(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸を、ナットウキナーゼと組み合わせて、含んでなる組成物であって、
コンドロイチン硫酸／ナットウキナーゼの比が、１．０／０．０５−０．８であり、
但し、該組成物は、アミノ酸からなる群から選択される、ただ一種のアミノ酸を含み；
前記アミノ酸からなる群から選択される、ただ一種のアミノ酸は、Ｌ−メチオニンである
ことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
Ｌ−メチオニンが存在する際、該組成物中に含まれる、コンドロイチン硫酸／Ｌ−メチオニンの比は、１．０／０．００１−０．０５の範囲である
ことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
コンドロイチン硫酸の分子量が１〜９５ｋＤａの範囲である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
コンドロイチン硫酸が、動物供給源からの抽出により得られる
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
コンドロイチン硫酸が、加水分解によるフルクトース残基の除去後に、大腸菌の莢膜多糖Ｋ４を化学的に硫酸化することにより得られる
ことを特徴とする、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項６】
コンドロイチン硫酸が、加水分解によるフルクトース残基の除去後に、大腸菌の莢膜多糖Ｋ４を化学的に硫酸化し、続いて酸またはラジカル解重合することにより得られる
ことを特徴とする、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項７】
コンドロイチン硫酸が、大腸菌の遺伝子組み換え菌株の、もともとフルクトース残基を含まない莢膜多糖を、化学的に硫酸化することにより得られる
ことを特徴とする、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項８】
コンドロイチン硫酸が、大腸菌の遺伝子組み換え菌株の、もともとフルクトース残基を含まない莢膜多糖を、化学的に硫酸化し、続いて酸またはラジカル解重合することにより得られる
ことを特徴とする、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項９】
該組成物中に、スルフヒドリル化合物が含まれており、
前記スルフヒドリル化合物が、メチオニンである
ことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
急性または慢性炎症の予防または治療において用いられる一または二以上の活性成分、および／または、ヒトおよび動物における筋骨格の健康を維持するために用いられる一または二以上の栄養補助物質をさらに含む
ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
一または二以上の活性成分が、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、コラーゲン、加水分解コラーゲン、多不飽和脂肪酸、ケラチン、メチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）、葉酸塩、還元葉酸塩、ビタミン類、ビタミンＢ、アスコルビン酸およびアスコルビン酸マンガンからなる群より選択される
ことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
微結晶性セルロース、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状シリカ、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、水性シェラック塩、アルギン酸ナトリウム、デンプン、加工デンプン、メタクリル酸コポリマー、マルトデキストリンおよびポリオールから選択される薬学的または栄養補助的に許容できる一または二以上の賦形剤をさらに含む
ことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
変形性関節炎に関連する、急性および慢性炎症の予防または治療において用いるための、経口投与剤の調製における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
