(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された腸組織からインプラントを製造する方法であって、この腸組織は、腸の管状部分とそれに関連するそのままの血管系の少なくとも一部とから成り、
この方法は、
ｉ）この血管系の血管中を、第1の灌流回路で灌流する段階であって、第１の灌流回路は、少なくとも１回の界面活性剤を使用する灌流工程、少なくとも１回のタンパク質分解酵素を使用する灌流工程、及び少なくとも１回のＤＮａｓｅを使用する灌流工程を含み、各灌流工程の間に洗浄媒体を使用する少なくとも1回の洗浄工程を含み、少なくとも１回の洗浄工程は抗生物質を使用する、段階、及び
ii）ｉ）段階とは別に、この腸の管状部分の内腔中を第２の灌流回路で灌流する段階であって、第２の灌流回路は、少なくとも２回の界面活性剤を使用する灌流工程、少なくとも２回のタンパク質分解酵素を使用する灌流工程、及び少なくとも１回のＤＮａｓｅを使用する灌流工程を含み、各灌流工程の間に洗浄媒体を使用する少なくとも1回の洗浄工程を含み、少なくとも１回の洗浄工程は抗生物質を使用する、段階、
から成り、第1の灌流回路で灌流する段階においては、第２の灌流回路で灌流する段階よりも、界面活性剤を使用する灌流工程およびタンパク質分解酵素を使用する灌流工程の回数が少ない、方法。
【請求項２】
ｉ）段階において、前記血管系が主動脈を介して灌流され、少なくとも一種の灌流に使用された前記媒体が、主静脈を介して血管系から排出される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腸組織から細胞が実質的に除去された請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記インプラント内に下記いずれか一つ又はそれ以上の構造が少なくとも部分的に保持される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
ｉ）前記管状部分の粘膜層
ii）前記管状部分の粘膜下組織層
iii）前記管状部分の漿膜層
iv）前記管状部分の環状及び/又は縦型の筋肉層
v）前記血管系の外膜
vi）前記血管系の中膜
vii）前記血管系の内膜
【請求項５】
内部弾性ラメラのエラスチン層が実質的に保持されて、前記インプラントの血管部分の内部、管腔、表面を形成する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、インプラント及びインプラントの製法に関する。本発明は、腸由来のインプラントの製造に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
様々な異なる疾患や症状の治療において、生物学的に誘導されたスカフォールドから成るインプラントは、組織/器官の修復及び再生のための重要な選択肢になっている。継続する主要な障害は、移植されたスカフォールドのために機能的血液の供給が必要なことである。
短腸症候群（SBS）の患者は、その小腸の半分以上を欠いており、それは多くの障害に起因し、典型的には外科的切除されることになる。短腸症候群（SBS）の治療において適当なインプラントは有用であろう。大人のクローン病や乳幼児の壊死性腸炎などの腸疾患は、短腸症候群（SBS）と、その結果としての腸移植を必要とする栄養吸収の障害につながる可能性のある疾患である。これは、生活の質を悪化させ、寿命を締め、そして生存のために高価な医療ケア体制に頼ることになる重要な臨床問題である。EUや米国では、短腸症候群（SBS）のための非経口栄養摂取だけで（介護やその他のケアを除く）、年間7億ポンドが費やされていると推定されている。
【０００３】
これまでの研究では、ネオ腸組織の短い部分を作るために、合成及び生物学的スカフォールドの両方を使用している。例えば、小動物モデルにおいてネオ腸を再生成するために、脱細胞されたブタの小腸サブ粘膜（SIS）が採用されている。この小腸サブ粘膜（SIS）とは、病気の又は機能していない生物システムを再生し又は補強するために使用されるコラーゲンベースの無細胞マトリックスである。しかし、小腸サブ粘膜（SIS）は組織へオリジナルの血管の供給を維持しないので、その結果、灌流は減る。更に、小腸サブ粘膜（SIS）の機械的及び再生特性は比較的乏しい。
厚く複合的で多層の組織を作成する際の重要な障害は、組織体のサイズを支配する制限因子である適切な血管供給が必要であることである。これが解決すると、小規模なスカフォールドの移植を、実際に臨床的関連性のある大きい移植片に代えることが可能になる。移植されたスカフォールドへ、現存している又は急速に成長している血管を供給することは、必要な酸素、栄養素及び増殖因子を提供することを可能にし、生存を確実にする。最も近い毛細血管からの拡散距離が100〜200μｍであると、細胞の生存を制限する。そして血管は成長するのに数日かかるので、利用可能な酸素の欠如が、潜在的にインプラントを虚血になり易くする。
【０００４】
今までの血管新生方法は、生物学的スカフォールドに付着した現存する血管系を利用することよりも、むしろ新たな血管の合成に焦点を当てる傾向がある。移植片に宿主の血管の増殖が起こるには数週間かかることがあるため、移植片にはしばしば虚血や壊死の危険がある。
最近、ドイツのあるグループが、スカフォールドの不可欠な部分として、動脈と静脈を供給する生物学的スカフォールドを得る方法を開発した。血管系を直接宿主の血液供給に通じさせると、宿主に取り付けられたとき又は移植の前にインビトロで、それを再内皮化することができる（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Linke et al. (2007) Tissue Engineering 13(11): 2699-2707
【非特許文献２】Mertsching et al. (2009) Transplantation 88(2): 203-210
【非特許文献３】Schanz et al. (2010) Journal of Biotechnology 148(1): 56-63
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、組織/臓器の修復のための、腸組織に由来するインプラントを製造するための改良された方法を提供する。
