(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から分離した血液試料内の補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準を測定することを含む、膵臓癌診断のための情報の提供方法。
【請求項２】
個体から分離した血液試料内の補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準とそれぞれ比較する段階をさらに含む、請求項１に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
【請求項３】
血液試料は、全血、血漿または血清試料である、請求項１に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
【請求項４】
補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準は、２次元蛍光電気泳動、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射免疫分析、放射免疫拡散法、免疫電気泳動または質量分析を利用して測定するものである、請求項１に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
【請求項５】
補体因子Ｂに特異的に結合する抗体及び糖鎖抗原１９−９に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断用キット。
【請求項６】
補体因子Ｂは、配列番号１のアミノ酸配列よりなる、請求項５に記載の膵臓癌診断用キット。
【請求項７】
抗体は、ポリクロナル抗体またはモノクロナル抗体である、請求項５に記載の膵臓癌診断用キット。
【請求項８】
膵臓癌診断のために膵臓癌診断用バイオマーカーとして補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準を測定することを含む方法において、
個体から収集された血液試料を用意する第１段階と；
バイオマーカーに特異的に結合し、検出可能に標識された抗体に前記血液試料を接触して、前記抗体及び前記バイオマーカーの複合体を形成する第２段階と；
複合体を含まない標識された抗体から前記第２段階で形成された複合体を分離する第３段階と；
前記第２段階で形成された複合体を含む抗体の検出可能な標識から信号を定量し、前記血液試料内のバイオマーカーの量を測定する第４段階と；
前記第４段階で測定されたバイオマーカーの量と対照群バイオマーカーの量を比較する第５段階と；
前記第５段階で、試料においてバイオマーカーの量が対照群バイオマーカーの量より多い場合、膵臓癌として決定される第６段階と；を含む方法。
【請求項９】
対照群バイオマーカーの量は、膵臓癌がない個体の血液試料内のバイオマーカーの量である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血液試料は、全血、血漿または血清試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第１段階と第２段階との間に、
免疫沈降によって血液試料内のバイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階は、
ｉ）個体から分離した血液試料をバイオマーカーに特異的に結合する抗体と接触して、前記抗体と前記バイオマーカーとの間に複合体を形成する段階と；
ｉｉ）前記ｉ）段階で形成された複合体を沈降させる段階と；
ｉｉｉ）バイオマーカー以外の他のタンパク質及び複合体を形成しない抗体を含む試料の上澄み液から沈降された複合体を分離する段階とを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、補体因子Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体及び糖鎖抗原１９−９タンパク質に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断キットと、これを利用して膵臓癌診断のための情報を提供する方法及びこれを利用した膵臓癌診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、世界的に９番目と多く発病する主要癌であって、死亡率が４番目と高い悪性腫瘍である（非特許文献１Ｌｏｗｅｎｆｅｌｓ、Ａ．Ｂ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１９７−２０９、２００６）。大部分の国家において膵臓癌が全体悪性腫瘍の発生で占める比重は、２〜３％に過ぎないが、死亡者の数が占める比重は、全体腫瘍関連死亡のうち略６％を占める。その理由は、膵臓癌の２年生存率が１０％内外に過ぎないほどに低くて、５年生存率も５％を越えないほどに予後が不良であるからである（非特許文献２Ｌｅｅ、Ｃ．Ｎ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｓ、９４−９４、２０１２）。
【０００３】
膵臓癌は、かなり進行する前までは症状が現われない場合が大部分であるから、一旦膵臓癌が診断されれば、既に非常に進行した後であるため、手術が不可能な場合が多い。また、手術が可能な場合にも、手術した患者の８０〜９０％が再発し、死亡に至るようになる。膵臓癌を治療するために、手術療法以外にも、放射線療法、化学療法などが実施されているが、患者の生存期間には、制限された効果を示す場合が大部分である。したがって、膵臓癌を早期に診断することが非常に重要である。
【０００４】
