(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための医薬品の製造のための、シトラート提示組成物の使用であって、
前記シトラート提示組成物は少なくとも２つの異なるポリマーまたはオリゴマーの混合物を含み、前記ポリマーまたはオリゴマーの少なくとも１つは、
式（Ｉ）の構造：
【化１】
0006286447.tif 000016
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、
【化２】
0006286447.tif 000017
もしくは
【化３】
0006286447.tif 000018
であり；
【化４】
0006286447.tif 000019
は、式（Ｉ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
または
式（ＩＩ）の構造：
【化５】
0006286447.tif 000020
（式中、Ｒ２は、−Ｈもしくは
【化６】
0006286447.tif 000021
であり；
【化７】
0006286447.tif 000022
は、式（ＩＩ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
を有する、使用。
【請求項２】
前記シトラート提示組成物が、前記組成物の容量に基づき２０μＭ〜２０００μＭのシトラート濃度を提供する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記シトラート提示組成物が、式（Ｉ）の構造を有する第一のポリマーまたはオリゴマーと、式（ＩＩ）の構造を有する第二のポリマーまたはオリゴマーとを含み、前記第一のポリマーまたはオリゴマーが前記第二のポリマーまたはオリゴマーと配合される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
骨成長を促進するための医薬品の製造のための、シトラート提示組成物の使用であって、
前記シトラート提示組成物は、
式（Ｉ）の構造：
【化８】
0006286447.tif 000023
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、
【化９】
0006286447.tif 000024
もしくは
【化１０】
0006286447.tif 000025
であり；
【化１１】
0006286447.tif 000026
は、式（Ｉ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
を有する第一のポリマーまたはオリゴマー、および
式（ＩＩ）の構造：
【化１２】
0006286447.tif 000027
（式中、Ｒ２は、−Ｈもしくは
【化１３】
0006286447.tif 000028
であり；
【化１４】
0006286447.tif 000029
は、式（ＩＩ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
を有する第二のポリマーまたはオリゴマーを含み、前記第一のポリマーまたはオリゴマーが前記第二のポリマーまたはオリゴマーと配合され、
前記シトラート提示組成物が、前記組成物の容量に基づき２０μＭ〜２０００μＭのシトラート濃度を提供する、使用。
【請求項５】
骨細胞の集団においてオステリックス遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を上方調節するための医薬品の製造のための、シトラート提示組成物の使用であって、
前記シトラート提示組成物は、
式（Ｉ）の構造：
【化１５】
0006286447.tif 000030
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、
【化１６】
0006286447.tif 000031
もしくは
【化１７】
0006286447.tif 000032
であり；
【化１８】
0006286447.tif 000033
は、式（Ｉ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
を有する第一のポリマーまたはオリゴマー、および
式（ＩＩ）の構造：
【化１９】
0006286447.tif 000034
（式中、Ｒ２は、−Ｈもしくは
【化２０】
0006286447.tif 000035
であり；
【化２１】
0006286447.tif 000036
は、式（ＩＩ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
を有する第二のポリマーまたはオリゴマーを含み、前記第一のポリマーまたはオリゴマーが前記第二のポリマーまたはオリゴマーと配合される、使用。
【請求項６】
前記医薬品が骨形成タンパク質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化２９】
0006286447.tif 000037
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、
【化３０】
0006286447.tif 000038
または
【化３１】
0006286447.tif 000039
であり；
【化３２】
0006286447.tif 000040
は、式（Ｉ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
の構造を有する第一のポリマーまたはオリゴマー；ならびに
式（ＩＩ）：
【化３３】
0006286447.tif 000041
（式中、Ｒ２は、−Ｈまたは
【化３４】
0006286447.tif 000042
であり；
【化３５】
0006286447.tif 000043
は、式（ＩＩ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
の構造を有する第二のポリマーまたはオリゴマー
を含む組成物であって、
前記第一のポリマーまたはオリゴマーが前記第二のポリマーまたはオリゴマーと配合される組成物。
【請求項８】
前記第一のポリマーまたはオリゴマー対前記第二のポリマーまたはオリゴマーの重量比が１０：１〜１：１０である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記第一のポリマーまたはオリゴマーおよび前記第二のポリマーまたはオリゴマーが互いに架橋されてポリマー網目構造を形成する、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
ポリマー網目構造内に分散される粒子状物質をさらに含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記粒子状物質が、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、バイオガラス、セラミック、マグネシウム粉末、マグネシウム合金および脱細胞化骨組織粒子のうちの１つ以上を含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
６５重量％までのヒドロキシアパタイトを含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヒドロキシアパタイトが、前記ポリマー網目構造の１つ以上のペンダント官能基によりキレート化される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリマー網目構造に接着される骨組織をさらに含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
前記骨組織が前記ポリマー網目構造を取り囲み、前記ポリマー網目構造が前記骨組織に統合される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも８０％の骨−インプラント接触を示す、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
骨成長を促進するための医薬品の製造のための、シトラート提示組成物の使用であって、前記シトラート提示組成物はクエン酸または単量体型の水性シトラートを含み、前記医薬品はクエン酸またはクエン酸塩を含み、
前記医薬品は骨芽細胞、骨髄細胞、または幹細胞に投与され、ここで、前記骨芽細胞、骨髄細胞、または幹細胞に骨形成タンパク質は提供されない、
使用。
【請求項１８】
骨細胞の集団においてオステリックス遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を上方調節するための医薬品の製造のための、シトラート提示組成物の使用であって、前記シトラート提示組成物はクエン酸または単量体型の水性シトラートを含み、前記医薬品はクエン酸またはクエン酸塩を含み、
前記医薬品は骨芽細胞、骨髄細胞、または幹細胞に投与され、ここで、前記骨芽細胞、骨髄細胞、または幹細胞に骨形成タンパク質は提供されない、
使用。
【請求項１９】
前記医薬品は、前記クエン酸またはクエン酸塩を２０μＭ〜２０００μＭの濃度で含む、請求項１７または１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第６１／７４８，９０６号（２０１３年１月４日出願）（この記載内容は参照により本明細書中に取り込まれる）に基づき３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に規定する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、シトラート提示組成物に、特に骨適用のためのシトラート提示組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
生来の骨基質は、コラーゲンタンパク質基質内に埋め込まれる約６０〜６５重量％の無機物質を含む複合体である。さらに、アパタイトナノ結晶の薄層がコラーゲン網目構造内に埋め込まれる。したがって、いくつかの工学処理生体物質は、骨組織工学処理用途に用いるために合成ポリマーと組み合わされた種々の無機物質を有する。しかしながら、いくつかの現存生体物質は、骨の生来の組成物と整合し、適切な機械的支持を提供し、炎症性応答を最小限にし、骨再生を迅速に促し、および／または周囲組織と完全に融合することができない。
【０００４】
したがって、種々の整形外科学的および骨適用のために改良された特性、例えば改良された機械的特性、および／または改良された骨成長特性を提供する組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一態様において、いくつかの場合、骨適用のための他の組成物と比較して、１つ以上の利点を提供し得る組成物が記載される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、機械的特性改良、炎症性応答低減、生分解性改良および周囲組織との優れた融合を提供し得る。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物は、改良された方法で、例えば幹細胞または骨芽細胞を含む集団のような骨細胞の集団における細胞分化または表現型進行を促すことにより、骨成長を促し得る。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物は、癌、例えば骨癌の増殖も抑制し得る。
【０００６】
