(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、（ｉ）０．５％（ｗ／ｖ）を超える量のアラントインと前記タンパク質調製物を接触させるステップ、（ｉｉ）トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、ヒスチジン、ヒスタミン、ポリヒスチジン、アルギニン、ポリアルギニン、リジン、ポリリジン、及びポリアリルアミンよりなる群から選択される少なくとも１種類の第１の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と前記タンパク質調製物を接触させるステップであって、前記第１の表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は前記所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、ステップ、及び（ｉｉｉ）前記タンパク質調製物を前記少なくとも１種類の第１の表面結合リガンドから分離するステップであって、１種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ正味電荷又は電荷中性のどちらかである、ステップを含み、前記所望のタンパク質が抗体である、方法。
【請求項２】
前記第１の表面結合リガンドが、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ相互作用、水素結合及びそれらの組合せからなる群から選択される更なる化学官能性を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｉｉ）の接触ステップが、さらに、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合及びそれらの組合せよりなる群から選択される化学官能性を与える少なくとも１種類の追加の表面結合リガンドと前記タンパク質調製物を接触させるステップを含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の表面結合リガンド上の正味電荷が正である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の表面結合リガンドが、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、及びデフェロキサミン（デスフェリオキサミン）からなる群から選択される一つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質調製物が（ａ）約０．６から約１％、（ｂ）約１から約２％、（ｃ）約２から約５％、（ｄ）約５から約１０％、（ｅ）約１０から約２５％及び（ｆ）約２５から約５０％からなる群から選択される過飽和濃度で前記アラントインと接触する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質調製物の伝導率が約０．１ｍＳ／ｃｍから約４０ｍＳ／ｃｍの範囲を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質調製物の伝導率が約４０ｍＳ／ｃｍから約２００ｍＳ／ｃｍの範囲を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された前記操作条件が、前記少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への前記所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに十分高く前記タンパク質調製物の伝導率を選択することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された前記操作条件が、前記少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への前記所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値よりも約０．００１％から約４００％高い前記タンパク質調製物の伝導率を選択することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記操作条件のｐＨが、前記所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの固体表面が粒子又は粒子の複合体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの固体表面が繊維又は繊維の複合体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの固体表面が膜又は膜の複合体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの固体表面がモノリス又はモノリスの複合体を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質調製物が細胞培養収集物を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質調製物が精製細胞培養収集物を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質調製物が組換えタンパク質を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法後、前記タンパク質調製物が、低下した凝集体含有量を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記凝集体含有量が、（ａ）約５０％から約９９％、（ｂ）約２５％から約５０％、（ｃ）約１０％から約２５％、（ｄ）約５％から約１０％、（ｅ）約１％から約５％、及び（ｆ）約０．１％から約１％からなる群から選択される範囲の量だけ低下する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記調製物中の凝集体混入物を低減する少なくとも１種類の有機添加剤と前記タンパク質調製物を接触させるステップを含み、前記有機添加剤が、正イオン、負イオン、有機溶媒、有機ポリマー及び界面活性剤からなる群から選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、（ｉ）０．５％（ｗ／ｖ）を超える量のアラントインと前記タンパク質調製物を接触させるステップ、（ｉｉ）イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ジエチルアミントリアミンペンタ酢酸、ニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びポリアスパラギン酸よりなる群から選択される少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面と前記タンパク質調製物を接触させるステップであって、前記表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は前記所望のタンパク質が前記少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、ステップ、及び（ｉｉｉ）前記タンパク質調製物を前記少なくとも１種類の表面結合リガンドから分離するステップであって、１種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ正味電荷又は電荷中性のどちらかである、ステップを含み、前記所望のタンパク質が抗体である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の記載
本願は、２０１３年２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７６１，６４６号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本明細書に開示した実施形態は、抗体を含めたタンパク質の精製のための方法及び材料に関する。特に、実施形態は、凝集体の含有量を低減する方法、タンパク質の標的精製レベルを得るためのこれらの能力と別の精製方法の統合に関する。
【背景技術】
【０００３】
不自然なヘテロ凝集体が宿主細胞由来の混入物とインビトロ細胞培養法によって生成される組換えタンパク質の間で自然に形成することが示された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。これらのヘテロ凝集体は、次の２つの点で不自然とみなすことができる。１）構成混入物は、生きている非ヒト宿主細胞によって分泌される、又は非ヒト宿主細胞が死後溶解すると培地中に放出される、非ヒト起源のものであることが多い。生きているヒトにおいては、かかる非ヒト混入物は存在しない。２）構成混入物は、死細胞成分が急速に除去されるヒト生体内システムに比較して高濃度に蓄積する。したがって、組換え生成物は、生物系では一般に生じない濃度で高レベルの強い相互作用混入物に曝される。一方、組換えタンパク質の発現レベルが高いと、その組換えタンパク質は、これらの非ヒト混入物との非特異的結合に適した基質となり、多様な組成の望ましくないヘテロ凝集体の形成を促進する。
【０００４】
抗体と安定な結合を形成する混入物の具体的出所は必ずしも知られていない（例えば、非特許文献１、前掲）。一部の試みはＤＮＡ混入物に集中し、可能性のある他の混入物の具体的出所はほとんど注目されていない（非特許文献４及び非特許文献５、前掲）。抗体調製における宿主混入物と凝集体の結合を示す一部の試みは、クロマチン異化産物を含む混入物に特に集中している（非特許文献２、非特許文献３、前掲）。これらの例においては、凝集は、ヒストン、ＤＮＡなどのクロマチン異化産物に対する抗体の免疫特異性を介して直接行われ得る。クロマチン異化産物は、非特異的相互作用によって抗体と安定な複合体を形成する能力もあることが示された。したがって、クロマチン異化産物を含まない、抗原に対して公知の免疫特異性を有するモノクローナル抗体は、死んだ宿主細胞の核に由来するヌクレオソーム、ヒストン及びＤＮＡと多様な種類の極めて安定な凝集体を形成することができる（非特許文献６）。特に、クロマチン異化産物は、高分子量（ＨＭＷ：ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）凝集体において高度に発現される。ＨＭＷ凝集体は、療法中和（ｔｈｅｒａｐｙ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）抗体の形成の促進に関与が疑われるので、特に関心が高い。ＨＭＷ凝集体は、一般に、対象となる小さい複数の抗体よりもサイズの大きい凝集体として定義される。
【０００５】
ヘテロ凝集体を解離させると予想され得る薬剤による抗体調製物の処理は無効であることが判明した。例えば、高濃度の尿素、塩又はこれら２つの組合せを使用してもＩｇＭ混入ヘテロ凝集体を実質的に解離させない（非特許文献４、前掲）。多数のこうした凝集体は４Ｍグアニジンなどの強いカオトロープ中でも安定であることが判明した。
