(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第一および第二のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、ここで、
前記第一および第二のアンキリン反復ドメインが、それぞれ、ＨＥＲ２の細胞外領域に特異的に結合し、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、そして、前記第二のアンキリン反復ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合し、
前記第一および第二のアンキリン反復ドメインが、同じポリペプチドに含まれており、かつ、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、前記第二のアンキリン反復ドメインのＮ末端側に配置されている（said first ankyrin repeat domain is located N-terminally to said second ankyrin repeat domain）、組換えタンパク質。
【請求項２】
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、ペルツズマブと、ＨＥＲ２との結合に競合しない、および／または
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、トラスツズマブと、ＨＥＲ２との結合に競合しない、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
前記第一のアンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中で、ＨＥＲ２の細胞外領域に、１０-7Ｍ未満のＫｄで結合し、そして、
前記第二のアンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中で、ＨＥＲ２の細胞外領域に、１０-7Ｍ未満のＫｄで結合する、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
（ｉ）組換えタンパク質が、ＢＴ４７４細胞の刺激された増殖を、１００ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害する、および／または
（ｉｉ）組換えタンパク質が、ＢＴ４７４細胞におけるアポトーシスを１００ｎＭ未満のＥＣ５０値で誘導する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質であって、ここで、
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインと、ＨＥＲ２との結合に競合する、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインと、ＨＥＲ２との結合に競合する、
組換えタンパク質。
【請求項６】
少なくとも第一および第二のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、ここで、
前記第一及び第二のアンキリン反復ドメインが、それぞれ、ＨＥＲ２の細胞外領域に特異的に結合し、
前記第一および第二のアンキリン反復ドメインが同じポリペプチドに含まれており、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、前記第二のアンキリン反復ドメインのＮ末端側に配置されており（said first ankyrin repeat domain is located N-terminally to said second ankyrin repeat domain）、そして
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
組換えタンパク質。
【請求項７】
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される、１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６の組換えタンパク質。
【請求項８】
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択される、１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６の組換えタンパク質。
【請求項９】
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される、１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択される、１つのアンキリン反復ドメインと、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６の組換えタンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、および／または、
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号７４〜８２からなる群より選択される、アミノ酸配列を含み、
そして、さらに、
前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳが欠失していてもよく、および
前記アンキリン反復ドメインのＣ−末端から２番目のＬおよび／またはＣ−末端のＮがＡと交換されていてもよい、
請求項６の組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質であって、ここで、
（ｉ）前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号１５〜１８、２１〜２３、３７、３８、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３、１３４および配列番号１５〜１８、２１〜２３、３７、３８、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３、１３４に含まれている３個までのアミノ酸残基が、他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含み、および／または
（ｉｉ）前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号４６、４７、５１、５２、５５および５６ならびに配列番号４６、４７、５１、５２、５５および５６に含まれている３個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、
組換えタンパク質。
【請求項１２】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載された組換えタンパク質であって、ここで、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、
（ｉ）ＫＤＦＱＧＩＴＰＬＨＩＡＡＴＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１６）、
（ｉｉ）配列番号１６に含まれている３個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基で置き換えられている配列、および
（ｉｉｉ）配列番号１６（ここで、
・３番目のＦがＡと交換されていてもよく、
・４番目のＱがＥと交換されていてもよく、
・５番目のＧがＳと交換されていてもよく、
・６番目のＩがＶと交換されていてもよく、
・１１番目のＩがＬと交換されていてもよく、
・１４番目のＴがＱと交換されていてもよく、および／または
・１５番目のＳが、ＮおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよい）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換えタンパク質。
【請求項１３】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載された組換えタンパク質であって、ここで、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、
（ｉ）ＫＤＩＴＧＥＴＰＬＨＨＡＡＤＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）、
（ｉｉ）配列番号１８に含まれている３個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列、および
（ｉｉｉ）配列番号１８（ここで、
・３番目のＩがＶと交換されていてもよく、
・６番目のＥがＤと交換されていてもよく、
・１１番目のＨがＬと交換されていてもよく、
・１４番目のＤがＱと交換されていてもよく、
・１５番目のＳがＨと交換されていてもよく、および／または
・１９番目のＥがＶと交換されていてもよい）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換えタンパク質。
【請求項１４】
少なくとも、第一及び第二のアンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質であって、ここで、
第一及び第二のアンキリン反復ドメインのそれぞれが、ＨＥＲ２の細胞外領域に特異的に結合し、かつ、
前記組換えタンパク質が、ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、組換えタンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載された、組換えタンパク質であって、ここで、
前記組換えタンパク質は、ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性を有する、組換えタンパク質。
【請求項１６】
請求項１４に記載された、組換えタンパク質であって、ここで、
前記組換えタンパク質は、ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、組換えタンパク質。
【請求項１７】
請求項１４に記載された、組換えタンパク質であって、
前記組換えタンパク質は、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドを含む、組換えタンパク質。
【請求項１８】
ＨＥＲ２の細胞外領域に対して、結合特異性を有する、配列番号８７のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質であって、
前記第一のアンキリン反復ドメインが、配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、および／または、
前記第二のアンキリン反復ドメインが、配列番号８１のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
【請求項２０】
請求項１１に記載の組換えタンパク質であって、
前記第一のアンキリン反復ドメインの前記アンキリン反復モジュールが、配列番号１２５または配列番号１２６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換えタンパク質および薬理学的に許容される担体を含んでいる医薬組成物。
【請求項２２】
腫瘍疾患または癌を治療するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物であって、前記腫瘍疾患または癌が、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の増幅、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の過剰発現、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の変異型の発現、および
・トラスツズマブ抵抗性腫瘍におけるＨｅｒ３をコードしている遺伝子の過剰発現、
からなる群より選択される少なくとも１つの特徴によって特徴付けられる、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２２〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記腫瘍疾患または癌が、
・乳癌、
・卵巣癌、
・消化器癌、
・胃癌、
・子宮癌、および
・結腸直腸癌、
からなる群より選択される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する結合特異性を有する反復ドメインを少なくとも２つ含んでいる結合タンパク質、ならびにそのようなＨＥＲ２結合タンパク質をコードしている核酸、そのようなタンパク質を含んでいる医薬組成物および疾患の治療におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ２としても知られているヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２；ヒトＨＥＲ２のユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）番号はＰ０４６２６である）は、ヒトではＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされているタンパク質である。この遺伝子の増幅または過剰発現が特定の癌の病理発生および進行において重要な役割を担っていることが分かっており、また近年になってこの遺伝子は、重要なバイオマーカーおよび疾患の治療における標的として発展してきた。ＨＥＲ２はより広義のＥｒｂＢ受容体ファミリーに属す膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である（ブブリルＥ．Ｍ．およびヤーデンＹ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９（２）、１２４−３４、２００７）。ＥｒｂＢ受容体ファミリーは脊椎動物で保存されており、このファミリーの発見のきっかけとなったＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＨＥＲ１とも呼ばれている；ヒトタンパク質のユニプロットＫＢ／スイスプロット番号はＰ００５３３）や、より最近になって同定された受容体のＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３とも呼ばれている；ヒトタンパク質のユニプロットＫＢ／スイスプロット番号はＰ２１８６０）、さらにはＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４とも呼ばれている；ヒトタンパク質のユニプロットＫＢ／スイスプロット番号はＱ１５３０３）も含んでいる。配列の大部分とドメインの相同性は全てのＥｒｂＢ受容体で共通しており、また、これらのタンパク質は、ホモ二量体（例えばＥｒｂＢ１−ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２−ＨＥＲ２およびＨＥＲ４−ＨＥＲ４）および全ての組み合わせにおけるヘテロ二量体の形で機能する。受容体のホモ−およびヘテロ二量体化はリガンドの結合または受容体の過剰発現に際して起こり、これが次に、細胞内受容体キナーゼドメインを自己リン酸化によって活性化する。これがその後、下流への細胞内シグナル伝達および生体反応の引き金となる。その他のＥｒｂＢ受容体とは異なり、ＨＥＲ２に関してはリガンドが全く知られていないが、二量体を形成することができる。二量体化はＨＥＲ２が過剰発現すると顕著になり、それ以前に起こるはずのリガンド結合を伴わずに活性化される。重要なことには、ＨＥＲ３も活性のある細胞内キナーゼドメインをもたないが、他のＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーとヘテロ二量体化することで非常に強力な下流へのシグナル伝達を誘導する。このようなＨＥＲ３のヘテロ二量体化および活性化は、ＨＥＲ３にリガンドが結合した時に、またはパートナー受容体、例えばＨＥＲ２が強く過剰発現している場合に生じる。
【０００３】
ＨＥＲ２ならびにその他の全ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーは、４つの細胞外ドメインからなる。これらは順に、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと命名されており、ドメインＩＶが細胞外細胞膜に最も近く、ドメインＩが最も遠位にある。リガンドを欠乏させた条件では、ＥｒｂＢ受容体のドメインＩとＩＩＩが分子内で相互作用し、ドメインＩＩを閉じ込める。隣接する２つのＥｒｂＢ受容体の相互作用にはドメインＩＩが必要なため、このドメインＩとＩＩＩの分子内相互作用によって、受容体のホモ／ヘテロ二量体化およびシグナル伝達が阻害される（バーゲスＡ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２（３）、５４１−５５２、２００３）。リガンド結合はドメインＩとＩＩＩの相互作用を妨害し、その結果、受容体の立体構造が屈曲構造（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）から伸張構造（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）へと変化してドメインＩＩが露出したままに維持される。ドメインＩＩが露出していることで、この受容体は他の伸張構造をとっているＥｒｂＢ受容体のいずれとも二量体化でき、シグナル伝達を開始する。興味深いことに、ＨＥＲ２はＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーの中で唯一、常に伸張した立体構造で発見されるメンバーであり、そのため、ドメインＩＩは常に露出していて、ホモおよびヘテロ二量体化するために接近することができる。
【０００４】
ＥｒｂＢ受容体の二量体化と自己リン酸化は、正常な生理機能ならびに疾患に関連する、下流にある多くの重要なシグナル伝達分子の活性化を引き起こす。そのような活性化されるシグナル伝達分子の性質はある程度、活性なＥｒｂＢ受容体二量体の組成に依存する。例えば、ＨＥＲ１−ＨＥＲ１およびＨＥＲ２−ＨＥＲ２ホモ二量体は、下流の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のシグナル伝達および増殖を優先的に活性化するが、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体もＰＩ３Ｋ−シグナル伝達経路（下流のＡＫＴキナーゼの活性化を含む）と、それによる細胞の生存を活性化する。実際に腫瘍細胞では、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３シグナル伝達によるＡＫＴの活性化は生存を促進し、腫瘍細胞を、ＨＥＲ２標的薬、例えばモノクローナル抗体のトラスツズマブに対して抵抗性のあるものにする（バーンズＫら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １２、３９５〜４０２、２００７）。興味深いことに、これらの細胞におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３介在性ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の阻害は律速であり、その結果、細胞死を引き起こす。細胞の増殖および生存以外でも、ＨＥＲ２シグナル伝達は、血管形成や移入などの他の過程の原因となっている。
【０００５】
ＨＥＲ２は、乳癌全体のおよそ２０％で過剰発現している。その臨床的関連から、ＨＥＲ２は、これを標的とする生物製剤、すなわちトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）；ジェネンテック）が開発された最初のＲＴＫとなった。この抗体はＨＥＲ２のドメインＩＶに結合し、複数の機序を介してＨＥＲ２のシグナル伝達を阻害する。その機序はまだ完全には明らかになっていないが、これらには、ＨＥＲ２の発現レベルおよびシグナル伝達の低下、ならびに腫瘍原性が弱まった表現型の誘導をもたらす、腫瘍細胞での受容体の内部移行の誘導が含まれる。トラスツズマブによって生存期間が延び、生活の質が高まることで、乳癌を患った何万人もの女性患者の人生が変わった。しかしながら、トラスツズマブの効果は主に抗増殖性の効果であるため、疾患がより進行した段階においては、腫瘍はトラスツズマブの治療から免れる場合がある。より効果的な治療を開発しようという試みの中で、ドメインＩＩまたはＨＥＲ２を認識する新しい抗体、すなわちペルツズマブ（オムニターグ（登録商標）、パージェタ（登録商標）；ジェネンテック）が生成された。トラスツズマブとは対照的に、この抗体はＨＥＲ２の膜における発現レベルを低下させるために開発されたのではなく、この受容体のドメインＩＩに結合し、ドメインＩＩの二量体化を阻害することによってＨＥＲ２ホモおよびヘテロ二量体の形成を干渉するように開発された。ペルツズマブは単剤治療としては、インビトロおよびインビボで予想外に低い治療効果を有するが、それにも関わらず、トラスツズマブと併用すると相乗効果を示す。そのため、両抗体の併用が、乳癌患者に対する標準的な治療法となってきている（カペランＭ．ら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２４、２７３〜８２、２０１３）。
【０００６】
前臨床および臨床の両方においてトラスツズマブとペルツズマブの併用が有効であったことから、抗腫瘍効果を高めるためには、ＨＥＲ２のドメインＩＩとＩＶの２つを標的とすることが必要であると考えられるようになった。この考えは、ＨＥＲ２のドメインＩＩとＩＶを同時に標的とする、より最近になって生成された他の分子とも一致している。例えば、デンマークの企業であるシンフォゲン（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ）は、ＨＥＲ２のドメインＩＩとＩＶに対する抗体混合物を開発しており、これが前臨床マウス腫瘍モデルよりもいくらか高い効力（つまりトラスツズマブ単独よりも高い効果）を有することを示した。
【０００７】
同様に、米国特許第２０１１／０３３４６０号では、ＨＥＲ２のドメインＩとドメインＩＶに結合する抗体の組み合わせがＤＮＡの合成とＢＴ４７４細胞の生存率に対して相乗効果を示すことが記載されている。さらに米国特許第２０１１／０３３４６０号には、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープ（片方のエピトープはＨＥＲ２のドメインＩに局在し、もう一方のエピトープはＨＥＲ２のドメインＩＶに局在している）に結合する二重特異性抗体についても記載がある。
【０００８】
国際公開第２００９／０６８６２５号では、ＨＥＲ２への結合に関してトラスツズマブと競合する第一の抗体ドメインおよびＨＥＲ２の別のエピトープまたは別の部分に結合する第二の抗体ドメインとを含む二パラトープ抗体構築物の開発が論じられている。興味深いことに、いくつかの構築物はＳＫＢＲ３細胞の増殖に対して拮抗性の効果をもち、その他の構築物は作用性の効果をもっていた。特に、国際公開第２００９／０６８６２５号では、ＨＥＲ２への結合（つまりＨｅｒ２のドメインＩＶとの結合）に関してトラスツズマブと競合する第一の抗体ドメインおよびＨＥＲ２との結合（つまりＨＥＲ２のドメインＩＩとの結合）に関してペルツズマブと競合する第二の抗体ドメインとを含む二パラトープ抗体構築物の開発が論じられている。ドメインＩＶに結合する抗体ドメインがドメインＩＩに結合する抗体ドメインのＮ末端側にクローニングされた構築物はマップ（ｍａｐ）キナーゼ活性化の遮断を示したが、その他の配向（つまり、ドメインＩＩ結合抗体ドメインがＮ末端側にある）ではそのような遮断は観察されなかった。全体として、国際公開第２００９／０６８６２５号では、ＳＫＢＲ３細胞の増殖（作用性もしくは拮抗性）または細胞のシグナル伝達に対して様々な程度の影響を及ぼすが、細胞毒性もアポトーシス作用も示さない、ＨＥＲ２を標的とする様々な二パラトープ抗体構築物が説明されていた。
【０００９】
