(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効量を含む、被験体における体重を減少、血糖値を低下又は耐糖能を改善するための医薬組成物であって、前記単離ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、位置１１０におけるノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンへのアミノ酸置換を含む配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドが、配列番号９、１３、１７、２１又は２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
単離ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効量を含む、被験体における体重を減少、血糖値を低下又は耐糖能を改善するための医薬組成物であって、前記単離ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、位置８８におけるノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンへのアミノ酸置換を含む配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドが、配列番号１１、１５、１９、２３又は２７のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記被験体が、２型糖尿病である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記被験体が、脂質異常症である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記被験体が、肥満である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記被験体が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記被験体が、哺乳類である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドが、薬学的に許容される担体と混合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示する発明は、治療有効量のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを治療を要する被験体に対して投与することによって、代謝障害、例えば２型糖尿病、高ブドウ糖値、高インスリン値、異常脂血症、肥満または糖尿病性腎症を治療または改善することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＡ２、グループＸＩＩＡ（ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ）は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）酵素のスーパーファミリーに属する分泌ポリペプチドである。また、それは、ホスホリパーゼＡ２、グループＸＩＩＡ、グループＸＩＩＡ分泌ホスホリパーゼＡ２、ＲＯＳＳＹ、ＦＫＳＧ３８、及びＵＮＱ２５１９／ＰＲＯ６０１２とも呼ばれる。
【０００３】
ＰＬＡ２Ｇ１２Ａを含むホスホリパーゼＡ２酵素は、ｓｎ−２位におけるリン脂質のカルシウム依存性加水分解を触媒して、脂肪酸及びリゾリン脂質を生成させる。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａの活性部位はＨｉｓ−Ａｓｐダイアド（２連鎖部位）を含む。しかしながら、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、標準的なホスホリパーゼＡ２アッセイではホスホリパーゼ活性は比較的低く、他の分泌ホスホリパーゼＡ２とは構造的及び機能的に異なっている。Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７５：７４９２−７４９６。Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１１４９４−１１５０３；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８：１０６５７−６７。
【０００４】
ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａ遺伝子は染色体４ｑ２５に位置している。成熟分泌ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、保存されたＣａ２＋結合ループ及び触媒部位を除いては、他のファミリーメンバーとの相同性は低い。Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３。
【０００５】
全長ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、切断されて成熟ペプチドを放出する予想シグナル配列を含む。ヒト全長前駆体は、２２個の予想アミノ酸シグナル配列を含む１８９個のアミノ酸を含む。ヒト成熟ポリペプチドは、１６７個のアミノ酸を含む。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓及び膵臓で大量に発現する。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、脳、肝臓、小腸、肺及び胎盤にも存在する。Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｅｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７５：７４９２−７４９６
【非特許文献２】Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１１４９４−１１５０３
【非特許文献３】Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８：１０６５７−６７
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ペプチドをコードする核酸分子、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物、及びそのような核酸、ポリペプチド、または医薬組成物を使用して代謝障害を治療する方法を提供する。
【０００８】
代謝障害を治療する方法を提供する。一つの実施形態では、前記方法は、治療有効量の単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド）を治療を要する被験体に対して投与することを含む。様々な実施形態において、前記代謝障害は、２型糖尿病、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肥満または糖尿病性腎症である。他の実施形態では、前記代謝障害は、被験体が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む。方法が実行される被験体は、哺乳類、例えばヒトであり得る。特定の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、配列番号１及び３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号２及び４から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、薬学的に許容される担体と混合されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを含む医薬組成物の形態で投与される。更に他の実施形態では、提供する方法は、投与後の時点における被験体の血糖値を測定する工程を更に含む。なお更に他の実施形態では、前記方法は、投与後の時点における被験体の血清インスリン値を測定する工程を更に含む。
【０００９】
配列番号１及び３から成る群より選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの治療有効量を、治療を要する被験体に投与することを含む、代謝障害を治療する方法も提供する。様々な実施形態において、前記代謝障害は、２型糖尿病、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肥満または糖尿病性腎症である。他の実施形態では、前記代謝障害は、被験体が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む。前記方法が実行される被験体は、哺乳類、例えばヒトであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、薬学的に許容される担体と混合されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを含む医薬組成物の形態で投与される。更に他の実施形態では、提供する方法は、投与後の時点における被験体の血糖値を測定する工程を更に含む。なお更に他の実施形態では、前記方法は、投与後の時点における被験体の血清インスリン値を測定する工程を更に含む。
【００１０】
別の実施形態では、前記方法は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群より選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効量を、治療を要する被験体に投与することを含む。様々な実施形態において、前記代謝障害は、２型糖尿病、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肥満または糖尿病性腎症である。他の実施形態では、前記代謝障害は、被験体が１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値を有する状態を含む。前記方法が実行される被験体は、哺乳類、例えばヒトであり得る。特定の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異タンパク質は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から選択される配列を含み、そして／または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、薬学的に許容される担体と混合されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物の形態で投与される。更に他の実施形態では、提供する方法は、投与後の時点における被験体の血糖値を測定する工程を更に含む。なお更に他の実施形態では、前記方法は、投与後の時点における被験体の血清インスリン値を測定する工程を更に含む。
【００１１】
また、単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド）及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。様々な実施形態において、単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、配列番号１及び３から選択され、そして／または配列番号２及び４から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる。他の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、配列番号１及び３から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１２】
また、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。様々な実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から成る群より選択される配列を含み、そして／または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる。他の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１３】
また、本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド及び／またはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスの体重（ｇ）を示している棒グラフである。体重は、注射２日前に測定し、そして注射３週間後、５週間後及び７週間後に測定した。
【図２】ＡＡＶ注射１１週間後と１２週間後の間の７日間に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスの平均摂食量（ｇ／ｇ体重／日）を示している棒グラフである。
【図３】注射２日前、そして注射３週間後、５週間後及び７週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける血糖値を示している棒グラフである。
【図４】注射３週間後（図４Ａ）、５週間後（図４Ｂ）及び７週間後（図４Ｃ）に行ったブトウ糖負荷試験を示している一連の３プロットである。各プロットは、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおけるブドウ糖（２ｇ／ｋｇ）の経口注入後６０分間にわたるブドウ糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示している。
【図５】注射９週間後に行われたインスリン感受性試験の結果を示している一連の２プロットである。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける１Ｕ／ｋｇインスリンの腹腔内注射後６０分間にわたるブドウ糖値が、図５Ａ（ｍｇ／ｄＬ）及び図５Ｂ（ベースラインからの％）に示してある。
【図６】注射２日前、そして注射３週間後及び５週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける血清インスリン値を示している棒グラフである。
【図７】注射５週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける血清トリグリセリド値（図７Ａ）及び血清コレステロール値（図７Ｂ）を示している一連の２つの棒グラフである。
【図８】注射８週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスの体脂肪量（ｆａｔ  ｍａｓｓ）及び除脂肪量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）を示している一連の４つの棒グラフである。前記動物の体脂肪量は、図８Ａ（ｇ）及び図８Ｂ（％脂肪）に示してある。前記動物の除脂肪量は、図８Ｃ（ｇ）及び図８Ｄ（％除脂肪）に示してある。
