(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
Zn、Co及びNiの少なくとも１種を含む第１の液体培地と、Se及びWの少なくとも１種を含む第２の液体培地とをブレンドして発酵培地を与える工程；
CO含有基質を前記発酵培地と接触させる工程；及び
クロストリジウム属の細菌を用いて前記CO含有基質を発酵させて酸性pHを与える工程
を含む発酵プロセスであって、
前記発酵プロセスが、Zn、Co及びNiの少なくとも１種とSeとWの少なくとも１種との沈殿を防止するのに有効であり、
前記発酵培地が3mM以下のホスファートを含み、かつ
前記発酵プロセスが、生成されるエタノール1米国ガロン(3.8リットル)当たり前記発酵培地に与えられる2米国ガロン(7.6リットル)以下の水を利用するのに有効である、前記発酵プロセス。
【請求項２】
前記発酵培地が30mS/cm以下の伝導率を有する、請求項1の発酵プロセス。
【請求項３】
前記発酵プロセスが10gの全アルコール/(L・日)以上のSTYを与えるのに有効である、請求項1の発酵プロセス。
【請求項４】
CO含有基質の発酵プロセスであって、下記工程：
前記CO含有基質を発酵槽に与える工程及び前記CO含有基質を発酵培地と接触させる工程、ここで、前記発酵培地は、Zn、Co及びNiから成る群より選択される1種以上の元素を含む第1溶液を、W及びSeから成る群より選択される1種以上の元素を含む第2溶液と、30mS/cm以下の伝導率を有し、3mM以下のホスファートを含む発酵培地を与えるのに有効な量でブレンドする工程を含むプロセスによって与えられる；及び
クロストリジウム属の細菌を用いて前記CO含有基質を発酵させる工程
を含む発酵プロセスであって、
前記発酵プロセスが、10gの全アルコール/(L・日)以上のSTYを与えるのに有効であり、
前記発酵プロセスが、生成されるエタノール1米国ガロン(3.8リットル)当たり前記発酵培地に与えられる2米国ガロン(7.6リットル)以下の水を利用するのに有効である、前記発酵プロセス。
【請求項５】
前記発酵培地に、下記
細胞1グラム当たり毎分0.04μg以上のZn、
細胞1グラム当たり毎分0.018μg以上のCo、
細胞1グラム当たり毎分0.02μg以上のNi、
細胞1グラム当たり毎分0.29μg以上のW、及び
細胞1グラム当たり毎分0.01μg以上のSe
の少なくとも1つ以上が与えられる、請求項4の発酵プロセス。
【請求項６】
前記発酵培地が0.02質量%未満のNaHCO3を含む、請求項4の発酵プロセス。
【請求項７】
前記発酵培地に、下記
細胞1グラム当たり0.044μg以上の窒素、
細胞1グラム当たり0.2μg以上のリン、又は
細胞1グラム当たり0.01μg以上のカリウム
の少なくとも1つ以上が与えられる、請求項4の発酵プロセス。
【請求項８】
前記全アルコールが、75質量パーセント以上のエタノールを含む、請求項4の発酵プロセス。
【請求項９】
前記全アルコールが、25質量パーセント以下のブタノールを含む、請求項4の発酵プロセス。
【請求項１０】
前記発酵が、4.2〜4.8のpHを与えるのに有効である、請求項1又は4の発酵プロセス。
【請求項１１】
前記Zn、Co及びNiの少なくとも１種を含む第１の液体培地とSe及びWの少なくとも１種を含む第２の液体培地とのブレンドが、580nmで0.7以下の光学密度を有する、請求項1の発酵プロセス。
【請求項１２】
前記発酵槽に与えられる前記CO含有基質が0.75以上のCO/CO2モル比を有する、請求項4の発酵プロセス。
【請求項１３】
前記CO含有基質をクロストリジウム属の細菌によって発酵する工程を含んでおり、クロストリジウム属の細菌が、クロストリジウム・アセチカム(Clostridium aceticum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・コスカチイ(Clostridium coskatii)、クロストリジウム・ドラケイ(Clostridium drakei)、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・マグナム(Clostridium magnum)、クロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)、クロストリジウム・ラグスダリ(Clostridium ragsdali)、クロストリジウム・スカトロゲネス(Clostridium scatologenes)、クロストリジウム・サーモアセチカム(Clostridium thermoaceticum)、クロストリジウム・ウルツネンセ(Clostridium ultunense)、及びその混合物から成る群より選択される、請求項1又は4の発酵プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、2013年6月10に出願され、その内容全体を参照によってここに援用する米国仮出願第61/833,240号の利益を主張する。
低ホスファート培地中でCO含有ガス状基質を発酵させるためのプロセスを提供する。さらに詳細には、本プロセスは、より少ない量の水を必要とするように調製された培地中でCO含有ガス状基質を発酵させる工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
背景
酢酸生成微生物は、ガス状基質の発酵を介して一酸化炭素(CO)からエタノールを生成することができる。クロストリジウム属由来の嫌気性微生物を用いる発酵は、エタノール及び他の有用な生成物を生成する。例えば、米国特許第5,173,429号は、合成ガスからエタノール及びアセタートを生成する嫌気性微生物であるクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)ATCC No. 49587について記載している。米国特許第5,807,722号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No. 55380を用いて廃ガスを有機酸とアルコールに変換するためのプロセス及び装置について記載している。米国特許第6,136,577号は、クロストリジウム・リュングダリイATCC No. 55988及び55989を用いて廃ガスをエタノールに変換するためのプロセス及び装置について記載している。
発酵プロセスは、大量の水と栄養素を必要とすることが多い。アルコールの生産性を維持しながら水の利用を低減し、特定成分を排除し、かつ他の成分の必要濃度レベルを低減すると、特に商業規模の発酵で顕著なコスト削減をもたらすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
概要
