(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ホスファチジン酸及び／又はカルジオリピンと、（ｉｉ）アポリポタンパク質Ｅ又はその誘導体とを含む、リポソームを含む、細胞内レベル及び細胞外レベルの両方で患者の中枢神経系におけるアミロイド斑を減少又は排除して、アルツハイマー病の治療又は予防に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
成分（ｉ）が前記リポソーム中に１％〜２０％のモル百分率で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
成分（ｉ）が前記リポソーム中に１％〜１０％のモル量で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
成分（ｉ）が前記リポソーム中に５％のモル量で存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
成分（ｉｉ）が前記リポソーム中に１％〜５％のモル量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
成分（ｉｉ）がＡｐｏＥフラグメント又はその二量体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
成分（ｉｉ）がＡｐｏＥのアミノ酸配列１００〜２００のうちから選択されるＡｐｏＥフラグメント、又はその二量体であるＡｐｏＥフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
成分（ｉｉ）がＡｐｏＥのアミノ酸配列１２０〜１７０のうちから選択されるＡｐｏＥフラグメント、又はその二量体であるＡｐｏＥフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
成分（ｉｉ）がＡｐｏＥのアミノ酸配列１４１〜１５０に相当するフラグメント、又はその二量体であるＡｐｏＥフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アポリポタンパク質Ｅ又はその誘導体が、そのＣ末端において、システイン末端トリペプチドを包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アポリポタンパク質Ｅ又はその誘導体が、そのＣ末端において、トリペプチドＣＷＧ−を包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
成分（ｉｉ）がリンカー分子を介して化学的に結合される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが、更なる標準的なリポソーム脂質を包含する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記標準的なリポソーム脂質が、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ化又は非ＰＥＧ化）及びコレステロールのうちの１又は複数から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記標準的なリポソーム脂質が、実質的に等モル比で存在するコレステロール及びスフィンゴミエリンである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
全身投与経路用に製剤化される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
７０ｋｇの患者に対して１ミリモル〜１５ミリモルの総脂質を投与することに好適な用量単位形態である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アルツハイマー病は、記憶及び認知機能の進行性の喪失を特徴とする神経変性疾患である。アルツハイマー病は認知症に分類でき、おそらく工業国において４番目に多い死因であり、さらに計り知れない社会的また経済的な被害をもたらす。アルツハイマー病患者の脳組織の死後観察により、大脳辺縁系及び大脳皮質において老人斑及び神経原線維濃縮体の存在が明らかにされる。主に細胞外レベルに存在する老人斑は、主成分として４０アミノ酸又は４２アミノ酸を含むβアミロイドペプチドを含有し、βアミロイドペプチド（本明細書ではＡβと略記する）は、単量体の形態で患者脳において大量に産生され、ますます大きな凝集体（オリゴマー、フィブリル、プラーク）の形成と関連する傾向がある。凝集体は神経細胞に毒性であり、認知能力の進行性の喪失、また最終的には死亡の原因となる神経細胞の変性を引き起こす。アルツハイマー病において異常に大量に産生されるペプチドＡβは、脳に蓄積する。
