(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1枚のうろこを得ること、
−前記うろこからグルココルチコイドを抽出すること、
−前記うろこから抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
グルココルチコイドが、コルチゾール、コルチコステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチゾール、１１−デオキシコルチコステロン、コルチゾン、２０−ジヒドロコルチゾン、テトラヒドロコルチゾール、および／またはテトラヒドロコルチゾンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
魚が硬骨魚類下綱に属していることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
魚から少なくとも1枚のうろこを得ることが、魚から４０〜８０枚のうろこを得ることである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
グルココルチコイドを抽出することが、メタノールを抽出溶媒として添加することにより実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
メタノールによる抽出に続いて固相抽出を行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抽出されたグルココルチコイドの定量化を、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー、紫外線、ダイオードアレイ、もしくは蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、またはセンサーに基づく技術により行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーが、超高速液体タンデム質量分析である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
免疫測定法が、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定法である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
魚からサンプリングした魚のうろこの、グルココルチコイドを定量化することによる、前記魚の慢性ストレスレベルを定量化するための使用。
【請求項１１】
定量化が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により実施される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
魚からサンプリングした棘、鰭条または耳石の、グルココルチコイドを定量化することによる、前記魚の慢性ストレスレベルを定量化するための使用。
【請求項１３】
魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1つの棘、鰭条または耳石を得ること、
−前記棘、鰭条または耳石からグルココルチコイドを抽出すること、
−前記棘、鰭条または耳石から抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚の慢性ストレス状態の評価に使用することができる、魚が経験したストレスレベルを決定することに関する。より具体的には、本発明は、魚からサンプリングしたうろこならびに棘、軟鰭条および耳石などの他の石灰化組織の、前記うろこおよび他の基質におけるグルココルチコイドレベルを定量化するための使用に関する。コルチゾールまたはコルチコステロンなどの前記グルココルチコイドのレベルは、うろこにおいて時間と共に高くなり、これは、魚がその生存の間に受けてそのストレスレベルに影響を及ぼす、長期的なストレスの多い条件を反映する。したがって本発明は、魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitroの方法であって、ストレスホルモンの精密で正確な定量化のための、ロジスティックに実行可能で非侵襲的な基質としてのうろこを使用した、前記方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
魚は世界中でますます、公共的、科学的、および政治的な関心を集めている。レクリエーションおよび商業漁業は、我々の社会において盛んである；魚の問題は、保全生物学（１）および環境保護への取り組み（例えば気候変動、新たな捕食者、新たな動物−環境関係の、ストレスに対する、およびその結果として適応度に対する影響）（２、３）に関連した議論において、関連性の高い位置を占める。人間活動（例えばエネルギー生産、輸送交通、産業公害）は、自然のストックを危うくする（４）。したがって、様々な国際監視制度が、海洋ニッチの健康状態に及ぼすそれらの影響について、科学的に明らかにすることを目指している。同様の状況が淡水のストックにおいても存在し、それは淡水ストックが農業の拡大に伴う土壌浸食、肥料などの脅威にさらされていることによる。人口は拡大を続けており、持続可能な食料生産の必要性は、世界的に最重要な優先事項となっている。魚のタンパク質は、ヒトの消費のための最も重要なタンパク質源の１つである。現在の漁業は収量の限界を迎えており、水産養殖が急速に世界的に膨張して、養殖業者に対して最適で持続可能で動物に優しい方法で生産するよう、ますます圧力をかけている（５、６）。多くの魚（例えば、ゼブラフィッシュおよびメダカ）が、生物医学研究において脊椎動物モデルとして、および齧歯類の代替として使用されている（例えば、骨の生理学的研究において）。世界的に経済のアウトプットが縮小するなかで、この分野での研究主導型のイノベーションを維持するための必須条件が、魚の開発に追加される。近年、魚の苦しみや福祉に関する倫理は、多くの魚の、漁業（７）、急速に成長し強化されている水産養殖業（８、９）、公共水族館（１０、１１）および科学研究機関（１２）などへの関与に、より多くの注意を促す。魚の生物学を、魚の開発における管理、制御、および意思決定のベースとして認識し理解することは、多くの分野（分子生物学からエコ生理学まで）からの関係者に対して、複数の角度（すべて異なる利害関係者）から見た現象的なチャレンジを与え、高度に特異的で望ましい専門知識を表す。このフレームワークにおいて、魚におけるストレス、特に慢性ストレスのレベルを評価する科学的に検証された新規なバイオマーカーは、非常に重要である。
【０００３】
魚の福祉は危険にさらされやすいため、水質等の一貫性に劣る間接的な畜産関連のパラメータよりも優れた、動物に基づく生理学的指標が必要である。しかし、慢性ストレスについての、実用的で信頼できる検証されたバイオマーカーは不足している。頻繁に使用される、魚に対して一見論理的なバイオマーカーは、「ストレスステロイド」であるコルチゾールの血中レベルである。ストレスの刺激に直面した魚は、視床下部−下垂体−腎間（ＨＰＩ）軸の活性化を介した内分泌ストレス応答を起動して、コルチゾールを血中に放出する（１３、１４）。コルチゾールは、一連の生理学的および行動的変化を誘発し（１５−１７）、これは魚が変化した状況に対応することを可能にする（１８−２０）。短期的なコルチゾール作用の適応値は、広く認識されている（２１、２２）。持続的なストレスならびに、健康、成長、および再生に対する多くの場合有害なその結果については、ほとんど知られていない（１９、２０）。堅牢で容易に実施可能で、かつ科学的に検証された、慢性ストレスのバイオマーカーの定義は、このように最も重要である。魚の血漿中のグルココルチコイドレベルは、日周変動を示し（２３）、魚の生涯にわたるストレスに対する曝露は明らかにせず、サンプリングの時点におけるコルチゾールの状態のスナップショットしか提供しない（２４、２５）。さらに、血液のサンプリングは侵襲的であり、網による捕獲、空気曝露およびハンドリングのため、魚に対して交絡（confounding）ストレスの原因とならざるを得ない。血漿コルチゾールレベルはストレッサーとの対決の後数分間で急速に上昇するため、血漿コルチゾールにはバイアスが発生しやすい（１３）。血液サンプリングを容易にするために用いられる麻酔薬は、それ自体がＨＰＩ軸の活性化を低下または遮断する可能性があり、これによりコルチゾールの血液中への放出に影響を与え、誤った結果をもたらす（２６、２７）。制限事項はまた、粘液（２８、２９）、腸の内容物（２９）、糞（３０）および水（３１、３２）などの代替基質中のコルチゾールの測定にも適用される。関連する文献は、慢性ストレスの評価に適した基質における、コルチゾールのデータを欠いている。これまで、研究の大半はコルチゾールのみに対処し、グルココルチコイド産生経路（単数または複数）（３３）またはそれらの慢性ストレスでの重要性についての報告は少ない。魚は、生物的事象を記録し、石灰化組織内にその履歴を保存する。鳥の羽毛（３８）および哺乳動物の毛（３９）と同様に、魚の慢性ストレスの評価のための理想的な基質は、少なくとも以下の基準を満たすべきである：（ｉ）グルココルチコイドの取り込み；（ｉｉ）ゆっくりであるが持続的な成長；および（ｉｉｉ）サンプリングの容易さ。
【０００４】
板状鱗（elasmoid scale）、すなわち石灰化真皮外骨格構造（４０）は、魚と共に成長し、無細胞コラーゲン基質から構成されており、これは、外層がカルシウムヒドロキシアパタイトで鉱化され、骨芽細胞様および破骨細胞様の特性を有する細胞の単層で裏打ちされている。うろこは、除去されても何日間かのうちに再生される（４１）。うろこは、内分泌刺激についての標的である。高親和性の低容量エストラジオール−１７ｂ結合は、ニジマス（Oncorhychus mykis）の骨片形成細胞質ゾルに見出され（４２）、エストロゲン受容体はモザンビークテラピア（Oreochromis mossambicus）およびゴウシュウマダイ（gilthead sea bream）（Sparus auratus）のうろこで免疫組織化学的に検出されている（４３）。うろこは簡単かつ迅速に、魚が無視できる程度の傷害およびストレスで収集され、そのコルチゾールレベルはサンプリング手順によって悪化されない。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、ステロイドホルモン原理経路および慢性ストレス応答に関与する分析物の図である４４。