二価の結合タンパク質、例えばＨＥＲ２を標的としている二価の二重特異性抗体分子または二価のアフィボディーについても記載がある（ニールセンＵ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６０、６４３４〜６４４０、２０００；ステフェンＡ−Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．２０、２３９〜２４８、２００５）。このような分子は同じ結合ドメインを２回組み合わせたものであって、それぞれが同じ標的分子の別のエピトープに結合する２つの結合ドメインを含む二パラトープ分子とは異なる。
【００１０】
抗体由来の治療薬やＳＭＩとは別に、標的分子に特異的に結合させるために使用することができ、その結果、拮抗剤として作用する新規結合タンパク質または結合ドメインがある（例えばビンズＨ．Ｋ．、アムシュトゥッツＰ．およびプルクスンＡ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３、１２５７〜１２６８、２００５）。Ｆｃをもたないそのような新規結合タンパク質または結合ドメインの分類の１つに、設計反復タンパク質または設計反復ドメインに基づくものがある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズＨ．Ｋ．、アムシュトゥッツＰ．、コールＡ．、ストゥンプＭ．Ｔ．、ブリヨンＣ．、フォアーＰ．、グルッターＭ．Ｇ．、およびプルクスンＡ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、５７５〜５８２、２００４；ストゥンプＭ．Ｔ．、ビンズＨ．ＫおよびアムシュトゥッツＰ．、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １３、６９５〜７０１、２００８）。
【００１１】
国際公開第２００２／０２０５６５号に、どのようにすれば反復タンパク質の大規模なライブラリーを構築することができるかと、それらの一般的な用途についてが記載されている。そのような設計反復ドメインは反復タンパク質の構成単位（モジュール）としての性質を利用するもので、かつ、ドメインの疎水性コアを遮蔽することで設計反復ドメインが凝集するのを防ぐＮ末端およびＣ末端キャッピングモジュールを有する場合がある（フォアーＰ．、ストゥンプＭ．Ｔ．、ビンズＨ．Ｋ．およびプルクスンＡ．、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５３９、２〜６、２００３）。この結合タンパク質の新規分類には、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が含まれる。ＨＥＲ２に結合する単一特異性ＤＡＲＰｉｎの生成については既に記載がある（例えばシュタイナーＤ．、フォアーＰ．およびプルクスンＡ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２、１２１１〜１２２７、２００８；ザーンドＣ．、ペコラリＦ．、シュトロウマンＮ．、ワイラーＥ．およびプルクスンＡ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（４６）、３５１６７〜３５１７５、２００６）。
【００１２】
最近になって、ＨＥＲ２を標的とする、二重特異性設計アンキリン反復タンパク質が報告された（ヨストＣｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１、１〜１３、２０１３）。著者らは、短いリンカー（より長いリンカーは同様には機能しなかった）で連結した２つのアンキリン反復ドメイン（１つはＨｅｒ２のドメインＩを標的とし、もう１つがＨｅｒ２のドメインＩＶを標的とする）が結合すると、Ｈｅｒ２のドメインＩＶを標的とするトラスツズマブを単独で使用したのと比較して、ＢＴ４７４細胞により強く細胞毒性が生じることを示している。この二パラトープ反復タンパク質は、２つのＨｅｒ２分子の分子内架橋剤として機能する。つまりこのタンパク質は、２つの膜結合型ＨＥＲ２分子を連結し、それらが他のいずれのＥＧＦＲファミリーともシグナル伝達競合性二量体を形成することができなくなるように歪め、任意のキナーゼの二量体化を阻害し、その結果、観察された細胞毒性を引き起こす。
【００１３】
ＨＥＲ２を標的とすることが疾患、例えば癌の治療に有益なことが先行技術によって示されているが、ＨＥＲ２を標的とし、より高い効力を有する結合タンパク質を生成する必要があることは明らかである。
本発明の目的
【００１４】
本発明の目的は、Ｈｅｒ２に対する新規拮抗剤を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＨＥＲ２が関連する細胞のシグナル伝達を阻害する新規機序を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、ＨＥＲ２介在性細胞増殖を阻害するためのおよび／または細胞（例えば腫瘍細胞）、組織、器官または患者でアポトーシスを誘導するための新規アプローチを提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、二パラトープ反復タンパク質を使用することでＨｅｒ２の２つのドメインに対処する単剤治療法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、癌の新しい治療オプションを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、腫瘍性疾患に対する、効力が高いおよび／または副作用の小さい治療法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、先行技術による治療に反応しない（もしくはは部分的にしか反応しない）、またはそれらに抵抗性をもつ腫瘍性疾患に対する別の治療法を提供することである。
【発明の概要】
【００２１】
これらの目的は、独立請求項の発明の対象によって達成される。同時に、従属請求項および明細書はさらなる好ましい態様を開示する。
【００２２】
本発明を図面およびこれまでの記述によって図解および説明してきたが、このような図解および説明は実例または解説のためのものであり、限定するものではないと見なされ、本発明は開示の態様には限定されない。特許請求された発明を実践する中で、図面、開示、および添付の請求項を学ぶことによって、当業者は開示された態様の他の変更形態を理解し、実行に移すことができる。請求項における「含んでいる」という用語は他の構成要素または工程を排除するものではなく、また、「１つ」または「１種」などの不定冠詞は複数を除外するものではない。異なる従属請求項で互いに特定の測定値が引用されているという事実は、これらの測定値の組み合わせを都合良く利用することができないことを示しているのではない。請求項中のいかなる引用符号も範囲を制限するものとは解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ＤＡＲＰｉｎドメインのＨＥＲ２への結合。図１に図示するように、一価のＤＡＲＰｉｎがＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ドメインＩ〜ＩＶ）に結合することを、精製したＨＥＲ２ドメイン（ドメインＩ、ドメインＩＩＩ−ＩＶまたはドメインＩ−ＩＩＩ）を競合剤として使用した競合的ＥＬＩＳＡで試験した。５００ｎＭのＨｅｒ２ドメインＩ存在下では、ＤＡＲＰｉｎ＃５１およびＤＡＲＰｉｎ＃５２はＨＥＲ２（ドメインＩ−ＩＶ）にもはや結合できず、このことは、それらがドメインＩに局在するエピトープに結合することを示している。５００ｎＭのＨｅｒ２ドメインＩでも５００ｎＭのＨｅｒ２ドメインＩＩＩ−ＩＶでも完全長Ｈｅｒ２（ドメインＩ−ＩＶ）への結合を阻害することができないように、ＤＡＲＰｉｎ＃７、ＤＡＲＰｉｎ＃５３およびＤＡＲＰｉｎ＃５４は結合ドメインＩＩである。
【図１Ｂ】ＤＡＲＰｉｎドメインのＨＥＲ２への結合。図１Ｂで図示したＥＬＩＳＡでは、一次抗体（マウス抗ＲＧＳ−ヒス抗体）をモノクローナルマウス抗ＤＡＲＰｉｎ抗体に置き換えた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、一価のＤＡＲＰｉｎが予め形成しておいたＨＥＲ２−ペルツズマブ複合体に結合することができること、従って、ＨＥＲ２のドメインＩＩにあるペルツズマブとは異なるエピトープに結合することを示している。ＤＡＲＰｉｎの定義については以後を参照のこと。ＯＤ、４５０ｎＭの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を引いたもの；Ｃ、ＨＥＲ２に結合しない対照のＤＡＲＰｉｎ；ｄ１、ＨＥＲ２のドメインＩ；ｄ１−３；ＨＥＲ２のドメインＩ−ＩＩＩ；ｄ３−４、ＨＥＲ２のドメインＩＩＩ−ＩＶ。
【図２Ａ】一価のおよび二パラトープ結合タンパク質によるＢＴ４７４細胞の増殖阻害。一価のＤＡＲＰｉｎ（つまりＤＡＲＰｉｎ＃１およびＤＡＲＰｉｎ＃１８）、これら一価のＤＡＲＰｉｎの非共有結合性混合物およびこれらの一価のＤＡＲＰｉｎを異なる配向で含んでいる二パラトープ結合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびＤＡＲＰｉｎ＃４９）によるＢＴ４７４の増殖阻害について試験した。図２Ａは、それぞれ個別の単独実験に関して、様々な濃度の二パラトープＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害と、対応する阻害曲線を示している。その後、ＤＡＲＰｉｎ＃４１のＩＣ50値が約２ｎＭだったと計算した。個々のＤＡＲＰｉｎのＩＣ50値を表２に示す。図２Ａの図は、４５０ｎｍで測定した吸光度から６２０ｎｍで測定した吸光度を引いた値を対照（Ｃ）と比較してプロットしている。ＤＡＲＰｉｎ濃度の単位はｎＭである。Ｘ軸は対数で表している。ＤＡＲＰｉｎの定義については以後を参照のこと。＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１；＃４９、ＤＡＲＰｉｎ＃４９；＃１８、ＤＡＲＰｉｎ＃１８；＃１、ＤＡＲＰｉｎ＃１；ｎ．ｃ．、陰性対照。
【図２Ｂ】図２Ｂでは、二パラトープＤＡＲＰｉｎ、一価のＤＡＲＰｉｎ両方の混合物、および相当する個々の一価のＤＡＲＰｉｎの濃度が１００ｎＭの時の増殖阻害を示している。Ｙ軸にＯＤをプロットしている。ＯＤの低下は増殖の阻害を反映している。
【図３Ａ】様々な二パラトープＤＡＲＰｉｎによるＢＴ４７４細胞の増殖阻害。異なるＮ末端および／またはＣ末端アンキリン反復ドメインを含んでいる一群の二パラトープＤＡＲＰｉｎ（＃２３、＃２４、＃３３、＃３７、＃４３、＃４４および＃４１）によるＢＴ４７４の増殖阻害を示している。それぞれ個別の単独な実験に関して、種々の濃度のＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害および対応する阻害曲線を示している。個々のＤＡＲＰｉｎのＩＣ50値を表２に示す。図３Ａは、ＤＡＲＰｉｎ＃１５を含む二パラトープＤＡＲＰｉｎによる阻害を示している。図は、４５０ｎｍで測定した吸光度から６２０ｎｍで測定した吸光度を差し引いた値を対照（Ｃ）に対してプロットした吸光度（ＯＤ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎの濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。ＤＡＲＰｉｎの定義に関しては以後を参照のこと。＃２３、ＤＡＲＰｉｎ＃２３；＃２４、ＤＡＲＰｉｎ＃２４；．＃３３、ＤＡＲＰｉｎ＃３３；＃３７、ＤＡＲＰｉｎ＃３７；＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１；＃４３、ＤＡＲＰｉｎ＃４３；＃４４、ＤＡＲＰｉｎ＃４４。
【図３Ｂ】図３ＢはＣ末端にＤＡＲＰｉｎ＃１８を含む二パラトープＤＡＲＰｉｎによる阻害を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃでは、Ｎ末端にＤＡＲＰｉｎ＃５１を含み、Ｃ末端にＤＡＲＰｉｎ＃１８を含む二パラトープＤＡＲＰｉｎによる阻害を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄでは、Ｎ末端にＤＡＲＰｉｎ＃５１を含み、Ｃ末端にＤＡＲＰｉｎ＃２１を含む二パラトープＤＡＲＰｉｎによる阻害を示している。
【図４Ａ】二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１による種々の細胞株の細胞増殖の阻害。図４Ａでは、ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによるＮＣＩ−Ｎ８７（図４Ａ）の増殖の阻害を試験した。それぞれ個別の単独実験について、様々な濃度のＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害作用と対応する阻害曲線を示している。個々の細胞株のＩＣ50値を表３に示す。図は、４５０ｎｍで測定した吸光度から６２０ｎｍで測定した吸光度を差し引いた値を対照（Ｃ）に対してプロットした吸光度（ＯＤ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎの濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。ＤＡＲＰｉｎおよび参照分子の定義に関しては以後を参照のこと。＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１；Ｔ、トラスツズマブ。
【図４Ｂ】図４Ｂでは、ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによるＺＲ７５−３０の増殖の阻害を試験した。
【図４Ｃ】図４Ｃでは、ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによるＭＤＡ−ＭＢ１７５の増殖の阻害を試験した。
【図５Ａ】二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１による種々の細胞株でのアポトーシスの誘導。ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによる、ＢＴ４７４細胞でのアポトーシスの誘導について試験した。それぞれ別個の単独実験について、様々な濃度のＤＡＲＰｉｎによるアポトーシスの誘導と対応する阻害曲線を示している。個々の細胞株のＥＣ50値を表３に示す。図５Ａの図は４５０ｎｍで測定した吸光度から４９０ｎｍで測定した吸光度を差し引いた値を対照（Ｃ）に対してプロットした吸光度（ＯＤ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎまたはトラスツズマブの濃度単位はｎＭである。
【図５Ｂ】ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによる、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞でのアポトーシスの誘導について試験した。図５Ｂおよび５Ｃの図は、対照（Ｃ）に対してプロットした相対発光量（ＲＬＵ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎまたはトラスツズマブの濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。ＤＡＲＰｉｎの定義に関しては以後を参照のこと。Ｔ、トラスツズマブ；＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１。
【図５Ｃ】ＤＡＲＰｉｎ＃４１およびトラスツズマブによる、ＭＤＡ−ＭＢ１７５でのアポトーシスの誘導について試験した。
【図６Ａ】細胞増殖の阻害におけるＤＡＲＰｉｎ＃４１と基準の効力の比較。ＢＴ４７４細胞を用い、ＤＡＲＰｉｎ＃４１および基準であるトラスツズマブとペルツズマブ、ならびに１００ｎＭのトラスツズマブと一定の力価のペルツズマブとの組み合わせによる増殖の阻害を試験した。図６Ａは、それぞれ個別の単独実験に関して、様々な濃度のＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害、それぞれの基準濃度および対応する阻害曲線を示している。個々の細胞株のＩＣ50値を表３に示す。図は４５０ｎｍで測定した吸光度から６２０ｎｍで測定した吸光度を差し引いた値を対照（Ｃ）に対してプロットした吸光度（ＯＤ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎ／基準の濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。
【図６Ｂ】アポトーシスの誘導におけるＤＡＲＰｉｎ＃４１と基準の効力の比較。ＢＴ４７４細胞を用い、ＤＡＲＰｉｎ＃４１および基準であるトラスツズマブとペルツズマブ、ならびに１００ｎＭのトラスツズマブと一定の力価のペルツズマブとの組み合わせによるアポトーシスの誘導を試験した。図６Ｂは、それぞれ個別の単独実験に関して、様々な濃度のＤＡＲＰｉｎによるアポトーシスの誘導、それぞれの基準濃度および対応する活性化曲線を示している。個々の細胞株のＥＣ50値を表３に示す。図は対照（Ｃ）に対してプロットした相対発光量（ＲＬＵ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎ／基準の濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。ＤＡＲＰｉｎの定義に関しては以後を参照のこと。Ｔ、トラスツズマブ；Ｐ、ペルツズマブ；＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１。
【図７Ａ】種々の形式の二パラトープ結合タンパク質によるＢＴ４７４細胞の増殖阻害。Ｎ末端にＤＡＲＰｉｎ＃１を含みＣ末端にＤＡＲＰｉｎ＃１８を含む種々の形式の二パラトープＤＡＲＰｉｎによるＢＴ４７４の増殖阻害を示している。図７Ａは、個別の単独実験について、血清半減期が長くなるように改変した様々な濃度の二パラトープＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害と、対応する阻害曲線を示している。二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃６３はＣ末端のシステイン残基がペグ化されており、一方、二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃６４と＃６５は血清アルブミンに結合するアンキリン反復ドメインを含んでいる。
【図７Ｂ】図７Ｂは、個別の単独実験について、ＨＥＲ２結合反復ドメイン同士の間に種々のリンカーを含んでいる、様々な濃度の二パラトープＤＡＲＰｉｎによる増殖の阻害および対応する阻害曲線を示している。ＤＡＲＰｉｎのＩＣ50値を表２に示す。図は４５０ｎｍで測定した吸光度から６２０ｎｍで測定した吸光度を差し引いた値を対照（Ｃ）に対してプロットした吸光度（ＯＤ）を示しており、ＤＡＲＰｉｎの濃度単位はｎＭである。Ｘ軸は対数目盛りを示している。ＤＡＲＰｉｎの定義に関しては以後を参照のこと。＃６６、ＤＡＲＰｉｎ＃６６（２つの反復ドメインの間に長さ２アミノ酸の短いＧＳ−リンカーを含む）；＃６７、ＤＡＲＰｉｎ＃６７（２つの反復ドメインの間に長さ５アミノ酸のＧＳ−リンカーを含む）；＃４１、ＤＡＲＰｉｎ＃４１（２つの反復ドメインの間に長さ１０アミノ酸のＧＳ−リンカーを含む）；＃６８、ＤＡＲＰｉｎ＃６８（２つの反復ドメインの間に長さ２４アミノ酸のＰＴ−リンカーを含む）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一態様によれば、組換え結合タンパク質は、少なくとも第一の反復ドメインと第二の反復ドメインとを含んでおり、ここで前記２つの反復ドメインはそれぞれＨＥＲ２の細胞外領域に結合し、かつ、前記反復ドメインは共有結合している。
【００２５】
驚くべきことに、少なくとも２つの共有結合した反復ドメインであって、それぞれがＨＥＲ２の細胞外領域に対する特異性を有している反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質がＨＥＲ２の細胞外部分に結合することが、これまでに概要を示したように、複数の別個の結合剤（例えば、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ；図６）がＨＥＲ２に結合する先行技術のアプローチを超える有効でかつ予想外の効果をもつことが分かった。
【００２６】
ヒトＨＥＲ２は１２５５個のアミノ酸からなり、そのうちの２１アミノ酸がシグナル配列、６３１アミノ酸が細胞外領域（例えばドメインＩ〜ＩＶを含んでいる外部ドメイン）、２３アミノ酸が膜貫通領域、および５８０アミノ酸が細胞質ドメインである。
【００２７】
好ましくは、前記組換え結合タンパク質のＨＥＲ２の細胞外領域への前記結合は、前記反復ドメインの前記ＨＥＲ２の細胞外領域への結合と同時につまり同時発生的に生じる。さらに好ましくは、前記反復ドメインはＨＥＲ２の細胞外領域にある異なる２つのエピトープに結合する。また好ましくは、前記反復ドメインはＨＥＲ２の細胞外領域にある、異なっていてかつ重複していない２つのエピトープに結合する。
【００２８】
この高い効力の理由の１つは、本発明の二パラトープ結合タンパク質とＨＥＲ２の細胞外領域にある異なる２つのエピトープとの分子内相互作用に続いて起こると思われるこれまでに記載のないＨＥＲ２の細胞外領域の屈曲構造を、本発明の組換え結合タンパク質が誘導することにあると考えられる（実施例８）。つまり、結合タンパク質の両方の反復ドメインが同じＨＥＲ２分子上の異なるエピトープに同時に結合し、それによって、ＨＥＲ２の細胞外領域をこの新しい屈曲構造をとらざるを得なくなると考えられる。このような屈曲構造は先行技術では説明されていない。重要なことは、これら２つの反復ドメインが同じ結合タンパク質中に存在するように結合させる必要があるということである。つまり、２つの反復ドメインを単に混合しても効力を示さない（図２Ｂ）。さらに、このような結合タンパク質のＨＥＲ２細胞外領域への二価の結合は、高い結合活性、つまり標的上の異なるエピトープに同調的に結合した結果生じる複合的な強度を示すことで、相乗的な結合効果を発揮する可能性がある。結合活性は親和性とは別のもので、単一の結合性相互作用の強度に相当する。まとめると、このような分子による非常に効果的な増殖の阻害およびアポトーシスの誘導は、実施例で示すように、この結合タンパク質とＨＥＲ２との特異的な相互作用によって説明することができる。
【００２９】
この理論によれば、同じタンパク質中に存在する２つの異なる反復ドメインは、それぞれのエピトープに結合するという点で、互いを相乗的に支援し、それによって、標的への総合的な親和性の向上を誘導している。
【００３０】
第一の反復ドメインがＨＥＲ２にあるそのエピトープに結合することによって、第二の反復ドメインは、第二の反復ドメインがＨＥＲ２の対応するエピトープに結合するのを促進する、エネルギー的におよび／または立体的に好ましい位置に導かれる。
【００３１】
実施例に示すように、第一の反復ドメインと第二の反復ドメインの共有結合はそれらの生物学的活性を強めるようである。
【００３２】
本発明による組換え結合タンパク質の好ましい態様では、第一の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、かつ、第二の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する。
【００３３】
「ドメインＩＩに結合する」という用語が、それぞれの反復ドメインがＨＥＲ２のドメインＩＩに主に結合することを意味していると理解することが重要である。しかしながらこの定義は、前記反復ドメインのその部分が、他のドメインに結合する、または重複する可能性を排除しない。「ドメインＩＶに結合する」という用語にも同じことが言える。
【００３４】
本発明による二パラトープ結合タンパク質を用いてＨＥＲ２のドメインＩＩおよびＩＶを同時に標的とすることは、先行技術によって知られていたものを超える、際だった予想外の効果を有する。このような結合タンパク質による増殖の阻害と細胞アポトーシスの誘導に関する細胞の反応は、最先端の抗体によってもたらされる効果と比較した場合に、非常に劇的なものであった。例えば、そのような反応の度合いが、ＨＥＲ２のドメインＩＶとＩＩをそれぞれ標的とするトラスツズマブとペルツズマブの併用などの、臨床的に基準となる抗体によって誘導される反応の度合いを上回るものであることが分かった（図４、５および６）。興味深いことに、ＨＥＲ２のドメインＩとドメインＩＶに結合する二パラトープ結合タンパク質のいくつかはそのような予想外の効果を示さない（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【００３５】
