(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に対する粘膜免疫応答を必要とするヒト対象において病原体に対する粘膜免疫応答を刺激するための組成物であって、
負帯電不活化形態の該病原体、および
正電荷を有する１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含み、該１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ前記不活化形態の病原体に静電引力によって付着しており、
前記１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ＰＬＨ−ＰＥＧ）トリブロックコポリマーを含み、
前記組成物が、粘膜経路を介してヒト対象に投与される、組成物。
【請求項２】
病原体が細菌、ウイルス、寄生生物または真菌である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
病原体が、クラミジアトラコマチス（Chlamydia trachomatis）、不活化野兎病菌（Francisella tularensis）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、フレキシネル赤痢菌（Shigella flexneri）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
病原体が、アクチノミセス属（Actinomyces）、アナベナ属（Anabaena）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、ブデロビブリオ属（Bdellovibrio）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロロビウム属（Chlorobium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サイトファーガ属（Cytophaga）、ディノコッカス属（Deinococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ヘリコバクター属（Heliobacter）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ハイフォミクロビウム属（Hyphomicrobium）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptspirosis）、リステリア属（Listeria）、髄膜炎菌（Meningococcus）Ａ、ＢおよびＣ、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロバクター属（Nitrobacter）、オシラトリア属（Oscillatoria）、プロクロロン属（Prochloron）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ホドスピリルム属（Phodospirillum）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、スピリルム属（Spirillum）、スピロヘータ属（Spirochaeta）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、スルホロブス属（Sulfolobus）、サーモプラスマ属（Thermoplasma）、チオバチルス属（Thiobacillus）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、ならびにエルシニア属（Yersinia）からなる群から選択される細菌である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
病原体がクラミジアトラコマチスである、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
病原体が野兎病菌（Francisella tularensis）である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
病原体がヒト型結核菌である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
病原体が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択されるウイルスである、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
病原体がヒト呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ノロウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスである、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
粘膜経路が、眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路から選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、Endo-Porterペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がＴｏｌｌ様受容体アゴニストを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストがＲ８４８である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストが非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
粘膜投与に適した形態にある、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がモノホスホリル脂質Ａを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
病原体に対する粘膜免疫応答を必要とする対象において病原体に対する粘膜免疫応答を刺激する方法を実施するための薬剤を調製するための組成物の使用であって、
該方法は前記組成物を粘膜経路を介して対象に投与することを含み、
前記組成物は、
負帯電不活化形態の該病原体、および
正電荷を有する１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含み、該１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ前記不活化形態の病原体に静電引力によって付着しており、
前記１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック−ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ＰＬＨ−ＰＥＧ）トリブロックコポリマーを含む、
前記使用。
【請求項１８】
病原体が細菌、ウイルス、寄生生物または真菌である、請求項1７記載の使用。
【請求項１９】
病原体が、アクチノミセス属（Actinomyces）、アナベナ属（Anabaena）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、ブデロビブリオ属（Bdellovibrio）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロロビウム属（Chlorobium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サイトファーガ属（Cytophaga）、ディノコッカス属（Deinococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ヘリコバクター属（Heliobacter）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ハイフォミクロビウム属（Hyphomicrobium）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptspirosis）、リステリア属（Listeria）、髄膜炎菌（Meningococcus）A、BおよびC、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロバクター属（Nitrobacter）、オシラトリア属（Oscillatoria）、プロクロロン属（Prochloron）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ホドスピリルム属（Phodospirillum）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、スピリルム属（Spirillum）、スピロヘータ属（Spirochaeta）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、スルホロブス属（Sulfolobus）、サーモプラスマ属（Thermoplasma）、チオバチルス属（Thiobacillus）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、ならびにエルシニア属（Yersinia）からなる群から選択される細菌である、請求項1７記載の使用。
【請求項２０】
病原体がクラミジアトラコマチスである、請求項1７記載の使用。
【請求項２１】
病原体が野兎病菌（Francisella tularensis）である、請求項1７記載の使用。
【請求項２２】
病原体がヒト型結核菌である、請求項1７記載の使用。
【請求項２３】
病原体が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択されるウイルスである、請求項１７記載の使用。
【請求項２４】
病原体がヒト呼吸器合胞体ウイルスである、請求項1７記載の使用。
【請求項２５】
病原体がSARSコロナウイルスである、請求項1７記載の使用。
【請求項２６】
病原体がノロウイルスである、請求項1７記載の使用。
【請求項２７】
病原体がヒト免疫不全ウイルスである、請求項1７記載の使用。
【請求項２８】
粘膜経路が、眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路から選択される、請求項１７〜２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
１つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、Endo-Porterペプチドを含む、請求項１７〜２８のいずれか一項記載の使用。
【請求項３０】
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、請求項１７〜２８のいずれか一項記載の使用。
【請求項３１】
Toll様受容体アゴニストがR848である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
Toll様受容体アゴニストが非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項３０記載の使用。
【請求項３３】
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がモノホスホリル脂質Aを含む、請求項１７〜２８のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2013年3月14日に出願された米国特許出願第61/783,439号への優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府資金援助を受けた研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたNIH/RO1AI069259およびNIH/RO1AI072252の下、政府支援を受けて成されたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、ナノ粒子を含む組成物およびアジュバント組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
粘膜は、体内で最大の器官の1つであり、消化管、泌尿生殖管および気道の内層を含む。これらの粘膜は、体内に位置しているが、実際には、外部環境と、全身環境として知られる無菌内部体腔との間の物理的バリヤである。したがって、粘膜の重要な機能は、侵入する病原体を無菌体腔の外に維持することである。事実、細菌、ウイルス、寄生生物および真菌を含むヒト病原体の大多数が粘膜表面で感染を開始する（Ogra et al., Clin Microbiol Rev. 14(2):430-45, 2001（非特許文献1））。
【０００５】
粘膜免疫は重要である。理由は、粘膜免疫応答の刺激が、粘膜環境および全身環境の両方において防御B細胞およびT細胞の産生を生じさせて、病原体が内部体腔に侵入する前に感染を止めることができるからである（たとえば、McCluskie et al., Microbes Infect. 1(9):685-98; 1999（非特許文献2）； Rosenthal et al., Semin Immunol. 9(5):303-14, 1997（非特許文献3）を参照）。その重要な役割にもかかわらず、粘膜免疫系を特異的に標的化するワクチンは非常に少ない。
【０００６】
ワクチン接種は受動的または能動的のいずれかであることができる。規範的には、能動ワクチン接種は、個体の免疫系を、内因性免疫応答を誘発して抗原特異的ナイーブ白血球の活性化を生じさせる（その後、抗体分泌B細胞または抗原特異的エフェクターT細胞およびメモリーT細胞につながる）1つまたは複数の異物分子に暴露することを含む。この手法は、同じ抗原性物質への新たな暴露によってときどきブーストすることができる長命な防御免疫を生じさせることができる。能動ワクチン接種に対する良好な免疫応答の長寿命の見込みが、大部分の臨床設定において、この戦略を、事前に形成された抗体または抗体特異的エフェクターリンパ球をレシピエントに注射する受動ワクチン接種（速やかな防御を与えることはできるが、一般に、持続性の免疫を確立しない）よりも望ましいものにする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ogra et al., Clin Microbiol Rev. 14(2):430-45, 2001
【非特許文献２】McCluskie et al., Microbes Infect. 1(9):685-98; 1999
【非特許文献３】Rosenthal et al., Semin Immunol. 9(5):303-14, 1997
【発明の概要】
【０００８】
概要
本開示は、少なくとも部分的に、不活化病原体に付着した1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含む新規な組成物の開発に基づく。たとえば、新規な組成物は、不活化病原体、たとえば細菌、たとえばクラミジアトラコマチス（Chlamydia trachomatis）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、フレキシネル赤痢菌（Shigella flexneri）もしくはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、またはウイルス、たとえばヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）もしくはC型肝炎ウイルスと、1つまたは複数のアジュバント、たとえばToll様受容体アゴニスト、たとえばイミダゾキノリンレシキモド（R-848）、モノホスホリル脂質Aもしくは非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドまたはエンドソーム膜標的化剤、たとえばEndo-Porterペプチドを添加されている1つまたは複数のポリマーナノ粒子とを含む。ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーによって形成されることができる。アジュバント添加ナノ粒子の1つまたは複数は不活化病原体それぞれに結合している。これらの組成物は、特に対象の粘膜に投与されたとき、特定の病原体によって引き起こされる疾患を予防および／または治療するためのワクチンとして有用である。
【０００９】
同じく本明細書に提供されるものは、対象において、本明細書に記載される新規なワクチン組成物を粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃投与によって、または吸入、たとえば肺もしくは気管支、胃、腸管、直腸、膣もしく尿路経路によって対象に投与することにより、病原体、たとえば細菌、ウイルス、寄生生物または真菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法である。
【００１０】
いくつかの態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、表面電荷を有し、静電引力によって不活化病原体に付着する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体上の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドを介して不活化病原体に付着する。
【００１１】
たとえば、1つまたは複数のR848添加ポリマーナノ粒子に付着した不活化クラミジアトラコマチスを含むクラミジアトラコマチスワクチン組成物が作製され、マウスモデルにおいて評価されている。不活化クラミジアトラコマチスのみでは免疫寛容が誘導されるが、新規なクラミジアトラコマチスワクチン組成物は、粘膜経路を介して、たとえば鼻腔内または子宮内投与されると、その後のクラミジアトラコマチス感染を予防するのに有効であった。現在、クラミジアトラコマチス感染に対してヒトにおける使用に利用可能なワクチンはない。したがって、これらの新規なクラミジアトラコマチスワクチン組成物は、ヒトにおけるクラミジアトラコマチス感染に対する有望な新規予防および治療ワクチンである。
【００１２】
概して、1つの局面において、本開示は、粘膜免疫応答を必要とする対象において、1つまたは複数の異なるタイプの病原体、たとえばクラミジアトラコマチスまたは野兎病菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法に関する。方法は、不活化形態の病原体、および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含む組成物を対象に投与する工程を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子はそれぞれ不活化病原体に付着している。
【００１３】
これらの方法において、病原体は細菌、ウイルス、寄生生物および／または真菌であることができ、組成物は、1つまたは複数の粘膜経路、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣および／または尿路経路を介して対象に投与されることができる。
【００１４】
これらの方法のいくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含むこともできるし、Toll様受容体アゴニスト、たとえばR848、モノホスホリル脂質Aまたは非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドを含むこともできる。
【００１５】
特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック−ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。いくつかの態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化病原体に付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、1つまたは複数のリンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンおよび／または抗微生物性ペプチドを介して不活化病原体に付着している。
【００１６】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるものは、対象において、アクチノミセス属（Actinomyces）、アナベナ属（Anabaena）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、ブデロビブリオ属（Bdellovibrio）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロロビウム属（Chlorobium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サイトファーガ属（Cytophaga）、ディノコッカス属（Deinococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ヘリコバクター属（Heliobacter）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ハイフォミクロビウム属（Hyphomicrobium）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptspirosis）、リステリア属（Listeria）、髄膜炎菌（Meningococcus）A、BおよびC、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロバクター属（Nitrobacter）、オシラトリア属（Oscillatoria）、プロクロロン属（Prochloron）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ホドスピリルム属（Phodospirillum）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、スピリルム属（Spirillum）、スピロヘータ属（Spirochaeta）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、スルホロブス属（Sulfolobus）、サーモプラスマ属（Thermoplasma）、チオバチルス属（Thiobacillus）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、ならびにエルシニア属（Yersinia）からなる群から選択される細菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法である。いくつかの態様においては、対象において、クラミジアトラコマチスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの態様においては、対象において、野兎病菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの態様においては、対象において、ヒト型結核菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００１７】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるものは、対象において、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択されるウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法である。いくつかの態様においては、対象において、ヒト呼吸器合胞体ウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの態様においては、対象において、SARSコロナウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの態様においては、対象において、ノロウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。いくつかの態様においては、対象において、ヒト免疫不全ウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００１８】
もう1つの大きな局面において、本開示は、1つまたは複数の異なるタイプの不活化病原体、たとえばクラミジアトラコマチスまたは野兎病菌；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ付着機構を介して不活化病原体に付着している、組成物を含む。これらの組成物において、不活化病原体は、不活化細菌、不活化ウイルス、不活化寄生生物および／または不活化真菌であることができる。たとえば、不活化病原体は、クラミジアトラコマチス、野兎病菌、ヒト型結核菌、肺炎連鎖球菌、リステリア菌、コレラ菌、ソンネ赤痢菌、フレキシネル赤痢菌および／またはネズミチフス菌からなる群から選択される不活化細菌であることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、1つまたは複数の異なるタイプの不活化病原体、たとえばクラミジアトラコマチスまたは野兎病菌；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子からなり、または本質的にそれらからなり、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ付着機構を介して不活化病原体に付着している。
