(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を含まない水中油エマルジョンであって、スクアレン又は／及びトコールを含む代謝可能な油相と、精製水、注射用水、グリセロール水溶液、緩衝食塩水溶液又は臨床的に使用可能な輸液剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである水相と、水相に分散して生体適合性を有する、平均粒子径が１ｎｍ〜１０μｍの油水両親媒性の固体粒子とを含み、
前記固体粒子の粒子径分布係数ｓｐａｎが１．０未満であり、
前記水中油エマルジョンにおけるエマルジョン滴の平均粒子径が５０ｎｍ〜３００μｍであり、
前記水相のｐＨ値が５．０〜８．１である
ことを特徴とする界面活性剤を含まない水中油エマルジョン。
【請求項２】
前記トコールは、α−トコフェロール又はα−トコフェロールコハク酸エステルであり、
好ましくは、前記油相は受容体に対して無毒で代謝作用によって変換可能な植物油、魚油、動物油又は合成油のいずれかを含み、好ましくは、ダイズ油、ミグリオール、中鎖油、魚油、ビタミンＥ、ビタミンＥコハク酸エステル、ビタミンＥ酢酸エステル、サフラワー油、コーンオイル、サジー油、アマニ油、ピーナッツ油、椿油、ヒマワリ油、アーモンドオイル、ハトムギオイル、月見草油、ゴマ油、綿実油、ヒマシ油、低エルカ酸菜種油、オレイン酸エチル、オレイン酸、リノール酸エチル、ラウリン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、酪酸エチル、乳酸エチル、トリカプリルグリセリル又はカプリン酸トリグリセリドから選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の水中油エマルジョン。
【請求項３】
前記水相は注射用水、リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであり、
好ましくは、前記リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液のｐＨ値が独立に６．０〜８．０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の水中油エマルジョン。
【請求項４】
前記水相は、ヒト抗原、非ヒト動物抗原、植物抗原、細菌抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原又は腫瘍抗原のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである単価又は多価抗原を含み、
好ましくは、前記抗原は、ニワトリ胚培養、細胞培養、キャリア体液、器官又は組織からの精製分離、組換え遺伝子発現又は化学合成によって得られ、好ましくは前記抗原は、弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、スプリットワクチン、サブユニットワクチン、多糖結合ワクチン、組み換えワクチン又はＤＮＡワクチン等から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであり、
好ましくは、前記抗原は、季節性インフルエンザ株由来のウイルス抗原又は抗原性製剤を少なくとも三種類含み、更に、世界的流行の発生を引き起こし又は世界的流行の発生を引き起こす可能性があるインフルエンザウイルス株のウイルス抗原又は抗原性製剤を少なくとも１種含んでもよく、そのうち、世界的流行の発生を引き起こし又は世界的流行の発生を引き起こす可能性があるインフルエンザウイルス株は、
Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７を含むヒトインフルエンザウイルスのＡ、Ｂ、Ｃ型と、
豚インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２と、
犬や馬インフルエンザウイルスＨ７Ｎ７、Ｈ３Ｎ８と、
鳥類インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ５Ｎ９、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ４Ｎ８、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ８Ｎ４、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ６Ｎ５及びＨ１２Ｎ５と、から選ばれる１種又は２種以上のインフルエンザウイルスの組合せであり、
好ましくは、前記水相には、好ましくはｐＨ調節剤又は／及び緩衝剤、より好ましくは酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ−アルギニン塩酸塩、蔗糖、無水Ｄ−海藻糖、マンニトール、マンノース、澱粉又はゼラチンから選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである薬用補助物質を更に含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の水中油エマルジョン。
【請求項５】
前記固体粒子は、アルミニウム塩、カルシウム塩、多糖、多糖誘導体又は高分子重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物であり、前記多糖誘導体は、多糖に対して四級化反応、カルボキシメチル化、ヒドロキシ化、アルキル化、アシル化、スルホン化、硝化又はハロゲン化から選ばれる誘導体化反応を行って得た多糖誘導体であり、
好ましくは、前記アルミニウム塩は水酸化アルミニウム又は／及びリン酸アルミニウムであり、
好ましくは、前記カルシウム塩はリン酸カルシウム又は／及び炭酸カルシウムであり、
好ましくは、前記多糖は、キトサン、アルギン酸、ゼラチン、澱粉、グルカン、コンニャクグルコマンナン、ヘパリン、ペクチン系多糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン塩、アルギン酸塩、ゼラチン塩、グルコース塩、コンニャクグルコマンナン塩、ヘパリン塩、ペクチン系多糖塩、ヒアルロン酸塩又はコンドロイチン硫酸塩から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであり、好ましくはキトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、澱粉又はグルカンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであり、
好ましくは、前記多糖誘導体は、バラキトサン、アルギン酸、ゼラチン、澱粉又はグルカンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せに対して、四級化反応、カルボキシメチル化、ヒドロキシ化、アルキル化、アシル化、スルホン化、硝化又はハロゲン化から選ばれる誘導体化反応を行って得た多糖誘導体であり、
好ましくは、前記高分子重合体は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物又はポリシアノアクリレート及びその共重合体であり、前記共重合体の共重合単量体は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物又はポリシアノアクリレートのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せであることが好ましく、
好ましくは、前記高分子重合体は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）及びその共重合体であり、好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）又はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、最も好ましくはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）であり、
好ましくは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）において、ラクチドとグリコリドのセグメントのモル比は１０：９０〜９０：１０であり、
好ましくは、前記固体粒子は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、キトサン、アルギン酸塩、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリエチレングリコール−乳酸共重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物であり、更に好ましくは水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリエチレングリコール−乳酸共重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物であり、最も好ましくはポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の水中油エマルジョン。
【請求項６】
固体粒子の表面に対して親水性修飾、疎水性修飾、被覆又はグラフト変性を行い、
好ましくは、前記固体粒子の表面又は内部にターゲット物質、蛍光マーカー、同位体マーカー、環境応答物質、サイトカイン、抗体又は免疫調節剤が吸着、結合又は包埋され、
好ましくは、前記環境応答物質は、ｐＨ感受性、熱感受性又は生物学的活性物質感受性基から選ばれ、
好ましくは、前記固体粒子の表面又は内部に抗原が吸着、結合又は包埋され、
好ましくは、前記固体粒子の平均粒子径は１０ｎｍ〜５μｍであり、
好ましくは、固体粒子の水相での質量濃度が０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは０．５〜１０ｗｔ％、更に好ましくは１〜８ｗｔ％であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の水中油エマルジョン。
【請求項７】
スクアレンである代謝可能な油相と、精製水、注射用水、グリセロール水溶液、緩衝食塩水溶液又は臨床的に使用可能な輸液剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである水相と、水相に分散して生体適合性を有する、平均粒子径がナノ−ミクロンスケールのＰＬＧＡ油水両親媒性の固体粒子とを含み、
好ましくは、前記水中油エマルジョンの油相と水相の体積比が１：１００〜９：１、好ましくは１：５０〜１：２であり、
好ましくは、前記水中油エマルジョンにおけるエマルジョン滴の平均粒子径が１００ｎｍ〜１００μｍであり、
好ましくは、前記水中油エマルジョンは希釈剤、安定剤又は防腐剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含む薬用添加剤を更に含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の水中油エマルジョン。
【請求項８】
界面活性剤を含まない免疫原性組成物であって、（１）抗原又は抗原組成物、及び（２）請求項１〜３及び請求項５〜７のいずれか１項に記載の水中油エマルジョンからなるアジュバント組成物を含むことを特徴とする界面活性剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の水中油エマルジョンの、ワクチンアジュバント、薬物送達又は徐放性担体の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的製剤、特にヒト又は他の動物の体内に投与可能な水中油エマルジョンに関し、特に重要なのは、本発明の前記水中油エマルジョンは、界面活性剤を含まず、固体粒子をエマルジョンの安定剤とし、ワクチンアジュバント又は薬物送達又は徐放性担体として使用でき、生物医学技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
現代バイオテクノロジーの急速発展及び弱毒化ワクチンによる有害反応への社会重視度の向上に従い、スプリットワクチン、組み換えサブユニットワクチン、抗イディオタイプ抗体ワクチン、核酸ワクチン及び合成ペプチドワクチン等が開発されてきた。これらのワクチンは抗原純度が高く、相対分子量が小さく、ワクチンの有害反応が低い反面、これらの抗原の免疫原性と免疫保護性が普遍的に低く、抗原の有効性を向上させるために、抗原にアジュバントを添加して免疫反応誘導能力を強化させなければならない。
【０００３】
