(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）ラセミ体が富化された式（Ｉ）：
【化１】
0006334529.tif 000015
（式中、Ｒ１およびＲ２は、各々、フッ化物または水素であり、Ｒ１がフッ化物である場合はＲ２は水素であり、Ｒ２がフッ化物である場合はＲ１は水素であり、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２アリールまたはＣ６〜Ｃ１１アラルキルである）に従う３−ヒドロキシ−２−メチル−４−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−３−フェニル−酪酸エステル誘導体のジアステレオマーの混合物の製造方法であって、前記方法は、
（ｉ）溶媒の存在下における、前記溶媒の沸騰温度よりも低い温度での、式（ＩＩ）
【化２】
0006334529.tif 000016
（式中、Ｘは、臭化物、ヨウ化物または塩化物である）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルの調製の工程と、
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）
【化３】
0006334529.tif 000017
に従うケトンの導入の工程と、
（ｉｉｉ）溶媒の存在下において、式（ＩＩ）に従う前記２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルと式（ＩＩＩ）に従う前記ケトンとの間のレフォルマトスキー反応を行い、
結果として生じる反応混合物が、前記混合物への最後の試薬の添加後０．５時間より長い間、攪拌しながらまたは攪拌せずに、前記混合物を放置しておくことによって、沈殿物を形成することを可能にし（ここで、前記沈殿物は、式（Ｉ）に従うラセミ体（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）エステルが富化されている）、
前記沈殿物を分離する工程とを含み、
工程（ｉ）および（ｉｉ）が行われる順序は入れ替えられ得、前記沈殿物の形成の前に過剰な亜鉛が除去される、方法。
【請求項２】
工程（ｉｉｉ）が、結果として生じる前記反応混合物が、前記混合物への最後の試薬の添加後２時間より長い間、攪拌しながらまたは攪拌せずに、前記混合物を放置しておくことによって、沈殿物を形成することを可能にすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）中のＲ１がフッ化物であり、かつＲ２が水素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式（ＩＩ）中のＲがエチルであり、かつ／または式（ＩＩ）中のＸが臭化物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）における前記溶媒の沸騰温度が、−１０℃〜４０℃の間である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）における前記溶媒の沸騰温度が、−１０℃〜１０℃の間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉｉ）における温度が、前記溶媒の沸騰温度より低い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）が、工程（ｉｉ）の前に行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）および／または工程（ｉｉｉ）における前記溶媒が、極性非プロトン性溶媒である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒が、テトラヒドロフラン、２−メチル−テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔブチルメチルエーテル、ジ−イソプロピルエーテル、ジ−エチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはトルエンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）の前記２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルが、２−ハロプロピオネートエステルと金属亜鉛との反応によって得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）：工程（ｉｉｉ）で得られた前記沈殿物を有機溶媒で溶解および／または抽出し、前記溶液中の前記（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）ジアステレオマーを分割して、式（Ｉ）の前記エステルの所望の（２Ｒ，３Ｒ）エナンチオマー
【化４】
0006334529.tif 000018
が富化された生成物を得ることが後に続く、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
エステラーゼ酵素を用いて式（Ｉ）に従う前記エステルの前記ジアステレオマーの酵素的分割が行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エステラーゼ酵素が、配列番号４に示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するそのホモログを含む、エステラーゼ活性を有する単離ポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホモログが、少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エステラーゼ酵素が、配列番号２に示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するそのホモログを含む、エステラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであり、前記ホモログは、２３９位またはそれに対応する位置におけるアミノ酸としてバリンを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホモログが、少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有しており、かつ配列番号２に従うアミノ酸配列の２３９位またはそれに対応する前記ホモログの配列の位置におけるアミノ酸としてバリンを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホモログが、少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
エステラーゼ活性を有する前記単離ポリペプチドが、配列番号２に示される前記アミノ酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
