(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペグ化アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）と、薬学的に許容される担体とを含む治療用組成物であって、
前記ペグ化ＡＤＩが、リンカーを介して少なくとも１個のＰＥＧ分子に共有結合されており、前記ペグ化ＡＤＩが、配列番号８、２、６または１４のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むか、または、配列番号８、２、６または１４のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を示し、
前記ペグ化ＡＤＩが、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有し、前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体におけるＡＤＩがＭ．ホミニスに由来する、治療用組成物。
【請求項２】
前記ペグ化ＡＤＩが、表面リジン残基の数を減少させることによって少なくとも１つのペグ化部位を除去するように修飾されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
少なくとも１個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、請求項１または２に記載の治療用組成物。
【請求項４】
ａ）少なくとも５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されているか、
ｂ）少なくとも１０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されているか、
ｃ）少なくとも１５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されているか、または
ｄ）少なくとも２０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、
請求項３に記載の治療用組成物。
【請求項５】
ａ）前記ペグ化ＡＤＩが、１個を超えるＰＥＧ分子に共有結合しているか、
ｂ）前記ペグ化ＡＤＩが、約１〜約１０個のＰＥＧ分子に共有結合しているか、または
ｃ）前記ペグ化ＡＤＩが、約２〜約８個のＰＥＧ分子に共有結合している、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ分子が、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子である、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧが約１，０００〜約４０，０００、例えば、約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項８】
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項９】
前記スクシニル基の源が、スクシンイミジルスクシネートである、請求項８に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
化学療法剤を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
前記化学療法剤が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、及びエベロリムスからなる群から選択される、請求項１０に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用組成物であって、前記組成物はその必要性のある患者に投与されて、それによって前記癌が治療される、前記癌の症状が寛解される、または前記癌の進行が阻害されることを特徴とする、治療用組成物。
【請求項１３】
癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する必要性のある前記患者が、前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を有することが決定されている、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
前記癌が、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性の急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害のための組成物であって、前記組成物はＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含み、前記組成物はその必要性のある患者に投与されることを特徴とし、一定期間後に、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用組成物が前記患者に投与されて、それによって前記癌が治療される、前記癌の症状が寛解される、または前記癌の進行が阻害されることをさらに特徴とする、組成物。
【請求項１６】
前記一定期間が、前記患者における所定レベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を検出することによって決定され、前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体におけるＡＤＩがＭ．ホミニスに由来し、前記治療用組成物が、前記所定レベルの前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の検出後に投与されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記一定期間が、前記患者におけるＡＤＩ活性を検出することによって決定され、前記治療用組成物が、所定または低減レベルのＡＤＩ活性の検出後に投与されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害するための医薬品の製造における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用組成物の使用。
【請求項１９】
癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づいて、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７９０，８３３号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＰＯＬＡ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約１１７ＫＢであり、２０１４年３月１１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、一般に、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）タンパク質に関し、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有するＡＤＩタンパク質を含む。そのようなＡＤＩタンパク質は、癌などのアルギニン依存性疾患または関連疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００４】
アミノ酸欠乏療法は、幾つかの形態の癌の有効な治療であり得る。現在まで、アスパラギンの循環レベルを低下させ、タンパク質合成を阻害するアスパラギナーゼを利用するこの手法に関連する既知の臨床例が１つある。この治療は、急性リンパ芽球性白血病に特に有効である（Ａｖｒａｍｉｓ  ２００５，Ｖｉｅｒａ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ２００４）。急性リンパ芽球性白血病細胞は、増殖及び繁殖のためにアミノ酸のアスパラギンを必要とする。対照的に、大部分の正常なヒト細胞は、アスパラギンを合成する能力があり、アスパラギン枯渇により影響を受けない。したがって、アスパラギナーゼによる血清アスパラギンの減少は、正常な細胞、組織、及び宿主を傷つけることなく癌細胞を選択的に死滅させることができる。アスパラギナーゼの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来形態は、ヒトへの使用が承認されている。しかし、アスパラギナーゼは、微生物内においてのみ見出されており、ヒトにおいて極めて免疫原性があり、また、注射後に短い血清半減期を有する（Ａｖｒａｍｉｓ  ２００５）。アスパラギナーゼをより有効な薬剤にするため、これらの欠点は、大腸菌由来アスパラギナーゼをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と配合して、この酵素の免疫原性及び関連するアレルギー反応を低減することによって最小限にされた。加えて、ＰＥＧはアスパラギナーゼの循環半減期を大きく引き延ばし、このことは治療の頻度及び療法の総費用の両方を低減する。ＰＥＧ配合アスパラギナーゼは、使用が承認されており、商標名Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）２０１１，Ａｖｒａｍｉｓ  ２００５，Ｖｉｅｒａ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ２００４，Ｆｕ  ２００７，Ｚｅｉｄａｎ  ２００８）で市販されている。
【０００５】
アルギニンは、ヒト及びマウスにとって別の非必須アミノ酸である（概説についてはＲｏｇｅｒｓ  １９９４を参照されたい）。ヒトにおいて、アルギニンは、Ｋｒｅｂｓ（尿素）回路酵素のアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ、Ｌ−シトルリン：Ｌ−アスパラギン酸リガーゼ［ＡＭＰ形成］、ＥＣ  ６．３．４．５）、及びアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ、Ｌ−アルギニノコハク酸アルギニン−リアーゼ、ＥＣ  ４．３．２．）を介する２ステップによりシトルリンから合成され得る（Ｈａｉｎｅｓ  ２０１１，Ｗｕ  ２００９，Ｍｏｒｒｉｓ  ２００６，Ｈｕｓｓｏｎ  ２００３，Ｔａｐｉｅｒｏ  ２００２，Ｒｏｇｅｒｓ  １９９４）。ＡＳＳは、シトルリン及びアスパラギン酸からアルギノコハク酸への変換を触媒し、これは次にＡＳＬによりアルギニン及びフマル酸に変換される。ヒトにおけるアルギニン欠損食事は、成人において高アンモニア血症もオロト尿症も誘発せず、全身の一酸化窒素（ＮＯ）合成の率も変更しない（Ｔａｐｉｅｒｏ  ２００２，Ｃａｓｔｉｌｌｏ  １９９５，Ｒｏｇｅｒｓ  １９９４，Ｃａｒｅｙ  １９８７，Ｂａｒｂｕｌ  １９８６，Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ  １９５９，Ｒｏｓｅ  １９４９）。未熟児はアルギニンを必要とすると思われるが（Ｗｕ  ２００４）、アルギニンレベルは、乳児、小児、及び若年成人の間で年齢と相関しない（Ｌｕｅｃｋｅ  ２００７）。１９９２年において、Ｔａｋａｋｕ及びＳｕｇｉｍｕｒａは、ヒトの黒色腫及び肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞系が増殖のためにアルギニンを必要とすると思われることを別々に報告した。他の研究は、ペグ化ＡＤＩが有害作用をほとんど有しないで黒色腫及び肝細胞腫の治療に有効であることを示した。
【０００６】
ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の治療は、一定期間にわたる多回用量を必要とする。多くの治療の後では、継続的な有効性を制限することがある抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体が発生し得る。したがって、アルギニン枯渇療法の効力を改善及び延長する、治療に使用するための、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有するＡＤＩが当該技術分野において必要である。本発明は、癌治療のために、この利点及び他の利点を提供する。
参考文献：Ａｖｒａｍｉｓ  ＶＩ，Ｐａｎｏｓｙａｎ  ＥＨ．２００５．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４４：３６７−３９３、Ｂａｒｂｕｌ  Ａ．１９８６．Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ  １０：２２７−２３８、Ｃａｒｅｙ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｊ  Ｎｕｔｒ  １１７：１７３４−１７３９、Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３１）：Ｅ３６０−３６７、Ｆｕ  ＣＨ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  ＫＭ．２００７．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ８：１９７７−１９８４、Ｈａｉｎｅｓ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２：８−２３、Ｈｕｓｓｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１８８７−１８９９、Ｌｕｅｃｋｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４５：１５２５−１５３０、Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＭ  Ｊｒ．２００６．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８３（Ｓｕｐｐｌ）：５９８Ｓ−５１２Ｓ、Ｒｏｇｅｒｓ  ＱＲ．１９９４．Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｈｏｎｏｒｉｎｇ  Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｊ．  Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８６−Ａｐｒｉｌ，１９９４，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，２１１  Ｍｕｍｆｏｒｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ  ６１８０１，ｐｐ．９−２１、Ｔａｐｉｅｒｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ５６：４３９−４４５，２００２、Ｖｉｅｒａ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ＪＰ，Ｂｏｏｓ  Ｊ．２００４．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２５：１１７−１２７、Ｗｕ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３７：１５３−１６８、Ｗｕ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：４４２−４５１、Ｚｅｉｄａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：１１１−１１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｖｒａｍｉｓ  ＶＩ，Ｐａｎｏｓｙａｎ  ＥＨ．２００５．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４４：３６７−３９３
【非特許文献２】Ｂａｒｂｕｌ  Ａ．１９８６．Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ  １０：２２７−２３８
【非特許文献３】Ｃａｒｅｙ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｊ  Ｎｕｔｒ  １１７：１７３４−１７３９
【非特許文献４】Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ３１）：Ｅ３６０−３６７
【非特許文献５】Ｆｕ  ＣＨ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  ＫＭ．２００７．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ８：１９７７−１９８４
【非特許文献６】Ｈａｉｎｅｓ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２：８−２３
【非特許文献７】Ｈｕｓｓｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１８８７−１８９９
【非特許文献８】Ｌｕｅｃｋｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４５：１５２５−１５３０
【非特許文献９】Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＭ  Ｊｒ．２００６．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８３（Ｓｕｐｐｌ）：５９８Ｓ−５１２Ｓ
【非特許文献１０】Ｒｏｇｅｒｓ  ＱＲ．１９９４．Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｈｏｎｏｒｉｎｇ  Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｊ．  Ｖｉｓｅｋ−ｆｒｏｍ  Ａｍｍｏｎｉａ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８６−Ａｐｒｉｌ，１９９４，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，２１１  Ｍｕｍｆｏｒｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ  ６１８０１，ｐｐ．９−２１、
【非特許文献１１】Ｔａｐｉｅｒｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ５６：４３９−４４５，２００２
【非特許文献１２】Ｖｉｅｒａ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ＪＰ，Ｂｏｏｓ  Ｊ．２００４．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２５：１１７−１２７
【非特許文献１３】Ｗｕ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ３７：１５３−１６８
【非特許文献１４】Ｗｕ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：４４２−４５１
【非特許文献１５】Ｚｅｉｄａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：１１１−１１９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの態様は、単離アルギニンデイミナーゼを提供し、この単離アルギニンデイミナーゼは、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応を有する。単離アルギニンデイミナーゼまたはＡＤＩ活性を有するその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、治療用または薬学的組成物も含まれる。ある特定の実施形態において、組成物は、滅菌されている、かつ／または内毒素などの発熱物質を実質的に含まない。１つの実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、Ｍ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）からのものではない。別の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、表１に列挙されている生物からのものである。ある特定の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０と同等の、またはそれより良好な１つ以上の特性を有する。これに関係して、１つ以上の特性には、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、ｐＨ最適、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血中に予め存在していないイオンもしくは補助因子を要求しないこと、あるいはこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して少なくとも２０個の表面残基の変化を有する。別の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して、２０〜１３５個の表面残基の変化、４０〜１００個の表面残基の変化、３０〜６０個の表面残基の変化、８０〜１００個の表面残基の変化、または１００〜１２０個の表面残基の変化を有する。
