(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸の増幅に関するシグナルと関連するデータにアクセスすること、ここでデータはシグナルにおける連続するデータ点の最大比および対応する分割サイクル数を含むデータペアを含み；
第一の基準曲線に対して、データペアの第一の比較を行うこと；
第二の基準曲線に対して、データペアの第二の比較を行うこと；ならびに
第一の比較および第二の比較に基づいて、データペアは反応性サンプルを示すか、または非反応性サンプルを示すかを決定すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記データペアが第一の基準曲線より下にある場合、前記データペアを非反応性サンプルを示すものとして確認することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の基準曲線が第一のデータ点のセットを含み、第二の基準曲線が第二のデータ点のセットを含み、第二のデータ点のそれぞれの値が、第一のデータ点のセットおよび第二のデータ点のセットと関連する分割サイクル数についてデータ点の第一のセットのそれぞれの値より大きい、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナルにおける一つ以上のノイズまたはクロストークに基づいて、第一の基準曲線を調節することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第二の基準曲線のデータ点に対する前記最大比に基づいて、前記データペアを部分的増幅阻害サンプルを示すものとして確認することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第二の基準曲線のデータ点に対するデータペアの前記最大比に基づいて、サンプル中の標的核酸の濃度の定量に信頼度を割り当てることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記データペアが第一の基準曲線と第二の基準曲線の間にある場合、前記データペアを用いてサンプル中の標的核酸の濃度を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の標的核酸の増幅に関するシグナルと関連するデータを得るためのインターフェイスであって、ここで前記データがシグナルにおける連続するデータ点の最大比および対応する分割サイクル数を含むデータペアを含む、前記インターフェイス；ならびに
第一の基準曲線に対して、データペアの第一の比較を行う；
第二の基準曲線に対して、データペアの第二の比較を行う；および
第一の比較および第二の比較に基づいて、データペアが反応性サンプルを示すか、または非反応性サンプルを示すかを決定するためのプロセッサ；
を含む、システム。
【請求項９】
前記プロセッサが、前記データペアが第一の基準曲線より下にある場合、前記データペアを非反応性サンプルを示すものとして確認する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第一の基準曲線が第一のデータ点のセットを含み、第二の基準曲線が第二のデータ点のセットを含み、前記第二のデータ点のセットのそれぞれの値が前記第一のデータ点のセットのそれぞれの値より大きい、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記プロセッサが、シグナルにおける一つ以上のノイズまたはクロストークに基づき第一の基準曲線を調節する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記プロセッサが、第二の基準曲線のデータ点に対する前記最大比に基づいて、前記データペアを部分的増幅阻害サンプルを示すものとして確認する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プロセッサが、第二の基準曲線のデータ点に対するデータペアの前記最大比に基づいて、サンプル中の標的核酸の濃度の定量に信頼度を割り当てる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記プロセッサが、前記データペアが第一の基準曲線と第二の基準曲線の間にある場合、前記データペアを用いてサンプル中の標的核酸の濃度を決定する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１５】
指令を有する有形機械可読媒体であって、
前記指令は、読み取られたとき、少なくとも
サンプル中の標的核酸の増幅に関するシグナルと関連するデータにアクセスすることであって、前記データはシグナルにおける連続するデータ点の最大比および対応する分割サイクル数を含むデータペアを含むこと；
第一の基準曲線に対して、データペアの第一の比較を行うこと；
第二の基準曲線に対して、データペアの第二の比較を行うこと；および
第一の比較および第二の比較に基づいて、データペアは反応性サンプルを示すか、または非反応性サンプルを示すかを決定すること；
を機械に行わせる、前記有形機械可読媒体。
【請求項１６】
前記指令が、前記データペアが第一の基準曲線より下にある場合、前記データペアを非反応性サンプルを示すものとして確認することを
をさらに機械に行わせる、請求項１５に記載の媒体。
【請求項１７】
第一の基準曲線が第一のデータ点のセットを含み、第二の基準曲線が第二のデータ点のセットを含み、第二のデータ点のそれぞれの値が、第一のデータ点のセットのそれぞれの値より大きい、請求項１６に記載の媒体。
【請求項１８】
前記指令が、前記シグナルにおける一つ以上のノイズまたはクロストークに基づいて、第一の基準曲線を調節することをさらに機械に行わせる、請求項１６に記載の媒体。
【請求項１９】
前記指令が、第二の基準曲線のデータ点に対する前記最大比に基づいて、前記データペアを部分的増幅阻害サンプルを示すものとして確認することをさらに機械に行わせる、請求項１５に記載の媒体。
【請求項２０】
前記指令が、前記データペアが第一の基準曲線と第二の曲線の間にある場合、前記データペアを用いてサンプル中の標的核酸の濃度を決定することをさらに機械に行わせる、請求項１５に記載の媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応のデータ解析に関する。より具体的には本発明は、化学反応および／または生体反応に関する測定を行う情報システムおよび方法に関するものである。本発明には、標的の増幅を含むサンプル中の核酸の別途定量方法ならびに増幅反応時に得られるデータの解析も関与する。本発明にはさらに、ＰＣＲ分析など（それに限定されるものではない）のリアルタイム核酸増幅を用いる診断システムおよび／またはキットも関与する。
【背景技術】
【０００２】
多くの異なる工業分野、医学分野、生物分野および／または研究分野において、対象の核酸の量を測定することが望ましい。対象となる核酸の定量方法の一部では、それらを増幅し、生成した増幅生成物の量に比例するシグナルを観察する。他の方法には、標的核酸の存在に応じたシグナルの発生が関与し、そのシグナルは増幅反応の期間にわたって蓄積されるものである。本明細書で使用される場合、核酸増幅反応とは、標的核酸の配列の一部の増幅、ならびに標的核酸の存在を示すシグナルの増幅および蓄積の両方を指すものであり、前者の方が後者より好まれる場合が多い。増幅反応時のデータは標的核酸に応答して発生しないシグナル（すなわち、ノイズ）によってかなり不明瞭化される場合が多いことから、核酸の定量は比較的困難であるか正確さを欠くか、またはその両方である。さらに、多くのモニタリング方法によって取り込まれるデータには、反応時または反応の異なる場合間で変化し得る条件のために、変動や再現性の欠如が生じ得る。以上の点を鑑みると、改良された核酸定量手段の開発が必要とされている。核酸の定量が増幅反応によって可能になる場合、疑わしいまたは無関係な増幅反応を検出する現行法の改良も必要である。さらには、サンプル中の標的核酸の量の少なさ、増幅反応の阻害程度その他の原因を理由とする増幅反応から得られる弱いシグナルから標的核酸を検出しない増幅反応（すなわち、陰性反応）間で識別を行う現在の能力を高めることも必要とされている。本発明は、下記で開示のようなこれらの分野での改良を提供するものである。
【０００３】
本発明に関する背景情報を提供する参考文献のリストを下記に挙げるが、これらに限定されるものではない。
【０００４】
Ｌｉｖａｋ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２２ＤＤＣＴ  Ｍｅｔｈｏｄ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ２５：４０２−４０８（２００１）  ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｅｔｈ．２００１．１２６２．
Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１６９−１９３（２０００）．
Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ：ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２９：２３−２９（２００２）。
【０００５】
本発明者らは、下記のウェブサイトが現在も利用可能であることを保証できないとともに、そこに記載されている意見を必ずしも支持するとは限らないが、興味のある者は、有用な背景情報としてウェブサイトｗｗｗ．ｗｚｗ．ｔｕｍ．ｄｅ／ｇｅｎｅ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照しても良い。
【０００６】
本願とともに提出した文書中の内容を含めて、この提示文献にある研究、発表、販売またはいずれかの箇所での活動についてのいずれの言及も、逆の内容が明瞭に示されない限りは、いかなる形態でもそのような研究が先行技術を構成することを承認するものではない。同様に、本明細書中での活動、研究または発表についての言及は、そのような活動、研究または発表が特定の管轄領域で公知であったことを承認するものではない。
【０００７】
リアルタイムＰＣＲは、試験サンプル中の標的核酸の定量に用いられる増幅反応である。従来では当業者は、増幅反応を３つの異なる相を有するものと見るのが普通である。第一に、バックグラウンド期またはベースライン期があり、そこでは標的核酸を増幅しているが、標的とは独立のシグナル（「バックグラウンド」または「バックグラウンドシグナル」と称される場合がある）と比較して、標的核酸の量に比例するシグナルが観察するには小さすぎることから、そのシグナルを検出することはできない。次に対数期があり、そこでは、前記シグナルが増幅反応で標的核酸の量に実質的に比例しており、バックグラウンドシグナルより大きいことから、そのシグナルはほぼ対数的に強くなる。最後に、標的核酸の対数的増幅より小さい増幅を反映する「平坦」期時において、シグナルの上昇が低下する。当業界において公知であるように、バックグラウンドシグナルの値より若干大きい値である閾値を対数期が超える時点は、標的核酸の濃度の対数に再現性良く関係している。この先行技術の方法は、Ｃｔ法と称されるが、恐らくはシグナルが閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超えるサイクル（Ｃｙｃｌｅ）にちなんで命名されたものであろう。Ｃｔ解析は再現性および正確さがかなり高いが、いくつかの欠点もある。それらの欠点については、本発明を理解する上でここで議論する必要はない。
【０００８】
米国特許第６３０３３０５号には、ＰＣＲ反応を用いる核酸の定量方法が開示されている。そこで開示の方法は、蛍光核酸増幅反応の成長曲線のｎ次導関数を用いる。この方法は、ベースライン補正を行う必要性を効果的に回避するものであるが、非反応性サンプルから反応性サンプルを識別する信頼性の高い方法を提供するものではなく、得られる結果の妥当性を評価する上でのｎ次導関数計算の用い方を合理的に提示するものではない。さらに、そこで開示の方法を用いて、系中におけるアーチファクト（例：クロストークまたは陽性ブリードオーバー規定インフラ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｌｅｅｄｏｖｅｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｉｎｆｒａ））から生じる核酸増幅シグナルを、真正の陽性応答から識別することができず、偽陽性の結果を生じる可能性がある。しかしながら、米国特許第６３０３３０５号に開示の一次導関数計算は、本発明の文脈で有用である効率関連の値を提供するものである。核酸増幅シグナル成長曲線の一次導関数の計算に関係するさらなる詳細について、当業者は米国特許第６３０３３０５号を参照することができる。米国特許第６３０３３０５号は、米国および参照による組み込みを許可する他の管轄地域においてのみ、核酸増幅成長曲線の一次導関数の計算をそれが開示する範囲で、参照によって組み込まれるものである。しかしながら、米国特許第６３０３３０５号は、本開示に記載のこの効率関連の値（下記）の使用を開示も示唆もしていない。
【０００９】
２００３年１２月６日出願の共同所有の米国暫定特許出願６０／５２７３８９号には、増幅反応からのシグナルの対数について最大傾斜または勾配を調べる核酸増幅反応の解析方法が開示されている。あらゆるデータセットにおいて、増幅反応開始後の一定期間の時点またはサイクル数に相当するこの値は、その反応のＭＧＬと称される。ＭＧＬは、本発明のある種の実施形態において有用であり、特には標的核酸をわずかに含むサンプルを標的核酸を含まないサンプルから量的に識別する実施形態において有用である。２００３年１２月６日出願の米国特許出願第６０／５２７３８９号は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６３０３３０５号明細書
【特許文献２】米国特許出願第６０／５２７３８９号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｉｖａｋ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２２ＤＤＣＴ  Ｍｅｔｈｏｄ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ２５：４０２−４０８（２００１）  ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｅｔｈ．２００１．１２６２
【非特許文献２】Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１６９−１９３（２０００）
