(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセッサおよびインターフェイス部を備えるコンピュータシステムにおいて、成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定する方法であって、
−プロセッサが、インターフェイス部から成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、前記データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数と前記サイクル数における前記成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、
−プロセッサが、前記データセットを近似する関数を算出するステップと、
−プロセッサが、前記成長曲線のベースラインを判定するステップであって、前記ベースラインは線形である、ステップと、
−プロセッサが、前記関数の２次導関数の最大値が発生する前記関数の第１点を演算するステップと、
−前記プロセッサが、前記第１点において前記関数に接する接線を判定するステップと、
−前記プロセッサが、前記接線と前記ベースラインの交差点を演算し、前記交差点の前記サイクル数を前記サイクル閾値Ｃｔと決定するステップと、
を有する、前記方法。
【請求項２】
前記第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、この場合に、前記接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝において前記関数のスロープｓｌｐを判定し、ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として前記接線を取得するステップを含み、ここで、ｘは、サイクル数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベースラインは、ａｘ＋ｂという関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、前記接線と前記ベースラインの前記交差点を演算するステップは、次式をｘについて解くステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【数１】
0006280124.tif 000012
【請求項４】
前記関数が、ダブルシグモイドの関数形態を有し、そして前記ダブルシグモイドは、次式を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【数２】
0006280124.tif 000013
【請求項５】
前記成長プロセスが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、
−前記関数を算出するステップの前に、前記データ点の一部分を除去するステップを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ベースラインは、前記関数から判定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
−前記関数の２次導関数を算出するステップを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロセッサが、決定されたサイクル閾値Ｃｔをインターフェイス部から出力するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
実行された際に成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定するようにコンピュータシステムを制御する複数の命令を含むプログラムであって、
前記命令は、
−プロセッサが、インターフェイス部から成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、前記データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数と前記サイクル数における前記成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップ、
−プロセッサが、前記データセットを近似する関数を算出するステップ、
−プロセッサが、前記成長曲線のベースラインを判定するステップであって、前記ベースラインは線形である、ステップ、
−プロセッサが、前記関数の２次導関数の最大値が発生する前記関数の第１点を演算するステップ、
−プロセッサが、前記第１点において前記関数に接する接線を判定するステップ、
−プロセッサが、前記接線と前記ベースラインの交差点を演算して、前記交差点のサイクル数を前記サイクル閾値Ｃｔと決定するステップ、および
−プロセッサが、インターフェイス部から前記サイクル閾値Ｃｔを出力するステップと
を実行させる命令である、前記プログラム。
【請求項１１】
前記第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、この場合に、前記接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝において前記関数のスロープｓｌｐを判定し、ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として前記接線を取得するステップを含む、請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１２】
前記ベースラインは、ａｘ＋ｂという関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、前記接線と前記ベースラインの前記交差点を演算するステップは、次式をｘについて解くステップを含む、請求項１０又は１１に記載のプログラム。
【数３】
0006280124.tif 000014
【請求項１３】
前記関数は、ダブルシグモイドの関数形態を有し、且つ、この場合に、前記ダブルシグモイドは、次式を有し、
【数４】
0006280124.tif 000015
ここで、前記命令は、
−前記ダブルシグモイド関数の２次導関数を算出するステップ、
を更に有する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のプログラム。
【請求項１４】
前記プロセッサに、決定されたサイクル閾値Ｃをインターフェイス部から出力するステップを実行させる命令をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか一行に記載のプログラム。
【請求項１５】
請求項１０〜１４に記載のプログラムを含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項１６】
請求項１０〜１４に記載のプログラムを含む、コンピュータプロダクト。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムにおいて、
−ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成するＰＣＲデータ取得装置であって、前記データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、座標値のペアを有し、この場合に、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む対象領域内においてデータ点を含む、ＰＣＲデータ取得装置と、
−前記ＰＣＲデータセットを処理して前記Ｃｔ値を判定するように適合されたインテリジェンスモジュールと、
を有し、
前記Ｃｔ値の判定は、
−インテリジェンスモジュールが、ＰＣＲデータ取得装置から成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、前記データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数と前記サイクル数における前記成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、
−インテリジェンスモジュールが、前記データセットを近似する関数を算出するステップと、
−インテリジェンスモジュールが、前記成長曲線のベースラインを判定するステップであって、前記ベースラインは線形である、ステップと、
−インテリジェンスモジュールが、前記関数の２次導関数の最大値が発生する前記関数の第１点を演算するステップと、
−インテリジェンスモジュールが、前記第１点において前記関数に接する接線を判定するステップと、
−インテリジェンスモジュールが、前記接線と前記ベースラインの交差点を演算して、前記交差点の前記サイクル数を前記サイクル閾値Ｃｔと決定するステップと、
によって実行される、ＰＣＲシステム。
【請求項１８】
前記第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、前記接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝において前記関数のスロープｓｌｐを判定し、ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として前記接線を取得するステップを含む、請求項１７に記載のＰＣＲシステム。
【請求項１９】
前記ベースラインは、ａｘ＋ｂという関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、前記接線と前記ベースラインの前記交差点を演算するステップは、次式をｘについて解くステップを含む、請求項１７又は１８のいずれか一項に記載のＰＣＲシステム。