膵臓癌を診断する方法としては、コンピューター断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＣＴ）や磁気共鳴映像装置（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ；ＭＲＩ）を用いた組織検査があり、最近には、膵臓癌を診断できる臨床試料として血漿のような体液でのタンパク質分析を同時に測定し、膵臓癌の存在または発病可能性の有無を判断している。現在、膵臓癌と関連して最も頻繁に使用される腫瘍標識子は、糖鎖抗原１９−９（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９：ＣＡ１９−９）であるが、ＣＡ１９−９は、膵臓癌以外に、胆道を含む消化器系の癌患者の血漿においても全て上昇すると知られており、また、悪性腫瘍がない胆管炎と胆道の閉塞がある場合にも上昇すると知られていて、特異度が低いという問題点がある（出処：韓国国家健康情報ポータル）。また、早期癌では、ＣＡ１９−９標識子の血中濃度が正常に現われる場合が多いので、早期診断には使用できない。
【０００５】
なお、補体因子Ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ｂ；ＣＦＢ）は、ＣＦＢとも呼ばれるタンパク質であって、補体活性の代替経路（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ）のうち重要な成分の１つである。代替経路は、抗原−抗体複合体の形成と関係なく、病原体細胞表面の糖構造によって活性化される。まず、血液中に少量存在するＣ３ｂが微生物の表面に結合することによって、活性化が誘導される。Ｃ３ｂは、血液中の補体因子Ｂと結合すれば、補体因子ＤによってＣ３ｂＢｂとＢａとに分解され、Ｃ３ｂＢｂは、プロペリジンによって安定化され、代替経路のＣ３転換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）になり、さらに多いＣ３ｂを形成する増幅過程（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）に入る。その結果、さらに多いＣ３転換酵素が生成され、生成されたＣ３転換酵素とＣ３ｂが微生物細胞の表面に結合し、Ｃ３ｂＢｂ３ｂ複合体を形成する。形成されたＣ３ｂＢｂ３ｂ複合体は、代替経路のＣ５転換酵素作用を示し、Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂとに分解し、最終的に細菌の表面にＭＡＣを形成する。その結果、細菌が死んで、抗原が除去される。補体因子Ｂは、この代替経路の初期段階であるｃ３ｂタンパク質と結合し、ｃ５の生成に重要な役目をする分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と知られており、糖タンパク質としてグリカン位置（ｇｌｙｃａｎ  ｓｉｔｅ）が５個存在している。
【０００６】
補体因子Ｂは、卵巣癌（非特許文献３Ｗｕ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、ＪＰＲ、４５４１−５２、２０１２）、上咽頭癌（非特許文献４Ｓｅｒｉｒａｍａｌｕ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３８８−９５、２０１０）、乳房癌（非特許文献５Ｄｏｕｓｔｊａｌａｌｉ、Ｓ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３９２−４０１、２００４）などの多様な患者の血清で分泌されると知られている。しかし、現在まで補体因子Ｂとカーボーハイドレートを組み合わせて膵臓癌を診断しようとする試みはなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｏｗｅｎｆｅｌｓ、Ａ．Ｂ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１９７−２０９、２００６
【非特許文献２】Ｌｅｅ、Ｃ．Ｎ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｓ、９４−９４、２０１２
【非特許文献３】Ｗｕ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、ＪＰＲ、４５４１−５２、２０１２
【非特許文献４】Ｓｅｒｉｒａｍａｌｕ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３８８−９５、２０１０
【非特許文献５】Ｄｏｕｓｔｊａｌａｌｉ、Ｓ．Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３９２−４０１、２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本出願は、特異度及び敏感度に優れた新しい膵臓癌診断用バイオマーカーである補体因子Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体と糖鎖抗原１９−９タンパク質に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断キットと、これを利用して膵臓癌診断のための情報の提供方法及びこれを利用して膵臓癌を診断する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願は、個体から分離した血液試料内の補体因子Ｂのタンパク質発現水準を測定することを含む膵臓癌診断方法及び膵臓癌診断のための情報の提供方法を提供する。
【００１０】
また、本出願は、補体因子Ｂ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ；ＣＦＢ）の膵臓癌診断マーカーとしての用途を提供する。具体的に、本出願は、補体因子Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断用キットを提供する。
【００１１】
一具体例において、補体因子Ｂタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列よりなるものであることができる。
【００１２】
配列番号１：
