(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法であって、
（ｉ）いかなる架橋も伴わずに、水溶液である第１の液体媒体に溶解したヒアルロン酸基材を用意する工程と、
（ｉｉ）いかなる架橋も伴わずに、前記ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第１の水溶性有機溶媒を含む第２の液体媒体に供することによって沈殿させる工程と、
ここで、工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）は、前記ヒアルロン酸基材を所望の形状に構成することをさらに含み、
（ｉｉｉ）前記所望の形状の前記非架橋の沈殿したヒアルロン酸基材を、１１．５以上のｐＨを有し、１種以上の多官能性架橋剤と、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第２の有機溶媒とを含む第３の液体媒体中、好適な条件下で単一の架橋反応に供して、沈殿した成形された架橋ヒアルロン酸生成物を得る工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記最初の２つの工程（ｉ）および（ｉｉ）が、架橋剤の非存在下で行われ、前記多官能性架橋剤が、前記第３の架橋工程（ｉｉｉ）において添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）が、前記ヒアルロン酸基材溶液を疎水性表面上で所望の形状に構成することをさらに含み、工程（ｉｉ）における前記成形されたヒアルロン酸基材の前記沈殿が、前記疎水性表面上で行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性表面が、フルオロカーボン、ポリプロピレン（ＰＰ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記形状が、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択される、請求項１〜請求項４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記形状が、繊維であり、その長さとその幅との比が、１０：１以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）が、前記ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の前記第１の水溶性有機溶媒を含む前記第２の液体媒体中に押し出し、それにより、前記押し出されたヒアルロン酸基材に、前記第２の液体媒体中で、沈殿した繊維を形成させることを伴う、請求項１〜２の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）の前記第２の液体媒体が、０〜３０体積％の水と、７０〜１００体積％の前記第１の水溶性有機溶媒とを含有する、請求項１〜請求項７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）の前記第２の液体媒体が、０〜１０体積％の水と、９０〜１００体積％の前記第１の水溶性有機溶媒とを含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉｉ）の前記第３の液体媒体が、０〜３５体積％の水と、６５〜１００体積％の前記第２の有機溶媒と、１種以上の多官能性架橋剤とを含有する、請求項１〜請求項９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の水溶性有機溶媒および前記第２の有機溶媒が１種以上の低級アルキルアルコールから個々に選択される、請求項１〜請求項１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）の前記水溶液が、４０〜１００体積％の水と、０〜６０体積％の低級アルキルアルコールとを含有する、請求項１〜請求項１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記低級アルキルアルコールが、エタノールである、請求項１１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記多官能性架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される、請求項１〜請求項１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉｖ）前記沈殿した架橋ヒアルロン酸生成物を非沈殿条件に供する工程と、（ｖ）非沈殿形態の前記架橋ヒアルロン酸生成物を単離する工程と
をさらに含む、請求項１〜請求項１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｖ）が、前記架橋ヒアルロン酸生成物を滅菌することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個の修飾度、ヒアルロン酸１ｇあたり４〜３００ｍＬの膨潤度、および１０以上の修飾効率を有する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２０】
前記生成物が、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択される形状を有する、請求項１９に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２１】
前記生成物が、繊維であり、その長さとその幅との比が、１０：１以上である、請求項２０に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２２】
前記生成物が、繊維であり、その縦方向の延伸が、２ｍｍ超である、請求項２０〜２１の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２３】
前記膨潤度が、ヒアルロン酸１ｇあたり１５〜１８０ｍＬである、請求項１９〜２２の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２４】
前記修飾効率が、２０〜１９０の範囲である、請求項１９〜２３の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２５】
クロスリンカー比が、３５％以上である、請求項１９〜２４の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２６】
ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される１種以上の多官能性架橋剤により架橋されている、請求項１９〜２５の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２７】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される、請求項２６に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２８】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項２７に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項２９】
前記生成物が、滅菌済みである、請求項１９〜２８の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９の何れか１項に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物と、任意に緩衝剤とを含む、水性組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖の分野に関連する。より具体的には、本発明は、ヒアルロン酸を架橋する、および成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造する、新規な方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
医学的使用のための最も広く使用されている生体適合性ポリマーの１つは、ヒアルロン酸である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の群に属する天然に存在する多糖である。ヒアルロン酸および他のＧＡＧは、多量の水を吸収する容量を有する負に荷電したヘテロ多糖鎖である。ヒアルロン酸およびヒアルロン酸に由来する生成物は、生物医学および美容の分野において、たとえば、粘弾性液手術（viscosurgery）中におよび皮膚充填剤（dermal filler）として広く使用されている。
【０００３】
吸水性ゲル、またはヒドロゲルは、生物医学分野において広く使用されている。それらは、一般的に、ポリマーを化学的に架橋して無限の網目構造とすることによって調製される。天然ヒアルロン酸およびある特定の架橋ヒアルロン酸生成物は、完全に溶解するまで水を吸収する一方で、架橋ヒアルロン酸ゲルは、典型的には、飽和するまである特定の量の水を吸収する、すなわち、有限の液体保持容量、または膨潤度を有する。
【０００４】
生体適合性ポリマーからゲルを調製する際、高い生体適合性を維持するために、低い架橋度を確保することが有利である。しかしながら、適正な生物医学的効果を有するためにより濃厚なゲルが必要とされることが多く、そのような場合、生体適合性が失われることが多い。
【０００５】
ヒアルロン酸は、ほとんどの生物において、その分子質量を除いて同一の化学構造で存在することから、最小限の反応をもたらし、高度な医学的使用を可能にする。ヒアルロン酸分子の架橋および／または他の修飾は、インビボでのその耐分解性または持続時間を改善するために必要である。さらに、そのような修飾は、ヒアルロン酸分子の液体保持容量に影響する。その結果として、ヒアルロン酸は、多くの修飾の試みの対象となっている。
【０００６】
架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、高度に複雑な化学構造であることから、典型的には、その化学構造およびその物理的特性の組合せによって特徴付けられる。非修飾ヒアルロン酸からの化学構造の逸脱は、典型的には、修飾度（degree of modification）、修飾度（modification degree）、架橋度、架橋指数、または化学修飾として報告され、これらはすべて、ヒアルロン酸に共有結合した架橋剤の量に関連する。この本文を通じて、修飾度という用語が使用される。架橋ヒアルロン酸ゲル生成物の最も意義のある物理的特性は、ゲルが吸収できる液体の体積およびゲルのレオロジー特性である。何れの特性も、ゲルの強度または堅固性と称されることが多い、ゲルの構造的安定性を表すが、液体の吸収は乾燥ゲルについて決定できる一方で、レオロジー特性は所望の濃度まで膨潤したゲルで測定しなければならない。液体吸収に対する従来の表現は、膨潤、膨潤容量、液体保持容量、膨潤度（swelling degree）、膨潤度（degree of swelling）、最大液体取り込み、および最大膨潤である。この本文を通じて、膨潤度という用語が使用される。架橋ヒアルロン酸ゲル生成物のレオロジー特性に関して、回転式レオメトリーは、液体のレオロジーの決定にのみ有用であるのに対し、振動式レオメトリーは、ゲルのレオロジーを決定するために必要であることが分かる。測定により、変形に対するゲルの耐性が弾性係数および粘性係数の単位で得られる。ゲル強度が高いと、所望の濃度まで膨潤したゲル生成物の耐変形性が大きくなる。
【０００７】
ＵＳ２００７／００６６８１６は、二重架橋ヒアルロン酸を調製するための方法であって、ヒアルロン酸基材を、２つの工程で、それぞれエポキシドおよびカルボジイミドにより架橋することを伴う、方法を開示している。
【０００８】
ＥＰ２１９９３０８Ａ１は、エタノールを含有する液体媒体中に分散したヒアルロナン粉末の架橋を開示している。得られる生成物は、十分に制御されていない形状を有する。
【０００９】
ＵＳ２０１２／００３４４６２Ａ１は、実験的証拠なしに、架橋ＨＡゲルの固形塊をふるいまたはメッシュに通過させることによって、架橋ＨＡゲルの細い撚糸（strand）を生成できると提案している。
【００１０】
当分野における進歩にもかかわらず、好適な液体保持容量および分解プロファイルを有するが生体適合性が保持されている、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造する代替方法が依然として必要である。特に、たとえば液体保持容量として測定できる、所望のゲル強度を有する成形されたヒアルロン酸ゲル生成物を得るために必要とされる修飾度を最小化することが望ましい。
【００１１】
インプラントを伴う一部の公知の軟部組織増大処置は、時に、インプラントまたはその一部が所望の処置部位から離れて移動するという欠点を有する。インプラントを伴う一部の公知の組織増大処置の別の問題は、インプラントが所望の処置部位からずれることである。インプラントの移動およびずれは、患者にとって不利であり、その理由は、処置の美容的および／または治療的成果を損なうおそれがあり、インプラントの除去が望まれる場合に、これを妨げるおそれがあるからである。インプラントの完全性および場所を所望の時間にわたり維持することは非常に有益である。上述の問題を回避するために、ゲルは、変形に耐えるためにある特定のゲル強度を有することが必要とされる。この特性は、振動モードのレオメトリーを使用して測定することができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一目的は、所望の形状を有する架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法を提供することである。具体的な目的は、生成物が対象への埋入後に移動する可能性を制限する形状を有する、架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、高い生体適合性を有する成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造する、すなわち、望ましく有用な形状で固定化された際にヒアルロン酸の高い生体適合性を維持するための方法を提供することである。
【００１４】
根底にあるこれらの目標および／または本明細書から明らかである他の目標を果たすために、本発明の根底にある目的は、低から中程度の修飾度を有しながら、同時に低から中程度の液体保持容量、または膨潤度によって示される高いゲル強度を有する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法を提供することであることが分かった。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、液体保持容量が、ヒアルロン酸の修飾度以外のパラメーターによって制御または影響され得る、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明の一目的は、高割合の結合した架橋剤が（少なくとも）２つの端部で接合されている、すなわち、高い架橋効率を実現する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の液体保持容量、または膨潤度とを有する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を提供することである。
【００１８】
本発明の一目的は、高い耐変形性を有する成形された架橋ヒアルロン酸生成物を提供することである。
【００１９】
これらの目的および本開示から明らかとなる他の目的のため、本発明は、第１の側面によれば、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法であって、
（ｉ）いかなる架橋も伴わずに、水溶液である第１の液体媒体に溶解したヒアルロン酸基材を用意する工程と、
（ｉｉ）いかなる架橋も伴わずに、ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第１の水溶性有機溶媒を含む第２の液体媒体に供することによって沈殿させる工程と、
ここで、工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）は、ヒアルロン酸基材を所望の形状に構成することをさらに含み、
（ｉｉｉ）所望の形状の非架橋の沈殿したヒアルロン酸基材を、１１．５以上のｐＨを有し、１種以上の多官能性架橋剤と、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第２の有機溶媒とを含む第３の液体媒体中、好適な条件下で単一の架橋工程に供して、沈殿した成形された架橋ヒアルロン酸生成物を得る工程と
を含む、方法を提供する。
【００２０】