【数５】
0006280124.tif 000016
【請求項２０】
前記関数は、ダブルシグモイドの関数形態を有し、且つ、この場合に、前記ダブルシグモイドは、次式を有し、
【数６】
0006280124.tif 000017
この場合に、前記インテリジェントモジュールが、前記ダブルシグモイド関数の２次導関数を算出するステップ、
を更に有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＰＣＲシステム。
【請求項２１】
前記PCRシステムが、表示装置をさらに含み、前記インテリジェンスモジュールが、決定された前記サイクル閾値Ctを表示装置に表示させる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のＰＣＲシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関し、且つ、更に詳しくは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）増幅曲線における特性サイクル閾値（Ｃｔ）又はエルボー値或いはその他の成長曲線におけるエルボー値を判定するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応とは、定義された核酸配列を酵素によって合成又は増幅する体外法である。この反応は、通常、逆鎖に交雑すると共に増幅対象のテンプレート又はターゲットＤＮＡ配列の側面に位置する２つのオリゴヌクレオチドプライマを使用している。プライマの伸長は、熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼの触媒作用による。テンプレート変性、プライマアニーリング、及びポリメラーゼによるアニーリング済みのプライマの伸長を伴う反復的な一連のサイクルは、特定のＤＮＡ断片の指数的な蓄積を結果的にもたらす。通常、増幅プロセスの検出及び定量化を促進するためのプロセスにおいて、蛍光ブローブ又はマーカーが使用されている。
【０００３】
具体的には、均質であると共に分析のための反応の増幅又は物理的なサンプリングの開始後に試薬の追加を必要としない蛍光法が、魅力的である。例示用の均質な技法は、オリゴヌクレオチドを使用して信号生成のための対象領域及び蛍光ラベル又は色素を見出している。一般的なＰＣＲに基づいた方法は、２つの相互作用する発色団（隣接する交雑プローブ、ＴａｇＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ、１つの発蛍光団のみを有するシングルオリゴヌクレオチドプローブ（非特許文献１及びＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＳｉｍｐｌｅＰｒｏｂｅｓ）、及び蛍光によってラベルが付与された共有オリゴヌクレオチドプローブの代わりにｄｓＤＮＡ色素（例えば、ＳＹＶＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を使用した技法を使用している。ＰＣＲにおいてすべての二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ：ｄｓ）ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合色素は、結合の際に色素の蛍光発光を生成する。従って、ＰＣＲにおけるＤＮＡ生成物の増大は、蛍光強度の増大に結び付き、且つ、これをそれぞれのサイクルにおいて計測することにより、ＤＮＡ濃度の定量化が可能となる。但し、潜在的な欠点は、すべてのｄｓＮＮＡのＰＣＲ生成物に対する非特異的結合であり、これは、正確な定量化に対して影響を及ぼす。標準的な希釈率を参照することにより、ＰＣＲにおけるｄｓＤＮＡ濃度を判定することができる。
【０００４】
蛍光レポータプローブは、特定のプローブが結合するＤＮＡ配列のみを検出し、且つ、従って、特異性を大幅に増大させる。この結果、非特異的なＤＮＡ増幅が存在する場合にも、増幅の定量化が可能となる。同一の反応においていくつかのターゲットを検出するべく、多種検定において蛍光プローブを使用することが可能であり、この場合には、異なる色で着色されたラベルを有する特定のプローブが、それぞれのターゲットごとに使用される。又、蛍光レポータプローブの特異性は、増幅における望ましくない副産物であるプライマダイマによって生成される計測の干渉をも防止する。大部分の用途は、１つ又は複数のプローブに対して結合する蛍光レポータ化合物と蛍光の消光剤の相互作用に基づいている。レポータと消光剤化合物が近接した状態にある限り、励起源（例えば、レーザー、ＬＥＤ、及びこれらに類似したもの）による励起の際に、基礎的な蛍光のみが検出されることになる。増幅が発生したら、レポータと消光剤化合物の相互作用が中断され、検出可能な蛍光信号に結び付く。それぞれのＰＣＲサイクルにおける増幅された生成物の増大は、レポータ及び消光剤化合物の相互作用の減少に起因して蛍光の比例した増大を生成する。一般に、それぞれの増幅サイクルにおいて、蛍光が検出及び計測され、且つ、生成物の指数的増大に対応するその幾何学的増大を使用することにより、それぞれの反応における閾値サイクル（ＣＴ）を判定している。
【０００５】
図１には、一般的な動的ＰＣＲ曲線が示されており、この場合には、一般的なＰＣＲプロセスについて、蛍光強度値がサイクル数に照らしてプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ生成物の形成が監視されている。増幅は、通常、増幅反応において蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラ内において計測される。このようなサーモサイクラの一例は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（カタログ番号２０１１０４６８）である。増幅生成物は、例えば、ターゲット核酸に結合した際にのみ蛍光信号を放出する蛍光によってラベルが付与された交雑プローブにより、或いは、特定のケースにおいては、二重鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素により、検出される。
【０００６】
一般的なＰＣＲ曲線の場合には、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と一般に呼ばれるベースライン領域の末尾における遷移点を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するために非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用されてもよい。例えば、通常、定義された信号閾値が、分析対象のすべての反応について判定され、且つ、この閾値に到達するために必要とされるサイクルの数（Ｃｔ）が、ターゲット核酸のみならず、標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸についても、判定される。ターゲット核酸及び基準拡散について得られたＣｔ値に基づいて、ターゲット分子（出発物質）の絶対的又は相対的な複写数を判定することができる（非特許文献２、非特許文献３、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。図１Ａのベースライン領域１５の末尾におけるエルボー値２０は、サイクル数３０の領域内に存在することになろう。
【０００７】
結果を、既知の量のＲＮＡ又はＤＮＡの段階希釈のリアルタイムＰＣＲによって生成される標準曲線と比較することにより、ＲＮＡ又はＤＮＡの量を判定してもよい。サイクル閾値（Ｃｔ）を標準曲線と比較するか、基準核酸のサイクル閾値（Ｃｔ）と比較するか、或いは、絶対的に定量化された標準核酸と比較することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅におけるターゲット分子の絶対的又は相対的な複写数を判定することができる。更には、分析対象であるそれぞれの反応のサイクル閾値（Ｃｔ）を基準核酸のサイクル閾値（Ｃｔ）と比較することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の効率を判定してもよい。
【０００８】
ＰＣＲ曲線におけるエルボー値は、いくつかの既存の方法を使用して判定することができる。例えば、様々な方法においては、エルボー（Ｃｔ）の実際の値を、正規化されたＰＣＲ曲線上の蛍光が既定の信号レベルに到達する値として、判定しており、この既定の信号レベルは、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅ）と呼ばれ、且つ、プレエルボーＰＣＲサイクルにおける平均ベースライン蛍光レベルの変化の影響を受け易い可能性がある。その他の方法においては、蛍光の２次導関数対サイクル数が最大値に到達するサイクル数を使用しており、これは、特に放物曲線の場合に、最新のＣｔ値を付与することができる。更にその他の方法においては、屈折点（一次導関数の最大値）におけるＰＣＲ曲線の接線を使用しており、これは、放物曲線の場合には、１次導関数の最大値が存在しない場合があることから、問題である（非特許文献４）。従って、後者の２つの方法は、いずれも、放物曲線の場合には、欠点を有する。特許文献４は、放物曲線を識別すると共にこれらの問題を有する曲線の場合に異なる技法を使用することにより、放物曲線に伴う問題を解決している。この方法は、定性的リアルタイムＰＣＲの場合には、良好に機能するが、定量的リアルタイムＰＣＲに適用された場合には、低複写数において、なんらかの不正確性の増大に結び付く可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開第９７／４６７０７号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願公開第９７／４６７１２号パンフレット
