(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌を治療するための、修飾癌細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記修飾癌細胞が癌細胞の細胞分裂、細胞の成長、または、アポトーシスに対する抵抗性を促進する１つまたはそれ以上の拡散性成長因子の産生を消失させるよう修飾されている前記癌細胞であって、前記の１つまたはそれ以上の拡散性成長因子の産生の前記消失が拡散性成長因子または拡散性成長因子に対するプロモーターをコードする遺伝子の修飾によってかまたは拡散性成長因子をコードする遺伝子をノックアウトすることによって達成されていて、前記癌細胞が前記患者にとって自己由来または同種異系であり、前記修飾癌細胞の集団は直接注射によって前記癌細胞の集団に挿入され、前記細胞が治療しようとする前記癌と同じ種類の癌に由来し、前記癌細胞が腫瘍であって、
更に、前記拡散性成長因子が：ケモカインＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１／ＫＣ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２；ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）：ＴＮＦＡ、リンホトキシン（ＴＮＦＢ／ＬＴＡ、ＴＮＦＣ／ＬＴＢ）、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ４０ＬＧ、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＥＤＡ；インターロイキン：ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＷ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１Ａ／ＩＬ１Ｆ１、ＩＬ１Ｂ／ＩＬ１Ｆ２、１Ｒａ／ＩＬ１Ｆ３、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１Ｆ１０、３３／ＩＬ１Ｆ１１、１８／ＩＬ１Ｇ、ＩＬ１７／ＩＬ２５（ＩＬ１７Ａ）、ＣＳＦ１（マクロファージコロニー刺激因子）、ＣＳＦ２（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチン）、ＣＳＦ３（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム）；内皮成長因子、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＧＦ；上皮成長因子、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン−２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン−３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン−４（ＮＲＧ４）；線維芽細胞成長因子：ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３；神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）；血小板由来成長因子：ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ���ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ；ＴＧＦ（トランスフォーミング成長因子）：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、骨形成因子（ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５）、増殖分化因子（ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ミオスタチン／ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５）、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ；アディポカイン：ケメリン、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、プラスミノーゲン活性化阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、ビスファチン、レプチン、アディポネクチン、アペリン；Ｗｎｔ：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６；ヘッジホグタンパク質：ＤＨＨ、ＩＨＨ、ＳＨＨ；ソマトメジン：ソマトメジンＡ（インスリン様成長因子２）、ソマトメジンＢ、ソマトメジンＣ（インスリン様成長因子１）；セマフォリン（ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｃ、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＳＥＭＡ４Ｆ、ＳＥＭＡ４Ｇ、ＳＥＭＡ５Ａ、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＥＭＡ６Ｂ、ＳＥＭＡ６Ｃ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＭＡ７Ａ）；インターフェロン：ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７；エンドセリン（ＥＤＮ１  ＥＤＮ２  ＥＤＮ３）；ＣＣＮ細胞間シグナルタンパク質：ＣＣＮ１（ＣＹＲ６１）、ＣＣＮ２（ＣＴＧＦ、結合組織細胞成長因子）、ＣＣＮ３（ＮＯＶ、腎芽腫過剰発現タンパク質）、ＣＣＮ４（ＷＩＳＰ１、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−１）、ＣＣＮ５（ＷＩＳＰ２、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−２）、およびＣＣＮ６（ＷＩＳＰ３、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−３）からなる群から選択される、
ことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、前記癌細胞が癌腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍または芽腫からなる群から選択される癌に由来することを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の医薬組成物であって、前記癌細胞が：副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、脳幹膠腫、乳癌、気管支腺腫、気管支カルチノイド、バーキットリンパ腫、骨髄癌、原発部位不明癌、カルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、原発部位不明癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞種、子宮頸癌、結腸癌、線維形成性小円形細胞性腫瘍、体癌、子宮内膜癌、脳室上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍（肉腫）、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃カルチノイド、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹膠腫、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部視覚伝導路膠腫、視床下部膠腫、眼内（癌）メラノーマ、眼内メラノーマ、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポシ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、リンパ腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、メルケル細胞皮膚癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体胚細胞腫テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新生物、形質細胞新生物、肺胸膜芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、原発部位不明肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚癌（非メラノーマ）、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂尿管移行上皮癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、視覚伝導路および視床下部膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍（腎臓癌）からなる群から選択される癌に由来することを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載の医薬組成物であって、前記癌細胞がヒト癌細胞であることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の医薬組成物であって、前記拡散性成長因子または前記拡散性成長因子に対する前記プロモーターをコードする前記遺伝子の前記修飾が前記遺伝子またはプロモーターにおける１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、拡散性因子（例：成長因子）の産生の欠損した修飾癌細胞、およびヒト細胞集団の成長を減衰させるためのそのような細胞の使用に関し、具体的には細胞がヒト癌細胞でありかつ細胞集団が新生物、腫瘍または癌であることを特徴とする。本発明は、好ましくは細胞の生存および増殖を促進する拡散性成長因子をコードする（またはその産生に影響する）内因性遺伝子を、欠失させるかまたは修飾することによって癌または腫瘍細胞を修飾する段階を含む。
【０００２】
本発明は、適切な個数の前記細胞を腫瘍内に導入することにより拡散性因子を産生しない（または産生量がより低い）前記細胞の割合を増大させることによって新生物、腫瘍または癌を治療する方法にも関する。本方法は、好ましくは、たとえば欠失したかまたは修飾されている可溶性因子に相当する可溶性因子を一時的に添加することなどにより、そのような細胞に複製の優位性（好ましくは非一過性）を付与する段階を含む。
【背景技術】
【０００３】
現在の癌治療の手法は、化学的または物理的な方法（たとえば放射線照射または化学療法）により癌細胞を攻撃することを目標とする。より新しい手法は、細胞の成長を促進する拡散性因子の量を減少させるかまたはその受容体を減衰させることを目標とする。しかしこれらの手法は、細菌における抗生物質耐性の場合のように［Merlo et al., 2006, Lambert et al. 2011, Chabner & Roberts 2005］、耐性の進化に至る［Gorre et al. 2001, Wang et al. 2004, Donnenberg et al. 2005, Kobayashi et al. 2005, Bergers & Hanahan 2008, Ding et al. 2011, Roth et al. 2001］。これが、癌の死亡率が４０年間ほとんど変化しない主な理由である（化学療法および放射線療法は依然として治療の大半を占める）［Weinberg 2006, Chabner & Roberts 2005, Siegel et al. 2012］。
【０００４】
癌は、個体の生涯という時間尺度での体内のクローン選択プロセスであるので、治療は耐性について選択し［Cairns 1975, Nowell 1976］：クローン細胞系譜がより迅速に再生産されることを可能とする体細胞変異の度数は、たとえ長期的に宿主に対して有害となっても、近傍の細胞を犠牲にして増大する［Crespi & Summers 2005, Merlo et al. 2006, Lambert et al. 2011, Greaves & Maley 2012］。同じ理由により、たまたま治療に対して抵抗性となった変異細胞の度数が非抵抗性細胞を犠牲として増大し、最終的には疾患の再発に至る。この意味から、現在の治療法の問題はそれが「進化的に安定」でないことである。
【０００５】
達成したいものは、耐性細胞変種に対して優位性を付与せず、かつその代わりに患者に利益を付与する変異体に優位性を与えて度数を増大させる治療法である。本発明は、拡散性因子を産生しないか、または産生量の少ない細胞を用いて、拡散性因子産生のダイナミクスを修飾することによるそうした方法を提供する。本発明は、具体的には、その産生する成長因子の産生速度および有効性を減少させるよう修飾されている前記細胞に関する。好ましくは、細胞は遺伝子修飾される。
【０００６】
癌のプログレッションの過程では、腫瘍細胞は細胞の生存および増殖を高めるか、または細胞の維持および成長を促進する成長因子を産生する。
【０００７】
最近、成長因子またはその受容体を攻撃することが抗癌療法として試みられる一方で、従来の治療法と同じ問題：耐性変異体が発生して長期的にその治療法を無効にすることに悩まされている。たとえば、抗ＶＥＧＦ剤アバスチンは、血管新生を誘導する成長因子（ＶＥＧＦ）を減衰させることによって癌を攻撃する。抗ＶＥＧＦ剤は一定の種類の癌のプログレッションを平均で４ヶ月遅延させるのみで、その後は耐性が進化して再発に至ることが知られている。［Bergers & Hanahan 2008, Amit et al. 2013］。
【０００８】
ＲＮＡ干渉も同じ種類の手法を用い：成長因子をｍＲＮＡ段階で減少させる。
【０００９】
これらの先行手法と対照的に、本願に提案する方法は癌細胞を直接攻撃することも、あるいは拡散性因子またはその受容体を直接減衰させたりその量を減少させたりすることもない。
【００１０】
その代わりに、本願に提案する方法は、拡散性因子を産生しない細胞、または拡散性因子の産生量がより低い細胞（「非産生体」または「低産生体」または「−／−」）を用いて、−／−細胞を細胞集団に添加することにより直接的に、または−／−細胞に選択的優位性を付与する様式で細胞の環境を修飾することにより間接的に、拡散性因子産生のダイナミクスを変化させる。その後、自然発生的クローン選択（癌細胞同士の競合）が−／−細胞に有利に作用し、その度数を高めるか、または細胞が産生する拡散性因子の量の減少に至る。
【００１１】
そのような−／−細胞は、癌細胞集団（例：腫瘍）中に自然発生することも、あるいは実験室で作製された後で最終的に癌細胞集団（例：腫瘍）に添加されることもある。好ましくは、その様な−／−細胞は、実験室において既存の癌細胞を修飾することによって作製される。好ましくは、修飾は、１つまたは複数の成長因子をコードするか、またはその産生を促進する遺伝子の部分的または完全なノックアウトである。好ましくは、そのような−／−は複数の拡散性因子の産生が欠損している。
【００１２】
−／−細胞が選択的優位性を有する条件は、たとえば細胞集団に適切な個数の−／−細胞を導入することにより、または前記細胞からノックアウトされた因子の適切な量を導入することにより、細胞集団中の−／−細胞の割合を高めることによってもたらすことができる。
【００１３】
現在および過去の手法では、治療に対して耐性である変異細胞が非耐性細胞に対して個別に優位性を持つ一方、本願で提案する方法においては、拡散性因子の産生量がより高い変異体（「産生体」、「＋／＋」）は−／−に対して劣位性を持つので、治療は進化的に安定である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Amin EM, Oltean S, Hua J, et al (2011) WT1 mutants reveal SRPK1 to be a downstream angiogenesis target by altering VEGF slicing, Cancer Cell 20:768-780
【非特許文献２】Amit L, Ben-Aharon I, Vidal L, Leibovici L, Stemmer S (2013) e Impact of Bevacizumab (Avastin) on Survival in Metastatic Solid Tumors - A Meta-Analysis and Systematic Review. PLoS ONE 8: e51780
【非特許文献３】Baeriswyl V & Christofori G (2009) The angiogenic switch in carcinogenesis, Seminars in Cancer Biology 19:329-337
【非特許文献４】Baird A, Schubert D, Ling N, Guillemin R (1988) Receptor- and heparin-binding domains of basic fibroblast growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A 85:2324-2328
【非特許文献５】Baserga R (1994) Oncogenes and the strategy of growth factors, Cell 79:927-930
【非特許文献６】Baserga R, Hongo A, Rubini M, et al (1997) The IGF-I receptor in cell growth, transformation and apoptosis, Biochem Biophys Acta 1332:F105-F126
【非特許文献７】Begers G, Hanahan D (2008) Models of resistance to anti-angiogenic therapy, Nature Reviews Cancer 8:592-603
【非特許文献８】Bergers G, Brekken R, McMahon G, et al (2000) Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis, Nat Cell Biol 2:737-744
【非特許文献９】Bobek G, Scott CD, Baxter RC (1991) Secretion of soluble insulin-like growth factor-II/mannose 6-phosphate receptor by rat tissues in culture. Endocrinology 128:2204-2206
【非特許文献１０】Burtscher I, Christofori G (1999) The IGF/IGF-I receptor signaling pathway as a potential target for cancer therapy, Drug resistance updates 2:3-8
【非特許文献１１】Cairns J (1975) Mutation, selection and the natural history of cancer, Nature 255:197-200
【非特許文献１２】Chabner BA, Roberts TG Jr (2005) Timeline: Chemotherapy and the war on cancer, Nature Reviews Cancer 5:65-72
【非特許文献１３】Christofori G (2003) Changing neighbours, changing behaviour: cell adhesion molecule-mediated signalling during tumour progression, EMBO journal 22:2318-2323
【非特許文献１４】Christofori G (2006) New signals from the invasive front, Nature 441:444-450
【非特許文献１５】Cohen KL, Nissley SP (1976) The serum half-life of somatomedin activity: evidence for growth hormone dependence. Acta Endocrinol 83:243-258
【非特許文献１６】Collins MKL, Perkins GR, Rodrigueztarduchy G, et al (1993) Growth factors as survival factors regulation of apoptosis, BioEssays 16:133-138
【非特許文献１７】Cong L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339: 819-823.
