに4ラウンドのパンニングに供した。次いで、ファージ中のTG2ライブラリーフラグメントを配列決定し、重複配列を用いて、各抗体に対するエピトープを決定した。次いで、抗体間の共通配列を用いて、特定の阻害エピトープ（inhibitory epitope）に対するコンセンサス配列を決定し、それに従い、抗体をグループ分けした。3つの阻害エピトープを同定した。
【図６】TG2触媒コアと阻害エピトープの構造的位置。TG2アミノ酸配列をPymolに入れ、その構造の3Dグラフィック描写をその開いたCa2+活性化状態で作成し、参照のために、推定カルシウム結合部位（ターコイズ）及び触媒三残基（グレー）を示した（左パネル）。次いで、コンセンサス阻害エピトープをブルー（抗体Group 1-AB1部位）、レッド（抗体Group 2-DF4部位）及びイエロー（抗体Group 3、DD9部位）で追加した。
【図７】阻害抗体のVL配列。各阻害ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、縮重FR1プライマー、MH1及びMH2プライマー並びに3つの定常領域プライマーを用いたPCRにより増幅して、VH遺伝子を増幅した。得られたVH及びVK配列をAB1について示す。
【図８Ａ】細胞ホモジネートにおけるTG2活性を阻害するAB1の有効性。A：Hep2G細胞を溶解し、45 ugのタンパク質を、AB1、DH2、DD9、BB7、DC1及びEH6由来のIgG（750 ng）とともに20分間混合した。その後、これを、3Hプトレシン取込みTG活性アッセイを用いて、1時間にわたってサンプリングして、分析した。反応速度（rate of reaction）を計算し、ランダム抗体（MAB002）とともにインキュベートした同じ溶解物のパーセンテージとして表した。データは、2連で実施した2回の別個の実験から、平均パーセンテージ阻害±SEMを表す。*p＜0.05。
【図８Ｂ】細胞ホモジネートにおけるTG2活性を阻害するAB1の有効性。B：HepG2細胞を増加グルコース濃度に96時間暴露して、TG2発現を上方制御した。細胞を採取し、溶解し、25 μgの溶解物をSDS-PAGEにより分画し、ウエスタンブロットし、次いで、化学発光エンドポイントを用いて、1 ng/mlのAB1 IgG溶液でイムノプローブした。
【図９】（表1）：TG2阻害抗体に関する相対的（comparative）IC50値。ヒト、ラット及びマウスに対する、各抗体に関するIC50値を決定するため、3Hプトレシンアッセイを用いた。100 ngのヒトTG2、又は25 ngのマウス及びラットTG2を用いて、10 μlの反応混合物中、1時間あたりおよそ3000 cpmのプトレシンを取り込む反応を生じさせた。次いで、各抗体の段階希釈を、500 ng（最終濃度5 μg/ml）を反応混合物に添加することから開始して適用し、反応を活性化する前に、TG2とともに20分間インキュベートした。グラフパッドプリズムにおいて適切なカーブフィットを用いて、酵素反応速度が50％低下する濃度を決定することによりIC50値を計算した。値は、1 ngのTG2を阻害する、該反応におけるIgGの量（mg/ml）として表す。
【図１０】TG2阻害に反応する、HK2細胞における細胞外TG活性。HK2細胞をフィブロネクチン上にまき、4 ng/μlのヒト抗TG2抗体（AB1）（パートA）、4 ng/μlのヒト抗TG2抗体（DC1）（パートB）、又は400 μMの部位特異的汎TG阻害剤1,3-ジメチル-2-[（2-オキソ-プロピル）チオ］イミダゾリウム クロリドのいずれかとともに0.1 Mのビオチンカダベリンの存在下、2時間インキュベートした。ビオチンカダベリンのフィブロネクチンへの取込みを、エクストラバジン（extravadin）-HRP及びTMB基質を用いて明らかにすることにより、細胞外TG活性を測定した。96ウェルプレートリーダーにおいて、光学密度の変化を450 nmで測定した。データは、1 mgの細胞タンパク質に補正した、450 nmでの平均ODを示す。実験グループあたりn＝6ウェル。
【図１１】3Hプトレシン取込みアッセイを用いた、抗体AB1と、QuarkのTG2阻害抗体のfabフラグメントとのTG2阻害の比較。100 ngのhTG2について、WO 2006/100679においてQuarkにより記載され、Sheffield Universityにて合成された抗体のfabフラグメント1 μg、又は500 ngのAB1のいずれかを添加し、60分間の期間にわたる3Hプトレシンのジメチルカゼインへの取込みに基づき、TG2活性の測定を行った。データは、2連で実施した3回の独立実験から、3Hプトレシンの取込みとしての平均TG活性（CPM）±SEMを示す。
【図１２】3Hプトレシン取込みアッセイを用いた、抗体AB1と、QuarkのTG2阻害抗体のfabフラグメントとによる、TG2阻害のパーセンテージ比較。AB1及びQuark抗体fabフラグメントの適用によるTG2活性の相対比較ノックダウンを示すために、図11のデータを、各時点におけるTG活性のパーセンテージとして代替的に表す。
【図１３】3Hプトレシン取込みアッセイを用いた、抗体AB1と、QuarkのTG2阻害抗体の組換えラットIgGとのTG2阻害の比較。100 ngのhTG2について、WO 2006/100679においてQuarkにより記載され、Medical Research Council Technologyにて合成されたTG2阻害抗体の組換えラットバージョン500 ng、又は500 ngのAB1のいずれかを添加し、60分間の期間にわたる3Hプトレシンのジメチルカゼインへの取込みに基づき、TG2活性の測定を行った。データは、2連で実施した3回の独立実験から、3Hプトレシンの取込みとしての平均TG活性（CPM）±SEMを示す。
【図１４】3Hプトレシン取込みアッセイを用いた、抗体AB1と、QuarkのTG2阻害抗体の組換えラットIgGとによる、TG2阻害のパーセンテージ比較。AB1及びQuark組換えラットIgGの適用によるTG2活性の相対比較ノックダウンを示すために、図13のデータを、各時点におけるTG活性のパーセンテージとして代替的に表す。
【図１５】HK2細胞における、ECMレベルに対するAB1の効果。TG2阻害抗体AB1の添加又は非添加のいずれかにおいて、76時間の期間にわたる3HプロリンのECMへの取込みにより、HK2細胞における成熟コラーゲンレベルを測定した。データは、細胞タンパク質1 mgあたりの3Hプロリンの取込みを、非処理の細胞における平均レベルのパーセンテージ±SEMとして表す。n＝2。
【図１６】抗体ヒト化バージョンの結合ELISA。ヒト化軽鎖及び重鎖ベクターの異なる組み合わせを用いて共トランスフェクトしたHEK293F細胞由来の上清を、濃度を測定するための抗ヒトIgG ELISA、及び抗huTG2 ELISAにて分析した。各上清を3連で分析し、IC50を測定した。最も強力な組み合わせを、更なる研究のために候補ヒト化抗体として選択した。
【図１７】ELISAによるヒトTg2に対するMRC Quark CTD190の試験。炭酸塩バッファー中のhTG2（1 μg/ml）で一晩96ウェルプレートを覆い（plated）、100 ng/mlの一次抗体を用いてELISA検出を実施した。検出は、CUBについては抗マウスIgG（SIGMA 3673）を用いて、Quarkについては抗ラットIgG（SIGMA A5795）を用いて実施した（ともに1：5000）。MRC Tにより作製されたQuark抗体は、ヒトTG2と反応する。
【図１８】AB1ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1とともに縮重シグナル配列プライマーMHV4を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV4を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図１９】BB7ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1とともに縮重シグナル配列プライマーMHV4を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV4を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２０】DC1ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1とともに縮重シグナル配列プライマーMHV4を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV4を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２１】JE12ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1での5’ RACE PCRを用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともにシグナル配列プライマーMKV1を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２２】EH6ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG2Bでの5’ RACE PCRを用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともにシグナル配列プライマーMKVを用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２３】AG9ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1とともに縮重シグナル配列プライマーMHV7を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV1〜11混合物を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２４】AH3ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG2Bとともに縮重シグナル配列プライマーMHV7を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともにシグナル配列プライマーMKV1を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２５】DD9ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG2Aでの5’ RACE PCRを用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV5を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２６】DH2ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG2Bでの5’ RACE PCRを用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーMKV45を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２７】DD6ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG2Bでの5’ RACE PCRを用いるか、又はλ軽鎖定常領域プライマーMLCでの5’ RACE PCRを用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVL配列を示す。
【図２８】IA12ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、重鎖定常領域プライマーMHCG1とともに縮重シグナル配列プライマーMHV9を用いるか、又はκ軽鎖定常領域プライマーMKCとともに縮重シグナル配列プライマーCL14を用いて、PCRにより増幅した。得られたVH及びVK配列を示す。
【図２９−１】キメラ抗TG2抗体（a）cAB003及び（b）cBB001による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。IC50値は、3回の独立実験の平均である。
【図２９−２】キメラ抗TG2抗体（c）cDC001及び（d）cDD9001による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。IC50値は、3回の独立実験の平均である。
【図２９−３】キメラ抗TG2抗体（e）cDH001及び（f）市販のTG2抗体CUB7402による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。IC50値は、3回の独立実験の平均である。