【００１９】
いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、Toll様受容体アゴニストはR848または非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドであることができる。
【００２０】
様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック−ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化病原体に付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化病原体に付着している。
【００２１】
組成物は、本明細書でさらに詳細に説明するように、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。
【００２２】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、ブデロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファーガ属、ディノコッカス属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリウム属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、髄膜炎菌A、BおよびC、メタノバクテリウム属、ミクロコッカス属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ミキソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ホドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、スピリルム属、スピロヘータ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属、スルホロブス属、サーモプラスマ属、チオバチルス属、トレポネーマ属、ビブリオ属、ならびにエルシニア属からなる群から選択される不活化細菌を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化クラミジアトラコマチスを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化野兎病菌を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化ヒト型結核菌を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択される不活化ウイルスを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルスを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化SARSコロナウイルスを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化ノロウイルスを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物は不活化ヒト免疫不全ウイルスを含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本開示は、不活化クラミジアトラコマチス；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化クラミジアトラコマチスに付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントはR848である。様々な態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化クラミジアトラコマチスに付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化クラミジアトラコマチスに付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてクラミジアトラコマチスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００２５】
いくつかの態様において、本開示は、不活化野兎病菌；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化野兎病菌に付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントはR848である。様々な態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化野兎病菌に付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化野兎病菌に付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象において野兎病菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００２６】
いくつかの態様において、本開示は、不活化ヒト型結核菌；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化ヒト型結核菌に付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントはモノホスホリル脂質Aである。様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化ヒト型結核菌に付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化ヒト型結核菌に付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてヒト型結核菌に対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００２７】
いくつかの態様において、本開示は、不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルスに付着している、組成物を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントはR848である。様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルスに付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルスに付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてヒト呼吸器合胞体ウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示は、不活化SARSコロナウイルス；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化SARSコロナウイルスに付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントは非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである。様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化SARSコロナウイルスに付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化SARSコロナウイルスに付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてSARSコロナウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００２９】
いくつかの態様において、本開示は、不活化ノロウイルス；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化ノロウイルスに付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントは非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである。様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化ノロウイルスに付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化ノロウイルスに付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてノロウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００３０】
いくつかの態様において、本開示は、不活化ヒト免疫不全ウイルス；および1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含み、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化ヒト免疫不全ウイルスに付着している、組成物を含む。いくつかの実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、エンドソーム膜および／またはToll様受容体アゴニストを標的化するアジュバントを含む。たとえば、アジュバントは、R848、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Aの1つまたは複数であることができる。いくつかの態様において、アジュバントはモノホスホリル脂質Aである。様々な実施態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーでできていることができる。特定の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は静電引力によって不活化ヒト免疫不全ウイルスに付着している。他の態様において、1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子は、リンカー、たとえば付着機構、たとえば不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドの1つまたは複数を介して不活化ヒト免疫不全ウイルスに付着している。組成物は、粘膜投与、たとえば眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介する投与に適した形態に設計されることができる。いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物を投与することによって対象においてヒト免疫不全ウイルスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法が提供される。
【００３１】
本明細書の中で使用される「病原体」とは、そのホスト中で疾患を引き起こす感染性物質である。病原体は、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌または他の微生物性感染性物質であることができる。
【００３２】
本明細書の中で使用される「ナノ粒子」とは、500nm〜0.5nm未満の範囲の、たとえば50〜500nmである直径を有する粒子である。
【００３３】
本明細書の中で使用される語「アジュバント」とは免疫学的アジュバントをいう。この語は、病原体に対する免疫系の応答を増強または促進することができ、それにより、対象において免疫応答または一連の免疫応答を誘導する化合物または組成物を意味する。アジュバントは、たとえばデポ剤を形成することによって組成物の効果を促進する（組成物の半減期を延ばす）、さらなるT細胞ヘルプを提供する、および／またはサイトカイン産生を刺激することができる。
【００３４】
本発明の中で使用される「対象」とは、動物、たとえば哺乳動物、たとえばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギまたはマウスである。
【００３５】
本明細書の中で使用される「処置」は予防的または治療的であることができる。予防的処置は、感染性病原体から疾患を発症する危険にある対象を処置するために使用することができる。感染性風土病の地域に旅行する、または住む個人は、特定の感染性病原体の危険にあり、それに対する予防的ワクチン接種の候補者であるとみなされ得る。ワクチンによる治療的処置は、感染した病原体に対する対象の免疫応答を開始または増強するために使用することができる。
【００３６】
本明細書の中で概して使用される「有効量」とは、処置を受ける対象において防御免疫応答を誘導するのに十分である量である。実際の有効ワクチン量は、利用される具体的な病原体およびアジュバント、調合される具体的なワクチン組成物、投与形態およびワクチン接種を受ける対象の年齢、体重、状態ならびに投与経路および疾患もしくは障害にしたがって異なることができる。
【００３７】
本明細書の中で使用される「免疫刺激性」とは、物質が免疫系に対して刺激効果を有することをいう。そのような物質は、免疫応答の様々な局面、たとえばサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化およびT細胞増殖を示す標準的なアッセイ法を使用して容易に同定することができる。たとえば、WO97/28259；WO98/16247；WO 99/11275；Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549；Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-76；Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-45；Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-39；Sato et al. (1996) Science 273:352-354；Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423；Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816；Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-75；Roman et al. (1997) Nat. Med. 3:849-854；Lipford et al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-44；WO98/55495およびWO00/61151を参照されたい。したがって、これらおよび他の方法を使用して、免疫刺激性物質、たとえば免疫刺激性ヌクレオチド、免疫刺激性単離核酸を同定、試験および／または確認することができる。
【００３８】
本明細書の中で使用される「結合」、「結合した」または「結合する」などは、1つの実体（たとえば残基）を別の実体と化学的に結合させることを意味する。いくつかの態様において、結合は、2つの実体の間の共有結合の存在に関連して結合が起こることを意味する共有結合的である。非共有結合的実施態様において、非共有結合的結合は、非共有結合的相互作用、たとえば非限定的に電荷相互作用、アフィニティー相互作用、金属配位、物理的吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、TTスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用および／またはそれらの組み合わせによって媒介される。特定の態様においては、封入が結合の一形態である。
【００３９】
本明細書の中で使用される「封入」とは、合成ナノ粒子の中に封じ込めること、好ましくは合成ナノ粒子の中に完全に封じ込めることをいう。封入されている物質の大部分または全部分は、合成ナノ粒子に対して外部の局所環境に暴露されない。封入は吸収とは異なる。吸収は、物質の大部分または全部分を合成ナノ粒子の表面上に配置し、物質を、合成ナノ粒子に対して外部の局所環境に暴露した状態に残す。
【００４０】
別段定義されない限り、本明細書の中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する、またはそれらと均等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記す。本明細書の中で挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により全体として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、優先する。加えて、材料、方法および例は例示にすぎず、限定的であることを意図しない。
【００４１】
[本発明1001]
病原体に対する粘膜免疫応答を必要とする対象において病原体に対する粘膜免疫応答を刺激する方法であって、
不活化形態の該病原体、および
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ不活化病原体に付着している、方法。
[本発明1002]
病原体が細菌、ウイルス、寄生生物または真菌である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
組成物が粘膜経路を介して対象に投与される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
粘膜経路が、眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路から選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
Toll様受容体アゴニストがR848である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
Toll様受容体アゴニストが非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである、本発明1006の方法。
[本発明1009]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が生分解性ポリマーを含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
生分解性ポリマーがポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が静電引力によって不活化病原体に付着している、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がリンカーを介して不活化病原体に付着している、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1013]
リンカーが、不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドからなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
クラミジアトラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対する粘膜免疫応答を必要とする対象においてクラミジアトラコマチスに対する粘膜免疫応答を刺激する方法であって、
不活化クラミジアトラコマチス、および
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ該不活化クラミジアトラコマチスに付着している、方法。
[本発明1015]
組成物が粘膜経路を介して対象に投与される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
粘膜経路が、眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1014〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1014〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
Toll様受容体アゴニストがR848である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
Toll様受容体アゴニストが非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が生分解性ポリマーを含む、本発明1014〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
生分解性ポリマーがポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が静電引力によって不活化病原体に付着している、本発明1014〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がリンカーを介して不活化病原体に付着している、本発明1014〜1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
リンカーが、不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドからなる群から選択される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
不活化病原体；および
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含み、該1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ付着機構を介して該不活化病原体に付着している、組成物。
[本発明1027]
不活化病原体が不活化細菌、不活化ウイルス、不活化寄生生物または不活化真菌である、本発明1026の組成物。
[本発明1028]
不活化病原体が、クラミジアトラコマチス、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、フレキシネル赤痢菌（Shigella flexneri）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）からなる群から選択される不活化細菌である、本発明1026の組成物。
[本発明1029]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1026〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1026〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1031]
Toll様受容体アゴニストがR848である、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
Toll様受容体アゴニストが非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである、本発明1030の組成物。
[本発明1033]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が生分解性ポリマーを含む、本発明1026〜1032のいずれかの組成物。
[本発明1034]
生分解性ポリマーがポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーである、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が静電引力によって不活化病原体に付着している、本発明1026〜1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がリンカーを介して不活化病原体に付着している、本発明1026〜1034のいずれかの組成物。
[本発明1037]
リンカーが、不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドからなる群から選択される、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
粘膜投与に適した形態にある、本発明1026〜1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路による投与に適した形態にある、本発明1038の組成物。
[本発明1040]
不活化クラミジアトラコマチス；および
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子
を含み、該1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がそれぞれ該不活化クラミジアトラコマチスに付着している、組成物。
[本発明1041]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1040の組成物。
