(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉの化合物：
【化１】
0006365999.tif 000016
又はその薬学的に許容可能な塩であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０は同一、又は異なっており、独立して−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＨ３、−ＣＨ２、−ＮＨ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｈ、置換又は非置換一級、二級又は三級アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アルケニル基、置換又は非置換アルキニル基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換ヘテロシクリルアルキル基、置換又は非置換アルコキシアルキル基、置換又は非置換アリールオキシアルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリルオキシアルキル基から選択され；ＸはＣＨ又はＮである
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
化合物が式ＩＩの化合物：
【化２】
0006365999.tif 000017
であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
化合物が式ＩＩＩの化合物：
【化３】
0006365999.tif 000018
であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
化合物が式ＩＶの化合物：
【化４】
0006365999.tif 000019
であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
治療有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１種の追加の治療活性的薬剤を含むことを特徴とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌の予防又は治療用薬物を製造するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
悪性腫瘍の発生は、細胞の過剰な増殖、及び栄養供給を介する腫瘍内血管の形成（血管新生）に基づくことが分かっている（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ；３３９，５８（１９８９年））（非特許文献１）。新血管は既存の内皮から形成され、腫瘍の増殖及び転移、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生緑内障、血管腫、移植角膜及び他の組織の免疫拒絶、ならびに慢性炎症などの多くの疾患及び障害の重要な要素である。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞及び内皮細胞の増殖は自然に直接発生する様々な因子により引き起こすことが可能である。これらの因子は、腫瘍、内皮細胞及び他の細胞の表面上の受容体に結合し、受容体を活性化し、その後の分裂を伴う細胞内シグナルを誘導する。
【０００３】
十分なデータによると、線維芽細胞増殖因子由来の受容体（ＦＧＦＲ）は腫瘍細胞上に発現することが多く、これは腫瘍自体の細胞及び内皮細胞を増殖させ、腫瘍の進行を促進する。高頻度に変異を活性化するＦＧＦＲはまた、疾患の進行及び投与療法への感受性を変化させる。
【０００４】
ＦＧＦＲファミリーは、多様な細胞の血管新生、遊走、増殖、分化及び生存率などの生理学的過程に関与する。
【０００５】
ファミリーには１８因子あり、条件に応じて２群：従来型（ＦＧＦ１〜１０、１６〜１８及び２０）及びホルモン様型（ＦＧＦ１９、２１及び２３）に分けられる［Ｂｅｅｎｋｅｎら、２００９年］。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、５タイプで表されるＦＧＦＲに特異的に結合する。ＦＧＦＲタイプ１〜４は、チロシンキナーゼ活性を有する標準的な受容体であり、すなわち細胞内部分はチロシンキナーゼによって表される。チロシンキナーゼ活性化プロセス及び更なる細胞内シグナル伝達は、これらのような受容体全てに固有のリン酸化プロセスに基づいている。ＦＧＦＲの細胞外部分は、３つの免疫グロブリン様ドメインから成り；ＩＩ及びＩＩＩドメインはリガンド結合領域を含む。選択的スプライシングにより、ドメインＩＩＩの形状は変化し、２つの状態−ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃとなる。これはリガンドとの結合の強さ及び受容体を狙った治療薬の活性に影響し得る ［Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒら、２００５年；Ｂｒｏｏｋｓら、２０１２年］。更に、ＦＧＦがドメインＩＩＩｃ−１α又は１βの多様なサブユニットと結合したときの腫瘍細胞の様々な増殖活性に関する情報が存在する［Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１０年］。
【０００６】
ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質の群に関連する。シグナルを細胞に伝達し、細胞内プロセスを活性化するために、ＦＧＦは細胞表面上の受容体及びヘパラン硫酸（ヘパリン）と結合する必要がある［Ａｂｕｈａｒｂｅｉｄ ら、２００６年］。これにより、ＦＧＦ受容体活性化機序は、他の因子、特にヘパリン硫酸が不要なＶＥＧＦと異なるものになっている。
【０００７】
ホルモン様ＦＧＦはヘパリン硫酸との親和性が低い。ＦＧＦが受容体に結合すると、主要な細胞内経路ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲは、シグナルがコアに伝播することにより活性化する［Ｔｕｒｎｅｒら、２０１０年］。ＦＧＦＲから細胞内キナーゼへのシグナル伝達の主な要素は、ＦＲＳ２タンパク質である［Ｏｎｇら、２０００年；Ｋｏｕｈａｒａら、１９９７年］。ＦＲＳ２は、ＦＧＦＲがリガンドと結合するときに活性化してＳｈｐ２及びＧｒｂ２との複合体を形成する「ドッキングタンパク質」であり、これによりＦＲＳ２の活性化が両シグナル経路ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲの活性化を誘発する。
【０００８】
現在、様々なＦＧＦＲタイプの活性を遮断／阻害する標的医薬が多数作られている。これらにはチロシンキナーゼの阻害剤や、更にモノクローナル抗体が挙げられる。チロシンキナーゼの既存の阻害剤は細胞内チロシンキナーゼの様々な活性部位、又は典型的にはいくつかの受容体を遮断することで細胞内チロシンキナーゼの活性を低下させる。非選択的遮断には、腫瘍細胞、血管細胞、及び関連するタイプの受容体を発現する他の構造物に対する効果の有効性の低下が伴う。ＦＧＦ受容体のドメインＩＩＩが形状変化すれば（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲに対する治療用モノクローナル抗体の有効性はかなり低下し得ることが知られている［Ｗｅｓｃｈｅら、２０１１年；Ｔｓｉｍａｆｅｙｅｕら、２０１２年］。ＦＧＦＲが多様なアイソフォームで細胞上に存在する場合に同じことが起こる［Ｄｉｅｎｓｔｍａｎｎら、２０１３年］。チロシンキナーゼの既存の低分子阻害剤は１種のＦＧＦ受容体に選択的作用を示さず、数種のＦＧＦ、更に他の受容体を遮断する。従ってブリバニブ、ドバチニブ（ｄｏｖａｔｉｎｉｂ）は、ＦＧＦＲ及び血管内皮の増殖因子の受容体を阻害し［Ａｙｅｒｓら、２００７年；Ｓａｒｋｅｒら、２００８年］、ポナチニブ、ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ＢＡＹ１１６３８７７は数種のＦＧＦＲを阻害し、また程度は低いが血管内皮の増殖因子受容体及びいくつかの他のキナーゼも阻害する［Ｇｏｚｇｉｔら、２０１２年；Ａｒａｉら、２０１４年；Ｇａｖｉｎｅら、２０１２年；Ｐｅｒｅｒａら、２０１４年；Ｈｅｒｏｕｌｔら、２０１４年］。その上、特定の腫瘍の細胞はそのＦＧＦＲ型（例えば、腎臓癌−ＦＧＦＲ１［Ｔｓｉｍａｆｅｙｅｕら、２０１１年］、管腔型の乳癌−ＦＧＦＲ１［Ｔｅｎｈａｇｅｎら、２０１２年］、三種陰性乳癌−ＦＧＦＲ２［Ｔａｎｎｈｅｉｍｅｒら、２０００年］、胃癌−ＦＧＦＲ２［Ｘｉｅら、２０１３年］、膀胱癌−ＦＧＦＲ３ ［Ｇｕｓｔら、２０１３年］等）を発現することが示されている。従って、数種のＦＧＦＲを同時に遮断することは不要であり、毒性増加のみならず効率低下につながる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３７７３９１９号明細書
【特許文献２】米国特許第４４８５０４５号明細書
【特許文献３】米国特許第４５４４５４５号明細書
【特許文献４】米国特許第５０１３５５６号明細書
【特許文献５】ロシア連邦特許第２２８７５７８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ；３３９，５８（１９８９年）
【非特許文献２】Ｌａｎｇｅｒら（Ｊ。Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５，１６７（１９８１年））
【非特許文献３】Ｌａｎｇｅｒ（Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２（１９８２年））
【非特許文献４】Ｓｉｄｍａｎら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２，５４７（１９８３年））
【非特許文献５】Ｅｐｓｔｅｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，３６８８（１９８５年））