【０００９】
別の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、Ｍ．アルギニニ（ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．アルスリチジス（ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ホシセレブラル（ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ）、Ｍ．ガテア（ｇａｔｅａｅ）、Ｍ．ホシダ（ｐｈｏｃｉｄａｅ）、Ｍ．コルンビヌム（ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）、Ｍ．アイオワエ（ｉｏｗａｅ）、Ｍ．クロコジルイ（ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、Ｍ．アリガトリス（ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、Ｈ．オレニイ（ｏｒｅｎｉｉ）、またはＭ．ボビス（ｂｏｖｉｓ）からのものである。患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する例示的な単離アルギニンデイミナーゼは、配列番号２〜３２のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む。
【００１０】
別の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、少なくとも１つのペグ化部位を除去するように修飾されている。患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼの別の実施形態では、少なくとも１個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている。この点において、ある特定の実施形態では、少なくとも５個のリジン残基、少なくとも１０個のリジン残基、または少なくとも２０個のリジン残基がアミノ酸置換により修飾されている。
【００１１】
別の実施形態において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、リンカーを介してＰＥＧ分子に共有結合している。この点において、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、約１〜約１０個または約２〜約８個のＰＥＧ分子のように、１個以上のＰＥＧ分子に共有結合し得る。ＰＥＧ分子は、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子であり得、約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量または約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有し得る。ＰＥＧがリンカーを介して本発明のＡＤＩｒに共有結合しているこれらの実施形態において、リンカーは、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、スクシニル基の源はスクシンイミジルスクシネートである。
【００１２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されている単離アルギニンデイミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
【００１３】
本発明の追加の態様は、本明細書に記載されている、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を提供する。ある特定の実施形態において、組成物は化学療法剤を更に含む。例示的な化学療法剤には、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、及びエベロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明の別の態様は、癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、その必要性のある患者に、本明細書に記載されている、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、薬学的に許容される担体とを含む、治療上有効量の組成物を投与し、それによって癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を抑制することを含む、前記方法を提供する。ある特定の実施形態において、癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する必要性のある患者は、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を有することが決定されている。別の実施形態において、癌は、肝細胞癌、転移性黒色腫を含む黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性の急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選択される。
【００１５】
本発明の別の態様は、癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、その必要性のある患者に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む治療上有効量の組成物を投与し、一定期間後に、患者に、本明細書に記載されている、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を投与し、それによって癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を抑制することを含む、前記方法を提供する。この点において、一定期間は、例えば患者における所定レベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を検出すること、及び／または患者におけるＡＤＩ活性を測定すること、あるいは観察することによって決定することができ、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼを含む組成物は、患者における所定レベルの前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の検出、及び／または所定レベルのＡＤＩ活性の測定もしくは観察の後に投与される。
【００１６】
癌を治療する、その症状を改善する、またはその進行を阻害する医薬品の調製または製造に使用される、本明細書に記載されている単離アルギニンデイミナーゼタンパク質も含まれる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
単離アルギニンデイミナーゼまたはＡＤＩ活性を有するその断片と、薬学的に許容される担体とを含み、前記単離アルギニンデイミナーゼが、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する、治療用組成物。
（項目２）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニス（ｈｏｍｉｎｉｓ）からのものではない、項目１に記載の治療用組成物。
（項目３）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表１に列挙されている生物からのものである、項目２に記載の治療用組成物。
（項目４）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の特性に匹敵する、またはそれより良好である１つ以上の特性を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目５）
前記１つ以上の特性が、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、ｐＨ最適、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血中に予め存在していないイオンもしくは補助因子を要求しないこと、あるいはこれらの任意の組み合わせである、項目４に記載の治療用組成物。
（項目６）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して少なくとも２０個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目７）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して２０〜１３５個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目８）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して４０〜１００個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目９）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して３０〜６０個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１０）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して８０〜１００個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１１）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して１００〜１２０個の表面残基の変化を有する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１２）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．アルギニニ（ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．アルスリチジス（ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ホシセレブラル（ｐｈｏｃｉｃｅｒｅｂｒａｌｅ）、Ｍ．ガテア（ｇａｔｅａｅ）、Ｍ．ホシダ（ｐｈｏｃｉｄａｅ）、Ｍ．コルンビヌム（ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）、Ｍ．アイオワエ（ｉｏｗａｅ）、Ｍ．クロコジルイ（ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、Ｍ．アリガトリス（ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、Ｈ．オレニイ（ｏｒｅｎｉｉ）、またはＭ．ボビス（ｂｏｖｉｓ）からのものである、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１３）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号２〜３２のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１４）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも１つのペグ化部位を除去するように修飾されている、項目１〜１３のいずれか一項に記載の治療用組成物。
（項目１５）
少なくとも１個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１〜１４のいずれか一項に記載の治療用組成物。
（項目１６）
少なくとも５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の治療用組成物。
（項目１７）
少なくとも１０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の治療用組成物。
（項目１８）
少なくとも１５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の治療用組成物。
（項目１９）
少なくとも２０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の治療用組成物。
（項目２０）
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してＰＥＧ分子に共有結合している、先行項目のいずれか一項に記載の治療用組成物。
（項目２１）
前記アルギニンデイミナーゼが、１個を超えるＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２２）
前記アルギニンデイミナーゼが、約１〜約１０個のＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２３）
前記アルギニンデイミナーゼが、約２〜約８個のＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２４）
前記ＰＥＧ分子が、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子である、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２５）
前記ＰＥＧが約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量を有する、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２６）
前記ＰＥＧが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、項目２０に記載の治療用組成物。
（項目２７）
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの任意の組み合わせである、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目２８）
前記スクシニル基の源が、スクシンイミジルスクシネートである、項目２７に記載の治療用組成物。
（項目２９）
患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応を有する、単離アルギニンデイミナーゼ、またはＡＤＩ活性を有するその断片。
（項目３０）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスからのものではない、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３１）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表１に列挙されている生物からのものである、項目３０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３２）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の特性に匹敵する、またはそれより良好である１つ以上の特性を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３３）
前記１つ以上の特性が、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、ｐＨ最適、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血中に予め存在していないイオンもしくは補助因子を要求しないこと、あるいはこれらの任意の組み合わせである、項目３２に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３４）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して少なくとも２０個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３５）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して２０〜１３５個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３６）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して４０〜１００個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３７）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して３０〜６０個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３８）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して８０〜１００個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目３９）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．ホミニスアルギニンデイミナーゼと比較して１００〜１２０個の表面残基の変化を有する、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４０）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Ｍ．アルギニニ、Ｍ．アルスリチジス、Ｍ．ホシセレブラル、Ｍ．ガテア、Ｍ．ホシダ、Ｍ．コルンビヌム、Ｍ．アイオワエ、Ｍ．クロコジルイ、Ｍ．アリガトリス、Ｈ．オレニイ、またはＭ．ボビスからのものである、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４１）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号２〜３２のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、項目２９に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４２）
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも１つのペグ化部位を除去するように修飾されている、先行項目のいずれか一項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４３）
少なくとも１個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、先行項目のいずれか一項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４４）
少なくとも５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目４３に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４５）
少なくとも１０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４６）
少なくとも１５個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４７）
少なくとも２０個のリジン残基が、アミノ酸置換により修飾されている、項目１５に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４８）
