(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続水相及び少なくとも１つの分散相を含んで成るナノエマルション形態の製剤であって、
−少なくとも5モル%の両親媒性脂質、
−15〜70モル%の少なくとも１つのカチオン性界面活性剤であって、
−以下から選択される、少なくとも１つの親油性基：
−R又はR−（C=O）-基（式中、Rが、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である）、
−12〜24個の炭素原子、及びフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド、及び
−ポリ（酸化プロピレン）、及び
−以下から選択される、少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る、少なくとも１つの親水基：
−1〜12個の炭素原子を有し、且つ少なくとも１つのカチオン性基によって分断及び／又は置換された直鎖又は分岐アルキル基、及び
−少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る親水性重合性基、
を含んで成る、カチオン性界面活性剤、
−少なくとも25のエチレンオキシド単位を含んで成る、少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）鎖を含んで成る10〜55モル%の補助界面活性剤、
−可溶性脂質、
−任意にヘルパー脂質（helper lipid）、
−任意の油；
−任意のイメージング剤；及び
−任意の親油性治療剤；
を含んで成り、
両親媒性脂質、カチオン性界面活性剤及び補助界面活性剤のモルパーセンテージが、両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質の全量に対してであり、
そして前記分散相に対する可溶性脂質、任意の油、任意のイメージング剤、任意の親油性治療剤の全量の重量比率が１０〜６０％である、製剤。
【請求項２】
前記カチオン性界面活性剤が、
−N［1−（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウム、
−1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン、
−N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（テトラデシルオキシ−1−プロパンアニウム（propananium））、
−1−［2−オレオイルオキシ（oleoyloxy）エチル］−2−オレイル-3−（2−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム、及び
−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、
から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ヘルパー脂質を含んで成る、請求項1又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記両親媒性脂質がリン脂質である、請求項1〜３のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項５】
イメージング剤を含んで成る、請求項1〜４のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項６】
治療剤を含んで成る、請求項1〜５のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項７】
所望の分子が結合された補助界面活性剤を含んで成る、請求項1〜６のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項８】
200未満の塩基を含んで成る一本鎖又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列であって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる一本鎖又は二重鎖核酸配列を含んで成る、請求項1〜７のいずれか1項に記載の製剤。
【請求項９】
前記核酸配列が、
−低分子干渉RNA、
−ロックド核酸、及び
−合成マイクロRNA、
から選択される、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記核酸配列が低分子干渉RNAである、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか1項に記載の製剤の調製方法であって、以下の、
（ｉ）可溶性脂質、両親媒性脂質、カチオン性界面活性剤を含んで成る油相を調製する工程、
（ｉｉ）補助界面活性剤を含んで成る水相を調製する工程、
（ｉｉｉ）十分な剪断作用下で、上記油相を水相に分散し、ナノエマルション形態の、例えば、請求項１〜７のいずれか1項に記載の製剤を得る工程、続いて
（ｉｖ）200未満の塩基を含んで成る一本鎖又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列であって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる一本鎖又は二重鎖核酸配列を、エマルション形態の請求項１〜７のいずれか1項に記載の製剤に添加する工程、続いて
（ｖ）形成された製剤を回収する工程、
を含んで成る、方法。
【請求項１２】
200未満の塩基を含んで成る一本鎖又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列であって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる一本鎖又は二重鎖核酸配列の、真核生物細胞へのインビトロ（in vitro）での挿入方法であって、
上記真核生物細胞を請求項８〜１０のいずれか1項に記載の製剤と接触させる工程を含んで成る、方法。
【請求項１３】
疾患の予防及び／又は治療のための、請求項８〜１０のいずれか1項に記載の製剤を含んで成る、医薬組成物。
【請求項１４】
ナノエマルション形態の請求項１〜７のいずれか1項に記載の製剤、及び
少なくとも１つの200未満の塩基を含んで成る一本鎖又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列であって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる一本鎖又は二重鎖核酸配列、
を別々に含んで成る、キット。
【請求項１５】
前記ヘルパー脂質が、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンである、請求項３に記載の製剤。
【請求項１６】
前記所望の分子が、標的生物リガンドである、請求項７に記載の製剤。
【請求項１７】
前記分散相に対する可溶性脂質、任意の油、任意のイメージング剤、任意の親油性治療剤の全量の重量比率が２３．５３〜５９．５１％である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を送達するのに有用なナノエマルションタイプの製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉のメカニズムは、遺伝子発現の転写後阻害のメカニズムであり、標的mRNAを特異的に分解し、そして、高度に選択的、且つ特異的なタンパク質の発現を阻害する二本鎖低分子干渉RNAに基づいている。このメカニズムは、細胞質内でおこなわれ、RISC複合体と呼ばれる多タンパク質複合体（RNA誘導性サイレンシング複合体）が関与する。
【０００３】
この天然のメカニズムの発見以来、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列が、いくつかの生物学部門において多数の学術的及び／又は医薬的な実験室で研究手段として使用された。例えば、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列は、多数の病状で新しい治療標的を検出するのに使用される。所定のタンパク質の発現の高度に選択的且つ特異的な阻害によって、病状の発症過程でそのタンパク質が果たす役割を証明することが可能である。それにもかかわらず、細胞内への外来性遺伝物質の挿入（トランスフェクション）は、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列−それは通常巨大分子（>10kDa）であり、且つ陰性荷電されている−を本当のバリアを形成する陰性荷電した原形質膜を通過できるようにする、適合した物理的、化学的又は生物学的方法を必要とする。
【０００４】
物理的方法の中でも、エレクトロポレーション又は超音波による膜での細孔の作製が言及され得る。生物学的方法の中でも、ウイルスなどの核酸を送達するのに特化したシステムが採用され得る。化学的方法の中でも、以下の：
−lipoplexes（核酸とカチオン脂質の間で形成された複合体）、例えば、リポフェクタミン（登録商標）2000、
−polyplexes（核酸とカチオン性重合体の間で形成された複合体、例えば、ポリエチレンイミンPEI）、
−核酸とデンドリマーの間で形成された複合体、例えば、デンドリマー含有ポリ（アミドアミン）PANAM、
−lipopolyplexes（核酸、リポソームと重合体の間で形成された複合体）、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）タイプの重合体によって安定させたリポソームを形成するカチオン脂質と補助剤の混合物に相当するSNALPs（＜安定した核酸−脂質粒子＞）、
−核酸と高分子ポリ（DL−ラクチド−コグリコリド）PLGAナノ粒子の間で形成された複合体、
の使用が引用され得る。
【０００５】
発明者らの知る限りでは、Parkら（Molecular Pharmaceutics 5, 4, 622-631, 2008）だけが、siRNAを送達するための脂質ナノ粒子の使用を記載している。脂質ナノ粒子は、コレステロール、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン（DOPE）及びsiRNA誘導体を含んでおり、トランスフェクションとGFPタンパク質のノックダウンに使用された。しかしながら、ナノ粒子外へのsiRNAの漏出を予防するために、siRNAがそれに共有結合で結合された。siRNAをナノ粒子内に挿入されたポリ（エチレンオキシド）鎖に共有結合で結合させ、siRNAの固定を可能にした。加えて、蛍光標識（イメージング剤）もまた、トランスフェクションを追跡するためにsiRNAに共有結合で結合された。しかしながら、siRNAのあらゆる化学修飾が、その変性を引き起こす可能性がある。さらに、Parkらによって使用された技術は、使用されるそれぞれのsiRNAの化学修飾を必要とし、そしてそれは、手間がかかり、且つ高価である。そのため、これらの配列が化学的に改変されないRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を送達するためのシステムを提供する必要がある。
【０００６】
そのうえ、特許出願WO2010/018223は、水相、並びに両親媒性又は親油性治療剤を送達するためにアルキレンオキシド反復単位で構成された少なくとも１つの鎖を含んで成る、両親媒性脂質、可溶性脂質、治療剤、及び補助界面活性剤を含んで成る少なくとも１つの分散相を含んで成るナノエマルション形態の製剤の使用を記載している。治療剤は、特にsiRNAであり得る。しかしながら、siRNAは親水性化合物なので、それらは、ナノエマルションの分散相中ではなく、連続水相中に含まれるであろう。そのため、本出願に記載の製剤は、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の送達に適合させられない。加えて、複合体形成の収率が非常に低いので、トランスフェクションが効果的でないだろうので、そこにカチオン性が界面活性剤が組み込まれたときでさえ、WO2010/018223に記載の製剤のすべて、特に実施例に記載のものが、本願のために適しているというわけではないことを、本発明者らが証明した。以下に説明されているとおり、特定の割合の成分を含んで成る製剤だけが、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の送達を可能にする。
【０００７】
水中油型乳剤又は脂肪滴を含んで成るデオキシリボ核酸（DNA）を送達するためのシステムもまた、知られている。これらのシステムでは、脂肪滴は、それを介して静電的相互作用でDNAが液滴に結合するカチオン性界面活性剤を含んで成る。
【０００８】
例えば、Del Pozo-Rodriguezら（International Journal of Pharmaceutics, 385, 2010, 157-162）は、HEK293細胞のインビボトランスフェクション及びマウスへの投与後のインビトロトランスフェクションのための、蛍光タンパク質EGFPを発現する裸のプラスミドDNA（pDNA）、Precirol（登録商標）ATO5、Tween80、及び塩化1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）（カチオン性界面活性剤）を含んで成る脂質ナノ粒子が静脈内に与えられたマウスの肝臓と脾臓に蛍光の存在を観察した。
【０００９】
Tabattら（European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57, 2004, 155）は、COS−1細胞のインビトロトランスフェクションのためのCompritol ATO888又はcetylpalmitate、Tween80、Span85、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（BA）と臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）と塩化ヘキサデシルピリジニウム（CPC）と臭化ジメチル−ジオクタデシルアンモニウム（DDAB）と塩化N,N−ジ−（b−ステアロイルエチル）−N,N−ジメチル−アンモニウム（Esterquat1、EQ1）と塩化8,N−［1−（2,3−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウム（DOTAP）から選択されるカチオン性界面活性剤を含んで成る固体脂質ナノ粒子の使用を記載している。
【００１０】
これらの物品の両方では、Tween80が使用された。しかし、これには、細胞に対する何らかの毒性がある。加えて、Tween80は、20単位のエチレンオキシドを含んで成るポリ（エチレンオキシド）鎖を含んでいる。以下で説明するとおり、発明者らは、長いポリ（エチレンオキシド）鎖（少なくとも25エチレンオキシド単位）を有する界面活性剤は、処方するのがより簡単であり、より安定していて、そして、外部媒質に対して製剤に含まれた核酸配列のより効果的な保護を可能にすることを証明した。
【００１１】
最後に、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列、特にsiRNAは、一般にDNAより安定していない。加えて、DNAとsiRNAの生物学的活性は大きく異なっており、それは、DNAに適合させた送達システムが、siRNAの送達のために適合させたものと必ずしも同じではないことを意味する。特に、いずれかの場合において、１つの前提条件が効率的トランスフェクションを可能にする送達システムであったとしても、これは、遺伝子のサイレンシングを可能にする場合にしか役に立たないsiRNAを送達するのに十分ではない。
【００１２】
そのため、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列のインビボ及びインビトロでの送達を可能にする新製剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【００１３】
［製剤］
この目的のため、且つ本発明の最初の課題により、連続水相と少なくとも１つの分散相を含んで成る、ナノエマルション形態の製剤を提供する。
【００１４】
本発明は、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成り、前記配列の送達を可能にする製剤を提供する。
【００１５】
RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んでいない、いわゆる＜プレミックス＞製剤も提供し、そしてそれは、この＜プレミックス＞製剤とRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の複合体形成によって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成る製剤の調製を可能にする。そのため、この＜プレミックス＞製剤は、最終的な製剤の所望される使用によって、適しているRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列と有利に複合体化される。
【００１６】
［プレミックスタイプの製剤］
そのため、本発明の第一の目的は、連続水相と少なくとも１つの分散相を含ん成り、且つ以下の：
−少なくとも5モル%の両親媒性脂質；
−以下のものを含んで成る15〜70モル%の少なくとも１つのカチオン性界面活性剤：
−以下の中から選択される少なくとも１つの親油性基：
【００１７】
−R又はR−（C=O）−基（式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である）、
−12〜24個の炭素原子及びフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド、及び
