(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドの検出方法であって、
ＳＤＳを含むゲルによりタンパク質またはペプチドを分離すること；
該分離されたタンパク質またはペプチドを膜に転写すること；
該タンパク質またはペプチドと、生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液とを接触させることであって、該ポリマードットが半導体ポリマーを含む、こと；および
該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出することであって、該少なくとも１つのシグナルは該タンパク質またはペプチドに対応している、こと
を含む、方法。
【請求項２】
クロマトグラフィー法、濾過法、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法、液体抽出法、沈殿法、免疫沈降法またはこれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマードットが、非半導体ポリマーをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマードットが、フルオレンポリマー、フルオレンベースのポリマーもしくはコポリマー、フェニレンビニレンベースのポリマーもしくはコポリマー、フェニレンエチニレンベースのポリマーもしくはコポリマー、またはＢＯＤＩＰＹベースのポリマーもしくはコポリマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマードットが、前記ポリマードットに結合した官能基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記官能基が、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体分子が、タンパク質、核酸、ペプチド、または脂質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体分子が、一次抗体、二次抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質またはペプチドを検出するためのキットであって、該キットが複数のポリマードットと、ブロッキング剤と、ＳＤＳを含むバッファーまたはＳＤＳを含むゲルとを含み、各ポリマードットが半導体ポリマーと該ポリマードットに結合した官能基とを含む、キット。
【請求項１０】
前記各ポリマードットが非半導体ポリマーをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
各ポリマードットが、フルオレンポリマー、フルオレンベースのポリマーもしくはコポリマー、フェニレンビニレンベースのポリマーもしくはコポリマー、フェニレンエチニレンベースのポリマーもしくはコポリマー、またはＢＯＤＩＰＹベースのポリマーもしくはコポリマーを含む、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記官能基がバイオコンジュゲーションに適したものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記官能基が、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記各ポリマードットを生体分子にコンジュゲートさせるための試薬をさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
生体分子をさらに含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記各ポリマードットが前記生体分子とコンジュゲートしている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記生体分子が、タンパク質、核酸、ペプチド、または脂質である、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記生体分子が、一次抗体、二次抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ブロッキング剤が、前記複数のポリマードットと、表面上または膜上への吸着に関して競合する、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記ブロッキング剤が、前記複数のポリマードットと、１種類以上の生体分子の結合に関して競合する、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
膜をさらに含み、該膜がニトロセルロース膜またはフルオロポリマー膜である、請求項９〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
タンパク質またはペプチドをアッセイするためのシステムであって、
生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットであって、半導体ポリマーを含む、ポリマードット；
電磁放射線源；
検出器；
実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータであって、該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：
該検出器を動作させて画像を取得すること、
該画像を格納すること、および
該画像を解析すること
をさせる、コンピュータ；ならびに
タンパク質またはペプチド分離プラットフォームであって、ＳＤＳを含むゲル分離プラットフォーム、またはＳＤＳを含むキャピラリー電気泳動分離プラットフォームを含む、タンパク質またはペプチド分離プラットフォーム
を備えた、システム。
【請求項２３】
前記タンパク質またはペプチド分離プラットフォームが、尿素、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ＤＭＳＯ、グリオキサール、水酸化メチル水銀もしくはこれらの組合せを含む、請求項２２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年３月５日に出願された米国仮出願第６１／７７３，０４４号の利益を請求し、この出願は、あらゆる目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により支援された研究に関する声明
米国国立衛生研究所による契約番号ＧＭ０８５４８５および米国国立科学財団による契約番号ＣＨＥ−０９２４３２０の下で米国政府の援助により本発明はがなされた。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウェスタンブロッティングは、タンパク質の解析のための広く使用されている検査手法である。この手法では、タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、次いで疎水性の膜上に転写し；その後、タンパク質を種々の標識手順を用いて可視化する。
【０００４】
化学発光の従来のイメージング方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いたタンパク質の標識が主体である。最近、蛍光検出が、その高感度性および多重の可能性のため普及してきている。しかしながら、ウェスタンブロッティングでの使用のための蛍光色素は急速に光退色するという欠点を有する傾向があり、これは、反復的ブロットイメージングの感度を低下させる。量子ドット（Ｑｄｏｔ）は、ウェスタンブロット解析における適用に使用され得る蛍光可視化の択一的な供給源である。しかしながら、量子ドットを用いた手法には、ほとんどの生化学研究室では容易に入手可能でない、いくぶん複雑なセットアップおよび解析が必要とされ得る。
【０００５】
したがって、ウェスタンブロット解析の一部としてタンパク質およびペプチドを可視化するための改善された手法の必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
一部の態様では、本発明により、ポリマードット（または「Ｐドット（Ｐｄｏｔ）」）を用いた解析のための方法およびシステムを提供する。一部の特定の態様では、本発明により、タンパク質を検出するための、例えば限定されないが、ウェスタンブロット解析のためのポリマードットの組成物を提供する。また、本発明により、ポリマードットおよび、一部の実施形態ではポリマードットを用いたウェスタンブロット解析に適したブロッキング剤を含むものであり得るキットを提供する。ブロッキング剤は、例えば、ウェスタンブロット解析へのポリマードットの適用において非特異的吸着／相互作用を改変するために使用され得る。また、本開示により、Ｐドットを用いてタンパク質またはペプチドの試料を解析するためのシステムを提供する。
【０００７】
種々の態様において、本開示により、ゲルを用いてタンパク質を分離すること；分離された該タンパク質を膜に転写すること；分離された該タンパク質を有する該膜を、分離された該タンパク質の少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出すること（該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質に対応している）を含む、ウェスタンブロット解析を行なうための方法を提供する。
【０００８】
種々の態様において、本開示により、混合物からタンパク質またはペプチドを分離すること；分離された該タンパク質またはペプチドを、分離された該タンパク質またはペプチドの少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出すること（該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質またはペプチドに対応している）を含む、タンパク質またはペプチドを検出するための方法を提供する。
【０００９】
種々の態様において、本開示により、ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットを含む組成物および該組成物を含むキットを提供する。
【００１０】
種々の態様において、本開示により、ポリマードット、コンジュゲーション生体分子およびブロッキング剤を含む、ウェスタンブロット解析を行なうためのキットを提供する。
【００１１】
種々の態様において、本開示により、生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；タンパク質またはペプチド分離プラットフォーム；電磁放射線源；検出器；および実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータ（該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析することをさせる）を備えた、タンパク質またはペプチドをアッセイするためのシステムを提供する。
【００１２】
種々の態様において、本開示により、生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；ゲル；電気泳動プラットフォーム；電磁放射線源；検出器；および実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータ（該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析することをさせる）を備えた、ウェスタンブロット解析を行なうためのシステムを提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ゲルを用いてタンパク質を分離すること；
分離された該タンパク質を膜に転写すること；
分離された該タンパク質を有する該膜を、分離された該タンパク質の少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および
該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出することであって、該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質に対応している、こと
を含む、ウェスタンブロット解析の実施方法。
（項目２）
混合物からタンパク質またはペプチドを分離すること；
分離された該タンパク質またはペプチドを、分離された該タンパク質またはペプチドの少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および
該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出することであって、該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質またはペプチドに対応している、こと
を含む、タンパク質またはペプチドの検出方法。
（項目３）
さらに前記タンパク質またはペプチドを定量することを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記タンパク質またはペプチドの分離が、クロマトグラフィー法、濾過法、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法、液体抽出法、沈殿法、免疫沈降法またはこれらの組合せを含む、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記ポリマードットが、半導体ポリマー、非半導体ポリマーまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記ポリマードットがＢＯＤＩＰＹ誘導体を含むものである、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記ＢＯＤＩＰＹ誘導体が、式（Ｉ）：
【化１２】
0006418698.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールおよびアルコキシ−アリールから選択される）の構造を有し、ここで、前記ＢＯＤＩＰＹ誘導体は発色団ポリマーに、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂまたはこれらの組合せとの結合によって一体化される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ポリマードットが、ポリ（（メタ）アクリル酸）ベースのポリマー、ポリジエンベースのポリマー、ポリ（エチレンオキシド）ベースのポリマー、ポリイソブチレンベースのポリマー、ポリスチレンベースのポリマー、ポリシロキサンベースのポリマー、ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのポリマー、ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのポリマー、ポリ（ビニルピリジン）ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−メチルビニルピリジニウムヨージド）ベースのポリマーまたはポリ（ビニルピロリドン）ベースのポリマーから選択されるポリマーを含むものである、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ポリマードットが、ポリ（アクリル酸−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸−ｂ−メタクリル酸ネオペンチル）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸ネオペンチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ｔ−ブチル−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−メチルアクリル酸、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−エチレンオキシド、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）およびポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ブチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｃ−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ニトロベンジル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸テトラヒドロフルフリル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−メチルオキサゾリン）、ポリ（イソブチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（イソブチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソブチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸セシウム）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ブロック接合部で切断可能なポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）酸、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレンスルホン酸−ｂ−���チルブチレン）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−メチルブチレン−コ−イソプレンスルホン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（フェロセニルジメチルシラン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン−ｂ−Ｄ／Ｌ−ラクチド）、ＰＤＨＦ、ＰＦＯ、ＰＦＰＶ、ＰＦＢＴ、ＰＦＴＢＴ、ＭＥＨ−ＰＰＶ、ＣＮ−ＰＰＶ、ＰＰＥまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリマードットが高分子電解質コーティングに囲まれている、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記高分子電解質コーティングが、ポリ（スチレンスルホネート）、ポリホスフェート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート−コ−マレエート、ポリアクリルアミド、キトサン、多糖、ポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリペプチドからなる群より選択される高分子電解質を含むものである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記高分子電解質コーティングが高分子電解質ポリマーを含むものであり、該高分子電解質ポリマーの各反復単位が、カルボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノ、ヒドロキシルおよびメルカプトからなる群より選択される荷電基を含むものである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリマードットが、前記ポリマードットに結合した官能基を含むものである、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記官能基が、疎水性官能基、親水性官能基またはこれらの組合せから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記官能基がバイオコンジュゲーションに適したものである、項目１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記官能基が、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せから選択される、項目１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記生体分子がタンパク質である、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記生体分子が抗体またはアビジンである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ゲルがポリアクリルアミド、アガロース、デンプンまたはこれらの組合せを含む、項目１および３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記分離がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記膜がニトロセルロース膜またはフルオロポリマー膜を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記フルオロポリマーがＰＶＤＦである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記検出が、ピコグラム量の分離された前記タンパク質の検出を含む、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記検出が、２ピコグラム未満の分離された前記タンパク質の検出を含む、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
さらに、電磁放射線源を用いて前記ポリマードットを励起させることを含む、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記電磁放射線源がレーザー、ランプ、ＬＥＤまたはこれらの組合せを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリマードットを励起させる前に、前記電磁放射線をスペクトルフィルター、マルチクロイックミラーまたはこれらの組合せに通す、項目２５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
試料を励起させる電磁放射線のピーク波長が約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍである、項目２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
電磁放射線の２つ以上のピーク波長で前記試料を励起させる、項目２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットを含む組成物。
（項目３１）
項目３０に記載の組成物を含むキット。
（項目３２）
ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットおよび少なくとも１種類のブロッキング剤を含むキット。
（項目３３）
ポリマードット、コンジュゲーション生体分子およびブロッキング剤を含む、ウェスタンブロット解析を行なうためのキット。
（項目３４）
前記ポリマードットが半導体ポリマー、非半導体ポリマーまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである、項目３１〜３３のいずれか１項に記載のキット。
（項目３５）
前記ポリマードットがＢＯＤＩＰＹ誘導体を含むものである、項目３１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３６）
前記ＢＯＤＩＰＹ誘導体が、式（Ｉ）：
【化１３】
0006418698.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールおよびアルコキシ−アリールから選択される）
の構造を有し、ここで、前記ＢＯＤＩＰＹ誘導体は発色団ポリマーに、
Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂまたはこれらの組合せとの結合によって一体化される、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
前記ポリマードットがＣＮ−ＰＰＶからなるポリマーを含むものである、項目３１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３８）