【非特許文献６】Ｈｕａｇら（Ｐｒｏｃｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７，４０３０（１９８０年））
【非特許文献７】Ｈ．Ｈｏｄｇｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｃｕｔｅ  Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．Ｅｄ．ＩＶ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９７５年，４２７ｐ．；Ｋ．Ｋ．Ｓｉｄｏｒｏｖ，１９７７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多くの研究から、ナノ分子濃度のチロシンキナーゼの既存の低分子阻害剤はＦＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼの活性を抑制するが、ＦＲＳ２のリン酸化（活性）にはほとんど影響しないことが示されている。言い換えれば、ＦＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼの活性が抑制されている場合でさえ、ＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用は重要であると考えられ、その欠如は耐性の要因になる可能性がある。従って、例えばＦＲＳ２に対するブリバニブの作用に関する情報はない（Ｈｕｙｎｈら、２００８年）；ドビチニブはナノ分子濃度でＦＧＦＲ１／３のリン酸化に影響し、程度は低いがＦＲＳ２の活性を抑制する（Ｚｈａｎｇら、２０１４年）；ポナチビブ（ｐｏｎａｔｉｂｉｂ）はＦＧＦＲの最も選択的な阻害剤として、３〜１８ｎｍｏｌ／ｌの範囲内のＩＣ５０でＦＧＦＲのリン酸化を阻害し、また、３３〜４０ｎｍｏｌ／ｌの範囲内でのみＦＲＳ２を阻害する（Ｇｏｚｇｉｔら、２０１２年）；高選択性阻害剤ＡＺＤ４５４７は２ｎｍｏｌ／ｌの範囲内のＩＣ５０でＦＧＦＲ２の活性を抑制することにより、１００ｎｍｏｌ／ｌの濃度を使用した場合にＦＲＳ２の活性を抑制する（Ｇａｖｉｎｅら、２０１２年）。これは、既存の阻害剤がＦＲＳ２に対して弱い間接的阻害効果を有し、更にＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用には干渉しないことを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は作用機序が上記事項全てを含む阻害剤を記載する：
１）結果としてリン酸化の減少及びＦＲＳ２による活性の低下が起こり、また場合により、必ずある訳ではないがＦＲＳ２複合体の他の成分との相互作用が破壊される、ＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用への干渉。
２）ＦＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼ及び受容体自体のリン酸化に対する影響の欠如。
３）チロシンキナーゼ活性を有する他の受容体の細胞内チロシンキナーゼに対する効果及びそのリン酸化に対する効果の欠如。
４）ＦＧＦＲの活性中心及び他の受容体の活性中心との結合の欠如。
５）主に１種のＦＧＦＲ、場合によっては数種のＦＧＦＲとのＦＲＳ２の相互作用への選択的干渉。
【００１３】
また、阻害剤により判定された発現毒性の不在は選択的作用の結果であると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＦＧＦ−２はＦＧＦＲ２を介して胃癌細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩのシグナル経路を刺激することを示すグラフである。
【図２】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はＦＲＳ２のリン酸化を有意に減少させることを示すグラフである。
【図３】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はＦＧＦ−２刺激の有無に関わらず、一般的なＦＧＦＲのリン酸化に対する影響を示さないことを示すグラフである。
【図４】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はＦＧＦＲ２のチロシンキナーゼ活性を抑制しないことを示す写真である。
【図５】ヘパリンの存在下又は非存在下のＦＧＦ−２とＦＧＦＲ２−Ｆｃｉｎとの結合を示すグラフである。
【図６】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はＦＧＦ−２とＦＧＦＲ２−Ｆｃ又は抗ＦＧＦ−２抗体との結合に影響しないことを示すグラフである。
【図７】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はｐ４４／４２（ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６のような細胞内キナーゼのリン酸化に影響しないことを示すグラフである。
【図８】式ＶＩＩＩで説明される阻害剤を様々な濃度で用いたＦＧＦＲ１のリン酸化を示す写真である。
【図９】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）はＦＧＦ−２刺激の有無に関わらずＦＲＳ２α（Ａ）、一般的なＦＧＦＲ１、細胞内キナーゼ（Ｂ）のリン酸化に影響しないことを示す写真である。
【図１０】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）を用いた培養時の、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃを発現する細胞の増殖を示すグラフである。
【図１１】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃを発現する細胞株においてＦＲＳ２αの有意なリン酸化の減少をもたらすことを示す写真である。
【図１２】マトリゲルインプラントの血管新生活性に対するベバクジマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）及び阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）の影響を示す写真である。
【図１３】マトリゲルインプラントの血管新生活性に対するベバクジマブ及び阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）の影響を示すグラフである。
【図１４】チロシンキナーゼ−ブリバニブの典型的阻害剤と比較した、本発明に記載の阻害剤を添加した内皮細胞ＨＵＶＥＣの増殖抑制を示すグラフである。
【図１５】インビトロでの阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）による腫瘍及び内皮細胞の増殖活性の阻害を示すグラフである。
【図１６】インビボでの阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）を用いた三種陰性乳癌ＳＵＭ５２ＰＥの腫瘍増殖阻害を示すグラフである。
【図１７】インビボでの阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）を用いた三種陰性乳癌ＨＳ５７８Ｔの腫瘍増殖阻害を示すグラフである。
【図１８】ＦＧＦＲ２を発現しない非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６のモデルにおけるインビボでの阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図１９】対照群の卵巣腫瘍ＳＫＯＶ−３の組織における病変形態の欠如を示す写真である。
【図２０】阻害剤ＲＰＴ８３５（本発明の式ＩＩ）の治療群における卵巣腫瘍ＳＫＯＶ−３の組織における顕著な治療病変形態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に記載された阻害剤はＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用に干渉し、ＦＲＳ２タンパク質にかなり影響を与え、その活性は低下する（実施例１）。記載された阻害剤の作用機序における最も重要なことは、一般的なＦＧＦＲ及びチロシンキナーゼに代表される受容体の細胞内部分の活性に対する影響の欠如、ならびにチロシンキナーゼ活性を有する他の受容体の活性に対する影響の欠如である（実施例２）。このことは阻害剤の高度に選択的な作用を特徴づけ、受容体のキナーゼ活性及び他の機序の遮断を必要とせずにＦＧＦＲ−ＦＲＳ２の相互作用を破壊できることの重要性を際立たせている。記載の阻害剤はＦＧＦＲの活性中心と相互作用せず、ＦＧＦＲとリガンドとの結合に干渉しないということに注目することは重要である（実施例３）。
【００１６】
受容体から細胞内細胞へのシグナルの主要な伝導体であるＦＲＳ２の活性低下は、細胞内のシグナル伝達の抑制につながる。その上、記載の阻害剤は、ＦＧＦＲとＦＲＳ２の相互作用に関してのみその選択的作用を特徴付けるシグナル経路ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲの他の要素に直ちに影響を与えるものでもない（実施例４、５）。数種の記載の阻害剤では、シグナル経路の１種又は数種の要素に対する作用は除外できない（実施例６）。
【００１７】
しかし、このことはシグナル経路要素構造物に対する独立した影響、及びＦＧＦＲ−ＦＲＳ２遮断の結果の両方である可能性がある。また、記載の阻害剤はＦＲＳ２とＳｈｐ２及び／又はＧｒｂ２との複合体に干渉することが可能であり、このことは効果の促進につながり得るが必然的なものではなく、シグナル伝達を制限する際の主要事項はＦＧＦＲ−ＦＲＳ２相互作用の遮断である（実施例７）。記載の阻害剤は、ＦＧＦＲ２について実施例８に記載されているような１種のＦＧＦＲタイプのみ、又は数種のＦＧＦＲを阻害する可能性がある（実施例６）。ほとんどの場合、特定のＦＧＦＲタイプのアイソフォームに対する阻害剤活性の依存性を排除する必要がある（実施例９）。