【０００２】
これまで、老人斑のわずかな、十分ではない減少が得られたに過ぎない。例えば、文献は、抗Ａβ抗体又はガングリオシドを使用することによるアミロイド斑の減少を報告しているが、わずかなアミロイド斑の減少を与える以上に、これらの物質は免疫系に対して重度の副作用リスク、例えば髄膜脳炎を伴う（非特許文献１）。特許出願である特許文献１は、コレステロール及びスフィンゴミエリン、更にカルジオリピン、ホスファチジン酸及びホスファチジルグリセロールのうちから選択される脂質に基づくリポソームを記載し、これらの製品は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでＡβペプチドとの結合能を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏデータもプラーク形成の阻害を示す研究も報告されていない。
【０００３】
論文である非特許文献２は、脳内皮細胞への内部移行能を示す、ホスファチジン酸及び改変アポリポタンパク質Ｅ由来ペプチドにより官能化された新たなリポソームを記載し、また、リポソームはｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイでＡβペプチドに結合し得ることが見出され、かかる結合はリポソームの唯一のホスファチジン酸成分に帰し、実際、追加のアポリポタンパク質の存在は、Ａβペプチドへの結合を改善しないどころか、部分的に妨げることが示され、この刊行物は、これらのリポソームのＡβペプチドのフィブリル及びプラークへの凝集を阻害する能力も、凝集体を脱凝集する能力も調査していない。
【０００４】
別の刊行物（非特許文献３）では、ホスファチジン酸により官能化されたリポソームを、ペプチドＡβのフィブリルへの凝集を阻害する、すなわち、プラーク形成プロセスを予防する実用的な能力について調査し、得られたデータは、ホスファチジン酸により官能化されたリポソームがかかる凝集を阻害できないことを示した。
【０００５】
要約すると、Ａβペプチド結合リポソームの一部の例が知られているものの、現在、任意のかかる製品が、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミロイド斑の明確かつ顕著な減少をもたらすことができるという証拠は存在しない。それどころか、或る特定の官能化リポソームについていくつかの活性の理論モデルが仮定されたが、Ａβアミロイド斑形成の病理プロセスを阻害する証拠は何ら報告されておらず、また、有効な証拠は、例えば、ホスファチジン酸系リポソームについて、Ａβペプチドの老人斑への凝集を阻害する効果が欠如していることを示唆している。
【０００６】
さらに、追加の置換基又は官能性アームを含有するリポソーム（「官能化リポソーム」）の分野では、２以上の追加の置換基が、プラーク形成の減少において、同じ生化学的レベルで協同し得るリポソームの構築に関する理論的根拠も証拠も存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５０６８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J.Neurosci.2011, 31(25), 9323-31
【非特許文献２】J.Biotechnology 156, 2011, 341-346
【非特許文献３】Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 7(2011), 541-550
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、アルツハイマー病の主な病理学的な構成要素を明確に阻害するために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡβペプチドのフィブリル及びプラークへの凝集の阻害を最大化することが可能な薬剤に対する高い必要性が残されたままである。また、アルツハイマー病及び他の神経変性状態の安全な治療を提示するために、毒性の副作用が疑われる外来性物質又は薬剤（ガングリオシド等）を使用することでできる限り回避するｉｎ−ｖｉｖｏでのアミロイド斑に対して強い有効性を持つ治療に対する必要性が感じられる。