この方法は、有利なことに、非常に望ましい特性を有する成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造することを可能にすることが見出された。この方法は、架橋の良好な制御をもたらし、その理由は、架橋が固体（沈殿）相のみで生じ、溶解相および／または方法工程間では生じないからである。得られる生成物は、ヒアルロン酸の低い修飾度にもかかわらず、低い膨潤度を有するゲルであるという点で独特である。実に限定された膨潤度を有するゲル生成物が、この低い修飾度で得られることは非常に驚くべきことである。単一の架橋反応を伴う方法により、そのような望ましい特性を有する生成物を実現できることも驚くべきことである。多くの用途の中でも、この方法は、製造方法中に保持される既定の形状を有する架橋ヒアルロン酸生成物を製造することを可能にする。本方法はまた、生体適合性の成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造することを可能にする。
【００２１】
具体的な態様では、最初の２つの工程（ｉ）および（ｉｉ）は、架橋剤の非存在下で行われ、多官能性架橋剤は、第３の架橋工程（ｉｉｉ）において添加される。これによって、架橋剤の量が確実に、厳しく制御され、その理由は、以前の工程において、たとえば沈殿工程中に、架橋剤が反応または消失しないからである。
【００２２】
一態様では、工程（ｉ）は、ヒアルロン酸基材溶液を疎水性表面上で所望の形状に構成することをさらに含み、工程（ｉｉ）における成形されたヒアルロン酸基材の沈殿は、前記疎水性表面上で行われる。これは、構造の溜まり（clogging）を回避し、その形状を維持するために有利である。疎水性表面は、好ましくは、フルオロカーボン、ポリプロピレン（ＰＰ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から選択される。
【００２３】
一部の態様では、工程（ｉ）の水溶液は、４０〜１００体積％の水と、０〜６０体積％の低級アルキルアルコールとを含有する。それにより、絡み合った構造を実現することができ、これは、所望の特性を有するゲル生成物を得るのに有利である可能性が高い。
【００２４】
具体的な態様では、工程（ｉｉ）の第２の液体媒体は、０〜３０体積％の水と、７０〜１００体積％の第１の水溶性有機溶媒とを含有する。一部の態様では、工程（ｉｉ）の第２の液体媒体は、０〜１０体積％の水と、９０〜１００体積％の第１の水溶性有機溶媒とを含有する。第１の水溶性有機溶媒の高い濃度は、急速な沈殿を実現するのに有利であると考えられる。それにより、絡み合った構造を実現することができ、これは、所望の特性を有するゲル生成物を得るのに有利である可能性が高い。
【００２５】
ある特定の態様では、工程（ｉｉ）の第１の水溶性有機溶媒は、１種以上の低級アルキルアルコールである。一部の態様では、低級アルキルアルコールは、エタノールである。これらの有機溶媒は、急速な沈殿をもたらす。
【００２６】
工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）は、ヒアルロン酸基材を所望の形状に構成することをさらに含む。「成形された」および「所望の形状」という用語は、最終生成物において有用である意図的設計を意味し、すなわち、凍結乾燥したまたは沈殿したヒアルロナン粉末だけではない。ある特定の態様では、形状は、粒子、繊維、紐（string）、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択され、好ましくは、少なくとも１つの寸法が、少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは１ｍｍ超、より好ましくは５ｍｍ超の延伸を有する。一部の態様では、基材の形状は、少なくとも１つの寸法が、５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満の延伸を有する。これにより、架橋剤が、後続の架橋工程において、沈殿したヒアルロン酸生成物の多数の利用可能な結合部位にアクセスすることが容易になる。ある特定の態様では、基材の形状は、縦方向に延伸しており、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。縦方向に延伸した形状は、本方法を通じておよび得られる生成物において維持されることから、架橋生成物は、インビボでの移動／ずれを回避するまたは減少させるように設計され得るが、依然として容易に注射可能である。具体的な態様では、形状は、繊維であり、その長さとその平均直径との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。
【００２７】
ある特定の態様では、工程（ｉｉ）は、ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の第１の水溶性有機溶媒を含む第２の液体媒体中に押し出し、それにより、押し出されたヒアルロン酸基材に、第２の液体媒体中で、沈殿した繊維を形成させることを伴う。
【００２８】
一部の態様では、工程（ｉｉｉ）の第３の液体媒体は、０〜３５体積％の水と、６５〜１００体積％の第２の有機溶媒と、１種以上の多官能性架橋剤とを含有する。ある特定の態様では、工程（ｉｉｉ）の第２の有機溶媒は、１種以上の低級アルキルアルコールである。一部の態様では、低級アルキルアルコールは、エタノールである。
【００２９】
具体的な態様では、工程（ｉｉｉ）の第３の液体媒体は、１３以上のｐＨを有する。驚くべきことに、沈殿した成形された基材上で高ｐＨで架橋を実施することにより、効率的な架橋を有する成形されたゲル生成物が得られること、すなわち、ここで、低い修飾度により、低い膨潤度を有する堅固なゲルが得られることが分かった。
【００３０】
具体的な態様では、多官能性架橋剤は、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される。一部の態様では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される。ある特定の態様では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【００３１】
ある特定の態様では、１種以上の多官能性架橋剤は、単一の種類の架橋をもたらす。具体的な態様では、１種以上の多官能性架橋剤は、安定であるエーテル架橋をもたらす。本発明の方法は、有利なことに、安定であり、容易に滅菌、たとえばオートクレーブすることができる、一重架橋ヒアルロン酸ゲル生成物を提供する。
【００３２】
一部の態様では、本方法は、
（ｉｖ）沈殿した架橋ヒアルロン酸生成物を非沈殿条件に供する工程と、
（ｖ）非沈殿形態の架橋ヒアルロン酸生成物を単離する工程と
をさらに含んでいる。
【００３３】
ある特定の態様では、工程（ｖ）は、架橋ヒアルロン酸生成物を滅菌することをさらに含む。
【００３４】
別の側面によれば、本発明は、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個の修飾度およびヒアルロン酸１ｇあたり４〜３００ｍＬの膨潤度を有する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を提供する。この成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の膨潤度、または液体保持容量との独特な組合せを含む、非常に有用な特性を有する。それにより、天然ヒアルロン酸の生体適合性を維持しながら、所望の形状を有する堅固な架橋ヒアルロン酸生成物を提供することが可能である。本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、既定の形状または構造で設計される。
【００３５】
ある特定の態様では、膨潤度は、ヒアルロン酸１ｇあたり１５〜１８０ｍＬである。
【００３６】
修飾効率（ＭｏＥ）は、ゲルの最小ＨＡ濃度（Ｃmin）、または剛性／強度と、架橋剤によるその化学修飾度との比の尺度である。具体的な態様では、修飾効率は、１０以上である。一部の態様では、修飾効率は、２０〜１９０または２０〜１５０の範囲である。１０以上、たとえば、２０〜１９０または２０〜１５０の範囲の修飾効率を有する生成物は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の膨潤度、または液体保持容量とを初めて兼ね備える。それにより、生体適合性であり高い耐変形性を有する、所望の形状を有する堅固な架橋ヒアルロン酸生成物を提供することが可能である。
【００３７】
ある特定の態様では、結合した全架橋剤のうち２個（以上）の二糖に結合しているものの割合を表すクロスリンカー比は、３５％以上である。具体的な態様では、クロスリンカー比は、４０％以上であり、一部では、さらに５０％以上である。これらの成形された生成物は、その結果、生成物中に有効な架橋をもたらさない少数の架橋剤を有する。高いクロスリンカー比は、低から中程度の膨潤度に対する驚くほど低い総修飾度を可能にし、これは、生体適合性に有利であるが所望の形状を維持するのに十分である組合せである。
【００３８】
一部の態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される１種以上の多官能性架橋剤により架橋されている。ある特定の態様では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される。具体的な態様では、多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【００３９】
ある特定の態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、一重架橋である。一重架橋生成物は、化学的に明確に定義されているという利点を有する。単一の種類の架橋を有する成形された生成物が、そのような望ましい特性を示すことが有利である。一部の態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、多重架橋である。具体的な態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、エーテル架橋により架橋されている。本発明に従う成形されたエーテル架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、安定であり、容易に滅菌、たとえばオートクレーブすることができる。
【００４０】
ある特定の態様では、ヒアルロン酸生成物は、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択される形状を有する。一部の態様では、ヒアルロン酸生成物は、中空であるかまたはいくつかの層を有する。ある特定の態様では、形状は、縦方向に延伸しており、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。縦方向に延伸した架橋生成物は、インビボでの移動／ずれを回避するまたは減少させるように設計され得るが、依然として容易に注射可能である。具体的な態様では、ヒアルロン酸生成物は、繊維であり、その長さとその幅、たとえばその平均直径との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。
【００４１】
一部の態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、完全膨潤状態で存在する。完全膨潤状態で、生成物は、縦方向に延伸した形状を有し、その最も大きい横方向の延伸は、５ｍｍ未満、たとえば１．５ｍｍ未満、好ましくは０．２ｍｍ未満であることが好ましい。最も大きい横方向の延伸が５ｍｍ未満またはさらに低い、縦方向に延伸した架橋生成物は、容易に注射可能である。完全膨潤状態で、生成物は、縦方向に延伸した形状を有し、その縦方向の延伸は、２ｍｍ超、たとえば２５ｍｍ超、たとえば５００ｍｍ超であることがさらに好ましい。縦方向の延伸が２ｍｍ超以上である、縦方向に延伸した架橋生成物が有利であり、その理由は、インビボでの移動／ずれを回避するまたは減少させるからである。
【００４２】
他の態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、部分膨潤または非膨潤状態で存在する。
【００４３】
具体的な態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、オートクレーブ可能である。さらに具体的な態様では、成形されたヒアルロン酸生成物は、オートクレーブ済みである。
【００４４】
本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造する好ましい様式の１つは、本発明に従う方法によるものである。
【００４５】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物と、任意に緩衝剤とを含む、水性組成物を提供する。
【００４６】
ある特定の態様では、本発明に従う成形されたヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物は、内科的または外科的方法における医薬または医療デバイスとして有用である。
【００４７】
さらなる側面によれば、本発明は、美容または医療手術における、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物の使用を提供する。換言すれば、本発明は、美容または医療手術における使用のための、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物を提供する。
【００４８】
一部の態様では、使用は、皮膚充填および体形矯正から選択される美容手術におけるものである。一部の他の態様では、使用は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁処置、および整形外科用途の処置における医薬としての、ならびに／またはそれらから選択される医療手術におけるものである。
【００４９】
一側面によれば、本発明は、薬物送達における、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物の使用を提供する。言い換えれば、本発明は、薬物送達における使用のための、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物を提供する。
【００５０】
さらに別の側面によれば、本発明は、滅菌済みの本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または滅菌済みの本発明に従う水性組成物を事前に充填した、事前充填シリンジを提供する。
【００５１】
一側面によれば、本発明は、美容または医療手術を受けている対象を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物または本発明に従う水性組成物を投与することを伴う、方法を提供する。
【００５２】
ある特定の態様では、対象は、皮膚充填および体形矯正から選択される美容手術を受けている。ある特定の他の態様では、対象は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁処置、および整形外科用途から選択される状態のための医療手術または医療処置を受けている。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、完全に膨潤した架橋ＨＡネットを示す。
【図２】図２は、２つの酵素分解されたＨＡゲル製剤の４００ＭＨｚ  1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、架橋ＨＡゲル繊維の顕微鏡画像を示す。
【図４】図４は、１４日間にわたる６０℃での保存中の膨潤度（ＳｗＤ）、ｇ／ｇの変化を示すグラフである。
【図５】図５は、架橋ＨＡ粉末（比較例）および本発明に従う生成物の顕微鏡画像を示す。
【図６】図６は、架橋ＨＡゲル繊維の顕微鏡画像を示す。
【図７】図７は、メッシュスクリーンに一度通過させた架橋ＨＡゲル（比較例）の顕微鏡画像を示す。
【発明の詳細な説明】
【００５４】
一側面によれば、本発明は、製造方法を提供する。本方法は、ヒアルロン酸基材から成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するためのものである。
【００５５】
別段の規定がない限り、「ヒアルロン酸」という用語は、様々な鎖長および電荷状態の、ならびに様々な化学修飾を有する、ヒアルロン酸またはヒアルロナンのすべてのバリアントおよびバリアントの組合せを包含する。つまり、この用語はまた、ヒアルロン酸の様々なヒアルロン酸塩、たとえば、ヒアルロン酸ナトリウムを包含する。ヒアルロン酸の様々な修飾もまた、この用語に包含され、たとえば、酸化、たとえば、ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＨへの酸化；ビシナルヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化、任意に、それに続く還元またはイミン形成等；還元、たとえば、ＣＯＯＨのＣＨ2ＯＨへの還元；硫酸化；脱アミド化、任意に、それに続く新たな酸による脱アミノ化またはアミド形成；エステル化；様々な化合物による置換、たとえば、架橋剤またはカルボジイミドを使用するものであり；異なる分子、たとえば、タンパク質、ペプチド、および活性薬物成分のヒアルロン酸とのカップリング；ならびに脱アセチル化を含む。様々な形態のヒアルロン酸が、化学修飾および分析中に考慮しなければならない異なる化学特性を有することは、当業者に周知である。たとえば、ある特定のｐＨを有するヒアルロン酸溶液を得ることが望まれる場合、溶解される材料の酸性度、溶解する液体の酸性度、およびあれば緩衝能はすべて、溶液の得られるｐＨに影響する。