エステラーゼ活性を有する前記単離ポリペプチドが、配列番号２に示される前記アミノ酸配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｔｅｒｔ−ブタノール、酢酸ｔｅｒｔブチル、メチルイソブチルケトンおよびトルエンから選択される有機補助溶媒が、前記酵素的分割において使用される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉｖ）で得られた式（Ｉ）の前記エステルの前記所望の（２Ｒ，３Ｒ）エナンチオマーが富化された前記生成物を、アンモニアでの処理によって対応するアミドに変換することが後に続く、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミドを脱水して対応するシアニドにすることが後に続く、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記シアニドを対応するチオアミドに変換し、任意選択で、前記チオアミドを、α−ケト置換４−シアノアセトフェノン試薬との反応によって、前記チオアミドのフェニル部分が２，５−ジフルオロ置換されている場合はイサブコナゾールに、前記チオアミドのフェニル部分が２，４−ジフルオロ置換されている場合はラブコナゾールにさらに変換することが後に続く、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イサブコナゾールまたはラブコナゾールのためのジアステレオマー的およびエナンチオマー的に富化されたエステル中間体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イサブコナゾールおよびラブコナゾールは、トリアゾール抗真菌化合物である。イサブコナゾールおよびラブコナゾールの製造方法は、Ｂａｓｉｌｅａへの特許である国際公開第９９／４５００８号パンフレット、国際公開第２００７／０６２５４２号パンフレットおよび国際公開第０３／００２４９８号パンフレットに開示された。国際公開第２０１１／０４２８２７号パンフレットには、エナンチオマー的に純粋な抗真菌アゾール（例えば、ラブコナゾールおよびイサブコナゾール）の製造方法が開示されており、ここでは、エナンチオピュアーなキラル酸の添加、次いで所望のジアステレオマーの収集、それに続く塩基またはイオン交換樹脂での処理によるエナンチオマー的に純粋な形態の所望の化合物への塩の変換によって、ラセミ混合物の古典的分割が行われる。このような古典的分割を用いることの不利点は、キラル助剤がほぼ化学量論量で適用される必要があること、ならびにこれらの比較的多量のキラル試薬の回収のため、および塩を遊離のエナンチオピュアーな生成物に変換するために、さらなるプロセス工程が必要とされることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、高いジアステレオマー過剰率およびエナンチオマー過剰率（それぞれ、ｄ．ｅ．およびｅ．ｅ．）を有するイサブコナゾールまたはラブコナゾールの改善された製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で定義される「エナンチオマー的に富化された」は、用語「光学活性な」と同義であり、ある化合物のエナンチオマーの一方が、他方のエナンチオマーに比べて過剰に存在することを意味する。以後、この過剰度を、（例えば、キラルＧＣまたはＨＰＬＣ分析により決定される場合の）「エナンチオマー過剰率」またはｅ．ｅ．と称する。エナンチオマー過剰率ｅ．ｅ．は、エナンチオマーの量の間の差をエナンチオマーの量の合計で除した値に等しく、その商が１００を乗じた後に百分率として表わされ得る。
【０００５】
「ジアステレオマー的に富化された」とは、ある化合物のジアステレオマーの一方が、他方のジアステレオマーに比べて過剰に存在することを意味する。以後、この過剰度を、「ジアステレオマー過剰率」またはｄ．ｅ．と称する。同様に、ジアステレオマー過剰率ｄ．ｅ．は、ジアステレオマーの量の間の差をジアステレオマーの量の合計で除した値に等しく、その商が１００を乗じた後に百分率として表わされ得る。
【０００６】
そこで、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
0006334529.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、各々、フッ化物または水素であり、Ｒ１がフッ化物である場合はＲ２は水素であり、Ｒ２がフッ化物である場合はＲ１は水素であり、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２アリールまたはＣ６〜Ｃ１１アラルキルである）に従うジアステレオマー的に富化された化合物の製造方法に関し、当該方法は、
（ｉ）溶媒の存在下における、その溶媒の沸騰温度よりも低い温度での、式（ＩＩ）
【化２】
0006334529.tif 000003
（式中、Ｘは、臭化物、ヨウ化物または塩化物である）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルの調製の工程と、
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）
【化３】
0006334529.tif 000004
に従うケトンの導入の工程と、
（ｉｉｉ）式（Ｉ）に従うエステルの所望の（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）−ジアステレオマーの沈殿物を結果としてもたらす、溶媒の存在下における式（ＩＩ）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルと式（ＩＩＩ）に従うケトンとの間のレフォルマトスキー反応、過剰な亜鉛の除去の工程と
を含み、工程（ｉ）および（ｉｉ）が行われる順序は入れ替えられ得る。
【０００７】
より具体的には、本発明は、対応する（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）ラセミ体が富化された式（Ｉ）：
【化４】
0006334529.tif 000005
（式中、Ｒ１およびＲ２は、各々、フッ化物または水素であり、Ｒ１がフッ化物である場合はＲ２は水素であり、Ｒ２がフッ化物である場合はＲ１は水素であり、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２アリールまたはＣ６〜Ｃ１１アラルキルである）に従う３−ヒドロキシ−２−メチル−４−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−３−フェニル−酪酸エステル誘導体のジアステレオマーの混合物の製造方法に関し、当該方法は、
（ｉ）溶媒の存在下における、その溶媒の沸騰温度よりも低い温度での、式（ＩＩ）
【化５】
0006334529.tif 000006
（式中、Ｘは、臭化物、ヨウ化物または塩化物である）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルの調製の工程と、
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）
【化６】
0006334529.tif 000007
に従うケトンの導入の工程と、
（ｉｉｉ）溶媒の存在下において、式（ＩＩ）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルと式（ＩＩＩ）に従うケトンとの間のレフォルマトスキー反応を行い、結果として生じる反応混合物が、その混合物への最後の試薬の添加後０．５時間より長い間、好ましくは２時間より長い間、攪拌しながらまたは攪拌せずに、混合物を放置しておくことによって、沈殿物を形成することを可能にし（ここで、この沈殿物は、式（Ｉ）に従うラセミ体（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）エステルが富化されている）、前記沈殿物を分離する工程と
を含み、工程（ｉ）および（ｉｉ）が行われる順序は入れ替えられ得、前記沈殿物の形成の前に過剰な亜鉛が除去される。
【０００８】
驚くべきことに、レフォルマトスキー型反応は、ジアステレオマー的に富化されたイサブコナゾールおよびラブコナゾールに繋がる。先行技術の方法と比べて、本発明に従う方法は、単純な反応物および条件を必要とし、かつ高い収率で所望の異性体を提供する。
【０００９】
欧州特許出願公開第０１９９４７４号明細書において、レフォルマトスキー反応が、トリアゾール化合物の製造のために適用された。これらの化合物がラセミ混合物の形態で得られ得ること、およびこれらの混合物が当該技術分野において知られている方法によって個々の異性体に分離され得ることが開示された。しかしながら、レフォルマトスキー反応により得られるラセミ体エステルの成功裏の酵素的分割には、エステルが高ジアステレオマー純度で大規模に実現可能でありかつ費用効率的に作製される必要がある。欧州特許出願公開第０１９９４７４号明細書に開示されるレフォルマトスキー反応から得られるエステルは、本出願の比較例Ｂにおいて実証されたように、その要件を満たしていない。驚くべきことに、本発明者らは、本発明に従って、レフォルマトスキー試薬２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルが溶媒の沸騰温度よりも低い温度で得られるレフォルマトスキー反応を適用し、次いで沈殿を可能にすることで、単一の工程において、非常に高いｄ．ｅ．（＞９７％）で、エステル（Ｉ）の所望のジアステレオマーへの直接的なアクセスが提供されることを見出した。
