(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セスキテルペンアルコールの製造方法であって、
ｉ）式Ｉ：
【化１】
0006410802.tif 000005
［式中、Ｒは、９個の炭素から構成される飽和の、一価不飽和の、または多価不飽和の脂肪族基であるとともに、Ｒは、分枝鎖であってよく、または１つ以上の非芳香族環から構成されていてよい］のテルペンと、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドとを接触させることと、
ｉｉ）前記アルコールを単離することと、
を含み、その際、産生されるセスキテルペンアルコールは少なくとも３６％のシス異性体を含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記アルコールは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含む１種またはそれ以上のセスキテルペンアルコールの製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させ、その際、前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項４】
前記産生されるセスキテルペンアルコールは、少なくとも４６％のシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記産生されるセスキテルペンアルコールは、５０％より多くのシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記産生されるセスキテルペンアルコールは、少なくとも７２％のシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記産生されるセスキテルペンアルコールは、少なくとも９６％のシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記産生されるセスキテルペンアルコールは、１００％のシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
モノオキシゲナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号７１または配列番号７３のアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号７０または配列番号７２の核酸配列を有する核酸ｉ）であるか、あるいはＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸ｉｉ）を含む単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸によってコードされるポリペプチドは、配列番号７１または配列番号７３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項３に記載の方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法。
【請求項１６】
請求項３に記載の方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７１または配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法。
【請求項１７】
請求項３に記載の方法であって、
ｉ）モノオキシゲナーゼ活性を有するＰ４５０ポリペプチドを産生するのに適した条件下で細胞を培養し、
その際、前記細胞は、
ａ）非環式ピロホスフェートであるテルペン前駆体を産生し、
ｂ）Ｐ４５０レダクターゼを発現し、
ｃ）α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンの合成酵素活性を有する１種またはそれ以上のポリペプチドを発現するとともに、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンを産生し、かつ
ｄ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し、
ｉｉ）前記細胞から前記アルコールを単離する、前記製造方法。
【請求項１８】
前記非環式ピロホスフェートであるテルペン前駆体は、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記非環式ピロホスフェートであるテルペン前駆体は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）請求項１３または１４に記載の核酸分子、または
ｂ）配列番号７１または配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項２１】
前記ベクターは、原核生物ベクター、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
発現ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
前記細胞は、原核細胞である、請求項１７から１９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞は、細菌細胞である、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、真核細胞である、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記真核細胞は、酵母細胞または植物細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記産生されたセスキテルペンアルコールが、少なくとも３６％のシス異性体を含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
当該分野は、シトクロムＰ４５０に関連し、セスキテルペンアルコールの製造に使用する。
【０００２】
背景
テルペン類炭化水素、例えばα−サンタレンおよびβ−サンタレンは、生化学的方法を介して、例えば遺伝的改変された細胞を通じて製造されている。これらのテルペン類および該テルペン類から誘導されるアルコールは、ビャクダン油の主成分であるとともに、前記アルコールは重要な香料成分であって、一般的にサンタルム属種（例えばビャクダン）の心材の蒸留を通じて工業的に得られる。そのようなアルコール類の例には、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトールおよびエピ−β−サンタロールが含まれる。テルペン炭化水素類の生成のために、遺伝子操作された細胞を含んだ新たな生化学的経路が開発されているが、それらのサンタレンから誘導されるアルコールを生成および製造する生化学的経路を見出すことが望まれる。更に、そのようなアルコールを生成するのみならず、生化学的経路を介して、当該アルコールのシス異性体、例えばイソ−α−シネンソール、イソ−β−シネンソール、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｚ）−エピ−β−サンタロールを選択的に製造することも望まれる。
【０００３】
シトクロムＰ４５０は、オキシダーゼ酵素の一つのファミリーに相当する。Ｐ４５０は、一般にモノオキシゲナーゼ反応を触媒する。シトクロムＰ４５０酵素は、アミノ酸配列ホモロジーに基づいて複数のファミリーとサブファミリーへと分類される。同じサブファミリーのメンバーは、５５％を超えるアミノ酸配列同一性を共有し、通常は同様の酵素活性（基質および／または産物の選択性）を有する。ＣＹＰ７１ＡＶ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＢ８２９４４．１、配列番号５１および配列番号５２）ならびにＣＹＰ７１ＡＶ８（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＭ８６７１９．１、配列番号１および配列番号２）は、ＣＹＰ７１ＡＶサブファミリーの２つのメンバーであり、７８％の配列同一性を共有する。ＣＹＰ７１ＡＶ１は、以前よりアモルファジエンを酸化することが明らかになっている（Ｔｅｏｈら，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８０（２００６）１４１１−１４１６）。ＣＹＰ７１ＡＶ８は、以前より（＋）−バレンセン、ゲルマクレンＡおよびアモルファジエンを酸化することが明らかになっている（Ｃａｎｋａｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８５（１），１７８−１８２（２０１１））。
【０００４】
操作された細胞を使用した方法は、ジテルペンまたはセスキテルペンの産生を触媒するために複数のテルペン合成酵素を使用することが報告されている。それらのジテルペンまたはセスキテルペンを、更にシトクロムＰ４５０ポリペプチドを使用して処理することで、前記細胞によって産生されたジテルペンまたはセスキテルペンのヒドロキシル化、酸化、脱メチル化またはメチル化が触媒される。
【０００５】
概要
本明細書において提供されるのは、セスキテルペンアルコールの製造方法であって、
ｉ）式Ｉ：
【化１】
0006410802.tif 000002
［式中、Ｒは、９個の炭素から構成される飽和の、一価不飽和の、または多価不飽和の脂肪族基であるとともに、Ｒは、分枝鎖であってよく、または１つ以上の非芳香族環から構成されていてよい］のテルペンと、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも４５％または少なくとも約４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることと、
ｉｉ）任意に、前記アルコールを単離することと、
を含む前記製造方法である。
【０００６】
本明細書において更に提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオール（ｌａｎｃｅｌｏｌ）および／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンの製造方法であって、
ｉ）α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも４５％または少なくとも約４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させて、前記アルコールを産生させることと、
ｉｉ）任意に、前記アルコールを単離することと、
を含む前記製造方法である。
【０００７】
また、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させ、その際、産生されるセスキテルペンアルコールは、少なくとも３６％または少なくとも約３６％のシス異性体を含む前記製造方法である。
【０００８】
本明細書において更に提供されるのは、モノオキシゲナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくはそれより高い同一性を有するか、または前記アミノ酸配列に対して少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％もしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む前記単離されたポリペプチドである。
【０００９】
本明細書において更に提供されるのは、モノオキシゲナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくはそれより高い同一性を有するか、または前記アミノ酸配列に対して少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％もしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む前記単離されたポリペプチドである。
【００１０】
また、本明細書において提供されるのは、モノオキシゲナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記単離されたポリペプチドである。
【００１１】
本明細書において更に提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロールおよびランセオールからなる群から選択されるセスキテルペンアルコールまたはそれらの混合物の製造方法であって、
ｉ）モノオキシゲナーゼ活性を有するＰ４５０ポリペプチドを産生するのに適した条件下で細胞を培養し、
その際、前記細胞は、
ａ）非環式ピロホスフェートであるテルペン前駆体を産生し、
ｂ）Ｐ４５０レダクターゼを発現し、
ｃ）α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンの合成酵素活性を有するポリペプチドを発現するとともに、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンを産生し、かつ
ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも４５％または少なくとも約４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現し、
ｉｉ）任意に、前記細胞から前記アルコールを単離する、前記製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】種々のＣＹＰ７１ＡＶ８変異体のＮ末端領域のアミノ酸配列アライメント。
【図２】種々のＣＹＰ７１ＡＶ８変異体のＤＮＡ配列のアライメント。コードされるアミノ酸配列が、各々の配列の下に一文字表記を用いて示されている。
【図３】ＣＹＰ７１ＡＶ８およびＣＰＲｍタンパク質を発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によるセスキテルペン類の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）（＋）−α−サンタレンの生体内変換、（Ｂ）（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン混合物の生体内変換。
【図４】Ｐ４５０とＣＰＲのｃＤＮＡを含む合成バイシストロン性オペロンの編成。
【図５】Ｐ４５０とＣＰＲのｃＤＮＡから構成される種々のバイシストロン性オペロンで形質転換されたＥ．コリ細胞による（＋）−α−サンタレンおよびα／β−サンタレン混合物の生体内変換の比較。（１）ＣＹＰ７１ＡＶ８−６５１８８およびａａＣＰＲ、（２）ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２およびａａＣＰＲ、（３）ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２ＯおよびａａＣＰＲ、（４）ＣＹＰ７１ＡＶ８−６５１８８およびＣＰＲｍ、（５）ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２およびＣＰＲｍ、（６）ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２ＯおよびＣＰＲｍ。
【図６】ＣＹＰ７１ＡＶ８、ＣＰＲｍ、α−サンタレン合成酵素（Ａ）またはα−サンタレン／β−サンタレン合成酵素（Ｂ）およびメバロン酸経路酵素を発現するＥ．コリ細胞によって産生されるセスキテルペン分子のＧＣＭＳ分析。（１）（＋）−α−サンタレン、（２）（−）−α−トランス−ベルガモテン、（３）（＋）−エピ−β−サンタレン、（４）（−）−β−サンタレン。
【図７】ＣＹＰ７１ＡＶ８野生型（Ａ）および突然変異体Ｌ−３５８（Ｂ）による（＋）−α−サンタレンの酸化。ＣＰＲｍ、ＣｌＡＳＳ、メバロン酸経路酵素およびＣＹＰ７１ＡＶ８（Ａ）またはＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｌ３５８Ｆ（Ｂ）を発現するＥ．コリ細胞ＫＲＸによって生成されるセスキテルペン産物のＧＣ−ＭＳプロファイル。培養は、炭素源として３％グリセロールを含有するＴＢ培地中で実施した。α−サンタレン（１）、（Ｅ）−α−サンタラール（２）、（Ｚ）−α−サンタロール（４）、および（Ｅ）−α−サンタロール（３）として、種々の産物が同定された。
【図８】ＣＰＲｍ、ＳａＳＡＳ、メバロン酸経路酵素およびＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｌ３５８Ｆを発現するＥ．コリ細胞ＫＲＸによって生成されるセスキテルペン産物のＧＣ−ＭＳプロファイル。培養は、炭素源として３％グリセロールを含有するＴＢ培地中で実施した。種々の産物がそれらの質量スペクトルによって同定され、それらの産物が指示されている。
【図９】ＣＹＰ７１ＡＶ１およびＣＰＲｍタンパク質を発現するＥ．コリ細胞による（＋）−α−サンタレンの変換のＧＣＭＳ分析。
【図１０】Ｐ４５０−ＢＭ３の二重突然変異体（変異体番号１７）による（＋）−α−サンタレンの（Ｚ）−α−サンタロールへのインビボ変換のＧＣ分析。クラウセナ・ランシウム（Ｃｌａｕｓｅｎａ  ｌａｎｓｉｕｍ）のα−サンタレン合成酵素と、野生型のＰ４５０−ＢＭ３（Ａ）か、Ｐ４５０−ＢＭ３変異体番号１７（Ｂ）か、のいずれかとを同時発現する組み換えＥ．コリ細胞の培養の溶剤抽出物を、例１１に記載されるようにして分析した。（１）（＋）−α−サンタレン、（２）（−）−α−トランス−ベルガモテン、（３）（Ｚ）−α−サンタロール。クロマトグラムは、選択されたイオンモード（Ｍ／Ｚ  ９３）で示される。
【図１１】Ｐ４５０−ＢＭ３の二重突然変異体による（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンのインビボ変換のＧＣ分析。サンタルム・アルブム（Ｓａｎｔａｌｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のα−サンタレン／β−サンタレン合成酵素と、野生型のＰ４５０−ＢＭ３（Ａ）か、Ｐ４５０−ＢＭ３変異体番号１７（Ｂ）か、のいずれかとを同時発現する組み換えＥ．コリ細胞の培養の溶剤抽出物を、例１１に記載されるようにして分析した。（１）（＋）−α−サンタレン、（２）（−）−α−トランス−ベルガモテン、（３）（＋）−エピ−β−サンタレン、（４）（−）−β−サンタレン、（５）（Ｚ）−α−サンタロール、（６）（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトール、（７）（Ｚ）−エピ−β−サンタロール、（８）（Ｚ）−β−サンタロール。クロマトグラムは、選択されたイオン（Ｍ／Ｚ  ９３）で示される。