カプセル、ソフトゲルカプセル、錠剤、顆粒または再構成粉末飲料を含む固形経口製剤中における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）およびタンパク分解活性を有する酵素または酵素混合物を単独でまたはスルフヒドリル化合物の存在下に含んでなる組成物、および、変形性関節炎および関連する急性および慢性炎症過程の治療および予防におけるそれらの使用、または、ヒトおよび動物における筋骨格の健康の維持のための栄養補助組成物としてのそれらの使用に関する。
【０００２】
前記組み合わせは、経口投与したときのＣＳの腸内吸収を促進する。より高い分子量のサンプルよりも大きな生物学的利用能が既に知られている非常に低い分子量（１〜１０ｋＤａ）を特徴とするオリゴ糖からなるサンプルを含む広範囲の分子量のＣＳに、前記組み合わせの効果が発揮される。
【背景技術】
【０００３】
ＣＳは、欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ：the European League against Rheumatism）により、大規模臨床エビデンスに基づいて、膝、臀部および手の変形性関節炎の治療における変形性関節炎用症候性遅効性薬物（ＳＹＳＡＤＯＡ）として勧められている。ＣＳは、また、局所および全身の両方において抗炎症活性を奏する組成物中において、栄養補助食品として単独でまたは他の成分と組み合わせて用いられる。
【０００４】
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、脊椎動物および無脊椎動物の両方に存在し、β１−３結合により結合し異なる位置において硫酸化している、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基と交互になっているグルクロン酸（ＧｌｃＡ）の残基により形成される二糖配列からなる、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のクラスに属する多糖である。二糖は、β１−４結合により順次結合される。ＣＳは、主に、ＧａｌＮＡｃの４位または６位における一硫酸化二糖単位からなる（それぞれ二糖ＡおよびＣと呼ばれる）。ＣＳ ＡおよびＣは、多糖の起源に応じて異なる割合で現れる。
【０００５】
種々の位置において酸素原子に結合している二つの硫酸基を有する非硫酸化二糖および二硫酸化二糖も、また、特定の動物起源に応じて様々なより少ない程度にＣＳ中に存在する：すなわち、ＧｌｃＡの２位およびＧａｌＮＡｃの６位（二糖Ｄ）、ＧｌｃＡの２位およびＧａｌＮａｃの４位、またはＧａｌＮＡｃの４および６位（二糖Ｅ）に存在する（Volpi N.J. Pharm. Pharmacol. 61, 1271, 2009. Volpi N.J. Pharm. Sci. 96, 3168, 2007. Volpi N.Curr.Pharm.Des. 12, 639, 2006）。
【０００６】
異なる動物起源のＣＳは、異なる分子量によっても特徴付けられる。
【０００７】
例えば、陸生動物起源のＣＳは、互いに類似した分子量値を有するが、より高い分子量値を有する魚種起源のＣＳとは異なる分子量値を有する。陸生起源のＣＳは、１４〜２６ｋＤａの範囲の平均分子量を有するが、海洋起源のイカ、軟骨魚および硬骨魚からのＣＳは５０ｋＤａを超える平均分子量を有する。
【０００８】
動物起源のＣＳに加えて、天然ＣＳに類似のポリマーを得るように後で合成により修飾される細菌起源の多糖骨格に基づく一部のＣＳ産物を説明する。細菌合成起源のこれらのバイオテクノロジーＣＳは、残留不純物中におけるウイルスおよび／またはプリオンまたは他の潜在的にアレルギー誘発性のマクロ分子の存在の可能性、最終産物における動物タンパクの高含量、動物産物と宗教または食事制限との不適合性、および大きくなる世界的要望を満たす利用可能な供給源が限られている、などの抽出ＣＳの動物起源に関わる欠点の一部を克服する。
【０００９】
細菌合成起源のＣＳの例が、例えば、ＥＰ１３０４３３８に記載されているが、そこでは、大腸菌菌株Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４の莢膜多糖が、最初のポリマーの抽出および加水分解の後に、化学的に硫酸化される。細菌合成ＣＳの他の例が、ＷＯ２０１２/１５２８７２、ＷＯ２０１２/１５９６５５およびＷＯ２０１３/１７４８４７に開示されているが、そこでは、細菌莢膜多糖が化学的に硫酸化されて、動物起源のものに類似のＣＳが得られる。
【００１０】