【課題を解決するための手段及び発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、腸組織からインプラントを製造する方法であって、この腸組織は、腸の管状部分とそれに関連するそのままの血管系の少なくとも一部とから成り、
ｉ）この血管系の血管中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流する段階、及び
ii）ｉ）段階とは別に、この腸の管状部分の内腔中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流する段階、から成る方法が提供される。
その結果得られるスカフォールドは、腸組織の修復及び再生のための優れたインプラントを提供する。このスカフォールドは、送り込む動脈、排出する静脈及び毛細血管接続部を含む。本発明の方法は、短腸症候群（SBS）や腸不全の患者における非経口栄養の必要性を低減させるインプラントを提供するための腸の短部分、又は、非経口栄養の必要性を完全に無くすことのできるインプラントを提供するに十分な長さの腸の部分、に適用することができる。
【０００８】
このスカフォールドには２つの構成部分が組み込まれている。この２つの構成部分とは、即ち、腸の管状部分に由来する管状部分と、それに関連する血管系に由来する血管部分である。このスカフォールドが移植された場合、スカフォールドの血管部分は、このスカフォールドへ血液を送達するための直接の経路を提供し、移植された患者においてスカフォールドが再生するようにスカフォールドに酸素と栄養を供給する。この血管部分は、スカフォールドの管状部分の絨突起に全身的に深く血液を提供する。
この血管系は、その動脈、最も好ましくは主動脈又は主動脈の一つ、を通して脱細胞化するための媒体を注入することによって灌流されることが好ましい。この動脈に、灌流を容易にするためにカニューレ処置をしてもよい。この脱細胞化するための媒体は、主静脈又は主静脈の一つのような静脈を介して血管系から排出されてもよい。
腸の管状部分の灌流を容易にするために、注入手段及び/又は排出手段を用いてもよい。例えば、腸の管状部分の中央及び/又は末端に、管を、例えば、結束又はステッチによって、取り付けてもよい。
効果的な灌流を確実にするために、典型的には、ポンプが使用される。
【０００９】
本発明の方法は、細胞が実質的に除去されたスカフォールドを提供するために使用されてもよい。そこでは、細胞は実質的に除去されている。このスカフォールドは、インビボで有害な組織反応や免疫反応が見られないように、細胞物質及びこれに付随する要素を十分に除去したものである。この反応は皮下移植により測定することができる。この実質的に脱細胞化されたスカフォールドには細胞が無く、それは倍率が40倍の顕微鏡で見ることができる。
【００１０】
最近の組織及び臓器全体の脱細胞化プロセスのレビュー(Crapo et al. (2011) Biomaterials 32: 3233-3243)では、有害な生体内反応が無いことに加えて、細胞外マトリックス（ECM）の脱細胞化の意図を満たすに十分な下記の最低限の基準が提案されている。即ち、ECMの乾燥重量1mgあたりdsDNAが<50 ng；DNA断片の長さが<200 bp；及びDAPI又はH＆Eで染色した組織切片に可視可能な核物質が無いこと。
本発明はこれらの基準を満たすものであり、本発明の代表的な回腸由来のスカフォールドに残存するDNAは、典型的には、自然の組織（回腸及び血管の両方）の1％未満である。これは、臨床用途に使用される市販の無細胞生物学マトリックスにおけるDNA量と同等であり、前臨床研究で用いられる他のECMスカフォールドのDNA量よりも著しく少ない。特に、Mertschingらは、本発明の典型的なDNA量よりも100倍も大きい残存DNAの測定値を報告している。残存DNA量が大きいと、残留DNAに対する宿主の反応による最適ではない細胞及び組織応答をもたらす可能性があり、それはその組織の再生可能性に影響する。
【００１１】
残りのスカフォールドは、細胞外マトリックス（ECM）、特にコラーゲン及びエラスチンから成る。コラーゲンは、通常、主にＩ型コラーゲン並びにIII型及びV型コラーゲンから成る。例えば、本発明の代表的なスカフォールドのコラーゲンの分析によれば、I型コラーゲンは約68％、III型コラーゲンは約20％、V型コラーゲンは約12％である。
自然の血管組織におけるコラーゲンとエラスチンの含有量、及びこれらのタンパク質の相対比は、血管により異なる。一例として、いくつかの動脈におけるコラーゲンの含有量は約5％と約25％の間であり、いくつかの静脈におけるコラーゲンの含有量は約15％と約45％の間である。いくつかの動脈におけるエラスチンの含有量は約20％と約60％の間であり、いくつかの静脈におけるエラスチンの含有量は約15％と約40％の間である。従って、コラーゲン、エラスチン及びその他のECM成分の相対量が、出発物質に応じて変化し得ることが理解されるであろう。
【００１２】
また、種々のECM成分の相対量が、典型的には、スカフォールドの管状部分と血管部分の間で異なることは理解されるであろう。腸由来の管状部分において、コラーゲンは、典型的には、主要なタンパク質である。
このように、脱細胞化スカフォールドは、非免疫原性であって、生体適合性であり、すぐに機能することができる。
細胞外マトリックス（ECM）の構造は、少なくとも部分的にスカフォールド内に保存されていることが好ましく、実質的に保存されていることがより好ましい。従って、このスカフォールドは、原繊維構造とそれが由来する自然の組織原料の分子超微細構造を示す、コラーゲン繊維及び/又はエラスチン繊維を含んでもよい。これらの繊維組織タンパク質の自然の三次元構造が実質的に保持されることが好ましい。
脱細胞化組織又は器官内の繊維のユニークな高分子構造が少なくとも部分的にそのまま残る場合にのみ、スカフォールドの起源に特有の細胞成分及び/又はそれを移植する場所が、細胞外マトリックス（ECM）の適切な建設的再構築をもたらすということが知られている。従って、機能的再生再構築をもたらし、腸の成長のために良いスカフォールドを提供するためには、任意の合成マトリックスよりも、細胞外マトリックス（ECM）が適している。
【００１３】
