(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚しわ改善及び皮膚弾力向上用の皮膚外用化粧料組成物。
【化１】
0006289629.tif 000008
【請求項２】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、組成物の総重量に対して０．０００００１〜５重量％含有される請求項１に記載の皮膚しわ改善及び皮膚弾力向上用の皮膚外用化粧料組成物。
【請求項３】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚外用化粧料組成物の皮膚しわ改善及び皮膚弾力向上のための使用。
【化２】
0006289629.tif 000009
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤組成物に係り、更に詳しくは、酸、塩基、酵素、又は前記酵素を産生する微生物を用いた分解反応を通じて緑茶種子抽出物から得られた緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有することにより、優れたしわ改善及び皮膚弾力向上効果が奏される抗老化用皮膚外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化は、その要因によって大きく２種類に分けられる。その一つである自然的な老化（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｇｉｎｇ）は、皮膚の構造及び生理的な機能が年を取るにつれて減退され続けるものであり、もう一つである外的老化（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ａｇｉｎｇ）は、太陽光線など累積された外部ストレスにより生じるものである。特に、太陽光の紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｒａｙｓ；ＵＶ）は、周知の老化原因の一つであり、長時間紫外線に露出された皮膚は角質層が厚くなり、皮膚の主な構成要素であるコラーゲン及びエラスチンが変性されて皮膚の弾力性を失ってしまう。
【０００３】
一方、皮膚の弾力は、真皮組織の細胞外基質（ＥＣＭ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  ｍａｔｒｉｘ）成分が担当するが、ＥＣＭは大きく２種類の成分からなる。一つは、ＥＣＭ全体の約２〜４％を占める弾力線維（ｅｌａｓｔｉｃ  ｆｉｂｅｒ）であり、もう一つは、ＥＣＭ全体の約７０〜８０％を占めるコラーゲンである。弾力線維は、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）という無定形の基質にミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｓ）が打ち込まれている形態を帯びており、エラスチンは、リシン由来のデスモシン（ｄｅｓｍｏｓｉｎｅ）及びイソデスモシン（ｉｓｏｄｅｓｍｏｓｉｎｅ）という弾力線維からしか見られない非常にユニークなアミノ酸からなるタンパク質である。このようなデスモシン及びイソデスモシンなどは、長いペプチド鎖内において架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｓ）を形成しているが、このような構造がエラスチンにゴムのような性質を持たせる。
【０００４】
また、エラスチンからなる弾力線維は、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）と呼ばれる膠原線維と共存するが、エラスチン及びコラーゲンが十分に存在する状態で皮膚の弾力が維持可能である。
【０００５】
皮膚弾力の低下は、老化や紫外線などにより引き起こされるコラーゲン及びエラスチンの生成の低下又は破壊に起因する。特に、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）及びエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）の発現により、皮膚内において正常に生成されたコラーゲン及びエラスチンが分解されて皮膚の弾力が低下する。
【０００６】
このような弾力減少の原因となるコラーゲン及びエラスチンの減少を抑えるために、種々の物質が開発されて用いられているが、中でも、レチノール及びレチノイン酸などのレチノイドなどが弾力改善効果を示し（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｈｅｒａｐｙ，  １９９８，  １６，  ３５７〜３６４）、レグミノサ種子（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ  Ｓｅｅｄｓ）から得られるタンパク質分画も弾力増大効果を示し（米国特許第５，３２２，８３９号）、麦芽抽出物（ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）などを含む組成物はコラゲナーゼを抑えるのに応用されている（日本国特許第５，１０５，６９３号）。
【０００７】
しかしながら、これらのレチノイドは少量のみを皮膚に適用しても刺激が現れるという欠点を有し、ほとんどの天然物由来の原料は単なる抽出物の形として用いられ、これらの抽出物が示す効能が正確にどのような物質によるものであるかが判明されず、その抽出物の活性を持続的に維持し続けて制御することが困難であるのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者らは、抗老化効果を示し、優れた皮膚弾力向上効果をも示す物質を発見するために鋭意努力したところ、緑茶種子抽出物から酸、塩基、酵素又は前記酵素を生成する微生物を用いた分解反応を通じて得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分が優れた皮膚しわ改善及び皮膚弾力向上効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、緑茶種子抽出物から得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を含有する抗老化用皮膚外用剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を解決するために、本発明は、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明において用いられる緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、コラーゲンの生合成を促しながら、エラスターゼ及びコラゲナーゼの発現を抑えて、効果的に皮膚しわを改善し、皮膚弾力を向上させて優れた抗老化効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、下記化学式1で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３（２１−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌｔｈｅａｓａｐｏｇｅｎｏｌ  Ｅ３）を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物を提供する。
【００１３】
【化１】
0006289629.tif 000002
【００１４】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、好ましくは、緑茶種子由来のものである。
【００１５】
