(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ゴムラテックス、ｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液であり、
前記緩衝液の含有量が天然ゴムラテックス１００質量部に対して５０質量部以下であり、
前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度が５００〜５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬであるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液。
【請求項２】
さらに、天然ゴム粒子の凝集阻害剤を含有する請求項１記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液。
【請求項３】
前記天然ゴム粒子の凝集阻害剤として、０．５ｍＭ以上の酸化防止剤を含有する請求項１または２記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液。
【請求項４】
前記緩衝液の含有量が１２質量部以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる凍結工程、ならびに
凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法。
【請求項６】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる温度が−２５℃以下である請求項５記載の輸送および／または保存方法。
【請求項７】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる温度が−７５℃以下である請求項５記載の輸送および／または保存方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法を適用した後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ抽出工程の前に、
前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を含む請求項８または９記載のＲＮＡ抽出方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ抽出工程が、ホットフェノール法によるＲＮＡ抽出工程である請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液、該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法および保存方法、ならびに該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）により採取することにより得られる。
【０００３】
天然ゴムは、主にゴムノキの乳管と呼ばれる細胞内で生産されるラテックス中に天然ゴム粒子として存在し、これを加工することにより製造される。天然ゴム粒子を含むラテックス（以下、天然ゴムラテックスとする）の採取は、一般的に、ゴムノキの幹に溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出するラテックスを回収することにより行われている。
【０００４】
天然ゴムは乳管細胞内で生合成されていることは知られているが（例えば非特許文献１参照）、その生合成機構はいまだ未解明な部分が多く、早期の解明が期待されており、天然ゴムラテックス中のＲＮＡを解析することは天然ゴムの生合成機構解明において有効である。しかしながら、ＲＮＡは非常に分解されやすい物質であり、効率的に天然ゴムラテックス中のＲＮＡを抽出する方法は確立されていない。天然ゴムの生合成機構の早期解明のためにも効率的な抽出方法の確立が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】河原成元ら、日本ゴム協会誌、第８２巻、第１０号、４１７−４２３（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液、該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法および保存方法、ならびに該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討の結果、天然ゴムラテックス中に存在するポリフェノールや多糖類、天然ゴム粒子などが効率的なＲＮＡ抽出を阻害していること、特に天然ゴム粒子が凝集することによりＲＮＡの抽出効率が大幅に低下することを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、天然ゴムラテックス、ｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液であり、前記緩衝液の含有量が天然ゴムラテックス１００質量部に対して５０質量部以下であり、前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度が５００〜５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬであるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液に関する。
【０００９】
さらに、天然ゴム粒子の凝集阻害剤を含有することが好ましい。
【００１０】
前記天然ゴム粒子の凝集阻害剤として、０．５ｍＭ以上の酸化防止剤を含有することが好ましい。
【００１１】
前記緩衝液の含有量が１２質量部以下であることが好ましい。
【００１２】
また、前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる凍結工程、ならびに凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法に関する。
【００１３】
前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる温度が−２５℃以下であることが好ましく、−７５℃以下であることがより好ましい。
【００１４】
また、前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法に関する。
【００１５】
さらに、前記の輸送および／または保存方法を適用した後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法に関する。
【００１６】
前記ＲＮＡ抽出工程の前に、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を含むことが好ましい。
【００１７】
前記ＲＮＡ抽出工程が、ホットフェノール法によるＲＮＡ抽出工程であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液および該溶液を用いた本発明のＲＮＡ抽出方法によれば、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができる。
【００１９】
また、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法によれば、ＲＮＡの抽出効率を悪化させることなく輸送および／または保存することができるため、本発明の輸送および／または保存後もＲＮＡを効率的に抽出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液＞
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスに中性領域の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有することを特徴とする。なお、本明細書中の天然ゴムラテックスとは後述する植物から採取されたものであり、採取後、何も処理を行っていない天然ゴムラテックスを意味する。すなわち、後述の緩衝液の含有量は、植物から採取した天然ゴムラテックス（未処理）１００質量部に対して添加する緩衝液の量を意味する。
