(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療のための薬剤を製造する方法であって、
前記薬剤は、対象の遺伝子治療の過程で生じるＭＹＣ依存性癌の腫瘍形成または腫瘍成長を抑制することが可能となるように構成され、
前記方法は、
単離された多能性幹細胞、多分化能幹細胞、または前駆細胞のいずれかの細胞に、誘導因子によって誘導可能な優性阻害型ＭＹＣ干渉タンパク質（Ｄ−ＭＩＰ）構築体をエクスビボで形質導入するステップと、
前記細胞に、前記遺伝子治療での使用のために治療遺伝子をエクスビボで形質導入するステップとを含み、
前記薬剤は前記Ｄ−ＭＩＰ構築体及び治療遺伝子が形質導入された前記細胞を含み、
前記薬剤は、前記薬剤が前記対象に投与された後に前記対象に癌が検出された場合に、前記誘導因子によって前記対象内で前記Ｄ−ＭＩＰ構築体を活性化させ、それにより前記ＭＹＣ依存性癌の前記腫瘍形成または腫瘍成長を抑制することが可能となるように構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記幹細胞が、哺乳類の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記哺乳類が、ヒト、霊長類、ウシ、またはマウスであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記幹細胞が、成体幹細胞、組織特異的幹細胞、胚性幹細胞、または臍帯血幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記前駆細胞が、造血前駆細胞、皮膚前駆細胞、骨前駆細胞、または神経前駆細胞であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記Ｄ−ＭＩＰ構築体が、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記細胞は、遺伝子治療ベクターで形質導入され、
前記遺伝子治療ベクターは、
第１の制御要素に作用可能に連結される治療遺伝子と、
誘導可能な第２の制御要素に作用可能に連結されるＤ−ＭＩＰ構築体とを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記遺伝子治療ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法であって、
前記Ｄ−ＭＩＰが、Ｏｍｏｍｙｃであるか、または
前記Ｄ−ＭＩＰ及び前記第２の制御要素によりＯｍｏｍｙｃＥＲを形成することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記細胞が、前記対象の自己細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１月１３日出願の米国仮特許出願第６１／５８６，３６６号に基づく優先権を主張するものである（該仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用されるものとする）。
【０００２】
（米国政府の支援）
本発明は、米国国立癌研究所により認可された認可番号第ＣＡ１４２７９８号に基づく米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、誘導されたときに、幹細胞または前駆細胞由来の健常組織または他の（非癌性）細胞に対して大きな影響を及ぼすことなく、幹細胞または前駆細胞由来の癌性細胞を選択的に殺滅する誘導可能な癌特異的自殺遺伝子構築体を含むように改変された、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、または他の前駆細胞を含む、多能性または多分化能幹細胞を提供する。前記自殺遺伝子構築体は、健常細胞及び組織に対して大きな悪影響を及ぼすことなく癌細胞内で腫瘍抑制因子として働く優性阻害型ＭＹＣ干渉タンパク質（Ｄ−ＭＩＰ）を発現する。前記自殺遺伝子構築体はまた、遺伝子治療ベクターの存在に関連して癌が発生する遺伝子治療に用いることもできる。さらに、前記自殺遺伝子構築体は、癌性細胞と、遺伝子治療ベクターにより改変された非癌性細胞とを識別して、癌性細胞だけを殺滅することができる。
【背景技術】
【０００４】
体内の任意の組織を代替または修復するための胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の多用途性は、癌の危険性の増加を伴う。また、癌の危険性の増加は、遺伝子治療にも関連している。そのため、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞（Takahashi 2006, Wernig 2010, Hanna 2010）、他の多能性細胞若しくは前駆細胞、または遺伝子治療ベクターで治療された細胞に由来する再分化された組織には、安全性に対する懸念が存在する（Knoepfler 2009, Shih 2007, Okita 2007, Nakagawa 2010）。例えば、皮下移植されたｉＰＳ細胞により奇形腫が発生したり、ｉＰＳキメラ動物に原始悪性癌が高発生率で生じたりする（Takahashi 2006, Knoepfler 2009, Shih 2007, Okita 2007）。良性奇形腫は手術によって容易に除去することができるが、侵襲性癌には細胞治療による危険性が残る。
【０００５】
自殺遺伝子ストラテジーを含む、幹細胞の腫瘍形成能を克服するためのストラテジーが考えられてきた（Knoeplfer 2009）。しかしながら、従来の自殺遺伝子ストラテジーは、良性組織と悪性組織とを識別することができず、活性化時に前記両組織を両方とも破壊していた（Shuldiner 2003）。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）をヒトＥＳ細胞に導入し、癌発生時にガンシクロビルで治療するという方法では、ｔｋ発現細胞、癌性細胞及び非癌性細胞の全てが殺滅されてしまう。この問題を克服するために、Knoepfler（2009）は、ｔｋ発現を制御するために幹細胞特異的プロモータを使用することを示唆している。しかし、このストラテジーには、分化したホスト細胞が幹細胞プロモータを遮断してしまい、必要とされるときに該プロモータが作用不能になるという問題や、該プロモータが作用可能であったとしても、患者は一生、ガンシクロビル治療（または、必要に応じて、他の自殺遺伝子誘導因子）を受ける必要があり得るという問題が認識されている。したがって、この方法も、癌特異的ではない。
【０００６】
多能性、分化、及び腫瘍形成間の関係は完全には分かっていない。ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、またはＳＯＸ２などの発癌性転写因子は、体細胞を効率的に再プログラムするのに必要であり（Takahashi 2006, Wernig 2010, Hanna 2010, Shachaf 2004, Jain 2002）、ＭＹＣの再活性化は、ｉＰＳキメラにおける大部分の癌の主原因となる（Okita 2007）。しかしながら、ＭＹＣを使用せずにｉＰＳ細胞を生成した場合でも、癌は発生する（Takahashi 2006, Wernig 2010, Hanna 2010, Nakagawa 2010, Wernig 2008）。
【０００７】
癌の動物モデルにおける遺伝子実験により、様々な組織由来の大部分の腫瘍及び癌における内因性ＭＹＣ活性についての広い要求が明らかになった（Soucek 1998, Sou  cek 2008, Felsher 1999, Shachaf 2004, Jain 2002）。さらに、ＭＹＣを標的とする効果的な薬剤は、現在市販されていない。最近、優性阻害型ＭＹＣ変異体であるＯｍｏｍｙｃが、筋芽細胞におけるＭＹＣ誘導型アポトーシスを強化し、乳頭腫症（Soucek 2004）、肺癌（Fukazawa 2011）、及び膵臓癌（Sodir 2011）の動物モデルにおけるＭＹＣ誘導型腫瘍形成の抑制因子として働くことが分かった。つまり、Ｏｍｏｍｙｃが、癌の腫瘍抑制因子であることが分かった。
【０００８】