【００１０】
ラセミ体エステル（Ｉ）の調製のための代替的な方法は、有機リチウム塩を用いたカップリング反応である。例えば、国際公開第９２１７４７４号パンフレットは、−７０℃でのプロピオン酸エチルとケトン（ＩＩＩ）（Ｒ２がＦである）とのリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）媒介カップリングによってエステル（Ｉ）（Ｒ２がＦである）を調製するための方法を開示している。その反応で形成される２つのジアステレオマーを分離するためにカラムクロマトグラフィーが適用された（ｄ．ｅ．は報告されていない）が、これは、大規模では、非効率的で費用のかかる精製方法であると考えられる。同様の結果が、社内で得られた（比較例Ａ参照）：プロピオン酸エチルが−７８℃でＬＤＡの存在下においてケトン（ＩＩＩ）（Ｒ１がＦである）とカップリングされた場合に、所望のエステル（Ｉ）（Ｒ１がＦである）は、６１％の収率で、２９％の低ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）を有して単離された。したがって、
ａ）反応の低ジアステレオ選択性および付随する低収率、
ｂ）反応後にｄ．ｅ．を高めるための費用効率的で大規模に実現可能な方法の欠如、および
ｃ）高費用に結び付く低温での無水条件の使用
を考慮すると、ＬＤＡなどの強塩基（ＬｉＨＭＤＳなど）を要するカップリング反応は、一般構造（Ｉ）のエステルへの工業的に適切な入口を提供しない。
【００１１】
本発明に従う方法のレフォルマトスキー反応後に測定されるジアステレオマー過剰率は、５０から６０％ｄ．ｅ．まで変化する。沈殿後に、生成物は、９７％〜９９．９％ｄ．ｅ．の間で変化するジアステレオマー過剰率を有して単離される。
【００１２】
本発明に従う方法の工程（ｉｉｉ）後に得られる生成物は、任意の公知の方法（例えば、エステル混合物の、エステルの鹸化および得られた酸混合物と１−フェニルエチルアミンもしくは２−アミノ−１−ブタノールのような光学的に純粋な塩基との反応後のジアステレオマー結晶化、またはキラルＨＰＬＣを含む）に従って分割され得る。
【００１３】
しかしながら、後に続くエステラーゼ酵素を用いた（２Ｒ，３Ｒ）／（２Ｓ，３Ｓ）−エステル（Ｉ）の酵素的分割の方が、それは９９％を上回るｄ．ｅ．および９９％を上回るｅ．ｅ．を有するイサブコナゾールまたはラブコナゾールへの特に魅力的な工業的に大規模に実現可能な経路に繋がるので、好ましい。そのような酵素的分割アプローチは、トリアゾールベースの抗真菌剤（に対する中間体）についてこれまで報告されていない。これは、このクラスの化合物が３０年間を超えて製薬工業の注目の的であったという事実にも関わらず、かつ酵素的分割がその他の場合は製薬プロセスにおいて頻繁に使用されている技術であるという事実にも関わらずである。また、当該分野における非常に最近の特許出願（国際公開第２０１１／０４２８２７号パンフレット）は、発明の主題として分割工程を有するが、古典的分割のみを開示し、酵素的分割は開示していない。恐らく、トリアゾールベースの抗真菌剤の比較的厳しい立体特性が、それらを酵素一般にとって難しい基質にしているのである。この種の基質に好適な酵素を見出すことは、明らかに簡単なことではない。実際、本発明に従う方法のために、２００種を超える加水分解酵素がスクリーニングされ、１種類の酵素ファミリー（すなわち、エステラーゼ）のみが、一般式（Ｉ）のエステルに対する活性および選択性の両方を提供した。
【００１４】
要するに、抗真菌剤イサブコナゾールおよびラブコナゾールの工業的調製は、ジアステレオ選択性およびエナンチオ選択性の両方の導入のための効率的な大規模に実現可能な方法を必要としている。本明細書で報告されるジアステレオ選択的なレフォルマトスキー−沈殿プロトコルは、酵素的分割手順と共に、両方を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、式（Ｉ）は、イサブコナゾールのためのエステル中間体を示す。式（Ｉ）中のＲ１がフッ化物でありかつＲ２が水素である場合は、イサブコナゾールのためのエステル中間体が示される。式（Ｉ）中のＲ１が水素でありかつＲ２がフッ化物である場合は、ラブコナゾールのためのエステル中間体が示される。
【００１６】
式（ＩＩ）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステル中のＲは、分岐もしくは非分岐のＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２アリールまたはＣ６〜Ｃ１１アラルキル、好ましくは分岐もしくは非分岐のＣ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ５〜Ｃ８アリール、より好ましくは分岐もしくは非分岐のＣ１〜Ｃ４アルキルであり得る。分岐もしくは非分岐のＣ１〜Ｃ４アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルからのいずれか１つであり得る。２−ハロ亜鉛プロピオン酸アリールエステルについての一例は、２−ハロ亜鉛プロピオン酸フェノールエステルである。好ましくは、Ｒはメチルまたはエチルであり、より好ましくは、Ｒはエチルである。
【００１７】
式（ＩＩ）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステル中のＸは、臭化物、ヨウ化物または塩化物からのいずれか１つであり得る。より好ましくは、Ｘは臭化物である。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、式（ＩＩ）中のＲはエチルであり、かつ式（ＩＩ）中のＸは臭化物である。
【００１９】
本発明に従うレフォルマトスキー反応において、より具体的には２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルの製造において適用される温度は、最高でも低く、−３０℃〜適用される溶媒の大気圧での沸騰温度の間で変化し得る。少なくとも、この温度は、大気圧での溶媒の沸騰温度より低い。より高い温度では、例えば反応を阻害する亜鉛塩の付随する放出を伴うエステルのホモカップリングのため、レフォルマトスキー試薬の形成が妨げられ、それに伴い完全な変換が妨げられ、沈殿に影響が及ぼされる。好ましくは、温度は、−３０℃〜８５℃の間、より好ましくは−１０℃〜４０℃の間、最も好ましくは−１０℃〜１０℃の間である。さらにより好ましくは、温度は、０℃近く（例えば、−２℃〜２℃の間）である。
【００２０】
したがって、本発明に従う方法の工程（ｉ）で適用される温度は、−３０℃〜適用される溶媒の大気圧での沸騰温度の間で変化し得る。好ましくは、工程（ｉ）における温度は、大気圧での溶媒の沸騰温度より低い。より好ましくは、工程（ｉ）における温度は、−３０℃〜８５℃の間、さらにより好ましくは−１０℃〜４０℃の間、最も好ましくは−１０℃〜１０℃の間である。さらにより好ましくは、工程（ｉ）における温度は、０℃近く（例えば、−２℃〜２℃の間）である。
【００２１】
さらに、本発明に従う方法の工程（ｉｉｉ）で適用される温度は、好ましくは、−３０℃〜適用される溶媒の大気圧における沸騰温度の間で変化し得る。より好ましくは、工程（ｉｉｉ）における温度は、大気圧における溶媒の沸騰温度より低い。さらにより好ましくは、工程（ｉｉｉ）における温度は、−３０℃〜８５℃の間、最も好ましくは−１０℃〜４０℃の間、さらにより好ましくは１０℃〜３０℃の間である。なおより好ましくは、工程（ｉｉｉ）における温度は、室温（例えば、１５℃〜２５℃の間）である。
【００２２】