【非特許文献１８】Crespi B, Summers K (2005) Evolutionary Biology of Cancer, Trends Ecol Evol 20:545-552
【非特許文献１９】Decock J, Thirkettle S, Wagstaff L, et al (2011) Matrix metalloproteinases: protective roles in cancer, J Cell Mol Med 15:1254-1265
【非特許文献２０】Deltcheva et al. (2011) CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471:602-607.
【非特許文献２１】Ding L, Ley TJ, Larson DE, et al (2011) Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing, Nature 481:506-510
【非特許文献２２】Donnenberg VS, Donnenberg AD (2005) Multiple drug resistance in cancer revisited: the cancer stem cell hypothesis, J Clin Pharmacol 45:872-877
【非特許文献２３】Downing JR, Roussel MF, Sherr CJ (1989) Ligand and protein kinase C downmodulate the colony-stimulating factor 1 receptor by independent mechanisms. Mol Cell Biol 9:2890-2896
【非特許文献２４】Driscoll WW, Pepper JW (2010) Theory for the evolution of diffusible external goods, Evolution 64:2682-2687
【非特許文献２５】Durai R, Yang WX, Gupta S, et al (2005) The role of the insulin-like growth factor system in colorectal cancer: review of current knowledge, Int J Colorectal Dis 20203-220
【非特許文献２６】Flaumenhaft R, Moscatelli D, Rifkin DB (1990) Heparin and Heparan Sulfate Increase the Radius of Diffusion and Action of Basic Fibroblast Growth Factor. The Journal of Cell Biology 111:1651-1659
【非特許文献２７】Flaumenhaft R, Rifkin DB (1992) The Extracellular Regulation of Growth Factor Action. Molecular Biology of the Cell 3:1057-1065
【非特許文献２８】Fowlkes JL, Thrailkill KM, George-Nascimento C, Rosenberg CK, Serra DM (1997) Heparin-binding, highly basic regions within the thyroglobulin type-1 repeat of insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins (IGFBPs) -3, -5, and -6 inhibit IGFBP-4 degradation . Endocrinology 138(6):2280-5
【非特許文献２９】Fukunaga R, Seto Y, Mizushima S, Nagata S (1990) Three different mRNAs encoding human granulocyte colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 87:8702-8706
【非特許文献３０】Gatenby R, Gillies RJ (2004) Why do cancers have high aerobic glycolisis?, Nature Reviews Cancer 4:891-899
【非特許文献３１】Gerhardt H, Golding M, Fruttiger M, et al (2003) VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia, J Cell Biol 161:1163-1177
【非特許文献３２】Goodwin RG, Friend D, Ziegler SF, Jerzy R, Falk BA, Gimpel S, Cosman D, Dower SK, March CJ, Namen AE, et al (1990) Cloning of the human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell 60:941-951
【非特許文献３３】Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al (2001) Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification, Science 293:876-880
【非特許文献３４】Gospodarowicz D, Cheng J (1986) Heparin protects basic and acidic FGF from inactivation. J Cell Physiol 128:475-484
【非特許文献３５】Gray PW, Barrett K, Chantry D, Turner M, Feldmann M (1990) Cloning of human tumor necrosis factor (TNF) receptor cDNA and expression of recombinant soluble TNF-binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A 87:7380-7384
【非特許文献３６】Greaves M (2007) Darwinian medicine: a case for cancer, Nature Reviews Cancer 7:213-221
【非特許文献３７】Greaves M, Maley CC (2012) Clonal evolution in cancer, Nature 481:306-313
【非特許文献３８】Grimberg A, Cohen P (2000) Role of insulin-like growth factors and their binding proteins in growth control and carcinogenesis, J Cellular Physiol 183:1-9
【非特許文献３９】Grunstein J, Masbad JJ, Hickey R, et al (2000) Isoforms of vascular endothelial growth factor act in a coordinate fashion To recruit and expand tumor vasculature, Mol Cell Biol 20:7282-7291
【非特許文献４０】Hawinkels LJ, Zuidwijk K, Verspaget HW, et al (2008) VEGF release by MMP-9 mediated heparan sulphate cleavage induces colorectal cancer angiogenesis, European Journal of Cancer 44:1904-1913
【非特許文献４１】Hazan RB, Phillips GR, Qiao RF, et al (2000), J Cell Biol 148:779-790
【非特許文献４２】Helmlinger G, Yuan F, Dellian M, Jain R K (1997) Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation, Nature Medicine 3:177-182
【非特許文献４３】Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, Fiddes JC, Klagsbrun M (1991) A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science 251:936-939
【非特許文献４４】Hintz RL (1990) Role of growth-hormone and insulin-like growth-factor-binding proteins. Horm Res 33:105-110
【非特許文献４５】Islam S, Carey TE, Wolf GT, et al (1996) Expression of N-cadherin by human squamous carcinoma cells induces a scattered fibroblastic phenotype with disrupted cell-cell adhesion, J Cell Biol 135:1643-1654
【非特許文献４６】Ito TK, Ishii G, Chiba H, Ochiai A (2007) The VEGF angiogenic switch of fibroblasts is regulated by MMP-7 from cancer cells, Oncogene 26:7194-7203
【非特許文献４７】Ito TK, Ishii G, Saito S, et al (2009) Degradation of soluble VEGF receptor-1 by MMP-7 allows VEGF access to endothelial cells, Blood 113:2363-2369
【非特許文献４８】Iwasa Y, Michor F (2011) Evolutionary Dynamics of Intratumor Heterogeneity. PLoS ONE 6(3) e17866. doi:10.1371/journal.pone.0017866
【非特許文献４９】Jinek MM. et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821.
【非特許文献５０】Johnson DE, Lee PL, Lu J, Williams LT (1990) Diverse forms of a receptor for acidic and basic fibroblast growth factors. Mol Cell Biol 10:4728-4736
【非特許文献５１】Jouanneau J, Moens G, Bourgeois Y, Poupon MF, Thiery JP (1994) A minority of carcinoma cells producing acidic fibroblast growth factor induces a community effect for tumor progression, Proc Natl Acad Sci USA 91:286-290
【非特許文献５２】Kadenhe-Chiweshe A, Papa J, McCrudden KW, et al (2008) Sustained VEGF blockade results in microenvironmental sequestration of VEGF by tumors and persistent VEGF receptor-2 activation, Mol Cancer Res 6:1-9
【非特許文献５３】Kim JJ, Tannock IF (2005) Repopulation of cancer cells during therapy: an important cause of treatment failure, Nature Reviews Cancer 5:516-525
【非特許文献５４】Klagsbrun M, Shing Y (1985) Heparin affinity of anionic and cationic capillary endothelial cell growth factors: analysis of hypothalamus-derived growth factors and fibroblast growth factors. Proc Natl Acad Sci U S A 82:805-809
【非特許文献５５】Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T, et al (2005) EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib, N Engl J Med 352:786-792
【非特許文献５６】Komarova NL, Wodarz D (2003) Evolutionary dynamics of mutator phenotypes in cancer: implications for chemotherapy, Cancer Research 63:6635-6642
【非特許文献５７】Lambert G, Estevez-Salmeron L, Oh S, et al (2011) An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues, Nature Reviews Cancer 11:375-382
【非特許文献５８】Lamm GM, Christofori G (1998) Impairment of survival factor function potentiates chemotherapy-induced apoptosis in tumor cells, Cancer Research 58:801-807
【非特許文献５９】Lee S, Jilani SM, Nikolova GV, et al (2005) Processing of VEGF-A by matrix metalloproteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors, J Cell Biol 169:681-691
【非特許文献６０】LeRoith D (1991) Insulin-like growth factors: molecular and cellular aspects, Boca Raton CRC press
【非特許文献６１】Li G, Satyamoorthy K, Herlyn M (2001) N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells, Cancer Research 61:3819-3825
【非特許文献６２】Mac Gabhann F, Ji JW, Popel AS (2006) Computational model of vascular endothelial growth factor spatial distribution in muscle and pro-angiogenic cell therapy, PloS Computational Biology 2:1107-1120
【非特許文献６３】Maley CC, Reid BJ, Forrest S (2004) Cancer prevention strategies that address the evolutionary dynamics of neoplastic cells: simulating benign cell boosters and selection for chemosensitivity, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 13:1375-1384
【非特許文献６４】Mali P. et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339:823-826.
【非特許文献６５】Marcon L, Fritz ME, Kurman CC, Jensen JC, Nelson DL (1988) Soluble Tac peptide is present in the urine of normal individuals and at elevated levels in patients with adult T cell leukaemia (ATL). Clin Exp Immunol 73:29-33
【非特許文献６６】Marraffini LA,  Sontheimer EJ (2010) Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature 463, 568
【非特許文献６７】Massague J (1990) Transforming growth factor-alpha. A model for membrane-anchored growth factors. J Biol Chem 265:21393-21396
【非特許文献６８】Merlo LMF, Pepper JW, Reid BJ, Maley CC (2006) Cancer as an evolutionary and ecological process, Nature Reviews Cancer 6:924-935
【非特許文献６９】Miller JC et al. (2010) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29:143-148.