【０００６】
クロマトグラフィカラムに結合したタンパク質の溶出前（ｐｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ）洗浄を実施すると幾らかの改善を助けた。尿素、アルコール及び界面活性剤が溶出前洗浄されたプロテインＡアフィニティクロマトグラフィは、尿素、塩及びＥＤＴＡをプロテインＧアフィニティクロマトグラフィと組み合わせた溶出前洗浄のように（非特許文献３、前掲）、洗浄なしよりも効果的にヘテロ凝集体レベルを低減することが示された（非特許文献１、前掲）。尿素が溶出前洗浄されたアニオン交換クロマトグラフィは、尿素洗浄なしよりも効果的にヘテロ凝集体を低減することが示された（非特許文献４、前掲）。カチオン交換クロマトグラフィは、溶出前ＥＤＴＡ洗浄の方が洗浄なしよりも効果的にヘテロ凝集体を低減することも示された（非特許文献４、前掲）。最後に、尿素及び／又は塩が溶出前洗浄されたヒドロキシアパタイトも、こうした洗浄なしよりも効果的にヘテロ凝集体を低減した（非特許文献５、前掲）。これらの観察にもかかわらず、一般に、クロマトグラフィカラムに結合した抗体の溶出前洗浄における解離剤の使用は、中程度にしか成功していない。
【０００７】
有機多価カチオンは、酸性タンパク質の沈殿（ファーナー（Ｆａｒｈｎｅｒ）ら、特許文献１；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、並びにＤＮＡ及びエンドトキシンの沈殿（非特許文献９、前掲；非特許文献１０；非特許文献１１）、及びウイルスの不活性化（ベルナール（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ）、特許文献２）に対して示された。多価金属カチオンも一部のタンパク質調製物からＤＮＡ及びエンドトキシンを除去することが示された（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。
【０００８】
固定化ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行う目的で公知であり、市販されている。固定化ＴＲＥＮは、最初に金属イオンが添加され、生体分子は、ＴＲＥＮ結合金属イオンとの接触によって捕捉され、続いて標的生体分子を金属イオンから解離させることによって回収される。イミノ二酢酸（ＩＤＡ：ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ：ｎｉｔｒｉｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）などのＴＲＥＮ以外のＩＭＡＣリガンドも、ＩＭＡＣを行う目的で公知であり、市販されている。このリガンドは、最初に金属イオンが添加され、生体分子は、リガンド結合金属イオンとの接触によって捕捉され、続いて標的生体分子を金属イオンから解離させることによって回収される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８０１９３９８１号
【特許文献２】米国特許第５，５５９，２５０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】シュクラ（Ｓｈｕｋｌａ）ら、バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．）（２００８）２４：１１１５〜１１２１
【非特許文献２】ルーアズ（Ｌｕｈｒｓ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＢ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ）（２００９）８７７：１５４３〜１５５２
【非特許文献３】メチェトナー（Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＢ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ）（２０１１）８７９：２５８３〜２５９４
【非特許文献４】ガグノン（Ｇａｇｎｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ）（２０１１）１２１８：２４０５〜２４１２
【非特許文献５】ガグノン（Ｇａｇｎｏｎ）、バイオプロセシング・ジャーナル（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．）（２０１０）９（４）：１４〜２４）
【非特許文献６】ガン（Ｇａｎ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＡ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ）１２９１（２０１３）３３〜４０
【非特許文献７】マ（Ｍａ）ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィＢ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ）（２０１０）８７８：７９８〜８０６
【非特許文献８】ペラム（Ｐｅｒａｍ）ら、バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．）（２０１０）２６：１３２２〜１３２６
【非特許文献９】Ｕ．ゴットシャルク（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ）（編）、抗体のプロセス規模精製（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｊ．Ｔ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、（２００９）Ｈｏｂｏｋｅｎ中のグリン（Ｇｌｙｎｎ）、３０９〜３２４
【非特許文献１０】コルデス（Ｃｏｒｄｅｓ）ら、バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．）（１９９０）６：２８３〜２８５
【非特許文献１１】ディシング（Ｄｉｓｓｉｎｇ）ら、バイオセパレーション（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、（１９９９）７  ２２１：９〜１１
【非特許文献１２】アクカス（Ａｋｃａｓｕ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９６０）１８７：３２３〜３２４
【非特許文献１３】マツザワ（Ｍａｔｓｕｚａｗａ）ら、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）（２００３）３（３）：１６３〜１６４
【非特許文献１４】クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピューリフィケーション（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．）（２００４）３７：４６８〜４７１
【非特許文献１５】ケジュノフスキー（Ｋｅｊｎｏｖｓｋｙ）ら、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）（１９９７）２５：１８７０〜１８７１
【非特許文献１６】オングクドン（Ｏｎｇｋｕｄｏｎ）ら、アナラティカル・ケミストリ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）（２０１１）８３  ３９１：１３〜１７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一部の態様においては、本明細書に開示した実施形態は、所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、（ｉ）金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とタンパク質調製物を接触させるステップ、ここで金属を結合可能な表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、及び（ｉｉ）タンパク質調製物を少なくとも１種類の表面結合リガンドから分離するステップ、ここで１種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ正味電荷又は電荷中性のどちらかである、を含む、方法に関する。
【００１２】
ある実施形態においては、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面を含む組成物を使用する方法であって、金属を結合可能な表面結合リガンドが最初に金属を実質的に含まない方法が、タンパク質調製物中の高分子量（ＨＭＷ）凝集体及びヘテロ凝集体の含有量の低減に有効であることが驚くべきことに発見された。ある実施形態においては、これらの方法及び組成物は、特に、ヌクレオソーム、及び／又はヒストン、及び／又はＤＮＡなどのクロマチンレムナントを含む凝集体の含有量を低減する。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、タンパク質調製物に添加され得る多価イオン、抗ウイルス化合物などの薬剤を除去する更なる能力を有する。ある実施形態においては、表面結合金属親和性リガンドを使用すると、可溶性キレート化剤では低減しなかった凝集体レベルを低減させることが驚くべきことに発見された。任意の特定の理論に帰するものではないが、これは、この効果が、金属ではなく、金属を結合可能なリガンドに含まれる未知の化学官能性（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を介して、又はその代わりに、又はそれに加えて、試料からの金属（ｍｅｔａｌｓ  ｂｏｕｎｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ）を介して、媒介され得ることを示唆している。更なる予想外の発見は、タンパク質凝集体に加えてタンパク質断片を除去する一部の実施形態の能力である。これは、特に理解が困難である。というのは、一部の実施形態は、凝集体の除去に加えて、重鎖と軽鎖の両方の混入物をＩｇＧ製剤から除去するからである。
【００１３】
本明細書に開示した各実施形態においては、凝集体レベルを低減するために、すべての固体表面（単数又は複数）上の表面結合リガンドの各々に所望のタンパク質が結合するのを実質的に防止する操作条件が選択される。一部の実施形態においては、所望のタンパク質の結合防止は、タンパク質調製物の伝導率の調節を含み得る。一部の実施形態においては、所望のタンパク質の結合防止は、塩濃度の調節を含み得る。当業者は、塩濃度の調節が伝導率の調節と相関することを認識するはずである。一部の実施形態においては、所望のタンパク質の結合防止は、カオトロピック塩の含有を含むことができる。一部の実施形態においては、所望のタンパク質の結合防止は、ｐＨ調節を含み得る。一部の実施形態においては、結合防止は、有機溶媒、界面活性剤、カオトロープ、別の有機調節剤などの有機調節剤の含有を含むことができる。一部の実施形態においては、表面結合リガンドへの所望のタンパク質の実質的な結合の防止は、ｐＨと塩濃度の組合せ、又は塩濃度と有機溶媒の組合せ、又は塩濃度とカオトロープの組合せ、任意の他の組合せなどの複合手法によって媒介することができる。したがって、所与の所望のタンパク質に最適な操作条件になるように、上記操作パラメータの任意の組合せを調節できることが当業者には理解されるはずである。