【００２１】
前記天然ゴムラテックスの由来としては、天然ゴムを生合成して産出する植物であれば特に限定されない。例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ．ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（ＳｏｌｉｄａｇｏｇｉｇａｎｔｅａＡｉｔ．ｖａｒ．ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａＦｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｖｅｎｕｓｔｕｍＨ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｈｏｎｄｏｅｎｓｅＮａｋａｉ）、カントウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍＤａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅＷｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（ＦｉｃｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）、イヌビワ（ＦｉｃｕｓｅｒｅｃｔａＴｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓａｍｐｅｌａｓＢｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（ＦｉｃｕｓｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓＭｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓｉｒｉｓａｎａＥｌｍ．）、ガジュマル（ＦｉｃｕｓｍｉｃｒｏｃａｒｐａＬ．ｆ．）、オオバイヌビワ（ＦｉｃｕｓｓｅｐｔｉｃａＢｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、およびＰａｒｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラ���ムノキ、ノゲシ、グアユール、およびロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００２２】
天然ゴムラテックスの採取方法は特に限定されず、従来からのゴムノキなどの幹に溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出するラテックスを回収する方法などとすることができる。
【００２３】
また、天然ゴムラテックスを採取する時間帯は特に限定されないが、恒常的な転写を示すＲＮＡの抽出が目的であれば、ラテックスの量を確保できる日の出前に採取することが望ましい。しかし、目的遺伝子によっては、外部の刺激（光、温度、ホルモン応答など）によりＲＮＡの転写量が増減することから、目的とする遺伝子の転写に合わせた時間帯に採取すればよい。
【００２４】
天然ゴムラテックスの固形分濃度は、２５〜６０ｗ／ｖ％が好ましく、３５〜５０ｗ／ｖ％がより好ましい。固形分濃度が２５ｗ／ｖ％未満の場合は、遠心分離後にゴム層がうまく形成されず、ゴム粒子の除去率が低下する傾向がある。また、６０ｗ／ｖ％を超える場合は、ラテックス粘度が高まり、天然ゴムラテックスの採取が困難となる恐れがある。
【００２５】
天然ゴムラテックスは、分散質である天然ゴム粒子が水に分散した不均一系であり、成分の多くは天然ゴム粒子であるが、それ以外にもポリフェノール、多糖類、蛋白質などのその他成分が含まれており、ＲＮＡもその他成分として天然ゴムラテックス中に含まれている。通常のＲＮＡ抽出方法では、ＲＮＡが不安定となる塩基性になることを防ぐため、ＲＮＡ抽出用溶液を酸性側に調整するが、天然ゴムラテックスは酸性環境下で凝集するという性質がある。ゴム粒子が凝集してしまうと、その後、遠心分離などによるゴム粒子とＲＮＡを含む水層との分離が非常に困難となり、効率的なＲＮＡ抽出を妨げる要因となっている。
【００２６】
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、前記中性領域の緩衝液を含有することにより、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液が、ＲＮＡが不安定となる塩基性になること、およびゴム粒子が凝集する酸性になることを併せて防ぐことができる。
【００２７】
前記緩衝液のｐＨは５．０以上であり、６．０以上が好ましく、７．２以上がより好ましい。５．０未満の場合は、ゴム粒子が凝集しやすくなりＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。また、該ｐＨは９．０以下であり、８．０以下が好ましく、７．８以下がより好ましい。９．０を超える場合は、溶液中のＲＮＡが不安定となりＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。なかでも、ｐＨ７．５の緩衝液とすることが最も好ましい。
【００２８】
天然ゴムラテックスが含有する緩衝液の成分としては、中性の緩衝液であって、前記ｐＨの範囲で緩衝能を発揮し得る成分であれば特に限定されない。例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液がゴム粒子の凝固に対する影響が少ないという理由から好ましい。
【００２９】
緩衝液の天然ゴムラテックス１００質量部に対する含有量は、５０質量部以下であり、２０質量部以下がより好ましく、１２質量部以下がさらに好ましい。５０質量部を超える場合は、溶液中のＲＮＡ濃度が薄くなり過ぎ、抽出効率が低下する傾向がある。また、該含有量は５質量部以上が好ましく、１０質量部以上がより好ましい。５質量部未満の場合は、緩衝能が不十分となり、ＲＮＡが不安定となり抽出効率が低下する傾向がある。
【００３０】
また、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中の緩衝成分の濃度は、０．００１Ｍ以上が好ましく、０．０１Ｍ以上がより好ましく、０．０５Ｍ以上がより好ましい。０．００１Ｍ未満の場合は、緩衝能が不十分となり、ＲＮＡが不安定となり抽出効率が低下する傾向がある。また、緩衝成分の濃度は、１．０Ｍ以下が好ましく、０．５Ｍ以下がより好ましく、０．２５Ｍ以下がさらに好ましく、０．１Ｍ以下が特に好ましい。１．０Ｍを超える場合は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の効果が低下する恐れがある。
【００３１】
天然ゴムラテックス中にも、ＲＮＡを分解するＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ）が存在する。該ＲＮＡ分解酵素や、後の工程での混入の恐れが高いＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を阻害するため、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液はＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有する。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、特に限定されず、通常のＲＮＡ抽出などに用いられるＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いることができる。