Ｏｍｏｍｙｃは、内因性ＭＹＣタンパク質（ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、及びＬ−ＭＹＣ）とともに、転写的に不活性なヘテロ二量体を形成して、ＭＹＣ−ＭＡＸ相互作用を阻害する（Soucek 1998, Soucek 2002, Soucek, 2004, Soucek 2008）。Savino（2011）は、Ｏｍｏｍｙｃの作用機構についての研究で、Ｏｍｏｍｙｃは、小分子抗癌治療の発見において役割を果たし得ることを示唆しており、Ｏｍｏｍｙｃを「ＭＹＣの腫瘍形成機能を阻害する将来のストラテジーの効果をモデル化するツール」であるとだけ認識している。別のグループ（Van Eyss 2011）は、Ｏｍｏｍｙｃの価値は、治療標的ＭＹＣを発見するための研究ツールとしてだけあると主張している。したがって、どちらも、Ｏｍｏｍｙｃタンパク質の治療効果についての可能性は認識していない。
【０００９】
しかしながら、本発明によれば、Ｏｍｏｍｙｃが、再プログラムされた細胞由来の組織から生じた癌性細胞を遺伝子導入動物及びｉＰＳキメラ動物における分化組織または正常再生組織の崩壊を持続させることなく殺滅する腫瘍選択的（または癌特異的）な方法を提供するための、治療薬としての機能を直接的に果たすことができることが見出された。したがって、本発明は、癌特異的自殺遺伝子構築体を使用する再生医療における再プログラムされた細胞由来の組織の安全性を高めるための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、癌を治療するため及び／または細胞ベース治療及び遺伝子治療での腫瘍形成を抑制するための自殺構築体における優性阻害型ＭＹＣ干渉タンパク質（Ｄ−ＭＩＰ、定義は後述する）の使用に関する。したがって、本発明の一態様は、単離された多能性幹細胞、多分化能幹細胞、または前駆細胞であって、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を含む細胞に関する。前記Ｄ−ＭＩＰ構築体は、一般的に、ただし必須ではないが、前記細胞のゲノムに組み込まれる。本発明の幹細胞には、これらに限定されないが、哺乳類のｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞、成体幹細胞（造血幹細胞、肺幹細胞、肝臓幹細胞、外内分泌幹細胞、膵臓幹細胞、及び胸腺幹細胞を含む）、組織特異的幹細胞、器官特異的幹細胞、胚性幹細胞、及び臍帯血幹細胞が含まれる。本発明の前駆細胞には、これらに限定されないが、造血前駆細胞、皮膚前駆細胞、骨前駆細胞、及び神経前駆細胞が含まれる。また、本発明の前駆細胞には、肝臓前駆細胞、外内分泌腺前駆細胞、膵臓前駆細胞、肺前駆細胞、胸腺前駆細胞、及び他の組織または器官特異的前駆細胞が含まれる。
【００１１】
好適な実施形態では、前記Ｄ−ＭＩＰは、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲであり、前記細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血前駆細胞、または神経細胞である。
【００１２】
本発明の別の態様は、対象におけるＭＹＣ依存性癌の腫瘍形成または腫瘍成長を抑制する方法であって、誘導可能Ｄ−ＭＩＰ構築体を含んでなる、治療的に有用な幹細胞、再プログラムされた細胞、または前記幹細胞若しくは再プログラムされた細胞由来の組織を、対象に導入するステップと、前記対象に癌が検出されたかまたは疑われたときに、前記Ｄ−ＭＩＰ構築体の誘導因子を、前記対象内で前記Ｄ−ＭＩＰ構築体を発現または活性化させることができる時間長さ及び量で用いて前記対象を治療するステップとを含み、それにより、前記腫瘍形成または腫瘍成長を抑制するようにした方法を提供する。本発明によれば、前記幹細胞、再プログラムされた細胞またはそれに由来する組織は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血前駆細胞、皮膚前駆細胞、骨前駆細胞、または神経前駆細胞から作製される。本発明の方法は、好適には、非ヒト哺乳類（例えば、霊長類）及びヒトの両方を含む哺乳類に用いられる。特定の実施形態では、前記Ｄ−ＭＩＰは、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲである。
【００１３】
本発明のさらなる別の態様は、遺伝子治療ベクターであって、第１の制御要素に作用可能に連結される治療遺伝子と、誘導可能な第２の制御要素に作用可能に連結されるＤ−ＭＩＰ構築体とを含むベクターに関する。例えば前記Ｄ−ＭＩＰに融合したホルモン結合領域を用いる場合（例えば、ＯｍｏｍｙｃＥＲの場合）などの前記Ｄ−ＭＩＰの活性がトランスにおいて誘導可能である場合は、前記治療遺伝子及びＤ−ＭＩＰを同一プロモータの制御下におくことも可能である。この方法の好適な実施形態では、前記Ｄ−ＭＩＰは、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲである。
【００１４】
本発明の遺伝子治療ベクターは、対象におけるＭＹＣ依存性癌の腫瘍形成または腫瘍成長を抑制する方法に使用することができる。該方法は、本発明の遺伝子治療ベクターを対象に投与するステップと、前記対象に癌が検出されたかまたは疑われたときに、前記Ｄ−ＭＩＰ構築体の誘導因子を、前記対象内でＤ−ＭＩＰを発現または活性化させることができる時間長さ及び量で用いて前記対象を治療するステップとを含み、それにより、腫瘍形成または腫瘍成長を抑制する。また、本発明の遺伝子治療ベクターは、該ベクターがエクスビボで形質導入された細胞を対象に投与するステップを含み該ベクターが前記対象に直接的に送達されたときに治療が開始されるようにした同様の方法にも使用することができる。好適な実施形態では、前記遺伝子治療ベクターは、前記対象の自己細胞に形質導入される。エクスビボ適用は、造血幹細胞または造血前駆細胞を使用して行われるが、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞には本発明の遺伝子治療ベクターを形質導入し、様々な造血細胞に再分化させて、前記方法のいずれかに使用することもできる。好適な実施形態では、前記Ｄ−ＭＩＰは、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲである。
【００１５】
本発明のさらなる別の態様は、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞の腫瘍形成能を抑制する方法に関する。例えば、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を形質導入することにより、再分化の前または後にＤ−ＭＩＰ活性を誘導し、生存細胞を選択することができる。前記生存細胞は、低い腫瘍形成能を有する。あるいは、対象に使用するために、前記細胞を、形質導入後に再分化させ、Ｄ−ＭＩＰ活性を誘導し、前記生存（分化した）細胞を、前記治療を必要としている対象に移植してもよい。別の実施形態では、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体が形質導入された細胞を、治療処置のために対象に移植し、前記細胞から生じた癌が検出されたときに、Ｄ−ＭＩＰ活性を誘導することができる。好適な実施形態では、これらの方法は、自己ｉＰＳ細胞と共に使用され、前記Ｄ−ＭＩＰは、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】誘導可能なＭＹＣの調節のためのｉＰＳ細胞の生成を概略的に示す。ＭＹＦ、マウス胚線維芽細胞；ベクター、レンチウイルス対照ベクター、ＯｍｏｍｙｃＥＲ、Ｏｍｏｍｙｃ活性のタモキシフェン誘導制御と比較するためのエストロゲン受容体の突然変異ホルモン結合領域（Littlewood 1995）に対するフレームにＯｍｏｍｙｃをコードしているベクター；ｉＰＳＯＭＯ、ＯｍｏｍｙｃＥＲを含んでいるｉＰＳ細胞。
【図２】ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＭＹＣが形質導入されたＭＥＦの蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を示す。ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＭＹＣの各々は、別々の蛍光マーカに転写的に連結されている。