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してＰＥＧ分子に共有結合している、先行項目のいずれか一項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目４９）
前記アルギニンデイミナーゼが、１個を超えるＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５０）
前記アルギニンデイミナーゼが、約１〜約１０個のＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５１）
前記アルギニンデイミナーゼが、約２〜約８個のＰＥＧ分子に共有結合している、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５２）
前記ＰＥＧ分子が、直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子である、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５３）
前記ＰＥＧが約１，０００〜約４０，０００の総重量平均分子量を有する、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５４）
前記ＰＥＧが約１０，０００〜約３０，０００の総重量平均分子量を有する、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５５）
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはこれらの任意の組み合わせである、項目２０に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５６）
前記スクシニル基の源が、スクシンイミジルスクシネートである、項目２７に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
（項目５７）
先行項目のいずれか一項に記載の単離アルギニンデイミナーゼをコードするポリヌクレオチド。
（項目５８）
項目５７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目５９）
項目５８に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
（項目６０）
化学療法剤を更に含む、先行項目のいずれか一項に記載の治療用組成物。
（項目６１）
前記化学療法剤が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、及びエベロリムスからなる群から選択される、項目６０に記載の治療用組成物。
（項目６２）
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、その必要性のある患者に、治療上有効量の先行項目のいずれか一項に記載の治療用組成物を投与し、それによって前記癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害することを含む、前記方法。
（項目６３）
癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する必要性のある前記患者が、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を有することが決定されている、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記癌が、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性の急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選択される、項目６２または６３に記載の方法。
（項目６５）
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、その必要性のある患者に、治療上有効量の、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与し、一定期間後に、前記患者に、先行項目のいずれか一項に記載の治療用組成物を投与し、それによって前記癌を治療する、その症状を寛解させる、または進行を阻害する、前記方法。
（項目６６）
前記一定期間が、前記患者における所定レベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を検出することによって決定され、前記治療用組成物が、前記所定レベルの前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の検出後に投与される、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記一定期間が、前記患者におけるＡＤＩ活性を検出することによって決定され、前記治療用組成物が、所定または低減レベルのＡＤＩ活性の検出後に投与される、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害するための医薬品の製造における、先行項目のいずれか一項に記載の単離アルギニンデイミナーゼの使用。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施形態は、選択されたＡＤＩ酵素に関し、これは幾つかの実施形態において、少数の表面リジン残基を有するように操作され、安定したリンカーを介してＰＥＧと抱合されている。選択されたＡＤＩ酵素は、有益な特性に基づいて異なる生物の多数のＡＤＩ酵素から選択される。これらの特性には、アルギニンからシトルリン及びアンモニアへのＡＤＩ変換を介してヒト血中に低いアルギニン濃度を確立及び維持する酵素の能力が含まれる。加えて、選択されたＡＤＩ分子は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０と比較して、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対する低減された交差反応性を有し、そのような抗体は、おそらく、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を用いた患者の以前の治療によってもたらされる。
【００１８】
ある特定の実施形態において、本発明の酵素は、腎クリアランス及びタンパク質分解に対する保護、ならびに低減された免疫原性または抗原性を提供するためペグ化される。ペグ化の有効性を増加するため、酵素における修飾は、表面リジン残基の数を低減し、したがって利用可能なＰＥＧ結合部位の数を制限するように操作され得る。このことは、残りのリジン結合残基へのより完全で均一なペグ化を提供する。
【００１９】
メトキシ−ＰＥＧをＡＤＩに結合するように選択されるＰＥＧリンカーは、化学的に安定した結合を提供するように選択される。このことは、分子の生体活性の寿命を増加することが予想される。化学的に安定したリンカーは、また、加水分解を排除し、酵素表面に結合された脱ペグ化リンカーに生じ得る免疫応答を低減する。
【００２０】
これらの累積的な特異化は、患者の血液からアルギニンを有効に除去し、以前のアルギニン枯渇療法からの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体により中和される、または取り除かれることのない１個以上の分子をもたらす。分子は、自己の免疫原性に起因する中和及びクリアランスを遅延するようにペグ化される。これらの因子は、アルギニン枯渇療法を延長するため、したがって、抗癌療法としてのアルギニン枯渇療法の有効性を増加するための、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０に代わる、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０に加えた（例えば、後続薬剤としての）その使用を可能にする。
【００２１】
正常な細胞は、ＡＳＳ及びＡＳＬにより触媒される２ステップによりシトルリンからアルギニンを合成することができるので、増殖のためにアルギニンを必要としない。対照的に、特定の癌はＡＳＳを発現しない。特定の癌はＡＳＬを発現せず、他の癌は、ＡＳＳ及び／またはＡＳＬの発現を減少することがある、または発現をしないことがある。したがって、これらの癌はアルギニンに対して栄養要求性ではない。この代謝の違いは、これらの形態の癌を治療する安全で有効な療法を開発するときに最大化し得る。ＡＤＩは、アルギニンジヒドロラーゼ経路を介するアルギニンからシトルリンへの変換を触媒し、したがってアルギニンを排除するために使用することができる。
【００２２】
本発明の実施は、特にそれとは反対の指定がない限り、当該技術分野の技能の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を用い、それの多くのものは例示の目的で下記に記載されている。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及び他の同様の参考文献を参照されたい。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に内容から明白に示されない限り、複数の対象を含む。
【００２４】
本明細書の全体を通して、文脈から必要とされない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、記述される要素または整数またはステップまたは要素もしくはステップの群を包含することを意味するが、他のあらゆる要素または整数または要素もしくは整数の群を除外することを意味しないことが理解される。
【００２５】
「約」とは、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さを意味する。
【００２６】
「統計的に有意」とは、結果が偶然により生じる可能性が低かったことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野で既知の任意の方法により決定することができる。有意性の一般的に使用される測度はｐ値であり、これは、帰無仮説が真実であった場合に、観察された事象が生じる頻度または確率である。得られたｐ値が有意レベルより小さい場合、帰無仮説が否定される。単純な事例において、有意レベルは、０．０５以下のｐ値と確定される。
【００２７】
本明細書のそれぞれの実施形態は、特に明確に記述されない限り、他のあらゆる実施形態に準用して適用されるべきである。
【００２８】
標準的な技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造会社の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されているように実施され得る。これらの、ならびに関連する技術及び手順は、一般に、当該記述において周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書の全体にわたって引用及び考察されている多様な一般的及びより特定的な参考文献に記載されているように実施され得る。特に特定的な定義が提供されない限り、本明細書に記載されている分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学及び薬化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室手順及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術を、組み換え技術、分子生物学的、微生物学的、化学的な合成、化学分析、薬学的調製、処方、及び送達、ならびに患者の治療に使用することができる。
【００２９】
「患者」または「対象」は、動物を指し、ある特定の実施形態では哺乳動物、特定の実施形態ではヒトを指す。
【００３０】
「生体適合性」は、生物学的機能に対して一般に有害ではなく、アレルギー及び疾患状態を含む許容されない任意の程度の毒性をもたらさない、材料または化合物を指す。
【００３１】
用語「基準配列」は、一般に、別の配列の比較対象となっている、核酸コード配列またはアミノ酸配列を指す。本明細書に記載されている全てのポリペプチド及びポリヌクレオチド配列が基準配列として含まれ、名称が記載されているもの、ならびに表及び配列表に記載されているものが含まれる。
【００３２】
本開示の全体にわたって、以下の略語を使用することができる：ＰＥＧ  ポリエチレングリコール、ＡＤＩ  アルギニンデイミナーゼ、ＳＳ  スクシンイミジルスクシネート、ＳＳＡ  スクシンイミジルスクシンイミド、ＳＰＡ  スクシンイミジルプロピオネート、ＮＨＳ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＡＳＳ１またはＡＳＳ  アルギニノコハク酸シンテターゼ、ＡＳＬ  アルギニノコハク酸リアーゼ。
【００３３】
本発明において、ポリヌクレオチドコードＡＤＩは、例えば、微生物、組み換えバイオテクノロジー、またはこれらの任意の組み合わせを含む任意の源から誘導、クローン化、単離、合成、または生成され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及び／またはジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）の属の微生物からクローン化され得る。ある特定の実施形態において、アルギニンデイミナーゼは、マイコプラズマ・アルスリチジス（ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・アルギニニ、ステプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ステプトコッカス・ニューモニエ、ボレリア・ブルグドルフェリ（ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・アフゼリ（ａｆｚｅｌｉｉ）、ジアルジア・インテスチナリス（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、ラクトバチルス・サケ（ｓａｋｅ）、またはこれらの任意の組み合わせからクローン化される。他の実施形態において、アルギニンデイミナーゼは、表１に列挙されている種からクローン化される。特に、本発明に使用されるＡＤＩは、配列番号１〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列、またはＡＤＩ活性を有する（例えば、アルギニンをシトルリン及びアンモニアに代謝することができる）その変種もしくは断片もしくは延長を含むことができる。配列表に提供されている配列のうちの幾つかは、完全長ＡＤＩタンパク質配列を提示していない。したがって、ある特定の実施形態において、追加のアミノ酸残基を、本明細書に提供される配列のいずれかの末端に付加して、ＡＤＩ活性を有する完全長タンパク質を作製することができる。付加される特定のアミノ酸は、既知のＡＤＩ配列の整列に基づいて当業者により決定され得る。そのようなＡＤＩ分子は、既知の技術を使用して合成され得る。例示された「延長」ＡＤＩ（ｒ）は、例えば配列番号２６〜３２に提供されている。
【００３４】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩ酵素は、Ｍ．ホミニスから誘導されるベンチマークＡＤＩ−ＰＥＧ２０分子と比較される。本明細書で使用されるとき、「ＡＤＩ−ＰＥＧ２０」は、当該技術分野において既知のＡＤＩ分子を指し、例えば、ＵＳ６１８３７３８、ＵＳ６６３５４６２、Ａｓｃｉｅｒｔｏ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３（３０）：７６６０−７６６８、Ｉｚｚｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２（１０）：１８１５-１８２２、Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＥＧ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８０（１−３）：２５９−２７１、Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １０６，３２４−３３２に記載されている。当業者には認識されるように、この分子は、Ｍ．ホミニスから誘導されたペグ化（ＰＥＧ２０，０００）ＡＤＩ酵素であり、野生型Ｍ．ホミニスＡＤＩ酵素と比べて２つの置換（Ｋ１１２Ｅ、Ｐ２１０Ｓ）を有する。
【００３５】
本明細書に記載されているアルギニンデイミナーゼ酵素は、多数のＡＤＩ酵素からスクリーニングされ、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減されたレベルの反応性を有する。抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０により治療された対象において現れ、既知の手法を使用して測定することができる。抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体への反応性は、例えば、当業者に既知のＥＬＩＳＡまたは他の類似のアッセイを使用して決定され得る。
【００３６】
この点において、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対する交差反応性レベルを評価する比較として使用することができる。患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対するＡＤＩ−ＰＥＧ２０のものよりも統計的に有意に低い交差反応性レベルが、本明細書において有用であり得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているアルギニンデイミナーゼ酵素は、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対して低い交差反応性を有する、または交差反応性を全く有しない。別の実施形態において、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０との反応性と比較した、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体への反応性における任意の低減は、ＡＤＩ酵素がアルギニン枯渇療法を必要とする患者の治療選択肢を改善するので、有益であり得る。したがって、本明細書に記載されているアルギニンデイミナーゼ酵素は、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体へのＡＤＩ−ＰＥＧ２０の反応性と比較して、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体への低減された交差反応性を有する。
【００３７】
「ＡＤＩｒ」は、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体へのＡＤＩ−ＰＥＧ２０の反応性と比較して、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体への低減された反応性を有する本発明のＡＤＩ酵素を指すために、本明細書において使用される。「ＡＤＩｒ」の命名法は、本明細書において識別される分子を、当該技術分野で既知のＡＤＩ及びＡＤＩ−ＰＥＧ２０と区別するために使用される。
【００３８】
本発明のＡＤＩｒ酵素は、有効な癌治療において低血中アルギニンレベルを低減及び維持するため、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０に匹敵する、またはそれより良好な特徴または特性を有する。そのような特性には、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、ｐＨ最適、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血中に予め存在していないイオンもしくは補助因子を要求しないこと、あるいはこれらの任意の組み合わせが含まれる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の匹敵する特性より、約または少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて高い特性を有する。他の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、比較されるＡＤＩ−ＰＥＧ２０の特定の特性より、約または少なくとも約１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２５０％、２６０％、２８０％、３００％、３２０％、３４０、３５０％、３６０％、４００％、４２０％、４５０％、４６０％、５００％、５２０％、５５０％、またはそれを超えて高い特性を有する。
