(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
0006410352.tif 000012
〔式中、Ｒ1及びＲ4は水素原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、点線と実線の二重線は単結合又は二重結合を示す。〕
で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。
【請求項２】
Ｒ2及びＲ3がメチル基を示す、請求項１記載のＴＲＰＡ１活性抑制剤。
【請求項３】
下記式（１）
【化２】
0006410352.tif 000013
〔式中、Ｒ1及びＲ4は水素原子を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、点線と実線の二重線は単結合又は二重結合を示す。〕
で表される化合物を有効成分とする皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤。
【請求項４】
Ｒ2及びＲ3がメチル基を示す、請求項３記載の刺激感緩和剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＡ１活性抑制剤及び刺激感緩和剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
感覚は、外部から受けた刺激が電気信号に変換され、神経細胞を通じて脳に伝達されることで生じる。外部刺激を電気信号に変換するには、その外部刺激を感知する受容体の存在が必要である。
ＴＲＰＡ１は、一過性受容器電位（ＴＲＰ）イオンチャネルのスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルであり、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器（17℃）として見出された（非特許文献１）。その後、ＴＲＰＡ１は、マスタードオイルやそれに含まれるアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、シナモン、ガーリック、メチルサリチレート、オイゲノール、アルコール類等に反応する化学受容体であること、更には低温と機械刺激、化学刺激に応答する痛み受容体であることが報告されている（非特許文献２、３、４及び５)。
【０００３】
また、最近では、パラベン類やアルカリ剤がＴＲＰＡ１に応答し、ＴＲＰＡ１で形質転換させた細胞を用いてパラベン類やアルカリ剤の刺激を抑制する物質をスクリーニングできること（特許文献１及び２）が報告されている。
【０００４】
斯様に、ＴＲＰＡ１は皮膚や粘膜の侵害受容器であり、様々な刺激によって活性化されることから、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することは、刺激による痛みの軽減に有効であると考えられ、これまでに、被験物質とＡＩＴＣを、ＴＲＰＡ１を発現する細胞に接触させて、ＡＩＴＣによりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することにより、刺激（痛み）抑制物質の探索・評価がなされ、刺激抑制物質が見出されている（非特許文献６）。本出願人においても、特定のフェニルペンタノール誘導体にＴＲＰＡ１活性抑制作用があることを見出している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【特許文献３】特開２０１１−２０５９７５号公報
【特許文献４】国際特許公開第２０１３／１０３１５５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Story et al. 2003, Cell 112, 819-829
【非特許文献２】Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289
【非特許文献３】日本薬理学雑誌、第１２４巻、第２１９頁−第２２７頁、２００４年、社団法人  日本薬理学会発行
【非特許文献４】Fijita et al. 2010, IFSCC Congress 2010
【非特許文献５】Komatsu et al. 2012, Eur J Physio 463, 549-559
【非特許文献６】Molecular Pain 2008, 4:48
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、皮膚や粘膜に対する感覚刺激を緩和できるＴＲＰＡ１活性抑制剤、及び皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤を提供することに関する。
【０００８】
本発明者らは、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する素材について検討したところ、下記式（１）で表される化合物に、極めて優れたＴＲＰＡ１活性抑制作用があり、刺激感原因物質による皮膚や粘膜に対する刺激感の緩和に有効であること、さらに当該化合物はそれ自体には匂いが殆どなく、化粧品等の香粧品に配合しやすいことを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）下記式（１）で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。
２）下記式（１）で表される化合物を有効成分とする皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤。
３）下記式（１）で表される化合物を皮膚又は粘膜に適用する、皮膚又は粘膜の刺激感緩和方法。
【００１０】
【化１】
0006410352.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｒ１及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、点線と実線の二重線は単結合又は二重結合を示す。〕
【発明の効果】
【００１２】