反復ドメインが結合するＨＥＲ２の細胞外領域ドメインの決定方法は、例えば実施例３に示したように、当業者にはよく知られている（例えば、ヨストら、前掲文献）。
【００３６】
出願人の発見は、本発明による二パラトープ結合タンパク質を使ってＨＥＲ２のドメインＩＩとＩＶを同時に標的とすることが、現行の抗体標的アプローチに取って代わるより有効な方法になり得るという点で、ＨＥＲ２によって引き起こされるヒトの癌の治療に対して重要な意味をもつ。
【００３７】
従って本発明による結合タンパク質は、好ましくは二パラトープ結合タンパク質つまり、同じタンパク質標的（すなわちＨＥＲ２）にある２つの異なるエピトープまたはドメイン（例えばドメインＩＩおよびＩＶ）を認識する、抗原反復ドメインを２つ含む結合タンパク質である。しかしながら、多パラトープ性ポリペプチド、すなわち同じ標的タンパク質上にある３個、４個またはそれ以上の数のエピトープを認識する抗原反復ドメインを含有しているポリペプチドも、二パラトープまたは多パラトープの両方および多価のポリペプチド、つまり１つ以上の他の標的タンパク質を認識する抗原反復ドメインを有するポリペプチドと同様に、本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する場合ＨＥＲ２は、Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）またはｐ１８５としても知られているヒト上皮成長因子受容体２に関する。ＨＥＲ２は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのメンバーである。ヒトにおいてＨＥＲ２は、既知の癌源遺伝子であり、ヒト１７番染色体長腕（１７ｑ１２）に局在しているＥＲＢＢ２によってコードされている。ＨＥＲ２のユニプロットＫＢ／スイスプロット番号はＰ０４６２６である。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、第一の反復ドメインと第二の反復ドメインは同じポリペプチド上に位置しているが、ＨＥＲ２のドメインＩＩを標的とする反復ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩＶを標的とする反復ドメインのＮ末端側に位置している。
【００４０】
例として、これらの態様を図２Ａ、および対応する説明に示す。驚くことに発明者らは、ＨＥＲ２のドメインＩＩを標的とする反復ドメインがＨＥＲ２のドメインＩＶを標的とする反復ドメインのＣ末端側に位置している結合タンパク質の効果が、ＨＥＲ２のドメインＩＩを標的とする反復ドメインがＨＥＲ２のドメインＩＶを標的とする反復ドメインのＮ末端側に位置している結合タンパク質の効果よりも有意に低いことを示した。
【００４１】
好ましくは、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する前記第一の反復ドメインは、ペルツズマブのＨＥＲ２との結合に競合しない。例えば図１Ｃに、そのような反復ドメインがペルツズマブのＨＥＲ２との結合に競合しないことを示している。同様に、好ましくは、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する前記第二の反復ドメインはトラスツズマブのＨＥＲ２との結合に競合しない。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃１８〜２０の反復ドメインはトラスツズマブのＨＥＲ２との結合に競合しない。反復ドメインがトラスツズマブまたはペルツズマブのＨＥＲ２との結合に競合するか否かを決定する方法は、例えば実施例３で示しているように、当業者にはよく知られている。
【００４２】
このことは、第一の好ましい態様では第一の反復ドメインがＨＥＲ２のドメインＩＩにあるペルツズマブのエピトープとは異なるエピトープに結合することを意味している。同様に第二の好ましい態様では、第二の反復ドメインは、ＨＥＲ２のドメインＩＶにあるトラスツズマブのエピトープとは異なるエピトープと結合する。理論に束縛されないが、発明者らは、実施例の項に示す効果うちの少なくともいくつかが、これらの事実に起因すると考えている。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記第一の反復ドメインはアンキリン反復ドメイン、つまり設計アンキリン反復ドメインであり、かつ、前記第二の反復ドメインがアンキリン反復ドメイン、つまり設計アンキリン反復ドメインである。
【００４４】
好ましくは、前記アンキリン反復ドメインつまり設計アンキリン反復ドメインは、７０から３００個のアミノ酸、具体的には９０から２００個のアミノ酸を含む。
【００４５】
また好ましくは、本発明の反復ドメインは、国際公開第２００２／０２０５６５に記載のアンキリン反復ドメインつまり設計アンキリン反復ドメインである。Ｈｅｒ２の異なるドメインに対する二パラトープ結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインの例を実施例に示している。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、第一の反復ドメインはＰＢＳ中でＨＥＲ２の細胞外領域に１０-7Ｍ未満のＫｄで結合し、前記第二の反復ドメインはＰＢＳ中でＨＥＲ２の細胞外領域に１０-7Ｍ未満のＫｄで結合する。
【００４７】
Ｋｄは平衡解離定数であり、以後の文章内でさらに定義する。反復ドメインにその標的に対する十分な親和性をもたらすには、１０-7Ｍ未満のＫｄが必要とされる。好ましくは、反復ドメインはＰＢＳ中で、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ未満のＫｄで、または最も好ましくは１０-11Ｍ未満のＫｄでその標的ドメインに結合する。
【００４８】
Ｈｅｒ２のドメインＩＩおよび／またはドメインＩＶにＰＢＳ中で１０-7Ｍ未満のＫｄで結合するタンパク質を含んでいる組換え結合タンパク質を実施例２に示す。
【００４９】
好ましい態様によれば、前記結合タンパク質は、ＢＴ４７４細胞の刺激された増殖を、１００ｎＭ未満の半数阻害濃度（ＩＣ５０）で阻害する。好ましくは、前記結合タンパク質はＢＴ４７４細胞の刺激された増殖を９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害する。また好ましくは、前記結合タンパク質は、刺激されたＢＴ４７４細胞の増殖を少なくとも１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％阻害する。
【００５０】
当業者によく知られている標準的な手段、例えば実施例４に示す手段により、ＢＴ４７４細胞を使用して、本発明の結合タンパク質が増速を阻害する機能を測定することができる。好ましくは、ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＺＲ７５−３０、ＨＣＣ１４１９またはＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞を使用して、例えば実施例５に示すように、本発明の化合物の増殖阻害機能を測定することができる。
【００５１】
実施例４では、ＢＴ４７４細胞の刺激された増殖を１００ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害する組換え結合タンパク質を開示し、考察する。
【００５２】
別の好ましい態様によれば、前記結合タンパク質は１００ｎＭ未満の半数効果濃度（ＥＣ５０）でＢＴ４７４細胞のアポトーシスを誘導する。好ましくは、前記結合タンパク質は、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＢＴ４７４細胞のアポトーシスを誘導する。
【００５３】
当業者によく知られている標準的な手段、例えば実施例５に示す手段により、ＢＴ４７４細胞を使用して本発明の結合タンパク質がアポトーシスを誘導する機能を測定するのにすることができる。好ましくは、ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＺＲ７５−３０、ＨＣＣ１４１９またはＭＤＡ−ＭＢ１７５細胞を使用して、例えば実施例５に示すように、本発明の化合物のアポトーシス誘導機能を測定することができる。
【００５４】
実施例５では、１００ｎＭ未満のＥＣ５０値でＢＴ４７４細胞でのアポトーシスを誘導する組換え結合タンパク質を開示し、考察する。
【００５５】
好ましい態様によれば、前記第一の反復ドメインと第二の反復ドメインはポリペプチドリンカーで連結されている。
【００５６】
そのようなポリペプチドリンカーは、例えば、それぞれのドメインをコードしているｃＤＮＡを融合させる単なる遺伝子融合によって達成してもよい。そのような型の態様からは、２つの異なる反復ドメインを有する融合ペプチドタンパク質が得られる。
【００５７】
リンカーは、配列番号７〜１２に示すように、それぞれ、ＧおよびＳ、またはＰおよびＴのアミノ酸を含んでいるオリゴペプチドからなる可能性がある。別の好ましい態様によれば、後に説明する「多量体化部分」を使用することもできる。あるいは２つの反復ドメインを互いに、例えばペプチドを利用しない化学的なリンカーの手段によって連結することができる。
【００５８】
好ましくは、組換え結合タンパク質および／または反復ドメインがｐＨ７．４のＰＢＳ中で熱変性する際の変性中点温度（ｍｉｄｐｏｉｎｔ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）は４５℃より高く、より好ましくは５０℃より高く、より好ましくは５５℃より高く、最も好ましくは６０℃より高い。本発明の結合タンパク質または反復ドメインは、生理学的条件では規定された二次構造および三次構造を有する。そのようなポリペプチドが熱変性するとその三次構造および二次構造が失われるが、これは例えば円二色性（ＣＤ）測定によって追うことができる。結合タンパク質または反復ドメインが熱変性する際の変性中点温度は、生理学的な緩衝液中で温度を１０℃から約１００℃に徐々に上げていくことで前記タンパク質を熱変性させた際に、共同して構造転移を起こす温度の中間点に相当する。熱編成の際の変性中点温度の決定は、当業者にはよく知られている。結合タンパク質または反復ドメインが熱変性する際のこの変性中点温度は、前記ポリペプチドの熱安定性の指標である。
【００５９】
２０ｇ／Ｌまで、好ましくは４０ｇ／Ｌまで、より好ましくは６０ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは８０ｇ／Ｌまで、および最も好ましくは１００ｇ／Ｌまでの濃度で、ＰＢＳ中３７℃で５日間以上、好ましくは１０日間以上、より好ましくは２０日間以上、より好ましくは４０日間以上、および最も好ましくは１００日間以上インキュベートしたときに、不溶性の凝集体を５％（ｗ／ｗ）未満しか形成しない組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインもまた好ましい。不溶性凝集体の形成は、目に見える沈殿の様子、ゲル濾過または不溶性の凝集体が形成されると非常に高まる動的光散乱によって検出することができる。不溶性の凝集体は、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することでタンパク質試料から除去することができる。好ましくは、組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインは、前述のインキュベート条件で、ＰＢＳ中、３７℃でインキュベートした時に、２％未満、より好ましくは１％、０．５％、０．２％、０．１％未満、または最も好ましくは０．０５％（ｗ／ｗ）未満しか不溶性の凝集体を形成しない。不溶性凝集体のパーセンテージは、不溶性の凝集体を可溶性タンパク質から分離し、その後、可溶性および不溶性画分に含まれるタンパク質量を標準的な定量法によって測定することで決定することができる。
【００６０】
また、１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で１時間または１０時間インキュベートした際に、その天然の三次元構造を失わない組換え結合タンパク質および／またはアンキリン反復ドメインが好ましい。
【００６１】
特定の一態様において本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合し、かつ、指示したまたは好ましい変性中点温度および前段で定義した非凝集特性を有するアンキリン反復ドメインを２つ含んでいる組換え結合タンパク質に関する。
【００６２】
本発明の他の好ましい態様によれば、
・前記第一の反復ドメインは、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＨＥＲ２との結合に競合し、および／または
・前記第二の反復ドメインは、配列番号７４〜８２からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＨＥＲ２との結合に競合する。
【００６３】
発明者らは、これらの反復ドメインのうち、第一の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するが、第二の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＶに結合することを証明した。
【００６４】
好ましくは、前記第一の反復ドメインは配列番号６２〜６７および１１５〜１２１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＨＥＲ２への結合に競合する。より好ましくは、前記第一の反復ドメインは配列番号６２、１１５、１２０、および１２１、特に配列番号１１５および１２０からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＨＥＲ２への結合に競合する。また好ましくは、前記第一の反復ドメインは、ＤＡＲＰｉｎ＃１〜６および５４〜６０の群から選択される結合タンパク質；より好ましくは、ＤＡＲＰｉｎ＃１、５４、５９および６０の群から選択される結合タンパク質；特にＤＡＲＰｉｎ＃５４および６０の群から選択される結合タンパク質のＨＥＲ２との結合に競合する。
【００６５】
さらに好ましくは、前記第二の反復ドメインは、配列番号７９〜８１、特に配列番号８０および８１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインとＨＥＲ２との結合に競合する。また好ましくは、前記第二の反復ドメインは、ＤＡＲＰｉｎ＃１８〜２０の群から選択される結合タンパク質、特にＤＡＲＰｉｎ＃１９および２０の群から選択される結合タンパク質とＨＥＲ２との結合に競合する。
【００６６】
本発明のその上さらに他の好ましい態様によれば、
・第一の反復ドメインは、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
・第二の反復ドメインは、配列番号７４〜８２からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
さらに、
・前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳは欠失していてもよく、および
・前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮはＡと交換されていてもよい。
【００６７】
好ましくは、前記第一の反復ドメインは、配列番号６２〜６７および１１５〜１２１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記第一の反復ドメインは、配列番号６２、１１５、１２０、および１２１、特に配列番号１１５および１２０からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また好ましくは、前記第一の反復ドメインは、ＤＡＲＰｉｎ＃１〜６および５４〜６０からなる群より選択される結合タンパク質、より好ましくはＤＡＲＰｉｎ＃１、５４、５９および６０の群から選択される結合タンパク質、特にＤＡＲＰｉｎ＃５４および６０の群から選択される結合タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６８】
さらに好ましくは、前記第二の反復ドメインは、配列番号７９〜８１、特に配列番号８０および８１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。また好ましくは、前記第二の反復ドメインは、ＤＡＲＰｉｎ＃１８〜２０からなる群に由来する結合タンパク質、特にＤＡＲＰｉｎ＃１９および２０の群に由来する結合タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６９】
好ましくは、第一のアンキリン反復ドメインは、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
好ましくは、第二のアンキリン反復ドメインは、配列番号７４〜８２からなる群より選択される１つのアンキリン反復ドメインと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
また好ましくは、第一のアンキリン反復ドメインは、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＮ末端とＣ末端キャッピングモジュールとの間にある１、２または３つのアンキリン反復モジュールと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７２】
また好ましくは、第二のアンキリン反復ドメインは、配列番号７４〜８２からなる群より選択されるアンキリン反復ドメインのＮ末端とＣ末端キャッピングモジュールとの間にある１、２または３つのアンキリン反復モジュールと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
本発明の一層さらに他の好ましい態様によれば、
・前記第一の反復ドメインは、配列番号６２〜６８、７２および１１４〜１２１からなる群より選択され、
・前記第二の反復ドメインは、配列番号７４〜８２からなる群より選択され、
さらに、
・前記アンキリン反復ドメインの１番目のＧおよび／または２番目のＳは欠失していてもよく、および
・前記アンキリン反復ドメインの末端から２番目のＬおよび／または末端のＮはＡと交換されていてもよい。
【００７４】
好ましくは、第一のアンキリン反復ドメインは、配列番号６２〜６７および１１５〜１２１、より好ましくは１１５、１２０および１２１、特に配列番号１１５および１２０からなる群より選択される。
【００７５】
好ましくは、第二のアンキリン反復ドメインは、配列番号７９〜８１、特に配列番号８０および８１からなる群より選択される。
【００７６】
本発明の一層さらに他の好ましい態様によれば、
・前記第一の反復ドメインは、配列番号１５〜１８、２１〜２３、３７、３８、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３および１３４からなる群より選択されるおよびアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュール、および配列番号１５〜１８、２１〜２３、３７、３８、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３および１３４の９つまでのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列を含み、および／または
・前記第二の反復ドメインは、配列番号４６、４７、５１、５２、５５および５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュール、および配列番号４６、４７、５１、５２、５５および５６の９つまでのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列を含む。
【００７７】
好ましくは、第一のアンキリン反復ドメインのそのようなアンキリン反復モジュールは、配列番号１５〜１８、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３および１３４から、より好ましくは１５、１２５、１２９および１３３から、さらに好ましくは１２５および１３３からなる群より選択される。
【００７８】
好ましくは、第二のアンキリン反復ドメインのそのようなアンキリン反復モジュールは、配列番号４６、４７、５５および５６から、より好ましくは５５および５６からなる群より選択される。
【００７９】
また好ましくは、配列番号１５〜１８、２１〜２３、３７、３８、４６、４７、５１、５２、５５、５６、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３および１３４の反復モジュールに含まれる８個までのアミノ酸、より好ましくは７個までのアミノ酸、より好ましくは６個までのアミノ酸、より好ましくは５個までのアミノ酸、さらにより好ましくは４個までのアミノ酸、より好ましくは３個までのアミノ酸、より好ましくは２個までのアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸は別のアミノ酸と交換されている。
【００８０】
キャッピングモジュール、反復モジュールつまり反復ドメイン、反復ドメイン、または結合タンパク質に含まれるアミノ酸が置き換えられている場合には、これらのアミノ酸は、好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群由来のアミノ酸と交換される。また好ましくは、アミノ酸は相同のアミノ酸で置き換えられる。つまりアミノ酸は、生物物理学的な特性が似ている側鎖を有するアミノ酸と交換される。例えば、負に帯電しているアミノ酸Ｄは負に帯電しているアミノ酸Ｅに置き換えてもよく、または、Ｌなどの疎水性のアミノ酸をＡ、ＩまたはＶに置き換えてもよい。ポリペプチド中のアミノ酸を別のアミノ酸と交換する技術は当業者にはよく知られている。
【００８１】
好ましくは、本発明による反復モジュールは、ＫＤＦＱＧＩＴＰＬＨＩＡＡＴＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１６）、および配列番号１６に含まれている９個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、
・３番目のＦはＡと交換されていてもよく、
・４番目のＱはＥと交換されていてもよく、
・５番目のＧはＳと交換されていてもよく、
・６番目のＩはＶと交換されていてもよく、
・１１番目のＩはＬと交換されていてもよく、
・１４番目のＴはＱと交換されていてもよく、および／または
・１５番目のＳは、ＮおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよい。
【００８２】
この群の非常に好ましい反復モジュールの１つは、ＫＤＦＱＧＶＴＰＬＨＩＡＡＱＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２５）、配列番号１２９または配列番号１３３からなるアミノ酸配列を有する。
【００８３】
また好ましくは、本発明によるアンキリン反復モジュールは、ＫＤＩＴＧＥＴＰＬＨＨＡＡＤＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）、および配列番号１８に含まれている９個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで
・３番目のＩはＶと交換されていてもよく、
・６番目のＥはＤと交換されていてもよく、
・１１番目のＨはＬと交換されていてもよく、
・１４番目のＤはＱと交換されていてもよく、
・１５番目のＳはＨと交換されていてもよく、および／または
・１９番目のＥはＶと交換されていてもよい。
【００８４】
この群の非常に好ましい反復モジュールの１つは、ＫＤＶＴＧＤＴＰＬＨＬＡＡＱＨＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２６）、配列番号１３０または配列番号１３４からなるアミノ酸配列を有する。
【００８５】