【００３９】
したがって、ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０のＫｃａｔより、約または少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて良好なＫｃａｔを有する。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０のＫｃａｔより、約または少なくとも約１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２５０％、２６０％、２８０％、３００％、３２０％、３４０、３５０％、３６０％、４００％、４２０％、４５０％、４６０％、５００％、５２０％、５５０％、またはそれを超えて長い時間のＫｃａｔを有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒ酵素またはそれを含む組成物のＫｃａｔは、約０．５秒−１〜約１５秒−１であり、更なる実施形態では、約１秒−１〜約１２秒−１、約１秒−１〜約１０秒−１、約１．５秒−１〜約９秒−１、約２秒−１〜約８秒−１、または約２．５秒−１〜約７秒−１である。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約２．５秒−１〜約７．５秒−１のＫｃａｔを有する。幾つかの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは約２．５秒−１、約３秒−１、約３．５秒−１、約４秒−１、約４．５秒−１、約５秒−１、約５．５秒−１、約６秒−１、約６．５秒−１、約７秒−１、約７．２秒−１、約７．５秒−１、約８秒−１、約１０秒−１、約１５秒−１、約２０秒−１、約２５秒−１、約３０秒−１、約３５秒−１、約４０秒−１、約４５秒−１、約５０秒−１、約５５秒−１、約６０秒−１、約６５秒−１、約７０秒−１、約７５秒−１、約８０秒−１、約８５秒−１、約９０秒−１、約９５秒−１、または約１００秒−１のＫｃａｔを有する。
【００４０】
したがって、ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０のＫｍより、約または少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて良好なＫｍを有する。したがって、ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０のＫｍの約または少なくとも約１００％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、または２５０％のＫｍを有する。１つの実施形態において、ＡＤＩｒまたはそのペグ化製剤は、約０．５μＭ〜約５０μＭ、または約１．６μＭ〜約４８μＭ、または約０．５μＭ〜約１５μＭのＫｍを有し、更なる実施形態では、約１μＭ〜約１２μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１．５μＭ〜約９μＭ、約１．５μＭ〜約８μＭ、または約１．５μＭ〜約７μＭである。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約１．５μＭ〜約６．５μＭのＫｍを有する。幾つかの実施形態において、ＡＤＩｒまたはそのペグ化製剤は、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約２２μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２８μＭ、約３０μＭ、約３２μＭ、約３４μＭ、約３５μＭ、約３６μＭ、約３８μＭ、約４０μＭ、約４２μＭ、約４４μＭ、約４５μＭ、約４６μＭ、約４８μＭ、または約５０μＭのＫｍを有する。
【００４１】
ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ヒトの血液の生理学的ｐＨに近いｐＨで機能する。したがって、１つの実施形態においてＡＤＩｒは、約４〜約１０．８、または約６〜約８、または約６．５〜約７．５のｐＨで機能する。１つの実施形態において、ＡＤＩｒは約ｐＨ７．４で良好な酵素活性を有する。
【００４２】
ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、長期保存の際に安定性を有し、人体の治療の際に温度及びタンパク質分解安定性を有する。更なる実施形態において、ＡＤＩｒは、血中に予め存在していないイオンまたは補助因子を活性のために要求しない。
【００４３】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体のための抗原部位を低減または排除する表面残基の変化が存在するように、一般に、Ｍ．ホミニスと十分に異なるアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、対象において選択されたＡＤＩｒ分子と存在する抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との間には交差反応性が存在せず、Ｍ．ホミニスのＡＤＩへの存在する応答の成熟ではなく、完全に新しい免疫反応が対象において生成される。したがって、１つの実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、配列番号１に記載されているＭ．ホミニスのＡＤＩに対して２０％〜８５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩに対して１０％または１５％の同一性などの更に低い率の配列同一性を有する。別の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩに対して２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、または更には８３％の同一性を有し、なおも低減された交差反応性を抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に対して有する。
【００４４】
１つの実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩと比較して、約２５〜１４０個の表面残基の変化を有する。表面残基は、Ｍ．ホミニスのＡＤＩの結晶構造から識別することができ、他の生物のＡＤＩの表面残基は、配列相同性により決定することができる。本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩと比較して、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または約１４０個の表面残基の変化を有することができる（配列番号１を参照されたい）。
【００４５】
別の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩと比較して、約２５〜１４０個の残基の変化を有する。そのような残基の変化は、必ずしも表面のアミノ酸残基のみである必要はない。そのような残基の変化（または付加もしくは欠失）は、分子の末端であり得る、または修飾されたＡＤＩが本明細書に記載されている所望のＡＤＩ活性を有するように、ＡＤＩの任意の残基であり得る。残基は、Ｍ．ホミニスのＡＤＩの結晶構造から識別することができ、他の生物のＡＤＩの残基は、配列相同性により決定することができる。本明細書に記載されているＡＤＩｒは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩと比較して、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または約１４０個のアミノ酸残基の変化を有することができる（配列番号１を参照されたい）。
【００４６】
多数のＡＤＩ酵素から、表１は、Ｍ．ホミニスのＡＤＩに対して配列同一性率を有する２４個のＡＤＩｒ酵素を列挙する。文献によると、Ｍ．ホミニス、Ｍ．アルギニニ、及びＭ．アルスリチジスのＡＤＩアミノ酸配列は、密接に関係しており、これらの酵素は良好な触媒特性を有する。更に最近では、これら３つと密接に関係する配列を有する、追加のＡＤＩ酵素が発見されている。より遠縁のマイコプラズマＡＤＩ酵素が識別されているが、これらについてあまり良く知られていない。細菌及び他の源からの更により遠縁のＡＤＩ酵素が存在する。
【００４７】
ある特定の実施形態において、多数の選択された種からの本明細書において識別されるＡＤＩｒ酵素は、表面リジン残基を（ある特定の実施形態では、３０個以上まで）有する。しかし、ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒ酵素は、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）のＡＤＩの場合では僅か２個のリジン残基などのはるかに少ない表面リジン残基を有し得る、または更にはリジン残基を有しないことがある（例えば、マイコバクテリウム種ＭＣＳ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢＧ１０３８１のＡＤＩを参照されたい）。したがって、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低減された交差反応性を有する本明細書において識別されるＡＤＩｒ酵素は、約０、１、２、３、４、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８個、またはそれよりも多くの表面リジン残基を有する。
【００４８】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、交換可能に使用され、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、シグナル配列のミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、及び付加または欠失などの修飾を除外しない。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味し、それぞれの鎖は、ペプチド結合により共有結合しているアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合により非共有的及び／または共有的に結合され、天然のタンパク質、すなわち天然に生じる、特に非組み換えの細胞により、または遺伝子操作された、もしくは組み換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有する、複数の鎖を含むことができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失形態、付加及び／もしくは置換を有する分子を含むことができる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、本開示のＡＤＩｒタンパク質、またはＡＤＩｒタンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失形態、付加、及び／または置換を有する配列を包含する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、あるいは細胞において見出されない異種ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の組み合わせから典型的に作製される１つ以上の組み換えＤＮＡ分子を含む組み換え細胞により産生される、「組み換え」ポリペプチドである。
【００４９】
本明細書において参照される用語「単離タンパク質」は、主題のタンパク質が、（１）天然に典型的に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ源、例えば同じ種からの他のタンパク質を実質的に含まないこと、（３）異なる種の細胞に発現すること、（４）天然において関連するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離タンパク質」が天然において関連するタンパク質の一部と（共有もしくは非共有相互作用により）関連しないこと、（６）天然において関連しないポリペプチドと（共有もしくは非共有相互作用により）機能的に関連すること、または（７）天然に生じないことを意味する。そのような単離タンパク質は、合成由来であり得るゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせによりコードされ得る。ある特定の実施形態において、単離タンパク質は、（治療用、診断用、予防用、研究用、または別の）使用に干渉する天然の環境に見出されるタンパク質もしくはポリペプチド、または他の汚染物質を実質的に含まない。
【００５０】
用語「変種」には、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入により、本明細書に特定的に開示されている基準ポリペプチド（例えば、配列番号１〜３２）と異なるポリペプチドが含まれる。変種ポリペプチドは、生物学的に活性であり、すなわち、基準ポリペプチドの酵素または結合活性を有し続けている。そのような変種は、例えば、遺伝子多型から、及び／または人為的な操作によりもたらされ得る。
【００５１】
多くの場合において、生物学的に活性な変種は、１つ以上の保存的置換を含有する。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性の性質が実質的に不変であると予想するほどに、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものである。上記に記載されたように、修飾を、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に行うことができ、それでも、所望の特性で変種または誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。
【００５２】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位などの構造に相互作用的結合能を相当程度失うことなく、タンパク質構造における他のアミノ酸に置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能及び性質であるので、特定のアミノ酸配列の置換を、タンパク質配列及び当然のことながらその基礎となるＤＮＡコード配列に行うことができ、その場合でも同様の特性を持つタンパク質を得ることができる。したがって、多様な変化を開示された組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、これらの有用性を相当程度失うことなく行い得ることが考慮される。
【００５３】
そのような変化を行うには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与する疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該技術分野において理解されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、そのことが、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義すると認められている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性及び電荷性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。特定のアミノ酸を、類似した疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換し、それでも、類似した生物学的活性を持つタンパク質をもたらす、すなわち、それでも生物学的機能性が同等のタンパク質を得ることができることが、当該技術分野において知られている。そのような変化を行うことにおいて、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更にとりわけ好ましい。
【００５４】
同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行い得ることも、当該技術分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が参照により本明細書に特定的に組み込まれる）は、隣接するアミノ酸の親水性により左右されるタンパク質の親水性の最大局所平均が、タンパク質の生物学的特性と相関すると記述している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似した親水性値を有する別のアミノ酸で置換し、それでも、生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のタンパク質を得ることができることが理解される。そのような変化を行うことにおいて、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが更にとりわけ好ましい。
【００５５】
上記に概説したように、したがってアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。多様な前記の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者に良く知られており、アルギニン及びリジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれる。
【００５６】
アミノ酸置換は、更に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両新媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正荷電アミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、類似した親水性値を有する非電荷極性ヘッド基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。
【００５７】
変種は、その上、または代替的に、非保存的変化を含有することができる。好ましい実施形態において、変種ポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２個より小数のアミノ酸、または更には１個のアミノ酸の置換、欠失、または付加により、天然配列と異なる。変種は、その上（または代替的に）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、及び／または疎水性親水性の性質に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加により修飾され得る。
【００５８】
一般に、変種は、基準ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜３２）に約または少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性、または配列同一性、または配列相同性を示す。更に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれよりも多くのアミノ酸の付加（例えば、Ｃ末端付加、Ｎ末端付加、その両方）、欠失、切断、挿入、または置換により天然または親配列と異なるが、親または基準ポリペプチド配列の特性または活性を保持する配列が、考慮される。
【００５９】
幾つかの実施形態において、変種ポリペプチドは、少なくとも１個であるが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３、または２個未満のアミノ酸残基の分だけ、基準配列と異なっている。他の実施形態において、変種ポリペプチドは、約または少なくとも０．５％または１％であるが、２０％、１５％、１０％、または５％未満の残基の分だけ基準配列と異なっている。（この比較が整列を必要とする場合、配列は、最大類似性によって整列されるべきである。欠失または挿入またはミスマッチによる配列からの「ループ」アウトが、考慮される差である。）
【００６０】
