(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルで
ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、
上記段階で決定されたＲＮＡ転写体の発現度に基づいて上記生物学的サンプルの危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、上記ＲＳ（％）によって予後を予測する段階とを含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法。
【請求項２】
ＲＳ及びＲＳ（％）は、下記数式１及び２によって計算する、請求項１に記載の方法：
［数式１］
ＲＳ＝ＨＲ１＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ１＋ＨＲ２＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ２＋．．．＋ＨＲｎ＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎ
［数式２］
ＲＳ（％）＝１００×（生物学的サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
上記式中、
ＨＲｎは、ｎ番目ＲＮＡ転写体の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を示し、上記ＨＲｎが１未満の場合、−１／ＨＲｎに変換して使用し、
ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎは、ｎ番目ＲＮＡ転写体の発現と関連した値であり、この値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心にスケールを変化させた値であり、
上記母集団は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌を有する一定数の集団を意味し、一定数は、ＲＳ最高値と最小値を算出することができる程度の任意の整数である。
【請求項３】
上記方法がＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記方法は、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から生物学的サンプルのＲＳ（％）が５０％以上を有する場合、高危険群、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群、２５％未満の場合、低危険群と予測するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルで
ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現水準を測定する段階と、
上記転写体の発現増加は、肯定的な臨床結果可能性の増加と予測する段階を含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法。
【請求項６】
上記方法がアレイ基盤方法である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記臨床結果が全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から表現されるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記方法がＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するものである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
胃癌の予後予測を実行するプログラムを記録したコンピュータで読み取り可能な記録媒体において、患者から得た核酸試料で
ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、
上記段階で決定されたＲＮＡの発現度に基づいて上記試料の危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から上記ＲＳ（％）の設定値の範囲が５０％以上を有する場合、高危険群患者、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群患者、２５％未満の場合、低危険群患者に分類する段階とをコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【請求項１０】
上記ＲＳ及びＲＳ（％）は、下記数式１及び２によって計算するものである、請求項９に記載の記録媒体：
［数式１］
ＲＳ＝ＨＲ１＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ１＋ＨＲ２＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ２＋．．．＋ＨＲｎ＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎ
［数式２］
ＲＳ（％）＝１００×（生物学的サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
上記式中、
ＨＲｎは、ｎ番目ＲＮＡ転写体の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を示し、上記ＨＲｎが１未満の場合、−１／ＨＲｎに変換して使用し、
ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎは、ＲＮＡ転写体の発現と関連した値であり、この値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心にスケールを変化させた値であり、
上記母集団は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌を有する一定数の集団を意味し、一定数は、ＲＳ最高値と最小値を算出することができる程度の任意の整数である。
【請求項１１】
上記記録媒体は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するものである、請求項９に記載の記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現比較分析法を通じて局所進行性胃癌の予後予測が可能な新規な予後予測システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
胃腺腫（Ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、２０００年に７００、３４９名の死亡において二番目の原因であって、世界で最も一般的に診断された四番目の癌である。いくつかの力学的及び組織病理学的特徴を有する単一異質的疾患として見なしている。胃癌治療は、主に患者を手術だけで、または手術と化学療法で治療すべきかを決定するＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ、ｎｏｄｅ、ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）病期決定のような臨床的パラメータに基づく。胃癌は、乳房癌と大腸癌などとは異なって、ＴＮＭ病期システムによって１期から４期まで明確に差異がある。すなわち、１期の場合には、５年生存率が９０％以上であり、４期の場合には、２０％以下であって、大きい差異を示す。したがって、ＴＮＭ病期システムの予後予測力に非常に優れていることが分かる［参考文献、７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＪＣＣ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ：ｓｔｏｍａｃｈ．Ａｎｎ  ＳｕｒｇＯｎｃｏｌ  ２０１０；１７：３０７７−３０７９］。上記病期システムによって、胃癌は、通常、早期胃癌（Ｅａｒｌｙ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）、局所進行性（ＬｏｃａｌｌｙＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）、局所浸潤性（Ｌｏｃａｌｌｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）及び転移胃癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）などに分けることができる。
【０００３】
たとえ手術が実施可能な胃癌の主要治療ではあるが、進行性の場合、再発率が高い。再発を予防し、胃癌患者の予後を改善するために、化学療法と化学−放射線療法を含む集学的治療が導入された。しかし、これら治療方法が患者にとって一般的な臨床結果を改善することがあるが、腫瘍の臨床病理学的異質性と、同じ病期にある患者の異なる結果は、アジュバント化学療法の任務を予測するのに限界があり、個別患者に対する最適接近が不足な状態である。
【０００４】
腫瘍浸潤及びリンパ節転移の深さは、胃癌で２個の主要予後因子である。胃癌患者の５０％以上が診断時にリンパ節転移を伴っており、３０％未満が５年生存率を有する悪い予後を示す。したがって、胃癌患者からリンパ節転移の正確な分類は、根治胃切除術後の後続治療の決定に根本的に重要である。しかし、リンパ節状態だけでは、手術後の予後結果の異質性及び化学療法薬剤の任務を説明しない。しかも、同じリンパ節病期を含む同じ病期を有する患者も、同じ予後結果を示さない。したがって、固有の臨床的異質性に原因がある腫瘍間の明確な生物学的差異が、胃癌の新しい治療戦略開発のための最も重要な段階である。
【０００５】
胃癌患者の予後結果に影響を与える生物学的特徴に対する理解は、胃癌が力学及び組織病理学で差異を有する異質的疾患であるから非常に難しい。胃癌の予後結果は、たとえ拡散タイプ及び腸内タイプのように胃癌亜流型を含んで多くの他の予後因子があるが、主に病期によって影響を受ける。しかし、同じ病期であるとしても、異質的な予後結果を有し、これら異質性の大部分が完全に説明されない。同じ病期内で予後結果の差異に原因がある遺伝的特徴の同定は、患者の治療方案を選択するのに非常に重要である。しかし、既に開発された遺伝的特徴の大部分は、再現可能性の不足と治療方案の選択に利用されることができる情報の不足に起因して臨床で利用されなかった。これら予後の導入を苦しめる他の重要な因子は、これら予後のうちいずれも胃癌患者の予後結果を定義するにあたって、病期を統制できるものがないということである。したがって、同じ病期の患者において予後予測因子の導入が必然的に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＪＣＣ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ：ｓｔｏｍａｃｈ．Ａｎｎ  ＳｕｒｇＯｎｃｏｌ  ２０１０；１７：３０７７−３０７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、局所進行性胃癌、特にＮ０病期（Ｎ０  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）で胃癌患者の臨床結果に影響を与える重要な生物学的特徴を糾明し、遺伝子発現危険度点数（Ｒiｓｋ Ｓｃｏｒｅ、ＲＳ）に基づく新しい予後予測システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルでＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、上記段階で決定されたＲＮＡ転写体の発現度に基づいて上記生物学的サンプルの危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、上記ＲＳ（％）によって予後を判断する段階とを含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、また、対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルでＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現水準を測定する段階と、上記転写体の発現増加は、肯定的な臨床結果可能性の増加と判断する段階とを含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法を提供する。
