(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の疾患：
（１）悪性腫瘍；
（２）病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患；
（３）自己免疫疾患
の１つまたはそれより多くの予防または治療において用いるための医薬品またはワクチンであって；
リンカーに対してタンパク質および細胞を共有結合することによって形成されるコンジュゲートであるタンパク質−細胞コンジュゲートであって；前記リンカーが二官能性架橋剤であり、そして二官能性架橋剤が、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含み、前記タンパク質が腫瘍に関連する抗原、感染性疾患に関連する抗原、または自己免疫疾患に関連する抗原であり、前記細胞がリンパ球である、前記コンジュゲート
を含む、前記医薬品またはワクチン。
【請求項２】
二官能性架橋剤が、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む、請求項１記載の医薬品またはワクチン。
【請求項３】
二官能性架橋剤が、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−（６−アミドカプロエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミド−ウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）からなる群より選択される、請求項１または２記載の医薬品またはワクチン。
【請求項４】
二官能性架橋剤のスクシンイミジルがタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルが細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する、請求項２または３記載の医薬品またはワクチン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のタンパク質−細胞コンジュゲートを調製するための方法であって；
（１）タンパク質と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結されたタンパク質を含む第一の混合物を得て；
（２）第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製タンパク質を得て；
（３）工程（１）または（２）において得られた連結基に連結されたタンパク質を、細胞と接触させ、二官能性架橋剤の他の連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（４）細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る
前記方法；
または以下の工程：
（ａ）細胞と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結された細胞を含む第一の混合物を得て；
（ｂ）第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製細胞を得て；
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）において得られた連結基に連結された細胞を、タンパク質と接触させ、二官能性架橋剤の他の連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（ｄ）細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る
前記方法であって；
前記二官能性架橋剤が、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含み、前記タンパク質が腫瘍に関連する抗原、感染性疾患に関連する抗原、または自己免疫疾患に関連する抗原であり、前記細胞がリンパ球である、
前記方法。
【請求項６】
二官能性架橋剤が、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
二官能性架橋剤が、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−（６−アミドカプロエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（スルホン酸基ＳＭＣＣ、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミド−ウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）からなる群より選択される、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
二官能性架橋剤のスクシンイミジルがタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルが細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
以下の項目（I）〜（IV）：
（I）工程（１）、（３）、（ａ）、または（ｃ）の接触が、４〜４０℃で行われる；
（II）接触が、１０〜６０分間行われる；
（III）接触が、生理学的生理食塩水溶液または緩衝溶液中で行われる；
（IV）接触が、４．０〜９．０のｐＨで行われる
の１つまたはそれより多くで特徴付けられる、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および生物医薬分野に関し、そしてコンジュゲート、特にタンパク質および細胞のコンジュゲートに関する。本発明はさらに、タンパク質−細胞コンジュゲートの調製法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の発生および進行は、免疫監視の機能低下に関連し、ある感染は、病原性微生物に対するワクチンの投与によって有効に予防可能であり、そして自己免疫寛容の障害によって引き起こされる自己免疫疾患における免疫寛容は、免疫制御によって、または免疫寛容の誘導によって回復されうる。すべてのこれらの免疫学的介入手段は、抗原または抗体に関連するが、抗原または抗体の大部分はタンパク質である。したがって、上記免疫学的介入手段は、主に、抗原タンパク質に対する免疫反応または該タンパク質への免疫寛容を誘導するか、あるいは抗体のターゲティング能を十分に利用することを意図する。
【０００３】
前述の免疫学的介入を達成するための鍵は、抗原タンパク質をどのように効率的にリンパ組織に運ぶかである。抗原タンパク質が、効果的にそして堅固に免疫細胞表面にカップリングする場合、免疫細胞がリンパ組織に遊走し、そしてそこに位置する特徴、または抗原を提示する特徴を有するため、抗原タンパク質は、免疫細胞の注入を通じてリンパ組織に効率的に運ばれるか、またはよりよく提示されることが可能である。あるいは、免疫エフェクター細胞は、抗体のターゲティング能を用いることによって、免疫エフェクター細胞の殺傷効率を改善するように、ターゲット細胞に係留されることも可能である。
【０００４】
細胞膜にタンパク質をカップリングする既知の方法の１つは、エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）での細胞固定によって、細胞表面に既知の抗原をカップリングする工程を含む（ｌｕｏら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８  Ｓｅｐ  ２３；１０５（３８）：１４５２７−３２．；  Ｓｍａｒｒ  ＣＢら  抗原固定された白血球は、アレルギーのマウスモデルにおいて、Ｔｈ２反応を寛容化する  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｎｏｖ  １５；１８７（１０）：５０９０−８．）。この方法によって調製される細胞は、ＥＣＤＩ固定のため死んでおり、そしてこれらの論文によれば、これらの細胞の注入は、抗原特異的免疫学的寛容しか誘導することが出来ず、抗原に対する免疫学的反応を誘導不能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ｌｕｏら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８  Ｓｅｐ  ２３；１０５（３８）：１４５２７−３２．
【非特許文献２】Ｓｍａｒｒ  ＣＢら  抗原固定白血球は、マウスアレルギーモデルにおいて、Ｔｈ２反応を寛容化する  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｎｏｖ  １５；１８７（１０）：５０９０−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当該技術分野には、感染および腫瘍の予防または治療に有用な免疫学的反応をより効率的に誘導するように、生存細胞にタンパク質をカップリングする方法を提供する必要性がなおある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