【００３２】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中のＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度は、５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上であり、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上が好ましい。５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ未満の場合は、ＲＮＡ分解酵素の阻害効果が弱く、ＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度は、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下であり、２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下が好ましい。５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬを超える場合は、コストが高くなり、コストに見合った効果が得られない傾向がある。
【００３３】
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、さらに天然ゴム粒子の凝集阻害剤を含有することが、ＲＮＡの抽出効率がさらに向上するという理由から好ましい。
【００３４】
本発明における天然ゴム粒子の凝集阻害剤とは、含有することで天然ゴム粒子の凝集を阻害する性質を発揮するものであれば、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されない。このような凝集阻害剤としては、酸化防止剤、界面活性剤などが挙げられる。
【００３５】
なかでも酸化防止剤は、本発明者が、酸化により茶変した天然ゴムラテックスが、茶変していないものに比べて天然ゴム粒子の凝集が起こりやすい傾向があることを見出し、天然ゴム粒子の凝集阻害剤として効果を発揮することを見出したものであり、前記の天然ゴムラテックス、中性の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤に加えて含有することで、ＲＮＡ抽出効率をさらに向上させることができる。
【００３６】
前記酸化防止剤としては、それ自体がＲＮＡの分解を促進するようなものでなければ、特に限定されないが、メルカプト基を有するものが好ましく、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）やβ−メルカプトエタノールなどが挙げられる。なかでも、酸化防止能力が高く、少量の添加で済むため、ゴム粒子への影響が少ないという点で、ＤＴＴが特に好ましい。
【００３７】
酸化防止剤を含有する場合のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中の濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、１．０ｍＭ以上がより好ましく、２．０ｍＭ以上がさらに好ましい。濃度が０．５ｍＭ未満の場合は酸化防止剤を含有することによる効果が得られ難い傾向がある。また、酸化防止剤の濃度は、１０ｍＭ以下が好ましく、８ｍＭ以下がより好ましく、５ｍＭ以下がさらに好ましい。濃度が１０ｍＭを超える場合は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の効果が低下する恐れがある。
【００３８】
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスに、前記の所定の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤、必要に応じて天然ゴム粒子の凝集阻害剤などを添加するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製工程により調製される。なお、該調製工程は必要に応じて撹拌などを含んでよい。
【００３９】
天然ゴムラテックスの採取から前記調製工程を行うまでの時間は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されないが、天然ゴムラテックスをゴムノキから採取した後、３０分以内が好ましく、１０分以内がより好ましい。３０分を超える場合は酸化やＲＮＡの分解が進行してしまい、ＲＮＡ抽出効率が低下する傾向がある。
【００４０】
＜輸送方法および保存方法＞
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法は、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる凍結工程、ならびに凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法は、ゴムノキから採取した天然ゴムラテックスを採取した場所（例えば、タイ、マレーシアなどの農場であるが、特に限定されない）から、凍結させたＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送する方法である。
【００４２】
また、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存方法とは、ゴムノキから採取した天然ゴムラテックスを採取してから、凍結させたＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、ＲＮＡ抽出作業を行う時まで保存する方法や、前記輸送の後にＲＮＡ抽出作業を行う時まで保存する方法である。なお、輸送の後保存する場合であって、保存工程で添加する成分などがある場合は、一度融解させてから添加すればよい。
【００４３】
前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有させた溶液であるが、さらに凍結させることにより溶液のｐＨ変化、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を防ぐことができ、ＲＮＡの抽出効率を悪化させることなく輸送および／または保存することができる。
【００４４】
前記輸送方法および保存方法における凍結工程は、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる工程である。すなわち、該凍結工程はＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製工程の後であって、輸送工程および保存工程の前に行う工程である。該凍結工程を行う場合の、天然ゴムラテックスの採取から凍結工程を開始するまでの時間は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されないが、天然ゴムラテックスをゴムノキから採取した後、１時間以内が好ましく、３０分以内が好ましく、１０分以内が好ましい。１時間を過ぎる場合は酸化やＲＮＡの分解が進行してしまい、ＲＮＡ抽出効率が低下する傾向がある。
【００４５】
前記凍結工程において凍結させる温度は、−２０℃以下が好ましく、−７５℃以下がより好ましい。−２０℃より高い場合は、ラテックスが十分に凍結しない恐れがある。また、凍結させる温度の下限は特に限定されず、通常−１９６℃以上であればよい。
【００４６】
前記輸送工程としては特に限定されず、飛行機などによる空路、自動車や鉄道などによる陸路、船舶による海路のいずれによる輸送でもよいが、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の凍結状態を維持したまま輸送する必要があり、凍結させた温度以下を維持して輸送することが好ましい。
【００４７】
また、前記保存工程は凍結したＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の凍結状態を維持できるものであれば特に限定されず、フリーザー、ドライアイス、液体窒素などを用いて保存することができる。保存温度は凍結状態を維持できる温度であれば特に限定されないが、凍結させた温度以下が好ましい。
【００４８】
＜抽出方法＞