【特許文献３】国際特許出願公開第９７／４６７１４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第８，２１９，３６６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ，  Ｃｒｏｃｋｅｔｔ，  Ａ．  Ｏ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｔ．  Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；  ２９０：  ８９−９７
【非特許文献２】Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１
【非特許文献３】Ｂｉｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：２７５９−２７６５，１９９９
【非特許文献４】Ｇｕｅｓｃｉｎｉ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ９：３２６，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、上述の且つその他の問題を克服するリアルタイムＰＣＲ増幅曲線又はその他の成長曲線などの成長曲線においてＣｔ値を判定するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
様々な実験条件に対して適用可能な１つの技法に従ってＣｔを判定するシステム、方法、及び装置が提供される。Ｃｔを判定するための単一の技法は、標準的なシグモイド成長曲線と、放物曲線などの問題を有する成長曲線と、に使用することができる。成長曲線のベースラインとの間における２次導関数の最大値において成長曲線に接するラインの交差として、Ｃｔ値を判定することができる。このようなＣｔ値は、シグモイド曲線及び放物曲線の場合に使用可能であり、且つ、初期濃度の判定における正確性を実現するための線形較正曲線を提供することができる。
【００１３】
例えば、実施形態においては、２次導関数の最大値におけるダブルシグモイドフィット（即ち、ＰＣＲ曲線の未加工データ点に対するもの）のスロープ及び信号値を判定している。このスロープ及び信号値は、ＰＣＲ曲線のベースラインと交差する直線を引くために十分なものである。次いで、この交差点をＣｔ値として定義することができる。
【００１４】
一実施形態によれば、方法は、成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定する。成長曲線を表すデータセットを受け取る。データセットは、複数のデータ点を含む。それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する。データセットを近似する関数を算出する。成長曲線のベースラインを判定し、この場合に、ベースラインは線形である。コンピュータシステムにより、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算する。コンピュータシステムにより、第１点において関数に接する接線を判定する。コンピュータシステムにより、接線とベースラインの交差点を演算し、この場合に、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである。
【００１５】
その他の実施形態は、本明細書に記述されている方法と関連付けられたシステム及びコンピュータ可読媒体を対象としている。
【００１６】
以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することにより、本発明の特性及び利点について更に十分に理解することができよう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】蛍光強度対サイクル数としてプロットされた一般的なＰＣＲ成長曲線の一例を示す。
【図１Ｂ】本発明の実施形態による模擬リアルタイムＰＣＲ曲線である。
【図２Ａ】本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０の１次導関数２３０のプロット２００を示す。
【図２Ｂ】本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０の２次導関数２６０のプロット２５０を示す。
【図３】本発明の実施形態によるＣｔ３７５の判定を示す模擬リアルタイムＰＣＲ曲線１１０を有するプロット３００を示す。
【図４】成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定する方法４００を示すフローチャートである。
【図５Ａ】本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１０１から５倍に拡大されたＰＣＲ曲線５１０のプロット５００を示す。
【図５Ｂ】本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０から１／５に縮小されたＰＣＲ曲線５１０のプロット５００を示す。
【図６Ａ】本発明の実施形態によるＰＣＲデータ点６０５及び点６０５を近似する関数６１０のプロット６００を示す。
【図６Ｂ】関数６１０の２次導関数６６０のプロット６５０を示す。
【図７Ａ】本発明の実施形態に従って判定された較正曲線７１０のプロット７００を示す。
【図７Ｂ】２次導関数の最大値を使用して判定された較正曲線７６０の類似のプロット７５０を示す。
【図８Ａ】２次導関数最大値のみならず放物曲線用の放物法を使用した計測Ｃｔと予想Ｃｔの間の相関ライン８１０のプロット８００を示す。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態を使用した計測Ｃｔと予想Ｃｔの間の相関ライン８６０のプロット８５０を示す。
【図９】２つの未加工データ曲線９１０及び９２０のプロット９００を示す。
【図１０】本発明の実施形態によるシステム及び方法と共に使用可能な例示用のコンピュータシステム１２００のブロックダイアグラムを示す。
【図１１】本発明の方法及びシステムの実装に使用されてもよいソフトウェア及びハードウェアリソースの間の関係を示す概略ブロックダイアグラムの一例である。
【図１２】サーモサイクラ装置とコンピュータシステムの間の関係を示す概略ブロックダイアグラムの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
サンプルの成長曲線（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）曲線）を分析して初期濃度を判定することができる。通常、サイクル閾値Ｃｔ（エルボー値とも呼ばれる）が初期濃度の代用品として使用され、この場合に、較正曲線を使用することにより、計測Ｃｔから、対応する初期濃度を判定することができる。但し、特定の成長（増幅）曲線は問題を有する可能性があることから、一貫性を有するＣｔ値の判定が困難である可能性がある。これらの問題を有する曲線の場合には、異なる技法を使用することができるが、これを実行することにより、較正曲線と、初期濃度を適切に定量化する能力と、が損なわれる可能性がある。
【００１９】
本発明の実施形態は、標準的なシグモイド成長曲線と、放物曲線などの問題を有する成長曲線と、について使用することができるＣｔを判定する単一の技法を提供している。成長曲線のベースラインとの間における２次導関数の最大値において成長曲線に接するラインの交差として、Ｃｔ値を判定することができる。このようなＣｔ値は、シグモイド曲線及び放物曲線について使用可能であり、且つ、初期濃度の判定における正確さを実現するための線形較正曲線を提供することができる。まず最初に、リアルタイムＰＣＲ曲線について説明する。
【００２０】
Ｉ．概要
図１Ａには、動的ＰＣＲプロセスの環境における増幅曲線１０の一例が示されている。図示のように、曲線１０は、遅滞フェーズ領域１５と、指数フェーズ領域２５と、を含む。遅滞フェーズ領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線は、遅滞フェーズと指数フェーズをリンクする遷移領域２０を含む。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、ベースラインの末尾と、基礎をなすプロセスの成長又は増幅速度の遷移部と、を定義している。特定の遷移点を領域２０内において識別することは、基礎をなすプロセスの振る舞いを分析するために有用であろう。
【００２１】
一般的なＰＣＲ曲線においては、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移点の識別が、ＰＣＲプロセスの効率特性を理解するために非常に有用である。例えば、Ｃｔ値を使用することにより、分析対象のサンプル中に存在するＤＮＡの量の定量化を提供することができる。定量化は、Ｌｏｇ（ＤＮＡの量）対Ｃｔ値の較正曲線を実行することにより、得られる。この結果、後続のサンプルは、較正曲線と共にＣｔ値を使用することにより、サンプル中のＤＮＡの推定値を直接的に得ることができる。又、Ｃｔ値を使用することにより、ＤＮＡサンプルに関する定性的情報を提供することもできる。
【００２２】