用語「ポリペプチド断片」は、天然に生じる、または組み換え的に産生されるポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失もしくは置換を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約４００個のアミノ酸長さのアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００のアミノ酸長さであると理解される。特に有用なポリペプチド断片は、本明細書に記載されているＡＤＩｒの触媒ＡＤＩドメインを含む機能性ドメインを含む。ＡＤＩｒの場合、有用な断片は、触媒ドメイン及びα−ヘリカルドメインを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
ＡＤＩへの抱合に使用される多くの活性化ＰＥＧは、リジン残基に共有結合する。通常、リジン残基よりはるかに少ないＰＥＧ分子が、ＡＤＩに結合している。結合の数及び分布の両方は、分子間で不均一であり得る。任意の特定のリジン残基は、ＡＤＩ分子のほんの僅かな部分において修飾される。この部位修飾の不均一性及び低いＰＥＧ占有率は、薬剤の特徴決定及び抗原部位のＰＥＧ遮蔽の有効性の両方にとって問題をもたらし得る。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている選択されたＡＤＩｒ酵素は、他の種類の残基によるリジン置き換えによって修飾され、リジン残基の数を低減する。このことは、より均一にペグ化されたタンパク質を産生し、残りのリジン残基におけるＰＥＧ占有率を増加する。他の残基と交換されるために選択される特定のリジン残基は、酵素活性を保存するために選択される。このより均一なペグ化は、血中のタンパク質分解に対する保護の増加、及び患者の抗体からの抗原部位の遮蔽の増加を提供する。
【００６２】
ある特定の実施形態において、本開示のＡＤＩｒは、米国特許第６，６３５，４６２号に記載されているように修飾され得る。特に、ＡＤＩｒの天然に生じる１個以上のアミノ酸残基の修飾は、より容易に復元及び配合される酵素を提供し、それによってＡＤＩｒ及びそれを含む治療用組成物の製造が改善される。１つの実施形態において、本開示のＡＤＩｒは、１個以上のリジン残基を除去するために修飾される（例えば、リジンは、別のアミノ酸もしくはその類縁体、または非天然アミノ酸により置換され得る）。特に、１つの実施形態において、ＡＤＩｒは、配列番号１（Ｍ．ホミニスのＡＤＩ）の１１２、３７４、４０５、または４０８に同等の位置、またはこれらの位置の１つ以上の組み合わせにリジンを含まないように修飾される。更なる実施形態において、ＡＤＩｒは、１個を超えるリジン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、またはそれよりも多くのリジン残基を含まないように修飾され、存在する場合、別のアミノ酸もしくはその類縁体、または非天然アミノ酸により置換され得る。１つの実施形態において、ＡＤＩｒは、例えば、配列番号１の７、８８、１３７、２０９、及び３８０位と同等の位置で置換されている５個のリジンを有する。別の実施形態において、ＡＤＩｒは、例えば、配列番号１の７、９、５９、８８、１１５、１１６、１３７、１７８、２０９、及び３８０位と同等の位置で置換されている１０個のリジンを有する。なおも別の実施形態において、ＡＤＩｒは、例えば、配列番号１の７、９、５９、６６、８８、９１、９３、１１５、１１６、１３７、１４１、１７８、２０９、２７９位、及び３８０位と同等の位置で置換されている１５個のリジンを有する。１つの実施形態において、ＡＤＩｒは、例えば、配列番号１の７、９、５６、５９、６６、８８、９１、９３、９６、１１５、１１６、１３７、１４１、１７８、２０９、２５４、２７９、３２５、３２６、３８０、及び４０６位と同等の位置で置換されている２１個のリジンを有する。
【００６３】
未変性ＡＤＩｒが微生物において見出されることがあり、免疫原性であり、患者の循環から迅速に取り除かれる。これらの問題は、ＡＤＩｒを修飾することにより克服することができる。したがって、本開示は、巨大分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、多糖、または他の化合物が含まれるが、これらに限定されない修飾剤により修飾されるＡＤＩｒを提供する。本明細書に記載されているアルギニンデイミナーゼ及び修飾剤は、共有結合または非共有相互作用により結合され、安定した抱合体または安定した組成物を形成して所望の効果を達成することができる。ある特定の実施形態において、修飾されたＡＤＩｒは、非修飾ＡＤＩｒの生物学的活性を保持し、非修飾ＡＤＩｒより長いインビボ半減期及び低い抗原性を有する。ある特定の実施形態において、修飾されたＡＤＩｒは、非修飾ＡＤＩｒの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える生物学的活性を保持する。一般に、修飾されたＡＤＩｒは、治療上の使用に十分な生物学的活性を保持する。
【００６４】
１つの実施形態において、修飾剤は、生体適合性のあるポリマーもしくはタンパク質、またはこれらの断片であり得、血中のＡＤＩｒの半減期を増加し得る。修飾剤は、ＡＤＩｒに化学的に結合する、または適用可能な場合、融合タンパク質発現を介してＡＤＩｒに結合することができる。
【００６５】
巨大分子ポリマーには、非ペプチド巨大分子ポリマーが含まれ得、特定の実施形態では、それ自体、生体活性を有し得る。適切なポリマーには、ポリエノール化合物、ポリエーテル化合物、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、多糖、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリンまたはその断片、ポリ−アルキル−エチレングリコール及びその誘導体、ポリ−アルキル−エチレングリコールとその誘導体のコポリマー、ポリ（ビニルエチルエーテル）、ａ，Ｐ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］、ポリカルボキシレート、ポリオキシエチレン−オキシメチレン、ポリアクリロイルモルホリン、アミノ化合物とオキシオレフィンのコポリマー、ポリヒアルロン酸、ポリオキシラン、エタン二酸とマロン酸のコポリマー、ポリ（１，３−ジオキソラン）、エチレンとマレイン酸ヒドラジドのコポリマー、ポリシアル酸、シクロデキストリンなどが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００６６】
本明細書において使用されるポリエノール化合物には、ポリエチレングリコール（モノメトキシポリエチレングリコール、モノヒドロキシルポリエチレングリコールを含む）、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリブテノールなど、及び脂質などのこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
ポリマー化合物には、ポリアルキレングリコール（ＨＯ（（ＣＨ２）ｘＯ）ｎＨ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシレヒレン（ＨＯ（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎＨ）、ポリビニルアルコール（（ＣＨ２ＣＨＯＨ）ｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
ポリアミノ酸には、１種類のアミノ酸のポリマーまたは２種類以上のアミノ酸のコポリマー、例えば、ポリアラニンもしくはポリリジン、またはこれらのブロックコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
多糖には、グルコサン及びその誘導体、例えば、硫酸デキストラン、セルロース及びその誘導体（メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む）、デンプン及びその誘導体、ポリスクロースなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の１つの特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、タンパク質またはペプチドとカップリングすることにより修飾され、ここで１つ以上のタンパク質またはペプチドは、ＡＤＩｒと直接的または間接的に結合される。タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、ａ１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、Ｉｇ  Ｆｃ領域、アルブミン、及びこれらの断片などの天然に存在するヒト血清タンパク質またはそれらの断片が含まれるが、これらに限定されない天然に存在するタンパク質またはその断片であり得る。「断片」とは、タンパク質全体よりも小さいが、タンパク質の所望の機能を保持するタンパク質の任意の部分を意味する。本明細書に記載されているＡＤＩｒは、共有結合を介してタンパク質に直接的または間接的に結合することができる。直接結合は、ＡＤＩｒの１個のアミノ酸が、ペプチド結合またはジスルフィド結合を介して修飾タンパク質の１個のアミノ酸と直接的に結合することを意味する。間接結合は、間に元々存在している化学基、または生物学的もしくは化学的な手段により付加された特定の化学基、または上記に記述された結合の組み合わせを介する、ＡＤＩｒと修飾タンパク質との結合を指す。
【００７１】
１つの特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＰＥＧとの共有結合により修飾される。ＰＥＧ（リンカーを用いる、または用いない）により共有的に修飾されたＡＤＩｒは、本明細書以降、「ＡＤＩｒ−ＰＥＧ」と呼ぶことができる。非修飾ＡＤＩｒ−ＰＥＧと比較したとき、ＡＤＩｒ−ＰＥＧは、その大部分の酵素活性を保持し、免疫原性または抗原性がずっと少なく、大きく延長された循環半減期を有し、腫瘍の治療にいっそう効果的である。
【００７２】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、ｎが少なくとも４である一般式：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨにより表される、分岐鎖または直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を指す。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」を数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその重量平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ５，０００は、約５，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指し、ＰＥＧ１２，０００は、約１２，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指し、ＰＥＧ２０，０００は、約２０，０００の総重量平均分子量を有するＰＥＧを指す。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００、１つの実施形態では、約３，０００〜約４０，０００、別の実施形態では、約５，０００〜約３０，０００、ある特定の実施形態では、約８，０００〜約３０，０００、他の実施形態では、約１１，０００〜約３０，０００、追加の実施形態では、約１２，０００〜約２８，０００、なおも他の実施形態では、約１６，０００〜約２４，０００、他の実施形態では、約１８，０００〜約２２，０００、別の実施形態では、１９，０００〜約２１，０００の総重量平均分子量を有し、１つの実施形態において、ＰＥＧは、約２０，０００の総重量平均分子量を有する。一般に、３０，０００以上の重量平均分子量を有するＰＥＧは、溶解することが困難であり、配合生成物の収率は低減され得る。ＰＥＧは、分岐鎖または直鎖であり得る。一般に、ＰＥＧの分子量が増加すると、ＡＤＩｒの免疫原性が減少する。この実施形態に記載されている分子量を有するＰＥＧをＡＤＩｒ及び任意に生体適合性リンカーと一緒に使用して、例えば、再発性の急性骨髄性白血病などの急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、及び食道癌を含む癌を治療することができる。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００、ある特定の実施形態では、約３，０００〜約３０，０００、他の実施形態では、約３，０００〜約２０，０００、１つの実施形態では、約４，０００〜約１２，０００、なおも他の実施形態では、約４，０００〜約１０，０００、追加の実施形態では、約４，０００〜約８，０００、なおも更なる実施形態では、約４，０００〜約６，０００、別の実施形態では、約５，０００の総重量平均分子量を有する。ＰＥＧは、分岐鎖または直鎖であり得、ある特定の実施形態では、直鎖である。この実施形態に記載されている分子量を有するＰＥＧをＡＤＩｒ及び任意に生体適合性リンカーと一緒に使用して、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または癌を治療することができる。
【００７５】
ＡＤＩｒ−ＰＥＧが本明細書に記載されている例示的な修飾されたＡＤＩｒであるが、当業者に認識されるように、ＡＤＩｒは、特に抗原性を低減し、血清半減期を増加する所望の効果のために他のポリマーまたは適切な分子により修飾され得る。
【００７６】
ＡＤＩｒは、リンカーを用いる、または用いることなく、ＰＥＧなどの修飾剤に共有結合することができるが、好ましい実施形態は、リンカーを利用する。
【００７７】
ＡＤＩｒを修飾剤、例えばＰＥＧに供給結合させるために使用されるリンカーは、任意の生体適合性リンカーであり得る。上記に考察されたように、「生体適合性」は、化合物または基が非毒性であること、及び損傷、病気、疾患、もしくは死亡を引き起こすことなくインビトロもしくはインビボにおいて利用され得ることを示す。ＰＥＧなどの修飾剤は、例えば、エーテル結合、チオール結合、またはアミド結合を介してリンカーに結合することができる。リンカー基には、例えば、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。１つの実施形態において、生体適合性リンカーの源はスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）である。リンカーの他の適切な源には、オキシカルボニルイミダゾール基（例えば、カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）を含む）、ニトロフェニル基（例えば、ニトロフェニルカルボネート（ＮＣＰ）もしくはトリクロロフェニルカルボネート（ＴＣＰ）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、または第一級アミンが含まれ得る。別の実施形態において、リンカーは、ＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、またはＮＨＳから誘導され、ある特定の実施形態では、ＳＳ、ＳＰＡ、またはＮＨＳが使用され、他の実施形態では、ＳＳまたはＳＰＡが使用される。したがって、ある特定の実施形態において、潜在的なリンカーは、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルグルタレート（ＳＧ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＳＣＭ）、メトキシ−ＰＥＧ２Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、メトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルグルタルアミド、及びメトキシ−ＰＥＧスクシンイミジルスクシンアミドにより形成され得る。
【００７８】
代替的には、ＡＤＩｒは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を介して、ＰＥＧなどの修飾剤に直接的に（すなわち、リンカーを用いることなく）結合され得る。
【００７９】
ＡＤＩｒは、例えば、開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：３７３−３７６（１９８１）、及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２１（１９９２）に記載された、当該技術分野で既知の方法を使用して、生体適合性リンカーを介してＰＥＧに共有結合され得る。
【００８０】
ＡＤＩｒへのＰＥＧの結合は、ＡＤＩｒの循環半減期を増加する。一般に、ＰＥＧは、ＡＤＩｒの第一級アミンに結合する。ＡＤＩｒにおけるＰＥＧまたは他の修飾剤の結合部位の選択は、タンパク質の活性ドメイン内のそれぞれの部位の役割により決定され、当業者には知られている。ＰＥＧは、酵素活性を実質的に失わせることなくＡＤＩｒの第一級アミンに結合し得る。例えば、ＡＤＩｒに存在するリジン残基は、本明細書に記載されているＡＤＩｒがＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡ、及び／またはＮＨＳなどの生体適合性リンカーを介してＰＥＧに結合し得る全ての可能な地点である。ＰＥＧは、ＡＤＩｒの他の部位に結合することもでき、本開示を考慮すると当業者には明白である。
【００８１】
１〜約３０個のＰＥＧ分子がＡＤＩｒに共有結合することができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、１個のＰＥＧ分子により修飾される。他の実施形態において、ＡＤＩｒは、１個を超えるＰＥＧ分子により修飾される。１つの実施形態において、ＡＤＩｒは、約１〜約１０個または約７〜約１５個のＰＥＧ分子、１つの実施形態において、約２〜約８個または約９〜約１２個のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態において、ＡＤＩｒは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＰＥＧ分子により修飾される。１つの特定の実施形態において、ＡＤＩｒは、ＡＤＩｒあたり４．５〜５．５個のＰＥＧ分子により修飾される。別の実施形態において、ＡＤＩｒは、５±１．５個のＰＥＧ分子により修飾される。
【００８２】
別の実施形態において、ＡＤＩｒの約１５％〜約７０％の第一級アミノ基がＰＥＧにより修飾されており、１つの実施形態では、約２０％〜約６５％、約２５％〜約６０％であり、またはある特定の実施形態では、約３０％〜約５５％もしくは４５％〜約５０％であり、他の実施形態では、アルギニンデイミナーゼにおける約５０％の第一級アミノ基がＰＥＧにより修飾されている。ＰＥＧがＡＤＩｒの末端に供給結合するとき、利用される１個のＰＥＧ分子のみを有することが望ましいことがある。ＡＤＩｒにおけるＰＥＧ単位の数の増加は、酵素の循環半減期を増加する。しかし、ＡＤＩｒにおけるＰＥＧ単位の数の増加は、酵素の特定の活性を減少する。したがって、２つの釣り合いを得る必要があり、本開示を考慮すると当業者には明白である。
【００８３】
本発明において、生体適合性リンカーの共通の特徴は、スクシンイミド基を介してアルギニンデイミナーゼの第一級アミンに結合することである。ＡＤＩｒと結合すると、ＳＳ−ＰＥＧは、ＰＥＧの隣にエステル結合を有し、そのことはこの部位に血清エステラーゼに対する感受性を持たせ、ＡＤＩｒからＰＥＧを体内に放出させ得る。ＳＡＰ−ＰＥＧ及びＰＥＧ２−ＮＨＳは、エステル結合を有しないので、血清エステラーゼに対する感受性はない。
【００８４】
ある特定の実施形態において、生体適合性リンカーが本発明に使用される。タンパク質に結合しているＰＥＧは、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ、及びＳＣ−ＰＥＧのように直鎖であり得、またはＰＥＧ２−ＮＨＳのようにＰＥＧの分岐鎖が使用され得る。
【００８５】
ある特定の実施形態では、酵素の触媒領域に位置または隣接するＡＤＩｒと関連するペグ化部位が修飾される。本発明の目的において、語句「ペグ化部位」は、ポリエチレングリコールにより共有的に修飾され得るＡＤＩまたはＡＤＩｒの任意の部位または位置と定義され得る。「ペグ化部位」は、酵素の触媒領域に位置または隣接すると考慮され得、部位のペグ化は、酵素の触媒活性に有意な低減をもたらす。そのような部位のペグ化は、伝統的に、酵素の不活性化をもたらしている。例えば、マイコプラズマ・ホミニスのＡＤＩは、酵素の触媒領域にある、または隣接すると考慮され得る１１２位にリジンを有する。１１２位のこのリジンへのＰＥＧの結合は、酵素を不活性化し得る。加えて、マイコプラズマ・ホミニスのＡＤＩは、酵素の触媒領域にある、または隣接すると考慮され得る３９７位にシステインを有する。３９７位のシステインのアミノ酸置換は、酵素を不活性化し得る。特に、３９７位でシステインをアラニン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、リジン、またはチロシンに置換すると、検出可能な全ての酵素活性の損失をもたらし得る。マイコプラズマ・ホミニスのＡＤＩは、この保存システインに近接して位置する３個のリジン、特にＬｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、及びＬｙｓ４０８も有する。Ｌｙｓ３７４、Ｌｙｓ４０５、Ｌｙｓ４０８、またはこれらの組み合わせへのＰＥＧの結合は、酵素を不活性化し得る。
