(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
極性媒体の第１の容積部と極性媒体の第２の容積部との間に膜を形成する方法であって、
（ａ）無極性媒体によって互いに分離している、極性媒体を含む第１の容積部および極性媒体を含む第２の容積部を用意するステップであって、前記第１および第２の容積部の少なくとも１つは、極性媒体と無極性媒体との間の界面に両親媒性分子を含む層を含み、前記両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、前記第１および第２の外側の親水性基のそれぞれは、前記疎水性コア基に連結されている、ステップと、
（ｂ）前記第１および第２の容積部を互いに接触させて、極性媒体の前記第１の容積部と前記第２の容積部との間に前記両親媒性分子を含む膜を形成するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記第１および第２の容積部のそれぞれは、極性媒体と無極性媒体との間の界面に両親媒性分子を含む層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の外側の親水性基は、疎水性コア基の異なる原子に独立に連結されている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２の外側の親水性基は、疎水性コア基の反対側の端に連結されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記両親媒性分子のそれぞれは、少なくとも３個のポリマーセグメントを含む共重合体であり、前記疎水性コア基は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢであり、前記第１および第２の外側の親水性基は、第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記共重合体は、直鎖状またはグラフト構造を有し、前記第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢから懸垂している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記共重合体は、式（Ｉ）
【化１】
0006375301.tif 000009
のブロック共重合体であり、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｘ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２は追加的ポリマーセグメントであり；
ｎ、ｐ、ｑおよびｍは独立に０または１のいずれかである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑが０であり、前記共重合体は、式（ＩＩＩ）
【化２】
0006375301.tif 000010
のトリブロック共重合体であり、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法において、ｍおよびｎが両方とも１であり、ｐおよびｑが両方とも０であり、
Ｘ１およびＸ２が、第１および第２の追加的疎水性ポリマーセグメントＢ１およびＢ２であり、前記Ｂ１およびＢ２は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢと共に整列でき、前記共重合体が、式（ＩＩ）：
【化３】
0006375301.tif 000011
のペンタブロック共重合体であり、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂ１は前記第１の追加的疎水性ポリマーセグメントであり；
Ｂ２は前記第２の追加的疎水性ポリマーセグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記内側の疎水性ポリマーセグメントＢが、ポリシロキサンまたはポリアルケンを含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
同じかまたは異なっていてよい、前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１および前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２が、ポリ（２−メチルオキサゾリン）を含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記両親媒性化合物は、ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記極性媒体を含む第１の容積部は、液滴またはビーズである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）無極性媒体によって互いに分離している、極性媒体を含む少なくとも３つの容積部を用意するステップであって、前記容積部の少なくとも１つまたはそれぞれが、極性媒体と無極性媒体との間の界面に前記両親媒性分子を含む層を含む、ステップ；および
（ｂ）前記容積部のそれぞれを別の前記容積部と接触させて、極性媒体の容積部間に前記両親媒性分子を含む膜を形成するステップ
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記容積部のそれぞれが液滴またはビーズであり、ステップ（ｂ）が液滴またはビーズの鎖またはネットワークを生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記両親媒性分子を含む前記または各膜は、膜タンパク質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜タンパク質は、イオンチャネルまたはポアである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
電極を前記極性媒体の容積部と電気的に接触させるステップ、および電極を使用して電気的測定値を得るステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
極性媒体の第１の容積部；
極性媒体の第２の容積部；および
極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間の両親媒性分子を含む膜
を含むシステムであって、
前記両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、前記第１および第２の外側の親水性基のそれぞれは、疎水性コア基に連結されており、
前記極性媒体の第１の容積部は無極性媒体中にある、システム。
【請求項２０】
極性媒体の１つまたは複数のさらなる容積部および前記両親媒性分子を含む１つまたは複数のさらなる膜を含み、前記極性媒体のそれぞれのさらなる容積部は、前記さらなる膜によって極性媒体の別の容積部から分離している、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
極性媒体を含み、無極性媒体内に配置されており、前記極性媒体と前記無極性媒体との間のその表面周辺に両親媒性分子を含む層を有する容積部であって、
前記両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基、疎水性コア基、および第２の外側の親水性基を含み、
前記第１および第２の外側の親水性基のそれぞれは、前記疎水性コア基に連結されており、
前記両親媒性分子のそれぞれは、少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体であり、
前記疎水性コア基は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢであり、
前記第１および第２の外側の親水性基は、第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２である、容積部。
【請求項２２】
極性媒体を含み、無極性媒体内に配置されており、前記極性媒体と前記無極性媒体との間のその表面周辺に両親媒性分子を含む層を有する容積部を生成するためのプロセスであって、
前記両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、
前記第１および第２の外側の親水性基のそれぞれは、前記疎水性コア基に連結されており、
前記両親媒性分子のそれぞれは、少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体であり、
前記疎水性コア基は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢであり、
前記第１および第２の外側の親水性基は、第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２であり、
前記プロセスは、
（ｉ）無極性媒体中に極性媒体の容積部を導入するステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前または後のいずれかで、前記無極性媒体もしくは極性媒体または両方の中に両親媒性分子を提供するステップ；および
（ｉｉｉ）前記極性媒体と前記無極性媒体との間の界面に前記両親媒性分子を含む層を形成するために十分な時間、前記極性媒体の容積部を置いたままにするステップ
を含むプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間の膜に関する。本発明は、そのような膜を形成する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質二重層は、脂質分子の二層から形成された薄い極性膜である。脂質二重層は、大部分の生物の細胞膜において見出され、通常リン脂質でできている。それらは、大部分の親水性分子およびイオンに不浸透性であり、イオンポンプとして公知である膜貫通タンパク質を使用して脂質二重層を超えたイオンポンピングによって細胞がそれらの塩濃度およびｐＨを調節できるようにしている。脂質二重層、またはさらに一般に両親媒性分子の二重層は、さまざまな実験的研究のための優れたプラットホームとしても役立つ。Holdenら、J. Am. Chem. Soc. 2007、129、8650-8655は、液滴間にもたらされた脂質二重層を含む水性液滴の機能的生物学的ネットワークの形成を開示している。そのようなネットワークは、二重層へのポンプ、チャネルおよびポアの組み込みによって光センサー、電池および電気的構成成分として作用できる。Sackmann、Science、New Series、Vol 271、No.5245 (Jan 5, 1996)、43-48頁は、支持された脂質タンパク質二重層の科学的および実際的応用の総説をそれらの電気光学的バイオセンサーにおける使用を含んで提供している。Jungら、J. Am. Chem. Soc.、2009、131 (3)、1006-1014は、支持された二重層上のタンパク質リガンド結合の検出のための光学的アッセイを開発した。ＤＮＡおよび他の分析物の検出のための高抵抗性両親媒性脂質二重層中のイオンチャネルの提供は、十分立証されている、例えばBayleyら、Nature、Vol 413、September 2001を参照されたい。水性溶液は、脂質二重層の両側に提供され、ナノポアを通じたイオン流が電位勾配の下で生じる。ＤＮＡは、イオンチャネルに移行され、チャネルを通じたＤＮＡの移行のときにイオン流における変化が測定される。脂質二重層の大きな抵抗のために、イオン流はイオンチャネルを通じて排他的に生じる。脂質二重層は、基質の開口部を越えてつり下げられて（suspended）よく、パッチクランピングまたはペインティングなどの当技術分野において周知の方法によって形成できる。
【０００３】
ＷＯ２００９／０７７７３４は、マイクロウエル開口部のアレイを越えて形成された複数の個々にアドレス可能な脂質二重層を開示しており、各マイクロウエルは電極および脂質二重層に接触している水性媒体を含有している。
【０００４】
ＷＯ２００９／０１２５５２は、親水性媒体を含有する両親媒性分子の層を含む２つの液滴間に形成された両親媒性脂質分子の二重層を開示し、液滴は疎水性媒体中に提供されている。脂質二重層を越えるイオン流は、各液滴の親水性内部に提供された電極で測定される。
【０００５】
両親媒性分子は、非極性疎水性領域に付着している極性親水性領域を含むと考えられてよい。二重層は、両親媒性分子の２つの単層から形成されていてよく、水性溶液中では、極性基は二重層の両側で親水性媒体に面しており、疎水性基は内側に向いている。
【０００６】
ＷＯ２００９／０２４７７５は、液滴界面二重層（ＤＩＢ）を生成するための方法を開示しており、液滴は、油／脂質溶液を水性溶液に接触させることによって調製され、得られた液滴は水性アガロースゲル支持層に接触させる。
【０００７】
１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）などのリン脂質は脂質二重層を形成するために日常的に使用される。しかし、脂質二重層にしばしば関連する難点は、それらが特に頑丈ではなく、例えば、酵素による消化によって破壊されやすく、大きな電位差に抵抗できないことを含む。
【０００８】
ＵＳ６，７２３，８１４は、親水性および疎水性セグメントを有する両親媒性共重合体から形成された平面膜を開示している。共重合体は、メチルオキサゾリン親水性セグメントおよびジメチルシロキサン疎水性コア（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）を有するＡＢＡトリブロックであってよい。このトリブロックから形成される膜は、脂質膜よりも高い電位差に抵抗できる（ＵＳ６，７２３，８１４の表１）。
【０００９】
ＵＳ６，９１６，４８８は、親水性媒体中にＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡから作られる小胞（ＡＢＡ型）の調製を記載している。両親媒性ＡＢＡトリブロック小胞（親水性内部を有する親水性媒体中の液滴）の構造は、ポリマー分子が２つの親水性「Ａ」セグメントが小胞壁の両側で個別の親水性溶液に面している直鎖状立体配置を有する、トリブロックポリマーの単層と考えられてよい。そのような立体配置は、ＵＳ６，９１６，４８８の図１に示されているが、油中で水性液滴を安定化させるために好適であるとは考えられない。そのためそのようなＡＢＡ分子は、油中水システムから液滴界面層を生成するための、ＷＯ２００９／０２４７７５に記載の脂質の実行可能な代替であるとは考えられない。
【００１０】
したがって、従来の脂質二重層と比較して安定性が改善された界面膜を生成するための代替方法を提供する継続的な必要性がある。
【発明の概要】
【００１１】
極性媒体をＡＢＡ分子を含有する無極性媒体に接触させることが、無極性−極性界面で、極性媒体周辺でのＡＢＡ分子の層の自発的形成を生じることは本発明の発見である。さらに、極性媒体のそのような２つの容積部が次に合わせられると、無極性媒体を通じて、ＡＢＡ分子の安定な膜が第１および第２の極性容積部の間の界面に形成する。
【００１２】
合成された、生じた膜は、従来の脂質システムよりも頑丈、安定で、界面活性剤およびタンパク質での分解を受けにくいことが示されている。膜は、それを越えて印加されるより大きな電位差にも抵抗できる。膜貫通タンパク質ポアなどのタンパク質は、膜に挿入されてよく、ＤＮＡを含む標的分析物を特性決定するために使用できる。
【００１３】
このような安定なＡＢＡ膜の形成の成功は反直観的であり、ＡＢＡ分子が極性−無極性界面で自発的に層を形成し、次に続いて２つの極性相の間に安定な膜を生成することは予想外であった。
【００１４】
したがって、本発明は第１の態様において、極性媒体の第１の容積部と極性媒体の第２の容積部との間に膜を形成する方法であって、
（ａ）無極性媒体によって互いに分離している、極性媒体を含む第１の容積部および極性媒体を含む第２の容積部を用意するステップであって、
前記第１および第２の容積部の少なくとも１つが極性媒体と無極性媒体との間の界面に両親媒性分子を含む層を含み、
両親媒性分子のそれぞれが、第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、第１および第２の外側の親水性基のそれぞれが疎水性コア基に連結されている、ステップ；ならびに
（ｂ）第１および第２の容積部を互いに接触させて、極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間に前記両親媒性分子を含む膜を形成するステップ
を含む方法を提供する。
【００１５】
第１の容積部は、無極性媒体内に提供されてよい。
【００１６】
別の態様では本発明は、本発明の方法によって得ることができる膜を提供する。
【００１７】
別の態様では本発明は、
極性媒体の第１の容積部；
極性媒体の第２の容積部；および
極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間の両親媒性分子を含む膜
を含むシステムであって、
両親媒性分子のそれぞれが第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、第１および第２の外側の親水性基のそれぞれが疎水性コア基に連結されており、
第１の容積部が無極性媒体内にある、システムを提供する。
【００１８】
システムは、極性媒体の第１の容積部と無極性媒体との間の界面に前記両親媒性分子の層をさらに含む場合がある。
【００１９】
システムは、無極性媒体内の複数の第１の容積部および複数の第１の容積部と第２の容積部との間に個別の複数の膜を含む場合がある。
【００２０】
システムは、無極性媒体内の複数の第１の容積部、複数の第２の容積部および個別の第１の容積部と第２の容積部との間にもたらされる複数の膜を含む場合がある。１つまたは複数の第２の容積部も無極性媒体内に提供されてよい。
【００２１】
本発明は、極性媒体を含み、無極性媒体内に配置されており、極性媒体と無極性媒体との間のその表面周辺に両親媒性分子を含む層を有する容積部であって、両親媒性分子のそれぞれが第１の外側の親水性基、疎水性コア基、第２の外側の親水性基を含み、第１および第２の外側の親水性基のそれぞれが疎水性コア基に連結されており、両親媒性分子のそれぞれが少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体であり、疎水性コア基が内側の疎水性ポリマーセグメント、Ｂであり、第１および第２の外側の親水性基が第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１およびＡ２である容積部も提供する。
【００２２】
さらに提供されるのは、極性媒体を含み、無極性媒体内に配置されており、極性媒体と無極性媒体との間のその表面周辺に両親媒性分子の層を有する容積部を生成するためのプロセスであって、両親媒性分子のそれぞれが第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含み、第１および第２の外側の親水性基のそれぞれが疎水性コア基に連結されており、ならびに両親媒性分子のそれぞれが少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体であり、疎水性コア基が内側の疎水性ポリマーセグメント、Ｂであり、第１および第２の外側の親水性基が第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１およびＡ２であり、
（ｉ）無極性媒体中に極性媒体の容積部を導入するステップ；
（ｉｉ）（ｉ）の前または後のいずれかで無極性媒体もしくは極性媒体または両方の中に両親媒性分子を提供するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）十分な時間について極性媒体の容積部を置いたままにして、極性媒体と無極性媒体との間の界面に両親媒性分子の層を形成するステップ
を含むプロセスである。
【００２３】
膜は、ポア中の分析物の存在またはポアを通る分析物の移動の決定のための膜貫通ポアを含んでよい。膜中の膜貫通ポアの存在および／または量も決定できる。
【００２４】
したがって本発明は、標的分析物を特性決定する方法であって、
（ａ）標的分析物を本明細書に定義の本発明のシステムの膜に存在する膜貫通ポアに接触させるステップ、
（ｂ）ポアに関して分析物が移動するときにまたはポア内の分析物の存在の１つまたは複数の測定値を得るステップであって、測定値が標的分析物の１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的分析物を特性決定するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００２５】