−ポリ（酸化プロピレン）、並びに
【００１８】
−以下の中から選択される少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る少なくとも１つの親水性基：
−1〜12個の炭素原子を有し、且つ少なくとも１つのカチオン性基によって分断及び／又は置換された直鎖又は分岐アルキル基、及び
−少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る親水性重合性基、そして、
−少なくとも25単位のエチレンオキシドを有する少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）鎖を含んで成る、10〜55モル%の補助界面活性剤；
−少なくとも１つの脂肪酸グリセリドを含んで成る可溶性脂質；
−任意にヘルパー脂質；
を含んで成り、両親媒性脂質、カチオン性界面活性剤、及び補助界面活性剤のモルパーセンテージが、全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対してである、ナノエマルション形態の製剤を提供することである。
【００１９】
以下で説明したとおり、両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質は、＜プレミックス＞製剤における液滴構造のクラウン部分で主要な成分である。
【００２０】
そのため、エマルションは水中油型のエマルションである。それは、単純エマルションであっても、特に分散相中に第二の水相を含んでいる多重エマルションであってもよい。好ましくは、それは単純エマルションである。
【００２１】
本発明は、上記製剤がトランスフェクション剤、及び／又はRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列のインビトロ及びインビボの送達に使用できるという意外な発見に基づいている。その製剤は、有利なことに良好な生物学的利用能を呈し、他の送達システムで一般に観察されるRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の分解、特にタンパク質による分解の制限を可能にできる。
【００２２】
加えて、その製剤は、有利なことには安定している；それは分解がまったく観察されることなく数時間保存できる。
【００２３】
・カチオン性界面活性剤
本発明の製剤は、以下のもの含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで成る：
−以下の中から選択される少なくとも１つの親油性基：
−11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖を表すR基；
−12〜24個の炭素原子と、例えばジステアリルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）などのフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド；及び
−ポリ（酸化プロピレン）；並びに
−以下の中から選択される少なくとも１つの親水性基を含んで成る少なくとも１つのカチオン性基：
【００２４】
−1〜12個の炭素原子を有し、少なくとも１つのカチオン性基によって分断及び／又は置換された直鎖又は分岐アルキル基；そして、
−少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る親水性重合性基であって、その重合性基が以下の中から特に選択されるもの：
−一般的に3〜500のエチレンオキシド単位、好ましくは、20〜200エチレンオキシド単位を含んで成り、且つ少なくとも１つのカチオン性基を含んで成るポリ（エチレンオキシド）、
【００２５】
−特に0.5〜20kDa、例えば1〜12kDaの分子量を有する、例えばデキストラン、セルロース又はキトサンなどの多糖、
−特に0.5〜20kDa、例えば1〜12kDaの分子量を有する、例えばキトサン又はポリリシンなどのポリアミン。
【００２６】
＜12〜24個の炭素原子とフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド＞とは、以下の式の基を意味している：
【００２７】
【化１】
0006280120.tif 000002
【００２８】
｛式中：
−R3及びR4は独立に、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖であり；
−A3及びA4は、O又はNHを表し；及び
−Mは、H又はカチオンである｝。
【００２９】
カチオン性界面活性剤のカチオン性基は、一般的に以下のものである：
−アンモニウム、イミダゾリウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ホスホニウム又はスルホニウム基の中から選択されるオニウム；又は
−例えばCa2+、Al3+、Ni+、Zn2+、Fe2+、Fe3+又はCu2+などの無機カチオンとの間の複合した、単座又は多座キレート性有機基、例えばフェナントロリン、ピリジン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリン、バクテリオクロリンのラジカルの間の金属複合体、又は
−アンモニウム基、特に−+NMe3、−+NHMe2、−+NH2Me、及び−+NH3であり、−+NH3が特に優先される。
【００３０】
明らかに、アニオンは、製剤が電気的に中性であるように（単数若しくは複数の）カチオン性基に結び付いている。アニオンのタイプは限定されない。例示のとおり、ハロゲン化物、特に塩化物、臭化物又はトリフルオロ酢酸塩に言及され得る。
【００３１】
カチオン性界面活性剤では、（単数若しくは複数の）親油性基を少なくとも１つのカチオン性基を含ん成る（単数若しくは複数の）親水基に連結する連結基のタイプは限定されない。連結基の例は、以下に与えられる（基L）。
【００３２】
一実施形態において、カチオン性界面活性剤は、以下の式（A）を有する：
［（Lipo）l−L−（Hydro）h］n+、（n／m）［A］m-    （A）
｛式中：
−l及びhは独立に、1〜4の整数であり；
−nは、1以上の整数、一般に1〜50であり；
−Lipoは、例えば先に規定されるものなどの親油性基を表し；
−Hydroは、少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る、例えば先に規定されるものなどの親水基を表し；
−Lは、連結基であり；
−Aは、アニオンであり；
−mは、アニオンの荷電を表す整数であり；
−nは、カチオン［（Lipo）l−L−（Hydro）h］の荷電を表す整数である｝。
【００３３】
上記の式（A）において、Lは、好ましくは以下のようなものである：
−l及びhが1を表すとき、Lは、以下の中から選択される二価の連結基であり；
−単結合；
−−O−、−NH−、−O（OC）−、−（CO）O−、−（CO）NH−、−NH（CO）−、−O−（CO）−O−、−NH−（CO）−O−、−O−（CO）−NH−、及び−NH−（CO）−NH、−O−PO（OH）−O又は5〜6個の原子を有する環状の二価ラジカルの中から選択されるZ基；
【００３４】
−1〜6個の炭素原子を有するアルキレンであるAlk基；及び
−基：Z−Alk、Alk−Z、Alk−Z−Alk又はZ−Alk−Z（式中、Alk及びZは、先に規定されるようなものであり、且つ式中、Z−Alk−Z基中の2つZの基は同じであるか又は異なっている）；
−基l又はhの１つが1を表し、且つもう片方が2を表すとき、Lは、リン酸基OP−（O−）3、式−O−CH2−CH−（O−）CH2−O−のグリセロールから得られた基、及び5〜6個の原子を有する環状の三価ラジカルから選択される三価の基であり；
−他の値のlとhに関して、Lは、5〜6個の原子を有する環状の多価ラジカルである。
【００３５】
特に好ましい様式において、Lは、以下のようなものである：
−l及びhが1を表すとき、Lは、以下の中から選択される二価の連結基であり；
−単結合；
−−O−、−NH−、−O（OC）−、−（CO）O−、−（CO）NH−、−NH（CO）−、−O−（CO）−O−、−NH−（CO）−O−、−O−（CO）−NH−、及び−NH−（CO）−NH、又は−O−PO（OH）−Oの中から選択されるZ基；
−基l又はhの１つが1を表し、且つもう片方が2を表すとき、Lは、リン酸基OP−（O−）3、式−O−CH2−CH−（O−）CH2−O−のグリセロールから得られた基である。
【００３６】
上記の式（A）において、lとhは、好ましくは、独立に1又は2である。
【００３７】
第一の選択肢によると、カチオン性界面活性剤の親水基は、1〜12個の炭素原子を有し、且つ少なくとも１つのカチオン性基によって分断及び／又は置換された直鎖又は分岐アルキル基である。そのようなカチオン性界面活性剤に関する例として、次のものが引用できる：
【００３８】
1）（Lipo）−（CH2）m1−NR30R31R32｛式中、Lipoは、先に規定されているような親油性基であり、m1は、1又は2であり、R30、R31、及びR32は独立に、H、Me又は−CH2−CH2−OHである｝、
2）
【００３９】
【化２】
0006280120.tif 000003
【００４０】
｛式中、各Lipoは独立に、例えば先に規定されるような親油性基であり、R33は、H、Me又は−CH2−CH2−OHである｝、
3）
【００４１】
【化３】
0006280120.tif 000004
【００４２】
｛式中、Lipoは、先に規定されるような親油性基であり、且つR34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、及びR43は独立に、H、Me又は−CH2−CH2−OHである｝。
【００４３】
一実施形態において、カチオン性界面活性剤は、以下：
−N［1−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］N,N,N−トリメチルアンモニウム（DOTMA）、
−1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）、
−N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（テトラデシルオキシ−1−プロパンアニウム）（DMRIE）、
−1−［2−（オレオイルオキシ）エチル］−2−オレイル−3−（2−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム（DOTIM）、及び
−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）（プロトン型で）、
の中から選択され、そして、好ましくは、1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）である。
【００４４】
第二の選択肢によると、カチオン性界面活性剤の親水基は、少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る親水性重合性基である。
【００４５】
カチオン性界面活性剤の親水基が重合性基であるとき、カチオン性基は、末端であっても、ペンダント基であってもよい。例えば：
−親水性重合性基がポリ（エチレンオキシド）であるときに、一般に、（単数若しくは複数の）カチオン性基はポリ（エチレンオキシド）鎖の末端部の末端基に配置され；
−親水性重合性基がデキストラン又はセルロースであるときに、一般に、（単数若しくは複数の）カチオン性基は多糖類鎖の末端部の末端基に配置され；
−親水性重合性基がキトサンであるときに、一般に、（単数若しくは複数の）カチオン性基は、ペンダント基、特にキトサン上の酸性媒質中に存在している−NH3+基である。
【００４６】
一実施形態において、（単数若しくは複数の）カチオン性基が、末端基である。分散相の液滴表面の隣接しているアニオン界面活性剤のペンダント基は、静電的相互作用によって互いに反発するので、その結果、一般に、ヒドロ基がペンダント基を含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで成る製剤は安定していない。
【００４７】
別の実施形態において、（単数若しくは複数の）カチオン性基が、（単数若しくは複数の）ペンダント基である。親水基がいくつかのペンダントカチオン性基を含んで成るカチオン性界面活性剤を使用し、したがって、より大きい陽電荷を有し、例えば干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列などの陰性種の複合体形成をよりよく可能にする製剤を得ることが、有利なことには可能である。
【００４８】
好ましい親水性重合性基は、一般的に3〜500エチレンオキシド単位、好ましくは20〜200エチレンオキシド単位を含んで成り、且つ少なくとも１つのカチオン性基を含んで成るポリ（エチレンオキシド）のラジカルである。
【００４９】
そのため、一実施形態において、カチオン性界面活性剤は、以下の式の中の１つを有する：
【００５０】
【化４】
0006280120.tif 000005
【００５１】
｛式中：
−R1、R2、R3、及びR4は独立に、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖であり；
−A1、A2、A3、及びA4は、O又はNHであり；
−m、n、o、及びpは独立に、3〜500、好ましくは20〜200の整数を表し；そして、
−aは、20〜120の整数であり；
−Mは、H又はカチオンであり；
−A10、A11、A12、及びA13は独立に、−+NR20R21R22基（式中、R20、R21、及びR22は独立に、H、Me又は−CH2−CH2−OHを表す）である｝。
一実施形態において、式（AII）において、A11は、−+NH3を表し、そして、カチオン性界面活性剤は、以下の式を有する：
【００５２】
【化５】
0006280120.tif 000006
【００５３】
｛式中、A2、R2、及びnは、先に規定されるようなものである｝。好ましくは、式（AII）において、R2は、C17H35を表す。
【００５４】
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、親水性重合性基の存在が、以下の：
−製剤の安定化；及び
−その中で製剤が投与／使用される媒質のタンパク質に対して、液滴の表面に位置する、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の保護、したがって、これらのタンパク質による分解に対する、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の保護、
を可能にするようである。
【００５５】
第三の選択肢によると、本発明の製剤は、以下の少なくとも2つのカチオン性界面活性剤を含んで成る：
−１つは、以下の：
−N［1−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］N,N,N−トリメチルアンモニウム（DOTMA）；
−1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）；
−N−（2−ヒドロキシエチル）−N,N−ジメチル−2,3−ビス（テトラデシルオキシ−1−プロパンアニウム）（DMRIE）；
−1−［2−（オレオイルオキシ）エチル］−2−オレイル−3−（2−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライド（DOTIM）；及び
−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、
の中に選択され、そして、好ましくは、1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）であり、そして、
−もう片方が、以下を含んで成るカチオン性界面活性剤である：
−以下の：
−R又はR−（C=O）−基（式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である）；
−12〜24個の炭素原子、及びジステアリルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）などのフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド；及び
−ポリ（酸化プロピレン）、
の中から選択される少なくとも１つの親油性基；並びに
【００５６】
−少なくとも１つのカチオン性基を含んで成る親水性重合性基であって、前記重合性基が、以下の：
−一般的に3〜500単位のエチレンオキシド、好ましくは、20〜200単位のエチレンオキシドを含んで成り、且つ少なくとも１つのカチオン性基を含んで成るポリ（エチレンオキシド）；
−例えばデキストラン、セルロース又はキトサンなどの多糖；
−例えばキトサン又はポリリシンなどのポリアミン、
の中から選択され、そして、好ましくは、少なくとも１つのカチオン性基を含んで成るポリ（エチレンオキシド）である。
【００５７】
一実施形態において、本発明の製剤は、カチオン性界面活性剤として、以下のものを含んで成る：
−1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン；及び
−以下を含んで成るカチオン性界面活性剤：
−以下の：
−R又はR−（C=O）−基（式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である）；
−12〜24個の炭素原子及びジステアリルフォスファチジルエタノールアミン（DSPE）などのフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド、
の中から選択される少なくとも１つの親油性基；並びに
【００５８】
−一般的に3〜500単位のエチレンオキシド、好ましくは、20〜200単位のエチレンオキシド含んで成り、且つ少なくとも１つのカチオン性基を含んで成るポリ（エチレンオキシド）。
【００５９】
