(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを５．０％（ｗ／ｖ）含む培地１．２Ｌに、細胞濃度がＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ）で３２ｍＬ／Ｌのクロレラ細胞液を２００ｍＬ接種して３６℃で培養し、培養開始１８時間後からグルコースを５０％（ｗ／ｖ）含む培地を０．０３Ｌ／時間で１０時間流加したとき、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が４７ｍｇ／ｇ以上、かつ総カロテノイド含量が７ｍｇ／ｇ以上であることを特徴とするクロレラ・レギュラリス  Ｚ−１９２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２３９）。
【請求項２】
請求項１に記載の培養条件で培養したとき、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の１．５倍以上、かつ培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の１．５倍以上である請求項１記載のクロレラ・レギュラリス  Ｚ−１９２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２３９）。
【請求項３】
クロレラ・レギュラリス  Ｚ−１９２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２３９）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロロフィルおよびカロテノイドを高濃度に含有するクロレラに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラは、クロロコックム目（Chlorococcales）、オオシスティス科（Oocystanceae）、クロレラ属（Chlorella）に分類される直径２〜１０μｍの球状または卵形の単細胞緑藻である。その藻体には、良質なタンパク質や、ビタミン、ミネラル類が豊富に含まれているため、健康食品や食品素材として利用されている。また、クロレラは光合成により独立栄養的に増殖することができるだけでなく、有機炭素源を利用して従属栄養的に増殖することも可能であり、培養条件の変動がなく、品質や収量を一定に保ちやすくなるとともに、微生物等による汚染を防止できるなどの利点があるため、日本では従属栄養的培養が主に採用されている。
【０００３】
上記したように、クロレラは様々な栄養成分を含有するが、特に食物繊維を豊富に含むとともに、クロロフィルやカロテノイドなどの色素を多く含有することから、緑黄色野菜の代替あるいは補助食品として主に利用されている。またクロロフィルやカロテノイドは、抗酸化活性など種々の生理活性を有することが知られており、例えば、クロロフィルには、抗胃潰瘍作用、抗肝障害作用、抗アレルギー等の他、抗変異原作用やダイオキシン類排泄促進作用があることが報告されている。したがって、クロロフィルや総カロテノイド含量が高いことはクロレラの品質上重要である。
【０００４】
しかし、従属栄養的培養では、クロロフィルやカロテノイドの含量が独立栄養的培養のクロレラに比べて低くなる。このため、既存の株に紫外線照射や突然変異剤投与等を行って変異を生じさせ、クロロフィル等を高濃度に含有する変異株が報告されているが、乾燥藻体に対し、クロロフィル含量は３５ｍｇ／ｇ、総カロテノイド含量は５ｍｇ／ｇ程度にとどまっていた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−７５８２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、短時間培養で、高濃度のクロロフィルおよびカロテノイドを含有するクロレラを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究の結果、短時間の従属栄養的培養で、高濃度のクロロフィルおよび総カロテノイドを含有するクロレラを得、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明はグルコースを５．０％（ｗ／ｖ）含む培地１．２Ｌに、細胞濃度がＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ）で３２ｍＬ／Ｌのクロレラ細胞液を２００ｍＬ接種して３６℃で培養し、培養開始１８時間後からグルコースを５０％（ｗ／ｖ）含む培地を０．０３Ｌ／時間で１０時間流加したとき、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が４７ｍｇ／ｇ以上、かつ総カロテノイド含量が７ｍｇ／ｇ以上のクロレラである。