[本発明1043]
Toll様受容体アゴニストがR848である、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
Toll様受容体アゴニストが非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドである、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が生分解性ポリマーを含む、本発明1040〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
生分解性ポリマーがポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマーである、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が静電引力によって不活化病原体に付着している、本発明1040〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がリンカーを介して不活化病原体に付着している、本発明1040〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1049]
リンカーが、不活化病原体の表面分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、アプタマー、抗生物質、レクチンまたは抗微生物性ペプチドからなる群から選択される、本発明1048の組成物。
[本発明1050]
粘膜投与に適した形態にある、本発明1040〜1049のいずれかの組成物。
[本発明1051]
眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路による投与に適した形態にある、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
不活化病原体が、アクチノミセス属（Actinomyces）、アナベナ属（Anabaena）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、ブデロビブリオ属（Bdellovibrio）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カウロバクター属（Caulobacter）、クラミジア属（Chlamydia）、クロロビウム属（Chlorobium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、サイトファーガ属（Cytophaga）、ディノコッカス属（Deinococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ヘリコバクター属（Heliobacter）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ハイフォミクロビウム属（Hyphomicrobium）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptspirosis）、リステリア属（Listeria）、髄膜炎菌（Meningococcus）A、BおよびC、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロバクター属（Nitrobacter）、オシラトリア属（Oscillatoria）、プロクロロン属（Prochloron）、プロテウス属（Proteus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ホドスピリルム属（Phodospirillum）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、スピリルム属（Spirillum）、スピロヘータ属（Spirochaeta）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、スルホロブス属（Sulfolobus）、サーモプラスマ属（Thermoplasma）、チオバチルス属（Thiobacillus）、トレポネーマ属（Treponema）、ビブリオ属（Vibrio）、ならびにエルシニア属（Yersinia）からなる群から選択される不活化細菌である、本発明1026の組成物。
[本発明1053]
不活化病原体が不活化クラミジアトラコマチスである、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
不活化病原体が不活化野兎病菌（Francisella tularensis）である、本発明1052の組成物。
[本発明1055]
不活化病原体が不活化ヒト型結核菌である、本発明1052の組成物。
[本発明1056]
不活化病原体が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択される不活化ウイルスである、本発明1026の組成物。
[本発明1057]
不活化病原体が不活化ヒト呼吸器合胞体ウイルスである、本発明1056の組成物。
[本発明1058]
不活化病原体が不活化SARSコロナウイルスである、本発明1056の組成物。
[本発明1059]
不活化病原体が不活化ノロウイルスである、本発明1056の組成物。
[本発明1060]
不活化病原体が不活化ヒト免疫不全ウイルスである、本発明1056の組成物。
[本発明1061]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1052〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1052〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1063]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がR848を含む、本発明1052〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1064]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドを含む、本発明1052〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1065]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がモノホスホリル脂質Aを含む、本発明1052〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1066]
病原体が、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、ブデロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファーガ属、ディノコッカス属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリウム属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、髄膜炎菌A、BおよびC、メタノバクテリウム属、ミクロコッカス属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ミキソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ホドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、スピリルム属、スピロヘータ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属、スルホロブス属、サーモプラスマ属、チオバチルス属、トレポネーマ属、ビブリオ属、ならびにエルシニア属からなる群から選択される細菌である、本発明1001の方法。
[本発明1067]
病原体がクラミジアトラコマチスである、本発明1066の方法。
[本発明1068]
病原体が野兎病菌である、本発明1066の方法。
[本発明1069]
病原体がヒト型結核菌である、本発明1066の方法。
[本発明1070]
病原体が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、トガウイルス科およびトチウイルス科からなる群から選択されるウイルスである、本発明1001の方法。
[本発明1071]
病原体がヒト呼吸器合胞体ウイルスである、本発明1070の方法。
[本発明1072]
病原体がSARSコロナウイルスである、本発明1070の方法。
[本発明1073]
病原体がノロウイルスである、本発明1070の方法。
[本発明1074]
病原体がヒト免疫不全ウイルスである、本発明1070の方法。
[本発明1075]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が、エンドソーム膜を標的化するアジュバントを含む、本発明1066〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がToll様受容体アゴニストを含む、本発明1066〜1074のいずれかの方法。
[本発明1077]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がR848を含む、本発明1066〜1074のいずれかの方法。
[本発明1078]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子が非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドを含む、本発明1066〜1074のいずれかの方法。
[本発明1079]
1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子がモノホスホリル脂質Aを含む、本発明1066〜1074のいずれかの方法。
本発明の他の特徴および利点が以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】UV不活化Ct（UV-Ct）による子宮内免疫化がその後の生菌クラミジアチャレンジに対する感受性の増強を生じさせることを示し、UV-Ctによって免疫寛容が誘導されることを示すドットプロットである。
【図１Ｂ】アジュバントの同時投与がUV-Ct誘導免疫寛容に打ち勝たないことを示すドットプロットである。
【図１Ｃ】UV-Ct誘導免疫寛容がFoxP3+Treg細胞によって媒介されることを示す棒グラフである。
【図１Ｄ】UV-Ct誘導免疫寛容がFoxP3+Treg細胞によって媒介されることを示す棒グラフである。
【図１Ｅ】抗CD25モノクローナル抗体による処置がUV-Ct誘導免疫寛容に打ち勝つことを示し、CD4+FoxP3+Treg細胞がUV-Ct誘導免疫寛容の媒介において重要な役割を演じることを示すドットプロットである。
【図１Ｆ】IL-10欠損が不活化クラミジア誘導免疫寛容を無効化することを示し、Treg分泌IL-10が不活化クラミジア誘導免疫寛容において重要な役割を演じることを確認すドットプロットである。
【図２Ａ】表面電荷切り換え性合成アジュバント粒子（cSAP）が不活化クラミジアトラコマチスに結合することを示す模式図である。
【図２Ｂ】不活化クラミジアトラコマチスの表面へのR848添加ナノ粒子の結合を示すクリオTEM（極低温透過型電子顕微鏡）画像である。
【図２Ｃ】不活化クラミジアトラコマチスへのナノ粒子の結合を確認する動的光散乱グラフである。
【図２Ｄ】pH7.4および6.0での、BacLight染色UV-Ctと、Alexa Fluor 488標識cSAPまたはPLH基を欠く対照粒子（SAP）との結合を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図２Ｅ】図2Dに対応するヒストグラムである。
【図２Ｆ】UV-Ct-cSAPを含むワクチン組成物による免疫化がその後の生菌クラミジアチャレンジに対してマウスを防御することを示すドットプロットである。
【図２Ｇ】UV-Ctへの付着の前のR848添加cSAPの滴定または中和がワクチン組成物の免疫防御性を変化させないことを示すドットプロットである。
【図２Ｈ】UV-Ct-cSAPを含むワクチン組成物によるIgG誘導を示すドットプロットである。データは、2つの独立した実験からプールされたものである。n.d.＝検出されず。
【図３】新規なクラミジアトラコマチスワクチン組成物によって刺激される防御免疫がCD4+T細胞によって媒介されることを示す一連のドットプロットである。
【図４】A. UV不活化クラミジア（UV-Ct）で免疫化されたマウスまたは非感染対照マウス（ナイーブ）と比較して、より有意にクラミジア特異的なトランスジェニックCD4+T細胞が新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）または感染性クラミジア（Ct）でチャレンジされたマウスのリンパ節中に存在したことを示す棒グラフである。B. CtまたはUV-Ct-cSAPで免疫化されたマウスにおけるクラミジア特異的CD90.1+CD4+T細胞の数が、非感染マウスまたはUV-Ctで免疫化されたマウスにおけるそれらの数を大きく超えたことを示し、CtおよびUV-Ct-cSAPがクラミジア特異的CD4+T細胞増殖を誘導するが、UV-Ctはそれを誘導しないことを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。C. 3つのサイトカイン（TNF-α、IFN-γおよびIL-2）すべてを産生するCD90.1+CD4+T細胞の数が、UV-Ctで免疫化されたマウスまたは非感染対照マウスと比較して、CtまたはUV-Ct-cSAPで免疫化されたマウスにおいて有意に高かったことを示す一連の円グラフである。
【図５Ａ】F4/80+CD103-マクロファージが高レベルのCD11bおよびCX3CR1かつ低レベルのCD11cを発現し；F4/80-CD103-樹状細胞が高レベルのCD11c、CD11bおよびCX3CR1を発現し；F4/80-CD103+樹状細胞が低レベルのCD11bおよびCX3CR1かつ高レベルのCD11cを発現することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図５Ｂ】子宮においてCD103-樹状細胞がF4/80+マクロファージおよびCD103+樹状細胞よりも有意に高いクラミジア負荷を有したことを示し、クラミジアの認識および提示においてCD103-樹状細胞が重要な役割を演じることを示す一連のドットプロットである。
【図５Ｃ】リンパ節においてCD103-樹状細胞がF4/80+マクロファージおよびCD103+樹状細胞よりも有意に高いクラミジア負荷を有したことを示し、クラミジアの認識および提示においてCD103-樹状細胞が重要な役割を演じることを示す一連のドットプロットである。
【図５Ｄ】インビトロにおいて、感染性クラミジア（Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で免疫化されたマウスの子宮から単離されたCD103-樹状細胞がクラミジア特異的CD90.1+CD4+トランスジェニックT細胞（NR1細胞）の増殖を誘導したが、他の抗原提示細胞はそれを誘導しなかったことを示す一連の棒グラフである。
【図５Ｅ】インビボにおいて、感染性クラミジア（Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で免疫化されたマウスの子宮から単離されたCD103-樹状細胞がクラミジア特異的CD90.1+CD4+トランスジェニックT細胞（NR1細胞）の増殖を誘導したが、他の抗原提示細胞はそれを誘導しなかったことを示す一連の棒グラフである。
【図５Ｆ】UV-Ct免疫化ののちCD103+樹状細胞がFoxP3+CD25+NR1細胞の数を増大させたことを示す棒グラフである。
【図６Ａ】新規なワクチン組成物または感染性クラミジアによる子宮内免疫化が、免疫化ののち6ヶ月間、その後の性器クラミジア感染に対する防御を生じさせたが、不活化クラミジアによる子宮内免疫化はそれを生じさせなかったことを示すドットプロットである。
【図６Ｂ】新規なワクチン組成物による鼻腔内免疫化がその後の性器クラミジア感染に対する防御免疫を生じさせたが、皮下免疫化はそれを生じさせなかったことを示し、新規なワクチン組成物によって異なる粘膜にまたがる防御免疫が誘導されたことを示すドットプロットである。
【図６Ｃ】クラミジア特異的トランスジェニックCD4+T細胞の子宮内への組織ホーミングが子宮内または鼻腔内免疫化によって誘導されたが、皮下免疫化によっては誘導されなかったことを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図６Ｄ】子宮内（i.u.）または鼻腔内（i.n.）経路によるUV-Ct-cSAPによる免疫化が性器粘膜および肺における防御NR1細胞の動員および保持を誘導したが、皮下（s.c.）経路による免疫化がそれを誘導しなかったことを示す一連の棒グラフである。肝臓、リンパ節、脾臓または血液中のNR1細胞の数は異なる免疫化経路の間で匹敵しうるほどである。
【図７】A. 実施例5の実験プロトコルを示す模式図である。B-C. α4インテグリンの阻止が、子宮中のT細胞蓄積を効率的に阻止したが（7C）、脾臓中のNR1細胞の数には影響を及ぼさなかった（7B）ことを示す棒グラフである。D. 脾臓中に存在する全身性NR1細胞がα4抗体注射によって影響されなかったことを示す棒グラフである。E. クラミジアチャレンジのみののち、IgGで処置されたGr.1マウスおよび抗α4mAbで処置されたGr.3マウスにおいてNR1細胞の蓄積が認められたが、ワクチン接種およびチャレンジの両方ののち、抗α4mAbで処置されたGr.2マウスにおいてそれが認められなかったことを示す棒グラフである。F. クラミジアチャレンジのみののち、抗α4mAbで処置されたGr.3マウス（子宮常在メモリーT細胞を含むが、さらに動員された循環メモリー細胞を含まない群）が性器クラミジアチャレンジに対して防御されたことを、ワクチン接種およびチャレンジの両方ののちのナイーブ対照マウスおよび抗α4mAbで処置されたGr.2マウスと比較して示すドットプロットである。
【図８Ａ】実施例6の並体結合実験プロトコルを示す模式図である。
【図８Ｂ】グループAマウスでは、両パートナーがその後の性器クラミジアチャレンジに対して防御されたことを示すドットプロットである。
【図８Ｃ】グループBマウスでは、免疫化されたパートナー（CD45.2）だけがその後の性器クラミジアチャレンジに対して防御され、他方のパートナー（CD45.1）は防御されなかったことを示すドットプロットである。
【図８Ｄ】その後の性器クラミジアチャレンジに対して防御されたマウスの中に、防御されなかったマウスの中と比べてより多くのNR-1細胞が存在したことを示す棒グラフである。
【図８Ｅ】その後の性器クラミジアチャレンジに対して防御されたマウスの中に、防御されなかったマウスの中と比べてより多くのNR-1細胞が存在したことを示す棒グラフである。
【図８Ｆ】並体結合のタイミングから独立した、UV-Ctによる免疫化が免疫寛容を誘導したことを示すドットプロットである。
【図８Ｇ】並体結合のタイミングから独立した、UV-Ctによる免疫化が免疫寛容を誘導したことを示すドットプロットである。
【図９Ａ】UV-LVS-cSAP免疫化マウスが、野兎病菌の弱毒化LVS株によるその後のチャレンジに対して完全に防御されたことを示す線グラフである。
【図９Ｂ】UV-LVS-cSAP免疫化マウスが、野兎病菌の完全毒性SchuS4株によるその後のチャレンジに対して部分的に防御されたことを示す線グラフである。
【図９Ｃ】腹腔内経路によるUV-LVS-cSAPによる免疫化ののち、野兎病菌の弱毒化LVS株によるその後のチャレンジに対して完全な防御が得られたことを示す線グラフである。
【図９Ｄ】皮下経路によるUV-LVS-cSAPによる免疫化ののち、野兎病菌の弱毒化LVS株によるその後のチャレンジに対して完全な防御が得られなかったことを示す線グラフである。
【図９Ｅ】誘導されたIgG抗体のレベルが、生菌LVS感染マウスよりもUV-LVS-cSAP免疫化マウスにおいて高かったことを示す線グラフである。すべての図面に関し、*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001である。
【図９Ｆ】誘導されたIgM抗体のレベルが、生菌LVS感染マウスよりもUV-LVS-cSAP免疫化マウスにおいて高かったことを示す線グラフである。すべての図面に関し、*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
本開示は、少なくとも部分的に、不活化病原体に付着した1つまたは複数のアジュバント添加ポリマーナノ粒子を含む新規なワクチン組成物の開発に基づく。たとえば、新規なワクチン組成物は、不活化病原体、たとえば細菌、たとえばクラミジアトラコマチス、野兎病菌、ヒト型結核菌、肺炎連鎖球菌、リステリア菌、コレラ菌、ソンネ赤痢菌、フレキシネル赤痢菌もしくはネズミチフス菌またはウイルス、たとえばインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、C型肝炎ウイルスと、アジュバント、たとえばToll様受容体アゴニスト、たとえばイミダゾキノリンレシキモド（R-848）、モノホスホリル脂質Aもしくは非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドまたはエンドソーム膜標的化物質、たとえばEndo-Porterペプチドを添加されている1つまたは複数のポリマーナノ粒子とを含む。アジュバント添加ナノ粒子の1つまたは複数は不活化病原体それぞれに結合している。これらのワクチン組成物は、特に対象の粘膜に投与されたとき、特定の病原体によって引き起こされる疾患を予防および／または治療するのに有用である。
【００４４】
本明細書に開示されるワクチン組成物は、たとえば付着機構を介して不活化された完全な病原体それぞれに付着した1つまたは複数のアジュバント添加ナノ粒子を含む。この付着機構は、静電引力、共有結合または疎水性相互作用であることができる。アジュバントは、樹状細胞を標的化する分子、たとえばToll様受容体アゴニスト、たとえばTLR7/TLR8の強力な合成アゴニストとして認識されているR-848もしくはTLR-9の免疫刺激性アゴニストである非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドもしくはTLR-4の免疫刺激性アゴニストであるモノホスホリル脂質Aまたはエンドソーム膜を標的化する物質、たとえばEndo-Porterペプチドである。
【００４５】
今日利用可能なワクチンの大多数は、全身免疫系を標的化するものであり、病原体が粘膜バリヤを通過し、正常ならば無菌の全身環境に侵入した後で疾患進行を阻止する。本明細書に開示されるワクチン組成物は、粘膜を標的化し、免疫化対象において粘膜免疫を刺激することができ、その粘膜免疫が、ワクチンに含まれる不活化病原体の活性形態による感染から対象を防御する。これらのワクチン組成物は、病原体の初期コロニー形成および複製を防ぐことにより、またはさらなる感染進行を阻止することにより、免疫防御を達成する。したがって、これらのワクチン組成物は予防的かつ治療的である。
【００４６】
不活化病原体
本明細書の中で使用される「病原体」とは、そのホスト中で疾患を引き起こす感染性物質である。病原体は、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌または他の微生物性感染性物質であることができる。病原体に対する多くのワクチンは、生きた微生物または弱毒化された微生物を含む。しかし、生菌または弱毒化ワクチンは、特に免疫無防備状態のレシピエントに投与された場合、ときどき感染症を引き起こす可能性がある。他のワクチンは、病原体溶解産物の1つまたは複数の精製成分、たとえば1つまたは複数の表面炭水化物または組換え病原体由来タンパク質を利用する。しかし、このタイプのワクチンにおいては、病原性抗原の部分的提示のせいで、不完全な防御が見られることがある。ワクチンに含まれないこれらの病原性抗原は、免疫化された個体においてさえも感染症を引き起こすことができる。
【００４７】
本明細書に開示されるワクチン組成物は、1つまたは複数の不活化された完全な病原体、たとえば不活化細菌、不活化ウイルス、不活化寄生生物または不活化真菌を含む。本明細書に開示されるワクチン組成物のレシピエントは、特定の病原体の病原性抗原の全スペクトルを提示され、したがって、その病原体に対する完全な免疫防御を得る。
【００４８】
完全な病原体は、当技術分野において公知の物理的または化学的処置、たとえばUV光、高温、固定化、電離放射線、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、ヒドロキシルアミン、フェノール、ポリソルベートなどへの暴露によって不活化することができる。不活化法のタイプは、完全な病原体の免疫原性を保持する観点をもって選択することができる。
【００４９】
細菌病原体は、細菌性疾患、たとえば炭疽、細菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、ネコ引っ掻き病、コレラ、ジフテリア、流行性発疹チフス、淋病、膿痂疹、ライ病（ハンセン病）、リステリア症、リウマチ熱、ノカルジア症、百日咳（Pertussis）（百日咳（Whooping cough））、ペスト、肺炎連鎖球菌性肺炎、オウム病、Q熱、ロッキーマウンテン紅斑熱（RMSF）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフスおよび尿路感染症を引き起こす。
【００５０】