【図３０】キメラ抗TG2抗体（a）cDC001及び（b）市販のTG2抗体CUB7402による組換えカニクイザル（cynomogulus monkey）TG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３１−１】ヒト化抗TG2抗体（a）hBB001AA及び（b）hBB001BBによる組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３１−２】ヒト化抗TG2抗体（c）hAB005及び（d）hAB004による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３２】ヒト化抗TG2抗体（a）hBB01AA及び（b）hAB004による組換えカニクイザル（cynomogulus monkey）TG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３３−１】マウス（murine）モノクローナル抗TG2抗体（a）mAB003及び（b）mBB001による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３３−２】マウス（murine）モノクローナル抗TG2抗体（c）mDC001及び（d）mDD9001による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３３−３】マウス（murine）モノクローナル抗TG2抗体（e）mDH001及び（f）mDD6001による組換えヒトTG2の酵素阻害についての用量反応曲線及びIC50値。
【図３４】AB1抗体のヒト化バージョンの結合ELISA。ヒト化AB1軽鎖及びAB1重鎖ベクターの異なる組み合わせを用いて共トランスフェクトしたHEK293F細胞由来の上清を、濃度を測定するための抗ヒトIgG ELISA、及び抗huTG2 ELISAにて分析した。各上清を3連で分析し、IC50を測定した。最も強力な組み合わせを、更なる研究のために候補ヒト化抗体として選択した。
【図３５−１】ヒトTG2と結合する抗体（a）キメラ抗体cDD9001、cDH001、cDC001、市販のTG2抗体CUB7402及びアイソタイプ適合コントロール（isotype-matched control）についての用量反応ELSA結合曲線及びEC50データ。
【図３５−２】ヒトTG2と結合する抗体（b）キメラ抗体cBB001及びアイソタイプ適合コントロール、並びに（c）キメラ抗体cAB003及びアイソトープ適合コントロールについての用量反応ELSA結合曲線及びEC50データ。
【図３６−１】カニクイザル（cynomogulus monkey）TG2と結合する抗体（a）キメラ抗体cDD9001、cDH001、cDC001、市販のTG2抗体CUB7402及びアイソタイプ適合コントロール、並びに（b）キメラ抗体cBB001及びアイソタイプ適合コントロールについての用量反応ELSA結合曲線及びEC50データ。
【図３６−２】カニクイザル（cynomogulus monkey）TG2と結合する抗体（c）キメラ抗体cAB003及びアイソタイプ適合コントロールについての用量反応ELSA結合曲線及びEC50データ。
【図３７】ヒトTG2と結合する抗体（a）ヒト化抗体hBB001AA、HBB001BB、市販のTG2抗体CUB7402及びアイソタイプ適合コントロール、並びに（b）ヒト化抗体hAB004についての用量反応ELISA結合曲線及びEC50データ。
【図３８】カニクイザル（cynomogulus monkey）TG2と結合する抗体（a）ヒト化抗体hBB001AA、HBB001BB、市販のTG2抗体CUB7402及びアイソタイプ適合コントロール、並びに（b）ヒト化抗体hAB004及びアイソトープ適合コントロールについての用量反応ELISA結合曲線及びEC50データ。
【図３９】細胞外TG2とのヒト化AB1結合活性。HK2細胞により産生される細胞外TG2活性の阻害を、ビオチンカダベリンのフィブロネクチンへの取込みを測定するELISAを用いて分析した。ヒト化AB1（hAB005）によるTG2活性の阻害を示す例示曲線、及び得られたICを示す。
【図４０】細胞外TG2とのヒト化BB7結合活性。HK2細胞により産生される細胞外TG2活性の阻害を、ビオチンカダベリンのフィブロネクチンへの取込みを測定するELISAを用いて分析した。ヒト化BB7バージョン（hBB001AA及びhBB001BB）によるTG2活性の阻害を示す例示曲線、及び得られたICを示す。
【図４１】サイトカラシンD、R281及びZDONコントロールスクラッチ（screatch）アッセイの結果、及び市販の抗体CUB7402スクラッチアッセイの結果。WI-38細胞を用いてスクラッチ傷アッセイ（scratch wound assay）を実施し、該細胞をまいて一晩増殖後、これを無血清培地で洗浄し、Essen Wound Makerを用いてスクラッチ傷を作製した。培地を除去し、コントロール及び試験抗体を含む無血清培地95 μl/ウェルと交換した。プレートをEssen Incycteに置き、Incucyteソフトウェアを用いて傷の閉鎖（closure）を分析した。コントロールサイトカラシンD、R281及びZ-Don（パネルA）、並びに市販の抗体CUB7402及びサイトカラシン（パネルB）について、相対傷密度を時間に対してプロットした。
【図４２】ヒト化BB7スクラッチアッセイの結果。WI-38細胞を用いてスクラッチ傷アッセイを実施し、該細胞をまいて一晩増殖後、これを無血清培地で洗浄し、Essen Wound Makerを用いてスクラッチ傷を作製した。培地を除去し、コントロール及び試験抗体を含む無血清培地95 μl/ウェルと交換した。プレートをEssen Incycteに置き、Incucyteソフトウェアを用いて傷の閉鎖を分析した。ヒト化hBB001AA及びコントロールサイトカラシンD（パネルA）、並びにhBB001BB及びコントロールサイトカラシンD（パネルB）について、相対傷密度を時間に対してプロットした。
【図４３】ヒト化AB1スクラッチアッセイの結果。WI-38細胞を用いてスクラッチ傷アッセイを実施し、該細胞をまいて一晩増殖後、これを無血清培地で洗浄し、Essen Wound Makerを用いてスクラッチ傷を作製した。培地を除去し、コントロール及び試験抗体を含む無血清培地95 μl/ウェルと交換した。プレートをEssen Incycteに置き、Incucyteソフトウェアを用いて傷の閉鎖を分析した。ヒト化hAB005及びコントロールサイトカラシンDについて、相対傷密度を時間に対してプロットした。
【図４４】キメラDC1スクラッチアッセイの結果。WI-38細胞を用いてスクラッチ傷アッセイを実施し、該細胞をまいて一晩増殖後、これを無血清培地で洗浄し、Essen Wound Makerを用いてスクラッチ傷を作製した。培地を除去し、コントロール及び試験抗体を含む無血清培地95 μl/ウェルと交換した。プレートをEssen Incycteに置き、Incucyteソフトウェアを用いて傷の閉鎖を分析した。キメラ抗体cDC001及びコントロールサイトカラシンDについて、相対傷密度を時間に対してプロットした。
【図４５】BiacoreによるcAB003固定化抗体とのヒトTG2結合。25、50、100及び200 nMでcAB003をコーティングしたバイオセンサー（50 nMを2連で含む）上でのヒトTG2インジェクションの結合フェーズ（association phase）を左に示す。同一実験から、右に示すように、2つの長期の解離フェーズ（dissociation phase）が集められた。適合を黒い実線として示し、結果を表25に示す。
【図４６】BiacoreによるhAB004固定化抗体とのカニクイザルTG2結合。25、50、100、200及び400 nMでhAB004をコーティングしたバイオセンサー（50 nMを2連で含む）上でのカニクイザルTG2インジェクションの結合フェーズを左に示す。同一実験から、右に示すように、2つの長期の解離フェーズが集められた。適合を黒い実線として示し、結果を表26に示す。
【図４７】カルシウム不在下、BiacoreによるcDH001固定化抗体とのヒトTG2結合。25、50、100及び200 nMでcDH001をコーティングしたバイオセンサー（50 nMを2連で含む）上でのヒトTG2インジェクションの結合フェーズを左に示す。同一実験から、右に示すように、2つの長期の解離フェーズが集められた。適合を黒い実線として示し、結果を表25に示す。
【実施例】
【０４０４】
実施例1：3つの特異的阻害エピトープの同定を用いた、ヒトでの治療的使用に適したTG2阻害抗体の開発
2型トランスグルタミナーゼ（TG2）は、隣接するペプチド又はタンパク質（細胞外マトリックス（ECM）のものを含む）間のε-（γ-グルタミル）-リジン イソペプチド結合の形成を触媒する。細胞外TG2の上昇は、組織瘢痕化及び線維症の基礎となる、ECM沈着の加速及びクリアランスの低下を導く。また、それは、セリアック病、神経変性障害、及びある種の癌とも関連する。トランスグルタミナーゼを阻害する化合物が多数開発されているものの、これらはいずれもTG2に対して特異的でなく、全てのトランスグルタミナーゼをある程度阻害する。これらは、これらの病状におけるTG2の役割について概念研究の証明を可能にしているものの、アイソフォーム特異性の欠如により、それらのヒトへの適用が妨げられている。これに対処するため、我々は、TG2活性のみを阻害する、高親和性のTG2特異抗体の開発を試みた。
【０４０５】
ヒトTG2コアのアミノ酸143〜473を包含する組換えタンパク質を大腸菌にて作製し、リフォールディングし、100 μgを4匹のマウスに注入し、2、5、7及び10週目にブーストした。最後のブーストから4日後に脾臓を回収し、脾細胞をSp2/0-Ag-14ミエローマ細胞と融合した。75のハイブリドーマ上清がTG2に対して特異性を示した。これらのハイブリドーマ上清を、100 μgのTG2を含有するプトレシン取込みアッセイにて、TG2活性を阻害する能力についてスクリーニングした。10のTG2特異的上清が、阻害性であった。その後、これらをダブルクローニングした。TG2フラグメントライブラリーをスクリーニングするためにファージディスプレイを用いて、TG2コアドメイン中の正確なエピトープに各抗体をマッピングし、3つの別個の阻害エピトープを決定した。100 ngのTG2由来の活性を50％低下する抗体量を決定した。
【０４０６】
2つの最も有効な抗体AB1及びDC1は、アミノ酸304〜327と結合し、1 ngの組換えTG2あたり、1.1×10-5 mg/ml IgGのIC50を有した。AB1及びDC1の適用により、ヒトHep2G細胞においてはTG2を首尾よく阻害でき、培地に適用した場合にはヒトHK-2細胞において細胞外TG2を阻害できた。
【０４０７】
従って、TG2コアドメインでマウスを免疫することにより、驚くべきことに、触媒コア内の以前には未報告のエピトープを標的とするモノクローナル抗体の作製が可能であった。これらの抗体は特異的であり、TG2活性を効果的に阻害し、in vivo適用に適している。
【０４０８】
材料及び方法
トランスグルタミナーゼ2触媒コアドメインの作製
ヒトTG2の触媒コアドメイン（TG2の残基Cys 143〜Met 473）を発現し、リフォールディングし、精製して、マウスでの免疫を可能にした。触媒コアドメイン（PCRセンスプライマーGCG CGC GCT AGC TGC CCA GCG GAT GCT GTG TAC CTG GAC、アンチセンスGCG CGC AAG CTT CAT CCC TGT CTC CTC CTT CTC GGC CAG）を発現ベクターpET21a（+）にクローニングし、E. coli株BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL（Agilent Technologies）中、不溶性の封入体として発現した。簡単に述べると、50 μlのコンピテントBL21（DE3）pLysS細胞を、1 μlの発現プラスミド（30 ng/μl）で形質転換し、選択的抗生物質（100 μg/ml アンピシリン、34 μg/ml クロラムフェニコール）及び1％グルコースを含むLB寒天プレート上にまき、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーをピックアップして、37℃、200 rpmでのシェイキングインキュベーター中、100 μg/ml アンピシリン、34 μg/ml クロラムフェニコール及び1％グルコースを含む新しいLB培地10 mlに播種した。一晩増殖後、1％グルコースを有する2×YT培地100 mlに培養物を移し、OD600nm＝0.8まで増殖させ、次いで、OD600nmが再度0.8に達するまで、1 Lの2×YT培地に移した。発現を刺激するために1 mMのIPTG下、4時間誘導後、ペレット化し、バッファーA（10 mM Tris；1 mM EDTA；10 mM DTT；1 mM PMSF；0.5 mg/ml リゾチームプロテアーゼインヒビタータブレット（Roche）、pH 8.0）中、超音波処理により細菌を溶解した。40,000×gでの遠心分離により封入体を集め、洗浄バッファーB（50 mM Tris；1 mM EDTA；10 mM DTT；2％デオキシコール酸ナトリウム、pH 8.0）で3回洗浄後、最後に脱イオン水で洗浄した。
【０４０９】
3.5 mlの再可溶化バッファー（40 mM Tris-HCl、8 M 尿素、及び10 mM DTT pH12）中、封入体を可溶化し、リフォールディングバッファー（40 mM Tris HCl；150 mM NaCl；20％グリセロール；5 mM システイン；0.5 mM シスチン pH 8）中、暗所、4℃にて16時間の期間にわたりリフォールディングした。
【０４１０】
再可溶化した封入体を1 mlのニッケルカラム上にロードした。簡単に述べると、結合バッファー（40 mM Tris；300 mM NaCl；10 mM イミダゾール）でカラムを予め平衡化し、封入体を適用した。カラムを広範囲に（extensively）洗浄した（40 mM Tris；300 mM NaCl；30 mM イミダゾール）。高濃度イミダゾールバッファー（40 mM Tris；300 mM NaCl；300 mM イミダゾール）により組換えタンパク質を溶出した。フラクションを含む溶出タンパク質をプールし、適切なバッファー（40 mM Tris；300 mM NaCl pH 8）に対して一晩透析した。Bradfordプロテインアッセイを用いて、タンパク質を評価した。
