(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性ナノ粒子の自己組織化メソポーラス凝集体が組み込まれている連続マクロポーラススカフォールドを含む、階層的触媒組成物であって、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に第１の酵素が磁気的に埋め込まれており、
そして、前記連続マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記組成物。
【請求項２】
前記酵素が、拡散性基質を拡散性生成物に変換することによって機能する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素が、フリーラジカル生成酵素から構成される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素が、オキシドレダクターゼから構成される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記オキシドレダクターゼが、ペルオキシダーゼから構成される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、万能ペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、およびラクトペルオキシダーゼから選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第２の酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の酵素がペルオキシダーゼであり、そして前記第２の酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の酵素がペルオキシダーゼであり、そして前記第２の酵素がラッカーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記連続マクロポーラススカフォールドに埋め込まれた、磁性ナノ粒子の前記メソポーラス凝集体に属していない磁気粒子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記連続マクロポーラススカフォールドがポリマー組成物を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記連続マクロポーラススカフォールドが、５０ｎｍと２００ｎｍの間の孔径を有するマクロ細孔を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
連続マクロポーラススカフォールドに組み込まれた磁性ナノ粒子−酵素メソポーラス凝集体を含有する階層的触媒アセンブリを生成するための方法であって、前記方法が、磁性ナノ粒子−酵素メソポーラス凝集体と連続マクロポーラススカフォールドとを溶液中で接触させて、前記磁性ナノ粒子−酵素メソポーラス凝集体を前記連続マクロポーラススカフォールドのマクロ細孔内に実質的に埋め込む工程を含み、ここで磁性ナノ粒子−酵素メソポーラス凝集体の前記メソ細孔に酵素が磁気的に補足されており、
そして、前記連続マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項１４】
前記連続マクロポーラススカフォールドが、（ｉ）内部に犠牲鋳型形成剤が埋め込まれているスカフォールド前駆体材料を含む複合体を生成する工程と、（ｉｉ）前記犠牲鋳型形成剤を選択的に除去して、前記スカフォールド前駆体材料中にマクロ細孔を生成する工程とを含む鋳型形成プロセスによって生成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
芳香族物質を水から除去するための方法であって、前記方法が、芳香族物質で汚染された水と、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含む階層的触媒組成物とを接触させる工程、ここでフリーラジカル生成酵素は磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されている、および、前記芳香族汚染物質を前記水から除去する工程を含み、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項１６】
前記芳香族物質が、置換フェノール、ポリフェノール、芳香族アミン、生物活性芳香族、およびこれらの混合物から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
フリーラジカル反応により重合可能なモノマーを重合するための方法であって、前記方法が、前記モノマーと、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含む階層的触媒組成物とを反応させて、前記モノマーから誘導されたポリマーを生成する工程を含み、ここでフリーラジカル生成酵素が磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されており、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項１８】
アルケンのエポキシ化反応のための方法であって、前記方法が、酸素の存在下でアルケンと、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含む階層的触媒組成物とを反応させて、アルケンオキシドを生成する工程を含み、ここで酸素移送酵素が磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されており、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項１９】
前記酸素移送酵素がクロロペルオキシダーゼまたはリパーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
フェノールのハロゲン化反応のための方法であって、前記方法が、フェノールと、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含む階層的触媒組成物とを反応させて、ハロゲン化フェノールを生成する工程を含み、ここでハロゲン化酵素が磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されており、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項２１】
前記ハロゲン化酵素がクロロペルオキシダーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
溶液中の微生物の成長および機能を阻害するための方法であって、前記方法が、前記溶液を、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含む階層的触媒組成物で処理する工程を含み、ここでフリーラジカル生成酵素が磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されており、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【請求項２３】
前記フリーラジカル生成酵素がラクトペルオキシダーゼを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ラクトペルオキシダーゼがグルコースオキシダーゼと組み合わされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
二酸化炭素をメタノールに変換するための方法であって、前記方法は、二酸化炭素と、磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体が組み込まれているマクロポーラススカフォールドを含みさらに磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体のメソ細孔に磁気的に補足されたギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含む複数の酵素を含む階層的触媒組成物とを、反応させる工程を含み、ここで前記デヒドロゲナーゼが二酸化炭素からメタノールを生成し、
そして、前記マクロポーラススカフォールドが５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔を有し、前記メソ細孔は少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍのサイズを有する、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその両方の全体を本明細書に組み入れる、２０１２年１０月５日に出願した米国仮出願第６１／７１０，１１０号および２０１３年２月２１に出願した米国仮出願第６１／７６７，４７７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明は、ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｓｕｎ  Ｇｒａｎｔ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ  ＃ＤＴＯＳ５９−０７−Ｇ−０００５２に対する契約の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明において、ある権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシダーゼ（ＥＣ  １．１１．１）は、生物系において広く見出され、フェノールから芳香族アミンにまで及ぶ広く様々な芳香族化合物を酸化するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水に還元するオキシドレダクターゼの部分集合を形成する。ペルオキシダーゼの反応サイクルは非常に複雑であり、Ｈ２Ｏ２によるヘムの活性化から開始して、２電子活性化化合物Ｉを形成する（非特許文献１）。次いで化合物Ｉを、有機基質の酸化により１個の電子で還元し、その結果、静止状態よりも１電子高い化合物ＩＩが形成される。第２の還元は、酵素をその静止状態に回復させて、新しいサイクルを開始する。全体として、消費される過酸化水素の分子ごとに、２個の芳香族フリーラジカルが生成され、２次反応で容易に反応することができる。
【０００４】
ペルオキシダーゼは、ほとんどがＨ２Ｏ２による基質阻害に対して非常に感受性があり、その結果酵素の可逆的不活性化形態（化合物ＩＩＩ）を形成することがある。これらの活性は、生成物阻害によっても阻止される。したがって、ペルオキシダーゼ酵素に関連した複雑な動態は、多くのプロセスおよびバイオプロセスにおける酵素の使用を制限する可能性がある。この酵素およびその他の酵素ファミリーの活性と、種々のプロセス条件に対する耐性とを増大させることにより、酵素の現行の使用を改善し、ならびに新しい用途での酵素の使用に道を開くことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｃ．Ｖｅｉｔｃｈ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、６５、２４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書では、酵素、特にフリーラジカル生成（ＦＲＰ：ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）であって、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）と共に自己組織化されたものからなるバイオナノ触媒（ＢＮＣ：ｂｉｏｎａｎｏｃａｔａｌｙｓｔ）が、高い酵素活性を保有することを発見した。詳細には、本明細書では、酵素と磁性ナノ粒子との自己組織化クラスターが、遊離酵素または酵素を持たない磁性ナノ粒子クラスターに比べ、酵素のより速い代謝回転およびより低い阻害を一般に保有することが見出された。さらに本明細書では、ＭＮＰのサイズおよび磁化がＢＮＣの形成および最終的には構造に影響を及ぼし、その全ては捕捉された酵素の活性に著しい影響を及ぼすことが見出された。特に、それらの様々な反応条件下での意外な回復力により、本明細書に記述されるＢＮＣは、改善された酵素または触媒剤として、その他のそのような薬剤が現在使用されている場所で使用することができ、さらに、酵素が未だ適用可能であると見なされておらずまたは見出されていない他の用途で使用することができる。
【０００７】
本明細書に記述される手法は、酵素活性および反応効率をしばしば犠牲にする複雑な生化学による表面改質粒子でのタンパク質共役に依拠した古典的な方法とは、鮮明に異なる。本発明の方法によれば、酵素動態は、例えば１次ＭＮＰ微結晶およびペルオキシダーゼ酵素の自己組織化クラスター（凝集）として酵素がＭＮＰに緊密に会合している場合のみ、実質的に修正される。得られるＢＮＣの全体的な活性は、生物学的に関連ある基質濃度の遊離酵素またはＭＮＰの場合よりも、何桁か高くできることが有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、酵素が磁性ナノ粒子またはそのクラスターに埋め込まれた（即ち、捕捉された）組成物を対象とする。特定の実施形態では、組成物は、磁性ナノ粒子と、ＦＲＰ酵素などの酵素の１種または組合せとの、メソポーラス・クラスター化アセンブリである。メソポーラス・クラスター化アセンブリは、酵素が埋め込まれるメソ細孔を保有する。その他の実施形態では、前述のクラスター組成物は、金などの貴金属で表面被覆された磁性ナノ粒子を含む。
【０００９】
他の実施形態では、磁性ナノ粒子（ＢＮＣ）の前述のメソポーラス凝集体が、マクロポーラススカフォールドに組み込まれて、第１および第２のレベルのアセンブリを有する階層的触媒アセンブリを形成する。マクロポーラススカフォールドは、ミクロン・サイズの磁気粒子の集合体で構成されていてもよく、または粒子から構成されていない連続スカフォールドであってもよく、またはそれらの組合せであってもよい。結果は、高度にマクロポーラスおよびメソポーラスな磁気固形分と、酵素の官能化、即ち任意の酵素と拡散性の小さい基質および生成物との固定化に有益な酵素の官能化との組合せである。全体的な階層的触媒アセンブリは、少なくともＢＮＣの存在によって磁性である。
【００１０】
連続マクロポーラススカフォールドの場合、実施形態の第１の組では、ＢＮＣが組み込まれる連続マクロポーラススカフォールドが磁性である。連続マクロポーラススカフォールドは、磁気ポリマー組成物で構成することによってかつ／またはＢＮＣに属さない磁気粒子（例えば、酵素に会合していない磁気ナノまたはミクロ粒子）を内部に埋め込むことによって、磁性にすることができる。実施形態の第２の組では、ＢＮＣが組み込まれている連続スカフォールドが磁性であり；それにも関わらず、非磁気スカフォールドを含有する全体的な階層的触媒アセンブリは、少なくとも、内部に組み込まれているＢＮＣの存在によって、磁性であり続ける。
【００１１】
本発明は、上述の酵素埋込み磁性ナノ粒子組成物を生成するための方法も対象とする。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子またはその凝集体が最初に製造され、その後、その内部に酵素が吸収される。その他の実施形態では、酵素埋込み磁性ナノ粒子組成物は、酵素の存在下、単分散性磁性ナノ粒子を組み立て、それによって酵素を自己組織化メカニズムによりＭＮＰのクラスターに埋め込むことによって、生成される。
【００１２】