【００１０】
上記予後予測方法は、ＴＮＭ病期分類でＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するものであることができる。
【００１１】
本発明は、また、胃癌の予後予測を実行するプログラムを記録したコンピュータで読み取り可能な記録媒体において、患者から得た核酸試料でＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、上記段階で決定されたＲＮＡの発現度に基づいて上記試料の危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から上記ＲＳ（％）の設定値の範囲が５０％以上を有する場合、高危険群患者、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群患者、２５％未満の場合、低危険群患者に分類する段階とをコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータで読み取り可能な記録媒体を提供する。
【００１２】
上記記録媒体は、ＴＮＭ病期分類でＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するものであることができる。
【００１３】
上記ＲＳ及びＲＳ（％）は、下記数式１及び２によって計算することができる：
【００１４】
［数式１］
ＲＳ＝ＨＲ１＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ１＋ＨＲ２＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ２＋．．．＋ＨＲｎ＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎ
【００１５】
［数式２］
ＲＳ（％）＝１００×（生物学的サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
【００１６】
上記式中、ＨＲｎは、ｎ番目のＲＮＡ転写体の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を示し、上記ＨＲｎが１未満の場合、−１／ＨＲｎに変換して使用し、
ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎは、ＲＮＡ転写体の発現と関連した値であり、この値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心としてスケールを変化させた値であり、
上記母集団は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌を有する一定数の集団を意味し、一定数は、ＲＳ最高値と最小値を算出することができる程度の任意の整数である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ＴＮＭ病期のうちＮ０期の胃癌患者群に対する全体生存率の観点から予測モデルを作った後、統計的に有意な生存に影響を及ぼすＲＮＡ転写体の発現度を決定し、これから危険ど評点システムを作って予後指標値を算出する方式で胃癌手術による切除後の臨床結果を予測することができる。
【００１８】
また、本発明は、遺伝子の生物学的機能による遺伝子集合システムを利用することによって、胃癌自体の生物学的機能による遺伝子群の分析が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】図１ａ〜図１ｄは、分散濾過後にプローブを使用したｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって作った２個の主要クラスタの予後結果を示す図であって、Ａ）は、分散濾過後、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓに使用されたプローブの数とクラスタリング分析で生じた２個の主要クラスを使用したｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ分析での予後ｐ値である。各クラスタは、フィルタリング基準に基づいて命名した。Ｍ以後、一番目の数字は、各プローブの平均値に対するフォルド（ｆｏｌｄ）の差を表示したものであり、二番目の数字は、一番目の数字で表示されたフォルド差と比べて高いかまたは低い発現を示すプローブの数を表示したものである。例えば、Ｍ２＿３は、平均値に対して２倍以上の高いかまたは低い発現を示す少なくとも３個のサンプルを有するプローブを選択して、分散濾過後にそのプローブを使用して生じたクラスタである。Ｂ）は、分散濾過後に２個の主要クラスタの患者サンプルの分布である。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔで良い予後群と悪い予後群に対して注釈をつけた後、２個の主要クラスのサンプルのクラスタリング分析である。Ｃ）は、Ｍ２＿５クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たものである。Ｄ）は、Ｍ３＿３クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たのである。
【図１ｂ】図１ａ〜図１ｄは、分散濾過後にプローブを使用したｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって作った２個の主要クラスタの予後結果を示す図であって、Ａ）は、分散濾過後、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓに使用されたプローブの数とクラスタリング分析で生じた２個の主要クラスを使用したｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ分析での予後ｐ値である。各クラスタは、フィルタリング基準に基づいて命名した。Ｍ以後、一番目の数字は、各プローブの平均値に対するフォルド（ｆｏｌｄ）の差を表示したものであり、二番目の数字は、一番目の数字で表示されたフォルド差と比べて高いかまたは低い発現を示すプローブの数を表示したものである。例えば、Ｍ２＿３は、平均値に対して２倍以上の高いかまたは低い発現を示す少なくとも３個のサンプルを有するプローブを選択して、分散濾過後にそのプローブを使用して生じたクラスタである。Ｂ）は、分散濾過後に２個の主要クラスタの患者サンプルの分布である。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔで良い予後群と悪い予後群に対して注釈をつけた後、２個の主要クラスのサンプルのクラスタリング分析である。Ｃ）は、Ｍ２＿５クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たものである。Ｄ）は、Ｍ３＿３クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たのである。
【図１ｃ】図１ａ〜図１ｄは、分散濾過後にプローブを使用したｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって作った２個の主要クラスタの予後結果を示す図であって、Ａ）は、分散濾過後、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓに使用されたプローブの数とクラスタリング分析で生じた２個の主要クラスを使用したｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ分析での予後ｐ値である。各クラスタは、フィルタリング基準に基づいて命名した。Ｍ以後、一番目の数字は、各プローブの平均値に対するフォルド（ｆｏｌｄ）の差を表示したものであり、二番目の数字は、一番目の数字で表示されたフォルド差と比べて高いかまたは低い発現を示すプローブの数を表示したものである。例えば、Ｍ２＿３は、平均値に対して２倍以上の高いかまたは低い発現を示す少なくとも３個のサンプルを有するプローブを選択して、分散濾過後にそのプローブを使用して生じたクラスタである。Ｂ）は、分散濾過後に２個の主要クラスタの患者サンプルの分布である。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔで良い予後群と悪い予後群に対して注釈をつけた後、２個の主要クラスのサンプルのクラスタリング分析である。Ｃ）は、Ｍ２＿５クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たものである。Ｄ）は、Ｍ３＿３クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たのである。
【図１ｄ】図１ａ〜図１ｄは、分散濾過後にプローブを使用したｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって作った２個の主要クラスタの予後結果を示す図であって、Ａ）は、分散濾過後、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓに使用されたプローブの数とクラスタリング分析で生じた２個の主要クラスを使用したｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ分析での予後ｐ値である。各クラスタは、フィルタリング基準に基づいて命名した。Ｍ以後、一番目の数字は、各プローブの平均値に対するフォルド（ｆｏｌｄ）の差を表示したものであり、二番目の数字は、一番目の数字で表示されたフォルド差と比べて高いかまたは低い発現を示すプローブの数を表示したものである。例えば、Ｍ２＿３は、平均値に対して２倍以上の高いかまたは低い発現を示す少なくとも３個のサンプルを有するプローブを選択して、分散濾過後にそのプローブを使用して生じたクラスタである。Ｂ）は、分散濾過後に２個の主要クラスタの患者サンプルの分布である。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔで良い予後群と悪い予後群に対して注釈をつけた後、２個の主要クラスのサンプルのクラスタリング分析である。Ｃ）は、Ｍ２＿５クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たものである。Ｄ）は、Ｍ３＿３クラスタ患者のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。ｐ値は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ後に得たのである。
【図２】図２は、分散濾過後、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって作った２個の主要代表クラスタを示す図である。Ｍ２＿５に対するクラスタリング分析は、平均値に対して２倍以上の増加または減少を示す少なくとも５個のサンプルを有するプローブをフィルタリングした後、濾過された１５５６個のプローブで作ったものである。Ｍ３＿３に対するクラスタリング分析は、平均値に対して３倍以上の増加または減少を示す少なくとも３個のサンプルを有するプローブをフィルタリングした後、濾過された７０６個のプローブで作ったものである。
【図３】図３は、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ後、２個の主要クラスの比較時に有意的な差異を示す遺伝子及び生物学的特徴を示す図であって、Ａ）は、Ｍ２＿５のクラスタリング分析によって作った２個の主要クラスの比較で統計的有意（ｐ＜０．００１及び２倍差、５５４個のプローブ）を示すプローブを使用した条件付きクラスタリングのヒットマップを示すものである。Ｂ）は、Ｍ３＿３のクラスタリング分析によって作った２個の主要クラスの比較で統計的有意（ｐ＜０．００１及び２倍差、４５３個のプローブ）を示すプローブを使用した条件付きクラスタリングのヒットマップを示すものである。
【図４ａ】図４ａ及び図４ｂは、Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでＭ２＿５の２個の主要分類群のＧＳＥＡ結果 （Ａ）であり、Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでＭ３＿３の２個の主要分類群のＧＳＥＡ結果（Ｂ）である。
【図４ｂ】図４ａ及び図４ｂは、Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでＭ２＿５の２個の主要分類群のＧＳＥＡ結果 （Ａ）であり、Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでＭ３＿３の２個の主要分類群のＧＳＥＡ結果（Ｂ）である。