【００１０】
さらに、Ａβペプチドプラークの凝集に関与する或る理論的機構が提案されているが、これまで、罹患患者又はその動物モデルにおいて、任意のかかる機構の阻害がアルツハイマー病を治療するのに足りるという何らの証拠も存在しない。そのため、認知能力の喪失、記憶喪失及び認知症等のアルツハイマー病の確立された行動性の損傷の現実の矛盾のない改善をもたらすことができる薬物に対する必要性が感じられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（ｉ）ホスファチジン酸及び／又はカルジオリピン、（ｉｉ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）又はその誘導体、追加的に標準的なリポソーム脂質を含むリポソームの使用に関する。そのように改変されたリポソームをアルツハイマー病の動物モデルに投与すると、その成分の相乗的相互作用により、ｉｎ−ｖｉｖｏでアミロイド斑の著しい減少が得られる。これは、低毒性リスクの薬剤を使用し、中等量でｉｎ−ｖｉｖｏにおいて得られ、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の効果的な治療を可能とする、Ａβペプチド結合戦略に対する強い治療反応の最初の例である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】二重官能化リポソームを用いたＡＰＰ−ｓｗｅトランスジェニックマウスの治療を示す図である。ｍＡｐｏ＝ホスファチジン酸を含まない改変ＡｐｏＥペプチドで官能化されたリポソームで治療されたマウス、ＰＡ−ｍＡｐｏ＝ホスファチジン酸及び改変ＡｐｏＥペプチドで官能化されたリポソームで治療されたマウス。
【図２】改変ＡｐｏＥペプチド（ｍＡｐｏ）又は改変ＡｐｏＥペプチド＋ホスファチジン酸（ＰＡ−ｍＡｐｏ）で官能化されたリポソームで治療されたＡＰＰ−ｓｗｅトランスジェニックマウスの脳ホモジネート中のＡβ４０又はＡβ４２の含有量を示す図である。
【図３】ＰＡ−ｍＡｐｏリポソームが、Ａβ４２凝集を阻害することを示す図（Ａ）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで予め形成された凝集体の脱凝集を刺激することを示す図（Ｂ）である。
【図４Ａ】ＰＡ−Ｍａｐｏリポソームの全身投与が、ＡＤ二重ＴＧマウスにおけるＡβ４２脳レベルを減少することを示す図である。
【図４Ｂ】リン酸緩衝生理食塩水又はＰＡリポソームで治療されたＴＧマウスと比較して、ＰＡ＿Ｍａｐｏリポソームの全身投与により、二重ＴＧマウスの脳Ａβ斑の有意な減少がもたらされることを示す図である。
【図４Ｃ】ＰＡ−ｍＡｐｏリポソームは、物体認識試験により評価されるＡＤ二重ＴＧマウスにおける認知障害を回復することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用される「ホスファチジン酸」の用語は、２つの脂肪酸及び１つのリン酸基でエステル化されたグリセロール骨格を有する分子、例えば、ジミリストイルホスファチジン酸を意味する。カルジオリピンはよく知られた化合物であり、１，３−ビス（ｓｎ−３’−ホスファチジル）−ｓｎ−グリセロールとしても知られている。リポソームでは、ホスファチジン酸（又はカルジオリピン）は、（リポソームを構成する全ての物質の総モルの）好ましくは１％〜２０％、より好ましくは１％〜１０％、最も好ましくは５％のモル量で存在する。ホスファチジン酸又はカルジオリピンが両方存在する場合、上記範囲は、両方の物質のモルの合計を指し、両方が存在する場合、ホスファチジン酸及びカルジオリピンは任意の相互の比で使用され得る。