一実施形態において、本発明の製剤は、カチオン性界面活性剤として、以下のものを含んで成る：
−1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン；及び
−先に規定されるような式（AII）の化合物、特に式（AV）の化合物。
【００６０】
カチオン性界面活性剤は、製剤の液滴のクラウン部に配置される。それは、静電的相互作用によって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列に連結されるので、siRNAを液滴の表面に維持することを可能にする。
【００６１】
製剤は、全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対して15〜70モル%の少なくとも１つのカチオン性界面活性剤を含んで成る。15%を下回ると、製剤は十分な陽電荷を含んでいないので、その後の核酸配列（陰性荷電）との＜プレミックス＞製剤の複合体形成が不十分である。70%以上だと、製剤は、安定せず、一般に製剤化できず（液滴が融合して2つの相を形成するために、ナノエマルションの形成が不可能である）、そして、液滴は、通常は細胞にとって毒性である。
【００６２】
これらの割合は、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の効果的な複合体形成を得、したがって、良好な送達及び／又はトランスフェクションを得るために特に適している。
【００６３】
・ヘルパー脂質
一実施形態において、本発明の製剤は、エンドソーム膜を不安定化することによってサイトゾル放出を容易にすることができるヘルパー脂質を含んで成る。好ましくは、この脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）である。
【００６４】
この脂質は、本発明の製剤の液滴、したがって、そこに含まれたRNA干渉の内在性メカニズムを変調できる核酸配列のエンドソームエンドソーム脱出を促進し、そして、一般に、所望の遺伝子のサイレンシング効果を改善する。
【００６５】
脂質は、製剤の液滴のクラウン部に配置されているエンドソーム膜を不安定化することによってサイトゾル放出を容易にすることができる。
【００６６】
・両親媒性脂質
製剤は、製剤の液滴のクラウン部に配置された少なくとも１つの両親媒性脂質を含んで成る。
【００６７】
安定したナノエマルションを形成するために、組成物中に界面活性剤として少なくとも１つの両親媒性脂質を含んでいることが必要である。界面活性剤の両親媒性の性質は、連続水相中の油滴の安定化を確保する。全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対して5モル%未満の両親媒性脂質では、製剤は不安定であり、一般に製剤化さえできない（液滴が融合して2つの相を形成するため、ナノエマルションの形成が不可能である）。
【００６８】
一般に、製剤は、全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対して5〜85モル%、好ましくは、5〜75モル%、特に5〜50モル%、そして、さらに特に8〜30モル%の両親媒性脂質を含んで成る。
【００６９】
両親媒性脂質の量は、ナノエマルションの分散相のサイズを制御することに対して有利に貢献する。
【００７０】
両親媒性脂質は、疎水性部位と親油性部分を含んで成る。それらは、一般に、親油性部分が、8〜30個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖を含んで成る化合物から選択される。これらは、天然若しくは合成起源のリン脂質、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、グルコリピド、ステアリルアミン、カルジオリピン；ソルビタンエステルなどのエーテル又はエステル官能基によって親水基と結合した脂肪酸から構成された分子、例えば、SigmaからSpan（登録商標）という商品名で市販されているソルビタンモノオレエートやモノラウレート；高分子脂質；ICI Americas, Inc.からTween（登録商標）という商品名で、Union Carbide Corp.からTriton（登録商標）という商品名で市販されている非イオン性界面活性剤などの、短鎖ポリエチレンオキシド（PEG）に結合された脂質；例えばモノ及びジラウレート、モノ及びジパルミテート、スクロースモノ及びジステアレートなどの糖エステルの中から選択される。
【００７１】
前記界面活性剤は、単独で又は混合物で使用される。
【００７２】
リン脂質は、好ましい両親媒性脂質である。
【００７３】
レシチンは、特に好ましい両親媒性脂質である。
【００７４】
・可溶性脂質
製剤はまた、ナノエマルションの分散相中、より詳しく述べると、液滴のコア部分の中に含まれる少なくとも１つの脂肪酸グリセリドを含んで成る可溶性脂質を含んで成る。
【００７５】
この化合物には、ナノエマルションの分散相中でほとんど可溶性でない両親媒性脂質を可溶化する主な役割がある。
【００７６】
可溶性脂質は、それを可能にするのに十分な両親媒性脂質に対する親和性を有する脂質である。好ましくは、可溶性脂質は、周囲温度で固形物である。
【００７７】
両親媒性脂質がリン脂質である場合、それは、特に以下の：
−脂肪酸及び脂肪アルコールのエステル、例えばパルミチン酸セチルなど；又は
−グリセロールの誘導体、特に脂肪酸でのグリセロールのエステル化によって得られたグリセリド、
であり得る。
【００７８】
使用される可溶性脂質は、有利には、使用される両親媒性脂質に基づいて選択される。これは、一般に所望の可溶化をもたらすような近似する化学構造を有する。これは、油であっても、ワックスであってもよい。好ましくは、可溶性脂質は、周囲温度（20℃）で固形物であるが、体温（37℃）で液体である。
【００７９】
特にリン脂質に対する好ましい可溶性脂質は、脂肪酸及び脂肪アルコールのエステル、例えばパルミチン酸セチルなど、又は脂肪酸のグリセリド、特に飽和脂肪酸、特に8〜18個の炭素原子、より好ましくは、12〜18個の炭素原子を有する飽和脂肪酸のグリセリドである。有利なことには、それは異なったグリセリドの混合物である。
【００８０】
好ましくは、それらは、少なくとも10重量%のC12脂肪酸を含んで成る飽和脂肪酸のグリセリドと、少なくとも5重量%のC14脂肪酸と、少なくとも5重量%のC16脂肪酸と少なくとも5重量%のC18脂肪酸である。
【００８１】
好ましくは、それらは、少なくとも10重量%のC12脂肪酸、少なくとも5重量%のC14脂肪酸、少なくとも5重量%のC16脂肪酸、及び少なくとも5重量%のC18脂肪酸を含んで成る飽和脂肪酸のグリセリドである。
【００８２】
好ましくは、それらは、0重量%〜20重量%のC8脂肪酸、0重量%〜20重量%のC10脂肪酸、0重量%〜70重量%のC12脂肪酸、5重量%〜30重量%のC14脂肪酸、5重量%〜30重量%のC16脂肪酸、そして5重量%〜30重量%のC18脂肪酸を含んで成る脂肪酸のグリセリドである。
【００８３】
GattefosseからSuppocire（登録商標）NCという商品名で販売され、ヒトの注射用として承認されている、周囲温度にて固形物の半合成のグリセリドの混合物が特に好ましい。NタイプのSuppocire（登録商標）は、脂肪酸とグリセロールの直接エステル化によって得られる。それらは、C8〜C18飽和脂肪酸の半合成グリセリドであり、その定性−定量的組成を以下の表に示す。
【００８４】
前記可溶性脂質により、有利なことに安定したナノエマルション形態での製剤を得ることが可能になる。いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、前記可溶性脂質によりアモルファスコアを有する液滴をナノエマルション中に得ることが可能になるものと思われる。このようにして得られたコアは、結晶性を呈すことなく、高い内部粘性を有する。結晶化は、一般に液滴の凝集及び／又は封入分子の液滴外への排出を引き起こすので、ナノエマルションの安定性にとって有害である。これらの物理的特性は、ナノエマルションの物理的安定性を促進する。
【００８５】
可溶性脂質の量は、分散相中に含まれる両親媒性脂質のタイプと量に関連して広範囲に変化させることができる。一般に、（可溶性脂質、任意の油、任意のイメージング剤、それが親油性であれば任意の治療剤を含んでいる）液滴のコアは、1〜100重量%、好ましくは5〜80重量%、そしてより好ましくは40〜75重量%の可溶性脂質を含んで成る。
【００８６】
【表１】
0006280120.tif 000007
【００８７】
・油
分散相はまた、液滴のコアに含まれる他の1若しくは複数の油を含んでいてもよい。
【００８８】
好ましくは、使用される油は、8未満、より好ましくは3〜6の親水性−親油性バランス（HLB）を有する。有利なことには、油は、エマルションの形成前にいかなる化学的又は物理的変性もなしで使用される。
【００８９】
油は、一般に、生物学的に適合している油、特に天然起源（植物性又は動物性）又は合成の油の中から選択される。このうち、天然植物起源の油、例えばダイズ、アマニ、パーム、ラッカセイ、オリーブ、グレープシード、及びヒマワリ種子油；特にトリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリドを含めた合成油が、特に言及され得る。これらの油は、それらの自然形態の油であっても、精製された油であっても、又はエステル交換されいる油であってもよい。
【００９０】
好ましい油は、ダイズ油とアマニ油である。
【００９１】
一般に、且つ存在している場合には、油は、（可溶性脂質、任意の油、任意のイメージング剤、それが親油性であれば任意の治療剤を含んでいる）液滴のコア中に、1〜80重量%、好ましくは、5〜50重量%、より好ましくは、10〜30重量%に及ぶ割合で含まれている。
分散相はさらに、好適な量の、例えば色素、安定剤、保存料又は他の有効成分などの他の添加剤を含んでいてもよい。
【００９２】
・補助界面活性剤
製剤は、ナノエマルションを安定させることができる補助界面活性剤を含んで成る。
【００９３】
本発明の製剤に使用される補助界面活性剤は、通常、水溶性界面活性剤である。それらは、少なくとも25、特に少なくとも30、好ましくは少なくとも35単位のエチレンオキシドを含んで成る少なくとも１つのポリ（エチレンオキシド）鎖を含んで成る。一般に、エチレンオキシド単位の数は、500未満である。
【００９４】
25単位未満のエチレンオキシドを含んで成るポリ（エチレンオキシド）鎖を含んで成る補助界面活性剤を含んで成る製剤は、安定していない。一般に、ナノエマルションを調製することが可能でさえない。
【００９５】
これらの単位数は、干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の液滴外への漏れを予防するために特に適している。
【００９６】
発明者らは、補助界面活性剤を含まない製剤が十分安定していないことを効果的に観察した。
【００９７】
加えて、いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、補助界面活性剤中のエチレンオキシド単位で構成された鎖の存在が、その中で製剤が投与又は使用される媒質のタンパク質に対する、液滴の表面に位置する干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の保護、したがって、これらのタンパク質による前記核酸配列の分解に対する保護をもたらすように思えるだろう。
【００９８】
補助界面活性剤の例として、特に、ポリエチレングリコール／フォスファチジルエタノールアミンの共役化合物（PEG−PE）、脂肪酸とポリエチレングリコールのエーテル、例えばICI Americas Inc.からBrij（登録商標）の商品名で販売されている製品（例えば、Brij（登録商標）35、58、78又は98）、脂肪酸とエステルポリエチレングリコールのエステル、例えばICI Americas Inc.からMyrj（登録商標）の商品名で販売されている製品（例えば、Myrj（登録商標）45、52、53又は59）、並びにエチレンオキシドと酸化プロピレンのブロック共重合体、例えばBASF AGによってPluronic（登録商標）という商品名で販売されているた製品（例えば、Pluronic（登録商標）F68、F127、L64、L61、10R4、17R2、17R4、25R2又は25R4）、或いはUnichema Chemie BVによってSynperonic（登録商標）という商品名で販売されている製品（例えば、Synperonic（登録商標）PE／F68、PE／L61又はPE／L64）が挙げられる。
【００９９】
そのため、補助界面活性剤は、連続水相中と分散相中の両方に含まれている。補助界面活性剤の疎水性部分は、分散相の液滴にそれ自体を挿入するが、連続水相にはポリアルコキシル化鎖がある。本願では、補助界面活性剤が分散相に属することを考慮した場合に、記載した分散相の重量パーセントが計算される。
【０１００】
製剤は、全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対して10%〜55モル%の補助界面活性剤を含んで成る。10%未満では、製剤は、安定せず、一般に製剤化できない（液滴が融合して2つの相を形成するので、ナノエマルションの形成が不可能である）。55%以上では、カチオン性界面活性剤の陽電荷が補助界面活性剤のポリ（エチレンオキシド）鎖によってマスクされるので、その後の核酸配列と＜プレミックス＞製剤の複合体形成がたぶんおこなわれず、したがって、核酸配列との静電的結合によって結合がより容易になる。
【０１０１】
補助界面活性剤はまた、ナノエマルションの構想している適用における他の効果を呈してもよい。
【０１０２】
一実施形態によると、ナノエマルションの分散相は、例えば生物学的リガンドなどの所望の分子を表面に結合させて、臓器の特異的標的化を増強する。前記結合は、表面受容体発現する標的細胞による、本発明の製剤の液滴の内面化を促進することによって、いくつかの細胞又はいくつかの臓器の特異的認識を可能にする。そのため、従来技術のトランスフェクション剤において耐性であることが知られている細胞を形質移入することが可能である。好ましくは、表面結合は、所望の分子又はそれらの前駆体を、両親媒性化合物、特に補助界面活性剤と結合することによっておこなわれる。そのとき、ナノエマルションは、結合された補助界面活性剤を含んで成る。この場合、補助界面活性剤は、表面上の所望の分子の受け入れを可能にするスペーサーとして機能する。
【０１０３】
例えば、所望の分子は、以下の：
−例えば抗体、ペプチド、サッカリド、アプタマー、オリゴヌクレオチドなどの標的化生物学的リガンド、又は例えば葉酸などの化合物；
−ステルス剤：ナノエマルションに免疫系に対する隠密性を与えて、体内でのその循環時間を増加させ、且つその排除を遅らせるもの、
であってもよい。
【０１０４】
例えば、生物学的リガンドが1若しくは複数のシステインを含んで成るペプチドである場合、界面活性剤のアルキレンオキシド鎖への結合は、チオールマレイミドカップリングによって確保できる。
【０１０５】
・イメージング剤
一実施形態において、製剤は、細胞内又は患者体内の液滴分配、したがって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の分配の視覚化を有利に可能にするイメージング剤を含んで成る。
【０１０６】
イメージング剤は、特に以下のタイプのイメージングに使用され得る：
−ポジトロン放出型断層撮影法（PET）（例えば18F、11Cなどの放射性核種、金属カチオンのキレート68Ga、64Cuを含んで成る化合物であると思われるイメージング剤）、
−単光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）（放射性核種、例えば123I又はキレート99mTc若しくは111Inを含んで成る化合物であると思われるイメージング剤）、
−磁気共鳴映像法（MRI）（ガドリニウムのキレート、又は例えば酸化鉄のナノ結晶、鉄−プラチナFePtの酸化マンガンなどの磁気ナノ結晶であると思われるイメージング剤）、
−光学映像法又はX線映像法（親油性フルオロフォア、又は、例えばイオパミドールなどのヨード分子、アミドトリアゾエート、若しくは金ナノ粒子であると思われるイメージング剤）。
【０１０７】
好ましくは、イメージング剤は、光学映像法の実行を可能にする親油性フルオロフォアである。
【０１０８】
使用される（単数若しくは複数の）親油性フルオロフォアのタイプは重要でないが、但し、それらがインビボ映像法に適合できることとする（すなわち、それらは、生物学的に適合し、且つ無毒である）。好ましくは、イメージング剤として使用されるフルオロフォアは、可視光線又は近赤外線を吸収及び放射する。組織又は生体（動物、ヒト）における非侵襲性イメージングのために、好ましいフルオロフォアは、近赤外線で吸収又は放射する。励起光とフルオロフォアによって放射される光が最もよく組織を透過するために、最も好適なフルオロフォアは、近赤外、すなわち、640〜900nmの波長を吸収及び放射するものである。
【０１０９】
親油性フルオロフォアとして、Invitrogenカタログの第13章（「脂質と膜のためのプローブ」）に記載の化合物を引用することができる。より詳しく述べると、フルオロフォアとしては、特にインドシアニングリーン（ICG）、例えば商品名Bodipy（登録商標）、例えばBodipy（登録商標）665／676（Ex／Em）で販売されている蛍光製品などの蛍光性基によって官能基化された脂肪酸及びリン脂質の類似体；例えば参照番号D−307で販売されている1,1−ジオクタデシル−3,3,3',3'−テトラメチルヨードジカルボシアニンペルクロラート（DiD）、参照番号D1125で販売されている3,3'−ジヘキサデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（DiO）、例えば参照番号D384で販売されている1,1'−ジヘキサデシル−3,3,3',3'−テトラメチルヨードカルボシアニンペルクロラート（DiI）などのカルボシアニンの親油性誘導体；スフィンゴリピド、ステロイド又はリポ多糖から得られた蛍光プローブ、例えば商品名BODIPY（登録商標）TR セラミド、BODIPY（登録商標）FL C5−ラクトシルセラミド、BODIPY（登録商標）FL C5−ガングリオシド、BODIPY（登録商標）FLセレブロシドで販売されている製品など；シアニン、ローダミン、フルオレセイン又はクマリンの両親媒性誘導体、例えばオクタデシルローダミンB、フルオレセインのオクタデシルエステル及び4−ヘプタデシル−7−ヒドロキシクマリンなど；並びにジフェニルヘキサトリエン（DPH）とその誘導体；Invitrogenから販売されるこれらのすべての製品に言及することができる。