本発明の方法の工程（ｉ）および（ｉｉｉ）で適用される溶媒は、非プロトン性溶媒である。好ましくは、溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。代替法においては、無極性非プロトン性溶媒が、極性非プロトン性溶媒と組み合わせて使用される。好適な溶媒は、テトラヒドロフラン、２−メチル−テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔブチルメチルエーテル、ジ−イソプロピルエーテル、ジ−エチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはトルエンである。本発明の方法の工程（ｉ）および（ｉｉｉ）における好ましい溶媒は、独立して、テトラヒドロフランおよび２−メチル−テトラヒドロフランである。
【００２３】
本発明に従う方法の工程（ｉ）および（ｉｉｉ）で適用される溶媒は、同じかまたは異なり得る。より好ましくは、本発明に従う方法の工程（ｉ）および（ｉｉｉ）で適用される溶媒は、同じである。さらにより好ましくは、工程（ｉ）および（ｉｉｉ）における溶媒は、テトラヒドロフランまたは２−メチル−テトラヒドロフランである。
【００２４】
２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルは、２−ハロプロピオネートエステルと金属亜鉛との間の反応によって得られ得る。亜鉛の活性化は、フュルストナー（第１４章，Ｔｈｅ  Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｏｚｉｎｃ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｋｎｏｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ２８７−３０５，１９９９）によって記述されている。本発明に従う方法において適用される亜鉛は、亜鉛の酸もしくはヨウ素処理によって、または亜鉛塩の還元処理によって、有利には活性化され得る。亜鉛塩の還元処理は、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムまたはジイソブチルアルミニウムヒドリドを用いて行われ得る。
【００２５】
さらに、本発明に従う方法において適用される金属亜鉛の粒径は、好ましくは、可能な限り小さい。より小さい粒子は、より大きな表面積をもたらし、したがって、反応における相互作用を高める。好ましくは、亜鉛粒子は、５０μｍより小さい、より好ましくは１０μｍより小さい、さらにより好ましくは５μｍより小さい直径を有する。このような大きさの亜鉛粒子は、多くの場合、亜鉛ダストと称される。溶媒と組み合わせて、亜鉛は、本発明に従う方法において、多くの場合、懸濁液として存在する。この懸濁液は、レフォルマトスキー反応の間撹拌され得る。
【００２６】
２−ハロプロピオネートエステルと金属亜鉛との間の反応において、亜鉛は、２−ハロプロピオネートに対して１〜３モル当量、好ましくは２−ハロプロピオネートに対して１〜２モル当量、より好ましくは１〜１．２モル当量で適用される。
【００２７】
代替法において、式（ＩＩ）に従う２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルは、好適な金属触媒の存在下における２−ハロプロピオネートエステルとジアルキル亜鉛試薬との反応によって得られ得る。一例として、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００７，１８，９４９−９６２）においてＹａｎｇらにより記述される、ジエチル亜鉛およびニッケル（ＩＩ）アセトアラセトネート（ａｃｅｔａｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）が使用され得る。
【００２８】
本反応に従う方法の工程（ｉｉｉ）においては、無水条件が好ましい。そのような条件は、例えば、窒素またはアルゴンを適用することにより、不活性雰囲気下において作業を行うことにより得られ得る。本発明に従う不活性雰囲気においては、可能な限り少ない水が存在する。当該雰囲気は、それが本発明に従う化学合成において反応しないという点で不活性である。
【００２９】
本発明に従う方法において、式（ＩＩ）に従うエステルの調製（工程（ｉ））および式（ＩＩＩ）に従うケトンの添加（工程（ｉｉ））の順序は、入れ替えられ得る。本発明の１つの実施形態において、ケトンは、２−ハロプロピオネートエステルが亜鉛と反応してレフォルマトスキー試薬を形成した後に添加された（国際公開第２００９０３５６８４号パンフレット）。代替法において、ケトンは既に存在し、２−ハロ亜鉛プロピオネートエステルの調製のための反応物が後から添加される（Ｂａｒｂｉｅｒ条件）。過剰な亜鉛は、工程（ｉ）の完了後であってかつ沈殿が開始する前に除去される。過剰な亜鉛の除去は、濾別によって行われ得る。
【００３０】
レフォルマトスキー反応後、式（Ｉ）に従うエステルの所望のジアステレオマーは、沈殿が可能にされる。エステルを沈殿可能にする要因の１つは、ある時間の間、反応混合物を放置しておくことである。好ましくは、反応物は、最後の試薬の添加後１２時間より長い間、より好ましくは６時間より長い間、さらにより好ましくは２時間より長い間、最も好ましくは０．５時間より長い間置いておかれる。待ち時間の間、反応混合物の撹拌が、従前通り行われ得る。沈殿は、先に得られた所望のジアステレオマーを含有する少量の沈殿物の添加によって高められ得る。さらに、非プロトン性無極性溶媒（例えば、ｔｅｒｔブチルメチルエーテルまたはｎ−ヘプタン）の添加によって、沈殿が刺激され得、収率が改善され得る。
【００３１】
本発明に従う方法の工程（ｉｉｉ）で得られる沈殿物は、濾過によって単離される。その後、有機溶媒（例えば、酢酸エチル）中への抽出によって、エステル（Ｉ）の所望のジアステレオマーが得られる。有利には、この抽出は、水性酸性溶液での処理を含む。任意選択で、その後の酵素的分割工程に先立って、エステル（Ｉ）を含有する有機溶液が濃縮されて固体が得られる。
【００３２】
特に好ましいのは、分割に使用されるエステラーゼ酵素が配列番号４に示されるアミノ酸配列または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログを含む、エステラーゼ活性を有する単離ポリペプチドである、本発明に従う方法である。
【００３３】
【化７】
0006334529.tif 000008
配列番号４に示されるエステラーゼおよびそのホモログは、国際公開第２００９／００４０３９号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１２２１７５号パンフレットに記述されている。
【００３４】
好ましくは、前記エステラーゼ酵素は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有し、より好ましくは配列番号４と少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは９９％を上回る同一性を有する。
【００３５】
さらにより好ましいのは、エステラーゼ酵素が、配列番号２に示されるアミノ酸配列または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するそのホモログを含む、エステラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであり、当該ホモログが、前記配列の２３９位またはそれに対応する位置におけるアミノ酸としてバリンを含有する、本発明に従う方法である。
【００３６】
【化８】
0006334529.tif 000009
配列番号４のエステラーゼ酵素（ＡＰＬＥ）の、前記配列の２３９位におけるロイシンをバリンで置換することによる変異は、国際公開第２０１０／１２２１７５号パンフレットから知られている。
【００３７】
知られているように、アミノ酸の付番は、タンパク質が由来する種に依存する。付番は、欠失または挿入の結果としても変化し得る。しかしながら、どのように配列をアライメントさせるかは当業者に知られている。したがって、本出願では、語句「またはそれに対応する」は、番号以外は配列番号２における２３９位と同じであるアミノ酸位置を記述するために使用される。
