(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮のマトリックス成分の分解を抑制する分解抑制剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、分解抑制剤。
【請求項２】
前記マトリックス成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制する、請求項１記載の分解抑制剤。
【請求項３】
前記マトリックス成分に含まれるエラスチンを分解する酵素エラスターゼの活性を阻害する、請求項１または２記載の分解抑制剤。
【請求項４】
真皮のマトリックス成分の分解を抑制する抗老化剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、抗老化剤。
【請求項５】
真皮のマトリックス成分の分解を抑制する皮膚外用剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。より詳細には、本発明は、真皮のマトリックス成分の分解を抑制することにより、皮膚の老化等を抑制する分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚を構成する真皮は、主に線維芽細胞およびマトリックス成分からなっている。線維芽細胞は、コラーゲンなどのタンパク質およびヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚において重要な役割を果たしている。そのため、コラーゲンやヒアルロン酸などが減少すると、結合組織が崩壊することにより皮膚が老化し、シワ、たるみ、きめの消失、弾力性の低下などが起こることになる。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の合成を促進させることができる皮膚外用剤が検討されてきた。
【０００３】
これまでに多くの植物抽出物が種々の生理作用を有することが知られている。たとえば、オオボウシバナの場合、そのアルコール抽出物に含まれるフラボノイドがヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤として適用し得ることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−９４７９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示された技術は、オオボウシバナ由来のフラボノイドを含有することにより、上記作用効果を奏することが開示されているに過ぎない。また、特許文献１に開示された技術は、オオボウシバナの全草を使用し、かつ、アルコール抽出物が利用される。
【０００６】
本発明は、このような従来技術とは異なり、オオボウシバナ（変種体を含む）の花に由来する非フラボノイド成分を含有することにより、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し、皮膚の老化等を抑制することのできる分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明の分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤には、以下の構成が主に含まれる。
【０００８】
（１）真皮のマトリックス成分の分解を抑制する分解抑制剤であり、オオボウシバナの花、または、前記オオボウシバナの変種体の花のうち、少なくともいずれか一方に由来する非フラボノイド成分を含有する、分解抑制剤。
【０００９】
このような構成によれば、分解抑制剤は、非フラボノイド成分の寄与により、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し得る。その結果、皮膚の老化等が抑制され得る。
【００１０】
（２）前記非フラボノイド成分は、前記オオボウシバナまたは前記オオボウシバナの変種体の花のうち、花弁の抽出物に含まれる、（１）記載の分解抑制剤。
【００１１】
オオボウシバナの花（青花）は、友禅染の下絵の染料として利用されている。また、オオボウシバナの変種体の花（たとえば美白くさつばな中村一号（白花））には、色素成分が少ないため、染料としての用途がない。しかしながら、このような構成によれば、分解抑制剤は、上記染料用途以外に積極的な用途の無いオオボウシバナの花を、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し得る分解抑制剤として有効利用し得る。
【００１２】
（３）前記マトリックス成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の発現を抑制する、（１）または（２）記載の分解抑制剤。
【００１３】
このような構成によれば、分解抑制剤は、真皮のマトリックス成分を分解する分解酵素であるＭＭＰｓの発現を抑制し得る。その結果、真皮のマトリックス成分は、より分解が抑制されやすい。
【００１４】
（４）前記マトリックス成分に含まれるエラスチンを分解する酵素エラスターゼの活性を阻害する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の分解抑制剤。
【００１５】
このような構成によれば、分解抑制剤は、真皮のマトリックス成分であるエラスチンを分解する酵素エラスターゼの活性を阻害する。そのため、エラスチンは、分解されにくい。その結果、真皮のマトリックス成分は、より分解が抑制されやすい。
【００１６】
（５）真皮のマトリックス成分の分解を抑制する抗老化剤であり、オオボウシバナの花、または、前記オオボウシバナの変種体の花のうち、少なくともいずれか一方に由来する非フラボノイド成分を含有する、抗老化剤。
【００１７】
このような構成によれば、抗老化剤は、非フラボノイド成分の寄与により、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し得る。その結果、皮膚の老化が抑制され得る。
【００１８】
（６）真皮のマトリックス成分の分解を抑制する皮膚外用剤であり、オオボウシバナの花、または、前記オオボウシバナの変種体の花のうち、少なくともいずれか一方に由来する非フラボノイド成分を含有する、皮膚外用剤。
【００１９】