【００１４】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法の別の驚くべき特徴は、試料の伝導率が所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合しないようにするのに必要な伝導率よりも高い可能性があるにもかかわらず、凝集体レベルが実質的に低下又は解消されることである。ある種のこうした実施形態においては、試料の伝導率は、表面結合リガンドへの所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要なレベルよりも５％高い。ある種のこうした実施形態においては、試料の伝導率は、表面結合リガンドへの所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要なレベルよりも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％又は３００％高い。
【００１５】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法の別の驚くべき特徴は、試料のｐＨが、所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合しないようにするのに必要なｐＨより高くても、又は低くてもよいことである。負に帯電したリガンドを含むかかる一実施形態においては、ｐＨは、所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合しないようにするのに必要なｐＨよりも０．５ｐＨ単位高くすることができる。かかる一実施形態においては、ｐＨは、所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合するのを防止するのに必要なｐＨよりも１単位又は２単位又は３単位以上高くすることができる。正に帯電したリガンドを含むかかる一実施形態においては、ｐＨは、所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合しないようにするのに必要なｐＨよりも０．５ｐＨ単位低くすることができる。かかる一実施形態においては、ｐＨは、所望のタンパク質が表面結合リガンドに結合するのを防止するのに必要なｐＨよりも１単位又は２単位又は３単位以上低くすることができる。
【００１６】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、所望の抗体を含む試料を少なくとも２種類の表面結合リガンドと同時に接触させるステップを含むことができる。一つは、金属又は金属イオンに親和性を有する表面結合リガンドを有し、他は金属又は金属イオンに親和性を特に持たない別の官能性を有する。いずれのリガンドでも、とりわけ、疎水性、パイ−パイ結合、水素結合又は静電相互作用を含めた化学官能性を含むことができる。追加のリガンドが帯電性を有する場合、リガンド上の正味電荷は、中性、又は金属親和性リガンド上の正味電荷と同じである。ある実施形態においては、１種類を超えるリガンドは有用度が異なってもよく、異なるサブセットの異物との相互作用を個々に促進することを潜在的に示している。ある実施形態においては、異なるリガンドは、異なる表面に分布することができる。
【００１７】
ある実施形態においては、タンパク質調製物の凝集体レベルは、混合化学特性（ｍｉｘｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）の可溶性多価イオンをかかる調製物に混合添加し、混合化学特性の不溶性粒子又は別の基質を続いて添加することによって、劇的に低減できることが驚くべきことに発見された。実験結果によれば、この処理によって、塩及び／又はカオトロープを用いた液相処理、単一機序固相法（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、又は固相法と意図的凝集体解離洗浄の組合せよりも、高分子量（ＨＭＷ）凝集体含有量の低減及びヘテロ凝集体の解離を劇的に高めることができる。この手法の価値ある利点は、１種類以上の可溶性薬剤自体がタンパク質調製物から除去され、実質的に凝集体がなく、実質的に添加剤もないタンパク質調製物を生成することである。これは、多価イオンがそれぞれ約０．０２から約０．０２５％、約０．０２５から約０．５％などの極度に少ない量で存在するときでも、驚くべきことに１時間以内に起こり得る。実験の証拠によれば、さらに、ある実施形態においては、有機多価イオンであらかじめ試料処理すると、得られる結果を向上させ得ることが示された。
【００１８】
本明細書に開示した各実施形態においては、可溶性多価イオンが含まれる場合、操作条件は、所望のタンパク質の沈殿を実質的に防止するように設定される。所望のタンパク質の沈殿を実質的に防止するように操作条件を調節することは、例えば、タンパク質調製物伝導率、ｐＨを調節すること、又は有機溶媒、有機ポリマー、界面活性剤、カオトロープなどの有機調節剤を含有することによって行うことができる。所与の所望のタンパク質に最適な操作条件になるように、上記操作パラメータの任意の組合せを調節できることが当業者には理解されるはずである。
【００１９】
本明細書に開示した実施形態は、所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、（ｉ）金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とタンパク質調製物を接触させるステップ、ここで金属を結合可能な表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、及び（ｉｉ）タンパク質調製物を少なくとも１種類の表面結合リガンドから分離するステップ、ここで１種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ電荷又は電荷中性のどちらかである、を含む、方法を提供する。
【００２０】
一部のかかる実施形態においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ相互作用、水素結合及びその組合せからなる群から選択される更なる化学官能性を提供する。
【００２１】
前述の実施形態の１つ以上においては、接触ステップは、さらに、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドとタンパク質調製物を接触させるステップを含む。
【００２２】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドと同じ固体表面にある。
【００２３】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドとは別の固体表面にある。
【００２４】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合及びその組合せからなる群から選択される化学官能性を提供する。
【００２５】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンド上の正味電荷は正である。
【００２６】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、デフェロキサミン（デスフェロキサミン）、ヒスチジン、ヒスタミン、アルギニン、リジン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリリジン及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【００２７】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンド上の正味電荷は負である。
【００２８】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ジエチルアミントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅａｍｉｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【００２９】
前述の実施形態の１つ以上においては、方法は、さらに、タンパク質調製物の凝集体混入度を低下させる有機添加剤とタンパク質調製物を接触させるステップを含むことができる。
【００３０】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤はウレイドである。
【００３１】
前述の実施形態の１つ以上においては、ウレイドはアラントイン又は尿素である。
【００３２】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に可溶性であり、約０．６％までのゼロ以外の量で存在する。
【００３３】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約２％の範囲で存在する。
【００３４】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約１０％の範囲で存在する。
【００３５】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約２０％の範囲、又は３０％、又は４０％、又は５０％で存在する。
【００３６】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約０．５Ｍから約８Ｍの範囲で存在する。
【００３７】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約１から約４Ｍの範囲で存在する。
【００３８】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約１から約２Ｍの範囲で存在する。
【００３９】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤は有機溶媒である。
【００４０】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【００４１】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約１％から約５０％体積／体積の範囲で存在するエチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド及びその組合せからなる群から選択される一つを含み、任意の組合せの総凝集体量は約１％から約５０％体積／体積の範囲である。