1つまたは複数の不活化された完全な細菌を、本明細書に開示されるワクチン組成物中で病原体として使用することができ、それは、以下の細菌属のいずれかに由来することができる。アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属（たとえば炭疽菌）、バクテロイデス属、ブデロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファーガ属、ディノコッカス属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属（たとえば野兎病菌）、ハロバクテリウム属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属（たとえばインフルエンザ菌B型）、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、髄膜炎菌A、BおよびC、メタノバクテリウム属、ミクロコッカス属、マイコバクテリウム属（たとえばヒト型結核菌）、マイコプラズマ属、ミキソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属（たとえば緑膿菌肺炎）、ホドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ属、シゲラ属、スピリルム属、スピロヘータ属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属（たとえば肺炎連鎖球菌）、ストレプトミセス属、スルホロブス属、サーモプラスマ属、チオバチルス属、トレポネーマ属、ビブリオ属（たとえばコレラ菌）、ならびにエルシニア属。
【００５１】
ウイルス病原体は、ウイルス性疾患、たとえばAIDS、AIDS関連複合症候群、水痘、感冒・インフルエンザ（流感）、デング熱、手足口病、肝炎、単純ヘルペス、HPY、ラッサ熱、麻疹、おたふく風邪、ポリオ、狂犬病、SARS、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病および黄熱病を生じさせる。
【００５２】
1つまたは複数の不活化ウイルスを、本明細書に開示されるワクチン組成物中で病原体として使用することができ、それは、以下のウイルス科のいずれかに由来することができる。アデノウイルス科、アレナウイルス科、アリテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バマウイルス科、ビマウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウィルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科（たとえば、重症急性呼吸器症候群（SARS）ウイルスのようなコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ジアントウイルス、エナモウイルス、フラビウイルス科、フィロウイルス科（たとえばマールブルグウイルスおよびエボラウイルス（たとえばザイール、レストン、コートジボワールまたはスーダン株））、フラビウイルス科（たとえばC型肝炎ウイルス、デングウイルス1型、デングウイルス2型、デングウイルス3型およびデングウイルス4型）、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（たとえばヒトヘルペスウイルスI型、3型、4型、S型および6型ならびにサイトメガロウイルス）、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（たとえばインフルエンザウイルスA型、B型およびC型）、パピローマウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（たとえば麻疹、おたふく風邪およびヒト呼吸器合胞体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（たとえばポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスおよびアフトウイルス）、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科（たとえば種痘症および天然痘ウイルス）、レオウイルス科（たとえばロタウイルス）、レトロウイルス科（たとえば、ヒト免疫不全ウイルスHIVIおよびHIV2のようなレンチウイルス）、ラブドウイルス科（たとえば狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、トガウイルス科（たとえば風疹ウイルス、デングウイルスなど）およびトチウイルス科。
【００５３】
ウイルスベースのワクチンはまた、抗原性ウイルス性タンパク質を含有するウイルス様粒子または偽型ウイルス、たとえばRSV、HIVまたはノロウイルスを使用して作製することもできる。
【００５４】
寄生生物病原体は、寄生生物性疾患、たとえばアフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活性アメーバ感染症、ジアルジア虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエ症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、蟯虫感染症、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、旋毛虫症、鞭虫症、トリコモナス症およびトリパノソーマ症を引き起こす。
【００５５】
1つまたは複数の不活化寄生生物を、本明細書に開示されるワクチン組成物中で病原体として使用することができ、それは、たとえばアスカリス・ルンブリコイデス（Ascaris lumbricoides）、バベシア・マイクロッティ（Babesia microti）、バベシア・ドゥンカニ（Babesia duncani）、ブルギア・マライ（Brugia malayi）、ブルギア・チモリ（Brugia timori）、肝吸虫（Clonorchis sinensis）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、裂頭条虫（Diphyllobothrium）、メジナ虫（Dracunculus medinensis）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、蟯虫（Enterobius vermicularis）、肝蛭（Fasciola hepatica）、巨大肝蛭（Fasciola gigantica）、肥大吸虫（Fasciolopsis buski）、ランブル鞭毛虫（Gardia lamblia）、顎口虫（Gnathostoma）、膜様条虫（Hymenolepis）、イソスポーラ・ベリ（Isospora belli）、リーシュマニア（Leishmania）、マンソネラ（Mansonella）、メタゴニムス（Metagonimus）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium Jalciparum）、ヒゼンダニ（Sarcoptes scabiei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、有鉤条虫（Taenia solium）、トキソカラ（Toxocara）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、鞭虫（Trichuris trichiura）、腟トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、腟トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、またはバンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）に由来することができる。
【００５６】
病原性真菌は、ホストにおいて真菌性疾患、たとえばアスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症および足白癬を引き起こす。1つまたは複数の不活化真菌を、本明細書に開示されるワクチン組成物中で病原体として使用することができ、それは、真菌属、たとえばアスペルギルス属（Aspergillus）、ブラストミセス属（Blastomyces）、カンジダ属（Candida）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、スタキボトリス属（Stachybotrys）、トリコフィトン属（Trichophyton）に由来することができる。
【００５７】
ポリマーナノ粒子
本明細書に開示されるワクチンおよびアジュバント組成物は、1つまたは複数のアジュバント添加ナノ粒子またはナノ担体を含む。ナノ粒子を形成するポリマーは、任意の生分解性または非生分解性合成または天然ポリマーであることができる。好ましくは、ポリマーは生分解性ポリマーである。有用な生分解性ポリマーの例は、ポリ乳酸（PLA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）またはポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）を含む。これらのポリマーは、安全性の記録が確立されており、ヒト対象において使用することができる（Jiang, et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 57(3):391-410, 2005；Aguado and Lambert, Immunobiology, 184(2-3): 113-25, 1992；Bramwell, et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 57(9):1247-65, 2005）。他の両親媒性ポリ（アミノ酸）ナノ粒子、両親媒性多糖類ナノ粒子またはポリイオンナノ粒子を、本明細書に開示されるワクチン組成物に使用することもできる（Akagi et al., Adv Polym Sci. 247:31-64, 2012を参照）。
【００５８】
前記ポリマーは、単独で使用することもできるし、物理的混合物として使用することもできるし、コポリマーを形成させることによって使用することもできる。特定の態様において、ナノ粒子は、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマー；PLGA-PEGジブロックコポリマーおよびPLAの混合物によって形成される。これらのコポリマーは、標準的技術を使用して合成することができる。たとえば、コポリマーPLGA-PLH-PEGは、ブロックエンドグラフト法を使用して合成することができる。
【００５９】
直鎖構造PLGA-PLH-PEGは、長期循環および電荷媒介標的化と適合するいくつかの特性をナノ粒子に提供することができる。第一に、PLHセグメントが酸性条件下で正電荷を帯び、全体的に正の電位をナノ粒子表面に生じさせ、負帯電病原体との相互作用を促進し、強力な多価静電媒介結合を生成する。第二に、PLGAセグメントは、酸性pHでPLHの不安定化力を有することなく、固いコアマトリックスを形成することができる。第三に、PLHセグメントは、一般的な調合条件下でのその固有の親水性と、その相対的親和性のせいで優先的に表面まで上昇するであろうPEGとの緊密な結合とにより、ポリマー自己集合中、ナノ粒子表面の近くまで上昇する。これは、ナノ粒子表面のカチオン電荷を増すため、有意である。第三に、ポリマーの末端にPEG部分を有することが、生理的pHにおけるナノ粒子コロイド安定性および循環時間を増進する（Radovic-Moreno, et al., ACS Nano 6: 4279-4287, 2012；Gref et al., Science 263: 1600-1603, 1994）。
【００６０】
いくつかの態様において、天然ポリマーを使用することができる。天然ポリマーの例は、アルギン酸塩および他の多糖類、コラーゲン、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン類ならびに疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物を含む。概して、これらの材料は、インビボでの酵素的加水分解または水への暴露によって、表面またはバルク浸蝕によって分解する。
【００６１】
他の適当な生分解性ポリマーは、ポリ（ヒドロキシ酸）、たとえば乳酸およびグリコール酸のポリマーおよびコポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル類、ポリエステル類、ポリウレタン類、ポリ（酪酸）、ポリ（バレリアン酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）およびポリ（ラクチド-co-カプロラクトン）を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
ポリマーは、親水性または疎水性である生体接着性ポリマーであることができる。親水性ポリマーは、CARBOPOL（商標）（Noveon製の高分子量架橋アクリル酸系ポリマー）、ポリカルボフィル、セルロースエステル類およびデキストランを含む。
【００６３】
これらのポリマーは、Sigma Chemical Co.（St. Louis, Mo.）；Polysciences（Warrenton, Pa.）；Aldrich（Milwaukee, Wis.）；Fluka（Ronkonkoma, N.Y.）およびBioRad（Richmond, Calif.）のような供給元から得ることもできるし、これらまたは他の供給元から得られたモノマーから、標準的技術を使用して合成することもできる。
【００６４】
多種多様なポリマーおよびそれらのポリマーからポリマーマトリックスを形成する方法が従来から公知である。概して、ポリマーマトリックスは1つまたは複数のポリマーを含む。ポリマーは天然または非天然（合成）ポリマーであることができる。ポリマーは、ホモポリマーまたは2つ以上のモノマーを含むコポリマーであることができる。配列に関して、コポリマーは、ランダムであることもできるし、ブロックであることもできるし、ランダム配列とブロック配列との組み合わせを含むこともできる。一般に、本発明のポリマーは有機ポリマーである。
【００６５】
本発明における使用に適したポリマーの例は、ポリエチレン類、ポリカーボネート類（たとえばポリ（1,3-ジオキサン-2-オン））、ポリ酸無水物類（たとえばポリ（セバシン酸無水物））、ポリプロピルフマレート類、ポリアミド類（たとえばポリカプロラクタム）、ポリアセタール類、ポリエーテル類、ポリエステル類（たとえばポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド-co-グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酸（たとえばポリ（β-ヒドロキシアルカノエート）））、ポリ（オルトエステル）類、ポリシアノアクリレート類、ポリビニルアルコール類、ポリウレタン類、ポリホスファゼン類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリウレア類、ポリスチレン類およびポリアミン類、ポリリジン、ポリリジン-PEGコポリマーおよびポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンイミン）-PEGコポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００６６】
いくつかの実施態様において、本発明のポリマーは、米国食品医薬品局（FDA）によって21C.F.R.§177.2600の下でヒトにおける使用が承認されているポリマー、たとえば非限定的にポリエステル類（たとえばポリ乳酸、ポリ（乳酸-co-グルコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（1,3-ジオキサン-2-オン））；ポリ酸無水物類（たとえばポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル類（たとえばポリエチレングリコール）；ポリウレタン類；ポリメタクリレート類；ポリアクリレート類およびポリシアノアクリレート類を含む。
【００６７】
いくつかの実施態様において、ポリマーは親水性であることができる。たとえば、ポリマーは、アニオン基（たとえばリン酸基、硫酸基、カルボン酸基）、カチオン基（たとえば第四級アミン基）または極性基（たとえばヒドロキシル基、チオール基、アミン基）を含むことができる。いくつかの実施態様において、ポリマーは疎水性であることができる。ポリマーの親水性または疎水性の選択は、合成ナノ粒子内に組み込まれる（たとえば結合される）材料の性質に影響を及ぼすことができる。
【００６８】
いくつかの実施態様において、ポリマーは、1つまたは複数の残基および／または官能基によって修飾されることができる。多種多様な残基または官能基を本発明にしたがって使用することができる。いくつかの実施態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）、炭水化物および／または多糖類に由来する非環式ポリアセタール類によって修飾されることができる（Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301）。特定の実施態様は、Grefらへの米国特許第5,543,158号またはVon AndrianらによるWO公開公報WO2009/051837の一般的教示を使用して達成することができる。
【００６９】
いくつかの実施態様において、ポリマーは、脂質または脂肪酸基によって修飾されることができる。いくつかの実施態様において、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸またはリグノセリン酸の1つまたは複数であることができる。いくつかの実施態様において、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、αリノール酸、γリノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはエルカ酸の1つまたは複数であることができる。
【００７０】
いくつかの実施態様において、ポリマーは、乳酸およびグリコール酸単位、たとえばポリ（乳酸-co-グリコール酸）およびポリ（ラクチド-co-グリコリド）（本明細書ではまとめて「PLGA」と呼ぶ）を含むコポリマー；ならびにグリコール酸単位（本明細書では「PGA」と呼ぶ）および乳酸単位、たとえばポリ-L-乳酸、ポリ-D-乳酸、ポリ-D,L-乳酸、ポリ-L-ラクチド、ポリ-D-ラクチドおよびポリ-D,L-ラクチド（本明細書ではまとめて「PLA」と呼ぶ）を含むホモポリマーを含む、ポリエステル類であることができる。いくつかの実施態様において、例示的なポリエステル類は、たとえばポリヒドロキシ酸；PEGコポリマーおよびラクチドとグリコリドとのコポリマー（たとえばPLA-PEGコポリマー、PGA-PEGコポリマー、PLGA-PEGコポリマーおよびそれらの誘導体を含む。いくつかの実施態様において、ポリエステル類は、たとえば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）-PEGコポリマー、ポリ（L-ラクチド-co-L-リジン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）、ポリ［α-（4-アミノブチル）-L-グリコール酸］およびそれらの誘導体を含む。PLGAの分解速度は、乳酸：グリコール酸比を変えることによって調節することができる。いくつかの実施態様において、本発明にしたがって使用されるPLGAは、約85：15、約75:25、約60：40、約50：50、約40：60、約25：75または約15：85の乳酸：グリコール酸比を特徴とする。
【００７１】
いくつかの実施態様において、ポリマーは1つまたは複数のアクリルポリマーであることができる。特定の実施態様において、アクリルポリマーは、たとえば、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート類、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸無水物）、メチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）コポリマー、ポリアクリルアミド、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、グリシジルメタクリレートコポリマー、ポリシアノアクリレート類および前述のポリマーの1つまたは複数を含む組み合わせを含む。アクリルポリマーは、第四アンモニウム基の含量が低いアクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの完全重合コポリマーを含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施態様において、ポリマーはカチオン性ポリマーであることができる。概して、カチオン性ポリマーは、負帯電核酸（たとえばDNAまたはその誘導体）の鎖を縮合および／または保護することができる。アミン含有ポリマー、たとえばポリ（リジン）（Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97およびKabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7）、ポリ（エチレンイミン）（PEI；Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297）およびポリ（アミドアミン）デンドリマー（Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897；Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703およびHaensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372）は、生理学的pHで正電荷を帯び、核酸とでイオン対を形成し、多様な細胞株においてトランスフェクションを媒介する。
【００７３】
いくつかの実施態様において、ポリマーは、カチオン性側鎖を有する分解性ポリエステル類であることができる（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658；Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010；Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250；Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633およびZhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399）。これらのポリエステル類の例は、ポリ（L-ラクチド-co-L-リジン）（Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010）、ポリ（セリンエステル）（Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399）、ポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658およびLim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633）およびポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658およびLim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633）を含む。
【００７４】
これらおよび他のポリマーの性質ならびにそれらを調製する方法は当技術分野において周知である（たとえば、米国特許第6,123,727号、第5,804,178号、第5,770,417号、第5,736,372号、第5,716,404号、第6,095,148号、第5,837,752号、第5,902,599号、第5,696,175号、第5,514,378号、第5,512,600号、第5,399,665号、第5,019,379号、第5,010,167号、第4,806,621号、第4,638,045号および第4,946,929号；Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480；Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460；Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94；Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7およびUhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181を参照されたい）。より概して、特定の適当なポリマーを合成するための多様な方法が、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980；Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004；Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981；Deming et al., 1997, Nature, 390:386ならびに米国特許第6,506,577号、第6,632,922号、第6,686,446号および第6,818,732号に記載されている。