より少ない量の水を用いてCO含有ガス状基質を発酵させるプロセスを提供する。本プロセスに用いる発酵培地は、顕著に少ない量の水と低減したレベルのホスファートを必要とするように調製される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発酵プロセスは、少なくとも1種の遷移金属元素を含む液体培地を、少なくとも1種の他の遷移金属元素及び1種の非金属元素を含む液体培地とブレンドして発酵培地を与える工程を含む。本プロセスは、CO含有基質を発酵培地と接触させる工程及びCO含有基質を発酵させて酸性pHを与える工程を含む。本プロセスは1種以上の遷移金属元素と1種以上の非金属元素との沈殿を防止するのに有効であり、かつ生成されるエタノール1米国ガロン(3.8リットル)当たり発酵培地に与えられる約2米国ガロン(7.6リットル)以下の水を利用するのに有効である。
CO含有基質の発酵プロセスは、CO含有基質を発酵槽に与える工程及びCO含有基質を発酵培地と接触させる工程を含む。本プロセスは、Zn、Co及びNiから成る群より選択される1種以上の元素を含む第1溶液を、W及びSeから成る群より選択される1種以上の元素を含む第2溶液と、30mS/cm以下の伝導率及び約3mM以下のホスファートを有する発酵培地を与えるのに有効な量でブレンドする工程を含む。CO含有基質を発酵させる工程は、10gの全アルコール/(L・日)以上のSTYを与えるのに有効であり、かつ生成されるエタノール1米国ガロン(3.8リットル)当たり発酵培地に与えられる約2米国ガロン(7.6リットル)以下の水を利用するのに有効である。
別の態様では、発酵培地の調製における水の利用を低減するためのプロセスは、Zn、Co、Niの1種以上から成る群より選択される元素を含む溶液を、W、Seの1種以上から成る群より選択される元素を含む溶液と、約30mS/cm以下の伝導率を有する発酵培地を与えるのに有効な量でブレンドする工程を含む。この発酵培地は、約3mMより多くのホスファートを有する発酵培地より約10%〜約40%少ない水を必要とする。
本プロセスのいくつかの態様の上記及び他の態様、特徴及び利点は下記図面からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】低ホスファート培地及びpHを制御し、かつ窒素源として作用するための塩基としてのNH4OHの使用に関する定常状態クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)培養の性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
以下の説明は、限定的意味に解釈すべきでなく、単に例示実施形態の一般原理を説明する目的で構成される。本発明の範囲は、特許請求の範囲を参照して決定すべきである。
一態様では、発酵槽への栄養素供給原料中の栄養レベルは、発酵槽内における酢酸生成微生物による各栄養素の消費%が本質的に等しくなるように最適化される。不運なことに、培地中の消費される栄養素の量と結果として生じる栄養素の残量とのアンバランスが伝導率上昇をもたらし、発酵性能が低下する。伝導率上昇を軽減するためには、大量の水が必要とされる。与えられる栄養素と消費される栄養素のバランスを慎重に取ると、水の利用と栄養素の利用が低減することになる。この態様では、栄養培地及び発酵プロセスは、90%以上の栄養素が利用され、別の態様では、少なくとも約95%以上の栄養素が利用されるように栄養素の利用を最適化する。
本明細書に記載の培地及び酢酸生成菌を含むバイオリアクター内で行なわるシンガス発酵は、シンガス中のCOのアルコールと他の生成物への変換をもたらすのに有効である。この態様では、生産性をgの全アルコール/(L・日)として表されるSTY(空時収量(space time yield))として表すことができる。この態様では、プロセスは、少なくとも約10g以上の全アルコール/(L・日)のSTY(空時収量)を与えるのに有効である。可能なSTY値としては約10gの全アルコール/(L・日)〜約200gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約10gの全アルコール/(L・日)〜約160gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約10gの全アルコール/(L・日)〜約120gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約10gの全アルコール/(L・日)〜約80gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約20gの全アルコール/(L・日)〜約140gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約20gの全アルコール/(L・日)〜約100gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約40gの全アルコール/(L・日)〜約140gの全アルコール/(L・日)、別の態様では、約40gの全アルコール/(L・日)〜約100gの全アルコール/(L・日)が挙げられる。
【０００７】
定義
特に指定のない限り、本開示のためにこの明細書全体を通じて使用する下記用語は下記定義どおりであり、下記定義の単数形又は複数形のどちらをも含み得る。
任意量を修飾する用語「約」は、実社会の条件内、例えば、実験室、パイロットプラント、又は生産施設内で遭遇する当該量の変動を指す。例えば、「約」で修飾されるときに混合物又は分量において用いられる成分又は測定値の量には、生産プラント又は実験室内の実験条件下で測定する際に典型的に払われる注意の変動又は程度が含まれる。例えば、「約」で修飾されるときの生成物の成分の量には、プラント又は実験室内の複数の実験のバッチ間の変動及び分析方法に固有の変動が含まれる。「約」で修飾されるか否かにかかわらず、量は当該量と等価な量を包含する。本明細書で言及され、「約」で修飾されたいずれの量も本開示では「約」で修飾されない量として利用することもできる。
用語「ガス状基質」は非限定的意味で使用され、この用語には1種以上のガスを含有するか又は1種以上のガスから誘導される基質が含まれる。
用語「シンガス」又は「合成ガス」は、各種量の一酸化炭素と水素を含有するガス混合物に与えられる名称である合成ガスを意味する。生産方法の例としては、水素を生産するための天然ガス又は炭化水素の水蒸気改質、石炭のガス化及びいくつかのタイプの廃棄物・トゥー・エネルギーのガス化施設内のガス化が挙げられる。この名称は、合成天然ガス(SNG)を作り出す際及びアンモニア又はメタノールを生産するための中間体としてのそれらの使用に由来する。シンガスは可燃性であり、他の化学薬品の生産のための燃料源又は中間体として用いられることが多い。
【０００８】