【図１２】組み換えＳａＣＰ８１６酵素による（＋）−α−サンタレンの変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）保持時間の比較用のビャクダン油。全てのアッセイは、例４に記載されるようにしてインビトロで実施した。（１）（＋）−α−サンタレン、（５）（Ｚ）−α−サンタロール、（６）（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトール、（７）（Ｚ）−エピ−β−サンタロール、（８）（Ｚ）−β−サンタロール。セスキテルペン分子の同定は、質量スペクトルと基準試料との突き合わせによって確認した。
【図１３】組み換えＳａＣＰ８１６酵素による（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）保持時間の比較用のビャクダン油。全てのアッセイは、例４に記載されるようにしてインビトロで実施した。（１）（＋）−α−サンタレン、（２）（−）−α−トランス−ベルガモテン、（３）（＋）−エピ−β−サンタレン、（４）（−）−β−サンタレン、（５）（Ｚ）−α−サンタロール、（６）（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトール、（７）（Ｚ）−エピ−β−サンタロール、（８）（Ｚ）−β−サンタロール。セスキテルペン分子の同定は、質量スペクトルと基準試料との突き合わせによって確認した。
【図１４】セスキテルペン類を産生するように操作されているとともに、ＳａＣＰ８１６、ＣＰＲｍ、α−サンタレン合成酵素（ＣｌＡＳＳ）（Ａ）またはα−サンタレン／β−サンタレン合成酵素（ＳａＳＡＳ）（Ｂ）を発現するＥ．コリによって産生される分子のＧＣＭＳ分析。（１）（＋）−α−サンタレン、（２）（−）−α−トランス−ベルガモテン、（３）（＋）−エピ−β−サンタレン、（４）（−）−β−サンタレン、（５）（Ｚ）−α−サンタロール、（６）（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトール、（７）（Ｚ）−エピ−β−サンタロール、（８）（Ｚ）−β−サンタロール（過剰なファルネシル二リン酸のプールから産生されるファルネソールと一緒に同時溶離される）。セスキテルペン分子の同定は、質量スペクトルと基準試料との突き合わせによって確認した。
【図１５】組み換えＳａＣＰ１０３７４  Ｐ４５０酵素による（＋）−α−サンタレン（２１）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図１６】組み換えＳａＣＰ１０３７４  Ｐ４５０酵素による（＋）−α−サンタレン（２１）、（−）−α−トランス−ベルガモテン（１７）、（＋）−エピ−β−サンタレンおよび（−）−β−サンタレン（２５）から構成される混合物（ＳａＴｐ８２０１組み換えタンパク質を使用して調製される、例４）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図１７】組み換えＳ．アルブムのＰ４５０酵素によるβ−ファルネセン（１）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含有するＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図１８】組み換えＳ．アルブムのＰ４５０酵素によるα−ファルネセン（５）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含有するＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図１９】組み換えＳ．アルブムのＰ４５０酵素による（−）−セスキサビネンＢ（９）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含有するＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図２０】組み換えＳ．アルブムのＰ４５０酵素による（−）−β−ビサボレン（１３）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含有するＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図２１】組み換えＳ．アルブムのＰ４５０酵素による（−）−α−ベルガモテン（１７）の変換のＧＣＭＳ分析。（Ａ）組み換えＰ４５０酵素を用いない対照、（Ｂ）組み換えＳａＣＰ１０３７４タンパク質を含むＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ、（Ｃ）組み換えＳａＣＰ８１６タンパク質を含有するＥ．コリ粗製タンパク質抽出物を用いたアッセイ。該クロマトグラムで示される番号は、図２７に表される構造を指す。
【図２２】プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびプラスミドｐＤ４４４−ＳＲ−ＡａＢＦＳ（Ａ）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＡａＢＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（Ｂ）、またはＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＡａＢＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（Ｃ）で形質転換されたＥ．コリ細胞ＫＲＸによって例２３に記載されるようにしてインビボで生成される産物のＧＣＭＳ分析。当該クロマトグラムは、（Ｅ）−β−ファルネセン（１）と同様に、酸化された誘導体（２〜３）の形成も示している（相応の構造については図２７を参照のこと）。
【図２３】プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびプラスミドｐＤ４４４−ＳＲ−ＰａＢＡＦＳ（Ａ）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＰａＡＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（Ｂ）、またはＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＰａＡＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（Ｃ）で形質転換されたＥ．コリ細胞ＫＲＸによって例２３に記載されるようにしてインビボで生成される産物のＧＣＭＳ分析。当該クロマトグラムは、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセン（５）と同様に、酸化された誘導体（６〜８）の形成も示している（相応の構造については図２７を参照のこと）。過剰のＦＰＰの加水分解により得られるファルネソールのピークが各クロマトグラムで指示されている。
【図２４】プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳａＴｐｓ６４７（Ａ）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＳａＴｐｓ６４７−ｐＣＷｏｒｉ（Ｂ）、またはＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＳａＴｐｓ６４７−ｐＣＷｏｒｉ（Ｃ）で形質転換されたＥ．コリ細胞ＫＲＸによって例２３に記載されるようにしてインビボで生成される産物のＧＣＭＳ分析。当該クロマトグラムは、（−）−セスキサビネン（９）と同様に、酸化された誘導体（１０〜１２）の形成も示している（相応の構造については図２７を参照のこと）。
【図２５】プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｌＴｐｓ２（Ａ）、またはＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＣｌＴｐｓ−ｐＣＷｏｒｉ（Ｂ）で形質転換されたＥ．コリ細胞ＫＲＸによって例２３に記載されるようにしてインビボで生成される産物のＧＣＭＳ分析。当該クロマトグラムは、（＋）−α−サンタレン（２１）と同様に、酸化された誘導体（２３〜２４）の形成も示している（相応の構造については図２７を参照のこと）。
【図２６】プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６およびプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳａＴｐｓ８２０１（Ａ）、またはＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＳａＴｐｓ８２０１−ｐＣＷｏｒｉ（Ｂ）で形質転換されたＥ．コリ細胞ＫＲＸによって例２３に記載されるようにしてインビボで生成される産物のＧＣＭＳ分析。当該クロマトグラムは、（＋）−α−サンタレン（２１）、（−）−β−サンタレン（２５）および（−）−トランス−α−ベルガモテン（１７）と同様に、酸化された誘導体（１９、２０、２３、２４、２７および２８）の形成も示している（相応の構造については図２７を参照のこと）。
【図２７】本文中で議論される酵素基質と産物の構造。
【００１３】
詳細な説明
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロールおよびランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンの製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号２８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号３０に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号３２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号３４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号３６に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号３８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号４０に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号４２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２５】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号４４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号５０に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号５２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号５４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号５８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６０に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６２に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６６に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号６８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号７１に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号７３に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号７９に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物の製造方法であって、α−ファルネセン、β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンと、配列番号８１に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとを接触させることを含む前記製造方法である。具体的な一実施形態においては、前記方法は、当該ポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００３９】
アルコールの製造において使用されるポリペプチドを製造するために本明細書において提供されるヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７８および配列番号８０からなる群から選択される配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の核酸配列を有する。本明細書において提供されるヌクレオチド配列は、該配列の発現がなされる細胞によって前記配列が一般的にはもしくは通常は産生されず、かつ一般的に前記配列が導入される細胞に固有のものでなく、当該配列は一般的に別の細胞から得られるか、または合成により製造されうるという点で異種性である。
【００４０】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも３６％または少なくとも約３６％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４１】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも４６％または少なくとも約４６％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４２】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも５０％または少なくとも約５０％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６８、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４３】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも７２％または少なくとも約７２％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６８、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４４】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも９６％または少なくとも約９６％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号６８、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４５】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、α−シネンソール、β−シネンソール、α−サンタロール、β−サンタロール、α−トランス−ベルガモトール、エピ−β−サンタロール、ランセオールおよび／またはそれらの混合物を含むセスキテルペンアルコールの製造方法であって、トランス−α−ファルネセン、トランス−β−ファルネセン、α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテン、エピ−β−サンタレンおよび／またはβ−ビサボレンと、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとを接触させることを含み、産生されるアルコールが少なくとも１００％または少なくとも約１００％のシス異性体を含むとともに、前記ポリペプチドが、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む前記製造方法である。
【００４６】
また、本明細書において提供されるのは、ｉ）配列番号７０および配列番号７２からなる群から選択される核酸配列を有する核酸、ならびにｉｉ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドは、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれより高い同一性、または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む前記単離された核酸分子である。より具体的には、前記コードされるポリペプチドは、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択される配列を有する。
【００４７】
また、本明細書において提供されるのは、ｉ）配列番号７８および配列番号８０からなる群から選択される核酸配列を有する核酸、ならびにｉｉ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドは、配列番号７９および配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれより高い同一性、または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む前記単離された核酸分子である。より具体的には、前記コードされるポリペプチドは、配列番号７９および配列番号８２からなる群から選択される配列を有する。
【００４８】
また、本明細書において提供されるのは、ｉ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５からなる群から選択される核酸配列を有する核酸、ならびにｉｉ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドは、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６からなる群から選択される配列を有する前記単離された核酸分子である。
【００４９】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法である。