【０４１１】
HepG2細胞培養及び溶解物
HepG2細胞は、Richard Ross（University of Sheffield）により供与された。10％ウシ胎児血清（FCS）、100 IU ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン（全てGIBCO）を補充した、DMEM/グルコース1リットルあたり4.5 g中、37℃、5％CO2の95％湿潤大気にて、細胞をルーチン的に増殖させた。10 cmのディッシュに200万個の細胞を播種し、48時間増殖させた。250 μlのSTEバッファー（プロテアーゼインヒビター フッ化フェニルメチルスルホニル（1 mM）、ベンズアミジン（5 mM）及びロイペプチン（10 μg/ml）を含有する、0.32 M スクロース、5 mM Tris、1 mM EDTA）に細胞を溶解し、氷上で超音波処理して、TG2活性アッセイに使用可能な細胞溶解物を作製した。
【０４１２】
ヒト腎臓2（HK2）細胞：
HK-2細胞（腎臓近位尿細管上皮）は、継代3代目にてEuropean cell culture collectionから購入した。組換えEGF（0.1〜0.2 ng/ml）及びウシ脳下垂体抽出物（20〜30 ug/ml）を補充した、L-グルタミンを有するケラチノサイト無血清培地（KSFM, Gibco 17005-042）中、37℃、5％CO2の95％湿潤大気にて、細胞をルーチン的に増殖させた。継代のために、培地を除去し、1×PBSで1回洗浄した後、1 mlの0.25％トリプシン/EDTA（T75 flask）で37℃、1分間トリプシン処理した。10 mlのKSFMに細胞を再懸濁し、400 gで1分間遠心分離した。培地を除去し、細胞をKSFM中にまいた（1：3〜1：5の分割が通常）。5〜14継代にて細胞を実験的に使用した。細胞は典型的には、95％コンフルエントまで十分に増殖した。
【０４１３】
クマシー染色及びウエスタンブロッティング
10％（w/v）ポリアクリルアミド変性ゲル上に回収タンパク質5 μgを流し、Coomassie Brilliant Blue R染色溶液（Sigma）で染色することにより、組換えタンパク質の純度を確認した。
【０４１４】
TG2コアタンパク質合成の確認、並びに免疫後のTG2及びTG2コア反応性レベルは、全てウエスタンブロッティングにより測定した。組換えタンパク質（10〜80 ng）を、必要に応じて、10％（w/v）ポリアクリルアミド変性又は非変性ゲルにロードし、100 Vで1時間、PVDFメンブレン（Transblot SD, Biorad, UK）上に移した。TBS/0.1％（v/v）Tween 20中3％（w/v）BSAを用いて、メンブレンを4℃で一晩ブロッキングした。次いで、メンブレンを洗浄し、1％BSA含有TBS/Tween中のモノクローナルマウス抗トランスグルタミナーゼ抗体でプローブした。組換えTG2コアタンパク質を確認するため、且つ抗体スクリーニングのためのポジティブコントロールとして、市販の抗体Cub7402（neomarkers）を1：1000希釈で使用した。抗マウスγ鎖-HRP結合二次抗体（Sigma, Poole, UK）を用いて、一次抗体の結合を検出した。ECLケミルミネッセント検出システム（Amersham, UK）を用いてバンドを可視化した。
【０４１５】
マウス免疫及び融合体
50 μgの抗原（滅菌PBSで50 μlの体積に作製）と50 μlの完全フロイントアジュバントとの混合物で各マウスを免疫した。4匹（8〜12週齢）のBALB/Cマウスに注射した。2回のブースト免疫を、これらの注射に不完全フロイントアジュバントを使用した以外は同じ手順を用いて実施した（14日目及び35日目）。45日目に、全ての動物から試験血を採取し、ELISAによりTG2との反応性について評価した。
【０４１６】
10週目に、2匹の最良のレスポンダーを、不完全フロイントアジュバントと再度混合した100 μgのコアタンパク質（PBS中）の注射により更にブーストし、4日後、脾細胞の回収とSp2/0-Ag-14ミエローマ細胞との融合体のために、動物を犠死した。この融合体から、ELISAにより、およそ1000ウェルをTG2タンパク質に対する反応性についてスクリーニングした。
【０４１７】
TG2特異性についてのスクリーニング
トランスグルタミナーゼファミリーメンバーに対する反応性について、馴化培地又は精製IgGを試験した。各トランスグルタミナーゼ（TG1、TG2、TG3、TG5、TG7及び第XIIIa因子；全てZedira）と結合するそれぞれの能力を、プレート結合アッセイを用いて測定した。50 μlの0.1 M 重炭酸塩/炭酸塩バッファー（pH 9.6）中の組換えTG（Zedira, Darmstadt, Germany）でマイクロタイタープレート（Costar, Cambridge, UK）を4℃、一晩コーティングした。3％w/v BSA含有PBS（200 μl）でプレートを37℃、2時間ブロッキングした。0.05％Tween 20含有PBS（洗浄バッファー）でプレートを3回洗浄し、100 μlの希釈馴化培地（1：5〜1：20希釈）又は精製抗TG2触媒コアmAbを添加した。プレートを室温でさらに1時間インキュベートした。洗浄工程を繰り返し、0.05％ Tween20（v：v）及び1％ BSA（w：v）（Sigma, Poole UK）含有PBS中の抗マウスγ鎖-西洋ワサビペルオキシダーゼ（1：5000）を1時間添加した。8回洗浄後、50 μlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン基質を用いて結合を明らかにした。25 μlの0.1 M H2SO4を添加することにより反応を停止し、450 nmでの吸光度を測定した。
【０４１８】
TG2阻害についてのスクリーニング
3H-プトレシンのN’,N’-ジメチルカゼインへのCa2+依存性の取込みによりTG活性が測定される。反応開始前に、組換えヒトTG2（100 ng）を、試験サンプル（馴化培地又は精製IgG）とともに室温で20分間予めインキュベートした。25 μlの反応混合物（5 μlの25 mM CaCl2、5 μlの40 mM ジチオスレイトール、5 μlの3H-プトレシンミックス、及び10 μlの25 mg/mlのN,N’ ジメチルカゼイン）（非酵素コントロールについては、25 mM CaCl2を100 mM EDTAと置き換える）を添加して反応を開始し、サンプルを37℃で最大1時間までインキュベートした。3 MM Whatmanフィルターペーパー片上に10 μlのアリコートをスポットし、氷冷10％トリクロロ酢酸（TCA）中にすぐに入れ（plunged）、典型的には、0、10、30及び60分間の時間にて、反応物へと架橋タンパク質を沈殿させた。氷冷5％TCA中で3回広範に洗浄し、それに続いて氷冷95％エタノールで3回すすいだ後、空気乾燥したフィルターを、2 mlのシンチレーション液（Ultima Gold Packard, Perkin Elmer）中でカウントした。反応速度を計算した。1 TG単位は、37℃、1時間あたり、1 nmolのプトレシンの取込みに相当する。
【０４１９】
25 μlの組換えタンパク質を25 μlの細胞溶解物と置き換えることにより、同じプロトコルを用いて、細胞溶解物におけるTG阻害を評価した。
【０４２０】
ハイブリドーマクローニング、及び馴化培地からの抗体精製
クローニングした阻害ハイブリドーマからモノクローナル抗体の単離を開始した。最初に同定したハイブリドーマウェルを、ELISA及び活性スクリーニングによって記載されるように試験したサブクローンを用いて、常法（Loirat MJ et al, 1992）に従い、限界希釈プロセス（安定性及びクローン性を確保するため）によりダブルクローニングした。選択した抗体産生クローンを25及び75 cm2フラスコ中で増殖（expand）し、無血清培地（Hyclone, Fisher Scientific, Loughborough, UK）を与えた。細胞が増殖した際に、プロテインGカラム（Amersham Life Sciences）でのアフィニティクロマトグラフィーを用いたIgG精製のために馴化培地を集めた。馴化培地を等量の10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.25）で希釈し、1.0〜2.0 ml/分の流速でプロテインGカラムに適用した。10カラム体積の同一バッファーでカラムを広範に洗浄した。結合抗体をグリシン溶液（0.1 M；pH 2.7）で溶出し、0.15％体積の1M Tris/HCl pH 9により中和した。1000倍体積（1000 volumes）のリン酸緩衝生理食塩水に対し、サンプルを24時間、2回バッファー交換して透析した。
【０４２１】
抗体エピトープのファージディスプレイマッピング
ヒトTG2の全長コーディング配列を、以下のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅した；TG2-FL-1 5’ ATGGCCGAGGAGCTGGTCTTAGAGA 3’及びTG2-FL-2 5’ GGCGGGGCCAATGATGACATTCCGGA 3’。およそ2 kbの増幅産物をQuiagen PCRクリーンアップキット（Qiagen）を用いて精製し、RQ DNAse I（Promega）を用いてランダムなフラグメントに消化した。RQ DNAse反応を、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント及びT4 DNAポリメラーゼで処理して、平滑末端フラグメントを生成した。これらをゲル電気泳動により精製し、50〜150 bpの範囲のフラグメントをQiagenゲルリカバリーキット（Qiagen, Crawley UK）を用いて抽出した。
【０４２２】
ファージディスプレイベクターをEcoRVで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、ゲル電気泳動及びQiagenゲルリカバリーキットにより精製した。100 ngの精製ベクターを、調製したヒトTG2 cDNA平滑フラグメント15 ngとライゲーションした。結果として得られたライゲーションをXL1-Blueエレクトロコンピテントセル（Agilent Technologies）にエレクトロポレーションし、フラグメントライブラリーをVCSM13ヘルパーファージ（Agilent）でレスキューした。ファージ粒子を2％グルコース及び4％PEG 6000で沈殿し、PBS 0.1％Tween 20（v：v）1％BSA（w：v）中に再懸濁した。
【０４２３】
以下の手順を用いてエピトープマッピングを実施した。100 μlのコーティングバッファー中30 μgのモノクローナル抗体を用いて、ELISAウェルを4℃で一晩コーティングした。コーティングウェルをPBS/Tweenで洗浄し、PBS中3％BSA（w：v）（400 μl）で室温、1時間ブロッキングした。およそ1010のファージ粒子（100 μl）をブロッキングしたウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。400 μlのPBS/0.5％Tween（v：v）でウェルを8回洗浄し、0.2 Mグリシン（pH 2.2）で付着ファージを溶出した。溶出したファージを用いて、1 mlのXL1-Blue宿主を感染させ、サンプルをLB寒天（60 μg/ml アンピシリン、15 μg/ml テトラサイクリン）上にまき、残りの宿主は100 mlのLB培地（60 μg/ml アンピシリン、15 μg/ml テトラサイクリン）に添加し、シェイキングインキュベーター中、200 rpm、37℃で一晩増殖させて、選択したフラグメントの濃縮（enriched）ライブラリーを生成した。この濃縮プロセスを5回繰り返し、最終ラウンドからランダムコロニーをシークエンシングのために選択した。
【０４２４】
抗体VL領域の配列の決定
プライマー
重鎖センスプライマー - VH遺伝子を増幅するため、一対の高縮重（highly degenerate）FR1プライマーMH1及びMH2（Wang et al 2000）を、3つの定常領域プライマーと組み合わせた。
MH1  5’ CGCGCGCTCGAGSARGTNMAGCTGSAGTC 3’
MH2  5’CGCGCGCTCGAGSARGTNMAGCTGSAGSAGTC 3’
マウス-G1  5’ AGGCGCAGTACTACAATCCCTGGGCACAATTTTCTTGTCCACC 3’
マウス-G2a  5’ AGGCGCAGTACTACAGGGCTTGATTGTGGGCCCTCTGGG 3’
マウス-G2b  5’ AGGCGCAGTACTACAGGGGTTGATTGTTGAAATGGGCCCG 3’
【０４２５】
κプライマー
VK1  5’ CGCTGCGAGCTCGATATTGTGATGACBCAGDC 3’
VK2  5’ CGCTGCGAGCTCGAGRTTKTGATGACCCARAC 3’
VK3  5’ CGCTGCGAGCTCGAAAATGTGCTCACCCAGTC 3’
VK4  5’ CGCTGCGAGCTCGAYATTGTGATGACACAGTC 3’
VK5  5’ CGCTGCGAGCTCGACATCCAGATGACACAGAC 3’
VK6  5’ CGCTGCGAGCTCGAYATTGTGCTSACYCARTC 3’
VK7  5’ CGCTGCGAGCTCGACATCCAGATGACYCARTC 3’
VK8  5’ CGCTGCGAGCTCCAAATTGTTCTCACCCAGTC 3’
K-CONST  5’ GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA 3’
