(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0006309902.tif 000004
（配列番号：１７）
［式中、
（ｉ）Ｐｈｅ１Ｇｌｙ；
（ｉｉ）Ｔｒｐ４Ａｌａ；
（ｉｉｉ）Ａｒｇ１３Ａｓｐ；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組合せ；
（ｖ）Ｐｈｅ１ＧｌｙおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｖｉ）Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｖｉｉ）Ｔｒｐ４ＡｌａおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｖｉｉｉ）Ａｒｇ１３ＡｓｐおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｉｘ）Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４ＡｌａおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｘ）Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ；
（ｘｉ）Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｔｒｐ４ＡｌａおよびＤｈａ５Ａｌａ；
（ｘｉｉ）Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ；
（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ；または
（ｘｉｖ）Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｄｈａ５ＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ
のアミノ酸置換が存在する］
またはその薬学的に許容される塩、を含む変異ランチビオティクス(lantibiotic)。
【請求項２】
変異ランチビオティクスが、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ変異、ΔＴｒｐ４変異、アミノ酸置換Ａｂｕ８Ａｌａおよびアミノ酸置換Ｄｈｂ１４Ａｌａの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の変異ランチビオティクス。
【請求項３】
変異ランチビオティクスが、環Ｄのビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）がエチル基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）である、請求項２に記載の変異ランチビオティクス。
【請求項４】
（ａ）請求項１から３のいずれかに記載の１つ以上の単離された変異ランチビオティクスおよび薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、他の希釈剤または賦形剤；
（ｂ）ｐＨ３から８で生理溶液中に有効量の請求項１から３のいずれかに記載の１つ以上の変異ランチビオティクス；
（ｃ）組成物中に細菌の繁殖または細菌の数を減少させるために十分な量の請求項１から３のいずれかに記載の１つ以上の変異ランチビオティクスを含む食物、飲料、ガムまたは歯磨き剤；
（ｄ）請求項１から３のいずれかに記載のランチビオティクス組成物を有するか、あるいは請求項１または２に記載のランチビオティクス組成物が固体表面または布上に被覆されているか、または固体表面または布に固定、連結もしくは結合されている固体表面または織布または不織布
；または
（ｅ）請求項１から３のいずれかに記載の１つ以上のランチビオティクスのミュータシンおよび１つ以上のアプリケーター
を含む組成物。
【請求項５】
組成物が、少なくとも１つの抗真菌剤、１つのさらなる抗菌剤、膜破壊剤、グラム陰性細菌を変異ランチビオティクスに対して感受性にする膜破壊剤、グラム陰性菌静菌剤、グラム陰性菌殺菌剤またはそれらの組合せをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１つ以上の単離されたランチビオティクスが、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌまたはそれ以上で組成物中に存在する、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
対象中または対象上に存在する細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させる方法において使用するための、治療有効量の請求項４から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
対象がヒトである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、経口的または局所的、経鼻的、バッカル的(buccally)、舌下的、経粘膜的、経直腸的、経皮的、吸入により、注射により、筋肉内注射、静脈内注射、肺内注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、または皮下注射または髄腔内的に投与される、請求項４から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
組成物または物体中あるいは組成物または物体上に存在する細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させる方法であって、組成物または物体中あるいは組成物または物体上の細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させるために十分な期間中、請求項４から９のいずれかに記載の抗菌性組成物を該組成物または該物体と接触させることを含む方法。
【請求項１１】
組成物が食物、飲料、ガムまたは歯磨き剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号：１９−２６またはそれらの組合せを含む、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
生物膜または生物付着状態を減少させる方法において使用するための組成物であって、該方法は生物膜または生物付着状態中または生物膜または生物付着状態上の細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させるために十分な期間中、該組成物を該生物膜または該生物付着状態と接触させることを含む、請求項４から９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、２０１２年２月２７日出願の米国仮出願第６１／６０３，６６１号および２０１２年２月２７日出願の米国仮出願第６１／６０３，６９３号の利益を主張するものであり、両方を出典明示によりそれら全体において本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
医学的に重要な細菌の多数の株は、現在利用できる抗生物質に対してますます耐性となっている。多剤耐性病原体により引き起こされる医療関連感染は特に悩ましい。世界中で、１００万人が抗生物質耐性の感染を受け、医療制度において莫大な費用を抱える。新規な抗生物質の要求が、医学界において重大な満たされていない要求となっている（Infectious Society of America, 2010）。
【０００３】
（Smith & Hillman, (2008) Curr. Opin. Microbiol. 11:401において概説される）潜在的な臨床的関連を有する重要なクラスの抗生物質であるランチビオティクス(lantibiotic)は、存在する特有のランチオニン環のために、かかる名前が付いた。ランチビオティクスはまた、種々の珍しいアミノ酸、例えば、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）、２、３−ジデヒドロブチル酸(didehydrobutyrine)（Ｄｈｂ）、Ｓ−アミノビニル−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−オキソプロピオニル、２−オキソブチリルおよびヒドロキシプロピオニルを有することが知られている。Hasperら (2006) Science 313, 1636-1637。脂質ＩＩ結合ドメインであるミュータシン１１４０（「ＭＵ１１４０」）環ＡおよびＢ（図１Ａ参照）は、５０年間にわたって食品産業において使用されてきたラクトバチルス・ラクチス(Lactococcus lactis)により生産されるよく知られているランチビオティクスであるナイシン(nisin)と似ている。ナイシンおよびＭＵ１１４０の両方は新規な細胞壁合成部位から脂質ＩＩを外転させ(abduct)、最後に細胞死を引き起こすことが見出された。Smithら (2008) Biochemistry 47:3308-3314。
【０００４】
ランチビオティクスの特定の特性、例えば、それらの新規な種々の作用メカニズム、および、それが試験される場合において（Chatterjeeら., (2005) Chem Rev. 105:633）、感受性細菌の耐性を獲得する困難性が、潜在的な治療剤としてこれらの分子にかなりの興味を起こさせている。現在まで、ランチビオティクスの有機合成もまた、これらの非常に珍しいペプチド分子において見られる複雑な絡み合った環構造（例えば、図１ＡにおけるＭＵ１１４０の環Ｃ／Ｄ）のために阻止されている。
【０００５】
ランチビオティクスの絡み合った大環状環特徴を合成する問題は最近解決された。米国特許第７，５２１，５２９号；米国出願第２００９／０２１５９８５号参照。特異的に保護された直交ランチオニン技術（ＤＰＯＬＴ）は、全ての既知のランチビオティクスのコスト的に有効な大規模製造のために優れた可能性を有するペプチド合成プラットフォーム技術である。ＤＰＯＬＴの核心は、絡み合った環構築のための２つの新規な特異的に保護されたランチオニン（アラニン−Ｓ−アラニン）構成要素の製造を含む。標準の固体および／または液相ペプチド合成化学と組み合わせてのこれらの構成要素の使用は、絡み合った環の合成のために重要である。
【０００６】
ＭＵ１１４０は、口腔微生物ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)の特定の株により合成され得る。Smithら. (2000) Eur. J. Biochem. 267:6810-6816。大規模発酵方法を介して苦労して生産され、段階的沈殿、クロマトグラフィーおよび結晶化方法を使用して精製されるとき、それは、試験された物に対して全てのグラム陽性菌についてマイクロモル以下の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を証明した。Ghobrialら. (2009) International Journal of Antimicrobial Agents 33:70-74。該試験はまた、ＭＵ１１４０が、肺炎連鎖球菌および黄色ブドウ球菌の多剤耐性株に対して殺菌性であり、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)（ＶＲＥＦ）に対して静菌性であり、グラム陰性菌または酵母に対して活性を有さなかったことが証明された。同文献参照。該試験は、選択された病原体に対するＭＵ１１４０の時間−殺菌プロフィールが、最後の手段として現在使用される抗生物質の１つであるバンコマイシンのものと同様であったことを示した。同文献参照。それは、細胞壁生合成のために重要である脂質ＩＩへの結合および該脂質ＩＩの外転を含む新規な作用機序を有する。Hasperら., (2006) Science, 313:1636; Smithら., (2008) Biochem. 47:3308。それは、インビトロにて低い細胞毒性、マウスモデルに静脈内経路を介して投与されたとき低い毒性を有し、それは、全ての体区画に分配された。Ghobrialら., J. Pharm. Sci. Epub: Dec 28, 2009, DOI 10.1002/jps.22015。有効性の証明は、ＬＤ５０の黄色ブドウ球菌がラット腹膜炎モデルに６０回投与された予備試験においてなし遂げられた。有意な耐性の発生は、亜致死濃度のＭＵ１１４０を含む培地中での黄色ブドウ球菌または肺炎連鎖球菌の繰り返し継代培養中に観察されなかった。Ghobrialら. (2009) International Journal of Antimicrobial Agents 33:70-74。この観察の根拠は、一つには、分子標的の脂質ＩＩが細菌界中で進化的に古代のものであり、高度に保存されており、その構造および／または機能を変化させる変異が妨げられ得ることを示すという事実によってであり得る。ＭＵ１１４０の分子構造は４つの大環状環（図１Ａ参照）を含み、これらそれぞれはランチオニンまたはメチルランチオニン残基を含む。この奇妙な化学的特徴は、報告されているとおり、加水分解に対するＭＵ１１４０の耐性において重要である可能性がある。Hillmanら., Infect. Immun. 44:141 (1984)。加水分解に対する耐性はまた、一つには、ＭＵ１１４０の珍しい馬蹄形の三次元構造の現れであり得る。Smithら. (2003) Biochem. 42:10372-10384。これらの試験および他の試験に基づいて、ＭＵ１１４０は、最後の手段の現在の後退しつつある薬物と置き換わる可能性があり、グラム陽性菌、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)(C. diff)により引き起こされる問題のある感染の処置において役立つ。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明の１つの態様は、位置１でのアミノ酸がＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのアミノ酸がＡｌａに変化されているか、位置４でのアミノ酸が除去されているか、位置５でのアミノ酸がＡｌａで置換されているか、ＭＵ１１４０の場合のように、位置１３でのアミノ酸がＡｒｇである場合、位置１３でのＡｒｇがＡｓｐで置換されているか、または２つ以上のこれらの変化の組合せを含むランチビオティクスの変異体またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。変異ランチビオティクスは、Ｌｙｓ残基がＡｓｐで置換されている１つ以上の位置１２、１３、１４、１５、２２、２３、２７または３２をさらに有し得る。ＭＵ１１４０に加えて、変異ランチビオティクスは、例えば、ナイシン、エピデルミン、エピデルミン［Ｖａｌ１およびＬｅｕ６］、ガリデルミン、スタフィロコクシン１５８０、スタフィロコクシンＴ、ミュータシンＢ−ＮＹ２６６、ミュータシンＩＩＩ、ミュータシンＩ、ミクロビスポリシンＡ１およびミクロビスポリシンＡ２、クローディン(clausin)、ストレプチン、エリシン(ericin)Ａ、エリシンＳ、サブチリン、またはその薬学的に許容される塩を含む。