本発明の式（１）で表される化合物は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという作用を有する。したがって、本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤、皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤を、防腐剤、防腐助剤等の刺激感原因物質を含有する各種組成物と共に、或いは当該組成物の使用前後に使用することにより、当該刺激感原因物質による刺激感や痛みを緩和することができる。また、本発明の化合物はそれ自体には匂いが殆どないことから、化粧品等の香粧品にも容易に配合できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明化合物のＴＲＰＡ１活性抑制効果（用量依存性）を示すグラフ。
【図２】本発明化合物のＴＲＰＡ１活性抑制効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖又は分岐の何れでもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、このうちメチル基が好ましい。
Ｒ１及びＲ４は、少なとも一方は水素原子であるのが好ましく、共に水素原子であるのがより好ましい。
Ｒ２及びＲ３は、少なとも一方はメチル基であるのが好ましく、共にメチル基であるのがより好ましい。
【００１５】
Ｘで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられ、このうちフッ素原子、塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
【００１６】
本発明の式（１）で表される化合物において、点線と実線の二重線が二重結合である場合には、シス体（Ｚ体）及びトランス体（Ｅ体）が存在するが、トランス体であるのが好ましい。また、置換基の種類や組み合わせによって、ｄ体−、ｌ体−等の光学異性体及び回転異性体等の異性体が存在し得る。
本発明においては、当該各異性体の混合物や単離されたものの何れをも包含する。
【００１７】
本発明の式（１)で表される化合物は、公知の方法（例えば、J. Org. Chem. 2005, 70, 1281-1290）に準じて化学合成することができる。例えば、下記反応式に示すように、塩基の存在下、Ａで示されるカルボニル化合物とホスホノカルボン酸トリエステル等を縮合させてα、β不飽和エステル体Ｂとし、これをＬｉＡｌＨ４等を用いた還元反応に付してアルコール体Ｃとすること、更にはこれを水素化して飽和のアルコール体Ｄとすること、更にはこれをＴＥＭＰＯとヨードベンゼンジアセテート等を用いた酸化反応に付してアルデヒド体Ｅとし、グリニャール試薬等のアルキル化剤を用いてアルキル基を導入して化合物Ｆとすることにより合成することができる。
【００１８】
【化２】
0006410352.tif 000003
【００１９】
〔式中、Ｒ１〜Ｒ４及びＸは前記したものと同じ〕
【００２０】
本発明の式（１）で表される化合物のうち好ましくは、Ｒ1及びＲ４が共に水素原子であり、Ｒ２及びＲ３が共にメチル基であり、Ｘがフッ素原子である化合物が挙げられ、より好適な化合物としては、後記表１に記載の、（Ｅ）−４−（ｐ−フルオロフェニル）−２，３−ジメチル−２−ブテン−１−オール(化合物１)、及び４−（ｐ−フルオロフェニル）−２，３−ジメチル−１−ブタノール（化合物２）を例示することができる。
【００２１】
本発明の式（１)で表される化合物は、後記実施例に示すように、種々のＴＲＰＡ１刺激物質と共に、ＴＲＰＡ１を形質導入した細胞（ＴＲＰＡ１発現細胞）に接触させた場合に、刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するというＴＲＰＡ１活性抑制作用を有する（試験例１及び２）。
したがって、本発明の式（１)で表される化合物はＴＲＰＡ１活性抑制剤、及びＴＲＰＡ１を介して引き起こされる刺激や痛みの緩和に有効な刺激感緩和剤、例えば皮膚や粘膜に対する刺激感や痛みの緩和に有効な、皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤となり得る。
【００２２】
ここで、「ＴＲＰＡ１の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＡ１の活性を抑制すること、具体的にはＴＲＰＡ１刺激物質（アゴニスト）がＴＲＰＡ１に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制或いは阻害することを云う。
ここで、ＴＲＰＡ１刺激物質としては、例えば、アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、アンモニア、ブラジキニン、シンナムアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、アリシン、アクロレイン、メントール、メチルサリチレート、オイゲノール、パラベン類、フェノキシエタノール、ブチルカルバミン酸ヨウ化プロピニル（ＩＰＢＣ）、トリクロサン、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００２３】
尚、本発明の式（１)で表される化合物によるＴＲＰＡ１の活性の抑制効果は、例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞を用い、式（１)で表される化合物の存在下にＴＲＰＡ１刺激物質（例えばＡＩＴＣ）と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、式（１)で表される化合物の非存在下でＴＲＰＡ１刺激物質と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度との差異を比較すること等によって評価することができる。
【００２４】
