(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたマイクロＲＮＡ様ＲＮＡ（ｍｉｌＲＮＡ）であって、
（ｉ）  配列番号１で示される配列のｍｉｌＲＮＡ、
（ｉｉ）  （ｉ）における前記ｍｉｌＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なｍｉｌＲＮＡ、
から選ばれるｍｉｌＲＮＡ。
【請求項２】
ｍｉｌＲＮＡは、サルモネラ菌由来のものである請求項１に記載のｍｉｌＲＮＡ。
【請求項３】
単離された前駆体ｍｉｌＲＮＡまたは人工的に構築された前駆体ｍｉｌＲＮＡであって、動物細胞内において切断され、請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡとして発現される、前駆体ｍｉｌＲＮＡ。
【請求項４】
単離されたポリヌクレオチドであって、動物細胞によって前駆体ｍｉｌＲＮＡに転写され、前記の前駆体ｍｉｌＲＮＡがヒト細胞内において切断され、請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡとして発現される、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡ、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
（ａ）サルモネラ菌感染を検出する試薬、検出チップまたはキットの製造、あるいは（ｂ）ｉＮＯＳの発現または活性を調節する調節剤の製造に用いられる請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡの使用。
【請求項７】
固相担体と、
前記固相担体に規則正しく固定化された、特異的に請求項1または２に記載のmilRNAを捕獲するオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む核酸チップ。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸チップまたは請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡを含むキット。
【請求項９】
請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡを特異的に抑制または遮断する阻害剤。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体と、請求項１または２に記載のｍｉｌＲＮＡを特異的に抑制または遮断する阻害剤とを含む薬物組成物。
【請求項１１】
サルモネラ菌感染の治療に用いられる候補薬物を選別する方法であって、
（ａ）テスト群とコントロール群を提供し、前記テスト群では、候補物質をテスト群の細胞または動物に施用し、かつ使用後の前記テスト群におけるｓａｌ−１の発現レベルを測定し、一方、前記のコントロール群では、テスト群と同様の条件を使用するが、候補物質をコントロール群の細胞または動物に施用しない工程と、
（ｂ）テスト群のｓａｌ−１とコントロール群のｓａｌ−１の発現レベルを比較する工程と、
を含み、
ここで、ｓａｌ−１の配列は配列番号１で示され、テスト群のｓａｌ−１の発現レベルがコントロール群のｓａｌ−１の発現レベルよりも顕著に低い場合、当該候補物質はサルモネラ菌感染の治療に用いられる候補薬物であることを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に関し、より具体的には、サルモネラ菌の非コードRNAおよびその同定と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物（Microorganism）は、幅広く自然界に存在する、肉眼で見られないで、光学顕微鏡または電子顕微鏡で数百倍、数千倍ひいては数万倍に拡大しないと観察できない微小生物の総称である。これらは、体形が微小、構造が簡単、繁殖が早い、変異しやすい、および環境の順応力が高いといった特徴を持つ。
【０００３】
微生物は、種類が多く、自然界における分布が非常に幅広い。人類、動物や植物の体表およびその外部とつながる腔道にも多くの微生物が存在する。
【０００４】
微生物の人類に対する重要な影響の一つは、疾患、特に伝染病を起こすことである。疾患の予防および治療において、人類はすでに大きな進歩を遂げたが、新発見および再発見の微生物感染はまだ相次ぎ、多くの疾患はずっと有効な治療薬がない。また、大量の広域抗生物質の濫用は、強い選択圧になり、多くの菌株が変異し、危害が大きくなった薬剤耐性菌株の発生につながる。
【０００５】
生きている生物の体外または体内で生活する微生物であれば、すべて寄生微生物と呼ばれ、寄生生活の微生物はほかの生物の栄養を奪い、ひいてはほかの生物の身体の一部を栄養とする。微生物は、口腔、皮膚または気道からヒトまたは動物の体内に入り、ヒトまたは動物の栄養を利用して成長・繁殖する。これらの細菌が毒素を出すと、ヒトを病気、たとえばコレラ、腸チフス、肺炎などにさせる。エイズ、風邪などの疾患はウイルスによるものである。ウイルスは、より特異的な寄生微生物で、生細胞から離れると生活できないので、偏性寄生微生物と呼ばれる。
【０００６】
微生物感染（Microbial infection）は、臨床でよく見られる微生物による疾患である。細菌性疾患の診断は、ほとんど細菌学的診断によって病因を確定する必要がある。しかし、標本から単離された細菌は必ずしも疾患の病原であるわけではないため、患者の臨床の状況、標本採取の部位、得られた細菌の種類によって総合的に分析するべきである。ときにはさらに毒力、細胞や動物などの試験によって当該菌株の病原性を確認する必要がある。
【０００７】
細菌およびその代謝物は抗原性を有するため、細菌性感染は抗体を検出することによって診断することもできる。また、近年、細菌の遺伝物質を検出することによって細菌に対して診断する新しい方法、すなわち遺伝子診断法が発展してきた。しかし、上記検出方法は、操作が煩雑で、検出標本の採取および保存に対する要求が厳しいだけでなく、検出結果の偽陽性率が高く、検出周期が長く、患者の病状に対する対応を遅らせる。
【０００８】
感染性疾患、特に慢性持続性感染は、人類の健康および命を脅かす世界的な難病の一つである。人類に重要な影響を与える細胞内病原体は、結核菌、サルモネラ菌、ブルセラ菌、レジオネラ菌、リステリア菌やらい菌などを含む。結核、AIDS、肝炎といった七つの疾患は世界的な脅威となる疾患で、治療が困難な原因は病原体の細胞内寄生性に密接に関連する。
【０００９】
細胞内微生物感染に対する治療は一つの難題である。主な原因は、これらの病原体が侵入して細胞内に潜伏すると、通常の抗生物質を細菌が潜伏する細胞内に送達することが困難で、しかも送達できても、濃度も有効な殺菌効果が得られない。抗体は細胞に入って作用を発揮することができない。細胞内寄生菌が細胞に入ったら、呑み込み、殺傷や排除から逃れるだけでなく、細胞内に長期間に存在し、適切な時（たとえば生体の免疫力が低下した時）に生体を発病させる。
【００１０】
サルモネラ属（Salmonella）は、人類と動物の腸管内に寄生し、生物化学反応と抗原構造が類似のグラム陰性桿菌で、人類だけを病気にさせるものもあり、動物だけを病気にさせるものもあり、人類も動物も病気にさせるものもあり、これらをサルモネラ菌と総称する。サルモネラ菌は、現在１８００種類以上発見され、抗原成分によってA、B、C、D、Eなどの基本の群に分かれる。中では、人類の疾患に関連するのは、主にA群のパラチフスA菌、B群のパラチフスB菌とネズミチフス菌、C群のパラチフスC菌とブタコレラ菌、D群のチフス菌と腸炎菌がある。これらの菌は、トリチフス、ひな白痢、ブタコレラ、ネズミチフス、ブタパラチフス、ウマパラチフスなどの疾患を起こす。病原性が最も強いのは、ブタコレラ菌(Salmonella cholerae)で、その次はネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)と腸炎菌(Salmonella enteritidis)である。サルモネラ菌に感染するか、保菌者の糞便に汚染された食品を食用すると、ヒトの食中毒を引き起こすことがある。
そのため、微生物感染症を予防・治療するために、本分野では、操作が簡単で、結果が正確な、新しい診断・治療技術を開発することによって、このような疾患の実験室診断および臨床治療を改善し、患者の病状の対応の遅れを避け、患者の身体および経済的な負担を軽減することが切望されている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、微生物感染に対する操作が簡単で、結果が正確な診断・治療方法を提供することである。