本発明は、上述の階層的触媒アセンブリを生成するための方法であって、磁性ナノ粒子（ＢＮＣ）のメソポーラス凝集体が連続または粒状マクロポーラススカフォールドに組み込まれる方法も対象とする。この方法では、ＢＮＣが溶液状態でマクロポーラススカフォールドに接触して、実質的にＢＮＣをマクロポーラススカフォールドのマクロ細孔に埋め込む。連続マクロポーラススカフォールドの特定の場合、連続マクロポーラススカフォールドは：（ｉ）犠牲鋳型形成剤が内部に埋め込まれたスカフォールド前駆体材料を含有する複合体を生成する工程と、（ｉｉ）犠牲鋳型形成剤を選択的に除去して、連続前駆体材料中にマクロ細孔を生成する工程とを含む、鋳型形成プロセスによって生成することができる。より具体的な実施形態では、鋳型形成プロセスは、スカフォールド前駆体材料に埋め込まれた溶媒が鋳型形成剤として機能する、溶媒鋳型形成プロセスを含む。溶媒が埋め込まれたスカフォールド前駆体材料を含有する複合体を、埋め込まれた溶媒が凍結して溶媒結晶を形成するまで冷却し、次いで凍結溶媒を、蒸発または昇華のいずれかによって除去して、スカフォールド前駆体材料にマクロ細孔を生成する。溶媒が水の場合、溶媒鋳型形成プロセスは、氷鋳型形成プロセスと見なすことができる。
【００１３】
さらにその他の態様では、本発明は、上述の酵素埋込み磁性ナノ粒子組成物が使用される方法を対象とする。特定の実施形態では、酵素埋込み磁性ナノ粒子組成物は、リグニンを解重合するためのプロセス、芳香族汚染物質を水から除去するためのプロセス、フリーラジカル・メカニズムによりモノマーを重合することによってポリマーを生成するためのプロセス、アルケンをエポキシ化するための方法、フェノールをハロゲン化するための方法、溶液中で微生物の成長および機能を阻害するための方法、および二酸化炭素をメタノールに変換するための方法を対象とする。
【００１４】
さらにその他の態様では、本発明は、ＢＮＣまたはその階層的触媒アセンブリのいずれかなどの磁気粒子を含む液相化学反応の空時収量および／又は総代謝回転数を増加させて、化学反応を容易にするための方法を対象とする。この方法では、内部に磁気粒子を含有する液相化学反応は、磁気粒子を空間的に閉じ込めるよう選択された磁気強度、液相化学反応中の相対位置、および相対運動を有する複数の磁場に供され、この複数の磁場の磁気強度、相対位置、および相対運動は、電流の流れが適切に制御されまたは調節された電磁石のシステムによって提供される。
【００１５】
マクロポーラス枠に組み込まれたＢＮＣを含有する全階層的アセンブリの、より大きいサイズおよび質量の磁化により、酵素含有ＢＮＣは、外部磁場によってより容易に獲得することができ、したがって、反応媒体からより容易に除去することができる。単純化された除去は、さらに、触媒により容易な再使用を可能にする。本明細書に記述される階層的組立て触媒の別の利益は、より大きいサイズであることにより酵素活性の保存を助けることである。さらに、磁気ミクロ粒子の表面に取着されるＢＮＣは、ＢＮＣを除去しまたは反応を高めるのに使用され得る磁場に供された場合、過剰に凝集しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】磁性ナノ粒子および西洋ワサビペルオキシダーゼのメソポーラス凝集体から構成されたＢＮＣを含有する階層的触媒アセンブリの、アセンブリの第１のレベルの形成（図１Ａ）を示す図である。
【図１Ｂ】氷鋳型形成セルロースから構成されたマクロポーラススカフォールドにＢＮＣを組み込むことによる、アセンブリの第２のレベルの形成（図１Ｂ）を示す図である。
【図２Ａ】水の改質および／または芳香族化合物のフリーラジカル重合に特に適用されるような、一重螺旋（図２Ａ）磁気トラップ配置を示す図である。
【図２Ｂ】水の改質および／または芳香族化合物のフリーラジカル重合に特に適用されるような、二重螺旋（図２Ｂ）磁気トラップ配置を示す図である。
【図３】６個の電磁石、または３個の電磁石が２列に並んだものを、独立して制御する際に有用な、コンピュータ・プログラマブル・コントローラの配置構成に関する電子回路図である。
【図４】図３で提供される電子配置構成の制御入力（「ＣｔｒＩｎｐ（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｐｕｔ）」）コンポーネントで使用される、例示的なマイクロコントローラの図である。
【図５】マロン酸緩衝液（５０ｍＭ）中ｐＨ３．５で、２．５ｎＭのマンガンペルオキシダーゼ、種々の濃度のＡｕ−Ｍ６０、およびそれらのＢＮＣによって触媒される、ＤＭＰ酸化速度に対するＨ２Ｏ２の効果を示すグラフである。ｘ軸は、便宜上、ｌｏｇ１０スケール上にある。ＢＮＣ（金被覆ナノ粒子）は、マンガンペルオキシダーゼの活性を増大させ、阻害を低下させる。
【図６】マロン酸緩衝液（５０ｍＭ）中ｐＨ３．５で、２．５ｎＭの万能ペルオキシダーゼ、種々の濃度のＡｕ−Ｍ６０、およびそれらのＢＮＣによって触媒される、ＤＭＰ酸化速度に対するＨ２Ｏ２の効果を示すグラフである。ｘ軸は、便宜上、ｌｏｇ１０スケール上にある。ＢＮＣ（金被覆ナノ粒子）は、万能ペルオキシダーゼの活性を増大させ、阻害を低下させる。
【図７Ａ】バイオマス原料（混合草）のリグニン解重合のための、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの使用を示すスペクトルである。図７Ａは、水溶性リグニンモノマーおよびオリゴマーに特徴的な、希釈補正スペクトルを示す。ＢＮＣは、２５ｍＭのＭｎＰおよびＶｅＰ（合計酵素５０ｍＭ）と、Ａｕ−ＭＮＰ  ４００μｇ．ｍｌ−１で形成した。反応は、０．２ｍＭのＨ２Ｏ２で開始し、２４時間インキュベートした。ＢＮＣは、バイオマスからの芳香族の放出を増大させる。
【図７Ｂ】バイオマス原料（混合草）のリグニン解重合のための、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの使用を示すスペクトルである。図７Ｂは、バイオマス制御補正スペクトルを示す。ＢＮＣは、２５ｍＭのＭｎＰおよびＶｅＰ（合計酵素５０ｍＭ）と、Ａｕ−ＭＮＰ  ４００μｇ．ｍｌ−１で形成した。反応は、０．２ｍＭのＨ２Ｏ２で開始し、２４時間インキュベートした。ＢＮＣは、バイオマスからの芳香族の放出を増大させる。
【図８Ａ】バイオマス原料（混合草）のリグニン解重合のための、クルコースオキシダーゼの存在下でのマンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの使用を示すスペクトルである。グルコースオキシダーゼは、グルコースの存在下で過酸化水素を生成する。種々のペルオキシダーゼとオキシダーゼとのモル比に関し、１２時間でのバイオマス加水分解物のスペクトルを補正した。ＢＮＣは、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼで、それぞれ２５ｎＭで−１５μｇ．ｍｌ−１  Ａｕ−ＭＮＰで形成した。図８Ａ：グルコースオキシダーゼは６．１２５ｎＭ（４Ａ：比４）であった。ＢＮＣは、ｉｎ  ｓｉｔｕ水素生成システムに順応して、バイオマスからの芳香族の放出を増大させ、酸化剤としてグルコースを使用することができる。
【図８Ｂ】バイオマス原料（混合草）のリグニン解重合のための、クルコースオキシダーゼの存在下でのマンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの使用を示すスペクトルである。グルコースオキシダーゼは、グルコースの存在下で過酸化水素を生成する。種々のペルオキシダーゼとオキシダーゼとのモル比に関し、１２時間でのバイオマス加水分解物のスペクトルを補正した。ＢＮＣは、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼで、それぞれ２５ｎＭで−１５μｇ．ｍｌ−１  Ａｕ−ＭＮＰで形成した。図８Ｂ：１２．５ｎＭ（４Ｂ：比２）であった。ＢＮＣは、ｉｎ  ｓｉｔｕ水素生成システムに順応して、バイオマスからの芳香族の放出を増大させ、酸化剤としてグルコースを使用することができる。
【図８Ｃ】バイオマス原料（混合草）のリグニン解重合のための、クルコースオキシダーゼの存在下でのマンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの使用を示すスペクトルである。グルコースオキシダーゼは、グルコースの存在下で過酸化水素を生成する。種々のペルオキシダーゼとオキシダーゼとのモル比に関し、１２時間でのバイオマス加水分解物のスペクトルを補正した。ＢＮＣは、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼで、それぞれ２５ｎＭで−１５μｇ．ｍｌ−１  Ａｕ−ＭＮＰで形成した。図８Ｃ：２５ｎＭ（４Ｃ：比１）であった。ＢＮＣは、ｉｎ  ｓｉｔｕ水素生成システムに順応して、バイオマスからの芳香族の放出を増大させ、酸化剤としてグルコースを使用することができる。
【図９】フェノールの改質および芳香族の化学変換を含めた適用例で階層的マクロポーラス触媒を形成するための、磁気ミクロ粒子上の西洋ワサビペルオキシダーゼ鋳型のＢＮＣのアセンブリを示す概略図である。
【図１０】フェノールおよびＨ２Ｏ２（１ｍＭ）が等モル濃度の状態で、室温で１２時間後に、ＢＮＣおよびＢＭＣを使用したフェノール除去の程度を示すグラフである。誤差棒は、３つの測定値の標準偏差である。メソポーラス触媒を形成するための、ミクロ粒子上でのＢＮＣの鋳型形成は、ＢＮＣの活性に有害ではない。
【図１１】Ａ、Ｂは、フェノール除去のための５サイクルでの各サイクル後の触媒の再使用性能を示す棒グラフである：［フェノール］＝［Ｈ２Ｏ２］＝１ｍＭ；反応時間  室温で２時間；［ＨＲＰ］＝３０ｎＭ、［ＭＮＰ］＝６０ｕｇ／ｍｌ。図１１Ａは、［ＭＭＰ］／［ＭＮＰ］／［ＨＲＰ］＝２０：２：１に関し、図１１Ｂは［ＭＭＰ］／［ＭＮＰ］／［ＨＲＰ］＝１６０：２：１に関する。誤差棒は、３つの測定値の標準偏差である。階層的構造は、数サイクルに関する酵素触媒の再使用を可能にする。
【図１２】Ａ、Ｂは、磁気ミクロ粒子上に鋳型形成された西洋ワサビペルオキシダーゼＢＮＣと、２種の異なる比のＢＮＣとの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。ミクロ粒子の表面上のアセンブリは、磁気相互作用によって推進される自己組織化プロセスである。
【図１３】磁気反応器のＶ字形構成を示す写真である；電磁石は対になっており、１〜２ベースでサイクル動作する。原型システムは、電磁石（管状９．６×１６．７ｍｍ、シリーズＥ−６６−３８、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）、単純なマイクロコントローラ、このマイクロコントローラと電磁石との間のインターフェース回路を用いて設計されている。電磁石はカスタム・スタンドに載置され、断面が０．５ｃｍの使い捨てＵＶ透過性プラスチック・マイクロ・キュベットからなる小さいバイオリアクタの側面に様々な構成で位置決めすることが可能になる。
【図１４】磁気反応器のＩ字形構成を示す写真であり；電磁石は対になっており、１〜１ベースでサイクル動作する。ピンク色は、高効率の西洋ワサビペルオキシダーゼをベースにした磁気触媒を使用した、フェノールおよびアミノピレンからのキノンイミンの合成に特有のものである。この反応は、フェノールの除去と、顔料、染料、芳香族、および微細な化学物質の合成化学とを示す。
【図１５】酸化重合によるフェノール除去のためのＢＮＣの使用を示す概略図である。フェノール分子は酸化されてフェノキシラジカルになり、それらが互いに重合する。反応は、芳香族の改質、および酸化カップリングによる重合に、特有のものである。
【図１６】水処理のための磁気反応器の一体化を示す概略図である。
【図１７】フリーラジカルの発生および重合をデカップリングするための、磁気反応器のコア部を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一態様では、本発明は、１種またはそれ以上の酵素に吸着された磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体を含む、酵素含有組成物であって、１種またはそれ以上の酵素がフリーラジカル生成（ＦＲＰ：ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）酵素を含んでも含んでいなくてもよい酵素含有組成物を対象とする。酵素に吸着される磁性ナノ粒子のアセンブリを、本明細書では「バイオナノ触媒」または「ＢＮＣ」とも呼ぶ。本明細書で使用される「吸着される」という用語は、取着の形態が、磁性ナノ粒子が使用されまたは後で使用するために収納される条件下で磁性ナノ粒子からの酵素の放出を防止しまたは実質的に最小限に抑える限り、「結合する」、「〜に会合する」、または「と凝集する」という用語と同義であることを意味する。ＢＮＣまたはそれが貴金属でコーティングされたものは、マクロポーラススカフォールドの表面上に吸着され（即ち、表面に存在するように作製され）てもよく、これは磁気ミクロ粒子および／または以下に記述する連続マクロポーラススカフォールドのいずれかのアセンブリであってもよい。
【００１８】
ＢＮＣは、磁性ナノ粒子間の間隙であるメソ細孔を含有する。酵素は、磁性ナノ粒子上のいずれかの場所、例えばＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部の表面に位置付けられかつ／またはその中に埋め込まれていてもよい。本明細書で使用される「磁気」という用語は、永久磁石的、超常磁性、常磁性、強磁性、およびフェリ磁性挙動も含めた有用な磁気特性の全てのタイプを包含する。
【００１９】
磁性ナノ粒子またはＢＮＣは、ナノスケール、即ち一般に５００ｎｍ以下のサイズを有する。本明細書で使用される「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子がほぼまたは実質的に球状の磁性ナノ粒子の直径を指すことができる。磁性ナノ粒子がほぼまたは実質的に球状ではない場合（例えば、実質的に卵形または不揃い）、「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子の最長寸法または３つの寸法の平均を指すことができる。「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子の集団全体のサイズの平均（即ち、「平均サイズ」）を指してもよい。異なる実施形態では、磁性ナノ粒子は、厳密に例えば５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、もしくは１ｎｍの値、これらの値付近、最大でこれらの値まで、もしくはこれらの値未満のサイズを有し、または前述の例示的なサイズのいずれか２つにより境界が定められた範囲内のサイズを有する。
【００２０】
ＢＮＣでは、個々の磁性ナノ粒子を、上記にて提供されたサイズのいずれかを有する１次ナノ粒子（即ち、１次微結晶）と見なすことができる。ＢＮＣにおけるナノ粒子の凝集体は、そのサイズがナノ粒子よりも大きく、一般に少なくとも５ｎｍのサイズ（即ち、２次サイズ）を有する。異なる実施形態では、凝集体は、厳密に例えば５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、もしくは８００ｎｍの値、これらの値付近、少なくともこれらの値、これらよりも大きい値、最大でこれらの値まで、もしくはこれらの値未満のサイズを有し、または前述の例示的なサイズのいずれか２つにより境界が定められた範囲内のサイズを有する。
【００２１】
典型的には、１次および／または凝集磁性ナノ粒子またはそのＢＮＣは、サイズ分布を有し、即ちこれらの粒子は一般にサイズ内で分散し、狭くまたは広く分散する。異なる実施形態では、１次または凝集体サイズの任意の範囲は、１次または凝集体サイズの全範囲の大部分または小部分を構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、１次粒子サイズの特定の範囲（例えば、少なくとも１、２、３、５、または１０ｎｍ、および最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｍまで）、または凝集粒子サイズの特定の範囲（例えば、少なくとも５、１０、１５、または２０ｎｍ、および最大で５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ｎｍまで）が、１次粒子サイズの全範囲の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％またはそれ以上を構成する。その他の実施形態では、１次粒子サイズの特定の範囲（例えば、１、２、３、５、もしくは１０ｎｍ未満、または１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍよりも大きい）、または凝集粒子サイズの特定の範囲（例えば、２０、１０、もしくは５ｎｍ未満、または２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは３００ｎｍよりも大きい）が、１次粒子サイズの全範囲の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下またはそれらの値未満を構成する。