さらに提供されるのは、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ）本明細書に定義の本発明のシステムの膜中に存在するポアと、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質との間に複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法である。
【００２６】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーであって、（ａ）本明細書に定義の本発明のシステムの膜中に存在するポアと、（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質との間の複合体を含み、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する、センサーも提供する。
【００２７】
追加的に提供されるのは、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットであって、（ａ）本明細書に定義の本発明のシステムの膜中に存在するポアおよび（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質を含み、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する、キットである。
【００２８】
別の態様では本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置であって、（ａ）本明細書に定義の本発明の１つまたは複数のシステムの複数の膜中に存在する複数のポアおよび（ｂ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含む装置を提供する。
【００２９】
極性媒体は親水性媒体であってよい。無極性媒体は疎水性媒体であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】液滴生成設定の模式図である。この設定は、シリンジポンプ（Ｅｌｉｔｅ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）２個、気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）２個、ピークチュービング（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および特注Ｔ字接合マイクロ流体チップからなる。
【図２】液滴安定性実験を示す図である。Ａ）は、ＡＲ２０油中での６−３３−６Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅ液滴の経時変化の安定性を示す。２０時間後、これらの液滴は融合していないことが見出された。Ｂ）は、例示的目的のために不安定、準安定および安定な液滴の例を示す。
【図３】液滴界面二重層実験のための実験的設定を示す図である。
【図４】液滴界面二重層実験がファラデー箱内でどのように設定されているかを示す図である。Ａ）は模式的像を示し、Ｂ）はファラデー箱下の顕微鏡で観察された液滴を示す。
【図５】ＡＲ２０油中で２つの６−３３−６ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ液滴の電気容量がどのように経時的に増加するかを例示する電気的トレース例を示すグラフである。
【図６】ＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（配列番号２５、次の変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）がＡＲ２０油中の６−３３−６Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅトリ−ブロック共重合体液滴に挿入された場合に鋭い電流増加がどのように観察されたのかを例示する電気的トレース例を示すグラフである。ポアがトリ−ブロックに挿入された実例は、黒矢印によって示される。
【図７】セクションＡ）で、ヘキサデカン中の２つの６−４５ＰＥ−６ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ液滴の電気容量がどのように経時的に増加したかを例示する電気的トレース例を示し、セクションＢ）は、ＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（配列番号２５、次の変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）がＡＲ２０油中の６−４５ＰＥ−６Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅトリ−ブロック共重合体液滴に挿入された場合の鋭い電流増加がどのように観察されたのかを例示する電気的トレース例を示す図である。ポアがトリ−ブロックに挿入された実例は、黒矢印によって示される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００３２】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００３３】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号８は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号９は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号１０は、大腸菌（E. coli）由来ｓｂｃＢ遺伝子由来のコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードしている。
【００３９】
配列番号１１は、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号１２は、大腸菌（E. coli）由来ｘｔｈＡ遺伝子由来のコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードしている。
【００４１】
配列番号１３は、大腸菌（E. coli）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、３’−５’方向での２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の１本鎖からの５’ヌクレオシド一リン酸の離散性消化を実施する。鎖での酵素開始は、およそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００４２】
配列番号１４は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ｒｅｃＪ遺伝子由来のコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪ酵素をコードしている（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）。
【００４３】
配列番号１５は、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’−３’方向でのｓｓＤＮＡからの５’ヌクレオシド一リン酸の前進性消化を実施する。鎖での酵素開始は、少なくとも４ヌクレオチドを必要とする。
【００４４】
配列番号１６は、バクテリオファージラムダｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子由来のコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼをコードしている。
【００４５】
配列番号１７は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。配列は、三量体に会合する３つの同一のサブユニットの１つである。酵素は、５’−３’方向でのｄｓＤＮＡの１本鎖からのヌクレオチドの高度に前進性の消化を実施する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。鎖での酵素開始は、５’リン酸を含むおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを優先的に必要とする。
【００４６】
配列番号１８は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号１９は、Ｈｅｌ３０８ＣｓｙのＨｅｌ３０８モチーフを示す。
【００４８】
配列番号２０は、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号２１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号２２は、ＴｒａＩ  Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号２３は、ＸＰＤ  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号２４は、ＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（次の変異：Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）をコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００５３】
配列番号２５は、ＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（次の変異：Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）のアミノ酸配列を示す。
【００５４】
本発明の詳細な記載
本発明の第１の態様の方法は、実施が容易であり、両親媒性分子を含みバイオテクノロジーの分野における幅広い研究および応用において使用できる頑丈な膜を生じる。膜は、従来のリン脂質二重層よりも分解されにくく、より大きな電位差にも抵抗できる。膜は、従来の脂質二重層膜よりも長い存続時間を有してさらに頑丈および安定であることが示されており、作成済みの膜でセンサーを提供および保存できるようにする。それは、生物学的試料などの界面活性剤およびタンパク質を含有している試料を分析物の決定のための膜に直接適用できるようにもする。
【００５５】
無極性媒体によって互いに分離している、極性媒体を含む第１および第２の容積部を用意するステップは、非常に容易に実施できる。それは、通常極性媒体を含むそれぞれの容積部を無極性媒体に接触させるステップを含む。
【００５６】
極性媒体は、１つもしくは複数の液滴および／または１つもしくは複数のビーズの形態で提供される場合がある。液滴は、例えば、シリンジまたはピペットによって無極性媒体中に極性媒体を導入することによって形成できる。極性媒体の１つまたは複数の液滴は、例えば本明細書下の実施例１に記載のマイクロ流体デバイスを使用して、無極性媒体中にも形成できる。マイクロ流体デバイス内のチャネルのサイズならびにマイクロ流体デバイスを通る無極性および極性媒体の流速は、生成される極性液滴のサイズを制御するために所望により変動させることができる。具体的には小さな液滴、例えば５μｍから５００μｍのサイズ（直径）範囲はマイクロ流体デバイスを使用することによって生成できる。マイクロ流体デバイス内に形成される極性媒体の液滴は、所望により、さらなる操作のためにバルク無極性媒体、マイクロ流体デバイスの外に移されてよい。極性媒体の１つまたは複数のビーズは、液滴と同様の様式で無極性媒体内に形成できる。例えば、ハイドロゲルなどのビーズを形成できる極性流動性媒体は、ピペットまたはシリンジによって無極性媒体中に導入できる。
【００５７】
代替的に、極性媒体を含む１つまたは複数の予め形成されたビーズは、無極性媒体中に単純に分注できる。そのような例は、極性媒体を含有するアガロースもしくはセファロース、または多孔性ガラスもしくはプラスチックビーズなどの架橋されていないまたは架橋されたハイドロゲルである。ビーズは、例えば冷却またはＵＶでの架橋によって液滴から原位置で形成できる。無極性媒体中に導入されたビーズは、例えば融解によって液滴を形成できる。
【００５８】
無極性媒体内に第２の容積部を用意するための代替として、第２の容積部は無極性媒体の表面に適用できる。これは、任意の好適な方法によって行われてよい。例えば極性媒体は、ピペットもしくはシリンジによって、またはフローセルを使用して無極性媒体の表面に適用できる。別の方法では極性媒体の容積部は、最初に、例えば容器中に提供されてよく、無極性媒体は極性媒体の表面に適用される。極性媒体の第１の容積部は、続いて極性媒体の２つの容積部間に界面を提供するために無極性媒体の表面に適用できる。
【００５９】
極性媒体の複数の別々の容積部と極性媒体の層との間の界面に、複数の膜を設けてもよい。極性媒体の容積部は、無極性媒体によって互いに分離していてもよい。
【００６０】
両親媒性分子は無極性または極性媒体のいずれかの中に提供されてよい。無極性媒体中に極性媒体の単一の容積部を用意する場合、両親媒性分子は、無極性および極性媒体が互いに接触するにようにされる前または後のいずれで提供されてもよい。しかし極性媒体の複数の容積部が無極性媒体中に、例えば乳剤の形態で提供される場合、両親媒性分子は、極性媒体の容積部の融合（merging）を回避するために無極性と極性媒体とを接触させるより先に無極性または極性媒体のいずれかの中に好ましくは提供される。両親媒性分子が提供された後に、無極性と極性媒体とは互いに接触され、両親媒性分子を含む層は、無極性媒体と極性媒体との間の界面に自然に形成される。両親媒性分子の層の形成速度は、存在する両親媒性分子の濃度およびそれらが無極性容積部内または極性容積部内のどちらに提供されたかなどの実験的因子に依存する。両親媒性層を形成するために要した時間は、変動する場合があり、数分間程度またはさらに長い場合がある。両親媒性分子は、媒体にそれらを溶解することによって、または例えば無極性もしくは極性媒体中に両親媒性分子の小胞を形成することによって無極性または極性媒体中に提供できる。両親媒性分子は、通常無極性媒体中に提供される。典型的にはそれらは、無極性媒体に溶解される。
【００６１】
理論に束縛されることなく、極性媒体と無極性媒体との間の界面の前記または各（the or each）層における両親媒性分子は、おそらくフォールドしており、疎水性コア基が外側に、極性媒体から離れ、無極性媒体に向いており、第１および第２の外側の親水性基は内側に極性媒体に向いていると考えられる。したがって、極性媒体と無極性媒体との間の界面の両親媒性分子の前記または各層がこのようにフォールドした両親媒性分子の単層を含む場合があってよい。分子がトリブロックＡＢＡ型共重合体であり、各Ａが外側の親水性ポリマーセグメントであって、Ｂが内側の疎水性セグメントである場合、疎水性Ｂ基が外側を向いて極性媒体から離れて、無極性媒体に向かっており、２つの親水性Ａ基が内側に極性媒体に向かっているように層中の分子は、Ｕ形である場合がある。
【００６２】
本発明の第１の態様のステップ（ｂ）において使用される用語「生じる（causing）」は、一方では極性媒体の２つの容積部を積極的に互いに接触させることを、他方では、極性媒体の第１および第２の容積部をそれ自体によって接触させること、すなわち極性媒体の２つの容積部を互いに接触させ、自己会合によって膜を形成させることを包含することを意図する。
【００６３】
極性媒体の容積部は、種々の技術によって扱われる場合がある。例えば極性媒体の液滴またはビーズは、液滴またはビーズの内側に親水性外側表面を有するアンカーを配置することによって移動できる。アンカーの移動は、例えば極性媒体の別の容積部に接触させるように液滴またはビーズを移動させる。そのような操作は、親水性、アガロースでコーティングされた接点を有する２つの電極がアンカーとして役立つ下の実施例２ならびに、図３および４に記載されている。
【００６４】
極性媒体の第１よび第２の容積部を接触させるようにするステップにおいて、極性媒体の第１および第２の容積部は、介在する無極性媒体を通して比較的に互いに向かって移動し、介在する無極性媒体は２つの容積部間から出される。
【００６５】
第１および第２の容積部が互いに接触するように、無極性媒体が極性媒体を含む第１の容積部と第２の容積部との間から十分に出されるとすぐに両親媒性分子の膜が第１の容積部と第２の容積部との間に形成される。
【００６６】
膜が形成されるために要する時間は、実験条件に応じて秒から時間の間で変動する場合がある。極性媒体の２つの容積部間の両親媒性分子の膜の形成は、極性媒体の２つの容積部間での電気容量における変化をモニタリングすることによって実験的に測定できる。そのような実験は、本明細書下の実施例２、セクション２．３に記載されている。結果は、経時的な電気容量における増大が検査した水性緩衝液の２つの液滴間での両親媒性分子の膜の形成を実証して、図５に示されている。したがって電気容量をモニタリングすることによって、当業者は本発明の方法による、極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間の両親媒性分子を含む膜の形成を検証できる。
【００６７】
理論に束縛されることなく、本発明のプロセスにおいて極性媒体の２つの容積部間に形成された膜は、両親媒性分子の単層を含む可能性があると考えられる。具体的には、疎水性コア基が極性媒体の２つの容積部のいずれにも接触しない中央の疎水性層を形成するように整列されるように、ならびに第１および第２の外側の親水性基が膜の両側で極性媒体の２つの容積部に接触している第１および第２の外側の親水性層を形成するように整列されているように、膜は互いに整列された両親媒性分子の単層を含む可能性があると考えられる。
【００６８】
そうであれば、および本明細書において主張するとおり、極性媒体と無極性媒体との間の界面の両親媒性分子は、すべての疎水性コア基が無極性媒体に向かっており、すべての第１および第２の外側の親水性基が極性媒体に向かっているようにフォールドされれば、本発明の方法による膜の形成は両親媒性分子のアンフォールディングを含む両親媒性分子の再配置を含む可能性が高い。
【００６９】
しかし別の可能性は本発明の方法が実施される場合に両親媒性分子がフォールドされたままであり、極性媒体の２つの容積部間に形成された膜がフォールドされた両親媒性分子の二重層を含み、すべての疎水性コア基が二重層の中央に内側に向いており、すべての外側の親水性基が外側、第１および第２の極性媒体を向いていることである。そのような二重層は、例えばフォールドした両親媒性分子の２つの単層を一緒に合わせることによって、極性媒体の第１および第２の容積部のそれぞれが無極性と極性媒体との間の界面に両親媒性分子を含む層を含む本明細書に定義の本発明の方法を実施することによって形成されている場合がある。
【００７０】
本明細書において使用される用語二重層は、両親媒性分子の２つの単層を含む膜を指す。用語単層は、両親媒性分子の単一の層から形成された膜を指す。
【００７１】
用語「ビーズ」は、典型的には明確な形状を有し、一般に予め形成された媒体の容積部を指す。そのような例は、極性媒体を含有するガラスもしくはプラスチック多孔性ビーズ、またはアガロースもしくはセファロースなどの架橋されていないもしくは架橋されたハイドロゲルである。
【００７２】
一方液滴は、典型的には無極性媒体への挿入の前に予め形成された形状を有さない流動性媒体の容積部を指す。そのような例は、水性溶液またはハイドロゲルである。ハイドロゲルは、流動性を増加させるために無極性媒体への挿入の前に加熱されてもよい。ビーズは、例えば冷却することによって、またはＵＶで架橋することによって無極性媒体中で液滴から原位置で形成されてよい。無極性媒体に添加されたビーズは、例えば融解することによって次に液滴を形成できる。
【００７３】
ビーズは、球状、桿体、三角形、四角形、六角形または不整形などの任意の特定の形状を有してよい。
【００７４】
極性媒体を含む２つより多い容積部は、そのような容積部の鎖またはネットワークを形成するように合わせられてよく、極性媒体を含む各容積部は、極性媒体を含む隣接する容積部に接触する。イオンチャネルは、相互接続したイオン性ネットワークを提供するように個別の容積部間に提供されてよい。
【００７５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、極性媒体を含む第２の容積部は、無極性媒体の表面に提供される。第２の容積部は、目的の標的分析物を含むと考えられる試料である場合があり、測定は分析物を特性決定するために行われてよい。第２の容積部は、標的分析物を含む試料である場合がある。
【００７６】
