(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタのマイコプラズマ属菌種感染を予防するための組成物であって、
配列番号:02の配列を有する、Tufを含む第一の活性成分を含む、前記組成物。
【請求項２】
さらに、P46及び／又は第二の活性成分を含み、該第二の活性成分がMHP30、NrdFC、又はその組み合わせのタンパク質を含み、P46が配列番号:01の配列を有し、MHP30が配列番号:03の配列を有し、NrdFCが配列番号:04の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第一の活性成分及び/又は前記第二の活性成分が、前記組成物の全体積を基準にしてそれぞれ独立して20〜2000μg/mLの濃度である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらに医薬的に許容できるアジュバントを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を製造する方法であって、
プラスミドを含む発現ベクターを使用して、可溶性抗原を調製する工程を含み、前記抗原がTufを含み、
前記プラスミドは、
配列番号:06の配列を含むヌクレオチド；
大腸菌のMsyBである融合パートナーをコードする遺伝子；及び
プロモーター及びリボソーム結合部位を含む調節エレメント
を含む、前記方法。
【請求項６】
請求項２に記載の組成物を製造する方法であって、
プラスミドを含む発現ベクターを使用して、可溶性抗原を調製する工程を含み、前記抗原がP46、Tuf、MHP30、及び、NrdFCから選択され、
前記プラスミドは、
配列番号:05、配列番号:06、配列番号:07、及び配列番号:08から成る群から選択される少なくとも1つの配列を含むヌクレオチド；
大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、大腸菌のGroS17、枯草菌のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウスのTrxA、S.セレビシアエのSUMO、及びビトレオシラ属菌種のVgbから成る群から選択される融合パートナーをコードする遺伝子；及び
プロモーター及びリボソーム結合部位を含む調節エレメント
を含み、
前記ヌクレオチド配列が、配列番号:05、配列番号:06、及び配列番号:08から成る群から選択される少なくとも1つの配列であるときは、融合パートナーをコードする遺伝子は大腸菌のMsyBであることを条件とし、
前記ヌクレオチド配列が配列番号:07であるときは、融合パートナーをコードする遺伝子は、大腸菌のYjgD、大腸菌のGroS17、枯草菌のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウスのTrxA、S.セレビシアエのSUMO、及びビトレオシラ属菌種のVgbから成る群から選択されることを条件とする、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、マイコプラズマ属菌種（Mycoplasma spp.）に対するワクチン、特にマイコプラズマ属菌種に対するサブユニットワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ属菌種は、宿主細胞外で自己複製できる、これまでのところ知られている最小の細菌である。ブタ地域性（enzootic）肺炎はブタを死に至らしめることはないが、飼料効率を低下させ、発育遅延、炎症及び免疫抑制を引き起こすだけでなく、他の病原体に感染しやすくし、したがって前記は当該産業における経済的損害となろう。
これまでのところ、ブタ地域性肺炎は、医薬の投与、環境の管理、及びワクチン接種を含む3つの主要な手法によって予防される。マイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ（Mycoplasma hyopneumoniae）に対する抗生物質の貧弱な予防効率を見れば、医薬の投与は治療目的のために用いることができ、予防の要件をほとんど満たさない。さらにまた、薬剤の濫用が薬剤耐性菌によるより大きな感染をもたらし得ることを考慮すれば、医薬の投与は慎重な計画を必要とし、多くの制限が存在する。
環境の管理はマイコプラズマ属菌種感染の予防の基礎である。良好な豚舎衛生設備及び管理は感染の発生減少に有用であろう。他方、予防はワクチン接種によってより広範となり得る。
野外の常套的ワクチンはその活性成分として不活化菌/死菌を使用する。しかしながら、マイコプラズマ属菌種はえり好みの厳しい細菌であり、実験室での培養が困難であるために当該常套的ワクチンの価格は高すぎる。マイコプラズマ属菌種ワクチンのコストを削減するために、研究者は種々のタイプのワクチン（例えば（1）弱毒ワクチン、（2）ベクターワクチン、（3）サブユニットワクチン、及び（4）DNAワクチン）の開発を試み続けている。それらの中で、とりわけサブユニットワクチンは、製造の容易さ及び高い安全性という利点によりもっとも高い潜在能力を有する。
今日まで、M.ヒオプニューモニアエワクチンに用い得るいくつかの潜在的候補タンパク質が存在するが、M.ヒオプニューモニアエワクチンに適切なタンパク質を立証する更なる報告はない。
【発明の概要】
【０００３】
上記を勘案して、本発明の目的の1つは、マイコプラズマ属菌種ワクチンで用いるために適切な抗原を提供し、それによって予防コストを軽減できる新規なマイコプラズマ属菌種ワクチンを製造することである。
本発明の別の目的は、マイコプラズマ属菌種ワクチンで用いるために適切な抗原の組合せを提供し、それによってより良好な成果を示すサブユニットワクチンを提供することである（したがって予防という課題のためにより多くの選択肢があり得よう）。
上述の目的を達成するために、本発明は、マイコプラズマ属菌種感染を予防するためのタンパク質を提供し、前記タンパク質は、配列番号:01、配列番号:02、又はその組み合わせのアミノ酸配列を含む。
本発明はまたマイコプラズマ属菌種感染を予防するための組成物を提供し、前記組成物は、第一の活性成分（P46、Tuf、又はその組み合わせのタンパク質を含む）及び医薬的に許容できるアジュバントを含む。