【００１２】
本発明の第一では、単離されたマイクロ様ＲＮＡ（ｍｉｌＲＮＡ）であって、
（ｉ）  配列番号１〜５のいずれかで示されるような配列のｍｉｌＲＮＡ、
（ｉｉ）  （ｉ）における前記ｍｉｌＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なｍｉｌＲＮＡ、
から選ばれるｍｉｌＲＮＡを提供する。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の相補的なものは、基本的に相補的なもの（相補的ではない塩基が≦３個、好ましくは≦３個、より好ましくは≦１個のもの）と完全に相補的なものを含む。
もう一つの好適な例において、前記のｍｉｌＲＮＡは、サルモネラ菌由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記のｍｉｌＲＮＡは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の血液、体液、または組織のサンプルから単離されたものである。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記の血液は、血漿および／または血清である。
もう一つの好適な例において、前記のヒト以外の哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジなどである。
もう一つの好適な例において、前記のｍｉｌＲＮＡは、ヒトから単離されたものである。
【００１５】
本発明の第二では、単離された前駆体ｍｉｌＲＮＡまたは人工的に構築された前駆体ｍｉｌＲＮＡであって、動物細胞内において切断され、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡとして発現される、前駆体ｍｉｌＲＮＡを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の動物細胞は、ヒトの細胞を含む。
【００１６】
本発明の第三では、単離されたポリヌクレオチドであって、動物細胞によって前駆体ｍｉｌＲＮＡに転写され、前記の前駆体ｍｉｌＲＮＡがヒト細胞内において切断され、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡとして発現される、ポリヌクレオチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のヌクレオチドは、式Iで表される構造を有し、
Seqフォワード-X-Seqリバース    式Ｉ
（式Ｉにおいて、
Ｓｅｑフォワードは、動物細胞において前記のｍｉｌＲＮＡとして発現されるヌクレオチド配列である。
Ｓｅｑリバースは、Ｓｅｑフォワードに基本的にまたは完全に相補的なヌクレオチド配列である。
Ｘは、ＳｅｑフォワードとＳｅｑリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記ペーサー配列はＳｅｑフォワードおよびＳｅｑリバースに相補的なものではない。）
かつ式Ｉで表される構造は、動物細胞に導入された後、式ＩＩで表される二次構造になる。
【化１】
0006280222.tif 000002
（式ＩＩにおいて、Ｓｅｑフォワード、ＳｅｑリバースおよびＸの定義は前記通りである。
｜｜は、ＳｅｑフォワードとＳｅｑリバースの間に形成された相補的塩基の対合関係を表す。）
【００１７】
本発明の第四では、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡ、または本発明の第三または５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の第五では、（ａ）サルモネラ菌感染を検出する試薬、検出チップまたはキットの製造、あるいは（ｂ）ｉＮＯＳの発現または活性を調節する調節剤の製造に用いられる、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡの使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のｉＮＯＳの発現または活性を調節する調節剤は、ｉＮＯＳの発現または活性を下方調節する阻害剤である。
【００１８】
本発明の第六では、
固相担体と、
前記固相担体に規則正しく固定化された、特異的に本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡを捕獲するオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む核酸チップを提供する。
【００１９】
本発明の第七では、サルモネラ菌感染を検出するキットの製造に用いられる、本発明の第六に記載の核酸チップの使用を提供する。
本発明の第八では、本発明の第六に記載の核酸チップまたは本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡを含むキットを提供する。
本発明の第九では、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡを特異的に抑制または遮断する阻害剤を提供する。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の阻害剤は、ｍｉｌＲＮＡスポンジ（sponge）、ｍｉｌＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス核酸、小分子化合物である。
もう一つの好適な例において、前記の阻害剤は、（ｉ）または（ｉｉ）に記載のｍｉｌＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的な核酸（たとえばＲＮＡ、ＤＮＡまたは類似体）である。
【００２１】
本発明の第十では、（ａ）サルモネラ菌感染を治療する薬物、あるいは（ｂ）ｉＮＯＳの発現または活性を上方調節する薬物の製造に用いられる、本発明の第九に記載のｍｉｌＲＮＡの阻害剤の使用を提供する。
本発明の第十一では、薬学的に許容される担体と、本発明の第一に記載のｍｉｌＲＮＡを特異的に抑制または遮断する阻害剤とを含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のｍｉｌＲＮＡの阻害剤は、ｍｉｌＲＮＡスポンジ（sponge）、mｉｌＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス核酸を含む。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記のｍｉｌＲＮＡの阻害剤は、配列番号７で示されるようなものである。
本発明の第十二では、サルモネラ菌感染の治療に用いられる候補薬物を選別する方法であって、
（ａ）テスト群とコントロール群を提供し、前記テスト群では、候補物質をテスト群の細胞または動物に施用し、かつ使用後の前記テスト群におけるsal-1の発現レベルを測定し、一方、前記のコントロール群では、テスト群と同様の条件を使用するが、候補物質をコントロール群の細胞または動物に施用しない工程と、
（b）テスト群のsal-1とコントロール群のsal-1の発現レベルを比較する工程と、
を含み、
ここで、テスト群のsal-1の発現レベルがコントロール群のsal-1の発現レベルよりも顕著に低い場合、当該候補物質はサルモネラ菌感染の治療に用いられる候補薬物であることを示す、
方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のｓａｌ−１の配列は、配列番号１で示されるようなものである。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記の動物はマウスを含み、前記の細胞は体外で培養された細胞を含む。
本発明の第十三では、ｉＮＯＳの発現または活性を下方調節する調節剤あるいは薬物組成物の製造に用いられる、ｓａｌ−１の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のｓａｌ−１の配列は、配列番号1で示されるようなものである。
【００２４】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。  
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は、体内における病原体のサルモネラ菌のncRNAの同定結果を示す。ここで、sａｌ−１、２、３、４、５は、検出された同種のサルモネラ菌における異なるmilRNAを示す。mockは、PBSで処理して細菌感染をシミュレートしたことを示し、細胞内にsal-1、2、3、4、5が検出されなかった。