【非特許文献３】Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ．，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ：ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２９：２３−２９（２００２）
【非特許文献４】ウェブサイトｗｗｗ．ｗｚｗ．ｔｕｍ．ｄｅ／ｇｅｎｅ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、サンプルが対象となる核酸を含むか否かを決定する方法、その核酸の定量方法、ならびに前記の定性的および定量的測定を行うのに用いられるデータの妥当性もしくは質を評価する方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の方法は、増幅試薬もしくは検出試薬またはその両方とサンプルとを接触させて核酸を増幅する段階を有する（本明細書において「増幅」という用語を用いるように）。その増幅反応は、サンプル中に存在する標的核酸の量を示すシグナルを発生させるものであり、そのシグナルを増幅反応中に多くの点で記録する。そのシグナルは、測定し、時間値の関数としてまたは別の形態ではサイクル数で記録することができる。
【００１４】
時間の関数として見たりまたは計算される好適な「効率関連変換値」を増幅反応について求め、効率関連変換値の最大値の増幅反応における点、効率関連変換値の最大値の大きさ、または時間の関数としての効率関連変換値のプロットにおけるピークの幅（または類似のパラメータ）を用いて、その反応についての情報を得ることができる。反応におけるその点は、効率関連変換値が最大値となる時間点または増幅サイクルを表す。有利には、特定の反応における効率関連変換値の最大値、ならびに計算される効率関連変換値での実質的な変化の期間および大きさは、サンプル中の標的核酸の初期濃度、そのアッセイによって生じるデータおよび情報の信頼性、真正の標的核酸の有無および反応の他のパラメータに対して一貫して再現性のある関係を有する。有利には、それらの関係は、前記増幅反応に生じるシグナル中における実質的なノイズおよび予想外の変動があっても保持される。本明細書で使用される場合に、効率関連変換値に使用される「最大値」という用語は、効率関連変換値の逆数を用いる場合には、効率関連変換値の最小値を含むものである。その逆比を利用することができ、曲線の場合には、その曲線はベースライン領域では約１の値で開始し、成長領域時には低下し、平坦領域ではほぼ１に戻る。この変換値の使用により、解析において、ピークの大きさおよび位置ではなく、谷の大きさおよび位置を用いることが可能になると考えられる。この変換は、特定の反応における効率関連変換値の最大値を用いる比率法と実質的に同等の方法で行われる。
【００１５】
いずれの実施形態においても、増幅反応からのシグナルを、増幅反応中のその増幅反応に適した時間間隔で測定する。それらのシグナルは、時間基準測定値または定期的測定値を称することができ、そうして特定の反応において発生するシグナルの各測定値を時間の関数として表現することができる。一部の実施形態では、増幅反応は周期性である（例えば、ＰＣＲでの場合）。サイクルは実質的に一定の期間を有する場合が多いことから、時間測定値に代えて「サイクル数」を用いることが簡便である場合が非常に多い。従って、本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の情報処理システム上の１以上の方法によって確認されるデータ領域が、サイクル数に相当し得る。しかしながら、一部の周期的増幅反応は、期間が一定しないサイクルを有する。これらの増幅反応では、一定しない尺度で時間を測定することが好ましい場合がある。例えば、期間が変動するサイクルを有するＰＣＲ反応における理論上の増幅程度は、反応期間ではなく実施されるサイクル数と、より直接に関連している。従って、時間基準測定値を容易にスケール調整して、基礎となる増幅反応を反映させることが可能であることは、当業者には明らかであろう。当業界では公知のように、サイクル数間のデータおよび結果を内挿することが有用である場合が多く、それによって分割サイクル数「ＦＣＮ」の概念が生じる。同様に、測定が時間に基づくものである反応では、分割時間単位で事象を測定することができる。
【００１６】
別の実施形態において、本発明には有利には、反応曲線が閾値を通過する点のような非常に限られたデータセットを用いるのではなく、利用可能な反応速度論データの実質的な集合を用いて対象領域を確認するＰＣＲ反応サンプルなどの反応サンプルを解析するためのシステムもしくは方法またはその両方が関与する。
【００１７】
ある種の実施形態では、１つの確認された領域を用いて、１以上の定性的結果もしくは定量的データ解析結果またはその両方を求めることができる。効率関連変換値が最大値の反応点を用いて、サンプル中の標的核酸の濃度を求めたり、または試験サンプル中に標的分析物が存在するか否かを定性的に求めることができる。これらおよび他の値を、先行技術において閾値サイクル数（Ｃｔ）または分割閾値サイクル数を用いることができるのとほぼ同様にして、基準量と比較することができる。
【００１８】
効率関連変換値の最大値に相当する反応点は、反応効率の最大時または反応効率最大値に関係するもしくは何らかの他の反応進行に一貫して関係する領域などの、反応効率に関して比較的一定の点に位置するサイクル数を示すか、そのサイクル数から誘導されるものであると理解することができる。各種方法を用いて、反応効率の最大値に関係する反応点を求めることができる。その値は、下記のような調節ＦＣＮ値（例：ＦＣＮＭＲＡｄｊ．およびＦＣＮＩｎｔＡｄｊ．）を含むことができる。本発明のある種の実施形態において、本発明の方法によって、標的および／または対照などの複数の反応シグナルについてＦＣＮ値を求めることができ、それらの値を、サンプル中に最初に存在する標的核酸の量および増幅反応によって生じる結果の妥当性など（これらに限定されるものではない）の反応パラメータ測定で用いることができる。
【００１９】
本発明は、シグナル成長曲線上の１以上の領域で反応効率（本明細書においては、「効率関連値」（ＥＲＶ）と称する場合がある）を示す値を確認することができる。具体的な効率関連値は、最大比（ＭａｘＲａｔｉｏ）値またはＭＲと称される。最大比とは、本明細書においてさらに議論する一つの可能な効率関連値の計算方法に関連する。これはＥＲＶ測定方法の一例であり、ＭＲについて言及する本明細書での例示的な実施例が、２００３年１２月６日出願の共同所有の米国特許出願第６０／５２７３８９に記載の成長曲線の対数における最大勾配、増幅反応から得られるシグナルの最大一次導関数（例：米国特許第６３０３３０５号に開示のもの）および増幅反応から得られる２つの連続するシグナル間の最大差など（これらに限定されるものではない）の効率関連値を求める上での他の好適な方法を含むことも明らかである。従って本発明には、反応曲線における２つの値、すなわち（１）サイクル数または時間値に関係する一つの値および（２）効率関連値を示す一つの値を確認する解析方法が関与する。本発明は、情報取り扱いシステムを用いて行う反応データの解析ならびにそのシステムの使用方法でそれら２つの値を用いることができる。そのような２つの値の例は、下記で記載のＦＣＮおよびＭＲの具体的な実施形態である。
【００２０】
本発明には、調べている反応から求められる上記で記載の２つの値を用いて、その反応を１以上の基準データセットと比較する方法およびシステムも関与する。基準比較を用いて、本明細書に記載の結果および／または定量値を確認および／または補正することができる。基準データは、量既知もしくは濃度既知またはその両方である複数の較正反応からサイクル数関連値−効率関連値のペア（例えば、ＦＣＮ−ＭＲのペア）を得ることで誘導することができる。
【００２１】
本発明にはまた、反応データの効率解析を行う１以上の技術も関与する。その解析は、本明細書で議論されるサイクル数関連値−効率関連値解析とは別個に、またはそれと組み合わせて用いることができる。効率解析を用いて、当業界で知られているＣｔ解析と同様にして、較正データセットとの比較などの反応データに関する測定を行うための対象領域を見いだすことができる。
【００２２】
本発明はまた、核酸を含むサンプルを増幅試薬と接触させ、好適な増幅条件下に置いてサンプル中の核酸の一部を増幅させる核酸増幅反応の分析方法を提供する。その増幅反応中、存在する標的核酸の量に比例するシグナルを、好適な期間で定期的に測定する。簡便にはその期間は、周期性のある増幅反応のサイクル期間に相当するものであることができる。次に、そのシグナルを操作して、増幅反応における効率関連変換値を求める。いずれか好適な効率関連変換値を本発明では用いることができる。本発明の文脈において好ましい効率関連変換値には、一連のデータ点に関する差計算、反応シグナルの成長曲線に適合させた直線の一次導関数の測定およびその成長曲線の対数（すなわち、Ｌｏｇ（成長曲線））の傾斜、勾配もしくは導関数の測定など（これらに限定されるものではない）、多くの方法によって求めることができる直線の勾配などがある。より好ましくは、効率関連変換値は、本明細書において場合により比曲線とも称される一連のデータ点の比率である。反応における効率関連変換値が既知である場合、時間の関数としての効率関連変換値のプロット（好ましくは、シグナルを測定するのに用いられる単位で表される）（またはプロットと同様の情報を与える数学的操作）を用いて、ピーク値を確認することができる。しかしながら、プロットは必要ない。許容されるピーク幅の特定範囲におけるピーク幅を、いずれか好適な技術または方法によって求めることができる。しかしながら、許容されるピーク幅を求める好ましい方法では、本発明の方法によって解析される増幅方法と非常に類似または同一である客観的に正常な増幅反応から得られるピーク幅における分散度を統計的に解析する。解析される反応では、増幅反応または分析物アッセイを特性決定するのに用いられるサンプルに代えて、未知の試験サンプルを用いるのが普通である。解析される増幅反応のピーク幅が許容されるピーク幅の所定範囲内にある場合、その反応は正常であると宣言される。解析される増幅反応のピーク幅が許容されるピーク幅の所定範囲内にない場合、その反応は最適より低い、異常その他の形の問題のあるシグナルを提供したものとされる。効率関連変換値ピークの最初の半分の幅を評価する。この評価は、増幅反応の妥当性のより許容性の大きい測定であることから、一部の場合では好ましい可能性があるが、全ての場合においてそうであるとは限らない。
【００２３】
本発明にはさらに、捕捉データを解析することができる情報システムおよび／またはプログラムが関与する。データは、そのデータの観察可能な特徴からの画像データとして捕捉することができ、情報システムが他の成分と統合して、サンプルデータの捕捉、準備および／または表示を行うことができる。本発明を用いることができるシステムの代表例には、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ；登録商標）ｉ−サイクラー（ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ）（登録商標）、ストラータジーンズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ；登録商標）ＭＸ４０００（登録商標）およびＡＢＩプリズム（Ｐｒｉｓｍ）７０００（登録商標）システムなどがあるが、これらに限定されるものではない。同様に、本発明は、本発明の方法を実行する能力を有するコンピュータ製品を提供する。
【００２４】
本発明の各種実施形態が、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｃｏｂｏｌ、Ｃ、Ｐａｓｃａｌ、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＰＬ１、ＬＩＳＰ、アセンブリなどの好適なプログラミング言語ならびにＨＴＭＬ、ＸＭＬ、ｄＨＴＭＬ、ＴＩＦＦ、ＪＰＥＧ、タブ区切りテキスト、バイナリなどの好適なデータまたはフォーマット規格による汎用または特殊目的の情報取り扱いシステム上で実行することができる方法および／またはシステムを提供する。議論を容易にするため、本発明の文脈において有用な各種コンピュータソフトウェアコマンドは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コマンドで示している。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアは、マスワークス者（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（米国））から市販されている線形代数マニピュレータおよびビューワソフトである。当然のことながら、いずれか特定の実行では（ソフトウェア開発プロジェクトでの場合のように）、多くの実行特有の決定を行って、実行ごとに変動するシステム関連および／または業務関連の制約の順守などの開発者の具体的な目標を達成することができる。さらに、そのような開発努力は複雑かつ時間を要するものである可能性があるが、本開示の恩恵を受ける当業者にとっては日常的なソフトウェア工学の仕事であると考えられることは明らかであろう。
【００２５】
下記の図面および詳細な説明を参照することで、本発明についての理解が深まるであろう。明瞭を期して、ここでの議論は、具体的な例に関して装置、方法および概念について言及するものである。しかしながら、本発明およびそれの態様は、多様な種類の装置およびシステムに用いることが可能である。
【００２６】
さらに、本明細書に記載のものなどの論理システムおよび方法には、モジュラー形式での各種の異なる構成要素および異なる機能が含まれ得ることは明らかである。本発明の異なる実施形態は、要素および機能の異なる組み合わせを含み得るものであり、各種要素の一部として各種機能をグループ化し得るものである。明瞭を期して、多くの異なる構成要素ならびに新規な構成要素および公知の構成要素の組み合わせを含むシステムに関して本発明の説明を行う。いずれの推定も、本発明の例示的な実施形態における全ての新規構成要素を必要とする組み合わせに本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「本発明」という言葉は、本発明の１以上の具体的な実施形態を含むものと理解すべきである（逆の内容が明瞭に示されていない限り）。当業者には、本発明による多くの変形形態が、本明細書の内容から理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施形態による解析方法で使用可能な核酸増幅反応から取った４３の読み取り値（例、サイクル）からの不連続な捕捉反応データ値のプロットである。
【図２】本発明の実施形態に従って正規化されている標的および対照データセットを示す捕捉反応データを示すプロットである。
【図３】本発明の実施形態に従ってスケール調整された標的および対照データを示す反応データを示すプロットである。