好ましくは、前記第一の活性成分は、配列番号:01、配列番号:02、又はその組み合わせのアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記組成物はさらに第二の活性成分を含み、前記第二の活性成分はMHP30、NrdFC、又はその組み合わせのタンパク質を含む。
好ましくは、前記第二の活性成分は配列番号:03、配列番号:04、又はその組み合わせのアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記第一の活性成分及び/又は前記第二の活性成分は、前記組成物の全体積を基準にしてそれぞれ独立して20から2000μg/mLの濃度である。
好ましくは、前記医薬的に許容できるアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、多価陰イオンアジュバント、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである。
好ましくは、前記組成物はさらに医薬的に許容できる添加物を含む。
好ましくは、前記医薬的に許容できる添加物は、溶剤、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、又はそれらの組合せである。
【０００４】
本発明はさらにマイコプラズマ属菌種感染を予防するための組成物を提供し、前記組成物は、P46、Tuf、MHP30、及びNrdFCから成る群から選択される少なくとも2つのタンパク質を有する活性成分、並びに医薬的に許容できるアジュバントを含む。
好ましくは、前記活性成分はP46、Tuf、MHP30、及びNrdFCである。
好ましくは、前記活性成分は、配列番号:01、配列番号:02、配列番号:03、及び配列番号:04から成る群から選択される少なくとも2つのアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記活性成分は配列番号:01、配列番号:02、配列番号:03、及び配列番号:04のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記活性成分は、前記組成物の全体積を基準にして20から2000μg/mLの濃度である。
好ましくは、前記医薬的に許容できるアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、多価陰イオンアジュバント、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである。
好ましくは、前記組成物はさらに医薬的に許容できる添加物を含む。
好ましくは、前記医薬的に許容できる添加物は、溶剤、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、又はそれらの組合せである。
【０００５】
本発明はまた、上述の活性成分を調製する発現ベクターを提供し、ここで前記発現ベクターはプラスミドを含み、前記プラスミドは以下を含む：配列番号:05、配列番号:06、配列番号:07、及び配列番号:08から成る群から選択される少なくとも1つの配列を含むヌクレオチド；大腸菌（E. coli）のMsyB、大腸菌のYjgD、大腸菌のGroS17、枯草菌（Bacillus subtilis）のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）のTrxA、S.セレビシアエ（S. cerevisiae）のSUMO、及びビトレオシラ属菌種（Vitreosclla spp.）のVgbから成る群から選択される融合パートナーをコードする遺伝子；並びに調節エレメント。
好ましくは、前記調節エレメントはプロモーター及びリボソーム結合部位を含む。
好ましくは、前記プラスミドは、pET-MSY、pET-YjgD、pET-GroS17、pET-GroES、pET-TrxA、pET-SUMO、又はpET-Vgbである。
好ましくは、前記発現ベクターに関しては、前記ヌクレオチド配列が、配列番号:05、配列番号:06、及び配列番号:08から成る群から選択される少なくとも1つの配列であるときは、前記融合パートナーコード遺伝子は大腸菌のMsyBであることを条件とする。
好ましくは、前記発現ベクターに関しては、前記ヌクレオチド配列が配列番号:07であるときは、融合パートナーをコードする前記遺伝子は、大腸菌のYjgD、大腸菌のGroS17、枯草菌のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウスのTrxA、S.セレビシアエのSUMO、及びビトレオシラ属菌種のVgbから成る群から選択されることを条件とする。
好ましくは、前記発現ベクターは大腸菌遺伝子発現系に使用するために適用される。
【０００６】
本発明はさらに、上述の発現ベクターを使用する工程を含む可溶性抗原の調製方法を提供し、ここで前記抗原はP46、Tuf、MHP30、又はNrdFCである。
要約すれば、本発明は、マイコプラズマ属菌種感染を予防するために、抗原、組成物、及び前記抗原を調製するための発現ベクターに関する。本開示は予防という課題のために新規な選択肢を提供するだけでなく、少なくとも2つの抗原を組み合せた（すなわち活性成分として少なくとも2つの抗原を有する）“カクテル”サブユニットワクチンは免疫誘発を強化できるということを立証する。さらにまた、本発明は、ある発現系で上述の抗原の発現を補助するために特に適切であり、したがって所望のワクチン調製のための製造能力の増強に有利であり得るいくつかの融合パートナーを教示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1はタンパク質の電気泳動の結果であり、調製されたMHP30の可溶性に対して多様な融合パートナーが種々の影響を有することを示す。ラインM：タンパク質マーカー（PageRulerTMの付属タンパク質ラダー；Fermentas, USA）；ライン1：大腸菌BL21（DE3）（pET-YjgD-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン2：大腸菌BL21（DE3）（pET-SUMO-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン3：大腸菌BL21（DE3）（pET-GroS17-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン4：大腸菌BL21（DE3）（pET-GroES-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン5：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン6：大腸菌BL21（DE3）（pET-MsyB-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン7：大腸菌BL21（DE3）（pET-Vgb-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン8：大腸菌BL21（DE3）（pET-TrxA-MHP30）、可溶性タンパク質。