【００５６】
ヒアルロン酸基材は、化学修飾されていない、すなわち、本発明の製造方法の前に架橋または他の修飾に供されていない、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩であることが好ましい。
【００５７】
ヒアルロン酸は、動物および非動物起源の様々な供給源から得ることができる。非動物起源の供給源には、酵母および好ましくは細菌が含まれる。単一のヒアルロン酸分子の分子量は、典型的には、１．５〜３ＭＤａの範囲であるが、他の分子量範囲、たとえば０．５〜１０ＭＤａも可能である。
【００５８】
本方法によって製造される生成物は、成形された架橋ヒアルロン酸である。本方法は、ヒアルロン酸鎖が望ましい形状に構成された際にヒアルロン酸鎖間の架橋をもたらし、これにより、共有結合的架橋、ヒアルロン酸鎖の物理的絡み合い、ならびに様々な相互作用、たとえば、水素結合、ファンデルワールス力、および静電相互作用によって結び付いている、ヒアルロン酸分子の連続的な成形された網目構造が作り出される。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、ゲル、またはヒドロゲルである。つまり、これは、液体、典型的には水性液体にさらした際に、水不溶性であるが実質的に希薄な、ヒアルロン酸分子の架橋系とみなすことができる。
【００５９】
得られる成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、好ましくは、生体適合性である。これは、処置された個体において、免疫応答が生じないまたは非常に軽度の免疫応答しか生じないことを示唆する。例において、ヒアルロン酸生成物の生体適合性を決定する方法、および本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物の生体適合性をラットにおいて試験した結果が提供される。
【００６０】
本発明に従う方法は、少なくとも３つの工程：準備工程、沈殿工程、および架橋工程を含んでいる。ある特定の態様では、本方法は、これらの３つの工程からなっている。
【００６１】
第１の方法工程において、ヒアルロン酸基材が用意される。上記のように、「ヒアルロン酸基材」という用語は、様々な鎖長および電荷状態の、ならびに様々な化学修飾を有する、ヒアルロン酸またはヒアルロナンのすべてのバリアントおよびバリアントの組合せを包含する。ヒアルロン酸基材は、化学的に修飾されていないヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウムであり、０．５〜１０ＭＤａ、好ましくは０．８〜５ＭＤａ、より好ましくは１．５〜３ＭＤａまたは２〜３ＭＤａの範囲の平均分子量を有することが好ましい。ヒアルロン酸は、非動物起源、好ましくは細菌から得られることが好ましい。
【００６２】
ヒアルロン酸基材を、水溶液である第１の液体媒体に溶解する。「溶解した」および「溶液」という用語は、ヒアルロン酸基材が、液体との均質な混合物として存在し、その混合物中で、エネルギー的に有利な相互作用が生じると理解される。溶液に液体を添加すると、溶解したヒアルロン酸基材の濃度が低下する。溶液は、水性である、すなわち、水を含有する。水溶液は、水に溶解したヒアルロン酸基材のみからなっていてもよい。水溶液は、４０〜１００体積％の水と、０〜６０体積％の低級アルキルアルコールとを含有することが好ましい。「低級アルキルアルコール」という用語には、１から６個の炭素原子を有する、第一級、第二級、および第三級アルキルアルコール、すなわち、Ｃ1〜6アルキルアルコールが含まれる。低級アルキルアルコールの具体的な例には、メタノール、エタノール、変性スピリット、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびｔ−ブタノールが含まれる。好ましい低級アルキルアルコールは、価格、入手可能性、および容易な取り扱いに起因して、メタノールおよびエタノール、特にエタノールである。低級アルキルアルコール濃度は、好ましくは、０〜４０％、たとえば、０〜２０％、１０〜３０％、または２０〜４０％エタノールの範囲であり、水成分をそれに応じて調整する。この水溶液のｐＨは、好適には６以上、たとえば９以上である。
【００６３】
任意に、第１の方法工程は、ヒアルロン酸基材を所望の形状、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズに構成することをさらに伴い、これは、任意に、中空であるかまたは異なる層の材料を含有する。これは、様々な様式、たとえば、成型および押出で達成してよい。ヒアルロン酸基材の押出は、典型的には、ヒアルロン酸基材溶液を、所望のサイズの開口部を通してプレスすることを伴う。押し出されたヒアルロン酸基材は、沈殿した、繊維、紐、または撚糸を自発的に形成する。繊維、紐、または撚糸の寸法、たとえば太さは、開口部の寸法もしくは種類、たとえば、０．１〜２ｍｍもしくは１４〜３０Ｇの範囲の様々な開口部直径を使用、押出圧力、押出速度、および／またはヒアルロン酸濃度を変動させることによって制御することができる。他の種類のオリフィスおよび隙間を使用することによって、異なる形状または構造を生成することができる。たとえば、ヒアルロン酸は、フィルム、ネット、ディスク、またはビーズとして沈殿させることができる。
【００６４】
好ましい態様では、ヒアルロン酸基材溶液は、疎水性表面上で所望の形状に構成され、後続の成形されたヒアルロン酸基材の沈殿は、前記疎水性表面上で行われる。これは、形状構造の溜まりを回避し、後続の架橋工程によって固定化されるまで所望の形状を維持するために有利である。好適な疎水性表面は当業者に周知であり、たとえば、フルオロカーボン、ポリプロピレン（ＰＰ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が含まれる。
【００６５】
この形状は、製造方法を通じておよび最終生成物において維持することができる。形状は、ヒアルロン酸基材が沈殿形態である場合、少なくとも１つの寸法が、５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、たとえば、０．５ｍｍ未満またはさらに０．２ｍｍ未満の延伸を有することが好ましい。これにより、架橋剤が、後続の架橋工程において、沈殿したヒアルロン酸生成物の多数の利用可能な結合部位にアクセスすることが容易になる。形状は、縦方向に延伸しており、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下であることも好ましい。縦方向に延伸した形状は、本方法を通じておよび得られる生成物において維持されることから、架橋生成物は、インビボでの移動／ずれを回避するまたは減少させるように設計され得るが、依然として容易に注射可能である。そのような形状の好適な例は、繊維であり、その長さとその幅との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。好ましい組成物は、本発明に従う架橋された撚糸／繊維状のヒアルロン酸生成物を含んでおり、ここで、生成物の５０％超は、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。
【００６６】
例として、２０ｍＬシリンジを満たす単一の撚糸または繊維形状を有する本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、膨潤状態で、１ｍｍの太さおよび２５ｍの長さを有していてもよく、すなわち、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、２５０００：１であってもよい。好ましい組成物の例は、本発明に従う架橋された撚糸／繊維状のヒアルロン酸生成物を含んでおり、ここで、生成物の５０％超は、縦方向の延伸が２ｍｍ超であり、最も大きい横方向の延伸が０．２ｍｍ未満であり、すなわち、比が１０：１以上である。
【００６７】
第１の方法工程は、架橋を伴わずに実行され、これは、この工程において架橋剤を除外することおよび／または架橋に好適でない条件を提供することによって実現してもよい。好ましい形状に達するまで架橋が生じないことを確実にすることが重要である。これは、最終生成物の所望の形状を得、維持するのに有利であり、その理由は、基材の成形が既存の架橋によって限定されず、第３の工程において生成されるすべての架橋が、生成物の所望の形状を維持することに向けられるからである。第１の工程は、架橋剤の非存在下で行われることが好ましい。これは、架橋が溶解相および／または方法工程間で生じないことの良好な制御をもたらす。これはまた、架橋剤の量が厳しく制御され、得られる生成物の品質が均質であることを確実にし、その理由は、以前の工程において、架橋剤が反応または消失しないからである。架橋、特に、この工程における架橋剤の添加を回避することは、工業規模にスケールアップし、均質な品質を有する生成物を提供するのに好適である製造方法を得るために有用である。
【００６８】
第２の方法工程において、ヒアルロン酸基材は、ヒアルロン酸基材の可溶性の低減に起因して沈殿する。これは、ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸基材が不溶である第２の液体媒体に供することによって実現される。第２の液体媒体は、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第１の水溶性有機溶媒を含む。得られる固体沈殿物は、溶質相から析出し、典型的には、濾過、デカンテーション、遠心分離によって、または手動でピンセットなどを使用して、残液から分離することができる。好ましい一態様では、沈殿したヒアルロン酸基材もまた、媒体から取り出され、乾燥される。沈殿物はまた、第２の液体媒体中に懸濁させて維持することもできる。したがって、別の好ましい態様では、沈殿したヒアルロン酸基材は、乾燥に供されない。たとえば、ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸基材が不溶である第２の液体媒体中に押し出すまたは浸漬することによって、ヒアルロン酸基材の沈殿を急速に実現することが有利である。
【００６９】
本発明に従って使用される有機溶媒は、炭素含有溶媒であり、多様な極性度を示してよい。「溶媒」と呼ばれるが、これらの有機溶媒は、製造方法中に、ヒアルロン酸の可溶性を均衡およびシフトさせるのに利用されると理解されたい。ヒアルロン酸は、ある特定の有機溶媒濃度間隔では、有機溶媒に非常に良く溶解し得るが、有機溶媒濃度が増加すると、析出し、沈殿物を形成する。たとえば、ヒアルロン酸は、有機溶媒、たとえば低級アルキルアルコールおよび水の５０／５０（体積／体積）混合物には溶解することができるが、９０／１０（体積／体積）混合物中では析出し、沈殿物を形成する。非沈殿条件、たとえば、５０／５０または０／１００混合物に供すると、ヒアルロン酸は、沈殿していない溶解状態に戻る。他の因子、たとえば、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒の種類が、ヒアルロン酸の沈殿のための限界有機溶媒濃度に影響を及ぼし得ることは、当業者に熟知されている。所与の条件下でのヒアルロン酸の沈殿のための限界濃度は、当業者に周知であるかまたは当業者が容易に決定することができる。例として、ヒアルロン酸の沈殿のための限界濃度（水およびエタノールの混合物中）は、およそ７０％エタノールである。
【００７０】
これらに限定されないが、本発明に従う有機溶媒は、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、酢酸エチル、アセトアミド、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルエチルケトン、アセトン、低級アルキルアルコール、たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールからなる群から選択することができる。本発明に従う有機溶媒は、水溶性であることが好ましい。有機溶媒の好ましい群は、低級アルキルアルコールである。低級アルキルアルコールという用語には、１から６個の炭素原子を有する、第一級、第二級、および第三級アルキルアルコール、すなわち、Ｃ1〜6アルキルアルコールが含まれる。低級アルキルアルコールの具体的な例には、メタノール、エタノール、変性スピリット、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびｔ−ブタノールが含まれる。好ましい低級アルキルアルコールは、価格、入手可能性、および容易な取り扱いに起因して、メタノールおよびエタノール、特にエタノールである。
【００７１】
第２の方法工程の第２の液体媒体は、水性媒体である、すなわち、水をある程度含有することが好適である。第２の液体媒体は、０〜３０体積％の水と、７０〜１００体積％の第１の水溶性有機溶媒とを、好ましくは、０〜１０体積％の水と、９０〜１００体積％の第１の水溶性有機溶媒とを含有することが好ましい。ある特定の態様では、第１の水溶性有機溶媒の濃度は、９５％、たとえば、９９％またはさらに９９．５％と高くてもよく、たとえば、９９％メタノールまたはエタノールである。第１の水溶性有機溶媒の高い濃度は、急速な沈殿を実現するのに有利であると考えられる。それにより、絡み合った構造を実現することができ、これは、所望の特性を有するゲル生成物を得るのに有利である可能性が高い。
【００７２】
第２の方法工程は、架橋を伴わずに実行され、これは、この工程において架橋剤を除外することおよび／または架橋に好適でない条件を提供することによって実現してもよい。好ましい形状に達するまで架橋が生じないことを確実にすることが重要である。これは、最終生成物の所望の形状を得、維持するのに有利であり、その理由は、基材の成形が既存の架橋によって限定されず、第３の工程において生成されるすべての架橋が、生成物の所望の形状を維持することに向けられるからである。第２の工程は、架橋剤の非存在下で行われることが好ましい。これは、架橋が溶解相および／または方法工程間で生じないことの良好な制御をもたらす。これはまた、架橋剤の量が厳しく制御され、得られる生成物の品質が均質であることを確実にし、その理由は、以前の工程において、架橋剤が反応または消失しないからである。架橋、特に、この工程における架橋剤の添加を回避することは、工業規模にスケールアップし、均質な品質を有する生成物を提供するのに好適である製造方法を得るために有用である。
【００７３】
任意に、第２の方法工程は、ヒアルロン酸基材を所望の形状、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズに構成することをさらに伴い、これは、任意に、中空であるかまたは異なる層の材料を含有する。これは、様々な様式、たとえば、成型および押出で達成してよい。この形状は、製造方法を通じておよび最終生成物において維持することができる。沈殿した基材の形状は、ヒアルロン酸基材が沈殿形態である場合、少なくとも１つの寸法が、５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、たとえば、０．５ｍｍ未満またはさらに０．２ｍｍ未満の延伸を有することが好ましい。これにより、架橋剤が、後続の架橋工程において、沈殿したヒアルロン酸生成物の多数の利用可能な結合部位にアクセスすることが容易になる。沈殿した基材の形状は、縦方向に延伸しており、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下であることも好ましい。縦方向に延伸した形状は、本方法を通じておよび得られる生成物において維持されることから、架橋生成物は、インビボでの移動／ずれを回避するまたは減少させるように設計され得るが、依然として容易に注射可能である。そのような形状の好適な例は、繊維であり、その長さとその幅との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である。例として、２０ｍＬシリンジを満たす単一の撚糸または繊維形状を有する本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、膨潤状態で、１ｍｍの太さおよび２５ｍの長さを有していてもよく、すなわち、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、２５０００：１であってもよい。
【００７４】
第２の方法工程は、ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の第１の水溶性有機溶媒を含んでいる第２の液体媒体中に押し出すことを伴っていてもよい。これは、典型的には、ヒアルロン酸基材溶液を、所望のサイズの開口部を通して、第２の液体媒体中にプレスすることを伴っている。押し出されたヒアルロン酸基材は、第２の液体媒体中で、沈殿した、繊維、紐、または撚糸を自発的に形成する。繊維、紐、または撚糸の寸法、たとえば太さは、開口部の寸法もしくは種類、たとえば、０．１〜２ｍｍもしくは１４〜３０Ｇの範囲の様々な開口部直径を使用、押出圧力、押出速度、および／またはヒアルロン酸濃度を変動させることによって制御することができる。他の種類のオリフィスおよび隙間を使用することによって、異なる形状または構造を生成することができる。たとえば、ヒアルロン酸は、フィルム、ネット、ディスク、またはビーズとして沈殿させることができる。繊維、紐、または撚糸が形成される場合、その長さとその平均直径との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下であることが好ましい。繊維／紐／撚糸形状の利点は、繊維／紐／撚糸それ自体が、肉眼的レベルで絡み合って、たとえばインプラントの完全性を維持するために有利であり得るコイルまたはボール効果を引き起こすことができることである。