【図４】本発明の実施形態に従ってデジタルフィルタリングした後の標的および対照データを示す捕捉反応データを示すプロットである。
【図５】本発明の実施形態に従って取り出した勾配値を有する標的および対照データを示す捕捉反応データを示すプロットである。
【図６】本発明の実施形態による反応標的および対照データの比変換を示すプロットである。
【図７】本発明の実施形態による反応標的および対照データのシフト比変換を示すプロットである。
【図８】本発明の実施形態に従って内挿された標的および対照データを示す内挿変換反応データを示すプロットである。
【図９】本発明の実施形態によるＦＣＮおよびＭＲ点の確認を示す内挿反応データを示すプロットである。
【図１０】本発明の実施形態による反応データの特性決定を行うフローチャートである。
【図１１】本発明の実施形態による基準データを求めるための方法を示すプロットである。
【図１２】同濃度初期サンプルについての反応曲線が各種反応異常のためにどのように変動し得るかを示す２つの反応データセットを示すプロットである。
【図１３】図１２におけるデータセットについてのピーク効率計算を示す図であり、本発明の具体的な実施形態によるオフセット効率変換の使用が望ましいことを示す図である。
【図１４】５０、５００、５０００、５００００、５０００００および５００００００コピー／ｍＬの既知濃度サンプルの８回複製で行ったＨＩＶアッセイ用のデータを示す図である。
【図１５】本発明の実施形態による４つの異なるサイクル数関連値（例：ＦＣＮ、ＦＣＮ２、ＦＣＮＭＲＡｄｊ．およびＦＣＮｉｎｔ．Ａｄｊ．）を用いる３点較正データから得られた４つの線形標準曲線を示すプロットである。
【図１６】本発明の実施形態による図１５に示した４つの曲線を用いて図１４に示したデータについて、計算濃度を既知濃度と比較する図である。
【図１７】本発明の実施形態による１点較正を用いる結果を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態による１点較正とともにＭＲ解析を用いる実験的ＨＢＶ結果を示す図である。
【図１９】本発明の実施形態による１点較正とともにＭＲ解析およびＦＣＮＭＲａｄｊ．を用いる実験的ＨＢＶ結果を示す図である。
【図２０】Ｃｔ解析および本発明の実施形態による１点較正を用いる実験的ＨＢＶ結果を示す図である。
【図２１】本発明に従ってＭＲ解析および１点較正を用いる、例えばキャリブレータとして１０３および１０７コピー／ｍＬ応答を用いる実験的ＨＩＶ結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施形態による２種類の基準データを示すプロットであって、下側の水平線が陰性反応を陽性反応から識別する上で好適な基準データを表すものである。
【図２３】本発明の実施形態に従って、データにフィットさせた曲線を用い、信頼区間を求める統計解析ソフトウェアによって解析した５０コピー／ｍＬ〜５００００００コピー／ｍＬのＨＩＶデータについてのＦＣＮ−ＭＲを示すプロットである。
【図２４】本発明の実施形態によって信頼区間を求める統計解析ソフトウェアによって解析される内部対照データを示すプロットである。
【図２５】本発明の実施形態に従って、内部対照および標的増幅反応の両方についてのサイクル数関連値−効率関連値のペアの解析によってアッセイの妥当性を評価するための論理解析ツリーを示すフローチャートである。
【図２６】本発明の実施形態に従って、サイクル数関連値−効率関連値のペアを用いる妥当性基準評価とともに標的結果を報告するための論理解析ツリーを示すフローチャートである。
【図２７】本発明の実施形態によるピーク幅測定値の較正を示す図である。
【図２８】本発明の実施形態による全ピーク幅測定値を用いる実験的ＨＩＶ結果を示す図である。
【図２９】本発明の実施形態による全ピーク幅測定値を用いて異常応答を確認する実験的ＨＩＶ結果を示す図である。
【図３０】本発明の実施形態によるＦＣＮ−ＭＲプロットを示すユーザーインターフェースの１例を示す図である。
【図３１】本発明の実施形態によるシフト比プロットを示すユーザーインターフェースの１例を示す図である。
【図３２】本発明の各種態様を具体化することができる論理デバイスの代表例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書で使用される場合、「効率関連値」という用語は、増幅反応の効率に対して一貫した関係を有する値を意味する。「効率関連変換値」という用語は、効率関連値を求めるのに使用される増幅反応における応答が関与する数学的変換を意味する。「反応点」という用語は、効率関連値が起こる反応中の時点を意味する。反応点は、反応開始から測定される時間点であることができる。あるいは反応点は、反応開始から測定されるサイクルを示す時点であることができる。「導関数」という用語は、曲線中の所定の点でのその曲線の傾きを意味する。
【００３０】
本発明は、分析物を含むサンプルの分析に関するものである。分析物は核酸であることができる。本発明の文脈において、分析物の一部のコピーを、増幅時に検出可能なシグナルを発生するように作る（以下、「増幅」と称する）。そのシグナルは増幅反応の進行を示すものであり、好ましくは試験サンプル中に存在する分析物および分析物のコピーの量に関するものであるか、またはその反応によって産生される分析物のコピーの量に関するものである。増幅は好ましくは、標的分析物の対数的蓄積（例えば、ＰＣＲ反応でのもの）を可能とするような構成とし、より好ましい実施形態では増幅は、各ＰＣＲサイクルでの特定の時点でデータを収集するＰＣＲ反応である。
【００３１】
核酸を増幅および検出することができる多くのシステムが開発されている。同様に、多くのシステムが、別の方法では検出限界より低いと考えられる量の核酸の測定を可能とするシグナル増幅を用いるものである。本発明は、それらシステムのいずれかを利用することができる。ただし、核酸および核酸のコピーの増幅の存在を示すシグナルは、時間依存的またはサイクル依存的に測定することができる。本発明の文脈において有用であるいくつかの好ましい核酸検出システムには、ＰＣＲ、ＬＣＲ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡおよびＳＤＡなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は当業界において公知であり、主にサイキらの報告（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０；１３５０−１３５４（１９８５））；サイキらの報告（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８））、リバク（Ｌｉｖａｋ）らの米国特許第５５３８８４８号；５７２３５９１号；および５８７６９３０号、ならびに他の文献に記載されている。ＰＣＲはまた、逆転写酵素（ＲＴ）および／またはある種の多官能性ＤＮＡポリメラーゼとともに用いて、ＲＮＡ分子をＤＮＡコピーに形質転換することで、ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅用の基質としてＲＮＡ分子を使用できるようにすることも可能である（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０：７６６１−７６６６（１９９１））。
【００３３】
連結連鎖反応（ＬＣＲ）はＰＣＲと類似しているが、主要な特色は、ＬＣＲでは重合ではなく連結を用いて標的配列を増幅するという点である。ＬＣＲについては、特にバックマン（Ｂａｃｋｍａｎ）らの欧州特許第３２０３０８号；ランデグレンらの報告（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８））；ウーらの報告（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９））に記載されている。一部の最新の形態のＬＣＲでは、オリゴヌクレオチド間のギャップを提供することで特異性を高めることができ、そのギャップは鋳型依存性重合で埋められなければならない。４つのｄＮＴＰ全てがオリゴヌクレオチドプローブのギャップを埋める必要がなく、４つのｄＮＴＰ全てが増幅試薬で供給されない場合に、それは特に有利となり得る。同様に、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）が、リズビーらの報告（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２（１）：７５−９９（１９９９））、ハッチらの報告（Ｈａｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．  １５（２）：３５−４０（１９９９））およびその他に記載されており、本発明の文脈において有用である。
【００３４】
等温増幅反応も当業界において公知であり、本発明の文脈において有用である。等温増幅反応の例には、コーらの報告（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８６：１１７３−１１７７（１９８９））に記載され、当業界でさらに発展している３ＳＲ；キービッツらの報告（Ｋｉｅｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６（１９９１））に記載され、当業界でさらに発展しているＮＡＳＢＡ；およびウォーカーらの報告（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８９：３９２−３９６（１９９２））および米国特許第５２７０１８４号に記載され、当業界でさらに発展している鎖置換増幅（ＳＤＡ）法などがある。
【００３５】
従って、標的核酸の量を示すシグナル取得を時間依存的またはサイクル依存的に測定可能であることのみを必要とする多くの増幅または検出システムが、本発明の文脈において有用である。それらの特徴を有する他のシステムが当業者には公知であり、上記で議論はしなかったが、本発明の文脈において有用である。
【００３６】
前記増幅反応から収集されたデータの解析は、下記の質問のうちの１以上に対する回答を提供することができる。
（１）標的配列が見つかったか？
（２）「イエス」であれば、標的配列の初期レベルまたは量はいくらか？
（３）結果は正確か？
（４）一連の反応は正しく行われたか？
（５）所望の反応または予想される反応の阻害はなかったか？
（６）サンプル調製物回収は許容されるか？
（７）基準データを用いる場合には、その基準データに対する較正が、なおも妥当であるか？
【００３７】
本発明の一部の実施形態によれば、対象領域（例：ＦＣＮ）および標的および／または内部対照反応の効率関連値（例：ＭＲ）を確認することで、これらの質問の１以上に答えることができる。他の実施形態では、本明細書において基準データ、基準曲線および／または基準データセットと称されるデータセットとそのような値を比較することで、これらの質問の１以上に答えることができる。別の実施形態では、同じ反応混合物中の内部対照（例：二次増幅対照反応）について得られたそのような値をそれの基準データとして比較することで、これらの質問の１以上に答えることができる。さらに別の実施形態では、標的反応について得られたそのような値を、それらの個々の基準データとして同じ反応混合物中の内部対照反応について得られたそのような値と比較することで、これらの質問の１以上に答えることができる。
【００３８】
明瞭を期して、ヒト核酸、動物核酸、植物核酸、ならびにヒト、ヒト以外の動物および植物の病原体の核酸を検出および定量するための自動および手動システムで非常に興味深い種類の測定およびモニタリング技術であるリアルタイムＰＣＲ反応を参照して、本発明の説明を行う。リアルタイムＰＣＲは、生物戦争剤および環境中の他の生物もしくはウィルス生物の検出にも十分に適応させられる。リアルタイムＰＣＲは、核酸（ＮＡ）配列標的の増幅を、増幅産生物のほぼ同時検出と組み合わせるものである。任意に、検出は、標的核酸の存在に応じて消光もしくは活性化される蛍光プローブまたはプライマーに基づいて行うことができる。蛍光の強度は、サンプル中の標的配列の濃度または量によって決まる（当然のことながら、標的の量は最低検出可能限界より上であり、飽和限界より低いものと仮定する）。プローブのこの消光／蛍光能力により、均一なアッセイ条件が可能である。すなわち、増幅および検出の両方のための全ての試薬を、反応容器、例えば複数ウェル反応プレートにおける単一ウェルに一緒に加える。特定のシステムが標的増幅反応の各種時間点時においてサンプル中に存在する標的の量を示すデータを蓄積する限りにおいて、電子検出システム、標的捕捉に基づくシステムならびに少量サンプル分析のシステムおよび技術が、本発明の文脈において有用な他の形態の検出システムである。
【００３９】
ＰＣＲ反応では、試薬が限定的となるか消費されたり、重大な競争、反応物の不十分な供給その他の反応途中で累積する他の要素があるまで、各サイクルで標的核酸の量は倍加する。特定のサイクルでＰＣＲ反応が標的の倍加（正確に）を起こした時点で、その反応は効率（ｅ）１を有すると言われる（例えば、ｅ＝１）。多くのサイクル後、非常に少量で最初は検出できない量の標的から、検出可能な量の標的を得ることができる。代表的には、ＰＣＲサイクルプロトコールは、ほぼ３０〜５０サイクルの増幅からなるが、それより多いまたは少ないサイクルを用いるＰＣＲ反応が当業界では知られており、本発明の文脈において有用である。
【００４０】
本発明を説明するために下記にされるリアルタイムＰＣＲ反応では、反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマー、相補標的核酸に結合していない時には消光され得る蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、増幅酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）および別の支持試薬の適切な試薬カクテルを含む。さらに、一連の反応を通じて増幅されないままであるオリゴヌクレオチドに結合していても良い増幅可能な「対照配列」もしくは「内部対照」および「基準色素」の検出用の第二の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを、リアルタイムＰＣＲ反応用の混合物に加えることができる。従って、一部のリアルタイムＰＣＲシステムでは、各サンプルまたは反応容器（例：ウェル）において最低３種類の蛍光色素を用いる。第二の標的核酸の検出用の追加の蛍光プローブを用いるＰＣＲシステムが当業界では公知であり、本発明の文脈において有用である。
【００４１】
一つまたは可能であればそれ以上の反応のそれぞれ（例えば、複数ウェルプレートにおける各ウェル）についてデータをプロットまたは表示するシステムも、本発明の文脈において有用である。それらのシステムは任意に、時間もしくはサイクル数（ＣＮ）またはその両方の関数としてのプローブの蛍光強度を二次元プロット（ｙとｘ）として表す値を計算する。従って、プロットされた蛍光強度は、複数色素（例えば、プローブ色素および／または基準色素によって正規化された対照色素）からの計算値を表すものであっても良く、バックグラウンドシグナルの計算値の減算を含むものであっても良い。ＰＣＲシステムでは、そのようなプロットはＰＣＲ増幅曲線と称され、プロットされたデータはＰＣＲ増幅データと称することができる。