アジュバントは抗原と同時に使用し、又は抗原と協同使用することにより（短い時間間隔内で（一般的に１時間以下）順番に同一部位又は隣接部位に接種する）、生体の抗原に対する免疫応答能力を強化させ、又は免疫反応タイプを変えることができる。機能としては、主に、使用部位で免疫細胞と免疫分子を集めて、免疫応答を強化させること、ワクチン抗原送達を向上させること、免疫接触を促進すること、弱い抗原、例えば高度精製抗原又は組み換え抗原の免疫原性と免疫記憶を強化させること、抗原接種用量と接種の回数を減少させること、ワクチンの免疫応答能力が低い団体での免疫効果を促進すること、免疫応答の速度を速めて継続時間を延長させること、抗原の立体配置を変えること、抗体タイプの多様性を向上させて、変異しやすい病原体に対する交差防御（例えばインフルエンザウイルス）を実現すること、体液抗体の種類、ＩｇＧサブクラス及び抗体の親和性を変えること、及び細胞免疫と粘膜免疫の効果を刺激することなどを含む。
【０００４】
アルミニウムアジュバントは現在の使用が普遍に許容されるヒト用ワクチンの主なアジュバントであり、１９２６年にＧｌｅｎｎｙが初めてアルミニウム塩を使用してジフテリアトキソイドを吸着して以来、今まで、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの２種のアルミニウム塩アジュバントは複数種のワクチンに幅広く適用されている。しかしながら、アルミニウムアジュバントは体液免疫応答を主にするものであり、細胞免疫と粘膜免疫応答効果を誘導することができず、特に近年、アルミニウムアジュバントを含むワクチンを複数回接種することによって免疫抑制と累積中毒を引き起こす恐れがあり、更に、アルミニウムアジュバントは一部のワクチン抗原に対する免疫強化効果が低く、注射部位に深刻な局所反応、例えば紅斑、皮下結節、接触性アレルギーや肉芽腫性炎症が発生することがたまにあることが見出されるため、新規なワクチンアジュバントの開発はワクチン学の重大な課題となっている。
【０００５】
近年、油エマルジョンアジュバントは注目を集めてきて、多数の企業や研究機関が油エマルジョンアジュバントについて研究を行い、表１に市販及び臨床に実用化された一部の油エマルジョンアジュバントが示される。
【０００６】
表１  市販及び臨床に実用化された一部の油エマルジョンアジュバント
【０００７】
【表１−１】
0006434995.tif 000002
【０００８】
【表１−２】
0006434995.tif 000003
【０００９】
【表１−３】
0006434995.tif 000004
【００１０】
これらの油エマルジョンアジュバントは通常に油相と水相からなり、少なくとも１種の界面活性剤を含み、一般的な界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの界面活性剤（一般的に、ツイーンと呼ばれる）、ソルビタン脂肪酸エステル（一般的に、スパンと呼ばれる）、オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）及びレシチン等が含まれ、特にツイーン８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、スパン８５（トリオレイン酸ソルビタン）及びトリトンＸ−１００は一般的に使用されている。製剤において、界面活性剤は主にエマルジョンを安定させて、解乳化を防止する役割を果たす。この目的を実現するために、少なくとも１種の界面活性剤の使用が必要であり、且つ、エマルジョンの安定性を保持するために、エマルジョン中の界面活性剤の含有量が乳化に必要な量を超えることが求められるので、水相又は油相又は両方に遊離界面活性剤が存在することになる。更に、油エマルジョンアジュバントに使用される界面活性剤は一般的に生分解性（代謝可能）と生体適合性を有するが、界面活性剤の使用によっていくつかの悪影響を招く恐れがある。例えば、油エマルジョンアジュバントに脂肪族成分が存在する場合が多い。例えば、ＭＦ５９アジュバントにスクアレン、ＭＰＬ（商標登録）に複数の脂肪酸鎖がジグルコサミン主鎖に連結された脱アシル化モノホスホリル脂質Ａを含む。研究によれば、ワクチン組成物中の脂肪族アジュバントが界面活性剤成分を含む抗原と適合しないことが見出された（ＣＮ１０１２６７８３５Ａ）。更に、ＭＦ５９とＡＳ０３に使用される界面活性剤のスパン８５とツイーン８０は、長い間に食品、化粧品又は体内注射用に用いられるが、それら自体が免疫アジュバントではないので、免疫細胞を刺激する作用を果たさないどころか（ＣＮ１０２２９３７４３Ｂ）、体に代謝負担を掛けることになる。更に、抗原中の膜糖蛋白質が長期的に遊離界面活性剤と接触すると、変性する可能性がある（ＣＮ１０１３６５４８５Ａ）。その同時に、界面活性剤の添加量を厳密に制御しなければならず、過量の界面活性剤を添加すると、溶血現象を引き起こす恐れがある。
【００１１】
界面活性剤を安定剤とする従来のエマルジョンと異なり、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンは従来の界面活性剤の代わりに固体粒子を使用したエマルジョン系である。エマルジョンの安定化メカニズムについて、主に固体粒子を油水界面に吸着して、固体粒子の単層又は多層構造を形成することによって、エマルジョンを安定させる。従来の界面活性剤含有エマルジョンに比べて、下記の突出した長所を有する：（１）人体に対する毒性や副作用が低い；（２）環境汚染を低減させる；（３）エマルジョンは安定性が高く、高内相エマルジョンを調製することもできる。しかし、従来の文献において報告されたＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンは生体適合性がない固体粒子又は油相を使用して調製される場合が多いので、生物医薬分野への応用が制限される。例えば、文献（Ｚｈｕｏ  Ａｏ，Ｚｈｉ  Ｙａｎｇ，Ｊｉａｎｆａｎｇ  Ｗａｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈａｏ  Ｚｈａｎｇ，Ｔｏ  Ｎｇａｉ，Ｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｒｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｈｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５：２５７２−２５７４）では、ポリスチレンコロイド粒子を使用して水中油型（ｏ／ｗ）Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンを調製し、更にエマルジョン滴の表面に一層のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（グリコリドラクチド共重合体又はポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）重合体とも呼ばれ、英語名がＰｏｌｙ（１ａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）であり、ＰＬＧ又はＰＬＧＡと略称する）のシェル層を沈殿させて、マイクロカプセル構造を形成することが提案されている。その使用される油相はオクタノールと酢酸エチルの混合液であり、薬物系に使用できず、且つポリスチレンは生分解できない。文献（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｐ．Ｗｈｉｔｂｙ，ＬｉＨｕｉＬｉｍ，Ｎａｓｒｉｎ  Ｇｈｏｕｃｈｉ  Ｅｓｋａｎｄａｒ，Ｓｐｏｍｅｎｋａ  Ｓｉｍｏｖｉｃ，Ｃｌｉｖｅ  Ａ．Ｐｒｅｓｔｉｄｇｅ，Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ａｓ  ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３７５：１４２−１４７）において、生分解性と生体適合性に優れた高分子材料ＰＬＧＡ（ラクチドとグリコリドの重合割合は５０：５０、分子量は４０〜７５ｋＤａである）のナノ粒子を直接使用してＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンを調製することが報告されている。該文献において、油相としてドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）、トルエン（ｔｏｌｕｅｎｅ）、ミリスチン酸イソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）を検討し、その中でもＰＬＧＡナノ粒子はドデカンとポリジメチルシロキサンを油相にする水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンを安定させることができるが、上記油相は薬用佐剤として使用できないため、ワクチンアジュバントとしても使用できない。文献（Ｚｅｎｇｊｉａｎｇ  Ｗｅｉ，Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｗａｎｇ，Ｈａｏ  Ｌｉｕ，Ｓｈｅｎｇｗｅｎ  Ｚｏｕ���Ｚｈｅｎ  Ｔｏｎｇ，Ｆａｃｉｌｅ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ＰＬＧＡ  ｄｒｕｇ−ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  Ｏ／Ｗｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ＳｕｒｆａｃｅｓＢ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１２，９ｌ：９７−１０５）では、二酸化ケイ素ナノ粒子を固体粒子、ＰＬＧＡを含有するジクロロメタンを油相として、二酸化ケイ素ナノ粒子被覆層としてのＰＬＧＡミクロスフェアを調製したが、該系中の二酸化ケイ素とジクロロメタンの臨床使用が制限されるので、該Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンは生物医薬分野に直接応用できない。また、従来の公知文献又は特許において、ワクチンアジュバントとしてのＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンについての研究がなく、既知のＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョン系もワクチン製剤の要求に応じて設計、最適化されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先行技術の問題に対して、本発明はワクチンアジュバントとして界面活性剤を含まない水中油エマルジョンを提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成させるために、本発明は下記の技術案を採用する。
【００１４】
界面活性剤を含まない水中油エマルジョンであって、スクアレン又は／及びトコールを含む代謝可能な油相と、精製水、注射用水、グリセロール水溶液、緩衝食塩水溶液又は臨床的に使用可能な輸液剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである水相と、水相に分散して生体適合性を有する、平均粒子径がナノ−ミクロンスケールの油水両親媒性の固体粒子とを含む。
【００１５】
本発明では、固体粒子は油水両親媒性を有するので、前記水相と前記油相との間の液−液界面に吸着されて、エマルジョン滴を安定させる役割を果たすことができ、固体粒子の平均粒子径がナノ−ミクロンスケールである。
【００１６】
本発明では、ナノ−ミクロンスケールの粒子径を有する固体粒子は免疫アジュバントとして作用することができ、アジュバントとしての作用メカニズムは以下の複数の点にある：１）ナノ−ミクロン粒子は抗原提示細胞を特異的に活性化させて、その摂取量を増加することができる；２）ナノ−ミクロン粒子で抗原を包埋、吸着又は結合することにより、持続的に抗原を放出して、細胞吸収と抗原発現の時間を延長させる；３）一部のナノ−ミクロン粒子（例えば正電荷を有するナノ−ミクロンキトサン粒子）は、プロトンポンプ効果等によって抗原のリソソーム脱出を実現して、抗原の交差提示を実現して、体の細胞の免疫応答を促進する；４）一部のナノ−ミクロン粒子は炎症細胞を集めることで、抗原と抗原提示細胞との間の作用を強化させる。
【００１７】
従って、界面活性剤の代わりとして固体粒子を使用して前記のような界面活性剤を含まない水中油エマルジョンを調製することにより、界面活性剤によるワクチン製剤への悪影響を防止するだけでなく、固体粒子と水中油エマルジョンの免疫相乗作用を利用して、更に全面的で著しく、且つ持続的な免疫保護効果が得られる。該水中油エマルジョンは、界面活性剤を含まないため、界面活性剤による抗原への影響を防止し、製品は優れた安全性及び安定性を有し、更にワクチンの様々な接種ルート方法に用いられてもよい。
【００１８】