【図２】図２は、体内における病原体のサルモネラ菌のｎｃＲＮＡの電気泳動像を示す。ここで、各レーンは以下の通りである。レーン１は、分子量マーカーを、レーン２は、ｓａｌ−１標準品を、レーン３は、ｍｏｃｋ感染シミュレーション（ＰＢＳ処理）を、レーン４は、ＬＢで培養されたサルモネラ菌ＳＥ２４７２（細胞に接触しなかった）を、レーン５は、サルモネラ菌ＳＥ２４７２に感染されたＨＴ−２９細胞を示す。
【図３】図３は、サルモネラ菌のｓａｌ−１とｐｒｅ−ｓａｌ−１の関係を示す。
【図４】図４は、サルモネラ菌のｓａｌ−１がｉＮＯＳにおける２つの標的を調節することを示す。
【図５】図５は、ＲＡＷ２６４．７細胞に全長ｉＮＯＳの発現プラスミドを導入する場合、ｓａｌ−１が同様にｉＮＯＳの発現を調節することを示す。
【図６】図６は、サルモネラ菌のｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）の標的遺伝子ｉＮＯＳに対する調節作用を示す。
【図７】図７は、Ｓａｌ−１のサルモネラ菌に感染されたマウスにおける調節作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者は、幅広く深く研究したところ、体内の病原体（感染微生物、寄生微生物、共生微生物などを含む）が非コードＲＮＡ（non-coding RNA、ncRNA）を放出し、これらの特定のncRNAは体内の病原体のバイオマーカーとし、有効に体内の病原体の検出と治療に使用することで、微生物感染症の診断と治療を顕著に改善できることを初めて意外に見出した。これに基づき、本発明を完成させた。
【００２７】
具体的に、本発明の研究によると、体内の感染微生物、寄生微生物、共生微生物はいずれもｎｃＲＮＡを介して生理的恒常性および疾患の発生・発展に関与することができる。異なる病原体が持つ特有のｎｃＲＮＡ（病原体のバイオマーカーとして）を同定・検出することによって、正確かつ迅速に異なる病原体を検出することができる。また、体内の病原体が宿主系を利用して加工したｎｃＲＮＡに基づき、（たとえばアンチセンスＲＮＡ技術で）特異的に抑制・除去することによって、微生物感染症の治療を行うことができる。ｎｃＲＮＡの治療に基づき、微生物および／または微生物性疾患の抑制に新しい治療対策を提供した。
【００２８】
用語
ここで用いられるように、用語「本発明のｍｉｌＲＮＡ」、「サルモネラ菌特異的ｍｉｌＲＮＡ」とは、ｓａｌ−１、ｓａｌ−２、ｓａｌ−３、ｓａｌ−４、ｓａｌ−５のいずれかまたはこれらの組み合わせを指し、入れ替えて使用することができる。
ここで用いられるように、用語「阻害剤」、「拮抗剤」および「遮断剤」は、意味が同様で、入れ替えて使用することができる。
ここで用いられるように、用語「ｓａｌ−１遮断剤」とは、ｓａｌ−１の機能を抑制または遮断する物質を指し、たとえばアンチセンス配列や核酸スポンジなどが挙げられる。これらの阻害剤は、ｓａｌ−１と標的遺伝子ｉＮＯＳのｍＲＮＡの結合を抑制し、そしてｓａｌ−１の標的遺伝子の発現に対する下方調節を抑制することができる。
【００２９】
用語
ここで用いられるように、用語「微生物」は、ウイルス、細菌、古細菌、衣原体、原生生物などの様々な微小生物を含む。本発明において、「体内微生物」とは、宿主（ヒトまたはほかの動物）の体内に存在する、感染微生物、寄生微生物、および共生微生物を含む様々な微生物を指す。一種類の典型的な体内微生物は、疾患を引き起こす病原体である。
本発明において、病原体と宿主細胞の関係によって、病原体は、細胞外寄生菌と細胞内寄生菌の2種類に分かれる。細胞外寄生菌とは、宿主細胞外の細胞の隙間、血液、リンパ液、組織液などの体液の中で生長・繁殖する細菌を指す。細胞内寄生菌は、また2種類に分かれる。通性細胞内寄生菌とは、宿主の体内では主に細胞内に寄生して生長・繁殖し、体外では活細胞のない培地でも生長することができる。偏性細胞内寄生菌は、体内でも体外でも、活細胞内でしか生長・繁殖しない。
【００３０】
ここで用いられるように、用語「ｍｉｌＲＮＡ」、すなわちｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｌｉｋｅとは、細菌由来のｍｉｃｒｏＲＮＡと類似のＲＮＡ配列を指す。
ここで用いられるように、用語「ｓＲＮＡ」、すなわちsmall non-coding  ＲＮＡとは、微小の非コードＲＮＡ配列を指す。本発明において、ｓＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｍｉｌＲＮＡを含む。
ｉＮＯＳとは、誘導型一酸化窒素合成酵素を指す。
【００３１】
非コードRNA
非コードＲＮＡ（non-coding  ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）とは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡを指し、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの様々なＲＮＡを含み、これらのＲＮＡはゲノムから転写され、タンパク質に翻訳されないが、タンパク質の翻訳過程に関与し、ＲＮＡレベルでそれぞれの生物学的機能を発揮する。たとえば、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡは、ＲＮＡスプライシングとＲＮＡ修飾に関与する。
【００３２】
非コードＲＮＡは、長さによって３種類に分かれる。５０  ｎｔよりも小さい場合、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡを含む。５０  ｎｔ〜５００  ｎｔの場合、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ＳＬＲＮＡ、ＳＲＰＲＮＡなどを含む。５００  ｎｔよりも大きい場合、長いｍＲＮＡと類似の非コードＲＮＡ、長いｐｏｌｙＡ尾を持たない非コードＲＮＡなどを含む。
【００３３】
ｓｎＲＮＡは、ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡの略称で、核内低分子ＲＮＡとも呼ばれる。その機能は、タンパク質因子と結合して核内低分子リボ核タンパク質粒子（small nuclear ribonucleo-protein partcle、snRNPと略称される）となり、ｍＲＮＡをスプライスする機能を行う。
ｓｎｏＲＮＡは、最初核小体で発見された小さなＲＮＡで、核小体低分子ＲＮＡと呼ばれ、最初発見された生物的機能はｒＲＮＡの修飾である。大多数の核小体低分子ＲＮＡは、２種類に分かれる。一種類はＣ／Ｄ  ｂｏｘ  ｓｎｏＲＮＡで、この種類のｓｎｏＲＮＡはＲＮＡの塩基に対してメチル化修飾を行うものである。もう一種類はＨ／ＡＣＡ  ｂｏｘで、この種類のｓｎｏＲＮＡはＲＮＡの塩基に対してメチルウラシル化修飾を行うものである。その特徴は、一つの二本鎖双ステムが形成し、途中に一つのループ領域があり、途中のループ領域に一つのｂｏｘ  Ｈがある。また、尾部のテールに一つのｂｏｘ  ＡＣＡがある。ｂｏｘ  Ｈおよびｂｏｘ  ＡＣＡの一次配列の特徴の線引きが比較的に緩い。
【００３４】
ｍｉＲＮＡは、小さいＲＮＡ分子で、転写される遺伝子に相補的で、遺伝子サイレンシングを仲介する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、２１〜２３  ｎｔの小さいＲＮＡで、その前駆体は約７０〜１００  ｎｔくらいで、標準のステム構造が形成し、加工後２１〜２３  ｎｔの一本鎖ＲＮＡになる。ｍｉｃｒｏＲＮＡの作用機序は、ｍＲＮＡに相補的に結合し、ｍＲＮＡをサイレンシングまたは分解させる。ｍｉＲＮＡの機序に基づいて開発されたＲＮＡｉ技術は、ｍｉｃｒｏＲＮＡと類似のスモールＲＮＡで相応のmRNAをサイレンシングさせる。
【００３５】
ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡとも呼ばれ、真核生物においてＲＮＡ編集に関与する、ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡを指す。
ｅＲＮＡは、イントロンまたは非コードＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子で、精確に遺伝子の転写および翻訳の効率を調節する。
シグナル認識粒子ＲＮＡとは、細胞質においてシグナルペプチドを含むｍＲＮＡを認識し、分泌を決めるＲＮＡ機能分子である。
ｐＲＮＡとはファージのＲＮＡである。たとえば、研究によると、ｆｉ２９ファージにおいて、６個の同様の小さいＲＮＡ分子がＡＴＰを利用してＤＮＡのパッケージングに関与する。