【０００８】
変異ランチビオティクスは、例えば、
（ａ）位置１でのＩｌｅがＧｌｙに変化されているか、位置４でのＩｌｅがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか；位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置１２でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、位置２２でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ナイシン；
（ｂ）位置１でのＩｌｅまたはＶａｌがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＬｙｓがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＰｈｅがＡｌａに変化されているか、位置１３でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、エピデルミン、エピデルミン［Ｖａｌ１およびＬｅｕ６］、ガリデルミン、スタフィロコクシン１５８０またはスタフィロコクシンＴ；
（ｃ）位置１でのＰｈｅがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＴｒｐがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置１３でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ミュータシンＢ−ＮＹ２６６；
（ｄ）位置１でのＰｈｅがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＴｒｐがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置１３でのＡｒｇがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ミュータシンＩＩＩ；
（ｅ）位置１でのＰｈｅがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＬｅｕがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置１５でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ミュータシンＩ；
（ｆ）位置１でのＴｒｐがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＣｌｏｒｏ−ＴｒｐがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ミクロビスポリシンＡ１およびミクロビスポリシンＡ２；
（ｇ）位置１でのＰｈｅがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＶａｌがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、クローディン；
（ｈ）位置１でのＴｒｐがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＡｒｇがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＴｙｒがＡｌａに変化されているか、位置１４でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、位置２３でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、ストレプチン；
（ｉ）位置１でのＶａｌがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＬｙｓがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置２８でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、エリシンＡ；
（ｊ）位置１でのＴｒｐがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＧｌｕがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置３２でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、エリシンＳ；または
（ｋ）位置１でのＴｒｐがＩｌｅまたはＧｌｙに変化されているか、位置４でのＧｌｕがＡｌａに変化されているか、もしくは除去されているか、位置５でのＤｈａがＡｌａに変化されているか、位置２７でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、位置３０でのＬｙｓがＡｓｐに変化されているか、またはそれらの組合せを含む、サブチリン；
またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、式Ｉ：
【化１】
0006309902.tif 000002
（配列番号：１７）
［式中、Ｐｈｅ１ＩｌｅもしくはＰｈｅ１Ｇｌｙ；Ｔｒｐ４Ａｌａ；Ｄｈａ５Ａｌａ；Ａｒｇ１３Ａｓｐ；またはそれらの組合せのアミノ酸置換が存在する］
を含むランチビオティクスＭＵ１１４０の変異体、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供する。変異ランチビオティクスは、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ変異またはΔＴｒｐ４変異をさらに含み得る。また、Ａｂｕ８Ａｌａ、またはＤｈｂ１４Ａｌａ、またはＡｂｕ８ＡｌａおよびＤｈｂ１４Ａｌａの両方のアミノ酸置換が存在し得る。環Ｄのビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）がエチル基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）であり得る。
【００１０】
本発明の別の態様は、本発明の１つ以上の単離された変異ランチビオティクスおよび薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、他の希釈剤または賦形剤を含む抗菌性組成物を提供する。組成物は、少なくとも１つの抗真菌剤、１つのさらなる抗菌剤、膜破壊剤、またはそれらの組合せをさらに含み得る。１つのさらなる抗菌剤は、グラム陰性菌の静菌または殺菌活性を有し得、膜破壊剤は、グラム陰性細菌を変異ランチビオティクスに対して感受性にし得る。１つ以上の単離されたランチビオティクスは、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌまたはそれ以上で組成物中に存在し得る。
【００１１】
本発明のさらなる別の態様は、対象中または対象上に存在する細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させる方法であって、治療有効量の本発明の抗菌性組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。対象はヒトまたは動物であり得る。組成物は、経口的または局所的、経鼻的、バッカル的(buccally)、舌下的、経粘膜的、経直腸的、経皮的、吸入により、注射により、または髄腔内的に投与され得る。注射は、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、または皮下注射であり得る。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、ｐＨ３から８で生理溶液中に有効量の１つ以上の本発明の変異ランチビオティクスを含む防腐剤を含む。
【００１３】
本発明のさらなる別の態様は、食物、飲料、ガムまたは歯磨き剤用組成物中の細菌の繁殖または細菌の数を減少させるために十分な量の１つ以上の本発明の変異ランチビオティクスを含むを含む、食物、飲料、ガムまたは歯磨き剤用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、処理される組成物または物体中あるいは組成物または物体上に存在する細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させる方法であって、組成物または物体中あるいは組成物または物体上の細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させるために十分な期間中、本発明の抗菌性組成物を処理される組成物または物体と接触させることを含む方法を提供する。処理される組成物は、例えば、食物、飲料、ガムまたは歯磨き剤であり得る。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、配列番号：１９−２６またはそれらの組合せを含む精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明のさらなる別の態様は、本発明の変異ランチビオティクス組成物を有するか、あるいは本発明の変異ランチビオティクス組成物が固体表面または布上に被覆されているか、または固体表面または布に固定、連結もしくは結合されている固体表面または織布または不織布を含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、生物膜または生物付着状態を減少させる方法であって、生物膜または生物付着状態中または生物膜または生物付着状態上の細菌の繁殖を減少させるか、または細菌の数を減少させるために十分な期間中、本発明の抗菌性組成物を生物膜または生物付着状態と接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、１つ以上の本発明のランチビオティクスのミュータシンおよび１つ以上のアプリケーターを含むキットを提供する。
【００１９】
したがって、本発明は、とりわけランチビオティクスＭＵ１１４０のユニークな(unique)変異体および改善された薬理学的特性を有する他のランチビオティクス、ならびに、１つ以上の型の細菌による感染、疾患およびコロニー形成を処置または予防するために組成物を使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、野生型ＭＵ１１４０の一次アミノ酸配列および大環状環を示す（配列番号：１７）。図１Ｂは、本明細書に記載されているＭＵ１１４０のアミノ酸置換部位を示す（配列番号：１６）。
【００２１】
【図２】図２は、ＭＵ１１４０の変異誘発のために使用されるプライマーを示す。
【００２２】
【図３】図３は、野生型ＭＵ１１４０  ｌａｎＡ  ポリヌクレオチド配列と共に、変異体ＭＵ１１４０  ｌａｎＡ  ポリヌクレオチド配列の導入された変異を強調している染色体ＤＮＡのＢＬＡＳＴ配列を示す。
【００２３】
【図４】図４Ａ−Ｂは、阻害プレートアッセイの領域の結果を示す。
【００２４】
【図５】図５は、野生型ＭＵ１１４０と比較して、ＭＵ１１４０の変異体を生産する株の生物活性に対する平均および標準偏差を示す。
【００２５】
【図６】図６は、黒鉛表面上に覆われている５μＭガリデルミンサンプルの原子間力顕微鏡像の重ね撮り(overlaid)高度(height)および相(phase)トポグラフィーマップを示す。ガリデルミンの大型の均一な複合体(complex)（いくつかが四角により区分されている）およびファイバー(fiber)（いくつかが矢印により区分されている）が明確に見える。スキャンサイズ＝５μｍ。
【００２６】
【図７】図７は、ＭＵ１１４０と構造的類似性を有するランチビオティクスの配列を示す。ランチビオティクスの天然変異体（例えば、ナイシンＡ、ナイシンＱ、ナイシンＣ、ナイシンＦおよびナイシンＵ）におけるアミノ酸置換は、記載されている変異体と同じ順番で丸括弧で示されている。
【００２７】
【図８】図８は、Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ変異体に対する阻害プレートアッセイの領域の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００２９】
ＭＵ１１４０は、環ＢおよびＣ間に「ヒンジ領域」でねじられた全体で馬蹄様形を有する。Smithら. (2003) Biochem. 42:10372-10384。この形は、カルボキシ末端に重なった環ＣＤに向かって、アミノ末端ＡＢ環（脂質ＩＩ結合ドメイン）を折り畳むヒンジ領域におけるターン様(turn-like)モチーフの結果である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＭＵ１１４０の側面集合を容易にすること、脂質ＩＩを外転させることおよび脂質ＩＩを封鎖することを可能にすることにおいて重要であると考えられる。環ＡにおけるＴｒｐ４のΨ角度およびＤｈａ５のΦ角度は、その柔軟性に寄与する。また、ＳＡｌａ７（チオエーテル環により制限されていない残基）のΨ結合が３６０°回転し、環Ｂに対して環Ａを自由に回転させることができることを決定した。該柔軟性は、脂質ＩＩ結合中に環ＡおよびＢを正しい位置に置くことにおいて重要であると考えられる。該ヒンジ領域はまた、残基１３にて潜在的に酵素的に感受性のアルギニンを含む。ＭＵ１１４０について構造遺伝子（ｌａｎＡ）における変異体を、以下のアミノ酸改変の効果を決定するために作製した：Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ、ΔＴｒｐ４、Ｄｈａ５Ａｌａ、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐ。図１Ｂ。
【００３０】