また、固体粒子をエマルジョンの安定剤として水中油型エマルジョンを調製する場合に、水中油エマルジョンのアジュバントとして作用する以外、固体粒子自体も免疫アジュバントの作用を果たすこともできる。固体粒子と水中油エマルジョンを組み合わせることにより、両方による免疫強化・調節作用を発揮させて、抗原の使用量を低減させ、抗体レベルを向上させると同時に、抗体タイプの多様性を向上させて、範囲が更に幅広く様々なタイプの抗原に対する抗体を発生できる。
【００１９】
油相はスクアレン及びトコフェロールのうちの１種又は２種の混合物が好ましい。前記スクアレンは、英語名Ｓｑｕａｌｅｎｅのトリテルペノイドであり、分子構造がＣ30Ｈ50のイソプレンであり、分子式が２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサ−２，６，１０，１４，１８，２２−ヘキサエン、ＣＡＳが１１１−０２−４、分子量が４１０．７２であり、動物、植物から抽出しても、化学合成してもよい。スクアレンはコレステロールの生合成中間産物（Ｍｅｒｃｋインデックス、第１０バージョン、登録番号８６１９）であるため、代謝可能な油である。これは、人間を含む全ての高等生物が自然に分泌する油脂（皮脂に存在する）である。スクアレンを含有するエマルジョン（界面活性剤含有）は動物実験や臨床実験において優れた免疫強化作用を示す。
【００２０】
前記トコールはα−トコフェロール又はその誘導体、例えばα−トコフェロールコハク酸エステル（ビタミンＥコハク酸エステルとも呼ばれる）である。α−トコフェロールは、高齢患者（例えば６０歳以上の患者）向けのワクチンにおいて、免疫応答を強化させる作用を果たす。従来のトコールはα、β、γ、δ、ε、ζ等の複数種のトコフェロールを含み、α−トコフェロールが好ましく、ＤＬ−α−トコフェロールが特に好ましい。好ましくは、前記油相と水相は互いに相溶せず、更にその他の代謝可能な油を含んでもよい。
【００２１】
前記水中油エマルジョンがワクチン又は薬物製剤に用いられるようにするため、本発明の前記水中油エマルジョンの油相を代謝可能な油とする。用語である「代謝可能な油」とは本分野において公知するものである。「代謝可能」は「代謝作用によって変換できる」（Ｄｏｒｌａｎｄによる医学辞典に記載の解釈、Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ社、第２５バージョン（１９７４））として定義されている。
【００２２】
典型的な代謝可能な油の例として、受容体に対して無毒で代謝作用によって変換可能な植物油、魚油、動物油又は合成油であれば、ダイズ油、ミグリトール（Ｍｉｇｌｙｏｌ８１２）、中鎖油、魚油、ビタミンＥ、ビタミンＥコハク酸エステル、ビタミンＥ酢酸エステル、サフラワー油、コーンオイル、サジー油、アマニ油、ピーナッツ油、椿油、ヒマワリ油、アーモンドオイル、ハトムギオイル、月見草油、ゴマ油、綿実油、ヒマシ油、低エルカ酸菜種油、オレイン酸エチル、オレイン酸、リノール酸エチル、ラウリン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、酪酸エチル、乳酸エチル、トリカプリルグリセリル又はカプリン酸トリグリセリドのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含むが、これらに制限されない。ナッツ、種子や穀物は一般的な植物油源である。
【００２３】
本発明において、前記水中油エマルジョンの水相は好ましくは注射用水、リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである。前記組合せとして、例えば注射用水とリン酸塩緩衝液の組合せ；クエン酸緩衝液とＴｒｉｓ緩衝液の組合せ；注射用水、リン酸塩緩衝液及びクエン酸緩衝液の組合せ；Ｔｒｉｓ緩衝液、注射用水、リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液の組合せが挙げられる。
【００２４】
好ましくは、前記リン酸塩緩衝液、クエン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液のｐＨ値は独立に５．０〜８．１、例えば５．２、５．４、５．６、５．８、６、６．２、６．４、６．６、６．８、７、７．２、７．４、７．６、７．８又は８、好ましくは６．０〜８．０である。
【００２５】
本発明において、前記水中油エマルジョンの水相は単価又は多価抗原を含んでもよく、前記抗原はヒト抗原、非ヒト動物抗原、植物抗原、細菌抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原又は腫瘍抗原のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含むが、これらに制限されない。前記組合せとして、例えばヒト抗原と非ヒト動物抗原の組合せ；植物抗原と細菌抗原の混合物；真菌抗原、ウイルス抗原及び寄生虫抗原の組合せ；腫瘍抗原、ヒト抗原、非ヒト動物抗原、植物抗原、細菌抗原及び真菌抗原の組合せ；ウイルス抗原、寄生虫抗原、腫瘍抗原、ヒト抗原、非ヒト動物抗原及び植物抗原の組合せ；細菌抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原及び腫瘍抗原の組合せが挙げられる。
【００２６】
前記抗原は、ニワトリ胚培養、細胞培養、キャリア体液、器官又は組織から精製分離することができ、或いは組換え遺伝子発現又は化学合成により得られるが、これらに制限されず、好ましくは、前記抗原は弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、スプリットワクチン、サブユニットワクチン、多糖結合ワクチン、組み換えワクチン又はＤＮＡワクチン等のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せを含むが、これらに制限されない。前記組合せとして、例えば弱毒化ワクチンと不活化ワクチンの組合せ；スプリットワクチンとサブユニットワクチンの組合せ；多糖結合ワクチンと組み換えワクチンの組合せ；ＤＮＡワクチンと弱毒化ワクチンの組合せ；不活化ワクチンとスプリットワクチンの組合せ；サブユニットワクチン、多糖結合ワクチン、組み換えワクチン及びＤＮＡワクチンの組合せが挙げられる。
【００２７】
前記抗原は、少なくとも三種類の季節性インフルエンザ（大流行期間）株由来のウイルス抗原又は抗原性製剤を含み、且つ少なくとも１種の世界的流行の発生を引き起こし又は世界的流行の発生を引き起こす可能性があるインフルエンザウイルス株のウイルス抗原又は抗原性製剤を含んでもよく、その中でも、世界的流行の発生を引き起こし又は世界的流行の発生を引き起こす可能性があるインフルエンザウイルス株は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７を含むヒトインフルエンザウイルスのＡ、Ｂ、Ｃ型；豚インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２；犬や馬インフルエンザウイルスＨ７Ｎ７、Ｈ３Ｎ８；又は鳥類インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ５Ｎ９、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ９Ｎ２、Ｈ５Ｎ２、Ｈ４Ｎ８、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ８Ｎ４、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ６Ｎ５及びＨ１２Ｎ５から選ばれる１種又は２種以上のインフルエンザウイルスの組合せである。
【００２８】
本発明において、前記水相は薬用補助物質、例えばｐＨ調節剤又は／及び緩衝剤等を更に含み、好ましくは酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ−アルギニン塩酸塩、蔗糖、無水Ｄ−海藻糖、マンニトール、マンノース、澱粉又はゼラチンから選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである。前記組合せとして、例えば酢酸ナトリウムと乳酸ナトリウムの組合せ；塩化ナトリウムと塩化カリウムの組合せ；塩化カルシウム、ヒト血清アルブミン及び必須アミノ酸の組合せ；非必須アミノ酸、Ｌ−アルギニン塩酸塩、蔗糖及び無水Ｄ−海藻糖の組合せ；マンニトール、マンノース、澱粉及びゼラチンの組合せ；酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及びヒト血清アルブミンの組合せ；必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ−アルギニン塩酸塩、蔗糖、無水Ｄ−海藻糖、マンニトール、マンノース、澱粉及びゼラチンの組合せが挙げられる。
【００２９】
本発明において、前記水中油エマルジョンに少なくとも１種の固体粒子を含む。本発明の前記水中油エマルジョンにおける固体粒子は生体適合性を有し、アルミニウム塩、カルシウム塩、多糖、多糖誘導体又は高分子重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物である。
【００３０】
好ましくは、前記アルミニウム塩は水酸化アルミニウム又は／及びリン酸アルミニウムである。好ましくは、前記カルシウム塩はリン酸カルシウム又は／及び炭酸カルシウムである。
【００３１】
好ましくは、前記多糖はキトサン、アルギン酸、ゼラチン、澱粉、グルカン、コンニャクグルコマンナン、ヘパリン、ペクチン系多糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン塩、アルギン酸塩、ゼラチン塩、グルコース塩、コンニャクグルコマンナン塩、ヘパリン塩、ペクチン系多糖塩、ヒアルロン酸塩又はコンドロイチン硫酸塩から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の組合せ、好ましくは、キトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、澱粉又はグルカンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである。
【００３２】
好ましくは、前記多糖誘導体は多糖に対して四級化反応、カルボキシメチル化、ヒドロキシ化、アルキル化、アシル化、スルホン化、硝化又はハロゲン化等の誘導体化反応を行って得た多糖誘導体であり、好ましくは、バラキトサン、アルギン酸、ゼラチン、澱粉又はグルカンのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せに対して四級化反応、カルボキシメチル化、ヒドロキシ化、アルキル化、アシル化、スルホン化、硝化又はハロゲン化等の誘導体化反応を行って得た多糖誘導体である。
【００３３】
本発明では、使用される抗原の大きさ、所望した放出速度等の要因により適当な分子量を決める。キトサンの場合、適当な分子量は例えば約５万〜９０万ダルトン、好ましくは１０万〜８０万ダルトンである。
【００３４】
好ましくは、前記高分子重合体はポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物又はポリシアノアクリレート及びその共重合体を含み、前記共重合体の共重合単量体は好ましくはポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物又はポリシアノアクリレートのうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せである。前記組合せとして、例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）とポリヒドロキシ酪酸の組合せ；ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物の組合せ；ポリシアノアクリレート、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン及びポリオルトエステルの組合せ；ポリ無水物、ポリシアノアクリレート及びポリ（α−ヒドロキシ酸）の組合せ；ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びポリシアノアクリレートの組合せが挙げられる。
【００３５】
好ましくは、前記高分子重合体はポリ（α−ヒドロキシ酸）及びその共重合体であり、好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）又はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から選ばれ、最も好ましい重合体は「ＰＬＧ」又は「ＰＬＧＡ」と呼ばれるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（グリコリドラクチド共重合体又はポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）重合体とも呼ばれ、英語名はＰｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）で、ＰＬＧ又はＰＬＧＡと略称する）である。
