(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦のα／βグリアジン遺伝子において、配列番号３における１１４位チミンの有無及び配列番号６における４７位チミンの有無を検出することを含む、小麦の生地伸展性の判定方法。
【請求項２】
前記α／βグリアジン遺伝子に前記の塩基が存在していた場合に、前記小麦の生地伸展性は高いと判断される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下のプライマーセットを含む、小麦の生地伸展性の判定用のプライマーセット：
配列番号３の１１４位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド又はその相補鎖を含むプライマーセット、及び
配列番号６の４７位を５’末端又は３’末端とする配列番号６の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド又はその相補鎖を含むプライマーセット。
【請求項４】
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのプライマーセットと、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのプライマーセットを含む、請求項３記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項３又は４記載のプライマーセットを含む小麦の生地伸展性の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小麦の生地伸展性の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベーカリー食品や麺類などの小麦粉生地から製造される食品の品質は、小麦の生地物性に左右される。小麦の生地物性の中でも、生地の「締まり」（弾性）や「伸び」（伸展性）は、その小麦の製パン性や製麺性に大きな影響を与える。例えば、ベーカリー食品の場合、適度な弾性と伸展性がある生地は、生地中の空気や炭酸ガスを保持する気泡膜が薄く伸びるため、発酵により生地が大きく膨らみ高品質なパンになる。また、麺類の場合も同様に、生地の「締まり」（弾性）や「伸び」（伸展性）は、得られる麺類の食感を左右する。したがって、小麦の生地の弾性や伸展性を評価することは、小麦粉の二次加工性を推定する上で非常に重要である。
【０００３】
従来、小麦の製パンや製麺への適性は、実際に小麦を製粉し、得られた小麦粉からパンや麺を製造し、それを官能評価することにより判定されていた。しかし、この方法は、パンや麺を製造する手間がかかり、かつその製造のために多量の小麦粉を準備する必要がある。比較的少量の小麦粉で物性を評価する方法としては、生地の状態で、弾性についてはファリノグラフやミキソグラフ、伸展性についてはエクステンソグラフやアルベオグラフなどにかける方法が知られている。しかし、これらの方法においても、生地を調製するためにある程度の量の小麦粉を必要とするので、極少量の小麦粉しか手元にないとき、あるいは小麦粉がない（製粉していない）状態で物性を評価、推定することはできない。特に、育種選抜中の小麦では、生地物性の試験が求められる一方で、小規模栽培であるため製粉に十分な量の小麦種子を確保することは容易ではない。したがって、小麦粉生地を調製する必要なく、微量の小麦粉、製粉してない小麦種子やその胚乳の一部、又は芽や葉のような種子以外の組織から小麦の生地物性を評価することができる方法が求められている。
【０００４】
こうした問題を解決するため、これまでに、小麦の物性を評価するためのいくつかのＤＮＡマーカーが提案されている。例えば、非特許文献１には、高分子量グルテニンサブユニット５＋１０の遺伝子の有無をＰＣＲで判定することにより製パン性に優れた小麦を選別する方法が提案されている。また、特許文献１には、４２ｋＤａ低分子量グルテニンの遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを用いて強力小麦系統を選抜することが記載されている。しかし、これらの方法は、いずれも生地の弾性を評価する方法であり、生地の伸展性を評価することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2005-117979号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. Ahmad, 2000, Theor Appl Genet 101:892-896
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、小麦粉生地を調製する必要なく、小麦の生地伸展性を判定するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、小麦に含まれる生地伸展性に関わるグリアジンタンパク質の１つであるα／βグリアジンにおいて、生地の高伸展性に関連している遺伝子型を見出した。さらに本発明者らは、上記知見に基づき、小麦における当該高伸展性遺伝子型のα／βグリアジンの存在の有無を判定することで、その小麦の生地伸展性を推定、評価する方法を開発した。
【０００９】
すなわち、本発明は、小麦のα／βグリアジン遺伝子において、以下からなる群より選択される少なくとも１つの塩基の有無を検出することを含む、小麦の生地伸展性の判定方法を提供する。