【００５０】
更なる一実施形態において、本明細書において提供されるのは、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７１および配列番号７３からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法である。
【００５１】
もう一つの実施形態において、本明細書において提供されるのは、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％または少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％もしくは約９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法である。
【００５２】
更なる一実施形態において、本明細書において提供されるのは、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、宿主細胞または非ヒト生物を、配列番号７９および配列番号８１からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換させるステップと、前記宿主細胞または生物を前記ポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養するステップとを含む前記製造方法である。
【００５３】
前記アルコールは、アルデヒドまたは酸へと、例えば制限されるものではないが、シネンサール、サンタラール、ベルガモテナールおよびランセアールへと転化されうる。前記アルコール、アルデヒドまたは酸は、更に、誘導体へと、例えば制限されるものではないが、エステル、アミド、グリコシド、エーテルまたはアセタールへと転化されうる。
【００５４】
本明細書に記載される核酸およびポリペプチドは、例えばシコリウム・インチブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）  Ｌ．、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、サンタルム・アルブム（Ｓａｎｔａｌｕｍ  Ａｌｂｕｍ）およびアルテミシア・アヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）から単離できる。ＣＹＰ７１ＡＶ８、Ｐ４５０−ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）およびＣＹＰ７１ＡＶ１を含む変異体は、本明細書に記載されている。
【００５５】
植物のシコリウム・インチブス  Ｌ．由来のＣＹＰ７１ＡＶ８は、（＋）−バレンセンを位置選択的に酸化して、トランス−ヌートカトール、シス−ヌートカトールおよび（＋）−ヌートカトンを産生することができるＰ４５０モノオキシゲナーゼとして過去に特徴付けられている。また、ＣＹＰ７１ＡＶ８は、ゲルマクレンＡおよびアモルファ−４，１１−ジエンをＣ１２位で酸化することを触媒することが見出されている（Ｃａｎｋａｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８５（１），１７８−１８２（２０１１））。野生型酵素のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＭ８６７１９．１、配列番号１および配列番号２）を使用して、Ｅ．コリ中での発現に最適化されたｃＤＮＡ配列を設計した。
【００５６】
真核生物において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、膜結合型タンパク質であり、これらのタンパク質のＮ末端配列は、これらの酵素の膜局在化に必須の膜アンカーを構成する。該タンパク質のこの部分は、通常はプロリンリッチドメインによって区切られているが、そこは酵素活性の特異性の制御には必須ではない。従ってこの領域は、酵素活性に影響を及ぼすことなく、欠失、挿入または突然変異によって改変することができる。しかしながら、植物のＰ４５０を含む真核性のＰ４５０のＮ末端領域の具体的な改変は、微生物中で発現される場合に、機能的な組み換えタンパク質のレベルに良い影響を及ぼすことが判明した（Ｈａｌｋｉｅｒら（１９９５）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２２，３６９−３７７；Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｅｌｄら（２０００）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７９，１２７−１３６）。
【００５７】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼにおいて、基質の認識および結合は、該タンパク質のアミノ酸配列に沿った種々の領域に分布する幾つかのアミノ酸残基によって制御される。これらの領域は、基質認識部位（ＳＲＳ）と定義されるが、それは、例えば後藤によって作成された論文（Ｇｏｔｏｈ  Ｏ（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１），８３−９０）に基づく単純な配列アライメントによれば、あらゆるＰ４５０のアミノ酸配列にも局在化しうる。こうして、基質と相互作用してヒドロキシル化反応の位置選択性に影響を及ぼしうるＣＹＰ７１ＡＶ８中の残基は、アミノ酸Ａｓｎ９８〜Ｇｌｙ１２１、Ｔｈｒ１９８〜Ｌｅｕ２０５、Ｌｙｓ２３２〜Ｉｌｅ２４０、Ａｓｎ２８２〜Ａｌａ３００、Ｈｉｓ３５５〜Ａｒｇ３６７およびＴｈｒ４６９〜Ｖａｌ４７６である。これらの領域における１つ以上の残基の改変は、潜在的に、基質特異性、反応の立体化学またはその位置選択性を変更しうる。Ｐ４５０によって触媒される反応の位置選択性の変化の一例は、Ｓｃｈａｌｋら（２００２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（２２），１１９４８−１１９５３で見出すことができる。この刊行物において、植物のＰ４５０酵素での単独の残基の変更によって、酵素反応の位置選択性に全面的な変換がもたらされた。
【００５８】
「セスキテルペン合成酵素」または「セスキテルペン合成酵素活性を有するポリペプチド」は、本出願の目的のためには、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からなる群から選択される非環式ピロホスフェートであるテルペン前駆体からのセスキテルペン分子またはセスキテルペン分子の混合物の合成を触媒することができるポリペプチドと意図される。
【００５９】
α−サンタレン、β−サンタレン、α−トランス−ベルガモテンおよび／またはエピ−β−サンタレンは、例えば２０１１年１月１３日に公開された米国特許出願公開第２０１１−０００８８３６号明細書および２０１１年１１月２７日に公開された米国特許出願公開第２０１１−０２８１２５７号明細書（両者とも本明細書にその全体が援用される）に記載される合成酵素を使用して製造できる。
【００６０】
本発明によれば、ポリペプチドとは、欠損ポリペプチドも含むと見なされるが、但し、前記欠損ポリペプチドは、前記実施形態のいずれかに定義されるそれらのＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を保持するものとする。
【００６１】
２つのペプチド配列またはヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージは、これらの２つの配列のアライメントを作成した場合の該２つの配列において同一であるアミノ酸またはヌクレオチド残基の数の関数である。同一の残基は、２つの配列で前記アライメントの与えられた位置において同一の残基として定義される。本明細書で使用される配列同一性のパーセンテージは、最適なアライメントから、２つの配列間で同一の残基の数を出し、それを最短の配列中の全残基数によって割り、１００を掛けることによって計算される。最適なアライメントは、同一性のパーセンテージが可能な限り高いアライメントである。１つまたは２つの配列中に該アライメントの１つ以上の位置においてギャップを導入することで、最適なアライメントを得ることができる。その際、これらのギャップは、配列同一性のパーセンテージの計算の場合に非同一残基としてみなされる。
【００６２】
アミノ酸または核酸の配列同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアライメントは、コンピュータプログラム、例えばワールドワイドウェブで利用できる公共利用可能なコンピュータプログラムを使用して様々に達成することができる。特に、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）からｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで利用できる、デフォルトパラメータに定められるＢＬＡＳＴプログラム（Ｔａｔｉａｎａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４：２４７−２５０，１９９９）を使用して、ペプチド配列またはヌクレオチド配列の最適なアライメントを得ることができ、配列同一性のパーセンテージを計算することができる。
【００６３】
具体的な生物または細胞は、本明細書に記載される核酸で形質転換される前か、それどころか前記核酸と一緒に形質転換される前のいずれかにおいて、ＦＰＰを天然に産生する場合、またはＦＰＰを天然に産生しないが、ＦＰＰを産生するように形質転換されている場合に「ＦＰＰを産生できる」とみなされる。自然に存在する生物または細胞よりも多量のＦＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞も、「ＦＰＰを産生できる生物または細胞」に含まれる。生物、例えば微生物を、それらがＦＰＰを産生するように形質転換する方法は当該技術分野で既に知られている。そのような方法は、例えば文献において、例えば以下の刊行物：Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｊ．、Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．、Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．、Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．およびＫｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（７），７９６−８０２（Ｅ．コリの形質転換）；Ｗｕ，Ｓ．、Ｓｃｈａｌｋ，Ｍ．、Ｃｌａｒｋ，Ａ．、Ｍｉｌｅｓ，Ｒ．Ｂ．、Ｃｏａｔｅｓ，Ｒ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，２４（１１），１４４１−１４４７（植物の形質転換）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．、Ｙｅｏ，Ｙ．、Ｇｒｅｅｎｈａｇｅｎ，Ｂ．Ｔ．、ＭｃＭｕｌｌｉｎ，Ｔ．、Ｓｏｎｇ，Ｌ．、Ｍａｕｒｉｎａ−Ｂｒｕｎｋｅｒ，Ｊ．、Ｒｏｓｓｏｎ，Ｒ．、Ｎｏｅｌ，Ｊ．、Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，９７（１），１７０−１８１（酵母の形質転換）に見出すことができる。
【００６４】
本明細書に記載される方法をインビボで実施するのに適した非ヒト宿主生物は、任意の非ヒトの多細胞または単細胞の生物であってよい。具体的な一実施形態においては、本発明をインビボで実施するのに使用される非ヒトの宿主生物は、植物、原核生物または菌類である。あらゆる植物、原核生物または菌類を使用することができる。特に有用な植物は、多量のテルペン類を天然に産生する植物である。より具体的な一実施形態においては、前記植物は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）の科から選択される。前記植物は、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（セイヨウアブラナ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）（アルファルファ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）（木綿）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、サルビア属（Ｓａｌｖｉａ）およびハッカ属（Ｍｅｎｔｈａ）の属から選択される。特に、前記植物は、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の種に属している。
【００６５】
より具体的な一実施形態においては、本発明の方法をインビボで実施するのに使用される非ヒトの宿主生物は、微生物である。あらゆる微生物を使用できるが、更により具体的な一実施形態によれば、前記微生物は細菌または酵母である。最も具体的には、前記微生物はＥ．コリであり、前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００６６】
これらの生物の幾つかは、ＦＰＰを天然には産生しない。本発明の方法の実施に適したものにするために、これらの生物は、前記前駆体を産生するように形質転換させる必要がある。前記生物は、前記実施形態のいずれかにより記載される核酸で改変する前か、または同時のいずれかにおいて、前記説明されるようにして形質転換させることができる。
【００６７】
単離された高等真核細胞は、本発明の方法をインビボで実施するための宿主として、完全な生物でなくとも使用することができる。適切な真核細胞は、いかなる非ヒト細胞であってよいが、具体的には植物細胞または菌類細胞である。
【００６８】
本明細書で使用されるように、前記ポリペプチドは、本明細書で同定されるアミノ酸配列だけでなく、欠損ポリペプチドもしくは変異ポリペプチドをも包含するポリペプチドもしくはペプチド断片とみなされるが、但し、前記ポリペプチドは、前記定義のそれらのＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を維持するとともに、相応のポリペプチドとの定義された同一性のパーセンテージを少なくとも共有するものとする。
【００６９】
変異ポリペプチドの例は、天然に存在するタンパク質であって、選択的ｍＲＮＡスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）事象により得られるか、または本明細書に記載されるポリペプチドのタンパク質分解により得られるタンパク質である。タンパク質分解の結果としての変異には、例えば本発明のポリペプチドからの１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解的除去による、種々のタイプの宿主細胞で発現させたときのＮ末端またはＣ末端における差異が含まれる。以下に記載される本発明の核酸の天然または人工的な突然変異により得られる核酸によってコードされるポリペプチドも本発明に包含される。
【００７０】
アミノ末端とカルボキシル末端に追加のペプチド配列を融合させることにより得られるポリペプチド変異体も本発明の方法で使用することができる。特にそのような融合は、ポリペプチドの発現を増強でき、タンパク質の精製に有用なことがあり、または所望の環境もしくは発現系において該ポリペプチドの酵素活性を向上させることができる。そのような追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。従って、本発明は、変異ポリペプチド、例えば他のオリゴペプチドもしくはポリペプチドとの融合によって得られたポリペプチドおよび／またはシグナルペプチドに結合されたポリペプチドを使用した方法を包含する。別の機能的タンパク質、例えばテルペン生合成経路からの別のタンパク質との融合により得られるポリポリペプチドは、有利には本発明の方法において使用することもできる。
【００７１】
本明細書で使用されるように、前記ポリペプチドは、本明細書で同定されるアミノ酸配列だけでなく、欠損ポリペプチドもしくは変異ポリペプチドをも包含するポリペプチドもしくはペプチド断片とみなされるが、但し、前記ポリペプチドは、前記定義のそれらの活性を維持するものとする。
【００７２】
変異ポリペプチドの例は、天然に存在するタンパク質であって、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象により得られるか、または本明細書に記載されるポリペプチドのタンパク質分解により得られるタンパク質である。タンパク質分解の結果としての変異には、例えば本発明のポリペプチドからの１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解的除去による、種々のタイプの宿主細胞で発現させたときのＮ末端またはＣ末端における差異が含まれる。以下に記載される本発明の核酸の天然または人工的な突然変異により得られる核酸によってコードされるポリペプチドも本発明に包含される。
【００７３】
アミノ末端とカルボキシル末端に追加のペプチド配列を融合させることにより得られるポリペプチド変異体も、本発明のポリペプチドによって包含される。特にそのような融合は、ポリペプチドの発現を増強でき、タンパク質の精製に有用なことがあり、または所望の環境もしくは発現系において該ポリペプチドの酵素活性を向上させることができる。そのような追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの変異体、例えば他のオリゴペプチドもしくはポリペプチドとの融合によって得られたポリペプチドおよび／またはシグナルペプチドに結合されたポリペプチドを使用した方法を包含する。別の機能的タンパク質、例えばテルペン生合成経路からの別のタンパク質との融合により得られるポリポリペプチドも、本発明のポリペプチドによって包含される。
【００７４】
本発明の核酸は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの多量体を、一本鎖形または二本鎖形（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）のいずれかで含むものと定義できる。用語「ヌクレオチド配列」は、また、ポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を、別個の断片の形で、またはより大きい核酸の一部分として含むものと理解されるべきである。本発明の核酸は、また、ある特定の単離されたヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列には、固有の夾雑物を本質的に含まない配列が含まれる。本発明の核酸は欠損していてよいが、該核酸は、前記の本発明によって包含されるポリペプチドをコードするものとする。