【００１８】
ＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用へのこのような選択的干渉により、記載の阻害剤の目的の治療効果、例えば、内皮細胞遊走の増殖の抑制、血管の管状構造物の形成、成熟血管の成長（実施例１０及び１１）、腫瘍細胞増殖の抑制（実施例１２）、腫瘍増殖の原則（実施例１３）、腫瘍における壊死の発生（実施例１４）、他の疾患の発症の減速（実施例１５）がもたらされる。記載された阻害剤の選択的効果があり、他の標的への効果がなければ、明らかに毒性の低下がもたらされ、このことは治療剤使用において極めて重要である（実施例１６）。
【００１９】
本発明の主な目的は、上記の性質によって線維芽細胞増殖因子受容体とＦＲＳ２との相互作用、及びＦＲＳ２複合体の他の要素との相互作用を選択的に干渉する阻害剤の使用である。２型のＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用に干渉するこのような阻害剤の例には、化学式Ｉで定義される物質を挙げることが可能である。
【００２０】
【化１】
0006365999.tif 000002
【００２１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０は類似していても異なっていることも可能であり、独立して基−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｈ、置換又は非置換一級、二級及び三級アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アルケニル基、置換又は非置換アルキニル基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換ヘテロシクリルアルキル基、置換又は非置換アルコキシアルキル基、置換又は非置換アリールオキシアルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリルオキシアル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｏｘｉａｌ）基が挙げられる。ＸはＣＨ１Ｎ又はＣＨ又はＮで表してもよい。
【００２２】
線維芽細胞増殖因子受容体と一般式Ｉで表されるＦＲＳ２との相互作用に選択的に干渉する阻害剤の例として、本発明では、式ＩＩにより示され、３−（Ｎ−（４−メチル−２−ニトロ−５−（ピリジン−３−イル）フェニル）スルファモイル）安息香酸に関連する化学物質ＲＰＴ８３５を提供することが可能である。
【００２３】
【化２】
0006365999.tif 000003
【００２４】
その上、類似の阻害剤は３−（Ｎ−（４−メチル−２−ニトロ−５−（ピリミジン−５−イル）フェニル）スルファモイル）安息香酸に関連し、式ＩＩＩにより表され：
【００２５】
【化３】
0006365999.tif 000004
【００２６】
又は、３−（Ｎ−（５−（フラン−３−イル）−４−メチル−２−ニトロフェニル）スルファモイル）安息香酸に関連し、式ＩＶにより表され：
【００２７】
【化４】
0006365999.tif 000005
【００２８】
３−（Ｎ−（２−アミノ−４−メチル−５−（ピリミジン−５−イル）フェニル）スルファモイル）安息香酸に関連し、式Ｖにより説明することが可能である。
【００２９】
【化５】
0006365999.tif 000006
【００３０】
更に、本発明に記載の阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖから選択するいくつかの成分を組み合わせることが可能である。よって、そのような複合物質の化学式は、例えば、下記のようなものとなり得る（式ＶＩ）。
【００３１】
【化６】
0006365999.tif 000007
【００３２】
線維芽細胞増殖因子受容体とＦＲＳ２との相互作用に干渉する阻害剤は、式ＶＩＩにより説明される物質のクラスであればどのようなクラスからでも選択することが可能である。
【００３３】
【化７】
0006365999.tif 000008
【００３４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は類似していても異なっていることも可能であり、独立して基−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｈ、置換又は非置換一級、二級及び三級アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アルケニル基、置換又は非置換アルキニル基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換ヘテロシクリルアルキル基、置換又は非置換アルコキシアルキル基、置換又は非置換アリールオキシアルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリルオキシアル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｏｘｉａｌ）基が挙げられる。
【００３５】
式ＶＩＩに従ったクラスに関する化学物質の最も簡単な例としては、３−（３−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン−１−カルボニル）安息香酸（式ＶＩＩＩ）及び３−（２−メチル−３−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン−１−カルボニル）安息香酸（式ＩＸ）が挙げられる。
【００３６】
【化８】
0006365999.tif 000009
【００３７】
【化９】
0006365999.tif 000010
【００３８】
線維芽細胞増殖因子受容体とＦＲＳ２との相互作用に干渉する阻害剤は、式Ｘにより説明される物質のクラスであればどのようなクラスからでも選択することが可能である。
【００３９】
【化１０】
0006365999.tif 000011
【００４０】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１は類似していても異なっていることも可能であり、独立して基−ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｈ、置換又は非置換一級、二級及び三級アルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アルケニル基、置換又は非置換アルキニル基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換ヘテロシクリルアルキル基、置換又は非置換アルコキシアルキル基、置換又は非置換アリールオキシアルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリルオキシアル基が挙げられる。
【００４１】
このクラスに関する化学物質の最も簡単な例としては、式ＸＩを含む３−（キノリン−５−イルアミン）安息香酸が挙げられる。
【００４２】
【化１１】
0006365999.tif 000012
【００４３】
また、阻害剤には式Ｉ〜ＸＩに記載の構造物全てが挙げられ、複合物質を表すことが可能である。
【００４４】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩによる化学物質は、薬学的に許容される塩、互変異性体、薬学的に許容される互変異性体塩、及びこれらの組合せで表すことが可能である。
【００４５】
阻害剤の治療用途
本発明に記載の阻害剤を使用するため、治療の実施の際、阻害剤は静脈内注射などの薬学的に許容される形態で、以下の方式：経口、筋肉内、皮下、腹腔内、脳脊髄内、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、局所、又は吸入によって哺乳動物、好ましくはヒトに投与する必要がある。阻害剤はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内及び病変周囲経路により投与し、全身の治療効果と共に局所効果を確実にすることが可能である。
【００４６】
このような投与法には、その性質上、毒性作用も治療作用も持たない薬学的に許容される担体が挙げられる。本発明に記載の阻害剤に基づいて薬剤を調製するために使用する補助剤は、剤形の物理的及び化学的特性及び薬物動態への影響に依存して、以下の群に分けることが可能である：
・  成形
・  安定化
・  維持長期化
・  可溶化
・  修正。
【００４７】
担体を使用することが可能である。このような担体の例には、イオン交換物質、硫酸アルミニウムカリウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血漿タンパク質など）、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、ならびに硫酸プロタミン、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース質の物質及びポリエチレングリコールなどの塩又は電解質が挙げられる。
【００４８】
拮抗剤用の局所又はゲルベース形態の担体には、カルボキシメチルセルロース又はメチルセルロースのナトリウム塩などの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックのポリマー、ポリエチレングリコール及びアルコールが挙げられる。全ての場合において、投与には、卸売業者から入手する通常の剤形を使用する。そのような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、バンドエイド、吸入薬、エアロゾル、舌下錠、及び物質を一定放出させる薬物が挙げられる。