前記ポリマードットが、ポリ（（メタ）アクリル酸）ベースのポリマー、ポリジエンベースのポリマー、ポリ（エチレンオキシド）ベースのポリマー、ポリイソブチレンベースのポリマー、ポリスチレンベースのポリマー、ポリシロキサンベースのポリマー、ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのポリマー、ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのポリマー、ポリ（ビニルピリジン）ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−メチルビニルピリジニウムヨージド）ベースのポリマーまたはポリ（ビニルピロリドン）ベースのポリマーから選択されるポリマーを含むものである、項目３１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３９）
前記ポリマードットが、ポリ（アクリル酸−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸−ｂ−メタクリル酸ネオペンチル）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸ネオペンチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ｔ−ブチル−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−メチルアクリル酸、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−エチレンオキシド、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）およびポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ブチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｃ−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ニトロベンジル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸テトラヒドロフルフリル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−メチルオキサゾリン）、ポリ（イソブチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（イソブチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソブチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸セシウム）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ブロック接合部で切断可能なポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）酸、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレンスルホン酸−ｂ−���チルブチレン）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−メチルブチレン−コ−イソプレンスルホン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（フェロセニルジメチルシラン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン−ｂ−Ｄ／Ｌ−ラクチド）、ＰＤＨＦ、ＰＦＯ、ＰＦＰＶ、ＰＦＢＴ、ＰＦＴＢＴ、ＭＥＨ−ＰＰＶ、ＣＮ−ＰＰＶ、ＰＰＥまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである、項目３１〜３８のいずれか１項に記載のキット。
（項目４０）
前記ポリマードットが高分子電解質コーティングに囲まれている、項目３１〜３９のいずれか１項に記載のキット。
（項目４１）
前記高分子電解質コーティングが、ポリ（スチレンスルホネート）、ポリホスフェート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート−コ−マレエート、ポリアクリルアミド、キトサン、多糖、ポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリペプチドからなる群より選択される高分子電解質を含むものである、項目４０に記載のキット。
（項目４２）
前記高分子電解質コーティングが高分子電解質ポリマーを含むものであり、該高分子電解質ポリマーの各反復単位が、カルボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノ、ヒドロキシルおよびメルカプトからなる群より選択される荷電基を含むものである、項目４０に記載のキット。
（項目４３）
前記ポリマードットが、前記ポリマードットに結合した官能基を含むものである、項目３１〜４２のいずれか１項に記載のキット。
（項目４４）
前記官能基が、疎水性官能基、親水性官能基またはこれらの組合せから選択される、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
前記官能基がバイオコンジュゲーションに適したものである、項目４３〜４４のいずれか１項に記載のキット。
（項目４６）
前記官能基が、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せから選択される、項目４３〜４５のいずれか１項に記載のキット。
（項目４７）
前記コンジュゲーション生体分子を前記ポリマードットにコンジュゲートさせる、項目３３〜４６のいずれか１項に記載のキット。
（項目４８）
前記生体分子がタンパク質である、項目３１〜４７のいずれか１項に記載のキット。
（項目４９）
前記生体分子が抗体またはアビジンである、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
前記ブロッキング剤が前記コンジュゲート化したポリマードットの非特異的吸着特性を改変するものである、または前記ブロッキング剤が前記ポリマードットの非特異的吸着特性を改変するものである、項目３１〜４９のいずれか１項に記載のキット。
（項目５１）
前記ブロッキング剤が前記ポリマードットと、表面上または膜上への吸着に関して競合する、項目３１〜５０のいずれか１項に記載のキット。
（項目５２）
前記ブロッキング剤が前記ポリマードットと、１種類以上の生体分子の結合に関して競合する、項目３１〜５１のいずれか１項に記載のキット。
（項目５３）
さらに、前記ポリマードットを前記生体分子にコンジュゲートさせるための試薬を含む、項目３３〜５２のいずれか１項に記載のキット。
（項目５４）
さらに、ニトロセルロース膜またはフルオロポリマー膜から選択される膜を含む、項目３１〜５３のいずれか１項に記載のキット。
（項目５５）
前記フルオロポリマーがＰＶＤＦである、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
さらにＰＥＧ、ＥＤＬまたはこれらの組合せを含む、項目３１〜５５のいずれか１項に記載のキット。
（項目５７）
生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；
タンパク質またはペプチド分離プラットフォーム；
電磁放射線源；
検出器；および
実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータであって、該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：
該検出器を動作させて画像を取得すること、
該画像を格納すること、および
該画像を解析すること
をさせる、コンピュータ
を備えた、タンパク質またはペプチドをアッセイするためのシステム。
（項目５８）
前記タンパク質またはペプチド分離プラットフォームがゲル分離プラットフォームまたはキャピラリー電気泳動分離プラットフォームを含む、項目５７に記載のシステム。
（項目５９）
生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；
ゲル；
電気泳動プラットフォーム；
電磁放射線源；
検出器；および
実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータであって、該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：
該検出器を動作させて画像を取得すること、
該画像を格納すること、および
該画像を解析すること
をさせる、コンピュータ
を備えた、ウェスタンブロット解析を行なうためのシステム。
（項目６０）
前記ゲルがポリアクリルアミドゲルを含む、項目５９に記載のシステム。
（項目６１）
前記膜がニトロセルロースまたはフルオロポリマーを含むものである、項目５７〜５８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６２）
前記フルオロポリマーがＰＶＤＦである、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記電磁放射線源がレーザー、ランプ、ＬＥＤまたはこれらの組合せを含む、項目５７〜６２のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６４）
さらに、スペクトルフィルター、マルチクロイックミラーまたはこれらの組合せを備えた、項目５７〜６３のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６５）
前記検出器がゲルイメージング装置を備えている、項目５７〜６４のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６６）
前記検出器が顕微鏡を備えている、項目６５〜６５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目６７）
前記検出器がカメラを備えている、項目５７〜６６のいずれか１項に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の新規な特長は添付の特許請求の範囲に具体的に示している。本発明の原理を用いた例示的実施形態を示す以下の詳細説明、および添付の図面を参照することにより本発明の特長および利点のより良好な理解が得られよう。図面において：
【００１４】
【図１】図１Ａは、ＣＮ−ＰＰＶポリマーの構造ならびに０．１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中のＣＮ−ＰＰＶ  ＰドットおよびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲート（ＣＮＰＰＶ−Ｓｔｒｅｐ）の吸収（点線）および発光（実線）スペクトルを示す。
【００１５】
図１Ｂは、Ｑｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを示す。
【００１６】
図１Ｃは、ＣＮ−ＰＰＶ  ＰドットおよびＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンＰドットのＴＥＭ画像の一例を示す；スケールバーは５０ｎｍの長さを表す。
【００１７】
図１Ｄは、ＣＮ−ＰＰＶおよびＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンＰドットの両方の動的光散乱の測定値の一例を示す。
【００１８】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、Ｑｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジン（図２Ａ）およびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲート（図２Ｂ）とともにインキュベートした抗マウスＩｇＧ−ビオチンのドットブロットの画像を示す。図２Ｃおよび２Ｄは、それぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示したドットブロットの対応する正規化積分強度を示す。
【００１９】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、対応する一次抗体なしの（図３Ａ）トランスフェリンおよび（図３Ｂ）トリプシンインヒビターのドットブロットの画像を示す。ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は１ｎＭとした。これらのドットブロットでは蛍光は検出されず、したがって、これらのＰドットとタンパク質間の明白な非特異的結合はなかったことを示す。
【００２０】
図３Ｃ〜３Ｆは、トランスフェリン（図３Ｃと３Ｅ）およびトリプシンインヒビター（図３Ｄと３Ｆ）のドットブロット画像および対応するバックグラウンド減算した正規化積分強度を示す。ドットブロットは、対応するビオチン化抗体およびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートとともにインキュベートした。
【００２１】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、対応するビオチン化抗体およびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートとともにインキュベートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（図４Ａ）およびトランスフェリン（図４Ｂ）のドットブロットの、インキュベーション後１４日目のバックグラウンド減算した正規化積分強度を示す（試料は６℃のＴＴＢＳバッファー中に保存した）。
【００２２】
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜への転写、ブロッキング、ならびに対応するビオチン化抗体およびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートとのインキュベーションの全ウェスタンブロッティング手順後のトランスフェリン（図５Ａと５Ｃ）およびトリプシンインヒビター（図５Ｂと５Ｄ）の画像および対応するバックグラウンド減算した正規化積分強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細説明
本発明により、ポリマードットを用いた解析のための方法、組成物、キットおよびシステムを提供する。種々の態様において、本開示により、タンパク質のウェスタンブロット解析を行なうための方法、組成物およびキットを提供する。
【００２４】
本開示の一部の態様では、生体分子にコンジュゲートさせた発色団ポリマードットを用いて標的分子を検出および解析するための方法、システム、組成物およびキットを提供する。ポリマードットの使用により、既存の手法と比べて改善された検出感度および安定性がもたらされる。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、表示した数の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族原子団をいう。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルとしては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。他のアルキル基としては、限定されないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。アルキルは、任意の数、例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を含むものであり得る。アルキル基は典型的には一価であるが、二価であってもよい（例えば、アルキル基が２つの部分に一体に結合している場合）。本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアルキル」は、炭素原子の直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族原子団であって、該炭素原子のうち少なくとも１個がヘテロ原子、例えば、Ｎ、ＯまたはＳで置き換えられたものをいう。また、さらなるヘテロ原子、例えば限定されないが、Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰも有用であり得る。
【００２６】
上記および以下、本明細書において有機原子団または化合物に関して言及される用語「低級」は、それぞれ分枝であっても非分枝であってもよい化合物または原子団が７個（を含む）まで、好ましくは４個（を含む）まで、（非分枝として）１個または２個の炭素原子を有するものであり得ることと定義する。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「アルキレン」は、少なくとも２つの他の基が連結される、すなわち二価の炭化水素原子団である上記に定義したアルキル基をいう。アルキレンに連結される２つの部分は、アルキレンの同じ原子に連結されても異なる原子に連結されてもよい。例えば、直鎖アルキレンは−（ＣＨ２）ｎの二価の原子団であり得、式中、ｎは１、２、３、４、５または６である。アルキレン基としては、限定されないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレンおよびヘキシレンが挙げられる。
【００２８】
本明細書に記載している基は置換されていても非置換であってもよい。アルキルおよびヘテロアルキル原子団（例えば、多くの場合、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基）に対する置換基はさまざまな基、例えば、アルキル、アリール、シアノ（ＣＮ）、アミノ、スルフィド、アルデヒド、エステル、エーテル、酸、ヒドロキシルまたはハライドであり得る。置換基は反応性基、例えば限定されないが、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、またはアミノであってもよい。好適な置換基は：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮおよび−ＮＯ２（ゼロ〜（２ｍ’＋１）の範囲の数，ここで、ｍ’はかかる原子団の炭素原子の総数である）から選択され得る。Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は各々、独立して、水素、非置換の（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリール−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を示す。Ｒ’とＲ”が同じ窒素原子に結合されている場合、これらは該窒素原子と一体となって５−、６−、または７−員環を形成していてもよい。例えば、−ＮＲ’Ｒ”には１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが包含されることが意図されている。置換基の上記の論考から、当業者には、用語「アルキル」に、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）ならびにアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの基が包含されることが意図されていること理解されよう。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「アルコキシ」は、アルコキシ基を結合点と連結させるか、またはアルコキシ基の２個の炭素に連結されているかのいずれかである酸素原子を有するアルキル基をいう。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ−プロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、本明細書に記載したさまざまな置換基でさらに置換されていてもよい。例えば、アルコキシ基はハロゲンで置換されて「ハロ−アルコキシ」基を形成したものであってもよい。
【００３０】
本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を有する２〜６個の炭素原子の直鎖または分枝のいずれかの炭化水素をいう。アルケニル基の例としては、限定されないが、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、または１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられる。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「アルケニレン」は、少なくとも２つの他の基が連結される、すなわち二価の炭化水素原子団である上記に定義したアルケニル基をいう。アルケニレンに連結される２つの部分は、アルケニレンの同じ原子に連結されても異なる原子に連結されてもよい。アルケニレン基としては、限定されないが、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ−ブテニレン、ペンテニレンおよびヘキセニレンが挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を有する２〜６個の炭素原子の直鎖または分枝のいずれかの炭化水素をいう。アルキニル基の例としては、限定されないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、または１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、用語「アルキニレン」は、上記に定義した、少なくとも２つの他の基が連結される、すなわち二価の炭化水素原子団であるアルキニル基をいう。アルキニレンに連結される２つの部分は、アルキニレンの同じ原子に連結されても異なる原子に連結されてもよい。アルキニレン基としては、限定されないが、エチニレン、プロピニレン、イソプロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ−ブチニレン、ペンチニレンおよびヘキシニレンが挙げられる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、用語「アルキルアミン」は、１つ以上のアミノ基を有する本明細書に定義したアルキル基をいう。アミノ基は第１級であっても第２級であっても第３級であってもよい。アルキルアミンはヒドロキシ基でさらに置換されていてもよい。アルキルアミンとしては、限定されないが、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミンおよびエタノールアミンが挙げられ得る。アミノ基は、アルキルアミンを化合物の残部との結合点と連結させるもの、アルキル基のω位に存在するもの、またはアルキル基の少なくとも２個の炭素原子に一体に連結されるものであり得る。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語「ハロゲン」または「ハライド」はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。本明細書で用いる場合、用語「ハロアルキル」は、一部またはすべての水素原子がハロゲン原子で置換されている上記に定義したアルキルをいう。ハロゲン（ハロ）は、好ましくはクロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。本明細書で用いる場合、用語「ハロ−アルコキシ」は、少なくとも１つのハロゲンを有するアルコキシ基をいう。ハロ−アルコキシは、一部またはすべての水素原子がハロゲン原子で置換されているアルコキシと定義する。アルコキシ基は１つ、２つ、３つまたはそれ以上のハロゲンで置換されていてもよい。すべての水素がハロゲン、例えばフッ素で置き換えられている場合、該化合物は全置換型（ｐｅｒ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）、例えばパーフルオロ型である。ハロ−アルコキシとしては、限定されないが、トリフルオロメトキシ、２，２，２，−トリフルオロエトキシ、パーフルオロエトキシなどが挙げられる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の環内原子または表示した数の原子を含む飽和または部分不飽和の単環式、縮合二環式または橋かけ多環式の環集合体をいう。