【非特許文献７０】Moscatelli D (1987) High and low affinity binding sites for basic fibroblast growth factor on cultured cells: absence of a role for low affinity binding in the stimulation of plasminogen activator production by bovine capillary endothelial cells. J Cell Physiol 131:123-130
【非特許文献７１】Mosley B, Beckmann MP, March CJ, Idzerda RL, Gimpel SD, VandenBos T, Friend D, Alpert A, Anderson D, Jackson J, et al (1989) The murine interleukin-4 receptor: molecular cloning and characterization of secreted and membrane bound forms. Cell 59:335-348
【非特許文献７２】Nesse RM, Bergstrom CT, Ellison PT, et al (2010) Making evolutionary biology a basic science for medicine, Proc Natl Acad Sci USA 1071800-1807
【非特許文献７３】Novick D, Engelmann H, Wallach D, Rubinstein M (1989) Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J Exp Med 170:1409-1414
【非特許文献７４】Nowell PC (1976) The clonal evolution of tumor cell populations, Science 194:23-28
【非特許文献７５】Nozawa H, Chiu C, Hanahan D (2006) Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic switch in a mouse model of multistage carcinogenesis, Proc Natl Acad Sci USA 103:12493-12498
【非特許文献７６】Parker A, Clarke JB, Busby WH Jr, Clemmons DR (1996) Identification of the extracellular matrix binding sites for insulin-like growth factor-binding protein 5 . J Biol Chem 271(23):13523-9
【非特許文献７７】Pepper JW (2008) Defeating pathogen drug resistance: guidance from evolutionary theory, Evolution 62:3185-3191
【非特許文献７８】Pepper JW (2012) Drugs that target pathogen public goods are robust against evolved drug resistance, Evolutionary applications in press
【非特許文献７９】Pollak M (2008) Insulin and insulin-like growth factor signaling in neoplasia, Nature Reviews Cancer 12:915-928
【非特許文献８０】Pollak M (2012) The insulin and insulin-like growth factor receptor family in neoplasia: an update, Nature Reviews Cancer 12:159-169
【非特許文献８１】Raines EW, Ross R (1992) Compartmentalization of PDGF on extracellular binding sites dependent on exon-6-encoded sequences. J Cell Biol 116:533-543
【非特許文献８２】Rathjen PD, Toth S, Willis A, Heath JK, Smith AG (1990) Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternate promoter usage. Cell 62:1105-1114
【非特許文献８３】Reeve AE Eccles MR, Wilkins RJ, et al (1985) Expression of insulin-like growth factor-II transcripts in Wilms’ tumour, Nature 317:258-260
【非特許文献８４】Renehan AG, Zwahlen M, Minder C, et al (2004) Insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF binding protein-3, and cancer risk: systematic review and meta-regression analysis, The Lancet 363:1346-1353
【非特許文献８５】Rodriguez-Manzaneque JC, Lane TF, Ortega MA, et al (2001) Thrombospondin-1 suppresses spontaneous tumor growth and inhibits activation of matrix metalloproteinase-9 and mobilization of vascular endothelial growth factor, Proc Natl Acad Sci USA 98:12485-12490
【非特許文献８６】Roth MJ, Hu N, Emmert-Buck MR, et al (2001) Genetic progression and heterogeneity associated with the development of esophageal squamous cell carcinoma, Cancer Research 61:4098-4104
【非特許文献８７】Rubin R, Baserga R (1995) Biology of disease: insulin-like growth factor-1 receptor, Lab Invest 73:311-331
【非特許文献８８】Ruhrberg C, Gerhardt H, Golding M, et al (2002) Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis, Genes Dev 16:2684-2698
【非特許文献８９】Saksela O, Moscatelli D, Sommer A, Rifkin DB (1988) Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation. J Cell Biol 107:743-751
【非特許文献９０】Saksela O, Rifkin DB (1990) Release of basic fibroblast growth factor-heparan sulfate complexes from endothelial cells by plasminogen activator-mediated proteolytic activity. J Cell Biol 110:767-775
【非特許文献９１】Samani AA, Yakar S, LeRoith D, et al (2007) The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: overview and recent insights, Endocrine Reviews 28:20-47
【非特許文献９２】Schall TJ, Lewis M, Koller KJ, Lee A, Rice GC, Wong GH, Gatanaga T, Granger GA, Lentz R, Raab H, et al (1990) Molecular cloning and expression of a receptor for human tumor necrosis factor. Cell 61:361-370
【非特許文献９３】Scott J, Cowell J, Robertson ME, et al (1985) Insulin-like growth factor-II gene expression in Wilms’ tumour and embryonic tissues, Nature 317:260-262
【非特許文献９４】Siegel R, Naishadham D, Jemal A (2012) Cancer Statistics, 2012, CA Cancer J Clin 62:10-29
【非特許文献９５】Sommer A, Rifkin DB (1989) Interaction of heparin with human basic fibroblast growth factor: protection of the angiogenic protein from proteolytic degradation by a glycosaminoglycan. J Cell Physiol 138:215-220
【非特許文献９６】Stearns SC (2001) Evolution in health and disease, Q Rev Biology 76:418-432
【非特許文献９７】Stearns SC, Koella J (2008) Evolution in health and disease, Oxford University Press
【非特許文献９８】Stearns SC, Nesse RM, Govindaraju DR, et al (2010) Evolutionary perspectives on health and medicine, Proc Natl Acad Sci USA 107:1691-1695
【非特許文献９９】Stephan-Otto Attolini C, Michor F. (2009) Evolutionary Theory of Cancer. The Year in Evolutionary Biology 2009: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1168: 23-51.
【非特許文献１００】Suiter AM, Banziger O, Dean AM (2003) Fitness consequences of a regulatory polymorphism in a seasonal environment, Proc Natl Acad Sci USA 100:12782-12786
【非特許文献１０１】Symons JA, Duff GW (1990) A soluble form of the interleukin-1 receptor produced by a human B cell line. FEBS Lett 272:133-136
【非特許文献１０２】Tran NL, Nagle RB, Cress AE, et al (1999) N-cadherin expression in human prostate carcinoma cell lines - An epithelial-mesenchymal transformation mediating adhesion with stromal cells, Am J Pathol 155: 787-798
【非特許文献１０３】Trikha M, Corringham R, Klein B, Rossi JF (2003) Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cancer: a review of the rationale and clinical evidence. Clin Cancer Res 9: 4653-4665.
【非特許文献１０４】Uhlrich S, Lagente O, Lenfant M, Courtois Y (1986) Effect of heparin on the stimulation of non-vascular cells by human acidic and basic FGF. Biochem Biophys Res Commun 137:1205-1213
【非特許文献１０５】Vempati P, Popel AS, Mac Gabhann F (2011) Formation of VEGF isoform specific spatial distributions governing angiogenesis: computational analysis, BMC Systems Biology
【非特許文献１０６】Wang et al. (2013) One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153:910-918.
【非特許文献１０７】Wang TL, Diaz LA, Romans K, et al (2004) Digital karyotyping identifies thymidylate synthase amplification as a mechanism of resistance to 5-fluorouracil in metastatic colorectal cancer patients, Proc Natl Acad Sci USA 101:3089-3094
【非特許文献１０８】Weber W, Gill GN, Spiess J (1984) Production of an epidermal growth factor receptor-related protein. Science 224:294-297
【非特許文献１０９】Weinberg RA (2006) The Biology of Cancer, Garland Science