Ｔｒｐ４の欠失またはＴｒｐ４後へのＡｌａの挿入を有するＭＵ１１４０の変異体が標的株としてミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)株ＡＴＣＣ２７２を使用する延長(deferred)アンタゴニスト作用アッセイにおいて野生型とほぼ同等の生物活性を示すことを見出した。Wilson-Sanfordら., (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:1381。このアッセイにおいて、活性は、阻害領域の面積を計算することにより決定される。これらの結果は、環Ａの短縮または伸長はＭＵ１１４０活性に対して悪影響を有さないことを示し、環Ａの構造において予期されない寛容性を示す。図５に示されるとおり、Ｔｒｐ４Ａｌａ置換は、野生型と比較したとき、生物活性における統計的に有意な（ｐ＜．００１）増加を引き起こした。両方のアミノ酸が非荷電性および疎水性であるため、生物活性における違いは２つのアミノ酸間のサイズの違いによるものであったと推測することができる。ＡｌａでのＤｈａ５の置換はまた、生物活性における統計的に有意な（ｐ＜．００１）増加を引き起こした。該変異は、固相合成がＤｈａの代わりにＡｌａ取り込みにより簡素化され、商品原価に影響を与えるはずであるため、非常に有用である可能性がある。位置７でのＳＡｌａ後へのアラニンの挿入は、生物活性の有意な（ｐ＜．００１）減少を引き起こした。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、ＳＡｌａ７が３６０°自由に回転し、環Ｂに対して環Ａを自由に回転させることができることが決定されているため、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａ変異が脂質ＩＩ結合中の環の方向を変化させ、恐らく、基質である脂質ＩＩに対する分子のアフィニティーに影響すると結論づけることができる。Ａｒｇ１３Ａｓｐ置換は、野生型と比較したとき、生物活性における有意な（ｐ＜．００１）増加を示した。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、観察された効果は、増加した溶解度の結果であり得る。該部位特異的変化は、用量サイズを減少させること、および加水分解の可能性を減少させることにより、ＭＵ１１４０を有意に改善する可能性を有する。
【００３１】
図５に示されるとおり、Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ置換の両方が、野生型と比較したとき、生物活性における統計的に有意な（ｐ＜．００１）増加を引き起こした。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、増加の根拠は、脂質ＩＩ標的に対する結合親和性の増加またはリーダー配列の開裂における効率の改善によるものであり得る。Ａｓｐ（ＧＡＴ／ＧＡＣ）でのＡｒｇ（ＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＴ／ＣＧＣ／ＣＧＡ／ＣＧＧ）の置換またはＴｒｐ（ＴＧＧ）に対するＡｌａ（ＧＣＴ／ＧＣＴ／ＧＣＡ／ＧＣＧ）の置換またはＳｅｒ（ＡＧＴ／ＡＧＣ）に対するＡｌａ（ＧＣＴ／ＧＣＴ／ＧＣＡ／ＧＣＧ）の置換またはＰｈｅ（ＴＴＴ／ＴＴＣ）に対するＩｌｅ（ＡＴＴ／ＡＴＧ）もしくはＧｌｙ（ＧＧＴ／ＧＧＣ／ＣＣＡ／ＧＧＧ）の置換は全て、影響されるコドンにおいて１つ以上のトランスバージョンを含み得る複数の点突然変異と関与するため、天然に非常に起こる可能性が低いことは注目に値するものである。
【００３２】
ランチビオティクスＭＵ１１４０および改善された特性および構造的特徴を有する他のランチビオティクスの変異体
本発明のランチビオティクスＭＵ１１４０および他のランチビオティクスの変異体は、翻訳後修飾を含むポリペプチドである。翻訳後修飾は、翻訳された後のポリペプチドの化学修飾である。ポリペプチドは、アミド結合により共有結合された２つまたはそれ以上のアミノ酸のポリマーである。精製されたポリペプチドｈあ、細胞物質、他の型のポリペプチド、化学的前駆体、ポリペプチドの合成において使用される化学物質、またはそれらの組合せを実質的に含まないポリペプチド調製物である。細胞物質、培養培地、化学的前駆体、ポリペプチドの合成において使用される化学物質などを実質的に含まないポリペプチド調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％未満で、他のポリペプチド、培養培地、化学的前駆体、および／または合成において使用される他の化学物質を有する。したがって、精製されたポリペプチドは、約７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上で純粋である。精製されたポリペプチドは、未精製もしくは半精製の細胞抽出物または７０％未満で純粋であるポリペプチドの混合物を含まない。
【００３３】
野生型ＭＵ１１４０は図１Ａにおいて示される。ＭＵ１１４０は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと表示された４つの環を有する。これらの環の２つは、環Ａに１つ（Ａｌａ３−Ｓ−Ａｌａ７）および環Ｃに１つ（Ａｌａ１６−Ｓ−Ａｌａ２１）を含むランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）残基により形成される；位置８におけるα−アミノ酪酸残基および位置１１におけるＡｌａから成る環Ｂ（Ａｂｕ８−Ｓ−Ａｌａ１１）を形成するメチル−ランチオニン残基（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）がある；そして、第４の環Ｄは、チオエーテル結合によりアミノビニル基に連結されている位置１９におけるＡｌａ（Ａｌａ１９−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−）から成る。
【００３４】
本発明の１つの態様は、図１Ｂに示されている、ランチビオティクスのミュータシン、ＭＵ１１４０の１つ以上の以下の変異体を提供する（配列番号：１６）。すなわち、本発明は、１つ以上の以下の変異を有する野生型ランチビオティクスＭＵ１１４０（配列番号：１７）の変異体を含む：
１．Ｐｈｅ１ＩｌｅまたはＰｈｅ１Ｇｌｙ；すなわち、位置１でのフェニルアラニンがイソロイシンまたはグリシンに変化されている。
２．Ｔｒｐ４Ａｌａ；すなわち、位置４でのトリプトファンがアラニンに変化されている。
３．Ｄｈａ５Ａｌａ；すなわち、位置５での２，３−ジデヒドロアラニンがアラニンに変化されている。
４．Ａｒｇ１３Ａｓｐ；すなわち、位置１３でのアルギニンがアスパラギン酸に変化されている。
【００３５】
本発明の１つの態様において、ランチビオティクスＭＵ１１４０の変異体は、Ｐｈｅ１ＩｌｅまたはＰｈｅ１Ｇｌｙアミノ酸置換；Ｔｒｐ４Ａｌａアミノ酸置換；Ｄｈａ５Ａｌａアミノ酸置換；Ａｒｇ１３Ａｓｐアミノ酸置換；またはそれらの組合せを含む。本発明のＭＵ１１４０変異体はまた、例えば、アラニンが第４のトリプトファン残基後に挿入されているＴｒｐ４ｉｎｓＡｌａ；または位置４でのトリプトファンの欠失があるΔＴｒｐ４を含み得る。他のアミノ酸変化が存在し得る。例えば、ＡｂｕＳ８ＡｌａＳ、またはＤｈｂ１４Ａｌａ、またはＡｂｕ８ＡｌａおよびＤｈｂ１４Ａｌａの両方のアミノ酸置換が存在し得る。さらに、環Ｄのビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）がエチル基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）であり得る。これらの変化は、本発明のランチビオティクスのミュータシンの薬理学的特性を改善し得る。これらの変化はまた、分子を容易かつ安価に合成させる。ＡｂｕＳ８ＡｌａＳ置換が存在する場合、ランチビオティクスのミュータシンの環Ｂは、メチルランチオニン橋の代わりにランチオニン橋である。
【００３６】
ランチビオティクスポリペプチドの生物学的に活性な同等物は、１つ以上の保存アミノ酸変異または他の小さな(minor)修飾を有し、生物学的活性を保持し得る。生物学的に活性な同等物は、対応するランチビオティクス、例えば、ＭＵ１１４０と比較したとき、実質的に同等な機能を有する。本発明の１つの態様において、ランチビオティクスは、１、２、３、４または５つ以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【００３７】
同様の変異およびアミノ酸置換は、ＭＵ１１４０と同様の構造を有する他のランチビオティクスにおいて作製され（図７参照）、有利な特性および構造的特徴を有する変異ランチビオティクスを引き起こし得る。変異ランチビオティクスは、野生型ランチビオティクスと比較したとき、１つ以上のアミノ酸変異、置換、欠失または付加を有する。「本発明のランチビオティクス」なる用語は、本明細書に記載されている全ての変異ランチビオティクスを含む。例えば、アミノ酸置換および欠失は、ナイシンにおいて類似の位置で（Ｉｌｅ１、Ｉｌｅ４、Ｄｈａ５およびＬｙｓ２２）およびエピデルミン、ガリデルミンおよびスタフィロコクシンにおいて（Ｉｌｅ１またはＶａｌ１、Ｌｙｓ４、Ｐｈｅ５およびＬｙｓ１３）起こり得る。
【００３８】
すなわち、ナイシンの位置１でのＩｌｅはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＩｌｅはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく；位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置１２でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、位置２２でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００３９】
エピデルミン、エピデルミン［Ｖａｌ１およびＬｅｕ６］、ガリデルミン、スタフィロコクシン１５８０またはスタフィロコクシンＴについて、位置１でのＩｌｅまたはＶａｌはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＬｙｓはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＰｈｅはＡｌａに変化されていてもよく、位置１３でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４０】
ミュータシンＢ−ＮＹ２６６について、位置１でのＰｈｅはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＴｒｐはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置１３でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４１】
ミュータシンＩＩＩについて、位置１でのＰｈｅはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＴｒｐはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置１３でのＡｒｇはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。ミュータシンＩについて、位置１でのＰｈｅはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＬｅｕはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置１５でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４２】
ミクロビスポリシンＡ１およびミクロビスポリシンＡ２について、位置１でのＶａｌはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＣｌｏｒｏ−ＴｒｐはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４３】
クローディンについて、位置１でのＰｈｅはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＶａｌはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４４】
ストレプチンについて、位置１でのＴｒｐはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＡｒｇはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＴｙｒはＡｌａに変化されていてもよく、位置１４でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、位置２３でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４５】
エリシンＡについて、位置１でのＶａｌはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＬｙｓはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置２８でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４６】
エリシンＳについて、位置１でのＴｒｐはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＧｌｕはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置３２でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４７】
サブチリンについて、位置１でのＴｒｐはＩｌｅまたはＧｌｙに変化されていてもよく、位置４でのＧｌｕはＡｌａに変化されているか、もしくは除去されていてもよく、位置５でのＤｈａはＡｌａに変化されていてもよく、位置２７でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、位置３０でのＬｙｓはＡｓｐに変化されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
【００４８】
生物学的に活性な同等なランチビオティクスのミュータシンまたは他のランチビオティクスポリペプチドは、一般的に、本発明の変異ランチビオティクス配列の１つを修飾すること、および生物学的同等物であるか否かを決定するために修飾されたランチビオティクスの特性を評価することにより同定することができる。ランチビオティクスは、阻害領域アッセイのようなアッセイにおいて本発明のランチビオティクスと実質的に同じように反応するとき、例えば元のランチビオティクスの活性の９０−１１０％を有するとき、生物学的同等物である。
【００４９】
保存的置換は、ペプチド化学の当業者が実質的に変化しないポリペプチドの二次構造および一般的性質を予期するような、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸に置換される置換である。一般的に、アミノ酸の以下のグループは保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｄｈａ、ａｂｕ、ｄｈｂ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｇｌｙ、ｄｈａ、ａｂｕ、ｄｈｂ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