【００４２】
ＰＣＲにおいて、データ解析は多くの因子によって困難になっている場合がある。従って、各種段階を行って、これらの要素を説明することができる。例えば、捕捉された光シグナルを解析して、光検出自体における不正確さを説明することができる。そのような不正確さは、色素混合物中の複数の色素間で個々の色素の蛍光を分離する際の誤差および困難さが原因となっている可能性がある（下記において「ブリードオーバー」として説明）。同様に、わずかな量のシグナルが存在する場合があり（例えば、「バックグラウンドシグナル」）、標的が存在しない場合であってもそれが増加する可能性がある（例えば、「ベースラインドリフト」）。従って、好ましくはベースラインドリフト、動向分析および正規化など、バックグラウンドシグナルを取り除くための多くの技術が、本明細書に記載されているか、ないしは当業界で公知である。それらの技術は有用であるが、本発明の文脈においては必要ではない（ベースラインドリフトまたは傾向化は、例えば色素の不安定性、ランプの不安定性、温度の変動、光学系の配列、センサーの安定性またはそれらの組み合わせなどの多くの原因によって生じ得るものである。これらの因子および他のノイズ因子のため、自動でのベースライン領域の確認および補正方法は誤差を生じる傾向がある。）。
【００４３】
ＰＣＲにおいて代表的には、対象となる答えは成長曲線から決定され、その曲線は特徴的には、検出可能なシグナルを生じるにはまだ倍加が不十分である初期反応サイクル中にはほぼ平坦で始まり、その後、１以上の反応物の消費などの１以上の反応制限条件が増幅反応もしくは検出プロセスに影響し始めるまで指数関数的に上昇する。
【００４４】
ＰＣＲ型の反応データを解析するために、多くの方法が提案され、研究および他の状況で使用されている。代表的にはこれらの方法は、通常は指数関数的またはほぼ指数関数的なシグナル成長期（「対数−直線期」とも称される）の間の反応曲線が特定の点に到達した時点の検出を試みるものである。いずれかの理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、対数−直線期がベースラインもしくはバックグラウンドシグナルより上で観察できる最も早い時点が、反応についての最も有用な情報を提供するものであり、対数−直線期の傾きは増幅効率の反映であると考えている。先行技術の参考文献の中には、その傾きが真の増幅（シグナルドリフトではなく）の指標であるためには、対数−直線期が終わる成長曲線上の点である変曲点がなければならないことを、誤って示唆しているものがある。変曲点は成長曲線の最大変化率を表す場合もあり得る。阻害が起こる一部の反応では、指数関数的成長期の終わりが起こってから、バックグラウンドからシグナルが生じる可能性がある。
【００４５】
ＰＣＲ分析を行う際には、標的分子の初期量／濃度に関する１以上のアッセイ結果を求めることが望まれる。説明を目的として、結果は、下記の４つの質問の少なくとも一つに対する回答によって表すことができる。
（１）一体、初期サンプルに標的分子が存在したのか（例えば、陽性／陰性の検出結果）？
（２）存在した初期標的の絶対量はいくらだったか？
（３）信頼度はどの程度か（例えば、質問１または２に対する回答が正しいという信頼値として表現される場合がある）？
（４）２つの異なるサンプルに存在する標的の相対的な量はいくらか？
【００４６】
多くの方法が開発されており、研究および他の状況でそれらを用いて、これらの質問の１以上に回答することができる。
【００４７】
ＰＣＲ反応のデータは多くの場合、反応において測定される各色素について各サイクルで１回収集される（すなわち、測定される蛍光）。そのようなデータは本発明の文脈において有用であるが、各サイクルで得られたデータ点間の内挿によって、より正確な定量を行うことができる。このようにして、データを解析して、「部分サイクル数」を得ることができ、対象の時点を、特定のサイクル数と、またはいずれかのサイクル数ペア間の反応点で同期させることができる。
【００４８】
特に、閾値を固定することが望まれる診断環境において、閾値に依存する方法での一つの問題は、それらの方法が、例えば「クロストーク」および「ブリードオーバー」などの特定の系統的ノイズ因子が存在するために誤差を生じやすくなり得るという点である。クロストークは通常、ある位置（複数ウェルプレートでの１個のウェルなど）でのアッセイからのシグナルが、異なる（通常は隣接する）アッセイ位置においてシグナルに異常を生じさせる場合に起こるものと理解することができる。ブリードオーバーは、複数のシグナルまたはデータセットが反応から検出される状況で起こるものと理解することができる。反応用の検出色素は、ほぼ互いに独立に選択され、個々の蛍光発光スペクトラムを有するが、場合によってはその発光スペクトラムが重なって、一つの色素からの発行スペクトラムが、別の色素の発行スペクトラムにブリードオーバーする。
【００４９】
クロストークとブリードオーバーのいずれも、対象の計算測定値を増加または減少させる効果を有し得る。さらに、いずれの場合も、これら現象のいずれかまたは両方のために曲線自体に異常が生じる状況があり得る。クロストークおよびブリードオーバーなどの系統的ノイズ因子は、ベースライン補正を実施する際には取り扱いが特に難しい可能性がある。
【００５０】
先行技術の一部のシステムでは、定性的結果または定量的結果において低レベルのシグナルを検出するために、低い閾値が必要である。しかしながら、低閾値を使用すると、クロストークのために偽陽性シグナルと正確な陽性シグナルとの間の識別が特に困難になる。それは、いずれによってもＰＣＲ曲線が増幅閾値を超えることで、標的分析物が存在することが示唆されるからである。陽性および陰性の陰性ブリードオーバーも問題を生じさせ得る。陽性ブリードオーバーは、偽陽性の結果を生じる可能性があるか、サンプル中の標的の初期量を誤って高く推定させる可能性があり、陰性ブリードオーバーはサンプル中の標的の初期量を誤って低く推定させたり、試験サンプル中に標的が存在しないと誤って示す可能性がある。
【００５１】
本発明の方法またはシステムは、好ましくは情報処理システムを用いて反応曲線またはデータにおける領域を再現性良く確認することができ、次にそれを用いて増幅反応データに基づいた結果を提供することができる。本発明は、たとえかなりのノイズが存在しても、シグナルのベースラインレベルとは無関係に、その領域を確認することができる。本発明はさらに、その領域での効率を代表する値を確認することができる。その値は、主要な結果を求めたり、結果を調節したり、本明細書に記載の信頼値を求めたり、またはそれらの全てを行うのに用いることができる。
【００５２】
本発明は、下記の示す具体的な実施例によって説明することができる。この例では、情報処理システムを用いて、増幅反応の成長曲線を表すデータを解析する。その増幅では、データ解析中の１段階によって「ピーク」が生じる。そのピークの位置（増幅反応開始からの時間単位またはサイクルで測定）は、部分サイクル数（ＦＣＮ）と称され、ピークの最大値はＥＲＶ（効率関連値）と称される。これらの値を、効率関連値領域を確認する方法およびそのピークでの効率関連値の測定方法で用いることができる。これらの値のいずれも、同一サンプルで開始したとしても反応ごとおよび装置ごとに変動し得る増幅シグナルの強度とは無関係に反応曲線の形状を解析する方法から誘導されるものと理解することができる。反応曲線は、反応における標的の量を実質的に示すシグナルが時間または適切であればサイクル数の関数としてプロットされる反応を表すものである。ＦＣＮは反応曲線の最大成長効率の点に常に関連していると理解することができ、ＥＲＶはその時点での効率に常に関連していると理解することができる。
【００５３】
本発明の一部の実施形態では、任意にそして有利には、ベースライン補正を用いずに、解析方法を用いることができる。
【００５４】
本発明により、一部の先行技術で用いられている主観的かつ変動し得る閾値やＣｔ値を計算する必要なく、試験サンプル中に存在する標的の量を客観的に定量することが可能となる。さらに本発明は、Ｃｔ後のサイクルでのデータなどの以前は無視されていたデータなどのＰＣＲ増幅曲線の形状を解析することで、反応における阻害程度を求める上で利用可能な情報を用いることができる。
【実施例】
【００５５】
反応曲線データから求められるデータペアの形成および使用の一般的方法については、下記の実施例から理解されよう。明瞭を期して、これらの実施例は、特定のデータセットおよびそのデータを解析するための具体的な関数に言及するものである。ただし本発明は、議論されている実施例に限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１−捕捉データ）
１例として、代表的なリアルタイムＰＣＲ反応検出システムによって、１以上の検出色素から発生するシグナルを記憶するデータファイルを作成する。図１には、本発明による解析方法で使用することができる捕捉反応データのプロットを示してある。この例では、１色素シグナル（ＤＹＥ１）が捕捉標的データを提供し、別の色素シグナル（ＤＹＥ２）が捕捉内部対照データを提供し、さらに別の色素シグナル（ＤＹＥ３）が任意の捕捉基準データを提供する。これらのデータは、標準出力ファイルから取った単一の反応からのデータを代表するものである。この特定のプロットは、何らかの形の複数成分アルゴリズムが適用された初期データを表すものと理解することができる。このプロットにおいて、ｘ軸はサイクル数（例：１〜４５）、ｙ軸は相対的な蛍光単位で検出される色素強度を示す。この図においては、３種類の異なる捕捉データセットを、連続曲線として示している。しかしながら実際の捕捉データ値は、各サイクル数で捕捉される別個のシグナル値である。従って、図１に示した初期データセットは、３組（標的、対照および基準）の好適な別個の値（例えば、この場合には約５０値）からなるものであることができる。
【００５７】
（実施例２−正規化）
任意ではあるが、いくつかの異なる方法で、捕捉データについて正規化を行うことができる。一つの方法には、相当する基準色素シグナルによる各サイクル読み取り時での標的値と対照値の分割が関与する。あるいは、約数は全サイクルにわたる基準値であったり、一定のサイクルにおける平均であることができる。別の別途実施形態では、増幅シグナルが検出されない場合には、約数は、１以上の比較的初期の（ベースライン）サイクルでの標的色素もしくは対照色素の平均または標的色素および対照色素の平均であることができる。公知の正規化方法を、データ解析に用いることができる。ＰＣＲシステムによってすでに正規化されているデータとともに、本発明を用いることができる。図２は、本発明に従って正規化された標的および対照データセットを示す捕捉反応データのプロットである。この例では、正規化の結果として、ｙ軸スケールは単純な数字で表わされる。この場合、数字は約０〜９である。他の正規化方法が当業界で公知であり、その数字を０〜１００の値や他の所望の範囲に変換することができる。
【００５８】
正規化は任意であることから、正規化や基準色素を用いずに、本発明を用いて反応データを解析することができる。あるいは、標的シグナルもしくは対照シグナルまたは両方を正規化に用いることができる。
【００５９】
（実施例３−スケール調整）
スケール調整は任意であるが、それを行って、オペレータがデータを目視しやすくすることが可能である。スケール調整は解析結果に影響するものではない。スケール調整は、正規化に加えて、正規化を行わずに、または正規化の前もしくは後に行うことができる。
【００６０】
スケール調整の一つの方法では、陽性データシグナルが検出される前のベースライン領域で、いくつかの初期サイクル中の値の平均で各データセット値を割る。この例では、４〜８の読み取りの平均を求め、最初に正規化を行った。図３は、スケール調整を行った標的および対照データを示す反応データのプロットである。この例では、スケール調整は標的および対照の早期値を１とするもので、早期値が１未満であることから、割り算によってその後の値は若干大きい純粋な数値となる。
【００６１】
（実施例４−デジタルフィルタリング）
捕捉データに１以上のデジタルフィルタリング法を適用して、シグナルデータセットを「クリーンアップ」し、シグナル／ノイズ比を高めることができる。多くの異なるフィルタリングアルゴリズムが知られている。本発明は、ゼロなしの４極フィルターを用いることができる。それによって、フィルタリングされたシグナルのオーバーシュートの可能性がなくなる。例として、それは、前方および後方の両方のフィルターが位相ずれ（時間遅延）を排除するＭＡＴＬＡＢのシグナル処理ツールボックス（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ）が添付されたＭＡＴＬＡＢ関数「フィルトフィルト（ｆｉｌｔｆｉｌｔ）」で行うことができる。パラメータおよびＭＡＴＬＡＢ関数呼び出しの１例は次の通りである。
ｂ＝０．３１６４；
ａ＝［１．００００−１．０００００．３７５０−０．０６２５０．００３９］；
データ（：，：，アッセイ）＝フィルトフィルト（ｂ，ａ，データ（：，：，アッセイ））；
データ（：，：，ｉｃ）＝フィルトフィルト（ｂ，ａ，データ（：，：，ｉｃ））；
【００６２】
この例では、「ｂ」および「ａ」はフィルター係数を含む。「データ（：，：，アッセイ）」および「データ（：，：，ｉｃ）」は、正規化、スケール調整またはその両方を行っていても良いまたは行っていなくとも良い捕捉データを含む。この場合、フィルタリングされたデータについて、正規化とスケール調整の両方を行う。図４は、デジタルフィルタリング後の標的および対照データを示す捕捉反応データのプロットである。値はデジタルフィルタリングによって変化しないが、データセットは若干「平坦化」される。
【００６３】
（実施例５−傾き除去／ベースライン化）
任意の傾き除去方法を用いて、検出可能な実際のシグナルが生じる前に早期ベースラインシグナルに存在する残存傾斜を除去することができる。この手順はベースライン化と称することもできるが、一部の実施形態ではオフセットは除去せず、傾きのみである。本発明によれば、傾き除去の場合、標的（ＤＹＥ１）および対照（ＤＹＥ２）シグナルの両方を同時に調べる。いずれか最初に出た方のシグナルが前方回帰点を規定し、メソッドは１０サイクル戻る。１０サイクル戻りがサイクル５以前である場合は、サイクル５を初期回帰点として用いて、比較的早期の一過性シグナルを回避する。これらの点間のシグナルデータを用いて線形回帰線を計算し、各色素についての回帰の傾きを色素のシグナルから引く。この場合、傾き除去を、上記で記載の正規化、スケール調整およびフィルタリングしたデータに適用する。図５は、勾配値を除去した標的および対照データを示す捕捉反応データのプロットである。これらの各図において、早期サイクルでは傾きはほとんど存在しなかった。従って、傾き除去は捕捉データ値にほとんど影響していない。