ｔｍＲＮＡとは、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方の性質を持つ複合体のＲＮＡである。ｔｍＲＮＡは、幅広く細菌に存在し、翻訳またはコードの解読が間違ったリボソームを認識し、機能を休止したリボソームも認識し、これらの問題のあるリボソームの崩壊を仲介する。
また、ｍＲＮＡにおける非コード領域は、イントロン領域および５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲなどのリボソーム認識エレメントを含み、非コードＲＮＡと見なすこともできる。
【００３６】
ｍｉｌＲＮＡおよびその前駆体
本発明は、サルモネラ菌由来の新しい種類のｍｉｌＲＮＡを提供する。この種類のｍｉｌＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと非常に似ていて、ＲＮＡ分子で、ｍｉｌＲＮＡ前駆体を形成できる転写物から加工して得られる。長さは、通常、１８〜２８個のヌクレオチド（ｎｔ）を有する（特に約２０〜２６  ｎｔ）。ｍｉＲＮＡと同様に、ｍｉｌＲＮＡは、通常、ノーザンブロッティングによって検出することができる。
【００３７】
ここで用いられるように、「単離された」とは、物質がその本来の環境から単離されたこと（天然の物質の場合、本来の環境は天然の環境である）を指す。たとえば、活細胞内の天然の状態におけるポリヌクレオチドとポリペプチドは単離・精製されていないが、同様のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然の状態から存在するほかの物質とわかれると、単離・精製されたものになる。
ｍｉｌＲＮＡは、前駆体ＲＮＡ（Precursor milRNA、Pre-milRNA）から加工して得られ、前記の前駆体ＲＮＡはフォルディングして安定したステム・ループ（ヘアピン）構造になり、前記のステム・ループ構造の長さは、通常、５０〜１００  ｂｐの間である。前記の前駆体ｍｉｌＲＮＡは、フォルディングして安定したステム・ループ構造になり、ステム・ループ構造のステム部の両側は基本的に相補的な二本の配列を含む。前記の前駆体ｍｉｌＲＮＡは、天然のものでも人工合成されたものでもよい。
【００３８】
前記前駆体ｍｉｌＲＮＡは、切断されてｍｉｌＲＮＡになり、前記のｍｉｌＲＮＡはコード遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部の配列に基本的に相補的である。ここで用いられるように、「基本的に相補的」とは、ヌクレオチドの配列が十分に相補的であることを指し、予想可能な様態で相互作用し、たとえば二次構造（たとえばステム・ループ構造）を形成することができる。通常、二本の「基本的に相補的」なヌクレオチド配列は、両者の間に少なくとも７０％のヌクレオチドが相補的で、好ましくは少なくとも８０％のヌクレオチドが相補的で、より好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチドが相補的で、さらに少なくとも９５％のヌクレオチドが相補的で、たとえば９８％、９９％または１００％である。一般的に、二本の十分に相補的な分子の間に多くとも４０個のマッチしないヌクレオチドを有し、好ましくは多くとも３０個のマッチしないヌクレオチドを有し、より好ましくは多くとも２０個のマッチしないヌクレオチドを有し、さらに好ましくは多くとも１０個のマッチしないヌクレオチドを有し、たとえば１、２、３、４、５、８個のマッチしないヌクレオチドを有する。
【００３９】
ここで用いられるように、「ステム・ループ」構造は、「ヘアピン」構造とも呼ばれ、ヌクレオチド分子で、二本鎖領域（ステム部）を含む二次構造が形成し、前記の二本鎖領域は当該ヌクレオチド分子の２つの領域（同一の分子にある）から形成し、２つの領域はそれぞれ二本鎖部分の両側にある。また、少なくとも一つの「ループ」構造を含み、相補的ではないヌクレオチド分子、すなわち一本鎖領域を含む。当該ヌクレオチド分子の２つの領域が不完全相補でも、ヌクレオチドの二本鎖部分も二本鎖の状態を保つことができる。たとえば、挿入、欠失、置換などによって一つの小さい領域が相補的ではなくなり、あるいはその小さい領域自身がステム・ループ構造またはほかの様態の二次構造になるが、その２つの領域は基本的に相補的で、かつ予想可能な様態で相互作用し、ステム・ループ構造の二本鎖領域を形成する。ステム・ループ構造は、当業者に熟知のもので、通常、一次構造のヌクレオチド配列の核酸を得ると、当業者は当該核酸がステム・ループ構造になれるかわかる。
【００４０】
本発明に係るｍｉｌＲＮＡは、配列番号１〜５で示される配列を有する。ｍｉｌＲＮＡの安定性またはほかの性質を上げるために、前記のｍｉｌＲＮＡの少なくとも一方の末端に少なくとも一つの保護性塩基、たとえば「ＴＴ」などを付加することができる。
【００４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明によって提供されるｍｉｌＲＮＡ配列に基づき、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは体内で相応のｍｉｌＲＮＡの発現を下方調節する。ここで用いられるように、「アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense-oligonucleotides、ＡＳ−ＯｎまたはＡＳＯ）」は、「アンチセンスヌクレオチド」とも呼ばれ、長さが約１８〜２８  ｎｔ（特に約２０〜２６  ｎｔ）のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子またはその類似体を指す。
【００４２】
本発明において、前記の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、さらに、たとえばロックド核酸または核酸鎖骨格修飾技術などの手段によって修飾されたアンチセンスヌクレオチドも含み、前記の修飾はアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性をほとんど変えず、好ましくは、前記修飾はアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、活性または治療効果を向上させる。ロックド核酸（locked nucleic acid、LNA）とは、通常、メチレンブリッジによってリボースの2'-酸素原子と4'-炭素原子を連結する修飾技術である。ＬＮＡは、ｍｉｌＲＮＡの血清半減期を延し、標的に対する親和性を向上させ、標的外れの範囲と程度を減少する。核酸鎖骨格に基づいた修飾技術によって発展したアンチセンス薬物は、可溶性、抗リボヌクレアーゼ分解などの面で大幅に改善され、かつ大量の合成も容易である。オリゴヌクレオチドの骨格修飾方法は様々で、たとえばデオキシヌクレオチド鎖に対して硫黄化修飾を行って硫黄化デオキシヌクレオチド鎖にするという硫黄化法を含む。当該方法は、ＤＮＡ骨格におけるりん酸結合の酸素原子を硫黄原子で置換し、リボヌクレアーゼによる分解に耐えることができる。もちろん、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのほとんどまたは全部の活性を保つ修飾はいずれも本発明に含まれる。
【００４３】
本発明の好適な様態として、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してロックド核酸修飾を行い、好ましくはさらに硫黄化修飾を行う。
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物（たとえばサルモネラ菌の感染者）の体内に導入すると、関連ｍｉｌＲＮＡの発現を顕著に下方調節する。
【００４４】
ポリヌクレオチド構築物
本発明によって提供されるｍｉｌＲＮＡ配列に基づき、導入された後加工されて相応のｍＲＮＡの発現に影響するｍｉｌＲＮＡになるようなポリヌクレオチド構築物を設計することができ、すなわち、前記ポリヌクレオチド構築物は体内で相応のｍｉｌＲＮＡの量を上方調節することができる。そのため、本発明は、単離されたポリヌクレオチド（構築物）であって、ヒト細胞によって前駆体ｍｉｌＲＮＡに転写され、前記の前駆体ｍｉｌＲＮＡがヒト細胞内によって切断され、かつ前記のｍｉｌＲＮＡとして発現される、ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の一つの好適な様態として、前記ポリヌクレオチド構築物は、式Ｉで表される構造を有し、
Seqフォワード-X-Seqリバース         式I
（式Ｉにおいて、