【００３６】
好ましくは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）において、ラクチドとグリコリドのセグメントのモル比は１０：９０〜９０：１０である。セグメントのモル比が材料の親水性・疎水性及び分解速度に影響し、例えば、５０％のＤ,Ｌ−ラクチドと５０％のグリコリドを含む５０：５０のＰＬＧＡ重合体は分解速度が高く、それによってラクチド量が増加し、７５：２５のＰＬＧＡは分解速度が低い。
【００３７】
界面活性剤を含まない水中油エマルジョンの一例は、代謝可能な油相としてスクアレンと、水相として精製水、注射用水、グリセロール水溶液、緩衝食塩水溶液又は臨床的に使用可能な輸液剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せと、水相に分散して生体適合性を有する、平均粒子径がナノ−ミクロンスケールのＰＬＧＡ油水両親媒性の固体粒子とを含む。
【００３８】
これらの重合体は公知のプロセスによって様々な分子量を有するものが調製でき、使用される抗原の大きさ、所望した放出速度等の要因により適当な分子量を決めることができる。ポリ（Ｌ−ラクチド）とポリ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）の場合、例えば適当な分子量は約２０００〜５０００ダルトンである。ＰＬＧＡの場合、適当な分子量は通常約１００００〜約２０００００ダルトン、好ましくは約１３０００〜約１５００００ダルトンである。
【００３９】
好ましくは、前記固体粒子は水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、キトサン、アルギン酸塩、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリエチレングリコール−乳酸共重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物、更に好ましくは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体又はポリエチレングリコール−乳酸共重合体から選ばれるいずれか１種又は少なくとも２種の混合物、最も好ましくはポリ乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体である。
【００４０】
「水酸化アルミニウム」は一般的に水酸化酸化アルミニウム塩であり、通常少なくとも部分的に結晶化する。水酸化酸化アルミニウムは分子式ＡｌＯ（ＯＨ）に示され、その他のアルミニウム化合物、例えば水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）3に比べて、赤外線（ＩＲ）スペクトルにおいて、特に１０７０ｃｍ-1で吸収バンド、３０９０〜３１００ｃｍ-1で強烈なショルダーピークがある。水酸化アルミニウムは典型的な繊維形態を示し、水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩが通常約１１であり、即ち、生理的ｐＨでアジュバント自体に表面正電荷がある。ｐＨが７．４である場合は、水酸化アルミニウムの吸着能力について、１ｍｇのＡｌ3+が１．８〜２．６ｍｇのタンパク質を吸着できる。市販水酸化アルミニウムはロット間にバラツキが存在するため、現在デンマーク製のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）が一般に認められた標準となり、コロイド粒子のサイズが３．０７μｍである。「リン酸アルミニウム」は一般的にヒドロキシリン酸アルミニウムであり、少量の硫酸根（即ち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）を含む場合もよくある。これらのアジュバントは沈殿によって入手し得る。リン酸アルミニウムは通常粒子状である。これらの粒子は任意の抗原を吸着した後の直径が代表的に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）である。ｐＨが７．４である場合、リン酸アルミニウムの吸着能力について、１ｍｇのＡｌ3+が０．７〜１．５ｍｇのタンパク質を吸着できる。
【００４１】
カルシウム塩のうち、本発明の固体粒子としてリン酸カルシウムが好ましく使用される。従来、リン酸カルシウムの各種アジュバント形式が報告されており、本発明ではこれらのいずれかが使用可能である。アジュバントとして、寸法約１０ｎｍ×１５０ｎｍの針状粒子及び直径約２０〜３０ｎｍの不規則的な形状のシートにしてもよい。粒子の直径が３００〜４０００ｎｍ（ナノ粒子）で、形状が球状で表面が平滑である粒子状リン酸カルシウム（「ＣＡＰ」）も報告された。上記リン酸カルシウムのいずれによっても本発明を実現することができる。本発明では、前記固体粒子の形状として、球状、ロッド状、紡錘状、ディスク状、立方体、ピーナッツ状又は無定形等の複数種の形状を取り得て、固体粒子の形態として、滑らかな表面、多孔質表面、マルチチャンバの内部、中空又はシングルホール等の複数種の形態を取り得て、当業者であれば、使用される油相や水相、及び抗原の性質に応じて、有限のプロセスによって最適化させてスクリーニングして使用要求を満たす水中油エマルジョンを得ることができる。
【００４２】
本発明において、前記水中油エマルジョン中の固体粒子は油水両親媒性を有するため、油相と水相の界面に安定的に分散して、エマルジョンを安定させる作用を果たす。油水系に応じて、適当な油水両親媒性の固体粒子を使用してエマルジョンを安定させても、固体粒子の表面に対して親水又は疎水性修飾、被覆又はグラフト変性等を行って、適宜な両親媒性（又は粒子濡れ性（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ、一般的にｏｉｌ−ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｉｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎｇｌｅ  θowで示される））を得ることができる。
【００４３】
好ましくは、前記固体粒子の表面又は内部にターゲット物質、蛍光マーカー、同位体マーカー、環境応答物質、サイトカイン、抗体又は免疫調節剤等の機能性物質を吸着、結合又は包埋する。前記環境応答物質はｐＨ感受性、熱感受性又は生物学的活性物質感受性等を有する基から選ばれる。
【００４４】
前記固体粒子の表面又は内部に抗原を吸着、結合又は包埋してもよく、抗原の輸送システムとして、抗原の安定性を向上させ、抗原提示細胞の抗原摂取を促進して、免疫応答を強化させることができる。
【００４５】
前記固体粒子は複数種の方法によって調製できる。例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）固体粒子は、溶剤蒸発法、溶剤抽出法、沈殿法等の複数種の方法によって調製可能である。キトサン固体粒子は、単一エマルジョン法（油中水エマルジョンを形成する）と化学架橋法（例えば油相に溶解したグルタルアルデヒドで架橋させる）の組み合わせにより調製しても、噴霧乾燥法又は沈殿法によって調製してもよい。
【００４６】
調製後、固体微粒子を水溶液又は緩衝溶液に保存してもよいし、凍結乾燥させて使用に備えてもよい。
【００４７】
好ましくは、前記固体粒子の平均粒子径は１ｎｍ〜１０μｍ、例えば５ｎｍ、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ又は９μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５μｍである。
【００４８】
好ましくは、前記固体粒子の粒子径分布係数のｓｐａｎ値は１．０未満である。
【００４９】
好ましくは、水相中の固体粒子の質量濃度は０．１〜２０ｗｔ％、例えば０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、３ｗｔ％、４ｗｔ％、５ｗｔ％、６ｗｔ％、７ｗｔ％、８ｗｔ％、９ｗｔ％、１０ｗｔ％、１１ｗｔ％、１２ｗｔ％、１３ｗｔ％、１４ｗｔ％、１５ｗｔ％、１６ｗｔ％、１７ｗｔ％、１８ｗｔ％又は１９ｗｔ％、好ましくは０．５〜１０ｗｔ％、更に好ましくは１〜８ｗｔ％である。水相中の前記固体粒子の質量濃度は固体粒子の質量を固体粒子と水相の全質量で割って得た値である。
【００５０】
好ましくは、本発明において、前記水中油エマルジョンの油相と水相の体積比が１：１００〜９：１、例えば１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１又は８：１、好ましくは１：５０〜１：２である。
【００５１】
好ましくは、前記水中油エマルジョンにおいて、エマルジョン滴の平均粒子径が５０ｎｍ〜３００μｍ、例えば１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍ、１μｍ、１０μｍ、３０μｍ、５０μｍ、８０μｍ、１１０μｍ、１４０μｍ、１７０μｍ、２００μｍ、２３０μｍ、２６０μｍ又は２９０μｍ、好ましくは１００ｎｍ〜１００μｍである。
【００５２】
本発明の前記水中油エマルジョンには、薬用添加剤を更に含んでもよく、前記薬用添加剤として、例えば希釈剤、安定剤又は防腐剤のうちのいずれか１種又は少なくとも２種の組合せが含まれる。
【００５３】
本発明の前記水中油エマルジョンには、アジュバントとして、パターン認識受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、ＲＩＧ−１とＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）の刺激剤、例えばＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド又は二本鎖ＲＮＡ、或いは、回文配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）、鉱物塩（例えばミョウバン、腸内細菌（例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ、ネズミチフス菌、又は赤痢菌）のモノホスホリルリピド（ｍｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄ、ＭＰＬ）Ａに結合されたミョウバン、又は、それぞれＭＰＬ（登録商標)（ＡＳ０４）、上記細菌ＭＰＬＡに特異的に結合されたミョウバン）、ＭＰＬ、サポニン（例えばＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ、ｉｓｃｏＭｓ、ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標登録））、リポソームやリポソーム製剤（例えばＡＳ０１）、合成又は特別に調製された微粒子とマイクロキャリア（例えば淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、クラミジアトラコマチス及びその他の細菌の細菌由来外膜小胞（ＯＭＶ））、多糖（例えばキトサン）、特異的修飾又は調製されたペプチド（例えばムラミルジペプチド）、アミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（例えばＲＣ５２９）、又はタンパク質（例えば細菌トキソイド又は毒素フラグメント）、選択可能な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、小分子免疫増強剤（ＳＭＩＰ）、サイトカイン及びケモカインを含んでもよいが、これらに制限されない。サイトカインとして、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（例えばインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ等）、インターロイキン（例えばインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８））、胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＩｔ３Ｌ）又は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）等を含んでもよいが、これらに制限されない。
【００５４】
本発明では、前記水中油エマルジョンは複数種の方法によって調製できる。具体的に、本発明の前記水中油エマルジョンは下記方法によって調製できるが、下記調製方法に制限されない。