【００７５】
いくつかの実施態様において、ポリマーは直鎖状または分岐鎖状のポリマーであることができる。いくつかの実施態様において、ポリマーはデンドリマーであることができる。いくつかの実施態様において、ポリマーは実質的に互いに架橋していることができる。いくつかの実施態様において、ポリマーは実質的に架橋していないことができる。いくつかの態様において、本発明にしたがって、ポリマーは、架橋工程を受けることなく使用することができる。さらに、本発明の合成ナノ粒子は、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、前述および他のポリマーのブレンド、混合物および／または付加物を含むことができることが理解されよう。当業者は、本明細書に挙げられるポリマーが、本発明にしたがって使用することができるポリマーの例示的な（包括的ではない）リストを表すことを理解するであろう。
【００７６】
いくつかの実施態様において、合成ナノ粒子は任意選択で1つまたは複数の両親媒性実体を含むことができる。いくつかの実施態様において、両親媒性実体は、増大した安定性、改善された均一性または増大した粘度を有する合成ナノ粒子の製造を促進することができる。いくつかの実施態様において、両親媒性実体は、脂質膜の内面（たとえば脂質二重層、脂質一重層など）と結合することができる。当技術分野において公知である多くの両親媒性実体が、本発明にしたがって合成ナノ粒子を製造する中での使用に適している。そのような両親媒性実体は、ホスホグリセリド類；ホスファチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）；ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジオレイルオキシプロピルトリエチルアンモニウム（DOTMA）；ジオレオイルホスファチジルコリン；コレステロール；コレステロールエステル、ジアシルグリセロール；ジアシルグリセロールスクシネート；ジホスファチジルグリセロール（DPPG）；ヘキサンデカノール；脂肪アルコール類、たとえばポリエチレングリコール（PEG）；ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル；界面活性脂肪酸、たとえばパルミチン酸またはオレイン酸；脂肪酸；脂肪酸モノグリセリド類；脂肪酸ジグリセリド類；脂肪酸アミド類；トリオレイン酸ソルビタン（Span（登録商標）85）グリココレート；モノラウリン酸ソルビタン（Span（登録商標）20）；ポリソルベート20（Tween（登録商標）20）；ポリソルベート60（Tween（登録商標）60）；ポリソルベート65（Tween（登録商標）65）；ポリソルベート80（Tween（登録商標）80）；ポリソルベート85（Tween（登録商標）85）；ポリオキシエチレンモノステアレート；サーファクチン；ポロキサマー；ソルビタン脂肪酸エステル、たとえばトリオレイン酸ソルビタン；レシチン；リゾレシチン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）；カルジオリピン；ホスファチジン酸；セレブロシド類；ジセチルホスフェート；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ステアリルアミン；ドデシルアミン；ヘキサデシルアミン；パルミチン酸アセチル；リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル；ミリスチン酸イソプロピル；チロキサポール；ポリ（エチレングリコール）5000−ホスファチジルエタノールアミン；ポリ（エチレングリコール）400−モノステアレート；リン脂質；高い界面活性剤特性を有する合成および／または天然洗浄剤；デオキシコレート類；シクロデキストリン類；カオトロピック塩；イオン対形成物質ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。両親媒性実体成分は、異なる両親媒性実体の混合物であることができる。当業者は、これが、界面活性を有する物質の例示的な（包括的ではない）リストであることを理解するであろう。任意の両親媒性実体を、本発明にしたがって使用される合成ナノ粒子の製造において使用することができる。
【００７７】
いくつかの実施態様において、合成ナノ粒子は任意選択で1つまたは複数の炭水化物を含むことができる。炭水化物は天然または合成であることができる。炭水化物は、誘導体化された天然炭水化物であることができる。特定の実施態様において、炭水化物は、単糖類または二糖類、たとえば非限定的にグルコース、フルクトース、ガラクトース、リボース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セロビオース、マンノース、キシロース、アラビノース、グルコロン酸、ガラクトロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸を含む。特定の実施態様において、炭水化物は、多糖類、たとえば非限定的にプルラン、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、ヒドロキシセルロース（HC）、メチルセルロース（MC）、デキストラン、シクロデキストラン、グリコーゲン、ヒドロキシエチルデンプン、カラギーナン、グリコン、アミロース、キトサン、N,O-カルボキシルメチルキトサン、アルギンおよびアルギン酸、デンプン、キチン、イヌリン、コンニャク、グルコマンナン、プスツラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、カードランおよびキサンタンである。諸実施態様において、本発明の合成ナノ粒子は、多糖類のような炭水化物を含まない（または特異的に除外する）。特定の実施態様において、炭水化物は、炭水化物誘導体、たとえば糖アルコール、たとえば非限定的にマンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトールおよびラクチトールを含むことができる。
【００７８】
アジュバント
本明細書に開示されるワクチンおよびアジュバント組成物はアジュバント添加ナノ粒子を含む。1つまたは複数のアジュバントが、ナノ粒子中に封入または他のやり方で捕らえられることもできるし、ナノ粒子の表面と結合することもできる。
【００７９】
本明細書の中で使用される語「アジュバント」とは免疫学的アジュバントをいう。この語は、病原体に対する免疫系の応答を増強または促進することができ、それにより、対象において免疫応答または一連の免疫応答を誘導する化合物または組成物を意味する。アジュバントは、たとえばデポ剤を形成することによってワクチン組成物の効果を促進する（ワクチンの半減期を延ばす）、さらなるT細胞ヘルプを提供する、および／またはサイトカイン産生を刺激することができる。
【００８０】
樹状細胞は、体内でもっとも強力な抗原提示細胞であり、病原性抗原に結合することによってすべての病原体特異的免疫応答を開始する役割を負う。樹状細胞はまた、遭遇した病原体の性質に関し、走化性シグナルを介してT細胞と連絡し、適切なT細胞応答を誘導する。したがって、樹状細胞を標的化すると、病原性抗原の送達および提示を増強し、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の性質を制御することができる。
【００８１】
遭遇した様々なタイプの病原体に応答して、樹状細胞は、様々な表面受容体を利用して、露呈した病原性抗原に結合する。遊走中、樹状細胞は、成熟プロセスを受け、その中で食作用能力を失い、リンパ節中のT細胞と連絡する能力を増強させる。この成熟プロセスは、病原体関連分子パターン（PAMP）分子からパターン認識受容体、たとえばToll様受容体ファミリー（TLR）のメンバーを介するシグナル伝達に依存する。PAMPは、樹状細胞の表面上のTLRを標的化し、内部的にシグナル伝達し、それにより、樹状細胞抗原取り込み、成熟およびT細胞刺激能力を潜在的に増大させる。したがって、TLRアゴニスト、たとえばCpGオリゴデオキシヌクレオチド（細菌性）、二本鎖RNA（ウイルス性）、リポ多糖類（細菌性）、ペプチドグリカン（細菌性）、リポアラビノマンニン（細菌性）、ザイモサン（酵母）、マイコプラズマリポタンパク質、たとえばMALP-2（細菌性）、フラゲリン（細菌性）、ポリ（イノシン−シチジル）酸（細菌性）、リポタイコ酸（細菌性）またはイミダゾキノリン類（合成）は、強力な樹状細胞活性化因子あり、本明細書に記載されるワクチン組成物に含まれることができる。
【００８２】
R848（レシキモド）は、イミダゾキノリンのグアノシン誘導体であり、TLR7およびTLR8のアゴニストである。R848は、樹状細胞およびB細胞を活性化して、Tヘルパー1（Th1）細胞免疫および抗体産生に最適なサイトカインを産生させる効果的なアジュバントである。したがって、R848は、体液性免疫応答および細胞媒介免疫応答の両方を増強するためのアジュバントとして本明細書に開示されるワクチン組成物に含まれることができる。このアジュバントを使用する方法は以下の実施例において詳細に説明される。
【００８３】
TLR9は、CpGモチーフを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチドによって模倣することができる、微生物DNAの特徴である非メチル化CpGモチーフを特異的に認識する。CpG DNAまたはCpGオリゴデオキシヌクレオチドによるTLR9の刺激が細胞内シグナル伝達を起動して、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞の活性化ならびにサイトカイン、ケモカインおよび免疫グロブリンの産生を生じさせる。その後、樹状細胞によって産生されたサイトカイン、たとえばIL-12がナイーブT細胞をTh1および細胞傷害性T細胞（CTL）へと分化させる。研究が、ワクチンアジュバントとしてのCpGオリゴデオキシヌクレオチドが多様なウイルス性、細菌性および寄生生物性疾患、たとえばB型肝炎に対する免疫防御を増強することができることを証明している（Krieg et al., Proc Am Thorac Soc. 4(3):289-94, 2007；Schmidt et al., Nat. Biotechnol. 25(8):825-6, 2007）。したがって、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、体液性免疫応答および細胞媒介免疫応答の両方を増強するためのアジュバントとして本明細書に開示されるワクチン組成物に含まれることができる。
【００８４】
グラム陰性細菌細胞壁構成要素リポ多糖類（LPS）の生物学的活性部分である脂質Aは、強力な免疫刺激性を有することが知られ、免疫応答を促進するためのアジュバントとして評価されている。TLR4は、脂質Aのシグナル伝達受容体として同定されたものである。モノホスホリル脂質A（MPLA）はSalmonella minnesota LPSの脂質A部分を含む。LPSおよびMPLAは類似したサイトカインプロフィールを誘導するが、MPLAのほうが毒性が低い。MPLAを他の免疫刺激物質と組み合わせると、効果的な免疫応答の誘発を促進することができる。
【００８５】
特定の実施態様において、本発明の組成物は、Toll様受容体（TLR）-9のためのリガンド、たとえば、I型インターフェロン分泌を誘導し、TおよびB細胞活性化を刺激して、増大した抗体産生および細胞傷害性T細胞応答をもたらす、CpGを含む免疫刺激性DNA分子を組み込む（Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549；Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186:1623-1631；Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344；Roman et al. "Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants," Nat. Med. 1997. 3:849-854；Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876；Lipford et al., "Bacterial DNA as immune cell activator," Trends Microbiol. 1998. 6:496-500；Kriegらへの米国特許第6,207,646号；Tuckらへの米国特許第7,223,398号；Van Nestらへの米国特許第7,250,403号またはKriegらへの米国特許第7,566,703号。
【００８６】
樹状細胞標的化分子はまた、樹状細胞の表面に表示されたエピトープを認識し、それに結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体もしくはそれらのフラグメントを含むことができる。たとえば、樹状細胞表面エピトープであるレクチンDEC-205が、マウスにおいて抗DEC205組換え抗体によって標的化され、抗体の重鎖に結合した抗原に対する体液性応答および細胞応答の両方を増大させた（Hawiger, et al., J. Exp. Med., 194(6):769-79, 2001；Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 196(12):1627-38, 2002；Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 199(6):815-24, 2004）。また、マンノース特異的レクチン（マンノース受容体）およびIgG Fc受容体を含む多様な他のエンドサイトーシス受容体がこの方法で標的化され、抗原提示効率が同様に増大している。標的化することができる他の適当な受容体は、DC-SIGN、33D1、SIGLEC-H、DCIR、CD11c、熱ショックタンパク質受容体およびスカベンジャー受容体を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
ワクチンが樹状細胞を標的化するように使用される多くの受容体、たとえばレクチンDEC-205は、抗原を、免疫原性ペプチドが形成され、MHCクラスII分子（CD4T細胞および抗体応答のために必要）に添加される後期エンドソームに送達する性質を有する（Mellman, Adv. Exp. Med. Biol. 560:63-7, 2005；Mellman and Steinman, Cell 106(3):255-8, 2001）。しかし、効果的なワクチン接種は、多くの場合、CD8細胞傷害性T細胞応答の生成を要し、それは、抗原が細胞質中に存在する場合のみ起こる。樹状細胞は交差提示によってこの機能を発揮させる。交差提示においては、外因性抗原がエンドサイトーシス小胞から逃れ、細胞質に侵入し、そこでプロテオソームによってペプチドへと切断され、小胞体の中に移入され、新たに合成されたMHCクラスI分子（CD8T細胞の刺激のために必要）に添加される。交差提示の効率は、抗原取り込み中のエンドソーム−リソソーム膜の限られた破壊によって人為的に高めることができる。したがって、エンドソーム膜破壊物質は、効果的なアジュバントとして働くことができ、たとえば、小分子薬物、ペプチド、ポリペプチド、たとえばエラスチンおよび細胞内pHまたは小胞膜を破壊する合成物質を含むことができる。特定の態様において、エンドソーム破壊物質は、低pH活性化両親媒性気孔形成性ペプチド、たとえばEndo-Porterペプチドである（Endo-Porter；GeneTools, Philomath, Oreg.）（Summerton, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1058:1-14, 2005）。したがって、Endo-Porterペプチドは、病原性抗原の交差提示を増強するためのアジュバントとして本明細書に開示されるワクチン組成物に含まれることができる。
【００８８】
たとえばPCT WO2012/068295に様々なアジュバントが記載されている。そのようなアジュバントは、パターン認識受容体の刺激物質、たとえばRIG-1およびNOD様受容体（NLR）、無機塩類、たとえばミョウバン、腸内細菌、たとえば大腸菌、サルモネラミネソタ、ネズミチフス菌もしくはフレキシネル赤痢菌のモノホスホリル脂質（MPL）Aと組み合わせたミョウバンまたは特異的にMPL（登録商標）（AS04）と組み合わせたミョウバン、上述の細菌それぞれのMPLA、サポニン、たとえばQS-21、Quil-A、ISCOM、ISCOMATRIX（商標）、エマルション、たとえばMF59（商標）、Montanide（登録商標）ISA51およびISA720、AS02（QS21＋スクアレン＋MPL（登録商標））、リポソームおよびリポソーム製剤、たとえばAS01、合成または特異的に調製された微粒子およびマイクロ担体、たとえば淋菌、クラミジアトラコマチスなどの細菌由来外膜小胞（OMV）またはキトサン粒子、デポ剤形成物質、たとえばPluronic（登録商標）ブロックコポリマー、特異的に修飾または調製されたペプチド、たとえばムラミルジペプチド、アミノアルキルグルコサミニド4-リン酸、たとえばRC529またはタンパク質、たとえば細菌トキソイドまたは毒素フラグメントを含むことができるが、これらに限定されない。
【００８９】
アジュバントは、上記Toll様受容体に加えて、パターン認識受容体（PRR）、たとえば非限定的にToll様受容体（TLR）、具体的にはTLR2、3、4、5、7、8、9および／またはそれらの組み合わせのためのアゴニストを含むことができる。他の実施態様において、アジュバントは、Toll様受容体3のためのアゴニスト、Toll様受容体7および8のためのアゴニストまたはToll様受容体9のためのアゴニスト；米国特許第6,329,381号（Sumitomo Pharmaceutical Company）に開示されているようなアデニン誘導体；免疫刺激性DNAまたは免疫刺激性RNAを含む。特定の実施態様において、本発明の組成物は、アジュバントとして、Toll様受容体（TLR）7および8のためのアゴニスト（「TLR7/8アゴニスト」）である化合物を組み込む。有用なものは、Tomaiらへの米国特許第6,696,076号に開示されているTLR7/8アゴニスト化合物、たとえば非限定的に、イミダゾキノリンアミン類、イミダゾピリジンアミン類、6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン類および1,2-架橋イミダゾキノリンアミン類である。
【００９０】
特定の実施態様において、アジュバントは、表面分子CD40のためのアゴニストであることができる。特定の実施態様において、寛容よりもむしろ免疫を刺激するために、本発明の組成物は、DC成熟（ナイーブT細胞の初回刺激のために必要）およびサイトカイン、たとえばI型インターフェロン（抗体免疫応答を促進する）の産生を促進するアジュバントを組み込む。諸実施態様において、アジュバントはまた、免疫刺激性RNA分子、たとえば非限定的にdsRNAまたはポリI:C（TLR3刺激物質）および／またはF. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004)；J. Vollmer et al., "Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides" WO 2008033432 A2；A. Forsbach et al., "Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway" WO 2007062107 A2；E. Uhlmann et al., "Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity"米国特許出願公開公報US2006/0241076；G. Lipford et al., "Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections" WO 2005097993 A2；G. Lipford et al., "Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods" WO 2003086280 A2に開示されているものを含むことができる。いくつかの実施態様において、アジュバントは、TLR-4アゴニスト、たとえば細菌性リポ多糖類（LPS）、VSV-Gおよび／またはHMGB-1であることができる。いくつかの実施態様において、アジュバントは、TLR-5アゴニスト、たとえばフラゲリンまたはその一部分もしくは派生物、たとえば非限定的に、米国特許第6,130,082号、第6,585,980号および第7,192,725号に開示されているものを含むことができる。
【００９１】
いくつかの実施態様において、アジュバントは、壊死細胞（たとえば尿酸結晶）から放出される炎症誘発性刺激であることができる。いくつかの実施態様において、アジュバントは、補体カスケードの活性化成分（たとえばCD21、CD35など）であることができる。いくつかの態様において、アジュバントは免疫複合体の活性化成分であることができる。アジュバントはまた、補体受容体アゴニスト、たとえばCD21またはCD35に結合する分子を含むことができる。いくつかの実施態様において、補体受容体アゴニストは合成ナノ粒子の内因性補体オプソニン化を誘導する。いくつかの実施態様において、アジュバントはサイトカインであり、サイトカインとは、細胞によって放出され、かつ細胞間相互作用、伝達および他の細胞の行動に特定の効果を及ぼす小さなタンパク質または生物学的因子（5kD〜20kDの範囲）である。いくつかの実施態様において、サイトカイン受容体アゴニストは、小分子、抗体、融合タンパク質またはアプタマーである。
【００９２】
様々な態様において、アジュバントの用量の少なくとも一部分が合成ナノ粒子に結合していることができる。たとえば、アジュバントの用量のすべてが合成ナノ粒子に結合していることができる。他の実施態様において、アジュバントの用量の少なくとも一部分は合成ナノ粒子に結合していない。特定の実施態様において、アジュバントの用量は2つ以上のタイプのアジュバントを含む。たとえば、非限定的に、様々なTLR受容体に作用するアジュバントを組み合わせることができる。一例として、ある実施態様において、TLR7/8アゴニストをTLR9アゴニストと組み合わせることができる。もう1つの実施態様において、TLR7/8アゴニストをTLR4アゴニストと組み合わせることができる。さらに別の実施態様において、TLR9アゴニストをTLR3アゴニストと組み合わせることができる。
【００９３】
いくつかの他の態様において、アジュバントは、以下の1つまたは複数を含むことができる。糖脂質αガラクトシルセラミド；オイルエマルション（たとえばフロイントアジュバント）；サポニン製剤；ビロソームおよびウイルス様粒子；細菌および微生物由来物、たとえば非限定的に炭水化物、たとえばリポ多糖類（LPS）；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ADPリボシル化毒素およびその解毒誘導体；ミョウバン；BCG；無機質含有組成物（たとえば無機塩類、たとえばアルミニウム塩およびカルシウム塩、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）；生体接着剤および／または粘膜接着剤；微粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤；ポリホスファゼン；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物ならびに界面活性物質（たとえばリゾレシチン、Pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール）。
【００９４】
アジュバントはまた、免疫調節物質、たとえばサイトカイン、インターロイキン（たとえばIL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12など）、インターフェロン（たとえばインターフェロン-γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子ならびに共刺激因子、たとえばB7ファミリーのものを含むことができる。
【００９５】
アジュバント添加ナノ粒子をアセンブルする方法
多くの公知のプロセスを使用してアジュバント添加ナノ粒子を形成することができる。たとえば、アジュバント添加ナノ粒子は、溶剤蒸発技術（Mathiowitz, et al., J. Scanning Microscopy 4:329, 1990；Beck et al., Fertil. Steril. 31:545, 1979；Benita, et al., J. Pharm. Sci., 73:1721, 1984および米国特許第3,960,757号に記載されている）によって形成することができる。1つまたは複数のポリマーを揮発性有機溶媒、たとえば塩化メチレンに溶解する。アジュバントを溶液に加えることができ、混合物を、界面活性剤、たとえばポリ（ビニルアルコール）を含有する水溶液中に懸濁させる。有機溶媒の大部分が蒸発するまで得られたエマルションをかく拌して、固体ナノ粒子を残す。
【００９６】