本発明において用いられる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、植物から水又は有機溶媒を用いてサポニン粗抽出物を得る第１の段階、及び前記抽出物を酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて加水分解して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を分離する第２の段階を含む方法により製造することができる。
【００１６】
［第１の段階：サポニン粗抽出物の収得］
植物、特に、緑茶種子からサポニン粗抽出物を得る。このとき、抽出溶媒としては、水又は有機溶媒が使用可能であり、有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、又はこれらと水との混合物、好ましくは、５０％のエタノールが使用可能である。
【００１７】
植物から水又は有機溶媒を用いてサポニン粗抽出物を得るために、植物に約１〜６倍、好ましくは、約３倍の水又は有機溶媒を入れ、常温で１〜５回攪拌しながら抽出して脱脂させる。脱脂された植物に約１〜８倍、好ましくは、約４倍の水又は有機溶媒を入れ、１〜５回還流抽出した後、１０〜２０℃で１〜３日間浸漬させる。次いで、ろ過及び遠心分離を用いて残渣及びろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテルなどを用いて色素を除去する。水層を有機溶媒を用いて１〜５回抽出した後、得られた有機溶媒層を減圧濃縮して有機溶媒エキスを得た後、これを少量のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどに溶かす。次いで、大量のエチルアセテート、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）などを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、本発明のサポニン粗抽出物を得る。
【００１８】
［第２の段階：２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の分離］
前記第１の段階において得たサポニン粗抽出物を加水分解して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を分離し、加水分解は、酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて行うことができる。
【００１９】
前記酸としては、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、又はこれらの酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒、好ましくは、５０％エタノールとの混合溶媒が使用可能である。
【００２０】
酸を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物に０．１〜２Ｎ、好ましくは、１Ｎの濃度の酸、又は酸とアルコールとの混合溶媒を１〜１０％の量で加えた後、５０〜１００℃、好ましくは、８０℃の水浴槽において０．５〜８時間、好ましくは、１時間加熱還流させる。
【００２１】
前記塩基としては、ナトリウムメトキシド、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、又はこれらの塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒、好ましくは、５０％ブタノールとの混合溶媒が使用可能である。
【００２２】
塩基を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を水又は水とエタノールとの混合溶媒に溶かした後、０．１〜２Ｎ、好ましくは、１Ｎの濃度の塩基、又は塩基とアルコールとの混合溶媒を１〜１０％の量で加えた後、５０〜１００℃、好ましくは、１００℃の水浴槽において０．５〜２４時間、好ましくは、１２時間加熱還流させる。
【００２３】
前記酵素は、糖結合を分解する酵素であり、緑茶サポニンの糖部分を除去して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を生成することを特徴とする。この酵素としては、商業的に市販中のものを用いるか、又は必要に応じて製造して用い、特に、前記酵素を産生する微生物から得られる。
【００２４】
また、前記酵素としては、更に好ましくは、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、アラビノシダーゼ（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ）、ラムノシダーゼ（ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅ）、キシロシダーゼ（ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ヘスペリジナーゼ（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎａｓｅ）、ナリンギナーゼ（ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅ）、グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）及びアミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上が使用可能である。
【００２５】
更に、前記酵素を産生する微生物としては、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、タラロマイセス（ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ビフィドバクテリウム（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モルティエレラ（ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコッカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイクロバクテリウム（ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リューコノストック（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属及びラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上が使用可能である。
【００２６】
酵素を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を５〜２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を０．００１〜１０％の量で添加する。これを約２５〜３７℃の水浴上において約４０〜５５時間、好ましくは、約４８時間攪拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において５〜１５分間加熱して反応を終える。
【００２７】
微生物を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を５〜１０倍、好ましくは、約１０倍のイオン水に溶解させた後、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃まで冷却させる。次いで、予め培養された微生物を液体量に対して５〜１０重量％接種し、２０〜３０℃で２〜５日間、好ましくは、５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失すると、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得る。