【００５５】
本発明において、前記水中油エマルジョンは先ず固体粒子を水相に分散させ、次に油相と水相を混合することによって調製できる。固体粒子の分散方法として、振とう、撹拌、超音波処理（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）等の方法を使用して、固体粒子を水相に良好に分散させることができる。粒子を水相によく分散できる上、使用される分散方法が水中油エマルジョンの性質に顕著な影響を与えない限り、使用される水相及び固体粒子の性質、自体の実験装置条件に基づいて適当な分散方法及び具体的な操作パラメータを選択することができる。油相と水相の混合には、微流動化（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、均質化（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、超音波処理、ツーシリンジ注射器による乳化（Ｔｗｏ−ｓｙｒｉｎｇｅ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、噴霧、マイクロジェット、マイクロチャネル（Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｅ  ｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、膜乳化（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、撹拌、振とう、反転又は手動振動による混合等の複数種の方法から選択することができる。必要に応じて、混合方法として、微流動化、マイクロチャネル又は膜乳化等の粒子径分布が均一なエマルジョンを調製できる方法が好ましく使用され、更に、マイクロジェット、ツーシリンジ注射器による乳化、均質化、撹拌又は振とう等の量産に適する混合方法が好ましく使用されてもよい。なお、油相と水相の混合方法は得たエマルジョンにおけるエマルジョン滴の粒子径の大きさ、エマルジョンの安定性等に影響を及ぼし、更に最終的な免疫又は投与効果にも影響を与える。本発明の一実施例に示されるように、機械撹拌に比べて、膜乳化方法によれば、粒子径分布がより均一で、エマルジョン滴が更に小さいエマルジョンが得られ、更に高い抗体レベルに達する。従って、使用される油相と水相、及び固体粒子の性質、調製しようとするエマルジョン滴の粒子径範囲等の要因に基づき、適当な混合方法を使用して、具体的な操作パラメータを設定する。
【００５６】
本発明に係る前記水中油エマルジョンにおける固体粒子、油相、水相はそれぞれ独立に包装して、使用前に前記調製方法に応じて、一時的に混合してもよいし、前記調製方法に応じて予めそのうちの２種又は３種を混合してもよい。
【００５７】
本発明の前記水中油エマルジョンの滅菌方法として、湿熱滅菌又は濾過滅菌が使用可能であり、使用される粒子の粒子径が２２０ｎｍ未満である場合は、濾過滅菌方法が好ましい。
【００５８】
水中油エマルジョンに抗原が含まれる場合、前記水中油エマルジョンは抗原と独立に包装して、免疫接種前に一時的に混合し、又は短い時間間隔内（通常、１時間以下）で同一部位に接種してもよいし、前記調製方法に応じて、混合後に包装して、免疫接種時に直接使用してもよい。
【００５９】
本発明の別の目的は（１）抗原又は抗原組成物、及び（２）前記水中油エマルジョンからなるアジュバント組成物を含む界面活性剤を含まない免疫原性組成物を提供することである。
【００６０】
本発明の更なる目的は、上記水中油エマルジョンのワクチンアジュバント、薬物送達又は徐放性担体としての用途を提供することである。本発明では、免疫接種又は投与方法は、静脈内注射、脊髄腔注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、経呼吸器噴霧又は吸入、腹腔内注射、経鼻投与、眼内投与、経口投与、経直腸投与、経腟投与、局所投与又は経皮投与を含む。前記水中油エマルジョンはワクチンアジュバントとして人間、家畜、家禽及び水産物に用いられる。
【発明の効果】
【００６１】
先行技術に比べて、本発明は下記有益な効果を有する。
【００６２】
本発明は、初めて固体粒子と油乳製剤（水中油エマルジョン）を混合して界面活性剤を含まない水中油エマルジョンを調製して、ワクチンアジュバントの開発分野に用いる。固体粒子の添加によって、製剤の生体適合性を向上させ、界面活性剤による人体、動物又はワクチンへの悪影響を防止するだけでなく、免疫細胞をより効果的に刺激して、免疫調節機能を活性化させることができる。その同時に、固体粒子は、性質が制御しやすく、表面修飾又は被覆を行い、又は性質（例えば組成、形態、構造、粒子径等）が異なる固体粒子を使用して、異なる免疫強化メカニズムを発揮させること、及び抗原を包埋、吸着又は結合して、抗原の輸送担体として、抗原の制御放出能力を利用して免疫応答を調節することが可能であり、更に、複数種の免疫接種方法に適用できる。
【００６３】
本発明に係る水中油エマルジョンの主な免疫強化メカニズムは以下を含む。
【００６４】
（１）使用される粒子で抗原を吸着又は包埋することによって、該水中油エマルジョンは抗原の放出速度を低減させて、抗原を加水分解から保護して、抗原の体内での滞留時間を延長させることにより、高親和力抗体の発生に役立つ。（２）粒子はマクロファージを活性化させてマクロファージとＴ及びβ細胞との相互作用を促進することで、リンパ細胞に対して特異的な刺激強化作用を果たす。（３）使用される粒子で抗原を吸着又は包埋することにより、抗原の表面積を増加して、抗原がマクロファージに貪食されやすくなる。（４）水中油エマルジョンは注射部位で僅かな炎症応答を引き起こして、炎症細胞を集め、炎症因子の分泌を刺激して、免疫応答を活性化させることもできる。（５）特定の粒子、例えばｐＨ感受性を有するキトサン粒子は、抗原を吸着又は包埋することで、抗原のリソソーム脱出を実現して、細胞免疫応答を強化させることができる。
【００６５】
また、本発明に係る水中油エマルジョンは薬物送達又は徐放性担体にも使用可能であり、脂溶性薬物、蛍光マーカー又はその他の生物学的活性物質を油相に分散させ、又は薬物、蛍光マーカー又はその他の生物学的活性物質を粒子表面に包埋又は吸着することで、薬物の制御放出を実現することができる。粒子の表面又は内部にターゲット物質（例えばＦｅ3Ｏ4、葉酸、マンノース等）を結合又は包埋することにより、該粒子を含む水中油エマルジョンを薬物、蛍光マーカー又はその他の生物学的活性物質の標的化送達に用いることが可能である。
【００６６】
従って、本発明で開示されている水中油エマルジョンはワクチンの免疫アジュバントとしても、薬物又はその他の生物学的活性物質の送達又は徐放性担体としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】は水中油型Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンの模式図である。
【図２】は実施例１で調製されたＰＬＧＡ粒子の粒子径分布図である。
【図３】は実施例１で調製されたＰＬＧＡ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】は実施例１で調製されたＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンの光学顕微鏡写真（２０倍拡大）である。
【図５】は実施例１で調製されたＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンの遠心処理前後の写真（１遠心前、２遠心後）である。
【図６】は実施例２で調製された水酸化アルミニウム粒子の粒子径分布図である。
【図７】は実施例２で調製されたＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンの光学顕微鏡写真（２０倍拡大）である。
【図８】は実施例４で調製されたＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下は図面を参照して具体的な実施形態によって本発明の技術案を更に説明する。
【００６９】
本発明は以下の実施例によって実現できるが、以下の実施例の原料、器械、割合、組成、方法、工程に制限されない。なお、以下検討する実施例及び実施形態は説明するためのものに過ぎず、当業者であれば、各種の改良や変更を行うことができ、これらの改良や変更は本願の主旨及び添付した特許請求の範囲に属される。
【００７０】
原料表
【表２−１】
0006434995.tif 000005
【表２−２】
0006434995.tif 000006
【表２−３】
0006434995.tif 000007
【００７１】
【表３】
0006434995.tif 000008
【００７２】
特性評価
【００７３】
粒子又はエマルジョン滴の粒子径分布測定
ミクロン粒子又はエマルジョン滴の粒子径分布の測定はレーザー粒度分析器を使用して行われ、具体的な測定工程は、５ｍｇのミクロン粒子を５０ｍＬの脱イオン水に添加して、５ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させ、又は、５０ｍＬのエマルジョンを使用し、粒子懸濁液又はエマルジョンを試料セルに添加して、レーザー粒度分析器（Ｍａ１ｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏ．,ＵＳＡ）を使用して測定することである。
【００７４】
ナノ粒子又はエマルジョン滴の粒子径分布の測定はＺｅｔａ電位粒度分析装置を使用して行われ、具体的な測定工程は、１ｍｇのナノ粒子を１０ｍＬの脱イオン水に添加して、５ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させ、又は２ｍＬのエマルジョンを使用し、粒子懸濁液又はエマルジョンを試料セルに添加して、Ｚｅｔａ電位測定装置（Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に入れて測定することである。
【００７５】
粒子又はエマルジョン滴の均一性は粒子径分布係数（Ｓｐａｎ）値として表示される。Ｓｐａｎ算式は以下のとおりであり、値が小さいほど、粒子の粒子径が均一になる。
【００７６】
Ｓｐａｎ＝（ｄ90−ｄ10）／ｄ50        （１）
【００７７】
式（１）中、ｄ10、ｄ50及びｄ90はそれぞれ粒子累積体積が１０％、５０％、９０％である時の粒子径である。
【００７８】
走査型電子顕微鏡による粒子形態の観察
１ｍｇの粒子を秤量して、１０ｍＬの脱イオン水に添加し、５ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させた。１ｍＬの懸濁液を吸い取って、アルミ箔に滴下し、アルミ箔において均一に広げ、自然乾燥させた。アルミ箔を導電性接着剤で試料台に貼り付け、真空条件において金粒子を蒸着し（サンプルの性質に応じて適当な条件とする）、その後、走査型電子顕微鏡で観察する。
【００７９】
光学顕微鏡によるエマルジョン滴の形態観察
水中油エマルジョンを少量吸い取って、スライドに滴下し、光学顕微鏡で観察する。
【００８０】
遠心法によるエマルジョンの安定性測定
５ｍＬの水中油エマルジョンを１５ｍＬの遠心分離管に入れ、２０００ｇの遠心力の作用下で１０ｍｉｎ遠心分離後、分層状況を観察する。
【００８１】
粒子における抗原又は薬物の包埋率及び担持量の測定
【００８２】
１０ｍｇの薬物担持粒子凍結粉末を正確に秤量して、適当な方法によってミクロスフェアを完全に分解し（例えば、ポリ乳酸系ミクロスフェアの場合に、ＮａＯＨ溶液又はアセトニトリルを添加する方法でミクロスフェアを分解し、キトサン系ミクロスフェアの場合に、希塩酸を添加する方法でミクロスフェアを分解する）。粒子が完全に分解した後、ＮａＯＨ又は塩酸で分解液を中和して、ｐＨ＝７にした後、２ｍＬまで定容した。抗原又は薬物含有量はＢＣＡキット、ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキット又はその他の適当な検出方法で測定される。抗原又は薬物の包埋率は下式により計算する。
【００８３】
包埋率＝（粒子における抗原又は薬物の実測量／調製際の抗原又は薬物の実際添加量）×１００％
【００８４】
抗原又は薬物の粒子での担持量は下式により計算する。
【００８５】
担持量＝（粒子における抗原又は薬物の実測量／測定した粒子質量）
【００８６】
粒子に吸着した抗原又は薬物の吸着率及び担持量の測定
【００８７】
抗原又は薬物を吸着した粒子懸濁液を取り、遠心分離して上澄み液（粒子の大きさ及び密度に応じて適当な遠心条件とする）を得て、上澄み液中の抗原又は薬物濃度を測定することで、粒子の表面に吸着した抗原又は薬物の量を間接的に算出した。抗原又は薬物の含有量はＢＣＡ、ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキット又はその他の適当な検出方法で測定される。抗原又は薬物吸着率は下式により計算される。
