(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精神神経疾患における情緒障害の予防または治療に使用するための、二糖であるＧａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、三糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、および五糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含む、ガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項２】
前記精神神経疾患が、うつ病性障害または不安障害である、請求項１に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項３】
粉末、錠剤、カプセル、液体製剤、シロップ、またはソフトトローチの形状である、請求項１または請求項２に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項４】
前記ガラクトオリゴ糖組成物が粉末形状であり、１．６５ｇ〜２０ｇの前記粉末組成物中に１．３５〜９．６ｇのガラクトオリゴ糖を含む、請求項３に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項５】
前記ガラクトオリゴ糖組成物がシロップ形状であり、２．１ｇ〜２５．２９ｇの前記シロップ組成物中に１．３５ｇ〜９．６ｇのガラクトオリゴ糖を含む、請求項３に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項６】
一日一回、毎日経口投与される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項７】
有効量で４時間〜１２時間空けて２回に分けて、毎日経口投与される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項８】
コルチゾール分泌の低下に使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【請求項９】
前記不安障害が不眠症及び心配を含む、請求項２に記載のガラクトオリゴ糖組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおいて精神神経疾患もしくは 障害、または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害の予防または 治療に使用するための、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の混合物を含む組成物に関する。本発明はまた、精神神経疾患もしくは 障害、または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害を、ガラクトオリゴ糖の混合物を含む組成物の有効量を個体に経口投与することにより予防または 治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患を予防とは、リスク因子の減少など、疾患の発生を予防するだけでなく、その進行を阻止し、一旦確立 されたその影響を減少させる医薬組成物または治療の能力を指す（参照：Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ｆｏｒ  Ａｌｌ  Ｓｅｒｉｅｓ．ＷＨＯ，Ｇｅｎｅｖａ，１９８４出典）。
【０００３】
一次予防は、障害の初期発生の予防を目的とし、一方、二次予防および 三次予防は、既存の疾患を阻止、または遅らせて、再発および 慢性症状の定着を減少することを目指す。
【０００４】
認知機能障害とは、思考、記憶、および推論などの、個人の日常機能を妨げるのに十分な重症度の知的機能の低下を指す。これは、老化および認知症患者、特にアルツハイマー病を患う人々に見られることがある。認知機能の障害は、思考能力、集中力、考えを組み立てる能力、推論能力、および記憶力に影響を与え得る。
【０００５】
精神神経疾患または 障害とは、精神症状をもたらす器質的な脳障害または 神経障害を指し、高齢患者に一般に生じる不安障害およびうつ病性障害を含む。
【０００６】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ／Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ；１３；７０１−７１２；（２０１２）におけるＧｒｙａｎ，Ｊ  Ｆおよび Ｄｉｎａｎ，Ｔ  Ｇによるレビューには、無菌動物の研究、および 病原性細菌感染、プロバイオティクス細菌、または抗生物質に曝された動物の研究が、不安、気分、認知、および 痛みの制御における腸管細菌叢の役割をどのように示唆しているかについて記載されている。
【０００７】
プロバイオティクス細菌は、摂取すると宿主に健康上の利益を与え得る、生きている細菌として定義される。
【０００８】
Ｂｒａｖｏ，Ｊ  Ａらは、マウスが摂取した場合、生菌のラクトバチルス・ ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の抗うつ作用および抗不安様作用を実証した（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；１０８；１６０５０−１６０５５；（２０１１）参照）。
【０００９】
Ｂｕｒｎｅｔ，Ｐ  Ｗ  Ｊ  は、腸管常在性の乳酸菌および ビフィズス菌の菌株を増加させる選択的な抗菌剤および プレバイオティクスを使用するさらなる研究により、動物および ヒトの行動および 神経生理学的アウトプットに効果を有する可能性があることを示唆した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；Ｅ１７５；（２０１２）参照）。
【００１０】
プレバイオティクスは、結腸中の１つまたは 限られた数の細菌の成長および／または 活性を選択的に刺激することにより、宿主に好影響を与えて宿主の健康の改善をもたらす、難消化性食品成分として定義される。ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）およびフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、哺乳動物の胃腸の消化酵素に耐性を示すが特定の結腸細菌によって発酵されるプレバイオティクスの例である。
【００１１】
ガラクトオリゴ糖の混合物を含む組成物をヒトなどの哺乳動物に経口投与すると、消化管に存在するニューロンと直接相互作用して、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）のレベルの予想外の増加がもたらされ得ることが、現在では分かっている。具体的には、脳の皮質部分と海馬部分の両方において、ＮＭＤＡＲ  ＮＲＩのタンパク質および／またはｍＲＮＡのレベルの増加が見出され、海馬におけるＮＭＤＡＲ  ＮＲ２Ａタンパク質の上昇も見出された。このことから、このような混合物を含む組成物は、精神神経疾患もしくは 障害、または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害の予防または 治療に有益であり得ることが示唆された。