配列番号１における、４４位チミン、１０６位アデニン、１５１位グアニン、１７９位チミン、２６８位アデニン、及び２７４位シトシン；
配列番号２における、５３位アデニン、及び８８位グアニン；
配列番号３における、１１４位チミン、１２４位シトシン、及び１３８位チミン；
配列番号４における、２０５位チミン；
配列番号５における、１４位チミン、５４位アデニン、９４位グアニン、１１１位シトシン、及び１３７位アデニン；ならびに、
配列番号６における、４７位チミン、及び６５位グアニン。
【００１０】
また本発明は、以下の（a）〜（t）からなる群より選択される、小麦の生地伸展性の判定用のプライマー又はプローブを提供する。
（a）配列番号１の４４位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（b）配列番号１の１０６位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（c）配列番号１の１５１位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（d）配列番号１の１７９位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（e）配列番号１の２６８位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（f）配列番号１の２７４位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（g）配列番号２の５３位を５’末端又は３’末端とする配列番号２の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（h）配列番号２の８８位を５’末端又は３’末端とする配列番号２の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（i）配列番号３の１１４位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（j）配列番号３の１２４位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（k）配列番号３の１３８位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（l）配列番号４の２０５位を５’末端又は３’末端とする配列番号４の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（m）配列番号５の１４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（n）配列番号５の５４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（o）配列番号５の９４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（p）配列番号５の１１１位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（q）配列番号５の１３７位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（r）配列番号６の４７位を５’末端又は３’末端とする配列番号６の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；
（s）配列番号６の６５位を５’末端又は３’末端とする配列番号６の部分配列からなる１０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチド；及び、
（t）上記（a）〜（s）の相補鎖からなるオリゴヌクレオチド。
【００１１】
また本発明は、上記プライマー又はプローブを含む小麦の生地伸展性の判定用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、製パン試験や製麺試験を行うことなく、又は生地を調製することなく、小麦の生地伸展性を迅速に判定することが可能となる。また本発明の方法では、小麦種子、胚乳の一部、ふすま、さらには芽や葉、茎のような種子以外の組織を被検体とすることができ、且つ少量の被検体があればよいので、微量の小麦粉しか使用できないか、又は小麦粉が全く準備できない状態でも、小麦の生地伸展性を正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】小麦α／βグリアジン遺伝子の塩基配列のアラインメント。グループ１−１〜１−３；生地伸展性が高い品種のみが持つα/βグリアジン遺伝子のうちグループ１に属するα／βグリアジン遺伝子、グループ２−１〜２−３；生地伸展性が高い品種のみが持つα/βグリアジン遺伝子のうちグループ２に属するα／βグリアジン遺伝子、グループＡ〜Ｇ；生地伸展性が高い品種及び高くない品種が持つグループ１及び２に属さないα／βグリアジン遺伝子。影を付けた領域はポリＱリッチ領域をコードする領域を表す。図中に、実施例１で用いたセットＡ及びセットＢのプライマーの結合部位を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２−１】α／βグリアジン遺伝子のドメイン１コード領域の塩基配列のアラインメント。四角で囲まれた塩基は、本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】α／βグリアジン遺伝子のドメイン２コード領域の塩基配列のアラインメント。四角で囲まれた塩基は、本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである。