【０４２６】
Trizol（GIBCO）を用いて、製造者のプロトコルに従って、モノクローナルハイブリドーマ細胞（〜105細胞）からトータルRNAを抽出し、A260nmにより定量化した。ImProm II逆転写酵素（Promega）及びランダムヘキサマープライマーを用いてcDNAを合成した。反応ミックスは以下のとおりであった；1 μgのトータルRNA、0.1 μgのオリゴ（dN）6、12 μlのImProm IIバッファー、1 μlの10 mM dNTPs（Promega）、8 μlの25 mM MgCl2、4 μlのImProm II逆転写酵素（Promega）、DEPC処理H2O（全反応体積が60 μlとなるまで）。RNA及びランダムプライマーミックスを70℃まで10分間加熱し、次いで、氷上に置いた。残りの反応成分を添加し、次いで20℃で10分間、次いで40℃でさらに40分間インキュベートした。
【０４２７】
GoTaqポリメラーゼ（Promega）を用いて、VH及びVK遺伝子の増幅を実施した。それぞれ50 μlの反応物は以下を含有した；cDNA 2 μl、20 pmolのセンス及びアンチセンスプライマー、10 μlのGoTaq反応バッファー、1 μlの10 mM dNTPs、5 μlの25 mM MgCl2、2.5 uのGoTaqポリメラーゼ、H2O（最終体積50 μlまで）。以下の条件を用いて、反応を35サイクル行った：最初の変性95℃ 2分間；変性94℃ 1分間、アニーリング56℃ 1分間、伸長72℃ 1分間。ゲル電気泳動によりPCR産物を分析し、TOPO TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングした。重鎖及び軽鎖PCR産物のランダムミニプレップをシークエンシングのために選択した。
【０４２８】
細胞外TG活性の測定
改変細胞ELISA（modified cell ELISA）により細胞外TG活性を測定した。0.1M EDTA又は0.25％トリプシン/EDTAを用いてHK-2上皮細胞を採取し、100 μl/ウェルのフィブロネクチン（50 mM Tris-HCl pH 7.4中、5 μg/ml）（Sigma, Poole UK）で一晩コーティングしておいた96ウェルプレート上、無血清培地中8×104細胞/ウェルの密度でまいた。0.1 mMのビオチンカダベリン［N-（5 アミノ ペンチル ビオチンアミド）トリフルオロ酢酸］（Molecular Probes, Eugene OR, USA）の存在下、細胞を37℃、2.5時間接着させた。3 mM EDTA/PBSでプレートを2回洗浄し、5 mM EDTA/PBS中0.1％（w/v）デオキシコレートを用いて細胞を除去した。上清を集め、タンパク質定量（protein determination）のためにこれを使用した。プレートを50 mM Tris-HClで洗浄し、1：5000のエクストラビジン（extravidin）HRP（Sigma, Poole, UK）を室温で1時間、それに続いてTMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン）基質を用いて、取り込まれたビオチンカダベリンを明らかにした。50 μlの2.5 M H2SO4で反応を停止し、吸光度を450 nmで読んだ。
【０４２９】
放射性標識によるコラーゲンレベルの測定
細胞を、10 cm2のペトリディッシュあたり3.75×106の密度、又は6ウェルプレートの1ウェルあたり1×106の密度で播種した。20 iCiの3,4Hプロリン（1.0 mCi/ml、ICN）で標識することによりECMコラーゲンを評価した。標識は、標準的な細胞培養条件下、72時間実施した。標識後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、50 mM Tris pH 7.4中0.25 M水酸化アンモニウム2 mlを用いて、37℃、10分間取り除いた。可溶性画分を集め、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。増加体積のPBSでディッシュを広範に洗浄した後、50 mM Tris pH 6.8中2.5％（w/v）SDS（2 ml）でECMを可溶化した。ECMの完全な除去を確実にするためにディッシュをスクレイプし、βシンチレーションカウンターにおいて、200 ilを放射活性について測定した。可溶化細胞タンパク質1 mgあたりにカウントを補正し、平均コントロール値のパーセンテージとして表した。
【０４３０】
組換えラット化Quark IgGの作製
実験目的のために、ヒト2型トランスグルタミナーゼ抗体の「ヒト」一本鎖Fv配列からヒト-ラットキメラ抗体を作製した。該抗体はQPCDTGII（QCTと略記）と称され、可変領域の配列は、WO 2006/100679A2で利用可能である。
【０４３１】
重鎖定常領域のためにラットγ2aサブクラスを選択し、ラット試験動物においてADCC反応の可能性を低くするためにグリコシル化部位を除去した。重鎖について、選択したラット正常領域は、Kabatデータベース（Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest.（NIH National Technical Information Service, 1991））の013593（Bruggemann, M. Gene 74：473-482（1988）；Bruggemann, M., Free, J., Diamond, A., Howard, J., Cobbold, S. and Waldmann, H. Proc. Natl. Acad. Sci USA 83：6075-6079（1986））であった。κ軽鎖についてのものは、Kabatの013718（Sheppard, H. W. and Gutman, G. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：7064-7068（1981））であった。
【０４３２】
簡単に述べると、重鎖及びκ鎖コーディング配列をDNA合成により作製した（コドン使用頻度（codon usage）は哺乳動物コドンバイアスに適合させた）。
【０４３３】
重鎖遺伝子合成産物を、プライマーQCT_HindIII及びQCT_H_revを用いたPCRにより増幅した。PCR産物をHindIII及びNgoMIVで切断し、MRCT発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション産物により化学的に形質転換したコンピテントDH5α細菌のクローンを、プライマーHCMVi及びrat_gamma1を用いてPCRスクリーニングした。予測サイズのPCR産物を生成した3つのクローンを配列決定した。
【０４３４】
κ鎖遺伝子合成産物を、プライマーQCT_HindIII及びQCT_L_revを用いたPCRにより増幅した。PCR産物をHindIII及びPpuMIで切断し、発現ベクターpKN100にライゲーションした。ライゲーション産物により化学的に形質転換したコンピテントDH5α細菌のクローンを、プライマーHCMVi及びrat_kappaを用いてPCRスクリーニングした。予測サイズのPCR産物を生成した3つのクローンを配列決定した。
【０４３５】
重鎖及びκ鎖の両方をコードするダブルインサート発現ベクターを作製し、HEK293T細胞にトランスフェクトした。2つのラージスケールHEK293Tトランスフェクション由来の細胞培養上清をプールし、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステムを用いて、製造者のプロトコルに従い、1 mlのプロテインL-アガロースカラムでアフィニティ精製した。単一のOD 280 nmピークをIgG溶出バッファーで溶出し、PBSを2回交換して透析した。これを、280 nmでのUV吸光度と、ラットIgG2aELISAとの両方により分析した。全収率は、およそ700 μg（OD280nmによる）；303.5 μg（ELISAによる）であった。
【０４３６】
AB1抗体のヒト化
ヒトVH及びVK cDNAデータベース
International Immunogenetics Database 2009101、及びSequences of Proteins of Immunological InterestのKabatデータベースリリース5（ラストアップデート17-Nov-1999）102のヒト及びマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を用いて、Kabatアライメントにおいてヒト免疫グロブリン配列をデータベース化した。我々のデータベースは、10,606のVH配列及び2,910のVK配列を含む。
【０４３７】
AB1の分子モデル
マウス抗体AB1可変領域のホモロジーモデルは、オートマティックモードで操作されるModellerプログラム103を用いて計算されている。1 MQK.pdb、3LIZ.pdb及び1MQK.pdbの原子座標は、Accelrys抗体pdb構造データベースのBlast分析により決定されるように、それぞれ、インターフェース（Interface）、VL及びVHに対して最も高い同一性の配列鋳型であった。これらの鋳型を用いて20の最初のモデルを作製し、それらのうち最良のものを、その3つの最良のループ鋳型を用いて各CDRループをモデリングすることにより精製（refined）した。
【０４３８】
hAB1フレームワークセレクション
配列分析プログラムgibsSRを用いて、様々な選択基準を使用して、AB1 VHc、VKc及びVKc1タンパク質配列とともにヒトVH及びVKデータベースを調べた。マウス抗体AB1のホモロジーモデルにおいて、CDR残基の5Å内のFW残基（Kabat定義）を同定し、「5Å近接（Proximity）」残基と表した。
【０４３９】
最初のヒト化AB1 VHc構築物の基となるFWとしてAF06220を選択した。表1は、AF06220のマウス（murine）Ab1とのアライメント及び残基同一性（residue identity）を示す。表2は、配列の5Å近接エンベロープ（envelope）を示す。AF062260は、その生殖細胞系列VH遺伝子Z12347から離れて、体細胞変異を1つのみ有する（表3）。
【０４４０】
最初のヒト化AB1 VKc構築物の基となるFWとしてAY247656を選択した。マウス（murine）AB1とのアライメント及び残基同一性を表4に示す；表5は、配列の5Å近接エンベロープを示す。該配列は、その生殖細胞系列VK遺伝子X93620から、5つの体細胞変異を示す（表6）。
【０４４１】
最初のAB1 VKc1構築物の基となるFWとしてAF193851を選択した。マウス（murine）AB1とのアライメント及び残基同一性を表7に示す。表8は、配列の5Å近接エンベロープを示す。該配列は、その生殖細胞系列VK遺伝子J00248から、いずれの体細胞変異も示さない（表9）。
【０４４２】
結合ELISA
異なるヒト化重鎖ベクターと関連する異なるヒト化軽鎖ベクターの組み合わせを用いてHEK 293F細胞を共トランスフェクトした。組換えヒトTG2を用いて、ELISAにより抗体結合を測定した。結果から、軽鎖バージョンRKE及びRKJ（表11）（ヒト化された異なる軽鎖バージョンを表す）のいずれかと組み合わせた重鎖バージョンRHA（表10）が、最適な結合を示したことが示された（図16）。
【０４４３】
重鎖バージョンRHAは、ヒトドナー配列上における、AB1抗体のマウスCDR領域の非修飾グラフトである。しかしながら、軽鎖バージョンRKE及びRKJはともに、同じ単一の5Å近接残基逆突然変異F72（Kabatナンバリング - 緑で示す）を有する。この逆突然変異は、バーニア（Vernier）104、カノニカル（Canonical）105又はインターフェース（Interface）106残基の外側に位置する（表11を参照）。
【０４４４】
101. Lefranc, M.P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database(R). Nucleic Acids Res. 31, 307-310 (2003).
102. Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S. & Foeller,C. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH National Technical Information Service, (1991).
103. Eswar, N. et al. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr. Protoc. Bioinformatics. Chapter 5: Unit 5.6., Unit (2006).
104. Foote, J. & Winter, G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol. Biol. 224, 487-499.
105. Morea, V., Lesk, A. M. & Tramontano, A. (2000). Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20, 267-279.
106.Chothia, C., Novotny, J., Bruccoleri, R. & Karplus, M. (1985). Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol. Biol. 186, 651-663.