【００７５】
本発明の方法をインビボで実施するのに適した宿主生物または細胞を形質転換させるための別の重要なツールは、本発明のいずれかの実施形態による核酸を含む発現ベクターである。従ってそのようなベクターも本発明の主題である。
【００７６】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、あらゆる線状または環状の組み換えベクターを含み、該ベクターは、制限されるものではないが、ウイルスベクター、バクテリオファージおよびプラスミドを含む。当業者は、発現系に応じて適切なベクターを選択することができる。一実施形態においては、前記発現ベクターは、転写、翻訳、開始および停止を制御する少なくとも１つの調節配列、例えば転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、またはｍＲＮＡリボソーム結合部位へと作動的に結合され、場合により少なくとも１つの選択マーカーを含む本発明の核酸を含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が本発明の核酸に機能的に関連している場合に「作動的に結合」されている。
【００７７】
本発明の発現ベクターは、遺伝的に形質転換された宿主生物および／または細胞を製造する方法において、本発明の核酸を保有する宿主生物および／または細胞において、ならびにＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法において、更に以下に開示されるように使用することができる。
【００７８】
本発明の少なくとも１つの核酸を保有して、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを異種発現または過剰発現するように形質転換された組み換え非ヒトの宿主生物および細胞は、本発明の方法を実施するのに非常に有用なツールでもある。従ってそのような非ヒトの宿主生物および細胞は、本発明のもう一つの主題である。
【００７９】
前記の実施形態のいずれかによる核酸は、前記非ヒトの宿主生物および細胞を形質転換させるために使用でき、前記発現されたポリペプチドは、前記ポリペプチドのいずれかであってよい。
【００８０】
本発明の非ヒトの宿主生物は、あらゆる非ヒトの多細胞または単細胞の生物であってよい。具体的な一実施形態においては、前記非ヒトの宿主生物は、植物、原核生物または菌類である。本発明により形質転換させるためには、あらゆる植物、原核生物または菌類が適している。特に有用な植物は、多量のテルペン類を天然に産生する植物である。より具体的な一実施形態においては、前記植物は、ナス科、イネ科、アブラナ科、マメ科、アオイ科、キク科またはシソ科の科から選択される。前記植物は、タバコ属、ナス属、モロコシ属、シロイヌナズナ属、アブラナ属（セイヨウアブラナ）、ウマゴヤシ属（アルファルファ）、ワタ属（木綿）、ヨモギ属、サルビア属およびハッカ属の属から選択される。特に、前記植物は、ニコチアナ・タバクムの種に属している。
【００８１】
より具体的な一実施形態においては、前記非ヒトの宿主生物は、微生物である。あらゆる微生物が本発明のために適しているが、更により具体的な一実施形態によれば、前記微生物は細菌または酵母である。最も具体的には、前記微生物はＥ．コリであり、前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエである。
【００８２】
また、単離された高等真核細胞は、完全な生物でなくとも形質転換させることができる。高等真核細胞とは、本明細書においては、酵母細胞を除くあらゆる非ヒトの真核細胞を意味する。具体的な高等真核細胞は、植物細胞または菌類細胞である。
【００８３】
用語「形質転換された」は、宿主が、前記実施形態のいずれかで必要とされる核酸のいずれかの１、２もしくはそれより多くのコピーを含むように遺伝子操作に付されたことを指す。特に用語「形質転換された」は、形質転換される核酸によってコードされたポリペプチドを異種発現する宿主だけでなく、前記ポリペプチドを過剰発現する宿主にも関連している。従って、一実施形態においては、本発明は、前記ポリペプチドを、形質転換されていない同じ生物におけるよりも多量に発現する形質転換された生物を提供する。
【００８４】
トランスジェニック宿主生物または細胞、例えば植物、菌類、原核生物または高等真核細胞の培養の作製のためには、当該技術分野において公知の幾つかの方法が存在する。細菌、菌類、酵母、植物および哺乳動物の細胞の宿主で使用するために適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばＰｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。高等植物および／または植物細胞のためのクローニングベクターおよび発現ベクターは、特に当業者に利用される。例えば、Ｓｃｈａｒｄｌら，Ｇｅｎｅ  ６１：１−１１，１９８７を参照のこと。
【００８５】
トランスジェニック核酸を保有するように宿主生物または細胞を形質転換する方法は、当業者に周知である。トランスジェニック植物の作製のために、近年の方法には、例えば植物プロトプラストのエレクトロポレーション法、リボソーム媒介型の形質転換法、アグロバクテリウム媒介型の形質転換法、ポリエチレングリコール媒介型の形質転換法、パーティクル・ボンバードメント法、植物細胞のマイクロインジェクション法、およびウイルスを用いた形質転換法が含まれる。
【００８６】
一実施形態においては、形質転換されるＤＮＡは、非ヒトの宿主生物および／または細胞の染色体中に、安定な組み換え系が生ずるように組み込まれる。当該技術分野で公知の任意の染色体組み込み法を本発明の実施において使用してよく、前記方法には、制限されるものではないが、レコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）、ウイルスによる部位特異的染色体挿入、アデノウイルスおよび前核の注入が含まれる。
【００８７】
本明細書で示される「ポリペプチド変異体」は、前記活性を有するポリペプチドであって、前記実施形態のいずれかによるポリペプチドに本質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入または置換により本発明の核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列とは異なる配列を有するポリペプチドを意味する。
【００８８】
変異体は、保存的に置換された配列、つまりは、所定のアミノ酸残基が同様の物理化学的特性を有する残基によって置き換えられた配列を含んでよい。保存的な置換の例には、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基で置換すること、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａを別の脂肪族残基で置換すること、またはある極性残基を別の極性残基で置換すること、例えばＬｙｓとＡｒｇとの間の置換、ＧｌｕとＡｓｐとの間の置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの間の置換が含まれる。Ｚｕｂａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８３，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂ．Ｃｏを参照のこと。そのような置換の効果は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２１９，５５５−５６５で議論されるＰＡＭ−１２０、ＰＡＭ−２００およびＰＡＭ−２５０のような置換スコア行列を使用して計算することができる。他のそのような保存的な置換、例えば同様の疎水性特性を有する領域全体の置換はよく知られている。
【００８９】
天然に存在するペプチド変異体も本発明によって包含される。そのような変異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象により得られるか、または本明細書に記載されるポリペプチドのタンパク質分解により得られるタンパク質である。タンパク質分解の結果としての変異には、本発明の配列によってコードされるポリペプチドからの１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解的除去による、種々のタイプの宿主細胞で発現させたときのＮ末端またはＣ末端における差異が含まれる。
【００９０】
本発明のポリペプチドの変異体を使用して、例えば所望の増強されたもしくは低減された酵素活性、変更された位置化学もしくは立体化学、または変えられた基質利用性もしくは生成物分布、高められた基質親和性、１種以上の所望の化合物の産生についての向上された特異性、酵素反応の高められた速度、特定環境（ｐＨ、温度、溶剤等）におけるより高い活性もしくは安定性、または所望の発現系における向上された発現レベルを得ることができる。変異体または部位特異的突然変異体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって作成することができる。本来のポリペプチドの変異体および誘導体は、天然に存在する変異体、または変異体のヌクレオチド配列、他のまたは同じ植物系統もしくは植物種、例えばサンタルム属種からの植物を単離することによって、または本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の人工的にプログラミングする突然変異によって得ることができる。本来のアミノ酸配列の改変は、多数の従来法のいずれかによって達成することができる。
【００９１】
本発明のポリペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端に追加のペプチド配列を融合することにより得られるポリペプチド変異体を使用すると、ポリペプチドの発現を増強でき、タンパク質の精製に有用なことがあり、または所望の環境もしくは発現系において該ポリペプチドの酵素活性を向上させることができる。そのような追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの変異体、例えば他のオリゴペプチドもしくはポリペプチドとの融合によって得られたポリペプチドおよび／またはシグナルペプチドに結合されたポリペプチドを使用した方法を包含する。本発明によって包含される融合ポリペプチドは、他の機能的タンパク質、例えばテルペン生合成経路からの他のタンパク質の融合により得られる融合ポリペプチドも含む。
【００９２】
本明細書で製造されるアルコールは、抽出によって、例えば天然に生成されるアルコールの抽出（例えばビャクダンからの抽出）のための公知法を使用して単離できる。本明細書で製造されるアルコールは、香料に使用することができる芳香性化合物として使用される。
【００９３】
使用される略語
ａａＣＰＲ  アルテミシア・アヌアのシトクロムＰ４５０レダクターゼ
ｂｐ  ベースペア
ｋｂ  キロベース
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ＣｌＡＳＳ  クラウセナ・ランシウムの（＋）−α−サンタレン合成酵素
ＣＰＲｍ  メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）のシトクロムＰ４５０レダクターゼ
ＤＴＴ  ジチオトレイトール
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＦＰＰ  ファルネシルピロリン酸
ＧＣ  ガスクロマトグラフ
ＩＰＴＧ  イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＬＢ  溶原化ブロス
ＭＳ  質量分析計
ＭＴＢＥ  メチルｔ−ブチルエーテル
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＭＣＥ  レコンビナーゼ媒介カセット交換
ＲＮＡ  リボ核酸
ｍＲＮＡ  メッセンジャーリボ核酸
ＳａＳＡＳ  サンタルム・アルブムの（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素。
【００９４】
以下の実施例は説明を目的とするものにすぎず、概要、詳細な説明または特許請求の範囲に示される本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【００９５】
実施例
例１
細菌における発現のためのＣＹＰ７１ＡＶ８のｃＤＮＡ配列の最適化
ＣＹＰ７１ＡＶ８の膜アンカー領域を、以下に詳説される改変を導入するために再設計した。
【００９６】
最適化されたＣＹＰ７１ＡＶ８配列において、５’末端を改変して、膜アンカー領域の最初のアミノ酸を細菌細胞における膜結合型Ｐ４５０の異種発現を改善することが示されたペプチド（Ａｌｋｉｅｒ，Ｂ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２２，３６９−３７７（１９９５）、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｅｌｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７９，１２７−１３６（２０００））で置き換えた。更に、ｃＤＮＡ全体について、コドン利用を、Ｅ．コリのコドン利用に合うように適合させた。こうして、幾つかのｃＤＮＡをデザインして、種々の３’末端改変および最適化を伴うＣＹＰ７１ＡＶ８とした：
−  ＣＹＰ７１ＡＶ８−６５１８８：この構築物においては、初めの２２個のコドンが、ＭＡＬＬＬＡＶＦＷＳＡＬＩＩＬＶペプチドをコードする配列によって置き換えられた（配列番号３および配列番号４）
−  ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２：アンカーをコードする配列全体が、ミント由来の最適化されたリモネン−ヒドロキシラーゼ（ＰＭ２、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｅｌｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７９，１２７−１３６（２０００））によって置き換えられた（配列番号５および配列番号６）
−  ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２Ｏ：この構築物は、前のタンパク質と同じタンパク質をコードするが、膜アンカー領域を更にコドン最適化した（配列番号７および配列番号８）。
【００９７】
図１は、種々のＣＹＰ７１ＡＶ８変異体のＮ末端領域のアミノ酸配列を比較しており、図２は、３種の構築物のＤＮＡ配列を比較している。３種の最適化されたＣＹＰ７１ＡＶ８のｃＤＮＡを、インビトロで合成し（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＣＷｏｒｉ＋発現プラスミド（Ｂａｒｎｅｓ，Ｈ．Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７２，３−１４；（１９９６））中にクローニングした。
【００９８】
例２
ＣＹＰ７１ＡＶ８の細菌細胞中での機能的発現
異種発現のために、Ｅ．コリ細胞ＪＭ１０９を、ＣＹＰ７１ＡＶ８発現プラスミド（例１）で形質転換させた。形質転換体の単コロニーを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地の接種培養に使用した。該細胞を３７℃で１０時間〜１２時間にわたり増殖させる。次いで該培養を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのチアミンＨＣｌを補った２５０ｍＬのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）の接種に使用した。該培養を適度に振盪（２００ｒｐｍ）しながら２８℃で３時間〜４時間にわたりインキュベートしてから、７５ｍｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸（ｓｉｇｍａ）および１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加し、そして該培養を２００ｒｐｍでの振盪をしながら２８℃で２４時間〜４８時間にわたり維持した。
【００９９】
Ｐ４５０酵素の発現は、Ｅ．コリタンパク質フラクションにおけるＣＯ結合スペクトルを測定することによって（Ｏｍｕｒａ，Ｔ．＆Ｓａｔｏ，Ｒ．（１９６４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，２３７９−２３８７）定性的かつ定量的に評価することができる。タンパク質抽出のために、細胞を遠心分離（１０分、５０００ｇ、４℃）し、そして３５ｍＬの氷冷バッファー１（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０％のグリセロール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁する。水中０．３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１容量を添加し、その懸濁液をかき混ぜながら４℃で１０分〜１５分にわたり放置した。その懸濁液を７０００ｇおよび４℃で１０分間にわたり遠心分離し、そのペレットを２０ｍＬのバッファー２（２５ｍＭのＫＰＯ4  ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＤＴＴ、２０％のグリセロール）中に再懸濁する。その懸濁液を、−８０℃での１サイクルの凍結−融解に供し、０．５ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、そしてその懸濁液に２０秒間にわたり３回の超音波処理を行う。その懸濁液を１００００ｇで１０分間遠心分離（細胞破片を除去するために）し、そして上清を回収し、１０００００ｇで２時間にわたり遠心分離する。前記ペレット（膜タンパク質フラクション）を２ｍｌ〜３ｍｌのバッファー３（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール）中に再懸濁させる。ＣＯスペクトルの測定のために、前記タンパク質フラクションを、バッファー３中で希釈（１／１０）して最終容量２ｍＬとする。亜二チオン酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ4）の結晶をいくらか添加し、試料を２つのキュベット中に分け、３７０ｎｍと５００ｎｍの間でベースラインを記録する。次いで試料キュベットを一酸化炭素で飽和させ、差分スペクトルを記録する。Ｐ４５０酵素の濃度は、４５０ｎｍでのピークの大きさから、還元されたＣＯ錯体についての９１ｍＭ-1・ｃｍ-1の吸光係数（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を使用して見積もることができる（Ｏｍｕｒａ，Ｔ．＆Ｓａｔｏ，Ｒ．（１９６４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，２３７９−２３８７）。
