(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型バチルス・サブチリスＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼから誘導される、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸又は請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
好適なＳ−アルキルホモシステイン、Ｓ−メチルビニルホモシステイン、又は他のホモシステイン誘導体と、請求項１に記載のポリペプチドとを反応させる工程を含む、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、及び／又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ若しくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（式中、ｎは１〜３であり、Ｒはアルキルであり、Ｈａｌはハロゲンである）タイプの鎖を有するＳＡＭ類似体を生体触媒により生成する方法。
【請求項６】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、及び／又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ若しくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（式中、ｎは１〜３であり、Ｒはアルキルであり、Ｈａｌはハロゲンである）タイプの鎖を有するＳＡＭ類似体の生成のための請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は野生型バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis：枯草菌）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導される単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドは上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してＩ３１７位及びＩ１０５位のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関するものである。本発明は更に、ＳＡＭ誘導体の生成のための単離核酸、ベクター、宿主細胞、使用及び方法それぞれに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんど全ての酵素触媒メチル転移反応が補因子Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に依存する。そのため、この化合物の可用性がバイオテクノロジー、例えば貴重なファインケミカル及び薬剤の製造における対応するメチルトランスフェラーゼの適用に重要である。細胞代謝において、この汎用メチル供与体はＳＡＭシンターゼ（ＳＡＭＳ）によるＬ−メチオニンのアデノシル化により形成される。しかしながら、ＳＡＭの酵素合成は生成物であるＳＡＭによりほとんどのＳＡＭＳが阻害され、それにより変換の停滞、低収率、又は生きた全細胞生体触媒では、補因子の不十分な可用性が起こることから、産業用途には適していない。加えて、ほとんどのＳＡＭＳ酵素はそのアミノ酸基質の構造変化を許容しない。そのためこれらの酵素は人工メチオニン誘導体から補因子類似体を合成する能力を欠いている。特徴付けられている多数のＳＡＭＳ酵素の中でも、２つのタンパク質のみがＳ−エチル−Ｌ−ホモシステイン（エチオニン）をＳ−アデノシルエチオニンへと相当に変換する。しかしながら、これらのタンパク質は非天然の長鎖又は官能化アルキル基の転移を可能にするＳＡＭ誘導体の合成には適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、ＳＡＭ、及び人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ若しくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（式中、ｎは１〜３であり、Ｒはアルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｈａｌはハロゲンである）タイプの鎖を有するＳＡＭ類似体の生体触媒による生成に使用することができるＳＡＭシンターゼの変異体を、好ましくは工業規模にて提供することであり、該変異体は従来のＳＡＭシンターゼと比べて広い基質特異性、高い触媒効率及び生成物阻害の低減を呈する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の技術的課題の解決策は、特許請求の範囲にて特徴付けられている実施の形態により達成される。
【０００５】