【図２】図2はタンパク質の電気泳動の結果であり、調製されたP46、NrdFC、及びTufの可溶性に対して多様な融合パートナーが種々の影響を有することを示す。ラインM：タンパク質マーカー（PageRulerTMの付属タンパク質ラダー；Fermentas, USA）；ライン1：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-P46M）、可溶性タンパク質；ライン2：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-P46M）、不溶性タンパク質；ライン3：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-NrdFC）、可溶性タンパク質；ライン4：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-NrdFC）、不溶性タンパク質；ライン5：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-Tuf）、可溶性タンパク質；ライン6：大腸菌BL21（DE3）（pET-D-Tuf）、不溶性タンパク質；ライン7：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-P46M）、可溶性タンパク質；ライン8：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-P46M）、不溶性タンパク質；ライン9：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-NrdFC）、可溶性タンパク質；ライン10：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-NrdFC）、不溶性タンパク質；ライン11：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-Tuf）、可溶性タンパク質；ライン12：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-Tuf）、不溶性タンパク質。
【図３】図3はタンパク質の電気泳動の結果であり、本発明の組換えプロテイオンMHP30、P46、NrdFC、及びTufの精製を示す。ラインM：タンパク質マーカー（PageRulerTMの付属タンパク質ラダー；Fermentas, USA）；ライン1：大腸菌BL21（DE3）（pET-YjgD-MHP30）、可溶性タンパク質；ライン2：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-P46M）、可溶性タンパク質；ライン3：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-NrdFC）、可溶性タンパク質；ライン4：大腸菌BL21（DE3）（pET-MysB-Tuf）、可溶性タンパク質；ライン5：精製MHP30融合タンパク質；ライン6：精製P46融合タンパク質；ライン7：精製NrdFC 融合タンパク質；ライン8：精製Tuf融合タンパク質。
【図４】図4はウェスタンブロットアッセイの結果であり、マウス抗血清がM.ヒオプニューモニアエの全細胞溶解物を識別することを示す。
【図５】図5はELISAアッセイの結果であり、本発明の実施例7で実行した免疫チャレンジ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、マイコプラズマ属菌種感染を予防するための抗原、組成物、及び前記抗原を調製するための発現ベクターに関する。とりわけ、本発明は、マイコプラズマ属菌種感染を予防する組成物の調製に要するP46及びTufの抗原性効果を立証する。さらにまた、本発明はまた、活性成分としてP46、Tuf、MHP30、及びNrdFCの少なくとも2つを組み合わせた“カクテル”サブユニットワクチンは免疫誘発を強化できることを立証する。他方、本発明は融合パートナーを開示し、前記融合パートナーは高い溶解性（すなわち水溶性）のP46、Tuf、MHP30、及びNrdFCを調製するために特に適切である。上述の融合パートナーを使用することにより、ワクチン調製に必要な時間及びコストを顕著に削減できる。
本発明のある特徴では、本発明はマイコプラズマ属菌種感染を予防する組成物を提供し、前記組成物は、P46、Tuf、又はその組み合わせのタンパク質を含む第一の活性成分、及び医薬的に許容できるアジュバントを含む。また別の実施態様では、前記組成物はさらに第二の活性成分を含むことができる。前記第二の活性成分はMHP30、NrdFC、又はその組み合わせのタンパク質を含む。
本発明の別の特徴では、本発明はマイコプラズマ属菌種感染を予防する組成物を提供し、前記組成物は、P46、Tuf、MHP30、及びNrdFCから成る群から選択される少なくとも2つのタンパク質を有する活性成分、並びに医薬的に許容できるアジュバントを含む。
【０００９】
本発明のまた別の実施態様では、前記P46は配列番号:01として示されるアミノ酸配列と一致し、前記Tufは配列番号:02として示されるアミノ酸配列と一致し、前記MHP30は配列番号:03として示されるアミノ酸配列と一致し、前記NrdFCは配列番号:04として示されるアミノ酸配列と一致する。前記アミノ酸配列のペプチドの折り畳みによって形成される抗原決定基が損なわれない限り、前記活性成分は少なくとも2つの前記配列との融合タンパク質であり得ることは当業者には容易に理解されよう。