【００５０】
本発明のランチビオティクスは、ランチビオティクスが天然において通常関連しないアミノ酸配列、すなわち、異種アミノ酸配列に、共有的または非共有的に連結され得る。異種アミノ酸配列は、本発明のランチビオティクスのカルボキシまたはアミノ末端に通常位置しない非ストレプトコッカス・ミュータンス生物体、合成配列、またはミュータンス菌配列からの配列であり得る。さらに、本発明のランチビオティクスは、アミノ酸以外の化合物または分子、例えば、指示薬に、共有的または非共有的に連結され得る。本発明のランチビオティクスは、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、またはそれらの組合せに、共有的または非共有的に連結され得る。ポリペプチドはまた、精製を容易にする部分（すなわち、ポリペプチドまたは他の化合物であり得る官能基）（例えば、アフィニティータグ、例えば、ｓｉｘ−ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ブドウ球菌プロテインＡまたはｃｏｍ）、またはポリペプチド安定性を助ける部分（例えば、ポリエチレングリコール；アミノ末端保護基、例えば、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル；カルボキシル末端保護基、例えば、アミド、メチルアミドおよびエチルアミド）に連結され得る。本発明の１つの態様において、タンパク質精製リガンドは、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端での、１つ以上のアミノ酸残基であり得る。アミノ酸スペーサーは、本発明のポリペプチドと全く関連していないアミノ酸の配列である。アミノ酸スペーサーは、約１、５、１０、２０、１００または１，０００個のアミノ酸を含み得る。
【００５１】
所望により、本発明のランチビオティクスは、異種アミノ酸配列を含むことができる融合タンパク質の一部であり得る。異種アミノ酸配列は、本発明のランチビオティクスのＣまたはＮ末端に存在し、融合タンパク質を形成することができる。２つ以上の本発明のランチビオティクスは、融合タンパク質中に存在し得る。本発明のランチビオティクスフラグメントのフラグメントは、本発明の融合タンパク質中に存在し得る。本発明の融合タンパク質は、１つ以上の本発明のランチビオティクス、それらのフラグメントまたはそれらの組合せを含み得る。
【００５２】
ランチビオティクスのミュータシンの薬学的に許容される塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミドおよびプロドラッグは、本発明の一部である。これらの化合物は、対象での使用のために適当であり、過度の毒性、刺激またはアレルギー性応答を引き起こさず、妥当な利益／危険比率に見合い、それらの意図される使用に対して有効である。塩は、本発明のランチビオティクスの実質的に非毒性な、無機および有機酸付加塩である。塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩(naphthylate)、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸(laurylsulphonate)塩などを含む。これらは、アルカリおよびアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに基づく陽イオン、ならびに、限定はしないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む非毒性アンモニウム、四級アンモニウムおよびアミン陽イオンを含み得る。
【００５３】
本発明のランチビオティクスの薬学的に許容される非毒性のエステルは、例えば、アルキル基が直鎖または分岐鎖であるＣ１−Ｃ６アルキルエステルを含む。他のエステルは、Ｃ５−Ｃ７シクロアルキルエステルならびにアリールアルキルエステル、例えば、限定はしないが、ベンジルＣ１−Ｃ４アルキルエステルを含む。
【００５４】
本発明のランチビオティクスの薬学的に許容される非毒性アミドは、アンモニア由来のアミド、第一級Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンおよび第二級Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミン（アルキル基は直鎖または分岐鎖である）を含む。第二級アミンの場合、アミンは、１つの窒素原子を含む５もしくは６員ヘテロ環の形態であり得る。アンモニア由来のアミド、Ｃ１−Ｃ３アルキル第一級アミン、およびＣ１−Ｃ２ジアルキル第二級アミンも含まれる。
【００５５】
本発明の１つの態様において、本発明のランチビオティクスポリペプチドは、ＤＰＯＬＴ方法論を使用して合成することができる。例えば、米国特許第７，５２１，５２９号；米国出願第２００９／０２１５９８５号参照。本発明のランチビオティクスは、組換え的に生産することができる。本発明のランチビオティクスをコードするポリヌクレオチドは、当分野でよく知られている技術を使用して適当な発現宿主細胞系において発現させることができる組換え発現ベクターに導入することができる。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫発現系が当分野で利用でき、任意のかかる発現系を使用することができる。本発明のランチビオティクスはまた、ミュータンス菌細胞培養物から精製することができる。
【００５６】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、微生物ゲノム全体未満を含み、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらの組合せであり得る。ポリヌクレオチドは、他の成分、例えば、タンパク質、脂質および他のポリヌクレオチド無しに精製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％で精製され得る。例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲル切片内の、多数から非常に多数の他の核酸分子中に存在する核酸分子は、単離されたポリヌクレオチドと考えるべきでない。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、上記の本発明のポリペプチドをコードする（図１および７参照）。本発明の１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：１９−２６（図３参照）において示されるポリペプチド、それらの組合せ、またはそれらのフラグメントをコードする。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、約６６、６０、５０、４５、３０、１５個未満の（または約６６から１５個の任意の範囲の）隣接ヌクレオチドからなり得る。精製されたポリヌクレオチドは、さらなる異種ポリヌクレオチド（すなわち、ストレプトコッカス・ミュータンスに由来しないヌクレオチド）および、さらにさらなるストレプトコッカス・ミュータンスのポリヌクレオチドを含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、他のヌクレオチド配列、例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、またはタンパク質精製において有用なリガンド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡを含み得る。本発明の１つの態様は、配列番号：１９−２６をコードする少なくとも約６、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、６６個またはそれ以上の隣接ヌクレオチドを含む精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは単離され得る。単離されたポリヌクレオチドは、天然に関連する５’および３’フランキングゲノム配列の一方または両方と即座に隣接していない天然ポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、あらゆる長さの組換えＤＮＡ分子であり得る。単離されたポリヌクレオチドはまた非天然核酸分子を含む。本発明のポリヌクレオチドは、完全長ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、および変異もしくは融合ポリペプチドをコードし得る。
【００６０】
本発明のポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０、または約９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である同種ヌクレオチド配列、およびそれらの相補体もまた、本発明のポリヌクレオチドである。縮重ヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであるが、遺伝子コードの縮重によって、核酸配列において所定のポリヌクレオチド配列と異なる。
【００６１】
配列同一性パーセントは当分野で認識されている意味を有し、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在する。例えば、Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987);およびGribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)参照。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアラインするための方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereuxら (1984) Nuc. Acids Res. 12:387）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschulら (1990) J. Molec. Biol. 215:403）、およびＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（(1981) Adv. App. Math., 2:482-489）の局所相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711）を含むコンピュータープログラムにて体系化される。例えば、−１２のギャップオープンペナルティおよび−２のギャップ伸長ペナルティと共にアフィンギャップサーチを用いて、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるコンピュータープログラムＡＬＩＧＮを使用することができる。
【００６２】
特定の配列が、例えば、参照配列と約９５％同一であるか否かを決定するために任意の配列アラインメントプログラムを使用するとき、パラメーターは、同一性のパーセントを参照ポリヌクレオチドの全長にわたって計算するように、および参照ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの総数の最大５％の同一性ギャップとなるように、設定される。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、細菌サンプルに存在する核酸配列から単離することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば自動合成器を使用して、実験室において合成することができる。増幅方法、例えばＰＣＲを、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅するために使用することができる。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、天然ポリペプチドに対するコード配列を含むことができ、または天然に生じない改変配列をコードすることができる。所望により、ポリヌクレオチドは、発現コントロールエレメント、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、または宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動する他の調節要素を含む発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクターは、例えばプラスミドであり得る。ミニ染色体、例えば、ＭＣおよびＭＣ１、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（ファージラムダのコス(cos)部位が挿入されているプラスミド）およびレプリコン（細胞においてそれら自身のコントロール下で複製することができる遺伝学的エレメント）も使用することができる。
【００６５】
発現コントロール配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを調製するための、および宿主細胞においてこれらを発現するための方法は、当分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３６６，２４６号参照。本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を指向する１つ以上の発現コントロールエレメントに隣接または近接して位置付けられているとき、作動可能に連結されている。
【００６６】
組成物
本発明のランチビオティクスは、抗菌剤、殺菌剤、抗生物質、消毒剤、防腐剤、抗ウイルス剤または汚染除去剤として作用することができる。抗菌性組成物は、微生物を殺すか、または微生物、例えば、細菌の繁殖を遅延する。抗菌性組成物は、微生物を殺すか、または微生物、例えば、細菌の繁殖を遅延するために、無生物に適用される。抗生物質は、対象の体または細胞もしくは組織において、微生物を殺すか、または微生物、例えば、細菌の繁殖を遅延する。消毒剤は、皮膚、組織または臓器上で、微生物を殺すか、または微生物、例えば、細菌の繁殖を遅延する。防腐性組成物は、微生物、例えば細菌による分解を防止するために、生産物、例えば、塗料、木材、食物、飲料、生物学的サンプル、細胞もしくは組織培養または医薬組成物において、微生物を殺すか、または微生物の繁殖を遅延する。汚染除去剤は、生体、細胞、組織または物体中またはそれら上で、微生物を殺すか、または微生物、例えば、細菌の繁殖を減少させるために使用することができる洗浄剤である。