このような構成によれば、皮膚外用剤は、非フラボノイド成分の寄与により、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し得る。その結果、皮膚の老化等が抑制され得る。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、非フラボノイド成分の寄与により、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し、皮膚の老化等を抑制することのできる分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例１〜３および比較例１で調製した分解抑制剤のＭＭＰ−１発現抑制効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】図２は、実施例１〜３および比較例１で調製した分解抑制剤のＭＭＰ−３発現抑制効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態の分解抑制剤は、真皮のマトリックス成分の分解を抑制する分解抑制剤である。また、分解抑制剤は、オオボウシバナの花、または、オオボウシバナの変種体の花のうち、少なくともいずれか一方に由来する非フラボノイド成分を含有する。
【００２３】
オオボウシバナ（C. communis var. hortensis）は、ツユクサ科（Commelinaceae）の植物である。オオボウシバナは、青花とも呼ばれ、主に友禅染の下絵の染料として利用されている。また、オオボウシバナとしては、青色色素の発現が大幅に低下した美白くさつばな中村一号（白花）が知られている。本実施形態の分解抑制剤は、これらオオボウシバナの花およびオオボウシバナの変種体の花のうち、少なくともいずれか一方に由来する非フラボノイド成分を含む。なお、本明細書では、オオボウシバナおよびその変種体を、単にオオボウシバナ等ともいう。
【００２４】
本実施形態において、非フラボノイド成分は、オオボウシバナ等の花に含まれる成分のうち、フラボノイド以外の成分をいう。非フラボノイド成分は、花のうち、特に花弁に多く含まれる。このような非フラボノイド成分は、特に限定されない。一例を挙げると、非フラボノイド成分は、以下の方法によりオオボウシバナ等の花から抽出物を得る際に、水分画中に含まれる成分である。本実施形態の抽出物（水分画）には、フラボノイド成分は、１質量％以下であり、好ましくは実質的に含まれない。
【００２５】
すなわち、まず、収穫後のオオボウシバナ等（凍結保存されてもよい）の花弁を水、もしくは、アルコール溶媒、または、水・アルコール混合溶媒で抽出する（アルコール抽出工程の一例）。アルコール溶媒は、特に限定されない。一例を挙げると、アルコール溶媒は、低級アルコール（水で希釈されたものを含む）である。低級アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が例示される。水・アルコール混合溶媒におけるアルコール溶媒は、濃度範囲５０〜８０％であることが好ましい。アルコール溶媒での抽出条件は特に限定されない。一例を挙げると、アルコール抽出は、オオボウシバナ等をアルコール溶媒に浸漬した状態で、５℃以下（冷蔵庫内）で１週間程度保持することにより行い得る。
【００２６】
また、上記抽出時における抽出溶媒の量は、オオボウシバナ等１００重量部に対して、１００重量部以上であることが好ましく、５００重量部以上であることがより好ましい。また、抽出溶媒の量は、１０００００重量部以下であることが好ましく、１００００重量部以下であることがより好ましい。抽出溶媒の量が１００重量部未満である場合、抽出効率が悪くなる傾向がある。一方、抽出溶媒の量が１０００００重量部を超える場合、抽出効率の向上が望めない傾向があり、かつ、濃縮および精製に時間がかかり、製造効率が低下する傾向がある。抽出時の温度は特に限定されない。一例を挙げると、温度は、６０〜８０℃である。また、抽出時の浸漬時間は特に限定されない。一例を挙げると、浸漬時間は、６０〜１２０分である。抽出操作は、２回以上であってもよい。
【００２７】
得られるエキス原液は、そのまま使用してもよい。好ましくは、エキス原液は、不純物の除去や脱臭、脱色、濃縮などの精製操作が行われる。精製操作は、ろ過、ゲルろ過、遠心分離、クロマトグラフィ、蒸留、分配法等が例示される。
【００２８】
本実施形態の分解抑制剤は、好適には、たとえばクロマトグラフィにて成分が分離される。カラムクロマトグラフィの吸着担体は、たとえば、メタノールで洗浄後、水に置換したＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）を使用し得る。エキス原液は、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０が加えられ、溶媒留去する。これにより、エキス原液中のエキス成分は、吸着担体に吸着する。これをクロマト管内に移し、溶出溶媒として水、５０％エタノール、１００％エタノールの順に加え、それぞれの溶出成分を得る（溶出工程）。
【００２９】
以上の溶出工程によれば、フラボノイド成分は、水分画以外の分画に主に含まれ、水分画には実質的に含まれない。すなわち、水分画に含まれる成分は、主に非フラボノイド成分となる。
【００３０】
水分画は、その後、溶媒留去され、次いで、凍結乾燥が行われてもよい（乾燥工程）。なお、溶媒の留去および凍結乾燥は、常法により行い得る。
【００３１】
以上の操作により得られる非フラボノイド成分は、真皮のマトリックス成分の分解を効果的に抑制する。具体的には、非フラボノイド成分を含有する分解抑制剤は、真皮のマトリックス成分を分解する分解酵素であるＭＭＰｓの発現を抑制し得る。
【００３２】
ＭＭＰｓは、真皮のマトリックスを分解する分解酵素群である。ＭＭＰｓは、紫外線や酸化、炎症といったストレスを被ることにより活性化され、皮膚の弾力低下やシワの増加を引き起こし得る。ＭＭＰｓは、コラーゲンを分解する代表的な酵素であるＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３等を含む。本実施形態の分解抑制剤は、これらＭＭＰｓ（特にＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３）の発現を抑制し得る。そのため、真皮のマトリックス成分の分解が抑制され、皮膚の老化等が抑制され得る。
【００３３】
また、非フラボノイド成分を含有する分解抑制剤は、真皮のマトリックス成分であるエラスチンを分解する酵素エラスターゼの活性を阻害し得る。
【００３４】
エラスチンは、弾性線維と呼ばれ、優れた弾力性を示す。そのため、靭帯や血管、肺、皮膚の真皮など伸縮性が必要な臓器に多く含まれている。真皮において、エラスチンは、コラーゲンを束ね、弾性を生む重要な役割を担っている。本実施形態の分解抑制剤は、このようなエラスチンを分解する酵素エラスターゼ（特に、線維芽細胞由来の酵素エラスターゼ）の活性を阻害し得る。そのため、真皮のマトリックス成分の分解が抑制され、皮膚の老化（シワやたるみの形成）等が抑制され得る。
【００３５】
分解抑制剤に含まれる非フラボノイド成分の含有量は、特に限定されない。非フラボノイド成分は、分解抑制剤中、０．００００１重量％以上であることが好ましく、０．０００１重量％以上であることがより好ましい。また、非フラボノイド成分は、分解抑制剤中、１０重量％以下であることが好ましく、１重量％以下であることがより好ましい。含有量が０．００００１重量％未満である場合、真皮のマトリックス成分の分解を抑制する効果が充分に得られない傾向がある。一方、含有量が１０重量％を超える場合、さらなる効果の発現が望めない傾向がある。
