(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域；並びに
配列番号４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域；
を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、配列番号７の配列を有することを特徴とする請求項１に記載のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域は、配列番号８の配列を有することを特徴とする請求項１に記載のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１１または配列番号１２の核酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養することと、この培養物からｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を分離することを含む、ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗体またはこれの断片に関し、より詳細にはヒトＦｖ（ＳｃＦｖ）ファージライブラリーから分離されたｃ−Ｍｅｔに高い親和度及び特異性を有する完全ヒト抗体及び前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された細胞及び前記細胞を培養してｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）は、細胞表面の受容体であり、受容体チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）キナーゼファミリー（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）の癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であり、５０ｋＤの細胞外ドメインだけで構成されたアルファ（α）サブユニットと細胞外、細胞膜透過、チロシンキナーゼドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、そしてリン酸化と関連したチロシンモチーフ（ｍｏｔｉｆ）で構成された合計１４５ｋＤのベータ（β）サブユニットで構成されていることが明らかになった（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４；３１８（６０４４）：３８５，１９８５；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１８）：６３７９，１９８７，Ｍａｇｇｉｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７３：１８３，１９９７）。不適切なｃ−ＭｅｔやＨＧＦの発現は多くのタイプの悪性腫瘍と関連されて、過発現する場合、その予後が良くないと報告されている（ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ，Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１５：２２０７，２００９）。
【０００３】
ｃ−Ｍｅｔは、ＨＧＦに反応して、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を介した様々な信号伝達経路を刺激して癌細胞及び血管細胞の分裂（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を増進させて、細胞死滅を抑制して、血管形成と細胞外基質（ＥＣＭ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）に浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を誘導するなど癌化過程（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を促進させる（Ｊｅｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７４：５０５，１９９６；Ａｍｉｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：４９５，１９９７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２３９：６３９，１９９７；Ｃｏｒｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１５１，１９９７）。特に、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａｓ，Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：５３９１，１９９７）、乳癌（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，５：１５，１９９６；Ｔｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４８：２２５，１９９６）、膵臓がん（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：５７７５，１９９４）、胸膜中皮腫（ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａｓ，Ｔｏｌｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２４：２９１，１９９８；Ｋｌｏｍｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６：２４０，１９９８）など様々な癌組織と細胞でｃ−ＭｅｔとＨＧＦが同時に過発現すると報告されているが、ＨＧＦと関係なくｃ−Ｍｅｔの過発現を介しても癌への発達が進行される場合がよく観察されていて、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０（５）：１２３１，１９９６）、胃癌（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８２：２１１２−２１２２（１９９８）、肺癌（Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８０：３８９，１９９６）、腎臓癌（Ｎａｔａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６９：２１２，１９９６）、卵巣癌（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，６０：９５，１９９５）、大腸癌（Ｈｉｓｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１５：５１３，１９９７）などがその良い例である。このようにｃ−Ｍｅｔが活性化したり過発現する場合、癌化過程が促進されるので、ｃ−Ｍｅｔの活性化を抑制する様々な方法が有望な坑癌治療戦略として開発されている。例えば、ｃ−ＭｅｔにＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が結合するのを妨害するように考案された低分子化合物が挙げられる。これらの低分子化合物にはＦｅｒｍｅｎｔｅｋ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＫ２５２ａ、スゲン（Ｓｕｇｅｎ）社のＳＵ１１２７４、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）社のＰＨＡ−６６５７５２等（Ｍｏｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１（３２）：４８８５，２００２；Ｂｅｒｔｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３（３１）：５３８７��２００４；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３（２１）：７３４５，２００３）があって、これらはｃ−Ｍｅｔのリン酸化を妨害して、信号伝達の下流タンパク質が活性化できないように考案された。しかし、これらの低分子化合物の短所は、ｃ−Ｍｅｔによるリン酸化だけを特異的に阻害できないところにある。