標的分析物は、例えば金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である場合がある。タンパク質は、膜貫通タンパク質である場合がある。具体的には標的分析物は、標的ポリヌクレオチドである。試料は、例えば生物学的試料である場合がある。
【００７７】
発明の方法のいくつかの実施形態では、第１の容積部は、液滴またはビーズであり、第２の容積部は標的分析物を含むまたは含むと考えられる試料である。
【００７８】
液滴またはビーズの平均直径は、典型的には約５μｍから約５００μｍである。
【００７９】
両親媒性分子および極性媒体の容積部間に形成される得られた１つまたは複数の膜を含む前記または各層は、追加的にさらなる分子を含む場合がある。
【００８０】
さらなる分子は、膜貫通ポアおよび膜タンパク質などの機能性分子を含む場合があり、本明細書下にさらに詳細に記載される。追加的にまたは代替的にさらなる分子は、追加的両親媒性分子、すなわち、それ自体が第１の外側の極性基、無極性コア基、および第２の外側の極性基を含まない両親媒性分子を含む場合があり、第１および第２の外側の極性基のそれぞれは無極性コア基に連結されている。したがってさらなる分子は、従来の脂質、例えばリン脂質、脂肪酸、脂肪性アシル（fatty acyl）、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質およびポリケタイドなどの両親媒性分子を含む場合がある。
【００８１】
第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基を含む層または膜中の両親媒性分子は、すべて同じ種類である必要はない。むしろそのような両親媒性分子の混合物が存在してよい。
【００８２】
本明細書で定義の両親媒性分子に関して開示される用語「連結された（linked）」は直接または１つもしくは複数のさらなる基を介する結合を意味する。１つまたは複数のさらなる基は、リンカー基、さらなる親水性基（すなわち、第１および第２の外側の親水性基以外の親水性基）、ならびにさらなる疎水性基（すなわち、疎水性コア基以外の疎水性基）から選択されてよい。したがって両親媒性分子のそれぞれにおいて、第１の外側の親水性基は直接または１つもしくは複数のさらなる基を介してのいずれかで疎水性コア基に結合しており、第２の外側の親水性基は直接または１つもしくは複数のさらなる基を介してのいずれかで疎水性コア基に結合している。
【００８３】
第１および第２の外側の親水性基が両方とも独立にこの方法で疎水性コア基に結合していることは、分子が疎水性に関して違っている少なくとも３つの領域、すなわち内側の疎水性領域および２つの外側の親水性領域を含有することを確実にすることから重要である。したがって分子が、第１および第２の外側の親水性基の１つだけが疎水性コア基に連結されているもの、例えば、第１および第２の親水性基が互いに結合しており、これらの基の１つだけが疎水性コアに連結されているＡＡＢ型の分子ではないことは重要である。むしろ、疎水性に関して分子中に少なくとも３つの違っている領域を提供するように第１および第２の外側の親水性基のそれぞれは、疎水性コア基に独立に連結されていなければならない。
【００８４】
一般に同じ理由から、第１および第２の外側の親水性基は、疎水性コア基の異なる領域に独立に連結されており、そのため第１および第２の外側の親水性基は疎水性コア基によってある程度互いに離されている。
【００８５】
したがって通常、第１および第２の外側の親水性基は、疎水性コア基の異なる原子に独立に連結されている。好ましい実施形態では、第１および第２の外側の親水性基は疎水性コア基の反対側の端に連結されている。
【００８６】
上に述べたとおり両親媒性分子は、少なくとも１つの追加的疎水性または親水性基を、すなわち第１の外側の親水性基、疎水性コア基および第２の外側の親水性基に加えて、さらに含む場合がある。
【００８７】
したがって例えば、前記両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基または第２の外側の親水性基に結合している少なくとも１つの追加的疎水性基をさらに含む場合がある。
【００８８】
両親媒性分子が１つまたは複数の追加的疎水性基をさらに含む場合があるという事実は、両親媒性分子がトリブロック型立体配置、すなわち分子が疎水性に関して３つの違っている領域をまだ有している立体配置をとることができないことを意味する必要はない。例えば、両親媒性分子が第１のまたは第２の外側の親水性基に結合している追加的疎水性基を有する場合、追加的疎水性基は疎水性コア基と共にそれ自体を整列させるように、内向きにフォールディングできる場合がある。得られた両親媒性分子のコンホメーションは、追加的疎水性基が疎水性コア基と一緒にコア疎水性領域の一部に本質的になるために内向きにフォールドできることから「トリブロック特性」をまだ有している。したがって本質的に、そのような両親媒性分子は、内側の疎水性領域および２つの外側の親水性領域をまだ有し、したがって本発明の方法により極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間に膜を形成するために非常に有用である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、両親媒性分子のそれぞれは、第１の外側の親水性基に結合している第１の追加的疎水性基、および第２の外側の親水性基に結合している第２の追加的疎水性基をさらに含む。そのような両親媒性分子はＢＡＢＡＢ型のペンタブロック分子を含み、同じまたは異なっていてよい各Ｂ基は疎水性基であり、および同じまたは異なっていてよい各Ａ基は、親水性である。典型的には各追加的疎水性基は、疎水性コア基と共にそれ自体を整列できる。上に述べたとおりこれは、両親媒性分子が「トリブロック特性」を保持でき、したがって内側の疎水性領域および２つの外側の親水性領域を本質的にまだ有し、それが本発明の方法により極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間に膜を形成する目的のために非常に有用であることを意味する。
【００９０】
通常両親媒性分子のいくつかまたはすべては、少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体分子であり、疎水性コア基は内側の疎水性ポリマーセグメント、Ｂであり、第１および第２の外側の親水性基は第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１およびＡ２である。
【００９１】
しかし共重合体以外の両親媒性分子、例えば双極性またはボラ脂質（bola lipid）なども想定される。それらは、天然に存在してよい、または事実上合成であってよい。したがって両親媒性分子のそれぞれは、疎水性尾部基（tail group）の反対側の端に結合している２つの親水性頭部基（head group）を含む双極性脂質であってよい。各親水性頭部基は、場合により少なくとも１つのさらなる疎水性尾部基に結合していてよい。任意の好適なそのような双極性脂質は、用いられてよい。具体的な好適な双極性脂質は、双極性リン脂質を含む。双極性およびボラ脂質の例は、スルホロブス・アシドカルダリウス（sulfolobus acidocaldarius）、高度好熱性古細菌において見出された２つの疎水性Ｃ４０フィタニル鎖によって連結された２つの極性頭部を有する大環状テトラエーテル、Brardら J. Org. Chem.、2007、72 (22)、8267-8279頁よって開示されたなどの双極性脂質、およびSchubertらJ. Phys. Chem. B 2008、1212、10041-10044によって開示されたものなどのボラ脂質である。
【００９２】
双極性脂質は、当業者に周知の合成経路を使用して合成でき、商業的に入手もできる。種々の双極性脂質の構造および合成は、総説「Archaeabacteria bipolar lipid analogues: structure, synthesis and lyotropic properties」Thierry Benvegnuら、Current Opinion in Colloid & Interface Science、Volume 8、Issue 6、April 2004、469-479頁に記載されている。
【００９３】
しかし通常、両親媒性分子のそれぞれは、少なくとも３つのポリマーセグメントを含む共重合体であり、疎水性コア基は内側の疎水性ポリマーセグメントＢであり、第１および第２の外側の親水性基は第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２である。
【００９４】
共重合体は、例えば直鎖状またはグラフト構造を有する場合がある。第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２は、例えば内側の疎水性ポリマーセグメントＢから懸垂していてよい。通常Ａ１およびＡ２は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢの反対側の端に連結されている。上で述べたとおり、この内容において用語、連結されたは、直接または１つもしくは複数のさらなる基を介してのいずれかで結合されていることを意味する。
【００９５】
共重合体は、１つまたは複数の追加的ポリマーセグメント、すなわちＡ１、Ａ２およびＢに加えて１つまたは複数のさらなるポリマーセグメントをさらに含む場合がある。前記または各追加的ポリマーセグメントは、同じまたは異なっていてよい。典型的には、前記または各追加的ポリマーセグメントは、追加的親水性ポリマーセグメントまたは追加的疎水性ポリマーセグメントである。
【００９６】
したがって、第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１は、１つまたは複数の追加的ポリマーセグメントに結合している場合がある。同様に第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２は、１つまたは複数の追加的ポリマーセグメントに結合している場合がある。いくつかの実施形態では、Ａ１およびＡ２はそれぞれ１つまたは複数の追加的ポリマーセグメントに結合している。
【００９７】
同様に内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、直接または１つもしくは複数の追加的ポリマーセグメントを介してのいずれかで第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１に結合している場合がある。同様に内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、直接または１つもしくは複数の追加的ポリマーセグメントを介して第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２に結合している場合がある。いくつかの実施形態では、内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、Ａ１およびＡ２の両方に直接結合している。しかし、内側の疎水性ポリマーセグメントＢが１つまたは複数の追加的ポリマーセグメントを介してＡ１およびＡ２の両方に結合している他の実施形態は、想定される。
【００９８】
これらの追加的ポリマーセグメントのそれぞれは、親水性ポリマーセグメントおよび疎水性ポリマーセグメントから独立に選択されてよい。
【００９９】
したがって共重合体は、式（Ｉ）
【０１００】
【化１】
0006375301.tif 000002
のブロック共重合体であってよく、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｘ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２は追加的ポリマーセグメントであり；
ｎ、ｐ、ｑおよびｍは独立に０または１のいずれかである。
【０１０１】
前記または各追加的ポリマーセグメント、Ｘ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２は、同じまたは異なっていてよい。これらの追加的ポリマーセグメントのそれぞれは、親水性ポリマーセグメントまたは疎水性ポリマーセグメントであってよい。
【０１０２】
しかし、通常Ｘ１およびＸ２は両方とも追加的親水性ポリマーセグメントであるか、またはＸ１およびＸ２は両方とも追加的疎水性ポリマーセグメントである。
【０１０３】
同様に典型的には、Ｙ１およびＹ２は両方とも追加的疎水性ポリマーセグメントであるか、または両方とも追加的親水性ポリマーセグメントである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のブロック共重合体中のｍおよびｎは両方とも１であり、ｐおよびｑは両方とも０であり、したがって共重合体はペンタブロック共重合体である。１つの好ましいペンタブロック共重合体は、式（Ｉ）のブロック共重合体であり、ｍおよびｎは両方とも１であり、ｐおよびｑは両方とも０であり、Ｘ１およびＸ２は両方とも追加的疎水性ポリマーセグメントである。
【０１０５】
好ましくは本実施形態では、追加的疎水性ポリマーセグメントＸ１およびＸ２は、内側の疎水性ポリマーセグメントＢと共にそれ自体を整列できる。例えばＸ１およびＸ２は、セグメントＢと共にそれ自体を整列させるように、内向きにフォールディングできる場合がある。これは、疎水性ポリマーセグメントＸ１およびＸ２が、本質的に疎水性コア基と共にコア疎水性領域の一部になることから、ペンタブロック分子の生じたコンホメーションが「トリブロック特性」をまだ有していることを意味する。したがって共重合体は、内側の疎水性領域（ＢおよびＸ１およびＸ２を含む）ならびに２つの外側の親水性領域をまだ有しており、本発明の方法により極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間に膜を形成するためにそれを非常に有用にしている。
【０１０６】
したがっていくつかの実施形態では、共重合体は、式（ＩＩ）：
【０１０７】
【化２】
0006375301.tif 000003
のペンタブロック共重合体であり、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂ１は第１の追加的疎水性ポリマーセグメントであり；
Ｂ２は第２の追加的疎水性ポリマーセグメントである。
【０１０８】
本実施形態では、Ｂ１およびＢ２は、セグメントＢと共にそれ自体を整列するために一般に内向きにフォールドでき、ペンタブロック分子が内側の疎水性領域（互いに整列したＢ、Ｂ１およびＢ２を含む）ならびに２つの外側の親水性領域、Ａ１およびＡ２と共に「トリブロック特性」を有するコンホメーションをとることができることを意味し、本発明の方法により極性媒体の第１の容積部と第２の容積部との間に膜を形成するために両親媒性分子を特に有用にしている。
【０１０９】
しかし通常共重合体は、前記内側の疎水性ポリマーセグメントＢである中央のポリマーセグメント、ならびに前記第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１およびＡ２である２つの外側ポリマーセグメントを有するトリブロック共重合体である。
【０１１０】
したがって典型的には式（Ｉ）において、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはすべて０であり、共重合体は、式（ＩＩＩ）
【０１１１】
【化３】
0006375301.tif 000004
のトリブロック共重合体であり、
式中、
Ａ１は前記第１の外側の親水性ポリマーセグメントであり；
Ｂは前記内側の疎水性ポリマーセグメントであり；
Ａ２は前記第２の外側の親水性ポリマーセグメントである。
【０１１２】
通常本実施形態では、Ａ１およびＡ２は、内側の疎水性ポリマーセグメント、Ｂの反対側の端に結合している。
【０１１３】
次の置換基定義は、本明細書下に定義の化合物に関して適用する：
【０１１４】
Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基は、炭素原子１個から１８個を有する置換されていないまたは置換されている、直鎖状または分枝状鎖飽和炭化水素ラジカルである。典型的にはそれは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルもしくはデシル、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルもしくはヘキシル、またはＣ１〜Ｃ４アルキル、例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｎ−ブチルである。しかしアルキル基は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキル、または例えばＣ４〜Ｃ１２アルキル基であってよい。アルキル基が置換される場合、それは典型的には、置換されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル、置換されているまたは置換されていないアリール（例えば、フェニル）、シアノ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アリールアルキルアミノ、アミド、アシルアミド、オキソ、ハロ、エステル、アシル、アシルオキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、スルフヒドリル、アリールチオ、スルホニル、リン酸エステルから選択される１つまたは複数の置換基を持つ。具体的にはアルキル基が親水性基内にまたは親水性ポリマーセグメント内にある場合、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、リン酸およびホスホン酸から選択される１つまたは複数の置換基を持つ場合がある。置換アルキル基の例は、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキルおよびアルカリル基を含む。本明細書において使用される用語アルカリル（alkaryl）は、少なくとも１つの水素原子がアリール基で置き換えられているＣ１〜Ｃ１８アルキル基に関連する。そのような基の例は、これだけに限らないが、ベンジル（フェニルメチル、ＰｈＣＨ２−）、ベンズヒドリル（Ｐｈ２ＣＨ−）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｐｈ３Ｃ−）、フェネチル（フェニルエチル、Ｐｈ−ＣＨ２ＣＨ２−）、スチリル（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−）、シンナミル（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）を含む。典型的には置換Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基は、１個、２個もしくは３個の置換基、例えば１個もしくは２個、またはさらに典型的には１個の置換基を保有する。しかし通常本明細書のアルキル基は、他に規定のない限り置換されていない。
【０１１５】
ビニルＣ１〜Ｃ１８アルカノエートは、したがって式Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ２の化合物であり、式中Ｒは上に定義のＣ１〜Ｃ１８アルキル基である。
【０１１６】
他に規定のない限り本明細書に明記の「アルキル」基は、上に定義のＣ１〜Ｃ１８アルキル基、または例えば上に定義のＣ１〜Ｃ１０アルキル基、または上に定義のＣ１〜Ｃ４アルキル基であると理解されてよい。
【０１１７】
Ｃ１〜Ｃ１０ペルフルオロアルキル基は、炭素原子１個から１０個を有する直鎖状または分枝状鎖飽和完全フッ素化炭化水素ラジカルである。Ｃ２〜Ｃ１０ペルフルオロアルキル基は、炭素原子２個から１０個を有する直鎖状または分枝状鎖飽和完全フッ素化炭化水素ラジカルである。この内容において「完全フッ素化（Perfluorinated）」は、フッ素で置き換えることができる炭素結合水素原子がないように完全にフッ素化されたことを意味する。Ｃ２〜Ｃ１２ペルフルオロアルキル基の例は、ペルフルオロエチル（Ｃ２）ペルフルオロプロピル（Ｃ３）（ペルフルオロ−ｎ−プロピルおよびペルフルオロ−イソ−プロピルを含む）、ペルフルオロブチル（Ｃ４）（ペルフルオロ−ｎ−ブチル、ペルフルオロ−ｓｅｃ−ブチルおよびペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチルを含む）、ペルフルオロペンチル（Ｃ５）、ペルフルオロヘキシル（Ｃ６）、ペルフルオロヘプチル（Ｃ７）、ペルフルオロオクチル（Ｃ８）、ペルフルオロノニル（Ｃ９）およびペルフルオロデシル（Ｃ１０）であり、その直鎖状および分枝状異性体を含む。Ｃ１〜Ｃ１０ペルフルオロアルキルも当然のことながら−ＣＦ３を含む。
【０１１８】