【０４４５】
表
【０４４６】
【表１−２】
0006411998.tif 000070
【０４４７】
【表２】
0006411998.tif 000071
【０４４８】
【表３】
0006411998.tif 000072
【０４４９】
【表４】
0006411998.tif 000073
【０４５０】
【表５】
0006411998.tif 000074
【０４５１】
【表６】
0006411998.tif 000075
【０４５２】
【表７】
0006411998.tif 000076
【０４５３】
【表８】
0006411998.tif 000077
【０４５４】
【表９】
0006411998.tif 000078
【０４５５】
【表１０】
0006411998.tif 000079
【０４５６】
【表１１】
0006411998.tif 000080
【０４５７】
結果
rh TG2コアタンパク質の作製
TG2分子上の好適な部位というよりむしろTG2活性に重要なエピトープを標的にする可能性が高い抗体の作製を強いるために、全長TG2分子よりもむしろTG2触媒コアでマウスを免疫した。組換えTG2ドメインを作製するために、塩基329〜1419に走るPCR構築物を作製し、Pet21+（a）ベクターに挿入した（図1A）。BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL細菌におけるこのベクターの挿入及び発現により、触媒コア全体を包含するアミノ酸143〜473にわたる不溶性タンパク質の生成がもたらされた。このタンパク質を可溶化し、40 mM Tris HCl；150 mM NaCl；20％グリセロール；5 mM システイン；0.5 mM シスチン（pH 8）中でリフォールディングした。これ（10 ng）を非還元ポリアクリルアミドゲルに流し、ウエスタンブロッティングし、CUB7402でイムノプローブした。クリアなバンドが37 kDaで見え、これは、TG2コアの予測サイズと一致する（図1B）。より大きなバンドもCUB7402と免疫反応性を示したが、これらは、還元ゲルを流した場合には存在しなかったことから（データ示さず）、コアタンパク質の凝集体を示す可能性が高い。
【０４５８】
免疫及び融合体
4匹のマウスを50 μgのrhTG2コアで免疫した。免疫からおよそ5及び9週間後に、各マウスから血清サンプルを採取し、血清の段階希釈を用いて、ELISAによりrh TG2に対する反応性を試験した。全てのマウスは、rhTG2コアに対し、使用した最も高い希釈率（1：51 000）においてさえ強い免疫反応を示した（図2A）。抗体が全長TG2も認識し得るか確認するために、rhTG2及びrhTG2コアタンパク質を非変性ゲルに流し、ウエスタンブロッティングし、1：1000希釈したマウス血清でイムノプローブした（図2B）。両方のタンパク質に対して最も強い反応性を有したマウス（マウスC）をブーストし、University of Sheffield’s Hybridoma service, Bioservを用いた融合体のために脾細胞を回収した。
【０４５９】
ポジティブハイブリドーマの選択及びクローニング
Bioservにより最も高いポジティブとして選択された400のハイブリドーマウェルのうち、109由来の上清が、TG2に対して持続的反応性を示したが、ELISAで試験した場合、他のキーとなるTGファミリーメンバーと反応しなかったのは34のみであった（図3Aに代表例を示す）。TG2に対して特異的であったそれらについて、3H-プトレシン取込みアッセイにより、100 ngのTG2に起因するTG2活性を阻害する能力について上清をスクリーニングした（図4）。この最初のスクリーニングにより、10のハイブリドーマ上清が、TG2活性を阻害できたことが示された（AB1；DC1；BB7；EH6；DH2；DD9；JE12；AG9；AH3；DF4）。10のうち9は、限界希釈法により首尾よくクローニングされた。クローンDF4については、クローニング後にクローンが単離されたものの、それらは阻害性であるように見えなかった。クローニング後、クローニングした各ハイブリドーマからIgGを精製し、TG2に対する選択反応性について再試験した（図3B）。
【０４６０】
TG2阻害可能性
クローニングした各ハイブリドーマについて、そのIgGを、ヒト、ラット及びマウスTG2に対するTG2阻害活性について試験し、1 ngのTG2を阻害するのに必要なIgG量に基づいてIC50を算出した。ヒトTG2に対するIC50値は、最も効果的なAB-1（1.1×10-5 mg/mlのIgG）から最も効果が少ないJE12（12.3 1.1×10-5 mg/mlのIgG）まで、およそ12倍の範囲が存在した（図9；表1）。興味深いことに、ラットTG2に対しては4抗体（DH2、DD9、EH6及びBB7）についてのIC50を測定することしかできず、2.23×10-4 mg/mlのIgGであるIC50を有する最良のDH2は、ヒトTG2に対してよりもおよそ6倍低い活性であり、TG2に対する最良のAB-1阻害剤よりも比較上38倍低い活性であった（図9；表1）。阻害抗体はいずれも、おそらく免疫寛容に起因して、マウスTG2を阻害することができなかった。
【０４６１】
阻害抗体のエピトープのマッピング
TG2のどのエピトープが、TG2に対して阻害性でありつつ、免疫学的に特有であるかを確立するため、且つこれらの10抗体が、同一又は異なる部位を標的としているかどうかを確立するために、ファージディスプレイを用いて各抗体をマッピングした。TG2ファージライブラリーを構築し、各mAbに対してパンニングした。次いで、結合ファージのコンセンサスシークエンシングによりエピトープを決定した。
【０４６２】
AB1、AG1、AH1、BB7、DC1、EH6及びJE12は全て、アミノ酸304〜326を包含し且つ基質結合ポケット内の活性部位の前に位置するように見える（図6）、単一エピトープと全体的又は部分的に結合すると考えられた（図5）。この領域をAB-1部位と称し、この部位を標的とする抗体をGroup 1抗体と称した。
【０４６３】
DF4は、アミノ酸351〜365に達する配列（図5）であって、触媒三残基のAsp 358を包含するコアの前部から後部まで達する配列（図6）を独自に標的とした。これをGroup 2と称した。
【０４６４】
DH2及びDD9は、アミノ酸450〜467にわたる配列と結合した（図5）。これらのGroup 3抗体は、βバレル-1との接合部に近いコア後部の領域と結合し、これをDH2部位と称した。エピトープは、推定カルシウム結合部位を包含する（図6）。
【０４６５】
抗体シークエンシング
各抗体について可変軽鎖配列を確立するために、各阻害ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写し、VH遺伝子を増幅するために、一対の高縮重FR1プライマーMH1及びMH2プライマーを、3つの定常領域プライマーと組み合わせて用いてPCRにより増幅した。
【０４６６】
得られたVH及びVK配列をAB1について図7に示す。
【０４６７】
in vitroにおいてタンパク質混合物中のTG2活性を阻害するAB1の能力
組換えTG2に対して最も強力な阻害抗体はAB1である。治療的に価値あるものであるためには、純粋溶液中でTG2活性を阻害できるだけでなく、複合タンパク質溶液においても、他のタンパク質と多少なりとも関連することなく、TG2活性を阻害できなければならない。これを試験するため、ヒト肝細胞細胞株HepG2のホモジネートを調製した。0.5 μgのAB1を適用すると、TG2活性を70％阻害することができた（図8A）。しかしながら、BB7は、TG2活性を90％ノックダウンする、有意に良好な阻害をもたらした。この溶解物25 μgをAB1でイムノプローブすると、TG2に対応するサイズにて単一の免疫反応バンドを有し、オフターゲットな関連は何ら示されなかった（図8B）。
【０４６８】
細胞外TG2活性を阻害するAB1及びDC1の能力
これらの抗体が細胞系においてTG2活性を阻害し得るかを評価するため。AB1（図10a）及びDC1（図10b）を、培養ヒト腎臓2（HK-2）尿細管上皮細胞に適用し、ビオチンカダベリンアッセイを用いて細胞外TG活性を文政した。培地中4 ng/μlで適用した場合、AB1は60％の活性阻害を達成でき、DC1は55％の活性阻害を達成でき、これは、化学的汎Tg阻害剤1,3-ジメチル-2-［（2-オキソ-プロピル）チオ］イミダゾリウム クロリドを400 μMで適用した場合に匹敵した。
【０４６９】
抗体AB1と他の公知の阻害抗体との比較
他の公知のTG2阻害抗体と比較してAB1の有効性を試験するために、Quark biotechnologyにより特許出願番号WO 2006/100679に記載される抗体のfabフラグメント（図11、12）及び全長IgG（図13、14）の両方を、3Hプトレシン取込みアッセイにおいて、TG2活性を阻害するか試験した。100 ngのヒトTG2由来の活性は、500 ngのAB1により60〜80％阻害され得た。対して、Quark抗体のfabフラグメント又は全長IgGはいずれも、このアッセイにおいて有意にTG2を阻害できなかった。
【０４７０】
考察
実験的な研究によりその関与が示唆されている疾患範囲にわたって、ヒトにおける治療標的としてTG2を検証する明確なニーズが存在する。これらには、組織瘢痕化、セリアック病、神経変性疾患、及びいくつかの癌における化学療法抵抗性が含まれる。ヒトにおいてTG2活性を選択的に阻害できる真のTG2特異的化合物の欠如により、これが制限されている。
【０４７１】
本研究において、我々は、阻害エピトープの探索において、酵素触媒コアに対する広範囲の抗TG2抗体を単離できることを目的として、初めて、TG2フラグメントでマウスを免疫した。これにより、rhTG2コア及び天然TG2の両方を認識し、他のTGを認識しない抗体との良好な免疫反応が引き出された。
【０４７２】
10の単離された抗体が阻害活性を示した。その後、これらをTG2特異的であり、さらに阻害性である3つのエピトープにマッピングした。これらの抗体をクローニングし、配列決定し、IgGを単離し、IC50値を計算した。基質ポケットを標的とする3つの抗体（AB1、DC1及びBB7）が特に効果的な阻害剤であると証明された。最も重要なことに、これらの抗体はまた、細胞溶解物及び細胞培養物の両方において十分に作用したことから、これにより、これらの抗体が、in vivo適用のために重要であるタンパク質に富む環境において機能する可能性があることが示された。
【０４７３】
これら阻害抗体の産生成功におけるキーエレメントは、まさにコアタンパク質で免疫することを決定したことにあると確信する。我々の知る限り、市販のTG2抗体はいずれも、なんらかの意義ある阻害可能性を有さない。全長TG2を使用する我々自身の試みにより多数の抗体がもたらされたが、それらのうちTG2に対して特異的であるものはほとんどなく、阻害性であるものは全くなかった。これは、全長TG2内のタンパク質ループに対する明らかな免疫原性の優先性に起因すると考えられ、それらの多くは、触媒コアの後部に位置し、最も広範に使用される抗TG2抗体CUB7402（aa447 aa478）と類似の位置である。
【０４７４】
驚くべきことに、我々のアプローチによって、非常に効果的な抗体の産生がもたらされている。いずれの理論に拘束されることなく、ちょうど中心のコアをカバーする、より小さなタンパク質に対して抗体を単純に産生することにより、好まれる免疫学的エピトープのいくつかが排除されるだけでなく、コアターゲティングが推し進められると考えられる。これ単独により、選択に利用可能な抗体の多様性が増加し、従ってより広いコアの範囲が増加する。しかしながら、ちょうどコアで免疫することは、コアフォールディングの大部分が失われることを意味し、従って、TG2分子全体内ではおそらくあまり利用され得ないエピトープのいくつかが、このフォーマットにおいては、コア内のより魅力的なエピトープであり得る。免疫原として全長TG2を用いて以前に単離した抗体の80％がコンフォメーション依存性であった一方、10の抗体全てが直鎖状エピトープを認識した（すなわち、還元ゲル上でTG2と結合した）ことを考慮すると、これが主要な因子であり得ることが示唆される。
【０４７５】
TG2阻害抗体をヒトに適用するという考えを前提とした他の研究は以前に存在した。Espositoらは、TG2抗体が阻害的役割を有し得ることを前提とし、セリアック病患者から組換え抗体を開発した［19］。これら抗体のうちの一つは、Quark Biotechnologyにより商用アプリケーションのために開発され、特許出願された（WO 2006/100679）。この抗体により、ラットUUOモデルにおいて、腎線維症の予防におけるいくつかの刺激的な初期データが実証された。しかしながら、我々がこの抗体の組換えバージョンを作製したところ、これはELISA（図17）及びウエスタンブロットにおいてTG2と反応したものの、この抗体については、TG2 1 ngあたり最大で500 ngのIgG（これにおいては、本研究で開発された抗体全てが、実質的に全てのTG2活性をブロックする）でもほとんど阻害は達成されなかった。さらに、WO 2006/100679は、このヒト抗体のマウスバージョンの作製を記載しており、それ自体、認められている腎臓疾患ラットモデルにおいて、長期の適用が難しいことを証明している。