【図３ａ】タモキシフェン誘導型ＯｍｏｍｙｃＥＲ融合タンパク質及びシトリンレポータをコードしているレンチウイルス構築体を概略的に示す。
【図３ｂ】レンチウイルスベクターの作製に使用されるプラスミドを示す。
【図４】上側の図は、対照ｉＰＳ細胞及びシトリン発現ｉＰＳＯＭＯ細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す。ＳＳＣは側方散乱を意味する。下側の図は、対照ｉＰＳ細胞及びＯｍｏｍｙｃＥＲ／シトリン発現ヒトｉＰＳ細胞クローン５．１０−ｏｍｏ１０のＦＡＣＳ分析結果を示す。
【図５ａ】Ｋｉ６７染色の場合の、対照ｉＰＳ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＯｍｏｍｙｃＥＲ発現ｉＰＳ細胞（Ｏｍｏ）由来の奇形腫及び胚性癌の定量的免疫組織化学分析の結果を示す棒グラフである。
【図５ｂ】ＴＵＮＥＬ染色の場合の、対照ｉＰＳ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＯｍｏｍｙｃＥＲ発現ｉＰＳ細胞（Ｏｍｏ）由来の奇形腫及び胚性癌の定量的免疫組織化学分析の結果を示す棒グラフである。
【図５ｃ】ＳＡＬＬ４染色の場合の、対照ｉＰＳ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＯｍｏｍｙｃＥＲ発現ｉＰＳ細胞（Ｏｍｏ）由来の奇形腫及び胚性癌の定量的免疫組織化学分析の結果を示す棒グラフである。
【図６】マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）及び胚性癌における外因性（ヒト）発現（Ｂ）及び内因性（マウス）（Ｃ）ｃＭＹＣ発現の、定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定の結果を示す棒グラフである。
【図７ａ】ＯｍｏｍｙｃＥＲを発現するｐ５３−／−ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＯＭＯ：左側の図）または対照ｐ５３−／−ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣｏｎｔｒｏｌ：右側の図）が注入されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける代表的な腫瘍を示す写真である。腫瘍は、タモキシフェン治療の３週間後に採取した。
【図７ｂ】タモキシフェン治療後（ｇ）の腫瘍重量を示すグラフである。
【図８ａ】ＯｍｏｍｙｃＥＲを発現するｐ５３−／−ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＯＭＯ：左側の図）または対照ｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣｏｎｔｒｏｌ：右側の図）が注入されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける代表的腫瘍を示す写真である。腫瘍は、タモキシフェン治療の３週間後に採取した。
【図８ｂ】タモキシフェン治療後（ｇ）の腫瘍重量を示すグラフである。
【図９】ｉＰＳ細胞由来組織におけるＯｍｏｍｙｃの発現を活性化するためにタモキシフェン治療（ＴＡＭ）の実施前（上側の図）と実施３週間後（下側の図）のキメラマウスを示す写真である。黒い皮膚斑点はｉＰＳドナー細胞に由来する。
【図１０】対照細胞（Ｔ−ＡＬＬ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＯｍｏｍｙｃＥＲ細胞（Ｔ−ＡＬＬ／ＯＭＯＭＹＣ）を導入したマウスの生存率を示すグラフである。
【図１１】タモキシフェン治療の３日目のＴ−ＡＬＬ／Ｏｍｏｍｙｃ及びＴ−ＡＬＬ／Ｃｏｎｔｒｏｌマウスの骨髄から得た細胞についてのＧＦＰ蛍光発光のＦＡＳＣプロットを示す。
【図１２】原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）及び健常な分化ニューロンにおけるｈＭＹＣの相対発現レベルを示す棒グラフである。
【図１３】癌及び健常組織におけるＭＹＣ依存性の差異を利用するための細胞の操作方法を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
概要及び定義
【００１８】
本発明は、再プログラムされた細胞由来の組織から生じたかまたは遺伝子治療中に生じた癌細胞を選択的に殺滅する方法を提供する。本発明によれば、ＭＹＣの条件付きの不活性化により癌性組織と分化組織（あるいは別の非癌性細胞）とを識別し、かつ、再プログラムされた細胞由来の組織から生じたかまたは遺伝子治療中に生じた標的癌細胞に対して、それ以外の健常組織に対して大きな悪影響を及ぼすことなく、自殺機能を提供する。腫瘍の大部分はＭＹＣ依存性であるので、本発明の方法は、ＭＹＣ依存性癌の治療において幅広い適用性を有する。前記自殺ストラテジーは、誘導可能な優性阻害型ＭＹＣ干渉タンパク質（Dominant-negative Myc-Interfering Protein：Ｄ−ＭＩＰ）遺伝子構築体を幹細胞または前駆細胞に導入すること、または、誘導可能なＤ−ＭＩＰ遺伝子構築体を遺伝子治療ベクターの一部として提供することを含む。いずれの場合でも、Ｄ−ＭＩＰは、ＭＹＣ依存性癌の治療が必要とされるときに活性化される。したがって、誘導制御下にあるＤ−ＭＩＰ構築体を幹細胞（または遺伝子治療ベクター）に導入することにより、細胞治療及び遺伝子治療で用いるための腫瘍選択的な自殺機能が提供される。
【００１９】
本明細書で使用するとき、本発明の「優性阻害型ＭＹＣ干渉タンパク質」または「Ｄ−ＭＩＰ」は、それのＤＮＡ標的へのＭｙｃ−Ｍａｘ結合を阻害し、ＭＹＣ転写抑制活性を維持しながらＭＹＣ転写促進活性を抑制する、遺伝子にコードされたタンパク質またはペプチドである。本発明のＤ−ＭＩＰはまた、腫瘍抑制活性を有する。本発明のＤ−ＭＩＰは、Ｄ−ＭＩＰ発現または活性化の誘導制御を提供するやり方で遺伝子構築体に組み込まれる。このことは、例えば、誘導可能なプロモータを用いて発現を制御する方法や、Ｄ−ＭＩＰ活性の活性化を引き起こす誘導因子に応答するタンパク質を用いる方法などの、当業者に公知の方法で実現することができる。いずれの場合でも、Ｄ−ＭＩＰを誘導制御下におくことにより、特定の条件下または特定の時間（医師により決定されるかまたは予め定めされる）で発現または活性化させることができる。Ｄ−ＭＩＰは、細胞ベース治療または遺伝子治療の過程中に癌性細胞が発生した場合に、本発明の誘導可能構築体を有する細胞またはベクターによって活性化させるようにすることが好ましい。したがって、Ｄ−ＭＩＰ自殺構築体は、本発明に従って使用するために、細胞に導入されるか、または遺伝子治療ベクターに組み込まれる。Ｄ−ＭＩＰの例としては、ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏｍｙｃＥＲがある。Ｄ−ＭＩＰのさらなる例には、遺伝子発現を調節する役割を果たす転写因子対立遺伝子、シグナル伝達経路の優性ネガティブ阻害因子（例えば、細胞外受容体または細胞内受容体の阻害性対立遺伝子）、及びタンパク質翻訳の優性阻害因子（例えば、ｅＩＦ４Ｅ−ＢＰ及びそれの構成的活性型対立遺伝子）が含まれる。
【００２０】
「Ｏｍｏｍｙｃ」は、Soucek（1998）に記載されているタンパク質、または、Ｏｍｏｍｙｃの突然変異体（すなわち、Ｏｍｏｍｙｃ活性）が保たれる限りは、例えばＭＹＣコード配列における対立遺伝子変異などによって得られる、前記タンパク質と同等に機能する前記タンパク質の変異体を意味する。Ｏｍｏｍｙｃは、それのロイシン・ジッパー領域に導入された４つの突然変異体を有するヒトＭＹＣである。前記突然変異体は、Ｅ５７Ｉ、Ｅ６４Ｉ、Ｒ７０Ｑ、及びＲ７１Ｎである（つまり、５７位のグルタミン酸がイソロイシンに変更されており、６４位のグルタミン酸がイソロイシンに変更されており、７０位及び７１位のアルギニンがそれぞれグルタミン及びアスパラギンに変更されている）。Ｏｍｏｍｙｃは、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＭＡＸ、及びＭＩＺ−１とホモ二量体あるいはヘテロ二量体を形成する。ＯｍｏｍｙｃのＭＹＣ及びＭＡＸへ結合する能力は、ＭＹＣの隔離及びＭＹＣのＭａｘネットワークにおける転写活性化機能の阻害をもたらす（Ｍｙｃインタラクトームとも呼ばれる）（Meyer 2008;, Savino 2011）。Ｏｍｏｍｙｃはまた、腫瘍抑制因子である。したがって、Ｏｍｏｍｙｃは、優性阻害型ＭＹＣ突然変異体（すなわち、Ｄ−ＭＩＰ）としての役割を果たす。Ｏｍｏｍｙｃは、例えば、その発現を誘導可能なプロモータの制御下におくことにより、条件付きで活性化させることができる。
【００２１】
ＯｍｏｍｙｃＥＲは、エストロゲン受容体の突然変異体ホルモン結合領域を有するＯｍｏｍｙｃの融合タンパク質である（Littlewood 1995）。タモキシフェンの非存在下では、ＯｍｏｍｙｃＥＲは、不活性複合体の細胞内に存在する（構成的プロモータにより発現させた）。タモキシフェンの存在下では、ＯｍｏｍｙｃＥＲ不活性複合体は分離され、Ｏｍｏｍｙｃは活性になり、本明細書中で説明されているようなＤ−ＭＩＰ活性を発揮する。
【００２２】
本発明のＤ−ＭＩＰは、種特異的であってもよいし、そうでなくてもよい。ＭＹＣは、生物種間で高度に保存され、異種間活性も可能である。当業者であれば、異種間活性が可能であるかどうかを容易に判断することができる。例えば、ヒトＭＹＣ配列に基づくＯｍｏｍｙｃは、マウス細胞及びネズミ細胞、並びにヒト細胞において機能する。望ましくない免疫原性の問題は、種特異的タンパク質を使用することにより避けることができる。
【００２３】
本発明では、「誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体」は、特定のイベントの発生時に特定のシグナルまたは物質によって活性化させることができ、それによりＤ−ＭＩＰを発現させることができる、１またはそれ以上の「誘導可能な」制御要素を含む。これらの制御要素は、シス作用型またはトランス作用型であり得る。例えば、誘導可能なプロモータは、該プロモータが作用可能に連結したＤ−ＭＩＰコード配列の転写を、特定の誘導信号に応答して活性化するシス作用型遺伝子制御要素である。当業者であれば、組み換えＤＮＡ技術及び既知の誘導可能な制御要素を用いて、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を容易に作製することができる。Ｏｍｏｍｙｃの場合、それがコードしている配列は、Soucek（1998）に記載されている。誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を提供するための制御要素の適切な組み合わせの選択は、当該技術分野では公知である。
【００２４】
遺伝子制御要素には、これらに限定されないが、プロモータ、エンハンサー、誘導因子などが含まれ、誘導可能な発現を提供するために、単一でまたは組み合わせて使用することができる。誘導可能なプロモータ及び制御要素の例には、これらに限定されないが、キュメート（cumate）スイッチ誘導可能システム（SparQ(tm) Cumate Switch, System Biosciences）、グルココルチコイド応答性プロモータ、及び、ドキシサイクリンで誘導可能なテトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）が含まれる。このようなプロモータには、強力なプロモータ及び組織特異的プロモータの両方が含まれ得る。例えば、組織特異的プロモータは、特定の細胞系統（例えば、造血−ｖａｖプロモータ；肝臓−アルブミンプロモータ）または特定の細胞段階（例えば、ＣＤ３４を発現する細胞または他の段階特異的マーカ）に対する活性化を制限することができる。誘導可能なまたは条件付きで活性化するプロモータまたは他の制御要素の配列は、遺伝子制御要素に作用可能に連結されたＤ−ＭＩＰコード配列によりベクターを作製及び精製する技術と同様に、当業者に既知である。
【００２５】
誘導活性化はまた、例えば、ホルモン受容体リガンド結合領域がＤ−ＭＩＰに融合されているホルモン誘導融合タンパク質を使用して実現することができる。そのような領域の例は、タモキシフェンに応答する突然変異エストロゲン受容体（ＥＲ）領域がある（Littlewood 1995）。ＯｍｏｍｙｃＥＲは、そのＣ末端に、前記突然変異ＥＲ領域が融合されている（Soucek 2002）。ホルモン誘導型融合により、前記遺伝子構築体を、強力な構成的プロモータの制御下におくことができる。発現した融合タンパク質は、タモキシフェンが追加されるまで、不活性状態に隔離されている。融合タンパク質が除去されると、Ｄ−ＭＩＰ領域がその活性を発揮することが可能となる。Ｏｍｏｍｙｃまたは他のＤ−ＭＩＰとの融合タンパク質として使用することができる他の活性化可能な領域には、これらに限定されないが、ＨＳＶウイルスタンパク質ＶＰ１６活性化領域、転写制御因子を特定部位に標的にする人工ヌクレオチド配列（例えば、ＴＡＬＥＮ）、及び、標的ゲノムＤＮＡに対する部位特異的分子（例えば、人工または天然の亜鉛フィンガー・タンパク質）が含まれる。
【００２６】
細胞
【００２７】
したがって、本発明の一態様は、誘導可能なＤ−ＭＩＰ自殺構築体を有する、単離された哺乳類の多能性幹細胞、多分化能幹細胞、または前駆細胞に関する。好的な実施形態では、本発明の細胞は、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞であり、前記Ｄ−ＭＩＰ構築体は、誘導可能なＯｍｏｍｙｃ遺伝子構築体である。
【００２８】
本発明の幹細胞及び前駆細胞（本明細書中では、総称して「幹細胞」という）には、成体幹細胞、または組織特異的幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。組織特異的幹細胞の例には、これらに限定されないが、造血幹細胞、造血前駆細胞、抹消血幹細胞、及び間葉幹細胞が含まれる。好適な多能性幹細胞はｉＰＳ細胞であり、より好適な多能性幹細胞は、患者特異的ｉＰＳ細胞、すなわち自己体細胞由来のｉＰＳ細胞である。多能性細胞及び多分化能細胞は、一般的に、当業者に公知の方法を用いて細胞表面マーカにより識別することができる。別の好適な実施形態では、前記幹細胞は、ＥＳ細胞、神経幹細胞、多分化能造血幹細胞、または造血前駆細胞である。
【００２９】
本発明の幹細胞または前駆細胞は、非ヒト哺乳類及びヒトを含む哺乳類由来のものであり得る。非ヒト哺乳類には、これらに限定されないが、霊長類、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ及びラットが含まれる。
【００３０】
幹細胞または前駆細胞に誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を形質導入する方法は当該技術分野で公知であり、代表的な方法を下記の実施例に記載する。
【００３１】
遺伝子治療ベクター
【００３２】
本発明の別の態様は、上記したような誘導可能なＤ−ＭＩＰ遺伝子構築体を含む遺伝子治療ベクターに関する。前記ベクターは、治療遺伝子と、本発明の誘導可能なＤ−ＭＩＰ遺伝子構築体とを含む。前記構築体は、とりわけ、誘導可能なプロモータを使用してＤ−ＭＩＰの転写を制御する場合は、別個のかつ一般に独立的に制御される遺伝子ユニットとして前記ベクター内に含まれる。しかし、例えば、Ｄ−ＭＩＰがホルモン誘導型の融合タンパク質である場合、所望ならば、治療遺伝子及びＤ−ＭＩＰは協調的に発現される。遺伝子治療ベクターは、当該技術分野では公知であり、これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドなどがある。本発明の遺伝子治療ベクターの構築は、当該技術分野で公知の方法によって行うことができる。好適な実施形態では、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体は、本発明の誘導型Ｏｍｏｍｙｃ構築体である。
【００３３】
本発明の遺伝子治療ベクターの一例として、本発明の誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体は、遺伝子治療ベクターに組み込むことができ、例えば、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）または異常ヘモグロビン症（サラセミア、または鎌状赤血球病）の治療のために、Ｄ−ＭＩＰ構築体をレンチウイルスベクターに組み込むことができる。白血病は特定の遺伝子治療に関連しているので、ベクターにＤ−ＭＩＰ自殺構築体を組み込むことにより、適切な誘導因子によって治療時に白血病細胞を殺滅することが可能となる。この場合、Ｄ−ＭＩＰ含有治療ベクターは、エクスビボ細胞または患者由来細胞に形質導入することができる。同様に、本発明の治療ベクターは、患者に直接的に送達させてもよい。
【００３４】
方法
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ヒト患者を含む哺乳類対象において、治療中に生じたＭＹＣ依存性癌の腫瘍形成または腫瘍成長を、再プログラムされた細胞またはそれに由来する組織によって抑制する方法に関する。例えば、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を、それの形質導入または治療用途のための作製時の任意の都合の良い段階で、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、または本発明の他の幹細胞に導入する。このようにして作製した治療的に有用な再プログラムされた細胞またはそれに由来する組織（生成した場合）は、標的の疾患または病状の治療のために使用される。対象または患者において癌が検出されるかまたは疑われるかをモニタし、その後、Ｄ−ＭＩＰを活性化させるための適切な誘導因子を用いて対象または患者を治療する。例えば、ＯｍｏｍｙｃＥＲを使用する場合、患者または対象は、当業者により決定された用量のタモキシフェンにより治療される。例えば、乳癌及び乳癌リスク減少のためのタモキシフェンの適切な耐性用量は、２０〜４０ｍｇ／日であり、体重７０ｋｇの患者の場合は約０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ／日である。したがって、タモキシフェンは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で、誘導因子として使用することができる。他の誘導因子についての適切な用量は、その誘導因子を他の目的に使用したときの耐性用量との類推により求めることができる（例えば、適切なドキシサイクリン用量は、それを抗生物質として使用した場合の用量から類推することができる）。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、対象または患者の遺伝子治療に関連してまたは該遺伝子治療の過程中に生じたＭＹＣ依存性癌の腫瘍形成または腫瘍成長を抑制する方法に関する。誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を有する本発明の遺伝子治療ベクターを、対象または患者に投与し、標的の疾患または病状に関する治療効果並びに前記対象または患者の健康全般をモニタする。癌が検出されたかまたは疑われたとき、前記対象または患者を、誘導因子でＤ−ＭＩＰ発現または活性を活性化させて治療する。遺伝子治療における誘導因子の用量は、細胞ベース治療の場合と同様である。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞の腫瘍形成能を抑制する方法であって、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞に、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を（通常は形質導入により）挿入するステップと、Ｄ−ＭＩＰ活性を誘導するステップとを含む方法を提供する。前記細胞は、Ｄ−ＭＩＰ活性の誘導前または導入後に、治療目的に使用することができる。例えば、前記細胞を標的治療用の特定の細胞型に分化させ、前記治療を必要とする患者に移植することができる。その後、癌が検出されたときに、前記自殺構築体を活性化させることができる。
【００３８】
本発明の幹細胞は、再プログラムされた細胞由来の組織または細胞による治療、または幹細胞や前駆細胞など（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞を含む）を用いた治療の影響を受けやすい任意の疾患または病状の治療に使用することができる。例えば、神経疾患を治療するために、ｉＰＳ由来ニューロンに自殺Ｄ−ＭＩＰ発現を遺伝子操作により組み込むことができる。腫瘍が生じた場合、Ｄ−ＭＩＰの発現または活性化を誘導して、腫瘍の縮小または寛解をもたらす。
【００３９】
幹細胞治療の影響を受けやすい疾患または病状には、これらに限定されないが、脳卒中、脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、やけど、心臓疾患、クローン病、糖尿病、筋ジストロフィ、ＡＬＳ（ルー・ゲーリッグ病）、変形性関節症、関節リウマチなどが含まれる。本発明は、再プログラムされた幹細胞であって、移植後に癌性細胞を生成した場合に選択的に殺滅することができる幹細胞を作製することを可能にする。このことを実現するために、関連する幹細胞集団を同定または作製し、それらの細胞に本発明の誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を形質導入して、前記細胞を分化させるか、または他の方法で前記細胞の移植の準備を行い（例えば組織を作製して）、その後、前記細胞（または作製した組織）を患者に移植する。その後、患者における癌の発生について、または他の任意の発癌シグナルについてモニタする。癌または発癌シグナルが検出された場合、Ｄ−ＭＩＰ発現の誘導因子を、移植細胞（または組織）から生じた癌細胞を殺滅することができる時間長さ及び量で使用して、患者を治療する。あるいは、前記幹細胞はそれの治療目的のために作製することもでき、例えば、前記幹細胞を分化させ、分化させた細胞を移植する前に、分化させた細胞に、誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体を形質導入してもよい。
【００４０】
本明細書で使用するとき、癌は、ＭＹＣ依存性癌を意味する。ＭＹＣ依存性癌には、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色種、骨髄腫（多発性骨髄腫を含む）、神経芽細胞腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、小細胞肺癌、爪下黒色腫、ぶどう膜メラノーマなどが含まれる。ＭＹＣ依存性癌は、転移性または非転移性であり得る。
【００４１】
再プログラムされた細胞由来の組織または遺伝子治療ベクター内における誘導可能なＤ−ＭＩＰ構築体の存在は、たとえ再プログラムされた細胞由来の組織または遺伝子治療ベクターの使用に伴い癌が生じた場合でも、従来のまたは公知の癌治療の使用を妨げることはない。
【００４２】
以上は、本発明の原理を例示するだけのものと考えられる。さらに、当業者であれば様々な修正及び変更に容易に想到し得るため、ここに示し説明した通りの構成及び動作に本発明を限定することは望ましくなく、したがって、本発明の範囲内に含まれる全ての適切な修正および均等物を用いることができるであろう。全ての参照文献、特許、特許文献または他の引用文献は、その全体が参照により本明細書に援用されるものとする。
【００４３】
実施例１
ｐ５３＋／＋及びｐ５３−／−ｉＰＳ細胞の生成及び特性評価
【００４４】
Ａ．ｉＰＳ細胞の生成
【００４５】
標準プロトコルを用いて、ｐ５３＋／＋及びｐ５３−／−動物由来のＭＥＦをｉＰＳ細胞に再プログラムした（図１）（Papapetrou 2009）。簡単に説明すると、１０５ＭＥＦを、６ウェルプレートにプレートし、２４時間後、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で４つのレンチウイルスベクター（ｐＬＭ−ＯＣＴ４、ｐＬＭ−Ｓｏｘ２、ｐＬＭ−ＭＹＣ、及びｐＬＭ−Ｋｌｆ４）を形質導入した。培地は２４時間後に交換し、その後は毎日、１０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ及び０．５ｍＭのバルプロ酸（VPA; SIGMA）が添加されたｍＥＳ培地（Invitrogen）と交換した。
【００４６】
ＥＳ細胞形態を有する単一コロニーを形質導入１５〜２５日後に採取し、機械的に分離させ、そして、１５％のウシ胎児性血清（Hyclone）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸、及び１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦが添加された高グルコース（ＧＩＢＣＯ）含有ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ中のマイトマイシンＣ処理ＭＥＦ（Global Stem）上にプレートした。培地は毎日交換した。その後、細胞を、トリプシンを用いて継代培養及び増殖させて、ｉＰＳ細胞株を生成した。
【００４７】
Ｂ．ｉＰＳ細胞の特性評価
【００４８】
免疫蛍光分析のために、ｉＰＳ細胞をガラス製のカバースリップ上で成長させ、４％のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。固定された細胞を、加湿チャンバ内で、２０％のヤギ血清を含むＰＢＳ中で、３７℃で３０分間培養し、その後、５％のヤギ血清を含むＰＢＳ中で、１：１０００に希釈した抗Ｎａｎｏｇ抗体（eBioscience）及び抗ＳＳＥＡ１抗体（eBioscience）と共に４℃で一晩培養した。０．００５％のTween 20を含むＰＢＳ中で中５回洗浄した後、核を、０．１ｍｇ／ｍｌの４´，６´−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて、２×ＳＳＣ中で、室温で３分間対比染色した。サンプルをその後ＰＢＳ中で洗浄し、スライドガラス上に配置されたVectashield（登録商標）載置培地（Vector Laboratories）上に載置した。細胞製剤を、冷却ＣＣＤカメラ（Coolsnap, Photometrics）を備えたＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡で検査した。
【００４９】
説明されているように、フローサイトメトリー分析及び核型分析を行った（Papapetrou 2011）。
【００５０】
多能性遺伝子の発現を評価するために、トリゾール（Invitrogen）を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離させた。Superscript III（Invitrogen）を用いて逆転写を行った。そして、Ｓｏｘ２（Mm03053810）、Ｏｃｔ４（Mm03053917）、ＭＹＣ（Mm00487804）、Ｋｌｆ４（Mm00516104）の遺伝子用の標識プローブを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブベース遺伝子発現解析（Biosystems）によりｑＰＣＲを行った。ABI PRISM 7500配列検出システム（Biosystems）内で反応を２回実施した。ΔΔＣｔ法を用いた相対定量化より発現を計算した。
【００５１】
Ｃ．結果
【００５２】
以前に観測されたように（Hong 2009, Kawamura 2009, Marion 2009）、ｉＰＳ細胞コロニーは、ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞から、ｐ５３＋／＋ＭＥＦ細胞よりも速くかつより効率的に成長した。免疫蛍光法により、ｐ５３＋／＋ｉＰＳクローン及びｐ５３−／−ｉＰＳクローンの両方において、内因性Ｎａｎｏｇ及び段階特異的胚抗原１（ＳＳＥＡ１）の発現が示された。Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭＹＣ、及びＯｃｔ４の発現は、ＥＳ細胞に見られるレベル以下であった。Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭＹＣ、及びＯｃｔ４（各々、互いに異なる蛍光レポータに対して転写によってテザーされている）を発現するｉＰＳ細胞についてのＦＡＣＳ分析が、図２の上側の図に示されている。ＦＡＣＳは、外因性ＯＣＴ４、ＭＹＣ、ＫＬＦ４、及びＳＯＸ２連結レポータのサイレンシングを示しており（図２の下側の図）、それらの内因性対応物のＲＴ−ＰＣＲにより確認された発現は、ＥＳ細胞に見られるレベル以下であった。
【００５３】
実施例２
ｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞及びｐ５３−／−ｉＰＳ細胞へのＯｍｏｍｙｃの形質導入
【００５４】
正常核型を有するｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞及びｐ５３−／−ｉＰＳ細胞の各細胞の３つのクローンに、ｐＭＬ−ＯＭＯＭＹＣＥＲ−シトリン（Citrine）からのウィルス上清を用いて、タモキシフェン誘導型ＯｍｏｍｙｃＥＲ融合タンパク質をコードしているレンチウイルスと、シトリンレポータを形質導入した。レンチウイルスベクターは、図３ａ及び図３ｂに概略的に示したプラスミド構築体から作製した。
【００５５】
図４は、対照ｉＰＳ細胞細胞（左側）及びＯｍｏｍｙｃＥＲ−シトリンｉＰＳ細胞（右側）のＦＡＣＳ分析を示す。誘導型Ｏｍｏｍｙｃを含んでいるｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞及びｐ５３−／−ｉＰＳ細胞は、ＭＹＣ活性の時間的制御の影響を受けやすい。
【００５６】
実施例３
ｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞及びｐ５３−／−ｉＰＳ細胞からのインビボ腫瘍形成
【００５７】
Ａ．腫瘍形成及び分析
【００５８】
腫瘍を形成するために、１０６の未分化ｉＰＳ細胞をNOD-SCID IL2Rg-nullヌルマウス（Jackson Laboratory）に皮下（s.c.）注射した。４〜６週間後、前記腫瘍を外科的に切除し、４％のホルムアルデヒド中に固定した。前記腫瘍を、胚細胞腫瘍病理の専門家によって評価した。組織学的診断は、ヘマトキシリン・エンジン染色法、及び、Ｓａｌ４（Abcam）、Ｏｃｔ４（Ventana）及びＣＤ３０（Dako）に対する抗体を使用した実施例１で概略的に説明した免疫組織化学に基づくものであった。治療実験においては、最後の治療の１週間後に腫瘍を採取し、重量測定し、固定し、上述のように染色した。
【００５９】
Ｂ．結果
【００６０】
ｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞の皮下注射は、６０日以内に腫瘍（＞１ｃｍ３）を形成するが、同数のｐ５３−／−ｉＰＳ細胞の注射は、３０日以内に腫瘍を形成する（各グループにおいてｎ＝６；ｐ＜０．０１）。ＲＴ−ＰＣＲ法で測定したところ、ｐ５３＋／＋由来腫瘍及びｐ５３−／−由来腫瘍の両方は同等のｃ−ＭＹＣ発現を示した。
【００６１】
ｐ５３＋／＋ｉＰＳ細胞から生じた腫瘍は、未熟奇形腫であり、３つの胚層全てを示す分化組織を含んでいた。これらの腫瘍は、Ｋｉ６７発現（平均値±標準偏差：８．７％±５％）で示されるように（図５ａ）、低い成長率を有していた。また、ＴＵＮＥＬ分析により求められるように（図５ｂ）、アポトーシス細胞はわずかしか含んでいなかった（平均値±標準偏差：５．６％±３％）。開裂カスパーゼ３により、わずかなアポトーシス細胞が観察され、ＭＹＣ再活性化の証拠は存在しなかった。免疫組織化学は、多能性細胞（ＣＤ３０及びＯＣＴ４）のマーカに対して陰性であった。卵黄嚢内胚葉洞分化のＳＡＬＬ４に対して陽性に染色された細胞の小ポケットが明らかにされた（平均値±標準偏差：１１．８％±７％）（図５ｃ）。これらの観察結果に基づいて、これらの腫瘍は、未熟奇形腫として最もよく示されている。
【００６２】