【００２２】
磁性ナノ粒子の凝集体（即ち、「凝集体」）またはそのＢＮＣは、それらを作る個々の１次微結晶の量に依存して実質的に不十分な多孔率を含めた、任意の程度の多孔率を有することができる。特定の実施形態では、凝集体は、間隙メソ細孔（即ち、充填配置構成により形成された、１次磁性ナノ粒子間に位置付けられたメソ細孔）を含有することにより、メソポーラスである。メソ細孔は、そのサイズが一般に少なくとも２ｎｍであり最大で５０ｎｍである。異なる実施形態では、メソ細孔は、厳密に例えば２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍの値またはこれらの値付近の孔径を有することができ、または前述の例示的な孔径のいずれか２つにより境界が定められた範囲内の孔径を有することができる。粒度の場合と同様に、メソ細孔は、典型的にはサイズ分布を有し、即ちメソ細孔は、一般にサイズ内に分散し、狭くまたは広く分散する。異なる実施形態では、メソ細孔サイズの任意の範囲は、メソ細孔サイズの全範囲または全細孔容積の大部分または小部分を構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、メソ細孔サイズの特定の範囲（例えば、少なくとも２、３、または５、および最大で８、１０、１５、２０、２５、または３０ｎｍまで）が、メソ細孔サイズの全範囲または全細孔容積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％またはそれ以上を構成する。その他の実施形態では、メソ細孔サイズの特定の範囲（例えば、２、３、４、もしくは５ｎｍ未満、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍよりも大きい）が、メソ細孔サイズの全範囲または全細孔容積の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％以下またはこれらの値未満を構成する。
【００２３】
磁性ナノ粒子は、当技術分野で公知の組成物のいずれかを有することができる。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性のゼロ価金属部分でありまたはこのゼロ価金属部分を含む。そのようなゼロ価金属のいくつかの例には、コバルト、ニッケル、および鉄と、それらの混合物および合金が含まれる。その他の実施形態では、磁性ナノ粒子は、コバルト、ニッケル、もしくは鉄の酸化物、またはそれらの混合物など、磁性金属の酸化物でありまたはこの磁性金属の酸化物を含む。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、完全に区別されるコア部分および表面部分を保有する。例えば、磁性ナノ粒子は、元素の鉄、コバルト、またはニッケルから構成されるコア部分と、金属酸化物などの不動態層、または金、白金、パラジウム、もしくは銀の層などの貴金属コーティングから構成される表面部分とを有していてもよい。その他の実施形態では、金属酸化物磁性ナノ粒子またはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁性ナノ粒子表面の電荷の数を低減させてもよく、これは溶液中の分散性を有益に増大させかつＢＮＣのサイズをより良好に制御することができる。貴金属コーティングは、酸化、浸出による可溶化、またはクエン酸、マロン酸、もしくは酒石酸などのキレート有機酸を生化学反応もしくはプロセスで使用する場合のキレート化から、磁性ナノ粒子を保護する。不動態層は、任意の適切な厚さ、特に、少なくとも例えば０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、もしくは１０ｎｍであり、最大でこれらの値まで、もしくはこれらの値未満、またはこれらの値のいずれか２つにより境界が定められた範囲内の厚さを有することができる。
【００２４】
特定の実施形態では、磁性ナノ粒子が酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当技術分野で公知の磁気または超常磁性酸化鉄組成物のいずれか、例えばマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（α−Ｆｅ２Ｏ３）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、または式ＡＢ２Ｏ４に従うスピネルフェライトとすることができ、式中、Ａは２価の金属（例えば、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、またはこれらの組合せ）であり、Ｂは３価の金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋、またはこれらの組合せ）である。
【００２５】
特定の実施形態では、上述の磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体（ＢＮＣ）は、連続マクロポーラススカフォールドに組み込まれて、第１および第２のレベルのアセンブリを持つ階層的触媒アセンブリを形成する。アセンブリの第１のレベルはＢＮＣ内に見出される。アセンブリの第２のレベルは、連続マクロポーラススカフォールドにＢＮＣを組み込んだものに見出される。全体的な階層的触媒アセンブリは、少なくともＢＮＣの存在により磁性を持つ。
【００２６】
マクロポーラススカフォールドに関して本明細書で使用される「連続」という用語は、粒状アセンブリではない材料、即ちマクロポーラス構造を形成するのに粒子または離散物体で互いに構成されていない材料を示す。粒状アセンブリとは対照的に、連続構造は実質的に継ぎ目を持たず、継ぎ目のない均一な構造を周期的に遮断するマクロ細孔の周りが均一である。したがって連続スカフォールド内のマクロ細孔は、凝集粒子間の間隙ではない。それにも関わらず、１次連続スカフォールドのアセンブリまたは凝集が１次連続スカフォールド間の間隙によって形成されたマクロ細孔（例えば、５０ｎｍよりも大きく１００ミクロンまで）を含まない限り、連続スカフォールドは、より小さい１次連続スカフォールドのアセンブリまたは凝集で構成することができる。特に、セラミックまたは元素材料などの無機材料の場合、連続スカフォールドは結晶質ドメインまたは相境界も含んでも含まなくてもよい。
【００２７】
マクロポーラススカフォールドは、５０ｎｍよりも大きいサイズを有するマクロ細孔（即ち、マクロスケール・サイズの細孔）を含有する。異なる実施形態では、マクロ細孔は、厳密に例えば６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１ミクロン（１μｍ）、１．２μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、もしくは１００μｍの値、これらの値付近、少なくともこれらの値、これらよりも大きい値、最大でこれらの値まで、もしくはこれらの値未満のサイズ、または前述の例示的なサイズのいずれか２つにより境界が定められた範囲内のサイズを有する。
【００２８】
マクロポーラススカフォールドは、マクロ細孔を収容することができる限り、任意の適切なサイズを有することができる。典型的な実施形態では、マクロポーラススカフォールドは、マクロスケールの少なくとも１つのサイズ寸法を保有する。少なくとも１つのマクロスケール寸法は、５０ｎｍよりも大きく、マクロ細孔に関して上記にて提供された値のいずれか、特に、厳密には例えば１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、もしくは１ｃｍの値、これらの値付近、少なくともこれらの値、これらよりも大きい値、最大でもこれらの値まで、もしくはこれらの値未満の寸法、または前述の例示的なサイズのいずれか２つにより境界が定められた範囲内のサイズとすることができる。サイズ寸法のただ１つまたは２つがマクロスケールにある場合、残りの１つまたは２つの寸法を、磁性ナノ粒子に関して上記にて提供された値のいずれかのような（例えば、独立して例えば１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｎｍの値、厳密にこれらの値、これらの値付近、少なくともこれらの値、これらよりも大きい値、最大でもこれらの値まで、もしくはこれらの値未満、または前述の値のいずれか２つによって境界が定められた範囲内の値）ナノスケールとすることができる。いくつかの実施形態では、マクロポーラススカフォールドのサイズ寸法の少なくとも２つまたは全てが、マクロスケールにある。
【００２９】
実施形態の第１の組では、ＢＮＣが組み込まれる連続マクロポーラススカフォールドが磁性であり、即ちＢＮＣが存在しない状態であっても磁性である。連続マクロポーラススカフォールドは、例えば磁気ポリマー組成物から構成されることによって磁性にすることができる。磁気ポリマーの例は、当技術分野で周知のように、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）とエメラルジンをベースにした形のポリアニリン（ＰＡＮｉ）との組合せであるＰＡＮｉＣＮＱである。あるいは、またはさらに、連続マクロポーラススカフォールドは、ＢＮＣに属さない磁気粒子が内部に埋め込まれることにより、磁性にすることができる。ＢＮＣに属さない磁気粒子は、例えば、ＦＲＰ酵素または任意の酵素に会合していない磁気ナノまたはミクロ粒子であってもよい。磁気ミクロ粒子は、マクロ細孔に関して上記にて提供されたようなサイズまたはサイズ分布を有していてもよいが、マクロ細孔サイズとは無関係であってもよい。特定の実施形態では、磁気ミクロ粒子は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍの値、厳密にこれらの値、もしくは少なくともこれらの値のサイズ、または前述の例示的なサイズのいずれか２つにより境界が定められた範囲内のサイズを有する。いくつかの実施形態では、連続マクロポーラススカフォールドは、ＢＮＣの少なくとも一部に吸着された磁気ミクロ粒子がスカフォールドの内部に埋め込まれており、またはこの磁気ミクロ粒子は、ＢＮＣに会合しておらずまたは吸着されていない。
【００３０】
実施形態の第２の組では、ＢＮＣが組み込まれる連続スカフォールドが非磁性である。それにも関わらず、非磁性スカフォールドを含有する全体的な階層的触媒アセンブリは、少なくとも内部に組み込まれたＢＮＣの存在によって磁性であり続ける。
【００３１】
一実施形態では、連続マクロポーラススカフォールド（またはその前駆体）は、ポリマー組成物を有する。ポリマー組成物は、当技術分野で公知の、固体有機、無機、または混成有機無機ポリマー組成物のいずれかとすることができ、結合剤として働く合成またはバイオポリマーであってもよい。好ましくは、ポリマーマクロポーラススカフォールドは、階層的触媒が使用される予定の水またはその他の媒体中で溶解せずまたは分解しない。合成有機ポリマーのいくつかの例には、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸またはポリメタクリル酸塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールなど）、フルオロポリマー（例えば、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、およびポリテトラフルオロエチレンなど）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レゾルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、およびこれらのコポリマーが含まれる。バイオポリマーのいくつかの例には、多糖（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、およびアルギン酸）、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸が含まれる。セルロースの特定の場合、セルロースは、微生物または藻類由来セルロースであってもよい。無機または混成有機無機ポリマーのいくつかの例には、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどの、ゾルゲル合成により製造される）およびポリホスファゼンが含まれる。いくつかの実施形態では、上記にて提供されたポリマー組成物のいずれか１つまたはそれ以上の種類または特定のタイプは、マクロポーラススカフォールドとして除外される。
【００３２】
別の実施形態では、連続マクロポーラススカフォールド（またはその前駆体）が非ポリマー組成物を有する。非ポリマー組成物は、例えば、セラミックまたは元素組成物を有することができる。セラミック組成物は、結晶質、多結晶質、または非晶質であってもよく、酸化物組成物（例えば、アルミナ、ベリリア、セリア、イットリア、またはジルコニア）および非酸化物組成物（例えば、炭化物、ケイ化物、窒化物、ホウ化物、または硫化物組成物）を含めた当技術分野で公知の組成物のいずれかを有していてもよい。元素組成物は、結晶質、多結晶質、または非晶質であってもよく、炭素、アルミニウム、またはケイ素などの任意の適切な元素組成物を有していてもよい。
【００３３】
その他の実施形態では、ＢＮＣは、磁気ミクロ粒子間の間隙としてマクロ細孔を含む磁気ミクロ粒子（ＭＭＰ）のアセンブリ（即ち、凝集）を含有する（またはアセンブリで構成される）、不連続マクロポーラス担体中にある。磁気ミクロ粒子は、典型的には強磁性である。ＢＮＣは、磁気ミクロ粒子の凝集のマクロ細孔の少なくとも一部に埋め込まれ、磁気ミクロ粒子の表面にあってもよい。ＢＮＣは、磁気相互作用によって、磁気ミクロ粒子の表面に会合することができる。磁気ミクロ粒子は、金属酸化物または貴金属コーティング層で被覆されても被覆されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＢＮＣ−ＭＭＰアセンブリは、上述のように連続マクロポーラススカフォールドに組み込まれ（即ち、埋め込まれ）て、階層触媒アセンブリを提供する。
【００３４】
個々の磁性ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の適切な程度の磁気を保有する。例えば、磁性ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−スカフォールドアセンブリは、少なくともまたは最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｅｍｕ／ｇの飽和磁化（Ｍｓ）を保有することができる。磁性ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−スカフォールドアセンブリは、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（即ち、最大で）または未満、より好ましくは４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ、または０．１ｅｍｕ／ｇまでまたは未満の残留磁化（Ｍｒ）を保有する。磁性ナノ粒子、ＢＮＣ、またはＢＮＣ−スカフォールドアセンブリの表面磁場は、例えば約または少なくとも０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ガウス（Ｇ）、または前述の値のいずれか２つにより境界が定められた範囲内の磁場とすることができる。ミクロ粒子が含まれる場合、ミクロ粒子は、上記磁気強度のいずれかを保有していてもよい。
【００３５】
磁性ナノ粒子またはその凝集体は、結果的にＢＮＣが生成されるように、適用例に応じて、飽和レベルまでまたはそれよりも低い適切な量の酵素を吸着するように作製することができる。異なる実施形態では、磁性ナノ粒子またはその凝集体は、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、または３０ｐｍｏｌ／ｍ２の値、少なくともこれらの値、最大でこれらの値まで、またはこれらの値未満の酵素を吸着してもよい。あるいは、磁性ナノ粒子またはその凝集体は、例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の値、少なくともこれらの値、最大でこれらの値まで、またはこれらの値未満の飽和レベルである酵素の量を吸着してもよい。
【００３６】
磁性ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の適切な細孔容積を保有する。例えば、磁性ナノ粒子またはその凝集体は、例えば約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、もしくは１ｃｍ３／ｇの値、少なくともこれらの値、最大でこれらの値まで、もしくはこれらの値未満の細孔容積、または前述の値のいずれか２つによって境界が定められた範囲内の細孔容積を保有することができる。
【００３７】
磁性ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の適切な比表面積を保有する。例えば磁性ナノ粒子またはその凝集体は、例えば約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍ２／ｇの値、少なくともこれらの値、最大でこれらの値まで、またはこれらの値未満の比表面積を有することができる。
【００３８】
本発明の目的で、酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することによって好ましくは機能する。酵素は、任意の供給源、例えば真菌、微生物、動物、または植物からとすることができる。
【００３９】
特定の実施形態では、酵素は、フリーラジカルを生成する性質を有し、即ち「ＦＲＰ酵素」である。特定の実施形態では、ＦＲＰ酵素は、酵素のＥＣ  １ファミリーに属するオキシドレダクターゼである。ＥＣ  １オキシドレダクターゼは、例えば、ドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するＥＣ  １．１オキシドレダクターゼ、ドナーのアルデヒドまたはオキソ基に作用するＥＣ  １．２オキシドレダクターゼ、ドナーのＣＨ−ＣＨ基に作用するＥＣ  １．３オキシドレダクターゼ、ドナーのＣＨ−ＮＨ２基に作用するＥＣ  １．４オキシドレダクターゼ、ドナーのＣＨ−ＮＨ基に作用するＥＣ  １．５オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに作用するＥＣ  １．６オキシドレダクターゼ、ドナーとして様々な窒素性化合物に作用するＥＣ  １．７オキシドレダクターゼ、ドナーとして硫黄基に作用するＥＣ  １．８オキシドレダクターゼ、ドナーとしてヘム基に作用するＥＣ  １．９オキシドレダクターゼ、ドナーとしてジフェノールおよび関連ある物質に作用するＥＣ  １．１０オキシドレダクターゼ、アクセプターとして過酸化物に作用するＥＣ  １．１１オキシドレダクターゼ、ドナーとして水素に作用するＥＣ  １．１２オキシドレダクターゼ、分子状酸素（オキシゲナーゼ）の組込みにより単一ドナーに作用するＥＣ  １．１３オキシドレダクターゼ（オキシゲナーゼ）、分子状酸素の組込みまたは還元により対になったドナーに作用するＥＣ  １．１４オキシドレダクターゼ、アクセプターとして過酸化物に作用するＥＣ  １．１５オキシドレダクターゼ、金属イオンを酸化するＥＣ  １．１６オキシドレダクターゼ、ＣＨまたはＣＨ２基に作用するＥＣ  １．１７オキシドレダクターゼ、ドナーとして鉄−硫黄タンパク質に作用するＥＣ  １．１８オキシドレダクターゼ、ドナーとして還元フラボドキシンに作用するＥＣ  １．１９オキシドレダクターゼ、ドナーとしてリンまたはヒ素に作用するＥＣ  １．２０オキシドレダクターゼ、Ｘ−Ｙ結合を形成するためにＸ−ＨおよびＹ−Ｈに作用するＥＣ  １．２１オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．９７オキシドレダクターゼ、還元剤として水素を使用するＥＣ  １．９８オキシドレダクターゼ、および酸化剤として酸素を使用するＥＣ  １．９９オキシドレダクターゼとすることができる。オキシドレダクターゼは、上記にて提供されたＥＣ  １．１のグループ分けのいずれかの亜属に属することが、より特別に明らかにされてもよい。
【００４０】
実施形態の第１の特定の組では、ＦＲＰ酵素がオキシドレダクターゼ酵素のＥＣ  １．１属から選択される。ＥＣ  １．１酵素はさらに、下記の亜属：アクセプターとしてＮＡＤまたはＮＡＤＰを有するＥＣ  １．１．１、アクセプターとしてシトクロムを有するＥＣ  １．１．２、アクセプターとして酸素を有するＥＣ  １．１．３、アクセプターとしてジスルフィドを有するＥＣ  １．１．４、アクセプターとしてキノンまたは類似の化合物を有するＥＣ  １．１．５、およびその他のアクセプターを有するＥＣ  １．１．９９のいずれかに属することを明らかにすることができる。より特定の実施形態では、ＦＲＰ酵素は、上記にて提供されるＥＣ  １．１亜属のいずれかの亜属に属することが明らかにされる。例えば、ＦＲＰ酵素は、ＥＣ  １．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．８（Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１５（２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１８（２次アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２２、ＥＣ  １．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２５、ＥＣ  １．１．３．２６、ＥＣ  １．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．２９（Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３１、ＥＣ  １．１．３．３２、ＥＣ  １．１．３．３３、ＥＣ  １．１．３．３４、ＥＣ  １．１．３．３５、ＥＣ  １．１．３．３６、ＥＣ  １．１．３．３７（Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成）、ＥＣ  １．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）、およびＥＣ  １．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）などのＥＣ  １．１．３の亜属のいずれかに属することを明らかにすることができる。
【００４１】
実施形態の第２の特定の組では、ＦＲＰ酵素がオキシドレダクターゼ酵素のＥＣ  １．１０属から選択される。ＥＣ  １．１０酵素はさらに、下記の亜属：アクセプターとしてＮＡＤまたはＮＡＤＰを有するＥＣ  １．１０．１、アクセプターとしてシトクロムを有するＥＣ  １．１０．２、アクセプターとして酸素を有するＥＣ  １．１０．３、およびその他のアクセプターを有するＥＣ  １．１０．９９のいずれかに属することを明らかにすることができる。ＥＣ  １．１０．１酵素は、より具体的には、例えばＥＣ  １．１０．１．１、即ちトランス−アセナフテン−１，２−ジオールデヒドロゲナーゼとすることができる。ＥＣ  １．１０．２酵素は、より具体的には、例えばＥＣ  １．１０．２．１（シトクロム−ｂ５レダクターゼ）またはＥＣ  １．１０．２．２（シトクロム−ｃレダクターゼ）とすることができる。ＥＣ  １．１０．３酵素は、より具体的には、例えばＥＣ  １．１０．３．１（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．２（ラッカーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．３（Ｌ−アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．４（ｏ−アミノフェノールオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．５（３−ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．６（リファマイシン−Ｂオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１０．３．７、またはＥＣ  １．１０．３．８とすることができる。ＥＣ  １．１０．９９酵素は、より具体的には、例えばＥＣ  １．１０．９９．１（プラストキノール−プラストシアニンレダクターゼ）、ＥＣ  １．１０．９９．２（リボシルジヒドロニコチンアミドデヒドロゲナーゼ、キノン）、またはＥＣ  １．１０．９９．３（ビオラキサンチンデヒドロゲナーゼ）とすることができる。
【００４２】
実施形態の第３の特定の組では、ＦＲＰ酵素がオキシドレダクターゼ酵素のＥＣ  １．１１属から選択される。ＥＣ  １．１１酵素はさらに、亜属ＥＣ  １．１１．１（ペルオキシダーゼ）に属することを明らかにすることができる。ＥＣ  １．１１．１酵素は、より具体的には、例えばＥＣ  １．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．４、ＥＣ  １．１１．１．５（シトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．８（ヨウ化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１０（塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ  １．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）、またはＥＣ  １．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）とすることができる。
【００４３】
特定の実施形態では、ＦＲＰ酵素がペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは、機能によってさらに指定されてもよく、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、または万能ペルオキシダーゼであってもよい。ペルオキシダーゼは、真菌、微生物、動物、または植物ペルオキシダーゼと指定されてもよい。ペルオキシダーゼは、クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩペルオキシダーゼと指定されてもよい。ペルオキシダーゼは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ：ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ：ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ：ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ：ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ピーナツペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、大麦ペルオキシダーゼ、またはペルオキシダシンと指定されてもよい。特定の実施形態では、ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＦＲＰ酵素であってもそうでなくてもよい単一酵素を使用する。その他の実施形態では、ＦＲＰ酵素を含んでいてもいなくてもよい酵素の組合せを使用する。酵素の組合せは、例えば、上記クラスまたはそのサブクラスのいずれかから選択された任意の２種または３種のオキシドレダクターゼとすることができる。いくつかの実施形態では、ＦＲＰ酵素（例えば、ＥＣ  １酵素）の組合せを使用する。特定の実施形態では、ＥＣ  １．１酵素の組合せを使用する。その他の特定の実施形態では、ＥＣ  １．１０酵素の組合せを使用する。その他の特定の実施形態では、ＥＣ  １．１１酵素の組合せを使用する。その他の実施形態では、上述の特定のＦＲＰ酵素のいずれかとペルオキシダーゼとの組合せを使用する（例えば、ＥＣ  １．１またはＥＣ  １．１．３酵素とペルオキシダーゼとの組合せ）。ＦＲＰ酵素の組合せが使用される場合、２種またはそれ以上の酵素をコア−シェル型の配置構成に配置してもよく、即ち、第１のＦＲＰ酵素は磁性ナノ粒子またはその凝集体のコア部分または表面部分のいずれかにあり、第２の（異なる）ＦＲＰ酵素は、第１のＦＲＰ酵素が位置付けられている領域を覆う。第２のＦＲＰ酵素は、磁性ナノ粒子の凝集体であってもよく、またはその表面にあって、第１の酵素の上に重なっていてもよい。
【００４５】
多重酵素系の場合、メソポーラス凝集体内の種々の酵素の分布を操作することによって、種々の反応をデカップリングしかつ反応の基質および生成物を１つの層から別の層にまたはＢＮＣのコアに拡散させるという利点が得られる。したがって、ＢＮＣの閉じ込められた細孔構造内で酵素反応を行う場合、コア／シェル分布は、種々の捕捉されたＦＲＰ酵素の動態をより良好に制御する可能性をもたらす。類似の反応を行うが異なる反応要件（基質、基質濃度など）を有する酵素（例えば、２種もしくはそれ以上のペルオキシダーゼ、または１種のペルオキシダーゼおよび１種のラッカーゼ）を組み合わせることにより、高レベルの効率で広範かつ様々なプロセス条件で行うＢＮＣの多様性を有益に増大させることができる。連結反応で酵素を組み合わせることにより、酵素付近での基質の生成を確実にすることができ、過酸化水素などの有害で不安定な化学基質の必要性を回避することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ酵素は、安価で無害な化合物であるグルコースから過酸化水素を発生させることができる。
【００４６】
別の態様では、本発明は、内部に酵素が埋め込まれている磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体（ＢＮＣ）を生成するための方法を対象とする。特定の実施形態では、ＢＮＣは、可溶性酵素と、被覆されていてもいなくてもよい磁性ナノ粒子の単分散溶液とを組み合わせることによって製造される。混合前のナノ粒子の単分散状態は、ナノ粒子の超音波処理によって実現することができる。酵素および単分散ナノ粒子を、永続的な撹拌の下で、全ての酵素が吸着されクラスターを形成するまでインキュベートする。ＢＮＣ合成のための溶液のｐＨは、酵素の表面基の全静電荷がナノ粒子の表面の全静電荷と反対になるようにする必要がある。ＢＮＣの最適な形成では、溶液のｐＨは、ナノ粒子の自己凝集を防止するように調節されるべきであり、対イオンの存在は一般に望ましくない。一実施形態では、ＢＮＣの最適な形成のため、酵素およびナノ粒子の表面電位（ｐＫａ）は過剰凝集およびクランプ形成が制限されるように３単位以下である。別の実施形態では、ＢＮＣの最適な形成のため、酵素の濃度は、過剰凝集を防止するためにナノ粒子表面の全結合能の約８０％以下である。ＢＮＣクラスターのサイズは、溶液中のナノ粒子対酵素の比に関係する。一般に、酵素が多くなるほど、クラスターはより大きくなる。最適な活性のためにかつ基質および生成物の拡散障害を制限するために、クラスターは一般に約２００ｎｍよりも大きくあるべきである。
【００４７】
磁性ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、金、白金、またはパラジウムなどの貴金属で被覆されていてもよい。あるいは、またはさらに、磁性ナノ粒子またはその凝集体またはそのＢＮＣは、磁性ナノ粒子の酸化を防止するために、金属酸化物層（例えば、シリカまたはチタニア）またはポリマー保護コーティングで被覆されていてもよい。磁性ナノ粒子を被覆するための任意の適切な方法を使用してもよい。例えば、特定の実施形態では、磁性ナノ粒子は、貴金属塩を含有する溶液中に分散され、この貴金属塩は還元状態に置かれる。前述の方法は、貴金属塩を還元する前に２官能性分子を磁性ナノ粒子の表面に結合することにより、容易に行うことができる。この目的で使用される２官能性分子は、磁性ナノ粒子に結合するのに有用な部分（上述のような）、ならびに貴金属イオンを結合するための貴金属結合部分（例えば、アミン、チオール、ホスフィン、またはキレート部分）を含有すべきである。場合により、金属イオンがナノ粒子表面に結合したら、磁性ナノ粒子から余分な貴金属塩を洗い落とすことができる（例えば、磁気的獲得、濾過、またはデカンテーションによって）。貴金属イオンは表面に取着するので、前述の方法は、貴金属コーティング（即ち、貴金属ナノ粒子の同時生成なし）ならびにより均一なコーティングを生成するためのより選択的な方法を提供する。いくつかの実施形態では、貴金属コーティングは、酵素が磁性ナノ粒子に含まれる前に付着され、その場合、酵素は貴金属コーティングに後で結合する。酵素は、例えば、貴金属コーティングに結合しかつ酵素に結合するための別の反応性基を保有する２官能性分子による貴金属コーティングの官能化によって、貴金属コーティングに結合することができる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、上述のようにマクロポーラススカフォールドに組み込まれたＢＮＣを含有する、階層的触媒アセンブリを生成するための方法を対象とする。典型的な実施形態において、ＢＮＣまたはそれに貴金属が被覆されたものは、ナノ粒子がマクロポーラススカフォールドの表面に吸着されるように、ＢＮＣまたはそれに貴金属が被覆されたものとマクロポーラススカフォールドとを水系溶液中で接触させることによって、マクロポーラススカフォールドの表面に吸着されるように作製される。この方法では、ＢＮＣは一般に溶液（即ち、液体溶液）中でマクロポーラススカフォールドと接触して、実質的にＢＮＣをスカフォールドのマクロ細孔に埋め込む。溶液は、水、および／またはＢＮＣとスカフォールドとの間の効率的で密接な接触を可能にする任意の適切な溶媒を、含むことができる。典型的にはＢＮＣは、自己組織化メカニズムによって、即ち磁気相互作用、物理吸着、および／または化学吸着によって、スカフォールドの上または中に吸着されることになる。ＢＮＣがスカフォールドに埋め込まれた後、触媒アセンブリを、さらに処理することなく使用してもよく、または触媒アセンブリを、水または適切な溶媒中で濯いでもよく、または使用前に、例えば酵素を保存するのに適切な溶液中に収納してもよい。いくつかの実施形態では、ＢＮＣは磁気ミクロ粒子の表面に接着され、ＢＮＣ−ミクロ粒子アセンブリは、連続マクロポーラススカフォールド内に埋め込まれる。
【００４９】
マクロポーラススカフォールド上でのＢＮＣの鋳型形成は、ＢＮＣ形成で使用したものと同じ緩衝液中で行うことができる。少量のマクロポーラススカフォールドは、上澄みが透明になるまで典型的にはＢＮＣに順次添加され、これは全てのＢＮＣがスカフォールドの表面に捕えられたことを示す。上澄みの色は、小さい電磁石により、ＢＮＣ投入スカフォールドを獲得した後のナノ粒子クラスターの吸光度によって一般にモニタされる。ＢＮＣを獲得するのに必要なスカフォールドの量は、質量磁化およびスカフォールドの表面積に依存する。あるいは、スカフォールドの結合能を決定することができ、適切な量のＢＮＣを、完全な獲得のために添加することができる。溶液中の材料の質量磁化を増大させるため、ＢＮＣ官能化スカフォールドを、このプロセスに必要な酵素の濃度を変化させることなく非官能化スカフォールドで希釈することができる。
【００５０】
連続マクロポーラススカフォールドは、任意の適切な方法により製造することができる。マクロ細孔を材料に組み込むための、当技術分野で公知の任意のプロセスが、本明細書で考慮される。特定の実施形態において、連続マクロポーラススカフォールドは：（ｉ）内部に犠牲鋳型形成剤が埋め込まれたスカフォールド前駆体材料または組成物を含有する複合体を生成する工程と、（ｉｉ）犠牲鋳型形成剤を選択的に除去して、スカフォールド前駆体材料中にマクロ細孔を生成する工程とを含む、鋳型形成（テンプレーション）プロセスによって生成される。実施形態の第１の組では、鋳型形成プロセスは、鋳型形成剤として溶媒を用い、この溶媒はスカフォールド前駆体材料中に埋め込まれている。溶媒鋳型形成プロセスにおいて、埋め込まれた溶媒と共にスカフォールド前駆体材料を含有する複合体を、埋め込まれた溶媒が凍結するまで冷却して、溶媒結晶を形成し、次いで凍結溶媒を、蒸発または昇華のいずれかによって除去することにより、スカフォールド前駆体材料中にマクロ細孔を生成する。溶媒が水の場合、溶媒鋳型形成プロセスを、氷鋳型形成プロセスと呼ぶことができる。実施形態の第２の組において、鋳型形成プロセスは、スカフォールド前駆体材料に埋め込まれた固体犠牲鋳型形成剤を用いる。犠牲鋳型形成剤は、例えば、スカフォールド前駆体に組み込んだ後に選択的に除去できるポリマーまたは金属酸化物基質であってもよい。そのような犠牲鋳型形成剤の組込みは、当技術分野で周知である。当技術分野で周知の方法により、犠牲鋳型形成剤は、例えば、酸または塩基の浸出、溶媒溶解、または熱分解による分解によって、選択的に除去することができる。その他の実施形態では、犠牲鋳型形成剤は、マクロ細孔が生成されるように十分な熱が加えられる時に揮発しまたは分解する材料である、焼却材料である。
【００５１】
当技術分野で従来から使用されているマクロ細孔形成法のその他の詳細は、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れるＬ．Ｙａｎｇら、「Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．、１８（２）、２９７〜３０００頁（２００６）；Ｍ．Ａｂｄｕｌｌａｈら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｘｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｏｒｅｓ  ｂｙ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｙ  Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ」、Ａｃｔａ  Ｍａｔｅｒｉａｌｉａ、５２、５１５１〜５１５６頁（２００４）；Ｔ．Ｎｉｕら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｓｏ−Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  Ａ−Ａｌｕｍｉｎａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｏｐｏｒｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯ  ｉｎ  Ｈ２−Ｒｉｃｈ  Ｇａｓｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ｖｏｌ．２０、ｉｓｓｕｅ  ４、７８９〜７９８頁（２０１３）；およびＭ．Ｄａｖｉｓら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｌｙ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅｓ  ｖｉａ  ａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  Ｅｐｏｘｉｄｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ／Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、５（１６）、７７８６〜７７９２頁（２０１３）に見出すことができる。
【００５２】
図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、階層的触媒アセンブリの第１および第２のアセンブリ・レベルを生成するための例示的なプロセスを示す。図１Ａは、磁性ナノ粒子と西洋ワサビペルオキシダーゼとのメソポーラス凝集体から構成されたＢＮＣを含有する、階層的触媒センブリの第１のアセンブリ・レベルを形成するための例示的なプロセスを示す。図１Ｂは、セルロースなどの多糖であってもよいバイオポリマーなどのポリマー材料など、氷鋳型形成連続材料から構成されたマクロポーラススカフォールドに、図１ＡのＢＮＣを組み込むことによって、第２のアセンブリ・レベルを形成するための、例示的なプロセスを示す。いくつかの実施形態では、使用前に、材料の個々のシート、繊維、またはリボンのもつれを解きまたは分散させるために、使用前にスカフォールド材料を超音波処理してもよい。上述の氷鋳型形成手法は、例えばキトサン、寒天、およびポリマー樹脂などのその他のポリマーに適用することができる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、リグニンを解重合するための方法、即ち上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかが、リグニンを解重合しまたはリグニンの解重合を容易にするために使用される、リグニン解重合法を対象とする。解重合されるリグニンは、任意のリグニン含有材料とすることができる。前駆体リグニンは、天然に見出されまたは当技術分野で公知の広く様々なリグニン組成物のいずれかとすることができる。
【００５４】
当技術分野で公知のように、均一なリグニン組成物は天然に見出されていない。リグニンは、植物種の間で著しい組成変動を示すランダムポリマーである。環境条件、年数、および処理方法などの多くのその他の条件は、リグニン組成に影響を及ぼす。リグニンは、３つのアルコール単位、即ちｐ−クマリルアルコール、グアヤシルアルコール、およびシナピルアルコールの比が主に異なる。ｐ−クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、およびシナピルアルコールの重合は、それぞれリグニンポリマーのｐ−ヒドロキシフェニル（Ｈ）、グアヤシル（Ｇ）、およびシリンジル（Ｓ）成分を形成する。前駆体リグニンは、Ｈ、Ｇ、およびＳ成分の広く様々な相対重量パーセント（ｗｔ％）のいずれかを有することができる。リグニンの天然種とは別に、リグニンが処理された手法に基づいてさらなる組成変動がある可能性がある。例えば前駆体リグニンは、クラフトリグニン、亜硫酸リグニン（即ち、リグノスルホネート）、または硫黄フリーリグニンとすることができる。
【００５５】
リグニンは、地球上で最も豊富な芳香族ベースのバイオポリマーであるが、その化学組成および物理構造の明らかなランダム性により、変換およびバイオ変換するのに化学的に扱い難い。リグニンは、維管束植物の細胞壁に強度、剛性、および保護をもたらす多糖繊維間の「グルー」または「エポキシ」と見なすことができる。化学的見地から、リグニンは、アリール結合、エーテル結合、および炭素間結合を介したコニフェリル、シナピル、およびクマリルアルコールを含むフェニル−プロパノイド分子の重合によって形成された、高度に不均質なポリマーである。
【００５６】
エタノール１００ガロンがバイオマス１トンから生成され、かつバイオマス（例えば、木材または草）がリグニンを平均で２０％含有するという仮定に基づき、年に１億ガロンの能力で運転される生物精製所はリグニン材料を約２００，０００トン生成し得ることを、迅速に推定することができる。２０２０年までに米国だけで、エタノール約３５０億ガロンと同等の、ガソリンの２０％を代替するために、年にリグニンを合計で約７億トン生成することになると考えられる。ほとんどが製紙工業の副生成物としてのクラフトリグニンである、リグニンの実際の生成は、世界中で年に約９千万トンである。言い換えれば、世界中でのリグニンの生成は、１桁超増大すると考えられる。
【００５７】
リグニンは、適用例および化学純度の程度に基づいて、低または高価格の生成物に使用することができる。最近まで、リグニン生成物の市場は、その燃焼から誘導された回収エネルギーに比べ、単離および精製のコストを補うほど十分には大きくなく、競争もなく、または魅力的でもなかった。これは主に、油のコストが依然として十分に低いからであり、供給物が、化学および材料工業用に構成要素を提供するのに十分高いからである。しかしバイオ燃料およびバイオ製品の同時生成に基づく炭水化物の経済枠組みでは、変換専用の高純度単離リグニンは、同時焼成で使用される場合、＄０．０４に比べて原材料ｋｇ当たり＄１．１０と推定することができる。低価格の適用例は、ほとんどが分散剤、炭素隔離のための土壌調整剤、肥料および農薬用の吸着剤、ならびに抽出後にさらなる変換をほとんどまたは全く必要としない燃料を対象とする。リグニンの解重合を必要とする高価格の適用例は、フェノール前駆体（例えば、ＤＭＳＯ、バニリン、フェノール、および芳香族化合物）と、ポリマー成分（例えば、エポキシ樹脂、ポリウレタンフォーム、フェノール樹脂粉末、炭素繊維、およびグルー、および結合剤）の生成を含む。
【００５８】
天然では、リグニンの変換は、特殊な微生物、特に真菌および細菌によって行われる。リグノセルロース系の細菌および真菌は、バイオマスのセルロース画分に接触するためにリグニンを解重合する能力を有する。そのために、リグノセルロース系細菌および真菌は、有機酸およびＨ２Ｏ２生成カタラーゼと共にラッカーゼ、オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼを含むオキシドレダクターゼ酵素のアレイを排出する。最も強力なオキシドレダクターゼ酵素は、リグノセルロール分解専用の、白色腐朽菌として公知の特殊な真菌群によって生成される。様々なタイプの真菌ペルオキシダーゼは、それらの基質の性質が異なる。
【００５９】
リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ、Ｅ．Ｃ．  １．１１．１．１４）は、いくつかのモデル化合物においてＣ−Ｃ結合の酸化的切断を触媒し、ベンジルアルコールを酸化してアルデヒドまたはケトンにする。リグニンペルオキシダーゼにより触媒された典型的な反応は、Ｃα−Ｃα切断、Ｃα酸化、アルキルアリール切断、芳香環開裂、脱メチル化、ヒドロキシル化、および重合である。リグニンペルオキシダーゼは、白色腐朽担子菌におけるリグニンの酸化破壊に関与する。リグニンペルオキシダーゼは、Ｈ２Ｏ２による、アリール陽イオンラジカルへの非フェノール系芳香環の酸化を触媒する。典型的な例は、ベラトリル陽イオンおよびベンジルラジカルの中間形成を介した、ベラトリルアルコール（３，４−ジメトキシベンジルアルコール）からベラトリルアルデヒド（３，４−ジメトキシベンズアルデヒド）への酸化である：ベラトリルアルコール＋Ｈ２Ｏ２→ベラトリルアルデヒド＋２Ｈ２Ｏ。マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ；Ｅ．Ｃ．  １．１１．１．１３）は、レドックス電位（最大で１．１Ｖ）がＬｉＰ（最大で１．５Ｖ）よりも低く、リグニンおよびフェノール化合物のＭｎ媒介性酸化を触媒する。この酵素は、Ｈ２Ｏ２によるＭｎ（ＩＩ）からＭｎ（ＩＩＩ）への酸化を触媒する。高度に反応性のあるＭｎ（ＩＩＩ）は、ジカルボン酸の存在下でのキレート化を介して安定化する：２Ｍｎ（ＩＩ）＋２Ｈ＋＋Ｈ２Ｏ２→２Ｍｎ（ＩＩＩ）＋２Ｈ２Ｏ。ＭｎＰの目的は、木質化細胞壁に拡散する小さくかつ強力な酸化剤を発生させること、およびその内部からのリグニンの解重合を実現することである。万能ペルオキシダーゼ（同義語  混成ペルオキシダーゼ、マンガン−リグニンペルオキシダーゼ：ＶｅＰ  ＥＣ  １．１１．１．１６）は、全く新しいリグニン分解酵素であり、マンガンペルオキシダーゼ（Ｍｎ（ＩＩ）の酸化）、リグニンペルオキシダーゼ（非フェノール系芳香族化合物のＭｎ非依存性酸化）、および植物ペルオキシダーゼ（ヒドロキノンおよび置換フェノールの酸化）の触媒の性質を組み合わせたものである。上述のペルオキシダーゼのいずれか１種または組合せは、本明細書に記述されるリグニン解重合プロセスで使用されてもよい。
【００６０】