【非特許文献１１０】Xu X, Rao G, Quiros RM, Kim AW, Miao HQ, Brunn GJ, Platt JL, Gattuso P, Prinz RA (2007) In vivo and in vitro degradation of heparan sulfate (HS) proteoglycans by HPR1 in pancreatic adenocarcinomas. Loss of cell surface HS suppresses fibroblast growth factor 2-mediated cell signaling and proliferation . J Biol Chem 282(4):2363-73
【非特許文献１１１】Yee D, Paik SY, Lebovic GS, et al (1989) analysis of insulin-like growth factor-i gene-expression in malignancy - evidence for a paracrine role in human-breast cancer, Mol Endocrinol 3:509-517
【非特許文献１１２】Zapf J, Hauri C, Waldvogel M, Froesch ER (1986) Acute metabolic effects and half-lives of intravenously administered insulinlike growth factors I and II in normal and hypophysectomized rats. J Clin Invest 77:1768-1775
【非特許文献１１３】Zupan AA, Osborne PA, Smith CE, Siegel NR, Leimgruber RM, Johnson EM (1989) , Jr Identification, purification, and characterization of truncated forms of the human nerve growth factor receptor. J Biol Chem 264:11714-11720
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（１．産生物）
１つの実施形態においては、本発明は修飾癌細胞集団を含む医薬組成物であって、修飾癌細胞が、癌細胞の維持または成長を促進する１つまたはそれ以上の拡散性因子の産生を減少または消失させるよう修飾された癌細胞であることを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００１６】
好ましくは、修飾癌細胞は遺伝子修飾された修飾癌細胞である。
【００１７】
（２．方法）
（２．１．）
１つの実施形態においては、本発明は、癌細胞集団の成長速度を減衰させるかまたは癌細胞集団のサイズを縮小する方法であって、癌細胞集団が第１の細胞サブセットを含むことを特徴とし、第１の細胞サブセットが拡散性因子を第１の速度および第１の力価で産生することを特徴とし、拡散性因子が第１の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とし、方法が（ａ）第２の細胞サブセットが拡散性因子を第２の速度および第２の力価で産生することを特徴とし、拡散性因子が第２の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とし、第２の細胞サブセットにより産生される拡散性因子の全体的な効力が第１の細胞サブセットにより産生される拡散性因子の全体的な効力よりも低いことを特徴とする、第２の細胞サブセットを細胞集団に導入すること、（ｂ）細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合が低下し、これにより第１および第２の細胞サブセットによって産生される拡散性因子の複合効力が減少するよう、第１および第２の細胞サブセットを複製させることという段階を含み、それによって細胞集団の成長速度が減衰するかまたはそのサイズが縮小することを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
（２．２．）
他の実施形態においては、本発明は、癌細胞集団の成長速度を減衰させるかまたは癌細胞集団のサイズを縮小する方法であって、癌細胞集団が、第１の細胞サブセットが拡散性因子を第１の速度で産生することを特徴とする第１の細胞サブセット、および第２の細胞サブセットが第２の速度で拡散性因子を産生すること特徴とする第２の細胞サブセットを含むことを特徴とし、第２の速度が第１の速度よりも遅いことを特徴とし、拡散性因子が第１および第２の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とし、方法が（ａ）第２の細胞サブセットに第１の細胞サブセットに対する選択的優位性を付与すること、（ｂ）細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合が低下し、それにより第１および第２の細胞サブセットによる拡散性因子の複合産生速度が減速するよう、第１および第２の細胞サブセットを複製させることという段階を含み、それによって細胞集団の成長速度が減衰するかまたはそのサイズが縮小することを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
（２．３．）
本発明は、癌細胞集団の成長速度を減衰させるかまたは癌細胞集団のサイズを縮小する方法であって、癌細胞集団が、第１の細胞サブセットが拡散性因子を第１の速度および第１の力価で産生することを特徴とする第１の細胞サブセット、および第２の細胞サブセットが拡散性因子を第２の速度および第２の力価で産生することを特徴とする第２の細胞サブセットを含むことを特徴とし、第２の細胞サブセットにより産生される拡散性因子の全体的な効力が第１の細胞サブセットにより産生される拡散性因子の全体的な効力よりも低いことを特徴とし、拡散性因子が第１および第２の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とし、方法が（ａ）第２の細胞サブセットに第１の細胞サブセットに対する選択的優位性を付与すること、（ｂ）細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合が低下し、これにより第１および第２の細胞サブセットによって産生される拡散性因子の複合効力が減少するよう、第１および第２の細胞サブセットを複製させることという段階を含み、それによって細胞集団の成長速度が減衰するかまたはそのサイズが縮小することを特徴とする方法も提供する。
【００２０】
好ましくは、細胞集団中の第２の細胞サブセットの割合が増加しかつ細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合が減少するよう、第２の細胞サブセットに第１の細胞サブセットに対する選択的優位性が与えられる。好ましくは、細胞集団は実質的に第１の細胞サブセットおよび第２の細胞サブセットから構成される。
【００２１】
（２．４．）
さらなる実施形態においては、本発明は、癌細胞集団の成長速度を減衰させるかまたは癌細胞集団のサイズを縮小する方法であって、癌細胞集団が：第１の細胞サブセットが拡散性因子を第１の速度で産生することを特徴とし、拡散性因子が第１の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とする第１の細胞サブセットを含み、方法が（ａ）第２の細胞サブセットが拡散性因子を第２の速度で産生することを特徴とし、第２の速度が第１の速度よりも遅いことを特徴とし、かつ拡散性因子が第２の細胞サブセットの維持または成長を促進することを特徴とする、第２の細胞サブセットを細胞集団に導入すること、（ｂ）細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合が低下し、これにより第１および第２の細胞サブセットによって産生される拡散性因子の複合産生速度が減速するよう、第１および第２の細胞サブセットを複製させることという段階を含み、それによって細胞集団の成長速度が減衰するかまたはそのサイズが縮小することを特徴とする方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、方法は第２の細胞サブセットに選択的優位性を与えるという段階をさらに含む。好ましくは、第２のサブセットは拡散性因子を産生しないかまたはほとんど産生しない、すなわち第２の速度はゼロまたはほぼゼロである。好ましくは、細胞集団中の第２の細胞サブセットの割合は上昇しかつ細胞集団中の第１の細胞サブセットの割合は減少する。好ましくは、細胞集団は実質的に第１の細胞サブセットおよび第２の細胞サブセットから構成される。
【００２３】
（２．５．）
またさらなる実施形態においては、本発明は、癌細胞集団の成長速度を減衰させるかまたは癌細胞集団のサイズを縮小する方法であって、癌細胞集団が：それぞれが同じ拡散性因子を産生する複数の細胞を含み、拡散性因子が複数の細胞の維持または成長を促進することを特徴とし、かつ複数の細胞中の相異なる細胞が拡散性因子を１つまたはそれ以上の相異なる速度で産生することを特徴とし、方法が（ａ）複数の細胞のうち拡散性因子の産生の速度が低いかまたはその速度を低下させる細胞に選択的優位性を付与すること、（ｂ）複数の細胞のうち拡散性因子の産生速度が高いかまたはその速度が減速されていない細胞の割合が低下し、これにより複数の細胞による拡散性因子の全般的な産生速度が減速するよう、複数の細胞を複製させることという段階を含み、それによって細胞集団の成長速度が減衰するかまたは細胞集団のサイズが縮小することを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】たとえば成長因子（Ａ）などの拡散性因子は、１つまたはそれ以上のタンパク質（Ｂ）と結合することが可能であり、かつ両者は、（Ｅ）細胞外マトリクス（Ｄ）と結合できるかまたは（Ｆ）可溶である結合分子（Ｅ、Ｆ）と反応する結合ドメイン（Ｃ）を有することが可能である。
【図２】曲線はβ（ｘ）（実線）およびΔｂｊ（０からｎ−１までのｊの関数、離散値ｊについてのみ定義され；ｘ＝ｊ／ｎ；点線は見やすくするためのものである）を示す。平衡は、β（ｘ）が定数線ｃ（拡散性因子を産生するコスト／利益比）と交叉するところで認められ；ｃの値に相当する各線上で矢印はそのｃ値を有する系の進化ダイナミクスを示し、丸印は安定（黒丸）および不安定（白丸）平衡を示す。ここでは、利益はロジスティック関数ｂ（ｊ）＝１／［１＋ｅｎｓ（ｈ−ｊ／ｎ）］，ただしｓ＝５；ｎ＝３０、ｈ＝０．３または０．７で得られる。増加するｃは常に＋／＋の平衡度数の減少をもたらしかつ＋／＋の死滅にまで至ることに留意すること。また、＋／＋の度数が不安定平衡を下回るとき、＋／＋は集団から消失することにも留意すること。
【図３】異なるｃ値に対するｈ（ｎ＝３０，ｓ＝１）、ｓ（ｎ＝２０，ｈ＝０．５）、およびｎ（ｈ＝０．５，ｓ＝１）の関数としての＋／＋の平衡度数（実線：安定；破線；不安定）。
【図４】シミュレーションにおいて、変異−／−細胞（白）は＋／＋細胞（灰色）の集団を侵食しかつ＋／＋細胞を死滅に至らせることが可能である。ｄ＝３（拡散範囲）、ｃ＝０．０５（成長因子産生のコスト）、ｈ＝０．２（変曲点）、ｓ＝２０（利益関数の勾配）。
【図５】Ａ：十分に混合された集団のダイナミクス。太線：成長率（健全性）；点線：＋／＋の割合。ｎ＝１００、ｈ＝０．５、ｃ＝０．０５。＋／＋細胞の割合が２０％減少すると（１００世代目）、＋／＋の割合はゼロに低下する。Ｂ：立体的に構造化された集団のダイナミクス。臨界量の−／−細胞を導入することで集団を崩壊に導くことが可能である。プロットは経時的な度数および健全性を示す（太線は平均）。＋／＋細胞の初期割合が局部的に不安定内部平衡を下回る場合（例ｂ）、クローン選択は自然に−／−細胞の度数の上昇をもたらし、結果として必須成長因子の不足により腫瘍の崩壊をもたらし；そうでない場合（例ａ）、初期の平衡度数が持続する。確率論的更新、ｓ＝２０、ｈ＝０．７、ｃ＝０．１、ｄ＝５。
【図６】Ａ−Ｂ：十分に混合された集団のダイナミクス。太線：成長速度（健全性）；点線：＋／＋の割合；破線：変曲点の位置（ｈ）。Ａ：従来の手法では、たとえば利用可能な拡散性因子の量を減少させることにより変曲点の位置が上昇し；ここではｎ＝３０であり；拡散性因子の量は１００世代目で変曲点がｈ＝１５／３０からｈ＝２５／３０に移行するように減少し、また変化は１０世代で完了し：これが速やかな成長の減少をもたらス一方で、＋／＋の度数は速やかに増加し始め、また成長速度は最終的に初期レベルより少し高いレベルに戻る。変曲点が初期値ｈ＝１５／３０に戻るよう治療が中断される場合（２００世代目から１０世代）、成長がわずかに増加する一方で＋／＋の度数は元の値まで低下し、その後初期の成長速度が回復する。Ｂ：本特許に提案される手法は、たとえば利用可能な拡散性因子の量を上昇させることにより変曲点の位置（閾値）を低下させ；ここではｎ＝３０であり；１００世代目で変曲点がｈ＝１５／３０からｈ＝３／３０に移行する様態で拡散性因子の量が増加し、また変化は１０世代で完了し：これが速やかな成長の増加をもたらす一方で、＋／＋の度数は速やかに減少し始め、また成長速度は最終的に初期レベルと同様のレベルに戻る。変曲点が初期値ｈ＝１５／３０に戻るよう治療が中断されると（２００世代目から１０世代）、成長が急激に低下する一方で＋／＋の度数はわずかに上昇した後でほぼゼロまで低下する。いずれの場合もｃ＝０．０５であり；＋／＋の初期度数は０．９であった。Ｃ：立体的に構造化された集団のダイナミクス。プロットは、外因性拡散性因子を（ｔ２＝１で）提供することによる経時的度数と健全性を示し、閾値（ｈ＝０．７）は（ｈ＝０．３まで）低下し、その結果、＋／＋細胞の度数は新たな安定内部平衡に向かって低下する；外因性拡散性因子の提供が（ｔ３＝１で）中断すると、閾値は初期値（ｈ＝０．７）に戻り；＋／＋の割合がここで新たな（初期と同じ）不安定平衡を下回るので、＋／＋細胞は死滅する。ｓ＝２０、ｃ＝０．１、ｄ＝３。
【図７】Ａ．十分に混合された集団のダイナミクス。太線：成長率（健全性）；点線：＋／＋の割合；破線：１にスケールを合わせた群のサイズ（ｈ）。拡散性因子の拡散範囲は、１００世代目で群のサイズがｎ＝２０からｎ＝１００に増加する様態で拡張され、変化は２０世代で完了し：これにより速やかでわずかな成長の増加がもたされた一方で、＋／＋の度数は速やかに減少を開始し、かつ成長率も最終的に減少した。Ｂ．立体的に構造化された集団のダイナミクス。プロットは、相異なる拡散範囲の値（ｄ：成長因子の拡散範囲内の辺の数）およびｓ＝２０、ｈ＝０．５、ｃ＝０．１について＋／＋細胞の経時的な度数を示す（太線は平均）。
【図８】ＩＧＦ−ＩＩを産生しないインスリノーマ由来のβ細胞（−／−）は、十分なＩＧＦ−ＩＩの存在下で産生細胞（＋／＋）よりも良好に成長する。＋／＋細胞の成長は、外部ＩＧＦ−ＩＩにほぼ非依存的である。−／−β細胞は、＋／＋培養に由来する調製培地（「［＋／＋］」）では＋／＋β細胞より良好に成長するが、−／−培養に由来する調製培地（「［−／−］」）もしくは７％ＦＢＳ（「ＦＢＳ７」）または１０％ＦＢＳ（「ＦＢＳ１０」）を含有する成長培地では成長しない。プロットは中央値、２５％および７５％四分位値、最大最小範囲および外れ値を示し；アスタリスクはｔ検定による有意なｐ値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５）。