【００３８】
好ましくは、エステラーゼ酵素は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有し、より好ましくは配列番号２と少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは９９％を上回る同一性を有する。
【００３９】
このカテゴリーに属する酵素は、主としてブタ肝臓エステラーゼまたはその変異体である。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、工程（ｉｖ）における酵素的分割が、ブタ肝臓エステラーゼまたはその変異体によって、特に配列番号２または４、最も好ましくは配列番号２のエステラーゼ酵素によって行われる、本発明に従う方法に関する。
【００４０】
本出願において、「（参照配列）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するエステラーゼ」とは、そのようなタンパク質が、配列アライメントツール（例えば、ＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２）またはＡｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ  ５（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ））を用いて行われる配列アライメントにおいて決定される場合に、少なくとも９０％については参照配列のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有している、それぞれの参照配列のホモログであることを意味する。
【００４１】
本出願では、ホモログという用語はまた、別の核酸配列と遺伝コードの縮重によって異なってはいるが、同じポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）を含むことも意味する。
【００４２】
配列同一性または類似性は、本明細書において、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性または類似性は、配列の全長にわたって比較されるが、しかしながら、互いにアライメントした配列の一部についてのみ比較されることもあり得る。当該技術分野において「同一性」または［類似性」はまた、場合によっては、そのような配列間のマッチングによって決定されるポリペプチド配列間または核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大のマッチングをもたらすように設計される。本発明との関連において、２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＮＣＢＩおよび他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から公的に入手できるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３−４１０が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを用いたポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを用いた核酸配列比較のための好ましいパラメータは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡフルマトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００４３】
本発明に従う酵素的分割において、いくつかの反応パラメータ（例えば、溶媒、補助溶媒、ｐＨ、温度、および基質濃度）が、反応を最適化するために変更され得る。
【００４４】
一般的に、溶媒は、水と水混和性溶媒（例えば、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール）またはジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトンもしくはジメチルスルホキシド）との混合物、または水および水不混和性溶媒（例えば、芳香族化合物（例えば、トルエンまたはキシレン）、アルカン（例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンまたはシクロヘキサン）またはエーテル（例えば、ジイソプロピルエーテルまたはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル））の二相系であり得る。
【００４５】
本発明に従う酵素的分割における補助溶媒の性質は、非常に重要な役割を果たす。というのは、例えば、２−メチルテトラヒドロフランが使用された場合には、変換が観察されなかったからである。好ましくは、ｔｅｒｔ−ブタノール、酢酸ｔｅｒｔブチル、メチルイソブチルケトンまたはトルエンが、補助溶媒として使用される。より好ましくは、トルエンが、酵素的分割のための補助溶媒として使用される。
【００４６】
酵素活性に対するｐＨの影響は重大ではない。反応溶液のｐＨは、４〜１１の間、好ましくは６〜９の間である。しかしながら、より好ましくは、本発明に従う酵素的分割のためのｐＨ最適条件は、ｐＨ７．５〜８の間の範囲にある。
【００４７】
本発明の変換のための反応温度は、通常、０〜９０℃の間、好ましくは１０〜６０℃の間である。本発明に従う酵素的分割反応は、温度が高いほど速い。しかしながら、酵素活性は、３７℃において経時的に低下する。したがって、酵素的分割反応の間の温度は、より好ましくは２８〜３７℃の間である。
【００４８】
酵素的分割のための基質濃度は、０．１から５０重量パーセントまで、好ましくは１から２５重量パーセントまで、より好ましくは２から１０重量パーセントまで変化し得る。最も好ましくは、基質濃度は、４〜６重量パーセントの間である。
【００４９】
本発明に従うエステラーゼは、任意の形態で使用され得る。エステラーゼは、例えば、分散体の形態、溶液の形態、または固定化された形態で使用され得る。さらに、エステラーゼは、例えば、粗酵素として、市販酵素として、市販調製物からさらに精製された酵素として、知られている精製方法の組み合わせによってその供給源から得られた酵素として、天然にもしくは遺伝子改変を通じて必要とされるエステラーゼ活性を有する（任意選択で透過化および／または固定化された）全細胞の状態で、またはそのような活性を有する細胞の溶解産物の状態で、使用され得る。
【００５０】
酵素的分割工程後に、生成物の単離が、従来の方法（例えば、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィーおよび／または蒸留）によって行われ得る。
【００５１】
本発明に従う方法の工程（ｉｖ）後に得られるエステルは、当該技術分野において知られている方法によって（例えば、アンモニアでの処理によって）対応するアミドに変換され得る。その後、アミドは、例えば国際公開第０３／００２４９８号パンフレットに開示されたように、知られている方法によって、イサブコナゾールまたはラブコナゾールにさらに変換される。アミドは、脱水されて対応するシアニドにされ得、シアニドは、例えばスルフィド塩（例えば、アンモニウムスルフィド）との反応によって、対応するチオアミドに変換され得、最後に、チオアミドは、適切に置換された４−シアノアセトフェノン試薬（例えば、α−ブロモ−４−シアノアセトフェノンなど）との反応によって、イサブコナゾールまたはラブコナゾールに変換され得る。
【００５２】
本発明はさらに、本明細書に記述される本発明に従う方法に従う異なる実施形態および／または好ましい特徴の全ての可能な組み合わせに関する。
【００５３】
本発明を、以下の実施例を参照して説明するが、しかしながら、本発明は、これらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