ＭＧＳＮＬＳＰＱＬＣＬＭＰＦＩＬＧＬＬＳＧＧＶＴＴＴＰＷＳＬＡＲＰＱＧＳＣＳＬＥＧＶＥＩＫＧＧＳＦＲＬＬＱＥＧＱＡＬＥＹＶＣＰＳＧＦＹＰＹＰＶＱＴＲＴＣＲＳＴＧＳＷＳＴＬＫＴＱＤＱＫＴＶＲＫＡＥＣＲＡＩＨＣＰＲＰＨＤＦＥＮＧＥＹＷＰＲＳＰＹＹＮＶＳＤＥＩＳＦＨＣＹＤＧＹＴＬＲＧＳＡＮＲＴＣＱＶＮＧＲＷＳＧＱＴＡＩＣＤＮＧＡＧＹＣＳＮＰＧＩＰＩＧＴＲＫＶＧＳＱＹＲＬＥＤＳＶＴＹＨＣＳＲＧＬＴＬＲＧＳＱＲＲＴＣＱＥＧＧＳＷＳＧＴＥＰＳＣＱＤＳＦＭＹＤＴＰＱＥＶＡＥＡＦＬＳＳＬＴＥＴＩＥＧＶＤＡＥＤＧＨＧＰＧＥＱＱＫＲＫＩＶＬＤＰＳＧＳＭＮＩＹＬＶＬＤＧＳＤＳＩＧＡＳＮＦＴＧＡＫＫＣＬＶＮＬＩＥＫＶＡＳＹＧＶＫＰＲＹＧＬＶＴＹＡＴＹＰＫＩＷＶＫＶＳＥＡＤＳＳＮＡＤＷＶＴＫＱＬＮＥＩＮＹＥＤＨＫＬＫＳＧＴＮＴＫＫＡＬＱＡＶＹＳＭＭＳＷＰＤＤＶＰＰＥＧＷＮＲＴＲＨＶｉｉＬＭＴＤＧＬＨＮＭＧＧＤＰＩＴＶＩＤＥＩＲＤＬＬＹＩＧＫＤＲＫＮＰＲＥＤＹＬＤＶＹＶＦＧＶＧＰＬＶＮＱＶＮＩＮＡＬＡＳＫＫＤＮＥＱＨＶＦＫＶＫＤＭＥＮＬＥＤＶＦＹＱＭＩＤＥＳＱＳＬＳＬＣＧＭＶＷＥＨＲＫＧＴＤＹＨＫＱＰＷＱＡＫＩＳＶＩＲＰＳＫＧＨＥＳＣＭＧＡＶＶＳＥＹＦＶＬＴＡＡＨＣＦＴＶＤＤＫＥＨＳＩＫＶＳＶＧＧＥＫＲＤＬＥＩＥＶＶＬＦＨＰＮＹＮＩＮＧＫＫＥＡＧＩＰＥＦＹＤＹＤＶＡＬＩＫＬＫＮＫＬＫＹＧＱＴＩＲＰＩＣＬＰＣＴＥＧＴＴＲＡＬＲＬＰＰＴＴＴＣＱＱＱＫＥＥＬＬＰＡＱＤＩＫＡＬＦＶＳＥＥＥＫＫＬＴＲＫＥＶＹＩＫＮＧＤＫＫＧＳＣＥＲＤＡＱＹＡＰＧＹＤＫＶＫＤＩＳＥＶＶＴＰＲＦＬＣＴＧＧＶＳＰＹＡＤＰＮＴＣＲＧＤＳＧＧＰＬＩＶＨＫＲＳＲＦＩＱＶＧＶＩＳＷＧＶＶＤＶＣＫＮＱＫＲＱＫＱＶＰＡＨＡＲＤＦＨＩＮＬＦＱＶＬＰＷＬＫＥＫＬＱＤＥＤＬＧＦＬ
【００１３】
一具体例において、個体は、膵臓癌が疑われる患者であることができる。
一具体例において、個体から分離した血液試料内の補体因子Ｂのタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子Ｂのタンパク質発現水準と比較する段階をさらに含むことができる。本明細書で、正常対照群は、膵臓癌その他疾病がない健常な個体から分離した血液試料を意味する。２つの膵臓癌の試料を比較し、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子Ｂのタンパク質発現水準が正常対照群試料の補体因子Ｂのタンパク質発現水準より高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。例えば、膵臓癌候補患者の試料の補体因子Ｂタンパク質水準が正常対照群試料の補体因子Ｂタンパク質水準より２倍以上高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。
一具体例において、血液試料は、全血、血漿または血清試料であることができる。
【００１４】
本出願で用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本出願の目的に照らして、診断は、膵臓癌の生成及び再発可否を確認するものである。
【００１５】
本出願で用語「診断用マーカー」または「診断マーカー」は、癌細胞を正常細胞と区分して診断できる物質であって、正常細胞に比べて癌を有する細胞で増加または減少するポリペプチドまたは核酸（例：ｍＲＮＡなど）、脂質、糖脂質、糖タンパク質または糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などのような有機生体分子などを含む。本出願の目的に照らして、膵臓癌診断マーカーは、正常膵腸組織の細胞に比べて、膵臓癌細胞で特異的に高い水準の発現を示すＣＡ１９−９及び／または補体因子Ｂの遺伝子及びこれによってコーディングされるタンパク質である。
【００１６】
本出願で用語「タンパク質発現水準測定」というのは、癌を診断するために生物学的試料において癌マーカー遺伝子で発現されたタンパク質の存在有無と発現程度を確認する過程であって、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を利用してタンパク質の量を確認する。このための分析方法としては、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉo  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【００１７】
本出願において「特異的に結合する」というのは、結合によってターゲット物質の存在有無を検出できるほどに、他の物質に比べてターゲット物質に対する結合力に優れていることを意味する。
【００１８】
本出願において「抗体」は、抗原またはエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子ら、またはその断片から由来するか、これを倣って作った実質的にこれによって暗号化されたペプチドまたはポリペプチドを示す。本出願で抗体は、全体抗体及び抗体断片を含み、これに制限されない多様な形態の抗体構造を含む。抗体断片は、全体長さの抗体の一部分、抗体の可変ドメイン、または少なくとも抗体の抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異的抗体を含む。
【００１９】
一具体例において、抗体は、ポリクロナル抗体またはモノクロナル抗体であることができる。補体因子Ｂタンパク質に対する抗体は、当業界において通常的に実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５１１−５１９（１９７６））、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）またはファージ抗体ライブラリ方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８、１−５９７（１９９１））によって製造され得る。抗体の製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｄ．、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９；Ｚｏｌａ、Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ、１９９１に詳細に記載されている。例えば、モノクロナル抗体を生産するハイブリードマ細胞の製造は、不死滅化細胞株を抗体−生産リンパ球と融合させてなり、この過程に必要な技術は、当業者によく知られており、容易に実施できる。ポリクロナル抗体は、補体因子Ｂタンパク質抗原を適合な動物に注射し、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）技術を利用して抗血清から抗体を分離して得ることができる。