特に第１の態様では、本発明は、野生型バチルス・サブチリスＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導される単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドは上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してＩ３１７位及びＩ１０５位のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。特に、本発明の単離ポリペプチドはＩ３１７位、Ｉ１０５位、又はＩ３１７位及びＩ１０５位の両方に任意のアミノ酸置換を有することができ、Ｉ３１７位、又はＩ３１７位及びＩ１０５位の両方におけるアミノ酸置換が特に好ましい。置換アミノ酸は特に限定されず、イソロイシン（Ｉ）を明らかな例外とする任意のタンパク質を構成するアミノ酸とすることができる。しかしながら、置換アミノ酸はイソロイシンよりも空間の狭い、すなわち体積の小さいアミノ酸であるのが好ましい。これに関する特に好ましいアミノ酸はグリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、バリン（Ｖ）及びアラニン（Ａ）であり、バリン（Ｖ）及びアラニン（Ａ）が最も好ましい。
【０００６】
このため特に好ましい実施の形態では、本発明は、野生型バチルス・サブチリスＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導される単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドは、該野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ｇ、Ｉ３１７Ｌ、Ｉ３１７Ｐ、Ｉ３１７Ｔ、Ｉ３１７Ｃ、Ｉ３１７Ｄ、Ｉ３１７Ｅ、Ｉ３１７Ｎ、Ｉ３１７Ａ及びＩ３１７Ｖからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。
【０００７】
別の特に好ましい実施の形態では、本発明は、野生型バチルス・サブチリスＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導される単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドは、該野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ａ及びＩ３１７Ｖからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。
【０００８】
これに関連して「野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ又はその生物学的に活性のある断片から誘導されるポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼに関して上記で規定されるアミノ酸置換が少なくとも１種含まれている場合に、野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼに本質的に対応するポリペプチドに関連するものであることが意図される。さらに、上記用語は、得られるポリペプチドがＳＡＭシンターゼの生物活性を保持している場合に任意数の更なるアミノ酸置換、付加又は欠失を含み得るポリペプチドに関連するものであることが意図される。これに関連して、本明細書で使用される「ＳＡＭシンターゼの生物活性を保持している」という用語及び本明細書で使用される「その生物学的に活性のある断片」という用語は、当該技術分野で既知の標準ＳＡＭシンターゼ活性アッセイにて求められるように、野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼの活性の少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、１００％、又は１００％超を有するポリペプチドに関するものである。
【０００９】
更なるアミノ酸置換、付加又は欠失の数は一般的に、得られるポリペプチドの生物活性に関する上記条件によってのみ制限されるが、得られるポリペプチドは、野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼに対して少なくとも５０％、少なくとも５２．５％、少なくとも５５％、少なくとも５７．５％、少なくとも６０％、少なくとも６２．５％、少なくとも６５％、少なくとも６７．５％、少なくとも７０％、少なくとも７２．５％、少なくとも７５％、少なくとも７６．２５％、少なくとも７７．５％、少なくとも７８．７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１．２５％、少なくとも８３．７５％、少なくとも８５％、少なくとも８６．２５％、少なくとも８７．５％、少なくとも８８％、少なくとも８８．５％、少なくとも８９％、少なくとも８９．５％、少なくとも９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、少なくとも９５．２５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９５．７５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．２５％、少なくとも９６．５％、少なくとも９６．７５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．２５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９７．７５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．２５％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．７５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２５％、少なくとも９９．５％、又は９９．７５％の同一性を有することが好ましい。