【図９】＋／＋β細胞の割合の関数としての成長速度（３実験の平均値）。予想されたように、β細胞の混合培養の実測成長速度（７日後、最小値に対する相対値）は＋／＋細胞の中間度数でピークとなり、純＋／＋株の成長率は純−／−株よりも高かった。プロットは平均、２５％および７５％四分位、および最大最小範囲を示す。
【図１０】Ａ：＋／＋および−／−β細胞の混合培養において、−／−細胞は追加的ＩＧＦ−ＩＩがなくとも成長し、経時的に度数が増加し、最終的に＋／＋細胞を駆逐した。Ｂ：−／−細胞のクラスターを純粋な＋／＋細胞に導入すると、−／−細胞の度数が増加し、最終的に培養中の＋／＋細胞を駆逐した。
【図１１】β細胞の＋／＋および−／−単層培養の経時的成長。２日毎に測定した。ＩＧＦ−ＩＩを添加しない場合、＋／＋細胞の度数（黒四角）は比較的一定した中間的レベルを保ち；０から２０日目にＩＧＦ−ＩＩを添加した場合、＋／＋細胞の度数（黒丸）は減少し；ＩＧＦ−ＩＩの提供を停止した場合＋／＋細胞の度数は初期値に戻らず；その代わり＋／＋は死滅した。結果として、外部ＩＧＦ−ＩＩの供給を中断した場合成長（白丸）は急激に低下した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
細胞集団は、そこにおいて細胞がクローン選択を受ける任意の組織である。当該細胞は、拡散性因子またはその作用に応答することのできるものである。好ましくは、細胞はヒト細胞である。当該集団は、一般に細胞の異常増殖によってもたらされる任意の組織（化性、異形成または新生物）となる。
【００２６】
一部の実施形態においては、細胞集団は、たとえば良性、前悪性（原位置癌腫）または悪性（癌）の腫瘍でありうる。たとえば、癌は癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病、胚細胞腫瘍または芽腫でありうる。集団の具体的な種類のリストは：急性リンパ芽球性（リンパ性）白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄（骨髄性）白血病、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、脳幹膠腫、乳癌、気管支腺腫、気管支カルチノイド、バーキットリンパ腫、骨髄癌、原発部位不明癌、カルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、原発部位不明癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞種、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞性腫瘍、体癌、子宮内膜癌、脳室上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍（肉腫）、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃カルチノイド、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部視覚伝導路膠腫、視床下部膠腫、眼内（眼）メラノーマ、眼内メラノーマ、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポシ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、リンパ腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、メルケル細胞皮膚癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体胚細胞腫テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新生物、形質細胞新生物、肺胸膜芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、原発部位不明肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚癌（非メラノーマ）、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂尿管移行上皮癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、視覚伝導路および視床下部膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍（腎臓癌）を含む。
【００２７】
発明の一部の実施形態においては、細胞集団は患者または対象に存在する。患者または対象は、化生、異形成、新生物、腫瘍、または癌、好ましくは本願に定義する癌または他の障害、最も好ましくは上記に定義する癌または他の障害の治療を受けていてもよい。
【００２８】
一部の実施形態においては、第２の細胞サブセット（例：修飾「非産生」癌細胞）は注射によって、好ましくは細胞集団（例：腫瘍）への直接注射によって標的細胞集団に挿入される。
【００２９】
一部の実施形態においては、細胞集団は異なる原発集団（上述のものなど）に由来する転移である。
【００３０】
一部の実施形態（転移癌など）においては、第２の細胞サブセット（例：修飾「非産生」癌細胞）は血流中への注射により間接的に標的細胞集団に挿入される。そのような修飾（−／−）癌細胞は、＋／＋癌細胞の存在下、すなわち転移部位においてのみ成長することができるので、さらなる独立した転移を形成することはできない。
【００３１】
本願で用いる用語「成長を減衰させる」は、細胞集団（例：腫瘍）の全般的な成長または成長速度を減速するか、または細胞集団（例：腫瘍）の全体的なサイズを縮小することを意味する。
【００３２】
一部の実施形態においては、細胞集団は異なる平均速度で拡散性因子を産生する少なくとも１つまたは２つの細胞サブセットを含む。
【００３３】
他の実施形態においては、細胞集団は複数の細胞を含む。
【００３４】
これらの細胞サブセットまたは複数の細胞は、拡散性因子またはその作用に応答することができる。細胞サブセットは異なる速度で拡散性因子を産生するさらなる細胞サブセットを含みうる。したがって、その拡散性因子産生速度に応じて順位付けすることのできる２つを上回る細胞サブセットがありうる。
【００３５】
サブセット（具体的には第１および／または第２のサブセット）の細胞は哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００３６】
細胞サブセットが細胞集団（例：腫瘍）に導入されることを特徴とする本発明の実施形態においては、細胞サブセットは細胞集団内からまたは他のサブセット内から自然に（例：変異により）発生したサブセットでありうる。一部の好ましい実施形態においては、細胞サブセットは、遺伝子において拡散性因子を産生するかまたは拡散性因子の産生に影響する遺伝子において（好ましくは、異なる拡散性因子を産生する複数の遺伝子において）少なくとも１つのヌクレオチドのたとえば欠失、挿入または置換によって（例：実験室内で）生成され、かつ最終的に細胞集団に導入されていることもある。好ましくは、前記細胞サブセットは、成長因子をコードするかまたはその産生を促進する１つまたはそれ以上の遺伝子を部分的にまたは完全に欠失させることによって、すなわちそのような遺伝子をノックアウトすることによって作製される。
【００３７】
一部の実施形態においては、導入された細胞サブセットは治療される患者または対象から得られ、たとえば細胞は自己由来細胞である。たとえば、導入された細胞サブセットは治療しようとする患者または対象から得てもよく、かつその後拡散性因子またはそのプロモーターをコードする遺伝子が、細胞内で産生される拡散性因子の量を減少させるかまたは拡散性因子の力価または効力を減少させる様態で変異させられる（例：１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって）。他の実施形態においては、拡散性因子またはそのプロモーターをコードする遺伝子の全てまたはほとんど全てが欠失するかまたはノックアウトされる。
【００３８】
「非産生体」は、拡散性因子をコードするかまたはその発現を促進する遺伝子が部分的または完全な欠失によりノックアウトされたために、前記拡散性因子を産生しないか、他の細胞サブセットよりも低い速度で拡散性因子を産生する細胞サブセットを意味する。非産生体を規定する修飾は、細胞の少なくとも１つのゲノム部位における少なくとも１つのヌクレオチド塩基の付加、欠失または置換であってもよく、そのような修飾によって、細胞が、拡散性因子を産生する（またはその産生を促進する）少なくとも１つの遺伝子の発現を欠損することを特徴とする。好ましくは、それぞれが異なる拡散性因子の産生を担う複数の遺伝子が同じ細胞核内で修飾され；そのような細胞株はその後複数の拡散性因子の産生を欠損するであろう。我々の「非産生細胞」の定義は、ｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉または外因性ＤＮＡの付加による他の同様の遺伝子操作の方法によって修飾された細胞を含まない。
【００３９】
拡散性因子は少なくとも１部の細胞サブセットによって生成される因子であり、各サブセットは異なる速度で拡散性因子を産生しうる。産生細胞から離れて拡散することができるか、またはその効果がそれを産生する細胞によって制限されない分子である。一部の実施形態においては、拡散性因子は細胞サブセットまたは複数の細胞の生存および増殖に直接的作用を示し；他の実施形態においては、細胞サブセットまたは複数の細胞に対して間接的作用を示す。たとえば、これらの細胞に対して防御作用（たとえばアポトーシスに対して）または成長刺激作用を示すことがある。他の実施形態においては、拡散性因子は直接的な競合関係にない細胞集団に対して作用を示す。たとえば、拡散性因子はこれらの細胞に対して防御（たとえばアポトーシスに対して）または成長刺激作用を示すことがある。そのような細胞は、たとえば酸素またはエネルギー源といった栄養素または生存または増殖を促進するその他の拡散性因子を提供することにより細胞サブセットの成長を間接的に促進しうる。
【００４０】
「因子」は、たとえば細胞分裂、細胞の成長、アポトーシスに対する抵抗性、または免疫系反応に対する抵抗性を促進することなどにより、細胞の健全性を促進する、細胞によって産生される任意の分子である。因子は、その効果がそれを産生する細胞に限定されない場合「拡散性」であると言われる。拡散性因子は、たとえば、成長因子、インターロイキン、サイトカインまたはカドヘリンでありうる。好ましくは、拡散性因子は成長因子である。
【００４１】
因子は、因子それ自体を産生する細胞とは異なる他の細胞との相互作用を介して細胞の健全性を促進することもある。そのような他の細胞の例は間質細胞（または「間質」）、すなわち、腫瘍発生前の正常組織実質に存在するかまたは遠隔部位から動員された（すなわち循環または骨髄）非癌細胞である。「動員」または「活性化」は、癌細胞自体が産生する拡散性因子によってこれらの細胞が癌細胞のより近い近傍に移動するか、または癌細胞に影響することを意味する。間質細胞の例は癌関連線維芽細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、およびＴ細胞およびＢ細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、間葉系幹細胞および他の骨髄由来細胞を含む免疫／炎症細胞を含む。間質細胞は、細胞または栄養素の供給を通じてかまたは成長因子、ホルモンおよびサイトカインのような多様な拡散性因子を提供することにより腫瘍細胞の増殖を刺激する。
【００４２】
表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のような一部の拡散性因子は、腫瘍細胞をアポトーシスから保護し、かつそれにより生存因子として作用することが示されている［Baserga 1994, Collins et al. 1993; Lamm & Christofori 1998, Le Roith 1991, Yee et al. 1989 Scott et al. 1985 Reeve et al. 1985; Rubin et al. 1995, Baserga et al. 1997, Burtscher & Christofori 1999, Grimberg & Cohen 2000, Renehan et al. 2004, Durai et al. 2005; Pollak 2008, 2012, Samani et al. 2007］。腫瘍細胞によって分泌される血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は新たな血管の成長を刺激するが、血管新生を誘導しなければ腫瘍は約２ｍｍ以上に成長できないなど［Baeriswyl & Christofori 2009］、毛細血管からの酸素の拡散は範囲が限定されているので［Helmlinger et al. 1997］、これは腫瘍の成長にとって不可欠である。Ｆａｓリガンド分子（ＦａｓＬ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびトランスフォーミング成長因子β型（ＴＧＦ−β）は、多様な様態で（たとえばリンパ球のアポトーシスを誘導することにより）癌細胞を免疫系から防御する［Weinberg 2006］。上皮−間葉系転移および血管内異物侵入に至る移動（転移の第１段階）［Christofori 2006]を促進する拡散性分子は、Ｎ−カドヘリン[Christofori 2003, Islam et al. 1996, Tran et al. 1999, Hazan et al. 2000, Li et al. 2001］、細胞外マトリクスを変化させるメタロプロテイナーゼ、および多様な成長因子：トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ｂ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）［Jouanneau et al. 1994, Christofori 2006］を含む。
【００４３】