【０００４】
また、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ信号伝達機序を中和する二回目の方法として、ｃ−ＭｅｔとそれのリガンドであるＨＧＦの結合を阻害する方法がある。このような方法には、損失されたＨＧＦ断片（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ＆  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，９４（４）：３２１，２００３）や、ＨＧＦを中和する抗体（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．，９８（１３）：７４４３，２００１；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２：１２９２，２００６；Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６６（３）：１７２１，２００６）または元のＨＧＦより強い親和力でｃ−Ｍｅｔに結合するが、ｃ−Ｍｅｔを活性化はさせないＨＧＦ前駆体（ｐｒｏ−ＨＧＦ，Ｍａｚｚｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４（１０）：１４１８，２００４）を使用する方法などがある。さらにファージディスプレイ法（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）及びパニング技術（ｐａｎｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を利用してｃ−Ｍｅｔの活性を抑制できるペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）配列を選別することによって、該当ペプチドをｃ−Ｍｅｔ活性化防止に利用することもある（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，３５４：１１５，２００７）。選別されたペプチドは、ｃ−Ｍｅｔが過発現した生体内組織や器官を探索するための分子映像に適用されることもある（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（２０）；６０４９，２００７）。これらはただＨＧＦ依存的なｃ−Ｍｅｔ活性化だけ阻害するとの限界を有しているが、実験室で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で実際の坑癌効果を示しているので、既存の坑癌治療と併合するなどの応用を介して有用に使用できると思われる。また、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）キナーゼ抑制剤であるｇｅｆｉｔｉｎｉｂとｅｒｌｏｔｉｎｉｂは、効果的な癌治療剤として使用されているが、たびたび薬剤耐性が生じたることもあるが、その原因がｃ−Ｍｅｔ受容体の集中的な増幅に起因すると報告されており（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６（５８２７）：１０３９，２００７）、従ってｃ−Ｍｅｔ抑制物を併合処理すれば坑癌効果が増幅されると期待する。
【０００５】
また、ｃ−Ｍｅｔは、ＨＧＦによって活性化されて、それ自体で新生血管形成に寄与することと知られて、新生血管形成の主な受容体であるＶＥＧＦＲ−２と相互作用を介して、新生血管形成を刺激すると知られている。この時、ｃ−ＭｅｔをＶＥＧＦＲ−２と同時にターゲッティングして阻害する場合、ヒト異種移植モデルで腫瘍成長が相乗的に阻害されることを観察することができた（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＤｒｕｇｓ，１３：１１２，２０１０）。
【０００６】
ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの間の調節障害（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）及びｃ−Ｍｅｔの過発現は、転移癌の進行に重要な役割を果たすと知られていて、従ってｃ−Ｍｅｔに対する抗体は、拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として抗癌剤への開発が多くなされてきている。
【０００７】
そこで、本発明者等はｃ−Ｍｅｔに高い親和度を有して特異的に結合することができ、ヒト由来配列からなり体内投与時免疫反応誘発の可能性が低いｃ−Ｍｅｔヒト抗体を開発しようと鋭意努力した結果、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ファージライブラリー（ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）からファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技術を利用してｃ−Ｍｅｔに高い親和度及び特異性を有して結合する完全ヒト抗体を分離して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ｃ−Ｍｅｔに高い親和度及び特異性を有するｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域を提供するところにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ｃ−Ｍｅｔに高い親和度及び特異性を有するｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域を提供するところにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域；及びｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの断片を提供するところにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域またはｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供するところにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記組換え細胞を利用したｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の製造する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域を提供して、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域を提供する。