「部分的にフッ素化」は、フッ素で置き換えることができる１つまたは複数の炭素結合水素原子が存在することを意味する。したがって部分的フッ素化Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基は、１つまたは複数のフッ素原子で置換されているが完全にはフッ素化されていないＣ１〜Ｃ１０アルキル基である。同様に部分的フッ素化Ｃ２〜Ｃ１０アルキル基は、１つまたは複数のフッ素原子で置換されているが完全にはフッ素化されていないＣ２〜Ｃ１０アルキル基である。したがって部分的フッ素化Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基およびＣ２〜Ｃ１０アルキル基は、フッ素で置き換えることができる少なくとも１つの炭素結合水素原子を有する。
【０１１９】
Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基は、置換されていないまたはシクリル（cyclyl）基でもある置換されているアルキル基であり；つまり、炭素環式化合物の環状炭素の脂環式環原子（ring atom）から水素原子を除去することによって得られる一価成分であり、成分は炭素原子３個から１０個（他に規定のない限り）を有し、環原子３個から１０個を含む。Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基の基の例は、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルを含む。Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基が置換されている場合、それは典型的にはアルキル基について上に明記したものから選択される１つまたは複数の置換基を持つ。典型的には置換Ｃ３〜１０シクロアルキル基は、１個、２個もしくは３個の置換基、例えば１個もしくは２個、またはさらに典型的には１個の置換基を保有する。しかし通常、本明細書のシクロアルキル基は、他に規定のない限り置換されていない。Ｃ３〜１０シクロアルキル基の例は、これだけに限らないが、そのＣ３〜１０シクロアルキル基が置換されていないまたは上に定義のとおり置換されている飽和単環式炭化水素化合物由来のものを含む：シクロプロパン（Ｃ３）、シクロブタン（Ｃ４）、シクロペンタン（Ｃ５）、シクロヘキサン（Ｃ６）、シクロヘプタン（Ｃ７）、メチルシクロプロパン（Ｃ４）、ジメチルシクロプロパン（Ｃ５）、メチルシクロブタン（Ｃ５）、ジメチルシクロブタン（Ｃ６）、メチルシクロペンタン（Ｃ６）、ジメチルシクロペンタン（Ｃ７）、メチルシクロヘキサン（Ｃ７）、ジメチルシクロヘキサン（Ｃ８）、メンタン（menthane）（Ｃ１０）。
【０１２０】
アリール基は、典型的には環部分に炭素原子６個から１４個、好ましくは炭素原子６個から１０個を含有する置換されているまたは置換されていない、単環式または二環性芳香族基である。例は、フェニル、ナフチル、インデニルおよびインダニル（indanyl）基を含む。アリール基は、例えばアルキルについて上に明記されたとおり、置換されていなくても置換されていてもよい。それは、典型的には０個、１個、２個または３個の置換基を保有する。
【０１２１】
Ｃ２〜Ｃ１８アルケンは、炭素原子２個から２０個を有する直鎖状または分枝状鎖アルケンである。ハロ基は、塩素、フッ素、臭素またはヨウ素（クロロ基、フルオロ基、臭素基またはヨード基）である。典型的にはそれは、塩素、フッ素または臭素である。Ｃ２〜Ｃ１８ハロアルケンは、したがって、１つまたは複数のハロ基で置換されている炭素原子２個から２０個を有する直鎖状または分枝状鎖アルケンである。典型的にはそれは、ハロ置換基０個、１個、２個、３個または４個を保有する。
【０１２２】
本明細書において使用される用語アミノは、式−ＮＨ２の基を表す。用語Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノは、式−ＮＨＲ’の基を表し、式中Ｒ’は既に定義のとおりＣ１〜Ｃ６アルキル基である。用語ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ）は、式−ＮＲ’Ｒ’’の基を表し、式中Ｒ’およびＲ’’は同じまたは異なっており、既に定義のとおりＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す。
【０１２３】
上に定義の両親媒性共重合体分子の内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、典型的には、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルおよびＣ３〜Ｃ１８シクロアルキルアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルアクリルアミドおよびメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニルＣ１〜Ｃ１８アルカノエート、Ｃ２〜Ｃ１８アルケン、Ｃ２〜Ｃ１８ハロアルケン、スチレン、（Ｃ１〜６アルキル）スチレン、Ｃ４〜Ｃ１２アルキルビニルエーテル、Ｃ２〜Ｃ１０ペルフルオロ−アルキルアクリレートおよびメタクリレートならびに対応する部分的にフッ素化されたアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３〜Ｃ１２ペルフルオロアルキルエチルチオカルボニルアミノエチルアクリレートおよびメタクリレート、アクリルオキシ−およびメタクリルオキシアルキルシロキサン、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ハロシラン（halosilane）、Ｎ−ビニルカルバゾール、マレイン酸のＣ１〜Ｃ１２アルキルエステル、フマル酸、イタコン酸、メサコン酸、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル、クロロプレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルトルエン、ビニルエチルエーテル、ペルフルオロヘキシルエチルチオカルボニルアミノエチルメタクリレート、イソボミルメタクリレート、トリフルオロエチルメタクリレート、ヘキサ−フルオロイソプピルメタクリレート、ヘキサフルオロブチルメタクリレート、トリストリメチルシリルオキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＲＩＳ）、ならびに３−メタクリルオキシプロピルペンタメチルジシロキサンから選択される１つまたは複数の単量体のポリマーを含む。したがって、内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、上に列挙した任意の１つの単量体のポリマーを含む場合がある、または上に列挙した任意の２つ以上の単量体の共重合体を含む場合がある。
【０１２４】
内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、例えば１つまたは複数のＣ２〜Ｃ１８アルケン単量体のポリマー、例えば１つまたは複数のＣ２〜Ｃ４アルケン単量体のポリマーを含む場合がある。
【０１２５】
代替的に、疎水性ポリマーセグメントＢは、例えば１つまたは複数のジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ハロシラン（halosilane）単量体のポリマー、例えばジメチルクロロシランのポリマーを含んでよい。
【０１２６】
１つまたは複数の追加的疎水性ポリマーセグメントが共重合体中に存在する場合に、例えばＸ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２のいずれかが上の式（Ｉ）中に存在し、追加的疎水性ポリマーセグメントである場合、または例えば共重合体が、追加的疎水性ポリマーセグメントＢ１およびＢ２を含む上の式（ＩＩ）のペンタブロック共重合体である場合、同じまたは異なっていてよい前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、典型的には、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルおよびＣ３〜Ｃ１８シクロアルキルアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルアクリルアミドおよびメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ビニルＣ１〜Ｃ１８アルカノエート、Ｃ２〜Ｃ１８アルケン、Ｃ２〜Ｃ１８ハロアルケン、スチレン、（Ｃ１〜６アルキル）スチレン、Ｃ４〜Ｃ１２アルキルビニルエーテル、Ｃ２〜Ｃ１０ペルフルオロ−アルキルアクリレートおよびメタクリレートならびに対応する部分的にフッ素化されたアクリレートおよびメタクリレート、Ｃ３〜Ｃ１２ペルフルオロアルキルエチルチオカルボニルアミノエチルアクリレートおよびメタクリレート、アクリルオキシ−およびメタクリルオキシアルキルシロキサン、Ｎ−ビニルカルバゾール、マレイン酸のＣ１〜Ｃ１２アルキルエステル、フマル酸、イタコン酸、メサコン酸、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニル、クロロプレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルトルエン、ビニルエチルエーテル、ペルフルオロヘキシルエチルチオカルボニルアミノエチルメタクリレート、イソボミルメタクリレート、トリフルオロエチルメタクリレート、ヘキサ−フルオロイソプピルメタクリレート、ヘキサフルオロブチルメタクリレート、トリストリメチルシリルオキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＲＩＳ）、ならびに３−メタクリルオキシプロピルペンタメチルジシロキサンから選択される１つまたは複数の単量体のポリマーを含む。したがって、前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、上に列挙した単量体の任意の１つのポリマーを含む場合がある、または上に列挙した単量体の任意の２つ以上の共重合体を含む場合がある。
【０１２７】
前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、例えば１つまたは複数のＣ２〜Ｃ１８アルケン単量体のポリマー、例えば１つまたは複数のＣ２〜Ｃ４アルケン単量体のポリマーを含む場合がある。前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、１つまたは複数のジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ハロシラン（halosilane）単量体のポリマー、例えばジメチルクロロシランのポリマーを追加的にまたは代替的に含む場合がある。
【０１２８】
通常、共重合体中の内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、ポリシロキサン、ポリアルケン、ペルフルオロポリエーテル、ペルフルオロアルキルポリエーテル、ポリスチレン、ポリオキシプロピレン、ポリ酢酸ビニル（polyvinylacetate）、ポリオキシブチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリル酸アルキル（polyalkylacrylate）（ＰＡＡ）、ポリメタクリル酸アルキル（polyalkylmethacrylate）、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ＰＴＨＦ、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスルホン、ポリビニルエーテル、ポリ（プロピレンオキシド）およびその共重合体から選択されるポリマーを含む。
【０１２９】
内側の疎水性ポリマーセグメントＢについての特に好ましい選択肢は、ポリシロキサンおよびポリアルケンを含む。
【０１３０】
好適なポリシロキサンは、ポリジメチルシロキサンおよびポリジフェニルシロキサンを含む。例えば内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、末端アルキレン基を有するポリシロキサンブロックを含む場合がある。したがって内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、末端アルキレン基を有するポリジメチルシロキサンブロック、または例えば末端アルキレン基を有するポリジフェニルシロキサンブロックを含む場合がある。
【０１３１】
代替的に、内側の疎水性ポリマーセグメントＢは、ポリアルケンを含む場合がある。ポリアルケンは、例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリブテンである場合がある。典型的にはポリアルケンは、ポリエチレンである。
【０１３２】
同様に、１つまたは複数の追加的疎水性ポリマーセグメントが共重合体中に存在する場合に、例えばＸ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２のいずれかが上の式（Ｉ）中に存在し、追加的疎水性ポリマーセグメントである場合、または例えば共重合体が、追加的疎水性ポリマーセグメントＢ１およびＢ２を含む上の式（ＩＩ）のペンタブロック共重合体である場合、同じまたは異なっていてよい前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、典型的にはポリシロキサン、ポリアルケン、ペルフルオロポリエーテル、ペルフルオロアルキルポリエーテル、ポリスチレン、ポリオキシプロピレン、ポリ酢酸ビニル（polyvinylacetate）、ポリオキシブチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリル酸アルキル（polyalkylacrylate）（ＰＡＡ）、ポリメタクリル酸アルキル（polyalkylmethacrylate）、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ＰＴＨＦ、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスルホン、ポリビニルエーテル、ポリ（プロピレンオキシド）およびその共重合体から選択されるポリマーを含む。１つまたは複数の追加的疎水性ポリマーセグメントについての特に好ましい選択肢は、ポリシロキサンおよびポリアルケンを含む。好適なポリシロキサンは、ポリジメチルシロキサンおよびポリジフェニルシロキサンを含む。ポリアルケンは、例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリブテンである場合がある。典型的にはポリアルケンは、ポリエチレンである。
【０１３３】
したがって典型的には、内側の疎水性ポリマーセグメントＢおよび、存在する場合に、前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、ポリシロキサンまたはポリアルケンを含む。好適なポリシロキサンは、ポリジメチルシロキサンおよびポリジフェニルシロキサンを含む。ポリアルケンは、例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリブテンである場合がある。
【０１３４】
しかしいくつかの実施形態では、内側の疎水性ポリマーセグメントＢは不飽和ポリマーを含む。不飽和ポリマーは、例えば、ジエンが置換されていないまたはハロゲンもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルによって置換されている、コンジュゲートした脂肪族または脂環式ジエンのポリマー；アルキンまたはジアルキンが置換されていないまたはＣ１〜Ｃ６アルキルもしくはトリメチルシリルによって置換されているアルキンまたはジアルキンのポリマー；コンジュゲートしたジエンと親水性または疎水性ビニル単量体との共重合体；およびその部分的水和誘導体から選択されてよい。使用できる特に好ましい不飽和ポリマーは、ｃｉｓ−、ｔｒａｎｓ−、イソ−もしくはシンジオタクチックポリ−１，２−ブタジエン、ポリ−１，４−ブタジエンもしくはポリイソプレン、ポリ−ペンテナマー、ポリクロロプレンもしくはポリピペリレン（polypiperylen）；アクリロニトリル、スチレン、アクリル酸もしくはヒドロキシエチルメタクリレートから選択される親水性もしくは疎水性ビニル単量体を含むブタジエン−もしくはイソプレン−共重合体；またはポリ−１−トリメチルシリル−プロピンを含む。
【０１３５】
存在する場合に、同じまたは異なっていてよい、前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、不飽和ポリマーを含む場合がある。前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントが不飽和ポリマーを含む場合、不飽和ポリマーは、例えば内側の疎水性ポリマーセグメントＢについて上に列挙した任意のものから選択されてよい。
【０１３６】
内側の疎水性ポリマーセグメントＢおよび、存在する場合に、前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントは、１種類のポリマーまたは上に考察したものの２つ以上などの１種類より多いポリマーを含む場合がある。
【０１３７】
内側の疎水性ポリマーセグメントＢの平均分子量は、典型的には約１５０から約５０，０００である。いくつかの実施形態では、それは約８００から約１５，０００、または例えば約１，０００から約１２，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５，０００から約１２，０００、例えば約４，０００から約１１，０００である。
【０１３８】
同様に、前記または各追加的疎水性ポリマーセグメントの平均分子量は、存在する場合に、典型的には約１５０から約５０，０００である。いくつかの実施形態では、それは約８００から約１５，０００、または例えば約１，０００から約１２，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５，０００から約１２，０００、例えば約４，０００から約１１，０００である。
【０１３９】
上に定義の両親媒性共重合体分子の第１の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１、および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ２は、同じまたは異なっていてよい。通常同じまたは異なっていてよいＡ１およびＡ２は、ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルアクリレートおよびメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−アクリルアミド、エトキシル化アクリレートおよびメタクリレート、ポリエチレングリコール−モノメタクリレートおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ヒドロキシル置換（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルビニルエーテル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ビニルオキサゾリン、２−ビニル−４，４’−ジアルキルオキサゾリン−５−オン、２−および４−ビニルピリジン、炭素原子合計３個から５個を有するビニル型（vinylically）不飽和カルボン酸、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−、モノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−およびジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−アクリレートおよびメタクリレート、アリルアルコール、３−トリメチルアンモニウム２−ヒドロキシプロピルメタクリレートクロリド、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、グリセロールメタクリレート、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミド、環状イミノエーテル、ビニルエーテル、エポキシドを含む環状エーテル、環状不飽和エーテル、Ｎ置換アジリジン、［ベータ］−ラクトンおよび［ベータ］−ラクタム（lactame）、ケテンアセタール、ビニルアセタールならびにホスホランから独立に選択される単量体のポリマーを含む。したがって第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、上に列挙した任意の１つの単量体のポリマー、または上に列挙した任意の２つ以上の単量体の共重合体を含む場合がある。
【０１４０】
同じまたは異なっていてよい第１の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１、および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ２は例えば、２−メチルオキサゾリン、２−オキサゾリンおよび２位にアルケニル基を有する２−オキサゾリンから選択される環状イミノエーテル、ならびにメチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルおよびメトキシエチルビニルエーテルから選択されるビニルエーテルから独立に選択される単量体のポリマーを含む場合がある。さらに典型的には、Ａ１およびＡ２は、２−メチルオキサゾリン、２−オキサゾリンおよび２位にアルケニル基を有する２−オキサゾリンから選択される単量体のポリマーを含む。例えば、Ａ１およびＡ２の１つまたは両方はポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ）を含む場合がある。
【０１４１】
同様に、１つまたは複数の追加的親水性ポリマーセグメントが共重合体中に存在する場合に、例えばＸ１、Ｙ１、Ｙ２およびＸ２のいずれかが上の式（Ｉ）中に存在し、追加的親水性ポリマーセグメントである場合、同じまたは異なっていてよい前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、典型的には、ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルアクリレートおよびメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−アクリルアミド、エトキシル化アクリレートおよびメタクリレート、ポリエチレングリコール−モノメタクリレートおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ヒドロキシル置換（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ヒドロキシル置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルビニルエーテル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ビニルオキサゾリン、２−ビニル−４，４’−ジアルキルオキサゾリン−５−オン、２−および４−ビニルピリジン、炭素原子合計３個から５個を有するビニル型（vinylically）不飽和カルボン酸、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−、モノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−およびジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−アクリレートおよびメタクリレート、アリルアルコール、３−トリメチルアンモニウム２−ヒドロキシプロピルメタクリレートクロリド、ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、グリセロールメタクリレート、Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミド、環状イミノエーテル、ビニルエーテル、エポキシドを含む環状エーテル、環状不飽和エーテル、Ｎ置換アジリジン、［ベータ］−ラクトンおよび［ベータ］−ラクタム（lactame）、ケテンアセタール、ビニルアセタールおよびホスホランから選択される１つまたは複数の単量体のポリマーを含む。したがって、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、存在する場合に、上に列挙した任意の１つの単量体のポリマーまたは上に列挙した任意の２つ以上の単量体の共重合体を含む場合がある。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、存在する場合に、２−メチルオキサゾリン、２−オキサゾリンおよび２位にアルケニル基を有する２−オキサゾリンから選択される環状イミノエーテル、ならびにメチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルおよびメトキシエチルビニルエーテルから選択されるビニルエーテルから選択される単量体のポリマーを含む。さらに典型的には、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、２−メチルオキサゾリン、２−オキサゾリンおよび２位にアルケニル基を有する２−オキサゾリンから選択される単量体のポリマーを含む。例えば、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ）を含む場合がある。
【０１４３】
典型的には、同じまたは異なっていてよい、第１の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ１、および第２の外側の親水性ポリマーセグメント、Ａ２は、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（メス（meth））アクリル酸、ポリエチレンオキシド−ｃｏ−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、ポリ（ビニルエーテル）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリアシルアルキレンイミン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルアクリレートおよびヒドロキシプロピルアクリレートなどのポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリオール、ならびにそれらの２つ以上の共重合体混合物、多糖およびポリペプチドなどの天然ポリマーならびにその共重合体、ならびにポリアリルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリアニリン、スルホン化ポリアニリン、ポリピロールおよびポリピリジニウムなどのポリイオン性分子、ポリチオフェン−酢酸、ポリスチレンスルホン酸、双性イオン分子、ならびにその塩および共重合体から選択されるポリマーを含む。
【０１４４】
親水性ポリマーセグメントのためのポリマーの特に重要な選択は、ポリ（２−メチルオキサゾリン）、すなわちＰＭＯＸＡである。したがって通常、第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２は、ポリ（２−メチルオキサゾリン）を含む。
【０１４５】
同様に、１つより多い追加的親水性ポリマーセグメントが、存在する場合に、同じまたは異なっていてよい前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、存在する場合に、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（メス（meth））アクリル酸、ポリエチレンオキシド−ｃｏ−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、ポリ（ビニルエーテル）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリアシルアルキレンイミン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルアクリレートおよびヒドロキシプロピルアクリレートなどのポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリオール、ならびにそれらの２つ以上の共重合体混合物、多糖およびポリペプチドなどの天然ポリマーならびにその共重合体、ならびにポリアリルアンモニウム、ポリエチレンイミン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリアニリン、スルホン化ポリアニリン、ポリピロールおよびポリピリジニウムなどのポリイオン性分子、ポリチオフェン−酢酸、ポリスチレンスルホン酸、双性イオン分子、ならびにその塩および共重合体から選択されるポリマーを含む。追加的親水性ポリマーセグメント（複数可）は、存在する場合に、例えばポリ（２−メチルオキサゾリン）、すなわちＰＭＯＸＡを含む場合がある。
【０１４６】
第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２は、存在する場合に、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントは、１種類のポリマーまたは、上に考察のものの２種類以上などの１種類より多い種類のポリマーを含む場合がある。
【０１４７】
第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１およびＡ２の平均分子量は、それぞれ典型的には約１５０から約５０，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５００から約１５，０００、または例えば約１，０００から約１２，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５，０００から約１２，０００、例えば約４，０００から約１１，０００である。
【０１４８】
同様に前記または各追加的親水性ポリマーセグメントの平均分子量は、存在する場合に、典型的には約１５０から約５０，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５００から約１５，０００、または例えば約１，０００から約１２，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５，０００から約１２，０００、例えば約４，０００から約１１，０００である。
【０１４９】
したがって第１の外側の親水性ポリマーセグメントＡ１、第２の外側の親水性ポリマーセグメントＡ２および、存在する場合に、前記または各追加的親水性ポリマーセグメントのそれぞれの分子量は、通常１５０から５０，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５００から約１５，０００、または例えば約１，０００から約１２，０００である。いくつかの実施形態では、それは約５，０００から約１２，０００、例えば約４，０００から約１１，０００である。
【０１５０】
両親媒性分子は、例えばトリブロック共重合体ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）、または例えばトリブロック共重合体ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（エチレン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＥ−ＰＭＯＸＡ）を含む場合がある。
【０１５１】
両親媒性分子は、例えばトリブロック共重合体６−３３−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）、６−３２−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）または６−４５ＰＥ−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＥ−ＰＭＯＸＡ）を含む場合がある。
【０１５２】
上に定義の種類のポリマー性両親媒性分子、すなわち内側の疎水性ポリマーセグメントならびに第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントを含む共重合体分子は、当技術分野において公知である標準的共重合体合成方法を使用して合成できる。そのような方法は、ＵＳ  ６，７２３，８１４  Ｂ２およびＵＳ  ６，９１６，４８８  Ｂ１に記載されている。
【０１５３】
例えば光重合、酸化還元重合、アニオン性重合、縮合反応、付加反応、および鎖重合反応を含む任意の好適な重合方法は、疎水性または親水性ポリマーセグメントを調製するために適切に使用できる。同様に、両親媒性ブロック共重合体においてセグメントとして使用できる多種多様な親水性および疎水性ポリマーは、商業的に入手できる。
【０１５４】
親水性および疎水性セグメントは、例えば、適切に官能基化された疎水性ポリマーセグメントの存在下で好適な親水性単量体を重合することによって、親水性単量体単位のブロックが疎水性セグメントの官能基化の部位から伸びるように合わせて連結されてよい。代替的に好適な疎水性単量体は、適切に官能基化された親水性ポリマーセグメントの存在下で、疎水性単量体単位のブロックが親水性セグメントの官能基化の部位から伸びるように、重合されてよい。
【０１５５】
したがって、例えばトリブロック共重合体は、２回官能基化されている疎水性ポリマーセグメントの存在下で、親水性単量体単位の２つのブロックが疎水性セグメントの官能基化の部位から伸びるように、１つまたは複数の好適な親水性単量体を重合することによって調製できる。
【０１５６】
官能基化セグメントは、マクロイニシエーターと称される場合がある。好適なマクロイニシエーターは、１つもしくは複数の熱的にもしくは光化学的に活性化可能なカチオン性もしくはアニオン性官能基、または例えば１つもしくは複数の熱的にもしくは光化学的に活性化可能なラジカルイニシエーター基を有する場合がある。アニオン性重合、重縮合および重付加も使用できる。好ましい光化学的に活性化可能なカチオン性イニシエーター基の具体的な例は、トリフレート（−Ｏ−ＳＯ２−ＣＦ３）、−Ｉ（ヨウ化）、−Ｏ−メシル、−Ｏ−トシル、および−Ｃｌ＋ＡｇＳｂＦ６である。イニシエーター基は、開始セグメントの末端基と、両親媒性共重合体を調製するためのグラフト共重合体化のときに開始セグメントに付着している伸長セグメントを形成している第１の単量体との間に共有結合を提供する方法で開始セグメントに通常連結されている。グラフト化は、ポリマー鎖が単量体の末端またペンダント位置（pendant position）のいずれかから別の予め形成されたポリマーへ伸びることを意味する。
【０１５７】
イニシエーター基は、任意の好適な方法で、例えば開始単量体上に存在する官能基へのカチオン性または熱性イニシエーター基の連結を通じて、予め形成されたポリマーセグメントに導入されてよい。トリフレート基は、例えば末端またはペンダント官能基化ヒドロキシル基と（ＣＦ３ＳＯ）２Ｏなどの活性化トリフリン酸誘導体との反応によって導入できる。
【０１５８】
例えば、第１の親水性セグメントＡ１およびＡ２が予め形成された疎水性セグメントＢ上で伸ばされ、次いでさらなる疎水性セグメントＢ１およびＢ２が先に調製されたセグメントＡ１およびＡ２の末端に付着されるように、グラフト共重合体化のときに単量体を変更することも可能である。そのようなプロセスは、本明細書に定義の式（ＩＩ）のペンタブロック共重合体に使用することができる。
【０１５９】
当然のことながら重合は、当業者に公知のとおり溶媒の存在または不在において、重合反応が起きるために好適な条件下で実施できる。好適な溶媒は、使用される単量体を溶解するすべての溶媒、例えば、水、エタノールもしくはメタノールなどの低級アルカノールなどのアルコール、ジメチルホルムアミドなどのカルボキサミド、ジメチルスルホキシドもしくはメチルエチルケトンなどの双極性非プロトン溶媒、アセトンもしくはシクロヘキサノンなどのケトン、トルエンなどの炭化水素、ＴＨＦなどのエーテル、ジメトキシエタンまたはジオキサン、トリクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、および水とアルコールとの混合物、例えば水／エタノールもしくは水／メタノール混合物などの好適な溶媒の混合物である。
【０１６０】
内側の疎水性ポリマーセグメント、ならびに第１および第２の外側の親水性ポリマーセグメントを含む完全な共重合体も、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ（商標）、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａおよび例えばＨｉｇｈ  Ｆｏｒｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｄｕｒｈａｍ、ＵＫなどの企業から商業的に入手できる。
【０１６１】
極性媒体の第１および第２の容積部中で用いられる極性媒体は（存在する極性媒体の任意のさらなる容積部で）、目的に応じて自由に選ばれてよい。それは、典型的には液体またはゲルである。第１および第２の容積部中で用いられる極性媒体は、同じまたは異なっていてよい。
【０１６２】
極性媒体が水性媒体である場合。任意の好適な水性媒体を用いてよい。水性媒体は、１つまたは複数の溶質を含む場合がある。水性媒体は、極性媒体のｐＨを適切に調節するために緩衝液を含む場合がある。
【０１６３】
極性媒体は、酸化還元対をもたらすように部分的に酸化または還元されている場合がある酸化還元対または酸化還元対のメンバーをさらに含む場合がある。酸化還元対は、Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋、フェロセン／フェロセニウムまたはＲｕ２＋／Ｒｕ３＋などの当技術分野において公知のものから選ばれてよい。そのような例はフェロ／フェリシアン化物、ルテニウムヘキサミンおよびフェロセンカルボン酸である。
【０１６４】
無極性媒体は、典型的には油である。油は単一の化合物であってよい、または油は２つ以上の化合物の混合物を含む場合がある。
【０１６５】
油は、例えばシリコン油を含む場合がある。好適なシリコン油は、例えば、ポリ（フェニルメチルシロキサン）およびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）を含む。シリコン油は、水酸基末端シリコン油、例えば水酸基末端ＰＤＭＳを含む場合がある。
【０１６６】
油は、単一のシリコン油、例えばポリ（フェニルメチルシロキサン）またはポリ（ジメチルシロキサン）を含む場合がある。代替的に油は、２つ以上の異なるシリコン油の混合物、例えばポリ（フェニルメチルシロキサン）とポリ（ジメチルシロキサン）との混合物を含む場合がある。
【０１６７】
追加的にまたは代替的に油は、炭化水素、例えばヘキサデカンを含む場合がある。油が炭化水素を含む場合、それは単一の炭化水素化合物、または２つ以上の炭化水素の混合物を含む場合がある。いくつかの実施形態では、無極性媒体は、（ａ）１つまたは複数の炭化水素、および（ｂ）１つまたは複数のシリコン油を含む混合物である油である。
【０１６８】
任意の好適な炭化水素が油として用いられる場合がある。用いられる炭化水素は、当然のことながら操作温度、すなわち方法が実施される温度で液体でなければならない。典型的にはこれは室温であり、したがって用いられる炭化水素は通常、室温で液体であるものである。
【０１６９】
油が炭化水素を含む場合、炭化水素は分枝状または非分枝状、例えば炭素原子５個から３０個、または炭素原子５個から２０個を有する炭化水素（しかしより低い分子量の炭化水素は蒸発の制御を必要とする）であってよい。好ましくは炭化水素は、本発明において使用される液滴の操作温度で液体である。好適な例は、ヘキサデカン、デカン、ペンタンまたはスクアレンなどのアルカンまたはアルケンを含む。通常、油は炭化水素を含む。
【０１７０】
典型的には炭化水素は、置換されていないＣ１０〜Ｃ２０アルカン、例えばヘキサデカンである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、炭化水素は、スクアレンなどの置換されていないＣ１６〜Ｃ３０アルカンなどの長鎖炭化水素である。
【０１７２】
他の種類の油も可能である。例えば油は、フッ化炭素またはブロモ置換Ｃ１０〜Ｃ３０アルカン（例えば、ブロモ置換Ｃ１０〜Ｃ２０アルカン、例えばブロモドデカン）である場合がある。しかし典型的には油は、シリコン油または炭化水素を含む。
【０１７３】
シリコン油は、その密度が水のものに近いことから有利である場合があり、水性容積部である極性媒体の容積部が水中でおよそ中立的に浮揚性であることを確実にする。シリコン油は、例えば約１ｇ．ｃｍ−３の密度を有するポリ（フェニルメチルシロキサン）であってよい。
【０１７４】