【図４−１】α／βグリアジン遺伝子のドメイン３コード領域の塩基配列のアラインメント。四角で囲まれた塩基は、本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】実施例１で用いた被検体小麦品種のうち６種についての、α／βグリアジンＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の電気泳動図。左：セットＡプライマーによる増幅産物、右：セットＢプライマーによる増幅産物。矢印：α／βグリアジン遺伝子の増幅産物を示すバンド。１：分子量マーカー（ＯｎｅＳＴＥＰ  Ｌａｄｄｅｒ５０）、２：品種Ｃ、３：品種Ｅ、４：品種Ａ、５：品種Ｉ、６：品種Ｇ、７：品種Ｌ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「小麦」とは、イネ科コムギ属植物、例えばTriticum aestivum、Triticum compactum、Triticum durumなどである。
【００１５】
本明細書において、「小麦の生地伸展性」（又は単に「生地伸展性」）とは、小麦を製粉して得られた小麦粉から調製した生地の伸展性値、例えば、コンシストグラフのＥｘ値の大小のことである。コンシストグラフのＥｘ値とは、アルベオコンシストグラフ（例えばショパン社製）にて、硬さが２２００ｍｂ（水分１５％ベース時）である生地が、測定開始から破裂するまでの横座標の平均値のことである（Ｔｈｅ  ＡｌｖｅｏＣｏｎｓｉｓｔｏｇｒａｐｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＡＣＣインターナショナル）。例えば、「小麦の生地伸展性が高い」又は「生地伸展性が高い小麦」とは、その小麦はＥｘ値の高い、例えばＥｘ値７０以上、好ましくは７５以上の生地になることを意味し、一方、「小麦の生地伸展性が低い（又は高くない）」又は「生地伸展性が低い（又は高くない）小麦」とは、その小麦はＥｘ値の低い（又は高くない）、例えばＥｘ値７０未満、好ましくは６５未満の生地になることを意味する。
【００１６】
グリアジンは小麦貯蔵タンパク質の１つであり、グルテニンとともにグルテンを形成するタンパク質である。グリアジンはグルテンの弾性と伸展性に影響を与え、またグルテンの性質は小麦の二次加工性に強い影響を与える。グリアジンは、大きくα、β、γ、ωの４タイプに分類され、α／βグリアジン、γグリアジン、ωグリアジン等の種類が知られている。グリアジンは多重遺伝子ファミリーであり、また小麦のゲノムは倍数体であるため、小麦のゲノムは通常、複数種のα／βグリアジン遺伝子を有している。
【００１７】
α／βグリアジンのアミノ酸配列中には、グルタミン残基が連続して出現するポリグルタミンリッチな領域（以下、「ポリＱリッチ領域」という；図１−１〜図１−３の影を付けた部分にコードされる領域）が２か所存在し、これらポリＱリッチ領域により分けられた３つの領域が存在する。本明細書においては、このα／βグリアジンのアミノ酸配列上の３つの領域を、それぞれドメイン１、２及び３と称する。ドメイン１は、α／βグリアジンのアミノ酸配列のＮ末端から第１のポリＱリッチ領域のＮ末端の前までの領域をいい、ドメイン２は、第１及び第２のポリＱリッチ領域の間の領域をいい、ドメイン３は、第２のポリＱリッチ領域のＣ末端の後ろからα／βグリアジンのアミノ酸配列のＣ末端までの領域をいう。上記ドメイン１、２、３はいずれも保存性の高い領域であり、小麦に含まれる複数種のα／βグリアジンの間で、ドメイン１同士、ドメイン２同士、ドメイン３同士は、互いにアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列間の相同性は高い。
【００１８】
その一方で、上記ドメイン１、２、３をコードする遺伝子には多型が存在する。そしてそれらの多型の中には、小麦の生地伸展性と相関のあるものがある。本発明において、生地伸展性の高い小麦に特徴的な２種類のα／βグリアジン遺伝子型が初めて明らかとなった。なお、この生地伸展性の高い小麦に特徴的な２種類のα/βグリアジン遺伝子群を、便宜上、それぞれグループ１及びグループ２と称する。
【００１９】
生地伸展性が高いある小麦品種が有するα／βグリアジン遺伝子の塩基配列のアラインメントを図１−１〜図４−２に示す。図１−１〜図１−３では、生地伸展性が高い品種のみが持つα/βグリアジン遺伝子のうちグループ１に属するα／βグリアジン遺伝子の全塩基配列（グループ１−１；配列番号１１）に対して、グループ１に属する別のα／βグリアジン遺伝子の全塩基配列（グループ１−２〜１−３；配列番号１２〜１３）、同じく生地伸展性が高い品種のみが持つα/βグリアジン遺伝子のうちグループ２に属するα／βグリアジン遺伝子の全塩基配列（グループ２−１〜２−３；配列番号１４〜１６）、ならびに生地伸展性が高い品種及び高くない品種が持つ、すなわち生地伸展性が高い品種及び高くない品種のいずれにも見出される、グループ１及び２に属さないα／βグリアジン遺伝子の全塩基配列（グループＡ〜Ｇ；配列番号１７〜２３）がアラインメントされている。影を付けた部分はポリＱリッチ領域である。