【００８８】
吸着率＝（吸着前の抗原又は薬物濃度−吸着後の上澄み液中の抗原又は薬物濃度）／吸着前の抗原又は薬物濃度×１００％
【００８９】
抗原又は薬物の粒子での担持量は下式により計算される。
【００９０】
担持量＝（粒子における抗原又は薬物の実測量／測定した粒子質量）
【００９１】
動物実験の測定
【００９２】
実験用のＢａｌｂ／ｃマウスはｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ社に提供される。先ず、マウスをランダムにグループに分け、各グループから６匹以上のマウスを選択して実験を行い、実施例の具体的な説明により、マウスをグループに分けて免疫接種を行った。接種前に、２００μＬ採血し、採血直後に１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して、血清を得て、ＩｇＧ抗体レベルを測定し、この際のＩｇＧ抗体レベルを初期値とし、次に、マウスを免疫した。免疫後、マウスの眼周囲又は尾端から２００μＬの採血量で定時的に採血し、ＩｇＧ抗体レベルを測定した。二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺して採血し、ＩｇＧ抗体レベルを測定した（インフルエンザワクチンの場合は、血球凝集力価（ＨＩ）も測定する）。マウスの脾臓細胞を培養して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってマウス脾臓細胞培養液の上澄み液におけるＩＬ−４とＩＦＮ−γサイトカインの分泌状況を検出する。
【００９３】
実施例１：ポリＰＬＧＡ粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【００９４】
ナノ沈殿法によるＰＬＧＡ粒子の調製
【００９５】
電子天秤で０．３０ｇのＰＬＧＡ（ＬＡ：ＧＡ５０：５０、分子量１１万ダルトン）を正確に秤量して、１ｍＬのアセトンに溶解し、該溶液を９号針で１秒間に１滴の速度で２０ｍＬの水溶液（１ｗｔ．％のＰＶＡ（アルコール分解度９９％、粘度５．０ｍＰａ・ｓ）含有、磁気撹拌、回転数５００ｒｐｍ）に滴下し、２５℃で撹拌して一晩放置し、２００００ｇで２０ｍｉｎ遠心分離して、上澄み液を捨てて、沈殿に５ｍＬの脱イオン水を加えて、超音波分散させ、２００００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して、上澄み液を捨てた後、沈殿を凍結乾燥させてＰＬＧＡ粒子を得て、冷蔵庫に入れて４℃で保存した。調製されたＰＬＧＡ粒子は平均粒子径が２２６ｎｍ、Ｓｐａｎが０．５３５である。調製された粒子を走査型電子顕微鏡で観察した結果、表面が滑らかで、規則的な球状である。粒子の粒子径分布図は図２、形態は図３に示される。
【００９６】
水中油エマルジョンの調製
【００９７】
電子天秤で０．５０ｇのＰＬＧＡ粒子を正確に秤量して、４０ｍＬの脱イオン水に添加し、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで、水相のｐＨ値は６．５である。ピペットを使用して１ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に加え、均質化（１５０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）乳化法によって、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が１８．９μｍ、Ｓｐａｎが０．８９５である。エマルジョンの安定性を遠心法によって検出され、調製された水中油エマルジョンの外観は未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。エマルジョンの光学顕微鏡写真は図４、エマルジョンの遠心前後の写真は図５に示される。
【００９８】
そのほかのＰＬＡ系粒子を使用して水中油エマルジョンを調製してもよく、調製工程は実施例１と類似し、具体的なプロセスパラメータ及び結果は表１に示される。
【００９９】
表１
【０１００】
【表４】
0006434995.tif 000009
【０１０１】
実施例２：水酸化アルミニウム粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１０２】
マイクロエマルジョン法による水酸化アルミニウム粒子の調製
【０１０３】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｎ−ブチルアルコール及びシクロヘキサンを１：０．５：２０の体積比で混合して磁気撹拌し（８００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）混合して油相を得た。注射器推進ポンプを使用して２ｍＬ／ｍｉｎの速度で磁気撹拌（５００ｒｐｍ）している油相２０ｍＬに１ｍｏｌ／ＬのＡｌＣｌ3溶液（２ｍＬ）を滴下して、塩化アルミニウムの逆相マイクロエマルジョンを得た。注射器推進ポンプを使用してアンモニア水を０．５ｍＬ／ｍｉｎの滴下速度で上記逆相マイクロエマルジョンに滴下し、反応系のｐＨ値を１０．０より高く保持しながら２ｈ反応させた後、１０ｍＬのアセトンを添加して解乳化し、遠心分離（１５０００ｇ、５ｍｉｎ）後に上澄み液を捨てて、無水エタノールで３回洗浄し、脱イオン水で１回洗浄し、最終的に凍結乾燥させて水酸化アルミニウム粒子を得て、冷蔵庫に入れて４℃で保存した。粒子の平均粒子径は１２０．５ｎｍ、Ｓｐａｎは０．４８６である。調製された粒子は形態が略球体である。粒子の粒子径分布図は図６に示される。
【０１０４】
水中油エマルジョンの調製
【０１０５】
電子天秤で０．７２ｇの水酸化アルミニウム粒子を正確に秤量して、４０ｍＬのリン酸塩緩衝溶液に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで水相のｐＨ値は７．４である。ピペットで２ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、均質化（２００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）乳化方法によって、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が７．４μｍ、Ｓｐａｎが０．６９６である。調製された水中油エマルジョンは外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。エマルジョンの光学顕微鏡写真は図７に示される。
【０１０６】
実施例３：リン酸カルシウム粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１０７】
テンプレート法による中空リン酸カルシウム粒子の調製
【０１０８】
３．０ｇのＴｗｅｅｎ８０、０．２５ｇのＰＥＧ６０００、３．０ｍＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１．５ｍＬの脱イオン水を混合して均一に撹拌した後、２０ｍｉｎ（１０Ｗ）超音波処理して非イオン界面活性剤のベシクルを形成し、３．５５ｍＬのＣａＣｌ2（０．１７５ｍｏｌ／Ｌ）溶液に滴下し、０．５ｈ撹拌後、３．５５ｍＬのＮａ2ＨＰＯ4（０．１７５ｍｏｌ／Ｌ）溶液を添加してリン酸ナトリウム粒子の懸濁液を得て、０．８３ｍＬのＭｇＣｌ2溶液（０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して形成したばかりのリン酸カルシウム粒子を安定させ、更に２ｈ撹拌後に、遠心分離して洗浄し、真空乾燥させて中空リン酸カルシウム粒子を得た。粒子は平均粒子径が２１０ｎｍ、シェル層の厚さが３０〜４０ｎｍ、Ｓｐａｎが０．３４９である。調製された粒子は中空球体であった。
【０１０９】
水中油エマルジョンの調製
【０１１０】
電子天秤で１．００ｇの中空リン酸カルシウム粒子を正確に秤量して、２０ｍＬのクエン酸緩衝溶液に加え、２ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させ、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで水相のｐＨ値は６．０である。ピペットで２ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、磁気撹拌（５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）乳化方法によって、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が１０．２μｍ、Ｓｐａｎが０．６９６である。調製された水中油エマルジョンは外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１１１】
実施例４：キトサン被覆アルギン酸粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１１２】
高速膜乳化技術によるキトサン被覆アルギン酸粒子の調製
【０１１３】
先ず、石油エーテル（沸点範囲６０〜９０℃）と液体パラフィンを２：１の体積比で混合して、混合有機相に質量百分率が４ｗｔ．％の乳化剤Ｓｐａｎ８０を添加し、上記混合物を油相、アルギン酸ナトリウム水溶液（１．０ｗｔ％）を水相とした。２ｍＬの水相と６０ｍＬの油相を均質化（３６００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）の作用下で乳化してプレエマルジョンを形成し、続いて、プレエマルジョンを高速膜乳化タンクに添加し、窒素ガスの圧力下（１ＭＰａ）で、プレエマルジョンをＳＰＧ膜（膜孔径１．４μｍ）を通過させて、５回繰り返して、均一なエマルジョンを得た。ＣａＣｌ2溶液（５ｍｏｌ／Ｌ、１２ｍＬ）を硬化剤として、超音波処理（１２０Ｗ、１ｍｉｎ）によって油相（２４ｍＬ）に分散させてミニエマルジョンを形成した。該ミニエマルジョンと上記で得た均一なエマルジョンを混合した後に、３７℃の水浴において５ｈ（２５０ｒｐｍ）撹拌してエマルジョンを硬化してコロイド粒子を得て、石油エーテル、エタノール、水を使用してそれぞれ３回洗浄して、アルギン酸粒子を得た。
【０１１４】
アルギン酸粒子にキトサンを被覆する工程は以下を含む：先ず、１ｇのアルギン酸粒子を０．７ｗｔ％のキトサン酢酸溶液（２０ｍＬ、キトサン分子量８０万ダルトン、脱アセチル化度９０％）に分散させ、１ｈ（２００ｒｐｍ）撹拌後、粒子を酢酸緩衝溶液（ｐＨ４、ｐＨ５．５）及び脱イオン水できれいに洗浄し、キトサンで被覆されたアルギン酸粒子を得た。更に、粒子に対して複数回コーティングしてもよく、工程は以下のとおりである：被覆されたコロイド粒子（１ｇ）を０．５ｗｔ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）に分散させて、１ｈ（２００ｒｐｍ）撹拌し、脱イオン水で一回洗浄した後、粒子を０．７ｗｔ％のキトサン酢酸溶液（２０ｍＬ）に分散させて、１ｈ（２００ｒｐｍ）撹拌する。次に、粒子を酢酸緩衝溶液（ｐＨ４、ｐＨ５．５）と脱イオン水で洗浄して、二重被覆キトサン−アルギン酸粒子を得た。上記工程を複数回繰り返して、キトサンを複数回被覆したアルギン酸粒子を得た。本発明では、アルギン酸粒子に対して３回被覆し、粒子の平均粒子径が４５７ｎｍ、粒子のＳｐａｎが０．８３９である。調製された粒子は表面が荒れて、規則的な球状である。
【０１１５】
水中油エマルジョンの調製
【０１１６】
電子天秤で１．２２ｇのキトサン被覆アルギン酸粒子を正確に秤量して、１０ｍＬのリン酸塩緩衝溶液に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで水相のｐＨ値は８．０である。ピペットで２ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、渦巻き振とう（１０ｍｉｎ）乳化方法により、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴の平均粒子径は１０．２μｍ、Ｓｐａｎは０．７４１である。調製された水中油エマルジョンを遠心分離した後、上層に１ｃｍ程度の油相が析出された。エマルジョンの写真は図８に示される。
【０１１７】
実施例５：モノメトキシポリエチレングリコール−乳酸共重合体（ＰＥＬＡ）多孔質粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１１８】
相分離−溶剤除去法によるＰＥＬＡ多孔質粒子の調製
【０１１９】
１００ｍｇのＰＥＬＡ（ｍＰＥＧ：ＰＬＡモル比１：１９、平均分子量４０ｋＤａ）を７．５ｍＬのアセトンに溶解して、７．５ｍＬの無水エタノール溶液に加え、上記溶液を（１滴／ｓ）で急速に撹拌している（７５０ｒｐｍ）脱イオン水（９０ｍＬ、１０ｇ／ＬＳＤＳを含有する）に滴下し、滴下終了後、更に２４ｈ（７５０ｒｐｍ）撹拌する。脱イオン水で遠心分離して５回洗浄した後、沈殿を１０ｍＬの脱イオン水に懸濁させて保存して、ＰＥＬＡ粒子懸濁液とする。