【００８６】
他の生物から誘導されたＡＤＩｒも、マイコプラズマ・ホミニスのＡＤＩの１１２位に対応するペグ化部位を有し得ることが理解されるべきである。加えて、幾つかの生物からのＡＤＩは、マイコプラズマ・ホミニスのＡＤＩの１１２位と同じ一般位置に対応するリジンを有し得る。そのような生物のＡＤＩにおけるリジンの位置は、当業者に知られており、米国特許第６，６３５，４６２号に記載されている。
【００８７】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＡＤＩｒのポリペプチド鎖におけるある特定のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、修飾剤により修飾されたとき、すなわちペグ化されたとき、あまり活性を失わない修飾されたＡＤＩｒを提供する。ペグ化部位または他の既知の修飾部位を、酵素の触媒領域において、または隣接して排除することにより、最適な修飾、例えばペグ化が、活性を失うことなく達成され得る。
【００８８】
本発明の他の実施形態は、アルギニンデイミナーゼのある特定の構造的特徴が、組み換え技術により産生されたとき適正で迅速な復元を防止または干渉し得るという理解に基づいていることを、理解するべきである。特に、これらの構造的特徴は、組み換え産生の際に酵素が活性立体配座を呈することを妨げる、または防止する。本発明の目的において、語句「活性立体配座」は、非修飾または修飾されたアルギニンデイミナーゼによる酵素活性を可能にする三次元構造と定義され得る。活性立体配座は、特に、アルギニンからシトルリンへの変換を触媒するために必要であり得る。語句「構造的特徴」は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせによりもたらされるポリペプチド鎖の任意の形質、品質、または特性と定義され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、正常なペプチド鎖における折り曲げ、またはねじれをもたらし、したがって、酵素の復元の際に酵素が活性立体配座を呈することを妨げるアミノ酸を含有し得る。特に、マイコプラズマ・ホミニスのアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖に折り曲げ、またはねじれをもたらし、組み換え産生の際に酵素を復元することをより困難にし得るプロリンを、２１０位に有する。他の生物から誘導されたアルギニンデイミナーゼも、マイコプラズマ・ホミニスのアルギニンデイミナーゼの２１０位に対応する部位を有し得ることが理解されるべきである。
【００８９】
したがって本発明は、野生型アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖に、ある特定のアミノ酸置換を提供する。そのようなアミノ酸置換は、アルギニンデイミナーゼのペプチド鎖から問題のある構造的特徴を排除することができる。そのようなアミノ酸置換は、修飾されたアルギニンデイミナーゼに改善された復元を提供する。これらのアミノ酸置換は、低減された量の緩衝液を使用した、修飾されたアルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能にする。これらのアミノ酸置換は、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの増加した収率も提供することができる。本発明の１つの実施形態において、修飾されたアルギニンデイミナーゼは、Ｐ２１０または同等の残基にアミノ酸置換を有する。上記に記述されたように、マイコプラズマ・ホミニスから誘導されたアルギニンデイミナーゼは、２１０位に位置するアミノ酸のプロリンを有する。本発明に限定されることなく、２１０位のアミノ酸プロリンの存在は、アルギニンデイミナーゼの復元（すなわち、再折りたたみ）の困難さを増加する折り曲げ、またはねじれを正常なポリペプチド鎖にもたらすと、現在考えられている。２１０位のプロリンの置換は、低減された量の緩衝液を使用した、修飾されたアルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能にする。２１０位のプロリンの置換は、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの増加した収率も提供することができる。１つの実施態様において、２１０位のプロリンはセリンにより置換される。本発明の態様によると、２１０位で他の置換を行い得ることが理解されるべきである。他の置換の例には、Ｐｒｏ２１０をＴｈｒ２１０にする、Ｐｒｏ２１０をＡｒｇ２１０にする、Ｐｒｏ２１０をＡｓｎ２１０にする、Ｐｒｏ２１０をＧｌｎ２１０にする、またはＰｒｏ２１０をＭｅｔ２１０にすることが含まれる。野生型アルギニンデイミナーゼの２１０位のアミノ酸に関連するこれらの構造的特徴を排除することによって、酵素の適正な再折りたたみを達成することができる。
【００９０】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボのいずれかの用途を伴うことができる。細胞培養用途を含むインビトロ用途の場合、本明細書に記載されている化合物を培養物中の細胞に加え、次にインキュベートすることができる。本発明の化合物を、当該技術分野において周知の抗体産生技術を使用して、モノクローナル及び／またはポリクローナル抗体の産生を推進することもできる。次にモノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を、多種多様な診断用途に使用することができ、当業者には明白である。
【００９１】
本発明の化合物を投与するインビボ手段は、目的の用途に応じて変わる。本明細書に記載されているＡＤＩｒ組成物の純粋な形態または適切な薬学的組成物による投与は、類似した有用性で機能する薬剤の任意の許容される投与様式により実施され得る。薬学的組成物は、ＡＤＩｒ、例えば、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０を、適切な生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることより調製することができ、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、懸濁剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、及びエアゾール剤などの固体、半固体、液体、または気体の形態の調合剤に配合することができる。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の他に記載されている他の抗癌剤を含む）、ならびに／または塩、緩衝液、及び安定剤などの適切な賦形剤が、組成物内に存在し得るが、必ずしもその必要はない。投与は、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下、または局所を含む様々な異なる経路により達成され得る。投与様式は、治療または予防される状態の性質によって決まる。したがって、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ、例えばＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０は、経口、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、組織内、動脈内、皮下、眼球内、滑液内、経上皮、及び経皮投与され得る。投与後に、癌の進行及び／または転移を低減、阻害、防止、または遅延する量が、有効であると考慮される。ある特定の実施形態において、本明細書のＡＤＩｒ組成物は、統計的に有意な量で患者の生存期間の中央値を増加する。１つの実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒ治療は、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、４０週間、またはそれ以上、患者の生存期間の中央値を増加する。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒ治療は、１年間、２年間、３年間、またはそれ以上、患者の生存期間の中央値を増加する。１つの実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒ治療は、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、またはそれ以上、無進行生存期間を増加する。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒ治療は、１年間、２年間、３年間、またはそれ以上、無進行生存期間を増加する。
【００９２】
ある特定の実施形態において、投与された量は、生存腫瘍の量における統計的に有意な減少、例えば、腫瘍量における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれを超える減少、または走査寸法の変更（例えば、統計的に有意な減少）により示される、腫瘍退縮をもたらすのに十分である。ある特定の実施形態において、投与される量は、安定した疾患をもたらすのに十分である。他の実施形態において、投与される量は、熟練臨床医に既知の特定の疾患の適応症の症状に臨床的に関連する低減をもたらすのに十分である。
【００９３】
ある特定の実施形態において、投与される量は、ＮＯ合成を阻害する、血管新生を阻害するのに十分である、及びまたは腫瘍細胞にアポトーシスを誘発するのに十分である、あるいはこれらの任意の組み合わせである。ＮＯ合成、血管新生、及びアポトーシスは、当該技術分野において既知の方法を使用して測定することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｔｈｅｒｅｔｏ）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５、及び他の同様の参考文献を参照されたい。１つの特定の実施形態において、投与される量は、ＮＯ合成を阻害し、黒色腫及び補体の増殖を阻害し、シスプラチンなどの本明細書に記載されている他の化学療法剤に追加される、またはそれと相乗作用する。したがって、本開示の１つの実施形態は、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０をシスプラチンと組み合わせて投与することにより、黒色腫を治療する方法を提供し、この治療は、内在性一酸化窒素（ＮＯ）を枯渇させる。
【００９４】
正確な投与量及び治療の持続期間は、治療される疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使用して経験的に、または当該技術分野で既知のモデル系において組成物を試験し、推定することにより決定され得る。対照臨床試験を実施することもできる。投与量は、緩和される状態の重篤度によっても変わり得る。薬学的組成物は、一般に、治療上有用な効果を発揮し、同時に望ましくない副作用を最小限にするように配合及び投与される。組成物は、１回で投与され得る、または時間間隔を置いて投与される多数の小用量に分割され得る。任意の特定の対象では、特定の投与量レジメンを個人の必要性に従って経時的に調整することができる。
【００９５】
ＡＤＩｒ組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法などの既知の他の癌治療と組み合わせて投与され得る。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。
【００９６】
ＡＤＩｒ組成物は、単独で、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０療法と組み合わせて投与することもできる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているＡＤＩｒは、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０により治療され、かつ抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を発生している患者に使用される。そのような患者は、酵素が抗体により中和されるので、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０治療により利益を受けることはない。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、癌を治療する、その症状を寛解させる、または進行を阻害する方法であって、その必要性のある患者に、治療上有効量の、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む組成物を投与し、一定期間後に、患者に、本明細書に記載されているＡＤＩｒを含む組成物を投与し、それによって癌を治療する、その症状を寛解させる、または進行を阻害する、前記方法を提供する。
【００９７】
方法の１つの実施形態において、一定期間は、患者における所定レベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を検出することによって決定され、ＡＤＩｒを含む組成物は、所定レベルの前記抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の検出後に投与される。ある特定の実施形態では、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０及び本発明のＡＤＩｒで治療される患者における抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の閾値または所定レベルが、確立され得る。抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の「所定の閾値」（「所定レベル」もしくは「所定のカットオフ値」とも呼ばれる）、または所定のカットオフと時々呼ばれる、は、当該技術分野において既知の方法を使用して、例えば、受信者動作特性曲線または「ＲＯＣ」曲線を使用して確立され得る。１つの実施形態において、非常に低いレベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体であっても、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０から本発明のＡＤＩｒ−ＰＥＧに治療を切り替える十分な根拠であると認められる。ある特定の実施形態において、いつＡＤＩ−ＰＥＧ２０治療を終了し、本発明のＡＤＩｒ−ＰＥＧによる治療を開始するかを決定する適切なレベルの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０は、熟練臨床医により決定され得る。
【００９８】
幾つかの実施形態において、一定期間は、患者においてＡＤＩ活性を検出する、あるいは観察することによって決定され、組成物は、所定レベルのＡＤＩ活性の検出または観察の後に投与される。特定の実施形態において、組成物は、患者における低減されたレベルのＡＤＩ活性の検出または観察の後に投与される。ＡＤＩ活性は、直接的に、例えば生物学的試料をＡＤＩ活性の少なくとも１つの指標についてアッセイすることにより、または間接的に、例えばＡＤＩ−ＰＥＧ２０治療の所望もしくは目的の効果を観察することにより、測定され得る。ある特定の実施形態において、いつＡＤＩ−ＰＥＧ２０治療を終了し、本発明のＡＤＩｒ−ＰＥＧによる治療を開始するかを決定する適切なレベルのＡＤＩ活性は、熟練臨床医により決定され得る。
【００９９】
したがって、これらの、及び関連する薬学的組成物を投与する典型的な経路には、限定されることなく、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸内、膣内、及び鼻腔内が含まれる。本明細書で使用されるとき、非経口という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技術が含まれる。
【０１００】
本発明のある特定の実施形態による薬学的組成物は、含有されている活性成分が、組成物の患者への投与時に生物化学的利用能があることを可能にするように配合される。対象または患者に投与される組成物は、１つ以上の投与単位の形態をとることができ、例えば、錠剤は、単回投与単位であり得、エアゾール形態の本明細書に記載されているＡＤＩｒの容器は、複数の投与単位を保持し得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、知られており、当業者には明白である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照されたい。投与される組成物は、いずれの場合においても、治療上有効量の、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０などの本開示のＡＤＩｒ−ＰＥＧを、本明細書の教示に従って目的の疾患または状態を治療するために含有する。ある特定の実施形態において、薬学的または治療用組成物は、滅菌及び／または発熱物質無含有である。
【０１０１】
薬学的組成物は、固体または液体の形態であり得る。１つの実施形態において、担体は粒状であり、そのため組成物は、例えば錠剤または粉末剤の形態である。担体は、液体であり得、組成物は、例えば、アノーラル油（ａｎｏｒａｌ  ｏｉｌ）、注射用液体、またはエアゾールであり、例えば吸入投与に有用である。経口投与が意図される場合、薬学的組成物は、一般に、固体または液体のいずれかの形態であり、半固体、半液体、懸濁液、及びゲルの形態が、本明細書において固体または液体として考慮される形態の範囲内に含まれる。
【０１０２】
経口投与用の固体組成物として、薬学的組成物は、粉末剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム剤、ウエハ剤などに配合され得る。そのような固体組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤または食用担体を含有する。加えて、以下の１つ以上が存在し得る。カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの潤滑剤、コロイド二酸化ケイ素などの滑剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味などの風味剤、及び着色剤。薬学的組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、上記の種類の材料に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体担体を含有することができる。
【０１０３】
薬学的組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤であり得る。液体は、２つの例として、経口投与用または注射送達用であり得る。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、１つ以上の甘味剤、防腐剤、染料／色素、及び風味増強剤を含有する。注射による投与が意図される組成物では、１つ以上の界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定剤、及び等張剤が含まれ得る。
【０１０４】
液体の薬学的組成物は、液剤、懸濁剤、または他の同様の形態であるかにかかわらず、１つ以上の以下の佐剤を含むことができる。注射用水、食塩水、ある特定の実施形態では生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒体として機能し得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの固定油、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調節用の薬剤。非経口調合剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多回用量バイアルに密閉され得る。生理食塩水が好ましい佐剤である。注射用の薬学的組成物は、好ましくは滅菌である。