【００２０】
本出願で用語「敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）」とは、当該疾患にかかったとき、その診断検査結果が陽性と現われる確率を示し、「特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、ある疾患にかかっていない場合、検査結果が陰性となる可能性の程度を示す。
【００２１】
膵臓癌診断用マーカーの候補物質として補体因子Ｂタンパク質を選定し、正常人及び膵臓癌患者の血漿において補体因子Ｂタンパク質の存在を確認し、変化を観察した。その結果、補体因子Ｂのタンパク質発現水準が膵臓癌患者の血漿において正常対照群に比べて非常に高いことを確認できた（実施例１及び実施例２）。また、従来膵臓癌診断用マーカーとして知られたＣＡ１９−９と比較したとき、ＣＦＢの膵臓癌診断用マーカーとしての効用性を検証するために、ＥＬＩＳＡ及びＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線分析を行い、これらの最適カット−オフ値に基づいてＣＦＢ及びＣＡ１９−９それぞれの敏感度及び特異度を分析した（実施例３〜６）。その結果、ＣＡ１９−９は、膵臓癌を含めて肝癌、胆管癌及び胃癌においても発現が増加し、特異度が劣ることが分かった。すなわち、これは、ＣＡ１９−９単独では、膵臓癌診断マーカーとして使用するに適していないことを意味する。しかし、ＣＦＢは、膵臓癌だけでは、特異的に発現が増加し、敏感度及び特異度に優れていて、膵臓癌診断用マーカーとして適していることを意味する。
【００２２】
なお、ＣＡ１９−９単独では、膵臓癌診断マーカーとして特異度が劣る問題があるが、ＣＡ１９−９をＣＦＢとともに使用した場合には、敏感度及び特異度に最も優れていることが分かった。これは、ＣＡ１９−９単独の場合、膵臓癌診断のためのマーカーとして使用するに適していないが、ＣＦＢとともに使用した場合、さらに正確に膵臓癌を診断できることを意味する。
【００２３】
したがって、一具体例において、前記キットは、糖鎖抗原１９−９に特異的に結合する抗体をさらに含むことができる。
【００２４】
また、本出願は、個体から分離した血液試料内の補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準を測定することを含む膵臓癌診断方法及び膵臓癌診断のための情報の提供方法を提供する。
【００２５】
一具体例において、個体は、膵臓癌疑い患者群であることができる。
一具体例において、膵臓癌疑い患者から分離した血液試料内の補体因子Ｂ及びＣＡ１９−９のタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子Ｂ及びＣＡ１９−９のタンパク質発現水準と比較する段階をさらに含むことができる。２つの試料を比較し、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子Ｂ及びＣＡ１９−９のタンパク質の発現水準が、いずれも、正常対照群試料の補体因子Ｂ及びＣＡ１９−９のタンパク質の発現水準より高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。例えば、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子Ｂのタンパク質水準が正常対照群試料の補体因子Ｂのタンパク質水準より２倍以上高くて、膵臓癌疑い患者の試料のＣＡ１９−９の濃度が３７Ｕ／ｍＬ以上である場合、前記膵臓癌疑い患者を膵臓癌患者に分類できる。
一具体例において、血液試料は、全血、血漿または血清試料であることができる。
【００２６】
また、本出願は、膵臓癌診断用バイオマーカーとして補体因子Ｂ及び糖鎖抗原１９−９のタンパク質発現水準を測定することを含む膵臓癌診断方法において、
個体から血液試料を収集する第１段階と；
バイオマーカーに特異的に結合し、検出可能に標識された抗体に前記血液試料を接触して、前記抗体及び前記バイオマーカーの複合体を形成する第２段階と；
複合体を含まない標識された抗体から前記第２段階で形成された複合体を分離する第３段階と；
前記第２段階で形成された複合体を含む抗体の検出可能な標識から信号を定量し、前記血液試料内のバイオマーカーの量を測定する第４段階と；
前記第４段階で測定されたバイオマーカーの量と対照群バイオマーカーの量を比較する第５段階と；
前記第５段階で、試料においてバイオマーカーの量が対照群バイオマーカーの量より多い場合、膵臓癌として診断する第６段階とを含む膵臓癌診断方法を提供する。
【００２７】
ここで、バイオマーカーは、補体因子Ｂまたは糖鎖抗原１９−９を意味する。
前記第４段階で、バイオマーカー−抗体複合体の検出可能な標識からの信号は、血液試料内のバイオマーカーの量と比例するので、これから前記バイオマーカーの量を把握できる。
一具体例において、対照群バイオマーカーの量は、膵臓癌がない個体の血液試料内のバイオマーカーの量を意味する。
【００２８】
一具体例において、血液試料は、全血、血漿または血清試料であることができる。
一具体例において、前記第１段階と第２段階との間に、免疫沈降によって血液試料内のバイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階をさらに含むことができる。
【００２９】
一具体例において、バイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階は、
ｉ）個体から分離した血液試料をバイオマーカーに特異的に結合する抗体と接触して、前記抗体と前記バイオマーカーとの間に複合体を形成する段階と；
ｉｉ）前記ｉ）段階で形成された複合体を沈降させる段階と；