エステル（Ｉ）のジアステレオマー過剰率をＧＣにより測定した。ＧＣ：ＨＰ−５カラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ）；初期温度：５０℃、０分、１５０℃まで２０℃／分、０分間１５０℃；１９０℃まで１０℃／分、２分間１９０℃；３００℃まで２０℃／分、０分間３００℃；保持時間：２．０６分：プロピオン酸エチル；３．２５分：２−ブロモプロピオン酸エチル；９．１７分：ケトンＩＩ（Ｒ１＝Ｆ）；１２．８２分：ＲＳ／ＳＲ−エステルＩ；１２．９０分：ＲＲ／ＳＳ−エステルＩ
ＲＲ／ＳＳ−エステルＩの１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ＝１．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），３．３０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ），６．９５（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
ＲＳ／ＳＲ−エステルＩの１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ＝０．９８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．４１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｍ，２Ｈ），４．６１（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），６．９７（ｍ，３Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【００５５】
比較例Ａ：有機リチウムカップリングによるラセミ体エステル（Ｉ）の調製
ａ）テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のリチウム−ジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）のストック溶液の調製：
ジイソプロピルアミン（７１６ｍｇ、７．１ｍｍｏｌ、１．０５当量）を無水ＴＨＦ（２１．３ｍＬ）に溶解させ、結果として生じた溶液を窒素雰囲気下で−７８℃まで冷却した。その後、ｎ−ＢｕＬｉ（ｎ−ヘプタン中２．７Ｍ溶液、２．５ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ、１．０当量）を１５分かけて滴下様式で添加し、この反応混合物をさらに１５分間−７８℃で攪拌した。次いで、溶液を０℃まで温め、３０分間攪拌した後に、このストック溶液を再び−７８℃まで冷却した。
【００５６】
ｂ）カップリング反応：
そうして得られたＬＤＡ溶液（３．６６ｍＬ、０．９８ｍｍｏｌ、１．１当量）を、シュレンク容器に移し、プロピオン酸エチル（１００ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、１．１当量）を窒素雰囲気下において−７８℃にて滴下様式で添加した。結果として生じた混合物を−７８℃で３０分間攪拌し、次いでＴＨＦ（３．６６ｍＬ）中の１−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）エタノン（２００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１．０当量）を１５分かけて滴下様式で添加した。この反応混合物を、−７８℃で２時間攪拌し、次いで酢酸でクエンチし、室温まで温めた。混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水および酢酸エチルで希釈した。水層を酢酸エチル（２×）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、所望のＲＲ／ＳＳジアステレオマーを選好して２９％のジアステレオマー過剰率を有するラセミ体エステルＩを含有する黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ  ６０／４０／５  ｖ／ｖ／ｖ）によるさらなる精製により、合わせた全収量１７９ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ、６１％）で、ＲＲ／ＳＳジアステレオマー（淡黄色固体）およびＲＳ／ＳＲジアステレオマー（オフホワイト固体）を得た。
【００５７】
比較例Ｂ：ケトンが既に存在する（Ｂａｒｂｉｅｒ条件）高温での工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に従うレフォルマトスキー反応
冷却器付き二つ口フラスコに亜鉛（１．１ｇ、１７ｍｍｏｌ、３．８当量）を投入し、ホットガンを用いて真空中で加熱した（３回の窒素−真空サイクル）。その後、ＴＨＦ（６０ｍＬ）を添加し、次いでトリメチルシリルクロリド（０．１５ｍＬ）を添加した。結果として生じた懸濁液を室温にて１５分間窒素雰囲気下で撹拌した後に、ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ、１．０ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を添加した。次いで、この反応混合物を６６℃に加熱した後に、加熱源を除去した。その後、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２−ブロモプロピオン酸エチル（０．８７ｍＬ、１．２ｇ、６．７ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を、１０分かけて滴下した。次いで、反応混合物を６６℃で１．５時間撹拌した後に、これを室温まで冷却した。反応物を、飽和アンモニウムクロリド水溶液（１００ｍＬ）の添加によってクエンチし、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１００ｍＬ）で希釈した。層を分離し、水層をＭＴＢＥ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、ラセミ体エステルＩを含有する黄色油状物（１．４ｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲおよびＧＣ分析により、８０％のケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ）の変換率および所望のＲＲ／ＳＳ−ジアステレオマーを選好して６０％のエステルＩのｄ．ｅ．が示された。生成物をさらには精製しなかった。
【００５８】
実施例１：ケトンへの添加が後に続く低温でのレフォルマトスキー試薬の事前形成を用いた工程（ｉｉｉ）に従うレフォルマトスキー反応
ａ）レフォルマトスキー試薬のストック溶液の調製：
二つ口フラスコに、窒素雰囲気下で亜鉛（５．８ｇ、８９ｍｍｏｌ、２．０当量）を投入し、無水ＴＨＦ（１０１ｍＬ）、次いでトリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ、１．１２ｍＬ）を添加した。結果として生じた懸濁液を、室温で３０分間撹拌し、次いで０℃まで冷却した。その後、２−ブロモプロピオン酸エチル（５．８ｍＬ、８．１ｇ、４４．７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、３０分かけて滴下様式で懸濁液に添加した。この反応混合物をさらに１５分間撹拌し、次いで、窒素雰囲気下でシュレンク容器中に濾過して残留亜鉛を除去した。
【００５９】
ケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ、１．０ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１．０当量）をシュレンク容器に投入し、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を窒素雰囲気下で添加した。結果として生じた溶液に、２０ｍＬの先に調製したレフォルマトスキー試薬ストック溶液（前記参照、８．３６ｍｍｏｌ、１．９当量）を、撹拌しながら室温で３０分かけて滴下様式で添加した。添加の完了後、結果として生じた反応混合物を、窒素雰囲気下で３６時間撹拌した（透明溶液）。ＧＣ分析により、ケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ）に基づき８０％の変換率、および所望のＲＲ／ＳＳジアステレオマーを選好して６０％のｄ．ｅ．で、エステルＩ（Ｒ１＝Ｆ）が形成したことが示された。反応混合物を真空中で１０ｍＬの体積まで濃縮した後に、固体の形成が観察されるまでｎ−ヘプタンを添加した。結果として生じた懸濁液を１６時間撹拌した後に、固体を濾過によって単離した。次いで、固体をＨＣｌ水（ｐＨ＝１）と酢酸エチルとの混合物に溶解させて、透明な二相系を結果としてもたらした。相を分離し、水層を酢酸エチル（２×）で抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、ＧＣにより決定される場合に＞９９％ｄ．ｅ．を有するラセミ体ＲＲ／ＳＳエステルＩ（Ｒ１＝Ｆ）を淡黄色固体として得た。
【００６０】
実施例２：ケトンの添加に先立つ亜鉛除去を用いた工程（ｉｉｉ）に従うレフォルマトスキー反応
亜鉛（１１．７ｇ、１７９ｍｍｏｌ、４．０当量）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、２５０ｍＬ３つ口フラスコ中で、窒素雰囲気下において周囲温度で３０分間、ＴＭＳＣｌ（２．２５ｍＬ）の存在下で撹拌した。その後、懸濁液を０℃まで冷却し、２−ブロモプロピオン酸エチル（１１．６ｍＬ、８９．６ｍｍｏｌ、２．０当量）を４５分かけてシリンジポンプによって添加した。この反応混合物を０℃でさらに１５分間撹拌した（変換が１００％であることがＧＣにより確認された）後に、懸濁液をカニューレを介してガラスフィルターに通して窒素流下において反応容器（５００ｍＬ三つ口フラスコ）に濾過した。その後、ＴＨＦ（１３０ｍＬ）中のケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ、１０ｇ、４４．８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、室温で１時間かけて反応混合物に添加した。混合物をさらに７２時間撹拌した時点で固体が形成した。懸濁液を濾過し、オフホワイト固体をＥｔＯＡｃに懸濁し、水およびＨＣｌ水の添加によって、透明な二相系が得られるまで溶解させた（ｐＨ１）。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、ＧＣにより決定される場合に＞９９％ｄ．ｅ．を有するラセミ体ＲＲ／ＳＳエステルＩ（Ｒ１＝Ｆ、８．８ｇ、２７ｍｍｏｌ、６０％）を淡黄色固体として得た。濾液を同様の水性後処理に供した。ＧＣ分析により、濾液中には残存ケトンおよび（所望されないＲＳ／ＳＲジアステレオマーを選好して）−２５％のｄ．ｅ．を有するラセミ体エステルＩが存在することが示された。
【００６１】
実施例３：ケトンの添加後であるが沈殿の開始前における亜鉛除去を用いた工程（ｉｉｉ）に従うレフォルマトスキー反応
亜鉛（９８ｇ、１．５ｍｏｌ、４．０当量）をＴＨＦ（１．７Ｌ）に懸濁し、窒素雰囲気下において周囲温度で３０分間、ＴＭＳＣｌ（１８．７ｍＬ）の存在下で機械的に撹拌した。その後、懸濁液を０℃まで冷却し、２−ブロモプロピオン酸エチル（９６．６ｍＬ、７４４ｍｍｏｌ、２．０当量）を１時間かけてシリンジポンプによって添加した。この反応混合物を０℃で１５分間撹拌した（変換が１００％であることがＧＣにより確認された）後に、ＴＨＦ（８３０ｍＬ）中のケトンＩＩＩ（Ｒ１＝Ｆ、８３ｇ、３７２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、室温で２０分かけて添加した。この混合物を、さらに１５分間撹拌し（変換が＞９０％であることがＧＣにより確認された）、次いでセライトに通して濾過した。ＧＣにより、反応混合物のｄ．ｅ．は、６０％であることが決定された。反応混合物を撹拌すると、５時間後に懸濁液が形成し始めた。懸濁液を８８時間撹拌した時点で、母液のｄ．ｅ．は、（所望されないＲＳ／ＳＲジアステレオマーを選好して）−１０％まで低下した。懸濁液を濾過し、オフホワイトの固体をＭＴＢＥ（２×１２５ｍＬ）で洗浄した。その後、固体をＥｔＯＡｃ（２．１Ｌ）に懸濁し、水（１．２５Ｌ）およびＨＣｌ水（１０％ｗ／ｗ；７６ｇ）の添加によって、透明な二相系が得られるまで溶解させた（ｐＨ１．３）。層を分離し、有機層をＨＣｌ水（１．１Ｌ、ｐＨ１．１）、ＮａＨＣＯ３水（０．６０ｇのＮａＨＣＯ３を含有する５００ｍＬ）、水（２×２５０ｍＬ）およびブライン（２５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮して、９７％ｄ．ｅ．でラセミ体ＲＲ／ＳＳ−エステルＩ（５４ｇ、１６７ｍｍｏｌ、４５％）を得た。
【００６２】
実施例４：工程（ｉｖ）に従う酵素的分割
リン酸カリウム緩衝溶液（５００ｍＬ、５０ｍＭ、ｐＨ７．８）に、配列番号１のエステラーゼ（１０ｇ、国際公開第２０１０／１２２１７５号パンフレットに記述されるように調製された、配列番号２のエステラーゼをコードする配列番号１の組換えエステラーゼ遺伝子を発現させるエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）全細胞）を含有する懸濁液（１００ｍＬ）を添加した。ｐＨを７．８に合わせ、その後、トルエン（４００ｍＬ）中のラセミ体ＲＲ／ＳＳエステルＩ（Ｒ１＝Ｆ、４０ｇ、１２３ｍｍｏｌ、９７％ｄ．ｅ．）の溶液を添加した。結果として生じた混合物を、ＮａＯＨ（１Ｍ、水溶液）での滴定によってｐＨを７．８で維持しながら、２８℃で撹拌した。ＨＰＬＣによる分析により、Ｒ，Ｒ−エステルＩのｅ．ｅ．が、２２時間後に９８．５％であることが示された。反応物を２６時間後に下記のように後処理した。２：１および３：１のＳ／Ｃ比での反応は、共に２０時間以内に終了したことに注意されたい；Ｒ，Ｒ−エステルＩのｅ．ｅ＞９９％。
【００６３】
【化９】
0006334529.tif 000010
後処理：
Ｄｉｃａｌｉｔｅ  ４２０８（２０ｇ）を反応混合物に添加し、結果として生じた懸濁液を５分間撹拌した。その後、この混合物を、プレコートされた（ｄｉｃａｌｉｔｅ  ４１０８）ガラスフィルターに通して濾過した。濾過ケークをトルエン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、合わせた濾液を分離した。この段階で、トルエン層は僅かに乳化していたので、プレコートフィルターに通す別の濾過を行った。結果として生じた二相濾液を分離し、水層を先に得られた水相に添加した。次いで、合わせた水層をトルエン（２５０ｍＬ）で抽出して、完全に乳化した有機相を得た。トルエン層をプレコートフィルターに２回通して濾過すると、透明な二相系が得られた。層を分離し、合わせた有機層をＮａＨＣＯ３水（１００ｍＬ、５重量％）で洗浄した。最後に、有機層を真空中で濃縮して、Ｒ，Ｒ−エステルＩをオフホワイト固体として得た。
【００６４】
こうして得られたプロトコルを用いて、２１０ｇのラセミ体ＲＲ／ＳＳ−エステルＩ（ｄ．ｅ．９７％）を、各々４０〜４５グラムの出発物質を含有する５つのバッチで変換した。エナンチオピュアーなエステルＲ，Ｒ−エステルＩ（ｄ．ｅ．９５％；ｅ．ｅ．＞９９．５％）を、４８％収率（１０１ｇ、３１１ｍｍｏｌ）で単離した。
【００６５】
分析：
キラルＨＰＬＣによって、エステルＩのｅ．ｅ．の決定を行った。ラセミ体ＲＲ／ＳＳ−エステルＩのエナンチオマーおよび対応するカルボン酸のエナンチオマーを分離する、単一の方法を開発した：
カラムＤａｉｃｅｌ  ＡＤ、２×５０×４．６ｍｍ内径、粒径：１０μｍ、溶離剤：ヘプタン／ＭｅＯＨ／ＥｔＯＨ  ９５：２．１：２．９  ｖ／ｖ／ｖ＋０．０５％トリフルオロ酢酸＋０．０５％ジエチルアミン；運転時間：１５分、圧力：１０バール、流量：１．８ｍＬ／分、温度：２０℃、２１０ｎｍでのＵＶ検出。保持時間：ＳＳ−エナンチオマーエステルＩ：２．１５分；ＳＳ−エナンチオマーカルボン酸：３．０２分；ＲＲ−エナンチオマーカルボン酸：４．３１分；ＲＲ−エナンチオマーエステルＩ：８．２１分。