【００４２】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約１％から約２５％体積／体積の範囲のエチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド及びその組合せからなる群から選択される一つを含み、任意の組合せの総凝集体量は約１％から約２５％体積／体積の範囲である。
【００４３】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約０．０５から約５％体積／体積の範囲のジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール及びその組合せからなる群から選択される一つを含み、任意の組合せの総凝集体量は約０．０５％から約５％体積／体積の範囲である。
【００４４】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤は界面活性剤を含む。
【００４５】
前述の実施形態の１つ以上においては、方法は、さらに、非イオン性又は両性イオン性（ｚｗｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤を含むことができる。
【００４６】
前述の実施形態の１つ以上においては、非イオン性又は両性イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びオクチルグルコシドからなる群から選択される一つを含む。
【００４７】
前述の実施形態の１つ以上においては、界面活性剤濃度は約０．００１％から約１％の範囲を含む。
【００４８】
前述の実施形態の１つ以上においては、界面活性剤濃度は約０．０１から約０．１％の範囲を含む。
【００４９】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物の伝導率は約０．１ｍＳ／ｃｍから約４０ｍＳ／ｃｍの範囲を含む。
【００５０】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物の伝導率は約４０ｍＳ／ｃｍから約２００ｍＳ／ｃｍの範囲を含む。
【００５１】
前述の実施形態の１つ以上においては、更なる固体表面は所望のタンパク質と実質的に相互作用しない。
【００５２】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに十分高くタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５３】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも約０．０１％、約０．１％、約１％又は約１０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５４】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも１０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５５】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも２０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５６】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも５０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５７】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも１００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５８】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも２００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００５９】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも４００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【００６０】
前述の実施形態の１つ以上においては、操作条件は、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択され、所望のタンパク質の結合を防止するのに必要なｐＨより約０．５を超える単位から約４を超える単位高いｐＨを選択することを含む。
【００６１】
前述の実施形態の１つ以上においては、操作条件は、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択され、所望のタンパク質の結合を防止するのに必要なｐＨより約０．５を超える単位から約４を超える単位低いｐＨを選択することを含む。
【００６２】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物のｐＨは約５から約９の範囲を含む。
【００６３】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は粒子又は粒子の複合体を含む。
【００６４】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は繊維又は繊維の複合体を含む。
【００６５】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は膜又は膜の複合体を含む。
【００６６】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面はモノリス又はモノリスの複合体を含む。
【００６７】
前述の実施形態の１つ以上においては、異なる表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とは構造的に似ているが異なる固体表面上に存在する。
【００６８】
前述の実施形態の１つ以上においては、異なる表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とは構造的に異なる固体表面上に存在する。
【００６９】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は細胞培養収集物を含む。
【００７０】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は精製細胞培養収集物を含む。
【００７１】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は組換えタンパク質を含む。
【００７２】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は抗体を含む。
【００７３】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約２０％を超える凝集体を含む。
【００７４】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約１０％を超える凝集体を含む。
【００７５】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約５％を超える凝集体を含む。
【００７６】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約１％を超える凝集体を含む。
【００７７】
前述の実施形態の方法のいずれか一つの好都合な実施のためにキットを提供することができる。
【００７８】
ある実施形態においては、特に抗体、第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子、及び組換えタンパク質を含めて、組換えタンパク質調製物の凝集体含有量を低減する方法を提供する。いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、凝集体は異物との相互作用によって安定化することが予想外に発見された。抗体よりも異物に対する親和性が高い多官能性表面と抗体調製物の接触は、異物を置換する効果を有する。次いで、異物は、それが結合した多官能性表面の簡単な除去によって除去することができる。ある実施形態においては、凝集体レベルがかなり低下し、抗体回収は、時折、存在すると考えられる量を超えて増加する。これは、凝集体を解離させ、解離した抗体を精製可能な生成物集団に回復させる方法の能力を示している。ある実施形態においては、方法は、単一の抗体と混入物の複合体を解離させることもできる。凝集体集団のより少ない抗体調製物の生成に加えて、ある実施形態においては、処理された抗体は、宿主タンパク質、ＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルス混入も少ない。
【００７９】
ある実施形態においては、表面は、タンパク質調製物全体に分散された、又はカラムに充填された、又は初期に分散され、次いでカラムに充填された、多孔質若しくは非多孔質粒子を含むことができ、又は膜、又はモノリス、又は繊維、又は複合構築物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を含むことができる。
【００８０】
ある実施形態においては、凝集体除去は、可溶性有機多価イオンを単独で又は別の薬剤と組み合わせて用いて試料を前処理することによって促進することができる。この場合、方法は、有機多価イオン及び潜在的に別の薬剤を除去する更なる有用性を有する。方法の有用性は、抗ウイルス剤を単独で又は多価イオンの存在下で含有することによって高めることもできる。
【００８１】
一部の実施形態においては、所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、（ｉ）金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とタンパク質調製物を接触させるステップ、ここで金属を結合可能な表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、及び（ｉｉ）タンパク質調製物を少なくとも１種類の表面結合リガンドから分離するステップ、ここで１種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ電荷又は電荷中性のどちらかである、を含む、方法を提供する。
【００８２】
一部の実施形態においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用及びその組合せからなる群から選択される更なる化学官能性を与える。
【００８３】
前述の実施形態の１つ以上においては、接触ステップは、さらに、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドとタンパク質調製物を接触させるステップを含む。
【００８４】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドと同じ固体表面にある。