【００１４】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、２９９個のアミノ酸を含有する３４ｋＤａの糖タンパク質であり、肝臓及び脳において高レベルで産生される。ＡｐｏＥは、その天然供給源から得られるものとして使用され得るか、又は意図的に合成され得る。「ＡｐｏＥ誘導体」の用語は、Ｅ２、Ｅ３とコードされる既知のＡｐｏＥアイソフォームを包含する。また、用語「ＡｐｏＥ誘導体」は、ＡｐｏＥのフラグメント、好ましくはアミノ酸配列１００〜２００、より好ましくは１２０〜１７０に属するフラグメントを包含し、好ましいフラグメントは、ＡｐｏＥのアミノ酸１４１〜１５０で構成されるもの（配列：（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−ＮＨ２）又はその二量体（配列：（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−ＮＨ２）である。ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、脂質への化学結合を補助するシステイン末端の小ペプチド配列（最大５アミノ酸）、例えば、トリペプチドＣＷＧ−の末端を包含することが好ましい。得られるフラグメントの好ましい例は、本明細書では「ｍＡｐｏＥ」であるＣＷＧ−（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−ＮＨ２、又は本明細書では「ｄＡｐｏＥ」であるＣＷＧ−（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ）−ＮＨ２である。
【００１５】
上記ＡｐｏＥ又はその誘導体は、例えば、リポソーム膜の他の脂質構成成分との物理的な混合物としてリポソーム中に存在してもよく、又はかかる膜上に付着されてもよく、又はこれらの脂質に化学結合されてもよく、又はリポソーム内に含有されてもよく、又は既存のリポソームに追加されてもよい。上記ＡｐｏＥ又はその誘導体は化学結合されることが好ましい。この場合、上述のＡｐｏＥはリンカー分子を介して連結又は接続されてもよく、好ましいリンカーは、化合物１，２ステロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリ（エチレングリコール）−２０００）］（本明細書では「ｍａｌ−ＰＥＧ−ＰＥ」と略記する）である。最終リポソームでは、ＡｐｏＥは（リポソームを構成する全ての物質の総モルの）１％〜５％のモル量で存在することが好ましい。
【００１６】
最終リポソームは、標準的なリポソーム脂質を更に含む。これらは、リポソームの大半を構成し、（リポソームを構成する全ての物質の総モルの）９０％〜９８％のモル量を占めることが好ましい。好ましい標準的リポソーム脂質は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ化又は非ＰＥＧ化）及びコレステロールである。
【００１７】
上述のリポソームは、本明細書で実証されるように、それ自体でｉｎ−ｖｉｖｏでアミロイド斑に対して十分に効果的であり、選択肢として、上述のリポソームは、意図される治療に有用でもある更なる活性剤を追加的に包含してもよく、かかる場合、本発明のリポソームは薬物と薬物担体との二重機能を果たす。
【００１８】
本発明の更なる目的は、上述のリポソームを調製するプロセスである。リポソーム調製プロセスは、上述の成分（ｉ）、（ｉｉ）の使用を特徴とするリポソームを調製する任意の既知の方法であり得る。既知の方法の例は、押し出し、脂質水和、溶剤小球体法、超音波処理、フレンチプレスセル、溶媒注入、界面活性剤除去（detergent removal）、逆相蒸発、カルシウム誘導融合、微小流動化、凍結融解、凍結乾燥等である。上記プロセスは、リポソームの大半を構成する、上述の標準的なリポソーム脂質の添加を更に含む。
【００１９】
本発明に特有であるＡｐｏＥ添加工程は、ＡｐｏＥとの望ましい接続様式の機能において行われる。例えば、ＡｐｏＥが他の脂質との物理的混合物として添加される場合、好適な手法は、
（ａ）溶媒中での成分（ｉ）及び標準的なリポソーム脂質の混合、
（ｂ）工程（ａ）の混合物の乾燥、
（ｃ）緩衝溶液中での工程（ｂ）の混合物の再水和、
（ｄ）工程（ｃ）の溶液の撹拌、及び好適な細孔径、例えば１００ｎｍのフィルタを通すその後の押し出し、
（ｅ）成分（ｉｉ）の添加、
を含んでもよい。
【００２０】
ＡｐｏＥがリンカー分子を介して添加される場合、好適な手法は、
（ａ）溶媒中での成分（ｉ）、リンカー分子及び標準的なリポソーム脂質の混合、
（ｂ）工程（ａ）の混合物の乾燥、
（ｃ）緩衝溶液中での工程（ｂ）の混合物の再水和、