【図５ａ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図５ｂ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図５ｃ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図５ｄ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図５ｅ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図５ｆ】図５ａ〜図５ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ２＿５の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ａ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ｂ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ｃ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ｄ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ｅ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図６ｆ】図６ａ〜図６ｆは、ＧＳＥＡ結果で（ｐ＜０．００１）有意的な増加を示す遺伝子の発現を示す図である。ヒットマップは、Ｍ３＿３の各分類群の平均発現水準を示す。
【図７ａ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｂ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｃ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｄ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｅ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｆ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｇ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｈ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図７ｉ】図７ａ〜図７ｉは、Ｍ３＿３の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示す図である。プローブは、Ｍ３＿３クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）。この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図７ａ〜図７ｉ に記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。Ｄ−Ｆ）は、検証データ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ａ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｂ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｃ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｄ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｅ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｆ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｇ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｈ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図８ｉ】図８ａ〜図８ｉは、Ｍ２＿５の分類群によるＮＯ胃癌患者の予後予測を示すのである。プローブはＭ２＿５クラスタによって定義された２個のクラスの比較で有意的に異なる（ｐ＜０．００１）．この分析のために３個の異なる予測アルゴリズム（ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣ）を使用した。各模型の予測エラーを推定するために単一残留交差検証を使用した。予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。 図８ａ〜図８ｉに記載されたＡ−Ｃ）は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（ＹＵＳＨデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｄ−Ｆ）は、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（ＭＤＡＣＣ  ｄａｔａ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。Ｇ−Ｉ）は、全体サンプルデータ（ＹＵＳＨデータ及びＭＤＡＣＣデータ）の予測された結果のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すものである。
【図９ａ】図９ａ及び図９ｂは、ＮＯ胃癌患者の予後結果でＣＧＡＰによってあらかじめ定められた機能的遺伝子分類の影響を示す図であって、 図９ａ及び図９ｂに記載されたＡ）は、ＹＵＳＨ、ＭＤＡＣＣ及び全体データセットでＣＧＡＰによって機能的に分類された遺伝子の予後結果である。ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓは、ＣＧＡＰの機能的遺伝子分類で当該遺伝子を利用して行った。主要クラスタの予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔによって比較した。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔのｐ値は、ログｐ値に変化させ、棒グラフで示す。Ｂ）は、各機能的遺伝子分類で主要クラスタの差を示す生物学的特徴である。ＧＳＥＡを行い、ＧＳＥＡの統計的有意をログｐ値で示す。
【図９ｂ】図９ａ及び図９ｂは、ＮＯ胃癌患者の予後結果でＣＧＡＰによってあらかじめ定められた機能的遺伝子分類の影響を示す図であって、 図９ａ及び図９ｂに記載されたＡ）は、ＹＵＳＨ、ＭＤＡＣＣ及び全体データセットでＣＧＡＰによって機能的に分類された遺伝子の予後結果である。ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓは、ＣＧＡＰの機能的遺伝子分類で当該遺伝子を利用して行った。主要クラスタの予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔによって比較した。ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔのｐ値は、ログｐ値に変化させ、棒グラフで示す。Ｂ）は、各機能的遺伝子分類で主要クラスタの差を示す生物学的特徴である。ＧＳＥＡを行い、ＧＳＥＡの統計的有意をログｐ値で示す。
【図１０ａ】図１０ａ〜図１０ｃは、危険度評点システムの百分率の形成を示す図である。 図１０ａ〜図１０ｃに記載されたＡ）は、予測模型とＣＧＡＰの機能的遺伝子分類によって定義された死亡率のヒットマップを示すものである。すべてのサンプルは、分類群またはクラスタによって定義された各分類群の死亡率で注釈をつけて、予後結果で患者分布と機能的生物学の各分類の影響をチェックするために、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。Ｂ）は、全体サンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｃ）は、ＹＵＳＨサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｄ）は、ＭＤＡＣＣサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｅ−Ｇ）は、３個の異なるデータセット（ＹＵＳＨ、ＭＤＡＣＣ及び全体サンプルデータセット）で％危険度点数として定義された３個の異なる危険群（Ｈｉｇｈ、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐ）のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。３個の異なる危険群間の予後的差異の有意性は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔによって定義した。
【図１０ｂ】図１０ａ〜図１０ｃは、危険度評点システムの百分率の形成を示す図である。 図１０ａ〜図１０ｃに記載されたＡ）は、予測模型とＣＧＡＰの機能的遺伝子分類によって定義された死亡率のヒットマップを示すものである。すべてのサンプルは、分類群またはクラスタによって定義された各分類群の死亡率で注釈をつけて、予後結果で患者分布と機能的生物学の各分類の影響をチェックするために、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。Ｂ）は、全体サンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｃ）は、ＹＵＳＨサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｄ）は、ＭＤＡＣＣサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｅ−Ｇ）は、３個の異なるデータセット（ＹＵＳＨ、ＭＤＡＣＣ及び全体サンプルデータセット）で％危険度点数として定義された３個の異なる危険群（Ｈｉｇｈ、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐ）のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。３個の異なる危険群間の予後的差異の有意性は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔによって定義した。
【図１０ｃ】図１０ａ〜図１０ｃは、危険度評点システムの百分率の形成を示す図である。 図１０ａ〜図１０ｃに記載されたＡ）は、予測模型とＣＧＡＰの機能的遺伝子分類によって定義された死亡率のヒットマップを示すものである。すべてのサンプルは、分類群またはクラスタによって定義された各分類群の死亡率で注釈をつけて、予後結果で患者分布と機能的生物学の各分類の影響をチェックするために、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。Ｂ）は、全体サンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｃ）は、ＹＵＳＨサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｄ）は、ＭＤＡＣＣサンプルデータセットで各患者の危険度点数の百分率である。Ｅ−Ｇ）は、３個の異なるデータセット（ＹＵＳＨ、ＭＤＡＣＣ及び全体サンプルデータセット）で％危険度点数として定義された３個の異なる危険群（Ｈｉｇｈ、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐ）のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔを示すのである。３個の異なる危険群間の予後的差異の有意性は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔによって定義した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明者は、リンパ節転移がない相対的に初期病期で胃癌患者の予後的差異に原因がある主要生物学的特徴を定義するために、リンパ節転移がない患者から全体ゲノム遺伝子発現プロファイルを作った。このために、フィルタリング基準を変えながら連続分散濾過後にｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ方法を適用した。予後結果は、クラスタリング分析によって定義された２個の主要分類群に対してｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用して推定した。各癌患者の全体生物学的特徴を示す遺伝子を利用した自律分析であるから、それぞれ異なる予後群を示す生物学的特徴は、予後的差異に原因がある主要生物学的特徴であり、治療方案の開発のための潜在的標的に利用されることができる。