【００８５】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性を与える少なくとも１種類の表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドとは別の固体表面にある。
【００８６】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合することを含まない化学官能性は、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合及びその組合せからなる群から選択される化学官能性を提供する。
【００８７】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンド上の正味電荷は正である。
【００８８】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、ヒスチジン、ヒスタミン、ポリヒスチジン及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【００８９】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンド上の正味電荷は負である。
【００９０】
前述の実施形態の１つ以上においては、金属を結合可能な表面結合リガンドは、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ジエチルアミントリアミンペンタ酢酸、ニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【００９１】
前述の実施形態の１つ以上においては、方法は、さらに、タンパク質調製物中の凝集体混入物の程度を低下させる有機添加剤とタンパク質調製物を接触させるステップを含むことができる。
【００９２】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤はウレイドである。
【００９３】
前述の実施形態の１つ以上においては、ウレイドはアラントイン又は尿素である。
【００９４】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に可溶性であり、約０．６％までのゼロ以外の量で存在する。
【００９５】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約２％の範囲で存在する。
【００９６】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約１０％の範囲で存在する。
【００９７】
前述の実施形態の１つ以上においては、アラントインは、実質的に不溶性であり、約１から約２０％の範囲で存在する。
【００９８】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約０．５Ｍから約８Ｍの範囲で存在する。
【００９９】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約１から約４Ｍの範囲で存在する。
【０１００】
前述の実施形態の１つ以上においては、尿素は約１から約２Ｍの範囲で存在する。
【０１０１】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤は有機溶媒である。
【０１０２】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【０１０３】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約１％から約５０％の範囲でエチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【０１０４】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約１％から約２５％の範囲で、かつ合計して約５０％以下の範囲で、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【０１０５】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機溶媒は、各々独立に約０．０５から約５％の範囲で、かつ合計して約５０％以下の範囲で、ジメチルスルホキシド、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール及びその組合せからなる群から選択される一つを含む。
【０１０６】
前述の実施形態の１つ以上においては、有機添加剤は界面活性剤を含む。
【０１０７】
前述の実施形態の１つ以上においては、方法は、非イオン性又は両性イオン性界面活性剤の使用を含むことができる。
【０１０８】
前述の実施形態の１つ以上においては、非イオン性又は両性イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びオクチルグルコシドからなる群から選択される一つを含む。
【０１０９】
前述の実施形態の１つ以上においては、界面活性剤濃度は約０．００１％から約１％の範囲を含む。
【０１１０】
前述の実施形態の１つ以上においては、界面活性剤濃度は約０．０１から約０．１％の範囲を含む。
【０１１１】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物の伝導率は約０．１ｍＳ／ｃｍから約５０ｍＳ／ｃｍの範囲を含む。
【０１１２】
前述の実施形態の１つ以上においては、更なる固体表面は所望のタンパク質と実質的に相互作用しない。
【０１１３】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに十分高くタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１４】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも約０．０１％又は約０．１％又は約１％又は約５％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１５】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも１０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１６】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも２０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１７】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも５０％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１８】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも１００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１１９】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも２００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１２０】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、少なくとも１種類の表面結合リガンドの各々への所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値より少なくとも４００％高いタンパク質調製物の伝導率を選択することを含む。
【０１２１】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、ｐＨを選択することを含む。
【０１２２】
前述の実施形態の１つ以上においては、所望のタンパク質が少なくとも１つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された操作条件は、有機調節剤を供給することを含む。
【０１２３】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物のｐＨは約５から約９の範囲を含む。
【０１２４】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は粒子又は粒子の複合体を含む。
【０１２５】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は繊維又は繊維の複合体を含む。
【０１２６】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面は膜又は膜の複合体を含む。
【０１２７】
前述の実施形態の１つ以上においては、少なくとも１つの固体表面はモノリス又はモノリスの複合体を含む。
【０１２８】
前述の実施形態の１つ以上においては、異なる表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とは構造的に似ているが異なる固体表面上に存在する。
【０１２９】
前述の実施形態の１つ以上においては、異なる表面結合リガンドは、金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とは構造的に異なる固体表面上に存在する。
【０１３０】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は細胞培養収集物を含む。
【０１３１】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は精製細胞培養収集物を含む。
【０１３２】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は部分的に精製される。
【０１３３】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は組換えタンパク質を含む。
【０１３４】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は抗体を含む。
【０１３５】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物はＩｇＧ抗体を含む。
【０１３６】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物はモノクローナルＩｇＧ抗体を含む。
【０１３７】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約２０％を超える凝集体を含む。
【０１３８】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約１０％を超える凝集体を含む。
【０１３９】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約５％を超える凝集体を含む。