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含むことを特徴とする。また、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液には、前記の輸送および／または保存方法を適用した後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液も含む。
【００４９】
前記ＲＮＡの抽出工程としては特に限定されず、従来行われているＲＮＡの抽出工程を採用することができる。例えばチオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法などを採用することができる。また、例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ  ＭＩＮＩ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）などのキットを用いた抽出工程としてもよい。なかでも、一度に多くの量を処理できるという理由からホットフェノール法とすることが好ましい。
【００５０】
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記ＲＮＡ抽出工程を行う前に、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、ゴム粒子を含む層とＲＮＡを含有する水層とに分離することができ、ゴム粒子を除去することができるため、ＲＮＡの抽出効率が向上する。
【００５１】
前記遠心分離の遠心速度は特に限定されないが、２００００×ｇ以上が好ましく、小さなゴム粒子も分離することができることから５００００×ｇ以上がより好ましい。
【００５２】
遠心分離を行う温度は特に限定されないが、ＲＮＡの分解を防ぐという理由から、１℃以上が好ましく、３℃以上がより好ましい。また、１０℃以下が好ましく、５℃以下がより好ましい。なかでも、遠心分離を行う温度は４℃が特に好ましい。
【００５３】
遠心分離を行う時間は特に限定されないが、ゴム粒子の除去精度を高める観点から、３０分間以上が好ましく、４５分間以上がより好ましい。また、ＲＮＡの分解を防ぐという理由からは９０分間以下が好ましく、６０分間以下がより好ましい。
【実施例】
【００５４】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例などで用いる天然ゴムラテックスは全て共通し、タイにおけるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のものを氷冷しながら採取後、何も処理を行わず、そのまま使用した。また実験に用いる器具はＲＮＡ分解酵素の混入を防ぐため、適切な方法によりＲＮＡ分解酵素除去処理を行い、さらに作業者は手袋とマスクを着用したうえで操作を行った。
【００５５】
＜実施例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１０分前に採取した天然ゴムラテックス９ｍＬに、２０ｍＭのＤＴＴおよび５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｉｎ（プロメガ株式会社製のリボヌクレアーゼ阻害剤）を含有する１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１ｍＬ（天然ゴムラテックス１００質量部に対して１１質量部）添加し、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを調製した。
【００５６】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを、ドライアイス（−７９℃凍結）を用いて凍結させた。天然ゴムラテックスの採取から凍結開始までの時間は１５分であった。そして、凍結させた溶液は、ドライアイスで凍結を維持させたまま、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。溶液の凍結状態を維持するために、輸送途中にドライアイスの追加を行った。
【００５７】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内にフリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００５８】
ゴム粒子の分離、除去
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａ１０ｍＬを、４５分、４℃、２００００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、上層に分離されたゴム粒子層にスパチュラ穴を開け、水層を採取し定量した。水層が白く濁っていない（ゴム粒子が残っていない）ことを確認し、次の操作に進んだ。
【００５９】
ＲＮＡの抽出
採取した水層の内６ｍＬを別容器に移し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。そして、６５℃で５分間インキュベートした後、ボルテックスにより溶液を撹拌した。撹拌後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい容器に採取した。採取した上清にフェノール：クロロホルム（５０：５０）を１２ｍＬ添加し、２分間振盪後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい容器に採取した。採取した上清にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を１２ｍＬ添加し、２分間振盪後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し上清を新しい容器に採取した。さらに、上清に３Ｍ酢酸ナトリウムを１．２ｍＬ、イソプロパノールを１３ｍＬ添加し、ボルテックスで撹拌の後、−２０℃で３０分インキュベートし、１０分、４℃、５０００×ｇで遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで１ｍＬで２度洗浄し、乾燥させたのち、０．２ｍＬのＲＮａｓｅフリーの水に溶解させることで抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００６０】
＜実施例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製、輸送および保存を行った。
【００６１】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００６２】
＜実施例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＤＴＴを含有しない１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は実施例１と同様にＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｂを調製した。
【００６３】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｂを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送した。
【００６４】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｂを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、終濃度が２．０ｍＭとなるようにＤＴＴを添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００６５】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００６６】
＜参考例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを調製した。