【００２１】
分析結果、ＮＯ病期の胃癌患者の予後的差異に主に原因がある２個の異なる生物学的特徴（細胞増殖及び免疫反応）が同定され、これら２個の生物学的特徴は、分散濾過に基づく分類群またはＣＧＡＰの機能的遺伝子分類と関係なく、一般的にかなり保存されている。細胞増殖及び免疫活性化の生物学的特徴を示すこれら分類群の検証は、独立データセットで行い、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでＴｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ  ｓｅｔと類似の予後結果を示す。単一残留交差検証法で訂正予後比を実験した結果、分類群のタイプと予後予測アルゴリズムによって８５〜９６％の範囲を示す。良い予後群で細胞増殖関連遺伝子の発現が増加した結果は、正常細胞と比べて大部分の癌細胞でさらに高い増殖率を有しているため、予想しない結果であった。しかし、初期胃癌の細胞増殖は、進行性病期の胃癌より格別に強力であり、細胞特徴が幹細胞特徴の獲得及び転移潜在力が変化する中であると推測される。高い細胞増殖率を有する患者の良い予後結果を説明することができる他の要因として、化学療法薬剤の責任をあげることができる。化学療法薬剤治療を受けた患者で細胞増殖特徴の高い発現を有する患者は、予想したとおり、良い反応を示す。しかし、化学療法薬剤治療を受けない患者は、化学療法薬剤治療を受けた患者と類似の細胞増殖特徴の高い発現を有するときにのみ、良い予後結果を示すので、ＭＤＡＣＣ検証データセットの予後結果は、このような考えを裏付けない。したがって、高い増殖特徴発現を有する良い予後結果に対する理由は、化学療法薬剤の感受性だけでなく、高い細胞増殖生物学を反映する生理的差異にある。
【００２２】
リンパ節浸潤がない胃癌患者の良い予後に対する免疫活性化特徴の影響に対する発見は、免疫活性化、特に癌患者の治療でＣＴＬの活性化状態の重要な役目を立証したものである。免疫反応の有意的な役目は、胃癌でダウンストリーム非センチネルリンパ節転移と関連したセンチネルリンパ節で高いＦｏｘｐ３陽性調節Ｔ−細胞密度を提供する胃癌で既に報告されたことがある。腫瘍進行調節で免疫活性化の重要な役目は、いくつかの論文で報告されたことがあり、一般的に多くの癌腫で異なる治療方案として受け入れられている。致死量の放射線の照射とワクチン処理による活性免疫治療、ＧＭＣＳＦを分泌するように製作された自家腫瘍細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球−結合抗原−４（ＣＴＬＡ−４）の抗体遮断は、腫瘍新生血管形成を標的化して腫瘍脈管構造を崩壊させた。免疫耐性、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する主要メカニズムとして腫瘍捕獲（ｃｏ−ｏｐｔ）特定免疫チェックポイント経路は既に知られている。Ｔ細胞反応の劇的な拡大及び品質は、Ｔ細胞受容体による抗原認知を通じて開始され、共同刺激及び抑制信号間の均衡によって調節される。共同調節受容体の作用剤及び抑制信号の拮抗剤は、両方共に抗原特異Ｔ細胞反応を増幅させ、免疫チェックポイントの遮断は、ヒト癌の治療時に抗腫瘍免疫反応の潜在力を示す。特に、ＣＴＬＡ−４は、重要な免疫−チェックポイント受容体であり、Ｔ細胞活性化の大きさを下向き調節する。ＣＴＬＡ−４抗体は、免疫治療剤として米国ＦＤＡで承認を受け、拮抗的ＣＴＬＡ４抗体を利用した臨床研究は、進行性黒色腫患者で生存長所を立証した。したがって、拮抗的ＣＴＬＡ４抗体を胃癌患者治療に導入することは、初期ＮＯ患者で悪い予後結果を有する患者のための他の治療方案であることができる。本発明で明らかにした遺伝的特徴は、治療方案のための正しい患者を選択するためのガイド役目をすることができる。
【００２３】
本発明者は、主に細胞増殖と関連した特徴と免疫反応と関連した特徴で構成された２個の異なる生物学的特徴がＮＯ病期の胃癌患者の予後結果に原因がある主要生物学的特徴であることを立証した。これら発見に基づいて、本発明者は、胃癌患者で免疫治療の導入とこれら治療のための患者選択時に免疫治療のための最大利点を得るためには、遺伝的特徴に基づかなければならないことを提案する。
【００２４】
したがって、本発明は、対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルでＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、上記段階で決定されたＲＮＡ転写体の発現度に基づいて上記生物学的サンプルの危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、上記ＲＳ（％）によって予後を判断する段階とを含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法を提供する。
【００２５】
本発明による予後を予測する方法は、胃癌患者の臨床結果を支配する２つの主要生物学的特徴である免疫活性化及び細胞増殖に関連した遺伝子のうちＣＧＡＰ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）で発見される機能的に分類された遺伝子群（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅｄ  ｇｅｎｅ  ｇｒｏｕｐ）でＣｏｘ回帰分析で統計的有意（ｐ＜０．００１）を有する遺伝子を予後と関連した遺伝子対象に選定し、上記遺伝子の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を遺伝子の発現値に乗算し、下記数式１及び２によって危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を求めた後、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から上記ＲＳ（％）が５０％以上を有するサンプルを高危険群、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群、２５％未満の場合、低危険群に分類することによって、胃癌として診断された対象で予後を予測することができることを特徴とする。
【００２６】
上記ＲＳ及びＲＳ（％）は、下記数式１及び２によって計算することができる：
【００２７】
［数式１］
ＲＳ＝ＨＲ１＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ１＋ＨＲ２＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ２＋．．．＋ＨＲ＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎ
【００２８】
［数式２］
ＲＳ（％）＝１００×（生物学的サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
【００２９】
上記式中、ＨＲｎは、ｎ番目ＲＮＡ転写体の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を示し、上記ＨＲｎが１未満の場合、−１／ＨＲｎに変換して使用し、
ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎは、ＲＮＡ転写体の発現と関連した値であり、この値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心にスケールを変化させた値であり、
上記母集団は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌を有する一定数の集団を意味し、一定数は、ＲＳ最高値と最小値を算出することができる程度の任意の定数である。
【００３０】
上記母集団の数は、特に制限されず、一具体例では、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌組織１５８個を母集団として使用した。
【００３１】
上記式中、用語、危険係数（Ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：ＨＲ）とは、癌の進行、再発、または療法反応に対する寄与度を反映する係数を意味する。危険係数は、多様な統計的技法によって導出されることができる。上記危険係数、ＨＲ値は、多様な統計的モデルで決定することができ、例えば、多変量Ｃｏｘ比例危険回帰分析で決定することができる。一具体例で、ＨＲ値をＲＳ数式に使用するにあたって、ＨＲ値が１より大きいかまたは同一である場合、ＨＲ値をそのまま使用し、ＨＲ値が１より小さい場合、−１／ＨＲ値を使用することができる。
【００３２】
また、上記式中、用語、ＲＮＡ転写体の発現値というのは、個別遺伝子、すなわちＲＮＡ転写体の発現と関連した値を意味する。上記値は、公知された多様な統計的手段を使用して決定することができる。例えば、発現値は、Ｃｏｘ回帰分析によって測定されたｐ値をｌｏｇ２関数値に変形した後、四分位数標準化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）後の値を使用することができる。上記数式１で使用された発現値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心にスケールを変化させた値を使用した。
【００３３】
一具体例によれば、ＲＳは、次のように決定することができる：
ＲＳ＝−ＧＡＲＴ×３．５８４＋ＰＴＮ×３．６３１−ＰＣＮＡ×２．７０２７＋ＧＬＩ３×４．０７３＋ＳＭＡＲＣＤ３×２．２６６−ＳＵＬＴ１Ａ３×３．２７８＋ＩＬＫ×２．２５１−ＦＵＣＡ１×２．８０８９９＋ＰＫＤ１×２．８２７−ＴＯＰ２Ａ×１．７６６８＋ＡＢＬ１×２．７８４−ＣＫＳ２×１．９６８５＋ＦＺＤ１×４．３０２−ＴＩＡＬ１×４．２５５３＋ＳＧＣＤ×２．４９４−ＰＩＧＦ×２．６５２５−ＣＣＮＢ１×２．４２７２−ＣＳＫ×３．２５７３＋ＣＲＹＡＢ×１．５２４＋ＴＰＭ１×２．９７５−ＲＦＣ４×２．８１７＋ＧＵＣＹ１Ｂ３×２．８０１−ＴＹＭＳ×２．０６１７−ＦＥＮ１×２．３１４８＋ＧＮＡＩ１×２．７５８＋ＣＳＲＰ１×１．６４２−ＵＮＧ×２．６９５＋ＡＸＬ×２．０１８＋ＭＡＰ１×Ｂ１．７０５＋ＶＣＬ×２．４７８＋ＩＴＧＡ５×１．６４２−ＬＩＧ１×２．８４１−ＨＰＲＴ１×２．９５−ＧＲＢ２×３．６３６−ＨＭＭＲ×１．９８−ＭＣＭ４×２．０２＋ＳＲＦ×２．２８７＋ＤＭＰＫ×１．９２５−ＡＣＰ５×２．５５１−ＣＤ３８×２．１６−ＰＲＩＭ１×３．００３−ＣＣＮＦ×２．０２４＋ＧＬＲＢ×２．１３８−ＩＦＮＡＲ２×３．７１７＋ＨＳＰＡ２×１．７３４−ＣＬＮ３×２．４４５−ＢＵＢ１×１．７４＋ＣＡＬＭ１×２．８３９−ＣＤＣ２×１．５６２＋ＡＴＦ４×５．６７７−ＲＲＭ１×３．７１７
【００３４】
上記数式１によって計算されたＲＳは、上記数式２によってＲＳ（％）で示すことができる。
上記で決定された値を母集団で該当する順位に変換して全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から上記ＲＳ（％）が５０％以上を有するサンプルを高危険群、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群、２５％未満の場合、低危険群に分類する。高危険群は、悪い予後、低危険群は、良い予後であると判断することができる。すなわち、ＲＳ（％）値が５０％以上を有するサンプルを、高危険群は３年以上、６年以上、１０年以上の期間の間に全体生存率が低いことを意味し、２５％未満の低危険群は、３年以上、６年以上、１０年以上の間に全体生存率が高いことを意味する。上記用語、良い予後は、臨床結果の肯定的臨床結果可能性の増加で表現されることができ、悪い予後は、臨床結果の肯定的臨床結果可能性の減少で表現されることができる。
【００３５】
上記方法は、ＴＮＭ病期のうちＮ０期の胃癌患者群、例えば、Ｔ１Ｎ０期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するのに有用であることができる。
【００３６】