【０１４０】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約１％を超える凝集体を含む。
【０１４１】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約０．１％を超える凝集体を含む。
【０１４２】
前述の実施形態の１つ以上においては、タンパク質調製物は、所望のタンパク質の約０．０１％を超える凝集体を含む。
【０１４３】
前述の実施形態の１つ以上においては、本明細書に開示した方法を実施した後、残りの凝集体の含有量は、約５％未満又は約２％未満又は約１％未満とすることができる。
【０１４４】
本明細書に開示した実施形態のいずれか一つの好都合な実施のためにキットを提供することができる。かかるキットは、所望のタンパク質の精製を行うためのすべての試薬及び説明書を提供することができる。
【０１４５】
ある実施形態においては、所望のタンパク質を含むタンパク質試料の凝集体含有量を低減する方法を提供する。ある方法は、（ｉ）金属を結合可能な少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む第１の固体表面を用意するステップ、ここで金属を結合可能な表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まない、（ｉｉ）金属結合能力のない少なくとも１種類の表面結合リガンドを含む第２の固体表面を用意するステップ、（ｉｉｉ）試料を第１及び第２の固体表面と接触させるステップ、ここで第１及び第２の固体表面は、試料が両方の表面に同時に接触できるように構成され、操作条件は、所望のタンパク質が第１及び第２の固体表面に結合するのを実質的に防止する、及び（ｉｖ）凝集体含有量の少ない所望のタンパク質を含むタンパク質試料を第１及び第２の固体表面から分離するステップを含む。
【０１４６】
一部の実施形態においては、第３の固体表面を用意することができ、タンパク質試料は、第１、第２及び第３の固体表面と同時に接触することができる。一部の実施形態においては、第４の固体表面を用意することができ、タンパク質試料は、第１、第２、第３及び第４の固体表面と同時に接触することができる。当業者は、固体表面が金属親和性リガンドと逆の正味電荷を持たないという条件で、静電引力、パイ−パイ結合、水素結合、ファン・デル・ワールス引力などの任意の数の相互作用を増強する各々が潜在的に異なる官能性、又は様々な類似の官能性を有する任意の数の固体表面を用意できることを理解するはずである。
【０１４７】
一部のかかる実施形態においては、第１及び第２の固体表面はどちらも電気陽性である。別の実施形態においては、第１及び第２の固体表面はどちらも電気陰性である。更に別の実施形態においては、第１の固体表面は電気陽性とすることができ、第２の固体表面は電荷中性である。更なる実施形態においては、第１の固体表面は電気陰性とすることができ、第２の固体表面は電荷中性とすることができる。更なる実施形態においては、第１の固体表面は電荷中性とすることができ、第２の固体表面は電気陽性とすることができる。更なる実施形態においては、第１の固体表面は電荷中性とすることができ、第２の固体表面は電気陰性とすることができる。更なる実施形態においては、第１と第２の両方の固体表面は電荷中性である。
【０１４８】
ある実施形態においては、試料を第１及び第２の固体表面と接触させる前に、混合化学特性の有機多価イオンを試料と化合させる。ある実施形態においては、タンパク質調製物を接触させる前に、第１と第２の固体表面を化合させる。ある実施形態においては、試料を第１及び第２の固体表面と接触させる前に、試料を混合化学特性の有機多価イオンと一緒に適切な期間インキュベートする。ある実施形態においては、試料を第１及び第２の固体表面と一緒に適切な期間インキュベートする。ある実施形態においては、凝集体含有量の少ないタンパク質試料を第１及び第２の固体表面から分離するステップにおいて、混合化学特性の有機多価イオンが第１又は第２の固体表面の基質と結合する程度に、混合化学特性の有機多価イオンを試料から除去する。
【０１４９】
ある実施形態においては、第１の固体表面は粒子である。ある実施形態においては、第２の固体表面は粒子である。粒子固体表面は、複数の粒子として各々用意することができる。ある実施形態においては、第１の固体表面及び第２の固体表面の粒子の一方又は両方を非多孔質又は多孔質とすることができる。かかる多孔質粒子は、タンパク質調製物中のタンパク質の流入を可能にするのに十分大きい、又は小さすぎてタンパク質調製物中のタンパク質を流入させることができない、又は約１０ｎｍから約１００ｎｍである、平均孔径を有することができる。固体表面が粒子であるある実施形態においては、粒子を複数の多孔質膜又はモノリスの間に挟むことができる。ある実施形態においては、粒子を複数の織られた又はアモルファスの繊維フィルタ間に挟むことができる。ある実施形態においては、粒子を複数の結晶性フリットの間に挟むことができる。ある実施形態においては、粒子を網状ポリマーネットワークに埋め込むことができる。
【０１５０】
ある実施形態においては、試料の伝導率は、第１及び第２の固体表面を接触させる間、所望のタンパク質が試料から実質的に沈殿しないようにするのに十分な高いレベルである。ある実施形態においては、試料の伝導率は２０ｍＳ／ｃｍを超える。別の実施形態においては、試料は、３０ｍＳ／ｃｍを超え、約４０ｍＳ／ｃｍを超え、又は約１００ｍＳ／ｃｍを超える。ある実施形態においては、試料の伝導率は、試料を第１及び第２の固体表面と接触させるステップの前に、混合化学特性の有機多価カチオンの接触中に所望のタンパク質が試料から実質的に沈殿しないようにするのに十分な伝導率よりも少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、１００％又は２００％高い。
【０１５１】
一部の実施形態においては、伝導率範囲の上端は、生理学的伝導率の約３倍より高いが、生理学的伝導率の約４倍未満である。生理学的伝導率が約１５ｍＳ／ｃｍである場合の伝導率値として表して、本明細書に開示した方法は、伝導率が約４０ｍＳ／ｃｍまで増加するにつれてより有効になり得るが、その後、低下することがあり、約６０ｍＳ／ｃｍに達するまでに効果がかなり低下する。当業者は、これらの値が特定の所望の標的タンパク質の特性に応じて増加又は減少し得ることを理解するはずである。
【０１５２】
ある実施形態においては、凝集体は、所望のタンパク質のホモ凝集体を含む。ある種のこうした実施形態においては、所望のタンパク質のホモ凝集体の存在が実質的に消去される。ある実施形態においては、凝集体は、所望のタンパク質と混入物又は複数の混入物のヘテロ凝集体を含む。ある種のこうした実施形態においては、ヘテロ凝集体は、所望のタンパク質と実質的に同じ流体力学的サイズである。ある実施形態においては、混入物は、核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質又は細胞培養培地成分である。ある種のこうした実施形態においては、所望のタンパク質と混入物のヘテロ凝集体の存在は、実質的に消去される。ある実施形態においては、試料中の凝集体は、ホモ凝集体とヘテロ凝集体の両方を含む。ある実施形態においては、所望のタンパク質は、抗体又は抗体断片である。ある種のこうした実施形態においては、試料は、細胞培養収集物、細胞培養上清、細胞培養に由来する抗体含有溶液、又はタンパク質精製の前段階からの抗体含有溶液などのタンパク質調製物である。ある種のこうした実施形態においては、タンパク質調製物は、タンパク質精製の前段階からの抗体含有溶液である。ある種のこうした実施形態においては、タンパク質調製物は、クロマトグラフィカラムからの溶出物である。
【０１５３】
ある実施形態においては、タンパク質調製物は、未精製、中間純度又は高度精製でもよい。一部の実施形態においては、試料の中間純度は、約４０％から約９０％純度の範囲であり得る。一部の実施形態においては、試料の高純度は約９０％以上の範囲であり得る。
【０１５４】
ある実施形態においては、タンパク質調製物を第１及び第２の固体表面に流すことによって、調製物を第１及び第２の固体表面と接触させる。
【０１５５】
ある実施形態においては、タンパク質調製物中に固体を懸濁させることによってタンパク質調製物を第１の固体表面と接触させる。
【０１５６】
ある実施形態においては、タンパク質調製物中に固体を懸濁させることによってタンパク質調製物を第１及び固体表面と接触させる。
【０１５７】
ある実施形態においては、第１又は第２の固体表面の表面の電荷は、１つを超える化学官能性を含む１種類以上の複合化学部分を介して、又は表面で混合された単一化学基と複合化学基の組合せを介して、又は化学組成の異なる表面の組合せを介して、付与される。ある実施形態においては、第１又は第２の固体表面の表面の電荷は、イミノ二酢酸、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、カルボン酸、亜硫酸、スルホナート又はリン酸からなる群からの部分によって部分的に付与される。ある実施形態においては、第１又は第２の固体表面の表面の電荷は、１つを超える化学官能性を含む１種類以上の複合化学基を介して、又は表面で混合された単一化学基と複合化学基の組合せを介して、又は化学組成の異なる表面の組合せを介して、付与される。ある種のこうした実施形態においては、第１又は第２の固体表面の表面の電荷は、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基及び第四級アミノ基からなる群から選択される部分によって部分的に付与される。ある実施形態においては、第１又は第２の固体表面の表面の電荷は、イミノ二酢酸によって部分的に付与され、第２の成分の表面の電気陽性度は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）からなる群からの部分によって部分的に付与される。ある実施形態においては、第１の固体表面は、金属親和性官能性を有する表面結合化学部分を有し、第２の固体表面は、第１の固体表面と同じ荷電表面を有する第２の基質である。ある実施形態においては、第２の固体表面は、荷電表面を有する第２の基質であり、第１の固体表面は、金属親和性官能性を有する表面結合化学部分を含む。ある種のこうした実施形態においては、基質の少なくとも１個は、金属親和性官能性を有する表面結合化学部分に加えて１個以上の化学部分を有する。かかる追加の化学部分は、タンパク質調製物のタンパク質との水素結合、疎水性相互作用又はパイ−パイ結合に関与する１種類以上の成分の能力を増強する。ある実施形態においては、金属親和性官能性を有する表面結合化学部分は、多座配位金属キレート部分である。
【０１５８】
