(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺組織試料における遺伝子産物の発現レベルを対象における甲状腺がんの指標とする方法であって、
（ａ）該対象から得た甲状腺組織試料における遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、該遺伝子産物が、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子によって発現される遺伝子産物からなる、ステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された該発現レベルと該甲状腺組織試料における甲状腺がんの有無とを相関させることにより、該甲状腺組織試料ががん性であるか良性であるかを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記甲状腺組織試料と正常対照発現レベルの間で前記遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記甲状腺組織試料において、前記正常対照発現レベルと比較した、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、および／もしくはＸＢ−１３０遺伝子のうちの１つもしくは複数の発現レベルの低下、ならびに／またはＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子、および／もしくはＣＣＲ７遺伝子のうちの１つもしくは複数の発現レベルの上昇に基づいて、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定され、発現が増加または減少した遺伝子の総数が少なくとも３である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記甲状腺組織試料とがん対照発現レベルの間で前記遺伝子産物の発現レベルに実質的な差異がない場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）の前記相関させることが、前記発現レベルを、以下の２種の生物学的試料のセット：
（ｉ）複数の正常な甲状腺組織試料；および
（ｉｉ）複数のがん性甲状腺組織試料
における前記遺伝子産物について決定された遺伝子発現データと比較することを含み、
前記甲状腺組織試料と（ｉ）の遺伝子発現データの間で前記遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合、または、前記甲状腺組織試料と（ｉｉ）の遺伝子発現データの間で前記１種または複数の遺伝子産物の遺伝子発現レベルに実質的な差異がない場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）の前記相関させることを、非定型的なＣＴ値および／または非定型的でないＣＴ値を同定する分類子を使用して実施し、必要に応じて、前記分類子が、複数の正常な甲状腺組織試料および／またはがん性甲状腺組織試料からの遺伝子産物について決定された遺伝子発現データを使用して生成したものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子産物がＲＮＡまたはタンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）の前に、前記対象から得た甲状腺組織試料に対して細胞学的分析を実施するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記甲状腺組織試料が、
（ｉ）９２％以上の感度；
（ｉｉ）７０％以上の特異度；
（ｉｉｉ）６０％以上の陽性的中率；
（ｉｖ）９２％以上の陰性的中率；
（ｖ）２以上の陽性尤度比；
（ｖｉ）６０％以上の陽性検査後確率；
（ｖｉｉ）０．１４以下の陰性尤度比；または
（ｖｉｉｉ）７．０％以下の陰性検査後確率
でがん性であるか良性であるか同定される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
甲状腺がんを診断するためのキットであって、遺伝子産物を検出するための試薬を含み、該試薬のそれぞれは異なる遺伝子産物を検出し、該遺伝子産物が表１に列挙されている遺伝子によって発現される、キット。
【請求項１１】
前記試薬が
（ｉ）抗体であって、各抗体がポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する、抗体；および
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであって、各オリゴヌクレオチドが核酸遺伝子産物に特異的に結合する、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット
から選択される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
（ｉ）甲状腺組織試料を処理するための１種または複数の試薬；あるいは
（ｉｉ）１種または複数の対照遺伝子産物
をさらに含む、請求項１０また１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記甲状腺組織試料ががん性であると同定された対象が、放射線療法、化学療法、ホルモン療法または外科手術で処置されるべき対象であることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
甲状腺がんと診断された対象が、放射線療法、化学療法、ホルモン療法または外科手術で処置されるべき対象であることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
甲状腺組織試料における遺伝子産物の発現レベルを対象における甲状腺がんの指標とする方法であって、
（ａ）該対象から得た甲状腺組織試料における遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、該遺伝子産物が、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子によって発現される、ステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された該発現レベルと該甲状腺組織試料における甲状腺がんの有無とを相関させることにより、該甲状腺組織試料ががん性であるか良性であるかを同定するステップであって、該甲状腺組織試料が、９５％以上の感度で、かつ８０％以上の特異度で、がん性であるか良性であるか同定される、ステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記甲状腺組織試料が、７０％以上の陽性的中率で、かつ９２％以上の陰性的中率で、がん性であるか良性であるか同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子産物が、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子、ＨＯ−１およびＣＣＲ７遺伝子によって発現される遺伝子産物からなる、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／７３０，３９１号および２０１３年３月８日に出願された米国仮特許出願第６１／７７５，４１９号の優先権を請求する。これらの出願は、それらの全体が本明細書により参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、また、本明細書によって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＭＲＣ＿００１＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約５７ＫＢであり、２０１３年１１月２６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
分野
本発明は、甲状腺がんを診断するため、および甲状腺結節を評価して、それらが良性であるかがん性であるかを決定するための組成物および方法に関する。
【０００４】
関連技術の説明
米国では毎年およそ３５０，０００件の甲状腺結節の細針穿刺吸引（ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）（ＦＮＡ）生検が実施されており、そのうちの２０％が、結節ががん性であるか否かに関して不確定であると報告されている。これらの患者は、ほとんどの場合、たった１５〜３０％の範囲にしか及ばないであるがんのリスクを考慮して外科手術を受ける。これは、大部分の患者には甲状腺の外科的除去が必要ではないことを意味する。甲状腺外科手術に付随する急性のリスクおよび長期のリスク、ならびに患者および医療制度に関する費用を考慮すると、甲状腺ＦＮＡ生検の診断の正確度を改善するツールの差し迫った必要性が存在する。
【０００５】
最近、米国の市場において、不確定の甲状腺結節の診断を種々の程度に改善する新しい検査法が発売された。これらとしては、１６７種の遺伝子に基づいた遺伝子発現分類子アッセイ（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ａｓｓａｙ）であるＡｆｉｒｍａ（登録商標）甲状腺ＦＮＡ分析検査（Ｖｅｒａｃｙｔｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられる。しかし、Ａｆｉｒｍａ（登録商標）検査では、症例の約５０％のみでしか外科的行為を正確に変化させないと思われる。２つの他の検査法として、Ｑｕｅｓｔ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓおよびＡｓｕｒａｇｅｎにより開発された検査法が挙げられ、これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎにより認められた公知のバイオマーカーの変異性分析に基づく。しかし、妥当な臨床試験による検証が不足している。残念ながら、Ａｆｉｒｍａ（登録商標）検査では多数のバイオマーカーの分析が要求され、全ての検査を中央検査室で実施しなければならず、また、試料を分析のために輸送する必要がある。さらに、これらのアッセイを実施するために適した試料を得るために第２のＦＮＡを実施しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当技術分野において、甲状腺結節を評価し、甲状腺がんを診断するための改善された方法および組成物が必要とされていることが明らかである。本発明は、細針穿刺吸引（ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）（ＦＮＡ）生検によっては不確定であることが報告された甲状腺結節を評価するための、新しい簡易化された診断的手法を提供することによって、この必要性を満たし、追加的な利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試料、例えば甲状腺組織試料または甲状腺結節試料における悪性または良性の組織の有無を決定するための組成物、方法およびキットを提供する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象における甲状腺がんを診断する方法であって、対象から得た甲状腺組織試料の３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、遺伝子産物の少なくとも１種が、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現される、ステップと、決定された発現レベルと甲状腺組織試料における甲状腺がんの有無とを相関させることにより、甲状腺組織試料ががん性であるか良性であるかを同定するステップとを含む、方法を提供する。種々の実施形態では、組織試料ががん性であるか良性であるかを決定するため、例えば、対象が例えば甲状腺がんなどのがんを有するかどうかを決定するために当該方法を使用する。
【０００９】
本発明の方法のある特定の実施形態では、相関させるステップを、３種以上の遺伝子産物の発現レベルを、遺伝子産物のそれぞれについて正常対照発現レベルと比較することによって実施し、甲状腺組織試料と正常対照発現レベルの間で３種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合に、当該甲状腺組織試料ががん性であると同定する。関連する実施形態では、甲状腺組織試料と正常対照発現レベルの間で４種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合に、当該甲状腺組織試料ががん性であると同定する。ある特定の実施形態では、正常対照発現レベルは正常な甲状腺組織試料における発現レベルであり、他方である特定の実施形態では、正常対照発現レベルは複数の正常な甲状腺組織試料における発現レベルに基づく所定の値である。本発明の方法のある特定の実施形態では、甲状腺組織試料において、正常対照発現レベルと比較して、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１１遺伝子、ＳＰＡＧ−９遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、Ｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子および／もしくはＣＸＣＬ４遺伝子の任意の１つもしくは複数の発現レベルが低下しており、かつ／またはＣＸＣＲ３Ａ遺伝子、ＣＸＣＲ３Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、および／もしくはＣＣＲ７遺伝子の任意の１つもしくは複数の発現レベルが上昇している場合に、甲状腺組織試料が悪性またはがん性であると同定され、発現が増加または減少した遺伝子の総数は少なくとも３である。
【００１０】
本発明の方法のある特定の実施形態では、相関させるステップを、各遺伝子産物について３種以上の遺伝子産物の発現レベルをがん対照発現レベルと比較することによって実施し、甲状腺組織試料とがん対照発現レベルの間で３種以上の遺伝子産物の発現レベルに実質的な差異がない場合に、当該甲状腺組織試料ががん性であると同定する。特定の実施形態では、甲状腺組織試料とがん対照発現レベルの間で４種以上の遺伝子産物の発現レベルに実質的な差異がない場合に、当該甲状腺組織試料ががん性であると同定する。ある特定の実施形態では、がん対照発現レベルは、がん性甲状腺組織試料における発現レベルである。特定の実施形態では、がん対照発現レベルは、複数のがん性甲状腺組織試料における発現レベルに基づく所定の値である。
【００１１】
本発明の方法のある特定の実施形態では、相関させるステップは、発現レベルを、以下の２種の生物学的試料のセット：（ｉ）複数の正常な甲状腺組織試料；および（ｉｉ）複数のがん性甲状腺組織試料、における３種以上の遺伝子産物について決定された遺伝子発現データと比較することを含み、甲状腺組織試料と（ｉ）の遺伝子発現データの間で３種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合、または、甲状腺組織試料と（ｉｉ）の遺伝子発現データの間で１種または複数の遺伝子産物の遺伝子発現レベルに実質的な差異がない場合に、甲状腺組織試料ががん性であると同定する。
【００１２】
本発明の方法の特定の実施形態では、相関させるステップを、非定型的なＣＴ値および／または非定型的でないＣＴ値を同定する分類子を使用して実施する。ある特定の実施形態では、分類子は、複数の正常な甲状腺組織試料および／またはがん性甲状腺組織試料からの３種以上の遺伝子産物について決定された遺伝子発現データを使用して生成したものであった。
【００１３】
本発明の方法の特定の実施形態では、甲状腺組織試料は、針穿刺吸引、細針穿刺吸引、コア針生検、吸引生検、ラージコア生検、切開生検、切除生検、またはパンチ生検によって得たものであった。
【００１４】
本発明の方法の種々の実施形態では、遺伝子産物は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ発現レベルは、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲまたはｑＮＰＡを使用して決定される。本発明の種々の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ある特定の実施形態では、タンパク質の遺伝子発現は、ＥＬＩＳＡ、質量分光測定（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）、ブロッティング、プロテオミクス技法、または免疫組織化学的検査を使用して決定される。
【００１５】
本発明の方法、組成物およびキットの種々の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの３種以上の遺伝子産物；ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる。これらの遺伝子セットのいずれかに関連する方法、組成物およびキットの特定の実施形態では、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１１遺伝子、ＳＰＡＧ−９遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、Ｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子および／もしくはＣＸＣＬ４遺伝子の発現レベルが低下し、かつ／またはＣＸＣＲ３Ａ遺伝子、ＣＸＣＲ３Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子および／もしくはＣＣＲ７遺伝子の発現レベルが上昇する。したがって、特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、およびＸＢ１３０遺伝子のうちの１つ以上、２つ以上、または全ての発現レベルが低下し、かつ／またはＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または全ての発現レベルが上昇する。他の特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＸＣＲ３遺伝子およびＣＡＲ遺伝子のうちの一方または両方の発現レベルが低下し、かつ／またはＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または全ての発現レベルが上昇する。他の特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の１つ以上または両方の発現レベルが低下し、かつ／またはＣＣＲ３遺伝子およびＴＩＭＰ−１遺伝子の１つ以上または両方の発現レベルが上昇する。他の特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＡＲ遺伝子の発現レベルが低下し、かつ／またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子のうちの１つ以上、２つ以上、または全ての発現レベルが上昇する。他の特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＡＲ遺伝子の発現レベルが低下し、かつ／またはＴＩＭＰ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の１つ以上または両方の発現レベルが上昇する。他の特定の実施形態では、３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなり、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上または全ての発現レベルが上昇する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、対象から得た甲状腺組織試料に対して細胞学的分析を実施して予備診断を得るステップをさらに含む。特定の実施形態では、予備診断が中間または不確定である試料を、本発明の方法に従って遺伝子産物発現レベルを決定し、それらを良性または悪性の組織と相関させることによってさらに分析する。特定の実施形態では、細胞学的に分析する組織試料と遺伝子産物発現レベルの決定に使用する組織試料は同じ組織試料である。本発明の方法のある特定の実施形態では、組織試料を細針穿刺吸引によって得た。
【００１７】
本発明の方法、組成物、またはキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料は９２％以上または９７％以上の感度でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は６０％以上または９０％以上の特異度でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は５０％以上または９０％以上の陽性的中率でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は９２％以上または９４％以上の陰性的中率でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は２以上または１０以上の陽性尤度比でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は５０％以上または８０％以上の陽性検査後確率でがん性であるか良性であるか診断され、甲状腺組織試料は０．１４以下または０．０８以下の陰性尤度比でがん性であるか良性であるか診断され、および／または甲状腺組織試料は７．０％以下または３．０％以下の陰性検査後確率でがん性であるか良性であるか診断される。
【００１８】
本発明の方法の特定の実施形態は、甲状腺組織試料を対象から得るステップをさらに含む。
【００１９】
本発明の方法の特定の実施形態は、甲状腺組織試料ががん性であると診断された場合に、対象の甲状腺またはその一部を外科的に除去するステップをさらに含む。
【００２０】
関連する実施形態では、本発明は、甲状腺がんを診断するためのキットであって、遺伝子産物を検出するための３種以上の試薬を含み、３種以上の試薬のそれぞれは異なる遺伝子産物を検出し、遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現される、キットを含む。ある特定の実施形態では、試薬は抗体であり、各抗体はポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであり、各オリゴヌクレオチドは核酸遺伝子産物に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、試薬はそれぞれ基質に付着している。特定の実施形態では、試薬は基質に共有結合によって付着している。特定の実施形態では、試薬はそれぞれ固体基質の別々の領域に付着している。特定の実施形態では、試薬は固体基質と共有結合したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであり、固体基質は必要に応じてアレイであり、アレイは必要に応じてマイクロアレイである。特定の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドのセットであり、オリゴヌクレオチドのセットはＤＮＡを含む。特定の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドのセットであり、オリゴヌクレオチドのセットのそれぞれは遺伝子産物のうちの１つに特異的にハイブリダイズする。一実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットのそれぞれは、遺伝子産物のうちの１つをＰＣＲ増幅することができる増幅プライマーを含む。本発明の種々のキットのある特定の実施形態では、遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの３種以上の遺伝子産物；ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる。
【００２１】
本発明の方法、組成物およびキットのある特定の実施形態では、試薬は標識されている。特定の実施形態では、本発明のキットは、前記試薬を前記遺伝子産物に結合させるために適した１種または複数の溶液をさらに含む。本発明のキットのある特定の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドのセットであり、キットは、ＰＣＲアッセイを実施するための１種または複数の追加的な試薬をさらに含む。特定の実施形態では、１種または複数の追加的な試薬は、耐熱性ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドの混合物、および検出可能に標識されたプローブから選択される。ある特定の実施形態では、検出可能に標識されたプローブは、フルオロフォア部分およびクエンチング部分を含む。特定の実施形態では、検出可能に標識されたプローブは切断されると検出可能なシグナルを放出するが、プローブがインタクトである場合には放出されない。
【００２２】
本発明のキットの種々の実施形態では、キットは、甲状腺組織試料を処理するための１種または複数の試薬をさらに含む。特定の実施形態では、甲状腺組織試料の処理は、遺伝子産物を甲状腺組織試料から抽出することを含み、ある特定の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質または核酸である。
【００２３】
種々の実施形態では、本発明のキットは、１種または複数の対照遺伝子産物をさらに含む。
【００２４】
本発明のキットの特定の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数（キット中に存在する場合）は、別々の容器内に存在する：遺伝子産物を検出するための試薬、溶液、任意の追加的な試薬、および対照遺伝子産物。
【００２５】
他の関連する実施形態では、本発明は、甲状腺がんを処置する方法であって、本発明の方法に従って、または本発明のキットを使用して、対象から得た甲状腺組織試料ががん性であると同定するステップと、対象の甲状腺またはその一部を外科的に除去する、または対象に対して放射線療法、化学療法、またはホルモン療法を実施するステップを含む方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
対象における甲状腺がんを診断する方法であって、
（ａ）該対象から得た甲状腺組織試料の３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、該３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、該遺伝子産物の少なくとも１種が、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現される、ステップと、
（ｂ）（ａ）において決定された該発現レベルと該甲状腺組織試料における甲状腺がんの有無とを相関させることにより、該甲状腺組織試料ががん性であるか良性であるかを同定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
（ｂ）の前記相関させることを、前記３種以上の遺伝子産物の発現レベルを各遺伝子産物について正常対照発現レベルと比較することによって実施し、前記甲状腺組織試料と該正常対照発現レベルの間で前記３種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記甲状腺組織試料と前記正常対照発現レベルの間で４種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記正常対照発現レベルが、正常な甲状腺組織試料における発現レベルである、項目２または項目３に記載の方法。
（項目５）
前記正常対照発現レベルが、複数の正常な甲状腺組織試料における発現レベルに基づく所定の値である、項目２または項目３に記載の方法。
（項目６）
前記甲状腺組織試料において、前記正常対照発現レベルと比較して、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１１遺伝子、ＳＰＡＧ−９遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、Ｎｅｃｔｉｎ−１遺伝子、ＸＢ−１３０遺伝子および／もしくはＣＸＣＬ４遺伝子の任意の１つもしくは複数の発現レベルが低下している、かつ／またはＣＸＣＲ３Ａ遺伝子、ＣＸＣＲ３Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ−１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、および／もしくはＣＣＲ７遺伝子の任意の１つもしくは複数の発現レベルが上昇している場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定され、発現が増加または減少した遺伝子の総数が少なくとも３である、項目２から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
（ｂ）の前記相関させることを、各遺伝子産物について前記３種以上の遺伝子産物の発現レベルをがん対照発現レベルと比較することによって実施し、前記甲状腺組織試料と前記がん対照発現レベルの間で前記３種以上の遺伝子産物の発現レベルに実質的な差異がない場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記甲状腺組織試料と前記がん対照発現レベルの間で４種以上の遺伝子産物の発現レベルに実質的な差異がない場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記がん対照発現レベルが、がん性甲状腺組織試料における発現レベルである、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記がん対照発現レベルが、複数のがん性甲状腺組織試料における発現レベルに基づく所定の値である、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１１）
（ｂ）の前記相関させることが、前記発現レベルを、以下の２種の生物学的試料のセット：
（ｉ）複数の正常な甲状腺組織試料；および
（ｉｉ）複数のがん性甲状腺組織試料
における前記３種以上の遺伝子産物について決定された遺伝子発現データと比較することを含み、
