(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を使用する生体液からのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、前記シトレート溶液が、生体液からの前記ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のための結合バッファーの役割を果たす、使用。
【請求項２】
前記ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基が、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
0006280293.tif 000031
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【化２】
0006280293.tif 000032
から選択される複素環を形成していてもよく、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とする、請求項１に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項３】
前記ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基が、下記一般式（ＩＩ）：
【化３】
0006280293.tif 000033
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【化４】
0006280293.tif 000034
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項４】
前記シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム、クエン酸三リチウム、クエン酸二水素アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、二クエン酸三カルシウム（クエン酸カルシウム）、二クエン酸三マグネシウム（クエン酸マグネシウム）及び／若しくはクエン酸部分エステルを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物を含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項５】
少なくとも１種の前記シトレート化合物が、クエン酸及び一価金属カチオンとのクエン酸塩から選択される、請求項４に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項６】
前記シトレート溶液が、シトレート化合物以外に追加のＣａ２＋キレート化剤を含有しない、請求項４又は５に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項７】
前記シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、Ｄ−グルコース及び水からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項８】
前記シトレート溶液が、５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の総シトレート濃度を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項９】
前記シトレート溶液が、ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０の範囲のｐＨ値を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項１０】
前記生体液による１：５０〜１：５の範囲の希釈での、請求項１から９のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【請求項１１】
前記生体液が血液又は血漿である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のシトレート溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生体液からのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われる、使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ＷＨＯ）によれば、２００８年にはおよそ１７，０００，０００人の人々が、心血管疾患で死亡した。したがって、心血管疾患は、非感染性疾患の中で最も多い死因であり、世界的には全ての死亡の約１／３の原因となっている。推定では、この死亡者数は、２０３０年までに１年当たり約２３，０００，０００人まで上昇するであろう。
【０００３】
したがって、心血管疾患は世界的に主な死因であるだけでなく、国民保健制度及び健康保険基金に関する莫大な医療費も生じさせる。心血管疾患の最も多く見られ且つ最も損傷を及ぼす徴候の２つは、アテローム性動脈硬化症及び血栓症の出現であり、これらは特に、心臓発作及び脳卒中の原因となる。
【０００４】
近年、心血管疾患の治療は大きく進歩した。この進展が可能になったのは、疾患誘発メカニズムに関する洞察を深めることによるだけでなく、リスク患者の早期特定にもよる。実際、疾患リスクの特定及びそれらの早期治療は、現代の医療の重要な特徴である。過去２５年間に、疾患の現在の状態又は将来の心血管疾患の可能性のいずれかと相関する様々な因子及び臨床パラメーターが特定された。このようなリスク因子は、測定可能な生化学的又は生理学的パラメーター、例えば、血清コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びフィブリノーゲンレベルであり得るが、行動パターン、例えば、過体重及び喫煙でもあり得る。リスク因子が単に疾患又はその発生を示すだけでなく、その発生に実際に因果関係がある症例では、このリスク因子に対する治療的影響は、疾患の経過に影響を及ぼし得る、又はその発生のリスクを低減させ得る。
【０００５】
急性期タンパク質としてのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、自然免疫系の一部であり、炎症反応の過程で肝臓で形成され、血液中に放出される。ＣＲＰの形成は、急性又は慢性炎症反応と関連して発現されるサイトカインによって主に誘発される。ＣＲＰの形成に対する最も強力な刺激は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）である。したがって、ＣＲＰ及びＩＬ−６の血中レベルは、局所又は全身炎症応答の指標である。慢性炎症は、心血管疾患の根底にあり、それを裏付ける病理学的徴候の１つであると推定される。ＣＲＰは、心血管疾患を予測するだけでなく、心血管疾患の発生にも因果関係があるか又は心血管疾患の経過に影響も及ぼし得るとますます推定されるようになっている。
【０００６】
Ｙｅｈ（Ｃｌｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、２００５、２８、４０８〜４１２頁）は、ＣＲＰレベルを使用して心血管疾患リスクを予測できること、ＣＲＰが炎症応答の指標でもあること、及び炎症がアテローム性動脈硬化症の全ての段階を促進することを示している。Ｚｏｃｃａｌｉら（Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００５、２５、３５８〜３６２頁）は、ＣＲＰレベルが、末期の腎疾患患者の心血管死亡リスクを予測することを示している。Ｎｕｒｍｏｈａｍｅｄら（Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５、６３、３７６〜３８１頁）によれば、ＣＲＰレベルは、血液透析患者の心血管死亡リスクを予測する。
【０００７】
Ｓｏｌａら（Ｊ．Ｃａｒｄ．Ｆａｉｌ．２００５、１１、６０７〜６１２頁）は、スタチン療法を使用して、ＣＲＰ量を減少させ、したがって心血管疾患に起因する死亡率及び罹病率を低減させることができることを示した。しかし、この種の治療法は、心筋梗塞によって生じる高いＣＲＰレベル（最高で正常値より１０００倍高い値に達する）又は透析患者の血液中の高いＣＲＰレベルを有意には低減させない。
【０００８】
ヒト血液中のＣＲＰ正常値はヒトによって異なるが、中央値で血液１リットル当たりＣＲＰ約０．８ｍｇである。しかし、急性又は慢性炎症反応（例えば、細菌感染、アテローム性動脈硬化症、心臓発作後）の場合には、これは、実質的に血液１リットル当たりＣＲＰ約１００ｍｇ超のレベルに達する可能性がある。血液中のＣＲＰの半減期（約１９時間）は一定であり、したがって、患者の健康状態と無関係であるので、ＣＲＰの合成速度のみが血液中のＣＲＰレベルの調節に関与する（Ｐｅｐｙｓ  ＆  Ｈｉｒｓｃｈｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３、１１、１８０５〜１８１２頁）。したがって、ＣＲＰレベルを標準血中レベルまで低下させるためには相当量のＣＲＰを除去する必要があるため、急性病態におけるＣＲＰ合成の著しい増加は、患者（リスク患者又は急性患者）のＣＲＰ除去のための治療アプローチに特別な要求をつきつける。
【０００９】
その結果、患者血液中のＣＲＰレベルを低減させるための治療手法に関心が高まっている。ＣＲＰは臨床的に重要であるので、その後に精製ＣＲＰをさらなる実験で、例えば、その分子機能の検討に使用するために、ＣＲＰの精製のための効果的な方法にも関心が寄せられている。
【００１０】
ＷＯ２００４／０７６４８６は、ＣＲＰレベルが増加した患者にＣＲＰ結合分子を投与することによって免疫応答、炎症応答及び／又は病態生理学的応答を阻害する方法を開示している。しかし、生体液からＣＲＰを除去するための前記生体液の体外処置については開示されていない。
【００１１】
ＷＯ９０／１２６３２は、癌の治療のためにこれらの生体液からＣＲＰ及び抗ホスホコリン抗体を除去することを目的とする、生体液の体外処置のための方法及び装置を開示している。このために使用されるホスホコリン含有マトリックスは、例えば、シリカ、セファロース、アクリルビーズ又はアガロースからなっていてよく、含有ホスホコリンによってＣＲＰ及び抗ホスホコリン抗体がいずれも結合される。
【００１２】
ＵＳ２００７／２２５２２６Ａ１は、ＣＲＰを結合する、したがってＣＲＰアフェレーシスにおいて機能性カラム材料として使用できる特異的なペプチドを開示している。この結合は、カルシウムと無関係に起こる。また、抗凝固薬としてシトレートを使用するエンドトキシンの除去システムを含む、ＣＲＰアフェレーシスのためにこのカラム材料を用いるいくつかの体外血液精製装置も記載されている。ＣＲＰは、五量体であり、そのサブユニットはそれぞれ２つのＣａ２＋イオンと会合しており、それが、本発明において使用されるリガンドに結合する。シトレートはＣａ２＋イオンを高い親和性で結合するので、Ｃａ２＋依存性リガンドが使用される場合には、シトレートはカラムのＣＲＰ結合能力に悪影響を及ぼすとこれまで想定されていた。しかし、本出願の発明者らは、使用されるリガンドの方が、能力がより高いことを示した。ＣＲＰはオプソニンであり、Ｃ１ｑを介して結合された形態で補体系を活性化させ得る。しかし、驚くべきことに、シトレートは、その能力をさらに増加させる補体の活性化を防止し、それにより、シトレートが使用されるリガンドの能力をさらに増加させることが示された。Ｃａ２＋依存性リガンドによって生じるこの効果は、ＵＳ２００７／２２５２２６Ａ１に鑑みても全く驚くべきことである。
【００１３】
ＷＯ２００７／０７６８４４は、患者へのリスク（血液中のＣＲＰレベルの増加によって引き起こされる）を低減させるための、アフェレーシスを用いる血漿からの体外ＣＲＰ除去による方法を開示している。本発明によれば、ホスホコリン誘導体を結合させたマトリックス含有カラムが使用されて、ＣＲＰを結合してそれを血漿から除去することによって、自己免疫疾患、心血管疾患、糖尿病及び腎不全が治療及び／又は予防される。
【００１４】
Ｓｌａｇｍａｎら（Ｂｌｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆ．２０１１、３１、９頁）は、ブタモデルで、心臓発作後における体外アフェレーシスによる血液中のＣＲＰレベルの低減に成功したことを明らかにしている。
【００１５】
分析用又は調製用であろうと、しかしまた透析又はアフェレーシスにおいてであろうと、血液又は血漿の体外使用で起こる問題は、血液凝固の開始であり、これは使用自体を妨げ又は不可能にするが、それはまた、使用装置を詰まらせると共に汚染する。この理由から、抗凝固薬（いわゆる抗血液凝固薬）が、ヒト又は動物の体からの除去後の血液又は血漿に直接添加される。
【００１６】
血液凝固を阻害する１つの可能性は、Ｃａ２＋キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、シュウ酸塩及びシトレートの投与である。血液凝固の間に、いくつかの凝固因子の補因子としてカルシウムが必要とされる。血液又は血漿からカルシウムを除去することによって凝固を阻害するために、Ｃａ２＋キレート化剤が使用される。しかし、これは、ホスホコリン若しくはホスホエタノールアミン又はホスホコリン誘導体若しくはホスホエタノールアミン誘導体を用いるＣＲＰの除去のためのアフィニティークロマトグラフィー法にとって重要な問題である。ホスホコリン又はその誘導体へのＣＲＰの結合にはＣａ２＋が必要である（Ｂｌａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、２７９：４８４８７頁、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９９、７（２）、１６９〜１７７頁）ので、先行技術における一致した意見は、ホスホコリンへのＣＲＰの結合の間にＣａ２＋キレート化剤を投与することは絶対に回避すべきであるということであった（例えば、ＷＯ９０／１２６３２を参照のこと）。したがって、先行技術によれば、ホスホコリンへのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー結合の間にシトレート含有結合バッファーを使用することは、全く不適当である。しかし、シトレート含有溶液（ＥＤＴＡの投与と同様に）は、溶出バッファーとして、即ち、結合されたＣＲＰをホスホコリンから除去するのに適当であった。
【００１７】
Ｃａ２＋非依存性抗凝固の１つの可能性は、ヘパリンの投与にある。ヘパリンは、肥満細胞によって産生される内因性物質であり、凝固カスケードに阻害作用を及ぼす。活性化された凝固因子、例えば、トロンビン及び第Ｘａ因子を不活性化し得る、血液中を循環するプロテアーゼインヒビターであるアンチトロンビンＩＩにヘパリンを結合させることによって、アンチトロンビンＩＩのコンフォメーション変化が誘発される。これにより、アンチトロンビンＩＩによって媒介される凝固因子の不活性化が２，０００倍加速される。血液凝固は停止する。したがって、ホスホコリン及びホスホコリン誘導体又はホスホエタノールアミン及びホスホエタノールアミン誘導体を用いる血液又は血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のための方法においては、ヘパリンが抗凝固薬としてこれまで専ら使用されてきた。
【００１８】
しかし、ヘパリンは、特に未分画ヘパリンの場合、出血に加えて、免疫反応であるヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）を引き起こす可能性があるため、これにはいくつかの欠点がある。このため、ヘパリンは静脈及び動脈血栓症を誘発する。ＣＲＰアフェレーシスの使用も考えられる脳卒中患者では、未分画ヘパリンを受ける場合のＨＩＴのリスクは、約３％である。加えて、ヘパリンは、血液を細胞成分と血漿に分離するためにしばしば使用される遠心細胞分離機と共に使用することが承認されていない。
【００１９】
本発明の目的は、従来技術からのヘパリンに関連する問題を回避し、加えてホスホコリン又はホスホエタノールアミン及びそれらの誘導体へのＣＲＰのＣａ２＋依存性結合を損なわない、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のための抗凝固剤を提供することである。
【００２０】
この目的は、独立請求項の教示によって達成される。さらに有利な実施形態は、説明、実施例及び従属請求項から明らかである。
驚くべきことに、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を使用する生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用が、驚くべきことに生体液からのＣＲＰの効率的な除去を達成するだけでなく、先行技術の問題を解決することを発見できた。
【００２１】
［発明の説明］
本発明は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を使用する生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用に関する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ＣＲＰ」は、「Ｃ反応性タンパク質」に等しい。本明細書中で、これは好ましくは、ヒトＣ反応性タンパク質を指す。
本明細書中で使用する用語「ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去」は、ＣＲＰの除去が、ＣＲＰとＣＲＰ除去手段の成分との特異的結合によって起こることを意味する。これに関連して、これは、「ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去」又は「ＣＲＰの選択的除去」を指すことも可能である。ＣＲＰと適当に官能化されたカラム材料とのこのような特異的結合は、ＣＲＰタンパク質の構造的性質に基づき、例えば、ホスホコリンへのＣＲＰの特徴的な結合、又はＣＲＰのエピトープに対する抗体へのＣＲＰの結合を挙げることができる。ＣＲＰの選択的除去又は分子特異的除去は、ＣＲＰが生体液の他の成分よりも高い親和性で、官能化されたカラム材料に結合することを含む。したがって、本出願において使用する、ＣＲＰの除去に関する用語「選択的」は、除去されるＣＲＰの、生体液中に含有されるＣＲＰの量に対する比が、他の除去される物質の、生体液中に含有されるその物質の量に対する各比の少なくとも３倍であることを意味する。しかし、本出願において使用する、ＣＲＰの除去に関する用語「選択的」は、ＣＲＰのみが除去されることを意味しない。本明細書中において、ＣＲＰのこのようなアフィニティークロマトグラフィー除去により、他の物質がある程度（意図せずに）不可避的にカラム材料に結合する可能性があり、したがってそれもまた、ある程度除去されることは、当業者には自明である。ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基との特異的な結合の原因となるＣＲＰの構造との構造上の一致が、例えば、タンパク質に存在する場合には、この構造的に類似したタンパク質も、ある程度結合される。１つの例は、ホスホコリンに対する抗体であり得、したがって、それは、ホスホコリンで官能化されているカラム材料にも結合させることができる。別の可能性は、例えばマトリックス基質材料への生体液成分の、決して完全には回避できない非特異的結合である。
【００２３】
既述の通り、ホスホコリン若しくはその誘導体又はホスホエタノールアミン若しくはその誘導体へのＣＲＰの結合は、Ｃａ２＋の存在に依存し、したがって、カラム材料中又はカラム材料上に固定化されたω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基へのＣＲＰの結合もまた、Ｃａ２＋の存在に依存する。
【００２４】
したがって、本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われる、使用に関する。
【００２５】
言うまでもなく、本発明による、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われる、使用は、ＣＲＰ除去の前に、シトレート溶液を、ＣＲＰを除去すべき生体液と混合することを意味する。したがって、シトレート溶液は、カラム材料のω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基へのＣＲＰの望ましい結合の間に存在する。したがって、アフィニティークロマトグラフィーの分野からの技術用語によれば、シトレート溶液を「結合バッファー」として使用すると言えるであろう。
【００２６】
しかし、これは、シトレート溶液を「溶出溶液」として（又は「溶出バッファー」として）使用すること、したがってω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料からのＣＲＰの除去に、即ち、カラム材料の再生に使用することは意味しない。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「結合バッファー」（「結合溶液」とも称する）は、試料（本明細書中では、生体液、例えば、血液又は血漿）からの物質の除去（本明細書中では、ＣＲＰの選択的及びＣ２＋依存性除去）のためのアフィニティークロマトグラフィー法の場合には、試料に添加され、次いで試料と共に、物質を除去するためのカラム材料（本明細書中では、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料）に適用される溶液を指す。結合バッファーは、除去すべき物質のカラム材料への特異的結合に適切な条件を提供すべきである。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「溶出バッファー」（「溶出溶液」とも称する）は、試料（本明細書中では、生体液、例えば、血液又は血漿）からの物質の除去（本明細書中では、ＣＲＰの選択的及びＣ２＋依存性除去）のためのアフィニティークロマトグラフィー法の場合には、カラム材料に試料を適用して、除去すべき物質のカラム材料への特異的結合が起こった後に適用されて、特異的結合を再び壊すことによって、除去すべき物質をカラム材料から脱離させる（又は溶出する）溶液を指す。したがって、結合バッファーとは異なり、除去すべき物質を結合させずに、逆に結合を防ぐ条件が、溶出バッファーによってカラム材料中で作りされるべきである。
【００２９】
したがって、本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われ、シトレート溶液が生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のための結合バッファー（又は結合溶液）の役割を果たす、使用に関する。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「生体液」は、哺乳動物、好ましくはヒトで見られる水溶液、例えば、脳脊髄液、腹膜液、胸膜液、腹水、血液、血漿、肝抽出物及び間質液を指す。言うまでもなく、本発明は、ＣＲＰを含有する生体液に関する。
【００３１】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、生体液が血液又は血漿である、使用を対象とする。
【００３２】
換言すれば、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる血液及び／又は血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用を対象とする。
シトレート溶液
本明細書中で使用する用語「シトレート」は、クエン酸アニオン若しくはクエン酸の塩、又は換言すれば、下記化学式：
【００３３】
【化１】
0006280293.tif 000002
の有機トリカルボキシレートを指す。
【００３４】
シトレートは種々の形態で（又は化合物で）、したがって、例えば、クエン酸として（１〜３倍プロトン化された形態で）、クエン酸を他の（Ｈ＋以外の）無機カチオンと組み合わせた塩として（例えば、金属カチオンとの金属塩として又はアンモニウムイオンとのアンモニウム塩として）生じ得るが、クエン酸部分エステルとしても生じ得る。これに関連して、用語「シトレート化合物」も本明細書中で使用する。
【００３５】
クエン酸の塩、即ち、クエン酸アニオンが無機カチオンと錯体を形成する場合、用語「クエン酸塩」もまた、本明細書中でシトレート化合物の特殊な形態として言及される。
したがって、本明細書中で使用する用語「シトレート溶液」は、少なくとも１種のシトレート化合物を含有する水溶液を含む。シトレート溶液の組成物に関するより詳細な情報を以下に示す。
【００３６】
しかし、本発明によれば、シトレート溶液中のシトレート濃度は、１ｍＭ以上、好ましくは１．１ｍＭ以上、好ましくは１．２ｍＭ以上、より好ましくは１．３ｍＭ以上、さらに好ましくは１．４ｍＭ以上、最も好ましくは１．５ｍＭ以上であるのが好ましい。
【００３７】
加えて、本発明によれば、シトレート化合物は、本発明によるシトレート溶液の必須成分であるのが好ましい。本明細書中で、「必須成分」は、シトレート溶液中の全てのシトレート化合物のモル濃度の合計が、シトレート溶液内の水以外の他の化合物と比較して、シトレート溶液中に見られる３つの最も高い濃度のうちの１つであることを意味する。
【００３８】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム、クエン酸三リチウム、クエン酸二水素アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、二クエン酸三カルシウム（クエン酸カルシウム）、二クエン酸三マグネシウム（クエン酸マグネシウム）及び／若しくはクエン酸部分エステルを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物を含有する、使用に関する。
【００３９】
本発明によれば、シトレート溶液が、上記に列挙したシトレート化合物のうちのいくつか混合物を含有することも可能である。
本明細書中で使用する用語「シトレート化合物」は、クエン酸及びその塩の両方を含む。
【００４０】
本出願において総括的な用語「クエン酸ナトリウム」を使用する場合、この用語は、クエン酸ナトリウムの種々のプロトン化形態、即ち、非プロトン化形態（クエン酸三ナトリウム）、一プロトン化された形態（クエン酸水素二ナトリウム）又は二プロトン化された形態（クエン酸二水素ナトリウム）を包含する。
【００４１】
本出願において総括的な用語「クエン酸カリウム」を使用する場合、この用語は、クエン酸カリウムの種々のプロトン化形態、即ち、非プロトン化形態（クエン酸三カリウム）、一プロトン化された形態（クエン酸水素二カリウム）又は二プロトン化された形態（クエン酸二水素カリウム）を包含する。
【００４２】
本出願において総括的な用語「クエン酸リチウム」を使用する場合、この用語は、クエン酸リチウムの種々のプロトン化形態、即ち、非プロトン化形態（クエン酸三リチウム）、一プロトン化された形態（クエン酸水素二リチウム）又は二プロトン化された形態（クエン酸二水素リチウム）を包含する。
【００４３】
本出願において総括的な用語「クエン酸アンモニウム」を使用する場合、この用語は、クエン酸アンモニウムの種々のプロトン化形態、即ち、非プロトン化形態（クエン酸三アンモニウム）、一プロトン化された形態（クエン酸水素二アンモニウム）又は二プロトン化された形態（クエン酸二水素アンモニウム）を包含する。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「クエン酸部分エステル」はクエン酸のエステルを指すが、シトレートの３つのカルボキシル基（即ち、−ＣＯＯ−）が全てエステル化されている［即ち、−ＣＯＯＲ（式中、Ｒは有機残基である）］とは限らず、シトレートの３つのカルボキシル基のうち最大で２つ、しかし好ましくはシトレートの３つのカルボキシル基のうち最大で１つがエステル化されている。１つ又は２つのエステル基に加えて、クエン酸部分エステルはまた、シトレートの１つ又は２つの非エステル化カルボキシル基と錯体を形成する１つ又は２つの生理的に許容される無機カチオン（例えば、金属カチオン、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋）を含む。
【００４５】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム、クエン酸三リチウム、クエン酸二水素アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、二クエン酸三カルシウム（クエン酸カルシウム）、二クエン酸三マグネシウム（クエン酸マグネシウム）及び／若しくはクエン酸部分エステルを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物を含有し、少なくとも１種のシトレート化合物が、クエン酸及び一価金属カチオンとのクエン酸塩から選択される、使用に関する。
【００４６】
本発明によれば、シトレート溶液はクエン酸鉄（ＩＩ）を含有しないのが好ましい。より好ましくは、シトレート溶液はクエン酸鉄（ＩＩＩ）を含有しない。加えて、本発明によれば、シトレート溶液は、クエン酸銅（ＩＩ）（二クエン酸三銅）もクエン酸アルミニウムも含有しないのが好ましい。
【００４７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、シトレート溶液は、クエン酸カリウム（二クエン酸三カルシウムとしても知られる）を含有しない。
本発明のさらに好ましい一実施形態において、シトレート溶液は、クエン酸マグネシウム（二クエン酸三マグネシウムとしても知られる）を含有しないか、又はクエン酸マグネシウムの濃度は最大でも１ｍＭである。
【００４８】
本発明のさらに好ましい一実施形態において、シトレート溶液は、クエン酸カルシウムもクエン酸マグネシウムも含有しないか、又はクエン酸マグネシウムの濃度が最大でも１ｍＭである。
【００４９】
本出願において、溶液がある特定の物質を含有しないと述べる場合、これは、この溶液がその物質を全く含有しないか、又は回避できない不純物を考慮に入れても少なくとも、この物質を０．０１重量％以下しか含有しないことを意味する。
【００５０】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム及び／若しくはクエン酸三リチウムを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物を含有する、使用に関する。しかし、さらにより好ましいのは、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム及び／又はクエン酸三カリウムである。しかし、最も好ましいのは、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム及びクエン酸三ナトリウム二水和物である。
【００５１】
本発明によれば、シトレート溶液は、１種又は複数の前記シトレート化合物の他に、Ｃａ２＋キレート化する追加の、即ち、さらなる非シトレートベース物質（いわゆるＣａ２＋キレート化剤）含有しないのがさらに好ましい。
【００５２】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、化学的にシトレート化合物をベースとしないＣａ２＋キレート化剤を含有しない、使用に関する。化学的にシトレート化合物をベースとしない、したがって好ましくないＣａ２＋キレート化剤の考えられる例は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（アミノエチルエーテル）−Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸）及びシュウ酸塩である。
【００５３】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム、クエン酸三リチウム、クエン酸二水素アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、二クエン酸三カルシウム（クエン酸カルシウム）、二クエン酸三マグネシウム（クエン酸マグネシウム）及び／若しくはクエン酸部分エステルを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物を含有し、シトレート溶液が、シトレート化合物以外に追加のＣａ２＋キレート化剤を含有しない、使用に関する。
【００５４】
したがって、本発明によれば、シトレート溶液は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（アミノエチルエーテル）−Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−アミノフェノキシ）エタン−Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸）又はシュウ酸塩を含有しないのがさらに好ましい。
【００５５】
上記で列挙したシトレート化合物に加えて、シトレート溶液は、追加の物質を含有していてもよいが、それらの物質はいかなるキレート化特性を有さない。例えば、さらなる物質は、生体液の、即ち、例えば血液又は血漿のモル浸透圧濃度にほぼ等しいシトレート溶液のモル浸透圧濃度をもたらす添加剤として可能である。モル浸透圧濃度を調節するためのこのような物質は、無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど、しかしまた、糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、フルクトース及びスクロース又はヘパリンを含む。デキストロース及びＤ−グルコースという用語は等しく、したがって、本明細書中では同義的に使用できる。
【００５６】
同様に、さらなる物質は、シトレート溶液のｐＨ値を所定の値、例えば、生体液（したがって、例えば、血液又は血漿）のｐＨ値に調節する役割を果たす添加剤として可能である。本明細書中において、シトレート化合物と共に含有される追加の物質は、シトレート溶液のｐＨ値を調節できる、及びｐＨ値のわずか変動を相殺できるバッファー系を形成することが、例えば可能である。シトレート溶液がシトレート化合物及び非シトレートバッファー物質のバッファー系を含有する場合、用語「シトレート含有バッファー」も使用する。添加されるシトレート化合物でないバッファー物質（即ち、非シトレートバッファー物質）の考えられる例は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、乳酸塩及び酢酸塩を含む。
【００５７】
シトレート化合物及び非シトレートバッファー物質からのバッファー系、即ち、シトレート含有バッファーの形態の本発明によるシトレート溶液の考えられる例は、クエン酸とリン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム又はリン酸二水素カリウムとの組合せである。しかし、クエン酸とリン酸水素二ナトリウムとの組合せが特に好ましい。
【００５８】
しかし、シトレート溶液が２種の異なるシトレート化合物を含有し、それらがまた、一緒になってバッファー系を形成する場合には、用語「シトレートバッファー」も使用する。
【００５９】
２種の異なるシトレート化合物からのバッファー系、即ち、シトレートバッファーの形態の本発明によるシトレート溶液の考えられる例は、クエン酸とクエン酸水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸二水素カリウム、クエン酸水素二カリウム又はクエン酸三カリウムとの組合せ；
クエン酸二水素ナトリウムとクエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二カリウム又はクエン酸三カリウムとの組合せ；
クエン酸二水素カリウムとクエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二カリウム又はクエン酸三カリウムとの組合せ；
クエン酸水素二ナトリウムとクエン酸三ナトリウム又はクエン酸三カリウムとの組合せ；
クエン酸水素二カリウムとクエン酸三ナトリウム又はクエン酸三カリウムとの組合せ
である。
【００６０】
しかし、シトレートバッファーの形態のシトレート溶液としてのクエン酸とクエン酸三ナトリウムとの組合せが特に好ましい。
言うまでもなく、モル浸透圧濃度を調節するための２種の異なるシトレート化合物を含有するシトレート溶液（即ち、シトレートバッファー）にさらなる物質を添加することも考えられる。
【００６１】
本発明によれば、シトレート溶液は、水、１種又は複数の上記シトレート化合物のみからなる、或いは加えて、場合によってはモル浸透圧濃度を調節するための１種若しくは複数の上記化合物（「オスモライト」とも称する）、及び／又は場合によっては１種若しくは複数の上記非シトレートバッファー物質からなるのが好ましい。
【００６２】
したがって、本発明のさらなる一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、水、並びに
クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸水素カリウム、クエン酸水素二カリウム、クエン酸三カリウム、クエン酸二水素リチウム、クエン酸水素二リチウム、クエン酸三リチウム、クエン酸二水素アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、二クエン酸三カルシウム（クエン酸カルシウム）、クエン酸三マグネシウム（クエン酸マグネシウム）及び／若しくはクエン酸部分エステルを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種のシトレート化合物、並びに
（場合によっては）塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース及びスクロースを含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種の化合物、並びに／或いは
（場合によっては）リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、乳酸塩及び酢酸塩を含む又はそれらからなる群からの少なくとも１種の化合物
からなる、使用に関する。
【００６３】
したがって、本発明のさらに好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸三ナトリウム及び水からなる、使用に関する。
【００６４】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、３８ｍＭのクエン酸、７４．８ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び水を含む、使用に関する。
【００６５】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液がクエン酸、クエン酸三ナトリウム、Ｄ−グルコース及び水からなる、使用に関する。
【００６６】
クエン酸、クエン酸三ナトリウム、Ｄ−グルコース及び水からなるシトレート溶液は、「酸−シトレート−デキストロース溶液（ＡＣＤ溶液）とも称する。
本発明に従って使用するシトレート溶液の好ましい変形形態は、２２．９ｍＭ〜３８．０ｍＭの間のクエン酸、４４．９ｍＭ〜７４．８ｍＭの間のクエン酸三ナトリウム、７４．２ｍＭ〜１２３．６ｍＭの間のＤ−グルコース及び水を含有するＡＣＤ溶液に関する。
【００６７】
本発明に従って使用するシトレート溶液の特に好ましい変形形態は、３８ｍＭのクエン酸、７４．８ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２３．６ｍＭのＤ−グルコース及び水を含有するＡＣＤ溶液に関する。これは、「ＡＣＤ−Ａ溶液」とも称する。
【００６８】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、３８ｍＭのクエン酸、７４．８ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２３．６ｍＭのＤ−グルコース及び水を含有する、使用に関する。
【００６９】
したがって、本発明のさらに好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液がクエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、Ｄ−グルコース及び水からなる、使用に関する。
【００７０】
クエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、Ｄ−グルコース及び水からなるシトレート溶液は、「シトレート−ホスフェート−デキストロース溶液（ＣＰＤ）」とも称する。
【００７１】
本発明に従って使用するシトレート溶液の好ましい一変形形態は、１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２８．７ｍＭのＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム及び水を含有するＣＰＤ溶液に関する。
【００７２】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２８．７ｍＭのＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム及び水を含有する、使用に関する。
【００７３】
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、Ｄ−グルコース、アデニン及び水からなる、使用に関する。
【００７４】
クエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、Ｄ−グルコース、アデニン及び水からなるクエン酸溶液は、「アデニンを含むシトレート−ホスフェート−デキストロース溶液（ＣＰＤＡ）」とも称する。
【００７５】
したがって、本発明に従って使用するシトレート溶液の好ましい一変形形態は、１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２８．７ｍＭ〜１６０．９ｍＭの間のＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム、２ｍＭのアデニン及び水を含有するＣＰＤＡ溶液に関する。本発明に従って使用するシトレート溶液のさらに好ましい一変形形態は、１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２８．７ｍＭのＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム、２ｍＭのアデニン及び水を含有するＣＰＤＡ溶液に関する。本発明に従って使用するシトレート溶液の特に好ましい一変形形態は、１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１６０．９ｍＭのＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム、２ｍＭのアデニン及び水を含有するＣＰＤＡ溶液に関する。
【００７６】
したがって、本発明の特に好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が１５．６ｍＭのクエン酸、８９．４ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２８．７〜１６０．９ｍＭの間のＤ−グルコース、１６．１ｍＭのリン酸水素ナトリウム、２ｍＭのアデニン及び水を含有する、使用に関する。
【００７７】
本発明の一部の実施形態によれば、シトレート溶液は、多価の、即ち、二価又は三価のカチオンとの金属塩を含有しないのが好ましい。したがって、本発明のさらに好ましい一実施形態において、シトレート溶液はカルシウム塩を含有しない。本発明のさらに好ましい一実施形態において、シトレート溶液は、マグネシウム塩を含有しない、又は少なくとも、マグネシウム塩の濃度が最大でも１ｍＭである。
【００７８】
換言すれば、本発明の一部の実施形態によれば、シトレート溶液は、一価のカチオンとの金属塩のみを含有するのが好ましい。
シトレート濃度及び生体液による希釈
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは６０ｍＭ〜１５０ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜１２０ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜１１５ｍＭ、最も好ましくは７４．８ｍＭ〜１１３ｍＭの範囲の総シトレート濃度を有する、使用に関する。
【００７９】
したがって、本発明の好ましい一実施形態はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、好ましくは５０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、より好ましくは６０ｍＭ、より好ましくは１２０ｍＭ、より好ましくは１１５ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ、より好ましくは７４．８ｍＭ、最も好ましくは１１３ｍＭの総シトレート濃度を有する、使用に関する。
【００８０】
言うまでもなく、実際のシトレート溶液の中のシトレートの濃度が重要なだけでなく、シトレート溶液と生体液、即ち、例えば、血液又は血漿との混合物中の全最終濃度がとりわけ重要である。したがって、使用するシトレート溶液の希釈も、重要である。
【００８１】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、生体液が、ＣＲＰ除去前にシトレート溶液と混合される、使用に関する。
【００８２】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のための結合バッファー（又は、結合溶液）としてのシトレート溶液の使用であって、生体液が、ＣＲＰ除去前にシトレート溶液と混合される、使用に関する。
【００８３】
したがって、本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われ、生体液が、ＣＲＰ除去前にシトレート溶液と混合される、使用に関する。
【００８４】
シトレート溶液と生体液（即ち、例えば、血液又は血漿）との混合後、シトレート溶液と生体液との混合物を、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されているカラム材料上に適用し、それによって、官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合が起こる。
【００８５】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、生体液によって１：５０〜１：５、好ましくは１：４０〜１：１０、好ましくは１：３０〜１：２０、好ましくは１：２０〜１：１５、好ましくは１５〜１：１０の範囲で希釈される、使用に関する。
【００８６】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、生体液によって１：５０、好ましくは１：４５、さらに好ましくは１：４０、好ましくは１：３５、好ましくは１：３０、好ましくは１：２５、さらに好ましくは１：２０、さらに好ましくは１：１５、さらに好ましくは１：１０、好ましくは１：５に希釈される、使用に関する。
【００８７】
したがって、本発明の好ましい一実施形態は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の、生体液による１：５０〜１：５の範囲での希釈での使用に関する。
【００８８】
したがって、本発明の好ましい一実施形態はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは６０ｍＭ〜１５０ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜１２０ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜１１５ｍＭ、最も好ましくは７４．８ｍＭ〜１１３ｍＭの範囲の総シトレート濃度を有し、シトレート溶液が、生体液によって１：５０〜１：５、好ましくは１：４０〜１：１０、好ましくは１：３０〜１：２０、好ましくは１：２０〜１：１５、好ましくは１：１５〜１：１０の範囲で希釈される、使用に関する。
【００８９】
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が７０ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲の総シトレート濃度を有し、シトレート溶液が生体液によって１：５０〜１：５の範囲で希釈される、使用に関する。
【００９０】
言うまでもなく、前段落に記載した濃度より低い又は高いシトレート濃度を含むシトレート溶液が使用されることも考えられる。したがって、言うまでもなく、生体液による希釈度は、それに応じて低減させ（より低いシトレート濃度）又は増加させる（より高いシトレート濃度）必要があるであろう。しかし、前段落に記載したシトレート濃度及び希釈が、本発明による、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用との関連で特に有利であることが判明している。
【００９１】
溶液のｐＨは、酸及び塩基（したがってまた、例えばクエン酸）の解離に実質的な影響を及ぼし、したがってまた、Ｃａ２＋が存在する場合にはＣａ２＋の結合に影響を及ぼすので、使用するシトレート溶液のｐＨ値は本発明の重要な側面である。
【００９２】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、シトレート溶液が、ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０、好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ６．５、より好ましくはｐＨ４．７〜ｐＨ６．０、より好ましくはｐＨ４．９〜ｐＨ５．８、より好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ５．６、最も好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ５．５の範囲のｐＨ値を有する、使用に関する。
ＣＲＰに対するＣａ２＋依存性リガンド
生体液、例えば、血液又は血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去に関して、既に数回述べたように、ホスホコリン及び／若しくはホスホエタノールアミン又はその誘導体を含むカラム材料が使用され、それによって、前記官能化されたカラム材料へのＣＲＰのＣａ２＋依存性結合が可能である。
【００９３】
このために、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン又はその誘導体は、カラム材料上に固定化される。これは通常、有機リンカー基を介して行われる。この有機リンカー基を介して、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン又はそれらの誘導体は、カラム材料に吸着によって又はさらにより好ましくは共有結合によって結合される。これにより、いわゆる「官能化されたカラム材料」が生じる。官能化されたカラム材料においては、ＣＲＰのＣａ２＋依存性結合に関与する化学基が外側に露出しているので、生体液中に存在するＣＲＰもまた、前記化学基にアクセスできる。
【００９４】
換言すれば、本明細書中で使用する用語「官能化されたカラム材料」は、化学官能基を備える、アフィニティークロマトグラフィー用のカラム材料を指す。この場合、化学官能基は、吸着又はイオン相互作用によって、しかし好ましくは共有結合によってカラム材料に結合され得る。言うまでもなく、化学官能基は、官能基が活性であり且つ露出しているようにカラム材料に結合され、それによってその官能性が保持されることが重要である。その結果、カラム材料に結合した基（ここでは、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基）は、試料（ここでは、生体液、例えば、血液又は血漿）からのリガンド（ここでは、ＣＲＰ）と相互作用するか又はそれを結合することが可能である。
【００９５】
ホスホコリン、ホスホエタノールアミン又はその誘導体がカラム材料に有機リンカーを介して結合するか、アンモニウム基を介して結合するか又はリン酸基を介して結合するかによって、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基で官能化された（アンモニウム基を介する結合）カラム材料とω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化された（リン酸基を介する結合）カラム材料とは区別される。
【００９６】
カラム材料との結合（場合によっては有機リンカーによる）は、以下に記載の式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、アンモニウム基の窒素原子上又はリン酸基の酸素原子上に点線によって示されている。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基」は、「オメガ−ホスホノオキシアルキルアンモニウム」と同様に使用でき、下記一般式（Ｉ）
【００９８】
【化２】
0006280293.tif 000003
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【００９９】
【化３】
0006280293.tif 000004
から選択される複素環を形成しており、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
の化合物を表す。
【０１００】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基が下記一般式（Ｉ）：
【０１０１】
【化４】
0006280293.tif 000005
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１０２】
【化５】
0006280293.tif 000006
から選択される複素環を形成していてもよく、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とする、使用を対象とする。
【０１０３】
好ましいω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基は、一般式（Ｉ）：
【０１０４】
【化６】
0006280293.tif 000007
［式中、
ｎ＝２又は３であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１０５】
【化７】
0006280293.tif 000008
から選択される複素環を形成していてもよい］
の化合物を構成する。
【０１０６】
特に好ましいω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基は、一般式（Ｉ）：
【０１０７】
【化８】
0006280293.tif 000009
［式中、
ｎ＝２であり、
Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５から、特に好ましくは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１０８】
【化９】
0006280293.tif 000010
から選択される複素環を形成していてもよい］
の化合物を構成する。
【０１０９】
対応するカラム材料の官能化に適当な、前述のω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基を含む好ましい化合物は、例えば、以下を含む：
リン酸水素２−［２−（２−アミノエトキシ）エチル−ジエチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［４−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］モルホリン−４−イウム−４−イル］エチル、リン酸水素２−［１−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］ピペリジン−１−イウム−１−イル］エチル−、リン酸水素２−［２−（２−アミノエトキシ）エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［３−アミノプロピル−（ジメチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［ジメチル（４−スルファニルブチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［４−アジドブチル（ジメチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［ジメチル（ペンタ−４−イニル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［３−（６−アミノヘキサノイル−アミノ）プロピル−ジエチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［１−［２−［２−（６−アミノヘキサノイル−アミノ）エトキシ］エチル］ピペリジン−１−イウム−１−イル］エチル、リン酸水素２−［４−［２−［２−［３−（６−アミノヘキサノイルアミノ）プロパノイルアミノ］エトキシ］エチル］モルホリン−４−イウム−４−イル］エチル、リン酸水素２−［１−［２−［２−［６−（６−アミノヘキサノイルアミノ）−ヘキサノイルアミノ］エトキシ］エチル］ピロリジン−１−イウム−１−イル］エチル、リン酸水素２−［２−アリルオキシエチル（ジメチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［２−アリルオキシエチル（ジエチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［４−（２−アリルオキシエチル）モルホリン−４−イウム−４−イル］エチル、リン酸水素２−［１−（２−アリルオキシエチル）ピペリジン−１−イウム−１−イル］エチル、リン酸水素２−［２−［２−（６−アミノヘキサノイルアミノ）エトキシ］エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［２−［２−［３−（６−アミノヘキサノイルアミノ）プロパノイルアミノ］エトキシ］エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［３−アジドプロピル（ジメチル）アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［ジメチル−［２−［２−（プロパ−２−イノキシカルボニルアミノ）エトキシ］エチル］アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［２−［２−（アリルオキシカルボニルアミノ）エトキシ］エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［２−［２−［６−（アリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノイルアミノ］エトキシ］エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［２−（６−アミノヘキサノイルアミノ）エチル−ジメチル−アンモニオ］エチル、リン酸水素２−［ジメチル−［３−［６−（プロパ−２−イノキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイルアミノ］プロピル］アンモニオ］エチル、及びリン酸水素２−［３−（６−アミノヘキサノイルアミノ）プロピル−ジメチル−アンモニオ］エチル
本明細書中で使用する用語「ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基」は、「オメガ−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基」と同様に使用でき、下記一般式（ＩＩ）
【０１１０】
【化１０】
0006280293.tif 000011
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１１１】
【化１１】
0006280293.tif 000012
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
の化合物を表す。
【０１１２】
好ましい「ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基」は、一般式（ＩＩ）
【０１１３】
【化１２】
0006280293.tif 000013
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１１４】
【化１３】
0006280293.tif 000014
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈである］
の化合物を構成する。
【０１１５】
本発明の範囲内において、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基は、ω−トリアルキルアンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基であるのが特に好ましい。
【０１１６】
したがって、特に好ましいω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基は、一般式（ＩＩ）
【０１１７】
【化１４】
0006280293.tif 000015
［式中、
ｎ＝２であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５から、特に好ましくは−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５から選択される］
の化合物を構成する。
【０１１８】
また、ω−アンモニウムアルコキ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基は、ω−トリメチルアンモニムメトキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基又はω−トリメチルアンモニウムプロポキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基であるのが特に好ましい。
【０１１９】
対応するカラム材料の官能化に適当な、前述のω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基を含む好ましい化合物は、例えば、ｐ−アミノフェニルホスホコリン（ＡＰＰＣ）、４−［［ヒドロキシ［２−（トリメチルアンモニオ）エトキシ］ホスフィニル］オキシ］ベンゼンジアゾニウム（ｐ−ジアゾニウムフェニルホスホコリン）又はｐ−ニトロフェニル−６−（Ｏ−ホスホコリン）ヒドロキシヘキサノエートを含む。
【０１２０】
本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基が、下記一般式（ＩＩ）
【０１２１】
【化１５】
0006280293.tif 000016
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１２２】
【化１６】
0006280293.tif 000017
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とする、使用を対象とする。
【０１２３】
したがって、本発明はまた、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基が、下記一般式（Ｉ）
【０１２４】
【化１７】
0006280293.tif 000018
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１２５】
【化１８】
0006280293.tif 000019
から選択される複素環を形成しており、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とし、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基が、下記一般式（ＩＩ）
【０１２６】
【化１９】
0006280293.tif 000020
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１２７】
【化２０】
0006280293.tif 000021
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有することを特徴とする、使用を対象とする。
【０１２８】
したがって、本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われ、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基が下記一般式（Ｉ）
【０１２９】
【化２１】
0006280293.tif 000022
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１３０】
【化２２】
0006280293.tif 000023
から選択される複素環を形成しており、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有する、使用に関する。
【０１３１】
本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われ、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基が、下記一般式（ＩＩ）
【０１３２】
【化２３】
0006280293.tif 000024
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１３３】
【化２４】
0006280293.tif 000025
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有する、使用を対象とする。
【０１３４】
したがって、本発明はまた、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用であって、ＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料へのＣＲＰの（Ｃａ２＋依存性）結合によって行われ、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基が下記一般式（Ｉ）
【０１３５】
【化２５】
0006280293.tif 000026
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１３６】
【化２６】
0006280293.tif 000027
から選択される複素環を形成していてもよく、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有し、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基が、下記一般式（ＩＩ）
【０１３７】
【化２７】
0006280293.tif 000028
［式中、
ｎは、２及び３から選択され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択される、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、
【０１３８】
【化２８】
0006280293.tif 000029
から選択される複素環を形成していてもよく、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ５Ｈ１１、−Ｃ６Ｈ１３から選択され、好ましくは−Ｈであり、
１つ又は複数の水素原子は、フッ素原子で置き換えられていてもよい］
を有する、使用に関する。
【０１３９】
本発明の考えられる一実施形態において、ω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基は、ホスホエステル結合を介して、グリセロール分子のヒドロキシ基に結合され（有機リンカーとして）、得られたグリセロールエステルは次に、グリセロールの第２のヒドロキシ基を介してカラム材料に結合される。このような実施形態においては、グリセロールの残りの第３のヒドロキシ基は、脂肪酸によってエステル化されるか、又は第２のω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基によってエステル化されることも可能である。さらに、グリセロール分子上の各エステル化の位置は、異なり得る。適当な脂肪酸は、８〜２８個の炭素原子を有する通常の飽和のモノオレフィン性、ポリオレフィン性、モノアセチレン性脂肪酸、不飽和の直鎖及び／又は分枝脂肪酸である。好ましい脂肪酸残基は、パルミチン酸、アラキドン酸、オキソ吉草酸、グルタル酸、エポキシイソプロスタン及びステアリン酸である。
カラム材料
ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を調製するためには、原則として、特に、カラム材料との接触後の血液若しくは血漿がもはや患者に注射できなくなるほどに血液若しくは血漿と反応したり、又は血液若しくは血漿を変化させたり又は血液若しくは血漿に夾雑したりすることがない、全ての不活性クロマトグラフィー又はカラム材料が、材料として適当である。本発明のカラム材料は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：Ｅｕｐｅｒｇｉｔｅ（登録商標）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリアクリレート、メタクリレート、メタクリル酸樹脂、例えば、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）及びポリ（グリシジルメタクリレート）（ＰＧＭＡ）、ポリ（ヒドロキシメタクリレート）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリウレタン（ＰＵ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、アクリルビーズ、アガロース、セルロースマトリックス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギネート、カラギーナン、キチン、デンプン、ニトロセルロース、セラミックマトリックス、ガラスビーズ及び／若しくは固相シリカ又はこれらの物質の混合物及び／若しくは誘導体。固相シリカマトリックスは、ほとんどあらゆる形態の微粒子シリカ、非晶質シリカ、例えば、コロイドシリカ、シリカゲル、沈降シリカ及び燻煙シリカ（ｓｍｏｋｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）又は焼成シリカ；微晶質シリカ、例えば、珪藻土；並びに結晶シリカ、例えば、石英を含むことができる。シリカは、約４５〜１２０メッシュ（約３４５μｍ〜１２５μｍ）の範囲、好ましくは約４５〜６０メッシュ（約３４５μｍ〜２１２μｍ）の範囲の粒径を有する。
【０１４０】
多くの場合、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基による官能化のためには、既に「前官能化」されている、即ち、次にω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基の共有結合を可能にする化学基を備えているカラム材料を使用する。
【０１４１】
カラム材料のこのような「前官能化」は、当業者に周知の方法によって達成される（Ｃｈｉｎ．Ｊ  Ｃｈｅｍ．２０１２、３０、２４７３頁；Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．２０１３、６２、９９１頁）。加えて、いくつかの既に「前官能化された」カラム材料、例えば、以下のものが市販されている：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ａｍｉｎｏ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｔｒｅｓｙｌ、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＣＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、末端ビニルスルホン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｆｆｉｌａｎｄ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｅｐａｒｏｐｏｒｅ（登録商標）（Ａｇａｒｏｓｅ）４Ｂ、ＥＣＨ  Ｓｅｐａｒｏｐｏｒｅ（登録商標）（Ａｇａｒｏｓｅ）４Ｂ（Ｓｅｐａｒｏｐｏｒｅ）、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．からのアガロース、例えば、Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−４  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−６  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨからのアガロース、Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−４  Ａｇａｒｏｓｅ（ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−６  Ａｇａｒｏｓｅ（ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、任意の架橋度を有する活性化アガロース。
【０１４２】
本発明による、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用は、心停止後の蘇生のための並びに心血管疾患、特に心臓発作（心筋梗塞）、脳卒中及び肺塞栓症の予防及び／又は治療のための、血液又は血漿からのＣＲＰの体外除去に特に適当である。本発明による、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用はまた、慢性炎症、移植中の拒絶反応及びアレルギー反応の群から選択される免疫系の過剰反応の予防及び／又は治療のための、血液又は血漿からのＣＲＰの体外除去に適当である。したがって、本発明によるシトレート溶液の使用は、以下の群から選択される慢性炎症の予防及び／又は治療のための、血液又は血漿からのＣＲＰの体外除去に特に適当である：痛風、変形性関節症、多発性硬化症、慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、重症筋無力症、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、例えば橋本甲状腺炎及びオード甲状腺炎、尋常性乾癬、強直性（ａｎｋｙｌｏｓａｎ）脊椎炎（ベヒテレフ病）、グッドパスチャー症候群及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症（ヴェゲナー病）、多発性筋炎及び皮膚筋炎。上記慢性炎症のうち、以下のいくつかの疾患は、リウマチ様疾患という総称に含まれる：例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、オード甲状腺炎、尋常性乾癬、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症（ヴェゲナー病）、血管炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎。
【０１４３】
シトレートは、血小板の凝集及び補体の活性化を防止するので、良好な抗凝固薬である。特に、これは、血漿遠心分離機を使用する場合に重要である。そうでなければ凝固が起こるので、これらにはシトレートが必要である。これは、ヘパリンによる純粋な抗凝固によっては実現できない。加えて、シトレートは肝臓においてクエン酸回路で急速に代謝される。したがって、患者はさらに全身的に抗凝固されることはない。特に梗塞患者の場合、標準的な梗塞療法（例えば、アセチルサリチル酸、クロピドグレルによる）の過程で既に強力に抗凝固されているので、これは重要である。追加の抗凝固は、重大である出血のリスクを増加させる。加えて、血漿遠心分離機では、膜（フィルター）ベースの一次分離システムよりもはるかに少ない血流量を達成できる。通常の又は望ましい血漿流量は、約３０ｍｌ／分である。膜一次分離システムは、約１５０〜２００ｍｌ／分の血流量を必要とする（効率は、約１７％である）。血漿遠心分離機は、６０ｍｌ／分以下の血流量で十分である（効率約８７％）。特に高齢患者又は潜在能力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）がほとんどない患者においては、血流量が少ないほど、実現がはるかに容易である。
【０１４４】
加えて、膜ベースの一次分離システムでは、非常に侵襲的であって、抗凝固療法を受けている患者においては出血リスクのために危険である中心アクセス（例えば、カテーテル）が必要であるのに対し、血漿遠心分離機を使用する場合、出血の問題を生じない、例えば比較的大きい注入カニューレによる末梢アクセスで通常は、十分である。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ＣＲＰの精製のためのいくつかのクロマトフラフィーランの結果を示すグラフである。ＣＲＰ減少（％）がマトリックス体積に対して片対数表示でプロットされている。シトレート溶液は、ＣＲＰ濃度５０ｍｇ／Ｌのヒト血漿に１：５、１：１０、１：２０又は１：５０で添加され、ＡＰＰＣ結合Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−４  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ）０．５ｇをマトリックスとして含有するクロマトグラフィーカラムに適用された。シトレートが添加されていない試料は、対照の役割を果たした。カラムランを、１ｍｌの画分中の５、１０、２５、５０及び７５マトリックス体積の流量で収集した。次いで、画分中のＣＲＰ濃度を測定し、ＣＲＰの初期濃度（適用前の）に基づきＣＲＰ減少（％）を決定した。データ点は、少なくとも２つの独立した実験からの平均値を表す。
【図２】シトレートを添加して又は添加せずに、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された血漿中のＣＲＰの減少量を示す棒グラフである。
【図３】３つの異なる日に、シトレートを添加して又は添加せずに、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された血漿に適用したＳＤＳゲルを示す写真である。矢印は、Ｃ１ｑバンドを示す。このバンドは、ＡＣＤ−Ａと混合された血漿からの溶出液中のタンパク質をほとんど含有しない。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
［実施例］
本明細書中で使用する用語「マトリックス体積」（ＭＶとも略する）は、各アフィニティークロマトグラフィーに使用されるカラム材料の体積を指す。
【０１４７】
［実施例１］
血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー精製に対するシトレート溶液の添加の効果に関する比較研究
出発材料として、ＣＲＰ濃度約５０ｍｇ／Ｌのヒト血漿を、３５μｍフィルターを使用して濾過し、場合によりシトレート溶液を添加した（以下を参照のこと）。
アフィニティークロマトグラフィーの一般的な手順
クロマトグラフィーに関しては、低圧クロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＬｏｇｉｃ（商標）ＬＰ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ミュンヘン  ドイツ、カタログ番号７３１−８３００）を、３５μｍフィルター（ＭｏＢｉＴｅｃ  ＧｍｂＨ、製品番号Ｍ５２３５１５）を備えるカラム（Ｍｏｂｉｃｏｌ  「Ｃｌａｓｓｉｃ」、ＭｏＢｉＴｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ、製品番号Ｍ１００２）と共に使用し、これにカラム材料として０．５ｇのＡＰＰＣ結合アガロース（Ｅｐｏｘｙ−Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ−４  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ）（ＡＰＰＣ  １．６ｍｇ／ｍｌ）を、即ち、ホスホコリン誘導体ｐ−アミノフェニルホスホコリン（ＡＰＰＣ）が結合されたセファロース−マトリックスを含むカラム材料を充填した。カラムを３マトリックス体積（ＭＶ）の洗浄バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）で平衡化し、流れを廃棄した。
【０１４８】
次いで、試料をカラムに適用した。カラムの下流に接続されたフラクションコレクター（ＢｉｏＦｒａｃ（商標）  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号７４１−０００２）を用いて、カラムの流れをそれぞれ１ｍｌの画分に分けた。流量５ＭＶ、１０ＭＶ、２５ＭＶ、５０ＭＶ、７５ＭＶ及び１００ＭＶにおける１ｍｌ画分（フローフラクションとも称する）を収集し、残りの画分は合わせて、いわゆる「フロープール」を形成した。
【０１４９】
次いで、試料の適用後に、カラムを２５ＭＶの洗浄バッファーで洗浄した。これに続いて、７．５ＭＶ溶出バッファー１（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の適用によって、カラムに結合したＣＲＰを溶出させた。ここで、溶出液を分画し、ＵＶ吸収が０．０１を超える場合のみ、収集した。
【０１５０】
その後に、５ＭＶ溶出バッファー２（グリシンバッファー  ｐＨ２．８）を使用して、カラムを再生した。溶出バッファー１による溶出が完全でない場合、タンパク質、特にＣＲＰもまた、この画分中に存在する可能性がある。ＣＲＰが溶出バッファー２の２．８の酸性ｐＨで変性しないように、この溶出液に中和バッファー（３．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０）を添加する。最後に、カラムを、２０ＭＶの洗浄バッファーで再び洗浄する。
【０１５１】
濾過された出発材料、フロープール及び収集された画分のＣＲＰ含量を、競合的ヒト特異的イムノアッセイによって決定した（例えば、実施例２を参照のこと）。
出発材料中の平均ＣＲＰ濃度（平均［ＣＲＰ］とも称する）から出発して、次に、以下の式に従って、各画分についてＣＲＰ減少パーセントを求めた。
【０１５２】
【数１】
0006280293.tif 000030
したがって、出発材料中の同様に決定されたＣＲＰ濃度を考慮に入れて、画分、即ち、カラムからの流れ中のＣＲＰ濃度によって、カラムによるＣＲＰの保持についての結論を導き出した。
【０１５３】
カラム上に残る総ＣＲＰ量は、出発材料中の総ＣＲＰ量から、フロープール及び個々の画分の総ＣＲＰ量を減ずることによって算出できる。
シトレートの影響
ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いる生体液、例えば、血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー精製に対するシトレートの効果を検討するために、ヒト血漿をシトレート溶液と種々の混合比で混合した。使用したシトレート溶液は以下の通りであった：１リットル当たりクエン酸（無水）７．３ｇ（即ち、３８ｍＭクエン酸）、１リットル当たりクエン酸三ナトリウム二水和物２２．０ｇ（即ち、７４．８ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物）、水を加えて１Ｌ。シトレート溶液が１リットル当たりデキストロース（一水和物）２４．５ｇ（即ち、１２３．６ｍＭデキストロース一水和物）をさらに含有する実験は、同じ結果をもたらした。
【０１５４】
以下の混合比を検討した：
以下の混合比を検討した：
１：５０、即ち、シトレート溶液１部＋血漿４９部
１：２０、即ち、シトレート溶液１部＋血漿１９部
１：１０、即ち、シトレート溶液１部＋血漿９部
１：５、即ち、シトレート溶液１部＋血漿４部
シトレートが添加されていないヒト血漿は、参照試料の役割を果たした。シトレート溶液を、カラムの前にヒト血漿に、グラジエントミキサーを使用して添加した。
【０１５５】
参照試料（シトレート添加なし）及び各シトレート濃度に関しては、２つの独立したアフィニティークロマトグラフィーランを行った。
結果
図１から、参照測定（即ち、シトレートなし）の間に血漿からの効率的なＣＲＰ減少が起こっていることが分かる。カラムへの試料の適用開始時における減少パーセントは、９０％超であり（図５ＧＶを参照のこと）、その後、試料適用のさらなる過程において５０％をわずかに下回る値まで低下した。このような下降は、使用したカラムが持続的な試料適用によってますますＣＲＰを結合し、それによってますます飽和されるという事実によって説明できる。
【０１５６】
しかし、驚くべきことに、１：５０〜１：５の混合比において、参照条件下における減少性能（図１も参照のこと）に相当するＣＲＰ減少が見られる。全ての予想に反して、本発明による、生体液からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー除去のためのシトレート溶液の使用下における、血漿からのＣＲＰの効率的な除去が、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基で官能化されたカラム材料を用いてもたらすことができた。
【０１５７】
［実施例２］
試料中のＣＲＰ濃度の測定のためのｈｕ−ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡ
生体液、例えば、血漿からのＣＲＰのアフィニティークロマトグラフィー精製の有効性を判定するために、適切な試料中のヒトＣＲＰ（ｈｕ−ＣＲＰ）の濃度を、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着測定法）によって測定した。
【０１５８】
このために、マイクロタイタープレートのウェルを最初に、コーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）中で１：５００に希釈されたウサギポリクローナル抗ヒトＣＲＰ抗体（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ、製品番号Ｑ０３２９）の溶液１００μｌを添加することにより、ヒトＣＲＰに対する抗体でコーティングし、室温で１時間インキュベートした。次いで、これをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）少なくとも２５０μｌで４回洗浄した。
【０１５９】
濃度の測定のために、ゼロ較正としての試料バッファー（ＰＢＳＴ中５ｍＭ  ＥＤＴＡ）並びにＣＲＰ３００、２００、１００、５０、３０、１５及び８．３ｎｇ／ｍｌの濃度（試料バッファー中）の標準系列を使用した。標準系列に関しては、市販ＣＲＰ標準（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、ＣＲＰ１６２ｍｇ／Ｌ、Ｄａｋｏ、製品番号Ｘ０９２３）を試料バッファーで適宜希釈した。
【０１６０】
加えて、高いＣＲＰ濃度を有する参照試料（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｄａｋｏ、製品番号Ｘ０９２６）を試料バッファーで１：６００及び１：１５００に希釈し、低いＣＲＰ濃度を有する参照試料（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｄａｋｏ、製品番号Ｘ０９２５）を試料バッファーで１：２５０及び１：１０００に希釈し、ＥＬＩＳＡのための追加の参照試料として使用した。測定すべき実際の試料（即ち、出発材料、フロープール、フローフラクション）を３つの希釈（試料バッファー中）でマイクロタイタープレートに適用した。
【０１６１】
マイクロタイタープレートの各ウェルに対して、それぞれ１００μｌを適用し、室温で１．５時間インキュベートし、振盪機上で撹拌し（１分当たり６００回転）、次いで少なくとも２５０μｌのＰＢＳＴで４回洗浄した。
【０１６２】
検出のために、その後に、ブロッキング溶液（１％カゼイン、０．９％  ＮａＣｌ、０．００１％チオメルサール）中ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体（ウサギ抗ｈｕＣＲＰ−ＰＯＤコンジュゲート、２０μｇ／ｍｌ原液、１：１０００希釈）及びウサギ由来の競合ポリクローナル抗ヒトＣＲＰ抗体（Ｄａｋｏ、製品番号Ｑ０３２９、１：２０００希釈）を添加した。ウェル当たり１００μｌを再び適用し、室温で１．５時間インキュベートし、振盪機上で撹拌し（１分当たり６００回転）、次いで少なくとも２５０μｌのＰＢＳＴで再び４回洗浄した。
【０１６３】
その後、検出反応のために、基質を添加した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの溶液（ＴＭＢ、ＤＭＳＯ及びＥｔＯＨ中で２５ｍｇ／ｍｌ）を基質バッファー（０．２Ｍクエン酸中０．０１％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ３．９５）で希釈し、その１００μｌをピペットで各ウェルに取った。暗所で１０〜１５分間インキュベート後、ウェル当たり５０μｌの停止液の添加によって検出反応を停止させた。次いで、マイクロタイタープレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ  ６８０ＸＲ、ＢｉｏＲａｄ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて、４５０ｎｍ（参照６５５ｎｍ）における吸光度を測定することにより、測光検出を行った。装置によって引き起こされる測定の不正確さを排除するために、各場合に各マイクロタイタープレートの二重測定を行った。加えて、結果の再現性を増加させるために、各実験を３回繰り返した。
【０１６４】
予備実験において、ｈｕ−ＣＲＰ−ＥＬＩＳＡの信頼性に対する、使用したシトレート濃度の影響を排除した。
言うまでもなく、ＣＲＰの測定のための他の方法もまた、調べるべき試料中のＣＲＰ濃度の測定に使用できることを、ここで指摘すべきである。
【０１６５】
［実施例３］
シトレート下におけるＣＲＰの減少
規定ＣＲＰ濃度（３８．８ｍｇ／ｌ）の血漿をそれぞれ１２．５ｍｌに分けた。半分をシトレート（酸−シトレート−デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）溶液１：１５）の添加によって希釈して、アフィニティークロマトグラフィーカラム（０．５ｍｌマトリックス体積の４−アミノフェニルホスホコリンと結合したアガロース）にかけ、他の半分を、ＡＣＤ−Ａを用いずに同一カラムにかけた。アフェレーシスの前後に、ＣＲＰ含量を測定した。これから、排除されたＣＲＰ量を算出した。シトレートの添加後は、より多くのＣＲＰがカラムに結合し、除去されることが判明した。結果を図２に示す。
【０１６６】
溶出液をまた、ＳＤＳゲルに適用した。その写真を図３に示す。シトレート（ＡＣＤ−Ａ）を使用するアフェレーシスでは、除去される補体（Ｃ１ｑ）が、シトレート溶液を用いないアフェレーシスよりも少ないことが示されている。
【０１６７】
シトレートによるカラム能力の増加は、本発明者らによって、正確さを主張することなく、以下のように説明される。補体は、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基に結合したＣＲＰに結合する。シトレートの存在下では、活性化される補体はより少なく、Ｃ１ｑ／Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ複合体の結合も少ないように見える。Ｃ１−４／Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ複合体がカラム材料に直接的に又は間接的に結合するならば、これらのかなり大きい複合体のため、生じるＣＲＰ結合の立体障害も少なくなる。
【０１６８】
総合的に言えば、精製すべき生体液にシトレート溶液を添加すると、ω−ホスホノオキシアルキルアンモニウム基及び／又はω−アンモニウムアルコキシ−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ基によって官能化されたカラム材料の能力が増加する。さらにまた、活性化される補体はより少ない。ペプチドリガンドと比較すると、能力のこの増加は、シトレートによっては観察されなかった。
【図１】
0006280293.tif 000035
【図２】
0006280293.tif 000036
【図３】
0006280293.tif 000037