拡散性因子の非排他的リストは：ケモカイン：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１／ＫＣ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８／ＩＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ＿）：ＴＮＦＡ、リンホトキシン（ＴＮＦＢ／ＬＴＡ、ＴＮＦＣ／ＬＴＢ）、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ４０ＬＧ、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＥＤＡ；インターロイキン（ＩＬ＿）：ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＫ、ＩＦＮＷ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１Ａ／ＩＬ１Ｆ１、ＩＬ１Ｂ／ＩＬ１Ｆ２、１Ｒａ／ＩＬ１Ｆ３、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１Ｆ１０、３３／ＩＬ１Ｆ１１、１８／ＩＬ１Ｇ、ＩＬ１７／ＩＬ２５（ＩＬ１７Ａ）、ＣＳＦ１（マクロファージコロニー刺激因子）、ＣＳＦ２（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチン）、ＣＳＦ３（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ、フィルグラスチム）；内皮成長因子、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＧＦ；上皮成長因子、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン−２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン−３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン−４（ＮＲＧ４）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ＿）：ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３；神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）；血小板由来成長���子（ＰＤＧＦ＿）：ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ；ランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−）：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、骨形成因子（ＢＭＰ＿）：ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５；増殖分化因子（ＧＤ＿）：ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ミオスタチン／ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５；ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ；アディポカイン：ケメリン、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、プラスミノーゲン活性化阻害因子−１（ＰＡＩ−１）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、ビスファチン、レプチン、アディポネクチン、アペリン；Ｗｎｔ：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６；ヘッジホグタンパク質：ＤＨＨ、ＩＨＨ、ＳＨＨ；ソマトメジン：ソマトメジンＡ（インスリン様成長因子２）、ソマトメジンＢ、ソマトメジンＣ（インスリン様成長因子１）；セマフォリン（ＳＥＭＡ３Ａ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＭＡ３Ｆ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｃ、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＳＥＭＡ４Ｆ、ＳＥＭＡ４Ｇ、ＳＥＭＡ５Ａ、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡ６Ａ、ＳＥＭＡ６Ｂ、ＳＥＭＡ６Ｃ、ＳＥＭＡ６Ｄ、ＳＥＭＡ７Ａ）；インターフェロン：ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７；エンドセリン（ＥＤＮ１  ＥＤＮ２  ＥＤＮ３）；ＣＣＮ細胞間シグナルタンパク質：ＣＣＮ１（ＣＹＲ６１、システインリッチ血管新生誘導因子６１）、ＣＣＮ２（ＣＴＧＦ、結合組織細胞成長因子）、ＣＣＮ３（ＮＯＶ、腎芽腫過剰発現タンパク質）、ＣＣＮ４（ＷＩＳＰ１、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−１）、ＣＣＮ５（ＷＩＳＰ２、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−２）、ＣＣＮ６（ＷＩＳＰ３、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝導経路タンパク質−３）を含む。
【００４４】
因子結合タンパク質は拡散性因子と結合する分子でありかつ細胞外マトリクス（ＥＣＭ）との結合などの新たな特異的特性を因子に付与しうる。これらの結合タンパク質は独立した遺伝子の産生物であることも、あるいは成長因子前駆体の一部であることも可能である［図１］。
【００４５】
ＥＣＭ結合ドメインは、たとえばプロテオグリカン（たとえばヘパリン、ヘパラン硫酸などのヘパラン硫酸プロテオグリカンであるが、またコンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸でもある）［Fowlkes et al. 1997, Baird et al 1998, Higashiyama 1991, Raines and Ross 1992］によって生成される、拡散性因子内または拡散性因子と結合する結合タンパク質内のドメインと結合する［Massague 1990］、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）［図１］中の分子または膜貫通領域である．
【００４６】
因子結合ドメインは拡散性因子の一部であるか、またはＥＣＭの結合ドメインと反応する因子結合タンパク質である［図１］。いくつかの成長因子は、ＥＣＭ中でプロテオグリカン（たとえばヘパリン）と強く結合するので、細胞外微小環境においてあまり拡散性でない［Flaumenhaft & Rifkin 1992, Klagsburn and Shing, 1985; Gospodarowicz and Cheng, 1986; Saksela et al., 1988; Sommer and Rifkin, 1989; Saksela and Rifkin, 1990; Uhlrich et al., 1986］。
【００４７】
拡散性因子は、産生細胞から拡散するという事実によって、またはその効果が産生細胞の外部に拡張するという事実によって定義される。因子の拡散範囲内、または因子の作用領域内の細胞は、因子の産生によって利益を受ける。したがって、拡散範囲は因子の産生から利益を受ける細胞（群）の数を規定する。
【００４８】
第１の細胞サブセットは拡散性因子を第１の速度で産生しかつ第２の細胞サブセットは同じ拡散性因子を第２の速度で産生し、第１の速度が第２の速度よりも大きいことを特徴とする。第２の細胞サブセットによる拡散性因子の産生速度はゼロまたはほぼゼロであることもありえ、すなわち第２の細胞サブセットが拡散性因子を産生しないこともある。より一般的には、２種類を上回る細胞がある場合、各種類は拡散性因子を異なる速度で産生することがあり、かつ速度はゼロでありうる。代替的な場合、速度は同等であるか、または第１の細胞サブセットは因子を同等かまたはより速い速度であるがより低いコストで産生することもある。
【００４９】
全般的に、「より低い」速度は、拡散性因子が細胞に示す全般的効果に対するより低い寄与を意味する。これは、単位時間毎に産生される因子の量がより低いことによる可能性もあるが、またたとえば産生される因子の効果がより低い（すなわちより低い効力または力価を有する）という事実による可能性もある。
【００５０】
したがって、本発明の一部の実施形態においては、第１の細胞サブセットは拡散性因子を第１の速度および第１の力価で産生しかつ第２の細胞サブセットは拡散性因子を第２の速度および第２の力価で産生し、第２の細胞サブセットによって産生される拡散性因子の全体的な効力が第１の細胞サブセットによって産生される拡散性因子の全体的な効力よりも低いことを特徴とする。この文脈において、用語「力価」はその細胞サブセットによって産生されている個々の拡散性因子分子の強度または有効性を意味する。用語「全体的な効力」は、それらの個々の拡散性因子分子の力価と個別の細胞サブセットによって産生される速度の組み合わせの尺度である。
【００５１】
本方法はインビボかまたはエクスビボで遂行しうる。好ましくは、修飾細胞を腫瘍に導入する方法はインビボで遂行されるであろう。好ましくは、細胞を（遺伝子）修飾する方法はエクスビボで遂行されるであろう。
【００５２】
患者または対象が治療される本発明の実施形態においては、患者または対象は好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。
【００５３】
第１および第２の細胞サブセットまたは複数の細胞は、複製または進化させるかまたはクローン選択を受けさせる。このプロセスの間、拡散性因子によって付与される選択的優位性から利益をより多く受ける細胞は、選択的優位性から利益を受けない細胞よりもより速く複製するかまたはより速く成長する。その結果、細胞集団のうち選択的優位性から利益を受けない細胞の割合は減少するであろう。
【００５４】
集団中の細胞は互いに空間およびリソースについて競合し；細胞が複製する際には、他の細胞と競合するその能力により細胞は多かれ少なかれその隣接細胞を犠牲にして存続するかまたは死滅する可能性があり；この組織内の細胞間の自然淘汰のプロセスはクローン選択と呼ばれる。
【００５５】
細胞または細胞の種類は、他の細胞または細胞種よりも高い健全性（高い複製速度、または高い生存確率）を有することがある。この意味では、その細胞または細胞種はクローン選択のプロセスにおいて選択的優位性を有する。選択的優位性は、一般的に、第２の細胞サブセットに付与される、第１のサブセットに対する健全性の優位性となる。２種類を上回る細胞種がある場合、健全性のより高い細胞は、健全性のより低い他の種類の細胞に対して選択的優位性を有する。そのような選択的優位性は、好ましくは恒久的であるが必ずしもそうではない。本方法の好ましい実施形態においては、選択的優位性は恒久的でありかつ細胞集団は「非産生体」が「産生体」を完全にまたはほぼ完全に駆逐する状態に進化する。本方法の他の実施形態においては、選択的優位性は一過性でありかつ細胞集団は異なる種類の細胞が共存する状態に進化する。一般的に、選択的優位性は成長の優位性である。換言すると、選択的優位性を有する細胞サブセットはより成長および分裂し、それゆえ第１の細胞サブセットを犠牲にして個数が上昇する。選択的優位性は、アポトーシスまたは免疫系反応を生き延びる可能性がより高いことにもよる可能性もある。一部の実施形態においては、用語「第２の細胞サブセットに優位性を付与する」は、拡散性因子のダイナミクスを修飾することを意味する。
【００５６】
好ましくは、選択的優位性は、１つまたはそれ以上の細胞サブセットの割合を直接増加させることによって、すなわち、大量の非産生細胞を集団に導入することによって、または修飾細胞においてその遺伝子がノックアウトされている拡散性因子の量を一時的に増加させることによって、誘導される。
【００５７】
（根拠）
細胞が拡散性因子を産生する細胞集団を考察されたい。拡散性因子を産生する細胞種を＋／＋と呼びかつその拡散性因子を産生しないか、または＋／＋細胞種よりも低い量で産生する変異型細胞種を−／−と呼ぼう。本発明は、細胞集団において、−／−の細胞種が＋／＋の細胞種に対して選択的優位性を有し、かつそれにより度数を高めることになる条件を誘導することを目標とし；これは拡散性因子の産生の減少、およびその結果、細胞集団全体の増殖の減少に至るであろう。このプロセスが機能するメカニズムは以下に記載する通りである。
【００５８】
同じメカニズムが、２種類がいずれも拡散性因子を産生するが＋／＋型が−／−型よりも高い速度で拡散性因子を産生する場合に該当することに留意することが重要である。さらに、この節で説明するように、細胞種（２つを上回る）の連続体があり、それぞれが異なる速度で拡散性因子を産生する場合に同じ論理が該当し；この場合に細胞毎に産生される拡散性因子の割合は２種類の場合の＋／＋型の割合と同等である。したがって、以下の考察は、２種類のみについて説明される一方で、細胞種の連続体がある類似した状況を記載することも意図される。
【００５９】
拡散性因子の拡散範囲はｎ個の細胞の群を定義する。各細胞は２つのうち１つの戦略、すなわち拡散性因子の産生に寄与するか（寄与体＋／＋）または寄与しないか（非寄与体−／−）を採用することができる。寄与する細胞はｃ＞０で示されるコストを支払う。全細胞に対する利益ｂ（ｊ）は、寄与体の数ｊの増加関数、すなわちΔｂｊ＝ｂ（ｊ＋１）−ｂ（ｊ）＞０、ただしｊ＝０，……，ｎ−１である。したがって、大きく十分に混合された集団における寄与体および非寄与体の完全性は、それぞれ次式で得られる。
【数１】
0006410237.tif 000002
ただし０≦ｘ≦１は細胞集団中の＋／＋細胞の割合である。この系のレプリケーターダイナミクスは次式で与えられる。
ｘ’＝ｘ（１−ｘ）［β（ｘ）−ｃ］    （１）
ただしこの式では健全性の差π＋／＋（ｘ）−π−／−（ｘ）はβ（ｘ）−ｃの形で表され、かつ
【数２】
0006410237.tif 000003
はｘについて連続微分可能である。レプリケーターダイナミクス（１）には２つの自明な静止点ｘ＝０およびｘ＝１があり；選択の勾配を０に設定することでさらに内部静止点が得られる可能性があり；それは以下の方程式の根による。
β（ｘ）−ｃ＝０    （３）
【００６０】
一般的に、利益関数はＳ字型をとる（任意のｊ＊＜ｎに対し、ｊ≦ｊ＊→Δｂｊ＋１≧Δｂｊ、ｊ＞ｊ＊→Δｂｊ＋１≦Δｂｊ）。β（ｘ）は係数Δｂｊ＝ｂ（（ｊ＋１）／ｎ）−ｂ（ｊ／ｎ）のバーンスタイン多項式であることに留意されたい。このことは、（バーンスタイン多項式の単峰性の維持により）β（ｘ）が（０，１）で唯一の最大値ｘ＊を有するという意味を含む。さらに、端点条件β（０）＝Δｂ０およびβ（１）＝Δｂｎ−１を満たす。したがってΔｂ０＜ｃであるときかつそのときに限りｘ＝０は（１）の安定静止点であり、かつΔｂｎ−１≧ｃであるときかつそのときに限りｘ＝１は（１）の安定静止点であるということになる。さらに、任意の内部安定静止点ｘ（Ｓ）は（３）およびβ’（ｘ（Ｓ））＜０を満たさなければならない。したがって、単峰性により、高々１つの内部安定静止点ｘ（Ｓ）があり、かつそのような静止点が存在するのであればそれはｘ＊＜ｘ（Ｓ）＜１を満たす。これらの結論から以下の５種類のダイナミクスが定義され［図２］、式中β＊＝β（ｘ＊）と定義することにより記号の使用法を単純化する：