【図２】図２は、方法の概略図である。
【図３】図３は、検証のための、うろこ、棘、および軟鰭条についての基質の最適量を示す図である。
【図４】図４は、うろこ、棘、および軟鰭条中のコルチゾールについての抽出時間および反復の最適化を示す図である。
【図５】図５は、魚のうろこにおけるコルチゾールについての、希釈液および基質中の検量線の図である。
【図６】図６は、処置の４２日目の、コルチゾール（ｎＭ）、グルコース（ｍＭ）、乳酸塩（ｍＭ）、全カルシウム（ｍＭ）、および重量オスモル濃度（ｍＯｓｍ・ｋｇ−１）の血漿分析の図である。観測の５０％が、箱の下端および上端（第１および第３四分位点）の間に発生し、ひげは、箱からの四分位範囲の１．５倍以内である最も極端な観察まで伸びている；白丸はこの範囲外の値を表す。
【図７】図７は、処置の４２日目の、視床下部（ｃｒｆ）、下垂体前葉（ｐｏｍｃ）、および腎間（ｓｔａｒ）の遺伝子の分析を示す（平均正規化発現−ＭＮＥ）。箱ひげ図（ボックスプロット）のひげは、図６で定義の通りである。
【図８】図８は、処置の４２日後の、えらにおけるａｔｐ１ａ１ａの遺伝子発現（ＭＮＥ）の図である。箱ひげ図のひげは、図６で定義の通りである。
【０００６】
【図９】図９は、処置の２１日および４２日後の、個体発生うろこにおけるコルチゾール（うろこ当たりのｐｍｏｌ）を示す図である（ＣＣα＝決定限界およびＣＣβ＝検出能力）。４２日目のＳＴＲＥＳＳの１つの値（うろこ当たり２．８ｐｍｏｌ）は、表示の理由により箱ひげ図から省略した。箱ひげ図のひげは、図６で定義の通りである。
【図１０】図１０は、個体発生うろこおよび再生うろこ（ＭＮＥ）の相対的ｃｏｌ１ａ１発現に対する血漿コルチゾール（ｎＭ）の、バッグプロット（bagplot）を示す図である。バッグは、すべての観測の５０％を含む。挿入図は、２１日の再生うろこにおけるコルチゾール（うろこ当たりのｐｍｏｌ）を示す。箱ひげ図のひげは、図６で定義の通りである。
【図１１】図１１は、処置の４２日目の、コルチゾール（ｎＭ）、グルコース（ｍＭ）、全カルシウム（ｍＭ）、および重量オスモル濃度（ｍＯｓｍ・ｋｇ−１）の血漿分析の図である。観測の５０％が、箱の下端および上端（第１および第３四分位点）の間に発生し、ひげは、箱からの四分位範囲の１．５倍以内である最も極端な観察まで伸びている；白丸はこの範囲外の値を表す。
【図１２】図１２は、処置の２１日および４２日後の、個体発生うろこにおけるコルチゾール（うろこ当たりのｐｍｏｌ）を示す図である（ＣＣα＝決定限界およびＣＣβ＝検出能力）。箱ひげ図のひげは、図１１で定義の通りである。
【図１３】図１３は、処置の２１日後の、再生うろこにおけるコルチゾール（うろこ当たりのｐｍｏｌ）を示す図である（ＣＣα＝決定限界およびＣＣβ＝検出能力）。箱ひげ図のひげは、図１１で定義の通りである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、魚においてグルココルチコイドのプロファイルがうろこに捕捉されること、および、これらの皮骨プレートにおけるグルココルチコイドレベルが、魚が時間とともに経験したストレスの度合いの時間積分された試料を反映すること、との所見に関する。うろこは簡単に非侵襲的にサンプリングされ、うろこにおけるグルココルチコイドレベルのさらなる定量化のための、便利な試料調製を可能にするために、うろこは実際、魚における慢性ストレスのモニタリングのための理想的な基質と考えられている。したがって本発明は、魚のうろこにおけるコルチゾールなどの糖質コルチコイドを定量化して、長期間のストレスへの魚の暴露を評価するための、精密で正確かつ堅牢な方法に関する。
より具体的には、本発明は、魚における慢性ストレスレベルを定量化するためのin vitro方法であって、
−前記魚から少なくとも1枚のうろこを得ること、
−前記うろこからグルココルチコイドを抽出すること、
−前記うろこから抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、
を含む、前記方法に関する。
【０００８】
用語「グルココルチコイド」は、硬骨魚類下綱（infraclass Teleostei）に属する魚（Pisces）から（板状）鱗が採取された場合にはコルチゾールを意味し、および／または、軟骨魚綱（class Chondrichtyes）に属する魚から（硬）鱗が採取された場合にはコルチコステロンを意味し、および／または、―可能な腎間外経路の検出が追加的に必要とされる場合には―、１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび／または１１−デオキシコルチゾールなどのコルチゾールの前駆体、および／または１１−デオキシコルチコステロンなどのコルチコステロンの前駆体を意味し、および／またはコルチゾン、ライヒシュタインＵ（または２０−ジヒドロコルチゾン）、テトラヒドロコルチゾール、および／またはテトラヒドロコルチゾンなどのコルチゾールの代謝物、および／またはコルチコステロンの代謝物を意味し、なぜならばこれらの代謝物は、うろこにおけるグルココルチコイドレベルに影響を与える可能性があり、したがってそれらの検出が追加的に必要とされるからである。
【０００９】
上記に示したグルココルチコイドの化学構造を以下に示す４５：
−コルチゾールまたは１１β，１７α，２１−トリヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン：
【化１】
0006348186.tif 000002
−コルチコステロンまたは１１β，２１−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３，２０−ジオン：
【化２】
0006348186.tif 000003
−１７α−ヒドロキシプロゲステロンまたは１７α−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン：
【化３】
0006348186.tif 000004
−１１−デオキシコルチゾールまたは１７α，２１−ジヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン：
【化４】
0006348186.tif 000005
【００１０】
−１１−デオキシコルチコステロンまたは２１−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン：
【化５】
0006348186.tif 000006
−コルチゾンまたは１７α，２１−ジヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３，１１，２０−トリオン：
【化６】
0006348186.tif 000007
−ライヒシュタインＵまたは２０−ジヒドロコルチゾンまたは１７α，２０，２１−トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３，１１−ジオン
【化７】
0006348186.tif 000008
−テトラヒドロコルチゾールまたは３α，１１β，１７α，２１−テトラヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オン：
【化８】
0006348186.tif 000009
−テトラヒドロコルチゾンまたは３α，１７α，２１−トリヒドロキシ−５ｆ３−プレグナン−１１．２０−ジオン：
【化９】
0006348186.tif 000010
【００１１】
したがって本発明は、本明細書に記載の方法であって、グルココルチコイドがコルチゾール、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチゾール、コルチコステロン、１１−デオキシコルチコステロン、コルチゾン、ライヒシュタインＵ、テトラヒドロコルチゾール、および／またはテトラヒドロコルチゾンである、前記方法に関する。硬骨魚におけるストレス応答を反映すると考えられる古典的なパラメータとして、コルチゾールは血流中に放出され、石灰化構造への組み込みが可能となり、これにより慢性ストレス研究のための主要な標的分析物となる。その前駆体である１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾールは、可能な腎間外経路の存在を解明するための方法に含められていた。魚における腎間外経路の存在は、現在知られていないが、ヒトにおける副腎外経路の兆候があるため４６、両方の分析物は、さらなる研究目的のための方法に組み込まれた。かかる経路の存在は、ＨＰＩ軸の、またその結果としてのストレスについての我々の理解に対して、大きな影響を与える可能性がある。代謝物であるコルチゾン、ライヒシュタインＵ、テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾンもまた方法に含められたが、これは、水中の外因性のグルココルチコイド（他の魚、人為的活動等に由来）が内分泌かく乱物質として作用し得て、うろこにおけるグルココルチコイドのプロファイルに影響を与える可能性があるからである。
【００１２】
用語「魚」は本質的に、うろこを有し、えらのある任意の有頭水生動物を意味するが、しかし特には、軟骨魚綱（軟骨魚）の分類学的クラス、または硬骨魚類（硬骨魚）の分類学的下綱に属する魚を指す。
本発明はさらに具体的に、前記魚が硬骨魚類下綱に属する、上述の方法に関する。
より具体的には、本発明は、前記硬骨魚類下綱に属する魚が、モロネ科（例えば、ヨーロピアンシーバス）、タイ科（例えば、タイ類（Sea breams））、ササウシノシタ科（例えば、ヨーロッパソールおよびセネガルソール）、サケ科（例えば、サケ、マス）、いわゆるキングフィッシュ（例えばイエローテールキングフィッシュ）、サバ科（例えばマグロ）、タラ科（例えばタラ）、コイ科（例えば、コイ、鯉（錦鯉））、およびシクリッド魚（例えば、モザンビークおよびナイルテラピア）に属する魚である、上述の方法に関する。
【００１３】
用語「うろこ」は、魚の皮に一般に見出される皮骨プレートであって、成長に依存して同心円状の輪または環を示すものを意味する。より具体的には、用語「うろこ」は、硬骨魚類に見られるような「板状鱗」、および軟骨魚綱に見られるような「硬鱗」を指す。
魚における「慢性ストレス」の用語は、時間とともに増大して長期に持続するストレスの多い状況を反映するストレスを意味し、かかる状況は、取り扱い、水質悪化、ストック密度、捕食、および風車（windmills）、漁船による輸送、接触等その他いくつかの人の活動の要因によるものである。慢性ストレスはこのように、魚が完全には回復できない長期に持続する条件である。ストレス因子の直接の影響、ならびに内分泌レベル、免疫システムまたは機能的レベルで生じる変化は、（前）病理学的結果に影響し得て、これは魚の福祉を低下させる。
「魚からうろこを得る」という用語は、前記（生きているか死んだ）魚の皮から、少なくとも1枚のうろこを、例えば微細ピンセットを用いて除去することを意味する。前記うろこは、魚の体の任意の部分から採取することができる：すなわち、背側、頭腹側、中腹側、尾側、右側または左側など。本発明の方法を標準化するために、うろこは胸びれの背側の中背腹ゾーンから採取した。試料収集のこの非侵襲的な方法は、除去されたうろこが短期間で再生するため、魚には影響を及ぼさない。これらの再生うろこは、経験したストレスに関して同一のグルココルチコイドの取り込みプロファイルを示すことが証明され、したがって、明確に定義された時間枠内の慢性的ストレスを定量化するための、追加のツールを提供する。
【００１４】
うろこ１枚の重量は、魚種にだけでなく魚の年齢にも依存し、稚魚は小さいうろこを有するため、必要なうろこの数はこれらの要因の両方に依存する。そのため、本発明の方法は、例えば１００ｍｇのうろこに対応する標準化されたうろこ量を用いて、標準化した；しかし、試験の指摘によれば、より少量（例えば、８０、６０、４０、２０、１０、５、１ｍｇ、などのうろこ）を用いることも可能である。例えば１００ｍｇのうろこに対応するうろこの数は、多くの場合、約４０〜８０枚のうろこ、例えば６０枚のうろこであるが、本発明の方法を、上記のような両因子を考慮して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１枚以上のうろこを使用して実施可能であることは、明らかである。
したがって、本発明は、また、上述の方法に関し、魚から少なくとも1枚のうろこを得ることが、前記魚から４０〜８０枚のうろこを得ることである。
【００１５】
「うろこからグルココルチコイドを抽出する」という用語は、前記うろこからグルココルチコイドを分離／抽出するための任意の方法に関する。本発明の典型的な、しかし非限定的な抽出方法は、水相から有機相への、グルココルチコイドの抽出を含む。例えば、使用可能な抽出溶媒は、メタノール、２−プロパノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル等である。しかし、好ましい溶媒は、メタノールである。
したがって本発明は、グルココルチコイドの抽出が、メタノールを抽出溶媒として添加することにより実施される、上記の方法に関する。本発明の抽出の例は、以下である：均質化うろこ試料０．１ｇ±０．００１ｇを、１０ｍＬの試験管に秤量する。続いてメタノール８ｍｌを抽出溶媒として添加し、０．５μｇ・Ｌ−１のコルチゾール−ｄ４溶液１０μＬを、内部標準として添加する。試料を３０秒間ボルテックス混合し、室温で１時間、６０ｒｐｍでオーバーヘッドシェーカー上に置き、７℃、３５００×ｇで１０分間遠心分離する。すべての上清を採取し、窒素下６０℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させ、後続の固相抽出（ＳＰＥ）のために、５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）中に再構成する。
【００１６】
用語「うろこから抽出したグルココルチコイドを精製する」とは、本発明のグルココルチコイドを、純粋にまたはさらに純粋にし、および濃縮するかまたはさらに濃縮するための、および／または可能な限り多くの不純物を除去するための、任意の方法に関する。
特に、本発明はまた、メタノールを用いた抽出の後にＳＰＥ（固相抽出）が続く、上記の方法にも関する。本発明の精製ステップの非限定的な例は、以下である：Ｃ１８ ＳＰＥカラムを３ｍｌのメタノールと続いて３ｍｌの超純水でコンディショニング後、上記のようにして得られた試料を供する。カラムを４．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（６５：３５；ｖ／ｖ）で洗浄し、保持された化合物を、２．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２０：８０；ｖ／ｖ）で１０ｍｌの試験管に溶出し、窒素下６０℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させる。試料を最後に、バイアル内の１００μＬのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）中に再構成し、タンデム質量分析と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析する。
「精製したグルココルチコイドを定量化する」という用語は、上記のように抽出／精製後に得られたグルココルチコイドの量を決定するための、任意の方法を指す。
【００１７】
より具体的には、本発明は、抽出され精製されたグルココルチコイドの定量化が、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（（Ｕ）ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）４７−４８、紫外線検出（ＨＰＬＣ−ＵＶ）およびダイオードアレイ検出（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）４９−５０または蛍光検出（ＨＰＬＣ−ＦＬ）５１−５２と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）５３−５４、（放射）（酵素）免疫測定法（ＲＩＡ）５５−５６（ＥＩＡ）５７−５８またはセンサーベースの技術５９−６０によって実施される、上述の方法に関する。
本発明はまた、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーが、超高速液体タンデム質量分析である、上述の方法に関する。
より具体的には、本発明は、免疫測定法が、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定法である、上述の方法に関する。
【００１８】
「定量化グルココルチコイドと慢性ストレスレベルの相関をとる」という用語は、ストレスを受けた硬骨魚がコルチゾールを生成し、これが血流中に放出されるという事実を指す。このストレス負荷が時間的に持続されると、コルチゾールは、この期間の間に血液中を循環する。うろこの構造を考慮すると、この生理活性かつ遊離の循環コルチゾールの一定割合は、うろこに取り込まれる。うろこが時間と共に成長すると、これはコルチゾールを、したがって時間におけるストレス負荷を定量化する機会を与える。これを知り、変化するストレス負荷にさらされる魚のうろこを、グルココルチコイドについて分析することができる。例えば、小さなストレス負荷にさらされている魚（すなわち、低減された容積（例えば元の容積の２５％）への、１日おきに３０分間の閉じ込め）は、１．７０μｇ・ｋｇ−１の平均コルチゾール量を有し、一方高度なストレスの魚（すなわち、１日おきに１０％容積に３０分間の閉じ込め＋５分間追い回し、＋週に１回１分間空気に暴露する）では、これは３．４４μｇ・ｋｇ−１である。
したがって本発明は、本質的に、魚からサンプリングした魚のうろこの、前記魚における慢性ストレスレベルを決定または定量化するための使用に関する。
【００１９】
本発明は、定量化／決定が、上記の方法に従った方法により行われる、上述の使用にも関する。
うろこは、それらが非侵襲的に収集されるため、慢性ストレスの定量化のための最も重要な基質である。しかし、耳石、棘、鰭条などの他の石灰化基質も、一定の状況においては、慢性ストレスの定量化のための基質と同様に使用することができる。後者の定量化は、うろこについて上述したのと同様の方法で行うことができる。特に、棘と鰭条はハサミで切断し、それらを小片にカットして均質化し、一方耳石はメスで除去し、乳鉢を用いて粉砕することにより均質化する。
柔鰭条は柔軟で、先端部で分節および分岐し、先端に新しい分節を追加することにより延長される。棘は分節していないが、基底から癒合しており、持続的な成長を示す。耳石は、内耳のバランスの器官の一部であり、アラゴナイトの形態の結晶化した炭酸カルシウム、およびオトリン（otoline）と呼ばれる繊維質のコラーゲン様タンパク質から、主として構成される。これらは、放射状に堆積され、体細胞の成長がない場合には維持される、容易に識別可能な毎日の増分を表示する。柔鰭条およびうろこは、失われたかまたは損傷された場合には、急速に再生可能である。
【００２０】
したがって本発明はさらに、魚からサンプリングした棘、鰭条、耳石などの他の石灰化基質の、前記魚の慢性ストレスレベルを定量化するための使用に関する。
したがって本発明はさらに、魚における慢性ストレスレベルを定量化するin vitroの方法であって、
−前記魚から少なくとも1つの棘、鰭条または耳石を得ること、
−前記棘、鰭条または耳石からグルココルチコイドを抽出すること、
−前記棘、鰭条または耳石から抽出されたグルココルチコイドを精製すること、
−前記精製されたグルココルチコイドを定量化すること、および
−前記定量化されたグルココルチコイドと慢性ストレスレベルの、相関をとること、を含む、前記方法に関する。
本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００２１】
例１：ヨーロピアンシーバス（Dicentrarchus labrax）のうろこにおけるグルココルチコイドを定量化するための、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の開発および検証
方法および材料
機器、材料、および試薬
クロマトグラフィー分析は、Acquity Ultra Performance LC BEH C18カラム（１．７μｍ；２．１×１００ｍｍ）を用いてAcquity UPLC-MS/MS Premier XE（Waters, Milford, USA）で実施した。試料は、Turbovap（商標）窒素エバポレーター（Biotage, Sweden）で乾燥まで蒸発させた。固相抽出（ＳＰＥ）用のGrace Pure（商標）SPE C18-Maxカラム（５００ｍｇ、６ｍｌ)は、Grace Davison Discovery Sciences（Lokeren, Belgium）から入手した。抽出溶媒としての、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）勾配グレードのメタノール（Hipersolv Chromanorm）は、VWR International BVBA（Leuven, Belgium）から入手し、一方、Biosolve BV（Valkenswaard, The Netherlands）からのＬＣ−ＭＳ無水メタノールおよびＵＬＣ−ＭＳグレードギ酸、およびMillipore（Billerica, USA）からのMilli-Q勾配Q-Gard 2の超純水を、移動相溶媒として使用した。
【００２２】
化合物、標準、および溶液
分析証明書を持つ製品のみを使用した。コルチゾール、コルチゾン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、および１１−デオキシコルチゾールは、Sigma-Aldrich（Diegem, Belgium）から入手した。テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾンは、Sequoia Research Products Ltd(Pangbourne, United Kingdom）から入手した。CDN Isotopes（Pointe-Claire, Canada）からのコルチゾール−ｄ４を、内部標準として使用した。
すべての化合物および内部標準の、１ｍｇ・ｍＬ−１の個々のストック標準溶液は、メタノール中に調製し、４℃で保存した。０．００５ｍｇ・Ｌ−１〜０．１ｍｇ・Ｌ−１までの範囲の較正標準は、０．５μｇ・Ｌ−１のコルチゾール−ｄ４溶液１０μＬを、１００μＬのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）中のそれぞれ１μｇ・Ｌ−１の標準溶液０．５μＬ、１μＬ、２．５μＬ、５μＬ、および１０μＬに添加することにより調製した。１００ｍｇの試料を使用したので、これは、基質中５μｇ・ｋｇ−１〜１００μｇ・ｋｇ−１の範囲に相当する。
【００２３】
サンプリング
すべての石灰化構造は、２−フェノキシエタノールで深く麻酔し脊髄切断により屠殺したヨーロピアンシーバス（Dicentrarchus labrax）からサンプリングした。すべての魚は約１００ｇの重量であった。胸びれの背側の左中背腹ゾーンから６０枚のうろこを、微細ピンセットで皮から除去した。尾びれからの４個の背棘と６個の柔鰭条は、ハサミを使用して取得した。２つの矢状耳石は、開いた頭骨から採取した。全試料は超純水ですすぎ、室温でティッシュペーパー上空気乾燥させた。
【００２４】
試料調製
うろこ、棘、および柔鰭条は、ハサミで微細片に切断した。耳石は乳鉢で粉砕した。ハサミと乳鉢は、エタノールと続いて超純水で洗浄し、ティッシュペーパーで乾燥させた。均質化した試料０．１ｇ±０．００１ｇを、１０ｍｌの試験管に秤量した。続いて８ｍｌのメタノールを抽出溶媒として添加し、０．５μg・Ｌ−１のコルチゾール−ｄ４溶液１０μＬを、内部標準として添加した。試料を３０秒間ボルテックス混合し、室温で１時間、６０ｒｐｍでオーバーヘッドシェーカー上に置き、７℃、３５００ｇで１０分間遠心分離した。すべての上清を採取し、窒素下６０℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させ、５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）中に再構成した。Ｃ１８ ＳＰＥカラムを３ｍｌのメタノールと続いて３ｍｌの超純水でコンディショニング後、試料を供した。カラムを４．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（６５：３５；ｖ／ｖ）で洗浄し、保持された化合物を、２．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２０：８０；ｖ／ｖ）で１０ｍｌの試験管に溶出し、窒素下６０℃で窒素エバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発させた。試料を最後に、バイアル内の１００μＬのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）中に再構成し、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【００２５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
グルココルチコイドを、移動相ＡおよびＢの勾配溶出を使用して分離した。移動相Ａは、超純水と０．１％ギ酸の混合物であり、一方移動相Ｂは、メタノールと０．１％ギ酸の混合物であった。最初に、勾配溶出は、２０％（ｖ／ｖ）の移動相Ｂで開始した。次に、移動相Ｂを１．５分で５６％まで、６．５分で６３％まで、７．５分で９９．１％まで増加し、その後これを８分まで９９．１％に維持し、最終的に９分で２０％まで減少させ、ここで１０分まで維持した。流量は、０．４ｍｌ・分−１の一定値に維持し、１０分の実行時間を得た。試料はオートサンプラーで７℃に冷却した。注入容量は４０μＬとし、一方カラム温度は３０℃に維持した。
【００２６】
クロマトグラフィー分析は、最適な感度および選択性を達成するために、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで使用する質量分析計で実施した。すべての標的分析物のために、２種の前駆フラグメントイオンの遷移を決定した。機器のパラメータは、メタノール中１０μｇ・Ｌ−１の標準液＋０．１％ギ酸への、１０μＬ・分−１の流量での直接注入により、最適化した。２種の前駆フラグメントイオンの遷移の使用により、両遷移の間の比率の決定が可能となり、これは、相対保持時間と共に、Commission Decision No. 2002/657/EC６１の要件に従った各分析物の同一性の同定および確認のために使用した。質量分析計は、正のエレクトロスプレーイオン化モード（ＥＳＩ＋）で使用した。すべての化合物は、それらのプロトン付加体［Ｍ＋Ｈ］＋と共に分析した。ＭＳ検出器の設定は以下の値とした：ソース温度１２０℃、ガス流８００Ｌ・ｈ−１で脱溶媒和温度３００℃、コーンガス流量５０Ｌ・ｈ−１、およびキャピラリー電圧３ｋＶ。アルゴンを、１．１１・１０−２ｍｂａｒの圧力で衝突ガスとして使用した。全化合物の保持時間、前駆イオン、生成イオン、コーン電圧、および衝突エネルギーを示した最適化ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件を、表１に示す。
【００２７】
表１．化合物ごとの最適化ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件
【表１】
0006348186.tif 000011
データ分析は、WatersからのQuan/Targetlynxソフトウェアを用いて行った；分析結果は、包含係数（ｋ）が２（９５％の信頼区間）における、値（μｇ・ｋｇ−１）±拡張測定不確かさ（μｇ・ｋｇ−１）として報告した。
【００２８】
検証
すべての石灰化構造の検証試料は、同様の条件下で飼育したそれぞれ５１、５１、５７、および１１８匹の魚からのうろこ、棘、柔鰭条、および耳石のプーリングによって作製された。上記の分析物／基質の組み合わせについての認証標準物質、実験室間の比較試験、または任意の他の検証された方法は存在しないため、検証は、検証試料への標準添加を用いて行った。すべての石灰化構造に対して、１〜５０μｇ・ｋｇ−１の範囲の５つの濃度レベルを５重で試験し、これを、１ヶ月の期間内の４つの異なる日に、実験内再現性条件（intra-reproducibility conditions）のもとで、すなわち２人が異なる溶液および１つのＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを使用して、繰り返した。すべての検証実験は、許可された者により、制御された環境下で、較正機器と制御された溶液を用いて、標準EN ISO/IEC 17025６２の要件に従って実施した。分析は、異なる較正標準、ブランク、陰性および陽性対照（すべて希釈液中）からなる標準化された順序を用いて行った。すべての化合物についての結果は、（相対）保持時間および化合物とその断片の相対的なイオン強度を評価することにより、評価した。全ての検証パラメータは、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に応じて決定し、評価した：真度、精度、動作範囲、直線性、決定限界（ＣＣα）、検出能力（ＣＣβ）、感度、および選択性。
【００２９】
全化合物の見かけの回収ならびに精度（反復性および実験室内再現性）は、実験内再現性条件下で決定され、すべての濃度レベルについて２０の分析結果および、化合物および基質あたり全部で１００の分析結果が得られた。濃度レベルが低いため、ディクソンの異常値試験６３およびGrubbs検定６４を実施して、可能な外れ値を検出した。決定限界（ＣＣα）は、検量線の切片に実験室内再現性の標準偏差の２．３３倍を加えて算出し（α＝１％）、一方検出能力（ＣＣβ）は、ＣＣαの濃度に実験室内再現性の標準偏差の１．６４倍を加えて算出した（β＝５％）。拡張測定不確かさは、真度および実験室内再現性の検証データに基づき、２つの異なるアプローチ、すなわち線形加算により、および二次加算またはNordtest法により決定した。また、方法の堅牢性および希釈液中および基質中の検体の安定性は、方法の開発中にモニタリングした。最後に、拡張測定不確かさは、線形加算によってだけでなく、二次加算またはNordtest法４７−５２によって決定した（文献には好ましい方法に関するコンセンサスはない）。
【００３０】
結果
魚のうろこにおける、コルチゾール、その前駆体である１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾール、コルチゾン、および重要な代謝物であるテトラヒドロコルチゾール、およびテトラヒドロコルチゾンについてのＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量法は、EN ISO/IEC 17025:2005認定の環境で開発され、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って検証された。ほとんどの魚においてストレス応答を反映していると考えられる古典的なパラメータとして、コルチゾールは血流中に放出されて、石灰化構造への組み込みが可能となり、これにより、慢性ストレス研究のための標的分析物となっている。その前駆体１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾールも、可能な腎間外経路の検出をカバーするために分析に含めた。代謝物テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾンも含めたが、これは、外因性グルココルチコイド（水中）が内分泌かく乱物質として作用し、試験する石灰化構造のグルココルチコイドプロファイルに影響を与える可能性があるためである。この方法は、棘、柔鰭条、および耳石についても試験して検証された。うろこのサンプリングの利便性が検討される。
【００３１】
方法の開発
サンプリングおよび試料調製
各石灰化構造について、サンプリング位置を決定した。うろこは、変態後の魚における中胚葉性骨格要素である。魚の様々な側面（例えば、背側、頭腹側、中腹側、または尾側）から採取したうろこにおけるコルチゾール含有量に差はなく、左側と右側から採取したうろこの間にも差は見出されなかった。側線のうろこは、構造が異なるため避けるべきである。簡便さと将来の研究のために（水産養殖における適用可能性を考慮して）、うろこは、胸びれの背側の中背腹ゾーンから選択した。シーバスの棘は、特に、第一背びれの頭骨部分に見出される（８〜１０個の棘）。棘は分節しておらず、基底に癒合しており、したがって柔鰭条よりも硬い。グルココルチコイドのより高い濃度は、そのベースにある棘において見出だされ、この組織は経時的なコルチゾールの取り込みについてよりよい微調整を必要とする。さらに、棘の末端部を除く全体は上皮で覆われている。背びれ、頭腹部のひれ、中腹部のひれ、または尾びれから採取した柔鰭条におけるコルチゾール含有量に、差は見出されなかった。水産養殖における適用可能性を考慮して、尾びれからの柔鰭条を選択した。矢状耳石は、最も大きく、最も取り出しが簡単であるために選択された。
【００３２】
ロジスティックな実行可能性と分析性能の最適な組み合わせの点で、分析のための基質の最適量は、各石灰化構造について異なる量の試料をスパイクすることにより、すなわち、同じ魚から異なる数のうろこ、棘、および柔鰭条を、５μｇ・ｋｇ−１の標的分析物を用いてスパイクすることにより、決定した。うろこ、棘、および柔鰭条についての結果を図３に示す。水産養殖および野生生物における将来の適用性を考慮して、検証のために、すべての石灰化構造について０．１ｇを選択した。
図３．検証用のうろこ、棘、および柔鰭条についての基質の最適量
内因性６５および外因性のグルココルチコイドを含むことが知られている粘液を除去するために、全試料を、超純水により集中的に洗浄した。
異なる抽出効率の４種の溶媒を試験した：メタノール、２−プロパノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル。メタノールは、うろこならびに棘および柔鰭条における様々なグルココルチコイドについて、最良の結果を与えた；耳石中では、溶媒間に明確な差は見られなかった（データ示さず）。
次に、メタノールによる時間依存性のインキュベーション（１５、６０、１２０分および１６時間）および反復抽出を試験した。魚のうろこ中のコルチゾールについて、抽出の改善は、６０分のインキュベーション後に見られなかった。２回目の抽出での改善も、１５分２サイクルの組み合わせ（６０分１サイクルに対して）での改善も見られなかった。うろこ、棘、および柔鰭条についての結果を図４に示す。
図４．うろこ、棘、および柔鰭条におけるコルチゾールついての抽出時間と反復の最適化
【００３３】
高いスループットとコスト効果的な方法が必要とされているため、うろこでの抽出は、８ｍｌのメタノールによる、オーバーヘッドシェーカー上室温で１時間を標準とした。
ＳＰＥ手順
Ｃ１８相ＳＰＥカートリッジは、血漿６６、尿６７、糞６８などの生物学的試料からのグルココルチコイド抽出に成功して使用され、したがってこのカラムの種類を、本研究における石灰化構造からの選択されたグルココルチコイドの抽出および精製を最適化するように選択した。
Grace Pure（商標）SPE C18-Max（５００ｍｇ、６ｍｌ）カラムは、シリカベースの支持体上に重合的結合した１７．１％の炭素が装填された逆相吸着剤である。逆相抽出法を選択した理由は、極性の試料基質からの、適度に極性から非極性の化合物に結合するためである。５００ｍｇの床のサイズは、２５ｍｇの吸着剤保持能力を提供する。うろこおよび他の石灰化構造におけるグルココルチコイドの予測濃度範囲を考慮すると、この保持能力は、関心のあるすべての分析物を結合するのに十分であろう。ＳＰＥのためのコンディショニング、試料の負荷、洗浄および溶出ステップは、溶媒の種類と量について最適化した。３ｍｌのメタノールによるコンディショニングステップで吸着剤のリガンドを活性化し、続いて３ｍｌの超純水で吸着床を平衡化することにより、最良の結果が得られた（コルチゾールの平均回収率＞９０％）。両方の溶媒の最小容量は２．５ｍｌであり、一方３ｍｌより多くの容量を使用した試験では、精製は改善されなかった。蒸発された試料を５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）に再懸濁させる、試料の負荷ステップは、最良の結果をもたらした。超純水および／またはメタノールの割合を変化させた溶媒の組み合わせは、次善の結果をもたらした。カラムを４．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（６５：３５；ｖ／ｖ）で洗浄することは、グルココルチコイドの回収について最良の結果をもたらした。
【００３４】
メタノールのより高い濃度は、グルココルチコイドの溶出をもたらし、一方メタノールのより低い濃度は、ノイズの増加をもたらした。保持された化合物を、１０ｍｌの試験管内の２．５ｍｌのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２０：８０；ｖ／ｖ）に溶出させた。低い溶出体積または超純水の増加は、すべてのグルココルチコイドを回収せず、一方より高い溶出体積またはメタノールの増加は、効率に関して準最適であり、これは、基質からより多くの妨害化合物が溶出されたからである。蒸発の後、試料をバイアル内の１００μＬのＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）に再懸濁させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。１００μＬ中での再構成は、デュプロ注入の可能性を有するように選択した。メタノールに対する超純水の比率を変化させる溶媒の組み合わせは、準最適な結果をもたらしたが、これは、クロマトグラフィー分析のための勾配が最適化されて、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ（８０：２０；ｖ／ｖ）で開始されたからであった。Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２０：８０；ｖ／ｖ）までの濃度での再構成は可能であったが、クロマトグラフィーのピーク形状にマイナスの影響を及ぼした。
【００３５】
クロマトグラフィー分析
Acquity Ultra Performance LC BEH C18カラム（１．７μｍ；２．１×１００ｍｍ）を用いたクロマトグラフィー分析を最適化するための最初のステップにおいて、全化合物ならびに内部標準を、正（ＥＳＩ＋）および負（ＥＳＩ−）のエレクトロスプレーイオン化モードでの質量分析計を使用して調整した。ＥＳＩ−で得られた結果は小さなピークと少ないノイズを与え、一方ＥＳＩ＋は、全体的に良好な結果を与え、これをさらなる試験のために選択した。
【００３６】
第２のステップにおいて、超純水およびメタノールとアセトニトリルなどの非極性溶媒を０．１％ギ酸と共に用いる、異なる勾配系を試験した。最初に、超純水とアセトニトリルを使用した第１の勾配を試験した：アセトニトリルの高い出発濃度は短い保持時間を与え、コルチゾール、コルチゾンおよび１７α−ヒドロキシプロゲステロンの分離のみが見られた；アセトニトリル濃度をゆっくりと増加する勾配を実行すると、１７α−ヒドロキシプロゲステロンのピークの損失と、１２分の実行時間がもたらされ、アセトニトリルは移動相として適切でないとされた。続いて超純水とメタノールを使用した勾配を試験した：メタノール濃度の緩やかな増加から極めて迅速な増加の範囲の、異なる勾配を実行した後に、全化合物は完全に分離され、異なる添加剤の種々の濃度を試験した。０．５％酢酸の使用は、ｐＨ３．０での２ｍＭのギ酸アンモニウムまたはｐＨ５．０での酢酸アンモニウムよりも良好な結果を与えたが、０．１％ギ酸よりも劣っていた。続いてギ酸の濃度を最適化し、０．１％ギ酸を選択した；ギ酸の低い濃度は、他の添加剤を用いる方法からのキャリーオーバーのために、不安定な結果をもたらした。最後に、カラム温度および流量を、それぞれ３０℃、０．４ｍｌ・分−１に最適化して、１０分の総実行時間とした。
最後のステップで、ＭＳ／ＭＳ法を最適化した：滞留時間を最適感度のために増加して、全化合物のすべてのイオンのピークに渡る点が少なくとも２０のデータ点からなることを確実にし、ＭＳフレームウィンドウをそれに応じて最適化した。
【００３７】
検証
うろこ（または任意の他の石灰化構造）におけるグルココルチコイドの濃度の値は、公開された文献には載っておらず、そのため我々は、１μｇ・ｋｇ−１〜５０μｇ・ｋｇ−１の初期動作範囲を選択した。
魚のうろこ中のコルチゾールの見かけの回収は、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って８０％〜１１０％の性能基準内である、８８．１４％〜９８．８５％の範囲のＣＣβレベルより下か、このレベルであるか、またはこれより上である。プールされた検証試料の均質化が最適ではなかったという事実にもかかわらず（すなわち、均質な粉末ではなく、非常に細かい断片のプールであった）、魚のうろこ中のコルチゾールについての再現性は、１２．３６％〜１７．１５％の範囲であった。実験室内の再現性は、１４．６３％〜２０．０２％の範囲であった。魚のうろこにおいて分析された化合物の、真度、精度および測定不確かさの結果を表２に示す。
【００３８】
表２：魚のうろこにおける全化合物についての、真度（見かけの回収ＡＲ、パーセント）の値、精度（再現性ＣＶｒおよび実験室内での再現性ＣＶＲ）についての変動値の係数（ＣＶ、パーセント）、および拡張測定不確かさ（Ｕ、パーセント）。
【表２−１】
0006348186.tif 000012
【表２−２】
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１包含係数（ｋ）がそれぞれ２（９５％の信頼区間）および３（９９％の信頼区間）での線形加算を用いた、拡張測定不確かさの算出。
２包含係数（ｋ）が２（９５％の信頼区間）の二次加算（Nordtest法）を用いた、拡張測定不確かさの算出。
３クオリファイヤーイオンについての不十分な応答。
【００３９】
今後の研究において、基質に適合した検量線は実質的に実現不可能であるので、可能な基質の効果の決定を、希釈液中の検量線からのデータを、すべての石灰化構造における全化合物について５μｇ・ｋｇ−１〜５０μｇ・ｋｇ−１の範囲で基質に適合したものと比較することにより、行った。図５では、魚のうろこ中のコルチゾールについて顕著な効果は示されないが（試料の生物学的変動を考慮すると）、しかし希釈液および基質中の検量線は通常は分けられているので、希釈液中の検量線を用いた定量化が可能である。
図５．魚のうろこ中のコルチゾールについての、希釈液中および基質中の検量線
その後、すべての石灰化構造内の全化合物に対する応答の直線性を、希釈液における、５μｇ・ｋｇ−１〜１００μｇ・ｋｇ−１の範囲の、５個の較正点からなる４重の検量線を用いて、実験室間の再現性条件下で分析して試験した。全化合物についてこの範囲の線形性を評価した場合、０．９９より低い決定係数（Ｒ２）の値は見出されなかった。さらに、計算されたモデルは、全化合物について正規分布を示した。魚のうろこにおける全化合物についての直線性、ＣＣα、およびＣＣβの結果を、表３に示す。
【００４０】
表３：魚のうろこにおける全化合物についての、検量線の決定係数（Ｒ２）、決定限界（ＣＣα、μｇ・ｋｇ−１）、および検出能力（ＣＣβ、μｇ・ｋｇ−１）。
【表３】
0006348186.tif 000014
【００４１】
この方法の感度を、ブランクの基質試料の希釈系列を作製することによって決定し、予測動作範囲を考慮した場合の、魚のうろこにおける全化合物についての良好な感度を有する方法が得られた。方法の選択性は、ブランクおよびスパイクされた試料を分析することにより証明された。スパイクされた試料において、全化合物は、予想保持時間でそれらの２つのイオン遷移を有して出現した。イオン比を標準的な注入と比較し、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って許容可能であることが見出された。さらに、干渉ピークは観察されなかった。
この方法の堅牢性を、抽出およびＳＰＥ精製などのすべての重要なステップについての方法の開発中に、最適値を変化させることにより試験した。
魚のうろこにおけるコルチゾール、その前駆体（１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾール）、コルチゾンおよび代謝物（テトラヒドロコルチゾールおよびテトラヒドロコルチゾン）に対するＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、EN ISO/IEC 17025:2005認定の環境で開発され、Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って検証され、その意図する目的に適していることが証明された。さらにこの方法は、棘、柔鰭条および耳石である他の３種類の石灰化構造に対しても試験され検証された。
【００４２】
例２：ストレス有り対ストレス無しのシーバス（Dicentrarchus labrax）のうろこにおけるグルココルチコイドレベルの定量化
方法および材料（例1参照）
実験の設定
３つの条件の２回の反復で試験した：対照（低ストレス、中ストレスおよび高ストレス）。ストレスは、３週間の期間中にランダム適用された様々な種類のストレッサー（混雑、追い回しおよび空気曝露）の組み合わせであった。ストレッサーは、１日のうちいくつかの予測不可能な時点に、示されているように適用した：
・低ストレス：閉じ込め（２５％容積）３０分を１日おき
・中ストレス：閉じ込め（２５％容積）３０分、追い回し５分を１日おき
・高ストレス：閉じ込め（１０％容量）３０分、追い回し５分を１日おき、大気への暴露を週１回１分間
【００４３】
血漿コルチゾールはドュプリケートで、Gorissenら６９に従って９６ウェルプレート中のＲＩＡを使用して測定した。一次抗体は、コルチゾールに１００％の交差反応性を示し、１１−デオキシコルチゾールに０．９％、コルチコステロンに０．６％、および１１−デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、１７−ヒドロキシプロゲステロン、テストステロンおよびエストラジオールに＜０．０１％の交差反応性を示した。「非特異物（non-specifics）」を除くすべてのウェルに、１００μｌのコルチゾール抗体（コルチゾール抗体[xm210]モノクローナルおよびＩｇＧ精製（Abcam）、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、５０ｍＭのＮａＨ２ＣＯ３、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ＝９．６）を加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１００ｍＭトリス、０．９％のＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３）で３回洗浄した。その後、非特異的部位を、各ウェルに１００μｌのブロッキング緩衝液（１００ｍＭトリス、０．９％のＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、０．２５％正常ウシ血清）を添加することによりブロックした。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、１０μｌの標準（１００ｍＭトリス、０．９％のＮａＣｌ、０．１％の８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、０．０２％のＮａＮ３を含有する、４ｐｇ〜２０４８ｐｇのコルチゾール／１０μｌのアッセイ緩衝液）、または１０μｌの非希釈血漿もしくは洗い流し培地（perifusion medium）を、指定されたウェルに添加した。非特異物およびＢ０に、１０μｌのアッセイ緩衝液を加えた。標準および試料を添加した後、９０μｌ（３３３Ｂｑ）の３Ｈ−ヒドロコルチゾン（PerkinElmer, USA、アッセイ緩衝液中１：１０，０００）溶液を、すべてのウェルに添加した。プレートを室温で４時間インキュベートし、または４℃で一晩保存した。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄ステップの後、すべてのウェルに２００μｌの「Optiphase hisafe-3シンチレーション液」（PerkinElmer, USA）を添加し、これを覆った。ベータ放射を、Microbeta Plus（Wallac/PerkinElmer, USA）を使用してウェルあたり３分の計数によって定量した。アッセイ間およびアッセイ内の変動は、それぞれ１２．５％および３．５％であった。
【００４４】
結果
【表４】
0006348186.tif 000015
【００４５】
【表５】
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【００４６】
例３：コイ（Cyprinus carpio L.）のうろこにおけるグルココルチコイドレベルの定量化
方法および材料（例１など参照）
実験の設定
各６匹の魚の、４つの条件の３回の反復でコイについて試験した：対照（ストレスなし）、デキサメタゾン（ストレス経路の阻害）、コルチゾール（ストレス経路の活性化）、および６週間ランダム適用の様式で与えられた種々のストレッサーに起因するストレス。
【００４７】
方法
実験手順はオランダの法律に従い、地元の倫理委員会によって承認された。コイ（Cyprinus carpio L.）は、Radboud University of Nijmegenで飼育し、既往歴を確実にした。成長した成魚（２１日目：３４０±９２ｇおよび２４．６±２．４ｃｍ；４２日目：３７７±１０８ｇおよび２５．４±２．５ｃｍ）を、１２：１２時間の明：暗の下で保持し、１日に２食（９：３０ａｍおよび１５：３０ｐｍ）、体重の０．９％を与えて、２０．０±０．４℃で６週間維持した。４つの群を、１群当たり２つのタンクの反復で、各１４０Ｌのタンク当たり６匹の魚に設定した。ＣＴＲ群の魚は、妨害なしで維持した。ＤＥＸ群およびＣＯＲＴ群には、５００ｍｇ・ｋｇ−１でスパイクした餌を与えた。ＳＴＲＥＳＳ群には、１日１回ストレスを与えた；ストレッサーの種類、持続時間およびタイミングはランダムに適用され、以下を含む：網による捕獲（１５〜６０分）、空気暴露（１〜３分）、温度低下（５℃まで）、追い回し（１０分まで）、および閉じ込め（低水位のバケツで）。全実験の間に、健康および挙動の劣化の兆候は認められなかった。４２日後、魚を２−フェノキシ−エタノール（０．１％ｖ／ｖ）で麻酔して屠殺し、尾部血管から血液およびうろこ（個体発生および２１日間再生うろこ）を収集した。血漿は、コルチゾール６９、グルコース７０、乳酸塩７０、全カルシウム７１、および重量オスモル濃度７０について分析した。うろこは側線の背側の標準化された列からサンプリングした。標的遺伝子のＭＮＥを、ｅｅｆ１ａ１ ｒｐｓ５およびβ-アクチンを参照遺伝子として用いて評価した７２。すべてのパラメータは、SAS 9.4（SAS Institute Inc., Cary, NC）の線形混合モデルを用いて、処置、サンプリングの日およびそれらの相互作用（適切な場合）を固定効果としてモデル化した。タンクについてのランダム切片をモデルに導入して、タンク内の魚のクラスタリングを補正した。ダネット検定を実施して、処置と対照を比較した。
【００４８】
結果
１）論理的根拠の制御および実験設定の実行
６週間の試験期間中、妨害なしのコイ（ＣＴＲ）と毎日ストレスを与えたコイ（ＳＴＲＥＳＳ）を比較した。デキサメタゾン（ＤＥＸ）またはコルチゾール（ＣＯＲＴ）を与えた魚は、うろこにおけるコルチゾール取り込みについての、それぞれ陰性および陽性対照とした。すべての処置において、提供された餌は５分以内に消費され、条件因子７３によって示されるようにすべての魚は臨床的に健康なままであり、死亡は観察されなかった。適切な水質は、毎日（ｐＨ、温度、溶存酸素）または毎週（亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウム）のモニタリングにより維持した。餌からの漏れによる、水に媒介されたグルココルチコイドの観察された効果に対する寄与は、排除可能である。コルチゾール、その前駆体および代謝物の、社内開発され検証された（うろこコルチゾールを参照）超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析は、水中でのコルチゾール濃度の上昇が、給餌後２．５時間以内にベースラインに戻ったことを明らかにした。
【００４９】
一般的にストレスの指標として使用される５つの血液パラメータについての結果は、ＤＥＸの魚が陰性対照として、およびＣＯＲＴの魚が陽性対照として考えられることを確認する（図６）。血漿コルチゾールは、ＣＯＲＴ群で上昇しており（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）、コルチゾールの餌から血中への吸収を確認した；ＳＴＲＥＳＳの魚において、コルチゾールレベルは陰性対照と差がなく、後者が慢性ストレスの評価に不適当であることを示した。二次ストレスパラメータである血漿グルコースは、予想されるグルココルチコイドの作用（糖新生）を反映するが、これはＤＥＸで増加し（ＤＥＸ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）、一方ＣＯＲＴ（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．２００４）およびＳＴＲＥＳＳ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０５３１）では有意な差はなく、これはＤＥＸのより強力な作用と整合した。血漿乳酸塩は、ＤＥＸ（ＤＥＸ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）およびＣＯＲＴ（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０００４）で増加したが、しかしＳＴＲＥＳＳ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．４２２４）では有意ではなく、ＤＥＸとＣＯＲＴの下流の効果と整合した。血漿総カルシウムおよび重量オスモル濃度は影響を受けず、処置が魚の回復力を超えず、ストレスを引き起こさなかったことを示した。我々は以下の結論を得た：（ｉ）ＣＴＲ、ＤＥＸおよびＣＯＲＴの処置が、意図したグルココルチコイド作用を誘発した；（ｉｉ）ＳＴＲＥＳＳの魚の血漿中において、ＨＰＩ軸の活性化の兆候は認められなかった；（ｉｉｉ）血漿パラメータは、所与の時点でのストレス応答のスナップショット以上のものを反映しないため、慢性ストレスの優れた予測因子ではない。
【００５０】
上記から、慢性的にストレスを受けた魚における血漿コルチゾール値は、経験したストレスについての適切な読み出しを提供しないことになる。しかし、図７は、内分泌ストレス軸が最も確かに活性化されることを示している。視床下部、下垂体前葉、および腎間の主要な遺伝子：ｃｒｆ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ： Ｐ＝０．０００２）、ｐｏｍｃ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）、およびｓｔａｒ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０１４０）の発現は、実際有意に上方制御されている。負のグルココルチコイドフィードバックが、有意に減少したｐｏｍｃ発現（ＤＥＸ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０２３６）によって示されている。
血漿コルチゾールのレベルでは見えない、慢性ストレスの第２の証拠は、えらのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ７４のサブユニットα１をコードする遺伝子の上方制御である（図８）。ＤＥＸ（ＤＥＸ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０００１）、ＣＯＲＴ（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）およびＳＴＲＥＳＳ（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０２１５）の魚において、有意に増大された発現レベルが観察され、コルチコイドの作用を示す。
要約すると、結果は、ＳＴＲＥＳＳ群の魚が慢性的にストレスを受けたことを示す。我々は次に、板状鱗におけるコルチゾールの定量化に着手した。
【００５１】
２）慢性ストレスのバイオマーカーとしての、魚の個体発生うろこにおけるコルチゾール
５枚（２１日目）から６枚（４２日目）のうろこを、検証されたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法（Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って）によりNBN EN ISO/IEC 17025規制環境下で、コルチゾールについて分析した。ＣＴＲおよびＤＥＸのすべての魚は、検出能力（ＣＣβ）未満のうろこのコルチゾール値を示した；２１日目に、１２匹のＣＯＲＴの魚のうち１０匹はＣＣβを超える値を示し、４２日目ではすべてがＣＣβを超えていた；２１日目に、１１匹のＳＴＲＥＳＳの魚のうち７匹はＣＣβを超える値を示し、４２日目ではすべてがＣＣβを超えていた（図９）。処置を比較すると、２１日目にＣＯＲＴの魚に有意な蓄積が見出された（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）；４２日目にＳＴＲＥＳＳの魚に有意な蓄積が見出された（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０００１）。２１〜４２日の処置内で比較すると、うろこのコルチゾールの有意な増加が、ＳＴＲＥＳＳ（Ｐ＝０．００３１）およびＣＯＲＴ（Ｐ＝０．００２６）の魚で見出された。これらの所見は、時間経過によるうろこ中のコルチゾールの、予測された取り込みおよび蓄積と整合するものであり、うろこのコルチゾール含有量を、慢性ストレスのバイオマーカーとして確認した。ＤＥＸによる、内因性コルチゾールの生産をブロックする予測された効果と整合して、我々は、ＤＥＸ処置の魚のうろこにコルチゾールの取り込みは認めなかった。一方、魚にコルチゾールを供給して物理的にストレスを与えると、うろこのコルチゾールレベルが増大された。
要約すると、個体発生うろこ中のコルチゾールの結果により、うろこ中のコルチゾールは、魚が時間と共に経験するストレスレベルを反映することを確認した。我々は、慢性ストレスの定量化のための追加のツールとしての、再生うろこ中のコルチゾールの定量化と、最も豊富な基質タンパク質コラーゲン１αの遺伝子発現レベルとのその相関について着手した。
【００５２】
ｃ）個体発生うろこの次に、コルチゾールは再生うろこにも蓄積する
コルチゾール濃度を、個体発生うろこの除去後２１日に、魚当たり５枚の再生うろこにおいて決定した（図１０）。ｃｏｌ１ａ１のＭＮＥは、個体発生うろこで阻害されることが見出され、高い血漿コルチゾールレベルと相関し、これは、よく知られている骨形成に対するグルココルチコイドの阻害効果と整合する。再生うろこにおいて、骨片母細胞（うろこを形成する骨芽細胞様の細胞７５は、すべての処置における同様のｃｏｌ１ａ１発現により示されるように、グルココルチコイドフィードバックに対し感度が低いように見える。形態学的には、ＣＴＲ、ＳＴＲＥＳＳ、およびＣＯＲＴの再生うろこは類似していることが判明し、一方、ＤＥＸの魚のうろこの面積、周囲長、および隆起部の数は、顕著に低い値を示し、障害され遅延された再生を示す。ＣＯＲＴの魚における、４２日目の個体発生および再生うろこのサンプリングの時点における、高いコルチゾール血漿レベルは、うろこの高いコルチゾール含有量と相関し、これは、遊離コルチゾールがうろこに取り込まれていることを確認する。さらに、ＳＴＲＥＳＳの魚中の再生うろこのコルチゾール含有量は、有意ではないが、ＣＴＲよりも高くしかしＣＯＲＴよりも低いようであり、基質中でコルチゾールの最大の封鎖（sequestering）に達していなかったことを示す。これにより、分析された基質の非常に低い量（平均してうろこ４ｍｇ）に注意すべきである。ＣＯＲＴの魚のうろこにおいて、コルチゾールの有意な増加が観察された（ＣＯＲＴ対ＣＴＲ：Ｐ＜０．０００１）。この所見は、コルチゾールのうろこ中への時間経過による取り込みおよび蓄積、および高い血漿コルチゾールレベルと整合し、個体発生うろこについての我々の所見を再確認する。再生うろこについての結果は、このように個体発生うろこの結果を、したがってうろこ中のコルチゾールが、時間内に魚が経験するストレスレベルを反映しているという事実を裏付ける。
【００５３】
例４：テラピア（Oreochromis mossambicus）のうろこにおけるグルココルチコイドレベルの定量化
方法および材料（例１など参照）
実験の設定
各６匹の魚の、４つの条件の２回の反復でテラピアについて試験した：対照（ストレスなし）、デキサメタゾン（ストレス経路の阻害）、コルチゾール（ストレス経路の活性化）、および６週間ランダム適用の様式で与えられた種々のストレッサーに起因するストレス。
【００５４】
方法
実験手順はオランダの法律に従い、Animal Ethics Committee of the Radboud University（許可番号：RU-DEC2013-192）により承認された。テラピア（Oreochromis mossambicus）は、Radboud University of Nijmegenで飼育し、既往歴を確実にした。成長した成魚（２１日目：３２１±３７ｇおよび２６．０±０．９ｃｍ；４２日目：３２８±３８ｇおよび２６．５±０．９ｃｍ）を、１２：１２時間の明：暗の下で保持し、１日に２食（９：３０ａｍおよび１５：３０ｐｍ）、体重の０．９％を与えて、２０．０±０．４℃で６週間維持した。２つの群を、１群当たり２つのタンクで反復し、各１４０Ｌのタンク当たり６匹の魚で設定した。ＣＴＲ群の魚は、妨害なしで維持した。ＳＴＲＥＳＳ群には、１日１回ストレスを与えた；ストレッサーの種類、持続時間およびタイミングはランダムに適用され、以下を含む：網による捕獲（１５〜６０分）、空気暴露（１〜３分）、温度低下（５℃まで）、追い回し（１０分まで）、および閉じ込め（低水位のバケツで）。全実験の間に、健康および挙動の劣化の兆候は認められなかった。４２日後、魚を２−フェノキシ−エタノール（０．１％ｖ／ｖ）で麻酔して屠殺し、尾部血管から血液およびうろこ（個体発生および２１日間再生うろこ）を収集した。血漿は、コルチゾール、グルコース７０、全カルシウム７１、および重量オスモル濃度７０について分析した。うろこは側線の背側の標準化された列からサンプリングし、超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。
【００５５】
結果
１）論理的根拠の制御および実験設定の実行
６週間の試験期間中、妨害なしのテラピア（ＣＴＲ）と毎日ストレスを与えたテラピア（ＳＴＲＥＳＳ）を比較した。すべての処置において、提供された餌は５分以内に消費され、条件因子７３によって示されるようにすべての魚は臨床的に健康なままであり、死亡は観察されなかった。適切な水質は、毎日（ｐＨ、温度、溶存酸素）または毎週（亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニウム）のモニタリングにより維持した。餌からの漏れによる、水に媒介されたグルココルチコイドの観察された効果に対する寄与は、排除可能である。コルチゾール、その前駆体および代謝物の、社内開発され検証されたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析は、水中でのコルチゾール濃度の上昇が、給餌後２．５時間以内にベースラインに戻ったことを明らかにした。
一般的にストレスの指標として使用される、５つの血液パラメータを分析した（図１１）。血漿コルチゾールは、ＳＴＲＥＳＳ群で上昇しており（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．００１４）、後者が急性ストレスの評価に適当であることを示す。二次ストレスパラメータである血漿グルコースは、予想されるグルココルチコイドの作用（糖新生）を反映するが、これはＳＴＲＥＳＳで増加し（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０００６）、有意に異なった。血漿総カルシウムおよび重量オスモル濃度は影響を受けず、処置が魚の回復力を超えず、ストレスを引き起こさなかったことを示した。我々は以下の結論を得た：（ｉ）ＳＴＲＥＳＳでの処置は、意図されたグルココルチコイド作用を誘発した、なぜならばＳＴＲＥＳＳの魚の血漿において、ＨＰＩ軸の活性化の兆候が観察されたからである；および（ｉｉ）血漿パラメータは、所与の時点でのストレス応答のスナップショット以上のものを反映しないために、慢性ストレスの優れた予言者ではない。
【００５６】
慢性ストレスのバイオマーカーとしての、魚の個体発生うろこにおけるコルチゾール
５枚（２１日目）から６枚（４２日目）のうろこを、検証されたＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法（Commission Decision No. 2002/657/ECの要件に従って）によりNBN EN ISO/IEC 17025規制環境下で、コルチゾールについて分析した。
２１日目に、全２１匹のＣＴＲおよびＳＴＲＥＳＳの魚は、決定限界（ＣＣα）未満のうろこのコルチゾール値を示し、一方４２日目では、ＳＴＲＥＳＳの魚のレベルはほとんどがＣＣαを超えていた（図１２）。
処置を比較すると、２１日目に、有意に近い蓄積がＳＴＲＥＳＳの魚で見出された（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０５９０）；４２日目に、有意に近い蓄積がＳＴＲＥＳＳの魚で見出された（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０５１５）。２１〜４２日の処置内で比較すると、うろこのコルチゾールの有意な増加は、ＣＴＲでは見出されず（Ｐ＝０．３９６２）、一方、うろこのコルチゾールの有意な増加が、ＳＴＲＥＳＳの魚で見出された（Ｐ＝０．００２０）。これらの所見は、うろこ中のコルチゾールの、時間経過による予測された取り込みおよび蓄積と整合するものであり、うろこのコルチゾール含有量を、慢性ストレスのバイオマーカーとしてさらに確認する。対照群での予測された効果と整合して、我々は、ＣＴＲの魚のうろこにおけるコルチゾールの有意な取り込みは認めなかった（ＣＴＲ２１対ＣＴＲ４２：Ｐ＝０．０７７０）。一方、物理的に魚にストレスを与えると、うろこのコルチゾールレベルが増大した（ＳＴＲＥＳＳ２１対ＳＴＲＥＳＳ４２：Ｐ＜０．０００１）。
要約すると、個体発生うろこ中のコルチゾールの結果により、うろこ中のコルチゾールが、魚が時間と共に経験するストレスレベルを反映するという、コイにおける最初の所見が確認された。我々は、慢性ストレスの定量化のための追加のツールとしての、再生うろこ中のコルチゾールの定量化について着手した。
【００５７】
個体発生うろこの次に、コルチゾールは再生うろこにも蓄積する
コルチゾール濃度を、個体発生うろこの除去後２１日に、魚当たり５枚の再生うろこにおいて決定した（図１３）。
ＳＴＲＥＳＳの魚の再生うろこにおいて、コルチゾールの有意な増加が観察された（ＳＴＲＥＳＳ対ＣＴＲ：Ｐ＝０．０１０５）。４２日目の再生うろこおよび個体発生うろこのサンプリング時点での、ＳＴＲＥＳＳの魚における高いコルチゾール血漿レベルは、うろこの高いコルチゾール含有量と相関し、これは、遊離コルチゾールがうろこに取り込まれるという我々の仮説を確認した。この所見は、利用可能なより高い血漿コルチゾールレベルに伴う、時間経過によるうろこ中のコルチゾールの予測された取り込みおよび蓄積と整合し、これにより、個体発生うろこでの我々の所見を再確認する。再生うろこについての結果は、個体発生うろこの結果およびコイについての我々の前の所見を裏付けし、したがって、うろこ中のコルチゾールが時間内に魚が経験するストレスレベルを反映することを確認する。
【００５８】
血漿中ならびに糞、粘液および水などの代替基質中のコルチゾールのアッセイは、慢性ストレスの評価には適さない。我々は、うろこのコルチゾール含有量が、魚における慢性ストレスの定量化のために非常に適していることを示し、この見解は、うろこのコルチゾールを、魚に関連する科学や産業（例えば生理学、毒物学、免疫学、行動研究等）における、高い潜在的な影響を有する革新的で最先端のバイオマーカーとする。コイおよびテラピアについて示された所見は、板状鱗を有するすべての魚（例えば、コイ）に適用可能である。広義では、盾鱗（例えば、サメ）および硬鱗（例えばチョウザメ）も適しており、このバイオマーカーの使用を条鰭網（actinopterygian）、さらには軟骨魚網（chondrichtyan）の種へと拡大する。最後に、慢性ストレスのモニタリングのためのこの新しいツールは、広い範囲の政治的、学問的、および産業的設定、例えば動物にやさしい水産養殖の意思決定（例えば、再循環水産養殖システムの動物ベースの最適化や製品品質の改善）、野生の魚のストックのモニタリング（例えば、生態に基づく個体群動態）、公共水槽内および動物試験における魚の福祉などにおいて採用される、大きな物価安定の可能性（huge valorization potential）を有する。魚のうろこ中のコルチゾールについてのオンサイト分析のための、財政的でロジスティックな、広く適用でき実施可能なアッセイの開発が、必要とされている。
【００５９】
例５：サケのうろこにおけるグルココルチコイドレベルの定量化
方法および材料（例１参照）
実験の設定
キングサーモンの１２の試料（ストレス前およびストレス（１時間の閉じ込め））を、サケにおける慢性ストレスに関する米国との延長協力の枠組みの中で、うろこのグルココルチコイドについてブラインドで分析した。
【００６０】
結果
【表６】
0006348186.tif 000017
【００６１】
例６：タイおよびシーバスのうろこにおけるグルココルチコイドレベルの定量化
方法および材料（例１参照）
実験の設定
魚に対するコンディショニングの影響（１日目対３日目）を、シーバス（Dicentrarchus labrax）およびタイ（Pagrus pagrus）を用いて試験した。
結果
シーバス
【表７】
0006348186.tif 000018
【００６２】
タイ
【表８】
0006348186.tif 000019
【００６３】
参考文献
Ａ．背景技術の参考文献
【表９−１】
0006348186.tif 000020
【００６４】
【表９−２】
0006348186.tif 000021
【００６５】
【表９−３】
0006348186.tif 000022
【００６６】
【表９−４】
0006348186.tif 000023
【００６７】
Ｂ．発明の概要の参考文献
【表９−５】
0006348186.tif 000024
【００６８】
【表９−６】
0006348186.tif 000025
【００６９】
【表９−７】
0006348186.tif 000026
【図１】
0006348186.tif 000027
【図２】
0006348186.tif 000028
【図３】
0006348186.tif 000029
【図４】
0006348186.tif 000030
【図５】
0006348186.tif 000031
【図６ａｂ】
0006348186.tif 000032
【図６ｃｄ】
0006348186.tif 000033
【図６ｅ】
0006348186.tif 000034
【図７】
0006348186.tif 000035
【図８】
0006348186.tif 000036
【図９】
0006348186.tif 000037
【図１０】
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【図１１】
0006348186.tif 000039
【図１２】
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【図１３】
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