【００１０】
さらに、「上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してＩ３１７位及びＩ１０５位のアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列」及び「上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）又はその生物学的に活性のある断片のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ａ及びＩ３１７Ｖからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸置換が含まれるアミノ酸配列」という用語は、本明細書で使用される場合、各アミノ酸配列、すなわち（ｉ）上記野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に本質的に対応し、（ｉｉ）上記配列に対して上記アミノ酸置換の少なくとも一方を含み、かつ（ｉｉｉ）上記で規定されるような任意の更なるアミノ酸置換、付加又は欠失を含み得るアミノ酸配列に関連するものであることが意図され、また上記更なるアミノ酸置換、付加又は欠失の数は得られるポリペプチドの生物活性に関して、好ましくは野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼに対する得られるポリペプチドの同一性に関して上記で規定されるようなものである。
【００１１】
更なる実施の形態では、本発明の単離ペプチドはアミノ酸置換Ｉ１０５Ｇ、Ｉ１０５Ｌ、Ｉ１０５Ｐ、Ｉ１０５Ｔ、Ｉ１０５Ｃ、Ｉ１０５Ｓ、Ｉ１０５Ａ及びＩ１０５Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を更に含む。
【００１２】
好ましくは更なる実施の形態では、本発明の単離ペプチドはアミノ酸置換Ｉ１０５Ａ及びＩ１０５Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を更に含む。
【００１３】
好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ａを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１４】
更に好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ｖを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１５】
更に好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ａ及びＩ１０５Ａを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１６】
更に好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ｖ及びＩ１０５Ａを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１７】
更に好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ａ及びＩ１０５Ｖを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１８】
更に好ましい実施の形態では、本発明の単離ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ（配列番号１）のアミノ酸配列に関してアミノ酸置換Ｉ３１７Ｖ及びＩ１０５Ｖを含有している。本発明の単離ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列からなるのが更により好ましい。
【００１９】
更なる態様では、本発明は本発明によるポリペプチドをコードする単離核酸に関する。このような核酸は特に限定されず、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子、又は人工及び／又は修飾核酸分子とすることができる。「本発明によるポリペプチドをコードする核酸」という用語は本明細書で使用される場合、各ポリペプチドのコード配列を含む核酸分子、及び各ポリペプチドのコード配列に対して完全に相補的な配列を含む核酸分子に関連するものであることが意図される。
【００２０】