また好ましくは、本発明によるアンキリン反復モジュールは、ＫＤＷＥＧＴＴＰＬＨＬＡＡＨＴＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２１）、および配列番号２１に含まれている９個までのアミノ酸残基が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、
・３番目のＷはＦと交換されていてもよく、
・４番目のＷはＱと交換されていてもよく、
・６番目のＴは、Ｉ、ＹおよびＶ、好ましくはＴからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく；
・１１番目のＬは、ＩおよびＶ；好ましくはＩおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく；
・１４番目のＨは、Ｈ、Ｑ、ＹおよびＷ、好ましくはＨからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、および／または
・１５番目のＴは欠失していても、またはＡおよびＤからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよい。
【００８６】
また好ましくは、本発明によるアンキリン反復モジュールは、ＫＤＴＶＧＴＴＰＬＨＹＡＡＥＤＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号２２）、および配列番号２２に含まれている９個までのアミノ酸残が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、
・３番目のＴは、等しいアミノ酸分布のＳ、Ｋ、ＥおよびＩからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・４番目のＶは、Ｑ、ＩおよびＹ；好ましくはＹからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・６番目のＴは、Ｑ、Ｆ、ＲおよびＷからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・１１番目のＹは、Ｌ、ＥおよびＳ；好ましくはＳからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・１４番目のＥは、Ｓ、Ｑ、ＹおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、および／または
・１５番目のＤは、Ｓ、ＦおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・１６番目のＧはＤと交換されていてもよい。
【００８７】
また好ましくは、本発明によるアンキリン反復モジュールは、ＫＤＶＥＧＷＴＰＬＨＹＡＡＳＳＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号３８）、および配列番号３８に含まれている９個までのアミノ酸残が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、
・６番目のＷはＱと交換されていてもよく、
・１１番目のＹはＬと交換されていてもよく、および／または
・１５番目のＳはＹと交換されていてもよい。
【００８８】
また好ましくは、本発明によるアンキリン反復モジュールは、ＫＤＷＲＧＦＴＰＬＨＹＡＡＹＬＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号４６）および配列番号４６に含まれている９個までのアミノ酸残が他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、
・３番目のＷは、Ｗ、Ｔ、ＶおよびＲ；好ましくはＴおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・４番目のＲは、Ｒ、ＴおよびＩ；好ましくはＩからなる群より選択されるアミノ酸と交換されていてもよく、
・６番目のＦは、ＦまたはＨ；好ましくはＦと交換されていてもよく、
・１１番目のＹはＲと交換されていてもよく、
・１４番目のＹはＦと交換されていてもよく、
・１５番目のＬはＶと交換されていてもよく、および／または
・１７番目のＨはＱと交換されていてもよい。
【００８９】
好ましくは、配列番号１６、１８、２８、３１、２１、２２、３８および／または４６に含まれている９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸残基は他の任意のアミノ酸残基に置き換えられている。
【００９０】
さらに、前記結合タンパク質がポリペプチドを含んでいることが特に好ましく、ここで前記ポリペプチドは前記第一のアンキリン反復ドメインと第二のアンキリン反復ドメインを含み、かつ、前記ポリペプチドは、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９１】
好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号８３〜９８、１０２、１０３、１２２、１２３および１３６〜１４１からなる群より選択されるポリペプチドと、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９２】
また好ましくは、そのようなポリペプチドは、配列番号８４、８５、８６、８７、９０、９１、９２、９８、１０２、１０３、１２２および１２３から、より好ましくは８５、８６、８７、９０、９１、９２、１０２、１０３、１２２および１２３から、さらにより好ましくは８６、８７、９１および９２から、そして最も好ましくは８６および８７からなる群より選択される。
【００９３】
一層さらに他の好ましい態様によれば、前記第一のおよび第二のアンキリン反復ドメインのアンキリン反復モジュールの１つ以上のアミノ酸残基は、アンキリン反復単位を整列させた場合に一致する位置に見られるアミノ酸残基と交換される。
【００９４】
本発明の別の態様では、前述の説明に従う少なくとも１つの結合タンパク質または特定のアンキリン反復ドメインをコードしている核酸分子を提供する。さらに、前記核酸分子を含んでいるベクターについても検討する。
【００９５】
本発明による結合組成物の全てがポリペプチドまたはタンパク質を含むのではない。後半の態様は、それらを実行する者にだけ関するものである。これに関して出願人は、それらをコードすることが可能な核酸分子の全てを本明細書で開示するのを控える。なぜならば、遺伝子コードの縮重によって、多くの核酸分子が１つのおよび同じポリペプチドまたはタンパク質をコードする可能性があるためである。
【００９６】
しかしながら、所与の核酸が所与のポリペプチドまたはタンパク質をコードしているか否かを明白にかつ一義的に決定することができる。従って、本態様は当業者によっては明らかであり、また、その範囲は容易に決定される。
【００９７】
本発明の別の態様では、
・ＨＥＲ２受容体の二量体化、
・ＨＥＲ２／ＨＥＲ３のヘテロ二量体化、
・ＨＥＲ２受容体の自己リン酸化、
・ＨＥＲ受容体介在性シグナル伝達
・ＨＥＲ３受容体リガンド誘導性リン酸化、および／または
・ＨＥＲ３受容体介在性シグナル伝達、
のうちの少なくとも１つを阻害するための、前述の説明に従う結合タンパク質の使用を提供する。
【００９８】
ＨＥＲ２受容体の二量体化（「ホモ二量体化」とも呼ばれる）はリガンドとは無関係にＨＥＲ２を過剰発現している組織でおこる。前記ホモ二量体化によって細胞内の自己リン酸化が誘導され、これによって最終的に、例えば細胞増殖の高まりが誘導される可能性がある。
【００９９】
ＨＥＲ３は固有のキナーゼ活性を欠いているため、ＨＥＲ２が過剰発現している乳癌でＨＥＲ３は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体が形成された後にリン酸化され、その結果、最終的に、例えばアポトーシスの阻害が起こる。
【０１００】
前記使用はインビトロまたはインビボのいずれでも行うことができる。前段に示すように、これら全ての過程は病原性の結果を、すなわちそれぞれのシグナル伝達経路を活性化することで、もたらす場合がある。ＨＥＲ２の二量体化および／またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３のヘテロ二量体化によって活性化されるシグナル伝達経路としては、マイトゲン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）、ホスホリパーゼＣγ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）、Ｒａｓ−Ｍａｐキナーゼ経路およびｍＴＯＲ経路が挙げられる。
【０１０１】
例えば、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路は、アポトーシスを遮断することで細胞の生存を維持する、非常に重要な経路のうちの１つだと考えられている。従ってその病的な活性化、例えばＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化による活性化は悪性の増殖を誘導し得る（例えば実施例を参照のこと）。
【０１０２】
ＨＥＲ２の病的な活性化、例えばＨＥＲ２ホモ二量体化による活性化は、悪性細胞の転移、浸潤、または増殖を引き起こし得る（例えば、実施例；ハイネスＮＥ．およびレーンＨＡ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．、５、３４１〜５４、２００５を参照のこと）。
【０１０３】
本発明の一層さらに別の態様では、前述の開示に従う結合タンパク質または組成物、および必要に応じて薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含んでいる医薬製剤を提供する。
【０１０４】
薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤は当業者に知られており、また、より詳細に後述する。さらには、前述の組換え結合タンパク質、具体的には反復ドメインを含んでいる結合タンパク質を１つ以上含んでいる診断的組成物についても検討する。
【０１０５】
医薬製剤は、前述の組換え結合タンパク質、および薬学上許容可能な担体、賦形剤または安定剤（例えば、レミントンの薬学、第１６版、オソルＡ．編［１９８０］に記載の）を含む。当業者に知られている好適な担体、賦形剤または安定剤には、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水に溶解した５％デキストロース、等張性や化学的な安定性を高める物質、緩衝剤および防腐剤がある。他の好適な担体としては、組成物、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸およびアミノ酸共重合体の投与を受けている個人に有害な抗体をその担体自体が産生しない、いずれもの担体が含まれる。
【０１０６】
インビボ投与に用いられる製剤は、無菌的すなわち滅菌されたものでなくてはならない。このことは、無菌的な濾過膜を介して濾過することで容易に達成される。医薬製剤は、当業者が知り得るいずれの好適な方法によっても投与することができる。
【０１０７】
さらに本発明の別の態様では、前述の開示に従う少なくとも１つの結合タンパク質、組成物または医薬製剤の薬物としての使用を提供する。同様に、前述の特許請求項に従う結合タンパク質、組成物または医薬製剤を患者に投与することを含む方法を提供する。どちらの例でも、治療される疾患は腫瘍性疾患、好ましくは癌であることが好ましい。
【０１０８】
それぞれの例で、疾患を治療するために、有効量の前述の特許請求項に従う結合タンパク質、組成物または医薬製剤が患者に好ましく投与される。
【０１０９】
本明細書で使用する場合「腫瘍性疾患」という用語は、増殖が急激な細胞成長または新生物によって特徴付けられる、細胞または組織の異常な段階または状態を指す。より具体的な意味では、この用語は癌の過程、例えば腫瘍および／または白血病に関する。
【０１１０】
本発明による結合タンパク質はアポトーシス性および抗増殖性の作用を示した（実施例の項を参照のこと）。腫瘍性疾患はアポトーシスの抑制および／または増殖の高まりによって特徴付けられることが多いため、これらの実験から、本発明による結合タンパク質が腫瘍性疾患の治療において使用可能であるとする蓋然性が高い。
【０１１１】
好ましくは、前記腫瘍性疾患は、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の増幅、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の過剰発現、
・ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の変異型の発現、および／または
・トラスツズマブ抵抗性腫瘍におけるＨｅｒ３をコードしている遺伝子の過剰発現、
からなる群より選択される少なくとも１つによって特徴付けられる疾患である。
【０１１２】
ヒトでは、ＨＥＲ２はＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされている。前述の選択肢は、現在市販されているもののような、現代の分子診断学的な手段によって検出することができる、ＥＲＢＢ２遺伝子に入った突然変異の結果と帰せられる。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の発現」という用語は、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）で検出される、ＨＥＲ２受容体タンパク質を発現している細胞、組織または器官に関する。本明細書で使用する場合、「ＨＥＲ２をコードしている遺伝子の増幅または過剰発現」という用語は、正常な細胞、組織または器官での発現レベルと比較して、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）で検出したときに、細胞、組織、または器官でＨＥＲ２受容体タンパク質の異常な発現レベルが示されることに関連する。
【０１１４】
そのようなＩＨＣ検出アッセイは当該分野で知られており、またこれらには、臨床試験アッセイ（ＣＴＡ）、商業的に利用可能なラボコープ（ＬａｂＣｏｒｐ）４Ｄ５試験、および市販されているダコ（ＤＡＫＯ）・ハーセプテスト（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ）（登録商標）（ダコ、カーピンテリア、カリフォルニア）が含まれる。後者のアッセイでは、細胞の染色を０〜３＋の一定のスコア範囲に分類して（０が正常な発現であり、３＋は陽性の発現が最も強いことを示している）ＨＥＲ２タンパク質を過剰発現している癌を同定する。従って、１＋、２＋、または３＋、好ましくは２＋または３＋、より好ましくは３＋の範囲に分類されるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を患っている患者が本発明の治療方法の恩恵を受けるだろう。
【０１１５】
あるいは、Ｈｅｒ２の発現および／または過剰発現に関するスコアをインサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＴ−ＰＣＴおよび他の方法によって検出することもできる。
【０１１６】
特に好ましい態様によれば、前記腫瘍性疾患は、
・乳癌、
・卵巣癌、
・消化器癌(gastric cancer)、
・胃癌(stomach cancer)、
・子宮癌、および／または
・結腸直腸癌、
を含む群より選択される疾患のうちの少なくとも１つである。
【０１１７】
さらに前記使用を、状況に合わせて、
・抗腫瘍剤、
・内分泌薬、
・腫瘍ワクチン、
・免疫治療、および／または
・細胞治療、
からなる群より選択される少なくとも１つの活性成分を投与することで補完することが好ましい。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「状況に合わせて補完する」という用語は、所与の投与計画の元で行われる同時投与を指す。これには、異なる化合物を同時に投与すること、ならびに異なる化合物を時間をおいて投与すること（例えば、化合物Ａを一回投与し、その後、化合物Ｂを複数回投与すること、もしくはその逆、または両方の化合物を同時に投与し、２つの化合物のうちの一方を後の段階でも投与すること）が含まれる。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「抗腫瘍剤」という用語は、抗腫瘍作用または抗がん作用を有する薬剤または薬剤の組み合わせに関する。これは特に、有糸分裂を害すること、急速に分裂している細胞を効果的に標的とすること、または細胞のアポトーシスを起こすことで機能する化学療法薬について言える。化学療法薬の多くは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン系薬剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および他の抗腫瘍剤に分類することができる。
【０１２０】
好ましい抗腫瘍剤は、５−フルオロウラシル、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン系薬剤、アザチオプリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、メクトレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、ポドフィロトキシン、テニポシド、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、および／またはビノレルビンである。
【０１２１】
免疫治療は、癌細胞からのタンパク質の単離、およびその後、癌細胞を死滅させる免疫反応を刺激することを期待して、癌患者にそれらのタンパク質に対する免疫を接種することを伴う。治療学的な抗癌ワクチンの別のアプローチには、患者の中でその場で免疫応答を引き起こすものがある。これによって、溶菌性のウイルス複製に続いて放出された腫瘍抗原に対する抗腫瘍性の免疫応答が高まり、その結果、その場で、患者に特異的な特異的抗腫瘍ワクチンが生成される。一層さらに別のアプローチでは、癌の発生において生理学的な役割を担う化合物で患者を免疫して、ヒトの身体が前記化合物を排除するようにする。
【０１２２】
標的薬剤は、急速に分裂している細胞を単純に干渉する（例えば従来型の化学療法）というよりはむしろ、発癌および腫瘍の成長に必要な特定の標的分子を干渉することで癌細胞の成長を遮断する型の薬剤である。標的治療の主な分類としては低分子およびモノクローナル抗体がある。
【０１２３】
この定義に含まれる低分子には、ラパチニブ、ネラチニブ、アファチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、Ｂｃｌ−２阻害剤（例えばオバトクラックス（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ）、ＡＢＴ−２６３、およびゴシポール）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えばイニパリブ（Ｉｎｉｐａｒｉｂ）、オラパリブ（Ｏｌａｐａｒｉｂ））、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、アパチニブ（Ａｐａｔｉｎｉｂ）、ｍＴＯＲ阻害剤（エベロリムス）、ＡＮ−１５２、ＡＫＴ−阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、［Ｄ−Ｌｙｓ（６）］−ＬＨＲＨ結合型ドキソルビシン、ペガプタニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、チボザニブおよびバゾバニブが包含されるがこれらには限定されない。この定義に含まれるモノクローナル抗体には、リツキシマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＴＤＭ１、ペルツズマブ、セツキシマブおよびベバシズマブが包含されるがこれらには限定されない。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、内分泌薬とは、ホルモンまたはホルモン受容体に拮抗的で、そのため、成長にホルモンを必要とする型の癌を干渉する薬剤である。そのような内分泌薬の一例としては、乳房組織のエストロゲン受容体拮抗剤であるタモキシフェンがある。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「細胞治療」という用語は、改変したまたは未改変の細胞障害性リンパ球または樹状細胞の養子移植などの、細胞を用いた治療に関する。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「腫瘍ワクチン」と言う用語は、ａ）癌源ウイルスの感染を防ぐワクチン（作用機序はウイルス感染に対する他のワクチンと同様である）、ｂ）既存の癌を治療するワクチン（治療的癌ワクチン）またはｃ）癌の発展を阻害するまたはその作用を軽減するワクチン（予防的癌ワクチン）のいずれかを指す。
【０１２７】
これらに加えてあるいはこれらとは別に、前記使用は状況に合わせて、
・放射線治療、
・手術、および／または
・レーザー焼灼術、
からなる群より選択される少なくとも１つの他の治療で補完されることが好ましい。
【０１２８】
さらに、前述の開示に従う使用を含む、ヒトまたは動物対象の治療方法を提供する。好ましくは、前記治療方法は、前述の開示の中で示した適応に関する。この方法は、それを必要とするヒトまたは動物に、治療上有効量の本発明の組換え結合タンパク質を投与することを含む。
【０１２９】
本発明による組換え結合タンパク質またはアンキリン反復ドメインを、バクテリオファージ（国際公開第１９９０／００２８０９号、同第２００７／００６６６５号）もしくは細菌細胞（国際公開第１９９３／０１０２１４号）表面での提示、リボソームディスプレー（国際公開第１９９８／０４８００８号）、プラスミドを使ったディスプレー（国際公開第１９９３／００８２７８号）もしくはＲＮＡ−反復タンパク質交雑構築物を使ったディスプレー（国際公開第２０００／０３２８２３号）、または例えばタンパク質相補性検定（国際公開第１９９８／３４１１２０号）による細胞内での発現と選抜／スクリーニングなどの複数の方法によって得てもよく、および／またはそれをさらに発展させてもよい。このような方法は当業者には知られている。
【０１３０】
本発明による組換え結合タンパク質またはアンキリン反復ドメインの選抜／スクリーニングに用いられるアンキリン反復タンパク質のライブラリーを、当業者には知られている手法に従って得てもよい（国際公開第２００２／０２０５６５号、ビンズＨ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３２、４８９〜５０３、２００３、およびビンズら、２００４、前掲文献）。ＨＥＲ２の細胞外領域に対する特異性を有するアンキリン反復ドメインを選抜するためのそのようなライブラリーの使用を実施例１に例示する。さらに、本発明のアンキリン反復ドメインは、本発明のアンキリン反復モジュールや適切なキャッピングモジュールまたはキャッピング試薬（フォアーＰ．ら、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５３９、２〜６、２００３）から、標準的な組換えＤＮＡ技術によって（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号、ビンズら、２００３、前掲文献およびビンズら、２００４、前掲文献）、規格単位（モジュール）を使った方式で組み立てることができる。
【０１３１】
本発明は実施例で説明した特定の態様に限定されるものではない。以降で説明する一般的な概要に従って、他の供給源を使用・処理してもよい。
定義
【０１３２】
「タンパク質」という用語はポリペプチドを指し、ここでそのポリペプチドの少なくとも一部は、規定された三次元配置を有するか、またはそのポリペプチド鎖の中におよび／またはそのポリペプチド鎖の間に二次、三次、もしくは四次構造を形成することで、規定された三次元構成を獲得することができる。あるタンパク質が２つ以上のポリペプチドを含む場合、個々のポリペプチド鎖は非共有的にまたは共有的に、例えば２つのポリペプチド間のジスルフィド結合によって結合されている場合がある。個別に規定された三次元構成を有するか、または二次、三次、もしくは四次構造を形成することで規定された三次元配置を獲得することができるタンパク質の一部分は「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。当業者であればこのようなタンパク質ドメインをよく知っている。