【００２８】
上述したように、酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて加水分解した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回攪拌する。次いで、沈殿した塩をろ過して除去し、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得る。
【００２９】
本発明の組成物は、上述した方法を用いて製造可能な２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を組成物の総重量に対して０．０００００１〜５重量％の量で含有する。含有量が０．０００００１重量％未満であれば、前記成分によるしわ改善及び皮膚弾力効果が得られず、含有量が５重量％を超えても、含有量の増加に比べて効果の増加が大きくない。
【００３０】
本発明の組成物は、抗老化用組成物として使用可能であり、コラーゲン生合成を促し、エラスターゼ及びコラゲナーゼの発現を抑え、これらの２種類の活性の複合相乗作用により更に優れた皮膚弾力向上効果及び皮膚しわ改善効果が奏される。
【００３１】
本発明の組成物は、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有して剤形化される。これは、局所適用に適したあらゆる剤形であり、例えば、溶液、ゲル、固体、練り物無水生成物、水相に油相を分散させて得た乳液、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポソーム）及び非イオン型の小嚢分散剤の形で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー又はコンシールスティックの形で提供される。なお、フォーム（ｆｏａｍ）の形で、又は圧縮された推進剤を更に含有するエアロゾル組成物の形で使用可能である。これらの組成物は、当該分野における通常の方法により製造される。
【００３２】
また、本発明の組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型若しくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性若しくは親油性活性剤、脂質小嚢又は化粧品に一般的に用いられる任意の他の成分などの化粧品学若しくは皮膚科学分野において一般的に用いられる補助剤を含有することができる。前記補助剤は、化粧品学又は皮膚科学分野において一般的に用いられる量で取り込まれる。
【００３３】
更に、本発明の組成物は、皮膚老化改善効果を増大させるために、皮膚吸収促進物質を含有することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明がこれらの例に限定されることはない。
［実施例１］緑茶種子抽出物の製造
緑茶種子２ｋｇにヘキサン６ｌを入れ、常温で３回攪拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶種子１ｋｇに５０％のエタノール４ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間浸漬させた。次いで、ろ過布を用いたろ過及び遠心分離を行って残渣及びろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍｌで３回抽出した。これから得られた全体の１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、これを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに追加して、生成された沈殿物を乾燥させて、緑茶種子抽出物（サポニン粗抽出物）３００ｇを得た。
【００３５】
［実施例２］酸加水分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［２−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ ＨＣｌ−５０％メタノール溶液（ｖ／ｖ）を加えて、８０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌させた後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．５５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００３６】
［２−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４−３０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて、９０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．５９ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００３７】
［２−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＨＮＯ３−１０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて、９０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．３９ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００３８】
［実施例３］塩基加水分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［３−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に溶かし、ここにナトリウムメトキシド（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）粉末１０ｇを加えて油浴上において８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．３５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００３９】
［３−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＮａＯＨ−２０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて８０℃で８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．３１ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４０】
［３−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＫＯＨ−２０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて８０℃で８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．２５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４１】