類似のシグモイド又は成長曲線を提供しうるその他のプロセスには、バクテリアプロセス、酵素プロセス、及び結合プロセスが含まれる。例えば、バクテリア成長曲線においては、対象となる遷移点は、遅滞フェーズにおける時点λと呼ばれている。本発明に従って分析してもよいデータ曲線を生成するその他の特定のプロセスには、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）プロセス、核酸配列に基づいた増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）プロセス、及び転写介在増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＭＡ）プロセスが含まれる。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセス及びデータ曲線の例については、それぞれ、Ｗａｎｇ，  Ｓｈａ−Ｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ  ＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ，”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００３  ４９（１０）：１５９９及びＷｅｕｓｔｅｎ，  Ｊｏｓ  Ｊ．Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｏａｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２  ３０（６）：２６において見出すことができる。従って、本明細書の残りの部分においては、ＰＣＲ曲線に対するその適用性の観点において本発明の実施形態及び態様について説明することになるが、本発明は、その他のプロセスに関係するデータ曲線に対して適用してもよいことを理解されたい。
【００２３】
図１Ａに示されているように、一般的なＰＣＲ成長曲線用のデータは、例えば、二次元座標系において表すことが可能であり、この場合に、ＰＣＲサイクル数がＸ軸を定義し、且つ、蓄積されたポリヌクレオチド成長のインジケータがｙ軸を定義している。蛍光マーカーの使用が、恐らくは、最も広範に使用されているラベル付与方式であることから、通常、蓄積された成長のインジケータは、蛍光強度値である。但し、使用する特定のラベル付加及び／又は検出方式に応じて、その他のインジケータを使用してもよいことを理解されたい。蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例には、ルミネッセンス強度、化学ルミネッセンス強度、生物ルミネッセンス強度、燐光強度、電荷転送、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射線強度、反射率、透過率、及び吸収率が含まれる。このようなすべての例が信号強度に含まれる。又、サイクルの定義は、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを含むこともできる。
【００２４】
ＩＩ．Ｃｔ値の判定
実施形態においては、成長曲線のベースラインとの間における２次導関数の最大値において成長曲線に接するラインの交差を使用している。成長曲線の２次導関数の最大値の点を得るべく、特定の成長プロセス（例えば、リアルタイムＰＣＲ）のデータ点に対する関数近似（曲線フィット）を得ることができる。関数の２次導関数を演算及び分析することにより、どのサイクル（ｘｖａｌ）において最大値が発生するかを判定することができる。次いで、ｘｖａｌにおける関数のスロープに基づいて接線を判定することができる。関数のベースラインが判定された後に、接線とベースラインの交差を算出することができる。次いで、Ｃｔ値が返されるが、このＣｔ値は、表示してもよく、或いは、さもなければ、更なる処理のために使用してもよい。このようなＣｔ値は、シグモイド曲線及び放物曲線の場合に使用可能であり、且つ、初期濃度の判定における正確さを実現するための線形較正曲線を提供することができる。以下、模擬成長曲線を使用して実施形態を例示する。
【００２５】
図１Ｂは、本発明の実施形態による模擬リアルタイムＰＣＲ曲線１１０を有するプロット１００を示している。ＰＣＲ曲線１１０は、水平（ｘ）軸上にサイクル数を、そして、垂直（ｙ）軸上に強度（例えば、蛍光）を、有する。ＰＣＲ曲線１１０は、明確なベースライン１１５を有する。図示のように、ベースライン１１５は、２に等しい強度（ｙ）を有する水平ラインである。提示を容易にするべく、模擬ベースライン１１５には、スロープが存在していない。但し、ベースラインは、スロープを有する任意の線形形態を有してもよい。エルボー領域１２０が、ベースライン１１５と指数フェーズ領域１２５の間に位置している。指数フェーズ領域１２５は、ＰＣＲ曲線１１０が、エルボー領域１２０における上方とは反対に、下方への湾曲を開始する屈折点１２８を含む。
【００２６】
ＰＣＲ成長曲線１１０が模擬されているが、ＰＣＲ成長曲線は、それぞれのサイクルごとに強度のデータ点から判定することができる。特定の関数形態を仮定することが可能であり、且つ、特定の関数形態がデータ点を近似するように、パラメータを判定することができる。いくつかの実施形態においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって判定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用し、データ点に対する近似を見出すことができる。その他の実施形態においては、例えば、有限要素分析において発生しうる（例えば、最大で２次導関数まで連続した）連続境界条件を有する多項式を使用した補間、シングルシグモイド関数、或いは、対象領域に跨る連続した２次導関数を有する１つ又は複数の関数の任意の組などのその他の関数形態を使用してもよい。一態様においては、曲線近似及びパラメータを使用してデータ信号を事前処理することが可能であり、例えば、データ信号を正規化することも可能であり、且つ／又は、データ信号内に存在しうるスパイク又は異常値データ点を除去することもできる。
【００２７】
図２Ａは、本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０の１次導関数２３０のプロット２００を示している。ｘ軸は、依然としてサイクル数であるが、プロット２００が１次導関数を示していることから、ｙ軸は、サイクル当たりの強度の変化を単位としている。１次導関数２３０は、データ点に対する曲線フィッティングプロセスの結果として得られる関数の１次導関数を取得することにより、判定してもよい。図示のように、１次導関数２３０は、（屈折点１２８に対応する）屈折点２２８において最大値を有する。
【００２８】
図２Ｂは、本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０の２次導関数２６０のプロット２５０を示している。２次導関数２６０は、データ点に対する曲線フィッティングプロセスの結果として得られる関数の２次導関数を取得することにより、判定してもよい。屈折点は、点２７８として示されており、これは、２次導関数２６０がゼロであるところに対応している。２次導関数２６０は、点２６５において最大値を有し、これは、サイクルｘｖａｌにおいて発生している。図２Ｂにおいて、ｘｖａｌは、３２．３６に等しい。最大値は、例えば、２次導関数２６０の値に沿ってサーチするか又は３次導関数のゼロを判定するなどの様々な方法により、見出すことができる。２次導関数の最大値２６５が屈折点２７８の前において発生していることが理解されよう。
【００２９】
ｘｖａｌが判定されたら、サイクルｘｖａｌにおけるＰＣＲ曲線のスロープを判定することができる。一実施形態においては、スロープは、サイクルｘｖａｌにおける１次導関数の値を取得することにより、判定することができる。この結果、このスロープが最大２次導関数の点を通過するラインが、サイクルｘｖａｌにおいてＰＣＲ曲線に接するラインを提供することができる。
【００３０】
図３は、本発明の実施形態によるＣｔ３７５の判定を示す模擬リアルタイムＰＣＲ曲線１１０を有するプロット３００を示している。ＰＣＲ曲線１１０上の点３６５は、２次導関数の最大値の点に対応している。従って、点３６５は、点２６５と同一のサイクルｘｖａｌにおいて発生しており、このサイクルｘｖａｌは、３２．３６である。ｘｖａｌ（３２．３６）におけるＰＣＲ曲線１１０のスロープは、０．８３７５に等しい。ｘｖａｌ（３２．３６）におけるＰＣＲ曲線１１０の強度は、４．０５（ｙｖａｌ）に等しい。所与のスロープ（０．８３７５）を伴って（ｘｖａｌ，ｙｖａｌ）を通過するラインの式は、ｌｉｎｅ（ｘ）＝ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）＝０．８３７５ｘ−２３．０４である。接線３７５は、この式に準拠している。
【００３１】
ｙ＝２に位置するベースライン１１５が、ライン３１５として、延在した状態で示されている。０．８３７５ｘ−２３．０４＝２という式をｘについて解くことにより、ベースライン３１５との間における接線３７５の交差３７０を判定することができる（即ち、この場合に、接線の式は、ベースライン用の式と等しく、ベースラインの式も、ａｘ＋ｂの形態を有してもよい）。交差は、ｘ＝２９．９という解を有し、交差３７０が発生するｘ軸上の点に対する下方矢印によって示されているように、これがＣｔ値３７５として取得される。点３６５を使用して接線３７５を判定することの利益は、点３６５がＰＣＲ曲線１１０のエルボー領域内に出現するという点にある。従って、交差３７０も、エルボー領域内に出現することになろう。
【００３２】
ＩＩＩ．方法
図４は、成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定する方法４００を示すフローチャートである。方法４００は、コンピュータシステムによって演算することができる。例示用の成長プロセスは、リアルタイムＰＣＲ増幅である。その他の成長プロセスには、バクテリアプロセス、酵素プロセス、及び結合プロセスが含まれる。成長プロセスは、一連の点によって計測することが可能であり、それぞれのデータ点は、サイクル数における信号強度を提供している。