ｉｉｉ）バイオマーカー以外の他のタンパク質及び複合体を形成しない抗体を含む試料の上澄み液から沈降された複合体を分離する段階とを含むことができる。
【００３０】
また、本発明は、前記方法によって膵臓癌として診断される場合、個体に膵臓癌治療剤を処理することを含む膵臓癌治療方法を提供する。膵臓癌治療剤は、膵臓癌治療効果があると知られた公知の薬物を制限なく利用できる。
【発明の効果】
【００３１】
本出願によれば、敏感度及び特異度が向上した膵臓癌診断用マーカーを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】図１ａは、正常人の血漿に対する２次元電気泳動イメージを示し、図１ｂは、膵臓癌患者の血漿に対する２次元電気泳動イメージを示す。矢印が示すスポットは、補体因子Ｂタンパク質を意味する。
【図１ｂ】図１ａは、正常人の血漿に対する２次元電気泳動イメージを示し、図１ｂは、膵臓癌患者の血漿に対する２次元電気泳動イメージを示す。矢印が示すスポットは、補体因子Ｂタンパク質を意味する。
【図２】正常人の血漿と膵臓癌患者の血漿において補体因子Ｂの発現差を示す図であり、図１ａ及び図１ｂのスポット（黒色）部分の２次元垂直電気泳動イメージを示す。
【図３ａ】正常人と膵臓癌患者の血漿の補体因子Ｂのタンパク質発現水準をウェスタンブロッティングで分析した結果を示す（Ｎ：正常人、Ｃ：膵臓癌患者）。
【図３ｂ】図３ａのウェスタンブロッティングバンドの強度を示すグラフである。
【図４ａ】正常細胞株（ＨＰＤＥ）と膵臓癌細胞株（ＨＰＡＣ１、ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ１）において補体因子Ｂのタンパク質発現水準をウェスタンブロッティングで分析した結果を示す。
【図４ｂ】正常細胞株（ＨＰＤＥ）と膵臓癌細胞株（ＨＰＡＣ１、ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ１）において補体因子Ｂのタンパク質発現水準をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。
【図４ｃ】図１ｂのバンド強度を示すグラフである。
【図５ａ】ウェスタンブロッティングによる補体因子Ｂ（ＣＦＢ）のタンパク質発現水準を分析した結果である。ＨＤは正常、ＣＰは膵臓炎、ＰＣは、膵臓癌を示す。
【図５ｂ】図５ａのウェスタンブロッティングバンドの強度を示すグラフである。ＨＤは正常、ＣＰは膵臓炎、ＰＣは膵臓癌を示す。
【図６ａ】多様な癌において、ＣＦＢ及びＣＡ１９−９の発現水準をＥＬＩＳＡによって分析した結果を示す（ａ：ＣＦＢ、ｂ：ＣＡ１９−９）。ＨＤは正常、ＣＰは膵臓炎、ＰＣは膵臓癌、ＨＣＣは肝臓癌、ＣＣは胆管癌及びＧＣは胃癌を示す。
【図６ｂ】多様な癌において、ＣＦＢ及びＣＡ１９−９の発現水準をＥＬＩＳＡによって分析した結果を示す（ａ：ＣＦＢ、ｂ：ＣＡ１９−９）。ＨＤは正常、ＣＰは膵臓炎、ＰＣは膵臓癌、ＨＣＣは肝臓癌、ＣＣは胆管癌及びＧＣは胃癌を示す。
【図７】ＣＡ１９−９、ＣＦＢ及びＣＦＢ＋ＣＡ１９−９のＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本出願を実施例を通じて詳しく説明する。下記実施例は、本出願を例示するものに過ぎず、本出願の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
［実施例１］補体因子Ｂ（ＣＦＢ）のタンパク質発現水準分析
［実施例１−１］電気泳動及び質量分析による血漿でのＣＦＢタンパク質検出
正常人及び膵臓癌患者の血漿においてＣＦＢの存在及び量を検出するために、電気泳動及び質量分析を行った。
【００３５】
血漿の収得は、セブランス病院遺伝子銀行と消火器内科から供給を受け、臨床試験委員会（ＩＲＢ）の規定に従った。血漿試料は、２００μＬずつ分注し、−７０℃で実験前まで保管して使用した。補体因子Ｂは、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、血漿には、知られている多量のタンパク質（ｈｉｇｈ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が存在しているため、Ｈｕ−１４（Ａｇｉｌｅｎｔ）を利用して補体因子Ｂ以外のタンパク質を除去した後、２次元蛍光電気泳動を行った。２次元電気泳動のために、１０人の正常人の血漿及び１０人の膵臓癌患者の血漿の試料に対して各分析試料とそれに該当する標準試料５０μｇは、蛍光染料である４００ｐｍｏｌ  Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で暗黒条件で３０分間標識させ、１μＬの１０ｍＭリジン（ｌｙｓｉｎｅ）で反応を停止させた。蛍光染料でそれぞれ標識された３個の試料は、互いに混合させて最終４５０μＬとなるように試料緩衝溶液［６Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％チャップス（ＣＨＡＰＳ）、６０ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）、３０ｍＭトリス、ｐＨ８．５］を添加し、２％のＩＰＧ４−７ＮＬ緩衝溶液とともに常温で１６時間再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）させた。等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ；ＩＥＦ）は、イモビラインドライストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ）ｐＨ４−７ＮＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＭｕＬｔｉＰｈｏｒ  電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で最適要件である９５，０００Ｖまで高めて実施し、トリブチルホスフィン（Ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）緩衝溶液［６Ｍウレア、２％硫酸塩（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、３０ｍＭトリス、２０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、２．５％アクリルアミド溶液（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５ｍＭトリブチルホスフィン］で２５分間ワン−ステップ還元及びアルキル化した。