【０１０５】
非経口または経口投与のいずれかが意図される液体薬学的組成物は、適切な投与量が得られるような、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０などの本明細書に開示されているＡＤＩｒの量を含有するべきである。典型的には、この量は、組成物中において少なくとも０．０１％のＡＤＩｒである。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の重量の少なくとも０．１〜約７０％に変わり得る。ある特定の経口用薬学的組成物は、約４％〜約７５％のＡＤＩｒ−ＰＥＧを含有する。ある特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物及び調合剤は、非経口投与単位が希釈前に０．０１〜１０重量％のＡＤＩｒ−ＰＥＧを含有するように調製される。
【０１０６】
薬学的組成物は、局所投与が意図され得、この場合、担体は、適切には溶液、エマルション、軟膏、またはゲルの基剤を含有することができる。基剤は、例えば、１つ以上の以下を含むことができる。ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、水及びアルコールなどの希釈剤、乳化剤、ならびに安定剤。増粘剤が、局所投与用の薬学的組成物に存在することができる。経皮投与が意図される場合、組成物には、経皮パッチ剤またはイオン導入装置が含まれ得る。薬学的組成物は、直腸内で融解し、薬剤を放出する、例えば坐剤の形態により直腸内投与用に意図される。直腸投与用の組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有することができる。そのような基剤には、限定されることなく、ラノリン、カカオバター、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０７】
薬学的組成物は、固体または液体の投与単位の物理的な形態を改変する様々な材料を含むことができる。例えば、組成物は、活性成分の周りに被覆シェルを形成する材料を含むことができる。被覆シェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば、糖、セラック、及び他の腸溶性被覆剤から選択され得る。代替的には、活性成分は、ゼラチンカプセルの中に入れられる。固体または液体形態の薬学的組成物は、ＡＤＩｒ−ＰＥＧに結合する薬剤を含むことができ、それによって化合物の送達を助ける。この能力で作用し得る適切な薬剤には、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質、またはリポソームが含まれる。薬学的組成物は、エアゾール剤として投与され得る投与単位から実質的に構成され得る。エアゾール剤という用語は、コロイド性の系から、加圧包装で構成される系までの範囲の様々な系を示すために使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによるもの、または活性成分を分配する適切なポンプ系によるものであり得る。エアゾール剤は、活性成分を送達するために、単相、二相、または三相系により送達され得る。エアゾール剤の送達には、必要な容器、活性化剤、バルブ、副容器などが含まれ、一緒になってキットを形成し得る。当業者は、実験を過剰に行うことなく、好ましいエアゾール剤を決定することができる。
【０１０８】
薬学的組成物は、薬学技術において周知の手法により調製され得る。例えば、注射により投与されることが意図される薬学的組成物は、本明細書に記載されているＡＤＩｒ−ＰＥＧ、ならびに任意に１つ以上の塩、緩衝液、及び／または安定剤を含む組成物を、滅菌蒸留水と合わせて、液剤を形成することにより調製され得る。界面活性剤を加えて、均質な液剤または懸濁剤の形成を推進することができる。界面活性剤は、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ組成物と非共有的に相互作用して、水性送達系におけるＡＤＩｒ−ＰＥＧの溶解または均質な懸濁を推進する化合物である。
【０１０９】
組成物は、治療上有効量で投与され得、これは、用いられる特定の化合物（例えば、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ）の活性、化合物の代謝安定性及び作用の長さ、患者の年齢、体重、身体全体の健康状態、性別、及び食事、投与の様式及び時点、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の障害または状態の重篤度、ならびに療法を受けている対象を含む様々な要因に応じて変わる。
【０１１０】
本発明の１つの化合物の治療上有効量は、腫瘍増殖を阻害するのに有効な量である。一般に、治療は、少量の投与量で開始され、状況下で最適な効果が達成されるまで少量ずつの増量により増加され得る。一般に、本発明の化合物の治療投与量は、１週間に２回から２週間毎に約１回の約１〜約２００ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、投与量は、２ｍｌの静脈内注射による、１週間に１回の１ｍｇ／ｋｇから３日毎に１回の約２０ｍｇ／ｋｇであり得る。更なる実施形態において、用量は、３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与される、約５０ＩＵ／ｍ２〜約７００ＩＵ／ｍ２であり得る。ある特定の実施形態において、用量は、３日毎に約１回、１週間に約１回、１週間に約２回、または２週間毎に約１回投与される、約５０ＩＵ／ｍ２、６０ＩＵ／ｍ２、７０ＩＵ／ｍ２、８０ＩＵ／ｍ２、９０ＩＵ／ｍ２、１００ＩＵ／ｍ２、１１０ＩＵ／ｍ２、１２０ＩＵ／ｍ２、１３０ＩＵ／ｍ２、１４０ＩＵ／ｍ２、１５０ＩＵ／ｍ２、１６０ＩＵ／ｍ２、１７０ＩＵ／ｍ２、１８０ＩＵ／ｍ２、１９０ＩＵ／ｍ２、２００ＩＵ／ｍ２、２１０ＩＵ／ｍ２、２２０ＩＵ／ｍ２、２３０ＩＵ／ｍ２、２４０ＩＵ／ｍ２、２５０ＩＵ／ｍ２、２６０ＩＵ／ｍ２、２７０ＩＵ／ｍ２、２８０ＩＵ／ｍ２、２９０ＩＵ／ｍ２、３００ＩＵ／ｍ２、３１０ＩＵ／ｍ２、約３２０ＩＵ／ｍ２、約３３０ＩＵ／ｍ２、３４０ＩＵ／ｍ２、約３５０ＩＵ／ｍ２、３６０ＩＵ／ｍ２、３７０ＩＵ／ｍ２、３８０ＩＵ／ｍ２、３９０ＩＵ／ｍ２、４００ＩＵ／ｍ２、４１０ＩＵ／ｍ２、４２０ＩＵ／ｍ２、４３０ＩＵ／ｍ２、４４０ＩＵ／ｍ２、４５０ＩＵ／ｍ２、５００ＩＵ／ｍ２、５５０ＩＵ／ｍ２、６００ＩＵ／ｍ２、６２０ＩＵ／ｍ２、６３０ＩＵ／ｍ２、６４０ＩＵ／ｍ２、６５０ＩＵ／ｍ２、６６０ＩＵ／ｍ２、６７０ＩＵ／ｍ２、６８０ＩＵ／ｍ２、６９０ＩＵ／ｍ２、または約７００ＩＵ／ｍ２であり得る。ある特定の実施形態において、用量は、熟練臨床医が望むように改変され得る。
【０１１１】
ＡＤＩｒ−ＳＳ−ＰＥＧ５，０００の最適な投与は、１週間に約２回であり得るが、ＡＤＩｒ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の最適な投与は、１週間に約１回から２週間毎に約１回であり得る。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒ−ＳＳ−ＰＥＧ２０，０００の最適な投与は、１週間に約２回であり得る。
【０１１２】
ＡＤＩｒ−ＰＥＧを、リン酸緩衝食塩水または当業者に既知の任意の他の適切な溶液と、注射する前に混合することができる。１つの実施形態において、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む液体組成物は、約１０〜約１２ｍｇのＡＤＩｒ、約２０〜約４０ｍｇのポリエチレングリコール、１．２７ｍｇの＋５％一塩基リン酸ナトリウム、ＵＳＰ、約３ｍｇの＋５％二塩基リン酸ナトリウム、ＵＳＰ、７．６ｍｇの＋５％塩化ナトリウム、ＵＳＰを、約６．６〜約７のｐＨで適切な量の注射用水（例えば、約１ｍｌまたは約２ｍｌ）に含む。１つの実施形態において、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む液体組成物は、ヒスチジン−ＨＣｌを含み、ある特定の実施形態において、組成物の緩衝液は、約０．００３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌ〜約０．３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌである。１つの特定の実施形態において、組成物は、ｐＨ６．８で０．０３５Ｍのヒスチジン−ＨＣｌを０．１３Ｍの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液により配合される。別の実施形態において、組成物は、ｐＨ６．８で０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を０．１３Ｍの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液により配合される。
【０１１３】
１つの実施形態において、ＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物は、約５〜約９、約６〜約８、または約６．５〜約７．５のｐＨを有する。幾つかの実施形態においてＡＤＩｒを含む組成物は、約６．８±１．０のｐＨ有する。
【０１１４】
１つの実施形態において、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離ＰＥＧは、１〜１０％であり、更なる実施形態では、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の総ＰＥＧである。ある特定の実施形態において、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物中の非修飾ＡＤＩｒは、約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％未満、または０．１％未満である。一般に、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物は、約４％、３％、２％、１．５％、１％、または０．５％以下の総不純物を有する。１つの実施形態において、内毒素の制限は、ＵＳＰに記述されている要件を満たし、すなわち、≦５０ＥＵ／ｍＬである。
【０１１５】
１つの実施形態において、ＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９０％を超える。幾つかの実施形態において、ＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、もしくは約９５％、約９６％約９７％、約９８％約９９％、またはそれ以上である。
【０１１６】
１つの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約０．１μＭまたは約０．５μＭ〜約１５μＭのＫｍを有し、更なる実施形態では、約１μＭ〜約１２μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１．５μＭ〜約９μＭ、約１．５μＭ〜約８μＭ、または約１．５μＭ〜約７μＭである。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約１．０μＭ〜約１０μＭまたは約１．５μＭ〜約６．５μＭのＫｍを有する。幾つかの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約、少なくとも約、または約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、もしくは約７μＭ、もしくは約８μＭ、もしくは約９μＭ、もしくは約１０μＭ未満のＫｍを有する。
【０１１７】
１つの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約０．５秒−１〜約８０秒−１、または約０．５秒−１〜約７０秒−１、または約０．５秒−１〜約６０秒−１、または約０．５秒−１〜約５０秒−１、または約０．５秒−１〜約４０秒−１、または約０．５秒−１〜約３０秒−１、または約０．５秒−１〜約２０秒−１、または約０．５秒−１〜約１５秒−１のＫｃａｔを有し、更なる実施形態では、約０．５秒−１〜約８０秒−１、または約１秒−１〜約８０秒−１、または約５秒−１〜約８０秒−１、または約１０秒−１〜約８０秒−１、または約２０秒−１〜約８０秒−１、または約３０秒−１〜約８０秒−１、または約４０秒−１〜約８０秒−１、または約５０秒−１〜約８０秒−１、または約６０秒−１〜約８０秒−１、または約７０秒−１〜約８０秒−１、または約１秒−１〜約１２秒−１、約１秒−１〜約１０秒−１、約１．５秒−１〜約９秒−１、約２秒−１〜約８秒−１、または約２．５秒−１〜約７秒−１のＫｃａｔを有する。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約２．５秒−１〜約７．５秒−１のＫｃａｔを有する。幾つかの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約または少なくとも約２．５秒−１、約３秒−１、約３．５秒−１、約４秒−１、約４．５秒−１、約５秒−１、約５．５秒−１、約６秒−１、約６．５秒−１、約７秒−１、約７．５秒−１、もしくは約８秒−１、約１０秒−１、約１５秒−１、約２０秒−１、約２５秒−１、約３０秒−１、約３５秒−１、約４０秒−１、約４５秒−１、約５０秒−１、約５５秒−１、約６０秒−１、約６５秒−１、約７０秒−１、約７５秒−１、約８０秒−１、約８５秒−１、約９０秒−１、約９５秒−１、または約１００秒−１のＫｃａｔを有する。
【０１１８】
１つの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、更なる実施形態では、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率（当該技術分野において、導電率とも呼ばれる）を有する。幾つかの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約９ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ、または約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ、または約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約１３ｍＳ／ｃｍ±１．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【０１１９】
１つの実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する。ある特定の実施形態において、組成物中のＡＤＩｒまたはＡＤＩｒ−ＰＥＧは、約３００±３０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する。
【０１２０】
１つの実施形態において、タンパク質濃度は、約１１．０±１．０ｍｇ／ｍＬである。±ある特定の実施形態において、タンパク質濃度は、約８〜約１５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、タンパク質濃度は、約８、９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、または１５ｍｇ／ｍＬである。
【０１２１】
１つの実施形態において、特定の酵素活性は、約５．０〜９０ＩＵ／ｍｇまたは約５〜５５ＩＵ／ｍｇであり、ここで１ＩＵは、１μｍｏｌのアルギニンを１μｍｏｌのシトルリン及び１μｍｏｌのアンモニアに３７℃において１分間で変換する酵素の量と定義され、効力は、１００±２０ＩＵ／ｍＬである。別の実施形態において、特定の酵素活性は、約５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３５、４０、４５、５０、５５、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００±２．０ＩＵ／ｍｇである。１つの実施形態において、特定の酵素活性は、９±２．０ＩＵ／ｍｇである。
【０１２２】
本開示のＡＤＩｒ−ＰＥＧを含む組成物は、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を含む１つ以上の他の治療剤の投与と同時に、その前に、またはその後に投与することもできる。そのような併用療法には、本発明の化合物及び１つ以上の追加の活性剤を含有する単一の薬学的投与製剤の投与、ならびに本発明のＡＤＩｒ−ＰＥＧ（例えば、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０）及びそれぞれの活性剤をそれ自体別個の薬学的投与製剤で含む組成物の投与が含まれ得る。例えば、本明細書に記載されているＡＤＩｒ−ＰＥＧ及び他の活性剤を、錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与組成物で一緒に患者に投与することができる、またはそれぞれの薬剤を別個の経口投与製剤により投与することができる。同様に、本明細書に記載されているＡＤＩｒ−ＰＥＧ及び他の活性剤を、食塩水もしくは他の生理学的に許容される溶液などにより単一の非経口投与組成物で一緒に患者に投与することができる、またはそれぞれの薬剤を、同じ、もしくは異なる経路により（例えば、１つを注射により、１つを経口により）別個の非経口投与製剤で投与することができる。別個の投与製剤が使用される場合、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ及び１つ以上の追加の活性剤を含む組成物を、実質的に同じ時に、すなわち同時発生的に、または別々に時差をつけて、すなわち連続的に任意の順番で投与することができ、併用療法は、これら全てのレジメンを含むことが理解される。
【０１２３】
したがって、ある特定の実施形態において、１つ以上の他の治療剤と組み合わせた、本開示のＡＤＩｒ組成物の投与も考慮される。そのような治療剤は、特定の癌またはＧＶＨＤなどの本明細書に記載されている特定の疾患状態の標準的な治療として、当該技術分野において許容され得る。考慮される例示的な治療剤には、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、自食作用阻害剤、または他の活性及び補助剤が含まれる。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されているＡＤＩｒ組成物を、任意の数の化学療法剤と共に投与することができる。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロメタミン、酸化メクロエタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カムルスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類縁体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸など葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファアミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２′，２″−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンなど白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバントロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も、この定義に含まれる。更なる化学療法薬には、ソラフェニブ、ならびにアファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ホスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、及びスニチニブなどの他のタンパク質キナーゼ阻害剤、シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス、及び他のｍＴＯＲ阻害剤が含まれる。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も、本明細書における使用が考慮される。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されているＡＤＩｒ組成物を、任意の数の自食作用阻害剤と共に投与することができる。幾つかの実施形態において、自食作用阻害剤は、クロロキン、３−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））、バフィロマイシンＡ１、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）、オカダ酸、２Ａ型または１型のタンパク質ホスファターゼを阻害する自食作用抑制性藻毒素、ｃＡＭＰの類縁体、及びｃＡＭＰレベルを上昇させる薬剤、アデノシン、Ｎ６−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマニン、ならびにビンブラスチンからなる群から選択される。加えて、例えばＡＴＧ５などの自食作用に必須のタンパク質の発現を阻害する、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡを使用することもできる。