【００３３】
ブロック４１０において、成長曲線を表すデータセットを受け取っている。データセットは、複数のデータ点を含む。それぞれのデータ点は、座標値のペア｛サイクル数，そのサイクル数における成長プロセスの信号強度｝を有する。例えば、図１Ａのそれぞれのデータ点は、蛍光強度とサイクル数によって表記されている。本明細書には、その他のタイプの強度を含むその他のタイプの信号強度についても、言及されている。
【００３４】
ブロック４２０において、コンピュータシステムにより、データセットを近似する関数を算出することができる。この関数は、データセットに対するベストフィットを識別するための回帰法を使用することにより、判定することができる。関数は、可変パラメータを有する既定の関数形態を有することが可能であり、且つ、フィッティングプロセスにより、パラメータが判定される。一実装形態においては、ダブルシグモイド関数形態が使用されており、これは、１次及び２次導関数の正確な判定を許容するように、正確な関数を提供することができる。
【００３５】
一実施形態においては、コンピュータシステムにより、次式（１）に示されているダブルシグモイド式のベストフィットを判定している。
【数１】
0006280124.tif 000002
【００３６】
例えば、米国特許第７，６８０，８６８号明細書に開示されているように、ダブルシグモイドＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｉｇｍｏｉｄ  Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ：ＤＳＬＭ）曲線フィットを実行することができる（「ＰＣＲ  Ｅｌｂｏｗ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｉｇｍｏｉｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ  Ｆｉｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ」）。一実施形態においては、曲線フィットを実行する前に、例えば、開始時点における又は成長曲線における点などの特定のデータ点を除去してもよい。例えば、２００５年１２月２０日付けで出願された米国特許出願第１１／３１６，３１５号明細書、２００６年７月１９日付けで出願された米国特許出願第１１／４５８，６４４号明細書、２００６年９月１９日付けで出願された米国特許出願第１１／５３３，２９１号明細書、及び２００７年９月２５日付けで出願された米国特許出願第１１／８６１，１８８号明細書に開示されているＤＳＬＭ（ダブルシグモイドＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）式、ベースライン減算（ＢａｓｅＬＩｎｅ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ：ＢＬＳ）の選択肢を有するＤＳＬＭ、ベースライン除算（ＢａｓｅＬｉｎｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：ＢＬＤ）、及び除算を伴うベースライン減算（ＢａｓｅＬｉｎｅ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：ＢＬＳＤ）、曲率式、及びその他のものなどのダブルシグモイド式の様々な実装形態及び処理が既に紹介されている。
【００３７】
ブロック４３０において、成長曲線のベースラインを判定している。例えば、図１Ａのベースライン１５をデータ点から判定することができる。例えば、成長曲線が指数領域に進入する際を判定するなどの様々な方法により、ベースラインの末尾を判定することができる。ベースラインに対応するデータ点を線形関数に対してフィッティングすることにより、ベースラインを判定することができる。別の例として、関数フィットを使用し、ベースラインを判定することができる。式（１）は、ベースラインを定義するために使用可能な線形部分（ａｘ＋ｂ）を含む。
【００３８】
ブロック４４０において、コンピュータシステムにより、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算することができる。例えば、コンピュータシステムにより、式（１）の２次導関数の最大値に対応する（ｘｖａｌ）及び（ｙｖａｌ）の位置を判定することができる。２次導関数のｘｖａｌは、例えば、図２について説明したように演算することができる。次いで、関数フィットを使用することにより、ｘｖａｌからｙｖａｌを判定することができる。
【００３９】
ブロック４５０において、コンピュータシステムにより、第１点において関数に接する接線を判定することができる。一実施形態においては、第１点（ｘｖａｌ，ｙｖａｌ）において、（例えば、式（１）を使用して判定された）関数フィットのスロープ（ｓｌｐ）が判定されている。次いで、次式を使用することにより、接線を判定することができる。
【数２】
0006280124.tif 000003
【００４０】
ブロック４６０において、コンピュータシステムにより、接線とベースラインの交差点を演算することが可能であり、この場合に、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである。接線は、上述のライン（ｘ）及びベースラインの場合と同様に、ａｘ＋ｂによって定義され、これは、式（１）からなどのように、様々な方法によって定義することができる。一実装形態においては、以下の式をｘについて解くことが可能であり、この場合に、値ａ及びｂは、式（１）からの値である。
【数３】
0006280124.tif 000004
これは、次式の解を有する。
【数４】
0006280124.tif 000005
【００４１】
プロセス４００が、サーモサイクラなどのＰＣＲデータ取得装置内に存在するインテリジェンスモジュール（例えば、プロセッサ実行命令など）内において実装されるケースにおいては、データが収集されのに伴って、データセットをインテリジェンスモジュールに対してリアルタイムで提供してもよく、或いは、メモリユニット又はバッファ内において保存しておき、且つ、実験が完了した後に、インテリジェンスモジュールに対して提供してもよい。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステム又はその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに対して提供してもよく、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれに類似したものなどの携帯可能な媒体上において提供してもよい。特定の態様においては、データセットは、座標値のペア（又は、二次元ベクトル）を有するデータ点を含む。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表している。
【００４２】
従って、本発明は、成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定する方法を提供する。本明細書においては、方法は、成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、データセットを近似する関数を算出するステップと、成長曲線のベースラインを判定するステップであって、ベースラインは線形である、ステップと、コンピュータシステムにより、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算するステップと、コンピュータシステムにより、第１点において関数に接する接線を判定するステップと、コンピュータシステムにより、接線とベースラインの交差点を演算するステップであって、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである、ステップと、を有する。
【００４３】
特定の実施形態においては、第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝における関数のスロープｓｌｐを判定し、接線をｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として取得するステップを含み、ここで、ｘは、サイクル数である。その他の実施形態においては、ベースラインは、ａｘ＋ｂの関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、接線とベースラインの交差点を演算するステップは、以下の式をｘについて解くステップを含む。
【数５】
0006280124.tif 000006
【００４４】
特定の実施形態においては、ベースラインは、線形である。その他の実施形態においては、関数は、ダブルシグモイドの関数形態を有する。特定の実施形態においては、ダブルシグモイドは、次式を有する
【数６】
0006280124.tif 000007
【００４５】
いくつかの実施形態においては、成長プロセスは、出発物質の増幅である。特定の実施形態においては、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅である。特定の実施形態においては、出発物質は、ターゲット核酸を含む。
【００４６】
別の実施形態においては、方法は、関数を算出する前に、データ点の一部を除去するステップを更に有する。更に別の実施形態においては、ベースラインは、関数から判定されている。特定の実施形態においては、方法は、関数の２次導関数を算出するステップを更に有する。