最後に、抽出された多糖（Cho SY et al. Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A. et al. Osteoart. Cartil. 8, 343, 2000）および細菌起源の多糖（ＷＯ２０１３/１７４８４７(特許文献１)、ＷＯ２０１２/１５２８７２）の解重合により低分子量ＣＳの一部の例が得られた。これらのタイプのＣＳの低分子寸法によって、天然ＣＳの既知の活性の多くが維持されつつ、優れた経口吸収がもたらされる。
【００１１】
経口投与されると、小腸および遠位管の腸粘膜によりＣＳが吸収される。ＣＳは、部分的には高分子量多糖として小腸内で吸収されるが、大部分は、オリゴ糖の状態で盲腸および結腸において吸収される（Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009）。これらのオリゴ糖は、消化器の下方管において腸内細菌叢により生成される加水分解酵素により最初の多糖を部分的に解重合することにより生じる。
【００１２】
ＣＳを構成する多糖の腸内吸収に含まれる機構は完全には明らかでないが、大部分のマクロ分子の場合のように、腸上皮の細胞間隙を通過する吸収が量的に有意であり、ＣＳのオリゴ糖断片もこの経路により吸収されると考えられている。その輸送が腸粘膜を通過する特定の分子キャリアによる媒介を含まない大きな分子の吸収を制限する障壁を形成する密接結合がこの水準で存在する。
【００１３】
高分子量ＣＳの吸収は、約１〜５％に至ると推定される。既述のように、吸収されたＣＳの大部分は、腸内微生物叢により生成されるコンドロイチナーゼによるその酵素的消化に由来するオリゴ糖からなる。しかしながら、オリゴ糖の吸収を考慮すると、腸粘膜によるＣＳの合計取り込み量は、摂取された多糖の２０〜２３％を超えない量である（Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009 (非特許文献１) - Barthe L. et al. Arzneimittelforsch./Drug Res. 2004; 54: 286-92）。
【００１４】
通常、経口投与後のＣＳの吸収が依然として問題であり、前記グリコサミノグリカンの腸内吸収を増すことができる方法が高度に話題となっている。
【００１５】
ブロメラインは、パイナップル科(Bromeliaceae family)に属する植物であるパイナップル(Ananas comosus)の果実および茎から抽出されるシステインプロテアーゼ混合物である。その抽出のための主な供給源は果実の茎であり、そこでその濃度が最も高い。この混合物の４つの別々の断片を区別することができる、または質量分析により行われるより洗練された分析的特性解析によれば、全てが匹敵するタンパク分解活性を有する８つのタンパク分解構成要素を区別することができる。この理由のために、天然状態の混合物が通常用いられる。ブロメラインは、Ｃ１Ａペプチダーゼの亜科に属するエンドペプチダーゼと分類される（ＭＥＲＯＰＳ命名法）。プロテアーゼ混合物に加えて、抽出物は、ペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼおよびグリコシダーゼを含む。構成要素の分子量は８〜２８．５ｋＤａの範囲である。ブロメライン濃度は、重量単位よりもタンパク分解単位（ＧＤＵ単位または国際単位ＩＵ）で表現されることが多い。
【００１６】
そのタンパク分解特性を考慮すると、ブロメラインは膵臓プロテアーゼと類似の活性を有し、従って、消化を促進する。これは、膵臓抽出物と組み合わせて、消化不良のために用いられる。ブロメラインは、また、長鎖脂肪を分割する。
【００１７】
ブロメラインは他の薬理活性も有し、その最も重要なものは有力な抗炎症活性であり、それが、外傷または術後反応および局所炎症と関連する軟組織の炎症状態の治療においてブロメラインを効果的にする。ブロメラインは、抗炎症性プロスタグランジン（例えば、Ｅ２プロスタグランジン）の生合成を増加させ、反対に、炎症誘発性プロスタグランジンの生合成を阻害することにより、この活性を発現することが示された。
【００１８】
ブロメラインの他の薬理活性としては、抗血栓および線維素溶解誘発作用、降圧作用、およびアテローム性動脈硬化プラークの退縮を誘発する性能がある。抗生および抗腫瘍治療におけるその相乗性能も記載されてきた。
【００１９】
ブロメラインは、タンパクにとって稀な特徴である約４０％と推定される優れた経口生物学的利用能により特徴付けられる。さらに、吸収されていないブロメラインの大部分は、胃液または唾液中に存在するシスタチンによって強く攻撃されないので、無傷のままであり、腸管腔においてその酵素活性を発現することができる。その特徴を考慮すると、ブロメラインは、それぞれパパイヤ（Carica papaya）およびイチジク（Ficus carica）に由来する類似の抽出物であるパパインおよびフィカインに似ている。
【００２０】