第１の実施形態において、リグニン含有材料は、リグノセルロース材料の前処理プロセスから一般に提供されるように、木材の他の成分（例えば、セルロースおよびヘミセルロース成分）から部分的にまたは実質的に分離されたリグニンの形をとり、その詳細は、リグノセルロースの処理および変換の技術分野で周知である。前処理プロセスは、リグニン含有供給源のその他の成分からリグニンを分離するように、またはリグニンとその他の成分との間の結合を弱めるように、働く。当技術分野でも周知のように、リグニンは、例えば抽出によってさらに単離されてもよい。第２の実施形態では、リグニン含有材料は、前処理されていてもいなくてもよい紙または厚紙などのリグニン含有消耗生成物である。第３の実施形態では、リグニン含有材料は、解重合するのにリグニンを十分利用可能にするするためにその全てが一般に前処理される、木材チップ、草、（例えば、スイッチグラスおよび混合草）、トウモロコシ茎葉（例えば、トウモロコシ植物の葉、皮、茎、または穂軸）、サトウキビ、おが屑、麻、またはこれらの組合せなどの、リグニン含有天然供給源（即ち、未処理のリグノセルロース材料）である。
【００６１】
リグニン解重合プロセスでは、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかを、リグニンの部分的なまたは完全な解重合が酵素結合磁性ナノ粒子またはその凝集体のフリーラジカル活性によって生ずる条件下、リグニン接触材料に接触させる。ＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造、およびリグニン含有材料は、リグニン含有材料の前処理プロセスで使用される水溶液などの水溶液中でそれらを組み合わせることにより、一般に接触させる。いくつかの実施形態では、室温条件（例えば、少なくとも１０、１５、１８、２０、または２２℃であり、かつ最大で２５℃、３０℃、または４０℃であり、またはそれらの任意の範囲）を、解重合プロセス中に使用する。その他の実施形態では、高温条件（例えば、４０℃よりも高く、または少なくとも４５、５０、もしくは６０℃またはこれらよりも高い値であり、または最大でＦＲＰ酵素が分解しもしくは活性のかなりの損失を受ける温度）は、解重合プロセス中に使用される。その他の実施形態では、低温条件（例えば、１５℃よりも下、または最大で１０、５、もしくは０℃またはそれよりも低い温度）を、解重合プロセス中に使用する。解重合されることにより、リグニンは破壊されて、その当初の形に比べて短いセグメントになる。完全な解重合は、リグニンの全てのまたはかなりの部分（例えば、少なくとも８０、９０、または９５％）が、リグニンの基本構成単位、即ちコニフェリル、シナピル、およびクマリルアルコール、ならびにこれらの誘導体の少なくとも１つまたはそれ以上に変換される。部分解重合では、一般に、リグニンの８０％未満、または最大で７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、もしくは１％が１次構成単位に変換され、リグニンの残りは、２、３、４、またはそれよりも多くの多数の（最大でも１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００）の構成単位（例えば、クマリル、コニフェリル、およびシナピルアルコールからそれぞれ誘導されたｐ−ヒドロキシフェニル、グアヤシル、およびシリンジル単位）を含有するセグメントに変換される。異なる適用例には、異なるリグニン解重合度が好ましいと考えられるので、解重合条件は、適切な解重合度が得られるようにまたは他の生成物よりも１種またはそれ以上のタイプの解重合生成物が優先されるように、適切に調節することができる。
【００６２】
各リグニン含有材料は、各構成単位を異なる分布および相対量で有するので、解重合から生成された各生成物の相対量は、リグニン含有材料のタイプに非常に依存する。その他の解重合生成物、例えば芳香族アルデヒド、ケトン、アルコール、および酸は、一般に重合プロセス中に、典型的にはより少ない量で生成される。そのようなその他の生成物が望まれない実施形態において、そのような生成物は、ＦＲＰ結合磁性ナノ粒子またはその凝集体の適切な選択も含めた反応条件の調節によって、生成物として有利に最小限に抑えられまたは除外されてもよい。
【００６３】
上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかを、リグニン解重合プロセスに使用することができる。特定の実施形態では、リグニン解重合プロセスで使用される酵素は、ペルオキシダーゼなどのＦＲＰであり、特に、リグニンペルオキシダーゼ、万能ペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、またはこれらの組合せ（そのコア−シェル組合せを含む）などの、リグニン分解ペルオキシダーゼである。ＦＲＰ酵素は、より特別には真菌、微生物、または植物ペルオキシダーゼであってもよい。特定の実施形態では、ＦＲＰ酵素は、グルコースオキシダーゼと組み合わせたペルオキシダーゼ、またはラッカーゼと組み合わせたペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼなどの、２種のＦＲＰ酵素の系である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、リグニン解重合プロセスは、リグニン解重合プロセスで生成された解重合生成物がその他の生成物の生成に使用される下流プロセスと連結される（即ち、一体化される）。下流プロセスは、リグニン解重合生成物を例えばバイオ燃料または工業化学製品、例えばポリマー、プラスチック、ポリマー前駆体（モノマー）、溶媒、接着剤、塗料、界面活性剤、潤滑剤、食品、医薬品、もしくはアロマ、またはこれらの前駆体に変換してもよい。下流プロセスは、あるいは、リグニン解重合生成物を任意のそのような最終生成物に組み込んでもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、リグニン解重合プロセスは、本明細書に記述されるリグニン解重合プロセスで使用するためにリグニン含有材料が提供される、上流プロセスに連結される。上流プロセスは、例えば、紙またはパルプ生成プロセス、バイオマスからバイオ燃料へのプロセス（即ち、主にセルロース系材料が加水分解し、バイオ燃料に変換される）、またはバイオマスからエタノールへの発酵プロセス（即ち、主にセルロース系材料が加水分解し、エタノールに変換される）とすることができる。
【００６６】
別の態様では、本発明は、芳香族汚染物質を水から除去するための方法（即ち、水改質法）を対象とする。この方法では、１種またはそれ以上の芳香族物質で汚染された水を、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかと接触させて、芳香族物質を、即ち不溶性材料として沈殿させる。次いで沈殿した（即ち、沈積した）材料を、遠心分離または沈降などによって好ましくはさらに分離し、例えば濾過またはデカンテーションによって水から除去する。いかなる理論にも拘泥するものではないが、芳香族物質は、酵素結合磁性ナノ粒子により生成されたフリーラジカルと反応して、芳香族物質から誘導された重合材料を生成すると考えられる。芳香族汚染物質は、汚染水中でより一般に見出されるものを含めた任意の芳香族物質とすることができる。いくつかの実施形態において、芳香族汚染物質は、ベンゼン、またはベンゼン誘導体、例えばハロゲン化ベンゼン（例えば、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、またはポリ塩化ビフェニル、即ちＰＣＢ）、アルキルベンゼン（例えば、トルエン、エチルベンゼン、またはキシレン）、フェノール系物質（例えば、フェノール、レゾルシノール、カテコール、ポリフェノール、またはクレゾールなどの置換フェノール）、エーテル化ベンゼン（例えば、アニソール）、縮合環化合物（例えば、ナフタレン、またはポリ芳香族炭化水素）、芳香族アミン（例えば、アニリンおよびＮ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキル置換アニリン）、安息香酸化合物（例えば、安息香酸、そのエステル、および安息香酸のヒドロキシ置換誘導体）、または生物活性芳香族化合物（例えば、細菌、真菌、または植物により生成されたような）である。その他の実施形態では、芳香族汚染物質は、フラン、ピラン、ジオキシン、チオフェン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、インドール、およびこれらの誘導体などの複素芳香族物質である。
【００６７】
上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかを、水改質プロセスに使用することができる。特定の実施形態では、水改質プロセスで使用される酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼとオキシダーゼとの組合せなどの、ＦＲＰ酵素である。
【００６８】
別の態様では、本発明は、フリーラジカル・メカニズムによって重合可能なモノマーを重合するための方法を対象とする。この方法では、１種またはそれ以上のタイプのモノマーを、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかと反応させて、モノマーを重合させる。モノマーは、例えば、水改質プロセスのために上記にて提供された物質のいずれかとすることができる。特定の実施形態では、モノマーは、ビニル付加モノマーでありまたはビニル付加モノマーを含む。重合する時、ビニル付加ポリマーが生成される。そのようなモノマーのいくつかの例には、エチレン、プロピレン、ブタジエン、アクリレートおよびそのエステル、メタクリレートおよびそのエステル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、スチレン、ジビニルベンゼン、フッ化ビニル、および塩化ビニルが含まれる。その他の実施形態では、モノマーがフェノール化合物である。重合する時、フェノール樹脂またはポリマーが生成される。重合プロセスは、重合反応、特にフリーラジカル開始重合反応を実施するための技術分野で周知の条件および装置のいずれかを利用することができる。
【００６９】
別の態様では、本発明は、アルケンをエポキシ化するための方法を対象とする。この方法において、アルケンは酸素の存在下で上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかと反応するが、このときＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造は、クロロペルオキシダーゼまたはリパーゼ酵素などの酸素移送酵素を含むことを前提とする。反応は、アルケンをエポキシ化するための技術分野で従来から使用されている温度に比べて著しく低い温度（例えば室温、約２５℃）で有利に実行される。アルケンは、例えばエチレンまたはプロピレンとすることができ、最終生成物は例えばエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドとすることができる。
【００７０】
特定の実施形態では、エポキシ化プロセスは、固定化クロロペルオキシダーゼもしくはリパーゼ、またはその両方を、磁気スカフォールド上に固定化されたＢＮＣで用いる。酵素含有触媒は、磁気反応器と共に（即ち、以下のさらに記述する磁石トラップ法により）、連続流またはバッチ・システムのいずれかで使用されてもよい。連続流システムでは、触媒は、電磁石の磁場によって反応器内に保持される。試薬（アルケンおよび酸化剤）は上流に導入され、反応ゾーン内で酵素と反応する。酸化剤は、例えば過酸化水素、またはクロロペルオキシダーゼがグルコースオキシダーゼと共に使用される場合にはグルコースとすることができる。溶液は、水性もしくは有機（ジオキサンなど）とすることができ、または酵素に対して相溶性がある任意のその他の溶媒とすることができる。連続流は、酵素付近から反応生成物を除去し、阻害レベルの基質および生成物が蓄積されるのを防止する。生成物は、溶解度の差によって典型的には変換プロセスの下流で濃縮され、その後、エポキシド基の不十分な安定性によって２次反応で反応する。バッチ・システムでは、試薬が一般に触媒と混合され撹拌され、触媒は、反応が終了すると磁気的獲得によってバッチから除去される。反応の生成物は、溶解度の差により濃縮され、次いで引き続き反応する。獲得された触媒は、新しいバッチ反応のために再使用することができる。
【００７１】
別の態様では、本発明は、フェノールのハロゲン化のための方法を対象とする。この方法において、フェノールは、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかと反応するが、ＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造はクロロペルオキシダーゼなどのハロゲン化酵素を含むことを前提とする。フェノール反応物は、フェノールそのもの、または任意の適切なフェノール誘導体、例えば上記にて提供されたフェノール化合物のいずれかとすることができる。フェノール生成物は、例えば塩素化、臭素化、またはヨード化フェノール化合物とすることができる。
【００７２】
特定の実施形態では、ハロゲン化プロセスは、磁気スカフォールド上に固定化されたＢＮＣで、固定化クロロペルオキシダーゼを用いる。酵素含有触媒は、連続流またはバッチ・システムのいずれかで、磁気反応器と共に（即ち、以下にさらに記述するように、磁石トラップ法により）使用されてもよい。連続流システムにおいて、触媒は、電磁石の磁場によって反応器内に保持される。試薬（フェノールまたはフェノール誘導体、酸化剤、およびＩ−、Ｂｒ−、またはＣｌ−などのハロゲン化物イオン）は、上流で導入され、反応ゾーン内で酵素と反応する。酸化剤は、例えば過酸化水素、またはクロロペルオキシダーゼがクルコースオキシダーゼと共に使用される場合にはグルコースとすることができる。溶液は、水性もしくは有機（ジオキサンなど）、または酵素に対して相溶性のある任意のその他の溶媒とすることができる。連続流は、酵素付近から反応生成物を除去し、阻害レベルの基質および生成物が蓄積されるのを防止する。生成物は、揮発性および溶解度の差に起因して、変換プロセスの下流で典型的には濃縮される。バッチ・システムでは、試薬が一般に触媒と混合され撹拌され、触媒は、反応が終了すると磁気的獲得によってバッチから除去される。反応生成物は、揮発性および溶解度の差によって濃縮される。獲得された触媒は、新しいバッチ反応のために再使用することができる。
【００７３】
別の態様では、本発明は、溶液中での微生物の成長および機能を阻害するための方法を対象とする。この方法では、微生物を含有する水（即ち、微生物汚染水）を、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかで処理するが、このＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造は、ペルオキシダーゼ、またはより詳細にはラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）、もしくはグルコースオキシダーゼと組み合わせたラクトペルオキシダーゼなどの、ＦＲＰ酵素を含むことを前提とする。
【００７４】
ＬＰＯは、チオシアネートおよび過酸化水素の存在下で広範な抗真菌および抗細菌活性を示すので、ＬＰＯ系は、微生物感染に対する身体の自然防御メカニズムの１つであると見なされる。その結果、ラクトペルオキシダーゼの用途は、食品、化粧品、および点眼液の保存において見出されている。さらにラクトペルオキシダーゼは、歯科および創傷治療での用途が見出された。ラクトペルオキシダーゼは、抗腫瘍および抗ウイルス薬としての用途も見出すことができる。ラクトペルオキシダーゼ基質は、臭化物、ヨウ化物、およびチオシアネートを含む。この酵素の作用を通して生成された酸化生成物は、強力な殺菌活性を有する。ラクトペルオキシダーゼ触媒は、以下に記述する磁気トラップ反応器と組み合わせて使用して、チオシアネート、臭化物、およびヨウ化物からそれぞれ、広範に作用するヒポチオシアナイト、次亜臭素酸塩、および次亜ヨウ素酸塩イオンを生成することができる。次いでこれらのイオンは流出液と共に放出され、下流で微生物に対する酸化ストレスを誘発し、それによって流出液を除染する。あるいは触媒は、バッチ反応器内でまたは水溶液中の表面で使用され、次いで磁化収集器により再度獲得することができる。例えば細菌に対するヒポチオシアネートの作用は、スルフヒドリル（ＳＨ）酸化によって引き起こされることが報告されている。細菌性細胞質膜における−ＳＨ基の酸化は、グルコースを輸送する能力の損失と、カリウムイオン、アミノ酸、およびペプチドの浸出ももたらし、それによって微生物の死滅が誘発される。ラクトペルオキシドの生成物は、一般に安全かつ非変異原性と見なされ、したがって食品および健康の用途に適合可能である。