【００３６】
以上、本実施形態の分解抑制剤は、上記のとおり、オオボウシバナ等の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、真皮のマトリックス成分の分解を抑制する。そのため、分解抑制剤は、たとえば抗老化剤、皮膚外用剤等として使用し得る。分解抑制剤の形態は特に限定されない。分解抑制剤は、たとえば、ローション剤、乳剤、ゲル剤、ゾル剤、クリーム、軟膏、パウダー、スプレーなどの種々の形態とすることができる。分解抑制剤は、抗老化剤として使用される場合、シワ予防改善用、皮膚老化防止用等の用途で使用され得る。また、皮膚外用剤として、とくに化粧料の形態で用いる場合、分解抑制剤は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック剤、洗顔料などの皮膚用化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、リキッドファンデーション、口紅などのメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、ボディソープ、石鹸などの身体用化粧料、シャンプー、リンス、養毛剤などの頭髪用化粧料とすることができる。
【００３７】
また、本実施形態の分解抑制剤は、上記形態で使用される際に、適宜、公知の添加剤等が配合されてもよい。一例を挙げると、分解抑制剤は、外用剤基剤に通常用いられる油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、水溶性高分子、界面活性剤、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、防腐剤、防カビ剤、香料、顔料、賦形剤、酸化防止剤、美容成分、化粧料安定化剤等が配合されてもよい。また、本実施形態の分解抑制剤は、他の細胞賦活剤、抗老化剤、コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤等が配合されてもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。本発明は、これら実施例に何ら限定されない。
【００３９】
＜オオボウシバナ抽出物（非フラボノイド成分）の調製＞
収穫後、凍結保存されたオオボウシバナ（青花）およびオオボウシバナの変種体（白花）のそれぞれの花弁１ｋｇを、２Ｌの５０％エタノールに浸漬し、４℃の冷蔵庫に１週間保持し、ろ過し、それぞれの５０％エタノールエキス原液を得た。それぞれのエキス原液は、メタノールで吸着担体を洗浄し、水に置換したＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）が加えられ、溶媒が留去され、吸着担体に吸着された。吸着担体をクロマト管内に移し、溶出溶媒として水、５０％エタノール、１００％エタノールの順に加え、それぞれの溶出成分を得た。これらのうち、水分画のみ、溶媒留去し、次いで、凍結乾燥した。乾燥粉末として、それぞれ１７．５ｇのオオボウシバナの抽出物（非フラボノイド成分）を得た。
【００４０】
（実施例１）
得られたオオボウシバナ（青花）の抽出物を、非フラボノイド成分の濃度が２５０（μｇ／ｍＬ）となるよう精製水で希釈し、実施例１の分解抑制剤を調製した。
【００４１】
（実施例２）
非フラボノイド成分の濃度が５００（μｇ／ｍＬ）となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例１と同様の方法により、実施例２の分解抑制剤を調製した。
【００４２】
（実施例３）
非フラボノイド成分の濃度が１０００（μｇ／ｍＬ）となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例１と同様の方法により、実施例３の分解抑制剤を調製した。
【００４３】
（実施例４）
得られたオオボウシバナの変種体（白花）の抽出物を、非フラボノイド成分の濃度が２５０（μｇ／ｍＬ）となるよう精製水で希釈し、実施例４の分解抑制剤を調製した。
【００４４】
（実施例５）
非フラボノイド成分の濃度が５００（μｇ／ｍＬ）となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例１と同様の方法により、実施例５の分解抑制剤を調製した。
【００４５】
（実施例６）
非フラボノイド成分の濃度が１０００（μｇ／ｍＬ）となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例１と同様の方法により、実施例６の分解抑制剤を調製した。
【００４６】
実施例１〜６で調製した分解抑制剤について、以下の方法にしたがって、ＭＭＰ−１活性阻害効果および線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害効果を確認した。結果を表１に示す。
【００４７】
＜ＭＭＰ−１活性阻害効果の確認＞
ＭＭＰ−１酵素（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＭＭＰ−１  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ（リコンビナント）（ｓｉｇｍａ社製））、および、基質（ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2（ペプチド研究所（株）製）を準備した。これらは、ＴＮＣＢバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊｉ−３５、ｐＨ７．５）で適宜希釈した。まず、試料溶液５０μＬに、酵素溶液を１００μＬ添加し、３７℃で１０分間、遮光下でインキュベートし、その後、基質溶液５０μＬを添加し、３７℃遮光下でさらに６０分間インキュベートした。終了後、速やかに蛍光光度計で励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍにて蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を元に、阻害率（％）＝１００−［（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）］×１００
Ａ：被験溶液の４０５ｎｍにおける蛍光強度
Ｂ：被験溶液ブランクの４０５ｎｍにおける蛍光強度
Ｃ：対照溶液の４０５ｎｍにおける蛍光強度
Ｄ：対照溶液ブランクの４０５ｎｍにおける蛍光強度
の式に従い、ＭＭＰ−１活性阻害効果（阻害率（％））を算出した。なお、ブランク（比較例１）の分解抑制剤として、非フラボノイド成分を含まないＴＮＣＢバッファーを用いた。
【００４８】
＜線維芽細胞由来エラスターゼ活性阻害効果の確認＞