単環式の環としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが挙げられる。二環式および多環式の環としては、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ３〜８シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンが包含される。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「シクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基が連結される、すなわち二価の炭化水素原子団である上記に定義したシクロアルキル基、をいう。シクロアルキレンに連結される２つの部分は、シクロアルキレンの同じ原子に連結されても異なる原子に連結されてもよい。シクロアルキレン基としては、限定されないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロオクチレンが挙げられる。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロシクロアルキル」は、３個の環構成員〜約２０個の環構成員ならびに１〜約５個のヘテロ原子（Ｎ、ＯおよびＳ）を有する環系をいう。また、さらなるヘテロ原子、例えば限定されないが、Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰも有用であり得る。また、ヘテロ原子は酸化型、例えば限定されないが、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−であってもよい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基が連結される上記に定義したヘテロシクロアルキル基をいう。ヘテロシクロアルキレンに連結される２つの部分は、ヘテロシクロアルキレンの同じ原子に連結されても異なる原子に連結されてもよい。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「アリール」は、６〜１６個の環内炭素原子を含む単環式または縮合二環式、三環式のまたはそれ以上の環式の芳香族環集合体をいう。例えば、アリールはフェニル、ベンジル、アズレニルまたはナフチルであり得る。「アリーレン」はアリール基から誘導される二価の原子団を意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシおよびオキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレン（これらはすべて、例えば、本明細書において先に定義したとおりに任意選択でさらに置換されている）または１−もしくは２−ナフチル；または１−もしくは２−フェナントレニルから選択される１つ、２つまたは３つの原子団による一置換型、二置換型または三置換型であり得る。アルキレンジオキシは、フェニルの隣接している２個の炭素原子に結合される二価の置換体、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。また、オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンも、フェニルの隣接している２個の炭素原子に結合される二価の置換基、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレン−フェニルの一例は２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルである。
【００４１】
アリール基としては、限定されないが、ナフチル、フェニル、またはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキルもしくはトリフルオロメチルによる一置換型または二置換型のフェニル、フェニルまたはアルコキシ、ハロゲンもしくはトリフルオロメチルによる一置換型または二置換型のフェニル、特にフェニルが挙げられ得る。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「アリーレン」は、少なくとも２つの他の基が連結される上記に定義したアリール基をいう。アリーレンに連結される２つの部分はアリーレンの異なる原子に連結される。アリーレン基としては、限定されないがフェニレンが挙げられる。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「アルコキシ−アリール」または「アリールオキシ」は、アリールに連結されている部分のうちの１つが酸素原子を介して連結される上記に定義したアリール基をいう。アルコキシ−アリール基としては、限定されないがフェノキシ（Ｃ６Ｈ５Ｏ−）が挙げられる。また、本発明には、アルコキシ−ヘテロアリールまたはヘテロアリールオキシ基も包含される。
【００４４】
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、５〜１６個の環内原子を含み、環内原子のうち１〜４個がヘテロ原子（各々、Ｎ、ＯまたはＳ）である単環式または縮合二環式または三環式の芳香族環集合体をいう。例えば、ヘテロアリールとしては、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニルまたは任意の他の原子団（置換型、特に、例えばアルキル、ニトロまたはハロゲンによる一置換型または二置換型）が挙げられる。また、本発明に好適な基としては、アリーレンおよびアリーレン−オキシ基について上記のものと同様のヘテロアリーレンおよびヘテロアリーレン−オキシ基も挙げられ得る。
【００４５】
同様に、本明細書に記載のアリールおよびヘテロアリール基は置換されていても非置換であってもよい。アリールおよびヘテロアリール基に対する置換基はさまざまであり、例えば、アルキル、アリール、ＣＮ、アミノ、スルフィド、アルデヒド、エステル、エーテル、酸、ヒドロキシルまたはハライドである。置換基は反応性基、例えば限定されないが、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、またはアミノであってもよい。置換基は：−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２（ゼロ〜芳香族環系の空き結合価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅｓ）の総数の範囲の数；ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換のアリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される）から選択され得る。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「アルキル−アリール」は、アルキル成分とアリール成分を有し、該アルキル成分が該アリール成分を結合点と連結させる原子団をいう。アルキル成分は、アリール成分を結合点と連結させるために少なくとも二価であること以外は上記に定義したとおりである。一部の場合では、アルキル成分が存在しない場合があり得る。アリール成分は上記に定義したとおりである。アルキル−アリール基の例としては、限定されないがベンジルが挙げられる。また、本発明にはアルキル−ヘテロアリール基も包含される。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「アルケニル−アリール」は、アルケニル成分とアリール成分の両方を有し、該アルケニル成分が該アリール成分を結合点と連結させる原子団をいう。アルケニル成分は、アリール成分を結合点と連結させるために少なくとも二価であること以外は上記に定義したとおりである。アリール成分は上記に定義したとおりである。アルケニル−アリールの例としては、とりわけエテニル−フェニルが挙げられる。また、本発明にはアルケニル−ヘテロアリール基も包含される。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「アルキニル−アリール」は、アルキニル成分とアリール成分の両方を有し、該アルキニル成分が該アリール成分を結合点と連結させる原子団をいう。アルキニル成分は、アリール成分を結合点と連結させるために少なくとも二価であること以外は上記に定義したとおりである。アリール成分は上記に定義したとおりである。アルキニル−アリールの例としては、とりわけエチニル−フェニルが挙げられる。また、本発明には、アルキニル−ヘテロアリール基も包含される。
【００４９】
発色団ポリマードット
本開示により、タンパク質およびペプチドを解析するための発色団ポリマードット（Ｐドット）を含む方法、システム、組成物およびキットを提供する。Ｐドットは卓越した光学特性を有し、そのためタンパク質および他の生物学的分子の検出に特に有用である。
【００５０】
ポリマードット（Ｐドット）は、検出剤としての使用に対していくつかの利点を有する。Ｐドットは、さまざまな立体形状、例えば限定されないが、一様で均質な組成を有するモノリシックポリマードットまたは相違するコアとキャップ構造を有するポリマードットが採用され得る蛍光性ポリマーベースの粒子である。Ｐドットは、単一のポリマーで構成されたものであってもよく、ポリマーブレンドを含むものであってもよい。
【００５１】
本明細書で用いる場合、用語「ポリマードット」、「発色団ポリマードット」、「蛍光性ポリマードット」、「発色団ナノ粒子」および「Ｐドット」は、安定なサブミクロンサイズの粒子に崩壊させた１種類以上のポリマー（例えば、半導体ポリマー）を含む構造を示すために互換的に用いている。用語「発色団ポリマー」は、ポリマーの少なくとも一部分が、ＵＶから近赤外スペクトルの範囲の特定波長の光を吸収する発色団単位を含むものであるポリマーをいう。本開示による発色団ポリマーは発光性であってもそうでなくてもよい。
【００５２】
本開示によるポリマードットは、タンパク質またはペプチド、特にタンパク質の検出を可能にする任意の適当なポリマーサブユニット（１つまたは複数）を含むものであってもよい。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「ポリマー」は、少なくとも２つの反復構造単位が典型的には共有結合性化学結合によって接続されて構成された分子をいう。反復構造単位は１つの型のモノマーであってもよく、得られるポリマーはホモポリマーである。一部の態様では、ポリマーは、異なる２つの型のモノマー、または異なる３つの型のモノマー、またはそれより多くの型のモノマーを含むものであり得る。当業者には、異なる型のモノマーはポリマー鎖に沿ってさまざまな様式で分布させ得ることが認識されよう。例えば、異なる３つの型のモノマーはポリマーに沿ってランダムに分布させ得る。同様にして、ポリマーに沿ったモノマーの分布は種々の様式で提示され得ることが認識されよう。
【００５４】
本開示により、半導体、非半導体またはこれらの組合せであるＰドットを提供する。例えば、ウェスタンブロット解析過程などにおけるタンパク質およびペプチドの検出に適している限り、任意のポリマー組成が本開示に従って使用され得る。
【００５５】
本開示により、望ましい表面の化学的性質および光学特性を有し、そのため本発明の方法によるタンパク質の検出に特によく適したＰドットを提供する。Ｐドット集団の光学特性および官能化の度合いはＰドットの作製時に調整され得る。特に、Ｐドットの属性は、さまざまな光物理学的特性（例えば、吸光度、発光の明るさおよび／または発光色）を微調整するために必要に応じて調整され得る。一部の特定の態様では、ポリマードットにより、予期しない明るさおよび／または光安定性がもたらされる。注目すべきことには、一部の場合において、蛍光の消光は粒子形成のため増大しない。さらに、ポリマードットの表面の少数で離散した官能基により、生物学的に関連性のある分子および／または細胞へのＰドットの非特異的吸収が低減され得る。高い明度および特異的結合能を有するポリマードットにより、化学的系および生物学的系の試験のためのイメージング手法および検出手法の分野を拡大する重要な側面がもたらされることは認識されよう。
【００５６】
本明細書において使用される発色団ポリマードットは、ポリマーを崩壊させるための当該技術分野で知られた任意の方法、例えば限定されないが、析出に依存する方法、エマルジョン（例えば、ミニエマルジョンまたはマイクロエマルジョン）の形成に依存する方法、および濃縮に依存する方法によって形成され得る。
【００５７】
一部の態様では、Ｐドットは析出によって形成され得る。この手法は、発色団ポリマーの希薄溶液（例えば、有機溶媒に溶解させた発色団ポリマー）の過剰容量の非溶媒（だが該有機溶媒と混和性）、例えば、水または別の生理学的に関連性のある水溶液への急速添加（例えば、超音波処理または激しい撹拌によって助長する）を伴うものである。例えば、本明細書に記載の手順の一部のものでは、発色団ポリマーをまず、溶解性が良好である有機溶媒（良溶媒）、例えばＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解させ得、その後、ＴＨＦに溶解したポリマーを過剰容量の水またはバッファー溶液（これは、疎水性の発色団ポリマーにとっては貧溶媒であるが良溶媒（ＴＨＦ）とは混和性である）に添加する。得られた混合物を超音波処理するか、または激しく撹拌して発色団ポリマードットの形成を補助し、次いで有機溶媒を除去すると、充分に分散された発色団ナノ粒子が得られる。この手順の使用において、発色団ポリマーは有機溶媒（例えば、ＴＨＦ）に溶解されるのに充分に疎水性であるのがよい。生体分子または高密度の親水性側鎖とのカップリングのために側鎖に高密度の親水性官能基を導入することにより、得られるポリマーは、高分子電解質の挙動と同様または同一の様式で有機溶媒（例えば、ＴＨＦ）中に不溶性または難溶性となる。一部の態様では、他の方法、例えば限定されないが、エマルジョン（例えば、ミニエマルジョンもしくはマイクロエマルジョン）または析出または濃縮に基づいた種々の方法によって形成されるＰドットの使用のための方法、システム、組成物およびキットを提供する。また、発色団ポリマードットの崩壊および安定性に影響を及ぼさない疎水性官能基を有する他のポリマーを使用してもよい。次いで、ナノ粒子の表面上の疎水性官能基は、バイオコンジュゲーションのために親水性官能基に変換され得る（例えば、後官能化により）か、または直接、疎水性官能基が生体分子に連結される。この後者のアプローチは、疎水性であり、かつクリック可能な（すなわち、クリックケミストリーの枠に含まれる化学反応）官能基、例えば限定されないが、アルキン、歪みアルキン（ｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｌｋｙｎｅ）、アジド、ジエン、アルケン、シクロオクチン、およびホスフィン基を用いて特に良好に奏功し得る。
【００５８】
一部の態様では、官能化Ｐドットの使用のための方法、システム、組成物およびキットを提供し、官能化Ｐドットは、一価であっても二価であっても多価であってもよい単分子ポリマードットが形成されるように修飾されたものである。修飾は、該ドットからいくつかポリマー分子を除去するが分子を１個だけ残すことであり、該分子は、１つだけ官能基を有するものであってもよく、２つ以上の官能基を有するものであってもよい。一実施形態では、修飾を容易にするために加工表面が使用され得る。加工表面は、特定の官能基、例えば、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネート、その置換型誘導体、およびこれらの組合せを有するものであり得る。一般に、バイオコンジュゲーションに適した任意の他の官能基が使用され得る。かかる官能基は当業者には、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６またはそれ以降の版）において知得され得よう。表面は平坦な表面、例えば、カバーガラスまたは任意の粒子の湾曲表面であってもよい。表面はシリカ、金属、半導体、シリコンおよび種々のポリマー表面であり得る。上記の官能化された多分子発色団ポリマードットは表面に、１つだけの発色団ポリマー分子により任意の安定な物理的または化学的会合によって結合される。発色団ポリマードット内のすべての遊離分子（表面と会合しているもの以外）は、例えば有機溶媒での表面の洗浄によって除去され得、その結果、表面と会合している分子だけが保持される。次いで、この単分子発色団ドットは表面から任意の物理的または化学的方法によって解放され得る。得られる単分子ドットは、元のポリマー分子の官能基数に応じて一価、二価または多価となり得る。
【００５９】
いくつかの半導体ポリマーが本開示による使用に適している。可視スペクトル全体を含むＵＶから赤外の範囲の発光波長を有する半導体ポリマーを開発した。種々の態様において、半導体ポリマー、例えば限定されないが：ポリフルオレンポリマー、例えば限定されないが、ポリ（９，９−ジヘキシルフルオレニル−２，７−ジイル）（ＰＤＨＦ）およびポリ（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）（ＰＦＯ）；フルオレンベースのコポリマー、例えば限定されないが、ポリ［｛９，９−ジオクチル−２，７−ジビニレン−フルオレニレン｝−ａｌｔ−コ−｛２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−フェニレン｝］（ＰＦＰＶ）、ポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１，３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ）、ポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（４，７−ジ−２−チエニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾール）］（ＰＦＴＢＴ）、ならびにポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（４，７−ジ−２−チエニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾール）］（ＰＦ−０．１ＴＢＴ）；フェニレンビニレンポリマー、例えば限定されないが、ポリ［２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−フェニレンビニレン］（ＭＥＨ−ＰＰＶ）およびポリ［２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−（１−シアノビニレン−１，４−フェニレン）］（ＣＮ−ＰＰＶ）；フェニレンエチニレンポリマー、例えば限定されないが、ポリ（２，５−ジ（３’，７’−ジメチルオクチル）フェニレン−１，４−エチニレン（ＰＰＥ）の使用のための方法、システム、組成物およびキットを提供する。一部の態様では、ポリスチレンベースのの櫛形ポリマーを含むＰドットが使用され得る。ポリスチレンベースのの櫛形ポリマーの非限定的な例としては、ポリスチレングラフトアクリル酸、ポリスチレングラフトエチレンオキシド、ポリスチレングラフトブチルアルコールなどが挙げられる。
【００６０】
一部の態様では、ポリ（メタクリル酸メチル）ベースのの櫛形ポリマーを含むＰドットが使用され得る。ポリ（メタクリル酸メチル）ベースのの櫛形ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（メタクリル酸メチル）グラフトアクリル酸、ポリ（メタクリル酸メチル）グラフトエチレンオキシドなどが挙げられる。
【００６１】
一部の態様では、カルボキシル、アミン、チオール、エステル、スクシンイミジルエステル、アジド、アルキン、シクロオクチンまたはホスフィン基を含む櫛形ポリマーを含むＰドットが使用され得る。
【００６２】
一部の態様では、末端モノマー単位が例えばカルボキシル、アミン、チオール、エステル、スクシンイミジルエステル、アジド、アルキン、シクロオクチン、ホスフィンまたは同様の官能基で官能化されたポリマーを含むＰドットが使用され得る。使用され得るポリマーの例としては、限定されないが、ポリ（メタ）アクリレートポリマー、ポリアクリルアミドポリマー、ポリイソブチレン、ポリジエン、ポリフェニレン、ポリエチレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリウレタン、そのブロックコポリマー、そのランダムコポリマーまたは交互コポリマーなどが挙げられる。
【００６３】
一部の態様では、１つ以上の官能化モノマー単位を有するコポリマー、例えば、両親媒性ポリマー、例えば限定されないが：ポリ（（メタ）アクリル酸）ベースのコポリマー、例えば：ポリ（アクリル酸−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸−ｂ−メタクリル酸ネオペンチル）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸ネオペンチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ｔ−ブチル−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−ｂ−アクリル酸）；ポリジエンベースのコポリマー、例えば：ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−メチルアクリル酸、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−エチレンオキシド、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）およびポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）；ポリ（エチレンオキシド）ベースのコポリマー、例えば：ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ブチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｃ−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ニトロベンジル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸テトラヒドロフルフリル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−メチルオキサゾリン）；ポリイソブチレンベースのコポリマー、例えば、ポリ（イソブチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（イソブチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソブチレン−ｂ−メタクリル酸）；ポリスチレンベースのコポリマー、例えば、ポリ（スチレン−ｂ−アク���ルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸セシウム）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ブロック接合部で切断可能なポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）酸、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレンスルホン酸−ｂ−メチルブチレン）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−メチルブチレン−コ−イソプレンスルホン酸）；ポリシロキサンベースのコポリマー、例えば、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−メタクリル酸）；ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのコポリマー、例えば、ポリ（フェロセニルジメチルシラン−ｂ−エチレンオキシド）；ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのコポリマー、例えば、ポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ビニルピリジンおよびＮ−メチルビニルピリジニウムヨージド）ベースのコポリマー、例えば、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）ＰＥＯ末端官能性ＯＨ；ならびにポリ（ビニルピロリドン）ベースのコポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン−ｂ−Ｄ／Ｌ−ラクチド）；などを含むＰドットが使用され得る。