他の例において、アジュバント添加ナノ粒子は、転相を使用することによって形成することができ、その場合、ポリマーを溶媒に溶解し、アジュバントの微粒子をポリマー溶液に混合または溶解し、その混合物をポリマーのための強い非溶剤に注加して、好ましい条件下、ポリマーが粒子でコートされているか、粒子がポリマー中に分散しているポリマーミクロスフェアを自発的に形成させる。
【００９７】
特定のアジュバントは、たとえば吸着により、ナノ粒子に非共有結合的に結合させることができる。たとえば、ナノ粒子の表面への核酸の吸着は、塩形成によって達成することができる。この方法を使用するとき、ナノ粒子は、ナノ粒子に電荷を導入する材料を含むようなやり方で調製される。多くの場合、荷電界面活性剤の使用、たとえばナノ粒子調製中に負帯電核酸を吸着するために使用されるカチオン性界面活性剤の使用が、ナノ粒子に表面電荷を提供するのに十分である。荷電ナノ粒子と核酸溶液との接触が核酸の吸着を生じさせる。この方法は、O'Hagenらの国際特許出願公開公報WO00/06123に記載されている。
【００９８】
いくつかのアジュバントはナノ粒子によって封入されることができる。たとえば、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドのような核酸の封入は、核酸を水性バッファーに溶解したのち、その溶液をシングルまたはダブルエマルションプロセスにおいて使用してナノ粒子を自己集合によって形成することによって達成することができる。このプロセスは、Tse, et al International Journal of Pharmaceutics, 370 (1-2), 33 (2009）に記載されている。加えて、C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006)；K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004)；C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006）をはじめとする多様な方法を使用して様々な材料を合成ナノ粒子に封入することができる。
【００９９】
2003年10月14日にUngerに付与された米国特許第6,632,671号；H. Martimprey et al., "Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids: Oligonucleotides and siRNA" European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71:490-504 (2009)またはP. Malyala, et al., "Enhancing the therapeutic efficacy of CpG oligonucleotides using biodegradable microparticles" Advanced Drug Delivery Reviews 61: 218-225 (2009）に開示されている方法をはじめとする、核酸のような物質を合成ナノ粒子中に封入するのに適した他の方法を使用することもできる。
【０１００】
共有結合は、たとえばHermansonによるBioconjugate Techniques, 2nd edition, Elsevier (2008)に記載されているような多様な方法によって形成することができる。アミン官能基を有するポリマーまたはナノ粒子に核酸を結合するのに有用である1つの方法は、核酸の5'リン酸を1-（3-ジメチルアミノ）プロピル-3-エチルカルボジイミドメチオジド（EDC）およびイミダゾールで活性化したのち、活性化された核酸をアミン置換ポリマーまたはナノ粒子と反応させる方法である（Shabarova et al, FEBS Letters, 154 288, (1983)）。表面アミン官能化ナノ粒子の場合のこのプロセスの模式図を以下に示す。
0006382936.tif 000002
【０１０１】
特定の態様において、共有結合は、共有結合リンカーを介して形成することができる。たとえば、共有結合リンカーは、アミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、ヒドラゾンリンカー、ヒドラジドリンカー、イミンまたはオキシムリンカー、尿素またはチオ尿素リンカー、アミジンリンカー、アミンリンカーおよびスルホンアミドリンカーであることができる、またはそれらを含むことができる。
【０１０２】
1つの要素上のアミンと第二の要素、たとえばナノ粒子のカルボン酸基との間のアミド結合によってアミドリンカーが形成される。リンカー中のアミド結合は、適切に保護されたアミノ酸または抗原もしくはアジュバントおよび活性化されたカルボン酸、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルとの従来のアミド結合形成反応のいずれかを使用して形成することができる。
【０１０３】
ジスルフィドリンカーは、たとえばR1-S-S-R2の形態の2つの硫黄原子の間のジスルフィド（S-S）結合の形成によって形成される。ジスルフィド結合は、チオール／メルカプタン基（-SH）を含有する抗原またはアジュバントと、チオール／メルカプタン基を含有する要素上の別の活性化チオール基と、活性化チオール基を含有する要素とのチオール交換によって形成することができる。
【０１０４】
トリアゾールリンカー、たとえば
0006382936.tif 000003
（式中、R1およびR2は任意の化学実体であることができる）
の形態の1,2,3-トリアゾールは、第一の要素に付着したアジ化物と、第二の要素に付着した末端アルキンとの1,3-双極子環化付加反応によって形成することができる。1,3-双極子環化付加反応は、触媒を用いて、または用いずに、好ましくは、1,2,3-トリアゾール官能基によって2つの要素を結合させるCu（I）触媒を用いて実施される。このケミストリーは、Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002)およびMeldal, et al, Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015に記載されており、多くの場合、「クリック反応」またはCuAACと呼ばれる。
【０１０５】
チオエーテルリンカーは、たとえばR1-S-R2の形態の硫黄−炭素（チオエーテル）結合の形成によって形成される。チオエーテルは、1つの成分、たとえば要素上のチオール／メルカプタン（-SH）基を第二の要素上のハライドまたはエポキシドのようなアルキル化剤によってアルキル化することによって形成することができる。チオエーテルリンカーはまた、1つの要素上のチオール／メルカプタン基を、マイケル受容体としてのマレイミド基を含有するポリマーのような第二の要素上の電子不足アルケン基にマイケル付加することによって形成することもできる。別の方法では、チオエーテルリンカーは、1つの要素上のチオール／メルカプタン基と、ポリマーまたはナノ粒子のような第二の要素上のアルケン基とのラジカルチオール−エン反応によって調製することができる。
【０１０６】
ヒドラゾンリンカーは、1つの要素上のヒドラジド基と、第二の要素上のアルデヒド／ケトン基との反応によって形成される。
【０１０７】
ヒドラジドリンカーは、1つの要素上のヒドラジン基と、第二の要素上のカルボン酸基との反応によって形成される。そのような反応は概して、カルボン酸が活性化試薬で活性化されるアミド結合の形成に類似したケミストリーを使用して実施される。
【０１０８】
イミンまたはオキシムリンカーは、1つの要素上のアミンまたはN-アルコキシアミン（またはアミノオキシ）基と、第二の要素上のアルデヒドまたはケトン基との反応によって形成される。
【０１０９】
尿素またはチオ尿素リンカーは、1つの要素上のアミン基と第二の要素上のイソシアネートまたはチオイソシアネート基との反応によって調製される。
【０１１０】
アミジンリンカーは、1つの要素上のアミン基と第二の要素上のイミドエステル基との反応によって調製される。
【０１１１】
アミンリンカーは、1つの要素上のアミン基と、第二の要素上のアルキル化基、たとえばハライド、エポキシドまたはスルホン酸エステル基とのアルキル化反応によって形成される。または、アミンリンカーはまた、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムのような適当な還元試薬を用いて1つの要素上のアミン基を第二の要素上のアルデヒドまたはケトン基によって還元的アミノ化することによって形成することもできる。
【０１１２】
スルホンアミドリンカーは、1つの要素上のアミン基と第二の要素上のハロゲン化スルホニルハライド（たとえば塩化スルホニル）基との反応によって形成される。
【０１１３】
また、様々なアジュバントは、非共有結合的結合法によって結合させることもできる。たとえば、負帯電アジュバントを静電吸着によって正帯電担体に結合することができる。また、金属リガンドを含有するアジュバントを金属リガンド錯体を介して金属錯体を含有する担体に結合することもできる。
【０１１４】
特定の態様においては、アジュバントをポリマー、たとえばポリ乳酸-ブロック−エチレングリコールに付着したのち、表面に反応性または活性化性基を有する合成ナノ粒子のアセンブリまたは合成ナノ粒子を形成することができる。後者の場合、アジュバントは、合成ナノ粒子の表面によって提示される付着ケミストリーと適合性である基を用いて調製することができる。他の実施態様においては、適当なリンカーを使用して、ペプチドアジュバントをウイルス様粒子（VLP）またはリポソームに付着させることができる。
【０１１５】
特定の態様において、リンカーは、Hermanson 2008に記載されているようなホモ二官能性またはヘテロ二官能性試薬であることができる。たとえば、カルボン酸基を表面に有するVLPまたはリポソーム合成ナノ粒子を、EDCの存在下、ホモ二官能性リンカーであるアジピン酸ジヒドラジド（ADH）で処理して、ADHリンカーを有する対応する合成ナノ粒子を形成することができる。そして、得られたADH結合合成ナノ粒子を、NC上のADHリンカーの他端を介して、酸基を含有するペプチド抗原とコンジュゲートさせて、対応するVLPまたはリポソームペプチドコンジュゲートを製造する。
【０１１６】
付着機構
1つまたは複数のアジュバント添加ナノ粒子は、多様な付着機構、たとえば非限定的に静電引力、直接共有結合もしくはリンカーを介する共有結合または疎水性相互作用を介して各不活化病原体に付着することができる。
【０１１７】
いくつかの態様において、不活化病原体は、静電引力によってアジュバント添加ナノ粒子に付着する。大部分の原生動物、細菌およびウイルスは生理的pHで負電荷を有する（Robert A. Freitas Jr., Nanomedicine, Volume IIA: Biocompatibility, Landes Bioscience, Georgetown, TX, 2003）。たとえば、グラム陰性細菌は、それらの表面に強い負電荷を与えるリポ多糖類で構成された外膜を有する。ほぼすべてのグラム陽性細菌細胞壁は、負帯電タイコ酸に富む厚いペプチドグルカン層で構成されている（Knox, et al., Bacteriol. Rev. 37(2):215, 1973）。カチオン性ナノ粒子は、これらの負帯電病原体を静電引力によって効果的に標的化するために使用することができる（Liu et al., Nature Nanotechnology 4, 457-463, 2009）。
【０１１８】
いくつかの態様において、PLGA-PLH-PEGによって形成されるナノ粒子は、静電引力によって負帯電不活化病原体に結合することができるような十分に強いカチオン電荷をその表面に有する。
【０１１９】
いくつかの態様において、不活化病原体は、ナノ粒子表面にコンジュゲートしたリンカーを介してアジュバント添加ナノ粒子に付着することができる。リンカーは、不活化病原体の表面抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、たとえば大腸菌O157表面抗原を標的化するモノクロール抗体であることができる（Zhao et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101(42):15027-32, 2004）。リンカーは、不活化病原体の表面標的に特異的に結合するアプタマー、たとえば毒力ヒト型結核菌（H37Rv株）に高い親和性および特異性で結合するアプタマーNK2であることができる（Chen et al., Biochem Biophys Res Commun. 8;357(3):743-8, 2007）。リンカーは、不活化病原体の表面標的に特異的に結合する抗生物質、たとえばバンコマイシンであることができる（Kell et al., ACS Nano 2: 1777-1788, 2008）。リンカーは、不活化病原体の表面多糖類に特異的に結合するレクチン、たとえばＨ．ピロリ菌株の炭水化物受容体に結合するハルエニシダ凝集素I（Ulex Europaeus Agglutinin I）（UEA I）またはコンコナバリンA（Con A）レクチンであることができる（Umamaheshwari et al., J Drug Target. 11(7):415-23, 2003）。リンカーはまた、不活化病原体の表面標的に特異的に結合する抗微生物性ペプチド、たとえばSushi 1であることができる（Leptihn et al., BMC Biol 7: 22, 2009）。また、本明細書に記載される他のリンカーを使用することもできる。
【０１２０】
いくつかの態様において、不活化病原体は、互いとで高特異性非共有結合的相互作用を形成する1対の結合パートナーを介してアジュバント添加ナノ粒子に付着する。適当な結合対は当技術分野において周知であり、たとえば、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとニュートラアビジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとグルタチオン、マルトース結合タンパク質とアミラーゼおよびマルトース結合タンパク質とマルトースである。
【０１２１】
ワクチン組成物の使用方法
本明細書に開示されるワクチン組成物は、対象において、ワクチンに含まれる特定の病原体によるその後の感染に対する免疫防御を付与する予防ワクチンとして有用である。たとえば、病原体は、細菌、たとえばクラミジアトラコマチス、野兎病菌、ヒト型結核菌、肺炎連鎖球菌、リステリア菌、コレラ菌、ソンネ赤痢菌、フレキシネル赤痢菌もしくはネズミチフス菌またはウイルス、たとえばインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、C型肝炎ウイルスであることができる。感染性病原体から疾患を発症する危険のある対象は、本明細書に開示されるワクチン組成物によって予防的に処置されることができる。感染性風土病の地域に旅行する、または住む個人は、特定の感染性病原体の危険にあり、それに対する予防的ワクチン接種の候補者であるとみなされ得る。予防的処置は、特定の疾患と特定の危険因子、たとえば地理的場所または職場環境との間に既知の関係がある任意の数の病原体関連疾患に適用されることができる。
【０１２２】
ワクチン組成物はまた、感染した病原体に対する対象の免疫応答を開始または増強するために使用することができる治療ワクチンとしても有用である。感染性病原体に感染した対象は、本明細書に開示されるワクチン組成物によって治療的に処置されることができる。
【０１２３】
T細胞媒介粘膜免疫応答を誘発するこれらのワクチン組成物の能力が、これらの組成物を、粘膜を通って対象に侵入する細菌、ウイルス、寄生生物、真菌または他の微生物病原体によって引き起こされる感染症を予防および治療するために特に有用なものにする。
【０１２４】
予防的または治療的免疫応答の所望の転帰は、当技術分野において周知の原理にしたがって、疾患よって異なり得る。たとえば、病原体に対する免疫応答は、病原体のコロニー形成および複製を抑止または防止して、防御免疫および任意の症候の非存在または減少を生じさせ得る。しかし、病原体に対するワクチンは、それが症候の数、重篤度または持続期間を減らす、集団中の症候を示す個体の数を減らす、または感染性病原体の伝染を単に減らすとしても、有効とみなされ得る。処置は、単回投与で実施されてもよいし、間隔をおいて繰り返されてもよい。適切な用量は、当業者によって理解される様々なパラメータ、たとえばワクチン組成そのもの、投与経路またはワクチン接種を受ける対象の状態（体重、年齢など）に依存する。
【０１２５】
投与
概して、ワクチンは、多様な経路、たとえば非限定的に経口、吸入（鼻、気管支または肺）、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、膣または直腸手段によって投与することができる。
【０１２６】
本明細書に開示されるワクチン組成物および感染症予防または治療方法は、経口／消化管、気道または泌尿生殖路への粘膜投与を通して特に効果的である。たとえば、ワクチン組成物は、眼、鼻腔内、経口、経頬、舌下、扁桃、気管支、肺、胃、腸管、直腸、膣または尿路経路を介して投与することができる。いくつかの態様において、ワクチン組成物は鼻腔内ワクチン接種によって投与することができる。鼻腔内ワクチン接種法は、小滴、噴霧または乾燥粉末形態のワクチン、たとえば噴霧化またはエアロゾル化ワクチン組成物の、免疫化される個体の鼻咽頭の中への投与を含む。代替投与経路は膣内および直腸内投与を含み、直腸および膣投与のための座剤を利用することができる。ワクチン組成物は膣経路によって投与することができ、膣クリームおよび座剤のための乳化剤、ポリマー、たとえばCARBOPOL（登録商標）および他の公知の安定剤をはじめとする、膣投与のための薬学的に許容可能な賦形剤を使用することができる。ワクチン組成物は直腸経路によって投与することができ、直腸座剤を形成するための当技術分野において公知のワックスおよびポリマーを含めることができる。いくつかの態様において、ワクチン組成物は、経口的に、または他の胃腸管経路を介して投与することができる。腸溶製剤、たとえば胃液耐性カプセルおよび経口投与のための顆粒がそのような投与に適している。
【０１２７】
ワクチン組成物が直接粘膜を標的にすると、ワクチン組成物が粘膜免疫を誘導する能力が大きく増進する。粘膜免疫は、病原体が粘膜バリヤを通過する前に病原体による感染に対する防御にとって不可欠である。そのうえ、鼻腔内ワクチン接種のような1つの経路を介する粘膜ワクチン接種は、その粘膜部位だけでなく、性器粘膜のような離れた粘膜部位ででも粘膜免疫を誘導し得る（Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265-276, 1987）。粘膜免疫応答を誘導するその優越さの他に、粘膜ワクチン接種のもう1つの魅力的な利点は、良好な全身免疫をも誘導するその能力に依存する。粘膜投与はまた、特に、強力な免疫を維持するためにブーストが必要であるとき、痛い注射および患者に対する関連するマイナスの効果を回避させる。
【０１２８】
ワクチン組成物の投与は、有効量のワクチンがその標的に達することを可能にする任意の許容可能な方法によって達成することができる。粘膜投与に適切な浸透剤、たとえば洗浄剤、胆汁酸塩またはフシジン酸誘導体をワクチン組成物に含めることができる。選択される具体的な形態は、具体的な組成、処置を受ける対象の状態の重篤度および対象において効果的な免疫応答を誘導するために必要な投与量のような要因に依存する。本明細書の中で概して使用される「有効量」とは、処置を受ける対象において免疫応答を誘導するのに十分である量である。ワクチンの実際の有効量は、利用される特定の病原体およびアジュバント、調合される具体的なワクチン組成物、投与形態、ワクチン接種を受ける個体の年齢、体重、状態ならびに投与経路および疾患または障害にしたがって異なることができる。
【実施例】
【０１２９】
請求項に係る発明の範囲を限定しない以下の実施例において本発明をさらに説明する。
【０１３０】
実施例1
不活化クラミジアトラコマチスによる免疫化は制御性T細胞媒介免疫寛容を誘導する
クラミジア属の細菌は、結膜炎および失明性トラコーマ、非淋菌性尿道炎、子宮頸管炎、骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、卵管因子不妊ならびに間質性肺炎のような、余りあるほどの眼、生殖器および呼吸器疾患を引き起こす（Igietseme et al., Expert Review of Vaccines 10:1585-1596, 2011）。クラミジアトラコマチス（以下、「クラミジア」または「Ct」）は、そのライフサイクル中で感染性の基本小体（EB）と代謝的活性の網状体（RB）との間で交代する偏性細胞内病原体である。現在、クラミジアトラコマチス感染に対する、ヒトにおける使用のために利用可能なワクチンはない（Igietseme et al., Expert Review of Vaccines 10:1585-1596, 2011）。
【０１３１】
不活化クラミジアに基づくワクチンを、まず、その免疫防御効果に関して試験した。生きた病原性クラミジア基本小体をUV光への30分間の暴露によって不活化した。McCoy細胞を感染させて活発に増殖するクラミジアを除外することにより、不活化クラミジア菌を単離した。
【０１３２】
マウスを感染性またはUV不活化クラミジアで子宮内免疫化した。非外科的胚移植装置（NSET, ParaTechs）を添付の取り扱い説明にしたがって使用して子宮内接種を実施した。マウスを一時的に拘束する間、1個の小さなプラスチック「検鏡」を膣内に挿入した。これにより、10〜20μlのクラミジア菌を子宮頸部に通して正確に送達するための特殊なマイクロピペット先端（通常のピペットの上）を配置することができた。
【０１３３】
免疫化から4週後、免疫化マウスおよびナイーブ対照マウスを106感染単位（IFU）の生菌クラミジアで子宮内的にチャレンジした。6日後、チャレンジされた全マウスから子宮を採取し、子宮からRNAサンプルを調製した。定量的PCR（qPCR）を実施して、マウスグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の量に対するクラミジア16s RNAの量を検出し、測定した。4つの独立した実験のマウスごとにクラミジア16s rRNAの正規化量を計算し、図1Aにクラミジア負荷として提示した。感染性クラミジアによる子宮内免疫化は、クラミジア負荷の減少およびその後の生菌クラミジアによる子宮内チャレンジに対する免疫防御を生じさせた（図1A）。しかし、UV不活化クラミジア（UV-Ct）による子宮内免疫化は、その後の生菌クラミジアチャレンジに対する感受性の増大を生じさせて、UV不活化クラミジアによって免疫寛容が誘導されたことを示す（図1A）。これは、不活化細菌だけでは防御が誘導されず、むしろ免疫寛容が誘導されることを示す。
【０１３４】
次に、様々なタイプのアジュバントをUV不活化クラミジアとともに投与して、不活化クラミジアによって誘導される免疫寛容に打ち勝つことができるかどうかを調べた。マウスを、水酸化アルミニウム（Alum）；イミキモド（IMQ）またはCpGオリゴデオキシヌクレオチドC型（CpG）の1つのアジュバントを伴う、感染性クラミジア、UV不活化クラミジアまたはUV不活化クラミジア
で子宮内的に免疫化した。免疫化から4週後、免疫化マウスおよびナイーブ対照マウスを上記のように生菌クラミジアで子宮内的または皮下的にチャレンジした。チャレンジののち6日目、qPCRによってクラミジア負荷を計測し、代表的な実験からのデータを図1Bに示した。ここでもまた、UV不活化クラミジアによる子宮内免疫化は免疫寛容を生じさせ、アジュバントの同時投与は免疫寛容効果に打ち勝たない（図1B）。UV不活化クラミジアによる皮下免疫化は、Alum、IMQまたはCpGと同時に投与された場合でさえ、その後の性器クラミジアチャレンジに対する防御または寛容を提供しなかった（図1B）。
【０１３５】
クラミジア特異的TCRトランスジェニックマウスを使用することにより、免疫寛容を媒介する特定のT細胞型を調査した。野生型CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞（NR1細胞）をCD90.2+ホストマウスの中に移入した。1日後、レシピエントマウスを106IFUの感染性またはUV不活化クラミジアで子宮内的に接種した。感染ののち4日目、流入領域リンパ節を採取し、フーサイトメトリーに備えて細胞を下処理した。移入されたCD90.1+CD4+T細胞を、制御性T（Treg）細胞のマーカーである細胞内FoxP3発現に関して分析した。UV-Ct免疫化ののち、子宮および流入領域LN中にFoxP3発現性CD25highNR1細胞の有意な増加が認められた（図1C〜1D）。FACSによって単離されたeGFP-NR1細胞の移入が類似した数のTregを生じさせたため、これらのFoxP3+細胞は、増殖ではなく変換によって産生されたものである（図1C〜1D）。これらのデータは、UV-Ct免疫化がFoxP3+Tregの誘導を招くことを示し、このワクチン手法がなぜ無効であり、免疫寛容を誘導するのかを説明し得る。
【０１３６】
CD25は、マウスにおけるCD4+FoxP3+Treg細胞のための確立されたマーカーである。Tregが寛容をつかさどるかどうかを判定するために、UV-Ctを事前にワクチン接種したマウスにおけるクラミジアチャレンジの前後3日間、抗CD25モノクローナル抗体処置によってTreg細胞を枯渇させた。クラミジア負荷を上記のように試験した。具体的には、マウスを106IFUのUV不活化クラミジアで子宮内的に免疫化した。4週後、免疫化マウスおよびナイーブ対照マウスを106IFUの感染性クラミジアでチャレンジした。チャレンジ前の3日間およびチャレンジ後の3日間、免疫化マウスを抗CD25モノクロナール抗体（PC61.5）または対照IgG（500mg）で処置した。チャレンジののち6日目、qPCRによってクラミジア負荷を計測した。Tregの枯渇は、生殖路中のクラミジアレベルを対照IgG処置マウスに比べて低下させ（図1E）、CD4+FoxP3+Treg細胞が、不活化クラミジア誘導免疫寛容の媒介において重要な役割を演じることを示した。