【００４９】
物質を一定放出させる薬物のいくつかの好適な例には、阻害剤を含む固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスが挙げられ；そのようなマトリックスは特定の形態を有し、例えばフィルム又はマイクロカプセルとすることが可能である。一定放出させるマトリックスの例には、ポリエーテル、Ｌａｎｇｅｒら（Ｊ。Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５，１６７（１９８１年））（非特許文献２）及びＬａｎｇｅｒ（Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２（１９８２年））（非特許文献３）に記載されたハイドロゲル［例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）］、又はポリ（ビニアルコール（ｖｉｎｙａｌｃｏｈｏｌ））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）（特許文献１）、Ｓｉｄｍａｎら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２，５４７（１９８３年））（非特許文献４）に記載されたＬ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、上記を参照）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸、グリコール酸及び酢酸ロイプロリドのポリマーから成る注入ミクロスフェア）などの乳酸とグリコール酸との崩壊性共重合体、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチレ（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｉｒｅ）酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートや乳酸とグリコール酸との共重合体などのポリマーは１００日以上、分子を一定に放出させることが可能であるが、特定のハイドロゲルは比較的短い期間でタンパク質を放出する。安定化の目的で、作用機序に基づいて合理的な戦略を展開することが可能である。例えば、ジオジスルフィド（ｄｉｏｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）交換に起因する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成において発現した凝集機序が見られれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液除去のための凍結乾燥、湿度制御、適当な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス溶液の開発により安定化が達成できる。
【００５０】
阻害剤を一定放出させる化合物ではリポソームへの封入もある。阻害剤を含むリポソームはこの分野で公知の方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，３６８８（１９８５年））（非特許文献５）；Ｈｕａｇら（Ｐｒｏｃｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７，４０３０（１９８０年））（非特許文献６）；米国特許第４４８５０４５号（特許文献２）、及び米国特許第４５４４５４５号（特許文献３）に記載の方法により得られる。通常、リポソームは小型で（約２００〜８００オングストローム）、脂質の含有量はコレステロールの３０モル％より高い単層型に属し；選択された比率は最適な治療条件を選択するために変更することが可能である。循環期間の長いリポソームは米国特許第５０１３５５６号（特許文献４）で取り上げられている。
【００５１】
本発明を使用する別の方法としては、特定の形態を有する物品へ阻害剤を組み込むことが挙げられる。このような物品は内皮細胞増殖及び血管新生の調節に使用することが可能である。その上、このような製品は、腫瘍及び転移侵襲の調節に使用することが可能である。
【００５２】
記載の阻害剤と別の治療剤との併用が可能である。記載された阻害剤は、治療作用の増強のために、他の治療活性的及び／又は補助的な薬剤と組み合わせて多様な様式で使用し、副作用及び望ましくない事象の頻度を減少させることも可能である。
【００５３】
疾患の予防及び治療時における記載の阻害剤の必要量は、疾患のタイプ、その重篤度及び進行度、阻害剤が注入されるのは予防目的であるか治療目的であるか、治療歴、患者の症例記録、及び阻害剤に対する患者の反応、ならびに主治医の指示に依存する。阻害剤指示が出されたときに履行されている有効性の標準的基準により阻害剤療法が有効であると考えられる時期に、阻害剤は様々な方法で、同時に、又は一連の指示事項として患者に投与することが可能である。
【００５４】
本発明に記載の阻害剤は、様々な腫瘍性及び非腫瘍性の疾患及び障害の治療に使用可能である。このような治療に反応する腫瘍及びそれに近い状態には、例えば乳癌、非小細胞及び小細胞肺癌、気管腫瘍、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢及び胆道腫瘍、胃腸腫瘍、卵巣癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮内膜過形成、子宮内膜症、肉腫、頭部及び頸部癌、肝芽腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、副腎癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経鞘腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、ルブディオ芽腫（ｒｈｂｄｙｏｂｌａｓｔｏｍａ）、平滑筋肉腫、腎細胞癌、膀胱癌及び尿路上皮癌、陰茎癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍、生殖細胞腫瘍、神経内分泌腫瘍、未確認原発部位の腫瘍、白血病及びリンパ腫、母斑症に関連する異常な血管増殖が挙げられる。
【００５５】
リウマチ性疾患、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、呼吸器系の疾患、消化器系の疾患、糸球体腎炎などの腎疾患、乾癬などの皮膚疾患、糖尿病性及び他の網膜症、線維増殖、新脈管緑内障、内分泌疾患及び代謝疾患、角膜及び他の組織の移植、慢性炎症、腹水、子癇前症、心膜液貯留（例えば、心膜炎に関連する）及び胸水、神経学的疾患などの、治療に応答性のある非癌疾患に、記載の阻害剤を使用する可能性がある。
【００５６】
疾患のタイプ及びその重篤度に応じて、患者に投与する初期投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであり、一回又は複数回の別々の処方／投与、又は持続輸注により導入することが可能である。通常の一日量は、上述の因子に応じて約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間及びそれ以上で変更可能である。数日間以内、及びそれ以上長く処方を繰り返すために、条件に応じて、病状が望ましく抑制されるまで治療を繰り返す。しかし、他の投与様式を利用することが可能である。治療の成功は通常の方法及び分析、例えば腫瘍のＸ線可視化方法により判断する。
【００５７】
本発明の使用に従えば、疾患の予防又は治療における阻害剤の有効性は、この目的に有効な別の物質、例えば、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン；モノクローナル抗体、血管内皮細胞の増殖因子の活性を中和又は阻害することが可能な増殖因子「トラップ」及び他の阻害剤、及び／又はその受容体、及び／又は肝細胞の増殖因子、及び／又はその受容体、及び／又は上皮増殖因子、及び／又はその受容体、及び／又は胎盤増殖因子、及び／又はその受容体、及び／又はインスリン様増殖因子、及び／又はその受容体、及び／又は線維芽細胞増殖因子、及び／又はその受容体、及び／又はｍＴＯＲ、及び／又は他の細胞内キナーゼ、又はアルキル化化合物、抗生物質、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、他の細胞分裂阻害薬などの１種以上の通常の治療薬を阻害剤に続いて、あるいは阻害剤と組み合わせて投与することにより向上させることが可能である。本発明に記載の阻害剤と抗炎症薬、治療薬、心血管病理薬とを組み合わせることも可能である。このような物質は、投与する組成物中に配合することも、又は別々に投与することも可能である。その上、本方法に従った阻害剤は連続的に投与することも、又は放射線治療と組み合わせて投与することも可能である。
【００５８】
適用可能であれば、腫瘍を有する患者に、例えば腫瘍壊死又はその転移病巣の観察で決定される治療有効量で１種以上の阻害剤を投与する。このような治療は、更なる改善が観察されなくなるか、又は臨床検査により腫瘍もしくはその転移の消失が示されるまで継続する。疾患が進行する場合には、１種もしくは数種の上記物質を投与するか、又は他の治療法を利用する。追加物質の有効性が多様であるため、標準的なスクリーニングにより腫瘍に対する追加物質の影響を比較することが望ましい。阻害剤及び更なる薬剤の反復投与は、所望の臨床効果が達成されるまで行う。あるいは、阻害剤（単数又は複数）を、必要に応じて追加物質と組み合わせて導入する。標準的な治療効果評価スケールを利用し、他の疾患、例えばリウマチ性疾患を阻害剤で治療する。
【００５９】
本発明に記載の阻害剤は、担持薬及び添加治療薬、例えば赤血球新生を伴って、白血球新生を刺激するかあるいは血小板及び／又は好中球、マクロファージの数を増加させる薬剤と共に、栄養補助剤、非ステロイド性抗炎症薬、血液成分、コルチコステロイド、ゾレドロン酸、ＲＡＮＫＬに対する抗体、制吐剤等と共に、使用することが可能である。