【００６４】
本開示の一部の態様では、検出に使用されるＰドットはポリマーＣＮ−ＰＰＶを含むものであり得、該ポリマーは、ポリ［２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−（１−シアノビニレン−１，４−フェニレン）］としても知られている明るくてコンパクトなオレンジ色発光半導体ポリマードットである。ＣＮ−ＰＰＶは、卓越した蛍光特性、例えば、大きな吸収断面積、高い量子収量および高速発光速度を有する。
【００６５】
一部の態様では、タンパク質およびペプチドを検出するために使用されるＰドットは、本質的にＣＮ−ＰＰＶからなるポリマーを含むものであり得る。一部の態様では、該ナノ粒子はＣＮ−ＰＰＶと少なくとも１種類の他の物質を含むものである。例えば、ＣＮ−ＰＰＶは、さらなる機能性をもたらすコポリマーまたは他の物質と混合され得る。
【００６６】
一部の態様では、タンパク質およびペプチドの検出に使用されるポリマードットは、少なくとも２つの異なる発色団単位を有する半導体コポリマーを含むものであり得る。例えば、コンジュゲートコポリマーは、所与の比率で存在させたフルオレン発色団単位とベンゾチアゾール発色団単位の両方を含むものであり得る。半導体コポリマーを合成するために使用される典型的な発色団単位としては、限定されないが、フルオレン単位、フェニレンビニレン単位、フェニレン単位、フェニレンエチニレン単位、ベンゾチアゾール単位、チオフェン単位、カルバゾールフルオレン単位、ボロン−ジピロメテン単位、およびその誘導体が挙げられる。該異なる発色団単位は、ブロックコポリマーの場合のように隔離されていてもよく、混ざり合っていてもよい。本明細書で用いる場合、発色団コポリマーは、主な発色団の種の実体を記載することにより示している。例えば、ＰＦＢＴは、フルオレン単位とベンゾチアゾール単位を特定の比率で含む発色団ポリマーである。一部の場合では、ダッシュを用いて少ない方の発色団の種の割合を示し、次いで、少ない方の発色団の種の実体を示している。例えば、ＰＦ−０．１  ＢＴは９０％のＰＦと１０％のＢＴを含む発色団コポリマーである。
【００６７】
一部の特定の態様では、ポリマードットは半導体ポリマーブレンドを含むものであり得る。該ブレンドは、ホモポリマー、コポリマーおよびオリゴマーの任意の組合せを含むものであり得る。ポリマードットを形成するために使用されるポリマーブレンドは、得られるポリマードットの特性が微調整されるように、例えば、ポリマードットのための所望の励起スペクトルまたは発光スペクトルが得られるように選択され得る。
【００６８】
一部のアッセイでは、半導体Ｐドットにより、一部において他の蛍光レポーターよりも高い量子収量を示すため検出感度の改善がもたらされる。一部の態様では、使用されるＰドットの量子収量は２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、８０％より大きい、または９０％より大きい。
【００６９】
一部のアッセイでは、半導体Ｐドットにより、一部において他の蛍光レポーターよりも速い発光速度を示すため検出感度の改善がもたらされる。一部の特定の態様では、使用されるＰドットの発光速度は約０．１ナノ秒〜約５０ナノ秒である。
【００７０】
一部の態様では、使用される発色団ポリマードットは、有機色素小分子、金属錯体、フォトコトクロミック（ｐｈｏｔｏｃｈｏｔｏｃｈｒｏｍｉｃ）色素およびその任意の組合せの単位を有するポリマー、例えば光学的に不活性なポリマー、例えば、小分子有機色素、金属錯体、フォトクロミック色素およびその任意の組合せが共有結合またはグラフトされたポリスチレンを含むものである。このような色素または金属錯体はタンパク質感知能を有するものであり得る。
【００７１】
一部の態様では、有機色素小分子、金属錯体、フォトクロミック色素、およびその任意の組合せを発光性単位として共有結合させた半導体ポリマーを含むＰドットの使用のための方法、システム、組成物およびキットを提供する。かかる発光性単位は、発光色を微調整し得、量子収量を増大させ得、発色団ポリマードットの光安定性を改善し得るものである。
【００７２】
一部の態様では、小分子有機色素または金属錯体は、感知機能を有し、したがって発色団ポリマードットに対してさらなる機能性、例えば、タンパク質感知能を付加し得る。
【００７３】
一部の態様では、Ｐドットは、小分子有機色素、金属錯体、フォトクロミック色素およびその任意の組合せが共有結合またはグラフトされた他の発色団ポリマー、例えば光学的に不活性なポリマーと物理的に混合または化学架橋されてさらなる機能性、例えばタンパク質感知を有する半導体ポリマーを含むものであり得る。
【００７４】
一部の態様では、Ｐドットは、発光色を微調整するため、量子収量および／または光安定性を改善するため、および／またはさらなる機能性、例えば、磁性機能、プラズモン共鳴機能などをもたらすために他の成分、例えば、蛍光色素、無機発光性物質、磁性物質、金属物質などと物理的に混合または化学架橋された半導体ポリマーを含むものであり得る。
【００７５】
本明細書において提供するナノ粒子のサイズは、ナノ粒子の最小寸法を示す「限界寸法」に関して規定する。多くのナノ粒子は、おおまかには球形の形状であり、このため限界寸法は球形粒子の半径または直径となる。典型的なナノ粒子、例えばナノスフェアおよびナノキューブは完全にナノスコピックサイズであるが、ナノ粒子のどの寸法もナノスケールである必要はない。例えば、ナノシリンダーは、ナノスケールの直径を有するが長さはマイクロスケールであるものであってもよい。
【００７６】
一部の態様では、使用されるＰドットの限界寸法は３０ｎｍ以下である。一部の態様では、限界寸法は２５ｎｍ以下である。一部の態様では、限界寸法は２０ｎｍ以下である。一部の態様では、限界寸法は１５ｎｍ以下である。一部の態様では、限界寸法は１０ｎｍ以下である。一部の態様では、限界寸法は５ｎｍ以下である。
【００７７】
一部の態様では、使用されるＰドットは１ｎｍより大きく１０００ｎｍ未満の限界寸法を有する。
【００７８】
ナノ粒子の考えられ得る形状には本質的に制限はない。しかしながら、一部の特定の態様では、形状は、球形、円筒形、楕円、多面体、角柱形、棒状およびワイヤから選択される。ナノ粒子の形状は検出特性に寄与する場合があり得、これは当業者には認識されよう（例えば、ナノロッドはナノスフェアとは異なる光学特性を有し得る）。
【００７９】
ナノ粒子のナノスケールサイズは、大型粒子サイズによって提示される問題点を回避するために必須である。例えば、光ルミネセンスイメージングのためにナノ粒子を標的分子（例えば、タンパク質）に結合させる場合、比較的大型の粒子の方が、標的以外の分子への非特異的結合または表面への吸着に利用可能な表面積が大きい。
【００８０】
提供する本ナノ粒子は、解析方法、システムまたはキットの一部として標的分子に結合され得る光ルミネッセントレポーターとしての使用に最適化されたものである。該ナノ粒子は、光ルミネセンスを用いて容易に検出可能なものであるのがよく、標的分子に対する特異性を有するものであるのがよい。
【００８１】
所与のＰドットの光学特性、例えば吸収波長は、その組成および幾何形状を改変することにより微調整され得る。可視スペクトル全体を含むＵＶから赤外の範囲の吸収波長を有する半導体ポリマーを開発した。一部の態様では、約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍのピーク吸収波長を有するＰドットが使用される。
【００８２】
可視スペクトル全体を含むＵＶから赤外の範囲の発光波長を有する半導体ポリマーを開発した。一部の態様では、約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約９５０ｎｍ〜約１０５０ｎｍ、約１０００ｎｍ〜約１１００ｎｍ、約１１５０ｎｍ〜約１２５０ｎｍ、または約１２００ｎｍ〜約１３００ｎｍのピーク発光波長を有するＰドットが使用される。
【００８３】
一部の態様では、提供する本方法、システム、組成物およびキットは、狭帯域発光を有するＰドットを利用するものである。狭帯域発光は一部の特定の用途、例えば限定されないが多重化用途に好都合である。ポリマードットの発光波長は紫外領域から近赤外領域までさまざまであり得る。発光バンドの半値全幅（ＦＷＨＭ）は７０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約６５ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約６０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約５５ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約５０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約４５ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約４０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約３５ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約３０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約２５ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約２０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、ＦＷＨＭは約１０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリマードットのＦＷＨＭは約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約３０ｎｍ〜約４５ｎｍの範囲であり得る。
【００８４】
一部の態様では、Ｐドットを作製するための狭帯域発光性のポリマーとしては、狭帯域モノマーとして、ボロン−ジピロメテン（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、ＢＯＤＩＰＹ）およびまたはその誘導体、および／または他のボロン含有モノマーおよびその誘導体が挙げられる。ＢＯＤＩＰＹおよび他のボロン含有モノマーならびにこれらの誘導体としては、限定されないが、これらのアルキル誘導体、アリール誘導体、アルキン誘導体、芳香族誘導体、アルコキシド誘導体、アザ誘導体、ＢＯＤＩＰＹ拡張系および他のＢＯＤＩＰＹ誘導体が挙げられる。また、狭帯域発光性のポリマーは任意の他のモノマーを含むものであってもよい。最終Ｐドットが狭帯域発光を示し得るものとなるように、ＢＯＤＩＰＹベースのモノマーをエネルギー受容体にし、他のモノマーをエネルギー供与体にしてもよい。良溶媒中の狭帯域発光性の発色団ポリマーは、広域発光を示す場合または狭域発光を示す場合があり得る。ＢＯＤＩＰＹおよび他のボロン含有モノマーならびにこれらの誘導体を含む狭帯域発光を有するＰドットの包括的説明はＷＯ２０１３／１０１９０２（これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００８５】
当業者には認識されるように、本明細書に定義した種々の化学用語は、本開示のポリマーおよびモノマーの化学構造を説明するために使用したものであり得る。例えば、さまざまなモノマー誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ誘導体）は、本明細書に記載したさまざまな化学置換基および基を含むものであり得る。例えば、一部の実施形態では、種々のモノマーの誘導体は、水素、重水素、アルキル、アラルキル、アリール、アルコキシ−アリール、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、Ｎ−ジアルコキシフェニル−４−フェニル、アミノ、スルフィド、アルデヒド、エステル、エーテル、酸、および／またはヒドロキシルで置換されたものであり得る。本発明はポリマードット、例えば狭帯域発光性発色団ポリマードットを含むものであり得る。本明細書においてさらに記載するように、本発明には、狭帯域発光特性（例えば、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭ）を示す多種多様なポリマードットが包含される。本明細書においてさらに記載するように、本発明の多様なポリマードットとしては、狭帯域発光性単位（例えば、狭帯域モノマーおよび／または狭帯域単位）を有するポリマーが挙げられ得る。例えば、本発明には、狭帯域モノマー、例えば、ＢＯＤＩＰＹおよび／またはＢＯＤＩＰＹ誘導体モノマー、スクアラインおよび／またはスクアライン誘導体、金属錯体および／または金属錯体誘導体モノマー、ポルフィリンおよび／またはポルフィリン誘導体モノマー、フタロシアニンおよび／またはフタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙｎａｎｉｎｅ）誘導体モノマー、ランタニド錯体および／またはランタニド錯体誘導体モノマー、ペリレンおよび／またはペリレン誘導体モノマー、シアニンおよび／またはシアニン誘導体モノマー、ローダミンおよび／またはローダミン誘導体モノマー、クマリンおよび／またはクマリン誘導体モノマー、および／またはキサンテンおよび／またはキサンテン誘導体モノマーを含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが包含され得る。狭帯域単位は、例えば、狭帯域モノマーまたはポリマードットに包埋もしくは結合させた蛍光ナノ粒子であり得る。蛍光ナノ粒子は、例えば量子ドットであり得る。また、狭帯域単位としては、本発明のポリマードットにおいて狭域発光をもたらすポリマーまたは蛍光色素分子も挙げられ得る。
【００８６】
さまざまな他のＢＯＤＩＰＹ誘導体が本発明に使用され得る。ＢＯＤＩＰＹおよびＢＯＤＩＰＹ誘導体は、重合させてポリマー（例えば、ホモポリマーまたはヘテロポリマー）を形成してもよい、および／またはポリマー主鎖、側鎖および／または末端に結合（例えば、共有結合）させてもよい。一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（Ｉ）：
【化１】
0006418698.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（ａｌｋａｌｅｎｅ）（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル（ｂｅｎｚｏｏｘａｄｉｚｏｌｙｌ）、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉｚｏｌｙｌ）、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが���げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＩＩ）：
【化２】
0006418698.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アル���ル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。該モノマーは、例えば、ポリマーの主鎖とＲ３Ａ基およびＲ３Ｂ基との結合によって一体化され得る。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＩＩＩ）：
【化３】
0006418698.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フル���レニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、例えばＲ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。括弧はポリマーの主鎖とのモノマーの結合点を示す。
【００８９】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＩＶ）：
【化４】
0006418698.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アルキル−９，９−ジ���ルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（Ｖ）：
【化５】
0006418698.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５ＡおよびＲ５Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオ���ニル、７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに共重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。一部の特定の実施形態では、狭帯域モノマーは主鎖にＲ５Ａ基およびＲ５Ｂ基との結合によって一体化され得る。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＶＩ）：
【化６】
0006418698.tif 000009
（式中、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３ＡおよびＲ３Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アルキル−���，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＶＩＩ）：
【化７】
0006418698.tif 000010
（式中、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５ＡおよびＲ５Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル���７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る）。
【００９３】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＶＩＩＩ）：
【化８】
0006418698.tif 000011
（式中、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される）の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得る。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル���７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。また、式中、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ６ＡおよびＲ６Ｂは各々、独立して、限定されないが、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロア��キル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに共重合させる）、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ６Ａ、Ｒ６Ｂもしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る）。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明の発色団ポリマードットは、式（ＩＸ）：
【化９】
0006418698.tif 000012
の構造を有する狭帯域モノマーを含むポリマーを含むものであり得、
式中、Ｘは、式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）もしくは（ＸＩＩＩ）のいずれか１つの構造またはその誘導体：
【化１０】
0006418698.tif 000013
を有するものであり、
式中、式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は各々、独立して、水素（Ｈ）、重水素（Ｄ）、ハロゲン、直鎖または分枝鎖アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アルコキシ、アリール、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エーテルおよびその誘導体、エステルおよびその誘導体、アルキルケトン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキニル、アルキルアミン、フルオロアルキル、フルオロアリール、ならびにポリアルカレン（例えば、メトキシエトキシエトキシ、エトキシエトキシおよび−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜５０）、フェニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フェニル、ピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピリジル、ビピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ビピリジル  トリピリジル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換トリピリジル、フリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フリル、チエニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チエニル、ピロリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピロリル、ピラゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラゾリル、オキサゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換オキサゾリル、チアゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換チアゾリル、イミダゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換イミダゾリル、ピラジニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ピラジニル、ベンゾオキサジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾオキサジゾリル、ベンゾチアジゾリル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換ベンゾチアジゾリル、フルオレニル、アルキル−（アルコキシ−、アリール−、フルオロアルキル−、フルオロアリール−）置換フルオレニル、トリフェニルアミニル置換フルオレニル、ジフェニルアミニル置換フルオレニル、アルキル置換カルバゾリル、アルキル置換トリフェニルアミニルおよびアルキル置換チオフェニルからなる群より選択される。例示的な実施形態として、アルキル置換フェニルとしては、２−アルキルフェニル、３−アルキルフェニル、４−アルキルフェニル、２，４−ジアルキルフェニル、３，５−ジアルキルフェニル、３，４−ジアルキルフェニルが挙げられ得；アルキル置換フルオレニルとしては、９，９−ジアルキル置換フルオ���ニル、７−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、６−アルキル−９，９−ジアルキル置換フルオレニル、７−トリフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルおよび７−ジフェニルアミニル−９，９−ジアルキル置換フルオレニルが挙げられ得；アルキル置換カルバゾリルとしては、Ｎ−アルキル置換カルバゾリル、６−アルキル置換カルバゾリルおよび７−アルキル置換カルバゾリルが挙げられ得；アルキル置換トリフェニルアミニルとしては、４’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’−アルキル置換トリフェニルアミニル、３’，４’−ジアルキル置換トリフェニルアミニルおよび４’，４’’−アルキル置換トリフェニルアミニルが挙げられ得；アルキル置換チオフェニルとしては、２−アルキルチオフェニル、３−アルキルチオフェニルおよび４−アルキルチオフェニル、Ｎ−ジアルキル−４−フェニル、Ｎ−ジフェニル−４−フェニル、ならびにＮ−ジアルコキシフェニル−４−フェニルが挙げられ得る。Ｘがナフタレンおよびその誘導体を表す場合、狭帯域モノマーは、主鎖に一体化され得る（例えば、ポリマーに重合させる）、および／またはポリマーのポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２もしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る）。Ｘがアントラセンおよびその誘導体を表す場合、狭帯域モノマーは、ポリマーの主鎖に一体化され得る、および／またはポリマーの主鎖、末端もしくは側鎖に、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５もしくはこれらの組合せとの少なくとも１つの結合によって共有結合され得る。