【０４７６】
本研究において注目すべきは、TG2コア内の3つの阻害エピトープのマッピングである。AB1エピトープは、標的に対し群を抜いて強力であり、エピトープの位置を考慮すれば、これは驚きかもしれない。予測されるTG2活性構造内その位置の検証により［20］、それが、基質ポケットであり得る触媒三残基とエントリーポートで結合することが示唆される。我々のスクリーニングアッセイで使用した基質が比較的小さい（プトレシン及びジメチルカゼイン）ことを考慮すると、この部位が非常に効果的であることは驚きかもしれない。しかしながら、エピトープの位置は、大きなIgG（150 kDa）が触媒部位へと緊密に位置づけられるようなものでなければならない。エピトープデータから、DD9部位は、推定カルシウム結合部位と関連するので、より効果的であり得ると予測され得る［21］。しかしながら、文献の検討により、5以上の推定Ca2+結合部位が示唆されており［21］、それは明らかに劇的な効果を有するものの、全てのTG2活性に重要なものではない。
【０４７７】
DF4部位は、抗体が触媒三残基の必須アミノ酸の1つと結合することから、仮定上最も効果的なエピトープであり得る。しかしながら、この阻害抗体を産生するDF4を首尾よくクローンアウト（clone out）することは不可能であり、それ自体、IC50試験を適切に実施するのに十分なIgGの産生は不可能である。リンパ球は増殖のためにTG2活性を必要とし、従って、良好な阻害可能性を有する抗体は、組換えアプローチ又は連続的IgG抽出システムを用いてのみ可能であり得ることを示唆したGunzler et al（1982）FEBS Lett. 150（2）：390-6の研究を考慮すると、高すぎる有効性を有する抗体をクローンアウトすることは実際に非常に困難なものであり得る。
【０４７８】
この研究に取り組むに際し最もストレスのたまる問題の一つは、開発された抗体全てが、前臨床試験に重要である非ヒトTG2活性を効果的にブロックすることが不可能であるように思われることである。抗体は全て、ウエスタンブロット及びELISAの両方においてラット及びマウスTG2と反応し、いくつかのケースでは、その強度にほとんど差はなかった。しかしながら、IgGを産生する9抗体のうち、IC50を測定可能であったのは、ラットでは4つのみであり、マウスではいずれもできなかった。ラットTG2に対してIC50を計算した4つは、ヒトTG2に対するAB1よりも、ラットTG2に対して30倍以下のIC50を示し、これは、いずれのin vivo用量も極めて大きいことを意味する。さらに、ラット細胞溶解物においてはいずれも全く阻害しなかった。ELISA及びウエスタンブロットにおける反応性に加えて、AB1については種間にわずか5つのミスマッチが、DD9については3つのミスマッチしか存在しないことを考慮すると、阻害に対する有意な種特異性は驚くべきものであり、効果的阻害に対する親和性の決定的な重要性が明らかに実証される。従って、ヒトTG2についてこれらの阻害エピトープが同定されたことから、疾患のin vivo前臨床モデルにおいてそれらの価値が確立されるべきであるならば、ラットTG2において、これらの部位に対するアナログ抗体を開発することが現在重要である。
【０４７９】
利用可能な広範なTG阻害剤が存在する。とりわけ、元々Merke Sharpe Domeにより開発されたチオミダゾール（thiomidazole）系化合物［22］、Griffinらに開発されたCBZ-グルタミルアナログ［23］は、これらを用いて、実験的腎臓瘢痕化が非常に首尾よく治療されており［16］、Khoslaらにより開発されたジヒドロイソオキサゾールタイプの阻害剤［24〜27］は、様々な癌モデルで首尾よく使用された。これらの化合物の引き続きの改良により、実行可能なヒトTG2阻害剤がもたらされ得るとの期待があるが、化合物の交差TGファミリー反応性又は潜在的毒性（toxic nature）が、これを妨げているようである。最近になって、アシリデンオキソインドール（Acylideneoxoindoles）が、新規な可逆的クラスTG2阻害剤として記載されたが［24］、他のTGファイリーメンバーとのその交差反応性に関するデータは欠如している。ヒト疾患におけるTG2に対する2010 Gordon conferenceにおいて、ZediraのPasternackらは、TG2阻害剤として側鎖マイケルアクセプターを使用する様々な化合物の詳細を提示し、in vivo適用及びTG2選択性に対する適合性を主張したが、これらに関する完全な出版物は、現在まで実現されていない。同じミーティングにおいて、Macdonaldらの初期研究により、ハンチントン舞踏病（Huntington’s Chorea）を治療するためのTG2阻害剤の設計において、いくつかの興味深い開発が実証されたが、これについてもやはり完全な出版物は未だ待たれている。疑う余地なく、TG2の低分子阻害剤が非常に望ましく、達成可能であるべきである。組織透過性、血液脳関門を通過する能力、製造、コスト及び容易な投与は、利点のほんのいくつかである。しかしながら、本明細書で開発した抗体阻害剤は、何らかの点で望ましいものであり得る。
【０４８０】
TG2は明らかに多機能酵素であり、核安定化及び輸送［28、29］、エンドサイトーシス［30、31］、GTPaseシグナリング［32〜34］、アポトーシス［35、36］、細胞接着［37〜39］、細胞骨格完全性（integrity）［28、29］及びECM安定化［9］を含む様々な細胞機能と関連づけられる。明らかに、低分子阻害剤は、一般に、細胞外スペース及び細胞内部へのアクセスがフリーであることから、これらの機能の全てを妨げ得る。抗体は細胞へ侵入できず、それ自体としては、TG2の細胞内の役割は影響を受けないだろう。重要なことに、TG2の病理学的役割の大部分、例えば、組織の瘢痕化及び線維症、セリアック病並びに癌におけるその役割などは、細胞外であると思われる。従って、抗体を用いることは、所望しない細胞内効果を予防する、さらなる選択性の度合いをもたらし得る。従って、抗体は、TG2がECMタンパク質を架橋する線維性及び瘢痕化疾患、グリアジンが細胞外スペースで脱アミド化されるセリアック病、及び細胞接着が防御因子であると思われる癌における化学療法抵抗性においてTG2をブロックするという利点を提供し得る。しかしながら、血液脳関門を通過し得る小さなFabフラグメントが設計され得ない限り、TG2阻害抗体は、神経系の病態の治療にはほとんど使用されないだろう。
【０４８１】
結論として、我々は、初めて、TG2を選択的に標的とするTG2阻害抗体を開発することができた。我々はまた、TG2のコアドメイン内に3つの新規阻害エピトープを同定した。抗体AB1のヒト化は、初めて、ヒトにおける標的化TG2療法への可能性を開くだろう。
【０４８２】
参考文献
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【０４８３】
実施例2：本発明の新規TG2阻害抗体のシークエンシング
抗体シークエンシング
本発明の各抗体の可変領域配列を確立するために、ハイブリドーマ細胞のペレットを、Qiagen RNeasy Mini Kitを用いて、製造者のプロトコルに従って処理し、RNAを抽出した。抽出したRNAを、1stStrand cDNA Synthesis Kit（GE Healthcare）を用いて、NotI-dT18プライマーを使用し、製造者のプロトコルに従って逆転写し、cDNAを生成した。cDNA調製物は、Qiagen PCR Purification Kitを用いて、製造者のプロトコルに従ってクリーンアップ（cleaned up）した。
【０４８４】
重鎖配列を決定するために、表12に示すように、縮重プライマーのセット（MHV1〜12）を定常領域プライマー（MHCG1、MHCG2A、MHCG2B、MHCG3、又は4つの混合物）とともに用いて、PCRによりマウスcDNAを増幅した。同様に、軽鎖配列を決定するために、表13に示すように、縮重プライマーのセット（MVK1〜11）を定常領域プライマーMKCとともに用いて、マウスcDNAを増幅した。
【０４８５】
重鎖PCRの最初のセットを用いていずれの増幅産物も見られない場合、cDNAを生成するためのNotI-dT18プライマー；並びに定常領域プライマー（MHCG1、MHCG2A、MHCG2B、MHCG3、又は4つの混合物）及び5' RACEアンカープライマー（Anchor Primer）GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG（式中、Iは、デオキシイノシンの塩基である）をPCRのために使用して、5' RACE PCR（Invitrogen）を実施した。
【０４８６】
結果として生じた増幅バンドを、TOPO-TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen）を用いて、製造者のプロトコルを使用して、pCR2.1（登録商標）-TOPO（登録商標）ベクターにライゲーションし、シークエンシングのためにGATC Biotech AGに送付した。
【０４８７】
【表１２】
0006411998.tif 000081
【０４８８】
曖昧コード（Ambiguity codes）：R＝A又はG；Y＝C又はT；M＝A又はC；K＝G又はT；S＝G又はC；W＝A又はT。
MHVは、マウス重鎖可変領域遺伝子のリーダー配列とハイブリダイズするプライマーを示し、MHCGは、マウス定常領域遺伝子とハイブリダイズするプライマーを示す。
【０４８９】
【表１３】
0006411998.tif 000082
【０４９０】
曖昧コード：R＝A又はG；Y＝C又はT；M＝A又はC；K＝G又はT；S＝G又はC；W＝A又はT。
MKVは、マウスκ軽鎖可変領域遺伝子のリーダー配列とハイブリダイズするプライマーを示し、MKCは、マウスκ定常領域遺伝子とハイブリダイズするプライマーを示す。
【０４９１】
配列データ
抗体AB1に加えて抗体BB7、DC1、JE12、EH6、AG9、AH3、DD9、DH2、DD6及びIA12を配列決定した。配列を図18〜28に提供する。
【０４９２】
実施例3：本発明のキメラ及びヒト化新規抗TG2抗体の構築及び特徴付け
本発明の抗体をさらに特徴付けるため、及びヒト化のために抗体のランキング及び優先順位化を可能にするために、キメラTG2抗体のパネルを構築した（マウス（murine）可変領域及びヒトIgG1及びヒトκ）。キメラ抗体を産生するために使用した方法論を以下に記載する。
【０４９３】
方法
ヒトVH及びVK cDNAデータベース
International Immunogenetics Database 20091、及びSequences of Proteins of Immunological InterestのKabatデータベースリリース5（ラストアップデート17-Nov-1999）2のヒト及びマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を用いて、Kabatアライメントにおいてヒト免疫グロブリン配列をデータベース化した。我々のデータベースは、10,606のVH配列及び2,910のVK配列を含む。
【０４９４】
AB1の分子モデル
Group 1抗体（すなわち、ヒトTG2のアミノ酸304〜326にわたるエピトープと結合する抗体）の代表として、マウス抗体AB1可変領域のホモロジーモデルは、オートマティックモードで操作されるModellerプログラム3を用いて計算されている。1 MQK.pdb、3LIZ.pdb及び1MQK.pdbの原子座標は、Accelrys抗体pdb構造データベースのBlast分析により決定されるように、それぞれ、インターフェース（Interface）、VL及びVHに対して最も高い同一性の配列鋳型であった。これらの鋳型を用いて20の最初のモデルを作製し、それらのうち最良のものを、その3つの最良のループ鋳型を用いて各CDRループをモデリングすることにより精製した。
【０４９５】
hAB1フレームワークセレクション
配列分析プログラムgibsSRを用いて、様々な選択基準を使用して、AB1 VHc、VKc及びVKc1、BB7 VHc及びVKc、並びにDC1 VHc及びVKcタンパク質配列とともにヒトVH及びVKデータベースを調べた。マウス抗体AB1のホモロジーモデルにおいて、CDR残基の5Å内のFW残基（Kabat定義）を同定し、「5Å近接（Proximity）」残基と表した。
【０４９６】
最初のヒト化重鎖バージョンの基となるFWとしてAF06220を選択した。表14は、AF06220のマウス（murine）抗体とのアライメント及び残基同一性を示す。表15は、配列の5Å近接エンベロープを示す。AF062260は、その生殖細胞系列VH遺伝子Z12347から離れて、体細胞変異を1つのみ有する（表16）。