【０１３３】
組換えタンパク質、組換えタンパク質ドメイン、組換え結合タンパク質などに関して使用される「組換え」という用語は、前記ポリペプチドが、関連する分野の当業者にはよく知られている組換えＤＮＡ技術を用いて生産されたものであることを意味している。例えば、ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生成された分子）を、細菌性の発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、キアゲン）、酵母の発現プラスミドまたは哺乳類の発現プラスミドにクローニングすることができる。例えば、構築したそのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば大腸菌）に挿入すると、この細菌はこの組換えＤＮＡによってコードされているポリペプチドを生産することができる。このようにして生産されたポリペプチドは組換えポリペプチドと呼ばれる。
【０１３４】
本発明において「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で繋がれた複数の、つまり２個以上のアミノ酸を含む１本以上の鎖からなる分子に関する。ポリペプチドは、ペプチド結合によって繋がれた９個以上のアミノ酸からなることが好ましい。
【０１３５】
「ポリペプチドタグ」という用語はポリペプチド／タンパク質に付加されたアミノ酸配列を指し、ここで前記アミノ酸配列は、精製、検出もしくは前記ポリペプチド／タンパク質の標的化に有用なアミノ酸配列であるか、そのポリペプチド／タンパク質の物理化学的な挙動を改善するアミノ酸配列であるか、またはエフェクター機能を有するアミノ酸配列である。結合タンパク質のそれぞれのポリペプチドタグ、部分および／またはドメインは、直接またはポリペプチドリンカーを介して互いに連結していてもよい。これらのポリペプチドタグは当該分野でよく知られており、当業者であれば十分に利用できる。ポリペプチドタグの例としては、ヒス（Ｈｉｓ、例えば配列番号６のヒスタグ）、ミック（ｍｙｃ）、フラグ（ＦＬＡＧ）、またはストレプ（Ｓｔｒｅｐ）タグなどの短いポリペプチド配列、または前記ポリペプチド／タンパク質の検出を可能にする酵素（例えばアルカリホスファターゼのような酵素）などの部分、もしくは標的化するのに使用できる部分（例えば免疫グロブリンまたはその断片）および／またはエフェクター分子として使用できる部分がある。
【０１３６】
「ポリペプチドリンカー」という用語は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、または２つの配列タグを繋ぐことができるアミノ酸配列を指す。そのような付加的なドメイン、タグ、非ポリペプチド部分およびリンカーは、関連する分野の当業者には知られている。例を一覧にしたものが、特許出願国際公開第２００２／０２０５６５号の明細書中に示されている。そのようなリンカーの具体例としては、様々な長さのグリシン−セリン−リンカーやプロリン−トレオニン−リンカーがあり、好ましくは、前記リンカーの長さは２〜２４アミノ酸、より好ましくは前記リンカーの長さは２〜１６アミノ酸である。グリシン−セリン−リンカーの例を配列番号７〜１０に、およびプロリン−トレオニン−リンカーの例を配列番号１１および１２に示す。配列番号１１のプロリン−トレオニン−リンカーの前および／または後にＧＳがあることが好ましい。
【０１３７】
「ポリマー部分」という用語は、タンパク質性のポリマー部分または非タンパク質性のポリマー部分のいずれかを指す。「タンパク質性のポリマー部分」は、安定な三次構造をとらないポリペプチドであることが好ましい。タンパク質性のポリマー部分の例としては、ＸＴＥＮ（登録商標）（アムニクス（Ａｍｕｎｉｘ）の登録商標；国際公開第２００７／１０３５１５号）ポリペプチド、または国際公開第２００８／１５５１３４号に記載されている、プロリン、アラニンおよびセリン残基を含んでいるポリペプチドが挙げられる。そのようなタンパク質性のポリマー部分を、例えば、標準的なＤＮＡクローニング技術によって遺伝的に融合させたポリペプチドを生成し、その後、それらを標準的に発現・精製することで、本発明の反復ドメインに共有結合することができる。「非タンパク質性のポリマー部分」とは、ポリペプチドから構成されていないポリマー部分である。非タンパク質性ポリマー部分の例としては、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンが挙げられる。「ペグ化」という用語は、ペグ（ＰＥＧ）部分が、例えば本発明のポリペプチドに共有結合していることを意味する。本発明のポリマー部分の分子量は大きく変わり得る。前記ポリマー部分がポリペプチドリンカーによって反復ドメインに連結されていることが好ましい。
【０１３８】
具体的な態様では、ペグ部分または他の任意の非タンパク性ポリマーを、例えば本明細書に記載するように、システインがペプチドリンカーを介して反復ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合している状態で、マレイミドリンカーを介してシステインチオールに結合させることができる。
【０１３９】
「結合タンパク質」という用語は、さらに詳しく後述するように、１つ以上の結合ドメイン、１つ以上の生理活性化合物および１つ以上のポリマー部分を含んでいるタンパク質を指す。好ましくは、前記結合タンパク質は最大４つの結合ドメインを含む。さらに、そのような結合タンパク質はいずれも、結合ドメインではない付加的なタンパク質ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーおよび／またはシステイン残基を１つ含む場合がある。
【０１４０】
「多量体化部分」の例としては、対合して機能性の免疫グロブリンＦｃドメインとなる免疫グロブリンの重鎖定常領域およびロイシンジッパーまたは遊離チオールを含んでいるポリペプチド（遊離チオールは、２つのそのようなポリペプチド間の分子間ジスルフィド結合を形成する）が挙げられる。ポリペプチドに他の部分を抱合させるために、例えば、当業者にはよく知られているマレイミド化学によって抱合させるために、システイン残基を１つ使用することもできる。好ましくは、前記結合タンパク質は組換え結合タンパク質である。また好ましくは、結合タンパク質の結合ドメインは異なる標的特異性を有する。
【０１４１】
「との結合に競合する」という用語は、本発明の２つの異なる結合ドメインは同時に同じ標的には結合できないが、両方の結合ドメインはそれぞれ同じ標的に結合可能であることを意味している。従ってこのような２つの結合ドメイン同士が前記標的との結合に競合する。好ましくは、前記２つの競合する結合ドメインは、前記標的上の重複しているまたは同じ結合エピトープに結合する。２つの結合ドメインが標的との結合に関して競合するか否かを決定するための方法、例えば競合的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または競合的ＳＰＲ測定（例えばバイオ・ラッドのプロテオン（ＰｒｏｔｅＯｎ）装置を使った測定）は当業者によく知られている。
【０１４２】
「多パラトープ性結合タンパク質」という用語は、同じ標的タンパク質にある２つ以上の異なるエピトープに対する結合タンパク質を意味する。例えば、ＨＥＲ２を標的としている多パラトープ性結合タンパク質は、少なくとも、ＨＥＲ２の第一のエピトープを標的とする第一の結合ドメインとＨＥＲ２の別の第二のエピトープを標的とする第二の結合ドメインを含み、場合により、ＨＥＲ２のさらなるエピトープを標的とするさらなる結合ドメインを含む。
【０１４３】
「二パラトープ結合タンパク質」という用語は、同じ標的タンパク質に局在している２つの異なるエピトープに対する結合タンパク質を意味する。例えば、ＨＥＲ２を標的とする二パラトープ結合タンパク質は、少なくとも、ＨＥＲ２の第一のエピトープを標的とする第一の結合ドメインとＨＥＲ２の別の第二のエピトープを標的とする第二の結合ドメインを含む。同様に、「二パラトープＤＡＲＰｉｎ」は、同じ標的分子上の第一のエピトープに対する第一の結合ドメインと、別の第二のエピトープに対する第二の結合ドメインを含む。
【０１４４】
「生理活性化合物」という用語は、疾患を患っている哺乳動物に使用したときに、前記疾患の性質を部分的に変化させる化合物を指す。生理活性化合物は拮抗的な性質をまたは作用性の性質を有していてもよく、また、タンパク質性の生理活性化合物である場合もまたは非タンパク質性の生理活性化合物である場合もある。そのようなタンパク質性の生理活性化合物を、例えば、標準的なＤＮＡクローニング技術によって遺伝的に融合させたポリペプチドを生成し、その後、それらを標準的に発現・精製することで、本発明の結合ドメインに共有結合することができる。そのような非タンパク質性の生理活性化合物を、例えば、化学的な手段によって、例えば本明細書に記載するように、マレイミドリンカーを介してシステインオールに結合させることで、ペプチドリンカーを介してシステインが結合ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合している状態で、本発明の結合ドメインに共有結合することができる。タンパク質性の生理活性化合物の例としては、別個の標的特異性を有する結合ドメイン（例えば、成長因子に結合することでそれを中和する）、サイトカイン（例えばインターロイキン）、成長因子（例えばヒト成長ホルモン）、抗体およびその断片、ホルモン（例えばＧＬＰ−１）ならびに生産可能なあらゆるタンパク質性の薬剤が挙げられる。非タンパク質性の生理活性化合物の例には、毒物（例えばイムノゲン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）社のＤＭ１）、ＧＰＣＲを標的とする低分子、抗生物質および生じ得るあらゆる非タンパク質性の薬剤がある。
【０１４５】
「結合ドメイン」という用語は、以後で定義するように、タンパク質足場と同じ「折り畳み構造」（三次元の配置）を示し、予め決められた特性を有するタンパク質ドメインを意味する。このような結合ドメインは合理的に、最も一般的なところでは、当該分野で知られているコンビナトリアルなタンパク質改変技術によって得ることができる（ビンズら、２００５、前掲文献）。例えば、予め決められた特性を有する結合ドメインは、（ａ）以後でさらに定義するタンパク質足場と同じ折り畳み構造を示すタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供する工程；および（ｂ）前記予め決められた特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを得るために、前記多様なコレクションをスクリーニングする工程および／または前記予め決められた特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを前記多様なコレクションから選抜する工程、を含む方法によって得ることができる。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用されるスクリーニングおよび／または選抜の系に応じて複数の方法によって提供することができ、また、ファージディスプレーまたはリボソームディスプレーなどの当業者にはよく知られている方法の使用が含まれ得る。好ましくは、前記結合ドメインは組換え結合ドメインである。また好ましくは、前記結合ドメインは、反復タンパク質かまたは設計反復タンパク質である。
【０１４６】
従って、本明細書で使用する場合「結合する」という用語は、所与の標的を認識しかつ結合するが、他の標的を実質的に認識も結合もしない結合ドメインに関する。好ましくは、本発明の意味における結合ドメインの候補としての資格を得るためには、ＰＢＳ中で１０-7Ｍ未満の平衡解離定数が必要である。
【０１４７】
「Ｋｄ」という用語は平衡解離定数に関するもので、平衡解離定数とは、複合体がその構成分子に分離する場合のように、より大きな物体がより小さい化合物に可逆的に分離する（解離する）傾向を測る特定の型の平衡定数である。
【０１４８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた技術（例えばＳＰＲ平衡解析）または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などのタンパク質間相互作用の平衡解離定数を決定する方法が当業者にはよく知られている。異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定すれば、測定された特定のタンパク質間相互作用のＫｄ値は変わる可能性がある。従って、Ｋｄ値の測定は、標準化されたタンパク質溶液と標準化された緩衝液、例えばＰＢＳを使って行われるのが好ましい。
【０１４９】
「ＰＢＳ」という用語は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸および２．７ｍＭのＫＣｌを含有し、ｐＨが７．４のリン酸緩衝水溶液を意味する。
【０１５０】
「タンパク質足場」という用語は、アミノ酸の挿入、置換または欠失を多く許容することができる露出した表面を有するタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインの生成に用いることができるタンパク質足場の例としては、抗体またはその断片（１本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片など）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）由来のビリン結合タンパク質もしくは他のリポカリン類、アンキリン反復タンパク質もしくは他の反復タンパク質類、およびヒトのフィブロネクチンがある。タンパク質足場は当業者に知られている（ビンズら、２００５、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。
【０１５１】
「標的」という用語は、核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物または他のあらゆる天然に存在する分子などの個々の分子およびそのような個々の分子の一部、または２つ以上のそのような分子の複合体を指す。標的は細胞全体または組織試料であってもよく、または標的は任意の非天然の分子もしくは部分であってもよい。好ましくは、標的は、天然に存在するもしくは非天然のポリペプチドであるか、あるいは化学修飾、例えば天然のもしくは非天然のリン酸化、アセチル化、またはメチル化による修飾を含有しているポリペプチドである。本発明の特定の用途では、標的はＨＥＲ２の細胞外領域である。
【０１５２】
「予め決められた特性」という用語は、標的との結合、標的の遮断、標的介在性反応の活性化、酵素活性、および関連するさらなる特性などの特性を指す。所望される特性の種類によって、当業者は、所望の特性を有する結合ドメインのスクリーニングおよび／または選抜を実施するための形式およびその実施に必要な工程を確認することができる。好ましくは、前記予め決められた特性は標的との結合である。
【０１５３】
以降の反復タンパク質に関する定義は、特許出願である国際公開第２００２／０２０５６５号に記載されている定義に基づくものである。特許出願である国際公開第２００２／０２０５６５号はさらに、反復タンパク質の特徴、技術および用途の一般的な説明も含んでいる。
【０１５４】
「反復タンパク質」という用語は、１つ以上の反復ドメインを含んでいるタンパク質を指す。好ましくは、前記反復タンパク質はそれぞれ、４つまでの反復ドメインを含む。より好ましくは、前記反復タンパク質はそれぞれ、２つまでの反復ドメインを含む。最も好ましくは、反復タンパク質はそれぞれ、反復ドメインを１つだけ含む。さらに前記反復タンパク質は、付加的な非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグおよび／またはポリペプチドリンカーを含んでいてもよい。
【０１５５】
「反復ドメイン」という用語は、２つ以上の連続した反復単位（モジュール）を構造単位として含んでいるタンパク質ドメインを指し、ここで前記構造単位はそれぞれ同じ折り畳み構造を有し、密に積み重なって、疎水性の結合コアを有する高次らせん構造を形成している。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端にキャッピング単位（またはモジュール）をさらに含む。一層好ましくは、前記Ｎ末端および／またはＣ末端のキャッピング単位（またはモジュール）はキャッピング反復である。
【０１５６】
「設計反復タンパク質」および「設計反復ドメイン」という用語はそれぞれ、特許出願の国際公開第２００２／０２０５６５号で説明されている発明的な手順の結果として得られた反復タンパク質または反復ドメインを指す。設計反復タンパク質および設計反復ドメインは合成されたもので、天然由来のものではない。これらはそれぞれ、それに応じて設計された核酸を発現させることによって得られた人工のタンパク質またはドメインである。真核細胞または細菌細胞などの原核細胞の中で発現させるか、細胞を使わないインビトロの発現系を用いて発現させることが好ましい。従って、設計アンキリン反復タンパク質（つまりＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含んでいる本発明の組換え結合タンパク質に相当する。
【０１５７】
「構造単位」という用語は、ポリペプチドのうちの局所的に構造が整っている部分を指し、これは、ポリペプチド鎖に沿って隣接している２つ以上の二次構造セグメント間の三次元的な相互作用によって形成されている。このような構造単位は構造モチーフを表している。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも１つの構造単位中に存在する、二次構造の構成要素の三次元的な配置を指す。構造モチーフは当業者にはよく知られている。構造単位だけでは規定の三次元配置を取ることはできないが、それらが、例えば反復ドメインの中の反復モジュールとして、連続して配置されることで隣り合った単位が相互に安定化し、その結果、高次らせん構造がもたらされる。
【０１５８】
「反復単位」という用語は、１種以上の天然に存在する反復タンパク質の反復配列モチーフを含んでいるアミノ酸配列を指し、ここで前記「反復単位」は複数のコピーに見られ、前記モチーフの全てに共通している規定の折り畳み位相構造を示すことで、タンパク質の折り畳み構造を決定している。このような反復単位は、フォアーら（２００３、前掲文献）に記載されている、反復タンパク質の「反復している構造単位（反復）」またはビンズら（２００４、前掲文献）に記載されている、反復タンパク質の「連続した相同の構造単位（反復）」に相当する。このような反復単位は骨格残基と相互作用残基とを含んでいる。このような反復単位の例としては、アルマジロ反復単位、ロイシン・リッチ反復単位、アンキリン反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、およびロイシン・リッチ変異型反復単位が挙げられる。このような反復単位を２つ以上含有している天然に存在するタンパク質は、「天然に存在する反復タンパク質」と呼ばれる。反復タンパク質の個々の反復単位のアミノ酸配列には、それぞれを比較した場合に、有意な数の変異、置換、付加および／または欠失が入っている場合があるが、それでもなお、反復単位の基本的なパターン、すなわちモチーフを実質的に保持している。
【０１５９】
従って、「アンキリン反復単位」という用語は反復単位を意味し、これは、記載されている、例えばフォアーら、２００３、前掲文献に記載されているアンキリン反復である。アンキリン反復は当業者によく知られている。「アンキリン反復ドメイン」という用語は、２つ以上の連続したアンキリン反復単位（モジュール）を構造単位として含み、好ましくは、Ｎ末端および／またはＣ末端にキャッピング単位（またはモジュール）も含む反復ドメインを指す。
【０１６０】
「骨格残基」と言う用語は反復単位のアミノ酸残基、すなわち反復モジュールの相当するアミノ酸残基に関するもので、骨格残基は折り畳みの位相構造、つまり前記反復単位（またはモジュール）の折り畳み構造に寄与するか、または隣り合った単位（またはモジュール）間の相互作用に寄与する。このような寄与は反復単位（またはモジュール）中の他の残基との相互作用となるか、またはαヘリックスもしくはβシート、または直線状のポリペプチドもしくはループを形成している一定の長さ(stretches)のアミノ酸に見られるようなポリペプチド骨格の高次構造に影響を与えるものであり得る。
【０１６１】
「標的相互作用残基」という用語は、反復単位のアミノ酸残基、すなわち反復モジュールの相当するアミノ酸残基に関するもので、これは、標的物質との相互作用に寄与するものである。このような寄与は標的物質との直接的な相互作用となるか、または直接相互作用している他の残基に、例えば反復単位（またはモジュール）のポリペプチドの高次構造を安定化し、前記標的と直接相互作用している残基の相互作用を可能にするまたは向上させることで影響を与えるものであり得る。そのような骨格残基および標的相互作用残基は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲおよび／またはＣＤ分光法などの物理化学的な方法によって得られたデータを解析すること、あるいは構造生物学および／またはバイオインフォマティクス分野の当業者がよく知っている既知のおよび関連する構造情報を比較することによって同定することができる。
【０１６２】
反復配列モチーフの推定に用いられる反復単位は、好ましくは、同じ構造モチーフを有する反復単位で、前記反復単位の骨格残基が７０％を超えて互いに相同な、相同な反復単位である。前記反復単位のうち、８０％を上回る骨格残基が相同であることが好ましく、前記反復単位のうち、９０％を上回る骨格残基が相同であることが最も好ましい。ポリペプチド間の相同性（パーセンテージ）を決定するためのコンピュータープログラム、例えばＦａｓｔａ、ＢｌａｓｔまたはＧａｐが当業者に知られている。さらに好ましくは、反復配列モチーフの推定に用いられる反復単位は、規定の標的に関して選択された反復ドメインから得られる相同な反復単位である。
【０１６３】
「反復配列モチーフ」という用語は、１つ以上の反復単位または反復モジュールから推定されたアミノ酸配列を指す。好ましくは、前記反復単位または反復モジュールは同じ標的に対する結合特異性を有する反復ドメインに由来するものである。そのような反復配列モチーフは、骨格残基位置と標的相互作用残基位置を含む。前記骨格残基位置は反復単位（またはモジュール）の骨格残基の位置に相当する。同様に、前記標的相互作用残基位置は、反復単位（またはモジュール）の標的と相互作用する残基の位置に相当する。反復配列モチーフは、定位置および無作為な位置を含む。「定位置」という用語は反復配列モチーフ中のアミノ酸の位置を指し、ここで前記位置には特定のアミノ酸が存在する。たいていの場合、そのような定位置は、骨格残基の位置および／または特定の標的に特異的な標的相互作用残基の位置に相当する。「無作為な位置」という用語は反復配列モチーフ中のアミノ酸の位置を指し、この場合、前記アミノ酸の位置には２種類以上のアミノ酸のいずれが存在してもよい。例えば、一般的な２０種類の天然に存在するアミノ酸のいずれが存在してもよく、または２０種類の天然に存在するアミノ酸の多くが、例えばシステイン以外のアミノ酸が、もしくはグリシン、システインおよびプロリン以外のアミノ酸が存在してもよい。ほとんどの場合、そのような無作為な位置は標的相互作用残基の位置に相当するが、骨格残基のいくつかの位置が無作為な場合もある。
【０１６４】
「折り畳みの位相構造」という用語は、前記反復単位または反復モジュールの三次構造を指す。折り畳みの位相構造は、αヘリックスまたはβシートの少なくとも一部を形成している一定の長さのアミノ酸、または直線状ポリペプチドもしくはループを形成している一定の長さのアミノ酸によって決定されるか、あるいはαヘリックス、βシートおよび／または直線状ポリペプチド／ループの任意の組み合わせによって決定される。例えば、アンキリン反復単位／モジュールはβターン、それに続く２つの逆平行αヘリックス、そして次の反復単位／モジュールのターンに達しているループからなる。
【０１６５】