長期間のそして膨大な実験研究の後、本発明の発明者らは、驚くべきことに、二官能性架橋剤を用いることによって、細胞にタンパク質をカップリング可能である上、タンパク質および細胞の活性が維持されることを見出し、それによって本発明を達成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
［１］タンパク質−細胞コンジュゲートであって、それぞれ、リンカーに対してタンパク質および細胞を共有結合することによって形成されるコンジュゲートであり；好ましくは、細胞がリンカーに連結されていない際、細胞はその表面上に分布する遊離のスルフヒドリル基を有し；好ましくは、リンカーは二官能性架橋剤由来であり、そして二官能性架橋剤は、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含む、前記コンジュゲート。
［２］細胞が免疫学的機能を持つ細胞であり；好ましくは細胞が、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］記載のタンパク質−細胞コンジュゲート。
［３］二官能性架橋剤が、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む、［１］または［２］記載のタンパク質−細胞コンジュゲート。
［４］二官能性架橋剤が、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはその類似体、ＳＭＣＣの長鎖類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−（６−アシルアミノヘキサノエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミド−ウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）からなる群より選択される、［１］〜［３］のいずれか記載のタンパク質−細胞コンジュゲート。
［５］二官能性架橋剤のスクシンイミジルがタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルが細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する、［３］または［４］記載のタンパク質−細胞コンジュゲート。
［６］タンパク質が、抗原タンパク質（例えば腫瘍関連抗原、感染性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原）、エピトープ、抗体、ホルモン、増殖因子、ビタミン、およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、［１］〜［５］のいずれか記載のタンパク質−細胞コンジュゲート。
［７］（１）タンパク質と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結されたタンパク質を含む第一の混合物を得て；
（２）場合によって、第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製タンパク質を得る工程をさらに含み；
（３）工程（１）または（２）において得られた連結基に連結されたタンパク質を、細胞と接触させ、連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、別個にリンカーに共有結合した、タンパク質および細胞のコンジュゲート、すなわちタンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（４）場合によって、細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る工程をさらに含む
前記方法；
または以下の工程：
（ａ）細胞と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結された細胞を含む第一の混合物を得て；
（ｂ）場合によって、第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製細胞を得る工程をさらに含み；
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）において得られた連結基に連結された細胞を、タンパク質と接触させ、連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、別個にリンカーに共有結合した、タンパク質および細胞のコンジュゲート、すなわちタンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（ｄ）場合によって、細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る工程をさらに含む
前記方法であって；
好ましくは、細胞はリンカーに連結されていない際、表面上に分布する遊離のスルフヒドリル基を有し；
好ましくは、二官能性架橋剤が、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含む、
前記方法。
［８］細胞が免疫学的機能を持つ細胞であり；好ましくは、細胞が、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、［７］記載の方法。
［９］二官能性架橋剤が、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む、［７］または［８］記載の方法。
［１０］二官能性架橋剤が、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはその類似体、ＳＭＣＣの長鎖類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−（６−アシルアミノヘキサノエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（スルホン酸基ＳＭＣＣ、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミド−ウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）からなる群より選択される、［７］〜［９］のいずれか記載の方法。
［１１］二官能性架橋剤のスクシンイミジルがタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルが細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する、［９］または［１０］記載の方法。
［１２］タンパク質が、抗原タンパク質（例えば腫瘍関連抗原、感染性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原）、エピトープ、抗体、ホルモン、増殖因子、ビタミン、およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、［７］〜［１１］のいずれか記載の方法。
［１３］以下の項目（１）〜（４）：
（１）接触が、４〜４０℃、好ましくは６〜３７℃、より好ましくは１５〜２５℃の温度、例えば室温で行われる；
（２）接触が、１０〜６０分間、好ましくは２０〜５０分間、より好ましくは３０〜４０分間の時間、行われる；
（３）接触が、溶液中で行われ、溶液が例えば生理学的生理食塩水溶液または緩衝溶液であり、緩衝溶液が例えばリン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、乳酸緩衝溶液または炭酸緩衝溶液である；
（４）接触が、４．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．５〜７．５、より好ましくは７．０〜７．２のｐＨで行われる
の１つまたはそれより多くで特徴付けられる、［７］〜［１２］のいずれか記載の方法。
［１４］医薬品および／またはワクチンの製造における、［１］〜［６］のいずれか記載のタンパク質−細胞コンジュゲートの使用であって、医薬品および／またはワクチンが、以下の疾患：
（１）タンパク質−細胞コンジュゲート中のタンパク質と関連する疾患；
（２）悪性腫瘍；
（３）病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患；
（４）自己免疫疾患
の１つまたはそれより多くの予防または治療のために用いられる、前記使用。
［１５］以下の疾患：
（１）タンパク質−細胞コンジュゲート中のタンパク質と関連する疾患；
（２）悪性腫瘍；
（３）病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患；
（４）自己免疫疾患
の１つまたはそれより多くの予防または治療のための方法であって；
［１］〜［６］のいずれか記載のタンパク質−細胞コンジュゲートの予防的または療法的有効量を、こうした必要がある対象に投与する工程を含む、前記方法。
【０００８】
本発明の第一の側面は、タンパク質−細胞コンジュゲートであって、それぞれ、リンカーに対してタンパク質および細胞を共有結合することによって形成されるコンジュゲートであり；好ましくは、細胞がリンカーに連結されていない際、細胞はその表面上に分布する遊離のスルフヒドリル基を有し；好ましくはリンカーは二官能性架橋剤由来であり、そして二官能性架橋剤は、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含む、前記コンジュゲートに関する。
【０００９】
本発明の第一の側面の任意の項目のタンパク質−細胞コンジュゲートによれば、細胞は免疫学的機能を持つ細胞であり；好ましくは、細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００１０】
本発明のいくつかの態様において、細胞はリンパ球であり、そして例えば、リンパ球はＴリンパ球またはＢリンパ球である。
本発明の第一の側面の任意の項目のタンパク質−細胞コンジュゲートによれば、リンカーは二官能性架橋剤由来である。
【００１１】
本発明のいくつかの特定の態様において、二官能性架橋剤は、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む。
本発明のいくつかの態様において、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む任意の化合物が、本発明を達成しうる。本発明のいくつかの特定の態様において、化合物には、限定されるわけではないが、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはその類似体、ＳＭＣＣの長鎖類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミド−ウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）またはＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）が含まれる。
【００１２】
本発明の第一の側面の任意の項目のタンパク質−細胞コンジュゲートによれば、二官能性架橋剤のスクシンイミジルはタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルは細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する。
【００１３】
本発明の第一の側面の任意の項目のタンパク質−細胞コンジュゲートによれば、タンパク質には、限定されるわけではないが、抗原タンパク質（例えば腫瘍関連抗原、感染性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原）、エピトープ、抗体、ホルモン、増殖因子、ビタミン、コロニー刺激因子が含まれる。
【００１４】
本発明の態様において、タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり；別の態様において、タンパク質はインスリンである。別の態様において、タンパク質は肝臓癌関連タンパク質、グリピカン−３（ＧＰＣ３）である。
【００１５】
本発明の第二の側面は、以下の工程：
（１）タンパク質と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結されたタンパク質を含む第一の混合物を得て；
（２）場合によって、第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製タンパク質を得る工程をさらに含み；
（３）工程（１）または（２）において得られた連結基に連結されたタンパク質を、細胞と接触させ、連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、別個にリンカーに共有結合した、タンパク質および細胞のコンジュゲート、すなわちタンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（４）場合によって、細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る工程をさらに含む
タンパク質−細胞コンジュゲートを調製するための方法；
または以下の工程：
（ａ）細胞と二官能性架橋剤を接触させて、二官能性架橋剤の連結基が細胞に共有結合するようにし、それによって、連結基に連結された細胞を含む第一の混合物を得て；
（ｂ）場合によって、第一の混合物から非連結二官能性架橋剤を除去して、連結基に連結された精製細胞を得る工程をさらに含み；
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）において得られた連結基に連結された細胞を、タンパク質と接触させ、連結基がタンパク質に共有結合するようにし、それによって、別個にリンカーに共有結合した、タンパク質および細胞のコンジュゲート、すなわちタンパク質−細胞コンジュゲートを含む、第二の混合物を得て；
（ｄ）場合によって、細胞に連結していないタンパク質を第二の混合物から除去して、タンパク質−細胞コンジュゲートを含む精製された第二の混合物を得る工程をさらに含む
前記方法であって；
好ましくは、細胞はリンカーに連結されていない際、表面上に分布する遊離のスルフヒドリル基を有し；
好ましくは、二官能性架橋剤が、アミノ基と反応可能な基およびスルフヒドリル基と反応可能な基の両方を含む、
前記方法に関する。
【００１６】
本発明の第二の側面の任意の項目の方法によれば、細胞は免疫学的機能を持つ細胞であり；好ましくは、細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００１７】
本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤は、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む。スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含む任意の化合物が、本発明を達成しうる。
【００１８】
本発明のいくつかの特定の態様において、二官能性架橋剤には、限定されるわけではないが、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはその類似体、ＳＭＣＣの長鎖類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸−３−スルホスクシンイミドエステル（スルホン酸基ＳＭＣＣ、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）またはＮ−スクシンイミジル４−（パラ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）が含まれる。
【００１９】
本発明の第二の側面の任意の項目の方法によれば、二官能性架橋剤のスクシンイミジルはタンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド連結を形成し、そして二官能性架橋剤のマレイミジルは細胞上の遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル連結を形成する。
【００２０】
本発明の第二の側面の任意の項目の方法によれば、タンパク質には、限定されるわけではないが、抗原タンパク質（例えば腫瘍関連抗原、感染性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原）、エピトープ、抗体、ホルモン、増殖因子、ビタミン、コロニー刺激因子が含まれる。
【００２１】
本発明の態様において、タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であり；別の態様において、タンパク質はインスリンである。別の態様において、タンパク質は肝臓癌関連タンパク質、グリピカン−３（ＧＰＣ３）である。
【００２２】
本発明の第二の側面の任意の項目の方法によれば、本発明は、以下の項目（１）〜（４）：
（１）接触が、４〜４０℃、好ましくは６〜３７℃、より好ましくは１５〜２５℃の温度、例えば室温で行われる；
（２）接触が、１０〜６０分間、好ましくは２０〜５０分間、より好ましくは３０〜４０分間の時間、行われる；
（３）接触が、溶液中で行われ、溶液が例えば生理学的生理食塩水溶液または緩衝溶液であり、緩衝溶液が例えばリン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、乳酸緩衝溶液または炭酸緩衝溶液である；
（４）接触が、４．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．５〜７．５、より好ましくは７．０〜７．２のｐＨで行われる
の１つまたはそれより多くで特徴付けられる。
【００２３】
本発明のいくつかの態様において、緩衝溶液はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）である。
本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤はジメチルスルホキシド中に溶解される。
【００２４】
本発明はさらに、医薬品および／またはワクチンの製造における、本発明の第一の側面の項目の任意の１つのタンパク質−細胞コンジュゲートの使用であって、医薬品および／またはワクチンが、以下の疾患：
（１）タンパク質−細胞コンジュゲート中のタンパク質と関連する疾患；
（２）悪性腫瘍；
（３）病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患；
（４）自己免疫疾患
の１つまたはそれより多くの予防または治療のために用いられる、前記使用に関する。
【００２５】
本発明はさらに、以下の疾患：
（１）タンパク質−細胞コンジュゲート中のタンパク質と関連する疾患；
（２）悪性腫瘍；
（３）病原性微生物によって引き起こされる感染性疾患；
（４）自己免疫疾患
の１つまたはそれより多くの予防または治療のための方法であって；
本発明の第一の側面の項目のいずれか１つのタンパク質−細胞コンジュゲートの予防的または療法的有効量を、こうした必要がある対象に投与する工程を含む、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、タンパク質および細胞のＳＭＣＣへのカップリングの模式図を示し、図中、「タンパク質」はタンパク質分子を指し、「細胞」は細胞を指す。
【図２】図２は、ＳＭＣＣへのＫＬＨのカップリング後のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、ＫＬＨおよびＳＭＣＣの反応系の透析前および透析後の高圧液体クロマトグラフィの結果を示し；左のピークはＫＬＨピークであり、右のピークはＳＭＣＣピークであり；図中、左のピークに関する３つの曲線は、上から下の順に、透析前のＳＭＣＣ＋ＫＬＨ、透析後のＳＭＣＣ＋ＫＬＨ、ＳＭＣＣであり、右のピークに関する３つの曲線は、上から下の順に、透析前のＳＭＣＣ＋ＫＬＨ、ＳＭＣＣ、透析後のＳＭＣＣ＋ＫＬＨであり；左の縦軸はＵＶ吸光度（ＡＵ）であり、下部横軸は保持時間（１／１０分）であり、単位は分であり、右の縦軸は伝導率であり、単位はミリジーメンス／ｃｍ（ｍＳ／ｃｍ）であり、上部横軸は試験管番号である。
【図４】図４は、マウス脾臓細胞表面上のスルフヒドリル分布を検出するためのフローサイトメトリーの結果を示し、図中、Ａは、いかなる染色もない細胞（陰性対照）を指し、Ｂは、ＳＭＣＣ−ＫＬＨにカップリングせず、そしてフルオレセイン連結マレイミドで染色された細胞を指し（細胞表面のスルフヒドリルレベルを反映する）、Ｃは、ＳＭＣＣ−ＫＬＨにカップリングされ、そしてフルオレセイン連結マレイミドで染色され、そして抗ＫＬＨ−ＡＰＣで染色された細胞を指す（ＳＭＣＣはいくつかのスルフヒドリル基を占めるため、フルオレセイン連結マレイミド染色は弱まる）。
【図５】図５は、カップリング前および後の上清中のタンパク質含量（Ａ）、ならびに脾臓細胞にＫＬＨ−ＳＭＣＣをカップリングする前および後のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果（Ｂ）を示す。
【図６】図６は、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞およびＫＬＨで動物を免疫することによって誘導された免疫反応の比較フローサイトメトリーの結果を示し、図中、Ａは、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、これらは（培養溶液を除いて）いかなる他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激にも供されておらず、Ｂは、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、これらは非特異的タンパク質−ヒトアルブミン（ＡＬＢ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に供されており（陰性対照）、Ｃは、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、これらは植物性血球凝集素（ＰＨＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に供されており（陽性対照）、Ｄは、ＫＬＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を伴う、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、Ｅは、いかなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激も伴わない、ＫＬＨで免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、Ｆは、ＡＬＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を伴う、ＫＬＨで免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、Ｇは、ＰＨＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を伴う、ＫＬＨで免疫されたマウスの脾臓細胞を指し、Ｈは、ＫＬＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を伴う、ＫＬＨで免疫されたマウスの脾臓細胞を指す。
【図７】図７は、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞によって誘導されるＴ細胞増殖を示す。
【図８】図８は、ＳＭＣＣ−インスリン・カップリング脾臓細胞の膜表面上にカップリングしたインスリンの免疫蛍光アッセイの結果を示し；図中、Ａはインスリンとインキュベーションした脾臓細胞を指し、ＢはＳＭＣＣ−インスリンとインキュベーションした脾臓細胞を指す。
【図９】図９は、ＧＰＣ３およびアジュバントの筋内注射によって、マウスの免疫から生じる抗体力価を示す。
【図１０】図１０は、マウスにおいて、ＧＰＣ３カップリング脾臓細胞の注入から生じる抗体力価を示す。
【図１１】図１１は、マウスにおいてＧＰＣ３カップリング脾臓細胞の注入によって誘導される抗腫瘍効果を示し、図中、左のパネルは対照群を指し、そして右のパネルはＧＰＣ３カップリング脾臓細胞群を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、以下のように詳細に記載される。
本発明において、タンパク質は、損なわれていないタンパク質分子、またはエピトープ機能などの特定の機能を持つポリペプチドのいずれかであることが可能であり、そしてポリペプチドのサイズは８〜１００アミノ酸であることが可能であり、ここでタンパク質またはポリペプチドのアミノ基は、二官能性架橋剤と化学的に反応して、共有結合を形成することが可能である。
【００２８】
本発明において、タンパク質には、限定されるわけではないが、抗原タンパク質（例えば腫瘍関連抗原、感染性疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原）、エピトープ、抗体、ホルモン、増殖因子（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ等）、ビタミン、コロニー刺激因子（例えばＧ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）が含まれる。
【００２９】
タンパク質が抗原タンパク質または抗原エピトープである場合、抗原タンパク質は、タンパク質−細胞コンジュゲート中の細胞を通じて、リンパ系組織に運ばれることが可能であり、抗原タンパク質のターゲティング能が改善されうる。
【００３０】
タンパク質が抗体、ホルモン、増殖因子等である場合、キラー細胞は、抗体等のターゲティング能を利用することによって、ターゲット細胞に運ばれることが可能であり、ターゲット細胞に対する殺傷効果が改善されうる。例えば、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、抗体による腫瘍細胞の表面抗原の認識によって腫瘍に運ばれることも可能であり、腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷および除去効果が改善されうる。
【００３１】
本発明のいくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
本発明において、抗体は、損なわれていない抗体、またはその抗原結合部位のいずれかであることが可能である。
【００３２】
本発明において、細胞は、好ましくは、表面上に分布する遊離のスルフヒドリル基を有する細胞であり、そしてスルフヒドリル基は、二官能性架橋剤と化学的に反応して、共有結合を形成することが可能である。当業者には、表面上に分布したスルフヒドリル基を有する細胞には：リンパ球（例えばＢ細胞、Ｔ細胞）、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞等が含まれることが周知である（Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｔ  Ｓｔｅｐｈａｎ，  Ｊａｍｅｓ  Ｊ  Ｍｏｏｎ，  Ｓｏｏｎｇ  Ｈｏ  Ｕｍら  表面コンジュゲート化合成ナノ粒子を伴う療法細胞操作  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０１０，  １６（９），  １０３５−１０４２）。これらの細胞を、血液（例えば末梢血）から得るか、または組織から分離し、そして得ることが可能である。
【００３３】
本発明において、細胞は生存細胞または死んだ細胞（例えばアポトーシス細胞）であることが可能である。
本発明において、細胞は、単一種の細胞、または複数種の細胞の混合物であることが可能であり、例えばＴリンパ球およびＢリンパ球の混合物であることも可能であるし、あるいはさらに、単球または他の細胞構成要素を含むことも可能である。
【００３４】
本発明において、細胞を分離しそして培養するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、細胞は、末梢血から分離されてもよく、または骨髄から分離されてもよく、または組織から分離されてもよい。
【００３５】
本発明のいくつかの態様において、細胞は脾臓から分離され、そして得られた脾臓細胞は、主に、リンパ球を含む。
本発明において、タンパク質−細胞コンジュゲート中のリンカーは、それぞれ、タンパク質および細胞との二官能性架橋剤の化学的反応後に形成される連結基である。
【００３６】
本発明において、二官能性架橋剤は、タンパク質にカップリング可能な（すなわちタンパク質と共有結合を形成する）基、および細胞にカップリング可能な（すなわち細胞と共有結合を形成する）基の両方を含む化合物を指す。
【００３７】
本発明のいくつかの態様において、アミノ基と反応可能な基を用いて、タンパク質に二官能性架橋剤をカップリングすることも可能であり、一方、スルフヒドリル基と反応可能な基を用いて、細胞に二官能性架橋剤をカップリングすることも可能である（図１を参照されたい）。
【００３８】
本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤は、スクシンイミジル基およびマレイミジル基の両方を含み、ここでスクシンイミジル基を用いてタンパク質に剤をカップリングし、そしてマレイミジル基を用いて細胞に剤をカップリングする。
【００３９】
本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤のスクシンイミジル基は、タンパク質の遊離のアミノ基と反応して、アミド結合を形成し、一方、二官能性架橋剤のマレイミジル基は、遊離のスルフヒドリル基と反応して、チオエーテル結合を形成する（図１を参照されたい）。
【００４０】
本発明において、アミド結合は−ＣＯ−ＮＨ−を指し；本発明のいくつかの態様において、アミド結合は、ＳＭＣＣのスクシンイミジル基およびタンパク質分子の遊離のアミノ基の間の「クリック（click）」化学反応によって形成される連結を指す。
【００４１】
本発明において、チオエーテル結合は、Ｒ１−Ｓ−Ｒ２を指し、式中、Ｒは有機基であり；本発明のいくつかの態様において、チオエーテル結合は、マレイミジル基および細胞膜上の遊離のスルフヒドリル基の間で形成される共有結合を指す。
【００４２】
当該技術分野において周知であるが、本発明に列挙されていない他の二官能性架橋剤、例えばスクシンイミジルおよびマレイミジル基の両方を含む架橋剤もまた、本発明において使用可能である。
【００４３】
本発明において、タンパク質−細胞コンジュゲートを調製するための方法は：二官能性架橋剤にタンパク質をカップリングする工程、および次いで、二官能性架橋剤とコンジュゲート化したタンパク質を、細胞にカップリングする工程を含み；好ましくは、細胞にタンパク質をカップリングする前に、非連結二官能性架橋剤を除去する工程をさらに含み、または好ましくは、細胞にタンパク質をカップリングした後に、二官能性架橋剤にカップリングした遊離のタンパク質を除去する工程をさらに含み；あるいは
方法は：二官能性架橋剤に細胞をカップリングする工程、および次いで、二官能性架橋剤にカップリングした細胞を、タンパク質にカップリングする工程を含み；好ましくは、タンパク質に細胞をカップリングする前に、非連結二官能性架橋剤を除去する工程をさらに含み、または好ましくは、タンパク質に細胞をカップリングした後に、連結していないタンパク質を除去する工程をさらに含む。
【００４４】
本発明において、タンパク質をまず、二官能性架橋剤にカップリングしてよく、次いで、二官能性架橋剤とコンジュゲート化したタンパク質を、細胞にカップリングする；または細胞をまず、二官能性架橋剤にカップリングしてよく、次いで、タンパク質を、二官能性架橋剤とコンジュゲート化した細胞にカップリングする。
【００４５】
本発明において、非連結二官能性架橋剤を除去するプロセスには、当該技術分野において周知のプロセスが含まれ、そしてこうしたプロセスは、コンジュゲートのサイズにしたがって選択可能であり、例えば、該プロセスは、接線流濾過（ＴＦＦ）、吸着クロマトグラフィ、例えば高圧液体クロマトグラフィ、吸着濾過、選択的沈殿または透析であることが可能である。
【００４６】
本発明において、遊離のタンパク質から細胞を分離するプロセスは、当該技術分野において周知であり、例えば、細胞含有溶液中のタンパク質を、遠心分離によって除去することが可能である。
【００４７】
本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤およびタンパク質または細胞の間のカップリング反応は、溶液中で行われる。反応溶液は、当業者によって、タンパク質および細胞の特性にしたがって選択可能である。本発明のいくつかの態様において、反応をリン酸緩衝溶液中で行う。本発明のいくつかの態様において、二官能性架橋剤は、ジメチルスルホキシド中で溶解される。
【００４８】
本発明において、用語「カップリング」は、２つの分子間または分子および細胞間の化学反応を通じて、共有結合を形成することを指す。
本発明において、緩衝溶液は、「弱酸およびその共役塩基」または「弱塩基およびその共役酸」からなる緩衝剤対から調製される溶液を指し、そしてある量の他の物質が添加された際のｐＨ変化を減少させることが可能である。
【００４９】
本発明において、タンパク質と関連する疾患は、例えば、腫瘍抗原タンパク質関連の腫瘍、あるいは病原性微生物の既知の特異的表面抗原タンパク質と関連する感染性疾患、あるいは自己抗原タンパク質と関連する自己免疫疾患、あるいは、タンパク質と関連することが知られており、かつ該タンパク質に対する免疫反応を刺激するかまたは該タンパク質に対する免疫寛容を誘導することによって、予防または治療することが可能である他の疾患、であることが可能である。
【００５０】
本発明のいくつかの態様において、抗原は癌抗原である。本明細書において、「癌抗原」は、腫瘍または癌細胞表面と関連する化合物、例えばペプチドまたはタンパク質であり、そして抗原が抗原提示細胞の表面上に発現されている場合、免疫反応を誘発することが可能である。癌抗原は、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＰＡら  （１９９４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１０５５−８に記載されるように、癌細胞から癌細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組換え技術によって、または既知の抗原の新規合成によって、得ることが可能である。癌抗原には、限定されるわけではないが、組換え的に発現される抗原、腫瘍または癌の免疫原性部分、あるいは腫瘍または癌全体が含まれる。これらの抗原を単離するか、または組換え的にもしくは当該技術分野において知られている任意の他の方法によって調製することが可能である。
【００５１】
用語「癌抗原」および「腫瘍抗原」は、互換的に使用可能であり、そして癌細胞によって示差的に発現される抗原を指し、そしてそれによって癌細胞をターゲティングするために利用可能である。癌抗原は、著しい腫瘍特異的免疫反応を刺激することが可能な抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常細胞において、通常、サイレントである（すなわち発現されない）もの、分化の特定の段階でのみ発現されるもの、および一時的に発現されるもの（例えば胚抗原および胎児性抗原）と特徴付け可能である。他の癌抗原は、突然変異体遺伝子、例えば癌遺伝子（例えば活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば突然変異体ｐ５３）によってコードされるか、あるいは内部欠失または染色体転座から生じる融合タンパク質である。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子によってコードされるもの、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスによって運ばれるものであることも可能である。腫瘍抗原の例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシン・デアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ１１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−ウボモルリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−プラコグロビン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発性大腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、カルスペクチン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えばヒト・パピローマウイルスのタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、１ｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶにコードされる核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１お��びＣＴ−７およびｃ−ｅｒｂＢ−２が含まれる。
【００５２】
癌または腫瘍およびこうした腫瘍に関連する腫瘍抗原には（排他的ではないが）、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６；ａｍ１１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇイディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−ウボモルリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−プラコグロビン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（１ｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球系細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、癌胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（１ｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ならびに、その免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸部および食道の扁平細胞癌（ウイルス産物、例えばヒト・パピローマウイルスタンパク質）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、および黒色腫（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ｒａｓ；ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７）が含まれる。
【００５３】
本発明のいくつかの態様において、悪性腫瘍には、限定されるわけではないが、皮膚の基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳およびＣＮＳの癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮細胞における新生物、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌（例えば小細胞および非小細胞肺癌）、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽腫、口部癌（例えば、唇、舌、口腔および咽頭癌）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌および肉腫が含まれる。腫瘍関連抗原は、例えば、肝臓癌のα−フェトプロテイン、黒色腫のチロシナーゼ関連タンパク質−２等であることが可能である。
【００５４】
本発明において、感染性疾患は、例えば、細菌、真菌、ウイルスおよび寄生虫に関連する感染性疾患であることが可能である。
ウイルスには、限定されるわけではないが：レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩとも称される）、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩ、ならびに他の単離体、例えばＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒト・コクサッキーウイルス、ライノウイルス、ヒト腸管オーファンウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、ルベラウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばハンターンウイルス、寄生性エジネシア（ａｅｇｉｎｅｔｉａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水疱性帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、牛痘ウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えばアフリカ・ブタ熱ウイルス）；ならびに分類されていないウイルス（例えばΔ肝炎因子（Ｂ型肝炎ウイルスの不全付随体（ｔｒａｂａｎｔ）ウイルスと考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎因子（クラス１＝内在伝染；クラス２＝非経口伝染（すなわちＣ型肝炎））；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が含まれる。
【００５５】
細菌には、グラム陰性およびグラム陽性細菌が含まれ、これらはどちらも脊椎動物における抗原として使用可能である。グラム陽性細菌には、限定されるわけではないが、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種が含まれる。グラム陰性細菌には、限定されるわけではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種が含まれる。感染性細菌の例には、限定されるわけではないが、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の種（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、ゴードン・マイコバクテリウム（Ｇｏｒｄｏｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性菌）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の種、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の種、フゾバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  Ｉｓｒａｅｌｉ）が含まれる。
【００５６】
真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。
【００５７】
寄生虫の例には、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、ならびにトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。血液感染性および／または組織寄生虫には、プラスモジウム属の種、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ディベルゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）の種、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  Ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマ・ロデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）（アフリカ眠り病）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）（シャーガス病）、およびトキソプラズマ原虫が含まれる。
【００５８】
感染性疾患に関連するタンパク質抗原の大部分は開示されてきている。例えば、Ｂ型肝炎の表面抗原タンパク質、ＡＩＤＳのＨＩＶ関連タンパク質、大部分の細菌の膜タンパク質、真菌の壁保持タンパク質、寄生虫の発生プロセスの異なる段階の寄生虫タンパク質である。
【００５９】
本発明において、自己免疫疾患には、限定されるわけではないが、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多様な皮膚疾患、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病等が含まれる。いくつかの自己免疫疾患と関連する自己抗原が開示されており，例えばＩ型糖尿病の膵臓の膵島β細胞抗原、多発性硬化症の神経鞘細胞抗原、乾癬のＰｓｏ  ｐ２７、関節リウマチのｈｓｐ９０、クローン病のＣＵＺＤ１およびＪＰ２等である。