また、本発明は、前記培養条件で培養したとき、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の１．５倍以上、かつ培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の１．５倍以上のクロレラである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のクロレラは、品質上非常に重要なクロロフィルおよび総カロテノイドを多く含有するものであり、培養開始４８時間後におけるクロロフィルおよび総カロテノイド含有量が高いものである。このクロレラを従属栄養的培養方法で培養することにより、クロロフィルおよび総カロテノイド含量が高いクロレラを短い培養時間で効率的に安定して生産することが可能である。さらに培養したクロレラからクロロフィルやカロテノイドを抽出することにより、これらの色素を効率的に高収率で生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のクロレラは、グルコースを５．０％（ｗ／ｖ）含む培地（基礎培地）１．２Ｌに、細胞濃度がＰＣＶ(Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ)で３２ｍＬ／Ｌのクロレラ細胞液を２００ｍＬ接種して３６℃で培養し、培養開始１８時間後からグルコースを５０％（ｗ／ｖ）含む培地（添加培地）を０．０３Ｌ／時間で１０時間流加したとき、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が４７ｍｇ／ｇ以上、かつ総カロテノイド含量が７ｍｇ／ｇ以上のクロレラである。また、本発明のクロレラは、前記培養条件で培養したときに、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の１．５倍以上、かつ培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の１．５倍以上のクロレラである。
また、前記培養条件で培養したときに、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が４７ｍｇ／ｇ以上、かつ総カロテノイド含量が７ｍｇ／ｇ以上であり、さらに、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の１．５倍以上、かつ培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の１．５倍以上であることが好ましい。
さらに、前記培養条件で培養したときに、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の１．７倍以上であることがより好ましく、２倍以上であることがさらに好ましい。また、前記培養条件で培養したときに、培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量が培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の１．７倍以上であることがより好ましく、１．９倍以上であることがさらに好ましい。
ここで、培養開始４８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の上限は特に限定されるものではないが、培養開始１８時間後の乾燥藻体におけるクロロフィル含量の３．５倍以下、または３倍以下を例示することができる。
そして、培養開始４８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の上限は特に限定されるものではないが、培養開始１８時間後の乾燥藻体における総カロテノイド含量の３．５倍以下、または３倍以下を例示することができる。
さらに、前記方法で培養を行ったときの、培養開始４８時間後の培養液あたりのクロロフィル含量は特に限定されないが、培養開始１８時間後の培養液あたりのクロロフィル含量の１．３倍以上であることが好ましく、１．５倍以上がより好ましく、１．７倍以上がさらに好ましい。また、その上限は特に限定されないが、３倍以下、または２．５倍以下を例示することができる。
そして、前記方法で培養を行ったときの、培養開始４８時間後の培養液あたりの総カロテノイド含量は特に限定されないが、培養開始１８時間後の培養液あたりの総カロテノイド含量の１．３倍以上であることが好ましく、１．５倍以上がより好ましく、１．７倍以上がさらに好ましい。また、その上限は特に限定されないが、３倍以下、または２．５倍以下を例示することができる。
また、基礎培地、添加培地は表１に示す組成のものを用いることができる。なお、培養液のＰＣＶは、ヘマトクリット遠沈管（藤本理化製）に培養液を加え、１，６１０×ｇで３０分間遠心分離した後、藻体の容積値を遠沈管の目盛りから読み取ることにより測定できる。そして、添加培地を流加しながら行う流加培養は、通気撹拌培養（１．０ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）、５５０ｒｐｍ）で、３６℃、１０時間行う。
そして、本発明のクロレラは前記培養条件における、培養開始１８時間後から培養開始４８時間後での比増殖速度が０．０２〜０．１／時間であることが好ましい。
本発明のクロレラは、例えば、湖沼等から採取された水等から分離される野生株や、公知のクロレラに公知の変異処理を施した変異株の中から、前記培養条件で培養した際の培養開始から４８時間後のクロロフィル含量および総カロテノイド含量を指標として選抜され得る。