【００２０】
なお、配列のアラインメントは、目的配列と参照配列とを最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させる手順であり、詳細な手順は当業者に公知である。アラインメントは公知のアルゴリズムを用いて実行することができる。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）等を用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２１】
図２−１〜図４−２は、図１−１〜図１−３に示したα／βグリアジン遺伝子の塩基配列について、ドメイン１〜３をコードする領域ごとに別々にアラインメントを実行した例である。図２−１〜図４−２に示すように、ドメイン１、２、３をコードする遺伝子領域の配列中に、生地伸展性の高い小麦に特徴的に存在する一群の一塩基多型（図中の四角で囲まれた塩基）があることが見出された。さらに、当該塩基の存在を指標に小麦をスクリーニングすることにより、生地伸展性の高い小麦と高くない小麦とを選別することができた。したがって、それらの塩基は、小麦の生地伸展性の判定用のマーカーとして用いることができ、また、当該マーカーを指標に小麦の生地伸展性を判定することができる。
【００２２】
代表的な例において、生地伸展性の高い小麦に特徴的に存在するα／βグリアジン遺伝子型のうち、グループ１に属するものは、配列番号１で示される塩基配列からなるドメイン１をコードする領域と、配列番号２で示される塩基配列からなるドメイン２をコードする領域と、配列番号３で示される塩基配列からなるドメイン３をコードする領域とを含む。配列番号１、２及び３で示される塩基配列中において、以下の塩基は、生地伸展性の高い小麦に特異的に検出される：
配列番号１における、４４位チミン、１０６位アデニン、１５１位グアニン、１７９位チミン、２６８位アデニン、及び２７４位シトシン；
配列番号２における、５３位アデニン、及び８８位グアニン；ならびに
配列番号３における、１１４位チミン、１２４位シトシン、及び１３８位チミン；
これらの塩基は、小麦の生地伸展性の判定用マーカーとして使用することができる。
【００２３】
別の代表的な例において、生地伸展性の高い小麦に特徴的に存在するα／βグリアジン遺伝子型のうち、グループ２に属するものは、配列番号４で示される塩基配列からなるドメイン１をコードする領域と、配列番号５で示される塩基配列からなるドメイン２をコードする領域と、配列番号６で示される塩基配列からなるドメイン３をコードする領域とを含む。配列番号４、５及び６で示される塩基配列において、以下の塩基は、生地伸展性の高い小麦に特異的に検出される：
配列番号４における、２０５位チミン；
配列番号５における、１４位チミン、５４位アデニン、９４位グアニン、１１１位シトシン、及び１３７位アデニン；ならびに
配列番号６における、４７位チミン、及び６５位グアニン；
これらの塩基は、小麦の生地伸展性の判定用マーカーとして使用することができる。
【００２４】
なお、配列番号１〜３の塩基配列は、グループ１−１のα／βグリアジン遺伝子のドメイン１〜３をコードする塩基配列であり、配列番号４〜６の塩基配列は、グループ２−１のα／βグリアジン遺伝子のドメイン１〜３をコードする塩基配列である。
【００２５】
上記本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカー（以下、本発明のマーカーともいう）を指標に、小麦の生地伸展性を判定することができる。すなわち、生地伸展性を調べたい小麦に含まれるα／βグリアジンの遺伝子の塩基配列中における本発明のマーカーの有無を検出し、当該マーカーが存在していれば、当該小麦は生地伸展性が高いと判断される。
【００２６】
したがって、本発明は、小麦のα／βグリアジン遺伝子において、本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである塩基の有無を検出することを含む、小麦の生地伸展性の判定方法を提供する。当該方法においては、当該α／βグリアジン遺伝子に本発明のマーカーである塩基が存在していれば、当該小麦の生地伸展性は高いと判断される。
【００２７】
また、図２−１〜図４−２に示すとおり、生地伸展性の高い小麦に特徴的なα／βグリアジン遺伝子はいずれも、上述した配列番号１〜３中の生地伸展性の判定用マーカーの全部を有するか、又は上述した配列番号４〜６中の生地伸展性の判定用マーカーの全部を有する。一方で、生地伸展性の高くない小麦には、当該マーカーは１つも存在していない。したがって、本発明の方法において小麦の生地伸展性を判定する場合、上記に挙げた配列番号１〜３中の本発明のマーカー塩基、又は配列番号４〜６中の本発明のマーカー塩基を全部検出してもよいが、いずれか１つを検出すれば足りる。言い換えれば、α／βグリアジン遺伝子の塩基配列上で、上記に挙げた本発明のマーカー塩基のうちの少なくとも１つの塩基が検出できれば、該α／βグリアジン遺伝子を有する小麦は生地伸展性が高いと判断することができる。
【００２８】
好ましくは、α／βグリアジン遺伝子の塩基配列上で、上記に挙げた配列番号１〜３中のマーカー塩基のうちの少なくとも１つの塩基、ならびに上記に挙げた配列番号４〜６中のマーカー塩基のうちの少なくとも１つの塩基がともに検出できれば、該α／βグリアジン遺伝子を有する小麦は生地伸展性が高いと判断することができる。
【００２９】
上記本発明の方法においては、生地伸展性を調べたい小麦から調製した小麦試料に含まれるα／βグリアジン遺伝子における、本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーの存在を検出する。当該「小麦試料」としては、生地伸展性を調べたい小麦の植物体のいずれかの組織、例えば、種子、胚乳、ふすま、葉、茎、根、芽、花などを挙げることができ、あるいは小麦粉（全粒粉を含む）又はその加工品も使用可能である。
【００３０】
本発明のマーカーの検出には、遺伝子上の特定の塩基又は塩基配列の検出に用いられる任意の手段を使用することができる。例えば、小麦試料から核酸を調製した後、α／βグリアジン遺伝子配列中の目的の位置の塩基を同定すればよい。小麦試料からの核酸の抽出は常法に従って行うことができ、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出してもよく、ＲＮＡを抽出してもよく、又はＲＮＡからｃＤＮＡを調製してもよい。ＤＮＡやＲＮＡの抽出、及びｃＤＮＡの調製には、市販のキットをそのプロトコルに従って使用すればよい。α／βグリアジン遺伝子配列中の塩基を同定する方法は特に限定されず、配列決定や遺伝子多型の検出のために一般的に用いられている方法を採用することができる。
【００３１】
本発明の方法の一実施形態においては、ＰＣＲ（通常のＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法を含む）、又はインベーダー法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法（例えば特開２００２−３６９７００号公報）等により本発明のマーカー塩基を含む領域を検出することで、小麦試料中における本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである塩基の有無を調べる。本発明のマーカーの塩基が存在していた場合、当該小麦試料は生地伸展性が高い小麦の試料であると判定される。
【００３２】
ＰＣＲは常法に従って行えばよく、例えば、小麦試料から抽出した核酸を鋳型にして、これを本発明のマーカー塩基を含む領域に選択的に結合するように設計したプライマーを用いて増幅させる。ＰＣＲの後は、電気泳動等の手段により、本発明のマーカー塩基を含む目的の増幅産物が得られたか否かを調べればよい。電気泳動法の手順には特に制限はなく、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法など、通常行われる方法を用いればよい。あるいは、リアルタイムＰＣＲにより、本発明のマーカー塩基を含む目的の増幅産物の増幅を直接測定してもよい。目的の増幅断片が得られた場合には、当該小麦試料は生地伸展性が高い小麦の試料であると判定される。
【００３３】
本発明のマーカー塩基を検出するためのＰＣＲ、又はＩｎｖａｄｅｒ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法に使用されるプライマー又はプローブとしては、配列番号１〜６で示される塩基配列の部分配列であって、本発明のマーカー塩基を含む部分配列からなるオリゴヌクレオチド、又はその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法に使用される好ましいプローブ又はプライマーとしては、以下が挙げられる：
（a）配列番号１の４４位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（b）配列番号１の１０６位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（c）配列番号１の１５１位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（d）配列番号１の１７９位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（e）配列番号１の２６８位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（f）配列番号１の２７４位を５’末端又は３’末端とする配列番号１の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（g）配列番号２の５３位を５’末端又は３’末端とする配列番号２の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（h）配列番号２の８８位を５’末端又は３’末端とする配列番号２の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（i）配列番号３の１１４位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（j）配列番号３の１２４位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（k）配列番号３の１３８位を５’末端又は３’末端とする配列番号３の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（l）配列番号４の２０５位を５’末端又は３’末端とする配列番号４の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（m）配列番号５の１４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（n）配列番号５の５４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（o）配列番号５の９４位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（p）配列番号５の１１１位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（q）配列番号５の１３７位を５’末端又は３’末端とする配列番号５の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（r）配列番号６の４７位を５’末端又は３’末端とする配列番号６の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（s）配列番号６の６５位を５’末端又は３’末端とする配列番号６の部分配列からなるオリゴヌクレオチド；
（t）上記（a）〜（s）の相補鎖からなるオリゴヌクレオチド。
【００３５】
さらに、上記（a）〜（s）のオリゴヌクレオチドから１〜数個（例えば１〜３個）の塩基が置換、挿入、削除、又は付加されたオリゴヌクレオチドであって、ただしその５’末端又は３’末端に上記（a）〜（s）で述べた本発明のマーカー塩基を有するオリゴヌクレオチド、又はその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法で本発明のマーカー塩基の検出に用いることができるプローブ又はプライマーである。
【００３６】
上記プライマーを含むＰＣＲ用のプライマーセットは、一方が上記（a）〜（t）のオリゴヌクレオチドである１組のプライマーである。
【００３７】
具体的なＰＣＲ用プライマーセットの例としては、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、及び配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせが挙げられる。
【００３８】
本発明の方法の別の実施形態においては、シークエンシング（通常のシークエンシング、パイロシークエンシング、ＲＮＡダイレクトシークエンシングを含む）、一塩基伸長法等により小麦試料中のα／βグリアジンの塩基配列又は塩基を直接決定し、配列中の塩基を調べることで、小麦試料中における本発明の小麦の生地伸展性の判定用マーカーである塩基の有無を検出する。本発明のマーカーの塩基が存在していた場合、当該小麦試料は生地伸展性が高い小麦の試料であると判定される。
【００３９】
上記シークエンシングに使用されるプライマーとしては、配列番号１〜６で示される塩基配列の部分配列であって、本発明のマーカーである塩基の５’側に結合するオリゴヌクレオチドからなるか、又は当該塩基の３’側に結合するオリゴヌクレオチドの相補鎖からなり、かつ各小麦品種において保存されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
上記一塩基伸長法に使用されるプライマーとしては、配列番号１〜６で示される塩基配列の部分配列であって、本発明のマーカーである塩基の１塩基上流を３’末端とするオリゴヌクレオチド、又は当該塩基の１塩基下流を５’末端とするオリゴヌクレオチドの相補鎖からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４１】
上記本発明で使用されるプライマー又はプローブの鎖長は、通常は１０〜４０塩基長、好ましくは１５〜３５塩基長、例えば１５〜２５塩基長である。
【００４２】
上述した本発明により提供されるプライマー及びプローブは、小麦の生地伸展性の判定用のプライマー及びプローブである。また本発明は、当該小麦の生地伸展性の判定用のプライマー又はプローブを含む小麦の生地伸展性の判定用キットを提供する。当該キットは、ＰＣＲ法（通常のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲを含む）、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法、シークエンシング（通常のシークエンシング、パイロシークエンシング、ＲＮＡダイレクトシークエンシングを含む）、一塩基伸長法等を行うためのキットであり得る。
【００４３】
小麦のα／βグリアジンのドメイン１〜３は、上述したように保存性の高い領域であるが、その遺伝子には、本発明のマーカー塩基以外にもある程度の塩基の多型や変異が存在することがある。すなわち、小麦中のα／βグリアジンのドメイン１〜３をコードする塩基配列は、例えば図１−１〜図４−２に示すように、配列番号１〜６に対して塩基の一部が異なっていることがある。そのような場合でも、本発明の方法によれば、上述した手順で本発明のマーカーを利用して、小麦の生地伸展性を判定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（参考例１）試料となる被検体小麦の小麦粉生地の伸展性の測定試験