【００３６】
正常人の血漿に対する２次元電気泳動結果を図１ａに示し、膵臓癌患者の血漿に対する２次元電気泳動結果を図１ｂに示した。図面内の矢印は、ＣＦＢを示す。その結果、膵臓癌患者において、ＣＦＢの発現が増加することが分かった。
【００３７】
また、正常人と膵臓癌患者の血漿において、ＣＦＢの発現差を調べるために、２次垂直電気泳動を行った。２次垂直電気泳動は、Ｅｔｔａｎ  Ｄａｌｔｔｗｅｌｖｅ電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて９％〜１６％ポリアクリルアミドゲルを使用して分離し、電気泳動が終わった後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）スキャナを利用してＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５に該当する波長でスキャンした。各ゲルイメージは、ＤｅＣｙｄｅｒ  ２−Ｄ分析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して分析した。
【００３８】
その結果、２次元電気泳動結果と同様に、膵臓癌患者において、ＣＦＢの発現が増加することが分かった（図２）。
【００３９】
イメージ分析後、ＣＦＢの存在を確認するために、図１ａ及び図１ｂの矢印が示すスポットに対して質量分析を行った。タンパク質スポットは、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染料で染色されたゲルからピッキング（ｐｉｃｋｉｎｇ）し、脱色してトリプシンで切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した後、切断したペプチドは、ポロス（Ｐｏｒｏｓ）Ｒ２及びオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）Ｒ３レジン（ｒｅｓｉｎ）混合物を使用して脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）させた。タンパク質の同定は、Ｑ−ＴＯＦ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析し、Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳで得たスペクトルは、ＭＡＳＣＯＴデータベースを利用して同定した。
【００４０】
その結果、下記表１に示されたように、図１ａ及び図１ｂの矢印が示すスポットがＣＦＢであることを確認できた。
【００４１】
【表１】
0006361943.tif 000002
【００４２】
［実施例１−２］血漿内でのＣＦＢタンパク質発現水準分析
膵臓癌患者の血漿でのＣＦＢタンパク質発現水準を分析するために、免疫ブロットを行った。１０人に対する正常人の血漿と１０人の膵臓癌患者の血漿において同一のタンパク質量から抗体を利用してウェスタンブロッティングを行った。血漿タンパク質１０μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後、ウェスタンブロッティングのためにゲル全体をニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＮＣ）膜に転換（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した後、５％脱脂乳（ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋ）が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液［２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ｐＨ７．６］で１時間ブロッキングした。抗−補体因子Ｂ抗体（ＣＦＢ、Ａｂｃａｍ）を５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液に１：１０００倍ずつ希釈して１次処理し、抗−マウス（ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１：１００００倍を２次処理した。最終ＮＣ膜は、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１分間反応させ、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００スキャナでスキャンして分析した。
【００４３】
その結果、図３ａに示されたように、膵臓癌患者群においてＣＦＢの発現が増加することが分かった。
【００４４】
図３ａの結果を、バンド強度（Ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を通じてｆｏｌｄ  ｒａｔｉｏを分析した結果、正常群に比べて膵臓癌患者の血漿においてＣＦＢが高く発現することを確認した（図３ｂ）。
【００４５】
［実施例１−３］膵臓癌細胞内でのＣＦＢ発現水準分析