機能的細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を保持することは、生物学的活性、構造的完全性、及びスカフォールドの耐久性と物理的機械的性質を維持するために重要である。タンパク質やグリコサミノグリカン(GAG)の分子構造（即ち、アミノ酸と炭水化物/糖質配列、結合及び相互作用）から腸とそれに関連した血管組織の巨視的超微細構造に至るまでの構造の階層を保持及び維持することは、固有の物理的機械的性質を維持するために重要であり、これはまた正しい腸機能（動き、拡張及び伸縮）のために重要である。更に、細胞の機能及び応答は、自然の組織に固有の構造的又は地形的手がかり(cue)又は信号によって部分的に決定される。言い換えれば、組織の構造は、細胞の運命及び分化の決定において重要な役割を果たしている。従って、脱細胞化と組織処理を行う間、三次元構造を維持することは、腸と血管組織の最終的な細胞再生と、細胞及び組織に特異的な機能の再構築を改善する。
【００１４】
グリコサミノグリカン(GAG)の大部分は細胞又は細胞外マトリックス（ECM）に関連していることが知られている。本発明は、細胞関連のグリコサミノグリカン(GAG)を実質的に排除し、細胞外マトリックス（ECM）に由来の/に位置するグリコサミノグリカン(GAG)を優先的に保持する。従って、脱細胞化プロセスは、結果的に、細胞関連のグリコサミノグリカン(GAG)を含む細胞及び細胞成分の除去により、総グリコサミノグリカン(GAG)の減少をもたらす。一方、細胞外マトリックス（ECM）に関連するグリコサミノグリカン(GAG)の大部分が保存されていることが好ましい。これは、細胞外マトリックス（ECM）のグリコサミノグリカン(GAG)と異なる細胞型の間の「クロストーク」が存在し、細胞輸送及び細胞分化の方向を定める手助けになるので、重要である。また、細胞外マトリックス（ECM）のグリコサミノグリカン(GAG)は、成長因子を貯蔵するところとして機能するので、スカフォールドの移植後に組織再生を監督するのに役立つ。
従って、腸組織由来の細胞及び細胞成分を枯渇させ、その一方で、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質へのダメージを最小限に抑えるように、脱細胞化するための媒体が選択される。その結果、細胞外マトリックス（ECM）の構造及び機能が可能な限り保存されたスカフォールドがもたらされる。
【００１５】
脱細胞化は、脱細胞化するための溶液をいくつか用いて灌流することにより行われることが好ましい。適当な脱細胞化するための媒体として、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの界面活性剤、タンパク質分解酵素などの酵素、例えば、トリプシン、及びヌクレアーゼ、例えば、DNase Iなどのデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
即ち、灌流は、一連の異なる媒体を用いて行ってもよく、通常、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などの適切な洗浄媒体を用いた洗浄工程を含んでもよい。
灌流は、抗生物質の存在下で行ってもよい。
細胞、細胞質成分及びDNAを破壊するために、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、トリプシン及びDNase Iの各溶液で連続的に灌流を行い、各工程の間でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて洗浄すると、特に良好な結果が得られる。
【００１６】
重要であって有利なことに、本発明は、腸組織の管状部分と血管部分を別個に脱細胞化することを提供する。典型的には、より脆弱な血管系の脱細胞化は、より厚くより複雑な管状部分よりも、より迅速に行われる。従って、細胞外マトリックス（ECM）及びその構成要素への損傷を最小限に抑えながら脱細胞化を最適化するために、これら部分にそれぞれ異なる灌流プロトコルを採用することが好ましい。このことは、組織処理をより効果的かつ効率的にし、改善されたスカフォールドをもたらす。
このように、血管系の灌流が第一の灌流プロトコルに従って行われ、腸の管状部分の灌流がこれとは異なる第二の灌流プロトコルに従って行われてもよい。第一及び第二の灌流プロトコルは、各脱細胞化するための媒体及び/又は反応時間や試薬の濃度等を含む処理条件が異なっていてもよい。
【００１７】
灌流の間、組織は、典型的には、インキュベーション用媒体中で処理される。このインキュベーション用媒体は、脱細胞化プロセスの効率を最大にするために、少なくとも一つの脱細胞化するための媒体を含んでもよい。ここで用いられる脱細胞化するための媒体は、血管系及び/又は腸の管状部分の灌流に使用される脱細胞化するための媒体と同じもの又は似たものであってもよい。腸組織の血管系及び/又は管状部分の灌流に一連の脱細胞化溶液を使用する好ましい実施形態においては、インキュベーション用媒体と同じ又は似た溶液が使用される。これらのインキュベーション用媒体の組成は、実質的に、腸組織の血管部分を灌流するために使用される一連の脱細胞化溶液の組成に相当することが好ましい。
【００１８】
本発明の方法は、脱細胞化溶液が血管系のみを通して組織に灌流され、拡散により小腸組織を脱細胞化し浄化するので、当該技術分野で公知の方法と比較して、組織処理を大幅に改善する。このプロセスは、1つの組織には最適化されるが他の組織には最適以下であるか、又は包括的であって両者にとって最適以下であるか、のいずれかであるから、その結果、この２つのタイプの組織（即ち、血管及び小腸組織）の最適ではない脱細胞化と浄化をもたらす。このような従来の方法はMertschingらの文献（非特許文献２）に記載されており、この文献の焦点は、非特異的な組織再生に使用するための包括的な管状組織構造体を提供するところにあり、Linkeらのレポート（非特許文献１）の焦点は、脱細胞化された組織を肝細胞のための「バイオリアクター」として使用するところにあることは明らかである。これらとは対照的に、本発明は、血管系と腸の管状部分の脱細胞化及び浄化プロトコルを別々に提供し、これらのプロトコルは、特定の組織に特異的な三次元構造を維持しながら、これらの組織構造のそれぞれの脱細胞化及び浄化を最適化するように設計される。
【００１９】
好ましい実施形態においては、管状部分の粘膜層は、絨突起及び陰窩のような機能的に重要なマクロ構造や関連する微細構造を含んでもよく、これらはスカフォールド内に少なくとも部分的に保持される。これは、小腸組織の内腔から粘膜層が除去された先行技術の方法とは対照的である。たとえば、Mertschingらは粘膜構造を削除したが（非特許文献２）、それは、小腸の修復のために処理された小腸組織を使用することを意図しているのではなく、他の組織を再構築するために一般的な管状構造を提供することを意図しているためと推測される。本発明においては、粘膜層は削除されないことが好ましく、実質的に保存されていることが好ましい。