【０１００】
この方法によって、４５０ｎｍに最大吸収を有する典型的なＣＯスペクトルが組み換えＣＹＰ７１ＡＶ８について測定され、こうして機能的なＰ４５０酵素へと適切に折り畳まれていることが裏付けられる。
【０１０１】
例３
ＣＹＰ７１ＡＶ８とＰ４５０レダクターゼの細菌中での同時発現
植物のＰ４５０の活性を再構成するために、第二の膜タンパク質の存在は必須である。このタンパク質、つまりはＰ４５０−レダクターゼ（ＣＰＲ）は、補因子ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）からＰ４５０活性部位へと電子を移動させることに関与している。ある植物由来のＣＰＲはその他の植物由来のＰ４５０酵素の活性を補完できることは明らかにされている（ＪｅｎｓｅｎとＭｏｌｌｅｒ（２０１０）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ  ７１，１３２−１４１）。幾つかのＣＰＲをコードするＤＮＡ配列は種々の植物起源から報告されている。本発明ではまず、メンタ・ピペリタから事前に単離されたＣＰＲ（ＣＰＲｍ、未公開のデータ、配列番号１０）を選択し、全長ｃＤＮＡ（配列番号９）のコドン利用を最適化し、それをｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位中にクローニングすることで、プラスミドｐＡＣＹＣ−ＣＰＲｍを得た。
【０１０２】
ＣＹＰ７１ＡＶ８とＣＰＲｍをＥ．コリ細胞中で２つのプラスミドｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−６５１８８およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−ＣＰＲｍを使用して同時発現させた。ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）のＥ．コリ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、これらの２つのプラスミドで同時形質転換させた。形質転換された細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）のＬＢアガロースプレート上で選択した。単コロニーを用いて、それらの同じ抗生物質を補った５ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。該培養を３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、それらの同じ抗生物質を補ったＴＢ培地２ｍＬ〜２５０ｍＬに０．２ｍＬ〜２ｍＬのオーバーナイト培養を接種した。３７℃で６時間インキュベートした後に、該培養を２８℃に冷却し、１ｍＭのＩＰＴＧおよび７５ｍｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸を添加した。１６時間〜２４時間後に、細胞を対数増殖期に回収し、遠心分離し、そして５％グリセロールもしくは３％グルコースを補ったリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  ｐＨ７．０）０．５容量中に再懸濁させた。これらの細胞を用いて、Ｐ４５０酵素の酵素活性を評価した。
【０１０３】
例４
ＣＹＰ７１ＡＶ８を発現するＥ．コリ細胞を使用した（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの生体内変換
生体内変換アッセイで基質として使用される種々のセスキテルペン炭化水素は、先に記載したようにして、異種のメバロン酸経路からファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を産生するように操作された、植物由来のセスキテルペン合成酵素を発現するＥ．コリ細胞を使用して製造した。Ｅ．コリ宿主細胞の操作および使用は、特許ＷＯ２０１３０６４４１１またはＳｃｈａｌｋら（２０１３）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４，１８９００−１８９０３に記載されている。簡潔には、完全なメバロン酸経路のための酵素をコードする遺伝子から構成される２つのオペロンを含む発現プラスミドを調製した。Ｅ．コリのアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素（ｍｖａＳ）、スタフィロコッカス・アウレウスのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）およびサッカロマイセス・セレビシエのＦＰＰ合成酵素（ＥＲＧ２０）の遺伝子からなる第一の合成オペロンをインビトロで合成し（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）、そしてＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションすることで、ｐＡＣＹＣ−２９２５８を得た。メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）を含む第二のオペロンを、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３４）のゲノムＤＮＡから増幅させ、ｐＡＣＹＣ−２９２５８の第二のマルチクローニングサイト中にライゲーションすることで、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６を得た。従って、このプラスミドは、アセチル補酵素ＡからＦＰＰへと導く生合成経路の全ての酵素をコードする遺伝子を含んでいる。Ｅ．コリ細胞（ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６と、プラスミドｐＥＴ１０１−Ｃｏｎｔ２＿１（クラウセナ・ランシウムの（＋）−α−サンタレン合成酵素（ＣｌＡＳＳ）をコードするｃＤＮＡを含む、ＷＯ２００９１０９５９７）か、プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳＣＨ１０−Ｔｐｓ８２０１−ｏｐｔ（サンタルム・アルブムの（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素（ＳａＳＡＳ）をコードするｃＤＮＡを含む、ＷＯ２０１００６７３０９）のいずれかとで形質転換させ、そしてこの細胞を使用して（＋）−α−サンタレンまたは（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの混合物を製造および精製した。
【０１０４】
ＣＹＰ７１ＡＶ８の酵素活性は、基質として上記のセスキテルペン分子を使用したＥ．コリ細胞中での生体内変換によって評価した。プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−ＣＰＲｍおよびｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−６５１８８で形質転換されたＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）のＥ．コリ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養し、例３に記載されるようにして回収した。基質（セスキテルペン炭化水素）を、細胞懸濁液へと、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌにまるまで、１０ｍｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍｇの抑泡剤（Ｅｒｏｌ  ＤＦ，ＰＭＣ  Ｏｕｖｒｉｅ，Ｌｅｓｑｕｉｎ，フランス）、２０ｍｇのセスキテルペンおよび１ｍｌの水から構成される混合物として添加した。その変換は、適度に振盪しながら２０℃で２４時間にわたり進めさせた。その培地を、２容量のＭＴＢＥ（メチルｔ−ブチルエーテル、Ｓｉｇｍａ）で抽出し、その抽出物をＧＣＭＳによってＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０シリーズのＧＣシステムにＡｇｉｌｅｎｔ  ５９７５の質量検出器を接続したものによって分析した。前記ＧＣは、０．２５ｍｍ内径×３０ｍのＳＰＢ−１キャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を備えていた。キャリヤーガスは、１ｍＬ／分の一定の流れのＨｅであった。初期オーブン温度は８０℃（１分維持）であり、引き続き１０℃／分で３００℃にまで段階的に変動させた。生成物の同定は、質量スペクトルおよび保持係数を、基準試料および内部データベースを用いて比較することを基礎としている。
【０１０５】
これらの条件において、（＋）−α−サンタレンの酸化が観察された。該変換の主たる生成物は（Ｅ）−α−サンタロールであった。Ｅ．コリの固有の酵素による（Ｅ）−α−サンタロールの変換から得られる他の生成物、つまり（Ｅ）−α−サンタラール（アルコールデヒドロゲナーゼによって産生される）および（Ｅ）−α−ジヒドロサンタロール（エン酸レダクターゼによって産生される）が検出された（図３Ａ）。同様に、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの混合物を基質として使用することで、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｅ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｅ）−エピ−β−サンタロールの形成が観察されただけでなく、更なる代謝産物も得られた（図３Ｂ）。この例は、ＣＹＰ７１ＡＶ８が、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよび構造的に類似の分子の末端酸化のために使用できることを示している。
【０１０６】
例５
単独のプラスミドからＣＹＰ７１ＡＶ８およびＣＲＰを同時発現する合成オペロンの構築
幾つかのバイシストロン性オペロンを、単独のプラスミドからユニークなプロモーターの制御のもとＰ４５０酵素およびＣＰＲを発現するように設計した。最適化されたＣＹＰ７１ＡＶ８のｃＤＮＡの３種の変異体（例１）を、２種のＣＰＲのｃＤＮＡ、つまりコドン最適化されたＣＰＲｍのｃＤＮＡ（例２）およびアルテミシア・アヌアのＣＰＲ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＭ８８７８９．１、配列番号１２）をコードするコドン最適化されたｃＤＮＡ（配列番号１１）と組み合わせた。こうして、６種の構築物を設計した（配列番号１３〜配列番号１８）。それぞれは、Ｐ４５０のｃＤＮＡに続いて、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むリンカー配列およびＣＰＲのｃＤＮＡを含んでいる（図４）。この構築物はＰＣＲによって調製した。Ｐ４５０およびＣＰＲのｃＤＮＡは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＣＷｏｒｉ＋プラスミドのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングするのに適した５’および３’の突出末端を用いて別々に増幅させた。
【０１０７】
Ｐ４５０に対してなされた種々のＮ末端改変およびＣＰＲとのカップリングの効果を評価するために、前記６種のプラスミドをＥ．コリのＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）細胞中に移入させ、その組み換え細胞を例４に記載される生体内変換アッセイで使用した。（＋）−α−サンタレンと、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの混合物を、基質として使用し、酸化されたセスキテルペン産物の全量を評価した。図５に示される結果は、前記の６種のプラスミドの１つで形質転換された全ての組み換え細菌細胞は、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよび構造的に類似の分子の酸化に使用できることを示している。最高の力価は、ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２ＯのｃＤＮＡとＣＰＲｍのｃＤＮＡとを組み合わせたオペロンで得られた。この構築物（プラスミドｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２Ｏ−ＣＰＲｍ）を更なる実験のために使用した。
【０１０８】
例６
操作された細胞における酸化されたセスキテルペンのインビボ産生
（＋）−α−サンタレンの酸化生成物と、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテン、（＋）−エピ−β−サンタレンまたは他の構造的に類似した分子の酸化生成物は、グルコースまたはグリセロールのような炭素源からセスキテルペンを産生するように操作されたＥ．コリ細胞において直接産生させることもできる。Ｐ４５０、ＣＰＲおよびテルペン合成酵素から構成される合成オペロンを含むｐＣＷｏｒｉ＋プラスミド（Ｂａｒｎｅｓ  Ｈ．Ｊ（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７２，３−１４）からなるプラスミドを調製した。Ｐ４５０のために、ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２またはＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２ＯのｃＤＮＡを使用し、テルペン合成酵素のために、クラウセナ・ランシウムの（＋）−α−サンタレン合成酵素のｃＤＮＡ（ＣｌＡＳＳ）（ＷＯ２００９１０９５９７）またはサンタルム・アルブムの（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素（ＳａＳＡＳ）（ＷＯ２０１００６７３０９）をコードするｃＤＮＡを使用した。このように４種のプラスミドを以下の手順を用いて構築した。コドン最適化したＣｌＡＳＳのｃＤＮＡ（配列番号１９〜配列番号２０）を設計し、合成（ＤＮＡ  ２．０）し、そしてｐＥＴＤＵＥＴ−１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングすることで、プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−Ｔｐｓ２ｏｐｔを得た。ＳａＳＡＳのためには、最適化された全長ｃＤＮＡを設計し（配列番号２１〜配列番号２２）、合成し、そしてｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１４プラスミド（ＤＮＡ２．０）中にクローニングすることで、プラスミドｐＪ４１４−ＳａＴｐｓ８２０１−１−ＦＬｏｐｔを得た。それぞれの構築物について、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を使用したクローニングのためにプライマーを設計した。最適化されたＣｌＡＳＳのｃＤＮＡと最適化されたＳａＳＡＳのｃＤＮＡを、これらのプライマーおよび鋳型としてのｐＥＴＤｕｅｔ−Ｔｐｓ２ｏｐｔとｐＪ４１４−ＳａＴｐｓ８２０１−１−ＦＬｏｐｔのプラスミドをそれぞれ使用して増幅した。２種のＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍまたはｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２Ｏ−ＣＰＲｍのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化したものに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いてライゲーションすることで、４種の新たなプラスミド、つまりｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳ、ｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＳａＳＡＳ、ｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２Ｏ−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳおよびｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２Ｏ−ＣＰＲｍ−ＳａＳＡＳ（配列番号２３〜配列番号２６）を得た。
【０１０９】
これらのオペロンの性能の評価は、前記４種のプラスミドのいずれかと、完全なメバロン酸経路を有するプラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６（例４）とを同時形質転換させたＥ．コリのＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞中で実施した。形質転換された細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）のＬＢアガロースプレート上で選択した。単コロニーを用いて、適切な抗生物質を補った５ｍＬのＬＢ培地に接種した。該培養を３７℃および２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日に、１００μｇ／Ｌのカルベニシリンおよび１７μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むガラス培養管中の２ｍＬのＴＢ培地に、２００μｌのＬＢ前培養を接種し、３７℃および２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養６時間後に（または培養の６００ｎｍでの光学密度が３の値に達したときに）、該培養を２０℃に冷却し、そしてタンパク質の発現を０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そして７５μｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸（ｓｉｇｍａ）および２％（容量／容量）のデカンを添加した。２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間インキュベートした後に、全培養ブロスを１容量のＭＴＢＥで抽出し、そして例４に記載されるようにしてＧＣＭＳによって分析した。