「連続した」という用語は、反復単位または反復モジュールが直列に配置されている配置を指す。設計反復タンパク質では、少なくとも２個、一般的には約２〜６個、具体的には少なくとも約６個、しばしば２０個以上の反復単位（またはモジュール）が連続している。ほとんどの場合、反復ドメインの反復単位同士（またはモジュール同士）は、高レベルの配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基がある）または配列相同性（アミノ酸残基は異なるが、同様の物理化学的特性を有する）を示し、いくつかのアミノ酸残基は重要な残基であり、高度に保存されている。しかしながら、アミノ酸の挿入および／または欠失、および／または反復ドメインの異なる反復単位（またはモジュール）間における置換による高度な配列の変動も、その反復単位（またはモジュール）に共通の折り畳みの位相構造が維持される限りにおいて可能である。
【０１６６】
Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはＣＤ分光法などの物理化学的な手段によって、反復タンパク質の折り畳みに関する位相構造を直接決定するための方法は当業者によく知られている。反復単位もしくは反復配列モチーフを同定および決定するための方法、またはそのような反復単位もしくはモチーフを含んでいる関連するタンパク質のファミリーを決定および同定するための方法、例えば相同性検索（ＢＬＡＳＴなど）は、バイオインフォマティクスの分野において十分に確立されており、かつ、当該分野の当業者によく知られている。最初の反復配列モチーフを改良する工程には過程を繰り返すことが含まれる場合がある。
【０１６７】
「反復モジュール」という用語は、設計反復ドメインのうちの反復しているアミノ酸配列を指し、これは元々は天然に存在する反復タンパク質の反復単位に由来するものである。反復ドメインに含まれているそれぞれの反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリーまたはサブファミリー、例えばアルマジロ反復タンパク質もしくはアンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。さらに好ましくは、反復ドメインに含まれるそれぞれの反復モジュールは、例えば実施例１に記載するように、ある標的に関して選択された反復ドメインより得られた相同の反復単位から推定された反復配列モチーフを含み、かつ、同じ標的特異性を有する。
【０１６８】
従って、「アンキリン反復モジュール」という用語は、元々は天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位由来の反復モジュールを意味する。アンキリン反復タンパク質は当業者によく知られている。
【０１６９】
「反復モジュール」は、対応している反復モジュールの全コピーに存在しているアミノ酸残基が入っている位置（「定位置」）と、異なるまたは「無作為な」アミノ酸残基が存在する位置（「無作為な位置」）を含んでいてもよい。
【０１７０】
「キャッピングモジュール」という用語は、反復ドメインのＮ末端またはＣ末端の反復モジュールに融合させたポリペプチドを指し、ここで前記キャッピングモジュールは前記反復モジュールと密な三次元相互作用（つまり三次元構造相互作用）を形成し、それによって、連続した反復モジュールに接触していない側の前記反復モジュールの疎水性コアを溶媒から保護するキャップを構成している。前記Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールは、反復単位に隣接している天然に存在する反復タンパク質中に見られるキャッピング単位または他の構造単位であってよく、あるいはそれらに由来するものであってもよい。「キャッピング単位」という用語は、反復単位のＮ末端またはＣ末端に融合させた特定の構造単位を規定する天然に存在する折り畳まれたポリペプチドを指し、ここで前記ポリペプチドは、前記反復単位と密な三次元構造相互作用を形成し、それによって、前記反復単位の片方にある疎水性コアを溶媒から保護している。好ましくは、キャッピングモジュールまたはキャッピング単位はキャッピング反復である。「キャッピング反復」という用語は、前記隣接している反復単位（またはモジュール）と同様のもしくは同じ折り畳み構造を有する、および／または前記隣接している反復単位（またはモジュール）と同様の配列を有するキャッピングモジュールもしくはキャッピング単位を指す。キャッピングモジュールおよびキャッピング反復については国際公開第２００２／０２０５６５号に、およびインターランディら、２００８（前掲文献）による記載がある。
【０１７１】
Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（つまりＮ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号１、２、３、１３、１４、２０、２６、２７、３６、４０、４４、４５、５０、５４、１２４、１２８および１３２が、ならびにアンキリンＣ末端キャッピングモジュール（つまりＣ末端キャッピング反復）の例としては配列番号４、５、１９、２４、２５、３３、３４、３５、３９、４３、４８、４９、５３、５７、１２７、１３１および１３５が挙げられる。
【０１７２】
例えば、配列番号１３のＮ末端アンキリンキャッピングモジュールは１〜３２番目のアミノ酸によってコードされており、配列番号１９のＣ末端キャッピングモジュールは９９〜１２６番目のアミノ酸によってコードされている。
【０１７３】
本発明による組換え結合タンパク質は少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含み、ここで前記アンキリン反復ドメインは哺乳類のＨＥＲ２の細胞外領域に対する結合特異性を有する。
【０１７４】
「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」または「標的特異性」などの用語は、ある結合タンパク質または結合ドメインが、ＰＢＳ中で、関連のないタンパク質、例えば大腸菌の麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）よりも低い平衡解離定数で標的に結合することを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での平衡解離定数は、対応するＭＢＰの平衡解離定数の少なくとも１０分の１、より好ましくは少なくとも１００分の１、さらに好ましくは少なくとも１，０００分の１、最も好ましくは少なくとも１０，０００分の１よりも小さい。
【０１７５】
「共通配列」という用語は、複数の反復単位を構造によっておよび／または配列によって整列することで得られるアミノ酸配列を指す。構造によっておよび／または配列によって整列させた２つ以上の反復単位を用いて、また、整列中にギャップを入れることを許容することで、各位置で最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になる。共通配列とは、各位置で最も出現頻度の高いアミノ酸を含む配列である。同じ位置に平均より高い頻度で２個以上のアミノ酸が現れる場合には、共通配列はそれらアミノ酸の小集団を含む場合がある。前記２つ以上の反復単位は、単一の反復タンパク質に含まれる複数の反復単位から得られるものであっても、２つ以上の異なる反復タンパク質から得られるものであってもよい。
【０１７６】
共通配列およびそれらの決定方法は当業者によく知られている。
【０１７７】
「共通アミノ酸残基」とは、共通配列の特定に位置に見られるアミノ酸である。前記２つ以上の反復単位中に同様の確率で２個以上、例えば３、４または５個のアミノ酸残基が見られる場合には、最も高い頻度で見られるアミノ酸を、または前記２個以上のアミノ酸残基の組み合わせを共通アミノ酸とすることができる。
【０１７８】
天然に存在しないキャッピングモジュール、反復モジュール、結合タンパク質または結合ドメインがさらに好ましい。
【０１７９】
「天然に存在しない」という用語は、合成のものであることまたは天然に由来しないことを意味し、より具体的には、この用語は、人工のものであることを意味する。「天然に存在しない結合タンパク質」または「天然に存在しない結合ドメイン」という用語は、前記結合タンパク質または前記結合ドメインが合成されたもの（つまりアミノ酸を使った化学合成によって生産されたもの）または組換えられたものであり、天然に由来しないことを意味する。「天然に存在しない結合タンパク質」または「天然に存在しない結合ドメイン」はそれぞれ、それに応じて設計した核酸を発現させることで得られる人工のタンパク質またはドメインである。真核細胞または原核細胞の中で発現させるか、細胞を使わないインビトロの発現系を用いて発現させることが好ましい。この用語はさらに、前記結合タンパク質または前記結合ドメインの配列が、配列データベース、例えばジェンバンク、ＥＭＢＬバンクまたはスイスプロットに非人為的な配列として登録されていないことも意味している。これらのデータベースおよび他の同様の配列データベースは当業者によく知られている。
【０１８０】
本発明によるアンキリン反復ドメイン、特に本発明によるアンキリン反復モジュールおよびキャッピングモジュールの基本的な修飾および誘導体。
【０１８１】
Ｎ末端またはＣ末端アンキリンキャッピング反復をそれぞれ含んでいるＮ末端またはＣ末端アンキリンキャッピングモジュールがさらに好ましく、ここで前記キャッピング反復中に存在する１つ以上のアミノ酸残基は、対応するアンキリンキャッピング単位またはアンキリン反復単位を整列させたときに相当する位置に見られるアミノ酸残基に置き換えられている。
【０１８２】
アミノ酸置換は、最も多く天然に存在する２０種類のアミノ酸のいずれによる置換であってもよく、好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられ；およびより好ましくはＡ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸によって置き換えられる。また好ましくは、アミノ酸の置換は相同のアミノ酸によるものである。つまり、アミノ酸は類似の生物物理学的特性をもつ側鎖を有するアミノ酸によって置き換えられる。例えば、負に帯電しているアミノ酸Ｄは負に帯電しているアミノ酸Ｅで置換することができ、またはＬなどの疎水性のアミノ酸はＡ、ＩまたはＶで置換することができる。相同なアミノ酸によるアミノ酸置換は当業者によく知られている。
【０１８３】
また、配列番号４、５、１９、２４、２５、３３、３４、３５、３９、４３、４８、４９、５３、５７、１２７、１３１または１３５に基づく前述のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの、２７番目および２８番目の位置のＡのアミノ酸を含んでいるＣ末端アンキリンキャッピングモジュールも好ましい。
【０１８４】
また、配列番号４、５、１９、２４、２５、３３、３４、３５、３９、４３、４８、４９、５３、５７、１２７、１３１または１３５に基づく前述のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの、１〜２６番目または１〜２７番目の位置のアミノ酸を含んでいるＣ末端キャッピングモジュールも好ましい。
【０１８５】
配列番号１、２、３、１３、１４、２０、２６、２７、３６、４０、４４、４５、５０、５４、１２４、１２８または１３２の１番目のＧおよび／または２番目のＳアミノ酸は、その特性に何ら明白な影響を及ぼすことなく、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールから除去することができる。これら２個のアミノ酸は、アンキリン反復ドメインを別のアミノ酸およびタンパク質と連結するためのリンカーとして役立つ。本発明はまた、１番目のＧおよび／または２番目のＳが除去されているＮ末端アンキリンキャッピングモジュールを含んでいるそのようなアンキリン反復ドメインも含む。当然のことながら、本発明で定義したアンキリン反復ドメイン中のアミノ酸の位置（例えば「３３番目」）は状況に応じて、例えば１個のアミノ酸が欠失している場合には「３３番目」は「３２番目」に、または、２つのアミノ酸が欠失している場合には「３３番目」は「３１番目」に番号が変わる。
【０１８６】
本発明のアンキリン反復ドメインのアンキリンキャッピングモジュールを、当業者に知られているアミノ酸配列の整列、突然変異生成および遺伝子合成などの結合技術によってアンキリンキャッピングモジュールと交換することができる。例えば、（ｉ）配列番号５の配列と整列させることで、配列番号７９のＣ末端キャッピング反復（つまり９９〜１２６番目の配列）を決定すること、（ｉｉ）決定した配列番号７９のＣ末端キャッピング反復の配列を、配列番号５の配列で置換すること、（ｉｉｉ）交換したＣ末端キャッピングモジュールをコードしている反復ドメインをコードしている遺伝子を生成すること、（ｉｖ）改変した反復ドメインを大腸菌の細胞質内で発現させること、および（ｖ）改変した反復ドメインを標準的な手段によって精製することによって、配列番号７９のＣ末端キャッピング反復を配列番号５のＣ末端キャッピング反復と置換することができる。別の例としては、（ｉ）配列番号３の配列と整列させることで、配列番号７９のＮ末端キャッピング反復（つまり１〜３２番目の配列）を決定すること、（ｉｉ）決定した配列番号７９のＮ末端キャッピング反復の配列を、配列番号３の配列で置換すること、（ｉｉｉ）交換したＮ末端キャッピングモジュールをコードしている反復ドメインをコードしている遺伝子を生成すること、（ｉｖ）改変した反復ドメインを大腸菌の細胞質内で発現させること、および（ｖ）改変した反復ドメインを標準的な手段によって精製することによって、配列番号７９のＮ末端キャッピング反復を配列番号３のＮ末端キャッピング反復と置換することができる。
【０１８７】
さらに、本発明のアンキリン反復ドメインを、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（例えば配列番号３のＮ末端キャッピング反復）、その後に１つ以上の反復モジュール（例えば配列番号７９の３３〜９９番目のアミノ酸残基を含んでいる２つのアンキリン反復モジュール）さらにその後にＣ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号５のＣ末端キャッピング反復）を配置することで、遺伝子合成の手段によって遺伝的に構築することができる。その後、遺伝的に構築した反復ドメイン遺伝子を前述したように大腸菌内で発現させることができる。
【０１８８】
Ｃ、ＭまたはＮのアミノ酸を含まないアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質、反復ドメイン、反復モジュール、Ｎ末端キャッピングモジュールまたはＣ末端キャッピングモジュールがさらに好ましい。
【０１８９】
Ｎのアミノ酸の次にＧが存在しないアミノ酸配列を有する組換え結合タンパク質、反復ドメイン、反復モジュール、Ｎ末端キャッピングモジュールまたはＣ末端キャッピングモジュールがさらに好ましい。
【０１９０】
そのようなＮ末端またはＣ末端キャッピングモジュールのいずれかを含んでいる組換え結合タンパク質または反復ドメインがさらに好ましい。
【０１９１】
本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、Ｎ末端キャッピング単位を整列させた場合に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは、３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのようなＮ末端キャッピング単位が天然に存在するＮ末端キャッピング単位であることが最も好ましい。
【０１９２】
本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記反復ドメインのＣ末端キャッピングモジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、Ｃ末端キャッピング単位を整列させた場合に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのようなＣ末端キャッピング単位が天然に存在するＣ末端キャッピング単位であることが最も好ましい。
【０１９３】
その上さらに別の特定の態様では、３０％までのアミノ酸残基、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が、反復単位、Ｎ末端キャッピング単位、またはＣ末端キャッピング単位の対応する位置に見られないアミノ酸で交換されている。
【０１９４】
本発明によるアンキリン反復ドメインを含んでいる組換え結合タンパク質のさらに好ましい態様では、前記アンキリン反復ドメインの反復モジュールに含まれている１つ以上のアミノ酸残基が、反復単位を整列させた時に対応する位置に見られるアミノ酸残基で交換されている。好ましくは３０％までのアミノ酸残基が交換されており、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が交換されている。そのような反復単位が天然に存在する反復単位であることが最も好ましい。
【０１９５】
その上さらに別の特定の態様では、３０％までのアミノ酸残基、より好ましくは２０％まで、一層好ましくは１０％までのアミノ酸残基が、反復単位の対応する位置に見られないアミノ酸で交換されている。
【０１９６】
さらなる態様では、本明細書に記載の組換えＨＥＲ２結合タンパク質またはドメインをいずれも、１つ以上の付加的な部分、例えば、異なる標的に結合して二重特異性結合剤を作り出す部分、生理活性化合物、標識部分（例えばフルオレセインなどの蛍光標識または放射性追跡子）、タンパク質の精製を促進する部分（例えばヒスタグまたはストレプタグなどの小さいペプチドタグ）、治療効果を改善するためのエフェクター機能をもたらす部分（例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用をもたらすための抗体のＦｃ部分、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）などの有毒なタンパク質部分またはメイタンシノイドもしくはＤＮＡアルキル化剤などの低分子毒物）または薬物動態を向上させる部分などに共有結合させることができる。薬物動態の向上は、認知されている治療の必要性に応じて評価することができる。可能であれば、投与後にタンパク質が利用可能な状態で血清中に維持される時間を長くすることで、生物学的利用能が高まることおよび／または投与間隔が長くなることが望まれることが多い。時には、タンパク質の血清濃度の経時的な持続性を改善する（例えば、タンパク質の血清濃度について、投与直後の濃度と次の投与直前の濃度との差を小さくする）ことが望まれる。血中からのタンパク質の排出を遅くする傾向のある部分としては、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類（例えばシアル酸）、耐用性の高いタンパク質部分（例えばＦｃ断片または血清アルブミン）、および結合ドメインまたは大量の血清タンパク質、例えば抗体のＦｃ断片もしくは血清アルブミンに対する特異性および親和性を有するペプチドが挙げられる。血清アルブミンに対して親和性を有するそのような結合ドメインまたは反復ドメインの例が国際公開第２０１２／０６９６５４号に挙げられている。本発明の組換え結合タンパク質を、哺乳動物中での（例えばマウス、ラット、またはヒトでの）ポリペプチドの排出速度を、未改変ポリペプチドの３分の１よりも低下させる部分と結合させてもよい。
【０１９７】
特定の一態様において本発明は、ＨＥＲ２に結合する第一の反復ドメイン、ＨＥＲ２に結合する第二の反復ドメインを含み、さらに、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するアンキリン反復ドメインを１つ以上含んでいる組換え結合タンパク質に関する。ＨＥＲ２に対する特異性を有する反復ドメインの例を本明細書に記載しており、また、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するアンキリン反復ドメインの例は国際公開第２０１２／０６９６５４号に記載されている。このようなドメイン同士を当業者には知られている方法によって、ポリペプチドリンカーを使った遺伝的な手段で連結させることができる。
【０１９８】
別の好ましい態様は組換え結合タンパク質であり、ここで第一の反復ドメインと第二の反復ドメインはＨＥＲ２に対する結合特異性を有し、ＨＥＲ２との結合に関与する内部反復モジュールを１つ、２つ、３つまたはそれ以上含んでいるアンキリン反復ドメインである。好ましくは、そのようなアンキリン反復ドメインはＮ末端キャッピングモジュール、１〜４個の内部反復モジュール、およびＣ末端キャッピングモジュールを含む。好ましくは、前記キャッピングモジュールはキャッピング反復である。また好ましくは、前記キャッピングモジュールはＨＥＲ２との結合に関与する。
【０１９９】
さらに、前述した医薬組成物はいずれも、障害の治療に関して検討される。
【０２００】
本発明はさらに、治療方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、治療上有効量の本発明の組換え結合タンパク質を投与することを含む。
【０２０１】
さらに、それを必要とする患者に有効量の前述した医薬組成物を投与することを含む、ヒトなどの哺乳動物における病理学的状態の治療方法についても検討する。
【実施例】
【０２０２】
これ以後に開示する出発材料および試薬は全て当業者には知られているものであり、市販されているか、またはよく知られている技術によって準備することができる。
【０２０３】
材料
化学物質はフルカ（Ｆｌｕｋａ、スイス）から、オリゴヌクレオチドはミクロシシンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス）から購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素および緩衝液はニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）またはフェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、リトアニア）より購入した。クローニングおよびタンパク質の産生には、大腸菌ＸＬ１−ブルー（ストラタジーン、米国）またはＢＬ２１（ノバジェン、米国）株を用いた。組換えヒトＨＥＲ２外部ドメイン（標準的な手段によってＣＨＯ細胞内で産生されたＥｒｂＢ２  Ｓ２２−Ｎ５３０−フラグおよびＥｒｂＢ２  Ｓ２２−Ｅ６４５−フラグ）は豪州科学産業研究機構（ＣＳＩＲＯ、オーストラリア）から購入した。ビオチン化Ｈｅｒ２外部ドメインは、標準的なビオチン化試薬と方法（ピアス、米国）により、ビオチン部分をタンパク質の一級アミンにカップリングさせることで化学的に得た。細胞株は、ＬＧＣ／ＡＴＣＣ（フランス／米国；カタログ番号：ＢＴ４７４−ＨＴＢ−２０、ＳＫＢＲ−３−ＨＴＢ−３０、ＮＣＩ−Ｎ８７−ＣＲＬ５８２２、ＺＲ７５−３０−ＣＲＬ１５０４、ＨＣＣ１４１９−ＣＲＬ２３２６、ＭＤＡ−ＭＢ１７５  ＶＩＩ−ＨＴＢ−２５）から購入した。細胞用培地はインビトロジェン／ルビオ（Ｌｕｂｉｏ、スイス）から、ウシ胎仔血清はＰＡＡから、細胞増殖検出用、細胞増殖ＥＬＩＳＡ用、ＢｒｄＵ用（発色）（カタログ番号１１６４７２２９００）の検定試薬はロシュ（スイス）から、アポトーシス検出用の検定試薬、カスパーゼＧｌｏ３／７（カタログ番号Ｇ８０９１）はプロメガおよびスイスから、ならびに細胞死検出用ＥＬＩＳＡ  ＰＬＵＳシステム（１１  ７７４  ４２５  ００１）はロシュ（スイス）から、細胞のトランスフェクション用試薬、リポフェクタミン２０００（１１６６８０２７）はインビトロジェン（スイス）から得た。ＦＡＣＳ分析はベクトン・ディッキンソン社（スイス）のＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩシステムを用いて行った。ＤＡＲＰｉｎのＨｅｒ２との結合は、抗ペンタ−ヒス・アレクサフルオロ６４７（ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）抱合体（カタログ番号Ａ２１４４５；ルビオ、スイス）を用いて検出した。アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ、カタログ番号：Ｌ−１１−００７）はＰＡＡから、トラスツズマブはカントナル・アポティーケ・チューリッヒ（Ｋａｎｔｏｎａｌ  Ａｐｏｔｈｅｋｅ  Ｚｕｒｉｃｈ）から購入し、ペルツズマブはエビトラ（Ｅｖｉｔｒａ、スイス）で合成した。ＧＦＰ−タグ化Ｈｅｒ２（ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ  Ｈｅｒ２）用の発現ベクターはオリジーン（Ｏｒｉｇｅｎｅ、米国、カタログ番号ＲＧ２１２５８３）から得た。