また、管状部分の粘膜下組織層が、少なくとも部分的にスカフォールド内に保持されることが好ましい。さらに、管状部分の漿膜層が、少なくとも部分的にスカフォールド内に保持されることが好ましい。さらに、管状部分の円形及び/又は長手状の筋肉層が、少なくとも部分的にスカフォールド内に保持されることが好ましい。そのため、これらの組織層は除去されないことが好ましく、それらをインプラント内に実質的に保持することができる。
本発明は、スカフォールドの腸の管状部分のこれらの重要な構成成分を保持することにより、スカフォールドの解剖学的構造をできるだけ元の構造に近くなることを確実にしている。これにより、組織構造が細胞レベルで「認識」され、適切な特定の細胞型により細胞が再配置され、移植後の組織の再生に有利になり、そのため、分化を助け、人体が構造層を再生する必要がないことを確実にする。そのままの構造層、特に筋肉層は、スカフォールドの本来の強度を大幅に改善し、移植後のインプラントの耐久性と強度を向上させる。有利なことに、これは、適切な物理的応力及び生体力学的特性を確保し、細胞の発生や分化に貢献する。
【００２０】
また、本発明において最適化された脱細胞化方法と浄化方法によって、処理された小腸組織内の神経や神経管構造が保持されうることが観察されている。これは、保存された神経構造が、神経再生及び再生のための導管とスカフォールドとして働き、自然の組織から保持された正しい解剖学的及び自然の位置に配置されているという点で有利である。腸の機能は、腸の組織が腸の内容物を肛門に向かって消化管に沿って押し出す、腸組織の蠕動運動に依存している。この蠕動運動は、その一部は、細胞により引き起こされる蠕動波の伝播により成し遂げられ、また、神経のよる刺激により成し遂げられる。従って、正しい腸の蠕動機能は、神経由来及び細胞由来の刺激の組み合わせを必要とする。これら両方のメカニズムは、本発明の実施形態のスカフォールドにより補助される。即ち、これら両方のメカニズムは、組織特異的細胞再生をもたらす三次元組織構造の維持、及び新たな神経再生を引き起こす導管として機能する神経路の維持により、補助される。
【００２１】
本明細書に記載のインプラントの血管部分は、実質的にそのままの管状構造体として提供されてもよく、その直径は出発物質の特性により変えてもよい。また、インプラントの血管部分の長さは、組織処理の前、後又は処理中のいずれかの段階で、適切に切断することによって調整することができることを理解されたい。従って、使用に当たっては、組織の処理された血管部分を、特定の手順又は移植部位に適切なサイズに切断することができる。
血管組織の外膜は、少なくとも部分的に保持されていることが好ましい。また、血管組織の中膜は、少なくとも部分的に保持されていることが好ましい。また、血管組織の内膜は、少なくとも部分的に保持されていることが好ましい。これらの組織構造は、インプラント内で実質的に保持されてもよい。
さらに、内部弾性ラメラのエラスチン層が部分的に保持されて又は実質的に保持されて、インプラントの血管部分の内部、管腔、表面を形成することが好ましい。
【００２２】
本発明の更なる実施態様によれば、腸組織由来のインプラントであって、
ｉ）該腸組織の管状部分に由来する管状部分、及び
ii）関連する血管系に由来する血管部分、
から成り、該血管部分の内腔表面が、それが由来する血管系の元のエラスチン繊維構造と超微細分子構造を示す内部弾性ラメラから成る、インプラントが提供される。
本発明の出発材料は、ヒト又は非ヒトの如何なる哺乳動物から得てもよい。いくつかの実施態様において、インプラントを提供するために、ブタ腸組織材料を処理することが好ましいが、他の哺乳動物源を用いてもよいことは理解されるであろう。
小腸、例えば、付随する腸間膜アーケードを有する回腸は、好ましい腸組織である。
管状の腸の一部を、腸組織への損傷を最小限にするように、慎重に取り出す。
【００２３】
本発明の更なる実施態様によれば、腸組織からインプラントを製造する方法であって、
ｉ）関連する血管系の少なくとも一部がそのまま保持されるように、ヒト又は非ヒト動物からの腸の管状部分を取り出す段階；
ii）この血管系の血管中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流する段階、及び
iii）これとは別に、この腸の管状部分の内腔中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流する段階、
から成る方法が提供される。
【００２４】
動脈と静脈のような、血管系の特定部分を、脱細胞化することができることが以前報告された。それぞれ、組織構造の損傷なしに脱細胞化を達成するために、特定の脱細胞化法を必要とする。本発明は、主動脈から、小径の動脈、細動脈、毛細血管（血管と静脈の両方）、細静脈及び静脈にわたる範囲の血管組織の脱細胞化を可能にする。本質的には、完全な血管系（又は血管'ツリー'）は、腸組織に付随し、管状腸組織への送り込み及び管状腸組織からの排出の両方を行い、管状腸組織内に統合され、如何なる見地からも実質的に損傷又は破壊することなく、単一のプロトコルによって脱細胞化される。
従って、本発明は、細胞外マトリックス（ECM）構造と血管組織の主要な及び主要でない血管とを実質的に維持しながら、腸組織を伴う完全な血管ツリーを効果的に脱細胞化することができる方法を提供する。これは、使用時に、脱細胞化されたスカフォールドの血管部分の再灌流の際に、顕著な漏れや血栓症のないことで証明される。
【００２５】
生理学的及び生化学的な機能を達成するために、脱細胞化された腸のスカフォールドに、腸の特定の細胞型へ分化及び成長することのできる細胞を、再播種することが好ましい場合がある。これを達成するために、幹細胞や細胞の混合物を含む同種異系細胞から患者由来の自家細胞に至る広い範囲の細胞型及び細胞源を用いてもよい。十分な数の適切に分化した細胞をスカフォールドに再播種するため、及び/又は脱細胞化されたスカフォールドの上及び/又はその中でインキュベートするために、選択された細胞を操作し拡張して、再増殖及び細胞数と機能の再生を可能にするようにしてもよい。このプロセスは、バイオリアクター中で行ってもよい。