【００６４】
（実施例６−変換値計算）
本発明の方法の１実施形態は、ＭａｘＲａｔｉｏ法である。この方法では、順次測定値間の比率を計算することで、一連の比率を得て、そのそれぞれを時間値およびサイクル数にインデックス付けすることができる。これらの比率を計算する好適な手段が多くあり、いずれか好適な手段を用いることができる。最も簡単なこの比率計算法は、下記の関数を利用するものである。
【００６５】
比率（ｎ）＝ｓ（ｎ＋１）／ｓ（ｎ）
式中、ｎはサイクル数を表し、ｓ（ｎ）はサイクルｎでのシグナルを表し。この計算は、応答のベースライン領域において約１で開始し、成長領域中に最大まで上昇し、平坦領域で約１に戻る曲線を提供する。この計算を効率的に行うＭＡＴＬＡＢ表現は、下記の通りである。
【００６６】
比率＝ｓ（２：ｅｎｄ，：）．／ｓ（１：ｅｎｄ−１，：）
式中、「ｓ」は、各列が別個の応答を表すシグナル応答行列を表す。
【００６７】
図６は、この比率変換の１例を示す図である。固有のバックグラウンド蛍光のため、その比率は、シグナルが倍加されている場合のＰＣＲ反応に予想されるように２には達しない。それとは無関係に、ピークの大きさは増大性強度変動とは独立であり、その点での成長速度または効率に比例する。その比率計算方法は単純であり、効率的に計算される。他の等価な計算を行うことができると考えられる。１例では、正および逆の比率を計算してから、それらの平均を求めるものが考えられる。その比率の逆数を用いることができ、その場合は、曲線はベースライン領域では約１の値で開始し、成長領域で低下し、平坦領域で約１の値に戻る。次に、ピークではなく谷の大きさおよび位置を用いて解析を行うことになると考えられる。この変換は、比率法と実質的に等価な方法で実行することができる。
【００６８】
ＭａｘＲａｔｉｏアルゴリズムは上記のように使用可能であるが、各点から定数（例えば、約１）を引くことで曲線をシフトさせることが簡便である。この操作は、元の応答の変換を提供するものであり、ベースライン領域でほぼゼロで始まり、曲線の成長領域で上昇してピークに達し、平坦領域でほぼゼロに戻る。このシフト比率計算は、比率（ｎ）＝｛ｓ（ｎ＋１）／ｓ（ｎ）｝−１という関数によって説明される。図７は、このシフト比率計算の出力を示す図である。次に、シフト比率曲線のピークの反応点および大きさを求める。反応点（すなわち、ｘ軸方向の距離）はＦＣＮ値を指定するものであり、大きさは効率関連値ＭＲ（比率の最大値）を指定するものである。
【００６９】
（実施例７−内挿）
サイクル数の分離能を高めるため、内挿を行うことができる。この操作を行うには多くの方法が当業界で知られている。本発明の文脈における一つの内挿方法は、三次スプライン補間であり、それは平滑な内挿を提供することで、捕捉データセットの二次導関数であっても連続的となるものである。本発明を用いて一連のデータ全体を内挿することができる。本発明を用いて、対象の領域を決定し、その領域のみで内挿を行って、周期より小さいまたはサイクルより小さい分離能を達成することができる。三次スプライン補間を行うためのＭＡＴＬＡＢコマンドの１例は、下記の通りである。
【００７０】
ｏｕｔ＝ｉｎｔｅｒｐ１（ｘ，ｉｎ，ｘ２，’ｓｐｌｉｎｅ’）
式中、「ｘ」は周期（またはサイクル）数（１、２、３．．．）を表し、「ｉｎ」はそれらのサイクルでの未内挿シグナルを表し、「ｘ２」は相対的に高分離能周期（またはサイクル）ベクトル（１．００、１．０１、１．０２、．．．）を表し、「ｏｕｔ」は「ｘ２」での部分サイクルに相当する内挿シグナルを表す。
【００７１】
図８は、内挿されて関数の連続性を提供している標的および対照データを示す捕捉反応データのプロットである。内挿の結果として、データセット中の値の数字が大幅に上昇し、例えば４３値から４２０１値に上昇する。
【００７２】
理解すべき点として、上記で記載の段階を異なる順序で行うことができる。例えばフィルタリングを最初に行い、次にベースライン化を行って、その後にスケール調整を行うことができる。しかしながら、内挿を行ってから比率計算を行う場合、比率計算に適した内挿応答値を選択するよう注意を払う必要がある。比率値間の間隔が同一のままとなるようにすることが重要である。従って、サイクルを測定周期として用い、内挿によって時間分離能が０．０１サイクルまで上昇する場合、ｘ＝２．３５でのシフト比率はＲ＝ｓ（３．３５）／ｓ（２．３５）−１になると考えられる。
【００７３】
（実施例８−ピーク発見による標的および対照のＦＣＮおよびＥＲＶ（例：ＭＲ）測定）
別の段階は、一連のデータにおいてピークを選択するというものである。この操作では、（１）局所ピークを発見する段階および（２）任意に基準データ（前記で定義）を用いて、局所ピークから１以上のさらなる解析用ピークを選択する段階を行う。
【００７４】
ピーク発見アルゴリズムは、極大を表す正から負への曲線勾配の変化を確認するものである。このアルゴリズムは、ピークの位置および大きさを確認するものである。その計算を行うためのＭＡＴＬＡＢ関数の１例は次の通りである。
【００７５】
【数１】
0006388627.tif 000002
【００７６】
図９は、本発明の実施形態による標的および内部対照色素の確認されたＦＣＮおよびＭＲ値ならびに基準曲線を示す効率計算の図である。標的データに関しては、ＦＩＮＤＰＥＡＫＳが、一つのピークを０．３５４の大きさでサイクル軸ｘ＝１９．４２に配置した。内部対照データに関しては、ＦＩＮＤＰＥＡＫＳがｘ＝２．０３、５．２９、７．６７、１２．８３、２２．７０、３７．８６でピークを発見し、それぞれの大きさは０．００２７、０．００２７、０．００２２、０．００５８、０．１７３８、０．０２２２である。
【００７７】
（実施例９−ピーク選択による標的および対照のＦＣＮおよびＥＲＶ（例：ＭＲ）の測定）
上記で論じた方法において、多くの極大ピークが標的データおよび対照データの両方で確認される場合が多い。それらの極大ピークのどれを用いてＦＣＮおよびＥＲＶを求めるかを選択するのに、各種方法を用いることができる。
【００７８】
代表的には、そして特に反応が正常に進む時には、最も高いピークまたは最大ピークを選択する。多くの状況で、その選択によって、本明細書で記載のようにさらに計算を行う最も再現性の高い反応点が提供される。しかしながら、状況によっては、最初のピーク、または特定のカットオフより上もしくは特定数のサイクル後の最初のピークが好ましい。従って、特定の例では、Ｍａｘ  Ｐｅａｋ選択もしくはＦｉｒｓｔ  Ｐｅａｋ選択を用いることができ、Ｍａｘ  Ｐｅａｋはシフト比曲線での最も大きいピークを見いだすものであり、Ｆｉｒｓｔ  Ｐｅａｋは何らかの選択値より高い第１のピークを見いだすものである。
【００７９】
基準データが決定されたら、そのデータを用いて、特に弱くてノイズの多いシグナルの場合に、実際の操作時にＥＲＶ測定用にどのピークを選択するかを決定することもできる。
【００８０】
例えば図９において、色素２データの場合、ピーク発見アルゴリズムが６つの局所ピークを見いだしているが、５番目のピークが最大ピークであり、基準曲線より上にある唯一のピークでもあった。従ってこの例では、色素２について求められるＦＣＮは２２．７０であり、色素２について求められるＭＲは０．１７３８である。
【００８１】
情報機器またはシステム装置を用いて、本発明の方法を行うこともできる。図１０は、本発明の実施形態による反応データ特性決定を行うためのフローチャートである。この一般的方法の詳細については、下記の議論から明らかになろう。
【００８２】
本明細書に記載の解析方法は、既知もしくは不明の標的濃度を有する反応に適用することができる。１実施形態において、既知標的核酸濃度は、多ウェル反応プレートで行われる反応における較正ウェルに含まれ、反応点のＥＲＶおよび値を、これらの既知濃度サンプルから用いて、定量を実施する。既知濃度を用いて、本明細書でさらに説明する基準データを得ることもできる。
【００８３】
（実施例１０−基準曲線／基準データセットの決定）
他の実施形態において、効率関連値（例：ＭＲ値）を、既知濃度の多くのデータセットに関するそれらの反応点値（ＦＣＮ）値の関するとしてプロットして、特定のアッセイに特徴的な基準曲線を得ることができる。その基準曲線は、特定のアッセイ設計および検出プロトコールの特徴を有し、陽性／陰性結果を高信頼性で求め、ある特定の結果が信頼性がないものとして棄却するか否かを決定し、結果の信頼性尺度を求め、またはそれらの組み合わせを行うのに用いることができる。概して、基準曲線より下にある反応データのペアは、非反応性サンプルまたはかなりの阻害を受ける反応のような非機能性反応を示す。
【００８４】
基準データを用いて、反応解析でどのピークを報告もしくは使用またはその両方を行うかを選択することができる。基準データは、陰性結果（例えば、全く存在しない標的）と低量の標的を示す結果との間を識別する自動的な高信頼性の方法を提供する。
【００８５】
図１１は、６組の既知濃度の反応（すなわち、標準もしくはキャリブレータ）および１組の陰性反応がＭＲ値の計算ＦＣＮ値の関数としてプロットされたプロットである。このプロットによって、基準曲線を選択することができる。前述の基準曲線は、陽性結果を陰性結果から分ける曲線または直線である。その基準曲線は好ましくは、それが（プロットのｘ−ｙ空間において）陰性反応データに比較的近く、しかもその上にあるように選択する。図１１では、同一もしくは類似のアッセイ条件下で測定された既知濃度の多くのサンプルからのＭＲ−ＦＣＮデータのペアを、サンプルが陰性物とも称されるアッセイの標的を含まないサンプルからのＭＲ−ＦＣＮデータのペアとともにプロットする。陰性物は増幅応答を示さないはずであるが、その解析方法はそれらサンプルについてのＭＲ−ＦＣＮデータペアを決定するものではない。陰性サンプルについてのこれらのデータは通常、通常はランダム応答である応答出力上のノイズ由来最大値に相当する。ノイズから求められるＭＲ値は非常に低く、既知濃度サンプルからの応答からはかけ離れている。ブリードオーバーなどの系統的ノイズ源がある場合には、陰性反応におけるＭＲ−ＦＣＮペアがクラスタ形成する場合があり、その場合には、ＭＲ−ＦＣＮペアが偽って陽性反応シグナルであるように見える可能性がある．真陰性に対して真陽性のＭＲ−ＦＣＮ応答を特徴付ける場合、図１１において波線または曲線、すなわち基準曲線によって表されるこれら２組のデータ間の明瞭な分離領域を確認することができる。この図では、各円はＦＣＮ−ＭＲデータペアを表す。この場合、円の各クラスタは、標的の既知濃度での複数応答を表す。この例内には、６つの既知濃度で８つの異なる反復がある。例えばプロットの右から、これらの既知濃度は５０コピー／ｍＬ、５×１０２コピー／ｍＬ、５×１０３コピー／ｍＬ、４×１０４コピー／ｍＬ、５×１０５コピー／ｍＬおよび５×１０６コピー／ｍＬの濃度を表すことができる。これらの基準データクラスターを用いて、基準曲線を得ることができる。
【００８６】
複数の比較的単純な基準データセットを用いて、多くのアッセイに特徴的な基準曲線を得ることができる。ある有用なアプローチでは、陰性応答のセットについてＭＲ値の平均を取り、陰性応答についてのＭＲ値の複数の標準偏差をその値に加える。図１１に示した例では、陰性応答についての前記平均＋ＭＲ値の１０個の標準偏差に等しい水平線となるように、基準曲線を設定した。この例での基準値を計算すると、約０．０２６となった。一部のシステムでは、他の検討を加えることで、例えばクロストークもしくは陽性ブリードオーバーなどの可能なシグナル異常を考慮する上で望ましい基準値の変更を行うことができる（例：ＦＣＮ−ＭＲ値）。クロストークは、複数ウェル装置の陽性ウェルでのシグナルから生じて、異なるウェルからのシグナルに影響を与える可能性がある。ある装置では、２％という量のクロストークが観察されている。そのため、その基準が高くなって、真陰性サンプルを陽性サンプルとして分類することを回避できる。図１１で表したアッセイデータの場合、陽性アッセイにおいて最もＭＲ値は約０．５０である。この値のパーセントは０．０１０である。０．０１０ずつ基準を上昇させることで、クロストークによる擬陽性を排除すべきである。このアッセイでの最高ＭＲ値は相対的に小さいＦＣＮ値を有する相対的に高濃度のサンプルでのみ起こることから、クロストークが起こりやすい相対的に小さいＦＣＮ値でのみ前記基準を高くすることができる。この変更基準セットは、多成分曲線を記述する一連のデータ対（Ｘｎ，Ｙｎ）によって記述することができる。例えば、図１１に示した変更基準曲線は、下記の基準データセットによって特定することができる。
【００８７】
（Ｘ１，Ｙ１）＝（１，０．０３６）
（Ｘ２，Ｙ２）＝（２０，０．０３６）
（Ｘ３，Ｙ３）＝（２５，０．０２６）
（Ｘ４，Ｙ４）＝（４５，０．０２６）。
【００８８】
別の例として、図１０に示した基準曲線は下記の基準データセットによって特定することができる。
【００８９】
（Ｘ１，Ｙ１）＝（１，０．１０）
（Ｘ２，Ｙ２）＝（１０，０．１０）
（Ｘ３，Ｙ３）＝（２０，０．０５）
（Ｘ４，Ｙ４）＝（４０，０．０５）。
【００９０】
不要な実験を行うことなく、異なる形状もしくはより複雑な形状またはその両方を有するセットなどの基準曲線および／または基準データセットを決定することができる。ＰＣＲ使用の所期の用途は、基準線を確立する上での異なるアプローチを必要とするものである。当業者であれば、あるアッセイで高感度が要求される場合、低い基準線を用いることは容易に理解されよう。例えば、母集団コンセンサス配列（すなわち、「野生型」配列）と多形もしくは変異配列（例：「一塩基多形」）などの配列変異体を識別するようアッセイを設計する場合、配列変異体の確認には通常は標的核酸の限界量の検出必要ないことから、比較的高い値の基準線を用いることができる。
【００９１】
図１１に示した特定の例は、内部対照（ＩＣ）シグナル応答からアッセイシグナル応答への陽性ブリードオーバーを示さない。アッセイブリードオーバーに対する陽性ＩＣシグナル応答が存在すると仮定した場合、基準に対する同様の変更を行うことができると考えられる。ＩＣシグナル応答は狭い範囲のＦＣＮ値でのみ起こるはずであることから、その基準はその限られた範囲でのみ上昇させることができると考えられる。
【００９２】
通常、本明細書においてさらに議論するように、対象とする標的濃度範囲にわたって既知濃度のサンプルについてＦＣＮ−ＭＲ応答を求めて、「正常」応答を定義する。アッセイ反応を調べるサンプルの母集団における別の試験を行って、アッセイ成績が低下する前にＭＲにおいてどれだけの劣化が許容されるかを確認することができる。それらの種類の特性決定解析を用いて、標準偏差や標的核酸を含まないサンプルを増幅条件下で処理した時に認められるノイズもしくはベースラインの他の特徴から独立の基準データもしくは基準データセットを確立することができる。
【００９３】