更なる態様では、本発明は本発明による核酸を含むベクターに関する。好適なベクターは特に限定されず、当該技術分野で既知である。これらのベクターとしては例えば、プラスミドベクター、例えば既知の発現ベクター、特にｐＥＴ２８ａ（＋）等の細菌発現ベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター及び人工染色体が挙げられる。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は本発明による核酸又は本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。好適な宿主細胞は特に限定されず、当該技術分野で既知である。これらの宿主細胞としては例えば、細菌細胞、例えば大腸菌株Ｋ１２、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に基づく細胞等の組換えタンパク質発現に既知の細菌細胞、バチルス・サブチリス等のグラム陽性菌細胞が挙げられるが、更に酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞も挙げられる。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、好適なＳ−アルキルホモシステイン、Ｓ−メチルビニルホモシステイン、又は他のホモシステイン誘導体と、本発明のポリペプチドとを反応させる工程を含む、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、及び／又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ若しくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（式中、ｎは１〜３であり、Ｒはアルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｈａｌはハロゲンである）タイプの鎖を有するＳＡＭ類似体を生体触媒により生成する方法に関する。
【００２３】
本発明の方法を用いて生成することができるＳＡＭ類似体は特に限定されず、用いられるＳＡＭシンターゼ変異体の基質特異性及び選択される開始生成物のみに依存するものである。例としては、Ｓ−エチル−Ｌ−ホモシステインから生成されるＳ−アデノシルエチオニン、Ｓ−ｎ−プロピル−Ｄ，Ｌ−ホモシステインから生成されるＳ−アデノシルプロピオニン、Ｓ−ｎ−ブチル−Ｄ，Ｌ−ホモシステインから生成されるＳ−アデノシルブチオニン、及びＳ−メチルビニル−Ｄ，Ｌ−ホモシステイン由来のＳ−アデノシル−Ｓ−メチルビニルホモシステインが挙げられる。
【００２４】
最後の態様では、本発明はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、及び／又は人工アルキル鎖若しくはアリル鎖、若しくは−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ若しくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｈａｌ（式中、ｎは１〜３であり、Ｒはアルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｈａｌはハロゲンである）タイプの鎖を有するＳＡＭ類似体の生成のための本発明によるポリペプチドの使用に関する。この態様では、生成することができるＳＡＭ類似体及びそれらの各開始生成物が本発明の方法について上記で規定されている。
【００２５】
本発明はＳＡＭ及びＳＡＭ類似体の生成に、特に工業規模にて有利に使用することができるＳＡＭシンターゼ変異体を提供する。本発明によるＳＡＭシンターゼ変異体は、好適な宿主細胞にて高度に発現することができ、高い生産性、生成することができる広範なＳＡＭ類似体をもたらす広範な開始生成物のための広い基質特異性、及び生成物阻害の低減を特徴とする。これらの特徴から、本発明によるＳＡＭシンターゼ変異体は工業環境にてＳＡＭ及びＳＡＭ類似体の大量生成に理想的な候補物質となる。
【００２６】
ＳＡＭ及び類似体の生体触媒による生成に適したＳＡＭＳ酵素を得るために、バチルス・サブチリス由来のタンパク質を合理的タンパク質設計により改善した。活性部位にごく接近して位置する２つの保存されたイソロイシン残基（Ｉ１０５及びＩ３１７）の置換によって、酵素の基質スペクトルが人工メチオニン誘導体まで広げられた。１０５位及び３１７位への空間の狭いバリン残基又はアラニン残基の導入により変異体がもたらされ、該変異体は炭素数２〜４の置換基を保有するメチオニン及びＳ−アルキルホモシステインを変換することができるものであった。野生型酵素とは対照的に、変異体Ｉ３１７Ｖ及びＩ３１７Ａは生成物阻害による影響をあまり受けず、ＳＡＭ及びその長鎖類似体の調製合成に有益であることが分かった。加えて、これらの変異体を適用することで、メチオニンを成長培地に添加した際に原核細胞宿主において高レベルの細胞内濃度のＳＡＭを生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＳＡＭシンターゼ酵素を示す図である。バチルス・サブチリス由来の精製ＳＡＭシンターゼ（レーン１）、並びにその変異体Ｉ３１７Ｖ（レーン２）、Ｉ３１７Ａ（レーン３）、Ｉ１０５Ｖ／Ｉ３１７Ａ（レーン４）、Ｉ１０５Ａ／Ｉ３１７Ａ（レーン５）、Ｉ１０５Ｖ／Ｉ３１７Ｓ（レーン６）及びＩ１０５Ｓ／Ｉ３１７Ｓ（レーン７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２】バチルス・サブチリス由来のＳＡＭシンターゼのモデルを示す図である。Ａ）ＳＡＭ（空間充填表示）が２つのモノマー単位間に結合したテトラマーの三次構造。Ｂ）結合した生成物ＳＡＭを有する活性部位。より大きい官能基ＲとのＳＡＭ誘導体のドッキング空間が２つのイソロイシンＩ１０５及びＩ３１７により制限されることから、イソロイシンＩ１０５及びＩ３１７を部位特異的変異誘発の対象とした。Ｃ）活性中心における基質類似体Ｓ−ｎ−ブチル−Ｌ−ホモシステイン及びアデニリルイミドジホスフェートの配置。矢印は触媒反応の際の求核攻撃（短い矢印）を示している。反応に伴い、タンパク質の立体構造変化が起こり、これによりアミノ酸側鎖により立体障害（長い矢印）が引き起こされることになる。