【００４７】
本発明の更なる態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の効率を計測する方法が提供され、この方法は、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表す蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値を計測するステップと、定義された信号閾値及びこの閾値に到達するために必要とされるサイクルの数を判定するステップであって、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）が、成長曲線を表すデータセットを受け取るステップによって判定され、データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、データセットを近似する関数を算出するステップと、成長曲線のベースラインを判定するステップであって、ベースラインは線形である、ステップと、コンピュータシステムにより、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算するステップと、コンピュータシステムにより、第１点において関数に接する接線を判定するステップと、コンピュータシステムにより、接線とベースラインの交差点を演算するステップであって、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである、ステップと、増幅されたポリヌクレオチドのサイクル閾値（Ｃｔ）を基準核酸のサイクル閾値（Ｃｔ）と比較することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の効率を判定するステップと、を有する。
【００４８】
本発明の別の態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅におけるターゲット分子の絶対的又は相対的な複写数を判定する方法が提供され、この方法は、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積を表す蛍光強度値、ルミネッセンス強度値、化学ルミネッセンス強度値、燐光強度値、電荷転送値、生物ルミネッセンス強度値、又は吸収値を計測するステップと、成長曲線を表すデータセットを受け取る方法ステップによって成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を判定するステップであって、データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、データセットを近似する関数を算出するステップと、成長曲線のベースラインを判定するステップであって、ベースラインは線形である、ステップと、コンピュータシステムにより、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算するステップと、コンピュータシステムにより、第１点における関数に接する接線を判定するステップと、コンピュータシステムにより、接線とベースラインの交差点を演算するステップであって、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである、ステップと、Ｃｔ値に基づいてターゲット分子の絶対的又は相対的な複写数を判定するステップと、を有する。
【００４９】
ＩＶ．スケール不変性
以下の理由から、Ｃｔの判定法をスケール不変性を有する方式とすることが有益である。異なるＰＣＲ装置は、異なるランプ強度、光ファイバ長、及びサーマルサイクラを有することが可能であり、これらは、いずれも、蛍光強度に対する乗数として機能しうる。従って、正確なデータ点は、装置に依存することになるが、Ｃｔの判定が装置間の可変性に依存しないことが理想的である。以下の図は、実施形態のスケール不変性を示している。
【００５０】
図５Ａは、本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０から５倍に拡大されたＰＣＲ曲線５１０のプロット５００を示している。ＰＣＲ曲線５１０は、５によって乗算されていることを除いて、ＰＣＲ曲線１１０と同一である。図示のように、２次導関数の最大値における接線５３５は、図３においてＰＣＲ曲線１１０について判定したように、同一のサイクル数（２９．９）においてベースライン５１５と交差している。従って、ＰＣＲ曲線が（例えば、異なる装置の使用に起因して）所定の定数によって乗算された場合にも、同一のＣｔが得られる。
【００５１】
図５Ｂは、本発明の実施形態によるＰＣＲ曲線１１０から１／５に縮小されたＰＣＲ曲線５１０のプロット５００を示している。ＰＣＲ曲線５６０は、５によって除算されていることを除いて、ＰＣＲ曲線１１０と同一である。図示のように、２次導関数の最大値における接線５８５は、図３においてＰＣＲ曲線１１０について判定したように、同一のサイクル数（２９．９）においてベースライン５６５と交差している。従って、ＰＣＲ曲線が（例えば、異なる装置の使用に起因して）所定の定数によって除算された場合にも、同一のＣｔが得られる。
【００５２】
Ｖ．放物曲線
上述のように、放物曲線は、Ｃｔを算出するための特定の技法の場合に、問題を有する。例えば、屈折点（１次導関数の最大値及び２次導関数のゼロ）は、常に入手可能であるわけではない。更には、２次導関数の最大値の使用によって不満足な結果しか得られない可能性がある。但し、本発明の実施形態は、相対的に良好なＣｔ値を確実に提供することができる。
【００５３】
図６Ａは、本発明の実施形態によるＰＣＲデータ点６０５及び点６０５を近似する関数６１０のプロット６００を示している。図示のように、関数６１０は、式（１）を使用してフィッティングしたものである。図６Ｂは、関数６１０の２次導関数６６０のプロット６５０を示している。プロット６５０は、２次導関数６６０が（４９．３１において）２次導関数の最大値を有することを示している。但し、２次導関数は、そのベースラインから増大した後に、ゼロを通過しないことから、屈折点は存在していない。従って、屈折点におけるスロープを使用してＣｔを判定することは不可能である。
【００５４】
２次導関数の最大値を使用してＣｔを判定することができるが、推定値は、４９．３１であり、これは、２次導関数６６０の最大値である。ベースラインとの間における接線（即ち、サイクル４９．３１において関数６１０に接するライン）の交差を使用することにより、Ｃｔ＝４５．５３が得られ、これは、４９．３１よりも良好な推定値である。２次導関数６６０の最大値における接線を使用することにより、Ｃｔは、関数６１０のエルボーと更に整合した状態となる。
【００５５】
ＶＩ．較正曲線
上述のように、較正曲線を使用することにより、Ｃｔ値を使用してサンプルの初期濃度を判定することができる。このような較正曲線は、通常、濃度の対数として提示され、且つ、線形のプロットを付与する。この結果、Ｃｔの値により、対数スケール上において、対応する初期濃度を得ることができる。以下の較正データは、９つの対数の範囲（即ち、１０9の濃度の範囲）をカバーする検定用のものである。
【００５６】
図７Ａは、本発明の実施形態に従って判定された較正曲線７１０のプロット７００を示している。Ｘ軸は、濃度の対数であり、且つ、Ｙ軸は、デルタＣｔ（ターゲットＣｔから対照Ｃｔを減算したもの）であり、ここで、対照Ｃｔとは、調査対象である純粋種の固定量に伴って計測されたＣｔである。較正曲線７１０は、３．２６８ｘ＋８．８６２という線形形態を有する。図７Ａにおいて、較正曲線７６０は、デルタＣｔを濃度の対数に対してプロットした際には、Ｒ2＝０．９７７というほぼ完全な線形性を示すことがわかる。
【００５７】
比較のために、図７Ｂは、２次導関数の最大値を使用して判定された較正曲線７６０の類似のプロット７５０を示している。較正曲線７６０は、３．２３５ｘ＋８．６３５という線形形態を有し、Ｒ2は、０．９９５である。従って、プロット７００において使用された実施形態は、２次導関数の最大値を使用した技法よりも、わずかに良好な線形性を有する。更には、非放物曲線のＣｔ値として２次導関数の最大値を使用する場合と比べた利点は、相対的に小さく且つ相対的に現実的なＣｔ値である。
【００５８】
ＶＩＩ．予想Ｃｔに対する相関
本発明の実施形態の正確さに関する更なるチェックとして、計測されたＣｔの相関を予想Ｃｔと比較する。予想Ｃｔは、例えば、曲線がベースラインの上方において上昇する際などのように、研究者が視覚的に推定するものによって判定される。
【００５９】
図８Ａは、２次導関数の最大値を使用した計測Ｃｔと予想Ｃｔの間の相関ライン８１０のプロット８００を示している。放物法（例えば、米国特許第８，２１９，３６６号明細書を参照されたい）を放物曲線について使用した。楕円内において強調表示されたエリア８２０内において、これらの水平データ点は、放物固有の方法の実装の結果であり、これは、低減された線形性を付与している。それぞれのデータ点は、ＰＣＲ曲線の計測Ｃｔ値及び予想Ｃｔ値に対応している。相関ライン８１０は、データに対する線形フィットであり、且つ、０．９１１６ｘ＋４．２８という形態を有する。完全な相関が存在する場合には、ラインは、スロープ１及び０のｙ切片と、１のＲ2と、を有することになろう。この場合には、Ｒ2は、プロット８００において示されているように、０．９６に等しい。又、算出されたＣｔ値は、一般に、予想Ｃｔを上回る２つのＣｔ値である。２つのＣｔ値の差は、相関ラインが、予想Ｃｔが２５である際に２７の計測Ｃｔに位置していることを観察するにより、判明する。
【００６０】