また、「皮膚又は粘膜の刺激感緩和」とは、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされる皮膚や粘膜に対する刺激感や痛みを抑制又は低減することを意味し、より具体的には、上述したＴＲＰＡ１刺激物質とされる化学物質によって引き起こされる、感覚刺激を抑制又は低減することが挙げられる。ここでいう好適なＴＲＰＡ１刺激物質としては、皮膚や粘膜に対して刺激感を与える可能性がある化学物質（「刺激感原因物質」という）、例えば、パラベン類、フェノキシエタノール、ブチルカルバミン酸ヨウ化プロピニル（ＩＰＢＣ）、トリクロサン等の防腐剤、ベンジルアルコール等の防腐助剤、アンモニア、アクロレイン、メントール、メチルサリチレート、オイゲノール、一価アルコール、多価アルコール等のアルコール類等が挙げられる。ここで、一価アルコールとしては、例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどの炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールなどが挙げられ、多価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールなどが挙げられる。
【００２５】
尚、ここでいう、「粘膜」としては、口腔、咽喉、鼻腔、耳腔、結膜嚢等が挙げられる。
刺激感緩和効果は、後記実施例に示すような官能評価により測定してもよく、又は上記のＴＲＰＡ１発現細胞を用いた細胞内カルシウムイオン濃度の変化を以て評価することもできる。
【００２６】
ＴＲＰＡ１活性抑制剤及び皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤は、本発明の式（１)で表される化合物を単独で用いたものであってもよく、あるいは油分、色素、香料、防腐剤、キレート剤、顔料、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、甘味料、調味料、保存料、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、被膜剤、担体、希釈剤等の、医薬品、化粧品、香粧品、医薬部外品、生活用品等の各種製剤に用いられる添加剤や賦形剤等と組み合わせた組成物であってもよい。またそれらの形態も特に限定されず、例えば溶液、エマルジョン、サスペンジョン、ゲル、固形、粉体、粒体、エアゾールなど、任意の形態に調製できる。
当該組成物における式（１)で表される化合物の配合量は、製剤全質量の０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上であり、そして、１０質量％以下、好ましくは１質量％以下である。例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１質量％が挙げられる。
【００２７】
本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤及び皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤は、例えば、上述した刺激感原因物質を含有する組成物（皮膚洗浄剤、頭髪洗浄剤、メイクアップ剤、入浴剤、パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、石鹸類、台所用洗剤、洗濯用洗剤、歯磨類等の化粧品、香粧品、医薬部外品、医薬品、生活用品等）に配合して使用すること、或いは刺激感原因物質を含有する組成物とは別個の組成物として調製し、前記組成物と同時或いは前記組成物の使用前後に使用することにより、当該刺激感原因物質により引き起こされる感覚刺激を緩和できる。
【００２８】
本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤及び皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤を、刺激感原因物質を含有する組成物と共に用いる場合、ＴＲＰＡ１活性抑制剤及び皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤の使用量は、刺激感緩和効果を有する限り特に限定されないが、例えば、刺激感原因物質１質量部に対し、本発明の式（１)で表される化合物を好ましくは０．０１質量部以上、より好ましくは０．１質量部以上、そして好ましくは１０質量部以下、より好ましくは１質量部以下の割合とすることができる。例えば、刺激感原因物質１質量部に対し、好ましくは０．０１〜１０質量部、より好ましくは０．１〜１質量部の割合とすることができる。
【００２９】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記式（１）で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。
＜２＞下記式（１）で表される化合物を有効成分とする皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤。
＜３＞ＴＲＰＡ１活性抑制剤を製造するための下記式（１）で表される化合物の使用。
＜４＞皮膚又は粘膜の刺激感緩和剤を製造するための下記式（１）で表される化合物の使用。
＜５＞ＴＲＰＡ１活性抑制に使用するための下記式（１）で表される化合物。
＜６＞皮膚又は粘膜の刺激感緩和に使用するための下記式（１）で表される化合物。
＜７＞下記式（１）で表される化合物を皮膚又は粘膜に適用する、ＴＲＰＡ１活性抑制方法。
＜８＞下記式（１）で表される化合物を皮膚又は粘膜に適用する、皮膚又は粘膜の刺激感緩和方法。
＜９＞上記＜２＞、＜４＞、＜６＞又は＜８＞において、感覚刺激の緩和は、例えば防腐剤、防腐助剤、アルコール類及びアンモニアから選ばれる刺激感原因物質による皮膚又は粘膜の感覚刺激の緩和である。
＜１０＞上記＜５＞、＜６＞、＜７＞又は＜８＞において、下記式（１）で表される化合物は、刺激感原因物質を含有する組成物に配合して使用するか、或いは当該組成物とは別個の組成物として調製し、前記組成物と同時又は前記組成物の使用前後に使用するものである。
＜１１＞上記＜１０＞において、下記式（１)で表される化合物を、刺激感原因物質１質量部に対し、好ましくは０．０１質量部以上、より好ましくは０．１質量部以上、そして好ましくは１０質量部以下、より好ましくは１質量部以下の割合で使用するものである。
【００３０】
【化３】
0006410352.tif 000004
【００３１】