本発明の予後予測方法に使用された上記遺伝子は、免疫反応と細胞増殖に関与する遺伝子セットに分けることができ、良い予後群では、統計的に有意に発現が増加する。
【００３７】
免疫反応に関与する遺伝子セット：ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＡＢＬ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＣＤ３８、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１
細胞増殖／ＤＮＡ復旧に関与する遺伝子セット：ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＩＬＫ、ＴＯＰ２Ａ、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＣＣＮＢ１、ＲＦＣ４、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＵＮＧ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＣＡＬＭ１及びＣＤＣ２
【００３８】
上記免疫反応に関与する遺伝子セットは、主に抗原プロセッシングと提示（ＭＨＣ経路）及びＩＦＮガンマ信号伝達経路と、その他、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化（ＴＨ１ＴＨ２経路）、標的細胞に対するＣＴＬ媒介免疫反応（ＣＴＬ経路）、ＮＫ細胞でＮＯ２依存性ＩＬ１２経路（ＮＯ２ＩＬ１２経路）、Ｔ細胞活性化でＴｏｂの役目（ＴＯＢ１経路）、Ｔｈ１発達時にＩＬ１２及びＳｔａｔ４依存的信号伝達経路（ＩＬ１２経路）及びＴ細胞毒性細胞表面分子（Ｔ細胞毒性経路）と関連がある。
【００３９】
上記細胞増殖／ＤＮＡ復旧に関与する遺伝子セットは、癌感受性（ＡＴＲ  ＢＲＣＡ経路）でＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及びＡＴＲの役目、ＤＮＡ損傷（ｃｄｃ２５経路）に対する反応でｃｄｃ２５及びｃｈｋ１調節経路、サイクリン及び細胞周期調節（細胞周期経路）、サイクリンＥ破壊経路（ＦＢＷ７経路）、細胞周期：Ｇ１／Ｓチェックポイント（Ｇ１経路）、細胞周期：Ｇ２／Ｍチェックポイント（Ｇ２経路）、ＣＤＫ調節（ＭＣＭ経路）、細胞周期進行中にｐ２７リン酸化調節（Ｐ２７経路）、細胞周期を調節するＳｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）受容体Ｐｔｃ１（ＰＴＣ１経路）、ＤＮＡ損傷に対する反応でＲＢ腫瘍抑制子／チェックポイント信号伝逹（ＲＢ経路）、及びＥ２Ｆ１破壊経路（ＳＫＰ２Ｅ２Ｆ経路）と関連がある。
【００４０】
本発明は、また、対象から得た癌細胞を含む生物学的サンプルで
ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現水準を測定する段階と、
上記転写体の発現増加は、肯定的な臨床結果可能性の増加と判断する段階とを含む、胃癌として診断された対象で予後を予測する方法を提供する。
【００４１】
上記方法は、アレイ基盤方法であることができる。
【００４２】
上記発現水準が１つ以上のＲＮＡ転写体の発現水準に対して標準化されるものであることができる。
【００４３】
上記臨床結果が全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から表現されるものであることができる。
【００４４】
上記方法は、ＲＮＡ転写体全体の発現水準を測定し、発現増加を分析して、肯定的な臨床結果可能性の増加または減少を判断して予後を予測することができる。
【００４５】
上記方法は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するのに有用であることができる。
【００４６】
本発明は、また、患者から得た核酸試料で
ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を決定する段階と、
上記段階で決定されたＲＮＡの発現度に基づいて上記試料の危険度点数（ＲＳ、Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）及びＲＳ百分率（ＲＳ（％））を計算し、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点から上記ＲＳ（％）の設定値の範囲が５０％以上を有する場合、高危険群患者、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群患者、２５％未満の場合、低危険群患者に分類する段階とをコンピュータに実行させるプログラムを記録したコンピュータで読み取り可能な記録媒体を提供する。
【００４７】
上記記録媒体は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌の手術による切除後の臨床結果を予測するのに有用な媒体を提供することができる。
【００４８】
上記ＲＳ及びＲＳ（％）は、上記数式１及び２によって計算することができる。
【００４９】
上記記録媒体は、全体生存率（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）の観点からＲＳ（％）の設定値の範囲が５０％以上を有する場合、高危険群、２５％以上〜５０％未満の場合、中間危険群、２５％未満の場合、低危険群と判断することができる。すなわち、ＲＳ（％）値が５０％以上を有するサンプルを、高危険群は３年以上、６年以上、１０年以上の期間の間に全体生存率が低いと判断し、２５％未満の低危険群は、３年以上、６年以上、１０年以上の間に全体生存率が高いと判断する。上記用語、良い予後は、臨床結果の肯定的臨床結果可能性の増加で表現されることができ、悪い予後は、臨床結果の肯定的臨床結果可能性の減少で表現されることができる。
【００５０】
別途定義が無い限り、本願に使用された技術及び科学用語は、当業者の水準で一般的に理解するような意味がある。本発明は、いずれの方式でも、説明された方法及び材料に制限されない。本発明の目的上、下記用語が以下で定義される。
【００５１】
用語、「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」は、基質上の混成化可能なアレイ構成要素、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブの規則的な配置を言う。
【００５２】
用語、「ポリヌクレオチド」は、一般的に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを言い、例えば変形または非変形ＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。本明細書で、「ポリヌクレオチド」は、具体的にｃＤＮＡを含む。
【００５３】
用語、「オリゴヌクレオチド」は、非制限的に一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド及び二本鎖ＤＮＡを含む、比較的短いポリヌクレオチドを言う。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、例えば商業的に入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成器を使用する化学的方法によって合成されることがある。しかし、オリゴヌクレオチドは、試験管内の再組換えＤＮＡ−媒介技術を含む各種他の方法によって及び細胞及び有機体中でのＤＮＡ発現によって製造されることができる。
【００５４】
用語、「差等的に発現された遺伝子」または「差等的な遺伝子発現」は、正常または対照用対象体の発現に比べて胃癌のような癌を病む対象体のうちさらに高いかまたは低い水準に活性化される遺伝子を言う。また、同一の疾病の異なる病期でさらに高いかまたは低い水準に活性化される遺伝子を含む。差等的に発現される遺伝子は、核酸水準またはタンパク質水準で活性化または抑制されるか、異なるスプライシングを受けて、異なるポリペプチド産物を引き起こす場合であることができる。このような差異は、例えばポリペプチドのｍＲＮＡ水準、表面発現、分泌または他の分配における変化によって立証されることができる。本発明の目的上、「差等的な遺伝子発現」は、正常及び疾病にかかった対象体で、または疾病にかかった対象体の多様な病期で与えられた遺伝子の発現の間に約１．５倍以上、約４倍以上、約６倍以上、約１０倍以上の差異があるときに存在するものと見なされる。
【００５５】
遺伝子転写体または遺伝子発現生成物に関する用語「標準化された」は、基準遺伝子セットの転写体／生成物の平均水準に対する転写体または遺伝子発現生成物の水準を言い、ここで、レファレンス遺伝子は、患者、組織または治療にわたってこれらの最小限の変動に基づいて選択されるか（「ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ）」）、またはレファレンス遺伝子は、試験された遺伝子全体を言う。後者の場合、一般的に「全体標準化（ｇｌｏｂａｌ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」と言及され、試験された遺伝子の総数が比較的大きい、好ましくは、５０超過であることが重要である。具体的に、ＲＮＡ転写体に関する用語「標準化された」は、基準遺伝子セットの転写水準の平均に対する転写水準を言う。
【００５６】
用語、「発現閾値」及び「定義された発現閾値」は、混用して使用し、この水準以上では、遺伝子または遺伝子生成物が患者反応に対する予測マーカーとして使用される当該遺伝子または遺伝子生成物の水準を言う。閾値は、代表的に臨床的研究から実験的に定義される。発現閾値は、最大敏感性、または最大選択性（例えば１つの薬物に対する反応者だけを選択するように）、または最小誤差で選択されることができる。
【００５７】
用語、「遺伝子増幅」は、特定細胞または細胞株で遺伝子または遺伝子断片の多数個の複製物が形成される過程を言う。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸長）は、「アンプリコン」と言及されることがある。生産されたｍＲＮＡの量、すなわち遺伝子発現度は、また、特定遺伝子の作られた複製数に比例して増加する。
【００５８】
本明細書で、「予後」は、本願で癌による死亡または胃癌のような新生物性疾患の進行（再発、転移性拡散及び耐薬物性を含む）の可能性の予測を言うのに使用される。用語「予測」は、本願で患者が主要腫瘍の手術除去後に癌再発なしに特定の期間の間に生存するようになる可能性を言うのに使用される。このような予測は、任意の特定患者に対して最も適切な治療技法を選択することによって、治療を決定するのに臨床的に使用されることができる。このような予測は、患者が治療摂生、例えば手術施術に対して有利に反応しやすいか、または手術終了後に患者の長期間生存が可能であるかを予測するのにあたって、貴重な手段になる。用語、「予後指標」は、「危険度点数」と混合されて使用されることができる。
【００５９】
他に指示しない限り、分子生物学（再組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来技術を使用して本発明を行うことができる。
【００６０】
１．遺伝子発現プロファイル作成（Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）
遺伝子発現プロファイル作成方法は、ポリヌクレオチドの混成化分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列化に基づく方法、及びプロテオミクス基盤方法を含む。例えばｍＲＮＡ発現の定量化のための方法は、ノーザンブロッティング（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びインサイチュー ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）；ＲＮＡｓｅ保護検定試験；及びＰＣＲ基盤方法、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などを含む。または、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗体が使用されることができる。配列化基盤遺伝子発現分析で代表的な方法は、遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＳＡＧＥ）及び大量並行シグネチャー配列化（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析を含む。
【００６１】