用語「発酵槽」には、1つ以上の容器及び／若しくは塔又は配管から成る発酵装置が含まれ、連続撹拌槽型反応器(Continuous Stirred Tank Reactor)(CSTR)、固定化細胞反応器(Immobilized Cell Reactor)(ICR)、トリクルベッド反応器(Trickle Bed Reactor)(TBR)、移動床バイオフィルム反応器(Moving Bed Biofilm Reactor)(MBBR)、気泡塔、ガスリフト発酵槽、膜反応器、例えば中空繊維膜バイオリアクター(Hollow Fibre Membrane Bioreactor)(HFMBR)、静的ミキサー、又は気液接触に適した他の容器若しくは他の装置が挙げられる。
用語「発酵」、「発酵プロセス」又は「発酵反応」等はプロセスの成長期と生成物生合成期の両方を包含する意図である。一態様では、発酵は、COのアルコールへの変換を意味する。
用語「細胞密度」は、発酵ブロスの単位体積当たりの微生物細胞の質量、例えば、グラム/リットルを意味する。
発酵プロセスに関して使用するとき、用語「効率を高める」、「向上した効率」等には、発酵における微生物の成長速度、消費された基質(例えば一酸化炭素)の体積又は質量当たりの生成された所望生成物(例えばアルコール)の体積又は質量、所望生成物の生産速度又は生産レベル、及び生成された所望生成物の、発酵の他の副生物と比較した相対的比率の1つ以上を高めることが含まれる。
本明細書で使用する場合、「全アルコール」には、エタノール、ブタノール、プロパノール及びメタノールが含まれる。一態様では、全アルコールは、少なくとも約75質量パーセント以上のエタノール、別の態様では、約80質量パーセント以上のエタノール、別の態様では、約85質量パーセント以上のエタノール、別の態様では、約90質量パーセント以上のエタノール、別の態様では、約95質量パーセント以上のエタノールを含み得る。別の態様では、全アルコールは約25質量パーセント以下のブタノールを含み得る。
用語「比CO取込み」は、分での単位時間当たりの微生物細胞の単位質量(g)によって消費されたミリモルでのCOの量、すなわちミリモル/グラム/分を意味する。
【０００９】
CO含有基質
CO含有基質には、COを含むいずれのガスも含まれ得る。この態様では、CO含有ガスには、シンガス、産業ガス、及びその混合物が含まれ得る。
いずれの既知源からシンガスを供給してもよい。一態様では、炭素質材料のガス化からシンガスを調達することができる。ガス化は、酸素の制限された供給下でのバイオマスの部分燃焼を伴う。結果として生じるガスは主にCOとH2を含む。この態様では、シンガスは少なくとも約10モル%のCO、一態様では、少なくとも約20モル%のCO、一態様では、約10〜約100モル%のCO、別の態様では、約20〜約100モル%のCO、別の態様では、約30〜約90モル%のCO、別の態様では、約40〜約80モル%のCO、別の態様では、約50〜約70モル%のCOを含有するであろう。適切なガス化の方法及び装置のいくつかの例は、米国特許出願第61/516,667号、第61/516,704号及び第61/516,646号(全て2011年4月6日に出願された)、並びに米国特許出願第13/427,144号、第13/427,193号及び第13/427,247号(全て2012年3月22日に出願された)に提供されており、これら全ての内容を参照によってここに援用する。
別の態様では、本プロセスは、高体積CO含有産業煙道ガスのようなガス状基質からのアルコールの生産を支援する適用性を有する。一部の態様では、COを含むガスは、炭素含有廃棄物、例えば、産業廃ガス又は他の廃棄物のガス化から誘導される。そのようなものとして、本プロセスは、そうでなければ環境に排出されるであろう炭素を捕獲するための有効なプロセスを提起する。産業煙道ガスの例として、鉄類製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産及びコークス製造中に生成されるガスが挙げられる。
【００１０】
CO含有基質の組成に応じて、CO含有基質を発酵プロセスに直接与えるか又は適切なH2対COモル比を含むようにさらに改変してよい。一態様では、発酵槽に与えるCO含有基質は、約0.2以上のH2対COモル比、別の態様では、約0.25以上のH2対COモル比、及び別の態様では、約0.5以上のH2対COモル比を有する。別の態様では、発酵槽に与えられるCO含有基質は約40モルパーセント以上のCOプラスH2及び約30モルパーセント以下のCO、別の態様では、約50モルパーセント以上のCOプラスH2及び約35モルパーセント以下のCO、別の態様では、約80モルパーセント以上のCOプラスH2及び約20モルパーセント以下のCOを含み得る。
一態様では、CO含有基質は主にCOとH2を含む。この態様では、CO含有基質は、少なくとも約10モル%のCO、一態様では、少なくとも約20モル%、一態様では、約10〜約100モル%、別の態様では、約20〜約100モル%のCO、別の態様では、約30〜約90モル%のCO、別の態様では、約40〜約80モル%のCO、別の態様では、約50〜約70モル%のCOを含有するであろう。CO含有基質は、少なくとも約0.75のCO/CO2比、別の態様では、少なくとも約1.0、別の態様では、少なくとも約1.5のCO/CO2比を有するであろう。
【００１１】
一態様では、ガス分離器を配置して、ガス流の少なくとも一部を実質的に分離する。この部分には1種以上の成分が含まれる。例えば、ガス分離器は、下記成分：CO、CO2、H2を含むガス流からCO2を分離し、CO2をCO2除去器に通し、ガス流の残り(CO及びH2を含む)をバイオリアクターに通すことができる。技術上周知のいずれのガス分離器をも利用し得る。この態様では、発酵槽に与えられるシンガスは約10モル%以下のCO2、別の態様では、約1モル%以下のCO2、別の態様では、約0.1モル%以下のCO2を有するであろう。
ある一定のガス流は高濃度のCOと低濃度のH2を含んでよい。一態様では、より高いアルコール生産効率及び／又は全体的な炭素捕獲を達成するため、基質流の組成を最適化するのが望ましいことがある。例えば、基質流をバイオリアクターに通す前に基質流中のH2濃度を高めてよい。
本発明の特定の態様によれば、2種以上の起源からの流れを組み合わせ及び／又はブレンドして所望の及び／又は最適化基質流を生成することができる。例えば、製鋼所転炉からの排ガス等の高濃度COを含む流れを製鋼所コークス炉からのオフガス等の高濃度H2を含む流れと組み合わせることができる。
ガス状CO含有基質の組成によっては、CO含有基質を発酵に導入する前に処理して、粉塵粒子等のいずれの望ましくない不純物をも除去するのが望ましいこともある。例えば、既知の方法を用いてガス状基質をろ過又は洗浄することができる。
【００１２】
バイオリアクターの設計と操作
発酵槽設計の詳細は米国特許出願第13/471,827号及び第13/471,858号(両方とも2012年5月15日に出願された)、並びに2012年5月16日に出願された米国特許出願第13/473,167号に記載されており、これら全ての内容を参照によってここに援用する。