【００１５】
また、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域を提供して、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域を提供する。
【００１６】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域；及び
配列番号４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域；
を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの断片を提供する。
【００１７】
ましくは、本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの断片は、配列番号７で表される重鎖可変領域と、配列番号８で表される軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
また、本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域またはｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記前記組換え細胞を培養してｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を生成させる段階；及び前記生成されたｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を回収する段階を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明でスクリーニングされたｃ−Ｍｅｔ特異的ＳｃＦｖのｃ−Ｍｅｔに対する結合能力を示したものである。
【図２】本発明に係る１Ｅ４−ＳｃＦｖのｃ−Ｍｅｔに対する結合能力を示したものである。
【図３】１Ｅ４−ＩｇＧの重鎖不変領域と重鎖可変領域を含むベクターであるｐＩＧＨＤ−１Ｅ４Ｈｖｙの系列地図を示したものである。
【図４】ＩｇＧの軽鎖不変領域と軽鎖可変領域を含むベクターであるｐＩｇＧＬＤ−１Ｅ４Ｌｇｔの系列地図を示したものである。
【図５】精製された１Ｅ４−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示したものである。
【図６】本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の分散能（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）をＭＤＣＫ−２細胞株を介して確認した結果を示したものである。
【図７】本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体のｃ−Ｍｅｔのリン酸化能をウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示したものである。
【図８】本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体のマウスｃ−Ｍｅｔとヒトｃ−Ｍｅｔに対する結合能力を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２３】
本発明に係る抗体は、ｃ−Ｍｅｔに高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有して特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合することができて、ヒトから由来した配列からなっている。
【００２４】
一観点において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域に関する。
【００２５】
他の観点において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域に関する。
【００２６】
さらに他の観点において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域；及び
配列番号４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域；
を含むｃ−Ｍｅｔ特異的抗体またはこれの断片に関する。
【００２７】
具体的に、本発明では一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ファージライブラリー（ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）からファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技術を利用してｃ−Ｍｅｔに高い親和度及び特異性を有して結合する完全ヒト抗体を収得した。ファージライブラリーの製造及びファージディスプレイは、米国登録特許第７０６３９４３号、米国登録特許第６１７２１９７号などに公示された通り製造して実施することができる。
【００２８】
前記方法を介して収得されて提供される本発明に係るｃ−Ｍｅｔ−特異的抗体は、各々配列番号１、２及び３の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖可変領域ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域と、各々配列番号４、５及び６の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を有する。
【００２９】
本発明の一様態で、本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体は、配列番号７の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号８の配列を有する軽鎖可変領域からなる１Ｅ４抗体である。
【００３０】
さらに本発明は、各々配列番号１、２及び３で表示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と及び各々配列番号４、５及び６で表示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を提供する。好ましくは１Ｅ４抗体の配列番号７で表示される重鎖可変領域及び配列番号８で表示される軽鎖可変領域を提供する。
【００３１】
【表１】
0006434147.tif 000002
【００３２】
前記のような本発明に係る抗体の断片も同じ目的に使用可能であるが、本発明における抗体の断片は、ｃ−Ｍｅｔに対する結合機能を保有した単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、デュアル−特異抗体、ミニボディ、スキャップ、ＩｇＤ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、抗体不変領域誘導体、足場タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に基づいた人工抗体などが含まれるか、これに限定されない。ｃ−Ｍｅｔに対する結合機能が維持される限り、本発明に係るいかなる形態の抗体の断片も本発明に係る抗体と同じ特性を示す点は、通常の技術者には自明である。