【０１２０】
３ｍＬの脱イオン水に２００μＬのジクロロメタンを加え、超音波細胞破砕装置（４００Ｗ、６０ｓ）に投入して均一に混合して膨潤剤とする。上記ＰＥＬＡ粒子懸濁液２ｍＬを溶剤に加えて、更に磁気撹拌して（２５０ｒｐｍ）３０ｍｉｎ膨潤させ、１ｈ静置後に迅速に液体窒素に投入して迅速に冷凍し、−２０℃で保存して有機溶剤を揮発させて多孔質構造を有するＰＥＬＡ粒子を得た。粒子の平均粒子径は７８．５５ｎｍ、Ｓｐａｎは０．３３１であり、粒子は表面が多孔質の球状構造である。
【０１２１】
水中油エマルジョンの調製
【０１２２】
電子天秤で０．３５１ｇのＰＥＬＡ粒子を正確に秤量して、１０ｍＬの注射用水に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで水相のｐＨ値は７．０である。油相として２ｍＬのα−トコフェロールを使用し、順テーパー型微流動化乳化方法（コーンポートの直径範囲２０〜４０μｍ、油相流速範囲５００〜６００μＬ／ｈ、水相流速範囲１０００〜１２００μＬ／ｈ）により、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴の平均粒子径は７０μｍ、Ｓｐａｎは０．０９６である。調製された水中油エマルジョンの外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１２３】
実施例６：ピーナッツ状の炭酸カルシウム粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１２４】
液相直接混合沈殿法によるピーナッツ状の炭酸カルシウム粒子の調製
【０１２５】
電子天秤で酢酸カルシウムとクエン酸三ナトリウムを秤量して２００ｍＬの蒸留水（クエン酸三ナトリウムの質量濃度はそれぞれ１０ｗｔ．％と３０ｗｔ．％である）に溶解し、該溶液に１０ｗｔ．％の炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて、撹拌しながら（３００ｒｐｍ）３ｈ反応させ、濾過して、蒸留水及び無水エタノールでそれぞれ沈殿を３回洗浄した後、７０℃で乾燥させて、ピーナッツ状の炭酸カルシウム粒子を得た。粒子は長さが７．２μｍ、長短軸比が２：１であり、調製された粒子の形態がピーナッツ状である。
【０１２６】
水中油エマルジョンの調製
【０１２７】
電子天秤で３．１５ｇの炭酸カルシウム粒子を正確に秤量して、４０ｍＬのリン酸塩緩衝溶液に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで水相のｐＨ値は７．４である。ピペットで２ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、高速膜乳化（Ｓｈｉｒａｓｕ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｇｌａｓｓ（ＳＰＧ）微多孔膜の孔径５０．２μｍ、膜通過圧力２００ＫＰａで、膜を３回通過させる）の方法によって、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が４５．１０μｍ、Ｓｐａｎが０．７２６である。調製された水中油エマルジョンを遠心分離した後、上層に０．５ｃｍの油相が析出される。
【０１２８】
実施例７：抗原を包埋したポリ乳酸（ＰＬＡ）粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１２９】
高速膜乳化と二重エマルジョン溶剤除去法の組み合わせによるＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）を包埋したＰＬＡ粒子の調製
【０１３０】
２００ｍｇのＰＬＡを４．０ｍＬの酢酸エチルに溶解して、０．４ｍＬの５％（ｗ／ｖ）ＨＢｓＡｇを加え、超音波細胞破砕装置を使用して氷水浴条件下で一次乳化（パワー１２％、時間１５ｓ）を行い、次に一次エマルジョンを１．０ｗｔ．％ＰＶＡを含有する水溶液（外水相）２００ｍＬに投入して磁気撹拌によってプレ二次エマルジョン化（３００ｒｐｍ、５０ｓ）を行った。プレ二次エマルジョン化後にプレ二次エマルジョンを高速膜乳化装置のタンクに投入して、圧力３００ＫＰａの窒素ガスでプレ二次エマルジョンをＳＰＧ膜（膜孔径５．２μｍ）を通過させて二次エマルジョンを得た。二次エマルジョンを８００ｍＬの０．９ｗｔ．％ＮａＣｌ水溶液（硬化溶液）に投入して５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ磁気撹拌し、ミクロスフェアを硬化した。硬化したミクロスフェアを脱イオン水で遠心分離（４０００ｒ／ｍｉｎ、５ｍｉｎ）して３回洗浄し、最終的に凍結乾燥させて完成品を得た。粒子は平均粒子径が２．３２μｍ、Ｓｐａｎが０．４９６であり、粒子は表面が滑らかな球状構造である。抗原の包埋率は９０％、粒子の抗原担持量は０．０９ｍｇ抗原／ｇミクロスフェアである。
【０１３１】
水中油エマルジョンの調製
【０１３２】
電子天秤で７．２２ｇのＰＬＡ粒子を正確に秤量して、４０ｍＬの注射用水に加え、渦巻き振とうを５ｍｉｎ行って均一に分散させ、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで、水相のｐＨ値は７．０である。ピペットで２ｍＬのα−トコフェロールを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、マイクロジェット乳化（１２０００ｐｓｉ）方法により、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が４２．３９μｍ、Ｓｐａｎが０．７４２である。調製された水中油エマルジョンの外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１３３】
実施例８：キトサン粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１３４】
高速膜乳化と温度硬化法の組み合わせによるキトサン粒子の調製
【０１３５】
水相調製：所定量のキトサン（分子量５万ダルトン、脱アセチル化度８０％）を正確に秤量して９ｍＬの酢酸溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）に溶解し、磁気撹拌下で十分に溶解してキトサン酢酸溶液を得て、また、所定量のグリセロリン酸ナトリウムを１ｍＬの脱イオン水に溶解した。キトサン酢酸溶液及びグリセロリン酸ナトリウム溶液をそれぞれ４℃で１０ｍｉｎ保温した後、グリセロリン酸ナトリウム溶液を緩慢にキトサン酢酸溶液に滴下し、磁気撹拌（３００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して均一に混合した。この溶液を２００００ｒｐｍで遠心分離して不溶性不純物を除去し、上澄み液を水相として使用に備える。水相において、キトサンの濃度は３．５ｗｔ．％、グリセロリン酸ナトリウムの濃度は１０．０ｗｔ．％である。
【０１３６】
油相調製：油相におけるＰＯ−５００の濃度が４ｗｔ．％になるように、油溶性乳化剤ＰＯ−５００を６０ｍＬの液体パラフィンと石油エーテル（石油エーテルの沸点範囲６０〜９０℃）の混合物（体積比５：７）に加え、完全に溶解するまで撹拌して、４℃で１０ｍｉｎ保温して油相とする。
【０１３７】
エマルジョンの調製：４℃で、２ｍＬの水相と５０ｍＬの油相を混合して均質化乳化器を使用して６０００ｒｐｍで１ｍｉｎ乳化し、プレエマルジョンを調製した。得たプレエマルジョンを高速膜乳化装置のプレエマルジョンタンクに迅速に投入し、５．０ＭＰａの窒素ガス圧力下で、迅速にＳＰＧ微多孔膜（膜孔径２．８μｍ）を通過させ、粒子径が均一なＷ／Ｏ型エマルジョンを得て、得たエマルジョンをプレエマルジョンとして５．０ＭＰａの窒素ガス圧力下でＳＰＧ微多孔膜を通過させ、二次エマルジョン化を約１０ｍｉｎかけて５回繰り返して、最終的に粒子径が均一なＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。乳化終了後、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを３５℃の水浴に入れて、機械撹拌（２００ｒｐｍ）して１ｈ硬化した。硬化反応終了後、１００００ｒｐｍで遠心分離し、順に石油エーテル、エタノール及び脱イオン水で洗浄して、キトサン粒子を得た。粒子は平均直径が８７０ｎｍ、Ｓｐａｎ値が０．４８７であり、粒子は表面が多孔質の球状構造である。
【０１３８】
水中油エマルジョンの調製
【０１３９】
電子天秤で１．００ｇのキトサン粒子を正確に秤量して、２０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで、水相のｐＨ値は８．１である。ピペットで２ｍＬのα−トコフェロールを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、渦巻き振とう（１０ｍｉｎ）の方法により、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が１８．１０μｍ、Ｓｐａｎが０．９３５である。調製された水中油エマルジョンの外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１４０】
その他のキトサン材料を使用して粒子及び水中油エマルジョンを調製してもよく、分子量及び脱アセチル化度が異なるキトサンを使用し、油相と水相の組成と調製プロセスを変える以外、調製工程は実施例８と類似であり、具体的なプロセスパラメータ及び結果は表２に示される。脱アセチル化度が同一の条件において、分子量が小さいほど、粘度が低く、同一の膜乳化条件で調製された粒子の粒子径が小さいほど、調製されたエマルジョンの粒子径が小さくなる。同一の分子量条件において、脱アセチル化度が高いほど、粘度が低く、同一の膜乳化条件で調製された粒子の粒子径が小さいほど、調製されたエマルジョンの粒子径が小さい。
【０１４１】
表２
【０１４２】
【表５】
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【０１４３】
実施例９：抗原を吸着したキトサン粒子を使用した水中油エマルジョンの調製
【０１４４】
キトサン粒子にＨ５Ｎ１鳥インフルエンザスプリットワクチンを吸着させる以外、粒子の調製方法は実施例８と同様である。
【０１４５】
調製されたキトサン粒子１ｇを正確に秤量して、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザスプリットワクチン（ＨＡ濃度１５０μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ緩衝液１０ｍＬに加え、４℃で振とう（１２０ｒｐｍ、２４ｈ）して、１００００ｒｐｍで遠心分離し、脱イオン水で３回洗浄して、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザスプリットワクチンを吸着したキトサン粒子を得た。抗原の吸着率は６０％、粒子での抗原担持量は９００μｇＨＡ／ｇ粒子である。
【０１４６】
水中油エマルジョンの調製
【０１４７】
電子天秤で抗原を吸着したキトサン粒子１．００ｇを正確に秤量して、２０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液に加え、１ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させて、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで、水相のｐＨ値は８．１である。ピペットで２ｍＬのα−トコフェロールを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、渦巻き振とう（１０ｍｉｎ）の方法により、水中油エマルジョンを調製した。エマルジョン滴は分散性に優れて、規則的な球状である。エマルジョン滴は平均粒子径が１９．７０μｍ、Ｓｐａｎが０．９４１である。調製された水中油エマルジョンの外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１４８】
実施例１０：水中油エマルジョンの安全性の評価
【０１４９】
１．血管刺激性試験
【０１５０】
実施例１と実施例２のそれぞれをカイウサギの耳静脈内から、一日に一回、連続的に３日間注射投与した。その結果、カイウサギの耳静脈投与部位で目視により観察したところ、明らかな変化がなく、組織病理学的切片を顕微鏡検査したところ、注射部位から１ｃｍ、５ｃｍ離れる部位での血管の内皮が連続的且つ完全であり、過形成、腫れがなく、血管周囲組織に炎症性細胞浸潤及び壊死が見られず、血管腔内に血栓が形成されていない。本製品はカイウサギの耳静脈血管に対して著しい刺激作用がないことを示した。