【０１２６】
１つの実施形態において、ＡＤＩｒ−ＰＥＧと１つ以上の治療剤との組み合わせは、相補的、相加的、または相乗的に作用する。この点において、相補または相乗作用剤が、本明細書に記載されており、本明細書に提供されているＡＤＩｒ−ＰＥＧと相補的または相乗的に作用することができる治療剤（例えば、本明細書に記載されている、化学療法剤、自食作用阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、または癌、ＧＶＨＤ、もしくは炎症性腸疾患の治療に使用される任意の他の治療剤）が含まれ、そのような相補性または相乗作用は、化学療法剤が存在するが、ＡＤＩｒ−ＰＥＧ組成物が不在であるとき、及び／またはＡＤＩｒ−ＰＥＧが存在するが、化学療法剤が不在であるときに検出され得る効果より大きな（すなわち、適切な対照条件に対して統計的に有意な）、検出可能な効果として現れる。相乗作用及び相補性を測定する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊａｎｕａｒｙ  １５，２０１０  ７０；４４０を参照されたい）。
【０１２７】
本明細書に記載されているＡＤＩｒ及び任意に他の治療剤を含む組成物は、癌を治療する治療方法、及び癌の転移を予防する方法に使用することができる。したがって、本発明は、様々な異なる癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する、または予防する方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、ＧＶＨＤを治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法を提供する。特に、本開示は、患者において癌またはＧＶＨＤを治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、患者に、治療上有効量の本明細書に記載されているＡＤＩｒ組成物を、任意には、特に患者が抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を発生している場合、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０による治療の後に投与し、それによって癌またはＧＶＨＤを治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害することを含む、前記方法を提供する。したがって、本明細書に記載されているＡＤＩｒ組成物を、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、ＧＶＨＤ、または肝細胞癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び再発性の急性骨髄性白血病）、転移性黒色腫を含む黒色腫、肉腫（転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない）、膵癌、前立腺癌（ホルモン不応性前立腺癌などであるが、これに限定されない）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腺癌が含まれるが、これに限定されない）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（腎細胞癌が含まれるが、これに限定されない）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮癌、舌の癌が含まれるが、これらに限定されない）、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢癌、胆管癌、ならびに胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）が含まれるが、これらに限定されない癌に罹患している個人に投与することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、本開示は、患者において癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、患者に、本明細書に記載されているＡＤＩｒ及び任意に１つ以上の他の治療剤を含む組成物を投与することを含み、癌がＡＳＳ、ＡＳＬ、またはその両方を欠損している、前記方法を提供する。この点において、ＡＳＳまたはＡＳＬの欠損は、ｍＲＮＡ発現もしくはタンパク質発現により測定される発現の低減であり得、またはタンパク質活性の低減であり得、一般に、発現または活性に統計的に有意な低減を含み、当業者により決定される。低減されたＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性は、癌がないことが知られている適切な対照試料における発現または活性と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれを超える低減であり得る。ある特定の実施形態において、ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性は、非癌対照試料における発現または活性と比較して少なくとも２倍低減されている。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、ＡＳＳまたはＡＳＬの低減された発現または活性は、ＡＳＳもしくはＡＳＬ助長剤のメチル化、またはＡＳＳもしくはＡＳＬ助長剤の阻害によってもたらされる。別の実施形態において、ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性の低減は、ＤＮＡ突然変異（例えば、１つ以上の点突然変異、小さな欠失、挿入など）、または遺伝子の欠失による染色体異常によってもたらされる。１つの実施形態において、癌は、ＡＳＳまたはＡＳＬ陰性であり、これは観察される発現または活性がないことを意味する。
【０１３０】
ＡＳＳまたはＡＳＬの発現または活性の低減は、定量的ＰＣＲ、免疫組織化学、酵素活性アッセイ（例えば、シトルリンからアルギニノコハク酸への変換、またはアルギニノコハク酸からアルギニン及びフマル酸への変換を測定するアッセイ）などであるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して測定することができる。
【０１３１】
したがって、本発明は、患者において癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、患者に、本明細書に記載されているＡＤＩｒ組成物を含む組成物を投与することを含み、癌が、ＡＳＳもしくはＡＳＬ、またはその両方の低減された発現または活性を示し、癌には、肝細胞癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び再発性の急性骨髄性白血病）、転移性黒色腫を含む黒色腫、肉腫（転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない）、膵癌、前立腺癌（ホルモン不応性前立腺癌などであるが、これに限定されない）、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腺癌が含まれるが、これに限定されない）、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌（腎細胞癌が含まれるが、これに限定されない）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮癌、舌の癌が含まれるが、これらに限定されない）、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢癌、胆管癌、ならびに胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）が含まれるが、これらに限定されない、前記方法を提供する。
【０１３２】
文献における様々な研究が、以下の腫瘍においてＡＳＳが欠損していることを示している。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、神経膠芽腫、ＨＣＣ、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、肉腫、及び小細胞肺癌。したがって、これらのＡＳＳ欠損癌の治療には、ＡＤＩｒ−ＰＥＧを単独で用いる、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０による最初の治療を含む他の治療との組み合わせを用いることが、本明細書において特定的に考慮される。
【０１３３】
本発明は、患者において、癌を治療する、その症状を寛解させる、またはその進行を阻害する方法であって、患者に、本明細書に記載されているＡＤＩｒ（例えばＡＤＩｒ−ＰＥＧ、特にＡＤＩｒ−ＰＥＧ２０）を自食作用阻害剤と組み合わせて含む組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、患者において癌を治療する方法であって、治療上有効量の、本明細書に記載されているＡＤＩｒを自食作用阻害剤と組み合わせて含む組成物を投与することを含み、癌が膵癌または小細胞肺癌である、前記方法を提供する。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているＡＤＩｒを含む組成物の投与が、血漿中のアルギニンを少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、またはそれ以上にわたって枯渇させる治療の方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているＡＤＩｒを含む組成物の投与が、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の検出後のＡＤＩ−ＰＥＧ２０による治療を終了した後、血漿中のアルギニンを少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、またはそれ以上にわたって枯渇させる治療の方法を提供する。
【実施例】
【０１３５】
実施例１
患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低い交差反応性を有するＡＤＩ酵素のスクリーニング及び選択
この実施例は、患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体との低い交差反応性を有するＡＤＩ酵素のスクリーニング及び選択を記載する。
【０１３６】
多数のＡＤＩ酵素から、表１は、Ｍ．ホミニスのＡＤＩに対する配列同一性率により選択された２４個のＡＤＩ酵素を列挙する。文献によると、Ｍ．ホミニス、Ｍ．アルギニニ、及びＭ．アルスリチジスのＡＤＩアミノ酸配列は、密接に関係しており、これらの酵素は良好な触媒特性を有する。更に最近では、これら３つと密接に関係する配列を有する、追加のＡＤＩ酵素が発見されている。より遠縁のマイコプラズマＡＤＩ酵素が識別されているが、これらについてあまり良く知られていない。細菌及び他の源からの更により遠縁のＡＤＩ酵素が存在する。
【表１−１】
0006382934.tif 000002
【表１−２】
0006382934.tif 000003
【０１３７】
公共のデータベースにより入手可能な幾つかのタンパク質配列は、完全長ＡＤＩ配列ではないことがある。これらの場合、公的に入手可能な配列を、必要であれば延長して、既知のＡＤＩ配列に基づいて完全長ＡＤＩを作製した。ある特定の場合では、ＡＤＩタンパク質の他の場所を修飾した（例えば、Ｃ２５１Ｓの置換）。これらの合成されたＡＤＩ配列は、配列番号２６〜３２に提供されており、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｃ２５１Ｓ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｃ２５１Ｓ）、マイコプラズマ・ホシセレブラル、マイコプラズマ・ガテア、マイコプラズマ・ホシダ、Ｈ・オレニイ、及びマイコバクテリウム・ボビスの延長及び／または修飾されたＡＤＩ配列に対応する。
【０１３８】
様々な生物からの多数のＡＤＩ酵素を特徴決定して、どの酵素が、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の存在下であっても、患者の血中に低濃度のアルギニンを除去または維持すると予想されるかを決定した。表２（下記）は、表１からの研究されたＡＤＩ酵素の選択されたサブセットを列挙する。下記に詳述されるように、これらの研究のデータは、Ｍ．ホミニスに密接に関係する多数の種からのＡＤＩが、配列同一性に基づいて、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体と十分に良好な酵素触媒特性及び低減された交差反応性を有することを示す。
【０１３９】
ＡＤＩの調製。組み換えＡＤＩ酵素を、例えば、Ｇａｌｌｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，７（１０）：ｅ４７８８６，２０１２、Ｍｏｎｓｔａｄｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｄｏｒｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３：７３９−７４５，１９９０、Ｊｏｏ  Ｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ．１３：１３７−１４３，２００２、及びＳｕｇｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．５８：２５１０−２５１５，１９９０に記載されている標準的なプロトコールによる試験のため、クローン化、発現、及び精製した。
【０１４０】
ヒト抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の精製。抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体を、臨床研究の際に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０を受けた患者の血漿試料から精製した。合計６０ｍｌの血漿を、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定して、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０に対して高い力価（力価＞／＝４）に達した８人の異なる患者からプールした。プロテイン「Ａ」クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続くＡＤＩアフィニティークロマトグラフィーの、２ステップ精製を使用した。約２０ｍｇの精製抗体を得て、必要になるまで−８０℃でアリコートに保存した。
【０１４１】
ＡＤＩ  酵素アッセイ。アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）は、Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリン及びアンモニアへの変換を触媒する。Ｌ−シトルリンの量を、比色終点アッセイ（例えば、Ｋｎｉｐｐ  ａｎｄ  Ｖａｓａｋ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８６：２５７−２６４，２０００を参照されたい）により検出し、Ｌ−シトルリンの既知の量の標準曲線と比較して、タンパク質のＩＵ／ｍｇと表されるＡＤＩの特定の活性を計算することができる。１ＩＵの酵素活性は、試験されるｐＨ及び温度において、１分あたり１μｍｏｌのシトルリンを産生する酵素の量と定義される。標準アッセイ条件は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の生理学的ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨＢ）（Ｌａｎｇ  ａｎｄ  Ｚａｎｄｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．３７：５６３−５７１，１９９９）＋０．１％のＢＳＡにおいて、３７℃で実施した。全ての試料及び基準を、条件が許す場合には二重または三重に実施した。
【０１４２】
Ｋｍ及びＫｃａｔ値は、上記に記載された活性アッセイの変数を使用して決定した。活性アッセイでは、全ての反応はＰＨＢ＋０．１％ＢＳＡ中において３７℃で実施した。酵素濃度、反応時間、及び基質濃度範囲は、活性の差を考慮して、それぞれのＡＤＩまたはＡＤＩｒ構築物において調整した。一般に、２ｎＭの酵素、５分間の反応時間、及び０〜１６０μＭのアルギニンを、出発条件として使用した。条件を最適化する場合、消費される基質の量に対し、反応に添加される全ての基質の率として特に注意を払った。検出の下限は１μＭのシトルリンであり、定量化の下限は、２μＭである。シトルリン標準曲線を、プレート毎に実施し、酵素反応により産生されたシトルリンの定量化に使用した。
【０１４３】
活性アッセイも実施して、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０の存在下での酵素活性を評価した（抗体中和プロファイル）。これらのアッセイを、８００ｎＭ、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、及び０ｎＭの抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の存在下で、上記に記載されたように実施した。
【０１４４】
計算。それぞれの反応ウエルで産生されたシトルリン濃度（μＭ）を、シトルリン標準曲線を使用して計算及び平均した。次にそれぞれの反応の速度を、μＭ／分／５０ｎＭのＡＤＩにより計算した。特定の活性（ＩＵ／ｍｇまたはμｍｏｌの生成物／分／ｍｇのＡＤＩ）を、この値に「ＩＵ」因数を掛けて計算した（ＩＵ因数は、ＡＤＩの分子量及び反応体積から計算した）。結果を下記の表２にまとめる。
【表２−１】
0006382934.tif 000004
【表２−２】
0006382934.tif 000005
【０１４５】
これらのデータは、Ｍ．ホミニスのＡＤＩに対して高い相同性（約５０〜１００パーセントの同一性）があるＡＤＩ酵素が、優れた触媒活性を維持したことを示す。これらは、また、抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体の存在下の酵素活性により測定すると、例えばマイコプラズマ・ホミニスと比べて低減された親和性を患者の抗ＡＤＩ−ＰＥＧ２０抗体に示した。したがって、これらのＡＤＩ酵素は、アルギニン枯渇療法の有効性を延長及び／または増加する癌治療の療法における、単独での、またはＡＤＩ−ＰＥＧ２０治療後の使用に治療有用性を有し得る。
【０１４６】
上記に記載された様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本出願において参照されている、及び／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、及び非特許出版物は、全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様を、様々な特許、出願、及び公開公報の概念を用いる必要があれば、改変して、なおも更なる実施形態を提供することができる。
【０１４７】
これら及び他の変化を、上記の詳細な記載を考慮して、実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定すると解釈するべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲を伴って、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により制限されない。
【配列表】
0006382934000001.app