【０１３７】
活性化されると、Treg細胞は多量のインターロイキン-10（IL-10）を分泌する。したがって、不活化クラミジア誘導免疫寛容におけるIL-10の役割を試験した。野生型またはIL-10-/-マウスを感染性またはUV不活化クラミジアによって子宮内的に免疫化した。生菌クラミジアによるチャレンジおよびクラミジア負荷の測定を上記のように実施した。IL-10欠損が不活化クラミジア誘導免疫寛容（図1F）を無効化し、Treg分泌IL-10が不活化クラミジア誘導免疫寛容において重要な役割を演じることを確認させた。
【０１３８】
これらの結果は、UV-Ctワクチン接種がクラミジア特異的CD4+Tregの誘導を通して寛容をIL-10依存的に刺激することを示す。
【０１３９】
実施例2
クラミジアトラコマチスワクチン組成物の生成および評価
アジュバント添加ポリマーナノ粒子に付着したUV不活化クラミジアを含むワクチン組成物を調製し、評価した。TLR7アゴニストR848を、ワクチン組成物に含めることができる適当なアジュバントの例として使用した。生理的pH7.4で、R848をPLAに共有結合させ、わずかに負に帯電し、かつ表面PEG化されたナノ粒子へとアセンブルした。pHを6に下げて表面切り換え機構を活性化すると、ナノ粒子の正の表面電荷およびその後の負帯電クラミジアへの結合が生じた（図2A）。
【０１４０】
ポリマー合成
ポリ（L-ヒスチジン）（PLH）を、GenScript（Piscataway, NJ）により、N末端リジンおよびC末端システインをその間の20のヒスチジン残基とともに含むようにカスタム合成した（N〜C末端配列：KH20C）。このKH20Cペプチド（0.01mmol）を、水中、0.01mmolオルトピリジル修飾メトキシポリ（エチレングリコール）（mPEG-OPSS、Laysan Bio（Arab, AL）から購入）と混合して、PLH-PEGジブロックコポリマーを生成し、それを、Slide-A-Lyzer 2,000 MWCO透析カセット（Thermo Scientific）を使用する透析によって精製し、乾燥物へと凍結乾燥させた。
【０１４１】
別に、0.67の内部粘度を有する5μmolポリ（乳酸-co-グリコール酸）-COOH（PLGA-COOH）（LACTEL Absorbablesから購入）を、ジクロロメタン2mL中、0.246mmol  1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）および0.295mmol  N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）によって活性化した。PLGA-NHSを−20℃メタノールによって沈降させ、真空中、50℃で乾燥させた。次いで、乾燥したPLGA-NHS（104.9mg）を、DMSO中、少なくとも24時間の反応により、24.8mg  PLH-PEGジブロックコポリマー（上記のように合成）に結合させて、PLGA-PLH-PEGトリブロックコポリマーを生成した。PLGA-PEGジブロックコポリマーは、Boehringer Ingelheim GmbHから購入したものであった。
【０１４２】
開環重合によってR848-PLA（ポリ乳酸）を合成した。R-848（100mg、3.18×10-4モル、InVivogen）、D/Lラクチド（5.6gm、3.89×10-2モル、Sigma Aldrich）および無水硫酸ナトリウム（4.0gm）を真空下50℃で8時間乾燥させたのち、トルエン（100mL）を加えた。反応物を、120℃に設定された油槽中でかく拌したのち、エチルヘキサン酸スズ（75mg、60μL）を加えた。次いで、アルゴン下、加熱を16時間継続した。水を加えることによって反応を停止させ、その後さらなるトルエン（200mL）を加えた。次いで、トルエン溶液を、5％塩酸を含有する10％塩化ナトリウム溶液（200mL）で洗浄し、その後、飽和炭酸水素ナトリウム（200mL）で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させて、ポリ乳酸-R-848コンジュゲート3.59グラムを得た。ポリマーの一部分を塩基中で加水分解し、R-848含量に関してHPLCによって試験した。HPLC応答を示すR-848濃度の標準曲線との比較により、このポリマーが1グラムあたり5.6mgのR-848を含有することがわかった。ポリマーの分子量は、GPCにより、約27,000であることがわかった（米国特許出願公開公報第20110268805号を参照）。
【０１４３】
R848添加ポリマーナノ粒子調製
以前に記載されているようにして（Kamaly et al., Chem. Soc. Rev., 41: 2971-3010, 2012）、ポリマー含有有機相を水相中に乳化させることによってR848添加ナノ粒子を調製した。有機相は、以下の3つのポリマー：（1）ポリ（乳酸-co-グリコール酸）-ブロック-ポリ（L-ヒスチジン）-ブロック-ポリ（エチレングリコール）（PLGA-PLH-PEG）トリブロックコポリマー（40重量％）、（2）PLGA-PEGジブロックコポリマー（20重量％）および（3）ポリ（乳酸）-R848コンジュゲート（PLA-R848）（40重量％）を混合することによって調製したものである。PLGA-PEGコポリマーは、有機相の安定性を改善するために加えたものである。有効成分と生分解性ポリマーとのコンジュゲートの形成は、封入を改善し、PLGAまたはPLAベースのナノ粒子からの有効成分の放出を抑制する（Kolishetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107:17939-17944, 2010）。
【０１４４】
ワクチン調合
一般的な調合において、15/85DMSO/酢酸エチル溶液400μL中、PLH含有ポリマー5.33mgをPLGA-PEG2.66mgおよびR848-PLAコンジュゲート5.33mgと混合することにより、クラミジア菌に付着するように設計されたナノ粒子を調製した。正に帯電していない対照ナノ粒子を、同様なやり方で、ただしPLGA-PEG8.0mgおよびR848-PLA5.33mgのみを使用して調合した。R848-PLAを含有しないナノ粒子の場合、等しい量のPLGAを使用した（内部粘度0.67、LACTEL Absorbables）。プローブチップソニケーター（Misonix Sonicator S-4000、Farmingdale, NY）を連続モード中40％振幅で30秒間使用してポリマー含有有機溶液を純水2mL中に音波処理したのち、ヒュームフード中、電磁かく拌下、純水8mL中に希釈した。溶媒を少なくとも2時間蒸発させ、その時点でナノ粒子を捕集し、Amicon Ultra-4  100,000NMWLカットオフフィルター（Millipore, Billerica, MA）を使用する反復限外ろ過によって精製した。
【０１４５】
ポリマーナノ粒子（40重量％PLGA-PLH-PEG、40重量％PLA-R848、20重量％PLGA-PEG）（0.67mg/用量）を、1用量あたり107IFUのUV不活化クラミジアとともに、pH6.0の希釈塩溶液中でインキュベートした。このpHで、ナノ粒子は正の表面電荷を生じさせ（ζ電位20.7±1.0mV）、負帯電UV不活化細菌（ζ電位−12.9±0.6mV）の表面に結合して、所望のクラミジア−ナノ粒子コンジュゲートを形成することができる（図2A）。対照調合物として、（1）PLGA-PEG（60重量％）および（2）PLA-R848コンジュゲート（40重量％）を含有する調合物を調製し、上記と同じ工程で処理した。
【０１４６】
不活化クラミジアへのR848添加ナノ粒子（「電荷切り換え性合成アジュバント粒子」（cSAP）とも呼ばれる）の結合を原子間力顕微鏡によって検査した。図2Bは、低pH条件、たとえばpH6での不活化クラミジアトラコマチスの表面へのR848添加ナノ粒子の結合を示すクリオTEM（極低温透過型電子顕微鏡）画像である。動的光散乱が、UV-CtまたはcSAPのみに比較したUV-Ct-cSAP作成物のサイズ差を明らかにすることにより、不活化クラミジア菌へのR848添加ナノ粒子の結合を確認させる（図2C）。
【０１４７】
UV不活化クラミジア（UV-Ct）をBacLight染色キットで染色したのち、Alexa Fluor 488標識cSAPまたはPLH基を欠く対照粒子（SAP）とともにpH7.4および6.0でインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、UV-CtとcSAPまたはSAPとの間の結合を試験した。UV-CtはpH6でのみcSAPに結合し、pH7.4では結合しない（図2D〜2E）。
【０１４８】
ワクチン組成物の評価
R848添加ナノ粒子に付着したUV不活化クラミジアを含むワクチン組成物の免疫防御効果を試験した。マウスを、106IFUの感染性クラミジアまたはUV不活化クラミジア（UV-Ct）、R848添加ナノ粒子に付着したUV-Ct、空のナノ粒子に付着したUV-CtもしくはR848と混合したUV-Ctを含むワクチン組成物で子宮内的に免疫化した。免疫化から4週後、免疫化マウスおよびナイーブ対照マウスを106IFUの生菌クラミジアでチャレンジした。チャレンジののち6日目、qPCRによってクラミジア負荷を計測した。R848添加ナノ粒子に付着したUV不活化クラミジアを含むワクチン組成物による免疫化は、その後の生菌クラミジアチャレンジに対してマウスを防御するが、他の組成物による免疫化はそれを防御しない（図2F）。特定の条件においては、R848添加ナノ粒子を、UV不活化クラミジアに付着する前に、水酸化ナトリウム（NaOH）で中和した。いくつかの他の条件においては、R848添加ナノ粒子を、UV不活化クラミジアに付着する前に、1：10または1：100に希釈した。UV不活化クラミジアへの付着の前のR848添加ナノ粒子の1：10滴定または中和はワクチン組成物の免疫防御性を変化させない（図2G）。
【０１４９】
生菌クラミジア、UV不活化クラミジアおよびUV-Ct-cSAPによる血清中の抗クラミジアIgGの誘導をELISAによって測定した。データを個々のマウスの血清の光学密度（OD）として図2Hに提示した。UV-Ct-cSAPは、生菌クラミジアと同様なレベルでマウスにおいてIgGを誘導することができた（図2H）。
【０１５０】
実施例3
クラミジアトラコマチスワクチン組成物誘導防御免疫はCD4+T細胞によって媒介される
防御免疫を媒介するエフェクター細胞を試験するために、C57BL/6野生型、DHLMP2a-/-（抗体欠損）、μMt（B細胞欠損）、CD8-/-、MHCクラスII-/-（CD4+T細胞による抗原認識を欠く）およびRAG-2-/-マウス（TおよびBリンパ球を欠く）を、UV不活化クラミジアに付着したR848添加ナノ粒子を含む新たなワクチン組成物で免疫化し、1ヶ月後、生殖路中、感染性クラミジアでチャレンジした。その後のクラミジア感染に対する防御免疫は、DHLMP2a-/-（抗体欠損）、μMt（B細胞欠損）およびCD8-/-マウスにおいては保存されたが、MHCクラスII-/-（CD4+T細胞による抗原認識を欠く）およびRAG-2-/-（TおよびBリンパ球を欠く）マウスにおいては失われた（図3A〜3C）。これらの発見は、UV不活化クラミジアに付着したR848添加ナノ粒子を含む新規なワクチン組成物によって刺激される防御免疫の媒介においてCD4+T細胞が重要な役割を演じ得ることを示す。
【０１５１】
CD4+T細胞が新規なワクチン組成物によって刺激される防御免疫を媒介することを確認するために、マウスを感染性クラミジア（Ct）、UV不活化クラミジア（UV-Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で免疫化した。4週後、CD4+もしくはCD8+T細胞またはT細胞枯渇リンパ球を免疫化マウスまたは対照マウスから単離し、ナイーブマウスに移入した。移入から1日後、レシピエントマウスを106IFUの生菌クラミジアでチャレンジし、チャレンジから6日後、これらのマウスからの子宮を採取した。先に実施例1に記載したようにクラミジア負荷を測定した。
【０１５２】
その後のクラミジアチャレンジに対する防御免疫は、感染性クラミジアまたは新規なワクチン組成物で免疫化されたマウスから得られたCD4+T細胞を移入されたレシピエントマウスにおいては認められたが、他のレシピエントマウスにおいては認められなかった（図3D）。不活化クラミジアのみで免疫化されていたマウスからのCD4+T細胞の移入は、その後のクラミジアチャレンジに対する感受性の増大を付与して、免疫寛容もまたCD4+T細胞に依存することを確認させた（図3D）。したがって、図3Dは、防御免疫はCD4+T細胞によって媒介されたが、CD8+T細胞または他のリンパ球によっては媒介されなかったことを示す。
【０１５３】
クラミジア特異的T細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウスを使用して、新規なワクチン組成物によるクラミジア特異的CD4+T細胞の誘導を試験した。野生型CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞（NR1細胞）を蛍光色素カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識し、免疫化から1日後、CD90.2ホストマウスに移入した。レシピエントマウスを106IFUの感染性クラミジア（Ct）、UV不活化クラミジア（UV-Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で子宮内的にチャレンジした。チャレンジののち4日目、流入領域リンパ節および子宮をレシピエントマウスから採取し、フローサイトメトリーによって分析した。リンパ節および子宮中のクラミジア特異的トランスジェニックCD4+T細胞の絶対数を計数した。有意により多くのNR1細胞が、UV不活化クラミジアでチャレンジされたマウスと比較して、感染性クラミジアまたは新規なワクチン組成物でチャレンジされマウスの子宮および流入領域LN中に蓄積していた（図4A）。
【０１５４】
リンパ節からのクラミジア特異的トランスジェニックCD90.1+CD4+T細胞の増殖をCFSE希釈に関してフローサイトメトリーによって分析した。CD90.1+CD4+T細胞は、非感染マウスへの移入ののち高レベルのCFSEを保持して、それらCD90.1+CD4+T細胞が感染の非存在においては増殖しないことを示した（図4B）。UV不活化クラミジア（UV-Ct）を感染させたマウスは、対照マウスと匹敵しうるレベルのクラミジア特異的CD4+T細胞を有して、これらのマウスにもクラミジア特異的CD4+Tの刺激がないことを示す（図4B）。他方、感染性クラミジア（Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）でチャレンジされたマウスにおけるCD90.1+CD4+T細胞の数は、非感染対照マウスまたはUV-Ctでチャレンジされたマウスにおける数を大きく超えた（図4B）。これらの発見は、新規なワクチン組成物が生菌クラミジアと同様なやり方でクラミジア特異的CD4+T細胞増殖を誘導したことを示す。
【０１５５】
免疫化ののち4日目、CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞をリンパ節から単離し、T細胞刺激物質ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシンによってインビトロで再び刺激し、細胞内TNF-α、IFN-γおよびIL-2産生に関して染色した。3つのサイトカインすべてを産生するCD90.1+CD4+T細胞の数は、UV不活化クラミジアで免疫化されたマウスまたは対照マウスと比較して、新規なワクチン組成物または感染性クラミジアで免疫化されたマウスにおいて有意に高く（図4C）、新規なワクチン組成物が生菌クラミジアと同様なやり方で活性なクラミジア特異的T細胞応答を誘導することを示した。
【０１５６】
これらのデータは、UV-Ct-cSAPのワクチン接種がNR1細胞増殖（図4B）ならびに子宮および流入領域LN中の蓄積（図4A）を生じさせ、それが、生菌クラミジアを感染させたマウスから区別できないほどにサイトカインTNF-α、IFN-γおよびIL-2を産生したことを示す（図4C）。したがって、不活化細菌へのアジュバントの直接結合は、その後の細菌感染に対して粘膜を防御する多機能性抗原特異的細胞免疫応答を促進する。
【０１５７】
実施例4
子宮のCD103-樹状細胞はクラミジア特異的T細胞を誘導する
CD45+MHC-II+抗原提示細胞をF4/80およびCD103発現にしたがって3つのサブセット：F4/80+CD103-マクロファージ、F4/80-CD103-樹状細胞およびF4/80-CD103+樹状細胞に選別し、CD11c、CD11bおよびCX3CR1発現に関して分析した。F4/80+CD103-マクロファージは高いCD11bおよびCX3CR1発現かつ低いCD11c発現を示し、F4/80-CD103-樹状細胞は高いCD11c、CD11bおよびCX3CR1発現を示し、F4/80-CD103+樹状細胞は低いCD11bおよびCX3CR1発現かつ高いCD11c発現を示した（図5A）。
【０１５８】
マウスを感染性クラミジア（Ct）、UV不活化クラミジア（UV-Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で子宮内的にチャレンジした。感染から18または24時間後、CD45+MHC-II+細胞を子宮またはリンパ節から単離し、それらのCD103およびF4/80発現にしたがって蛍光活性化細胞選別法（FACS）によって選別した。選別された抗原提示細胞1,000個あたりのクラミジア負荷をqPCRによって計測した。単離された子宮CD326+上皮細胞（EC）が正の対照として働いた。CD103-樹状細胞は、子宮（図5B）およびリンパ節（図5C）の両方においてF4/80+マクロファージおよびCD103+樹状細胞よりも有意に高いクラミジア負荷を有して、CD103-樹状細胞がクラミジアの認識および提示において重要な役割を演じることを示す。
【０１５９】
クラミジア特異的CD4+トランスジェニックT細胞（NR1細胞）をCFSEで標識し、感染性クラミジア（Ct）、UV不活化クラミジア（UV-Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で子宮内的にチャレンジされたマウスの子宮から単離されたF4/80+マクロファージ、CD103-樹状細胞またはCD103+樹状細胞とともに3日間同時培養した。クラミジア特異的CD4+トランスジェニックT細胞の増殖をCFSE希釈によって計測した。感染性クラミジアで免疫化されたマウスの子宮から単離されたCD103-樹状細胞は、インビトロでクラミジア特異的CD4+トランスジェニックT細胞の増殖を誘導するが、他の抗原提示細胞はそれを誘導しない（図5D）。次いで、クラミジア特異的CD4+トランスジェニックT細胞に対するCD103-樹状細胞の効果をインビボで試験した。野生型CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞をCFSEで標識し、CD90.2ホストマウスに移入した。1日後、レシピエントマウスの右足蹠に、感染性クラミジア（Ct）、UV不活化クラミジア（UV-Ct）または新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）で免疫化されたマウスの子宮から単離されたF4/80+マクロファージ、CD103-樹状細胞またはCD103+樹状細胞を注射した。細胞注射から3日後、CFSE希釈CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞に関して左右の膝窩リンパ節を分析した。ここでもまた、生菌CtまたはUV-Ct-cSAPで免疫化されたマウスの子宮から単離されたCD103-樹状細胞は、右の膝窩リンパ節においてクラミジア特異的CD4+トランスジェニックT細胞の増殖を誘導するが、他の抗原提示細胞はそれを誘導しない（図5E）。したがって、子宮のCD103-樹状細胞はインビトロおよびインビボの両方でクラミジア特異的T細胞の増殖を誘導する。
【０１６０】
これらのデータは、生菌クラミジア感染マウスまたはUV-Ct-cSAP免疫化マウスから選別されたCD103-樹状細胞が、CFSE希釈による計測で、インビトロおよびインビボでNR1細胞の増殖を刺激したことを示す（図5D〜5E）。CD103+樹状細胞は、UV-Ct免疫化のみののち、FoxP3+CD25+NR1細胞の数を増すことによって（図5F）有意なNR1増殖を促進することができた（図5D）。合わさって、これらの結果は、クラミジア感染またはUV-Ct-cSAP免疫化ののち、性器粘膜からのCD103-樹状細胞がクラミジア抗原を輸送し、クラミジア特異的CD4+T細胞を直接活性化して防御免疫を促進することを実証する。逆に、UV-Ctは、CD103-樹状細胞集団によって効率的には取り込まれず、むしろ、CD103+樹状細胞中に見いだされ、性器粘膜における防御と寛容との間のバランスに影響し得るTregの誘導を招く。
【０１６１】
実施例5
クラミジアトラコマチスワクチン組成物によって誘導される異なる粘膜にまたがる防御免疫
新規なワクチン組成物によって誘導される防御免疫の長さを評価した。マウスを、抗原刺激なし、感染性もしくは不活化クラミジアまたは新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）による子宮内免疫化から6ヶ月後、生菌クラミジアで子宮内的にチャレンジした。先に実施例1で記載したようにクラミジア負荷を測定した。新規なワクチン組成物または感染性クラミジアによる子宮内免疫化は、免疫化ののち少なくとも6ヶ月間、その後の性器クラミジア感染に対する防御を生じさせて、長期的免疫の存在を示したが、不活化クラミジアによる子宮内免疫化はそれを生じさせなかった（図6A）。
【０１６２】
また、様々なワクチン投与経路を試験した。新規なワクチン組成物を、別の粘膜界面として鼻腔内粘膜を介して、または従来の経路として皮下的に投与した。鼻腔内チャレンジの場合、マウスを麻酔し、ワクチン組成物の滴をその鼻孔の上に載せ、吸入させた。皮下接種の場合、ワクチン組成物を尾の付け根または脇腹で皮下投与した。免疫化から4週後、マウスを感染性クラミジアで子宮内的にチャレンジし、クラミジア負荷を測定した。新規なワクチン組成物（UV-Ct-cSAP）による鼻腔内免疫化はその後の性器クラミジア感染に対する防御免疫を生じさせたが、皮下免疫化はそれを生じさせなかった（図6B）。したがって、異なる粘膜にまたがる防御免疫が新規なワクチン組成物によって誘導された。
【０１６３】
次に、野生型CD90.1+トランスジェニックCD4+T細胞（NR1）をCD90.2ホストマウスに移入し、1日後、ホストマウスをUV-Ct-cSAPで子宮内的（i.u.）、鼻腔内的（i.n.）または皮下的（s.c.）に免疫化した。免疫化ののち7日目、子宮を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。クラミジア特異的トランスジェニックCD4+T細胞の絶対数を計数した。クラミジア特異的トランスジェニックCD4+T細胞は、子宮内または鼻腔内免疫化によって性器粘膜組織に移入したが、皮下免疫化によっては移入しなかった（図6C）。
【０１６４】
鼻腔内免疫化後のクラミジア特異的T細胞応答と皮下免疫化後のクラミジア特異的T細胞応答との間で定量的および／または定性的差を調査した。子宮常在メモリー細胞が、免疫化ののちを肺に刷り込まれ、次いで生殖路に輸送され、そこで防御を媒介するのかもしれない。この仮説を試験するために、マウスにNR1細胞を注射し、次いで様々な経路によって新規なワクチン組成物UV-Ct-cSAPで免疫化した。ワクチン接種から7日後および30日後、いくつかの器官中のNR1細胞の数を定量した。循環NR1細胞の誘導（たとえば血液、脾臓中）ならびにリンパ節および肝臓中のNR1細胞の数は、異なる免疫化経路の間で匹敵しうるものであった（図6D）。
【０１６５】
対照的に、子宮内免疫化は性器粘膜中で最高レベルのNR1動員および保持をもたらしたが、皮下ワクチン接種は任意のNR1保持をもたらさなかった（図6D）。興味深いことに、鼻腔内免疫化から30日後でさえ、有意な数のNR1細胞が子宮中に存在していた（図6D）。鼻腔内および子宮内ワクチン接種の場合、肺中のNR1細胞の数は子宮中のNR1細胞の数とは逆であった（図6D）。これらのデータは、子宮内または鼻腔内経路による免疫化が性器粘膜中で防御NR1細胞の動員および保持を誘導するのに十分であることを示す。
【０１６６】
粘膜常在および循環メモリーT細胞の機能を分析するために、マウスにNR1細胞を静脈注射したのち、UV-Ct-cSAPを鼻腔内的にワクチン接種した。これらの免疫化マウスを3グループに分割し、以下に記すように、抗α4インテグリン（α4）モノクローナル抗体（mAb）および／または対照IgGで処置した。免疫化から9日後（D9）、3グループすべてのマウスを生菌クラミジアで子宮内的にチャレンジした。マウスの第一のグループ（Gr.1）を3日目から11日目まで（D3〜11）対照IgGで静脈内的に処置した。マウスの第二のグループ（Gr.2）を、D3〜11の間、抗α4mAbで処置してクラミジア特異的T細胞の移入を完全に阻止した。マウスの第三のグループ（Gr.3）を、D3〜9の間、対照IgGで処置して、組織常在メモリーT細胞が性器組織の中に輸送されることを許し、次いで、クラミジアチャレンジののちD9〜11の間、抗α4mAbで処置してT細胞のさらなる動員を阻止した。α4インテグリンの阻止は、子宮中のT細胞蓄積を効率的に防止したが（図7C）、脾臓中のNR1細胞の数には影響を及ぼさなかった（図7B）。脾臓中に存在する全身性NR1細胞はα4抗体注射によって影響されなかった（図7D）。
【０１６７】