【００９５】
多種多様なポリマードット、例えば、本明細書に記載した実施例ならびに例えばＷＯ２０１１／０５７２９５およびＷＯ２０１３／１０１９０２（これらは各々、引用によりその全体が、特に、本明細書に記載した具体的なＰドット組成物およびそのそれぞれの作製方法に関して本明細書に組み込まれる）に開示された他のものが使用され得る。例えばＷＯ２０１１／０５７２９５に示されているように、ポリマードットのポリマーは、物理的にブレンドしたもの、または化学結合（もしくは化学架橋）したものであり得る。例えば、物理的にブレンドしたポリマードットは、ポリマードットにブレンドされて非共有結合性相互作用によって一体に保持されたポリマーを含むものであり得る。化学結合したポリマードットは、互いに共有結合させたポリマーをポリマードット中に含むものであり得る。化学結合型ポリマーは、ポリマードットの形成前に互いに共有結合させ得る。例えば、ポリマードットは、直接官能化したもの、および／または低密度官能化を有するものを含むものであり得る。
【００９６】
官能化ポリマードット
種々の態様において、本開示により「官能化」ポリマードットの使用、特に、Ｐドットの表面を修飾するための手段としての使用を提供する。本明細書で用いる場合、Ｐドットに関連する用語「官能化（された）」は、Ｐドットが１つ以上の官能基に連結（例えば、共有結合）されていることをいう。本明細書で用いる場合、用語「官能基」は、例えば任意の安定な物理的または化学的会合によって発色団ポリマーに結合され、それによりＰドットの表面を改質し得る、例えば、該表面をコンジュゲーション（例えば、バイオコンジュゲーション）に利用可能にし得る任意の化学単位をいう。官能基は、発色団ポリマーの主鎖、側鎖、または末端単位の１つに共有結合され得る。官能基は、限定されないが、以下：アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネート、その置換型誘導体もしくはこれらの組合せの任意のものであり得る。一般に、バイオコンジュゲーションに適した任意の他の官能基が使用され得る。かかる官能基は当業者には、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６またはそれ以降の版）（これは、引用によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）において知得され得よう。
【００９７】
一部の態様では、本開示の官能基は、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネート、その置換型誘導体もしくはこれらの組合せから選択される。
【００９８】
一部の態様では、官能化されたＰドットの使用のための方法、システム、組成物およびキットを提供する。本開示によれば、Ｐドットは、さらなる修飾、例えばバイオコンジュゲーション、または後続のタンパク質もしくはペプチドの検出における使用に適したものにする任意の様式で官能化され得る。例えば、官能基は、発色団ポリマーの主鎖、側鎖、または末端単位の１つに連結（例えば、共有結合）され得る。一部の態様では、一価のポリマードットは、例えば、単一の線状ポリマー分子の２つの末端単位のうちの一方に官能基を１つだけ含む単一のポリマー分子を含むものであり得る。二価のポリマードットは、例えば、単一の線状ポリマー分子の２つの末端単位の各々に２つの官能基を含む単一のポリマー分子を含むものであり得る。三価のポリマードットは、例えば、３つの枝を有する分枝ポリマーの３つの末端単位にのみ官能基が結合している３つの官能基を含む単一のポリマー分子を含むものであり得る。同様に、例えば、４つの枝を有する、５つの枝を有する、６つの枝の末端単位に結合している官能基を有する分枝ポリマー、およびそれより多くの分枝数を有する分枝ポリマーが他の多価ポリマードットの調製に使用され得る。
【００９９】
一部の態様では、末端単位に少なくとも１つの官能基を有する単一のポリマー分子を含むポリマードットの使用により利点がもたらされ得る。例えば、発色団ポリマーの末端単位への１つだけの官能基の結合はポリマー合成時に充分に制御され得る。例えば、官能基を含む化学単位は、ポリマー合成において重合開始剤ならびに鎖成長触媒としての機能を果たし得、このようにして、各ポリマー分子の末端に官能基が１つだけ含まれる。また、線状発色団ポリマーの２つの末端単位だけへの官能基の結合もポリマー合成時に充分に制御され得る。例えば、官能基を含む化学単位は、ポリマー合成時にポリマーの鎖成長を終結させるためのキャッピング剤として使用され得、それにより、各線状ポリマー分子が２つの末端単位に２つだけ官能基を含むものになる。同様に、多価ポリマードットに対する官能基の結合もポリマー合成時に充分に制御され得、例えば、官能基は、３つの枝を有する分枝ポリマーの３つの末端単位のみに付加され得る。
【０１００】
種々の態様において、ポリマードットは、該ポリマードットに結合した官能基を含むものである。一部の特定の態様では、官能基は、疎水性官能基、親水性官能基またはこれらの組合せから選択される。一部の態様では、官能基はバイオコンジュゲーションに適したものである。
【０１０１】
一部の特定の態様では、官能基は、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せから選択される。
【０１０２】
種々の態様において、生体分子はタンパク質である。さらなる態様では、生体分子は抗体またはアビジンである。
【０１０３】
高分子電解質コートポリマードット
本開示により、例えば、ウェスタンブロット解析を行なうことによりタンパク質を検出して測定するためにＰドットを使用するための方法、組成物、キットおよびシステムを提供する。一部の態様では、高分子電解質コーティングを有するポリマードットが使用され得る。好都合には、高分子電解質コーティングは、例えば、高いイオン強度を有するか、二価の金属イオンを含んでいるか、または両方である溶液中でのポリマードットのコロイド安定性を改善し得るものである。高分子電解質コーティングなしの一部のポリマードットと比べて改善されたコロイド安定性により、例えば、ポリマードットをアッセイにおいてその機能性を失うことなく使用することが可能になり得る。一部の特定の態様では、高分子電解質コーティングの組成構成は、溶液中、例えば、高イオン強度の溶液中でのポリマードットの凝集が低減または解消されるようにあつらえられ得る。また、特定の条件下では、溶液中のイオン（例えば、二価イオン）がポリマードットの表面上の基にキレート化し、それにより凝集特性に影響を及ぼし得る。一部の態様では、高分子電解質コーティングは、溶液中でのポリマードットの凝集を低減または解消するために使用される。
【０１０４】
さらなる態様では、ポリマードットは高分子電解質コーティングに囲まれている。またさらなる態様では、高分子電解質コーティングは、ポリ（スチレンスルホネート）、ポリホスフェート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート−コ−マレエート、ポリアクリルアミド、キトサン、多糖、ポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリペプチドからなる群より選択される高分子電解質を含むものである。
【０１０５】
一部の特定の態様では、高分子電解質コーティングが高分子電解質ポリマーを含むものであり、該高分子電解質ポリマーの各反復単位が、カルボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノ、ヒドロキシルおよびメルカプトからなる群より選択される荷電基を含むものである。
【０１０６】
高分子電解質コーティングは約２〜４ナノメートルの範囲の層厚を有するものであり得、それにより、ポリマードットと高分子電解質コーティングを含むナノ粒子の直径に約４〜８ナノメートルが加えられる。
【０１０７】
コーティング中の高分子電解質はポリマードットの表面上にさまざまな様式で形成され得る。例えば、１つの型の高分子電解質が使用される場合、高分子電解質ポリマー分子は一緒に物理的にブレンドされ、コーティングが形成され得る。２つ以上の型の高分子電解質が使用される場合、高分子電解質ポリマー分子は一緒に物理的にブレンドされ、コーティングが形成され得るか、または一部の態様では、異なる高分子電解質の領域（またはラフト（ｒａｆｔ））がナノ粒子の表面上に形成され得る。一部の態様では、高分子電解質は化学架橋され得る。例えば、コーティング中の高分子電解質の一部または全部が、一般的に当該技術分野でよく知られた任意の架橋反応を用いて化学架橋され得る。また、高分子電解質を、ポリマードットを形成している縮合ポリマー（１種類または複数種）を用いて化学架橋してもよい。一部の態様では、コーティングは１層より多くの高分子電解質層を含むものであり得る。例えば、コーティングは２つの高分子電解質層、３つの高分子電解質層、またはそれ以上の高分子電解質層を含むものであり得る。層内の高分子電解質は同じ型の高分子電解質を含むものであっても、異なる型の高分子電解質を含むものであってもよい。
【０１０８】
本明細書において言及する場合、「高分子電解質」には、例えば、反復単位が電荷を有する電解質基を有するポリマーが包含され得る。一部の態様では、高分子電解質は、すべての反復単位がポリマーに沿って電解質基を有するポリマーを含むものであり得る。一部の特定の態様では、ポリマーの一部の反復単位が電解質基を有する。例えば、本発明の高分子電解質は、ポリマーの反復単位の少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％が電解質基を有するポリマーを含むものであり得る。一部の態様では、本発明の高分子電解質は、ポリマーの反復単位の少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％または８０％が電解質基を有するポリマーを含むものであり得る。
【０１０９】
一部の態様では、高分子電解質は少なくとも１つの型の電解質基を含むものであり得る。例えば、高分子電解質は１つだけの型の電解質基、または２つ以上の型の電解質基を含むものであり得る。本明細書に記載の種々の電解質基が、さまざまな異なる型の高分子電解質に含められ得る。本発明における高分子電解質の例としては、限定されないが、ポリ（スチレンスルホネート）、ポリホスフェート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート−コ−マレエート、ポリアクリルアミド、キトサン、多糖、ポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリペプチドが挙げられ得る。本明細書に記載の電解質基は、ポリマー主鎖に含めてもよく、ポリマー主鎖に結合している側鎖に含めてもよく、および／またはポリマーの側鎖に結合している基に含めてもよい。
【０１１０】
多種多様な電解質基が本発明において使用され得る。一般的に、特定の条件下で電荷を生成する任意の基が高分子電解質に使用され得る。例えば、電解質基はアニオンまたはカチオンを含むものであり得る。一部の態様では、電解質基は１つのアニオンまたは１つのカチオンを含むものであり得る。あるいはまた、電解質基は、電解質基全体として負または正の電荷を含むものとなるように１つより多くのアニオンおよび／またはカチオンを含むものであり得る。電解質基の電荷は永久電荷であってもよく、溶液の特定のｐＨに従って生成する電荷であってもよい（例えば、水素が解離して荷電電解質基を形成し得る）。一部の態様では、電解質基は、水溶液に溶解させる前は塩であってもよい（例えば、対イオンで中和されている）。一部の態様では、電解質基としては、限定されないが、カルボキシル基、スルホネート基、ホスフェート基、アミノ、ヒドロキシル基、およびメルカプト基が挙げられ得る。一部の態様では、電解質基の電荷は溶液の酸性特性または塩基性特性に応じて発生し得るものである。例えば、カルボキシル基、スルホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基、またはメルカプト基は、例えば、溶液のｐＨおよびそれぞれの電解質基のｐＫａに従って負電荷を有し得る、水溶液中では、ポリマーの電解質基は解離して荷電基を形成し、それにより該ポリマーが荷電状態になり、高分子電解質が形成され得る。一部の態様では、電解質基は、電解質基に永久電荷を配するために置換基で置換されていてもよい。例えば、アミノ基は、永久正電荷を有する第４級アンモニウムカチオンを含むものであり得る。電解質基に対する置換基は種々であり得、例えば、アルキル、アリール、ＣＮ、アミノ、スルフィド、アルデヒド、エステル、エーテル、酸、ヒドロキシルまたはハライドであり得る。一部の特定の態様では、電解質基の置換基は電解質に電荷をもたらすものであり得る。
【０１１１】
本発明の一態様には、高分子電解質コーティングを設けることによりポリマードットのゼータ電位を改変することが包含される。このコーティングは、例えば、ナノ粒子の表面電荷を改変するため、および溶液中での凝集を抑制するために使用され得る。溶液に応じて、ゼータ電位は凝集が抑制されるようにあつらえられ得る。一部の態様では、ゼータ電位は、溶液中に分散された粒子が凝集に抵抗性であり得るかどうかを評価するためのパラメータである。例えば、粒子（例えば、高分子電解質でコートされたポリマードット）は、該粒子が＋３０ｍＶよりプラス側または−３０ｍＶよりマイナス側のゼータ電位を有する場合に安定である（例えば、凝集に抵抗性である）。ゼータ電位の値が大きいほど、凝集に対してより大きな安定性がもたらされ得る。例えば、＋／−６０ｍＶを有する粒子の分散では優れた安定性がもたらされ得る。選択される本明細書に記載の高分子電解質（１種類または複数種）に応じて、本発明には、約＋３０ｍＶよりプラス側、約＋４０ｍＶよりプラス側、約＋５０ｍＶよりプラス側、または約＋６０ｍＶより（ｍｏｖｅ）プラス側であるゼータ電位を有する粒子分散体（例えば、高分子電解質コーティングを有するポリマードット）が包含される。本発明には、約−３０ｍＶよりマイナス側、約−４０ｍＶよりマイナス側、約−５０ｍＶよりマイナス側、または約−６０ｍＶより（ｍｏｖｅ）マイナス側であるゼータ電位を有する粒子分散体（例えば、高分子電解質コーティングを有するポリマードット）が包含される。高分子電解質コーティングを有するポリマードットを有する粒子は、本明細書に記載の多種多様な高分子電解質のための方法を用いて調製され得る。粒子分散体のゼータ電位は、次いでさまざまな手法を用いて、例えばＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒによりゼータ電位を測定するために設計された計測器を使用することなどにより測定され得る。
【０１１２】
一部の特定の態様では、本発明には、１種類より多くの高分子電解質ポリマーを含むコーティングを有するポリマードットを含むナノ粒子が包含される。例えば、コーティングは、２種類の異なる高分子電解質、３種類の異なる高分子電解質、４種類の異なる高分子電解質、またはそれ以上の種類を任意の所望の比率で含むものであり得る。
【０１１３】
ポリマードットのバイオコンジュゲート
種々の態様において、本開示のポリマードットは、タンパク質またはペプチドの検出を容易にするためにバイオコンジュゲートされ得る。一部の態様では、生体分子にコンジュゲートさせたＰドットの使用、例えば、生体分子をＰドットに直接または官能基によって間接的のいずれかで結合させるＰドットの官能化などのための方法、システム、組成物およびキットを提供する。
【０１１４】
用語「生体分子」は、合成または天然に存在するタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、アミノ酸、代謝産物、薬物、毒素、核酸、ヌクレオチド、糖質、糖、脂質、脂肪酸などを示すために用いている。生体分子にコンジュゲートさせたＰドットは、場合によっては本明細書において「バイオコンジュゲート」と称している。また、バイオコンジュゲートは、生物学的粒子、例えば、ウイルス、細菌、細胞および天然に存在するかまたは合成の小胞、例えばリポソームと会合させた官能化発色団ポリマードットを含むものであってもよい。官能化発色団ポリマードットは、１つもしくは２つの末端官能基または低密度側鎖官能基を有する発色団ポリマーから形成される１つ以上の官能基を含むものであり得る。
【０１１５】
一部の特定の態様では、バイオコンジュゲートは一価の発色団ポリマードットと生体分子を含むものであり、この場合、生体分子はポリマードットに直接または官能基によって間接的のいずれかで結合される。また、バイオコンジュゲートは、生物学的粒子、例えば、ウイルス、細菌、細胞、および天然に存在するかまたは合成の小胞、例えばリポソームと会合させた一価の発色団ポリマードットを含むものであり得る。
【０１１６】
本開示の一部の態様では、生体分子は一価の発色団ポリマードットの官能基に共有結合によって結合される。例えば、ポリマードットの官能基がカルボキシル基である場合、タンパク質生体分子は、カルボキシル基とタンパク質分子のアミン基との架橋によってポリマードットに直接結合され得る。
【０１１７】
本開示の種々の態様では、Ｐドットのバイオコンジュゲーションを助長するために架橋剤が使用され得る。本明細書で用いる場合、用語「架橋剤」は、同様の分子または異なる分子の分子基間に該分子が一体に共有結合されるように化学結合を形成し得る化合物または部分を示すために用いている。一般的な架橋剤の例は当該技術分野で知られている。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６またはそれ以降の版）を参照のこと。生体分子と一価の発色団ポリマードットとの間接結合は、「リンカー」分子、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチンまたは同様の分子の使用によって行なわれ得る。
【０１１８】
一部の態様では、標的に特異的に結合する生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを用いた標的分子（例えば、タンパク質）の解析のための方法、システム、組成物およびキットを提供する。
【０１１９】
一部の態様では、蛍光性Ｐドットを、機能または他の有益性、例えば限定されないが、標的分子に対する結合親和性をもたらす１つ以上の分子にコンジュゲートさせる。
【０１２０】
一部の態様では、標的分子は対象のタンパク質であり、Ｐドットにコンジュゲートさせる生体分子は、標的タンパク質に特異的に結合する一次抗体である。
【０１２１】
他の態様では、標的分子は、対象のタンパク質に対する一次抗体に結合している前記タンパク質であり、Ｐドットにコンジュゲートさせる生体分子は、一次抗体に特異的に結合する二次抗体である。
【０１２２】
他の態様では、標的分子は対象のビオチン化タンパク質であり、Ｐドットにコンジュゲートさせる生体分子は、ビオチン化タンパク質に特異的に結合するアビジン（例えば、ストレプトアビジン）である。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、用語「ビオチン」は、アビジン結合に有効なさまざまなビオチン誘導体および類似体のいずれか１種類をいう。好適なビオチン部分としては、ビオチン化ペプチド断片がアビジンおよび関連アビジンタンパク質によって単離されることを可能にする部分が挙げられる。代表的なビオチン部分としては、ビオチン誘導体、例えば、イミノビオチン、ビオシチンおよびカプロイルアミドビオチン、ならびにビオチン類似体、例えば、デスチオビオチンおよびビオチンスルホンが挙げられる。
【０１２４】
本明細書で用いる場合、用語「アビジン」は、ビオチンに結合する免疫グロブリン以外の任意のビオチン結合タンパク質をいい、天然タンパク質、および組換えタンパク質と遺伝子操作したタンパク質との両方を包含している。この用語には、「卵白」または「鳥類」アビジンおよび「ストレプトアビジン」として知られる２種類の一般的なビオチン結合タンパク質が包含される。卵白アビジンまたは鳥類アビジンは、一般的には単にアビジンと称され、卵白の構成要素であり、ビオチンと非共有結合性複合体を形成するタンパク質である。ストレプトアビジンは、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉから単離されるアビジンタンパク質であり、これもビオチンと非共有結合性の複合体を形成する。また、ビオチン結合タンパク質の他の細菌供給源も知られている。卵白アビジンおよびストレプトアビジンはどちらもビオチン結合部位が対でアビジン分子の対面上に配列された四量体タンパク質である。また、この用語は、アビジン誘導体、例えば、スクシニルアビジン、フェリチンアビジン、酵素アビジン、および架橋アビジンも示す。
【０１２５】
一部の態様では、蛍光性Ｐドットは、Ｐドットの他の特性、例えば、そのサイズ、蛍光、疎水性、非特異的結合または吸着特性などを改変する１つ以上の分子にコンジュゲートされ得る。
【０１２６】
一部の態様では、生体分子とＰドットとのコンジュゲーションは、Ｐドットへの官能基の結合、例えば限定されないがカルボキシル基の結合を含むものであり得る。一部の態様では、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に、カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在下で反応させ、架橋のためのカルボキシレート基と特定の生体分子に存在する第１級アミン基とのアミン反応性エステルが作製され得る。
【０１２７】
一部の態様では、カルボキシル化Ｐドットを生体分子、例えばタンパク質に、Ｐドットと生体分子を、例えば、０．１％ＰＥＧ（ＭＷ３３５０）含有ＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）溶液中で混合することによりコンジュゲートさせる。Ｐドットのカルボキシル基と生体分子のアミン基間のペプチド結合の形成はＥＤＣによって触媒され得る。しかしながら、Ｐドットの本質的に疎水性の性質のため、生体分子は粒子表面上に非特異的に吸着される傾向になる。一部の態様では、Ｐドットの表面上への生体分子の非特異的吸着を低減させるためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が導入される。
【０１２８】
本明細書に記載の実施例に加え、一部の態様では、生体分子とＰドットとのコンジュゲーションのための他のストラテジーおよび方法、例えば、ＷＯ２０１１／０５７２９５およびＷＯ２０１３／１０１９０２に開示されたものなどが使用され得る。生体分子とＰドットとのコンジュゲーションのための他のストラテジーおよび方法は、当業者には、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６またはそれ以降の版）において知得され得よう。
【０１２９】
ポリマードットの安定性
また、本開示により、本発明の方法による使用のための安定なＰドット集団の作製および維持に適した組成物および方法を提供する。本明細書に記載のＰドットは、ウェスタンブロット解析での使用のための組成物およびキットにおける使用のために調製され得る。一部の態様では、Ｐドット集団は、ウェスタンブロットアッセイでの使用前に一定期間の保存が可能であるような安定な形態で調製され得る。
【０１３０】
本明細書で用いる場合、用語「安定な」とは、発色団ポリマードットが、適切な水溶液中に長期間保存したとき凝集しない、および／または実質的にサイズが変化しない（電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査または動的光散乱による測定時）ことを示し得る。ポリマードットの凝集またはサイズの実質的な変化は、例えば、１つより多くのポリマードットを含む凝集塊の数の増加で特性評価され得る。凝集塊は、目での目視、イメージング手法、例えば、電子顕微鏡検査もしくは原子間力（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒ）顕微鏡検査の使用、および／または動的光散乱によって示されるサイズ測定値の増大によって検出され得る。一部の態様では、凝集は、発色団ポリマードットの最初の測定値と比べて粒子直径の測定値の少なくとも約１０％の増大、少なくとも約２５％の増大、少なくとも約５０％の増大、少なくとも約１００％の増大、少なくとも約５００％の増大、または少なくとも約１０００％の増大で特性評価され得る。例えば、発色団ポリマードットは、１日目にメジアン径は１５ｎｍと測定され、次いで、４ヶ月後、メジアン径は３０ｎｍと測定されたとすると、それにより粒子直径の測定値の１００％の増大が示される（すなわち、凝集を示す）。
【０１３１】
一部の特定の態様では、発色団ポリマードットは、適切な水溶液中に少なくとも約１ヶ月間、好ましくは少なくとも約２ヶ月間、より好ましくは少なくとも約４ヶ月間保存された場合も安定であり得る。一部の特定の態様では、安定な発色団ナノ粒子は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３６、４２、４８ヶ月間、またはそれ以上、凝集しない、またはサイズが実質的に変化しない。一部の態様では、本明細書において提供する官能化発色団ナノ粒子は、適切な水溶液中で少なくとも約４ヶ月間安定なままである。他の態様では、本明細書において提供する官能化発色団ナノ粒子は、適切な水溶液中で少なくとも約６ヶ月間安定なままである。また他の一態様では、本明細書において提供する官能化発色団ナノ粒子は、適切な水溶液中で少なくとも約１年間安定なままである。
【０１３２】
一部の態様では、用語「安定な」とは、発色団ポリマードットが該ポリマードットのポリマー分子またはドーパントの解離に対して抵抗性であることを示し得る。例えば、発色団ポリマードットはいくつかのポリマー分子を含むものであり得る。該ポリマー分子はポリマードット内に留まっているが、一定期間の後、溶液中に浸出し得る。ポリマードットからのポリマー分子の浸出は、例えば、ポリマードットの光物理学的特性の低下で特性評価され得る。一部の態様では、発色団ポリマードットの安定性の低下が、ポリマードットの発光に対応する波長での経時的な発光強度の低下で特性評価され得る。一部の特定の態様では、ポリマードットの分解が、ポリマーの発光に対応する特定波長での経時的な発光強度の増大によって検出され得る。また、ポリマーの発光の測定に加え、ポリマードットを、ナノ粒子形成時に溶液中に存在する蛍光色素が組み込まれるように設計してもよい。ポリマードットが分解されるにつれて、経時的に色素が浸出して検出され得る。
【０１３３】
発色団ポリマードットを用いた解析方法
本開示により、タンパク質およびペプチドの検出のための発色団Ｐドットの使用を提供する。一部の態様では、本開示は、ウェスタンブロッティングアッセイ、例えば、対象のタンパク質またはペプチドの分離および検出における使用のためのバイオコンジュゲートさせたＰドットの使用に関する。
【０１３４】
本開示の種々の態様によれば、タンパク質またはペプチドはクロマトグラフィー、濾過、キャピラリー電気泳動、析出、液抽出もしくは他の抽出方法、免疫沈降またはこれらの組合せによって分離され得る。
【０１３５】
一部の特定の態様では、他のタンパク質検出アッセイ、例えば限定されないが、免疫染色、分光測光、酵素ベースのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）およびこれらの組合せがＰドットを用いて行なわれ得る。
【０１３６】
本開示は、Ｐドットを用いたタンパク質またはペプチド被検質の検出を含む任意のアッセイと併用して使用され得る。種々の態様において、タンパク質またはペプチドは、検出前に混合物から分離され得る。本発明の方法は、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ、ＥＬＩ−Ｓｐｏｔアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、免疫組織化学的性質アッセイ、免疫染色、ウェスタンブロット解析、およびタンパク質チップアッセイ）、物理学的方法（例えば、一次元もしくは二次元ゲル電気泳動アッセイ、キャピラリー電気泳動アッセイ、ＦＲＥＴアッセイ、クロマトグラフアッセイ、もしくは色素検出アッセイ、分光測光アッセイ、析出法）またはこれらの組合せとともに使用され得る。
【０１３７】
種々の態様において、本開示のＰドットを用いた検出の前に、タンパク質またはペプチドはクロマトグラフィー法、濾過法、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法、液抽出法、析出法または免疫沈降法によって分離され得る。さらに、クロマトグラフィー法は逆相クロマトグラフィーであってもよい。
【０１３８】
種々の態様において、解析処理量を改善するために複数のアッセイがパラレルで行なわれ得る。
【０１３９】
種々の態様において、本開示により、ゲルを用いてタンパク質を分離すること；分離された該タンパク質を膜に転写すること；分離された該タンパク質を有する該膜を、分離された該タンパク質の少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出すること（該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質に対応している）を含む、ウェスタンブロット解析を行なうための方法を提供する。
【０１４０】
種々の態様において、本開示により、混合物からタンパク質またはペプチドを分離すること；分離された該タンパク質またはペプチドを、分離された該タンパク質またはペプチドの少なくとも一部に特異的な生体分子にコンジュゲートさせたポリマードットを含む溶液と接触させること；および該ポリマードットからの少なくとも１つのシグナルを検出すること（該少なくとも１つのシグナルは分離された該タンパク質またはペプチドに対応している）を含む、タンパク質またはペプチドを検出するための方法を提供する。
【０１４１】
一部の態様では、本発明の方法はタンパク質またはペプチドを定量するものである。
【０１４２】
一部の態様では、該タンパク質またはペプチドの分離は、クロマトグラフィー法、濾過法、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法、液抽出法、析出法、免疫沈降法またはこれらの組合せを含む。
【０１４３】
一部の態様では、ポリマードットは、半導体ポリマー、非半導体ポリマーまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである。
【０１４４】
一部の態様では、ポリマードットは、ポリ（（メタ）アクリル酸）ベースのポリマー、ポリジエンベースのポリマー、ポリ（エチレンオキシド）ベースのポリマー、ポリイソブチレンベースのポリマー、ポリスチレンベースのポリマー、ポリシロキサンベースのポリマー、ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのポリマー、ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのポリマー、ポリ（ビニルピリジン）ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−メチルビニルピリジニウムヨージド）ベースのポリマーまたはポリ（ビニルピロリドン）ベースのポリマーから選択されるポリマーを含むものである。
【０１４５】
一部の態様では、本開示により、ウェスタンブロットアッセイと関連するタンパク質またはペプチドの検出を提供する。ウェスタンブロッティングは、タンパク質を、質量および／または長さにより典型的にはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離し、次いで、例えばニトロセルロースまたはフルオロポリマー、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）で構成された膜上に転写し、標識手順を用いて可視化するタンパク質解析方法である。本開示において、Ｐドットによりウェスタンブロット解析を用いて５０ピコグラムという少量のタンパク質の検出が得られることが示されている（例えば、実施例５参照）。
【０１４６】
一部の態様では、本開示により、ウェスタンブロットにおいてポリマードットを用いたタンパク質の超高感度蛍光イメージングが可能である。一部の特定の態様では、明るくてコンパクトなオレンジ色発光半導体ポリマードットＣＮ−ＰＰＶが使用される。
【０１４７】
一部の特定の態様では、タンパク質またはペプチドはゲル電気泳動を用いて分離される。本開示のさらなる態様では、タンパク質およびペプチドはキャピラリー電気泳動を用いて分離され、この場合、タンパク質またはペプチドはキャピラリー内で分離され、標識される。該方法はキャピラリー空間内で行なわれる以外は標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離で行なわれるものと同様である。
【０１４８】
ゲル電気泳動中、タンパク質はサイズに従ってゲル中で分離される。次いで、サイズ範囲すなわち「バンド」がゲル中から膜上に転写され得る。一部の態様では、タンパク質またはペプチドは膜に、当該技術分野でエレクトロブロッティングとして知られている手法で電流を用いてタンパク質をゲルから膜上に引き出して転写される。他の態様では、毛管力を用いてタンパク質をゲルから膜上に移動させ得る。本開示の他の態様では、タンパク質をゲルから膜に転写する他の方法が使用され得る。
【０１４９】
一部の態様では、タンパク質をニトロセルロース膜上に配置させる。他の態様では、タンパク質を、フルオロポリマー（例えば、ＰＶＤＦ）で構成された膜上に配置させる。任意の適当な膜が本開示に従って使用され得る。
【０１５０】
他の態様では、ドットブロットアッセイにおけるＰドットを用いた分子の超高感度蛍光イメージングのための方法を提供する。ドットブロットアッセイでは、検出対象のタンパク質またはペプチドを最初に分離しない。そうではなく、未分離の試料を直接、膜上にドットとして適用し、標識手順を用いて可視化する。本開示において、Ｐドットにより、ドットブロット解析を用いて２ピコグラムより少ない量のタンパク質の検出が得られることが示されている。
【０１５１】
慣用的なウェスタンブロッティングでは１桁ピコグラムレベルの検出限界が観測されている。トランスフェリンおよびトリプシンインヒビターでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜への転写後、５０ピコグラムレベルの検出が観測されている。多くの利点の中でも、本発明には、従来の蛍光プローブを用いる慣用的な手順と比べてなんらさらなる設備または時間が必要とされない方法が包含される。
【０１５２】
本開示の一部態様では、解析は、１種類以上の生物学的細胞、組織、体液または他の試料中に含まれた試料に対して行なわれる。他の態様では、解析は、１種類以上の生物学的細胞、組織、体液または他の試料から収集された後の試料に対して行なわれ得る。タンパク質またはペプチドは任意選択で例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法によって分離され得、その後、該タンパク質またはペプチドは、対象のタンパク質またはペプチドに特異的なバイオコンジュゲートさせたＰドットを用いて検出され得る。
【０１５３】
タンパク質またはペプチドは組織、細胞または体液試料から、限定されないが凍結／解凍、超音波処理、高圧によるホモジネーション、濾過、透過および遠心分離が挙げられ得る方法によって収集され得る。一部の態様では、収集されたタンパク質またはペプチドには、解析前に１回以上の単離または精製工程も行なわれ得る。
【０１５４】
一部の態様では、解析は、種々のタンパク質の不均一系ミックスを含む試料に対して行なわれ得る。他の態様では、解析は精製タンパク質に対して行なわれ得る。
【０１５５】
一部の態様では、試料は解析前に、例えば、ゲル電気泳動または試料の分離に適した別の方法によって分離される。一部の態様では、タンパク質またはペプチドは解析前に、その質量および／または電荷に基づいて分離される。
【０１５６】
一部の態様では、Ｐドットを液体中に縣濁させ、この液体を、第２の液体に縣濁させたもの、または表面上に配置したもののいずれかである試料と物理的に接触させる。一部の態様では、試料を、膜を含む表面上に配置する。
【０１５７】
一部の態様では、Ｐドットを表面上に配置し、この表面を、液体中に縣濁させた試料と物理的に接触させる。一部の態様では、Ｐドットが配置される表面は膜を含む。
【０１５８】
一部の態様では、免疫沈降アッセイが行なわれ、この場合、Ｐドットは表面上に配置され、液体中に縣濁させたタンパク質試料と物理的に接触される。この態様によれば、タンパク質試料と対応するＰドット間の接触により該タンパク質が該表面に結合性Ｐドットによって付着することが引き起こされる。
【０１５９】
種々の態様において、本明細書に記載のＰドットは、励起源によって適正に誘導された場合、蛍光を発する。一部の特定の態様では、存在するＰドットの量が測定され、続いて、所与の対象の被検質（例えば、対象のタンパク質など）の量と相関され得る。したがって、本明細書に記載の方法ではＰドットの蛍光を誘導するために励起光源が使用され、次いで、この蛍光が測定され、試料濃度と相関され得る。種々の態様では、電磁放射線（例えば、赤外線、可視光または紫外線）を用いてＰドットからの電磁放射を誘発し、放射されたシグナルを用いて試料中に存在する標的分子の量が評価され得る。一部の態様では、電磁放射線源にはレーザー、ＬＥＤ、ランプ、スペクトルフィルターまたはマルチクロイック（ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｉｃ）ミラーが包含され得る。一部の実施形態では、励起光源は、ゲルイメージング装置、顕微鏡または他の適当な装置の一構成要素であり得る。所与のＰドットの化学的および物理的特性は、他の光学特性の中でも励起波長および発光波長が微調整されるように調整され得る。
【０１６０】
一部の態様では、Ｐドットの励起を誘導する電磁放射線のピーク波長は約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍである。一部の場合では、例えばマルチプレックス解析では試料に１つより多くの励起スペクトルが当てられ得る。
【０１６１】
一部の態様では、検出されるシグナルのピーク波長は約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約９５０ｎｍ〜約１０５０ｎｍ、約１０００ｎｍ〜約１１００ｎｍ、約１０５０ｎｍ〜約１１５０ｎｍ、約１１００ｎｍ〜約１２００ｎｍ、約１１５０ｎｍ〜約１２５０ｎｍ、または約１２００ｎｍ〜約１３００ｎｍである。
【０１６２】
一部の態様では、アッセイは、５００ピコグラム未満、４００ピコグラム未満、３００ピコグラム未満、２００ピコグラム未満、１００ピコグラム未満、５０ピコグラム未満、４０ピコグラム未満、３０ピコグラム未満、２０ピコグラム未満、１０ピコグラム未満、５ピコグラム未満、４ピコグラム未満、３ピコグラム未満、２ピコグラム未満、または１ピコグラム未満の標的分子（例えば、タンパク質）が検出されるのに充分高感度である。
【０１６３】
検出感度および光安定性の改善などの多くの利点の中でも、本発明には、従来の蛍光プローブを用いる慣用的な手順と比べてなんらさらなる設備または時間が必要とされない方法が包含される。
【０１６４】
本明細書に記載のポリマードットを用いるウェスタンブロット解析は既存の方法と比べて、一部においてＰドットの卓越した発光特性および特異性に由来する大きな利点を有する。コンジュゲート型Ｐドットの使用により、既存の方法と比べて卓越した発光特性、例えば、蛍光ベースの検出法のための高い明度がもたらされる。一部の態様では、コンジュゲート型Ｐドットの使用により、対象の標的分子、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質またはペプチドなどに対する卓越した特異性がもたらされる。
【０１６５】
本明細書で用いる場合、「特異性」は、コンジュゲート型Ｐドットがその標的に対して、該ドットが物理的に接触している他の成分に対してよりも大きな結合親和性を有することをいう。コンジュゲート型Ｐドットは、コンジュゲート型Ｐドットとその標的の平衡定数が、コンジュゲート型Ｐドットと該ドットが物理的に接触しているその他の成分の平衡定数の平均より大きい場合、標的に特異的である。特異性が大きいほど他の成分と比べて標的に対する結合親和性が大きいことを示し、これにより標的のアッセイにおける検出感度の改善がもたらされる。好都合には、本発明の方法では、本開示の標的分子、例えばタンパク質またはペプチドなどに対して非常に高い特異性が示される。
【０１６６】
本開示の一部の態様では、コンジュゲート化したポリマードットの非特異的吸着および／または結合特性を改変するためにブロッキング剤が使用される。一部の態様では、ブロッキング剤はポリマードットと表面上または膜上への吸着に関して競合し、それによりＰドットの非特異的吸着の発生が低減される。一部の態様では、ブロッキング剤はポリマードットと１種類以上の妨害タンパク質の結合に関して競合する。ブロッキング剤と表面、膜およびタンパク質との相互作用により、コンジュゲート化したポリマードットの吸着または結合に利用可能な表面、膜およびタンパク質の量が低減される。ブロッキング剤により、標的タンパク質に結合していないポリマードットからの発光量（すなわち、ノイズ）が低減されるが、標的タンパク質に結合しているポリマードットからの発光量（すなわち、シグナル）に対する影響は最小限であるため、ウェスタンブロットまたは他のタンパク質解析の信号対ノイズ比が改善される。
【０１６７】
一部の態様では、ブロッキング剤はアルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むものであり得る。一部の態様では、ブロッキング剤は乳ベースの生成物、例えば脱脂粉乳を含むものであり得る。一部の態様では、ブロッキング剤はカゼインベースの生成物、例えばＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むものであり得る。一部の態様では、ブロッキング剤にさらに、デタージェント、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘが含められ得る。
【０１６８】
一部の態様では、コンジュゲート型Ｐドットの使用では、該Ｐドットによる表面への、例えば、試料が配置された膜への非特異的吸着レベルが比較的低いため検出感度が改善される。一部の特定の態様では、非特異的吸着はブロッキング剤を使用することにより最小限になり、ブロッキング剤は、Ｐドットを用いた標的タンパク質またはペプチドの正確な検出を妨害し得る非特異的結合をブロックする任意の薬剤である。例えば、ブロッキング剤は、好都合には、Ｐドットおよび／または生体分子が物理的に接触し得る表面上へのＰドットおよび／または生体分子の非特異的吸着をブロックするものである。
【０１６９】
一部の態様では、分離はゲルの使用を含むものであり、ここで、ゲルはポリアクリルアミド、アガロース、デンプンまたはこれらの組合せを含む。一部の態様では、分離はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を含む。一部の特定の態様では、該方法で膜が使用され、膜はニトロセルロース膜またはフルオロポリマー膜を含む。さらなる態様では、フルオロポリマーがＰＶＤＦである。
【０１７０】
一部の特定の態様では、検出は、ピコグラム量の分離された該タンパク質の検出を含む。さらなる態様では、検出は、２ピコグラム未満の分離された該タンパク質の検出を含む。一部の特定の態様では、該方法は、さらに、電磁放射線源を用いてポリマードットを励起させることを含む。一部の態様では、電磁放射線源はレーザー、ランプ、ＬＥＤまたはこれらの組合せを含む。さらなる態様では、ポリマードットを励起させる前に、電磁放射線をスペクトルフィルター、マルチクロイックミラーまたはこれらの組合せに通す。
【０１７１】
一部の態様では、試料を励起させる電磁放射線のピーク波長が約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍである。一部の態様では、電磁放射線の２つ以上のピーク波長で試料を励起させる。
発色団ポリマードットを用いた解析のための組成物およびキット
【０１７２】
本開示の一部の態様では、ポリマードットを用いた解析のためのキットを提供する。また、種々の態様では、本明細書において提供する組成物は各々、キットにおける使用のために構成され得る。一部の態様では、組成物またはキットは、アッセイを行なうための生体分子にコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。一部の態様では、キットによりエンドユーザーに、慣用的な実験室設備および手順を用いてより高感度のアッセイを行なうための方法および試薬が提供される。
【０１７３】
この試験キットは任意選択で、標準および／または対照としての使用のための物質を備え得る。
【０１７４】
種々の態様において、本開示により、標的タンパク質またはペプチドの絶対濃度もしくは相対濃度を測定するため、または有無を調べるためのキットを提供する。一部の態様では、本発明のキットは被検体由来の試料を解析するために使用され得る。一部の態様では、キットは、例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、濾過、析出、液抽出法もしくは他の抽出法、免疫沈降またはこれらの組合せなどの分離方法と併用して使用され得る。
【０１７５】
さらなる一実施形態では、本開示のキットは任意選択で、本開示に従ってタンパク質またはペプチドを分離および／または検出するための使用説明書を備え得る。また、使用説明書には、どのようにしてキットを使用するか、どのようにして試料を調製するか、使用対象試料の種類、どのようにして解析し、結果を解釈するかの使用説明書も包含され得る。
【０１７６】
種々の態様において、本開示により、ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットを含む組成物およびキットを提供する。さらなる態様では、該組成物およびキットはブロッキング剤を備えている。
【０１７７】
一部の態様では、組成物またはキットは、アッセイの特性を改変する薬剤を備えている。
【０１７８】
一部の態様では、組成物またはキットは、試料中に存在し得る標的分子以外の成分とのＰドットおよび／または生体分子の非特異的結合をブロックするブロッキング剤を備えている。
【０１７９】
一部の特定の態様では、本開示の組成物およびキットは、コンジュゲート化したポリマードットまたはコンジュゲート化していないポリマードットの非特異的吸着特性を改変し得るブロッキング剤を有する。さらなる態様では、ブロッキング剤はポリマードットと表面上または膜上への吸着に関して競合するか、またはブロッキング剤はポリマードットと１種類以上の生体分子の結合に関して競合する。
【０１８０】
一部の態様では、組成物またはキットはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むものである。
【０１８１】
一部の特定の態様では、本開示の組成物およびキットは、半導体ポリマー、非半導体ポリマーまたはそのブレンドから選択されるポリマーを含むポリマードットを含むものである。
【０１８２】
一部の態様では、組成物およびキット内のポリマードットは、３０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１５ｎｍ未満、１０ｎｍ未満または５ｎｍ未満の限界寸法を有する。
【０１８３】
一部の態様では、組成物またはキットは、中間の官能化工程、例えばカルボキシル化を受けたＰドットを含むものである。
【０１８４】
一部の特定の態様では、本開示のキットにさらに、ポリマードットを生体分子にコンジュゲートさせるための試薬を備える。
【０１８５】
一部の態様では、組成物またはキットは、機能または他の有益性、例えば標的分子に対する結合親和性をもたらす１種類以上の生体分子にコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。
【０１８６】
一部の態様では、本開示の組成物およびキットは、ポリマードットにコンジュゲートさせたコンジュゲーション生体分子を有する。該コンジュゲーション生体分子はタンパク質または他の適当な生体分子であり得る。さらなる態様では、生体分子は抗体またはアビジンであり得る。
【０１８７】