（ｄ）工程（ｃ）の溶媒の撹拌、及び好適な細孔径、例えば１００ｎｍを有するフィルタを通すその後の押し出し、
（ｅ）工程（ｄ）の押し出し溶液の精製、
（ｆ）緩衝溶液中での工程（ｅ）の精製溶液の再懸濁、及び成分（ｉｉ）との混合、
（ｇ）工程（ｆ）の溶液の精製、及び最終乾燥、
を含んでもよい。
【００２１】
本発明の更なる目的は、１又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、及び任意に、更なる活性剤と共に上述のリポソームを含む医薬組成物である。賦形剤の種類及び量は、選択される医薬形態の機能に応じて選択され、好適な医薬形態は、例えば、溶液、点滴液、懸濁液のような液体系；コロイド、ゲル、ペースト又はクリームのような半固形系；粉末、顆粒、錠剤、カプセル、ペレット、微顆粒、ミニタブレット（minitablet）、マイクロカプセル、マイクロペレット、坐剤等の固形系である。上記各系は、当該技術分野でよく知られている技法を使用して、通常放出用、遅延放出用又は加速放出用に好適に製剤化され得る。
【００２２】
本発明の更なる目的は、中枢神経の神経変性疾患、特にアルツハイマー病及び他の形態の認知症を治療又は予防する方法における上述のリポソーム又は医薬組成物の使用である。本発明は、さらに、治療法における使用のための上記リポソーム又は医薬組成物に及ぶ。
【００２３】
本発明は、中枢神経の神経変性疾患、特にアルツハイマー病及び他の形態の認知症の治療又は予防に使用する上記リポソーム又は医薬組成物を更に含む。
【００２４】
また、本発明は、中枢神経の神経変性疾患、特にアルツハイマー病及び他の形態の認知症の治療用又は予防用の医薬の製造における上記リポソーム又は医薬組成物の使用を含む。本出願の実験欄では、出願人により得られたアルツハイマー病の動物モデルに関する組織学的知見及び行動の知見により本治療の有効性が確認されている。
【００２５】
リポソームは、中枢神経系においてｉｎ−ｖｉｖｏでアミロイド斑を阻害（すなわち、予防、減少又は排除、排除が好ましい）するのに特に活性である。この活性は、上記疾患に罹患した、又は上記疾患を発症するリスクがある患者に有用であり、追加的な利点として、上記アミロイド斑の阻害が細胞外レベルと細胞内レベルとの両方でＣＮＳにおいて行われ、それにより中枢神経に存在する全てのＡβ堆積に対して活性を拡大し、これはアミロイド斑の総合的な排除を達成する必須の要件である。
【００２６】
そのため、本発明は、上述のリポソーム又は医薬組成物の投与を特徴とする、上記疾患に罹患した、又は上記疾患を発症するリスクがある患者の中枢神経系におけるアミロイド斑のｉｎ−ｖｉｖｏでの阻害を目的とする治療的方法及び医学的使用を包含する。
【００２７】
本発明は、ホスファチジン酸及び／又はカルジオリピンを含有するリポソームにＡｐｏＥ又はその誘導体を包含させることを特徴とし、これらの成分がＡβペプチドのフィブリル及びプラークへの凝集の阻害において相乗的に協働し、既に存在する凝集体の脱凝集を刺激するという予想外の知見を利用する、Ａβ堆積の減少の増強を提供するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を更に包含する。
【００２８】
上記治療は、上記リポソーム／医薬組成物を、それを必要とする患者に好適な用量単位で任意の好適な投与経路を介して輸送することにより行われ得る。
【００２９】
好適な用量単位は、平均７０ｋｇの患者に対して１ミリモル〜１５ミリモルの総脂質に含まれる。医薬の全身分布を可能とする全ての投与経路（経腸、非経口）が考えられる。可能な投与経路の例は、経口、静脈内、筋肉内、吸入、気管内、腹腔内、口腔、舌下、鼻腔、皮下、経皮、経粘膜である。本発明では、中枢神経系への（すなわち、血液脳関門を越えた領域への）直接的な投与経路は、本発明のリポソームが単純な全身的投与を介してＣＮＳにおいて有利に活性であることから、必ずしも必要ではない。治療的な視点からは、本発明のリポソームによる治療が、中等量で、副作用から免れた低毒性の活性剤を用いて、全身投与を介してアミロイド斑の強力なｉｎ−ｖｉｖｏ減少を得ることが何よりも重要である。長く求められていたｉｎ−ｖｉｖｏで有効な治療は、そのようにして提供され、容易に行われ、安価な調製プロセスを含み、アミロイド斑の形成による疾患、特に、中枢神経系における神経変性、より具体的にはアルツハイマー病及び関連する認知症の治療及び予防に有用である。ここで、以下の非限定的な実施例を用いて、本発明を更に開示する。