【００７５】
別の態様では、本発明は、二酸化炭素をメタノールに変換するための方法を対象とする。この方法では、二酸化炭素を上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかと反応させるが、このＢＮＣおよびＢＮＣ−スカフォールド構造は、少なくとも２、３、または少なくとも４種のデヒドロゲナーゼ酵素を含有するデヒドロゲナーゼ系を含むことを前提とする。デヒドロゲナーゼ酵素系は、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ、例えばＥＣ  １．２．１．２；またはフェリシトクロム−ｂ１オキシドレダクターゼ、例えばＥＣ  １．２．２．１）を、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ  １．２．１．２）またはシトクロムをホルメートに加えたものと組み合わせたもの；フェリシトクロム−ｂ１オキシドレダクターゼ（例えば、ＥＣ  １．２．２．１）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）；およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．１０）を含むことができる。
【００７６】
二酸化炭素はギ酸デヒドロゲナーゼによってギ酸に変換され、ギ酸はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼによりホルムアルデヒドに変換され、ホルムアルデヒドはアルコールデヒドロゲナーゼによってメタノールに変換される。グルコースデヒドロゲナーゼは、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼとそれらの基質（ＣＯ２、ギ酸、および／またはホルムアルデヒド）およびＮＡＤＨとの反応からＮＡＤ＋補因子を再生利用している。理論上のモル比は、ＣＯ２  １分子をメタノールに変換するのに対してグルコースが３分子である。特定の実施形態では、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼを個々にまたは一緒にＢＮＣ内に捕捉する。次いでＢＮＣを、磁気スカフォールド上に鋳型形成する。次いでグルコースデヒドロゲナーゼで作製されたＢＮＣを、先の触媒に添加する。この構成は、補因子のトラップおよび再生利用を可能にし、それらのギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ付近での使用を最大限にする。
【００７７】
あるいはＣＯ２変換プロセスは、ＣＯ２からギ酸を合成するためにギ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ触媒を使用し、次いでギ酸からホルムアルデヒドを合成するためにホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼ触媒を使用し、次いでホルムアルデヒドからメタノールを合成するためにアルコールデヒドロゲナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを使用する３つの異なる逐次反応と切り離すことができる。流動反応器内の個別の反応ゾーン、または個別のバッチ・プロセスを、使用することができる。したがってプロセスは、ギ酸、ホルムアルデヒド、および／またはメタノールを生成するのに使用することができる。
【００７８】
上述のプロセスのいずれかでは、ＢＮＣ−スカフォールド構造は、最終生成物の汚染を予防するために磁気分離によって有利に獲得することができる。さらに、本明細書に記述されるＢＮＣ−スカフォールド構造のその他の利点は、多くの場合、それらの活性を維持しかつ獲得後に再形成できるという能力であり、この能力によってこれらの構造を獲得後に再使用可能になり、それによって酵素の総代謝回転数（ＴＴＮ：ｔｏｔａｌ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒ）が増加する。数サイクル後の活性の損失を示すＢＮＣ−スカフォールド系は、有利に、容易に抽出し濃縮してそれらの固体形態にすることにより、無駄を少なくしプロセスをより効率的にすることができる。特に金属被覆されたＢＮＣは、新たな機能性酵素により回復し再使用するために、酵素の変性、超音波処理、および精製によって再度目的を果たすことができる。ＢＮＣ−スカフォールド構造は、より低い強度の磁場を使用するプロセス用途に魅力あるものである。ＢＮＣ−スカフォールド構造は、安定なナノサイズのメソポーラス構造を維持し、それが磁気触媒の全体密度および質量磁化率を増大させながら酵素活性を維持するのを助ける。これらの超微細構造は、永久小型磁石および弱場電磁石によって生成された外部磁場によって、容易に取り扱い易くなる。反応溶液は、ＢＮＣ−スカフォールド構想が磁気的に捕えられている間にパージし置き換えることができ、したがって酵素がプロセス・レベルの活性を維持する限り、ＢＮＣ−スカフォールド構造の連続使用が可能になる。
【００７９】
さらに別の態様では、本発明は、化学反応を容易にする磁気粒子を含む液相化学反応の空時収量および／または総代謝回転数を増大させるための、磁気トラップ法を対象とする。この方法では、上述のＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールド構造のいずれかを含む液相化学反応を、１つまたは複数の電磁石による複数の磁場（即ち、「動的磁気トラップ反応器（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔｒａｐ  ｒｅａｃｔｏｒｓ）」または「ＤＭＴＲ」）に供し、これらの磁場のそれぞれは、磁気粒子を空間的に閉じ込める所望の磁気強度の磁場、液相化学反応での相対位置、および相対運動が得られるように独立して調節されてもよい。この方法では、複数の磁場の磁気強度、相対位置、および相対運動は、電流の流れが適切に制御されまたは調節された電磁石のシステムによって提供される。特に空時収量は、反応容積空間が限定されるように磁場を印加することによって増大させることができる。
【００８０】
上述のＢＮＣまたはその階層的触媒アセンブリのいずれかは、磁石トラップ法で使用することができる。特定の実施形態では、ＢＮＣまたはその階層的触媒アセンブリは、移動する外部磁場の影響を受けながら、反応の過程で、「流動的」な手法で有利に振る舞う。流動的運動は、電磁石に引き付けられたときの反応器の壁の影響を受けて潰れるＢＮＣまたは階層的触媒アセンブリの集合（即ち、「クラウド」）によって、特徴付けることができる。そのようにすることによって、酵素の反応の生成物は触媒から排出される。「クラウド」が他の方向に移動する場合、クラウドは新たな基質を吸収して酵素と反応し、次いで「クラウド」が反対側の壁に衝突したときに生成物が再び排出される。この挙動によって磁気スカフォールドは「マイクロポンプ」として機能できるようになるので（即ち、スポンジを絞るのに似ている）、これは磁気スカフォールドの有意な特徴である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、閉じ込めの結果、個別の反応を各反応ゾーン内で実行することができる少なくとも第１および第２の反応ゾーンが得られる。前述の実施形態の目的は、触媒付近での基質および生成物の蓄積を回避することである。酵素によって発生したフリーラジカルは反応性が高く、酵素と反応することができまたは触媒の表面で重合することができる。酵素の全プロセスおよび効率に有害となり得るそのような状態を回避するために、プロセスを、フリーラジカルが発生する反応容積１、および触媒がなくフリーラジカルが互いに反応する反応容積２で、切り離す。磁気触媒は、溶液および試薬が触媒内を流れ、反応し、この流れによって運び去られる間、電磁石により発生した交流磁場によって反応容積１内に維持される。プロセスを制御するパラメータは主に、磁気触媒を閉じ込める誘導磁場の強度および反跳運動の周波数と、反応器内の溶液の流量である。
【００８２】
その他の実施形態において、磁気トラップ法は、反応が終了に到達した後に、動的磁気トラップ反応器を使用することによる磁気粒子の磁気的獲得を含む。この構成では、磁気触媒の全てを獲得するために、電磁石をオンにする。反応の生成物を含有する溶液は、典型的には除去されまたはさらなる処理のために洗い流される。バッチには、一般に新たな溶液が補充され、基質が変換される。典型的には電磁石アレイは、バッチ内の磁気触媒が撹拌されるよう、サイクリング電力オン／電力オフを再開する。触媒がその最終用途に到達したら、触媒を電磁石により獲得することができ、反応器を濯ぎ溶液で満たすことができる。次いで電磁石をオフにして、磁気触媒を自由にし、この触媒を濯ぎ溶液で洗い流すことができる。磁気触媒は、下流の２次プロセスで電磁石の２次アレイにより、濃縮し、濯ぎ溶液から抽出することができる。
【００８３】
磁気トラップ法の特定の実施形態では、電磁石への電流の流れがコンピュータ・プログラムにより制御され、その結果、磁気粒子を空間的に閉じ込める複数の磁場の磁気強度、液相化学反応での相対位置、および／または相対運動の、所望の組が得られる。任意の所望の数の電磁石を使用してもよく、電磁石を、任意の適切な手法で反応容器の周りに位置決めして、例えば反応容積の限定、反応の分離、または磁気粒子の磁気的獲得を実現することができる。電磁石は、２つの電磁石が並んだ２つのアレイ、３つの電磁石が並んだ２つのアレイ、４つの電磁石が並んだ２つのアレイ、２つの電磁石が並んだ３つのアレイ、３つの電磁石が並んだ３つのアレイなど、アレイ状に配置されてもよく、このとき個々の電磁石のそれぞれまたは電磁石の各アレイは独立して動作し制御される。
【００８４】
例えば、図２Ａおよび２Ｂにそれぞれ特に示されるように、電磁石の一重螺旋または二重螺旋の配置構成を使用してもよい。磁気アレイは、磁気触媒を反応ゾーン内に維持しかつ溶液と共に酵素の浸出を防止する、コンピュータ制御されたプログラム可能な電磁石を含む。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、芳香族の重合またはそのような芳香族を含有する水の改質に特に適用される場合、電磁石のアレイは、ＢＮＣまたはＢＮＣ−スカフォールドアセンブリを磁気的に捕えるように適切に動作して、反応容器内の画定されたセクションまたは複数のセクション内でフリーラジカル重合を促進させることができ、それと共に反応容積のその他の部分は、非磁気誘導反応または物理プロセス、例えばポリマー縮合または沈積に利用可能である。芳香族の酸化とその重合との分離は、触媒近くのポリフェノールの形成を防止する。ポリフェノールによる触媒（および酵素）の分子捕捉を、生成物阻害と呼ぶ。分子捕捉による生成物阻害は不可逆的であり、触媒効率が劇的に失われるようになる。さらに、個別の反応器内では、塩または２価の陽イオンなどの凝固剤を含むことにより、またはポリフェノールおよびフリーラジカルを捕える砂や有機材料などの連結面を含むことにより、重合および縮合が反応器の底部で優先的に行われる可能性がある。
【００８５】
磁場の運動は、走査垂直（上および／または下）運動、走査水平（左および／または右）運動（例えば、「ピンポン運動」）、８字形（「８」）運動、斜め上及び下（「Ｖ」）運動、二重斜め（Ｗ運動）、走査水平、斜め下走査水平（Ｚ運動）など、所望の結果に応じて任意の適切な運動とすることができる。その他のタイプの運動は、電磁石により発生した反力により液体の流れが補償されることを前提として、溶液中の触媒の運動を制御することが望ましいと考えられる。運動は、反応器の幾何形状に関係した電磁石の幾何形状と、電磁石の電力をオン／オフするサイクルの結果である。触媒運動の速度は、電磁石の周波数（電力オン／電力オフ）とこれらの磁石からの磁場の強度であって電磁石に提供される電流強度の関数であるものによって決定される。コンピュータ・プログラムは、任意の所望の運動がなされるように考え出すことができる。
【００８６】
例えば、コンピュータ・プログラムは、磁場の交流または「ピンポン」運動が得られるように考え出すことができる。ピンポン運動は、磁石を順次オンにし、このオンになった磁石に対向する磁石を遮断することによって実現される。ピンポン運動を誘発させるためのそのようなプログラムの例は、下記の通りである：
ｉｎｔ  ｐｅｒｉｏｄ＝１０００；／／期間をｍｓｅｃ単位で設定する
ｖｏｉｄ  ｓｅｔｕｐ（）｛
ｐｉｎＭｏｄｅ（６，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｕ軸出力ピンをｐｉｎＭｏｄｅ（６，ＯＵＴＰＵＴ）に設定する；９と対
ｐｉｎＭｏｄｅ（７，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｕ軸出力ピンを設定する；１０と対
ｐｉｎＭｏｄｅ（８，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｕ軸出力ピンを設定する；１１と対
ｐｉｎＭｏｄｅ（９，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｖ軸出力ピンを設定する；６と対
ｐｉｎＭｏｄｅ（１０，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｖ軸出力ピンを設定する；７と対
ｐｉｎＭｏｄｅ（１１，ＯＵＴＰＵＴ）；／／ｖ軸出力ピンを設定する；８と対
｝
ｖｏｉｄ  ｌｏｏｐ（）｛
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（６，ＨＩＧＨ）；／／ｕ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（７，ＬＯＷ）；／／ｕ軸をオフにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（８，ＨＩＧＨ）；／／ｕ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（９，ＬＯＷ）；／／ｖ軸をオフにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（１０，ＨＩＧＨ）；／／ｖ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（１１，ＬＯＷ）；／／ｖ軸をオフにする
ｄｅｌａｙ（ｃｅｉｌ（ｐｅｒｉｏｄ／２））；／／所与の間隔だけ遅らせる
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（６，ＬＯＷ）；／／ｕ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（７，ＨＩＧＨ）；／／ｕ軸をオフにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（８，ＬＯＷ）；／／ｕ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（９，ＨＩＧＨ）；／／ｖ軸をオフにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（１０，ＬＯＷ）；／／ｖ軸をオンにする
ｄｉｇｉｔａｌＷｒｉｔｅ（１１，ＨＩＧＨ）；／／ｖ軸をオフにする
ｄｅｌａｙ（ｃｅｉｌ（ｐｅｒｉｏｄ／２））；／／所与の間隔だけ遅らせる
｝
【００８７】