前記甲状腺組織試料と（ｉ）の遺伝子発現データの間で前記３種以上の遺伝子産物の発現レベルに差異がある場合、または、前記甲状腺組織試料と（ｉｉ）の遺伝子発現データの間で前記１種または複数の遺伝子産物の遺伝子発現レベルに実質的な差異がない場合に、前記甲状腺組織試料ががん性であると同定する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
（ｂ）の前記相関させることを、非定型的なＣＴ値および／または非定型的でないＣＴ値を同定する分類子を使用して実施する、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記分類子が、複数の正常な甲状腺組織試料および／またはがん性甲状腺組織試料からの３種以上の遺伝子産物について決定された遺伝子発現データを使用して生成したものである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記甲状腺組織試料が、針穿刺吸引、細針穿刺吸引、コア針生検、吸引生検、ラージコア生検、切開生検、切除生検、またはパンチ生検によって得たものである、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記遺伝子産物がＲＮＡである、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＮＡがｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ＲＮＡ発現レベルが、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、分子バーコーディング技法、ＴＲＡＣ、ＰＣＲアレイ、マルチプレックスｑＰＣＲまたはｑＮＰＡを使用して決定される、項目１５または項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記遺伝子産物がタンパク質である、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質の遺伝子発現が、ＥＬＩＳＡ、質量分光測定、ブロッティング、プロテオミクス技法、または免疫組織化学的検査を使用して決定される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記３種以上の遺伝子産物が、
（ｉ）ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの３種以上の遺伝子産物；
（ｉｉ）ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
（ｉｉｉ）ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；
（ｉｖ）ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
（ｖ）ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；または
（ｖｉ）ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物
を含む、またはそれからなる、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
（ａ）の前に、前記対象から得た甲状腺組織試料に対して細胞学的分析を実施して予備診断を得るステップをさらに含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
予備診断が中間または不確定である試料をステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の方法によってさらに分析する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
細胞学的に分析する組織試料と前記（ａ）において使用する組織試料が同じ組織試料である、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記組織試料が細針穿刺吸引によって得たものである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記甲状腺組織試料が、９２％以上または９７％以上の感度でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記甲状腺組織試料が、６０％以上または９０％以上の特異度でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記甲状腺組織試料が、５０％以上または９０％以上の陽性的中率でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記甲状腺組織試料が、９２％以上または９４％以上の陰性的中率でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記甲状腺組織試料が、２以上または１０以上の陽性尤度比でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記甲状腺組織試料が、５０％以上または８０％以上の陽性検査後確率でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記甲状腺組織試料が、０．１４以下または０．０８以下の陰性尤度比でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記甲状腺組織試料が、７．０％以下または３．０％以下の陰性検査後確率でがん性であるか良性であるか診断される、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記甲状腺組織試料を前記対象から得るステップをさらに含む、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記甲状腺組織試料ががん性であると診断された場合に、前記対象の甲状腺またはその一部を外科的に除去するステップをさらに含む、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
甲状腺がんを診断するためのキットであって、遺伝子産物を検出するための３種以上の試薬を含み、該３種以上の試薬のそれぞれは異なる遺伝子産物を検出し、該遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現される、キット。
（項目３６）
前記試薬が抗体であり、各抗体がポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
前記試薬がオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであり、各オリゴヌクレオチドが核酸遺伝子産物に特異的に結合する、項目３５に記載のキット。
（項目３８）
前記試薬がそれぞれ基質に付着している、項目３５から３７のいずれか一項に記載のキット。
（項目３９）
前記試薬が前記基質に共有結合によって付着している、項目３８に記載のキット。
（項目４０）
前記試薬がそれぞれ固体基質の別々の領域に付着している、項目３８または項目３９に記載のキット。
（項目４１）
前記試薬が固体基質と共有結合したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであり、前記固体基質が必要に応じてアレイであり、該アレイが必要に応じてマイクロアレイである、項目３５および項目３７から４０のいずれか一項に記載のキット。
（項目４２）
前記試薬がオリゴヌクレオチドのセットであり、該オリゴヌクレオチドのセットがＤＮＡを含む、項目３５または項目３７に記載のキット。
（項目４３）
前記試薬がオリゴヌクレオチドのセットであり、オリゴヌクレオチドのセットのそれぞれが前記遺伝子産物のうちの１つに特異的にハイブリダイズする、項目３５または項目３７に記載のキット。
（項目４４）
オリゴヌクレオチドのセットのそれぞれが、前記遺伝子産物のうちの１つをＰＣＲ増幅することができる増幅プライマーを含む、項目４３に記載のキット。
（項目４５）
前記遺伝子産物が、
（ｉ）ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの３種以上の遺伝子産物；
（ｉｉ）ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
（ｉｉｉ）ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；
（ｉｖ）ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
（ｖ）ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；または
（ｖｉ）ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物
を含む、またはそれからなる、項目３５から４４のいずれか一項に記載のキット。
（項目４６）
前記試薬が標識されている、項目３５から４５のいずれか一項に記載のキット。
（項目４７）
前記試薬を前記遺伝子産物に結合させるために適した１種または複数の溶液をさらに含む、項目４３から４７のいずれか一項に記載のキット。
（項目４８）
前記試薬がオリゴヌクレオチドのセットであり、前記キットが、ＰＣＲアッセイを実施するための１種または複数の追加的な試薬をさらに含む、項目４６または項目４７に記載のキット。
（項目４９）
前記１種または複数の追加的な試薬が、耐熱性ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドの混合物、および検出可能に標識されたプローブから選択される、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
前記検出可能に標識されたプローブが、フルオロフォアおよびクエンチング部分を含む、項目４９に記載のキット。
（項目５１）
前記検出可能に標識されたプローブが切断されると、該プローブが検出可能なシグナルを放出するが、該プローブがインタクトである場合には放出されない、項目４９または項目５０に記載のキット。
（項目５２）
甲状腺組織試料を処理するための１種または複数の試薬をさらに含む、項目３５から５１のいずれか一項に記載のキット。
（項目５３）
前記甲状腺組織試料の前記処理が、前記遺伝子産物を前記甲状腺組織試料から抽出することを含む、項目５２に記載のキット。
（項目５４）
前記遺伝子産物がタンパク質または核酸である、項目５３に記載のキット。
（項目５５）
１種または複数の対照遺伝子産物をさらに含む、項目３５から５４のいずれか一項に記載のキット。
（項目５６）
遺伝子産物を検出するための前記試薬、前記溶液、前記追加的な試薬、および前記対照遺伝子産物のうちの１つまたは複数が別々の容器内に入った、項目３５から５５のいずれか一項に記載のキット。
（項目５７）
甲状腺がんを処置する方法であって、
（ａ）項目１から３４のいずれか一項に記載の方法に従って、または項目３５から５６のいずれか一項に記載のキットを使用して、前記対象から得た甲状腺組織試料ががん性であると同定するステップと、
（ｂ）前記対象の甲状腺またはその一部を外科的に除去する、または前記対象に対して放射線療法、化学療法、またはホルモン療法を実施するステップと
を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、定量的リアルタイムＰＣＲによって決定し、Ｐｆａｆｆｌによって提唱された相対的な定量化モデルによって分析した、がん試料（１００）と良性結節（５６）の間での１８種の遺伝子の示差的発現を示すグラフである。値ゼロは良性結節の遺伝子発現に対応し、棒は、がん試料における遺伝子発現の変動（相対的な倍率変化）に対応する。１８種の遺伝子は実施例１において同定される。
【００２７】
【図２】図２は、実施例１において同定される１８種の個々の遺伝子のそれぞれの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線データを提供する表である。ＡＵＣ：曲線下面積、ＦＰ：偽陽性、ＴＰ：真陽性。
【００２８】
【図３】図３は、新しい分類子を開発するための異なるアルゴリズムの作成に使用した方法（３Ａ）および使用（３Ｂ）の概略図である。２つの異なるアルゴリズムを訓練した；１つは非定型的な（外れ値）ＣＴ値を同定し、分類するためのものであり、１つは非定型的でないＣＴ値を分類するためのものであった（線形判別分析および非線形判別分析）（３Ａ）。アルゴリズムを二段階で逐次的に使用し、その後、出力データを組み込んで新しい分類子を開発することによって、新しい分類子を開発する（３Ｂ）。
【００２９】
【図４】図４は、非定型的なＣＴ値の同定および分類、その後の線形判別分析（ＬＤＡ）または非線形判別分析（ＮＬＤＡ）によって開発した新しい分類子のＲＯＣ曲線グラフである。ＡＵＣ：曲線下面積、ＦＰ：偽陽性、ＴＰ：真陽性。
【００３０】
【図５】図５は、図３に記載されている方法の後の、新しい分類子（ＳＶ）のＡＵＣと最良の個々の遺伝子分類子およびそれらの組合せ（遺伝子１０、１１、１２）のＡＵＣとの比較を提供する図である。＊は、ｐ値＜０．０５に対応し、ＳＶ分類子が個々の遺伝子またはそれらの組合せよりも有意に優れていることが示されている。
【００３１】
【図６】図６は、最良の個々の分類遺伝子のスピアマン相関分析を示すグラフである。これらが密接に関連することが示されており、それらの組合せによりそれらの遺伝子分類子としての性能が改善されない理由が説明されている。
【００３２】
【図７】図７は、訓練セットを用いて開発した３種の新しい分類子（ＳＶ、ＦＭ７２、ＦＭ２０８）、最良の個々の遺伝子（遺伝子１０、遺伝子１１、遺伝子１２）、最良の遺伝子の組合せ（遺伝子（１０、１１、１２））およびＶｅｒａｃｙｔｅ（Ａｆｆｉｒｍａ）によるＡｆｉｒｍａ（登録商標）分類子の分類性能の比較表である。
【００３３】
【図８】図８は、ＳＶ分類子を使用して独立した検定セットと訓練セットの性能を比較したＲＯＣ曲線グラフおよびデータである。
【００３４】
【図９】図９は、外科的試料およびＦＮＡ試料に対してＳＶアルゴリズムを使用して得られた感度、特異度、ＰＰＶ値およびＮＰＶ値を示す比較表である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本発明は、甲状腺試料を悪性または良性に正確に分類することを可能にする遺伝子およびその種々のサブコンビネーションの小さなパネルを同定することに部分的に基づく。本発明に従って使用する遺伝子の組合せにより、個々の遺伝子または以前に記載された遺伝子の組合せの使用と比較して、甲状腺結節を分類する能力の驚くべき改善がもたらされる。さらに、遺伝子パネルにより、以前に利用可能な遺伝子セットおよび関連する方法と比較して優れた診断結果および分類結果がもたらされる。例えば、本発明の遺伝子セットおよび方法は、Ａｆｉｒｍａ（登録商標）遺伝子分類子よりもよい予測可能性および信頼度を示す。本発明の遺伝子セットを二相の段階的なアルゴリズムと共に使用することにより、集団の遺伝子プロファイルの発現の変動を考慮に入れて、オーバーフィット（ｏｖｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）が回避され、外れ値遺伝子プロファイルを有する患者を適切に分類することができる。さらに、本発明の小さな遺伝子パネルにより、病理検査室に配布することができるキットが可能になり、したがって、診断プロセスが単純化および迅速化されるだけでなく費用も低減する。小さな遺伝子パネルの別の利点は、必要な組織試料の量が減少し、元のＦＮＡ試料から十分なｍＲＮＡを抽出することが潜在的に可能になり、したがって、患者を第２のＦＮＡに供することが回避される。
【００３６】
以下の説明では、本発明の種々の実施形態の完全な理解をもたらすために、ある特定の具体的な詳細が記載されている。しかし、当業者には、これらの詳細を伴わずに本発明を実施することができることが理解されよう。
【００３７】
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語を下で定義する。
【００３８】
「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」という単語は、特に記載がなければ１つまたは複数を示す。
【００３９】
「約」とは、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％程度変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。「約」という用語と併せて使用される数値に関して考察されているいずれの実施形態でも、約という用語を省略できることが具体的に意図されている。
【００４０】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する任意のポリヌクレオチド配列を意味する。対照的に、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しない任意のポリヌクレオチド配列を指す。
【００４１】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語およびその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、制限のない包括的な意味で、すなわち、「これだけに限定されないが、これを含めた」と解釈されるべきである。
【００４２】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句に続くいかなるものも含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在してはならないことを示す。
【００４３】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その句の後に列挙されている要素をいずれも含み、かつ、列挙されている要素に関して本開示で特定されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在する場合もあり、存在しない場合もあることを示す。
【００４４】
「低下した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」または「低減した（ｌｅｓｓｅｒ）」量とは、典型的には、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１分の１、約１．２分の１、約１．３分の１、約１．４分の１、約１．５分の１、約１．６分の１、約１．７分の１、約１．８分の１、約１．９分の１、約２分の１、約２．５分の１、約３分の１、約３．５分の１、約４分の１、約４．５分の１、約５分の１、約６分の１、約７分の１、約８分の１、約９分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約３０分の１、約４０分の１、または約５０分の１またはそれ以下（例えば、１００分の１、５００分の１、１０００分の１）（１を超える全ての整数およびその間の少数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である低下／減少を含んでよい。
【００４５】
本明細書全体を通して「ある実施形態」または「一実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して各所に現れる「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で１つまたは複数の実施形態に組み合わせることができる。
【００４６】
「遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝の単位を意味し、転写調節配列および／または翻訳調節配列ならびに／あるいはコード領域および／または非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）配列）からなる。
【００４７】
「上昇／増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、典型的には、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍またはそれ以上（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）（１を超える全ての整数およびその間の少数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４などを含む）である上昇／増加を含んでよい。
【００４８】
「単離された」とは、材料のネイティブな状態では通常それに付随する成分を、実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、その天然に存在する状態ではそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常その断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を包含する。あるいは、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド分子の、その天然の細胞の環境から、および細胞の他の成分との関連からのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離および／または精製を包含する、すなわち、ペプチドまたはポリペプチド分子はｉｎ  ｖｉｖｏの物質と有意に関連しない。
【００４９】
「ｍＲＮＡ」または時には「ｍＲＮＡ転写物」と称される用語は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、ｍＲＮＡ前駆体転写物（複数可）、転写プロセシング中間体、遺伝子（複数可）の翻訳および転写の準備ができた成熟ｍＲＮＡ（複数可）、またはｍＲＮＡ転写物（複数可）に由来する核酸を包含する。転写プロセシングは、スプライシング、編集および分解を含んでよい。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ転写物に由来する核酸とは、そのｍＲＮＡ転写物またはその部分配列の合成が最終的には鋳型としての機能を果たした核酸を指す。ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは全てｍＲＮＡ転写物に由来し、そのような得られた産物を検出することにより、試料中の元の転写物の存在および／または存在量が示される。したがって、ｍＲＮＡに由来する試料としては、これだけに限定されないが、遺伝子（複数可）のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
「から得た」とは、例えば、組織、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの試料が、所望の生物（例えば、対象）、または所望の生物内の特定の組織などの特定の供給源から単離されたもの、またはそれに由来するものであることを意味する。例えば、組織試料を対象から得ることもでき、またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドを対象から直接単離された組織または生体液から得ることもできる。「に由来する」または「から得た」とは、組織またはポリペプチド配列もしくはポリヌクレオチド配列の供給源を指す場合もある。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」との記載は、本明細書で使用される場合は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを示す。この用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態の、長さが少なくとも１０塩基であるポリマーの形態のヌクレオチドを指す。この用語は、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。当業者に理解される通り、種々の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現する、または発現するように適応させることができるゲノム配列、ゲノム外（ｅｘｔｒａ−ｇｅｎｏｍｉｃ）配列およびプラスミドにコードされる配列およびより小さな操作された遺伝子セグメントなどを含んでよい。そのようなセグメントは、天然に単離することもでき、人間の手によって合成的に改変することもできる。本発明のポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、その結果、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を使用することができることが意図されており、全長は意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける調製の容易さおよび使用によって限定されることが好ましい。
【００５２】
「ポリヌクレオチドバリアント」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列または下で定義されているストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。この用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドから区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失した、または異なるヌクレオチドと置き換えられたポリヌクレオチドを包含する。この点について、当技術分野では、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含めたある特定の変更を行うことができ、それにより、変更されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持する、または参照ポリヌクレオチドに関して活性の増大を有する（すなわち、最適化される）ことがよく理解されるであろう。ポリヌクレオチドバリアントとしては、例えば、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％（ならびに少なくとも５１％から少なくとも９９％および中間の全ての整数のパーセンテージ、例えば、９０％、９５％、または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語は、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよびこれらの酵素をコードするオルソログも包含する。
【００５３】
「配列同一性」、または、例えば「〜と５０％同一の配列」を含む記載は、本明細書で使用される場合、比較のウィンドウにわたる、ヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに基づいて、配列が同一性である程度を示す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較のウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出することができる。
【００５４】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の関係を説明するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さがヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて少なくとも１２単量体単位であるが、１５〜１８単量体単位であることも多く、多くの場合、少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれが（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所的な領域を同定および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較される、少なくとも６つ、通常は約５０〜約１００、より通常には約１００〜約１５０の連続した位置の概念的なセグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピュータによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または、選択された種々の方法のいずれかによって生成した検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い相同性のパーセンテージを生じる）によって行うことができる。プログラムのＢＬＡＳＴファミリー、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁に開示されているものに対する参照を行うこともできる。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８年、１５章のＵｎｉｔ１９．３に見いだすことができる。
【００５５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマー、ならびにそのバリアントおよび合成類似体および天然に存在する類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよびそれらの天然に存在する化学的誘導体に当てはまる。
【００５６】
「対象」とは、本明細書で使用される場合、本発明に従って処置または診断することができる、症状を示しているまたは症状を示すリスクがある任意の動物を包含する。本発明の遺伝子産物のレベルをプロファイルすることが診断または他の目的のために望ましいものである対象も包含される。適切な対象（患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物または愛玩動物（例えば、ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類およびヒトを含めた哺乳動物が包含される。
【００５７】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、本明細書で使用される場合、疾患または状態、例えば甲状腺がんの症状または病態に対するあらゆる望ましい影響を包含し、処置される疾患または状態の１種または複数の測定可能なマーカーの最低限の変化または改善さえも包含し得る。「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患もしくは状態、またはそれに付随する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも包含しない。この処置を受けている対象は、それを必要とするあらゆる対象である。臨床的な改善の例示的なマーカーは当業者には明らかになろう。