【００７５】
第３の方法工程において、沈殿したヒアルロン酸基材は、第３の液体媒体中で、初めて架橋に供される。「架橋」という用語は、（少なくとも）２つの異なるヒアルロン酸鎖または単一のヒアルロン酸鎖の（少なくとも）２つの別個の部位の間の安定な共有結合的連結（架橋）の導入を指し、これにより、ヒアルロン酸分子の連続的な網目構造が作り出される。架橋は、単に、ヒアルロン酸鎖中の２個の原子間の共有結合、たとえば、２個のヒドロキシル基間のエーテル結合、またはヒドロキシル基とカルボキシル基との間のエステル結合であってもよい。架橋はまた、異なるヒアルロン酸鎖の２個以上の原子または単一のヒアルロン酸鎖の別個の部位に共有結合しているリンカー分子であってもよい。架橋はある特定の条件下で自発的に生じ得るが、架橋は、典型的には、プロセスを容易化および加速する１種以上の架橋剤の使用を伴う。架橋が達成される際、架橋剤は、ヒアルロン酸に完全にまたは部分的に連結されている場合もあり、または分解されている場合もある。非結合の架橋剤の残存する残留物があれば、架橋後に除去することができる。
【００７６】
好ましい形状に達するまで架橋が生じないことを確実にすることが重要である。これは、最終生成物の所望の形状を得、維持するのに有利であり、その理由は、基材の成形が既存の架橋によって限定されず、第３の工程において生成されるすべての架橋が、生成物の所望の形状を維持することに向けられるからである。最初の２つの工程は、架橋剤の非存在下で行われ、架橋剤は、第３の架橋工程において添加されることが好ましい。これは、架橋の良好な制御をもたらし、その理由は、架橋が固体（沈殿）相のみで生じ、溶解相および／または方法工程間では生じないからである。これはまた、架橋剤の量が厳しく制御され、得られる生成物の品質が均質であることを確実にし、その理由は、以前の工程において、たとえば沈殿工程中に、架橋が反応または消失しないからである。全体として、架橋、特に、架橋剤の添加を最終工程に集中させることは、工業規模にスケールアップし、均質な品質を有する生成物を提供するのに好適である製造方法を得るために有用である。
【００７７】
第３の液体媒体は、多官能性である１種以上の架橋剤を含有する、すなわち、架橋剤は、架橋されるヒアルロン酸分子との共有結合を形成するための２つ以上の反応部位を有する。この第３の工程において使用される架橋剤は、二官能性である、すなわち、架橋されるヒアルロン酸分子との共有結合を形成するための２つの反応部位を有することが好ましい。これらに限定されないが、有用な多官能性架橋剤には、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシド、たとえば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンが含まれ、好ましくはＢＤＤＥである。１種以上の多官能性架橋剤は、エーテル架橋をもたらすことが望ましい。本発明の方法は、有利なことに、安定であり、容易に滅菌、たとえばオートクレーブすることができる、エーテル架橋ヒアルロン酸ゲル生成物を提供する。エステル架橋はより不安定であり、より容易に加水分解される。
【００７８】
第３の方法工程の架橋は、成形されたヒアルロン酸基材が沈殿するように、沈殿条件下で実施される。特に、ヒアルロン酸分子の利用可能な表面は、沈殿条件に起因して、沈殿形態である。第３の液体媒体は、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第２の有機溶媒を含有し、その量および／または有機溶媒は、第２の方法工程の第２の液体媒体中で、成形されたヒアルロン酸基材を沈殿させるために使用されたものと同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【００７９】
上記に詳述したように、有機溶媒は、製造方法中に、ヒアルロン酸の可溶性を均衡およびシフトさせるために利用されると理解されたい。他の因子、たとえば、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒の種類が、ヒアルロン酸の沈殿のための限界有機溶媒濃度に影響を及ぼし得ることは、当業者に熟知されている。所与の条件下でのヒアルロン酸の沈殿のための限界濃度は、当業者に周知であるかまたは当業者が容易に決定することができる。
【００８０】
この方法を使用すると、第３の方法工程における単一の架橋反応により、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を得ることも可能である。単一反応工程における架橋剤の選択および数に応じて、得られる成形された生成物は、一重架橋である、すなわち、単一の種類の架橋、好ましくは安定なエーテル架橋を本質的に含有する場合もあり、または多重架橋である、すなわち、好ましくは安定なエーテル架橋を含む少なくとも２つの異なる種類の架橋を含有する場合もある。単一の架橋反応を伴う方法により、そのような望ましい特性を有する成形された生成物を実現できることは驚くべきことである。
【００８１】
これらに限定されないが、本発明に従う有機溶媒は、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、酢酸エチル、アセトアミド、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルエチルケトン、アセトン、低級アルキルアルコール、たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールからなる群から選択することができる。本発明に従う有機溶媒は、水溶性であることが好ましい。有機溶媒の好ましい群は、低級アルキルアルコールである。低級アルキルアルコールという用語には、１から６個の炭素原子を有する、第一級、第二級、および第三級アルキルアルコール、すなわち、Ｃ1〜6アルキルアルコールが含まれる。低級アルキルアルコールの具体的な例には、メタノール、エタノール、変性スピリット、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびｔ−ブタノールが含まれる。好ましい低級アルキルアルコールは、価格、入手可能性、および容易な取り扱いに起因して、メタノールおよびエタノール、特にエタノールである。
【００８２】
第３の方法工程の第３の液体媒体は、水性媒体である、すなわち、水をある程度含有することが好適である。第３の液体媒体は、架橋剤に加えて、０〜３５体積％の水と、６５〜１００体積％の第２の水溶性有機溶媒とを、好ましくは、２０〜３５体積％の水と、６５〜８０体積％の第２の水溶性有機溶媒とを含有することが好ましい。
【００８３】
第３の液体媒体は、１１．５以上のｐＨを有する、すなわち、架橋は、１１．５以上のｐＨで実施される。当業者に熟知されているように、第３の液体媒体中の所望のｐＨを得るために、ヒアルロン酸出発材料の酸性度を考慮しなければならない。これは、酸、塩基、または好適な緩衝能を有する緩衝液系の添加によって達成してもよい。好ましいｐＨ調節剤は、強塩基、たとえば、水酸化ナトリウムである。沈殿したヒアルロン酸分子を架橋する場合、塩基性ｐＨが有利であることが見出された。第３の工程の第３の液体媒体は、１３以上のｐＨを有することが好ましい。水と有機溶媒の両方を含有する液体媒体において、測定されたｐＨは、溶媒の種類およびそれぞれの溶媒の量に起因して、理論上のｐＨと異なり得る。したがって、所与の条件下で標準的なｐＨ測定装置を使用して測定されるｐＨを指示するために、見かけのｐＨ（ｐＨapp）という用語が導入される。正確なｐＨ値は、たとえば滴定によって、容易に決定することができる。
【００８４】
第３の方法工程における架橋は、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物を生成する。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、ゲル、またはヒドロゲルである。つまり、これは、液体、典型的には水性液体にさらした際に、水不溶性であるが実質的に希薄な、ヒアルロン酸分子の架橋系とみなすことができる。第３の方法工程の架橋は、沈殿条件下で実施されることから、成形されたヒアルロン酸基材と成形された架橋生成物の両方が沈殿する。特に、成形されたヒアルロン酸基材と成形された架橋生成物の両方の利用可能な表面は、この第３の方法工程の沈殿条件に起因して、沈殿形態である。架橋反応は、好適な条件下で、所望の量の架橋剤が成形されたヒアルロン酸基材と反応するまで進行させる。ヒアルロン酸に結合した架橋剤の量は、修飾度（ＭｏＤ）、すなわち、繰り返しＨＡ二糖単位の総数に対する結合した架橋剤のモル量として定量し、報告することができる。架橋反応は、架橋ヒアルロン酸生成物の修飾度（ＭｏＤ）が二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個（０．１〜４％）、好ましくは、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜１０個（０．１〜１％）の範囲になるまで進行させることが好ましい。所要の反応時間は、いくつかの因子、たとえば、ヒアルロン酸濃度、架橋剤濃度、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒の種類に左右される。これらの因子はすべて、当業者に周知であり、当業者は、これらの因子および他の関連する因子を容易に調整し、それにより、０．１〜４％の範囲の修飾度を得るための好適な条件を提供し、修飾度に対する得られる生成物特徴を検証することができる。第３の工程の架橋は、少なくとも２時間、好ましくは、室温で少なくとも２４時間行われる。
【００８５】
残留する非結合の架橋剤があれば、成形された沈殿生成物を架橋媒体から分離する際に除去することができる。成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、好適な洗浄液、たとえば、水、メタノール、エタノール、生理食塩水、またはそれらの混合物および／もしくは組合せによるさらなる洗浄工程によって、さらに精製することができる。
【００８６】
したがって、本発明に従う製造方法は、架橋ヒアルロン酸生成物の既定の物理的形態または構造、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、またはビーズの生成を可能にする。縦方向に延伸している、または棒状であり、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である構造は、医療用または美容用インプラントとして特に有用であり、その理由は、十分な長さを有することによって、移動を回避するように寸法決定することができ、同時に、限定された幅に起因して、針を通した注射によって容易に投与することができるからである。例として、２０ｍＬシリンジを満たす単一の撚糸または繊維形状を有する本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、膨潤状態で、１ｍｍの太さおよび２５ｍの長さを有していてもよく、すなわち、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、２５０００：１であってもよい。
【００８７】
既定の構造は、任意に、中空であるかまたは複数の層からなっていてもよい。中空の既定の構造中に作り出された空間には、任意に、ＨＡが充填され、これは、修飾、たとえば、架橋または他の化合物によって置換されていてもよい。既定の層構造中の複数の層の１つ以上は、架橋または非架橋のＨＡからなっていてもよく、これは、他の化合物による置換によって化学修飾されていてもよい。これは、第１の方法工程において、たとえば、押出もしくは成型によって、または第２の方法工程において、たとえば、溶解したヒアルロン酸基材を沈殿媒体、たとえばエタノール中に押し出すことによって、ヒアルロン酸基材を所望の形状に構成することによって達成してもよい。得られた形状は、製造方法を通じておよび最終生成物において維持することができる。
【００８８】
任意に、製造方法は、成形された沈殿した架橋ヒアルロン酸生成物を非沈殿条件に供する第４の工程をさらに伴う。つまり、本方法は、ある特定の態様では、４つの工程を含んでいる、あるいは４つの工程からなっている。これは、典型的には、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を液体媒体にさらし、非沈殿状態に戻らせることを伴う。液体媒体は、典型的には、水、生理食塩水、またはそれらの混合物および／もしくは組合せであり、任意に、非沈殿濃度の有機溶媒、たとえば、メタノールまたはエタノールを含む。架橋に起因して、得られる成形されたヒアルロン酸生成物は、相互接合され絡み合ったヒアルロン酸鎖の連続的な網目構造であり、これは、非沈殿条件下で、液体を吸収（膨潤）し、ゲルを形成する。膨潤は、ゲルが完全に膨潤し、さらなる液体を吸収できなくなるまで進行させることもでき、またはより初期の段階で中断して、部分的に膨潤したゲルを得ることもできる。部分的に膨潤したゲルは、ゲルのさらなる加工のための中間体として有用であり得、たとえば、所望のサイズおよび形状のゲル構造のさらなる機械的生成を実施することができる。例として、フィルムを切断して粒子、薄片、または小片とすることができる、ゲル繊維を切断してより短い断片とすることができる、フィルムから明確に定義された不規則な形状を設計することができる、等である。架橋ＨＡの、繊維、紐、または撚糸はまた、架橋完了後、乾燥の前または後に、織り合わせてネットまたはフィルムを形成することもできる。部分的に膨潤した成形されたゲル生成物を所望の部位でその埋入中に使用して、投与を容易化し、患者の不快感を最小化し、残存膨潤容量を使用することによって挙上能（lifting capacity）を高めることも好都合であり得る。
【００８９】
成形されたゲル生成物を過剰の液体中で非沈殿条件に供すると、その最大膨潤度、または逆にその最小ヒアルロン酸濃度（Ｃmin）、すなわち、ゲル生成物が完全に膨潤する際のヒアルロン酸濃度を決定することも可能である。本発明に従う製造方法を使用すると、ヒアルロン酸１ｇあたり４〜３００ｍＬ、好ましくは、ヒアルロン酸１ｇあたり１５〜１８０ｍＬの膨潤度を得ることが可能である。これは、０．３〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．６〜７％（ｗ／ｖ）の範囲のＣmin値を示唆し、３〜２５０ｍｇ／ｇ、好ましくは６〜７０ｍｇ／ｇに相当する。所望の膨潤度（またはＣmin値）を、最小限の修飾度で実現できることが非常に有利であるが、膨潤度を調節する従来の様式は、修飾度を変動させることによるものである。したがって、本発明の製造方法は、成形されたゲル生成物の膨潤容量を調節するための新たな概念を提供し、これは、驚くべきことに、ゲルの低い修飾度に対する比類なく高いＣmin値（低い膨潤度）を有する堅固な成形されたゲルの生成を可能にする。
【００９０】
修飾効率（ＭｏＥ）は、ゲルの最小ＨＡ濃度（Ｃmin）、または剛性／強度と、架橋剤によるその化学修飾度との比の尺度である。本発明に従う製造方法を使用すると、１０以上、好ましくは１０〜２００、たとえば、２０〜１５０または２０〜１９０の範囲の修飾効率を有する架橋ヒアルロン酸生成物を得ることが可能である。何れかの具体的な理論に限定されることは望まないが、ゲルの有益な特性は、驚くほど高い程度の有効な架橋、すなわち、高い程度の結合した架橋剤（クロスリンカー比、典型的には、０．３５または３５％以上、たとえば、４０％以上またはさらに５０％以上）が、実際に、ヒアルロン酸に２つ（以上）の部位で結合していることと、所望の目的のための架橋の有効な位置決定、および恐らくは、極めて高い程度の絡み合いの保持とを組み合わせた結果であると企図される。得られるヒアルロン酸生成物の低い修飾度から当業者が予測するものとは対照的に、本発明に従う方法は、驚くべきことに、高い剛性／強度を有するゲルを提供する。いかなる状況下でも、本発明に従う方法は、修飾度に対する膨潤度をさらに調節する有用な様式を提供する。本方法はまた、連続作業に非常に好適であり、これは、大規模生産に有利である。
【００９１】
任意に、製造方法はまた、架橋ヒアルロン酸生成物を単離する最終工程を伴う。つまり、本方法は、ある特定の態様では、４つまたは５つの工程を含んでいる、あるいは４つまたは５つの工程からなっている。生成物が沈殿条件下に保たれるかまたは非沈殿条件に供されたかに応じて、この工程は、沈殿形態または非沈殿形態の生成物を単離することを伴い得る。次いで、単離された沈殿または非沈殿生成物は、滅菌した架橋ヒアルロン酸生成物を得るために、滅菌に供することができる。
【００９２】
所望の場合、他の物質、たとえば、局所麻酔薬（たとえば、塩酸リドカイン）、抗炎症薬、抗生物質、および他の好適な補助的薬剤、たとえば、骨成長因子または細胞を、架橋ヒアルロン酸生成物が得られた後に添加してもよい。
【００９３】
一側面によれば、本発明は、成形された架橋ヒアルロン酸生成物を提供する。一態様によれば、生成物は、本発明の製造方法によって製造されるまたは製造することができる。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、ゲル、またはヒドロゲルである。つまり、これは、液体、典型的には水性液体にさらした際に、水不溶性であるが実質的に希薄な、ヒアルロン酸分子の架橋系とみなすことができる。ゲルは、重量で大部分が液体であり、たとえば、９０〜９９．９％の水を含有することができるが、液体中の３次元の架橋ヒアルロン酸網目構造に起因して、固体のように挙動する。その相当な液体含量に起因して、成形されたゲルは、構造的に柔軟であり、天然の組織と類似しており、これにより、組織工学における足場としておよび組織増大のために非常に有用となる。ヒアルロン酸鎖の天然の絡み合いとともに、ゲルにその構造および特性を付与するのは、ヒアルロン酸分子における架橋およびその付着位置であり、これらは、その膨潤度に緊密に関連する。
【００９４】
付着した架橋剤の量は、修飾度（ＭｏＤ）、すなわち、繰り返しＨＡ二糖単位の総数に対する結合した架橋剤のモル量として定量し、報告することができる。本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個（０．１〜４％）、好ましくは、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜１０個（０．１〜１％）の修飾度を有することが好ましい。架橋反応の有効性は、１つ（以上）のヒアルロン酸鎖に（少なくとも）２つの端部で接合されている、付着した架橋剤の量によって示され、クロスリンカー比（ＣｒＲ）として報告される。本発明に従う生成物は、３５％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、たとえば、３５〜８０％、４０〜８０％、および５０〜８０％の範囲のクロスリンカー比を有することが好ましい。その結果、これらの生成物は、生成物中に有効な架橋をもたらさない少数の架橋剤を有する。高いクロスリンカー比は、ゲル強度に対する驚くほど低い総修飾度を可能にし、これは、高い生体適合性を確保するのに有利である。
【００９５】
ゲルの別の特徴は、完全に膨潤するまで水を吸収するその容量である。液体のさらなる添加は、ゲルをさらに希釈せず、すなわち、ゲルは、遊離分子の溶液のように無限に希釈することができない。ゲルを非沈殿条件に供すると、その膨潤度、または逆にその最小濃度（Ｃmin）、すなわち、ゲル生成物が完全に膨潤する際のヒアルロン酸濃度を決定することも可能である。より硬質（低膨潤）のゲルは、一般的に、より軟質（高膨潤）のゲルよりも、粘性が低く、弾性が高く、長いインビボ半減期を有すると予測される。しかしながら、より硬質のゲルは、高度に化学修飾されている場合、身体によって異物として認識され得る。本発明に従う生成物は、ヒアルロン酸１ｇあたり４〜３００ｍＬ、好ましくは、ヒアルロン酸１ｇあたり１５〜１８０ｍＬの膨潤度を有することが好ましい。これは、０．３〜２５％（ｗ／ｗ）、すなわち３〜２５０ｍｇ／ｇ、たとえば、０．６〜７％（ｗ／ｗ）、すなわち６〜７０ｍｇ／ｇの範囲のＣmin値を示唆する。Ｃmin値は、０．６〜５％（ｗ／ｖ）、すなわち、６〜５０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００９６】
本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、多官能性である１種以上の架橋剤により架橋されている、すなわち、架橋剤は、架橋されるヒアルロン酸分子との共有結合を形成するための２つ以上の反応部位を有することが好ましい。架橋剤は、二官能性である、すなわち、架橋されるヒアルロン酸分子との共有結合を形成するための２つの反応部位を有することが好ましい。これらに限定されないが、有用な多官能性架橋剤には、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシド、たとえば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンが含まれ、好ましくはＢＤＤＥである。ヒアルロン酸ゲル生成物は、安定であるエーテル架橋により架橋されていることが望ましい。
【００９７】
成形されたヒアルロン酸ゲル生成物は、多重架橋である、すなわち、好ましくはエーテル結合を含む少なくとも２つの異なる種類の結合を含有することもできる。ヒアルロン酸生成物は、一重架橋である、すなわち、単一の種類の架橋、好ましくはエーテル架橋を本質的に含有することが好ましい。一重架橋生成物は、化学的に明確に定義されているという利点を有する。単一の種類の架橋を有する生成物が、そのような望ましい特性を示すことが有利である。具体的な態様では、ヒアルロン酸生成物は、エーテル架橋により架橋されており、これにより、安定でオートクレーブ可能な生成物が得られる。
【００９８】
成形された生成物の所望の膨潤度（またはＣmin値）が、最小限の修飾度で得られることが非常に有利であるが、膨潤度を調節する従来の様式は、修飾度を変動させることによるものである。修飾度を最小化する主要な理由は、ゲルの生体適合性が高いことを確実にすることであるが、当業者は他の利点を熟知している。成形された生成物は、ゲルの修飾度に対する比類なく高いＣmin値（低い膨潤度）を特徴とする。修飾効率（ＭｏＥ）は、ゲルの剛性および強度を反映する最小ＨＡ濃度（Ｃmin）と、架橋剤によるゲルの化学修飾度との比の尺度である。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、１０以上、好ましくは１０〜２００の範囲、たとえば、２０〜１５０または２０〜１９０の範囲の修飾効率を有する。１０以上、たとえば２０〜１９０の範囲の修飾効率を有する生成物は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の膨潤度、または液体保持容量とを初めて兼ね備える。それにより、生体適合性であり高い耐変形性を有する、堅固な架橋ヒアルロン酸生成物を提供することが可能である。
【００９９】
さらに、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、粘弾性であることが好ましい。これは、ゲル生成物が粘性および弾性特性の組合せを示すことを示唆する。当業者に周知であるように、粘弾性特性は、レオメーターを用いて決定することができる。振動モードにおいて、弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）を、０．１または１Ｈｚの周波数で決定することができる。本発明に従うある特定の粘弾性ゲル生成物の場合、以下の関係を満たすことが好ましい：
【０１００】
【数１】
0006434003.tif 000002
【０１０１】
本発明に従う生成物は、既定の物理的形態または構造、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、またはビーズで製造され、これは、任意に、中空であるかまたは異なる層のヒアルロン酸材料からなる。縦方向に延伸している、または棒状であり、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下である構造は、医療用または美容用インプラントとして特に有用であり、その理由は、十分な長さを有することによって、移動を回避するように寸法決定することができ、同時に、限定された幅に起因して、針を通した注射によって容易に投与することができるからである。繊維、紐、または撚糸が形成される場合、その長さとその幅またはその平均直径との比は、５：１以上、たとえば１０：１以上、たとえば２０：１以上であり、任意に、１０００００：１以下、たとえば２５０００：１以下、たとえば１００：１以下であることが好ましい。例として、２０ｍＬシリンジを満たす単一の撚糸または繊維形状を有する本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、膨潤状態で、１ｍｍの太さおよび２５ｍの長さを有していてもよく、すなわち、その縦方向の延伸とその最も大きい横方向の延伸との比が、２５０００：１であってもよい。好ましい紐太さ間隔は、５０〜２００μｍである。
【０１０２】
ゲル生成物は、ヒト細胞、薬物、または他の物質を収容する中空容器として設計してもよい。本発明の一態様によれば、架橋ＨＡゲル生成物は、薬物送達デバイスとして有用であり、薬物送達の方法において使用され得る。本発明の一態様によれば、架橋ＨＡゲル生成物は、非架橋ＨＡまたは異なる修飾度もしくは架橋度を有する架橋ＨＡと組み合わせてもよい。たとえば、架橋ゲル生成物は、所望の容器形状で生成してもよい。容器は、非架橋ＨＡまたは異なる、たとえばより低い修飾度を有する架橋ＨＡのためのリザーバーを形成してもよく、これらは次いで、得られる組合せ生成物の総強度を変調する目的で、ゆっくりと放出するかまたは収容しておくことができる。
【０１０３】
架橋に起因して、成形されたヒアルロン酸生成物は、相互接合され絡み合ったヒアルロン酸鎖の連続的な網目構造であり、これは、非沈殿条件下で、液体を吸収（膨潤）し、ゲルを形成する。膨潤は、ゲルが完全に膨潤し、さらなる液体を吸収できなくなるまで進行させることができる。したがって、成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、完全膨潤状態で提供されてもよい。膨潤はまた、より初期の段階で中断して、部分的に膨潤したゲルを得ることもできる。部分的に膨潤したゲルは、ゲルのさらなる加工、たとえば、所望のサイズおよび形状のゲル構造または小片の生成のための中間体として有用であり得る。部分的に膨潤したゲルを所望の部位でその埋入中に使用して、投与を容易化し、患者の不快感を最小化することも好都合であり得る。したがって、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物はまた、部分膨潤または非膨潤状態で提供することもできる。
【０１０４】
本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、美容または医療手術において有用である。美容手術の非限定的な例は、皮膚充填および体形矯正である。医療手術の非限定的な例は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、整形外科用途、失禁処置、膀胱尿管逆流（ＶＵＲ）の処置、ならびにたとえば眼科における排液を目的としたおよび組織を離しておくためのチャネルの形成である。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物はまた、薬物送達において有用である。さらに、これは、術後（腹腔内）癒着のためのフィルムとしてならびに腰および関節治療において使用することができる。
【０１０５】
一側面によれば、本発明は、美容または医療手術を受けている対象を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物を投与することを伴う、方法を提供する。医療手術の非限定的な例は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、整形外科用途、たとえば、腰および関節治療、ならびにたとえば眼科における排液を目的としたおよび組織を離しておくためのチャネルの形成である。
【０１０６】
本発明の一態様によれば、成形された架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、生理食塩液にさらした際に０．１ｍｍを超えるサイズを有する、異なる形状のさらなる構造または小片とすることができる。本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、縦方向に延伸した形状を有し、最も大きい横方向の延伸は、完全膨潤状態で、５ｍｍ未満、好ましくは１．５ｍｍ未満、たとえば、０．８ｍｍ未満またはさらに０．５ｍｍ未満であることが好ましい。これは、膨潤したゲル生成物を所望の寸法のシリンジを通して注射する目的のために有利である。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、縦方向に延伸した形状を有し、縦方向の延伸は、完全膨潤状態で、５ｍｍ超、好ましくは５００ｍｍ（０．５ｍ）超、たとえば、５ｍ超またはさらに２５ｍ超であることも好ましい。多くの可能性の中でも、この縦方向の延伸は、埋入されたゲル生成物のインビボでの移動および／またはずれを防止する。
【０１０７】
所望の形状およびサイズは、生成物の製造中に、すなわち、架橋の前に基材を所望の形状に構成することによって構成される。所望の構造サイズを得る別の好適な様式は、所望の濃度の成形された架橋ヒアルロン酸ゲルを製造し、ゲルを機械的破砕に供する、たとえば、膨潤したもしくは部分的に膨潤したゲルまたは沈殿した架橋生成物を、細断する、磨砕する、または好適な細孔径を有するフィルターもしくはメッシュに通過させることを伴う。得られるゲル粒子または小片を生理食塩液中に分散させて、所望のサイズおよび形状の粒子を有するゲル分散液またはスラリーが得られる。形状に応じて、ゲル構造のサイズは、任意の好適な様式で、たとえば、レーザー回折、顕微鏡法、濾過等によって決定してよく、粒子の２つの端部間の最長距離によって決められる。球形構造の場合、直径は、この目的でのサイズと同等である。
【０１０８】
有用なゲル構造のサイズ範囲および形状は、意図された用途によって決まる。軟部組織増大、好ましくは皮下投与、筋肉下投与、または骨膜上投与の場合、生理食塩液にさらした際に０．１ｍｍ超のサイズを有する、ゲルの、粒子、小片、または繊維が有用である。ここで使用される「軟部組織増大」という用語は、顔面輪郭形成（たとえば、より目立つ頬または顎）、陥凹変形の修正（たとえば、外傷後、ＨＩＶ関連脂肪組織萎縮症）、および加齢による深い顔面しわの修正を含むがこれらに限定されない、軟部組織の任意の種類の体積増大を指す。したがって、軟部組織増大は、単に、美容目的でまたは医療目的で、たとえば、外傷または変性疾患後に使用してもよい。これらの２つの目的は、当業者によって容易に区別される。ここで使用される「軟部組織」という用語は、身体の他の構造および器官を接合する、支持する、または取り囲む組織を指す。軟部組織には、筋肉、線維組織、および脂肪が含まれる。軟部組織増大は、ヒトを含む任意の哺乳動物において実施してよい。本方法は、ヒト対象において実施されることが好ましい。
【０１０９】
ここで使用される「表皮下投与（subepidermal administration）」または「上皮下投与（subcuticular administration）」という用語は、皮膚の表皮の下への投与を指し、真皮、皮下組織、もしくはより深く、たとえば筋肉下への、または適用可能な場合、骨膜（骨組織の近傍の）への投与を含む。
【０１１０】
ゲル構造の投与は、任意の好適な様式で、たとえば、標準的なカニューレおよび適切なサイズの針からの注射、またはたとえばフィルムの投与の場合、外科的挿入によって実施してよい。投与は、軟部組織増大が望まれる箇所、たとえば、顎、頬、または顔もしくは身体の他の箇所で実施される。
【０１１１】
本発明に従うインプラントは、本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物、たとえば、≧０．１ｍｍ大のヒアルロン酸ゲル構造の形状のもの、たとえば、粒子、ビーズ、繊維、または切り出された切片と、任意に緩衝剤とを含む、水性組成物であってもよい。組成物は、典型的には、生理食塩緩衝液を含有していてもよい。組成物は、他の好適な添加剤、たとえば、局所麻酔薬（たとえば、塩酸リドカイン）、抗炎症薬、抗生物質、および他の好適な補助的薬剤、たとえば、骨成長因子または細胞をさらに含んでいてもよい。本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸生成物またはその水性組成物は、事前充填シリンジ、すなわち、滅菌済みの成形された架橋ヒアルロン酸生成物または成形された生成物を含む滅菌済みの水性組成物を事前に充填したシリンジとして提供されてもよい。任意に、成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、シリンジ、バッグ、または他の好適な容器中に沈殿形態で保たれ、注射の前にまたはその注射後に体内でその非沈殿形態とされてもよい。
【０１１２】
膨潤したまたは部分的に膨潤した成形された架橋ヒアルロン酸生成物は、オートクレーブ可能であることが好ましく、その理由は、これは最終生成物を滅菌する最も好都合な様式であるからである。これは、滅菌した成形された架橋ヒアルロン酸生成物の調製を可能にする。
【０１１３】
本発明に従うゲル構造、たとえば繊維のサイズは、ゲルをどれだけ膨潤させたか、ならびにゲル構造に含まれるおよび／またはそれを取り囲む、緩衝液、溶液、または担体のイオン強度によって決まることは言うまでもない。本明細書を通じて、所与の構造サイズは、生理的条件、特に等張条件を想定している。ゲル構造は、生理食塩液を含有し、その中に分散していることが好ましいが、本発明に従うゲル構造は、ゲル構造を別の張性、異なるｐＨの溶液に供することによって、またはゲル構造をその最大サイズまで膨潤させていない場合、一時的に異なるサイズとすることができると企図されることに留意されたい。
【０１１４】
ここで使用される場合、生理または等張溶液は、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｌ、好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｌ、より好ましくはおよそ３００ｍＯｓｍ／ｌの範囲のオスモル濃度を有する溶液である。実用目的では、このオスモル濃度は、０．９％（０．１５４Ｍ）ＮａＣｌ溶液の調製によって容易に実現される。
【０１１５】
本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、生理的条件下で、恒久的ではないが安定である。インビトロ安定性は、例７において、６０℃で１４日間の加速安定性研究によって実証される。本発明の一態様によれば、成形された架橋ヒアルロン酸ゲル生成物の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％は、インビボで少なくとも２週間、より好ましくは２週間〜２年間残存する。「分解された」という用語は、２０％未満、好ましくは１０％未満の媒体が体内に残存することを示唆する。
【０１１６】
本発明に従う成形された架橋ヒアルロン酸ゲル生成物は、天然のヒアルロン酸よりも、インビボでの耐生分解性が大きい。安定なゲル生成物の長期にわたる存在は、患者にとって有利であり、その理由は、処置間の時間が増加するからである。天然ヒアルロン酸の高い生体適合性を維持するために、生成物が天然ヒアルロン酸と高度に類似していることも重要である。天然ＨＡと類似している生成物は、ヒアルロニダーゼ酵素によって、好ましくは少なくとも９９％の程度まで、分解可能であるべきである。本発明に従う堅固なヒアルロン酸ゲル生成物の生分解性は、例８において実証され、ここで、それらは、ヒアルロニダーゼによって認識される。これは、天然ヒアルロン酸とのその類似性を反映する。
【０１１７】
定義
本開示を通じて、下記の用語は以下のように定義される。
【０１１８】
【表１−１】
0006434003.tif 000003
【０１１９】
【表１−２】
0006434003.tif 000004
【０１２０】
【表１−３】
0006434003.tif 000005
【０１２１】
これらに限定されることは望まないが、本発明を例として以下に例示する。
【０１２２】
［実施例］
分析方法
ＨＡ濃度の決定
ＨＡ含量の決定のための方法は、欧州薬局方１４７２に記載されたヒアルロン酸ナトリウムについてのアッセイ試験から採用する。この方法の原理は、硫酸中での加熱によって形成されたフルフラール誘導体の縮合反応がカルバゾール試薬により生じて、紫色の生成物を形成することである。反応は、ＨＡのＤ−グルクロン酸部分に対して特異的である。吸光度を５３０ｎｍで測定し、グルクロン酸を標準化のために使用する。
【０１２３】
試料中のＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の含量から形成された生成物を、カルバゾールとの反応によって決定する。均質な試料溶液を得るため、ＨＡの安定化ゲルを７０℃で硫酸によって分解し、０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈する。溶液を９５℃で硫酸と混合し、その後、カルバゾール試薬と混合する。反応によりピンク色の溶液が得られる。色の強度を、比色計を用いて５３０ｎｍで測定し、各試料の吸光度は、ＧｌｃＡ含量に正比例する。ＨＡ含量を、各試料中のＧｌｃＡ含量から計算する。
【０１２４】
ゲル含量（ＧｅｌＣ）の決定
ＧｅｌＣは、全ＨＡのうちゲル形態で結合しているものの割合を％で表す。ゲル含量は、０．２２μｍフィルターを通過しない試料中のＨＡの量として定義される。ＧｅｌＣは、ここでは抽出可能ＨＡと称される、濾液中に収集されたＨＡの量から計算される。ゲル含量および抽出可能ＨＡ含量は、ゲル試料中のＨＡの総量に対するパーセントで示される。手短に言えば、ゲル含量は、ある特定の量のゲル試料を試験管中で０．９％ＮａＣｌと混合することによって決定される。ゲルを膨潤させ、その後、ＮａＣｌ相を、０．２２μｍフィルターを通して濾過することによってゲル相から分離する。濾液中のＨＡの濃度を、ＨＡ濃度の決定のための手順に従って決定する。
【０１２５】
膨潤度（ＳｗＤ）の決定
ＳｗＤは、生成物の液体吸収能力、すなわち、０．９％ＮａＣｌを吸収するその能力を表す。生成物は、典型的には、乾燥した架橋ＨＡゲルである。乾燥生成物は、沈殿していてもよく、または沈殿していなくてもよい。ＳｗＤは、ある特定の重量の乾燥生成物を生理食塩水中で膨潤させると形成される、完全に膨潤した生成物の重量から決定することができる。乾燥生成物が沈殿している場合、これらの条件下で非沈殿形態に戻る。
【０１２６】
所定の重量（典型的には０．１ｇ）を有する乾燥生成物を過剰の０．９％ＮａＣｌ（水溶液）にさらし、生成物を室温（２３℃）で１時間膨潤させる。完全に膨潤した生成物を収集し、吸収されていない液体を除去した後に秤量する。吸収されていない液体の除去はまた、架橋ゲルに結合していないまたはその中で絡み合っていないあらゆる物質、たとえば、非架橋のおよび弱く架橋されたヒアルロネート分子を除去する。これらは、完全に膨潤した生成物の重量に寄与せず、それにより、見かけ上、より低いＳｗＤを与えることから、真のＳｗＤを決定するために、ゲル含量に対する補正を行うべきである。ゲル含量が、結果が影響されない１００％に十分に近いと考えられる場合、この補正は省略してもよい。
【０１２７】
ＳｗＤは、上記のように完全に膨潤し、抽出可能ＨＡからすすがれた生成物の重量と、生成物中の乾燥した架橋ＨＡの重量との比として計算される：
【０１２８】
【数２】
0006434003.tif 000006
【０１２９】
式中、ＧｅｌＣは、無次元数として表される。ＧｅｌＣが１（１００％）に近いと考えられる場合、ＳｗＤは以下のように計算することができる：
【０１３０】
【数３】
0006434003.tif 000007
【０１３１】
完全に膨潤した生成物を収集し、吸収されていない液体を除去する、３つの技法を使用した：１）膨潤生成物を１つずつ収集して、生成物を乾燥した表面に短時間接触させる、２）金属ネットを使用して膨潤生成物をすべて収集して、ネットを乾燥した表面に短時間接触させる、３）０．２μｍフィルターを通して吸引することによって膨潤生成物から液体を除去する。最後の場合、完全に膨潤した生成物の重量は、直接秤量せず、以下の式を使用して、膨潤前の乾燥試料の重量、添加された液体の重量、および濾過によって除去された液体の重量から計算した：
【０１３２】
【数４】
0006434003.tif 000008
【０１３３】
とりわけ、強いゲルほど低いＳｗＤを有し、弱いゲルほど高いＳｗＤを有する。
【０１３４】
最小濃度（Ｃmin）の決定
Ｃminは、すべての抽出可能ＨＡを除去した後の、０．９％ＮａＣｌ中で完全に膨潤した架橋ＨＡゲル生成物中のゲル形態ＨＡの濃度を表す。生成物はこれ以上液体を吸収できないことから、この濃度は、この特定のゲル生成物について得ることができる最小ＨＡ濃度である。とりわけ、強いゲルほど高いＣminを有し、弱いゲルほど低いＣminを有する。
【０１３５】
Ｃminは、上記のＳｗＤの決定と同様にして、以下の関係を使用して決定される：
【０１３６】
【数５】
0006434003.tif 000009
【０１３７】
修飾度（ＭｏＤ）の決定
ＭｏＤは、繰り返しＨＡ二糖単位の総数に対する結合した架橋剤のモル量を表す。この尺度は、単連結された架橋剤と実際に架橋された架橋剤とを区別せず、すなわち、少なくとも１つの共有結合を介してＨＡに結合しているすべての架橋剤が含まれる。たとえば、ＢＤＤＥにより架橋されたＨＡゲルについての１％のＭｏＤは、ＨＡゲル中の二糖単位１００個あたり結合した（単連結されたまたは架橋された）ＢＤＤＥ分子が１個存在することを意味する。
【０１３８】
ＭｏＤは、酵素分解されたゲル生成物に対するＮＭＲ分光法を使用して決定される。可溶性ＨＡ、残留（非結合）架橋剤、およびその誘導体を、ゲルの分解の前に、０．２２μｍフィルターで濾過することによって洗浄除去する。ゲル生成物を、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣを使用する酵素処理によって３７℃で分解する。分解されたゲル生成物を、標準的な５ｍｍプローブを備えた４００ＭＨｚ分光計で１次元1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録することによってＮＭＲ分光法に供する。
【０１３９】
ＮＭＲスペクトルを、連結されたＢＤＤＥ分子中の４個のプロトンを起源とするδH１．６ｐｐｍのシグナル、およびＨＡ二糖のＮ−アセチルグルコサミン残基上のＣＨ3基中の３個のプロトン由来のδH２．０ｐｐｍのシグナルの積分によって評価する。これらの２つのシグナルについての積分間の比は、各シグナルに関与するプロトンの数に対する補正後の、結合したＢＤＤＥのモル量と二糖のモル量との比に比例し、したがって、ＭｏＤを与える。
【０１４０】
【数６】
0006434003.tif 000010
【０１４１】
修飾効率（ＭｏＥ）の決定
ＭｏＥは、ゲルの最小ＨＡ濃度と修飾度との比である、すなわち：
【０１４２】
【数７】
0006434003.tif 000011
【０１４３】
Ｃmin（ｍｇ／ｇまたはｍｇ／ｍＬ）およびＭｏＤ（％）は、以前に記載されたように決定される。Ｃminはゲルの強度に密接に関連することから、ＭｏＥは、架橋手順が所望の強度のゲルを生成するのにいかに効率的であるかの尺度である。高いＭｏＥを有するプロセスは、高いＣminおよび低いＭｏＤを有するゲルを生成する、すなわち、ＨＡの限定された化学修飾にもかかわらず強いゲルが生成される。
【０１４４】
クロスリンカー比（ＣｒＲ）の決定
ＣｒＲは、結合した全架橋剤（ＨＡ−Ｘ−ＨＡおよびＨＡ−Ｘ）のうち２個（以上）の二糖に結合しているもの（ＨＡ−Ｘ−ＨＡのみ）の割合を表す：
【０１４５】
【数８】
0006434003.tif 000012
【０１４６】
式中、Ｘは、架橋剤である。
【０１４７】
この方法は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣまたはＰｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを使用して、ＨＡゲルを主要二糖（Δｄｉ−ＨＡ）からなる断片および１〜１６個の二糖を含有する結合した架橋剤（ＨＡ−Ｘ）を含む断片に分解し、続いて、ＳＥＣ−ＵＶ−ＭＳを使用してＨＡ−Ｘ断片を決定することに基づく。断片は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分離され、質量分析（ＭＳ）を使用して検出される。各断片群についてのピーク面積を合計し、ＣｒＲを以下のように計算する：
【０１４８】
【数９】
0006434003.tif 000013
【０１４９】
すべての種類のＨＡ−Ｘ断片は、ＭＳ検出器において同じ応答を有する、すなわち、すべての種類のＨＡ−Ｘ断片について、ある特定のピーク面積は、所与のモル量に相当すると想定される（Ｋｅｎｎｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１（２０１３）４１０〜４１８）。
【０１５０】
ＣｒＲを決定する際、エーテル連結によって結合したＢＤＤＥのみを含めるように注意すべきである。架橋中の条件に応じて、ＢＤＤＥは、エーテル連結とエステル連結の両方を介して、ＨＡに結合し得る。エステル連結は、容易に加水分解されることから、長期的なゲル強度および持続時間に寄与するのはエーテル結合したＢＤＤＥのみである。エステル結合したＢＤＤＥを有する断片は、エーテル結合したＢＤＤＥと同じ質量を有するが、わずかに異なるクロマトグラフィー保持時間を有することから検出することができる。いかなるエステル結合したＢＤＤＥも含まないＣｒＲを決定するため、分析の前に試料を加水分解すべきである。試料の加水分解は、たとえば、酵素分解の前または後に塩基および／または熱を加えることによって行うこともできる。
【０１５１】
ｐＨの決定
ｐＨ決定は、ガラス電極を使用して周囲温度で電位差滴定により実施される。膨潤生成物のｐＨ決定のために使用される方法は、ＵＳＰ方法＜７９１＞に基づく。手順：ｐＨメーターを、周囲室温で標準化のための緩衝溶液を用いてｐＨ７．０および４．０で較正する。約１．２ｍＬの試料（測定ごとに）を好適な容器に移す。試料が室温であることを確かめる。２連の試料に対してｐＨを測定する。各測定の間に、電極を蒸留水中で洗浄し、慎重に拭き取る。
【０１５２】
プロセス溶液、とりわけ有機溶媒のｐＨ決定のための方法は、上記のとおりであるが、ｐＨ７．０および１０．０で較正する。
【０１５３】
水および有機溶媒の混合物中で測定されたｐＨ値は、同じ濃度の塩基、たとえば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）について、純水溶液中で測定されたｐＨと比較して異なる。したがって、有機溶媒の水性混合物中で測定されたｐＨに対して、見かけのｐＨ（ｐＨapp）という表現を使用する。見かけのｐＨは、有機溶媒の種類、有機溶媒の濃度、温度、イオン強度、および混合物中の他の化合物の存在を含む、いくつかの因子によって決まる。
【０１５４】
実験セクションにおいて報告された見かけのｐＨ値は、ｐＨ範囲０〜１４のＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｉｎｌａｂ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｐｒｏ電極を備えたＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＭＡ２３４  ｐＨ／イオン分析器を用いて測定した。
【０１５５】
レオメトリー
振動モードのレオメトリーを使用して、膨潤したゲル生成物の粘弾性特性を決定する。弾性係数（Ｇ’）は、弾性変形に対するゲルの物理的耐性の観点からのゲル強度を表す。粘性係数（Ｇ”）は、粘性変形に対するゲルの物理的耐性の観点からのゲル強度を表す。測定は、振動式レオメーターを使用して実施される。
【０１５６】
レオメトリー測定は、以下のように実施される。周波数掃引を、試料ローディングおよび測定間の少なくとも１５分の休止時間、ならびに０．１％のひずみ（γ）で行う。直径２５ｍｍの平行平板プローブをギャップ２ｍｍで使用する。弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）の平均値を、周波数掃引から０．１および１Ｈｚで評価する。振幅掃引を１Ｈｚで行って、周波数掃引が線形粘弾性範囲内のひずみ（γ）で実施されたことを検証する。
【０１５７】
酵素分解性の決定
架橋ゲルがヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼによって分解可能であることを確認することによって、架橋ゲルが生分解性に関して天然ＨＡと同等であることを検証するために、酵素分解を実施する。
【０１５８】
所定の重量を有する生成物（乾燥したまたは既知濃度まで膨潤した）を、１００ｍＬの０．９％生理食塩水中で３７℃で終夜膨潤させる。ヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼ（ＩＩ型、Ｈ２１２６  Ｓｉｇｍａ）を添加して、２００Ｕ／ｍＬの酵素濃度を得、調製物を３７℃で終夜振盪させる。溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過し、濾液中のＨＡの量をカルバゾール法を使用して決定する。分解は、濾液中のＨＡの量と試料中のＨＡの総量との比として計算される。
【０１５９】
例
例１
架橋手順
０．８〜３ＭＤａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムおよそ１ｇを、０〜４０％のエタノールと０〜１２０ｍＭの強塩基とを含有する水溶液１０〜５０ｍＬに溶解した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、６〜１３のｐＨappを有していた。（準備工程）
ヒアルロネート溶液を、直径０．３〜０．５ｍｍの開口部を通して、有機溶媒を含有する液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。（沈殿工程）
次いで、沈殿したＨＡ繊維およそ１ｇを、６５〜８０％の有機溶媒、０．３〜１．２ｇ（３０〜２３０ｍＭ）の架橋剤、および１〜７５ｍＭの強塩基を含有する水性架橋媒体およそ２０〜７０ｍＬに移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。（架橋工程）
次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を架橋媒体から取り出し、リン酸などで中和した。架橋ＨＡ繊維を、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥した。
【０１６０】
沈殿した中間体を以下のように特性決定した。乾燥した架橋ヒアルロネート繊維の重量を決定した。乾燥した繊維を過剰の０．９％生理食塩水に浸し、液体を自由に吸収させた。次いで、繊維が水性ゲルを形成し、繊維の平衡（最大）膨潤が得られるまで生理食塩水が吸収された。ゲル繊維を過剰の生理食塩水および非架橋のヒアルロネートの溶液から手動で取り出し、天秤に直接移した。完全に膨潤した繊維の重量を決定した。生理食塩水取り込みの結果から、完全に膨潤したゲル中のある特定のヒアルロン酸ナトリウム濃度（Ｃmin）に相当する、膨潤度（ＳｗＤ）を決定した。
【０１６１】
得られた架橋ヒアルロネート繊維の修飾度（ＭｏＤ）を、上記のようにＮＭＲ分光法によって決定した。簡潔に言えば、連結されたＢＤＤＥ由来のシグナルについての強度は、ＨＡ中のアセチル基由来のシグナルに関連する。次いで、シグナルを生じさせるプロトンの数に対する補正後に、連結されたＢＤＤＥ対ＨＡのモル比を計算することができる。対応する修飾効率（ＭｏＥ）を、膨潤度から計算した。
【０１６２】
記載された架橋ＨＡ繊維の沈殿した中間体を、以下のように規定のＨＡ濃度まで膨潤させた。リン酸緩衝生理食塩液（４ｍＭリン酸および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）などを乾燥したＨＡ繊維に添加して、約１０〜４０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬの濃度とした。部分的に膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終等価時間（Ｆ0）で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法を用いて、ｐＨ、ＨＡ濃度、膨潤度（ＳｗＤ）、および最小濃度（Ｃmin）に関して特性決定し、ＭｏＥを、中間体について決定されたＭｏＤから計算した。
【０１６３】
架橋ＨＡ繊維を上記のように調製した。沈殿した中間体についての分析データを表１に報告し、膨潤したオートクレーブ済みの生成物について得られたデータを表２に示す。
【０１６４】
【表２】
0006434003.tif 000014
【０１６５】
【表３】
0006434003.tif 000015
【０１６６】
例２
異なる架橋剤による架橋
ヒアルロネート溶液を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、９を超えるｐＨを有していた。ヒアルロネート溶液を、直径０．５ｍｍの開口部を通して、９９．５％エタノールの液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。
【０１６７】
沈殿したＨＡ繊維およそ１ｇを、７０％エタノール、クロスリンカー
、およびＮａＯＨを含有する水性／有機架橋媒体に移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１６８】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を架橋媒体から取り出し、リン酸で中和した。架橋ＨＡ繊維を、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ２時間乾燥した。
【０１６９】
記載された架橋ＨＡ繊維の沈殿した中間体を、以下のように規定のＨＡ濃度まで膨潤させた。リン酸緩衝生理食塩液を乾燥したＨＡ繊維に添加して、約２０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬの濃度とした。部分的に膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法を用いて、ｐＨ、膨潤度（ＳｗＤ手順３）、最小濃度（Ｃmin）、修飾度（ＭｏＤ）、および修飾効率（ＭｏＥ）に関して特性決定した。表３に示した結果は、異なるジエポキシドが、記載されたプロセスにおける有用な架橋剤であることを示唆する。
【０１７０】
【表４】
0006434003.tif 000016
【０１７１】
例３
メタノール中での架橋
ヒアルロネート溶液を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、９を超えるｐＨを有していた。ヒアルロネート溶液を、直径０．５ｍｍの開口部を通して、９９．５％エタノールの液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。
【０１７２】
次いで、沈殿したＨＡ繊維およそ０．７５ｇを、８０％メタノール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、およびＮａＯＨを含有する水性架橋媒体に移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１７３】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を架橋媒体から取り出し、リン酸で中和した。架橋ＨＡ繊維を、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥した。
【０１７４】
膨潤度をＳｗＤ手順１に従って測定した。架橋繊維の乾燥した中間体を、リン酸緩衝生理食塩液中で２０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬまで膨潤させた。膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法に従って、ｐＨおよび修飾度（ＭｏＤ）に関して特性決定した。得られたゲル製剤は、６．８のｐＨおよび０．３４％のＭｏＤを有していた。
【０１７５】
例４
イソプロパノール中での架橋
ヒアルロネート溶液を例３に記載されたように調製した。次いで、沈殿したＨＡ繊維およそ０．５ｇを、７０％イソプロパノール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、およびＮａＯＨを含有する水性架橋媒体３０ｍＬに移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１７６】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を架橋媒体から取り出し、リン酸で中和した。次いで、架橋ＨＡ繊維を、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥した。
【０１７７】
架橋繊維の乾燥した中間体を、リン酸緩衝生理食塩液中で２０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬのＨＡ濃度まで膨潤させた。膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法に従って、ｐＨ、膨潤度（手順３に従って）、ゲル含量、および修飾度（ＭｏＤ）に関して特性決定した。最小濃度Ｃminおよび修飾効率（ＭｏＥ）を、上記のように計算した。得られたゲル製剤は、７．６のｐＨ、ＳｗＤ  ４７ｇ／ｇ  ＨＡ、Ｃmin  ２１ｍｇ／ｍＬ、ＭｏＤ  ０．４１％、およびＭｏＥ  ５２を有していた。
【０１７８】
例５
所望の形状および構造での架橋
ヒアルロネート溶液を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、９を超えるｐＨを有していた。
【０１７９】
異なる形状または構造を有する沈殿したＨＡ基材を、上記のヒアルロネート溶液から、以下によって調製した：
１）直径０．５ｍｍの開口部を通して押し出して、液滴を形成し、
２）直径０．５ｍｍの開口部を通して押し出して、ネットを形成し、
３）プラスチック箔上に広げて、フィルムを形成し、
続いて、９９．５％エタノールの液体媒体中に浸漬した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿して、それぞれ、ヒアルロネートの、液滴、ネット、およびフィルムとなった。
【０１８０】
次いで、各沈殿したＨＡ基材およそ１ｇを、７０％エタノール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、およびＮａＯＨを含有する水性架橋媒体４５ｍＬに移した。架橋反応中、ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、所定の形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１８１】
架橋終了後、架橋ヒアルロネート製剤を架橋媒体から手動で取り出し、リン酸で中和し、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥した後、それらを特性決定した。
【０１８２】
膨潤度（ＳｗＤ）を液滴およびフィルムについて決定した。既知量の乾燥した架橋ヒアルロネート試料を過剰の０．９％生理食塩水に浸し、液体を自由に吸収させた。次いで、試料が水性ゲルを形成し、試料の平衡（最大）膨潤が得られるまで生理食塩水が吸収された。次いで、ゲル試料を過剰の生理食塩水および最終的に非架橋の残留ヒアルロネートの溶液から手動で取り出し、天秤に直接移した。膨潤したゲルの重量を乾燥材料の初期重量と比較することによって、最大生理食塩水取り込みを推定した。結果を膨潤度（ＳｗＤ手順１）と最小濃度（Ｃmin）の両方として表４に提示する。ネットを、上記のように過剰の０．９％生理食塩水中で膨潤させた。膨潤したゲルネットを図１に示す。
【０１８３】
架橋ヒアルロネートの液滴およびフィルムの修飾度（ＭｏＤ）を、上記のようにＮＭＲ分光法によって決定した。簡潔に言えば、連結されたＢＤＤＥ由来のシグナルについての強度は、ＨＡ中のアセチル基由来のシグナルに関連する。次いで、シグナルを生じさせるプロトンの数に対する補正後に、連結されたＢＤＤＥ対ＨＡのモル比を計算した。ＭｏＤの結果および計算された修飾効率（ＭｏＥ）を表４に提示する。
【０１８４】
架橋液滴の乾燥した中間体を、リン酸緩衝生理食塩液中で２０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬのＨＡ濃度まで膨潤させた。膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分のＦ0で滅菌した。オートクレーブ済みの液滴の特性決定の結果もまた表４に提示する。
【０１８５】
【表５】
0006434003.tif 000017
【０１８６】
結果は、架橋プロセスおよびオートクレーブ中に保持される既定の形態を有する架橋ＨＡ材料を生成することが可能であることを示す。
【０１８７】
例６
アルカリ性繊維の架橋
ヒアルロネート溶液を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、９を超えるｐＨを有していた。ヒアルロネート溶液を、２１Ｇ針（内径０．５ｍｍ）を通して、９９．５％エタノールの液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。
【０１８８】
次いで、沈殿した未洗浄のＨＡ繊維およそ１ｇを、７０％エタノールおよび１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含有する水性架橋媒体６８ｍＬに移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、アルカリ性であり、繊維形態であった。アルカリ性ＨＡ繊維を添加した後の得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１８９】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を水性架橋媒体から取り出し、リン酸で中和し、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥し、特性決定した。
【０１９０】
架橋繊維の乾燥した中間体を、リン酸緩衝生理食塩液中でおよそ２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ濃度まで膨潤させた。部分的に膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法に従って、ｐＨ、膨潤度（ＳｗＤ）、ゲル含量、および修飾度（ＭｏＤ）に関して特性決定した。最小濃度Ｃminおよび修飾効率（ＭｏＥ）を、上記のように計算した。結果を表５に提示する。
【０１９１】
【表６】
0006434003.tif 000018
【０１９２】
したがって、１１．５を超える最終の見かけのｐＨを有する、７０％アルコールを含有する中性架橋媒体中でのアルカリ性繊維の架橋により、明確に定義されたゲル繊維が得られた。
【０１９３】
例７
生体適合性および安定性研究
インビボでの材料の生体適合性を研究する目的で、４つの製剤を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、９を超えるｐＨを有していた。ヒアルロネート溶液を、１８Ｇ（φ０．８ｍｍ、製剤１および２）または２５Ｇ（φ０．３ｍｍ、製剤３および４）幅の開口部を通して、９９．５％エタノールの液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。
【０１９４】
次いで、沈殿したＨＡ繊維およそ１ｇを、７０％エタノール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、およびＮａＯＨを含有する水性架橋媒体６０ｍＬに移した。製剤２および４を、製剤１および３よりも４倍高いＢＤＤＥ濃度にさらした。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、上記の装置を用いて測定して、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０１９５】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を水性架橋媒体から取り出し、リン酸で中和し、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ１時間乾燥し、特性決定した。
【０１９６】
乾燥した繊維を過剰の０．９％生理食塩水に浸し、液体を自由に吸収させた。次いで、繊維が水性ゲルを形成し、繊維の平衡（最大）膨潤が得られるまで生理食塩水が吸収された。次いで、ゲル繊維を過剰の生理食塩水および非架橋のヒアルロネートの溶液から手動で取り出し、天秤に直接移した。沈殿した材料の初期重量を完全に膨潤した繊維の重量と比較することによって、最大生理食塩水取り込みを推定した。滅菌前のゲル繊維から得られた結果を、膨潤度（ＳｗＤ）と最小ＨＡ濃度（Ｃmin）の両方として表６に提示する。
【０１９７】
【表７】
0006434003.tif 000019
【０１９８】
得られた架橋ヒアルロネート繊維の修飾度（ＭｏＤ）を、上記のようにＮＭＲ分光法によって決定した。簡潔に言えば、連結されたＢＤＤＥ由来のシグナルについての強度は、ＨＡ中のアセチル基由来のシグナルに関連する。次いで、シグナルを生じさせるプロトンの数に対する補正後に、連結されたＢＤＤＥ対ＨＡのモル比を計算することができる。図２Ａ（製剤１）および２Ｂ（製剤２）は、重水（Ｄ2Ｏ）中の酵素分解されたＨＡゲルの４００ＭＨｚ  1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。連結されたＢＤＤＥおよびＮ−アセチル基由来のシグナルをスペクトル中に印す。それぞれの製剤ごとのＭｏＤおよびＣｒＲの結果を、修飾効率（ＭｏＥ）とともに表６に提示する。
【０１９９】
架橋繊維の乾燥した中間体を、以下のように規定のＨＡ濃度まで膨潤させた。リン酸緩衝生理食塩液を乾燥したＨＡ繊維に添加して、およそ２０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬの推定濃度を実現した。製剤１および３は添加された溶液をすべて吸収した一方で、製剤２および４はすべては吸収しなかった。次いで、膨潤したゲルを、無菌条件下で１ｍＬガラスシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２５℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。
【０２００】
オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法に従って、ＨＡ濃度、ゲル含量（ＧｅｌＣ）、膨潤度（ＳｗＤ）、およびｐＨに関して特性決定した。滅菌後の生成物の結果を表７に提示する。
【０２０１】
【表８】
0006434003.tif 000020
【０２０２】
表６および７から、製剤１および３は、製剤２および４よりも、剛性が低く化学修飾度が低いことが明白である。製剤２および４  の高いＨＡ濃度は、水の最大取り込みが低いこと、およびこれらの条件下で生成されたゲルについて、より低いＨＡ濃度を有するゲル生成物を実現することが不可能であることを反映する。
【０２０３】
製剤を、バイオバーデン（混釈平板法）およびエンドトキシン（ゲルクロット法）に関して分析した。すべての製剤は、０ｃｆｕ／シリンジのバイオバーデンおよび＜０．２１ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン値を有していた。製剤はすべて、生体適合性研究のための純度に関する要件を満たしていた。
【０２０４】
顕微鏡法
膨潤したオートクレーブ済みの繊維を、トルイジンブルー水溶液中で１５分間繊維を着色することによって視覚化した。顕微鏡画像を図３Ａ〜Ｄに示す。３Ａ：製剤１、３Ｂ：製剤２、３Ｃ：製剤３、および３Ｄ：製剤４。バー＝１ｍｍ。
【０２０５】
安定性試験
製剤の安定性試験を、６０℃／周囲相対湿度（ＲＨ）で１４日間実施した。製剤はすべて良好な安定性を示した。図４は、６０℃での経時的なＳｗＤの増加を示す（ＳｗＤ手順３に従って測定し、ゲル含量に対して補正）。製剤１（ひし形）、製剤２（四角形）、製剤３（三角形）、および製剤４（バツ印）。
【０２０６】
生物学的評価