【００６７】
本発明のランチビオティクスは、細菌の繁殖を減少させるか、または該繁殖を防止することを意味する静菌性であり得る。本発明の１つの態様において、変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスの静菌作用は、細菌の繁殖を約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（または約５％から１００％の間の範囲のいずれか）減少させる。本発明のランチビオティクスは、細菌を殺すことを意味する殺菌性であり得る。本発明の１つの態様において、変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスは、細菌と接触したとき、細菌の約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（または約５％から１００％の間の範囲のいずれか）を殺す。ランチビオティクスが静菌剤または殺菌剤として役割を果たすかの違いは、処置される対象、組成物または物体に送達されるランチビオティクスの量または濃度であり得る。本発明のランチビオティクスは、処置される組成物、対象、細胞または組織中に存在する細菌の数を減少させ得る。本発明の１つの態様において、変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスは、細菌の数を約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（または約５％から１００％の間の範囲のいずれか）減少させる。
【００６８】
本発明の単離された変異ランチビオティクスは、本発明の１つ以上の単離されたランチビオティクスおよび１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む抗菌性組成物（固体または液体）中に存在し得る。本発明の１つの態様において、変異ランチビオティクスは、少なくとも１つの型のグラム陽性菌の細菌の繁殖を実質的に約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（または約５％から１００％の間の範囲のいずれか）減少させるために有効な量において存在する。本発明の１つの態様において、変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスは、少なくとも１つの型のグラム陽性菌の数を実質的に約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（または約５％から１００％の間の範囲のいずれか）減少させるために有効な量において存在する。少なくとも１つの型のグラム陽性菌は、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、アクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノミセス・ネスルンディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アクチノミセス・ビスコーサス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コリネバクテリウム  ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）であり得る。試験された全てのグラム陽性種が、本発明のランチビオティクスのミュータシンに対して感受性である。
【００６９】
さらに、外膜が例えば、キレート化剤、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、またはＥＤＴＡで破壊されている場合、グラム陰性細菌は、本発明のランチビオティクスのミュータシンに感受性であり得る。任意の膜破壊化合物、例えば、ポリミキシン、膜を破壊する抗生物質、セクロピン（例えば、イエバエのセクロピン、ヒアロフォラ（ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ）のセクロピン、セクロピンＢ、セクロピンＰ１）、Ｇ１０ＫＨｃ（Ｅｃｋｅｒｔら，  （２００６）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５０：１４８０参照）；アルファおよびベータデフェンシン、ヒツジ由来のカテリシジン（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，  （２００４）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４８：６７３参照）、スクアラミン誘導体（例えば、ＳＭ−７、Ｋｉｋｕｃｈｉら，  （１９９７）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４１：１４３３参照）、ヘキサメタリン酸ナトリウム、顆粒球の細胞性酵素（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，  （１９８９）  Ｒｅｖ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １１：２１３）、ＥＭ４９（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら，  （１９７６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １５：５７８３）、およびラウロイルサルコシン酸ナトリウムを、グラム陰性細菌の本発明のランチビオティクスのミュータシンに対する感受性を増加させるために、本発明の組成物に加えられ得る。本発明のランチビオティクスのミュータシンと膜破壊剤および／またはグラム陰性菌種を標的とする他の抗生物質または薬物との組合せは、グラム陽性およびグラム陰性菌種の両方に対して有効である組成物を提供し得る。したがって、本発明は、１つ以上の本発明のランチビオティクスおよび少なくとも１つのさらなる抗菌剤または膜破壊剤を含む組成物を含む。１つ以上のさらなる抗菌剤は、グラム陰性菌の静菌または殺菌活性を有し得る。膜破壊剤は、グラム陰性細菌を本発明のランチビオティクスに感受性にさせ得る（すなわち、膜破壊剤は、１つ以上の本発明のランチビオティクスのミュータシンと組み合わられて、グラム陰性細菌に対して静菌性または殺菌性である）。グラム陰性細菌は、例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、イヌ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ）、マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）���緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を含む。
【００７０】
グラム不定性細菌およびグラム染色不確定性細菌もまた、本発明のランチビオティクスのミュータシンに対して感受性であり得る。これらの生物体の外膜を破壊するために、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡが本発明の組成物に加えられ得る。グラム不定性細菌およびグラム染色不確定性細菌は、例えば、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、およびマイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む。
【００７１】
本発明のランチビオティクスは、動物への投与、組成物、または物体のために適当である、１つ以上の薬学的に許容される担体、他の担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤または封入物質と組み合わせられ得る。それらの典型的な薬学的に許容される担体、他の担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤または封入物質は、糖、例えば、ラクトース、グルコース、デキストロース、およびスクロース；デンプン、例えば、コーンデンプンおよびポテトデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、およびメチルセルロース；多糖類、例えば、ラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（登録商標）およびアガロース；粉末状トラガカント；グリセロール；モルト(malt)；ゼラチン；タルク；固体滑剤、例えば、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えば、ピーナッツオイル、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、およびコーンオイル；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール；タンパク質、例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド；アルギン酸；乳化剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリソルベート）；ポリ乳酸；ポリグリコール酸；重合体アミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸、およびポリリジン；アミノ酸コポリマー；ペプチド様物質(peptoid)；脂質様物質(lipitoid)；不活性な非病原性ウイルス粒子または細菌細胞；リポソーム；ヒドロゲル；シクロデキストリン；生分解性ナノカプセル；生体接着物質；湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；香味剤；錠剤化する剤；安定剤；抗酸化剤；防腐剤；ピロゲンフリー水(pyrogen-free water)；等張食塩水；エタノール；オレイン酸エチル；ピロリドン；リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液；アルギン酸ナトリウム；ポリビニルピロリドン；トラガカントゴム；アカシアゴム；および滅菌水および水性バッファーおよび溶液、例えば、生理学的リン酸緩衝食塩水を含む。
【００７２】
治療的使用のための担体、例えば、薬学的に許容される担体および希釈剤は、当分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985))において記載されている。
【００７３】
薬学的に許容される塩、例えば、無機塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩、ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩(proprionate)、マロン酸塩(malonate)、または安息香酸塩がまた、本発明の組成物において使用され得る。
【００７４】
変異ランチビオティクス組成物は、経口使用のために適当な形態、例えば、錠剤、トローチ剤、ドロップ、口内洗浄液、歯磨き剤、バッカル錠、溶液、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬または軟カプセル、またはシロップ剤またはエリキシル剤であり得る。このような組成物は、１つ以上の薬剤、例えば、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含み得る。ランチビオティクス組成物は、使用前に水または他の適当な液体での再構成のための乾燥製品であり得る。
【００７５】
本発明のランチビオティクスはまた、薬物の経直腸、膣内または尿道投与のための坐薬の形態において投与され得る。これらの組成物は、変異ランチビオティクスを常温で固体であるが、体温で液体である適当な刺激の少ない担体と混合することにより調製され得、したがって直腸において溶けて、薬物を放出する。かかる物質はココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【００７６】
本発明のランチビオティクスはまた、例えば、ローション、ゲル、またはリポソーム送達系、例えば、小型(small)単層小胞、大型(large)単層小胞、および多重膜小胞の形態において、局所的に投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質、例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成され得る。
【００７７】
他の投与形態は、例えば、注射投与形態、舌下投与形態および経鼻投与形態を含む。吸入のための組成物は、一般的に、乾燥粉末として投与することができる溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態において、または慣用の高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタン）を使用してエアロゾルの形態において提供され得る。
【００７８】
製剤は、約０．０００１％から約９９．９９９９重量％の１つ以上の本発明のランチビオティクス、通常少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％（重量％）の１つ以上の本発明のランチビオティクスのミュータシンを含み得る。いくつかの態様は、約２５％から約５０％または５％から７５％の本発明のランチビオティクスを含む。
【００７９】
１つ以上の本発明のランチビオティクスは、１つ以上の抗菌剤、抗生物質、バクテリオシン、抗ウイルス、殺ウイルスまたは抗真菌化合物または分子と混合され、本発明の方法において有用な組成物を形成し得る。抗生物質は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシン、キノロン、スルホンアミド、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、環状リポペプチド（例えば、ダプトマイシン）、グリシルシクリン(glycylcycline)（例えば、チゲサイクリン）、およびオキサゾリジノン（例えば、リネゾイド）を含む。
【００８０】