【００５８】
「野生型」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物（例えば、細菌の種または株）、微生物（例えば、細菌の種または株）の特性を有する遺伝子または遺伝子産物、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団において最も頻繁に観察され、したがって、任意に設計される「正常な」または「野生型」形態のものである。
【００５９】
本発明の実施では、特にそれに反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学の方法および組換えＤＮＡ技法を使用し、その多くが例示するために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻＆ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、２００４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＢｕｚｄｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ編、２００９年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．（２００５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版、Ｈｏｂｏｋｅｎ  ＮＪ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版  ２０１０年）；Ｆａｒｒｅｌｌ，  Ｒ．、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（第３版  ２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．  Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（編集者）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）（１９８８年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３、４−２）、１８５５頁。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ編、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１年、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ  Ｒｅｆ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編、（２００２年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３）を参照されたい。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本発明の診断目的のために従来の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムを使用することができる。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、典型的には、本発明の方法の論理ステップを実施するための、コンピュータにより実行可能な命令を有するコンピュータ可読媒体を含む。適切なコンピュータ可読媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピュータにより実行可能な命令は、適切なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組合せで書かれていてよい。基本的なコンピュータによる生物学的方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７年）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ（編）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８年）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２０００年）およびＯｕｅｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｂｚｅｖａｎｉｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、第２版、２００１年）に記載されている。米国特許第６，４２０，１０８号を参照されたい。
【００６１】
ある特定の実施形態では、プローブの設計、データの管理、分析、および機器の操作などの種々の目的のために、種々のコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを使用することができる。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号を参照されたい。
【００６２】
診断アッセイ
本発明は、甲状腺腫瘍または甲状腺結節を良性またはがん性、すなわち悪性に分類することを可能にする、甲状腺がんの新規のバイオマーカーの同定に部分的に基づく。したがって、本発明は、対象が甲状腺がんを有するか否かを決定するために、対象から得た生物学的試料を分析するための診断アッセイおよび関連するキットを提供する。種々の実施形態では、本発明の方法およびキットを使用して、例えば、対象から得た生物学的試料における甲状腺がん細胞の有無を決定することにより、対象における甲状腺がんの有無を診断または検出する。特定の実施形態では、本発明の方法およびキットを使用して、以前に例えば細胞学的分析によって不確定であると診断された対象における甲状腺がんの有無を診断する。
【００６３】
甲状腺における異常な増殖により、良性またはがん性（すなわち悪性）のいずれかであり得る結節が形成される可能性がある。甲状腺がんとしては、少なくとも４つの異なる種類の甲状腺の悪性腫瘍：乳頭性、濾胞性、髄質性および未分化性が挙げられ、悪性の亜型としては、例えば、濾胞状癌（ＦＣ）、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、濾胞型乳頭癌（ＦＶＰＴＣ）、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、ハースル細胞癌（ＨＣ）、および甲状腺未分化癌（ＡＴＣ）が挙げられる。良性（非がん性）の甲状腺腫瘍または甲状腺結節の例としては、例えば、濾胞状腺腫（ＦＡ）、結節性過形成（ＮＨＰ）、リンパ球性甲状腺炎（ＬＣＴ）、およびハースル細胞腺腫（ＨＡ）が挙げられる。本発明の複数の態様では、甲状腺がんは、侵襲性がんである、または転移能を有するものであり、例えば、侵襲性の甲状腺髄様がんもしくは甲状腺濾胞がん、または転移能を有する甲状腺髄様がんもしくは甲状腺濾胞がんである。本発明の特定の実施形態では、甲状腺がんは甲状腺未分化癌（ＡＴＣ）である。「転移能」とは、がん細胞が最初の部位（すなわち甲状腺）から体内の他の部位に移動する能力または可能性を指す。本発明の方法を容易に使用して、適切な参照対照試料のパネルを利用することによってこれらの甲状腺のがん性腫瘍または非がん性状態のいずれかの有無の診断または検出することができることが当業者には理解されよう。
【００６４】
「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」または「診断的な（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」または「診断された（ｄｉａｇｎｏｓｅｄ）」という用語は、甲状腺がんなどの病理的な状態の存在または性質を同定すること、そのような状態が発生するリスクを特徴付けること、および／または治療に応答した病理的な状態の変化（または変化がないこと）を測定することを包含する。診断方法は、それらの感度および特異度が異なり得る。ある特定の実施形態では、診断アッセイの「感度」とは、検査陽性（「真陽性」のパーセント）である疾患を有する細胞、組織または対象のパーセンテージを指す。アッセイによって検出されなかった疾患を有する細胞、組織または対象は、一般には「偽陰性」と称される。疾患を有さず、アッセイにおいて検査陰性である細胞、組織または対象は「真陰性」と称され得る。ある特定の実施形態では、診断アッセイの「特異度」は１から偽陽性率を引いたものと定義され得、「偽陽性」率は、疾患を有さず、検査陽性である試料または対象の割合と定義される。特定の診断方法によって状態の決定的な診断をもたらすことはできない可能性があるが、当該方法によって診断に役立つ陽性指標がもたらされれば十分である。
【００６５】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の感度で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００６６】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の特異度で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００６７】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の陽性的中率で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００６８】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の陰性的中率で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００６９】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、１０以上、１５以上、２０以上、または２５以上の陽性尤度比で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００７０】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の陽性検査後確率で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００７１】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、０．２０以下、０．１８以下、０．１６以下、０．１４以下、０．１２以下、０．１０以下、０．０８以下、または０．０６以下の陰性尤度比で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００７２】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、１０．０％以下、９．０％以下、８．０％以下、７．０％以下、６．０％以下、５．０％以下、４．０％以下または３．０％以下の陰性検査後確率で、がん性であるか良性であるか診断される。
【００７３】
本発明の方法およびキットの特定の実施形態では、甲状腺組織試料または甲状腺結節試料は、９２％以上または９７％以上の感度および６０％以上または９０％以上の特異度で、がん性であるか良性であるか診断される。特定の実施形態では、ＡＵＣが０．９７よりも大きく、感度値と特異度値の両方が、それぞれ９２％以上および６０％以上である。特定の実施形態では、ＡＵＣが０．９７よりも大きく、感度値と特異度値の両方が、それぞれ９２％以上および９０％以上である。特定の実施形態では、ＡＵＣが０．９７よりも大きく、感度値と特異度値の両方が、それぞれ９７％以上および９０％以上である。
【００７４】
一部の実施形態では、本発明は、がん、例えば甲状腺がんを診断、同定、または分類する方法であって、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを得るステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定するステップとを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、がん、例えば甲状腺がんを診断、同定、分類、または診断する方法であって、生物学的試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを得るステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップとを含む方法を提供する。例えば、これは、生物学的試料中の甲状腺がんの存在を同定する（または除外する）ために、生物学的試料中の遺伝子産物の発現レベルを対照試料中の同じ遺伝子産物の発現レベルまたは参照値と相関させることによって行うことができる。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん、例えば甲状腺がんを診断、同定、または分類する方法であって、アッセイを実施して、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、当該２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含む。ある特定の実施形態では、当該方法は、生物学的試料ががん性または悪性であると決定された場合に、対象に対して外科手術、例えば甲状腺切除術を実施するステップをさらに含む。特定の実施形態では、遺伝子産物はＲＮＡであり、アッセイは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくは定量的ＰＣＲ、または、本明細書に記載の任意のアッセイを含めた、ＲＮＡの量もしくは発現レベルを測定するための任意の他のアッセイを含む。特定の実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドであり、アッセイは、免疫組織化学的検査アッセイ、または、本明細書に記載の任意のアッセイを含めた、ポリペプチドの量もしくは発現レベルを測定するための任意の他のアッセイを含む。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん、例えば甲状腺がんを診断、同定、または分類する方法であって、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料を対象から得るステップと、アッセイを実施して、生物学的試料中の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、当該２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含む。ある特定の実施形態では、当該方法は、生物学的試料ががん性または悪性であると決定された場合に、対象に対して外科手術、例えば甲状腺切除術を実施するステップをさらに含む。特定の実施形態では、遺伝子産物はＲＮＡであり、アッセイは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくは定量的ＰＣＲ、または、本明細書に記載の任意のアッセイを含めた、ＲＮＡの量もしくは発現レベルを測定するための任意の他のアッセイを含む。特定の実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドであり、アッセイは、免疫組織化学的アッセイ、または、本明細書に記載の任意のアッセイを含めた、ポリペプチドの量もしくは発現レベルを測定するための任意の他のアッセイを含む。
【００７７】
本明細書にさらに記載されている通り、特定の実施形態では、生物学的試料を、対象、例えば、がんを有する疑いがあるまたはがんを有するリスクがある対象から得た。発現が決定される遺伝子産物は本明細書に記載のものを含み、「遺伝子産物のセット」とも称することができる２種以上の遺伝子産物を含んでよい。がん、例えば甲状腺がんの有無を決定するために使用することができる本明細書に記載の遺伝子産物は、「バイオマーカー」とも称することができる。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明は、対象における甲状腺がんの有無を検出または診断する方法であって、対象から得た甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、当該２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップと、対象由来の生物学的試料について決定された発現レベルを甲状腺がんの有無と相関させることによって甲状腺組織試料ががん性であるか良性であるかを同定するステップとを含む方法を提供する。
【００７９】
本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、対象が甲状腺がんを有すると決定された場合に、対象に対して外科手術、例えば対象の甲状腺またはその一部の外科的除去（例えば、甲状腺切除術）を実施するステップであって、当該決定が本発明の診断方法のいずれかによって成されたものであるステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、それを必要とする対象を処置する方法は、アッセイを実施して、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップとを含む方法によって対象が甲状腺がんを有すると決定された場合に、対象に対して外科手術、例えば甲状腺切除術を実施するステップを含む。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含んだ。特定の実施形態では、当該方法は、例えば針生検または細針穿刺吸引によって対象から得た生物学的試料の細胞学的分析または組織化学的分析を実施することによって、対象が甲状腺がんを有するリスクがあると同定するステップをさらに含む。
【００８０】
関連する実施形態では、本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、対象が、がん、例えば甲状腺がんを有するかどうかを本発明の診断方法のいずれかによって決定するステップと、対象ががん、例えば甲状腺がんを有すると決定された場合に、外科手術、例えば対象の腫瘍またはその一部の外科的除去（例えば、甲状腺切除術）を実施するステップとを含む方法を含む。特定の実施形態では、それを必要とする対象を処置する方法は、（ｉ）アッセイを実施して、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップを含む方法によって、対象が甲状腺がんを有するかどうかを決定するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の結果により、対象ががん、例えば甲状腺がんを有するまたは有する可能性があることが示される場合に、対象に対して外科手術、例えば甲状腺切除術を実施するステップとを含む。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含む。特定の実施形態では、当該方法は、例えば針生検または細針穿刺吸引によって対象から得た生物学的試料の細胞学的分析または組織化学的分析を実施することによって、対象が甲状腺がんを有するリスクがあると同定するステップをさらに含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、（ｉ）対象から得た生物学的試料、例えば甲状腺試料に対して実施した本明細書に記載の診断アッセイの結果を要求または入手するステップと、（ｉｉ）診断アッセイの結果により、対象ががん、例えば甲状腺がんを有することが示される場合に、外科手術、例えば対象の腫瘍またはその一部の外科的除去（例えば、甲状腺切除術）を実施するステップとを含む方法を含む。特定の実施形態では、診断アッセイは、アッセイを実施して、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはその疑いがあると同定するステップとを含む。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、当該２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含む。特定の実施形態では、当該方法は、例えば針生検または細針穿刺吸引によって対象から得た生物学的試料の細胞学的分析または組織化学的分析の結果を要求または入手することによって対象が甲状腺がんを有するリスクがあると同定するステップをさらに含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象から得た生物学的試料に対して実施した最初の検査、例えば、甲状腺組織のＦＮＡが不確定であった場合に、対象が、がん、例えば甲状腺がんを有するかどうかを決定する方法を含み、当該方法は、対象から得た生物学的試料、例えば甲状腺試料に対して実施した本明細書に記載の診断アッセイを実施、要求またはその結果を入手するステップを含む。特定の実施形態では、診断アッセイは、アッセイを実施して、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップと、遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中にがんがないことが示される場合に、生物学的試料が良性であると同定する、または遺伝子産物発現レベル（複数可）により生物学的試料中のがんが示される場合に、生物学的試料が悪性であるまたはがん性であると同定するステップとを含む。特定の実施形態では、当該方法は、甲状腺組織試料中の２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップであって、当該２種以上、または３種以上の遺伝子産物が表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、当該遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現されるステップを含む。
【００８３】
本発明の任意の方法の特定の実施形態では、対象由来の試料中の遺伝子産物の発現レベル（複数可）を、検査した各遺伝子産物についての対照または参照発現レベルと比較することによって相関させることを実施する。甲状腺組織試料と正常対照または参照発現レベルの間で遺伝子産物の発現レベルに有意差がある場合に、甲状腺組織試料をがん性であると同定する。ある特定の実施形態では、甲状腺組織試料と正常対照または参照発現レベルの間で２種以上、３種以上、または４種以上の遺伝子産物の発現レベルに有意差がある場合に、甲状腺組織試料をがん性であると同定する。同様に、甲状腺組織試料と正常対照または参照発現レベルの間で遺伝子産物の発現レベルに有意差がない（すなわち、実質的な類似性がある）場合に、甲状腺組織試料を良性であると同定する。ある特定の実施形態では、甲状腺組織試料と正常対照または参照発現レベルの間で２種以上、３種以上、または４種以上の遺伝子産物の発現レベルに有意差がない場合に、甲状腺組織試料を良性であると同定する。
【００８４】
本明細書に記載の任意の方法のある特定の実施形態では、甲状腺組織試料において、正常対照発現レベルと比較して遺伝子１、８、９、１３、１４、１５および／または１８の任意の１つまたは複数の発現レベルが低下しており、かつ／または遺伝子２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、１６および／または１７の任意の１つまたは複数の発現レベルが上昇している場合に、甲状腺組織試料をがん性であると同定し、ここで、発現が増加または減少した遺伝子の総数は少なくとも３である。各遺伝子の同一性は以下の通りである：ＣＸＣＲ３（遺伝子１）、ＣＸＣＲ３Ａ（遺伝子２）、ＣＸＣＲ３Ｂ（遺伝子３）、ＣＸＣＲ４（遺伝子４）、ＣＣＲ３（遺伝子５）、ＣＸＣＬ９（遺伝子６）、ＣＸＣＬ１０（遺伝子７）、ＣＸＣＬ１１（遺伝子８）、ＳＰＡＧ−９（遺伝子９）、ＣＫ−１９（遺伝子１０）、ＴＩＭＰ−１（遺伝子１１）、ＣＬＤＮ−１（遺伝子１２）、ＣＡＲ（遺伝子１３）、Ｎｅｃｔｉｎ−１（遺伝子１４）、ＸＢ−１３０（遺伝子１５）、ＨＯ−１（遺伝子１６）、ＣＣＲ７（遺伝子１７）、およびＣＸＣＬ４（遺伝子１８）。本明細書に記載の任意の方法の他の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子のサブセットのいずれかのうちの１種以上、２種以上、３種以上、または４種以上の遺伝子産物の発現レベルが上記の通り変更されている場合に、甲状腺組織試料をがん性であると同定する。特定の実施形態では、遺伝子セットは、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＡＲ、ＸＢ１３０、ＨＯ−１またはＣＣＲ７のうちの１種または複数を含む。
【００８５】
特定の実施形態では、アルゴリズムを使用して、対象から得た試料中の遺伝子産物の発現レベルを参照レベルと比較することによって相関させることを実施する。参照レベルは、以前に複数のがん性生物学的試料および／または非がん性生物学的試料から決定された各遺伝子産物についての発現レベルを含んでよい。
【００８６】
ある特定の実施形態では、相関させることは、発現レベルを以下の２種の生物学的試料のセット：
複数の正常な甲状腺組織試料；および
複数のがん性甲状腺組織試料
についての遺伝子産物について決定された遺伝子発現レベルと比較することを含み、
甲状腺組織試料と複数の正常な甲状腺組織試料についての遺伝子発現レベルの間で遺伝子産物の発現レベルに有意差がある場合、または、甲状腺組織試料と複数のがん性甲状腺組織試料についての遺伝子発現レベルの間で遺伝子産物の遺伝子発現レベルに実質的に差異がない場合に、甲状腺組織試料をがん性であると同定する。
【００８７】
本発明の任意の方法およびキットの特定の実施形態では、発現レベルが決定される２種以上または３種以上の遺伝子産物は、
ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの２種以上または３種以上の遺伝子産物；
ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；
ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；または
ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物
を含む、またはそれからなる。
【００８８】
上記の遺伝子産物セットのいずれかの特定の実施形態では、２種以上または３種以上の遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＡＲ、ＸＢ１３０、ＨＯ−１またはＣＣＲ７のうちの１種または複数を含む。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＣＸＣＲ３遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＣＣＲ３遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＣＸＣＬ１０遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＣＡＲ遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＸＢ１３０遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＨＯ−１遺伝子によって発現される。特定の実施形態では、遺伝子産物は表１に列挙されている遺伝子のうちの１種以上、２種以上、または３種以上を含み、遺伝子産物の少なくとも１種はＣＣＲ７の遺伝子によって発現される。
【００８９】
種々の実施形態では、本発明の方法は、例えば予備診断を得るために、対象から得た生物学的試料、例えば甲状腺組織試料に対して細胞学的分析または組織学的分析を実施するステップも包含する。細胞学的分析または組織学的分析は、本明細書に記載の遺伝子産物の発現に基づく分析を実施する前に、それと同時に、またはその後に実施することができる。ある特定の実施形態では、予備診断が中間または不確定である試料を本発明の方法によってさらに分析する。
【００９０】
本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、対象から生物学的試料を得るステップをさらに含む。
【００９１】
本発明の方法のある特定の実施形態では、方法は、患者が甲状腺がんを有すると診断される場合に、対象を甲状腺がんについて処置するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、処置は、対象の甲状腺またはその一部の外科的除去を含む。
【００９２】
本発明は、甲状腺がんを特徴付けるために有用な方法およびキットも含む。本明細書で使用される場合、対象における「甲状腺がんを特徴付ける」という用語は、対象におけるがん試料の１つまたは複数の性質、例えば特定の種類の甲状腺がんを同定することを指し、対象の予後または生存を決定することも含まれ得る。がんは、これだけに限定されないが、本明細書に開示されている遺伝子産物を含めた１種または複数のマーカーの発現を同定することによって特徴付けることができる。本明細書に記載の一般的な方法を、例えば、遺伝子産物の発現レベルを様々な種類の甲状腺がんについて決定されたものと比較することにより、甲状腺がんの種類を決定するために容易に適合させることができることが当業者には理解されよう。甲状腺がんの種類の決定に基づいて、予後、生存、および／または転移の可能性を、例えば、歴史的なデータまたは転帰に基づいて決定または推定することができる。
【００９３】
生物学的試料
ある特定の実施形態では、本発明の方法では対象から得た生物学的試料を利用し、ある特定の方法は、対象から生物学的試料を得るステップを含む。生物学的試料は、検査される対象の組織、細胞、核酸、遺伝子、遺伝子断片、発現産物、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）、または遺伝子産物断片を含有する任意の材料であってよい。試料の適合性および／または妥当性を決定するための方法が提供される。試料は、これらに限定されないが、個体の組織、細胞、または細胞からのもしくは細胞に由来する生物学的材料を含んでよい。試料は、不均一または均一な細胞または組織の集団であってよい。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、組織試料、例えば、対象の甲状腺または甲状腺結節から得た試料である。甲状腺結節は、甲状腺における増殖である。特定の実施形態では、生物学的試料は、遺伝子産物、例えばｍＲＮＡなどの核酸、および／またはタンパク質を含む。