【００６７】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを、凍結させずに４℃を維持して、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。
【００６８】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａ（輸送工程で凍結なし）を、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００６９】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００７０】
＜参考例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮａｓｉｎを含有しない１００Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は実施例１と同様にＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｃを調製した。
【００７１】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｃを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送した。
【００７２】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｃを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、終濃度が５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｉｎを添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００７３】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００７４】
＜実施例４＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
【００７５】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、ＤＴＴの終濃度が１．５ｍＭとなるように、５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｉｎを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍＬ添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００７６】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００７７】
＜参考例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
【００７８】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に冷蔵庫（４℃）に入れて、そのまま２箇月間保存した。
【００７９】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００８０】
＜参考例４＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
【００８１】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｃを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、ＲＮａｓｉｎの終濃度が３７０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように、２０ｍＭのＤＴＴを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍＬ添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
【００８２】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００８３】
＜比較例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを調製した。ＤＴＴ、ＲＮａｓｉｎの終濃度も同じになるように調製した。
【００８４】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送、保存、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行った。
【００８５】
＜比較例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを調製した。ＤＴＴ、ＲＮａｓｉｎの終濃度も同じになるように調製した。
【００８６】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送および保存を行った。
【００８７】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００８８】
＜比較例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＤＴＴおよびＲＮａｓｉｎを含有しない１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅを調製した。
【００８９】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅを、凍結させずに４℃を維持して、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。
【００９０】
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｅを、冷蔵庫（４℃）に入れて、そのまま２箇月間保存した。
【００９１】
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
【００９２】
得られた抽出ＲＮＡ溶液を用いて以下に示す方法により評価した。評価結果は表１に示す。また、表１には各実施例、参考例および比較例の概要を併せて表１に示す。なお、表１中の緩衝液含有量は天然ゴムラテックス１００質量部に対する含有量である。
【００９３】
得られた各抽出ＲＮＡ溶液について下記の評価を行った。
【００９４】
ＲＮＡ純度
各抽出ＲＮＡ溶液の一部（１００μＬ）を分取し、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）にて、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２６０ｎｍの値／Ａ２８０ｎｍの値を算出した。２６０ｎｍの値／Ａ２８０ｎｍの値が２．０に近いほど、抽出ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ純度が高いことを示す。比較例２および３の結果は検出限界以下であり検出できなかった。
【００９５】
ＲＮＡ抽出効率
また、２６０ｎｍの吸光度から算出した各抽出ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度から、各実施例、参考例および比較例において、天然ゴムラテックス１ｍＬ当たりから得られたＲＮＡ量（μｇ／ｍＬ−天然ゴムラテックス）を算出した。比較例２および３の結果は検出限界以下であり検出できなかった。
【００９６】
【表１】
0006434253.tif 000002
【００９７】
表１に示す結果より、天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を適切に、輸送、保存およびＲＮＡ抽出することで、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができることがわかる。