(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子プロセッサを含む装置であって、各生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される１つ以上のバイオリアクターチャンバー；
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体；
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素；並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記１つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された１つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記１つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端及び出力端を有し、前記１つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも（ｉ）前記１つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、前記１つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第１のセンサーと（ｉｉ）前記１つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、前記１つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第２のセンサーとを含む２つ以上のセンサーを含む、１つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、装置。
【請求項２】
前記１つ以上のバイオリアクターチャンバー内及び前記１つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を生成するように機能的に配置された電場発生器をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記１つ以上の飛行時間型チャネルが、幅５０ｎｍ以下でありかつ深さ５０ｎｍ以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記１つ以上の飛行時間型チャネルが、長さ５μｍ〜２５０μｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記１つ以上のバイオリアクターチャンバーが、幅１００〜１０００ｎｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記１つ以上のバイオリアクターチャンバー内の前記支持構造体が、幅５０〜９００ｎｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記固体基板がポリマー材料で作られている、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記切断酵素がエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記２つ以上のセンサーがそれぞれ、貴金属ナノワイヤ、セグメント化されたナノワイヤ、又はナノ粒子から成る、１対の検出電極を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記１つ以上の飛行時間型チャネルが３つ以上のセンサーを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記１つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記１つ以上の飛行時間型チャネルが、電荷中性の親水性壁表面、荷電した親水性壁表面、又は電荷中性の疎水性壁表面を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
１０，０００個以上の生体分子プロセッサを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
以下の工程を含む、核酸分子の配列決定の方法：
請求項１に記載の装置を提供する工程；
前記装置の前記生体分子プロセッサに、１つ以上の核酸分子を含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記１つ以上の核酸分子に結合して前記１つ以上の核酸分子を前記１つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端に１つずつ入る単量体ヌクレオチドへと切断するのに有効な条件下で供給する工程；
切断された前記単量体ヌクレオチドを前記１つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記１つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記１つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程；
前記印加する工程に基づいて、切断された前記単量体ヌクレオチドを、それらが前記１つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１及び第２のセンサーを通過する際に検出する工程；
前記検出する工程に基づいて、切断された各単量体ヌクレオチドが前記１つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１及び第２のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるかを測定する工程；並びに
前記測定する工程に基づいて前記単量体ヌクレオチドを同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年２月８日に出願された米国仮特許出願、出願番号６１／７６２，６７１の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＮＩＨ−Ｒ２１−ＨＧ００６２７８−０１、及び全米科学財団によって与えられたＮＳＦ−ＥＰＳ−０３４６４１１及びＮＳＦ−ＥＰＳ−０７０１４９１のもとで政府の援助によって行われた。政府はこの発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は核酸の配列決定及びタンパク質／ポリペプチドの同定に好適な装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
１，０００ドルゲノムの恩恵は文献で十分に立証されている（Kaiser, J., "DNA Sequencing - A Plan to Capture Human Diversity in 1000 Genomes," Science 319:395-395 (2008)（非特許文献1）; Kuehn, B.M., "1000 Genomes Project Promises Closer Look at Variation in Human Genome," JAMA 300:2715-2715 (2008)（非特許文献2）; Mardis, E., "Anticipating the $1,000 Genome," Genome Biol. 7:112 (2006)（非特許文献3）; Metzker, M.L., "Emerging Technologies in DNA Sequencing," Genome Res. 15:1767-1776 (2005)（非特許文献4）; Schloss, J.," How to Get Genomes at One Ten-Thousandth the Cost," Nature Biotechnol. 26:1113-1115 (2008)（非特許文献5））。重要な帰結のいくつかには、（ｉ）ゲノム全体にわたる配列変異の評価を通じて、さらに効果的な疾患予防に役立ち、診断及び予後診断を改善して、特定の患者と適切な治療法をマッチングさせ得る個別化医療、（ｉｉ）ゲノム全体にわたる複雑性の理解；（ｉｉｉ）新しい治療剤の設計；及び（ｉｖ）配列変異の型を問わないインビトロ診断（ＩＶＤ）のための事実上の業界基準の開発が挙げられる。
【０００５】
例えば、散発性の変異、遺伝性の変異、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、メチル化パターン（エピジェネティクス）、遺伝子発現、コピー数の違い、マイクロサテライト不安定性等のような、種々の疾患の有効な生体マーカーとして役立つ多数の異なる遺伝的変化がある。残念ながら、これらの構造的な修飾はすべて独自のアッセイ形式を必要とし、したがって、それぞれの分子アッセイを行うのに必要な特殊化した装備及び専門知識のゆえに診療所で実施するのは難しい（Thomas et al., "Biomedical Microelectromechanical Systems (BioMEMS) Using Electrophoresis for the Analysis of Genetic Mutations," Molecular Review Diagnostics 2:429-447 (2002)（非特許文献6））。操作者の専門知識はほとんどなしで単一の機器を用いて配列の違いすべての存在／非存在を明らかにすることができる「標準的な」アッセイ形式は、ＩＶＤの完全な有用性を拡大するであろう。多くの場合、ゲノムにおける選択されたエクソンの広範な再配列決定が、配列変異の型に関わりなく、必要な感度を伴って必要な臨床情報を提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ配列決定における進歩は、胎児検診、移植有効性、癌及び他の疾患の検出、及び個々に応じた治療を改善する非侵襲性の分子診断を標準化し、進展させる可能性を秘めている。現在、素因となる疾患又は早期疾患を持つ患者は特定されず、疾患のある者が最良の治療を受けていない。それはすべて診断レベルの失敗のためである。その結果、臨床検査室で使用され得る自動化された超高速の配列決定プラットフォームを開発する緊急のニーズがある。そのような低コストの卓上機械が、分子マーカーの発見、検証及び臨床的利用を加速させるのに必要とされる。
【０００７】
例えば、癌の分野では、すべて血液試料からの早期検出、治療指針及び再発のモニタリングのためのそのような技術を開発する必要がある。これには、（ｉ）プロモータの高メチル化及び低メチル化の高感度での検出（無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％で存在する場合）、（ｉｉ）既知の遺伝子における一般の及び稀な変異の高感度での検出（無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％で存在する場合）、（ｉｉｉ）血液における腫瘍に由来するエキソソーム又はＲＩＳＣ複合体から単離される腫瘍特異的なｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの正確な定量、（ｉｖ）循環腫瘍細胞から単離されるＤＮＡにおける腫瘍特異的なコピー変化の正確な定量、（ｖ）循環腫瘍細胞から単離されるＤＮＡにおける変異、プロモータの高メチル化及び低メチル化の正確な定量を開発する必要性が含まれる。上記の場合はすべて（循環腫瘍細胞から単離されるＤＮＡにおける腫瘍特異的なコピー変化の定量を除き）ゲノムの標的とされる遺伝子又は領域での配列決定に焦点を絞ることを必要とする。さらに、元々の断片の双方の鎖からの配列情報又はメチル化状態の測定は稀な事象の決定的に必要な確認を提供する。
【０００８】
胎児検診の分野では、一般的な異数性（例えば、２１トリソミー、１８トリソミー、又は１３トリソミー）、小さな欠失（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子における欠失から生じるもの）、他の小さなコピー数異常（例えば、自閉症に関与するもの）、潜在的な臨床兆候を決定する平衡転座、刷り込みに関連する疾患をもたらし得るメチル化の変化（例えば、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群）、ハンチントン病などの疾患に関与するトリプレット反復変化、点変異（例えば、嚢胞性線維症に関与するＣＦＴＲ遺伝子におけるもの）のための非侵襲性アッセイを開発する緊急のニーズがある。
【０００９】
一分子シーケンシング（ＳＭＳ）は、１０００ドルゲノム計画によって示された大がかりな指令を達成するという点で、アンサンブルに基づく戦略（例えば、ＰＣＲに基づくもの）では利用できない幾つかの独自の特質を提供する。例えば、ＳＭＳは、（ｉ）試料処理のパイプラインを合理化して仕上げの塩基配列決定コストを低下させ（Bayley, H., "Sequencing Single Molecules of DNA," Curr. Opin. Chem. Biol. 10:628-637 (2006)（非特許文献7））、（ｉｉ）増幅及びそれに関連する偏り、並びに試薬の必要性、及びゲノムの難しい領域（すなわち、高度に反復性の領域）に適したプライマーを設計する必要性を排除し、（ｉｉｉ）高い同定効率でメチル化部位、稀な変異及び他の配列の違いを直接見る能力を提供し、（ｉｖ）コピー数の違いをモニタリングするための高い感度を提供し、（ｖ）組み立ての要求及び高反復領域を介した配列を減らすことができる長い読み取り情報を生成する。
【００１０】
ＳＭＳのアプローチのタイプの１つには、ポリメラーゼにより生成された、蛍光標識したデオキシヌクレオチドで構成される相補的ＤＮＡ鎖の合成が含まれた（Davis et al., "Rapid DNA Sequencing Based Upon Single Molecule Detection," Genetic Analysis-Biomolecular Engineering 8:1-7 (1991)（非特許文献8）; Goodwin et al., "Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing," Nucleosides & Nucleotides 16:543-550 (1997)（非特許文献9）; Goodwin et al., "DNA Sequencing by Single Molecule Detection," Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:SMI02-SMI02 (1996)（非特許文献10））。相補的ＤＮＡ鎖は、ストレプトアビジン：ビオチンの結合を用いてマイクロビーズに係留される。ビーズ：ＤＮＡの複合体を、光学捕捉を用いて、高度にプロセッシブなエキソヌクレアーゼで満たされた流れの中に浮遊させ、当該エキソヌクレアーゼによって末端モノヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を順に切り取り、それらを励起レーザービーム（蛍光光子バーストを色と共に生じ、それにより同定メカニズムを提供する）を通して送る。概念的には単純であるが、単色配列決定の実証にもかかわらず（Werner et al., "Progress Towards Single-Molecule DNA Sequencing: A One Color Demonstration," J. Biotechnol. 102:1-14 (2003)（非特許文献11））、色素修飾したｄＮＴＰを専ら使用して相補体を作れないこと、スケーリングの問題から生じる拡散性の誤秩序化、及び単一分子検出の間にシグナル対ノイズ比を低下させる不純な蛍光を含む、このアプローチに伴う幾つかの難題に遭遇している（Demas et al., "Fluorescence Detection in Hydrodynamically Focused Sample Streams: Reduction of Diffusional Defocusing by Association of Analyte With High-Molecular Weight Species," Appl. Spectroscopy 52:755-762 (1998)（非特許文献12）およびGoodwin et al., "DNA Sequencing by Single Molecule Detection," Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:SMI02-SMI02 (1996)（非特許文献10））。
【００１１】
最近、ポリメラーゼによる蛍光標識ｄＮＴＰの取り込み事象に従い、且つ、スペクトル的に区別できる色素で標識（ｄＮＴＰのリン酸基に結合）されたｄＮＴＰをモニタリングするゼロモードの導波管を用いる、代わりの蛍光系のＳＭＳ戦略が提案されている（Eid et al., "Real-Time DNA Sequencing From Single Polymerase Molecules," Science 323:133-138 (2009)（非特許文献13））。別のアプローチは、固体支持体に並べられた単一ＤＮＡ分子を使用し、各取り込み事象が光子の蛍光バーストを生成する（Braslavsky et al., "Sequence Information Can be Obtained From Single DNA Molecules," Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A. 100:3660-3964 (2003)（非特許文献14））。これらは単一分子から配列情報を直接確保する優れた例である一方で、それは、蛍光基質の必要性、クロストーク又は交差励起を生成する分子系間での大量のスペクトル重複及び得られる符号を読み取るための大規模な光学ハードウェアの必要性などの幾つかの共通の難題を提供する。
【００１２】
ＳＭＳ形式からの蛍光系の読み取りの必要性を回避するために、標的ＤＮＡを含むモノヌクレオチドの電気的符号からＤＮＡ配列データを直接読み取ることを可能にするナノポア技術が提案されており、蛍光の必要性を取り除く（Akeson et al., "Microsecond Time-Scale Discrimination Among Polycytidylic Acid, Polyadenylic Acid, and Polyuridylic Acid as Homopolymers or as Segments Within Single RNA Molecules," Biophys. J. 77:3227-3233 (1999)（非特許文献15）; Deamer & Branton, "Characterization of Nucleic Acids by Nanopore Analysis," Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)（非特許文献16）; Meller & Branton, "Single Molecule Measurements of DNA Transport Through a Nanopore," Electrophoresis 23:2583-2591 (2002)（非特許文献17）; Meller et al., "Voltage-Driven DNA Translocations Through a Nanopore," Phys. Rev. Lett. 86:3435-3438 (2001)（非特許文献18）; およびMeller et al., "Rapid Nanopore Discrimination Between Single Polynucleotide Molecules," Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 97:1079-1084 (2000)（非特許文献19））。ほとんどの研究では、ナノポアはα−ヘモリシンであり、それは細菌、黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって産生されるタンパク質様の膜チャネルである。応用的見地から、この細孔の使用は、幾つかの限界を有する：（１）その機械的及び化学的な安定性が多くの場合不適切である、（２）それは選択されたタイプの分子だけの変換を可能にする固定された孔径を有する、及び（３）そのような高密度のナノポアアレイを製造する能力は疑わしい可能性がある。これらのα−ヘモリシンの限界は、電子ビーム又はイオンビームを用いてポリマー又は窒化ケイ素の膜にて１〜５０ｎｍのサイズで製作することができる合成ナノポアの使用をもたらしている（Rhee & Burns, "Nanopore Sequencing Technology: Research Trends and Applications," Trends Biotechnol. 24:580-586 (2006)（非特許文献20）およびStorm et al., "Fabrication of Solid-State Nanopores With Single-Nanometre Precision," Nat. Mater. 2:537-541 (2003)（非特許文献21））。合成ナノポアの魅力的な特徴は、合成細孔を装飾してトンネル電流又は導電性の変化にて乱れをモニタリングする横方向電極の使用のような、異なる読み出し様式を導入する能力である（Lagerqvist et al., "Fast DNA Sequencing Via Transverse Electronic Transport," Nano Lett. 6:779-782 (2006)（非特許文献22）; Lagerqvist et al., "Influence of the Environment and Probes on Rapid DNA Sequencing Via Transverse Electronic Transport," Biophys. J. 93:2384-2390 (2007)（非特許文献23）; Zikic et al., "Characterization of the Tunneling Conductance Across DNA Bases," Phys. Rev. E 74(1 Pt 1):011919 (2006)（非特許文献24）; およびZwolak & Di Ventra, "Colloquium: Physical Approaches to DNA Sequencing and Detection," Rev. Modern Physics 80:141-165 (2008)（非特許文献25））。
【００１３】
原則として、ＤＮＡの構造情報は、天然のナノポアを使用しようと合成のナノポアを使用しようと、インタクトなＤＮＡ分子が細孔を通って動く際の阻止電流の大きさからヌクレオチドの同一性を推定することによって得られる。このＤＮＡ配列決定法の利点には、（１）大きなＤＮＡ断片（≧５０ｋｂｐ）を配列決定する能力、（２）増幅又はサブクローニングの技法の使用を必要としないこと、（３）蛍光標識されたデオキシヌクレオチド又はジデオキシヌクレオチドの使用を必要としないこと、（４）ゲノム全体の配列決定に１×１０８台のコピーの少ない投入量のＤＮＡ試料サイズが必要とされること、及び（５）ＤＮＡ配列情報を得ることができる速度がほぼリアルタイムの読み出しを提供し得ることが挙げられる。残念ながら、ナノポアから直接ＤＮＡ配列決定を行う機能している実証はまだ示されていない。
【００１４】
ＤＮＡ配列決定のためのナノポア技術の潜在力に焦点を置いた幾つかの概説があり、これらの概説が指摘するように、この刺激的な新しいプラットフォーム及びＤＮＡ配列決定のためのその潜在力を実現するには多数の難題が存在する（Branton et al., "The Potential and Challenges of Nanopore Sequencing," Nat. Biotechnol. 26:1146-1153 (2008)（非特許文献26）およびZwolak & Di Ventra, "Colloquium: Physical Approaches to DNA Sequencing and Detection," Rev. Modern Physics 80:141-165 (2008)（非特許文献25））。第１に、細孔を通る移動時間がかなり長く（ヌクレオチド当たり１〜２０μｓ）、ＭＨｚ範囲で機能する読み出し電子工学のバンド幅を必要とする。第２に、読み出し分解能はＤＮＡ分子の単一塩基の間隔、約０．３４ｎｍ以下の細孔の厚さを必要とする。合成細孔及びα−ヘモリシン細孔双方の厚さはこの間隔よりもはるかに大きい（５〜１５ｎｍ）ので、複数の塩基が細孔の中で同時に存在する。この前もって必要な厚さでナノポアを製作し得るとしても、有効な電場読み取り領域は細孔のいずれかの側でおよそ細孔１つ分の直径単位拡大するであろう（Liu et al., "The Effect of Translocating Cylindrical Particles on the Ionic Current Through a Nanopore," Biophys. J. 92:1164-1177 (2007)（非特許文献27））。第３に、ナノポアのアレイの製造は、意図される適用を受け入れるために予め必要なサイズ寸法及び低コストにて高い製造モード再現性で行われなければならない。第４に、高品質のゲノムＤＮＡが多種多様な試料（血液、組織、骨髄、尿、唾液等）から抽出されなければならず、次いで処理されて配列決定のための投入物として使用されるＤＮＡ断片（約５０ｋｂｐ）を生じなければならない。試料の調製及び配列決定のステップは、単一プラットフォームに統合されるべきであり、基本的なターンキー方式で操作して広いユーザー基盤を可能にすべきである。
【００１５】
例えば、エキソヌクレアーゼ酵素の使用により、ＤＮＡ切り取り後、元々の順序を維持しながらヌクレオチドが互いに物理的に分離されれば、読み出し分解能の限界を軽減することができる（Davis et al., "Rapid DNA Sequencing Based on Single Molecule Detection," In Los Alamos Science (1992)（非特許文献28））。これは高度にプロセッシブなエキソヌクレアーゼ酵素を用いて実現可能であることが実証されており、それは、インタクトなＤＮＡ断片から個々のヌクレオチドを順に切り取り、シクロデキストリンのエリで固定されたα−ヘモリシンナノポアを通してこれらの塩基を方向づける（Wu et al., "Protein Nanopores With Covalently Attached Molecular Adapters," J. Am. Chem. Soc. 129:16142-16148 (2007)（非特許文献29）およびClarke et al., "Continuous Base Identification for Single-Molecule Nanopore DNA Sequencing," Nature Nanotechnol. 4:265-270 (2009)（非特許文献30））。残念ながら、阻止電流を用いた単一塩基の同定効率は９３〜９８％である（Astier et al., "Toward Single Molecule Sequencing: Direct Identification of Ribonucleoside and Deoxyribonucleoside 5'-Monophosphates by Using an Engineered Protein Nanopore Equipped With a Molecular Adaptor," J. Am. Chem. Soc. 128:1705-1710 (2006)（非特許文献31））ので、阻止電流のみを用いた配列決定におけるエラーは、例えば、変異部位の同定に必要な配列決定精度をもたらさない。また、最適なエキソヌクレアーゼ活性に必要な塩条件は高精度の塩基同定に必要な条件に合致し得ないので、同定効率は９０％〜９９％の範囲である。従って、追加の塩基同定戦略を検討しなければならない。
【００１６】
本発明は、当該技術におけるこれら及び他の欠陥を克服する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Kaiser, J., "DNA Sequencing - A Plan to Capture Human Diversity in 1000 Genomes," Science 319:395-395 (2008)
【非特許文献２】Kuehn, B.M., "1000 Genomes Project Promises Closer Look at Variation in Human Genome," JAMA 300:2715-2715 (2008)
【非特許文献３】Mardis, E., "Anticipating the $1,000 Genome," Genome Biol. 7:112 (2006)
【非特許文献４】Metzker, M.L., "Emerging Technologies in DNA Sequencing," Genome Res. 15:1767-1776 (2005)
【非特許文献５】Schloss, J.," How to Get Genomes at One Ten-Thousandth the Cost," Nature Biotechnol. 26:1113-1115 (2008)
【非特許文献６】Thomas et al., "Biomedical Microelectromechanical Systems (BioMEMS) Using Electrophoresis for the Analysis of Genetic Mutations," Molecular Review Diagnostics 2:429-447 (2002)
【非特許文献７】Bayley, H., "Sequencing Single Molecules of DNA," Curr. Opin. Chem. Biol. 10:628-637 (2006)
【非特許文献８】Davis et al., "Rapid DNA Sequencing Based Upon Single Molecule Detection," Genetic Analysis-Biomolecular Engineering 8:1-7 (1991)
【非特許文献９】Goodwin et al., "Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing," Nucleosides & Nucleotides 16:543-550 (1997)
【非特許文献１０】Goodwin et al., "DNA Sequencing by Single Molecule Detection," Prog. Biophys. Mol. Biol. 65:SMI02-SMI02 (1996)
【非特許文献１１】Werner et al., "Progress Towards Single-Molecule DNA Sequencing: A One Color Demonstration," J. Biotechnol. 102:1-14 (2003)
【非特許文献１２】Demas et al., "Fluorescence Detection in Hydrodynamically Focused Sample Streams: Reduction of Diffusional Defocusing by Association of Analyte With High-Molecular Weight Species," Appl. Spectroscopy 52:755-762 (1998)
【非特許文献１３】Eid et al., "Real-Time DNA Sequencing From Single Polymerase Molecules," Science 323:133-138 (2009)
【非特許文献１４】Braslavsky et al., "Sequence Information Can be Obtained From Single DNA Molecules," Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A. 100:3660-3964 (2003)
【非特許文献１５】Akeson et al., "Microsecond Time-Scale Discrimination Among Polycytidylic Acid, Polyadenylic Acid, and Polyuridylic Acid as Homopolymers or as Segments Within Single RNA Molecules," Biophys. J. 77:3227-3233 (1999)
【非特許文献１６】Deamer & Branton, "Characterization of Nucleic Acids by Nanopore Analysis," Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)
【非特許文献１７】Meller & Branton, "Single Molecule Measurements of DNA Transport Through a Nanopore," Electrophoresis 23:2583-2591 (2002)
【非特許文献１８】Meller et al., "Voltage-Driven DNA Translocations Through a Nanopore," Phys. Rev. Lett. 86:3435-3438 (2001)
【非特許文献１９】Meller et al., "Rapid Nanopore Discrimination Between Single Polynucleotide Molecules," Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 97:1079-1084 (2000)
【非特許文献２０】Rhee & Burns, "Nanopore Sequencing Technology: Research Trends and Applications," Trends Biotechnol. 24:580-586 (2006)
【非特許文献２１】Storm et al., "Fabrication of Solid-State Nanopores With Single-Nanometre Precision," Nat. Mater. 2:537-541 (2003)
【非特許文献２２】Lagerqvist et al., "Fast DNA Sequencing Via Transverse Electronic Transport," Nano Lett. 6:779-782 (2006)
【非特許文献２３】Lagerqvist et al., "Influence of the Environment and Probes on Rapid DNA Sequencing Via Transverse Electronic Transport," Biophys. J. 93:2384-2390 (2007)
【非特許文献２４】Zikic et al., "Characterization of the Tunneling Conductance Across DNA Bases," Phys. Rev. E 74(1 Pt 1):011919 (2006)
【非特許文献２５】Zwolak & Di Ventra, "Colloquium: Physical Approaches to DNA Sequencing and Detection," Rev. Modern Physics 80:141-165 (2008)
【非特許文献２６】Branton et al., "The Potential and Challenges of Nanopore Sequencing," Nat. Biotechnol. 26:1146-1153 (2008)
【非特許文献２７】Liu et al., "The Effect of Translocating Cylindrical Particles on the Ionic Current Through a Nanopore," Biophys. J. 92:1164-1177 (2007)
【非特許文献２８】Davis et al., "Rapid DNA Sequencing Based on Single Molecule Detection," In Los Alamos Science (1992)
【非特許文献２９】Wu et al., "Protein Nanopores With Covalently Attached Molecular Adapters," J. Am. Chem. Soc. 129:16142-16148 (2007)
【非特許文献３０】Clarke et al., "Continuous Base Identification for Single-Molecule Nanopore DNA Sequencing," Nature Nanotechnol. 4:265-270 (2009)
【非特許文献３１】Astier et al., "Toward Single Molecule Sequencing: Direct Identification of Ribonucleoside and Deoxyribonucleoside 5'-Monophosphates by Using an Engineered Protein Nanopore Equipped With a Molecular Adaptor," J. Am. Chem. Soc. 128:1705-1710 (2006)
【発明の概要】
【００１８】
本発明の第１の態様は、生体分子プロセッサを含む装置を対象とする。各生体分子プロセッサは、固体基板によって画定される１つ以上のバイオリアクターチャンバーと、各バイオリアクターチャンバー内において固定基板に取り付けられた支持構造体を含む。当該生体分子プロセッサは、当該支持構造体に固定化された切断酵素であって、当該切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように当該各バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素も有する。当該生体分子プロセッサは、当該固体基板内に形成されかつ１つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された１つ以上の飛行時間型のチャネルも有する。当該１つ以上の飛行時間型のチャネルのそれぞれは流入端と出力端を有し、当該１つ以上の飛行時間型のチャネルのそれぞれは、（ｉ）１つ以上の飛行時間型のチャネルの入力端の近位にある、１つ以上の飛行時間型のチャネルに接触する第１のセンサーと（ｉｉ）１つ以上の飛行時間型のチャネルの出力端の近位にある、１つ以上の飛行時間型のチャネルに接触する第２のセンサーとを少なくとも含む２つ以上のセンサーを有する。
【００１９】
本発明の他の態様は、本発明の装置を用いた核酸の配列決定及びタンパク質又はポリペプチドの同定の方法に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上を同定する方法を対象とする。この方法には、そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程が含まれ、１つ以上の核酸分子及びハイブリッド形成したその相補体のそれぞれは、標的特異的部分と、ヘアピンの形成に好適な一本鎖３'アダプター部分とを含む。試料は、１つ以上の核酸分子及びその相補体の３'アダプター部分がヘアピンを形成するのに有効な条件に供される。当該方法にはさらに、ポリメラーゼを提供する工程、並びに、伸長混合物を形成させるために１つ以上の３'ヘアピン化核酸分子及びその相補体とポリメラーゼを混合する工程が含まれる。１つ以上の核酸分子及びその相補体は、それぞれの３'ヘアピン化領域から伸長して、１つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成する。当該方法にはさらに、試料中の１つ以上の核酸分子を同定するために１つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程が含まれる。
【００２１】
本発明の別の態様は、１つ以上の所望の核酸分子の標的特異的な濃縮を達成するための固体支持体への固定化を含む、試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上を同定する方法を対象とする。この方法には、そのそれぞれの相補体とそれぞれハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程が含まれ、１つ以上の核酸分子とそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれは、標的特異的部分、５'アダプター部分、及び３'アダプター部分を含み、５'アダプター部分及び３'アダプター部分はそれぞれヘアピン形成に好適である。当該方法にはさらに、１つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるためにその相補体から１つ以上の核酸分子を変性させる工程が含まれ、１つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体それぞれの５'及び３'のアダプター部分のヘアピン配列がヘアピンを形成する。１つ以上の核酸分子又はその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体が提供される。１つ以上の変性させた一本鎖核酸分子及びその相補体は、固体支持体上に固定化された相補的な捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。当該方法にはさらに、ポリメラーゼを提供する工程、並びに、１つ以上のハイブリッド形成した核酸分子及びその相補体を含有する固体支持体にポリメラーゼを接触させる工程が含まれる。１つ以上の核酸分子及びその相補体は、それぞれの３'ヘアピン化領域から伸長されて１つ以上の完全長ヘアピン化標的核酸分子を形成し、それによって１つ以上の核酸分子が捕捉オリゴヌクレオチド及び固体支持体から遊離する。１つ以上の核酸分子の少なくとも一部を配列決定して、試料中の１つ以上の核酸分子を同定する。
【００２２】
本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上を同定する方法を対象とする。この方法は、そのそれぞれの相補体とそれぞれハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程を含み、１つ以上の核酸分子とそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれは、標的特異的部分、５'アダプター部分、及び３'アダプター部分（一本鎖ホモポリマー反復配列を含む）を含む。当該方法はさらに、一本鎖核酸分子とその相補体の収集物を形成させるために、その相補体から１つ以上の核酸分子を変性させる工程を含む。１つ以上の核酸分子又はその相補体の３'末端に対して相補的な複数のオリゴヌクレオチドプライマー及びポリメラーゼが提供され、１つ以上の核酸分子及びその相補体がポリメラーゼ及びプライマーと混合されて伸長混合物を形成する。当該方法はさらに、オリゴヌクレオチドプライマーを１つ以上の核酸分子及びその相補体の相補的な３'末端とハイブリッド形成させる工程、並びに、完全長二本鎖核酸分子を形成させるためにハイブリッド形成したプライマーを伸長させる工程を含む。１つ以上の完全長二本鎖核酸分子の少なくとも一部を配列決定して、試料中の１つ以上の核酸分子を同定する。
【００２３】
本発明は、完全に自動化されたプラットフォームを用いて配列決定情報を得ることに関連するコスト、労働、及び時間を実質的に低減することができ、本明細書では生体分子プロセッサと呼ばれる、バイオポリマーの配列決定プラットフォームに関する。当該プラットフォームは、低コストのマイクロ及びナノ複製技法を用いて成形可能な固体支持体にて製作した二次元（２Ｄ）飛行時間型チャネルを通る特徴的な飛行時間に基づいてバイオポリマー分子の単量体単位及び多量体単位を同定する、ナノ規模のセンサーを使用する。単量体単位及び多量体単位は、インタクトなバイオポリマー（例えば、生体分子プロセッサの反応器チャンバー内に含有される支持構造体に共有結合で係留される核酸分子又はタンパク質）から切断酵素を用いて生成される。切断された単量体単位又は多量体単位は飛行時間型チャネルに搬送され、飛行時間型チャネルを通る分子依存的な飛行時間から当該単量体又は多量体の識別が推定される。当該飛行時間はチャネルの各端に備えられた少なくとも２対のセンサーを用いて変換され、単量体単位又は多量体単位によって誘導される電気的応答の乱れからシグナルが生じる。
【００２４】
本明細書で提案されるアプローチは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるBrantonら、The Potential and Challenges of Nanopore Sequencing,"Nat.Biotechnol.26:1146-1153(2008)によって言及されたような、ナノポアベースのＤＮＡ配列決定技術に関連する主要な難題に直接対処する。第１に、移動速度の低下を必要とするナノポアシーケンシングに関連するバンド幅の限界は、個々の塩基は、酵素の切り取り速度及び印加される電場並びに単量体の電気泳動移動度によって決まる長さだけ間隔を空ける（Δｔ）という事実によって否定される。例えば、１，０００ヌクレオチドｓ−１のλ−エキソヌクレアーゼの切り取り速度（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMatsuura et al., "Real Time Observation of a Single DNA Digestion by Lambda Exonulease Under a Fluorescence Microscope Field," Nucleic Acids Res. 29:e79 (2001)）及び０．１ｍｍ  ｓ−１の線速度を用いると、ヌクレオチドの間隔は１００ｎｍである。開始時間及び停止時間は、飛行管内に備えられた少なくとも２つの電極対によって測定されるので、飛行管ナノチャネル内に複数のヌクレオチドが存在することは課題ではない。第２に、ナノポアの厚さが０．３４ｎｍ未満であるという単一塩基分析のための要件は、エキソヌクレアーゼによって課されるｄＮＭＰの間隔、及び、ヌクレオチド塩基の識別には阻止電流を用いないという事実のために、必要ではない。実際、ヌクレオチドの識別は、ヌクレオチド実体の確立されたクロマトグラフィ特性及び電気泳動特性に基づく（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCzarnecka et al., "Application of Solid Phase Extraction and High-Performance Liquid Chromatography to Qualitative and Quantitative Analysis of Nucleotides and Nucleosides in Human Cerebrospinal Fluid," J. Chromatogr. B 822:85-90 (2005））。加えて、トランスコンダクタンス又はトンネル電流の使用、及び、変換されたシグナルに対する分子配向効果に関する潜在的な課題は、本発明には存在しない（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるZikic et al., "Characterization of the Tunneling Conductance Across DNA Bases," Phys. Rev. E 74(1 Pt 1):011919 (2006)）。マイクロ流体要素及びナノ流体要素の双方が、確立された複製技術を用いて成形可能な物質にて作製されるので、それらは低コスト且つ高生産率で作製することができる。加えて、多孔性鋳型における鋳型法又は本明細書に記載されている他の方法を用いてナノ規模の電極を生成し、検出要素の高規模製造を可能にするであろう。第４に、本発明の生体分子プロセッサは、本明細書に記載されているようにマイクロ規模のモジュールに接続されることができ、配列解析にかけられる前に試料を処理する自律システムを生成することができる。例えば、ＤＮＡの標的細胞からの選択、精製、及び切り取りを、配列決定前に完全に自動化された方法で実施することができる。加えて、多種多様な成形可能な物質によりもたらされる物質特性の柔軟性及びモジュール式アプローチの採用は、適用に最適な基板物質の選択と共に、これらのシステムの組み立てを可能にするであろう。最後に、これらのモジュールの低コストでの製造及びそれらの単純な組み立て並びに組み立てられたシステムの高い機能性は低コストのプラットフォームを提供するであろうし、その自動化能力は、再配列決定又はデノボシー��ンシングのためのプラットフォームを、臨床の現場又は小さな発見ベースの研究室の中で直接作製するであろう。
[本発明1001]
生体分子プロセッサを含む装置であって、各生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー；
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体；
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素；並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端及び出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも（ｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと（ｉｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、装置。
[本発明1002]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を生成するように機能的に配置された電場発生器をさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、幅50ｎｍ以下でありかつ深さ50ｎｍ以下である、本発明1001の装置。
[本発明1004]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、長さ5μｍ〜250μｍである、本発明1001の装置。
[本発明1005]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーが、幅100〜1000ｎｍである、本発明1001の装置。
[本発明1006]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内の前記支持構造体が、幅50〜900ｎｍである、本発明1001の装置。
[本発明1007]
前記固体基板がポリマー材料で作られている、本発明1001の装置。
[本発明1008]
前記切断酵素がエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1001の装置。
[本発明1009]
前記切断酵素がプロセッシブなエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1008の装置。
[本発明1010]
前記切断酵素がプロテアーゼである、本発明1001の装置。
[本発明1011]
前記2つ以上のセンサーがそれぞれ、貴金属ナノワイヤ、セグメント化されたナノワイヤ、又はナノ粒子から成る、1対の検出電極を含む、本発明1001の装置。
[本発明1012]
各検出電極対が、それらが前記飛行時間型チャネルに接触する狭い断面を有する、本発明1011の装置。
[本発明1013]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが3つ以上のセンサーを含む、本発明1001の装置。
[本発明1014]
前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有する、本発明1001の装置。
[本発明1015]
前記フィーダーチャネルの前記入力端の近位にある、前記フィーダーチャネルに接触するセンサーをさらに含む、本発明1014の装置。
[本発明1016]
前記フィーダーチャネルのセンサーが1対の検出電極を含む、本発明1015の装置。
[本発明1017]
前記フィーダーチャネルが、前記入力端と前記出力端の間に1つ以上のエントロピートラップを含む、本発明1014の装置。
[本発明1018]
前記フィーダーチャネルが、幅100ｎｍ以下でありかつ深さ100ｎｍ以下である、本発明1014の装置。
[本発明1019]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、電荷中性の親水性壁表面、荷電した親水性壁表面、又は電荷中性の疎水性壁表面を含む、本発明1001の装置。
[本発明1020]
10，000個以上の生体分子プロセッサを含む、本発明1001の装置。
[本発明1021]
100，000個以上の生体分子プロセッサを含む、本発明1001の装置。
[本発明1022]
以下の工程を含む、核酸分子の配列決定の方法：
本発明1001の装置を提供する工程；
前記装置の前記生体分子プロセッサに、1つ以上の核酸分子を含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記1つ以上の核酸分子に結合して前記1つ以上の核酸分子を前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端に1つずつ入る単量体ヌクレオチドへと切断するのに有効な条件下で供給する工程；
切断された前記単量体ヌクレオチドを前記1つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程；
前記印加する工程に基づいて、切断された前記単量体ヌクレオチドを、それらが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過する際に検出する工程；
前記検出する工程に基づいて、切断された各単量体ヌクレオチドが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるかを測定する工程；並びに
前記測定する工程に基づいて前記単量体ヌクレオチドを同定する工程。
[本発明1023]
前記同定する工程に基づいて、前記試料中の前記1つ以上の核酸分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得る工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記試料中の前記1つ以上の核酸分子のうちの1つより多くのヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、前記印加する工程、前記検出する工程、前記測定する工程、前記同定する工程を繰り返す工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記繰り返す工程を行って、少なくとも10，000個の核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部を得る、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記繰り返す工程を行って、少なくとも100，000個の核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部を得る、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記測定する工程が、切断された各単量体ヌクレオチドが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける前記第1及び第2のセンサーのうちの少なくとも一方を通過する際の前記切断された各単量体ヌクレオチドの電気的ピークの振幅を測定することをさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記1つ以上の核酸分子が、二本鎖デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ分子、1つ以上のメチル化されたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ分子、1つ以上の修飾又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、1つ以上の修飾又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ分子、及びＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子から成る群より選択される、本発明1022の方法。
[本発明1029]
前記1つ以上の核酸分子が、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、小分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）から成る群より選択されるＲＮＡ分子を含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記1つ以上の核酸分子が二本鎖ＤＮＡ分子を含み、かつ、前記二本鎖ＤＮＡ分子の双方の鎖に由来する単量体ヌクレオチドの少なくとも一部が同定される、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記1つ以上の核酸分子が、1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ分子を含み、前記1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷を受けたヌクレオチド塩基が、前記測定する工程に基づいて同定される、本発明1028の方法。
[本発明1032]
1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが前記1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を有しない、試料中の100〜10，000倍過剰な核酸分子と区別される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記1つ以上の核酸分子が、1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含み、かつ、前記1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基が前記測定する工程に基づいて同定される、本発明1028の方法。
[本発明1034]
1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子と類似するヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾されていないヌクレオチド塩基を有する、試料中の100〜10，000倍過剰の核酸分子と区別される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
1つ以上のメチル化又は修飾されていないヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する、試料中の100〜10，000倍過剰の核酸分子と区別される、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記供給する工程の前に、前記1つ以上の核酸分子を組織、細胞、血清、血漿、血液、又はエキソソームから単離する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1037]
前記方法を実施する間に、前記1つ以上の核酸分子の200〜50，000個の単量体ヌクレオチドが同定される、本発明1022の方法。
[本発明1038]
前記同定する工程に基づいて、病態を診断又は予後診断する工程及び遺伝子型又は発生段階を区別する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1039]
前記切断酵素が、エキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1022の方法。
[本発明1040]
前記切断酵素が、プロセッシブなエキソヌクレアーゼ又はプロセッシブなエキソリボヌクレアーゼである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記切断酵素が、λ−エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ7エキソヌクレアーゼ、ＸＲＮ−1、ＲＮａｓｅＩＩ、及びエキソソーム複合体から選択されるか又はその構成成分である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有し、
前記方法が、
前記1つ以上の核酸分子を含む前記試料を前記フィーダーチャネルに導入する工程；および
前記フィーダーチャネル内で前記1つ以上の核酸分子を引き延ばすために、前記フィーダーチャネルの長さ方向に電場を印加する工程
をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1043]
前記フィーダーチャネルが、前記入力端と前記出力端の間に、前記1つ以上の核酸分子の方向を調整するための1つ以上のエントロピートラップをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記装置が、前記フィーダーチャネルの前記入力端の近位にある、前記フィーダーチャネルに接触するセンサーをさらに含み、
前記方法が、
前記1つ以上の核酸分子を、それらが前記フィーダーチャネルのセンサーを通り抜ける際に検出する工程；および
前記検出する工程の持続時間に基づいて、前記1つ以上の核酸分子の長さを決定する工程
をさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記フィーダーチャネルのセンサーが1対の検出電極を含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
以下の工程を含む、1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを同定する方法：
本発明1001の装置を提供する工程；
前記装置の前記生体分子プロセッサに、1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドに結合して前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを前記1つ以上の前記飛行時間型チャネルの前記入力端に入るより小さなペプチド断片へと切断するのに有効な条件下で供給する工程；
切断された前記ペプチド断片を前記1つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程；
前記印加する工程に基づいて、前記ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過する際に前記ペプチド断片を検出する工程；
前記検出する工程に基づいて、（ｉ）各ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるか及び／又は（ｉｉ）各ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける第1又は第2のセンサーのうちの少なくとも一方を通過する際の各ペプチド断片の電気ピークの振幅を測定する工程；並びに
前記ペプチド断片を測定する前記工程に基づいて、前記試料中の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも一部を同定する工程。
[本発明1047]
前記試料の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドから切断された前記ペプチド断片の（ｉ）及び（ｉｉ）の測定値を、既知のタンパク質又はポリペプチドの切断により生成されたペプチド断片の対応する測定値と比較する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記供給する工程の前に、生体試料から前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを濃縮又は単離する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
前記濃縮又は単離する工程が、アフィニティー精製、リガンド結合、又は抗体に基づく濃縮を用いて実施される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドが、Ｇタンパク質共役型受容体、核内受容体、電位依存性イオンチャネル、リガンド依存性イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、増殖因子、プロテアーゼ、配列特異的プロテアーゼ、ホスファターゼ、プロテインキナーゼ、生物活性のある脂質、サイトカイン、ケモカイン、ユビキチンリガーゼ、ウイルス調節因子、細胞分裂タンパク質、足場タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、細菌リボソーム、ヒストン脱アセチル化酵素、アポトーシス制御因子、シャペロンタンパク質、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、増殖因子受容体、プロテアソーム、シグナル伝達タンパク質複合体、タンパク質／核酸輸送体、及びウイルスカプシドから成る群より選択される、本発明1046の方法。
[本発明1051]
前記供給する工程の前に、1つ以上の細胞内区画から前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを単離又は濃縮する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドが1つ以上の修飾されたアミノ酸残基を含み、前記測定する工程が前記1つ以上のアミノ酸の修飾を同定する、本発明1046の方法。
[本発明1053]
前記アミノ酸の修飾が、メチル化、アセチル化、及びリン酸化から選択される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記切断酵素がプロテアーゼである、本発明1046の方法。
[本発明1055]
前記切断酵素が、プロテイナーゼＫ、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｖ−8プロテアーゼ、トリプシン、リジンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びキモトリプシンプロテアーゼから成る群より選択される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
以下の工程を含む、試料中の複数の核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法：
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分とヘアピン形成に好適な一本鎖3'アダプター部分とを含む、工程；
前記試料を、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の3'アダプター部分がヘアピンを形成するのに有効な条件に供する工程；
ポリメラーゼを提供する工程；
伸長混合物を形成させるために、1つ以上の3'ヘアピン化核酸分子及びその相補体を前記ポリメラーゼと混合する工程；
1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を、それらのそれぞれの3'ヘアピン化領域から伸長させる工程；並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1057]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー；
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体；
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素；並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも（ｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと（ｉｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記ポリメラーゼが、前記伸長させる工程の間に、前記1つ以上の核酸分子を、そのそれぞれの相補体核酸分子から解離させる、本発明1056の方法。
[本発明1059]
前記ポリメラーゼが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記伸長させる工程の前に、前記1つ以上の3'ヘアピン化核酸分子及びその相補体を変性させる工程をさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1061]
前記1つ以上の完全長ヘアピン化核酸分子の5'末端がリン酸化されている、本発明1056の方法。
[本発明1062]
前記試料を提供する工程が、
1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程；並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に前記アダプター部分を付加する工程
を含む、本発明1056の方法。
[本発明1063]
前記アダプター部分又はその相補体が、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の前記標的特異的部分に、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて付加される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグをさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1065]
前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長ヘアピン化核酸分子のヘアピン化部分に移動度変更因子（mobility modifier）を付加する工程をさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1066]
以下の工程を含む、試料中の複数の核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法：
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分、5'アダプター部分、及び3'アダプター部分を含み、前記5'及び3'アダプター部分がそれぞれヘアピン形成に好適である、工程；
1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子をその相補体から変性させる工程であって、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体のそれぞれの5'及び3'アダプター部分のヘアピン配列がヘアピンを形成する、工程；
複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を提供する工程であって、各捕捉オリゴヌクレオチドプローブが前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
変性させた前記一本鎖核酸分子及びその相補体のうちの1つ以上を、前記固体支持体上に固定化されたそれらの相補的な捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程；
ポリメラーゼを提供する工程；
前記ポリメラーゼを、ハイブリッド形成させた前記核酸分子及びその相補体のうちの1つ以上を含有する前記固体支持体に接触させる工程；
1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体を、それらのそれぞれの3'ヘアピン化領域から伸長させる工程であって、それによって前記1つ以上の核酸分子が前記捕捉オリゴヌクレオチド及び前記固体支持体から遊離する、工程；並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1067]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー；
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体；
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するようにバイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素；並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも（ｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと（ｉｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記試料を提供する工程が、
1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程；並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に前記アダプター部分を付加する工程
を含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
前記アダプター部分又はその相補体が、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の前記標的特異的部分に、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて付加される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグをさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
前記完全長ヘアピン化標的核酸分子の5'末端がリン酸化されている、本発明1066の方法。
[本発明1072]
前記配列決定する工程の前に、前記完全長ヘアピン化核酸分子のヘアピン化部分に移動度変更因子を付加する工程をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1073]
以下の工程を含む、試料中の複数の標的核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法：
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分、5'アダプター部分、及び一本鎖ホモポリマー反復配列を含む3'アダプター部分を含む、工程；
1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子をその相補体から変性させる工程；
前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の3'末端に対して相補的な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程；
ポリメラーゼを提供する工程；
伸長混合物を形成させるために、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を前記ポリメラーゼ及びプライマーと混合する工程；
前記オリゴヌクレオチドプライマーを、それらの相補的な、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の3'末端とハイブリッド形成させる工程；
1つ以上の完全長の二本鎖核酸分子を形成させるために、ハイブリッド形成させた前記プライマーを伸長させる工程；並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長の二本鎖核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1074]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー；
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体；
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素；並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも（ｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと（ｉｉ）前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記試料を提供する工程が、
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程；
前記3'及び5'アダプター部分を、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に付加する工程；並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の、一本鎖ホモポリマー反復配列を有する3'アダプター部分を伸長させる工程
を含む、本発明1073の方法。
[本発明1076]
前記付加する工程及び伸長させる工程が、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて実施される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグを含む、本発明1073の方法。
[本発明1078]
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、3'アダプターに特異的な部分及び3'ホモポリマー反復配列に特異的な部分を含む、本発明1073の方法。
[本発明1079]
前記5'アダプター部分が5'リン酸部分を含む、本発明1073の方法。
[本発明1080]
複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を提供する工程であって、各捕捉オリゴヌクレオチドプローブが前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；並びに
標的特異的な濃縮を達成するために、前記混合する工程の前に前記1つ以上の変性させた一本鎖核酸分子及びその相補体を前記固体支持体上でそれらの相補的な固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程であって、前記伸長させる工程の前に又はその間に前記1つ以上の核酸分子及びその相補体が前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから解離する、工程
をさらに含む、本発明1073の方法。
[本発明1081]
前記ポリメラーゼが、前記伸長させる工程の間に、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を、前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから解離させる、本発明1080の方法。
[本発明1082]
前記ポリメラーゼが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有する、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリッド形成させる工程の後かつ前記伸長させる工程の前に、前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を変性させる工程をさらに含む、本発明1080の方法。
[本発明1084]
前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の伸長させた完全長の二本鎖標的核酸分子の3'末端に移動度変更因子を付加する工程をさらに含む、本発明1073の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の生体分子プロセッサの平面図である。
【図２】図２Ａは、本発明の生体分子プロセッサの斜視図である。図２Ｂは、バイオリアクター支持構造体１６に固定化され、核酸分子１５と機能的に結合した切断酵素３６を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、本発明の生体分子プロセッサの種々の部分の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。図３Ａは、マイクロピラー及び／又はナノピラーのアレイを含有するＶ形状のフィーダーチャネルの流入口２８のＳＥＭ画像である。図３Ｂは、エントロピートラップ３０を含有しかつバイオリアクターチャンバー１４に連結されたフィーダーチャネル２０のＳＥＭ画像である。図３Ｃは、固定化された切断酵素３６を有する固体支持体１６を含有するバイオリアクターチャンバー１４のＳＥＭ画像である。バイオリアクターチャンバーは、フィーダーチャネル２０及び飛行時間型チャネル２４に流体的に連結されている。図３Ｄは、チャネル２４内に位置するナノ検出電極の第１の対３２及び第２の対３４を有する飛行時間型チャネル２４を示す。示されているように、ナノ検出電極はそれぞれ、ナノ検出電極を装置の外部の電子コンポーネントに連結するマイクロコンタクトパッド４０に接続されている。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、フィーダーチャネルの試料流入口の種々の設計を示す。図４Ａは、溝型流入口、Ｖ形状のマイクロ／マイクロ以下の溝型流入口、マイクロ／ナノピラーのアレイを有するピラー状の流入口、及び漏斗型の流入口を含む種々の流入口のＳＥＭ画像を示す。図４Ｂは、マイクロ流体とナノチャネルとの境目がはっきりしたインターフェース（「オリジナル」）に比べたときの図４Ａの種々の流入口設計を用いたＤＮＡ捕捉の向上を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の装置のバイオリアクターチャンバー内の固体支持体に1種又は複数種の切断酵素を固定化する二通りのアプローチの模式図を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、３つのナノ検出電極を含有する飛行時間型チャネルを有する本発明の生体分子プロセッサを示す。図６Ａは、フィーダーチャネル２０、バイオリアクターチャンバー１４、ならにびナノ検出電極の第１の対（３２）および第２の対（３４）および第３の対（３３）を含有する飛行時間型チャネル２４を含む生体分子プロセッサ１０の平面図である。図６Ｂは、３対のナノ検出電極３２、３３、３４を含有する飛行時間型チャネル２４に流入し、流出するモノヌクレオチド４６を示す斜視図である。
【図７】飛行時間型チャネルが複数の飛行管を含有し、各飛行管が、独自の表面化学的性質を有する飛行時間型チャネルの一部によって分離された２対のナノ検出電極を有する、本発明の生体分子プロセッサの平面図である。各飛行管の第１及び第２のセンサーは、特定の飛行管の表面化学的性質に応じてバイオポリマー単位の飛行時間を検出する。
【図８Ａ】本発明の方法に従う配列解析のための、二本鎖ゲノムＤＮＡの双方の鎖を調製する代替法を示す模式図である。
【図８Ｂ】本発明の方法に従う配列解析のための、二本鎖ゲノムＤＮＡの双方の鎖を調製する代替法を示す模式図である。
【図９】本発明の方法に従う配列解析のための、標的ゲノムＤＮＡについての試料の濃縮を行い、濃縮した二本鎖ゲノムＤＮＡの双方の鎖を調製する方法を示す図式的概観である。
【図１０】本発明の方法に従う配列解析のための、二本鎖ゲノムＤＮＡの双方の鎖を調製する方法を示す模式図である。
【図１１】本発明の方法に従う配列解析のための、標的ゲノムＤＮＡについての試料の濃縮を行い、濃縮した二本鎖ＤＮＡの双方の鎖を調製する方法を示す図式的概観である。
【図１２】本発明の生体分子プロセッサを作るのに好適な第１のプロセスを示す図式的概観である。
【図１３】本発明の生体分子プロセッサを作るのに好適な第２のプロセスを示す図式的概観である。
【図１４】本発明の生体分子プロセッサを作るのに好適な第３のプロセスを示す図式的概観である。
【図１５】本発明の生体分子プロセッサを作るのに使用されるシリコンマスタースタンプの形成を示す図式的概観である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、後にマイクロ及びナノ流体ネットワークの製作に使用されるシリコンマスタースタンプから樹脂スタンプを形成するのに使用されるナノインプリントリソグラフィのプロセス（図１６Ａ）、及び本発明の生体分子プロセッサに関連する他の構造（図１６Ｂ）を示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、本発明の生体分子プロセッサで使用するのに好適な単相ナノワイヤを形成するプロセス（図１７Ａ）及びこの方法で作製されるナノワイヤの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（図１７Ｂ）を示す。
【図１８】本発明の生体分子プロセッサで使用するのに好適なセグメント化されたナノワイヤを形成するプロセスを示す。
【図１９】本発明の生体分子プロセッサで使用するのに好適な極薄のナノワイヤを形成するプロセスを示す図である。
【図２０】選択的エッチングを用いたナノワイヤ菲薄化のプロセスを示す。
【図２１】本発明の生体分子プロセッサにおける検出電極の位置で化学パッチを用いたナノワイヤの位置決めを説明する図である。
【図２２】リフトオフ（ＭＡＰＬ）法による分子アセンブリのパターン形成を用いた生体分子プロセッサの基板上での化学パッチの形成を示す図式的概観である。
【図２３】ナノステンシルマスクを用いた生体分子プロセッサの基板上での化学パッチの形成を示す図式的概観である。
【図２４】生体分子プロセッサにおける電極センサーの位置でナノワイヤの位置決めを行うためのナノステンシルマスクの使用を示す図式的概観である。
【図２５】印加される磁場を用いることなく電極センサーの位置にナノワイヤを磁気的に向けるプロセスを示す図式的概観である。
【図２６】外側に印加される磁場を用いて電極センサーの位置にナノワイヤを磁気的に向けるプロセスを示す図式的概観である。
【図２７】ナノインプリントリソグラフィを用いたナノギャップとナノチャネルの同時形成のプロセスを示す。
【図２８】ナノチャネル及び他の流体ネットワークが基板にて機能する場合のナノインプリントリソグラフィを用いたナノギャップ形成のプロセスを示す。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂは、飛行時間型センサーのナノ検出電極を外部の電子コンポーネントに連結するマイクロコンタクトパッドを形成する代替プロセスを概略的に説明する。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｃは、構造的な変形を出来るだけ抑えながら熱によってカバー板を生体分子プロセッサに組み付けるプロセスを示す。図３０Ａは、組み付けプロセスの模式図である。図３０Ｂは、組み付けプロセスで使用される圧力ヒーターの模式図である。図３０Ｃは、接合されたカバー板のイメージである。
【図３１】マイクロコンタクトパッドと、基板上のシグナル処理電子部品を有するプリント回路基板（ＰＣＢ）との間の種々の電気的接続を作るプロセスを示す。
【図３２】本発明の生体分子プロセッサの電子部品を示す。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｄは、４種の核酸塩基を含有するｄＮＭＰの構造を示す。図３３Ａは、プロトン化３'ｄＡＭＰを示す。図３３Ｂは、非プロトン化３'ｄＧＭＰを示す。図３３Ｃは、プロトン化５'ｄＣＭＰを示す。図３３Ｄは、非プロトン化５'ｄＴＭＰを示す。図３３Ｂの構造における円で囲った原子における部分電荷と、図３３Ａの構造における対応する原子における部分電荷との間の差異が図３３Ｃの構造に適用されて、図３３Ｄの構造における円で囲った原子における部分電荷が得られた。図３３Ｂ及び３３Ｄの構造における円で囲った原子の間の唯一の構造的な差異は、Ｃ３'とＣ５'の原子にある。４種の異なる核酸塩基を有する図３３Ｄのような構造をシミュレーションに用いた。核酸塩基が何であるかは、リン酸基における部分電荷に影響しない。核酸塩基上の軸の標識した軸１を、スリット壁へのｄＮＭＰの吸着及び脱着の解析に使用したが、その中で考察する。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、平衡シミュレーション及び非平衡シミュレーションの双方で使用されるシステム及びＤＮＡの化学構造を示す。図３４Ａは、ナノスリットにて水、塩化ナトリウム及びｄＮＭＰを含有するシミュレーションシステムを示す。灰色球体は壁原子を表し、緑色は塩化物を表し、黄褐色はリンを表し、黄色はナトリウムを表し、赤色は水のものではない酸素を表し、白色は水のものではない水素を表し、シアン色は壁のものではない炭素を表し、青色は窒素を表し、紫色は水分子を表す。明瞭にするために壁原子の一部は示されていない。ｘ方向及びｙ方向に周期的な境界条件がある。図３４Ｂは、２つのｄＮＭＰ（極性水素のみを示す）を示す。１つの環ピリミジン（Ｃ、Ｔ）及び２つの環プリン（Ａ、Ｇ）の核酸塩基が糖リン酸の主鎖に連結されている。λ−エキソヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの１つの鎖を、５'末端から開始して一度にヌクレオチド１個ずつ消化することができ、遊離したヌクレオチドそれぞれの５'末端にリン酸を残す。
【図３５】吸着及び脱着の時間を決定するためのアルゴリズムにおけるステップを示す。吸着期間中のｄＮＭＰと壁との間のエネルギーの算出のために、異なる定義を吸着に用いた。当該エネルギーが−２．０ｋｃａｌ／モル未満であれば、ｄＮＭＰは吸着していると見なした。
【図３６】４つのｄＮＭＰの自由エネルギーを、疎水性の壁からの距離ｄｗの関数として示す。これらの曲線は、異なる壁構成の組すべてにわたる平均である。
【図３７】ｚ方向（壁表面に垂直）におけるｄＮＭＰの質量中心の典型的な５０ｎｓの軌道を示す。
【図３８】平衡の場合（灰色）及び非平衡の場合（黒色）における吸着についての、ｄｗの関数としての表面平面に対する軸１の角度を示す。構造における矢印は軸点の方向を示す。負は、スリットの中心平面（ｄｗ＝１．５ｎｍ）から離れる方向であることを示す。
【図３９】平衡の場合（灰色）及び非平衡の場合（黒色）における脱着についての、ｄｗの関数としての表面平面に対する軸１の角度を示す。構造における矢印は軸点の方向を示す。負は、スリットの中心平面（ｄｗ＝１．５ｎｍ）から離れる方向であることを示す。
【図４０】図４０〜４０Ｄは、核酸塩基の平面にある軸２の定義を示す。図４０Ａは、ｄＡＭＰを示す。図４０Ｂは、ｄＧＭＰを示す。図４０Ｃは、ｄＣＭＰを示す。図４０Ｄは、ｄＴＭＰを示す。
【図４１】平衡の場合（灰色）及び非平衡の場合（黒色）における吸着についての、ｄｗの関数としての表面平面に対する軸２の角度を示す。構造における矢印は軸点の方向を示す。負は、スリットの中心平面（ｄｗ＝１．５ｎｍ）から離れる方向であることを示す。
【図４２】平衡の場合（灰色）及び非平衡の場合（黒色）における脱着についての、ｄｗの関数としての表面平面に対する軸２の角度を示す。構造における矢印は軸点の方向を示す。負は、スリットの中心平面（ｄｗ＝１．５ｎｍ）から離れる方向であることを示す。
【図４３】５．９μｍにわたる飛行時間分布を示すグラフである。０．５ｎｍにわたる飛行時間分布に由来するＮｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ＝１１８８７個の無作為試料の飛行時間を合計することによって生成される各データ点と共に合計１０，０００個の飛行時間を各ｄＮＭＰに用いた。ｄＮＭＰ当たりの最小解析時間（Δｔ解析）は約１０μｓである。
【図４４】０．０４８ｃｍ／ｓの中心線速度（Ｖｍａｘ）及び２．４７ｍｍのチャネル長について推定された飛行時間分布を示すグラフである。
【図４５】ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）表面にλ−エキソヌクレアーゼ（λ−Ｅｘｏ）を固定化するプロセスを概略的に示す。
【図４６】図４６Ａ〜４６Ｃは、ＰＭＭＡ表面上へのλ−Ｅｘｏの固定化を示す。図４６Ａ及び４６Ｂは、λ−Ｅｘｏのみ（４６Ａ）又はλ−Ｅｘｏと３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリング試薬との組み合わせ（４６Ｂ）に暴露したＰＭＭＡ表面の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による走査データである。図４６Ｃは、ポリマー表面全域にわたる固定化したλ−Ｅｘｏ酵素のサイズ分布を示すヒストグラムである。
【図４７】自由溶液λ−Ｅｘｏ消化後及び固相反応器λ−Ｅｘｏ消化後のλ−ＤＮＡの蛍光スペクトルを示す。未消化のλ−ＤＮＡの蛍光スペクトルも対照として示す。
【図４８】λ−Ｅｘｏの消化活性のリアルタイム蛍光モニタリングを示すグラフである。ＭｇＣｌ２補因子の存在下（■）及び非存在下（●）で、蛍光的に標識したλ−ＤＮＡを、固定化されたλ−Ｅｘｏと共にインキュベートし、λ−Ｅｘｏの消化活性を示す相対蛍光強度の低下を反応時間の経過にわたってモニタリングした。
【図４９】キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による天然デオキシヌクレオチド一リン酸（ｄＮＭＰ）のベースライン分離を示すグラフである。
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｂは、電気浸透流（ＥＯＦ）に対する熱可塑性（ＰＭＭＡ）表面処理の効果を示す。図５０Ａは、天然の未修飾ＰＭＭＡナノチャネル（◆）及びＯ２プラズマで処理したＰＭＭＡナノチャネル（▲）におけるＥＯＦを示す。図５０Ｂは、天然の未修飾ＰＭＭＡナノチャネル（●）、及び、プラズマ酸化してＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬の存在下でエチレンジアミンにて処理したＰＭＭＡナノチャネル（■）におけるＥＯＦを示す。
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｃは、ＰＭＭＡナノチャネルを通る単一体の電気泳動移動度を示す。図５１Ａは、電場強度４０００Ｖ／ｃｍで実施したＰＭＭＡナノチャネルを通る単一体の電気泳動が推進する移動時間を示すヒストグラムである。このデータを、より低い電場強度で実施したものと比較することによって、高い電場での低下した分散効果のために、移動時間の散布度は電場強度に逆相関することが示された。図５１Ｂは、電場の非存在下でＰＭＭＡナノチャネルに配置された単一の銀ナノ粒子（Ａｇ−ＮＰ）の画像（３Ｄ−プロット）である。図５１Ｃは、ＰＭＭＡナノチャネルにおける電気的に推進された単一体の移動についての電気泳動移動度及び段数（図５１Ａで示したヒストグラムの幅の測定値）を示すグラフである。
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｉは、ＰＭＭＡナノチャネルを通るＴ４ＤＮＡの移動事象の光学的及び電気的な測定を示す。図５２Ａ及び５２Ｂは、短いＤＮＡ分子（約５μｍ未満）の移動によって生成されるイオン性の電流スパイクを示す。図５２Ｃは、ナノ流体装置のナノピラーアレイ及びナノチャネルを通って移動する短いＤＮＡ分子を概略的に示す。図５２Ｄ〜５２Ｆ及び５２Ｇ〜５２Ｉは、それぞれ長いＤＮＡ（完全長ではないＴ４ＤＮＡ）及び完全長のＴ４ＤＮＡ分子の移動によって生成されるイオン性の電流スパイクを示す。本明細書に記載されているように、ＤＮＡ分子の長さは、生成される電流過渡の長さに相関する。
【図５３】図５３Ａ〜５３Ｂは、電気化学エッチングによって作製されたナノギャップを含有するセグメント化されたナノワイヤの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、生体分子プロセッサを含む装置を対象とする。各生体分子プロセッサは、固体基板によって画定される１つ以上のバイオリアクターチャンバーと、各バイオリアクターチャンバーにおいて当該固体基板に取り付けられた支持構造体とを含む。当該生体分子プロセッサはまた、当該支持構造体に固定化された切断酵素であって、当該切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素も有する。当該生体分子プロセッサはまた、当該固体基板内に形成されかつ１つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された１つ以上の飛行時間型チャネルも有する。当該１つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれは入力端と出力端を有し、当該１つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれは、（ｉ）当該１つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、当該１つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第１のセンサーと（ｉｉ）当該１つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、当該１つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第２のセンサーとを少なくとも含む２つ以上のセンサーを有する。
【００２７】
当該装置の生体分子プロセッサはさらに、当該固体基板の壁によってまた画定されるフィーダーチャネルを含有し得る。当該フィーダーチャネルは、当該固体基板の表面の近位にある入力端から、当該１つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有する。
【００２８】
一実施形態では、本発明の装置は、１００〜１，０００個の生体分子プロセッサ、１，０００〜１０，０００個の生体分子プロセッサ、又は１０，０００〜１００，０００個の生体分子プロセッサを含む。別の実施形態では、本発明の装置は、１００，０００個を超える生体分子プロセッサを含む。
【００２９】
図１は、本発明の装置の生体分子プロセッサ１０の平面模式図である。当該生体分子プロセッサは、試料に存在するバイオポリマー分子を同定し且つ／又はその配列決定を行うように共に機能する、種々のマルチスケールの流体ネットワーク並びにマイクロ構造及びナノ構造を含む。特に、当該生体分子プロセッサは、核酸分子又はタンパク質などのバイオポリマー分子を含有する試料を受け取ることができるフィーダーチャネル２０の入力端に位置する試料流入口２８を有する。フィーダーチャネル２０はその出力端でバイオリアクターチャンバー１４に流体的に連結されており、バイオリアクターチャンバー１４はその中に、固体支持構造体１６に固定化された切断酵素を含有する。当該切断酵素は、バイオポリマーがフィーダーチャネル２０からバイオリアクターチャンバーに入ると、当該バイオポリマーと結合してそれを単量体単位又は多量体単位へと切断する。切断された単量体単位又は多量体単位は、その後、流体的に連結された飛行時間型チャネル２４に入る。本明細書にさらに詳細に記載されているように、当該飛行時間型チャネルは、切断された単量体単位又は多量体単位がチャネルを通って動電学的に輸送されるとそれらを検出する、少なくとも２つのセンサー３２、３４を含有する。切断された単量体単位又は多量体単位が飛行時間型チャネルにおける第１及び第２のセンサーを通過するのにかかる時間が、単量体又は多量体の「飛行時間」である。切断された単位の飛行時間を用いて、単量体若しくは多量体の単位及び／又はバイオポリマー分子の特徴付け及び／又は同定を行う。
【００３０】
図２は、本発明の装置の生体分子プロセッサの斜視図である。この図には、当該装置のマイクロ流体成分を完全に封入する、当該生体分子プロセッサのカバー板が示されていない。
【００３１】
生体分子プロセッサ１０の固体基板１２は、ポリマー物質又は他の成形可能な物質であり得る。好適なポリマー物質には、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、エポキシ系樹脂、コポリマー、ポリスルホネート、エラストマー、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、及び高分子オルガノシリコンが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、生体分子プロセッサ１０の固体基板１２は、ガラス、シリカ、又は融合シリカ基板物質であり得る。
【００３２】
図２を参照すると、生体分子プロセッサ１０のフィーダーチャネル２０は、固体基板１２内の壁によって画定されている。フィーダーチャネル２０は、入力端に試料流入口２８を有し、その出力端１８にてバイオリアクターチャンバー１４に流体的に連結されている。当該フィーダーチャネルは、バイオポリマー分子（例えば、核酸分子１５）を受け取ってその方向を調整し、その後、当該分子を酵素処理のためにバイオリアクターチャンバーに供給する。
【００３３】
１つ以上のバイオポリマー分子を含有する試料がフィーダーチャネル流入口２８を通って生体分子プロセッサに入る。当該試料流入口は、当該装置の別のモジュール又はコンポーネントから当該生体分子プロセッサ内へのバイオポリマー分子の捕捉及びロードを円滑にするために、種々の方法で構造的に改変され得る。例えば、試料流入口は、図３Ａ及び４Ａに示しているような試料マイクロ／マイクロ以下の溝型流入口、Ｖ形状のマイクロ／マイクロ以下の溝型流入口、マイクロ／ナノピラーのアレイを有するピラー状の流入口、又は漏斗型の流入口であり得る。図４Ｂは、ナノチャネル接続への急に露出したマイクロ流体ネットワーク（図４Ｂにて「オリジナル」として名前を付けられた）と比べて、改変された流入口構造が種々の駆動電圧でのフィーダーチャネルへのＤＮＡの捕捉及びロードの速度を有意に高めることを示すグラフである。
【００３４】
本発明の一実施形態では、フィーダーチャネルの寸法は幅１００ｎｍ以下及び深さ１００ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、フィーダーチャネルの寸法は幅７５ｎｍ以下及び深さ７５ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、フィーダーチャネルの寸法は幅５０ｎｍ以下及び深さ５０ｎｍ以下である。フィーダーチャネルの長さは好ましくは約１μｍ〜約１００μｍ以上の範囲であるが、さらに長い及びさらに短いフィーダーチャネルの長さも本発明の生体分子プロセッサには好適である。フィーダーチャネルは任意の所望の幾何的断面、すなわち、円形、三角形、四角形、長方形、五角形、六角形、七角形又は八角形を有し得る。
【００３５】
図２を参照すると、生体分子プロセッサのフィーダーチャネルはさらに、フィーダーチャネル２０内でのバイオポリマー分子（例えば、核酸分子１５）の成形、引き伸ばし、及び位置決めを行うのに使用される１つ以上のエントロピートラップ３０を含み得る。好適なエントロピー核酸トラップは当該技術で既知であり、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｈａｎ及びＣｒａｉｇｈｅａｄ，"Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｅｎｔｒｏｐｉｃ  Ｔｒａｐ  Ａｒｒａｙ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：１０２６−１０２９（２０００）、Ｏ'Ｄｏｎｎｅｌｌら、 "Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｄｒｉｖｅｎ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｃｒｏｓｓ  ａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎａｎｏｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，"Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１１：０７５０３２（２００９）、並びにＲｅｉｓｎｅｒら、 "Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｎａｎｏｓｌｉｔ  ｖｉａ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｎａｎｏｐｔ  Ａｒｒａｙｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：７９−８４（２００９）を参照のこと。
【００３６】
フィーダーチャネルはさらに、バイオリアクターチャンバーにおける下流の酵素的切断の前にバイオポリマー分子の方向を調整する又は処理するのに使用される１つ以上の事前処理チャンバー又はトラップを含有し得る。例えば、バイオポリマーがｍＲＮＡ分子であるならば、酵素的切断に好適な基質を生成するために、当該分子はキャップを取り除かれる又は脱アデニル化される必要がある。好適な処理酵素を、フィーダーチャネルの壁又はバイオリアクターチャンバーの上流でのフィーダーチャネル内に位置するバイオリアクターより前の処理チャンバーの壁に繋ぎ止める又は連結することができる。
【００３７】
エントロピートラップ、フィーダーチャネル、及び任意の他のバイオリアクター前処理チャンバーは、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドも含有し得る。チャネル、トラップ又はチャンバーの中で壁又は支持構造体に固定化されているこれらの捕捉オリゴヌクレオチドは、チャネルを介して供給されるバイオポリマー分子（例えば、核酸）の末端に対して相補的なホモポリマー反復配列を含み得る。固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとバイオポリマー分子の相補的領域との間でのハイブリッド形成は、バイオポリマー分子がフィーダーチャネルを通り抜ける際に当該分子の方向を調整するのを助ける。
【００３８】
フィーダーチャネル２０はまた、当該フィーダーチャネルと交差する１つ以上のセンサー２６も含み得る。図１及び２に描かれている実施形態で示されているように、フィーダーチャネル２０は、センサー２６（例えば、フィーダーチャネル２０に垂直である電気シグナルを測定することができるフィーダーチャネル２０の入力端の近位にある１対の検出電極）を含む。検出電極２６のそれぞれは、生体分子プロセッサの外部の電気コンポーネントへの接続を提供するマイクロコンタクトパッド４０に連結される。バイオポリマー分子１５が検出電極２６を通過すると、電気シグナルの乱れが検出され、この乱れの持続時間によって分子の長さの近似値が提供され得る（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるLiang et al., "Nanogap Detector Inside Nanofludic Channel for Fast Real-Time Label Free DNA Analysis," Nano Lett. 8(5):1472-1476 (2008)）。
【００３９】
生体分子プロセッサ１０のフィーダーチャネル２０は、その出力端１８にて、バイオリアクターチャンバー１４に流体的に連結されている。図３Ｂは、バイオリアクターチャンバー１４に連結された、エントロピートラップ３０を含有するフィーダーチャネル２０の一部を示す、走査電子顕微鏡像（ＳＥＭ）である。バイオリアクターチャンバー１４も生体分子プロセッサの固体基板の壁によって画定され、約１００〜約１０００ｎｍの幅である。図３ＣのＳＥＭに示されているように、バイオリアクターチャンバー１４は、１種以上の切断酵素３６（例えば、エキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、又はプロテアーゼ）が共有結合している支持構造体１６（例えば、ピラー状のもの）を含有する。バイオリアクターチャンバーの支持構造体は、生体分子プロセッサの固体基板と同じ又は異なる材料を含み得る。一実施形態では、支持構造体はポリマー支持構造体（例えば、ＰＭＭＡ、ＰＣ又はＣＯＣポリマー）である。バイオリアクターチャンバーの支持構造体は、幅約５０ｎｍ〜約９００ｎｍ及び高さ約１０ｎｍ〜約１００ｎｍである。支持構造体の表面積は約１５００〜約２８５，０００ｎｍ２である。支持構造体に固定化された切断酵素は、フィーダーチャネル２０の出力端１８からバイオリアクターチャンバー１４に入るバイオポリマー分子に結合し、切断する。いくつかの実施形態では、切断酵素は活性化を必要とし得る。活性化剤、例えば、Ｍｇ２＋を含有する緩衝液又は電気泳動緩衝液は、バイオリアクターチャンバー１４に流体的に連結された貯蔵チャンバー４２にて保存される（図２）。
【００４０】
図２Ｂは、バイオリアクター支持構造体１６に固定化されており、かつ、核酸分子１５と結合している、切断酵素３６を示す。当該切断酵素は、当該技術で既知の標準のカップリングの化学的性質を用いて、バイオリアクターチャンバーの支持構造体に繋ぎ止められ得る。一実施形態では、当該酵素は、偶発的な固定化によって支持構造体に繋ぎ止められる（図５Ａ）。種々の抗体に日常的に利用される確立されたカルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＥＤＣ）の化学的性質を用いて、エキソヌクレアーゼ（New England Biolabs）又は他の酵素などの市販の切断酵素を固定化することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Chen et al., "Functional Template-Derived Poly(methyl methacrylate) Nanopillars for Solid-Phase Biological Reactions," Chem. Mater. 19:3855-3857 (2007); および Wang et al., "Microarrays Assembled in Microfluidic Chips Fabricated From Poly(methyl methacrylate) for the Detection of Low-Abundant DNA Mutations," Anal. Chem. 75:1130-1140 (2003））。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、当該切断酵素は好適な捕捉部分の固定化によって支持構造体に繋ぎ止められ、ここで当該酵素は、捕捉部分結合パートナーを含有する又は含有するように操作されている。例えば、一実施形態では、支持構造体の表面は、ヘキサヒスチジンタグで操作された酵素を用いた酵素の固定化を可能にするＮｉ（ＩＩ）に結合した複数の捕捉リガンドを含有する（図５Ｂ）（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるDapprich, J., "Single-Molecule DNA Digestion by Lambda-Exonuclease," Cytometry 36:163-168 (1999)）。１−アセタト−４−ベンジル−トリアザシクロノナン（Ａｃｂｚｔａｃｎ）（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Johnson & Martin, "Controlling Protein Orientation at Interfaces Using Histidine Tags: An Alternative to Ni/NTA," J. Am. Chem. Soc. 127:2018-2019 (2005); Warden et al., "Synthesis of Novel Derivatives of 1,4,7-Triazacyclononane," Organic Lett. 3:2855-2858 (2001)）又はニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）によって修飾されているＣＴ−ＰＭＭＡにＮｉ（ＩＩ）を配位させることによってＮｉ（ＩＩ）表面を生成することができる。ＣＴ−ＰＭＭＡの表面をＥＤＣ／Ａｃｂｚｔａｃｎに暴露してトリアザシクロノナンの２級アミンを介してＰＭＭＡへのＡｃｂｚｔａｃｎのアミド結合を形成することによってＡｃｂｚｔａｃｎ−ＰＭＭＡ表面を形成することができる（図５Ｂを参照）（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるJohnson & Martin, "Controlling Protein Orientation at Interfaces Using Histidine Tags: An Alternative to Ni/NTA," J. Am. Chem. Soc. 127:2018-2019 (2005)）。
【００４２】
切断酵素を支持構造体に繋ぎ止めるのに使用することができる別の捕捉と結合の組には、ビオチンとストレプトアビジン、マルトースとマルトース結合タンパク質、キチンとキチン結合タンパク質、アミラーゼとＭＢＰ、グルタチオントランスフェラーゼとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、インテグリンとインテグリン結合ペプチド、核酸オリゴヌクレオチド又は核酸類似体オリゴヌクレオチドとその相補的オリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
別の実施形態では、固定化抗体を用いて酵素が支持構造体に繋ぎ止められる。例えば、ヘキサヒスチジンタグを含有するように操作されている切断酵素は、抗Ｈｉｓタグ抗体を介して支持構造体に固定化することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるPerkins et al., "Sequence-Dependent Pausing of Single Lambda Exonuclease Molecules," Science 301:1914-1918 (2003)）。市販の抗ヒスチジンタグ抗体（Roche、Qiagen、又はNovagen）又は他の抗体の固定化は、種々の抗体に日常的に利用される確立されたカルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＥＤＣ）の化学的性質を用いて達成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMcCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Chen et al., "Functional Template-Derived Poly(methyl methacrylate) Nanopillars for Solid-Phase Biological Reactions,"Chem. Mater.19:3855-3857 (2007); 及び Wang et al., "Microarrays Assembled in Microfluidic Chips Fabricated From Poly(methyl methacrylate) for the Detection of Low-Abundant DNA Mutations,"Anal. Chem.75:1130-1140 (2003)）。抗体による、操作されたペプチド捕捉配列を含有する酵素の捕捉の追加の実施形態には、抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧエピトープ；及び抗Ｍｙｃタグ抗体によるＭｙｃタグエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
切断酵素による支持構造体の表面被覆率は、固定化の前後での固定化溶液中のタンパク質含量の評価によって評価することができ（溶液差分法）（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Smith et al., "Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid," Anal. Biochem. 150:76-85 (1985); Stoscheck, C.M., "Quantitation of Protein," Methods in Enzymol. 182:50-68 (1990)）、その活性は標準の速度論的方法を用いて測定されるであろう（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるChen et al., "Functional Template-Derived Poly(methyl methacrylate) Nanopillars for Solid-Phase Biological Reactions," Chem. Mater. 19:3855-3857 (2007)）。
【００４５】
本発明の一実施形態では、バイオリアクターチャンバーの固定化された切断酵素はエキソヌクレアーゼである。本明細書で使用されるとき、「エキソヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子の末端からの単一ヌクレオチドの加水分解を触媒することができる任意の酵素を包含する。一実施形態では、エキソヌクレアーゼはプロセッシブな酵素であり、すなわち、それは鋳型を遊離させることなく、鋳型の一連の連続的な切断事象を触媒する。そのようなエキソヌクレアーゼは、単量体酵素、多量体酵素、又は複数のサブユニットで構成される酵素複合体であることができる。そのようなエキソヌクレアーゼには、５'→３'の方向で二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ基質を切断するλ−エキソヌクレアーゼ、３'→５'の方向で一本鎖のＤＮＡ基質を切断するエキソヌクレアーゼＩ、３'→５'の方向で二本鎖のＤＮＡ基質を切断するエキソヌクレアーゼＩＩＩ、５'→３'の方向で二本鎖のＤＮＡ基質又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド基質を切断するＴ７エキソヌクレアーゼ；５'→３'の方向で一本鎖のＲＮＡ基質を切断するＸＲＮ−１（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Geisler and Coller, "XRN1: A Major 5' to 3' Exoribonuclease in Eukaryotic Cells," Enzymes 31:97-110 (2012), Jinek et al., "Coupled 5' Nucleotide Recognition and Processivity in Xrn1-Mediated mRNA Decay," Mol. Cell 41:600-608 (2011), および Jones et al., "The 5'->-> 3' Exoribonuclease XRN1/Pacman and its Functions in Cellular Processes and Development," WIREs RNA 3:455-468 (2012)）、３'→５'の方向で一本鎖のＲＮＡ基質を切断するＲＮａｓｅＩＩ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるZuo et al., "Structural Basis for Processivity and Single-Strand Specificity of RNaseII," Mol. Cell 24:149-156 (2006)）、及び３'→５'の方向で一本鎖のＲＮＡ基質を切断するエキソソーム複合体（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるLee et al., "Elastic Coupling Between RNA Degradation and Unwinding by an Exoribonuclease, Science 336:1726-1729 (2012)）が挙げられるが、それらに限定されない。バイオリアクターチャンバーの支持構造体は前述のエキソヌクレアーゼ酵素のうち１種以上を含み得る。いくつかの実施形態では、酵素の組み合わせ（例えば、ＸＲＮ−１と組み合わせたエキソソーム複合体）は、ＲＮＡ分子がバイオリアクターチャンバーに入ると、ＲＮＡの向き（すなわち、５'→３'又は３'→５'）を問わずに確実にＲＮＡ分子を切断する。いくつかの実施形態では、プロセッシング前ステップ（例えば、メッセンジャーＲＮＡのキャップを外してＸＲＮ−１のための５'リン酸化基質を生成すること、又はメッセンジャーＲＮＡを脱アデニル化してエキソソーム複合体に好適な基質を生成すること）が必要となり得る。そのような追加の酵素は、反応前チャンバー、フィーダーチャネルに存在するか、又はバイオリアクターチャンバーの支持構造体に連結され得る。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、バイオリアクターチャンバーの固定化された切断酵素はプロテアーゼ又はペプチダーゼである。本明細書で使用されるとき、「プロテアーゼ」及び「ペプチダーゼ」は相互に交換可能に使用され、ペプチド結合の加水分解によるタンパク質分解が可能な酵素を指す。好適なプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（アスパラギン酸残基のアミノ側で切断する）、アスパラギンプロテアーゼ、リジンプロテアーゼ（リジン残基のカルボキシル側で切断する）、メタロプロテアーゼ、及びグルタミン酸プロテアーゼ（グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボキシル側で切断する）が挙げられるが、それらに限定されない。本発明での使用に好適である特定のプロテアーゼには、脂肪族残基、芳香族残基及び疎水性残基のカルボキシル側で切断するプロテイナーゼＫ、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基のカルボキシル側で切断する黄色ブドウ球菌のＶ−８プロテアーゼ、アルギニン残基及びリジン残基のカルボキシル側で切断するトリプシン、並びに、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンのカルボキシル側で切断するキモトリプシンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４７】
図２に示すように、バイオリアクターチャンバー１４は、フィーダーチャネル２０の反対側に延びている出力チャネル４４に流体的に連結されている。出力チャネル４４は、切断されなかったバイオポリマー成分を回収するのに役立ち、例えば、バイオポリマー分子が二本鎖ＤＮＡ分子であり、切断酵素によって一方の鎖のみのＤＮＡが切断される場合、出力チャネルは消化されなかった鎖のＤＮＡを回収する。或いは、出力チャネルは、消化されなかったバイオポリマー単位を回収し、それらを切断のために１つ以上の他のバイオリアクターチャンバーまで下流へと輸送する第２のフィーダーチャネルとして役立ち得る。
【００４８】
バイオリアクターチャンバー１４はまた、生体分子プロセッサ１０の固体基板１２の壁によって画定される飛行時間型チャネル２４に流体的に連結されている。飛行時間型チャネルの寸法は、幅５０ｎｍ以下及び深さ５０ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、飛行時間型チャネルの寸法は、幅２５ｎｍ以下及び深さ２５ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、飛行時間型チャネルの寸法は、幅１５ｎｍ以下及び深さ１５ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、飛行時間型チャネルの寸法は、幅１０ｎｍ以下及び深さ１０ｎｍ以下である。本発明の別の実施形態では、飛行時間型チャネルの寸法は、幅５ｎｍ以下及び深さ５ｎｍ以下である。飛行時間型チャネルは長さ１μｍ〜２５０μｍ超又は長さ５μｍ〜２５０μｍであることができ、所望の幾何的断面、すなわち、円形、三角形、四角形、長方形、五角形、六角形、七角形又は八角形を有し得る。
【００４９】
図２にて及び図３ＤのＳＥＭにて示すように、飛行時間型チャネル２４は、少なくとも第１のセンサー３２（例えば、飛行時間型チャネル２４の入力端２２の近位にある、飛行時間型チャネル２４と交差する１対のナノ検出電極）と、第２のセンサー３４（例えば、飛行時間型チャネル２４の出力端３８の近位にある、飛行時間型チャネル２４と交差する１対のナノ検出電極）とを有する。各ナノ検出電極は、生体分子プロセッサの外部の電気コンポーネント及び検出コンポーネントに接続を提供するマイクロコンタクトパッド４０に連結される。飛行時間型チャネルは２個より多くのセンサーを含有し得る。図６Ａにて示すように、飛行時間型チャネル２４は、少なくとも第１の電極３２、第２の電極３４、及び第３の電極３３の電極（例えば、３対のナノ検出電極）を含み得る。図７にて示すように、飛行時間型チャネルは３個より多くのセンサーを含み得る。
【００５０】
飛行時間型チャネルのナノ検出電極は、当該チャネルに対して垂直の電気的符号を測定することができる。本発明の一実施形態では、各電極対は、分子実体が電極間に滞留又は通過するときに電極間を流れる電流の変化を、溶液のコンダクタンス又はインピーダンスの変化により、検出することができる。
【００５１】
本発明の装置は、１つ以上のバイオリアクターチャンバー内及び１つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を生成するように機能的に配置された電場発生器も有する。バイオポリマー分子の切断された単位がバイオリアクターチャンバー１４から出て飛行時間型チャネルを通って動電的に輸送されるように、電場をバイオリアクターチャンバー１４及び飛行時間型チャネル２４に印加する。切断された単量体単位又は多量体単位が飛行時間型チャネル２４を通って移動すると、それらは飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１のセンサー３２、第２のセンサー３４、及びさらなるセンサーによって検出される。核酸分子から切断されたモノヌクレオチドが３つのセンサーを含有する飛行時間型チャネルを通り抜ける三次元図を図６Ｂに示す。本明細書に記載されているように、２つ以上のセンサーの間（例えば、第１及び第２のナノ電極対の間並びに／又は第２及び第３のナノ電極対の間）における各バイオポリマー単位の飛行時間を用いて、切断されたバイオポリマー単位が何であるかを同定し且つ／又は特徴づける。加えて、第１及び／若しくは第２又はそれより多くのセンサーによって検出される切断された単位の電気ピークの振幅もまた、切断されたバイオポリマー単位を同定し且つ／又は特徴づけるのを助けるのに用いられる。
【００５２】
飛行時間型チャネルを通るバイオポリマー単位の移動時間は、印加される電場、飛行時間型チャネルの長さ、及び、バイオポリマー単位とチャネル壁との相互作用の数、又は、個々のバイオポリマー単位の電気泳動移動度の差によって決定される。壁の相互作用又は電気泳動移動度が分子依存性である場合（例えば、モノヌクレオチド塩基）、飛行時間は、バイオポリマー単位が何であるかの直接的な指標を提供するであろう。
【００５３】
バイオポリマー単位と飛行時間型チャネルの壁との間の分子特異的な相互作用は、飛行時間型チャネルの壁の組成及び官能化によって制御することができる。一実施形態では、飛行時間型チャネルの壁は修飾を伴って又は伴わずに基板と同じ組成を含む。或いは、飛行時間型チャネルの壁は、修飾を伴って又は伴わずに基板と異なる組成を含む。別の実施形態では、分子依存性の飛行時間は、各切断されたバイオポリマー単位の独自の電気泳動移動度によって決定され、したがって壁の相互作用は必要とされない。
【００５４】
本発明の一実施形態では、飛行時間型チャネルは、ポリマー物質、例えば、ＰＭＭＡ、ＰＣ、エポキシ系樹脂、コポリマー、ポリスルホン、エラストマー、及び高分子オルガノシリコン、又はこれらの物質の組み合わせを含む。高分子物質は未変性の状態であってもよく、又は代わりにバイオポリマー単位の識別を向上させるように改質された表面であってもよい。例えば、ポリマーの飛行時間型チャネルの壁は、異なる程度の鎖規則性を有する中性で疎水性の炭化水素表面を含み得る。別の例では、飛行時間型チャネルの壁表面は、電荷中性の親水性表面を含み得る。さらに別の例では、飛行時間型チャネルの壁表面は、荷電した親水性表面を含み得る。
【００５５】
異なる程度の鎖規則性を有する中性で疎水性の炭化水素表面を含む飛行時間型チャネルの壁表面は、ポリマーのナノチャネル表面に作られる種々の長さを有するメチルで終端するアルカン鎖の単層によって形成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHenry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices," Anal. Chem. 72:5331-5337 (2000)）。当該単層は、カルボン酸終端表面へのアミノアルカンの連結によって形成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices." J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)）。或いは、当該単層は、アミド結合を介してポリマーに連結されたアミン官能基上で尿素に連結したアルカン層から形成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Henry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems," In Chemistry, pp. 147, Louisiana State University, Baton Rouge (2001); Henry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices," Anal. Chem. 72:5331-5337 (2000)）。例えば、良好に秩序立ったオクタデシル単層は、アミンで終端したＰＭＭＡ表面とｎ−オクタデシルイソシアネートの反応によってＰＭＭＡ表面上に形成することができ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHenry & McCarley, "Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical Devices: Photo-Directed Formation of Metal Features on PMMA," J. Phys. Chem. B 105:8755-8761 (2001)）、これらのＣ１８−ＰＭＭＡ表面は、エンボス加工されたチャネルにおけるクロマトグラフィ分離に優れている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるGalloway et al., "Contact Conductivity Detection in Poly(methyl methacylate)-Based Microfluidic Devices for Analysis of Mono- and Polyanionic Molecules," Anal. Chem. 74:2407-2415 (2002)）。従って、種々の鎖長のｎ−アルキルイソシアネートを用いて異なる程度の規則性を持つ疎水性のポリマー表面を作ることができ、それは単量体（例えば、ｄＮＭＰ）の飛行時間に影響するであろう。ゼロではない電気浸透流（ＥＯＦ）に関する課題には、未反応の土台基にキャップをすることによって対処することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Henry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems," In Chemistry.  Louisiana State University, Baton Rouge (2001); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices." J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)）。
【００５６】
後半２つの目的は、（ａ）グリコール及び（ｂ）有機酸又はアミン末端を持つ物質を、カルボキシル又はアミンで終端するポリマー表面に連結することによって達成される。親水性の電荷中性の表面を生成するアプローチの１つには、適切に活性化されたカルボン酸で終端するポリマー表面を、エタノールアミン又はアミノ−トリ（エチレングリコール）と反応させることが含まれる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWei, S., "Multianalyte Detection of Breast Cancer by Fabrication of Hybridmicroarrays on Polymer-based Microanalytical Devices," In Chemistry. Louisiana State University, Baton Rouge (2005)）。代替として、アミンで終端するＰＭＭＡ及びＰＣ表面を、表面に生成されたカルボキシル基を有するグリコール（例えば、グリコール酸又はカルボキシル−トリ（エチレングリコール））によって修飾することができる。カチオン表面（エキソヌクレアーゼに使用されるｐＨ条件での）は、アミンで終端するポリマーを製造するための確立された方法を用いて形成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Henry & McCarley, "Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical Devices: Photo-Directed Formation of Metal Features on PMMA," J. Phys. Chem. B 105:8755-8761 (2001); Henry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices," Anal. Chem. 72:5331-5337 (2000); McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices. J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)）。アニオン表面は、カルボン酸で終端する表面（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Vaidya et al., "Surface Modification and Characterization of Microfabricated Poly(carbonate) Devices: Manipulation of Electroosmotic Flow," Analyst 127:1289-1292 (2002））又はスルホン酸を有する表面のうちいずれかをもたらす経路から生じるであろうし、後者はほぼｐＨに無関係な表面電荷を有する（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHenry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems," In Chemistry, pp. 147, Louisiana State University, Baton Rouge (2001)）。
【００５７】
ほとんどの修飾化学は、官能基で構成される足場（例えば、カルボキシ基）の生成をベースとし、活性化されるつもりではない領域をマスクしてこのアセンブリをＵＶ露光することによって基板上の特定の位置のみが活性化されるという点で、領域特異的にパターン形成することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices. J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)）。マスクすること、固体支持体基板の残りとその中の構造体を元の形態のままにすることによって、単層要素をナノチャネルドメインのみに選択的に固定化することができる。ナノチャネルの寸法は活性化光（２５４ｎｍ）の回析限界を下回るが、チャネルの長さは回析限界を十分上回り、これが限界寸法である。
【００５８】
図７にて示すように、本発明の装置の生体分子プロセッサは、共に連結された複数の飛行管を含み得る。各飛行管は、飛行時間型チャネルの一部によって分離されたセンサーを有する。各飛行管は、切断されたバイオポリマー単位と特異的に相互作用する特有の又は異なる化学的性質を特徴とする。この設計形式によって、個々のバイオポリマー単位の同定及び特徴づけを向上させる多次元的なバイオポリマー単位の分離が可能になる。さらに、そのような装置は、投入試料中の１つ以上のタンパク質のタンパク質分解から生成されたペプチド断片のフィンガープリントを生成するのに使用され得る。２つ以上のセンサー及び／又は２つ以上の飛行管（チャネル当たり１つ以上の飛行時間測定値を生成する異なる壁表面化学的性質を有する）を有する飛行時間型チャネルを用いることによって、考えられるタンパク質及びその修飾体すべてを所与の画分から本質的に区別する非常に洗練されたペプチドのフィンガープリント（例えば、２次元（４つのセンサーを使用）、３次元（６つのセンサーを使用）、又は４次元（８つのセンサーを使用）のフィンガープリント）が作り出される（図７を参照）。
【００５９】
上で記載したように、飛行時間型チャネルにおけるセンサーは、切断されたバイオポリマー単位がチャネルを通過するときに、それらを検出することができる。本発明の一実施形態では、各センサーは、１対の貴金属ナノワイヤ、セグメント化されたナノワイヤ、又はナノ粒子から形成された、チャネルを横切るナノギャップによって分離された１対の検出電極を含む。本発明の別の実施形態では、各１対の検出電極は狭い断面を有し、それらは飛行時間型チャネルに接触する。ナノワイヤは、５０ｎｍ未満、好ましくは約３０ｎｍ未満、さらに好ましくは約１０ｎｍ未満である直径を有する。本発明の別の実施形態では、ナノワイヤは約５ｎｍ〜約２０ｎｍの間の直径を有する。検出電極間の空間、すなわち、ナノギャップは１ｎｍ〜１０ｎｍの間であり、いくつかの実施形態では、１ｎｍ〜５ｎｍの間である。検出電極及びギャップの寸法は、多量体又は単量体の単位についてのシグナル対ノイズ比を制御し、ナノワイヤ及びギャップの寸法が小さければ小さいほど、高いシグナル対ノイズ比が得られる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるLiang et al., "Nanogap Detector Inside Nanofluidic Channel for Fast Real-Time Label-free DNA Analysis," Nano Letters 8: 1472-1476 (2008), Tsutsui et al., "Identifying Single Nucleotides by Tunneling Current," Nature Nanotechnology 5: 286-290 (2010); Ohshiro et al., "Single-Molecule Electrical Random Resequencing of DNA and RNA," Scientific Reports 2: 1- 7 (2012)）。
【００６０】
本明細書にさらに詳細に記載されているように、ナノワイヤは金属成分の組み合わせから形成されるセグメント化されたナノワイヤであってもよい。例となる組み合わせには、金（Ａｕ）とコバルト（Ｃｏ）（Ａｕ／Ｃｏ）及びＡｕと白金（Ｐｔ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
生体分子プロセッサは本発明の装置の１つのモジュール又はコンポーネントであり、上で言及されたように、当該装置は、１００〜１００，０００個の生体分子プロセッサ又は１００，０００個より多くの生体分子プロセッサを含有し得る。当該生体分子プロセッサは当該装置の１つ以上の初期段階の処理モジュールと連動してバイオポリマーの解析のための高度に統合されたシステムを生成することができる。モジュール設計のアプローチによって、システムにおける異なるモジュールを上手く組み合わせて応用ニーズに合わせる機会が可能になる。加えて、モジュールは自律的なので、それらはシステムレベルでの統合の前に性能測定基準に関して最適化することができる。当該装置の初期段階の処理モジュールには、例えば、細胞溶解物からの核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ双方）の固相抽出のためのモジュール（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWitek et al., "96-Well Polycarbonate-Based Microfluidic Titer Plate for High-Throughput Purification of DNA and RNA," Analytical Chemistry 80:3483-3491 (2008); Park et al., "A Titer Plate-Based Polymer Microfluidic Platform for High Throughput Nucleic Acid Purification," Biomedical Microdevices 10:21-33 (2008)）又はタンパク質／ポリペプチドの単離及び濃縮のためのモジュール、生体分子プロセッサに入れるために核酸を適当なサイズに剪断するためのモジュール、熱増幅モジュール（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHashimoto et al., "Rapid PCR in a Continuous Flow Device," Lab On A Chip 4:638-645 (2004); Hashimoto et al., "Ligase Detection Reaction/Hybridization Assays Using Three-Dimensional Microfluidic Networks for the Detection of Low-Abundant DNA Point Mutations," Analytical Chemistry 77:3243-3255 (2005)）、稀少細胞選択モジュール（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるAdams et al., "Highly Efficient Circulating Tumor Cell Isolation From Whole Blood and Label-Free Enumeration Using Polymer-Based Microfluidics With an Integrated Conductivity Sensor," J. Am. Chem. Soc. 130:8633-8641 (2008); Dharmasiri et al., "Capture and Enumeration of LNCaP Prostate Cancer Cells Using Aptamers Immobilized to a PMMA Microsampling Unit," Electrophoresis 30:3289-3300 (2009)）、及びＤＮＡアレイ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるXu et al., "Polymer Microfluidic Chips with Integrated Waveguides for Reading Microarrays," Analytical Chemistry 79:9007-9013 (2007)）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
本発明の別の態様は、生体分子プロセッサを含有する本発明の装置を用いて核酸分子の配列決定を行う方法を対象とする。当該方法は、１つ以上の核酸分子を含有する試料を、当該装置の生体分子プロセッサに、固定化された切断酵素が試料中の１つ以上の核酸分子と結合し、当該１つ以上の核酸分子を切断して（１つ以上の飛行時間型チャネルの入力端に１つずつ入る）単量体ヌクレオチドにするのに有効な条件下で供給する工程を含む。当該方法は、切断された単量体ヌクレオチドを１つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、１つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び１つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程をさらに含む。切断された単量体ヌクレオチドは、それらが１つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１及び第２のセンサーを通過するとき、前記印加する工程に基づいて検出される。各切断された単量体ヌクレオチドが１つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１及び第２のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるのかを測定し、測定する工程に基づいて、切断された単量体ヌクレオチドが同定される。
【００６３】
上で記載されたように、当該装置の生体分子プロセッサはさらに、バイオリアクターチャンバーに流体的に連結されたフィーダーチャネルを含有し得る。フィーダーチャネルは、バイオリアクターチャンバーにおける切断の前に核酸分子の方向を調整して引き延ばす１つ以上のエントロピートラップ及び前処理チャンバーを含有することができる。従って、本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の核酸分子を含む試料がフィーダーチャネルのチャネル試料流入口に導入される。フィーダーチャネルの長さ方向に電場が印加され、核酸分子がバイオリアクターチャンバーに入る前にフィーダーチャネルを通して核酸分子を引き延ばす。
【００６４】
本発明の方法及び装置を用いて配列決定することができる核酸分子には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子及びリボ核酸（ＲＮＡ）分子が挙げられるが、それらに限定されない。具体的には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ分子、１つ以上のメチル化されたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ及びＲＮＡの分子、１つ以上の修飾又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むＤＮＡ及びＲＮＡの分子。特に、本発明の方法は、特に少量で試料に存在する場合、１つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座及び変異を含むＤＮＡ及びＲＮＡの分子を容易に同定することができる。１つ以上の核酸分子が二本鎖ＤＮＡ分子である場合、本発明の方法は二本鎖ＤＮＡ分子の双方の鎖に由来する単量体ヌクレオチドの少なくとも一部を同定する能力を提供する。本発明の方法を用いて配列決定することができるＲＮＡ分子には、例えば、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、小分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子が挙げられる。１つ以上の核酸分子は、組織、細胞、血清、血漿、血液又はエキソソームを含むが、限定されない生物供給源から単離することができる。
【００６５】
核酸分子の配列決定のためには、バイオリアクターチャンバーにおける切断酵素はエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである。好適なエキソヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼは上で記載されている。核酸分子の配列決定については、切断酵素は好ましくは、それがバイオリアクターチャンバーに入るとき、核酸分子と結合し、核酸分子を単量体単位、すなわち、個々のヌクレオチド塩基に順に切断するプロセッシブなエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである。切断された単量体単位は、動電的にバイオリアクターチャンバーを出て、飛行時間型チャネルの中に及びそれを通って輸送され、そこでそれらはセンサーによって検出され、チャネルを通るその飛行時間に基づいて同定される。
【００６６】
本明細書の実施例にさらに詳細に記載されているように、溶液中の各ヌクレオチド塩基（例えば、デオキシヌクレオチド５'一リン酸塩基）は飛行時間型チャネルを通って移動し、個々の分子の同一性及びチャネルの表面の化学的同一性（例えば、異なる程度の鎖規則性を有する中性で疎水性の炭化水素表面ｖｓ電荷中性の親水性表面ｖｓ上で記載されたような荷電した親水性表面）に依存する方法でチャネルの壁と相互作用する。その結果、各モノヌクレオチド塩基は、チャネルの少なくとも２つの空間的に分離したセンサーによって検出および測定される、飛行時間型チャネルの通過時間に基づいて区別される。各モノヌクレオチド塩基の電気ピークの振幅が異なり得るので（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるTsutsui et al., "Identifying Single Nucleotides by Tunneling Current," Nat. Nanotech. 5:286-290 (2010)）、センサーの少なくとも１つを通過する際の各切断されたモノヌクレオチド塩基の電気ピークの振幅を測定することもできる。この測定をモノヌクレオチドの飛行時間と併せて用いて、塩基が飛行チャネルを通り抜ける際に当該塩基を同定することができる。
【００６７】
別の分析では、単一のモノヌクレオチドは飛行管と相互作用しなくてもよいが、それでも分子依存的な飛行時間を示す。モノヌクレオチドは飛行管を通して電気的に運ばれるので、電気泳動移動度で差異を示すことができ、それによって壁相互作用を必要とすることなく、特定のモノヌクレオチドに依存する固有の飛行時間を示す。いずれの形式でも、飛行時間は検出電極対の間の移動時間から推定される。
【００６８】
本発明の一実施形態では、飛行時間型チャネルは、２つのセンサー（例えば、２対のナノ検出電極）を有し、それは、個々のヌクレオチド単量体が飛行時間型チャネルを通り抜ける際にその飛行時間を測定する。例示の目的のみで、２つの電極間の間隔が１０μｍ（ミクロン）であり、印加される電圧が１０，０００Ｖ／ｃｍである場合、４つのモノヌクレオチドは以下の平均飛行時間値を有することとなろう（従来のキャピラリー電気泳動の結果に基づいて）。
ＧＭＰ：２４２μｓ（マイクロ秒）
ＡＭＰ：２４６μｓ
ＣＭＰ：２５４μｓ
ＴＭＰ：２６６μｓ
【００６９】
各ランについては、所与のモノヌクレオチドは規定の飛行時間値を有するであろう。従って、バイオポリマーの個々の単量体単位の飛行時間値はガウス分布を示すであろう。
【００７０】
別の実施形態では、飛行時間型チャネルは、ナノチャネルに沿ってほぼ同等の間隔で３つ以上のセンサー（例えば、３つ以上のナノ検出電極対）を含有する（図６Ａ〜６Ｂを参照）。切断されたバイオポリマー単位は飛行時間型チャネルに入ると第１のセンサーのそばを通り、当該センサーによって、第１のシグナルを与えるよう測定され得る第１の電気的符号が生じる。第１のシグナルは特定の時間に生じ、所与の形状及び振幅も有する。バイオポリマー単位が飛行時間型チャネルを通過し続けると、それは第２のセンサーのそばを通り、これによって第２の電気的符号が生じ、第２のシグナルを与えるよう測定され得る。第２のシグナルはある特定の時間に生じ、所与の形状及び振幅も有する。このプロセスは第３のセンサーまで、及び第ｎのセンサーまで反復する。この実施形態によれば、３つのシグナルが得られ、各センサー間（１、２又は１、３又は２、３）の飛行時間を算出することができる。これは３つの飛行時間数及び３つの独立したシグナル符号を提供する。
【００７１】
センサー１及び３の間の飛行時間はセンサー１及び２の間の飛行時間とセンサー２及び３の間の飛行時間との合計を表すので、３つの飛行時間数は互いに依存する。にもかかわらず、移動した距離で飛行時間を割ると、２つの独立した速度、並びに各バイオポリマー単位についての平均速度が得られる。ｎ個の電極については、（ｎ−１）個の独立した速度が得られ、電極の数を制御することによって各平均値の統計的な完全性が制御される。これによって飛行時間型ナノチャネルに入る所与のバイオポリマー単位についてのコール精度を有意に改善することが可能になる（エラー率を０．２５％に減らす）。さらに、振幅及び形状の追加の特徴（シグナルの増減）はバイオポリマー単位のコールの潜在的にさらなる検証の機会を提供する。例えば、ＡＭＰとＣＭＰについての飛行時間が当該時間の２％重複するのであれば、３つのシグナルの特徴がさらなる区別に役立つであろう。
【００７２】
あるバイオポリマー単位が、壁に吸着するか又はその電気泳動移動度で大きな差異を示し、且つ、別のバイオポリマー単位が飛行時間型チャネル内にある間に離れる場合、これは順序間違いエラーをもたらし得る。しかしながら、２対より多くの検出電極の使用は直ちにこのエラーを指摘するであろう。複数の検出部の使用はベースコールの精度を有意に改善するであろう。それは、飛行時間型チャネルに入る前に生じ得るエラー（例えば、塩基の喪失又は順序間違いエラー）については訂正できない。そのようなエラーは、本明細書で明確に述べられるように、二本鎖標的ＤＮＡの双方の鎖を配列決定することによって減らすことができる。
【００７３】
飛行時間型チャネルはさらに、共に連結された複数の飛行管を含み得、各飛行管は、固有の壁表面化学的性質を有する飛行時間型チャネルの一部によって分離された少なくとも２つのセンサーから成る。飛行時間型チャネル内の連結された飛行時間管の種々の構成が、多次元的な分離を提供する（図７を参照）。異なる表面化学的性質を含むチャネルを通るバイオポリマー単位の飛行時間の測定値を得ることは、非常によく似たモノヌクレオチド間（例えば、メチル化又はヒドロキシメチル化された塩基と、メチル化されていない塩基との間）の区別を高めるであろう。
【００７４】
このプロセスを、順に切断された単量体ヌクレオチド塩基のそれぞれについて繰り返し、試料中の１つ以上の核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得る。いくつかの実施形態では、試料中の１つ以上の核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列全体が得られる。当該方法の印加する工程、検出する工程、測定する工程、及び同定する工程を繰り返して、試料中の１つより多くの核酸分子の少なくとも部分的なヌクレオチド配列を得る。いくつかの実施形態では、当該方法は、試料中の１つより多くの核酸分子のヌクレオチド配列全体又は実質的に全体を得ることができる。
【００７５】
現在利用可能な技術の一部を悩ます問題は、稀な変異又はメチル化の事象（例えば、プロモータの高メチル化若しくは低メチル化、又は全ＤＮＡの１％〜０．０１％で存在する変異）を正確に検出できないことである。例示の目的で、ｐ５３遺伝子に変異を含む血漿中で循環している腫瘍ＤＮＡの存在、又は変異し得る１００個の遺伝子のいずれか若しくはそのタイプの腫瘍でメチル化され得る１００個のプロモータ領域のいずれかの存在を考慮する。そのような試料は正常な細胞から生じる無細胞ＤＮＡの大半を含有し、腫瘍ＤＮＡは無細胞ＤＮＡ全体のわずか０．０１％を構成し得るにすぎない。従って、全配列決定によってそのような変異体ＤＮＡの存在を見つけようと試みたとしても、変異を含む１０個のゲノムを同定するには１００，０００個のゲノムの配列決定が必要である。これは、ＤＮＡの３００，０００ＧＢの配列決定を必要とし、現在の配列決定技術には手が届かない課題であり、巨大なデータ管理の問題は言うまでもないことである。この問題を回避するために、多数のグループが特定の標的領域を捕捉しよう又は対象の領域をＰＣＲで増幅しようと試みている。配列捕捉には脱落の問題が伴い、所望の配列のおそらく９０〜９５％は捕捉されるが、所望の断片が欠落する。或いは、ＰＣＲ増幅は、真の変異と区別できない稀なエラーを導入するリスクをもたらす。さらに、ＰＣＲは、メチル化及びヒドロキシメチル化の情報を失う。従来、亜硫酸水素塩処理を用いてプロモータのメチル化の存在を決定しているが、それもまたＤＮＡ試料に破壊的であり、無細胞ＤＮＡにおける複数のメチル化の変化を同定する能力を欠く。
【００７６】
単一分子の配列決定は前述の配列決定の限界の一部をなしで済ませることができるが、従来の単一分子の配列決定の主な限界は、これらの技法のほとんどに伴う高いエラー率である。エキソヌクレアーゼに基づく配列決定を使用する場合、一本の鎖が破壊され、二本鎖ＤＮＡの双方の鎖を配列決定して変異又はメチル化の状態を検証することを妨げる。これは、λ−エキソヌクレアーゼに基づく配列決定で特に難題であり、それは、プロセッシブな様式のヌクレアーゼ活性によって確実にモノヌクレオチドだけを生成するために、５'リン酸及び二本鎖ＤＮＡ基質を必要とする。以下に記載されている本発明の方法は、核酸分子の双方の鎖における標的領域の直接捕捉、濃縮、及び配列決定を可能にする幾つかのアプローチを提供し、それは、非常に量の少ない変異又は配列差異の優れた校正及び確認を提供し、それによって現在の配列決定技術の上述の限界を克服する。
【００７７】
従って、本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上を同定する方法を対象とする。特に、当該方法は、試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上の配列差異を同定することを可能にする。この方法には、そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供することが含まれ、その際、１つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれは、標的特異的部分とヘアピン形成に好適な一本鎖３'アダプター部分を含む。試料は、１つ以上の核酸分子及びその相補体の３'アダプター部分がヘアピンを形成するのに有効な条件に供される。当該方法にはさらに、ポリメラーゼを提供する工程、並びに、伸長混合物を形成させるために１つ以上の３'ヘアピン化された核酸分子及びその相補体とポリメラーゼとを混合する工程が含まれる。１つ以上の核酸分子及びその相補体は、それぞれその３'ヘアピン化領域から伸長されて１つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成する。当該方法にはさらに、１つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部の配列決定を行って試料中の１つ以上の核酸分子の１つ以上を同定することが含まれる。
【００７８】
本発明のこの態様によれば、提供される試料は、同定されるべき１つ以上の潜在的な配列差異を含有する１つ以上の核酸分子及びその相補体を含有する。試料中の核酸分子は、断片化された核酸分子の各末端にアダプター（すなわち、ヘアピン形成に好適な３'アダプター部分）を付加するように無作為に断片化され、処理され得る。例えば、平滑末端である又は平滑にしたＤＮＡ分子の末端をＴ４ポリメラーゼ又は大腸菌ポリメラーゼ及びＴ４キナーゼなどの種々の酵素を用いてリン酸化することができる。３'→５'の校正活性がないポリメラーゼ（例えば、クレノウ（エキソ））を用いて３'末端に追加の「Ａ」を付加して単一塩基３'オーバーハングを生成させる。核酸分子及びその相補体にアダプター部分を付加することは、当該技術で既知の種々の酵素反応のいずれかを用いて達成される。好適な酵素には、リガーゼ（例えば、大腸菌リガーゼ又はＴ４ＤＮＡリガーゼ）、ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、又は大腸菌ポリメラーゼ）、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、及び逆転写酵素が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７９】
本発明のこの態様によれば、３'アダプター部分はヘアピン形成に好適な配列を含有する。さらに、アダプター部分は１種以上の一意のヌクレオチド配列タグ（例えば、患者を同定する配列タグ及び／又は鎖を同定する配列タグ）を含有し得る。別の任意の特徴は、散在している無作為配列を有するアダプターを設計するので、いったんアダプターが伸長されて一本鎖にされると、互いにハイブリッド形成する各末端におけるアダプターのために、それらはフライパンの取っ手のような構造を形成しない。これはまた、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼを使用するのであれば、３'ヘアピン化末端の伸長の間に断片の一方の側におけるアダプター識別子領域が偶然に破壊される機会も減らす。
【００８０】
例示のみの目的で、本発明のこの態様での使用に好適なアダプター部分を以下に描いている。この例では、任意の患者識別配列は６塩基、すなわち、ＣＧＴＧＡＣ（４，０９６種の異なる識別子タグを可能にする）であり、下線が引かれている。示されているように、患者識別配列は、散在している無作為なヌクレオチドを含有する（すなわち、患者同定領域内に「Ｎ」塩基を含有する（ＣＧＮＴＮＧＮＡＮＣ；配列番号１のヌクレオチド１〜１０））。４つの「Ｎ」の使用は２５６倍の多様性を提供し、断片の両端に同じアダプター配列を有する機会を有意に減らす。断片識別配列は１０塩基（１，０４８，５７６通りの異なる組み合わせを可能にする）であり、四角で囲ったＮの文字列によって示されている。ヘアピン配列は太字で示している。さらに短いオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号２）は３'末端に追加の「Ｔ」を含有するので、アダプターは、Ａが尾部の断片へのライゲーションに好適である。
0006388605.tif 000002
【００８１】
各セットについて規定の患者識別配列及びヘアピン配列を用いてオリゴヌクレオチドアダプターを合成するが、残りの塩基は４つの塩基すべての混合物として付加されて、各断片に一意の識別子の組み合わせを与えるのに必要な多様性を提供する。
【００８２】
図８Ａは本発明のこの態様を説明する模式図である。この例では、ステップ２において、患者識別配列とヘアピン化領域を含有するアダプター部分を各ＤＮＡ断片（すなわち、１つ以上の核酸分子とその相補体のそれぞれ）の末端に付加する。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、各断片の３'ヘアピン化末端を伸長させることができ（ステップ３）、それによって１つ以上の核酸分子をそのそれぞれの相補体核酸分子から解離させる。或いは、ポリメラーゼ酵素による伸長の前に、ハイブリッド形成した相補体から３'ヘアピン化核酸分子を変性させることができる。この実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を欠くポリメラーゼを利用することができる。３'ヘアピン化末端の伸長後、得られた二本鎖ヘアピン化ＤＮＡ分子は、本発明の装置を用いた配列決定に最適である。
【００８３】
核酸断片の両端に一意の配列識別子を付加する代替のアプローチは、「二本鎖配列決定（DuplexSequencing）」について最近開発されている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるSchmitt et al., "Detection of Ultra-Rare Mutations by Next-Generation Sequencing," Proc Natl Acad Sci U S A 109(36):14508-13 (2012)）。この方法は、１２塩基のランダムタグを含有する二本鎖リンカーの使用に基づく。入力標的ＤＮＡの上下双方の鎖を増幅することによって、所与の断片は、配列決定により追跡され得るように一意の識別子（各末端にて１２塩基で構成される）を得る。一意のタグセットを共有する配列の読み取り情報は、上の鎖又は下の鎖のいずれかの向きで鎖識別子を有するメンバーを有する対になったファミリーにグループ分けされる。各ファミリー対は、二本鎖ＤＮＡ断片１つの増幅を反映する。１つのみ又はわずかなファミリーメンバーに存在する変異は、配列決定の誤り又はＰＣＲにより導入されたエラー（増幅の後半に生じている）を表す。対になった１つのファミリーの多数又は全てのメンバーで生じている変異は、変異誘発性のＤＮＡ損傷部位にわたってコピーする場合に生じ得るような、１回目の増幅の間のＰＣＲエラーから生じる。一方、ＤＮＡ断片の双方の鎖に存在する真の変異は、ファミリー対のメンバーすべてに出現する。真の変異と共に人工的な変異がファミリー対で同時に生じ得るが、１回目のＰＣＲ増幅の間に生じるものを除くすべては、エラー補正一本鎖コンセンサス配列を作製する際、独立して同定し、考慮に入れないようにすることができる。次いで、個々のＤＮＡ二本鎖の２つの鎖のそれぞれから得た配列を比較して、二本鎖コンセンサス配列を得ることができ、これは１回目のＰＣＲの間に生じた残りのエラーを排除する。このアプローチの短所は、ファミリー対で各鎖の少なくとも５つのメンバーを得るために、多数の断片の配列決定が必要であることである（すなわち、元々の断片当たり最低１０回の配列読み取り、しかし、変動のためにさらに多くを必要とすることが多い）。さらに、当該方法は断片内でのＣｐＧ部位のメチル化状態の情報を提供しない。
【００８４】
にもかかわらず、標的の末端に一意の配列のアダプターを付加する上記のアプローチは、本発明での使用のために改変され得る。例示のみの目的で、本発明のこの態様での使用に好適な代替のアダプター部分を以下に描いている。この例では、任意の患者識別配列は６塩基、すなわち、ＣＧＴＧＡＣ（４，０９６種の異なる識別子タグを可能にする）であり、下線が引かれている。示されているように、患者識別配列は、散在している無作為なヌクレオチドを含有する（すなわち、患者同定領域内に「Ｎ」塩基を含有する（ＣＧＮＴＮＧＮＡＮＣ；以下の配列番号３のヌクレオチド１３〜２２））。４つの「Ｎ」の使用は２５６倍の多様性を提供し、断片の両端に同じアダプター配列を有する機会を有意に減らす。断片特定配列は１０塩基（１，０４８，５７６通りの異なる組み合わせを可能にする）であり、四角で囲ったＮの文字列によって示されている。ヘアピン配列は太字で示している。アダプターのさらに短いオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号４）は５'ＯＨ又は５'尾部（すなわち、ＴＴＴ、太字）を含有し、さらに長いアダプター鎖におけるヘアピンとのライゲーションを妨げる。
0006388605.tif 000003
【００８５】
以下の例では、エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を欠くポリメラーゼ（すなわち、クレノウ（エクソ−））によってアダプターのさらに小さなオリゴヌクレオチドの３'末端が伸長される。完全なアダプターのＡ尾部はポリメラーゼ及びｄＡＴＰとの長いインキュベートによって確保される。
0006388605.tif 000004
【００８６】
各セットについて規定の患者識別配列及びヘアピン配列を用いてオリゴヌクレオチドのアダプターを合成するが、残りの塩基は４つの塩基すべての混合物として付加されて、各断片に一意の識別子の組み合わせを与えるのに必要な多様性を提供する。上記の手順がＡをオリゴヌクレオチドに付加するので、標的ＤＮＡは両端で単一の３'「Ｔ」によって尾部を付けられるであろう。
【００８７】
図８Ｂは本発明のこの態様を説明する模式図である。この例では、ステップ２において、患者識別配列とヘアピン化領域を含有するアダプター部分を各ＤＮＡ断片（すなわち、１つ以上の核酸分子とその相補体）の末端に付加する。鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて各断片の３'ヘアピン化末端を伸長させる（ステップ３）。得られた二本鎖ヘアピン化ＤＮＡ分子は、本発明の装置を用いた配列決定に最適である。このアプローチは、（ｉ）ＰＣＲ増幅を必要としない、（ｉｉ）１０コピーではなく、各断片に由来する元々の鎖のみの配列決定を必要とする、及び（ｉｉｉ）元々の鎖が配列決定されるので、それはＣｐＧメチル化の情報を保存するので、従来技術を超える利点を有する。
【００８８】
５'リン酸を含有する完全長のヘアピン化二本鎖ＤＮＡは、特にλ−エキソヌクレアーゼなどの切断酵素がバイオリアクターチャンバーの固体支持体に繋ぎ止められる場合、本発明の装置を用いた配列決定に最適である。ヘアピン化領域は、（５'リン酸化された）遊離末端が最初にエキソヌクレアーゼに遭遇するようにＤＮＡ断片の方向を調整する機会を提供する。ＤＮＡはバイオリアクターチャンバーに向かってフィーダーチャネル及びエントロピートラップを通して電気泳動的に輸送されるため、ヘアピンを含有する末端の動きが邪魔されるので反対側（遊離末端）の方が速く動き、従ってバイオリアクターチャンバーにおけるエキソヌクレアーゼに達する最初のものとなる。加えて、ヘアピン配列は、バイオリアクターチャンバーの下流のフィーダーチャネル、エントロピートラップ、又は他のチャンバーの中に位置する、相補的な配列（すなわち、Ｔｎ又はＴＧｎ）を含有する固定化されたオリゴヌクレオチドとの一時的なハイブリッド形成に好適な単純な反復配列（例えば、Ａｎ又はＣＡｎ）を含有するように設計することができる。ヘアピン領域は固定化された相補的配列と一時的にハイブリッド形成し、それから変性するので、電気泳動の場においてヘアピン領域は遊離末端よりもゆっくりと移動し、従って、遊離末端がバイオリアクターチャンバーに達する最初の末端であるように遊離末端が移動の先頭に並ぶ。
【００８９】
代替の実施形態では、ヘアピン配列は、既知の相補的配列を含有するオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に好適なさらに長い既知の配列を含有するように設計される。相補的なオリゴヌクレオチドは「移動抵抗」又は「移動度変更因子」に連結される。ＤＮＡの移動を邪魔することができる移動度変更因子の例には、ペプチド、タンパク質、ＰＥＧ、他の高分子量ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。そのような条件下では、同定されるべきＤＮＡの標的特異的な領域を含有するヘアピン化分子の形成の後で、移動度変更因子を含有する相補的なオリゴヌクレオチドを、例えば、ハイブリッド形成を介してヘアピン化分子に付加する。ハイブリッド形成した移動度変更因子を負うヘアピン化末端は電気泳動の場で遊離末端よりもゆっくり移動し、遊離末端が優先的に最初にバイオリアクターチャネル入るようにバイオリアクターチャネルに入るための追加のエネルギーバリア（エントロピートラップに加えて）を提供する。
【００９０】
本発明の関連する態様では、上で記載された試料中の複数の核酸分子のうちの１つ以上の配列差異を同定する方法にはさらに、１つ以上の所望の核酸分子の配列特異的な濃縮を達成するための固体支持体上での核酸分子の固定化が含まれる。この方法には、そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供することが含まれ、その際、１つ以上の核酸分子とそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分、５'アダプター部分、及び３'アダプター部分を含み、５'及び３'のアダプター部分はヘアピンの形成に好適である。当該方法にはさらに、１つ以上の一本鎖核酸分子とその相補体の収集物を形成させるために、その相補体から１つ以上の核酸分子を変性させる工程が含まれ、その際、１つ以上の一本鎖核酸分子とその相補体のそれぞれの５'及び３'のアダプター部分のヘアピン配列がヘアピンを形成する。複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体が提供され、前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の一本鎖核酸分子とその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。１つ以上の変性させた一本鎖核酸分子とその相補体は、固体支持体上に固定化されたそれらの相補的な捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。この方法にはさらに、ポリメラーゼを提供する工程と、１つ以上のハイブリッド形成した核酸分子とその相補体を含有する固体支持体にポリメラーゼを接触させる工程とが含まれる。１つ以上の核酸分子とその相補体は、そのそれぞれの３'ヘアピン化領域から伸長されて１つ以上の完全長のヘアピン化標的核酸分子を形成し、それによって１つ以上の核酸分子を捕捉オリゴヌクレオチドから及び固体支持体から遊離させる。１つ以上の完全長のヘアピン化標的核酸分子の少なくとも一部を配列決定して試料中の１つ以上の核酸分子を同定する。
【００９１】
図９は、本発明のこの実施形態を説明する模式図である。この例では、ヘアピン化配列が各断片の５'末端に付加される（図９、ステップ２）ように、患者識別子配列タグ、鎖識別子配列タグ、及びヘアピン領域を含有するアダプター部分が二本鎖ＤＮＡの末端に付加される。二本鎖ＤＮＡの３'末端はリンカー領域を含有する。３'リンカー末端は、５'→３'活性を欠くポリメラーゼを用いてヘアピンを介して伸長されて、標的特異的部分、５'アダプター部分、及び３'アダプター部分を含有する二本鎖ＤＮＡ産物を形成し、その際、５'及び３'アダプター部分のそれぞれは図９のステップ３で示されているようなヘアピン形成に好適である。図９のステップ４に示されているように、二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性される。センス及びアンチセンスのＤＮＡ鎖は双方とも、固体支持体上に固定化された相補的な捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって捕捉される。微細製作された装置における固体支持体上でのハイブリッド形成時間は３０〜６０秒程度であり、従来のアレイ（３〜５時間台）に比べて迅速である（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWang et al., "Microarrays Assembled in Microfluidic Chips Fabricated From Poly(methyl methacrylate) for the Detection of Low-Abundant DNA Mutations," Anal. Chem. 75:1130-1140 (2003)）。相補鎖の間での再ハイブリッド形成を回避するよう、相補鎖は空間的に分離される。
【００９２】
固定化された一本鎖ＤＮＡのヘアピン領域がヘアピンを形成し、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を持つポリメラーゼを用いて固定化されたＤＮＡ鎖の３'ヘアピン化末端を伸長させ（図９、ステップ５）、それによって二本鎖ヘアピン化ＤＮＡが固体支持体から遊離する。或いは、伸長の前に、固定化された核酸分子をその相補的捕捉オリゴヌクレオチドから変性させる。この場合、ヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を欠くポリメラーゼを利用することができる。
【００９３】
本発明の別の態様は、試料中の複数の標的核酸分子のうちの１つ以上又は当該複数の標的核酸分子における配列の差異を同定する別のアプローチ（ヘアピン形成を含まないが、核酸分子の双方の鎖における標的領域を直接的に捕捉して配列決定することが可能である）を対象とする。この方法には、それぞれその相補的な核酸分子とハイブリッド形成した１つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程が含まれ、ここで、１つ以上の核酸分子及びハイブリッド形成したその相補体のそれぞれは、標的特異的部分、５'アダプター部分、及び３'アダプター部分（一本鎖ホモポリマー反復配列を含む）を含む。当該方法にはさらに、一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるために、その相補体から１つ以上の核酸分子を変性させる工程が含まれる。１つ以上の核酸分子又はその相補体の３'末端に対して相補的な複数のオリゴヌクレオチドプライマーとポリメラーゼが提供され、１つ以上の核酸分子及びその相補体がポリメラーゼ及びプライマーと混合されて伸長混合物を形成する。当該方法にはさらに、１つ以上の核酸分子及びその相補体の相補的３'末端とオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成したプライマーを伸長させて完全長の二本鎖核酸分子を形成することが含まれる。１つ以上の完全長の二本鎖核酸分子の少なくとも一部を配列決定して、試料中の１つ以上の核酸分子を同定する。
【００９４】
図１０は、本発明のこの態様を説明する模式図である。示されているように、二本鎖ゲノムＤＮＡは、本方法を用いて同定することができる例となる核酸分子である。ゲノムＤＮＡを無作為に断片化して、分子の各末端にアダプターを付加するように処理する（図１０、ステップ２）。例えば、平滑末端である又は平滑にしたＤＮＡの末端を上で記載したようにリン酸化し、ポリメラーゼを用いて追加の「Ａ」を３'末端に付加し、単一塩基の３'オーバーハングを生成させる。例えば、鎖識別子の配列又はタグを含有するアダプター部分をＤＮＡ断片の各末端に付加する（図１０、ステップ２）。ポリメラーゼを用いて３'アダプターの末端を伸長させ、次いでターミナルトランスフェラーゼによって尾部を付ける（図１０、ステップ３）。尾部導入を用いて、ポリＡ尾部などのホモポリマー反復配列を３'アダプター部分の末端に導入する。
【００９５】
二本鎖ＤＮＡを変性させ、尾部のあるアダプター鎖の３'末端とプライマーをハイブリッド形成させる（図１０、ステップ４）。ハイブリッド形成したプライマーをポリメラーゼを用いて伸長させ、本発明の装置を用いた配列決定に最適な二本鎖ＤＮＡを生成させる。配列決定される鎖は両端に鎖識別子配列を含有し、その起源の一意的検証が可能である。加えて、元々のゲノム鎖が配列決定されるので、塩基の修飾がすべて保存される。
【００９６】
特定のＤＮＡ断片の標的特異的な濃縮を達成するために、固体支持体上での選択的な標的配列特異的な捕捉を含む、上述の方法の変形を採用することができる。この実施形態を説明する模式図を図１１に示す。上述のようなＤＮＡ断片の各末端にアダプター部分を付加する（図１１、ステップ２）。この例では、アダプター部分は患者識別子配列タグも含有する。ポリメラーゼで３'アダプターの末端を伸長させ、上述のようなトランスフェラーゼを用いて尾部を付ける（図１１、ステップ３）。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させる。固体支持体上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって上下の標的鎖双方を捕捉する（図１１、ステップ４）。相補鎖を空間的に分離し、それらも標的鎖も互いに再ハイブリッド形成しないようにする。
【００９７】
固定化された一本鎖ＤＮＡの３'末端とオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリッド形成させ、ポリメラーゼを用いて伸長させて、配列決定に最適な二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる（図１１、ステップ５）。本発明の一実施形態では、プライマーの伸長の前に、固体支持体上に固定化された一本鎖ＤＮＡを相補的な捕捉プローブから変性させる。或いは、鎖置き換えポリメラーゼ（相補的な捕捉鎖をインタクトのままにする）を用いることによって、又は５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ（相補的な捕捉鎖を消化してしまう）を用いることによって、固定化された一本鎖ＤＮＡを遊離させる。
【００９８】
本発明のこの態様で利用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鎖識別子部分の既知の配列並びにアダプター断片のホモポリマー反復配列と重複する。当該プライマーは５'リン酸を有さず、ホモポリマー反復配列の３'末端に対して陥凹しているので、生成された完全長の二本鎖ＤＮＡが本発明の装置を用いて配列決定される場合、この末端は、λ−エキソヌクレアーゼなどの切断酵素の基質ではない。
【００９９】
本発明のこの態様によれば、（５'リン酸化された）平滑末端が切断酵素（すなわち、エキソヌクレアーゼ）に最初に遭遇するように本発明の生体分子プロセッサ内での断片の方向を調整する機会が、３'一本鎖ホモポリマー反復（例えば、Ａｎ）によって提供される。ＤＮＡがバイオリアクターチャンバーに向かってフィーダーチャネル及びエントロピートラップを通って電気泳動で輸送される際、３'一本鎖ホモポリマー反復を含有する末端の動きが邪魔されるので、遊離末端が最初にバイオリアクターチャンバーに入ってエキソヌクレアーゼに遭遇する可能性が高い。相補的なホモポリマー配列（すなわち、Ｔｎ）をフィーダーチャネル又はエントロピートラップの中で固定化することができ、３'一本鎖ホモポリマー反復が一時的にそれとハイブリッド形成し、それから変性して３'一本鎖末端が遊離末端よりも電気泳動の場でゆっくり移動させられるようになる。或いは、３'一本鎖ホモポリマー反復に対して相補的なより長いオリゴヌクレオチドであって電気泳動の場での移動抵抗として機能する付属物も含有するオリゴヌクレオチドを上述のように使用して、３'末端の移動を遅らせ得る。
【０１００】
上述の配列設計を含有するアダプターを付加することは、（ｉ）５'側の無作為断片ＩＤ配列；（ｉｉ）５'側の患者ＩＤ配列；（ｉｉｉ）標的配列の５'側の接合部位；（ｉｖ）捕捉された標的の配列；（ｖ）標的配列の３'側の接合部位；（ｖｉ）３'側の患者ＩＤ配列；及び（ｖｉｉ）３'側の無作為断片ＩＤ配列に基づいて各核酸断片を一意に同定する過剰な能力を提供する。２つの無作為な配列（各１０塩基を想定する）だけで１００，０００個のゲノム同等物から標的ＤＮＡを一意に区別するのに十分な１×１０１２程度の過剰な多様性を提供する。従って、真の変異は同一配列の上下の鎖双方における同一変異体塩基を同定することによって検証されるであろう。同様に、所与のＣｐＧジヌクレオチドでの真の５−メチル−ｄＣ又は５−ヒドロキシメチル−ｄＣは、所与のＣｐＧジヌクレオチド上下の鎖双方における５−メチル−ｄＣＭＰ又は５−ヒドロキシメチル−ｄＣＭＰのベースコールの存在として明らかであろう。
【０１０１】
何度も繰り返してＤＮＡの同じ領域を配列決定することによって、高いエラー率の存在下で高いコンセンサス精度を達成することができる。しかしながら、例えば、正常ＤＮＡの存在下で癌の変異を同定しようと試みる場合、高いエラー率は少量の配列変異体を同定するのを極度に困難にする。従って、相対的に少量の変異を検出するには低いエラー率が必要である。
【０１０２】
本発明の装置及び方法は、少量の変異を正確に検出するのに必要な低エラー率を達成するためのいくつかのアプローチを提供する。すなわち、本発明の方法は、１つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷した塩基を含有する少量の核酸分子（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ）を、試料中の、当該少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、対応する１つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに／又は損傷した塩基を有しない１００倍〜１０，０００倍以上多い核酸分子と区別することができる。例えば、１つのアプローチでは、λ−エキソヌクレアーゼを切断酵素として利用してｄｓＤＮＡの５'末端を消化し、ここで、双方の鎖は一意の配列識別子（上述のようなアダプター）を含有するので、それらは同一の元々の標的ＤＮＡから生じるものとして同定され得る。このアプローチでは、双方の鎖の配列決定についてのエラー率は、一方の鎖だけの場合よりも大幅に低い。一方の鎖におけるミスコールが他方の鎖における同じ位置での相補的なミスコールと合致する確率は、普通のミスコールよりも４倍低いためである。エラー率及び精度を以下の表１に示す。このアプローチはモノヌクレオチドを生成するのにどの酵素が使用されるのかに無関係であることに留意のこと。例えば、試料に由来する二本鎖ＤＮＡの両端に、一意の配列識別子を付加するのに適当なアダプターを付加した後、ＤＮＡは変性されて、エキソヌクレアーゼＩによる３'末端からの消化に好適な一本鎖にされ得、適当な片方の鎖がその一意の配列識別子によって同定され得る。
【０１０３】
（表１）鎖識別子を含有するｄｓＤＮＡのλ−エキソヌクレアーゼによる消化及び双方の鎖の解析
0006388605.tif 000005
【０１０４】
別のアプローチには、ｄｓＤＮＡの５'末端を消化するためのλ−エキソヌクレアーゼの使用、その後の得られた一本鎖ＤＮＡを３'末端から消化するためのエキソヌクレアーゼＩの使用が含まれる。この実施形態によれば、得られた一本鎖ＤＮＡを第２のフィーダーチャネルに導入し、エキソヌクレアーゼＩを含有する第２のバイオリアクターチャンバーに導く。消化されたモノヌクレオチドは、第２の消化によって遊離したヌクレオチドを分離及び同定するために第２の飛行時間型チャネルを通して往復させられる。以下の計算は、異なるエキソヌクレアーゼによって生成されたとしても、飛行時間型チャネルにおいてヌクレオチドを区別するエラー率には差異がないことを前提としている。
【０１０５】
（表２）ｄｓＤＮＡ標的分子の第１及び第２の鎖の、連動したλ−エキソヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼＩによる消化
0006388605.tif 000006
【０１０６】
別のアプローチには、二重検出（３つの飛行時間測定値を得るための３つのナノ電極対）との比較で単一検出（単一の飛行時間測定値を得るための２つのナノ電極対）を使用する、ｄｓＤＮＡのλ−エキソヌクレアーゼによる消化が含まれる。この場合の比較は、一方の鎖だけが切断される同一ヌクレオチドについての同じ潜在的エラー率の間の比較である。従って、当該エラー率は、同一の元々の標的分子の双方の鎖が調べられる上記のアプローチよりもやや高い。
【０１０７】
（表３）ｄｓＤＮＡのλ−エキソヌクレアーゼによる消化、単一及び二重の飛行時間測定の比較
0006388605.tif 000007
【０１０８】
メチル化又はヒドロキシメチル化された塩基を、そのメチル化されていない対応塩基と区別すること（すなわち、ｄ５ｍｅＣＭＰをｄＣＭＰと区別すること）は、単に２つの天然の塩基を互いに区別するよりも難しい可能性がある。その結果、ｄ５ｍｅＣＭＰをｄＣＭＰと区別するための分類エラー率は高くなり得る。以下の表４にて示すのは、メチル化Ｃ塩基と非メチル化Ｃ塩基との区別について算出されたエラー率である。
【０１０９】
（表４）メチル化、単一検出及び二重検出の比較
0006388605.tif 000008
【０１１０】
生物学的に関連するメチル化は、ＣｐＧアイランドとして知られるＧ＋Ｃ含量が高い領域、並びにＣｐＧショアとして知られる隣接領域で生じることが多い。従って、ＣｐＧ配列のような手掛かり用い、隣接するＣｐＧ配列のメチル化状況をスコア化することは、単一の飛行時間測定にてｄ５ｍｅＣＭＰをｄＣＭＰと区別するための高いエラー率を有したとしても、５ｍｅＣのスコア化における精度を劇的に改善する。これを以下の表５で例示説明する。
【０１１１】
（表５）メチル化、単一検出及び二重検出の比較、並びに、連続してメチル化されたＣｐＧの配列決定のスコア化
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【０１１２】
同様に、上で概説したように、双方の鎖の配列を決定することに二重検出を組み合わせることもエラー率を有意に低下させ、種々のプロモータ領域におけるメチル化状態のコール精度を改善する。従って、本発明の方法は、１つ以上のメチル化又は修飾のないヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子を、試料中の、当該少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する１００〜１０，０００倍以上多い核酸分子と区別することができる。同様に、本発明の方法は、１つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子を、試料中の、当該少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾のないヌクレオチド塩基を有する１００〜１０，０００倍以上多い核酸分子と区別することができる。
【０１１３】
本明細書に記載されている装置及び方法は、現在利用可能な配列決定技術を悩ます、上で言及された問題を克服するであろう。本発明の装置及び方法は、血漿中の無細胞ＤＮＡにおける腫瘍ＤＮＡに由来する、１００個の遺伝子における１つ以上の変異の存在又は１００個のプロモータにおける１つ以上のメチル化の変化の存在を同定することができ、ここで、１００，０００ゲノムの正常ＤＮＡ中、変異又はメチル化の変化を含有する腫瘍ＤＮＡは１０ゲノムに相当する。平均的な遺伝子が２，０００塩基の配列に相当し、平均的なプロモータ領域が５００塩基に相当することを考慮すると、捕捉プローブ（平均長５０塩基）は、２５０，０００塩基の一意の配列を捕捉するように合成されるであろう。それは、「上」の鎖の配列を捕捉するための５，０００個のプローブ及び「下」の鎖の配列を捕捉するための５，０００個のプローブを表す。５，０００個のプローブの各セットはまとめて合成され（又はＡｇｉｌｅｎｔチップ上で合成されてチップから切断され）、次いで、微細製作した装置の空間的に離れた領域に（例えば、オリゴヌクレオチドの連結に使用されたチップのその領域におけるピラー状のもの又は他のアスペクト比の高い形に）て連結されてもよい。
【０１１４】
患者が年を取るにつれて、加齢関連のプロモータのメチル化の結果として、一部の遺伝子は散発的にオフになる。腫瘍が拡大すると、それは全般的な低メチル化及び特定のプロモータ領域における特定の高メチル化を呈することが多い。メチル化状況におけるこれらの変化の双方は、血漿中の癌特異的ＤＮＡを早期に検出する機会を提供する。癌特異的なメチル化の変化を伴う複数の遺伝子座を同定して、加齢関連の変化による誤った偽陽性を回避することが重要である。本明細書に記載されている装置及び方法は、腫瘍組織におけるメチル化の変化を同定する迅速な方法、並びに血漿又は他の生体試料における少量の変化を同定する精度の高い方法を提供する。
【０１１５】
本発明の方法及び装置は、核酸分子の配列決定のための従来の方法及び装置を超える多数の利点を提供する。具体的には、本発明の方法は、１回のラン当たり、最初の塩基から最後の塩基まで高いレベルの精度での長い読み取り長さ（２００〜５０，０００塩基）、均一なカバー率、及び高速スループットを低コストで達成する。当該装置は１００，０００ゲノム同等物にて双方の鎖で２５０，０００塩基（＝５００，０００塩基）を配列決定することができる。それは５×１０１０＝５０ＧＢのＤＮＡ配列に等しい。１回１．４時間のランで５００ＧＢのＤＮＡの最大容量で、本発明の装置は１０個の血清試料を同時に評価し、そのメチル化状況が癌又は予後の状態に相関する１００個の癌遺伝子及び１００個のプロモータ領域の変異の状態の包括的な評価を提供することができる。たった２０個の遺伝子及び２０個のプロモータ領域のスクリーニング試験があれば、１回のランで５０個の血清試料が容易に評価されることとなるであろう。
【０１１６】
本発明の装置及び方法を用いて得られる配列読み取り情報は、他の配列決定技術を悩ます状況固有のエラー（例えば、高いＧＣ；長いホモポリマー）を有しない。単分子分離を達成する能力は異種の試料の特徴づけを円滑にし、他の配列決定技術では見ることができない違いの同定を可能にする。双方の鎖における標的領域の直接的な捕捉及び配列決定は、優れた校正及び非常に少量の変異の確認を提供する。長い一続きのヌクレオチド配列を配列決定する能力は、ＳＮＰ、ハプロタイプ、及び大規模な構造的再構成を高い感度及び特異性で解決することができる。長い読み取りも、同じ深さのカバー率での短い読み取りの配列決定技術に比べて、コンティグの数を減らし、さらに良好なコンセンサス精度を生じることによってゲノムアセンブリを単純化し、改善する。最後に、増幅しないで投入されたＤＮＡを直接配列決定することは、亜硫酸水素塩変換なしで、元々の塩基の修飾（例えば、５−メチル−Ｃ、５−ヒドロキシメチル−Ｃ、又は損傷したＤＮＡ塩基）の同定を可能にする。既存の単一分子ＤＮＡ配列決定戦略とは対照的に、本装置は、飛行時間同定プロトコール、及び、各単量体単位によって生成される一意の電気的符号のために、１回の配列決定ランで天然及び非天然の塩基に対して高精度のコールを生成する能力を有する。
【０１１７】
本発明の装置及び方法は、他の利用可能な配列決定機器では実行が難しい又は不可能である臨床研究及び診断試験を可能にする低コストの配列決定プラットフォームを提供する。例えば、血液から（例えば、血漿、エキソソーム、又は循環腫瘍細胞から）単離された核酸分子を配列決定することは、（ｉ）プロモータの高メチル化及び低メチル化（無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％で存在する場合）の高感度検出による種々の遺伝的に関連する疾患（例えば、癌）の正確な同定、（ｉｉ）既知の遺伝子の単一塩基の変異、小さな挿入、及び小さな欠失（無細胞ＤＮＡの１％〜０．０１％で存在する場合）の高感度検出による遺伝的に関連する疾患の正確な同定、（ｉｉｉ）血液から単離される特定のｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの定量による早期疾患発症の正確な同定、（ｉｖ）ＤＮＡにおける特定のコピーの変化の正確な同定、並びに（ｖ）特定の疾患関連の循環細胞から単離されたＤＮＡにおける変異並びにプロモータの高メチル化及び低メチル化の定量による早期疾患の正確な同定を提供するであろう。
【０１１８】
本発明の生体分子処理装置及び方法は、種々の診断アッセイを実施するのに特に良く適している。特に、本発明の生体分子処理装置及び方法は、母体血清試料を用いた出生前診断アッセイを実施するのに良く適している。最近の研究は、血清中の母体ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの割合は、第１、第２、及び第３のトリメスターにおいて、それぞれおよそ６％、２０％及び２６％であることを示している。ＤＮＡがどのように分解されるかによるが、母体ＤＮＡは通常約１６０塩基であって依然としてＨ１ヒストンに結合しているが、胎児ＤＮＡは約１４０塩基であってヒストンに結合していない。臨床的必要性に依存するが、知識が最良のケアを提供する場合には、適切なトリメスターで胎児ＤＮＡを検出するのに十分な感度を有する試験が開発され得る。
【０１１９】
遺伝子が既知のおよそ３，５００種の劣性遺伝性疾患がある。最も一般的な疾患はＤＮＡコピー数の異常から生じ、余分な染色体（例えば２１トリソミー）又は遺伝子の一部の欠失（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子の一部の欠失）のいずれかから生じる。出生前スクリーニングの考慮においては、遺伝性疾患の可能性を手技のリスクと比較する必要がある。２１トリソミー又は他の染色体異数性のリスクは２００分の１で手技後の自然流産のリスクに合致するので、現在、標準的治療は３５歳の妊婦については１７週目での羊水穿刺を推奨している。
【０１２０】
出生前スクリーニングについての本明細書に記載されている核酸配列決定法の使用の考慮においては、２つのレベルの試験が推奨される。２１トリソミー、１３トリソミー、及び１８トリソミーについての妊娠すべての低コストスクリーニングについては、本発明の配列決定法を用いて第２１、第１３、及び第１８染色体上で差次的に発現される遺伝子を迅速に同定する、例えば、メチル化サイレンシングの結果として胎児では止まっているが、成人では作動する遺伝子を同定する。同様の領域を３つの染色体、すなわち、第２、第５、第７染色体で同定する。第１トリメスターで母体血清からＤＮＡを単離する場合でさえ、対照染色体領域の間でメチル化されていないＤＮＡとメチル化されたＤＮＡとを比べることによって胎児由来のＤＮＡの割合を迅速に算出することができ、それは本明細書の実施例では６％となろう。他の染色体のいずれかでトリソミー（すなわち、２１トリソミー）があれば、その染色体からのプロモータは約９％のメチル化を示し、言い換えれば、正常な二染色体性の場合よりも約５０％高い。１，０００ゲノム相当をスコア化することが推奨されているので、トリソミーの場合のメチル化コピー数９０のカウントは、正常試料の場合のメチル化コピー数６０と容易に区別される。１０箇所のプロモータ領域を調べることを考えると、試料当たり、×６染色体×５００塩基×２つの鎖×１，０００コピー＝６０ＭＢのＤＮＡ配列である。１回１．４時間のランで５００ＧＢのＤＮＡの最大容量で、本発明の装置はおよそ８，３００個の血清試料を同時に評価することができる。
【０１２１】
欠失、点変異、又は異常なメチル化を含む、大まかに３，５００種の他の疾患に関連する遺伝性又は散発性の変異を胎児が含有するかどうかを判定するには、さらに洗練された解析が推奨されるであろう。配列解析は両親における劣性対立遺伝子の存在を容易に決定する。変異が両親で異なっていれば、母体血清に由来する無細胞ＤＮＡを評価することによって、子供が疾患について複合ヘテロ接合体であるかどうかを判定することができる。母体血清中の胎児ＤＮＡの解析から完全な回答を得ることは、二つの部分からなるアッセイを必要とし得る。第１は、疾患遺伝子を取り囲む反復領域における母親のＳＮＰ又は遺伝子多型のフェーズを立証することである。これは、母親の白血球又は父親の唾液から高分子量のＤＮＡを単離することによって達成され得る。本発明の核酸の配列決定法は長い一続きのＤＮＡを配列決定することができるので、これを用いて、疾患遺伝子に関連する反復領域における隣接するＳＮＰ又は遺伝子多型、並びに染色体フェーズ（ハプロタイプ）を立証し得る。それはまた、欠失があるかどうか、例えば、母親がＤＭＤ遺伝子における欠失のキャリアであるかどうかを立証するであろう。
【０１２２】
羊水穿刺が考慮される時である１７週目では、母親はすでに第２トリメスターにあり、すなわち、胎児ＤＮＡは１５〜２０％の範囲で存在する。第１のアプローチでは、１回２．８時間のランで１，０００ＧＢのＤＮＡの最大容量で、本発明の装置は３３０個のゲノム同等物を評価し、その１５％が胎児由来であれば、それは約５０個のゲノムであるか、又は約２５個の各ハプロタイプをカバーする。このアプローチは最も包括的であり、胎児における遺伝性の変化、並びにデノボ変化であるものの双方から生じる遺伝性疾患を検出することができるであろう。このアプローチはＤＭＤの欠失だけでなく、自閉症に関与するものなどの他の少ないコピー数の異常も検出するであろう。２００の妊娠ごとに約１が平衡転座を生じ、このアプローチは接合部を正確に決定し、潜在的な臨床兆候を判定することができる。さらにこのアプローチは、刷り込み（例えば、アンジェルマン症候群又はプラダー・ウイリー症候群）に関連する疾患を生じ得るメチル化の変化を正確に定量することができる。メチル化状況を決定し、同時にＳＮＰ検出によって欠失が父親の染色体にあるのか又は母親の染色体にあるのかを決定する（すなわち、上流又は下流のシス位に存在する母方か父方を識別するＳＮＰを検出する）本発明の能力は、刷り込み疾患の診断識別を向上させる。最終的に、本明細書に記載されている方法はクローニング又はＰＣＲ増幅を必要としないので、ハンチントン病及び脆弱Ｘ症候群などの疾患に関与するトリプレット反復変化が適正にスコア化され得る。ペプチド及びタンパク質の同定並びに定量的プロテオミクスも行う本発明の能力は、以下に記載されているように、それが母体血清中の胎児タンパク質の測定に用いられるのを可能にするであろうし、胎児異数性及び神経管欠損についての出生前スクリーニングの一部である。
【０１２３】
或いは、第２のアプローチにおいて疾患遺伝子は２０種の最も一般的な遺伝性疾患に分けられ、次いで、１７群のあまり一般的ではない変異配列（平均で各２００個の遺伝子をカバーする）に分けられ得る。各遺伝子群は双方の鎖についての捕捉プローブのセットによってカバーされ、次いで、親の配列決定解析の結果に応じて、母親の血液は、適正な患者識別子が与えられ、１７種の特殊チップのうちの１つ以上で評価される。所与の遺伝子の長さが平均で約２，５００塩基である場合、２００個の遺伝子については、双方の鎖についてチップ上の捕捉プローブは１ＭＢである。１，０００個のゲノム同等物が配列決定されるべきであるなら、血清試料１つは１ＧＢの配列を必要とするであろう。１回１．４時間のランで５００ＧＢのＤＮＡの最大容量では、当該装置は１回のランで５００個の血清試料を評価するであろう。
【０１２４】
上記アプローチのうちの第１のアプローチは、遺伝性及び散発性の変異双方を同定すると共に、胎児が母親からの変異を担う領域を遺伝で受け継いだかどうかを判定するであろう。このアプローチは、Ｘ連鎖遺伝性疾患についての欠失、他の染色体性の欠失、胎児における異常なメチル化、トリプレット反復から生じる疾患、及び染色体の転座又は他の再構成から生じる疾患の存在も決定できるはずである。
【０１２５】
第２のアプローチは、調べた遺伝子についての病態を同定するであろう。主要な課題は、家族が正しい回答を入手するのがどのように重要であるかであろう。両親がキャリアであるかどうか及び変異が異なるかどうかを判定するのは簡単であり、父親の対立遺伝子が胎児に存在するかどうかを判定するのは相対的に簡単である。それがなければ、胎児は疾患を含まない又はキャリアである。それが存在するのであれば、母親の対立遺伝子を遺伝で受け継ぎ、疾患を発症する機会は５０％である。母親の対立遺伝子のハプロタイプが決定されているのであれば、ハプロタイプマーカーを用いて遺伝した母親の対立遺伝子の存在又は非存在を検証し得る。慎重を期して羊水穿刺を行い、母親の対立遺伝子の存在を直接調べ得る。現在の推奨は、上で概説したように遺伝子を配列決定することであり、父親の疾患対立遺伝子をスコア化することである。存在するならば、又は父親と母親の疾患特異的な変異が同一であるならば、医師は羊水穿刺を推奨する。
【０１２６】
本発明の方法及び装置は、染色体転座の非侵襲性出生前診断及び着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）にとってそれを理想的にする長い読み取り長さを達成することができる。染色体転座を有する個体は、不妊のリスク、流産のリスク、死産のリスク、及び／又は出生異常を有する子供を持つリスクが高い。着床前遺伝子診断は、正しい量の遺伝物質を有する胎児（均衡型／正常）と、転座の結果として遺伝物質を失っている胎児（不均衡型）とを区別することができる。一方が転座のキャリアである多数のカップルは、流産を経験しているか、又は染色体セットが不均衡型である妊娠について知る際に難しい決断に直面しなければならなかった。ＰＧＤに基づく本発明の方法及び装置は、移植される胎児が均衡型の染色体転座を有することを受胎前に知ることによって、これらの特定の状況に対処しなければならない可能性を減らす。
【０１２７】
投入された二本鎖ＤＮＡの双方の鎖の配列決定を行うことは、ベースコールにおいて最高レベルの精度を可能にする。ＲＮＡ基質は、その一本鎖性の性質によって双方の鎖を調べる機会を提供しない。しかしながら、ほとんどの場合、ゲノム配列から完全に正しいＲＮＡ配列を推測することができ、それは次いで、同じ投入断片の双方の鎖の配列決定によって決定され得、最高の精度を提供する。従って、ＲＮＡの配列決定は、試料に存在する、循環腫瘍細胞に由来するものであれ血清から単離される癌特異的なエキソソームに由来するものであれ、スプライシング部位の変異体すべて、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）分子すべて、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子すべてを含むそれぞれ及び全てのメッセンジャーＲＮＡの文字通りの計数などの決定的に重要な情報を提供することができる。従って、一本鎖ＲＮＡ基質を配列決定することは、二本鎖ＤＮＡ基質と同じ高い忠実性を要求しないが、読み出しが依然として飛行時間型チャネルでの検出に基づくので、ＲＮＡにおける稀な又は修飾された塩基を定量する能力は保持される。
【０１２８】
本発明の装置は、ｍＲＮＡすべてを配列決定することにおける他の技術を超える利点を提示する。現在のマイクロアレイ技術は、転写物における異なるエクソンの発現を同定することはできるが、スプライス部位の変異体すべてを正確に決定又は定量する能力を欠く。ｍＲＮＡの現在の次世代定量は、３'末端に表示を生成し、ｃＤＮＡの短い断片を配列決定し、次いでそれを用いて各ｍＲＮＡ種のコピーの数を数える。それに対して、本明細書に記載されている現在の実施形態は、それが１４，０００塩基又は４００塩基であるかどうかに無関係に、元々のｍＲＮＡ鎖全体を配列決定することを可能にする。この方法は、治療法の腫瘍特異的な標的を同定する潜在力と共に、癌細胞における正常なスプライシング及び異常なスプライシングの双方を当該装置が決定するのを可能にする。
【０１２９】
既存の技術では容易に行われない、本発明の方法及び装置を用いてＲＮＡの修飾を区別する能力は、遺伝子発現及び疾患原因の我々の理解を根本的に変えるのに役立つ。最近の研究は、ヒトｍＲＮＡの２０パーセントまでが日常的にメチル化されることを示している。さらに、ＲＮＡのメチル化における欠陥は疾患をもたらし得ることが最近示されている。例えば、脂肪塊及び肥満に関連する（ＦＴＯ）遺伝子は、ＲＮＡのメチル化を元に戻すことができる酵素をコードする。ＦＴＯの変異は、食物摂取及び代謝に異常を引き起こし、肥満をもたらし得る。ＦＴＯの変異は、肥満及び２型糖尿病の主な原因である。ＲＮＡの修飾は、癌、並びに、自閉症、アルツハイマー病、及び統合失調症などの神経疾患においても役割を担い得るという最近の証拠がある。
【０１３０】
本発明の別の態様は、本発明の装置を用いて試料中の１つ以上のタンパク質又はポリペプチドを同定する方法に関する。この方法には、当該装置の生体分子プロセッサに、１つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む試料を、当該試料中の１つ以上のタンパク質又はポリペプチドがバイオリアクターチャンバー内の固定化された切断酵素と結合して当該１つ以上のタンパク質又はポリペプチドが１つ以上の飛行時間型チャネルの入力端に入るより小さなペプチド断片へと切断されるのに有効な条件下で供給する工程が含まれる。１つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び１つ以上の飛行時間型チャネルに沿って電場が印加され、切断されたペプチド断片を１つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送し、印加された電場に基づいて、１つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第１及び第２のセンサーを当該断片が通過する際に、ペプチド断片が検出される。当該方法にはさらに、当該検出に基づいて、（ｉ）各ペプチド断片が１つ以上の飛行時間型チャネルの少なくとも第１及び第２のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるか、及び／又は（ｉｉ）１つ以上の飛行時間型チャネルにおける第１又は第２のセンサーのうちの少なくとも一方を通過する際の各ペプチド断片の電気ピークの振幅を測定する工程が含まれる。測定されたペプチド断片に基づいて、試料中の１つ以上のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも一部が同定される。
【０１３１】
本発明のこの態様によれば、切断されたペプチド断片について得られる測定値（すなわち、各ペプチド断片の飛行時間及び電気ピークの振幅）を、既知のタンパク質又はポリペプチドの切断によって生成されたペプチド断片の対応する測定値を含有するデータベースと比較して、試料中の１つ以上の未知のタンパク質又はポリペプチドを同定する又は特徴づける。
【０１３２】
ヒトのゲノムは、同定された約２１，０００個のタンパク質のコーディング遺伝子を有し、選択的スプライシングによってこれらは約１００，０００個の異なる細胞性タンパク質を生じる。これらのタンパク質の大半は、リン酸化、アセチル化、及びメチル化などの翻訳後修飾を受け、そのような修飾はタンパク質の機能及び活性状態において決定的な役割を担うことが多い。
【０１３３】
本発明のこの態様の一実施形態では、複数のタンパク質を含有する試料から所望のタンパク質を分画又は濃縮する最初のステップを加えることによって、解析の複雑さを減らすことができる。この分画ステップは、モジュール集積アプローチを用いて本発明の装置に別個のモジュールを集積することによって容易に加えられる。この分画ステップは物性に左右され得、例えばクロマトグラフィを用いて、例えばサイズ、電荷、又は疎水性により分離され得る。分画は、抗体、小分子、又は高分子に対する親和性にも左右され得る。例えば、抗体濃縮ステップ、又は所与の転写因子と相互作用するタンパク質の単離（同様に特異的抗体によるプルダウンが行われる）。或いは、タンパク質は、リン酸化された、メチル化された、若しくはアセチル化されたペプチド、又は他のタンパク質ドメイン、又はメチル化されたＤＮＡ、又は特定のＤＮＡ配列のファミリー、又はＤＮＡ配列、ＡＴＰ若しくはＧＴＰ若しくはその類似体などの一般的な基質のファミリーの１つ以上に結合することによって濃縮されてもよく、共有結合した基質又はその類似体を含有する固体支持体上でのアフィニティ精製によって分画されてもよい。投入タンパク質を分画する他のアプローチは、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ、細胞膜、核膜、リソソーム又はＤＮＡ、ＲＮＡ、クロマチン、他のタンパク質足場との会合などの細胞内部分による分離が挙げられる。分画は、Ｇタンパク質共役受容体、核内受容体、電位依存性イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、増殖因子、プロテアーゼ、配列特異的プロテアーゼ、ホスファターゼ、プロテインキナーゼ、生物活性のある脂質、サイトカイン、ケモカイン、ユビキチンリガーゼ、ウイルス調節因子、細胞分裂タンパク質、足場タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、細菌リボソーム、ヒストン脱アセチル酵素、アポトーシス制御因子、シャペロンタンパク質、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、増殖因子受容体、プロテアソーム、シグナル伝達タンパク質複合体、タンパク質／核酸輸送体、及びウイルスカプシドを含むがこれらに限定されないタンパク質の群について濃縮するように設計されてもよい。
【０１３４】
個々のタンパク質がバイオリアクターチャンバーに供給されると、固定化された切断酵素（すなわち、プロテアーゼ）がタンパク質を完了するまで消化し、キャピラリー電気泳動又はキャピラリー電気クロマトグラフィを用いて１つ以上の飛行時間型ナノチャネルにて断片が分離され、検出される。この分離及び検出が所与のタンパク質についてのフィンガープリントを生成する。特定の残基が修飾されていると、例えば、リジンがアセチル化されていれば、断片の移動度はアセチル化されていないリジンを含有する同じ断片に比べて変更される。或いは、アセチル化は通常生じるその位置での酵素的切断を妨げてもよく（例えば、トリプシンはアセチル化された残基を切断しない）、ペプチドのフィンガープリントを変化させる。既知の修飾を有する既知のタンパク質から切断されたペプチド断片の測定値又はフィンガープリントを含有するデータベースを用いて、試料中の未知のタンパク質／ポリペプチドについて取得されたパターンをデータベースと比較し、試料中のタンパク質／ポリペプチドの同定及び特徴づけを行うことができる。この実施形態の独自の態様は、それが単一の分子レベルで行われるので、質量分光法の多数の異なる形式を利用する従来のタンパク質処理プロトコールを用いて明らかにされない稀な修飾を観察することができることである。
【０１３５】
チャネル当たり１つ以上の飛行時間測定値を生成するために、２つ以上の検出電極及び／又は異なる壁表面化学的性質を有する２つ以上の飛行管を有する、１つ以上の飛行時間型ナノチャネルを利用することによって、非常に洗練されたフィンガープリント（例えば、二次元、三次元又は四次元のフィンガープリント）が生成され、タンパク質及びその修飾体の考えられるすべてが本質的に区別される。異なる壁表面化学的性質を有する２つ以上の飛行管によってｎ次元のフィンガープリントを生成するための装置構造の例を図７にて提供する。修飾には、スレオニン又はチロシンのうちの１種以上のアミノ酸残基における、メチル化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、及び他の翻訳後修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
個々のタンパク質を区別するのに有効であるタンパク質のフィンガープリントについては、プロテアーゼは同じ断片を生成するのに時間の大部分を必要とし、すなわち、それは特異的な切断を示すことを必要とする。これを達成する最も容易な方法は、認識ポケットに特定の型の残基を必要とするプロテアーゼを使用することである。本発明での使用に好適な特定のプロテアーゼは上に記載されている。
【０１３７】
本発明の方法及び装置を用いたタンパク質／ポリペプチドの解析を用いて、細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、クロマチン、若しくは他のタンパク質足場と相互作用するタンパク質について、基質若しくはその類似体と結合するタンパク質について、又は高分子（例えば、タンパク質、糖質、脂質、メチル化ＤＮＡ、特定のＤＮＡ配列、若しくはＤＮＡ配列のファミリー）と結合するタンパク質について、細胞内区画から濃縮された試料中のタンパク質レベルの変化又はタンパク質の共有結合修飾の変化から生じる疾患を正確に同定する（すなわち、診断及び予後診断する）ことができる。
【０１３８】
タンパク質解析のための本発明の装置の使用は、生殖及び寿命のメカニズム、病原性細菌、不妊、癌の形質転換、糖尿病、加齢性疾患、クローン病、アルツハイマー病、インスリン抵抗性、病原性真菌の進行、及び前立腺癌の予後の研究を含む多種多様な健康関連の研究分野における先進的な知識及び理解に極めて重要な役割を担うであろう。本発明は、複合試料中の少量のタンパク質についての、タンパク質配列カバー率、正確な定量、及び信頼性の高い同定を最大化するショットガン定量プロテオミクスの成功の中心にもあるだろう。本発明の方法は、関心対象のタンパク質及び複合体が非常に少量で低いダイナミックレンジの範囲内にあることが多い異なる組織、細胞、及び細胞小器官の中でのタンパク質複合体の正確な定量及びタンパク質修飾の動的調節の感度の高い測定を提供するであろう。
【０１３９】
本発明の方法及び装置を用いて血清マーカーを検出し、悪性前立腺疾患と良性前立腺疾患を区別することができる。前立腺癌（ＣａＰ）は男性において最も一般的な非皮膚悪性腫瘍である。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングの導入は死亡率を有意に減らしているが、診断用血清マーカーとしてのＰＳＡの使用は完璧からは程遠い。本発明は、ＣａＰの存在及び進行を予測し、高い感度と特異性で悪性疾患と良性疾患を差別化する追加の血清マーカーの検出に使用することができる。特に、本発明は、入手し易い体液にて検出可能であり、正常で良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺上皮内腫瘍、及び皮膚前立腺組織の間で区別する前立腺特異的生体マーカーの検出に使用することができる。良性疾患と悪性疾患の間で異なる発現を提示し、ＰＳＡの役割を補完する又は満たす潜在力を有する血清生体マーカーには、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、エングレイルド−２（ＥＮ２）、ＢＣＬ−２、Ｋｉ−６７、ＥＲＫ５、クロモグラニン−Ａ（ＣｇＡ）、ヒト腺カリクレイン２（ｈＫ２）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、形質転換増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、前立腺膜特異抗原、前立腺特異的細胞抗原、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）自己抗体、早期前立腺癌抗原（ＥＰＣＡ）、ＧＳＴＰ１高メチル化、性ホルモン、及び性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）が挙げられる。例えば、ＥＰＣＡ及びｈＫ２は可能性のある診断用因子であり、ＣｇＡ、ＩＬ−６、及びＴＧＦ−βは可能性のある予後予測因子である。単一のマーカーでは所望のレベルの感度及び特異性を達成しそうにない。マーカー又は血清プロファイルの組み合わせがＣａＰスクリーニングの診断精度と同様に治療を改善するための予後精度を改善するであろう。本発明の方法及び装置の高い感度及び高いサンプリング率は、この多重因子の診断及び予後診断のアプローチについてそれを理想的にする。前立腺癌の正確な又は早期の診断を提供する血液タンパク質マーカーの検出及び同定のための本発明の使用は、不必要な前立腺生検の回数を減らし、前立腺癌の治療及び管理を有意に改善する潜在力を有する。
【０１４０】
本発明の方法及び装置を用いてアルツハイマー病患者の異なる組織にてＮ−グリコシル化タンパク質部位を同定することができる。Ｎ−結合グリコシル化は窒素原子（普通、アスパラギン残基のＮ４）へのオリゴ糖の連結であり、分泌タンパク質又は膜結合タンパク質で生じる。部位特異的なグリコシル化とアルツハイマー病の間に、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）をアルツハイマー病関連の短いペプチド、アミロイドβに処理することに含まれるプロテアーゼの１つであるγ−セクレターゼタンパク質複合体の一部であるタンパク質、プレセニリン−１を介して直接の関連付けがなされている。本発明の方法は、タンパク質におけるＮ−グリコシル化部位がアルツハイマー病及びさらなる理解において重要な役割を担っているという発見を基礎として、当該疾患の診断及び予後診断を改善するために用いることができる。
【０１４１】
現在、慢性肝疾患の診断は、線維症段階及び神経炎症活性の評価並びに肝硬変の検出のために、肝生検を必要とする。これらの患者の大きな亜群では、肝硬変は肝細胞癌の発症の主なリスク因子である。従って、肝線維症の進行を日常的に評価して肝硬変の病期を信頼できるように検出することができる血清マーカーに対するニーズがある。全血清タンパク質Ｎ−グライコームは、肝硬変を検出するための優れた生体マーカーである。本発明の方法及び装置を用いて、高い特異性と良好な感度でＮ−グライコームなどの肝硬変の血清マーカーを検出し、それにしたがって肝硬変患者における生検の代替を提供することができる。
【０１４２】
本発明の方法及び装置は、治療用のタンパク質製品の評価にも使用することができる。モノクローナル抗体は、癌から神経変性疾患に及ぶ種々の疾患を標的とする重要な治療剤である。本発明の方法は、開発段階及び臨床使用前において、現在の分析技法にとっての深刻な難題を提示する目的である、これらの分子の特徴決定に用いることができる。さらに、組換えＤＮＡ法を用いて製造された治療用タンパク質は一般に複雑であり、不均質であり、発現、精製及び長期保存の間に様々な酵素修飾又は化学修飾にさらされる。組換えタンパク質配列の評価のための本発明の使用は、治療用タンパク質製品の安全性及び活性に影響を及ぼす可能性を有するアミノ酸の修飾及び配列の変化に関する情報を提供し得る。翻訳後修飾、タンパク質分解、又は転写／翻訳のエラーから生じる配列の違い、及び処理又は最終製品の保存の間に形成される分解生成物から生じる組換えタンパク質の不均質性の評価に当該装置を用い得る。本発明の方法及び装置は、多種多様な不均質の治療用タンパク質製品についてモノクローナル抗体のグリコシル化、脱アミノ化、及びジスルフィドマッピングの解析に使用することができる。
【０１４３】
本発明の方法及び装置を用いて、食物に起因する病気を検出することもできる。細菌、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが原因で、米国では年間約１，６００人のヒト回旋病症例及び２５０人の死亡を生じ、食物に起因する病気による米国死亡例すべての約１０％を表す。本発明を用いて、伝染及び病原性に寄与する遺伝子を同時制御するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのタンパク質を同定することができる。本発明の方法は、制御ネットワークの重要な部分であり得る少量のタンパク質の感度の良い検出（複合試料における正確な定量を伴う）を可能にし、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの制御性タンパク質によって調節されるレギュロンを画定するのを助ける。
【０１４４】
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの病原性の判定に役立つことができる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ヒト及び種々の動物種で多様な疾患に関与するグラム陽性の胞子形成性の嫌気性細菌である。臨床的な症状は、無症状のコロニー形成及び軽い下痢から、命を脅かす偽膜性大腸炎及び死に及ぶ。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素はよく研究されているが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの病原性はよく理解されていない。本発明を用いて、診断又は治療の対策のための潜在的な候補を同定する目的で、生体内の感染を模倣するインビトロの条件下でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの時間依存性のタンパク質の発現の変化を測定することができる。
【０１４５】
クローン病（ＣＤ）は、細胞内への微生物の侵入に応答して抗原提示細胞によって産生されるサイトカインであるＩＬ−１２及びＩＬ−２３が関与する慢性の病的なＴ細胞介在性の自己免疫炎症状態である。しかしながら、免疫におけるその役割を考えると、治療法においてＩＬ−１２／ＩＬ−２３を直接標的とすることは望ましくない結果を有し得るので、他の標的がさらに有効であり得る。本発明の方法及び装置を用いて、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３の産生を刺激するＣＤ患者の血清から細胞外の可溶性因子を同定するのを助けることができる。
【０１４６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているような生体分子プロセッサを製作する方法に関する。製作プロセスは一般に、以下のステップ、すなわち（１）基板におけるマイクロ流体ネットワーク及びナノチャネルを含むナノ流体構造の製作、（２）基板におけるナノワイヤの位置決め、（３）ナノチャネル／ナノワイヤの接合部でのナノワイヤにおけるナノギャップの形成、（４）ナノワイヤセンサーに対するマイクロコンタクトの形成、及び（５）カバー板と接合させてナノ流体センサー装置を完成させることから成る。ステップ（１）〜（３）についての製作プロセスの順序は任意で選択することができ、且つ／又はそのうちの２つを任意で組み合わせることができる。各ステップを以下にさらに詳細に記載する。
【０１４７】
製作プロセスの順序の１例を図１２に示す。この実施形態では、ステップ１には、事前に構造化されたスタンプを用いる単一ステップのナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）を用いて、基板（例えば、ポリマー基板）にマイクロ及びナノチャネル構造を形成することが含まれる。ステップ２では、ナノワイヤ又はナノ粒子が、基板の形成されたチャネルに対して垂直に置かれ、これらのチャネルはフィーダーチャネル及び飛行時間型チャネルになる。ステップ３では、チャネルの上方に置かれたナノワイヤにナノギャップが形成され、各飛行時間型チャネルと交差する１対の検出電極が形成される。ステップ４では、当該検出電極が、外部リード接続のためのマイクロコンタクトに接続される。ステップ５では、製作された構造体がカバー板に接合されて、封入された流体装置が完成する。
【０１４８】
代わりの製作プロセスの順序を図１３に示す。この実施形態では、ステップ１には、ナノチャネル形成の前にナノワイヤ又はナノ粒子をセンサー位置に置くことが含まれる。ステップ２では、ＮＩＬを用いてマイクロ流体及びナノ流体の構造、チャネルが形成される。ナノギャップはＮＩＬプロセスの間又はその後に形成されることができ、ＮＩＬの間に部分的に形成され、追跡プロセスで完成する。ナノギャップの形成に続いて、外部リード接続のためにセンサー電極がマイクロコンタクトパッドに接続され（ステップ３）、製作された構造体がカバー板に接合されて流体装置が封入される（ステップ４）。
【０１４９】
別の代わりの製作プロセスの順序を図１４に描いている。このプロセスには、後で導電性金属ナノ粒子で満たされてその導電性を改善することができる横断液体イオンコア電極を用いてナノ流体装置を作ることが含まれる。ＮＩＬを用いてマイクロ／ナノ流体ネットワーク、構造及びチャネル並びに液体コアナノ電極構造が製作される（ステップ１）。次いで、製作された構造体がカバー板に接合されて流体装置が封入され（ステップ２）、金属ナノ粒子が液体コア電極に加えられる（ステップ３）。
【０１５０】
採用される製作プロセスの順序にかかわりなく、ＮＩＬによるナノ流体構造の製作に続いてサイズ低下プロセスのステップを含め、流体ネットワーク、特に飛行時間型チャネルのサイズを低下させることができる。例えば、このプロセスのステップは、基板ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）よりは低い高温にてブランクのプラテンで圧力を加えることを含んでもよく、それは、ナノ流体構造のサイズを低下させ、ナノ流体構造の側壁の粗さを低下させるであろう。
【０１５１】
製作プロセスすべてに共通するのは、ナノインプリントリソグラフィに基づいてマイクロ／ナノ流体ネットワーク及び構造を形成するための「マスタースタンプ」の使用である。
【０１５２】
図１５は、シリコン基板におけるマスタースタンプ構造の例示的製作プロセスを描く。ステップ１では、フォトリソグラフィ及びクロムエッチングと、反応性イオンエッチング又は湿式化学エッチングを用いたＳｉエッチングステップとの組み合わせを実施し、シリコン基板における流体ネットワークのマイクロ構造を画定及び形成する。異なる深さのマイクロ構造を必要とするのであれば、フォトリソグラフィ及びＳｉエッチングのステップを繰り返す。ステップ２では、集束イオンビーム加工又は電子ビームリソグラフィを用いて、ナノチャネル（例えば、飛行時間型チャネル）、ナノチャネル流入口構造、及びバイオリアクターチャンバーの支持構造体を含むセンサー装置のナノ構造を形成することができる。
【０１５３】
製作されたマスタースタンプをＮＩＬスタンプとして直接使用してポリマー基板にて流体構造を製造するか、又はそれらをマスター金型として用いてマスタースタンプにおける構造に関してネガティブトーン構造を持つ樹脂ＮＩＬスタンプを製造する。後者に関して、熱又はＵＶのＮＩＬプロセスを介して、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWuら,"Complete Plastic Nanofluidic Devices for DNA Analysis via Direct Imprinting with Polymer Stamps,"Lab Chip 11(17):2984-9(2011)によって記載されたようなポリマー基板における流体構造を製造するためにその後ＮＩＬスタンプとして使用される種々の材料に製作されたマスタースタンプを複製することができる。ＮＩＬ樹脂スタンプのための材料には、例えば、基板上にコーティングされる熱可塑性ポリマーシート、熱可塑性ポリマー層、基板上にコーティングされるＵＶ硬化性樹脂、及び基板上にコーティングされるゾル−ゲル物質が挙げられる。使用することができる基板には、ポリマーシート、金属、シリコン、ガラス、石英、及び複合材料が挙げられる。ポリマー基板上にコーティングされるＵＶ硬化性樹脂の使用は、成形の間に接触する物質のヤング率を下げることによって成形されたポリマー基板への低い接着を生じるので、好ましい材料の１つである。ＵＶ樹脂／ポリマーのスタンプとポリマー基板の類似する熱膨張係数のために、熱応力も低下する。
【０１５４】
図１６Ａは、ＵＶナノインプリントリソグラフィを介してシリコンマスタースタンプから樹脂スタンプを製造するプロセスを示す。このプロセスでは、先ず、適当量の低粘性のＵＶ硬化性樹脂をガラス基材上に分配する又はスピンコーティングする（ステップ１）。次いで、シリコンマスター上でＵＶ硬化性の樹脂／基板を穏やかに圧迫する（ステップ２）。シリコンマスターの構造体を樹脂が完全に満たした後、ＵＶ光を使ってＵＶ樹脂を硬化又は重合させる。硬化したＵＶ樹脂／基板をシリコンマスターから離型して、シリコンマスタースタンプからのＵＶ樹脂スタンプの製作を完成させる（ステップ３）。
【０１５５】
図１６Ｂは、製作された樹脂スタンプを用いて熱ＮＩＬを介して熱可塑性ポリマー基板に生体分子プロセッサのマイクロ／ナノ流体ネットワーク構造を製造するプロセスを示す。スタンプ／基板のアセンブリを基板ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）を上回って（普通、Ｔｇを１０〜１００℃上回って）加熱する（ステップ１）。これにスタンプ表面への圧力の印加が続く（ステップ２）。２つの平行なプラテンを用いた加力又は圧縮空気のいずれかによって圧力を加えることができる。ＮＩＬスタンプとポリマー基板の間で均質な圧力印加及びコンフォーマルな接触を達成するには、圧縮空気が望ましい。基板ポリマーがスタンプ構造に完全に満たされた後、スタンプ／基板アセンブリをＴｇ未満に冷却し、成形された基板から離型させる（ステップ３）。熱ＮＩＬに好適なポリマー基板には、ＰＭＭＡ、ＰＣ、及びＣＯＣが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５６】
生体分子プロセッサの製作プロセスすべてに共通する別の特徴は、センサーとして役立つ基板内のナノワイヤ又はナノ粒子の製作及び位置決めである。好適なナノワイヤは、当業者に既知のプロセスを用いて形成することができる。一般的な製作プロセスの模式的な概観を図１７Ａにて示す。手短には、電子ビームリソグラフィを用いてプラスチック基板又は酸化アルミニウム基板からナノ多孔性の鋳型又は膜を形成し、当該膜のベース上に導電性基板（例えば、銀、金、又は酸化スズインジウム）をスパッタリングによって堆積させる（ステップ１）。導電性基板を有するナノ多孔性膜への金属又は合金の電着によってナノワイヤを形成する（ステップ２）。ナノ多孔性膜を溶解し（ステップ３）、導電性基板を取り除いて（ステップ４）ナノワイヤを解放する。図１７Ｂはこのプロセスを介して形成された１０ｎｍの直径を有するＳＥＭ又はＮｉＷのナノワイヤである。
【０１５７】
セグメント化されたナノワイヤを形成するための１種以上の似ていない金属又は合金のナノ多孔性鋳型への電着は、通常、２つの異なる技法（例えば、異なる電解溶液及び異なるメッキ条件を使用する二槽法、又は１つの溶液を用いて電流若しくは電位をパルスして似ていない層を生成する一槽法）を用いて実施される（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるLiu et al., "Perpendicular Giant Magnetoresistance of Multilayered Co/Cu Nanowires," Physical Review B  51: 7381-7384 (1995); Blondel et al., "Wire-Shaped Magnetic Multilayers for 'Current Perpendicular to Plane' Magnetoresistance Measurements," Journal of Magnetism and Magnetic Materials 148:317-318 (1995); Blondel et al., "Comparative Study of the Magnetoresistance of Electrodeposited Co/Cu Multilayered Nanowires Made by Single and Dual Bath Techniques," Journal of Magnetism and Magnetic Materials 165:34 (1997); Piraux et al., "Arrays of Nanowires of Magnetic Metals and Multilayers: Perpendicular GMR and Magnetic Properties," Journal of Magnetism and Magnetic Materials 175: 127-136 (1997); Evans et al., "Current Perpendicular t Plane Giant Magnetoresistance of Multilayered Nanowires Electrodeposited in Anodic GMR in Electrodeposited CoNiFe/Cu Multilayered Nanowires and Nanotube Aluminum Oxide Membranes," Applied Physics Letters 76:481 (2000); Davis et al., "GMR in Electrodeposited CoNiFe/Cu Multilayered Nanowires and Nanotube," ECS Transactions 1:71-77 (2005); and Pratt et al., "Perpendicular Giant Magnetoresistances of Ag/Co Multilayers," Physical Review Letters 66: 3060-3063 (1991)を参照）。これらの技法の共通点は、境界領域が破壊に供され、それを用いて、生体分子プロセッサに必要な予め必要なナノギャップを形成できる点である。
【０１５８】
アニーリングステップは大きな粒子を生成するのに役立つことができ、したがって単一の単量体単位の電極測定を行う能力を高めるナノワイヤ抵抗性を下げることができる。しかしながら、難題は、隣接するセグメントの熱膨張係数を合致させることである。従って、出願人らは、組成が調整されたパルス電着を用いてＦｅＮｉＣｏをナノワイヤとして電着させる条件を開発した。印加した電流密度を変えること又は２−ブチン−１,４−ジオール（ＢＤ）などの添加剤を加えることによって、付着物の組成を変えることができ、そのようにして熱膨張係数を調整することができる。二槽構成にて金（又は銀）のセグメントを別の電解質から電着し、硫酸処理を含めて、ＡｕとＦｅＮｉＣｏステップの間でセグメント化された堅牢なナノワイヤを生成する。
【０１５９】
図１８は、本発明の生体分子プロセッサでの使用に好適なセグメント化された堅牢なナノワイヤを生成するのに使用される上述のプロセス及び条件の模式的概説である。ステップ１では、導電性基材（例えば、銀）がスパッタリングによってナノ多孔性膜のベース上に堆積される。ＦｅＮｉＣｏの電気化学パルス堆積（ステップ３）の前に表面が空気にさらされる（ステップ２）。パルス堆積は、５０％のデューティーサイクル（２秒オン／２秒オフ）及び２５ｍＡ／ｃｍ２以下の印加電流密度で行うことができる。さらに高い電流密度を用いてＦｅの量を減らすことができるが、パルス堆積のオフ時間は増やされるべきである。０．１ｇ／Ｌの２−ブチン−１,４−ジオール（ＢＤ）の添加は、これらの条件でＮｉがより多い合金を生じる。ＢＤは、熱膨張係数の調整、及び、パルスのオフ時間中の腐食防止にも用いられる。ステップ４では、ＤＣメッキを用いてＡｕが別の電解質から電気化学的に堆積される。その後のＦｅＮｉＣｏの電気化学堆積（ステップ６）の前に、硫酸溶液（５容積％）で表面を処理する（ステップ５）。ステップ４〜６を繰り返して完全にセグメント化されたワイヤを形成する（ステップ７）。膜を溶解し、ナノワイヤを解放する（ステップ８）。
【０１６０】
生体分子プロセッサのナノワイヤは、好ましくは５〜２０ｎｍの範囲の直径を有する。２０〜２００ｎｍのワイヤの製造のためのナノ多孔性膜における電着を含む手法は当該技術で既知であるが、さらに細いワイヤの製作はナノ多孔性膜又は代わりの技法の改良を必要とする。
【０１６１】
後者に関して、図１９は、犠牲ナノチューブ（すなわち、改変したナノ多孔性膜）を用いた極薄のナノワイヤの製作プロセスを示す模式図である。メッキ条件の制御をマストランスポート制御下とすることによって、銅又はポリピロールなどの類似しない金属又はポリマーから成るナノチューブをナノ多孔性鋳型の中に堆積させる（ステップ１）。次いで、ワイヤ及びそのセグメントをナノチューブの中に電気化学的に堆積させる（ステップ２）。孔口での堆積を回避するために、ボトムアップ充填を促進するＳｕｐｅｒｆｉｌｌｉｎｇ添加剤を使用する。膜を溶解することによってチューブ／ワイヤの複合材を解放し（ステップ３）、チューブを選択的にエッチングすることによってワイヤを解放する（ステップ４）。
【０１６２】
代わりの実施形態では、図２０に描かれている電気化学的なエッチング法を用いて極薄の電極が形成される。上で記載されたように製作されたセグメント化されたナノワイヤを当該装置のセンサーの位置に置く（ステップ１）。犠牲ギャップ領域を先ずチャネル内で化学的にエッチングする（ステップ２）。電流分布が大部分一次であり（例えば、低いＷａｇｎｅｒ数）且つ／又はエッチングが拡散によって駆動されるという条件で、残りの電極における鋭い端は、電気化学的なエッチングのための優先的な領域を提供する。当該装置の中に組み込まれた電気的コンタクトを用いて両側面がエッチングされ（ステップ３）生体分子プロセッサに好適な極薄電極を生成する。
【０１６３】
製作プロセスの別の不可欠のコンポーネントには、生体分子プロセッサのセンサーの位置にナノワイヤ又はナノ粒子を置く方法が含まれる。これは特に２０ｎｍ未満のナノワイヤでは困難である。一実施形態では、表面をプログラムしたアセンブリが使用される。図２１に示すように、表面をプログラムしたアセンブリにおいて、ナノワイヤが特異的に「接着する」化学パッチが基板の表面に形成される。化学パッチを含有する基板をナノワイヤ又はナノ粒子が分散している溶液に暴露すると、当該基板の表面において、ナノワイヤ又はナノ粒子は化学パッチの位置に位置付けられる。
【０１６４】
化学パッチは、リフトオフ（ＭＡＰＬ）法による分子アセンブリパターン形成を用いて、基板の表面に形成することができる（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるFalconnet et al., "A Novel Approach to Produce Protein Nanopatterns by Combining Nanoimprint Lithography and Molecular Self-Assembly," Nano Lett. 4(10):1909-1914 (2004); Park et al., "Nanostructuring of Anti-Adhesive Layers by Hot Embossing Lithography," Micorelectron Eng. 67-68: 252-258 (2003); Park et al., "Chemical Patterning of Sub-50-nm Half Pitches Via Nanoimprint Lithography," Microelectron. Eng. 78-79:682-688 (2005); and Park et al., "Chemical Nanopatterns Via Nanoimprint Lithography for Simultaneous Control Over Azimuthal and Polar Alignment of Liquid Crystals," Adv. Mater 17(11): 1398-1402 (2005)を参照のこと）。このプロセスの概要を説明する一般的な模式図を図２２に示すが、それは、例として、金系の物質に対する高い親和性を有するチオール基で終端化されたアルカンから成る化学パッチの生成を示す。この目的のために、図２２に描かれているように、ガラス転移温度（Ｔｇ）が基板（高Ｔｇ物質）に比べて低いレジストを、この基板の上にスピンコーティングする（ステップ１）。ステップ２では、熱ＮＩＬを利用してこの低Ｔｇのレジストにパターンを移す。これに続いて、残りのレジストを破壊してポリマー基板上に官能基も生成する反応性イオンエッチングステップが実施される（ステップ３）。ペンダント−ＣＯＯＨ表面官能基のアルカンチオールとの化学反応（ステップ４）に続いて、残りのレジストを表面から取り外す（ステップ５）。これらのチオールは、自己アセンブリを介した金又は銀のナノワイヤの係留点として役立つ。
【０１６５】
代わりの実施形態では、化学パッチが図２３に示すようにステンシルマスクを介して基板の表面に形成される。ＰＭＭＡ及びＰＣなどの熱可塑性プラスチックは例となる基板である。一般に、このプロセスには、ナノステンシルマスクを基板の表面に適用して、化学パッチが所望されない表面の領域をマスクすることが含まれる（図２３、ステップ１）。化学パッチの添加のために、露出された表面を反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）及び／又は他の化学修飾に供する（ステップ２及び３）。マスクを除去する（ステップ４）際に、化学パッチは所望の位置に置かれる。代わりの実施形態を図２４に描いている。この実施形態では、ナノステンシルマスクの適用（ステップ１）並びにＲＩＥ及び／又は他の化学修飾による化学パッチの添加（ステップ２）の後、マスクがインタクトなままナノワイヤが置かれる（ステップ３）。ナノワイヤが基板の表面に置かれるのに続いてマスクが取り外される（ステップ４）。
【０１６６】
それぞれ図２５及び図２６に描いているように、場の印加なし又はありで基板上のナノ検出位置にナノワイヤを磁気的に方向付けることができる。図２５で示す実施形態では、ナノインプリントリソグラフィを用いて、基板内にマイクロ／ナノ流体のチャネル及び構造を形成する。続いて、金のコンタクト（電極）を、基板表面上、ナノチャネルの両側のセンサー位置に堆積させる（ステップ１）。金のコンタクトの上に鉄を堆積させて磁場を創り（ステップ２）、ナノワイヤはチャネルに垂直に並ぶ（ステップ３）。図２６の実施形態では、金のコンタクト（電極）を、基板表面上、ナノチャネルの両側のセンサー位置に堆積させる（ステップ１）。ナノワイヤは、金のコンタクトの堆積の後、印加された外部磁場に平行に並べられる（ステップ２）。
【０１６７】
置かれたワイヤにおけるナノギャップの形成は、図２７及び２８に描かれている種々の方法で達成することができる。図２７は、ナノインプリントリソグラフィを用いたマイクロ／ナノ流体ネットワーク（すなわち、チャネル及び構造）及びナノギャップ形成の同時形成を示す。この実施形態では、上述の好適な方法のいずれかを用いてナノワイヤを基板上に位置付ける（ステップ１）。ステップ２では、ナノギャップ及びナノチャネルを形成するのに好適な薄い樹脂スタンプを、位置付けられたワイヤを含有する基板に、圧力（例えば、圧縮空気）を用いて適用する。応力の集中に応じて、完全な又は部分的な破断が達成される。マイクロコンタクトを基板表面に堆積させ、カバー板を接合してナノ流体装置を封入する（ステップ３）。部分的な破断しか達成されないのであれば、その後の電気的絶縁破壊（すなわち、ナノワイヤを介して高電場を印加すること）、化学エッチング、又は他の好適な手段によって完全な破断を形成させる（ステップ４）。
【０１６８】
図２８は、マイクロ／ナノ流体ネットワーク（すなわち、チャネル及び構造）が基板にて機能する場合のナノインプリントリソグラフィによるナノギャップ形成のプロセスを描く。この実施形態では、ナノワイヤは、上で記載された方法を用いてチャネルの上に置かれる（ステップ１）。置かれたナノワイヤは薄いポリマーと基板の間に挟まれ、圧力が印加されてチャネルを横切るナノワイヤの完全な又は部分的な破断を達成する（ステップ２）。マイクロコンタクトを基板表面に堆積させ、カバー板を接合してナノ流体装置を封入する（ステップ３）。部分的な破断しか達成されないのであれば、その後の電気的絶縁破壊、化学エッチング、又は他の好適な手段によって完全な破断を形成する（ステップ４）。
【０１６９】
例えば、走査プローブ、ワイヤ交差、鋳型合成物質、シャドウマスク蒸発、機械的切断接合技法、電気メッキ、及びカーボンナノチューブの局所酸化切断を含む、当該技術で既知の方法によってもナノギャップを製作することができる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるChen et al., "On-Wire Lithography-Generated Molecule-Based Transport Junctions: A New Testbed for Molecular Electronics," J. Am. Chem. Soc. 130(26):8166-8168 (2008); Hu et al., "A Self-Assembled Nano Optical Switch and Transistor Based on a Rigid Conjugated Polymer, Thioacetyl-End-Functionalized Poly(para-phenylene ethynylene)," J. Am. Chem. Soc. 127:2804-2805 (2005); Kushmerick et al., "Effect of Bond-Length Alternation in Molecular Wires," J. Am. Chem. Soc. 124:10654-10655 (2002); Mbindyo et al., "Synthesis and Assembly of Nanowires for Molecular Electronics," Abstracts of Papers of the Am. Chem. Soc. 223:155-PHYS (2002); Mbindyo et al., "Template Synthesis of Metal Nanowires Containing Monolayer Molecular Junctions," J. Am. Chem. Soc. 124:4020-4026 (2002); Reed et al., "Conductance of a Molecular Junction," Science 278:252-254 (1997); Tang et al., "Encoding Molecular-Wire Formation Within Nanoscale Sockets," Angew. Chem. Int. Ed. 46:3892-3895 (2007); Xu & Tao, "Measurement of Single-Molecule Resistance by Repeated Formation of Molecular Junctions," Science 301:1221-1223 (2003)）。
【０１７０】
電極によって検出されたシグナルを変換する外部の電子コンポーネントにナノワイヤ又は検出電極を連結する手段として、基板表面にマイクロコンタクトパッドを形成する。当該マイクロコンタクトパッドは、例えばＡｕ（金）の薄層をナノ粒子が堆積されている部分のみに無電解析出させるのを可能にする「シード」層として役立つように基板上にパターン形成された貴金属ナノ粒子による無電解析出プロセスを用いて形成することができる。
【０１７１】
２つの異なる可能なプロセス戦略を用いてマイクロコンタクトパッドを形成するプロセスを図２９Ａ及び２９Ｂに描いている。図２９Ａに描いている戦略については、流体ネットワークを形成するＮＩＬ及びナノワイヤの位置決め及びギャップ形成に続いて、ポリマー基板は従来の光マスクを介してＵＶ（２５４ｎｍ）に暴露される（ステップ１）。これは、ポリマーがＵＶ光で照射された部位のみでカルボン酸を生成する。ステップ２では、ウエハー全体がＥＤＣ／ＮＨＳの存在下でエチレンジアミンと反応し、これは表面カルボン酸とエチレンジアミンの一方のアミノ末端との間でアミド結合を生成することにより、アミン終端基を形成する。アミン終端基はＵＶ照射にさらされた部位でのみ形成される。次に、ウエハーをＡｇナノ粒子を含有する溶液に浸漬し（ステップ３）、それは文献で確立されているように、アミン基との強い錯体を形成する。これらの表面の疎水性及び係留点（この場合はアミン基）の欠如に起因して、Ａｇナノ粒子はＵＶ照射にさらされていないポリマー基板には接着しない。最終ステップには、Ａｕ無電解メッキ浴にウエハーを入れること及び所望のＡｕベースのマイクロコンタクトパッドを形成することが含まれる。
【０１７２】
図２９Ｂに描いているように、ポリマー基板上の光マスクの設置に続いて、当業者によく知られた種々の直接堆積法を用いて金属のマイクロコンタクトを形成することができる（ステップ１）。これらの技法には電子ビーム堆積、金属標的のスパッタリング、又はマグネトロン堆積が挙げられるが、これらに限定されない。堆積に続いて、ステンシルマスクが外される（ステップ２）。
【０１７３】
本発明の生体分子プロセッサの製作プロセスにおける最終ステップには、カバー板を接合してマイクロ／ナノ流体の装置を封入することが含まれる。カバー板の接合手順を図３０Ａに描いている。当該プロセスには、成形された基板にカバー板を組み付け、組み付けた産物を真空密封したバッグに入れることが含まれる。真空密封は、熱プロセス全体を介した構造の変形を最少限に抑える。脱気した真空密封バッグを圧力ヒーター（図３０Ｂ）に入れ、基板及びカバー板のガラス転移温度に近い溶媒の沸点まで加熱し、接合後にアセンブリを冷却する。溶媒を沸騰させることは均一な温度及び蒸気圧を提供し、それは、当該装置全体に圧力が均一に分配されることを保証する。このプロセスを用いた結果は、ナノメートル規模でさえ、低アスペクト比のマイクロ構造へのカバー板の接合について構造的な変形を示さない（図３０Ｃ）。
【０１７４】
組み立てた装置におけるマイクロコンタクトを、側面の、上面の、又は底面の電子接続（図３１）を用いて、図３２に示すような適当なシグナル処理電子機器に相互接続することができる。ワイヤを直接ナノ検出装置上でマイクロコンタクトに封止することによって、側面接続を作る。上面又は底面の接続は、マイクロコンタクトに対して垂直に作られており且つ図３２に描写されている追加の電子チップ上に含有されている、金属コンタクトを有する。シグナル処理に必要な電子コンポーネントは、当業者に共通する技法を用いて印刷回路基板（ＰＣＢ）上に備えられる。
【０１７５】
集積された二重電極ナノギャップ装置についての同等の回路を図３２に示す。電気的読み出しに対する主な寄与因子は、ナノギャップ抵抗（ＲＮ）、緩衝液との接触におけるナノ電極表面のキャパシタンス（Ｃｎｅ）、及びナノ電極の電気抵抗（Ｒｎｅ）である。
【０１７６】
ナノギャップがＲ２によって接続されるので、結果は、入口ナノギャップを横切る乱れがＲ２を介して出口ナノギャップを横切って同時に観察されるであろうということである。また、各ナノギャップを横切って生じる電流は、不定であって時間と共に変化する比にて、各ナノギャップの間で分かれる。従って、１つのナノギャップを横切るコモンを他から分離する（浮かせる）ことによって、Ｒ２を介する両ナノギャップ間のクロストークを妨げる電子回路を設計することが必要である（図３２を参照）。これを達成するために、２つの電流対電圧（Ｉ−Ｅ）変換器を２つの独立した非接地電源（±１５ＶのＤＣ）と共に使用する。さらに、システムの増幅端とデジタル化端との間の効果的な絶縁を保証するために、Ａ／Ｄ及びＤ／Ａの変換器の前後に集積リニア光アイソレータ（光カプラ）を使用する。光アイソレータは、光を利用して入力端から出力端まで電気信号を伝達するように設計された電子装置である。それらは、電気的な絶縁との連結を提供し、回路の一方の端での変化が他方に影響するのを防ぐ。各光アイソレータ回路は、光チップと４つの演算増幅器を備える。プラスチック遮蔽したＢＮＣケーブル及びコネクタをデジタイザとＩ−Ｅ変換器の間の接続すべてで使用する。
【０１７７】
Ｉ−Ｅ変換器の主要コンポーネントは前置増幅器である。電流メータは低い入力インピーダンスを有するべきであるが、測定される電流は非常に小さい（通常、ピコアンペア、ｐＡ）ので、Ｉ−Ｅ変換器における電子コンポーネントはすべて高い入力インピーダンスを持たなければならない。１，０００のゲインを達成し且つ高いバンド幅（約８０ｋＨｚ）を維持するために、２段階増幅器を用いることができる。振動を防ぐために、デジタル的に選択できるフィードバックコンデンサＣＦ（１ｐＦ）をＲｆに並列に接続することもできる。増幅器の非反転入力は、遮蔽された３軸ケーブルを介してナノギャップ電極に接続され、それによって指令電圧が提供され、出力電流が受け取られ、且つ容量結合からのシグナルラインを外部ノイズから遮蔽する。外部ノイズからの遮蔽は、１つの増幅器のコモンに接続され且つ他のものからは絶縁されたデュアルファラデーケージを用いて達成される。
【０１７８】
当業者に一般的な実践を用いて、上記の回路設計を単一チップで多重化することができる（図３２を参照）。データ記憶スペースをできるだけ減らすために、ピーク検出回路を、ピーク振幅も記録する単一チップで使用する。多重化チップをフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）に接続して、この多重化チップからの出力を処理する。
【実施例】
【０１７９】
本発明の実施形態を説明するために以下の実施例が提供されるが、それらは決して本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【０１８０】
実施例１〜５についての材料及び方法
以下の実施例及びシミュレーションの結果は、電気クロマトグラフィを用いた単一のモノヌクレオチドの飛行時間同定のプロセスを表す。ｄＮＭＰおよびイオンの相互作用のために、ＣＨＡＲＭＭ２７力場（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Foloppe & MacKerell, "All-Atom Empirical Force Field for Nucleic Acids: I. Parameter Optimization Based on Small Molecule and Condensed Phase Macromolecular Target Data," J. Comput. Chem. 21:86-104 (2000)）を、水についての剛体ＣＨＡＲＭＭ  ＴＩＰ３Ｐモデルと共に用いた。静電気学についての短距離のカットオフは１．０ｎｍであった。Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓの相互作用は０．８〜１．０ｎｍの間隔でゼロに切り替えた。長距離静電相互作用については、シミュレーションボックスの長さを非周期方向については３倍とした、平板体系用に補正した三次元の粒子-粒子-粒子-メッシュ法を用いた（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるYeh & Berkowitz, "Ewald Summation for Systems with Slab Geometry," J. Chem. Phys. 111:3155-3162 (1999)）。
【０１８１】
５'末端にリン酸基を持つ、デオキシヌクレオチド一リン酸又はｄＮＭＰ（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）を、例えば、二本鎖ＤＮＡにλ−エキソヌクレアーゼを用いて、インタクトな二本鎖又は一本鎖のＤＮＡの切断から作製することができる。酵素活性にとって最適なｐＨが７．５であることに基づいて、ｄＮＭＰはプロトン化されていないものとしてシミュレーションを行った。なぜならｄＮＭＰのｐＫａは約６．８であり（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるNucleic Acids in Chemistry and Biology; Blackburn, Eds.; IRL Press: Oxford, (1990)）、ｄＮＭＰは正味電荷−２ｅ（ｅは電子電荷である）を与えられるからである。ＣＨＡＲＭＭ２７トポロジーファイルは、５'末端に非プロトン化リン酸を有するＤＮＡについて末端断片を含有しない。パッチを用いて、原子を付加する又は差し引くこと及び部分電荷を改変することによって、既存のトポロジーを改変する。トポロジーファイルは、５'末端におけるプロトン化リン酸、３'末端におけるプロトン化リン酸、及び３'末端における非プロトン化リン酸を有するＤＮＡについての末端パッチを含有する。従って、３'非プロトン化版と３'プロトン化版の間における影響を受けた原子における部分電荷の差異を、５'非プロトン化版のための部分電荷に加えた。当該影響を受けた原子には、リン酸基及びそれに直接結合した炭素原子のみが含まれた。
【０１８２】
５'末端に非プロトン化リン酸基を有するデオキシヌクレオチド一リン酸を用いた分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを可能にするために、以下の「パッチ」を既存のＣＨＡＲＭＭ力場に加えた。
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【０１８３】
図３３は、４つすべての末端及び影響を受けた原子が標識されているｄＮＭＰを示す。
【０１８４】
スリット壁を、ｘｙ面に平行でｚ＝±１．５ｎｍに置かれた（壁原子の中央がｚ≦−１．５ｎｍ（底面）及びｚ≧１．５ｎｍ（上面）に置かれた）２つの平面によって画定した。炭素原子についてのＬｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓの１２−６パラメータ（ε炭素−炭素＝０．１１ｋｃａｌ／モル、σ炭素−炭素＝０．４／２１／６ｎｍ）を有する原子で構成されるバルク流体のシミュレーションを行うことによって、スリット壁を構築した。当該原子の質量を１２．０１１から１４．３０２２６ａｍｕに増やし、ＰＭＭＡの融合原子（united atom）表示における当該原子の平均質量と等しくなるようにした（水素原子はないが、水素原子が結合した原子の質量が上昇している）。このシミュレーションは５０００Ｋで実行し、それが流体でありかつその密度が非晶質ＰＭＭＡの密度に近いことを確保した。スリット壁の所望のサイズに合致させるためにｘ及びｙ方向のシミュレーションボックスのサイズは５．０ｎｍであるように選択した。スリット壁の最初の構成は、この流体の５．０×５．０×１．２ｎｍ３の長方形領域から取った。原子の中心が長方形領域の中にある場合、それは壁に含めた。これは原子的には平滑（原子のサイズ未満の粗さ）である表面を生じたが、不均質であった。スリット壁の各セットは１０ｐｓ間隔を空けて流体シミュレーションの間に異なる時間から取った。３ｎｍのスリット幅を選択して、５ｎｍより小さい寸法で実際のチャネルを製作しているが（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMenard et al., Nano Lett. 11: 512-517 (2011)）、無駄なシミュレーション時間を回避して長い間スリットの中心付近でｄＮＭＰを拡散させた。小さな完全に疎水性のナノ規模の形状を使用することは、水がその中に入る困難さのために実用的ではないことも言及されるべきである。スリット壁は物理的に現実的であるようには選択されなかったが、この最初の試験のための単純な系として選択された。
【０１８５】
いったん壁が構築されると、ｄＮＭＰがスリット壁の間に動かされ、ＶＭＤを用いて水及びイオンが加えられた。使用された体系についてはＬＡＭＭＰＳにおいて３８ＮＰＴシミュレーションを実施できなかったので、水の量は試行錯誤によって決定した。ＶＭＤにおけるＳｏｌｖａｔｅの機能を用いて、設定：境界＝２．４、結合したｘ及びｙ＝±２５．６５Å、結合したｚ＝±１５Åで水を加えた。これらの設定を試行錯誤によって決定し、水とスリット壁しか含有しない平衡シミュレーションにて水（スリットの中央）の理に適った嵩密度を得た。平衡嵩水密度は約１．０１５ｇ／ｃｍ３であった。ｄＮＭＰを溶媒和した後、ＶＭＤにおけるＡｕｔｏｉｏｎｉｚｅの機能を用いて４つの水分子を取り除き、３つのナトリウムイオンと１つの塩化物イオンで置き換えた。平衡シミュレーション及び非平衡シミュレーションの双方で使用したシミュレーションシステム及びＤＮＡの化学構造を図３４Ａ及び３４Ｂにて示す。
【０１８６】
以下に、シミュレーションの実施に用いた方法及び一般的なパラメータを記載する。壁原子は、８３８６０ｋｃａｌ／モル・ｎｍ２のバネ定数を持つバネによって初期位置に取り付けた。流れシミュレーションについては、０．１ｐｓの時間定数でＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットを用いて３００Ｋにて壁原子のみを温度調節した。定常状態での流れの間の流体の温度は、粘性の流れによる流体の加熱のために、温度調節した壁の温度よりも約３Ｋ高かった。平衡シミュレーションについては、同じ時間定数で追加のサーモスタットを流体に使用した。各ｄＮＭＰについては、異なる壁構成で３回又は４回のシミュレーションを実行して特定の壁構成による偏りを減らした。ｘ方向（図３４Ａを参照）に一定の物体力ｆｉを各原子に適用することによって流れを誘導した。ｆｉの大きさはｆｉ＝ｍｉａであるように選択し、式中、ｍｉは原子ｉの質量であり、ａは加速度であり、原子すべてについて同じものを選択した。このアプローチは、圧力駆動流（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Zhu et al., "Pressure-induced Water Transport in Membrane Channels Studied by Molecular Dynamics," Biophysical Journal 83:154-160 (2002)、Carr et al., IEEE Trans. Nanotechnol. 10:75-82 (2011)）または毛管力により起こる流れ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Han et al., J. Colloid Interface Sci. 293: 151-157 (2006))への近似である。流体の全ｎ個の原子に適用された力ｆｉによる流れの方向に沿った圧力勾配は、
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によって与えられ、式中、Ｌボックスは外部から加えられた力の方向（ｘ）に沿ったシミュレーションボックスの長さであり、Ａ流体は加えられた力の方向に垂直の面（ｙｚ面）における流体の面積である。ａ＝２６３．５９２ｎｍ／ｎｓ２を選択し、かつシミュレーションシステムを記述するパラメータの固有値（すなわち、流れ領域の原子の数及びその質量、流れに垂直な面積、及びシミュレーションボックスの長さ）を用いると、ナノスリットにおける流れを駆動する圧力勾配はおよそｄｐ／ｄｘ＝２．８３６バール／ｎｍである。加えられた力は、最大流速約１．５ｍ／ｓを特徴とする、ｚ方向を横切るほぼ放物線の速度プロファイルを生成する。ＭＤシミュレーションでは、アクセス可能な相対的に短い時間（普通はわずか数百ナノ秒）のため、ナノ規模の流れの典型的な速度に比べてそのように速い速度でのシミュレーションが必要である。後で考察されるように、非常に速い速度にもかかわらず、ｄＮＭＰの壁への吸着及び壁からの脱着を記述する特徴的なパラメータは、流れによる実質的な影響を受けないようである。定常状態の条件が達成されるのを可能にするために、各流れシミュレーションの最初の１５ｎｓを解析から捨てた。平衡シミュレーションでは、１ｎｓの平衡時間を捨てた。
【０１８７】
ヌクレオチドの吸脱着事象を判定するためのアルゴリズム
吸脱着の時間を測定するのに用いるアルゴリズムを、下壁に対する単回の吸脱着事象についての図３５にて説明し、以下のように実施した。先ず、長さ０．５ｎｓの移動平均を用いてｄｗを平滑化した（ｄ平滑と表示した）。ｄ1と表示されている、ｄ平滑が±０．８ｎｍと交差した点を画定した。これはＰＭＦ曲線が平坦になり始めるおよその位置である（図３６）。これらの点を、それらが±０．８ｎｍの境界と交差した方向によって、吸着事象の前であるか又は脱着事象の後であると仮定した。ステップの残りは元々の非平滑化ｄｗを用いた。ｄ１と同じ時間だがｄｗに対応する点のセット（ｄ２と表示する）を画定した。ｄ２から出発し、ＰＭＦ曲線（図３６）における最小点から離れて、ｄｗの値≧１．０ｎｍまで、時間における前方（脱着）又は後方（吸着）にデータをトレースした。次いでトレースの方向を逆転させ、ｄｗ≦ｄ上（上壁に近づく場合）まで、ｄｗ≦ｄ下（下壁に近づく場合）まで、又はデータの開始又は終了に達するまで、トレースを実施した。ほとんどの場合、ｄ上及びｄ下を、ＰＭＦ曲線（図３６）における大域的最小点よりもわずかに壁に近い０．４２ｎｍに設定した。場合によっては、明らかな吸脱着事象が見逃されないように、それらの１つを微修正する必要があった。これは必要であった。なぜなら、各壁における原子の構成は異なるので、各壁の吸着はわずかに異なっていたからである。当然、アルゴリズムは、事象を正確に捕捉するために当初のｄ上及びｄ下を手動で調整することがないように、当該ｄ上及びｄ下を決定するように工夫され得る。しかしながら、正確な出発値は吸着及び脱着の時間の最終的な値に影響しなかった。このトレースから得られた点をｄ３として示した。ｄ３又はデータセットの最初の時間若しくは最後の時間に等しい時間で繰り返しがあった場合、これらの点は吸着事象又は脱着事象の近傍ではないｄ２点に対応したので、これらの点を排除した。点を排除した後、ｄＮＭＰが上壁及び下壁に吸着した際のｄｗの平均値を、吸着点及び脱着点としてのｄ３を用いて算出した。次いでトレースステップを繰り返したが、ただし、ｄ上及びｄ下を、算出したばかりの当該平均値と置き換え、ｄ３を更新し、吸着中のｄｗの平均値を再算出した。２〜３回繰り返した後、ｄ３を一定値に変換した。平滑化及びｄ１を決定するためのｄｗ＝０．８ｎｍの選択によって、表面からの短い時間又は距離の逸脱が脱着事象として分類されるのが排除され、当初のｄ３を決定するためのｄ上及びｄ下の当初の選択によって、ｄＮＭＰが表面から跳ね返った事象が吸着事象として分類されるのが妨げられた。
【０１８８】
ＰＭＦの不確定度の推定
図３６に示すＰＭＦにおける不確定度を、各ビンにおける生成時間を３つの部分に分割することによって算出した。さらに、これらの部分から、次いで、各モノヌクレオチドについて３つのＰＭＦ曲線を生成した。これによって、得られる平均化されたＰＭＦ曲線上の各点の平均値及び平均値の標準偏差を評価することが可能になった。４つのＰＭＦでの最大値の位置における及び平均吸着自由エネルギーにおける不確定度を推定するために、以下の数値誤差伝搬法を用いた：（ｉ）曲線上の各点についての平均値及び平均値の標準偏差が各ビンについての正規分布を規定すると仮定した；（ｉｉ）各点についての分布から１００，０００個の無作為試料を取って１００，０００個のＰＭＦ曲線を生成した。ＰＭＦでの最大値の位置における及び平均吸着自由エネルギーにおける不確定度は、１００,０００個の最大値からの１００，０００個の自由エネルギー曲線と、これらの曲線から算出された平均吸着自由エネルギーから得られた。不確定度は標準偏差の２倍であると見なされた。
【０１８９】
ｄＮＭＰが壁に吸着している又はしていない間にのみ算出された流れの方向における速度と角度については、以下のように不確定度を推定した。ブロック平均化を用いたが、あらゆるブロックの長さが等しい通常のやり方ではなかった。その代わりに、各ｄＮＭＰについての全シミュレーションについて、各吸着又は脱着期間を別個のブロックとして利用した。各ブロックにおけるデータの平均値を用いてブロック平均値ｘｉを得た。重みｗｉが各ブロックのデータ点の数であるｎ個のブロック平均値の加重平均によって全体の平均値を得た。ｘｉの加重平均及び分散は以下を用いて算出した。
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【０１９０】
加重平均値の分散は、重みが等しい場合はｎに減る有効な基数（ｂ）で割ることによって算出し、不確定度（ｕ）は加重平均値の標準偏差の２倍と見なされた。
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流れの方向における全体平均速度及びその不確定度は以下を用いて算出した。
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式中、ｆ吸着は、各ｄＮＭＰについて、全シミュレーションの吸着時間を、全シミュレーションの合計時間で割ったものである。
【０１９１】
吸着している時間の割合の平均値、吸着事象の平均頻度、及びそれらの不確定度も、方程式Ｓ１〜Ｓ６を用いて算出した。違いは、「ブロック」は各ｄＮＭＰについてのシミュレーション全体であること、吸着している時間の割合についての重み（ｗｉ）は合計シミュレーショ時間であること、及び、吸着の頻度についての重みは流れの方向に移動した合計距離であることのみであった。吸着中のｄＮＭＰ−壁のエネルギーについては、等しいブロックの長さによるブロックの平均化を用いた（ｗｉはすべて方程式Ｓ１〜Ｓ６において等しい）。ブロックの長さは１３００点であり、０．５２ｎｓに相当した。
【０１９２】
軸２の壁表面との角度
図３５にて定義される軸２の、最も近位の壁表面の平面に対する平均角度を、ｄｗの関数として、平衡と非平衡双方の場合において、吸着については図４１にて、脱着については図４２にて示す。（以下の）表７は、吸着期間中か脱着期間中かに関わりなく、ｄＮＭＰが吸着している間に算出された軸２の平均角度を示す。軸２について図４１及び４２で示す所与のヌクレオチドについての吸着及び脱着の曲線は、角度の変化がノイズと同等であるので、容易には互いに区別できない。ヌクレオチドが吸着中に壁の近くにある場合、ｄＮＭＰにおける最も疎水性の側が概して壁に近いが、ｄＴＭＰは例外である。メチル基は疎水性であるが、非平面のメチル基は、ヌクレオチドにおける当該基が存在する側を壁から離す。壁の近くの軸２の配向度は、脱着の間、さほど強くない。ノイズのレベルを考えると、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、又はｄＧＭＰについての軸２の角度において有意な最小値又は最大値はない。ｄＴＭＰについては、疎水性のメチルと表面との相互作用が、吸着中及び脱着中の軸２の角度に有意な最大値をもたらす。脱着についてのｄＴＭＰの最大角度は、平衡の場合、吸着についての角度よりも小さい。また、この最大値は、非平衡の場合に比べて平衡の場合に小さい。ｄＴＭＰの脱着の場合、軸２の角度は、最大値の後に最小値も存在する。
【０１９３】
飛行時間分布を分離するのに必要なチャネル長の決定
モノヌクレオチドの飛行時間（ＴＯＦ）分布を分離するのに必要な最小のチャネル長Ｌの決定についての詳細は、以下のとおりである。飛行時間分布についての従来の形態は想定しなかった。代わりに、台形法則を用いて長さ０．５ｎｍ（ｄＴＯＦ）の軌跡セグメントにわたる飛行時間分布の確率ヒストグラムの数値積分によって連続分布関数（ＣＤＦ）を推定した。その後、各ＣＤＦが値０．００１３５（μ−δ−）及び０．９９８６５（μ＋δ＋）に達した点（μは平均ＴＯＦである）を、線形補間によって推定した。これらの点は試料分布の幅を画定する。以下の方程式では、これらの点はＴＯＦ分布の境界と見なされた。数値０．００１３５及び０．９９８６５は、どれだけの重複が許されるかを画定し、分布の分離において精度の増減を得るために変化し得る。単純化するために、この解析では、主文書で画定されたＤＴＯＦ０．５×Ｎを、正規化された形態で使用した（すなわち、無作為変数ＴＯＦの値をすべてＮで割った）。その結果、正規化された形態では、任意のヌクレオチドαについてのＤＴＯＦ０．５×Ｎは、平均ＴＯＦ値μαを特徴とし、Ｎの平方根と共に減少する幅を有する。ヌクレオチドの各対（α、β）の分布が重複しないために必要なＮα，βの最小値は、方程式（Ｓ９）と（Ｓ１０）の組み合わせである方程式（Ｓ１１）によって与えられる。必要な最小のチャネル長（Ｌ）は方程式（Ｓ１２）によって与えられる。
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【０１９４】
これらの方程式において、μは平均値であり、δ−及びδ＋は、当該平均値から、ＣＤＦが０．００１３５及び０．９９８６５に等しい点への距離である。Ｈ［ｘ］はＨｅａｖｉｓｉｄｅ階段関数（ｘ≦０の場合はＨ［ｘ］＝０であり、ｘ＞０の場合はＨ［ｘ］＝１である）であり、それは、分布の２つの考えられる構成（α型の分布の平均がβ型の分布の平均より小さい（μα＜μβ）、又はα型の分布の平均がβ型の分布の平均より大きい（μα＞μβ）のいずれか）を区別するのに用いられる。α型及びβ型のヌクレオチドに必要な試料の数（Ｎα及びＮβ）は、方程式（Ｓ１）を満たす多くの考えられる組み合わせを有する。しかしながら、それらは、２つのヌクレオチドが同じ全体距離を移動しなければならないという事実（ｄβＴＯＦＮβ＝ｄαＴＯＦＮα）によって制約される。α型及びβ型の飛行時間の算出に用いられる距離（ｄαＴＯＦ及びｄβＴＯＦ）はいずれも０．５ｎｍ（ｄＴＯＦ）なので、そのときＮα＝Ｎβ＝Ｎα，βである。Ｎα，βは今や方程式（Ｓ９）で唯一未知であり、それを解くことによって方程式（Ｓ１１）が与えられる。Ｎα，β×ｄＴＯＦの最大値が、必要なチャネル長である。
【０１９５】
実施例１−平衡シミュレーション及び吸着自由エネルギー
平衡シミュレーションの目的は、流れのない状況での個々のｄＮＭＰの吸脱着のメカニズム及びエネルギー特性を調べることである。各ｄＮＭＰについて、異なる壁構成で幾つかのシミュレーションを実行した（表８を参照）。各シミュレーションの持続時間は約６５ｎｓであったが、４つのｄＮＭＰすべて及び種々の壁構成のすべてについての合計シミュレーション時間は約９６６ｎｓであった。個々のｄＮＭＰとスリット壁との相互作用は、ナノスリットを横切るそれらの自由エネルギープロファイルによって最良に説明される。反応座標（平均力又はＰＭＦのポテンシャル）の関数としての、基準状態に対する自由エネルギーの差異ΔＦは、ｄＮＭＰが反応座標の所与の値に位置する確率Ｐｒに関連する。ｄＮＭＰが平滑な表面に吸着する又はそれから脱着する確率が対象であったので、反応座標は、ｚ＝±１．５ｎｍに位置する最も近いスリット壁平面からｄＮＭＰの質量中心までの距離ｄｗと見なされた。自由エネルギープロファイルは、Ｐｒ（ｄｗ）の値を用いて
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によって与えられ、式中、ｋはＢｏｌｔｚｍａｎｎの定数であり、Ｔは温度であり、ｄｗ，ｒｅｆはナノスリットの中心（ｚ＝０）における壁から離れて選択される基準状態である。
【０１９６】
平衡シミュレーションの間、４つのｄＮＭＰすべてが壁表面に対して複数回吸着及び脱着した。従って方程式（１）を直接適用できた。ｄＮＭＰが合計シミュレーション時間と同等の（例えば、数ナノ秒より長い）時間にわたってスリット表面に吸着する場合の自由エネルギーを計算するには、バイアスを受けた平衡シミュレーション、例えばアンブレラサンプリング（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるTorrie & Valleau,  Chem. Phys. Lett. 28:578-581 (1974); Novak et al., "Umbrella Sampling Simulations of Biotin Carboxylase: Is a Structure With an Open ATP Grasp Domain Stable in Solution?" J. Phys. Chem. B 113:10097-10103 (2009); and Novak et al., "Behavior of the ATP Grasp Domain of Biotin Carboxylase Monomers and Dimers Studied Using Molecular Dynamics Simulations," Proteins: Struct. Funct. Bioinform. 79:622-632 (2011)）を必要とし得る。複数回の吸脱着事象は、サンプリングされる不均質な表面上の異なる吸着部位についても可能なので、方程式１におけるΔＦはそれら異なる部位にわたる平均である。実際、ｄＮＭＰはそれらがもっと多くの壁表面をサンプリングするのを可能にする壁に吸着した場合でさえ、壁平面に対して接線方向で可動性であった。このことは、壁表面に強いｄＮＭＰ吸着部位がないこと、及び、当該表面全域で吸着強度にほとんど違いがないことを示している。これらは、飛行時間に基づく配列決定を実現可能にするために望ましい壁表面の特徴である。しかしながら、当該壁表面は現実の物質から作られておらず、現実の表面よりも平滑である。非晶質シリカ表面上の異なる部位における吸着の強さは０ｋＴから１０ｋＴまで様々であることが見いだされている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCarr et al., J. Phys. Chem. Lett. 2: 1804-1807 (2011)）。ＰＭＭＡ表面上のｄＮＭＰ吸着の強度のばらつきは将来の研究の主題である。
【０１９７】
図３６は、４つのｄＮＭＰすべてについてのｄｗの関数としての自由エネルギープロファイルを示す。当該プロファイルは類似しており、明確に画定された最小値の存在を特徴とする。熱エネルギーｋＴの多くても数倍の深さを持つ井戸型ポテンシャルの存在は、ｄＮＭＰは疎水性の壁に吸着するが強くは吸着しないという事実を反映している。４つの曲線の最小値は、ほぼ同じ距離（壁から約０．４７５ｎｍ）に位置する。次のセクションで考察するように、ｄＮＭＰが壁に吸着し、最小の自由エネルギー状態で位置する場合、その主な分子単位の２つ（窒素含有塩基と糖基）は壁表面に関して類似の幾何学的配置にあるので、それらはすべて、壁からほぼ同じ距離に位置する質量中心を有する。４つの曲線はすべて、吸着領域とスリットの中心に近いバルク溶媒との間に位置する（ｋＴ以下の）小さなバリアの存在を示している。ここで、吸着領域は、井戸型ポテンシャルの最小値へと牽引する力をｄＮＭＰが経験する、壁に近い領域として画定される。図３６に見られるように、４つのヌクレオチドの吸着領域の外側の範囲は、小さなエネルギーバリアの対応するピーク
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の位置によって区切ることができる。自由エネルギープロファイル及び対応する大域的最小値ΔＦｍｉｎ（表６に示す）によって、ｄＮＭＰと壁との相互作用の強度の直接的な尺度が得られるが、スカラーパラメータΔＦ吸着（いわゆる吸着の正味自由エネルギー）は、実験との比較にさらに適する（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるRaut et al., "Molecular Dynamics Simulations of Peptide-Surface Interactions," Langmuir 21:1629-1639 (2005)）。自由エネルギープロファイルから、吸着の正味自由エネルギーΔＦ吸着は
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のように、吸着した状態のｄＮＭＰを特徴づける状態すべての自由エネルギーの加重和を評価することによって得られる。この方程式では、ΔＦ吸着及びΔＦはｋＴの単位で表される。Ｃ吸着は吸着領域における濃度であり、Ｃバルクは壁から離れたバルク溶液における濃度である。下付き文字ｉはビン番号を示す。（ｄｗ）ｉは、幅（Δｄｗ）ｉを有するビンｉの位置である。Ｐｒｉは、ｄＮＭＰが所与のビンにある確率を表す。ＰＤｉ＝Ｐｒｉ／（Δｄｗ）ｉは所与のビンにおける正規化された確率密度を表す。表６は、エネルギー特性及びｄＮＭＰのスリット疎水性壁への吸着の吸着領域の範囲を特徴づける関連する量の概要を提供する。
【０１９８】
（表６）疎水性スリット壁と相互作用する４つのｄＮＭＰについての自由エネルギープロファイルの最小値（ΔＦｍｉｎ）及び吸着の平均自由エネルギーΔＦ吸着、並びに吸着領域を区切るのに使用される自由エネルギー最大値の位置
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【０１９９】
実施例２−吸着及び脱着の動力学
吸着及び脱着の統計的特性及び動力学的特性を他の特性（例えば飛行時間）と関連づけることは大いに興味深い。シミュレーション結果の解析は、ｄＮＭＰが吸着している間、相対的に疎水性の核酸塩基の環は表面上でほぼ平坦である傾向があり、親水性のリン酸基は表面から離れる方向にあり、糖も表面と何らかの接触を有したことを示している。（図３４Ａを参照）。表面への核酸塩基のこの疎水性の接着は、窒化ケイ素ナノポアを介したＤＮＡ鎖の輸送のシミュレーションにおいて以前観察されており（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるAksimentiev et al., Biophys. J. 87: 2086-2097 (2004)）、グラフェンシートについては、グラフェンナノポアを介したＤＮＡ鎖の輸送のシミュレーションにおいて以前観察されている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWells et al., Nano Lett. 12: 4117-4123 (2012)）。図３７は、流れシミュレーション中のｄＮＭＰの質量中心の軌道のｚ成分の５０ｎｓ間のセグメントを示す。平衡シミュレーションについての軌道も同様である。吸着事象の頻度及び長さの差異によって示されるように、４つのｄＮＭＰの軌道の間には明瞭な差異がある。吸着及び脱着の統計データを定量するために、吸着及び脱着の時間を決定する手法を導入し、上で詳細に説明している。
【０２００】
ＰＭＦ曲線における大域的最小値及び小さなバリアは、吸着及び脱着のメカニズムに関連する。ｄＮＭＰの平面環が壁に吸着する傾向があるので、核酸塩基の平面と壁表面の平面とによって画定される２つの軸の間の角度は、吸着／脱着のメカニズムを見るのに有用である。核酸塩基における糖が付着している原子又はその近くから当該核酸塩基の他の末端を向く軸（軸１）の、最も近い壁表面の平面との間の平均角度を、ｄｗの関数として、平衡の場合及び非平衡の場合双方で、吸着については図３８にて、脱着については図３９にて示す。核酸塩基の平面における軸１と直交する軸（軸２）の、最も近い壁表面との間の平均角度を、ｄｗの関数として、平衡の場合及び非平衡の場合双方で、吸着については図４１にて、脱着については図４２にて示す。当該軸は、図３３（軸１）及び図４０（軸２）において、並びにプロットの挿入図において示されている。当該平均角度を算出する目的については、前の脱着時間と所与の吸着時間との間の中間点から、当該吸着時間と次の脱着時間との間の中間点までを、吸着期間とした。同様のアプローチを用いて脱着期間を決定した。表７は、これが吸着中であるか又は脱着中であるかを問わず、ｄＮＭＰが吸着している間に算出した軸１及び軸２の平均角度を示す。
【０２０１】
（表７）平衡及び非平衡の場合のｄＮＭＰが吸着している間の軸１及び軸２の壁表面との間の平均角度。不確定度は平均値の標準偏差の２倍であり、上述のように算出する。
0006388605.tif 000021
【０２０２】
図３８及び図３９における曲線は、核酸塩基における糖に付着している末端が、最後に吸着し、最初に脱着することを示している。これは、糖基及びリン酸基は核酸塩基よりも親水性であり、核酸塩基の方がより好都合に疎水性のスリット壁と相互作用するからである。軸１の角度における大域的最小値の大きさは、核酸塩基の疎水性（Ｇ＜Ｃ＜Ａ＜Ｔ）と同じ傾向に従う（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるShih et al., "Hydrophobicities of the Nucleic Acid Bases: Distribution Coefficients from Water to Cyclohexane," J. Mol. Biol. 280:421-430 (1998) and Munoz-Muriedas et al., "A Hydrophobic Similarity Analysis of Solvation Effects on Nucleic Acid Bases," J. Mol. Model. 13:357-365 (2007)）。疎水性の点で糖により近い核酸塩基については、軸１の角度の最小値はさほど厳密ではない。ＰＭＦ曲線におけるｄｗ＝０．４７５ｎｍ前後の最小値は、核酸塩基の糖末端が他方の末端よりも表面からやや離れているもののまだ吸着している場合に生じた。表面からの糖末端の解離は、自由エネルギーを上昇させる。
0006388605.tif 000022
でのＰＭＦ曲線におけるバリア（表６を参照）は、核酸塩基における糖末端とは反対側の末端（ｄＮＭＰにおける最後に表面から離れる部分）の吸脱着に関連する。
【０２０３】
軸１について図３８及び図３９で示されている所与のｄＮＭＰの吸着及び脱着の曲線は同一ではない。ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＧＭＰについては、軸１の角度の大域的最小値の規模は、吸着の場合よりも脱着の場合の方が大きかった。ｄＴＭＰについては、軸１の角度の大域的最小値の規模は吸着の場合よりも脱着の場合の方が小さく、脱着曲線には有意な最大値があった。ｄＴＭＰの最小値の規模がより大きいのは、疎水性メチル基が表面に付着するためである。
【０２０４】
軸２について図４１及び図４２で示されている所与のヌクレオチドの吸着及び脱着の曲線は、角度の変化がノイズと同等であるので、互いに容易には区別できない。ヌクレオチドが吸着中に壁の近くにある場合、ｄＮＭＰにおける最も疎水性の側が概して壁により近いが、ｄＴＭＰは例外である。メチル基は疎水性であるが、非平面のメチル基は、ヌクレオチドにおける当該基がある側を壁から離す。壁の近くの軸２の配向度は、脱着の間、さほど強くない。ノイズのレベルを考えると、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、又はｄＧＭＰについての軸２の角度において有意な最小値又は最大値はない。ｄＴＭＰについては、疎水性のメチルと表面との相互作用が、吸着中及び脱着中の軸２の角度に有意な最大値をもたらす。脱着についてのｄＴＭＰの最大角度は、平衡な場合、吸着についてよりも小さい。ｄＴＭＰの脱着の場合、軸２の角度は、最大値の後に最小値も存在する。
【０２０５】
軸１の壁表面との間の角度は、普通、平衡の場合と比べて非平衡の場合に、同じ質的及びしばしば量的に非常に似た挙動を有する。質的挙動の例外は、ピリミジン塩基（ｄＡＭＰ及びｄＧＭＰ）の脱着中に、非平衡の場合には最大値があるが、平衡の場合にはないことである。量的例外は、ｄＴＭＰの脱着中の軸２の角度の最大値が、平衡の場合により小さいことである。
【０２０６】
実施例３−種々の平衡及び流れの特徴における、ｄＮＭＰとチャネル壁の相互作用の役割
表８はシミュレーションから算出された種々の量を示す。これらは、とりわけ、（ｉ）４つのｄＮＭＰのそれぞれについて、非平衡の場合の吸着時間の割合が平衡の場合とほぼ同じであることを示している。これは、ｄＮＭＰの吸着／脱着の挙動がこれらのシミュレーションで使用される相対的に高速の流速によっては有意に変化しないことを示している。使用される流速は、それでも、秒速数百メートルの桁である分子の最大瞬時熱運動速度に比べると小さい。（ｉｉ）ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰの飛行時間がたった５０ｎｍの移動距離であっても上手く分離され、これは、例えば、これらのシミュレーションで使用されるもののような非荷電の疎水性表面は、これら２つのｄＮＭＰを区別するのに十分であることを意味する。これは、ヌクレオチドの疎水性の差異（Ｇ＜Ｃ＜Ａ＜Ｔ）に起因し得る（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるShih et al., "Hydrophobicities of the Nucleic Acid Bases: Distribution Coefficients from Water to Cyclohexane," J. Mol. Biol. 280:421-430 (1998) and Munoz-Muriedas et al., "A Hydrophobic Similarity Analysis of Solvation Effects on Nucleic Acid Bases," J. Mol. Model. 13:357-365 (2007)）。チミンは疎水性のメチル基を有するのに対して、シトシンは親水性のアミン基を有する。（ｉｉｉ）疎水性の増加傾向は飛行時間の増加傾向と合致したが、例外としてｄＧＭＰとｄＣＭＰの順序が逆転した。これは、ｄＮＭＰと壁の相互作用が原因である。吸着中のｄＧＭＰ−壁のエネルギー（Ｖヌクレオチド―壁）の大きさは、吸着中のｄＣＭＰ−壁のエネルギーより大きかった。核酸塩基における様々な基と壁表面との間に強い特異的な相互作用はないので、及び核酸塩基は表面上でほぼ平坦に存在するので、Ｖヌクレオチド―壁は、核酸塩基における溶媒がアクセス可能な表面積（Ａ塩基）と同じ傾向に従う。グアニンはシトシンより大きな面積を有するので、ｄＧＭＰはｄＣＭＰよりも壁との接触でより大きな面積を有し、より大きなＶヌクレオチド―壁を有する。（ｉｖ）ｄＡＭＰは、ｄＧＭＰより２倍多い吸着事象を有したが、吸着している時間の割合はやや小さく、飛行時間はｄＧＭＰより長かった。これは、ｄＧＭＰの方が、再び脱着又は吸着する前に、より長い時間にわたって壁に吸着又は脱離しているという事実、及び、ｄＧＭＰの方がやや大きな壁滑り速度を有したという事実から生じた。表８で示すデータを表６で示すデータと比較すると、平衡シミュレーションから算出された自由エネルギーは予想された傾向を示しており、吸着自由エネルギーの最小値又は平均値が小さいほど飛行時間が長いことが示されている。ｄＧＭＰ及びｄＡＭＰについての自由エネルギーは、これに対する例外である。
【０２０７】
（表８）最後の３行を除いて、量は、流れシミュレーションから算出した。塩基の面積は単一の構成から得て、最後に残った２行は平衡シミュレーションから得た。括弧内の不確定度は平均値の標準偏差の２倍であり、その算出は上に記載されている。
0006388605.tif 000023
１壁構成の数（シミュレーション）
２全構成の合計シミュレーション時間
３各構成についての流れの方向での移動距離
４１ｎｍの移動当たりの吸着事象の数
５吸着している時間の割合、非平衡
６５０ｎｍの距離にわたる飛行時間
７流れの方向における平均速度
８吸着している間の流れの方向における平均速度
９吸着している間のｄＮＭＰ−壁の位置エネルギー
１０溶媒がアクセス可能な核酸塩基の表面積
１１吸着している時間の割合、平衡
【０２０８】
実施例４−非平衡ＭＤシミュレーションに基づくｄＮＭＰの分離に必要なチャネル長
ｄＮＭＰの飛行時間の信頼できる分離を達成するのに必要なチャネル長を、対応するＭＤ軌道の全長からサンプリングした０．５ｎｍのセグメントにわたるｄＮＭＰの飛行時間分布（ＤＴＯＦ０．５）から算出した。これらの軌道の全長は、ｄＴＭＰとｄＡＭＰについては１２８ｎｍであり、ｄＣＭＰについては１５０ｎｍであり、ｄＧＭＰについては１９２ｎｍである（表８の１行目と３行目を参照）。０．５ｎｍの選択は任意であり、０．５〜５０．０ｎｍの間の他の長さを使用してほぼ同じ結果が得られる。
【０２０９】
ＤＴＯＦ０．５を用い且つ従来の中心極限定理（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWasserman L.W., All of Statistics: A Concise Course in Statistical Inference (2004)）を採用して、各ｄＮＭＰについて、より長い距離ｄ＝０．５Ｎｎｍ（Ｎは正の整数）にわたる飛行時間分布（ＤＴＯＦ０．５Ｎ）を算出することができる。各ｄＮＭＰについて、ＤＴＯＦ０．５を用いて、無作為変数ＴＮ＝ｔ１＋ｔ２＋．．＋ｔＮ（式中、｛ｔ１，ｔ２，．．．，ｔＮ｝は、ＤＴＯＦ０．５から無作為に抽出された独立した飛行時間値ｔｉ（ｉ＝１，Ｎ）の組である）の分布を記載する関数として、対応するＤＴＯＦ０．５Ｎを構築することができる。新しい無作為変数ＴＮはそれぞれｄ＝０．５ＮｎｍにわたるｄＮＭＰの飛行時間を表す。中心極限定理によると、μ及びσ２がそれぞれ平均値及び分散である場合、Ｎの大きな値の極限で必ずしも正規分布又は偶対称分布である必要はないＤＴＯＦ０．５を特徴づけると、ＤＴＯＦ０．５Ｎは正規分布に近似し、平均値Ｎμと分散Ｎσ２（又は（Ｎ）１／２σに等しい標準偏差）を特徴とするであろう。セグメントの数Ｎが増えるにつれて、ＤＴＯＦ０．５Ｎの幅は、Ｎと共に線形に増える平均値と比較して、Ｎの平方根として増えるにすぎない。従って、Ｎの増加は、この場合、飛行距離の増加に変換され、ＤＴＯＦ０．５Ｎのより良好な分離をもたらす。明らかに、分離のために必要な最小のチャネル長ｄｍｉｎ＝０．５Ｎｎｍを推定する場合、分布の重複の許容可能なレベルを画定する必要がある。我々のアプローチでは、Ｎが、平均値の分布の１つの０．２７％未満が平均値の平均値の他の分布の１つと重複するような場合、ｄｍｉｎ＝０．５ＮｎｍはｄＮＭＰによって移動される距離として推定された。この割合（％）は、正規分布の平均値からの３標準偏差に相当する。Ｃ及びＴについての同定ミスの割合は０．２７％であり、Ａ及びＧについての当該割合は０．４６％である。Ｎの算出及び必要な長さの詳細は上に記載されている。
【０２１０】
表９は、６つの異なるｄＮＭＰの対のそれぞれについての飛行時間を分離するのに必要な距離の値を示す。ｄＮＭＰすべてを完全に区別するのに必要な長さは、ｄＡＭＰとｄＧＭＰの飛行時間を分離するのに必要な距離、５．９μｍである。近似ではあるが、現実の系で再現するのは難しいシミュレーションの条件について、この数を異なる表面の比較についての基準として用い得る。
【０２１１】
（表９）ｄＮＭＰ対の飛行時間を分離するのに必要な距離（μｍ）
0006388605.tif 000024
【０２１２】
図４３は、０．５ｎｍの飛行時間分布に由来するＮ＝ＮｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ個の試料を合計することによって生成した各飛行時間と共に、５．９μｍにわたる飛行時間分布を示す。この距離でｄＡＭＰとｄＧＭＰの分布は辛うじて分離される。順序ミスを防ぐためにチャネルに入るｄＮＭＰ間の時間は少なくともこの長さでなければならないので、分布の全セットの幅はｄＮＭＰ当たりの最小解析時間（Δｔ解析）である。
【０２１３】
実施例５−現実的な流速の推定
ＭＤシミュレーションではｄＮＭＰ当たりの最小解析時間１０μｓ台でマイクロメートルの桁の短い距離にわたってｄＮＭＰを分離することができるが、現実的な流速は２〜３桁小さいであろう。それらの条件下では、拡散のために飛行時間分布の有意により大きな広がりがあるだろう。このサブセクションでは、必要なチャネル長及びｄＮＭＰ当たりの最小解析時間に対する拡散の影響を推定する。おそらく、現実的な流速の効果を推定する最良の方法（極めて高価なＭＤシミュレーションを遅い流速で行うのは問題外として）は、Ｃａｒｒらによって導入された戦略を使用することであり、それには、３つのデカルト次元すべてにおいてｄＮＭＰと壁の間の平均力のポテンシャル（ＰＭＦ）を算出し、次いで、得られた力をブラウン動力学（ＢＤ）シミュレーションにおける位置の関数として用いることが含まれる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCarr et al., Lab Chip 11: 3766-3773 (2011)）。平衡ＰＭＦ計算により算出された力は非平衡条件下では厳密には正しくないが、Ｃａｒｒらは、ＢＤシミュレーションとＭＤシミュレーション（圧力により駆動された流れを伴う）は良く一致すること示した（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCarr et al., Lab Chip 11: 3766-3773 (2011)）。この３ＤのＰＭＦ＋ＢＤ戦略の利点は、ＰＭＦの計算は高価であるが、ＢＤシミュレーションにはＭＤシミュレーションと比べてはるかに大きな時間規模とチャネル幅を可能にする単一のｄＮＭＰのみが含まれることである。
【０２１４】
ｄＮＭＰの拡散性及び速度のプロファイルについて並びに方程式１によるＰＭＦに関連する壁からの距離の関数としてｄＮＭＰを観察する確率についての幾つかの仮定を用いて、３ＤのＰＭＦを算出する必要なしでチャネル長の桁及びｄＮＭＰ当たりの解析時間を得ることができる。
以下の仮定を用いた：
（１）壁からの任意の距離でのｄＮＭＰのすべての拡散性は同じであり、４．４４×１０−６ｃｍ２／ｓである環状ＡＭＰの拡散性（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるDworkin et al., J. Biol. Chem. 252:864-865 (1977)）に等しい。
（２）ｄＮＭＰの速度プロファイルは、最大速度（ｖｍａｘ）が０．０４８ｃｍ／ｓである放物線状であるが、当該最大速度は、１０００Ｖ／ｃｍの電場のもとでバルク水溶液における電気泳動によってｄＮＭＰが移動する速度くらいであり、吸着中のｄＮＭＰの平均位置以下のｄｗの値についての速度はゼロである。滑り速度をゼロと仮定することはおそらく正しくないが、遅い速度で且つ粗い壁で滑り速度の平均速度に対する比はＭＤシミュレーションよりもはるかに小さいであろう。異なる形状の速度プロファイルを仮定することは平均速度を幾分変えるであろうが、推定値の桁を変えることはない。
（３）流れの方向（ｘ）における平均速度は
0006388605.tif 000025
である。
これは方程式２に類似しており、ｖｘ，ｉ（ビンｉにおける流れの方向での速度）及びｄｗＣＬ（スリットの中心線における壁からの距離）を除いて同じ記号を使用する。方程式３の使用は、当該確率は流れの状況において平衡シミュレーションと同じであると仮定する。非常に速い速度での非平衡ＭＤシミュレーションにおいてさえ吸着時間の割合が類似することを考えると、これは正当な仮定である。
（４）所与のチャネルの長さＬ、平均速度
0006388605.tif 000026
及び拡散性Ｄについては、飛行時間の確率密度分布は
0006388605.tif 000027
であり、それはまさに、時間依存性の平均位置が
0006388605.tif 000028
である一次元拡散についての分布である。
（５）分布の許される重複はＭＤシミュレーションの解析で用いたものと同じであった。
【０２１５】
これらの仮定を適用して、分布の所望の重複及び対応するΔｔ解析を乱さないＬの最小値を見いだすことを目標とした。ｖｍａｘ＝０．０４８ｃｍ／ｓについて決定されたＬ及びΔｔ解析の値は、それぞれ約２．５ｍｍ及び３９秒であると推定された。図４４は、距離２．５ｍｍにわたる飛行時間分布を示す。１ｃｍまでの長さで２０ｎｍ以下の寸法のチャネルが製作されているが（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるLiang et al., Nano Lett. 7: 3774-3780 (2007)）、何百万又は何十億のｄＮＭＰ（ヒトゲノムは約３０億の塩基対を有する）を配列決定する必要があり得ることを考慮すると、各ｄＮＭＰを解析する時間は長すぎる。その速さで１日のうちにヒトゲノムを配列決定するには、冗長性を含まないで並行して約１４０万個のチャネルが必要である。幸いにも、Ｌのみが速度に反比例する一方で、Δｔ解析は速度の平方に反比例する。速度が１０の倍数で増加したら、必要な長さは２５０μｍであり、Δｔ解析は３９０ｍｓである。
【０２１６】
所与のｖｍａｘについては、推定することができる最小の可能なΔｔ解析がある。上記の仮定１、４及び５に加えて、ｄＮＭＰ型の１つを
0006388605.tif 000029
を有すると仮定し、それは壁によって影響されないと仮定する。第２のｄＮＭＰ型を
0006388605.tif 000030
を有すると仮定し、第３及び第４の型を上記の考えられる所与の仮定５の範囲までは分布のすべてが互いに混み合うようにさらに遅い速度
0006388605.tif 000031
を有すると仮定する。Δｖｘを変化させることによってΔｔ解析の最小値を見つけることができる。ｖｍａｘ＝０．０４８ｃｍ／ｓでは、Δｔ解析の最小値は約５．０ｓであり、Ｌは約１．２９ｍｍである。ｖｍａｘ＝０．４８ｃｍ／ｓでは、Δｔ解析の最小値は約５０ｍｓであり、Ｌは約１２９μｍである。
【０２１７】
実施例１〜５の考察
ＤＮＡにおいて一般に見いだされる４つのデオキシｄＮＭＰ５'一リン酸を、その飛行時間及び動力学を比較するために、不規則なＬｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ炭素原子で構成された３ｎｍ幅のナノスリットにて水溶液中でシミュレーションを行った。溶液は、物体力（圧力差又は毛管力により誘導されるものと類似する流れを誘導することが知られている）によって作動させた。比較のために、及びｄＮＭＰをスリット壁に吸着させる自由エネルギーを算出するために、外力がない場合も考慮した。ｄＮＭＰは流れがなくてもナノ秒範囲内で吸着し、脱着する。流れはｄＮＭＰの吸着及び脱着の挙動に大きな影響を有さず、ｄＮＭＰが吸着する時間の割合は、平衡シミュレーションと非平衡シミュレーションでほぼ同じであった。疎水性の炭素スリット壁を用いて最も疎水性のｄＮＭＰ（ｄＴＭＰ）及び最も親水性のｄＮＭＰの１つ（ｄＣＭＰ）の飛行時間が容易に分離されるということは、飛行時間がほぼ同じなのでｄＡＭＰ及びｄＧＭＰにおける化学基の壁表面における他の基との相互作用も重要であろうが、壁物質の濡れ性を改変することがナノチャネルを通るｄＮＭＰの飛行時間に基づいてｄＮＭＰ間を識別することにおいて高い信頼性を達成する有望な方法であり得る。ｄＡＭＰ及びｄＧＭＰに関する重要な疑問は、平衡条件に比べて流れの条件下での脱着の間の質的に異なるその挙動がその飛行時間を分離する能力において役割を担うかどうか及びこの挙動が現実的な装置で使用されるはるかに遅い速度で持続するかどうかである。現実的な流速での拡散の効果の解析は、ｄＮＭＰの速度がｄＮＭＰ当たり理に適った最小解析時間を得るために比較的に速くすべきであることを示している。
【０２１８】
実施例６−λ−エキソヌクレアーゼ（λ−Ｅｘｏ）の固相への固定化
λ−エキソヌクレアーゼ（λ−Ｅｘｏ）を熱可塑性（ＰＭＭＡ）固相表面に固定化した。λ−Ｅｘｏに１０×反応緩衝液（６７０ｍＭのグリシン−ＫＯＨ，ｐＨ９．４，２５ｍＭのＭｇＣｌ２，０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１００)(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD）を提供した。使用前に精製工程を実施しなかった。
【０２１９】
λ−Ｅｘｏが固定化されるＰＭＭＡ基板へのＰＭＭＡカバー板の熱融合接合（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHenry et al., "Surface Modification of Plastics Used in the Fabrication of Microanalytical Devices," Analytical Chemistry 72: 5331-5337 (2000); McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices," J. Am. Chem. Soc. 127: 842-843 (2005)）に続いて、酵素の連結を容易にするために、スクシンイミジルエステル中間体を形成させた。これを、０．１Ｍの２−（４−モルフォリノ）−エタンスルホン酸、ｐＨ５．１（MES, Fisher Biotech, Fair Lawn, NJ）中の２００ｍＭの３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及び５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する溶液で固相反応器を室温にて１５分間満たすことによって実施した。次いで、ＥＤＣ／ＮＨＳ試薬を、０．０３μｇ／μＬのλ−Ｅｘｏ酵素から成る溶液で流体力学的に置き換えた。４℃にて一晩反応を進めさせた。酵素で官能化した装置を１×λ−Ｅｘｏ反応緩衝液ですすぎ、ＰＭＭＡ表面から未結合の試薬すべてを取り除いた。図４５は、λ−Ｅｘｏ固定化のプロセスを要約する模式図である。
【０２２０】
ＡＣ（タッピング）モードで１．００Ｈｚの走査速度でＡｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＭＦＰ３Ｄ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて表面に固定化されたλ−Ｅｘｏの性状分析を行った。ＡＦＭに使用した試料は、固定化されたλ−Ｅｘｏ酵素を含有するＰＭＭＡシートから成った。ＰＭＭＡシートは、１．７ｃｍ×１．７ｃｍ四角へと切断された厚さ３ｍｍのものであった。切断後、上に記載されたように基板を清浄にし、乾燥させ、ＵＶで活性化させた。当該シートをＥＤＣ／ＮＨＳカップリングに供し、上述のように酵素付加を完了させた。試料を反応緩衝液、ｄｄＨ２Ｏですすぎ、ＡＦＭ解析の前に圧縮空気で穏やかに乾燥させた。
【０２２１】
基板表面上に生成されたカルボン酸基に対して外部のタンパク質上のアミン基をＥＤＣ／ＮＨＳを介してコンジュゲートさせることによって、ＰＭＭＡへのλ−Ｅｘｏの固定化を行った。ＰＭＭＡへのλ−Ｅｘｏの連結の成功は、ＡＦＭ解析によって確認した。酵素非特異的な吸着を測定するために、ＵＶ光でＰＭＭＡ基板を活性化し、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬の非存在下でλ−Ｅｘｏ酵素溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。図４６Ａは、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬の非存在下で行ったＰＭＭＡ／λ−Ｅｘｏの反応のＡＦＭ走査である。この走査は、λ−Ｅｘｏ酵素のサイズ及び形状に一致する表面組織の証拠を示しておらず、これらの進行中の条件下ではポリマー表面への酵素の物理吸着は生じなかったことを裏付けている。図４６Ｂは、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬の存在下で行ったＰＭＭＡ／λ−Ｅｘｏの反応のＡＦＭ画像である。図４６Ａの走査と比べると、図４６Ｂの走査はλ−Ｅｘｏのサイズと一致する表面形体を示す。ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬なしで酵素が存在した基板の平均ＲＭＳ粗さが０．３４±０．０１ｎｍであったのに比べて、共有結合したタンパク質を含有する基板の平均ＲＭＳ粗さは１．５８±０．１８ｎｍであった。従って、ＰＭＭＡ表面への酵素の共有結合はＥＤＣ／ＮＨＳカップリングの存在下でのみ観察され、物理吸着は生じなかった。表面の種々の領域（ｎ＝６）を横切る１５μｍの領域にわたって行った複数の走査から、表面形体のＡＦＭの高さプロファイルは、これらの形体の平均高さが１５ｎｍであることを示唆したが、それはＸ線結晶学データに基づいて報告されたλ−Ｅｘｏの外径（約１５０Å）に相当する。図４６Ｃは、これらの形体のサイズ分布を決定するように作製した形体の高さのヒストグラムである。このデータから検出された形体の７１％は、１４．３±２．３ｎｍの高さ範囲の範囲内に入った。高さのばらつきは、試料の崩壊を減らすために使用される非接触モードの画像化又は解析の間での移動に起因し得る。このデータは、形体の大半が、活性化された表面へのλ−Ｅｘｏの単一点連結に一致することを示している。従って、固定化された酵素の大半は、ｄｓＤＮＡを取り込むためのそれらのアクセス孔によって、基板表面にほぼ垂直に方向付けられる。固定化反応に用いたＵＶ照射量及び酵素濃度の下での酵素は、表面の立体評価に基づいて酵素とｄｓＤＮＡをアクセス不能にする、酵素及びそのアクセス孔が表面に対して平行に存在する表面架橋をもたらさなかったことが、ヒストグラムに形体の高さの二重分布が存在しなかったことにより示されている。固定化からのＡＦＭのデータは、完全なホモ三量体のコンジュゲーションが達成されたこと、及び、連結プロセスの結果として酵素がその単量体単位へと解離することは認められなかったことも確認している。
【０２２２】
実施例７−固相におけるλ−エキソヌクレアーゼを用いたλ−ＤＮＡの消化
λ−Ｅｘｏで修飾した反応器内で二本鎖λ−ＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）（New England Biolabs, Ipswich, MA)を種々の時間インキュベートした（当該時間は、所望の滞留時間を提供するのに適当な速度でλ−ＤＮＡ溶液をポンプで流体力学的に固相反応器を通すことによって選択した）。ポンプによる流体力学的な輸送は、機械的なポンプ（ＰＨＤ２０００シリンジポンプ, Harvard Apparatus, Holliston, MA）を用いて制御した。反応器アッセイは、特注の熱電温度計加熱ステージによって３７℃に温度制御した。下流の解析のために当該装置の流出口にて流出物を回収した。
【０２２３】
酵素反応器を通過した後に残っているｄｓＤＮＡの量を測定するために、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）挿入色素であるＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Life Technologies, Grand Island, NY）を用いた。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、ｄｓＤＮＡへの結合に対して高い特異性を示し、当該結合の結果として蛍光が増強する（ｄｓＤＮＡに挿入されるとその蛍光量子効率がおよそ１，０００倍上昇する）。当該色素は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又はモノヌクレオチドに結合せず、それに関連する蛍光の上昇もないので、当該色素は、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、及びモノヌクレオチドから成るはずであるλ−Ｅｘｏ固相反応からｄｓＤＮＡの含量を特異的に決定するのに好適である。インタクトなｄｓＤＮＡの量の定量のために、消化後に当該色素を加えた。以前の報告によると核染色の際にλ−Ｅｘｏの酵素活性が低下すると言及されている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるSubramanian et al., "The enzyme bias of processivity in lambda exonuclease," Nucleic Acids Research 31: 1585-96 (2003)）ので、消化前とは対照的に消化後に添加を行った。色素標識した試料を４８０ｎｍで励起させ、Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３分光蛍光計(Horiba JobinYvon, Edison, NJ)及びＤａｔａＭａｘソフトウエア２．２０を用いて４９０ｎｍ〜７００ｎｍで蛍光スペクトルを収集した。
【０２２４】
図４７は、自由溶液でのλ−Ｅｘｏで消化したλ−ＤＮＡ及び固相反応器でのλ−Ｅｘｏで消化したλ−ＤＮＡ（同じ有効な反応時間）の蛍光スペクトルを示す。反応器におけるＤＮＡ消化の量を測定するために、核染色色素であるＰｉｃｒｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を反応器床流出物又は酵素反応の自由溶液に加え、溶液中に残るｄｓＤＮＡの量を示す蛍光スペクトルを取得した。図４７のグラフにて示すように、自由溶液での消化で見られる蛍光の量は、固相反応器での消化から検出されるものよりも相当に多く、固相消化に比べて自由溶液消化ではさらに多いｄｓＤＮＡが存在したことを示している。
【０２２５】
実施例８−表面に固定化されたλ−エキソヌクレアーゼによる消化のリアルタイムモニタリング
固定化されたλ−Ｅｘｏの消化速度を測定するために、リアルタイム蛍光モニタリングを採用した。この試験で利用した顕微鏡は、Ｚｅｉｓｓ１００×／１．３  ＮＡ油浸対物レンズ及びＡｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ３  ＥＭＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｖｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ倒立顕微鏡（７５ＷのＸｅランプ, Zeiss, Germany)から成った。分析の間、組み立てられたＰＭＭＡ装置を顕微鏡試料台に保持するために、特注のマウントを機械製作した。全ての画像の取得及び解析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ７．７．６．０ソフトウエア (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA)及びＩｍａｇｅＪ１．４６(National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて行った。これらの実験での使用のために、補因子を含まないλ−Ｅｘｏ  １０×反応緩衝液（ｐＨ９．４での超純水中のグリシン−ＫＯＨ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を調製し、ｄｓＤＮＡの酵素消化の開始を制御した。λ−Ｅｘｏ酵素をＰＭＭＡに連結させた後、１：５０の色素対塩基対の比でＹＯＹＯ（登録商標）−１標識したλ−ＤＮＡを反応器内で約３時間インキュベートして、酵素−ＤＮＡ複合体を生成した。２５ｍＭのＭｇＣｌ２補因子を含有する反応緩衝液（１×）を当該装置に導入し、３７℃に加熱した後、酵素活性のリアルタイムモニタリングのために画像化した（図４８を参照）。試薬及びｄｓＤＮＡをポンプで反応器に通すことを可能にするために、ＰＨＤ２０００シリンジポンプ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)を用いた。エポキシを介した流入口／流出口のリザーバへの密封ピーク配管によってポンプを反応器に接続し、流入口の管はルアーロックコネクタを用いてシリンジに接続した。
【０２２６】
λ−ＤＮＡの塩基対の総数（４８，５０２ｂｐ）及び総消化時間に基づいて決定された、表面に固定化されたλ−Ｅｘｏの平均消化速度は、１１３５±１２４ヌクレオチド／秒であった（ｎ＝４）。この消化速度は、以前報告されたもの（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMatsuura et al., "Real Time Observation of a Single DNA Digestion by Lambda Exonuclease under a Fluorescence Microscope," Nucleic Acids Research 29: e79 (2001)）と一致したが、消化効率は上昇した（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるAyub et al., "Nanopore Based Identification of Individual Mononucleotides for Direct RNA Sequencing,"Nano Letters 13: 6144-6150 (2013); Matsuura et al., "Real Time Observation of a Single DNA Digestion by Lambda Exonuclease under a Fluorescence Microscope," Nucleic Acids Research 29: e79 (2001)）。この情報は、λ−Ｅｘｏのプロセッシブな挙動によって、以前の報告よりも１０倍多い値である３０，０００超のヌクレオチドの消化が得られることを示唆している。蛍光強度の低下が消化の結果であって光退色又は光切断の結果ではないことを確定するために、補因子の非存在下で通り抜けたλ−ＤＮＡ分子を、観察された消化の総時間より長い間、励起光にさらすことによって、対照実験を行った。反応が酵素の補因子で補強されない場合（すなわち、酵素活性が０．０に等しい）、図４８に描いているように典型的な消化実験の持続時間全体にわたって相対的に一定の蛍光が認められた。
【０２２７】
実施例９−モノヌクレオチドのマイクロチップ（ＰＭＭＡ）キャピラリー電気泳動
２５４ｎｍでのＵＶ検出と共にＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥ機器を用いてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行った。Ｍｏｌｅｘ  Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Phoenix, AZ）製の内径５０μｍのコーティングなし溶融シリカをＣＥ（全長＝３３ｃｍ、有効長さ＝２０ｃｍ）に用いた。０．１ＭのＮａＯＨで３０分間、ＣＥカラムを予備調整し、濾過した０．５×ＴＢＥ緩衝液（１８ＭΩの超純水中の４５ｍＭのＴｒｉｓ，４５ｍＭのホウ酸塩，１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．３）で洗い流すことによってすすいだ。最終的に、０．５×ＴＢＥ、ｐＨ８．３における２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ，Ｍｒ＝４０，０００; Sigma Aldrich St. Louis, MO）を含有する動的コーティングによってキャピラリー表面を処理し、電気浸透流を抑えた。ＣＥの泳動用緩衝液は、カチオン性界面活性剤、この場合、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）も含有した。１０ｋＶで１８０ｓの動電注入によって試料の導入を行った。ＣＥは、天然のデオキシヌクレオチド一リン酸（ｄＮＭＰ、メチル化Ｃを含む４種）について１μＭの濃度で行った。
【０２２８】
本明細書に記載されているＣＥの条件を用いて、図４９に描いているように天然のｄＮＭＰのベースライン分離を得た。しかしながら、これは長さほぼ２０ｃｍのカラムを用いて達成され、８分間の展開時間を要した。飛行時間解析については、分離時間は１ｍｓ台であり、カラムの長さは約５０μｍであろう。この短い展開時間とカラムにもかかわらず、分離はｄＮＭＰの電気泳動移動度のピーク幅と差異のみに依存するので、分離の質は低下しないであろう。電気泳動移動度は、電場強度、カラムの長さ、及びＣＥの展開時間に無関係である。
【０２２９】
実施例１０−ＰＭＭＡナノチャネルにおける熱可塑性電気浸透流に対する表面処理の効果
ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）を用いてＰＭＭＡナノ流体装置を製作した。手短には、ナノチャネルに基づく流体装置は３つの主な部分、すなわち（ａ）リザーバと幅７５μｍ及び深さ２０μｍの輸送チャネルを含むマイクロ流体ネットワーク、（ｂ）ナノチャネルの流入口における勾配のついたインターフェース（漏斗様の流入口は３０μｍから７５ｎｍに減る幅と１０μｍから７５ｎｍに減る深さを持つ１６の台形プリズムから成る）及び（ｃ）幅７５ｎｍ及び深さ７５ｎｍであるナノチャネルのアレイから成った。
【０２３０】
製作ステップは、４つの主要なステップ、すなわち（１）凹型のナノチャネル及び階層的なマイクロ規模の流体ネットワークを有するシリコンマスターを形成する工程、（２）ＵＶ−ＮＩＬを介してシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）基板にコーティングしたＵＶ硬化性樹脂層にシリコンマスターのパターンを移し、突出構造を持つポリマースタンプを作製する工程、（３）ＰＭＭＡ基板にＵＶ樹脂スタンプをナノインプリントしてナノ流体構造を生成する工程、及び（４）基板にＰＭＭＡカバーガラスを接合して流体システムを形成する工程に分けることができる。
【０２３１】
シリコンマスターを作るために、シリコン湿式エッチングと集束イオンビーム（ＦＩＢ）加工を組み合わせて階層的な構造を作った。リザーバ及び輸送チャネルを従来の光リソグラフィによって画定し、シリコンの表面にて３０％ＫＯＨ溶液によって異方性にエッチングした。次いで、ＦＩＢ（ＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ３Ｄ  ＦＥＧ）を用いて漏斗型の流入口及びナノチャネルアレイを段階的に加工した。最終的に、真空チャンバーにて気相から１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリクロロシランの単層をコーティングした。
【０２３２】
基剤としての６９重量％のトリプロピレングリコールジアクリレート（ＴＰＧＤＡ）と、架橋剤としての２９重量％のトリメチロールプロパントリアクリレートと、光開始剤としての２重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ６５１を含有するＵＶ硬化性のポリマーブレンドをポリマースタンプの材料として選択した。ピペットで分配することによってシリコン金型をＵＶ樹脂でコーティングした。次いで、ＵＶ樹脂でコーティングしたスタンプの上にＣＯＣ基板（ＣＯＣ−ＴＯＰＡＳ６０１７, TOPAS Advanced Polymers, Florence KY）を置き、樹脂が確実に金型空洞を完全に満たすために穏やかに圧迫した。続いて、硬化のために２０秒間、ＵＶに暴露した。硬化に使用したＵＶランプは、１．８Ｗ／ｃｍ２の強度、４００ｎｍのカットオフ角度を持つ広域帯波長、及び約３６５ｎｍの最大波長強度を有した。硬化の後、ＵＶ硬化性樹脂をシリコン金型から穏やかに離型させ、ＵＶ硬化性樹脂上にネガコピーを得た。
【０２３３】
次いで、パターン形成されたＵＶ硬化性樹脂をスタンプとして用いて、リザーバ用に予め加工した孔を有する厚さ３ｍｍのＰＭＭＡシート（ＬｕｃｉｔｅＣＰ）に熱型押しした。ＮＩＬ（Ｏｂｄｕｃａｔナノインプリントシステム）によって１３０℃及び２０バールで５分間インプリントを行った（圧縮空気を用いてスタンプ及び基板に圧力を加えたが、インプリント領域全体にわたって圧力の均一性を確保した）。スタンプと基板の双方を所望の成形温度にて３０秒間、予備加熱した後に圧力を加え、インプリントプロセスの間、システムが７０℃に冷却されるまで保持した。スタンプ及び基板が室温まで冷却された後、ＰＭＭＡのコピーはＵＶ樹脂スタンプから容易に離型され得る。
【０２３４】
厚さ１２５ｍｍのＰＭＭＡシート（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をカバーガラスとして使用した。パターン形成されたＰＭＭＡシート及びカバーガラスの双方を１５Ｗのもとで１５秒間酸素プラズマによって処理し、表面を活性化させた。プラズマ処理の直後に熱接合を行った。２０バールの圧力、８０℃の温度、及び１０分間の時間を用いて、ＰＭＭＡ上の構造に影響を及ぼすことなく所望の接合強度を達成した。接合プロセスの間、ＮＩＬの機械を用いて均質な圧力を提供した。
【０２３５】
ナノチャネルを１μＭのＫＣｌ溶液で満たした後、陽極のリザーバを２μＭのＫＣｌで満たし、陰極のリザーバを１μＭのＫＣｌで満たすという不連続緩衝液系を用いて、電気浸透流（ＥＯＦ）を測定した。２００Ｖ／ｃｍの電場を印加した電気泳動の間、ＡｘｏＰａｔｃｈ電流増幅器を用いて電流をモニタリングした。ＥＯＦは、特に言及されない限り、チャネル壁の表面の負の荷電のために、陰極リザーバに向かって流れた。アミンで修飾されたＰＭＭＡナノチャネル壁の場合、ＥＯＦは陽極の方向に流れた。
【０２３６】
未変性のＰＭＭＡナノチャネル（図５０Ａ）の場合は、ＥＯＦは、全ｐＨ値において陰極の方向に動いた。見て分かるように、ＥＯＦは、マイクロチャネルの以前の結果に一致して、溶液のｐＨにはほとんど無関係である。しかしながら、ＰＭＭＡナノチャネルをＯ２プラズマで処理した場合、ＥＯＦはｐＨ３を超えると大幅に速くなった。Ｏ２プラズマが表面限定のカルボン酸基を生成するＰＭＭＡ表面の酸化を誘導するので、この有意なＥＯＦの上昇は、表面限定のカルボン酸基の脱プロトン化に起因し得る。これらの基が脱プロトン化される場合、表面電荷密度は上昇し、ＥＯＦにおける有意な変化を生じる。従って、ポリマーナノチャネル上の表面電荷密度はＯ２プラズマ処理を用いて改変することができる。ＰＭＭＡナノチャネルがプラズマ酸化され、その後、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング試薬（図５０Ｂ）の存在下でエチレンジアミン（ＥＤＡ）によって処理された場合、ＥＤＡのアミン基の１つがＰＭＭＡナノチャネル表面で生成されたペンダントカルボン酸基に共有結合で係留される。この修飾がＥＯＦの逆転（陰極から陽極へ移動）をもたらし、このことは陽極から陰極に移動するＥＯＦについての負に比べて表面電荷が正であることを示している。このデータで見られる傾向はＰＭＭＡマイクロチャネルで以前認められたものに類似する。
【０２３７】
実施例１１−ポリマーナノカラムを用いたＳＭＥの評価：蛍光標識ｄＮＭＰの追跡
上述のようにナノチャネルを調製した。しかしながら、この場合は、チャネルは、熱ＮＩＬを用いて環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）で製作した。ナノチャネルは長さ１００μｍで１００ｎｍ×１００ｎｍであった。当該チャネルを、同じくＣＯＣで作製されたカバー板と同様にＯ２プラズマで処理し、当該装置を、未変性の熱可塑性物質のガラス転移温度よりやや低い温度７８℃で熱組み立てした。これらの実験については暗視野顕微鏡を用いて単一分子を追跡した。当該分子は、クエン酸イオンでコーティングされた直径１０ｎｍの単一の銀（Ａｇ）ナノ粒子（ＮＰ）から成り、当該コーティングによって当該Ａｇ−ＮＰ表面に負の電荷が付与されていた。当該Ａｇ−ＮＰを陰極リザーバに入れ、種々の電場強度で陽極リザーバへと電気泳動した。当該電気泳動は、ナノチャネルにおける電気的二重層の厚さを減らすために１０ｍＭのＫＣｌも加えたＴＢＥ緩衝液（１×、ｐＨ＝８．０）にて行った。
【０２３８】
図５１Ｂは、ポリマーナノチャネルに置かれた際の（定常状態の）当該粒子について高い強度を示す単一のＡｇ−ＮＰの画像（３Ｄ−プロット）である。ポリマーナノチャネルを通じた単一分子の電気泳動を種々の電場強度で行い、当該分子の移動を光学的に追跡した。移動時間をヒストグラム化して、測定された飛行時間における分散を電場強度の関数として決定した。最小の分散は、図５１Ａに示す最高の電場強度（４０００Ｖ／ｃｍ）について確認された。図５１Ｃから見て分かるように、Ａｇ−ＮＰ（１０ｎｍ）の電気泳動移動度は、印加された電場と無関係であったが、飛行時間分布における分散と逆相関する段数は、電場強度が高くなるにつれて増加した。このことは、当該分散は主として長手方向の拡散に起因し、移動事象に関連する他の人為的結果ではないという事実と一致する。拡散移動は（２Ｄｔ）１／２（式中、ＤはＡｇ−ＮＰの拡散係数であり、ｔは時間である）に比例するからである。電場強度が高いほど、移動時間が短くなり、したがって拡散移動時間も短くなる。
【０２３９】
実施例１２−Ｔ４ＤＮＡ及びλＤＮＡについての縦電流の遮断事象
ＰＭＭＡナノ流体装置の製作を、上で記載したように行った。倒立顕微鏡（Zeiss Axiovert 200）を用いて、当該装置を介したＤＮＡの移動事象の光学的測定を行った。蛍光顕微鏡をＥＭＣＤＤカメラ（iXon3 888 Andor）に装着した。電気的測定のための流体チップを遮蔽するのに２つのファラデーケージを用い、一方は試料台を遮蔽するのに用い、他方は顕微鏡全体を覆った。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Molecular Devices）によって、ビデオ画像の記録及び処理を行った。ビデオ記録中、ＥＭＣＣＤのオーバーラップモードを用いた（シャッター時間：５ｍｓ〜２０ｍｓ）。
【０２４０】
Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器及びＤｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａ(Molecule Devices)の全セルモードを用いて電流測定を行った。ｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエアを用いてデータの取得及び解析を行った。内部ベッセル・ローパスフィルターを１０ｋＨｚに設定して速度１００ｋＨｚでシグナルをサンプリングした。Ａｇ／ＡｇＣｌワイヤを電極として用いた。測定すべてについて、パッチクランプによって印加された１ＶのもとでＤＮＡを駆動した。
【０２４１】
１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス−ホウ酸及び２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．３）にてＴ４ＤＮＡ溶液（０．５μｇ／ｍｌ）を調製した。２０：１の比（ｂｐ／色素）にてＹＯＹＯ（登録商標）−１によってＤＮＡを染色した。β−メルカプトエタノール（３％）を光退色防止剤として加え、０．２ｍｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼと０．０４ｍｇ／ｍｌのカタラーゼと４ｍｇ／ｍｌのβ−Ｄ−グルコースから成る酵素的酸素スカベンジャー系も緩衝液に加えて酸素を取り除いた。真空ポンプを用いて先ずチャネルを濡らし、ＤＮＡ溶液を当該装置に導入した。
【０２４２】
図５２Ａ〜Ｈは、ＰＭＭＡナノチャネルを通って電気的に移動する、Ｔ４ＤＮＡについてのＤＮＡ移動事象の光学的及び電気的な描写である。これらの移動事象は電流応答を生成し、光学的に見られるようにＤＮＡがナノチャネルを通って移動すると正確にスパイクが生じた。移動事象の開始時は、低い電場強度のためにＤＮＡ分子はマイクロチャネル内をゆっくり移動した。ナノチャネルの入力端に置かれたナノピラーアレイ内をＤＮＡ分子が通り抜けるとき、当該分子は、ナノピラーとの衝突及びフッキングによって引き延ばされた。いったんナノチャネルに達すると、強い電場のためにＤＮＡはナノチャネルを迅速に通過し、それは高い抵抗性のためにナノチャネル内で濃縮された。ナノチャネルから離れた後、ＤＮＡ分子は迅速に減速して再コイル化した。これらの移動プロセスのうち、ＤＮＡがナノチャネルを通過するプロセスだけがイオン性の電流降下を生じた。ＤＮＡがナノチャネルに入った時点のイオン性の電流降下から、電流がベースラインからスパイクの底まで降下するのに１〜３ｍｓかかった。イオン性の電流は、約１５ｐＡの電流降下が、ＤＮＡ分子の長さに比例する時間持続した。Ｔ４ＤＮＡ鎖全体をナノチャネルを通して移動させるには、蛍光画像から示されるように２〜３フレーム（４０〜６０ｍｓ）かかった。当該時間はＩ−ｔ曲線からの読み取りに合致し、インタクトなＴ４ＤＮＡ分子についてのスパイクの幅は５２ｍｓであった（図５２Ｇ及び５２Ｈ）。
【０２４３】
ここで、tTは電流降下スパイクの持続時間（ＤＮＡの移動時間）を表し、IDは電流降下の振幅を表す。図５２Ａ〜５２Ｃは短いＤＮＡ分子の移動によって生成されたイオン性の電流スパイクを示す。それらの小さなＤＮＡ断片は普通、蛍光励起光のもとでの光切断又は試料調製中の剪断力によるＴ４ＤＮＡの損傷から生成される。蛍光画像から測定されたこれらのＤＮＡ断片の長さは普通５μｍ未満であった。より速い電気泳動移動度及び短い長さによって、それらＤＮＡが短時間内にナノチャネルを通って移動するのが可能になった：tT＝５〜１０ｍｓであり、IDは５〜１０ｐＡの幅があった。
【０２４４】
図５２Ｄ〜５２Ｆは、ナノチャネルを通って移動する、より長いＤＮＡを示す。それらのＤＮＡは２０〜６０ｍｓで通過し、IDは１５ｐＡ前後であった。それらはニックのあるＤＮＡ分子であると想定されたが、完全長のＴ４ＤＮＡ分子には対応しなかった。ナノチャネルを通って移動する完全長のＴ４ＤＮＡ分子を図５２Ｇ〜５２Ｉに示す。ここで、電流過渡の持続時間は完全長のＴ４ＤＮＡ分子にさらに一致した。
【０２４５】
このデータは、ＤＮＡ分子が専ら電気的測定によって検出することができ、ＤＮＡ分子の長さは、生成される電流過渡の長さと相関することを示している。これらの測定では、電流過渡は、ナノ電極を使用しないが代わりに当該装置の陽極リザーバ及び陰極リザーバに置かれたマイクロ電極を使用する縦方向の測定から推定された。これらの縦方向の電流測定は、電気的に駆動された移動事象の間行うことができる。これらの測定から、過渡の持続時間はＤＮＡの長さと相関させることができる。これらの場合は光学的測定を行ったが、それらは電気的変換には必要ではない。光学的測定は、電気的測定の性質を実証するためにのみ行われた。
【０２４６】
実施例１３−電気化学を用いた層状ナノワイヤにおけるナノギャップの生成
セグメント化されたナノワイヤにナノギャップを生成するために２ステップの手法を開発した。これらステップには、（１）多重セグメント化されたナノワイヤを電着することと、（２）埋め込まれた犠牲層からギャップを電気化学的にエッチングすることが含まれる。電着技法の実証として、ナノ多孔性のポリカーボネート鋳型（Ｗｈａｔｍａｎ、約１０８ナノポア／ｃｍ２、１００ｎｍの公称孔直径を持つ）を２つの電極セルの陰極として用いた。導電性電極を作製するために、ポリカーボネート鋳型の一方の面を金でスパッタリングした。陽極は白金メッシュであった。以下の順序、すなわちＦｅＮｉＣｏ／Ａｕ／Ｃｕ／Ａｕ／ＦｅＮｉＣｏで５つのナノワイヤセグメントを製作した。ＦｅＮｉＣｏナノワイヤセグメントがナノワイヤの最上部と最下部であり、他のワイヤを磁気的に操作する手段として役立った。ＦｅＮｉＣｏは、−２５ｍＡ／ｃｍ２（２０％の多孔性）、０．５のデューティーサイクル及び２秒間のオン／オフ時間のパルス堆積を用いて、０．７２Ｍのスルファミン酸ニッケル、０．１５５Ｍの硫酸第一鉄、０．００５Ｍの硫酸コバルト、０．５Ｍホウ酸、０．００１Ｍのラウリル硫酸ナトリウム、０．０１１Ｍのアスコルビン酸を含有する電解質からｐＨ２及び４０℃の温度で堆積させた、Ｆｅが豊富な合金（約６４重量％のＦｅ，３１重量％のＮｉ，５重量％のＣｏ）であった。金のセグメントは市販の金溶液（TG-25E RTU, Technic Inc.）を用いて−１ｍＡ／ｃｍ２の電流密度で６０℃の温度にて製作した。銅の中間層は−３ｍＡ／ｃｍ２にて定電流で堆積させた。銅電解質は０．１５Ｍ硫酸銅、０．０１Ｍの硫酸ナトリウム、０．４５Ｍのクエン酸ナトリウム及び０．４０Ｍのホウ酸を含有した。堆積の後、膜をジクロロメタンに溶解し、次いでエタノールで３回洗浄した。銅は犠牲層として役立ち、堆積の時間はギャップのサイズに比例した。第２のステップでは、導電性炭素表面に置いたナノワイヤをエッチングすることによって銅層の溶解を電気化学的に制御した。印加された作動電位はＳＣＥに対して＋０．１Ｖであり、溶液は銅のメッキに使用したものと同じクエン酸−ホウ酸電解質であった。
【０２４７】
当該手法は、異なる寸法で制御され得るギャップを有するナノワイヤを生成することに成功した（図５３Ａ〜５３Ｂを参照）。決定的な特徴は、印加される電位の選択に基づいて、エッチング中にＦｅＮｉＣｏ領域及びＡｕ領域が攻撃されないことである。電位及び電解質はコア−シェル型の構成でその表面上にポジフィルムを生成するように選択されるので、Ａｕは銅より貴金属であり、ＦｅＮｉＣｏは攻撃されないので、Ａｕは溶解されない。当該技法を開発するのに厚い大きな直径のナノワイヤを用いたが、より小さな直径のワイヤに拡張されるであろう。より別々のギャップ及びより細いギャップサイズを生成するために、パルスメッキ及びＰＲメッキのスキームでの銅層の堆積を調べている。
【０２４８】
本明細書では好ましい実施形態を詳細に叙述し記載してきたが、種々の改変、付加、置換等を本発明の精神から逸脱することなく行うことができる、これらは後に続く特許請求の範囲にて規定される本発明の範囲内にあると見なされることが当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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