【０１５１】
２．溶血及び凝集試験
【０１５２】
一般的なインビトロ試験管法（目視観察法）を使用して、実施例１と実施例２のそれぞれを２％赤血球懸濁液と混合したところ、３時間内で溶血や赤血球の凝集現象が見られない。
【０１５３】
３．筋刺激性試験
【０１５４】
実施例１と実施例２をそれぞれカイウサギの大腿四頭筋に注射投与し、各側に１ｍＬ投与した。４８時間後に投与部位を取って目視により観察して病理組織学検査を行った。その結果、本製品はカイウサギの大腿四頭筋に刺激性を与えない。
【０１５５】
実施例１１：水中油エマルジョンにおける水相と油相の混合方法による抗体力価発生への影響
【０１５６】
実施例１の方法と同様にＰＬＧＡ粒子を調製した。
【０１５７】
水中油エマルジョンの調製
【０１５８】
電子天秤で２ｇのＰＬＧＡ粒子を正確に秤量して、４０ｍＬのクエン酸緩衝溶液に加え、５ｍｉｎ超音波処理して均一に分散させ、粒子を分散させた水相懸濁液を得た。ここで、水相のｐＨ値は６．０である。ピペットで２ｍＬのスクアレンを吸い取って上記水相懸濁液に添加し、上記混合液を二つのアリコートに分け、それぞれ高速膜乳化（膜孔径４０．２μｍ、膜通過圧力５００ＫＰａで、膜を３回通過させる）と機械撹拌（５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）の方法によって乳化して、水中油エマルジョンを調製した。調製されたエマルジョンのエマルジョン滴は均分散性に優れて、規則的な球状である。高速膜乳化により調製されたエマルジョンのエマルジョン滴の平均粒子径は３２．２０μｍ、Ｓｐａｎは０．３７２である。機械撹拌により調製されたエマルジョン中のエマルジョン滴の平均粒子径は４５．３２μｍ、Ｓｐａｎは０．８３９である。調製された水中油エマルジョンの外観が未遠心エマルジョンと差異がなく、上層に油相析出がない。
【０１５９】
上記で調製された水中油エマルジョンをそれぞれＨ５Ｎ１鳥インフルエンザスプリットワクチン（ヘマグルチニン（ＨＡ）含有量はいずれも４．５μｇ／１００μＬである）と混合し（エマルジョンとワクチンの混合体積比を１：１にして、超音波処理（１０Ｗ、３ｍｉｎ）により混合する）、別のヘマグルチニンの含有量に相当するスプリットワクチンを対照とする。Ｂａｌｂ／ｃマウスの左後肢に筋肉内注射した後、二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、結果を表３に示し、機械撹拌群に比べて、高速膜乳化群はアジュバントの効果が高く、実験動物の体内において高レベルのＩｇＧ、ＨＩ力価が発生し、アジュバント群はすべて単抗原注射群と顕著的な差異が存在する。
【０１６０】
表３
【表６】
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【０１６１】
実施例１２：水中油エマルジョンと抗原の混合方法による抗体力価発生への影響
【０１６２】
実施例１１の方法によって調製された水中油エマルジョンをそれぞれＨ５Ｎ１鳥インフルエンザの不活化全ウイルスワクチン及びスプリットワクチン（ヘマグルチニン（ＨＡ）の含有量はいずれも４．５μｇ／１００μＬである）と混合し（エマルジョンとワクチンの混合体積比は１：１であり、混合方法は、振とう（５ｍｉｎ）、超音波処理（１０Ｗ、３ｍｉｎ）、均質化（１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）を含む）、Ｂａｌｂ／ｃマウスの左後肢に筋肉内注射した後、二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、結果を表４に示し、水中油エマルジョンはすべてアジュバントの効果が高く、実験動物の体内では、高レベルのＩｇＧ、ＨＩ力価が発生し、単抗原注射群と顕著的な差異が存在する。そのうち、均質化法で混合した水中油エマルジョンの注射群は更に高い抗体レベルを有する。
【０１６３】
表４
【表７】
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【０１６４】
実施例１３：水中油エマルジョンと抗原の接種方法によるアジュバントの作用への影響
【０１６５】
実施例１１の方法で調製された水中油エマルジョンをそれぞれ組換えＢ型肝炎表面抗原ワクチン（組み換えハンゼヌラワクチン、抗原濃度１．９ｍｇ／ｍＬ）と混合し（エマルジョンとワクチンの混合体積比を１：１として、均質化（１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）により混合する）、上記ワクチン組成物を使用してＢａｌｂ／ｃマウスにそれぞれ筋肉内注射、皮下注射及び腹腔内注射を行い、二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、結果を表５に示し、筋肉内注射群は高い体液抗体レベル（ＩｇＧ）及びサイトカイン分泌レベル（ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ）を示す。
【０１６６】
表５
【表８】
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【０１６７】
実施例１４：水中油エマルジョン、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９アジュバントのアジュバントとしての作用の比較
【０１６８】
実施例１１の水中油エマルジョン、水酸化アルミニウムアジュバント及びＭＦ５９を、それぞれＨ１Ｎ１インフルエンザＡの不活化全ウイルスワクチンと１：１の体積比で混合して、ヘマグルチニン濃度１５μｇ／ｍＬのワクチンアジュバント組成物を調製し、一剤を０．５ｍＬとする。別にヘマグルチニン濃度１５μｇ／ｍＬの不活化全ウイルスワクチンを対照とする。上記の三種類のワクチンアジュバント組成物及び対照ワクチンをそれぞれ等体積でＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉内注射して免疫接種し、二週間に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、免疫結果を表６に示す。その結果、本発明の水中油エマルジョンは機体のインフルエンザ不活化全ウイルスワクチンに対する体液免疫応答レベル及び細胞免疫レベルを大幅に向上することができる。水中油エマルジョンは、体液免疫の強化効果がＭＦ５９に相当し、水酸化アルミニウムアジュバントより高く、三者はいずれもアジュバントを含まないワクチンより高く、細胞免疫の点では、水中油エマルジョン群はＭＦ５９及び水酸化アルミニウムアジュバント群より優れる。これは、水中油エマルジョン中の粒子が抗原提示細胞による抗原の貪食を促進して、リンパ球を活性化させ、その分化やサイトカイン分泌を刺激することができるためである。
【０１６９】
表６
【表９】
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【０１７０】
実施例１５：水中油エマルジョンの添加量による免疫効果への影響
【０１７１】
実施例１１の方法で調製された水中油エマルジョンとＥＶ７１手足口不活化ウイルスワクチンを２：１、１：１、１：２、１：４等の割合で混合して、抗原濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬのワクチンアジュバント組成物を調製し、一剤を０．２ｍＬとする。上記ワクチンアジュバント組成物をＢａｌｂ／ｃマウスに筋肉内注射して接種し、二週間後に二次免疫を行い、結果は表７に示される。その結果、ワクチンアジュバント組成物におけるアジュバント量を増加させることにり、所定量の抗原による免疫応答レベルを強化させることができ、アジュバント用量とアジュバント作用強度は比例する。
【０１７２】
表７
【表１０】
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【０１７３】
実施例１６：ワクチンの抗原濃度による免疫効果への影響
【０１７４】
実施例１１の方法で調製された水中油エマルジョンとＨ５Ｎ１インフルエンザの不活化全ウイルスワクチンを使用してヘマグルチニン濃度３７．５μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬのワクチンアジュバント組成物を調製し、一剤を０．１ｍＬとする。上記の２種のワクチンアジュバント組成物、及び同じヘマグルチニン濃度を有する２種のアジュバントを含まないワクチンを筋肉内接種してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、結果は表８に示される。その結果、本発明の水中油エマルジョンはＨ５Ｎ１インフルエンザの不活化全ウイルスワクチンに対してアジュバント作用が高く、同じヘマグルチニン濃度を有するアジュバントを含まないワクチンに比べて、アジュバントワクチンはマウスのインビボ免疫応答強度を著しく向上することができる。
【０１７５】
表８
【表１１】
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【０１７６】
実施例１７：鼻粘膜免疫接種用の水中油エマルジョンのアジュバント効果
【０１７７】
実施例１１の方法で調製された水中油エマルジョンとＨ７Ｎ９インフルエンザのスプリットワクチンを使用してヘマグルチニン濃度１５０μｇ／ｍＬのワクチンアジュバント組成物を調製し、一剤を０．０３ｍＬとする。上記ワクチンアジュバント組成物及び同じヘマグルチニン濃度を有するアジュバントを含まないワクチンを鼻腔内接種してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、二週間後に二次免疫を行い、３５日間後にマウスを殺し、免疫結果は表９に示される。その結果、本発明の水中油エマルジョンはＨ７Ｎ９インフルエンザのスプリットワクチンに対して高いアジュバント作用を有し、同じヘマグルチニン濃度を有するアジュバントを含まないワクチンに比べて、アジュバントワクチンはマウス血清及び粘膜での免疫応答強度を著しく向上することができる。
【０１７８】
表９
【表１２】
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【０１７９】
実施例１８：免疫アジュバントとして使用される水中油エマルジョンの局所強化メカニズム（局所炎症誘発性作用）
【０１８０】
ＭＦ５９、ＡＳ０３及び本発明の水中油エマルジョン（実施例１１で調製される）の三種類の乳剤型ワクチンアジュバントに引き起こされる免疫応答を観察するために、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を抗原として三種類の乳剤型ワクチンアジュバントと混合してアジュバントワクチン組成物を調製した。上記アジュバントワクチン組成物をＢａｌｂ／ｃマウスの右後肢に筋肉内注射して接種免疫し、異なる時間にマウスを殺し、マウスの注射部位組織を切片して、Ｈ＆Ｅ、ＴＵＮＥＬの２種の方法によって組織切片を染色し、三種類の乳剤型ワクチンアジュバントの体内炎症反応を観察する。局所組織切片を観察した結果、三種類の乳剤型ワクチンアジュバントはいずれも一定の炎症反応を引き起こして、炎症細胞を集めることができるが、炎症が軽度であり、七日間後に炎症反応が消え、優れた生体適合性を有する。
【０１８１】
実施例１９：免疫アジュバントとして使用される水中油エマルジョンの局所強化メカニズム（細胞貪食促進作用）
【０１８２】
マウスのマクロファージ株ＲＡＷ２６４．７を抗原提示細胞、ＯＶＡを抗原として水中油エマルジョンと混合して、アジュバントワクチン組成物を調製した。インビトロ細胞実験を行って、水中油エマルジョン（実施例１１で調製された）による抗原提示細胞の抗原貪食量への影響を観察した結果、アジュバント群はＲＡＷ２６４．７細胞の抗原貪食量を著しく増加できる。
【０１８３】
実施例２０：水中油エマルジョンの薬物放出担体としての用途
【０１８４】
油相に質量濃度が０．５ｗｔ．％のタクソールを添加する以外、実施例４と同様に水中油エマルジョンを調製した。
【０１８５】
実施例２１：水中油エマルジョンの薬物放出担体としての用途
【０１８６】
ＰＥＬＡ粒子に質量濃度１ｗｔ．％のインシュリンを包埋した以外、実施例５と同様に水中油エマルジョンを調製した。
【０１８７】
本発明は上記実施例によって本発明の特定方法を説明したが、上記の特定方法に制限されず、即ち、本発明は上記の特定方法を利用しなければ実施できないものではないことを出願者により声明する。当業者であれば、本発明に対する全ての改良、本発明の製品の各原料の同等置換や、補助成分の添加、具体的な方法の選択等は、いずれも本発明の保護範囲と開示範囲に属されることが自明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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