〔式中、Ｒ１及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、点線と実線の二重線は単結合又は二重結合を示す。〕
【実施例】
【００３２】
製造例１
以下に、下記表１に示す化合物（化合物１〜２）の製造例を示す。
【００３３】
【表１】
0006410352.tif 000005
【００３４】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＨＣｌ３（７．２４）を内部標準物質として用いて、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−６００により測定し、１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＣＨＣｌ３（７７．０）を内部標準物質として用いて、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−６００により測定した。
【００３５】
（１）水素化ナトリウム（純度５５％、２４５ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に懸濁し、２−ホスホノプロピオン酸トリエチル（１．４６ｍＬ）を加え、室温・窒素雰囲気下、３０分撹拌した。反応液に、１−（４−フルオロフェニル）−２−プロパノン（３３５ｍｇ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解したものを加え、さらに１７時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液と酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を減圧乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、(Z)-α,β不飽和エステル体（１１１ｍｇ）および(E)- α,β不飽和エステル体（１５１ｍｇ）を得た。
【００３６】
【化４】
0006410352.tif 000006
【００３７】
（２）ＬｉＡｌＨ４（６３．９ｍｇ）をテトラヒドロフラン（４ｍＬ）に懸濁し、（１）で得られた(E)-α,β不飽和エステル体（１３２．６ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解したものを加え、０℃で３０分撹拌した。反応液に水（１００μＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１００μＬ）、水（３００μＬ）の順で加え、１日撹拌し、不溶物を濾過した。濾液を減圧乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、(E)-２，３ジメチル−４−（４−フルオロフェニル）−２−ブテン−１−オール（化合物１、９９．６ｍｇ）を得た。
【００３８】
【化５】
0006410352.tif 000007
【００３９】
化合物１のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) d 7.10-7.05 (m, 2H), 6.96-6.91 (m, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.36 (s, 2H), 1.87 (s, 3H), 1.64 (s, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) d 162.1-160.5 (d), 135.5 (d), 131.4, 129.7 (d), 129.6, 115.1-115.0 (d), 63.9, 39.5, 17.7, 16.7.
【００４０】
（３）（２）で得られた化合物１（７９．２ｍｇ）を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下でＰｄ／Ｃ（１０％、７９ｍｇ）を加えた後、系内を水素ガスで置換して室温で１４時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、濾液を減圧乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２，３−ジメチル−４−（４−フルオロフェニル）−１−ブタノール（ｄｒ＝５７：４３、化合物２、１１．７ｍｇ）を得た。
【００４１】
【化６】
0006410352.tif 000008
【００４２】
化合物２のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) d 7.10-7.06 (m, 2H-m,M), 6.96-6.91 (m, 2H-m,M), 3.66 (dd, J = 10.5, 5.8 Hz, 1H-m), 3.55-3.54 (m, 1H-m, 2H-M), 2.73 (dd, J= 13.5, 4.6 Hz, 1H-m), 2.60 (dd, J = 13.6, 6.6 Hz, 1H-M), 2.40 (dd, J = 13.6, 8.6 Hz, 1H-M), 2.22 (dd, J = 13.5, 9.9 Hz, 1H-m), 1.93 (m, 1H-M), 1.81 (m, 1H-m), 1.69-1.60 (m, 1H-m,M), 0.95 (d, J = 6.9 Hz, 3H-m), 0.85 (d, J = 7.1 Hz, 3H-M), 0.79 (d, J = 6.9 Hz, 3H-m), 0.75 (d, J = 7.0 Hz, 3H-M); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) d 162.0-160.4 (d-m,M), 137.2 (d-m), 137.0 (d-M), 130.3 (d-m), 130.3-130.2 (d-M), 115.0-114.8 (d-M), 114.9-114.8 (d-m), 66.7 (M), 65.8 (m), 40.5 (M), 40.2 (m), 38.7 (M), 38.5 (m), 37.0 (m), 35.5 (M), 16.4 (m), 13.8 (M), 13.7 (m), 11.0 (M).