【図９】ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスの体重（ｇ）を示している棒グラフである。体重は、注射２日前及び注射４週間後に測定した。
【図１０】注射２日前及び注射４週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける血糖値を示している棒グラフである。
【図１１】注射４週間後に行われたブトウ糖負荷試験を示しているプロットである。前記プロットは、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌマウス、及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおけるブドウ糖（２ｇ／ｋｇ）の経口注入後６０分間にわたるブドウ糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示している。
【図１２】注射２日前及び注射４週間後に測定されたＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌマウス及びＡＡＶ８空ベクター（対照）マウスにおける血清インスリン（ｎｇ／ｍｌ）値を示している棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本開示は、必要に応じて被験体に対して、治療有効量の単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド、例えばヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド、及び／またはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを投与することによって、代謝障害、例えば２型糖尿病（Ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）（本明細書では「２型糖尿病（ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ）」と互換可能に呼ばれる）、高ブドウ糖値、高インスリン値、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、糖尿病性腎症または肥満を治療する方法を提供する。投与及び送達の方法も提供する。
【００１６】
また、本開示は、単離ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド、例えばヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドをコードする核酸分子、及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを含む医薬組成物も提供する。
【００１７】
また、本開示は、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸分子、及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物も提供する。
【００１８】
本発明で使用される組換えポリペプチド及び核酸法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及びその後続の版またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）及びその後続の版に記載されている方法であり、前記文献の両方は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
Ｉ．一般的な定義
本明細書で使用される以下の慣例の不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、特に他に指示がない限り「１以上」を意味する。
【００２０】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」及び「残基」は、互換可能であり、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用されるとき、天然及び合成アミノ酸の両方ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、及び天然アミノ酸に化学的に類似している非天然アミノ酸を指している。
【００２１】
用語「天然アミノ酸」及び「天然にコードされたアミノ酸」は、互換可能に使用され、前記用語は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに、合成後に修飾される遺伝暗号によってコードされるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンを指している。
【００２２】
「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合されるα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有することができるが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。
【００２３】
「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有する化学化合物であるが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する構造を有する化学化合物である。例としては、アミド、β−、γ−、δ−イミノ酸（例えばピペリジン−４−カルボン酸）などのメタクリロイルまたはアクリロイル誘導体が挙げられる。
【００２４】
用語「非天然アミノ酸」及び「天然にコードされていないアミノ酸」は、互換可能に使用され、前記用語は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有しているが、翻訳複合体によって成長ポリペプチド鎖中に組み込まれない化合物を指している。また「非天然アミノ酸」は、天然にコードされたアミノ酸（２０個の共通のアミノ酸を含むがそれらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるが、成長するポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって天然にそれら自体組み込まれないアミノ酸も含むが、それらに限定されない。ポリペプチド配列中に挿入することができるか、または、ポリペプチド配列中の野生型残基と置換され得る非天然アミノ酸の例としては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を有するアミノ酸が挙げられるが、それらに限定されない。例としては（Ｌ体またはＤ体；括弧内に略語）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（略語「Ｋ（Ｎε−ｇｌｙｃｙｌ）」または「Ｋ（ｇｌｙｃｙｌ）」または「Ｋ（ｇｌｙ））、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β、β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニ；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β‐アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ‐ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３―メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコシルアミニル−Ｌ−トレオニン、Ｏ−ホスホチロシン及び他の類似のアミノ酸、及び詳細にリストしたもののいずれかの誘導体化形態が挙げられる。
【００２５】
用語「単離核酸分子」は、ポリペプチドの、ペプチドの、脂質の、炭水化物の、ポリヌクレオチドの、または、すべての核酸が供給源の細胞から単離されるときに核酸が天然に見出される他の材料の、少なくとも約５０％から分離された、５´から３´末端へと読みとられたデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマー（例えば、本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ核酸配列）またはその類似体を指している。好ましくは、単離核酸分子は、ポリペプチド生成における使用、または治療、診断、予防もしくは研究のための使用を妨げるであろう核酸の天然環境において見出される、他のあらゆる汚染されている核酸分子または他の分子を実質的に含まない。
【００２６】
用語「単離ポリペプチド」は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドが供給源の細胞から単離されるときに天然に見出される他の材料の少なくとも約５０％から分離されたポリペプチド（例えば、本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド配列）を指している。好ましく、単離ポリペプチドは、治療、診断、予防もしくは研究のための使用を妨げるであろう天然環境において見出される、他のあらゆる汚染されているポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００２７】
用語「コードする」は、１つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指している。前記用語は、開始コドンまたは停止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列によって提供される異なるリーディングフレームのいずれか１つにおいて、コードすることができる。
【００２８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況において、用語「同一の」及び％「同一性」は、同じである２つ以上の配列または下位配列を指している。「％同一性」は、比較される分子内のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一の残基の割合を意味しており、比較される分子の最小の大きさに基づき計算される。これらの計算において、（もしある場合）アライメントのギャップを、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により処理することができる。整列した核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及び  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されている方法が挙げられる。
【００２９】
％同一性を計算する場合、比較する配列を、配列間で最大の一致が得られるように整列させる。％同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン大学，ウィスコンシン州マディソン）を含むＧＣＧプログラムパッケージである。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを使用して％配列同一性が決定される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させる。その配列は、各アミノ酸またはヌクレオチドの最適なマッチング（アルゴリズムによって決定される「一致スパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）のために整列させる。ギャップオープンペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍で計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによって完全なアミノ酸の一致に割り当てられるスコアまたは数である）、及びギャップ伸長ペナルティ（通常はギャップオープンペナルティの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスを、アルゴリズムと共に使用する。ある実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２を、ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）も、アルゴリズムによって使用される。
【００３０】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の％同一性を決定するための推奨パラメータは、以下の通りである：すなわち、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：上記ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｆｒｏｍ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；
ギャップペナルティ：１２（しかし、末端ギャップについてはゼロペナルティ）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０。
【００３１】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのあるアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域だけの一致をもたらすことができ、この小さな整列された領域は、２つの全長配列の間に有意な関係がない場合であっても、非常に高い配列同一性を有することができる。したがって、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸にわたるアラインメントとなるようにしたい場合には、選択されるアラインメント方法（例えばＧＡＰプログラム）を調節することができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド」（または「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ」）は、動物（例えば、哺乳類、例えばヒト、サル、ウサギ、マウスまたはラット）で発現される天然（または「野生型」）ポリペプチドを指している。この開示のために、用語「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド」を使用して、任意の全長ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、配列番号１、それは１８９個のアミノ残基から成っていて、ヌクレオチド配列番号２によってコードされる）及びシグナル配列が除去された成熟ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、配列番号３、それは１６７個のアミノ酸残基から成っていて、ヌクレオチド配列番号４によってコードされる）を指している。また、本明細書で使用される用語ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、天然対立遺伝子（例えば、ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの天然対立遺伝子の形態）も含む。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、種々の供給源から、例えばヒトもしくは非ヒト（例えばマウス）組織から単離してもよく、または組換え法もしくは合成法によって調製してもよい。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、発現プロセス（例えば細菌の発現）を遺伝子操作することにより、またはそのプロセスの結果として導入してもよいアミノ末端メチオニンを、含むことができるが、含まなくてもよい。