膵臓癌細胞株でのＣＦＢ発現水準を確認するために、ウェスタンブロッティングとＲＴ−ＰＣＲを行った。正常細胞株としては、ＨＰＤＥ（ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）を使用し、膵臓癌細胞株としては、ＨＰＡＣ１、ＢＸＰＣ３（ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、ＰＡＮＣ１（ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａ）を使用した。それぞれの細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）１ｍｇを使用して抗−補体因子Ｂ抗体２ｕｇ、タンパク質Ｇアガローズ１０ｕＬを一緒に１ｍＬのチューブで２時間免疫沈降させた後、ウェスタンブロッティングを通じて正常細胞と膵臓癌細胞内でのＣＦＢ発現水準を確認した。その結果、ＣＦＢが正常細胞では検出されず、膵臓癌細胞だけで検出されることを確認した（図４ａ）。
【００４６】
次は、ＲＴ−ＰＣＲを利用してＣＦＢのｍＲＮＡ発現水準を確認した。全体ＲＮＡは、ｅａｓｙ−ＢＬＵＥ（ｉＮｔＲＯＮ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｋｏｒｅａ）を使用して抽出し、ｃＤＮＡは、オムニスクリプトＲＴキット（ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して合成した。使用されたプライマーは、次の通りである：
ＣＦＢプライマー（配列番号２）：５’−ＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣ−３’（フォワード）
ＣＦＢプライマー（配列番号３）：５’−ＴＡＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣ−３’（リバース）
ＧＡＰＤＨプライマー（配列番号４）：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（フォワード）
ＧＡＰＤＨプライマー（配列番号５）：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（リバース）
【００４７】
ＰＣＲ条件は、３５サイクル、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を９４℃で１分、アニーリングを５９℃で１分、プライマー伸長（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を７２℃で１分にした。その結果、ウェスタンブロッティングデータと同様に、正常細胞ではＣＦＢがほとんど検出されず、膵臓癌細胞だけでＣＦＢが検出されることを確認した（図４ｂ）。図１ｂの結果から、バンド強度（Ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を通じてｆｏｌｄ  ｒａｔｉｏを分析した結果、正常細胞株に比べて膵臓癌細胞株においてＣＦＢが高く発現することを確認した（図４ｃ）。
【００４８】
［実施例２］多数のサンプルを利用した補体因子Ｂ（ＣＦＢ）のタンパク質発現水準分析
ＣＦＢがバイオマーカー候補としての確かな可能性を調べるために、独立的な且つ大規模患者集団（ｌａｒｇｅ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｈｏｒｔｓ）を使用して追加確認実験を行った。
【００４９】
正常人４４人、膵臓炎患者１２人、膵臓癌患者４０人の血漿を使用し、標準として正常人の血漿はプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）したサンプルを使用して実施例１−３と同一の方法でウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＨＤとＣＰに比べてＰＣにおいてＣＦＢが高く発現することを確認でき（図５ａ）、このウェスタンブロッティングバンドの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を点で示した結果、ｐ＜０．０５であって、ＨＤとＣＰに比べてＰＣにおいてＣＦＢが高く発現することが分かった（図５ｂ）。したがって、大規模の患者集団を使用し、独立的な実験を行った場合にも、ＣＦＢが有意的な値でＨＤとＣＰに比べてＰＣにおいて約２倍高く発現していることを確認できた。
【００５０】
［実施例３］ＥＬＩＳＡによる多様な癌患者でＣＦＢ及びＣＡ１９−９のタンパク質発現水準分析
現在膵臓癌バイオマーカーとして知られているＣＡ１９−９とＣＦＢの発現水準を比較するためにＨＤ、ＣＰ、ＰＣ、ＨＣＣ、ＣＣ、ＧＣの血漿を使用してＥＬＩＳＡテストを行った。ＣＦＢとＣＡ１９−９  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴは、それぞれＵＳＣＮとＰａｎｏｍｉｃｓ製品を使用し、各製品ごとにそれぞれのプロトコルによって実験を行った。
【００５１】
まず、ＣＦＢ  ＥＬＩＳＡの場合、それぞれの血漿を１：１０，０００で希釈した後、ＣＦＢに対する抗体が敷かれているウェルにそれぞれ１００ｕＬずつ入れた。２時間常温でインキュベーションした。その後、ウェルから血漿を除去し、１００ｕＬの検出試薬Ａワーキング溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた後、常温で１時間インキュベーションした。１時間後、溶液をウェルから除去した後、３５０ｕＬの洗浄溶液を入れ、３回繰り返して洗浄した。その後、それぞれのウェルに１００ｕＬの検出試薬Ｂワーキング溶液を入れ、常温で３０分間反応させた。洗浄溶液で５回洗浄した。その後、９０ｕＬの基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をそれぞれのウェルに入れた後、１５分間ダーク条件で反応させ、その後、５０ｕＬの停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｍｍで定量した。これらグループにおいてＣＦＢの発現水準は、３４．０（範囲：２６．１−４１．３）、７３．５（範囲：６２．３−７７．１）、９２．０（範囲：７５．２−１２１．６）、３７．０（範囲：２８．８−４７．５）、４１．５（範囲：２９．１−５２．１）、６３．０（範囲：５６．３−７２．９）ｎｇ／ｍＬであった（図６ａ）。
【００５２】