いくつかの実施形態において、この細胞は、患者に移植された後の、再播種した細胞の免疫反応又は拒絶の可能性を最小にする、自家細胞であることが好ましい。さらに、スカフォールドを再脱細胞化するために、患者から得た脂肪組織（脂肪）由来の成人の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。脂肪組織は幹細胞を多く、典型的には骨髄の約100〜1000倍、含むので(Eberli and Atala (2006) Methods in Enzymology 420: 287-302)、ドナー組織として良い選択である。また、脂肪は、容易にアクセス可能であり、全ての個体に存在し、人体中で容易に再生される。必要に応じて、追加的又は代替的に、自家腸細胞を使用してもよく、任意に、自己の間葉系幹細胞と組み合わせて使用してもよい。この腸細胞は、上皮細胞、間葉及び腸の幹細胞などの細胞の混合物から成ってもよく、いずれも個別に又は集合的に多細胞オルガノイド単位になる。オルガノイド型単位のような腸細胞の小部分は、移植後、共播種された脂肪由来細胞や自然の浸潤細胞の適切な分化の誘導を助けるための種又は鋳型として作用することができる。
【００２６】
自家細胞の単離及び脱細胞化されたスカフォールドの再播種は、手術室において最小限の細胞操作で行われることが好ましい。その後、このスカフォールドの灌流を確実にし、このスカフォールドに酸素、栄養素及び細胞を送達するために、この再播種されたスカフォールドを患者の血液供給に吻合してもよい。その後、再播種され、灌流されたスカフォールドを、患者の腹部に配置することが好ましく、そのスカフォールドは、末端に小孔を持ち、患者の現在の腸に接続されるが、現在の腸の流れから外れた回路であることが好ましい。その後、患者は、効果的にバイオリアクターとしての役割を担い、自然な組織再生によって腸再生が起こる。この小孔は、再播種スカフォールドにおける腸の再生の進行状況を判断するための、視覚化手段として使用することができる。十分な再生が行われた後、機能することになった腸を、患者の既存の腸に吻合し、腸の流れの回路と接続することができる。
【００２７】
他の実施形態においては、その後患者に「移植」することができる機能を持つ再生された「臓器」を提供するために、脱細胞化されたスカフォールドの再播種を、手術室の外で、例えば、実験室やバイオリアクターで、行ってもよい。
幹細胞は多分化能を持ち、すなわち、特定の組織又は器官に特異的な多くの異なる細胞型を生じさせることができる、腸の脱細胞化スカフォールドは、細胞に対して、腸の自然の構造であってネイティブと認識されることが可能な自然な組織構造を含む。この構造的又は地形的メッセージは、マトリックス誘導再生プロセスによって、幹細胞に、その器官に特異的な細胞に分化せよというシグナルを送る。その後、この細胞は増殖して、スカフォールドを再生させ、腸に特異的な生化学的/生理的機能を発達させ、それにより、患者自身の細胞から機能的な生体器官を作る。
従って、本発明の方法は、インプラントに細胞を再播種する段階を含んでもよい。同様に、本発明のインプラントは、細胞が再播種された、再播種インプラントであってもよい。
本発明の更なる態様によれば、細胞が再播種された、ここに記載されたインプラントが提供される。
【００２８】
本発明の更なる態様によれば、ここに記載の方法により腸組織を処理するための装置であって、該腸組織が、関連する血管系の少なくとも一部をそのまま有する腸の管状部分を有し、
ｉ）この血管系の血管中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流するための第一の灌流回路、及び
ii）これとは別に、この腸の管状部分の内腔中に、少なくとも一種の脱細胞化するための媒体を灌流するための第二の灌流回路、
から成る装置が提供される。
この灌流回路は、血管系と腸の管状部分の灌流のために、それぞれの脱細胞化するための媒体を流すためように調整されたチューブ、ホース、パイプなどを含んでもよい。
効果的な灌流を確実にするために1つ以上のポンプが提供されてもよい。
本明細書中で記載されるように、培養用の容器は、インキュベーション用媒体を含むように提供されてもよい。
【００２９】
本発明の更なる態様によれば、本発明は、インプラントを製造するための、ここに記載の装置の使用である。
本発明の更なる態様によれば、ここに記載のプロセス及び/又は装置を用いて製造されたインプラントが提供される。
本発明の更なる態様によれば、ここに記載のインプラントを患者に外科的に移植する段階から成る治療方法が提供される。
本発明の更なる態様によれば、ここに記載のインプラントを手術で使用する方法が提供される。
本発明の更なる態様によれば、手術に使用するためのここに記載のインプラントが提供される。
本発明の更なる態様によれば、ここに記載のインプラントの、手術で使用するための製品を製造するための使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】小腸及びそれに関連する血管系の解剖学的構造を示す概略図である。
【図２】本発明の灌流システムを示す概略図である。
【図３】処理前のそのままの血管系を有する腸組織の管状部分を示す写真である。
【図４】図３に示す出発物質から製造された本発明の代表的なインプラントを示す写真である。
【図５Ａ】Picro Sirius Redで染色され、偏光下で観察された、本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x40）である。
【図５Ｂ】Picro Sirius Red及びMiller's elastinで染色された、本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x100）である。大きい矢印は粘膜層を示し、小さい矢印は、小口径の粘膜下血管内に保存されたエラスチンを指す。
【図６Ａ】ブタのレシピエントへ移植１時間後の本発明の代表的なインプラントを示す写真である。矢印の頭は、血栓のない腸間膜血管を指す。
【図６Ｂ】図６Ａのインプラントを他の視点から撮った写真である。矢印は、識別可能な脱細胞化血管を有する腸のミクロの接続を指す。
【図７Ａ】ブタのレシピエントへ移植１時間後の本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x20）である。マトキシリンとエオシンで染色されている。この縦断面は、血栓のない内腔を有する腸間膜静脈と動脈を示す。