ナットウキナーゼは、特別の種の枯草菌であるB. subtilis nattoを用いて発酵した煮大豆に基づく伝統的日本食品である納豆から最初に単離された酵素である。
【００２１】
ナットウキナーゼは、強力な線維素溶解活性を有する約３２ｋＤａのセリンプロテアーゼである。スブチリシンとのその相同性は７２％を超える。その線維素溶解活性は、ウロキナーゼおよびプラスミンの生成の増加を誘発する性能と共に線維素溶解における直接作用を含む。ナットウキナーゼは温度および低いｐＨ値に対する比較的高い安定性を特徴とし、この特徴は、タンパクに、胃環境に対する優れた抵抗を与え、経口投与によるその使用を可能にする。
【００２２】
胃環境に対する比較的安定性およびそのタンパク分解活性の特徴により、ナットウキナーゼは、ここに説明する使用においてブロメラインとの類似性を示すことができる酵素になる。
【００２３】
ＵＳ５６７９３４４は、抗炎症特性を有するタンパク分解酵素とグルコサミンとを含む、関節疾患に用いるための栄養組成物を開示している。その組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼと少なくとも１種の酸安定化プロテアーゼとを含む。
【００２４】
ＵＳ５８８８５１４（特許文献２）は、骨および関節の炎症の治療において用いるための、ビタミンおよび植物エキスと共に、軟骨、タンパク分解酵素、グルコサミン硫酸およびコンドロイチン硫酸を含む組成物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１７４８４７号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５８８８５１４号明細書
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Lauder R.; Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
ＣＳをブロメラインと組み合わせ、および、システイン、メチオニン、グルタチオンまたは他のスルフヒドリル化合物のようなブロメライン活性促進剤が同時に存在すると、小腸におけるその吸収が増加することが今回分かった。
【００２８】
ナットウキナーゼは、ＣＳの生物学的利用能に対してさらに驚くべき効果を有し、それは２５０％を超えるまで増加することも分かった。
【００２９】
本発明の目的は、コンドロイチン硫酸および一または二以上のプロテアーゼ、および任意にスルフヒドリル化合物を含む組成物であって、プロテアーゼがナットウキナーゼ以外の場合、スルフヒドリル化合物が存在するような組成物である。
【００３０】
ここで「スルフヒドリル化合物」は天然または合成アミノ酸、または小さなペプチド、あるいは少なくとも１つのスルフヒドリル基を含む他の化合物を意味する。スルフヒドリル化合物は、好ましくは、メチオニン、システイン、ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、アセチルシステイン、還元または酸化グルタチオン、およびＳ−アセチルグルタチオンから選択される。
【００３１】
本発明の組成物において、コンドロイチン硫酸/プロテアーゼ/スルフヒドリル化合物の比は１．０／０．０５−０．８／０．００１−０．０５である。
【００３２】
コンドロイチン硫酸は、好ましくは分子量が１〜９５ｋＤａの範囲であり、より好ましくは４〜５０ｋＤａの範囲である。
【００３３】
コンドロイチン硫酸は、好ましくは抽出動物起源のものである。ＣＳは、ＥＰ１３０４３３８、ＷＯ２０１２/１５２８７２およびＷＯ２０１２/１５９６５５に記載のように加水分解によりフルクトース残基を除去した後に大腸菌からの莢膜多糖Ｋ４を化学的硫酸化することにより、または、ＷＯ２０１３/１７４８４７およびＷＯ２０１２/１５２８７２に記載のように、加水分解によりフルクトース残基を除去した後に大腸菌からの莢膜多糖Ｋ４を化学的硫酸化し、続いて酸またはラジカル解重合することにより得ることができる。あるいは、ＣＳは、大腸菌の遺伝子組み換え菌株（例えば、ＤＳＭ２３６４４）からの、もともとフルクトース残基を欠いている莢膜多糖の化学的硫酸化により得ることができる（ＷＯ２０１２/１５９６５５）。このように得られるＣＳの分子寸法を、ＷＯ２０１３/１７４８４７におけるように、続いて酸またはラジカル解重合により小さくすることもできる。
【００３４】
プロテアーゼは、好ましくは、ブロメライン、パパイン、フィカインおよびナットウキナーゼから選択される。ナットウキナーゼが好ましい。従って、本発明の好ましい態様は、スルフヒドリル化合物の不存在下にコンドロイチン硫酸およびナットウキナーゼを含んでなる組成物を提供する。本発明は、コンドロイチン硫酸の腸透過性を向上させるためのナットウキナーゼの使用にも関する。