Ｓｅｑフォワードは、細胞において前記のｍｉｌＲＮＡとして発現されるヌクレオチド配列で、Ｓｅｑリバースは、Ｓｅｑフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。あるいは、Ｓｅｑリバースは、細胞において前記のｍｉｌＲＮＡとして発現されるヌクレオチド配列で、Ｓｅｑフォワードは、Ｓｅｑフォワードに基本的に相補的なヌクレオチド配列である。
【００４５】
Ｘは、ＳｅｑフォワードとＳｅｑリバースの間にあるスペーサー配列で、かつ前記ペーサー配列はＳｅｑフォワードおよびＳｅｑリバースに相補的なものではない。）
式Ｉで表される構造は、細胞に導入された後、式ＩＩで表される二次構造になる。
【化２】
0006280222.tif 000003
（式IIにおいて、Seqフォワード、SeqリバースおよびXの定義は前記通りである。
|| は、SeqフォワードとSeqリバースの間に形成された相補的塩基の対合関係を表す。）
【００４６】
通常、前記のポリヌクレオチド構築物は、発現ベクターにある。そのため、本発明は、さらに、前記のｍｉｌＲＮＡ、または前記ポリヌクレオチド構築物を含むベクターを含む。前記の発現ベクターは、通常、さらにプロモーター、複製起点および／またはマーカー遺伝子などを含む。当業者に熟知の方法は、本発明に必要な発現ベクターの構築に使用することができる。これらの方法は、体外組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、体内組換え技術などを含む。
前記の発現ベクターは、好ましくは１つまたは２つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえばカナマイシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、アンピシリン耐性を提供する。
【００４７】
機序
本発明がわかりやすくなるように、本発明者は以下の機序を提供する。しかし、もちろん、これらの機序は本発明の何らかの限定にはならない。
本発明の研究によって、微生物が人体に感染した後、自身のｎｃＲＮＡをすこし分泌して循環系に入ることが示され、これらのｎｃＲＮＡは微生物自身由来のものであるため、微生物感染症の診断のマーカーとすることができる。
典型的に、血清に存在する、微生物由来のｎｃＲＮＡは微生物感染症の診断のマーカーとすることができる。これらの血液または血清における病原体の特有のｎｃＲＮＡは、微生物感染症の診断の効率を大幅に向上させ、疾患自身の治療に大いに役立ち、重要な臨床上の意義があると同時に、微生物由来のｎｃＲＮＡの更なる研究はこのような疾患の発症または感染の機序に新しい手がかりを提供する。
【００４８】
同定方法
また、本発明は、汎用の病原体由来のｎｃＲＮＡを同定する方法であって、
血清または血液に存在する病原体のｎｃＲＮＡの同定を例として、
ａ．各種の微生物（細菌、古細菌、ウイルス、マイコプラズマ、クラミジア、原生生物などを含む）の感染者の血液または血清の標本を収集する工程と、
ｂ．ハイスループットシーケンシング技術と生物情報学的分析・比較を合わせた手段によって、患者の血液または血清における微生物由来の１組のｓＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）の初期選別を行う工程と、
ｃ．さらに高感度で、正確なリアルタイム蛍光定量ＰＣＲによって初期選別されたｓＲＮＡの検証を行い、各種の微生物の感染者の血清におけるそれぞれの特異的な微生物自身由来の血清ｓＲＮＡを見つけ、かつ疾患そのものに対する診断上の価値を評価する工程と、
を含む方法を提供する。
【００４９】
本発明において、同定された病原体由来のｎｃＲＮＡに対し、さらに前記ｎｃＲＮＡの診断マーカーとしての実行性を評価することができる。
本発明において、同定された病原体由来のｎｃＲＮＡに対し、さらに前記ｎｃＲＮＡの病原体感染における作用を評価することができる。
【００５０】
一つの典型的な方法は、体外細胞感染実験によって分析する。当該方法は、
ａ．各種の微生物（細菌、古細菌、ウイルス、マイコプラズマ、クラミジア、原生生物などを含む）で細胞に感染させ、感染後の細胞の培養液を収集する工程と、
ｂ．ハイスループットシーケンシング技術（Solexaシーケンシング技術）と生物情報学的分析・比較を合わせた手段によって、細胞培養液における微生物由来の１組のｓＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）の初期選別を行う工程と、
ｃ．さらに高感度で、正確なリアルタイム蛍光定量ＰＣＲによって初期選別されたｓＲＮＡの検証を行う工程と、
を含む。
本発明によって提供される上記方法では、微生物感染症の患者の体液、血液（または血清）における微生物自身由来の一つまたは複数のｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）の微生物感染症の診断に対する特異性、正確性を同定して評価し、かつ既存の臨床診断方法と比較することができる。
【００５１】
応用
本発明の研究は、初めて、体内の感染微生物、寄生微生物、共生微生物の宿主を調節する新たな手段を開示する。分泌経路を通し、異なる体内の病原体（たとえば体内の感染微生物、寄生微生物、共生微生物）は自身が生成した非コードＲＮＡ（non-coding  ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）を宿主細胞に提示し、宿主のタンパク質を「借り」、宿主の免疫系に影響することによって、体内の病原体の宿主の体内における生活に貢献する。そのため、病原体の特異的なｎｃＲＮＡを干渉または抑制するのは、微生物感染の抑制および微生物性疾患の治療の新たなアプローチである。
本発明の発見に基づき、病原体の特異的なｎｃＲＮＡを検出（または診断）のマーカーとして使用し、かつ治療の標的とすることができる。
サルモネラ菌を例として、サルモネラ菌は細菌自身によってコードされる非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を宿主細胞内に提示し、細胞のｍｉｃｒｏＲＮＡ切断システムによって、ｍｉｃｒｏＲＮＡと類似のｍｉｌＲＮＡを生成し、ｍｉｌＲＮＡで免疫系（たとえばｉＮＯＳ）を調節することで、細菌に利用され、宿主による除去から自身を守る。ｍｉｌＲＮＡの阻害剤でｍｉｌＲＮＡを吸着すると、細菌の細胞内の生存能力を有効に抑制し、細菌の生存能力を低下させるため、細菌感染の治療に使用することができる。
【００５２】
検出試薬、検出チップおよび検出キット
また、本発明は、サルモネラ菌またはサルモネラ菌感染を検出キットであって、本発明の検出試薬、または検出チップを含むキットを提供する。前記のキットは、本発明のサルモネラ菌感染の特異的なｍｉＲＮＡの発現プロファイルの検出、あるいはサルモネラ菌またはサルモネラ菌感染の検出に使用することができ、好ましくは、前記のキットは、さらに、ＲＮＡサンプルを標識するための標識物、および前記標識物に相応する基質を含む。
また、前記のキットは、さらに、ＲＮＡの抽出、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、呈色などに必要な様々な試薬を含んでもよく、抽出液、増幅液、ハイブリダイゼーション液、酵素、コントロール液、呈色液、洗浄液、抗体などを含むが、これらに限定されない。
また、前記のキットは、さらに、使用説明書および／またはチップ画像分析ソフトを含んでもよい。
【００５３】
チップ
ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現プロファイルチップは、通常、百、千またはそれ以上のプローブを含み、複数種類のｍｉｃｒｏＲＮＡに関し、二本鎖の相同対合の原理で標本に含まれる各種のｍｉｃｒｏＲＮＡの含有量を検出する。そのため、一回で標本におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの転写レベルを測定することができる。
本発明に係るｍｉｌＲＮＡ配列では、相応のｍｉｌＲＮＡチップを製造し、さらにその発現プロファイルおよびｍｉｌＲＮＡの調節方式を研究することができる。
一方、本発明は、さらに、ｍｉｌＲＮＡの発現プロファイルを分析するためのチップであって、サルモネラ菌またはサルモネラ菌感染の検出に使用できるチップを提供する。
【００５４】
本発明に係るｍｉｌＲＮＡチップは、固相担体と、前記固相担体に規則正しく固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとを含み、前記のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号１〜４で示される配列に対する核酸配列を含む。