【図７Ｂ】ブタのレシピエントへ移植24時間後の本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x20）である。マトキシリンとエオシンで染色されている。腸間膜アーケードのこの断面は、血栓の無い血管（黒矢印）と移植片の外側部分に浸透する炎症細胞（白矢印）を示す。
【図８Ａ】ブタのレシピエントへ移植１時間後の本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x100）である。マトキシリンとエオシンで染色されている。移植片の動脈吻合部位のこの長手方向の断面は、脱細胞化された腸間膜動脈に浸潤する宿主細胞（矢印）を示す。
【図８Ｂ】ブタのレシピエントへ移植24時間後の本発明の代表的なインプラントの断面を示す顕微鏡写真（倍率x200）である。マトキシリンとエオシンで染色されている。矢印は、移植片の脱細胞化動脈の内腔の内側を覆うCD133+細胞を指す。
【００３１】
図１は小腸及びそれに関連する血管構造（10）を示す。小腸は、中央内腔を有する管状構造体（11）である。この管状構造体は、２つの筋肉層を覆う外側の漿膜層（12）を有し、この筋肉層は、長手方向（13）と円形（14）の筋肉層で構成されている。この筋肉層の下は腸粘膜下組織（15）であり、この腸粘膜下組織は粘膜層（16）によって（腸内腔の内部側面で）覆われており、この粘膜層の微細構造は、絨突起、微絨突起及び陰窩で構成されている。この小腸はまた、送り込む管（動脈）と排出管（静脈）から成る血液供給系を有し、これらは血管樹（20）を形成し、最終的に、送り込む細動脈及び毛細血管（動脈供給側）と排出する毛細血管と細静脈（静脈還流側）の形で、統合され、小腸組織と連携する。
動脈側（送り込む側）では、送り込む動脈（21）が複数のサブ動脈枝（22）を有し、小腸の様々な部分を養う。これらの動脈及びその枝は、血管茎(pedicle)中に位置し、結合組織（腸間膜）（23）で囲まれ支えられている。この動脈枝は、小腸の統合され連携する動脈及び毛細血管（24）を養う。これらの血管は、小腸組織の上又は内部に配置され、血液及び他の流体並びに細胞を小腸組織に灌流するように働く。血液及び流体は、小腸組織の上又は内部に配置されている統合された毛細血管や静脈（25）を介して小腸から排出される。これらの血管はその後、血液や体液を、複数の静脈枝（排出する主静脈からの静脈枝）（27）を介して排出し、主静脈（静脈）（26）へ返す。
【実施例】
【００３２】
以下、非限定的な実施例及びそれに伴う図面を参照して、本発明の実施形態が更に記載される。
すべての試薬はSigma-Aldrich社（UK）又はFisher Scientific社（UK）から購入した。
すべての動物は、Animals Scientific Procedures Act 1986に従って養い、取り扱った。また本研究は、英国内務省が定めライセンスしたガイドラインに従って実施された。実験は、ラージホワイトランドレース雑種豚（Large White Landrace crossbreed pigs）を使用して行った。すべての動物は、標準的な実験室条件下に維持し、商業ペレット化飼料を与えた。
【００３３】
１．無細胞スカフォールドの調製
（ａ）ブタ腸組織の摘出
60〜65Kgのラージホワイトランドレース雑種豚にヘパリンの静脈内注射（7000 U）を行い、これに続いて、正中切開を行い、長さが約20〜30cmの回腸部分を、付属する血管と一緒に、単離した。腸間膜の残留リンパ節を解剖し、試料全体のリークの証拠を維持し、茎（組織）の先端を縛って単離した。動脈の基端部を14G Radiopaque I.V.を用いてカニューレ処置を行い、静脈の基端部から血液があふれ出さないように、ヘパリン（2000U）を含む0.9％NaCl液で洗い流した。血管系の腔内圧力を維持し、開通性を維持するために、茎（組織）を通ってヘパリン（2000U）を含む0.9％NaCl液を灌流させるための拍動ポンプを動脈のカニューレに取り付けた。移植されることになっている小腸への供給に関与していないすべての血管を縛って、移植片全体を動物から取り出した。この手順の最後に、麻酔を静脈内過量投与して動物を殺処分した。血管回路に漏れのないことを確認し、腸管腔を、1リットルの0.9％NaCl液で洗い流した。巾着縫合糸を用いて、回腸部分の両端にシリコーンチューブを取り付け、小腸部分を第２の灌流回路に取り付けた。このようにして、摘出した標本は脱細胞化の準備ができた。
図３は、上記のように調製した代表的試料を示す。腸部分のいずれかの端部をクランプで留め、生理食塩水を充填して、腸の構造、血管系及び漿膜表面を覆う微細な毛細血管の可視化を補助する。腸間膜アーケードは、腸部分のループの内部に扇状構造を形成しており、送り込む動脈血管と返すための静脈血管が明瞭に見える。この腸部分は、血管と組織中に細胞と血液が存在しているため、ピンク色の外観を呈する。
【００３４】
（ｂ）ブタ腸組織の脱細胞化
移植の直後に、血管部分及び腸管状部分を脱細胞化するために、二つの別々の灌流回路が設定された。
図２の概略図に示されているように、灌流システム（100）は、血管部分（102）と腸管状部分（103）とを含む腸組織（101）を処理するために設定された。回路Ｉは、カニューレを介して、腸間膜アーケードの主動脈（104）に取り付けられ、主静脈（105）から出る。回路IIは、移植された回腸の管状部分（103）の各末端に結びつけられたシリコーンチューブに取り付けられた。ポンプ（106、107）は、脱細胞化するための媒体を回路Ｉと回路IIを別々にポンピングするために使用された。矢印は流れの方向を示す。
表１に、用いた脱細胞化プロトコルを示す。なお、表中、回路Ｉは工程No.1-11から成り、回路IIは工程No.1-14から成り、工程No.1-10は回路Ｉと回路IIに共通である。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
回路Ｉを灌流するために用いる溶液に腸組織を浸漬した。プロセス全体を通して、回転速度が30-60rpmのワトソン・マーロウ323S/Dポンプ（UK）を用いて灌流を行った。SDS、トリプシン及びDNase I溶液による一連の灌流と各ステップの間の抗生物質のSDS溶液による洗浄により、細胞、細胞質成分及び最終的にはデオキシリボ核酸は破壊された。脱細胞化の最終段階の後、動脈からカニューレを取り外し、回腸からシリコンチューブを取り外した。この無細胞スカフォールドを、0.1％過酢酸のPBS溶液中に入れ、室温で3時間、水平振とう機に入れることで、滅菌した。これに続いて、これを、抗生物質を補充した滅菌PBS中で洗浄し、使用するまで抗生物質を含む滅菌PBS中で保存した。
このようにして得られた脱細胞化インプラントを図４に示す。この脱細胞化腸インプラントは、細胞及び血液を除去した後、灰白色で半透明の外観を呈する。図に示す腸管状部分は、クランプで留められ、生理食塩水で満たされており、保存された腸構造、腸間膜アーケード、及び漿膜表面上の微細な毛細血管がよく観察される。この腸間膜アーケードは、腸部分のループの内部に、扇状構造を形成している。送り込む動脈と返しの静脈がカニューレ処理されているのがはっきりと見える。
【００３７】
（c）無細胞スカフォールドの組織学的解析と分子解析
核物質の存在について、３つの代表的な無細胞スカフォールドの組織学的分析と分子分析を行った。比較のため、同じ年齢及び体重の動物の腸組織を使用した。通常の実験手順を使用して、脱細胞化された回腸の全長と腸間膜アーケードから成るスカフォールドサンプルを10％NBF中で固定し、ワックス包埋処理を行った。切片を5μmで切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）並びにPicro Sirius Red及びMiller's elastin（PSR-ME）で染色した。
各スカフォールドから0.025 gのサンプルを取り出し、GenElute哺乳類ゲノムDNAミニプレップキット（Sigma-Aldrich社、UK）を用いて、製造業者の説明書に従って、DNAを単離した。スカフォールド構造体の血管と腸部分に残留するDNA及び自然の回腸と関連する血管から単離されたDNAの量を、分光光度計（AD=260）を用いて定量した。無細胞のスカフォールドとネイティブ組織の各サンプル中のDNAの存在の違いを可視化するために、DNAの電気泳動分離を行った。トリス-酢酸エチレンジアミン四酢酸（TAE）緩衝液中の1％アガロースゲル上で、100Vで2時間、DNAを分離した。その後、ゲルを臭化エチジウム溶液で15分間染色した。
【００３８】
Blyscan硫酸化グリコサミノアッセイ（Biocolor社UK）を用いて、製造元の説明書に従って、無細胞スカフォールドにおけるグリコサミノグリカン(GAG)の量を評価した。この評価を用いて、グリコサミノグリカン(GAG)の提供された評価標準（2-50μg/mlの範囲）を用いて計算された、硫酸化レベル（色素結合能）の（656nm）の吸光度値により、総硫酸化グリカン含有量を計算した。このグリコサミノグリカン(GAG)は、試料の三つの異なるバッチから単離し、標準曲線を用いて濃度を計算した。結果は、μg/g湿重量で示す。無細胞スカフォールドについて得られた値を、対照のブタ腸組織の値と比較した。
脱細胞化スカフォールドの組織学的分析によれば、血管腸間膜アーケードと回腸組織のいずれにも、そのままの細胞は無かった。PSR-MEで染色された組織の切片を偏光下で分析したところ、粘膜下組織層の主に黄色〜オレンジ色のコラーゲン繊維と、ネイティブ腸に外観が似ている粘膜層の薄く緑の繊維と共に、血管にコラーゲンとエラスチンが保持されていることが分かった（図５Ａ）。H＆Eの染色により、小口径の粘膜下血管内にエラスチンが保存されていることが確認された（図５Ｂ）。
脱細胞化スカフォールドの血管部分と腸部分の両方で残留DNAがいくらか検出されたが、自然の組織と比較した場合、それは有意な減少を示した。脱細胞化スカフォールドの腸管状部分内で見いだされたDNAの総量は、自然の組織で見いだされた全DNAのわずか0.75％であり、脱細胞化血管系で見いだされたDNAの総量は、ネイティブな血管系で見いだされた全DNAの1％未満であった（表２）。脱細胞化処理後には、残存するグリコサミノグリカン(GAG)の量は減少した。即ち、脱細胞化スカフォールド内で、機能性グリコサミノグリカン(GAG)の保持は42％であった（表２）。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
２．無細胞スカフォールドの豚レシピエントへの移植
（a）外科手順
ラージホワイトランドレース雑種豚（N=7）（55〜75 Kg）に正中切開により右側腎摘出術を行った。スカフォールドの血管部分（送り込む動脈と回腸茎の静脈）を、腎動脈と腎静脈に、末端−末端方式で吻合した。この吻合部位と移植されるスカフォールド構造体の腸間膜血管系の出血を調べた。血液の過剰な損失を止めるために、Mersilk tieを用いた。腸間膜アーケードと脱細胞化回腸を包む微細毛細血管網を灌流する際に血液が観察されたら、スカフォールドインプラント全体を腎臓キャビティ内に１時間置き、動物の生理学的徴候をモニターした。その後、ペントバルビタールナトリウムの致死量（100mg/kg）を注射して、殺処分した。
１つのスカフォールドを、回復手順のために24時間移植した。スカフォールドを、腎臓キャビティ内に置き、筋肉縫合糸（3.0 Vicryl）を用いて腹部筋肉層を縫合し、水平マットレス縫合糸（3.0 Mersilk）を用いて皮膚を縫合した。手術後、動物は、静脈内カルプロフェン（4mg/kg体重）注射により、無痛処理を受けた。24時間後、殺処分し、直ちに移植片を回収した。
スカフォールドの外科的移植の前に、抗凝固プロトコルを適用した。このプロトコルは、外科的手順の前及びその間に動物を抗血栓薬で前処理することと、ヘパリンナトリウム正味又はヘパリンナトリウムを生理食塩水に溶解した溶液を注射することによりインプラントの血管部分を前処理することから成る。このプロトコルを表３に示す。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
脱細胞化された動脈と静脈と、レシピエント動物の腎動脈と腎静脈との、末端−末端方式の吻合は、全ての動物において成功であった。７つのインプラントのうち５つは、移植後１時間以内に、スカフォールドの完全な灌流（宿主の血液を含む脱細胞化腸内の血管の微小接続を含む）が行われ（図６）、そのスカフォールドにおいては実験中血管の詰りはなかった（表５）。この移植時、７番目の移植片は24時間の生体内に残された。
図６Ａは、移植１時間後のインプラントを示す。灌流された腸由来部分は、健康的なピンク色の外観を呈し、灌流された活気ある組織の代表的な外観である。腸間膜アーケードは、腸インプラントと同様に、良い灌流を示している。矢印の頭は、血栓のない腸間膜血管を指し、腸部分の漿膜表面上の微小血管の完全な灌流が見える。