【００３３】
様々な実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、天然ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、配列番号１または３）と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、天然ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドアミノ酸配列（例えば、配列番号１または３）と少なくとも約９０％、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、好ましくは、野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの少なくとも１つの活性、例えば、血糖値、インスリン値もしくはトリグリセリド値を低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能もしくはインスリン感受性を改善する能力を有するが、有していなくてもよい。また、本発明は、そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド配列をコードする核酸分子も含む。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド」（または「変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ」）は、天然ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド配列が修飾されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを指している。そのような修飾としては、１個以上のアミノ酸置換、例えば非天然アミノ酸、非天然のアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体による置換が挙げられるが、それらに限定されない。本開示のために、用語「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド」を使用して、シグナル配列もしくは予想シグナル配列を含むそのように修飾されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、配列番号９、それは、Ｈ１１０Ｌ変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を有していて、ヌクレオチド配列番号１０によってコードされる）またはそれからシグナル配列もしくは予想シグナル配列が除去されたそのように修飾されたＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（例えば、配列番号１１、それは、Ｈ１１０Ｌ変異を有する配列番号３のアミノ酸配列を有していて、ヌクレオチド配列番号１２によってコードされる）を指すことができる。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、組換え法または合成法によって調製してもよい。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、細菌の発現プロセスを遺伝子操作することによってまたはそのプロセスの結果として導入してもよいアミノ末端メチオニンを含むことができるが、含まなくてもよい。
【００３５】
様々な実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７から選択される配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７から選択される配列と少なくとも約９０％または約９５，９６，９７，９８、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、好ましくは、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの少なくとも１つの活性、例えば、血糖値、インスリン値、トリグリセリド値、またはコレステロール値を低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能もしくはインスリン感受性を改善する能力を有するが、有していなくてもよい。また、本発明は、そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド配列をコードする核酸分子も含む。
【００３６】
場合によっては、被験体における代謝障害を治療または改善するために使用されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドは、被験体と同じ種由来のＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの成熟形態である。同様に、場合によっては、被験体における代謝障害を治療または改善するために使用されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、被験体と同じ種のＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの成熟形態から誘導される。
【００３７】
ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは好ましくは生物学的に活性である。様々なそれぞれの実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの生物活性は、シグナルペプチドが除去された成熟ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの天然形態のそれと同じ、それを超える、またはそれを下回る。生物活性の例としては、血糖値、インスリン値、トリグリセリド値、もしくはコレステロール値を低下させる能力；体重を減少させる能力；または耐糖能、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力；尿糖及びタンパク質排出を減少させる能力が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、ホスホリパーゼ活性を欠いているが、生物学的に活性である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書記載のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、哺乳類における半減期延長部分を欠いているポリペプチドの血清半減期と比較して、哺乳類におけるポリペプチドの血清半減期を延長させる半減期延長部分を更に含む。例えば、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、及びＦｃ部分のうちの１つ以上である。
【００３９】
「保存的アミノ酸置換」は、天然のアミノ酸残基（すなわち、野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド配列の所定の位置に見出される残基）を、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に殆どまたは全く影響しないように、非天然の残基（すなわち、野生型  ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド配列の所定の位置に見出されない残基）で置換することを含むことができる。また、保存的アミノ酸置換は、生物系の合成によるものよりむしろ化学ペプチド合成により典型的に組み込まれる（本明細書で定義される）非天然のアミノ酸残基も含む。これらは、ペプチド模倣体、及び他のアミノ酸部分の逆転形態または反転形態を含む。
【００４０】
天然残基を、共通の側鎖特性に基づきクラスに分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００４１】
また、アミノ酸の追加の基を、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（第２版、１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を使用して配合することもできる。場合によっては、上記特徴の２つ以上に基づいて置換の特徴を更に記述することは有用であり得る（例えば、Ｔｈｒ残基などの「小極性」残基による置換は、適当な環境で、高度に保存的な置換を示し得る）。
【００４２】
保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの１メンバーを同じクラスの別のメンバーに置き換えることを含むことができる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスからのメンバーに置き換えることを含むことができる。
【００４３】
上記分類のものに類似の公知の生理化学特性を有する合成、希少、または修飾アミノ酸残基を、配列中の特定のアミノ酸残基のための「保存的」置換物として使用することができる。例えば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、典型的なＬ−Ａｒｇ残基のための置換物として役立ることができる。これはまた、特定の置換が、上記クラスのうちの２つ以上の観点から説明することができる場合でもあり得る（例えば、小さくかつ疎水性の残基による置換は、１個のアミノ酸を、上記クラスの両方に見出される残基（単数または複数）で、または、両方の定義を満たすそのような残基と類似の生理化学的特性を有することが当該技術分野で知られている他の合成残基、希少残基、もしくは修飾残基で置換することを意味している）。
【００４４】
本明細書で使用される用語「治療有効用量」及び「治療有効量」は、治療される疾患または障害の症状の緩和または改善を含む、研究者、内科医、または他の臨床医により探求されている、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的反応を引き出すＰＬＡ２Ｇ１２ＡペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの量、すなわち、１つ以上の所望の生物学的または医学的応答の観察可能な値、例えば、血糖値、インスリン値、トリグリセリド値、もしくはコレステロール値を低下させること；体重を減少させること；体脂肪量を減少させること；または耐糖能もしくはインスリン感受性を改善すること、ならびに前記状態の進行を遅延させることを支援するＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの量を意味している。
【００４５】
ＩＩ．ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド
本発明者は、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）動物モデルにおけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介過剰発現が、対照と比較して、これらの動物（「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物」）において、とりわけ、体重減少（さらなる摂食にもかかわらず）、耐糖能の改善、インスリン耐性の改善、血糖の低下、血清インスリンの低下、トリグリセリド値の低下、及び体脂肪量の減少をもたらす、ことを見出した。実施例２を参照されたい。このことは、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドが、代謝制御因子であって、代謝障害、例えば２型糖尿病、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肥満及び／または糖尿病性腎症の治療のために治療的に使用できるという本発明者の仮説を立証した。
【００４６】
さらなる研究において、本発明者は、配列番号１の位置１１０にあるヒスチジン残基（Ｈ１１０）をリジン残基で置換した。Ｈ１１０は、Ｈｉｓ−Ａｓｐ触媒ダイアドの一部であるので、この置換は、得られるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド（ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ）のホスホリパーゼ活性を除去すると予想された。しかしながら、本発明者は、驚くべきことに、ＤＩＯ動物モデルにおけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０ＬのＡＡＶ媒介過剰発現が、対照と比較して、またＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物と比較しても、これらの動物（「ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物」）において、とりわけ、体重の減少、耐糖能の改善、血清インスリン値の低下及び血糖値の低下をもたらす、ことを見出した。実施例３を参照されたい。而して、本発明のＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド、例えばＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは、代謝障害、例えば肥満、糖尿病及び／または異常脂血症の治療のために、治療的に使用することもできる。実際に、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは、体重の減少、耐糖能の改善、血清インスリン値の低下及び血糖値の低下に関して、野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａに比べて優れていた。
【００４７】
Ａ．ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド及び核酸
様々な実施例において、配列番号１及び２のすべてまたは一部を含むことができる、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから単離し、かつ／または増幅することができる。プライマーは、標準的な（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅法にしたがい、本明細書で提供される核酸配列及びアミノ酸配列に基づいて設計することができる。次いで、その増幅された核酸を、適当なベクター中にクローン化し、ＤＮＡ配列分析により特性を決定することができる。