【実施例】
【００３０】
実験部分
１．リポソームの調製
リポソーム組成物：
５モル％ホスファチジン酸
ＡｐｏＥへの化学結合を補助する２．５モル％ＰＥＧ−ＰＥ−マレイミド（ｍａｌ−ＰＥＧ−ＰＥ）：
４６．２５モル％コレステロール
４６．２５モル％スフィンゴミエリン
【００３１】
リポソームを押し出し技法により調製した。後の穏やかな窒素流と、続く少なくとも３時間に亘る真空ポンプとにより除去される、有機溶媒（クロロホルム／メタノール２：１（ｖ：ｖ））中で脂質を混合した。そのようにして得られた脂質フィルムを生理学的緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４０））に再懸濁し、押し出し機（Lipex Biomembranes）を使用して、１００ｎｍの細孔径を有するポリカーボネートフィルタを通して、温度５５℃で圧力をかけて（２０ｂａｒ）１０回押し出した。
【００３２】
モル比１．２：１（ペプチド：ｍａｌ−ＰＥＧ−ＰＥ）でｍＡｐｏＥペプチドをリポソームに添加し、この混合物を室温にて終夜インキュベートした。次の日、健康なマウス又は（アミロイド斑に関する試験のため）アルツハイマー病に関するトランスジェニックマウスに混合物を気管内（ｉ．ｔ．）注射するか（図１又は図２）、又は腹腔内注射した（図４）。
【００３３】
２．動物モデル
Ｂａｌｂ／Ｃ健常マウス
突然変異体ＡＰＰ−ｓｗｅのトランスジェニックＣ５６マウス
ＡＰＰ−ＳＰ１二重突然変異のトランスジェニックＣ５６マウス
【００３４】
３．薬物動態試験
健常マウス群は、この治療スケジュール（１００μＬのアリコート（総脂質４０ｍＭ）のリポソームを５日間に亘り２日毎に１回注射する）に従ってホスファチジン酸及びｍＡｐｏＥを含有し、放射性（３Ｈ−ＳＭ）スフィンゴミエリン及び（１４Ｃ−ＰＡ）ホスファチジン酸を含むリポソームの気管内投与を受けた。投与後、様々な時間に動物を屠殺した。臓器を取り出し、液体シンチレーションによる放射能測定のため加工した。
【００３５】
以下に報告される結果は、投与された総用量の％として報告される、脳内の放射能の計測結果を表す。３回目の投与後の脳内の放射能は、脳に到達する実質的に非常に低い量に相当する、投与量の０．７％の存在を示した。
【００３６】
４．ｉｎ−ｖｉｖｏでのアミロイド斑に対する試験
ＡＰＰ−ｓｗｅマウス（アルツハイマー病について遺伝的に改変された）の第１群にホスファチジン酸及びｍＡｐｏＥを含有するリポソームを投与し（「ＰＡ−Ｍａｐｏ」群、ｎ＝６）、ＡＰＰ−ｓｗｅマウスの第２群にはホスファチジン酸を含まない同じリポソームを投与した（「Ｍａｐｏ」群、ｎ＝６）。いずれの場合も、治療は、１回の注射につき４０ｍＭのリポソーム懸濁液１００μＬの３週間に亘る１週間当たり３回の気管内注射で構成された。最後に、マウスを屠殺し、脳を切除した。後の組織学的検査のため凍結切片を調製し、ＥＬＩＳＡのためホモジネートを調製した。抗Ａβ抗体と、その後の二次抗体ＨＲＰ／色素原による染色とを使用して、脳の凍結切片に対して組織学的解析を行った。染色（褐色）はＡβ堆積に対応する。
【００３７】
組織学的検査の結果
図１（「ＰＡ−Ｍａｐｏ」群の治療前及び治療後の画像）からわかるように、本発明のリポソームによる治療は、Ａβの堆積を除去し、除去は細胞外レベルと細胞内レベルとの両方で有効であることが見出された。特に、堆積の全面的な排除が、治療した動物６匹のうち４匹で観察された。それとは逆に、「Ｍａｐｏ」群では、Ａβ堆積の除去は観察されなかった。
【００３８】
これにより、本発明による方法の有効性が確認された。特に、ｍＡｐｏＥ＋ＰＡの組合せ（association）はＡβペプチド堆積の生体での減少／排除を得ることを可能とすると推定され得る。
【００３９】
ＥＬＩＳＡの結果
ギ酸を用いた脳組織からの抽出の後、ベータアミロイド（１〜４０及び１〜４２）の総含有量をＥＬＩＳＡアッセイにより定量した。図２からわかるように、ｍＡｐｏ群と比べてＰＡ−Ｍａｐｏ群において２つの形態のＡβの総含有量の顕著な減少が見られる。
【００４０】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアミロイド斑阻害に対する追加試験