ＣＡ１９−９  ＥＬＩＳＡの場合、ＣＡ１９−９抗体が敷かれているプレートにそれぞれの血漿を１０ｕＬずつ入れ、１００ｕＬのＣＡ１９−９アッセイバッファーをその上に入れた。その後、３０秒間よく交ぜた後、常温で９０分間インキュベーションした。その後、ウェルからバッファーを除去し、ウォッシュバッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて４回繰り返して洗浄した。その後、ワーキングコンジュゲート試薬（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）１００ｕＬをそれぞれのウェルに入れ、３０秒間よく交ぜた後、常温で９０分間インキュベーションした。試薬をウェルから除去し、ウォッシュバッファーを用いて４回繰り返して洗浄した。その後、ＴＭＢをそれぞれのウェルに入れ、１０秒間交ぜた後、ダーク条件で２０分間反応させた。その後、１００ｕＬの停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた後、３０秒間交ぜ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｍｍで定量した。これらのグループにおいてＣＡ１９−９の水準は、それぞれ４．６（範囲：２．８−７．２）、１０．２（範囲：６．０−２１．４）、２９８．８（範囲：１１１．４−８３２．６）、５０．５（範囲：１８．１−１５９．５）、１３７．５（範囲：５３．８−５３７．９）、１０．０（範囲：９．４−１６．７）Ｕ／ｍＬであった（図６ｂ）。ＣＦＢの血漿内の発現水準は、ＣＡ１９−９と同様に、非−ＰＣ群（ＨＤ、ＣＰ、ＨＣＣ、ＣＣ、ＧＣ）よりＰＣ群において特に高く発現した（ｐ＜０．００２）。また、ＣＦＢの場合、ＣＡ１９−９と比べて、ＰＣと非−ＰＣ患者をさらに良好に区別することが分かった（ｐ＜０．０００１）。
【００５３】
これは、ＣＡ１９−９単独では、膵臓癌診断マーカーとして使用するに適していないが、膵臓癌だけで特異的に発現が増加するＣＦＢは、膵臓癌診断用マーカーとして適していることを意味する。
【００５４】
［実施例４］膵臓癌診断において、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線によるＣＦＢ及びＣＡ１９−９の敏感度及び特異度分析
ＣＦＢとＣＡ１９−９が、膵臓癌患者と膵臓癌患者でない人（ＨＤ、ＣＰ、ＨＣＣ、ＣＣ、ＧＣ）をどれほど良好に区別するかどうかを確認するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔプログラムを利用してＲＯＣ曲線分析を行った。ＡＵＣ値を通じてＣＦＢとＣＡ１９−９を比較した。その結果、ＣＦＢの場合、０．９５８（９５％ＣＩ：０．９５６−０．９５９）であって、ＣＡ１９−９の０．８３３（９５％ＣＩ：０．８２９−０．８３７）よりＡＵＣ値がさらに高かった。２つの（ＣＦＢ＋ＣＡ１９−９）を組み合わせた場合のＡＵＣは、０．９８６（０．９８５−０．９８６）であって、ＣＦＢとＣＡ１９−９（ｐ＜０．０１）を単独で使用した場合より非常に高いＡＵＣ値を示した（図７）。
【００５５】
これは、ＣＦＢ単独またはＣＦＢ及びＣＡ１９−９の組合によって膵臓癌を診断できることを意味する。
【００５６】
［実施例５］ＣＦＢ及びＣＡ１９−９の最適カット−オフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｖａｌｕｅ）に基づく膵臓癌診断
それぞれのグループ別に（ＨＤ；正常、ＣＰ；膵臓炎、ＰＣ；膵臓癌、ＨＣＣ；肝臓癌、ＣＣ；胆管癌、ＧＣ；胃癌）ＣＡ１９−９とＣＦＢの診断効率を確認した。その結果、下記表２に示されたように、ＣＡ１９−９とＣＦＢがいずれもＰＣにおいて類似な診断効率を示した（ＣＡ１９−９：８０．５％、ＣＦＢ：７３．２％）。しかし、ＣＡ１９−９の場合、他の癌（ＨＣＣ、ＣＣ、ＧＣ）でも高い診断効率（ＨＣＣ：６１．３％、ＣＣ：７７．２％、ＧＣ：１７．１％）を示したが、ＣＦＢは、他の癌では低い診断効率を示した（ＨＣＣ：０％、ＣＣ：０％、ＧＣ：８．６％）。これは、他の癌と比較したとき、ＣＦＢがＣＡ１９−９よりＰＣにさらに特異的であることを意味する。
【００５７】
【表２】
0006361943.tif 000003
【００５８】
［実施例６］ＣＦＢ及びＣＡ１９−９の敏感度と特異度確認
ＣＦＢ、ＣＡ１９−９及びＣＦＢ＋ＣＡ１９−９の膵臓癌診断指標としての正確度を評価するために、最大ヨーデン指標（ｍａｘｉｍｕｍ  Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘ）によって予測された最適のカット−オフ値によるＣＡ１９−９、ＣＦＢ及びＣＦＢ＋ＣＡ１９−９の他の疾病と比較した膵臓癌診断の敏感度及び特異度（％）を確認した。その結果、下記表３に示されたように、ＰＣと他の群（ＨＤ、ＣＰ、ＨＣＣ、ＣＣ、ＧＣ）を比較した場合、ＣＡ１９−９の敏感度は８０．４％、特異度は７０．０％であり、ＣＦＢは、敏感度７３．１％、特異度９７．９％であることが分かった。また、ＣＦＢとＣＡ１９−９を組み合わせた場合には、敏感度９０．１％、特異度９７．２％であった。これは、ＣＡ１９−９とＣＦＢを単独で使用した場合に比べて、ＣＡ１９−９とＣＦＢを組み合わせた場合にさらに好適な診断効率が発揮されることを意味する。
【００５９】
【表３】
0006361943.tif 000004
【図１ａ】
0006361943.tif 000005
【図１ｂ】
0006361943.tif 000006
【図２】
0006361943.tif 000007
【図３ａ】
0006361943.tif 000008
【図３ｂ】
0006361943.tif 000009
【図４ａ】
0006361943.tif 000010
【図４ｂ】
0006361943.tif 000011
【図４ｃ】
0006361943.tif 000012
【図５ａ】
0006361943.tif 000013
【図５ｂ】
0006361943.tif 000014
【図６ａ】
0006361943.tif 000015
【図６ｂ】
0006361943.tif 000016
【図７】
0006361943.tif 000017
【配列表】
0006361943000001.app