【００３５】
本発明の組成物は、急性および慢性炎症状態の予防または治療において用いられる一または二以上の活性成分、および／または、ヒトおよび動物における筋骨格の健康を維持するために用いられる一または二以上の栄養補助物質も含むことができる。
【００３６】
活性成分は、例えば、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、アミノ酸、コラーゲン、加水分解コラーゲン、多価不飽和脂肪酸、ケラチン、メチルスルホニルメタン、葉酸塩、還元葉酸塩、ビタミン類、ビタミンＢ群、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アスコルビン酸およびアスコルビン酸マンガンからなる群より選択することができる。
【００３７】
組成物は、一または二以上の薬学的にまたは栄養補助的に許容できる賦形剤を含むこともできる。
【００３８】
グルコサミンおよびメチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）のような、コンドロイチン硫酸と通常組み合わされる成分の全てを、前記製剤に添加することもできる。
【００３９】
薬学的または栄養補助的に許容できる賦形剤は、例えば、微結晶性セルロース、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、水性シェラック塩、アルギン酸ナトリウム、デンプン、加工デンプン、メタクリル酸コポリマー、マルトデキストリンおよびポリオールである。
【００４０】
本発明の組成物は、好ましくは、例えば、カプセル、ソフトゲルカプセル、錠剤、顆粒、液状ドリンクまたは再構成される粉末ドリンクとして経口投与される。ＣＳの日用量は、栄養補助分野では４００ｍｇ〜３６００ｍｇの範囲とすることができ、薬剤としての通常の日用量は１２００ｍｇである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ウシコンドロイチン硫酸２０ｋＤａ（ダイヤモンド）、ＬＭＷコンドロイチン硫酸９ｋＤａ（四角）およびＨＭＷコンドロイチン硫酸４０ｋＤａ（三角）のラット腸粘膜を通る透過性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
ＣＳの透過性を試験管内（インビトロ、in vitro）モデルで試験し、そこで、ラット腸粘膜を安楽死直後の動物から切除し、２つのコンパートメントのインターフェースにおいて、適当な緩衝液に浸されたＵｓｓｉｎｇチャンバー内に置き、粘膜の側部は、ドナーコンパートメントと呼ばれる一方のコンパートメントに面する腸管腔に最初にさらされており、基部は、アクセプターコンパートメントと呼ばれる他のコンパートメントに面していた。
【００４３】
ＣＳを、組み合わせの他の成分の存在または不存在下にドナーコンパートメントに入れ、ラット腸粘膜からなる膜を通過してアクセプターコンパートメントにＣＳが浸透するインキュベーション期間の後にアクセプターコンパートメント中における多糖の存在を確定した。
【００４４】
その種々の組み合わせにおいてＣＳの腸透過性を評価するために用いられた実験技術を、ここで、より詳細に説明する。重さ１５０−１７０ｇのルイスラットを、ＣＯ２吸入により安楽死させ、小腸を直ちに切除し、洗浄し、１２５ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．３ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、５ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）、２０ｍＭグルコースおよび２５ｍＭ炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）からなる培地を充たしたＵｓｓｉｎｇチャンバー内に載置した。ＨＥＰＥＳで溶液のｐＨを７．４に調節した。９５％Ｏ２および５％ＣＯ２からなる雰囲気中、３７℃の温度で透過性試験を行った。透過性試験は、腸粘膜の切除後１５分以内に行った。
【００４５】
試験において用いられたＣＳサンプルは、性質および分子寸法において異なっていた。ウシ起源およびバイオテクノロジー（細菌合成）起源のＣＳサンプルを、種々の組み合わせで腸透過性試験に付した。用いられたＣＳサンプルは、１〜９５ｋＤaの範囲、好ましくは４〜５０ｋＤａの範囲の異なる分子量によっても特徴付けた。
【００４６】