６０ｍｍディッシュに正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（クラボウ（株）製）を６．３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、５％ＣＯ2、３７℃で一晩培養した。その後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３２５μＬずつ添加して室温で３０分間放置し細胞を溶解させた。細胞溶解液を回収し、１５秒間の超音波破砕を２回行い、粗酵素抽出液とした。培地には、５％ウシ血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変性イーグル（ＤＭＥＭ）（日水製薬（株）製）培地を用いた。Ｎ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で０．１Ｍとなるように溶解し、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５ｍＭに希釈したものを基質溶液とした。９６ウェルプレートを用い、試料溶液５０μＬに粗酵素溶液を５０μＬ添加した後、基質溶液１００μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。反応終了後、速やかに分光光度計にて４０５ｎｍの吸光度を測定した。エラスターゼ活性阻害率は次式で算出した。なお、ブランク（比較例２）の分解抑制剤として、酵素溶液の代わりに０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を５０μＬ添加した以外は同様の方法により調製し、エラスターゼ活性阻害効果を確認した。
阻害率（％）＝１００−［（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）］×１００
Ａ：被験溶液の４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験溶液ブランクの４０５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：対照溶液の４０５ｎｍにおける吸光度
Ｄ：対照溶液ブランクの４０５ｎｍにおける吸光度
【００４９】
【表１】
0006348890.tif 000002
【００５０】
表１に示されるように、オオボウシバナ等の花に由来する非フラボノイド成分を含有する実施例１〜６の分解抑制剤は、いずれもＭＭＰ−１活性阻害効果およびエラスターゼ活性阻害効果を有していた。その結果、本発明の分解抑制剤は、非フラボノイド成分の寄与により、真皮のマトリックス成分の分解を抑制し、皮膚の老化等を抑制し得ることが分かった。
【００５１】
実施例１〜３および比較例１で調製した分解抑制剤について、以下の方法にしたがって、ＭＭＰｓタンパク発現抑制効果を確認した。結果を図１〜図２に示す。
【００５２】
＜ＭＭＰｓタンパク発現抑制効果＞
（培養）
２４ウェル マイクロプレートにＮＨＤＦを１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、５％ＣＯ2、３７℃で２４時間培養後、サンプル添加培地交換を行った。培地交換の際にはＰＢＳ（−）で２回洗浄し、適量のＦＢＳもしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させたものに置き換え、さらに２４〜４８時間培養した。ＭＭＰｓ産生誘導はＩＬ−１α（ｓｉｇｍａ：Ｉ２７７８）を添加した。培地には、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いた。
（タンパク質抽出方法）
各ウェルより培地上清を回収し、等量の２×サンプルバッファー（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、２００ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール））を加え、９８℃で１５分間煮沸した。なお、標準化を行うため細胞のタンパク定量を行った。ウェルの培地を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄、除去後２％ＳＤＳを２００μＬ加え、ピペットで回収し、１５秒間、２回、超音波破砕し、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
１０％アクリルアミドゲル（分離ゲル：１０％ポリアクリルアミド（ＢｉｏＲａｄ社製）、０．３７５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％のＳＤＳ（ラウレス硫酸ナトリウム）、０．０３３％のＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）および０．０５％のＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエタン−１，２−ジアミン）、濃縮ゲル：４．７５％のポリアクリルアミド、０．１２５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％のＳＤＳ、０．０３３％のＡＰＳおよび０．０５％のＴＥＭＥＤ）を用いた。２枚のガラス板にランニングゲルとスタッキングゲルを重層し、１０％アクリルアミドゲルとした。泳動は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ ＳＤＳ）を用い、定電流２０ｍＡで９０分間行った。
（ブロッティング）
タンク式のブロッティング装置を用い、定電流２００ｍＡで２時間転写した。転写にはトランスファーバッファー（１２４ｍＭのＴｒｉｓ、３０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ、０．０１％のＳＤＳおよび２０％ＭｅＯＨ）を用い、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に転写した。
（抗体反応および検出）
１次抗体として、抗ＭＭＰ−１抗体（ａｂｃａｍ：ＥＰ１２４７Ｙ、Ｒ＆Ｄ：ＡＦ９０１）、抗ＭＭＰ−３抗体（ａｂｃａｍ：ＥＰ１１８６Ｙ）を用いた。２次抗体として、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：ＮＡ９３４）および抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ：２０３３）を用いた。抗体検出試薬はＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた。
【００５３】