バクテリオシンは、例えば、アシドシン(acidocin)、アクタガルジン(actagardine)、アグロシン(agrocin)、アルベイシン(alveicin)、オーレオシン(aureocin)、カルノシン(carnocin)、カルノサイクリン(carnocyclin)、コリシン(colicin)、クルバチシン(curvaticin)、ジベルシン(divercin)、デュラマイシン(duramycin)、エンテロシン(enterocin)、エンテロリシン(enterolysin)、エピデルミン、エルウィニオシン(erwiniocin)、ガリデルミン、グリシネシン（glycinecin）、ハロシン(halocin)、ハロデュラシン(haloduracin)、ラクトコシン(lactococin)、ラクチシン（lacticin）、レウコシン(leucoccin)、マセドシン(macedocin)、メルサシジン(mersacidin)、メセンテリシン(mesentericin)、ミクロビスポリシン、ミュータシン、ナイシン(nisin)、パエニバシリン(paenibacillin)、プラノスポリシン(planosporicin)、ペディオシン(pediocin)、ペントシン(pentocin)、プランタリシン(plantaricin)、ロイテリシン(reutericin)、サカシン(sakacin)、サリバリシン（salivaricin）、サブチリン、スルホロビシン(sulfolobicin)、ツリシン(thuricin)１７、トリホリトキシン(trifolitoxin)、バリアシン(variacin)、ビブリオシン(vibriocin)、ワルネリシン(warnericin)、およびワーネリン(warnerin)を含む。
【００８１】
抗真菌剤は、例えば、ポリエン抗真菌剤（例えば、アンホテリシンＢ、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイスタチン、カンジシジン(candicin)、ハマイシン）、アゾール抗真菌剤（例えば、イミダゾール、トリアゾール、チアゾール）、イミダゾール（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール、アルバコナゾール）、チアゾール（例えば、アバファンジン(abagungin)）、アリルアミン（例えば、テルビナフィン、ナフチフィン、ブテナフィン）、エキノキャンディン（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロクスオラミン、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシン、およびグリセオフルビンを含む。
【００８２】
抗ウイルス剤および殺ウイルス剤は、例えば、アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドフォビル、コンビビル、デラビルジン、ディダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル(imunovir)、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼインヒビター、ｉ、ｉｉもしくはｉｉｉ型インターフェロン、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル(nexavir)、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼインヒビター、ラルテグラビル、逆転写酵素インヒビター、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン(pyramidine)、サクイナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、バビリン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンを含む。
【００８３】
本発明のランチビオティクスの使用
本発明のランチビオティクス組成物は、物体、組成物または対象中または物体、組成物または対象上に存在する、細菌の増殖を減少させる、細菌の増殖を防止する、細菌の繁殖を防止する、細菌の繁殖を減少させる、または、細菌の数を減少させるか、もしくは細菌の数を削減するために使用することができる。本発明の１つの態様において、細菌は、少なくとも１つの型のグラム陽性菌、少なくとも１つの型のグラム陰性細菌、少なくとも１つの型のグラム不定性またはグラム染色不確定性の細菌、または少なくとも１つの型のグラム陽性または少なくとも１つの型のグラム陰性細菌または少なくとも１つの型のグラム不定性またはグラム染色不確定性の細菌の組合せである。本発明のランチビオティクス組成物は、処置を必要とする組成物または対象に投与する、該組成物または対象に付加する、または該組成物または対象と接触させることができる。
【００８４】
本発明のランチビオティクスは、疾患、感染またはコロニー形成を処置、改善または防止するために使用することができる。疾患は、感染によって生じる生物体の部分、臓器または系の病理学的状態であり、兆候および症状の同定可能なグループにより特徴付けられる。感染は、後の組織傷害を産生し、種々の細胞性または毒性メカニズムを介して明らかな疾患に進行し得る、体部位または組織における病原微生物、例えば細菌による侵入および病原微生物、例えば細菌の増殖である。コロニー形成は、宿主または物体上または宿主または物体内にそれ自体で確立している、微生物、例えば、細菌の作用またはプロセスである。コロニー形成は、以下に記載される後の生物膜または生物付着状態を産生し得る。本発明のランチビオティクスは、疾患、感染またはコロニー形成を防止するために、またはさらなる体部位または組織、さらなる表面、または異なる対象への疾患、感染またはコロニー形成の拡散を防止するために、予防的に使用することができる。本発明のランチビオティクスは、また、対象上または対象内または表面上の病原微生物の数を減少させるために使用することができる。
【００８５】
本発明の組成物および方法により処置または予防することができる疾患、感染およびコロニー形成の例は、例えば、敗血症、細菌性髄膜炎、嚢胞性線維症、ウシの乳房炎、膿痂疹、細菌性膣症、細菌性肺炎、尿路感染、細菌性胃腸炎、丹毒、蜂巣炎、炭疽病、百日咳、ブルセラ症、腸炎、日和見感染、市中(community acquired)呼吸器感染、上部および下部呼吸器感染、ジフテリア、院内感染、下痢、潰瘍、気管支炎、リステリア症、結核、淋病、シュードモナス感染、サルモネラ症、細菌性赤痢、ブドウ球菌感染、連鎖球菌感染、および壊疽性筋膜炎を含む。
【００８６】
本発明のランチビオティクスは、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、モルモット、マカクザル、ヒヒ、チンパンジー、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、または非哺乳動物、例えば、鳥類、アヒルまたは魚類に投与することができる。本発明のランチビオティクスはまた、植物にも投与され得る。
【００８７】
本発明のランチビオティクスの投与は、慣用の非毒性の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位の製剤において、当分野で知られている任意の手段により、例えば、注射（例えば、筋肉内、静脈内、肺内、筋肉内、皮内、腹腔内、髄腔内、または皮下注射）、エアロゾル、鼻腔内、注入ポンプ、坐薬（経直腸、膣内、尿道）、経粘膜的、局所的、バッカル的、経口的、非経腸的、注入技術、吸入またはスプレーにより、舌下的、経皮的、点眼液として、髄腔内適用、または他の手段により投与され得る。投与方法の組合せもまた使用され得る。
【００８８】
治療的適応において、本発明のランチビオティクス組成物は、細菌の繁殖を減少させるため、または細菌の数を減少させるため、またはその両方のために対象に投与される。組成物におけるランチビオティクスの特定の用量は、多数の因子、限定はしないが、例えば、種、年齢、性別、感染の重症度、併用投薬、組成物が投与される動物の全身状態、および組成物の投与様式に依存する。本発明の組成物の有効量は、日常の実験のみを使用して容易に決定することができる。治療有効量は、細菌感染またはコロニー形成の処置、改善または予防のために有効である、単回投与において、または一組の一部として、個体に投与される量を意味する。治療有効量はまた、感染の症状を緩和すること、または該症状を減少させること、または対象中または対象上の細菌の繁殖を減少させること、または対象中または対象上の細菌の量を減少させることにおいて有効な量である。
【００８９】
組成物におけるランチビオティクスの濃度は、大きく異なり得、選択される特定の投与様式および対象の必要性にしたがって、上記のとおり、ランチビオティクスの活性、対象の体重、対象の健康全般などに主に基づいて選択される。しかしながら、濃度は、一般的に、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０ｍｇ／ｋｇ／日（または約０．００１から１５０ｍｇ／ｋｇ／日の任意の範囲）の範囲の用量、および、ときどきそれら以上の用量を提供するように選択される。典型的な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日、および約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００９０】
本発明のランチビオティクスは、疾患、感染、コロニー形成、生物膜または生物付着状態を防止するか、またはそれらを減少させるために、特定の期間（例えば、１日、３日、１週、１月、２月、３月、６月、１年またはそれ以上）投与され得るか、または長期間にわたって維持量において投与され得る。
【００９１】
本発明のランチビオティクスは、細菌で感染またはコロニー形成されていない動物に投与してもよく、または細菌に感染またはコロニー形成された動物に投与してもよい。
【００９２】
本発明の１つの態様は、少なくとも１つの型の細菌の細菌の増殖を実質的に阻害するために十分な期間、物体と本発明のランチビオティクスとを接触させることを含む、無生物上または無生物内の細菌の増殖を除去するか、または減少させるための方法を提供する。該接触は、１、１５、３０または６０分、または２、３、１０、１２、２４、３６または４８時間（または約１分から４８時間の任意の範囲）であり得る。物体は、例えば、食物表面処理(food preparation surface)、食品製造機器、産業機器、管、または医療デバイス、例えば、カテーテル、外科用メス、ナイフ、ハサミ、スパチュラ、拡張機、クリップ、ピンセット、鏡、開創器、縫合糸、外科用メッシュ、チゼル、ドリル、水準器(level)、やすり、のこぎり、スプリント、キャリパー、クランプ、鉗子、フック、ランセット、針、カニューレ、キュレット、舌圧子(depressor)、拡張器、起子(elevator)、咬合器、抽出器、探針、ステープル、人工関節、創傷被覆材、カテーテル、ステント、チューブ、ボウル、トレイ、スポンジ、シュリンゲ、スプーン、シリンジ、ペースメーカー、ねじ、プレート、ピン、ワイアー、ガイドワイヤー、ペースメーカーリード、インプラント、センサー、グルコースセンサー、血管バイパスチューブ、ｉ．ｖ．バッグ、心室補助装置成分、眼科用レンズ、およびバルーンであり得る。
【００９３】
汚染除去され得る他の物体は、布、例えば、織布（天然または非天然材料または天然および合成材料の混合物からの織布）または不織布材料（例えば、弾性または非弾性熱可塑性ポリマー）を含む。布は、例えば、患者、医療従事者、または感染因子または微生物と接触し得る他の人により着用される保護用物品、例えば、家庭用、組織用、医療用および産業用適用のためのガウン(gown)、ローブ(robe)、フェイスマスク、ヘッドカバー、シューカバー(shoe cover)、または手袋のために使用することができる。他の保護用の布は、外科用ドレープ、外科用カバー、ドレープ、シーツ、寝具またはリンネル製品、パッド、ガーゼの包帯、拭く物、スポンジおよび他の抗菌性物品を含み得る。
【００９４】
本発明の１つの態様において、ランチビオティクスは、固体表面、例えば、食物表面処理、食品製造機器、産業機器、管、または医療デバイス、例えば、カテーテル、外科用メス、ナイフ、ハサミ、スパチュラ、拡張機、クリップ、ピンセット、鏡、開創器、縫合糸、外科用メッシュ、チゼル、ドリル、水準器、やすり、のこぎり、スプリント、キャリパー、クランプ、鉗子、フック、ランセット、針、カニューレ、キュレット、舌圧子、拡張器、起子、咬合器、抽出器、探針、ステープル、人工関節、創傷被覆材、カテーテル、ステント、チューブ、ボウル、トレイ、スポンジ、シュリンゲ、スプーン、シリンジ、ペースメーカー、ねじ、プレート、ピン、ワイアー、ガイドワイヤー、ペースメーカーリード、インプラント、センサー、グルコースセンサー、血管バイパスチューブ、ｉ．ｖ．バッグ、心室補助装置成分、眼科用レンズ、バルーンおよび上記の布の上に被覆されるか、またはそれらに固定、連結もしくは結合される。
【００９５】
本発明の別の態様において、本発明のランチビオティクス組成物は、経皮製剤において存在する。経皮製剤は、ランチビオティクス組成物が投与点で局所的に、または動物またはヒトの血液循環に入ることにより全身的に作用するように、望まれる可能性がある。したがって、軟膏またはローションの形態におけるランチビオティクス組成物の直接的局所適用により、または、ランチビオティクス組成物またはランチビオティクス組成物を保持し、一度に、または時間制御様式において、それを皮膚に放出するリザーバーを組み込んだパッチの接着により、送達は起こり得る。
【００９６】
所望により、ランチビオティクス組成物は、経皮または局所送達のための、小胞、例えば、微粒子、ミクロスフェア、リポソーム、脂質小胞またはトランスファーソーム(transfersomes)内に含まれ得る。孔を拡張するために衝撃波を産生する超音波装置、物質が皮膚を通過させるための電流の使用、および皮膚に穴を開けるための、ランチビオティクス組成物を血流に送達するための極微針の使用もまた、経皮または局所投与で使用され得る。
【００９７】
表面上にペプチド、例えば本発明のランチビオティクスを被覆、結合または固定する方法は、当分野でよく知られている。例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈ．  Ｓｃｏｕｔｅｎ，  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄ．  （２００１）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ），  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ  （１９９１）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ参照。
【００９８】
本発明の方法はまた、生物付着または生物膜を改善、減少、除去または防止するために使用され得る。生物付着は、溶媒に暴露される構造上の微生物、例えば細菌の望ましくない蓄積である。生物付着は、例えば、船体、膜システム、例えば、膜バイオリアクターおよび逆浸透渦巻き形膜、大規模産業機器および発電所の水冷システム、および、例えば、使用済み油、切削油、可溶化油または油圧オイルを運ぶ油パイプラインにおいて起こり得る。