●ｃ＞β＊であれば、β（ｘ）＜ｃ∀ｘ、かつｘ＝０がただ１つの安定平衡となる。
●ｃ＜Ｍｉｎ［Δｂ０，Δｂｎ−１］であれば、β（ｘ）＞ｃ∀ｘであり、かつｘ＝１がただ１つの安定平衡となる。
●Ｍｉｎ［Δｂ０，Δｂｎ−１］＜ｃ＜Ｍａｘ［Δｂ０，Δｂｎ−１］かつΔｂ０＜Δｂｎ−１であれば、ｘ＞ｘ（Ｕ）についてβ（ｘ）＞ｃかつｘ＜ｘ（Ｕ）についてβ（ｘ）＜ｃ；したがって唯一の内部不安定平衡ｘ（Ｕ）により２つの安定平衡ｘ＝１およびｘ＝０の吸引流域が分割される。
●Ｍｉｎ［Δｂ０，Δｂｎ−１］＜ｃ＜Ｍａｘ［Δｂ０，Δｂｎ−１］でありかつΔｂ０＞Δｂｎ−１であれば、ｘ＜ｘ（Ｓ）についてβ（ｘ）＞ｃかつｘ＞ｘ（Ｓ）についてβ（ｘ）＜ｃであり；したがって、唯一の内部安定平衡ｘ（Ｓ）により２つの不安定平衡ｘ＝１およびｘ＝０の吸引領域が分割される。
●Ｍａｘ［Δｂ０，Δｂｎ−１］＜ｃ＜β＊であればｘ（Ｕ）＜ｘ＜ｘ（Ｓ）についてβ（ｘ）＞ｃである一方、ｘ＜ｘ（Ｕ）およびｘ＞ｘ（Ｓ）についてβ（ｘ）＜ｃである；したがって内部不安定平衡ｘ（Ｕ）により２つの安定平衡ｘ＝０およびｘ＝ｘ（Ｓ）の吸引領域が分割される。
【００６１】
これは、任意のＳ字利益関数のダイナミクスを特徴付ける［図２］。
【００６２】
この度数依存的選択により新生物の不均一性が説明される。不均一性を維持するこのメカニズムはこれまで報告されたことがないことに留意されたい。この主題に関する最新の報告では言及されていない［Iwasa & Michor 2011］。実際、進化と癌に関する最近の総説［Stephan-Otto Attolini & Michor 2009］では、「度数依存的な健全性の検討からはさらなる評価可能な洞察にたどり着けず、また不必要な複雑性があるので無視すべきである」と述べている。
【００６３】
さらに、バーンスタインの定理により、多項式β（ｘ）は［０，１］でそのバーンスタイン係数に一様に収束することが分かっている。さらに、Δｂｊ，ｎは幅１／ｎの利益関数の前進差分であり、ｎが十分に大きければΔｂｊ，ｎ≒（１／ｎ）ｂ’（ｊ／ｎ）となる。任意のｘについて、この式の右辺に現れる無作為変数ｊ／ｎはｘに確率収束する。したがって、ｎが十分に大きければ、
ｂ’（ｘ）−ｃｎ＝０    （４）
から平衡を確認できる。
【００６４】
Ｓ字関数がロジスティック関数ｂ（ｊ）＝１／［１＋ｅｓ（ｋ−ｊ）］である場合、利益関数はｂ（ｊ）＝１／［１＋ｅｎｓ（ｈ−ｊ／ｎ）］、ただしｈ＝ｋ／ｎと書き換えることが可能となり、（４）したがって以下の平衡度数が得られ：
【数３】
0006410237.tif 000004
ただし安定平衡についてはｘ（Ｓ）（ｈ，ｓ）＝ｘ−（ｈ，ｓ）かつ不安定平衡についてはｘ（Ｕ）（ｈ，ｓ）＝ｘ＋（ｈ，ｓ）であり、ｃ＞Ｂ（ｈ）を維持する場合ｃ＜ｓ／４であり、Ｂ（ｈ）＝ｂ（ｎ）−ｂ（０）である。後者の条件が満たされない場合はｘ＝１が静止点となり；前者が満たされない場合はｘ＝０が唯一の安定静止点となる［図２］。本議論は任意のＳ字関数に該当し、かつ本願ではロジスティック関数を例としてのみ用いることに留意されたい。
【００６５】
細胞群のサイズｎにおける産生体＋／＋の安定平衡度数が低下すること、すなわち拡散性因子の拡散範囲が低下すること；また拡散性因子の産生への寄与である費用／利益比ｃおよび変曲点の位置ｈも低下することに留意されたい［図３］。したがって、一定の条件下においては、−／−は固定する場合もあること［図２］にも留意されたい。−／−が固定しない場合でも＋／＋の平衡度数を減少させたいかもしれない。次節では、ｎ、ｃまたはｋをどのように変更するか、および系が安定平衡ｘ＝０に至るか、または安定平衡ｘ（Ｓ）を減少させることができるためにはダイナミクスをどのように変化させるかを説明する。これらの結果の一部は十分に混合された細胞集団を前提としているものの、（インシリコおよびインビトロの結果で示すように）構造化された細胞集団を考察する場合も結果は同様となる。
【００６６】
最後に、我々は２種類の細胞のみがあると仮定しているもの、我々の近似ダイナミクスの安定静止点は、寄与するか否かを選択するのではなく、全ての細胞が寄与レベルｘ∈［０，１］を選択するダイナミクスの厳密な対称ナッシュ均衡に該当する。寄与体が割合ｘを有することの利益が、ｂ（ｊ）をすべてのｘ∈［０，１］に拡張したｂ（ｘ）である、寄与細胞集団ｘ中の寄与変異体ｘｍを考察されたい。変異体の健全性はｂ（ｘｍ，ｘ）＝ｂ（ｘｍ／ｎ＋（ｎ−１）ｘ／ｎ）−ｃｘｍでありかつ平衡は条件∂ｂ（ｘｍ，ｘ）／∂ｘｍ＝０および∂２ｂ（ｘｍ，ｘ）／∂２ｘｍ＜０で表される。第１の条件は我々の式（４）に等しい。換言すると、我々の分析は、大きなｎについて、２つの細胞種を有する系のダイナミクスを細胞種の連続体を有する系のダイナミクスと置き換えることができることが確認されると解釈される。
【００６７】
（方法および産生物）
発明の好ましい実施形態は、細胞の生存または増殖を促進する成長因子または他の拡散性因子をコードする遺伝子をノックアウト（すなわち完全にまたは部分的に欠失させる）することによって修飾される癌細胞であって、前記修飾細胞における前記因子の産生速度、またはその力価または効力が減少する癌細胞を含む。好ましくは、そのような細胞は１つまたはそれ以上のそのような因子についてノックアウトされる。本発明の代替的な実施形態においては、癌細胞は前記因子をコードするかまたはその産生を促進する遺伝子中の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって遺伝子修飾されるので、前記修飾細胞において前記因子の産生速度、またはその力価または効力が減少する。
【００６８】
前記修飾は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを用いてＲＮＡガイド部位特異的ゲノム編集を可能とする、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文配列）などの既存の技術（Deltcheva et al. 2011, Jinek et al. 2012, Marrafini and Sontheimer, 2010, Mali et al. 2013, Cong et al. 2013, Wang et al. 2013）、またはＤＳＢを誘導する特異なゲノム配列を認識部位で回裂し、その後修復ミスの多いＮＨＥＪによって修復されて遺伝子機能の喪失およびそれによるノックアウトがもたらされるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に基づくＴＡＬＥＮ技術などの他の方法を用いて遂行することが可能である。
【００６９】
本方法の好ましい実施形態においては、そのような修飾「非産生」細胞サブセットは、実験室において、たとえば細胞のゲノムの少なくとも１つの部位（好ましくはそれ以上の部位）における少なくとも１つのヌクレオチド塩基の欠失、挿入または置換によって既存の細胞を修飾することにより作製され、そのような修飾によって細胞が拡散性因子を産生するかその産生を促進する少なくとも１つの遺伝子の発現が欠損することを特徴とし；そのような細胞サブセットは最終的に癌細胞集団に導入される。代替手段においては、そのような「非産生」細胞サブセットは細胞集団中に自然発生する。
【００７０】
本方法の好ましい実施形態においては、「非産生体」に与えられた選択的優位性は恒久的でありかつ細胞集団は「非産生体」が「産生体」を完全にまたはほぼ完全に駆逐する状態に進化する。本方法の代替的実施形態においては、選択的優位性は一過性でありかつ細胞集団は異なる種類の細胞が共存する状態に進化する。
【００７１】
「非産生」細胞に所望の選択的優位性を与えるための好ましい方法は、細胞集団（例：腫瘍）に十分な個数の前記細胞を注射することにより集団中の前記細胞の個数を増加させることである。
【００７２】
代替的または追加的な方法は、所与の利益を達成するために細胞によって必要とされる因子の量を一時的に高めること、すなわち、５節に定義するパラメータｈ（またはｋ）の値を高めることである。
【００７３】
代替的または追加的な方法は、拡散性因子の拡散範囲を増大させることである。
【００７４】
方法は、好ましくは細胞集団の成長が減衰するのに十分な時間、細胞集団が成長することを可能とする段階を含みうる。
【００７５】
（１．「非産生体」を注射することにより「非産生体」の割合を直接高める）
一部の好ましい実施形態においては、第２の細胞サブセットに優位性を付与することは、細胞集団に一定量の「非産生体」を直接添加することによって達成される。細胞を添加することは、標準的な技法で細胞を注射することによって行うことができる。５節で説明される様に、産生体の度数が内部不安定平衡を下回る場合、細胞群は＋／＋細胞が死滅に至る安定平衡まで進化する。安定内部平衡にある細胞集団は、臨界量の−／−細胞を導入することにより、この安定平衡の吸引領域に至ることができる。一旦これらの−／−細胞が導入されると、＋／＋細胞の度数は安定平衡ｘ＝０の吸引領域内となり、またそれにより自然にその平衡に進化する［図２］。
【００７６】
（２．追加的可溶性因子を一時的に添加する）
一部の実施形態においては、第２の細胞サブセットに優位性を付与することは、その遺伝子を欠失させた可溶性因子を添加し、それにより生存および増殖のために細胞によって産生されなければならない拡散性因子の量を制限された時間の間減少させることにより達成される。この後、増加前と同様のレベルに戻す。５節に示す様に、産生体の平衡度数は閾値（５節のｈまたはｋ）の減少関数である。それを減少させることにより産生体の平衡度数が減少する。この方法の好ましい実施形態においては、細胞集団はこの新たな閾値ｈ１の元で新たな安定平衡ｘＳ１に到達することができ、かつこのｘＳ１は初期閾値ｈ０の元での不安定平衡ｘＵ０よりも低い。その後、閾値は突如として初期値ｈ０と同様のレベルに再び戻る。この閾値ｈ０の元で、細胞集団はここでｘ＝０安定平衡に進化するであろう。閾値を減少させる１つの方法は、追加的な外因性可溶性拡散性因子を添加することによる。反対に、現行の治療法は成長因子の量を減少させようと試みることに留意されたい。外因性拡散性因子を添加することにより、同じ生存および増殖レベルを達成する内因性因子を産生するのに必要な細胞の割合が減少する。５節に説明する様に、これはより低い産生体の度数と平衡に達するであろう。外因性拡散性因子は腫瘍の成長速度を高めるので、産生体の新たな安定度数ｘＳ１が初期の閾値レベルで産生体の不安定度数ｘＵ０よりも低くなったら速やかにこの手順を中断することが望ましい。これが起こった時点で外因性拡散性因子の提供を停止すべきであり、かつ全集団が安定平衡ｘ＝０に進化するであろう。
【００７７】
（３．拡散性因子の拡散範囲の拡大）
一部の実施形態においては、第２の細胞サブセットの優位性は、拡散性因子拡散範囲の拡張によって誘導される。５節に説明される様に、これは群サイズの増加と等価であり、産生体の消滅に至るか、産生体が非産生体と共存する場合には産生細胞の平衡度数の低下に至ることがある。拡散性因子の拡散範囲は多くの様態で拡大しうる。この例は以下のものを含む：
３ａ：細胞外マトリクス上の結合分子を破壊する
３ｂ：拡散性因子上の結合ドメインを破壊する
３ｃ：因子の半減期を延長する因子結合タンパク質を添加する
３ｄ：弱い結合ドメインを有する因子結合タンパク質を添加する
３ｅ：可溶性結合ドメインを添加してＥＣＭ結合分子を飽和させる
３ｆ：可溶性結合分子を添加して因子上の結合ドメインを飽和させる
３ｇ：因子の長鎖アイソフォームの量を増加させる
【００７８】
（３ａ：細胞外マトリクス上の結合分子を破壊する）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は、細胞集団の近隣または近傍の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を修飾することによって拡張される。成長因子の立体的分布は、たとえばプロテオグリカン（好ましくはヘパリン、ヘパラン硫酸などのヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）であるが、またコンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸でもある）などのＥＣＭ中の分子［Fowlkes et al. 1997, Baird et al 1998, Higashiyama 1991, Raines and Ross 1992］との相互作用によって、さらには成長因子を固定する膜貫通ドメイン［Massague 1990］によって媒介される。したがって、ＥＣＭおよび細胞膜上の結合部位を変化させることにより拡散性因子の拡散範囲を操作することができる。これらの結合部位を分解することにより、結合ドメイン（たとえばヘパリン結合ドメイン）を有する成長因子がＥＣＭ内でより自由に拡散し、それによりその拡散範囲が増大することを可能とするであろう。これを達成するための１つの方法は、成長因子［Lee et al 2005］とＥＣＭ［Hawinkels et al. 2008］の両者を回裂することができるマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのプロテアーゼを用いることによる。
【００７９】
（３ｂ：拡散性因子上またはその結合タンパク質上の結合ドメインを破壊する）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は、拡散性因子またはその随伴結合タンパク質の結合ドメインを変化させることによって拡張される。たとえば単量体ＦＧＦは、二量体ＦＧＦよりも低い親和性でヘパリンと結合し、またこれにより拡散が増大する［Harada et al. 2009］。
【００８０】
（３ｃ：因子の半減期を延長する因子結合タンパク質を添加する）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は因子結合タンパク質を添加することによって拡張される。大半の成長因子は、当該因子を分解から保護する（それによりその半減期を延長する［Cohen and Nissley 1976 Zapf et al. 1986］結合タンパク質を伴って発生する。したがって、これらの結合タンパク質の量を増加させれば因子の半減期を延長することが可能となり、これによってその拡散範囲が拡大するであろう。
【００８１】
（３ｄ：弱い結合部位を有する因子結合タンパク質を添加する）
一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は、弱い結合部位を有する特定の因子結合タンパク質を添加することによって拡張される。ＥＣＭ親和性の低い結合タンパク質を添加することでより長い拡散範囲がもたらされる。たとえばＩＧＦは、一般に、ヘパリン結合モチーフを有することでＥＭＣと結合するＩＧＦＢＰ（ＩＧＦ結合タンパク質）と結合した状態で利用可能である。ＩＧＦＢＰはＥＭＣとの親和性が異なる、相異なる形態で存在するので（ＩＤＦＢＰ−４の親和性が最も低く、ＩＧＦＢＰ−６がこれに続く一方、ＩＧＦＢＰ−３および−５は高い親和性を有する）［Fowlkes et al. 1997］、低親和性ＩＧＦＢＰ（たとえばＩＧＦＢ−４または−６）の量を高めるとＩＧＦ−ＢＰ複合体のＥＭＣへの平均親和性が減少し、またそれゆえＩＧＦの平均拡散速度が増加する。