ｐ５３−／−ｉＰＳ細胞から生じた腫瘍は、著しく異なっている、形態学的に類似した胚性癌（ＥＣ）である。前記腫瘍は、原始細胞から構成されており、分化領域を示している。それらの急激な発生と一致して、前記腫瘍は、Ｋｉ６７染色により、大きな成長率を有し（平均値±標準偏差：３４．６％±６％）、ＴＵＮＥＬ分析によりいくらかの多様なアポトーシスを示した（平均値±標準偏差：１４．２％±１０％）（図４ａ及び４ｂ）。Ｏｃｔ４及びＣＤ３０の染色は陰性であり、腫瘍組織の２８％（±１１％）がＳＡＬＬ４について染色され、これらの形態学的に原始の及び急成長している癌（図５ｃ）における卵黄嚢分化の領域を示す。外因性ヒトＭＹＣ導入遺伝子の（再）発現は検出されなかったが、内因性ＭＹＣ  ｍＲＮＡは胚性線維芽細胞と比べて５倍まで増加した（図６）。したがって、ｐ５３−欠損ｉＰＳ細胞は、外因性ＭＹＣ構築体を再活性化しない原始胚性癌を発生させた。
【００６３】
実施例４
Ｏｍｏｍｙｃ誘導は腫瘍退縮を引き起こす
【００６４】
Ａ．腫瘍形成及び誘導
【００６５】
約１０６個のＯｍｏｍｙｃＥＲ発現ｉＰＳ細胞または約１０６個の対照細胞を、NOD/MrkBomTac-Prkdcscidマウス（Taconic）に皮下注射した。腫瘍が容易に分かる場合（〜１ｃｍ３）、前記マウスを、１００μｌのタモキシフェン（ピーナッツ油中に１０ｍｇ／ｍｌ）で１日おきに２週間、腹腔内治療した。最後の治療の１週間後に腫瘍を採取し、重量測定し、実施例３で説明したヘマトキシリン・エンジン染色法及び免疫組織化学を含むその後の染色のために、４％のホルムアルデヒド中に固定した。
【００６６】
Ｂ．結果
【００６７】
ＯｍｏｍｙｃＥＲを発現するように操作されたｐ５３−／−ｉＰＳ細胞、またはｐ５３−／−ｉＰＳ対照細胞を、NOD/SCIDマウスの左右側腹部にそれぞれ移植することにより（各グループ、ｎ＝５）、ｉＰＳ由来腫瘍に対するＭＹＣ抑制の効果を評価した。図７ａ及び図７ｂに示すように、タモキシフェン治療は、ＯｍｏｍｙｃＥＲを発現する腫瘍には劇的な腫瘍退縮をもたらしたが、対照腫瘍は成長し続けた（ｐ＜０．００５）。一方、ｐ５３＋／＋ｉＰＳ由来奇形腫では、ＭＹＣ阻害は、対照と比較してほとんど効果がなかった（図８ａ及び図８ｂ）。これらの分化した奇形腫は、タモキシフェン治療下で成長を続け、最後のタモキシフェン適用１週間後の腫瘍サイズまたは重量において有意差を示さなかった（各グループ、ｎ＝６；ｐ＝０．７）。
【００６８】
腫瘍の顕微鏡観察により、これらの観察結果が確認された。例えば、ｐ５３−／−由来の浸潤性腫瘍は、広大なアポトーシス領域を有していた（ＴＵＮＥＬ分析、平均値±ＳＤ：対照は１４．２％±１０％、ＯｍｏｍｙｃＥＲは４１．２％±１３％；ｐ＜０．０５；Ｋｉ６７：対照は２４．２％±１０％、ＯｍｏｍｙｃＥＲは３４．６％±６％）。ＯｍｏｍｙｃＥＲを含んでいる胚性癌のタモキシフェン治療により、例えば原始成分及び未分化成分が大幅に消失し、分化、軟骨性及びＳＡＬＬ４陽性の組織からなる残留物が残るという細胞学的組成の明確な変化が生じた（平均値±ＳＤ：対照は２８．７％±１４％、ＯｍｏｍｙｃＥＲは９２．３％±１９％；ｐ＜０．０５）。
【００６９】
顕微鏡観察により、ｐ５３＋／＋奇形腫におけるわずかな変化が明らかになった。Ｋｉ６７陽性成長率は、対照は８．７±５％であり、ＯｍｏｍｙｃＥＲマウスは９．１±２．５％（ｐ＞０．０５）であった。アポトーシス指数は変化しなかった（対照は５．６％±３．６％、治療した場合は３．６％±２％；ｐ＞０．０５）。卵黄嚢分化によるＳＡＬＬ４陽性細胞のいくつかの強化（enrichment）が生じた（対照は１１．８％±７．５％、ＯｍｏｍｙｃＥＲは３３．８％±１５％；ｐ＜０．０５）。したがって、Ｏｍｏｍｙｃ誘導によるＭＹＣ不活性化は、再プログラムされた細胞から生じた未分化の浸潤性腫瘍に対する治療用薬剤を提供する
【００７０】
実施例５
健常なｉＰＳ由来組織におけるＯｍｏｍｙｃ発現の効果
【００７１】
Ａ．ｉＰＳ細胞によるキメラマウスの作製
【００７２】
C57B1/6J株（ブラックコート）由来のｉＰＳＯＭＯ凍結細胞を、照射ＭＥＦフィーダを含んでいる６ウェルプレートに解凍した。細胞が密集したら、トリプシン治療し、より大きな培養容器で１：４〜１：６の比率で継体培養した。十分な細胞が利用できるようになったら、その一部を染色体分析し、残りは将来使うために冷凍した。加えて、細胞のいくつかを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）発現について分析した。全ての細胞は、１５％のウシ胎児血清（Gemini）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸、及び１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦが添加された、高グルコース（GIBCO）含有ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭを含む培地中で培養した。注射する週の間、２×１０６の冷凍ｉＰＳ細胞を、フィーダ細胞を含んでいるＴ１２．５フラスコ内で解凍し、２日間培養して密集させた。注射の前日、細胞を新しいＴ１２．５フラスコ内に１：２または１：３で入れ、一晩培養し、胚盤胞注射のための対数増殖期細胞を作製した。注入の直前に単一の細胞懸濁液を作製するために、前記ｉＰＳ細胞をトリプシン処理した。胚盤胞は、同じ株（Jackson Laboratories）のｓｔｕｄオスマウスと交尾させ、かつキメラ胚を作製すべく平均８〜１２個のｉＰＳＯＭＯ細胞を注入した過剰排卵アルビノC57Bl/6J(B6(Cg)-Tyrc-2J/J)メスマウスから３．５妊娠日に得た。注入後、胚盤胞を最適化培地に戻し、レシピエントのメスに移植するまで３７℃で放置した。１０〜１５個の注入された胚盤胞を、２．５−ｄ−性交後―偽妊娠のメスの各子宮角に移植した。この株の組み合わせは、ｉＰＳ細胞による前記キメラへの寄与の、コートカラーに基づく確認を可能にする。ｉＰＳ細胞はC57Bl/6J（ブラック）マウス株に由来し、胚盤胞はアルビノ株から得られるためである。
【００７３】
Ｂ．結果
【００７４】
ＭＹＣは、正常な増殖細胞において重要な役割を有し、ＭＹＣの一時的な不活性化は有害な影響を与え得る可能性があるので（Davis 1993）、ＭＹＣ不活性化の健常ｉＰＳ由来組織に対する長期的影響を調べた。C57B1/6J株（黒のドナーコート）由来の核型的に正常なｉＰＳＯＭＯ細胞の２つのクローンを、C57Bl/6J(B6(Cg)-Tyrc-2J/J)株（白のレシピエントコート）の胚盤胞に注入することにより作製したキメラマウスは、キメラ動物（〜２０％）の容易な同定を可能にし、また、それらのキメラ現象のレベルの最初の兆候であった（図９）。実施例３で説明したタモキシフェン治療プロトコルを用いて（３週間にわたって１日おきに１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＹＣ阻害を誘導した。治療した動物及び未治療の動物は両方とも等しく活性的であり、餌を食べたり毛繕いしたりする習慣を維持し、かつ体重減少は示さなかった。さらに、黒いｉＰＳ細胞由来皮膚及び毛皮に対するＭＹＣ阻害の明らかな影響は観察されなかった（図９）。Ｏｍｏｍｙｃ遺伝子導入動物の再生組織は、胃腸の絨毛の損失、毛損失、及び造血系における細胞質の減少などの抗増殖効果を示し、これらの変化は４週間以内に回復可能である（Soucek 2008）。キメラマウスにおいて、ｉＰＳＯＭＯ細胞由来の組織は、共発現したシトリンレポータの疫組織化学的検出によって容易に認識することができる。ＭＹＣ不活性化のｉＰＳ由来組織及びホスト組織に対する影響を、治療後４週間比較した（毛包、真皮及び表皮構造、上部消化管及び甲状腺、腎臓、下部消化管及びその粘膜の絨毛、並びに、赤脾臓及び白脾臓を含む）。これらの部位に対する、ｉＰＳＯＭＯ由来細胞の多大な貢献が存在するが、重要なことは、顕微解剖学において、タモキシフェン治療後のｉＰＳＯＭＯ由来臓器構造及びホスト由来臓器構造間に差異が観察されなかったことである。したがって、長期間のＭＹＣ不活性化により、ｉＰＳ由来組織における長期的の器官障害が生じず、かつ生理学的に良好な耐容性を示した。
【００７５】
実施例６
ＯｍｏｍｙｃＥＲによる白血病の治療
【００７６】
細胞間Ｎｏｔｃｈ（ＩＣＮ）を発現する細胞株に、ＯｍｏｍｙｃＥＲまたは対照ベクターを形質導入し、クローンを培地中で成長させた。細胞を採取し、マウスに注入し、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）を急速に発症させた。図１０は、タモキシフェンで治療したＯｍｏｍｙｃマウス及び対照マウスにおける、Ｔ−ＡＬＬマウスの生存率を示す。図１１は、タモキシフェン治療３日目のＴ−ＡＬＬ／Ｏｍｏｍｙｃ及びＴ−ＡＬＬ／対照マウスの骨髄由来細胞のＦＡＣＳプロットを示す。これらの結果は、Ｏｍｏｍｙｃが、移植した造血細胞（骨髄または胚性肝臓）から生じた侵攻性白血病の細胞を寛解させることができることを示す。Ｏｍｏｍｙｃの非白血病性造血細胞（例えば、移植した骨髄または胚性肝臓に由来するもの）に対するこの作用は、Ｏｍｏｍｙｃが、移植時に、それらの細胞に対して有害でないこと及び造血系の再構成が損なわれないことを裏付けることができる。
【００７７】
実施例７
ｉＰＳ由来の神経腫瘍の生成及び治療
【００７８】
Ａ．ｉＰＳ細胞の分化
【００７９】
１．神経ロゼット
【００８０】
修正されたデュアルＳＭＡＤ抑制プロトコルにより（Smith 2008）、対照ｉＰＳ及びＯｍｏｍｙｃＥＲｉＰＳを神経運命に向けて分化させた。分化の８〜１０日後、非ＣＮＳ神経運命を阻害すべく、ｉＰＳ株に対してシグナリング阻害（ＸＡＶ９３９：１０μＭ）を行った。継代４日後、神経培養物により、神経ロゼットとして知られている、極性円柱状神経上皮構造体を形成した。これらの細胞を分離及び収集し、合計で２００，０００個の細胞を、免疫抑制状態にあるホストマウスの線条体内に注入した（下記の移植セクションを参照）。
【００８１】
２．中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロン
【００８２】
中脳ドーパミン作動性ニューロンを、前述したようにして得た（Lin 2009）。簡単に説明すると、ｉＰＳ細胞株を、ＳＨＨ（プルモルファミン）及びＷＮＴシグナリング（ＧＳＫ−阻害因子：CHIR99021）の活性化因子に曝して、FOXA2+/LMX1A+中脳フロアプレート細胞を誘導した。これらの細胞を、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、ジブチリル環状ＡＭＰ、及びＴＧＦβ３が添加されたNeuralbasal/B27培地中で、ＤＡニューロンにさらに分化させた。ＤＡニューロン分化の２３日目に、細胞に、ＯｍｏｍｙｃＥＲウィルスを４８時間感染させ、シトリン陽性細胞についてＦＡＣＳ精製した。合計で１５０，０００個の細胞を、免疫不全マウスホストの線条体に注入した（下記の移植セクションを参照）。移植する前に、ＤＡニューロンの同一性及び誘導率を、FOAX2/LMX1A/NURR1の共発現についての免疫細胞化学によって確認した。
【００８３】
Ｂ．移植
【００８４】
６〜８週齢のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（The Jackson Laboratory）を、ケタミン／キシラジン（Fort Dodge）で麻酔した。一側性定位注射によって、ｈＥＳＣ由来細胞を、下記の座標で線条体へ送達させた。前後方向［ＡＰ］、＋０．５；内外側方向［ＭＬ］、−１．８；背腹方向［ＤＶ］、−３．２。ハミルトン注射器（２６ゲージ）を使用して、１μｌ／分の速度で、１００，０００細胞／μｌの濃度の１５０、０００（ｍＤＡ）または２００、０００個の細胞（ロゼット）の移植を行った。
【００８５】
Ｃ．免疫組織化学
【００８６】
マウスに致死量のペントバルビタール（Nembutal, Abbot Laboratories）を投与し、ＰＢＳ、続いて４％のパラホルムアルデヒドを用いて、経心臓的に灌流した。脳を取り出して４℃で一晩固定し、その後、３０％のスクロースに移して一晩放置した。脳を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Tissue-Tek）に埋め込み、５本のボトル内で３０ミクロンに連続的に低温切開されるまで−８０℃で貯蔵した。蛍光免疫組織化学については、０．２％のTriton X-100を用いて、切片を１０％の正常ヤギ血清中（NGS; Gibco）（ＦＯＸＡ２株について１％ＢＳＡ）に室温で３０分間閉じ込めた。２％のＮＧＳ（Ｓｏｘ２及びＦＯＸＡ２染色の場合は１％のＢＳＡ）中に、一次抗体を４℃で一晩適用し、その後、蛍光色素共役二次抗体（Alexa Fluor conjugates; Molecular Probes）を室温で１時間適用した。ＤＡＰＩを有するVectashield（Vector Laboratories）でスライドを洗浄し、対比染色した。一次抗体には、マウス抗Nestin抗体（1:500; Neuromics）、ヤギ抗Ｓｏｘ２抗体（1:100; Santa Cruz）、マウス抗Ｋｉ６７抗体（1:500; DAKO）、ウサギ抗ＴＨ抗体（1:500; Pel Freez Biologicals）、ヤギ抗ＦＯＸＡ抗体（1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc.）、及びマウス抗ｈＮＣＡＭ抗体（ERIC-1; 1:100; Santa Cruz）が含まれる。
【００８７】
Ｄ．結果
【００８８】
ＯｍｏｍｙｃＥＲを、ＤＡニューロン、及び、ヒトｉＰＳ由来神経ロゼット細胞から生じた原始神経腫瘍で試験した。ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、及びＳＯＸ２を発現する単一の摘出可能な多シストロン性ベクター（Papapetrou 2011b）を使用してヒトｉＰＳ細胞を生成した。これらの細胞を、神経前駆（ロゼット細胞段階）に分化させ、前述した中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンに分化させた（Kriks 2011; Chambers 2009）。これらの細胞を、ＯｍｏｍｙｃＥＲまたは対照ベクターを発現するように操作した。ロゼット細胞の脳内接種により、４週間以内に脳腫瘍を発生させた（ベクターはｎ＝４、ＯｍｏｍｙｃＥＲはｎ＝５）。タモキシフェンによるＯｍｏｍｙｃＥＲの活性化（ＴＡＭ、１０ｍｇ／ｍｌ、１週間に２回の本頻度で５週間）により、脳腫瘍の成長を完全に阻害した。対照腫瘍を有する動物は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で測定すると、進行性腫瘍成長を示した。病理学的には、前記腫瘍は、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）に類似しており、Ｓｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎを発現するが、ニューロンまたはグリア分化のより特異的なマーカを欠いている（Ｏｌｉｇ２、ＮｅｕＮ、シナプトフィジン、またはＧＦＡＰ）。ＭＹＣ不活性化は、原始マーカ（Ｓｏｘ２、Ｎｅｓｔｉｎ）のさらなる損失を引き起こし、腫瘍細胞分化を誘導しなかった。組織学は、ＯｍｏｍｙｃＥＲ誘導時に、増殖細胞（Ｋｉ６７陽性）の高密度の島が完全に消失したことを示した。したがって、ＭＹＣ抑制は、インビボでのヒトｉＰＳ細胞の異常分化の結果として起こり得るＰＮＥＴの成長を阻害した。
【００８９】
ＯｍｏｍｙｃＥＲ誘導の、マウスの脳に注入されたｉＰＳ由来の中脳ＤＡニューロンに対する影響を、脳癌についての同じタモキシフェン治療スケジュールを用いて試験した。ＭＲＩは、ＯｍｏｍｙｃＥＲ及び対照細胞の両方の等しい生着を示した。顕微鏡的に見ると、ＯｍｏｍｙｃＥＲ及び対照ニューロンの両方は、中脳ＤＡニューロン及びヒト特異的ＮＣＡＭに典型的な転写因子ＦＯＸＡ２を共発現するＴＨ＋細胞から構成される、明確に定義された移植片コアを生成した。ＰＮＥＴ及び正常なＤニューロンにおけるＭＹＣ分化要件と一致して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、腫瘍におけるＭＹＣ発現上昇、及び分化ニューロンにおけるＭＹＣ検出不能レベルが明らかになった（図１２）。したがって、一時的なＭＹＣ不活性化により、原始及び未分化癌と、健常な、ヒトｉＰＳ由来分化組織とを区別することができる（図１３）。
【００９０】
（参照文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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