【０１１０】
本発明の好ましい一実施形態によると、フルオロフォアは、インドシアニングリーン、1',1−ジオクタデシル−3,3,3',3'−テトラメチルヨードジカルボシアニンペルクロラート、3,3'−ジヘキサデシルオキサカルボシアニンペルクロラート、又は1,1'−ジヘキサデシル−3,3,3',3'−テトラメチルヨードカルボシアニンペルクロラートである。
【０１１１】
・治療剤
本発明の製剤は、治療剤を含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明のナノエマルションに封入することができる治療剤は、特に化学的、生物学的又は物理的な方法で作用する有効成分を含む。従って、これらは、例えばDNA、タンパク質、ペプチド又は抗体などの医薬的な有効成分、生物学的薬剤、並びに温熱療法で有用な化合物、光によって励起されると一重項酸素を放出する、光線療法に有用な化合物及び放射性医薬品などの理学療法に有用な剤であってもよい。好ましくは、それらは、非経口経路を介して投与される有効成分である。
【０１１３】
親油性又は両親媒性の親和性によって、治療剤は、分散相に封入されるか又は2つの相の界面に配置される。
【０１１４】
ナノエマルションに封入される治療剤のタイプは、特に制限されない。しかし、ナノエマルションは、従来の投与システムで製剤するのが難しい、可溶性が不十分な化合物及び量子収量を維持しなければならない光線療法で使用される有効成分にとって特に有益である。
【０１１５】
製造方法の条件が温和なため、記載した製剤は、高温で分解する治療剤を封入するのに特に有益である。
【０１１６】
治療剤として有益である有効な医薬成分としては、特に、エイズの治療に使用される薬剤、心疾患の治療に使用される薬剤、鎮痛薬、麻酔薬、食欲減退薬、駆虫薬、抗アレルギー薬、抗狭心症薬、抗不整脈薬、抗コリン作用薬、抗凝血剤、抗鬱薬、抗糖尿病薬、抗利尿薬、制吐薬、抗痙攣薬、抗真菌薬、抗ヒスタミン剤、抗高血圧薬、抗炎症薬、片頭痛薬、抗ムスカリン薬、抗抗酸菌薬、抗パーキンソン病薬を含む抗癌剤、抗甲状腺薬、抗ウイルス薬、収斂剤、遮断薬、血液製剤、代用血液、強心剤、心血管作動薬、中枢神経系用薬剤、キレート剤、化学療法剤、造血成長因子、コルチコステロイド、鎮咳薬、外皮用剤、利尿薬、ドーパミン作動薬、エラスターゼ阻害剤、内分泌物質、麦角アルカロイド、去痰薬、胃腸薬、尿生殖器薬剤、成長ホルモン因子開始剤、成長ホルモン、血液作用薬、抗貧血薬、止血剤、ホルモン類、免疫学的薬剤、免疫抑制剤、インターロイキン、インターロイキン類似体、脂質調整剤、ゴナドリベリン、骨格筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、栄養物、栄養剤、腫瘍学的治療薬、有機硝酸塩、迷走神経作用薬、プロスタグランジン、抗生物質、腎臓作用薬、呼吸器作用薬、鎮静剤、性ホルモン類、刺激剤、交感神経様作用薬、全身消毒剤、タクロリムス、血栓溶解剤、抗甲状腺薬、注意障害用治療薬、ワクチン、血管拡張薬、キサンチン及びコレステロール低下薬が挙げられる。特に、例えばタキソール（パクリタキセル）、ドキソルビシン及びシスプラチンなどの抗癌剤が標的とされる。
【０１１７】
物理的又は化学的作用物質の中には、特に、放射性同位体や光増感剤が引用される。
【０１１８】
光増感剤の中では、特に、テトラピロール（例えば、ポルフィリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、クロリン、プルプリン、ポルフィセン、フェオフォルビド）の部類に属する光増感剤又はテキサフィリンまたはヒペリシンの部類に属する光増感剤が挙げられる。第一世代の光増感剤の中では、ヘマトポルフィリン及びヘマトポルフィリン誘導体（HpD）（Axcan PharmaからPhotofrin（登録商標）という商品名で販売されている）の混合物が挙げられる。第二世代の光増感剤の中では、メタ−テトラ−ヒドロキシフェニルクロリン（mTHPC、商品名：Foscan（登録商標）、Biolitec AG）およびベンゾポルフィリンのＡ環の一酸誘導体（QLT and Novartis OpthalmicsからVisudyne（登録商標）という商品名で販売されているBPD-MA）が挙げられる。輸送体として機能し、かつ腫瘍組織においてそれらの選択的な経路指定を可能にする分子（脂質、ペプチド、糖など）である、これらの光増感剤に関連する第二世代の光増感剤製剤は、第三世代の光増感剤と呼ばれている。
【０１１９】
生物学的薬剤の中では、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、siRNA、ペプチド、タンパク質、及びサッカリドが特に挙げられる。
【０１２０】
治療剤は、当然ながら、その活性型又はプロドラッグ形態で直接製剤化されてもよい。また、いくつかの治療剤を一緒にナノエマルション中に製剤化することも想起できる。
【０１２１】
治療剤の量は、標的とされた適用と剤のタイプに依存している。しかしながら、特に、可溶性が不十分な治療剤である場合には、一般に最高血中濃度の治療剤を有するナノエマルションを製剤化する試みがなされるため、患者に対して投与の量及び／又は期間の制限がされる。
【０１２２】
だが、分散相中の可溶性脂質の存在が、疎水性化合物であっても、両親媒性化合物であっても、大量の化合物の取り込みを可能にすることがわかった。
【０１２３】
・液滴中のコアの割合
一般に、液滴の成分に対する液滴のコア中の成分のモル割合は、10〜80%、特に25〜75%、好ましくは33.35〜73.99%である。言い換えれば、分散相に対する（すなわち、分散相のすべての成分に対する）全体（可溶性脂質／任意の油／任意のイメージング剤／任意の親油性治療剤）のモル割合（mol／mol）は、一般に10〜80%、特に25〜75%、好ましくは33.35〜73.99%である。
【０１２４】
一般に、液滴の成分に対する液滴のコア成分の重量割合（wt／wt）は、10〜60%、特に20〜60%、好ましくは23.53〜59.51%である。言い換えれば、分散相に対する（すなわち、分散相のすべての成分に対する）全体（可溶性脂質／任意の油／任意のイメージング剤／任意の親油性治療剤）の重量割合は、一般に10〜60%、特に20〜60%、好ましくは23.53〜59.51%である。
【０１２５】
これらのモル及び／又は重量の割合は、＜プレミックス＞形成が貯蔵、特に、40℃で28日間超保存されたとき、40℃で300日間保存されたときでさえ、安定しているように、特に適している。安定性は、特に、液滴のサイズ、それらの多分散性指数及び／又はそれらのゼータ電位を観察することによって（例えば、MalvernのZetaSizerタイプの装置を使用した動的光散乱によって）評価できる。＜プレミックス＞製剤のこの安定性は、構想している適用にとって重要である。以下で詳しく述べられるように、＜プレミックス＞製剤は、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成る＜最終的な＞製剤を調製するのに使用される。＜プレミックス＞製剤を保存できること、及び＜最終的な＞製剤の使用直前に前記配列との複合体形成をおこなうことは、特に有利なことである。
【０１２６】
・水相
本発明に使用されるナノエマルションの水相は、水及び／又はリン酸緩衝液、例えばPBS（「リン酸緩衝液生理的食塩水」）若しくは生理的食塩溶液、特に塩化ナトリウムなどの緩衝液から好ましくは形成される。
【０１２７】
一実施形態によると、連続水相はまた、グリセロール、サッカリド、オリゴ糖若しくは多糖、ゴム又はタンパク質、好ましくは、グリセロールなどの増粘剤も含んで成る。実際、より高い粘性の連続相の使用は、乳化を容易にし、その結果、超音波処理時間を短縮させることができる。
【０１２８】
水相は、有利には、0〜50重量%、好ましくは1〜30重量%、より特に5〜20重量%の増粘剤を含んで成る。当然のことながら、水相は、好適な量の色素、安定剤及び保存料などの他の添加剤をさらに含んでいてもよい。
【０１２９】
分散相と水相の割合は、最も変動的である。しかしながら、ほとんどの場合、ナノエマルションは、1〜50重量%、好ましくは5〜40重量%、特に10〜30重量%の分散相と50〜9重量9%、好ましくは60〜95重量%、そしてより特に70〜90重量%の水相によって調製される。
【０１３０】
・ゲル形態のナノエマルション
一実施形態において、製剤の粘性は、25℃で1ポアズ（0.1Pa.s）より高い。
【０１３１】
この実施形態において、使用されるナノエマルションは、＜ゲル＞形態である。＜ゲル＞という用語は、通常、熱力学的に安定していて、三次元の連続貫通ダブルネットワークを形成した、一方で固形物であり、もう一方で液体である、二相固液系を意味する。前記ゲルは、固形物のネットワークが液相を保持している二相液固系である。ゲルは固形物であるとみなされてもよいが、それらはまた、固形物（構造的な剛性、変形に対する弾性）並びに液体（水蒸気圧、圧縮性圧力、及び電導性）に特有の特性を呈する。
【０１３２】
ゲル形態のナノエマルションにおいて、三次元ネットワーク構造は、液滴によって形成され、液滴の隙間を連続相で満たしている。ネットワーク、すなわち、液滴の単位の間の結合は、主として静電的相互作用（イオン対）に基づいている。これらの静電的相互作用は、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列と、隣接している液滴のカチオン性界面活性剤との間に主に存在している。
【０１３３】
そのため、ゲル形態のナノエマルションは、耐圧性を示すので、規定された投与形状及び／又は経路に関して有利になり得る、所望の形状は経路を維持することができる。
【０１３４】
ナノエマルションがゲル形態であることを実証するために、粘弾性特性を評価するためのレオロジー研究、及び／又は三次元ネットワーク構造を形成する液滴の間の結合を証明する更なる構造研究がおこなわれ得る（X線回折、ニュートロン…）。ナノエマルションは、液体ナノエマルションより高い粘性と弾性係数があるゲル形態である。ゲル形態のナノエマルションは、液滴濃度、したがって、分散相の中の重量分率に関して、粘稠液状態、粘弾性固体状態又は弾性固体状態である。粘性が水のそれ（25℃で1mPa.s）に近い水性分散相と比べて、ナノエマルションは、その粘性が水のそれより10倍高い、すなわち、25℃で>10mPa.sであるとき、粘性液体であるとみなされる。また、「G'」（ずり貯蔵弾性率）と「G”」（ずり損失弾性率）のレオロジー測定で、G”>Gであるときに、ナノエマルションが粘性液の形態であるとみなされる。G'がG”に近づくとき、ナノエマルションは、粘弾性固体状態にある。「G」<G'であるときに、状態は弾性固体状態である。この実施形態において、粘性が注射による投与が関与する適用を可能にするこれらの状態で十分に許容されるので、ナノエマルションは、好ましくは、粘稠液状態又は粘弾性固体状態である。粘性と弾性係数は、円錐／プレートレオメーター又はコケットレオメーターを使用することで評価できる。液体ナノエマルションの粘性は、一般に1ポアズ未満であり、0.01ポアズ未満であることも多い。この実施形態に使用されるナノエマルションは、通常、1ポアズ超の粘性を有し、固形物のものと同じくらい高い粘性を有していてもよい（1000ポアズ超）。本発明のナノエマルションは、通常、1〜1000ポアズ、好ましくは1〜500ポアズ、そしてさらに好ましくは1〜200の粘性を有するが、これらの値は25℃で得られる。1ポアズ超の粘性は、分散相の液滴が連続相内で三次元ネットワーク構造を形成するように適合する。１ポアズ未満では、一般に、液滴は互いの近さが不十分であることが確かめられた。1000ポアズ以上では、近固体系が得られる。そのとき、ナノエマルションは、粘着性であり過ぎて使用するのが難しい。同様に、液体ナノエマルションに関しては、弾性係数が一般に10より低いのに対して、ゲル形態のナノエマルションの弾性係数は一般に10より高い。構造研究、特にX線又はニュートロン回折もまた、液体ナノエマルションの構成とゲル形態のナノエマルションの構成の間の区別を可能にする。液体ナノエマルションに関して得られた回折図形のピークは、分散相中の液滴の構造に独特であるが（短距離の特徴である大きい回折角）、ゲル形態のナノエマルションに関する回折図形のピークは、液滴の構造に独特であるだけではなく（短距離の大きな回折角度）、三次元ネットワーク構造におけるこれらの液滴の構成でも独特である（長距離の特徴である小さな回折角）。
【０１３５】
本発明のこの実施形態に使用されるナノエマルションは、有利に分散性ゲル形態である、すなわち、三次元ネットワーク構造を形成する液滴が、一定条件下でゲル系の＜脱ゲル化＞、本願では＜崩壊＞とも呼ばれる、によって連続相に放出される。崩壊は、ゲルに連続相を加えることによって、ナノエマルションを投与するときに生理液と接触させることによって、又は温度上昇によって観察される。連続相の添加は、ゲルの内部と連続相の間の浸透圧の差異をもたらす。そのため、連続相の全量中で均一な濃度の液滴が得られるまで過剰な連続相中に液滴を放出することによって、浸透圧のこの差異を相殺するように、系は減少する傾向がある。同様に、系の十分な温度上昇は、別の液滴への熱エネルギー、すなわち、結合、例えば水素結合に含まれるより高い熱エネルギー状態にし、そのため、これらの結合を破壊し、そして、三次元ネットワーク構造の液滴を放出する。これらの温度は、ゲルの組成、より特に、液滴のサイズ、補助界面活性剤のポリアルコキシル化鎖の長さに依存している。ゲル形態のナノエマルションの崩壊は、X線の回折、示差走査熱量計測（DSC）又は核磁気共鳴（NMR）で観察できる。X線回折でゲル形態のナノエマルションの崩壊を観察するとき、分光写真における変化が観察される、すなわち、（Matija Tomsic, Florian Prossnigg, Otto Glatter ‘Journal of Colloid and Interface Science’ Volume 322, Issue 1, 1 June 2008, Pages 41-50に記載のとおり）（三次元ネットワーク構造における液滴構成の特徴）小さい角度の強度の減少が観察されるを傾ける。崩壊はまた、DSCによっても観察できる。温度が上昇するとき、ゲル形態のナノエマルション／液体ナノエマルションの遷移状態の間、示差熱図にピークが見られる。最終的にNMR分析もまた、ゲル形態のナノエマルションと液体ナノエマルションを区別する各液滴に関する拡散係数を評価することによって、崩壊を観察するのに使用できる。系が閉鎖されたとき、拡散係数は、ゲル形態のナノエマルションに関して最も有意に低下する（そのとき、それは通常0.01μm2/s未満である）（WESTRIN B. A.; AXELSSON A.; ZACCHI G. ‘Diffusion measurement in gels’, Journal of controlled release 1994, vol. 30, n 3, pp. 189-199）。
【０１３６】
・液滴が一緒に共有結合されているエマルション
一実施形態において、製剤は、次の式（I）：
（L1−X1−H1−Y1）v−G−（Y2−H2−X2−L2）w  （I）
｛式中：
−L1及びL2は、独立に親油性基であり；
−X1、X2、Y1、Y2、及びGは、独立に連結基であり；
−H1及びH2は、独立にポリアルコキシル化鎖を含んで成る親水性基であり；
−v及びwは、独立に1〜8の整数である｝の界面活性剤を含んで成り、そして、分散相中の液滴は、式（I）の界面活性剤によって一緒に共有結合されている。
【０１３７】
式（I）の界面活性剤は、連続水相に一部が含まれ、且つ分散相に一部が含まれている。式（I）の界面活性剤は、実際には、2つの親油性基（L1とL2）と2つの親水基（H1とH2）を含んで成る。親水基は、連続水相中、液滴の表面にほとんど位置しているが、親油性基は、製剤の液滴中に位置している。
【０１３８】
より詳しく述べると、親油性基L1は、ある液滴中に位置し、基L2は隣接している液滴中に位置している。そのため、液滴は、式（I）の界面活性剤の基−（X1−H1−Y1）v−G−（Y2−H2−X2）wによって共有結合されている。
【０１３９】
基X1及びX2は、親油性基と親水基を連結する連結基である。基Gは、式（I）の界面活性剤の2つの部分［親油性部分−親水性部分］の間の連結基である。基Y1及びY2は、基Gをこれらの2つの部分［親油性部分−親水性部分］に連結する連結基である。
【０１４０】
この実施形態の製剤は、（例えば、所定の形状の鋳型又は容器内にセットすることによって）有利に成形されることができ、そして、所望の適用により所望の形状に維持できる。そのため、本発明のこの実施形態は、製剤がカプセル、ゲル、オビュール又はパッチの形態で使用されるとき、特に適している。
【０１４１】
加えて、それは、水相への希釈に抵抗性がある。より詳しく述べると、水相がこの製剤に加えられるとき、製剤はその形状を維持して、希釈されない。媒質中では、最初に、液滴を含んで成る製剤を見ることができ、次に、実質的に液滴を含まない水相が見られる。
【０１４２】
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、この製剤のこれらの特性は、液滴間の共有結合の存在で説明でき、そして、それに非常に強い結合を与えているように思われる。
【０１４３】
一実施形態において、上記の式（I）において：
−L1及びL2は、以下の中から独立に選択され：