炭化水素が、無極性媒体として用いられる場合、炭化水素は典型的には炭素原子５個から２０個（Ｃ５〜Ｃ２０炭化水素）、より典型的には炭素原子１０個から２０個（Ｃ１０〜Ｃ２０炭化水素）を有する。典型的にはそれは、アルカンまたはアルケンである。したがって炭化水素はＣ５〜Ｃ２０アルカン、またはＣ１０〜Ｃ２０アルカンである場合がある。別の実施形態では、炭化水素は、Ｃ５〜Ｃ２０アルケンまたはＣ１０〜Ｃ２０アルケンである場合がある。炭化水素は、典型的には置換されていない。したがって好ましい実施形態では、炭化水素は置換されていないＣ５〜Ｃ２０アルカンであり、好ましくは置換されていないＣ１０〜Ｃ２０アルカンである。炭化水素は、例えばスクアレン、ヘキサデカンまたはデカンである場合がある。一実施形態では、それはヘキサデカンである。しかし、いくつかの実施形態では、炭化水素は、ハロゲン原子、例えば臭素で置換されている場合がある。
【０１７５】
無極性媒体は、シリコン油と炭化水素との混合物を含む場合がある。混合物中のシリコン油および炭化水素は、上にさらに定義のとおりである。典型的には炭化水素は、置換されていないＣ１０〜Ｃ２０アルカン、好ましくはヘキサデカンである。シリコン油は、例えばポリ（フェニルメチルシロキサン）またはＰＤＭＳであってよい。
【０１７６】
本発明の方法の特定の好ましい実施形態では、無極性媒体はヘキサデカン、ポリ（フェニルメチルシロキサン）またはＰＤＭＳを含み、両親媒性分子はポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）、またはポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（エチレン）−ブロック−ポリ（２−メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ−ＰＥ−ＰＭＯＸＡ）を含み、極性媒体は水性緩衝液溶液を含む。
【０１７７】
膜タンパク質または膜貫通ポアは、本発明の方法によって極性媒体の容積部間に形成される１つまたは複数の膜への挿入のために、極性媒体の１つまたは複数の容積部中に提供されてよい。本方法は、膜タンパク質の選択を限定しない。したがって膜タンパク質は、任意の種類であってよい。膜内在性タンパク質の使用は実証されているが、末梢膜タンパク質を使用できることも同様に期待される。本方法は、β−バレルまたはα−ヘリックス束である２つの主要なクラスを含む任意の膜タンパク質に適用される。重要な適用は、ポアまたはチャネルである膜タンパク質である。加えて、タンパク質ポアまたはチャネル、さらに可能性がある膜タンパク質は、受容体、トランスポーターまたは細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響を与えるタンパク質を排他的でなく含む。
【０１７８】
したがって典型的には、膜を形成するための本発明の方法において、極性媒体の容積部の少なくとも１つは、両親媒性分子を含む１つまたは複数の膜への挿入が可能である膜タンパク質を含有する。好適な膜タンパク質は、これだけに限らないが、ポンプ、チャネル（例えばイオンチャネル）および／またはポア、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、および／または細胞認識もしくは細胞間相互作用に影響を与えるタンパク質を含む。通常膜タンパク質は、ポンプ、チャネルおよび／またはポアである。
【０１７９】
通常膜タンパク質は膜貫通ポア、例えば本明細書下の実施例２において使用されるＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）、または例えばα−ヘモリジン（αＨＬ）ポアである。しかしβ−バレルまたはα−ヘリックス束である２つの主要なクラスを含む任意の好適な膜タンパク質を使用できる。
【０１８０】
典型的には膜貫通タンパク質ポアは、
（ａ）ヘモリジン、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリアオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡから選択される；
（ｂ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットで形成されるまたは、７個のサブユニットの１つもしくは複数がアミノ酸同一性に基づいて配列全体にわたって配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である；あるいは
（ｃ）配列番号４に示す７個の同一のサブユニットから形成されるα−ヘモリジンまたは、７個のサブユニットの１つもしくは複数がアミノ酸同一性に基づいて配列全体にわたって配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である。
【０１８１】
通常、膜タンパク質が極性媒体中に存在する場合に、極性媒体中の膜タンパク質の濃度は、１ｎｇ  ｍＬ−１と同程度またはそれより多い、例えば１０ｎｇ  ｍＬ−１と同程度またはそれより多い。典型的には極性媒体中の膜タンパク質の濃度は、１０ｎｇ  ｍＬ−１から１０００ｎｇ  ｍＬ−１、または例えば２００ｎｇ  ｍＬ−１から８００ｎｇ  ｍＬ−１である。
【０１８２】
ポアの膜への挿入は、サーファクタントの存在によって補助される場合がある。サーファクタントは、共重合体と適合性である化学的成分を有利に有する。例えばＳｉｌｗｅｔ（登録商標）などの有機ケイ素ベースサーファクタントは、シロキサンを含む共重合体へのＭｓｐＡなどのタンパク質ポアの挿入を補助できることが示されている。サーファクタントは、極性媒体または無極性媒体中に提供される場合がある。
【０１８３】
膜を形成するための本発明の方法は、極性媒体の容積部で測定値を得て、容積部間の膜でまたは膜を通じて生じるプロセスを含む実験を実施するステップをさらに含む場合がある。例えば方法は、電極を極性媒体の容積部と電気的に接触させるステップ、および電極を使用して電気的測定値を得るステップをさらに含む場合がある。そのような測定は、本明細書下にさらに説明されるとおり、標的分析物を特性決定するために使用できる。
【０１８４】
本発明のシステムの種々の特質は、本発明の方法について本明細書先にさらに定義されたとおりであってよい。
【０１８５】
本発明のシステムにおいて、極性媒体の第１の容積部は、完全にまたは部分的に無極性媒体内であってよい。極性媒体の第１の容積部が部分的に無極性媒体内である場合、その部分は無極性媒体に接触していなくてもよい。したがって膜は、第１の容積部の曝露部分に接触している極性媒体を含む第２の容積部で形成されてよい。
【０１８６】
極性媒体を含む第１の容積部が、完全にまたは部分的に、無極性媒体内であることから、本発明のシステムは極性媒体の第１の容積部と無極性媒体との間の界面に両親媒性分子の層をさらに含む場合がある。
【０１８７】
本発明のシステム中の極性媒体の第１の容積部は、通常液滴またはビーズである。いくつかの実施形態では、本発明のシステム中の第１および第２の容積部のそれぞれは、液滴またはビーズである。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、極性媒体の第１および第２の容積部のそれぞれは、前記無極性媒体内にあり、システムは、極性媒体の第１の容積部と無極性媒体との間の界面に前記両親媒性分子の層、および極性媒体の第２の容積部と無極性媒体との間の界面に前記両親媒性分子の層をさらに含む。
【０１８９】
システムは、極性媒体の１つまたは複数のさらなる容積部、および前記両親媒性分子を含む１つまたは複数のさらなる膜を追加的に含んでよく、極性媒体のそれぞれのさらなる容積部は、前記両親媒性分子を含む前記さらなる膜によって極性媒体の別の容積部（第１もしくは第２の容積部、または別のさらなる容積部である場合がある）から分離されている。極性媒体の第１の容積部、第２の容積部および１つまたは複数のさらなる容積部は液滴またはビーズであってよい。
【０１９０】
システムは、例えば第１の容積部に隣接している極性媒体のさらなる容積部、および極性媒体の第１の容積部と極性媒体のさらなる容積部との間に両親媒性分子を含むさらなる膜を含む場合がある。
【０１９１】
同様にシステムは、第２の容積部に隣接している極性媒体のさらなる容積部、および極性媒体の第２の容積部と極性媒体のさらなる容積部との間に両親媒性分子を含むさらなる膜を含む場合がある。
【０１９２】
１つの重要な設定はシステムが、無極性媒体内に極性媒体の複数の第１の容積部、および複数の第１の容積部と第２の容積部との間に複数の個別の膜を含むものである。前記または各第１の容積部は、液滴またはビーズであってよい。第２の容積部は、目的の標的分析物を含むまたは含むと考えられる試料を含む場合がある。標的分析物は、本明細書先にさらに定義されたものであってよい。
【０１９３】
別の場合ではシステムは、無極性媒体内に極性媒体の複数の第１の容積部、極性媒体の複数の第２の容積部、および第１の容積部と第２の容積部との間に個別に与えられた複数の膜を含む場合がある。１つまたは複数の第２の容積部は、無極性媒体内に提供されてもよい。
【０１９４】
本発明は、極性媒体を含み、無極性媒体内に配置されており、その表面周辺の極性媒体と無極性媒体との間に両親媒性分子を含む層を有する、本明細書先に定義された容積部も提供する。容積部は、膜の形成について本明細書に定義の本発明の方法において有用に用いることができる。容積部を生成するためのプロセスも本明細書において提供される。
【０１９５】
本発明の容積部の種々の特質、および容積部を生成するための本発明のプロセスは、膜の形成のための本発明の方法または本発明のシステムについて本明細書でさらに定義されるとおりであってよい。したがって例えば、本発明の容積部において、または本発明の容積部を生成するための本発明のプロセスにおいて、両親媒性共重合体、両親媒性分子を含む層、極性媒体および無極性媒体は、すべて本発明の方法またはシステムについて本明細書先に定義されたとおりであってよい。通常、極性媒体の容積部は、前記極性媒体の液滴またはビーズである。
【０１９６】
分析物を特性決定する方法
本発明は、標的分析物を特性決定する方法を提供する。方法は、標的分析物がポアを通じて移動するように標的分析物を本発明のシステムの膜に存在するポアと、接触させるステップを含む。次いで、分析物がポアに関して移動するときに標的分析物の１つまたは複数の特性が当技術分野において公知の標準的方法を使用して測定される。標的分析物の１つまたは複数の特性は、分析物がポアを通じて移動するときに好ましくは測定される。ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体の形成を生じてよい。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。
【０１９７】
本発明の方法は、標的分析物を特性決定するためである。方法は、少なくとも１つの分析物を特性決定するためである。方法は、２つ以上分析物を特性決定するステップに関する場合がある。方法は、２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個以上の分析物などの任意の数の分析物を特性決定するステップを含む場合がある。
【０１９８】
標的分析物は、好ましくは金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である。方法は、２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上の医薬品などの同じ種類の２つ以上の分析物を特性決定するステップに関する場合がある。代替的に方法は、１つまたは複数のタンパク質、１つまたは複数のヌクレオチドおよび１つまたは複数の医薬品などの異なる種類の２つ以上の分析物を特性決定するステップに関する場合がある。
【０１９９】
標的分析物は、細胞から分泌される場合がある。代替的に標的分析物は、本発明が実行され得るより先に分析物が細胞から抽出されなければならないように細胞内部に存在する分析物である場合がある。
【０２００】
分析物は、好ましくはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するまたは天然に存在しない場合がある。ポリペプチドまたはタンパク質は、その中に合成または修飾されたアミノ酸を含む場合がある。アミノ酸への多数の異なる種類の修飾は、当技術分野において公知である。好適なアミノ酸およびその修飾は上のものである。本発明の目的のために、標的分析物が当技術分野において任意の利用可能な方法によって修飾できることは理解される。
【０２０１】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、増殖因子またはサイトカインなどの増殖制御タンパク質であってよい。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γならびにＴＮＦ−αなどの他のサイトカインから選択されてよい。タンパク質は、細菌性タンパク質、真菌性タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生生物由来タンパク質であってよい。
【０２０２】
標的分析物は、好ましくはヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【０２０３】
ヌクレオチドは、これだけに限らないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸ならびに５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシチジン三リン酸を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌクレオチドは、追加的修飾を含有する場合がある。具体的には好適な修飾ヌクレオチドは、これだけに限らないが、２’アミノピリミジン（２’−アミノシチジンおよび２’−アミノウリジンなど）、２’−ヒドロキシルプリン（２’−フルオロピリミジンなど（２’−フルオロシチジンおよび２’フルオロウリジンなど）、ヒドロキシルピリミジン（５’−α−Ｐ−ボラノウリジンなど）、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンなど）、４’−チオピリミジン（４’−チオウリジンおよび４’−チオシチジンなど）ならびに核酸塩基の修飾（５−ペンチニル−２’−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジンおよび１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジンなど）を有するヌクレオチドを含む。
【０２０４】
オリゴヌクレオチドは、典型的には４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下または５個以下のヌクレオチドなどの５０個以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、脱塩基および修飾ヌクレオチドを含んで上に考察の任意のヌクレオチドを含んでよい。
【０２０５】
本発明の方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのものである。核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、典型的には紫外線光による損傷と関連し、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は上に記載されている。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
【０２０６】
ヌクレオチドは上に定義されている。ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドは、典型的には、これだけに限らないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【０２０７】
ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠いている）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖を欠いていてもよい（すなわちＣ３スペーサーである）。
【０２０８】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに付着していてよい。ヌクレオチドは、核酸においてと同様に典型的にはそれらの糖およびリン酸基によって付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して接続されてよい。
【０２０９】
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。１本鎖ポリヌクレオチドは、それにハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーを有する場合があり、それにより２本鎖ポリヌクレオチドの１つまたは複数の短い領域を含む。プライマーは、標的ポリヌクレオチドと同じ種類のポリヌクレオチドであってよい、または異なる種類のポリヌクレオチドであってよい。
【０２１０】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
【０２１１】
標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
【０２１２】
標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物は、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物を含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドなどの１つまたは複数の標的分析物の同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【０２１３】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には始生代のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界に属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。
【０２１４】
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【０２１５】
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
【０２１６】
ポアは、本発明のシステムの前記膜または膜（the or a）に存在する。本発明のシステムの膜を参照して上に考察の任意の実施形態は、本発明の特性決定方法に適用可能である。標的ポリヌクレオチドなどの分析物は、膜に直接カップリングされてよい。標的ポリヌクレオチドなどの分析物は好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とポアの内側との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに好ましくは付着される。
【０２１７】
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とポアの内側との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。標的ポリヌクレオチドなどの分析物は、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【０２１８】
合成脂質二重層への、標的ポリヌクレオチドなどの分析物のカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表１に要約する。
【０２１９】
【表１】
0006375301.tif 000005
【０２２０】
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【０２２１】
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。
【０２２２】
代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。例えばポリヌクレオチドは、反応基が付着されたプライマーを用いて合成され得る。
【０２２３】
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。
【０２２４】
膜貫通ポアは、ある程度膜を越える構造である。それは、印加された電位によって水和イオンが膜を越えてまたは膜内に流れるように駆動されるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を越えており水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。しかし膜貫通ポアは、膜を越えている必要はない。それは、一方の末端で閉じていてよい。例えばポアは、それに沿ってまたはその中に水和イオンが流れられる膜中のウエルであってよい。