【００１２】
ＧＯＳ組成物の経口投与により、コルチゾール分泌が低下することも見出されている。コルチゾールはストレスに応答して放出されるので、このことから、組成物が、不安障害およびうつ病性障害の徴候である過剰なコルチゾール分泌を減少させ得ることが示唆される。
【００１３】
ガラクトオリゴ糖の混合物は、二糖であるＧａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、三糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、四糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、および五糖であるＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含んでいた。
【００１４】
このようなガラクトオリゴ糖の混合物は、ラクトースをこのガラクトオリゴ糖の新規混合物に変換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウム・ ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ   ｂｉｆｉｄｕｍ ）の新規菌株を記載する、欧州特許第１６４４４８２号に開示されている。この新規混合物は、腸管においてプレバイオティクス特性および抗炎症性特性を有することが示されている。
【００１５】
このガラクトオリゴ糖混合物は、Ｂｉｍｕｎｏ（登録商標）の名称で市販されており、Ｃｌａｓａｄｏ社（英国、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ）から入手可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のある態様によれば、精神神経疾患もしくは 障害、または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害の予防または 治療に使用するための、上に定義されるようなガラクトオリゴ糖の混合物を含む組成物が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、精神神経疾患もしくは 障害、または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害の予防または 治療のための薬剤の製造における、上に定義されるようなガラクトオリゴ糖の混合物の使用が提供される。
【００１８】
認知機能障害は、老化、認知症、または 統合失調症の結果としての認知機能低下または 認知機能障害であってもよい。精神神経疾患は、うつ病性障害または不安障害であってもよい。不安障害は、身体的健康および 心理的健康の両方に影響を及ぼすことがある、現実または想像上の出来事のいずれかに基づいた、将来への不安についての過剰な反芻、心配、困惑、懸念、および 恐れを特徴とする、種々の異なる形態の一般的な精神障害を含む。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、上に定義されるようなガラクトオリゴ糖の混合物を含む組成物の有効量をヒトなどの個体に投与することを含む、精神神経疾患または 老化で生じる認知機能障害および／または 情緒障害を予防または 治療する方法が提供される。ガラクトオリゴ糖組成物の有効量を、好ましくは一日一回、あるいは数時間空けて、例えば４時間〜１２時間空けて、好ましくは６時間〜１０時間空けて、最も好ましくは８時間空けて、２回に分けて、毎日投与する。
【００２０】
好ましくは、ガラクトオリゴ糖の組成物または 混合物を、凍結乾燥粉末、錠剤、カプセル、シロップなどの液体製剤、または ソフトトローチの形状で、毎日経口投与する。
【００２１】
Ｂｉｍｕｎｏとして公知の製品は、乾燥物質の少なくとも４９％ をガラクトオリゴ糖混合物として含む。組成物の残部は、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アカシアゴム、マルトデキストリン、およびクエン酸などの非活性成分を含んでいてもよい。
【００２２】
粉末組成物は、好ましくは１．６５ｇ〜２０ｇの粉末化した組成物中に１．３５ｇ〜９．６ｇのガラクトオリゴ糖、好ましくは２．５ｇ〜ｌ０ｇの粉末中に１．９６ｇ〜４．９ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは３．０ｇ〜５．５ｇの組成物中に２．７ｇ〜２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を含む。組成物は、飲料、好ましくは温かい飲料に添加してもよく、または、例えば、朝食用シリアルなどの食品に振りかけてもよい。組成物は、果汁、果実飲料、水、コーヒー、ヨーグルト、シリアル、パン、ケーキ、およびビスケットなどの様々な飲食品の成分として添加してもよい。
【００２３】
あるいは 、ガラクトオリゴ糖は、シロップまたは トローチ（脱水シロップ）として提供されてもよく、非活性成分がグルコース、ガラクトース、ラクトース、およびクエン酸を含んでいてもよい。シロップの１日用量は、２．１ｇ〜２５．２９ｇのシロップ組成物中に１．３５ｇ〜９．６ｇのガラクトオリゴ糖混合物、好ましくは３．０ｇ〜１２．９ｇのシロップ中に１．９６ｇ〜４．９ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは４．１ｇ〜７．２５ｇのシロップ中に２．７ｇ〜２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を含んでいてもよい。
【００２４】
本発明のガラクトオリゴ糖組成物は、不安緩解作用を有し、視床下部脳下垂体軸の活性（ストレスホルモン分泌）を低減させ、脳における炎症性反応を低減させる。したがって、Ｂｉｍｕｎｏ  ＧＯＳは、不安障害（例えば心配、不眠症）、うつ病性障害、細菌性髄膜炎による脳炎、単純ヘルペス脳炎、または アルツハイマー病に生じる脳炎の治療または 予防に有益である可能性がある。Ｂｉｍｕｎｏ  ＧＯＳはまた、老化、認知症、および統合失調症における認知障害を改善する可能性もある。さらに、ＧＯＳ組成物は、発生中の胎児脳への母体感染の有害な影響に利点がある可能性がある。
【００２５】
以下の実施例および図面を参照して、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】ラットの前頭皮質および 海馬の抽出物におけるＢＤＮＦタンパク質レベルに対する、ＦＯＳおよび ＧＯＳの効果を示す。
【図１Ｂ】ラットの前頭皮質および 海馬におけるＮＲＩサブユニットレベルに対する、ＦＯＳおよび ＧＯＳの効果を示す。タンパク質抽出物におけるＮＲＩおよびβ−アクチンの免疫活性のウェスタンブロット画像を示す。
【図２】Ａは、ラットの前頭皮質および 海馬におけるＮＲ２Ａサブユニットレベルに対するＦＯＳおよび ＧＯＳの効果を示す。ＮＲ２Ａサブユニットおよびβ−アクチンの免疫活性のウェスタンブロット画像を示す。  Ｂは、ラットの前頭皮質および 海馬におけるＮＲ２Ｂサブユニットレベルに対するＦＯＳおよび ＧＯＳの効果を示す。ＮＲ２Ｂおよびβ−アクチンの免疫活性のウェスタンブロット画像を示す。