【０１１０】
全ての得られた菌株は、セスキテルペン炭化水素だけでなく、生体内変換実験でも観察される相応の酸化された産物も産生した（図６）。この実験は、ＣＹＰ７１ＡＶ８を発現する操作された細胞を使用すると、セスキテルペン類の（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロールおよび他の構造的に類似した分子が産生されうることを示している。
【０１１１】
例７
ＣＹＰ７１ＡＶ８変異体を使用した（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−β−サンタロールの産生
先の例において、ＣＹＰ７１ＡＶ８が、（＋）−α−サンタレンおよび（−）−β−サンタレンの「末端トランス炭素」に対して選択性が高く、もっぱら（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロールを産生することが示された。この例では、（Ｚ）−α−サンタロールおよび（Ｚ）−β−サンタロールの産生のためにＣＹＰ７１ＡＶ８酵素活性を改変するための部位特異的突然変異誘発のアプローチを説明する。Ｌ３５８をまずは、酵素活性を制御する活性部位の残基として選択した。ＣＹＰ７１ＡＶ８の一連の変異体を、Ｌ３５８をコードするコドンを他のアミノ酸をコードするコドンによって置き換えることによって作製した。突然変異は、２ステップのＰＣＲ手法において、変性されたオリゴヌクレオチド（ＮＢＴ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔ）コドンを、Ｌ３５８をコードするコドンの代わりに含む）と特定のオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用して導入した。このオリゴヌクレオチドの組み合わせは、Ｌ３５８をコードするコドンと、疎水性側鎖を有するアミノ酸を全てが含む１２個の他の残基をコードするコドンと変更させる。第一のＰＣＲを、突然変異誘発リバースプライマーＡＶ８−Ｌ３５８−ｒｅｖ（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＶＮＣＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣ−３’）とプライマーＡＶ８−ｐｃｗ−ｆｗ（５’−ＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＡＴＴＡＧＣＡＧ−３’）を用いて実施することでｃＤＮＡの５’部分を増幅させた。第二のＰＣＲ産物は、プライマーＡＶ８−Ｌ３５８−ｆｗ（５’−ＴＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＣ−３’）およびＡＶ８−ＣＰＲ−ｒｅｖ（５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＴＧ−３’）を用いて増幅させた。両方の増幅で、ｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳを鋳型のために使用した。二回目の増幅は、前記２つのＰＣＲ産物を鋳型として用いるとともに、プライマーＡＶ８−Ｌ３５８−ｆｗとＡＶ８−ＣＰＲ−ｒｅｖを用いて実施し、全長ＣＹＰ７１ＡＶ８変異体のｃＤＮＡを増幅させた。全てのＰＣＲ反応は、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して製造元の指示に従って実施した。改変されたｃＤＮＡを、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩで消化されたｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳ中にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてライゲーションさせた。最後の構築は、配列決定により制御し、１つのプラスミドクローンを、それぞれの所望のＣＹＰ７１ＡＶ８変異体について選択した。このようにして１２種の変異体を、Ｌｅｕ３５８のＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＡｒｇによる置き換えによって作製した（配列番号２７〜配列番号５０）。
【０１１２】
それぞれのＣＹＰ７１ＡＶ８変異体の評価は、例６に記載されるインビボでのセスキテルペン産生法を使用して実施した。簡潔には、前記ＣＹＰ７１ＡＶ８変異体のｃＤＮＡ、ＣＰＲｍのｃＤＮＡおよびＣｌＡＳＳのｃＤＮＡの１つを含むｐＣＷｏｒｉ＋プラスミドを、ｐＡＣＹＣ−２９２５８プラスミドと一緒に、Ｅ．コリ細胞ＫＲＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に形質転換した。形質転換された細胞を選択し、培養し、そしてセスキテルペンの産生を、例６に記載されるようにして評価した。図７に示されるように、野生型のＰ４５０酵素と比較して、幾つかの変異体によっては、（Ｚ）−α−サンタロールが、トランス酸化産物に加えて産生された。それぞれの変異体について、シス酸化のトランス酸化に対する比率は、産生された（Ｚ）−α−サンタロールの全量を、酸化されたα−サンタレン誘導体の全量によって割ることによって計算した。それぞれの変異体についてのこれらの計算の結果は、以下の第１表に表されている。
【０１１３】
第１表  ＣＹＰ７１ＡＶ８の野生型酵素および活性部位変異体のα−サンタレンの酸化に関しての位置選択性
【表１】
0006410802.tif 000003
【０１１４】
前記第１表に表されるデータは、（Ｚ）−α−サンタロールを産生するようにＣＹＰ７１ＡＶ８を操作でき、そのために使用できることを示している。特に、Ｌ３５８Ｔ、Ｌ３５８Ｓ、Ｌ３５８ＡおよびＬ３５８Ｆ変異体は、シス末端炭素について４６％までの選択性で（＋）−α−サンタレンを末端酸化するために使用することができる。
【０１１５】
類似のアプローチにおいて、ＣＹＰ７１ＡＶ８の変異体を（Ｚ）−β−サンタロールの産生について評価した。前記プラスミド中のＣｌＡＳＳのｃＤＮＡをＳａＳＡＳのｃＤＮＡによって置き換えることによって新たなプラスミドを調製した。従ってプラスミドｐＣＷ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｌ３５８Ｆ−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳを、ＣｌＡＳＳのｃＤＮＡの除去のための制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。並行して、ｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＳａＳＡＳを同じ酵素で消化することで、適合した粘着末端を有するＳａＳＡＳを回収した。線状化したベクターと前記消化されたインサートとを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してライゲーションさせた。こうして得られたプラスミドを、前記と同じ条件下でＥ．コリ細胞中での酸化されたセスキテルペンのインビボでの産生のために使用した。図８は、ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｌ３５８Ｆによって形成される産物の分析のＧＣＭＳプロフィールを表し、改変されたＣＹＰ７１ＡＶ８酵素が（Ｚ）−β−サンタロールの産生にも使用できることを示している。
【０１１６】
例８
ＣＹＰ７１ＡＶファミリーの他のメンバーの評価
ＣＹＰ７１ＡＶ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＢ８２９４４．１）を、サンタレン骨格を有するセスキテルペンの酸化について評価した。例５に記載されるプラスミドと類似の構成を有するプラスミドを調製した。Ｎ末端改変したＣＹＰ７１ＡＶ１タンパク質をコードする最適化されたｃＤＮＡ（配列番号５３および配列番号５４）およびａａＣＰＲのｃＤＮＡ（例５）を含むバイシストロン性オペロンを設計し、インビトロで合成（ＤＮＡ２．０）し、そしてバイシストロン性オペロンとしてｐＣＷｏｒｉ＋プラスミド中にクローニングした。該プラスミドを使用して、Ｅ．コリ細胞ＫＲＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質転換した。前記形質転換された細胞を培養し、そしてタンパク質発現を例３に記載されるようにして誘導した。基質として（＋）−α−サンタレンを用いた生体内変換実験を例４に記載されるようにして実施した。図９に示されるように、ＣＹＰ７１ＡＶ８を用いたのと同じ産物が得られた（すなわち（Ｅ）−α−サンタロールおよび（Ｅ）−α−サンタラールが得られた）。これにより、ＣＹＰ７１ＡＶ  Ｐ４５０ファミリーの他のメンバーもサンタレンの末端酸化のために使用できることが示される。
【０１１７】
ＣＹＰ７１ＡＶ１を使用して、ＣＹＰ７１ＡＶ１のｃＤＮＡ、ａａＣＰＲおよび（＋）−α−サンタレン合成酵素のｃＤＮＡ（ＣｌＡＳＳ）を含む合成オペロンを調製した。ＣＹＰ７１ＡＶ８−Ｐ２−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳオペロンを含むｐＣＷｏｒｉ＋プラスミド（例６）をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、Ｐ４５０をコードするｃＤＮＡを切り出した。並行して、ＣＹＰ７１ＡＶ１のｃＤＮＡを先の段落に記載されるバイシストロン性オペロンから同じ酵素で消化することによって回収し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、前記の消化されたｐＣＷｏｒｉプラスミド中にライゲーションすることで、プラスミドｐＣＷｏｒｉ−ＣＹＰ７１ＡＶ１−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳを得た。このプラスミドと一緒にプラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６を使用して、Ｅ．コリ細胞ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を同時形質転換した。該組み換え細胞を、例６に記載されるようにセスキテルペン分子の産生を可能にする条件で培養した。産生されたセスキテルペンのＧＣＭＳ分析により、生体内変換実験と同じ産物の形成が明らかになった。この実験は、ＣＹＰ７１ＡＶ１を使用して、サンタレン分子を酸化させてサンタロールを産生させられることを示している（図９）。
【０１１８】
例９
Ｐ４５０−ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）突然変異体ライブラリーの構築
２４種の変異体のＰ４５０−ＢＭ３突然変異体ライブラリーを、５種の疎水性アミノ酸（アラニン、バリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびイソロイシン）をＰ４５０−ＢＭ３のヘム基の中心近くに位置する２つの位置において体系的に組み合わせることによって構築した。これらの２つのアミノ酸の側鎖の変更により、ヘム基の近くにある基質結合空隙の形状が劇的に変化することが判明している（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００６，７０：５３；Ａｄｖ  Ｓｙｎｔｈ  Ｃａｔａｌ  ２００６，３４８：７６３）。最初のホットスポット（Ｐｈｅ８７）は、基質特異性と位置選択性を変更することが知られている一方で、第二の位置（Ａｌａ３２８）は、酸化の間に全ての基質と相互作用すると想定されている（ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ  ２００９，１０：８５３）。Ｐ４５０−ＢＭ３変異体は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して作製したか、またはＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって化学的に合成した。Ｐ４５０−ＢＭ３変異体および野生型を、細菌発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２８＋、ｐＥＴＤｕｅｔ−１およびｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にサブクローニングし、そしてエシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換した。
【０１１９】
例１０
α−サンタレン：Ｐ４５０−ＢＭ３ライブラリーのインビトロスクリーニング
前記２４種のＰ４５０−ＢＭ３突然変異体と野生型の酵素を、以前より報告されるようにして（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００３，３４５：８０２）Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）中で異種発現させた。簡潔には、形質転換された細胞の単コロニーを使用して、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補った２ｍｌのルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地に接種し、軌道を描く振盪（１５０ｒｐｍ）により３７℃で、ＯＤ578が０．６〜１．０の値に至るまで増殖させた。この前培養を使用して、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２００ｍｌのＬＢ培地に接種した。該細胞を、１６０ｒｐｍでの軌道を描く振盪により３７℃で、ＯＤ578が０．８になるまで増殖させた。次いでタンパク質の発現を、０．３５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。かき混ぜながら３０℃で６時間増殖させた後に、細胞を遠心分離によって回収し、そして超音波処理によって溶解させた。
【０１２０】
生体内変換アッセイで基質として使用したα−サンタレンは、例４に記載されるようにして調製した。前記変換は、約０．５μＭのＣＹＰ酵素、２％（容量／容量）のＤＭＳＯおよび０．２ｍＭのμ−サンタレン基質を含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー１ｍｌ中で実施した。反応は、０．１ｍＭのＮＡＤＰＨの添加によって開始し、適度に振盪しながら室温で２２時間にわたり実施した。
【０１２１】
次いで試料を、ＧＣ／ＭＳ  ＱＰ−２０１０機器（島津製作所、日本）にＦＳ−Ｓｕｐｒｅｍｅ−５カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を設けて、キャリヤーガスとしてヘリウム（流速：０．６８ｍｌ／分；線速度：３０ｃｍ／ｓ）を用いて分析した。質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化を使用して収集した。インジェクター温度は２５０℃に定めた。カラムオーブンは、５０℃で１分間にわたり留め、次いで３０℃／分で１７０℃へと昇温させ、次いで５℃／分で１８５℃へと昇温させ、３分間にわたり等温で維持し、次いで５℃／分で２００℃へと昇温させ、次いで３０℃／分で３００℃へと昇温させ、最後に１分間にわたり等温で維持した。
【０１２２】
例１１
Ｐ４５０−ＢＭ３ライブラリーのα−サンタレンインビボスクリーニング
前記Ｐ４５０−ＢＭ３突然変異体ライブラリーを、単純な炭素源から（＋）−α−サンタレンを産生するように操作された細菌株を使用してまたインビボでスクリーニングした。このために、例４に記載されるＦＰＰを過剰産生する菌株をクラウセナ・ランシウム由来のコドン最適化された（＋）−α−サンタレン合成酵素（ＣｌＡＳＳ）（ＷＯ２００９１０９５９７）（配列番号１９および配列番号２０）と、ベクターの第一および第二の多重クローニングサイト（ＭＣＳ）中にクローニングされたそれぞれのＰ４５０−ＢＭ３変異体とをそれぞれ含むｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドで形質転換した。その一方で、（＋）−α−サンタレン合成酵素のｃＤＮＡを、ｐＥＴ１０１発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングし、そして前記ライブラリーからのＰ４５０−ＢＭ３突然変異体のそれぞれを、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。得られた組み換えベクターを、ＦＰＰを過剰産生する菌株中に同時形質転換した。
【０１２３】