【０２２５】
任意の膜貫通ポアは本発明において使用できる。ポアは、生物学的または人工的であってよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポアおよびポリヌクレオチドポアを含む。
【０２２６】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜を越えてまたは膜内に流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを好ましくは形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜の一方の側から他方へ流れるようにする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
【０２２７】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの反復サブユニット（６、７、８または９サブユニット）から好ましくは作られる。ポアは好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。
【０２２８】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【０２２９】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【０２３０】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
【０２３１】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【０２３２】
Ｍｓｐ由来の単量体は、通常、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【０２３３】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０２３４】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
【０２３５】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−Ｂ１の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。配列番号２の変種は、ＭＳ−Ｂ１のすべての変異に加えて変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有し、ＭＳ−Ｂ２Ｃと称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
【０２３６】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、無極性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表２に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表２におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０２３７】
【表２】
0006375301.tif 000006
【０２３８】
【表３】
0006375301.tif 000007
【０２３９】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０２４０】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０２４１】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０２４２】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０２４３】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
【０２４４】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、下に詳細に記載される。
【０２４５】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０２４６】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０２４７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０２４８】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
【０２４９】
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
【０２５０】
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
【０２５１】
変種は、構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
【０２５２】
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
【０２５３】
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
【０２５４】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
【０２５５】
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０２５６】
変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０２５７】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
【０２５８】
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【０２５９】
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０２６０】
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
【０２６１】
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０２６３】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０２６４】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０２６５】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０２６６】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載の任意のタンパク質は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０２６７】
ポアは明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば125I、35S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０２６８】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載の任意のタンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出されてよい。例えばポアは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ポアは、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
【０２６９】
ポアは、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０２７０】
ポアは、他の非特異的修飾もそれらがポア形成または構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０２７１】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載の任意のタンパク質は、当技術分野において公知の標準的方法を使用して生成できる。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ポアは、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
【０２７２】
ポアは、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムは、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを含む。
【０２７３】
方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドを特性決定するためであり、ステップ（ａ）は標的ポリヌクレオチドをポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質に接触させるステップを含み、タンパク質はポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。標的ポリヌクレオチドは、ポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質に任意の順序で接触されてよい。好ましくは、標的ポリヌクレオチドがタンパク質およびポアに接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にタンパク質と複合体を形成する。電圧がポアを越えて印加される場合、次いで標的ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は、ポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０２７４】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポアを通るその移動を制御できる任意のタンパク質であってよい。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するかどうかを決定することは当技術分野において容易である。タンパク質は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの性質と相互作用し、修飾する。タンパク質は、個々のヌクレオチドまたは、ジもしくはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は、特定の位置にポリヌクレオチドを方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾できる。
【０２７５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはポリヌクレオチドハンドリング酵素である。ポリヌクレオチドハンドリング酵素はポリヌクレオチドの少なくとも１つの性質と相互作用および修飾できるポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたは、ジ−もしくはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、特定の位置にポリヌクレオチドを方向付けるまたは移動させることによってポリヌクレオチドを修飾できる。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、標的配列に結合でき、ポアを通るその移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない。例えば酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されてよい、または酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。そのような条件は、下により詳細に考察される。
【０２７６】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素の構築物において使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ  ２０１０／０８６６０３として公開）において開示のいずれかであってよい。
【０２７７】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびジャイレースなどのトポイソメラーゼである。好適な酵素は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ（配列番号１１）、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１３）、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪ（配列番号１５）およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号１７）ならびにそれらの変種を含む。配列番号１５に示す配列またはその変種を含む３つのサブユニットは、三量体エキソヌクレアーゼを形成するように相互作用する。酵素は、好ましくはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）またはその変種である。トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０２７８】
酵素は、最も好ましくはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１８）、Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（配列番号１９）、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（配列番号２０）；Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（配列番号２１）、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ（配列番号２２）、ＸＰＤ  Ｍｂｕ（配列番号２３）またはその変種などのヘリカーゼ由来である。
【０２７９】
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合能力を保持している酵素である。これは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定できる。例えば変種は、ポリヌクレオチドに接触でき、ポリヌクレオチドに結合し、それに沿って移動するその能力は測定できる。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２８０】
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のアミノ酸配列の全長にわたって、変種はアミノ酸同一性に基づく配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のアミノ酸配列に配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０、２８０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００またはそれ以上）のストレッチの連続するアミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は、上に記載のとおり決定される。変種は、上記の配列番号２および４を参照して上に考察の任意の方法において野生型配列から異なっていてよい。酵素は、ポアに共有結合的に付着していてよい。任意の方法をポアに酵素を共有結合的に付着させるために使用できる。ナノポアを使用してポリヌクレオチドを配列決定するための２つの主な戦略、すなわち鎖配列決定およびエキソヌクレアーゼ配列決定がある。本発明の方法は、鎖配列決定またはエキソヌクレアーゼ配列決定のいずれかに関連する場合がある。
【０２８１】
鎖配列決定ではＤＮＡは、印加された電位に沿ってまたは反対のいずれかでナノポアを通って移行される。２本鎖ＤＮＡ上で進行的に（progressively）または前進的に（processively）作用するエキソヌクレアーゼは、印加された電位の下で残りの１本鎖を供給するためにポアのｃｉｓ側でまたは逆電位の下でｔｒａｎｓ側で使用できる。同様に２本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも同様の様式で使用できる。ポリメラーゼも使用できる。印加された電位とは反対の鎖移行を必要とする配列決定応用のための可能性もあるが、ＤＮＡは最初に逆電位下または無電位下で酵素によって「捕まえ」られなければならない。次いで結合に続いて電位が切り替えられ、鎖はｃｉｓからｔｒａｎｓへポアを通過し、電流によって伸長されたコンホメーションに保たれる。１本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは１本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、直近に移行された１本鎖を制御された段階的様式で、ｔｒａｎｓからｃｉｓへ、印加された電位とは反対にポアを通って戻して引く分子モーターとして作用できる。
【０２８２】
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法は、標的配列をポアおよびヘリカーゼ酵素に接触させるステップを含む。任意のヘリカーゼが方法において使用できる。ヘリカーゼは、ポアに関して２つの様式で作動できる。第一に方法は、好ましくはヘリカーゼを使用して印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通して標的配列を移動させるように実行される。この様式ではＤＮＡの５’末端がポアに最初に捕捉され、酵素は、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に通って移行するまで場に沿ってポアを通過するようにＤＮＡをポアに移動させる。代替的に方法は、ヘリカーゼ酵素が印加された電圧から生じる場とは反対にポアを通して標的配列を移動させるように好ましくは実行される。この様式では、ＤＮＡの３’末端が最初にポアに捕捉され、酵素は、標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ側に戻って放されるまで印加された場とは反対にポアの外側へ引かれるようにＤＮＡをポアを通して移動させる。
【０２８３】
エキソヌクレアーゼ配列決定ではエキソヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドの一方の端から個々のヌクレオチドを遊離させ、これらの個々のヌクレオチドは下に考察のとおり同定される。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法は、標的配列をポアおよびエキソヌクレアーゼ酵素に接触させるステップを含む。上に考察の任意のエキソヌクレアーゼ酵素が方法において使用できる。酵素は、上に考察のとおりポアに共有結合的に付着されていてよい。
【０２８４】
エキソヌクレアーゼは、典型的にはポリヌクレオチドの一方の端にラッチされ、配列を端から一度にヌクレオチド１個消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、５’から３’への方向でまたは３’から５’への方向でポリヌクレオチドを消化できる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの端は、典型的には当技術分野において公知の使用される酵素および／または使用する方法の選択を通じて決定される。ポリヌクレオチドのいずれかの末端のヒドロキシル基またはキャップ構造は、典型的には、ポリヌクレオチドの特定の末端へのエキソヌクレアーゼの結合を妨げるまたは促進するために使用できる。
【０２８５】