ペプチドのみの溶液との比較において、異なる量のリポソームの存在下で経時的にペプチド凝集をモニタリングすることによるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイにより、Ａβ４２凝集に対するリポソームの効果を評価した。異なる濃度の異なるリポソームの存在下で、異なる時間（１２０時間まで）に亘って、単量体Ａβ４２（２５μＭ）で富化した試料をインキュベートした。異なる時間間隔の後、ＴｈＴの添加後、蛍光発光を計測することによりアリコートを解析した。蛍光発光強度の増加は、Ａβ４２凝集の増加を示す。
【００４１】
結果（図３Ａ）は、ＰＡ−Ｍａｐｏリポソームの存在が、Ａβ凝集プロセスの阻害において、ＰＡリポソームよりも更に強力であることを示した。この試験では、ｍＡｐｏＥは、Ａβ斑形成プロセスの阻害において、ホスファチジン酸と相乗的に協働した。
【００４２】
また、予め形成されたＡβ凝集体（２５μＭ）に対する脱凝集に対するリポソームの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｈＴアッセイにより調査した。１０ｍＭのＨＣｌ中３７℃で２時間に亘るＡβ単量体のインキュベーションによりＡβ４２フィブリルを調製した後、異なる用量のＰＡ−Ｍａｐｏリポソームと共にインキュベートした。結果（図３Ｂ）は、上記混合物中のＰＡ−Ｍａｐｏリポソームの存在が、Ａβフィブリルの初期蛍光発光の用量依存的かつ時間依存的な減少をもたらし、脱凝集特性を示すことを示した。これとは逆に、ＰＡリポソームは、Ａβフィブリルに対して何らの有意な効果も示さなかった。
【００４３】
６．ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミロイド斑阻害に対する追加試験
ＰＡ−ＭＡｐｏリポソーム（総脂質濃度４０ｍＭ、１００μＬ容量の注射）を、腹腔内注射によりＡＤの動物モデル（ＡＰＰ／ＰＳ１  ２Ｔｇマウス）に投与した。３週間に亘り１週間当たり３回の注射でマウスを慢性的に治療した。その後、マウスを屠殺し、血漿、脳、肝臓及び脾臓を解剖し、組織ホモジナイズ及びＡβペプチド抽出の後ＥＬＩＳＡアッセイによりＡβ４０及びＡβ４２の含有量を解析した。さらに、免疫組織化学法によりＡβ含有量についても脳を解析した。
【００４４】
結果（図４Ａ）は、ＰＡ＿Ｍａｐｏリポソームによる治療が、対照マウス（リン酸緩衝生理食塩水で治療されたＴＧマウス）におけるペプチド量と比べて、総Ａβ脳含有量の平均４０％の減少をもたらしたことを示した。この減少は、ペプチドフラグメントＡβ４０及びＡβ４２の両方、また可溶性及び不溶性Ａβ凝集体の両方について計測された。
【００４５】
脳切片の免疫組織化学解析（図４Ｂ）は、ＰＡ＿Ｍａｐｏリポソームによる治療が、リン酸緩衝生理食塩水で治療されたＴＧマウスと比べて、ＴＧマウスの脳Ａβ斑の約３５％の減少をもたらしたことを示す。ＰＡリポソーム又はＭａｐｏリポソームを用いて行われた同様の実験は、脳Ａβの凝集に対して何らの効果も示さなかった。これにより、Ａβペプチド凝集の阻害においてＡｐｏＥによる官能化の根本的な寄与が確認される。
【００４６】
７．アルツハイマー病動物モデルに対する行動効果
実施例６に上述される実験を受けるのと同じマウスを、リポソームによる治療の終わりで屠殺の前に行動試験（物体認識試験）に供し、リポソームの潜在毒性（同じ齢の健康なマウスに対して行われる実験）及びＴＧマウスにおける記憶障害の回復可能性）のいずれかを評価した。
【００４７】
３日間に亘って１日当たり１０分間、マウスを２つの同一の物体に暴露した。訓練段階の後、２つの物体のうちの１つを異なる色及び形の新たな物体に変更した。各物体を探索するのに費やした時間を定量し、１０分間の中の調査％で表す。
【００４８】
図４Ｃに示される結果は以下の通りである。
健康なマウス（ＷＴ）：健康なマウスは、古い物体を記憶するため、新しい物体を探索するのにより多くの時間を費やした。
ＡＤマウス：ＴＧマウスは、古い物体を記憶しないことから、２つの物体でほぼ同じ時間を費やした。
ＰＡ−Ｍａｐｏで治療されたＡＤマウス。行動試験はＰＡ−ＭａｐｏリポソームによるＴＧ  Ｄマウスの治療が記憶障害を回復し、健康なマウスの学習及び記憶に何らの変化ももたらさなかったことを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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