典型的には、1つの単一ワクチンで2つ以上の抗原を組み合せることは、当該ワクチンの免疫誘発のために常に有利であるとは限らない。実際のところ、1つの単一ワクチンにおける2つ以上の抗原の組合せは、当該2つ以上の抗原の免疫誘発を互いに対立させ、したがって免疫誘発を低下させるという望ましくない状況を引き起こし得る。そのうえコストの観点から、たとえ互いに対立しないとしても当該2つ以上の抗原の免疫誘発が相乗的効果を示さない場合、1つの単一ワクチン中に2つ以上の抗原を組み合せることは価値がないであろう。本発明の研究者らは、P46、Tuf、MHP30、及びNrdFCは、組み合わせて使用されるときにより良好な免疫誘発を示すことを立証した。したがって、また別の実施態様では、本組成物の前記活性成分は上述のタンパク質の任意の2つ以上を含む（すなわち本発明のカクテルワクチンである）。
本組成物中の（1つ或いは複数の）前記活性成分の濃度は、前記組成物の全体積を基準にして20から2000μg/mLである。本発明の好ましい実施態様では、本組成物中の1つの活性成分は、前記組成物の全体積を基準にして20から2000μg/mLの濃度である。本発明のまた別の実施態様では、本組成物は活性成分として前記タンパク質の少なくとも1つを含み、それら活性成分の全濃度は、前記組成物の全体積を基準にして20から1000μg/mL、20から1500μg/mL、又は20から2000μg/mLである。
前記医薬的に許容できるアジュバントは、前記活性成分の免疫効果の改善、前記活性成分の安定化、及び/又はワクチンの安全性の増進のために用いられる。本発明の前記医薬的に許容できるアジュバントには、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、多価陰イオンアジュバント、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００１０】
本発明の別の特徴は発現ベクターに関する。とりわけ、前記発現ベクターは大腸菌発現系のために用いられる。換言すれば、前記発現ベクターは所望のタンパク質のアミノ酸配列のペプチドに翻訳され、前記ペプチドは折り畳まれて本組成物のために必要な所望の活性成分を形成できる。しかしながら、本発明の趣旨にしたがって、当業者は本発明の開示を参照し多様な発現系に適合させるために修正を実施できるが、ただしそれら改変はなお本発明の範囲に属する（例えば、異なるコドン使用頻度に一致させるために配列の修正を実施する）。
本発明の別の特徴は、前記発現ベクターを用いることによって、マイコプラズマ属菌種感染を予防するタンパク質を調製する方法に関する。当該分野の常套的発現ベクターにより調製されるタンパク質は通常不溶性という欠点を有し、したがって尿素及び塩酸グアニジンによって精製産物を処理及び溶解することが必要である。しかしながら、これらの処理は製造コストを増加させるだけでなく、当該タンパク質の変性をもたらし、したがってそれらの抗原性機能の回復のためにそれら変性タンパク質の再折り畳みを時に必要とする。再折り畳みプロセスが失敗する一定の可能性が存在する一方で、それらタンパク質の抗原性効果も低下し得る。上述の常套的調製物が不適当であることを考えれば、本方法は、マイコプラズマ属菌種感染を予防する前述のタンパク質に優れた可溶性を提供するために特に適切な融合タンパク質の継ぎ合わせに力を発揮する。したがって、製造コストを節約でき、調製手順を単純化でき、さらにワクチンの活性成分である当該製造タンパク質の有効性を強化することができる。
【００１１】
本発明のまた別の実施態様では、前記発現ベクターはプラスミドを含む。前記プラスミドはヌクレオチド配列、融合パートナーをコードする遺伝子及び調節エレメントを含む。前記ヌクレオチド配列は、配列番号:05、配列番号:06、配列番号:07、及び配列番号:08から成る群から選択される少なくとも1つの配列を含み、前記はそれぞれP46、Tuf、MHP30及びNrdFCに対応する。
また別の実施態様では、当該遺伝子発現系の作動が妨害されない限り、さらに前記ヌクレオチド配列の生成及び結果として生じるそのアミノ酸配列の折り畳みが妨害されない限り、前記プラスミドは2つ以上の前記ヌクレオチド配列を含むことができる。
融合パートナーをコードする前記遺伝子は、大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、大腸菌のGroS17、枯草菌のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウスのTrxA、S.セレビシアエのSUMO、及びビトレオシラ属菌種のVgbから成る群から選択される。
前記調節エレメントは、当該発現系で転写及び翻訳の開始に要求されるエレメントを指す。前記調節エレメントは少なくともプロモーター及びリボソーム結合部位を含むであろう。好ましくは、前記調節エレメントはさらにオペレーター、エンハンサー配列、又はその組み合わせを含むことができる。
以下の実施例は、本発明の特色及び利点をさらに説明するために、本発明の試験及び実験を詳述する。以下の実施例は模範例であり、本発明の特許請求の範囲を制限するために用いられるものではないことを特記する。
【００１２】
［実施例１］
株及びその培養
これまでに研究者らはブタから単離された以下の７種類のマイコプラズマ属菌種の存在を明らかにした：マイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ、マイコプラズマ・ヒオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・ヒオシノビアエ（Mycoplasma hyosynoviae）、マイコプラズマ・フロキュラレ（Mycoplasma flocculare）、マイコプラズマ・ヒオファリンギス（Mycoplasma hyopharyngis）、マイコプラズマ・スアルビ（Mycoplasma sualvi）、及びマイコプラズマ・ボビゲニタリウム（Mycoplasma bovigenitalium）（Gourlay et al., 1978；Blank et al., 1996；Assuncao et al., 2005）。それらのうちでとりわけマイコプラズマ・ヒオプニューモニアエは、ブタのマイコプラズマ肺炎を引き起こす主要な病原体である。感染率はおよそ25%から93%の間である。したがって、本研究者らは、抗原遺伝子源としてマイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ（マイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ、PRIT-5）を用いた。加えて、本研究者らは、遺伝子クローニングの宿主として大腸菌JM109を、さらにタンパク質発現のための宿主として大腸菌BL21（DE3）を用いた。