図８Ｂは、本発明の一実施形態を使用した計測Ｃｔと予想Ｃｔの間の相関ライン８６０のプロット８５０を示している。データ点のいずれのものにも、放物法を使用しなかった。相関ライン８６０は、データに対する線形フィットであり、且つ、１．０２９ｘ＋１．３９という形態を有する。線形フィットは、相対的に良好であり、Ｒ2は、０．９８対０．９６である。又、予想Ｃｔと算出Ｃｔの間に最小限のオフセットが存在していることが観察される。更には、スロープは、１に非常に近接している（１．０３対０．９１）。これは、シグモイド及び放物線であるＰＣＲ曲線において本発明の実施形態を使用してＣｔを算出するほうが、シグモイドについて２次導関数の最大値によってＣｔ値を算出し、且つ、放物曲線について異なる技法に切り替えるよりも、優れていることを実証している。
【００６１】
ＶＩＩＩ．除算を伴うベースライン減算との比較
又、本発明の実施形態は、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅ）を使用した除算を伴うベースライン減算法よりも優れている。ＡＦＬ法においては、ベースラインをシグモイド関数フィットから減算し、且つ、ベースラインの切片によって除算している。結果がＡＦＬ閾値と一致した際のサイクルによってＣｔを判定している。
【００６２】
図９は、２つの未加工のデータ曲線９１０及び９２０のプロット９００を示している。いずれのケースにおいても、予想Ｃｔ値は、Ｃｔ＝３６である。除算を伴うベースライン演算を使用して算出されたＣｔ値は、曲線９１０の場合には、３５．０３であり、且つ、曲線９２０の場合には、３７．０６である。本発明の実施形態を使用したＣｔは、曲線９１０の場合には、３５．８６を、そして、曲線９２０の場合には、３５．４３を、付与する。本発明の実施形態が、予想Ｃｔ値（３６）に対して相対的に良好に合致することが理解できよう。更には、３５．８６及び３５．４３という値は、相対的に互いに近接しており、この結果、相対的に大きな精度が得られる。
【００６３】
ＩＸ．コンピュータシステム及びコンピュータプロダクト
本明細書において言及されているコンピュータシステムの任意のものは、任意の適切な数のサブシステムを利用してもよい。図１０には、このようなサブシステムの例がコンピュータ装置１０００内に示されている。いくつかの実施形態においては、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、この場合に、サブシステムは、コンピュータ装置のコンポーネントであってもよい。その他の実施形態においては、コンピュータシステムは、内部コンポーネントを有するそれぞれがサブシステムである複数のコンピュータ装置を含むことができる。
【００６４】
図１０に示されているサブシステムは、システムバス１０７５を介して相互接続されている。プリンタ１０７４、キーボード１０７８、１つ又は複数のストレージ装置１０７９、ディスプレイアダプタ１０２に結合されたモニタ１０７６、及びその他のものなどの更なるサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ１０７１に結合される周辺装置及び入出力（Ｉ／Ｏ）装置は、シリアルポート１０７７などの当技術分野において既知の任意の数の手段により、コンピュータシステムに接続することができる。例えば、シリアルポート１０７７又は外部インターフェイス１０８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用し、コンピュータシステム１０００をインターネットなどのワイドエリアネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナに対して接続することができる。システムバス１０７５を介した相互接続により、中央プロセッサ１０７３は、それぞれのサブシステムと通信することが可能であり、且つ、システムメモリ１０７２又は１つ又は複数のストレージ装置１０７９（例えば、固定ディスク）からの命令の実行のみならず、サブシステムの間の情報の交換を制御することもできる。システムメモリ１０７２及び／又は１つ又は複数のストレージ装置１０７９は、コンピュータ可読媒体を実施してもよい。本明細書において言及されている値の任意のものをコンポーネント間において出力することも可能であり、且つ、ユーザーに対して出力することもできる。
【００６５】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェイス１０８１によって又は内部インターフェイスによって１つに接続された複数の同一コンポーネント又はサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態においては、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワーク上において通信することができる。このような例においては、１つのコンピュータをクライアントと見なすことが可能であり、且つ、別のコンピュータをサーバーと見なすことが可能であり、この場合に、それぞれは、同一のコンピュータシステムの一部分であってもよい。クライアント及びサーバーは、それぞれ、複数のシステム、サブシステム、又はコンポーネントを含むことができる。
【００６６】
本発明の実施形態の任意のものは、ハードウェア（例えば、アプリケーション固有の集積回路又はフィールドプログラム可能なゲートアレイ）を使用すると共に／又はモジュラー型の又は統合された方式によって一般的にプログラム可能なプロセッサと共にコンピュータソフトウェアを使用する制御ロジックの形態で実装することができることを理解されたい。本明細書において使用されている場合に、プロセッサは、同一の集積されたチップ上のマルチコアプロセッサ又は単一の回路基板上の又はネットワーク接続された複数の処理ユニットを含む。本明細書において提供されている開示及び教示内容に基づいて、当業者は、ハードウェア並びにハードウェアとソフトウェアの組合せを使用して本発明の実施形態を実装するためのその他の方式及び／又は方法について認知すると共に理解することになろう。
【００６７】
本出願において記述されているソフトウェアコンポーネント又は機能の任意のものは、例えば、従来の又はオブジェクト指向の技法を使用した、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、又はＰｅｒｌなどの任意の適切なコンピュータ言語を使用することにより、プロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装してもよい。ソフトウェアコードは、保存及び／又は送信のためにコンピュータ可読媒体上において一連の命令又はコマンドとして保存されてもよく、適切な媒体は、ランダムアクセスメモリ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ：ＲＡＭ）、読出し専用メモリ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ：ＲＯＭ）、ハードドライブ又はフロッピー（登録商標）ディスクなどの磁気媒体、又はコンパクトディスク（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｋ：ＣＤ）又はＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｋ）などの光媒体、フラッシュメモリ、或いは、これらに類似したものを含む。コンピュータ可読媒体は、このようなストレージ又は送信装置の任意の組合せであってもよい。
【００６８】
又、このようなプログラムは、インターネットを含む様々なプロトコルに準拠した有線、光学、及び／又は無線ネットワークを介した送信のために適合された搬送波信号を使用することにより、エンコード及び送信されてもよい。従って、本発明の一実施形態によるコンピュータ可読媒体は、このようなプログラムによってエンコードされたデータ信号を使用して生成されてもよい。プログラムコードによってエンコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性を有する装置とパッケージ化されてもよく、或いは、その他の装置とは別個に提供されてもよい（例えば、インターネットを介してダウンロードされてもよい）。任意のこのようなコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータプログラムプロダクト（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、又はコンピュータシステム全体）の上部に又は内部に存在してもよく、且つ、システム又はネットワーク内の異なるコンピュータプログラムプロダクトの上部に又は内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、本明細書において言及されている結果のうちのいずれかをユーザーに提供するためのモニタ、プリンタ、又はその他の適切なディスプレイを含んでもよい。
【００６９】