本明細書中に記載される組成物は、いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物である。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、シトラート部分を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に以下で記載される式（Ｉ）の構造を有する第一ポリマーまたはオリゴマー、および本明細書中に以下で記載される式（ＩＩ）の構造を有する第二ポリマーまたはオリゴマーを含み、この場合、第一ポリマーまたはオリゴマーは第二ポリマーまたはオリゴマーと配合される。さらに、いくつかの場合、第一ポリマーまたはオリゴマーおよび第二ポリマーまたはオリゴマーは、互いに架橋されて、ポリマー網目構造を形成する。さらに加えて、いくつかの場合、組成物は、ポリマー網目構造中に分散される粒子状物質をさらに含む。粒子状物質は、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、バイオガラス、セラミック、マグネシウム粉末、マグネシウム合金および脱細胞化骨組織粒子のうちの１つ以上であり得る。
【０００７】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、ポリマー網目構造に接着される骨組織をさらに含む。いくつかの場合、ポリマー網目構造周囲の骨組織およびポリマー網目構造は、骨組織に融合される。
【０００８】
別の態様では、いくつかの場合、他の方法を上回る１つ以上の利点を提供し得る骨成長を促す方法が、本明細書中に記載される。例えばいくつかの場合、本明細書中に記載される方法は、骨細胞の集団における細胞分化または表現型進行を促し、当該方法は、骨細胞にシトラート提示組成物を提供することを包含する。いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物は、第一細胞分化または表現型進行を獲得するために選択される細胞発達の第一段階で骨細胞に提供される。さらに加えて、いくつかの場合、第二シトラート提示組成物は、第二細胞分化または表現型進行を獲得するために選択される細胞発達の第二段階で骨細胞にさらに提供される。本明細書中に記載される方法に従って処置される骨細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る。いくつかの場合、骨細胞は、骨幹細胞を含む。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、生物学的環境にシトラート提示組成物を配置することを包含する。さらに、いくつかの実施形態では、骨成長を促すことは、生物学的環境においてオステリックス（ＯＳＸ）遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子発現を上方調節することを包含する。いくつかの場合、骨成長を促すことは、生物学的環境において骨伝導能および／または骨誘導能を改良することを包含する。いくつかの実施形態では、骨成長を促すことは、生物学的環境において鉱化またはカルシウム沈着形成を促すことを包含する。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される方法は、癌細胞、例えば骨癌細胞の成長および／または増殖を少なくとも部分的に抑制するためにも有効である。さらに、いくつかの実施形態では、前記の作用のうちの１つ以上が、用量依存的にシトラート提示組成物により提供される。
【０００９】
骨細胞に提供され、および／または本明細書中に記載される方法に従って生物学的環境中に配置されるシトラート提示組成物は、上記のいずれかの組成物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーのようなシトラート部分を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。その他のポリマーまたはオリゴマーも用いられ得る。さらに、いくつかのこのような実施形態では、本明細書中に記載される方法は、さらに、ポリマーまたはオリゴマーを分解することによりポリマーまたはオリゴマーからシトラートを放出することを包含する。他の場合には、シトラート提示組成物は、クエン酸または水性シトラートを含む。いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物は、クエン酸またはシトラートを補足された培地を含む。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される方法に用いられるシトラート提示組成物は、組成物の容量を基礎にして、約２０μＭ〜約２０００μＭのクエン酸濃度を提供する。さらに加えて、いくつかの場合、本明細書中に記載される方法は、生物学的因子、例えばＢＭＰ−２を骨細胞に提供することをさらに包含する。
【００１０】
さらに別の態様では、シトラート提示組成物を含む物品が、本明細書中で記載される。いくつかの実施形態では、物品は、本明細書中に上記したようなシトラート提示組成物、例えば式（Ｉ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマー、および／または式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーから形成される架橋ポリマー網目構造を含む。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される物品は、生物学的または外科的インプラント、例えば骨ネジのような整形外科用固定用具を形成する。
【００１１】
これらのおよびその他の実施形態を、以下の詳細な説明でさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本明細書中に記載される一実施形態による複合体網目構造を形成するための模式図を示す。
【図２】図２は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による一連の組成物に関する一連の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による一連の組成物の圧縮弾性率を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による一連の組成物の圧縮ピーク強度を示す。
【図４】図４は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による一連の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ分解速度を示す。
【図５】図５は、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態による一連の複合体の鉱化の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるカルシウム結節形成の光学顕微鏡画像を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるカルシウム結節形成データを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるカルシウム結節形成データを示す。
【図７】図７は、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態による発現ＡＬＰを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるＡＬＰの発現を示す。
【図９】図９は、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるオステオポンチン（ＯＰＮ）発現を示す。
【図１０】図１０は、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法の結果の光学顕微鏡画像を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法の結果のＳＥＭ画像を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるＡＬＰの発現を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態によるオステリックス（ＯＳＸ）の発現を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本明細書中に記載される一実施形態による骨成長を促す方法の結果のマイクロＣＴ画像を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本明細書中に記載される一実施形態による骨成長を促す方法の結果のマイクロＣＴ画像を示す。
【図１３】図１３は、本明細書中に記載される一実施形態による骨成長を促す方法の結果の２つのマイクロＣＴ画像を示す。
【図１４】図１４は、本明細書中に記載される方法の一実施形態に対応する細胞増殖データを示す。
【図１５】図１５は、本明細書中に記載される方法の一実施形態に対応する細胞増殖データを示す。
【図１６】図１６は、本明細書中に記載される方法の一実施形態に対応する細胞増殖データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中に記載される実施形態は、以下の詳細な説明、実施例および図に言及することによりさらに容易に理解され得る。しかしながら、本明細書中に記載される要素、装置および方法は、詳細な説明、実施例および図に示される具体的実施形態に限定されない。これらの実施形態は、本発明の原理の単なる例証である、と理解されるべきである。本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、多数の修正および改変がなされ得ることは、当業者には容易に明らかになる。
【００１４】
さらに、本明細書中に開示される範囲はすべて、そこに含まれる任意のおよびすべての部分範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１．０〜１０．０」と記述される範囲は、１．０以上の最小値で始まり、１０．０以下の最大値で終わる任意のおよびすべての部分範囲、例えば１．０〜５．３または４．７〜１０．０または３．６〜７．９を含むとみなされるべきである。
【００１５】
本明細書中で開示される範囲はすべて、さらにまた、別記しない限り当該範囲の終点を含むとみなされるべきである。例えば、「５〜１０」の範囲は、一般的に、終点５および１０を含むとみなされるべきである。
【００１６】
さらに、「〜まで」という語句を量または数量と一緒に用いられる場合、その量は少なくとも検出可能な量または数量である、と理解されるべきである。例えば、具体的量「まで」の量で存在する物質は、検出可能量から具体的量を含む量までで存在し得る。
【００１７】
Ｉ．  シトラートを含む組成物
一態様において、シトラートを含むかまたはシトラートを提示する組成物が、本明細書中で記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、シトラート部分を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。本明細書中で言及する目的のための「シトラート部分」は、式（ＩＩＩ）：
【化１】
0006286447.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、Ｍ＋またはポリマーまたはオリゴマーの残りの部分との結合点であり；
Ｒ４は、−Ｈまたはポリマーまたはオリゴマーの残りの部分との結合点であり；そして
Ｍ＋は、陽イオン、例えばＮａ＋またはＫ＋であるが、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つはポリマーまたはオリゴマーの残りの部分との結合点である）
の構造を有する部分を含む。
【００１８】