具体的に、本発明に係るｍｉｌＲＮＡに基づき、適切なプローブを設計し、固相担体に固定化し、「オリゴヌクレオチドアレイ」を形成することができる。前記の「オリゴヌクレオチドアレイ」とは、アドレス指定可能な位置（すなわち区別可能なアクセスできるアドレスを特徴とする位置）を有するアレイで、各アドレス指定可能な位置はいずれもそれに連結する特徴的なオリゴヌクレオチドを１つ含む。必要により、オリゴヌクレオチドアレイをいくつかのサブアレイに分けてもよい。
【００５５】
前記固相担体は、遺伝子チップの分野における様々な汎用の材料、たとえばナイロン膜、活性基（たとえばアルデヒド基、アミノ基など）で修飾されたガラスシートまたはシリコンシート、未修飾のガラスシート、プラスチックシートなどを使用してもよいが、これらに限定されない。
前記のｍｉｌＲＮＡチップの製造は、本分野で既知のバイオチップの通常の製造方法を使用してもよい。たとえば、固相担体を修飾されたガラスシートまたはシリコンシートとする場合、プローブの5’末端にアミノ基で修飾されたポリdT鎖が含まれ、オリゴヌクレオチドプローブを溶液とした後、スポッターでそれを修飾されたガラスシートまたはシリコンシートにスポットし、所定の配列またはアレイに並べた後、一晩置いて固定化させることで、本発明のmilRNAチップが得られる。
【００５６】
本発明に係るＲＮＡとｍｉｌＲＮＡチップの間の固相ハイブリダイゼーションは、本分野の典型的な方法で行われ、当業者は経験によって緩衝液、プローブおよび標本の濃度、予備ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション温度および時間などに関する最適な条件を容易に決定することができる。あるいは、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」における記載を参照してもよい。
その後、標識シグナルのｍｉｌＲＮＡチップにおける位置、強度などの情報から測定したい情報を獲得する。増幅産物を蛍光基で標識する場合、直接蛍光検出装置（たとえば共焦点レーザー走査装置Scanarray 3000など）で測定したい情報を獲得してもよい。
【００５７】
薬物組成物
また、本発明は、薬学的に許容される担体あるいは有効量の本発明のｍｉｌＲＮＡ（たとえばｓａｌ−１）の阻害剤、遮断剤または拮抗剤を含む薬物組成物を提供する。
ここで用いられるように、用語「有効量」または「有効投与量」とは、ヒト及び／又は動物に機能や活性があり、且つヒト及び／又は動物にとって受けられる量である。
ここで用いられるように、「薬学的に許容される」成分は、哺乳動物に適用する場合、過度の不良な副反応（例えば毒性、刺激とアレルギー反応）がない、すなわち、合理的なベネフィット／リスク比を持つ物質である。用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の給与のための担体で、各種の賦形剤と希釈剤を含む。
【００５８】
本発明は、安全有効量の本発明の活性成分と、薬学的に許容される担体とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。通常、薬物製剤は投与様態に応じ、本発明の薬物組成物の剤形は、注射剤、経口投与製剤（錠剤、カプセル、経口投与液）、経皮剤、徐放剤である。例えば生理食塩水或いはグルコースおよび他の助剤を含む水溶液を使用し通常の方法で製造することができる。前記の薬物組成物は、無菌条件で製造することが好ましい。
【００５９】
本発明に係る活性成分の有効量は、投与の様態と治療しようとする疾患の重篤度などによって変更することができる。好適な有効量の選択は、当業者がいろいろな要素によって決めることができる（例えば臨床試験による）。前記の要素は、前記活性成分の薬物動態学のパラメーター、例えば生物的利用率、代謝、半減期など、患者の治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、患者の免疫状況、投与の経路などを含むが、これらに限定されない。通常、本発明の活性成分は、毎日０．００００１  ｍｇ〜５０  ｍｇ／ｋｇ動物体重（好ましくは０．０００１  ｍｇ〜１０  ｍｇ／ｋｇ動物体重）の投与量で投与する場合、満足できる効果が得られる。例えば、治療状況の切望によって、毎日数回に分けた投与量、又は比率的に減少する投与量で投与することができる。
本発明に係る薬学的に許容される担体は、水、塩水、リポソーム、脂質、タンパク質、タンパク質−抗体複合体、ペプチド系物質、セルロース、ナノゲル、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。担体の選択は投与様態に応じ、これらはすべて当業者に熟知のことである。
【００６０】
また、本発明は、サルモネラ菌感染を治療し、サルモネラ菌感染の症状を緩和し、宿主動物におけるサルモネラ菌の数を減少し、サルモネラ菌感染の死亡率を低下させる薬物の製造、過剰な免疫の減少などに用いられる、前記薬物組成物の使用を提供する。
【００６１】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（a）病原体（たとえばサルモネラ菌）感染を検出する簡単で、迅速でかつ正確な新たな方法を提供する。
（b）微生物感染の抑制および微生物性疾患の治療の新たなアプローチを提供する。
【００６２】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【００６３】
以下の実施例において、体内の病原体のサルモネラ菌を研究したところ、サルモネラ菌は宿主を利用してｍｉｌＲＮＡ（ｎｃＲＮＡの一種）を生成することがわかり、当該ncRNAに対してサルモネラ菌感染の有効な検出および治療を行うことができる。
【００６４】
実施例1  細菌感染細胞におけるｍｉｌＲＮＡの選別  
サルモネラ菌の菌種を白金耳でＬＢ平板に画線分離し、中等の大きさの集落を取ってＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養した後、遠心でＬＢ培地を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ培地で菌体を再懸濁させた。
細菌感染の前日に、パンクレアチンで消化されたヒト腸管上皮細胞ＨＴ−２９細胞をシャーレに展開させ、５％  ＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。
【００６５】
ＭＯＩ（５〜１０：１）の比率で細胞を感染させ、感染から２時間後、ＰＢＳで感染して細胞に入っていない細菌を洗い流し、さらにゲンタマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳで培養し、一晩培養した後、さらにＰＢＳで３回洗浄し、０．１％  ＰＢＳＴ（PBS+Triton X-100）で細胞を溶解させ、さらに０．２２μmフィルターで細菌をろ過で除去した。上記処理後、細胞に入っていない細菌および細胞に残った細菌を徹底的に除去した。
その後、Trizol LSで溶解液における全RNAを抽出し、Solexaディープシーケンシング後、得られたデータを分析し、サルモネラ菌の特異的な小さいＲＮＡ断片を見つけた。
【００６６】
１．１ ｍｉｌＲＮＡの同定
solexaシーケンシングで得られた断片を分析し、コピー数の多いｍｉｌＲＮＡ断片配列を選別し、これらの配列に対し、定量ＰＣＲ検出プローブおよびノーザンブロッティングの検出プローブを設計して合成した。
【００６７】
１．２  ノーザンブロッティング検出
Trizol LS試薬でそれぞれLBで培養したサルモネラ菌の全ＲＮＡ、およびサルモネラ菌を細胞に感染させた後のサイトソルの全RNAを抽出し、全ＲＮＡを１×ＲＮＡ loading buffer(Takara)で再懸濁させた後、15％TBE-Urea polyacrylamidegelelectrophoresis (PAGE)で電気泳動を行い、電気泳動後RNAをナイロン膜に転写し、紫外線（ＵＶ）で架橋させた後ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたプローブでハイブリダイゼーションを行い、ｍｉｌＲＮＡの発現を分析した。
【００６８】
１．３．蛍光定量ＰＣＲ検出
Trizol LS試薬でそれぞれＬＢで培養したサルモネラ菌の全ＲＮＡ、およびサルモネラ菌を細胞に感染させた後のサイトソルの全ＲＮＡを抽出し後、ＤＥＰＣで処理された超純水でＲＮＡを溶解させ、まずプローブの下流プライマーでｃＤＮＡに逆転写し、さらに合成したプローブ（ＡＢＩ）で定量ＰＣＲ増幅を行い、増幅後各サンプルにおけるｍｉｌＲＮＡの含有量を分析した。
【００６９】
結果