【００６０】
本発明に記載の阻害剤を使用する合理性に関するいくつかの証拠は、実施例として以下に提供する。以下の実施例は単に例示として提案しており、本発明を限定するものと見なすべきではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１（研究結果）：阻害剤ＲＰＴ８３５を添加した場合のＦＧＦＲ２とＦＲＳ２との相互作用への干渉
式ＩＩにより本発明において特徴付けられたＲＰＴ８３５阻害剤の効果を評価するため、ＦＧＦＲ２を発現する胃癌細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩをＦＲＳ２リン酸化に使用した。ＦＧＦＲを刺激するために、濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び１０ｍｇ／ｍｌのヘパリンを細胞に添加した。ＲＰＴ８３５を様々な濃度で添加した。細胞の一部は阻害剤を添加せずに残し、また細胞の一部は阻害剤又は刺激剤のいずれかを添加せずに残した（対照群）。
【００６２】
ＦＧＦＲ及びＦＲＳ２のリン酸化レベルを評価するための２つの標準的方法：
−手動作業によるウェスタンブロッティング；
−自動システムＷｅｓ（商標）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社；カリフォルニア州、サンタクララ）を用いた自動キャピラリー電気泳動及び免疫検出。
【００６３】
ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞を線維芽細胞増殖因子で刺激すると、非刺激細胞と比較して、ＦＧＦＲ（４．３倍）、ＦＲＳ２α（１１．４倍）、ｐ４４／４２（ＭＡＰＫ、１２倍）及びＡＫＴ（４倍）が有意に活性促進（リン酸化）された。ｍＴＯＲタンパク質及びｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化は比較的低度で観察された（図１）。
【００６４】
阻害剤ＲＰＴ８３５を細胞に添加すると、ＦＧＦＲとＦＲＳ２との間の相互作用への干渉が観察され、阻害剤自体が、ＦＲＳ２のリン酸化をかなり減少させ（図２）、一般的なＦＧＦＲのリン酸化には影響しない（図３）ことが示された。更に、阻害剤ＲＰＴ８３を使用したＦＲＳ２の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は１０ｎＭ未満であった。
【００６５】
得られたデータに基づいて、ＦＧＦは、ＦＧＦＲ及びＦＲＳ２の相互作用を含むＦＧＦ受容体から細胞内キナーゼまでの全シグナル経路を刺激するという結論を下すことができる。阻害剤ＲＰＴ８３５はＦＧＦＲの活性には影響しないが、ＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用に干渉し、その結果、ナノモル濃度でＦＲＳ２の活性の抑制に影響を与える。
【００６６】
実施例２（研究結果）：ＲＰＴ８３５阻害剤はＦＧＦＲのチロシンキナーゼ活性に影響しない。
上記実施例では、ＦＧＦＲのリン酸化に対して阻害剤ＲＰＴ８３５の影響はないことが示された。本研究では、チロシンキナーゼ阻害剤としてのＲＰＴ８３５の作用機序に反論するため、一般的なＦＧＦＲ及び蛍光体−ＦＧＦのレベルをＲＰＴ８３５の添加前後で評価した。
【００６７】
実施例１と同様、ＦＧＦＲ２を強く発現する胃癌細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩを用いた。細胞の一部は濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び１０ｍｇ／ｍｌのヘパリンを刺激した。細胞の他の部分は刺激せずに残した。用量１、１０、１００、１０００ｎＭの阻害剤ＲＰＴ８３５を細胞に添加した。対照群はＲＰＴ８３５を添加せずに残した。
【００６８】
標準的なウエスタンブロッティング、及び免疫検出や自動システムＷｅｓ（商標）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社；カリフォルニア州、サンタクララ）の使用による自動キャピラリー電気泳動を利用してＦＧＦＲリン酸化のレベルを評価した。
【００６９】
阻害剤ＲＰＴ８３５はＦＧＦ−２に刺激されたＦＧＦＲ２のリン酸化には全く影響せず（図４）、すなわち最大濃度でさえもチロシンキナーゼに対して阻害活性を示さなかった。
【００７０】
実施例３（研究結果）：阻害剤ＲＰＴ８３５はＦＧＦ−２とＦＧＦＲ２との結合を阻害しない
ＲＰＴ８３５がＦＧＦＲ２及びリガンド（ＦＧＦ−２）の結合に影響を及ぼすか否かを評価するため、非放射性酵素結合ＦＧＦ２結合アッセイを実施した。ヒト細胞外ドメインＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）及びヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントから成る組換えキメラタンパク質ＦＧＦＲ２−ＦｃをＦＧＦ−２の結合アッセイで使用した。ＦＧＦＲ２αは３つの免疫グロブリン様ドメイン全てを含み、ＦＧＦ−２に対して高い親和性を有するドメインＩＩＩｃ  ＦＧＦＲ２を表していた。ＦＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質で９６穴プレートタブレットを被覆し、次に以下のものを穴に添加した：
１）ＦＧＦ−２のみ
２）ＦＧＦ−２＋ヘパリン
３）様々な濃度の阻害剤ＲＰＴ８３５＋ＦＧＦ−２＋ヘパリン
４）穴の一部は刺激剤（ＦＧＦ−２＋ヘパリン）及びＲＰＴ８３５を添加せずに残した（陰性対照）。
【００７１】
インキュベーション後、対応する抗体を用いて酵素結合免疫測定法を行い、続いてＯＤ６５０（波長６５０ｎｍでの光学濃度）を測定した。
【００７２】
阻害剤及びヘパリンを添加しない第１群では、ＦＧＦ−２は、タンパク質ＦＧＦＲ２−Ｆｃと十分に結合することが示された。ＦＧＦ２と受容体との結合は用量依存的であった。第２群では、ヘパリンの添加はＦＧＦ−２と受容体との結合を改善した。この場合、同一の結合強度を達成するために、ＦＧＦ−２はヘパリンを使用しない場合よりも少ない用量で使用できた。陰性対照群では、シグナルは陰性であった（陽性対照の１％未満）。結果を図５に示す。結果からこの方法の有意性を確認する：ＦＧＦ−２はヘパリンが存在しても存在しなくてもＦＧＦＲ２−Ｆｃと結合する。
【００７３】
次の課題は、ＦＧＦ−２とＦＧＦＲ２−Ｆｃとの結合に対する阻害剤ＲＰＴ８３５の影響を評価することであった。濃度１〜１０００ｎＭのＲＰＴ８３５はリガンドと受容体との結合に影響しなかった（図６Ａ）。結合に対するＲＰＴ８３５の非特異的効果を排除するため、もう１つの酵素結合免疫測定法を行い、この方法では固定化抗ＦＧＦ−２抗体で穴を被覆した。異なる濃度のＦＧＦ−２±ＲＰＴ８３５を穴に添加する。濃度１〜１，０００ｎＭのＲＰＴ８３５はＦＧＦ−２と抗ＦＧＦ−２抗体との結合に影響しなかった（図６Ｂ）。
【００７４】
この研究をまとめた結果から、本発明において例として提供した阻害剤ＲＰＴ８３５はリガンド（すなわちＦＧＦ−２）とその受容体との（すなわちＦＧＦＲ２）との結合に干渉しないことが分かる。
【００７５】
実施例４（研究結果）：式Ｖ、ＩＸ、ＸＩにより決定された阻害剤使用時のＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用への干渉
対応する式Ｖ、ＩＸ、ＸＩにより本発明において決定された阻害剤Ｖ、ＩＸ、ＸＩも、ＦＧＦＲからＦＲＳ２へのシグナル伝達に干渉する。化学合成により、特定の化合物が得られた。標準的な方法に従ってＦＧＦＲ２を発現する胃癌細胞Ｓｎｕ１６を培養した。一部の細胞を陰性対照用に残し、ＦＧＦ−２を他の部分に添加した（陽性対照）。治療群には：式Ｖに従った阻害剤の添加、及びそれに続くＦＧＦ−２の刺激、式ＩＸに従った阻害剤の添加、及びそれに続くＦＧＦ−２の刺激、式ＸＩに従った阻害剤の添加、及びそれに続くＦＧＦ−２の刺激を行った。様々なキナーゼのリン酸化レベルを評価するためにウェスタンブロッティング法を利用した。
【００７６】
結果：刺激しなかった細胞及び投与しなかった細胞では、ＦＧＦＲ２、ＦＲＳ２のリン酸化レベルは低かった（リン酸化がなかった）；ＦＧＦ−２の刺激後の細胞ではＦＧＦＲ２及びＦＲＳ２の活性レベルは高かった（陰性対照の１４及び１７倍高かった）；阻害剤を添加した細胞では、ＦＧＦＲ２活性のレベルは刺激ＦＧＦ−２対照と比較して変化がなく、その上、ＦＲＳ２リン酸化の報告はなかった（全ての場合において、ＩＣ５０の阻害濃度は１０ｎＭ未満であった）。更に、阻害剤はＡｋｔ、Ｅｒｋ１／２などの他の細胞内キナーゼに影響しないことが示された。
【００７７】
細胞数も計数した。阻害剤及びＦＧＦ−２を添加しない細胞は、ＦＧＦ−２を添加した細胞とは異なり、低度に増殖した。阻害剤を添加すると、細胞数は陰性対照群と同程度で（ｐ＝０．５）、阻害剤を添加しなかったＦＧＦ−２刺激群より確実に少なかった（ｐ＜０．０００１）。
【００７８】
従って、式Ｖ、ＩＸ、ＸＩに記載の物質はＦＧＦＲ２とＦＲＳ２との間の相互作用の選択的阻害剤であり、これはＦＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖活性に影響を与える。
【００７９】
実施例５（研究結果）：様々な細胞内キナーゼに対する本発明に記載の阻害剤の影響評価
細胞内キナーゼに影響を与えずにＦＧＦＲからＦＲＳ２へのシグナルの伝達のみに作用する阻害剤の選択的作用、細胞内キナーゼ、特にｐ４４／４２（ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６のリン酸化レベルを証明するため。
【００８０】
