(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシン抱合解毒系の能力の向上、解毒の増強、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒の治療および／または予防における使用のための、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ  E.C. number 2.3.1.13）を含む医薬を製造する方法であって、
適切な発現宿主を用意するステップと、
前記発現宿主においてＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）を発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現プラスミドを形成するステップと、
前記宿主を前記発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、
前記発現系において前記ＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）を発現させるステップと、
前記発現されたＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）を前記発現系から分離するステップと、
前記分離した発現されたＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）をグリシンと組み合わせるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記発現されたＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）を前記発現系から分離する前記ステップが、前記発現系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび前記分離されたＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）を濃縮または凍結乾燥するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現宿主が、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系および哺乳動物細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌および枯草菌を含む原核生物系、ならびに古細菌系からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現宿主が、大腸菌を含む原核生物系のとき、ベクターは、原核生物系発現宿主において、ＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）と、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬを含むシャペロンタンパク質とを発現させるための遺伝子を含むように調製されて、発現プラスミドを形成し、前記ＧＬＹＡＴ（E.C. number 2.3.1.13）とシャペロンタンパク質とが前記発現システム中で発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
分離した発現されたＧＬＹＡＴとグリシンとを、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質に基づく構造体を含有するコロイド系を含む群から選択される少なくとも１つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形剤に組み合わせるステップ、
分離した発現されたＧＬＹＡＴとグリシンとを、膜透過剤として使用されるＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）ペプチドと融合させるステップ、
分離した発現されたＧＬＹＡＴとグリシンとを、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、または皮下注射剤のための適切な形態で提供するステップ
のいずれか一つのさらなるステップを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記医薬が、それを必要とする哺乳動物に、水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴが体重１キログラム当たり０．１ｍｇから１６０ｍｇの間の生物学的に有効な量で与えられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記代謝障害が、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか１つまたは複数である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え酵素を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、水溶性の酵
素的に活性な組換えグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ（Ｅ．Ｃ．２．
３．１．１３））を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの体による毒性代謝産物の解毒は、必須の生理的過程である。解毒過程は、ステロ
イドホルモンなどのいくつかの内因性の代謝産物、および食物中の化合物または工業用化
学物質を含み得る外因性毒素の毒性を減少させる。
【０００３】
解毒過程は、３つの主要な相に分けられる。第Ｉ相解毒は、官能基を付加することによ
って代謝産物を活性化する。第Ｉ相解毒により生成される活性化された化合物は、もとの
代謝産物より反応性および毒性が高いことが多く、第ＩＩ相解毒系によってさらに処理さ
れる。第ＩＩ相解毒において、様々な抱合反応が、尿および胆汁中への排泄のために、活
性化された化合物をより低毒性かつより可溶性にするように働く。第ＩＩＩ相解毒は、細
胞からの毒素の排出を伴う。
【０００４】
有機酸血症は、有機酸代謝異常によって引き起こされる一群の代謝障害である。ある特
定の代謝酵素の欠損は、ヒトの体内に高いレベルで通常存在しない酸の蓄積を引き起こす
。いくつかの既知の有機酸血症があり、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、イソ吉
草酸血症、グルタル酸尿症およびメープルシロップ尿症がいくつかの一般的な例である。
【０００５】
イソ吉草酸血症は、常染色体劣性障害である。これは、イソバレリル補酵素Ａデヒドロ
ゲナーゼの欠損によって引き起こされる。この酵素の欠損は、イソ吉草酸、３−および４
−ヒドロキシイソ吉草酸、イソバレリルカルニチンならびにイソバレリルグリシンを含む
、ロイシン異化の中間体の蓄積をもたらす。
【０００６】
イソバレリルグリシンは、イソ吉草酸がグリシンと抱合するときにグリシンＮ−アシル
トランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）によって形成される。イソバレリルグリシンは、イソ
吉草酸より低毒性であり、イソ吉草酸血症の治療においてグリシン抱合が決定的に重要で
あることを示している。
【０００７】
尿素回路異常症は、アンモニアの血流からの排出に関与する尿素回路における酵素欠損
によって引き起こされる遺伝的障害である。尿素回路異常症において、窒素はアンモニア
の形態で蓄積し、高アンモニア血症をもたらし、これは最終的に、回復不能な脳損傷、昏
睡および／または死を引き起こす。
【０００８】
有機酸血症に罹患している個体のグリシン抱合能力を増強するための公知の方法は、グ
リシンサプリメントの投与である。しかしながら、肝臓試料についてのアッセイは、ヒト
のグリシン抱合能力には大きな変動性があることを示している。
【０００９】
よって、自然のグリシン抱合能力を増強させる手段は、ヒトの全体的な健康にとって有
益と思われるだけでなく、さらに、有機酸血症、尿素回路異常症、アミノ酸尿症、および
いくつかの生体異物化学物質への曝露の影響を受けている個体のための代替の治療戦略と
なり得ることが明らかである。
【００１０】
ＧＬＹＡＴは、グリシンへの抱合によっていくつかの毒性有機酸の第ＩＩ相解毒に関与
する酵素である。生体異物および内因性由来の代謝産物の両方の、いくつかの毒性化合物
は、グリシンへの抱合によって解毒される。安息香酸の解毒におけるＧＬＹＡＴの役割に
加えて、この酵素はまた、ある特定の先天性代謝異常の管理においても重要である。
【００１１】
これまで、酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴを細菌により発現し、精製する系は報告さ
れていない。
【００１２】
酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴの発現系がないことに伴う不都合は、特に代謝障害を
有する患者の場合において、グリシン抱合解毒系の能力を直接向上させるために現在利用
可能な商業的に実現性のある製品がないことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンＮ−アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）酵素を生産する新規な方法を提供することおよびそのよう
な方法を用いて生産されたＧＬＹＡＴを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物において、解毒を増強する方法、および代謝障害を
治療および／または予防するための方法における、製薬学的に有効な量のＧＬＹＡＴの使
用を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、前述の不都合を克服する、または少なくとも最小にするこ
とができる、哺乳動物において、解毒を増強する方法、および代謝障害を治療および／ま
たは予防するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンＮ−アシルトラ
ンスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）を生産する方法であって、
適切な発現宿主を用意するステップと、
発現宿主においてＧＬＹＡＴを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発
現プラスミドを形成するステップと、
宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、
発現系においてＧＬＹＡＴ遺伝子を発現させるステップと、
発現されたＧＬＹＡＴを発現系から分離するステップと
を含む方法が提供される。
【００１７】
さらに本発明によれば、発現されたＧＬＹＡＴを発現系から分離するステップは、発現
系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび分離されたＧＬＹＡＴを濃縮ま
たは凍結乾燥するステップを含んでもよい。
【００１８】
さらに本発明によれば、発現宿主は、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系および哺乳動物
細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ならびに古細菌系を含む原核生物系からなる
群から選択することができる。
【００１９】
さらに本発明によれば、この方法は、分離した発現されたＧＬＹＡＴをグリシンと組み
合わせるさらなるステップを含む。
【００２０】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様によって調製される水溶性の酵素的
に活性な組換えＧＬＹＡＴが提供される。
【００２１】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第１の態様によって調製される水溶性の酵素的
に活性な組換えＧＬＹＡＴを含む医薬が提供される。
【００２２】
本発明の第４の態様によれば、哺乳動物において、
グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、
解毒を増強する方法、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および／または予防する方法
における、製薬学的に有効な量の、本発明の第１の態様によって調製される水溶性の酵素
的に活性な組換えＧＬＹＡＴの使用が提供される。
【００２３】
本発明の第５の態様によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴは、それを必
要とする哺乳動物に、増加したグリシン抱合の要求に応じて、体重１キログラム当たり０
．１ｍｇから１６０ｍｇの間の生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬ
ＹＡＴを投与することによって、哺乳動物において、
グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、
解毒を増強する方法、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および／または予防する方法
において使用されてもよい。
【００２４】
本発明の第６の態様によれば、哺乳動物において、
グリシン抱合解毒系の能力を向上させること、
解毒を増強すること、または
代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を
治療および／または予防すること
に使用するための医薬を製造する方法における、製薬学的に有効な量の、本発明の第１の
態様の方法によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴの使用が提供さ
れる。
【００２５】
さらに本発明によれば、代謝障害は、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタ
ル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選
択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれ
か１つまたは複数であり得る。
【００２６】
本発明の第７の態様によれば、本発明の第１の態様による水溶性の酵素的に活性な組換
えＧＬＹＡＴ、ならびに少なくとも１つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形
剤から調製される、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤
、静脈内注射剤、および皮下注射剤からなる群から選択される剤形の医薬が提供される。
【００２７】
水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴは、所望の細胞内区画を標的とする形態の酵
素の製剤を用いて、静脈内注入（ＩＶ）によって投与されてもよい。代替として、水溶性
の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴは、膜透過ＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）ペプ
チドと融合したＧＬＹＡＴ酵素を使用することによって投与されて、組換え酵素が細胞膜
を効率的に通過して、所望のミトコンドリアマトリックスに到達することを可能にしても
よい。さらに代替として、水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡＴは、サブミクロンサ
イズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含有するコロイド系を使用する
ことによって投与されてもよい。
【００２８】
さらに本発明によれば、生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えＧＬＹＡ
Ｔを投与するステップは、グリシン抱合能力をさらに刺激するために、水溶性の酵素的に
活性な組換えＧＬＹＡＴをグリシンと組み合わせて投与するさらなるステップを含んでも
よい。
【００２９】
添付の図面を参照して、本発明を以下にほんの一例としてさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の好ましい一実施形態によるウシＧＬＹＡＴの発現のために使用されるｐＣｏｌｄＩＩＩ発現ベクターを示す図である。
【図２】ウシＧＬＹＡＴをコードしているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が既にクローニングされているプラスミド（もとのＰＣＲ増幅およびクローニングは、ウシ肝臓のｃＤＮＡを使用して実施された）の、ウシＧＬＹＡＴをコードしているＯＲＦのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を示す図である。
【図３】組換えウシＧＬＹＡＴの発現の全画分および可溶性画分（それぞれレーン２およびレーン３）を示すドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動図（ＰＡＧＥ）である。
【図４】組換えウシＧＬＹＡＴの発現の全画分および可溶性画分（それぞれレーン２およびレーン３）ならびにレーン４の部分的に精製された酵素（ニッケルアフィニティークロマトグラフィー）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図５】ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用した部分的な精製（この精製において２０ｍＭのイミダゾールを、洗浄精製バッファーに添加した）後の酵素を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図６−１】ヘキサヒスチジンタグおよびＴｒｘタグのＮ末端融合体を付けた可溶性組換えヒトＧＬＹＡＴ遺伝子（レーン４〜９）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図６−２】ヘキサヒスチジンタグおよびＴｒｘタグのＮ末端融合体を付けた可溶性組換えヒトＧＬＹＡＴ遺伝子（レーン４〜９）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図７】野生型組換えヒトＧＬＹＡＴ（レーン３）およびヒトＧＬＹＡＴの単一塩基多型（ＳＮＰ）変異体（レーン４〜９）の、ニッケルアフィニティー精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図８】グリシンの存在下および非存在下における、組換えヒトＧＬＹＡＴおよびウシ肝臓ＧＬＹＡＴの酵素活性を示す分光光度アッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンＮ−ア
シルトランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）を生産するための方法が提供される。
【００３２】
この方法は、ＧＬＹＡＴ発現遺伝子をもたらす適切な発現宿主を用意するステップと、
発現宿主においてＧＬＹＡＴを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現
プラスミドを形成するステップと、宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成
するステップと、ＧＬＹＡＴを発現系において発現させるステップと、発現ＧＬＹＡＴを
発現系から分離するステップと、分離した発現ＧＬＹＡＴをグリシンと組み合わせるステ
ップとを含む。
【００３３】
発現宿主は、酵母細胞発現、昆虫細胞発現および哺乳動物細胞発現を含む真核生物系、
大腸菌および枯草菌を含む原核生物系ならびに古細菌系からなる群から選択される。大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、特に適切な宿主を提供することが見出された。
【００３４】
ウシＧＬＹＡＴをコードしている遺伝子は、ウシ肝臓ＲＮＡから単離され、逆転写およ
びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、ｐＣｏｌｄＩＩＩ発現ベクター中にク
ローニングされた（図１において示されているとおり）。ｐＣｏｌｄＩＩＩ発現ベクター
は、摂氏１５度での大腸菌におけるタンパク質の発現を可能にし、これは、可溶性の酵素
的に活性な組換えタンパク質の発現を増強する。
【００３５】
様々な他のベクターもまた、真核生物、原核生物および古細菌の発現宿主における、組
換えヒトＧＬＹＡＴおよび組換えウシＧＬＹＡＴまたは他のＧＬＹＡＴ変異体の発現のた
めに使用され得る。
【００３６】
適切なベクターを得るために、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）が、遺伝子のＣ末端に
接続される。Ｃ末端ヒスチジンタグの代替として、タグは、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ
、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＧＳＴ
タグおよびＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩからなる群から選択される。
【００３７】
ＧＬＹＡＴは、代替として、精製タグなしで発現され、公知のタンパク質精製戦略を利
用することによって発現宿主のタンパク質から分離される。ＧＬＹＡＴはヌクレオチド−
補因子結合酵素であるという事実のために、ＧＬＹＡＴはさらに代替として、アフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【実施例】
【００３８】
［実施例１：  組換えウシＧＬＹＡＴ］
組換えウシＧＬＹＡＴを、Ｃ末端ヒスチジンタグをコードしている３つの改変されたｐ
ＣｏｌｄＩＩＩ（ｐＣｏｌｄＩＩＩ−Ｅ、ｐＣｏｌｄＩＩＩ−ＡおよびｐＣｏｌｄＩＩＩ
−ＥＨ）発現ベクターのセットにクローニングした。
【００３９】
コード配列を発現ベクター中にクローニングするために、定方向クローニングを容易に
するためのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位を含むプライマーを使用したポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって配列を増幅する。ＰＣＲ反応混合物は、１×Ｔａｋａｒａ
ＥｘＴａｑバッファー、１０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、約
５０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび２ユニットのＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑポリメラーゼを最終
体積５０μｌ中に含有していた。サーマルサイクリング条件は、摂氏９４度で１分間、次
いで摂氏９４度で３０秒間を３０サイクル、摂氏７０度で３０秒間および摂氏７２度で１
分間、続いて摂氏７２度で１０分間の最終伸長であった。
【００４０】
大腸菌を組換えＧＬＹＡＴコード配列を含む発現プラスミドで形質転換した後、制限分
析またはＰＣＲ増幅のいずれかを使用して、コロニーを所望の組換えプラスミドについて
スクリーニングした。図２において示されているように、アガロースゲルにおいて約９０
０ｂｐの切り取られた断片が見られれば、コロニーを陽性であるとみなした。
【００４１】
組換えタンパク質を、ニッケルアフィニティー精製プロセスを使用して精製した。組換
えＧＬＹＡＴと融合したヒスチジンタグは、ニッケルイオンが固定された樹脂を通過する
と、その表面に固定されたニッケルイオンと配位結合を形成することによってカラムマト
リックスに強固に結合する。このことにより、ヒスチジンタグ付きＧＬＹＡＴは結合した
ままでありながら、大部分の他のタンパク質をカラムから洗浄することが可能となる。タ
グ付きタンパク質を高濃度のイミダゾールを含有するバッファーで溶出し、イミダゾール
がヒスチジン残基とニッケルイオンとの間の配位結合と置き換わり、部分的に精製された
組換えタンパク質をもたらした。
【００４２】
図３に関して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
（ＰＡＧＥ）を使用して、ｐＣｏｌｄＩＩＩベクターからのウシＧＬＹＡＴの発現を分析
した。タンパク質を、クマシーブリリアントブルーで染色することによって可視化した。
レーン２は発現されたタンパク質の全画分を示し、レーン３は細菌溶解物の可溶性画分を
示しており、発現された可溶性組換えＧＬＹＡＴは、細菌タンパク質のバックグラウンド
においてはっきりと見られない。
【００４３】
図４に関して、組換えウシＧＬＹＡＴを、Ｃ末端ヒスチジンタグとともにｐＣｏｌｄＩ
ＩＩから発現した。可溶性画分を、ニッケルアフィニティー精製カラムに通過させて、タ
グ付き組換えＧＬＹＡＴ酵素を精製した。発現された可溶性組換えウシＧＬＹＡＴのレベ
ルは低く、よって、精製の最後の溶出液をかなり濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、レ
ーン２において発現されたタンパク質の全画分を明らかにした。レーン３は、組換えＧＬ
ＹＡＴの可溶性画分を表し、細菌タンパク質のバックグラウンドに対して顕著な量の可溶
性組換えＧＬＹＡＴは見られない。レーン４は、ニッケルアフィニティー精製の結果とし
て部分的に精製された酵素を示す。下のバンドは、ＧＬＹＡＴ酵素の活性な形態を示す。
【００４４】
図５に関して、２０ｍＭのイミダゾールを、精製キットのカラム洗浄バッファーに添加
した。バッファーにおいてイミダゾールを使用することにより、以前に同時精製したタン
パク質の大部分が失われる結果となった。図５における下のバンドは、酵素的に活性なウ
シＧＬＹＡＴおよび未知のタンパク質を表す。
【００４５】
本発明によって調製された組換えウシＧＬＹＡＴ酵素は、ウシ肝臓から精製されたＧＬ
ＹＡＴ酵素と同様の生化学的特性を有することが見出された。
【００４６】
［実施例２：  組換えヒトＧＬＹＡＴ］
ヒトＧＬＹＡＴ配列をコードしているヌクレオチド配列を合成し、ｐＥＴ３２発現ベク
ター中にクローニングした。
【００４７】
ｐＥＴ３２発現ベクターは、酵素の精製および正しいフォールディングをそれぞれ容易
にするＮ末端ヘキサヒスチジンタグおよびＮ末端Ｔｒｘタグを有するヒトＧＬＹＡＴの発
現を可能にする。
【００４８】
ヒトＧＬＹＡＴをコードしている発現ベクターで、Ｏｒｉｇａｍｉ発現細胞を形質転換
した。細胞はまた、ＴａｋａｒａのｐＧｒｏ７ベクターでも形質転換し、これにより、Ｇ
ｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬシャペロンタンパク質の共発現をもたらした。シャペロンタン
パク質は、タンパク質の正しいフォールディングを助け、可溶性組換え酵素の収率を増加
させる。
【００４９】
組換えヒトＧＬＹＡＴおよびシャペロンタンパク質の発現のためのプラスミドを含むＯ
ｒｉｇａｍｉ細胞を、液体培地中で増殖させた。可溶性ＧＬＹＡＴの最適な発現は、ＩＰ
ＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）の非存在下で起こり、したが
って、ＩＰＴＧを用いて融合タンパク質の発現を誘導する公知の方法とは対照的に、遅い
基本速度でＧＬＹＡＴの発現を可能にすることが見出された。
【００５０】
発現の後、細胞を遠心分離によって回収し、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸塩
バッファー、ｐＨ８．０、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、リゾチームおよ
びプロテアーゼ阻害剤を含有する最適化されたネイティブ溶解バッファーを使用して溶解
した。細胞溶解物を、１００００ｇで３０分間遠心分離を使用して清澄化して不溶性物質
を除去し、Ｐｒｏｔｉｎｏニッケルアフィニティー精製カラムを通してヘキサヒスチジン
タグ付き酵素を選択的に結合させた。カラムを洗浄し、精製されたタンパク質を最終体積
３ｍｌ中に溶出した。
【００５１】
図６に関して、可溶性組換えヒトＧＬＹＡＴを、Ｎ末端ヘキサヒスチジン−Ｔｒｘ融合
タグを付けて発現させた。レーン１は、分子サイズマーカーを含有する。レーン２および
レーン３は、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬を使用して溶解した細胞の培養物の
、それぞれ不溶性画分および可溶性画分を含有する。可溶性組換えヒトＧＬＹＡＴは見ら
れなかったため、この溶解試薬は組換えヒトＧＬＹＡＴの抽出に適していないことが見出
された。
【００５２】
代替として、最適化されたネイティブ溶解バッファーを使用して、０時間から４時間ま
で発現しているタンパク質を培養物から単離し、可溶性画分をレーン５〜９にロードした
。ヘキサヒスチジン−Ｔｒｘ−ＧＬＹＡＴ融合タンパク質を、５５ｋＤａ範囲にある矢印
によって示す。
【００５３】
図７に関して、可溶性組換えヒトＧＬＹＡＴ融合タンパク質は、Ｐｒｏｔｉｎｏ  Ｎｉ
−ＴＥＤカラムを使用したニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製され
る。レーン１は、分子量マーカーを含有し、レーン２には何も入っていない。レーン３は
、精製後の野生型組換えヒトＧＬＹＡＴ融合タンパク質を含有する。レーン４〜９は、Ｇ
ＬＹＡＴ遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）の既知異変に関する、本発明に従って調製された
精製済み組換えヒトＧＬＹＡＴ融合タンパク質を含有する。
【００５４】
図８に関して、得られた酵素調製物を、分光光度アッセイを使用してＧＬＹＡＴの酵素
活性についてアッセイした。アッセイにおいて、ウシＧＬＹＡＴを陽性対照として使用す
る。観察される酵素活性がグリシン依存的であることを示す陰性対照として、グリシンを
用いない反応を行った。組換えヒトＧＬＹＡＴは、４１２ｎｍでの吸光度（ＯＤ）の増加
を示し、本発明に従って調製した組換えヒトＧＬＹＡＴのグリシン存在下での酵素活性を
裏付けた。
【００５５】
上述のように治療用組換えＧＬＹＡＴ酵素を使用することに加えて、ＧＬＹＡＴ酵素の
新規な形態が、合理的なおよび半合理的な酵素工学戦略によって得られ得ること、および
これらが代替的にそれらの特殊化した機能のために使用され得ることが考えられる。酵素
工学戦略による改変を受け得るＧＬＹＡＴ酵素の特質には、触媒反応速度、基質特異性、
安定性、免疫学的側面および最適基質濃度が含まれる。
【００５６】
ヒトＧＬＹＡＴの既知の天然ＳＮＰ（一塩基多型）変異体が６種存在しており、部位特
異的突然変異誘発を使用して、野生型配列からこれらの変異体コード配列を生成した。６
種のＳＮＰ変異体のうち、２種は野生型ＧＬＹＡＴより高い酵素活性を有し、残りは野生
型ＧＬＹＡＴよりはるかに低い活性を有することが見出された。例えば触媒反応速度が増
加した変異体を使用すれば明らかな利益が伴うと予想することができる。
【００５７】
［さらなる発見および分析］
使用において、代謝障害の性質および程度に応じて、体重１キログラム当たり０．１ｍ
ｇ〜１６０ｍｇの製薬学的に有効な量の組換えＧＬＹＡＴ酵素が、それを必要とする患者
に、所望の細胞内区画を標的とする形態の酵素の製剤を用いて、静脈内注入（ＩＶ）によ
って投与される。代替として、調製された組換えＧＬＹＡＴ酵素は、膜透過剤として作用
するＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）ペプチドを使用することによって投与され、こ
れにより、組換え酵素が、細胞膜を効果的に通過して、所望のミトコンドリアマトリック
スに到達することが可能になろう。さらに代替として、調製された組換えＧＬＹＡＴ酵素
は、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含むコロイ
ド系を使用して投与することにより、哺乳動物において解毒を増強し、代謝障害、および
キシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性中毒または慢性中毒を治療および／ま
たは予防する。
【００５８】
代謝障害は、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される
有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、
ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか１つまたは複数でもよ
い。
【００５９】
組換えＧＬＹＡＴは、さらに代替として、以下の、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロッ
プ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、および皮下注射剤を含む剤形のいずれ
かに製剤化される。
【００６０】
グリシンと組み合わせて組換えＧＬＹＡＴから調製される医薬を使用して、化学物質お
よび工業溶媒に曝露された患者の治療、および急性アスピリン中毒の救急治療において、
グリシン抱合解毒系の能力が直接向上する。いくつかの有機酸のグリシン抱合は、治療用
組換えＧＬＹＡＴ酵素の使用によって増強される。
【００６１】
本発明に関して、組換え酵素を生産する新規な方法、より詳細には水溶性の酵素的に活
性な組換えグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）酵素を生産する新規な
方法を提供する際の詳細の変更が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく可能であ
ることは理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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