【００９４】
種々の実施形態では、対象は、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、魚などを含めた動物（例えば哺乳動物）である。特定の実施形態では、本方法および組成物をヒトからの生物学的試料に適用する。一部の実施形態では、ヒトは、小児、青年、または成人である。特定の実施形態では、対象は甲状腺腫瘍を有するリスクがあるまたはそれを有する疑いがあると決定されている。
【００９５】
甲状腺がんを「有する疑いがある対象」という用語は、甲状腺がん（例えば、顕著なしこりまたは腫瘤）を示す１種または複数の症状を示す、またはがんについてスクリーニングされた（例えば、常套的な身体検査の間に）対象を指す。例えば、対象は、甲状腺の肥大および／または１つもしくは複数の甲状腺結節を有することが決定されていてもよい。甲状腺癌を有する疑いがある対象は、１種または複数のリスク因子も有し得る。甲状腺がんを有する疑いがある対象は、最初の診断を受けたが、がんの病期は不明である対象を包含する。この用語は、一度がんを有した人（例えば、寛解の状態にある個体）をさらに含む。さらに、ある特定の対象は、以前に甲状腺腫瘍について検査されたことがあり得るが、結果が決定的でないまたは不確定であった。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「甲状腺がんのリスクがある対象」という用語は、甲状腺がん、具体的には侵襲性または転移性の甲状腺がん、より具体的にはＡＴＣの発症に関する１種または複数の危険因子を有する対象を指す。リスク因子としては、これだけに限定されないが、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、以前のがん事例、既存の非がん疾患、および生活様式が挙げられる。
【００９７】
生物学的試料は、本明細書に記載の分析方法に適した試料をもたらすことができる当技術分野で公知の任意の方法を使用して得ることができる。対象から生物学的試料を得る方法としては、これだけに限定されないが、細針穿刺吸引（ＦＮＡ）、針穿刺吸引、コア針生検、吸引生検、切開生検、切除生検、またはパンチ生検を含めた生検の方法が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の方法およびキットでは、ＦＮＡによって得られる生物学的試料を利用する。甲状腺の適切な試料を得る方法は、当技術分野で公知であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡＴＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｒｙｏｉｄ  ｎｏｄｕｌｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｔｈｙｒｏｉｄ、１６巻２号、２００６年）にさらに記載されている。生物学的試料を得るための一般的な方法も当技術分野で公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｍｚｙ、Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｐｓｙ、２００１年においてさらに記載されている。一実施形態では、試料は、甲状腺の細針穿刺吸引物、甲状腺結節または疑わしい甲状腺腫瘍である。いくつかの場合には、超音波、Ｘ線、または他のイメージングデバイスを使用することによって細針穿刺吸引試料収集手順を手引きすることができる。
【００９８】
いくつかの場合には、本発明の方法による診断のために、複数の生物学的試料、例えば複数の甲状腺試料などを、例えば同じ時間にまたは違う時間に得ることができる。いくつかの場合には、同じ時間または違う時間に得た試料（複数可）を保管し、そして／または異なる方法によって分析する。例えば、試料を得て、細胞学的分析（常套的な染色）によって分析することができる。いくつかの場合には、さらなる試料を、対象から同時にまたは後で、例えば細胞学的分析の結果に基づいて得ることができる。例えば、がんの有無に関して細胞学的分析が不確定であった場合に、さらなる試料を本発明の方法において使用することができる。本発明の方法の他の実施形態では、単一の試料を得て、試料の一部を細胞学的分析によって分析し、試料の別の一部を本発明の方法によって分析することができる。
【００９９】
ある特定の実施形態では、医療専門家が、例えば、病院、診察室、検査センターまたは検査室において対象から生物学的試料を得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の試料を得るための手段、試料を保管するための手段、およびキットの使用説明書を含有し得るキットを使用して生物学的試料を得ることができる。いくつかの場合には、キットは、分子プロファイリングサービスによって提供され、これは、生物学的試料に対する診断アッセイを実施することもできる。
【０１００】
特定の実施形態では、生物学的試料を、試料を得た後、試料を１つまたは複数の本発明の方法によって分析する前に、例えば数秒間、数分間、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、数年またはそれよりも長い時間にわたって保管する。いくつかの場合には、対象から得た試料を、試料の異なる一部が、これだけに限定されないが、保管、細胞学的分析、妥当性試験、核酸抽出、タンパク質抽出、分子プロファイリングまたはこれらの組合せを含めた異なる下流の方法またはプロセスに供されるように、保管またはさらなる分析ステップの前に細分する。いくつかの場合には、試料の一部を保管し、他方で前記試料の別の一部をさらに操作する。そのような操作は、これだけに限定されないが、分子プロファイリング；細胞学的染色；核酸（例えば、ｍＲＮＡ）抽出、核酸検出、または核酸定量化；タンパク質抽出、タンパク質検出、またはタンパク質定量化；固定（例えばホルマリン固定パラフィン包埋試料）；および／あるいは検査を含み得る。試料は、保管する前または保管中に、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはメタノールを使用することなどの当技術分野で公知の任意の方法によって固定することができる。他の場合では、試料を得て、保管し、保管するステップの後にさらなる分析のために細分し、その結果試料の異なる一部が、これだけに限定されないが、保管、細胞学的分析、妥当性試験、核酸抽出、ポリペプチド抽出、分子プロファイリング、１種または複数の遺伝子産物の発現の決定、またはこれらの組合せを含めた異なる下流の方法またはプロセスに供される。いくつかの場合には、試料を得て、例えば細胞学的分析によって分析し、生じた試料材料を、本明細書に記載の遺伝子産物の発現レベルを例えば分子プロファイリングによって決定することを含む本発明の１つまたは複数の方法によってさらに分析する。そのような場合では、細胞学的分析のステップと、例えば分子プロファイリングによる遺伝子産物発現レベルの決定のステップの間に、試料を保管することができる。ある特定の実施形態では、適切な培地、賦形剤、または溶液、例えば、細胞をその後の細胞学的分析のために保管するのに適した市販の調製物（例えば、これだけに限定されないが、Ｃｙｔｙｃ  ＴｈｉｎＰｒｅｐ、ＳｕｒｅＰａｔｈ、またはＭｏｎｏｐｒｅｐなど）の中、凍結させて（例えば、およそ０℃、−１℃、−２℃、−３℃、−４℃、−５℃、−６℃、−７℃、−８℃、−９℃、−１０℃、−１２℃、−１４℃、−１５℃、−１６℃、−２０℃、−２２℃、−２５℃、−２８℃、−３０℃、−３５℃、−４０℃、−４５℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−１００℃、−１２０℃、−１４０℃、−１８０℃、−１９０℃、または約−２００℃のいずれかで）、または低温（例えば約２０℃から約０℃の間）で、試料を保管することができる。
【０１０１】
試料を保管するステップの前、またはその後を含めた、試料の入手間または入手後に、生物学的試料を本発明の方法および組成物における使用に関するその適合性について評価することができる。試料は、さらなる分析のために妥当であるか、または、これだけに限定されないが、細胞の不足、遺伝材料の不足、タンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡの不足、示されている検査に細胞が適さないこと、または示されている検査に材料が適さないこと、試料の経年数、試料を得た様式、または試料を保管もしくは輸送した様式を含めた多くの因子に起因して、妥当かまたは妥当でないかが決定され得る。妥当性は、細胞染色手順、細胞の数もしくは組織の量の測定、総タンパク質の測定、核酸の測定、視覚的検査、顕微鏡レベルの検査、または温度もしくはｐＨの決定などの当技術分野で公知の種々の方法を使用して決定することができる。一実施形態では、遺伝子産物レベルの分析実験を実施した結果から試料の妥当性を決定する。
【０１０２】
妥当な数の特定の細胞型が存在することを決定するための方法の例としては、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学的分析、細胞学的分析、顕微鏡分析、および／または視覚的分析が挙げられる。
【０１０３】
これだけに限定されないが、分光光度計を使用した２６０ナノメートルにおける吸光度を含めた紫外線吸収などの当技術分野で公知の種々の方法を使用して、生物学的試料から抽出した後の核酸含量を決定することによって試料を分析することができる。ある特定の実施形態では、所与の試料からのＲＮＡの量または収率を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用し、ナノグラムからマイクログラムまでの範囲で測定する。一部の実施形態では、ＲＮＡの質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用して測定し、算出されたＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ、１−１０）によって特徴付ける。ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）は、ＲＮＡ測定に完全性値を割り当てるためのアルゴリズムである。ＲＩＮアルゴリズムは、よりロバストな普遍的測定をもたらすために、電気泳動によるＲＮＡ測定に適用され、ＲＮＡ完全性に関する情報に寄与する異なる特徴の組合せに基づくものである。このアルゴリズムにより、１〜１０のＲＩＮスコアが割り当てられ、レベル１０のＲＮＡが最も質が高い。一態様では、本発明は、ＲＮＡ  ＲＩＮ値が６．０以下、５以下、または４以下である試料からの遺伝子発現を解析する方法を提供する。一部の実施形態では、ＲＩＮ数がおよそ１．０、２．０、３．０、４．０、５．０または６．０のいずれかであるＲＮＡを含有する試料を、本発明の主題の方法およびアルゴリズムを使用して分析する。
【０１０４】
一部の実施形態では、生物学的試料中のタンパク質含有量を、これだけに限定されないが、２８０ナノメートルにおける紫外線吸収、細胞染色、または、例えばクーマシーブルーまたはビシンコニン酸（ｂｉｃｈｉｃｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を用いたタンパク質染色を含めた当技術分野で公知の種々の方法のいずれかを使用して測定する。いくつかの場合には、試料の測定前に生物学的試料からタンパク質を抽出する。
【０１０５】
特定の実施形態では、例えば、生物学的試料から遺伝子産物を単離するために、試料を当技術分野において公知であり、利用可能な任意の方法によって処理する。ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、核酸（例えば、ｍＲＮＡを含めたＲＮＡ）およびタンパク質から選択される。
【０１０６】
細胞学的分析
生物学的試料の細胞学的分析は、例えば、生物学的試料中の細胞の細胞染色と顕微鏡レベルの検査を組み合わせて実施することができる。細胞染色、または細胞学的検査は、これだけに限定されないが、ＥＡ染色、ヘマトキシリン染色、サイトステイン（ｃｙｔｏｓｔａｉｎ）、パパニコロー染色、エオシン、ニッスル染色、トルイジンブルー、銀染色、アゾカルミン染色、ニュートラルレッド、またはヤーヌスグリーンを含めた、当技術分野で公知のいくつもの方法および適切な試薬によって実施することができる。いくつかの場合には、染色手順の前またはその間に、例えばメタノール、エタノール、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドを使用して、細胞を固定し、かつ／または透過処理し、他方で、他の場合には、それを行わない。核酸含量は、例えば、臭化エチジウム、ヘマトキシリン、ニッスル染色または当技術分野で公知の任意の核酸染色を用いた染色手順を使用して実施してもしなくてもよい。
【０１０７】
一部の実施形態では、細胞学的検査のための当技術分野で周知の標準の方法によって細胞をスライド上に塗抹することができる。他の場合では、液体ベースの細胞診（ＬＢＣ）法を利用することができる。ＬＢＣ法では、生物学的試料を対象から、例えばＣｙｔｙｃ  ＴｈｉｎＰｒｅｐ、ＳｕｒｅＰａｔｈ、またはＭｏｎｏｐｒｅｐあるいは当技術分野で公知の任意の他の液体ベースの細胞診調製溶液などの液状細胞診調製溶液を含有する容器またはバイアルに移す。さらに、試料を、液状細胞診調製溶液を用いて収集デバイスから容器またはバイアル中にすすぎ落として、試料の実質的に定量的な移入を確実にすることができる。次いで、液体ベースの細胞診調製溶液中の生物学的試料を含有する溶液を保管し、そして／または機械によってもしくは当業者によって処理しされ、ガラススライド上に細胞の層を生成することができる。試料を、従来の細胞学的調製物と同様に、さらに染色し、顕微鏡の下で検査することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、試料を免疫組織化学的染色によって分析することができる。免疫組織化学的染色により、生物学的試料（例えば細胞または組織）中の抗体を使用することによる特定の分子または抗原の存在、位置、および分布の分析がもたらされる。抗原は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、または抗体が特異的に認識することができる任意の他の分子であってよい。試料を、先に固定および／または透過処理するステップを伴って、または伴わずに、免疫組織化学的方法によって分析することができる。いくつかの場合には、試料を抗原に特異的な抗体に接触させることによって目的の抗原を検出することができ、次いで、１回または複数回の洗浄によって非特異的な結合を除去することができる。次いで、特異的に結合した抗体を、例えば標識された二次抗体、または標識されたアビジン／ストレプトアビジンなどの抗体検出試薬によって検出することができる。いくつかの場合には、その代わりに、抗原特異的な抗体を直接標識することができる。免疫組織化学に適した標識としては、これだけに限定されないが、フルオロフォア（例えばフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）およびローダミン）、酵素（例えばアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ならびに放射性核種（例えば３２Ｐおよび１２５Ｉ）が挙げられる。免疫組織化学的染色によって検出することができる遺伝子産物マーカーの例としては、これだけに限定されないが、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＵｂｃＨＩＯ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１、サイトケラチン２０、カルシトニン、ＧＡＬ−３、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびサイログロブリンが挙げられる。
【０１０９】
常套的な細胞学的検査の結果により、生物学的試料が陰性である（がんが存在しない）こと、不明瞭であるまたは疑わしい（がんの存在が示唆される）こと、診断的（がんについて陽性診断）であること、または非診断的または不確定である（がんの有無に関してもたらされる情報が不十分である）ことが示され得る。診断結果は、悪性または良性に分類することができる。いくつかの場合には、診断結果により、本明細書に記載の疾患または状態のいずれかなどの特定の種類のがんまたは状態が示され得る。
【０１１０】
遺伝子および遺伝子産物
種々の実施形態では、本発明の方法は、例えば本明細書において同定される遺伝子または遺伝子セットのいずれかによって発現される遺伝子産物の発現レベルを決定することによる生物学的試料の分子プロファイリングを含む。遺伝子産物としては、これだけに限定されないが、ｍＲＮＡおよび遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられる。本発明の方法に従って発現レベルを決定、測定または分析する遺伝子産物（「遺伝子発現産物」とも称される）は、表１に記載の１種以上、２種以上、３種以上、または４種以上の遺伝子セット、ならびにそのバリアントまたはホモログ（すなわち、他の種からの対応する遺伝子）によって発現される遺伝子産物を含む、またはそれからなる。発現が決定される遺伝子産物は、排他的に、表１の遺伝子（またはそのバリアントもしくはホモログ）によって発現される遺伝子産物であってもよく、以前に甲状腺がんに関連付けられたいずれか、および、例えばＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１１／０３２２９６号、同第ＷＯ２０１１／１４３３６１号、または同第ＷＯ２０１０／０５６３７４号に記載されているものを含めた１種または複数の追加的な遺伝子産物を含んでもよい。表１はヒト遺伝子の例示的な配列の名称および受託番号を提供するものである。他の種からの対応する遺伝子は容易に入手可能である。
【表１−１】
0006309019.tif 000002
【表１−２】
0006309019.tif 000003
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料、例えば甲状腺組織試料中の、表１に示されている遺伝子のうちの２種以上、３種以上、４種以上、または５種以上の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップを含む。ある特定の実施形態では、当該方法は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、または少なくとも３種の遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを決定するステップを含む。一実施形態では、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる遺伝子産物について発現レベルを決定する。他の実施形態では、ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる遺伝子産物について発現レベルを決定する。発現が決定される特定の遺伝子産物のセットを遺伝子産物の「セット」と称することができ、発現が決定される特定の遺伝子を「遺伝子セット」と称することができる。ある特定の実施形態では、同じ種類の遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、利用する各遺伝子セットについて本発明の方法に従って決定する。したがって、特定の実施形態では、特定の組織試料に対する本発明の方法の実施において、１種類のみの遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを決定する。それにもかかわらず、利用する遺伝子セットの各遺伝子について２つ以上の異なる種類の遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡとタンパク質の両方の発現レベルを決定する場合に本発明の方法を実施することができることが意図されている。
【０１１２】
遺伝子産物のレベルの測定
遺伝子産物の発現レベルは、当技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって決定することができ、測定される遺伝子産物の種類に主に左右される。例えば、遺伝子産物を検出するための試薬により、本明細書に記載の遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現、タンパク質の発現、タンパク質の活性またはタンパク質の下流の生物学的機能を測定することができる。したがって、本発明は、核酸、ＤＮＡプローブ、またはコードされるタンパク質に結合する抗体などを含めた、そのような遺伝子またはその遺伝子産物を検出するための試薬を含む。
【０１１３】
タンパク質の発現レベルは、例えば、免疫組織化学的検査により、タンパク質遺伝子産物に特異的に結合する抗体を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質の発現レベルを、ポリペプチドアレイまたは抗体アレイを使用して決定する。ある特定の実施形態では、ウエスタンブロット法および免疫沈降、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、ならびにイメージングデバイスを利用する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）などの標準の方法論および検出器を使用することができる。これらの周知の方法では、典型的には、選択された本発明の標的ポリペプチド遺伝子産物、またはそのポリペプチドの独特の領域に特異的に結合し、一般に他のポリペプチドには有意に結合しない１種または複数のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはその断片を利用する。抗体、またはその抗原結合性断片は、本発明のポリペプチドと検出可能なレベルで（例えばＥＬＩＳＡアッセイの中で）反応し、かつ、無関係のポリペプチドとは、同様の条件下で統計的に有意な様式で検出可能には反応しない場合に、本発明のポリペプチドに「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」、および／または「免疫学的に反応性である」といえる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、「マイクロアレイ」などの「アレイ」を使用することができる。ある特定の実施形態では、「マイクロアレイ」とは、ポリペプチドの集合または複数のポリペプチドが基質に結合しており、複数の結合したポリペプチドのそれぞれとの結合が別々に検出可能である「ペプチドマイクロアレイ」または「タンパク質マイクロアレイ」を指す場合もある。あるいは、ペプチドマイクロアレイは、これだけに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ファージディスプレイ結合剤、酵母２ハイブリッド結合剤、およびアプタマーを含めた、本明細書に記載のポリペプチド遺伝子産物の結合を特異的に検出することができる複数の結合剤を有してよい。アレイは、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８巻（３号）：２９５〜３０１頁（２００２年）に記載されている通り、ポリペプチドの自己抗体検出に基づいてよい。ペプチドアレイの例は、そのそれぞれが参照により組み込まれる、ＷＯ０２／３１４６３、ＷＯ０２／２５２８８、ＷＯ０１／９４９４６、ＷＯ０１／８８１６２、ＷＯ０１／６８６７１、ＷＯ０１／５７２５９、ＷＯ００／６１８０６、ＷＯ００／５４０４６、ＷＯ００／４７７７４、ＷＯ９９／４０４３４、ＷＯ９９／３９２１０、およびＷＯ９７／４２５０７ならびに米国特許第６，２６８，２１０号、同第５，７６６，９６０号、および同第５，１４３，８５４号において見いだすことができる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物を診断的に検出するために、質量分析（ＭＳ）または他の分子量に基づく方法を使用することができる。ＭＳとは、一般に、試料または分子の元素組成を決定するための分析技法を指す。ＭＳは、ペプチドなどの分子および他の化学化合物の化学構造を決定するためにも使用することができる。例示的なＭＳ機器は３つのモジュール：気相試料分子をイオンに変換する（または、エレクトロスプレーイオン化の場合では、溶液中に存在するイオンを気相に移動させる）イオン供給源；電磁場を適用することによってイオンをそれらの質量により選別する質量分析機器；および指標となる量の値を測定し、したがって、存在する各イオンの存在量を算出するためのデータをもたらす検出器を有する。ＭＳ技法には、定性的使用と、試料中のポリペプチド遺伝子産物の量を定量化することを含めた定量的使用の両方がある。ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ／ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ）、およびイオン移動度分光分析／質量分析（ＩＭＳ／ＭＳまたはＩＭＭＳ）が包含される。したがって、試料中のポリペプチド遺伝子産物のレベルを測定するため、および必要に応じて、それらのレベルを対照試料または所定の値と比較するために、本明細書において提供される方法のいずれかに従ってＭＳ技法を使用することができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、試料中の遺伝子産物の存在またはレベルを検出または定量化するために、細胞選別または細胞可視化またはイメージングデバイス／技法を使用することができる。例としては、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳ、免疫蛍光法分析（ＩＦＡ）、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法が挙げられる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を、ポリペプチド遺伝子産物に結合する１種または複数のプローブ（例えば、ポリペプチドまたは抗体）に、そのような結合が起こるのに十分な条件下、それに十分な時間にわたって接触させ、次いで、プローブ（複数可）に結合しているポリペプチド遺伝子産物の量、例えば、プローブとポリペプチド遺伝子産物の複合体の量を検出することを含む、ポリペプチド遺伝子産物を検出する、またはポリペプチド遺伝子産物の量を決定もしくは測定するステップを含む。検出は、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって実施することができ、検出可能な標識、例えば、免疫蛍光部分の使用を利用することができる。ある特定の実施形態では、プローブは検出可能に標識されている。ある特定の実施形態では、結合したポリペプチド遺伝子産物を溶液中または固体支持体上で検出する。
【０１１８】
本発明の方法は、例えば、試料中の特定の遺伝子産物の量を決定する前、またはその間に、１種または複数の遺伝子産物を生物学的試料から単離するステップを含んでよい。ある特定の実施形態では、検出される遺伝子産物はポリペプチドであり、ポリペプチドを生物学的試料から精製または部分的に精製する。ある特定の実施形態では、検出される遺伝子産物はｍＲＮＡであり、ポリヌクレオチドまたはｍＲＮＡを生物学的試料から精製または部分的に精製する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物学的試料から精製または部分的に精製する方法は当技術分野で公知である。
【０１１９】
核酸発現レベルは、これだけに限定されないが、増幅アッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイを含めた種々の異なるアッセイを使用して決定することができる。本発明において有用な増幅アッセイとしては、これだけに限定されないが、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイムＰＣＲを含めたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、および等温増幅法が挙げられる。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、これだけに限定されないが、ノーザンブロット、定量的または定性的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的または定性的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイ、ドットまたはスロットブロット、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド遺伝子産物の発現を測定するためのハイブリダイゼーション方法を使用することができる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当技術分野において十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条件は、適用に応じて変動し、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、ＰＮＡＳ．  ８０巻：１１９４頁（１９８３年）において言及されているものを含めた公知の一般的な結合方法に従って選択される。反復的な制御されたハイブリダイゼーション反応を実行するための方法および装置は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号に記載されている。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）から商品名ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙの下で市販されているものなどの分子バーコーディング技法を使用することができる。この技術により、組織溶解物ほどの複雑さの試料から転写物の増幅を必要とせずに標的発現レベルを直接アッセイすることが可能になる。この方法では、ビオチン化した捕捉プローブおよびバーコードレポータープローブ（色分けされている）を目的の標的遺伝子と特異的に直接ハイブリダイズさせる。過剰な非結合プローブを除去した後、プローブ／標的複合体をｎＣｏｕｎｔｅｒカートリッジ上に固定化およびアラインメントし、次いで、デジタル画像を取得し、定量化し、各バーコードの数値により対応する標的遺伝子の転写物コピーが示される。重要なことに、このバーコーディング法の使用により、単一の試料反応において非常に高い再現性で５００種を超える遺伝子の多重検出が可能になる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、転写物の分析および親和性捕捉（ＴＲＡＣ）法を使用してＲＮＡの発現を測定することができ、その場合、発現されたＲＮＡ種の多重化検出を、いかなる逆転写または増幅も必要とせずに直接細胞溶解物においてまたは精製された全ＲＮＡ試料においてで実施することができる。この新規の手順では、ビオチン化したオリゴ−ｄＴおよび二重フルオロフォア標識した遺伝子特異的なプローブであって、それぞれサイズが明白に異なるプローブを所与の試料中でｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした材料を磁性ストレプトアビジンビーズに結合させ、洗浄し、放出させ、次いで、キャピラリー電気泳動によって分離する。したがって、プローブ／標的サイズおよび蛍光プロファイルを分析することによって標的の同定および定量化が同時に実現される。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイ（ｑＮＰＡ）またはＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）から市販されているものなどのｑＮＰＡマイクロアレイを使用することができ、その場合、遺伝子特異的プローブと発現されたＲＮＡのハイブリダイゼーションにより、転写物／プローブ複合体が一本鎖特異的Ｓ１リボヌクレアーゼによる消化から保護される。Ｓ１処理および塩基媒介性プローブ／標的複合体の解離の後、残りのプローブは、それらの対応する標的配列と１：１の化学両論比で存在し、したがって、マイクロアレイ表面への捕捉によるプローブの定量化により、対応する標的配列発現レベルの推測が可能になる。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、遺伝子産物を検出するために核酸増幅方法を使用することができる。「増幅」または「核酸の増幅」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部分の複数のコピーの産生を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称することができる。「選択的増幅」または「特異的増幅」とは、本明細書で使用される場合、本発明に従った標的核酸配列の増幅を指し、標的配列の検出可能な増幅は、試験される目的の核酸試料が寄与する標的配列の増幅に実質的に限定され、いくつかの他の試料供給源、例えば、増幅反応の間または増幅反応を実施する環境で使用される試薬中に存在するコンタミネーションが寄与する標的核酸配列の寄与は受けない。