従って、実施形態は、個々のステップ又はステップの個々のグループを実行する異なるコンポーネントを潜在的に伴う、本明細書において記述されている方法のうちの任意の方法のステップを実行するように構成された１つ又は複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを対象とすることができる。付番されたステップとして提示されているが、本明細書における方法のステップは、同時に又は異なる順序において実行することができる。更には、これらのステップの一部分は、その他の方法からのその他のステップの一部分と共に使用されてもよい。又、ステップの全体又は一部分が任意選択であってもよい。更には、方法のうちの任意の方法のステップのうちの任意のステップは、これらのステップを実行するモジュール、回路、又はその他の手段により、実行することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、コンピュータプロダクト内において実施されている。従って、このようなコンピュータプロダクトは、実行された際に成長プロセスの成長曲線においてサイクル閾値Ｃｔを判定するようにコンピュータシステムを制御する複数の命令を保存した一時的ではないコンピュータ可読媒体を有し、この場合に、命令は、成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有する、ステップと、データセットを近似する関数を算出するステップと、成長曲線のベースラインを判定するステップであって、ベースラインは線形である、ステップと、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算するステップと、第１点において関数に接する接線を判定するステップと、接線とベースラインの交差点を演算するステップであって、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである、ステップと、を有する。
【００７１】
コンピュータプロダクトの特定の実施形態においては、第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、この場合に、接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝において関数のスロープｓｌｐを判定し、ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として接線を取得するステップを含み、この場合に、ｘは、サイクル数である。コンピュータプロダクトのその他の実施形態においては、ベースラインは、ａｘ＋ｂという関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、接線とベースラインの交差点を演算するステップは、次式をｘについて解くステップを含む。
【数７】
0006280124.tif 000008
【００７２】
コンピュータプロダクトの更にその他の実施形態においては、関数は、ダブルシグモイドの関数形態を有し、且つ、この場合に、ダブルシグモイドは、次式を有し、
【数８】
0006280124.tif 000009
【００７３】
この場合に、命令は、ダブルシグモイド関数の２次導関数を算出するステップを更に有する。
【００７４】
Ｘ．ＰＣＲシステム
又、特定の態様においては、本発明は、ＰＣＲシステムを提供する。図１１及び図１２には、例示用のＰＣＲシステムが表示されている。図１１は、本発明の方法及びシステムを実装するために使用されてもよいソフトウェア及びハードウェアリソースの間の関係を表す概略ブロックダイアグラムを示している。図１２に示されているシステムは、サーモサイクラ装置内に配置されてもよい動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有する。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接的な接続を介して、分析モジュールからインテリジェンスモジュールに、或いは、この逆に、転送される。データセットは、例えば、図４に示されているフローチャートに従って処理されてもよい。このフローチャートは、便利には、例えば、図１１に示されているフローチャートに従って、コンピュータシステムのハードウェア上に保存されているソフトウェアによって実装されてもよい。図１１を参照すれば、コンピュータシステム（２０００）は、例えば、ＰＣＲ反応において得られた蛍光データを受け取る受取り手段（２０１０）と、データセットを近似する関数を算出することによって前記データを処理する計算手段（２０２０）と、成長曲線のベースラインを判定する第１判定手段（２０３０）であって、ベースラインは線形である、第１判定手段と、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を判定する第１演算手段（２０４０）と、演算手段２０４０によって判定された第１点に接する接線を判定する第２判定手段（２０５０）と、接線とベースラインの交差点を算出し、且つ、これにより、Ｃｔ値を判定する第２演算手段（２０６０）と、を有してもよい。又、特定の実施形態においては、システムは、コンピュータ画面上において結果を表示する表示手段（２０７０）を有してもよい。図１２は、サーモサイクラ装置とコンピュータシステムの間のやり取りを示している。システムは、サーモサイクラ装置内に配置されてもよい動的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部分であるインテリジェンスモジュールと、を有する。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接的な接続を介して、分析モジュールからインテリジェンスモジュールに、又はこの逆に、転送される。データセットは、プロセッサ上において稼働すると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置上に保存されているコンピュータコードにより、図１１に従って処理されてもよく、且つ、処理の後に、分析モジュールのストレージ装置に返送されてもよく、この場合に、変更済みのデータは、表示装置上において表示されてもよい。又、いくつかの実施形態においては、インテリジェンスモジュールは、サーモサイクラ上において実装されてもよい。
【００７５】
特定の態様においては、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを提供し、ＰＣＲシステムは、ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成するＰＣＲデータ取得装置であって、前記データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、座標値のペアを有し、前記データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む対象領域内においてデータ点を含む、ＰＣＲデータ取得装置と、ＰＣＲデータセットを処理してＣｔ値を判定するように適合されたインテリジェンスモジュールと、を有し、Ｃｔ値の判定は、成長曲線を表すデータセットを受け取るステップであって、データセットは、複数のデータ点を含み、それぞれのデータ点は、サイクル数とそのサイクル数における成長プロセスの信号強度の座標値のペアを有するステップと、データセットを近似する関数を算出するステップと、成長曲線のベースラインを判定するステップであって、ベースラインは線形である、ステップと、関数の２次導関数の最大値が発生する関数の第１点を演算するステップと、第１点において関数に接する接線を判定するステップと、接線とベースラインの交差点を演算するステップであって、交差点のサイクル数がサイクル閾値Ｃｔである、ステップと、によって実行される。ＰＣＲシステムの特定の実施形態においては、第１点は、ｘｖａｌのサイクル数とｙｖａｌの信号強度を有し、且つ、この場合に、接線を判定するステップは、｛ｘｖａｌ，ｙｖａｌ｝において関数のスロープｓｌｐを判定し、ｙｖａｌ＋ｓｌｐ（ｘ−ｘｖａｌ）として接線を取得するステップを含み、ここで、ｘは、サイクル数である。ＰＣＲシステムのその他の実施形態においては、ベースラインは、ａｘ＋ｂという関数形態を有するものと判定され、且つ、この場合に、接線とベースラインの交差点を演算するステップは、ｘについて次式を解くステップを含む。
【数９】
0006280124.tif 000010
【００７６】
ＰＣＲシステムの更にその他の実施形態においては、関数は、ダブルシグモイドの関数形態を有し、且つ、この場合には、ダブルシグモイドは、次式を有し、
【数１０】
0006280124.tif 000011
【００７７】
ここで、命令は、ダブルシグモイド関数の２次導関数を算出するステップを更に有する。
【００７８】
特定の実施形態の特定の詳細は、本発明の実施形態の精神及び範囲を逸脱することなしに、任意の適切な方式によって組み合わせられてもよい。但し、本発明のその他の実施形態は、それぞれの個々の態様又はこれらの個々の態様の特定の組合せに関係する特定の実施形態を対象としてもよい。本発明の例示用の実施形態に関する上述の説明は、例示及び説明を目的として提示されたものである。これは、本発明のすべてを網羅したり又は記述されている形態そのままに本発明を限定することを意図したものでなく、且つ、上述の教示内容に鑑み、多数の変更及び変形が可能である。実施形態は、本発明の原理及びその実際的な適用について十分に説明し、これにより、当業者が、様々な実施形態において、且つ、想定される特定の使用法に適した様々な変更を伴って、本発明を最良に利用することができるようにするべく、選択及び説明されたものである。
【００７９】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ）」という表現は、そうでない旨が具体的に示されていない限り、「１つ又は複数の」を意味するものと解釈されたい。
【図１Ａ】
0006280124.tif 000018
【図１Ｂ】
0006280124.tif 000019
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006280124.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0006280124.tif 000025
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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