また、本発明のクロレラは、特に限定されるものではないが、例えばクロレラ・レギュラリス、クロレラ・ピレノイドサ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・エリプソイデア、クロレラ・ソロキニアナ等が挙げられ、中でも工業的に生産されており、安全性が確認されているクロレラ・レギュラリスが好ましい。また、本発明のクロレラの好適な一例として、クロレラ・レギュラリスＺ−１９２株を挙げることができ、前記株は独立行政法人製品評価技術基盤機構に、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２３９として寄託されている。
【００１１】
本発明において、比増殖速度は、下記式１および２で求めることができる。また、本発明において、クロロフィル含量および総カロテノイド含量は、実施例１に記載の方法による測定値を指す。
（比増殖速度の算出方法）
次式（式１）で示すように、細胞の増加率が細胞数（X）に比例する場合、比例定数μ（h-1）を比増殖速度と定義し、細胞増殖の指標とすることが出来る。
dX/dt = μX  （式１）
式１を積分すると、式２となる。
lnX2 −lnX1 = μ（t2 - t1） （式２）
ここで、X1、X2はそれぞれ培養時間t1、t2における細胞数、あるいは細胞濃度やＰＣＶなどの細胞数と比例関係にある測定値を示す。
【００１２】
本発明のクロレラは、上記のように培養開始４８時間後におけるクロロフィル含量と総カロテノイド含量が高いという特徴を有するものである。例えば、特許文献１に記載の、クロロフィル等を高濃度で含有する変異株として知られているＹ−２１株と比較すると、本発明のクロレラは、培養開始１８時間後までにおいては、クロロフィルおよび総カロテノイド含量はＹ−２１株と同程度であるが、培養開始１８時間後から４８時間後までの間にＹ−２１株よりも活発に色素合成を行い、培養開始４８時間後では、Ｙ−２１株よりも著しくクロロフィル含量および総カロテノイド含量が高くなる（表２、表３参照）。このように、本発明のクロレラは培養開始４８時間後という短時間で、実用上十分な量までクロロフィルおよび総カロテノイド含量が増加するという特徴を有する。Ｙ−２１株等の従来のクロレラで、同等の量までクロロフィル量および総カロテノイド量を増加させようとすると４８時間以上培養する必要があり、培養時間が長くなると、年間のタンク当たりのクロレラ生産量が減少するだけでなく、１回の培養当たりの光熱費や労務費が増加し、製造費用が増大する。従って、本発明のクロレラは培養時間４８時間という従来よりも短い時間で、すなわち低い製造費用で、クロロフィルおよび総カロテノイド含量が高くなるという高付加価値を有する産業上優れたクロレラである。
【００１３】
本発明のクロレラの前々培養および前培養の培養条件は特に限定されるものではないが、例えば、前々培養では、３００ｍＬ容の三角フラスコに表１記載の前培養培地を１００ｍＬ入れ、スラントで継代したクロレラを一白金耳接種し、培養温度３０℃、回転数１６０ｒｐｍで３〜４日間振とう培養すればよい。また、前培養では３００ｍＬ容の三角フラスコに表１記載の前培養培地を１００ｍＬ入れ、前々培養で得られたクロレラ細胞液を１ｍＬ加え、培養温度３０℃、回転数１６０ｒｐｍで３〜４日間振とう培養すればよい。
本発明のクロレラの本培養の条件は特に限定されるものではないが、例えば、グルコース濃度が１〜１０％（ｗ／ｖ）である基礎培地に、細胞濃度がＰＣＶで２０〜５０ｍＬ／Ｌのクロレラ細胞液（クロレラの前培養で得られた細胞液）を、基礎培地の量に対して１２〜２０％（ｖ／ｖ）接種し、３２〜３８℃で培養し、培養開始１８時間後から、グルコース濃度が３０〜６０％（ｗ／ｖ）である添加培地を０．０１〜０．０５Ｌ／時間で、６〜３０時間流加する培養方法を挙げることができる。
上記で用いる基礎培地としては、クロレラの培養において、従来用いられてきた液体培地であれば特に制限されないが、例えば、炭素源としてグルコースや酢酸、窒素源として尿素、硫酸アンモニウムを含有し、その他にＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４、微量無機成分（ホウ酸塩、マンガン塩、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリブデン）等を含有する培地を挙げることができ、表１に記載の基礎培地を好適に用いることができる。
また、上記で用いる添加培地としては、クロレラの培養において従来用いられている液体培地であれば特に制限されないが、例えば、炭素源としてグルコースや酢酸、窒素源として尿素、硫酸アンモニウムを含有し、その他にＫＨ２ＰＯ４等を含有する培地を挙げることができ、表１に記載の添加培地を好適に用いることができる。
本発明のクロレラの培養方法は特に限定されないが、通気撹拌培養が好ましく、その通気量は特に限定されないが、０．５〜１．５ｖｖｍを例示することができる。また、撹拌の回転数も特に限定されるものではないが、３００〜７００ｒｐｍを例示することができる。
培養時のｐＨは６．７以下にならないように、適宜、アルカリ性溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液等を添加して調整することが好ましい。
【００１４】
本発明のクロレラは、その生細胞を餌料等として使用してもよく、また、加熱し、乾燥粉末としたものを錠剤等の形状で使用することもできる。さらにはクロレラ中の色素や栄養成分等を抽出して使用することもできる。その用途としては、健康食品、餌料、色素としての利用の他、食品素材、医薬品原料等にも好適に使用し得る。
【００１５】
以下に実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定を受けないことは言うまでもない。
【００１６】
実施例１
（クロロフィルおよび総カロテノイド定量法）
クロレラのクロロフィル含量および総カロテノイド含量の測定は、定量法（植物色素：林 考三、養賢堂）に従い行った。すなわち、培養装置で培養したクロレラ培養液をグラスファイバーフィルターで吸引濾過し、得られた藻体をフィルターごと摩砕した。これにアセトンを加え遠心分離（１，６１０×ｇ、１０分）により藻体とフィルターの破砕物を沈殿させた後、上清の吸光度（４８０nm、６３０nm、６４５nm、６６３nm、７５０nm）を測定し、下記の計算式より抽出溶媒中のクロロフィル濃度（クロロフィルａおよびクロロフィルｂの合計量）および総カロテノイド濃度を算出した。また、クロレラの乾燥重量を測定するために、培養装置から、クロロフィル濃度と総カロテノイド濃度を測定した時と同量のクロレラ培養液を分取し、遠心分離（１０,０００×ｇ、１０分）後、精製水で洗浄して、再度遠心分離（１０,０００×ｇ、１０分）した後、ペレットを１０５℃で８時間乾燥させ、クロレラの乾燥重量を求めた。乾燥藻体あたりのクロロフィル含量、総カロテノイド含量は、抽出溶媒中のクロロフィルおよび総カロテノイドの濃度とクロレラの乾燥重量を用いて算出した。
【００１７】
（計算式）
クロロフィルa(μg／ml)＝11.64(A663-A750)-2.16(A645-A750)+0.1(A630-A750)
クロロフィルb(μg／ml)＝3.94(A663-A750)-20.97(A645-A750)+3.66(A630-A750)
カロテノイド (μg／ml)＝4.0(A480-3.0A750)
【００１８】
（クロロフィル含量および総カロテノイド含量の経時変化）
クロレラ・レギュラリスＹ−２１株およびＺ−１９２株について、下記培養条件に従って培養し、培養期間中の乾燥藻体あたりのクロロフィル含量および総カロテノイド含量を上記定量法により測定した。結果を表２、３に示す。また、１８時間培養時におけるクロロフィル含量または総カロテノイド含量に対する４８時間培養時におけるそれぞれの含量の比を表４、５に示す。
【００１９】
（培養条件）
前々培養では、表１に記載の前培養培地を１００ｍＬ入れた３００ｍＬ容三角フラスコにスラントで継代したクロレラを一白金耳接種し、培養温度３０℃、回転数１６０ｒｐｍで４日間振とう培養した。また、前培養では、表１に記載の前培養培地を１００ｍＬ入れた３００ｍＬ容三角フラスコに、前々培養で得られたクロレラ細胞液を１ｍＬ加え、前培養と同様の条件で培養した。次いで、３Ｌジャーファーメンターに表１記載の基礎培地を１．２Ｌ加え、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した後、前培養で得られたクロレラ細胞液（ＰＣＶ：３２ｍＬ/Ｌ）を、２００ｍＬ接種し、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．８に調整し、４８時間通気撹拌培養（３６℃、１．０ｖｖｍ、５５０ｒｐｍ）した。また、培養開始１８時間後から、表１に記載の添加培地０．３Ｌを１０時間かけて流加した（流加速度：０．０３Ｌ／時）。なお、培養中は、ｐＨが６．７以下にならないように５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを調整した。基礎培地、添加培地および前培養培地の組成を表１に示す。
【００２０】
【表１】
0006434268.tif 000002
【００２１】
【表２】
0006434268.tif 000003
【００２２】
【表３】
0006434268.tif 000004
【００２３】
【表４】
0006434268.tif 000005
【００２４】
【表５】
0006434268.tif 000006
【００２５】
表２、３、４および５に示すとおり、Ｚ−１９２株は、Ｙ−２１株と比較し、培養開始１８時間後において、クロロフィルおよび総カロテノイドの含量は、ほぼ同量であったが、培養開始１８時間後から４８時間後までにＺ−１９２株はＹ−２１株よりも乾燥藻体におけるクロロフィル含量および総カロテノイド含量が顕著に増大した。
【００２６】
実施例２
（培養液あたりのクロロフィル含量および総カロテノイド含量）
実施例１と同様の方法で、培養液あたりのクロロフィル含量および総カロテノイド含量を測定した。結果を表６に示す。
【００２７】
【表６】
0006434268.tif 000007
【００２８】
表６に示すとおり、培養開始４８時間後において、Ｚ−１９２株の培養液あたりのクロロフィル含量および総カロテノイド含量は、Ｙ−２１株と比べて約１．８倍多い。このため、Ｚ−１９２株はＹ−２１株に比べ、４８時間の培養でより多くのクロロフィルおよびカロテノイドを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明のクロレラは、短時間培養でクロロフィル含量および総カロテノイド含量が高くなるため、生産効率が高く、有用なものである。
以上