【図３】メチオニン及び誘導体の変換を示す図である。基質濃度に応じた、バチルス・サブチリス由来のＳＡＭＳ酵素（Ａ）、及びその変異体Ｉ３１７Ｖ（Ｂ）、Ｉ３１７Ａ（Ｃ）、Ｉ１０５Ｖ／Ｉ３１７Ａ（Ｄ）又はＩ１０５Ａ／Ｉ３１７Ａ（Ｅ）により触媒されるアミノ酸基質の変換率。Ｌ−メチオニン（白丸）、Ｄ，Ｌ−メチオニン（黒丸）、Ｄ，Ｌ−メチオニン−（メチル−Ｄ３）（×）、Ｄ，Ｌ−エチオニン（灰色円）、Ｓ−ｎ−プロピル−Ｄ，Ｌ−ホモシステイン（白三角）、Ｓ−ｎ−ブチル−Ｄ，Ｌ−ホモシステイン（黒三角）又はＳ−（２−メチルビニル）−Ｄ，Ｌ−ホモシステイン（灰色菱型）との反応を反応中に補基質であるＡＴＰから放出されるホスフェートを分光光度的に求めることにより評価した。
【図４】ＳＡＭ及びＳＡＭ誘導体の形成を示す図である。バチルス・サブチリス由来のＳＡＭシンターゼ酵素（Ａ）又はその変異体Ｉ３１７Ｖ（Ｂ）及びＩ３１７Ａ（Ｃ）によるＳＡＭ及びＳＡＭ誘導体の形成。対応するラセミアミノ酸（１０ｍＭ）由来のメチオニン（黒丸）、エチオニン（灰色丸）、Ｓ−ｎ−プロピルホモシステイン（白三角）及びＳ−ｎ−ブチルホモシステイン（黒三角）のＬ−エナンチオマーの変換を等量の酵素（１０ｍＵ  ｍｌ−１）の存在下にて行った。反応をＨＰＴＬＣにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は下記アミノ酸配列を開示している。
【００２９】
【表１】
0006286036.tif 000002
0006286036.tif 000003
【００３０】
本発明は下記の実施例において更に説明されるが、それらに限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：
野生型バチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼの組換え発現
大腸菌における補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の可用性の課題に対処するために、内因性ＳＡＭ合成の増進を想定した。そのために、バチルス・サブチリス由来のＳＡＭシンターゼ遺伝子をベクターｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングして、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。精製酵素（図１、レーン１）を高収率（培養物１ｌ当たり５９ｍｇ）にて得ることができた。タンパク質がメチオニンのＤ−エナンチオマーにより阻害されないことから（図３Ａ）、このアミノ酸の更に安価なラセミ混合物を基質として使用することができる。
【００３２】
実施例２：
ＳＡＭシンターゼ変異体の生成及び特性化
天然の補因子であるＳＡＭの再生に加えて、組換えＳＡＭシンターゼ変異体（図１、レーン２〜レーン７）を、人工アルキル鎖を有する補因子類似体の合成に適用した。
【００３３】
これらの研究のために、直鎖（Ｄ，Ｌ−メチオニン−（メチル−Ｄ３）、−エチオニン、−プロピオニン及び−ブチオニン）、分岐（Ｄ，Ｌ−イソプロピオニン及び−イソブチオニン）、不飽和（Ｄ，Ｌ−メチルビニルホモシステイン）及び官能化（Ｄ，Ｌ−ヒドロキシエチオニン及び−カルボキシメチオニン）アルキル基を有する一連のＳ−アルキルホモシステインをＤ，Ｌ−ホモシステインチオラクトンから合成し、クローニングした（野生型）ＳＡＭシンターゼによる変換について調べた。しかしながら、酵素はこれらのメチオニン誘導体のいずれも許容しなかった。
【００３４】
大腸菌由来のタンパク質の結晶構造（ＰＤＢコード１ＸＲＡ）に基づく相同性モデルから導かれるように、２つの保存されたイソロイシン残基により形成される疎水性の溝が、嵩高いアルキル残基を有するアミノ酸基質からの補因子類似体の生成を妨げる（図２）。そのため、部位特異的突然変異誘発により両残基を体積の小さいアミノ酸に置き換えた。特にＩ３１７は基質選択性に重要であることが分かった。変異体Ｉ３１７Ｖはメチオニンに加えてエチオニンも変換させる（図３Ｂ）。Ｉ３１７が更に小さいアラニン残基により置換される場合、対応する変異体はエチオニン、プロピオニン、ブチオニン及び不飽和Ｄ，Ｌ−メチルビニルホモシステインに対して活性がある（図３Ｃ）。最後に、両イソロイシンのアラニンへの置き換えによって、人工長鎖基質のみが許容されることとなる（図３Ｄ）。
【００３５】
実施例３：
ＳＡＭシンターゼ変異体によるＳＡＭ誘導体の生成