本発明の他の実施形態によれば、基準データは、先行技術においてすでに行われているＣｔ解析においてＣｔを求める場合と同様の方法で求めることもできる。設計中の特定のアッセイを多数回行って、それの代表的なＭＲ−ＲＣＮ応答の特性を決定することができる。その代表的な応答から、基準データセットを定義することができる。しかしながら、Ｃｔ解析の場合とは異なり、ＦＣＮ−ＭＲでは、応答はシグナルとは独立であって、同一サンプルで非常に変動性の高い結果を生じる特定種類の装置においてであっても容易に再現することができる。
【００９４】
（実施例１１−別の対象領域）
上記で測定される効率関連値のＦＣＮ値を調節して、さらに再現性の高い定量値を得ることができるという効果があることが、経験的に認められている。例えば図１２は、同じ初期濃度を有するサンプルについての反応曲線が各種反応異常のためにどのように変動し得るかを示した２組の反応データのプロットである。この図には、等しい量のＨＩＶ標的核酸を含むサンプルについての２つの応答を図示してある。しかしながら、一方の応答では、その反応から得られたシグナルは、反応における異常のために早期に低下している。この低下は、図１３に示すように、シフト比曲線の最大値から求めたＦＣＮ値を２つのサンプル間で大きく変動させ得る。しかしながらこの図は、その２つの勾配曲線が、グラフのｘ軸上にプロットされた初期または早期サイクル数と比較的大きく類似していることも示している。
【００９５】
そこで本発明では、本明細書に記載の解析について用いることが可能な反応曲線上の別の点の位置である最大効率値のサイクル数（以下、ＦＣＮ２値と称する）からのオフセットを求める。さらに別の実施形態では、効率関連値閾値（ＥＲＶＴ）または比閾値（ＲＴ）値を選択および使用して、対象のサイクル数領域を決定することができる。ＥＲＶＴまたはＲＴは、特定のアッセイについて自動的または経験的に求めることができる。ＲＴ値は、アッセイ較正時の後者のサイクルで求められる基準データレベル付近もしくはそのレベルで設定することができる。
【００９６】
本発明の方法の１実施形態は、シフト比曲線上のＦＣＮ値で開始し、その曲線がＲＴ値を通過する相対的に早い反応点を求める。その反応点を、ＦＣＮ２値として報告する。ＦＣＮ２値は、非特異的な生成物形成が低コピー数を有するサンプルでの生成物形成の効率を低下させる反応などの、ある種のアッセイにおけるＦＣＮ値とは対象的に、低コピー数を有するサンプルにおいて改善された直線性を提供するものと考えられている。
【００９７】
図１３は、オフセット効率値を用いることが望ましいことを示す図である。この図は、図１２に示した応答におけるシフト比曲線および０．０３でのＲＴ線を示す。この例について、ＦＣＮおよびＦＣＮ２値を表１に示した。
【００９８】
【表１】
0006388627.tif 000003
【００９９】
この例では、一方の応答の曲線が早期に平坦となり。他方の応答の曲線と形状が異なっており、シフト比曲線が差を示す。この早期平坦化が相対的に早いピークを生じさせ得る。この例では、ＦＣＮ２値の方がＦＣＮ値より合致性が高い。通常、ＦＣＮおよびＦＣＮ２値は、Ｃｔ値より正確（標準偏差が相対的に低い）ことが認められている。これらの例はＭＲの使用に焦点を当てたものであるが、増幅反応の効率の他の尺度を本発明のＦＣＮおよびＦＣＮ２実施形態で用いることが可能であることは明らかであろう。本発明の文脈において有用な他の効率関連変換値には、（ａ）一次導関数の使用、（ｂ）連続する周期データ点間の差の使用、および（ｃ）成長曲線の対数の傾きもしくは勾配の使用などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
（実施例１２−ＭＲ−ＦＣＮ解析を用いる定量）
各種反応解析において定量が望ましい場合が多い。例えばＰＣＲ反応において、定量とは、反応を解析することによって、未知濃度を有する標的の開始時の量もしくは濃度を計算することを指す。本発明には、効率関連値およびサイクル数値（例：ＦＣＮ）を用いて定量を行うための方法もしくはシステムまたはその両方が関与する。具体的には、試験サンプルのＥＲＶを、それぞれが既知量の標的核酸を含む少なくとも１個のキャリブレータ、好ましくは少なくとも２個のキャリブレータ、そして任意に３、４、５もしくは６個のキャリブレータの１以上のＥＲＶと比較する。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、定量は、１以上の較正データ捕捉および１異常の定量データ捕捉が関与するものと理解することができる。較正データおよび定量は、定量関係もしくは式の使用に関係する。
【０１０２】
較正では、捕捉データまたは捕捉データから誘導される値（ＦＣＮ、ＦＣＮ２もしくはＭＲまたはそれらの組み合わせなど）と１以上の開始時濃度既知の反応との間の関係を用いて、定量式における１以上のパラメータを確立する。次にそれらのパラメータを用いて、１以上の未知反応の開始時濃度を求めることができる。
【０１０３】
反応解析での定量および／または較正を行うには、各種の方法および技術が公知である。例えば、診断ＰＣＲの状況では、９６ウェル反応プレートで試験サンプルを分析することは珍しいことではない。各９６ウェル反応プレートでは、一部のウェルが、既知の初期標的濃度を有するサンプルでの較正反応専用である。次に、それらのサンプルについての較正値を用いて、ウェル中の未知濃度のサンプルを定量することができる。
【０１０４】
２つの一般的な種類の較正方法が、１点較正および標準曲線（例：多点）較正と称される。これらの種類の例を以下に示す。しかしながら、いずれの好適な較正方法も本発明の文脈において用いることが可能である。
【０１０５】
阻害や妨害がない場合、ＰＣＲ反応が進行して、標的配列が指数関数的な成長を示すことで、Ｎサイクルの複製後、下記の関係に従って、初期標的濃度が増幅されている。
【０１０６】
ＣｏｎｃＮ∝Ｃｏｎｃ０（１＋ｅ）Ｎ
この式は、下記のようにも表現することができる。
【０１０７】
【数２】
0006388627.tif 000004
上記式中、ＣｏｎｃＮはＮ反応サイクル後の増幅標的濃度を表し；Ｃｏｎｃ０は、増幅前の初期標的濃度を表し；Ｎはサイクル数を表し；ｅは、標的増幅の効率を表す。
【０１０８】
定量データ解析を用いてリアルタイムＰＣＲ反応曲線を解析することで、許容される程度の正確さまでＣｏｎｃ０を求める。以前のＣｔ解析方法は、ＣｏｎｃＮが解析下の全ての反応について同じである反応点でのサイクル数を求めようとするものである。本発明の方法によって求められるＦＣＮ値は、入力標的濃度のダイナミックレンジにわたって重大な阻害やシグナル劣化が示されないアッセイにおけるサイクル数Ｎの良好な推定値を提供する。開始時濃度とＦＣＮとの間の下記の比例関係を用いることができる。
【０１０９】
【数３】
0006388627.tif 000005
式中、Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ）は、本発明の方法によって測定されるＦＣＮ値を用いることで測定される初期標的濃度の推定値を表す。
【０１１０】
すなわち、標的の開始濃度が低いほど、ＰＣＲ反応で求められるＦＣＮ値が高くなる。この関係を、較正データと定量データの両方について用いることができる。
【０１１１】
この比例関係は、下記のような等価な式として表すこともできる。
【０１１２】
【数４】
0006388627.tif 000006
式中、Ｋは較正比例定数を表す。
【０１１３】
較正データについて、Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ）は標的核酸５０００００コピー／ｍＬなどの既知濃度を表し；指数部ＦＣＮは、上記で求められるＦＣＮサイクル数であり；ｅは、反応における効率値を表し、ｅ＝１は各サイクルの倍加を示す。これらの因子を組み合わせて、比例定数の測定を可能とする関係を形成する。その比例定数測定は、増幅反応の効率ｅについての演繹的知識がある場合にのみ行うことができる。この演繹的知識は、１点較正を可能とするものである。定量データの場合、標的の未知濃度を有するサンプルが関与する反応についてＦＣＮ値を求める。次に、上記の等式を用いることで、ＦＣＮ値を濃度値に変換する。効率ｅが演繹的に未知である場合、標準曲線定量法を用いることができる。この場合、較正データについては、各種濃度の既知濃度を有するサンプルを増幅し、それらのサンプルのＦＣＮ値を求める。それらのＦＣＮ値を、既知濃度の対数（底１０）に対してプロットして、対数（濃度）−ＦＣＮ応答を記述する。入力標的濃度のダイナミックレンジにわたって有意な阻害やシグナル劣化を示さないアッセイの場合、この応答は代表的には、直線によって良好に適合される。下記式は、この標準曲線の形態を記述するものである。
【０１１４】
Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ））＝ｍ×ＦＣＮ＋ｂ
式中、Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ））は、初期標的濃度の対数（底１０）を表し；ｍは、線形標準曲線の傾きを表し；ｂは、線形標準曲線の切片を表す。
【０１１５】
２以上の既知濃度較正サンプルを用いることで、線形回帰を適用して、標準曲線の傾きｍおよび切片ｂを求めることができる。定量データに関しては、未知濃度の試験サンプルが関与する反応についてＦＣＮ値を求め、次に上記の一次方程式を用いることで、その値を対数（濃度）値に変換する。結果を、対数（濃度）または適切な変換によって濃度単位で報告することができる。
【０１１６】
留意すべき点として、１点較正式は、この線形標準曲線型に容易に変換される。
【０１１７】
【数５】
0006388627.tif 000007
【０１１８】
Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ））＝−ｌｏｇ１０（１＋ｅ）×ＦＣＮ＋ｌｏｇ１０（Ｋ）。線形係数ｍを用いて、特定のＰＣＲ反応の効率を計算することができる。
【０１１９】
（実施例１３−定量の調節）
ＰＣＲ反応が阻害を受ける場合、得られるリアルタイムＰＣＲシグナル強度は、抑制されるか遅延し得る。このシグナル劣化がＭＲなどの効率関連値に与える効果は、その値における低下である。さらに、部分サイクル数に対するシグナル劣化の効果は、阻害を受けない反応で予想されるものより早いサイクル数でのＦＣＮの確認である。これらの要素により、ＦＣＮの関数としての対数（濃度）のプロットが、線形曲線適合関数によって十分に記述されないようになる。標準曲線には比較的高次の曲線適合関数を適用することができるが、直線回帰は相対的に低い較正レベルを必要とし、計算が相対的に簡単である。
【０１２０】
これらの問題のうちの一部は、上記の定量関係にＥＲＶまたは強度値を組み込むことによって、標準曲線解析で取り扱うことが可能である。従って、上記の等式は下記のように書き換えることができる。
【０１２１】
【数６】
0006388627.tif 000008
【０１２２】
式中、強度は測定ＦＣＮ値での応答強度（バックグラウンドより高い）を表し；ＭＲは、前述のＭＲ値を表す。Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ強度Ａｄｊ）は、強度値を用いることで調節されるＦＣＮ値を用いることで求められる標的の初期濃度の計算値を表し；Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮＭＲＡｄｊ）は、ＭＲ値を用いることで調節されるＦＣＮ値を用いることで求められる標的に初期濃度の計算値を表す。
【０１２３】
これらの表現は、上記のような、特定ＦＣＮサイクルでの強度もしくは特定ＦＣＮサイクルで測定されるＭＲまたはその両方と阻害存在下でのＦＣＮ値に対する変化との間で認められる関係を利用するものである。正味の効果は、上記の比例表現の右側が、ＰＣＲ増幅曲線に影響を与える阻害および他の要素に対して比較的感受性が低いことから、標的の濃度値を求める上での表現としてかなりの堅牢性を提供するというものである。
【０１２４】
下記の議論は、ＦＣＮ、ＦＣＮ強度ＡｄｊおよびＦＣＮＭＲＡｄｊの特性および関係をさらに説明するものである。効率が１であると仮定すると、前記式は下記のものに簡略化することができる。
【０１２５】
【数７】
0006388627.tif 000009
【０１２６】
これらの表現に対数底２を取ると、下記のようになる。
【０１２７】
Ｌｏｇ２（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ））∝ＦＣＮ
Ｌｏｇ２（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮ強度Ａｄｊ））∝ＦＣＮ−Ｌｏｇ２（強度）
Ｌｏｇ２（Ｃｏｎｃ０（ＦＣＮＭＲＡｄｊ））∝ＦＣＮ−Ｌｏｇ２（ＭＲ）。
【０１２８】
これらの表現の右側から、強度またはＭＲの補償を行って下記式によってＦＣＮ値を調節する値が得られる。
【０１２９】
ＦＣＮ強度Ａｄｊ＝ＦＣＮ−Ｌｏｇ２（強度）
ＦＣＮＭＲＡｄｊ＝ＦＣＮ−Ｌｏｇ２（ＭＲ）。
【０１３０】
次に、ＦＣＮ値またはＣｔ値の使用と類似の調節ＦＣＮ値を用いることで、この計算によって定量が得られる。留意すべき点として、これらの調節ＦＣＮ値の使用によって、阻害ならびに未知サンプル中の標的の濃度を測定するのに使用されるＣｔ値などのＰＣＲ増幅に影響する他の要素に対するかなりの堅牢性を提供する。対数（濃度）−これら調節ＦＣＮ値のプロットは、線形標準曲線によって良好に適合される。従って本発明は、サンプル中の標的核酸の量を測定する方法であって、（ａ）効率関連値、好ましくはＭＲの最大値に相当する増幅反応の期間もしくはサイクル数を見出す段階、（ｂ）強度の対数もしくはＭＲの対数を引くことでその値を調節する段階、ならびに（ｃ）前記の得られた値を同じ方法を用いて得られる較正データと比較する段階を有する方法を提供する。
【０１３１】
（実施例１４−標準曲線較正）
既知濃度からの標準曲線の作成と定量におけるそれの使用は当業界で公知であり、下記の実施例からさらに理解が進む。代表的な例では、各増幅または一連の増幅時に多くの較正反応（初期濃度が既知であるウェルでのものなど）を用いて、較正操作を行う。広い範囲の可能な初期濃度でサンプル中の標的核酸を定量しようとした場合に生じる一つの問題は、特定の反応での比較的低量の標的核酸の定量がより困難になるという点である。例えば図１４には、試験サンプル中のＨＩＶの量を定量するよう設計されたアッセイについてのデータを示してある。それらの反応は、５０；５００；５０００；５００００；５０００００；および５００００００コピー／ｍＬという標的核酸の６種類の既知濃度について８連で行った。アッセイデータは、コピー数が低い（曲線が右に対して最も遠い）反応での有意なシグナル抑制を示している。標的核酸の４つの最高濃度の量（左側の曲線集合）によって低い変動係数で正確な結果が得られたが、２つの最低濃度では、正確さの低い曲線が得られた。ダイナミックレンジが１０００００〜１またはそれ以上であるアッセイでの低濃度の標的核酸を定量する上での難しさが原因で生じるその不正確さは、下記の本発明の方法によって扱うことができる。
【０１３２】