−R又はR−（C=O）−基（式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である）、
−12〜24個の炭素原子及びフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミド、及び
−ポリ（酸化プロピレン）；及び／又は
−X1、X2、Y1、及びY2は、以下の中から独立に選択され：
−単結合；
−−O−、−NH−、−O（OC）−、−（CO）O−、−（CO）NH−、−NH（CO）−、−O−（CO）−O−、−NH−（CO）−O−、−O−（CO）−NH−、及び−NH−（CO）−NHの中から選択されるZ基；
−1〜6個の炭素原子を有するアルキレンであるAlk基；及び
−基：Z−Alk、Alk−Z、Alk−Z−Alk又はZ−Alk−Z（式中、Alk及びZは、先に規定されるようなものであり、且つ式中、Z−Alk−Z基中の2つZの基は同じであるか又は異なっている）；及び／又は
−H1及びH2は、3〜500単位のエチレンオキシド、好ましくは20〜200単位のエチレンオキシドを通常含んで成るポリ（エチレンオキシド）の中から独立に選択され；及び／又は
−Gは、以下の式：
【０１４４】
【化６】
0006280120.tif 000008
【０１４５】
｛式中、A102は、CH又はNを表し、R102は、H又は1〜6個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖を表し、A101は、−O−、−NH−（CO）−又は−O−（CO）−を表し、R100は、H又はメチルを表し、A100は、−O−又は−NH−を表し、そして、R101は、H、Me又はOMeを表す｝の少なくとも１つを有するG'基を含んで成る（基Y1とY2は、以下で記載した式の左右で連結される）。
式：
【０１４６】
【化７】
0006280120.tif 000009
によって、Y2基が、シクロオクチルの6個の原子のどれかに連結できることが意味されて、式：
【０１４７】
【化８】
0006280120.tif 000010
【０１４８】
によって、基A101及びR101が、フェニルの4個の原子のどれかに連結されることが意味される。
【０１４９】
特に、v及びwは、独立に1又は2を表す。好ましくは、v及びwは1である。
【０１５０】
G基は、1若しくは複数の先に規定されたG'基を含んでいてもよい。
【０１５１】
そのため、第一の実施形態において、G基は、１つのG'基で形成される。この実施形態において、式（I）中、v及びwは1を表す。
【０１５２】
第二の実施形態において、G基は、式−G'−Y3−G'−
｛式中：
−Y3は、特に以下の中から選択される連結基である：
−単結合；
−−O−、−NH−、−O（OC）−、−（CO）O−、−（CO）NH−、−NH（CO）−、−O−（CO）−O−、−NH−（CO）−O−、−O−（CO）−NH−、及び−NH−（CO）−Nの中から選択されるZ基；
−1〜6個の炭素原子を有するアルキレンであるAlk基；及び
−基：Z−Alk、Alk−Z、Alk−Z−Alk又はZ−Alk−Z（式中、Alk及びZは、先に規定されるようなものであり、且つ式中、Z−Alk−Z基中の2つZの基は同じであるか又は異なっている）；
−それぞれのG'基は、独立に上記式（XI）〜（XXVI）の基を表し、好ましくは、式−G'−Y3−G'−の2つのG'基は同じである｝を意味する。
【０１５３】
この実施形態において、式（I）中、v及びwは1を表す。この実施形態は、2つのG'基が同じであり、且つ切断可能な官能基を含んで成るとき、特に興味深いものである。製剤の液滴間の共有結合を破壊するには、2つの官能基のうち１つだけを切断するので十分である。
【０１５４】
第三の実施形態において、G基は、（v+w）G'基を含んで成るデンドリマーである。G基は、特に、例えばポリアミドアミン基（PAMAM）を含んで成るデンドリマーなどのいくつかのG'基を含んで成るデンドリマーであってもよい。例えば、G基は、以下の式（XXX）〜（XXXIII）であって、以下の：
−式（XXVI）の4つのG'基：v及びwは2を表す、
−式（XXIV）の4つのG'基｛式中、R101は、−O−Meを表し、A101は−NHを表し、R100はメチルを表し、そして、A100は−NH−を表す、v及びwは2を表す｝、
−式（XIV）の4つのG'基：v及びwは2を表す、
−式（XXVI）の16のG'基：v及びwは8を表す、
を含むもののうちの１つを有していてもよい。
【０１５５】
【化９】
0006280120.tif 000011
【０１５６】
【化１０】
0006280120.tif 000012
【０１５７】
【化１１】
0006280120.tif 000013
【０１５８】
【化１２】
0006280120.tif 000014
【０１５９】
L1及び／又はL2は、R−（C=O）−基｛式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖を表す｝であり、L1及び／又はL2は、12〜24個の炭素原子を有する脂肪酸から得られた基を表す。
【０１６０】
＜L1及びL2は、12〜24個の炭素原子とフォスファチジルエタノールアミンを有する脂肪酸のエステル又はアミドを表す＞とは、それらが、以下の式：
【０１６１】
【化１３】
0006280120.tif 000015
【０１６２】
｛式中：
−R3及びR4は、独立に11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖であり；
−A3及びA4は、O又はNHであり；及び
−Mは、H又はカチオンである｝の基を表すことが意味されている。
【０１６３】
好ましくは、L1とL2は同じであり、及びX1とX2は同じである、及び／又はH1とH2は同じである。特に好ましい式（I）の界面活性剤は、L1とL2が同じであり、X1とX2が同じであり、及びH1とH2が同じものである。これらの界面活性剤は、対称化合物なので、そのため、一般に合成が簡単であり、したがって、それほど高価でない。
【０１６４】
一実施形態において、上記の式（I）中、ラジカルL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2−が、以下の式（Y1又はY2基が、以下に記載した式の右に連結されている）：
【０１６５】
【化１４】
0006280120.tif 000016
【０１６６】
｛式中：
−R1、R2、R3、及びR4は、独立に11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖であり；
−A1、A2、A3及びA4は、O又はNHであり；
−m、n、o、及びpは、独立に3〜500、好ましくは20〜200の整数であり；及び
−aは、20〜120の整数であり；
−Mは、H又はカチオンである｝の基の１つから成る。
【０１６７】
式（CII）の基L1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2−が好まれる。それらは、（特に脂肪酸とポリ（エチレングリコール）の誘導体の間のエステル又はアミドの形成によって）調製が簡単である。また、式（CII）のラジカルL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2−を含んで成る界面活性剤を含んで成る製剤は、一般に、式（CIII）のL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2ラジカルを含んで成る界面活性剤を含んで成る製剤より多くの量のこの界面活性剤を用いて調製できる。製剤中の式（I）の界面活性剤の割合が多く、液滴間の結合が多く、且つ強いほど、製剤はその形状を維持し、且つ希釈に抵抗性である。そのため、これらの2つの特性は、式（CII）のL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2ラジカルを含んで成る界面活性剤を含んで成る製剤でさらに促進される。式（CII）のラジカルL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2｛式中、A2がNHを表す｝が特に好ましい。そのようなラジカルを含んで成る界面活性剤は、式（CII）のラジカルL1−X1−H1−及び／又はL2−X2−H2−｛式中、A2がOを表す｝を含んで成る界面活性化合物より効果的な様式で任意に存在している所望の親油性薬物の液滴の漏出を防ぐことができる。
【０１６８】
一実施形態において、式（I）中、
v及びwは1を表し、L1及びL2は、独立にR−（C=O）−｛式中、Rは、11〜23個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖である｝を表し、H1及びH2は、独立に3〜500単位のエチレンオキシドを含んで成るポリ（エチレンオキシド）であり、X1及びX2は、−O−又は−NH−を表し、Gは、−S−S−（上記式（XV）の基）を表すG'基から形成され、そして、Y1及びY2は、−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−（上記Alk−Z−Alk基（式中、Alkは、−CH2−CH2−を表し、そして、Zは−NH−（CO）−を表す）を表し、且つそのとき、製剤の界面活性剤が、次の式（I'）：
【０１６９】
【化１５】
0006280120.tif 000017
【０１７０】
｛式中：
−R2及びR5は、独立に11〜23個、好ましくは17個の炭素原子を有する直鎖炭化水素鎖であり、
−A2及びA5は、O又はNH、好ましくはNHを表し、及び
−n及びqは、独立に3〜500、好ましくは20〜200の整数である｝である。
【０１７１】
一実施形態において、基H1及びH2は、3単位超、さらに20単位超、特に50超（上記の式中、m、n、o、p及び／又はqは、好ましくは、3超、さらに20、特に50超である）のポリ（エチレンオキシド）を含んで成るポリ（エチレンオキシド）の中から独立に選択される。
【０１７２】
一実施形態において、製剤の式（I）による界面活性剤のG基は、特に特定のpH値（塩基性又は酸性pH）にて、酵素によって、光（可視光、紫外線又は赤外線）によって及び／又は特定の温度以上で切断可能な官能基を含んで成る。通常、G基は、そのとき切断可能な官能基を含んで成るG'基を含んでいる。
【０１７３】
例えば：
−式（XX）によるG基のβ−ケトアミノエステル官能基は、酸性pH（一般的に5近辺）で切断可能であり、
−式（XV）によるG基のジスルフィド官能基は、紫外下又はチオレダクターゼなどの酵素で切断可能であり、
−式（XI）によるG基のアミド官能基は、プロテーアーゼなどの酵素で切断可能であり、
−式（XXII）によるG基のホスフェート官能基は、ホスファターゼなどの酵素で切断可能であり、
−式（XXI）及び（XIII）によるG基のイミン官能基は、酸性pH又は特定の温度以上で切断可能であり、
−式（XVII）によるG基のシクロヘキセンクラウンは、特定の温度以上で（レトロDiels-Alderによって）切断可能であり、
−式（XIX）によるG基のカルボネート官能基及び式（XII）によるG基のカルバメート官能基は、酸性pHで切断可能である。
【０１７４】
当業者は、彼らの一般知識の見地から、どの官能基が、そして、どの条件で切断可能である知っている。式（I）で界面活性剤G'基の官能基を、それが本発明による製剤の投与のために遭遇する条件下で切断され得るように選択することは、特に当業者が理解できる範疇の中にある。
【０１７５】
好ましくは、式（I）の界面活性剤の重量対全体（式（I）の界面活性剤／補助界面活性剤）の重量の比は、15%以上である。そのような製剤は、調製が容易であることは、事実上観察された。
【０１７６】
・＜プレミックス＞製剤中の液滴のサイズ
先に規定された＜プレミックス＞製剤の液滴には、通常、20〜200nmの直径がある。特に、この直径は、MalvernのZetaSizer装置による動的光散乱によって計測される。
【０１７７】
ナノエマルションの成分のパーセンテージを適合させることによって、より特異的なサイズの液滴を得ることが可能である。
【０１７８】
20〜40nmのサイズの液滴を含んで成る製剤において、少なくとも5モル%の両親媒性脂質、及び：
−25〜45モル%の補助界面活性剤（25モル%未満では、製剤が安定性の問題を呈する可能性がある）；及び／又は
−15〜50モル%のカチオン性界面活性剤、
を含んで成る製剤が好まれる。
【０１７９】
40〜100nmのサイズの液滴を含んで成る製剤において、少なくとも5モル%の両親媒性脂質：
−45〜50モル%の補助界面活性剤（45モル%未満では、製剤は、安定性の問題を呈する可能性がある。50%超では、核酸配列との複合体形成後の＜最終的な＞製剤のトランスフェクションの有効性が低い）；及び／又は
−30〜40モル%のカチオン性界面活性剤（30モル%未満では、ヌクレオチドとの複合体形成後の＜最終的な＞製剤のトランスフェクションの有効性が低い。40%以上では、製剤が安定性の問題を呈する可能性がある）、
を含んで成る製剤が好まれる。
【０１８０】
130〜175nmのサイズの液滴を含んで成る製剤において、少なくとも5モル%の両親媒性脂質と15〜70モル%の少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、及び：
−10〜25モル%、特に10〜15%の補助界面活性剤、
を含んで成る製剤が好まれる。
【０１８１】
両親媒性脂質、カチオン性界面活性剤、及び補助界面活性剤のモルパーセンテージは、全体（両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤／補助界面活性剤／任意のヘルパー脂質）に対する。
【０１８２】
［干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成る製剤］（＜最終的な製剤＞とも呼ばれる）
【０１８３】
・干渉RNAの内在性メカニズムを調節することができる核酸配列
先に規定した＜プレミックス＞製剤のRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列との複合体形成によって、前記配列を送達するのに有効である＜最終的な＞製剤が得られる。
【０１８４】
そのため、製剤は、200未満の塩基を含んで成る一本鎖核酸配列又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列である一本鎖又は二重鎖核酸配列をさらに含んでいてもよく、そしてそれは、干渉RNA（リボ核酸）の内在性メカニズムを調節することができる、例えば以下のものなどである：
−低分子（short又はsmall）干渉RNA−siRNA；
−ロックド核酸（locked nucleic acid）−LNA； 
−マイクロRNA又はmiRNAとも呼ばれる合成マイクロRNA模倣体。
【０１８５】
一実施形態において、前記核酸配列はsiRNAである。siRNAは、二本鎖RNAの核酸配列である。それは天然配列か、又は合成配列である。
【０１８６】
siRNAは、所望の核酸配列を標的とすることができる、すなわち、siRNA鎖の一方の核酸配列が所望の転写産物の核酸配列に対して相補的である。一般に、siRNAの二重鎖のそれぞれの鎖のサイズは、15〜30ヌクレオチド、好ましくは19〜25ヌクレオチド、特に19〜21ヌクレオチドで異なる。一般に、2つのデオキシチミジンが、その安定性を増強するために、それぞれの鎖の3'部分に付加される。そのため、デオキシチミジンが3'部分に結合されたsiRNAは、本願によるsiRNAの定義から逸脱していない。siRNAは、標的タンパク質の発現を、このタンパク質をコード化するメッセンジャーRNAに干渉することによって、低減できる。
【０１８７】
一実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、ロックド核酸である。
【０１８８】
ロックド核酸は、その核酸の少なくとも１本が2位のヒドロキシルとリボースの4位の炭素原子の間にメチレン架橋を含んでいる、一本鎖RNA及び／又はDNAから成る核酸配列である。それは、合成核酸配列である。
【０１８９】
ロックド核酸は、マイクロRNAの阻害剤であり、そのmRNAが前記マイクロRNAから得られたRNA配列の干渉状態にある、1若しくは複数の標的タンパク質の発現の調整を可能にする。調整は、タンパク質の発現の阻害の解除を伴うのがほとんどである。
【０１９０】
一実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、マイクロRNAである。
【０１９１】
マイクロRNAは、（100塩基程度の）一本鎖RNAの核酸配列である。それは、合成核酸配列である。
【０１９２】
マイクロRNAは、1若しくは複数の標的タンパク質の発現の調整を、これらのタンパク質をそれぞれコードする1若しくは複数のmRNAとの干渉によって可能にする。調整は、タンパク質の発現の阻害を伴うことがほとんどである。
【０１９３】
前記核酸配列は、カチオン性界面活性剤との静電的相互作用によって、製剤の分散相の液滴の表面に維持される。そのため、それらは、クラウンの親水性側の液滴クラウン部で液滴表面に位置している。
【０１９４】
前記デオキシチミジンへのsiRNAの任意の結合は別として、前記核酸配列は化学的に改変されていないので、それらは変性されていない。特に、前記核酸配列は、液滴の他の成分に共有結合されていない。特に、前記核酸配列は、補助界面活性剤にも、両親媒性脂質にも、又はどんな任意のイメージング剤にも共有結合されていない。前記核酸配列は、カチオン性界面活性剤との静電的相互作用によってナノエマルションの液滴に単独で連結されている。前記核酸配列は、その作用部位から放出された時点で、変性されていないため、それらの予想された役割を果たすことができるので、これはかなりの利点である。加えて、高価になるであろう核酸配列の誘導体を調製する必要がない。そのため、市販の核酸配列は、前もって改変することなく液滴と複合体形成され得る。
【０１９５】
一般に、＜最終的な＞製剤の液滴には、20〜250nm、通常40〜200nmの直径がある。特に、この直径は、MalvernのZetaSizer装置を使用した動的光散乱によって計測できる。