図６Ｂは、移植１時間後の同じインプラントを、図６Ａに示したものよりも高い倍率で、別の視点から見たものである。矢印は、識別可能な脱細胞化血管を有する腸のミクロの接続を指す。この写真は、血栓が無い開通性の血管システムを示しており、動脈と静脈がはっきり見え、レシピエントの血液で灌流されている。漿膜表面の毛細血管もはっきりと見え、灌流され、血液の漏れが無いことによって証明されるように、脱細胞化に続いて構造的に無傷である。この灌流された腸部分は、健康的なピンク色の外観を呈し、灌流された活気ある組織の代表的な外観である。
７例中５例で、全身の血液を用いた移植片の再灌流が成功した。失敗した２例では、スカフォールドに全身の血液を導入した直後に起こった腸間膜血管の凝固により、灌流が阻止された。
最も成功したプロトコルは、動物に経口でワルファリン12 mg/日を前投薬することと、スカフォールド構造体を正味ヘパリンナトリウム30.000 Uとパリンナトリウム12.000-20.000 Uの静脈内注射で事前調整を行うことを組み合わせたものである。255-260 U/kg/hの全ヘパリン（体重及び外科的処置の長さに基づいて計算）を摂取した動物の抗凝固処理は最良であった。しかし、表４に示すように、55 U/kg/hを摂取した動物も、脱細胞化血管の完全な再灌流及び開通性に満足な結果を有していた。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
短い血管を有するスカフォールドがより良く機能するためには、脱細胞化された送り込む動脈と排出する静脈の長さもまた再還流が成功するかどうかに寄与している（表５）。
【表５】
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【００４５】
（b）組織学的及び免疫組織化学的分析
移植手順に続いて、スカフォールドからサンプルを取り出し、固定し、ルーチン組織学的分析のために処理した。周囲の組織への血管漏出の程度、潅流の速度、及び血管内凝固の兆候を評価するために、H＆Eで染色した切片を使用した。
移植後１及び24時間後に取り出した移植片の、内皮前駆細胞（CD133）、平滑筋アクチン（αSMA）、マクロファージ（CD68）及びフォン・ヴィレブランド因子（vWF）を可視化するために、免疫組織化学的(IHC)染色を行った。IHC染色を行う前に、すべての部分を脱ワックスし、再水和し、この時点で必要な抗原回復を行った。組織内の内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中63％水素ペルオキシダーゼを用いて30分間ブロックした。正常ウマ血清(Impress Kit, Vector Laboratories, UK)を30分（CD68、αSMA）又は2時間（CD133、VWF）用いて、非特異的結合を防止した。その後、切片をPBSで希釈した一次抗体と共にインキュベートした。同時に、陰性対照として、PBSのみを使用したもので同様に行った。その後、切片をPBS中で、3×3分の洗浄サイクル洗浄した。その後、更にビオチン化二次抗体を用いてインキュベートした。これに続いて、Vectastain Elete ABCキット（Vector Laboratories、UK）とPBS（CD133）の3x3分サイクルを行った。3,3-ジアミノベンジジン四（DAB）基質（Vector Laboratories, UK）を用いて、蒸留水による5分間の洗浄により、可視化を行った。最後に、切片を、ハリスヘマトキシリンで１分間対比染色を行い、脱水し、キシレン中で洗浄し、カバーを取り外した。
【００４６】
すべての連続データは、平均値（n=3）±標準誤差（SEM）として表され、p<0.05を有意とした。p値は一方向分散分析(ANOVA)を用いて評価され、すべての計算はGraphPadプリズム4ソフトウエアを用いて行った。
組織学的分析によれば、７つのインプラントのうち５つ（４つは短期試験、１つは長期試験）において、血管（腸の小径の血管及び毛細血管を含む）の大部分は、開通性（詰まっていない）であり、非凝固血液を含んでいることを示した。（図７Ａ及びＢ）。ミラーエラスチン染色によれば、血栓は、主に血管壁又は内部エラスチンが妨害された場所で起こることを示した。
移植１時間後という早い時点で、スカフォールドの吻合され無細胞化された血管に、宿主細胞が存在した（図８Ａ）。細胞の浸潤速度は、移植片の遠位部分では減少した。それにもかかわらず、細胞は、腸間膜血管の内腔表面に存在していた。スカフォールド細胞外マトリックス（ECM）の細胞の浸潤速度は、移植24時間後に非常に高かったが、強い異物反応の兆候は無かった。
【００４７】
１時間後の動脈の吻合側からの浸潤細胞の大部分はCD68+であったが、24時間後では、マクロファージが、移植血管の中央部分よりも遠位に存在した。24時間後の移植片の主動脈（静脈ではない）中に存在する細胞のほとんどはCD68-であった。スカフォールド構造体の血栓のない部分では、より多くのマクロファージが存在した。少数のCD68+細胞が、宿主の腎血管に存在した。移植１時間後という早い時点で、吻合動脈の内側を覆う細胞の中には、CD133+のものがあり、その数は24時間以内に増加した（図８Ｂ）。吻合部位の切片は、ドナーとレシピエントの主茎でVWF+染色の同様の量を示した。しかし、移植されたものではない脱細胞化された主動脈と静脈を分析すると、染色は検出されなかった。移植片のいずれにもαSMA+細胞は見られなかった。
以上示した特定の実施態様は、本発明を限定する目的で提供されたものではなく、単に例示の目的で提供されたものであると理解されるべきことは勿論である。
【符号の説明】
【００４８】
１０  血管構造
１１  管状構造体
１３、１４  筋肉層
１５  腸粘膜下組織
１６  粘膜層
２１  送り込む動脈
２３  結合組織（腸間膜）
２４  毛細血管
２５  静脈
２６  主静脈
１００  灌流システム
１０１  腸組織
１０２  血管部分
１０３  腸管状部分
１０４  腸間膜アーケードの主動脈
１０５  主静脈
１０６，１０７  ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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