(m = minor diastereomer, M = Major diastereomer)
【００４３】
試験例１  ＴＲＰＡ１活性抑制作用
（１）ヒトＴＲＰＡ１安定発現株の作製
ヒトＴＲＰＡ１遺伝子は、その全長をＯｐｅｎ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社よりｐＥＮＴＲ２２３．１に挿入された状態で購入した。購入したエントリーベクターよりＴＲＰＡ１遺伝子を発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン社）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞をＧ−４１８（４５０μｇ／ｍＬ；プロメガ社）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させることにより選抜した。なおＨＥＫ２９３細胞は内在性ＴＲＰＡ１を発現しないため、ＴＲＰＡ１形質導入株に対する対照（コントロール）として使用できる。
【００４４】
（２）カルシウムイメージング
蛍光カルシウムイメージング法を用いてＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＡ１活性の測定を行った。まず培養したＴＲＰＡ１発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社）に播種（３００００細胞／ウェル）し、３７℃で一晩、インキュベートした後、培養液を除去し、リンガー液に溶解させたＦｌｕｏ４−ＡＭ（２μｇ／ｍＬ；同仁化学社）を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液を除去し、ウェルにリンガー液を添加して蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス社）にセットした。装置庫内温度２４℃にした状態で励起波長４８０ｎｍで励起させたときの蛍光イメージを検出波長５２０ｎｍにてＣＣＤカメラで検出した。測定は１秒毎に４分間行い、測定開始１５秒後にＦＤＳＳ３０００内蔵の分注器によりＴＲＰＡ１刺激物質であるアリルイソチオシアネート(ＡＩＴＣ)およびエタノールにて適当濃度に希釈した試験素材を添加し、その後の蛍光強度の変化によりＴＲＰＡ１活性を評価した。ＴＲＰＡ１活性は刺激物質添加後の蛍光強度のピーク（Ｆｐｅａｋ）を刺激物質添加前の蛍光強度（Ｆ０）で除算した蛍光強度比（Ｒａｔｉｏ；Ｆｐｅａｋ／Ｆ０）で表した。対照としてＴＲＰＡ１を形質導入していないＨＥＫ２９３細胞に同様の物質を添加し、その際の蛍光強度比（Ｒａｔｉｏ２９３）を算出し、刺激物質による活性がＴＲＰＡ１活性化に由来することを確認した。
【００４５】
（３）ＡＩＴＣに対するＴＲＰＡ１活性抑制評価（１）
ＡＩＴＣによるＴＲＰＡ１活性化に対する試験素材の効果を検証するため、ＡＩＴＣ（５．０μＭ）を添加した際のＴＲＰＡ１活性に対する試験素材の抑制作用（活性抑制率；％）を評価した。ＡＩＴＣ（刺激物質）と試験素材を混合し、添加することによるＴＲＰＡ１活性は下記の式により算出した。
〔数１〕
ＴＲＰＡ１活性（％）＝（（刺激物質＋試験素材添加によるＲａｔｉｏ）−（刺激物質＋試験素材添加によるＲａｔｉｏ２９３））／（（刺激物質＋エタノール添加によるＲａｔｉｏ）−（刺激物質＋エタノール添加によるＲａｔｉｏ２９３）））×１００
試験素材としては、上記化合物１及び２、並びに比較化合物１として国際特許公開ＷＯ２０１３／１０３１５５号（前記特許文献４）に記載された以下の２−メチル−４−フェニル−１−ペンタノールを用いた。
【００４６】
【表２】
0006410352.tif 000009
【００４７】
その結果、化合物１及び２によるＴＲＰＡ１活性抑制効果に用量依存性が認められ、そのＩＣ５０値はそれぞれ、２．６、０．９μＭであった（図１）。そして、当該ＴＲＰＡ１活性抑制効は、比較化合物１に比べて優れていることが認められた。
【００４８】
試験例２  ＡＩＴＣに対するＴＲＰＡ１活性抑制評価（２）
試験例１と同様にして、ＡＩＴＣ１０μＭによるＴＲＰＡ１活性化に対する試験素材５０μＭの効果を測定した。
試験素材としては、上記化合物２、及び比較化合物２として国際特許公開第２０１３／１０３１５５号（前記特許文献４）に記載された以下の２，３−ジメチル−４−フェニル−１−ブタノールを同文献に記載の方法により合成し、使用した。
【００４９】
【表３】
0006410352.tif 000010
【００５０】
その結果、本発明の化合物２は、10μＭ ＡＩＴＣによるＴＲＰＡ１活性化を完全に抑制し、パラ位にハロゲン原子を有さない比較化合物２と比較して、遥かに優れたＴＲＰＡ１活性抑制効果が認められた（図２）。
【００５１】
試験例３  既存のＴＲＰＡ１活性抑制作用を有する化合物との匂い比較
ガラス瓶に綿球を入れ、プロピレングリコール、及びプロピレングリコールで希釈した下記表４に示す各化合物 (５．０％ｗ/ｗ) を綿球に３０μＬ滴下した。このガラス瓶を一晩室温で静置し、匂いをガラス瓶中に十分に揮発させた。官能評価は、パネラー４名で実施し、比較化合物１の匂いの強さを５．０とし、試験素材の匂いの強さを０−１０（０．５刻み）の２０段階で評価した。
その結果、比較化合物１と比して、化合物１及び２は匂いの強さが小さいことが認められた。(表４)
【００５２】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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