【０４９７】
最初のAB1ヒト化κ軽鎖の基となるFWとしてAY247656を選択した。マウス（murine）AB1抗体κ軽鎖とのアライメント及び残基同一性を表17に示す；表18は、配列の5Å近接エンベロープを示す。該配列は、その生殖細胞系列VK遺伝子X93620から、5つの体細胞変異を示す（表19）。
【０４９８】
他のヒト化κ軽鎖構築物の基となるFWとしてAF193851を選択した。マウス（murine）抗体とのアライメント及び残基同一性を表20に示す。表21は、配列の5Å近接エンベロープを示す。該配列は、その生殖細胞系列VK遺伝子J00248から、いずれの体細胞変異も示さない（表22）。
【０４９９】
発現ベクターの作製
キメラ発現ベクターの構築は、VH及びVLに適切なリーダー配列を付加し、Hind III制限部位及びKozak配列を前につけることを伴う。Kozak配列は、可変領域配列の効率的な翻訳を保証する。それは、リボソームが翻訳を開始できる正しいAUGコドンを定義し、最も重要な塩基は、AUGスタートの上流3番目の位置のアデニンである。
【０５００】
重鎖について、キメラ発現ベクターの構築は、ヒトγ1定常領域の5’フラグメントを、可変領域のJ領域の3’末端と隣接する天然のApaI制限部位まで導入することを伴う。CHは、挿入されたVH配列の発現ベクター下流にコードされるが、V-Cイントロンを欠如している。
【０５０１】
軽鎖について、天然のスプライスドナー部位及びBamHI部位をV領域の下流に付加する。スプライスドナー配列は、定常領域とVLとのインフレームアタッチメントに必要なκ V：Cイントロンのスプライシングアウトを容易にする。
【０５０２】
GeneArt（登録商標）により、可変領域のDNA配列を最適化し合成した。リーダー配列は、培養哺乳動物細胞において、抗体の良好な発現をもたらすものとして選択された。
【０５０３】
HindIII＋ApaI消化を用いて、クローニングベクターから重鎖可変領域構築物を切り出し、精製し、これを、同様に切断してホスファターゼ処理したMRCT重鎖発現ベクターにライゲーションし、これを用いて、TOP10細菌を形質転換した。
【０５０４】
HindIII＋BamHI消化を用いて、κ鎖可変領域構築物を切り出し、精製し、これを、同様に切断しホスファターゼ処理したMRCT κ軽鎖発現ベクターにライゲーションし、これを用いて、TOP10細菌を形質転換した。
【０５０５】
抗体発現
重鎖及びκ鎖の両方をコードするダブルインサート発現ベクターを作製し、HEK293T細胞にトランスフェクトした。プロテインG-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーにより、製造者のプロトコルに従って細胞培養上清を精製した。
【０５０６】
結合ELISA
異なるヒト化重鎖ベクターと関連する異なるヒト化軽鎖ベクターの組み合わせを用いてHEK 293F細胞を共トランスフェクトした。組換えヒトTG2を用いて、ELISAにより抗体結合を測定した。結果から、軽鎖バージョンRKE及びRKJ（表24）（ヒト化された異なる軽鎖バージョンを表す）のいずれかと組み合わせた重鎖バージョンRHA（表23）が、最適な結合を示したことが示され（図34）、従って、更なる特徴付けのために選択した。同様のアプローチを用いて、ヒト化BB7重鎖及び軽鎖、並びにヒト化DC1重鎖及び軽鎖の最適なペアを同定した。
【０５０７】
重鎖バージョンRHAは、ヒトドナー配列上における、AB1抗体のマウスCDR領域の非修飾グラフトである。しかしながら、軽鎖バージョンRKE及びRKJはともに、同じ単一の5Å近接残基逆突然変異F72（表24）を有する。この逆突然変異は、バーニア（Vernier）4、カノニカル（Canonical）5又はインターフェース（Interface）6残基の外側に位置する。
【０５０８】
参考文献
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【０５０９】
下記表Aは、図面で使用される識別子と相互参照して、作製したキメラ及びヒト化抗体を要約する。
【０５１０】
【化６８】
0006411998.tif 000083
【０５１１】
表
【０５１２】
【表１４】
0006411998.tif 000084
【０５１３】
表14は、AF062260のマウス（murine）抗体とのアライメント及び残基同一性を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。該当する場合、ギャップ（-）を使用して、Kabatナンバリングを維持し、残基の挿入又は欠失を示す。 
【０５１４】
【表１５】
0006411998.tif 000085
【０５１５】
表15は、CDRの5Åエンベロープ内にある抗体重鎖フレームワーク残基を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５１６】
【表１６】
0006411998.tif 000086
【０５１７】
表16は、AF062260が、その生殖細胞系列VH遺伝子Z12347から離れて、体細胞変異を1つ有することを示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５１８】
【表１７】
0006411998.tif 000087
【０５１９】
表17は、AY247656のマウス（murine）AB1抗体とのアライメント及び残基同一性を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。該当する場合、ギャップ（-）を使用して、Kabatナンバリングを維持し、残基の挿入又は欠失を示す。
【０５２０】
【表１８】
0006411998.tif 000088
【０５２１】
表18は、CDRの5Åエンベロープ内にある抗体κ軽鎖フレームワーク残基を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５２２】
【表１９】
0006411998.tif 000089
【０５２３】
表19は、AY247656が、その生殖細胞系列VK遺伝子X93620から離れて、5つの体細胞変異を有することを示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５２４】
【表２０】
0006411998.tif 000090
【０５２５】
表20は、AF193851のマウス（murine）抗体とのアライメント及び残基同一性を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。該当する場合、ギャップ（-）を使用して、Kabatナンバリングを維持し、残基の挿入又は欠失を示す。
【０５２６】
【表２１】
0006411998.tif 000091
【０５２７】
表21は、CDRの5Åエンベロープ内にある抗体κ軽鎖フレームワーク残基を示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５２８】
【表２２】
0006411998.tif 000092
【０５２９】
表22は、AF193851が、その生殖細胞系列VK遺伝子J00248から離れて、いずれの体細胞変異も有さないことを示す。残基同一性はドット（.）文字で示す。該当する場合、残基差を示す。
【０５３０】
【表２３】
0006411998.tif 000093
【０５３１】
表23は、AB1、BB7及びDC1重鎖の最終ヒト化バージョンの配列アライメントを示す。該当する場合、ギャップ（-）を使用して、Kabatナンバリングを維持し、残基の挿入又は欠失を示す。
【０５３２】
【表２４】
0006411998.tif 000094
【０５３３】
表24は、AB1、BB7及びDC1 κ軽鎖の最終ヒト化バージョンの配列アライメントを示す。該当する場合、ギャップ（-）を使用して、Kabatナンバリングを維持し、残基の挿入又は欠失を示す。
【０５３４】
表24A
表24aは、表23及び24に示す配列情報を要約したものであり、特に、AB、BB-7及びDC-1抗体の重鎖及び軽鎖における、CDR配列、及びフランキング領域を有するCDR配列を示す。
【０５３５】
【表２４Ａ−１】
0006411998.tif 000095
【０５３６】
【表２４Ａ−２】
0006411998.tif 000096
【０５３７】
キメラ及びヒト化抗体の特徴付け
キメラ及びヒト化Abについて、ヒト及びカニクイザルTG2との結合の測定、並びにこれら酵素の酵素阻害の測定を下記方法論に従って行った。
【０５３８】
方法
TG2結合についてELISAアッセイ
ヒト及びカニクイザルTG2との抗体結合をELISAアッセイにて測定した。透明ポリスチレン「Maxisorp」96ウェルプレート（Nunc）を、50 μlの0.05 M 炭酸塩-重炭酸塩バッファー（pH 9.6）中50 ngの精製ヒト又はカニクイザル（cynomogulus monkey）TG2で4℃、一晩コーティングした。コントロールウェルは、50 μlの100 μg/mlウシ血清アルブミン（BSA）でコーティングした。300 μlのリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）（PBS）（0.1％Tween 20を含む（PBST））でプレートを3回洗浄し、PBS中3％ w/v Marvelスキムミルク（300 μl）で室温、1時間ブロッキングした。PBSTで3回洗浄後、50 μlのプロテインA精製キメラ若しくはヒト化抗TG2抗体、又はヒトIgG1 κアイソトープコントロール抗体若しくはCUB7402（Abcam）を、PBS中50 nMのトップ濃度から4倍に段階希釈し、2連でプレートに添加した。室温で1時間後、プレートをPBSTで3回洗浄し、PBS中3％ w/v Marvelスキムミルクで1/5,000に希釈した50 μlのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG（Fc）（Serotec）ととも、或いはCUB7402を含むウェルについてはペルオキシダーゼ結合1/5,000ヤギ抗マウスIgG（Fc）（Sigma）とともに、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄後、50 μlのTMB基質（Sigma）でプレートを室温、5分間発色（developed）させた後、0.5M H2SO4（25 μl）で反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダー（BioTek EL808）で450 nMにて吸光度を読み取った。用量反応曲線を分析し、データの4パラメータロジスティックフィット（GraphPad Prism）を用いて、EC50値及び他の統計パラメータを測定した。
【０５３９】
本発明の抗体によるTG2阻害の蛍光系トランスグルタミナーゼアッセイ
精製ヒト（Zedira）又はカニクイザル（cynomogolus monkey）TG2酵素（Trenzyme）のトランスグルタミナーゼ活性を、ダンシル化リジン KxD（Zedira）のN,N-ジメチル化カゼイン（DMC, Sigma）への取込みにより測定した。ヒト又はカニクイザル（cynomogolus monkey）TG2をアミド基転移バッファー（250 mM NaCl、2 mM MgCl2、5 mM CaCl2、0.2 mM DTT及び0.05％ v/v Pluronic F-127を含む、25 mM HEPES pH 7.4）でそれぞれ1 nM及び10 nMに希釈し、384ウェル黒色マイクロタイタープレート（Corning）中、様々な濃度のプロテインA精製マウス（murine）、キメラ又はヒト化TG2抗体と室温で180分間混合した。DMC及びKxDをそれぞれ10 μM及び20 μMの最終濃度で最終反応体積30 μlにて添加することにより反応を開始し、室温で180分間反応を進行させ、Tecan Safire2プレートリーダーを用いて、蛍光の増加（RFU）（励起280 nm、発光550 nm）をモニタリングした。データをパーセンテージ活性に正規化し、ここで、％活性＝（RFU 試験抗体−RFU 低コントロール）／RFU 高コントロール−RFU 低コントロール）×100であり、低コントロールは、酵素以外の全ての要素を含み、高コントロールは、抗体以外の全ての要素を含んだ。
【０５４０】
抗体用量反応曲線を、GraphPadプリズムソフトウェアを用いてプロットし、4パラメータロジスティックモデルを用いてフィットし、IC50及び他の統計パラメータを戻した（return）。結果を図29〜33に示す。
【０５４１】
ヒト化及びマウス（murine）抗TG2抗体による酵素阻害及びELISA結合実験の結果及び考察