方法は、上に考察のとおりヌクレオチドの割合の特性決定または同定を可能にする速度でポリヌクレオチドの末端からヌクレオチドが消化されるようにポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼに接触させるステップを含む。これを行うための方法は当技術分野において周知である。例えばエドマン分解は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してそれらを同定できるように、ポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を連続的に消化するために使用する。相同法は、本発明において使用できる。
【０２８６】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、典型的には野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よりも遅い。本発明の方法におけるエキソヌクレアーゼ活性の好適な速度は、１秒あたりヌクレオチド０．５個から１０００個、１秒あたりヌクレオチド０．６個から５００個、１秒あたりヌクレオチド０．７個から２００個、１秒あたりヌクレオチド０．８個から１００個、１秒あたりヌクレオチド０．９個から５０個または１秒あたりヌクレオチド１個から２０個もしくは１０個の消化を含む。速度は、好ましくは１秒あたりヌクレオチド１個、１０個、１００個、５００個または１０００個である。エキソヌクレアーゼ活性の好適な速度は、種々の方法において達成できる。例えば、活性の最適速度が低減されている変種エキソヌクレアーゼは本発明により使用できる。
【０２８７】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物の１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物の２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。標的ポリヌクレオチドに関して、１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
【０２８８】
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数を用いて測定できる。
【０２８９】
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
【０２９０】
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０２９１】
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
【０２９２】
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシオトシン（methylcyotsine）は、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
【０２９３】
本発明は、標的ポリヌクレオチドの配列を推定する方法も提供する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法をさらに提供する。
【０２９４】
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に：電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と１０組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
【０２９５】
電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネルシステムを用いても作出され得る。
【０２９６】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）はポアに関して分析物が移動するときにポアを通過する電流を測定するステップを含み、電流が標的分析物の１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的分析物を特性決定する。より好ましい実施形態では、標的分析物は標的ポリヌクレオチドであり、方法は（ａ）標的ポリヌクレオチドを本発明のシステムの膜に存在する膜貫通ポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質に、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動をタンパク質が制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポアに関してポリヌクレオチドが移動するときにポアを通過する電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む。
【０２９７】
方法は、ポアが本発明のシステムの膜に挿入されている膜／ポアシステムを調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。
【０２９８】
方法は、標的ポリヌクレオチドなどの分析物がポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０２９９】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドなどの分析物がポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップを含んでよい。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０３００】
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的には用いられる。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
【０３０１】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０３０２】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
【０３０３】
方法は、典型的には、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行される。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼを機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０３０４】
センサーの形成方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。方法は、（ａ）本発明のシステムの膜中に存在するポアと（ｂ）ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質との間に複合体を形成するステップを含む。複合体は、ポアとタンパク質とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアをタンパク質に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップを好ましくは含む。上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。
【０３０５】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーも提供する。センサーは（ａ）本発明のシステムの膜中に存在するポアと（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質との間の複合体を含む。上に考察する任意の実施形態は、本発明のセンサーに等しく適用される。
【０３０６】
キット
本発明は、配列決定などの標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは（ａ）本発明のシステムの膜中に存在するポアおよび（ｂ）ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質を含む。上に考察された任意の実施形態は、本発明のキットに等しく適用可能である。
【０３０７】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチド配列を増幅および／もしくは発現するための手段、または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
【０３０８】
装置
本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを、配列決定など、特性決定するための装置も提供する。装置は、（ａ）本発明の１つまたは複数のシステムの複数の膜に存在する複数のポア、および（ｂ）ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼなどの複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含んでよい。装置は、アレイまたはチップなどの分析物の分析のための任意の従来装置であってよい。
【０３０９】
装置は、
複数のポアおよび膜を支持でき、ポアおよびタンパク質を用いてポリヌクレオチド特性決定または配列決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定または配列決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体システム；および
各試料を受けるための複数の容器を好ましくは含み、
流体システムは、容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。
【０３１０】
装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。
【０３１１】
本発明は、次の実施例においてさらに詳細に記載される。
[実施例]
【実施例１】
【０３１２】
本実施例は、マイクロ流体チップ上の相互接続コンパートメントを満たすために使用されるトリブロック共重合体液滴を生成するために使用される方法を記載する。
【０３１３】
材料および方法
Ｔ字接合チップ（T-junction chip）を流体界面としてナノポートアセンブリ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けることによって液滴生成のために調製する。
【０３１４】
Ｔ字接合での液滴生成機序は、文献[Garsteckiら、Lab Chip、2006、6、 437-446およびThorsenら 、Physical Reviw Letters、86、18、4163-4166]に十分に記載されている。含まれる試薬の液体粘性を考慮して選んだＴ字接合配置は両方の場合（油および緩衝液）について５０μｍチャネル幅であった。
【０３１５】
１．１−液滴試薬
油中に水性相液滴を作出するために、緩衝液を分散相として使用し、一方シリコン油（例えばＡＲ２０）を連続相として使用する。緩衝液およびトリブロック共重合体含有油の両方を下に記載のとおり調製する。
【０３１６】
緩衝液の溶液（緩衝液１）をＫＣｌ（純度９９．９９％、Ｓｉｇｍａ）２９８ｍｇを脱気ＤＩ水１０ｍＬに添加することによって調製した。この溶液に２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（９９．９％、Ｓｉｇｍａ）３０．３５ｍｇを添加した。溶液は、少量のＨＣｌおよびＮａＯＨを使用してｐＨ８に緩衝させた。Ｋ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］（９９．９％、Ｓｉｇｍａ）３１６．５ｍｇおよびＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（９９．９％、Ｓｉｇｍａ）８２．３ｍｇを溶液に添加し、溶解するまで撹拌した。
【０３１７】
油−トリブロック共重合体溶液をポリマー（６−３３−６、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ、ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ）２０ｍｇをＡＲ２０（９９％、Ｓｉｇｍａ）１ｍＬに添加することによって調製した。ポリマーを油中で２４時間、すべてのポリマーが溶解するまで撹拌したままにした。
【０３１８】
１．２−液滴生成設定
液滴生成設定のための模式図は図１で見ることができる。この設定は、シリンジポンプ（Ｅｌｉｔｅ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）２個、気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）２個、ピークチューブ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および特注Ｔ字接合マイクロ流体チップからなる。シリンジに油および緩衝液をロードし、シリンジポンプに組み込むと、チップ上のポートへの流体接続を確立するためにピークチューブを使用する。油シリンジは、連続相チャネルインプットに接続されなければならず、一方緩衝液は分散相チャネルインプットに接続されなければならない。
【０３１９】
両方のシリンジポンプを、標準偏差１０．８７μｍで１２９．４６μｍの平均液滴サイズ（直径）を生成する流速１０μＬ／分での注入にセットした。次いで液滴をバイアルに回収した。
【実施例２】
【０３２０】
本実施例は、異なる油中の多数の異なるトリ−ブロック共重合体を使用して、液滴−界面−二重層（ＤＩＢ）を生成するために使用する方法を記載する（図３に示す実験設定）。二重層を形成し、生物学的ナノポア（ＭｓｐＡの変異体など）の挿入を可能にする能力も調査した。
【０３２１】
材料および方法
実験２．１、２．３および２．４をトリ−ブロック共重合体と油との下の組合せで実行した。
１  −  ６−３３−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）、ＡＲ２０油（ポリフェニル−メチルシロキサン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中
２  −  ６−３３−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）、ＰＤＭＳ−ＯＨ  ６５ｃＳｔ油（ポリ（ジメチルシロキサン）、水酸基末端、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中
３  −  ６−４５ＰＥ−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＥ−ＰＭＯＸＡ、式中ＰＥ＝ポリエチレン炭化水素鎖、長さ炭素原子およそ４５個）ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサデカン（９９．９％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中
４  −  ６−３２−６（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）ＨｉｇｈＦｏｒｃｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）、ＡＲ２０油（ポリフェニル−メチルシロキサン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中
【０３２２】
２．１−液滴安定性実験
液滴安定性を種々の油中に緩衝液およびトリブロックＡＢＡポリマーの溶液を調製することによってオフラインで測定した。小さな０．５ｃｍ２トレイをポリカーボネートおよびガラスのスライドを使用して調製した（図２）。トレイを油で満たした。油に、１μＬ緩衝液液滴を添加し、２４時間モニターした。わずかな融合だけを示した液滴を電気的ＤＩＢ検査に進めた。
【０３２３】
２．２−実験設定
実験装置を図３に示すとおり設定した。７００Ｂアキソパッチ（axopatch）を２つのマイクロマニピュレーターを含む遮蔽箱の内部に接続した。下から液滴の操作を見られるようにファラデー箱全体を倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）上に置いた。これは、ファラデー箱を開けることなく液滴を移動できるようにした。
【０３２４】
ファラデー箱内で、７００Ｂアキソパッチの電極を純金（Ａｕ）ワイヤーを介して接続した。
【０３２５】
ワイヤーが小さな金のビーズを形成するように末端を加熱することによって、Ａｕを液滴設定における使用のために調製した。Ａｕワイヤーを濃ＨＮＯ３に３０秒間浸漬することによって清浄し、ＤＩ水で完全に洗浄した。ボール状末端のワイヤーを次いで緩衝液から調製した液体アガロース溶液（５％ｗｔ低融点アガロース、Ｌｏｎｚａ／緩衝液４００ｍＭ  ＫＣｌ、７５ｍＭ  Ｋ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］（９９．９％、Ｓｉｇｍａ）および２５ｍＭ  Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（９９．９％、Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）を通して繰り返し移動させた。末端に小ビーズが形成されたら、アガロースを冷却し、ワイヤーを平衡化するために過剰量の緩衝液溶液中で保存した。
【０３２６】
液滴チャンバーをファラデー箱内のステージに組み込み、両方の電極がチャンバーの中心セクション内に入るように組み込んだ。マニピュレーターをＸおよびＹ方向の移動の範囲全体がチャンバーのエリア全体にわたって両方の電極によって達成可能であるように位置付けた。次いでチャンバーをＡＲ２０トリ−ブロック共重合体溶液で縁まで満たし、数分間そのままにした。緩衝液１μＬを先端にアガロースを付けたそれぞれのＡｕワイヤーにピペットで直接移し、両電極をＡＲ２０／トリブロック共重合体溶液下に直接移動させた。液滴を移動の前に３０秒間溶液下においた。
【０３２７】
２．３−膜形成
液滴対で膜を形成するために、１８０ｍＶのバイアス電圧に加え±２０ｍＶの波形を電極に適用した。電流応答を容量性膜（経時的に電気容量における増大を示す試料トレースについて図５を参照されたい）の形成の指標としてモニターした。２つの緩衝液容積部間に接触が作られるように液滴を注意深く合わせた（図４（Ｂ）を参照されたい）。膜が形成されるまで液滴をこの状態にした（図５を参照されたい）。膜成長が非常に遅い状況では、液滴をＸＹ方向に移動させ、液滴間のＡＲ２０／トリブロック共重合体を排除し、膜成長を促進した。
【０３２８】
２．４−ナノポア挿入実験
膜を越えてｔｒａｎｓ−膜ポアを挿入するために、ＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（配列番号２５、次の変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）の０．０００５ｍｇ／ｍｌ溶液を陽極液になる緩衝液に添加した。ポアの挿入は、電流における瞬間的な増大によって観察された（図６を参照されたい）。これは、波形は不在だがバイアス電位の印加下で実施した。
【０３２９】
結果
調査したさまざまなトリ−ブロック共重合体と油との組合せを下の表４に示す。
【０３３０】
【表４】
0006375301.tif 000008
【０３３１】
容量性膜成長およびポア挿入を検査したすべてのトリ−ブロック共重合体／油について観察した。図５および６は、膜成長およびＭｓｐＡ−（Ｂ２Ｃ）（配列番号２５、次の変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む配列番号２の変種）ポア挿入をＡＲ２０シリコン油で使用した６−３３−６ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅトリ−ブロック共重合体について示している。図７は、膜成長およびポア挿入をヘキサデカンで使用した６−４５ＰＥ−６ＰｏｌｙｍｅｒＳｏｕｒｃｅについて、ＰＭＯＸＡセントラルコア構造を有さないトリブロック共重合体の例として示している。
【０３３２】
本出願についてのＴｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄの参照はＯＮＴ  ＩＰ  ０３９である。
【図１】
0006375301.tif 000012
【図２】
0006375301.tif 000013
【図３】
0006375301.tif 000014
【図４】
0006375301.tif 000015
【図５】
0006375301.tif 000016
【図６】
0006375301.tif 000017
【図７】
0006375301.tif 000018
【配列表】
0006375301000001.app