(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の全重量に対して、少なくとも１種類の０．１重量％〜９９．９重量％のタンパク質と、９９．９重量％〜０．１重量％の生分解性ポリマーと、を含み、
前記生分解性ポリマーが、前記ポリマー主鎖から垂れ下がる未保護親水性基及び前記ポリマー主鎖から垂れ下がる保護疎水性基である、少なくとも２つの異なる官能基を含み、
前記未保護親水性基が、カルボキシル基、アミン基、チオール基またはヒドロキシル基から選択され、
前記保護疎水性基が、エステル基、アミド基またはチオエステル基から選択され、
前記未保護親水性基の前記保護疎水性基に対する比が０．１７〜３であり、
前記ポリマーが、生理学的条件に少なくとも２０日間曝露された場合に水を２〜２０重量％吸収するものであり、
前記生分解性ポリマーが、ポリエステルアミドであり、
前記ポリエステルアミドが、構造式（Ｉ）
【化１】
0006330815.tif 000009
によるポリエステルアミドコポリマーであり、
上記式中、ｍ＋ｐは０．９〜０．１で異なり、ｑは０．１〜０．９で異なり；ｍ＋ｐ＋ｑ＝１であり、ｍまたはｐは０であることができ；ｎは５〜３００で異なり、かつａは少なくとも０．１であり、ｂは少なくとも０．１５であり、ａ＋ｂ＝１であり：
ｍ単位、ｐ単位、ａ単位およびｂ単位はそれぞれランダムに分布しており、
−  Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
−  単一主鎖単位ｍまたはｐにおけるＲ３およびＲ４はそれぞれ、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−（ＣＨ２）ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（ＣＨ）３、（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３）、−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、およびその混合物からなる群から独立して選択され、
−  Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択され、
−  Ｒ６は、構造式（ＩＩ）；
【化２】
0006330815.tif 000010
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択され、
−  Ｒ７は、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンからなる群から独立して選択され、
−  Ｒ８は、−（ＣＨ２）４−である、薬物送達組成物。
【請求項２】
ｂが少なくとも０．２５である、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項３】
ｂが少なくとも０．５である、請求項１または２に記載の薬物送達組成物。
【請求項４】
ｐ＝０かつｍ＋ｑ＝１であり、ｍ＝０．７５であり、ｂは０．５であり、かつａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は（ＣＨ２）８であり、Ｒ３は（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５はヘキシルであり、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−である、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項５】
ｍ＋ｐ＋ｑ＝１であり、ｑ＝０．２５であり、ｐ＝０．４５かつｍ＝０．３であり、ｂは０．２５であり、かつａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は−（ＣＨ２）８であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から選択され、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−であり；Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択される、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項６】
ｍ＋ｐ＋ｑ＝１であり、ｑ＝０．２５であり、ｐ＝０．４５かつｍ＝０．３であり、ｂは０．５であり、ａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は−（ＣＨ２）８であり；Ｒ４は（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４であり；Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択される、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項７】
ｍ＋ｐ＋ｑ＝１、ｑ＝０．１、ｐ＝０．３０かつｍ＝０．６であり、ｂは０．５であり、かつａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１−（ＣＨ２）４であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり；Ｒ７ベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−であり；Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から選択され、Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択される、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項８】
前記タンパク質が、ペプチド、インスリン、ホルモン、ワクチン、酵素、抗生物質、抗体、神経刺激剤、成長因子、サイトカイン、抗原および糖タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物を含む、タンパク質の制御放出のための薬物送達システム。
【請求項１０】
微粒子、フィルム、コーティング、繊維、ペレット、シリンダー、ディスク、インプラント、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノスフェア、ウエハー、ミセル、リポソーム、織布または不織布を含む形態である、請求項９に記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
前記未保護親水性基の前記保護疎水性基に対する比が０．３〜１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
【請求項１２】
０．１重量％〜２０重量％の前記タンパク質と、６０重量％〜９９．９重量％の前記生分解性ポリマーと、を含む、請求項１〜８又は１１のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質および生分解性ポリエステルアミドを含む薬物送達組成物に関する。本発明はさらに、生物学的環境にタンパク質を長期間にわたり制御放出するための薬物送達システムに関する。
【０００２】
先行技術において、タンパク質は、その経口バイオアベイラビリティが乏しく、生体内での半減期が短いため、通常、繰り返しの注射によって、または点滴によって投与されており、したがって患者に著しい身体的負担が課され、それに伴う管理費用が生じる。したがって、制御放出配合物の開発および評価にかなりの関心が集まった。例えば、Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｔｏｐｐ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ＆ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，２００８，ｖｏｌ．２，（３）に、タンパク質配合物の制御放出の開発についての概要が記述されている。制御放出配合物は、生体内での分解および排出からの保護、毒性の低減を提供し、患者の服薬遵守を改善し、特定の部位にタンパク質を局在化または標的化する能力を向上させ、タンパク質をより効率的に利用し、その結果として投薬量が少なくなる。大規模な研究にもかかわらず、タンパク質の制御放出の進歩は、配合プロセス中のタンパク質の変性、長期間の生体内放出、バースト放出、不完全な放出過程での活性の低下、タンパク質の凝集および関連する免疫原性、低いカプセル化効率および配合の複雑さなど、多くの技術的問題によって阻まれている。その送達システムが、所定の時間で望まれるよりも多くのタンパク質を放出した場合には、バースト放出が起こる。最初にポリマーマトリックスに組み込まれたタンパク質の大部分が放出されず、送達システムからのタンパク質の溶出が既に終了している場合には、不完全放出が起こる。
【０００３】
タンパク質を放出するためのポリマーの使用は広く試験されており、ポリマーベースのタンパク質放出固形物の大部分は、初期のバースト放出および高いタンパク質濃度に対する患者の不必要な曝露を制限するが、ポリマーマトリックスからのタンパク質の拡散が乏しいために放出が不完全である。タンパク質の不完全放出の問題は、例えば国際公開第００００２２２号パンフレットに開示されるように、ヒドロゲルをベースとする薬物送達システムの使用によって解決されている。しかしながら、ヒドロゲルは、数週間よりも長い期間では、タンパク質の制御放出を提供しない。
【０００４】
α−ヒドロキシ酸ベースのポリエステル、例えばポリラクチド（ＰＬＬＡ）またはポリ乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）などの生分解性ポリマーもまた、タンパク質の徐放ためのポリマーマトリックスとして広く探究されている。しかしながら、ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡは、ポリマー分解中に放出される酸性副生成物のためにタンパク質の安定性に関する問題に直面している。これは図４で確認されている。
【０００５】
タンパク質の安定性はさらに、タンパク質送達配合物を製造する際の過酷な製造条件、例えば有機溶媒への曝露、気相液相界面、激しい撹拌、音波処理等によって影響を受ける。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、薬物送達組成物、ならびに安全かつより制御された様式でタンパク質を送達する、その組成物から製造された薬物送達システムを提供することである。さらに、本発明の目的は、数か月にわたって薬物送達システムからのタンパク質送達を延長することである。
【０００７】
本発明の目的は、少なくとも１つのタンパク質と、ポリマー主鎖から垂れ下がるカルボキシル、エステル、アミン、アミド、チオール、チオエステルまたはヒドロキシル基の群から選択される少なくとも２つの異なる官能基を有する生分解性ポリマーであって、それによって、生理学的条件に２０日間曝露されるとポリマーは水を２〜２０重量％吸収する、生分解性ポリマーと、を含む薬物送達組成物を提供することによって達成される。
【０００８】
意外なことに、その異なる官能基およびポリマー主鎖におけるその相対比によって、ポリマーマトリックスと水分子の相互作用が維持され、かつタンパク質の徐放が制御されることが見出された。この結果として、ポリマーマトリックスがゆっくりと開放され、生理学的条件にて数か月から数年の期間にわたってタンパク質の徐放が提供されることから、ポリマーマトリックスへの水分子の吸収はゆっくりと起こることが本発明において重要である。
【０００９】
好ましくは、ポリマーは、生理学的条件に２０日間曝露された場合に、水を４〜１５重量％吸収する。さらに好ましくは、ポリマーは、生理学的条件に２０日間曝露された場合に、水を４〜１０重量％吸収する。
【００１０】
水の吸収は、ポリマーマトリックスからのタンパク質分子の完全な遊離に重要である。例えば、膨潤したヒドロゲルにおいて、水の質量分率は、ポリマーの分率よりもかなり高い。これは、吸水率が著しく１００重量％を超えること、一般に１０００〜１００００重量％の範囲であることを意味する。さらに、水性環境にポリマーを曝露すると、吸水およびヒドロゲルのそれぞれの膨潤は、数時間から最長１週間の期間に起こる。１００重量％を超える水を一般に吸収する通常のヒドロゲルと異なり、本発明による組成物は、生理学的条件に２０日間曝露した場合に水を４〜１０重量％のみ吸収する。生理学的条件とは、３７℃、ｐＨ７．２〜７．４、およびＮａＣｌ０．９％水溶液に等しいイオン強度の水性媒体中を意味する。
【００１１】
好ましくは、２つの異なる官能基は、カルボキシル、アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの未保護親水性官能基と、エステル、アミド、チオールまたはチオエステル基から選択される少なくとも１つの保護疎水性官能基と、を含む。未保護とは、遊離カルボン酸基または−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基または−ＯＨ基を意味する。保護疎水性官能基とは、−ＣＯＯＲ基、−ＣＯＳＲ、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＳＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＳＲ基（Ｒは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル基または（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり得る）を意味する。
【００１２】
未保護親水性基と保護疎水性官能基との比は、好ましくは０．１７〜３、さらに好ましくは０．３〜１で異なる。
【００１３】
さらに好ましくは、本発明による組成物は、ペンダント未保護カルボキシル官能基およびペンダント保護エステル官能基を有する生分解性ポリマーを含む。
【００１４】
好ましい実施形態において、生分解性ポリマーは、構造式（Ｉ）
【化１】
0006330815.tif 000002
による生分解性ポリエステルアミドコポリマー（ＰＥＡ）であり、
上記式中、ｍ＋ｐは０．９〜０．１で異なり、ｑは０．１〜０．９で異なり；ｍ＋ｐ＋ｑ＝１であり、ｍまたはｐは０であることができ；ｎは５〜３００で異なり、ａは少なくとも０．１であり、ｂは少なくとも０．１５であり、かつａ＋ｂ＝１であり：
−  Ｒ１は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンから独立して選択される。
−  単一主鎖単位ｍまたはｐにおけるＲ３およびＲ４はそれぞれ、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、−（ＣＨ２）ＳＨ、−（ＣＨ２）２Ｓ（ＣＨ３）、−（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３）、−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、およびその混合物からなる群から独立して選択される。
−  Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から独立して選択される。
−  Ｒ６は、構造式（ＩＩ）；
【化２】
0006330815.tif 000003
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択される。
−  Ｒ７は、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたは保護基からなる群から独立して選択される。
−  Ｒ８は−（ＣＨ２）４−である。
【００１５】
式（Ｉ）によるポリエステルアミドを含む組成物であって、保護官能基が主鎖単位（ａ）に存在し、かつ未保護官能基が主鎖単位（ｂ）に存在し、それによって主鎖単位（ｂ）における未保護官能基のパーセンテージが少なくとも１５％であり、未保護官能基と保護官能基の合計が１００％となる、組成物は、少なくとも６週間にわたってタンパク質の均一な徐放を提供することが見出された。さらに、この組成物は、週当たりのタンパク質放出のばらつきを減らすことが確認される。Ｌ−リジン−ＣＯＯＨを少なくとも１５％、したがってＬ−リジン−ＣＯＯ−ベンジル（Ｂｚ）を８５％含むＰＥＡはさらに、ＰＥＡ−Ｈ／Ｂｚ  １５％Ｈと呼ばれる。
【００１６】
したがって、本発明は、タンパク質と、式（Ｉ）の生分解性ポリエステルアミドと、を含む薬物送達組成物であって、古典的なヒドロゲルと異なり、生理学的条件に２０日間曝露した場合にも著しく水を吸収せず、タンパク質充填（ｌｏａｄ）の急速な放出を防ぐ薬物送達組成物に関する。意外なことに、ポリエステルアミドマトリックスは、水の拡散および加水分解により誘導される生分解プロセスによって、水分子をゆっくり、かつ連続的に吸収することが確認された。この結果、ポリマーマトリックスはゆっくりと開放され、タンパク質がポリマーからゆっくりと拡散することが可能となり、それによって、長時間にわたるタンパク質の制御放出が得られる。さらに、ポリエステルアミドマトリックスならびに分解から生じるその副生成物は、タンパク質種と極めて適合性であり、その生物活性または安定性に影響を及ぼさないことは意外である。
【００１７】
以下の図において、左から右へ、タンパク質を含有する乾燥ポリマーマトリックスの放出が示されている。最初の吸水によって、マトリックス周辺部の膨潤が生じ、タンパク質の最初の放出が起こる。時間が経つにつれてポリマーが加水分解した結果、網状構造の密度が低くなり、徐々により多くの水が吸収される。タンパク質の徐放は、最終的に達成され、ポリマーが完全に分解するまで、マトリックス中に少量のタンパク質が残っている。
【化３】
0006330815.tif 000004
【００１８】
生分解性ポリエステルアミドは、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第２００８／０２９９１７４号パンフレットに開示されている。以下の式ＩＩＩに示すこれらのＰＥＡは、２つのビス−（αアミノ酸）ベースのジオールジエステル内に少なくとも２つの直鎖状飽和または不飽和脂肪族ジオール残基を含む。主鎖単位ｑに存在するリジン単位は、Ｒ７がベンジルである場合には保護されており、またはＲ７がＨである場合には未保護である。未保護リジンを含むＰＥＡはさらに、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈと示され、保護リジンを含むＰＥＡはさらにＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｂｚと示される。
【化４】
0006330815.tif 000005
【００１９】
式ＩＩＩにおいて、ｍは、０．０１〜０．９９で異なり；ｐは、０．２〜３で異なり、ｑは、０．１０〜１．００で異なり、それによってｎは、５〜１００であり；Ｒ１は−（ＣＨ２）８であり；主鎖単位ｍおよびｐにおけるＲ３およびＲ４はロイシンであり、−Ｒ５はヘキサンであり、Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片であり；Ｒ７は、Ｈまたはベンジル基から選択されてもよく、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−である。
【００２０】
ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈは高い膨潤プロファイルを示し、約２４〜４８時間で充填または封入された生理活性物質の急速なバースト放出が生じることが認識されている。ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈは、第１週でタンパク質の全充填を放出する。実際には、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｂｚは、初日に充填タンパク質のごく少量分を放出し、次いで放出が止まる。これらの特性は、膨潤データとも相関する。２つの異なるペンダント官能基を有するポリエステルアミドは、第１週でごくわずかに膨潤し、２０週間にわたってタンパク質を絶えず放出する。
【００２１】
本発明の以下の実施形態において、式（Ｉ）中のｎは好ましくは、５０〜２００で異なり、式（Ｉ）のポリエステルアミドの主鎖におけるｍ、ｐおよびｑ単位はランダム分布にある。
【００２２】
好ましい実施形態において、式（Ｉ）による生分解性ポリエステルアミドコポリマーは、ｐ＝０かつｍ＋ｑ＝１、ｍ＝０．７５を含み、ｂは０．５であり、ａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は（ＣＨ２）８であり、Ｒ３は（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５はヘキシルであり、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−であり、このポリエステルアミドはさらに、ＰＥＡ−Ｉ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈと呼ばれる。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）による生分解性ポリエステルアミドコポリマーは、ｍ＋ｐ＋ｑ＝１、ｑ＝０．２５、ｐ＝０．４５およびｍ＝０．３を含み、ｂは０．２５であり、ａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は−（ＣＨ２）８であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から選択され、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−であり；Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択され、このポリエステルアミドは、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ２５％Ｈと呼ばれる。
【００２４】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、式（Ｉ）による生分解性ポリエステルアミドコポリマーは、ｍ＋ｐ＋ｑ＝１、ｑ＝０．２５、ｐ＝０．４５およびｍ＝０．３を含み、ｂは０．５であり、ａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１は−（ＣＨ２）８であり；Ｒ４は（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４であり；Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択され、このポリエステルアミドはさらに、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈと呼ばれる。
【００２５】
さらに他の実施形態において、式（Ｉ）による生分解性ポリエステルアミドコポリマーは、ｍ＋ｐ＋ｑ＝１、ｑ＝０．１、ｐ＝０．３０およびｍ＝０．６を含み、ｂは０．５であり、ａ＋ｂ＝１であり、Ｒ１−（ＣＨ２）４であり；Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−であり；Ｒ７はベンジルであり、Ｒ８は−（ＣＨ２）４−であり；Ｒ５は、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキレンからなる群から選択され、Ｒ６は、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式断片から選択され、このポリエステルアミドはさらに、ＰＥＡ−ＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈと呼ばれる。
【００２６】
ポリエステルアミドコポリマーにおいて使用されるα−アミノ酸のうちの少なくとも１つは、天然αアミノ酸である。例えば、Ｒ３またはＲ４がＣＨ２Ｐｈである場合には、合成で使用される天然αアミノ酸はＬ−フェニルアラニンである。Ｒ３またはＲ４が−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２である代替方法において、コポリマーは天然アミノ酸ロイシンを含有する。本明細書に記載の２つのコモノマーの変形形態内でＲ３およびＲ４を独立して変化させることによって、他の天然α−アミノ酸、例えばグリシン（Ｒ３またはＲ４がＨである場合）、アラニン（Ｒ３またはＲ４がＣＨ３である場合）、バリン（Ｒ３またはＲ４がＣＨ（ＣＨ３）２である場合）、イソロイシン（Ｒ３またはＲ４がＣＨ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ３である場合）、フェニルアラニン（Ｒ３またはＲ４がＣＨ２−−Ｃ６Ｈ５である場合）、リジン（Ｒ３またはＲ４（ＣＨ２）４−−ＮＨ２である場合）；またはメチオニン（Ｒ３またはＲ４が−−（ＣＨ２）２Ｓ（ＣＨ３）である場合）、およびその混合物もまた使用することができる。
【００２７】
タンパク質の例は、サイトカイン＆アンタゴニスト、ペプチド、ホルモン、抗体、酵素、融合たんぱく質または凝固因子＆阻害剤である。サイトカイン＆アンタゴニストの具体的な例は、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファコン−２ａ、インターフェロンアルファコン−２ｂ、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ−２）、Ｆｉｌｇａｓｔｉｍ（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｍ（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ（Ｇ−ＣＳＦ）、Ｔａｓｏｎｅｒｍｉｎ（ＴＮＦ−ａ）、Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、Ｏｐｒｅｖｅｌｋｉｎ（ＩＬ−１１）またはＡｎａｋｉｎｒａ（ＩＬ−１−ＲＡ）である。ペプチドおよびホルモンの具体的な例は、インスリン、エポエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ）α、エポエチンβ、フォリトロピン（Ｆｏｌｉｔｒｏｐｉｎ）α、フォリトロピンβ、ソマトロピン（Ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）、グルカゴン、テリパラチド（Ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）（ＰＴＨ１−３４）、サケカルシトニン（Ｓａｌｍｏｎ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、チロトロピン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ）α、コリオゴナドトロピン（Ｃｈｏｒｉｇｏｎｄｏｔｒｏｐｉｎ）Ａ２、骨形成タンパク質−１、ジボテルミン（Ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ）α、ペグビソマント（Ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ）（ｈＧＨアンタゴニスト）、ネシリチド（Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）（ナトリウム排泄増加ペプチド）またはルトロピン（Ｌｕｔｒｏｐｉｎ）αである。抗体の具体的な例は、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃａｔｕｘｉｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｔｉｍｕｍａｂ）またはラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）である。酵素の具体的な例は、アルテプラーゼ（ｔ−ＰＡ）、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ（ＴＮＫ−ｔ−Ｐ）、モンテプラーゼ、ドルナーゼα（ＲＮａｓｅ）、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼα＆β、ラロニダーゼまたはラスブリカーゼである。凝固因子＆阻害剤の具体的な例は、エプタコグ（Ｅｐｔａｃｏｇ）α、抗血友病因子（３）、モロクトコグ（Ｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ）α、（ＦＶＩＩＩムテイン）、デシルジン（Ｄｅｓｉｒｕｄｉｎ）、レピルジン（Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ）、ドロトレコギン（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎ）α（タンパク質Ｃａｃｔ）またはα１プロテイナーゼ阻害剤である。融合たんぱく質の具体的な例は、デニロイキンディフチトクス（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）またはアレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）である。
【００２８】
タンパク質の他の例は、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、プロラクチン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨアゴニスト、ＬＨＲＨアゴニスト、成長ホルモン（ヒト、ブタ、およびウシを含む）、成長ホルモン放出因子、インスリン、エリスロポエチン（赤血球形成活性を有するすべてのタンパク質）、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等を含む）、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンギオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヘパリナーゼ、血管内皮成長因子（ＶＥＧ−Ｆ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ｈａｎｋ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジンまたはシクロスポリンである。
【００２９】
本発明による薬物送達組成物は、組成物の全重量に対して、例えばタンパク質０．１重量％〜９９．９重量％、生分解性ポリマー９９．９重量％〜０．１重量％を含む。好ましくは、組成物は、組成物の全重量に対して、タンパク質０．１重量％〜２０重量％、生分解性ポリマー６０重量％〜９９．９．重量％を含む。
【００３０】
本明細書で使用される、「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル等を含む直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される、「アルキレン」という用語は、主鎖において、または側鎖において少なくとも１つの不飽和結合を含有する、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等を含む二価分岐状または未分岐の炭化水素鎖を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素間三重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される、生分解性」という用語は、生体内環境または生体外環境に曝露された場合に完全にまたは実質的に分解または腐食されることができる材料を意味する。例えば、対象内での加水分解、酵素分解、酸化、代謝プロセス、バルクまたは表面浸食によって徐々に、破壊、再吸収、吸収かつ／または除去されることができる場合に、ポリマーは分解または腐食され得る。
【００３４】
本明細書で使用される、「ランダム」という用語は、ランダム分布における式（Ｉ）のポリエステルアミドのｍ、ｐおよびｑ単位の分布を意味する。
【００３５】
本明細書で使用される、「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、および時に硫黄を含有する複合有機化合物の群のうちの１つを含むことが意図される。
【００３６】
本明細書で使用される、「生物学的環境」とは、生体外であろうと生体内であろうと、生物活性が制御され得る、いずれかの環境を意味する。
【００３７】
ポリエステルアミドコポリマーは好ましくは、１５，０００〜２００，０００ダルトンの範囲の数平均分子量（Ｍｎ）を有する。本明細書に記載のポリエステルアミドコポリマーは、様々な分子量および主鎖におけるｍ、ｐ、およびｑ単位の様々な相対比率で製造することができる。特定の用途の適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。適切なＭｎは、約１５，０００〜約１００，０００ダルトン、例えば約３０，０００〜約８０，０００または約３５，０００〜約７５，０００である。Ｍｎは、標準物質としてポリスチレンを使用して、ＴＨＦ中のＧＰＣによって測定される。
【００３８】
ポリエステルアミドの基本重合プロセスは、Ｇ．Ｔｓｉｔｌａｎａｄｚｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄｎ．（２００４）１５：１−２４に記載のプロセスに基づくが、異なる構成単位および活性化基が使用された。
【００３９】
本発明の組成物において使用されるポリエステルアミドは、例えばスキーム１で示されるように、ｐ−トルエンスルホネートジアミン塩（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４）を活性化二酸（Ｙ１）で溶液重縮合することによって合成される。一般に、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドが溶媒として使用される。一般に、塩基として、トリエチルアミド１．１当量がｐ−トルエンスルホネートの量に対して添加され、その反応は、絶えず撹拌しながら、６０℃の不活性雰囲気下にて２４〜７２時間行われる。続いて、水での沈殿に続いて有機沈殿および濾過によって、得られた反応混合物を精製する。減圧下で乾燥させることによって、ポリエステルアミドが形成される。
【化５】
0006330815.tif 000006
【００４０】
一般に、本発明の薬物送達組成物は、複数種のタンパク質を含み得る。代替方法としては、複数種のタンパク質が、単一配合物の成分として存在することができる。例えば、第２タンパク質が存在することができる。
【００４１】
本発明の薬物送達組成物は、タンパク質以外の更なる生理活性物質も含み得る。そのような生理活性物質としては、小分子薬物、糖、脂質または全細胞が挙げられる。生理活性物質は、増殖抑制性または抗炎症性を有するか、または抗腫瘍性、抗有糸分裂性、抗菌性、抗アレルギー性、または抗酸化性などの他の特性を有し得る。増殖抑制剤の例としては、ラパマイシンおよびその機能性または構造誘導体、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン（エベロリムス）、およびその機能性または構造誘導体、パクリタキセルおよびその機能性または構造誘導体が挙げられる。抗腫瘍薬および／または抗有糸分裂薬の例としては、メトトレキセート、アザチオプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、フルオロウラシル、ドキソルビシン塩酸塩（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＮＤ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ  ＮＪ．からのアドリアマイシン（登録商標））、およびマイトマイシン（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．からのＭｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））が挙げられる。そのような抗血小板薬の例としては、ナトリウムヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、アルガトロバン、フォルスコリン、バピプロスト、デキストラン、Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ−クロロメチルケトン（合成アンチトロンビン）、ジピリダモール、糖タンパク質Ｈｂ／ｎｉａ血小板膜受容体アンタゴニスト抗体、組み換えヒルジン、トロンビン阻害剤、例えばアンギオマックス（Ａｎｇｉｏｍａｘ）（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、カルシウムチャネルブロッカー（ニフェジピンなど）、コルヒチン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、魚油（ω３−脂肪酸）、ヒスタミンアンタゴニスト、ロバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤、コレステロール低下薬，Ｍｅｒｃｋ  ＡＮＤ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪからの商標名Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標））、モノクローナル抗体（血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体に特異的な抗体など）、ニトロプルシド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、プロスタグランジン阻害剤、スラミン、セロトニン遮断薬、ステロイド、チオプロテアーゼ阻害剤、トリアゾロピリミジン（ＰＤＧＦアンタゴニスト）、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドジスムターゼミメティック、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−ｌ−オキシル（４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）、エストラジオール、抗癌剤、食事性サプリメント、例えば種々のビタミン、およびその組み合わせが挙げられる。抗炎剤の例としては、ステロイド系および非ステロイド系抗炎剤が挙げられ、バイオリムス、タクロリムス、デキサメタゾン、クロベタゾール、コルチコステロイドまたはその組み合わせが挙げられる。そのような細胞分裂阻害物質の例としては、アンギオペプチン、アンギオテンシン転化酵素阻害剤、例えばカプトプリル（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．からのＣａｐｏｔｅｎ（登録商標）およびＣａｐｏｚｉｄｅ（登録商標））、シラザプリルまたはリシノ��リル（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＡＮＤ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪからのＰｒｉｎｉｖｉｌ（登録商標）およびＰｒｉｎｚｉｄｅ（登録商標））が挙げられる。抗アレルギー剤の一例はペミロラストカリウムである。
【００４２】
薬物送達組成物は、式Ｉの生分解性ポリエステルアミドの他に更なるポリマーも含み得る。それは例えば、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）とグリコール酸のコポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（オキサ−エステル）、ポリ（オキサ−アミド）、ポリ（エチレンカーボネート）、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（チロシン誘導カーボネート）、ポリ（チロシン誘導アリーレート）、ポリ（チロシン誘導イミノカーボネート）、これらのポリマーとポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とのコポリマー、またはその組み合わせとブレンドされ得る。当然のことながら、式Ｉの複数種のポリエステルアミドを互いに混合すること、または式Ｉのポリエステルアミドを他のポリエステルアミドとブレンドすることもまた可能である。
【００４３】
薬物送達組成物は、例えば充填剤、酸化防止剤、安定剤、凝結防止剤、乳化剤、発泡剤、捕捉剤または色素などの更なる賦形剤も含み得る。
【００４４】
本発明の組成物は、制御されたタンパク質送達が望まれる場合には、生体外であろうと、生体内であろうと任意の生物学的環境に投与することができる。例えば、この組成物は、ヒトまたは動物に対して、注射および／または埋入することによって、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、静脈内、または動脈内に経粘膜投与することによって、あるいはその位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での送達によって投与され、様々な医療条件の処置に既知のパラメーターに基づく所望の投薬量のタンパク質を提供することができる。
【００４５】
本発明の薬物送達組成物は、痛みの管理の医療分野、筋骨格用途（ＭＳＫ）、眼科学、腫瘍学、皮膚科学、心血管分野、整形外科、脊髄、腸管、肺、鼻または耳の分野において使用することができる。
【００４６】
本発明はさらに、本発明の薬物送達組成物を含む物品に関する。他の態様において、本発明は、本発明の薬物送達組成物を含む薬物送達システムを提供する。本発明の文脈において、薬物送達システムとしては、限定されないが、微粒子、ナノ粒子、棒、フィルム、繊維、ペレット、シリンダー、ディスク、コーティング、インプラント、マイクロカプセル、ウエハー、ミセル、リポソーム、織布および不織布が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＰＢＳ緩衝液中に浸した後のＰＥＡフィルムの時間の経過に伴う質量増加。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定されたＨＲＰの放出。Ｍ＝タンパク質マーカー、ＨＲＰ＝ホースラディシュペルオキド標準物質、２〜１２＝２〜１２週間後に撮影されたＨＲＰ放出緩衝液。
【図３】ＰＥＡＩＩＩ  Ｘ５０のいくつかの放出培地のＳＥＣクロマトグラムのオーバーレイ。１０分時点でのピークは緩衝液から生じ、ＨＲＰは１６分時点で溶出し、小分子は２０〜２５分時点で溶出する。
【図４】２２週間にわたるポリマーマトリックスのＨＲＰの累積的放出。
【図５】ポリマーマトリックスにおける酵素の安定性。
【図６】ＰＥＡマトリックスからのタンパク質の放出。この図は、遊離カルボキシル基のみ、またはベンジルエステルのみを有する類似のモノマー組成物のＰＥＡポリマーが、徐放性のタンパク質放出を提供しないことを示す。対照的に、ポリマー鎖の側基の相対比率を変えることによって、本発明者らは、タンパク質種の放出プロファイルを制御することができる。
【００４８】
ＰＥＡＩＩＩ  １００％Ｈ（−ＣＯＯＨ側基のみを有するポリマー）−このポリマー繊維は、最初の数時間で全ポリマー充填を放出する―一般的なバースト放出）
ＰＥＡＩＩＩ  Ａｃ  Ｂｚ（ベンジルエステル側基のみを有するポリマー）−このポリマーは、著しい量のタンパク質を放出せず、その繊維の放出特性は、時間の経過に従って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ  ７５％Ｈ−ポリマー繊維は、３週間にわたって全タンパク質充填を放出し、放出された酵素の活性は、放出に伴って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ  ５０％Ｈ−ポリマー繊維は、３週目〜１１週目でタンパク質充填を放出し、酵素の大部分が６週目〜１０週目で放出された。放出された酵素の活性は、放出に伴って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ  ２５％Ｈ−ポリマー繊維は実質的に、７週目で放出を開始する。この放出は、１１週間の実験期間で終わらない。
【００４９】
次に、単なる例示である非限定的な以下の実施例を参照して、本発明が詳細に説明される。
【００５０】
［実施例］
［実施例１：ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚコポリマーの膨潤挙動］
溶液流延によって製造された円形ポリマーフィルムで、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ  Ｂｚ（ポリマー鎖に沿ってペンダントエステル基を有する）、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ２５％Ｈ（ペンダントエステル基とペンダントカルボキシル基の両方を有する）、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈ（ペンダントエステル基とペンダントカルボキシル基の両方を有する）およびペンダントカルボキシル基を有するＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈの膨潤挙動を評価した。殺生物剤としてＮａＮ３０．０５％を含有するＰＢＳ緩衝液にフィルムを浸漬し、３７℃で穏やかな撹拌下に置いた。ポリマーフィルムの質量増加に基づいて、膨潤挙動を評価した。それぞれの時点で緩衝液を新しくした。以下の式に従って、質量増加を計算することができる。
【数１】
0006330815.tif 000007
式中、Ｍｔ＝その時点（ｔ）での質量
Ｍ０＝初期質量
【００５１】
ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ−Ｂｚのフィルムは、試験期間にわたって５％までのわずかな膨潤を示した。対照的に、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈフィルムは、元の質量と比較して数日以内に１０００％まで質量が増加した。意外なことに、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ２５％ＨおよびＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈから製造されたフィルムは、遅く、かつ持続性の吸水プロファイルを示した。これを図１に示す。
【００５２】
［実施例２：ＨＲＰについてのＡＢＴＳ活性アッセイ］
ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）が一般に、ペルオキシダーゼ活性（例えば、ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシド）の活性アッセイとして使用される。このアッセイは、基質の濃い色の酸化／ラジカル形の形成に基づき、測光法で定量化することができる。濃い色の生成物の形成は、測定された酵素の活性の直接的な尺度である。スキーム１において、ＡＢＴＳの反応を示す。
【化６】
0006330815.tif 000008
【００５３】
このアッセイのプロトコルは、Ｐｕｅｔｔｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．，ｅｄ．）３ｒｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ  ＩＩＩ，ｐｐ．２８６−２９３，Ｖｅｒｌｕｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬから適応された。
【００５４】
濃度５ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳのストック溶液をＰＢＳ緩衝液で調製した。Ｈ２Ｏ２０．３重量％のストック水溶液を調製した。参照キュベット内で、ＡＢＴＳストック１ｍＬとＨ２Ｏ２ストック５０μＬを混合した。試料キュベット内で、ＡＢＴＳストック１ｍＬとＨ２Ｏ２ストック５０μＬを酵素溶液５０μＬと共に混合した。キュベットを直接、光度計に入れ、４０５ｎｍでの吸光度の増加を０．５秒の時間間隔で１分間にわたり測定した。吸光度の増加の勾配は、酵素の活性の尺度であり、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して光度計のデジタルデータに基づき決定された。最終的に、酵素の活性は、新たに調製されたＨＲＰ溶液の活性に基づいて濃度に相関し、定量化に用いられた。
【００５５】
［実施例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
すべてのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試薬およびゲルは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＮｕＰＡＧＥ  ｓｙｓｔｅｍ）から入手した。放出試料を４×ＳＤＳローディングバッファーおよび１０×還元剤と混合した。タンパク質の変性は、７０℃までの５分間の加熱によって達成された。一般に、試料２０μＬをゲルにローディングした。１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓまたは４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルをそれぞれ、ＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液と共に使用した。ＨＲＰ（＞１ｕｇ）を検出するために、クーマシー着色（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ｓａｆｅｓｔａｉｎ）を適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＰＥＡ−ＩＩＩ−５０％Ｈの放出培地を解析した。図において、ＨＲＰのいくつかの放出試料を示す。放出された酵素がＨＲＰ標準と同じスポットに現れることを観察でき、酵素の放出が確認される。これを図２に示す。
【００５６】
［実施例４：水性ＳＥＣ］
ＤＡＤ検出を用いて、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ７．８＊３００ｍｍ（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００ＬＣシステムを使用して、ＨＲＰ放出緩衝液を分析した。移動相として１．０５９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．９６６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）および１０％ＥｔＯＨを使用して、流量０．５ｍＬ／分でシステムを作動した。一般的な試料注入容積１０μＬを用いた。
【００５７】
ＰＥＡＩＩＩ  ５０％Ｈの様々ないくつかの放出緩衝液から得たＤＡＤデータを図示し、ＡＢＴＳ活性アッセイに対して相補的方法として酵素の定量化のために使用した。どちらの方法も良好な相関性（９０〜１１０％）を示し、放出された酵素が完全な活性を維持することが示された。１０分でのピークは、ブランク試験においても存在し、試料と関連しない。
【００５８】
図３の説明：ＰＥＡＩＩＩ  Ｘ５０のいくつかの放出培地のＳＥＣクロマトグラムオーバーレイ。１０分でのピークは緩衝液から生じ、ＨＲＰは１６分時点で溶出し、小分子は２０〜２５分時点で溶出する。
【００５９】
［実施例５：ポリマーマトリックスからのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の放出］
［処理およびローディング］
凍結乾燥ＨＲＰ２ｍｇに、ＰＬＧＡ５０：５０、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ  Ｂｚ（ポリマー鎖に沿ってペンダントエステル基を有する）、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈ（ペンダントエステル基とペンダントカルボキシル基の両方を有する）およびＰＥＡ−ＩＩＩ−１００％Ｈ（ペンダントカルボキシル基を有する）の、ＣＨＣｌ３中の１０重量％ポリマー溶液４００μＬを添加した。その溶液にＨＲＰを機械的に分散させた。ポリマーとＨＲＰとの得られた懸濁液を周囲温度にて減圧下で乾燥させた。
【００６０】
［ＨＲＰの放出］
乾燥ＨＲＰを充填したフィルムをＰＢＳ緩衝液３ｍＬに浸漬し、３７℃で穏やかな撹拌下に置いた。時間の経過に従って、水性ＳＥＣと測光による活性アッセイの両方で、試薬としてＡＢＴＳを使用して、放出されたＨＲＰを定量化した。１週間後に、両方の方法を用いて、緩衝液中でＨＲＰの濃度を決定した。両方の方法からのデータはかなり相関し、放出されたＨＲＰが活性であることが示された。ＰＥＡ−ＩＩＩ−１００％Ｈは、最初の週でフィルム中に存在するすべてのＨＲＰの大部分を既に放出し、３週間後には、フィルムは完全に空であった。ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ  Ｂｚから、最初の週の放出を除いて、試験期間にわたってほとんど放出は確認されなかった。ＰＬＧＡ５０：５０は、５週間の期間にわたってＨＲＰの放出を示し、その後、活性タンパク質はもはや放出されなかった。８週間後、ＰＬＧＡ５０：５０マトリックスは、さらに放出することなく完全に分解した。意外なことに、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈフィルムから、２２週間の時間枠にわたり、比較的一定の速度で活性なＨＲＰが放出された。
【００６１】
ＰＥＡフィルムからのＨＲＰの放出は、その後のポリマーの吸水性に合致していることが確認された。この実験から、ポリマー鎖に沿った両方の種類のペンダント官能基の役割が分かる。ペンダントエステル基とペンダントカルボキシル基の両方を同時に含有するポリエステルアミド（ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％Ｈ）を含む組成物のみが、長期間にわたるタンパク質の徐放での完全な放出を可能にする。２２週間後のポリマーマトリックスの分析から、有意な量の酵素が存在しないことが分かり、タンパク質の完全な放出の仮説が確認された。
【００６２】
ＰＥＡ−ＩＩＩ−１００％Ｈは急速に膨潤し、ＨＲＰを非常に急速に放出し、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ−Ｂｚはわずかな膨潤を示し、ＨＲＰをほとんど放出せず、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ｈ／Ｂｚ  ５０％は、１７週目を超える放出速度の増加と共に、ＨＲＰの徐放と併せてゆっくりとした膨潤を示した。これを図４に示す。
【００６３】
［実施例６：ＨＲＰ充填ＰＥＡポリマー繊維の製造］
溶媒の影響を調べる実験のために、ＰＥＡ−ＩＩＩ−２５％Ｈポリマーをエタノール、メタノール、クロロホルム、またはジクロロメタンに溶解した。放出の研究では、ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ  ＢｚおよびＰＥＡ−Ｈ／Ｂｚポリマーをエタノールに溶解した。ポリマー溶液を濃度１０％（ｗ／ｖ）で調製した。続いて、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）ビーカー内で激しい撹拌下にて、ＨＲＰを添加した。均一溶液が得られた後に、溶媒を蒸発させた。ポリマーが処理するのに十分に固形になった時に、テフロンシートに移した。次いで、ポリマーをテフロンシートとブロックの間で回転させることによって、ポリマーを手作業で繊維へと成形した。その繊維は直径０．８〜１．２ｍｍ、長さ３ｃｍであった。
【００６４】
使用前に５日間、繊維を周囲条件において乾燥させた。次いで、放出の実験において３つ組で使用するために、ＨＲＰ＃Ｐ６７８２の放出用の繊維を切断した。使用したＨＲＰはシグマ（Ｓｉｇｍａ）＃Ｐ６７８２であった。
【００６５】
［ＨＲＰの放出］
連続した振盪下にて±１００ｒｐｍ、３７℃で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において放出の実験を行った。実験開始前に、ＨＲＰ充填ＰＥＡ−ＩＩＩ−Ａｃ  Ｂｚ、２５％Ｈ、５０％Ｈ、７５％Ｈまたは１００％Ｈを計量し、顕微鏡下で分析した。すべての繊維が質量約５０ｍｇ（±５ｍｇ）を有した。初日に、２、５および２４時間後に緩衝液を交換し、その後は１週間に１回交換した。次いで、タンパク質の量およびＨＲＰ活性について、古い緩衝液を分析した。
【００６６】
図５から、ポリマーマトリックスから放出される酵素の活性が、実験の１１週間の期間全体にわたって同じレベルで維持されることが分かる。これは、ポリマーマトリックスもポリマー分解生成物も、酵素活性および安定性に影響を与えないことを示唆している。
【００６７】
図６から、遊離カルボキシル基のみ、またはベンジルエステルのみを有する類似のモノマー組成物のＰＥＡポリマーが、徐放性のタンパク質放出を提供しないことが分かる。対照的に、ポリマー鎖の側基の相対比率を変えることによって、本発明者らは、タンパク質種の放出プロファイルを制御することができる。
【００６８】
ＰＥＡＩＩＩ−１００％Ｈ（−ＣＯＯＨ側基のみを有するポリマー）−このポリマー繊維は、最初の数時間で全ポリマー充填を放出する―一般的なバースト放出）
ＰＥＡＩＩＩ−Ａｃ  Ｂｚ（ベンジルエステル側基のみを有するポリマー）−このポリマーは、著しい量のタンパク質を放出せず、その繊維の放出特性は、時間の経過に従って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ−７５％Ｈ−ポリマー繊維は、３週間にわたって全タンパク質充填を放出し、放出された酵素の活性は、放出に伴って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ−５０％Ｈ−ポリマー繊維は、３週目〜１１週目でタンパク質充填を放出し、酵素の大部分が６週目〜１０週目で放出された。放出された酵素の活性は、放出に伴って変化しない。
ＰＥＡＩＩＩ−２５％Ｈ−ポリマー繊維は実質的に、７週目で放出を開始する。この放出は、１１週間の実験期間で終わらない。
【００６９】
［タンパク質の分析］
［定量化：］
製造元の説明書に従って、ＢＣＡ  Ｑｕａｎｔｉｐｒｏアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、放出試料を分析した。ＰＥＡは分解時に小さなシグナルを出すことから、対照として、空の繊維（ＨＲＰを含有しない）からの放出試料もまた分析した。必要な場合には、このシグナルを実際の放出試料から取り除いた。Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＧＯプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＢＣＡアッセイを行った。
【００７０】
［活性アッセイ：］
濃度５ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（シグマ＃Ａ１８８８）のストック溶液をＰＢＳ緩衝液中で調製した。Ｈ２Ｏ２０．３重量％のストック水溶液を調製した。参照キュベット内で、ＡＢＴＳストック１ｍＬとＨ２Ｏ２ストック５０μＬを混合した。試料キュベット内で、ＡＢＴＳストック１ｍＬとＨ２Ｏ２ストック５０μＬを試料溶液５０μＬと共に混合した。キュベットを直接、光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−１８００）に入れ、４０５ｎｍでの吸光度の増加を１分間にわたり測定した。吸光度の勾配を用いて、酵素の活性を測定した。アッセイは室温で行った。
【００７１】
［膨潤挙動：］
各ポリマーのフィルム（厚さ０．５ｍｍ）を作製し、減圧下にて乾燥させて、試験材料の含水率を０．３重量％未満に下げた。直径４ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのディスクをフィルムから打抜いた。
【００７２】
ＰＢＳ緩衝液（２ｍＬ）中でインキュベートする前に、試料をＳａｒｔｏｒｉｕｓ微量天秤で計量し、厚さと直径の両方を記録した。ＮａＮ３０．０５重量％を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍＬに試料を浸した。すべてのポリマー試料を３７℃でインキュベートし、様々な時点で試料の重量増加を測定することによって、吸水を評価した。重量の増加は以下の通りであった：緩衝溶液から試料を取り出し、付着している水をディスクから除去するために、ほこりの出ない（ｄｕｓｔ−ｆｒｅｅ）吸収紙上で（プレスせず）乾燥させた。次に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ微量天秤で試料を分析し、測定値を記録した。各ポリマー試料を３つ組で分析した。次いで、その重量を元の重量と比較した。元の重量を１００％と設定した。読み取りの時点で、緩衝溶液を新しくした。
【００７３】
図から、ポリマーマトリックスから放出された酵素の活性が、実験の１１週間の期間全体にわたって同じレベルで維持されることが分かる。これは、ポリマーマトリックスもポリマー分解生成物も、酵素活性および安定性に影響を与えないことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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