ある実施形態においては、第１及び第２の成分の表面に曝露する前に、混合化学特性の有機多価カチオンでタンパク質試料を処理する。かかる有機多価カチオンとしては、エタクリジン、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（ａｃｒｉｚａｎｅ）（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド（ａｃｒｉｃｉｄｅ）、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（ａｃｒａｎｉｌ）（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、メチレンブルー、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物及び３，６−アクリジンジアミン（ａｃｒｉｄｉｎｅｉｄｉａｍｉｎｅ））、ポリエチレンイミン、クロルヘキシジン又はポリアミノ酸が挙げられる。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、エタクリジン、メチレンブルー、ポリエチレンイミン若しくはクロルヘキシジン又はその塩である。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、エタクリジン若しくはメチレンブルー、若しくはセチルトリメチルアンモニウム、又はその塩である。ある種のこうした実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、約０．０１％から約０．０５％の量で存在する。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、約０．０１％未満の量で存在する。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、約０．００５％未満の量で存在する。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、約０．００１％未満の量で存在する。ある実施形態においては、混合化学特性の有機多価カチオンは、約０．０２０から約０．０２５％の量で存在する。
【０１５９】
ある実施形態においては、試料を第１及び第２の成分と接触させるステップの前にポリエチレンイミン、ポリアリアミン（ｐｏｌｙａｌｌｙａｍｉｎｅ）、エタクリジン、メチレンブルー、又はクロルヘキシジン、又はセチルトリメチルアンモニウム、及びその塩などの１個以上の有機多価カチオンで試料を処理する。ある種のこうした実施形態においては、試料を第１及び第２の成分と接触させるステップの前に試料の処理に用いられる有機多価カチオンは、１％未満の濃度で用意される。ある実施形態においては、試料を第１及び第２の成分と接触させるステップの前に試料の処理に用いられる有機多価カチオンは、約０．０１％から約０．０５％の濃度、又は約０．０１％未満の濃度、又は約０．００５％未満の濃度、又は約０．００１％未満の濃度、又は約０．０２０から約０．０２５％の濃度で用意される。
【０１６０】
ある実施形態においては、試料を脂肪酸、ポリアニオンなどの１種類以上の有機多価アニオンで処理する。前者の例としては、濃度０．０５％から５％のヘプタン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸及びデカン酸が挙げられる。後者の例としては、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、又は他の負に帯電したポリマー、又は異なるサブユニットから合成された負に帯電したヘテロポリマーが挙げられる。
【０１６１】
ある実施形態においては、非イオン性有機ポリマー、有機溶媒、界面活性剤及びウレイドからなる群から選択される可溶性有機調節物質とタンパク質試料をさらに接触させる。試料を可溶性有機調節物質と接触させるこうしたステップは、試料を第１及び第２の成分と接触させるステップの前に行われる。
【０１６２】
ある実施形態においては、試料をさらに抗ウイルス剤と接触させる。試料を抗ウイルス剤と接触させるこうしたステップは、試料を第１及び第２の成分と接触させるステップの前に行われる。ある種のこうした実施形態においては、抗ウイルス剤は、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルー、クロルヘキシジン、リン酸トリ（ｎ−ブチル）などの非多価有機カチオンである。ある種のこうした実施形態においては、抗ウイルス剤は、約１％（ｗ／ｖ）未満の量、又は約０．１％（ｗ／ｖ）未満の量、又は約０．０１％（ｗ／ｖ）未満の量、又は約０．００１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する。
【０１６３】
ある実施形態においては、方法は、ウレイドがタンパク質調製物中で過飽和になるのに十分な量のウレイドと試料を接触させ、所望のタンパク質を含む上清をタンパク質調製物の部分から分離する追加のステップを提供する。試料をかかるウレイドと接触させるこうしたステップは、試料を第１及び第２の固体表面と接触させるステップの前に行われる。ある種のこうした実施形態においては、ウレイドは、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン、アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモカン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジイミダゾリジニル尿素又はプリンである。ある種のこうした実施形態においては、ウレイドはアラントインである。別の実施形態においては、ウレイドは尿酸である。ある実施形態においては、アラントインは、０．５％（ｗ／ｖ）を超える量、又は約１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。ある実施形態においては、尿酸は、０．００２５％（ｗ／ｖ）を超える量、又は約０．０１％（ｗ／ｖ）を超える量、又は約０．１％（ｗ／ｖ）を超える量、又は約１％（ｗ／ｖ）を超える量で存在する。
【０１６４】
ある実施形態においては、有機調節物質は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリブチレングリコールからなる群から選択される非イオン性有機ポリマーである。ある実施形態においては、非イオン性有機ポリマーの平均分子量は約５００Ｄ以下である。ある実施形態においては、有機調節物質は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、フェノキシエタノールなどの有機溶媒である。ある実施形態においては、有機調節物質は、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で用意される。ある実施形態においては、有機調節物質は、Ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びオクチルグルコシドからなる群から選択される界面活性剤である。ある種のこうした実施形態においては、界面活性剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で、又は約０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度で用意される。ある実施形態においては、有機調節物質は、ほぼ飽和量（ｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）のウレイドである。ある種のこうした実施形態においては、ウレイドは、尿素、ヒダントイン及びアラントインからなる群から選択される。
【０１６５】
ある実施形態においては、一般に本明細書に開示した方法の実行に好都合な量及び濃度の、方法の実行に必要な材料の一部又はすべてを含む方法実施形態の好都合な実施のためのキットを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１６６】
用語は、実施形態がより容易に理解できるように定義される。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。
【０１６７】
「凝集体（単数又は複数）」とは、生理的条件で安定であり、広範囲のｐＨ及び伝導率条件で安定なままであり得る２個以上の分子の結合を指す。凝集体は、タンパク質、核酸、脂質などの少なくとも１種類の生体分子、及び別の分子又は金属イオンを含むことが多い。結合は、化学相互作用の任意のタイプ又は任意の組合せを介して起こり得る。抗体の凝集体は、２つのカテゴリに分類することができる。すなわち、「ホモ凝集体」とは、２個以上の抗体分子の安定な結合を指し、「ヘテロ凝集体」とは、１個以上の抗体分子と１個以上の非抗体分子の安定な結合を指す。非抗体成分は、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、又は細胞培養培地成分からなる群からのもう一つの実体（ｏｎｅ  ｍｏｒｅ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）からなり得る。
【０１６８】
「抗体」とは、免疫グロブリン、複合体、又はその断片的形態を指す。この用語は、天然形態、又はヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植、インビトロで産生された抗体などの遺伝子改変形態を含めて、ヒト又は他のほ乳動物細胞系から誘導されるクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのポリクローナル又はモノクローナル抗体を含むことができるが、それだけに限定されない。「抗体」は、免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質を含めて、ただしそれだけに限定されない複合形態を含むこともできる。「抗体」は、抗原結合機能を保持するか否かにかかわらず、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃなどの抗体断片及び別の組成物を含むこともできる。
【０１６９】
「電気陽性表面」とは、正電荷によって支配される基質又は固体材料の表面を指す。表面の電気陽性は、アミノ、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンのような弱いアニオン交換基、第四級アミノ基などの強いアニオン交換基、ポリリジン、ポリアルギニン、又はトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、上記の任意の組合せなどの複合弱−強交換体（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｅａｋ−ｓｔｒｏｎｇ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）を含めて、ただしそれだけに限定されない化学基によって付与することができる。混合化学特性を正に帯電した表面に作り出す第２の官能性は、負又は正に帯電した基、疎水性基、パイ−パイ結合基、水素結合基、又は金属キレート化基からなり得る。第２の官能性は、製造材料の偶然の副生物、又は粒子を合成するプロセスの偶然の副生物として電気陽性表面に存在し得る。又は、計画的な設計によって存在し得る。第２の官能性の濃度は、１ミリ当量／ｍＬ粒子未満から１００ミリ当量／ｍＬを超える範囲とすることができる。
【０１７０】