【０１９６】
・液滴成分の配置
図1で例示されているように、本発明による製剤の液滴は、コア−リング型で構成されており、ここで：
−コアは、以下のものを含んで成り：
−可溶性脂質、
−任意の油、
−任意のイメージング剤、
−それが親油性であれば、任意の治療剤、
−クラウンは、以下のものを含んで成る：
−両親媒性脂質、
−カチオン性界面活性剤、
−補助界面活性剤（所望の分子と任意に結合される）、
−RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列、
−任意のヘルパー脂質、
−それが両親媒性あれば、任意の治療剤、
−任意に式（I）の界面活性剤。
【０１９７】
この構成は、この場合、クラウンがRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んでいないことを除いて、＜プレミックス＞製剤と同じである。
【０１９８】
［キット］
第二の態様によると、本発明は、先に規定されるような＜プレミックス＞製剤、及び別々に、200未満の塩基を含んで成る一本鎖核酸配列又は200未満の塩基対を含んで成る二重鎖核酸配列である、少なくとも１つの一本鎖又は二重鎖核酸配列を含んで成るキットは、RNA（リボ核酸）干渉の内在性メカニズムを調節することができる。
【０１９９】
キットでは、＜プレミックス＞製剤は、少なくとも１つの核酸配列と物理的に隔離されている。例えば、少なくとも2個のコンテナ、少なくとも1つが＜プレミックス＞製剤用及び少なくとも１つが核酸配列用、又は好ましくは、それぞれ異なったタイプの核酸配列を含んでいる数個のコンテナを含んで成るを使用することが可能である。
【０２００】
特に以下：
−液滴のクラウン中のカチオン性界面活性剤のモル割合、
−液滴のクラウン中の両親媒性脂質のモル割合、
−液滴のクラウン中の補助界面活性剤のモル割合、
−補助界面活性剤が少なくとも25エチレンオキシド単位を含んで成るポリ（エチレンオキシド）鎖を含んで成るという事実、
−液滴のコア中の可溶性脂質の存在、及び／又は
−液滴のコアのモル及び／又は重量の割合、
を用いて先に例示した＜プレミックス＞製剤は、有利に安定している。＜プレミックス＞製剤のこの安定性は、＜プレミックス＞製剤の長期保存を可能にし、そしてそれが、先に定義したキットの保存及び販売の前提条件である。
【０２０１】
有利なことには、＜最終的な＞製剤の使用直前に＜プレミックス＞製剤と配列から＜最終的な＞製剤を調製することが可能である。＜プレミックス＞製剤は保存できる。そのため、＜最終的な＞製剤を使用するのが望まれるときには常に、＜プレミックス＞エマルションを調製する必要はなく、そしてそれが、時間とコストの削減の点で利点をもたらす。
【０２０２】
［製造方法］
第三の態様によると、本発明は、上記で規定した製剤の調製方法に関する。
【０２０３】
一般的に、異なった油成分は、最初にエマルションの分散相のための油のプレミックスを調製するために混合され、次に、それを剪断効果下で水相中に分散される。
【０２０４】
製造方法は、一般的に以下の：
（ｉ）可溶性脂質、両親媒性脂質、カチオン性界面活性剤を含んで成る油相を調製する工程；
（ｉｉ）補助界面活性剤を任意に含んで成る水相を調製する工程；
（ｉｉｉ）十分な剪断作用下で、水相中に油相を分散させて、＜プレミックスが＞製剤を形成する工程；続いて
（ｉｖ）RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を、形成した＜プレミックス＞製剤に加える工程；続いて
（ｖ）こうして形成された製剤を回収する工程、
を含んで成る。
【０２０５】
・工程（ｉ）
一般に、油相の調製は、製剤の油性成分（可溶性脂質／両親媒性脂質／カチオン性界面活性剤）を混合することを含んで成る。製剤が、エンドソーム膜の不安定化によってサイトゾル放出を促す脂質、及び／又は油、及び／又はイメージング剤、及び／又は治療剤を含んで成る場合、これらは、工程（ｉ）の油相に一般に加えられる。
【０２０６】
混合は、好適な有機溶媒中の溶液の状態で、構成要素のうちの１つ又は完全な混合物を入れることによって任意に促進される。次に、有機溶媒が留去されて、分散相のための均一な油性プレミックスが得られる。
【０２０７】
また、すべての構成要素が液体である温度にて、予備混合（工程（ｉ））をおこなうことも望ましい。
【０２０８】
・工程（ｉｉｉ）
有利なことには、油相は、液体状態で水相中に分散される。相の１つが周囲温度にて凝固する場合、一方の相、又は好ましくは、両方の相を融解温度以上に加熱することによって、混合をおこなうことが望ましい。
【０２０９】
剪断効果下における乳化は、超音波処理器又はマイクロフルイダイザーを使用しておこなわれるのが好ましい。好ましくは、水相、次に油相が、所望の割合で円筒容器に加えられ、そして、超音波処理器がその中心に浸され、ナノエマルションを得るのに十分な時間、ほとんどの場合数分間、の運転が設定される。
【０２１０】
工程（ｉｉｉ）の終わりに、均質のナノエマルションが通常得られ、ここで：
−油滴の平均直径は、通常、10nm超、且つ200nm未満、好ましくは30〜190nmであり；そして、
−好ましくは、製剤の水相が0.15mMのNaCl水溶液であるときに、ゼータ電位は、20mV超、通常25mV〜60mV、好ましくは、40〜55mVである。
【０２１１】
工程（ｉｉｉ）の終わりに得られたナノエマルションは、先に規定した＜プレミックス＞製剤に相当する。
【０２１２】
・工程（ｉｖ）
次に、工程（ｉｖ）は、前記核酸配列を送達するのに使用される製剤の調製を、前記核酸配列を工程（ｉｉｉ）の最後に得られた＜プレミックス＞製剤と複合体形成することによって、可能にする。
【０２１３】
通常、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列は、形成されたナノエマルションに加えられ、そして、得られた混合物は、例えば、30分間、周囲温度にて混合される。
【０２１４】
工程（ｉｖ）では、陰性荷電リン酸基を担持している、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列は、カチオン性界面活性剤のカチオン性基によって表面が陽性荷電している液滴に静電結合によって連結される。これにより、複合体は、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列と、ナノエマルションの液滴との間で形成される。
【０２１５】
RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列は、通常、水相、例えばヌクレアーゼを含まない水、細胞培養液、トランスフェクションに最適化された細胞媒質、特にOpti−MEM媒質、又は緩衝溶液、及び特に4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）に添加される。
【０２１６】
工程（ｉｖ）は、通常、周囲温度（25℃）にて、5分間〜2時間、例えば30分間程度の時間、簡単な均質化又は撹拌（例えば100〜1000rpm）でおこなわれる。
【０２１７】
好ましくは、工程（ｉｖ）では、加えられる核酸配列の量は、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量と、媒質に追加された核酸配列によって提供される陰電荷の量との比が8：1超であるような量である。媒質に追加された核酸配列によって提供される陰電荷の量と、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量について計算することは、当業者の範疇内にある。前記の比は、得られるべき複合体形成の定量を可能にする、すなわち、媒質中にはRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列もう残っていない。
【０２１８】
工程（ｉｖ）は、様々な方法、例えば以下の方法によって観察できる：
−RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の移動の観察を可能にするアガロースゲル電気泳動法。良好な複合体形成により、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列は、より重くなり、ウェル内に見られる。遊離の少ない複合体形成により、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列が別の位置に移動する。
−動的光散乱法（DLS）、流体力学直径により複合体形成の影響について観察することによる。複合体形成が効果的であるほど、プロフィールがより単一様相の分配に向かう傾向がある。
【０２１９】
工程（ｉｖ）の終了時に、通常、均質のナノエマルションが得られ、ここで、油滴の平均直径が、通常、10nm超、且つ 200nm未満、好ましくは60〜200nmである。
【０２２０】
有利なことには、製剤を調製する方法は、核酸配列の化学修飾を必要とせず、特に製剤の別の成分にそれを共有結合で結合させることを必要としない。そのため、核酸配列を含んで成る本発明の多くの製剤を平行して調製することが、非常に簡単である。
【０２２１】
・任意のその後の工程
製剤は、例えば、カラム精製又は透析によって精製できる。
【０２２２】
包装前に、エマルションは、例えば濾過又は透析によって希釈及び／又は滅菌されてもよい。この工程は、エマルションの調製中に形成され得る凝集体の除去を可能にする。
これにより得られたエマルションは、任意の希釈後に、使用できる状態である。
【０２２３】
・式（I）の界面活性剤を含んで成る製剤の調製
製剤が式（I）の界面活性剤を含んで成る実施形態において、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列との複合体形成に使用されるナノエマルションは、以下の：
−連続水相と、両親媒性脂質及び以下の式（LI）：
L1−X1−H1−Y1−G1  （LI）
の界面活性剤を含んで成る液滴の形態での分散相とを含んで成るエマルション1、
−連続水相と、両親媒性脂質及び式（LII）：
G2−Y2−H2−X2−L2  （LII）
の界面活性剤を含んで成る液滴の形態での分散相とを含んで成るエマルション2、
を｛前記式中、L1、X1、H1、Y1、L2、X2、H2、及びY2は、先に規定されるようなものであり、そして、G1及びG2は、先に規定されるような基Gを形成するように反応できる基である｝、式（LI）と（LII）の界面活性剤を反応させて、先に規定されるような式（I）の界面活性剤が形成され、その後、分散相中の液滴の間で共有結合が形成され得るような条件下で、接触させること含んで成る方法を使用することで調製できる。
【０２２４】
エマルション1及び2の連続水相は、先に規定されるような補助界面活性剤を含んで成る。エマルション1及び2の分散相は、先に規定されるような可溶性脂質を含んで成る。エマルション1の分散相及び／又はエマルション2の分散相は、先に規定されるようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２２５】
G基がただ一つのG'基を含んで成るとき、基G1及びG2は、通常、互いと反応してG基を形成できる基である。
【０２２６】
G基がいくつかのG'基を含んで成るとき、エマルション1及び2は、通常、式（LI）及び（LII）の界面活性剤と反応して、G基を形成できる化合物と接触させられる。この化合物は、通常、基G1と反応できる少なくともv個のG'1官能基と、基G2と反応できる少なくともw個のG'2官能基を含んで成る。
【０２２７】
そのため、G基が先に規定されるような式−G'−Y3−G'−に対応する実施形態において、製剤の調製方法は、通常、以下の：
−先に規定されるようなエマルション1；及び
−先に規定されるようなエマルション2；と
−式G'1−Y3−G'2の化合物｛式中、Y3は、先に規定されるようなものであり、G'1は、G1と反応して、先に規定されるような第一の基G'を形成できる基であり、及びG'2は、G2と反応して、（第一の基G'と同じか又は異なったタイプの）先に規定されるような第二の基G'を形成できる基である｝、
とを、式（LI）及び（LII）の界面活性剤と式G'1−Y3−G'2の化合物を反応させて、G基が先に規定されるような式−G'−Y3−G'−に対応する式（I）の界面活性剤が形成され、その後、分散相中の液滴の間で共有結合が形成され得る条件下で、接触させることを含んで成る。
【０２２８】
同様に、G基が（v+w）G'基を含んで成るデンドリマーである、先に規定されるような実施形態において、製剤の調製方法は、通常、以下の：を接触させることを含んで成る。
−先に規定されるようなエマルション1；
−先に規定されるようなエマルション2；
−式（G'1）v−Y4−（G'2）w｛式中、v及びwは、先に規定されるようなものであり、G'1は、独立にG1と反応して、先に規定されるような基G'を形成できる基であり、G'2は、独立にG2と反応して、先に規定されるような基G'を形成できる基であり（それぞれのG'は、他の基G'と同じか又は異なったタイプのものである）、及びY4は、先に規定されるようなものである｝のデンドリマー、
とを、式（LI）及び（LII）の界面活性剤と式（G'1）v−Y4−（G'2）wの化合物を反応させて、G基が（v+w）G基を含んで成るデンドリマーである式（I）の界面活性剤が形成され、その後、分散相中の液滴の間で共有結合が形成され得る条件下で、接触させることを含んで成る。
【０２２９】
例えば、式（XXX）、（XXXI）、（XXXII）及び（XXXIII）のG基を形成するために、式（G'1）v−Y4−（G'2）wの化合物は、それぞれ以下の式（XXX'）、（XXXI'）、（XXXII'）及び（XXXIII'）の１つ有する：
【０２３０】
【化１６】
0006280120.tif 000018
（式中、G'1及びG'2はNH2を表し、及びv及びwは2を表す）、
【０２３１】
【化１７】
0006280120.tif 000019
（式中、G'1及びG'2はNH2を表し、及びv及びwは2を表す）、
【０２３２】
【化１８】
0006280120.tif 000020
（式中、G'1及びG'2は：
【０２３３】
【化１９】
0006280120.tif 000021
を表し、及びv及びwは2を表す）、
【０２３４】
【化２０】
0006280120.tif 000022
（式中、G'1及びG'2はNH2を表し、及びv及びwは8を表す）。
【０２３５】
彼らの一般的な化学知識の見地から、当業者は、G基を形成するのに使用されるべき基G'1、G'2、Y3、Y4、G1、及びG2のタイプ、並びに反応を可能にする条件を選択することが可能である。有機化学の普通の反応は、特にJohn Wiley & Sons Inc.によって刊行されたRichard C. Larockによる＜Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations＞、及び本明細書中に引用された引用文献に記載のものが使用できる。そのため、以下の基G1及びG2の例は、説明のために提供されるのであって、限定するためのものではない。
【０２３６】
通常、G基が１つのG'基から形成される場合、式（LI）及び（LII）の化合物の基G1及びG2は、例えば、以下のものから選択される：
−G1は、チオール（−SH）であり、且つG2は、以下のいずれかである：
−マレイミド、Gが、式（XIV）｛式中、A102はNを表す｝の基によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；又は
−ビニルスルホン、Gが、式（XVI）の基によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；又は
【０２３７】
−−S−S−ピリジニル又は−SH基、G基が、式（XV）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、ヒドロキシルであり、且つG2は、−COOH又は活性化エステルである、G基が、式（XXIII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、アミン−NH2であり、且つG2は、−COOH又は活性化エステルである、G基が、式（XI）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、ヒドロキシルであり、且つG2は、活性炭酸である、G基が、式（XIX）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、アミン−NH2であり、且つG2は、活性炭酸である、G基が、式（XII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、アミン−NH2であり、且つG2は、−CHOアルデヒドである、G基が、式（XXI）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、式−（C=O）−NH−NH2のヒドラジドであり、且つG2は、−（C=O）−R102基である、G基が、式（XIII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
【０２３８】
−G1は、アルキンであり、且つG2は、アジ化合物である、G基が、式（XVIII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、シクロオクチンであり、且つG2は、アジ化合物である、G基が、式（XVIII'）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、フランであり、且つG2は、マレイミドである、G基が、式（XVII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、アルデヒドであり、且つG2は、アミン、次にどのGがG'基を含んで成るかで式（XXI）の基を表しながら形成される式（I）の界面活性剤である。
−G1は、式−O−P（=O）（OH）2のホスファートであり、且つG2は、ヒドロキシルである、G基が、式（XXII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、良い脱離基LGであり、且つG2は、次の式：
【０２３９】
【化２１】
0006280120.tif 000023
の基である、G基が、式（XXIV）｛式中、A101はOである｝によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、ヒドロキシル又は−NH2アミンであり、且つG2は、次の式：
【０２４０】
【化２２】
0006280120.tif 000024
【０２４１】
の基を表す、G基が、式（XXIV）｛式中、A101は、それぞれ−O−（CO）−又は−NH−（CO）を表す｝によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、良い脱離基LGであり、且つG2は、ヒドロキシルである、G基が、式（XXV）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、良い脱離基LGであり、且つG2は、アミン−NH2である、G基が、式（XXVI）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される；
−G1は、オキシアミン−O−NH2であり、且つG2は、アルデヒドである、G基が、式（XXVII）によって表されるG'基を含んで成る式（I）の界面活性剤がその後形成される。
【０２４２】
G基が、いくつかの基G'を含んで成る場合、一緒に反応する基：G'1とG1、G'2とG2の選択は、上記の実施例の基G1又はG2をG'1又はG'2で置換することによって、同じ様式でおこなうことができる。
【０２４３】
方法で使用されるエマルション1及び2は、（RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を添加するための工程（ｉｖ）をおこなわないで）工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）を含んで成る、先に記載した第一の方法を使用して調製できる。
【０２４４】
［使用］
製剤は、有利なことには、安定していてほとんど毒性がない。それは、形質移入剤として、及び／又はRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を送達するためのシステムとして使用できる。
【０２４５】
製剤がイメージング剤を含んで成る場合、例えばイメージング剤が親油性フルオロフォアであれば、蛍光追跡を使用することで、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の送達、及び／又は細胞トランスフェクションを観察することが、有利なことには可能である。
【０２４６】
・トランスフェクション剤として
第四の態様によると、本発明は、真核生物細胞に、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を挿入する方法であって、本発明の製剤と真核生物細胞とを接触させることを含んで成る方法に関する。この方法は、トランスフェクション方法である。
【０２４７】
挿入方法は、インビトロでおこなわれる。この場合及び通常、本発明の製剤と真核生物細胞との接触は、緩衝溶液、例えばOptiMEMR媒質中でおこなわれる。接触は、通常37℃程度の温度で、8〜96時間、通常72時間程度続く。一般的に、接触工程後に、細胞が回収される。
【０２４８】
本発明の製剤の液滴は細胞の効率的トランスフェクションを可能にするだけではなく、さらにそれらは、機能的に活性であり、且つ所望の遺伝子の発現のサイレンシングを可能にする。
【０２４９】
いずれかの特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明のナノエマルションの液滴が細胞を形質移入した時点で、エンドソーム脱出が液滴及びRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を細胞質中、したがって、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の作用部位に放出するように思われ、そしてそれが、リソソームの中でのこれらの核酸配列の分解を妨げ、それらが標的mRNAに干渉することを可能にし、その結果、所望の遺伝子の発現を妨げる。
【０２５０】
一実施形態において、製剤は、標的生物学的リガンドに結合した補助界面活性剤を含んで成る。この実施形態は、有利なことには、通常トランスフェクションに耐性である、すなわち、形質移入するのが難しいことが知られている真核生物細胞、特に幹細胞、一次細胞（例えば、ヒト線維芽細胞又はヒト内皮細胞）、又はリンパ球細胞株（例えば、ジャーカットタイプ）又は神経芽細胞腫（例えば、SK−N−SHタイプ）へのRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の挿入を可能にする。生物学的リガンドを標的化することは、通常、製剤によるトランスフェクションに対して耐性である細胞のトランスフェクションを容易にできた。
【０２５１】
・RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列の送達用
本発明の製剤は、RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列のインビトロ又はインビボ送達のシステムである。
【０２５２】
そのため、第五の態様によると、本発明は、疾患の予防及び／又は処置における使用のための上記で規定した製剤に関する。
【０２５３】
疾患は、通常、1若しくは複数の遺伝子のサイレンシングが求められる以下のような疾患である：
−眼疾患、特に加齢性黄斑変性症（AMD）、緑内障又は先天的爪肥厚症；
−癌、固形腫瘍、転移だけでなく、慢性骨髄性白血病も；
−腎臓病、特に移殖又は急性腎不全後のもの；
−高コレステロール血症；
−特にC型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、及び呼吸系発疹ウイルス（RSV）による感染に関連するウイルス病。
【０２５４】
有利なことには、先に説明したように、本発明の製剤は、（特にその初期代謝を予防することによって）製剤が投与される患者の身体（及びタンパク質）からRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を保護する。
【０２５５】
製剤は疾患の処置を可能にする治療剤を含んでいてもよく、そしてそれは、二重治療効果；RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列によって引き起こされた効果と治療剤によって引き起こされた効果、の利益を提供する。
【０２５６】
それはヒトにおける使用が承認された構成要素からもっぱら調製され得るので、それは非経口経路を介した投与に関して所望のものである。しかしながら、他の経路、特に経口経路、局部経路、又は眼科経路を介した投与を構想することもまた可能である。
【０２５７】
効果的な量の先に規定した製剤の、哺乳動物、好ましくはそれを必要としているヒトに投与することを含んで成る疾患の予防及び／又は処置の方法もまた、本発明の対象の１つである。
【０２５８】
［定義］
本明細書において、「ナノエマルション」という用語は、少なくとも２つの相、一般に油相及び水相を有する組成物であって、分散相の平均的大きさが、１ミクロン未満、好ましくは１０〜５００ｎｍ、特に２０〜１００ｎｍ、最も好ましくは２０〜７０ｎｍである組成物を意味する（論文C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In, 2005, 10, 102-110を参照）。
【０２５９】
本願の意味において、＜分散相＞という表現は、任意の油／（単数若しくは複数の）カチオン性界面活性剤／可溶性脂質／両親媒性脂質／補助界面活性剤／任意の式（I）の界面活性剤／任意のヘルパー脂質／任意のイメージング剤／任意の治療剤／任意のRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成る液滴を示す。分散相は、通常水相を含まない。
【０２６０】
＜液滴＞という用語は、液体油の液滴そのまま、並びに油相が固体である水中油型エマルションの固体粒子を包含する。後者の場合、＜固体エマルション＞という用語が使用されることも多い。
【０２６１】
本明細書において、＜脂質＞という用語は、すべての油脂、又は動物脂肪及び植物油に存在する脂肪酸を含有する物質を意味する。脂質は、主に炭素、水素及び酸素から形成され、且つ水の密度より低い密度を有する疎水もしくは両親媒性分子である。脂質は、ワックスのように室温（25℃）で固体状態であっても、油のように液体であってもよい。
【０２６２】
＜リン脂質＞という用語は、リン酸基を有する脂質、特にホスホグリセリド類を指す。最も多くの場合、リン脂質は、置換されていてもよいリン酸基によって形成された親水性末端及び脂肪酸鎖によって形成された２つの疎水性末端を含む。特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びスフィンゴミエリンが挙げられる。
【０２６３】
＜レシチン＞という用語は、ホスファチジルコリン（すなわち、コリン、リン酸、グリセリン及び２つの脂肪酸から形成された脂質）を指す。より広くは、リン脂質が主にホスファチジルコリンからなる限り、レシチンとしては、生物源から抽出されたリン脂質、すなわち、植物又は動物由来のリン脂質が挙げられる。このようなレシチンは一般に、異なる脂肪酸を有するレシチンの混合物から成る。
【０２６４】
＜脂肪酸＞という用語は、少なくとも4個の炭素原子からなる炭素鎖を有する脂肪族カルボン酸を指す。天然の脂肪酸は、4〜28個（一般に偶数）の炭素原子からなる炭素鎖を有する。長鎖脂肪酸は、14〜22個の炭素原子長さの脂肪酸であり、非常に長い長鎖脂肪酸は、22個超の炭素原子を有する脂肪酸である。
【０２６５】
＜界面活性剤＞という用語は、水中油型及び油中水型界面との特定の親和性を化合物に与え、それにより、これらの界面の自由エネルギーを減少させ、かつ分散系を安定化させることができる両親媒性構造を有する化合物を意味する。
【０２６６】
＜補助界面活性剤＞という用語は、界面のエネルギーをさらに減少させるように別の界面活性剤と共に作用する界面活性剤を意味する。
【０２６７】
＜炭化水素鎖＞という用語は、飽和又は不飽和（二重又は三重結合）の炭素と水素原子から構成された鎖を示すことを意味している。好ましい炭化水素鎖は、アルキル又はアルケニルである。
【０２６８】
＜アルキレン＞という用語は、飽和の直鎖鎖又は分岐、好ましくは直鎖の脂肪族二価炭化水素基を示すことを意味している。
【０２６９】
＜環式ラジカル＞は、クラウン系に由来するラジカルを意味している。例えば、フェニレンラジカルは、ベンゼン基由来の二価ラジカルである。＜クラウン系＞は、飽和、不飽和又は芳香族（アリール又はヘテロアリール）の炭素環又は複素環化合物を意味している。
−炭素環：不飽和（例えば、シクロヘキセン）又は芳香族（すなわち、フェニル）の炭素原子（好ましい飽和炭素環は、特に例えばシクロペンチル又はシクロヘキシルなどのシクロアルキルである）で構成された飽和クラウン。
−複素環化合物：別段の指示がない限り、5〜6個の原子を含んで成り、且つO、N及び／又はSの中から選択される1若しくは複数のヘテロ原子を含んで成るクラウン基である。前記複素環化合物は、飽和であっても、部分不飽和であってもよく、1若しくは複数の二重結合を含んでいてもよい。この場合、ヘテロシクロアルキル基という用語が使用される。それはまた、別段の指示がない限り、5〜6個の原子を含んで成る芳香族であり、とのとき、ヘテロアリール基を表してもよい。
【０２７０】
−次の非芳香族複素環化合物又は複素環アルキルも引用され得る：ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロチオフェニル、ジチオラニル、チアゾリジニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサニル（ldioxanyl）、モルホリニル、ピペリジル、ピペラジニル、テトラヒドロチオピラニル、チオモルホリニル、ジヒドロフラニル、2−イミダゾリニル、2,3−ピロリニル、ピラゾリニル、ジヒドロチオフェニル、ジヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、イソキサゾリジニル、
【０２７１】
−ヘテロアリールとして、以下の代表的な基が挙げられる：フリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、1,2,4−オキサジアゾリル、1,3,4−オキサジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、1,3,4−チアジアゾリル、1,2,3−チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、1,2,3−チアゾリル、及び1,2,4−チアゾリル。
【０２７２】
＜活性エステル＞は、式−CO−LGの基を意味し、＜活性炭酸＞は、式−O−CO−LGの基を意味している。
【０２７３】
式中、LGは、特に、塩素、イミダゾリル、ペンタフルオロフェノレート、ペンタクロロフェノレート、2,4,5−トリクロロフェノレート、2,4,6−トリクロロフェノレートの中から、又は基−O−サクシニミジル、−O−ベンゾトリアゾリル、−O−（7−アザ−ベンゾトリアゾリル）及び−O−（4−ニトロフェニル）の中から選択される良い脱離基である。
【０２７４】
本発明は、添付の図面及び以下の実施例を参照することによってより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、本発明による製剤（RNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる核酸配列を含んで成る＜最終的な＞製剤）の液滴のコア／リング構造を例示する図解を示す。1が連続水相を表し、2が液滴のクラウン（一部）を表し、そして、3が液滴のコア（一部）を表す。クラウン2が説明される際に：両親媒性液体（例えば、レシチンなどの中性リン脂質）、カチオン性界面活性剤（例えば、カチオン性リン脂質DOTAP）、その折りたたみポリ（エチレンオキシド）鎖が水相中に示されている補助界面活性剤、及びRNA干渉の内在性メカニズムを調節することができる二重鎖核酸配列（例えば、siRNA）。
【図２】図２は、製剤B10及び表8で指定した濃度を用いたsiRNAの複合体形成後のUV検出法を用いた電気泳動を示す。尺度とsiRNA（基準）を左側に示した。
【図３】図３は、図２のUV検出法を用いた電気泳動ゲルについて、ImageJソフトウェアで電気泳動データを処理して得られたsiRNA量（ng）の結果を示す。
【図４】図４は、遊離siRNA（比較）及び比N／P：を用いた複合体形成によって得られた本発明の3種類の製剤について、nm単位の流体力学直径の関数としてMalvernのZetaSizer装置により得られた強度を示す。前記比N／Pは、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量（荷電した窒素による、したがって、N／PのN）と、siRNAによって提供される陰電荷の量（siRNAのリンによる、したがって、N／PのP）との間で4：1、8：1又は16：1である。
【図５】図５は、左から右に向かって以下のものを用いた、UV検出後の電気泳動ゲルを示す：−尺度；−遊離siRNA（基準）；次に、siRNAの複合体形成によって得られた移動：−製剤B1を用いた（比較例）（複合体形成なし、siRNAは遊離）；−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B6を用いた（定量的な複合体形成）；−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B6を用いた（定量的な複合体形成）；−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B10を用いた（定量的な複合体形成）；−リポフェクタミン（比較例）（不完全な複合体形成）。
【図６】図６は、複合体形成直後（T0）、次に、複合体形成後15分、45分、1時間30分、3時間及び6時間のsiRNA／B10製剤複合体のUV検出後の電気泳動ゲルを示す。尺度とsiRNA（基準）は左側にある。
【図７】図７は、以下を用いて細胞を形質移入した場合の、FITC蛍光強度の減少を%として示す。−リポフェクタミンRNAimax（市販の作用物質）；−siRNA／製剤B1複合体。−siRNA／製剤B6複合体、複合体形成前に周囲温度で7カ月保存した製剤；−siRNA／製剤B6複合体、複合体形成前に周囲温度で12カ月保存した製剤；−siRNA／製剤B10複合体、複合体形成前に周囲温度で12カ月保存した製剤；−siRNA／DOTAP（58wt%）、DOPE（18wt%）、コレステロール（2wt%）及びDSPE−PEG3000（22wt%）を含んで成るカチオン性リポソームの製剤の複合体（比較）。
【図８】図８は、蛍光タンパク質GFP（緑色蛍光タンパク質）を実験的に過剰発現する3種類の細胞株：siRNA／製剤B10複合体、GFPタンパク質をコードするmRNAを標的としているsiGFPと呼ばれるsiRNA、及び負の対照（陰性基準のsiRNAと複合体形成したB10製剤と一緒にインキュベートした細胞、すなわち、siAllStarと呼ばれる細胞のトランスクリプトームに影響しない＜不活性＞）のためのU2OS、PC3及びHela、に関する蛍光強度（FITC）を示す。
【図９】図９は、表9で指定した濃度での、模倣体タイプの合成マイクロRNAのA3製剤との複合体形成後のUV検出法を用いた電気泳動ゲルを示す。尺度及びマイクロRNA Mimic（基準）、並びに非複合体形成A3プレミックス製剤が左側にある。5種類の異なったN／P比を用いたA3プレミックス製剤と模倣体との複合体形成に由来する最終的な製剤は、右側に示されている。