収載されたキナーゼのリン酸化に対する本発明で式ＩＩにより特徴付けられた阻害剤ＲＰＴ８３５の効果を評価するため、ＦＧＦＲ２を発現する胃癌細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩを使用した。ＦＧＦＲを刺激するために濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び１０ｍｇ／ｍｌのヘパリンを細胞に添加した。ＲＰＴ８３５を様々な濃度で添加した。細胞の一部は阻害剤を添加せずに残し、また細胞の一部は阻害剤及び刺激剤の両方を添加せずに残した（対照群）。
【００８１】
リン酸化レベルを評価するために２つの標準的方法を利用した：
−手動作業によるウェスタンブロッティング。
−自動システムＷｅｓ（商標）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社；カリフォルニア州、サンタクララ）を用いた自動キャピラリー電気泳動及び免疫検出。
【００８２】
ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞を線維芽細胞増殖因子で刺激すると、非刺激細胞と比較して、ｐ４４／４２（ＭＡＰＫ、１２倍）、ＡＫＴ（４倍）が有意に活性促進（リン酸化）された。タンパク質ｍＴＯＲ及びキナーゼｐ７０Ｓ６のリン酸化は、比較的低度であると報告された。
【００８３】
阻害剤ＲＰＴ８３５を添加すると、収載されたキナーゼの活性は、ＦＧＦ−２のみで刺激した細胞（ＲＰＴ８３５の添加なし）と比較して変化はなかった。リン酸化レベルを図７に示す。
【００８４】
従って、ＲＰＴ８３５は他の細胞内キナーゼのリン酸化に影響しない。
【００８５】
実施例６（研究結果）：ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＶＥＧＦＲ１及び細胞内キナーゼに対する式ＶＩＩによって判定される阻害剤の影響の評価。
上記の手順に従って、１〜３型線維芽細胞増殖因子受容体ＦＲＳ２のリン酸化レベル、ならびにＶＥＧＦＲ１及び細胞内キナーゼＰＩ３Ｋ、ｐ４４／４２（ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ｍＴＯＲのリン酸化レベルをウェスタンブロッティング法により分析した。
【００８６】
研究には、内皮細胞ＨＵＶＥＣ、Ｃａｋｉ−１型のヒト腎細胞癌、胃癌細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩを用いた。上記細胞は全て、様々なタイプの上記受容体を発現した。実施例５と同様に、細胞の一部はＦＧＦ−２及び／又はＶＥＧＦ−Ａを刺激し、また細胞の一部は、式ＶＩＩＩで示される阻害剤と共に培養し、また細胞の一部は刺激及び投与をせずに残した。
【００８７】
ＦＧＦ−２は、非刺激細胞と比較して、３タイプのＦＧＦＲ全て、更にＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ及びＦＲＳ２のリン酸化を強く刺激した（全ての比較でＰ＜０．０００１）。ＶＥＧＦ−Ａは１〜３型のＦＧＦＲ及びＦＲＳ２に対して効果がなかったが（全ての比較でＰ＞０．３）、ＶＥＧＦＲ１、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫのリン酸化レベルを有意に高めた（全ての比較でＰ＜０．００１）。式ＶＩＩＩの阻害剤は、ＦＲＳ２（１４倍、Ｐ＝０．００１）及びＰＩ３Ｋ（１０倍、Ｐ＝０．０１７）のリン酸化を大幅に減少させ、ＦＧＦＲ２（１．５倍）及びＦＧＦＲ３（１．８倍）、ＶＥＧＦＲ１（２．３倍）のリン酸化を低度に減少させた。阻害剤は他のキナーゼに影響していなかった。また、ＦＧＦＲ１のリン酸化のレベルも増加した（図８）。
【００８８】
従って、本研究は、他のキナーゼ及び受容体に対するＦＧＦＲ２とＦＲＳ２との相互作用に干渉する数種の阻害剤の可能性ある影響を実証する。この効果は否定できず、またこれは主要な機序−下位キナーゼの段階的なリン酸化抑制につながるＦＧＦＲとＦＲＳ２との結合の破壊と関連付けることが可能である。他の受容体（例えばＶＥＧＦＲ１）に対する効果は顕著ではないが、相互作用の片方と同様である可能性がある。ＦＧＦＲ１リン酸化のレベルの増加は将来的にも利用可能であり、本発明に記載された阻害剤の使用時に治療効果がある。
【００８９】
実施例７（研究結果）：本発明に記載の阻害剤は、ＦＲＳ２とＳｈｐ２及び／又はＧｒｂ２との複合体に干渉し得る
ＦＲＳ２はＳｈｐ２及びＧｒｂ２と相互作用し、これらのタンパク質を介して細胞内キナーゼにシグナルを伝達することが知られている。この研究の目的は、本発明に記載の阻害剤がＦＲＳ２とＳｈｐ２及びＧｒｂ２との相互作用に影響し得ることを照明することであるが、これはその阻害剤を定義する作用機序ではなく：主要な機序はＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用への干渉である。
【００９０】
胃癌細胞Ｓｎｕ１６を９０ｍｃｌ／穴のサイズの９６穴プレートに分割した。温度３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気で湿気のあるインキュベーター中で２４時間インキュベートした後、細胞を試験し、１００ｍｃｇ／ｍｌの量の式ＶＩで説明した薬剤中に溶解し、次いでＦＧＦ−２を刺激剤として添加した。
【００９１】
自動ウェスタンブロッティング法による培養の数日後、以下のタンパク質：ＦＧＦＲ２、ＦＲＳ２α、ＦＲＳ２β、Ｓｈｐ２、Ｇｒｂ２のリン酸化レベルを細胞内で検討した。培養から更に２４時間後、細胞を計数した。
【００９２】
式ＶＩに従った阻害剤はＦＧＦＲ２のリン酸化を抑制しなかったが（対照との差は見られなかった）、ＦＲＳ２α及びＦＲＳ２βのリン酸化を有意に１２倍抑制した（ＩＣ５０＜１０ｎＭ）。更に、Ｓｈｐ２及びＧｒｂ２タンパク質のリン酸化の特定の抑制（１０倍超）がいくつかの細胞で認められた。従って、Ｓｈｐ２及び／又はＧｒｂ２のリン酸化因子により、細胞を２群に分けた：
−ＦＲＳ２ならびにＳｈｐ２及び／又はＧｒｂ２のリン酸化を抑制する群
−Ｓｈｐ２及び／又はＧｒｂ２のリン酸化に影響を与えずにＦＲＳ２のリン酸化を抑制する群。
【００９３】
次の培養後、細胞数は群間で等しく、また対照（阻害剤と共に培養していないＦＧＦ−２の刺激）とも同等であった。表１の結果を参照されたい。表から分かるように、阻害剤は、Ｓｈｐ２及び／又はＧｒｂ２のリン酸化と無関係に、対照と比較して腫瘍細胞の増殖を有意に抑制した。
【００９４】
従って、腫瘍細胞の増殖に対する阻害効果を有する決定因子は、ＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用への干渉である。この場合、Ｓｈｐ２及び／又はＧｒｂ２のリン酸化レベルは異なっている可能性もあり、このことは本発明に記載の阻害剤による増殖活性の抑制には影響しない。
【００９５】
実施例８（研究結果）：ＦＧＦＲ２とＦＲＳ２阻害剤ＲＰＴ８３５との相互作用への選択的干渉を加える。
ＦＧＦ２とＦＲＳ２との相互作用に対する、本発明において式ＩＩで特定された阻害剤ＲＰＴ８３５の特異的な作用の評価、及び他のタイプのＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用に対する影響の評価を本研究の目的とした。実験には、２種の細胞株：
−ＦＧＦＲ２を発現する胃癌ＫＡＴＯ  ＩＩＩ、及び
−ＦＧＦＲ１を発現する乳癌ＭＤＡ  ＭＢ１３４
を選択した。
【００９６】
研究手順は上記実施例と同様であった：ＲＰＴ８３５の存在下で細胞を培養し、続いてＦＧＦ−２及びヘパリンで刺激した。ＲＰＴ８３５の存在下で細胞の他の部分を培養した。ＦＧＦＲ１（乳癌細胞中）及びＦＧＦＲ２（胃癌細胞中）ならびにＦＲＳ２α（両細胞株中）及び数種の細胞内キナーゼ（乳癌細胞中）のリン酸化を、手動及び自動ウェスタンブロッティングを利用して評価した。
【００９７】
細胞ＫＡＴＯ  ＩＩＩでは、阻害剤ＲＰＴ８３５は、１００ｎＭの用量でＦＲＳ２α（ＦＧＦＲ２系）のリン酸化を初期レベルまで完全に減少させた。１０ｎＭの濃度でＦＲＳ２αリン酸化が５０％を超えて抑制されたことが観察された（図２）。この場合、受容体自体のキナーゼ活性に影響は見られなかった（図３）。
【００９８】
乳癌細胞ＭＤＡ  ＭＢ１３４では、阻害剤ＲＰＴ８３５はＦＲＳ２α（ＦＧＦＲ１系）、ならびにＦＧＦＲ１自体及び細胞内キナーゼのリン酸化に影響しなかった（図９）。図に見られるように、いくつかの細胞内キナーゼ及びＦＧＦＲ１のリン酸化レベルのわずかな増加が認められた。
【００９９】
従って、本実施例では、阻害剤ＲＰＴ８３５の選択的作用、及びＦＧＦＲ２系におけるその活性を確認する。阻害剤ＲＰＴ８３５は、ＦＧＦＲ２とＦＲＳ２との相互作用への干渉にのみ影響し、他のタイプのＦＧＦＲとＦＲＳ２との相互作用には影響しない。
【０１００】
実施例９（研究結果）：本発明に記載の阻害剤はＦＧＦＲアイソフォームと無関係に活性を示す
ＦＧＦＲの様々なアイソフォームの出現は、これらの受容体を遮断する薬剤の治療活性に影響を与え得ることが知られている。本発明に記載の阻害剤は１種のＦＧＦＲ内であればいかなるアイソフォームにも活性を示すと証明することを本研究の目的とした。
【０１０１】
本研究では、本発明の式ＩＩにより決定される阻害剤ＲＰＴ８３５の影響、２種の最も頻度の高いアイソフォームＩＩＩｂ及びＩＩＩｃに表されるＦＧＦＲ２とＦＲＳ２との相互作用への介入を評価した。このために、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃのみを発現する胎児骨芽細胞（ｈＦＯＢ）のヒト細胞株、及びＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する乳癌ＳＵＭ−５２のヒト細胞株（アイソフォームの主要な型全て−Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を選択した。
【０１０２】
細胞を以下の群：
１ａ）ｈＦＯＢ
１ｂ）ｈＦＯＢ、ＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）の刺激
１ｃ）ｈＦＯＢ、ＲＰＴ８３５（１ミクロン）との培養及びＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）の刺激