コンドロイチン硫酸を、３％（質量／体積）の濃度でドナーコンパートメントに加えた。ブロメラインの存在下での透過性研究のために、ブロメラインを１．５％の濃度でＣＳ溶液に加えた。あるいは、メチオニン、システイン、ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、アセチルシステイン、Ｓ−アセチルグルタチオンおよび還元または酸化グルタチオンから選択されるスルフヒドリル化合物を、ブロメラインと共に、０．０７５％の濃度で加えた。ナットウキナーゼの存在下での透過性研究のために、その酵素を、ブロメラインのように、１．５％の濃度で溶液に添加した。
【００４７】
合計インキュベーション期間は３時間であり、その間に、サンプル１００μlを３０分毎にアクセプターコンパートメントから取り出し、除去した体積を新鮮培地で置き換えた。取り出したサンプルは、多糖をコンドロイチナーゼＡＢＳ（特異活性：０．５Ｕ/ｍｌ）で消化した後、以下に記載の方法を用いて、ＨＰＬＣによりＣＳを構成する二糖の存在について分析した。
【００４８】
用いられたＨＰＬＣ法では、強力なアニオン交換カラム（ＳＡＸ）を使用し、ｐＨ４の酢水に基づく溶離液を用い、酢水中のみで最初の等張溶離を５分間行った後、１．２Ｍ ＮａＣｌで２５分間で０％〜１００％のリニアグラジエントとした。用いられた流量は１．０ｍｌ／分であり、二糖の検出は、ＵＶ検出器を用いて２３２ｎｍで行った。
【００４９】
アクセプターコンパートメント中のＣＳの量は、初期ＣＳ濃度Ｃの０．７８％〜１００％の範囲に相当する標準コンドロイチン硫酸の８点較正曲線を用いて計算した。コンドロイチン硫酸標準は、実験に用いたものと同じ培地に希釈されたコンドロイチナーゼＡＢＣと共に予めインキュベーションした。アクセプターコンパートメント中で見つかったＣＳに基づいて、見かけ透過性係数（Ｐａｐｐ）を、式：Ｐａｐｐ（ｃｍ／秒）＝Ｑ／Ａ?Ｃ?ｔ（Ｑは、透過したＣＳの合計量（μg）、Ａは、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーの拡散領域（ｃｍ２）、Ｃは、ドナーコンパートメント中のＣＳの初期濃度（μｇ／ｃｍ３）、およびｔは、インキュベーション時間（３０〜１８０分））を用いて計算した。増加比Ｒを、Ｐａｐｐについて（ＰａｐｐＣＳ＋プロテアーゼ）／（ＰａｐｐＣＳ単独）として計算した。各サンプルを取り出したとき、すなわち、３０、６０、９０、１２０、１５０および１８０分においてＰａｐｐを計算した。次に、これらの点で得られた異なるＰａｐｐ値の平均を計算して、実験全体におけるそれぞれのサンプルの平均透過係数を得た。ＣＳ透過データは、別々に測定した二糖Δｄｉ−０Ｓ、Δｄｉ−６ＳおよびΔｄｉ−４Ｓの濃度ピークの平均として表した。
【００５０】
データの統計値は、最少有意としてｐ＜０．０５でのスチューデントｔ検定を用いて分析した。
【００５１】
この実験モデルの有効性は、異なる分子量、すなわち９、２０および４０ｋＤａのＣＳの３つのサンプルが、生体内（インビボ、in vivo）で生じるように、分子量の関数である腸管膜への透過性を示したという事実により確認される。これは、実験の１８０分間の期間において考察された全ての時間間隔におけるＣＳの累積的輸送を示すグラフ（図１）により示される。
【００５２】
次に、低い分子量（９ｋＤａ）および高い分子量（４０ｋＤａ）の非動物起源のＣＳのサンプルを、プロテアーゼの存在または不存在下に、およびブロメラインの場合は、促進化合物を加えてまたは加えないで、透過性試験において用いた。
【００５３】
ＣＳサンプルの時間に対する透過の結果が、他のアジュバントの不存在下に、またはブロメライン、ブロメラインとメチオニン、またはナットウキナーゼの存在下に得られた。
【００５４】
ブロメラインが多くのマクロ分子の細胞間隙透過を促進する性能は知られているが、この性能は、密接結合を弱めるその性能と関係しており（Grabovac et al., Int. J. Pharm. 326, 153-159, 2006）、この試験においては、他の因子が介在することなくブロメラインのみを使用することは、低分子量ＣＳの吸収を増加させなかった。このことは、表１に示す測定平均Ｐａｐｐ値の間の比較により分かる。しかしながら、低分子量ＣＳ、ブロメラインおよびメチオニンの組み合わせについては、相当の増加が観察された。低分子量ＣＳとナットウキナーゼとの組合せの場合にも、腸粘膜の透過性の驚くべき増加が観察された（表１）。増加比Ｒは、ＣＳ/ブロメライン/メチオニンの組み合わせについては１を超える値であり、ＣＳ/ナットウキナーゼの組み合わせについては明らかに１より高いが、ＣＳ/ブロメラインの組み合わせについてはＲは１より小さい（表２）。従って、メチオニンは、ＣＳの腸透過性の促進剤としてブロメラインの作用に驚くほど好ましい効果を奏するが、さらに驚くべきことに、ナットウキナーゼは、他の因子が介在すること無しに、低分子量ＣＳの腸透過性をほとんど倍増させる。対応する大きな多糖よりも既に生物学的利用能が高い低分子量ＣＳの生物学的利用能を前述の組み合わせによりさらに増加させ得ることに注目することは興味深い。