【０１２５】
「増幅条件」という用語は、本発明に従った核酸の増幅を可能にする条件を指す。本発明の増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でそれらの意図された標的とハイブリダイズする。本発明に従って核酸の増幅を行うための許容される条件は、使用される特定の増幅方法に応じて当業者が容易に確認することができる。
【０１２６】
多くの周知の核酸増幅方法では、二本鎖核酸の変性とプライマーのハイブリダイズを交互に行うためにサーモサイクリングが必要であるが、他の周知の核酸増幅方法は等温性である。一般にＰＣＲと称されるポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号）では、変性、プライマー対と逆鎖とのアニーリング、および標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長の複数のサイクルを使用する。ＲＴ−ＰＣＲと称される変形では、逆転写酵素（ＲＴ）を使用してｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作出し、次いで、そのｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅してＤＮＡの複数のコピーを産生する。
【０１２７】
上記の通り、「ＰＣＲ」という用語は、標的核酸種を選択的に増幅する複数の増幅サイクルを指す。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が包含され、当技術分野において十分に記載されている。「ｑＰＣＲ」という用語は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指し、「ｑＲＴ−ＰＣＲ」という用語は定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ｑＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、標的ｃＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量化することができる。これにより、ｃＤＮＡプール内の特定の配列の検出と定量化の両方が可能になる。次いで、増幅産物を種々の手段によって例えば、染色によって直接ゲルにおいて可視化することができ、産物を、検出可能なプローブとのハイブリダイゼーションによって、かつ／または次世代配列決定を使用することによって検出することができる。
【０１２８】
「リアルタイムＰＣＲ」では、ＤＮＡ結合性色素を使用してＰＣＲ反応混合物中の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合させ、色素の蛍光を生じさせることができる。したがって、ＰＣＲの間のＤＮＡ産物の増加により、蛍光強度の増大が生じ、これを各サイクルにおいて測定し、したがって、ＤＮＡ濃度を定量化することが可能になる。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのｄｓＤＮＡ色素は全てのｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物に結合する。ある特定の実施形態では、Ｔａｑｍａｎプローブを使用することができ、これは、５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されており、所望のアンプリコンのフォワードプライマー結合部位とリバースプライマー結合部位の間でアニーリングするように設計されている。クエンチャーがフルオロフォアの極めて近傍に保持されている限りは、蛍光は放出されない。しかし、ＰＣＲのサイクルの間に、ポリメラーゼがプライマーを伸長させるにしたがい、結合したプローブのフルオロフォアおよびクエンチャーがポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断され、蛍光が放出される。したがって、試料中に存在する転写物の量は検出される蛍光の量に正比例し、ＰＣＲサイクル後の転写物数の増加により、放出される蛍光の対応する増加が導かれる。蛍光をリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて検出し、測定し、産物の指数関数的増加に対応するその幾何的増加を使用して、各反応における閾値サイクル（「Ｃｔ」）を決定する。
【０１２９】
「Ｃｔスコア」という用語は、ＰＣＲ増幅が閾値レベルを超えるサイクルである閾値サイクル数を指す。試料中で特定の遺伝子に対してより多い量のｍＲＮＡが存在する場合、増幅される出発ＲＮＡがより多く存在するので、発現がより低い遺伝子よりも前に閾値を超える。したがって、Ｃｔスコアが低いことにより、試料中の遺伝子発現が高いことが示され、Ｃｔスコアが高いことにより、遺伝子発現が低いことが示される。非定型的なＣＴ値とは、所与の遺伝子についての平均ＣＴ値の２標準偏差を超える値である。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、前記増幅方法では、本明細書では単一反応において２つ以上の標的配列を検出するプロセスと定義される、ＰＣＲベースの多重化を使用することができる。前記増幅方法の他の実施形態では、サーモサイクリングプロセスを制御するため、もしくは添加する試薬の量およびタイミングを正確に制御するため、または他の実施形態では、前記増幅方法を、前記方法を個人向け診断の代わりとなる臨床的に適用するために適した携帯型キットに適応させることを可能にするために、マイクロフルイディクスを使用することができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、例えばＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により商品名ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙで、またはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により商品名ＳｔｅｌｌＡＲｒａｙで、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により商品名ＯｐｅｎＡｒｒａｙで市販されているものなどの、アレイ形式の増幅に基づく検出方法を使用することができる。これらの手法では、高密度９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１００ウェルディスク、または４８ウェルチップにおいて独立したｑＰＣＲ反応を同時に実行し、それにより、標準または特別注文の遺伝子セットを、ｑＰＣＲの利益の全て、さらにハイスループットの利点を伴って定量化することを可能にすることができる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、一般にＬＣＲと称され、標的核酸の近接する領域にハイブリダイズする２セットの相補ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用するリガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５４巻：１２９２頁、１９９１年）を使用することができる。熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにおいてＤＮＡオリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって共有結合して、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド産物が産生される。
【０１３３】
別の方法は、一般にＳＤＡと称される鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３９２〜３９６頁；米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号）であり、この方法では、プライマー配列の対と標的配列の逆鎖をアニーリングさせ、ｄＮＴＰαＳの存在下でプライマー伸長させて２重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を産生し、半修飾された（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキングを行い、ニックの３’末端からポリメラーゼ媒介性プライマー伸長を行って現存する鎖を置換し、次のプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のラウンドのための鎖を産生させ、それにより産物の幾何的増幅をもたらすサイクルを使用する。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、基本的に同じ方法で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを高温で使用するものである（欧州特許第０  ６８４  ３１５号）。
【０１３４】
他の増幅方法としては、例えば、一般にＮＡＳＢＡと称される、核酸配列ベースの増幅（米国特許第５，１３０，２３８号）；一般にＱβレプリカーゼと称される、ＲＮＡレプリカーゼを使用してプローブ分子自体を増幅するもの（Ｌｉｚａｒｄｉ，  Ｐ．ら、１９８８年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６巻：１１９７〜１２０２頁）；転写ベースの増幅方法（Ｋｗｏｈ，  Ｄ．ら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３〜１１７７頁）；自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，  Ｊ．ら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４〜１８７８年）；および、一般にＴＭＡと称される、転写媒介性増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号）が挙げられる。公知の増幅方法に関するさらなる考察については、Ｐｅｒｓｉｎｇ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．、１９９３年、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）、５１〜８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）を参照されたい。
【０１３５】
本発明に従って使用することができる例示的な転写ベースの増幅系としては、ＲＮＡポリメラーゼを使用して標的領域の複数のＲＮＡ転写物を産生する転写増幅法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号）が挙げられる。ＴＭＡでは、「プロモーター−プライマー」を使用し、これは逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸とハイブリダイズして二本鎖プロモーターを形成し、それからＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ転写物が産生される。これらの転写物は、ＲＮＡ転写物とハイブリダイズすることができる第２のプライマーの存在下でＴＭＡのさらなるラウンドの鋳型になり得る。熱変性が必要とされるＰＣＲ、ＬＣＲまたは他の方法とは異なり、ＴＭＡは、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を使用してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化し、それにより、ＤＮＡ鎖をプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能にする等温性の方法である。一般に、増幅のために用意される逆転写酵素に付随するＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を使用する。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド遺伝子産物の発現を決定するために、マイクロアレイ解析（Ｈａｎ，  Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９巻：６３１〜６３５頁、２００１年；Ｂａｏ，  Ｐ．ら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、７４巻：１７９２〜１７９７頁、２００２年；Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：１０６１４〜１９頁、１９９６年；およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４巻：２１５０〜５５頁、１９９７年）およびＳＡＧＥ（遺伝子発現連鎖解析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））を含めた他の技法を使用することができる。ＭＰＳＳと同様に、ＳＡＧＥは計数的なものであり、ＭＰＳＳなどの技法から利用可能なものよりも桁は小さいが、多数のサイン配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を生成することができる（例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，  Ｖ．  Ｅ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、１６巻：４２３〜４２５頁、２０００年；Ｔｕｔｅｊａ  Ｒ．およびＴｕｔｅｊａ  Ｎ．  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．  ２００４年８月；２６巻（８号）：９１６〜２２頁を参照されたい）。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、「マイクロアレイ」という用語は、基質に結合した複数の核酸を有し、複数の結合した核酸のそれぞれとのハイブリダイゼーションが別々に検出可能な「核酸マイクロアレイ」を包含する。基質は固体であっても多孔質であってもよく、平面であっても非平面であってもよく、一体化されていても分配されていてもよい。核酸マイクロアレイは、Ｓｃｈｅｎａ（編）、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２１巻（１号）（補遺）：１〜６０頁（１９９９年）；Ｓｃｈｅｎａ（編）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００年）において称される全てのデバイスを包含する。例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７巻（４号）：１６６５〜１６７０頁（２０００年）に記載されている通り、核酸マイクロアレイは基質に結合した複数の核酸を含んでよく、複数の核酸は一体化された平面の基質ではなく複数のビーズ上に配置されている。核酸マイクロアレイの例は、その開示が参照により組み込まれる米国特許第６，３９１，６２３号、同第６，３８３，７５４号、同第６，３８３，７４９号、同第６，３８０，３７７号、同第６，３７９，８９７号、同第６，３７６，１９１号、同第６，３７２，４３１号、同第６，３５１，７１２、同第６，３４４，３１６号、同第６，３１６，１９３号、同第６，３１２，９０６号、同第６，３０９，８２８号、同第６，３０９，８２４号、同第６，３０６，６４３号、同第６，３００，０６３号、同第６，２８７，８５０号、同第６，２８４，４９７号、同第６，２８４，４６５号、同第６，２８０，９５４号、同第６，２６２，２１６号、同第６，２５１，６０１号、同第６，２４５，５１８号、同第６，２６３，２８７号、同第６，２５１，６０１号、同第６，２３８，８６６号、同第６，２２８，５７５号、同第６，２１４，５８７号、同第６，２０３，９８９号、同第６，１７１，７９７号、同第６，１０３，４７４号、同第６，０８３，７２６号、同第６，０５４，２７４号、同第６，０４０，１３８号、同第６，０８３，７２６号、同第６，００４，７５５号、同第６，００１，３０９号、同第５，９５８，３４２号、同第５，９５２，１８０号、同第５，９３６，７３１号、同第５，８４３，６５５号、同第５，８１４，４５４号、同第５，８３７，１９６号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４０５，７８３号において見いだすことができる。
【０１３８】
さらなる例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）から商品名ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）またはＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で市販されている核酸アレイが挙げられる。アレイの製造および使用のさらなる典型的な方法は、例えば、米国特許第７，０２８，６２９号；同第７，０１１，９４９号；同第７，０１１，９４５号；同第６，９３６，４１９号；同第６，９２７，０３２号；同第６，９２４，１０３号；同第６，９２１，６４２号；および同第６，８１８，３９４号において提供される。
【０１３９】
アレイおよびマイクロアレイに関連する本発明は、固体基質に付着させたポリマーに対する多くの使用も意図している。例示的な遺伝子発現のモニタリングおよびプロファイリング方法ならびに遺伝子発現のモニタリングおよびプロファイリングのために有用な方法は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号に記載されている。したがって、遺伝子型決定および使用が米国特許出願第１０／４４２，０２１号、同第１０／０１３，５９８号（米国特許出願公開第２００３／００３６０６９号）、ならびに米国特許第５，９２５，５２５号、同第６，２６８，１４１号、同第５，８５６，０９２号、同第６，２６７，１５２号、同第６，３００，０６３号、同第６，５２５，１８５号、同第６，６３２，６１１号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号、同第６，３６１，９４７号、同第６，３６８，７９９号、同第６，６７３，５７９号および同第６，３３３，１７９号に示されている。本明細書に開示されている方法と組み合わせて使用することができる核酸の増幅、標識付けおよび分析の他の方法は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号、および同第６，１９７，５０６号において具体化されている。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、一般にＲＮＡ−Ｓｅｑと称される、ＲＮＡの発現を解析するためのＷｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＷＴＳＳ）などのＲＮＡ配列決定を使用することができ、この方法では、深部配列決定技術を利用することによって単一のｎｔ分解を伴う発現プロファイルのトランスクリプトームマップを組み立てることができる。一実施形態では、ＲＮＡ試料、例えばｍＲＮＡを断片化されたｃＤＮＡに変換し、次いで、配列決定アダプターにライゲーションする。ハイスループット配列決定により、新規に組み立てること、または公知のゲノムまたは参照配列に対してアラインメントすることのいずれかができる数百万の短い配列リードを生成することが可能になる。次いで、個々の配列リードと記録されたリードの総数の比を使用して発現プロファイルを生成することができる。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、生物学的試料を、ポリヌクレオチド遺伝子産物に結合する１種または複数のプローブ（例えば、プライマーまたはポリヌクレオチド）に、そのような結合が起こるのに十分な条件下で、そのために十分な時間にわたって接触させること、次いで、プローブ（複数可）に結合したポリヌクレオチド遺伝子産物の量、例えば、プローブとポリヌクレオチド遺伝子産物の複合体の量を検出することを含む、ポリヌクレオチド遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する、またはポリヌクレオチド遺伝子産物の量を決定もしくは測定するステップを含む。検出は、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって実施することができ、検出可能な標識、例えば、免疫蛍光部分の使用を利用することができる。ある特定の実施形態では、プローブは検出可能に標識されている。ある特定の実施形態では、結合したポリヌクレオチド遺伝子産物を溶液中または固体支持体上で検出する。
【０１４２】
遺伝子産物を検出するための試薬
当業者には明らかになるように、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のプライマーまたはプローブを含めた、抗体およびオリゴヌクレオチドなどの遺伝子産物を検出するための試薬を使用することができる。特定の実施形態では、遺伝子産物を検出するための試薬は、標的遺伝子産物と特異的に結合するまたは特異的にハイブリダイズし、無関係の遺伝子産物、例えば、異なる、無関係の遺伝子から発現された遺伝子産物とは結合したりハイブリダイズしない。標的ポリペプチドまたは核酸配列と特異的に結合するまたは特異的にハイブリダイズする抗体およびオリゴヌクレオチドなどの試薬を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、抗体は、当業者に公知のさまざまな任意の技法よって調製することができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。目的のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６巻：５１１〜５１９頁、１９７６年の技法、およびそれを改善したものを使用して調製することができる。
【０１４３】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションが可能になるのに十分に相補的な配列（時には「実質的に相補的」と称される）である２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の会合を指す。特に、一実施形態では、この用語は、オリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列のハイブリダイゼーションを指し、オリゴヌクレオチドと非相補配列の一本鎖核酸のハイブリダイゼーションの実質的な排除を指す。例えば、特異的なハイブリダイゼーションとは、当技術分野で周知の種々の相補性の一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適当な条件下で遺伝子産物とハイブリダイズする配列を指す場合がある。
【０１４４】
一実施形態では、生物学的試料中の遺伝子産物の発現レベルを、ＲＮＡの転写の相対速度を、例えば対応するｃＤＮＡを産生し、次いで、生じたＤＮＡを、表１において同定される遺伝子配列から発生させたものなどのプローブを使用して分析することにより測定することによって決定する。したがって、生物学的試料のＲＮＡに逆転写酵素を使用することによって産生されるｃＤＮＡのレベルにより、対応する量のｃＤＮＡが産生され、次いでこれを、ポリメラーゼ連鎖反応、またはいくつかの他の手段を使用して増幅して、生じたｃＤＮＡの相対的なレベルを決定し、それにより、遺伝子発現の相対的なレベルを決定することができる。
【０１４５】
核酸遺伝子産物を検出するための例示的な試薬は、核酸を含み、特にオリゴヌクレオチドを含む。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡプローブ、または標的遺伝子から産生された核酸を増幅するためのプライマーである。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の遺伝子産物と特異的にハイブリダイズすることができる（例えば、中程度またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）。オリゴヌクレオチドは天然に存在するものであっても合成されたものであってもよいが、典型的には合成手段によって調製されたものである。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのセグメント、またはそれらの相補物を含んでよい。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、さまざまな因子、ならびにオリゴヌクレオチドの特定の適用および使用に左右される。プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから標的遺伝子産物（例えば、表１で提供される遺伝子から発現されたもの）の全長までの任意の長さであってよく、３から標的遺伝子産物の全長までのあらゆる可能性のある数の連続した核酸を明確に包含する。したがって、オリゴヌクレオチドは、５個から１００個の間の連続した塩基であってよく、多くの場合、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドから、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドまでにわたる。５〜１０塩基、５〜２０塩基、１０〜２０塩基、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１０〜５０塩基、２０〜５０塩基または２０〜１００塩基の長さのオリゴヌクレオチドが一般的である。
【０１４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはいずれかの誘導体であってよい。そのようなオリゴヌクレオチドの最小のサイズは、オリゴヌクレオチドと本発明の核酸分子（例えば、発現された遺伝子産物または生じたｃＤＮＡまたは増幅によって生じたそのコピー）上の相補配列の間に安定なハイブリッドが形成されるのに必要なサイズである。本発明は、例えば核酸分子を同定するためのプローブ（例えば、ＤＮＡプローブ）または核酸分子を増幅するためのプライマーとして使用することができるオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１４７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドはプローブであってよく、これは、例えば、精製された制限酵素消化物中にあるもののような天然に存在するものであるか合成的に生成されたかにかかわらず、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸を指し、プローブと相補的な配列を有する核酸とアニーリングすることまたは特異的にハイブリダイズすることができるものである。プローブは一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源および方法の使用を含めた多くの因子に左右される。例えば、診断への適用に関しては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５〜２５ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それよりも少ないヌクレオチドを含有してよい。ある特定の実施形態では、プローブは、５個から１００個の間の連続した塩基であってよく、一般に、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドの長さである、または約３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。本明細書のプローブは特定の標的核酸配列の種々の鎖と相補的になるように選択される。これは、プローブが、所定の条件のセットの下でそれらのそれぞれの標的鎖と特異的にハイブリダイズまたはアニーリングすることが可能になるのに十分に相補的でなければいけないことを意味する。したがって、プローブ配列は必ずしも標的の正確な相補配列を反映しない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片をプローブの５’末端または３’末端に付着させることができ、残りのプローブ配列は標的鎖と相補的である。あるいは、プローブ配列が標的核酸の配列に対してそれらが特異的にアニーリングするために十分な相補性を有するのであれば、非相補的な塩基またはより長い配列をプローブ内に散在させることができる。