図１は、実施例１〜３および比較例１で調製した分解抑制剤のＭＭＰ−１発現抑制効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図２は、実施例１〜３および比較例１で調製した分解抑制剤のＭＭＰ−３発現抑制効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【００５４】
ＭＭＰ−１タンパクのバンドは、図１のうち、５０ｋＤａ付近に出現した。比較例１の分解抑制剤は、ＭＭＰ−１の発現抑制効果がないため、ＵＶを照射することにより（＋ＵＶ）、ＭＭＰ−１の産生が亢進され、５０ｋＤａ付近に濃いバンドが現れた。一方、実施例１〜３の分解抑制剤は、亢進したＭＭＰ−１の発現が低下した。その結果、５０ｋＤａ付近のバンドが薄くなった。これにより、実施例１〜３の分解抑制剤は、ＭＭＰ−１タンパクに対する発現抑制効果が優れることが示された。
【００５５】
同様に、ＭＭＰ−３タンパクのバンドは、図２のうち、５０ｋＤａ付近に出現した。比較例１の分解抑制剤は、ＭＭＰ−３の発現抑制効果がないため、ＵＶを照射することにより（＋ＵＶ）、ＭＭＰ−３の産生が亢進され、５０ｋＤａ付近に濃いバンドが現れた。一方、実施例１〜３の分解抑制剤は、亢進したＭＭＰ−３の発現が低下した。その結果、５０ｋＤａ付近のバンドが薄くなった。これにより、実施例１〜３の分解抑制剤は、ＭＭＰ−３タンパクに対する発現抑制効果が優れることが示された。
【００５６】
＜処方例＞
次に、本発明の分解抑制剤を用いた処方例を例示する。これら分解抑制剤は、いずれも常法により調製することができる。また、これら処方例の分解抑制剤は、いずれも真皮のマトリックス成分の分解を抑制し、皮膚の老化等が抑制し得ることをあらかじめ確認した。
【００５７】
（処方例１：クリーム）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                    ０．０１
グリセリルモノステアレート                                ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート      ３．０
セタノール                                                ２．０
スクワラン                                                ３．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                          １０．０
グリセリン                                                ７．０
エチルパラベン                                            ０．１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００５８】
（処方例２：クリーム）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        １．０
ステアリン酸                                            １０．０
セタノール                                                ２．０
ラノリン                                                  １．０
ミリスチン酸イソプロピル                                  ３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール                    １．５
トリエタノールアミン                                      ０．８
ソルビトール（７０％）                                    ４．０
メチルパラベン                                            ０．１
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００５９】
（処方例３：リキッドファンデーション）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．１
ヒアルロン酸                                              ０．０１
グリセリルモノステアレート                                ２．０
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム  ０．５
ステアリン酸                                              ５．０
ベヘニルアルコール                                        １．０
ラノリン                                                  ２．０
スクワラン                                                ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                            ４．０
顔料                                                    １０．０
プロピレングリコール                                      ７．０
トリエタノールアミン                                      １．０
エチルパラベン                                            ０．１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００６０】
（処方例４：リキッドファンデーション）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．１
ラノリン                                                  ２．０
流動パラフィン                                            ５．０
ステアリン酸                                              ２．０
セタノール                                                １．０
グリセリン                                                ２．０