【００５５】
【表１】
0006348123.tif 000002
【００５６】
低分子量（ＬＭＷ）コンドロイチン硫酸の単独、または、ブロメライン、ブロメライン＋メチオニン、ナットウキナーゼと組み合わせた場合の透過性について決められた平均Ｐａｐｐ値
【００５７】
【表２】
0006348123.tif 000003
【００５８】
組み合わせと単独低分子量（ＬＭＷ）コンドロイチン硫酸との増加比
同様に非動物起源の高分子量ＣＳ（４０ｋＤａ）の吸収について匹敵する効果が観察された（表３および４）。この場合、組み合わせの促進効果はいっそう明らかであり、ＣＳ単独の吸収のほとんど３倍であって、このことは、吸収がより重要である寸法の大きな多糖の場合にも促進効果が起こることを示している。
【００５９】
【表３】
0006348123.tif 000004
【００６０】
高分子量（ＨＭＷ）コンドロイチン硫酸の単独、またはブロメライン、ブロメライン＋メチオニン、ナットウキナーゼと組み合わせた場合の透過性について決められた平均Ｐａｐｐ値
【００６１】
【表４】
0006348123.tif 000005
【００６２】
組み合わせと単独高分子量（ＨＭＷ）コンドロイチン硫酸との増加比
動物起源のＣＳのサンプル（分子量：１５〜２０ｋＤａ）も、ブロメラインとメチオニンの混合物の不存在下または存在下における透過性試験に付して、任意の供給源からのＣＳの透過性を増加させる組み合わせの性能を確認した（表５）。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
ウシコンドロイチン硫酸の単独またはブロメライン＋メチオニンと組み合わせた場合の透過性について決められた平均Ｐａｐｐ値
以下のものは、本発明による組成物の実施例である。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
ウシコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ブロメライン６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例２）
ウシコンドロイチン硫酸１２００ｍｇおよびナットウキナーゼ６００ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例３）
分子量が９ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ブロメライン６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例４）
分子量が９ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇおよびナットウキナーゼ６００ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例５）
分子量が４０ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ブロメライン６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例６）
分子量が４０ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇおよびナットウキナーゼ６００ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例７）
分子量が９ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ナットウキナーゼ６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例８）
分子量が４０ｋＤａのバイオテクノロジーコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ナットウキナーゼ６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した
（実施例９）
ウシコンドロイチン硫酸１２００ｍｇ、ナットウキナーゼ６００ｍｇおよびＬ−メチオニン３０ｍｇを混合することにより組成物を調製した。
【図１】
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