一態様によれば、培地を反応器に添加して発酵プロセスを開始する。培地組成物のいくつかの例は、2012年5月22日に出願された米国特許出願第61/650,098号及び第61/650,093号、並びに2001年7月23日に出願された米国特許第7,285,402号に記載されており、これら全ての内容を参照によってここに援用する。培地を滅菌して望ましくない微生物を除去することができ、所望の微生物を反応器に接種する。滅菌は常に必要なわけではない。
一態様では、利用微生物には酢酸生成菌が含まれる。有用な酢酸生成菌の例としては、クロストリジウム属のもの、例えばクロストリジウム・リュングダリイの株（WO 2000/68407、EP 117309、米国特許第5,173,429号、第5,593,886号及び第6,368,819号、WO 1998/00558及びWO 2002/08438に記載されたものを含めて）、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)の株(DSMZ, GermanyのDSM 10061及びDSM 19630)（WO 2007/117157及びWO 2009/151342に記載されたものを含めて）及びクロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)(P11, ATCC BAA-622)及びアルカリバクルム・バッキ(Alkalibaculum bacchi)(CP11, ATCC BAA-1772)（それぞれ米国特許第7,704,723号及び2010年4月29日にOklahoma EPSCoR Annual State Conferenceで提出された“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”,Hasan Atiyehに記載されたものを含めて）及び米国特許出願第2007/0276447号に記載のクロストリジウム・カルボキシディボランス(Clostridium carboxidivorans)(ATCC PTA-7827)が挙げられる。他の適切な微生物には、ムーレラ属(Moorella)のもの（ムーレラ種HUC22-1を含めて）、及びカーボキシドサーマス(Carboxydothermus)属のものがある。これらの各参考文献を参照によってここに援用する。2種以上の微生物の混合培養を使用してよい。
【００１３】
有用な細菌のいくつかの例として、アセトゲニウム・キブイ(Acetogenium kivui)、アセトバクテリウム・ノテラエ(Acetoanaerobium noterae)、アセトバクテリウム・ウッディイ(Acetobacterium woodii)、アルカリバクルム・バッキ(Alkalibaculum bacchi)CP11(ATCC BAA-1772)、ブラウティア・プロダクタ(Blautia producta)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)、カルダナエロバクター・サブテラネウス(Caldanaerobacter subterraneous)、カルダナエロバクター・サブテラネウス・パシフィカム(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、カーボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマンス(Carboxydothermus hydrogenoformans)、クロストリジウム・アセチカム(Clostridium aceticum)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・アセトブチリカムP262(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 19630)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 10061)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 23693)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(DSMZ GermanyのDSM 24138)、クロストリジウム・カルボキシディボランスP7(ATCC PTA-7827)、クロストリジウム・コスカチイ(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、クロストリジウム・ドラケイ(Clostridium drakei)、クロストリジウム・リュングダリイPETC(ATCC 49587)、クロストリジウム・リュングダリイERI2(ATCC 55380)、クロストリジウム・リュングダリイC-01(ATCC 55988)、クロストリジウム・リュングダリイO-52(ATCC 55889)、クロストリジウム・マグナム(Clostridium magnum)、クロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)(DSMZ GermanyのDSM 525)、クロストリジウム・ラグスダリ(Clostridium ragsdali)P11(ATCC BAA-622)、クロストリジウム・スカトロゲネス(Clostridium scatologenes)、クロストリジウム・サーモアセチカム(Clostridium thermoaceticum)、クロストリジウム・ウルツネンセ(Clostridium ultunense)、デスルホトマクルム・クズネツォビイ(Desulfotomaculum kuznetsovii)、ユーバクテリウム・リモスム(Eubacterium limosum)、ゲオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・バーケリ(Methanosarcina barkeri)、モーレラ・サーモアセティカ(Morrella thermoacetica)、モーレラ・サーモオートトロフィカ(Morrella thermoautotrophica)、オキソバクター・フェニジイ(Oxobacter pfennigii)、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス(Peptostreptococcus productus)、ルミノコッカス・プロダクツス(Ruminococcus productus)、サーモアネロバクター・キブイ(Thermoanaerobacter kivui)、及びその混合物が挙げられる。
【００１４】
望ましくは、所望の発酵(例えばCO→エタノール)が起こるのに適した条件下で発酵を行なうべきである。考慮すべき反応条件としては、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地のpH、培地の酸化還元電位、撹拌速度(連続撹拌槽型反応器を使用する場合)、接種レベル、液相内のCOが律速にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物抑制を回避するための最大生成物濃度が挙げられる。
本発明の方法を用いて、COの溶液中への移動速度が培養の取込み速度未満であるようにCOが限られている微生物培養の生存能を持続することができる。このような状況は、COを含む基質を微生物培養に連続的に供給せず；物質移動速度が低く；又は不十分なCOが基質流中に存在するときに生じて、最適温度で培養の生命力を持続し得る。該実施形態では、微生物培養は、液体栄養培地に溶解したCOを急速に枯渇させ、さらなる基質は十分速くは与えられないので、限られた基質になるであろう。
【００１５】
スタートアップ：接種したら、微生物の初期集団を供給するのに有効な初期供給ガスの供給速度を確立する。流出ガスを分析して流出ガスの内容を判定する。ガス分析の結果を用いて供給ガス速度を制御する。この態様では、プロセスは、約0.5〜約0.9、別の態様では、約0.6〜約0.8、別の態様では、約0.5〜約0.7、別の態様では、約0.5〜約0.6の計算CO濃度対初期細胞密度比を与える。
別の態様では、発酵プロセスは、約0.15mM〜約0.70mM、別の態様では、約0.15mM〜約0.50mM、別の態様では、約0.15mM〜約0.35mM、別の態様では、約0.20mM〜約0.30mM、別の態様では、約0.23mM〜約0.27mMの、発酵培地内の初期計算CO濃度を与えるのに有効な量でシンガスを発酵培地に与える工程を含む。このプロセスは、開始細胞密度に比べて細胞密度を増やすのに有効である。
【００１６】
スタートアップ後：所望レベルに達したら、液相及び細胞物質を反応器から取り出して培地を補充する。このプロセスは、細胞密度を約2.0グラム/リットル以上、別の態様では、約2〜約30グラム/リットル、別の態様では、約2〜約25グラム/リットル、別の態様では、約2〜約20グラム/リットル、別の態様では、約2〜約10グラム/リットル、別の態様では、約2〜約8グラム/リットル、別の態様では、約3〜約30グラム/リットル、別の態様では、約3〜約6グラム/リットル、別の態様では、約4〜約5グラム/リットルに増やすのに有効である。
一態様では、本プロセスは、Zn(プア培地とも呼ばれる)、Co、Niの1種以上からから成る群より選択される元素を含む第1溶液を、W及びSeの1種以上から成る群より選択される元素を含む第2溶液と、約30mS/cm以下の伝導率を有する発酵培地を与えるのに有効な量でブレンドする工程を含むプロセスにより与えられる発酵培地を含む。別の態様では、発酵培地は、約1〜約30mS/cm、別の態様では、約1〜約25mS/cm、別の態様では、約1〜約20mS/cm、別の態様では、約1〜約15mS/cm、別の態様では、約1〜約10mS/cm、別の態様では、約1〜約5mS/cm、別の態様では、約1〜約4mS/cm、別の態様では、約1〜約3mS/cm、別の態様では、約1〜約2mS/cm、別の態様では、約2〜約30mS/cm、別の態様では、約2〜約25mS/cm、別の態様では、約2〜約20mS/cm、別の態様では、約2〜約15mS/cm、別の態様では、約2〜約10mS/cm、別の態様では、約2〜約5mS/cm、約2〜約4mS/cm、別の態様では、約2〜約3mS/cm、別の態様では、約3〜約30mS/cm、別の態様では、約3〜約25mS/cm、別の態様では、約3〜約20mS/cm、別の態様では、約3〜約15mS/cm、別の態様では、約3〜約10mS/cm、別の態様では、約3〜約5mS/cm、別の態様では、約4〜約30mS/cm、別の態様では、約4〜約25mS/cm、別の態様では、約4〜約20mS/cm、別の態様では、約4〜約15mS/cm、別の態様では、約4〜約10mS/cm、別の態様では、約4〜約5mS/cmの伝導率を有する。
別の態様では、元素のブレンドは、580nmで約0.70以下の光学密度を有する。別の態様では、ブレンドは、約0〜約0.70、別の態様では、約0.001〜約0.65、別の態様では、約0.01〜約0.65、別の態様では、約0.01〜約0.50、別の態様では、約0.01〜約0.45の光学密度を有する。この態様では、任意の既知の方法によって濁度を決定可能である。光学密度測定のいくつかの例は、参照によってその内容全体をここに援用するEPA Guidance Manual, Turbidity Processes, April 1999に記載されている。
別の態様では、発酵培地は約14mM未満のホスファートを有する。関連態様では、発酵培地は約2〜約14mMのホスファート、別の態様では、約3〜約12mMのホスファート、別の態様では、約3〜約6mMのホスファート、別の態様では、約1〜約3mMのホスファート、別の態様では、約1〜約2mMのホスファート、別の態様では、約2〜約3mMのホスファートを有する。
【００１７】
一態様では、本プロセスは、エタノール1米国ガロン(3.8リットル)当たり発酵培地に供給される約2米国ガロン(7.6リットル)以下の水を利用するのに有効である。別の態様では、本プロセスは、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約1.8ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約1.5ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約1.35ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約1.2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約1ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.5〜約0.9ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約1.75ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約1.5ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約1.35ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約1.2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約0.75〜約1ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1〜約2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1〜約1.75ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1〜約1.5ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1〜約1.35ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1〜約1.2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1.5〜約2ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1.5〜約1.75ガロンの水、別の態様では、エタノール1ガロン当たり約1.75〜約2ガロンの水を利用するのに有効である。
別の態様では、発酵培地は、約3mM以上のホスファートを有する発酵培地より約10%〜約40%少ない水を必要とする。別の態様では、発酵培地は、約3mM以上のホスファートを有する発酵培地より約10%〜約30%少ない水、別の態様では、約10%〜約20%少ない水、別の態様では、約15%〜約40%少ない水、別の態様では、約15%〜約30%少ない水、別の態様では、約15%〜約20%少ない水、別の態様では、約20%〜約40%少ない水、別の態様では、約20%〜約30%少ない水、別の態様では、約25%〜約30%少ない水を必要とする。別の態様では、ホスファート濃度は、約2〜約2.5mM、別の態様では、約2.5mM〜約3.0mMであってよく、かつ指示範囲の水の低減を得るのに有効であり得る。
【００１８】
別の態様では、発酵培地は、細胞1グラム当たり毎分約0.005μg以上のZn、細胞1グラム当たり毎分約0.0002μg以上のCo、細胞1グラム当たり毎分約0.003μg以上のNi、細胞1グラム当たり毎分約0.039μg以上のW、及び細胞1グラム当たり毎分約0.001μg以上のSeが与えられる。この態様では、発酵培地は、下記量の下記元素の1種以上を含み得る：
Zn：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.11μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.09μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.065μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.04μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.075μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.055μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.02〜約0.075μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.02〜約0.055μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.04μgのZn供給速度を必要とするであろう；
Co：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.002〜約0.05μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.002〜約0.04μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.002〜約0.03μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.002〜約0.02μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.035μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.025μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.035μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.025μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.018μgのCo供給速度を必要とするであろう；
Ni：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.055μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.045μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.035μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.02μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.04μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.03μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.04μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.03μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.02μgのNi供給速度を必要とするであろう；
W：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.80μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.65μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.47μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.30μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.075〜約0.55μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.075〜約0.40μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.155〜約0.55μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.155〜約0.40μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.29μgのW供給速度を必要とするであろう；
Se：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約0.03μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.65μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.47μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.035〜約0.30μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.075〜約0.55μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.075〜約0.40μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.155〜約0.55μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.155〜約0.40μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.01μgのSe供給速度を必要とするであろう。
【００１９】
別の態様では、発酵培地は、細胞1グラム当たり毎分約0.006μg以上のN、細胞1グラム当たり毎分約0.025μg以上のP、及び細胞1グラム当たり毎分約0.001μg以上のKを与えられる。この態様では、発酵培地は、下記量の下記元素の1種以上を含み得る：
N：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.006〜約0.12μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.006〜約0.095μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.006〜約0.07μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.006〜約0.045μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.085μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.01〜約0.06μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.02〜約0.085μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.02〜約0.06μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.044μgのN供給速度を必要とするであろう；
P：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.025〜約0.55μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.025〜約0.45μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.025〜約0.35μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.025〜約0.20μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.05〜約0.38μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.05〜約0.27μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.1〜約0.38μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.1〜約0.3μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.2μgのP供給速度を必要とするであろう；
K：一態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約25μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約0.03μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約0.025μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約0.02μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.001〜約0.01μg 、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.02μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.003〜約0.015μg、別の態様では、約0.005〜約0.02μg、別の態様では、細胞1グラム当たり毎分約0.005〜約0.015μg；一例として、3g/L/日/グラム(細胞)の特定エタノール生産性は、細胞1グラム当たり毎分約0.01μgのK供給速度を必要とするであろう。
【００２０】
別の態様では、発酵培地は約0.02質量%未満のNaHCO3、別の態様では、約0.01質量%未満のNaHCO3、別の態様では、約0.005質量%未満のNaHCO3を含む。pH調整のためNaHCO3の代わりにNH4OHを利用してよい。低ホスファートレベルのみ又はNaHCO3の利用低減との組み合わせが、より低い培地伝導率をもたらす。培地伝導率低下には、上述したよう低い希釈度及び水要求低減が必要である。関連態様では、発酵培地は約4.2〜約4.8のpHを有する。
CO供給速度は、標準立方フィート毎分(standard cubic feet per minute)(SCFM)又は標準立法フィート毎時毎リットル(standard cubic feet per hour per liter)で表すことができる。この態様では、標準立法フィート毎時毎リットルは、約0.9〜約2.0SCFM(0.025〜0.057m3/分)、別の態様では、約1.25〜約1.75SCFM(0.0354〜0.0496m3/分)の範囲にあり得る。別の態様では、平均CO供給速度は、約0.016:1〜約0.04:1、別の態様では、約0.02:1〜約0.04:1、別の態様では、約0.02:1〜約0.035:1、別の態様では、約0.025:1〜約0.035:1、別の態様では、約0.025:1〜約0.03:1のCO供給速度対発酵槽容積の比を維持するのに有効なCO供給速度である。
【００２１】
別の態様では、プロセスは、H2転化率をモニターする工程及び約25%以上、別の態様では、約25%〜約95%、別の態様では、約30%〜約90%、別の態様では、約35%〜約85%、別の態様では、約40%〜約80%、別の態様では、約40%〜約70%、別の態様では、約40%〜約60%、別の態様では、約40%〜約50%のH2転化率を維持する工程を含む。プロセスは、CO取込みをモニターする工程及び約0.001〜約10ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.001〜約5ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.001〜約4ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.001〜約3ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.001〜約2ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.001〜約1ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約9ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約5ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約4ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約3ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約2ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約0.05〜約1ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約1〜約8ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約1〜約5ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約1〜約4ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約1〜約3ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)、別の態様では、約1〜約2ミリモル/分/グラム(乾燥細胞)のCO取込みを維持する工程をさらに含んでよい。
【実施例】
【００２２】
実施例1：適合性試験
以前に利用した微量金属溶液は下記成分を含んだ(全てグラム/リットルで表した)。
原液 適合性試験
1) ZnSO4*7H2O    0.5222      2.35
2) COCl2*6H2O    1.6         7.196
3) NiCl2*6H2O    0.4944      2.222
4) Na2SeO3       0.16        0.72
5) Na2WO4*2H2O    3.2         14.404
6) H3PO4(85%)    10%          N/A
【００２３】
1つの溶液に5種より多くの微量金属全てを維持するためには酸性マトリックスが必要である。しかしながら、これらの金属はそれらだけで水に高溶解性である。そこで、後述するように適合性試験を行なった。各微量金属の個々の溶液を作製した。各溶液の濃度は、原液中の各微量金属の濃度に等しかった。各溶液を互いに混合し、室温で一晩インキュベートした。翌朝の溶液を濁度について目視検査し、分光光度計で(ボルテックス)溶液の光学密度を測定した。結果を以下に示す。
【００２４】
0006400689.tif 000002
【００２５】
上記データは、Zn、Co及びNiと沈殿を形成しないようにSe及びWをプロトン化した状態にしておくためには酸性マトリックスが必要であることを示している。上記知見に基づいて、1つの微量金属原液の代わりに2つの微量金属原液を作製した。第1原液にはZn、Co、及びNiを含め、第2原液にはW及びSeを含めた。この調製方法はH3PO4の使用を低減する。実験原液中のリン酸の完全な排除を補うため、第1原液に添加するリン酸の量を0.075ml/Lから0.2ml/Lに増やした。従って、培地中のH3PO4の全体的な正味の低減は76%だった。
【００２６】
実施例2：低減ホスファート培地の使用
上記(76%少ないリン酸を含有する)培地を定常状態培養について以下のように4段階で試験した。
1.  定常培養に存在する培地を変性培地と交換した(T=0時間)。
2.  成長培地中のNH4ClをNH4OHと交換した。予防策としてH2SO4を成長培地に加えて反応器のpHを4.5で維持した(T=108.74時間)。
3.  H2SO4を培地から除去し、塩基としてNaHCO3をNH4OHと交換して反応器のpHを制御した(T=158.42時間)。
4.  第1原液中の成分を発酵培地に直接加えた(T=489.07時間)。
図1は、低ホスファート培地及びpHを制御し、かつ窒素源として作用するための塩基としてのNH4OHの使用に関する定常状態クロストリジウム・リュングダリイ培養の性能を示す。発酵中の事象は以下のとおりだった。
【００２７】
0006400689.tif 000003
【００２８】
108.74時間には、0.35ml/LのH2SO4(75%)を含有する培地を反応器に添加した。NH4Clを培地から除去し、NH4OHポンプ処理を開始した。これは、反応器にポンプ処理される追加塩基がpH設定点を飛び越えないようにするために行なった。このpHではH3PO4は一塩基性であり、H2SO4は二塩基性であることを考慮して、H3PO4として排除されるプロトンの量に基づいて添加量を計算した。後に培養は、依然として塩基を使用し、H2SO4は排除されていることを確証した。
135.32時間に開始して、NaHCO3の塩基溶液をNH4OHに交換した。0.5Mの最終溶液に決めるまで、NH4OHポンプ処理の流速にとともに塩基の濃度を調整した。この濃度を用いると、培養に窒素を与えるために追加のNH4OHを加える必要がなかった。
279.32時間と441.82時間の間に、培地中のビタミン濃度を1.6ml/Lに上昇させた。
392.22時間には、細胞密度を3g/Lに低減した。
最終培地組成変更を489.07時間に加えた。これは、第1原液成分をそれらの固体形態で(全ての他の成分で行なうように)直接培地に添加することによって行なった。第2原液成分は水溶液として添加した。
本発明を特定の実施形態、その実施例及び応用を利用して開示したが、当業者は、特許請求の範囲に明記する本発明の範囲を逸脱することなく、それらに多くの変更形態及び変形形態を加えることができるであろう。
【図１】
0006400689.tif 000004