(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性干渉物質の存在下、タクロリムス若しくはシロリムスの含有が疑われる試料中のタクロリムス若しくはシロリムスの総量を特定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）内因性結合物質によって結合されるタクロリムス若しくはシロリムスの部分量［Ｙ］を測定する工程、ここで当該［Ｙ］は、以下の工程（ａ’）〜（ｃ’）：
（ａ’）タクロリムス若しくはシロリムスを内因性結合物質から置換可能な試薬の存在下、試料の一部でアッセイを行うことによって、タクロリムス若しくはシロリムスの量［Ｖ］を特定する工程、
（ｂ’）タクロリムス若しくはシロリムスを内因性結合物質から置換可能な試薬の不在下、試料の一部でアッセイを行うことによって、タクロリムス若しくはシロリムスの量［Ｗ］を特定する工程、及び
（ｃ’）前記［Ｖ］から前記［Ｗ］を引く工程
によって測定され、
（ｂ）内因性結合物質によって結合されないタクロリムス若しくはシロリムスの量［Ｚ］を、下記式：
［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂ
によって特定する工程、ここで前記式中、「ａ」及び「ｂ」は、既知のタクロリムス若しくはシロリムス量は含有するが、内因性干渉物質を実質的に含有しない試料でアッセイを行うことにより予め特定され、前記「ａ」が、内因性結合物質によって結合されないタクロリムス若しくはシロリムスと、内因性結合物質によって結合されるタクロリムス若しくはシロリムスとの回帰直線の勾配であり、前記「ｂ」が、回帰直線の切片であり、
（ｃ）前記［Ｙ］と前記［Ｚ］を合計することにより、タクロリムス若しくはシロリムスの総量［Ｘ］を特定する工程
を有し、
前記アッセイが、以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）前記工程（ａ’）の試料の一部を含有する媒体、及び前記工程（ｂ’）の試料の一部を含有する媒体に、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬を添加する工程、ここで前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬は、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を少なくとも１種含有し、
（ｉｉ）前記工程（ａ’）において、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を含有する複合体の量を測定する工程、ここで当該複合体の量は、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量と関連し、及び前記工程（ｂ’）において、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を含有する複合体の量を測定する工程、ここで当該複合体の量は、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量と関連する、
前記方法。
【請求項２】
前記試料が、哺乳類の体からの排出物、哺乳類の体からの吸引物、哺乳類の体からの切除物、又は哺乳類の体からの抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｉ）における試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬がさらに、試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬である、タクロリムス類似体若しくはシロリムス類似体を含有し、試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬である、タクロリムス用若しくはシロリムス用の抗体又は前記類似体が、標識を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）において第二の抗体を前記媒体に添加し、ここで前記第二の抗体が、タクロリムス用若しくはシロリムス用抗体を含有する複合体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タクロリムス用若しくはシロリムス用の抗体、又は前記第二の抗体が、標識を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち１種が標識を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち１種が粒子を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち１種が酵素標識を含有し、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち１種が磁性粒子を含有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体の含有が疑われる試料において、検体濃度を特定するための方法及びキットに関する。本発明はより具体的には、慣用のイムノアッセイのフォーマットにおいて偽のシグナル発生に関与する干渉物質の存在下で、未知の試料における検体の濃度を特定することに関する。
【０００２】
人体は、自己と自己以外とを識別するための複雑な免疫応答系に基づく。時に人体の免疫系は、不充分な応答を補うため、又は過剰な応答を抑制するために、制御する必要がある。例えば、臓器（例えば腎臓、心臓、心肺、骨髄、及び肝臓）をヒトに移植する場合、人体はしばしば、同種異系移植拒絶によって、移植された組織を拒絶する。
【０００３】
同種異系移植拒絶を取り扱うに際して、免疫系はしばしば、投薬治療によって制御、抑制される。免疫抑制薬剤はしばしば、非自己組織の同種異系移植拒絶の防止を補助するため、移植患者に対して慎重に投与される。移植患者における臓器拒絶を防止するための、最も一般的に投与される２つの免疫抑制薬剤は、シクロスポリン（ＣＳＡ）と、ＦＫ−５０６（ＦＫ又はタクロリムス）である。米国やその他の国で免疫抑制剤として使用される他の薬剤は、シロリムスであり、これはラパマイシンとしても知られる。シロリムスの誘導体はまた、免疫抑制剤としても有用であるとされる。このような誘導体には例えば、エベロリムスなどが含まれる。
【０００４】
幾つかの免疫抑制剤と関連する副作用は、患者に存在する薬剤のレベルを慎重に制御することによって、部分的には制御できる。血中における免疫抑制剤と関連薬剤の濃度を治療学的にモニターするためには、投与レジメンを最適にし、最少の毒性で最大の免疫抑制を保証する必要がある。免疫抑制剤は、確かに非常に効果的な薬剤であるものの、その使用は慎重に行わなければならない。なぜならば、有効な薬剤投与範囲はしばしば狭く、過剰投与は、深刻な副作用につながり得るからである。その一方で、免疫抑制剤の過小投与は、組織の拒絶につながることがある。免疫抑制薬剤の分布と代謝は患者によって大きく異なることがあり、逆反応の幅広さと困難性が原因で、薬剤レベルの正確なモニタリングが必須である。
【０００５】
治療薬モニタリングの分野では、代謝の間の親薬剤を選択的に検知することが、イムノアッセイを設計するためにしばしば重要な目的となる。これは特に、免疫抑制薬剤に当てはまる。このためＨＰＬＣタンデムＭＳアッセイは、親薬剤を選択的に測定可能なため、シロリムス、タクロリムス、及び他の免疫抑制薬剤を測定するための標準的な方法となっている。しかしながら、上記方法はコストと時間がかかり、初期測定として実験室で使用されるというよりはむしろ、別のアッセイ法によって得られた肯定的な結果を実証するために、しばしば使用される。
【０００６】
免疫抑制薬剤のための全血アッセイの多くは、血液成分から薬剤を抽出するための薬剤を用いる手動の工程を必要とする。薬剤分子と薬剤代謝分子は、内因性の結合タンパク質から解離され、比較的きれいな溶液に抽出され、ここでプラズマタンパク質とリポタンパク質粒子も、他の多くの分子と同じく除去される。通常は沈殿技術が用いられるため、抽出された試料は基本的に、ほとんどの血液マクロ分子（免疫アッセイ成分のため、及びアッセイシグナルと干渉し得る他の物質のための片方、又は双方の結合タンパク質を含む）を含有しない。よって、抽出された試料において、親薬剤とその代謝物は、結合されていない個別の分子として溶解され、免疫反応混合物におけるアッセイ抗体との反応のために相互に競合する。薬剤へのアッセイ抗体の結合は、これらのアッセイにおいて大半の内因性結合物質が存在しない場合に起こる。薬剤代謝の交差反応はたいてい、このようなアッセイにおける抗体結合親和性に基づく。
【０００７】
手動抽出、又は血液成分からの薬剤の手動分離が行われない免疫抑制薬剤のための均質アッセイにおいて、免疫抑制薬剤のための抗体は、ほとんどの又は全ての血液成分の存在下で薬剤を検知しなければならず、これらの存在は、アッセイにおいて例えば、免疫抑制薬剤に対する抗体によって干渉することがあり、これにより偽のアッセイ結果につながるか、又は血液試料における真の薬剤濃度測定と干渉する。
【０００８】
よって、患者から採取した試料における検体の水準を測定するために、迅速かつ正確な診断法を開発することに対して継続的な需要が存在する。この方法は、完全に自動化可能であるべきであり、様々な緩衝性物質を有する試料で行った場合であっても、正確であるべきである。アッセイは試料中の検体量を正確に測定可能であるべきであり、また試料中に存在する干渉物質、特に不特定の干渉物質から生じる不正確性が最小化可能になるべきである。
【０００９】
ここに記載した原則と一致する幾つかの例は、未知の試料中に存在しうる内因性干渉物質の存在下、検体の含有が疑われる未知の試料における検体の総量を特定するための方法を目指している。この方法は、未知の試料において、内因性結合物質によって結合される検体（結合検体）の部分量［Ｙ］を測定する工程を伴う。未知の試料において、内因性結合物質によって結合されない検体（遊離検体）の部分量［Ｚ］は、下記式：［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂによって特定され、ここで「ａ」及び「ｂ」は、既知の検体量を含有するが、内因性干渉物質は実質的に含有しない試料でアッセイを行うことによって、予め特定される。［Ｙ］（結合された検体）と、［Ｚ］（遊離検体）とを合計することによって、未知の試料における検体の全量［Ｘ］が得られる。
【００１０】
ここに記載した原則と一致する幾つかの例は、未知の試料中に存在しうる内因性干渉物質の存在下、タクロリムスの含有が疑われる未知の試料におけるタクロリムスの総量を特定するための方法を目指している。内因性結合物質によって結合されるタクロリムスの部分量［Ｙ］は、内因性結合物質からタクロリムスを置換可能な試薬の存在下、試料の一部でアッセイを行うことによってタクロリムスの量［Ｖ］を特定し、そして内因性結合物質からタクロリムスを置換可能な試薬の不在下、試料の一部でアッセイを行うことによってタクロリムスの量［Ｗ］を特定し、この［Ｗ］を前記［Ｖ］から引くことによって測定する。内因性結合物質によって結合されないタクロリムスの部分量［Ｚ］は、下記式：［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂによって特定され、ここで「ａ」及び「ｂ」は、既知のタクロリムス量を含有するが、内因性干渉物質は実質的に含有しない試料でアッセイを行うことによって、予め特定される。上記等式において、「ａ」は内因性結合物質によって結合されない検体と、内因性結合物質によって結合される検体との回帰直線の勾配であり、「ｂ」は、回帰直線の切片である。未知の試料におけるタクロリムスの総量［Ｘ］は、［Ｙ］と［Ｚ］とを合計することによって特定される。
【００１１】
発明の詳細な説明：概論