スクワラン                                                ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル                            ４．０
顔料                                                    １０．０
プロピレングリコール                                      ７．０
トリエタノールアミン                                      １．０
エチルパラベン                                            ０．１
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００６１】
（処方例５：乳液）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．５
ヒアルロン酸                                              ０．０１
ステアリン酸                                              ２．０
エタノール                                                ０．５
流動パラフィン                                          １０．０
ラノリン脂肪酸イソプロピル                                ３．０
ラノリン                                                  ４．０
スクワラン                                                ５．０
セスキイソステアリン酸ソルビタン                          １．０
プロピレングリコール                                      ５．０
トリエタノールアミン                                      ０．６
エチルパラベン                                            ０．１
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００６２】
（処方例６：乳液）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．５
ステアリン酸                                              ３．５
エタノール                                                ０．５
流動パラフィン                                            ３．０
ラノリン                                                  ０．５
スクワラン                                                ２．０
プロピレングリコール                                      ３．０
トリエタノールアミン                                      ０．８
エチルパラベン                                            ０．１
カルボキシビニルポリマー１％液（アルカリ中和）            ８．０
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００６３】
（処方例７：化粧水）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．０５
ヒアルロン酸ナトリウム                                    ０．０１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン        １．０
１，３−ブチレングリコール                                ３．０
ソルビトール（７０％）                                    ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液                          ３．０
エタノール                                              １５．０
アスコルビン酸                                            ０．１
メチルパラベン                                            ０．１
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【００６４】
（処方例８：化粧水）
青花もしくは白花花弁エキス
（非フラボノイド成分の凍結乾燥品）                        ０．０５
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン        １．０
１，３−ブチレングリコール                                ５．０
ソルビトール（７０％）                                    ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液                          ３．０
エタノール                                              １５．０
アスコルビン酸                                            ０．１
メチルパラベン                                            ０．１
色素                                                      ０．０１
香料                                                      ０．０１
精製水                                                      残部
合計                                                  １００．０
【図１】
0006348890.tif 000003
【図２】
0006348890.tif 000004