国内産の小麦品種のうち、硬質小麦３品種（品種Ａ〜Ｃ）、及び軟質小麦１１品種（品種Ｄ〜Ｎ）の計１４品種の小麦種子をサンプルとした。小麦種子１４品種をＡＡＣＣ公定法２６−２１に従ってビューラー・テストミルにより粉砕し、６０％粉を作製した。次に、Ｔｈｅ  ＡｌｖｅｏＣｏｎｓｉｓｔｏｇｒａｐｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＡＡＣＣインターナショナル）に従って、６０％粉から調整した生地のコンシストグラフのＥｘ値を測定した。すなわち、各サンプルの生地の硬さが２２００ｍｂ（水分１５％ベース時）となるような吸水量を算出し、アルベオコンシストグラフ（ショパン社製）にて、算出した量の２．５質量％食塩水、及び指定された量の６０％粉をミキサーに投入し、Ｅｘ値を測定した。各サンプルについて２〜４回測定を行い、その平均値を採用した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒによる有意差検定を行った（有意水準５％）。
【００４６】
結果を表１に示す。なお、表１における有意差は、全データに対してＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重検定を行った結果であり、ａ〜ｈのアルファベットは有意差検定で、アルファベットが同じサンプルはその間で有意差が無く、異なる場合は有意差があることを示している。表１に示すとおり、硬質小麦２品種（「品種Ｃ」、「品種Ｂ」）、及び軟質小麦３品種（「品種Ｅ」、「品種Ｆ」、「品種Ｎ」）から得られた小麦粉生地のＥｘ値は、それ以外の品種から得られた小麦粉生地のＥｘ値よりも有意に大きかった。これらの結果から、硬質小麦２品種（「品種Ｃ」、「品種Ｂ」）、及び軟質小麦３品種（「品種Ｅ」、「品種Ｆ」、「品種Ｎ」）はＥｘ値が高く、故に生地伸展性が高い小麦であり、それ以外の品種はＥｘ値が低く、故に生地伸展性が低い（又は高くない）小麦であることが示された。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
（実施例１）ＰＣＲ増幅に基づく小麦の生地伸展性の判定
上記の１４品種の小麦種子をマルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕後、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ  １μＬ（２０ｎｇ／μＬ）、０．１μＬ（０．５Ｕ）のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．３μｌの１０μＭ各プライマー、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、水（残余）を添加した１０μＬの反応系でＰＣＲを行った。
ＰＣＲプライマーは、表２記載のものを用いた。フォワードプライマーは本発明のマーカーを含まない共通配列部分に設計し、セットＡでは配列番号２で示されるドメイン２のコード領域中に、セットＢでは配列番号５で示されるドメイン２のコード領域に対して設計した。リバースプライマーは、セットＡでは配列番号３で示されるドメイン３のコード領域の塩基配列の第１１４位のチミンが、セットＢでは配列番号６で示されるドメイン３のコード領域の塩基配列の第４７位のチミンが３’末端になるように設計した（図１−２参照）。
ＰＣＲは、９５℃で１０分間変性後、９５℃で１５秒、各アニーリング温度で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクルまわした。アニーリング温度はセットＡで６２℃、セットＢで６６℃に設定した。ＰＣＲ反応溶液の全量を２％アガロースゲルにて電気泳動し、ＥｔＢｒ溶液で染色後、ＵＶでバンドを検出した。アガロースゲル電気泳動でバンドが検出された場合、ＰＣＲ増幅あり（＋）と判定した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
電気泳動の結果の一部を図５に、被検体小麦１４品種のＰＣＲ増幅の結果及び小麦粉生地の伸展性の測定試験の結果を表３に示す。セットＡ及びセットＢのプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅産物が得られた小麦品種は、いずれもＥｘ値が高かった。一方で、Ｅｘ値の低い小麦品種では、どちらのプライマーセットを用いた場合でもＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
（実施例２）品種未判別小麦における生地伸展性の予測
生地伸展性の大小が不明である小麦３品種（未判定品種Ｏ〜Ｑ）について、実施例１と同様の手順で、種子からＤＮＡを抽出してＰＣＲにかけ、増幅産物の有無から生地伸展性を評価した。次いで、それらの小麦品種について、参考例１と同様の手順で生地伸展性Ｅｘ値の確認試験を行った。
【００５３】
ＰＣＲの結果、表４に示すとおり、セットＡ及びセットＢのプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅産物が得られた未判別品種Ｐは、生地伸展性の高い小麦と予測され、一方、ＰＣＲ増幅産物が得られなかった未判別品種Ｏ及びＱは、生地伸展性の低い小麦と予測された。ＰＣＲに基づくこれらの伸展性予測は、実際に測定されたＥｘ値の結果と一致していた。
【００５４】
【表４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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