［実施例４］酵素分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［４−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌの０．１Ｍの酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解させ、ここに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリンギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；シグマ社製）を添加して３７℃の水浴上において４８時間攪拌させながら、薄層クロマトグラフィーで定期的に確認して、緑茶サポニンが消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において１０分間加熱して反応を終えた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、１．０２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４２】
［４−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌの０．１Ｍの酢酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に溶解させ、ここに酵素３．５ｇ（グルコシダーゼ１ｇ、アラビノシダーゼ０．５ｇ、ラムノシダーゼ１ｇ、キシロシダーゼ０．５ｇ、ペクチナーゼ０．５ｇ）を添加して２７℃の水浴上において４８時間攪拌させながら、薄層クロマトグラフィーで定期的に確認して、緑茶サポニンが消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において１０分間加熱して反応を終えた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、１．５３ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４３】
［実施例５］微生物を活用した２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［５−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃まで冷却した後に、予め培養されたアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ １１８８５を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃で５日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．７２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４４】
［５−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養された リゾプスオリーゼ（ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で５日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．９２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４５】
［５−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたバチルスサブティリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．７２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４６】
［５−４］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたリューコノストックメゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．５２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４７】
［５−５］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．５２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４８】
［５−６］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．４２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４９】
［試験例１］コラーゲン生合成促進効果の測定
前記実施例２〜５から得た２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３のコラーゲン生合成促進効果を、トコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。
【００５０】
まず、ヒト線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（プロモセル社製、ドイツ）を２４ウェル（ｗｅｌｌ）に１ウェル当たりに１０５個ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して約９０％生長するまで培養した。これを２４時間無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した後、無血清培地に溶かされた実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３、トコフェロール及びＥＧＣＧをそれぞれ１０−４モルの濃度で処理し、２４時間ＣＯ２培養器において培養した。これらの上澄液をすくい上げ、プロコラーゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキットを用いてプロコラーゲン（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）の増減有無を調べ、その結果を下記表１に示す。ここで、合成能とは、非処理群を１００にして対比したものである。
【００５１】
【表１】
0006289629.tif 000003
【００５２】
前記表１から明らかなように、前記実施例２〜５において得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３がコラーゲンの生合成を効果的に増加させることが確認される。
【００５３】
［試験例２］コラゲナーゼ発現抑制効能の測定
前記実施例２〜５において得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３のコラゲナーゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のようにコラゲナーゼの発現度で測定した。
【００５４】
まず、２．５％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）入り９６ウェル平板培養器（９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に人間の線維芽細胞を５，０００細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）になるように入れ、約９０％生長するまで培養した。次いで、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において２４時間培養した後、試験物質として無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶かされた前記実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３、トコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０−４モルの濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００５５】