【０１４８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プライマーであってよく、これは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、一本鎖または二本鎖のいずれか、生物系に由来するもの、制限酵素消化により生成されたもの、または合成的に作製されたもののいずれかのオリゴヌクレオチドを指し、適切な環境に置いた場合、鋳型依存性の核酸合成の開始剤として機能的に働くことができる。適当な核酸鋳型、適切な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、ならびに適切な温度およびｐＨなどの条件と一緒に存在する場合、プライマーは、その３’末端にポリメラーゼの作用または同様の活性によりヌクレオチドが付加されることによって伸長して、プライマー伸長産物がもたらされ得る。プライマーは適用の特定の条件および要求に応じて長さが変動し得る。例えば、ある特定の適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが約１５〜２５ヌクレオチドまたはそれ以上であるが、ある特定の実施形態では、５個から１００個の間の連続した塩基であり得、多くの場合、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドの長さである、または、ある特定の実施形態では、約３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。プライマーは、所望の伸長産物の合成を刺激するために、すなわち、所望の鋳型鎖と、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用するためのプライマーの３’ヒドロキシル部分が適当な近位にもたらすのに十分な様式でアニーリングすることが可能になるように、所望の鋳型に対して十分に相補的でなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補物を示す必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列を、別の方法では相補的なプライマーの５’末端に付着させることができる。あるいは、プライマー配列が、所望の鋳型鎖の配列に対して、伸長産物を合成するための鋳型−プライマー複合体が機能的にもたらされるのに十分な相補性を有するのであれば、非相補的な塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在していてよい。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、遺伝子産物の発現を決定するための試薬は、２つ、３つ、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドのセットを含み、そのセットの各オリゴヌクレオチドは本明細書に記載の遺伝子産物または遺伝子産物の相補鎖とハイブリダイズする。したがって、例えば、各オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ遺伝子産物および／またはｍＲＮＡから産生されるｃＤＮＡの１つまたは複数の鎖とハイブリダイズし得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、ＤＮＡプローブを含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、少なくとも２つの増幅プライマーまたはＰＣＲプライマーを含み、これらは一緒になって、標的核酸配列の少なくとも一部分、例えば、ｍＲＮＡ遺伝子産物またはそれから生じたｃＤＮＡを増幅することができる。別の実施形態では、固相アレイ、染色体／ＤＮＡマイクロアレイ、またはマイクロビーズアレイなどのアレイ上にオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡプローブのセットをもたらすことができる。アレイ技術は当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。
【０１５０】
定義済みの配列および化学構造を有するオリゴヌクレオチドを、当業者に公知の技法によって、例えば、化学的または生化学的な合成によって、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける組換え核酸分子（例えば、細菌またはウイルスベクター）からの発現によって作製することができる。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、単に野生型染色体ＤＮＡまたはそのｉｎ  ｖｉｖｏ転写産物からなるのではない。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子またはポリヌクレオチド遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡと同一または相補的である、種々の長さの連続したひと続きの配列を含む、単離されたポリヌクレオチド、例えば、プライマーまたはプローブを提供する。
【０１５２】
オリゴヌクレオチド、プローブまたはプライマーは、所与の改変が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能と適合する限りは、いずれかの手段で改変することができる。当業者は、所与の改変が本発明の任意の所与のオリゴヌクレオチドに適したものであるかまたは所望のものであるかどうかを容易に決定することができる。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドの設計および配列は、本明細書に記載のそれらの機能に左右されるが、いくつかの変数が一般に考慮される。最も関連性のあるものとしては、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系内の他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）のひと続き、および３’末端配列が挙げられる。これらおよび他の変数の制御については、オリゴヌクレオチド設計の標準かつ周知の態様であり、多数の潜在的オリゴヌクレオチドを最適なものについてスクリーニングするために種々のコンピュータプログラムが容易に利用可能である。
【０１５４】
当業者には認識される通り、ポリヌクレオチドは一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。追加的なコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してよいが、必ずしも必要ではなく、ポリヌクレオチドは他の分子および／または支持材料に連結していてよいが、必ずしも必要ではない。
【０１５５】
本発明は、これだけに限定されないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＴを含めた本明細書に記載のアッセイのいずれかを実施するために適した条件下で標的遺伝子産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチドの使用を含む。適切な条件は当技術分野で公知であり、ＰＣＲの装置および試薬の小売業者によって提供される説明書に従って実施される標準の反応において使用されるものを含む。ある特定の実施形態では、本発明は、下記のストリンジェンシー条件下で参照ヌクレオチド配列（例えば、標的遺伝子産物）、またはそれらの相補物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含めたポリヌクレオチドを意図している。本明細書で使用される場合、「低ストリンジェンシー、中間のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載するものである。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９８年、上記）、セクション６．３．１〜６．３．６に見いだすことができる。この参考文献には水性の方法および非水性の方法が記載されており、いずれかを使用することができる。
【０１５６】
本明細書において低ストリンジェンシー条件への言及は、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖまでのホルムアミド、および少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩、ならびに４２℃での洗浄のために少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩が挙げられ、これを包含する。低ストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および室温での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも含んでよい。低ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件に関しては洗浄の温度を５５℃まで上昇させることができる）で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄を含む。
【０１５７】
中間のストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍまでの塩、ならびに５５℃での洗浄のために少なくとも約０．１Ｍから少なくとも約０．２Ｍの塩が挙げられ、これを包含する。中間のストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および６０〜６５℃での洗浄のために（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも含んでよい。中間のストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃で、６×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせ、その後、６０℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回洗浄することを含む。高ストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのために少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび約０．０１Ｍから約０．１５Ｍの塩、ならびに５５℃での洗浄のために約０．０１Ｍから約０．０２Ｍの塩が挙げられ、これを包含する。
【０１５８】
高ストリンジェンシー条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションのために１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および６５℃を超える温度での洗浄のために（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳも含んでよい。高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃で、６×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせ、その後、６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回洗浄することを含む。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃で、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中でハイブリダイズさせ、その後、６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１回または複数回洗浄することを含む。
【０１５９】
他のストリンジェンシー条件が当技術分野で周知であり、さまざまな因子を操作してハイブリダイゼーションの特異性を最適化することができることが当業者には認識されよう。最終的な洗浄のストリンジェンシーを最適化することは高度のハイブリダイゼーションを確実にすることに役立ち得る。詳細な例については、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．１〜２．１０．１６頁およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、上記）、セクション１．１０１〜１．１０４を参照されたい。
【０１６０】
ストリンジェントな洗浄は、典型的には約４２℃から６８℃までの温度で行われるが、他の温度がストリンジェントな条件に適切であり得ることが当業者には理解されよう。最大ハイブリダイゼーション率は、典型的にはＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成についてのＴｍの約２０℃〜２５℃より下で起こる。Ｔｍとは、融解温度、または２つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることが当技術分野で周知である。Ｔｍを推定するための方法は当技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、２．１０．８頁を参照）。
【０１６１】
一般に、完全にマッチするＤＮＡの２重鎖のＴｍは、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）（式中、ＭはＮａ＋の濃度であり、０．０１モル濃度〜０．４モル濃度の範囲であることが好ましい；％Ｇ＋Ｃは塩基の総数に対するパーセンテージとしてのグアノシン塩基およびシトシン塩基の合計であり、３０％〜７５％Ｇ＋Ｃの範囲内である；％ホルムアミドは体積によるパーセントホルムアミド濃度である；長さは、ＤＮＡ２重鎖内の塩基対の数である）による近似値であると予測することができる。２重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチする塩基対の数が１％増加するごとにおよそ１℃ずつ低下する。洗浄は、一般に、高ストリンジェンシーについてはＴｍ−１５℃、または中程度のストリンジェンシーについてはＴｍ−３０℃で行われる。
【０１６２】
本発明のオリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブは、標的遺伝子またはｍＲＮＡ配列の一部、またはその相補物のポリヌクレオチドバリアントである領域を含んでもよく、それからなってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域、またはその相補物に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含んでもよく、それからなってもよい。
【０１６３】
プライマーまたはプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のソフトウェアを使用して選択することができる。例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェアは、それぞれ最大で１００ヌクレオチドのＰＣＲプライマー対を選択するため、ならびに最大で３２キロベースの入力ポリヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチドおよび最大で５，０００ヌクレオチドのより大きなポリヌクレオチドを分析するために有用である。同様のプライマー選択プログラムには性能を拡張するための追加的な特徴が組み入れられている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ  Ｔｅｘ．から一般に公開されている）では、メガベース配列から特異的なプライマーを選択することができ、したがって、これはゲノムワイドな範囲でプライマーを設計するために有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．から一般に公開されている）により、使用者が、プライマー結合部位として回避する配列を使用者が指定する「ミスプライミングライブラリー」を入力することが可能になる。Ｐｒｉｍｅｒ３は、特に、マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを選択するために有用である（後者の２つのプライマー選択プログラムについてのソースコードは、それらのそれぞれの供給源からも得ることもでき、使用者の特定の必要性に見合うように改変することもできる）。ＰｒｉｍｅＧｅｎプログラム（ＵＫ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫから一般に公開されている）では、プライマーを複数の配列アラインメントに基づいて設計し、それにより、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域または最も少なく保存された領域のいずれかとハイブリダイズするプライマーの選択が可能になる。したがって、このプログラムは、独特のおよび保存されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片の両方を同定するために有用である。オリゴヌクレオチドを選択する方法は本明細書に記載されているものに限定されない。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、混合または非荷電および陽イオン骨格連結を有するオリゴヌクレオチドの合成に関して上および下で引用されている参考文献において詳述されている方法を使用する段階的な固相合成によって調製することができる。いくつかの場合には、例えば薬物動態を増強するため、または化合物の捕捉または検出を容易にするために、追加的な化学的部分をオリゴヌクレオチドに付加することが望ましい。そのような部分は、典型的にはオリゴマーの末端に、標準の合成方法に従って共有結合により付着させることができる。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー、例えば、１０〜１００単量体サブユニットを有するものを付加することが、溶解性の増強に有用であり得る。１つまたは複数の荷電基、例えば、有機酸などの陰イオン荷電基により、細胞への取り込みが増強され得る。
【０１６５】
放射性同位元素、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または、直接（例えば、光の放出によって）または間接的に（例えば、蛍光標識された抗体の結合によって）検出することができる当技術分野で公知の他の単量体などの種々の検出可能な分子を使用して、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質を検出可能にする（すなわち、検出可能に標識する）ことができる。
【０１６６】
放射性同位元素により、本発明のある特定の態様で利用することができる検出可能な分子の例がもたらされる。ヌクレオチドまたはタンパク質を標識するための検出可能な分子として、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、および１２５Ｉを含めたいくつかの放射性同位元素を使用することができる。これらの放射性同位元素は、半減期、減衰のタイプ、および特定のプロトコールの必要性に見合うように調整することができるエネルギーのレベルが異なる。例えば、３Ｈは、低バックグラウンドレベルをもたらす低エネルギーエミッターであるが、このエネルギーが低いことにより、オートラジオグラフィーのための期間が長時間になる。放射活性で標識されたリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびアミノ酸が市販されている。第１のもしくはαリン酸基、または第３のもしくはγリン酸基が放射活性で標識されたヌクレオチドが利用可能である。例えば、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰおよび［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰの両方が市販されている。さらに、放射活性で標識されたヌクレオチドに対する種々の特異的な活性のものも市販されており、種々のプロトコールに対して調整することができる。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドを検出するために利用することができる検出可能な分子の他の例としては、フルオロフォアが挙げられる。ヌクレオチドを標識するために、例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびいくつもの他の物（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ−第９版、２００２年、Ｍｏｌｅｃ．  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ；  Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−第１０版、２００５年、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含めたいくつかのフルオロフォアを使用することができる。
【０１６８】
一例として、ヌクレオチド合成の間にアミンまたはチオールを組み込むことにより、フルオロフォアの付加が可能になるので、オリゴヌクレオチドを化学合成の間に蛍光標識することができる。蛍光標識されたヌクレオチドが市販されている。例えば、スペクトルを網羅する１０種の異なるフルオロフォアとコンジュゲートするウリジン三リン酸およびデオキシウリジン三リン酸が利用可能である。ヌクレオチドに直接結合させることができる蛍光色素も検出可能な分子として利用することができる。例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸはヌクレオチドに付着したアミン反応性蛍光色素であり、自動ＤＮＡ配列決定において使用されている。これらの蛍光標識されたヌクレオチドは、例えば、ＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰおよびＲＯＸ−ｄｄＵＴＰが市販されている。
【０１６９】
非放射性分子および蛍光検出可能ではない分子も利用可能である。上記の通り、ビオチンをヌクレオチドに直接付着させ、比色反応を触媒する酵素（例えば、ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはペルオキシダーゼなど）と化学的に結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの特異的かつ親和性の高い結合によって検出することができる。ジゴキシゲニン標識されたヌクレオチドも同様に、同位体によらない核酸の検出に使用することができる。ビオチン化されたヌクレオチドおよびジゴキシゲニン標識されたヌクレオチドは市販されている。
【０１７０】
ナノ粒子と称される非常に小さな粒子もオリゴヌクレオチドプローブを標識するために使用することができる。これらの粒子は、サイズが１〜１０００ｎｍにわたり、金粒子および銀粒子ならびに量子ドットなどの多様な化学構造を含む。斜入射白色光（ａｎｇｌｅｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｗｈｉｔｅ  ｌｉｇｈｔ）を照射すると、４０〜１２０ｎｍにわたる銀ナノ粒子または金ナノ粒子は高強度の単色光を散乱する。散乱光の波長は粒子のサイズに左右される。極めて近傍にある４〜５つの異なる粒子がそれぞれ単色光を散乱し、これらを重ね合せると、特異的な独特の色が生じる。粒子はＧｅｎｉｃｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの会社により製造されている。誘導体化された銀または金粒子を、タンパク質、抗体、小分子、受容体リガンド、および核酸を含めた分子の広範なアレイに付着させることができる。例えば、粒子の表面を化学的に誘導体化して、ヌクレオチドへの付着を可能にすることができる。
【０１７１】
検出可能な分子を検出するために使用することができる他の種類のナノ粒子としては量子ドットが挙げられる。量子ドットは、大きな範囲の波長にわたる光によって励起される直径１〜５ｎｍの蛍光性の結晶である。適当な波長を有する光によって励起されると、これらの結晶は、それらの化学組成物およびサイズに左右される波長の単色光などの光を放出する。ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、またはＩｎＡｓなどの量子ドットは独特の光学的な性質を有し、これらおよび同様の量子ドットがいくつもの商業的な供給源から入手可能である（例えば、ＮＮ−Ｌａｂｓ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｏｃｅａｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ、Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ、ＡＲ；Ｎａｎｏｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを１種または複数の光を放出するまたは他のやり方で検出可能な色素で標識することができる。色素により放出される光は可視光であっても紫外線または赤外線などの不可視光であってもよい。例示的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素；フルオレセインおよびローダミンなどのキサンテン色素；アミノ基をアルファ位またはベータ位に有する色素（例えば、ナフチルアミン色素、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸、１−アニリノ−８−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｄｅ）スルホン酸および２−ｐ−トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）−６−ナフタレン  スルホン酸など）；３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する色素；アクリジン、例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジなど；ピレン、ベンゾオキサジアゾールおよびスチルベン；３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）を有する色素；６−カルボキシ  フルオレセイン（ＦＡＭ）；５＆６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）；Ｃｙ２；Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ；６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）；ＮＡＮ；ＮＥＤ；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；およびＣｙ７．５；ＩＲ８００ＣＷ、ＩＣＧ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０であってよい。
【０１７３】
したがって、ある特定の実施形態は、試料中の標的ポリヌクレオチド遺伝子産物を検出するための方法であって、ａ）試料を試料中の標的ポリヌクレオチド遺伝子産物と相補的な配列を含むプローブとハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチド遺伝子産物またはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下でプローブを前記標的ポリヌクレオチド遺伝子産物と特異的にハイブリダイズさせるステップと、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するかしないか、および存在する場合には、その量を検出するステップとを含む方法を包含する。試料中の標的ポリヌクレオチド遺伝子産物を検出するための方法であって、ａ）標的ポリヌクレオチド遺伝子産物またはその断片を増幅するステップと、ｂ）前記増幅された標的ポリヌクレオチド遺伝子産物またはその断片が存在するかしないか、および存在する場合には、その量を検出するステップとを含む方法も包含される。特定の実施形態では、プローブは検出可能に標識されている。
【０１７４】
遺伝子産物発現レベルの分析
ある特定の実施形態によると、本発明の方法およびキットを使用して、対象が甲状腺がんを有するかどうかまたは甲状腺腫瘍または甲状腺結節が良性であるかどうかを、これだけに限定されないが、本明細書に記載の遺伝子産物の任意の特定の組合せを含めた、表１に示されている２種以上の遺伝子によって発現される遺伝子産物の発現レベルに基づいて決定することができる。一般に、発現パターンが、がん性甲状腺組織から得た生物学的試料において観察された発現パターンと、正常または非がん性甲状腺組織から得た生物学的試料において観察された発現パターンよりも密接に相関すると決定される場合に、甲状腺がんの決定が成される。同様に、一般に、発現パターンが、正常または非がん性甲状腺組織から得た生物学的試料において観察された発現パターンと、がん性甲状腺組織から得た生物学的試料において観察された発現パターンよりも密接に相関すると決定された場合に、甲状腺組織試料が良性であるという決定がなされる。
【０１７５】