【００９９】
生物膜は、生物付着を引き起こすことができ、生物体が互いに、表面に、またはそれらの組合せに付着する生物体の凝集体となり得る。生物膜は、細菌、真菌、糸状真菌、酵母、藻類、シアノ細菌、ウイルスおよび原生動物の１つ以上の種およびそれらの組合せを含み得る。生物膜に存在する微生物は、細胞外ポリマー物質の自己生産のマトリックス内に埋め込まれていてもよい。微生物が生物膜の増殖モードに切り替わると、多数の一連の遺伝子が特異的に調節されている行動において表現型シフトを受け得る。微生物のほとんど全ての種は生物膜を形成することができる。生物膜は、生体上または生体中または無生物構造上または無生物構造中で見ることができる。生物膜は、天然水体または人工水体に含まれる構造上、水の表面上、水分に暴露される表面、管内部、冷却水系、海洋システム、ボートの船体、歯上、植物表面上、植物内部、ヒトおよび動物体表面上、ヒトおよび動物内部、コンタクトレンズ上、カテーテル上、人工心臓弁、他の人工器官、子宮内避妊器具、および他の構造／デバイスに存在し得る。
【０１００】
生物膜は、金属表面の腐食を引き起こし得、船速を阻害し得、植物疾患を引き起こし得、およびヒトおよび動物疾患を引き起こし得る。生物膜は、ヒトおよび動物感染、例えば、尿路感染、カテーテル感染、中耳炎、歯垢、歯肉炎、齲蝕、歯周疾患、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染、慢性副鼻腔炎、および永久留置器具、例えば、人工関節および心臓弁の感染に関与する。生物膜はまた、感染した皮膚創傷の治癒または処置における、皮膚創傷治癒を低下させ得、局所抗菌効力を減少させ得る。
【０１０１】
生物膜を形成し得、生物付着を引き起こし得、および／またはヒトおよび動物において疾患を引き起こし得る微生物は、上記のとおり、例えば、細菌、真菌、酵母、藻類、原生動物、およびウイルスを含む。生物膜は、上記のとおり、生体において処理され得る。無生物表面上の生物膜および生物付着状態は、本発明のランチビオティクスを無生物表面上に、または該表面周辺の地域に適用することにより処理され得る。本発明のランチビオティクスはまた、無生物表面を覆っている、該表面と接触している水、油または他の液体に加えられ得る。
【０１０２】
本発明は、１つ以上の微生物、例えば細菌により引き起こされる生物付着状態または生物膜状態を改善または防止する方法を提供する。該方法は、１つ以上の変異ランチビオティクスを生物付着状態または生物膜状態に投与することを含み、該生物付着状態または生物膜状態が改善される。
【０１０３】
１つ以上のランチビオティクスは、生物膜または生物付着状態を有する表面に投与されてもよく、または予防処理として表面に投与されてもよい。ランチビオティクスは、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態または錠剤形態）または液体溶液または懸濁液形態においてであり得る。乾燥または液体形態は、表面（例えば、管または膜）を拭く、該表面に注ぐ、該表面に噴霧する、該表面に流される、または該表面に他の形式で適用され得る。本発明のランチビオティクスは、担体または希釈剤を有する組成物において、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０ｍｇ／ｍ２（または約０．００１から約１５０ｍｇ／ｍ２の任意の範囲）の量、および、ときどきそれら以上の量で存在し得る。
【０１０４】
生物膜がヒトまたは動物内の人工表面（例えば、カテーテルまたは医療デバイス）上に存在しているか、または、人工表面に存在する可能性がある場合、人工表面は、ヒトまたは動物への挿入前に、１つ以上のランチビオティクスと接触させられ得る。所望により、人工表面がヒトまたは動物に挿入された後に、ランチビオティクスが表面に送達され得る。
【０１０５】
本発明の１つの態様において、変異ランチビオティクスは、生物学的組織または細胞培養物において細菌の繁殖または細菌の数を除去するか、またはそれらを減少させるために使用することができる。ランチビオティクスは、上記医薬組成物に対して記載された用量比率で、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤に存在し得る。ランチビオティクスまたはランチビオティクス組成物は、少なくとも１つの型のグラム陽性菌の細菌の増殖を実質的に阻害するために十分な期間、組織または細胞培養物と接触され得る。ランチビオティクスは、生物学的組織または細胞の生理学的特性を維持するために有効な量において、および／または生物学的組織または細胞の生存能力を実質的に維持するために有効な量において提供され得る。
【０１０６】
本発明の１つの態様は、同種移植臓器、組織または細胞、自家移植組織または細胞、同種異系移植臓器、組織または細胞、異種移植臓器、組織または細胞、または移植のための他の細胞または組織を調製するための方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの型のグラム陽性菌の細菌の増殖または細菌の数を阻害するか、またはそれらを減少させるために十分な期間、臓器、細胞または組織を本発明のランチビオティクス組成物と接触させることを含む。細胞、臓器または組織は、例えば、心臓弁、血管、心膜または筋骨格組織、靱帯、例えば、前十字靱帯、膝関節、股関節、足関節、半月板組織、皮膚、角膜、心臓、肺、小腸、大腸、肝臓、腎臓、骨髄、骨および腱であり得る。
【０１０７】
接触する工程は、約０．５、１、２、３、５、１０、２４、３６または４８時間、約２℃から約４２℃の温度で行うことができる。ランチビオティクス組成物は、１つ以上の広域スペクトル抗菌剤および／または１つ以上の抗真菌剤、例えば、バンコマイシン、イミペネム、アミカシン、およびアンホテリシンＢをさらに含む生理溶液をさらに含み得る。
【０１０８】
本発明のランチビオティクス組成物はまた、同種移植および異種移植処理溶液、および細胞培養および組織溶液に対する防腐剤として使用され得る。溶液は、３から８のｐＨで生理溶液中で有効量の１つ以上のランチビオティクスを含み得る。
【０１０９】
１つ以上の本発明のランチビオティクスは、防腐剤として食物または飲料に加えられ得る。食物の例は、プロセスチーズ製品、殺菌乳製品、缶詰の野菜、高水分のもの、高温で焼いた(hot baked)穀粉製品、殺菌液状卵、ナチュラルチーズ製品を含む。本発明のランチビオティクスはまた、食物においてリステリアをコントロールするために、例えば、ビール、ワイン、アルコール生産、および低ｐＨ食物、例えば、サラダドレッシングにおいて乳酸菌による腐敗をコントロールするために、使用され得る。本発明のランチビオティクスは、食物処理技術、例えば、高圧滅菌およびエレクトロポレーションにおける補助剤として使用され得る。ランチビオティクスは、約０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／Ｌまたはそれ以上（または約０．００１から約１，０００ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｌの任意の範囲）およびときどきそれ以上の量において食物または飲料に存在され得る。
【０１１０】
本発明のランチビオティクスはまた、分子ワイヤー、分子スイッチ、または分子ベースの記憶システムとして使用され得る。ＭＵ１１４０と構造的に同様である抗菌性ペプチドガリデルミン溶液を、黒鉛表面上に置き、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりイメージ化した。図６は、相および高さイメージの重ね合わせを示す。これらのデータは、ランチビオティクスの構造的クラスが、大型に集合させ、複合体およびフィラメントを均一にするという傾向を証明する。したがって、変異ランチビオティクスおよび野生型ランチビオティクスは、ナノ回路、ならびに他のナノベースの適用を構築するために使用する可能性がある。
【０１１１】
分子ワイヤー（分子ナノワイヤーとしても知られている）は、分子電子素子のための基礎構成要素である電流を伝導する分子レベルの物質である。分子ワイヤーの典型的な直径は３ナノメートル未満であるが、長さはセンチメートル以上にまで及ぶ。分子ワイヤーは、ワイヤーの一方の端からワイヤーの他方の端へ電子を流すことを可能にする。分子ワイヤーは、ナノ電子デバイスのさらなる成分に接触するために、少なくとも２つの末端を含み得る。
【０１１２】
分子スイッチ（制御可能なワイヤーとしても知られている）は、電子流が要求に応じてオンオフされ得る分子構造である。分子ベースの記憶システムは、電子を蓄えることによりその伝導率を変化する能力を有する１つ以上の分子ワイヤーまたはスイッチである。
【０１１３】
分子ワイヤー、スイッチ、または分子ベースの記憶システムは、基質、例えば、シリコンウエハー、合成ポリマー支持体、ガラス、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ａｌ、Ａｌ２Ｏ３、ニッケルグリッド(grid)またはディスク、炭素支持体、アミノシラン処理されたシリカ、ポリリジン被覆ガラス、雲母、および半導体上存在されていてもよく、またはこれらに固定されていてもよい。
【０１１４】
キット
本発明の組成物は、１つ以上の本発明のランチビオティクスの容器を含むキットにおいて存在し得る。ランチビオティクスは、凍結乾燥され、凍結乾燥粉末または錠剤の形態であってよく、また、所望によりバッファー、賦形剤、希釈剤、アジュバント、または薬学的に許容される担体を有する溶液または懸濁液であってよい。キットはまた、体部位または組織または表面への１つ以上のランチビオティクスに対する１つ以上のアプリケーターを含み得る。アプリケーターは、例えば、綿棒、シリンジ（針を有するもの、または針を有さないもの）、ドロッパー、噴霧器、包帯、傷用パッキング(wound packing)、または絆創膏であり得る。所望により、キットは、１つ以上の変異体ＭＵ１１４０ランチビオティクスを再構成、希釈または調製するための、１つ以上のバッファー、希釈剤、アジュバント、治療的に許容される担体、または薬学的に許容される担体を含み得る。
【０１１５】
本明細書のいずれかの場所で引用する全ての特許、特許出願および他の科学的または技術的論文は、その全体を引用により本明細書に包含させる。ここで説明的に記載した本発明は、適宜上、ここに特に開示していない何らかの１種以上の要素、１種以上の制限の非存在下で実施できる。したがって、例えば、「含む」、「本質的にからなる」、および「からなる」の用語のいずれの場合も、その通常の意味を残しながら、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてよい。使用されている用語および表現は、限定ではなく、説明用の用語として使用し、かかる用語および表現の使用が、示したまたは記載した特性の何らかの等価物またはその一部を除外することを意図せず、請求する本発明の範囲内で種々の修飾が可能であることを認識すべきである。したがって、本発明は、態様、任意的特性により具体的に開示しているが、ここで開示した概念の修飾および変更が当業者により再分類されてよく、このような修飾および変更は明細書および添付する特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
【０１１６】
さらに、本発明の特性または観点がマーカッシュグループまたは他の選択肢の群により記載されているとき、当業者は、本発明が、またマーカッシュグループまたは他の群の各メンバーまたはメンバーのサブグループによっても記載されることを認識する。
【０１１７】
以下の記載は、例示の目的でのみ提供し、上記の広い観点で記載した本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ＭＵ１１４０の突然変異誘発
ストレプトコッカス・ミュータンス  ゲノムデータベースおよびｌａｎ遺伝子クラスター、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受入番号（ＡＦ０５１５６０）を使用し、突然変異誘発およびシーケンシング作業のためにプライマーを設計した。天然ＭＵ１１４０構造遺伝子（ｌａｎＡ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および５’および３’フランキングＤＮＡの５００塩基対（ｂｐ）をｐＶＡ８９１プラスミドにクローン化し、ｐ１９０を作製した。ｐ１９０のクローン化インサートは、ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２のプライマー配列を使用したストレプトコッカス・ミュータンス株ＪＨ１１４０（ＡＴＣＣ  ５５６７６）の染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅に由来した（図２参照）。他に記載がない限り、試薬および培地はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入し、プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。
【０１１９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
突然変異（図１Ｂ参照）をＭＵ１１４０の構造遺伝子であるｌａｎＡのプロペプチド領域に導入し、ＭＵ１１４０の変異体を作製した。図３参照。ｐ１９０プラスミド（J.D. Hillman、非公開）を鋳型として使用し、部位特異的突然変異を２段階ＰＣＲを使用して導入した。第１段階において、上流および下流外部プライマー（ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２）を適当な内部プライマー（例えば、ＳＲＷｌａｎＡ＿１／Ｔｒｐ４Ａｌａ＿２およびＳＲＷｌａｎＡ＿２／Ｔｒｐ４Ａｌａ＿１）（図２）と対形成させ、その一方は、野生型配列に対して改変した塩基配列を含むように合成した。この段階により、２つのフラグメントが産生され、５’フランキングＤＮＡおよびｌａｎＡの一部を含む一つは、部位特異的塩基変化を含んだ。第２のフラグメントは、ｌａｎＡの残りおよび３’フランキングＤＮＡを含んだ。ＭＵ１１４０変異体を生産するために使用されたプライマーは図２に見られる。次に、２つのフラグメントを等量で混合し、２つの外部プライマー、ＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を使用する第２ラウンドのＰＣＲに付し、最終アンプリコンを得た。
【０１２０】
ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼを０．４μｍｏｌの各プライマー、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．０１６ｍＭ  ｄＮＴＰ、および１単位のＤＮＡポリメラーゼを１Ｘポリメラーゼバッファーに含む、５０μＬの最終体積中で使用して行った。各フラグメントの増幅条件は次のとおりであった：９５℃で１分余熱、次に、変性（９５℃）を３０秒、アニーリング（５６℃）を３０秒および伸張（７２℃）を２分の２７サイクルインキュベーション、次に最終伸張（７２℃）を１０分。両フラグメントを５０：５０で合わせ、２つの外部プライマーＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を、上記と同じ増幅条件下で使用して増幅した。