【００６６】
エステルＩおよびカルボン酸の両方の濃度をＨＰＬＣによって測定することにより、変換率を確認した：
カラムＨｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ−３、２５０×４．６ｍｍ内径、粒径、５μｍ、溶離剤Ａ：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ中０．１５％ギ酸および０．０２５％トリエチルアミン；溶離剤Ｂ：アセトニトリル中０．１５％ギ酸および０．０２５％トリエチルアミン、勾配Ａ：Ｂ＝１０分かけて９５：５（ｖ／ｖ）〜５：９５、５：９５で５分間維持、３分かけて９５：５まで、９５：５で５分間維持（ｔ＝２３分）。流量：１．０ｍＬ／分、温度：４０℃、２１０ｎｍでのＵＶ検出。保持時間：カルボン酸：９．５５分；エステルＩ  １２．３５分。
【００６７】
実施例５：酵素スクリーニング
エステルＩの加水分解のための２００種を超えるヒドロラーゼ酵素（リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ）のスクリーニングにおいて、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中の各個々の酵素２２５μｌを、最終体積２５０μｌでｔｅｒｔ−ブタノールに溶解させた２ｍｇのエステルＩと共に蓋締めしたガラスバイアル中でインキュベートし、ＩＫＡ  ＫＳ  １３０シェーカー（ＩＫＡ，Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上において４００ｒｐｍで２８℃にてインキュベートした。一晩のインキュベーション後に、４０μｌの０．５Ｍリン酸を各バイアルに添加し、その後、７１０μｌのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で希釈し、ＪＳ−５．３ローターを備えたＡｖａｎｔｉ  Ｊ−２０ＸＰＩ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【００６８】
残存エステルおよび結果として生じたカルボン酸の両方のエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）を、（上記のように）ＨＰＬＣにより決定した。これらの２つのｅ．ｅ．値の比較によって、変換率を算出した。
変換率＝［ｅ．ｅ．エステル／（ｅ．ｅ．エステル＋ｅ．ｅ．カルボン酸）］＊１００％
【００６９】
この大きなヒドロラーゼコレクションから、８種の組換えブタ肝臓エステラーゼのみが、エステルＩの所望されないエナンチオマーを選択的に加水分解し得た（表１）。
【００７０】
【表１】
0006334529.tif 000011
【００７１】
この実施例は、いくつかの組換えブタ肝臓エステラーゼがエステルＩをエナンチオ選択的に加水分解することを示している。配列番号４、６、８、１０または１２を示すエステラーゼ酵素は、国際公開第２００９／００４０９３号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１２２１７５号パンフレットにおける記述に従う前記エステラーゼをコードするそれぞれ配列番号３、５、７、９または１１の組換えエステラーゼ遺伝子を発現させるエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞を用いて調製され得る。
【００７２】
実施例６：組換えブタ肝臓エステラーゼの再試験
最初の酵素スクリーニングの結果に基づき、５種の酵素を２５０ｍｇスケールでの再試験のために選択した。酵素の選択は、エステルＩに対する活性および選択性に基づいた。各個々の反応について、２５０ｍｇのエステルＩを、１ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノールに溶解させた。その後、５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５およびそれぞれの過剰発現された組換えブタ肝臓エステラーゼを含有する４ｍｌの無細胞抽出物を、エステルＩ１ｍｇ当たり１ｍｇの総タンパク質の酵素／基質比で、Ｍｅｔｒｏｈｍ  ７１８  ＳＴＡＴ  Ｔｉｔｒｉｎｏｓ（Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に加えた。１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５で一定に維持した。定期的な時点で、残存エステルおよび結果として生じたカルボン酸の両方のエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）について試料を分析した。このエナンチオマー過剰率は、（上記のように）ＨＰＬＣにより決定した。変換率を、これらの２つのｅ．ｅ．値の比較によって算出した。その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
個々のエステラーゼ反応のエナンチオ選択性（Ｅ）を、式：
Ｅ＝ｌｎ（（１−（変換率／１００）＊（１＋（ｅ．ｅ．酸／１００））））／ｌｎ（（１−（変換率／１００）＊（１−（ｅ．ｅ．酸／１００））））
に従って変換率および生成したカルボン酸のｅ．ｅ．から算出し、表３に示した。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
配列番号２の組換えブタ肝臓エステラーゼは、５時間後の変換率５０％、エステルＩについてのｅ．ｅ．９９．５％、およびＥ＞５００の優れたエナンチオ選択性を以って、最善の候補と確認された。
【００７７】
実施例７：ブタ肝臓エステラーゼ反応に対する溶媒の影響
配列番号２のブタ肝臓エステラーゼによるエステルＩの加水分解に対する有機溶媒の影響を、国際公開第２０１０／１２２１７５号パンフレットに記述されるように作製された、配列番号１の遺伝子を発現させる組換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を用いて調査した。０．５ｇのエステルＩに、７．５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８、（１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８中の）配列番号１のエステラーゼを含有する０．１ｇの湿潤組換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞および２．５ｍｌの有機溶媒を、２８℃で添加した。別個の反応において、トルエン、メチル−イソブチルケトン、酢酸ｔｅｒｔブチルまたは２−メチル−テトラヒドロフランのいずれかを、有機溶媒として添加した。コントロールとして、２．５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８を、有機溶媒の代わりに添加した。
【００７８】
１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．８で一定に維持した。定期的な時点で、残存エステルおよび結果として生じたカルボン酸の両方のエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）について試料を分析した。このエナンチオマー過剰率は、（上記のように）ＨＰＬＣにより決定した。変換率を、（上記のように）これらの２つのｅ．ｅ．値の比較によって算出した。その結果を表４に示す。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
溶媒酢酸ｔｅｒｔブチルおよび特にトルエンは、エステルＩ加水分解の速度に対する明確な好ましい影響を有していた。トルエンの場合は、２２時間後に５０．０％の変換率および９９．２％のｅ．ｅ．でエステルＩが得られる。
【配列表】
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