基質スペクトルが広いことに起因して、変異体Ｉ３１７Ｖ及びＩ３１７Ａを調製規模でのＳＡＭ誘導体であるＳ−アデノシルエチオニン、−プロピオニン、−ブチオニン及び−Ｓ−メチルビニルホモシステインの生成に使用した。それらの化合物は０．２ｍｍｏｌのＤ，Ｌ−アミノ酸から合成し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５上でのカチオン交換クロマトグラフィにより精製した。Ｌ型のアミノ酸に関連する収率は８％〜２５％の範囲であった。カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼにより生成されるＳＡＭの酵素変換で試験されるように、調製物は生物活性型の補因子を含んでいた（総ＳＡＭの８０％〜９２％）。
【００３６】
実施例４：
更なるＳＡＭシンターゼ変異体の特性化
触媒回転及び基質スペクトルの決定における重要な役割に対する３１７位の影響を他のサイズの小さいアミノ酸残基及びサイズが中程度のアミノ酸残基の導入により更に確認した。脂肪族（Ｉ３１７Ｇ、Ｉ３１７Ｐ、Ｉ３１７Ｌ）又は極性（Ｉ３１７Ｅ、Ｉ３１７Ｄ、Ｉ３１７Ｎ）アミノ酸にて置換した酵素は活性の強い低減を示した（５．４ｎｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１以上）。他方、システインによる置換によって相当に活性のある酵素が生じ、該酵素が変異体Ｉ３１７Ａと同様にメチオニン及びホモログを変換させた（５ｍＭ  Ｄ，Ｌ−メチオニン、−エチオニン、−プロピオニン及び−ブチオニンの変換についてそれぞれ５９．４±０．４ｎｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１、１６．４±０．７ｎｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１、８．４±０．３ｎｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１及び６．０±０．３ｎｍｏｌ  分−１  ｍｇ−１）。
【００３７】
実施例５：
二重突然変異型ＳＡＭシンターゼ変異体の特性化
基質認識における近接イソロイシン残基Ｉ１０５の役割を更に調べるために、変異体Ｉ１０５Ｖ／Ｉ３１７Ａ及びＩ１０５Ａ／Ｉ３１７Ａを生成した。酵素の活性中心のサイズが大きくなるにつれて、天然基質であるメチオニンの変換（図３Ｄ、図３Ｅ）が徐々に低減する。その一方で変異体は長鎖基質を選好する。野生型酵素（図３Ａ）と比べて、変異体Ｉ１０５Ａ／Ｉ３１７Ａ（図３Ｅ）の基質特異性は逆転している（Ｓ−ｎ−プロピルホモシステイン＞Ｓ−ｎ−ブチルホモシステイン＞エチオニン＞＞メチオニン）。そのため、立体効果はＳＡＭＳ酵素による基質変換において主要な役割を果たし、いくつかの基質に対する選択性は２つのアミノ酸位置のみの置き換えにより操作することができる。
【００３８】
実施例６：
ＳＡＭシンターゼ変異体によるＳＡＭ誘導体の合成
野生型タンパク質、並びにＳＡＭ及び類似体の合成に適した基質特異性を有する変異体（Ｉ３１７Ｖ及びＩ３１７Ａ）の適合性を高性能薄層クロマトグラフィにより評価した。酵素がアミノ酸基質のＤ−エナンチオマーにより阻害されなかったことから、メチオニン及びその誘導体をこれらの反応におけるその立体異性体のラセミ混合物として有益に適用することができた。野生型酵素によるＳＡＭ形成の時間経過を図４Ａに示す。いくつかの他のＳＡＭＳタンパク質について記載されるように、この酵素は生成物であるＳＡＭにより阻害され、それにより変換の停滞及び低収率が起こる。これとは対照的に、この生成物阻害は変異体Ｉ３１７Ｖでは完全になくなり（図４Ｂ）、突然変異型酵素Ｉ３１７Ａの場合では顕著に低くなる（図４Ｃ）。したがって、調製合成反応におけるＳＡＭＳ−Ｉ３１７Ｖによるメチオニン及びエチオニンの転換により、アミノ酸基質についての高い変換率がもたらされた。この合成は速度実験と同様ではあったが、より大規模に行った（２００μｍｏｌ）。生成物収率が最大に達するような長期のインキュベーション（１８時間）後、Ｌ−アミノ酸の８４％及び８９％が変換された。変異体Ｉ３１７ＡによるＳＡＭのｎ−プロピル−及びｎ−ブチル類似体の生成において、８時間の反応時間後、４３％及び２８％の変換を達成することができた。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５上でのカチオン交換クロマトグラフィによる生成物の精製後、ＳＡＭ及びそのホモログはそれぞれ２５％、１７％、８％及び１１％の最終収率にて回収することができた。１Ｈ  ＮＭＲにより証明されるように、酵素により生成されるＳＡＭは大過剰（９０％超）の生物学的に活性のある（Ｓ，Ｓ）−エピマーを含んでいた。興味深いことに、Ｓ−アデノシル−Ｌ−エチオニン、−プロピオニン及び−ブチオニンの調製物はキラルスルホニウム中心に対してラセミ体であり、これはカラム精製における強酸性条件下でのより迅速なラセミ化により引き起こされるものと考えられる。
【００３９】
実施例７：
Ｓ−アルキルホモシステインの変換についての動態パラメータ
表１に示されるようなバチルス・サブチリスＳＡＭシンターゼ及びその変異体によるＳ−アルキルホモシステインの変換についての動態パラメータを、基質濃度に応じたメチオニン及び類似体の変換率から算出した（図２）。該変換率は当該技術分野で既知の標準ＳＡＭシンターゼアッセイにより、すなわち切断されたホスフェートの分光光度的な検出により求めた。
【００４０】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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