【００８２】
（３ｅ：可溶性結合ドメインを添加してＥＣＭ結合部位を飽和させる）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は、ＥＭＣの結合分子と結合する可溶性結合ドメインを添加することによって拡張される。
【００８３】
（３ｆ：可溶性結合分子を添加して因子上の結合ドメインを飽和させる）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の拡散範囲は、拡散因子の結合ドメインと結合する可溶性分子を添加することによって拡張される。可溶性結合分子は、たとえば、ヘパリンまたはヘパリン硫酸であってもよいが、コンドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸またはＥＭＣ中でヘパリンと結合する合成ペプチドであってもよい［Parker et al. 1996］。可溶性受容体がＥＣＭ中の受容体と競合することが、多くの成長因子（ＥＧＦ［Ullrich et al. 1984, Weber et al. 1984]、ＮＧＦ[Zupan et al. 1989］、ＴＮＦ［Gray et al. 1990, Schall et al. 1990］、インターロイキン［Symons and Duff 1990, Marcon et al. 1988, Mosley et al. 1989, Novick et al. 1989, Goodwin et al. 1990]、ＩＦ−γ[Novick et al. 1989］、ＩＧＦ−ＩＩ［Bobek et al. 1991］、ＢＧＦＧ［Johnson et al. 1990］、ＣＦＳ［Downing et al. 1989, Fukunaga et al., 1990］、ｂＦＧＦ［Flaumenhaft et al. 1990］）について示されている。成長因子−グリコサミノグリカン複合体が、ＥＣＭ内の不溶性グリコサミノグリカンと結合せずに可溶相に分配されるならば、その拡散範囲を拡大するであろう。換言すれば、成長因子（またはその関連結合タンパク質）の結合ドメインをＥＣＭとの結合に利用できなくすると、成長因子がＥＣＭと結合せずに可溶相に残ることを可能とする。したがって、グリコサミノグリカンと複合体化した成長因子はその（ヘパリン）−結合部位が不溶性（ＥＣＭ）グリコサミノグリカン（たとえばＥＣＭ中のヘパラン硫酸プロテオグリカン）との結合に利用できなくなるので、可溶性グリコサミノグリカンの量を増加させることによって成長因子の拡散範囲を増大させることができる。成長因子の特性がこれによって変化しなければ（ｂＦＧＦ−ヘパラン硫酸複合体の場合のように［Moscatelli 1987, Saksela et al. 1988］）、これは単純にその拡散範囲を増大させるであろう。Flaumenhaftら（１９９０）は、ｂＦＧＦ−ヘパリン（またはより少ない程度でヘパラン硫酸）複合体が、そのいずれもがｂＦＧＦとの固定結合部位を有する寒天、フィブリンおよび細胞単層上で、ｂＦＧＦ単独よりも遠くに拡散することを確認した。ヘパリンとの親和性が低下すると拡散が増大することが示されている［Flaumenhaft & Rifkin 1992, Harada et al. 2009, Makarenkova et al. 2009］。
【００８４】
（３ｇ：因子の長距離アイソフォームの量を増加させる）
本発明の一部の実施形態においては、拡散性因子の平均拡散範囲は、その因子の長距離アイソフォームの度数を増加させることによって拡張される。オルタナティブスプライシングにより、一部の成長因子は、拡散範囲の異なる膜固定型および可溶型のいずれでも合成されることが可能である［Rathjen et al. 1990, Raines and Ross 1992］。たとえばＶＥＧＦのｍＲＮＡ前駆体は、オルタナティブスプライシングを受けて相異なる複数のアイソフォームとなる（ヒトにおける主要なアイソフォームはＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ１２１である）。より長いアイソフォームは、ＥＣＭのＨＳＰＧとの結合を増加させるＣ末端モチーフを含む［Mitchell et al 2006, Houck et al 2002］。この増大したマトリクス親和性によりアイソフォームの拡散率を減少させることができる。たとえば、ＨＳＰＧ親和性を欠くアイソフォームＶＥＧＦ１２０［Keyt et al. 1996］のみを発現するトランスジェニックマウスが緩やかなＶＥＧＦグラジエントを示す一方で［Ruhrberg et al. 2002, Gerhardt et al 2003］、主としてヘパリン結合性ＶＥＧＦ１６４を発現する野生種マウスはＶＥＧＦ立体分布がより限局化され、またＶＥＧＦ１８８は最大レベルのＥＣＭ親和性を示すので最短の拡散範囲を示す［Grunstein et al. 2000, Park et al. 1993］。癌細胞のスプライシング部位は、拡散性因子の長距離アイソフォームのみかまたは主としてこれを生成するよう修飾することが可能であり；そしてそのような拡散性因子はより長い平均範囲を有する。たとえば、ＶＥＧＦの拡散範囲を変化させる１つの代替的な方法は、（ＶＥＧＦについて開発されている：Reich et al. 2003）ｓｉＲＮＡ干渉を用いることである。オルタナティブスプライシングによって相異なるＶＥＧＦアイソフォームが産生されるのであれば、短距離アイソフォームに特異的なｉＲＮＡを用いることで総ＶＥＧＦの平均範囲を拡大することができるであろう。
【実施例】
【００８５】
本発明は、特に言及しない場合割合および百分率が重量部または重量百分率でありかつ温度が摂氏である以下の方法および実施例によって例示される。これらの方法および実施例は、本発明の好ましい実施形態を指示する一方で、例示的様態でのみ提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの方法および実施例より、当業者は本発明の本質的特性を確認することが可能であり、かつその趣旨および範囲から離れることなく、本発明を多様な使用および条件に適応させるためにその多様な変化および変更を実施することが可能である。したがって、本願に提示かつ記載するものに追加する本発明の多様な変更は、前記の記載により当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は付属の請求項の範囲内に収まることをも意図される。本願に記載される各参照文献の開示は、その全文を参照文献として本願に援用する。
【実施例１】
【００８６】
（１．インシリコ実験）
インシリコ実験においては、個々の細胞は拡散性因子の産生体（＋／＋）または非産生体（−／−）でありうる。産生体は非産生が支払わないコストｃを支払う（０＜ｃ＜１）。細胞（産生体および類似した非産生体）は、サイズがｎであるその群（群は以下に規定される）の全ての細胞によって産生される拡散性因子から利益を得る。産生体および非産生体の利得はそれぞれｂ（ｊ＋１）−ｃおよびｂ（ｊ）であり、式中、全体の良好さの利益ｂ（ｊ）＝１／［１＋ｅｓ（ｋ−ｊ）］（標準的正規化を用いて正規化）は他のｎ−１個の細胞の中の産生細胞ｊのｓ字型関数であり；パラメータｋは変曲点の位置を調節しかつパラメータｓは変曲点ｓにおける勾配を調節する。
【００８７】
細胞はネットワークの結節点を占め、相互作用は結節点を結ぶ辺に沿って進行する。ネットワーク上における各細胞およびそのｎ−１個の隣接細胞が群を規定する（サイズはｎ）。２種類のトポロジーが考えられる：十分に混合された集団および平面ネットワーク（平面上の乱雑な点のドロネー三角形分割によって得られ、単層細胞組織により密接に類似したボロノイ分割に対応する）［図４］。いずれのシミュレーションでもネットワークは進化を通じて変化しない。
【００８８】
プロセスは、グラフ上に乱雑に配置された数多くの非産生体（−／−）から開始する。ゲームの各ラウンドで、死亡−誕生プロセスに従い全ての戦略を更新する：更新（死亡）のための結節ｘと健全性Ｐｘを（無作為に）選択し；次に全ての隣接結節から隣接結節ｙ（健全性はＰｙ）を選択する。Ｐｘ＞Ｐｙの場合は更新しない；Ｐｘ＜Ｐｙの場合、ｘはｙの戦略を採用する（無条件模倣）；他のインシリコ実験においては、たとえば、（Ｐｙ−Ｐｘ）／Ｍ（ただしＭは適切な正規化を確保するものでありかつｘとｙの利得の最大可能な差によって得られる）で得られる確率で置換が発生する確率論的更新などを用いた、異なる更新手順が用いられる。結果は更新規則の変更に対して堅牢であり；これらの更新規則は細胞集団において認められる実際の更新規則の簡略版であり、方法を適用する更新規則の種類を制限すると解釈すべきではない。
【００８９】
（１．１．「非産生体」の割合を直接高めると新生物の成長を減衰させる）
図４（十分に混合された集団）および５（立体的に構造化された集団）は、臨界的割合の−／−細胞が平衡にある細胞集団に導入された場合に何が起こったかを示す。初期の平衡において＋／＋の度数はｘＳ０であった。追加的な−／−細胞を導入すると、＋／＋の度数は不安定平衡ｘＵ０未満まで低下した。この時点で、−／−細胞は＋／＋細胞に対して恒常的な選択的優位性を有するので、集団は安定平衡ｘ＝０に進化した［図２を参照］。この平衡では、拡散性因子は産生されず、細胞集団は成長を止めて崩壊した。
【００９０】
（１．２．閾値を一時的に低下させると新生物の成長が減衰する）
図６は、所与の利益（すなわち閾値）を達成するために必要な産生細胞の量を減少させかつ最終的に初期と同様のレベルに回復させた場合に何が起こったかを示す。当初、＋／＋の度数はｘＳ０であった。本方法の第１段階では、追加的な拡散性因子を外因的に提供した。より多くの拡散性因子が利用可能であったので（これはより低い変曲点を有することと等しい）、これにより細胞集団の成長が促進された。外部拡散性因子が提供されると、同じレベルの利益を達成するために必要な産生体が少なくなるので、＋／＋の度数はｘＳ１まで低下する。この時点で、方法の第２段階は（ほとんど）突発的な初期閾値の回復を指示し：すなわち外部拡散性因子の提供が中断される。この時点での細胞集団は、＋／＋度数（ｘＳ１）が現時点（初期）の不安定平衡（ｘＳ０）よりも低かったので、安定平衡ｘ＝０に進化した。この平衡では、拡散性因子は産生されず、細胞集団は成長を止めて崩壊した。
【００９１】
（１．３．拡散性因子の拡散範囲を拡張すると新生物の成長が減衰する）
図７は、拡散性因子の拡散範囲を拡張した場合に何が起こったかを示す。拡散範囲の中程度の拡張は＋／＋の度数、拡散性因子の量および有効性および腫瘍の成長の中程度の減少をもたらす。この減少の理由は、＋／＋の平衡度数（および、その結果として、拡散性因子の量および有効性および腫瘍の成長）が、拡散性因子の効果から利益を受ける細胞の個数の減少関数であることである。拡散性因子の拡散範囲のより大きな拡張は＋／＋細胞の完全な消失をもたらし、またその結果として細胞集団が成長を止めて崩壊した。
【実施例２】
【００９２】
（２．インビトロ実験）
Ｒｉｐ１Ｔａｇ２トランスジェニックマウス（＋／＋）、またはインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ、または簡略に「ＩＧＦ」）の遺伝子のホモ接合性欠失を担持するＲｉｐ１Ｔａｇ２トランスジェニックマウス（−／−）のβ細胞腫瘍（インスリノーマ）から確立されたβＴＣ株を、報告にしたがって［Lamm & Christofori 1998］標識し、成長させ、計数した。細胞株は、（特に言及しない限り）１０％ＦＢＳ、１％グルタミンおよび１％抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地における培養で維持した。調整培地は、使用時に、５％ＦＢＳ、１％グルタミンおよび１％抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でβ腫瘍細胞株＋／＋または−／−を４８時間準集密培養して得た。２４ウェルマルチウェルプレートに細胞を３０，０００個／ウェルで蒔き、各実験ポイントを３回ずつ繰り返した。処理後に、ＰＢＳに溶解した２．５％グルタルアルデヒドにより細胞を室温で３０分間固定した。脱イオン水で２回洗浄した後、０．１％クリスタルバイオレット２０％メタノール溶液を各ウェルに１５分間添加した。その後溶液を除去し、各ウェルを水で洗浄し室温で乾燥させた。１０％酢酸溶液５０μＬに色素を溶解し、９６ウェルマルチウェルプレートに移し、プレートリーダーで５９５ｎｍ波長の光度を測定した。成長率は対数期に測定した。
【００９３】
（２．１．非産生体は産生体よりも良好に成長することができる）
私は、まず−／−細胞が＋／＋細胞よりもより緩徐に成長するか試験した。予想されたように、−／−細胞単独ではＩＧＦ−ＩＩを含有する血清の非存在下で成長することができなかった一方で、＋／＋は追加的ＩＧＦ−ＩＩが全くなくとも成長したが；しかし−／−細胞は、ＩＧＦ−ＩＩ含有血清の存在下で、ＩＧＦ−ＩＩ量が高ければ、むしろ＋／＋細胞よりも速い速度で成長することができた［図８］。これは、ＩＧＦ−ＩＩを産生することが＋／＋にとってコストが高く、かつ−／−細胞は外因性ＩＧＦ−ＩＩを利用して成長することができることを立証する。さらに、−／−細胞は混合培養中で＋／＋細胞の存在下で成長することができたので、−／−細胞は＋／＋細胞が産生するＩＧＦ−ＩＩを利用できることが示される。さらなる実験［図８］よりこれらの結果が確認され、また−／−細胞は＋／＋細胞由来の調整培地の存在下で＋／＋細胞よりも高い速度で成長することができることが示され、＋／＋によって産生されたＩＧＦ−ＩＩが−／−細胞に選択的優位性を付与することが明らかとなった。さらに、理論上予測されたように、成長速度は中程度の＋／＋細胞度数でピークとなった［図９］。
【００９４】
（２．２．非産生体の割合を直接高めると成長が減衰する）
図１０は、相異なる＋／＋と−／−の混合物に何が起こったかを示す。＋／＋細胞は死滅した。
【００９５】
（２．３．一時的に閾値を低下させると成長が減衰する）
図１１は、さらなるＩＧＦ−ＩＩを外因的に提供した後突然初期レベルに修復したとき何が起こったかを示す。予想されたように、ＩＧＦ−ＩＩを添加することにより成長率の突発的上昇がもたらされ、これは最終的に低速化して一定値を保つ。外因性ＩＧＦ−ＩＩの提供を中断しかつＩＧＦ−ＩＩが初期レベルに戻ると、成長率は突然低下し、＋／＋細胞が死滅してから短時間の後培養は成長を止めた。
【図１】
0006410237.tif 000005
【図２】
0006410237.tif 000006
【図３】
0006410237.tif 000007
【図４】
0006410237.tif 000008
【図５】
0006410237.tif 000009
【図６】
0006410237.tif 000010
【図７】
0006410237.tif 000011
【図８】
0006410237.tif 000012
【図９】
0006410237.tif 000013
【図１０】
0006410237.tif 000014
【図１１】
0006410237.tif 000015