反応プレートでの較正試験は比較的高価であることから、従来では最小数の許容される較正データセットを収集する。例えば、ある実行では、それぞれ５００；５００００；および５００００００コピー／ｍＬサンプル２連の平均を診断アッセイとともに行うことで、較正反応で用いる９６ウェルプレートで恐らく６個のウェルが必要である。
【０１３３】
サイクル数とキャリブレータ濃度の対数の間の関係は実質的に線形であることから、キャリブレータ濃度の対数（例：ｌｏｇ１０）とサイクル数との間で線形回帰を行うことができる。この回帰は、エクセルプログラムおよび他の数学的解析ソフトウェアによって容易に行うことができる。図１５には、４種類の異なるサイクル数関連値（例：ＦＣＮ、ＦＣＮ２、ＦＣＮＭＲＡｄｊ．およびＦＣＮｉｎｔ．Ａｄｊ．）を用いて３点較正データから得られた４つの線形標準曲線を示してある。
【０１３４】
各曲線適合式において、ｘ軸はＬｏｇ１０［標的］実際または既知濃度を示す。従って、ｘについての解法は、サイクル数関連値からアッセイのＬｏｇ１０（標的）計算濃度への変換に関する表現を提供するものである。アッセイ応答がＬｏｇ（標的）と直線的でない場合、より高次もしくはより複雑な回帰もしくはより多くの較正曲線またはその両方を用いることができる。本実施例では、下記の式を求めた。
【０１３５】
ＦＣＮ＝−３．０７１３＊Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０）＋３１．２９５
ＦＣＮ２＝−３．０６３７＊Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０）＋２５．００６
ＦＣＮＭＲａｄｊ＝−３．２３４４＊Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０）＋３３．２７１
ＦＣＮＩｎｔ．ａｄｊ＝−３．２８７０＊Ｌｏｇ１０（Ｃｏｎｃ０）＋３２．７７５。
【０１３６】
（実施例１５−各種サイクル数関連値を用いる定量の比較）
上記の異なるサイクル数関連値を用いた較正の異なる特性を調べるため、既知濃度を有する各種サンプルについて定量を行い、計算濃度を既知濃度と比較することができる。そのような比較の１例では、上記で得られたパラメータを有する標準曲線を用いて、図１４に示したアッセイの定量を行った。各既知濃度での８連の計算濃度の平均を、既知濃度値と比較した。図１６は、既知濃度値のｌｏｇ１０（ｘ軸）を、各濃度での８個のサンプルについての各計算濃度のｌｏｇ１０の平均と比較するものである。
【０１３７】
図１６によって示したように、５０コピー／ｍＬサンプル（ｌｏｇ（濃度）＝１．７）はＦＣＮを用いると若干上に定量されるが（すなわち、実際の濃度より高い）それより高い濃度での（ＭＲの）ＦＣＮ法における正確さは非常に良好である。ＦＣＮ２は最低濃度でより正確であるが、若干下に定量され（すなわち、実際の濃度より低い）、いくつかのそれより高い濃度で比較的低い線形性および正確さを示す。ＦＣＮＭＲＡｄｊ．は、その濃度範囲を通じて非常に正確かつ直線的な定量を示した。ＦＣＮＩｎｔＡｄｊ．も、最低濃度での非常にわずかな下方定量以外は、ＦＣＮと比較して正確さおよび線形性においてかなりの改善を示した。従って、４つのいずれの方法も良好に機能するが、特定の状況では一部のものが他のものより優れている。従って当業者は、特定の用途に適した方法を容易に選択して、優れた結果を得ることができる。
【０１３８】
（実施例１６−１点較正を用いる定量）
１点較正を定量に用いることができる。この場合、５００００コピー／ｍＬ濃度（Ｌｏｇ（４．７））での２つのウェルを較正に用いた。較正定数を計算するため、下記式：Ｋ＝Ｃｏｎｃ０＊２ＦＣＮ［式中、Ｋは較正定数を表し；Ｃｏｎｃ０はキャリブレータの既知濃度を表し；ＦＣＮはキャリブレータの部分サイクル数を表し；前述した反応効率ｅは１であると仮定する。］を用いる。ＦＣＮ２、ＦＣＮＭＲＡｄｊ．およびＦＣＮＩｎｔ．Ａｄｊ．などの比例関係を用いて、同様の較正定数を得ることができる。
【０１３９】
この場合、２つのウェルについて定数を得て、平均を用いた。較正定数が得られたら、各アッセイについての濃度を下記式：Ｃｏｎｃ＝ＫＦＣＮ／２ＦＣＮで計算する。図１７は、１点較正からの結果を示す図である。
【０１４０】
図でわかる通り、ＦＣＮ結果は、最低の２濃度で高く、ｌｏｇ（Ｃｏｎｃ）＝３．７以上から正確である。ＦＣＮ２は、ＦＣＮと比較して低濃度で向上した正確さを示しているが、ｌｏｇ（標的）＝５．７および６．７では低く定量している。ＦＣＮ−ＭＲ調節は、範囲全体で良好な線形性を示し、２つの最低濃度では若干高い定量を示している。ＦＣＮ−強度調節も、良好な線形性を示し、２つの最低濃度で非常にわずかな下方定量を示している。従って、これらの各実施形態は良好に機能し、当業者はこれらの選択肢から容易に選択することができる。
【０１４１】
上記のように、ＦＣＮ−ＭＲ解析を用いて、特定の反応を陽性もしくは陰性として特徴付けたり、または反応データを基準データと比較したり、またはその両方を行うことができる。これらの値を用いて、反応を定量することができる。各種定量方法が、Ｃｔ解析ではなくＦＣＮ−ＭＲ解析から恩恵を得ることができる。
【０１４２】
１実施形態において、ＦＣＮ値、ＦＣＮ２値またはＦＣＮ調節値を、Ｃｔ値が先行技術で用いられていたあらゆる形態で用いることができる。必ずしも必要とは限らないが代表的には、ＦＣＮ−調節、ＦＣＮ２−調節またはＦＣＮ−調節解析を各種較正データ集合に適用することで、標的の濃度が未知である反応の結果と標的の濃度が既知である反応の結果を比較するための基準データ曲線または等式を得ることができる。従って、本発明を用いて、基準データを形成し、２つの値（例：ＦＣＮ−ＭＲ）を基準データ作成とそのデータに対する比較の実施の両方に用いる比較を行うことができる。
【０１４３】
ＭＲ方法を用いる実験は一様に捕捉データセットについて異なる再処理段階を用いてから、比率関数でデータセットを処理していたが、これらの段階のほとんどが必要ない。特に、実験結果は、スケール調整、基準色素による正規化、ベースライン調整（オフセットおよび傾き補正の両方）およびフィルタリングが必要ないことを示していた。しかしながら、フィルタリングは、それがノイズ存在下での成績を向上させることから、望ましいことが認められている。傾き補正（ベースライン領域に関して）も、それが、標的核酸を含まないサンプルと非常に少量の標的核酸を含むか増幅反応の大幅な阻害を受けるサンプルとの間の区別をわずかに改善することから、望ましいことが認められている。しかしながら、ＦＣＮ強度ａｄｊ．を用いる場合、スケール調整または基準色素に対する正規化など（これらに限定されるものではない）の正規化法を用いることが好ましい。
【０１４４】
（実施例１７−１点較正を用いるＨＢＶデータに適用されるＭＲアルゴリズム）
１０コピー／反応から１０９コピー／反応および陰性の範囲の対照溶液のＨＢＶアッセイを、各濃度６連でＡＢＩプリズム（Prism）７０００で処理した。捕捉データは、デジタルフィルターのみを用いて処理した。次に、上記のＭＲアルゴリズムを用いてＦＣＮ値を計算した。それらの濃度は、基準キャリブレータとして１０９コピー／反応での応答のうちの３つを用いる１点較正によって計算した。
【０１４５】
正規化やベースライン調整を行わないとしても、１０コピー／反応および１００コピー／反応サンプル（すなわち、Ｌｏｇ（標的）＝１および２サンプル）の許容量の上方定量以外は、得られる定量は非常に良好であった。陰性と１０コピー／反応アッセイとの間には非常に明瞭な区別があり、偽陽性も偽陰性もなかった。別の結果は、同じデータをＣｔ解析で定量した場合、１０コピー／反応および１００コピー／反応アッセイも若干上方定量し、１０コピー／反応より上の全ての濃度での精度はＭＲ解析の場合より良好であることを示していた。この場合、Ｃｔ結果は、正規化し、ベースライン調整し、１０３および１０７コピー／反応の各濃度で３連にて２点較正によって較正した。
【０１４６】
図１９には、ＭＲ解析およびＦＣＮＭＲａｄｊ．補正を用いる同じＨＢＶデータの例を示してある。やはり、その定量は、正規化、スケール調整およびベースライン調整を行わずに、１０９コピー／反応で３つの応答での１点較正によって行った。わかるように、低濃度での上方定量が大幅に減少している。すなわち、定量結果が大幅に向上している。
【０１４７】
（実施例１８−ＨＩＶデータに適用されるＭＲアルゴリズム）
本実施例では、対照溶液のＨＩＶアッセイを、６連での陰性、５０コピー／ｍＬ、および１００コピー／ｍＬ〜１０６コピー／ｍＬの濃度で行った。応答は、正規化およびベースライン調整を行うＦＣＮＭＲＡｄｊ．を用いるＭＲアルゴリズムによって処理した。図２１は、ＭＲ解析および例えばキャリブレータとして２連の１０２および１０５コピー／ｍＬ応答を用いる２点較正を使用した本実施例の結果を示した。陰性と５０コピー／ｍＬアッセイとの間に明瞭な区別があり、偽陽性も偽陰性もなかった。図でわかる通り、良好な線形性と精度がある。
【０１４８】
（実施例１９−標的およびＩＣ（ＦＣＮ、ＭＲ）ペアを用いる妥当性決定）
反応時間もしくはサイクル数値および効率関連値のペア（例：ＦＣＮ−ＭＲ値のペア）が核酸増幅反応、例えばＰＣＲ反応についての貴重な情報を得ることができ、それはさらに、内部対照および標的増幅反応の両方についてデータペアを考慮することでさらに向上させることができることが認められている。標的反応単独のペアは反応効率についての重要な情報を有し、基準データとの比較に用いることができるが、サンプルの処理またはサンプル自体で生じる別の要素も、対照データを考慮することでより良好に解析することが可能である。
【０１４９】
例えば、ＰＣＲまたは他の好適な増幅反応で用いられる試料の処理において、サンプルは、標的データのみの評価で検出可能になると考えられる反応への各種阻害因子を有する場合がある。しかしながら、サンプル調製時の標的核酸の異常回収は、単一の増幅反応の解析によっては検出されないのが普通であると考えられる。さらに、例えば配列の多形領域に結合するプローブを用いる場合、標的核酸は、標的核酸の検出を妨害する可能性のある多形配列を有する可能性がある。この領域での多形配列によって引き起こされる不一致が検出されるシグナルに影響を与えることが考えられ、結果的に、単一増幅におけるデータペアの評価を用いて、その増幅は異常だったり阻害されているようには見えない可能性がある。内部対照の標的増幅応答解析との共解析は、他の方法が通常は正しくない反応を示すと考えられる場合に、そのようなサンプル中の標的核酸の正確な定量を提供することができる。
【０１５０】
従って、反応時間またはサイクル数値と効率関連値のペアを一緒に用いることで、例えば所定の容器もしくはウェルでの所定の反応の妥当性を評価することができる。堅牢性において標的増幅反応に匹敵するか、若干堅牢性が低い内部対照（ＩＣ）増幅反応を設計することができると考えられる。この文脈での堅牢性は、サンプル調製やサンプル自体から生じる阻害などのＰＣＲ処理経路に影響し得る要素、またはピペットによる不正確な量の増幅試薬の移動などのピペットによる反応混合物の移動における変動性に対する反応成績の感受性を意味する。
【０１５１】
（実施例２０−多重基準データ曲線）
サイクル数値−効率関連値のペア（例：ＦＣＮ−ＭＲペア）についての多重基準曲線を作成することができ、それは特に妥当性決定での使用において、異なる用途および重要性レベルを有し得る。例えば、第一の基準曲線を選択して、反応性増幅シグナルを非反応性応答から区別可能とすることができる。第二の基準曲線を選択して、第一のものより制約を厳しくすることで、定量において相対的に低い信頼性を有すると考えられる部分阻害を有するものと対照して、正確な定量をもたらすサンプル応答を確認する上でそれが有用となるようにすることが可能である。図２２は、２種類の基準データを示すプロットであり、図中において下方の水平線は、陰性反応を反応性反応から区別する上で好適な基準データを表す。第二の直線集合は、ＦＣＮ−ＭＲペア応答における正常範囲を示す基準データを表す。これらの基準を用いて、部分的反応阻害が原因であるこの範囲外の値に関連すると考えられる相対的に低い信頼性との対照で、定量における高信頼性を識別することができる。
【０１５２】
例えば、反応性と非反応性の増幅反応を区別する第一の種類の基準データは、「ＭＲ基準データ」と称することができる。これらのデータはカットオフ閾値として働き、反応性応答はＭＲ基準データを超えるＭＲ値を有するが、陰性サンプルは基準値または基準線を越えないＭＲ値を有する。基準データは好ましくは、応答シグナルにおけるノイズが基準を超えず、クロストークやブリードオーバーなどの偏りではないように設定する。
【０１５３】
第二の種類の基準データは、ＭＲ正常範囲と称される。この範囲は、サンプルの定量が正確である所定のＦＣＮにおけるＭＲ値の範囲となると考えられる。シグナル応答が抑制される場合、観察されるＭＲ値が低下する。阻害のためにＭＲ値が低下するに連れて、ＦＣＮ値は早い方のサイクルにシフトし得るが、閾値に基づくＣｔは遅い方のサイクルにシフトし得る。ＭＲ正常範囲は、アッセイ標準曲線からサンプル中の標的の濃度を求めるのに使用される場合に、サイクル数に関係する選択値がサンプルについての正確な定量結果を与えると考えられる基準データセットにおけるＭＲ値の範囲であると考えられる。
【０１５４】
「ＭＲ正常範囲」は、当業界では明らかなＦＣＮによるＭＲの二変量適合を用いて形成することができる。例えば図２３には、５０コピー／ｍＬ〜５００００００コピー／ｍＬのＨＩＶデータについてのＦＣＮ−ＭＲプロットを示してある。そのデータを統計ソフトウェア（ＪＭＰ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）など）によって解析して、そのデータに三次元曲線適合を適用した。この三次元曲線適合は、図の中央の実線によって表される。上側および下側の点線は、αレベル０．００１での信頼区間個別解析オプションを用いて得られた信頼区間を表す。表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、図２３に関係するサンプルデータの入力および出力を示す図である。
【０１５５】
【表２】
0006388627.tif 000010
【０１５６】
【表３】
0006388627.tif 000011
【０１５７】
【表４】
0006388627.tif 000012
【０１５８】
統計的に誘導される信頼区間は、示したように、どのデータ点が「正常な」応答を表し、従って定量化すべきかに対する系統的なアプローチである。この区間外にあるデータ点は例外的であり、好ましくはソフトウェアプログラムによってオペレータに特定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）されることで、さらなる検討を行うことができる。
【０１５９】
別の実施形態では、そのような曲線は、１以上の直線部分の形態で単純化することができる。この単純化は、場合によって生データを見る技術者が行うことができるか、あるいは上記のα区間から誘導することができる。
【０１６０】