図7Eは、クラミジアチャレンジの後でのみ、IgGで処置されたGr.1マウスおよび抗α4mAbで処置されたGr.3マウス中でNR1細胞の蓄積が認められ、ワクチン接種およびチャレンジの両方のち、抗α4mAbで処置されたGr.2マウス中ではそれが認められなかったことを示す。図7Fは、クラミジアチャレンジの後でのみ、抗α4mAbで処置されたGr.3マウス（子宮常在メモリーT細胞を含むが、さらに動員された循環メモリー細胞を含まないグループ）が、ナイーブ対照マウスおよび免疫化およびチャレンジの両方のち抗α4mAbで処置されたGr.2マウスと比較して、性器クラミジアチャレンジに対して有意に防御されたことを示す。
【０１６８】
実施例6
常在粘膜メモリーT細胞は離れた粘膜面における免疫化によって誘導され、その後の細菌チャレンジに対する防御を付与する
後続の細菌チャレンジに対するワクチン誘導防御における常在粘膜メモリーT細胞および動員される循環メモリーT細胞の役割を試験するために、並体結合マウスの対を作製し、図8Aに示すように免疫化した。並体結合パートナーの一方（CD45.2）は、並体結合の前（グループB）または後（グループA）でUV-Ct-cSAPまたはUV-Ctで鼻腔内的に免疫化し、他方のパートナー（CD45.1）は免疫化しなかった。並体結合から2週後、リンパ球のキメリズムは45％超であった（データ示さず）。並体結合または免疫化の後に実施したほうから2週後、両パートナーを生菌クラミジアでチャレンジした。各マウスの子宮中のクラミジア菌のレベルをqPCRによって測定した。グループAマウスの両パートナーはその後の性器クラミジアチャレンジに対して防御された（図8B）。
【０１６９】
UV-Ct-cSAPによる免疫化の前に2匹のマウスが血液循環を共有するならば、免疫化によって誘導された粘膜常在メモリー細胞は両パートナーの子宮に移動し、両マウスへのその後の細菌チャレンジに対して防御を付与することができる。グループBマウスの場合、免疫化されたパートナー（CD45.2）だけがその後の性器クラミジアチャレンジに対して防御され、他方のパートナー（CD45.1）は防御されなかった（図8C）。NR-1細胞の数は、防御されなかったマウスと比較して、その後の性器クラミジアチャレンジに対して防御されたマウスにおいて多かった（図8D〜8E）。重要なことに、UV-Ctによる子宮内免疫化は、並体結合のタイミングから独立した免疫寛容を誘導した（図8F〜8G）。
【０１７０】
これらのデータは、本明細書に記載されるワクチン組成物による離れた粘膜面での免疫化によって常在粘膜メモリーT細胞を誘導し、その後の細菌チャレンジに対する防御を付与することができることを示す。対照的に、非修飾UV-Ctによる免疫化は、免疫寛容に影響する循環Tregを誘導する。合わさって、これらのデータは、本明細書に記載されるクラミジアワクチン組成物を使用して、異なる粘膜にまたがる免疫を達成することができることを示す。
【０１７１】
実施例7
野兎病菌ワクチン組成物の生成および評価
野兎病菌は、毒性が高く、野兎病を引き起こすグラム陰性細胞内細菌である。細菌がどのように体に侵入するか、どこから体に侵入するかに依存して、いくつかのタイプの野兎病が存在する。潰瘍腺性野兎病がもっとも一般的な種類の野兎病であり、この場合、感染部位、通常は昆虫または動物咬傷に皮膚潰瘍が形成する。肺炎性野兎病は、肺炎に典型的な徴候および症候を引き起こし、致命的になることがある。その低い感染量、エアロゾルによる拡散しやすさおよび高い毒性のせいで、野兎病菌は、米国政府により、他の潜在的なバイオテロ物質、たとえばペスト菌、天然痘およびエボラとともに、クラスA指定生物剤と分類されている。2つの異なる野兎病菌の実験室株：弱毒化株LVSおよび完全毒株SchuS4がある。LVSは、この菌の徹底的なインビトロ継代によって50年より前に創製され、生菌ワクチンとして使用されてきた。深刻な副作用、不完全な免疫および不明確な免疫原性のせいで、LVSは理想的なワクチンではない。
【０１７２】
生きたLVS菌をUV光への30分間の暴露によって不活化した。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖する細菌を排除することにより、不活化LVS菌を単離した。R848添加ナノ粒子を調製し、実施例2に記載したようにUV不活化野兎病菌（UV-LVS）に付着させた。UV不活化LVS（UV-LVS-cSAP）に付着したR848添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与した。対照マウスに対し、生菌LVSまたは対照粒子（cSAP、UV-LVS、UV-LVS＋SAP）を鼻腔内投与した。4週後、免疫化マウスおよび対照マウスを致死量の生菌LVSで鼻腔内的にチャレンジし、これらのマウスの生存率を21日間観察した。図9Aは、UV-LVS-cSAP免疫化マウスが野兎病菌の弱毒化LVS株によるその後のチャレンジに対して完全に防御されたことを示す。
【０１７３】
野兎病菌の完全毒性SchuS4株によるその後のチャレンジに対してワクチン組成物によって付与される防御を調査した。マウスをUV-LVS-cSAPで鼻腔的に免疫化した、または生菌LVSもしくは対照粒子（UV-LVSまたはUV-LVS＋SAP）で処置した。同じ組成物による2つの追加免疫化または処置を2週間隔で実施した。4週後、免疫化マウスおよび対照マウスを完全毒性SchuS4株で鼻腔内的にチャレンジし、これらのマウスの生存率を30日間観察した。図9Bは、UV-LVS-cSAP免疫化マウスが野兎病菌の完全毒性SchuS4株によるその後のチャレンジに対して部分的に防御されたことを示す。
【０１７４】
防御免疫に対する投与経路の効果を研究した。マウスをUV-LVS-cSAP、生菌LVSまたはUV-LVS+SAPで皮下的または腹腔内的に処置した。4週後、免疫化マウスおよび対照マウスを致死量の生菌LVSで鼻腔内的にチャレンジし、これらのマウスの生存率を21日間観察した。腹腔内経路によるUV-LVS-cSAPでの免疫化ののち、その後のLVSによるチャレンジに対して完全な防護が得られたが（図9C）、皮下経路による免疫化ではそれが得られなかった（図9D）。
【０１７５】
UV-LVS-cSAP免疫化から4週後、IgGおよびIgM抗体の誘導を研究した。誘導されたIgG（図9E）およびIgM（図9F）抗体のレベルは、生菌LVS感染マウスにおけるよりもUV-LVS-cSAP免疫化マウスにおいて高かった。対照粒子（UV-LVS＋SAPまたはUV-LVS）による処置はIgGまたはIgM抗体の増加を誘導しなかった（図9E〜9F）。
【０１７６】
これらのデータは、本明細書に記載される野兎病菌ワクチン組成物による免疫化がその後の野兎病菌チャレンジに対して防御的であることを示す。
【０１７７】
実施例8
肺炎連鎖球菌ワクチン組成物の生成および評価
肺炎連鎖球菌または肺炎球菌はグラム陽性α溶血性耐気性嫌気性細菌である。有意なヒト病原性細菌である肺炎球菌は、肺炎の主要因であり、肺炎症例のほぼ50％において単離することができる。名称にかかわらず、肺炎球菌は、肺炎の他にも、急性副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂巣炎および脳膿瘍をはじめとする多くのタイプの肺炎球菌性感染症を引き起こすことができる。
【０１７８】
生きた肺炎球菌をUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖する細菌を排除することにより、不活化肺炎球菌を単離する。
【０１７９】
R848添加ナノ粒子を調製し、実施例2に記載したようにUV不活化肺炎球菌に付着させる。UV不活化肺炎球菌に付着したR848添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。1ヶ月後、肺炎球菌ワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きた肺炎球菌でチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化された肺炎球菌16s RNAのqPCRによって肺炎球菌負荷を計測する。肺炎球菌負荷が対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、肺炎球菌ワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１８０】
実施例9
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ワクチン組成物の生成および評価
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、自然淘汰の過程を通して、ペニシリン系（メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリンなど）およびセファロスポリン系をはじめとするβラクタム系抗生物質に対する耐性を発現した黄色ブドウ球菌の任意の株である。これらの抗生物質に耐えることができない株はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌またはMSSAと分類される。そのような抗生物質耐性の発現が、その細菌を、抗生物質耐性を有しない黄色ブドウ球菌株よりも本質的に毒性にするわけではないが、耐性は、MRSA感染症を、標準的なタイプの抗生物質によってより治療し難いものにし、ひいてはより危険なものする。
【０１８１】
黄色ブドウ球菌は、もっとも一般的には、鼻孔、他の気道、開放創、静脈内カテーテルまたは尿路でコロニー形成する。健康な個体は、数週から何年の範囲の期間、無症候でMRSAを有し得る。免疫系不全の患者は、症候性の二次感染を起こす危険が有意に高い。MRSAは、開放創、侵襲的装置および弱まった免疫系を有する患者が一般人よりも高い感染リスクにある病院、刑務所および養護施設において特にやっかいである。
【０１８２】
生菌MRSAをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖する細菌を排除することにより、不活化MRSAを単離する。
【０１８３】
R848添加ナノ粒子を調製し、実施例2に記載したようにUV不活化MRSAに付着させる。UV不活化MRSAに付着したR848添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに経鼻投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。1ヶ月後、MRSAワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生菌MRSAでチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたMRSA16s RNAのqPCRによってMRSA負荷を計測する。MRSA負荷が対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、MRSAワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１８４】
実施例10
インフルエンザA型ウイルスワクチン組成物の生成および評価
インフルエンザA型ウイルスは、オルトミクソウイルス科の一属であり、トリおよび哺乳動物においてインフルエンザを引き起こすことができる。インフルエンザA型ウイルスのいくつかの分離株は家禽およびヒトの両方で重い疾患を引き起こす。野生の水鳥から家禽へのインフルエンザA型ウイルスの伝染が大発生を引き起こし、ヒトインフルエンザ大流行を生じさせることがある。
【０１８５】
生きたインフルエンザA型ウイルスをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化インフルエンザA型ウイルスを単離する。
【０１８６】
R848添加ナノ粒子を調製し、実施例2に記載したようにUV不活化インフルエンザA型ウイルスに付着させる。UV不活化インフルエンザA型ウイルスに付着したR848添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。1ヶ月後、インフルエンザA型ウイルスワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたインフルエンザA型ウイルスでチャレンジし、マウス血液サンプルからRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたインフルエンザA型ウイルスRNAのqPCRによってインフルエンザA型ウイルス負荷を計測する。インフルエンザA型ウイルス負荷が対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、インフルエンザA型ウイルスワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１８７】
実施例11
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）ワクチン組成物の生成および評価
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、気道感染症を引き起こすウイルスである。RSVは、一般的な呼吸器ウイルス、たとえば麻疹およびおたふく風邪を引き起こすウイルスを含むパラミクソウイルス科の一本鎖マイナスセンスRNAウイルスである。RSVは、パラミクソウイルス亜科Pneumovirinaeのメンバーである。これは、乳児期および小児期の下気道感染症および通院受診の主要因である。米国においては、はじめてのRSVシーズン中に乳児の60％が感染し、ほぼすべての子供が2〜3歳までにこのウイルスに感染することになる。RSV感染患者の約2〜3％が細気管支炎を発症し、入院治療を要する。
【０１８８】
生きたRSVをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化RSVを単離する。RSVワクチンはまた、抗原性RSVタンパク質を含有するウイルス様粒子または偽型ウイルスを使用して作製することもできる。
【０１８９】
R848添加ナノ粒子を調製し、実施例2に記載したようにUV不活化RSVに付着させる。UV不活化RSVに付着したR848添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。1ヶ月後、RSVワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたRSVでチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたRSV16s RNAのqPCRによってRSV負荷を計測する。RSV負荷が、免疫化されていない対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、RSVワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１９０】
実施例12
SARSコロナウイルスワクチン組成物の生成および評価
重症急性呼吸器症候群（SARS）は、SARSコロナウイルス（SARS-CoV）によって引き起こされる人畜共通起源のウイルス性呼吸器疾患である。世界保健機関によると、2002年11月から2003年7月までの間、中国南部におけるSARSの大発生が複数の国で775の死亡例を引き起こし、致死率は約9.6％であった。初期症候はインフルエンザ様であり、発熱、筋肉痛、嗜眠症候、咳、喉の痛みおよび他の非特異的症候を含み得る。
【０１９１】
生きたSARS-CoVをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化SARS-CoVを単離する。
【０１９２】
US2012/0213812に記載されているシングルまたはダブルエマルション法を使用してCpGオリゴデオキシヌクレオチドC型をナノ粒子中に封入することによってCpG添加ナノ粒子を合成する。封入は、CpGオリゴデオキシヌクレオチドC型を水性バッファー中に溶解し、次いでこの溶液を実施例2に記載された電荷切り換え性コポリマーとともにシングルまたはダブルエマルション法で使用してナノ粒子を自己集合によって形成することによって達成される。そして、実施例2に記載したようにCpG添加ナノ粒子をUV不活化SARS-CoVに付着させる。UV不活化SARS-CoVに付着したCpG添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。
【０１９３】
1ヶ月後、SARS-CoVワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたSARS-CoVでチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたSARS-CoV16s RNAのqPCRによってSARS-CoV負荷を計測する。SARS-CoV負荷が、免疫化されていない対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、SARS-CoVワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１９４】
実施例13
ノロウイルスワクチン組成物の生成および評価
ノロウイルスは、カリチウイルス科の遺伝的に多様な一本鎖RNA非エンベロープウイルスの一属である。このウイルスは、糞便汚染された食品または水によって、ヒトとヒトとの接触によって、およびウイルスのエアロゾル化とその後の表面汚染によって伝染する。ノロウイルスは、ヒトにおけるウイルス性胃腸炎のもっとも一般的な原因であり、全年齢の人々を襲う。この属の既知のウイルスはすべて、ノーウォークウイルスと呼ばれる1つの種の変異株と考えられている。この種は、世界中の胃腸炎の非細菌性流行性大発生の約90％を引き起こし、米国におけるすべての食品伝染性胃腸炎大発生の50％の原因であるといえる。ノロウイルス感染は、吐き気、強い嘔吐、水様下痢および腹痛および場合によっては味覚の損失を特徴とする。全身性嗜眠、脱力感、筋肉痛、頭痛および微熱が出ることもある。
【０１９５】
生きたノロウイルスをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化ノロウイルスを単離する。
【０１９６】
実施例12に記載したようにCpG添加ナノ粒子を合成する。そして、実施例2に記載したようにCpG添加ナノ粒子をUV不活化ノロウイルスに付着させる。UV不活化ノロウイルスに付着したCpG添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。
【０１９７】
1ヶ月後、ノロウイルスワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたノロウイルスでチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたノロウイルス16s RNAのqPCRによってノロウイルス負荷を計測する。ノロウイルス負荷が、免疫化されていない対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、ノロウイルスワクチン組成物を有効であると判定する。
【０１９８】
実施例14
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ワクチン組成物の生成および評価
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、進行性の免疫系不全が生命を脅かす日和見感染症および癌を増悪させるヒトにおける状態である後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こすレンチウイルスである。HIVの感染は、血液、精液、膣液、尿道球腺液または母乳の伝達によって起こる。これらの体液中、HIVは、遊離ウイルス粒子としても存在するし、感染した免疫細胞内のウイルスとしても存在する。HIVは、ヒト免疫系中の生活細胞、たとえばヘルパーT細胞（具体的にはCD4+T細胞）、マクロファージおよび樹状細胞に感染してそれらの細胞を死滅させる。
【０１９９】
HIVをUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化HIVを単離する。
【０２００】
シングルまたはダブルエマルション法を使用してモノホスホリル脂質A（MPLA）をナノ粒子中に封入することによってMPLA添加ナノ粒子を合成する。そして、実施例2に記載したようにMPLA添加ナノ粒子をUV不活化HIVに付着させる。UV不活化HIVに付着したMPLA添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。
【０２０１】
1ヶ月後、HIVワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたHIVでチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたHIV16s RNAのqPCRによってHIV負荷を計測する。HIV負荷が、免疫化されていない対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、HIVワクチン組成物を有効であると判定する。
【０２０２】
実施例15
結核ワクチン組成物の生成および評価
結核（TB）は、様々なバイコバクテリア株、通常はヒト型結核菌によって引き起こされる感染症である。結核は、一般には肺を攻撃するが、体の他の部位を襲うこともある。結核は、活性TB感染を有する人が咳、くしゃみまたは他のやり方で気道液を空気中に送出するとき、空気を介して拡散する。大部分の感染は症候を有さず、潜在性結核として知られている。潜在性感染10のうち約1つが最終的に活性疾患に進行し、治療せずに放置されると、感染者の50％超を死に至らしめる。活性TB感染の典型的な症候は、血痰を伴う慢性咳嗽、発熱、寝汗および体重減である。他の臓器の感染は広い範囲の症候を引き起こす。治療は困難であり、長期間にわたり複数の抗生物質の投与を要する。多剤耐性結核（MDR-TB）感染症においては抗生物質耐性がますます問題となっている。
【０２０３】
ヒト型結核菌をUV光への30分間の暴露によって不活化する。ヒト胚腎（HEK）293細胞を感染させて活発に増殖するウイルスを排除することにより、不活化ヒト型結核菌を単離する。
【０２０４】
実施例14に記載したようにモノホスホリル脂質A（MPLA）添加ナノ粒子を合成する。そして、実施例2に記載したようにMPLA添加ナノ粒子をUV不活化ヒト型結核菌に付着させる。UV不活化ヒト型結核菌に付着したMPLA添加ナノ粒子を含むワクチン組成物をマウスに鼻腔内投与し、実施例2に記載された方法によって評価する。
【０２０５】
1ヶ月後、ヒト型結核菌ワクチン組成物で免疫化されたマウスおよびナイーブ対照マウスを生きたヒト型結核菌でチャレンジし、マウス組織からRNAサンプルを調製する。マウスGAPDHに正規化されたヒト型結核菌16s RNAのqPCRによってヒト型結核菌負荷を計測する。ヒト型結核菌負荷が、免疫化されていない対照マウスよりもワクチン組成物で免疫化されたマウスにおいて低いとき、ヒト型結核菌ワクチン組成物を有効であると判定する。
【０２０６】
他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明したが、前記詳細な説明は、例を示すことを意図したものであり、特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことが理解されよう。他の局面、利点および変形が以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
0006382936.tif 000004
【図１Ｂ】
0006382936.tif 000005
【図１Ｃ】
0006382936.tif 000006
【図１Ｄ】
0006382936.tif 000007
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
0006382936.tif 000009
【図２Ａ】
0006382936.tif 000010
【図２Ｂ】
0006382936.tif 000011
【図２Ｃ】
0006382936.tif 000012
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
0006382936.tif 000014
【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
0006382936.tif 000016
【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
0006382936.tif 000020
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
0006382936.tif 000026
【図６Ｂ】
0006382936.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0006382936.tif 000029
【図７】
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【図８Ａ】
0006382936.tif 000031
【図８Ｂ】
0006382936.tif 000032
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0006382936.tif 000039
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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