次いで、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国のアマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてコラゲナーゼの生成程度を測定した。
【００５６】
まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に採取した細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽において行った。３時間後に発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に入れ、更に１５分間反応させた。１５分後に発色誘発物質を入れて室温で１５分間発色を誘発させ、更に１Ｍの硫酸を入れて反応（発色）を止めると、反応液の色相は黄色を帯び、反応の進行度により黄色度が異なってくる。
【００５７】
黄色を帯びる９６ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の吸光度を吸光計を用いて４０５ｎｍにおいて測定し、下記の数式１によりコラゲナーゼの発現度を計算した。このとき、前記試験物質を処理しなかった群から採取した細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。コラゲナーゼの発現度は下記表２に示し、これは、非処理群のコラゲナーゼの発現度を１００にして対比したものである。
【００５８】
［数式１］
コラゲナーゼの発現度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：前記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００５９】
【表２】
0006289629.tif 000004
【００６０】
前記表２から明らかなように、前記実施例２〜５において得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を処理した場合、コラゲナーゼの発現度は、コラゲナーゼの発現を抑えると知られているトコフェロールよりも低く、ＥＧＣＧと同じレベルのコラゲナーゼの発現度を示す。このため、このことから、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、コラゲナーゼの発現を効果的に抑えることが分かる。
【００６１】
［試験例３］エラスターゼ発現抑制効能の測定
前記実施例２〜５において得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３のエラスターゼ発現抑制効能（生成阻害能）をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して下記のようにエラスターゼの発現度で測定した。
【００６２】
まず、試験は、２．５％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）入り９６ウェル平板培養器（９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に人間の線維芽細胞を５，０００細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）になるように入れ、約９０％生長するまで培養した。次いで、無血清培地において２４時間培養し、試験物質として無血清培地に溶かされた前記実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３、トコフェロール及びＥＧＣＧ（陽性対照群）を１０−４モルの濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００６３】
次いで、採取した細胞培養液を商業的に利用可能なエラスターゼ測定器具（米国のアマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてエラスターゼの生成程度を測定した。
【００６４】
まず、１次エラスターゼ抗体が均一に塗布された９６ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に採取した細胞培養液を入れ、３時間抗原−抗体反応を恒温槽において行った。３時間後に発色団が結合された２次エラスチン抗体を９６ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に入れ、更に１５分間反応させた。１５分後に発色誘発物質を入れて室温で１５分間発色を誘発させ、更に１Ｍの硫酸を入れて反応（発色）を止めると、反応液の色相は黄色を帯び、反応の進行度により黄色度が異なってくる。
【００６５】
黄色を帯びる９６ウェル平板（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の吸光度を吸光計を用いて４０５ｎｍにおいて測定し、下記の数式２によりエラスターゼの発現度を計算した。このとき、前記試験物質を処理しなかった群から採取した細胞培養液の反応吸光度を対照群の吸光度にした。エラスターゼの発現度は下記表３に示し、これは、非処理群のエラスターゼの発現度を１００にして対比したものである。
【００６６】
［数式２］
エラスターゼの発現度（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：前記試験物質処理細胞群の吸光度
Ｂ：対照群の吸光度
【００６７】
【表３】
0006289629.tif 000005
【００６８】
前記表３から明らかなように、前記実施例２〜５において得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を処理した場合、エラスターゼの発現度は、エラスターゼの発現を抑えると知られているトコフェロールやＥＧＣＧよりも低く、このことから、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、エラスターゼの発現を効果的に抑えることが分かる。
【００６９】
［試験例４］皮膚弾力向上効能の確認
２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の皮膚弾力向上効能を確認するために、下記表４の成分及び含量を有するように化粧料組成物を用いて剤形例１及び比較例１の化粧水を製造した。
【００７０】
【表４】
0006289629.tif 000006
【００７１】
前記剤形例１及び比較例１の化粧水について皮膚弾力向上効果を比較するために、３０〜４０代の女性２０名を対象として皮膚弾力向上度を測定した。実験方法は、下記の通りである。
【００７２】
まず、被検者に剤形例１及び比較例１の化粧水を提供し、毎日１回ずつ１２週間に亘って目尻に一定量を塗布させた。このとき、被検者の左側の目尻には前記剤形例１の化粧水を、右側の目尻には比較例１の化粧水を塗布させた。前記化粧水の塗布を始める前及び塗布を終えてから１２週後に皮膚弾力を測定するキュートメーター（ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ；ＳＥＭ４７４、カレッジ・アンド・カザカ・エレクトロニック社製、ドイツ）を用いて被検者の皮膚弾力を測定し、その平均を求めた。その実験結果を下記表５に示す。
【００７３】
【表５】
0006289629.tif 000007
【００７４】
前記表５から明らかなように、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を含む剤形例１の化粧料組成物を用いた場合の皮膚弾力向上度は、比較例１の組成物を用いた場合に比べて３倍以上高いことが確認された。したがって、本発明の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を含む化粧料組成物は、皮膚弾力向上に非常に効果的であることが確認された。