【０２０４】
分子生物学
特に明記しない限り、方法は記載されている手法に従って実施される（サンブルックＪ．、フリッチＥ．Ｆ．およびマニアティスＴ．、分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー研究所、１９８９、ニューヨーク）。
【０２０５】
増殖解析
ＤＡＲＰｉｎが細胞の増殖に及ぼす影響を、ＢｒｄＵ標識（ＢｒｄＵ、細胞増殖用ＥＬＩＳＡ、ロシュ）を使ってＤＮＡの合成を測定することで決定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートの１ウェルごとに、１００μｌの完全培地に入れた１００００個のＢＴ４７４細胞を播種し、２４時間インキュベートした。ＤＡＲＰｉｎおよび基準物質を加えてさらに７２時間インキュベートした。細胞標識用のＢｒｄＵを加え、最後、２４時間インキュベートした。標識された（増殖している）細胞を製造業者による手順に従って検出した。データは、Ｘ軸には対数で濃度を、Ｙ軸には吸光度（ＯＤ  ４５０−６０２ｎｍ）をプロットするグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを使って解析した。非線形回帰フィッティングを使ってデータを当てはめた（ログ（拮抗剤）対反応−変化のある勾配（４指標））。
【０２０６】
アポトーシス解析
ＤＡＲＰｉｎによるアポトーシスの誘導を、カスパーゼ３／７−Ｇｌｏシステム（プロメガ、スイス）を使ってカスパーゼ３／７の活性化を測定することで決定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートの１ウェルごとに、１００μｌの完全培地に入れた１００００個のＢＴ４７４細胞を播種し、２４時間インキュベートした。ＤＡＲＰｉｎおよび基準物質を加えてさらに２４時間インキュベートした。カスパーゼＧｌｏ試薬を、製造業者による手順に従って１時間加えた。ルシフェラーゼ活性を測定することでカスパーゼ３／７の活性化を監視した。
【０２０７】
あるいは、アポトーシスの誘導を細胞死検出用のＥＬＩＳＡＰＬＵＳシステム（ロシュ、スイス）を使用して決定した。アッセイは、製造業者による手順に従って行った。細胞数およびインキュベーション時間はカスパーゼＧｌｏの測定と同様にした。
【０２０８】
データは、Ｘ軸に濃度を、Ｙ軸に吸光度（ＯＤ  ４０５／４９０ｎｍ）またはＹ軸にＲＬＵにプロットするグラフパッド・プリズムソフトウェアを使って解析した。非線形回帰フィッティングを用いてデータを当てはめた（ログ（アゴニスト）対反応−変化のある勾配（４指標））。
【０２０９】
設計アンキリン反復タンパク質のライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを生成するための方法については記載がある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズら、２００３、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。そのような方法により、無作為化したアンキリン反復モジュールおよび／または無作為化したキャッピングモジュールを有する設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを構築することができる。従って、例えばそのようなライブラリーは、決まったＮ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号２のＮ末端キャッピングモジュール）または配列番号６０の配列モチーフに従って無作為化したＮ末端キャッピングモジュール、配列番号５８もしくは５９の配列モチーフに従って無作為化した１つ以上の反復モジュール、および決まったＣ末端キャッピングモジュール（例えば配列番号５のＣ末端キャッピングモジュール）または配列番号６１の配列モチーフに従って無作為化したＣ末端キャッピングモジュールを用いて構築してもよい。そのようなライブラリーは、好ましくは、反復またはキャッピングモジュールの無作為な位置に、Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前のＮ）またはＰアミノ酸を含まないように構築される。加えて、配列番号５８もしくは５９の配列モチーフに従って無作為化した反復モジュールは、１０番目および／または１７番目の位置をさらに無作為化してもよく；配列番号６０の配列モチーフに従って無作為化したＮ末端キャッピングモジュールは７番目および／または９番目の位置をさらに無作為化してもよく；および、配列番号６１の配列モチーフに従って無作為化したＣ末端キャッピングモジュールは１０、１１および／または１７番目の位置をさらに無作為化してもよい。
【０２１０】
さらに、そのようなライブラリーに含まれているそのような無作為化したモジュールには、アミノ酸の無作為な位置を有するポリペプチドループがさらに挿入されている場合がある。そのような挿入されているポリペプチドループの例としては、抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）ループのライブラリーまたはデノボで合成されたペプチドのライブラリーが挙げられる。例えば、そのようなループ挿入物は、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を手本として利用することで設計してもよい（タナカＮ．、ナカニシＭ、クサカベＹ、ゴトウＹ．、キタデＹ、ナカムラＫ．Ｔ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．２３（３０）、３９２９〜３９３８、２００４）。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様、アンキリン反復タンパク質ライブラリーでも、アンキリン反復ドメインのβターンの１つ以上に、様々な長さの（例えば１〜２０アミノ酸の）無作為化されたループ（定位置と無作為な位置を含む）が挿入される場合がある。
【０２１１】
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーのＮ末端キャッピングモジュールはいずれも、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ（例えば、配列番号６５の２１〜２６番目にあるモチーフ）の代わりにＲＥＬＬＫＡまたはＲＩＬＫＡＡモチーフを有し、そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーのＣ末端キャッピングモジュールはいずれも、好ましくは、ＫＬＮモチーフ（例えば、配列番号６５の最後の３アミノ酸）の代わりにＫＡＡまたはＫＬＡモチーフを有する。
【０２１２】
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーは、標的と相互作用する、既知のアンキリン反復ドメインの構造を手本として設計することができる。そのような構造の例としては、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）でのそれらの固有の受入番号または識別コード（ＰＤＢ−ＩＤ）で同定される、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ−３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０および２ＺＧＤがある。
【０２１３】
Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃ設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例については記載がある（国際公開第２００２／０２０５６５号；ビンズら、２００３、前掲文献；ビンズら、２００４、前掲文献）。Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃの中の数字は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールとの間に存在する無作為化された反復モジュールの数を表している。
【０２１４】
反復単位およびモジュール内部の位置を定義するには、ビンズら、２００４（前掲文献）に基づく命名法を、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位の境界を１番目のアミノ酸にずらすという変更を加えて用いた。例えば、ビンズら、２００４（前掲文献）のアンキリン反復モジュールの１番目は、本開示のアンキリン反復モジュールの２番目に対応し、その結果、ビンズら、２００４（前掲文献）のアンキリン反復モジュールの３３番目は、本開示では、次のアンキリン反復モジュールの１番目に対応する。
【０２１５】
ＤＮＡの配列は全て配列決定によって確認し、また、記載の全タンパク質について計算した分子量は、質量分析によって確認した。
【０２１６】
実施例１：ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含んでいる結合タンパク質の選抜
リボソームディスプレー（ヘインズＪ．およびプルクスンＡ．、ＰＮＡＳ  ９４、４９３７〜４２、１９９７）により、ＨＥＲ２の外部ドメインに対する結合特異性を有する多数の設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、ビンズら、２００４（前掲文献）によって記載されているように、ＤＡＲＰｉｎライブラリーから選抜した。粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡ（以後を参照のこと）により、それらの結合特異性を評価した。ＥＬＩＳＡの結果は、数百ものＨＥＲ２−特異的結合タンパク質が選抜されたことを示している。二パラトープＤＡＲＰｉｎがＢＴ４７４細胞の増殖を阻害するその能力を試験することによって、選抜したクローンのＨＥＲ２特異的な増殖阻害およびアポトーシスの誘導を測定した。
【０２１７】
例えば、配列番号６２〜８２、１１２〜１２１のアンキリン反復ドメインは、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含んでいる選抜された結合タンパク質のアミノ酸配列である。ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメイン由来の個別のアンキリン反復モジュールを、配列番号１５〜１８、２１〜２３、２８〜３２、３７、３８、４１、４２、４６、４７、５１、５２、５５、５６、１２５、１２６、１２９、１３０、１３３および１３４に示す。ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインの個々のキャッピングモジュールを、配列番号１３、１４、１９、２０、２４〜２７、３３〜３６、３９、４０、４３〜４５、４８〜５０、５３、５４、５７、１２４、１２７、１２８、１３１、１３２および１３５に示す。
【０２１８】
リボソームディスプレーによるＨＥＲ２特異的アンキリン反復タンパク質の選抜
ＨＥＲ２特異的アンキリン反復タンパク質の選抜を、標的タンパク質としてのヒトＨＥＲ２と前述の設計アンキリン反復タンパク質のライブラリーを用い、確立されている手法（ザーンドＣ．、アムシュトゥッツＰ．およびプルクスンＡ．、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４、６９〜７９、２００７）を用いたリボソームディスプレー（ヘインズおよびプルクスン、前掲文献）によって行った。選抜の過程をそれぞれ１巡した後には、結合剤の濃縮に起因する収率に合わせて、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲのサイクル数を常に４５回から３０回に減らした。選抜の最初の４巡では、標準的なリボソームディスプレーによる選抜を行った。このとき、１巡目から４巡目にかけて標的濃度を下げ、かつ、洗浄の強度を上げることで、選択圧を高めていった（ビンズら、２００４、前掲文献）。高親和性の抗ＨＥＲ２  ＤＡＲＰｉｎを濃縮するために、４巡目の標準的なリボソームディスプレー選抜（前記）から選抜されたものを、選抜強度の高い解離速度選抜（ザーンド、２００７、前掲文献）に供した。標準的な選抜過程の最後の一巡を実施して、解離速度に関して選抜されてきた結合タンパク質を増幅・回収した。
【０２１９】
粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡで示される、ＨＥＲ２に特異的に結合するクローンの選抜
ＤＡＲＰｉｎを発現している大腸菌の粗抽出物を使った標準的な手法による酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）で、ＨＥＲ２の外部ドメインに特異的に結合する個々の選抜したＤＡＲＰｉｎを同定した。リボソームディスプレーで選抜したＤＡＲＰｉｎを、ｐＱＥ３０（キアゲン）発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＸＬ１−ブルー株（ストラタジーン）に形質転換し、その後、１ｍｌの成長培地（１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有している２ＹＴ）を入れた９６ウェルの深型プレート中、３７℃で一晩生育させた（それぞれのクローンを１つのウェルに入れた）。新しい９６ウェルの深型プレートに、１００μｌの一晩培養と、１ｍｌの新しい２ＹＴ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）を接種した。３７℃で２時間インキュベートした後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で発現を誘導し、３時間継続した。細胞を回収し、１００μｌのＢ−ＰＥＲＩＩ（ピアス）に再懸濁して、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。その後、９００μｌのＰＢＳ−ＴＣ（０．２５％のカゼイン加水分解物、０．１％のツイーン２０（登録商標）を追加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）を加え、遠心分離して細胞残渣を取り除いた。溶解したクローン１００μｌをそれぞれ、ビオチン部分で固定したＨＥＲ２または無関係のＭＢＰのいずれかが入った、ニュートラアビジンでコーティングしてあるマキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレートのウェルにいれ、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％のツイーン２０（登録商標）を追加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）で長く洗浄した後、モノクローナル西洋わさび標識抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）4抗体（３４６５０、キアゲン）を使った標準的なＥＬＩＳＡの手順でプレートを展開し、その後、ＰＯＤ基質（ロシュ）で結合を検出した。呈色を４０５ｎｍで測定した。このような細胞の粗抽出物を使ったＥＬＩＳＡによって数百個のクローンをスクリーニングした結果、ＨＥＲ２に対する特異性を有する１００を上回る種々のＤＡＲＰｉｎが明らかになった。これらの結合タンパク質をさらなる解析に用いた。ＨＥＲ２の外部ドメインに特異的に結合する選抜したアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号６２〜８２および１１２〜１２１に示す。
【０２２０】
これらのＨＥＲ２に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインと、ＨＥＲ２に対する結合特異性をもたない陰性対照のアンキリン反復ドメイン（つまり配列番号１１１）を、後述するように、単純なタンパク質の精製を促進するためのＮ末端ヒス−タグを提供するｐＱＥ（キアゲン、ドイツ）を基礎とする発現ベクターにクローニングした。従って、下記のＤＡＲＰｉｎをコードしている発現ベクターが構築された。
ＤＡＲＰｉｎ＃１（配列番号６２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２（配列番号６３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３（配列番号６４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５（配列番号６６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６（配列番号６７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃７（配列番号６８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃８（配列番号６９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃９（配列番号７０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１０（配列番号７１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１１（配列番号７２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１２（配列番号７３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１３（配列番号７４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１４（配列番号７５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１５（配列番号７６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１６（配列番号７７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１７（配列番号７８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１８（配列番号７９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃１９（配列番号８０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２０（配列番号８１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２１（配列番号８２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５０（配列番号１１１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）。
ＤＡＲＰｉｎ＃５１（配列番号１１２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５２（配列番号１１３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５３（配列番号１１４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５４（配列番号１１５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５５（配列番号１１６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５６（配列番号１１７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５７（配列番号１１８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５８（配列番号１１９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃５９（配列番号１２０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６０（配列番号１２１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
【０２２１】
選抜した二パラトープアンキリン反復タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号８３〜１１０、１２２、１２３、および１３６〜１４１に示す。これらの二パラトープＤＡＲＰｉｎを、後述するように、単純なタンパク質の精製を促進するためのＮ末端ヒス−タグを提供する、ｐＱＥ（キアゲン、ドイツ）を基礎とする発現ベクターにクローニングした。従って、以下のＤＡＲＰｉｎをコードしている発現ベクターが構築された。
ＤＡＲＰｉｎ＃２２（配列番号８３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２３（配列番号８４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２４（配列番号８５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２５（配列番号８６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２６（配列番号８７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２７（配列番号８８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２８（配列番号８９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃２９（配列番号９０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３０（配列番号９１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３１（配列番号９２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３２（配列番号９３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３３（配列番号９４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３４（配列番号９５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３５（配列番号９６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３６（配列番号９７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３７（配列番号９８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３８（配列番号９９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃３９（配列番号１００、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４０（配列番号１０１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４１（配列番号１０２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４２（配列番号１０３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４３（配列番号１０４、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４４（配列番号１０５、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４５（配列番号１０６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４６（配列番号１０７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４７（配列番号１０８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４８（配列番号１０９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃４９（配列番号１１０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）