特定の例では、本明細書に記載の１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを適切な対照と比較することによって甲状腺がんの存在を診断する。「適切な対照」または「適当な対照」としては、参照値、例えば、発現レベル、特徴、特性、または性質が挙げられ、これらは、組織または生物の細胞または他の生物学的試料（例えば、状態（例えば甲状腺がん）がないことを示す正常な形質を示す、例えば対照細胞もしくは正常な細胞、組織または生物）について決定される。ある特定の実施形態では、「適切な対照」または「適当な対照」は、予め定義された値、レベル、特徴、特性、または性質である。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、生物学的試料中の１種または複数の遺伝子産物の発現を遺伝子産物の参照発現レベルと比較し、遺伝子産物の参照発現レベルは、ある特定の実施形態では、所定のまたは予め定義された値であり得る。参照発現レベルは、１つまたは複数の適切な対照試料中の遺伝子産物の発現レベルに基づいて決定することができ、対照試料は正常な組織試料であっても腫瘍組織試料（例えば、甲状腺腫瘍）であってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、正常な組織に関連する参照発現レベルを、正常な甲状腺組織などの正常な非がん性組織から得た１、２、３、５、１０、２０、５０、またはそれ以上の生物学的試料中の遺伝子産物の発現レベルに基づいて決定する。他の実施形態では、がん組織、例えば甲状腺がんに関連する参照発現レベルを、甲状腺がん組織などのがん組織から得た１、２、３、５、１０、２０、５０、またはそれ以上の生物学的試料中の遺伝子産物の発現レベルに基づいて決定する。ある特定の実施形態では、表１の遺伝子によって発現される遺伝子産物の１種以上、２種以上、もしくは３種以上、あるいはＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子から選択される少なくとも１種、少なくとも２種、または少なくとも３種の遺伝子について、正常な組織およびがん組織のいずれかまたはその両方における参照発現レベルを決定する。関連する実施形態では、本明細書に記載の遺伝子産物の任意のセット、例えば、ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる遺伝子セットについて、正常な組織およびがん組織のいずれかまたはその両方における参照発現レベルを決定する。
【０１７７】
特定の実施形態では、生物学的試料中の遺伝子産物のうちの１種以上、２種以上、または３種以上の発現が正常な（非がん性の）対照試料または対照参照における発現と比較して示差的なことにより、がんが示される。対照的に、生物学的試料中の遺伝子産物のうちの１種以上、２種以上、または３種以上の発現が正常な（非がん性の）対照試料または対照参照における発現と比較して実質的に類似していることにより、他方で良性組織が示され、生物学的試料中の遺伝子産物のうちの１種、２種またはそれより多くの発現ががん対照試料またはがん対照参照における発現と比較して実質的に類似していることにより、がんが示される。
【０１７８】
示差的発現は、１種または複数の遺伝子産物の発現レベルにおける、適当な対照における同じ遺伝子産物の発現レベルと比較した統計的有意差を含む。統計的有意差は、ＲＮＡレベル、タンパク質レベル、タンパク質機能、または本明細書に記載のものなどの任意の他の関連性のある遺伝子発現の測定値によって測定される発現レベルの上昇または低下のいずれかに関するものであってよい。結果は、典型的には、偶然に起こった可能性が低ければ、統計的に有意であるといわれる。検査または結果の有意水準は、伝統的に、頻度論による統計学的な仮説検定概念に関する。単純な場合では、統計的有意性を、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説の拒絶の決定がなされる確率（第１種の過誤、または「偽陽性決定」として知られる決定）と定義することができる。この決定は、多くの場合、ｐ値を使用して成され、ｐ値が有意水準を下回る場合に帰無仮説が拒絶される。ｐ値が小さいほど、結果がより有意になる。統計的有意性を決定するために、ベイズ因子も利用することができる（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｓ．、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３０巻：１００５〜１３頁、１９９９年を参照されたい）。ある場合では、検査または結果の有意水準は、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説の拒絶の決定が成される確率が規定された確率以下であるという分析を反映し得る。この種類の分析により、帰無仮説に包含される仮定のいくつかのセットについて拒絶が決定される確率が有意水準よりもはるかに小さくなり得るという適用が可能になる。
【０１７９】
ある特定の例示的な実施形態では、統計的に有意な示差的発現は、生物学的試料中の所与の遺伝子産物の発現レベルが、適当な対照と比較して、中間の全ての整数および少数点（例えば、１．２４×、１．２５×、２．１×、２．５×、６０．０×、７５．０×など）を含めて、少なくとも約１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２．０×、２．２×、２．４×、２．６×、２，８×、３．０×、４．０×、５．０×、６．０×、７．０×、８．０×、９．０×、１０．０×、１５．０×、２０．０×、５０．０×、１００．０×、またはそれ以上の発現の差（すなわち、より高い発現またはより低い発現であり得る示差的発現）である状況を含んでよい。ある特定の実施形態では、統計的に有意な示差的発現は、生物学的試料中の所与の遺伝子産物の発現レベルが、適当な対照と比較して、中間の全ての整数および少数点を含めて、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００パーセント（％）またはそれ以上の発現の差（すなわち、より高いかより低いかであり得る示差的発現）である状況を含んでよい。
【０１８０】
追加的な例として、当技術分野で公知の通りＺ検定、すなわち、絶対Ｚスコアの算出を実施することによって示差的発現を決定することもできる。Ｚ検定は、典型的には、試料平均と集団平均の間の有意差を同定するために利用される。例えば、標準の正常な表（例えば、対照組織）と比較して、９５％信頼区間で（すなわち、５％有意水準で）、絶対値が１．９６を超えるＺ−スコアにより、非ランダム性が示される。９９％信頼区間については、絶対Ｚが２．５８を超える場合、これはｐ＜．０１を意味し、差異はさらにいっそう有意である−より大きな信頼度で帰無仮説が拒絶され得る。これらのおよび関連する実施形態では、絶対Ｚ−スコアが１．９６、２、２．５８、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上（間の全ての少数点（例えば、１０．１、１０．６、１１．２など）を含む）であることにより、統計的有意性の強力な尺度がもたらされ得る。ある特定の実施形態では、絶対Ｚ−スコアが６を超えることにより、例外的に高い統計的有意性がもたらされ得る。
【０１８１】
実質的に類似したとは、一般に、生物学的試料と参照対照の間で発現レベルに統計的有意差がないことに関する。実質的に類似した発現レベルの例としては、生物学的試料中の所与の遺伝子産物の発現レベルにより、参照試料と比較して、中間の全ての小数点（例えば、０．１５×、０．２５×、０．３５×など）を含めて、約０．０５×未満、約０．１×未満、約０．２×未満、約０．３×未満、約０．４×未満、約０．５×未満、約０．６×未満、約０．７×未満、約０．８×未満、約０．９×未満、約１．０×未満、約１．１×未満、約１．２×未満、約１．３×未満、または約１．４×未満の発現の差（すなわち、より高い発現またはより低い発現であり得る示差的発現）がもたらされる状況を挙げることができる。ある特定の実施形態では、示差的発現として、生物学的試料中の所与の遺伝子産物の発現レベルにより、参照試料と比較して、中間の全ての小数点を含めて、約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０パーセント（％）未満の発現の差（すなわち、より高いかより低いかであり得る示差的発現）がもたらされる状況を挙げることができる。
【０１８２】
示差的発現とは、所与の遺伝子産物の、対照試料または対照値と比較した発現の増加または減少を指し得る。本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、生物学的試料における、正常対照試料または正常対照値における発現レベルと比較した、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ１遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＣＲ７遺伝子およびＨＯ−１遺伝子のうちの１種以上、２種以上、３種以上、もしくは４種以上の遺伝子産物の発現の増加、ならびに／またはＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子のうちの１種以上、２種以上、３種以上の遺伝子産物の発現の減少、または、本明細書に記載されている遺伝子産物の種々のサブセットのいずれかの対応する変化により、腫瘍またはがんの存在が示される。増加または減少は、約１０％、約２０％、約５０％、約１００％、約２００％、約５００％、または約１０００％の増加または約１０％、約２０％、約５０％、または約９０％の減少などの上記の発現の差異のいずれかに対応し得る。
【０１８３】
上記の通り、特定の実施形態では、生物学的試料ががん組織を含むか否かの決定は、１種または複数の遺伝子産物の発現レベルをがんの有無と相関させることを含む。これは、生物学的試料中の遺伝子産物の発現レベルを、がんを有することが分かっている対象から得た試料またはがんを有さないことが分かっている対象から得た試料などの１つまたは複数の対照試料における発現レベルと比較することによって実現することができる。ある特定の実施形態では、相関または比較は、以前に対照試料から得られた遺伝子発現データ、例えば予め定義されたまたは所定の参照値などを使用して実施することができる。
【０１８４】
本明細書に記載の通り、いくつもの当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して１種または複数の遺伝子産物の発現レベルを定性的または定量的に決定するために、本発明の方法を使用することができる。いくつかの場合には、検出可能なプローブのハイブリダイゼーションの程度は、生物学的試料中の遺伝子産物の量に直接関連する。ソフトウェアを使用して、プローブからのシグナルを抽出し、正規化し、要約し、解析することができる。一部の実施形態では、生物学的試料について決定された所与のプローブのシグナル強度を参照セットと比較して、試料中で示差的発現が生じているかどうかを決定することができる。例えば、マイクロアレイに関しては、発現された遺伝子産物に対応するアレイ上の位置における相対的な強度の増加または減少により、それぞれ生物学的試料中の対応する遺伝子の発現の増加または減少が示される。
【０１８５】
遺伝子発現の解析およびがん表現型または良性表現型との関連付けは、分類子またはアルゴリズム、例えば、データを正規化するため、および／またはデータの信頼度を改善するために設計されたアルゴリズムを使用して実施することができる。使用することができるアルゴリズムとしては、本明細書に記載の任意のアルゴリズム、例えば、実施例２および３に記載されている分類子またはアルゴリズムが挙げられる。ある特定の実施形態では、遺伝子産物はｍＲＮＡであり、例えば実施例１に記載の通り、リアルタイムＰＣＲを使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、実施例１において例示されている通り、悪性甲状腺結節および良性甲状腺結節から得た甲状腺組織試料における種々の遺伝子の発現に基づいて、種々の遺伝子の分類の可能性を各遺伝子のＣＴ値を使用して決定して、ＲＯＣ曲線を作成することができる。各遺伝子の感度および特異度も決定することができる。
【０１８６】
特定の実施形態では、アルゴリズムは、多重遺伝子分類試験である。そのような分類子は、例えば実施例２に記載の通り、第１のステップで非定型的なＣＴ値を有する生物学的試料の群を同定し、分類し、第２のステップで、第１のステップの後に分類されずに残った生物学的試料を分類するためのアルゴリズムを生成する、二段階の手法を使用して開発することができる。両方のステップからの統合データをＲＯＣ曲線に組み込み、プロットすることができる。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、第１のステップは２つの相を含む。第１の相では、所与の遺伝子のセットについて、非定型的なＣＴ値を有する生物学的試料を同定する。非定型的なＣＴを定義するための基準は平均ＣＴ値＋／−２標準偏差と定義することができ、したがって、任意の所与の遺伝子についてのＣＴ値の５％のみを表す。各遺伝子について、がん群に属するが、真には良性群に属する非定型的なＣＴの誤差確率（ＥＰ）を算出することができる。ＥＰが低いほど高い分類能力が反映されることを考慮して、ＥＰに基づいて各遺伝子についてのスコアを算出することができる。第２の相では、スコアが最も良い遺伝子から得た複合スコア（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃｏｒｅ）を使用して、試料をがんまたは良性に分類することができる。
【０１８８】
第２のステップのある特定の実施形態では、図３に図示されている通り、第１のステップで分類されなかった試料を、下流のアルゴリズムを生成するための残りの訓練セットとして使用して、全てのデータの分類を完了することができる。例えば、これは、線形判別分析（ＬＤＡ）および非線形判別分析（ＮＬＤＡ）の２つの方法を使用して実施することができる。ＬＤＡ分析に関しては、変数および試料がＬＤＡに必要な条件を満たすかどうかが未知であり得るので、段階的なＬＤＡ手法を使用することができる。段階的な手法が選択され得、その理由は、それにより最大の分類確実性をもたらす変数の組合せを同時に同定することができ、ＬＤＡの条件を満たすからである。ＮＬＤＡに関しては、数学関数のセットを発展させるための遺伝的アルゴリズムベースの方法を使用して、２つ以上の特徴の線形または非線形のいずれかの組合せを生じさせることができる（Ｍｅｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年）。この方法により、最大４種の遺伝子の組合せの非線形変換が生成されて、単一の複合スコアが生じる。
【０１８９】
図３に図示されている通り、両方のステップを統合するために、第１のステップで得られたデータに数値を割り当てて、それらに第２のステップまたは相で得られた値と同様の出力同一性を与えることができる。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、感度／特異度の関係が最大になり、陽性的中率（ＰＰＶ）と陰性的中率（ＮＰＶ）の両方が９０％超に達し、かつ／またはＡＵＣ＞９０が実現されるように分類子またはアルゴリズム（または、それが基づく遺伝子）を選択する。
【０１９１】
特定の実施形態では、対象から得た生物学的試料ががん性であるか良性であるかの相関付けおよび／または決定を、分類子またはアルゴリズム、例えば、以下の遺伝子産物のセットいずれかによって発現される遺伝子産物を含めた、本明細書に記載の１種以上、２種以上、または３種以上の遺伝子産物の発現に基づく二段階分類子を使用して決定する：
ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの２種以上または３種以上の遺伝子産物；
ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；
ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；
ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；または
ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は「機械学習アルゴリズム」を使用して実施することができ、これは「分類子」としても当業者に公知のコンピュータベースの予測方法論を指し、遺伝子発現プロファイルを特徴付けるために使用することができる。典型的には、例えばマイクロアレイベースのハイブリダイゼーションアッセイによって得られる特定の発現レベルに対応するシグナルを、発現プロファイルを分類するためにアルゴリズムに供す。教師あり学習は、一般に、クラスの中での区別、例えば、良性甲状腺組織に対してがんの甲状腺組織を認識するように分類子を「訓練」し、次いで、独立した検定セットに対して分類子の正確度を「検定」することを伴う。新しい未知の試料に対しては、分類子を使用して、その試料が属するクラスを決定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子産物の任意のセットの発現レベルに基づくものを含め、アルゴリズムを使用して相関させることを実施する。
【０１９３】
試料のカテゴリー化に適したアルゴリズムの種類の例としては、これだけに限定されないが、ｋ−最近傍アルゴリズム、サポートベクターアルゴリズム、単純ベイズアルゴリズム、ニューラルネットワークアルゴリズム、隠れマルコフモデルアルゴリズム、遺伝的アルゴリズム、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。本発明の一部の実施形態では、対角線形判別分析、ｋ−最近傍アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形サポートベクターマシン、ランダムフォレストアルゴリズム、または確率的なモデルベースの方法あるいはこれらの組合せが、マイクロアレイデータを分類するために提供される。一部の実施形態では、試料を区別する（例えば良性と悪性、正常と悪性）または亜型を区別する（例えばＰＴＣとＦＶＰＴＣ）同定されたマーカーは、目的のクラス間の発現レベルの差の統計的有意性に基づいて選択される。いくつかの場合には、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇまたは偽発見率（ＦＤＲ）についての別の補正を適用することによって統計的有意性を調整する。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本発明のアルゴリズムは、コンピュータによる計算の１種または複数の追加的な分析的特徴を含んでよい。例えば、遺伝子産物発現レベルを解析する方法は、特徴選択アルゴリズムを使用することを含んでよく、これは、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（Ｓｍｙｔｈ，  Ｇ．  Ｋ．（２００５年）。Ｌｉｍｍａ：  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．  Ｉｎ：  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、Ｒ．  Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ、Ｖ．  Ｃａｒｅｙ、Ｓ．  Ｄｕｄｏｉｔ、Ｒ．  Ｉｒｉｚａｒｒｙ、Ｗ．  Ｈｕｂｅｒ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３９７〜４２０頁）を使用することによってもたらされ得る。遺伝子産物発現レベルを解析する方法は、予備分類子（ｐｒｅ−ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）アルゴリズムを使用することを含んでよい。例えば、アルゴリズムは、細胞特異的な分子指紋を使用して試料をそれらの組成に応じて予備分類し（ｐｒｅ−ｃｌａｓｓｉｆｙ）、次いで、補正／正規化因子を適用するものであってよい。次いで、このデータ／情報を、その情報を組み込んで最終的な診断を補助する最終的な分類アルゴリズムに送ることができる。
【０１９５】
選択された特徴は、分類子アルゴリズムを使用して分類することができる。例示的なアルゴリズムとしては、これだけに限定されないが、主成分分析アルゴリズム、部分最小二乗法、および独立成分分析アルゴリズムなどの、変数の数を減少させる方法が挙げられる。例示的なアルゴリズムは、これだけに限定されないが、統計学的な方法および機械学習技法に基づく方法などの、多数の変数を直接処理する方法をさらに含む。統計学的な方法としては、罰金付きロジスティック回帰、マイクロアレイ予測分析（ＰＡＭ）、シュランケンセントロイド（ｓｈｒｕｎｋｅｎ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）に基づく方法、サポートベクターマシン分析、および正則化線形判別分析を挙げることができる。機械学習技法としては、バギング手順、ブースティング手順、ランダムフォレストアルゴリズム、およびこれらの組合せが挙げられる。Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｆｏｒｍ．  ２００８年；６巻：７７〜９７頁では、マイクロアレイ強度データの分析に関して上記されている分類技法の概要が提供される。
【０１９６】
いくつかの場合には、本発明によるアルゴリズムを、ＦｉｓｈｅｌおよびＫａｕｆｍａｎら、２００７年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３巻（１３号）：１５９９〜６０６頁に記載されているものなどのメタ分析手法で補足することができる。いくつかの場合には、分類子アルゴリズムを再現性分析などのメタ分析手法で補足することができる。いくつかの場合には、再現性分析により、少なくとも１つの予測発現産物マーカーセットに見られるマーカーを選択する。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、試料において測定された遺伝子産物の発現のレベル、例えば、各遺伝子産物について得られた強度値を、これだけに限定されないが、データの内因性の性質について調べることによって特徴の関連性を評価するフィルター技法、モデル仮説を特徴サブセット検索内（ｆｅａｔｕｒｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｓｅａｒｃｈ）に埋め込むラッパー法、および特徴の最適なセットの検索が分類子アルゴリズムに組み込まれた埋め込み技法などの特徴選択技法を使用して分析することができる。
【０１９８】
本発明の方法において有用なフィルター技法の例としては、（１）パラメトリック法、例えば、２標本ｔ検定、ＡＮＯＶＡ分析、ベイズ法フレームワーク、およびガンマ分布モデルの使用など；（２）モデルを用いない方法、例えば、ウィルコクソン順位和検定、級間−級内平方和検定（ｂｅｔｗｅｅｎ−ｗｉｔｈｉｎ  ｃｌａｓｓ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅｓ  ｔｅｓｔ）、ランク積法（ｒａｎｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｍｅｔｈｏｄ）、ランダム置換法、または２つのデータセット間の発現の倍率変化差異について閾値点を設定し、次いで、各遺伝子において誤分類の数を最小限にする閾値点を検出することを伴うＴｎｏＭの使用など；ならびに（３）多変量法、例えば、二変量法、相関に基づく特徴選択法（ＣＦＳ）、最小冗長性最大関連性法（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌａｖａｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＭＲＭＲ）、マルコフブランケットフィルター法（Ｍａｒｋｏｖ  ｂｌａｎｋｅｔ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）、および非相関シュランケンセントロイド法などが挙げられる。本発明の方法において有用なラッパー法としては、逐次検索法、遺伝的アルゴリズム、および分布アルゴリズムの推定が挙げられる。本発明の方法において有用な埋め込み方法としては、ランダムフォレストアルゴリズム、サポートベクターマシンアルゴリズムの重みベクトル、およびロジスティック回帰アルゴリズムの重み付けが挙げられる。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００７年１０月１日；２３巻（１９号）：２５０７〜１７頁では、強度データの分析に関して上記されているフィルター技法の相対的な利点の概要が提供される。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、試料中の遺伝子産物の発現レベルをバイオマーカーの２種以上の異なるセットについての遺伝子発現データと比較することができ、バイオマーカーの各セットについての遺伝子発現データは１種または複数の組織型、例えば、甲状腺腫瘍組織の存在と相関する１種または複数の参照遺伝子発現レベルを含み、発現レベルを２種以上のバイオマーカーについての遺伝子発現データと逐次的に比較する。発現レベルとバイオマーカーのセットについての遺伝子発現データの比較は、遺伝子発現データに対して本明細書に記載のものを含めた１つの分類子を適用することまたは異なる分類子を逐次的に適用することを含んでよい。逐次的な分析は、がん組織の試料の遺伝子発現解析から得られた分類子を適用し、その後、そのような試料の一部ががん組織を含有し、その他が良性組織を含有する、異なる生物学的試料の混合物の分析から得られた分類子を適用することを伴ってよい。
【０２００】
ある特定の実施形態では、逐次的な分析の初期に使用した分類子を使用して、試料を良性または疑わしいとして含めるか、または除外することができる。一部の実施形態では、そのような逐次的な分析は、前述の分類子によって除外されていない試料からのデータに「主要な」分類子を適用して終了し、ここで、主要な分類子は、複数の組織型における遺伝子発現レベルのデータ解析から得て、主要な分類子は、試料が良性もしくは疑わしい（または、悪性）であると示すことができるものである。
【０２０１】
例えば、ある特定の実施形態では、遺伝子またはバイオマーカーのセットを使用したプロファイリングを使用して、甲状腺組織を、良性、疑わしい、および／または悪性と特徴付けることができる。セットは、濾胞状腺腫（ＦＡ）、結節性過形成（ＮＨＰ）、リンパ球性甲状腺炎（ＬＣＴ）、およびハースル細胞腺腫（ＨＡ）を含めた、良性（非がん性）の甲状腺亜型；濾胞状癌（ＦＣ）、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、濾胞型乳頭癌（ＦＶＰＴＣ）、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）、ハースル細胞癌（ＨＣ）、および甲状腺未分化癌（ＡＴＣ）を含めた悪性の亜型を含有するコホートの遺伝子発現レベルの解析に由来してよい。そのようなパネルは、腎癌（ＲＣＣ）、乳癌（ＢＣＡ）、黒色腫（ＭＭＮ）、Ｂ細胞リンパ腫（ＢＣＬ）、および副甲状腺（ＰＴＡ）を含めた非甲状腺亜型に由来してもよい。正常な甲状腺組織（ＮＭＬ）と関連のあるバイオマーカーセットも本明細書において提供される方法および組成物において使用することができる。例示的なバイオマーカーは表１に提供され、特異的なバイオマーカーのセットは本明細書に記載されている。
【０２０２】
上記の通り、本発明の方法およびキットは、生物学的試料を同定する、分類する、診断する、またはそうでなければ特徴付けるための、遺伝子または遺伝子産物の特定のセット、例えば、「バイオマーカーセット」の使用に関し得る。本発明では、本明細書では「分類セット」と記載されるバイオマーカーセットの群を使用することもできる。多くの場合、セット内のバイオマーカーの遺伝子発現のレベルのパターン（サインとしても公知である）を決定し、次いで、生物学的試料中のバイオマーカーの同じセットのサインを、試料のサインと参照サインの間の類似性の尺度などによって評価するために使用する。一部の実施形態では、当該方法は、バイオマーカーセット内にあり、かつ／または分類セット内にある２種以上の遺伝子産物のレベルを測定する（または、得る）ことを伴う。例えば、一部の実施形態では、バイオマーカーセットまたは分類セットは、少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３３種、３５種、３８種、４０種、４３種、４５種、４８種、５０種、５３種、５８種、６３種、６５種、６８種、１００種、１２０種、１４０種、１４２種、１４５種、１４７種、１５０種、１５２種、１５７種、１６０種、１６２種、１６７種、１７５種、１８０種、１８５種、１９０種、１９５種、２００種、または３００種のバイオマーカーを含有してよい。一部の実施形態では、バイオマーカーセットまたは分類セットは、１種以下、２種以下、３種以下、４種以下、５種以下、６種以下、７種以下、８種以下、９種以下、１０種以下、１５種以下、２０種以下、２５種以下、３０種以下、３３種以下、３５種以下、３８種以下、４０種以下、４３種以下、４５種以下、４８種以下、５０種以下、５３種以下、５８種以下、６３種以下、６５種以下、６８種以下、１００種以下、１２０種以下、１４０種以下、１４２種以下、１４５種以下、１４７種以下、１５０種以下、１５２種以下、１５７種以下、１６０種以下、１６２種以下、１６７種以下、１７５種以下、１８０種以下、１８５種以下、１９０種以下、１９５種以下、２００種以下、または３００種以下のバイオマーカーを含有する。一部の実施形態では、分類セットは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、または少なくとも２５種の異なるバイオマーカーセットを含有する。他の実施形態では、分類パネルは、１種以下、２種以下、３種以下、４種以下、５種以下、６種以下、７種以下、８種以下、９種以下、１０種以下、１５種以下、２０種以下、２５種以下の異なるバイオマーカーセットを含有する。
【０２０３】
バイオマーカーセットは、良性の発現プロファイルの非良性または疑わしい発現プロファイルからの妥当な分離に適応するように選択することができる。分類子、すなわちアルゴリズムの訓練は、多数の生物学的試料、例えば、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または４０００の生物学的試料（例えば、甲状腺試料）などに対して実施することができる。全試料集団はＦＮＡから得た試料からなってもよく、試料集団はＦＮＡによって得た試料と他の方法によって得た試料、例えば手術後組織の混合物であってもよい。一部の実施形態では、多くの訓練／検定セットを使用して予備のアルゴリズムを開発する。全体的なアルゴリズム誤差率は、非良性試料に対する良性試料についての遺伝子数の関数として示すことができる。一部の実施形態では、悪性に対する亜型または良性のいずれかについての遺伝子数（Ｂ対Ｍ）の関数である性能測定基準などの、他の性能測定基準を使用することができる。そのような性能測定基準は、ＣＶ、または当技術分野で公知の他の方法を使用して得ることができる。結果は全て、試料に対して交差検証形式で訓練および検定されるサポートベクターマシンモデルを使用して得ることができる。