【実施例】
【０２７６】
・siRNAとの複合体形成前の＜プレミックス＞製剤の調製と組成
使用した水相は、PBS 1X緩衝溶液であった。
化合物の供給業者は、次のとおりであった：
リポイドS75−3：Lipoid
リポイドS75：Lipoid
リポイドS100−3：Lipoid
DOTAP：Avanti Polar
DOPE：Avanti Polar
MyrjS40：Croda
Suppocire NB：Gattefosse
ダイズ油：Croda
【０２７７】
製剤中の液滴の流体力学直径及びそれらのゼータ電位を、MalvernのZetaSizer装置を使用した動的光散乱によって計測した。液滴の流体力学直径をPBSの0.1X溶液中で計測し、ゼータ電位をNaClの0.15mM水溶液中で計測した。
【０２７８】
16種類の異なった製剤を調製し、そして、その組成を表1〜5に示す。
【０２７９】
【表２】
0006280120.tif 000025
【０２８０】
【表３】
0006280120.tif 000026
【０２８１】
【表４】
0006280120.tif 000027
【０２８２】
【表５】
0006280120.tif 000028
【０２８３】
【表６】
0006280120.tif 000029
【０２８４】
表1〜5において：
wt%は、重量パーセントに対応している。
mol%は、モルパーセントに対応している。
ND（測定せず）は、実験がおこなわれなかったことを意味する。
パーセンテージ＜／液滴＞は、全体（リポイド／DOTAP／Myrj S40／任意のDOPE／Suppocire NB／ダイズ油）に対するパーセンテージを表す。
パーセンテージ＜／環＞は、全体（リポイド／DOTAP／Myrj S40／任意のDOPE）に対するパーセンテージを表す。
パーセンテージ＜／環PEGなし＞は、全体（リポイド／DOTAP／任意のDOPE）に対するパーセンテージを表す。
パーセンテージ＜／コア＞は、全体（Suppocire NB／ダイズ油）に対するパーセンテージを表す。
【０２８５】
リポイドS75−3は、65〜75%のフォスファチジルコリンを含んで成る。リン脂質の脂肪族鎖は、ほとんど飽和されている（平均組成：12〜16%のC16：0、80〜85%のC18：0、<5%のC18：1、<2%のC18：2）。
【０２８６】
リポイドS75は、65〜75%のフォスファチジルコリンを含んで成る。リン脂質の脂肪族鎖はほとんど不飽和である（平均組成：17〜20%のC16：0、2〜5%のC18：0、8〜12%のC18：1、58〜65%のC18：2、4〜6%のC18：3）。
【０２８７】
リポイドS100−3は、>94%のフォスファチジルコリンを含んで成る、すなわち、リン脂質の脂肪族鎖は、ほとんど飽和されている（平均組成：12〜16%のC16：0、85〜88%のC18：0、<2%のC18：1、<1%のC18：2）。
【０２８８】
製剤のA1、B1、B4、及びC1は、カチオン性界面活性剤を含んでいないので、比較例である。それらのゼータ電位はマイナスである。siRNAの複合体形成は、予想したとおり、液滴表面では起こらなかった。
【０２８９】
製剤B9は、両親媒性脂質を含んでいないので、比較例である。エマルションを調製することができなかった。
【０２９０】
以下の所定の製造方法は、以下のとおりである：
（ｉ）油相の調製：
ダイズ油、suppocire NC、両親媒性脂質、DOTAP、任意のDOPEを計量し、そして、ジクロロメタンと混合し、その後、60℃まで加熱して、均質の粘性溶液を得る。ジクロロメタンは可溶化を促進する。次に、溶媒を真空内で留去した。
【０２９１】
（ｉｉ）水相の調製：
エタノール留去相の間、水相は調製した。5mlのエッペンドルフチューブ中で、補助界面活性剤、グリセロール、及びPBSの水溶液（154mMのNaCl、pH7.4）を混合し、そして、75℃の水浴内で溶かした。
【０２９２】
（ｉｉｉ）2つの相の混合：
油相が約40℃であり（粘着性形態）、水相が約70℃であった（水浴のまま）。水浴を油相に注ぎ入れた。
【０２９３】
（ｉｖ）乳化：
2つの相が入ったボトルを、AV505R超音波処理器（Sonics, Newton, USA）の超音波処理チャンバー内に備え付けた。プロトコールでは、40分間にわたる100Wの出力での超音波処理サイクル（30秒ごとに10秒の作動）を伴った。
【０２９４】
（ｖ）精製：
次に、生じた液滴を、透析（カットオフ閾値：12kDa、154mMのNaClに対して一晩）によって精製して、LNP中に組み込まれていない脂質成分を取り除いた。最終的に、製剤を、セルロース膜による濾過によって滅菌した。
【０２９５】
・製剤の液滴のサイズとゼータ電位
−製剤の組成の影響
表1〜5の結果は、補助界面活性剤（Myrj S40）の割合の低下が液滴の直径の増大につながることを示している。
【０２９６】
−時間の傾向
製剤の液滴サイズ（表6）とゼータ電位（表7）における傾向を、40℃（加速安定性）で計測した。2回の測定の間、製剤を40℃で保存した。
【０２９７】
【表７】
0006280120.tif 000030
【０２９８】
【表８】
0006280120.tif 000031
【０２９９】
本発明による製剤の液滴のサイズとゼータ電位は、40℃で300日間保存しても変化を示さないことを観察した。
【０３００】
これらの結果は、本発明の製剤が経時的に安定していることを実証している。
【０３０１】
・siRNAとの複合体形成：siRNA核酸配列を含んで成る最終的な製剤の調製
以下の一般手法に従った：
複合体形成は、先に調製した製剤と、バッファー中のsiRNA溶液との単純な混合を伴った。構想している適用に関連するバッファーの選択：インビトロ研究のために、トランスフェクション工程に最適化した媒質は、OptiMEMであった。複合体形成試験のために、バッファーは、5mMのHepesを使用した。
【０３０２】
使用されるsiRNAの量は0.5μgであった（GFP−22 siRNAローダミン（カタログn°1022176）（Qiagen）又はsiGFP（Sigma））（20μL中に25μg／mL）。
【０３０３】
混合物を、周囲温度（約25℃）にて、600rpmで30分間撹拌した。
【０３０４】
複合体形成は、以下の2つの機器によって可視化した：
−siRNA移動の観察を可能にしたアガロースゲル電気泳動法。良好な複合体形成があれば、そのときには、複合体形成したsiRNAを含んで成る液滴が、遊離のsiRNAより重くなるので、ウェル内に見られる。複合体形成がそれほどでなければ、遊離のsiRNAが別の位置に向かって移動する。
【０３０５】
−DLSにより、流体力学直径における複合体形成の影響について観察した。複合体形成が効果的であるほど、プロフィールがより単一様相の分配に向かう傾向がある。
【０３０６】
siRNAの定量的な複合体形成収率を得るために必要とされる製剤の量を最適化した。
【０３０７】
実施において、siRNAによって提供される陰電荷は、製剤の陽電荷（すなわち、カチオン性界面活性剤DOTAPの陽電荷）によって相殺される。
【０３０８】
通常、製剤の唯一のカチオン性界面活性剤がDOTAP（単独の陽電荷しか含んでいない）であるときに、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量対siRNAによって提供される陰電荷の量の比が、図2及び3で例示される8：1より大きいときに、定量的な複合体形成収率を得る。
【０３０９】
図2は、siRNAの溶液と5mMのHepesバッファー中の製剤とを混合することによる、表8で指定した濃度における製剤B10とsiRNAとの複合体形成後のUV検出法を用いた電気泳動ゲルを示す。1.5%のアガロースゲル上への堆積の前に、2μLのローディングバッファーを試験物に添加した。100Vにて1時間30分の電気泳動後に、ゲルをGelRed 3Xに浸した。最終的にUV検出法をおこなった。
【０３１０】
【表９】
0006280120.tif 000032
【０３１１】
図3は、ImageJソフトウェアを使用して同じ実験の電気泳動データを処理することによって得られた結果を示す。
【０３１２】
図2及び3は、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量と、siRNAによって提供される陰荷電の量との比が8：1より大きいとき、媒質中にsiRNAが残らなくなり、しかも、siRNAが完全に複合体形成された。
【０３１３】
図4は、遊離siRNA（比較）及び比N／P：を用いた複合体形成によって得られた本発明の3種類の製剤について、nm単位の流体力学直径の関数としてMalvernのZetaSizer装置により得られた強度を示す。前記比の値は、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量と、siRNAによって提供される陰電荷の量との間で4：1、8：1又は16：1である。
【０３１４】
直径は、遊離siRNA（比較）より大きかった。
【０３１５】
＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量の間の比は4：1であるとき、2つの集団：約100nmのsiRNA／液滴複合体と遊離形態のsiRNAを表すより大きいサイズの集団（矢印）が観察された。
【０３１６】
＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量の比が8：1及び16：1であるとき、siRNA／液滴複合体を表す単一集団が観察された。
【０３１７】
これらの結果はまた、液滴に対してsiRNAの定量的な複合体形成（100%）が可能であることも示している。
【０３１８】
複合体形成工程は、様々な製剤でおこなわれた。
【０３１９】
比較を通して、複合体形成試験を、カチオン性界面活性剤を含まない製剤：上記の製剤B1、でおこなった。予想されるように、siRNAの複合体形成はおこなわれず、siRNAは遊離形態のままであった。
【０３２０】
図5は、左から右に向かって以下のものを用いた、UV検出後の電気泳動ゲルを示す：
−尺度；
−遊離siRNA（基準）；
次に、siRNAの複合体形成によって得られた移動：
−製剤B1を用いた（比較例）（複合体形成なし、siRNAは遊離）；
−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B6を用いた（6カ月前に製剤したプレミックス）（定量的な複合体形成）；
−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B6を用いた（12カ月前に製剤したプレミックス）、製剤は、複合体形成前に周囲温度で7カ月貯蔵した（定量的な複合体形成）；
−8：1の＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とsiRNAによって提供される陰電荷の量との間の比により製剤B10を用いた（定量的な複合体形成）；
−リポフェクタミン（比較例）（不完全な複合体形成）。
【０３２１】
製剤B6又はB10を使用したとき、siRNAの複合体形成は定量的であった。siRNAとの複合体形成前の周囲温度における製剤の貯蔵は、定量的なままである複合体形成の収率に少しの影響も与えず、その結果、使用した製剤の安定性が示された。
【０３２２】
DOPEを含有した製剤を使用したか否かに関係なく、収率は定量的であった。
【０３２３】
市販のトランスフェクション剤リポフェクタミンRNAimaxを用いて、siRNAの60%超が遊離形態で見られた。これは、本発明に使用したナノエマルションの製剤がリポフェクタミンより良い複合体形成収率を提供することを含意している。
【０３２４】
最終的に、先に調製したsiRNA／製剤B10複合体におけるsiRNAの放出速度論を試験して、経時的な複合体形成の傾向について観察し、そして、図6に例示する。最長で複合体形成の3時間後に、遊離形態のsiRNAは見られない。6時間で、siRNAは放出され始める。よって、複合体は少なくとも3時間安定している。
【０３２５】
・インビトロトランスフェクション
トランスフェクション試験を、Green Fluorescent Protein（GFP）を過剰発現する異種細胞株に対して、このタンパク質のメッセンジャーRNAの配列を特異的に阻害するsiRNAを提供することによっておこなった（GFP−22 siRNAローダミン（カタログn°1022176）（Qiagen））。
【０３２６】
トランスフェクションを、100nMの最終的なsiRNA濃度でおこなった。GFPを発現する細胞を、12ウェルプレート内に播種し（25000細胞／ウェル）、そして、先に得た複合体siRNA／製剤（B1、B6、B6（その調製の7月後）又はB10）で処理した。次に、細胞を、37℃で72時間インキュベートし、そして、フローサイトメトリーによる蛍光強度の分析のために回収して、形質移入剤としての製剤の有効性を判断した。GFPタンパク質原因の発現を特異的に阻害するsiRNAの能動的な送達が、このタンパク質によって提供される蛍光の減少を引き起こす。
【０３２７】
市販のトランスフェクション剤リポフェクタミンRNAimaxを、比較のために使用した。
【０３２８】
図7は、以下を用いて細胞を形質移入した場合の、蛍光強度の%減少を示す：
−リポフェクタミンRNAimax；
−siRNA／製剤B1複合体。
−siRNA／製剤B6複合体、複合体形成前に周囲温度で7カ月保存した製剤；
−siRNA／製剤B6複合体、複合体形成前に周囲温度で12カ月保存した製剤；
−siRNA／製剤B10複合体；
−siRNA／DOTAP（58wt%）、DOPE（18wt%）、コレステロール（2wt%）及びDSPE−PEG3000（22wt%）を含んで成るカチオン性リポソームの製剤の複合体（比較）。
【０３２９】
33〜50%の蛍光の減少が、試験した本発明の製剤によって観察されている。そのため、本発明の製剤は、GFP遺伝子の発現の相対的なサイレンシングを引き起こす能動的なsiRNAの送達を可能にする。
【０３３０】
加えて、製剤中にDOPEを組み込むことによって、蛍光のより大きな減少が観察されたので、DOPEがエンドソーム脱出を促進した。
【０３３１】
siRNAの複合体を用いても、蛍光の減少は全く観察されなかった。カチオン性リポソームの製剤化は、例えば、培養培地中でのリポソームの低い安定性、低い複合体形成収率及び／又は複合体形成後のリポソームによる低いsiRNAの保持に関与する可能性がある。
【０３３２】
最終的に、本発明の製剤によって媒介されるsiRNAの能動的な送達のこうした結果は、図8に例示したGFPを発現する3種類の細胞株：U2OS、PC3、及びHela、により再現された。
【０３３３】
・合成マイクロRNAを用いた複合体形成：合成マイクロRNA（模倣体）の核酸配列を含んで成る＜最終的な＞製剤の調製
以下に示した一般手法に従った：
複合体形成は、バッファー中での先に調製したA3プレミックス製剤と、マイクロRNA（miRIDIAN Mimic Human has-miR612（ThermoScientific REF#C-300937-01 Batch n°130611））の溶液との単純混合を伴った。バッファーの選択は、構想している適用に依存した：インビトロ研究向けに、トランスフェクションステップのための最適化した培養、OptiMEMRを使用した。複合体形成に関する試験のために、5mMのHepesバッファーを使用した。
【０３３４】
0.5μgの量のマイクロRNAを使用した（miRIDIAN Mimic Human has-miR612（ThermoScientific REF#C-300937-01 Batch n°130611））。
【０３３５】
混合物を、周囲温度にて600rpm、30分間撹拌した（約25℃）。
【０３３６】
複合体形成を、マイクロRNA移動の観察を可能にした電気泳動によって得られたアガロースゲル上での検出によって可視化した。良好な複合体形成により、複合体形成したマイクロRNAを含んで成る液滴は、遊離のマイクロRNAより重いので、ウェル内に見られる。複合体形成がそれほどでなければ、遊離のマイクロRNAが別の位置に向かって移行する。
【０３３７】
定量的なマイクロRNAの収率を得るために必要とされるA3プレミックス製剤の量を最適化した。
【０３３８】
実施において、マイクロRNAによって提供される陰電荷は、プレミックス製剤の陽電荷（すなわち、カチオン性界面活性剤DOTAPの陽電荷）によって相殺される。通常、プレミックス製剤の唯一のカチオン性界面活性剤がDOTAP（単独の陽電荷しか含んでいない）であるときに、＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量とマイクロRNAによって提供される陰電荷の量との間の比（N/P比）が、先にsiRNAを用いた、8：1より大きいときに、複合体形成の定量的な収率を得る。
【０３３９】
図9は、マイクロRNAの溶液と5mMのHEPESバッファー中のA3プレミックス製剤とを混合することによる、表9で指定した濃度における製剤A3とマイクロRNAとの複合体形成後のUV検出法を用いた電気泳動ゲルを示す。1.5%のアガロースゲル上への堆積の前に、2μLのローディングバッファーを試験物に添加した。100Vにて1時間30分の電気泳動後に、ゲルをGelRed 3Xに浸した。最終的にUV検出法をおこなった。
【０３４０】
【表１０】
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【０３４１】
図9は、8：1より高い＜プレミックス＞製剤中のカチオン性界面活性剤による陽電荷の量と、マイクロRNAによって提供される陰電荷の量との間の比の値に関して、siRNAによる図2及び3で例示されるように、媒質中にマイクロRNAが残らなくなり、しかも、マイクロRNAが完全に複合体形成された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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