【０１２１】
最終ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）にキットの指示にしたがってライゲートし、標準方法を使用してＤＨ５α−Ｔ１（登録商標）細胞（Invitrogen）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび４０μＬのＸ−ｇａｌ（４０ｍｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレートに広げた。ブルー・ホワイトスクリーニングを、インサートを含むコロニーを同定するために使用した。各コロニーからのプラスミドＤＮＡを、製造業者の指示にしたがってＰｕｒｅＹｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega, Madison, WI）を使用して精製した。精製されたプラスミドを、ＥｃｏＲＩを使用して制限消化に付し、アガロースゲル電気泳動を実施し、適切なサイズ（〜１１００ｂｐ）のクローン化インサートを有するものを同定した。適切なサイズのインサートを含むプラスミドを、Ｍ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）プライマー、５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：１８）を使用して配列決定し、ヌクレオチド塩基の適切な挿入、欠失または置換を確認した。
【０１２２】
組換え
制限酵素消化を、確認された突然変異を有するコロニーからの精製プラスミドで行った。インサートをＴＯＰＯプラスミドから電気泳動法により分離し、ゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen, Valencia, CA）を使用して精製した。次に、精製されたインサートを、ミュータンス菌自殺ベクターであるｐＶＡ８９１に、３：１インサート：ベクター比で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを１６℃で一晩使用してライゲートした。次に、得られたプラスミドを、標準方法を使用してＤＨ５α細胞に形質転換し、３００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含むＬＢプレートに広げた。インキュベーション後に生じるコロニーを分析して、上記のとおり適切なインサートサイズおよび配列を決定した。
【０１２３】
確認したインサートを含む精製されたｐＶＡ８９１  ＤＮＡを、ミュータンス菌株ＪＨ１１４０（ＡＴＣＣ  ５５６７６）に以下のとおりに形質転換した：ミュータンス菌を一晩増殖させ、次に、新鮮なＴＨｙｅｘ培養液（３０ｇ／Ｌ  ＴＨＢ、３ｇ／Ｌ  酵母抽出物）で１：１５希釈し、２００μＬの希釈細胞を９６ウェルプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。２マイクロリットルのコンピテンス刺激ペプチド（ＣＳＰ、０．１μｇ／ｍＬ）を加え、プレートをさらに６時間インキュベートした。Liら, (2002) J. Bacteriol. 184:2699参照。次に、５０マイクロリットルの細胞を、予め温めた３００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含むＴＨｙｅｘ寒天プレート（３０ｇ／Ｌ  ＴＨＢ、３ｇ／Ｌ  酵母抽出物および１５ｇ／Ｌのニュートリエント寒天培地）条に置き、３７℃で４８時間インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、標準クロロホルム／フェノール抽出方法を使用して生じたクローンから抽出し、ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し、ＰＣＲは、Hillmanら., (2000) Infect. Immun. 68:543-549により以前に記載されているとおり、ベクターＤＮＡにより分離されたｌａｎＡ遺伝子の１個の野生型および１個の変異コピーを有すると過程されるヘテロ二倍体クローンを同定するためにＳＲＷｌａｎＡ＿１およびＳＲＷｌａｎＡ＿２を使用した。
【０１２４】
突然変異体構築物の遺伝的同一性確認
所望のｌａｎＡ突然変異を含むクローンを、以下のとおりにヘテロディプロイド状態の自然的分割により得た：数個の確認されたヘテロディプロイドを、一晩、エリスロマイシンを含まない２０ｍＬ  ＴＨｙｅｘ培養液で増殖させた。培養物を継代培養し（新鮮培地に１：２０希釈）、再び飽和するまで一晩増殖させた。次に、培養物を１００，０００倍希釈し、大ＴＨｙｅｘ寒天プレートに広げ、３７℃で４８時間インキュベートした。得られたコロニーは、エリスロマイシン含有または非含有培地上にレプリカパッチ(replica patched)し、ｐＶＡ８９１プラスミド（エリスロマイシン耐性遺伝子を発現する）の除去および野生型または突然変異ｌａｎＡ遺伝子が起きている自然的組換えを同定した。レプリカプレーティング技術から同定されたエリスロマイシン感受性コロニーを、エリスロマイシン含有および非含有培地で再試験した。エリスロマイシン感受性クローンのｌａｎＡ領域を、上記のとおりＰＣＲにより増幅した。産生されたアンプリコンを配列決定して、修飾されたｌａｎＡ遺伝子のみを有するクローンを同定した。ＢＬＡＳＴ配列分析を使用して、ｌａｎＡの野生型配列と疑わしい突然変異体のｌａｎＡ配列を比較した（図３）。産生された突然変異体は：Ｐｈｅ１Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１Ｇｌｙ、Ｔｒｐ４Ａｌａ、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ、ΔＴｒｐ４、Ｄｈａ５Ａｌａ、Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａおよびＡｒｇ１３Ａｓｐであった。
【０１２５】
実施例２：突然変異体の生物活性
親ミュータンス菌株、ＪＨ１１４０（ＡＴＣＣ  ５５６７６）および突然変異体を、０．８のＯＤ６００まで増殖させ、０．２のＯＤ６００まで希釈した。培養物のサンプル（２μＬ）を、予め温めたＴＨｙｅｘ寒天プレート（１５０Ｘ１５ｍｍ）に３箇所スポットし、空気乾燥させた。このアッセイを、各サンプルが阻害帯の比較のために同じコロニーサイズを有することを保証する補助としてこの様式において行った。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、次に、５５℃のオーブンに３０分置いて細菌を殺し、ミクロコッカス・ルテウス(M. luteus)ＡＴＣＣ  ２７２インディケーター株を融解したトップ寒天に重層した。細菌を熱殺菌することにより、さらなる抗菌性化合物生産を阻止した。ミクロコッカス・ルテウスＡＴＣＣ  ２７２を、０．４から０．８のＯＤ６００ｎｍまで増殖し、０．２のＯＤ６００ｎｍに希釈した。次に、４００μｌのこれらの細胞を、１０ｍｌの融解したトップ寒天に加えた（４２℃）（３０ｇ／Ｌ  Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈおよび７．５ｇ／Ｌ  ニュートリエント寒天培地）。標準化懸濁液を含む全１０ミリリットルのトップ寒天を、約５０ｍｌのＴＨｙｅｘを含むプレートに加えた。プレートを固化させ、倒置し、３７℃で一晩インキュベートした。各阻止円半径を、コロニーの端から円の最も遠い部分までｍｍにおいて測定した。阻止域の面積を各円で計算し、野生型（ｎ＝１０）の平均域面積と比較した。
【０１２６】
図４は、野生型ＭＵ１１４０と比較したＭＵ１１４０の変異体を生産する株の生物活性を説明する。結果は図５において要約されており、これは、Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａおよびΔＴｒｐ４を生産する株が、野生型と有意差がない阻止域を形成することを示す（ステューデントｔ検定、ｐ＞．０５）。Ａｒｇ１３Ａｓｐを生産する株は、野生型と比較して２．５７倍増加の量の最大阻止域面積を有した（ｐ＜．００１）。Ｔｒｐ４ＡｌａおよびＤｈａ５Ａｌａを生産する株は、野生型と比較して、それぞれ有意な（ｐ＜．００１）２．１２倍および１．８７倍増加をもたらした。Ａｌａｓ７ｉｎｓＡｌａを生産する株は、最小阻止域面積を有し、これは、野生型と比較して、阻止域面積の有意な（ｐ＜．００１）約２倍減少した。図８は、野生型ＭＵ１１４０と比較して、ＭＵ１１４０の他の変異体（Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ）を生産する株の生物学的活性を示す。Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙを生産する株は、野生型と比較して、それぞれ有意な（ｐ＜．００１）１．８２倍および１．５７倍増加を示した。
【０１２７】
変異体分子の精製に関する予備試験は、変異体分子が全て、野生型株と同じ量で、それらのそれぞれの突然変異体株により作製されたことを示す。この結果は、阻止域面積における変化が、それらの生産および／または環境への排出のレベルにおける変化よりもむしろ、変異体分子の生物活性における変化の結果であったことを示す。
【０１２８】
実施例３：最小阻止濃度
野生型ミュータシン１１４０、Ｆ１Ｉ突然変異を有するミュータシン１１４０、Ｗ４Ａ突然変異を有するミュータシン１１４０およびＲ１３Ｄ突然変異を有するミュータシン１１４０を、約９０％純度まで精製した（ＨＰＬＣを介して測定された）。ＭＵ１１４０およびＭＵ１１４０の変異体の最小阻止濃度（ＭＩＣ）をいくつかの細菌に対して決定した。ＭＩＣは、２４時間インキュベーション後に、微生物の可視増殖を阻害するＭＵ１１４０の最低濃度である。ＭＩＣが低いほど、阻害活性が大きいことを示す。最小阻止濃度（ＭＩＣ）のための抗菌剤および細菌接種材料の調製を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）Ｍ０７−８Ａに記載されている方法にしたがって、わずかに小さな修飾で行った。ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９を、細菌の均一な分散を維持するように振盪させたインキュベーターにて一晩試験した。クロストリジウム・ディフィシルＵＫ１を嫌気性チャンバーで３７℃で試験した。使用された培地はＴＨｙｅｘであった。結果を表１に示される。
【表１】
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【０１２９】
ＭＩＣは、各突然変異体で各生物で必ずしも下がらないが、各突然変異体は、例えば、他の有利な特性の中で、製造が容易であり、輸送が容易であり、良好な貯蔵安定性を有し、良好な血清安定性を有し、または良好なタンパク分解性安定性を有し得るため、野生型ＭＵ１１４０を超える利点をなお有し得る。
【０１３０】
議論
ナイシンおよびある他のランチビオティクスの分子の活性における特定のアミノ酸の重要性を分析するために、ナイシンおよびある他のランチビオティクスに対する構造遺伝子の部位特異的突然変異誘発を使用した多くの試験がある（Chatterjeeら. (2005) Chem. Rev. 105:633によりレビュー）。これらの突然変異が生物活性を増加させることは稀であった。投与のために必要とされるランチビオティクスの量の減少は明らかに商品原価を改善するため、活性が増加している突然変異は、ランチビオティクスを治療剤として、または他の適用において使用する観点から重要である。薬物としての使用の場合において、さらなる利益は、治療指数を改善する可能性がある。
【０１３１】
独立の考えとして、天然分子の生物活性を増加させるか、または該生物活性を変化させない特定のアミノ酸置換および欠失は、ランチビオティクスの製造を容易にし得る。これは、特に、ランチビオティクスが、例えば、ＤＰＯＬＴを使用して（米国特許第７，５２１，５２９号；米国出願番号２００９／０２１５９８５）、化学的に合成される場合に当てはまる。
【０１３２】
Ｐｈｅ１ＩｌｅおよびＰｈｅ１Ｇｌｙ突然変異体は、阻害アッセイの領域により測定されるとき、有意な活性の増加を有する産物を生じた。これらの突然変異の１つまたは両方は、適用のために必要とされる量を減少させること、それにより、商品原価を低下させること、およびその治療指数を改善させることにより、ＭＵ１１４０を改善し得る。
【０１３３】
Ｔｒｐ４ｉｎｓＡｌａ変異体は、野生型ＭＵ１１４０と同様の殺菌性活性を有する産物を生じた。同じ結果が、位置４でのトリプトファンの欠失に対して見られた。位置４でのトリプトファンをアラニンと置き換えている突然変異は、野生型と比較したとき、有意な生物活性の増加を生じた。これらの突然変異の１つは、特に万一、環Ａの閉鎖が促進されるという場合には、ＤＰＯＬＴベースの合成を使用する製造に利益を与え得る。
【０１３４】
セリンとして始まり、翻訳後修飾中で脱水状態(dehydrated)にされる残基であるＤｈａの、アラニンでの置換はまた、有意な生物活性の増加を生じる。該同じ突然変異がナイシンにおいて作製されたとき、産物は、野生型ナイシンと比較して同様の生物活性を示した。Chanら (1996) Applied and Environmental Microbiology 62:2966-2969。該突然変異は、ＭＵ１１４０における脱水状態残基の数を減少させる、それにより、潜在的に製造を容易にする、および商品原価を低下させるため、非常に有用である。
【０１３５】
位置７でのＳＡｌａ後へのアラニンの付加は、有意な生物活性の減少を生じた。該残基の付加は、また、合成ＭＵ１１４０の作製の複雑性を増加させるであろう、そこで、この変異体は価値があるとは考えない。
【０１３６】
最も興味がある結果は、Ａｒｇ１３Ａｓｐ突然変異体に対して得られた。該突然変異は、野生型と比較したとき、生物活性における予期されない非常に有意な増加を生じた。ここで、ヒンジ領域において、正荷電残基の負荷電残基での置換があった。該見出したことは、正電荷が抗生物質と標的細胞膜に存在する負電荷脂質との相互作用に役立つと考えられるため、ランチビオティクスにおける負電荷は生物活性を減少させるはずであるという慣用の意見に反する。該突然変異はまた、化合物からトリプシン開裂部位を除去され、それにより、酵素加水分解に対してより安定にさせる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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