【図３】Ａ〜Ｆは、水（Ａ、Ｂ）、ＦＯＳ（Ｃ、Ｄ）、またはＧＯＳ（Ｅ、Ｆ）を経口投与した後のラット海馬における、ＢＤＮＦ（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびＮＲＩサブユニット（Ｂ、Ｄ、Ｆ）のｍＲＮＡ発現の代表的なオートラジオグラフである。矢印は発現増加を示し、矢頭は発現減少を示す。ＤＧ＝歯状回、ＣＡ１およびＣＡ３＝海馬のアンモン角亜領域。スケールバー＝２００μΜ。
【図４】Ａ〜Ｄは、海馬の歯状回（ＤＧ）および 海馬のＣＡ１および ＣＡ３（アンモン角）亜領域における、ＢＤＮＦ、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、および ＮＲ２ＢのｍＲＮＡレベルに対するＦＯＳおよび ＧＯＳの効果を示す。
【図５】ＦＯＳ（Ａ群）、ＧＯＳ（Ｃ群）、およびプラセボ（Ｂ群）の摂取後の成人健常者におけるコルチゾール分泌に対する効果を示す。
【図６Ａ】リポ多糖（ＬＰＳ）注射後の、水給餌マウスにおける自発運動活性に対する効果を示す。
【図６Ｂ】ＧＯＳが、自発運動活性に対するＬＰＳ効果をどのように消失させたかを示す。
【図７】ＬＰＳ処理後のマウスにおいて、ガラス玉覆い隠し試験（ｍａｒｂｌｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ  ｔｅｓｔ）で示される、自然な穴掘り行動および覆い隠し行動に対する効果を示す。
【図８】ＬＰＳ処理後のマウスにおける不安行動に対する効果を示す。（Ａ）待機時間＝暗所（ストレスがそれほど多くない）から明所（ストレスがより多い）に移動するのに要した時間。待機時間が長い＝よりストレスが多い／探策行動の低下。（Ｂ）明所にいた時間＝明所で費やされた時間。時間が長い＝それほど不安でない。
【図９】ＬＰＳ注射後２４時間のマウスの前頭皮質におけるサイトカインレベルに対する効果を示す。
【図１０】ＬＰＳ注射後２４時間のマウスの血漿におけるサイトカインレベルに対する効果を示す。
【図１１】健康なラットにおける認知機能に対するＢＧＯＳの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２７】
実施例１
最終生成物５．５ｇ当たりに、以下を含有する、「スティック包装」で包装された凍結乾燥粉末組成物。
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）混合物    ２．７５ｇ
ラクトース                          １．４０ｇ
単糖（グルコース、ガラクトース）    ０．６４ｇ
乾燥助剤                            ０．２４ｇ
灰分                                ０．２３ｇ
水分                                ０．１９ｇ
タンパク質                          ０．０５ｇ
【００２８】
実施例２
最終生成物７．２５ｇ当たりに、以下を含むシロップ組成物。
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）混合物    ２．７５ｇ
ラクトース                          ０．５８ｇ
単糖（グルコース、ガラクトース）    １．６９ｇ
灰分                                ０．２３ｇ
水分                                １．９５ｇ
タンパク質                          ０．０５ｇ
【００２９】
実施例３
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブユニットに対するプレバイオティクス給餌効果のｉｎ  ｖｉｖｏ研究
材料および 方法
プレバイオティクス投与
ラット実験はすべて、英国内務省ガイドラインに従って、承認済みライセンスの下で実施した。雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２２５〜２５０ｇ）に、５週間（ｎ＝８／群）、水、ＦＯＳ（フルクトオリゴ糖）（４ｇ／ｋｇ）、もしくはＧＯＳ（ガラクトオリゴ糖［Ｂｉｍｕｎｏ］）（４ｇ／ｋｇ）のいずれかを毎日経口投与（経管栄養）した。この用法は、従来の研究（Ａｎｔｈｏｎｙら；Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．；４４（６）；８１９−２６（２００６））、およびこれらのプレバイオティクスの最適用量が最大の細菌叢成長（図示せず）をもたらすことを示す試験的データに基づいた。最終経管栄養の２４時間後、動物をすべて屠殺し、体幹部血液を採取し、脳を取り出した。血液を遠心分離して血漿を得、摘出した脳の半分から前頭皮質および海馬を切り出した。脳全体および単離した領域を、ドライアイス上のイソペンタン中で急速凍結し、使用の前に−８０℃で血漿とともに保存した。
【００３０】
ＢＤＮＦ分析
全ての群から得た皮質組織および海馬組織を、プロテアーゼ阻害剤（「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ」、Ｒｏｃｈｅ社）を含有するＲＩＰＡ（ラジオ免疫沈降アッセイ）緩衝液（１：１０  ｗ／ｖ、英国、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）中でホモジナイズした。タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬（英国、Ｓｉｇｍａ社）を使用して決定した。タンパク質抽出物試料を、脱イオン水で１：５  ｖ／ｖに希釈した後、市販のＢＤＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤＮＦ  Ｅｍａｘ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、英国、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてこれらを分析した。
【００３１】
ウェスタンブロット法
プレバイオティクス群および 対照 群から得た皮質、海馬、または小脳の同濃度のタンパク質抽出物（２０μｇ）を、ローディングバッファー（５０ｍＭの１，４−ジオチトレイトールおよび ０．０２５％ ブロモフェノールブルー）と混合し、分子量マーカー（英国、バッキンガムシャー州、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、７．５％ プレキャストＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（英国、Ｂｉｏｒａｄ社）で電気泳動によって分画し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、英国、ウォトフォード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。
【００３２】
メンブレンを、０．１％ のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（ＰＢＳＴ）中の５％ （ｗ／ｖ）スキムミルクを用いて４５分間ブロッキングし、次いで、３種のＮＭＤＡＲサブユニット、すなわちＮＲ１（ＡＢ９８６４、英国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＮＲ２Ａ（ＡＢ１５５５、英国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、および ＮＲ２Ｂ（ＡＢ１５３６２、英国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）のうちのいずれか、ならびに ｂ−アクチン（英国、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、１：５０，０００に希釈）に対する一次抗体（１：１０００に希釈）を含むインキュベーション緩衝液（２％ ［ｗ／ｖ］ミルクを含むＰＢＳＴ）中で、室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンを、ＰＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中のＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合二次抗体中で３０分間インキュベートした。免疫反応性のバンドは、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓキット（英国、バッキンガムシャー州、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘ  ＡＲ  ｆｉｌｍ）にメンブレンを並置して化学発光により可視化した。抗体はすべて、予想分子量の単一バンドを生成した。ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ３４００を使用して、バンドの光学密度（ＯＤ）を測定し、データは、リン酸化したＮＭＤＡＲサブユニット：全ＮＭＤＡＲサブユニット、または全ＮＭＤＡＲサブユニット：ｂ−アクチンのＯＤ比率として示した。
【００３３】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学（ＩＳＨＨ）
凍結したラット脳半球を、クリオスタット上で冠状に薄切し（１４μｍ）、スーパーフロストプラススライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に載せて解凍して、−８０℃で保存した。（Ｂｕｒｎｅｔら；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．；４６；１６７−７５；（２０１１））に記載されているように、前頭皮質を含む切片を前処理した。
【００３４】
ＢＤＮＦ（８８３〜９２７塩基、ＮＭ００１２７０６３０．１）、ＮＲ１（７４６〜７８０塩基、ＮＭ００８１６９．１）、ＮＲ２Ａ（１６４２〜１６７６塩基、ＮＭ００８１７０．２）、またはＮＲ２Ｂ（１７５８−１７９２塩基、ＮＭ０１０３５０．２）に相補的な、商業的に合成された（英国、ＭＷＧ社）オリゴデオキシリボヌクレオチドを、確立 されているＩＳＨＨ方法（Ｅａｓｔｗｏｏｄら；Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．；２１；６３５−６４４；（２００７））で使用した。オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブを、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（英国、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、［３５Ｓ］−ｄＡＴＰで３′末端標識した。プローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈し、組織切片上にピペッティングし（１×１０６ｃｐｍ／切片）、カバーグラスをかけて、４×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）／５０％ ホルムアミドをしみ込ませた濾紙で内側を覆った蓋付きＰｅｒｓｐｅｘトレーで、３４℃で１６時間超インキュベートした。
【００３５】
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、カバーグラスを除去するために室温にて２×ＳＳＣでリンス、０．５×ＳＳＣで、５５℃、２０分（３回）のリンス、および０．５×ＳＳＣで、室温、３０分（２回）のリンスで行った。スライドをｄｄＨ２Ｏ中ですすぎ、乾燥し、１４Ｃ−マイクロスケールと共に７日〜２８日間、Ｘ線フィルム（Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳ、Ｋｏｄａｋ社）に並置した。前頭皮質灰白質の奥行き全体にわたる平均階調密度（ａｖｅｒａｇｅ  ｇｒａｙ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を、コンピューター支援画像分析を使用してｍＲＮＡのそれぞれについて測定し、１４Ｃ−マイクロスケール標準を使用して組織１ｍｇあたりのｎＣｉに変換した。
【００３６】
ＨＰＬＣ分析
皮質組織（５０ｍｇ）の小断片を、氷冷メタノール（ｌ：１０ｗ／ｖ）でそれぞれホモジナイズし、４℃で１０分間、１３２００ｒｐｍ で、微量遠心機で遠心した。（Ｇｒａｎｔら；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．；８４４；２７８−２８２（２００６））に記載されるように、上澄み液（１０μｌ）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｅｄ  １１００液体クロマトグラフ（カルフォルニア州、パロアルト、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に注入し、オンラインプレカラム誘導体化を行った。簡潔に説明すると、試料（１０μｌ）を等量 の誘導体化試薬［メタノール０．２ｍｌおよび ０．４Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９）０．８ｍｌ中のオルトフタルアルデヒド（２ｍｇ）および Ｂｏｃ−Ｌ−システイン（２ｍｇ）］を用いて、カラム分離の前に５分間反応させた。３０℃で維持したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）および（Ｍｏｒｉｋａｗａら；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．；７５７；１１９−２５（２００１））と同様の分離プロトコールを使用して分離を行った。移動相は、アセトニトリル（Ａ相）および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ＝６（Ｂ相）からなり、１．４ｍｌ／分でカラムを介してポンプで送流した。以下の勾配システムを使用した。（ｍｉｎ／％Ｂ）：０／９１、３５／８４、６５／８４。誘導体化されたアミノ酸の検出は、蛍光検出（発光：４４３ｎｍ、励起３４４ｎｍ）で行った。Ｄアミノ酸およびＬアミノ酸（英国、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の８点較正曲線を、信頼できる標準（０．５〜１０００ｐｍｏｌ）を使用して作図し、各場合において、相関係数＞０．９９５により線形であることが分かった。
【００３７】
データ分析
データはすべて、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示した。群間の統計比較は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）で行った後、事後分析（ＴｕｋｅｙのＨＳＤ法）で行った。
【００３８】
結果
対照 ラットおよび プレバイオティクスラットから得た糞塊中のビフィズス菌
ＦＯＳ給餌ラットから得た糞塊中のビフィズス菌の数（ｌｏｇ１０／ｇとして示した）は、対照 より有意に大きく（９．３５４±０．０５５に対して９．４９８±０．０２５、ｐ＜０．０５）、一方、ＧＯＳ給餌動物から得たビフィズス菌の密度は、対照 ラット（９．３５４±０．０５５に対して９．６２４±０．０５、ｐ＜０．０１）及び ＦＯＳ給餌ラット（９．４９８±０．０２５に対して９．６２４±０．０５、ｐ＜０．０５）のいずれよりも有意に大きかった。
【００３９】
ラット前頭皮質および 海馬におけるＢＤＮＦおよび ＮＲ１に対するプレバイオティクスの効果
前頭皮質抽出物におけるＢＤＮＦタンパク質のレベルは、群間で差がなかった（図１Ａ）。しかし、ＦＯＳ投与ラットの海馬抽出物におけるＢＤＮＦは、対照 動物およびＧＯＳ給餌動物より有意に高かった。ウェスタンブロットにより、ＧＯＳ給餌ラットは、対照 動物およびＦＯＳ動物と比較して有意に高いレベルのＮＲ１免疫活性を前頭皮質に含むことが明らかになった（図１Ｂ）。しかし、海馬の分析によって、ＦＯＳラットは他の群より有意に多くのＮＲ１サブユニットを含むが、対照 と比較してＧＯＳ動物で傾向増加（ｐ＝０．０５５）が観察されたことが明らかになった。
【００４０】
ラット前頭皮質および 海馬におけるＮＲ２Ａおよび ＮＲ２Ｂサブユニットに対するプレバイオティクスの効果
ウェスタンブロットにおいて、ＧＯＳ給餌動物から得た皮質抽出物ではなく、ＧＯＳ給餌動物から得た海馬抽出物が、他の２つの群と比較して有意に大きなＮＲ２Ａ免疫活性を含んでいた（図２）。前頭皮質および海馬におけるＮＲ２Ｂのレベルは、プレバイオティクス給餌による影響を受けなかった。
【００４１】
海馬におけるＢＤＮＦ  ｍＲＮＡおよび ＮＲサブユニットｍＲＮＡに対するプレバイオティクスの効果
プレバイオティクス投与により、海馬の歯状回においてＢＤＮＦ  ｍＲＮＡ（図３のＡ、Ｃ、Ｅ、および 図４のＡ）および ＮＲ１  ｍＲＮＡ（図３のＢ、Ｄ、Ｆ）の存在量が、対照 と比較して増加した。ＧＯＳ給餌ラットのＣＡ３亜領域におけるＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの減少も観察された（図３のＣ）。濃度測定によって、プレバイオティクスラットの歯状回において、有意に高いＢＤＮＦ発現およびＮＲ１発現が確認された（図４のＡ、Ｂ）。ＧＯＳ投与により、対照 動物および ＦＯＳ給餌動物と比較して、歯状回および ＣＡ１亜領域におけるＮＲ２Ａ  ｍＲＮＡが上昇したが（図４のＣ）、ＮＲ２Ｂ  ｍＲＮＡは上昇しなかった（図４のＤ）。
【００４２】
プレバイオティクス投与後の糞便、血漿、および 脳のアミノ酸濃度
この研究により、腸バクテリアの上昇が、腸管および 血行路中のＤ−アミノ酸量を上昇させることによって、中枢のＤアラニンの濃度を増大するか否かを試験した。ＧＯＳ給餌ラットの糞塊における遊離Ｄアラニンの濃度は、対照 動物およびＦＯＳ動物より有意に高く、ＦＯＳ給餌によりこのＤ−アミノ酸の中間レベルとなった（表１）。プレバイオティクスもＧＯＳも、単独で、Ｄ−セリンおよびグルタミン酸を含む他のアミノ酸を上昇させた。血漿では、Ｄ−アラニンのレベルは、対照 動物と比較して、ＧＯＳ給餌ラットで有意に高く（表１）、また、有意ではないが（ｐ＝０．０８６）、ＦＯＳ給餌ラットでわずかな増加が観察された。プレバイオティクス投与によって、他の血中アミノ酸濃度は変化しなかった（表１）。ＧＯＳ給餌ラットは、前頭皮質におけるＤ−セリン濃度が、対照 と比較して有意に高かったが（表２）、皮質および海馬のいずれにおいても他のすべてのアミノ酸レベルはプレバイオティクス給餌後に変化しなかった。皮質のＤ−セリンレベルとＮＲ１タンパク質レベルとの間に全体的な有意な相関があった（ピアソンのｒ＝０．６８４、ｐ＝０．０１）。個々の群分析により、この関連性がＧＯＳ給餌後にのみ有意であることが明らかになった（ＧＯＳ：ｒ＝０．９６、ｐ＝０．０４、ＦＯＳ：ｒ＝０．６８、ｐ＝０．３２、水：ｒ＝０．０１、ｐ＝０．９８９）。
【００４３】
【表１】
0006309612.tif 000002
【００４４】
【表２】
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【００４５】
考察
本発明では、１）ＦＯＳ給餌ラットの海馬ＢＤＮＦレベルは、ＧＯＳ給餌ラットおよび 対照 動物と比較して高かったが、ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡは、ＦＯＳ給餌ラットとＧＯＳ給餌ラットのいずれの歯状回でも増加したこと、２）ＧＯＳ給餌ラットの前頭皮質、および プレバイオティクス給餌動物の海馬におけるＮＲ１タンパク質の上昇、３）ＧＯＳ給餌ラットの海馬において、他の群と比較してＮＲ２Ａタンパク質および それをコードするｍＲＮＡのレベルが高いことが観察された。上記の効果のパターンに基づくと、ＧＯＳの効果は、そのプレバイオティクス特性に基づくのではなく、むしろＧＯＳ混合物中の糖類の化学構造に関連していることが明らかである。
【００４６】
プレバイオティクスは、ラットの海馬ＢＤＮＦを高める
ＦＯＳ給餌ラットにおけるＢＤＮＦおよび それにコードされるタンパク質の発現上昇は、プロバイオティクスビフィズス菌の効果（Ｂｅｒｃｉｋら；Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ．；２３；１１３２−９（２０１１ｂ）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら；Ｂｅｎｅｆ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ；２（３）；１９９−２０７（２０１１））、および 抗菌剤を用いたこれらの種の選択的増殖（Ｂｅｒｃｉｋら；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ；１４１；５９９−６０９（２０１１ａ））と一致している。したがって、ＦＯＳ投与により、ＧＯＳ給餌ラットと比較してビフィズス菌濃度の適度な全体的増加の範囲内で（結果を参照）、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ 、および／または類似の向精神性菌株の定着が、増強された可能性がある。したがってこれらの観察を考慮すると、ＧＯＳが、海馬ＢＤＮＦタンパク質のレベルを変化させなかったこと、さらに、ＦＯＳより大きく変化させなかったことは、驚きであった。本発明では、ＧＯＳ給餌により、海馬の歯状回およびＣＡ３領域のＢＤＮＦ  ｍＲＮＡに相互変化（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｈａｎｇｅ）がもたらされたことが実証された。歯状回のＢＤＮＦ遺伝子発現の上昇は、抗うつ作用と関連している（Ｋｅｒｍａｎ（Ｉ．Ａ．；Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１６９；１１３７−４０（２０１２））。したがって、ＧＯＳ投与後のＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの同様の上昇は、腸バクテリアの潜在的な抗うつ作用／不安緩解作用（Ｂｅｒｃｉｋら；２０１１ａ）と一致する。
【００４７】
ＧＯＳ投与は、ラット皮質のＮＲ１サブユニットを増加させる
対照 およびＦＯＳ動物と比較した、ＧＯＳ給餌ラットにおけるＮＲ１タンパク質の増加は、抗うつ薬、すなわち、セロトニン取込み阻害剤の一種であるフルオキセチンの効果と一致または類似している。最近の臨床試験により、遮断ＮＭＤＡＲが抗うつ作用効果を有することが示唆されている（Ａｕｔｒｙら；Ｎａｔｕｒｅ；４７５；９１−５；（２０１１））。皮質のＮＲ１サブユニットの増加には、ビフィズス菌が数倍増加する必要があり、これは、ＮＲ２ＡサブユニットおよびＮＲ２Ｂサブユニットのレベルの変化を伴わずに起こるということが、データから明らかである。
【００４８】
全体として、ラットへのＧＯＳ投与は、ＦＯＳよりも、ＮＭＤＡＲサブユニットに対して、より大きな効果があるように思われた。すなわち、ＧＯＳは、皮質および 海馬の両方におけるＮＲ１のタンパク質および ／またはｍＲＮＡ、ならびに 海馬におけるＮＲ２Ａを上昇させたが、ＦＯＳは、海馬におけるＮＲ１のみを上昇させた。
【００４９】
脳の健康との関連性
全体として、本発明の研究結果は、精神神経疾患および 老化における認知機能障害および 情緒障害の予防および ／または治療に、ある程度関連性を有している。例えば、統合失調症に罹患している患者は、ＮＭＤＡＲが複合的に関与している作動記憶を含む実行機能に治療抵抗性の障害を示す（Ｃｏｙｌｅ．Ｊ．Ｔ．；Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ．Ｂｕｌｌ．；３８；９２０−６；（２０１２））。したがって、ＧＯＳによるビフィズス菌および 乳酸菌の増大は、現代の薬理的治療および 心理的治療を支援する重要な補助的戦略である。さらに、ＮＭＤＡＲのプレコンディショニングは神経保護の効果を有するため（Ｓｏｒｒｉａｎｏら；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．；２６；４５０９−１８；（２００６））、通常の老化における認知機能低下がＧＯＳの「予防的な」摂取によって予防または妨害される可能性がある。
【００５０】
実施例４−ヒト試験
４５人の健常ボランティアに、２種のプレバイオティクスのいずれか１種（フルクトオリゴ糖［ＦＯＳ］（Ａ群）、または ガラクトオリゴ糖［ＧＯＳ］（Ｃ群））、または プラセボ（Ｂ群）（マルトデキストリン）を３週間投与した。覚醒状態の唾液のコルチゾールを処理の前後に採取した。処理の最終日に、参加者は、情緒的に突出した情報の処理を評価する、コンピューター化された作業課題バッテリーを終了した（情緒性試験バッテリー、ＥＴＢ；Ｈａｒｍｅｒら；Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ；１６１；１２５６−１２６３；（２００４））。
【００５１】
覚醒状態の唾液のコルチゾール応答は、ベースライン時に群間で有意な差はなかったが、ＧＯＳ処理後は、プラセボおよびＦＯＳと比較して有意に低下した（反復測定分散分析における、処理群×採取日×採取時点間の有意な相互作用［Ｆ（８、１６４）＝１．２０、ｐ＝０．０５］）。行動データの分析により、プラセボ処理と比較して、ＧＯＳ後、肯定情報と比べて否定情報に対する注意警戒の低下が明らかになった（群×情緒×遮蔽条件、［Ｆ（２、４１）＝３．１４、ｐ＝０．０５）。ＦＯＳ処理群は、ドットプローブ課題においてプラセボ群と異ならなかった。ＥＴＢの残りの作業課題に対する、プレバイオティクス処理の有意な効果はなかった。
【００５２】
本発明の研究は、ＧＯＳの摂取が健常ボランティアにおけるコルチゾール分泌を低下させることを実証している。さらに、ＧＯＳは、注意警戒によって測定されるような否定的情報に対する肯定情報の処理過程を変化させることが示されており、注意警戒は、不安および抗不安薬による不安の調節において重要な役割を果たすと考えられている（例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇら；Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．；２１；６８４−６９０；Ｍｕｒｐｈｙら；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．；１２；１６９−１７９；（２００８））。
【００５３】
実施例５
マウスにおける、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性疾病行動、病後不安、および サイトカインレベル変化に対するガラクトオリゴ糖混合物の効果
材料および 方法
動物、プレバイオティクス投与、および ＬＰＳ注射
実験はすべて、英国内務省の動物（科学的処置）法（１９８６）に従って、内務省ガイドライン下で実施した。雄ＣＤ１マウス（２５〜３０ｇ、６〜８週齢、英国、Ｈａｒｌａｎ  Ｏｒｌａｃ社）を、１ケージ（プレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）ケージ  ３３×１５×１３ｃｍ（Ｌ×Ｗ×Ｈ））当たり３匹収容し、標準的な管理実験室条件下（１２時間の明暗サイクル、午前７時点灯、２１±１℃、湿度５０±５％ ）で飼育した。動物施設に対する４〜５日の馴化後、マウスに標準的なマウス用固形飼料を不断給餌し、Ｂｉｍｕｎｏとして市販されておりＣｌａｓａｄｏ社（英国）から入手可能な、ガラクトオリゴ糖の１．３％ ｗ／ｖ混合物のプレバイオティクス溶液（以下、ＢＧＯＳと称する）、または飲用水のみのいずれかを、３週間与えた（重量一致、偽似ランダム様式）。予備実験により、このＢＧＯＳ用法が、マウス腸管のビフィズス菌および乳酸菌を最適に増加させることを確認した（英国、Ｃｌａｓａｄｏ社）。群間の潜在的な交差混入を避けるために、２つの食餌群を互いに離して飼育した。３週間後、ＬＰＳ注射および行動試験の２４時間前に、全動物に飲料水のみを与えた。生理食塩水（０．９％ ）中のＬＰＳ（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、または生理食塩水のみの単回投与を、行動試験の４時間前に腹腔内注射によってマウスに投与した。したがって、４つの群（１群あたり１５匹のマウス、１処理当たり５つの異なるケージ）を試験した。すなわち、１）水給餌／生理食塩水注射、２）水給餌／ＬＰＳ注射、３）ＢＧＯＳ給餌／生理食塩水注射、および４）ＢＧＯＳ給餌／ＬＰＳ注射である。この実験を繰り返して、１試験群当たり合計３０匹のマウスを分析した。
【００５４】
自発運動活性（ＬＭＡ）
自発運動活性は、ＬＰＳ処理によって低下する（Ｓｋｅｌｌｙら；（２０１３）ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ８：ｅ６９１２３）ため、疾病行動の判断基準として使用される。ＬＰＳ注射または生理食塩水注射の４時間後、この試験を行った。（呼吸用に空気穴を開けた）透明なプレキシグラスで蓋をし、おがくずの床敷を薄く敷いた透明なプレキシグラスボックス（４８×２７×２１ｃｍ（Ｌ×Ｗ×Ｈ）、Ｐｈｏｔｏ  Ｂｅａｍ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｏｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ社）を準備した。ボックスの照明は、約６０ルクスであった。各動物をボックスの角にそっと置き、２時間、自由に活動領域を探索させた。自発運動活性を、ボックス全域でフォトビームを使用して記録し、動物による経時的なビーム中断数として示した。実験者が試験終了時に糞塊の数を計数し、動物をホームケージに戻して次の行動試験の前に休ませた。
【００５５】
ガラス玉の覆い隠し（ｍａｒｂｌｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ）
この試験は、ストレスの多い状況で物体を覆い隠そうとするマウスの本能行動に基づいた、抗不安薬および 抗うつ薬のスクリーニング、ならびに 不安および 強迫行動の評価に使用される（Ｄｅａｃｏｎ  Ｒ．Ｍ．；Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ；（２００６）；１（１）；１２２−１２４、Ｎｉｃｏｌａｓら；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．；（２００６）；５４７；１０６−１１５）。ＬＰＳ処理、および関連するＬＰＳ誘発性疾病行動により、マウスによって覆い隠されるガラス玉の数の減少が引き起こされる（Ｎｊｕｎｇ’ｅ＆Ｈａｎｄｌｅｙ；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．；（１９９１）；３８（１）；６３−６７）。ガラス玉の覆い隠しは、ＬＰＳ／生理食塩水注射の７時間後に行われた。２０個のガラス玉を、透明プラスティックケージ（４４×２８×１２ｃｍ、Ｌ×Ｗ×Ｈ）の中の５ｃｍ厚のおがくずの床敷の上に、各列４個で５列に、互いに２ｃｍずつ離し、ケージの縁から２ｃｍ離して配置した。試験は、通常の室内照明下（床上１ｍで約１００ルクス）、既述の方法（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｌ．ら；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．；（２００７）；１５（４）；６１９−６２６）で、（Ｄｅａｃｏｎ，Ｒ．，２００６）の推奨を使用して行った。各動物を、３０分間、ガラス玉を備えたケージにそっと置き、その後、その表面の少なくとも２／３が覆い隠されたガラス玉の数を計数した。
【００５６】
明暗箱
この試験も、不安行動を評価するために使用され、新奇性に対する誘惑と明るく開放的な活動領域に対する恐怖とに直面した葛藤状態のマウスに基づいている（Ｂｏｕｒｉｎ，Ｍ．およびＨａｓｃｏｅｔ，Ｍ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００３）；４６３（１−３）；５５−６５；Ｏ’Ｌｅａｒｙ，Ｔ．Ｐ．ら；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；（２０１２）；２０３；３１５−３２４．ｄｏｉ：Ｓ０１６５−０２７０（１１）００５９４−２１）。不安が低いマウスは、恐ろしい場所、すなわち、明所でより多くの時間を過ごし、不安が高いマウスは、安全な暗所でより多くの時間を過ごす。ＬＰＳ処理により、この試験で不安行動が増加することが示された（Ｂａｓｓｉら；Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．；（２０１２）；１１０（４）；３５９−３６９）。ＬＰＳ／生理食塩水注射の２４時間後、この試験を行った。
【００５７】
２つの彩色した木製のコンパートメント、すなわち小さな黒いコンパートメント（２１×１６×１６ｃｍ（Ｌ×Ｗ×Ｈ）、３×２．７ｃｍ（Ｗ×Ｈ）の明所にアクセスするための小さな開口部を有する）、およびより大きな明るいコンパートメント（４６．５×２１×２１ｃｍ（Ｌ×Ｗ×Ｈ））を準備した。試験は、箱の明るいコンパートメントの内側が５０ルクスのわずかな薄明りの下、既述のように（Ｓｔｒｅｋａｌｏｖａ  Ｔ．ら；Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；（２００４）；２９；２００７−２０１７）行った。各動物を明暗箱の暗所にそっと置き、５分間、箱全体を自由に探索させた。暗所を出るまでの待機時間、暗所と明所との間の移動回数、および明所滞在時間を測定した。いずれかのコンパートメントに入ったと判断する基準は、４本の足が入った状態とした。手順の終了時、マウスを、同一ケージ飼育マウスと一緒にホームケージに戻した。各動物間の匂いの合図（ｏｄｏｕｒ  ｃｕｅ）を明らかなアルコール臭を生ずることなく除去するために、１０％ アルコールをわずかにしみ込ませたティッシュで箱を掃除した。部屋にはバックグラウンドノイズはなく、実験者は、試験中のスコアリングのために在室していた。動物が明所に入るまでの待機時間が長く、コンパートメント間の移動回数が少なく、明所にいる時間が短い場合は、動物はより不安を感じているため、ＬＰＳ注射による影響を受けたと見なされた。
【００５８】
組織採取
行動試験の３時間後、１２時〜午後１時の間に動物を屠殺した。脳全体を直ちに摘出し、ドライアイス上の冷イソペンタン（英国、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で急速凍結した後、次の分子分析まで−８０℃で保存した。体幹部の血液は、カリウムＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）試験管中に回収し、５０００ｒｐｍ で１５分間遠心した。血漿を単離し、次のコルチコステロン分析のために−８０℃で保存した。研究の全体にわたって、糞塊を、各ケージからＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の７０％ グリセロールに回収し、次の細菌計数のために−２０℃で保存した。
【００５９】
データ分析
データを、ＳＰＳＳソフトウェア（バージョン１９）を使用して分析した。データの正規性は、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を用いて試験した。自発運動活性を、二元配置分散分析を用いて評価し、他のすべてのデータを、一元配置分散分析（またはノンパラメトリックデータに対してＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を用いて評価し、その後、Ｔｕｋｅｙの事後検定を実施した。すべてのデータは平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示され、統計的有意性の閾値をｐ＜０．０５とした。
【００６０】
結果
即時型ＬＰＳ誘発性疾病行動に対するＢＧＯＳの効果：自発運動活性およびガラス玉覆い隠し
生理食塩水と比較して、水給餌動物は、ＬＰＳ注射後の自発運動活性の低下を示した（図６Ａ、時間効果、Ｆ（５、２６０）＝１４２．１２、ｐ＜０．０００１；ＬＰＳ注射の効果、Ｆ（１、５２）＝３．６１、ｐ＝０．０６３；時間×ＬＰＳ注射の交互作用  Ｆ（５，２６０）＝５．１２、ｐ＜０．００１）。事後検定により、水−ＬＰＳ動物が移動した距離は、３０分および４０分の時点で、生理食塩水動物と比べて有意に短い（いずれもｐ＜０．０５）ことが明らかになった。ＢＧＯＳは、依然として時間の効果があったが（Ｆ（５、２６０）＝１１３．０１、ｐ＜０．０００１）、ＬＰＳ注射の効果がなく（Ｆ（１、５２）＝１．１２、ｐ＝０．３）、時間×ＬＰＳ注射の交互作用の効果もなかった（Ｆ（５、２６０）＝０．１２、ｐ＝０．９９）ので、自発運動活性に対するＬＰＳの効果を消失させた（図６Ｂ）。水生理食塩水群と比較して、ＢＧＯＳは、生理食塩水動物における自発運動活性に差異をもたらさなかった。
【００６１】
ガラス玉覆い隠し試験（図７）では、ＬＰＳはマウスの行動に有意な効果を有していたが（Ｈ（ｄｆ＝３）＝１３．７９、ｐ＜０．０１）、ＬＰＳが投与された、水処理動物（ｐ＜０．０５）およびＢＧＯＳ処理動物（ｐ＜０．０５）のいずれも、生理食塩水給餌動物と比較して覆い隠されたガラス玉が少なかったので、この効果はＢＧＯＳでは消失しなかった。水生理食塩水群と比較して、ＢＧＯＳは、生理食塩水動物における覆い隠されたガラス玉数に差異をもたらさなかった。
【００６２】
遅延型ＬＰＳ誘発性不安行動に対するＢＧＯＳの効果：明暗箱
ＬＰＳは、水給餌動物の不安行動を増加させた（図８）。この効果は、明所に入るまでの待機時間（図８のＡ、Ｈ（ｄｆ＝３）＝１２．１７、ｐ＜０．０１）および明所にいた時間（図８のＢ、Ｆ（３、１０６）＝４．７１、ｐ＜０．０１）によって評価されるように、ＢＧＯＳにより消失した。実際に、事後検定によって、水−ＬＰＳ動物は、生理食塩水動物（ｐ＜０．０１）だけではなく、生理食塩水−ＬＰＳ動物およびＢＧＯＳ−ＬＰＳ動物のいずれ（いずれもｐ＜０．０５）よりも有意に２倍高い、待機時間を示すことが明らかになった。水−ＬＰＳ動物はまた、他のすべての群より、有意に短い明所滞在時間を示した（ｐ＜０．０５  すべての群に対する水−ＬＰＳ）。しかし、暗所と明所との間の移動回数には、群間で統計的な差異はなかった（図３のＣ、Ｆ（３、１１０）＝１．７、ｐ＝０．１７）。ＢＧＯＳ単独では、水−生理食塩水動物と比較して、いずれのパラメータにおいても、対照 マウス（すなわち、生理食塩水を投与されたマウス）に差異をもたらさなかった。
【００６３】
ＬＰＳの２４時間後の免疫パラメータに対するＢＧＯＳの効果：前頭皮質および 血漿のサイトカインレベル
前頭皮質において、ＬＰＳは、ＩＬ−１０に関してではなく、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および ＩＬ−６に関して、水動物における変化を引き起こして、ＢＧＯＳ動物には変化を引き起こさなかった（図９）。事後検定によって、水ＬＰＳ動物は、他のすべての群と比べて高いＴＮＦ−α（ｐ＜０．０５）、高いＩＬ−１β（水生理食塩水に対して、および ＢＧＯＳ生理食塩水に対してｐ＜０．０１、ＢＧＯＳ  ＬＰＳに対してｐ＜０．０５）、および 高いＩＬ−６（水生理食塩水に対してｐ＜０．０５）を呈することが示された。したがって、生理食塩水注射またはＬＰＳ注射のいずれかを受けたＢＧＯＳ給餌動物に対するサイトカインレベルはいずれも、対照 の水生理食塩水動物のサイトカインレベルと類似していた。
【００６４】
血漿では、ＬＰＳは、ＴＮＦ−αに関して、水動物における有意な変化を引き起こしたが、ＢＧＯＳ動物には有意な変化を引き起こさなかった（図１０）。しかし、ＩＬ−６および ＩＬ−１０、ならびに ＩＬ−１βに関しては、群間で全体的な統計的差異はなかったが、これらに関しては、ＬＰＳは、生理食塩水と比較して、水動物において有意でない２倍の増加を引き起こした。
【００６５】
考察
本研究は、マウスのＬＰＳ誘発性疾病行動、不安、およびサイトカイン発現に対するプレバイオティクス（ＢＧＯＳ）摂取の影響を試験し、ＢＧＯＳ（Ｂｉｍｕｎｏ）が免疫系を介して脳機能に影響を与えるという仮定に基づいたものであった。本発明の２つの重要な研究結果は以下の通りである。すなわち、１）ＢＧＯＳ給餌マウスは、対照 と比較して、ＬＰＳ単回投与後の自発運動活性（ＬＭＡ）障害および 不安を示さず、２）血漿における炎症促進性メディエーター（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）；ＩＦＮγ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカイン）、および 脳における炎症促進性メディエーター（ＴＮＦａ）のＬＰＳ誘導性の発現は、ＢＧＯＳの摂取によって抑制された。全体として、本発明のデータは、ＢＧＯＳ（Ｂｉｍｕｎｏ）が脳の健康維持に重要な役割を果たしており、免疫負荷に対する応答の修飾がこの作用を補強する可能性があるという現在の考えを支持している。
【００６６】
実施例６
健康なラットの認知機能に対するＢＧＯＳの効果
材料および方法
正常なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、３週間、水、またはＢＧＯＳの１．３％ ｗ／ｖ混合物であるプレバイオティクス溶液を投与し、次いで、標準プロトコールを使用して、注意セット移行課題（ａｔｔｅｎｔｉｏｎａｌ  ｓｅｔ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｔａｓｋ）（ＡＳＳＴ）（Ｂｉｓｓｏｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｂ．ら；Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；（２０１３）；２５０；９１−１０１参照）について試験した。
【００６７】
結果
図１１は、３週間、ＢＧＯＳ投与ラットが、柔軟学習（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）の判断基準であるＡＳＳＴの次元外（ＥＤ）要素において能力の改善を示したことを示す。次元内移行相（ＩＤ／ＥＤ移行）と同じくらい簡単にＥＤ要素を遂行することは、高齢者において障害されるパラメータである認知の柔軟性の向上を示唆する。図１１では、対照 ＩＤと比較して＃ｐ＜０．０５、および対照 ＥＤと比較して＊ｐ＜０．０５である。
【００６８】
結論
ＢＧＯＳ投与ラットは、精神障害および老化において障害されることが多い内側前頭前野に依存する作業課題における認知機能の改善を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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