【００３３】
本発明に係る抗体断片は、全抗体の切断または前記断片をコードするＤＮＡを発現させて製造することができる。抗体断片は、公示文献に記載された方法によって製造することができる（Ｌａｍｏｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６：２３５，１９８３；Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５，１９８３）。
【００３４】
本発明におけるＳｃＦｖは、リンカーを介して重鎖及び軽鎖可変領域配列が互いに連結できるが、リンカーはアミノ酸リンカーが使用されることが好ましく、本発明に係る１Ｅ４抗体のＳｃＦｖでのリンカーのアミノ酸配列は、配列番号９、全ＳｃＦｖは配列番号１０の配列であり得る。
【００３５】
本発明の一様態ではｃ−Ｍｅｔ特異ヒト抗体である１Ｅ４の場合、ＨＧＦ処理なくでも、ｃ−Ｍｅｔをリン酸化させることを確認して、犬の腎臓上皮細胞であるＭＤＣＫ−２細胞を利用して細胞分散能を確認した結果、陽性対照群であるＨＧＦ処理細胞群と同じ程度の細胞分散能を示すことが確認された（図６）。
【００３６】
また、本発明の抗体の特性が維持される限り、可変領域内での変移が起きた抗体も本発明の権利範囲に含まれる。その例として、可変領域でのアミノ酸の保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が挙げられる。保存的置換は、本来のアミノ酸配列と類似する特性を有する他のアミノ酸残基への置換を意味するが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンは、塩基の側鎖を有していて、類似する特性を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸は、酸側鎖を有する点で類似する特性を有する。また、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンは、比電荷極性の側鎖を有する点で特性が類似して、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンは、非極性の側鎖を有している点で、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンは、芳香族の側鎖を有している点で類似する特性を有する。従って、前記の通りに類似する特性を有するグループ内でのアミノ酸置換が起きても特別な特性変化が見られない点は、通常の技術者には自明なことであるため、本発明に係る抗体の特性が維持される限り、可変領域内での保存的置換による変移が起きた抗体も本発明の権利範囲に含まれる。
【００３７】
また、本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体には指定突然変異（ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）またはチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）等の方法によって親和度及び特異性が改善された抗体も含まれる。親和度及び特異性は、ＣＤＲを突然変異させて、目的とする特徴を有する抗原結合位置に対してスクリーニングすることにより変形または改善できる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２５４：３９２，１９９５）。ＣＤＲは様々な方式で突然変異されるが、例えば一つ方法で、同じ抗原結合位置の集団で２０個のすべてのアミノ酸が特定位置で発見されるように開発残基または残基の組み合わせをランダム化させることができ、また、突然変異を起こすエラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ方法によってＣＤＲ残基の範囲に亘って突然変異を誘発させることもできる（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２２６：８８９，１９９２）。重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）可変性部位（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子を含有するファージディスプレイベクター（ｐｈａｇｅｍｉｄ）はＥ．ｃｏｌｉの突然変異菌株で繁殖する（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９，１９９６）。このような突然変異誘発方法は、当業界で通常使用される方法である。
【００３８】
また、本発明に係る抗体またはその断片は、他の物質と接合された複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形態でも利用可能である。これにより、本発明では本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体と治療用薬物が結合された抗体−薬物接合体を提供する。本発明に係る抗体−薬物接合体に利用できる治療用薬物は本発明の目的に合致するのであれば、いずれも制限せず使用可能である。
【００３９】
本発明では本発明に係る抗体またはその断片を含む薬剤学的組成物を提供する。前記薬学組成物には、薬学的に許容可能な通常の担体及び賦形剤などが追加的に含まれることができる。
【００４０】
さらに他の観点において、本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。
【００４１】
本発明に係る抗体またはその断片の可変領域をエンコードするポリヌクレオチド配列は、重鎖可変領域の場合、配列番号１１、軽鎖可変領域の場合、配列番号１２で表示される配列を有することが好ましいが、これに限定されず縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、すなわち配列番号７及び配列番号８で表示される重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をエンコードするが、他のポリヌクレオチド配列を有するものも使用可能である点は本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者（以下「通常の技術者」という）には自明なことであり、本発明で提供される各重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列をエンコードするポリヌクレオチド配列も配列番号１〜６で表示される各ＣＤＲ配列から通常の技術者ならば自明に導出できるものである。
【００４２】
【表２】
0006434147.tif 000003
【００４３】
本発明は、前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクター及びこれを含む宿主細胞、そして前記組換えベクターまたは宿主細胞を利用して本発明に係るｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗体を製造する方法を提供する。特に遺伝子組換え方法で発現及び精製して製造することが好ましいが、具体的に、本発明に係るｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗体をコードする可変領域を各々別々に、または一つの宿主細胞で同時に発現させて製造することが好ましい。また、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をエンコードするポリヌクレオチドが本発明に係る抗体のＮ−末端に位置するようにして抗体の生産に利用されることができる。また、生産された抗体の分離精製及び分析を容易にするために、タグ（ｔａｇ）が付けられるが、代表的なタグはｈｉｓ−タグであるが、これに限定されない。