【００６０】
本発明において、細胞を使用する目的にしたがって生存細胞またはアポトーシス細胞を使用することが可能である。例えば、腫瘍または感染性疾患の予防または治療のためにヒト免疫反応を活性化させようとする場合、生存細胞が使用可能であり；一方、自己免疫疾患の予防または治療のために自己または外部抗原に対する免疫寛容を誘導しようとする場合、アポトーシス細胞が使用可能である（安定なアポトーシス細胞は免疫寛容を誘導する特性を有するため）。
【００６１】
アポトーシス細胞を調製するための方法は当該技術分野において周知であり、例えばタンパク質とカップリングした細胞を、紫外線で照射して、アポトーシス細胞を産生することが可能である。
【００６２】
本発明において、上記使用のためには、自己細胞または同種異系細胞が使用可能である。自己細胞は、好ましくは、自己免疫疾患の予防または治療に用いられる。
本発明において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ等を指す。
【００６３】
本発明において、有効量は、本発明に開示するような疾患または障害の治療、予防、軽減および／または緩和を達成可能な用量を指す。
本発明の有益な効果
本発明において、二官能性架橋剤を用いて、好適にそして有効にタンパク質および細胞をカップリングして、タンパク質−細胞コンジュゲートを得て、該コンジュゲートは、得たコンジュゲートのタンパク質および細胞の特性にしたがって、多くの目的に使用可能であり、例えば、細胞のターゲット能または抗原提示を利用して、タンパク質のより優れた免疫を発揮することが可能であり、そしてその一方、細胞が運ぶ非常に少量のタンパク質が直接免疫で用いる多量の遊離の可溶性タンパク質と類似のまたはそれより優れた効果を達成可能であるため、多量のタンパク質の直接免疫の副作用を回避可能である。
【００６４】
本発明の態様は、実施例と組み合わせて以下のように詳細に記載されるが、当業者は、以下の実施例が、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ用いられることを理解するであろう。実施例において、特定の条件が与えられていない場合、慣用的な条件または製造者によって示唆される条件が適用されるであろう。製造者が示されていない試薬または装置は、市場において商業的に入手可能である、慣用的な製品であった。
【実施例】
【００６５】
実施例１：スクシンイミジル４［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）への抗原のカップリング
１）ツール抗原、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品番号７７６５３）を入手し、そしてＰＢＳ溶液で調製して、１０ｍｇ／ｍｌ溶液を形成し、そしてＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国、商品番号２２３６０）を入手し、そしてジメチルスルホキシドと混合して、１０ｍＭ溶液を形成した。０．３ｍｌ  ＫＬＨ溶液および３０μｌの上記ＳＭＣＣ溶液を３ｍｌ  ＰＢＳ反応系に入れ、室温で３０分間インキュベーションし、そして反応後、次いで、タンパク質をＳＭＣＣ連結効率を決定するためのアッセイに供した。
【００６６】
２）タンパク質電気泳動によるＳＭＣＣ連結効率の決定：反応後、上記タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ＫＬＨタンパク質を対照として用い、そして結果を図２に示した。ＳＭＣＣ−ＫＬＨバンドの位置の分子量は、ＫＬＨバンドの位置と比較して、著しく増加することが見られ、ＳＭＣＣ−ＫＬＨバンドの下のテーリング現象は、ＫＬＨのごく一部のアミノ基が、なお、ＳＭＣＣによって飽和していないという事実のためである可能性があり、そしてこれはＳＭＣＣ濃度を増加させることによって改善可能であった。
【００６７】
３）遊離のＳＭＣＣの除去：ＳＭＣＣは低分子物質であり、そしてしたがって遊離のＳＭＣＣは、ＫＬＨ−ＳＭＣＣ反応系に不可避的に存在するが、遊離のＳＭＣＣは、ＫＬＨ−ＳＭＣＣおよび細胞のカップリングに深刻に影響を及ぼすであろう。工程１）の後に得られる溶液を、２Ｌ  ＰＢＳ溶液で、室温で一晩透析した。透析後、透析前および透析後のタンパク質溶液を高圧液体クロマトグラフィに供し、そしてその結果を図３に示した。ＳＭＣＣピークは、透析後に実質的に消滅することが見られ、これは遊離のＳＭＣＣが実質的に除去されたことを示した。透析後のタンパク質を凍結乾燥し、そして−８０℃で保存した。
【００６８】
実施例２：マウス脾臓細胞へのＫＬＨ−ＳＭＣＣのカップリング
１）脾臓細胞表面上のスルフヒドリル基の分布：
まず、脾臓細胞を調製した。新鮮な脾臓をＢａｌｂ／ｃマウスから採取し、すりガラス表面を持つ小さい容器中に入れ、次いで、すりガラス表面を持つ乳棒を用いて穏やかにすりつぶし、脾臓の細胞ホモジネートを調製した。次いで、赤血球を赤血球溶解溶液（ＢＤ社、米国、商品番号３４９２０２）で溶解して、脾臓の単核細胞を得た。脾臓の単核細胞（このうち、リンパ球が約９５％またはそれより多かった）をＰＢＳ溶液で洗浄し、そしてＰＢＳ溶液中に再懸濁した。マウス脾臓の単核細胞の表面上のスルフヒドリル基の分布をマレイミド−フルオレセイン剤（フルオレセイン−５−マレイミド、マレイミド−ＦＬ、ＡＮＡ  Ｓｐｅｃ社、商品番号８１４０５）で測定した。具体的な方法は：（製造者の説明書にしたがって）マレイミド−ＦＬ試薬と脾臓細胞を、室温で３０分間インキュベーションし、マレイミジル基が細胞膜上のスルフヒドリル基と反応するようにする工程を含んでいた。細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、次いで、蛍光強度をフローサイトメーターで測定した。蛍光強度は、細胞膜表面上のスルフヒドリル基の密度に相当し、そして結果を図４に示した。
【００６９】
２）マウス脾臓細胞へのＫＬＨ−ＳＭＣＣのカップリングおよびそのアッセイ：
１×１０７の脾臓細胞／０．２ｍｌ  ＰＢＳ／０．２ｍｇ  ＫＬＨ−ＳＭＣＣ（０．２ｍｇはＫＬＨの量を指す）の比で、実施例１において調製したようなマウス脾臓細胞（１×１０７）およびＫＬＨ−ＳＭＣＣを、室温で３０分間、相互作用に供し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄して、細胞に連結されていないＫＬＨ−ＳＭＣＣを除去した。その後、抗ＫＬＨ−ＡＰＣ（ＢＤ社、米国、商品番号５６０７２０）およびマレイミド−フルオレセインを染色に用いて、細胞膜上にカップリングしたＫＬＨおよび細胞表面上の遊離のスルフヒドリル基をそれぞれ測定し、そして結果を図４に示した。図４は、ＫＬＨ−ＳＭＣＣが細胞に有効にカップリングして、ＫＬＨカップリング脾臓細胞（ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞）を得ることが可能であることを明らかにした。
【００７０】
３）ＫＬＨが細胞にカップリングしているかどうかをさらに検証するため、細胞反応前および後の溶液をタンパク質含量に関するＥＬＩＳＡアッセイ（タンパク質濃度アッセイキットは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品番号２３２２５であった）に供し、そして結果は、タンパク質濃度が反応後にわずかに減少し、つまり、上清中のＫＬＨタンパク質濃度は、細胞反応前には３．６３３±０．０８８ｍｇ／ｍｌであり、そして上清中のＫＬＨタンパク質濃度は反応後に３．５０±０．０５８ｍｇ／ｍｌであり、ＫＬＨが細胞にカップリングしたことが示された（図５Ａ）。細胞にカップリングしたタンパク質の量は、以下の式：（（３．６３３−３．５０）／３．６３３）×０．２ｍｇ（反応前の溶液中の実際のＳＭＣＣ−ＫＬＨ含量）＝０．００７４ｍｇによって計算可能であり、したがって、１×１０７の脾臓細胞に連結されたタンパク質の量は約０．００７４ｍｇであった。細胞反応前および後の溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、そして結果はＥＬＩＳＡの結果と一致した。図５Ｂに示すように、反応後の電気泳動バンドの密度は、反応前のものと著しくは異ならず、これは、細胞にカップリングしたタンパク質が少量であることを示した。
【００７１】
実施例３：ＫＬＨカップリング脾臓細胞の活性アッセイ
１）ＫＬＨカップリング脾臓細胞によって誘導されるＫＬＨに対する免疫反応