製剤の生体適合性を、２４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの皮下注射によって試験した。動物を麻酔し、背部を剃毛し、１ｍＬの各製剤を皮下注射した。ラットの背部の正中線の各側に、２回の注射を実施した。動物を２つの群に分けた。一方の群を注射の１週間後に安楽死させ、他方の群を注射の３週間後に安楽死させた。動物を毎日検査し、疾病の徴候は記録されなかった。注射された製剤は、すべての皮膚試料において、肉眼的におよび組織学的に忍容性良好であった。したがって、壊死または急性炎症の徴候は見られなかった。埋入された製剤の部位を取り囲む薄い線維性被膜（図示せず）は別として、肉芽腫の形成または組織反応の徴候は見出されなかった。製剤はラットにおいて生体適合性であると結論付けられた。
【０２０７】
例８
異なるゲル強度を有するゲルのヒアルロニダーゼ分解
ヒアルロネート溶液を例１に記載されたように調製した。完全に溶解した後、得られたヒアルロネート溶液は、上記のように測定して、１１．５を超えるｐＨを有していた。ヒアルロネート溶液を、直径０．５ｍｍの開口部を通して、９９．５％エタノールの液体媒体中に押し出した。押し出されたヒアルロネート溶液は、直ちに沈殿してヒアルロネート繊維となった。
【０２０８】
沈殿したＨＡ繊維およそ１ｇを、７０％エタノール、ＢＤＤＥ、およびＮａＯＨを含有する水性／有機架橋媒体に移した。ヒアルロネートは、依然として沈殿しており、繊維形態であった。ＨＡを含む得られた架橋媒体は、１１．５を超えるｐＨを有していた。
【０２０９】
ＨＡ繊維を水性／有機架橋媒体中で架橋させた。次いで、こうして得られた架橋ヒアルロネート繊維を架橋媒体から取り出し、リン酸で中和した。架橋ＨＡ繊維を、真空チャンバーにおいて減圧下（約２００ｍｂａｒ）室温でおよそ２時間乾燥した。
【０２１０】
記載された架橋ＨＡ繊維の沈殿した中間体を、以下のように規定のＨＡ濃度まで膨潤させた。リン酸緩衝生理食塩液を乾燥したＨＡ繊維に添加して、約２０〜４０ｍｇ  ＨＡ／ｍＬの濃度とした。部分的に膨潤したゲルを１０ｍＬプラスチックシリンジに充填した。充填されたシリンジを、湿熱を使用して、１２３℃でおよそ２０分の最終Ｆ0で滅菌した。オートクレーブ済みのシリンジの内容物を、上記の方法に従って、膨潤度（ＳｗＤ手順２）、ＨＡ濃度、最小ＨＡ濃度（Ｃmin）、修飾度（ＭｏＤ）、修飾効率（ＭｏＥ）、および粘弾性特性に関して特性決定した。すべての異なる生成物を「酵素分解性の決定」に従ってヒアルロニダーゼ分解に供して、ＨＡの生分解性が架橋生成物において維持されることを検証した。
【０２１１】
結果を表８Ａおよび８Ｂに報告する。Ｇ’／（Ｇ’＋Ｇ”）の値は、すべての製剤について＞７０％であり、これは、それらがすべてゲルであることを明示する。さらに、Ｇ’値は、ゲルが堅固であることを示す。それにもかかわらず、ゲルは、決定された膨潤特性およびレオロジー特性によって示されるように、広範なゲル強度にわたり、ヒアルロニダーゼによって９９％超まで分解可能である。これは、天然ＨＡの生分解性が、有利なことに、本発明に従うゲル生成物において維持されることを示す。
【０２１２】
【表９】
0006434003.tif 000021
【０２１３】
【表１０】
0006434003.tif 000022
【０２１４】
例９
比較例
ＥＰ２１９９３０８Ａ１の例４に従って、５つのヒアルロン酸（ＨＡ）ゲル試料を調製した、下記の表９Ａ参照。上記の例１に記載された架橋手順を使用して、本発明に従う標準試料（ＦＵ０５０９：１）を調製した。
【０２１５】
【表１１】
0006434003.tif 000023
【０２１６】
【表１２】
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【０２１７】
すべての試料についてゲルが実現された、表９Ｂ参照。比較試料１〜５によって得られた不規則な形状のゲル粒子は、本発明に従う方法によって調製された試料と同じ範囲のＭｏＤ値を示した。しかしながら、Ｇ’およびＧ”値は、比較試料１〜５では、本発明に従う方法によって調製された試料と比較して有意に低い。本発明に従う方法は、ＥＰ２１９９３０８Ａ１に開示された方法よりも効率的であり、その理由は、本発明は、より低いＭｏＤで既により強いゲルを提供するからであると結論付けられる。
【０２１８】
比較試料１〜５の顕微鏡画像（それぞれ図５Ａ〜Ｅ、各々５０×の倍率である）は、生成物のサイズおよび形状の幅広い分布を示し、ＥＰ２１９９３０８Ａ１に開示された方法により、ランダムなサイズの粒子が得られることを指示している。得られる粒子の形状およびサイズは、制御されていない。対照的に、本発明に従う方法によって調製された生成物の顕微鏡画像（図５Ｆ）は、一様なサイズおよび形状を有する生成物を示す。
【０２１９】
例１０
沈殿工程におけるエタノール濃度
異なるエタノール濃度でＨＡ紐を沈殿させる効果を試験した。６５、７５、８５、９５ｗ／ｗ％の濃度を有する４つのエタノール水溶液を調製した。０．５％ＮａＯＨ（ｗ／ｗ）を含むエタノール（３５ｗ／ｗ％）中のＨＡ（５ｗ／ｗ％）の溶液を、小さいプラスチック（ＰＥ）フィルム上に手動で押し出し、これを、エタノール溶液および純粋な（９９．５ｗ／ｗ％）エタノールの各々を含む槽中に浸漬するか、または１分間７５％および８５％エタノール中に段階的に浸漬し、次いで、９９．５％エタノールに移した。
【０２２０】
得られた沈殿した紐を収集し、光学顕微鏡法を使用して視覚的に評価した。紐を取り扱う際の知覚的感覚もまた評価した。沈殿槽中のエタノール濃度が高いほど、紐は、より滑らかでより均一な表面を有し、より湾曲し、より脆弱であることが観察され、より束状の構造を示した。
【０２２１】
段階的に沈殿させた（７５％→８５％→９９．５％）紐は、７５ｗ／ｗ％または８５ｗ／ｗ％のみに沈殿させた紐のように挙動した。これらの条件下で、６５％エタノールでは、ＨＡの完全な沈殿は観察されなかった。６５％エタノール中で２０分間保ち、その後、９９．５％エタノール中に完全に沈殿させた試料は、他の紐とは完全に異なる外観を有しており、束状構造を有さず平らで細い帯状であった。
【０２２２】
例１１
疎水性表面上での所望の形状の構成
沈殿手法の効果を、以下の２つの手順を比較することによって試験した：
（Ｉ）：１）押出−２）ＰＥフィルム上に配置−３）９９．５％エタノール中で沈殿（例１０参照）
（ＩＩ）：１）押出−２）９９．５％エタノール中を自由沈降−３）ＰＥフィルム上に付着
得られた沈殿した紐を収集し、光学顕微鏡法を使用して視覚的に評価した。紐を取り扱う際の知覚的感覚もまた評価した。第１の種類の沈殿手順（Ｉ）では、滑らかで均一な紐が実現される一方で、第２の種類の沈殿手順（ＩＩ）では、隆起を有する脆弱で不均一な紐が得られると結論付けられた。
【０２２３】
例１２
ラットへの皮下注射
例７に記載されたのと本質的に同じ様式で調製されたゲル製剤を、無毛ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）への皮下注射によってインビボで試験した。埋入されたゲル（図６Ａ）の紐形状は、ラットの皮下領域において、６か月後（図６Ｂ）にも残存することが観察された。図６Ａは、１８Ｇカニューレを通して押し出した後の、Ｍｉｌｌｉ−ＲＸで希釈しトルイジンブルーで着色した紐（非外植）を示す。図６Ｂは、６か月後にラットの皮下領域から外植された同じ紐バッチを示す。
【０２２４】
紐形状は、針を通して押し出した後ならびにラットにおける６か月後にも保持されると結論付けられる。
【０２２５】
例１３
比較例
ＵＳ２０１２／００３４４６２Ａ１は、実験的証拠なしに、架橋ＨＡゲルの固形塊をふるいまたはメッシュに通過させることによって、架橋ＨＡゲルの細い撚糸を生成できると提案している。この理論を試験するため、ＵＳ２０１２／００３４４６２Ａ１の例１に従って、ゲルを調製した（ＨＡ  ＭＷ  ３ＭＤａ、ＢＤＤＥ  ７５ｍｇ／ｇ  ＨＡ、温度５０℃で２時間）。ヒドロゲルを３２μｍまたは６３μｍのメッシュスクリーンに一度通過させた。
【０２２６】
１０×に拡大した得られたＨＡゲル構造を、図７、（Ａ）メッシュサイズ３２μｍ、（Ｂ）メッシュサイズ６３μｍ（バー＝２ｍｍ）に示す。得られた粒子は、いかなる規則構造も、特にいかなる伸長形状も示さなかった。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
成形された架橋ヒアルロン酸生成物を製造するための方法であって、
（ｉ）いかなる架橋も伴わずに、水溶液である第１の液体媒体に溶解したヒアルロン酸基材を用意する工程と、
（ｉｉ）いかなる架橋も伴わずに、前記ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第１の水溶性有機溶媒を含む第２の液体媒体に供することによって沈殿させる工程と、
ここで、工程（ｉ）および／または工程（ｉｉ）は、前記ヒアルロン酸基材を所望の形状に構成することをさらに含み、
（ｉｉｉ）前記所望の形状の前記非架橋の沈殿したヒアルロン酸基材を、１１．５以上のｐＨを有し、１種以上の多官能性架橋剤と、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の１種以上の第２の有機溶媒とを含む第３の液体媒体中、好適な条件下で単一の架橋反応に供して、沈殿した成形された架橋ヒアルロン酸生成物を得る工程と
を含む、方法。
［２］
前記最初の２つの工程（ｉ）および（ｉｉ）が、架橋剤の非存在下で行われ、前記多官能性架橋剤が、前記第３の架橋工程（ｉｉｉ）において添加される、［１］に記載の方法。
［３］
工程（ｉ）が、前記ヒアルロン酸基材溶液を疎水性表面上で所望の形状に構成することをさらに含み、工程（ｉｉ）における前記成形されたヒアルロン酸基材の前記沈殿が、前記疎水性表面上で行われる、先行する何れかの態様に記載の方法。
［４］
前記疎水性表面が、フルオロカーボン、ポリプロピレン（ＰＰ）、グリコール変性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から選択される、［３］に記載の方法。
［５］
前記形状が、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択される、先行する何れかの態様に記載の方法。
［６］
前記形状が、繊維であり、その長さとその幅との比が、１０：１以上である、［５］に記載の方法。
［７］
工程（ｉｉ）が、前記ヒアルロン酸基材を、ヒアルロン酸の沈殿条件をもたらすある量の前記第１の水溶性有機溶媒を含む前記第２の液体媒体中に押し出し、それにより、前記押し出されたヒアルロン酸基材に、前記第２の液体媒体中で、沈殿した繊維を形成させることを伴う、［１］〜［２］の何れか１に記載の方法。
［８］
工程（ｉｉ）の前記第２の液体媒体が、０〜３０体積％の水と、７０〜１００体積％の前記第１の水溶性有機溶媒とを含有する、先行する何れかの態様に記載の方法。
［９］
工程（ｉｉ）の前記第２の液体媒体が、０〜１０体積％の水と、９０〜１００体積％の前記第１の水溶性有機溶媒とを含有する、［８］に記載の方法。
［１０］
工程（ｉｉｉ）の前記第３の液体媒体が、０〜３５体積％の水と、６５〜１００体積％の前記第２の有機溶媒と、１種以上の多官能性架橋剤とを含有する、先行する何れかの態様に記載の方法。
［１１］
前記有機溶媒が、１種以上の低級アルキルアルコールから個々に選択される、先行する何れかの態様に記載の方法。
［１２］
工程（ｉ）の前記水溶液が、４０〜１００体積％の水と、０〜６０体積％の低級アルキルアルコールとを含有する、先行する何れかの態様に記載の方法。
［１３］
前記低級アルキルアルコールが、エタノールである、［１１］〜［１２］の何れか１に記載の方法。
［１４］
前記多官能性架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される、先行する何れかの態様に記載の方法。
［１５］
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、［１５］に記載の方法。
［１７］
（ｉｖ）前記沈殿した架橋ヒアルロン酸生成物を非沈殿条件に供する工程と、
（ｖ）非沈殿形態の前記架橋ヒアルロン酸生成物を単離する工程と
をさらに含む、先行する何れかの態様に記載の方法。
［１８］
工程（ｖ）が、前記架橋ヒアルロン酸生成物を滅菌することをさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１９］
二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個の修飾度、ヒアルロン酸１ｇあたり４〜３００ｍＬの膨潤度、および１０以上の修飾効率を有する、成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２０］
前記生成物が、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズからなる群から選択される形状を有する、［１９］に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２１］
前記生成物が、繊維であり、その長さとその幅との比が、１０：１以上である、［２０］に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２２］
前記生成物が、繊維であり、その縦方向の延伸が、２ｍｍ超である、［２０］〜［２１］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２３］
前記膨潤度が、ヒアルロン酸１ｇあたり１５〜１８０ｍＬである、［１９］〜［２２］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２４］
前記修飾効率が、２０〜１９０の範囲である、［１９］〜［２３］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２５］
クロスリンカー比が、３５％以上である、［１９］〜［２４］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２６］
ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から個々に選択される１種以上の多官能性架橋剤により架橋されている、［１９］〜［２５］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２７］
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から個々に選択される、［２６］に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２８］
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、［２７］に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［２９］
前記生成物が、滅菌済みである、［１９］〜［２８］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［３０］
［１］〜［１８］の何れか１に記載の方法によって製造される、成形された架橋ヒアルロン酸生成物。
［３１］
［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物と、任意に緩衝剤とを含む、水性組成物。
［３２］
美容手術における、［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または［３１］に記載の水性組成物の使用。
［３３］
皮膚充填および体形矯正から選択される美容手術における、［３２］に記載の使用。
［３４］
医薬または医療デバイスとしての使用のための、［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または［３１］に記載の水性組成物。
［３５］
美容または医療手術における使用のための、［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または［３１］に記載の水性組成物。
［３６］
皮膚充填および体形矯正から選択される美容手術における［３５］に記載の使用のための、成形された架橋ヒアルロン酸生成物または水性組成物。
［３７］
皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁処置、および整形外科用途から選択される医療手術における［３５］に記載の使用のための、成形された架橋ヒアルロン酸生成物または水性組成物。
［３８］
薬物送達における使用のための、［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または［３１］に記載の水性組成物。
［３９］
滅菌済みの［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または滅菌済みの［３１］に記載の水性組成物を事前に充填した、事前充填シリンジ。
［４０］
美容または医療手術を受けている対象を処置する方法であって、それを必要とする対象に、［１９］〜［３０］の何れか１に記載の成形された架橋ヒアルロン酸生成物または［３１］に記載の水性組成物を投与することを伴う、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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