実験結果は図１、図２および図３に示した。
ノーザンブロッティングおよびｑＲＴ−ＰＣの検出では、図１および２の結果から、サルモネラ菌を細胞に感染させた後だけ、１９〜３０  ｎｔの小さいＲＮＡ（本発明においてｍｉｌＲＮＡと呼ぶ）が現れたことがわかり、本発明では、ｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）を選んで全面的に深く研究した。
【００７０】
生物学ソフトでｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）のサルモネラ菌のゲノムにおける配列の状況を分析し、結果を図３に示した。図３から、ｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）が位置するｎｃ−ＲＮＡがｐｒｅ−ｓａｌ−１にフォルディングされることがわかる。
サルモネラ菌(Salmonella)由来の一部のncRNAの配列は以下の通りである。
Sal-1: UGUGGGCACUCGAAGAUACGGAUU(配列番号1)
Sal-2:AUGCGAGAGUAGGGAACUGCCAGGCAU(配列番号2)
Sal-3:UCCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGC (配列番号3)
Sal-4: GAAGGUGGCGGAAUUGGUAGACG (配列番号4)
Sal-5:GCCCGGAUGGUGGAAUCGGUA (配列番号5)
Pre-sal-1の配列は以下の通りである。
5'-TGTGGGCACTCGAAGATACGGATTCTTAACGTCCTAGGACGAAAAATGAATACCAAGTCTCAAGAGTGAACACG-3'(配列番号6)
【００７１】
実施例 2
ｍｉｌＲＮＡに対する阻害剤(inhibitor)の宿主への細菌感染を抑制する能力
２．１  体外実験
本実験において、同定されたサルモネラ菌の特異的なsal-1に対し、それと標的遺伝子inducible nitric oxide synthase(ｉＮＯＳ）の関連性を研究した。
ＰＣＲでｍｉｌＲＮＡと結合する標的サイト領域を増幅し、Ｓｐｅ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで二重酵素切断を行った後、ｐＭＩＲ−ＲＥＰＯＲＴルシフェラーゼベクター（上海英為信科技有限公司から購入）に挿入し、組み換えプラスミド（ｉＮＯＳ）を構築した。一方、前記構築した組み換えプラスミドのｍｉｌＲＮＡ結合サイトを突然変異させ、組み換え突然変異プラスミド（ｉＮＯＳ  ｍｕｔ）を構築した。
【００７２】
同時に、ｍｉｌＲＮＡの前駆体をＣＭＶをプロモーターとする発現ベクターに導入してｍｉｌＲＮＡを過剰発現するベクター（ｐｒｅ−ｓａｌ−１）を構築した。
ｍｉｌＲＮＡコントロールプラスミドまたはｐｒｅ−ｓａｌ−１とｉＮＯＳまたはｉＮＯＳ  ｍｕｔをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、レポーター遺伝子の検出を行い、同時にβ−ｇａｌプラスミドを参照とした。
具体的な結果は図４に示す。図４のルシフェラーゼの結果から、ｓａｌ−１はｉＮＯＳにおける２つの標的サイトのいずれも調節することによって、ｉＮＯＳを下方調節することができることがわかる。
【００７３】
２．２  ウェスタンブロッティング
野生型の全長のｉＮＯＳ遺伝子を真核発現プラスミドにクローンし、組み換えｉＮＯＳ発現プラスミド（ｉＮＯＳ  ＷＴ）を構築してｉＮＯＳ発現を行ったと同時に、ｍｉｌＲＮＡ結合サイトを突然変異させ（同義突然変異で、アミノ酸配列を変えずに塩基配列だけを変える）、ｉＮＯＳ発現プラスミド（ｉＮＯＳ  ＭＵＴ）を構築して突然変異ｉＮＯＳの発現を行った。ｐｒｅ−ｓａｌ−１をそれぞれｉＮＯＳ  ＷＴおよびｉＮＯＳ  ＭＵＴとマウスＲＡＷ２６４．７細胞（当該細胞は刺激を受けないとｉＮＯＳを発現しない）にコトランスフェクトして発現させ、ｍｉｌＲＮＡのｉＮＯＳに対する調節能力を検出した。
具体的な結果は図５に示す。図５の結果から、ＲＡＷ２６４．７細胞に全長ｉＮＯＳの発現プラスミドを導入する場合、ｓａｌ−１が同様にｉＮＯＳの発現を調節する（下方調節）ことがわかる。
【００７４】
２．３  細胞感染実験
ＨＴ−２９細胞をサルモネラ菌感染の前日に２４ウェルプレートに置き、次の日にａｎｔｉ−ｓａｌ−１をｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ  ２０００で転写し、ａｎｔｉ−ｓａｌ−１をトランスフェクトしてから２４ｈ後、ＭＯＩ（５〜１０：１）でサルモネラ菌を感染させ、コントロール群ではランダムの配列を使用し、感染後２４ｈで細胞内の細菌の生存能力を検出した。
【００７５】
各アンチセンス核酸の配列は以下の通りである（5’から3’）。
anti-sal-1: AAUCCGUAUCUUCGAGUGCCCACA (配列番号7)
anti-sal-2:AUGCCUGGCAGUUCCCUACUCUCGCAU (配列番号8)
anti-sal-3: GCCGUUCUACCGACUGAACUACAGAGGA (配列番号9)
anti-sal-4: CGUCUACCAAUUCCGCCACCUUC (配列番号10)
anti-sal-5:UACCGAUUCCACCAUCCGGGC (配列番号11)
【００７６】
具体的な結果を図6に示す。図６は、ヒト腸管上皮細胞（ＨＴ−２９）を感染モデルとし、サルモネラ菌に感染されたＨＴ−２９細胞の場合、ｓａｌ−１の阻害剤（ａｎｔｉ−ｓａｌ−１）をトランスフェクトし、さらにｉＮＯＳの発現と活性検出を分析し、かつサルモネラ菌の細胞内の生存率を分析したことを示す。サルモネラ菌感染にｓａｌ−１に対する阻害剤を加えた後、ｉＮＯＳの発現量がさらに上昇し、約２．８倍になった（図６Ａ）。ｉＮＯＳ活性も相応に上昇し、約２．３倍になった（図６Ｂ）。一方、ｓａｌ−１の発現レベルが約９０％下方調節され（図６Ｃ）、サルモネラ菌感染後、細胞内の数もそれとともに４５％に低下した（図６Ｄ）。
【００７７】
２．４  体内実験
pre-sal-1配列を酵素切断を経て通常のlentivirusベクターに挿入することで、milRNAを過剰発現するレンチウイルスをパッケージングした。
milRNAに相補的に結合する配列を遺伝子工学的手段によってｍｉｌＲＮＡと結合するスポンジ体（３回繰り返す相補断片を含有する）を構築した後、ｍｉｌＲＮＡのスポンジ体もｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓベクターに挿入してｍｉｌＲＮＡを吸着するレンチウイルスをパッケージングした。
さらに、マウスの体内でもｉＮＯＳが発現されるので、ｍｉｌＲＮＡのｉＮＯＳに対する調節機能を検証するために、本発明者はマウスのｉＮＯＳにおけるｍｉｌＲＮＡの結合サイトがすべて突然変異した発現プラスミドを構築した後、このようなプラスミドを酵素切断を経てentivirusベクターに挿入することで、マウスｉＮＯＳを過剰発現するレンチウイルスをパッケージングした。
【００７８】
６〜８週齡のＢＡＬＡ／Ｃマウスを実験対象とし、ｍｉｌＲＮＡの発現の上方調節または下方調節によるｉＮＯＳ発現に対する影響を分析し、かつマウスに対する侵入能力を比較した。６〜８週の雌ＢＡＬＢ／Ｃを感染モデルとし、組み換えレンチウイルスでそれぞれｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）を過剰発現するレンチウイルス、ｉＮＯＳ（マウスｉＮＯＳのｓａｌ−１結合サイトがアミノ酸同義突然変異によってｓａｌ−１不結合または低結合能力になった）を過剰発現するレンチウイルス、および特異的にｍｉｌＲＮＡ（ｓａｌ−１）スポンジ体を吸着するレンチウイルスをパッケージングした。実験は、ｍｏｃｋ、サルモネラ菌（ＳＥ２４７２）、ｌｅｎｔｉ−ＮＴＣ＋  ＳＥ２４７２；  ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１＋ＳＥ２４７２、ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅ＋ＳＥ２４７２、ｌｅｎｔｉ−ＮＴＣ＋  ｉＮＯＳ  ＭＵＴ  ＳＥ２４７２、  ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１＋  ｉＮＯＳ  ＭＵＴ  ＳＥ２４７２、ｌｅｎｔｉ−  ｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅ＋  ｉＮＯＳ  ＭＵＴ  ＳＥ２４７２の８群に分けた。
【００７９】
具体的な結果を図７に示す。図７は、マウスモデルにおけるｓａｌ−１の発現量を示す。