２．マイクロアレイ
新鮮なまたはパラフィンに包埋された腫瘍組織で癌関連遺伝子の発現プロファイルを測定することができる。この方法では、関心を有する配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド含み）をマイクロチップ基板上にプレーティングまたは配列させる。配列された配列を引き続いて関心を有する細胞または組織からの特定ＤＮＡプローブと混成化させる。ＲＴ−ＰＣＲ方法と同様に、ｍＲＮＡの供給源は、通常、ヒトの腫瘍または腫瘍細胞株、及び対応する正常組織または細胞株から単離された全体ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、各種主要腫瘍または腫瘍細胞株から単離されることができる。マイクロアレイ技術は、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物を緻密なアレイで基板上に提供する。好ましくは、１０，０００以上のヌクレオチド配列を基板に加える。１０，０００エレメントそれぞれでマイクロチップ上に固定化された微細配列された遺伝子が厳格な条件下での混成化に適している。蛍光的に標識されたｃＤＮＡプローブが関心を有する組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドの混入を通じて生成されることができる。チップに加えられた標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡ各スポットに特異性を有するように混成化される。非特異的に結合されたプローブを除去するための厳格な洗浄後、チップを同一焦点レーザー顕微鏡によってまたは他の検出方法、例えばＣＣＤカメラによって走査する。各配列されたエレメントの混成化に対する定量化は、対応するｍＲＮＡ過多の評価を可能にする。二重色蛍光の場合、２個のＲＮＡ供給源から生成された別途に標識されたｃＤＮＡプローブがアレイに各対別に混成化される。したがって、各明示された遺伝子に対応する２個の供給源からの転写体の相対的過多が同時に決定される。小型化規模の混成化が多い数の遺伝子に対する発現パターンの便利で且つ迅速な評価を提供する。このような方法は、稀な転写体（これは、細胞当たり少数個の複製物に発現される）を検出するのに、及び発現度において少なくとも略２倍の差異で再現可能に検出するのに必要な敏感性を有するものと現われた。マイクロアレイ分析は、商業的に入手可能な装備によって製造業社のプロトコルによって、例えばアフィメトリクスジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ）技術またはインサイト（Ｉｎｃｙｔｅ’ｓ）マイクロアレイ技術を使用して行われることができる。
【００６２】
３．ｍＲＮＡ単離、精製及び増幅の一般的な説明
パラフィンに包埋された組織を使用して遺伝子発現プロファイルを作成する技術は、前述した通りである。最終的に得られたデータを分析して観察された腫瘍サンプルで確認された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者に利用することができる最上の治療選択事項を判別する。
【００６３】
本発明の重要な面は、胃癌組織による特定遺伝子の測定された発現を使用して予後情報を提供するものである。このような目的のために、検定試験されたＲＮＡの量、使用されたＲＮＡ品質における変動、及び他の因子、例えば機械及び作業者の差異における差異に対して補正する（標準化）ことが必須である。したがって、検定試験は、通常、ＧＡＰＤ及びＡＣＴＢのような公知されたハウスキーピング遺伝子から転写されたものを含む、基準ＲＮＡの使用を測定して混入させる。遺伝子発現データを標準化するための正確な方法は、文献［“Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２”  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；  １９９７）］に提供される。または、標準化は、検定試験された遺伝子またはこれらの多くのサーブセット全部の平均または中間信号（Ｃｔ）を基準とすることができる（全体標準化接近法）。下記実施例に説明された研究では、中心標準化戦略を使用したが、これは、標準化のために臨床的成果との相関性不足に基づいて選択されたスクリーニングされた遺伝子のサブセットを利用した。
【００６４】
用語、「トレーニングセット（Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）」というのは、予後に統計的に有意なＲＮＡ転写体を抽出した対象サンプルを意味する。
【００６５】
用語、「検証セット（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｅｔ）」または「テストセット（Ｔｅｓｔｓｅｔ）」というのは、上記抽出された変数が実際に予後の良し悪しを判断することができる正確度をテストするセットを意味する。このような方法を使用する理由は、特定サンプル群だけで効果的に予後判断能力があるものではなく、独立的サンプルでも効能があることを判断するためである。
【００６６】
４．再発に対する危険度点数及びこれらの応用
胃癌再発の可能性に対する癌予後方法を区分づける演算の特徴は、１）再発可能性を測定するのに使用された独特の試験ｍＲＮＡｓセット（または対応する遺伝子発現生成物）、２）発現データを式で合わせるのに使用された特定加重値、及び３）患者を異なる水準の危険を有する群、例えば低、中間及び高危険群に分けるのに使用された閾値を含む。この演算は、数値的な危険度点数（ＲＳ）及びＲＳ（％）を算出する。
【００６７】
試験は、明示されたｍＲＮＡまたはこれらの発現生成物の水準を測定するための実験室検定試験を必要とするが、新鮮な組織であるかまたは冷凍された組織、または既に必ず患者から収集され保管されている固定されてパラフィンに埋め込まれた腫瘍生検の試験片を非常に少量で利用することができる。したがって、試験は、非侵入性であることができる。例えばコア生検または微細針吸引を通じて収獲された腫瘍組織のいくつかの異なる方法と併用性であってもよい。
【００６８】
この方法によれば、癌危険度点数（ＲＳ）は、
（ａ）上記対象体から得た癌細胞を含む生物学的サンプルで遺伝子またはタンパク質発現プロファイルを作成し；
（ｂ）多数個の個別遺伝子の発現度、すなわち、ｍＲＮＡ水準を定量化して各遺伝子に対する発現値を定め；
（ｃ）それぞれ癌−関連生物学的関数によって及び（または）同時発現によって連結された遺伝子に対する発現値を含む、遺伝子発現値のサブセットを生成させ；
（ｄ）１サブセット内の各遺伝子の発現度に上記サブセット内での当該癌再発反応に対する相対的寄与度を反映する係数を乗算し、乗算した値を加算し、上記サブセットに対する値を算出し；
（ｅ）各サブセットの値に当該癌再発反応に対する寄与度を反映する係数を乗算し；
（ｆ）上記係数を乗算した各サブセットに対する値の和を求め、
危険度点数（ＲＳ）及びＲＳ（％）を得ることによって決定され、ここで、癌再発と線形相関関係を示さない各サブセットの寄与度は、ただ所定の閾値以上だけで含まれ、
明示された遺伝子の増加された発現が癌再発危険を減少させるサブセットには、負の値を付与し、明示された遺伝子の発現が癌再発危険を増加させるサブセットには、正の値を付与する。
【００６９】
具体的な実施態様で、ＲＳ及びＲＳ（％）は、
（ａ）ＧＡＲＴ、ＰＴＮ、ＰＣＮＡ、ＧＬＩ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＩＬＫ、ＦＵＣＡ１、ＰＫＤ１、ＴＯＰ２Ａ、ＡＢＬ１、ＣＫＳ２、ＦＺＤ１、ＴＩＡＬ１、ＳＧＣＤ、ＰＩＧＦ、ＣＣＮＢ１、ＣＳＫ、ＣＲＹＡＢ、ＴＰＭ１、ＲＦＣ４、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＹＭＳ、ＦＥＮ１、ＧＮＡＩ１、ＣＳＲＰ１、ＵＮＧ、ＡＸＬ、ＭＡＰ１Ｂ、ＶＣＬ、ＩＴＧＡ５、ＬＩＧ１、ＨＰＲＴ１、ＧＲＢ２、ＨＭＭＲ、ＭＣＭ４、ＳＲＦ、ＤＭＰＫ、ＡＣＰ５、ＣＤ３８、ＰＲＩＭ１、ＣＣＮＦ、ＧＬＲＢ、ＩＦＮＡＲ２、ＨＳＰＡ２、ＣＬＮ３、ＢＵＢ１、ＣＡＬＭ１、ＣＤＣ２、ＡＴＦ４及びＲＲＭ１のＲＮＡ転写体の発現度を測定し、
（ｂ）下記数式１及び２によって危険度点数（ＲＳ）及びＲＳ（％）を計算することによって決定される：
【００７０】
［数式１］
ＲＳ＝ＨＲ１＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ１＋ＨＲ２＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅ２＋．．．＋ＨＲｎ＊ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎ
【００７１】
［数式２］
ＲＳ（％）＝１００×（生物学的サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
【００７２】
上記式中、
ＨＲｎは、ｎ番目ＲＮＡ転写体の危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ）を示し、上記ＨＲｎが１未満の場合、−１／ＨＲｎに変換して使用し、
ｎｏｒｍＬｏｇＴｒａｎｓＶａｌｕｅｎは、ＲＮＡ転写体の発現と関連した値であり、この値は、当該遺伝子の全体値を対象として中間値を中心にスケールを変化させた値であり、
上記母集団は、ＴＮＭ病期分類でリンパ節転移がないＴ１ＮＯ期、Ｔ２Ｎ０期、Ｔ３Ｎ０期またはＴ４Ｎ０期の局所進行性胃癌を有する一定数の集団を意味し、一定数は、ＲＳ最高値と最小値を算出することができる程度の任意の定数である。
【００７３】
ここで、ＲＳ（％）値が５０％以上なら、悪い予後であり、２５％未満なら、良い予後であると判断する。
【発明の実施のための形態】
【００７４】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００７５】
〈製造例〉予後予測対象の選定及び実験設計
予後予測対象を選定するために、１９９９年から２００６年まで延世大学校セブランス病院で一次治療で胃切除術を受けた胃腺腫患者（ＹＵＳＨ、ｎ＝７８）から腫瘍標本及び臨床データを得た。すべてのサンプルは、患者から詳細に記載された同意書を受けた後、収集し、研究は、延世大学校セブランス病院の調査倫理委員会の承認を受けた。臨床データは、溯及して得た。全体生存期間は、手術から死亡に至る時間と定め、データは、患自が最後の接触時に生きているとき、検閲を受けたものと見なした。ＹＵＳＨデータは、予後結果に主に原因がある生物学的特徴を糾明し、トレーニングデータセット（Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）を利用して予後予測モデルを開発するのに使用した。
【００７６】
予後予測モデル及び危険度評点システムの検証のために、本発明では、ＭＤアンダーソン癌センターで作った遺伝子発現プロファイルを使用した。腫瘍標本及び臨床データは、１９９９年から２００６年まで延世大学校セブランス病院、高麗大学校九老病院及び高神大学医科大学で一次治療で胃切除術を受けた胃腺腫患者から得た。すべてのサンプルは、患者から詳細に記載された同意書を受けた後、収集し、研究は、ＭＤエンドス癌センターの調査倫理委員会の承認を受けた。
【００７７】
（遺伝子発現データ）
ＹＵＳＨデータセットで７８個のサンプルに対する実験及び分析は、延世大学校セブランス病院で行った。遺伝子発現プロファイルは、４８８０３個の遺伝子特徴を含むＩｌｌｕｍｉｎａ  ｈｕｍａｎ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ（Ｈｕｍａｎ  ＨＴ−１２、ｖ３．０、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と標識されたｃＲＮＡｓを混成化させて作った。全体ＲＮＡは、ｍｉｒＶａｎａＴＭＲＮＡ分離標識化キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）を使用して新鮮な冷凍組織から抽出した。製造メーカ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のマニュアルによって５００ｎｇの全体ＲＮＡを標識化及び混成化のために使用した。上記ビーズチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャニングした後、マイクロアレイデータは、Ｒ言語環境（Ｂｏｌｓｔａｄ  ＢＭ、２００３）でマイクロアレイデータ（ＬＩＭＭＡ）パッケージのための線形模型で四分位数標準化方法によって標準化した。一次マイクロアレイデータは、ＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）公開データベース（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＧＥＯ００００、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ＧＥＯ００００）で利用することができる。ＭＤＡＣＣデータセットで８０個サンプルに対する実験及び分析は、ＹＵＳＨデータセットで行われたことと同様の過程でＭＤアンダーソン癌センターのシステム生物学部で行った。ＭＤＡＣＣデータセットに対する一次マイクロアレイデータは、ＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）公開データベース（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＧＥＯ００００、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ＧＥＯ００００）で利用することができる。