２ａ）ＳＵＭ−５２
２ｂ）ＳＵＭ−５２、ＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）の刺激、
２ｃ）ＳＵＭ−５２、ＲＰＴ８３５（１ミクロン）との培養及びＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）の刺激
に分けた。
【０１０３】
阻害剤ＲＰＴ８３５は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する両株の細胞の増殖を確実に抑制した（図１０）。ＦＲＳ２αリン酸化レベルの評価時にも、これらの群間に有意な差はなかった−阻害剤はリン酸化を完全に抑制した（図１１）。
【０１０４】
従って、本発明に記載の阻害剤ＲＰＴ８３５は、１種のＦＧＦＲの範囲内であればいかなるアイソフォームにも活性を示す。
【０１０５】
実施例１０（研究結果）：本発明に記載の阻害剤の抗血管新生活性
体重２２〜３０ｇの１世代のＦ１（Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＤＢＡ／２）雄ハイブリッドマウス１８匹を研究に使用する。マウス（命名番号м０２．１３．０００１１）を保育施設「Ｓｔｏｌｂｏｖａｙａ」の支所から入手した。先行技術に記載の方法を実験に用いた［Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  Ａ．，１９９２年］。対照群及び実験群には、少なくとも３匹のマウスを用いた。６０通常単位／ｍｌのヘパリン、ＶＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）又はｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含むマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）のアリコート（１０００ｍｃｌ）を氷上で調製した。６０通常単位／ｍｌのヘパリンを含むマトリゲルを陰性対照として使用した。マトリゲルをマウス背中の側部に皮下注射した。注射後、マトリゲルは速やかに単一の硬質ゲル状インプラントを形成する。ＤＭＳＯ中に、１０−２Ｍの濃度になる重量の阻害剤を溶解した。アリコートを−２０°Ｃに凍結させ、注射直前に解凍した。
【０１０６】
溶液の再凍結は実施しなかった。試験対象物質及び基準物質を、マトリゲル移植の０、３及び６日目に腹腔内投与した：用量１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ、及び用量１５ｍｇ／ｋｇのＲＰＴ８３５。群の説明を表２に示す。マトリゲル投与の７日後、マウスをジエチルエーテルで睡眠導入し、インプラントを除去した。インプラントは１０％中性ホルマリン中で２４〜３６時間固定し、更なる組織学的研究用にパラフィンに封入した。
【０１０７】
増殖因子を含まない１０００ｍｃｌのマトリゲルの皮下注射は、微小血管の形成ならびに間質細胞及び内皮細胞のインプラントへの遊走を誘導しなかった。１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むマトリゲルの注射では、全体的に微小血管、管状構造物及び遊走細胞の数の大幅な増加（全ての指標で、ｐ＜０．００１）が観察された。２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ注入後に同様の効果が見られた（全ての指標で、ｐ＜０．００１）。
【０１０８】
対応する刺激剤の活性を遮断する物質の投与後、遊走細胞、管状構造物及び機能性微小血管の数の大幅な減少が観察された。ベバイズマブ（ｂｅｖａｉｚｕｍａｂ）の投与は、ＶＥＧＦを含むインプラントで血管新生を完全に遮断したが（全ての試験パラメーターで、ｐ＜０．００１）、ｂＦＧＦによって誘導した血管新生は阻害しなかった（全ての試験パラメーターで、ｐ＞０．０５）。阻害剤ＲＰＴ８３５は、ｂＦＧＦによって刺激された血管新生を効果的に阻害した。遊走細胞（ｐ＜０．００１）、管状構造物（ｐ＝０．０１６）及び機能性微小血管（ｐ＜０．００１）の数は対照群に比べて２倍以上減少した。研究の結果は図１２及び１３に示す。
【０１０９】
従って、研究から、１５ｍｇ／ｋｇの用量で３回投与すると、阻害剤ＲＰＴ８３５は、ｂＦＧＦにより刺激された血管新生を統計学的に有意に遮断することが立証された。同じ操作様式におけるベバシズマブは、ＶＥＧＦ刺激血管新生に対して有効であったが、ｂＦＧＦを使用した場合は有効ではなかった。
【０１１０】
得られたデータから、ＲＰＴ８３５は本発明に記載の阻害剤の例として、自己完結型作用機序を有する有望な抗血管新生物質であることが示唆されている。
【０１１１】
実施例１１（研究結果）：本発明に記載の阻害剤と、ＦＧＦＲ／ＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼの典型的な阻害剤−ブリバニブとの、内皮細胞の増殖活性に対する影響の比較
内皮細胞ＨＵＶＥＣを９６穴プレートに分割し、２４時間培養した。その後、以下の阻害剤：
１）阻害剤ＲＰＴ８３５、又は
２）本発明の式ＩＸで説明される阻害剤、又は
３）ブリバニブ−ＦＧＦＲ／ＶＥＧＦＲの多種キナーゼ阻害剤
を細胞に添加し、また、全細胞に２５ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−２も添加した。
【０１１２】
細胞は全体的に９６時間培養し、次いで計算した。
【０１１３】
細胞増殖の結果を図１４に示す。
【０１１４】
本発明に記載の阻害剤（ＲＰＴ８３５及び式ＩＸの阻害剤）は、ブリバニブのＦＧＦＲ／ＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼの典型的阻害剤とは異なり、内皮細胞に対して顕著な抗増殖効果をもたらした。
【０１１５】
実施例１２（研究結果）：インビトロでＦＧＦＲを様々に発現する腫瘍細胞の増殖に対する阻害剤ＲＰＴ８３５の影響
本発明に記載の阻害剤との培養時の、腫瘍細胞増殖活性の抑制は、実施例４、７、９で既に示されている。
【０１１６】
本研究では、追加の細胞株：ＳＫＯＶ３（卵巣癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）、ＨＳ５７８Ｔ（乳癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１２６）、Ｔ４７Ｄ（乳癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３３６）、非小細胞肺癌Ａ５４９の改変株、皮膚Ｍｅｌ  Ｋｏｒの転移性メラノーマの株（ロシア連邦特許第２２８７５７８号）（特許文献５）が使用され、抗血管新生活性の更なる研究では、細胞株ＳＶＥＣ−４−１０（内皮細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１８１）が使用された。
【０１１７】
細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社）、２ｍＭのグルタミン（ＰＡＮＥＣＯ社）、抗生物質（１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（全てＰＡＮＥＣＯ社））を含むＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＮＥＣＯ社）（ＳＫＯＶ３、ＨＳ５７８Ｔ、Ｔ４７Ｄ、Ｍｅｌ−Ｋｏｒ）又はＤＭＥＭ（ＰＡＮＥＣＯ社）（ＳＶＥＣ−４−１０）の環境で、３７°Ｃ、５％ＣＯ２下で培養した。実験には７０〜８０％単層の細胞を使用した。
【０１１８】
０．１％のＦＣＳ血清を含む環境で、９６穴プレート上に細胞を低密度（３０ｔの細胞／ｍｌ）で三重に播種した。翌日、必要な濃度で試験阻害剤ＲＰＴ８３５を穴に添加し、６時間後に線維芽細胞増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社））を添加した。３日に１度、環境、抗生物質及び薬物を変更した。細胞の増殖は、実験開始後７日間、改変した「クリスタルバイオレット細胞分裂促進法（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）」により判定した。細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドで固定し、エタノール中のＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のクリスタルバイオレット０．５％溶液で染色した。染色物をエタノールに溶解し、５４０〜５６０ｎｍで分光光度計において測定した。細胞増殖活性阻害の曲線は、プレートの穴における阻害剤ＲＰＴ８３５の濃度（Ｘ軸）に対する細胞量のパーセント（Ｙ軸）の依存度により構築した。生存細胞のパーセンテージが５０％未満になった試料濃度（ＩＣ５０）をプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ５で計算した。実験は少なくとも３回繰り返し、１実験につき３回反復した。
【０１１９】
図１５は、インビトロでの腫瘍及び内皮細胞の培養物に対する化合物ＲＰＴ８３５の抗増殖作用を示す。
【０１２０】
図面から分かるように、阻害剤ＲＰＴ８３５は、腫瘍及び内皮細胞の抗増殖活性を様々な程度で抑制した。増殖阻害の程度は、ＦＧＦＲ２の発現状態に依存し：受容体が発現し難い程、阻害剤ＲＰＴ８３５の効果は高かった。従って、ＦＧＦＲ２を強く発現するＳＶＥＣ−４−１０株を用いる場合に、最大の阻害効果が認められる。ＳＫＯＶ３及びＨＳ５７８Ｔの低ＦＧＦＲ２発現細胞では、増殖に対する適度な効果が見られる。試験阻害剤ＲＰＴ８３５は、ＦＧＦＲ２をほとんど発現しない転移性メラノーマＭｅｌ  Ｋｏｒ及び乳癌Ｔ４７Ｄの細胞株の増殖活性を遮断しなかった。
【０１２１】
ＦＧＦＲ２が顕著に発現する非小細胞肺癌Ａ５４９の改変株と阻害剤ＲＰＴ８３５との培養時に最大阻害効果が得られた（ＩＣ５０＝１０ｎＭ／Ｌ）。
【０１２２】