【００４４】
本発明で「組換えベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００４５】
本発明で「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と目的するタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で周知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができて、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、本発明が属する技術分野で一般に知られた酵素などを使用して容易に行うことができる。
【００４６】
本発明の適した発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終結コドンは、一般に免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされて、遺伝子作製物が投与された時、個体で必ず作用を示すべきであり、コード配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）になければならない。一般プロモーターは、構成的または誘導性でありうる。原核細胞にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７プロモーターがあるが、これに制限されない。真核細胞には猿ウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）由来のプロモーターがあるが、これに制限されない。
【００４７】
前記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。選択マーカーはベクターで形質感染された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されることができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が処理された環境で選別マーカーを発現する細胞だけ生存するので、形質感染された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターである場合、複製が開始される特定核酸配列である複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。
【００４８】
外来遺伝子を挿入するための組換え発現ベクターでは、プラスミド、ウイルス、コズミド（ｃｏｓｍｉｄｓ）等様々な形態のベクターを使用することができる。組換えベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の種々の宿主細胞で所望の遺伝子を発現して所望のタンパク質を生産する機能をする限り特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しながら自然状態と類似した形態の外来タンパク質を大量生産できるベクターが好ましい。
【００４９】
本発明に係る二重標的抗体を発現させるために種々の発現宿主／ベクターの組合せが利用されることができる。核細宿主に適した発現ベクターとしては、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス及びレトロウイルスから由来した現調節配列などが使用されるが、これに限定されない。
【００５０】
細菌宿主に使用できる発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴＲ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示することができるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性一本鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。特に、大腸菌での発現のためには、アントラニレーイト合成酵素（ＴｒｐＥ）及びカルボキシ末端のポリリンカーをコードするＤＮＡ配列を含むことができ、他の発現ベクターシステムは、β−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；λＰＬマルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づく（Ｇｅｎｅ  ６７：３１，１９８８；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：１６７，１９９０）。
【００５１】
酵母で発現させることが要望される場合に、酵母で私用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹｒｐ７に存在するｔｒｐｌ遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９，１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，遺伝子，７：１４１，１９７９）。Ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン内で成長する能力が欠乏した酵母のミュータント菌株、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１に対する選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２，１９７７）。従って、酵母宿主細胞ゲノム内にｔｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファンの不在下に成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。それと類似するようにｌｅｕ２−欠陥酵母菌株（ＡＴＣＣ２０，６２２または、３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を含有する公示のプラスミドによって補完される。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体であり、昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１である。
【００５２】
本発明における発現ベクターには、発現するＤＮＡ配列または断片に作動可能に連結された一つ以上の発現調節配列を含むことができる。発現調節配列は、クローニングされるＤＮＡ配列の発現を制御または調節するため、ベクターに挿入される。有用な発現調節配列としては、例えば、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ・ラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、酵母の糖分解（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）プロモーター、例えば、３−ホスホグリセレート・キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−接合因子のプロモーター、及びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、及びシミアン・ウィルス由来のプロモーター、例えば、初期及び後期プロモーター又はＳＶ４０、並びに原核又は真核細胞及びそれらのウィルス又はそれらの組換え体の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列およびこれらの種々の組合せが含まれる。