本発明の目的と矛盾しない任意のポリマーまたはオリゴマーが用いられ得る。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、（ｉ）クエン酸、シトラートまたはクエン酸のエステル、例えばクエン酸トリエチルと、（ｉｉ）ポリオール、例えばジオールとの反応生成物を含む。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態で用いるのに適したポリオールの非限定例としては、Ｃ２〜Ｃ２０α、ω−ｎ−アルカンジオールまたはＣ２〜Ｃ２０α、ω−アルカンジオールが挙げられる。その他の場合、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、（ｉ）クエン酸、シトラートまたはクエン酸のエステルと、（ｉｉ）ポリオール、および（ｉｉｉ）アミン、アミドまたはイソシアネートとの反応生成物を含む。アミンは、いくつかの場合、２〜１０個の炭素原子を有する１つ以上の第一級アミンを含む。その他の場合、アミンは、２〜１５個の炭素原子を有する１つ以上の第二級または第三級アミンを含む。イソシアネートは、いくつかの実施形態では、モノイソシアネートを含む。その他の場合、イソシアネートは、ジイソシアネート、例えばアルカンジイソシアネートを含む。さらに、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、（ｉ）クエン酸、シトラートまたはクエン酸のエステルと、（ｉｉ）ポリオール、および（ｉｉｉ）ポリカルボン酸、例えばジカルボン酸またはポリカルボン酸の機能的等価物、例えば、ポリカルボン酸の環状無水物または酸塩化物との反応生成物も含み得る。さらに、ポリカルボン酸またはその環状等価物は、飽和または不飽和であり得る。例えば、いくつかの場合、ポリカルボン酸またはその機能的等価物は、マレイン酸、無水マレイン酸、フマル酸または塩化フマリルを含む。さらに他の実施形態では、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、（ｉ）クエン酸、シトラートまたはクエン酸のエステルと、（ｉｉ）ポリオール、および（ｉｉｉ）アミノ酸、例えばアルファアミノ酸との反応生成物を含む。アルファアミノ酸は、いくつかの実施形態では、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＤ，Ｌ−アミノ酸を含む。いくつかの場合、アルファアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、バリンまたはその組合せを含む。さらに、いくつかの場合、アルファ・アミノ酸は、アルキル置換アルファアミノ酸、例えば２２の「標準」またはタンパク質構成アミノ酸のいずれかに由来するメチル置換アミノ酸、例えばメチルセリンを含む。さらに加えて、いくつかの場合、アミノ酸は、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーのペンダント基または側鎖基を構成する。さらに、本明細書中に記載されるモノマーの反応生成物は、いくつかの場合、モノマーの縮合反応生成物である。いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、米国特許第８，５３０，６１１号、米国特許第８，５７４，３１１号または米国特許第８，６１���，９４４号に記載されたポリマーまたはオリゴマーである。
【００１９】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、式（Ａ）の１つ以上のモノマー、および式（Ｂ）または（Ｂ’）の１つ以上のモノマーから形成される：
【化２】
0006286447.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３またはＭ＋であり；
Ｒ４は、−Ｈであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６は、−Ｈ、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｍ＋は、陽イオン、例えばＮａ＋またはＫ＋であり；そして
ｎおよびｍは、独立して、１から２０までの範囲の整数である）。いくつかの場合、例えばＲ１、Ｒ２およびＲ３は−Ｈであり、Ｒ５は−ＯＨであり、そしてＲ６は−Ｈである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、式（Ａ）の１つ以上のモノマー、式（Ｂ）または（Ｂ’）の１つ以上のモノマー、および式（Ｃ）の１つ以上のモノマーから形成される：
【化３】
0006286447.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３またはＭ＋であり；
Ｒ４は、−Ｈであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６は、−Ｈ、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｍ＋は、陽イオン、例えばＮａ＋またはＫ＋であり；
ｎおよびｍは、独立して、１から２０までの範囲の整数であり；そして
ｐは、１から１０までの範囲の整数である）。例えば、いくつかの場合、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は−Ｈまたは−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ５は−ＯＨであり、Ｒ６は−Ｈであり、ｎは２〜６であり、ｍは２〜８であり、そしてｐは２〜６である。
【００２１】
さらに、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーのいくつかの実施形態では、式（Ｂ）または（Ｂ’）のモノマーは、式（Ｂ）または（Ｂ’）の式を有さないアルコールに取って代わられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、不飽和アルコールまたは不飽和ポリオールが用いられ得る。さらに、いくつかの実施形態では、式（Ｃ）のモノマーまたはオリゴマーは、本明細書中に記載されるアミノ酸に少なくとも部分的に取って代わられ得る。
【００２２】
さらに加えて、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマーは、ポリマーまたはオリゴマーの主鎖中に少なくとも１つのエステル結合を有し得る。いくつかの場合、ポリマーまたはオリゴマーは、ポリマーまたはオリゴマーの主鎖中に複数のエステル結合、例えば少なくとも３つのエステル結合、少なくとも４つのエステル結合、または少なくとも５つのエステル結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーは、ポリマーまたはオリゴマーの主鎖中に２つのエステル結合〜５０のエステル結合を有する。
【００２３】
本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーは、本発明の目的と矛盾しない任意の量で、組成物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、例えば本明細書中に記載される組成物は、約９９重量％まで、約９５重量％まで、約９０重量％まで、約８０重量％まで、約７０重量％まで、約５０重量％まで、約４０重量％まで、または約３０重量％までのポリマーまたはオリゴマーを含む。いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物は、約２０〜約９９重量％、約３０〜約９５重量％、約３０〜約９０重量％、約４０〜約９０重量％、約４０〜約８０重量％、約５０〜約９５重量％、約５０〜約９０重量％、約５０〜約８０重量％、約５０〜約７０重量％、約６０〜約９９重量％または約６０〜約８０重量％を含む。
【００２４】
さらに、本明細書中に記載される組成物は、いくつかの場合、２つ以上のポリマーまたはオリゴマーの混合物、配合物または組合せを含み得る。いくつかの場合、２つ以上のポリマーまたはオリゴマーは、本明細書中に記載されるシトラート含有ポリマーまたはオリゴマーである。その他の場合、混合物、配合物または組合せのうちの少なくとも１つのポリマーまたはオリゴマーは、シトラート部分を含まない。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載されるシトラート含有ポリマーまたはオリゴマーと、生分解性ポリマー、例えばポリエステルとの混合物、配合物または組合せを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載されるシトラート含有ポリマーまたはオリゴマーと、ポリ（乳酸）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリレート）、ポリカーボネート、多糖、例えばセルロース、またはその組合せとの混合物、配合物または組合せを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、式（Ｉ）：
【化４】
0006286447.tif 000005
（式中、Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）
【化５】
0006286447.tif 000006
または
【化６】
0006286447.tif 000007
であり；
【化７】
0006286447.tif 000008
は、式（Ｉ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎ、ｐおよびｑは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
の構造を有する第一ポリマーまたはオリゴマー；ならびに
式（ＩＩ）：
【化８】
0006286447.tif 000009
（式中、Ｒ２は、−Ｈまたは
【化９】
0006286447.tif 000010
であり；
【化１０】
0006286447.tif 000011
は、式（ＩＩ）の構造を有する反復単位の付加的鎖を表し;そして
ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２から２０までの範囲の整数である）
の構造を有する第二ポリマーまたはオリゴマーを含み、この場合、第一ポリマーまたはオリゴマーは第二ポリマーまたはオリゴマーと配合される。
【００２６】
本明細書中に記載される混合物、配合物または組合せのポリマーまたはオリゴマーは、本発明の目的と矛盾しない任意の量で、混合物、配合物または組合せ中に存在し得る。いくつかの場合、ポリマーまたはオリゴマーの混合物、配合物または組合せの第一ポリマーまたはオリゴマー対混合物、配合物または組合せの第二ポリマーまたはオリゴマーの重量比は、約９９:１〜約１:９９である。いくつかの場合、第一ポリマーまたはオリゴマー対第二ポリマーまたはオリゴマーの重量比は、約１０：１〜約１：１０、約５：１〜約１：５、約３：１〜約１：３または約２：１〜約１：２である。理論に縛られずに考えると、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーの混合物を含む組成物は、いくつかの実施形態では、考え得る別の場合より多い量の粒子状物質を含む複合体を形成するために用いられ得る。さらにまた理論に縛られずに考えると、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーの混合物を含む組成物は、個々のポリマーまたはオリゴマーにより提供される特性の所望の組合せを提供し得る。例えば、式（Ｉ）のポリマーまたはオリゴマーは、式（ＩＩ）のポリマーまたはオリゴマーより大きい機械的強度を提供し得るが、しかしヒドロキシアパタイトのような粒子状物質と相互作用するためのヒドロキシルまたはカルボキシル基はより少ない。したがって、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物中に含まれる異なったポリマーまたはオリゴマーの比率は、１つ以上の官能基または部分の所望量、および／または組成物の所望の機械的強度に基づいて選択される。例えば、いくつかの場合、式（Ｉ）のポリマーまたはオリゴマーの量と比較して、相対的に多量の式（ＩＩ）のポリマーまたはオリゴマーを含む組成物は、相対的に少量の式（ＩＩ）のポリマーまたはオリゴマーを含む組成物より多い量のカルボキシル基を有し得る。
【００２７】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーの混合物、配合物または組合せのポリマーまたはオリゴマーは、互いに架橋されて、ポリマー網目構造を形成し得る。第一ポリマーまたはオリゴマーと第二ポリマーまたはオリゴマーとの架橋は、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で達成され得る。例えば、いくつかの場合、架橋は、ポリマーまたはオリゴマー間のエステルまたはアミド結合のような分子間共有結合により、例えば縮合反応により、達成される。他の場合には、架橋は、ポリマーまたはオリゴマー中の不飽和部分、例えばマレイン酸部分のエチレン性不飽和部分のカップリングにより、達成され得る。
【００２８】
さらに、いくつかの実施形態では、ポリマー網目構造を含む組成物はさらに、ポリマー網目構造中に分散される粒子状物質を含む。本発明の目的と矛盾しない任意の粒子状物質が用いられ得る。いくつかの場合、粒子状物質は、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、バイオガラス、セラミック、マグネシウム粉末、マグネシウム合金および脱細胞化骨組織粒子のうちの１つ以上を含む。その他の粒子状物質も用いられ得る。
【００２９】
さらに、本明細書中に記載される粒子状物質は、本発明の目的と矛盾しない任意の粒子サイズおよび／または粒子形状を有し得る。いくつかの実施形態では、例えば粒子状物質は、約１０００μｍ未満、約８００μｍ未満、約５００μｍ未満、約３００μｍ未満、約１００μｍ未満、約５０μｍ未満、約３０μｍ未満または約１０μｍ未満のうちの少なくとも１つの寸法での平均粒子サイズを有する。いくつかの場合、粒子状物質は、約１μｍ未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満または約３０ｎｍ未満のうちの少なくとも１つの寸法での平均粒子サイズを有する。いくつかの場合、粒子状物質は、２つの寸法または３つの寸法での本明細書中に列挙される平均粒子サイズを有する。さらに、粒子状物質は、実質的に球形の粒子、プレート様粒子、針様粒子、またはその組合せから形成され得る。他の形状を有する粒子状物質も、用いられ得る。
【００３０】
粒子状物質は、本発明の目的と矛盾しない任意の量で、本明細書中に記載される組成物中に存在し得る。例えば、いくつかの場合、組成物は、組成物の総重量を基礎にして、約７０重量％まで、約６０重量％まで、約５０重量％まで、約４０重量％まで、または約３０重量％までの粒子状物質を含む。いくつかの場合、組成物は、組成物の総重量を基礎にして、約１〜約７０重量％、約１０〜約７０重量％、約１５〜約６０重量％、約２５〜約６５重量％、約２５〜約５０重量％、約３０〜約７０重量％、約３０〜約５０重量％、約４０〜約７０重量％または約５０〜約７０重量％を含む。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載されるポリマー網目構造を含む組成物は、約６５重量％までのヒドロキシアパタイトを含む。理論に縛られずに考えると、本明細書中に記載されるポリマー網目構造中の約６５重量％までのヒドロキシアパタイトの組み入れは、生物学的環境またはｉｎ ｖｉｔｒｏでポリマー網目構造により提供される骨伝導能および／または骨誘導能を増強し得る。
【００３１】
さらに、本明細書中に記載される粒子状物質は、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で、ポリマー網目構造中に分散され得る。いくつかの実施形態では、例えば粒子状物質は、ポリマー網目構造中で混合または粉砕される。さらに、本明細書中に記載される粒子状物質は、いくつかの場合、ポリマー網目構造の１つ以上のペンダント官能基によりキレート化されるか、そうでなければ結合され得る。例えば、いくつかの場合、組成物は、本明細書中に記載されるポリマー網目構造中に分散されるヒドロキシアパタイト粒子を含むが、この場合、ヒドロキシアパタイトは、ポリマー網目構造の１つ以上のペンダント官能基によりキレート化される。いくつかの実施形態では、ポリマー網目構造の１つ以上のカルボキシル部分または１つ以上のシトラート部分は、ヒドロキシアパタイトの１つ以上のカルシウム含有部分とキレートを作る。理論に縛られずに考えると、このようなキレート化は、いくつかの他のポリマー基質と比較して、本明細書中に記載されるポリマー網目構造内でのより多量のヒドロキシアパタイト（または別の無機物質）の組み入れを可能にし得る。
【００３２】
本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、いくつかの実施形態では、生物医学的または組織工学処理的適用のための１つ以上の望ましい特性を示し得る。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、生分解性である。本明細書中で言及するための「生分解性」ポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、ｉｎ ｖｉｖｏで非毒性構成成分に分解して、これは、通常の生物学的過程により身体から取り除かれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される生分解性ポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、約４週間以下の経過中に、完全にまたは実質的に完全に、ｉｎ ｖｉｖｏで分解する。本明細書中で言及するための「生体適合性または細胞適合性」ポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、非毒性であり、実質的組織炎症を引き起こさないが、この場合、炎症は、繊維被膜形成の量により測定され得る。
【００３３】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、高機械的強度を示す。いくつかの場合、例えば本明細書中に記載される組成物のポリマーまたはオリゴマー、あるいは架橋ポリマー網目構造は、実施例２、本明細書中で以下に記載されるように測定した場合、以下の表Ｉに記載される１つ以上の特性を示す。
【表１】
0006286447.tif 000012
【００３４】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、骨組織をさらに含み得る。本発明の目的と矛盾しない任意の骨組織が用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えば骨組織は緻密骨組織を含む。他の場合には、骨組織は海綿骨組織を含む。さらに、いくつかの実施形態では、骨組織は、組成物のポリマー網目構造、例えば本明細書中に記載されるポリマー網目構造と接着される。さらに加えて、いくつかの場合、ポリマー網目構造周囲の骨組織およびポリマー網目構造は、骨組織中に組み入れられる。このような組成物は、いくつかの場合、高い骨−インプラント接触（ＢＩＣ）を示し得るが、この場合、「骨」は骨組織を指し、「インプラント」はポリマー網目構造を指す。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組織は、本明細書中に記載されるように測定した場合、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の骨−インプラント接触を示す。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載されるように測定した場合、約７０〜約９９％、約７５〜約９５％、約８０〜約９５％または約８０〜約９０％の骨−インプラント接触を示す。さらに、いくつかの場合、本明細書中に記載される組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで６週間後に、繊維組織封入を示さないし、または繊維組織封入を実質的に示さない。本明細書中で言及するための「実質的に繊維組織封入を示さない」は、約５重量％未満または約１重量％未満の組成物が繊維組織を封入する、ということを意味する。
【００３５】
本明細書中に記載される組成物は、本発明の目的と矛盾しない本明細書中に記載される特性または特徴の任意の組合せを有し得る、と理解されるべきである。例えば、本明細書中に記載される任意のポリマーまたはオリゴマーは、本明細書中に記載される粒子状物質の任意の量または型と組み合わせて用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えば組成物は、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーを含み得るが、この場合、１つ以上のポリマーまたはオリゴマーは、架橋されてポリマー網目構造を形成し、そしてヒドロキシアパタイトを含む粒子状物質は、ポリマー網目構造内に分散される。その他の組合せも考え得る。
【００３６】
ＩＩ．  骨成長を促す方法
別の態様では、骨成長を促す方法が本明細書中で記載される。いくつかの実施形態では、骨成長を促す方法は、シトラート提示組成物を骨細胞の集団に提供することを包含する。さらに、いくつかの場合、骨成長を促すことは、骨細胞の集団における細胞分化および／または表現型進行を促すことを包含する。例えば、いくつかの場合、骨細胞の集団にシトラート提示組成物を提供することは、骨細胞の集団における骨芽細胞表現型進行を促す。さらに、いくつかのこのような実施形態では、シトラート提示組成物は、第一細胞分化または表現型進行を獲得するために選択される細胞発達の第一段階で、骨細胞に提供される。さらに加えて、いくつかの場合、第二シトラート提示組成物が、第二細胞分化または表現型進行を獲得するために選択される細胞発達の第二段階で、骨細胞に提供され得る。他の実施形態では、本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、生物学的環境中にシトラート提示組成物を配置することを包含する。本明細書中で言及するための「生物学的環境」は、生きている生物体内の環境、例えば骨部位、あるいは創傷または損傷部位を含む。いくつかの場合、骨成長を促すことは、生物学的環境中でのオステリックス遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を上方調節することを包含する。さらに加えて、本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物から遊離クエン酸またはシトラートを放出することをさらに包含する。
【００３７】
ここで方法のステップに目を向けると、本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、骨細胞の一集団にシトラート提示組成物を提供すること、および／または生物学的環境中にシトラート提示組成物を配置することを包含する。本明細書中で言及するための「シトラート提示組成物」は、クエン酸、シトラート、クエン酸のエステル、例えばクエン酸トリエチル、または式（ＩＶ）：
【化１１】
0006286447.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、Ｍ＋、または化学種の残り部分との結合点であり；
Ｒ４は、−Ｈまたは化学種の残り部分との結合点であり；そして
Ｍ＋は、陽イオン、例えばＮａ＋またはＫ＋である）
の構造を有する部分を含む化学種を包含する組成物である。いくつかの実施形態では、化学種はポリマーまたはオリゴマーである。したがって、本明細書中に記載される「シトラート提示組成物」の「シトラート」は、本明細書中に上記したようなクエン酸の小分子または「単量体」型、例えばクエン酸、クエン酸塩またはクエン酸のエステルを指し得る。
【００３８】
本発明の目的と矛盾しない任意のシトラート提示組成物は、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えばシトラート提示組成物は、クエン酸および／またはシトラート、例えばクエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウムの水溶液を含む。その他の場合、シトラート提示組成物は、第１節に本明細書中で上記されたポリマーまたはオリゴマー、あるいは第１節に本明細書中で上記されたポリマーまたはオリゴマーの混合物、配合物または組合せを含む。例えば、いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーのようなシトラート部分を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。本明細書中に記載される方法のシトラート提示組成物は、式（Ｉ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマー、あるいは式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーの混合物、配合物または組合せも含み得る。その他のポリマーまたはオリゴマーも、本明細書中で上記したように、用いられ得る。
【００３９】
さらに、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で、骨細胞の集団に提供され得る。例えば、いくつかの場合、シトラート提示組成物は、水性混合物または溶液として、例えばシトラートを補足された培地として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨細胞に提供される。本発明の目的と矛盾しない任意の培地が、用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えば培地は、最小必須培地アルファ（αＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、あるいは前記培地のうちの１つ以上の混合物を包含する。さらに、シトラート提示組成物がシトラートを補足された培地を含むいくつかの場合、培地は、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物により提供されるシトラート以外の付加的骨成長因子を含まないかまたは実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培地は、亜鉛を含まないかまたは実質的に含まない。本明細書中で言及するための付加的骨成長因子または他の構成成分を「実質的に含まない」培地は、約１０μＭ未満、または約１μＭ未満の付加的骨成長因子を含む。代替的には、その他の場合、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物の培地は、１つ以上の骨成長因子をさらに含む。例えば、いくつかの場合、培地は骨形成培地である。その他の場合、シトラート提示組成物は、水性混合物または溶液として、あるいは固体インプラントまたは用具、例えば骨ネジまたは骨プレートとして、ｉｎ ｖｉｖｏで骨細胞に提供される。さらに、本明細書中に記載される方法に従って骨細胞に提供されるシトラート提示組成物は、いくつかの実施形態では、骨細胞に対して外因性であり得る、と理解されるべきである。
【００４０】
さらに、本明細書中に記載されるいくつかの方法では、１つ以上のシトラート提示組成物は、表現型進行または細胞分化のうちの１つ以上の段階で骨細胞に提供され得る。本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、本発明の目的と矛盾しない任意の段階または段階の組合せで、骨細胞に提供され得る。いくつかの場合、例えばシトラート提示組成物は、鉱化段階で、または前に、例えば骨細胞が少なくとも部分的に分化した後に、骨細胞に提供される。シトラート提示組成物は、さらにまた、表現型進行または分化のうちの１つ以上のその他の段階で、骨細胞に提供され得る。さらに、本明細書中に記載される同一のまたは異なるシトラート提示組成物が、１つ以上の段階で提供され得る。
【００４１】
本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、いくつかの実施形態では、シトラート提示組成物から遊離クエン酸またはシトラートを放出することをさらに包含する。本明細書中で言及するための「遊離クエン酸またはシトラート」は、本明細書中に記載されるポリマーまたはオリゴマーのような別の種と共有結合されないクエン酸またはシトラートを含む。クエン酸またはシトラートは、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物から放出され得る。さらに加えて、クエン酸またはシトラートは、任意の所望の環境中に放出され得る。例えばいくつかの場合、クエン酸またはシトラートは、生物学的環境中に配置されるシトラート含有ポリマーまたはオリゴマーを分解することにより、生物学的環境中に放出され得る。さらに、ポリマーまたはオリゴマーは、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で分解され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーまたはオリゴマーを分解することは、ポリマーまたはオリゴマーのエステル結合、例えばポリマーまたはオリゴマーの主鎖中のエステル結合を加水分解することを包含する。その他の場合、シトラート提示組成物からクエン酸またはシトラートを放出することは、加水分解、化学結合の切断、または組成物のその他の分解を必要としない。例えば、クエン酸またはシトラートの水溶液の使用を包含するいくつかの実施形態では、遊離クエン酸またはシトラートは、当該環境にシトラート提示組成物を提供することにより、簡単に所望の環境中に放出され得る。
【００４２】
さらに、本明細書中に記載される方法のシトラート提示組成物は、いくつかの場合、所望量のシトラートを提供し得る。いくつかの実施形態では、例えば本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、組成物の容量を基礎にして、約２０μＭ〜約２０００μＭのシトラート濃度を提供する。意外にも、約２０μＭ〜約２０００μＭのシトラートの量を提供すると、本明細書中に記載されるように骨成長を促し得るが、一方でさらにまた、本明細書中で以下に記載される容易、所望され得ない他の作用を回避するかまたは最小限にする、ということが見出された。他の量または濃度のシトラートも提供され得る。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、約２０μＭ〜約２００μＭ、約２０μＭ〜約１５０μＭ、約１００μＭ〜約２０００μＭ、約１００μＭ〜約１５００μＭ、約２００μＭ〜約２０００μＭ、約２００μＭ〜約１５００μＭ、約３００μＭ〜約１８００μＭ、約５００μＭ〜約２０００μＭ、約５００μＭ〜約１５００μＭ、約８００μＭ〜約２０００μＭ、約８００μＭ〜約１４００μＭ、約１０００μＭ〜約２０００μＭ、または約１０００μＭ〜約１５００μＭのシトラート濃度を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、約８００μＭより大きい、または約２０００μＭより大きいシトラート濃度を提供する。
【００４３】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、提供されるシトラートの量を基礎にして、用量依存的に生物学的作用を提供する。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される方法は、用量依存的に細胞におけるＡＬＰおよび／またはＯＳＸ遺伝子発現を上方調節するために、骨細胞の集団にシトラート提示組成物を提供することを包含するが、この場合、提供されるシトラートの量は、約２０μＭ〜約２０００μＭである。
【００４４】
さらに、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物は、本発明の目的と矛盾しない任意の骨細胞の任意の集団に提供され得る。例えば、いくつかの場合、骨細胞は骨芽細胞を含む。他の場合、骨細胞は骨髄細胞、例えば骨髄間質細胞を含む。いくつかの実施形態では、骨細胞は幹細胞を含む。幹細胞は、いくつかの場合、成人幹細胞であり得る。いくつかの場合、骨細胞の集団は、多能性、少能性または単能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞、例えばＣ２Ｃ１２細胞またはヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を含む。さらに、骨細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、内因性または外因性であり得る。
【００４５】
本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、いくつかの実施形態では、骨の一集団に生物学的因子を提供することをさらに包含する。本明細書中で言及するための「生物学的因子」は、特定の生化学的経路または身体的過程において機能する物質、例えば増殖因子を含む。本発明の目的と矛盾しない任意の生物学的因子が、用いられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、生物学的因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む。ＢＭＰは、いくつかの場合、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のうちの１つ以上を含む。その他の生物学的因子も用いられ得る。
【００４６】
本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、いくつかの実施形態では、オステリックス（ＯＳＸ）遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子発現を上方調節することを包含する。いくつかの場合、ＯＳＸ遺伝子発現を上方調節することは、４８時間培養後、ベアガラス対照と比較して、約３００％まで、遺伝子発現を増大することを包含する。いくつかの場合、いくつかの場合、ＯＳＸ遺伝子発現の量は、約１００％まで、約５０％まで、または約４０％まで増大される。いくつかの実施形態では、ＯＳＸ遺伝子発現の量は、４８時間の培養後、ベアガラス対照と比較して、約３０％〜約３００％、３５％〜約２５０％、約３５％〜約２００％、または約２００％〜約３００％増大される。
【００４７】
いくつかの場合、ＡＬＰ遺伝子発現の量は、４８時間培養後、ベアガラス対照と比較して、約４０％まで増大される。いくつかの場合、ＡＬＰ遺伝子発現の量は、約３６０％まで、約２５０％まで、約１５０％まで、約１００％まで、約５０％まで、約４０％まで、増大される。いくつかの実施形態では、ＡＬＰ遺伝子発現の量は、４８時間培養後、ベアガラス対照と比較して、約３０％〜約４００％、約３５％〜約３６０％、約３５％〜約３００％、約３５％〜約２５０％、約３００％〜約４００％、または約３００％〜約３６０％増大される。
【００４８】
さらに加えて、本明細書中に記載される方法は、いくつかの実施形態では、癌細胞、例えば骨肉腫細胞またはその他の骨癌細胞の成長および／または増殖を少なくとも部分的に抑制するクエン酸提示組成物を提供することを包含する。いくつかの実施形態では、癌細胞の成長および／または増殖は、癌細胞が当該方法により死滅される場合のように、完全に抑制されるかまたは停止される。他の場合には、癌細胞の成長および／または増殖は、細胞の集団にシトラート提示組成物を提供することを包含しない対照方法と比較して、約９０％まで、約８０％まで、約７０％まで、約５０％まで、約３０％まで、または約２０％まで、抑制される。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物の作用は、用量依存的である。さらに、いくつかの場合、癌細胞の成長および／または増殖を抑制することは、約８００μＭより高い濃度で、例えば約８００μＭ〜約２０，０００μＭの量または約８００μＭ〜約２０００μＭの量で、細胞にシトラートを提供することを包含する。
【００４９】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、癌細胞、例えば骨癌細胞を死滅させるシトラート提示組成物を提供することを包含する。いくつかの場合、癌細胞の全てが死滅される。他の場合には、細胞の集団にシトラート提示組成物を提供することを包含しない対照方法と比較して、癌細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約５０％が死滅される。さらに加えて、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるシトラート提示組成物の抗癌作用は、用量依存的である。さらに、いくつかの場合、癌細胞を死滅させることは、約２０００μＭより高い濃度で、例えば約２０００μＭより高い、そして約２０，０００μＭまでの濃度で、細胞にシトラートを提供することを包含する。
【００５０】
本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、本発明の目的と矛盾しないステップの任意の組合せを含み得るし、本発明の目的と矛盾しない組成物の任意の組合せを使用し得る、と理解されるべきである。いくつかの実施形態では、例えば本明細書中に記載される骨成長を促す方法は、細胞分化および／または表現型進行を促す目的のために、またはオステリックス遺伝子発現および／またはアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現を上方調節する目的のために、本明細書中に上記された骨細胞の集団に、または生物学的環境に上記のシトラート濃度で提供するために節Ｉに上記したシトラート提示組成物を用いることを包含し得る。
【００５１】
ＩＩＩ．  シトラート提示組成物を含む物品
別の態様において、シトラート提示組成物を含む物品が、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、物品は、式（Ｉ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマー、および／または式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーから形成される架橋ポリマー網目構造のような、節Ｉで上記されたシトラート提示組成物を含み、またはそれから形成される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される物品は、ポリマー網目構造中に分散される粒子状物質を含む、節Ｉに上記された架橋ポリマー網目構造を含むかまたはそれから形成される。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される物品は、ポリマー網目構造を形成するために式（ＩＩ）の構造を有するポリマーまたはオリゴマーと架橋される式（Ｉ）の構造を有する第一ポリマーまたはオリゴマーを含むかまたはそれから形成され、ポリマー網目構造はさらに、ポリマー網目構造全体に分散される約７０重量％までのヒドロキシアパタイトを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される物品は、生物学的または外科的インプラント、例えば整形外科用固定用具、例えば骨ネジまたは骨プレートである。したがって、いくつかの場合、本明細書中に記載される物品は、機械的支持を提供することにより、骨折あるいは他の創傷または損傷の治癒または修理を促すために用いられ得る。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される物品は、骨折のような創傷または損傷の部位での骨成長も促し得る。このようにして、本明細書中に記載される物品は、骨折骨成長障害および／または骨変性状態の処置改善を提供するために用いられ得る。本明細書中に記載される物品はさらにまた、生物学的区画、例えば骨における癌増殖を抑制し、または癌細胞を死滅させ得る。
【００５３】
本明細書中に記載される物品は、本発明の目的と矛盾しない任意のサイズおよび形状を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される物品は、円筒形、球形または多面形を有する。他の場合には、本明細書中に記載される物品は、整形外科用固定用具として用いるのに適した形状、例えばネジ形またはプレート形を有する。
【００５４】
さらに、本明細書中に記載される物品は、１つ以上の望ましい特性、例えば１つ以上の望ましい生物医学的または機械的特性を示し得る。いくつかの場合、例えば本明細書中に記載される物品は、遺伝子発現作用または骨誘導作用の増大といったような節Ｉまたは節ＩＩに本明細書中で上記した生物学的作用を示すかまたは促す。他の場合には、本明細書中に記載される物品は、節Ｉに本明細書中で上記した圧縮弾性率を示す。
【００５５】
さらに、本明細書中に記載される物品は、本発明の目的と矛盾しない任意のやり方で作られ得る。例えば、いくつかの場合、本明細書中に記載される物品は、押出工程、引抜き工程または成形工程、例えば射出成形工程（これらに限定されない）を用いて、本明細書中に記載される組成物から作られる。
【００５６】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態を、以下の非限定的実施例でさらに例証する。別記しない限り、下記の実験はすべて、二重反復実験で実行され、３回反復され（ｎ＝６）、統計学的結果は、３つの実験組を基礎にしている。適切な場合、データは平均±標準偏差として表される。２組のデータ間の統計学的有意は、両側スチューデントｔ検定を用いて算定した。差は、Ｐ＜０．０５の値が得られた場合、有意であると解釈した。
【実施例】
【００５７】
実施例１
ＰＯＣおよびＣＵＰＥポリマーまたはオリゴマー
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態によるシトラート提示ポリマーまたはオリゴマーを、以下のように調製した。第一ポリマーまたはオリゴマーをポリ（クエン酸オクタンジオール）（ＰＯＣ）として同定し、第二ポリマーまたはオリゴマーを架橋ウレタンドープポリエステル（ＣＵＰＥ）として同定した。
【００５８】
ＰＯＣを合成するために、等モル量の１，８−オクタンジオール（９８％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）およびクエン酸（９９．５％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を１００ｍＬ丸底フラスコに付加し、一定流量の窒素ガスに曝露した。混合物を、激しく撹拌しながら１６０〜１６５°で融解した。一旦、構成成分が融解したら、混合物を１４０°で１時間反応させて、非精製ＰＯＣポリマーまたはオリゴマーを生成した。次に、非精製ポリマーまたはオリゴマーを脱イオン水に滴下して、収集し、一晩凍結乾燥して、精製ＰＯＣポリマーまたはオリゴマーを得た。
【００５９】
ＣＵＰＥを合成するために、クエン酸および１，８−オクタンジオールをそれぞれ１：１．１モル比で反応させ、さらに、上述したように反応生成物を加工処理することにより、先ずＰＯＣポリマーまたはオリゴマーを合成した。次いで、精製ＰＯＣポリマーまたはオリゴマーを１，４−ジオキサン中に溶解して、ＰＯＣの３重量％溶液を生成し、その後、１，６−ヘキサメチルジイソシアネート（ＨＤＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と、１：１．５のＰＯＣ対ＨＤＩモル比で、５５℃で絶えず撹拌しながら反応させることにより、ＰＯＣポリマーまたはオリゴマーの鎖伸張を成し遂げた。フーリエ変換赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）分析が２２６７ｃｍ−１でのイソシアネートピークの消失を示した場合、反応を終結させた。
【００６０】
実施例２
ＣＢＰＢ配合物およびＣＢＰＢＨＡ複合体
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態によるポリマー網目構造、および網目構造内に分散される粒子状物質を含むポリマー網目構造を、以下のように調製した。ポリマー網目構造は、第一ポリマーまたはオリゴマーおよび第二ポリマーまたはオリゴマーの種々の配合物を含み、シトラートベースのポリマー配合物（ＣＢＰＢ）と称した。粒子状物質を含むポリマー網目構造を、シトラートベースのポリマー配合物／ヒドロキシアパタイト（ＣＢＰＢＨＡ）複合体と称した。ＣＢＰＢＨＡ複合体を、３段階で加工した。第一に、１，４−ジオキサンまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中にＰＯＣポリマーまたはオリゴマーを溶解し、ＰＯＣ溶液を１，４−ジオキサンまたはＴＨＦ中のＣＵＰＥポリマーまたはオリゴマーの種々の比率の溶液と混合して、均質シトラートベースのポリマーまたはオリゴマー配合物（ＣＢＰＢ−Ｘ（ここで、Ｘは、ＣＢＰＢ配合物中のＣＵＰＥの重量比と定義される）と呼ばれる）を生成することにより、ＣＵＰＥおよびＰＯＣの混合物を先ず調製した。第二に、各ＣＢＰＢを、組成物の総重量を基礎にして６５重量％のヒドロキシアパタイト（ＨＡ、［ＭＷ：５０２．３２；検定：＞９０％（Ｃａ３（ＰＯ４）２として）；粒子サイズ：＞７５μｍ（０．５％）、４５〜７５μｍ（１．４％）、＜４５μｍ（９８．１％）］、Ｆｌｕｋａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と混合し、５０℃に予熱したテフロン（登録商標）皿中で撹拌して、溶媒蒸発を手助けした。溶媒蒸発後、粘土様混合物を機械化円筒形金属製金型中に挿入し、棒形試料に圧縮した。最後に、その結果生じた円筒形複合体を、８０℃で５日間、後重合し、その後、２Ｐａ真空下で１日間、１２０℃で加熱して、架橋ＣＢＰＢＨＡ−Ｘ複合体（ここで、Ｘは、さらにまた、ＣＢＰＢ中のＣＵＰＥの重量比と定義される）を生成した。結果を、表ＩＩに示す。ＨＡ以外の粒子状物質を含む複合体も、同じようにして調製し得る。この工程を、図１に模式的に例示する。図１に示したように、ＣＵＰＥポリマーまたはオリゴマー主鎖は、本質的に垂直に配置されているものとして表され、ＰＯＣポリマーまたはオリゴマー主鎖は、本質的に水平に配置されるものとして表される。しかしながら、この図は、例証のために示しただけである。当業者が理解するように、ＣＵＰＥおよびＰＯＣ主鎖の配向は無作為であり得る。さらに、図１に示したように、複合体網目構造中の大きい方の円はＨＡ粒子を表し、小さい方の円はエステルまたはウレタン結合を表し、そして破線はペンダントカルボキシル基を示す。
【表２】
0006286447.tif 000014
【００６１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、ＣＢＰＢ配合物およびＣＢＰＢＨＡ複合体を特性化した。具体的には、ＤＳＣ  Ｑ２０００示差走査熱量計（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用いて測定を実行して、ＣＢＰＢポリマー配合物（ＣＢＰＢ−１００，ＣＢＰＢ−９０，ＣＢＰＢ−５０およびＣＢＰＢ−０）の熱特性および均質性を特性化した。試料を、最初に、１０℃／分の加熱率で、窒素下で室温から１５０℃まで走査し、その後、温度が−７５℃に達するまで、−４０℃／分の割合で冷却した。次に、試料を再び、１０℃／分の加熱率で、−７５℃から１５０℃まで走査した。二次加熱試験からの熱容量における記録済み段階変化の中点から、ガラス転移温度（Ｔｇ）を決定した。ＣＢＰＢ配合物中の２つのポリマーまたはオリゴマーの混和性を確定するために、配合物のガラス転移温度を、以下の方程式（２）（フォックス方程式）により表した：
１／Ｔｇ＝Ｗ１／Ｔｇ，１＋Ｗ２／Ｔｇ，２        （２），
（式中、Ｗｉは構成成分ｉの重量分率であり、温度は絶対温度である。結果を、図２に示す。図２は、種々のＣＢＰＢ配合物のＤＳＣサーモグラムを例示する。値は、平均±標準偏差（ｎ＝６）として報告される。ＣＢＰＢ配合物は、同一重合条件（５日、８０℃）下で、ＣＵＰＥ含量の増大に伴って増大する単一ガラス転移温度を示した。個々の構成成分ＣＢＰＢ−１００およびＣＢＰＢ−０のＴｇ値を基礎にしたＣＢＰＢ−９０およびＣＢＰＢ−５０に関するＴｇ値は、それぞれ０．４１℃および−９．１３℃であると算定された。
【００６２】
Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ試験機Ｑ  Ｔｅｓｔ−１５０（ＭＴＳ，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて、ＣＢＰＢＨＡ複合体に関して一軸圧縮試験を実施した。要するに、円筒形にした検体６ｍｍ×９ｍｍ（直径×高さ）を、壊れるまで２ｍｍ／分の速度で圧縮した。応力−歪み曲線の１０％の圧縮での勾配を測定することにより、初期弾性率を算定した。結果を表ＩＩＩに、そして図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、ＣＢＰＢＨＡ複合体の圧縮弾性率を示す。図３Ｂは、ＣＢＰＢＨＡ複合体の圧縮ピーク強度を示す。ｘ軸値は、ＣＢＰＢ配合物中のＣＵＰＥパーセンテージを表す。
【表３】
0006286447.tif 000015
【００６３】
ＣＢＰＢＨＡ複合体の円板試料（６ｍｍ直径×２ｍｍ厚）のｉｎ ｖｉｔｒｏ分解速度を、経時的重量減少により査定した。静的条件下で３７℃で２４時間まで、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に試料を配置した。ｐＨが７より低く下がらないことを確証するために、ＰＢＳを毎週取り替えた。計量前に、試料を脱イオン（ＤＩ）水で広範にすすいで、凍結乾燥した。以下の方程式（１）：
重量減少＝（Ｗ０−Ｗｔ）／Ｗ０×１００％                          （１）
で示されるように、初期重量（Ｗ０）を１、２、４、８、１２および２４週目（Ｗｔ）に測定された重量と比較することにより、重量減少を算定した。結果を、平均±標準偏差（ｎ＝６）として図４に示す。
【００６４】
Ｎａ＋（１４２．０ｍｍｏｌ）、Ｋ＋（５．０ｍｍｏｌ）、Ｍｇ２＋（１．５ｍｍｏｌ）、Ｃａ２＋（２．５ｍｍｏｌ）、Ｃｌ−（１０３ｍｍｏｌ）、ＨＣＯ３−（１０．０ｍｍｏｌ）、ＨＰＯ４２−（１．０ｍｍｏｌ）およびＳＯ４２−（０．５ｍｍｏｌ）（結果を速めるために１．０Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整）からなる４倍改質擬似体液（ＳＢＦ）溶液を用いて、ＣＢＰＢＨＡ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ鉱化を査定した。要するに、複合体円板（６ｍｍ直径×２ｍｍ高さ）を、３７℃で１５日間まで、１０ｍＬのＳＢＦ中に浸漬した。鉱化中のイオン濃度およびｐＨを保持するために、ＳＢＦを１日おきに取り替えた。種々の時間のインキュベーション後、検体をＤＩ水で注意深く洗浄して、あらゆる可溶性無機イオンを除去し、風乾した。次に、試料を銀で被覆して、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）下で観察した。化学量論的Ｃａ／Ｐモル比をエネルギー分散型ｘ線（ＥＤＸ）分析により分析して、１．３９±０．２５であると確定した。図５に示したように、ＣＢＰＢＨＡ複合体の全てが、迅速鉱化を誘導した。図５における画像標識化Ａ−１、Ａ−２およびＡ−３は、それぞれ０、３および１５日目のＣＢＰＢＨＡ−０に対応する。同様の標識化スキームは、図５におけるその他の複合体のために用いられる。
【００６５】
実施例３
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。６週齢雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに由来する骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾンそして１％（Ｖ／Ｖ）ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足した最小必須培地アルファ（αＭＥＭ）を含有する増殖培地中で、２×１０５細胞／ウェル（０日目）の密度で６−ウェルプレート中で培養した。３日目に、増殖培地を、１０％ウシ胎仔血清、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭのβ−グリセロールホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン、そして種々の濃度のクエン酸（０μＭ、２μＭ、２０μＭ、２００μＭ、１ｍＭおよび５ｍＭ）を補足したαＭＥＭからなる骨形成培地に変えた。骨形成誘導の１２日後、ＢＭＳＣ培養をフォン・コッサ染色で染色し、光学顕微鏡で画像処理した。ウェルあたりのカルシウム結節の数を、倒立顕微鏡で計数した。カルシウム結節の総面積も算定した。結果を図６Ａ〜６Ｃに示す。図６Ａは、フォン・コッサ染色の顕微鏡画像を例示する。図６Ｂは、観察されたカルシウム結節の数を示す。図６Ｃは、カルシウム結節の総面積を示す。シトラート補足培地はすべて、用量依存的にカルシウム結節形成を促す、ということが判明した。２０μＭのシトラート濃度が、より大きいサイズを有する最高数のカルシウム結節を誘導し（図６Ａ中の黒色）、一方、対照培地は可視的カルシウム結節形成を助長しなかった。
【００６６】
実施例４
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。ＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳそして１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＥＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で培養した。ＭＧ−６３細胞を、５０％集密度で６−ウェルプレート中に播種し、異なる濃度のクエン酸（０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭ）を含有するＥＭＥＭを用いて培養した。４日目に、細胞を溶解し、ＡＬＰ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の存在に関して検定した。ピコグリーン検定（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）により決定されるように、試料中に存在するＤＮＡの総量に対してＡＬＰレベルを正規化した。結果を、図７に示す。
【００６７】
他の実験では、０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１０００μＭまたは２０００μＭのクエン酸を含有する培地を用いて、上記と同様にＭＧ−６３細胞またはＭＳＣ細胞を培養し、播種した。種々の時点、例えば３日目、７日目、１０日目、１４日目および２１日目に、ＡＬＰの存在に関して、細胞を検定した。結果を、図８Ａおよび８Ｂに示す。
【００６８】
実施例５
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳそして１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。分化のために、ｈＭＳＣを、１０−７Ｍのβ−グリセロホスフェートおよび５０μＭのアスコルビン酸−２−ホスフェートをさらに捕捉した先のＤＭＥＭベースの培地を含む骨形成培地（ＯＧＭ）に切り替えた。９６ウェルプレート中で、８０〜９０％集密後に、１０４細胞／ｍＬの密度で、ｈＭＳＣ細胞を播種した。ｐＨを７．４に調整後、算定容量のシトラートをクエン酸の形態で増殖培地に付加して、２０μＭ、２００μＭまたは２０００μＭの増殖培地中の最終シトラート濃度を得た。ｈＭＳＣを、３７℃、５％ＣＯ２で、シトラート補足培地とともにインキュベートした。培地を１日おきに取り替えた。予定時点で（シトラートの付加後７日および１４日）、オステオポンチン（ＯＰＮ）タンパク質レベルを確定し、メーカーのプロトコール（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）に従ってウエスタンブロット検定により比較した。結果を図９に示す。図９に示したように、シトラートおよびＯＰＮ発現は、用量依存的関係で、密接に関連した。
【００６９】
実施例６
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳそして１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。分化のために、ｈＭＳＣを、１０−７Ｍのデキサメタゾン、１０−２Ｍのβ−グリセロホスフェートおよび５０μＭのアスコルビン酸−２−ホスフェートをさらに捕捉した先のＤＭＥＭベースの培地を含む骨形成培地（ＯＧＭ）に切り替えた。９６ウェルプレート中で、８０〜９０％集密後に、１０４細胞／ｍＬの密度で、ｈＭＳＣ細胞を播種した。ｐＨを７．４に調整後、算定容量のシトラートをクエン酸の形態で増殖培地に付加して、２０μＭの増殖培地中の最終シトラート濃度を得た。ｈＭＳＣを、３７℃、５％ＣＯ２で、シトラート補足培地とともにインキュベートした。培地を１日おきに取り替えた。予定時点で（シトラートの付加後７日、１４日および２１日）、培養をフォン・コッサ染色により染色して、次に、光学顕微鏡により検査して、カルシウム沈着の形成を検出した。結果を図１０に示す。図１０に示したように、外因性シトラート補足は、分化ｈＭＳＣ培養中でのカルシウム沈着形成を促すことができた。
【００７０】
実施例７
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、９５％空気および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補足した高グルコースのダルベッコの変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で、２４ウェルプレート中のＣＢＰＢ−１００、ＣＢＰＢＨＡ−１００、ＣＢＰＢＨＡ−９０および対照ガラス上で培養した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、Ｃ２Ｃ１２細胞からの総ＲＮＡを精製した。ＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＮＡを定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲに付した。ＡＢＩ  ７５００実時間ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により、相対的転写体レベルを分析した。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルに対して転写体レベルを正規化した。実験はすべて、二重反復実験で実行し、３回反復した。Ｃ２Ｃ１２細胞からの骨芽細胞分化を、ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）で処理することにより誘導した。６０〜８０％集密に到達後、０、６、１２、３６および４８時間、細胞を３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２で処理した。オステリックス（ＯＳＸ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子発現レベルを、前記と同様に分析した。走査電子顕微鏡を用いて、Ｃ２Ｃ１２細胞の形態を可視化した。結果を図１１Ａ〜Ｃに示す。
【００７１】
２４時間後、細胞は、検査したすべてのＣＢＰＢＨＡ複合体上に単一層を形成した（図１１Ａ）。さらに、ＣＢＰＢ−１００上でのＡＬＰおよびＯＳＸ遺伝子発現レベルは、４８時間の培養後、ベアガラス対照と比較して、それぞれ３５％および３７％増大した。ＣＢＰＢ配合物にＨＡを組み入れると、ＡＬＰおよびＯＳＸ遺伝子発現レベルはさらに増大した。４８時間の培養後、ベアガラス対照と比較して、ＣＢＰＢＨＡ−９０複合体で被覆したプレート上でのＡＬＰおよびＯＳＸ遺伝子発現は、それぞれ３６２％および１９１％増大し、ＣＢＰＢＨＡ−１００で被覆したプレート上での発現レベルは、それぞれ３３６％および２９０％増大した。４８時間後のＣＢＰＢ−１００被覆プレートと比較して、ＣＢＰＢＨＡ−９０複合体上でのＡＬＰおよびＯＳＸ発現はそれぞれ２４３％および１１３％増大したが、一方、ＣＢＰＢＨＡ−１００複合体上でのＡＬＰおよびＯＳＸ発現は、それぞれ２２４％および１８５％増大した（図１１Ｂおよびｎｄ１１Ｃ）。
【００７２】
実施例８
骨成長を促す方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による骨成長を促す方法を、以下のように実行した。体重２．３〜２．７ｋｇのニュージーランドシロウサギ１２羽を用いて、ＣＢＰＢＨＡ−１００およびＣＢＰＢＨＡ−９０複合体の生体適合性およびオッセオインテグレーション特性を査定した。円筒形試料を、ウサギの膝の外側大腿骨顆中に移植した。６週間移植後、マイクロＣＴ画像は、図１２Ａおよび１２Ｂで観察されるように、インプラントと周囲新規骨組織の完全融合を示した。図１２ＡはＣＢＰＢＨＡ−１００に対応し、そして図１２ＢはＣＢＰＢＨＡ−９０に対応する。付加的な新規形成骨が、元々そこには骨がなかった骨髄腔中でインプラントと接触して観察された。さらに、インプラント周囲の慢性炎症（繊維−被膜形成）または退行性変化の証拠は認められなかった。肉眼的組織学的検査で、インプラントは周囲骨と良好に一体化した。周囲骨組織に関してトルイジン染色およびフォン・コッサ染色で示されるように、インプラント弛緩は検出されなかった。骨−インプラント接触（ＢＩＣ）結果は、図１３で観察されるように、骨−インプラント（オッセオインテグレーション）が９４．７４％という高い値である、ということを示した。図１３は、移植後６週間での外側大腿骨顆の周囲骨を伴うＣＢＰＢＨＡ−９０インプラントの２−ＤマイクロＣＴ画像を示す。さらに、非脱灰化骨の界面で観察される骨吸収は認められなかった。さらにインプラントおよび周囲骨の界面での陽性染色マクロファージは認められなかった。
【００７３】
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，ＣＨＩＮＡ）により認可されたプロトコールに従って、すべての動物実験を実行した。動物を無作為に２つの群に分けて、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ  筋注）およびキシラジン（５〜７ｍｇ／ｋｇ  筋注）（イソフルラン（１〜２％吸入）を補足）により麻酔した。次に、外側膝上に１．５ｃｍ内側切開を作成して、外側大腿骨顆を曝露した。骨軟骨柱移植術（ｍｏｓａｉｃｐｌａｓｔｙ）採取機（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ，ＵＳＡ）を用いて、それぞれＣＢＰＢＨＡ−１００およびＣＢＰＢＨＡ−９０群に関して、４×３ｍｍ（直径×深度）骨欠損を左右の外側大腿骨顆の両方に穴あけした。ＣＢＰＢＨＡ−１００およびＣＢＰＢＨＡ−９０複合体から形成され、欠損の寸法に整合するインプラントを、圧入により群分けに従って挿入した。すべての外科的手順後、ウサギをケージ中に保持し、通常実験室餌で飼育した。膝を移植後６週間で採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存した。肉眼検査を、デジタルカメラで実証した。マイクロＣＴ画像処理システム（ＺＫＫＳ−ＭＣＴ−Ｓｈａｒｐ−ＩＩＩスキャナー、Ｃａｓｋａｉｓｈｅｎｇ，ＣＨＩＮＡ）を用いて、コンピュータートモグラフィー解析を実行した。走査システムを、７０ｋＶ、３０Ｗおよび４２９μＡに設定した。当該容量をインプラント周囲の骨組織と限定したが、これは、インプラントの縦軸から８ｍｍ延びる全骨梁区画を包含した。インプラントオッセオインテグレーションの程度は、一般的に、その骨−インプラント接触（ＢＩＣ）測定値に反映される。マイクロＣＴ画像を基礎にした総インプラント周囲全体の新規形成骨長のパーセンテージとして、ＢＩＣを算定した。
【００７４】
組織学的分析のために、パラフィン包埋脱灰組織を４μｍ切片にして、次にこれを脱パラフィン処理し、脱水して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学的染色のために、パラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、一連の段階濃度アルコールにより脱水した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素で遮断した。次いで、切片をウシ血清アルブミン（１：１００希釈液）で遮断し、４℃で一晩、ＣＤ６８およびＣＤ１６３の一次抗体（Ａｕｒａｇｅｎｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｃｈｉｎａ，１：５０希釈液）とともにインキュベートした。切片をＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で１時間、二次抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。ＤＡＢ溶液中で発色させて、ヘマトキシリンにより対比染色した。Ｈ＆Ｅ染色切片およびＩＨＣ染色から、盲検および無作為方式で、２名の個々の病理学者が、インプラント周囲の炎症性反応を査定した。炎症性応答により特徴づけられた、腱切除術後１週間のラットアキレス腱の治癒中の組織から、陽性対照群の供給源を採取した。ＩＨＣ染色をＣＤ１６３およびＣＤ６８に関して実施して、マクロファージを検出した。マクロファージは、ヘマトキシリン染色核を有する細胞中で褐色に見えた。
【００７５】
実施例９
癌増殖の抑制方法
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態による癌増殖の抑制方法を、以下のように実行した。先ず、細胞増殖に及ぼすシトラートの作用を調べた。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる増殖培地中で培養し、８０〜９０％集密後に、１０４細胞／ｍＬの密度で、９６ウェルプレート中に播種した。ｐＨを７．４に調整後、算定容量のシトラートをクエン酸の形態で増殖培地に付加して、２０μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、１０，０００μＭまたは２０，０００μＭの増殖培地中の最終シトラート濃度を得た。ｈＭＳＣを、３７℃、５％ＣＯ２で、シトラート補足培地とともにインキュベートした。培地を１日おきに取り替えた。予定時点で（シトラートの付加後１日、４日および７日）、ＭＴＴ（メチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウムブロミド）検定と、その後のメーカーのプロトコール（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）により、ｈＭＳＣの増殖を確定した。ＭＴＴ作業溶液中で３７℃で４時間インキュベーション後、９６ウェルプレート中のｈＭＳＣを、暗所でオービタル振盪器上で１５分間、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に沈めた。次に、９６ウェルプレートをマイクロプレート読取機上に載せて、５９５ｎｍでの吸光度値を得た。さらに、予定時点（１日、４日および７日）で、生／死染色を実行した。ｈＭＳＣを、生／死作業溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間染色し、次いで、ニコン倒立蛍光顕微鏡下で観察して、細胞生育能を確定した。結果を、図１４および１５に示す。図１４および１５に示したように、シトラートは、２０〜２０００μＭの濃度ウィンドウにおけるｈＭＳＣ増殖に影響を及ぼさないが、しかしより高い濃度（２０００μＭより上、そして２０，０００μＭまで）では、ｈＭＳＣ増殖を抑圧することが判明した。
【００７６】
別の実験では、ｈＭＳＣおよび骨肉腫細胞（Ｓａｏｓ−２細胞）（ＡＴＣＣ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を、シトラートの存在下で培養した。ｈＭＳＣを、上記と同様に培養した。Ｓａｏｓ−２細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したマッコイ５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）中で培養した。ｈＭＳＣおよびＳａｏｓ−２細胞の両方を、１０４細胞／ｍＬの密度で、８０〜９０％集密後に、９６ウェルプレート中に播種した。ｐＨを７．４に調整後、算定容量のシトラートをクエン酸の形態で増殖培地に付加して、２０μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、１０，０００μＭまたは２０，０００μＭの最終シトラート濃度を増殖培地中で得た。ｈＭＳＣおよびＳａｏｓ−２細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、シトラート補足培地とともにインキュベートした。培地を１日おきに取り替えた。予定時点（シトラートの付加後、１日および４日）で、ｈＭＳＣおよびＳａｏｓ−２細胞の増殖を、上記と同様に確定した。結果を、図１５および１６に示す。図１５および１６に示したように、シトラートは、８００μＭより高い濃度でＳａｏｓ−２細胞増殖を抑制することが判明した。さらに、２０００μＭより高い濃度では、ほとんどのＳａｏｓ−２細胞が死滅した。
【００７７】
本発明の種々の実施形態を、本発明の種々の目的の達成において記載してきた。これらの実施形態は、本発明の原理の単なる例証に過ぎない、と理解されるべきである。本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、その多数の修正および適応は、当業者には容易に明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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