【００４８】
本明細書で提供される配列のすべてまたは一部を単離または増幅するときにプローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して設計かつ生成させることができ、またはより長いＤＮＡ配列から単離することができる。
【００４９】
インビボにおいて（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、予想シグナル配列を含む連続アミノ酸配列として発現される。全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａの１８９個のアミノ酸配列は、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００５０】
【表１】
0006434485.tif 000002
であり、（任意の停止コドンと共に示されている）以下のＤＮＡ配列：
【００５１】
【表２】
0006434485.tif 000003
によってコードされる。
【００５２】
予測される２２個のアミノ酸残基シグナル配列の切断後のヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａの１６７個のアミノ酸配列は：
【００５３】
【表３】
0006434485.tif 000004
であり、（任意の停止コドンと共に示されている）以下のＤＮＡ配列：
【００５４】
【表４】
0006434485.tif 000005
によってコードされる。
【００５５】
全長マウスＰＬＡ２Ｇ１２Ａの１９２個のアミノ酸配列は、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００５６】
【表５】
0006434485.tif 000006
であり、（任意の停止コドンと共に示されている）以下のＤＮＡ配列：
【００５７】
【表６】
0006434485.tif 000007
によってコードされる。
【００５８】
予測される２５個のアミノ酸残基シグナル配列の切断後のマウスＰＬＡ２Ｇ１２Ａの１６７個のアミノ酸配列は：
【００５９】
【表７】
0006434485.tif 000008
であり、（任意の停止コドンと共に示されている）以下のＤＮＡ配列：
【００６０】
【表８】
0006434485.tif 000009
によってコードされる。
【００６１】
Ｂ．ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド及び核酸
本明細書で開示されるように、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、標準的な分子生物学的方法を使用して、遺伝子操作することができ、かつ／または生成させることができる。上記ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドと同様に、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核配列は、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｃＤＮＡから増幅され得る。プライマーを、標準的な（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅法にしたがい、本明細書で提供される核酸配列及びアミノ酸配列に基づいて設計することができる。次いで、その増幅された核酸を、適当なベクター中にクローン化し、ＤＮＡ配列分析により特徴づけすることができる。
【００６２】
本明細書で提供される配列のすべてまたは一部を単離または増幅するときにプローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して設計かつ生成させることができ、またはより長いＤＮＡ配列から単離することができる。
【００６３】
配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８に縮重したものを含む、本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸配列は、本開示の他の態様を形成する。
【００６４】
一つの実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、配列番号１における位置Ｈ１１０においてアミノ酸残基置換を含む。例えば、Ｈ１１０Ｌ変異を有する全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａのアミノ酸配列は、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００６５】
【表９】
0006434485.tif 000010
であり、以下のＤＮＡ配列によってコードされる：
【００６６】
【表１０】
0006434485.tif 000011
【００６７】
関連の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、予測される２２個のアミノ酸シグナル配列が切断された配列番号９のアミノ酸配列：
【００６８】
【表１１】
0006434485.tif 000012
を含み、以下のＤＮＡ配列：
【００６９】
【表１２】
0006434485.tif 000013
によってコードされる。
【００７０】
別の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、Ｈ１１０Ｍ変異を有する全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００７１】
【表１３】
0006434485.tif 000014
であり、以下のＤＮＡ配列：
【００７２】
【表１４】
0006434485.tif 000015
によってコードされる。
【００７３】
関連の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、予測される２２個のアミノ酸シグナル配列が切断された配列番号１３のアミノ酸配列：
【００７４】
【表１５】
0006434485.tif 000016
を含み、以下のＤＮＡ配列
【００７５】
【表１６】
0006434485.tif 000017
によってコードされる。
【００７６】
別の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、Ｈ１１０Ａ変異を有する全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００７７】
【表１７】
0006434485.tif 000018
であり、以下のＤＮＡ配列：
【００７８】
【表１８】
0006434485.tif 000019
によってコードされる。
【００７９】
関連の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、予測される２２個のアミノ酸シグナル配列が切断された配列番号１７のアミノ酸配列：
【００８０】
【表１９】
0006434485.tif 000020
を含み、以下のＤＮＡ配列：
【００８１】
【表２０】
0006434485.tif 000021
によってコードされる。
【００８２】
別の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、Ｈ１１０Ｖ変異を有する全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００８３】
【表２１】
0006434485.tif 000022
であり、以下のＤＮＡ配列：
【００８４】
【表２２】
0006434485.tif 000023
によってコードされる。
【００８５】
関連の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、予測される２２個のアミノ酸シグナル配列が切断された配列番号２１のアミノ酸配列：
【００８６】
【表２３】
0006434485.tif 000024
を含み、以下のＤＮＡ配列：
【００８７】
【表２４】
0006434485.tif 000025
によってコードされる。
【００８８】
別の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、Ｈ１１０Ｉ変異を有する全長ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａのアミノ酸配列（配列番号１）を含み、（アンダーラインされた予想切断シグナル配列と共に示されている）：
【００８９】
【表２５】
0006434485.tif 000026
であり、以下のＤＮＡ配列：
【００９０】
【表２６】
0006434485.tif 000027
によってコードされる。
【００９１】
関連の実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、予測される２２個のアミノ酸シグナル配列が切断された配列番号２５のアミノ酸配列：
【００９２】
【表２７】
0006434485.tif 000028
を含み、以下のＤＮＡ配列：
【００９３】
【表２８】
0006434485.tif 000029
によってコードされる。
【００９４】
Ｃ．ベクター
本明細書で提供される核酸配列を発現するために、適当なコード配列、例えば配列番号２、４、６、または８を、適当なベクターにクローン化することができ、適当な宿主に導入した後、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されているような）当該技術分野で公知である標準的なクローニング法及び発現法にしたがって、その配列を発現させて、コードされたポリペプチドを生成させることができる。また、本発明は、本発明による核酸配列を含むそのようなベクターにも関する。
【００９５】
「ベクター」とは、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進し、（ｂ）それからのポリペプチドの生成を促進し、（ｃ）それと共に標的細胞のトランスフェクション／形質転換を促進し、（ｄ）核酸配列の複製を促進し、（ｅ）核酸の安定性を促進し、（ｆ）核酸及び／または形質転換された／トランスフェクトされた細胞の検出を促進し、かつ／または（ｇ）そうでなければ有利な生物学的及び／または生理化学的な機能を、ポリペプチドをコードする核酸に付与する、送達ビヒクルを指している。ベクターは、染色体の、非染色体の、及び合成核酸のベクター（適当な発現制御要素のセットを含む核酸配列）を含む任意の適当なベクターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、そしてウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。
【００９６】
組み換え発現ベクターは、原核生物（例えば大腸菌）または真核生物の細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）内におけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの発現用に設計することができる。代表的な宿主細胞としては、クローニング及び発現に典型的に使用されるそれらの宿主、例えば、大腸菌株のＴＯＰ１０Ｆ´、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳動物細胞株のＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３−ＥＢＮＡ  ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。代替として、組み換え発現ベクターを、インビトロで、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列とＴ７ポリメラーゼ、及びインビトロ翻訳システムを使用して、転写及び翻訳することができる。好ましくは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むクローニング部位のプロモーター上流を含む。スイッチオン及びオフすることができるプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、及びｔｒｐプロモーターがある。
【００９７】
而して、本明細書では、組み換えＰＬＡ２Ｇ１２Ａまたは変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａの発現を促進するＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。様々な実施形態において、ベクターは、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａまたは変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａの発現を制御する操作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の適当なプロモーター、エンハンサー、及び他の発現促進要素を含むことができるか、または前記要素と関連させることができる。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、またはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、有効なポリ（Ａ）末端配列、大腸菌のプラスミド生成物のための複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、及び／または便利なクローニング部位（例えばポリリンカー）が挙げられる。また、ベクターは、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモーターを含むことができる。一つの態様では、肝臓または膵臓組織などの代謝関連組織内において配列の発現を促進する組織特異的プロモーターに操作可能に連結されるＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。
【００９８】
Ｄ．宿主細胞
本開示の別の態様では、本明細書で開示される核酸及びベクターを含む宿主細胞を提供する。様々な実施形態において、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノムに融合され、他の実施形態では、ベクターまたは核酸は、染色体外である。
【００９９】
そのような核酸、ベクター、またはそのいずれかもしくは両方の組み合わせを含む酵母、細菌（例えば、大腸菌）、及び哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）などの組み換え細胞を提供する。様々な実施形態において、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素などの非融合核酸を含む細胞を提供する。
【０１００】
本明細書で提供されるＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを、形質転換によって、またはトランスフェクションによって、宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを用いて細胞を形質転換する方法は公知である。
【０１０１】
ＰＬＡ２Ｇ１２Ａまたは変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａをコードする核酸を、ウイルスベクターを介して、宿主細胞または宿主動物に位置付けすることができ、かつ／または送達することができる。任意の適当なウイルスベクターをこのキャパシティで使用することができる。ウイルスベクターは、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを、単独で、または１つ以上のウイルスタンパク質と組み合わせて含むことができ、それにより、所望の宿主細胞内での本発明の核酸の送達、複製、及び／または発現が促進される。ウイルスベクターは、ウイルス核酸、及びＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドをコードする核酸を含む、ウイルスゲノム、ウイルスタンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または無傷のウイルス粒子のすべてまたは一部を含むポリヌクレオチドであり得る。ウイルス粒子ウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子または修飾ウイルス粒子を含むことができる。ウイルスベクターは、複製及び／または発現のために別のベクターまたは野生型ウイルスの存在を必要とするベクター、例えばアデノウイルスベクターアンプリコンなどであり得る（例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存型ウイルスであり得る）。典型的には、そのようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子か、または導入遺伝子のキャパシティを増大させ、もしくは核酸のトランスフェクション及び／または発現を補助する、タンパク質及び／または核酸含量を改変したウイルス粒子から成る（そのようなベクターの例としてはヘルペスウイルス／ＡＡＶアンプリコンが挙げられる）。典型的には、ウイルスベクターは、通常ヒトに感染するウイルスと類似のものであり、かつ／またはそれに由来する。この点において、適当なウイルスベクター粒子としては、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科のウイルスの任意のウイルスまたはアデノウイルス科のウイルス由来の任意のウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）、または他のパルボウイルス及びパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ならびにレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０１０２】
Ｅ．ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの単離
本明細書記載のように発現したＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、前記ポリペプチドが天然に発現される細胞から単離することができ、またはＰＬＡ２Ｇ１２Ａまたは変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａを発現するように遺伝子操作された細胞から、例えば、天然にＰＬＡ２Ｇ１２Ａを発現しない細胞から単離することができる。
【０１０３】
ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを単離するために使用することができるタンパク質精製方法、ならびに関連の材料及び試薬は当該技術分野で公知である。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを精製する例示的方法は、以下の本明細書の実施例で提供する。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを単離するために有用であり得る更なる精製方法は、例えばＢｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５１４−９，Ｆａｉｒｌｉｅ  ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ  ２５４：６７−７６の参照文献に見出すことができる。
【０１０４】
ＩＩＩ．医薬組成物
ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド医薬組成物は、投与形態との適合性で選択された薬学的または生理学的に許容される配合剤と混合された治療有効量のＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを含むことができる。同様に、そのようなＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド医薬組成物は、投与形態との適合性のために選択された薬学的または生理学的に許容される配合剤と混合された治療有効量のＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含むことができる。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」は、ヒトまたは非ヒト被験体の体内へのＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの送達を達成または増強するのに適した１種以上の配合剤を指している。この用語は、生理学的に相溶性である、任意及びすべての溶剤、分散媒体、被覆物、抗菌性及び抗真菌性薬剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせのうちの１以上が挙げられる。場合によっては、医薬組成物中に、等張化剤、例えば砂糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。湿潤剤などの薬学的に許容される物質、または、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくは緩衝剤などの半量未満の補助物質は、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの貯蔵寿命または効力を強化し、また、前記物質は、担体として作用することもできるかまたは担体の構成要素を形成することもできる。許容可能な薬学的に許容される担体は、好ましくは、使用される用量及び濃度でレシピエントに非毒性である。
【０１０５】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、香り、無菌、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を、改変、維持、または保存するための配合剤（単数または複数）を含むことができる。適当な配合剤としては、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えばホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸）、嵩高剤（例えばマンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（例えばブドウ糖、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香料及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えばポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル）、安定性増強剤（例えばスクロースまたはソルビトール）、張性増強剤（例えばアルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または薬学的補助剤が挙げられるが、それらに限定されない（例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９５）；Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６６１，１−１９（１９７７）を参照されたい）。更なる関連の原理、方法、及び物質は、例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ−ＤＩＳＰＥＲＳＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ（２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．３，１９９８）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＆  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（７ｔｈ  ｅｄ．２０００）；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，ＴＨＥ  ＥＸＴＲＡ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＥＩＡ（３１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１６ｔｈ−２０ｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎｓ）；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｅｄｓ．（９ｔｈ  ｅｄ．−−１９９６）；Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄｓ’  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．（１０ｔｈ  ｅｄ．，１９９８）に記載されている。薬学的に許容される組成物を配合する原理は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｕｌｔｏｎ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＯＦ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭ  ＤＥＳＩＧＮ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８８），ＥＸＴＥＭＰＯＲＡＮＥＯＵＳ  ＯＲＡＬ  ＬＩＱＵＩＤ  ＤＯＳＡＧＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，ＣＳＨＰ（１９９８）にも記載されている。
【０１０６】
最適な医薬組成物は、例えば、目的の投与経路、送達形式、及び所望の用量に応じて当業者によって決定される（例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい）。そのような組成物は、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの物理状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。
【０１０７】
医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は、本来、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射に適するビヒクルまたは担体は、非経口投与のための組成物に共通の他の材料と一緒におそらく補充される、水、生理食塩水、または人工脊髄液であり得る。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、ビヒクルの更なる例である。他の例示的医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、それはソルビトールまたは適当な代替物を更に含むことができる。本発明の一実施形態では、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物と、最適な配合剤を混合することによって、保存用に調製することができる（上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）。更に、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド生成物は、スクロースなどの適当な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として配合することができる。
【０１０８】
ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。代替として、前記組成物は、吸入用または経口などの消化管を通した送達用に選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。
【０１０９】
配合物構成要素は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤を使用し、組成物を、生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲に維持する。
【０１１０】
非経口投与を考慮するとき、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む、発熱物質を含まない、非経口で許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適するビヒクルは、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドが適当に保存された無菌等張溶液として配合される無菌蒸留水である。更に別の調製は、所望の分子と、後にデポ注射を介して送達することができる生成物を制御放出または持続放出する、注射可能なミクロスフェア、生分解性粒子、ポリマー化合物（例えばポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの薬剤との配合を含むことができる。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、血液循環の持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子を導入するための他の適当な手段としては、埋め込み可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０１１１】
一つの実施形態では、医薬組成物を吸入用に配合することができる。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、吸入用乾燥粉末として配合することができる。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤と共に配合することもできる。更にもう一つの実施形態では、溶液を霧状にすることができる。肺内投与は、国際公開ＷＯ９４／２００６９に更に記載されており、化学的に修飾されたタンパク質の肺内送達について説明している。