【００５３】
さらに他の観点においで、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された組換え細胞に関する。
本発明で前記組換え細胞は、前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター及び前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターで形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００５４】
さらに他の観点においで、本発明は、前記組換え細胞を利用したｃ−Ｍｅｔ抗体またはその断片の生産方法に関するものであり、前記組換え細胞を培養して、これの培養物からｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を分離することを特徴とし、
【００５５】
好ましくは本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体は、遺伝子組換え方法で発現及び精製して収得することが好ましいが、抗体の重鎖可変領域または重鎖全体領域をコードする遺伝子配列及び軽鎖可変領域または軽鎖全体領域をコードする遺伝子配列を一つのベクターまたは二つのベクターで別々に発現させることができるが、これに限定されない。
【００５６】
具体的に、前記ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の製造方法は、本発明のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体をコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入して組換えベクターを製造する段階；前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換させて培養する段階；及び前記培養された形質転換体からｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を分離、精製する段階を含むことができる。
【００５７】
また、組換えベクターが発現する形質感染体を栄養培地で培養することによって、本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を大量生産できて、培地と培養条件は、宿主細胞により慣用できるものを適当に選択利用することができる。培養時細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適切に調節することができる。
【００５８】
前記通り組換え的に生産されたｃ−Ｍｅｔ特異的抗体は、培地または細胞分解物から回収できる。膜結合型である場合、適した界面活性剤溶液（例、トリトン−Ｘ１００）を使用するかまたは酵素的切断によって膜から遊離され得る。ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体発現に使用された細胞は、凍結−解凍純化、音波処理、機械的破壊または細胞分解剤のような様々な物質的または化学的手段によって破壊でき、通常の生化学分離技術によって分離、精製が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））。電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、エレクトロフォーカシング及びこれの様々な変化及び複合方法などが利用可能であるが、これに限定されない。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６０】
実施例１：バイオパニング（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
バイオパニングに使用された完全ヒト非免疫単鎖抗体（ＳｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーは、既に登録された登録特許（韓国登録特許１０−０８８３４３０）で確立されたファージディスプレイライブラリーを使用した。単鎖抗体がディスプレイされたファージを回収するために、ファージライブラリー原液を対数期（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで成長させて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）でレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）した後、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｅｎｉｃｏｌ，Ｃｍ）と７０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）を含有する２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ／Ｃｍ＋、Ｋａｎ＋）で１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して３０℃で一夜増幅させた。
【００６１】
ヒトＦｃを利用して抗−ヒトＦｃ  ＳｃＦｖを示すファージを除去して、他の非特異的結合を遮断させるために、ファージ製剤を４％ＰＥＧ６０００／０．５Ｍ  ＮａＣｌ中沈殿させて、５００μｇ／ｍｌのヒトＦｃタンパク質を含有する２％脱脂乳／ＰＢＳ内に再懸濁させて３７℃で１時間インキュベーションした。
【００６２】
ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ  Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ（ｃａｔ  ｎｏ．３５８−ＭＴ／ＣＦ））５μｇ／ｍｌでコーティングされた９６ｗｅｌｌ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を室温で２時間、２％脱脂乳／ＰＢＳで先に遮断させた後、室温で１時間３Ｘ１０１１ｐｆｕのファージ製剤を接種した。前記チューブをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で５回洗浄した後、ＰＢＳで５回洗浄した。結合型ファージを室温で１０分間１００ｍＭトリエチルアミンの溶液を使用して湧出させた。湧出されたファージを１０ｍｌのミドログ（ｍｉｄ−ｌｏｇ）期ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞と共に３７℃で３０分間静置させた後、３０分間振とう培養した。続いて感染したＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を１％ｇｌｕｃｏｓｅが含まれた２ｘＹＴ／Ｃｍ＋プレートで３０℃一夜培養した。１次パニング後、２次、３次、４次のパニングは、洗浄回数を１０回、１５回、２０回に順次増加させて実施した。４次パニングを実施した後確保されたファージのｃ−Ｍｅｔ結合能力をｃ−Ｍｅｔ結合アッセイを介して再度確認した。
【００６３】
Ｍｅｔ結合アッセイのために１００ｎｇのｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を一夜の間コーティングしたマイクロプレートに２％脱脂乳／ＰＢＳで３７℃で２時間反応させた。前記マイクロプレートをＰＢＳで洗浄した後、パニング別に得られたファージを室温で１時間反応させた。前記反応液をＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｍ１３抗体（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を常温で１時間反応させた。反応が終わったｗｅｌｌをＴＭＢ溶液（ＢＤ）を利用して発色させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した（図１）。
その結果、１Ｅ４、１Ａ５、１Ｄ９、２Ｈ３、３Ｄ１及び３Ｆ１がｃ−Ｍｅｔに結合能力を有していることが確認された。
【００６４】
実施例２：可溶性ＳｃＦｖの生産及び精製
実施例１でｃ−Ｍｅｔ結合能が確認された１Ｅ４−ＳｃＦｖ、１Ａ５−ＳｃＦｖ、１Ｄ９−ＳｃＦｖ、２Ｈ３−ＳｃＦｖ、３Ｄ１−ＳｃＦｖ及び３Ｆ１−ＳｃＦｖに対して、可溶性１Ｅ４−ＳｃＦｖ、１Ａ５−ＳｃＦｖ、１Ｄ９−ＳｃＦｖ、２Ｈ３−ＳｃＦｖ、３Ｄ１−ＳｃＦｖ及び３Ｆ１−ＳｃＦｖを製造するために、ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇを介して確保したｐＡＫ−１Ｅ４、ｐＡＫ−１Ａ５、ｐＡＫ−１Ｄ９、ｐＡＫ−２Ｈ３、ｐＡＫ−３Ｄ１及びｐＡＫ−３Ｆ１をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断して１Ｅ４−ＳｃＦｖ、１Ａ５−ＳｃＦｖ、１Ｄ９−ＳｃＦｖ、２Ｈ３−ＳｃＦｖ、３Ｄ１−ＳｃＦｖ及び３Ｆ１−ＳｃＦｖ配列を有する断片を確保して、前記断片を同じ制限酵素を利用して確保した大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ２１ｂ−６Ａ６、Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）に挿入することによって、ｐＥＴ２１ｂ−１Ｅ４、ｐＥＴ２１ｂ−１Ａ５、ｐＥＴ２１ｂ−１Ｄ９、ｐＥＴ２１ｂ−２Ｈ３、ｐＥＴ２１ｂ−３Ｄ１及びｐＥＴ２１ｂ−３Ｆ１製作を終えた。前記製作されたｐＥＴ２１ｂ−１Ｅ４、ｐＥＴ２１ｂ−１Ａ５、ｐＥＴ２１ｂ−１Ｄ９、ｐＥＴ２１ｂ−２Ｈ３、ｐＥＴ２１ｂ−３Ｄ１及びｐＥＴ２１ｂ−３Ｆは、タンパク質発現のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて、これにより可溶性ＳｃＦｖタンパク質を発現させた後、細胞を遠心分離して、２０％スクロースと２００μｇ／ｍｌのリゾチーム及びプロテアーゼ阻害制カクテル（Ｒｏｃｈｅ、スイス）が含まれた５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液を利用して細胞のペリプラズム分画（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を確保した。確保された分画をＮｉ−ＮＴＡ  ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してＳｃＦｖタンパク質を精製した。
【００６５】
実施例３：ＳｃＦｖを利用したｃ−Ｍｅｔ結合アッセイ
実施例２で精製された可溶１Ｅ４−ＳｃＦｖ、１Ａ５−ＳｃＦｖ、１Ｄ９−ＳｃＦｖ、２Ｈ３−ＳｃＦｖ、３Ｄ１−ＳｃＦｖ及び３Ｆ１−ＳｃＦｖがｃ−Ｍｅｔに対する結合能力があるか否かを確認した。これのために、ｃ−Ｍｅｔ  １００ｎｇを９６ｗｅｌｌ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で４℃で一夜の間コーティングした後、２％脱脂乳／ＰＢＳを利用して３７℃で２時間反応させた。反応が終わったプレートをＰＢＳで洗浄した後、精製されたＳｃＦｖを入れた後、１時間室温で反応させた。反応が終わったプレートをＰＢＳを利用して洗浄した後、ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−Ｍｙｃマウス抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を添加して常温で１時間反応させた後、ＴＭＢ溶液で反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図２に示されたように、精製された１Ｅ４−ＳｃＦｖ、１Ａ５−ＳｃＦｖ、１Ｄ９−ＳｃＦｖ、２Ｈ３−ＳｃＦｖ、３Ｄ１−ＳｃＦｖ及び３Ｆ１−ＳｃＦｖ共にｃ−Ｍｅｔに結合能力を有することが確認された。
【００６６】
実施例４：ＩｇＧ発現及び精製
全ＩｇＧの形態で発現させるために、全不変領域を含む重鎖及び軽鎖発現ベクターを製造した。重鎖の場合は、ｈｕｍａｎ  ４−１  ｂｂの中鎖骨格を有しているｐＩｇＧＨＤベクター（Ａｐｒｏｇｅｎ、韓国）をＳｆｉＩで処理した後、ｐＡＫＳｃＦｖの重鎖可変領域をＳｆｉＩで処理した断片とライゲーションして全重鎖不変領域と重鎖可変領域を含む発現ベクターであるｐＩｇＧＨＤ−１Ｅ４Ｈｖｙ、ｐＩｇＧＨＤ−１Ａ５Ｈｖｙ、ｐＩｇＧＨＤ−１Ｄ９Ｈｖｙ、ｐＩｇＧＨＤ−２Ｈ３Ｈｖｙ、ｐＩｇＧＨＤ−３Ｄ１Ｈｖｙ及びｐＩｇＧＨＤ−３Ｆ１Ｈｖｙを製作した（図３）。
【００６７】
軽鎖の場合は、ｈｕｍａｎ  ４−１  ｂｂの軽鎖骨格を有しているｐＩｇＧＬＤベクターをＢｓｔＸＩで処理した後、ｐＡＫ−ＳｃＦｖの軽鎖可変領域をＢｓｔＸＩで処理した断片とライゲーションして全軽鎖不変領域と軽鎖可変領域を含む発現ベクターであるｐＩｇＧＬＤ−１Ｅ４Ｌｇｔ、ｐＩｇＧＬＤ−１Ａ５Ｌｇｔ、ｐＩｇＧＬＤ−１Ｄ９Ｌｇｔ、ｐＩｇＧＬＤ−２Ｈ３Ｌｇｔ、ｐＩｇＧＬＤ−３Ｄ１Ｌｇｔ及びｐＩｇＧＬＤ−３Ｆ１Ｌｇｔを製作した（図４）。
【００６８】
ＩｇＧ発現のために同量の軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションさせた。トランスフェクションさせた細胞は、ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｆｒｅｅ  ｓｙｔｌｅ  ２９３で培養させた（３７℃、５％ＣＯ２）後培地を収集した。製造者によって記述されたプロトコルに従ってｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって合わせた上澄み液から１Ｅ４−ＩｇＧ、１Ａ５−ＩｇＧ、１Ｄ９−ＩｇＧ、２Ｈ３−ＩｇＧ、３Ｄ１−ＩｇＧ及び３Ｆ１−ＩｇＧを精製した。上澄み液を２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）と１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で平衡化させたｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムに注入して、２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）と１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた溶液で洗浄した後、１００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．３）溶液で湧出した。湧出されたタンパク質は１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和させた。湧出されたタンパク質を５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．０）バッファーと１：１で混ぜた後、５０ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．０）で平衡化させたｐｒｅｐａｃｋｅｄ  ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）カラム注入した。カラムに結合されたタンパク質は、５０ｍＭ  ＮａＣｌが含まれたｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．０）バッファーで湧出して、湧出バッファーで平衡化させたｐｒｅｐａｃｋｅｄ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入して結合しなかったタンパク質を収得した。収得されたタンパク質は、３０Ｋｄ  ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮してＰＢＳで透析した。前記方法で精製された１Ｅ４−ＩｇＧ、１Ａ５−ＩｇＧ、１Ｄ９−ＩｇＧ、２Ｈ３−ＩｇＧ、３Ｄ１−ＩｇＧ及び３Ｆ１−ＩｇＧタンパク質中一部のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図５に示した。
【００６９】
実施例５：ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の分散能（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析
前記６種のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の分散能（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を調べるために、犬の腎臓上皮細胞であるＭＤＣＫ−２（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ−２）を培養した。２ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で２４−ウェルプレートに５％ウシ胎児血清が添加されたＤＭＥＭで培養した。一日の間培養後、細胞がプレートによく付いて育った時、１０μｇ／ｍｌの抗体または３０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦを処理した。１６時間培養後、Ｃｈｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で染色して、写真を撮って細胞がどの程度分散して成長したかを評価した（図６）。
その結果、図６に示された通り、６種の抗体中１Ｅ４を処理した場合にのみ陽性対照群であるＨＧＦ処理群と同様に細胞が分散して育つことを確認することができた。
【００７０】
実施例６：ウェスタンブロッティング法を介した細胞内ｃ−Ｍｅｔリン酸化分析
実施例５で示された１Ｅ４の作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としての活性を再確認するために、ウェスタンブロッティング法を介してｃ−Ｍｅｔ特異的抗体である１Ａ５と１Ｅ４のｃ−Ｍｅｔに対するリン酸化活性を測定した。ｃ−Ｍｅｔを過発現する直膓癌細胞株であるＨＴ２９細胞を２Ｘ１０５ずつ６ウェルプレートで２４時間培養して、ウシ胎児血清を含まない、ＲＰＭＩ培地条件で６時間無血清培地処理後、１０μｇ／ｍｌのｈＩｇＧとｃ−Ｍｅｔ抗体を３０分間先処理した。以後、処理群に３０ｎｇ／ｍｌのヒトＨＧＦを１５分間処理した。
【００７１】
ウェスタンブロッティング法を介した分析のために、溶菌緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ），２ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ａｎｄ  １ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，  １  Ｘ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ））を処理して溶解質を得て沸騰させた後、４℃で１００００ｇで５分間遠心分離して非溶解性沈殿物を除去した。上澄み液をＳＤＳサンプルバッファーと混ぜて１０分間沸騰させて準備した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングは当業界で通常使用される方法を準用して、使用された試料は次の通りである：４−２０％  ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ、米国）、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ０００１０、米国）、ｃ−Ｍｅｔリン酸化活性分析のための１次抗体としてａｎｔｉ−ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、米国）とａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）；ａｎｔｉ−ｐ−Ｅｒｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）とそして化学発光法のために１次抗体と結合する２次抗体としてＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）及びＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）（図７）。
その結果、図７に示された通り、１Ｅ４の場合は単独処理時にもｃ−Ｍｅｔに対するリン酸化能を有することを確認することができた。
【００７２】
実施例７：抗ｃ−Ｍｅｔ  ＩｇＧ（１Ｅ４−ＩｇＧ）の結合力分析
ｃ−Ｍｅｔに対する抗体の結合力を分析するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して測定した。製造者のマニュアルに従ってＣＭ５チップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上にｍｏｕｓｅ−ｃ−Ｍｅｔとｈｕｍａｎ−ｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を固定した後、様々な量の抗体を流すことによってセンソグラムを確保した。各々の濃度で確保されたセンソグラムを基に速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを測定して速度定数の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎからＫｄを計算した（表３）。その結果、１Ｅ４−ＩｇＧはｈｕｍａｎ−ｃ−Ｍｅｔだけでなくｍｏｕｓｅ−ｃ−Ｍｅｔとも高い結合力を示した（図８）。
【００７３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係るｃ−Ｍｅｔ特異的抗体は、ｃ−Ｍｅｔに高い親和度を有して特異的に結合できるだけでなく、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）機能を有している。
【００７５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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