実施例２において調製される、１×１０７（細胞にカップリングしたＫＬＨの量は約０．００７４ｍｇであった）の数のＫＬＨカップリング脾臓細胞（ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞）を、尾静脈内注射を通じてマウスに投与し、一方、対照には、腹腔内注射を通じて、０．４ｍｇ  ＫＬＨを投与し；別の対照群には、尾静脈内注射を通じて、１×１０７の非カップリング脾臓細胞を投与した（各群あたり３匹のＢａｌｂ／ｃマウス）。注射を週１回、２週間行い；２回目の注射の１週間後にマウスを屠殺し、そして免疫学的アッセイのため、マウスの脾臓細胞を採取した。マウス脾臓細胞をカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、商品番号Ｃ３４５５４）で染色した。染色法は以下の工程を含んでいた：１μＭ  ＣＦＳＥを２×１０７の細胞を含有する２ｍｌ細胞溶液に添加し、３７℃で１０分間染色を行い、次いで、細胞を１０ｍｌ  ＰＢＳ溶液で１２００ｒｐｍで２回遠心分離することによって洗浄し、そして次いで、続く細胞培養のため、細胞を細胞培養溶液中に再懸濁した。染色した脾臓細胞（１×１０６／ウェル）をＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）、ヒトアルブミン（ＡＬＢ、１０μｇ／ｍｌ）（Ｂａｘｔｅｎ社、商品番号ＶＮＡＩＭ０６８）、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社、商品番号Ｌ−８７５４）および１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地の刺激とともに、それぞれ４〜５日間培養し、次いで、フローサイトメーターで、Ｔ細胞の分裂および増殖をアッセイした。細胞分裂回数が多ければ多いほど、細胞上のＣＦＳＥの蛍光強度は低くなる。したがって、細胞増殖は、ＣＦＳＥの蛍光強度によって決定可能であった。図６に示すように、ＫＬＨカップリング脾臓細胞の注入は、ＫＬＨに対する非常に強い免疫反応を誘導した。細胞にカップリングしたＫＬＨの量は非常に少ないが、それによって誘導される、ＫＬＨに対する免疫反応は、動物において、多量のＫＬＨタンパク質での免疫によって誘導されるものよりさらに強い。
【００７２】
２）リンパ球増殖の試験
Ｂａｌｂ／ｃマウス（群あたり３匹のマウス）を、０．２ｍｇ  ＫＬＨで免疫し、実施例２で調製した１×１０７のＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞、１×１０７の脾臓細胞、０．２ｍｇ  ＫＬＨインキュベーション脾臓細胞（細胞−ＫＬＨ、この群を用いて、ＫＬＨおよび細胞の天然接着によって誘導される免疫効果を観察した。インキュベーション法は：１×１０７の脾臓細胞を、０．４ｍｌ  ＰＢＳ溶液中、０．２ｍｇ  ＫＬＨと室温で４０分間反応させる工程を含んでいた）。純粋なＫＬＨ  ０．２ｍｇおよび１×１０７の脾臓細胞を、腹腔内および静脈内注射で、それぞれ、週１回２週間、マウスに投与した。マウスを最後の注射の１週間後に屠殺し、そして脾臓細胞を分離した。脾臓細胞（１×１０６／ウェル）をＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）の刺激とともに５日間培養し、そして最後の１６時間の間、３Ｈ−ＴｄＲ（０．２５μＣｉ／ウェル）を添加した（３Ｈ−ＴｄＲは、中国軍事医学科学院の薬理学・毒性学研究室から提供され、そしてこの試験は中国軍事医学科学院の薬理学・毒性学研究室に委託して測定した）。液体シンチレーション分析装置を用いて、３Ｈ−ＴｄＲの取り込み量（ｃｐｍ）を決定した。取り込み量が多ければ多いほど、細胞増殖はより多い。図７に示すように、ＫＬＨおよびＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞の処置に供されたマウスにおいて、強いＴ細胞反応が誘導される一方、ＫＬＨのインキュベーションに供されたが、ＳＭＣＣにカップリングしていない細胞は、マウスにおいて、非常に弱いＴ細胞反応を誘導したのみであり、これはいかなる処置も行わない細胞よりもわずかに高いのみであった（ＫＬＨ群と比較して、ｐ＜０．０１；ＫＬＨ−ＳＭＣＣ−脾臓細胞群に比較して、ｐ＜０．０１）。
【００７３】
実施例４：インスリン・カップリング脾臓細胞の膜カップリング・インスリンの免疫蛍光分析
ＳＭＣＣ−インスリンを調製するためのプロセスは、実施例１におけるＳＭＣＣ−ＫＬＨの調製と同じであった。続いて、実施例２に記載する方法にしたがって、ＳＭＣＣ−インスリンおよび脾臓細胞をインキュベーションして、インスリン・カップリング脾臓細胞を得た。その後、回転装置を用いて、細胞をガラススライド上でスピンさせ、そして慣用的な免疫蛍光法によって、細胞を染色した。具体的なプロセスに関しては、インスリン・フルオレセイン染色キット（インスリン・フルオレセイン染色キット、コスモバイオ社、日本）の説明書を参照した。対照群はインスリンとインキュベーションした脾臓細胞であった。図８から、ＳＭＣＣ−インスリンは、非常に高い強度で脾臓細胞に成功裏にカップリングしたことがわかり、そして円形の蛍光は、さらに、インスリンが細胞膜にカップリングしたことを示した。対照的に、対照群の細胞は染色されず、陽性染色が、非特異的バックグラウンド染色ではなく、インスリン特異的染色であることが示された。
【００７４】
実施例５：肝臓癌特異的抗原ＧＰＣ３にカップリングされた脾臓細胞の注入によって誘導される、肝臓癌抗原グリピカン−３（ＧＰＣ３）に対する高力価抗体の生成、およびその抗腫瘍効果
抗原カップリングおよび注入：組換えヒトＧＰＣ３抗原タンパク質は、フロリダ大学病理学科のＬｉｕ教授の研究室で発現され、そして精製されたタンパク質であった（ＧＰＣ３タンパク質配列番号：ＡＫ２２２７６１、ＡＫ２２２７６６，ＡＫ３００１６８、ＡＫ３１０１９６またはＡＫ３１０６８９）。２×１０８の脾臓細胞およびＧＰＣ３タンパク質（０．２ｍｇ／ｍｌ）および５０μＭスルホン化ＳＭＣＣ（スルホ−ＳＭＣＣ）を振盪しながら、０．５ｍｌ反応系中、室温で１時間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、非カップリングＧＰＣ３タンパク質を除去した。細胞をＰＢＳで再懸濁して、１×１０８／ｍｌ細胞懸濁物を得た。各Ｂａｌｂ／ｃマウスを２００μｌのＧＰＣ３カップリング脾臓細胞（試験群）または２００μｌ  ＰＢＳ（対照群）の静脈内注射に供した。
【００７５】
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＧＰＣ３抗原タンパク質カップリング脾臓細胞（２×１０７の細胞／マウス）の静脈内注射に供した。対照群をＰＢＳ溶液の注入に供した。注入を週１回、２週間行った。２週間後、抗凝血試料を収集し、そしてＧＰＣ３特異的抗体のアッセイ（慣用的ＥＬＩＳＡアッセイ）のため、血漿を調製し；その間、マウスのすべての群を同系マウスの肝臓癌細胞株（１ＭＥＡ、ヒトＧＰＣ３遺伝子でトランスフェクションしたＢａｌｂ／ｃマウスの肝臓癌細胞株）（２×１０５細胞／マウス）の皮下注射に供し、そして対照群に、等量のＰＢＳを注射した。肝臓癌細胞の腫瘍形成および生長を動的に観察した。
【００７６】
ＧＰＣ３カップリング脾臓細胞の注入は、高レベルの抗ＧＰＣ３抗体を誘導した；本発明者らの先の試験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、筋内注射を通じて、フロイントアジュバントとともに添加したＧＰＣ３（５０μｇ／回／マウス）で、週１回２週間免疫し、そして第３週に収集した血漿中の抗体力価を測定した。結果は、いかなる検出可能なＧＰＣ３抗体もないことを示した（図９を参照されたい）。
【００７７】
注入用のＧＰＣ３カップリング脾臓細胞に関しては、細胞表面上にカップリングしたタンパク質の量は非常に少なかった。細胞あたり１０４のスルフヒドリル基があるという事実（Ｌａｕｒｅｎｃｅら，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏ，  １９９６）にしたがえば、２×１０７の細胞は、２×１０１１のスルフヒドリル基を有し、そしてこれらのすべてが飽和されれば、細胞に連結されたタンパク質分子の数は２×１０１１であった。したがって、飽和の場合、カップリングするタンパク質のモル数は：２×１０１１／６×１０２３＝３．３３×１０−１３であった。ＧＰＣ３の分子量は６２ＫＤであった。細胞にカップリングされるタンパク質の最大量は：６２×１０００×３．３３×１０−１３ｇ＝２．０６５×１０−８ｇ＝２．０６５×１０−２μｇであった。したがって、細胞によって所持され、そして体内に注入されうるタンパク質のありうる最大量は、筋内注射のもののわずか１／２０００であった。しかし、前者は高レベルの抗体を誘導可能であった（図１０を参照されたい）。
【００７８】
ＧＰＣ３カップリング脾臓細胞の注入は、非常に強い抗腫瘍効果を誘導し；マウスを２週間免疫した後、肝臓癌抗原ＧＰＣ３を高発現するネズミ肝臓癌細胞株を皮下注射した（２×１０５細胞／マウス）。５週間後、本発明者らは、対照群において腫瘍が迅速に生長し、塊が大きく、皮膚隆起が明らかであり、そして皮膚潰瘍が現れることを見出した。一方、試験群において、マウス中の腫瘍は小さく、そして皮膚隆起はほぼ観察不能であった。図１１は、対照群（左の図）および試験群（右の図）から切除された腫瘍塊を示す。
【００７９】
本発明は、特定のモデルで詳細に記載されるが、当業者は、上に開示したすべての解説にしたがって、これらの詳細は多様な修飾および置換に供することが可能であり、そしてすべてのこれらの変化が、本発明の保護範囲内に属することを理解するであろう。本発明の全保護範囲は、付随する請求項およびその任意の同等物によって提供される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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