【０１１２】
特定の配合物を経口投与できることも考えられる。本発明の一つの実施形態では、この様式で投与されるＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の調剤時に慣習的に使用される担体を用いてまたは用いずに配合することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化されるとき、かつ全身循環前の分解が最小化されているときに、消化管のポイントで配合物の活性部分が放出されるように設計することができる。更なる薬剤を、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの吸収を促進するように含むことができる。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用することができる。
【０１１３】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適する非毒性賦形剤と混合された有効量のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含むことができる。無菌水または別の適当なビヒクルに錠剤を溶解させることによって、溶液を単位剤形で調製することができる。適当な賦形剤としては、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア；または潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１４】
持続送達配合物または制御送達配合物中にＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む配合物を含む、追加のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド医薬組成物は、当業者には明らかである。様々な他の持続送達手段または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生分解性微粒子または多孔質ビーズ、及びデポ注射剤を配合する方法も、当業者に公知である（例えば、医薬組成物の送達用の多孔質ポリマー微粒子の制御放出について説明している国際公開ＷＯ９３／１５７２２、及びミクロスフェア／微粒子の調製及び使用について考察しているＷｉｓｃｈｋｅ  ＆  Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７、及びＦｒｅｉｂｅｒｇ  ＆  Ｚｈｕ，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８を参照されたい）。本明細書記載のように、ヒドロゲルは、持続送達配合物または制御送達配合物の一例である。
【０１１５】
持続放出調製物の追加の例としては、造形物形態の、例えばフィルムまたはマイクロカプセル形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，７７３，９１９及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０  ０５８  ４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（上記Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０  １３３  ９８８）が挙げられる。持続放出組成物は、リポソームも含むことができ、これは、当該技術分野で公知のいつくかの方法のいずれかによって調製することができる。例えばＥｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２；及び  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．０  ０３６  ６７６，０  ０８８  ０４６，及び０  １４３  ９４９を参照されたい。
【０１１６】
インビボでの投与のために使用されるＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド医薬組成物は、典型的には無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。前記組成物を凍結乾燥させる場合、この方法を使用する無菌を、凍結乾燥及び復元の前または後のいずれかで行うことができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。更に、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１１７】
医薬組成物を配合したら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として、無菌バイアルに保存することができる。そのような配合物は、すぐに使える形態または投与前に復元を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生成するキットに関する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性配合物を有する第２の容器の両方を含むことができる。また、単一及び多数に区切られた充填前シリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジ）を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０１１９】
治療として使用されるＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド医薬組成物の有効量は、例えば、治療内容及び目的によって決まる。而して、当業者には、治療のための適当な用量値は、送達される分子、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドが使用される適応症、投与経路、及び患者の体格（体重、体表面、または器官の大きさ）及び状態（年齢及び一般的健康）に応じてある程度異なることは明白だろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を設定し、投与経路を変更することができる。典型的な用量は、上記のファクターに応じて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態では、前記用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、あるいは５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。更に他の実施形態では、前記用量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１２０】
用量の回数は、使用される配合物中のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの薬物動態パラメータによって決まる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまで前記組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、時間をかけて２回以上の投与（同量の所望の分子を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい）として、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介して連続輸液として投与することができる。適当な用量の更なる微調整は、当業者によって、定期的に行われ、かつ定期的に行われる仕事の範囲内である。適当な用量は、適当な用量反応データの使用により確定することができる。
【０１２１】
前記医薬組成物の投与経路は、例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病変内経路による注射を介する；持続放出系（注射も可能である）による；または埋め込みデバイスによるなどの公知の方法に従う。所望の場合、前記組成物は、ボーラス注射により、もしくは輸液により連続して、または埋め込みデバイスにより、投与することができる。
【０１２２】
代替または追加として、組成物を、膜、スポンジ、または所望の分子を吸収もしくは封入した他の適当な材料の埋め込みを介して、局所的に投与することができる。埋め込みデバイスを使用する場合、デバイスは、任意の適当な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性のボーラス、または連続投与により行うことができる。
【０１２３】
薬物、例えばＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを、薬物濃度を長期間にわたり所望の治療有効レベルに維持することができるような所定の速度で送達するために、様々な異なる手法を使用することができる。一例において、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチン、または別の供給源由来のゼラチン）などのポリマーまたは天然もしくは合成して生成されたポリマーを含むヒドロゲルを使用することができる。ポリマー（例えばゼラチン）の任意のパーセンテージは、ヒドロゲル中、５、１０、１５、または２０％で使用することができる。適当な濃度の選択は、所望の治療特性及び治療分子の薬物動態特性などの様々なファクターによって決めることができる。
【０１２４】
ヒドロゲルに組み込むことができるポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−ｃｏ−ポリプロピレンオキシド、ｃｏ−ポリエチレンオキシドブロックもしくはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、ヘパリン、ポリサッカライド、ポリエーテルなどが挙げられる。
【０１２５】
ヒドロゲル配合物を作るときに考慮され得る別のファクターは、ヒドロゲル及び架橋剤の架橋度である。一つの実施形態では、架橋は、メタクリル酸無水物を含むメタクリル化反応を介して達成することができる。いくつかの状況では、高い架橋度は望ましいが、他の状況では、低い架橋度が好ましい。場合によっては、高い架橋度は、より長い持続放出をもたらす。高い架橋度は、より硬いヒドロゲルと、薬物が送達されるより長い時間をもたらし得る。
【０１２６】
ポリマーの架橋剤（例えばメタクリル酸無水物）に対する任意の比を使用して、所望の特性を有するヒドロゲルを生成させることができる。例えば、ポリマーと架橋剤の比は、例えば８：１、１６：１、２４：１、または３２：１であり得る。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンであり、架橋剤がメタクリレートであるとき、８：１、１６：１、２４：１、または３２：１のメタクリル酸無水物：ゼラチンの比で使用することができる。
【０１２７】
ＩＶ．治療用途
ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド及びＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドは、代謝状態または代謝障害を治療、診断、または改善するために使用することができる。一つの実施形態では、治療される代謝障害は、糖尿病、例えば２型糖尿病である。別の実施形態では、代謝状態または代謝障害は肥満である。他の実施形態では、代謝状態または代謝障害は、異常脂血症、高血糖値、高インスリン値または糖尿病性腎症である。例えば、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを使用して治療または改善することができる代謝状態または代謝障害は、ヒト被験体が１２５ｍｇ／ｄＬ以上、例えば１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、または２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖値を有する状態を含む。血糖値は、摂食もしくは絶食状態で、または任意の状態で測定することができる。代謝状態または代謝障害は、被験体が代謝状態を進行させる危険性が増大している状態を含むこともできる。ヒト被験体において、そのような状態は１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を含む。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物を使用して治療することができる状態は、参照により本明細書に組み込まれるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ−２０１１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｓ１１−Ｓ６１，２０１０にも見出すことができる。
【０１２８】
適応において、例えば２型糖尿病、高血糖値、高インスリン値、異常脂血症、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、糖尿病性腎症または肥満などの代謝障害または代謝状態は、治療有効用量のＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド、例えば配列番号１または３のヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドまたは治療有効用量のＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチド、例えば配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することによって治療することができる。投与は、本明細書記載のように、例えば、静脈注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下注射、筋肉内注射によって、または錠剤もしくは液体配合物の形態で経口により、行うことができる。いくつかの状況では、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効用量または好ましい用量は、臨床医が決定することができる。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効用量は、特に投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを他の治療剤と組み合わせて投与するか否か、免疫状態、及びレシピエントの健康によって決定される。本明細書で使用される用語「治療有効用量」は、治療される疾患または障害の症状の緩和または改善を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって探求される、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を引き出すＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの量、すなわち、１つ以上の所望の生物学的または医学的応答の観察可能な値、例えば血糖、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールの値を低下させること；体重を減少させること；または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改良することを支援するＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの量を意味している。
【０１２９】
尚、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの治療有効用量も、所望の結果によって変えることができる。而して、例えば、低い血糖値を示す状況において、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの用量は、比較的低い血糖値が望まれる用量に比べて相応して多くなる。反対に、高い血糖値を示す状況において、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの用量は、比較的高い血糖値が望まれる用量に比べて相応して少なくなる。
【０１３０】
様々な実施形態において、被験体は、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドで治療することができる１００ｍｇ／ｄＬ以上の血糖値を有するヒトである。
【０１３１】
一つの実施形態において、本開示の方法は、被験体におけるブドウ糖、インスリン、コレステロール、脂質などの１つ以上の代謝関連化合物のベースライン値を最初に測定することを含む。次いで、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物を被験体に投与する。所望の期間の後、被験体において１種以上の代謝関連化合物（例えば、血糖、インスリン、コレステロール、脂質）の値を再度測定する。次いで、被験体における代謝関連化合物の相対的変化を測定するために、２つの値を比較することができる。その比較の結果に応じて、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物の別の用量を投与して、１種以上の代謝関連化合物の所望の値を得ることができる。
【０１３２】
尚、ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物は、別の化合物と共投与することができる。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドと共投与される化合物の同一性及び特性は、治療または改善される状態の性質に応じて決まる。ＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物と組み合わせて投与することができる化合物の例としては、ロシグリチゾン、ピオグリチゾン、レパグリニド、ナテグリチニド、メトホルミン、エクセナチド、スチアグリプチン、プラムリンチド、グリピジド、グリメプリリドアカルボース、及びミグリトールが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３３】
Ｖ．キット
開示する方法を実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、例えば本明細書記載の医薬組成物のような医薬組成物を含むことができ、本明細書で提供されるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含むベクター及び細胞、及びそのような核酸含有化合物を含む医薬組成物を含み、そしてそれらは無菌容器で提供することができる。任意には、代謝障害の治療で提供される医薬組成物を使用する方法に関する取扱説明書も、含むことができるか、または患者もしくは医療提供者に利用可能にすることができる。
【０１３４】
一つの態様では、キットは、（ａ）治療有効量のＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドまたはＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを含む医薬組成物、及び（ｂ）医薬組成物のための１つ以上の容器を含む。例えば、前記キットは、医薬組成物の投与を容易にする注射器または他のデバイスを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、キットで提供される注射器または他のデバイスは、医薬組成物（例えば、医薬組成物の１以上の用量がプレロードされている）を含んでいてもよい。そのようなキットは、その使用に関する取扱い説明書を含むこともでき；その取扱い説明書は、治療されるまさにその代謝障害に応じて作成することができる。取扱い説明書は、キットで提供される材料の使用及び性質を説明することができる。ある実施形態では、キットは、代謝障害、例えば高ブドウ糖値、高インスリン値、肥満、２型糖尿病、異常脂血症または糖尿病性腎症を治療するために投与を行う患者のための取扱説明書を含む。
【０１３５】
取扱説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷することができ、また、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素（例えば、包装関連）の表示内などに存在することができる。他の実施形態では、取扱説明書は、適当なコンピュータ読み取り可能保存媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子保存データファイルとして存在する。更に他の実施形態では、実際の取扱説明書はキット内に存在しないが、インターネット上などの遠隔発信源から取扱説明書を得る手段が提供される。この実施形態の例は、取扱説明書を閲覧することができ、かつ／または取扱説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。
【０１３６】
しばしば、キットの一部またはすべての構成要素を、無菌を維持するために適当な包装容器中にパッケージする。キットの構成要素を、単一の、取り扱いが容易なユニットを作製するためにキット格納要素にパッケージすることができ、この場合、キット格納要素、例えば、箱または類似の構造は、例えば、キットの構成要素の一部またはすべての無菌性を更に保存するために気密容器であってもよく、またはそうでなくてもよい。
【実施例】
【０１３７】
行った実験及び得られた結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供し、本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【０１３８】
実施例１
ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの調製
野生型ヒトＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチド（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドを、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローン化する。当該技術分野で公知であって通常利用されるＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して野生型ヒトＰＬＡ２Ｇ１２ＡポリペプチドをコードするＤＮＡに突然変異を起こさせる。
【０１３９】
要するに、設計された突然変異を含むプライマー対を、新規に合成されたＤＮＡ分子に組み込む。新規に合成された（突然変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ）コード配列を、コードタンパク質のＣ末端において、ヒトＦｃフラグメントをコードするポリヌクレオチドでタグ化する。親テンプレートをＤｐｎ  Ｉエンドヌクレアーゼで消化する。所望の突然変異（単数または複数）を含む切断ベクターＤＮＡを、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌中に形質転換する。突然変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａをコードするプラスミドを形質転換大腸菌から回収する。プラスミド中の突然変異（単数または複数）の存在を、ＤＮＡ塩基配列決定分析によって確認し、そして変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｆｃ構造物を、ＤＨＦＲベースのベクターセット及び既知組成培地を使用して、タンパク質を発現させるためにＣＨＯ細胞中に形質転換する。組換えＦｃ融合ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドを、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培地から単離する。産物（すなわち、発酵産物）は、前記培地に分泌された変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｆｃを有する振盪フラスコまたはバイオリアクター容器のいずれかにおいて、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の増殖に影響を与えることができる。
【０１４０】
Ｆｃ融合ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドの精製は、以下のようにして行う。典型的には、タンパク質の生成から４〜６日後に培養物を回収し、そして、粗上清を、振盪フラスコ及びバイオリアクターの産物それぞれに関する遠心分離または中空糸濾過を介して、細胞から単離する。次いで、その粗混合物を、直接に充填するか、または１０倍〜２０倍に濃縮し、そして２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．２、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のアジ化物で緩衝液交換を行ってから、モノクローナル抗体選択シュア樹脂（ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ｒｅｓｉｎ）（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上へ充填する。次いで、その樹脂を、同じ高塩濃度リン酸緩衝液（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で５〜１０回洗浄し、結合したタンパク質を３００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ３．４で溶出する。溶出した分画を、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０で中和する。９０％を超える全長タンパク質に対して、タンパク質Ａ親和性精製物質を富化させるために、高分解能疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のクロマトグラフィーを利用する。ｐＨ中和したプールを、充填済みのＢｉｏｓｕｉｔｅ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に対して直接に充填すると、切断片種の大半がカラムを通って流れ去り、全長タンパク質の大半がカラムに結合する。変異ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｆｃタンパク質を、１００％ミリ−ＱＨ２Ｏの直線勾配を介して溶出した。分画を、Ｎ末端配列（ＮＴＳ）を介して全長タンパク質の割合について分析し、その後、それらをプールした。次いで、ＨＩＣプールを濃縮し、移動相としてＰＢＳ、ｐＨ７．２、１０％グリセロール、５０μＭのＥＤＴＡを有する分離用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して更に精製した。必要に応じて、非凝集ＳＥＣ産物を、５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、アリコートにし、そして急速冷凍した。
【０１４１】
実施例２
マウスモデルにおけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａの発現
高脂肪食（Ｄ１２４９２ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、ニュージャージー州ニューブランズウィック）を給餌されたマウスの表現型に関するＡＡＶ媒介ＰＬＡＧ１２Ａ発現の効果を調べた。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドが過剰発現されたマウスを、特に、同等の摂食量にもかかわらず体重が維持されることについて観察した。前記マウスは、空ベクターを受容したマウスと比較して、改善された耐糖能、改善されたインスリン耐性及び低い血糖値を有する。
【０１４２】
研究デザイン。同齢の若い成熟マウス（５週齢）雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を惹起させるために６０％高脂肪食を給餌した。前記食餌を６週間給餌した後、マウスを、体重、ならびに空腹時の血糖値及びインスリン値に基づいて、２群（ｎ＝１０〜１２／群）に無作為に振り分けた。ＡＡＶウイルス粒子は、パッケージングし、次のように注射前に用量設定した：（ｉ）ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ及び（ｉｉ）ＡＡＶ空ベクター（対照）。動物には本研究終了まで高脂肪食を給餌した。注射後１５週間にわたって、体重、摂食量、除脂肪筋量及び体脂肪量の変化についてマウスをモニターした。
【０１４３】
体重。体重は、注射前及び注射後の両方で、本研究を通じて追跡した。図１に示すように、群の体重は、注射前は同等であった。ＡＡＶ８空ベクターの注射を受けている動物（対照動物）の体重は研究中に著しく増加したが、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａの注射を受けている動物（ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物）の体重は比較的一定のままであった。対照動物とＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物との間の体重差は、注射後すべての時点で統計的に有意であった。
【０１４４】
摂食量。摂食量は、本研究の間も追跡した。ＡＡＶ注射１１週間後から１２週間後の７日間、マウスケージに残っている食物の重量を計量することにより測定した。図２に示すように、動物のＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の摂食量は、対照動物の摂食量に比べて多かった。而して、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物で観察された低体重は、摂食量が減少したからではなかった。むしろ、対照動物に比べてより多量の食物を消費していながら、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物は、低体重を維持することができた。
【０１４５】
ブドウ糖。ブドウ糖値は、注射２日前、そして注射３週間後、５週間後及び７週間後に、４時間絶食させた動物から採取した血液サンプルで測定した。図３に示すように、群のブドウ糖濃度は、注射前は同等であった（ＡＡＶ８空ベクター（対照）動物のブドウ糖値に比べてＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物のブドウ糖値はわずかに高い）。注射３週間後、５週間後及び７週間後に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物のブドウ糖値は、ＡＡＶ８空ベクター（対照）動物のブドウ糖値に比べて著しく低下し、５週間後及び７週間後には統計的有意に達した。
【０１４６】
耐糖能。３つの経口ブトウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を、４時間絶食させた動物で、本研究中に行った。注射３週間後に、ブドウ糖（２ｇ／ｋｇ）の経口投与後６０分間にわたってブドウ糖値及びブドウ糖ＡＵＣにより示されているように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物の耐糖能は、対照動物で観察されるそれに比べて幾分良好だった。図４Ａを参照されたい。
【０１４７】
注射５週間後及び７週間後に、ブドウ糖（２ｇ／ｋｇ）の経口投与後６０分間にわたって、ブドウ糖値とブドウ糖ＡＵＣによって示されているように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物の耐糖能は、対照動物で観察されるそれに比べて著しく良好であった。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物及び対照動物に関するブドウ糖値の差は、２０、４０及び６０分の測定で統計的有意に達した。図４Ｂ及び４Ｃを参照されたい。
【０１４８】
インスリン耐性。インスリン耐性試験を、４時間絶食させた動物で、注射９週間後に行った。図５Ａに示すように、インスリン（１．３Ｕ／ｋｇ）の腹腔内注射後６０分間にわたって、ブドウ糖値とブドウ糖ＡＵＣによって示されているように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物におけるインスリン耐性は、対照動物で観察されるそれに比べて良好であった。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物及び対照動物に関するブドウ糖値の差は、２０、４０及び６０分の測定で統計的有意に達した。図５Ｂは、ベースラインからの％についてプロットしたブドウ糖値を示している。
【０１４９】
インスリン。インスリン値は、注射２日前、そして注射３週間後及び５週間後に、４時間絶食させた動物から採取した血液サンプルで測定した。図６に示すように、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物及び対照動物のインスリン値は、注射前では同等であった。注射３週間後及び５週間後に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物のインスリン値は著しく低下したが、対照動物のインスリン値は著しく上昇した。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物と対照動物のインスリン値の差は、３週間で、統計的有意に達した。
【０１５０】
トリグリセリド及びコレステロール。トリグリセリド値及び総コレステロール値は、５週間後に、４時間絶食させた動物から採取した血液サンプルで測定した。図７Ａに示すように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物におけるトリグリセリド値は、対照動物におけるそれに比べて有意に低かった。図７Ｂに示すように、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物におけるコレステロール値は、対照動物におけるそれに比べて幾分低かったが、その差は統計的有意に達しなかった。
【０１５１】
体脂肪量及び除脂肪量。注射８週間後、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａマウス及び対照マウスの体脂肪量及び除脂肪量を、非破壊性及び非侵襲的全身組成分析（ｍｉｎｉｓｐｅｃ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ビルリカ）を使用して測定した。図８Ａに示すように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物は、対照動物に比べて、有意に体脂肪量（ｇ）が少なかった。同様に、図８Ｂに示すように、脂肪量％（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｆａｔ）について、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物の体脂肪量は、対照動物に比べて、有意に低かった。
【０１５２】
図８Ｃに示すように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物の除脂肪量（ｇ）は、対照動物のそれに比べて低かったが、その差は統計的有意に達しなかった。図８Ｄに示すように、脂肪量％について、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物の体脂肪量は、対照動物に比べて、有意に低かった。
【０１５３】
結論
マウスにおけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａの過剰発現は、対照と比較して、特に、体重の維持（摂食量が増加したにもかかわらず）、改善された耐糖能、改善されたインスリン耐性、及び低い血糖値をもたらした。例えば治療量のＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドをそれを必要としている被験体に対して投与することによって、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ発現は、代謝プロフィールを改善し、またＰＬＡ２Ｇ１２Ａは、代謝障害、例えば２型糖尿病、高いブドウ糖値、高いインスリン値、肥満または糖尿病性腎症の治療または改善を強化し得ることをデータは示している。
【０１５４】
実施例３
マウスモデルにおけるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌの発現
高脂肪食（Ｄ１２４９２ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、ニュージャージー州ブランズウィック）を給餌されたマウスの表現型に関するＡＡＶ媒介ＰＬＡＧ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ発現の効果を調べた。ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌが過剰発現したマウスは、空ベクターを受容しているマウスと比較して、驚くべきことにＡＡＶ８−ＰＬＡＧ１２Ａを受容しているマウスと比較しても、特に、体重の減少、血糖の低下、及び耐糖能の改善が観察された。
【０１５５】
研究デザイン。同齢の若い成熟マウス（５週齢）雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、メイン州バーハーバー）に、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を惹起させるために６０％高脂肪食を給餌した。前記食餌を６週間給餌した後、マウスを、体重ならびに空腹時の血糖値及びインスリン値に基づいて３群（ｎ＝１０／群）に無作為に振り分けた。ＡＡＶウイルス粒子は、パッケージングし、次のように注射前に用量設定した：（ｉ）ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ、（ｉｉ）ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＡＶ空ベクター（対照）。動物には本研究終了まで高脂肪食を給餌した。また、体重変化についても動物をモニターした。
【０１５６】
体重。体重は、注射前及び注射後の両方で、本研究を通じて追跡した。図９に示すように、群の体重は、注射前は同等であった。注射４週間後、ＡＡＶ８空ベクター（対照動物）の注射を受けている動物の体重は、増加した。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａの注射を受けている動物の体重は、比較的一定のままであったが、対照動物のそれに比べて有意に低かった。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌの注射を受けている動物の体重は、減少し、対照動物のそれに比べて有意に低かった。更に、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物の体重は、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物に比べても減少しており、体重を低下させる場合に、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは、野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを超える優位性を示した。
【０１５７】
ブドウ糖。ブドウ糖値は、注射２日前、そして注射４週間後に、４時間絶食させた動物から採取した血液サンプルで測定した。図１０に示すように、群のブドウ糖値は、注射前は同等であった。注射４週間後、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物のブドウ糖値は、対照動物と比較して有意に減少した。更に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物のブドウ糖値は、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物に比べても減少しており、ブドウ糖値を低下させる場合、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを超える優位性を示した。
【０１５８】
耐糖能。３つの経口ブトウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を、４時間絶食させた動物で、本研究中に行った。注射４週間後に、ブドウ糖（２ｇ／ｋｇ）の経口投与後６０分間にわたって、ブドウ糖値とブドウ糖ＡＵＣによって示されているように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ群の動物の耐糖能は、対照動物で観察されるそれに比べて良好だったが、統計的有意に達しなかった。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物の耐糖能は、対照動物で観察されたそれに比べて、良好であり、２０、４０及び６０分の測定で統計的有意に達した。更に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物の耐糖能は、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物で観察されたそれに比べても良好であり、耐糖能を改善させる場合、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを超える優位性を示した。図１１を参照されたい。
【０１５９】
インスリン。インスリン値は、注射２日前、そして注射４週間後に、４時間絶食させた動物から採取した血液サンプルで測定した。図１２に示すように、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ、及びＡＡＶ８空ベクター（対照）動物のインスリン値は、注射前は同等であった（ＡＡＶ８−ＰＬ２Ｇ１２Ａ動物のインスリン値は、ＡＡＶ８空ベクター動物及びＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物に比べて、わずかに低い）。注射４週間後、対照動物のインスリン値は増加した。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物のインスリン値は、対照動物と比較して有意に減少した。ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物のインスリン値は、対照動物と比較して有意に減少した。更に、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌ動物のインスリン値は、ＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ動物と比べても減少しており、インスリン値を低下させる場合、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは野生型ＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドを超える優位性を示した。
【０１６０】
結論
マウスにおいて、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌの発現は、ＡＡＶ８空ベクターを受容している対照動物ならびにＡＡＶ８−ＰＬＡ２Ｇ１２Ａを受容している動物と比較すると、特に、体重の減少、血糖の低下、血清インスリンの低下、及び耐糖能の改善をもたらした。データは、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌの発現は、驚くべきことにＰＬＡ２Ｇ１２Ａポリペプチドの発現さえも凌駕して、代謝プロフィールを改善することを示している。而して、例えばＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌの治療量を、それを必要としている被験体に対して投与することによって、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ変異ポリペプチドであるＰＬＡ２Ｇ１２Ａ−Ｈ１１０Ｌは、例えば２型糖尿病、高いブドウ糖値、高いインスリン値、肥満または糖尿病性腎症のような代謝障害の治療または改善を強化することができる。
【０１６１】
個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別的に示されるかのように、本明細書記載のすべての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前記発明を、明確に理解するために図及び例として若干詳細に説明してきたが、添付のクレームの趣旨及び範囲から逸脱せずに、ある種の変更及び修正を本発明に対して成してもよいことは、本発明の教示を考慮すると、当業者には直ちに明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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