一部の態様では、組成物またはキットは、標的タンパク質に特異的に結合する一次抗体にコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。一部の態様では、キットは、標的一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。一部の態様では、キットは、ビオチンおよび／またはビオチン化標的に特異的に結合するアビジンにコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。一部の態様では、キットは、Ｐドットの他の特性、例えば、そのサイズ、蛍光、疎水性、非特異的結合または吸着特性などを改変する１つ以上の分子にコンジュゲートさせたＰドットを含むものである。
【０１８８】
一部の態様では、組成物またはキットは、エンドユーザーがアッセイの実施における使用のためにＰドットをタンパク質またはペプチドにコンジュゲートさせるように構成された試薬を備えている。一部の態様では、キットは、Ｐドット（例えば、ＣＮ−ＰＰＶまたは本明細書およびＷＯ２０１３／１０１９０２に記載のＢＯＤＩＰＹ誘導体）、生体分子（例えば、ストレプトアビジン）、ＰＥＧおよび／またはＥＤＬを含むものである。他の態様では、キットは、他のＰドット、生体分子、およびエンドユーザーがアッセイの実施における使用のためにＰドットを生体分子にコンジュゲートさせるように構成された試薬を含むものである。
【０１８９】
種々の態様において、本開示により、ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットを含む組成物を提供する。他の態様では、本開示により、ウェスタンブロット解析のためのコンジュゲート化したポリマードットおよび少なくとも１種類のブロッキング剤を含むキットを提供する。他の態様では、本開示により、ポリマードット、コンジュゲーション生体分子およびブロッキング剤を含む、ウェスタンブロット解析を行なうためのキットを提供する。
【０１９０】
他の態様では、本開示により、タンパク質またはペプチドの解析を行なうためのキットであって、ポリマードット、コンジュゲーション生体分子およびブロッキング剤を含むキットを提供する。一部の態様では、ポリマードットは半導体ポリマー、非半導体ポリマーまたはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである。さらなる態様では、ポリマードットはＢＯＤＩＰＹ誘導体を含むものである。なおさらなる態様では、ＢＯＤＩＰＹ誘導体は、式（Ｉ）：
【化１１】
0006418698.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂは各々、独立して、水素、アルキル、アラルキル、アリールおよびアルコキシ−アリールから選択される）の構造を有し、ここで、ＢＯＤＩＰＹ誘導体は発色団ポリマーに、Ｒ１、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ４ＡおよびＲ４Ｂもしくはこれらの組合せとの結合によって一体化される。一部の特定の態様では、ポリマードットはＣＮ−ＰＰＶからなるポリマーを含むものである。
【０１９１】
一部の態様では、ポリマードットは、ポリ（（メタ）アクリル酸）ベースのポリマー、ポリジエンベースのポリマー、ポリ（エチレンオキシド）ベースのポリマー、ポリイソブチレンベースのポリマー、ポリスチレンベースのポリマー、ポリシロキサンベースのポリマー、ポリ（フェロセニルジメチルシラン）ベースのポリマー、ポリ（２−ビニルナフタレン）ベースのポリマー、ポリ（ビニルピリジン）ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−メチルビニルピリジニウムヨージド）ベースのポリマーまたはポリ（ビニルピロリドン）ベースのポリマーから選択されるポリマーを含むものである。
【０１９２】
種々の態様において、ポリマードットは、ポリ（アクリル酸−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−ｂ−アクリル酸）、ポリ（アクリル酸ナトリウム−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸−ｂ−メタクリル酸ネオペンチル）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸メチル−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリ（メタクリル酸ネオペンチル−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ｔ−ブチル−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ブタジエン（１，２付加）−ｂ−メチルアクリル酸、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−エチレンオキシド、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−アクリル酸ナトリウム）、ポリ（ブタジエン（１，４付加）−ｂ−Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソプレン−ｂ−エチレンオキシド）およびポリ（イソプレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ブチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ｃ−カプロラクトン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−ラクチド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ニトロベンジル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−アクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸ｔ−ブチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸テトラヒドロフルフリル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−２−メチルオキサゾリン）、ポリ（イソブチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（イソブチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（イソブチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸セシウム）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ブロック接合部で切断可能なポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）酸、ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（スチレン���ルホン酸−ｂ−メチルブチレン）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムヨージド）、ポリ（スチレン−ｂ−プロピルアクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリル酸ナトリウム）ポリ（スチレン−ｂ−メタクリル酸ナトリウム）、ポリｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリルアミド）、ポリ（スチレン−コ−ｐ−クロロメチルスチレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（スチレン−ｂ−メチルブチレン−コ−イソプレンスルホン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−メタクリル酸）、ポリ（フェロセニルジメチルシラン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルナフタレン−ｂ−アクリル酸）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（２−ビニルピリジン−ｂ−メチルアクリル酸）、ポリ（Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（Ｎ−メチル  ４−ビニルピリジニウムヨージド−ｂ−メタクリル酸メチル）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン−ｂ−Ｄ／Ｌ−ラクチド）、ＰＤＨＦ、ＰＦＯ、ＰＦＰＶ、ＰＦＢＴ、ＰＦＴＢＴ、ＭＥＨ−ＰＰＶ、ＣＮ−ＰＰＶ、ＰＰＥもしくはこれらの組合せから選択されるポリマーを含むものである。
【０１９３】
一部の態様では、ポリマードットは高分子電解質コーティングに囲まれている。一部の態様では、高分子電解質コーティングは、ポリ（スチレンスルホネート）、ポリホスフェート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリレート−コ−マレエート、ポリアクリルアミド、キトサン、多糖、ポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリペプチドからなる群より選択される高分子電解質を含むものである。さらなる態様では、高分子電解質コーティングが高分子電解質ポリマーを含むものであり、該高分子電解質ポリマーの各反復単位が、カルボキシル、スルホネート、ホスフェート、アミノ、ヒドロキシルおよびメルカプトからなる群より選択される荷電基を含むものである。
【０１９４】
一部の態様では、ポリマードットは、該ポリマードットに結合した官能基を含むものである。一部の特定の態様では、官能基は、疎水性官能基、親水性官能基またはこれらの組合せから選択される。種々の態様において、官能基がバイオコンジュゲーションに適したものである。一部の態様では、官能基は、アルデヒド、アルケン、アルキル、アルキン、歪みアルキン、アミノ、アジド、カルボニル、カルボキシル、シアノ、シクロオクチン、ジエノ、エステル、スクシンイミジルエステル、ハロアルキル、ヒドロキシル、イミド、ケトン、マレイミド、メルカプト、ホスフェート、ホスフィン、スルフェート、スルホネートまたはこれらの組合せから選択される。一部の態様では、コンジュゲーション生体分子をポリマードットにコンジュゲートさせる。さらなる態様では、生体分子はタンパク質である。なおさらなる態様では、生体分子は抗体またはアビジンである。
【０１９５】
一部の態様では、ブロッキング剤はコンジュゲート化したポリマードットの非特異的吸着特性を改変するものである、またはブロッキング剤がポリマードットの非特異的吸着特性を改変するものである。さらなる態様では、ブロッキング剤はポリマードットと表面上または膜上への吸着に関して競合する。またさらなる態様では、ブロッキング剤はポリマードットと１種類以上の生体分子の結合に関して競合する。
【０１９６】
一部の態様では、キットはさらに、ポリマードットを生体分子にコンジュゲートさせるための試薬を備えている。
【０１９７】
一部の特定の態様では、キットは、ニトロセルロース膜またはフルオロポリマー膜から選択される膜を備えている。さらなる態様では、フルオロポリマーがＰＶＤＦである。
【０１９８】
一部の態様では、キットはさらにＰＥＧ、ＥＤＬもしくはこれらの組合せを備えている。
【０１９９】
発色団ポリマードットを用いた解析のためのシステム
本開示の一部の態様では、ポリマードットを用いたウェスタンブロット解析を行なうためのシステムを提供する。種々の態様において、システムは、アッセイを行なうための生体分子にコンジュゲートさせたＰドット、ゲル、分離プラットフォーム、電磁放射線源、検出器、および実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータ（該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析して、対象の標的タンパク質またはペプチドを検出する、および／またはその濃度が測定することをさせる）を備えたものであり得る。一部の態様では、分離プラットフォームはゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を備えている。一部の態様では、システムはさらに膜を備えている。一部の態様では、Ｐドットが発するシグナルの強度が、タンパク質もしくはペプチドの検出および／またはタンパク質もしくはペプチドの濃度の計算に使用される。
【０２００】
一部の態様では、該システムにより、タンパク質試料をタンパク質の質量または電気泳動によって分離可能な他の特性に従って分離するためのゲルおよび電気泳動プラットフォームを提供する。ゲルとしては、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、デンプンもしくはこれらの組合せで構成されたゲルが挙げられ得る。ゲルとしては、さらに、ＳＤＳ、尿素、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ＤＭＳＯ、グリオキサール、水酸化メチル水銀もしくはこれらの組合せで構成されたゲルが挙げられ得る。電気泳動プラットフォームにはゲル、およびこのゲルが浸漬されたバッファー溶液が保持される。電気泳動プラットフォームは非導電性プラスチックなどの絶縁材で構成され得る。電気泳動プラットフォームは、タンパク質をゲルマトリックス中で移動させ、タンパク質の質量または他の分離可能な特性に従ってタンパク質を分離させるために使用され得る起電力を発生させるための電流源を含むもの、または該電流源に接続されるように構成されたものであり得る。
【０２０１】
本明細書においてさらに記載するように、タンパク質を検出するためのＰドットが発するシグナルは、任意の適当な様式によって発生させ、解析され得る。一部の態様では、該システムにより、タンパク質試料と、標的タンパク質に結合する生体分子にコンジュゲートさせたＰドットとを配置する膜を提供する。膜としては、ニトロセルロースまたはフルオロポリマー、例えばＰＶＤＦで構成された膜が挙げられ得る。
【０２０２】
一部の態様では、該システムにより、標的タンパク質に結合しているＰドットに対する励起源としての機能を果たすように構成された電磁放射線源を提供する。一部の態様では、電磁放射線源としてはレーザーが挙げられる。一部の態様では、レーザーが発するピーク波長は約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍである。一部の態様では、相違するピーク波長を有する２種類以上のレーザーが使用され得る。
【０２０３】
一部の態様では、電磁放射線源としては発光ダイオード（ＬＥＤ）が挙げられる。ＬＥＤは半導体光源である。ＬＥＤのアノードリード線が、少なくともＬＥＤの順電圧降下の分、カソードリード線よりもよりプラスである電圧を有する場合、電流が流れる。電子はデバイス内で正孔と再結合することができ、光子の形態のエネルギーを放出する。光の色（光子のエネルギーに対応している）は半導体のエネルギーバンドギャップによって決定される。一部の態様では、ＬＥＤが発するピーク波長は約２００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ〜約９５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍである。一部の態様では、相違するピーク波長を有する２種類以上のＬＥＤが使用され得る。
【０２０４】
一部の態様では、電磁放射線源としては、ランプ、例えば、水銀ランプ、ハロゲンランプ、金属ハライドランプ、または他の適当なランプが挙げられる。一部の態様では、ランプから放射される光は、光フィルタリング装置によってスペクトルフィルタリングされる。一部の態様では、光フィルタリング装置は、フィルター、例えば、特定の範囲内に含まれる波長の光だけ、Ｐドットを含む試料に向かって通過することを許容するバンドパスフィルターを含むものである。一部の態様では、光フィルタリング装置は、特定の範囲内に含まれる波長の光だけ、Ｐドットを含む試料に向かって指向されることが許容されるように光を相違するスペクトル成分に分けることができるマルチクロイックミラーを含むものである。
【０２０５】
一部の態様では、光フィルタリング装置を通過する最長波長は３００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、９００ｎｍ未満または１０００ｎｍ未満である。
【０２０６】
一部の態様では、光フィルタリング装置を通過する最短波長は２００ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、または９００ｎｍより大きい。
【０２０７】
本開示のシステムは、さらに、Ｐドットが発するシグナルが解析されるように構成された検出器およびコンピュータを含むものである。検出器としては、シグナル強度、信号対ノイズ比および／または対象の他の特性を解析するための検出器が挙げられ得る。本明細書に記載の方法は、一般的に、光学的情報、例えば画像が検出および解析され得る任意の既知のシステムと適合性である。
【０２０８】
一部の態様では、該システムにより、標的タンパク質に結合しているＰドットが発する１つ以上のシグナルを検出する検出器を提供する。一部の態様では、検出器はゲルイメージング装置、例えば、ＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９０００  Ｇｅｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。一部の態様では、検出器は、顕微鏡、例えば落射蛍光顕微鏡を含むものである。一部の態様では、検出器は、デジタルチップ上でシグナルを画像に積分し得るカメラ、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを含むものである。
【０２０９】
一部の態様では、該システムにより、実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータを提供する。一部の態様では、該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析することをさせ、対象の標的タンパク質が検出される、および／またはその濃度が測定される。
【０２１０】
プロセッサの例としては、限定されないが、検出器で取得された情報が格納されるパーソナルコンピューティングデバイス、および該情報を有するパーソナルコンピューティングデバイスで実行されるソフトウェアが挙げられる。他の態様では、情報プロセッサまたはそのコンポーネントは、検出器に、例えば、カメラで取得した光学的情報を永久または一時的のいずれかで格納するカメラに埋め込まれたチップに埋め込まれていてもよい。他の態様では、情報プロセッサおよび検出器は、アッセイにおいてＰドットが発するシグナル、例えば光学シグナルを取得するとともに格納する完全に一体化されたデバイスの一構成要素であってもよい。
【０２１１】
一部の態様では、該システムにより、シグナルを取得し、保存し、解析するためのコンピュータ可読記憶媒体を提供する。コンピュータ可読記憶媒体には命令が格納されており、該命令は、コンピュータの１つ以上のプロセッサによって実行される場合、コンピュータに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析して、対象の標的タンパク質を検出する、および／またはその濃度を測定することをさせる。
【０２１２】
また別の態様では、Ｐドットが発するシグナルを解析してタンパク質を検出するため、および／またはタンパク質の濃度を計算するためのシステムを提供する。該システムは、１つ以上のプロセッサ、および該１つ以上のプロセッサによって実行可能な命令を含むメモリデバイスを含むものである。命令が１つ以上のプロセッサによって実行されると、該システムでは少なくともユーザー入力が受信されてシグナルが解析される。該システムは、本開示の方法の態様が行なわれるように、例えば、シグナルの強度が測定されてタンパク質標的の濃度が求められるように構成されたものであり得る。また、該システムによりユーザーにデータを提供する。ユーザーに提供されるデータとしては、１種類以上のタンパク質の濃度が挙げられ得る。
【０２１３】
一部の態様では、本明細書に記載の方法を行なうためにコンピュータが使用され得る。種々の態様において、コンピュータは、上記に例示して説明したシステムまたは方法のいずれかを実行するために使用され得る。一部の態様では、コンピュータは、いくつかの周辺サブシステムとバスサブシステムを介して通信するプロセッサを含むものであり得る。このような周辺サブシステムとしては、メモリサブシステムおよびファイルストレージサブシステムを含むストレージサブシステム、ユーザーインターフェイス入力デバイス、ユーザーインターフェイス出力デバイス、ならびにネットワークインターフェイスサブシステムが挙げられ得る。
【０２１４】
一部の態様では、バスサブシステムにより、コンピュータの種々のコンポーネントおよびサブシステムが予定通りに互いに通信すること可能にするための機構が提供される。バスサブシステムは、単一のバスを含むものであっても多数のバスを含むものであってもよい。
【０２１５】
一部の態様では、ネットワークインターフェイスサブシステムにより、他のコンピュータおよびネットワークとのインターフェイスが提供される。ネットワークインターフェイスサブシステムは、コンピュータの他のシステムとのデータ受信およびデータ送信のためのインターフェイスとしての機能を果たし得る。例えば、ネットワークインターフェイスサブシステムにより、コンピュータをインターネットに接続し、インターネットを用いて容易に通信することが可能となり得る。
【０２１６】
一部の態様では、コンピュータは、ユーザーインターフェイス入力デバイス、例えば、キーボード、ポインティングデバイス、例えば、マウス、トラックボール、タッチパッド、またはグラフィックスタブレット、スキャナー、バーコードスキャナー、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーン、音声入力デバイス、例えば、音声認識システム、マイク、ならびに他の型の入力デバイスを含むものである。一般に、用語「入力デバイス」の使用は、コンピュータに情報を入力するための考えられ得るあらゆる型のデバイスおよび機構を包含していることを意図する。
【０２１７】
一部の態様では、コンピュータは、ユーザーインターフェイス出力デバイス、例えば、ディスプレイサブシステム、プリンタ、ファックス装置、または非表示型ディスプレイ、例えば、音声出力デバイスなどを含むものである。ディスプレイサブシステムは、ブラウン管（ＣＲＴ）、フラットパネルデバイス、例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、または投影デバイスであり得る。一般に、用語「出力デバイス」の使用は、コンピュータから情報を出力するための考えられ得るあらゆる型のデバイスおよび機構を包含していることを意図する。
【０２１８】
一部の態様では、コンピュータは、Ｂａｓｉｃプログラミングおよび構築データを格納するためのコンピュータ可読記憶媒体を提供するストレージサブシステムを含むものである。一部の態様では、ストレージサブシステムに、プロセッサによって実行されると本明細書に記載の方法およびシステムの機能性をもたらすソフトウェア（プログラム、コードモジュール、命令）が格納される。このようなソフトウェアのモジュールまたは命令は１つ以上のプロセッサによって実行され得る。また、ストレージサブシステムにより、本発明に従って使用されるデータを格納するためのリポジトリが提供され得る。ストレージサブシステムとしては、メモリサブシステムおよびファイル／ディスクストレージサブシステムが挙げられ得る。
【０２１９】
一部の態様では、コンピュータはメモリサブシステムを含むものであり、メモリサブシステムはいくつかのメモリ、例えば、命令およびプログラム実行中のデータを格納するためのメインランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ならびに固定長（ｆｉｘｅｄ）命令が格納されるリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含むものであり得る。ファイルストレージサブシステムは、プログラムおよびデータファイルの非一時的永続的（不揮発性）格納を提供するものであり、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ（関連リムーバブルメディアを伴う）、コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学ドライブ、リムーバブルメディアカートリッジ、および他の同様のストレージメディアが挙げられ得る。
【０２２０】