ＤＡＲＰｉｎ＃６１（配列番号１２２、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６２（配列番号１２３、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６３（配列番号１３６、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６４（配列番号１３７、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６５（配列番号１３８、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６６（配列番号１３９、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６７（配列番号１４０、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）；
ＤＡＲＰｉｎ＃６８（配列番号１４１、そのＮ末端にヒス−タグ（配列番号６）を融合させたもの）。
【０２２２】
一価ＤＡＲＰｉｎの高レベルかつ可溶性での発現
さらなる解析のために、ＤＡＲＰｉｎ＃１〜５０を大腸菌のＢＬ２１またはＸＬ１−ブルー細胞中で発現させ、そのヒスタグを利用して、標準的な手法によって精製した。静置一晩培養を２５ｍｌ（ＬＢ、１％グルコース、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を、１リットル培養（同培地）に接種した。６００ｎｍの吸光度が０．７になった時点で、この培養をＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）で誘導し、３７℃で４〜５時間インキュベートした。培養を遠心し、得られた沈殿物を４０ｍｌのＴＢＳ５００（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁し、超音波処理した。溶解物を再度遠心し、得られた上清にグリセロール（最終濃度１０体積％）とイミダゾール（最終濃度２０ｍＭ）を加えた。タンパク質をニッケル−ニトリロ三酢酸カラム（カラム容積２．５ｍｌ）に負荷し、製造業者の説明（キアゲン、ドイツ）に従って精製した。あるいは、６×ヒス−タグを欠いたＤＡＲＰｉｎまたは選抜した反復ドメインは、標準的な樹脂と当業者に知られている手法による陰イオン交換クロマトグラフィーと、その後のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。大腸菌の１リットル培養から最大２００ｍｇの高度に可溶化された、ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎを、９５％を超える純度で（ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥで予測）精製することができる。このような精製したＤＡＲＰｉｎを以降の解析に使用する。
【０２２３】
実施例２：ＨＥＲ２に対する結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎの表面プラズモン共鳴解析による解析
関心のもたれる精製したＨＥＲ２結合ＤＡＲＰｉｎのタンパク質結合動態を、プロテオン（ＰｒｏｔｅＯｎ）アレイシステム（バイオラッド）を使った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析で検定した。ニュートラアビジンを介してビオチン化ヒトＨＥＲ２を固定し、遊離している一価のＤＡＲＰｉｎを加えることで、相互作用を測定する設定とした。Ｋｄ値の決定は、標準的な手順に従って行った。
【０２２４】
ビオチン化したヒトＨＥＲ２分子の外部ドメインを、コーティングしておいたストレプトアビジンとの結合を介してフローセル内に固定し、選抜した様々なＤＡＲＰｉｎとの相互作用を解析した。
【０２２５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析
ＳＰＲはプロテオン装置（バイオラッド）を使用して測定し、また、測定は当業者に知られている標準的な手順に従って行った。泳動用緩衝液としては、０．００５％のツイーン２０（登録商標）含有のＰＢＳ、ｐＨ７．４を使った。ニュートラアビジンをＧＬＣチップ（バイオラッド）に、約８０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のレベルまで共有的に固定した。次いで、ＨＥＲ２をニュートラアビジンでコーティングしたチップに固定した。その後、段階希釈したＤＡＲＰｉｎ（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｎＭの濃度）を含む泳動用緩衝液（０．００５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）含有ＰＢＳ）１００μＬを注入し（会合速度測定）、次いで泳動用緩衝液を一定の流速（１００μｌ／分）で１０分から最長３時間流すことで（解離速度測定）、ＤＡＲＰｉｎとＨＥＲ２の相互作用を測定した。コーティングしていない参照セルおよび参照注入（つまり泳動用緩衝液のみの注入）のシグナル（つまりレゾナンスユニット（ＲＵ）の値）を、ＨＥＲ２を注入した後に得られたＲＵの追跡結果から差し引いた（二重参照）。会合速度と解離速度の測定から得られたＳＲＰの追跡結果から、対応するＤＡＲＰｉｎ−ＨＥＲ２間相互作用の会合速度と解離速度を決定することができる。
【０２２６】
結果を表１にまとめる。平衡解離定数（Ｋｄ）は当業者に知られている標準的な手順を用い、予測された会合速度と解離速度から算出した。
【表１】
0006410724.tif 000002
0006410724.tif 000003
【０２２７】
実施例３：特定の細胞外ＨＥＲ２エピトープに結合する反復ドメインのマッピング
反復ドメインとＨＥＲ２の細胞外ドメインとの相互作用を、当業者に知られている標準的な方法、例えば、Ｘ線結晶学もしくはＮＭＲ分光法による複合体の四次構造解析、または、相互作用残基の可能性がある残基へのアラニン突然変異生成を用いたマッピングもしくは質量分析によるエピトープマッピング、および共有結合によるタグ化で解析した。さらに、様々な競合アッセイ、例えば、当業者に知られている競合的酵素酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を実施して、選抜した反復タンパク質が結合する細胞外ドメインを同定するか、あるいは、それらが、他の結合タンパク質、例えばトラスツズマブまたはペルツズマブなどの抗体と重複しているエピトープをＨＥＲ２の細胞外ドメインに有しているか否かを同定した。
【０２２８】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは購入するか、あるいは記載されているように（ヨストら、前掲文献）生産した。
【０２２９】
関心のもたれる精製したＨＥＲ２結合ＤＡＲＰｉｎの競合を、プロテオンアレイシステム（バイオラッド）を使った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によって行った。ビオチン化ヒトＥｒｂＢ２  Ｓ２２−Ｎ５３０とＥｒｂＢ２  Ｓ２２−Ｅ６４５をニュートラアビジンを介して固定し、飽和濃度（１μＭ）の第一の一価ＤＡＲＰｉｎを加え、次いで、第一のＤＡＲＰｉｎと第二のＤＡＲＰｉｎ（それぞれ１００ｎＭ）を１：１の割合で混合したものを加えることによって競合を測定する設定とした。第一のＤＡＲＰｉｎが存在するにもかかわらず第二のＤＡＲＰｉｎが結合する場合には、この第二のＤＡＲＰｉｎは異なるエピトープに結合すると見なした。
【０２３０】
例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（図１Ａおよび１Ｂ）のデータは、ＤＡＲＰｉｎ＃５４がＨｅｒ２のドメインＩＩに結合し、ＤＡＲＰｉｎ＃５１がＨＥＲ２のドメインＩに結合することを示唆している。これまでに、ＤＡＲＰｉｎ＃１８がＨＥＲ２のドメインＩＶに結合することが分かっていた（ヨストら、前掲文献）。ＤＡＲＰｉｎ（２０ｎＭ）をＨＥＲ２のドメインＩ、ドメインＩ−ＩＩＩまたはドメインＩＩＩ−ＩＶ（いずれの場合もドメインの濃度は５００ｎＭとした）とともにＰＢＳに入れ、室温で４５分間、プレインキュベートした。この混合物を、Ｆ９６マキシソープ（ヌンク、カタログ番号４４２４０４）プレートにコーティングした２０ｎＭの完全長Ｈｅｒ２に加えた。モノクローナルマウス抗ＲＧＳ−ヒス抗体（キアゲン、カタログ番号３４６５０）を一次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識型抗マウス抗体（ピアス、カタログ番号３１４３８）を二次抗体として用い、結合したＤＡＲＰｉｎを特異的に検出した。図１Ｂで図示したＥＬＩＳＡでは、一次抗体（マウス抗ＲＧＳ−ヒス抗体）をモノクローナルマウス抗ＤＡＲＰｉｎ抗体に置き換えた。
【０２３１】
測定は４５０ｎｍで行った。全てのインキュベーション工程は、０．１％のツイーン２０（登録商標）と０．２５％のカゼインを含有しているＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用し、ハイドルフ社のタイトラマックス１０００振とう器上（４５０ｒｐｍ）、室温で２時間行った。ただし、プレートをコーティングする工程だけは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、４℃で一晩行った。
【０２３２】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、これらのＤＡＲＰｉｎと、Ｈｅｒ２組換えドメインＩ、ドメインＩ−ＩＩ−ＩＩＩおよびドメインＩＩＩ−ＩＶを有するＨｅｒ２を過剰発現している細胞（ＢＴ４７４）との結合を競合することで、ここまでの発見を確認した。ＤＡＲＰｉｎ（１００ｎＭ）をそれぞれのＨｅｒ２構築物（１μＭ）と２５℃で３０分、プレインキュベートした。氷上でこの混合物を細胞（１００μｌ中に１００，０００細胞）に加え、２０分間置いた。アレクサ６４７標識抗ペンタ−ヒス抗体（キアゲン、カタログ番号：３５３７０）で、ＤＡＲＰｉｎの細胞への結合を監視した。この解析によって、ＤＡＲＰｉｎ＃５１がＨＥＲ２のドメインＩに結合すること、ＤＡＲＰｉｎ＃１がＨＥＲ２のドメインＩＩに結合すること、およびＤＡＲＰｉｎ＃１８がＨＥＲ２のドメインＩＶに結合することを確認した。
【０２３３】
フローサイトメトリーを用い、ＤＡＲＰｉｎ＃１とペルツズマブおよびＤＡＲＰｉｎ＃１８とトラスツズマブの競合についても試験した。ここでは、ＢＴ４７４細胞をペルツズマブ、トラスツズマブ（いずれも１μＭ）のそれぞれとプレインキュベートし、その後、それぞれのＤＡＲＰｉｎ（１μＭ）を加えてインキュベートした。アレクサ６４７標識抗ペンタ−ヒス抗体（キアゲン、カタログ番号：３５３７０）を利用してＤＡＲＰｉｎの細胞への結合を、アレクサ５４６標識抗ヒト−ＩｇＧ抗体（インビトロジェンカタログ番号：Ａ−２１０８９）を利用してペルツズマブまたはトラスツズマブの結合を監視した。この実験から、いずれのＤＡＲＰｉｎも、ＢＴ４７４細胞で発現しているＨＥＲ２とペルツズマブまたはトラスツズマブとの結合に競合しないことが示された。
【０２３４】
このことは、ＥＬＩＳＡでも観察された（図１Ｃ）。この場合には、ペルツズマブ（Ｆ９６マキシソープ（ヌンク、カタログ番号４４２４０４）にコーティングされている、２０ｎＭ）を２０ｎＭのＨｅｒ２（ドメインＩ−ＩＩＩＩ）とプレインキュベートし、その後、それぞれのＤＡＲＰｉｎ（２０ｎＭ）とインキュベートした。モノクローナルマウス抗ＲＧＳ−ヒス抗体（キアゲン、カタログ番号３４６５０）と西洋わさびペルオキシダーゼ標識型抗マウス抗体（ピアス、カタログ番号３１４３８）（予め室温で４５分間混合しておく）を使用して、ＤＡＲＰｉｎとＨｅｒ２−ペルツズマブ複合体との特異的な結合を検出した。全てのインキュベーション工程は、ハイドルフ社のタイトラマックス１０００振とう器上（４５０ｒｐｍ）、室温で２時間行ったが、プレートをコーティングする工程だけは４℃で一晩行った。ブロッキング剤としては、０．１％のツイーン２０（登録商標）と０．２５％のカゼインを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用した。このアッセイで試験したＮ末端ＤＡＲＰｉｎは全て（ＤＡＲＰｉｎ＃７、ＤＡＲＰｉｎ＃５２、ＤＡＲＰｉｎ＃５３、およびＤＡＲＰｉｎ＃５４）ペルツズマブ存在下でＨｅｒ２と結合しており、このことは、これらは全て、抗体とは違うエピトープに結合することを示している。
【０２３５】
これらの実験は全体として、配列番号６２〜６８、７２、および１１４〜１２１によってコードされている一価の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、配列番号６９〜７１、７３、１１２および１１３によってコードされている一価の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩに結合し、ならびに、配列番号７４〜８２によってコードされている一価の反復ドメインはＨＥＲ２のドメインＩＶに結合することを示した。ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する一価の反復ドメイン（配列番号６２〜６８、７２、および１１４〜１２１）はどれも、ペルツズマブとＨＥＲ２との結合に競合しない。ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する一価の反復ドメインの中でも、配列番号７７、７８および８２によってコードされている反復ドメインは、トラスツズマブとＨＥＲ２との結合に競合するが、配列番号７４〜７６および７９〜８１によってコードされている反復ドメインはトラスツズマブと競合しない。
【０２３６】
実施例４：二パラトープＨｅｒ２結合ＤＡＲＰｉｎは、Ｈｅｒ２を過剰発現している腫瘍細胞の成長を阻害する。
一価のＤＡＲＰｉｎ、ＤＡＲＰｉｎの混合物、および二パラトープＨｅｒ２結合ＤＡＲＰｉｎによるＢＴ４７４細胞の増殖阻害について試験した。図２は、一価のＤＡＲＰｉｎおよび一価のＤＡＲＰｉｎの混合物はＢＴ４７４の増殖を阻害できないことを示している。対照的に、二パラトープＤＡＲＰｉｎの小集団は増殖阻害を誘導している（図２および表２）。興味深いことに、ＨＥＲ２のＤＡＲＰｉｎ反復ドメインＩＶ（ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合するＤＡＲＰｉｎ反復ドメイン）は、その分子のＣ末端に局在していなくてはならない（図２）。二パラトープ形式にした一価のＤＡＲＰｉｎの複数の組み合わせから、増殖阻害性の二パラトープＤＡＲＰｉｎが得られた。しかしながら、組み合わせの全てがＢＴ４７４の増殖を９０〜１００％阻害できるわけではなく（図３）、そのため、ＤＡＲＰｉｎの特定の組み合わせを等級付けることができる。これらの発見は、ＨＥＲ２の特定のエピトープの小集団のそれぞれを、二パラトープ形式で標的とすることが、効果を高めるのに重要であることを示している。トラスツズマブを使った例で報告されているようなＨＥＲ２受容体の内部移行および分解の誘導は、腫瘍細胞の増殖を強く阻害するには十分ではない（図３および５）。ＤＡＲＰｉｎ＃４１とＤＡＲＰｉｎ＃４３はトラスツズマブと同様にＨｅｒ２の分解を誘導するが、ＤＡＲＰｉｎ＃４１などのＤＡＲＰｉｎだけが腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【０２３７】
方法の項に記載したように実験を行った。例示的な結果を表２にまとめている。ＩＣ50値は、当業者に知られている標準的な手順を使用して、前述のようにして得た滴定曲線から算出した。ＤＡＲＰｉｎ＃４１に関する滴定曲線の例を図２および３に示す。
【表２】
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【０２３８】
実施例５：二パラトープＨｅｒ２標的ＤＡＲＰｉｎは、Ｈｅｒ２を過剰発現している様々な細胞株の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する。
二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１の有効性を試験した。このＤＡＲＰｉｎは、Ｈｅｒ２を過剰発現している細胞株の増殖を、Ｈｅｒ２  ＩＨＣ  ３＋〜１＋の範囲で阻害したが、野生型のレベルでＨＥＲ２を発現している細胞の増殖は阻害しなかった（図４；表３）。さらに、このＤＡＲＰｉｎは２４時間以内のインキュベーションで、表に挙げた細胞株で確実にアポトーシスを誘導する（図５、表３）。
【０２３９】
方法の項に記載したように実験を行った。例示的な結果を表３にまとめている。ＩＣ50値およびＥＣ50値は前述した通り当業者に知られている標準的な手順によって、滴定曲線から算出した。３種類の細胞株に関するＤＡＲＰｉｎ＃４１の滴定曲線の例を図４および５に示す。試験したＤＡＲＰｉｎと細胞株に応じて、ＩＣ５０値およびＥＣ５０値の範囲は０．２〜１０ｎＭの範囲である。例えば、ＤＡＲＰｉｎ＃４１、＃４５および＃４６がＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ１７５およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞のアポトーシスを誘導することが示された（表３）。本発明の他の二パラトープ結合タンパク質を用いても同様の結果が得られた。
【表３】
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【０２４０】
実施例６：最新の標準治療とは対照的に、Ｈｅｒ２を標的とする二パラトープＤＡＲＰｉｎはＢＴ４７４細胞の増殖を阻害し、そのアポトーシスを誘導する。
二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１の効力を、Ｈｅｒ２陽性の乳癌の治療に認可されている薬剤であるトラスツズマブおよびペルツズマブと比較した。トラスツズマブ単独、ペルツズマブ単独またはトラスツズマブとペルツズマブの併用とは対照的に、ＤＡＲＰｉｎは効率的にＢＴ４７４細胞の増殖を阻害し、かつ、アポトーシスを誘導する（図６）。
【０２４１】
方法の項に記載したように実験を行った。例示的な結果を図６示している。ＩＣ50値およびＥＣ50値は前述した通り当業者に知られている標準的な手順によって滴定曲線から算出した（表３）。本発明の他の二パラトープ結合タンパク質を用いても同様の結果が得られた。
【０２４２】
実施例７：様々な形式のＤＡＲＰｉｎの生成。
一例として、種々の形式の二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１によるＢＴ４７４細胞の増殖阻害をＤＡＲＰｉｎ＃４１と比較した（図７、表２）。ペグ化しても、またはＮ末端もしくはＣ末端にヒト血清アルブミン結合ＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ＃４１、＃６３、＃６４、＃６５）を融合させても、効果に影響はなかった（図７Ａ）。また、ＤＡＲＰｉｎ部分間のリンカーを換えても効果に影響を及ぼさなかった（図７Ｂ）。ＩＣ５０値は１．５〜５．５ｎＭの範囲である。対応する形式の二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１、＃６６、＃６７、＃６８を使った場合にも、同様の結果が得られた。まとめるとこれらの結果は全体として、二パラトープＤＡＲＰｉｎは、その効果を消失することなく、インビボでの半減期が長くなるように修飾できること（ペグ化または血清アルブミン結合ドメインとの融合などの当業者に知られている方法によって）を示唆している。さらにこれらの実験は、二パラトープ構築物に含まれている２つのＨＥＲ２結合反復ドメインの間のリンカーは、二パラトープ構築物の効果に有意な影響を及ぼすことなく、少なくとも２〜２４アミノ酸に変更できることを示唆している。
【０２４３】
実施例８：ＤＡＲＰｉｎ／Ｈｅｒ２相互作用のマッピング。
本発明の二パラトープＤＡＲＰｉｎとＨＥＲ２外部ドメインとの相互作用を、これら２つに分子で形成されている複合体を溶液（つまりｐＨ７．４のＰＢＳ）中で化学的に架橋結合し、その後、この複合体をプロテアーゼで消化し、そして得られたペプチドを質量分析で解析することによってさらに解析した。このような実験では、ＤＡＲＰｉｎがＨＥＲ２とごく接近している場合にのみ、ＤＡＲＰｉｎの領域をＨＥＲ２の領域に共有的に架橋結合させることができる。ＨＥＲ２の対応するペプチドに共有的に架橋結合しているＤＡＲＰｉｎ由来のペプチドを質量分光法解析で検出した結果は、これらのペプチドがＨＥＲ２／ＤＲＡＰｉｎ複合体中で非常に近接していることを示している。このような近接解析の方法は当業者に知られており（例えば、バーチＣ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、８２、１７２〜１７９、２０１０）、また、様々な企業からサービスとして提供されている（例えば、コバルクス・アーゲー（ＣｏｖａｌＸ  ＡＧ）、チューリッヒ、スイス）。
【０２４４】
例えばこのような実験から、ＨＥＲ２のドメインＩＩとドメインＩＶに結合する二パラトープＤＡＲＰｉｎ＃４１がＨＥＲ２と１対１の複合体を形成することができることが分かった。驚くことに、Ｃ末端反復ドメイン（ＨＥＲ２のドメインＩＶと結合している）とＨＥＲ２のドメインＩとの間には共有的な架橋結合が観察された。このことは、この反復ドメインは複合体中でドメインＩＶと結合していながらも、ＨＥＲ２のドメインＩとも近接していることを示している。ＨＥＲ２が先行技術（例えば、ブブリルおよびヤーデン、前掲文献）に記載されているような高次構造をとっているとすれば、このような架橋結合が見られるとは予想されなかった。重要なことは、ＨＥＲ２外部ドメインを解析した場合、このＣ末端反復ドメインがドメインＩＶだけに結合している複合体ではＨＥＲ２のドメインＩへのこのような架橋結合は観察できないということであり、このことは、ＨＥＲ２とドメインＩＶに結合する単量体反復ドメインとで形成されている複合体の例では、この反復ドメインのドメインＩへの近接は存在しないことを示している。従って、本発明の二パラトープ結合タンパク質から形成されている複合体中でのＨＥＲ２に対するドメインの三次元的な配置は、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する個々の反復ドメインで形成されている複合体の配置とは異なっているはずである。
【０２４５】
興味深いことに、ＨＥＲ２の外部ドメインに関してこれまでに知られている構造では、２つの反復ドメインの間に２〜２４アミノ酸の短いリンカーがあると想定する場合、本発明の二パラトープ結合タンパク質の両方の反復ドメインは同じＨＥＲ２分子に同時に結合することはできない。このことは、ＨＥＲ２が、両方の反復ドメインが同時に結合することを許容する未だ知られていない高次構造をとり得ることを示している。
【０２４６】
これらの実験は全体として、本発明の二パラトープ結合タンパク質はＨＥＲ２の外部ドメインと分子間相互作用し、それによってＨＥＲ２の外部ドメインを先行技術では知られていない新規の高次構造に固定する、すなわち、ドメインＩとドメインＩＶを、反復ドメイン（ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合している反復ドメイン）とドメインＩとの間の観察された架橋結合が生じるのを可能にする立体配置にすることができるのだろうということを示している。従って、ＨＥＲ２のこの新規高次構造は、本発明の二パラトープ結合タンパク質がＨＥＲ２のドメインＩＩとドメインＩＶに分子間的な様式で同時に結合することによって安定化されるのだろうと考えられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006410724.tif 000013
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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