M.ヒオプニューモニアエは、フリース（Friis）培地（Friis et al., 1975）を用いて培養した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）（大腸菌）株は、LB培地（Luria-Bertani）を用いて培養した。適量の抗生物質及び/又は1.5%の寒天を固形培地調製のために実験条件に応じて場合により添加した。
【００１３】
［実施例２］
M.ヒオプニューモニアエ抗原遺伝子のクローニング
種々の抗原遺伝子のために特異的プライマーを設計した（表１）。M.ヒオプニューモニアエのゲノムを鋳型として用い、上述のプライマーを用いて増幅を実施した。遺伝子増幅及びクローニングの詳細は以下のパラグラフに記載した。
【００１４】
表1：所望遺伝子増幅のためのプライマー
0006434017.tif 000002
*GGATCC：BamHI切断部位；GTCGAC：SalI切断部位
【００１５】
1．M.ヒオプニューモニアエゲノムの抽出
M.ヒオプニューモニアエゲノムの抽出はDNA精製キット（Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GeneMark, Taiwan）を用いて実施した。まず初めに、4.5mLのブロスをチューブ中で遠心分離し（5,870gｘg、5分）、上清を廃棄してペレットを収集した。続いて、20μLのプロテイナーゼK（10mg/mL）及び200μLの抽出試薬を加え、56℃で3時間反応させたた。その間、5分間毎にチューブを上下逆さまにするか又は振盪してペレット及び上述の試薬を混合して、それらが十分に混ざるようにした。
抽出試薬との反応後に、ペレットが完全に消化されたとき溶液は透明になった。続いて、200μLの結合試薬を添加して、70℃で10分間反応させた。その後で、200μLの無水エタノールをチューブに加え混合した。チューブ内の全内容物をスピンカラムに移し、続いてスピンカラムを収集チューブに静置した。2分間遠心分離（17,970gｘg）した後、流出液を廃棄し、700μLの洗浄溶液をスピンカラムに添加した。もう一回2分間遠心分離（17,970gｘg）した後で、流出液を廃棄し、上述の操作を再度繰り返した。最後に、チューブを5分間遠心分離（17,970gｘg）して残留エタノールを除去した。続いてスピンカラムを滅菌チューブに静置し、DNA溶出のために適量の滅菌水を加えた。
Quant-iTTM dsDNA高感受性アッセイキット（Invitrogen, Madison, USA）及びキュービットフルオロメーター（Qubit Fluorometer、Invitrogen, Madison, USA）を用いて、精製M.ヒオプニューモニアエのゲノムDNAの濃度を決定した。操作は以下のとおりである：Quant-iT試薬及びQuant-iT緩衝液を1：200の割合で混合して作業溶液を入手する。190μLの作業溶液及び10μLのスタンダードサンプルを混合し、室温に2分間放置した。続いてスタンダード曲線を作成した。その後で、2μLのサンプル及び198μLの作業溶液を混合し、2分間放置し、キュービットフルオロメーターによって検出し、ゲノムDNAの濃度を決定した。濃度の計算式は測定値ｘ100であった。
【００１６】
2．ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による所望遺伝子の増幅
M.ヒオプニューモニアエのゲノムDNAを鋳型として用い、さらにP46遺伝子、Tuf遺伝子、MHP30遺伝子、及びNrdFC遺伝子のために設計したプライマーをPCR反応にそれぞれ用いた。PCR反応のために用いた各プライマー及び条件を下記の表2に示した（プライマーの配列は上記の表1に列挙した）。50μLのPCR混合物は以下を含んでいた：1ｘGDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTPの混合物、1μMの増幅プライマー、200ngのM.ヒオプニューモニアエのゲノムDNA、並びに1 UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応後に、ゲル電気泳動を実施して予想サイズの増幅DNAフラグメントが存在することを確認した。
【００１７】
表2：PCR条件及びプライマーセット
0006434017.tif 000003
【００１８】
3．PCR生成物の収集及びそのクローニング
PCR-MTMクリーンアップ系キット（PCR-MTM Clean Up system kit；GeneMark, Taiwan）を用いてPCR生成物の収集を実施した（実験は操作マニュアルに従って実施され、本明細書では繰り返さない）。
続いてクローンジェットPCRクローニングキット（CloneJET PCR Cloning Kit）を用いてクローニングを実施した。クローニング実験は操作マニュアルに従って実施した（以下のように略記される）。まず初めに、収集したPCR生成物をキットの試薬及びDNAリガーゼと混合し、22℃で30分間連結反応を実施した。続いて連結混合物で大腸菌株ECOSTM9-5（Yeastern, Taiwan）を形質転換した。形質転換の条件はマニュアルを参照した。形質転換した細菌を1mLのSOC回収培地に移し、250rpmで振盪しながら37℃で培養した。アンピシリン（100μg/mL）を含むLB固形培地に適量のブロスをプレートし、このプレートを37℃で16時間培養した。その後で、コロニーPCRを実施して、形質転換が成功した株をスクリーニングした。コロニーPCRは以下の工程で実施した。まず初めに、50μLの2ｘTaq PCR マスターミックス（MasterMix；Genomics, Taiwan）、所望遺伝子を増幅するための0.5μLのフォワードプライマー、所望遺伝子を増幅するための0.5μLのリバースプライマー、及び49μLの滅菌水のPCR混合物を含むチューブを準備した。混合後に、前記PCR混合物をいくつかのPCRチューブに分けた（10μL/チューブ）。上述のプレート上のコロニーをPCR反応に対応してランダムにPCRチューブに採取した。PCR反応の条件は、95℃で5分（1サイクル）；95℃で30秒、55℃で30秒、72℃でX分（25サイクル）；72℃で7分（1サイクル）であった。前記において“X”はDNAポリメラーゼのために必要な伸長時間に左右され、増幅されるフラグメントにしたがって設定された。Taq DNAポリメラーゼの伸長速度は1kb/分であり、したがって、増幅されるフラグメントが約1kbのサイズを有するならば、“X”は1分と設定されよう。反応後に、ゲル電気泳動を実施してPCRの結果を確認した。それらの組換えプラスミド中に首尾よく挿入DNAを有すると確認された形質転換株について、DNA配列決定のためにプラスミドを抽出した。MHP30遺伝子、P46遺伝子、NrdFC遺伝子、及びTuf遺伝子を有するプラスミドを、それぞれpJET-MHP30、pJET-P46、pJET-NrdFC、及びpJET-Tufと称した。
DNA配列決定の結果は、本発明でクローニングしたP46はそれぞれ配列番号:01及び配列番号:05のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有することを示した。Tufはそれぞれ配列番号:02及び配列番号:06のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有する．MHP30はそれぞれ配列番号:03及び配列番号:07のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有する。NrdFCはそれぞれ配列番号:04及び配列番号:08のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
［実施例３］
P46遺伝子の点変異及びクローニング
P46は3つのTGAコドンを有する。TGAコドンはマイコプラズマ属菌種ではトリプトファンとして翻訳されるが、大腸菌では終止コドンである。全所望タンパク質の生成に大腸菌発現系を用いる際の失敗を防ぐために、P46遺伝子のTGAコドンに点変異を導入してそれらをTGGに入れ替える必要がある（TGGは大腸菌でトリプトファンとして翻訳される）。
点変異のための変異プライマーを設計するための原理は、変異点はプライマーの中心領域に位置し、さらにプライマーのTmは78℃より高いということである。プライマーのTmは、Invitrogeneが提供する以下の式によって計算できる：Tm＝81.5＋0.41(%GC)−675/N−%ミスマッチ（“%GC”は関係するプライマーのG及びCのパーセンテージであり、“N”は関係するプライマーの長さであり、“%ミスマッチ”は関係するプライマーの変異される塩基のパーセンテージである）。P46遺伝子の点変異に用いられるプライマーを下記の表3に列挙した（P46F/P46M2、P46M1/P46M4、P46M3/P46M6及びP46M5/P46Rを含む）。
【００２０】
表3：P46遺伝子の点変異に用いられるプライマー
0006434017.tif 000004
【００２１】
50μLのPCR混合物は以下を含んでいた：1ｘGDP-HiFi PCR緩衝液B、200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTPの混合物、1μMの増幅プライマー、100ngのpJET-P46並びに1 UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼ。PCR反応の条件は、98℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で45秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。PCR反応後に、ゲル電気泳動を実施して予想サイズの増幅DNAフラグメントが存在することを確認した。
Gel-MTMゲル抽出系キットを用いてPCR生成物の収集を実施し、実験はマニュアルに従って実施した。続いて、収集した4つのPCR生成物をP46F/P46Rプライマーセットによる遺伝子増幅のための鋳型として用いた。PCR反応の条件は、98℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で45秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。その後で、点変異を導入された完全長のP46遺伝子を入手できた。PCR-MTMクリーンアップ系キット（GeneMark, Taiwan）を用いてPCR生成物を収集した。変異遺伝子のクローニングはCloneJET PCRクローニングキットを用いて実施した。コロニーPCRによって確認を行いそれらの組換えプラスミド中に首尾よく挿入DNAを有する形質転換株について、DNA配列決定のためにプラスミドを抽出した。変異P46遺伝子を有するプラスミドをpJET-P46Mと称した。
【００２２】
［実施例４］
本M.ヒオプニューモニアエ抗原発現ベクターの樹立
多様な融合パートナーを有するプラスミドを、M.ヒオプニューモニアエ抗原発現ベクター樹立のための骨格として用いた。用いた融合パートナー遺伝子は、大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、大腸菌の17アミノ酸を含むGroSの部分的ペプチド（GroS17）、枯草菌のGroES、アリシクロバシルス・アシドカルダリウスのTrxA、S.セレビシアエのSUMO、バクテリオファージ phiX174のDタンパク質、及びビトレオシラ属菌種のVgbであった。樹立は以下のように実施した。
1．MHP30発現ベクターの樹立
pJET-MHP30をBamHI及びSalIで切断し、生じたDNAフラグメントを同じ制限酵素で予め切断した融合発現プラスミドに連結した。続いてこの連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。形質転換株をコロニーPCRでスクリーニングし、DNA電気泳動を用いて予想サイズのDNAフラグメントが存在するか否かを確認した。それらの組換えプラスミド中に首尾よく挿入DNAを有すると確認された形質転換株について、DNA配列決定のためにプラスミドを抽出した。正確なDNA配列を有するプラスミドをそれぞれpET-MSY-MHP30、pET-YjgD-MHP30、pET-GroS17-MHP30、pET-GroES-MHP30、pET-TrxA-MHP30、pET-SUMO-MHP30、pET-D-MHP30及びpET-Vgb-MHP30と称した。
2．P46発現ベクターの樹立
pJET-P46MをBamHI及びSalIで切断し、上述のMHP30発現ベクターの樹立工程を参照して以下の実験を実施した。正確なDNA配列を有するプラスミドをそれぞれpET-D-P46M及びpET-MSY-P46Mと称した。
3．NrdFC発現ベクターの樹立
pJET-NrdFCをBamHI及びSalIで切断し、上述のMHP30発現ベクターの樹立工程を参照して以下の実験を実施した。正確なDNA配列を有するプラスミドをそれぞれpET-D-NrdFC及びpET-MSY-NrdFCと称した。
4．Tuf発現ベクターの樹立
pJET-TufをBamHI及びSalIで切断し、上述のMHP30発現ベクターの樹立工程を参照して以下の実験を実施した。正確なDNA配列を有するプラスミドをそれぞれpET-D-Tuf及びpET-MSY-Tufと称した。
【００２３】
［実施例５］
組換えM.ヒオプニューモニアエ抗原の発現及びその精製
所望抗原の発現に関して：大腸菌BL21（DE3）を該抗原発現ベクターで形質転換した。１つの単一コロニーを採取して、LB培地（最終濃度30μg/mLのカナマイシンを含む）に接種し、37℃及び180rpmの条件で一晩培養した。続いて新しいLB培地（最終濃度30μg/mLのカナマイシンを含む）に前記ブロスを1：100の割合で接種し、そのOD600値がおよそ0.6〜0.8に達するまで37℃及び180rpmの条件で培養した。0.1mMのIPTGを添加し、所望タンパク質の発現を4時間誘発した。続いて、ブロスを遠心分離（10,000ｘg、10分、4℃）してペレットを収集した。その後で、Easy-Lyse細菌タンパク質抽出キット（Easy-Lyse Bacterial Protein Extraction kit；Epicentre, USA）を用いて、その可溶性部分及び不溶性部分を分離した。続いてタンパク質の電気泳動を実施し、生成された組み換え抗原の可溶性を観察した。
図1及び2はそれぞれ、発現に多様な融合タンパク質を用いた際のMH30の種々の可溶性、並びに発現に多様な融合タンパク質を用いた際のP46、NrdFC、及びTufの種々の可溶性を示す。それらの結果は、融合パートナーとしてYjgD、SUMO、GroS17、GroES、Vgb、又はTrxAを用いることによって、MHP30の可溶性を高めることができることを示した。他方で、MsyBの融合パートナーとしての使用は、P46、NrdFC、及びTufに優れた可溶性を提供することができる。
【００２４】
所望抗原の精製に関して：組換えタンパク質のN’Higタグはニッケル又はコバルトイオンと配位共有結合を形成できるという事実を利用して、固定金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）をタンパク質精製に用いた。タンパク質精製のプロトコルはQIA expressionistTM（第四版、Qiagen）を参照した。ペレットを溶解緩衝液（50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール（pH 8.0））に懸濁し、ホモジナイザーで破壊した。続いて遠心分離を実施して上清を収集した。収集上清を樹脂カラム（１mLのNi-NTA）に導入した（組換え抗原はその上に付着する）。15mLの洗浄緩衝液（50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール（pH8.0））を添加してカラム内の樹脂を洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去した。最後に、20mLの溶出緩衝液（50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール（pH8.0））を導入して樹脂上の抗原を溶出させた。溶出緩衝液は高濃度のイミダゾールを含み樹脂上の結合部位について当該組換えタンパク質と競合し、したがって組換えタンパク質を樹脂から洗い流すことができる。精製の結果はタンパク質電気泳動によって観察した。図3によれば、本組み換え抗原のN’に付されたHisタグは、IMACによる本組み換え抗原の精製に確かに有益であることが示された。
【００２５】
［実施例６］
マウス抗血清試験
本実施例は雌の5週齢BALB/cマウス（National Laboratory Animal Center）を用いた。マウスを空気整調装置の付いた標準動物室で維持し、飼料及び清浄な水を与えた。免疫チャレンジは7日間飼育後に実施した。上述の実施例で精製した組み換え抗原を、三方向コネクターを介する混合物（フロイントの完全アジュバント又はフロイントの不完全アジュバント）としてアジュバントと混合し、マウスの皮下に注射した。最初の注射はフロイントの完全アジュバント処方物であった。最初の注射から7日後に、マウスにフロイントの不完全アジュバント処方物を7日間隔で2回注射した。第二の注射から7日後にマウスの眼窩から血液を収集した。
収集血液サンプルを室温に1時間放置し、さらに4℃で一晩放置して血液を凝固させた。続いて、サンプルを30分間遠心分離（5,000ｘg）して抗血清を得た（前記抗血清は組み換え抗原に対して特異的な抗体を含んでいた）。
続いて、得られた抗血清をM.ヒオプニューモニアエの全細胞溶解物に対して用いた。実験プロトコルは以下の通りであった：M.ヒオプニューモニアエPRIT-5をSET緩衝液（50 mMグルコース、25mM-HCl、10 mM EDTA（pH8.0））に懸濁し、5ｘのサンプル緩衝液（312.5 mMトリス-HCl（pH6.8）、50%グリセロール、10% SDS、0.05%ブロモフェノールブルー）を添加し、上述の緩衝液とサンプルを十分に混合した後で前記サンプルを100℃で5分間加熱する。続いてタンパク質電気泳動を実施した。タンパク質電気泳動の後で、ゲルを移転緩衝液（25mMトリス塩基 、192mMグリシン、10%（v/v）メタノール（pH8.3））に浸漬した。適切なサイズのPVDF膜をメタノールで数秒間すすぎ、脱イオン水で洗浄し、続いて移転緩衝液に浸漬した。ゲル及びPVDF膜の両方を移転緩衝液に15分間浸漬した後、適切に電力が供給されるトランス-ブロットSDセミドライ移転セル（Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell）中に、ろ紙、ゲル、PVDF膜、及び別のろ紙を連続して配置した。移転実施後に、PVDF膜を20mLの封鎖緩衝液（20mMトリス、150mM NaCl、5%脱脂粉乳（pH7.4））に室温で1時間浸漬し、さらに10μLの組み換え抗原（2000ｘ希釈）を添加した。室温で1時間振盪した後、この封鎖緩衝液を廃棄し、PDFV膜を20mLのTBST緩衝液（20mMトリス、150mM NaCl、0.05%トゥイーン-20（pH7.4））で3回洗浄した（各回5分）。続いて、20mLの封鎖緩衝液及び4μLのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG（H+L）を添加し、この混合物を室温で1時間振盪した。その後で、PVDF膜をTBST緩衝液で3回洗浄し、さらにNBT/BCIP試薬を検出のために加えた。
結果は、本組み換え抗原及び適切なアジュバントの混合物は、該抗原に対してマウスで確かに抗体を誘発することを示した。すなわち、本タンパク質は免疫原であるべき潜在能力を有した（図4）。
【００２６】
［実施例７］
ブタ免疫試験及びチャレンジ試験
1．ワクチンの調製
上述の実施例の精製組換え抗原の1つ以上をアジュバントと混合し、所望のサブユニットワクチン又はカクテルワクチンを入手した。調製したワクチンの各々の投与量は2mLであり、前記は添加される本タンパク質のそれぞれの種類の200μgを含んでいた。
2．ブタ免疫試験
上述のサブユニットワクチン又はカクテルワクチンをブタ免疫試験に用いた。2週齢のSPFブタをアニマルテクノロジーインスチチュートタイワンの第二世代SPF豚舎から購入した。全てのブタが該SPF豚舎で等しく維持されかつ飼育された。
ブタが21日齢に達したときワクチン（2mL）を当該ブタの筋肉内に注射し、さらに血液を21、42、70、及び98日齢で収集して血清を単離した。マイコプラズマ属菌種抗体試験（IDEXX）キットを用いて収集血清の抗体を分析した。操作は以下の通りであった。まず初めに、10μLの血清を390μLのサンプル希釈液と穏やかに混合して混合物を得た。前記混合物の100μLを96ウェルプレートのウェルに添加した（前記ウェルは内部にすでにマイコプラズマ属菌種抗原を有していた）。その他に、100μLの陽性血清及び陰性血清もまた異なるウェルにコントロールとして添加された。このプレートを室温に30分静置した。続いて、プレート中の液体を廃棄し、350μLの洗浄緩衝液を3回添加して洗浄した。続いて、抗ブタ抗体で標識した350μLのセイヨウワサビペルオキシダーゼをプレートに添加し、このプレートを室温に30分静置した。その後で、プレートの液体を廃棄し、350μLの洗浄緩衝液を3回添加して洗浄した。100μLのTMB基質溶液をプレートに添加し、このプレートを室温に15分静置した。続いて、100μLの停止緩衝液を加えて、発色反応を停止させた。最後に、各ウェルの吸収をELISAリーダーによって650nmで評価し、S/P値を計算した。S/P値＝(試験グループのOD650吸収−陰性コントロールグループのOD650吸収)/(陽性コントロールグループのOD650吸収−陰性コントロールグループのOD650吸収)。S/P値が高ければ高いほど、M.ヒオプニューモニアエタンパク質に対する抗体は多い。実験結果は、本抗原が免疫応答を誘発できることを示した。すなわち、P46ワクチン及びカクテルワクチン（1つのワクチン中に4つの抗原（P46、Tuf、MHP30及びNrdFC）を含んでいた）は最良の誘発効果を示し、さらにこの誘発免疫応答は14週齢まで維持され得る（図5）。
3．ブタチャレンジ試験
本サブユニットワクチン及びカクテルワクチンの免疫有効性を評価するためのコントロールとして、M.ヒオプニューモニアエPRIT-5を用いて調製されたBayovac(商標)MH-PRIT-5ワクチンを本実験で用いた。4週齢のSPFブタをアニマルテクノロジーインスチチュートタイワンの第二世代SPF豚舎から購入した。全てのブタが該SPF豚舎で等しく維持されかつ飼育された。
チャレンジ試験に用いたM.ヒオプニューモニアエの細菌ブロスは以下により調製された：M.ヒオプニューモニアエ感染ブタ肺組織（約3ｘ3cm2）を収集し、20mLのフリース培地中ですり潰した。10分間の遠心分離（148.8ｘg）の後で、上清をさらに40分間の遠心分離（7,870ｘg）のために清浄なチューブに移した。続いて、上清を廃棄し、沈殿物を6mLのフリース培地で再懸濁して懸濁物を得た。その後で、この懸濁物を5μm及び0.45μmフィルターで連続的にろ過し、この実験に必要なチャレンジ細菌ブロスを得た。
ブタが35日齢に達したとき、ワクチン（2mL）を筋肉内に注射した。41日齢でもう1回の注射を同じ方法で実施した。63日齢で、免疫ブタを麻酔し、気管からチャレンジ細菌ブロス（5mL）を投与することによってチャレンジした。チャレンジ日から28日後に、ブタをサクリファイスし、その肺を収集して免疫効果を評価した。免疫効果の評価は以下の基準にしたがって実施した：観察した肺のどちらかの側のメドル（meddle）上部葉及び上部葉のいずれか1つが病理学的特徴を有すれば10ポイントの得点が与えられ、観察した肺のどちらかの側のメドル上部葉及び横隔膜葉のいずれかが病理学的特徴を有すれば5ポイントの得点が与えられた。最高得点は55ポイントであった。観察記録は表4に示した。
【００２７】
表4：チャレンジテストにおける肺病巣の評価
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表4に示したデータによれば、本発明のサブユニットワクチンは常套的ワクチン（Bayovac(商標)MH-PRIT-5）と等価の免疫効果を提供できることは明瞭である。さらにまた、カクテルワクチン（1つのワクチン中に4つの抗原（P46、Tuf、MHP30及びNrdFC）を含んでいる）は、常套的ワクチンより有意に良好な免疫効果を示した。総合すれば、本タンパク質は確かにワクチンの活性成分として利用するために適切であり、さらにそれらタンパク質はカクテルワクチンとして組み合わせて用いるとき相乗効果を示した。
当業者は、本発明の開示を基にして本発明の趣旨から外れることなく任意の可能な修正を容易に理解し得よう。したがって、上記の例は本発明の限定のために用いられることはなく、以下に列挙される特許請求の範囲に一致する本発明の趣旨及び範囲の下で任意の可能な修正をカバーすることを意図する。
【図１】
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【図２】
0006434017.tif 000007
【図３】
0006434017.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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