形質転換された細胞の単コロニーを用いて、適切な抗生物質を補った５ｍＬのＬＢ培地に接種した。次いで該培養を３７℃および２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日に、３％グリセロール、１ｍＭのチアミン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）および７５μｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補った２ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に、２００μｌのオーバーナイト培地を接種し、３７℃で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートした。培養の４時間〜６時間後に（または培養の６００ｎｍでの光学密度が２〜３の値に達したときに）、該培養を２８℃に冷却し、そしてタンパク質の発現を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。その時点で、１０％（容量／容量）のドデカンを前記増殖培地へと添加した。軌道を描く振盪（２５０ｒｐｍ）をしながら４８時間インキュベートした後に、該細胞培養を、１容量のメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回抽出し、その溶剤抽出物をＧＣ／ＭＳによって分析した。ＧＣ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０シリーズのＧＣシステムで、ＤＢ１カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍの膜厚；Ａｇｉｌｅｎｔ）を設け、５９７５シリーズの質量分析計と接続して実施した。キャリヤーガスは、１ｍＬ／分の一定の流れのヘリウムであった。インジェクションは、スプリットレスモードであり、インジェクター温度は２５０℃に定め、オーブン温度は、１０℃／分で５０℃から２２５℃へ、そして２０℃／分で３２０℃へと設定した。産物の正体は、基準試料の保持係数および質量スペクトルの一致に基づいて確認した。
【０１２４】
Ｐ４５０−ＢＭ３突然変異体ライブラリーのインビトロ（例１０）とインビボのスクリーニングは、同等の結果を示し、それらは第２表にまとめられている。Ｐ４５０−ＢＭ３野生型（配列番号５５および配列番号５６）は（＋）−α−サンタレンに対して検出可能な活性を一切示さないが、６種のＰ４５０−ＢＭ３変異体は、α−サンタレンを所望の１種以上のα−サンタロールへと変換することができる。これらの変異体は、（＋）−α−サンタレンのシス末端炭素の酸化に対して４５％から９６％の間の優先性を示した。単一突然変異体の番号２３（Ａ３２８Ｖ）（配列番号６７および配列番号６８）と、二重突然変異体の番号７（Ｆ８７Ｉ／Ａ３２８Ｉ）（配列番号５７および配列番号５８）、番号１７（Ｆ８７Ｖ／Ａ３２８Ｉ）（配列番号５９および６０）および番号１８（Ｆ８７Ｖ／Ａ３２８Ｌ）（配列番号６１および６２）は、７２％から９６％までの範囲の最高の位置選択性を示した（第２表および図１０）。２つの追加の変異体の番号１９（Ｆ８７Ｖ／Ａ３２８Ｖ）（配列番号６３および６４）および番号２０（Ｆ８７Ｖ／Ａ３２８Ｆ）（配列番号６５および配列番号６６）は、シス−ヒドロキシル化について選択性が低く（４５％〜５０％の範囲）、そして更なる酸化産物を生成した。
【０１２５】
第２表  Ｐ４５０−ＢＭ３変異体によるα−サンタレンの１種以上のα−サンタロールへの変換
【表２】
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【０１２６】
これらの結果は、Ｐ４５０−ＢＭ３活性部位突然変異が本来基質ではない（＋）−α−サンタレンの結合を可能にすることを示している。これらの突然変異を導入した選択されたＰ４５０−ＢＭ３変異体は、（＋）−α−サンタレンのシス末端炭素を選択的にヒドロキシル化して、嗅覚的に重要な化合物である（Ｚ）−α−サンタロールを生成することが示された（図１０）。
【０１２７】
例１２
Ｐ４５０−ＢＭ３二重突然変異体を使用した（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｚ）−エピ−β−サンタロールのインビボ産生
α−サンタレンスクリーニングで同定されたＰ４５０−ＢＭ３変異体の１つ（変異体番号１７；第２表）を、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンからなるセスキテルペン炭化水素のビャクダン油様混合物を酸化するその能力について試験した。この目的のために、例４に記載されるＦＰＰを過剰産生する細菌株を、サンタルム・アルブムの（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素（ＷＯ２０１００６７３０９）（配列番号２１および配列番号２２）をコードするコドン最適化されたｃＤＮＡを第一のＭＣＳ中に含むとともに、Ｐ４５０−ＢＭ３変異体番号１７を第二のＭＣＳ中に含む組み換えｐＥＴＤｕｅｔ−１発現ベクターで形質転換した。細胞増殖、誘導条件、培養抽出および産物分析は、例１１に記載されるのと本質的に同様に実施した。
【０１２８】
図１１に示されるように、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンは、Ｐ４５０−ＢＭ３二重突然変異体によって効果的に酸化されて、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｚ）−エピ−β−サンタロールが得られた。特筆すべきことに、セスキテルペンアルコールの所望のシス異性体だけがこれらの実験条件下で検出された。これらのデータは、バシラス・メガテリウムのＣＹＰ１０２Ａ１（Ｐ４５０−ＢＭ３）が、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよびベルガモタンセスキテルペンのような構造的に関連したテルペンのシス末端炭素を選択的にヒドロキシル化して、ビャクダン油中に見出される主要なセスキテルペンアルコールを生成するように効果的に操作できることを示している。
【０１２９】
例１３
ＳａＣＰ８１６、つまりサンタルム・アルブム由来のシトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡの単離
Ｓ．アルブムの種子は、Ｂ＆Ｔ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｅｅｄｓ（Ａｉｇｕｅｓ−Ｖｉｖｅｓ，フランス）およびＳａｎｄｅｍａｎ  Ｓｅｅｄｓ（Ｌａｌｏｎｇｕｅ，フランス）から入手した。次いでその種子を、まずは２．５％次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）中で１２０分間にわたり表面滅菌し、そして滅菌した超純水中で３回にわたりすすいだ。次いで前記種子の殻をむき、それを、１５ｇ／Ｌスクロースおよび７．８ｇ／Ｌアガーを補ったＭＳ基本培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５，４７３−４９７）（ｐＨ５．７）上に置いた。発芽は、一般的に９日〜１８日後に約４０％の発生量で観察された。無菌的に発芽させた種子から得られたサンタルム・アルブムの実生を、発芽から５週〜１０週後に土に移した。サンタルム種は根半寄生植物であるので、土壌順応は、６月齢〜１年齢の柑橘類植物（オレンジ）と密着させて行った。土に移してから２年〜３年後に、該サンタルム植物の根を採取し、宿主植物の根から離した。これらの根の抽出物のＧＣ−ＭＳ分析によって、ビャクダン油に特徴的なセスキテルペンの存在が示された。トータルＲＮＡは、Ｃｏｎｃｅｒｔ（商標）Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して根から取り出した。１２ｇの組織から、６４０ミリグラムのトータルＲＮＡが単離された。
【０１３０】
全トランスクリプトームを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ技術およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００シーケンサーを使用して配列決定した。全体で１億８７万の２×１００ｂｐのペアリードが生じた。前記リードのアセンブルは、ＣＬＣ−Ｂｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣＢｏ，デンマーク）のＤｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｙアプリケーションを使用して行った。平均サイズ６８３ｂｐを有する全体で８２４７９のコンティグがアセンブルされた。前記コンティグは、ｔＢｌａｓｔｎアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，１９９０）と、クエリー配列として既知のＰ４５０アミノ酸配列、例えばＣＹＰ７１ＡＶ１の配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＢ８２９４４．１）を使用して調査した。このアプローチにより、特徴的なシトクロムＰ４５０モチーフを有するタンパク質をコードする幾つかのコンティグが同定された。１つの選択されたコンティグのＳＣＨ３７−Ｃｔ８１６（配列番号６９）は、５００アミノ酸のタンパク質ＳａＣＰ８１６（配列番号７１）をコードする１５０３ｂｐ長のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号７０）を含むものであった。このアミノ酸配列は既知のシトクロムＰ４５０配列とホモロジーを示し、最も近い配列はヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＰ４５０、つまり６２％のアミノ酸配列同一性を共有するＣＹＰ７１Ｄ１０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＢ９４５８８．１）であった。
【０１３１】
例１４
ＳａＣＰ８１６の細菌細胞中での異種発現
ＳＣＨ３７−Ｃｔ８１６によってコードされるタンパク質の機能的キャラクタリゼーションのために、タンパク質をＥ．コリ細胞中で異種発現させた。Ｅ．コリ中での改善された発現のためにＯＲＦを改変した。最初の１７コドンをＭＡＬＬＬＡＶＦＷＳＡＬＩＩＬＶペプチドをコードするコドンによって置き換え、全ＯＲＦ配列のコドン利用を、Ｅ．コリコドン利用に適合するように改変させた。改変されたＳａＣＰ８１６（配列番号７３）をコードするこのｃＤＮＡ（ＳａＣＰ１２０２９３（配列番号７２））は、インビトロ（ＤＮＡ２．０）で合成し、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４０４プラスミド（ＤＮＡ２．０）中にクローニングした。異種発現は、例２に記載されるようにして実施した。
【０１３２】
例１５
ＳａＣＰ８１６とＰ４５０レダクターゼの細菌中での同時発現
１つのバイシストロン性オペロンを、単独のプラスミドからユニークなプロモーターの制御のもとＰ４５０酵素およびＣＰＲを発現するように設計した。最適化されたＳａＣＰ１２０２９３のｃＤＮＡをＣＰＲｍのｃＤＮＡ（配列番号９、例３）と組み合わせて、連続的にＰ４５０のｃＤＮＡ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むリンカー配列およびＣＰＲｍのｃＤＮＡを含むバイシストロン性構築物（配列番号７４）を調製した。この構築物は、ＰＣＲによりＰ４５０とＣＰＲのｃＤＮＡを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＣＷｏｒｉ＋プラスミド（Ｂａｒｎｅｓ  Ｈ．Ｊ（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７２，３−１４）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングするのに適した５’および３’の突出末端を用いて別々に増幅させることによって調製され、こうしてプラスミドＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号７４）を得た。
【０１３３】
Ｅ．コリ細胞ＪＭ１０９を、ＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ｐＣＷｏｒｉ発現プラスミドで形質転換した。前記形質転換された細胞を増殖させ、組み換えタンパク質を含む無細胞抽出物を例２に記載されるようにして調製した。このタンパク質フラクションは、セスキテルペン分子の酵素的変換を評価（例１６）するために使用した。
【０１３４】
例１６
組み換えＳａＣＰ８１６  Ｐ４５０酵素を使用した（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンのインビトロ変換
生体内変換アッセイで基質として使用した種々のセスキテルペン炭化水素は、例４に記載されるようにして調製した。
【０１３５】
組み換えのＳａＣＰ８１６およびＣＰＲｍタンパク質を発現するＥ．コリ由来の粗製タンパク質抽出物（例１５）を、これらのセスキテルペン分子のインビトロ酸化のために使用した。アッセイは、２０マイクロリットル〜５０マイクロリットルのタンパク質抽出物、５００マイクロモラーのＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、５マイクロモラーのＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、５マイクロモラーのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）、および３００マイクロモラーのセスキテルペン類（α−サンタレンまたは、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの混合物）を含有する１ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）バッファー中で実施した。テフロンで封止したガラス管中でやさしくかき混ぜながら２時間インキュベーションした後に、反応を氷上で停止させ、１容量のＭＴＢＥ（メチルｔ−ブチルエーテル、Ｓｉｇｍａ）で抽出した。該抽出物を、ＧＣＭＳによって例４に記載されるようにして分析した。
【０１３６】
これらの条件で、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの酸化が観察された。図１２は、ＳａＣＰ８１６による（＋）−α−サンタレンの酸化が（Ｚ）−α−サンタロールをもたらすことを示している。図１３は、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンが、ＳａＣＰ８１６によって効果的に酸化されて、（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロール、（Ｚ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｚ）−エピ−β−サンタロールを形成することを示している。全てのアッセイにおいて、検出可能な量のセスキテルペンアルコールの相応のトランス異性体は観察されなかった（それぞれのセスキテルペンアルコールのトランス異性体とシス異性体は、これらのアッセイで使用されるクロマトグラフィー条件で簡単に分離される）。
【０１３７】
この実験は、サンタルム・アルブムから単離されたシトクロムＰ４５０酵素であるＳａＣＰ８１６を、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよび類似のセスキテルペン構造のシス末端炭素の選択的なヒドロキシル化に使用できることを示している。
【０１３８】
例１７
組み換えＳａＣＰ８１６  Ｐ４５０酵素を使用した、操作された細胞における酸化されたセスキテルペンのインビボ産生
（＋）−α−サンタレンの酸化生成物と、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテン、（＋）−エピ−β−サンタレンまたは他の構造的に類似した分子の酸化生成物は、グルコースまたはグリセロールのような炭素源からセスキテルペンを産生するように操作されたＥ．コリ細胞において直接産生させることもできる。ＳａＣＰ１２０２９３のｃＤＮＡ（配列番号７２）、ＣＰＲｍのｃＤＮＡ（配列番号９）およびテルペン合成酵素をコードするｃＤＮＡから構成される合成オペロンを含むｐＣＷｏｒｉ＋プラスミドからなるプラスミドを調製した。テルペン合成酵素のために、クラウセナ・ランシウムの（＋）−α−サンタレン合成酵素のｃＤＮＡ（ＣｌＡＳＳ）（ＷＯ２００９１０９５９７）またはサンタルム・アルブムの（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素（ＳａＳＡＳ）（ＷＯ２０１００６７３０９）をコードするｃＤＮＡを使用した。
【０１３９】
このように２つのプラスミドは、例６に記載される手順と同様の手順を使用して構築した。コドン最適化された（＋）−α−サンタレン合成酵素ｃＤＮＡ（配列番号１９）および（＋）−α−サンタレン／（−）−β−サンタレン合成酵素のｃＤＮＡ（配列番号２１）を、例６に記載されるようにして増幅させ、そしてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化されたプラスミドＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ｐＣＷｏｒｉ中にライゲーションすることで、２つの新たなプラスミドＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＣｌＡＳＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号７５）およびＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＳａＳＡＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号７６）を得た。
【０１４０】
これらのオペロンの性能の評価は、前記２種のプラスミドのいずれかと、完全なメバロン酸経路を有するプラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６（例４）とを同時形質転換させたＥ．コリ細胞ＸＲＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で実施した。形質転換された細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）のＬＢアガロースプレート上で選択した。単コロニーを用いて、適切な抗生物質を補った５ｍＬのＬＢ培地に接種した。該培養を３７℃および２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日に、１００μｇ／Ｌのカルベニシリンおよび１７μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むガラス培養管中の２ｍＬのＴＢ培地に、２００μｌのＬＢ前培養を接種し、３７℃および２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養６時間後に（または培養の６００ｎｍでの光学密度が３の値に達したときに）、該培養を２０℃に冷却し、そしてタンパク質の発現を０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そして０．１％のラムノースおよび７５μｇ／Ｌのδ−アミノレブリン酸（ｓｉｇｍａ）および２％（容量／容量）のデカンを添加した。２５０ｒｐｍで振盪しながら４８時間インキュベートした後に、全培養ブロスを１容量のＭＴＢＥで抽出し、そして例４に記載されるようにしてＧＣＭＳによって分析した。
【０１４１】
全ての得られた菌株は、セスキテルペン炭化水素だけでなく、インビトロ実験でも観察される相応の酸化された産物も産生した（図１４）。この実験は、ＳａＣＰ８１６を発現する操作された細胞を使用すると、セスキテルペン類の（Ｚ）−α−サンタロール、（Ｚ）−β−サンタロールおよび他の構造的に類似した分子が産生されうることを示している。
【０１４２】
例１８
ＳａＣＰ１０３７６、つまりサンタルム・アルブム由来のシトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡの単離
例１３に記載されるようにして、Ｐ４５０をコーディングする幾つかのコンティグ配列を、サンタルム・アルブムの根からのトランスクリプトームにおいて同定した。ＳＣＨ３７−Ｃｔ８１６以外に、別のコンティグ：ＳＣＨ３７−Ｃｔ１０３７４（配列番号７７）を選択した。これは、５１０アミノ酸から構成されるタンパク質ＳａＣＰ１０３７４（配列番号７９）をコードする１５３３ｂｐ長のＯＲＦ（配列番号７８）を含み、既知のシトクロムＰ４５０配列とホモロジーを示すとともに、ヴィティス・ヴィニフェラ由来のＣＹＰ７１Ｄ１０、つまりＣＹＰ７１Ｄ１０と５８％の同一性を示している。
【０１４３】
例１９
細菌細胞中でのＳａＣＰ１０３７４の異種発現および細菌中でのＰ４５０レダクターゼとの同時発現
ＳＣＨ３７−Ｃｔ１０３７４によってコードされる酵素の機能的キャラクタリゼーションのために、タンパク質をＥ．コリ細胞中で異種発現させた。Ｅ．コリ中での発現を改善するためにＯＲＦ配列を改変した。最初の１８コドンをＭＡＬＬＬＡＶＦＷＳＡＬＩＩペプチドをコードするコドンによって置き換え、全ＯＲＦ配列のコドン利用を、最適化させた。改変されたＳａＣＰ１０３７４（配列番号８１）をコードする新たなｃＤＮＡ、つまりＳａＣＰ１２０２９２（配列番号８０）は、インビトロ（ＤＮＡ２．０）で合成し、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４０４プラスミド（ＤＮＡ２．０）中にクローニングした。
【０１４４】
異種発現は、例２に記載されるようにして実施した。この方法によって、４５０ｎｍに最大吸収を有する典型的なＣＯスペクトルがこの新たな組み換えＳ．アルブムのＰ４５０について測定され、こうして機能的なＰ４５０酵素へと適切に折り畳まれていることが裏付けられる。
【０１４５】
このＰ４５０酵素の活性を再構成するために、Ｐ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）を同時発現させた。この目的のために、１つのバイシストロン性オペロンを、例１５に記載されるのと同様にして、単独のプラスミドからユニークなプロモーターの制御のもとＳａＣＰ１０３７４およびＣＰＲｍ（ミントのＰ４５０レダクターゼ）を発現するように設計した。最適化されたＳａＣＰ１２０９２のｃＤＮＡをＣＰＲｍのｃＤＮＡと組み合わせて、連続的にＰ４５０のｃＤＮＡ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むリンカー配列およびＣＰＲｍのｃＤＮＡを含むバイシストロン性構築物（配列番号８２）を調製した。この構築物を、ＰＣＲによって例１５に記載されるようにして調製し、ｐＣＷｏｒｉ＋プラスミド（Ｂａｒｎｅｓ  Ｈ．Ｊ（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７２，３−１４）中にクローニングすることで、プラスミドＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ｐＣＷｏｒｉを得た。
【０１４６】
Ｅ．コリ細胞ＪＭ１０９を、これらのバイシストロン性発現プラスミドで形質転換した。前記形質転換された細胞を増殖させ、組み換えタンパク質を含む無細胞抽出物を例２に記載されるようにして調製した。それらの膜タンパク質フラクションは、セスキテルペン分子の酵素的変換を評価（例２１）するために使用した。
【０１４７】
例２１
組み換えＳａＣＰ１０３７４  Ｐ４５０酵素を使用した（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよび（−）−α−トランス−ベルガモテンのインビトロ変換
生体内変換アッセイのこの例において基質として使用した種々のセスキテルペン炭化水素（α−サンタレンか、または（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンの混合物のいずれか）は、例４に記載されるようにして調製した。
【０１４８】
組み換えのＳａＣＰ１０３７４およびＣＰＲｍタンパク質を発現するＥ．コリ由来の粗製タンパク質抽出物（例２０）を、これらのセスキテルペン分子のインビトロ酸化のために使用し、そして該アッセイを例１６に記載されるようにして実施した。テフロンで封止したガラス管中でやさしくかき混ぜながら２時間インキュベーションした後に、反応を氷上で停止させ、１容量のＭＴＢＥ（メチルｔ−ブチルエーテル、Ｓｉｇｍａ）で抽出した。該抽出物を、ＧＣＭＳによって例４に記載されるようにして分析した。
【０１４９】
これらの条件で、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンのＳａＣＰ１０３７４による酸化が観察された。図１５および図１６は、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテンおよび（＋）−エピ−β−サンタレンが、ＳａＣＰ１０３７４によって酸化されて、（Ｅ）−α−サンタロール、（Ｅ）−β−サンタロール、（Ｅ）−α−トランス−ベルガモトールおよび（Ｅ）−エピ−β−サンタロールを形成することを示している。全てのアッセイにおいて、検出可能な量のセスキテルペンアルコールの相応のシス異性体は観察されなかった（それぞれのセスキテルペンアルコールのトランス異性体とシス異性体は、これらのアッセイで使用されるクロマトグラフィー条件で簡単に分離される）。
【０１５０】
この実験は、サンタルム・アルブムから単離されたシトクロムＰ４５０酵素であるＳａＣＰ１０３７４を、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレンおよび構造的に類似のセスキテルペン分子のトランス末端炭素の選択的なヒドロキシル化に使用できることを示している。
【０１５１】
例２２
組み換えＳａＣＰ８１６およびＳａＣＰ１０３７４  Ｐ４５０酵素を使用した（Ｅ）−β−ファルネセン、（Ｅ）−α−ファルネセン、（−）−セスキサビネンＢ、（−）−β−ビサボレンおよび（−）α−トランス−ベルガモテンのインビトロ変換
例４に記載される方法を使用して、サンタレン類に構造的に類似した幾つかのセスキテルペン炭化水素を調製した。（−）−セスキサビネンＢおよび（−）−β−ビサボレンを、ＳａＴｐｓ６４７、つまりサンタルム・アルブムの（−）−セスキサビネンＢ合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＰ３７１９０．１）をコードするｃＤＮＡか、またはＳａＴｐｓ３０、つまりサンタルム・アルブムの（−）−β−ビサボレン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＰ３７１８９．１）をコードするｃＤＮＡのいずれかを含むｐＥＴＤｕｅｔ発現プラスミドと組み合わせて、例４に記載されるｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６プラスミドを使用して産生させた。β−ファルネセンは、Ｂｅｄｏｕｋｉａｎ（Ｄａｍｂｕｒｙ，Ｃｔ，ＵＳＡ）から入手し、α−ファルネセンは、Ｔｒｅａｔｔ（Ｓｕｆｆｏｌｋ，ＵＫ）から入手し、そして（−）−α−トランス−ベルガモテンは、シトラス油から精製したものであった。
【０１５２】
組み換えのＳａＣＰ８１６またはＳａＣＰ１０３７４と一緒に、ＣＰＲｍタンパク質を発現するＥ．コリ由来の粗製タンパク質抽出物（例１５および例２０）を、これらのセスキテルペン分子のインビトロ酸化のために使用した。アッセイおよびＧＣＭＳによる生成物同定は、例１６に記載されるようにして実施した。
【０１５３】
これらの条件で、（Ｅ）−β−ファルネセン、（Ｅ）−α−ファルネセン、（−）−セスキサビネンＢ、（−）−β−ビサボレンおよび（−）α−トランス−ベルガモテンの酸化が観察された（図１７〜図２１）。これらの全ての化合物について、前記２種のＳ．アルブムのＰ４５０は、末端ｇｅｍ−ジメチル基（図２７におけるＲ１またはＲ２）の２つの炭素原子の１つに位置選択性である。ＳａＣＰ８１６は、末端二重結合に対してシス位にあるメチル（図２７におけるＲ１）の炭素原子の選択的酸化を触媒する一方で、ＳａＣＰ１０３７４は、同じ基質の酸化を、もっぱら末端二重結合に対してトランス位にあるメチル基（図２７におけるＲ２）の炭素原子で触媒する。それぞれのセスキテルペンアルコールのトランス異性体とシス異性体は、これらのアッセイで使用されるクロマトグラフィー条件で簡単に分離される。相応のアルデヒドの形成は、トランス−メチル基が酸化される場合に、Ｅ．コリ固有のアルコールデヒドロゲナーゼ活性によるものである。
【０１５４】
この実験は、サンタルム・アルブムから単離されたシトクロムＰ４５０酵素であるＳａＣＰ８１６およびＳａＣＰ１０３７４を、β−ファルネセン、α−ファルネセン、（＋）−α−サンタレン、（−）−β−サンタレン、（−）−α−トランス−ベルガモテン、（−）−セスキサビネンＢまたは（−）−β−ビサボレンと構造類似性を有する様々なセスキテルペン分子の、シス末端炭素とトランス末端炭素のそれぞれの選択的ヒドロキシル化に使用できることを示している。
【０１５５】
例２３
組み換えＳａＣＰ８１６またはＳａＣＰ１０３７４  Ｐ４５０酵素を使用した、操作された細胞における様々な酸化されたセスキテルペンのインビボ産生
例２１および例２２に記載される酸化されたセスキテルペン分子は、全細胞、例えばグルコースもしくはグリセロール等の炭素源からセスキテルペン類を産生するように操作されたＥ．コリ細胞のような全細胞を使用して直接的に産生させることもできる。ＳａＣＰ１２０２９３のｃＤＮＡ（配列番号７２）またはＳａＣＰ１２０２９２（配列番号８０）、ＣＰＲｍのｃＤＮＡ（配列番号９）およびテルペン合成酵素をコードするｃＤＮＡ（アルテミシア・アヌアのβ−ファルネセン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＸ３９３８７．１．１）、ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）のα−ファルネセン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＳ４７６９７．１）、Ｓ．アルブムの（−）−セスキサビネンＢ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＰ３７１９０．１）、Ｓ．アルブムの（−）−β−ビサボレン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＰ３７１８９．１）、クラウセナ・ランシウムのα−サンタレン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＲ７１０５５．１）またはＳ．アルブムのα−／β−サンタレン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＤＰ３０８６７．１）のいずれかをコードするｃＤＮＡ）から構成される合成オペロンを含むｐＣＷｏｒｉ＋プラスミドからなるプラスミドを調製した。
【０１５６】
種々の合成オペロンの組み合わせを有するプラスミドを、以下の手順を使用して調製した。プラスミドｐＤ４４４−ＳＲ−ＡａＢＦＳ（ＡａＢＦＳ、アルテミシア・アヌアの（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＸ３９３８７．１）をコードする最適化されたｃＤＮＡを含む）、プラスミドｐＤ４４４−ＳＲ−ＰａＡＦＳ（ＰａＡＦＳ、ピセア・アビエスの（Ｅ）−α−ファルネセン合成酵素（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＳ４７６９７．１）をコードする最適化されたｃＤＮＡを含む）を使用して、ＰＣＲによって（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素および（Ｅ）−α−ファルネセン合成酵素のｃＤＮＡをそれぞれ増幅させた。プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳａＴｐｓ６４７およびｐＥＴＤｕｅｔ−ＳａＴｐｓ３０（例２２）を鋳型として使用して、ＰＣＲによってセスキサビネンＢ合成酵素およびビサボレン合成酵素のｃＤＮＡをそれぞれ増幅させた。それぞれの構築物について、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を使用したクローニングのためにプライマーを設計した。ＡａＢＦＳのｃＤＮＡを、フォワードプライマーＣＰＲｍ＿ａａＢＦＳ＿Ｉｎｆ１（ＴＴＡＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＣ）およびリバースプライマーＡａＢＦＳ＿Ｉｎｆ２（ＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡＡＣＣＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧ）を使用して増幅させた。ＰａＡＦＳのｃＤＮＡを、フォワードプライマーＣＰＲｍ＿ＰａＡＦＳ＿Ｉｎｆ１（ＴＴＡＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣ）およびリバースプライマーＰａＡＦＳ＿Ｉｎｆ２（ＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＴＣＧＧＧＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣ）を使用して増幅させた。ＳａＴｐｓ６４７のｃＤＮＡを、フォワードプライマーＣＰＲｍ＿Ｔｐｓ６４７＿ｉｎｆ１（５’ＧＣＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡＴＴＣＴ−３’）およびリバースプライマーＴｐｓ６４７＿Ｉｎｆ２（ＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＧＧＧＴＧＧＡ）を使用して増幅させた。ＳａＴｐｓ３０のｃＤＮＡを、フォワードプライマーＣＰＲｍ＿Ｔｐｓ３０＿Ｉｎｆ１−（ＧＣＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＣ）およびリバースプライマーＴｐｓ３０＿Ｉｎｆ２（ＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧ）を使用して増幅させた。
【０１５７】
前記ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化したプラスミドＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号７４）またはＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ｐＣＷＯｒｉ（配列番号８２）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）を用いてライゲーションすることで、新たなプラスミドＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＳａＴＰＳ６４７−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８３）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＳａＴＰＳ６４７−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８４）、ＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＳａＴＰＳ３０−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８５）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＳａＴＰＳ３０−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８６）、ＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＡａＢＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８７）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＡａＢＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８８）、ＳａＣＰ８１６−ＣＰＲｍ−ＰａＡＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号８９）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＰａＡＦＳ−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号９０）、ＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＣｌＴｐｓ２−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号９１）およびＳａＣＰ１０３７４−ＣＰＲｍ−ＳａＴｐｓ８２０１−ｐＣＷｏｒｉ（配列番号９２）を得た。
【０１５８】
前記プラスミドを使用したＥ．コリ細胞における酸化されたセスキテルペンのインビボ産生は、例１７に記載されるようにして実施した。これらのプラスミドで形質転換された全ての組み換え細菌細胞は、想定されるセスキテルペン炭化水素だけでなく、インビトロ実験でも観察される相応の酸化された産物も産生した（図２２〜図２６）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【配列表】
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