ここに記載した原則と一致する例は、内因性干渉物質を含有している可能性がある未知の試料において、検体の総量を正確に測定することを目指している。試料は、未知の試料において存在し得る検体をあらゆる内因性結合物質から置換する置換剤で処理することができるものの、内因性干渉物質（例えば未知の試料内に存在しうる不特定の干渉性タンパク質）は、イムノアッセイ成分に結合し、未知の試料における検体濃度の特定が不正確になり得る。さらに、多くの未知の試料は、アッセイシグナルと干渉する内因性物質を有さない。しかしながら、このような物質を含有しないこれらの未知の試料については、このような内因性干渉物質の量は、試料によって異なる。ここに記載した原則に従って、真の検体濃度は、内因性干渉物質（例えば不特定の干渉性タンパク質）の存在下で、未知の試料において測定できる。
【００１２】
ここに記載した原則に従って、内因性干渉物質を実質的に含有しない既知の試料における、内因性結合物質により結合された検体（以降、「結合検体」と呼ぶ）と、内因性結合物質によって結合されない物質（以降、「遊離検体」と呼ぶ）との関係は、いくつかの係数を特定することによって確立され、この係数は、内因性干渉物質の存在下で、未知の試料中に存在しうる真の検体濃度を特定するために使用できる。内因性干渉物質（例えば、結合性タンパク質）を実質的に含有しない試料は、結合された検体と遊離検体との間の関係を特定するため、検体用のアッセイに供され、こうして得られたデータを、回帰分析にかける。遊離検体の量は、既知の試料に結合された検体量に対してグラフ化され、未知の検体量と、存在する場合には内因性干渉物質とを含有する検体について、未知の試料における検体の真の総量を計算するために使用可能な係数を得る。既知の試料濃度を用いる特定のアッセイと試薬について確立された、遊離検体と結合検体との間の関係性は、このような試料が、内因性干渉物質（例えば不特定の干渉性タンパク質）を含有し得る場合であっても、未知の検体試料について真の検体濃度を特定するために使用できる。
【００１３】
試験すべき試料は、生物学的なものであっても、非生物学的なものであってもよい。「非生物学的な試料」とは、生物学的な材料と関連するものではなく、これには例えば、土壌試料、水試料、空気試料、他の気体試料、及び鉱物試料が含まれる。「生物学的な試料」という用語は、あらゆる生物学的な材料のことであり、例えば体液、体組織、人体由来の化合物、及び培養媒体である。試料は、あらゆる物質源からの固体、半固体、又は流体（液体又は気体）であり得る。幾つかの態様において試料は、体からの排出物、体からの吸引物、体からの切除物、又は体からの抽出物であり得る。体とは通常、哺乳類の体であり、幾つかの態様では、人体である。体からの排出物とは、体から排出された物体であり（ただし、切除又は抽出によって得られるものであってもよい）、例えば、尿、糞、便、膣分泌物、精液、涙、呼気、汗、水疱液、及び炎症性滲出物である。体からの切除物とは、体から切除された材料であり、例えば皮膚、毛髪、組織試料（臓器や他の体の部分からの生検材料を含む）である。体からの吸引物とは、体から吸引された材料であり、例えば、粘液、唾液、及び痰である。体からの抽出物とは、体から抽出された材料であり、例えば全血、血漿、血清、髄液、脳髄液、リンパ液、滑液、及び腹膜液である。
【００１４】
検体は、興味対象となる物質であるか、又は検知及び／又は定量化したい化合物又は組成物である。検体には例えば、治療薬、濫用薬、代謝産物、農薬、揮発性有機化合物、半揮発性有機化合物、非揮発性有機化合物、タンパク質、多糖類、汚染物質、毒物、脂質、及び核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が含まれるが、これらは単に説明のための例示に過ぎず、これらに制限されるわけではない。
【００１５】
ここに記載する原則に従った例は、検体に結合する内因性物質を含有する試料中に存在する検体に対して、特に適用される。このような内因性結合物質は、試料源から採取した試料中に存在する物質である。内因性結合物質の性質は例えば、試料の性質、試料の試料源の性質、検体の性質、及び検体を含有する分子複合体の性質のうち１つ以上に依存する。内因性結合物質は、内因性結合物質、及び内因性干渉物質の双方であり得る。
【００１６】
以下に記載するように内因性結合物質は、置換剤によって検体から置換可能な物質である。内因性結合物質は、特定の内因性結合物質、及び不特定の内因性結合物質をともに含有する。特定の結合物質は、表面上の領域、又は空洞内の領域を有する物質であり、これは特定の空間的及び極性の検体組織に特に結合し、それによって相補的であると規定され、この逆もまた成り立つ。特定の結合は、不特定の結合とは区別される。なぜならば特定の結合は、他の分子よりも実質的に認めづらい２つの異なる分子の一方を認識することを伴うからである。不特定の結合物質とは、特定の表面構造とは比較的無関係に、一般的には分子間の非共有結合によって検体に結合する物質である。検体に対する内因性結合物質に含まれるのは（以下のものに限定されるわけではない）、検体に対して特別に結合するタンパク質（例えば抗検体抗体）、及びレセプター（例えば免疫グロブリン）、及び主要なカテゴリーから構成されるイムノフィリン（例えば、ＣｓＡに結合するシクロフィリン、タクロリムス及びシロリムスに結合するＦＫ結合性タンパク質）、及び副次的なカテゴリーから構成されるイムノフィリンである。副次的なカテゴリーには、２つの群がある；１つは、ペプチジジルプロピルシス／トランスイソメラーゼ活性を有するものであり（１２、２５、及び５６〜５０ｋＤａ）、もう１つは、ペプチジジルプロピルシス／トランスイソメラーゼ活性を有さないもの（１４、３７、及び５２ｋＤａ）、ラパマイシンのターゲット（ＴＯＲ）、α１アシドグリコプロテイン、リポタンパク質、アルブミン、及びグロブリンであり、例えば上記物質の２種以上の組み合わせである。
【００１７】
干渉物質には、アッセイにおけるシグナル生成と干渉する、あらゆる物質が含まれる。干渉は、アッセイの１種以上の成分への干渉物質の結合から生じることがある。このようなアッセイ成分には例えば、アッセイ抗体、シグナル酵素、リンカー、タンパク質、又は固体担体とアッセイ試薬基質に存在する他の試薬が含まれるが、これらの例に制限されるわけではない。干渉物質は例えば不特定の結合性タンパク質であり得るが、これらの例に制限されるわけではない。前述のように不特定の結合とは、特定の表面構造とは比較的無関係な分子間の非共有結合である。干渉（例えば不特定の結合）は、分子間の疎水性相互作用を含む幾つかの要因から生じることがある。アッセイにおいて干渉（例えば不特定の結合）を生じさせる１種又は複数の分子の性質は例えば、試料の性質又はイムノアッセイ成分の性質のいずれか、又はその双方に依存する。干渉物質、例えば不特定の結合性タンパク質は、以下で述べるように、検体から置換剤によって置換されないものである。
【００１８】
幾つかの例において、干渉物質には以下の例が含まれるが、以下の例に制限されるものではない：例えば不特定の免疫グロブリン、試薬凝集につながりかねない物質、アッセイにおけるシグナル酵素又はシグナル分子の活性を上昇又は低下させうる物質、例えば、シグナル生成酵素に結合する抗体（例えば、酵素基質（例えばクロロフェノール赤（ＣＰＲ））から、着色生成物（例えばクロロフェノール赤−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＣＰＲＧ）への変換）、固体担体上に存在する検体類似体に結合するアッセイ抗体を上昇又は低下させる物質、シグナル共役試薬に結合する物質、例えば抗体と酵素との共役体（酵素−抗体共役体）、これには酵素−抗体共役体の１種以上の成分の一部に結合する物質が含まれ、それは例えば、抗体と酵素とをリンクさせるリンカー基、抗体自体、酵素自体、又はこれらの１種以上の組み合わせ、検体への抗体の結合性を上昇又は低下させる物質、アッセイシグナル生成のために、生成物への基質の酵素的な変換を変化させることができる物質、例えば親油性材料、例えばリポタンパク質（例えばコレステロールとトリグリセリド）、脂質２分子膜、及び血漿膜、細胞、例えば赤血球細胞、又は例えば、上記のもの２種以上の組み合わせである。
【００１９】
免疫抑制剤は、内因性結合物質と結合すると疑われる検体の１つの群である。前述のように免疫抑制薬剤は、非自己組織の同種異系移植拒絶の防止を補助するため、移植患者に対して投与される治療薬である。免疫抑制剤は、４つの群に分類できる：グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、及びその他の薬剤、例えばインターフェロン、アヘン剤、ＩＮＦ結合タンパク質、マイコフェノレート、ＦＴＹ７２０などである。免疫抑制剤の具体的な分類には、イムノフィリンに作用を及ぼす薬剤が含まれる。イムノフィリンは、生理学的な重要性を有する、親和性が高い特定の結合性タンパク質の例である。イムノフィリンには２つの明確な系統があることが、現在知られている：それはシクロフィリンとマクロフィリンであり、後者は特別に結合された、例えばタクロリムス又はシロリムスである。イムノフィリンに作用を及ぼす免疫抑制剤には例えば、シクロスポリン（シクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリンＥ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロスポリンＨ、シクロスポリンＩを含む）、タクロリムス（FK506、PROGRAF（登録商標））、シロリムス（ラパマイシン、RAPAMUNE（登録商標））、及びエベロリムス（RAD、CERTICAN（登録商標））が含まれる。
【００２０】
上述のように、ここに記載した原則と一致する幾つかの例は、内因性干渉物質の存在下、検体の含有が疑われる未知の試料における検体の真の総量を特定するための方法を目指している。アッセイとアッセイ試薬はまず、特定の係数を特定するために、実質的に内因性干渉物質不含の既知の試料で使用される。これらの係数を用いる等式は、内因性干渉物質の存在下で、未知の試料における検体の総量を計算するために使用でき、単に、内因性結合物質によって結合される未知の試料における検体の量を特定し、前記等式を用いればよい。前述のようにアッセイは、既知の検体量を含有する試料で行い、既知だが異なる量の検体を含有する各試料について、遊離検体の量と、結合された検体の量を特定する。遊離検体と結合検体の測定からデータをグラフ化して回帰分析することにより、内因性干渉物質が存在するか否かに関わらず、未知の検体量を含有する試料における検体濃度を算出するための等式で使用可能な係数が特定される。
【００２１】
前述のように、既知の検体量を含有する試料でアッセイを行い、得られるデータをグラフ化することによって、係数を特定する。この試料は、内因性干渉物質を実質的に含まない。既知の試料における検体の濃度は、未知の試料における検体の疑わしい濃度範囲をカバーすべきである。既知の試料は、較正物質の作製と同様に、既知の検体量を、生物学的な試料又は非生物学的な試料に添加することによって作製できる。その一方で試料は、特定量の検体を含有すると分かっているもの（ただし、内因性干渉物質は実質的に含有しないもの）から選択できる。いずれの手法においても、係数を特定するために検体濃度が異なる既知の試料の数は、例えば検体の性質、試料の性質、内因性結合物質の性質、アッセイ試薬又は成分の性質のうち１つ以上による。ここに記載した原則に従う例においては、濃度が異なる既知の特定用試料の数は例えば、約２〜約１０、又は約３〜約１０、又は約４〜約１０、又は約４〜約８、又は約４〜６、又は約４〜約５、又は約５〜約７である。検体の既知量は相互に異なるべきであり、例えば約１〜約１０，０００％、又は約１０％〜約１，０００％、又は約５０％〜約３００％異なり、検体の量が０から次の高い量までの差違が、少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬ、又は少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、又は少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬである。幾つかの例では、既知の検体量を含有する試料は、所望の検体量を有する試料を加えることによって作製する。
【００２２】