本発明は、上述の磁気トラップ法を実行するための装置も対象とする。装置は、少なくとも、適切な反応容器材料で構成されかつ少なくとも２つの対向する壁を有する反応チャンバと；少なくとも２つの対向する壁の外面に配置された１つまたはそれ以上の電磁石（典型的には電磁石のアレイ）と；電磁石内の電流の流れを制御するためのコンピュータ・プログラマブル制御器とを含むべきである。電磁石の数は、使用される制御器に基づいてまたは多数の制御器の使用によって、増減される。反応チャンバは、例えばバッチ反応器として、あるいは連続生成用のフローセルとして設計することができる。そのような反応容器の設計および構成は、当技術分野で周知である。典型的な実施形態では、装置は、電磁石のオン／オフ切換えの周波数を制御する１つまたはそれ以上のコンピュータ・プログラマブル制御器を使用することによって、電磁石を個々に制御するための手段も含む。コンピュータ・プログラマブル制御器は、例えば図３に示される電子装置を有していてもよい。図３の図において、プログラマブル電子基板は、例示の目的でのみ示される、例えば１２Ｖ電源および６出力（＋５Ｖ）を用いることができる。マイクロコントローラ制御入力（名称「ＣｔｒＩｎｐ」）は、例えば図４に示される通りとすることができ、この図は、１４本のデジタル入力／出力ピン（その中の６本はＰＷＭ出力として使用することができる）、６個のアナログ入力、１６ＭＨｚ水晶発振子、ＵＳＢ接続、電源ジャック、ＩＣＳＰヘッダ、およびリセット・ボタンを有する典型的な市販のコントローラ・ボード（例えば、Ａｒｄｕｉｎｏ（商標）ＵＮＯ）を示している。各出力は、電磁石または電磁石のアレイを制御することができる。基板には、１２Ｖ電源を備えた外部電力発生器により電力が供給される。＋５Ｖの出力は、地表に対するものである（０／＋５Ｖ）。ＵＳＢポートは、マイクロコントローラ基板をプログラムするのに使用される。
【００８８】
（実施例）
リグニン解重合
ペルオキシダーゼ酵素を、その工業部門での酸化活性の可能性について、十分に調査した。それでもこれらの酵素は、基質阻害を特に生じ易く、それが大規模なペルオキシダーゼをベースにしたバイオテクノロジーの発展を妨げている。本明細書では、真菌性リグニン分解ペルオキシダーゼの活性および回復力が、金被覆磁性ナノ粒子（Ａｕ−ＭＮＰ）に関連して劇的に増大できることを実証する。アセンブリは、遊離酵素系よりも優れた活性を有し、エネルギー供給原料のリグニン成分の高い解重合に適用することができる。結果は、このファミリーの酵素の現行の物理的および生化学的制約を克服するためにかつリグニン触媒の新世代を作成するために、アセンブリが複合酵素系を包含できることを示す。酵素をベースにした触媒は、０．１〜１ｍＭの間にかつ５００ｍＭよりも高いＨ２Ｏ２で、２つの最大値を持つ二峰性の活性を示した。Ａｕ−ＭＮＰは、酵素に最適な濃度範囲では活性を持たない。図５および６に示されるように、２つのタイプの磁性ナノ粒子、Ａｕ−Ｍ９０およびＡｕ−Ｍ６０で作製された触媒の初期速度に差が観察され、Ａｕ−Ｍ９０は、両方の速度に対してより明らかな効果を発揮し且つ最適なＨ２Ｏ２濃度を有していた。Ｍ６０は、６０℃で形成されたマグネタイトのナノ粒子を指し、Ｍ９０は、９０℃で形成されたマグネタイトナノ粒子を指す。形成中の温度は、微結晶サイズに影響を及ぼし、最終的にはナノ粒子の磁気特性に影響を及ぼす。Ｍ９０ナノ粒子は、約１０ｎｍの平均直径であり、一方、Ｍ６０ナノ粒子は、約８ｎｍの平均直径である。
【００８９】
図５は、２．５ｎＭのマンガンペルオキシダーゼ、種々の濃度のＡｕ−Ｍ６０、およびそれらのＢＮＣであって、ｐＨ３．５でマロン酸緩衝液（５０ｍＭ）に加えたものにより触媒されたＤＭＰ酸化速度に対する、Ｈ２Ｏ２の作用を示すグラフである。ｘ軸は、便宜上、ｌｏｇ１０スケール上にある。金によるコーティングは、酵素活性に必要な緩衝液中での磁気コア部（マグネタイト）の溶解を防止する。ＢＮＣ（金被覆ナノ粒子）は、活性を増大させ、マンガンペルオキシダーゼの阻害を低下させる。阻害は、酵素が金被覆ナノ粒子クラスターに埋め込まれた場合、１／５０に少なくなる。ナノ粒子は、過酸化水素のこの濃度範囲（０．００１〜１０ｍＭ）で固有の触媒活性を持たない。
【００９０】
図６は、２．５ｎＭの万能ペルオキシダーゼ、種々の濃度Ａｕ−Ｍ６０、およびそれらのＢＮＣであってｐＨ３．５のマロン酸緩衝液（５０ｍＭ）に加えられたものにより触媒されたＤＭＰ酸化速度に対する、Ｈ２Ｏ２の作用を示すグラフである。ｘ軸は、便宜上ｌｏｇ１０スケール上にある。ＢＮＣ（金被覆ナノ粒子）は、活性を増大させ、万能ペルオキシダーゼの阻害を低下させる。阻害は、酵素が金被覆ナノ粒子に埋め込まれた場合、１／２８に少なくなる。ナノ粒子は、過酸化水素のこの濃度範囲（０．００１〜１０ｍＭ）で固有の触媒活性を持たない。
【００９１】
図５および６に示されるように、Ａｕ−ＭＮＰの濃度を増大させると、ピーク速度は低下するが、Ｈ２Ｏ２の最適濃度はより高い濃度へとシフトした。これは、ＭＮＰの濃度の増加と共に低下するＶｍａｘとして、動態パラメータで反映された。酵素の阻害定数（Ｋｉ）は、Ａｕ−ＭＮＰの濃度の増加と共に増加した。遊離マンガンペルオキシダーゼに比べ、阻害はＡｕ−Ｍ９０の場合に１／５０に減少し、Ａｕ−Ｍ６０の場合には約３０倍であった。顕著なことに、ＢＮＣに関して観察された速度の相対的な増加を推進させたのは、より低いＫｍおよびより高いＫｉ値であると考えられる。金によるコーティングは、酵素活性に必要な緩衝液中への磁気コア部（マグネタイト）の溶解を防止する。金コーティングがないと、マグネタイトナノ粒子は、ｐＨ５よりも低いマロン酸中で、典型的には１０分で完全に溶解する。ＢＮＣ（金被覆ナノ粒子）は、活性を増大させ、マンガンペルオキシダーゼの阻害を低下させる。
【００９２】
ペルオキシダーゼをベースにした触媒系を、草バイオマスの解重合に適用し、可溶性芳香族が生成された後、ＵＶおよび蛍光分光法を行った。この適用例では、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼを等モル比で組み合わせた。過酸化水素を直接使用した初期試験は、使用された酵素の量について結論を出さなかった。バイオマスの任意の活性を検出するのに必要なペルオキシダーゼの濃度は、一度に添加された場合に阻害的になると考えられる。酵素の安定性は、反応の過程を通してより低い酸化剤濃度を維持することによって、著しく改善することができる。この場合、バックグラウンドの酸化は、過酸化物の入力を慎重に制御することにより過酸化水素の濃度を低レベルに保つことによって低減される。過剰な過酸化水素「遮断」酵素の作用は周知であり、帰還ループでＨ２Ｏ２供給流を厳密に制御するように、複合反応器デザインによって典型的には対処されてきた。この問題を回避するために、ペルオキシダーゼ酵素と周知のグルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）などのペルオキシダーゼ生成酵素とを連結させることによって、Ｈ２Ｏ２のｉｎ  ｓｉｔｕ生成が選択された。Ｇｏｘは、酸素の存在下、グルコースを過酸化水素およびグルコノラクトンに変換する。
【００９３】
グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ系を組み合わせて、バイオマス変換のために金被覆ナノ粒子と共に組み立てた。図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、および８Ｃに示されるように、ペルオキシダーゼ＋オキシダーゼの混成系は、酵素単独よりもバイオマスに対して高い活性を有する。図７Ａは、金被覆ＢＮＣに固定化されたまたは金被覆ＢＮＣ内にはないマンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼの混合物で処理した後の、上澄みのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。図７Ｂは、参照バイオマス・スペクトルを差し引いたときの、同じスペクトルを示す。これらの実験条件においてかつ酸化剤として過酸化水素を使用すると、酵素は、それらがＢＮＣ内に固定化された場合、バイオマスからの芳香族化合物の放出に対して活性を有するだけである。バイオマス・スラリーに過酸化物を直接添加することにより、酵素の基質阻害を誘発させる可能性がある。したがって過酸化物は、阻害レベルへの到達を回避するために、少量ずつ漸増的に添加する必要がある。これを回避するために、ペルオキシダーゼＢＮＣ内にグルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）を添加することにより、過酸化水素のｉｎ  ｓｉｔｕ生成を実施した（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。Ｇｏｘは、酸素の存在下、グルコースをグルコノラクトンおよび過酸化水素に変換する。このオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ系は、ペルオキシダーゼによる消費速度を満たすように、オキシダーゼによる過酸化水素の生成速度の調節を可能にする。適切な定常状態条件において、過酸化水素は阻害濃度に到達しない。触媒（ＢＮＣ）を実際のバイオマスに関して試験し、芳香族分子の放出（リグニンから）をＵＶ範囲（対照サンプルに対して補正されかつ差し引かれたスペクトル）でモニタした。図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃを比較することにより、ペルオキシダーゼ酵素４モルに対してＧｏｘが１分子という最適な比が、より適切であることが見出された。マンガンペルオキシダーゼ、万能ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼを埋め込むＢＮＣの活性は、遊離酵素系に比べて実際のバイオマスに関し約３０％高くなることが見出された。実際のバイオマスでは、図８Ｂおよび８Ｃで示されるように、Ａｕ−ＭＮＰは、過酸化物の濃度が遊離酵素に対してより有害である場合、阻害から保護する。
【００９４】
ＢＮＣは、マンガンペルオキシダーゼおよび万能ペルオキシダーゼが組み合わされてかつマンガンの存在下で使用される場合、バイオマスからの可溶性芳香族の放出を増大させる。金被覆磁性ナノ粒子で作製されたＢＮＣは、再使用し易くするために、磁気スカフォールドに固定化することができる。過酸化水素の生成速度は、ＢＮＣ内のグルコースオキシダーゼの濃度を修正することによって制御することができる。しかし、より多くの金を持つ金被覆ナノ粒子（例えば、ＡｕＭ９０）は、より高い過酸化水素濃度からのより低い酵素阻害に起因して、より高い変換率を提供する。
【００９５】
フェノール除去
この実施例では、磁性ナノ粒子と組み合わせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含有する階層的混成触媒の新しいファミリー、およびそのミクロ粒子への組込みと、その高度酸化プロセスおよびフェノールの除去での使用について報告する。階層的混成触媒は、図９に示されるプロセスによって組み立てることができる。混成ペルオキシダーゼ触媒は、遊離ＨＲＰよりも３倍高い活性を示し、類似の条件下で遊離ＨＲＰに比べて３倍多いフェノールを除去することができる。この場合のフェノールは、フェノール化合物を代表するモデル分子であり；フェノール除去に対するＢＮＣの効能を評価した。
【００９６】
図１０に示されるように、磁気スカフォールド上でのＢＮＣの鋳型形成は、遊離酵素よりも効率的なＢＮＣトラップ酵素の活性を変化させない。結果は、全ての系がフェノールを活発に除去するが、ＢＮＣは、同じ濃度のＨＲＰに関して遊離酵素よりも効果的であることを示す。さらに、９０％超のフェノール除去に到達するには、ＢＮＣで必要とされるＨＲＰの量は、遊離ＨＲＰで必要とされる場合よりも１／３〜１／４に減少する。
【００９７】
磁気スカフォールド上でのＢＮＣのアセンブリは、図１２Ａおよび１２Ｂの顕微鏡写真に示されるように、磁気ミクロ粒子のＢＮＣとの比によって制御することができる。図１２Ａには、サンプル・ホルダ面の表面で見ることができる、過剰なＢＮＣがある。図１２Ｂでは、過剰なＢＮＣを獲得するのに追加の磁気スカフォールドが添加され、その結果、遊離ＢＮＣは存在しない。前述の結果は、階層的構造を作成するための、ＢＮＣを鋳型形成するプロセスを実証する。そのような構造の少なくとも１つの利点は、図１１Ａおよび１１Ｂに示されるフェノール除去の結果に例示される。図１１Ａに比べ、鋳型形成されたＢＮＣ（図１１Ｂ）は、容易に除去することができ、バッチ条件で数回の反応サイクルの間活性を保持することができる。遊離酵素の活性は最初のサイクル後に素早く降下するが、鋳型形成されたＢＮＣは、遊離酵素に比べ、これらのバッチ条件で５サイクル後に有意な活性を保持する。
【００９８】
一般にＨＲＰは、Ｈ２Ｏ２の存在下、フェノール化合物の酸化を触媒し、それによって
フリーラジカルが生成される。フェノキシラジカルは、非酵素プロセスで引き続き互いに反応して、ポリマーを縮合しまたは形成する。連続流状態で階層的触媒を使用するために、電磁石で構成された反応器システムを、本明細書では設計した。このシステムを、図１３および図１４に示す。これらの図は、それぞれ、Ｖ字形構成およびＩ字形構成を示す。電磁石により促進される触媒の前後運動は、触媒を、反応器の所与の反応ゾーン内に維持する。触媒の運動は、電磁石アレイの幾何形状、電磁石の電力供給のオン／オフ順序、および電磁石により発生した磁場の強度によって推進される。フェノールおよび芳香族の改質に適用すると、この構成は、反応器の容積内に反応ゾーンを隔離することが可能になる。
【００９９】
フェノールの場合、上述のように適切な電磁石構成を使用して、図１７に概略的に示されるようにフリーラジカルの生成をポリフェノールの重合から切り離すことができる。酵素（およびＢＮＣ内に捕えられた酵素）はフェノールをそのフリーラジカル形態に酸化する。これらの高度に反応性のあるラジカルは、互いに反応してポリフェノールを形成する。これらのポリフェノールは、凝固剤または２価の塩を含めることによってさらに縮合することができる。上述のフェノール除去（重合）プロセスを、図１５に概略的に示す。このスキームの右側部分に示される褐色粒子は、ＢＮＣによる重合から得られたポリフェノールである。ポリフェノールのこれらのマイクロメートルからミリメートルのサイズの粒子は、沈積または濾過によって容易に除去することができる。
【０１００】
水改質用途のためのそのような反応器の一体化の例を、図１６に示す。磁気反応器は、水の流れに対して酵素ベースの触媒を維持し、汚染された流体のリザーバと受容リザーバとの間に配置される。重合した汚染物質を、砂またはその他の粒状材料などの粒状床に通過させることによって、水から分離する。水は、汚染の深刻度に応じてシステム内を数回循環させることができる。
【０１０１】
上述の混成触媒は、基質阻害を低減させ、反応生成物からの不活性化を制限するが、これは遊離酵素または従来固定されてきた酵素では一般的なことである。再使用可能性は、ＨＲＰ／磁性ナノ粒子混成体がミクロン・サイズの磁気粒子上に担持されかつ上述の特別に設計された磁気駆動式反応器により閉じ込めることができる場合に改善される。混成触媒の報告された性能は、それらの触媒をいくつかの工業的なおよび環境的な用途に魅力あるものにし、遊離酵素または従来固定化されてきた酵素の使用を妨げてきた制約のほとんどを排除することにより、実用的な用途への未知を開く。
【０１０２】
現時点で何が本発明の好ましい実施形態と見なされるかを図示し記述してきたが、当業者なら、添付される特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に存在する様々な変更および修正を行うことができる。
【図１Ａ】
0006410721.tif 000002
【図１Ｂ】
0006410721.tif 000003
【図２Ａ】
0006410721.tif 000004
【図２Ｂ】
0006410721.tif 000005
【図３】
0006410721.tif 000006
【図４】
0006410721.tif 000007
【図５】
0006410721.tif 000008
【図６】
0006410721.tif 000009
【図７Ａ】
0006410721.tif 000010
【図７Ｂ】
0006410721.tif 000011
【図８Ａ】
0006410721.tif 000012
【図８Ｂ】
0006410721.tif 000013
【図８Ｃ】
0006410721.tif 000014
【図９】
0006410721.tif 000015
【図１０】
0006410721.tif 000016
【図１１】
0006410721.tif 000017
【図１２】
0006410721.tif 000018
【図１３】
0006410721.tif 000019
【図１４】
0006410721.tif 000020
【図１５】
0006410721.tif 000021
【図１６】
0006410721.tif 000022
【図１７】
0006410721.tif 000023