【０２０４】
分子プロファイリングの結果の統計学的評価により、以下のうちの１つまたは複数を示す定量値（複数可）がもたらされ得る：診断の正確度の尤度；がんの尤度；または特定のがん亜型の尤度。データは、患者の治療を手引きするために最も有用な形式で医師に直接示すことができる。
【０２０５】
分子プロファイリングの結果は、これだけに限定されないが、スチューデントＴ検定、両側Ｔ検定、ピアソン順位和分析、隠れマルコフモデル分析、ｑ−ｑプロットの分析、主成分分析、一元配置ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ、ＬＩＭＭＡなどを含めた当技術分野で公知のいくつもの方法を使用して統計学的に評価することができる。
【０２０６】
本発明の一部の実施形態では、本発明の方法を単独で、または細胞学的分析と組み合わせて、例えば、がんか良性かの分類、同定、または診断を、約８５％の正確度から約９９％または約１００％の正確度の間で提供することができる。
【０２０７】
本明細書に記載のバイオマーカーセットまたは分類セットのそれぞれに基づくアルゴリズムには、所与の試料を、「良性」、「疑わしい」として、または１種または複数の組織型（例えばＮＭＬ、ＦＡ、ＮＨＰ、ＬＣＴ、ＨＡ、ＦＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ、ＭＴＣ、ＨＣ、ＡＴＣ、ＲＣＣ、ＢＣＡ、ＭＭＮ、ＢＣＬ、およびＰＴＡ）を含むもしくは含まないとして含める、または除外するためのアルゴリズム訓練の間に決定された遺伝子産物発現レベルに関する情報を使用することができる。各バイオマーカーセットまたは分類セットアルゴリズムには、入ってくる試料をフィルタリングするための簡単な決定規則を使用することができ、決定規則に適合する場合、あらゆるフラグ付けされた試料をその後の評価から有効に除去することができる（例えば、試料を、その中に含有される１種または複数の組織型の同一性または状態に関して特徴付ける）。本発明で提供されるバイオマーカーセットおよび分類セットは、甲状腺がんまたは他の甲状腺状態を分類し、特徴付けし、同定し、かつ／または診断するために有用である（甲状腺を正常または良性であると診断することを含む）。
【０２０８】
遺伝子発現レベルの解析は、遺伝子発現データに本明細書に記載の異なる分類子またはアルゴリズムを逐次的に適用することを伴ってよい。ある特定の実施形態では、そのような逐次的な分析は、複数のがん性甲状腺組織の試料の遺伝子発現解析から得られた分類子を適用し、その後、試料の一部ががん性甲状腺組織を含有し、その他が良性甲状腺組織を含有する、異なる甲状腺組織の試料の混合物の分析から得られた分類子を適用することを伴ってよい。一部の実施形態では、分類子は、良性組織、正常な組織、および／または非甲状腺組織（例えば、副甲状腺組織）の遺伝子発現パターンの解析から得たものである。一部の実施形態では、疾患組織はＨＡ組織および／またはＨＣ組織である。
【０２０９】
一部の実施形態では、各分類パネルが生物学的試料からのバイオマーカーの発現レベル（例えば、要約されたマイクロアレイ強度値、ｑＰＣＲ、または配列決定データ）を入力として受信すると分類プロセスが開始される。次いで、分類パネルにおいて指定されているバイオマーカーおよび発現レベルが評価される。所与の試料からのデータが分類パネル内で指定されている規則と一致する（または、他の点で分類パネルのサインと相関する）場合、そのデータ出力により試料がフラグ付けされ、その試料が主要な（下流の）分類子によるさらなる評価およびスコアリングが防止される。分類パネルにより試料がフラグ付けされた場合には、システムにより自動的にその試料に対して「疑わしい」コールが戻される。分類パネルにより試料がフラグ付けされなかった場合には、評価が次の分類パネルまで下流に継続され、そこでフラグ付けされるまたはフラグ付けされない可能性がある。いくつかの状況では分類パネルを特定の順序で適用し、他の場合では、適用の順序は任意の順序であってもよい。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、分類プロセスは、遺伝子発現解析などによって、対象からの試料（例えば甲状腺組織試料）からの１種または複数の遺伝子産物についての発現レベル（複数可）を決定することから開始される。別々に、参照または訓練試料の１つまたは複数のセットを分析して少なくともバイオマーカーの２つの異なるセットについての遺伝子発現データを決定することができ、各バイオマーカーセットの遺伝子発現データは１種または複数の組織型の存在と相関する１種または複数の遺伝子発現レベルを含む。バイオマーカーの第１のセットについての遺伝子発現データを使用して第１の分類子を訓練することができ、第２のセットについての遺伝子発現データを使用して第２の分類子を訓練することができ、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、またはそれ以上のバイオマーカーセット、および必要に応じて対応する分類子についても同様である。バイオマーカーのセットのそれぞれの分析に使用する参照試料または訓練試料のセットは重複していても重複していなくてもよい。一部の実施形態では、参照試料または訓練試料は、ＨＡ組織および／またはＨＣ組織を含む。例示的な分類プロセスの次のステップでは、試料の遺伝子発現レベル（複数可）とバイオマーカーの第１のセットまたは第１の分類子の間で第１の比較を行う。この第１の比較の結果が、マッチである場合には、分類プロセスは例えば試料が疑わしい、がん性である、または特定の組織型（例えばＨＡまたはＨＣ）を含有することを示す結果で終了する。比較の結果がマッチではない場合には、試料の遺伝子発現レベル（複数可）を比較の第２のラウンドにおいてバイオマーカーの第２のセットまたは第２の分類子と比較する。この第２の比較の結果がマッチである場合には、分類プロセスは例えば試料が疑わしい、がん性である、または特定の組織型（例えばＨＡまたはＨＣ）を含有することを示す結果で終了する。比較の結果がマッチではない場合には、上記プロセスは、同様の段階的な比較のプロセスにおいて、マッチが見いだされるまで、または分類プロセスに含まれる全てのバイオマーカーセットまたは分類子が比較の基礎として使用されるまで継続する。試料の遺伝子発現レベル（複数可）と分類プロセスにおいて利用したバイオマーカーのセットまたは分類子のいずれとの間にもマッチが見いだされない場合には、試料を「良性」であると指定することができる。一部の実施形態では、分類プロセスにおける最終的な比較は、試料の遺伝子発現レベル（複数可）と本明細書に記載の主要な分類子の間の比較である。
【０２１１】
本発明の一部の実施形態では、データ解析または相関させることには、処理する個々のデータ点が多数なので、本明細書に記載の種々のアルゴリズムを適用するためのコンピュータまたは他のデバイス、機械または装置が必要である。
【０２１２】
キット
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるがん、例えば甲状腺がんを診断または予測するためのキットまたは診断用検査を提供する。本明細書に記載の診断用検査はｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用検査であってよい。診断用検査としては、これだけに限定されないが、生物学的試料をアッセイし、甲状腺がんなどのがんの有無を検出するまたは示すために使用することができる、ＦＤＡに認可されたまたは承認を得たＩｎ  Ｖｉｔｒｏ診断薬（ＩＶＤ）、検査室で開発された検査（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｔｅｓｔ）（ＬＤＴ）、または消費者直結型（Ｄｉｒｅｃｔ−ｔｏ−Ｃｏｎｓｕｍｅｒ）（ＤＴＣ）検査が挙げられる。一実施形態では、診断用検査またはキットは検査室または他の医療専門の環境において使用することができるものである。別の実施形態では、診断用検査またはキットは消費者が自宅で使用することができるものである。
【０２１３】
診断用検査およびキットは、本明細書に記載の遺伝子産物を検出するための１種または複数の試薬を含み、また、疾患またはその続発症を治癒、緩和、処置、または予防するために、がん、例えば甲状腺がんのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける診断において使用することが意図された他の試薬、機器、およびシステムを含んでよい。一実施形態では、本明細書に記載のキットまたは診断用検査は、ヒトの身体から取得した検体の収集、調製、および検査において使用することが意図されたものであってよい。ある特定の実施形態では、キット、診断用検査および製品は、１つまたは複数の検査室検査を含んでよい。本明細書で使用される場合、「検査室検査」という用語は、対象から得た生物学的試料を検査することを伴う１種または複数の医学的なまたは検査室での手順を意味する。
【０２１４】
本発明のキットおよび診断用検査は、本明細書に記載の遺伝子産物、例えば表１に列挙されている遺伝子によって発現されるものなどを検出するための１種または複数の試薬を含む。この点について、検出用の試薬は、これだけに限定されないが、抗体およびオリゴヌクレオチドを含めた、遺伝子産物を検出するための当業者に公知の任意の試薬を含んでよい。ある特定の実施形態では、キットまたは診断アッセイは、キットを使用して遺伝子産物の発現レベルを決定するための本明細書に記載のアッセイとして実施する方法に関する使用説明書をさらに含んでよい。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本発明のキットまたは診断アッセイは、本明細書に記載の遺伝子産物を検出するための２種以上、３種以上、または４種以上の試薬、例えばプローブを含む。特定の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質または核酸、例えばｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、試薬は、本明細書に記載の任意のものを含めた抗体またはオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、各試薬はオリゴヌクレオチドのセットであり、例えば、各セットが、一緒になってＰＣＲにより標的ポリヌクレオチド遺伝子産物を増幅することができる２つのオリゴヌクレオチドを含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、試薬は検出可能に標識されたものである。一実施形態では、キットまたは診断アッセイは、遺伝子産物を検出するための２種以上、３種以上、または４種以上の試薬を含み、キットまたは診断アッセイは２つ以上、３つ以上、または４つ以上のプライマーセットを含み、各セットは標的遺伝子産物の少なくとも一部分を増幅することができる。ある特定の実施形態では、前記キットまたは診断アッセイは、２種以上、３種以上、または４種以上の検出可能に標識されたプローブをさらに含み、各プローブは、標的遺伝子産物またはその相補物のうちの１つに特異的に結合する。したがって、ある特定の実施形態では、各プライマーセットを使用して標的遺伝子産物を増幅し、次いで、各プローブを使用して増幅産物を検出し、したがって、各遺伝子産物の発現レベルを測定する。特定の実施形態では、各試薬、例えば、各プライマーセットにより、異なる遺伝子産物が検出される。しかし、ある特定の実施形態は、同じ遺伝子産物を増幅する２種以上の試薬を含んでよいことが理解される。例えば、キットまたは診断アッセイは、一方が増幅プライマーのセットであり、他方がプローブであり、それぞれが同じ遺伝子産物に特異的に結合し、そして／またはそれを検出する２種の試薬を含んでよい。さらに、キットまたは診断アッセイは、それぞれが同じ遺伝子産物を特異的に結合するまたは検出する２種以上の試薬の複数の組合せを含んでよく、例えば、各組合せが異なる遺伝子産物に特異的に結合するまたはそれを検出し、したがって、複数の遺伝子産物を、例えば同時に増幅し、検出することが可能になる。
【０２１６】
特定の実施形態では、キットまたは診断アッセイの試薬によって検出される遺伝子産物は、表１に列挙されている１種または複数の遺伝子によって発現され、遺伝子産物の少なくとも１種がＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子またはＣＣＲ７遺伝子によって発現される。ある特定の実施形態では、遺伝子産物は、ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＸＢ１３０遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子のうちの３種以上の遺伝子産物；ＣＸＣＲ３遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＣＫ１９遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＣＣＲ３遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＸＢ１３０遺伝子の遺伝子産物；ＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＡＲ遺伝子およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物；またはＣＸＣＬ１０遺伝子、ＴＩＭＰ−１遺伝子、ＣＬＤＮ−１遺伝子、およびＣＣＲ７遺伝子の遺伝子産物を含む、またはそれからなる。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、キットまたは診断アッセイは、別々の容器内に各試薬を含む。他の実施形態では、各試薬が同じ容器に提供される。特定の実施形態では、試薬は、それぞれがアレイなどの基質に付着している。特定の実施形態では、試薬はそれぞれが固体基質の別々の領域に付着している。したがって、一実施形態では、試薬は固体基質に共有結合したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットであり、固体基質は必要に応じてアレイであり、アレイは必要に応じてマイクロアレイである。ある特定の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドのセット、例えばプライマーであり、オリゴヌクレオチドのセットはＤＮＡを含む。
【０２１８】
本発明のキットまたは診断アッセイは、前記試薬を前記遺伝子産物に結合させるために適した１種もしくは複数の溶液、および／または本発明の方法の実施において遺伝子産物の発現レベルを決定するために利用される１種もしくは複数の溶液または試薬をさらに含んでよい。例えば、特定の実施形態では、ＰＣＲプライマーのセットを含むキットまたは診断アッセイは、ＰＣＲアッセイを実施するための１種または複数の追加的な試薬、例えば、耐熱性ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドの混合物、および／または検出可能に標識されたプローブなどをさらに含んでよい。特定の実施形態では、検出可能に標識されたプローブは、フルオロフォア部分およびクエンチング部分を含み、プローブが切断されると、プローブによって検出可能なシグナルが放出され得るが、プローブがインタクトな場合には放出されない。
【０２１９】
本発明のキットまたは診断アッセイは、生物学的試料を処理および／または保管するための１種または複数の試薬をさらに含んでよく、例えば、甲状腺組織試料の処理は、生物学的試料から遺伝子産物を抽出することを含む。
【０２２０】
本発明のキットまたは診断アッセイは、実施された方法により、遺伝子産物の発現および／または存在が首尾よく特異的に同定および／または測定されたことを確認するために、１種または複数の対照遺伝子産物、例えば、遺伝子産物の試料を含有する陽性対照および／またはそれを含有しない陰性対照などをさらに含んでよい。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、キットまたは診断アッセイは、例えば陽性対照試料および／もしくは陰性対照試料における遺伝子産物の遺伝子発現レベルまたは甲状腺がんなどのがんの有無を示す所定の遺伝子発現のカットオフレベルに対応するデータまたは情報を含む。関連する実施形態では、キットまたは診断アッセイは、生物学的試料中の遺伝子の発現レベルと、がん（例えば甲状腺がん）の有無を相関させることに使用するためのアルゴリズムを含む。特定の実施形態では、キットまたは診断アッセイは、データおよび／またはアルゴリズムを含有する、あるいはデータまたはアルゴリズムに対するコードを含有するコンピュータ可読媒体を含む。
【０２２２】
特定の実施形態では、遺伝子産物を検出するための試薬、溶液、追加的な試薬、および対照遺伝子産物のうちの１つまたは複数は、別々の容器内に入っている。
【実施例】
【０２２３】
（実施例１）
診断アッセイ用の遺伝子の選択
甲状腺がんとの関連性に基づいて予め選択した１８種の遺伝子を使用して、良性かがんに不確定の甲状腺結節を正確に分類する、改善された診断アッセイを開発した。これらの遺伝子として、ＣＸＣＲ３（遺伝子１）、ＣＸＣＲ３Ａ（遺伝子２）、ＣＸＣＲ３Ｂ（遺伝子３）、ＣＸＣＲ４（遺伝子４）、ＣＣＲ３（遺伝子５）、ＣＸＣＬ９（遺伝子６）、ＣＸＣＬ１０（遺伝子７）、ＣＸＣＬ１１（遺伝子８）、ＳＰＡＧ−９（遺伝子９）、ＣＫ−１９（遺伝子１０）、ＴＩＭＰ−１（遺伝子１１）、ＣＬＤＮ−１（遺伝子１２）、ＣＡＲ（遺伝子１３）、Ｎｅｃｔｉｎ−１（遺伝子１４）、ＸＢ−１３０（遺伝子１５）、ＨＯ−１（遺伝子１６）、ＣＣＲ７（遺伝子１７）、およびＣＸＣＬ４（遺伝子１８）が含まれた。
【０２２４】
訓練セットとして、悪性甲状腺結節と良性甲状腺結節の両方から新鮮なスナップ凍結甲状腺組織試料を手術室において前向きに収集し（ｎ＝１５６）、それには１００の甲状腺癌および５６の良性甲状腺結節が含まれた。甲状腺がんの亜型として、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）通常型（５６）、濾胞型（２２）、びまん性硬化型（８）および濾胞状癌（ＦＣ）（１４）が含まれた。良性結節には、濾胞過形成（２６）、甲状腺炎（１４）および濾胞状腺腫（１６）が含まれた。全ての外科的な検体についての最終的な生検報告書を２人の専門病理医が独立して精査し、確認した。試料をすぐに４℃でＲＮＡ保護溶液（ＲＮＡｌａｔｅｒ、Ａｍｂｉｏｎ）に入れ、その後、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズし、−８０℃で保管した。Ｐｉｃｏｄｒｏｐ  １００分光光度計を使用してＲＮＡの濃度を決定した。アガロース−ホルムアルデヒド電気泳動を使用してＲＮＡ完全性を確認した。
【０２２５】
リアルタイムＰＣＲによって遺伝子の示差的発現を解析して、各遺伝子の分類の可能性を、個別に、および異なる組合せの両方で決定した。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。２連の試料で、ＱｉａｇｅｎのＲｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｑ  ｃｙｃｌｅｒを用い、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）キットを製造者の説明書に従って使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。ＲｏｔｅｒＧｅｎｅソフトウェアアプリケーションによって標準曲線を分析して、各遺伝子に対する最適な増幅条件を決定した。得られた効率値は９５％〜１０９％にわたった。得られた線形回帰係数値（Ｒｓｑ）は０．９９０〜０．９９９の範囲内であった。最初の比較のために、１８ｓおよびβ−アクチンを用いて遺伝子発現を正規化し、Ｐｆａｆｆｌによって提唱された相対的な定量化モデルによって分析した。結果が、図１に、良性甲状腺結節と比較したがんにおける相対的な倍率変化として示されている。
【０２２６】
各遺伝子のＣＴ値を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を生成して、個々の遺伝子それぞれの、甲状腺試料を分類する能力を比較した。曲線下面積（ＡＵＣ）、および最適な感度および特異度を決定し、それが図２に示されている。個別に、ＡＵＣおよび感度／特異度値が最も優れた遺伝子は、遺伝子１１（ＡＵＣ：０．８７および感度／特異度：９６％／７８％）、遺伝子１２（ＡＵＣ：０．８５および感度／特異度：８５％／７３％）および遺伝子１０（ＡＵＣ：０．８４および感度／特異度：８１％／７９％）であった。遺伝子１７および遺伝子５では、それぞれ０．７４および０．７０のＡＵＣが示された。図２に示されている通り、他の全ての遺伝子では、より劣った分類性能が示された。
【０２２７】
（実施例２）
診断アッセイの開発
感度／特異度の関係が最大にし、陽性的中率（ＰＰＶ）と陰性的中率（ＮＰＶ）の両方が９０％超に達する多重遺伝子分類試験（遺伝子サイン）を使用した。分類子において使用するために遺伝子の最適なセットを選択するための基準は、ＡＵＣが０．９７よりも大きく、感度値と特異度値の両方が、それぞれ９２％および９０％を超えること；遺伝子分類子はロバストかつ非定型的な遺伝子プロファイルの変動に対して抵抗性であるべきであり、オーバーフィットが伴わないことであった。さらに、サインには遺伝子の小さなセットが使用されるべきであり、したがって、単純なキットを、病理検査室などのポイント・オブ・ケアの診断環境において使用することが可能になる。これらの基準を満たすために、別々のアルゴリズムを訓練した；第１のアルゴリズムにより非定型的な（外れ値）ＣＴ値を有する試料を同定して分類し、第２のアルゴリズムにより非定型的でないＣＴ値を有する試料を分類する（図３Ａ）。両方のアルゴリズムからの出力データを統合するために、第１のアルゴリズムから得られたデータを数学的に変換して第２のアルゴリズムから得られたデータと同様の出力同一性を与えた（図３Ａ）。
【０２２８】
分類子を開発するために、アルゴリズムを二段階プロセスで逐次的に使用した。分類子の第１のステップは２つの相を含み、第１の相では、各遺伝子について平均ＣＴ値から２標準偏差を超える値と定義される非定型的なＣＴ値（外れ値）を有する試料を同定した（図３ＡおよびＢ）。試料が遺伝子に対する非定型的なＣＴの基準を満たす場合には、第２の相を続け、そこでがん群に属するが、真には良性群に属する非定型的なＣＴ値の誤差確率（ＥＰ）を算出する。選択された遺伝子について算出されたＥＰを個々のスコアとして表し、それを使用して、試料をがんまたは良性に分類する複合スコアを生成した（図３ＡおよびＢ）。第１のステップでは、良性試料５６のうち２１およびがん試料１００のうち３６が非定型的と同定され、それらは１００％の正確度で分類された。
【０２２９】
第１の相の非定型的なＣＴ値の基準を満たさなかった試料または第２の相において分類されなかった試料には第２のステップによる分類プロセスを続けた（図３Ｂ）。第２のステップでは、２つの方法、すなわち線形判別分析（ＬＤＡ）および非線形判別分析（ＮＬＤＡ）によって訓練したアルゴリズムを使用した（図３Ｂ）。ＬＤＡ分析は、変数および試料がＬＤＡに必要な条件を満たすかどうかが未知であったので、ＳＰＳＳ  １５．０ソフトウェアを段階的な手法で使用して実施した。段階的な手法を選択し、その理由は、それにより最大の分類確実性をもたらす変数の組合せを同時に同定し、ＬＤＡに必要な条件を満たしたからである。ＮＬＤＡについては、数学関数のセットを発展させるための遺伝的アルゴリズムベースの方法を使用して、２つ以上の特徴の線形または非線形のいずれかの組合せを生じさせた（Ｍｅｌｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年）。この方法により、最大４種の遺伝子の組合せの非線形変換が生成され、それにより単一の複合スコアが生じた。
【０２３０】
（実施例３）
診断用遺伝子セットの選択
実施例２に記載の通りＬＤＡ戦略とＮＬＤＡ戦略の両方から生成された新しい遺伝子分類子を、曲線下面積（ＡＵＣ）、感度、および特異度を含めたＲＯＣ曲線パラメータに基づいて選択した。ＬＤＡ（ＳＶ）およびＮＬＤＡ（ＦＭ７２およびＦＭ２０８）によって得られた代表的なアルゴリズムの結果は図４に示されている。全ての分類子で、ＡＵＣが０．９８を超え、感度が９４〜９７．８％にわたり、特異度が９２〜９９％である優れた性能を示された。最も重要なことに、最も性能が良いアルゴリズム（ＳＶ；図４）で示された陽性的中率および陰性的中率はそれぞれ９５．８％および９６．１％であった（図７）。
【０２３１】
個々の性能が最も良い３種の遺伝子（ＣＫ１９、ＴＩＭＰ−１、ＣＬＤＮ１）は、甲状腺がんについての強力なバイオマーカーであることが以前に示されているが、それらの組合せ単独では、これらの新しいアルゴリズムの性能は説明されなかった。これを実証するために、これらの遺伝子を、個別におよび一緒に組み合わせての両方で、これらを統合するために実施例２に記載のものと同じ二段階アルゴリズム戦略を使用して、ＳＶ遺伝子組合せを含めた本明細書において同定される新しい遺伝子組合せと比較した。著しいことに、図５に示されている通り、３種の遺伝子の組合せでは、それらの性能が遺伝子個別のものと比較して変更されなかった。さらに、スピアマン相関分析により、これらが密接に関連することが示され（ｐ＜０．００１）（図６）、これにより、なぜこれらの遺伝子の組合せによりそれらの個々の性能が改善されないかが説明された。さらに、ＳＶ遺伝子組合せを含めた本明細書において同定される特定の遺伝子組合せの性能は、個別のおよび組み合わせての両方で、ＣＫ１９、ＴＩＭＰ−１およびＣＬＤＮ１よりも統計学的に優れていた（図５）。理論に束縛されることなく、本明細書に記載の遺伝子組合せの優位性は、「優れた」バイオマーカーと「劣った」バイオマーカーを組み合わせに基づいて、最大の分類能力を実現する。これは、おそらく、本明細書に記載の特定の組合せでは、遺伝子の大部分が互いに関連しないという事実に起因し、したがって、分類子の性能の改善は、各遺伝子により試料の異なるセットが同定され、正確に分類されるという事実によって実現される。特に、ＣＫ１９、ＴＩＭＰ−１およびＣＬＤＮ１によりがん試料の８０％が正確に分類され、他方で、本発明の診断用遺伝子組合せに使用した他の遺伝子は良性試料の大部分を分類した。
【０２３２】
本明細書に記載の通り開発した分類子で使用した３種の遺伝子セット（ＳＶ、ＦＭ７２、およびＦＭ２０８）の性能と遺伝子１０、遺伝子１１および遺伝子１２を、単独でまたは組み合わせて比較した比較の概要が図７に示されている。ＳＶは以下の遺伝子：ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＫ１９、ＴＩＭＰ−１、ＣＬＤＮ−１、ＣＡＲ、ＨＯ−１およびＣＣＲ７を含む。ＦＭ７２は以下の遺伝子：ＣＣＲ３、ＴＩＭＰ−１、ＣＡＲおよびＸＢ１３０を含む。ＦＭ２０８は以下の遺伝子：ＣＸＣＬ１０、ＴＩＭＰ−１、ＣＬＤＮ−１およびＣＣＲ７を含む。本明細書に記載の種々の遺伝子セットおよび分類子とＡｆｉｒｍａ（登録商標）甲状腺ＦＮＡ分析検査（Ｖｅｒａｃｙｔｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の性能の比較が図７に示されている。
【０２３３】
（実施例４）
独立した検定セットを用いた遺伝子分類子の検定
がん組織または良性組織の検出における選択された診断用遺伝子マーカーの正確度を、独立したデータのセットに対して決定した。２０のがん（ＰＴＣ通常型（１５）、ＰＴＣ濾胞型（４）、および濾胞状癌（１））ならびに３９の良性の（濾胞過形成（２８）、甲状腺炎（７）、および濾胞状腺腫（４））の組織試料を含む新しい試料のセットを使用した。この場合、不確定の甲状腺結節における細針穿刺吸引生検において見られるがんと同様の罹患率が示されるように、より少数のがん試料を含めた。
【０２３４】
ＳＶ分類子を使用してこの独立したセットを分析することにより、ＡＵＣが０．９５、感度が９５％、特異度が９０％、ＰＰＶが８３％およびＮＰＶが９８％の優れた性能が示された（図８）。陽性的中率が８３％まで低下したことは、ＰＰＶががんの罹患率に依存することを考慮して予測されるものであった。同様に、陰性的中率の上昇は良性の状態の出現率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）に依存し、したがって、この検定セットでは訓練セットと比較して９８％まで上昇した（図８）。これらの結果により、本明細書に記載の分類子に使用するマーカーが、オーバーフィットされていない正確な結果を生じさせ、信頼できる新しい診断アッセイがもたらされることが確認される。
【０２３５】
（実施例５）
細針穿刺吸引試料から得た第２の独立した検定セットを用いた遺伝子分類子の検定
がんまたは良性甲状腺結節の検出における選択された診断用遺伝子マーカーの正確度を細針穿刺吸引（ＦＮＡ）から得た独立した試料のセットに対して決定した。これらは、アッセイが実施される実際の臨床的な環境に対応する。ＦＮＡは非常に小さな試料に対応するので、細胞充実性の低下によりアッセイの性能が低下し得る可能性がある。したがって、本発明のマーカーセットの、ＦＮＡ試料中の甲状腺結節の性質を予測する能力を検定した。新しい試料のセットは、２６の甲状腺乳頭がんおよび７４の良性甲状腺結節を含んだ。不確定の甲状腺結節の細針穿刺吸引生検において見られるものと同様のがんの罹患率が示されるように、より少数のがん試料を含めた。ＦＮＡ試料の細胞病理学的診断を、アッセイの分子による分類結果を比較するためのゴールドスタンダードとして使用した。
【０２３６】
ＳＶ分類子を使用してこの独立したセットを分析することにより、感度が９６％、特異度が８９％、ＰＰＶが７５％およびＮＰＶが９８％の優れた性能が示された（図９）。これらの結果により、本明細書に記載の分類子に使用するマーカーが、オーバーフィットされていない正確な結果を生じさせることが確認され、本発明のアッセイが、臨床的な環境で常套的に使用されるＦＮＡ試料において優れた性能を有するという信頼できる確認がもたらされる。
【０２３７】
本明細書において参照されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、本明細書と相反しない範囲でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
前述のことから、本明細書では例示のために本発明の特定の実施形態が記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変が成され得ることが理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲には限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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