従って、インビトロでの研究では、阻害剤ＲＰＴ８３５は腫瘍及び内皮細胞に対して抗増殖作用を生じることが示され、このことはＦＧＦＲ２の発現強度と相関している。これは阻害剤の比活性を際立たせている。
【０１２３】
実施例１３（研究結果）：阻害剤ＲＰＴ８３５を用いたＦＧＦＲ２発現のレベルに依存するインビボでの腫瘍増殖の阻害
８週齢の雌免疫不全マウス（ヌード）に、ＦＧＦＲ２を様々に発現したヒト細胞株：
−ＦＧＦＲ２を強く発現する三種陰性乳癌ＳＵＭ５２ＰＥの細胞株（Ａｓｔｅｒａｎｄ社.（ミシガン州、デトロイト）から購入）
−ＦＧＦＲ２を低度に発現する三種陰性乳癌ＨＳ５７８Ｔの細胞株（ＡＴＣＣから購入（ＣＲＬ−１２５））
−ＦＧＦＲ２を発現しない非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６の細胞株（ＡＴＣＣから購入（ＣＲＬ−５８２６））
の２×１０６個の腫瘍細胞を投与した。
【０１２４】
腫瘍増殖が確立した後（１ｍｍ３）、腫瘍のタイプに従ってマウスを対照群及び治療群に分けた。
対照群１（Ｎ＝１０）：ＳＵＭ５２ＰＥ、胃管を介して水を毎日投与。
治療群１（Ｎ＝１０）：ＳＵＭ５２ＰＥ、胃管を介して３０ｍｇ／ｋｇの用量で阻害剤ＲＰＴ８３５を毎日投与。
対照群２（Ｎ＝１０）：ＨＳ５７８Ｔ、胃管を介して水を毎日投与。
治療群２（Ｎ＝１０）：ＨＳ５７８Ｔ、胃管を介して３０ｍｇ／ｋｇの用量で阻害剤ＲＰＴ８３５を毎日投与。
対照群３（Ｎ＝１０）：ＮＣＩ−Ｈ２２６、胃管を介して水を毎日投与。
治療群３（Ｎ＝１０）：ＮＣＩ−Ｈ２２６、胃管を介して３０ｍｇ／ｋｇの用量で阻害剤ＲＰＴ８３５を毎日投与。
【０１２５】
腫瘍のサイズ及び動物の体重を３日毎に測定した。マウスは、腫瘍が２０００ｍｍ３のサイズに達したとき、又は実験の６０日目になったときに安楽死させた。
【０１２６】
群１の腫瘍増殖の図表は図１６に示し、腫瘍体積は表３に示す。阻害剤ＲＰＴ８３５を投与されたマウスでは、腫瘍ＳＵＭ５２ＰＥの侵攻性増殖が有意に減速していることが認められた（実験の１６日目からＰ＜０．０００）。
【０１２７】
３１日目に、群の腫瘍平均サイズは２倍を超えて変化し、すなわち対照群では２７１２．２±３７ｍｍ３、治療群では約１０８０．７±４９ｍｍ３になった。腫瘍増殖の減速は６０．２％であった。研究規則（腫瘍体積＞２０００ｍｍ３）に従って、対照群のマウスを安楽死させた。治療群のマウスの観察を続けた。当該群において、疾患の安定化（その後の観察期間中の腫瘍増殖の欠如）が見られ、これはプラス効果として評価する。
【０１２８】
従って、阻害剤ＲＰＴ８３５は、ＦＧＦＲ２を強く発現する三種陰性乳癌ＳＵＭ５２ＰＥに関するインビボ実験において抗腫瘍効果を明確に示した。
【０１２９】
群２の腫瘍増殖の図表を図１７に示す。図面から分かるように、阻害剤ＲＰＴ８３５も、ＦＧＦＲ２を低度に発現する三種陰性乳癌ＨＳ５７８Ｔの腫瘍増殖をある程度抑制した。しかし、その差は、ＦＧＦＲ２が強く発現する三種陰性乳癌モデルにおいて阻害剤ＲＰＴ８３５を使用する場合より有意ではなかった。従って、研究３１日目までの治療群２及び対照群２の平均腫瘍サイズはそれぞれ７０３±８９．１ｍｍ３及び１０５３±１７９．８ｍｍ３、４０日目まではそれぞれ１１０４±１６２．２ｍｍ３及び１５９２±３３５ｍｍ３（Ｐ ＝ ０．０１）であった。３１日目及び４０日目の腫瘍増殖の減速は３３．２％及び３０．６％であった。
【０１３０】
群３の腫瘍増殖の図表は図１８に示す。実験３１日目では、対照群３と治療群３との間で、ＦＧＦＲ２を発現しない非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ２２６の増殖に有意差は認められず：平均腫瘍体積は、それぞれ１１１４±２８０．６ｍｍ３及び１０５３±２５９．７ｍｍ３であった（Ｐ＝０．６１９）。
【０１３１】
インビボでの研究結果に従って、主な結論が得られた：１）阻害剤ＲＰＴ８３５は顕著な抗腫瘍作用を示す；２）阻害剤ＲＰＴ８３５を使用した場合の腫瘍増殖の減速度はＦＧＦＲ２の発現レベルに依存する。
【０１３２】
実施例１４（インビボ研究結果）：阻害剤ＲＰＴ８３５は、いくつかの腫瘍で治療病変形態を引き起こす
免疫不全マウス（ヌード、治療開始時のマウスの年齢は８週齢；保育施設「Ｐｕｓｈｃｈｉｎｏ」）に、ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ−３の発現株のＦＧＦＲ２の細胞を皮下接種した。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３になったところで、マウスを無作為に対照群（パクリタキセル及びカロプラチン（ｃａｒｏｐｌａｔｉｎ）を用いた標準的化学療法）及び治療群（阻害剤ＲＰＴ８３５）に割り当てた。各群のマウスは１０匹であった。５０ｍｇ／ｋｇの用量で阻害剤ＲＰＴ８３５を毎日付与した。腫瘍体積は週２回測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したところで、マウスを安楽死させた。腫瘍組織の病変形態を検討した。
【０１３３】
病変形態は対照群に見られなかった（図１９）。腫瘍組織に変化はなかった。
【０１３４】
阻害剤ＲＰＴ８３５を使用したところ、治療群において肉眼及び顕微鏡の両方で顕著な治療病変形態が観察された（図２０）。広範な壊死が腫瘍内に見られた（腫瘍の７５％以上が大規模壊死となり、生存腫瘍細胞は腫瘍の周辺にのみ残存していた）。依然として活性的な組織の内部に血管の早期損傷も観察された。腫瘍細胞にジストロフィーが観察された。
【０１３５】
従って、阻害剤ＲＰＴ８３５はいくつかの腫瘍の治療病変形態、特に卵巣癌を引き起こすという結論が導かれた。
【０１３６】
実施例１５（インビボ研究結果）：リウマチ性疾患に対する本発明に記載の阻害剤の有効性
本研究では、コラーゲン誘発関節炎モデルを用いた。フロイントアジュバントと組み合わせたＩＩ型のコラーゲンの皮内注射で、関節炎をマウスに誘導した。マウスを５匹ずつの２群に無作為に割り当てた：
−１群：対照、チューブを介して４０日間水を与える。
−２群：本発明の式ＩＩＩで説明される阻害剤、チューブを介して４０日間１００ｍｇ／ｋｇ与える。
【０１３７】
４１日目にマウスを安楽死させ、組織を検討した。
【０１３８】
対照群で、滑膜炎、軟骨破壊、ならびに組織Ｔ及びＢリンパ球、好中球の大規模関節周囲浸潤が見られた。
【０１３９】
治療群で、単一好中球の有意ではない浸潤のみが見られた。
【０１４０】
従って、本発明に記載の阻害剤は、リウマチ性疾患及び結合組織病に有効となる可能性がある。
【０１４１】
実施例１６（インビボ研究結果）：本発明に記載の阻害剤は顕著な毒性の発現を伴わない
実施例１３に記載のインビボ試験で阻害剤ＲＰＴ８３５の毒性を評価した。標準的な手順に従い、当該阻害剤を使用したところ、対照群と比較して全ての望ましからざる事象が評価され、更に動物の体重が減少した。本研究では、体重減少も治療の望ましからざる副作用も見られなかった。
【０１４２】
その上、阻害剤ＲＰＴ８３５の急性毒性は、別の研究で以下の量で試験した：
−薬剤の急性毒性を調査した。毒性測定の結果、急性投与後の１４日間の試験動物の観察データ、及び剖検データにより、その薬剤をＩＶクラスの低毒性薬剤と関連付けることが可能になる（Ｈ．Ｈｏｄｇｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｃｕｔｅ  Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．Ｅｄ．ＩＶ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９７５年，４２７ｐ．；Ｋ．Ｋ．Ｓｉｄｏｒｏｖ，１９７７年）（非特許文献７）。急性投与後の動物の状態は、最大治療量（約４．３ｍｃｇ／ｋｇ）を超える用量、数十倍〜数百倍の用量での薬剤の良好な耐性を証明している。致死量中央値（ＬＤ５０）は２０００．０ｍｇ／ｋｇを超えていた。
−肉眼及び顕微鏡の結果によれば、当該薬剤は単回投与後の胃腸管の粘膜に対して刺激作用を示さない。
−変異原性作用（染色体異常）の研究結果によれば、当該薬剤には変異原性はない。
−当該薬剤は免疫複合体の反応、全身性アナフィラキシー、肥満細胞の脱顆粒、及び結膜検査において見られるアレルギー特性を全く示さない。
【０１４３】
この研究の結果に基づき、本発明に記載の阻害剤の例として阻害剤ＲＰＴ８３５の使用には顕著な毒性は存在しないと結論付けられた。
【０１４４】
【表１】
0006365999.tif 000013
【０１４５】
【表２】
0006365999.tif 000014
【０１４６】
【表３】
0006365999.tif 000015
【図１】
0006365999.tif 000020
【図２】
0006365999.tif 000021
【図３】
0006365999.tif 000022
【図４】
0006365999.tif 000023
【図５】
0006365999.tif 000024
【図６】
0006365999.tif 000025
【図７】
0006365999.tif 000026
【図８】
0006365999.tif 000027
【図９】
0006365999.tif 000028
【図１０】
0006365999.tif 000029
【図１１】
0006365999.tif 000030
【図１２】
0006365999.tif 000031
【図１３】
0006365999.tif 000032
【図１４】
0006365999.tif 000033
【図１５】
0006365999.tif 000034
【図１６】
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【図１７】
0006365999.tif 000036
【図１８】
0006365999.tif 000037
【図１９】
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【図２０】
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