コンピュータは、種々の型のもの、例えば、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、メインフレーム、キオスク、サーバーまたは任意の他のデータ処理システムであり得る。コンピュータおよびネットワークの絶えず変化しているという性質のため、本明細書に含めたコンピュータの説明は、コンピュータの実施形態の実例を示すことを目的とした具体的な一例にすぎないことを意図する。本明細書に記載のシステムよりも多いまたは少ないコンポーネントを有する多くの他の構成も考えられ得る。
【０２２１】
種々の態様において、本開示により、生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；タンパク質またはペプチド分離プラットフォーム；電磁放射線源；検出器；および実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータ（該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析することをさせる）を備えた、タンパク質またはペプチドをアッセイするためのシステムを提供する。
【０２２２】
一部の態様では、タンパク質またはペプチド分離プラットフォームはゲル分離プラットフォームまたはキャピラリー電気泳動分離プラットフォームを含む。
【０２２３】
種々の態様において、本開示により、生体分子にコンジュゲートさせたポリマードット；ゲル；電気泳動プラットフォーム；電磁放射線源；検出器；および実行可能命令が格納されたメモリデバイスを備えたコンピュータ（該命令は、プロセッサによって実行される場合、該プロセッサに：該検出器を動作させて画像を取得すること、該画像を格納すること、および該画像を解析することをさせる）を備えた、ウェスタンブロット解析を行なうためのシステムを提供する。
【０２２４】
一部の特定の態様では、ゲルはポリアクリルアミドゲルを含む。さらなる態様では、膜はニトロセルロースまたはフルオロポリマーを含むものである。またさらなる態様では、フルオロポリマーがＰＶＤＦである。
【０２２５】
一部の態様では、システムの電磁放射線源はレーザー、ランプ、ＬＥＤまたはこれらの組合せを含む。他の態様では、システムは、さらに、スペクトルフィルター、マルチクロイックミラーもしくはこれらの組合せを含むものである。さらなる態様では、検出器はゲルイメージング装置を備えている。またさらなる態様では、検出器は顕微鏡を備えている。なおさらなる態様では、検出器はカメラを備えている。
【０２２６】
本明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、引用により、個々の各刊行物、特許または特許出願が、あたかも具体的に個々に引用により組み込まれて示されているのと同程度に、本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
本発明の任意の装置、デバイス、システムおよびその構成要素の具体的な寸法は意図される用途に応じて容易に変更され得、これは、当業者には本明細書における開示に鑑みると自明であろう。さらに、本明細書に記載の実施例および実施形態は例示の目的のためのものにすぎないこと、ならびにこれらに鑑みて種々の修正および変更が当業者に示唆され得、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることは理解されよう。本明細書に記載の実施形態の数多くの異なる組合せが考えられ得、かかる組合せは本発明の一部であるとみなす。また、本明細書に記載の任意の１つの実施形態に関して論考した特長はすべて、本明細書における他の実施形態における使用のために容易に適合させることができよう。異なる実施形態における同様の特長に対する異なる用語または参照番号の使用は、必ずしも、明示したものとの違いを示すものではない。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の参照によってのみ説明されることを意図し、本明細書に開示した実施形態に限定されない。
【０２２８】
特に指定のない限り、本明細書に記載の方法およびプロセスは任意の順序で行なわれ得る。例えば、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を記載した方法は、まず工程（ａ）、続いて工程（ｂ）、次いで工程（ｃ）で行なわれ得る。あるいは、該方法を、例えば、まず工程（ｂ）の後、工程（ｃ）、次いで工程（ａ）などの異なる順序で行なってもよい。さらに、これらの工程は、具体的な指定のない限り、同時に行っても別々に行ってもよい。
【０２２９】
本明細書において本開示の好ましい態様を示し、説明したが、本開示は、記載した本開示の具体的な態様に限定されず、具体的な態様の変形が行なわれ得るが、なお添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることは理解されよう。また、専門用語の使用は本開示の具体的な態様を説明する目的のためであり、限定を意図するものではないことも理解されよう。実際、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって確立される。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中にそうでないことを明記していない限り、複数の指示対象物を包含している。
【０２３０】
値の範囲を示している場合、該範囲の上限と下限の間の各値（本文中にそうでないことを明記していない限り下限の単位の１０分の１まで）および記載の範囲内の任意の他の記載の値または間の値が本明細書に示した開示内容に包含されていることは理解されよう。このようなより小さい範囲の上限および下限は、独立して該より小さい範囲に含まれ得、また本発明の範囲にも含まれ、記載の範囲では特異的に除外されている限界値（あれば）の対象となる。記載の範囲が限界値の一方または両方を含む場合、含まれた限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本明細書に示した開示内容に包含される。
【実施例】
【０２３１】
例示的態様
実施例１
蛍光性ポリマードットベースのレポーターの特性
この実施例では、新しいオレンジ色発光ポリ［２−メトキシ−５−（２−エチルヘキシルオキシ）−１，４−（１−シアノビニレン−１，４−フェニレン）］（ＣＮ−ＰＰＶ）ポリマー（Ｙｅ，Ｆ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，２０１２，４８，１７７８）で作製したＰドット−ストレプトアビジンコンジュゲートを使用し、ビオチン−コンジュゲート抗体で標識したタンパク質を可視化した。低ピコグラム検出感度が得られた。タンパク質に結合しているＰドットからの蛍光シグナルは、ブロッティング手順の２週間後であっても連続画像において同じままであった。
【０２３２】
ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットを調製するため、ＣＮ−ＰＰＶ（ＡＤＳ  Ｄｙｅｓ  Ｉｎｃ．製）およびポリ（スチレン−コ−無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を各々、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬのストック溶液（１０００ｐｐｍ）を作製した。これらのストック溶液を、１２５μＬのＣＮ−ＰＰＶストック溶液および２５μＬのストックＰＳＭＡ溶液を５ｍＬアリコートのＴＨＦに入れることにより希釈した。この混合物を超音波処理し、浴型超音波装置内で速やかに１０ｍＬの水に注入した。その後、加熱しながら低速窒素流下でＴＨＦを除去した。このナノ析出手順により、Ｐドットの形成がもたらされた。１０ｍＬのＰドット溶液を、加熱しながら窒素流下でさらに濃縮し、５０ｐｐｍの濃度の５ｍＬの最終Ｐドット溶液を得た。さらなる使用の前に、このＰドット溶液を０．２μｍ酢酸セルロースフィルターに通し、溶液中の大きな凝集塊（あれば）を除去した。
【０２３３】
Ｐドットにストレプトアビジンをコンジュゲートさせるため、この５ｍＬのＰドット溶液に、１００μＬのＰＥＧ（水中５％ｗ／ｖ，ＭＷ  ３３５０）、１００μＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）、３００μＬのストレプトアビジン（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中１ｍｇ／ｍＬ）、および５０μＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）（水中１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。溶液をボルテックスで混合し、さらに室温で４時間撹拌した後、１００μＬアリコートの１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）（水中）を添加した。さらに２０分間の撹拌工程後、スクロース（１０％ｗ／ｖ）を添加し、溶液を遠心濾過（フィルターＭＷＣＯ  １００，０００）によって０．５ｍＬの容量まで濃縮した。最後に、Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートを、該濃縮溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ−３００  ゲルカラム（これは、０．１％ＰＥＧ（ｗ／ｖ）と２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で平衡化させる）に通すことによって精製した。Ｐドット−ストレプトアビジンの最終溶液は４００ｐｐｍのポリマー濃度を有し、これはそのＵＶ−可視吸収スペクトルから求めた。
【０２３４】
図１Ａは、ＣＮ−ＰＰＶポリマーの構造ならびにＣＮ−ＰＰＶ  ＰドットおよびＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンＰドットバイオコンジュゲートの光学特性を示す。ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットは、６０％もの高い量子収量および１０ｎｍ直径のＰドットで約２．３×１０−１３ｃｍ２の吸収断面積を有する。その蛍光寿命は１．５ｎｓである。ピーク発光は５９５ｎｍに存在し、その青色発光類似体と比べてバックグラウンド自家蛍光が少ないことを示す。
【０２３５】
図１Ｃは、ＣＮ−ＰＰＶ  ＰドットおよびＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンＰドットの代表的な透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）画像を示す。図１Ｄは、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したサイズを示し、ストレプトアビジンとのバイオコンジュゲーション後、直径の約２ｎｍの増大を示す。ストレプトアビジンに対するＰＳＭＡの比（モル濃度で１：２０）およびＰドットのサイズに基づき、１０ｎｍ直径のＰドット１個あたり約５〜１０個のストレプトアビジン分子と推定された。比較として、Ｑｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジン（約１５ｎｍの直径を有する；量子収量＝３０％）を使用した。その発光はＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットのものと非常に近く、その吸収断面積は約２．３×１０−１５ｃｍ２であり、蛍光スキャナーで使用されている励起波長である４７３ｎｍで効率的に励起され得る（図１Ｂ）。
【０２３６】
実施例２
一次抗体を検出するための蛍光性ポリマードットの使用
この実施例では、ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットコンジュゲートを用いたヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧの検出を説明する。ドットブロットの形態のポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）上に直接タンパク質を配置することにより、簡便な定量的タンパク質検出試験が可能となり、これにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから膜上へのタンパク質の転写に伴う不確実性が回避された。ドットブロットを用いてプローブ結合タンパク質の検出下限を調べた。
【０２３７】
抗体−タンパク質結合定数に伴う不確実性をさらに最小化するため、ビオチン化ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）ドットブロットを、Ｑｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジンまたはＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートのいずれかで可視化した。この比較を行うため、ビオチン化ＧＡＭ  ＩｇＧ（ＴＴＢＳバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中）を所望の濃度に希釈し、この溶液の２μＬの液滴を乾燥ＰＶＤＦ膜上に置いた。ブロットを１．５時間風乾し、その後、膜をメタノール中への１分間の浸漬によって活性化させ、洗い流し、水中で絶えず振り動かして、次いでＴＴＢＳバッファー中でそれぞれ２分間洗浄した。次いで、非特異的結合を抑制するため、絶えず振り動かしながら膜を３％ＢＳＡ  ＴＴＢＳ（ｗ／ｖ）で室温にて１時間ブロックし、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで２分間洗浄した後、最後に３％ＢＳＡ  ＴＴＢＳ中１ｎＭのＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジン溶液とともにインキュベートした。インキュベーション後、ブロットをＴＴＢＳ中で６回洗浄した（５分ずつ）後、イメージングした。ドットブロットをＴＴＢＳ中にてＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９０００  Ｇｅｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でイメージングし、このとき、４７３ｎｍ波長のレーザーを励起に使用し、５７５ｎｍロングパスフィルターを用いて発光を集めた。この実験で使用したＱｄｏｔおよびＰドットの濃度はどちらも１ｎＭとした。
【０２３８】
図２Ａは、Ｑｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジンとともにインキュベートした種々の濃度のＧＡＭ  ＩｇＧ−ビオチンのドットブロット画像を示す。図２Ｃは、ＧＡＭ  ＩｇＧの量の関数としてのその対応する強度を示す。強度を図２Ｃのｙ軸に示し、図２Ｄはバックグラウンド減算した正規化強度を示す。蛍光プローブとしてＱｄｏｔ  ６０５−ストレプトアビジンでは、液滴２μＬあたり下限２５ピコグラムのＧＡＭ  ＩｇＧが検出されたことがわかる。図２Ｂは、ＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンコンジュゲートとともにインキュベートした種々の濃度のＧＡＭ  ＩｇＧ−ビオチンのドットブロット画像を示す。その対応する強度はＧＡＭ  ＩｇＧの量の関数とし、図２Ｄに示す。Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートでは、検出限界が液滴２μＬあたり１．６ピコグラムまで有意に低くなったことがわかる。したがって、Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートの検出限界はＱｄｏｔ−ストレプトアビジンコンジュゲートのものより一桁高かった。ＧＡＭ  ＩｇＧの添加なしで対照実験を行ない、Ｑｄｏｔ／ＰドットとＰＶＤＦ膜間になんら明白な非特異的結合はみられないことが確認されたことに注目されたい。ポリマードットの非特異的結合は、種々の表面修飾（例えば、ポリマードットにＰＥＧを用いて表面修飾）を用いて、および／または非特異的結合が低減され得るサイズのポリマードットを用いてあつらえられ得る。
【０２３９】
実施例３
標的タンパク質を検出するための蛍光性ポリマードットの使用
この実施例では、蛍光標識ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットコンジュゲートを用いたトランスフェリンおよびトリプシンインヒビターの検出を説明する。次に、Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートを用いて、その一次抗体の存在下でタンパク質を検出した。ここでは、トランスフェリンとトリプシンインヒビター（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）およびその対応するビオチン化抗体を選択した。タンパク質をＴＴＢＳバッファー中で所望の濃度に希釈し、各溶液の２μＬの液滴を乾燥ＰＶＤＦ膜上に置いた。ブロットを１．５時間風乾し、その他の手順は、実施例１および２の上記のドットブロット実験と同一とした。具体的には、膜を活性化させ、洗浄し、ブロックし、次いで、ビオチン化一次抗体（ＴＴＢＳ中１：１０００の希釈度）とともに室温で１時間インキュベートした後、ＴＴＢＳで５回洗浄した（５分ずつ）。次いで、タンパク質ブロットをＣＮ−ＰＰＶ−ストレプトアビジンＰドット溶液（３％ＢＳＡ  ＴＴＢＳ中１ｎＭ）とともにインキュベートし、ＴＴＢＳ中で膜を６回洗浄した（５分ずつ）後、イメージングした。種々の濃度のトランスフェリンおよびトリプシンインヒビターを使用した。両方のタンパク質について一次抗体なしの対照実験を行ない、タンパク質とＰドット−ストレプトアビジン間に非特異的結合がみられるかどうかを調べた（図３Ａおよび３Ｂ）。結果は、液滴２μＬあたり４００ピコグラムという高いタンパク質濃度でもドットブロットからなんら蛍光は検出されなかったことを示す。
【０２４０】
図３Ｃは、ビオチン化一次抗体とＰドットストレプトアビジンを有するトランスフェリンドットブロットの画像を示す。図３Ｅは、トランスフェリン量の関数としての対応するバックグラウンド減算した正規化強度を示す。強度とトランスフェリン量の間に線形依存性がみられた（Ｒ２＝０．９９１５）。対応する一次抗体の存在下でのトランスフェリンタンパク質では、液滴２μＬあたり６．３ピコグラムの検出限界が得られた。
【０２４１】
図３Ｄは、ビオチン化一次抗体とＰドットストレプトアビジンを有するトリプシンインヒビターのドットブロットの画像を示す。トリプシンインヒビターの関数としてのその対応するバックグラウンド減算した正規化強度を図３Ｆに示した。強度とトリプシンインヒビター量の間にも線形依存性が見られた（Ｒ２＝０．９８８９）。その対応する抗体の存在下でのトリプシンインヒビターでは、液滴２μＬあたり２５ピコグラムの検出限界が得られた。なんら特定の理論に限定されないが、タンパク質とその対応する抗体間または対応する抗体とＰドットコンジュゲート間の結合効率の違いのため、検出限界がこれらの２つのタンパク質間で異なり得ると考えられる。また、抗体単位１つあたりのビオチン分子の数のばらつきも検出限界の違いによって引き起こされたのであろう。
【０２４２】
実施例４
蛍光性ポリマードットベースのタンパク質検出の長期光安定性
この実施例では、ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドットコンジュゲートの経時的な光安定性の評価を説明する。ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートを用いた場合の感度低下のないブロット反復イメージング能を示すため、ビオチン化ＧＡＭ  ＩｇＧおよびトランスフェリンドットブロットを、標識工程後、６℃でＴＴＢＳバッファー中に１４日間まで保存した。ＧＡＭ  ＩｇＧの検出限界（１．６ピコグラム）および強度とＧＡＭ  ＩｇＧ量間の線形性（Ｒ２＝０．９８１９）は標識直後と同じままであったが、シグナルのばらつきはわずかに増大した（図４Ａ）。また、トランスフェリンドットブロットでも、６℃で１４日間の保存後の検出限界（６．３ピコグラム）および強度とタンパク質量間の線形性（Ｒ２＝０．９９４６）は、標識直後と同じであることがわかった（図４Ｂ）。
【０２４３】
実施例５
蛍光性ポリマードットを用いたウェスタンブロット解析
この実施例では、ウェスタンブロッティング用途におけるタンパク質の可視化のためのＰドット−コンジュゲートの使用を説明する。全ウエスタン−ブロッティング手順を行ない、ブロットを、ＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートを用いて可視化した。ここでは、タンパク質をＬａｅｍｍｌｉバッファー（２０％グリセロール，２．１％ＳＤＳ，０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８，０．７３Ｍ  ２−メルカプトエタノール，ブロモフェノールブルー）中で適切な所望の濃度に希釈し、次いで、溶液を９５〜１００℃の水浴中で５分間加熱し、室温まで冷却し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（トランスフェリンでは１０％アクリルアミド、トリプシンインヒビターでは１５％アクリルアミド＋ブロモフェノールブルーを有する８％アクリルアミドを重層）に負荷した。また、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（１０〜１７０ｋＤａ）を参照として添加した。電気泳動は２００Ｖで約１時間行ない（色素の先端がゲルから消えるまで）、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に６℃にて１００Ｖで１時間転写し、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳで２回洗浄し（５分ずつ）、次いで膜をブロックし、上記の段落に記載のものと同じ様式でインキュベートした。Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートの濃度は１ｎＭとした。
【０２４４】
図５Ａおよび５Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離、ＰＶＤＦ膜への転写、ブロッキング、および対応するビオチン化抗体およびＣＮ−ＰＰＶ  Ｐドット−ストレプトアビジンコンジュゲートとのインキュベーションの全ウェスタンブロッティング手順後のトランスフェリンおよびトリプシンインヒビターの画像を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、それぞれ、トランスフェリンおよびトリプシンインヒビターの量の関数としてのバックグラウンド減算した正規化強度を示す。検出下限は、トランスフェリンおよびトリプシンインヒビターのどちらも５０ピコグラムであった。ドットブロット（図３）と比べて増大したこの検出限界は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜への転写の際のいくらかのタンパク質の減損を反映している。しかしながら、Ｐドットは、ウェスタンブロッティング手順全体と適合性であり、試料を高い検出感度で解析するために使用され得ることが示される。
【０２４５】
従来の蛍光プローブを用いた手順と比べてなんらさらなる設備または時間を必要としない簡単な手順で、低ピコグラム量のタンパク質が検出された。Ｐドットの発光特性が例えば微調整され得ることを考慮すると、この方法はマルチプレックス検出に容易に拡張され得、タンパク質解析に広く応用され得る。
【０２４６】
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、当業者には、かかる実施形態は例示として示したものにすぎないことが自明であろう。本発明から逸脱せずに数多くの変形、変更および置き換えが当業者に思い浮かばれよう。本明細書に記載の発明の実施形態の種々の択一例が本発明の実施において使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲によって本発明の範囲が規定されること、ならびにこの特許請求の範囲の範囲に含まれる方法および構造ならびにその均等物が特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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