ダンシル化リジンのN,N-ジメチル化カゼインへのTG2依存性の取込みの用量依存的な阻害により、キメラ及びヒト化TG2抗体が、ヒトTG2によるアミド基転移を阻害する能力を測定した（図29及び31に例示する）。Group 1のキメラ及びヒト化抗体（例えば、cAB003、cBB001、cDC001、hBB001AA、hAB001BB、hAB005及びhAB004）はともに、低ナノモル範囲においてTG2活性の強力な阻害を示し、これは、同じ範囲で固定化ヒトTG2との結合を示すELISAデータと一致する（図35及び37）。対照的に、市販抗体CUB7402は、ELISAアッセイにおいてはGroup 1抗体と同程度の結合であるにも関わらず（図35A、36A、37A及び38A）、ヒト又はカニクイザル（cynomogulus monkey）TG2酵素活性を阻害できず（図29F及び30B）、酵素のアミド基転移機能を妨げないエピトープのCUB7402による認識と一致する。従って、Group 1抗体は、結合するが酵素活性に影響を及ぼさない他の抗体（例えば、CUB7402など）と、酵素機能を阻害するその能力により区別することができる。同様に、Group 3のマウス（murine）及びキメラ抗体の代表（例えば、mDD9001、mDH001、cDD9001及びcDH001）は、ヒトTG2アミド基転移を一貫して阻害したが、Group 1抗体よりも効力は低かった（図29及び33）。Group 1及びGroup 3の例示的親マウス（murine）モノクローナル抗体によるヒトTG2の阻害（図33）は、そのキメラ及びヒト化バージョンと同程度の効力を示し、これは、マウス（murine）抗体の機能的効力が、ヒト化バージョンにおいて保持されていることを示す。同様に、例示的ヒト化抗体hBB001AA、hBB001BB及びhAB004についてのヒトTG2 ELISA結合データ（図37）は、そのキメラバージョンcBB001及びcAB003について得られたものと同程度のEC50値を示し、これは、結合親和性もヒト化バージョンにおいて保存されていることを示す。キメラ及びヒト化抗体はまた、カニクイザル（cynomogulus monkey）TG2の強力な阻害（図30及び32）、及び同程度のELISA EC50（図36及び38）を種にわたって実証し、これは、全体で99％の配列同一性を有するカニクイザル（cynomogulus monkey）TG2における同族エピトープ（cognate epitope）の保存と一致する。対照的に、CUB7402は、Group 1抗体と同様に、両方の種のTG2と同程度の結合を示したが、いずれの酵素活性も阻害しない（図35〜38及び29〜30）。
【０５４２】
細胞系アッセイ
HK-2上皮細胞からの細胞外TG2と本発明の抗体との結合を、以下のプロトコルを用いて分析した。
【０５４３】
細胞外TG活性の測定
改変細胞ELISAにより細胞外TG活性を測定した。Accutaseを用いてHK-2上皮細胞を採取し、100 μl/ウェルのフィブロネクチン（50 mM Tris-HCl pH 7.4中、5 μg/ml）（Sigma, Poole UK）で一晩コーティングしておいた96ウェルプレート上、無血清培地中2×104細胞/ウェルの密度でまいた。細胞を37℃、O/Nで接着させた。培地をDMEM（Life Technologies）と交換し、化合物、抗体又はコントロールを添加し、37℃で結合させた。0.1 mMのビオチンカダベリン［N-（5 アミノ ペンチル ビオチンアミド）トリフルオロ酢酸］（Zedira）をウェルに添加し、プレートを2時間、37℃に戻した。3 mM EDTA/PBSでプレートを2回洗浄し、5 mM EDTA/PBS中0.1％（w/v）デオキシコレートを用いて細胞を除去した。上清を集め、タンパク質定量のためにこれを使用した。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、1：5000のエクストラビジン（extravidin）HRP（Sigma, Poole, UK）を室温で1時間、それに続いてK Blue基質（SkyBio）を用いて、取込まれたビオチンカダベリンを明らかにした。Red Stop（SkyBio）で反応を停止し、吸光度を4650 nmで読んだ。少なくとも3つの独立した機会で各抗体を試験した。
【０５４４】
結果を図39及び40に提供し、試験した抗体について得られた例示曲線及びIC50値の表を示す。図39はヒト化AB1を用いた結果を示し、図40はヒト化BB7を用いた結果を示す。
【０５４５】
hAB005は、HK2細胞の細胞外TG2を、71.85 nMのIC50、及び約30％コントロール活性の最大阻害で阻害した。hBB001AAは、19.8 nMのIC50、及び40％コントロール活性の最大阻害で活性を阻害した。hBB001BBは、4.9 nMの良好なIC50を有したが、最大阻害は約55％コントロールであった。
【０５４６】
スクラッチアッセイ
本発明のヒト化及び／又はキメラ抗TG2抗体の結合活性を評価するため、スクラッチ傷アッセイ（scratch wound assay）も実施した。
【０５４７】
TG2は、肺線維症において重要な役割を担うことが示されており、TG2ノックアウトマウスは、ブレオマイシンモデルにおいて、瘢痕化及び線維症の低下を示す（Keith C. Olsen, Ramil E. Sapinoro, R. M. Kottmann, Ajit A. Kulkarni, Siiri E. Iismaa, Gail V. W. Johnson, Thomas H. Thatcher, Richard P. Phipps, and Patricia J. Sime. (2011) Transglutaminase 2 and Its Role in Pulmonary Fibrosis.  Am.J of Respiratory & Critical Care Med. 184 0699-707)。TG2ノックアウトマウス由来の細胞の傷上での移動は、野生型と比較して低下した。正常肺線維芽細胞（WI-38細胞）層における傷閉鎖率に対する、本発明のヒト化及び／又はキメラ抗TG2抗体の効果を評価するため、スクラッチ傷アッセイを実施した。
【０５４８】
スクラッチアッセイプロトコル：
WI-38細胞（正常ヒト肺線維芽細胞ATCC cat#CCL-75）を、10％FBSを有するαMEM培地（Life Technologies cat#32561）中、2×104/ウェルで96ウェルImage Lockプレート（Essen cat#4379）にまき、＞97％コンフルエントまでO/N増殖した。血清を含まないαMEM培地で細胞を2回洗浄し、Essen Wound Maker及び製造者のプロトコルを用いて、スクラッチ傷を作製した。培地を除去し、95 μl/ウェルの無血清培地と交換した。コントロール及び試験抗体をウェルに添加した。プレートをEssen Incucyteに置き、スクラッチ傷プロトコルを用いて傷の閉鎖を分析した。
【０５４９】
アッセイコントロールとしてサイトカラシンDを0.1 μMで使用した。R281（低分子非特異的トランスグルタミナーゼ阻害剤）を100 μMで試験した。Z DON（ペプチド不可逆的トランスグルタミナーゼ阻害剤）を10 μM及び100 μMで試験した。市販のTG2抗体Cub7402（ABcam cat#ab2386）を5 μg/mlで試験した。本発明の抗体を、示すとおりの様々な濃度にて、少なくとも3つの機会で試験した。全ての実験において、コントロールは、0.1 μMのサイトカラシンD、及び用量依存効果を示すため2つの濃度のZDONであった。
【０５５０】
スクラッチアッセイの結果例を図41〜44に示す。図41に示すように、サイトカラシンD、R281及びZDONは全て、傷閉鎖を阻害したが（ZDONは、用量依存的に阻害することを示した）、抗体Cub7402は傷閉鎖を阻害しなかった。ヒト化BB7、ヒト化AB1及びキメラDC1は全て、傷閉鎖を阻害した。
【０５５１】
キメラ及びヒト化抗TG2Abの親和性
ヒトTG2及びシアノ（cyano）TG2に対する、本発明のキメラ及びヒト化Abパネルについての結合親和性（Kd及びオフレート）をBiacore技術を用いて評価した。プロトコル及び結果を以下に記載し、図45〜47に示す。
【０５５２】
Biacore方法
組換えヒトTG2はZedira GmbH（cat. no.：T002）から得た。組換えカニクイザルTG2はTrenzymeから得た。Biacore T200装置（GE Healthcare）で表面プラズモン共鳴（SPR）を測定した。製造者の説明書に記載されるように、アミンカップリングにより、モノクローナルマウス抗ヒトIgG1（Fc）（MAH）抗体（GE Healthcare cat. no.：BR-1008-39）でCM5チップ（GE Healthcare cat. no.：BR-1006-68）をコーティングした。HBS-EP+ バッファー（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05％ v/v Surfactant P20）及びHBS-P+ バッファー（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、0.05％ Surfactant P20）は、10×ストックとしてGE Healthcareから購入した（cat. nos.：BR-1006-69及びBR-1006-71）。塩化カルシウム溶液は、Sigma Aldrich（cat. no.：21115）から得た。
【０５５３】
抗TG2抗体の親和性を決定するために用いた方法は、MAHコーティングCM5チップ上にキメラ又はヒト化抗体を捕捉し、それに続いて、ランニングバッファー中、一連のTG2サンプルを注入することを伴った。ランニングバッファーは、1 mM CaCl2を含む1×HBS-P+であるか、又はカルシウムを含まない実験については1×HBS-EP+であった。抗体捕捉は、10 μl/分の流速で120秒間の接触時間にて実施し、およそ40〜80 RUの捕捉がもたらされた。TG2は、25 nM〜400 nMの範囲の濃度で、30 μl/分の流速、最大600秒間の接触時間にて固定化抗体上に注入した。典型的には、TG2の解離を最大5400秒間（1.5時間）まで測定した。次いで、3 M MgCl2を用いて、30 μl/分の流速で60秒間の接触時間にてチップの再生を実施し、それに続いて、次のサンプルの前に300sの安定化期間を置いた。ヒト及びカニクイザルTG2のそれぞれについて、様々な濃度で少なくとも5回の注入を、少なくとも2回の別個の実験において実施した。
【０５５４】
Biacore T200 Evaluationソフトウェアからキネティックデータをエクスポートし、GraphPad Prismを用いて分析し、ここで、結合フェーズ及び解離フェーズは、それぞれ、一相会合モデル（one phase association model）及び一相指数関数的減衰モデル（one-phase exponential decay model）を用いて別々に分析した。個別に各曲線から結合速度（kon）を計算し、長期解離フェーズデータから解離速度（koff）値を集めた。koff値が＜1×10-5 s-1であると計算された場合、これよりも遅い速度は正確に推定できないことから、分析のために値を1×10-5と設定した。kon及びkoffの値は、複数の濃度から各TG2種について各抗体に関し個別に計算した値の平均+/-1標準偏差として下表に示す。KD値は、平均koff／平均konとして計算する。
【０５５５】
Biacore実験の結果
【０５５６】
【表２５】
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【０５５７】
表25は、ヒトTG2に対して得られたキネティックデータを示す。koff速度が10-5 s-1未満であると計算された場合、これよりも遅い速度は正確に測定できないことから、分析のために値を10-5 s-1と設定した。
【０５５８】
【表２６】
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【０５５９】
表26は、カニクイザルTG2に対して得られたキネティックデータを示す。koff速度が10-5 s-1未満であるとれた場合、これよりも遅い速度は正確に測定できないことから、分析のために値を10-5 s-1と設定した。
【０５６０】
図45〜47は、例となるBiacoreデータセットを提供する。図に示すように、TG2に対するヒト化及びキメラ抗体cAB003、cBB001、hAB004、hAB005、hBB001AA、hBB001BB、cDC001は、ヒト及びカニクイザルTG2に対して優れた親和性を有し、120 pM又はそれより良好なKD値を有する。キメラ抗体cDH001及びcDD9001は、ヒト及びカニクイザルTG2に対して、より遅い結合速度を示し、全体の親和性はより弱い。カルシウム不在下における抗体選択試験は、より速い解離速度（koff）に起因して結合がより弱くなる、cDH001及びcDD9001の場合を除いて、ほとんど又は全く効果がないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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