図７Ａの結果から、マウスにサルモネラ菌ＳＥ２４７２を感染させた後、ｓａｌ−１の発現量が上昇し、ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１＋ＳＥ２４７２群ではｓａｌ−１の発現量がさらに上昇し、ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅ＋ＳＥ２４７２群のｓａｌ−１の発現レベルはｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅ（ｓａｌ−１に対する阻害剤）に吸着されて低下したことがわかる。マウスｉＮＯＳのｓａｌ−１結合サイトを同義突然変異させてレンチウイルスにパッケージングしてマウスに感染させた後、ｓａｌ−１が若干低下し（突然変異したｉＮＯＳＮｏ発現が細菌のマウス体内における生存能力に影響し、数が若干低下したため）、ｌｅｎｔｉ−ｓａｌ−１＋  ｉＮＯＳ  ＭＵＴ  ＳＥ２４７２群ではｓａｌ−１の発現量がある程度回復し、ｌｅｎｔｉ−  ｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅ＋  ｉＮＯＳ  ＭＵＴ  ＳＥ２４７２群ではｓａｌ−１の発現量がさらに低下した。
図７Ｂは、この８群のマウスのＳＥ２４７２に感染した場合の臨床症状の変化を示し、これらの変化は前記ｓａｌ−１の変化による細菌感染症状の変化と一致する。
【００８０】
図７Ｃおよび７Ｄは、ｉＮＯＳのこの８群における発現量の変化を示し、サルモネラ菌ＳＥ２４７２感染の場合、ｉＮＯＳの発現が上昇したが、顕著な差ではなく、ｓａｌ−１  ｓｐｏｎｇｅを使用した場合だけ、ｉＮＯＳの発現が顕著に回復したことから、ｓａｌ−１がｉＮＯＳの発現を調節し、ｉＮＯＳが同義突然変異された後、ｉＮＯＳの発現がさらに上昇し、かつｓａｌ−１に調節されないことがわかり、結果は、ｓａｌ−１がｉＮＯＳの発現を調節することができることを示した。
図７Ｅは、この８群におけるマウスの大腸組織（腸腔内のものがすでに除去された）における細菌含有量を検出した。ｓａｌ−１の発現に対する上方調節は細菌の腸組織における感染能力を促進し、ｓａｌ−１がｓｐｏｎｇｅに吸着して除去された後、細菌感染能力が低下した。ｉＮＯＳ同義突然変異群では、ｓａｌ−１は調節作用を発揮せず、これらの結果はいずれもｓａｌ−１がｉＮＯＳを調節し、かつｉＮＯＳを介して細菌の宿主体内における侵入と生存能力に影響することを示した。
【００８１】
本発明の実施例の結果は、サルモネラ菌は細菌自身によってコードされる非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を宿主細胞内に提示し、細胞のｍｉｃｒｏＲＮＡ切断システムによって、ｍｉｃｒｏＲＮＡと類似のｍｉｌＲＮＡを生成し、ｍｉｌＲＮＡで免疫系（たとえばｉＮＯＳ）を調節することで、細菌に利用され、宿主による除去から自身を守ることを示した。本発明は、ｍｉｌＲＮＡの阻害剤でｍｉｌＲＮＡを吸着し、細菌の細胞内の生存能力を有効に抑制し、サルモネラ菌の生存能力を低下させたため、細菌感染の治療に使用することができる。
【００８２】
実施例  ３  
サルモネラ菌ｍｉｌＲＮＡの応用
本発明に係るｍｉｌＲＮＡの使用は、（ａ）サルモネラ菌感染を検出する試薬、検出チップまたはキットの製造、あるいは（ｂ）ｉＮＯＳの発現または活性を調節する調節剤の製造に用いられる。
ここで、サルモネラ菌感染を検出する核酸チップは、固相担体と、前記固相担体に規則正しく固定化された、特異的に本発明に係るｍｉｌＲＮＡを捕獲するオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００８３】
本発明の前記サルモネラ菌感染を検出する核酸チップは、ハイスループットで血清における安定して変化するｍｉｌＲＮＡプローブを選別すると同時に、血清におけるｍｉｌＲＮＡの全体的な変化によって疾患を予測・診断することができる。発明者は、まずシーケンシングの方法または定量ＰＣＲ方法によって血清におけるコピー数が１個以上のｍｉｌＲＮＡを確定した後、これらのｍｉｌＲＮＡの逆相補的プローブを合成し、さらにこれらのプローブをチップスポッターSmartArrayTMで７５×２５ｍｍで、化学修飾されたスライドガラスにスポットした。チップにスポットしたサンプルは、さらに、内部標準とするＵ６、ｔＲＮＡ、人工的に製造された塩基長さが３０個の外部標準、陽性コントロールＨｅｘなどを含む。全アレイは４つのサブアレイに分かれ、各サブアレイは２３行、２１列で、点間隔が１８５μmで、点の直径が約１３０μmで、各プローブは３回繰り返した。
【００８４】
チップの操作手順は以下の通りである。（１）血清／血漿における全ＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒド変性ゲルの電気泳動で全ＲＮＡの質量を検出した。（２）ｍｉｌＲＮＡの単離：５０−１００μg全ＲＮＡを取ってAmbion's miRNA Isolation Kit（Cat #. 1560）でmｉｌＲＮＡを単離させた。（３）ｍｉｌＲＮＡサンプルの蛍光標識：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ標識法で蛍光標識を行った後、さらに無水エタノールで沈殿させ、吹いて乾燥させてからチップハイブリダイゼーションに使用した。（４）ハイブリダイゼーションと洗浄：ＲＮＡを１６μＬのハイブリダイゼーション液（１５％ホルムアミド、０．２％  ＳＤＳ、３×ＳＳＣ、５０×Denhardt's solution）に溶解させ、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションが終わった後、まず４２℃くらいで０．２％  ＳＤＳ、２×ＳＳＣを含有する液の中で４分間洗浄し、さらに０．２×ＳＳＣ液の中で室温で４分間洗浄し、スライドガラスを振って乾燥した後、スキャンに使用した。（５）チップスキャン：チップをＬｕｘＳｃａｎ  １０Ｋ／Ａ二チャンネルレーザースキャナーでスキャンした。（６）データの採取および分析：ＬｕｘＳｃａｎ３．０画像分析ソフトでチップの画像を分析し、画像の信号をデジタル信号に変換し、最後にＳＡＭで分析して発現変動遺伝子を選択した。
【００８５】
定量ＰＣＲ技術とバイオチップ技術で二重検証されたサルモネラ菌感染と正常の生理状態における発現変動の大きな血清／血漿ｍｉｌＲＮＡプローブは、バイオチップの製造に用いられ、方法は上記と同様である。このチップは、従来のチップと比べ、製作プロセスと操作手順は大きく変わらないが、このチップはプローブライブラリーが簡略化されるため、チップの製作コストと生産時間が大幅に減少し、製造が容易である。同時に、チップの特異性と実用性も増加する。このチップを実践に投入すると、ほかの組織がなくても、患者の血清／血漿だけあれば、疾患を早期に発見することができ、診断と治療の指導に役立つ。
さらに、本発明に係る核酸チップの使用は、サルモネラ菌感染を検出するキットの製造に用いられる。サルモネラ菌感染を検出するキットは、本発明に係る核酸チップまたは本発明に係るｍｉｌＲＮＡを含む。
【００８６】
サルモネラ菌感染の診断、治療効果の評価、および薬物の活性成分の選別、薬物の効果の評価に用いられるｍｉｌＲＮＡキットの製作プロセスと操作手順は、定量および半定量のＰＣＲ技術とバイオチップ技術に基づくものである。
まず、シーケンシングの方法またはＰＣＲ法によって正常の血清／血漿にコピー数が１個以上のｍｉｌＲＮＡを確定した。そして、定量ＰＣＲ技術とバイオチップ技術で疾患と正常の生理状態における発現量および差異の大きな血清／血漿ｍｉｌＲＮＡを選別し、サルモネラ菌感染の有無の予測および病変の程度の診断の指標とした。最後に、相応の血清／血漿ｍｉｌＲＮＡの数を選別したが、これはチップのプローブライブラリーに基づいて最適な簡略化である。このキットは、血清／血漿ｍｉｌＲＮＡプライマー、Ｔａｑ酵素、ｄＮＴＰなどの試薬を含む。このキットの価値は、ほかの組織のサンプルが不要で、必要なのは血清／血漿だけで、最も簡略化したプローブライブラリーでｍｉｌＲＮＡの変化傾向を検出し、さらに当該変化傾向からサルモネラ菌感染の発生の可能性を予測し、またはサルモネラ菌感染の病理的段階を診断することにある。そのため、このキットを実践に投入すると、サルモネラ菌感染の早期発見の可能性が増加し、診断と治療の指導に役立つ。
【００８７】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｅ】
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【配列表】
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