前述のように既知の試料は、干渉物質を実質的に含有しない。「干渉物質を実質的に含有しない」ということは、既知の試料が、測定結果に影響を与える量でこのような物質を含有しないということであり、その量は約１０％以下、又は約５％以下、又は約３％以下、又は１％以下である。ここに記載する原則に従った幾つかの例では、干渉物質を実質的に含有しない試料は、試料を以下のような方法による分析にかけることによって得られるが、以下の方法に限られるわけではない：液体クロマトグラフィー、質量分析、又はこれらの組み合わせ、例えば液体クロマトグラフィーとタンデム型の質量分析、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とタンデム型の質量分析（ＬＣＭＳ2）、例えば干渉物質に否定的な試料を選ぶことである。その他のアプローチには、問題となる試料でアッセイを行うこと、及び検体に関連するシグナルを実質的に与えないものを選択することが含まれる。「検体に関するシグナルが実質的に無い」とは、アッセイ内で測定されるシグナルが検知できないか、又は全検体（［Ｙ］／［Ｘ］）にわたる結合検体の比率が、約５０％超、又は約６０％超、又は約７０％超、又は約８０％超、又は約９０％超、又は約９５％超、又は約９９％超であるか、又はその範囲が、約５０％〜約９９．９９％、又は約６０％〜約９９．９９％、又は約７０％〜約９９．９９％、又は約８０％〜約９９．９９％、又は約９０％〜約９９．９９％である。
【００２３】
既知の試料によるアッセイとは、未知の試料で使用すべきアッセイである。係数の特定は、未知の試料でアッセイを行うために使用されるアッセイ法及びアッセイ試薬のためである。アッセイは、置換剤の存在下（結合検体の量と、遊離検体の量を測定するため）、及び置換剤の不在下（遊離検体の量を測定するため）の両方で、既知の検体量を含有する試料で行う。様々な試料で測定されるアッセイシグナルは、試料における遊離検体＋内因性結合物質により結合される検体の量に変換され（アッセイは、置換剤を添加して行う）、試料中の遊離検体の量のみについての値に変換される（アッセイは、置換剤の不在下で行う）。後者を前者から引くことによって、内因性結合物質によって結合される、試料中の検体量が得られる。その結果は回帰分析に掛けられ、試料中の遊離検体量が、試料における結合検体の量に対してグラフ化される。１つの係数が可変であり、これは回帰直線の勾配に相当する。もう１つの係数が一定であり、回帰直線の切片に相当する。可変の（依存性）係数の値、及び一定の（独立性）係数の値は、以下でさらに説明するように、試料（未知の検体量を含有し、内因性干渉物質を含有しうるもの）における検体の総量を計算するために使用できる。
【００２４】
未知の試料における検体の総量を特定するための方法は、検体用のアッセイを用いて、内因性結合物質によって結合される検体（結合検体）を表す未知の試料における検体量［Ｙ］を測定する工程を伴う。未知の試料における内因性結合物質によって結合されない検体（遊離検体）の量［Ｚ］は、式：［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂによって特定され、ここで「ａ」及び「ｂ」は、既知の検体量を含有するが、内因性干渉物質は実質的に含有しない試料で行われたアッセイについての上記係数である。［Ｙ］と［Ｚ］を合計することにより、未知の試料における検体の総量［Ｘ］が得られ、この総量は未知の試料における内因性干渉物質の存在下で特定される。係数「ａ」は依存係数であり、係数「ｂ」が独立係数である。前述のように、既知の検体量を含有する試料でアッセイを行い、得られるデータをグラフ化することによって、係数「ａ」及び「ｂ」を特定する。「ａ」の値、及び「ｂ」の値は、干渉物質の存在下で、未知の検体量を含有する試料における検体の総量を計算するために使用できる。
【００２５】
以下の議論の特定の態様は、既知の試料と未知の試料のためのアッセイに、いずれも当てはまる。以下でさらに述べるように、あらゆるアッセイが使用できる。アッセイは、試料における検体濃度を特定するための試薬を、試料を含有する媒体に添加する工程を有する。幾つかの態様では、アッセイがイムノアッセイであり、試薬が、検体用の抗体を少なくとも１種含有する。検体用の抗体を含有する複合体の量を測定する。遊離検体によってのみ生じるシグナルレベルと、内因性結合物質によって結合される遊離検体＋内因性結合物質によって結合された検体によって生じるシグナルレベルの測定は、アッセイを用いて行う。試料の一部で行われるアッセイは、別個の反応槽で連続的若しくは付随的に、又は各試料の一部のための同じ反応槽内で連続的若しくは付随的に行うことができる。「検体用の抗体を含有する複合体」とは、検体用の抗体が、試料内の検体と複合化している複合体である。
【００２６】
結合検体の量は、試料の一部をアッセイにかけることによって測定し、この際、アッセイの前、又はアッセイの間に、結合検体を内因性結合物質から置換する試薬で、試料を処理する。置換剤は、内因性結合物質によって結合された検体を置換する。このようにして測定された測定検体の量は、内因性結合物質によって結合されていたが、今は置換された、検体＋遊離検体（試料における検体は、内因性結合物質によって結合されていない）の量である。遊離検体の量を測定するため、試料の別の一部をアッセイにかけ、この際にこの試料は、置換剤で処理しない。後者を前者から引くことによって、内因性結合物質によって結合される、試料中の検体量［Ｙ］が得られる。ここで内因性結合物質から検体を置換する薬剤は、置換剤と呼ぶ。置換剤の性質は例えば、検体の１つ以上の性質に依存し、検体の性質ほどではないが、内因性結合物質の性質にも依存する。
【００２７】
前述のように検体の測定は、置換剤で処理された試料と、置換剤で処理されていない試料で行い、結合検体と遊離検体の合計量、及び遊離検体のみの量を、それぞれ特定する。後者を前者から引くことによって、試料中の結合検体量が得られる。前述のように、試料の一部は、結合検体の量を特定するためのアッセイを行うために使用する。測定のためには、アッセイと干渉しないあらゆる便利な媒体中で、試料の一部を作製できる。一般的には、水性媒体が用いられる。試料の一部のサイズは例えば、検体の性質、アッセイの性質、アッセイを行うための様々な試薬の性質、及び検体を含有する複合体の性質のうち１つ以上に依存する。試料の一部のサイズは、両方の測定について実質的に同一であるのが望ましい。幾つかの態様において、試料の一部の体積は例えば、約１μＬ〜約１００μＬ、又は約２μＬ〜約１００μＬ、又は約５μＬ〜約１００μＬ、又は約１０μＬ〜約１００μＬ、又は約１μＬ〜約８０μＬ、又は１μＬ〜約６０μＬ、又は約１μＬ〜約４０μＬ、又は約１μＬ〜約２０μＬ、又は約５μＬ〜約５０μＬ、又は約１０μＬ〜約５０μＬである。
【００２８】
内因性結合物質によって結合される検体を測定するためのアッセイを行うための試料の部分量は、前述のように、置換剤で試料を処理する工程を有する。試料に添加する置換剤の量は、実質的に全ての検体を内因性結合物質から置換するために充分な量であり、これによって、試料でアッセイすることにより得られるシグナルは、内因性結合物質によって結合された検体量と、試料における遊離検体の量の両方の検体量を表すものとなる。ここで記載する原則に従って、「内因性結合物質によって結合される検体を実質的に全て置換する」とは、検体の少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％、又は１００％が、内因性結合物質から置換されており、アッセイの間、検知可能であるということを意味する。
【００２９】
置換剤の添加後、試料をしばらくの間、実質的に全ての検体が内因性結合物質から置換される条件下で、インキュベートする。インキュベートの長さと条件は例えば、置換剤の性質、検体の性質、及び検体の推定濃度による。幾つかの態様において、この工程のための培養温度は例えば、約５℃〜約９９℃、又は約１５℃〜約７０℃、又は約２０℃〜約４５℃である。培養のための時間は例えば、約０．２秒〜約２４時間、又は約１秒〜約６時間、又は約２秒〜約１時間、又は約１分〜約１５分である。培養は、利便性のため、ここで論じたアッセイ媒体で行うことができるが、必ずしもそのような媒体である必要はない。
【００３０】
試料における遊離検体の量を特定するため、同じ試料の一部を、置換剤で処理せずにアッセイにかける。このアッセイは、置換剤で処理された試料について先に記載したのと同じように行う。遊離検体の量を、上述のように遊離検体と結合検体の量の双方から引いて、結合検体のみの量を得る。未知の試料については、この結合検体の量は、試料中の検体の総量を計算するために用いる。結合検体の量は、上記式中で［Ｙ］によって表される。特定のアッセイについて、また既知の検体量を含有するが、内因性結合物質は実質的に含有しない試料を用いてアッセイ試薬について「ａ」と「ｂ」についての値を予め特定しておくことにより、内因性結合物質によって結合されていない未知の試料における検体（遊離検体）の量［Ｚ］は、式［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂによって特定される。［Ｙ］と［Ｚ］を合計することにより、未知の試料における検体の総量［Ｘ］が得られ、この総量は未知の試料における干渉物質の存在下で特定される。
【００３１】
置換剤はあらゆる部分であってよく、単一の化合物であるか、又は化合物の混合物であり、この置換剤により、内因性結合物質からの検体の置換について、アッセイ試薬（例えばアッセイ抗体）に対して有意な結合無しで、所望の結果が得られる。幾つかの例において、置換剤は検体を置換し、必要であれば内因性結合物質からのその代謝物は、検体と代謝物の両方を、検体のための結合相手（例えば検体用の抗体）に実質的に到達可能にする。
【００３２】
幾つかの態様において置換剤は、検体の類似体である（構造類似体を含む）。検体類似体は、検体類似体を結合物質から置換可能な変性された検体であるが、レセプター（例えば検体用の抗体）に対しては、実質的に競合しない。この変性により、他の分子と同様に、検体を参加させる手段が得られる。検体類似体は通常、検体類似体をハブ又は標識に結びつける結合による水素の置換以上に検体とは異なるが、必ずしもそうである必要は無い。検体類似体は例えば、検体に構造的に関連する分子、及び例えば結合基によって他の分子と共役した検体であり得る。ヒドロキシ官能基又はカルボン酸官能基を含有する検体については、置換剤は検体のエステルであってよく、これは検知すべき検体よりも、内因性結合物質に対して高い結合性を有し、検体用の抗体に対しては、有意な結合親和性を有さない。構造類似体は、検体と同じ又は類似の構造特性又は三次元特性を有する分子であり、これにより構造類似体は、内因性結合物質から検体を置換するに際して、検体の類似体と同じ又は類似の結果が得られる。構造類似体は例えば、検体に関連する別の化合物であり得る。
【００３３】
免疫抑制剤の場合、構造類似体は例えば、免疫抑制剤に関連する別の化合物であり得る。タクロリムス特定のための置換剤の例では、タクロリムスのエステル（例えばFK506）は、上記必要条件に合致する限り、置換剤として用いることができるが、この例は単に説明のためであり、この例に限定されるわけではない。別の態様において、シロリムスの特定に際して、タクロリムスのエステルは、置換剤として使用できる。このエステルは例えば、カルバメート、カーボネート、又はＣ1〜Ｃ6カルボン酸のエステルである。例えば、米国特許第7,186,518号を参照されたい。これに関連する開示内容は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。置換剤の他の例には、シクロスポリンＡに対しては、［Ｔｈｒ２、Ｌｅｕ５、Ｄ−Ｈｉｖ８、Ｌｅｕ１０］−シクロスポリンＡ、シロリムスについてはＦＫ５０６、及びＦＫ５０６についてはシロリムスが含まれるが、これらに限られるわけではない。例えば、米国特許第6,187,547号を参照されたい。これに関連する開示内容は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００３４】
媒体における置換剤の濃度は、検体を実質的に全て置換するという所望の結果を達成するために充分な濃度であり、幾つかの例では、検体の代謝物が、内因性結合物質から検体に（所望の場合には代謝物に）、前述の検体用抗体に対する結合に到達できるようにする。使用する置換剤の量又は濃度は例えば、試料の性質、検体の性質、検体代謝物の性質、他の試薬化合物の性質、及び反応条件のうち１つ以上による。幾つかの態様において置換剤の量は、約０．０００００１％〜約０．５％、約０．０００１％〜０．４％、約０．００１〜約０．３％、約０．０１％〜約０．２％、約０．１％〜約０．３％、約０．２％〜約０．５％、約０．１％〜約０．２％などである（パーセンテージは、質量／体積）。
【００３５】
置換剤の添加後、第二の試料の一部をしばらくの間、実質的に検体が放出される条件下で、インキュベートする。インキュベートの長さと条件は例えば、置換剤の性質、検体の性質、検体の推定濃度、抗体親和性、アビジチー、及び抗体断片化のうち１つ以上による。幾つかの態様において、この工程のための培養温度は例えば、約５℃〜約９９℃、又は約１５℃〜約７０℃、又は約２０℃〜約４５℃である。培養のための時間は例えば、約０．２秒〜約２４時間、又は約１秒〜約６時間、又は約２秒〜約１時間、又は約１分〜約１５分である。培養は、利便性のため通常、ここで論じたアッセイ媒体で行うが、必ずしもそのような媒体である必要はない。
【００３６】
幾つかの態様では溶血剤を使用するが、この溶血剤は、検体が捕捉されているかもしれない細胞膜を粉砕するものである。例えば、赤血球細胞内に捕捉された検体は、溶血剤を用いることによって赤血球細胞から放出される。溶血剤は、赤血球細胞の膜の完全性を破壊する化合物、又はこのような化合物の混合物であり、これによって細胞（特に赤血球）の細胞内部の内容物を置換する。多くの溶血剤が、従来技術で知られている。溶血剤には例えば、非イオン性洗浄剤、アニオン性洗浄剤、両性洗浄剤、低イオン性水溶液（低張溶液）、細菌剤、補体依存性溶解を引き起こす抗体などが含まれる。
【００３７】
溶血剤として使用可能な非イオン性洗浄剤には、合成洗浄剤と、天然洗浄剤の双方が含まれる。合成洗浄剤の例は、TRITON（登録商標）X-100、TRITON（登録商標）N-101、TRITON（登録商標）X-114、TRITON（登録商標）X-405、TRITON（登録商標）SP-135、TWEEN（登録商標）20（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、TWEEN（登録商標）80（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、DOWFAX（登録商標）、ZONYL（登録商標）、ペンタエリトリチルパルミテート、ADOGEN（登録商標）464、ALKANOL（登録商標）6112界面活性剤、アリルアルコール１，２−ブトキシレート−ブロック−エトキシレートHLB6、BRIJ（登録商標）、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトラオール、IGEPAL（登録商標）、MERPOL（登録商標）、ポリ（エチレングリコール）、２−［エチル［（ヘプタデカフルオロオクチル）スルホニル］アミノ］エチルエーテル、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、TERGITOL（登録商標）NP-9、GAFAC（登録商標）（RHODAFAC（登録商標）、アルキルポリオキシエチレングリコールホスフェートエステル、例えばα−ドデシル−ω−ヒドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）ホスフェート）、及びEP 110（登録商標）などである。溶血剤として使用可能な天然の洗浄剤には例えば、サポニン、ナトリウム若しくはカリウム、中和された脂肪酸、中和されたリン脂質、ジアシルグリセロール、中和されたホスファチジルセリン、ホスファチデート、中和されたホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルクロリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルクロリン、胆汁酸塩、エステル化されていないコレステロール、中和されたスフィンゴシン、セラミドなどが含まれる。１種以上の合成洗浄剤の組合わせ、又は１種以上の天然洗浄剤の組み合わせ、及び合成洗浄剤と天然洗浄剤の組み合わせも、使用できる。
【００３８】
本発明の態様で使用可能な他の薬剤に含まれるのは例えば、溶解試薬、例えば少量の有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、メトキシプロパノール、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びタンパク質分解を行うための試薬、例えばプロテイナーゼ、トリプシン、ペプシン、及びペプチダーゼである。
【００３９】
検体用アッセイについての概論
アッセイ測定結果を特定するためには、前述のようにあらゆる適切なアッセイが使用できる。アッセイは試料の一部で、前述のように置換剤でその一部を処理する工程に直ちに連続して行うことができるか、又はアッセイはその後の時点で行うことができる。アッセイは各試料の一部を、試料における検体の量を特定するための試薬と合することによって行う。試薬の性質は、行うべきアッセイの特定の種類に依存する。アッセイは一般的に、試料における検体の量を特定するための方法である。アッセイは、イムノアッセイ、又は非イムノアッセイであり得る。様々なアッセイ法を以下で説明するが、これらの例に限られることはない。
【００４０】
多くの態様において、試薬は検体用の少なくとも１種の抗体を含有し、このアッセイは一般的に、抗体を利用しないアッセイとは区別され、これは非イムノアッセイと呼ばれる。「検体用の抗体」とは、検体（及び所望の場合には、検体の代謝物）に特別に結合する抗体を意味し、検体用の抗体を変形させる他の物質に有意に結合することはない。
【００４１】
使用可能なイムノアッセイの一般的な群には、抗体の限定的濃度を用いたイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイの別の群は、１種以上の原則的な試薬を過剰に用いる工程（例えば検体用抗体の過剰量）を伴う。イムノアッセイの別の群は、非分離型均質アッセイであり、このアッセイでは、標識付けした試薬が、検体と抗体の結合反応に基づき標識シグナルを調整する。アッセイの別の群には、検体用のアッセイと限定的に競合する標識付けされた抗体試薬が含まれ、これにより、標識付けされた問題となるハプテンの使用が回避できる。この種類のアッセイには、固相に固定された検体が、一定の限定された量で存在する。固定された検体と、固定されていない検体との間の標識の分割は、試料における検体の濃度による。
【００４２】
イムノアッセイで用いるための検体の特別な抗体は、単クローン性又は多クローン性であり得る。このような抗体は、当業者に公知の技術によって作製でき、それは例えば、ホストの免疫化、及び血清の収集（多クローン性）によって、又は連続的なハイブリッド細胞ラインを作製し、分泌タンパク質を収集することにより（単クローン性）、又は天然抗体の特定の結合に必要な少なくとも１種のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列若しくはヌクレオチド配列の突然変異型を、クローニング及び発現させることにより、作製することができる。
【００４３】
抗体は完全な免疫グロブリン又は免疫グロブリンの断片を有することができるが、この免疫グロブリンには様々な分類とアイソタイプが含まれ、それは例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどである。これらの断片には例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＦ（ａｂ’）2、及びＦａｂ’が含まれ得る。加えて、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントのアグリゲート、ポリマー、及び共役体が、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、適切であれば使用できる。
【００４４】
前述のように、検体用のイムノアッセイで使用するために選択される抗体は例えば、特別に、また好ましくは検体（及びもし必要又は所望であれば、その医薬活性代謝物）に、他の配位子（例えば他の代謝物、又は関連物質）にわたって結合するべきである。
【００４５】
他の試薬は、行うべきアッセイの性質によって、アッセイ媒体中に含有される。このようなアッセイは通常、結合対象、例えば検体と、相応する検体との反応、又は抗体と相応する結合対象（結合相手、結合パートナーとも言う）、例えば第一の抗体に結合する第二の抗体との結合を伴う。従って、結合対象はタンパク質であってよく、これは抗体又は抗原であり得る。結合対象は、特定の結合ペアのメンバー（ｓｂｐメンバー）であってよく、これは１つ又は２つの異なる分子であり、この分子は、表面上の領域又は空洞内の領域を有し、これは特別に空間的に他分子の組織に特に極性的に結合し、それによって相補的であると規定される。特定の結合ペアのメンバーは通常、免疫学的なペア（例えば抗原と抗体）であるが、他の特定結合のペア、例えばビオチンとアビジン、ホルモンとホルモンレセプター、酵素基質、核酸二重構造、ＩｇＧタンパク質Ａ、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ）は、免疫学的なペアではないが、「ｓｂｐメンバー」という用語の範囲に包含される。
【００４６】
前述のように特定の結合には、他の分子よりも実質的に認めづらい２つの異なる分子の一方を特別に認識する工程を伴う。一方で、不特定の結合は、特定の表面構造とは比較的無関係な分子間の非共有結合を伴う。不特定の結合は、分子間の疎水性相互作用を含む幾つかの要因から生じることがある。アッセイの多くの態様において、好ましい結合対象は抗体であり、アッセイは、イムノアッセイを言う。
【００４７】
イムノアッセイは、標識付けされた試薬、又は標識付けされていない試薬を伴うことがある。標識付けされていない試薬を伴うイムノアッセイは通常、１種以上の抗体を伴う比較的大きな結合体を形成する工程を有する。このようなアッセイには例えば、抗体複合体を検知するための、免疫沈降法、凝集法、及び相応する光散乱技術（例えば、比濁計や濁度計）が含まれる。標識付けされたイムノアッセイには例えば、酵素イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ、放射免疫測定アッセイ、阻害アッセイ、励起ルミネセンス、及び蛍光酸素チャネリングアッセイが含まれる。
【００４８】
幾つかの態様において、均質なイムノアッセイが使用でき、このようなアッセイはまた、実質的に非分別型のイムノアッセイとも呼ばれることがある。この方法は、完全に自動化された均質アッセイに適用され、ここではアッセイに先立ち、試料（検体代謝物を含む）の他の成分から検体を抽出、又は分離しない。「手動抽出を行わない」アッセイでは、試料（例えば全血試料）を、（例えば有機溶媒で）抽出せずに、適切な媒体において検体用アッセイを行うための試薬と合して、アッセイ法を行う。この方法はまた、手動で抽出を行うアッセイにも適用できる。
【００４９】
アッセイは、あらゆるアッセイ成分又は生成物を分離せずに（均質）、又は分離ありで（不均質）で行うことができる。均質なイムノアッセイは、EMIT（登録商標）アッセイ（米国カリフォルニア州サンホセ在、Syva Company）に例示されており、Rubensteinらが米国特許第3,817,837号明細書、第３コラムの６行目〜第６コラムの６４行目で開示しており、免疫蛍光法は例えば、Ullmanらが米国特許第3,996,345号明細書、第１７コラムの５９行目〜第２３コラムの２５行目に開示しており、酵素チャネリングイムノアッセイ（ＥＣＩＡ）は、Maggioらが米国特許第4,233,402号明細書、第６コラムの２５行目〜第９コラムの６３行目に開示しており、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）は例えば特に、米国特許第5,354,693号明細書などに開示されている。
【００５０】
その他の酵素イムノアッセイは、Ngo及びLenhoffによる酵素活性調節イムノアッセイ（ＥＭＭＩＡ）FEBS Lett. (1980) 116:285-288、Oellerich, J.による基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904、Khannaらによるクローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240、均質粒子標識イムノアッセイ、例えば比濁分析阻害イムノアッセイ（ＰＥＴＩＮＩＡ）、粒子強化型比濁イムノアッセイ（ＰＥＴＩＡ）などである。
【００５１】
他のアッセイに含まれるのは、ゾル粒子イムノアッセイ（ＳＰＩＡ）、分散染色イムノアッセイ（ＤＩＡ）、金属イムノアッセイ（ＭＩＡ）、酵素膜イムノアッセイ（ＥＭＩＡ）、ルミノイムノアッセイ（ＬＩＡ）、固相で常磁性粒子を用いたアクリジニウムエステル標識イムノアッセイ（ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ  イムノアッセイ）などである。その他の種類のアッセイには、疎水性薬剤の結合を介して抗体が固定された表面の光学的、音波的、及び電気的な特性における変化のモニタリングを伴うイムノセンサーアッセイが含まれる。このようなアッセイには例えば、光学イムノセンサーアッセイ、音波イムノセンサーアッセイ、半導体イムノセンサーアッセイ、電気化学的な変換器によるイムノセンサーアッセイ、電位差的なイムノセンサーアッセイ、電流測定による電極アッセイなどが含まれる。
【００５２】
ここで論じた検体特定のための多くのアッセイでは、標識を用いる：この標識は通常、シグナル生成システムの一部である（ｓｐｓ）。標識の性質は、特定のアッセイフォーマットに依存する。ｓｐｓは通常、１種以上の成分、少なくとも１種の検知可能な標識成分を含有し、この標識成分が、結合された及び／又は結合されていない標識の量に関連する検知可能なシグナルを生成する。すなわち、検知すべき検体に、若しくは検知すべき検体の量を反映する薬剤に結合された、又は結合されていない標識の量が検知される。標識は、シグナルを生成する、又はシグナルを生成するために導入されうるあらゆる分子であり、例えば、蛍光性、放射性標識、酵素、ケミルミネッセンス剤、又は増感剤であり得る。よってシグナルは、標識の性質に基づき、酵素活性、ルミネセンス、吸光性、又は放射線活性を検知することにより検知及び／又は測定される。
【００５３】
適切な標識に含まれる例を、説明のために以下に示すが、これらに限定されるわけではない：酵素、例えばアルカリ金属ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、β−ガラトシダーゼ、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ；リボザイム；レプリカーゼ（例えばＱＢレプリカーゼ）用の基質；促進剤；染料；蛍光物質、例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、及びフルオレスカミン；錯体、例えば量子ドットとして知られる半導体ナノ結晶に存在するＣｄＳｅ及びＺｎＳから作製される錯体；ケミルミネッセンス物質、例えばイソルミノール、及びアクリジニウムエステル、例えば増感剤、補助酵素、酵素基質、放射性同位元素、例えば125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、57Ｃｏ、及び75Ｓｅ、粒子、例えばラテックス粒子、炭素粒子、金属粒子（磁性粒子を含む）、例えば二酸化クロム（ＣｒＯ2）粒子など、金属ゾル、クリスタリット、リポソーム、細胞など、これらは染料、触媒、又は他の検知可能な群によってさらに標識化されていてよい。適切な酵素と補助酵素は、Litmanらの米国特許第4,275,149,号明細書、第１９〜２８コラム、及びBoguslaskiらの米国特許第4,318,980第１０〜１４コラムに、適切な蛍光物質とケミルミネッセンス物質は、Litmanらが米国特許第4,275,149で第３０〜第３１コラムに開示しており、これらは参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００５４】
標識は、直接シグナルを生成することができるため、更なる成分は、シグナルを生成するために必要とはならない。様々な有機分子（例えば蛍光物質）は、紫外光と可視光を吸収することができ、ここで吸光がエネルギーをこれらの分子に伝達し、これらの分子をエネルギー励起状態に上げる。吸収されたエネルギーは、その後、第二の波長における光の放出によって放散される。シグナルを直接生成するその他の標識には、放射線活性同位体と、染料が含まれる。
【００５５】
標識はまた、シグナルを生成するために他の成分を必要とすることがあり、この場合にシグナル生成系は、測定可能なシグナルを生成するために必要な全ての成分を有する。このような他の成分には、基質、補助酵素、エンハンサー、付加的な酵素、酵素生成物と反応する基質、触媒、活性剤、補因子、阻害剤、補足剤、金属イオン、及びシグナル生成基質の結合に必要な特定の結合物質が含まれる。適切なシグナル生成系の詳細な論述は、Ullmanらの米国特許第5,185,243号、第１１〜１３コラムにあり、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００５６】
標識又は他のｓｐｓメンバーは、担体に結合されていてよい。検体、又は検体類似体は、当業者に公知のいかなる形で固体担体に結合されていてもよいが、ただしこの結合は、検体又は検体類似体が抗体に結合する能力に対して、実質的に干渉してはならない。幾つかの態様において検体又は検体類似体は、被覆されているか、又は固相に対して直接共有結合されているか、又は１種以上の担体分子層を有していてよく、その例は、例えばポリ（アミノ酸）（タンパク質、例えば血漿アルブミン若しくは免疫グロブリンを含む）、又は多糖類（炭水化物、例えばデキストラン若しくはデキストラン誘導体）である。結合基は、共有結合的に固体担体と検体とを結びつけるためにも使用できる。検体を結合するための他の方法もまた、可能である。固体の担体は例えば、小さな分子のためのバインダーのコーティング（例えばアビジン、抗体など）を有することができ、小さな分子、例えばビオチン、ハプテンなどは、検体に結合することができ、その逆もある。担体の表面に対する成分の結合は、直接的であっても、間接的であってもよく、共有結合、又は非共有結合であってもよく、また公知技術、文献で慣用の方法によって行うことができる。例えば「Immobilized Enzymes」Ichiro Chibata著、Halsted Press, New York (1978)、及びCautrecasas, L著、Biol. Chem., 245:3059 (1970)を参照されたい。
【００５７】
担体は、有機又は無機の、固体又は液体の、水不溶性の材料から構成されていてよく、これは透明であるか、又は一部が透明である。担体はどのような形状であってもよく、その形状は例えば、粒子（ビーズを含む）、フィルム、膜、チューブ、くぼみ、ストリップ、ロッド、平面（例えばプレート、紙）、繊維である。
【００５８】
アッセイの種類に応じて担体は、使用する媒体中に懸濁可能であるか、又は懸濁しない。懸濁可能な担体の例は、ポリマー材料、例えばラテックス、脂質二重層、若しくはリポソーム、油滴、細胞とヒドロゲル、及び磁性粒子である。他の担体組成物には、ポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、及びポリ（ビニルブチレート）が含まれ、それ自体で使用されるか、又は他の材料と合同で使用する。
【００５９】
担体は、粒子であり得る。粒子は平均直径が、少なくとも約０．０２ミクロンであり、約１００ミクロン以下である。幾つかの態様において粒子は、平均直径が約０．０５ミクロンから約２０ミクロンであるか、又は約０．３ミクロンから約１０ミクロンである。粒子は有機又は無機であり、膨潤性又は非膨潤性であり、多孔質又は非多孔質であり、好適には密度がほぼ水と同等、一般的には約０．７ｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／Ｌであり、透明、半透明、又は不透明な材料から構成されている。粒子は、生物学的な材料であってよく、例えば細胞、及び微生物、例えば赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、ステレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ウィルスなどである。粒子はまた、有機及び無機のポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、磁性若しくは非磁性粒子、ホスホリピド小胞、カイロミクロン、リポタンパク質などである。幾つかの態様において、粒子は二酸化クロム（クロム）粒子、又はラテックス粒子であり得る。
【００６０】
ポリマー粒子は、付加又は縮合により形成されたポリマーであり得る。粒子は水性媒体中にすぐに分散可能であり、吸着可能又は官能化可能であるため、結合基を介して直接的又は間接的に、検体に対して共役できる。この粒子はまた、天然材料から、人工的に変性された天然材料から、そして合成材料から誘導することができる。特に興味深い有機ポリマーは例えば、多糖類、特に架橋多糖類、例えばアガロース（SEPHAROSE（登録商標）として入手可能）、デキストラン（SEPHADEX（登録商標）、及びSEPHACRYL（登録商標）として入手可能）、セルロース、デンプンなど、付加ポリマー、例えばポリスチレン、ポリビニルアルコール、アクリレート及びメタクリレートの誘導体のホモポリマーとコポリマー、特に遊離ヒドロキシ官能性を有するエステルとアミドである。
【００６１】
標識及び／又は他のｓｐｓメンバーは、ｓｂｐメンバー又は他の分子に結合されていてよい。標識は例えば、ｓｂｐメンバーに共有結合されていてよく、その例は、例えば抗体、抗体用レセプター、抗体に共役している小さな分子に結合可能なレセプター、又は検体類似体である。ｓｂｐメンバーへの標識の結合は、標識の水素原子を、ｓｂｐメンバーの結合に置き換える化学反応によって行うことができるか、又は標識とｓｂｐメンバーとの間の結合基を有することができる。他のｓｂｐメンバーはまた、ｓｂｐメンバーに共有結合していてもよい。例えば、２つのｓｐｓメンバー（例えば蛍光物質と消光剤）はそれぞれ、検体と特定の錯体を形成する異なる抗体に結合していてよい。錯体の形成により、蛍光物質と消光剤は接近し、これにより消光剤が蛍光物質と相互作用して、シグナルを生成することができる。共役のための方法は、従来技術でよく知られている。例えば、Rubensteinらの米国特許第3,817,837号明細書を参照されたい。この内容については、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００６２】
標識タンパク質として特に興味深い酵素は、レドックス酵素であり、特に脱水素酵素、例えばグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素であり、例えば過酸化水素の生成を伴う酵素、及び染料前駆体を酸化して染料にするための過酸化水素の使用である。特別な組み合わせには、糖類オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼとガラクトースオキシダーゼ）、又は複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼとキサンチンオキシダーゼ）と、染料前駆体（ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ）を酸化するために過酸化水素を用いる酵素との組み合わせが含まれる。付加的な酵素の組み合わせは、従来技術でよく知られている。標識として１つの酵素を用いる場合、他の酵素としては、加水分解酵素、転移酵素、及び酸化還元酵素が使用でき、好適には加水分解酵素として、例えばアルカリ金属ホスホターゼとβ−ガラクトシダーゼが使用できる。またルシフェラーゼとして例えば、ホタルルシフェラーゼとバクテリアルシフェラーゼが使用できる。
【００６３】
使用可能なことが実証されている補助酵素は、ＮＡＤ［Ｈ］、ＮＡＤＰ［Ｈ］、ピリドキサールホスフェート、ＦＡＤ［Ｈ］、ＦＭＮ［Ｈ］などであり、補助酵素は通常、環化反応を伴う。例えば米国特許第4,318,980号明細書を参照されたい。その内容については、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００６４】
標識タンパク質、例えば酵素は、分子量の範囲が約１０，０００から６００，０００であるか、又は約１０，０００から約３００，０００である。通常は例えば、分子量約２００，０００あたり検体類似体が少なくとも約１個、又は分子量約１５０，０００あたり少なくとも約１個、又は分子量約１００，０００あたり少なくとも約１個、又は分子量約５０，０００あたり少なくとも約１個である。酵素の場合、検体類似体の群の数は例えば、１〜約２０、約２〜約１５、約３〜約１２、又は約６〜約１０である。
【００６５】
「非ポリ（アミノ酸）標識」という用語には、タンパク質ではない標識が含まれる（例えば酵素）。非ポリアミノ酸標識は、直接検知できるか、又は検知可能なシグナルを生成する特定の結合反応によって検知可能である。非ポリ（アミノ酸）標識には例えば、放射性同位体、蛍光化合物、担体（例えば粒子、プレート、ビーズなど）、ポリヌクレオチドなどが含まれる。より具体的には、非ポリ（アミノ酸）標識は、同位体又は非同位体であってよく、通常は非同位体であり、触媒、促進剤、染料、補助酵素、酵素基質、放射線活性基、低分子（例えばビオチン、蛍光分子、ケミルミネッセンス分子などを含む）、両性ポリヌクレオチド配列、担体、例えば粒子、例えばラテックス、又は炭素粒子、又は二酸化クロム（クロム）粒子、金属ゾル、クリスタリット、リポソーム、又は細胞であってよく、これらはさらに例えば染料、触媒、又は他の検知可能な群でさらに標識化されていてよい。
【００６６】
１つの態様においてアッセイは、励起ルミネセンスイムノアッセイであり、これは米国特許第5,340,716号明細書（Ullmanら）に「Assay Method Utilizing Photoactivated Chemiluminescent Label」（「induced luminescence assay」）という標題で記載されており、この開示は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。１つのアプローチにおいてアッセイは、増感剤と、ケミルミネッセンス化合物を組み込む標識粒子を組み込む粒子とを用いる。標識粒子は、ｓｂｐメンバー（例えば検体用抗体）に共役し、検体の量と関連してこの抗体は、検体と結合して複合体を形成可能であるか、又は第二のｓｂｐメンバーに結合して複合体を形成可能である。検体が存在する場合、増感剤とケミルミネッセンス化合物が近接する。増感剤によって一重項の酸素が生成し、２つの標識が近接すると、ケミルミネッセンス化合物が活性化する。活性化されたケミルミネッセンス化合物は、引き続き光を生成する。生成される光の量は、検体用抗体を含有する、形成される複合体の量に関連する。
【００６７】
さらなる例ではケミルミネッセンス粒子を用いるが、これはケミルミネッセンス粒子と会合するケミルミネッセンス化合物を含有するものであり、例えばこの化合物に組み込まれるか、又はこの化合物に付着される。検体に結合するｓｂｐメンバー（例えば検体用の抗体）は、粒子を被覆する多糖類に結合する。検体に結合する第二のｓｂｐメンバーは、ビオチン共役体の一部である。ストレプトアビジンは、ストレプトアビジンと会合する増感剤を有する粒子の第二の組に共役する。粒子（増感剤粒子）の第二の組へのストレプトアビジンの結合は、粒子上に多糖類を伴うことも、伴わないこともある。ケミルネッセンス粒子は、検体の含有が疑われる試料の一部とそれぞれ、また増感剤粒子と混合する。試料の第一の部分については、反応媒体をインキュベートして、粒子が試料中で検体以外の物質又は化合物と結合できるようにする。試料の第二の部分については、反応媒体をインキュベートして、検体に対するｓｂｐメンバーの結合によって、粒子が検体と結合できるようにする。それから媒体に、増感剤を励起させる光を照射するが、この増感剤は、活性化酸素の励起状態において一重項状態になることができるものである。幾つかの粒子の内の１つのケミルネッセンス化合物が、検体の存在によって増感剤と近接しているので、この化合物は一重項酸素によって活性化され、ルミネセンスを放出する。それからこの媒体は、放出されるルミネッセンス又は光の量について調査し、これらの存在量は、検体の量を基準とする。
【００６８】
検体の特定に使用可能なアッセイの他の特定の例は、米国特許第5,616,719（Davalianら）で論じられており、これは蛍光酸素チャネリングイムノアッセイである。
【００６９】
前述のアッセイは通常、水性緩衝媒体内で、適度なｐＨ（一般的には最適なアッセイ感度が得られる値）で行う。アッセイ媒体のｐＨは通常、約４〜約１１の範囲、又は約５〜約１０の範囲、又は約６．５〜約９．５の範囲にある。ｐＨは通常、あらゆる特定の結合相手の結合メンバーの最適な結合と、アッセイの他の試薬（例えばシグナル生成システムのメンバー）のためのｐＨ最適値との間で妥協的に決められる。所望のｐＨを達成し、インキュベートの間にｐＨを維持するために、様々な緩衝液が使用できる。例示的な緩衝液には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＣＩＮＥなどが含まれる。媒体はまた、血液凝固を防止するための薬剤を有することもできる。このような薬剤は当業者によく知られており、例えばエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）、クエン酸塩、ヘパリンなどが含まれる。様々な補助材料が、アッセイ法において使用できる。緩衝液と保存液に加えて例えば、媒体は媒体のための、また使用する試薬のための安定剤を含有することができる。幾つかの態様ではこれらの添加剤に加えて、タンパク質が含有されていてよく、その例は例えば、アルブミン、第四級アンモニウム塩、ポリアニオン、例えばデキストランスルフェート、及び結合エンハンサーである。前述の材料は全て、所望の効果又は作用を達成するために充分な濃度又は量で存在する。
【００７０】
１つ以上のインキュベート時間は、１つ以上のインターバル（前述の様々な試薬を添加する間のインターバルを含む）で媒体に適用できる。媒体は通常、試薬の様々な成分を結合させるのに充分な時間と温度でインキュベートする。適度な温度は通常、方法を実施するために用い、通常は測定の間、温度が一定、好ましくは室温で一定である。培養温度は通常、約５℃〜約９９℃の範囲、又は約１５℃〜約７０℃の範囲、又は約２０℃〜約４５℃の範囲にある。培養のための時間は例えば、約０．２秒〜約２４時間、又は約１秒〜約６時間、又は約２秒〜約１時間、又は約１分〜約１５分である。この時間は、媒体の温度と、様々な試薬の結合速度による。測定の間の温度は一般的に、約１０℃〜約５０℃の範囲、又は約１５℃〜約４０℃の範囲にある。
【００７１】
アッセイ可能な検体の濃度は一般的に、約１０-5〜約１０-17Ｍ、又は約１０-6〜約１０-14Ｍである。アッセイが定量的か、半量的か、又は定性的かを考慮すれば（試料中に存在する赤血球親和性薬剤検体の量との関連で）、通常は粒子検知技術と検体の濃度によって、様々な試薬の濃度が特定される。
【００７２】
アッセイ媒体における様々な試薬の濃度は一般的に、例えば興味対象となる検体の濃度範囲、アッセイの性質、抗体親和性、及びアビジチー、及び抗体断片化によって特定される。しかしながら、各試薬の最終的な濃度は通常、経験的に決定され、範囲にわたるアッセイの感度が最適化される。これはつまり、重要な検体の濃度における変化によって、正確に測定可能なシグナルの差違が生じるということである。例えばシグナル生成系、及び検体の性質を考慮すれば、通常は様々な試薬の濃度が特定される。
【００７３】
添加の順序は幅広く変えることができる一方で、アッセイの性質に応じて、好ましい順序が幾つかある。最も単純な添加順序は、全ての材料を同時に添加することであり、均質なアッセイと同じように、アッセイ媒体がシグナルに対して有する効果を特定することである。或いは試薬は順次、合してもよい。任意でインキュベート工程が、前述のように各工程に続いてよい。インキュベート時間の長さは、所望の作用を得るために充分な時間である。
【００７４】
特定の免疫抑制剤検体のための、アッセイの特別な態様
各試料の一部でアッセイするために使用可能なアッセイの特別な態様を、以下で単に説明のために論じるが、これにより免疫抑制剤の検体が何らかの形で制限されることはない。
【００７５】
均質アッセイでは、全ての試薬を合した後に、シグナルを特定し、試料内の検体量に関連させる。例えば、検体用のEMIT（登録商標）アッセイでは、検体の含有が疑われる試料を、水性媒体中で同時に、又は順次、検体の酵素共役体（すなわち、検体類似体、及び検体を認識可能な抗体）と合する。一般的には、酵素のために基質を添加し、この基質によって、酵素触媒反応により色素生成又は蛍光源の生成物が形成される。好ましい酵素は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、及びアルカリ金属ホスホターゼであるが、別の酵素を使用してもよい。検体と酵素共役部分は、抗体における結合部位について競合する。媒体における酵素活性は通常、分光光度計により測定する。
【００７６】
前述のアッセイは、グルコース−６−リン酸脱水素酵素の突然変異体を、酵素共役体の酵素として用いて行うことができる。この突然変異酵素は、米国特許第6,090,567号明細書、及び同6,033,890号明細書に記載されており、関連する開示内容は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。さらに、アッセイは検体用の抗体を用いて、また米国特許第5,328,828号明細書、及び同5,135,863号明細書に開示された手法で行うことができ、関連する開示内容は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００７７】
不均質アッセイは通常、１つ以上の分離工程を伴い、競合的であっても、非競合的であってもよい。競合的、及び非競合的なアッセイフォーマットの種類は、Davalianらの米国特許5,089,390号明細書の第１４コラム、２５行目〜第１５コラム、９行目に開示されており、この開示内容は、ここで参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。競合的なアッセイの１つの種類において担体は、ここで開示するように、担体に結合された検体用の抗体を有し、この担体を、試料を含有する媒体、及び検体の適切な酵素共役体と接触させる。担体と媒体とを分離した後、担体又は媒体の酵素活性を、測定結果を特定するための慣用の技術によって特定する。
【００７８】
特定の態様において第二の酵素は、酵素共役体の酵素に加えて、使用してもよい。一組の酵素の酵素は、第一の酵素の生成物が、第二の酵素の基質として役立つ点で関連している。
【００７９】
アッセイフォーマットの別の態様は、キャプチャーアッセイである。このアッセイフォーマットでは、検体用の抗体が、磁性粒子に対して供給結合している。試料は、これらの粒子とともにインキュベートし、これにより検体用の抗体が、検体に結合できるようになる。続いて、検体、又は共有結合で結びついた検体の誘導体を有する酵素を、磁性粒子とともにインキュベートする。洗浄後に、磁性粒子に結合された酵素の量を測定し、逆に検体用の抗体を含有する複合体の量と関連させる。
【００８０】
以下のアッセイの説明は、単に説明のために示すに過ぎず、本発明の例を何ら制限するものではない。免疫抑制剤としてのタクロリムス又はシロリムスの選択もまた、単に説明のために挙げるに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない。本発明は、特定の検体、及びその他の検体において、免疫抑制剤を検知するため一般的に適用されるからである。
【００８１】
１つの態様では試料の一部を、タクロリムス共役体と混合する。これはすなわち、例えばビオチンに結合しているクロリムス類似体である。分析すべき試料の量に応じて、試料の部分量をインキュベートして、検体以外の試料中の物質の結合を、タクロリムス用抗体に結合させるか、又はこのような物質の結合と試料のタクロリムスを、タクロリムスの類似体と競合するタクロリムス用の抗体に結合させ、ここで抗体は、タクロリムス又はタクロリムス類似体と結合することができる。適切な洗浄緩衝液ですすいだ後、ストレプトアビジンから成る検知分子、若しくは酵素と共役したアビジン、蛍光又はケミルミネセンス分子若しくは放射線活性分子を、媒体に添加することができ、それからこの媒体のシグナル量を調査する。シグナルの量は、試料におけるタクロリムスの量と関連する。
【００８２】
１つの態様において、使用するアッセイは、前述のように励起ルミネッセンスアッセイである。励起ルミネッセンスアッセイの幾つかの態様では（単に説明のためであり、これに限定されるわけではない）、試薬には２種のラテックスビーズ試薬と、ビオチニル化された抗タクロリムスマウス単クローン性抗体が含まれる。第一のビーズ試薬は、タクロリムス又はタクロリムス類似体で被覆され、かつケミルネッセンス染料を含有する。第二のビーズ試薬は、ストレプトアビジンで被覆され、増感剤染料を含有する。タクロリムスの含有が疑われる試料の一部は、上述のように処理する。試料の一部は、置換剤で処理されていないタクロリムス用の抗体で処理する。試料の一部は、タクロリムス用のビオチニル化された抗体でインキュベートし、これにより試料中のタクロリムスは、ビオチニル化された抗体へと結合できる。第二の工程では第一のビーズ試薬が添加され、これにより、検体と結合しないビオチニル化された抗体の断片との、ビーズ／ビオチン化された抗体免疫複合体が形成される。それから第二のビーズ試薬を添加し、ビオチンに結合させて、ビーズペアの免疫複合体を形成する。６８０ｎｍで照射すると、第二のビーズ試薬は、反応溶液中の溶解酸素をよりエネルギーのある一重項酸素形態に変換する。ビーズペアでは、一重項の酸素が、第一のビーズ試薬へと拡散し、これがケミルネッセンス反応のトリガーとなる。こうして生じるケミルネッセンスシグナルは、６１２ｎｍで測定して、タクロリムス抗体に結合する試料中のタクロリムス以外の物質濃度の逆関数である。このシグナル量は、試料中のこのような物質量と関連する。
【００８３】
同じアッセイはまた、別の試料の部分量で行い、これはＦＫ５０６で処理して、試料内で内因性結合物質からタクロリムスを放出させる。アッセイを行った後に、生成するケミルミネッセンスシグナルを６１２ｎｍで測定し、これはタクロリムス抗体に結合する試料中のタクロリムス濃度（遊離タクロリムスと、内因性結合物質に結合されたタクロリムスの両方）の逆関数である。遊離タクロリムスの量を、遊離タクロリムスと置換された遊離タクロリムスとの合計量から引くことにより、試料において結合されたタクロリムスの量が得られ、これらの値は前記等式において、内因性干渉物質の存在下で、試料中のタクロリムスの総量を計算するために使用できる。
【００８４】
別のアッセイフォーマットの例は（単に説明のための例示であり、これに限定されることはない）、ＡＣＭＩＡ（Affinity Chromium dioxide Mediated Immuno Assay）である。ＡＣＭＩＡアッセイフォーマットには、クロム粒子（シロリムス又はシロリムス類似体でコーティングされたもの）を第一成分として用いる。第二の成分は、シロリムス用抗体である。レポーター酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）と架橋しているこの抗体は、反応槽に過剰量で添加される。すなわち、試料に存在し得るシロリムス検体の全てを結合させるために必要な量よりも多い。シロリムスの含有が疑われる試料は、均等な分量に分ける。試料の１つの分量は、置換剤によって処理せずにシロリムス用抗体で処理し、これは遊離シロリムスに結合するが、アッセイで用いられる他の試薬、又は試料における干渉物質とは反応しない。抗体酵素共役体は、試料の部分量と混合して、シロリムス検体が抗体に結合できるようにする。次にクロム粒子試薬を添加して、あらゆる過剰な抗体酵素共役体と結合させる。それから磁石を適用し、これにより全てのクロム粒子と過剰な抗体酵素を懸濁液から排除し、その上澄みを最終的な反応容器に移す。レポーター酵素の基質を最終的な反応容器に添加し、吸収性の変化として経時的に分光光度計によって、酵素活性を測定する。このシグナルの量は、試料中野遊離シロリムスの量と関連する。
【００８５】
同じアッセイを別の試料の部分量でも行い、これは置換剤としてのタクロリムスエステルで処理して、試料内で内因性結合物質からシロリムスを放出させる。アッセイを行った後、生成する酵素活性を測定し、この量は遊離シロリムスと、内因性結合物質から置換されたシロリムスの双方の量と関連する。第一の試料の部分量から得られる酵素活性を、第二の試料の部分量から得られる酵素活性から引くことにより、試料中で内因性結合物質により結合された試料中のシロリムスの量に属する酵素活性の量が得られ、この量は結合シロリムスの量と関連する。これらの値は、内因性干渉物質の存在下、試料中におけるシロリムスの総量を計算するために、上記等式で使用できる。
【００８６】
測定工程
ここに記載する原則に従った、イムノアッセイを用いる方法は、検体用抗体（抗検体抗体）を含有する複合体の量に関して各アッセイ媒体を試験する工程を有する。この測定は、各アッセイ媒体についてそれぞれ行い、その後、使用する特定のアッセイに従ったアッセイ媒体のインキュベートが続く。試料の部分量の場合、測定結果は、試料中の抗−検体抗体に対して遊離した検体（つまり、内因性結合物質によって結合されていない試料における検体）の量を反映し、抗−検体抗体を含有する複合体を形成する。第二の試料の部分量の場合、測定は検体（試料中における遊離検体と、置換剤を抗検体抗体に添加することにより放出される試料における検体の双方）の量を表す検体の量を反映し、抗−検体抗体を含有する複合体が形成される。
【００８７】
「検体量の測定」とは、定量的、半定量的、及び定性的な検体の特定を言う。この手法は、定量的、半定量的、及び定性的であり、また検体を特定するための他の手法もまた、検体の量を測定するための方法と考えられる。例えば、検体の含有が疑われる試料における検体の存在又は不存在を検知するだけの方法は、本発明の態様の範囲に含まれるとみなされる。「検知」及び「特定」とは、測定のための他の一般的な同義語と同様に、本発明による態様の範囲に入ることが企図されている。
【００８８】
多くの態様において媒体の試験は、媒体からシグナルを検知する工程を伴う。このシグナルの量は、試料中における検体の量と関連する。検知の特定の手法は、シグナル生成系の性質による。ここで論じたように、ｓｐｓの標識が外部的手段によって、望ましくは視覚試験によって検知可能なシグナルを生成できる方法は数多くあり、これには例えば、電磁放射、電気化学、熱、放射線活性検知、及び化学的な試薬が含まれる。
【００８９】
シグナル生成系の活性化は、シグナル生成系メンバーの性質による。光で活性化されるシグナル生成系のメンバーについては、メンバーを光で照射する。粒子の表面にあるシグナル生成系のメンバーについては、塩基の添加により活性化を引き起こすことができる。他の活性法は、本開示の観点において当業者に示唆されている。幾つかのシグナル生成系については、例えば放射線活性標識、酵素などの標識を有する系とは異なり、活性化のために試薬は必要ない。酵素系については、基質及び／又は補因子の添加が必要なことがある。
【００９０】
シグナルの量についての調査にはまた、シグナルの検知工程が含まれ、これは一般的には、単にシグナルを読み取る工程である。シグナルは通常、装置を用いて読み取り、その装置の性質は、シグナルの性質による。この装置は例えば、分光光度計、蛍光光度計、吸光光度計、照度計、ケミルミネッセンス計、光量計、又は写真装置であり得る。検知されたシグナルの量は、試料に存在する検体の量と関連する。測定の間の温度は一般的に、例えば約１０〜約７０℃の範囲、又は約２０℃〜約４５℃の範囲、又は約２０〜約２５℃の範囲である。１つのアプローチにおいて標準曲線は、スクリーニングすべき検体の既知の濃度を用いて作製する。ここで論じるように、較正物質と、他の制御機器も使用できる。
【００９１】
試料の一部によりアッセイを行うためのキット
特定のアッセイを行うための試薬は、検体を特定するためのアッセイを慣用的に行うために有用なキット内に存在していてよい。１つの態様においてキットは、内因性結合物質から検体を置換する試薬、検体用の抗体、及びアッセイを行うための他の試薬を、パッケージ化された組み合わせで含有し、これらの性質は、特定のアッセイフォーマットによる。試薬は、個別の容器内にあるか、又は逆反応や試薬の安定性に応じて、様々な試薬を１つ以上の容器内で組み合わせることができる。キットはさらに、アッセイを行うために、その他の別個にパッケージ化された試薬を含むことができ、その例は例えば、付加的なｓｂｐメンバー、補助的な試薬、例えば補助的な酵素基質などである。
【００９２】
キットにおける様々な塩飽の相対的な量は、本発明による方法の間に起こす必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を得るため、またさらにアッセイの感度を実質的に最適化するために、広く変えることができる。適切な環境下では、キット内で１種以上の試薬を、通常は凍結乾燥により、乾燥粉末として用意することができ（賦形剤を含む）、これは溶解の際、方法又はアッセイを行うために、適切な濃度を有する反応溶液をもたらす。このキットはさらに、前述の本発明の態様に従って方法を行うための説明書を有することができる。
【００９３】
試料の一部でアッセイを行うための装置
前述のように、ここに記載する原則に従った方法は、方法工程を実施するためのアッセイ装置を用いて自動化することができる。本発明に従った方法は、コンピュータ制御下で行うことができる。これはすなわち、コンピュータの助けを借りて、アッセイ装置と関連付け可能だということである。コンピュータは例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）であってよい。コンピュータはソフトウェアによって稼働させ、これは特に、上記等式を用いた計算を含む、ここに記載した方法である。
【００９４】
方法を実施するために使用可能なソフトウェアは例えば、Microsoft Excel、又はMicrosoft Accessであり、ユーザーが書いた機能及びテンプレートによって適切に拡張でき、必要であれば、他の機能を行う独立型プログラムとつなげることができる。本発明による方法を行うに際してサポートで使用されるソフトウェア又はコンピュータプログラムは、例えばＣ言語、Ｃ＋＋言語、又はVisual basicで記載されていてよい。上記コンピュー情報とここで使用するソフトウェアは、単なる例示であり、これらに制限されるわけではない。これらの方法は、他のコンピュータとソフトウェアに適用できる。
【００９５】
コンピュータプログラムは、上記方法工程を実施するために利用できる。コンピュータプログラムにより、（ｉ）検体用アッセイを用いて、内因性結合物質によって結合された未知の試料における検体の部分量［Ｙ］を測定し、（ｉｉ）式：［Ｚ］＝ａ［Ｙ］；ｂによって、内因性結合物質によって結合されていない未知の試料における検体の量［Ｚ］を特定し、前記式中、「ａ」及び「ｂ」は、既知の検体量を含有するが、内因性干渉物質を実質的に含有しない試料でアッセイを行うことによって予め特定され、（ｃ）［Ｙ］及び［Ｚ］を合計して、未知の試料における総量［Ｘ］が得られる。
【００９６】
記載した原則に従った幾つかの例において、コンピュータプログラムにより、（ｉ）以下の（ａ’）〜（ｃ’）により、内因性結合物質によって結合されたタクロリムスの部分量［Ｙ］を測定し、（ａ’）タクロリムスを内因性結合物質から置換可能な薬剤の存在下、試料の一部でアッセイを行うことによってタクロリムスの量［Ｖ］を特定し、（ｂ’）タクロリムスを内因性結合物質から置換可能な薬剤の不在下、試料の一部でアッセイを行うことによってタクロリムスの量［Ｗ］を特定し、（ｃ’）［Ｗ］を［Ｖ］から引く、（ｉｉ）式：［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂによって、内因性結合物質によって結合されていないタクロリムスの量［Ｚ］を特定し、前記式中、「ａ」及び「ｂ」は、既知の検体量を含有するが、内因性干渉物質を実質的に含有しない試料でアッセイを行うことによって予め特定され、（ｃ）［Ｙ］及び［Ｚ］を合計して、試料中のタクロリムスの総量［Ｘ］を特定することができる。
【００９７】
コンピュータプログラムは、コンピュータで読み取り可能な記憶媒体（この中にコンピュータプログラムが記憶されている）を有するプログラム製品で行うことができ、これはプログラミング可能なプロセッサへとロードすれば、本発明による方法を実施するために必要な手順を実行するように、装置のプロセッサへと指示できる。コンピュータで読み取り可能な記憶媒体は、光学的、磁気的、又は固体状メモリーであってよく、これらのいずれも、持ち運び可能であるか、又は固定されていてよい。ここに記載した原則に従った幾つかの例は、コンピュータで読み取り可能な記憶媒体（この中にコンピュータプログラムが記憶されている）を有するコンピュータプログラム製品を指向しており、これは、コンピュータにロードすれば、上記方法を実行する。
【００９８】
本明細書で言及した全ての文献と特許出願は、ここで参照により、それぞれの文献又は特許出願が、具体的かつ個別に参照によって組み込まれているかのように、組み込まれるものとする。
【００９９】
ここで使用する「少なくとも」という用語は、特定の項目の数が、言及された数字と同じであるか、又はそれより大きくてよいことを意味する。ここで使用する「約」という用語は、言及された数字が、プラス１０％、又はマイナス１０％変わりうることを意味し、例えば「約５」とは、４．５〜５．５の範囲を意味する。
【０１００】
以下の例は本発明の特定の態様をさらに記載するものだが、これは単に説明のためであり、本発明の範囲をこれに制限することを意図するものではない。ここに記載した部とパーセンテージは、特に記載の無い限り、体積を基準とする。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】内因性結合物質によって結合されたタクロリムスの濃度に対する、遊離タクロリムスの濃度のグラフである。
【０１０２】
実施例
全ての化学物質は、特に記載が無ければ、Sigma- Aldrich Company（米国ミズーリ州St. Louis在）から購入できる。タクロリムスは、米国イリノイ州Deerfield在、Astellas Pharma US. Inc.から得られる。シロリムスは、米国ニューヨーク州New York在、Pfizer Inc.から得られる。
【０１０３】
試験は、DIMENSION（登録商標） RxL analyzerを用いて行い、これはドイツ国Newark在、Siemens Healthcare Diagnostics Inc.から手に入る。この装置は、ＡＣＭＩＡイムノアッセイ技術を採用している。ＡＣＭＩＡ法は、米国特許第7,186,518号明細書、同5,147,529号明細書、同5,128,103号明細書、同5,158,871号明細書、同4,661,408号明細書、同5,151,348号明細書、同5,302,532号明細書、同5,422,284号明細書、同5,447,870号明細書、及び同5,434,051号明細書に記載されており、これらの開示内容は、ここで完全に組み込まれるものとする。ここで使用するＡＣＭＩＡ法の態様は、以下でより詳細に論じるが、クロム粒子上にあるタクロリムス類似体と、酵素に共役したタクロリムス用の抗体（「共役体」）のための患者試料におけるタクロリムスとの間の競合は、患者試料におけるタクロリムスの量を特定するために使用する。クロム粒子上でタクロリムス類似体に結合している共役体は、磁性的な分離によって除去する。上澄みに残っている共役体からの酵素活性を測定し、この活性は、患者試料中のタクロリムスの量に直接比例する。ＡＣＭＩＡアッセイフォーマットを用いる場合、タクロリムスを含有しない試料を試験する際に観察される酵素活性は、活性抗体に結合されていない（すなわち、クロム粒子上ではタクロリムスと結合できない）酵素活性の量の指標である。クロム粒子が存在しない場合に観察される酵素活性は、共役体における酵素活性の総量の指標である。これらの値は、活性抗体に結合された酵素活性のパーセンテージを評価するために使用できる。
【０１０４】
タクロリムスを含有しない全血プールは、上記ＡＣＭＩＡアッセイを行うことによってスクリーニングして、内因性結合物質を実質的に含有しない全血プールを同定する。スクリーニングは、個々のタクロリムス不含全血試料への、プールのタクロリムス回収性の一貫性を試験することによって行う。プールをタクロリムス不含の較正物質として用いる時に、タクロリムス不含の全血試料の回収量が大部分、アッセイの低級感度にある場合、プールは内因性干渉物質不含のマトリックスとして受容される。それからこのプールは、純粋なタクロリムスの異なる量をプールに加えることによって、タクロリムス較正物質（又は標準）を作製するために使用する。較正物質（内因性干渉物質を実質的に含有しないもの）はそれから、方法の較正の間に、［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂの関係を生成するために用いられ、これは較正物質を、置換剤（シロリムス）の存在下、及び不在下で試験することによって得られる。［Ｚ］及び［Ｙ］の両方は、較正から得られる。較正の値［Ｚ］は、置換剤の不在下で較正を行うことによって得られ（遊離薬剤を示す）、較正物質の値［Ｙ］は、値［Ｚ］を、置換剤の存在下で測定した総薬剤から引くことによって得られる（結合された薬剤を示す）。全血プールから作製される較正物質は、内因性干渉物質を実質的に含有せず、以下の実験で使用するために選択される。
【０１０５】
例１
既知の試料を用いた、タクロリムスアッセイのための補助係数の決定
抗タクロリムス抗体−β−ガラクトシダーゼ共役体の作製：単クローン性の抗タクロリムス抗体（クローン１Ｈ６、例えば米国特許第7,078,495号明細書参照）を、公知の技術従って標準的なヘテロ二官能性ＳＭＣＣ（スクシンイミジルトランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）リンカーによって、β−ガラクトシダーゼに共役させる。抗体共役体溶液は、抗タクロリムス抗体−β−ガラクトシダーゼ共役体を約７．５μｇ／ｍＬ、プロテアーゼ不含のウシ血清アルブミンを３０ｍｇ／ｍＬ、ＭｇＣｌ2を０．１２６ｍｇ／ｍＬ、エチレングリコールを０．０３ｍＬ／ｍＬ、ＰＩＰＥＳ１．５ナトリウム塩を３５．１４ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌを５０ｍｇ／ｍＬ、及びβ−ガルムテイン（不活性化されたβ−ガラクトシダーゼ）を含有し、ｐＨは６．５である。
【０１０６】
磁性的なクロム粒子の作製：タクロリムスクロム粒子（イムノアッセイ固相）は、タクロリムスＣ２２オキシム（米国特許第7,078,495号明細書に記載の通り作製）をフルオレセインに共役させることによって作製され、これはグルタルアルデヒドによって二酸化クロム粒子上に固定した抗フルオレセイン抗体を予め装飾するために用いられるものである。クロム粒子試薬は、タクロリムスクロム粒子スラリーを約２．５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース二水和物を６０．８ｍｇ／ｍＬ、及びCARBOWAX（登録商標）を７．２ｍｇ／ｍＬ含有する。
【０１０７】
試料の作製：先に同定した内因性干渉物質を実質的に含まない全血プールを使用する。全血プールのアリクォート（１００ｍＬ）を、様々な量のタクロリムスに加え、これにより全血試料におけるタクロリムスの濃度を、０ｎｇ／ｍＬ、２．８ｎｇ／ｍＬ、６．０ｎｇ／ｍＬ、１１．９ｎｇ／ｍＬ、及び３１．３ｎｇ／ｍＬにする（試料Ｉ〜Ｖ）。
【０１０８】
タクロリムス検体＋結合されたタクロリムス検体の濃度特定：試料Ｉ〜Ｖを、以下のように処理する：ＳＩＲＯ置換剤溶液の作製は、表１により詳細に記載されている。
【表１】
0006388861.tif 000002
【０１０９】
試料は３７℃で１４０分間、置換剤の存在下でインキュベートし、内因性結合物質からタクロリムスを置換する。続いて、各試料を上記アッセイにかけ、シグナル（ｍＡＵ）を測定し、試料中の遊離検体量（内因性結合物質によって結合されていない検体＋内因性結合物質から置換された検体）を示す検体の濃度に関連付ける。
【０１１０】
アッセイ：タクロリムス用のＡＣＭＩＡアッセイは、以下の通りである：１５μＬの上記全血試料Ｉ〜Ｖ（内因性干渉物質を実質的に含有せず、タクロリムスが添加されたもの）を、DIMENSION（登録商標） RxL analyzerの容器内でＳＩＲＯ置換剤溶液（表１）と混合する。全血は、まず血液を超音波試料プローブで混合することによって、標準的なカップから採取する。全血試料とＳＩＲＯ置換剤溶液とを混合することにより、ＳＩＲＯ分子が存在する場合に、その結合箇所からタクロリムスに結合された分子の置換が保証される。その結果、このアッセイから生じるシグナルは、試料における遊離タクロリムス検体の量＋置換されたタクロリムス検体の量（結合検体）と関連する。
【０１１１】
抗タクロリムス検体−β−ガラクトシダーゼ共役体（５０μＬ）を、各反応槽のとなりに添加し、この混合物を一定時間（１０〜１５分間）、４３℃の温度に保ち、タクロリムスが存在する場合には、これを抗体試薬と反応させる。固定化されたタクロリムス−ＣＭＯ−ＤＡ１０−Ｄｅｘａｌを有するクロム粒子を各反応槽に添加し（５０μＬ）、結合されていない共役体に結合させる。タクロリムスに結合した抗タクロリムス抗体とβ−ガラクトシダーゼの共役体は、クロム粒子には結合しないが、クロム粒子から溶液を分離するために、上記反応混合物に磁場を適用すると、上澄みに残る。タクロリムスに結合した共役体は、各反応槽からの上澄みを光度測定用キュベットに移し、クロロフェノール赤−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）の存在下で、共役体の酵素速度を測定することによって検知する。各反応槽について酵素速度を、５７７ｎｍと７００ｎｍで二色法により測定する。
【０１１２】
遊離タクロリムス検体の濃度特定：試料Ｉ〜Ｖを処理し、アッセイを行ったのだが、表１の調製と異なるのは、ＳＩＲＯを含有しない点である。その結果、このアッセイから生じるシグナルは、試料における遊離タクロリムス検体の量についてのみのものとなる。
【０１１３】
結合されたタクロリムス検体の濃度特定：結合されたタクロリムス検体の濃度は、各試料について、遊離タクロリムス検体の濃度を、遊離タクロリムス検体＋結合タクロリムス検体の濃度から引くことによって特定する。その結果が、表２にまとめてある。
【表２】
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【０１１４】
遊離検体の濃度は、図１に記載された結合検体の濃度に対して、グラフ化する。回帰直線の勾配と回帰直線の切片はそれぞれ、０．２１８と、０．０９８１であり、これは前述のように式［Ｚ］＝ａ［Ｙ］＋ｂにおける係数「ａ」及び「ｂ」に相当する。
【０１１５】
それから上記ＡＣＭＩＡアッセイを、内因性干渉物質の含有量が分かっている未知の試料で行う。様々な病院から得られる試料を、下記表３の最初のコラムに記載したように特定する。結合タクロリムス［Ｙ］の濃度は、前述のように特定する。等式［Ｚ］＝０．２１８［Ｙ］＋０．０９８１（ただし「ａ」及び「ｂ」の値については、ＡＣＭＩＡアッセイについて述べたように特定）を用いて、試料中の遊離タクロリムス［Ｚ］の濃度を特定する。タクロリムス［Ｘ］の真の総濃度の見積もり量は、各試料において、［Ｙ］と［Ｚ］を合計することによって特定される。その結果が、表３にまとめてある。
【表３】
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【０１１６】
本明細書で言及した全ての文献と特許出願は、ここで参照により、それぞれの文献又は特許出願が、具体的かつ個別に参照によって組み込まれているかのように組み込まれる。
【０１１７】
本発明は細部において、説明と例示によって理解しやすいように記載されているが、本発明の教示に接した当業者にとっては、何らかの変更及び修正を、本願特許請求の範囲から外れることなく行えることは明らかである。さらに、本明細書は説明のため、特定の枠組みを用いて、本発明の完全な理解を図った。しかしながら、本発明を実施するために、具体的な細部が必要で無いことは、当業者には明らかである。本発明の特定の態様の記載は、説明のために提示したのであり、これらは網羅的であることを意図しておらず、また本願発明を、開示された形態に制限しようとする意図は無い。多くの修正と変更が、上記教示から可能である。これらの態様は、本発明の原則と具体的な適用を説明するために選択、記載されたものであり、これによって当業者は本発明を利用できる。
【図１】
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