同様の統計的適合を、内部対照（ＩＣ）データについて行うことができる。例えば図２４には、ＩＣデータ、すなわち図２３に示したデータに関連するＩＣデータについてのＦＣＮの関数としてのＭＲのプロットを示してある。このデータを用いて、ＩＣ基準を決定することができ、その基準は例えばＩＣのＭＲ値の平均より下の５標準偏差である単一の値であることができ、あるいは例えばＭＲおよびＦＣＮ値の平均５標準偏差に基づいた値の範囲もしくはボックスであることができる。
【０１６１】
そこで本発明は、増幅反応の解析方法であって、第一の値が最大効率関連値（それは好ましくはＭＲである）であり、第二の値が反応点での時間値もしくはサイクル数値（分数であっても良い）であるペアで提供される特定値の範囲である「信頼コリドー（ｃｏｒｒｉｄｏｒ）」を確立する段階を有する方法をも提供する。その方法はさらに、いずれか特定の周期的時間値または反応点でのサイクル数値（分数であっても良い）で起こる最大効率値が選択範囲内にあるか否かを決定する段階を有する。その値が範囲内でない場合、さらなる検討または結果の無視が示される。いずれか好適な方法を用いて、選択される信頼コリドーを確立することができる。好ましい方法には、アッセイを特徴付けるのに使用される１群の反応から得られるデータの平均からの約１、２、３、５、１０または他の好適な数字の標準偏差に信頼コリドーを設定することなどがある。別の好適な方法では、既知の異常もしくは矛盾した結果を観察することで信頼コリドーを変更し、さらなるアッセイでその異常もしくは矛盾する結果の一部を除外するように信頼コリドーを変更する。本発明の信頼コリドーの使用は、標的核酸定量、標準、キャリブレータ、対照のいずれかの解析、またはこれらの組み合わせに適用することができる。
【０１６２】
（実施例２１−妥当性解析）
図２５は、内部対照および標的増幅反応の両方についてのＥＲＶ（例：ＭＲ）を引いたサイクル数（例：ＦＣＮ）のペアの解析によるアッセイ妥当性の評価のための論理解析ツリーを示すフローチャートである。図２６は、サイクル数（例：ＦＣＮ）−ＥＲＶ（例：ＭＲ）のペアを用いる妥当性基準評価とともに標的結果を報告する論理解析ツリーを示すフローチャートである。
【０１６３】
これらのフローチャートでは、説明を明瞭にするためにＦＣＮを用いているが、本明細書の別の箇所に記載のように、例えばＣｔ法、ＦＣＮ２、ＦＣＮＭＲＡｄｊ．またはＦＣＮＩｎｔ．Ａｄｊ．その他の好適な方法のような他の方法を用いて、反応点値を得ることができる。
【０１６４】
従って、妥当性チェックは、内部対照（ＩＣ）および／または標的データに関する一連の質問として進めても良い。
【０１６５】
図２５において、最も左の矢印ブロックは、この方法の段階の全般的説明を提供する。方法の詳細は、下記のものを検討することでさらに理解することが可能である。その方法は、標的反応および対照（ＩＣ）反応の両方からのサイクル数／ＥＲＶペアを解析するものである。最初に、（１）ＩＣＭＲがＩＣＭＲ基準データより上である場合、そして（２）ＩＣＦＣＮが正常範囲内にある場合、さらには（３）ＩＣＭＲが正常範囲内にある場合に、反応の妥当性が確認される。
【０１６６】
図に示したように、標的ＭＲの１以上の特徴を考慮することで、無効な結果をさらに特徴付けもしくは説明することができる。
【０１６７】
図２６には、妥当な反応に関する標的データを解析することで、（１）非反応性標的サンプル、（２）アッセイの検出限界未満の濃度の標的、（３）存在するが恐らくサブタイプの不一致のために定量が阻害されている標的、または（４）妥当で定量可能な標的反応を示すものとして妥当な結果をさらに特徴付ける方法を示している。
【０１６８】
従って、複数標的に基づいた分析を組み合わせ、サイクル数および効率関連値の両方を用いることで、阻害されたサンプルを、サンプル調製時の核酸回収の不首尾があったサンプルから区別することができる。その解析は、内部対照および標的基準データに含まれるアッセイについての予め確立された知見を利用するものである。
【０１６９】
（実施例２２−ピーク幅を用いる妥当性決定）
増幅応答を説明する単一の値のみを提供する先行技術における従来のＣｔ解析とは対照的に、効率関連値解析（および好ましくはＭＲ解析）は、増幅反応全体またはそれの一部の時間値またはサイクル数値に相当するデータを効率関連変換値曲線に提供することができる。具体的なアッセイ形態内では、正常アッセイ応答は非常に再現性の高い効率関連変換値曲線を与えることが発見されている。特に、一つの特徴は、効率関連変換値曲線のピークの幅である。例えば最大高さの半値での幅によって定義される効率関連変換値のピークの幅は、蛍光強度の大きさが大きく変動する場合であってもほとんど変動しないことが認められている。
【０１７０】
いずれか好適な方法を用いて、効率関連値のピークの幅を求めることができる。図２７には、効率関連値ピークの幅を求める上でのある好適な方法を示してある。図２７では、全ピーク幅は、最大レベル半値でのピークのサイクルにおける幅である。図１４におけるＨＩＶ応答は、約８の相対的に高い濃度のサンプルでは正規化蛍光を示しているが、低濃度のサンプルについての正規化蛍光は約１という低いものである。シフト比法を用いた各増幅反応での効率関連変換値の計算および全ピーク幅計算は、図２８に示した結果を提供する。最終蛍光強度における８倍変化がある場合であっても、ピーク幅は驚くべきことに狭い範囲内に保存される。従って本発明は、増幅反応妥当性基準を提供し、そこでは効率関連値のピークの幅が増幅反応に特徴的な選択範囲内に含まれている場合には、増幅反応は妥当であると考えられる。図２８では、太い点線の水平線は、幅測定値の平均±１０標準偏差を表す。約５．５〜８．０の範囲（図２８に示したもの）内にない幅測定値は、妥当でないか少なくとも疑わしいと見なされる。当業者であれば、特定のアッセイの要件に応じて、不要な実験を行うことなく、許容される区間を説明するパラメータを容易に変動させることができる。
【０１７１】
ピーク幅を用いて、異常アッセイ応答を検出することができる。全ピーク幅計算を、図１２に示した異常応答を含むアッセイデータに適用した。その結果を図２９に示した。図からわかるように、このデータセットにおける正常応答は約６〜９サイクルの全ピーク幅を生じるが、ウェル４２の全ピーク幅は１７．４２である。従って、ウェル４２の増幅反応は異常であり、無視される。
【０１７２】
全ピーク幅計算は、効率関連値の反応点値（例：ＦＣＮ）の前および後の両方で起こる増幅反応における異常変動によって影響を受ける。効率関連値の反応点後に起こる異常変動は、それらがＭＲ方法によるアッセイ定量に影響し得ないことから、アッセイ妥当性試験では考慮しない。このオプションは、図２７に示したピーク幅半値計算またはそれの等価物を用いて容易に達成することができる。例示した例では、ほぼ最大効率関連変換値半値から最大効率関連値のほぼ反応点値までの周期的時間単位での幅のみを用いる。当然のことながら、ピーク幅およびピーク幅半値を測定する上での他の好適な方法が、当業界において公知である。
【０１７３】
（実施例２３−ソフトウェア実施形態）
本発明のシステムを、多数の好適なコンピュータ製品または情報機器に組み込むことができる。ＭＲソフトウェア実行の若干の詳細を以下に提供する。具体的なユーザーインターフェースの説明および図示は、具体的な実施形態を説明するためにのみ取ったものであり、情報処理業界で公知の多くの異なるユーザーインターフェース方法を、本発明を具体化するシステムで用いることができる。本発明は、下記の実質的に全ての選択肢が存在し、計算され、もしくは情報システムによって提供され、結果的にほとんどユーザーインターフェース選択肢を提供しないシステムも用いることができる。場合により、試作システムの詳細および／または選択肢が例示を目的として説明されており、それらの選択肢および／または詳細の多くが、製造システムには無関係であったり、利用できない場合がある。
【０１７４】
さらに、ソフトウェアの実施形態は、例えば一つもしくは二つの標的反応、または１以上の内部対照反応、または基準データ、またはそれらの組み合わせでの反応の処理などの各種機能性を含むことができる。本発明での使用に好適なソフトウェアシステムは、開く、閉じる、印刷、保存などの非常に多くの標準的なファイル取り扱い機能を提供することができる。
【０１７５】
図３０には、本発明によるＰＣＲデータ処理のためのユーザーインターフェースを示してある。このインターフェースでは、標的アッセイに相当する適切な色素、内部対照および基準応答の選択は、ウィンドウの左上部分にあるポップアップリストから選択される。異なる表示オプションを選択するためのタブが、ウィンドウの中央に配置されており、水平方向に並んでいる。図３０は、ＭＲ−ＦＣＮプロットを示すタブが選択されているのを示している。図３１は、ウェル１についての同じデータを示すユーザーインターフェースを図示しているが、シフト比曲線を示している。他のタブによって、全ての応答における生蛍光データ、正規化蛍光およびベースライン化データを表示することができる。さらに、タブによって、個別に各応答の検査を行うことができる。プロットの右手のフィールドは、ベースライン領域でのＭＲ、ＦＣＮ、Ｃｔおよび標準偏差などの計算応答値を示す。これらの計算値の下には、比率ボタンがあって、それによってユーザーはアッセイデータまたは内部対照データのいずれかを表示することができる。
【０１７６】
プログラム情報機器における実施形態
図３２は、本発明の各種態様を具体化することができる論理素子の１例を示すブロック図である。本明細書にある内容からわかるように、本発明はハードウェアもしくはソフトウェアまたはその両方で実行することができる。一部の実施形態では、本発明の各種態様を、クライアント側ロジックまたはサーバー側ロジックのいずれかで実行することができる。さらに、本発明または本発明の構成要素は、適切に構成されたコンピュータデバイスにロードされた時に、そのデバイスを本発明に従って実行させることができる論理指令もしくはデータまたはその両方を含む固定メディアプログラムコンポーネントで具体化することができる。論理指令を含む固定メディアコンポーネントは、閲覧者のコンピュータに物理的にロードするための固定メディア上で閲覧者に送ることができるか、または論理指令を含む固定メディアが、閲覧者が通信媒体を通じてアクセスしてプログラムコンポーネントをダウンロードできる遠隔サーバー上にあっても良い。
【０１７７】
図３２は、本明細書に記載の画像表示もしくは解析またはその両方に関する論理演算を行うための論理装置として用いることが可能な情報機器またはデジタル装置７００を示す図である。そのような装置は、本発明の各種実施形態に従って論理命令を行う汎用コンピュータシステムまたはワークステーションとして具体化することができる。そのような装置は、論理処理を各種サンプル取り扱い操作を行うための機械に統合する特注および／または特殊実験室用もしくは科学用ハードウェアであることもできる。概して、本発明による装置の論理処理コンポーネントは、メディア７１７もしくはネットワークポート７１９またはその両方から命令を読み取ることができる。中央演算処理装置は、固定メディア７２２を有するサーバー７２０に接続されていても良い。その後、装置７００は、本明細書に記載の動作を指示したり、解析を実行する指令を用いることができる。本発明を具体化することができるある種類の論理装置は、ＣＰＵ７０７、任意の入力装置７０９および７１１、記憶メディア７１５（例：ディスクドライブ類）および任意のモニター７０５を含む、７００で示したコンピュータシステムである。固定メディア７１７、またはポート７１９上の固定メディア７２２を用いて、そのようなシステムをプログラムすることができるか、またはそのメディアはディスク型の光学メディアもしくは磁気メディア、磁気テープ、固体のダイナミックメモリもしくはスタティックメモリなどを表すことができる。本発明はまた、全体または一部において、この固定メディア上に記録されたソフトウェアで具体化することもできる。通信ポート７１９を用いて、最初に命令を受信し、それを用いてそのようなシステムをプログラムすることができ、そのポートはあらゆる種類の通信接続を表す。
【０１７８】
図３２は、診断システムの一部となり得る別の構成要素を示す図である。これらの構成要素には、ビューワまたは検出器７５０または顕微鏡、サンプル取り扱い装置７５５、ＵＶその他の光源７６０およびフィルター７６５、ならびにシグナルデータを捕捉するためのＣＣＤカメラまたはキャプチャー装置７８０などがある。これらの別の構成要素は、論理解析および／または制御を含む単一システムの構成要素であることができる。これらの装置は、当業界では明らかなように、ネットワーク、バス、無線通信などを介して７００などの情報機器とデジタル通信している実質的にスタンドアロンの装置であることもできる。そのようなシステムの構成要素は、いずれか簡便な物理的構成および／または外観を有することができ、合わせて単一の統合システムとすることができる。従って、図４２に示した個々の構成要素は、システムのほんの１例を表しているにすぎない。
【０１７９】
本発明はまた、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能論理回路（ＰＬＤ）の回路機構内で全体または部分的に具体化することもできる。そのような場合、本発明は、本明細書に記載のように動作するＡＳＩＣまたはＰＬＤを作るのに用いることができるコンピュータが理解可能な記述言語で具体化することができる。
【０１８０】
他の実施形態
以上、具体的な実施形態を参照しながら、本発明について説明した。他の実施形態は、当業者には明らかであろう。特には、ビューワデジタル情報機器は、パーソナルコンピュータなどのコンピュータワークステーションとして説明してきた。しかしながら、そのデジタルコンピュータ装置は本発明の論理方法を実行するのに好適ないずれの機器も意味するものであって、デジタル的に可能な実験室システムもしくは装置、デジタル的に可能なテレビ、携帯電話、携帯情報端末などの機器を含むことができると考えられる。本発明の精神の範囲内での変更は、当業者には明らかであろう。さらに、各種の異なる作業を用いて、本発明の具体的な実施携帯によるシステムとの相互作用を実行することが可能である。例えば、オペレータが音声コマンドを話すことができ、オペレータがキーを押すことができ、クライアント側科学装置上のボタンをオペレータが押すことができ、またはポインティングデバイスを用いる選択をユーザーが行うことができる。
【０１８１】
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示を目的としたものであって、それを考慮した上での各種の修正または変更が、本明細書における記述によって当業者に示唆されるであろうし、それが本願の精神および範囲ならびに特許請求の範囲に包含されるものであることは明らかである。
【０１８２】
情報開示陳述書の一部として提出された引例を含む、本明細書で引用または本願とともに提出された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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