【００７８】
（マイクロアレイデータ分析）
クラスタ分析は、クラスタ及びトリビュ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／ＥｉｇｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍ）で行った。クラスタ分析のために、ログベース２変換されたデータは、各遺伝子発現値に対して中間値を記載した。患者の間に異なる発現水準を有する遺伝子を作るために、フィルタリング基準を替えながら連続遺伝子濾過を作った。ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓは、連続分散濾過後に行い、２個の主要クラスタで構成された２個のクラスの予後的差異は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ及びＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔによって試験した。
【００７９】
マイクロアレイデータセット分析のために、ＢＲＢ  Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｓ．ｎｉｃ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）を使用した。主要データ分析前及び四分位数標準化後に、データセットに対してログベース２変換を適用した。比較された２個のクラスの間に有意的に相異に発現された遺伝子を同定するために、２個サンプルのｔ−テストを適用した。主要生物学的機能及び遺伝的経路を特性糾明するために、Ｂｉｏｃａｒｔａデータベースで羅列された２８１個の経路に対してＧＳＥＡ（ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
【００８０】
予後予測模型を作るために、ＹＵＳＨデータをトレーニングセットとして使用し、ＭＤＡＣＣデータセットを検証セットとして使用した。独立的な患者データセットのクラスを予測するために、既に開発された３個の異なる予測アルゴリズム基盤予測モード（Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＬＤＡ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｖａｒｉａｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＣＣＰ）及びＮｅａｒｅｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄ（ＮＣ））を適用した。２個のサンプルテストによって評価されるときのように、上記模型を０．００１有意水準で遺伝子の間で差等的に発現されるものに結合させた。各模型の予測エラーを推定するために、単一残留交差検証（Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、ＬＯＯＣＶ）を使用した。単一残留交差検証トレーニングセットのために、遺伝子選別を含んで全体模型−ビルプロセスを繰り返した。また、交差検証エラー率推定値（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）が有意的に１未満であることが任意予測から期待されることができるかを評価した。予測模型の予後力を評価するために、予測模型のための検証データセットを使用し、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔ及びｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用してその結果を評価した。
【００８１】
分類された患者群の予後差を評価するために、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐｌｏｔ及びｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを使用した。
【００８２】
共変量として独立予後因子関連生存と、遺伝子特徴、腫瘍病期及び病理学的特徴を評価するために、多変量Ｃｏｘ比例危険回帰分析を使用した。
【００８３】
（予後危険度評点システムの開発）
腫瘍発生及び転移に主に原因がある遺伝子に基づく危険度評点システムを作るために、ＣＧＡＰで注釈がついた遺伝子から機能的に分類された遺伝子の予後的影響を行った。危険度評点システムは、ＣＧＡＰで注釈がついた遺伝子を利用して作成し、Ｃｏｘ−回帰分析（ｐ＜０．００１）で有意的な予後値を有する。危険度点数は、発現値の中間値に危険係数（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ、ＨＲ）を乗算し、その値の総和を計算して作成した。ＨＲ値が１未満の場合、−１／ＨＲに変換した。危険度点数の百分率（ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ  Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ）は、次の式によって計算した：
【００８４】
ＲＳ（％）＝１００×（サンプルのＲＳ−母集団のＲＳ最小値）／（母集団のＲＳ最高値−母集団のＲＳ最小値）
【００８５】
５０％以上のＲＳ（％）を有するサンプルは、高危険群に分類し、２５％以上のＲＳ百分率及び５０％未満のＲＳ（％）を有するサンプルは、中間危険群に分類した。最後に、２５％未満のＲＳ（％）を有するサンプルは、低危険群に分類した。
【００８６】
〈実施例１〉ＮＯ胃癌患者の遺伝子発現プロファイル調査
フィルタリング基準を替えながら行う連続分散濾過は、独特の２つの主要クラスタを有する１５個のクラスタを発生した。分散濾過した後、多数の遺伝子は、５６１２個のプローブから７０１個のプローブに至るまで多様であり、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでｐ値は、分散濾過基準によって最大０．２９１（Ｍ２＿１：中間値と比べて２倍以上の増加または減少を示すプローブを少なくとも１個有する遺伝子を選択して分散濾過した後、５６１２個のプローブを有するクラスタ）で最小０．０１８１（Ｍ３＿３：中間値と比べて３倍以上の増加または減少を示すプローブを少なくとも３個有する遺伝子を選択して分散濾過した後、７０６個のプローブを有するクラスタ）まで多様であった。１５個のクラスタのうち、１１個のクラスタは、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓでｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔで統計的に有意的な予後的差異を示す２つの主要クラスを発生した（図１ａ及び表１）。
【００８７】
【表１】
0006280206.tif 000002
【００８８】
予後結果で統計的有意を示す１１個のクラスタを使用して患者サンプルパターン分析を行った結果、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって発生した２個のクラスの構成は、フィルタリング基準に関係なく、非常に類似なパターンを示し、サンプル構成の２個の異なるパターンを示し、しかも、各クラスの１個または２個のサンプルは、フィルタリング基準による分類において差異を示す（図１ｂ）。したがって、サンプル構成の２個の異なるパターンを示す２個のクラスタを選択した（図２）。
【００８９】
Ｍ２＿５（中間値と比べて２倍以上の増加または減少を示すプローブを少なくとも５個有する遺伝子を選択して分散濾過した後、１５５６個のプローブを有するクラスタ）の良い予後群は、ただ１名の死亡患者を有するが（４％死亡率）、悪い予後群は、１５名の死亡患者（２８％死亡率）（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ  ｐ＝０．０２７９、図１ｃ）を有する。Ｍ３＿３の良い予後群は、ただ２名の死亡患者（６％死亡率）を有するが、悪い予後群は、１４名の死亡患者（２９．８％死亡率）を有する（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ  ｐ＝０．０１８１、図１ｄ）。
【００９０】
〈実施例２〉２個の主要クラスタの生物学的特徴
予後結果でこのような差異を示す２個のクラスの主要遺伝的特徴を定義するために、２個のサンプルに対するｔ−テストを行った。ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ後、Ｍ２＿５の２個の主要クラスタを示す２個のクラスの比較は、２８８６個の有意的に異なるプローブを生成した（ｐ＜０．００１）。
【００９１】
図３のＡは、Ｍ２＿５の２個のクラスの比較において統計的有意（ｐ＜０．００１）を有する２倍以上の差異を示すプローブを利用した条件付きクラスタリング分析のヒットマップを示すものである。免疫反応に関連した多い遺伝子（ＩＦＮＧ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＣＤ８Ａ、ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ２、ＨＬＡＤＰＡ１）が、良い反応群で発現が非常に増加した。
【００９２】
Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでこれら２個のクラスのＧＳＥＡを行ったとき、最も有意的に向上した経路は、統計的有意（ｐ＝０．００００１）を有する抗原プロセッシング及び提示（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＭＨＣ経路）とＩＦＮガンマ信号伝達経路（ＩＦＮＧ経路）であった。これら２個の主要信号伝達経路を除いて、Ｔｈ１／Ｔｈ２分化（ＴＨ１ＴＨ２経路）、標的細胞に対するＣＴＬ媒介免疫反応（ＣＴＬ経路）、ＮＫ細胞でＮＯ２依存性ＩＬ１２経路（ＮＯ２ＩＬ１２経路）、Ｔ細胞活性化でＴｏｂの役目（ＴＯＢ１経路）、Ｔｈ１発達時にＩＬ１２及びＳｔａｔ４依存的信号伝達経路（ＩＬ１２経路）及びＴ細胞毒性細胞表面分子（Ｔ細胞毒性経路）は、免疫反応に関連した信号伝達経路であり、Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースのＧＳＥＡで有意的に向上している（図４ａ）。有意的に向上した各経路の遺伝子成分は、良い予後群で免疫活性化と関連した遺伝子の一方向性活性化を示す（図５ａ〜図５ｆ）。
【００９３】
ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ後、Ｍ３＿３の２個の主要クラスタを示す２個のクラスの比較は、２６８０個の有意的に異なるプローブを生成した（ｐ＜０．００１）。
【００９４】
図３のＢは、Ｍ３＿３の２個のクラスの比較で統計的有意（ｐ＜０．００１）を有する３倍以上の差異を示すプローブを利用した条件付きクラスタリング分析のヒットマップを示すものである。細胞増殖（ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＡ２、ＣＤＣＡ５、ＡＵＲＫＡ、Ｅ２Ｆ７、ＣＤＣ２５Ａ）に関連した遺伝子とＤＮＡ復旧に関連した遺伝子（ＴＯＰ２Ａ）が良い反応群で発現が非常に増加した。
【００９５】
Ｂｉｏｃａｒｔａ経路データベースでこれら２個のクラスのＧＳＥＡを行った結果、最も有意的に向上した経路は、癌感受性（ＡＴＲ  ＢＲＣＡ経路）でＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及びＡＴＲの役目、ＤＮＡ損傷（ｃｄｃ２５経路）に対する反応でｃｄｃ２５及びｃｈｋ１調節経路、サイクリン及び細胞周期調節（細胞周期経路）、サイクリンＥ破壊経路（ＦＢＷ７経路）、細胞周期：Ｇ１／Ｓチェックポイント（Ｇ１経路）、細胞周期：Ｇ２／Ｍチェックポイント（Ｇ２経路）、ＣＤＫ調節（ＭＣＭ経路）、細胞周期進行中にｐ２７リン酸化調節（Ｐ２７経路）、細胞周期を調節するＳｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）受容体Ｐｔｃ１（ＰＴＣ１経路）、ＤＮＡ損傷に対する反応でＲＢ腫瘍抑制子／チェックポイント信号伝逹（ＲＢ経路）、及びＥ２Ｆ１破壊経路（ＳＫＰ２Ｅ２Ｆ経路）である（図４ｂ、ｐ＝０．００００１）。
【００９６】
有意的に向上した各経路の遺伝子成分は、良い予後群で細胞増殖と関連した遺伝子の一方向性活性化を示す（図６ａ〜図６ｆ）。
【００９７】
〈実施例３〉予後予測模型の生成
予後予測模型を作るために、３個の異なる予後予測アルゴリズム、すなわちＣｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃｏｖａｒｉａｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ＣＣＰ）、Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＬＤＡ）、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄ（ＮＣ）を使用した。分類群予測のために、０．００１有意水準で２個のクラスの間に有意的に異なる遺伝子を使用し、単一残留交差検証法を使用して訂正予測比を計算した。
【００９８】
Ｍ３＿３分類群に対するＴｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ  ｓｅｔ（ＹＵＳＨデータセット）で２個の予測された群間の予後的差異は、統計的に有意し（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、ＣＣＰ：ｐ＝０．００９３３、ＬＤＡ：ｐ＝０．０１３７及びＮＣ：ｐ＝０．００２１７）、Ｍ３＿３の分類群のための訂正予測比は、８５％〜９２％（ＣＣＰ：８６％、ＬＤＡ：８５％及びＮＣ：９２％）まで多様であった（図７ａ〜図７ｃ）。
【００９９】
ＭＤＡＣＣデータセットは、分類群の検証のために使用した。ＭＤＡＣＣテストデータセット患者（８０名の患者）の予測結果は、予後結果でＴｒａｉｎｉｎｇ  ＹＵＳＨ  ｄａｔａ  ｓｅｔと類似なパターンを示す。予後的差異は、統計的に有意し（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、ＣＣＰ：ｐ＝０．００６４５、ＬＤＡ：ｐ＝０．００３７２及びＮＣ：ｐ＝０．０２４７）、良い予後に分類された群は、ＣＣＰの場合、３．３％死亡率（３０名の患者のうち１名の患者が死亡する）、ＬＤＡの場合、３．２％死亡率（３１名の患者のうち２名の患者が死亡する）、ＮＣの場合、６．４５％死亡率（３１名の患者のうち２名の患者が死亡する）を有する良い予後結果を示す。また、悪い予後群に分類された群は、ＣＣＰの場合、３０％の死亡率（５０名の患者のうち１５名の患者が死亡する）、ＬＤＡの場合、３０．６％死亡率（４９名の患者のうち１５名の患者が死亡する）、ＮＣの場合、２８．６％死亡率（４９名の患者のうち１４名の患者が死亡する）を有する悪い予後結果を示す（図７ｄ〜図７ｆ）。
【０１００】
全体サンプルの予測された結果は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔのｐ値が、ＣＣＰ及びＬＤＡの場合、０．０００１１１を有し、ＮＣの場合、０．００００１２を有し、３個の異なるアルゴリズム全体に対して２個の主要クラス間の非常に強力な予後的差異を示す（図７ｇ〜図７ｉ）。
【０１０１】
たとえ訂正分類比（ｃｏｒｒｅｃｔ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）は、Ｍ３＿３分類群（ＣＣＰ９２％、ＬＤＡ９０％及びＮＣ９５％）より非常に高かったが、Ｍ２＿５に対するテストデータセットで予測された結果は、統計的に有意しなかった（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、ＣＣＰ：ｐ＝０．０９４８、ＬＤＡ：ｐ＝０．０５６及びＮＣ：ｐ＝０．０６）（図８ａ〜図８ｃ）。
【０１０２】
ＭＤＡＣＣテストデータセット患者の予測された結果は、より強力な統計的有意を有する予後結果でＴｒａｉｎｉｎｇ  ＹＵＳＨ  ｄａｔａ  ｓｅｔと類似なパターンを示している。予後的差異は、統計的に有意し（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、ＣＣＰ：ｐ＝０．０１５５、ＬＤＡ：ｐ＝０．０１５５及びＮＣ：ｐ＝０．０２１４）、良い予後に分類された群は、ＣＣＰ、ＬＤＡ、及びＮＣの場合３．８％死亡率（２６名の患者のうち１名の患者が死亡する）を有する良い予後結果を示す。また、悪い予後群に分類された群は、ＣＣＰ、ＬＤＡ及びＮＣの場合、２７．８％死亡率（５４名の患者のうち１５名の患者が死亡する）を有する悪い予後結果を示す（図８ｄ〜図８ｆ）。全体サンプルの予測された結果は、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでｐ値がＣＣＰの場合、０．００３７７、ＬＤＡの場合、０．００２０３、ＮＣの場合、０．００２８４を有し、３個の異なるアルゴリズム全体で非常に強力な予後結果を示す（図８ｇ〜図８ｉ）。
【０１０３】
〈実施例４〉ＮＯ胃癌患者の予後に影響を与えるＣＧＡＰから機能的遺伝子分類
ＮＩＨでＣＧＡＰから遺伝子注釈は、主に腫瘍生成、腫瘍進行及び癌転移に影響を与える機能的遺伝子分類を特徴としている。したがって、これら機能的遺伝子分類に基づく予後特性糾明は、これら接近法が癌の或る病期の予後に主に原因となる主要生物学的特徴を示すときに非常に有益である。したがって、本発明者は、ＹＵＳＨ（ｎ＝７８）及びＭＤＡＣＣ（ｎ＝８０）及び加算した全体患者データセット（ｎ＝１５８）から２個のデータセットから各遺伝子分類の影響を試験した。
【０１０４】
機能的遺伝子分類を持って実施したｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって生成された主要クラスタの予後結果は、２個の異なるデータセットの間に多様であった。新生血管生成は、ＹＵＳＨデータからＣＧＡＰで統計的有意を示す（ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔｐ＝０．０２１５）唯一の機能的分類であるのに対し、ＭＤＡＣＣデータセットは、新生血管生成（ｐ＝０．０３３７）、ＤＮＡ損傷（ｐ＝０．０１８８）、ＤＮＡ複製（ｐ＝０．０４０２）、転移（ｐ＝０．０２３５）、信号伝逹（ｐ＝０．０１７６）及び転写因子（ｐ＝０．００００７０６）において統計的有意を示す。加算した患者データセットは、細胞死滅及び発生を除いて、大部分、機能的遺伝子分類において有意を示す（図９ａ）。
【０１０５】
全体サンプルの機能的遺伝子分類のプローブを使用してｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｈｉｅｒａｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓによって定義された２個のクラスに対してＢｉｏｃａｒｔａ経路データベースのＧＳＥＡを行った結果、機能的遺伝子分類は、有意的に異なる遺伝子セット分類の２つの異なるパターンを示す。大部分の細胞増殖に関連した遺伝子セット（ＤＮＡ複製のＣＤＫ調節、Ｅ２Ｆ１破壊経路、細胞周期：Ｇ１／Ｓチェックポイント、細胞周期：Ｇ２／Ｍチェックポイント、ＤＮＡ損傷に対する反応でＣＤＣ２５及びｃｈｋ１調節経路）は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ損傷、遺伝子調節、代謝及び転写因子の機能的遺伝子分類のプローブによって作られた２個のクラスの比較において有意的に向上した。転移、免疫、新生血管生成、細胞信号伝逹、信号伝逹及び細胞周期の機能的遺伝子分類は、免疫反応（Ｔ細胞活性化でＴｏｂの役目、ＴＣＲ活性化、Ｔ細胞受容体及びＣＤ３複合体の開始でＬｃｋ及びＦｙｎチロシンキナーゼ、Ｔヘルパー細胞表面分子、ＮＫ細胞及びＢ細胞受容体複合体でＮＯ２依存的ＩＬ１２経路）、特にＴ細胞関連免疫反応に関連した遺伝子セットで最も有意的な差異を示す。Ｍ２＿５及びＭ３＿３クラスタを使用して作った２個のクラスの予後的差異に影響を与える生物学的特徴に原因となる２つの主要生物学的特徴を想起させる（図９ｂ）。
【０１０６】
〈実施例５〉予後危険度評点システムの生成
ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ後各クラスで作った死亡率と２個の分類群Ｍ３＿３及びＭ２＿５の予測された結果で患者を配列するとき、或る患者は、分類群及び機能的遺伝子分類で定義されたクラスタのタイプによって異なるクラスに分類されることを知見した。したがって、特徴または分類群の特定タイプに基づく分類及び予後予測は、たとえ定義されたクラスがｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔの予後比較において統計的有意を示すとしても、完全に予後結果を示すものではなかった（図１０ａ）。主に胃癌患者の複雑な生物学的特徴に起因し、胃癌患者の予後結果に影響を与える生物学的または生理学的特徴のすべての側面を考慮することが重要であることを暗示する。
【０１０７】
したがって、次に各機能的遺伝子分類の予後結果の差異に原因となる主要生物学的特徴を反映するために、機能的遺伝子分類で予後的差異に原因となる遺伝子を調査した。Ｃｏｘ回帰分析で統計的有意（ｐ＜０．００１）を有する５１個の遺伝子を選別し、予後危険度評点システムの百分率を作るのに使用した（表２）。予後プローブは、ＣＧＡＰで注釈がついたプローブからＣｏｘ回帰分析（ｐ＜０．００１）によって選択された。
【０１０８】
【表２】
0006280206.tif 000003
【０１０９】
全体患者（ｎ＝１５８）において２１名の患者は、５０％以上の危険度点数を示す危険度評点システムの百分率に基づいて高危険群と指定した。高危険群患者に対する死亡率は、全体サンプルで６１．９％を示し、極めて高かく、２個のデータセット患者は、非常に類似な臨床結果を示す（ＹＵＳＨ：５４．５％死亡率、ＭＤＡＣＣ：７０％死亡率）。
【０１１０】
７０名の患者を中間危険群（２５％以上〜５０％未満の危険度点数）と指定し、中間危険群に対する死亡率は、２０％であった。ＹＵＳＨデータセットに対する臨床結果は、ＹＵＳＨ患者に対する２５％の死亡率を示すＭＤＡＣＣデータ患者より若干悪いのに対し、ＭＤＡＣＣデータ患者に対しては、１６％の死亡率を示した。総６７名の患者は、低危険群と指定し、全体サンプルデータで７．４５％の死亡率を示した。ＹＵＳＨデータ患者は、９％の死亡率を有するＭＤＡＣＣデータ患者と比べて若干さらに良い予後を示す５．７％の死亡率を示した（図１０ｂ〜図１０ｄ）。
【０１１１】
予後的差異は、明白に３個の異なる危険群は、全体データセットでｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでｐ値が１．３６ｅ−０７と非常に強力な統計的有意を示す。ＹＵＳＨデータセットは、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでｐ値が０．００２５４を示し、ＭＤＡＣＣデータセットは、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔでｐ値が１．１１ｅ−０５を示した（図１０ｅ〜図１０ｆ）。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、胃癌再発予後予測分野において診断キットとして使用することができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
0006280206.tif 000031
【図７ｈ】
0006280206.tif 000032
【図７ｉ】
0006280206.tif 000033
【図８ａ】
0006280206.tif 000034
【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
0006280206.tif 000040
【図８ｈ】
0006280206.tif 000041
【図８ｉ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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