「電気陰性表面」とは、負電荷によって支配される基質又は固体材料の表面を指す。表面の電気陰性度は、カルボキシル、アミノカルボキシル（イミノ二酢酸又はニトリロ酢酸）、ホスホリルなどのいわゆる弱いカチオン交換体、又はスルホ、スルファート部分、ＳＯ３−などの強い交換体を含めて、ただしそれだけに限定されない化学基によって付与することができる。混合化学特性を負に帯電した表面に作り出す第２の官能性は、負又は正に帯電した基、疎水性基、パイ−パイ結合基、水素結合基、又は金属キレート化基からなり得る。第２の官能性は、粒子を合成する製造プロセスの偶然の副生物として電気陰性表面に存在し得る。又は、計画的な設計によって存在し得る。第２の官能性の濃度は、１ミリ当量／ｍＬ粒子未満から１００ミリ当量／ｍＬを超える範囲とすることができる。
【０１７１】
「エンドトキシン」とは、溶解によって細胞から放出されるグラム陰性菌の外膜に存在する有毒な耐熱性リポ多糖物質を指す。エンドトキシンは、一般に、リン酸及びカルボキシル残基含有量が高いので酸性であり得、リピドＡ領域の脂肪酸含有量に帰因して高度に疎水性であり得る。エンドトキシンは、水素結合の広範な機会を提供することができる。
【０１７２】
「リガンド」又は「表面結合リガンド」とは、何らかの別の化学物質に結合する１個以上の化学部分又は官能基からなる集合体を指す。本実施形態においては、リガンドは、凝集体の形成又は安定化に寄与する試料（タンパク質調製物）成分を結合する目的で表面に固定される。リガンドは、負電荷、正電荷、疎水性基など、組成がかなり単純であり得る。又は、リガンドは、どの成分も個々には能力のない、相互作用を介して化学物質を結合させる能力をリガンドに付与する２種類以上の成分を含む、より複雑な構成とすることができる。さらに、所与のリガンドは、その主要な又は支配的な機序以外の機序によって、別の化学物質と相互作用する能力を含むことができる。例えば、金属親和性リガンドイミノ二酢酸は、ほとんどの操作条件下で負に帯電する２個のカルボキシル基、及び低ｐＨで正に帯電することができる窒素基を含む。金属親和性を含むことに加えて、それは、静電相互作用及び水素結合によって別の化学物質と相互作用することもできる。金属親和性リガンドＴＲＥＮは、表面に固定されたときに、２個の第一級アミン、１個の第二級アミン、及び１個の第三級アミンを含む。ＴＲＥＮは、全体として、水溶液に溶解した金属と強い結合を形成することができ、個々のアミンは静電及び／又は水素結合に関与することができる。
【０１７３】
「金属親和性官能性」とは、表面に固定することができる化学部分の１：１様式などの金属イオンを結合する能力を指す。かかる部分は、金属イオンと配位結合を形成する能力を有することができ、ある種のこうした部分は、性質上、二座配位又は多座配位とすることができる。この能力を有する電気陰性部分の非限定的例としては、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）及びニトリロ酢酸（２，２’，２”−ニトリロ三酢酸）が挙げられる。この能力を有する電気陽性化合物の一例としては、トリス（２−アミノエチル）アミン又はジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン及びデフェロキサミンが挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１７４】
「非イオン性有機ポリマー」とは、荷電基がない連結繰り返し有機サブユニットで構成された天然又は合成炭化水素を指す。それは、線状、幾らかの枝分れを含む主に線状、又は主に分枝とすることができる。本明細書に開示した方法を実施するのに適切な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられるが、それだけに限定されない。ＰＥＧの構造式はＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈである。例としては、平均ポリマー分子量が１００ダルトン未満から１０００ダルトンを超える範囲の組成物が挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１７５】
「有機多価イオン」とは、少なくとも１個の電荷及び少なくとも１つの追加の化学官能性を含み、したがってそれを多価にする天然又は合成起源の有機分子、イオン又は塩を指す。ある実施形態においては、有機多価イオン少なくとも１つの追加の化学官能性は、有機多価カチオンが２個以上の同じ又は異なる電荷を有するように、追加の電荷である。有機多価イオンは、正味正、正味負又は正味中性の電荷を有することができる。有機多価イオンが正味正である場合、それは、塩化物、臭化物、硫酸、有機酸、乳酸、グルコン酸などのアニオン及び方法に不適合でない任意の他のアニオンと一緒に用意することができる。ある実施形態においては、有機多価イオンの正電荷の中の幾らかは、アミン、イミン又は別の窒素部分によって供給される。有機多価イオンは、さらに、混合化学特性のものとすることができ、疎水性残基、別の機能的部分を含むことができ、及び／又は例えば水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力を含めて、別のタイプの化学相互作用に関与する能力を有することができる。ある実施形態における正に帯電した有機多価イオンの例としては、ジアミノ酸、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンなどのジ−、トリ−、又はより大きいホモ−又はヘテロ−ペプチド；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメトリン、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン（ＣＡＳ番号４４２−１６−０；７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロルヘキシジン；アレキシジン；シトリシダル（ｃｉｔｒｉｃｉｄａｌ）、プロタミン；スペルミン；スペルミジン；サルミン；キトサン；並びに上記の変種及び誘導体が挙げられるが、それだけに限定されない。例えば、エタクリジンの変種及び誘導体は、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン、フェノキサジン、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物及び３，６−アクリジンジアミン）、及びその塩（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウムなどの塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）を含むと理解される。有機多価イオンが正味負である場合、それは、ナトリウム、カリウムなどのカチオン、又は方法に不適合でない任意の他のカチオンと一緒に用意することができる。ある実施形態においては、有機多価イオンの負電荷の中の幾らかは、カルボキシル、ホスホ又はスルホ部分によって供給される。有機多価イオンは、さらに、混合化学特性のものとすることができ、疎水性残基、別の機能的部分を含むことができ、及び／又は例えば水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力を含めて、別のタイプの化学相互作用に関与する能力を有することができる。ある実施形態における正に帯電した有機多価イオンの例としては、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、アニオン性ポリマーなどの脂肪酸、及びその塩（例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）が挙げられるが、それだけに限定されない。有機多価イオンは、特別な正味電荷を含むことができ、逆に帯電した部分を含むことができる。例えば、正味正電荷を有する有機多価イオンは１個以上の負電荷を含むことができ、又は正味負電荷を有する種は１個以上の正電荷を含むことができる。
【０１７６】
「有機溶媒」とは、液体状態で存在する天然又は合成有機化合物を指す。本明細書に開示した方法を実施するのに適切な例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール及びフェノキシエタノールが挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１７７】
「生理学的伝導率」とは、約１５ｍＳ／ｃｍの値を指す。この値は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度にほぼ対応する。異なる組成の異なる塩及びイオンは、塩化ナトリウムとは異なるレベルの伝導率を個々に付与することができる。本来の生体液においては、伝導率値は、複数の種の塩によって付与することができる。実験溶液においては、伝導率は、単一の種類の塩によって付与することができ、又は主に単一の種類の塩によって付与することができる。伝導率を全塩濃度の機能的尺度として使用すると、組成の異なる溶液間の同等性（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）を明確に表す。
【０１７８】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖状に共有結合された複数のヌクレオチドモノマーで構成される生体高分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）はポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合を形成する傾向があり得る。
【０１７９】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、及び通常硫黄を含む複雑な有機巨大分子のグループのいずれかを指し、ペプチド結合によって連結された１個以上のアミノ酸鎖で主に構成される。タンパク質は、天然又は組換え起源とすることができる。タンパク質は、グリコシル化、ＰＥＧ化、別の化学部分との複合化などによって、非アミノ酸部分で修飾することができる。タンパク質の例としては、抗体、凝固因子、酵素及びペプチドホルモンが挙げられるが、それだけに限定されない。「タンパク質調製物」とは、細胞含有細胞培養収集物、（実質的に）無細胞の細胞培養上清、又は精製の段階から目的タンパク質を含有する溶液など、目的タンパク質を含有する任意の水溶液又はほとんど水溶液の溶液を指す。
【０１８０】
「基質」又は「固体材料」とは、本質的に、粒状、結晶性、ポリマー状、繊維状、多孔中空繊維状、モノリス状、膜状であり得る不溶性有機固体を指す。それは、非多孔質又は多孔質粒子、多孔質膜、多孔質フィルタ又は多孔質モノリスからなり得る。粒状の場合、粒子は、概略球状であってもなくてもよく、１００ｎｍ未満から１００ミクロンを超える範囲のサイズとすることができる。多孔質粒子の平均孔径は、１０ｎｍ未満（ミクロポア）から１００ｎｍを超える（マクロポア）範囲とすることができる。膜の平均孔径は、１００ｎｍ未満から１ミクロンを超える範囲とすることができる。膜又はモノリスの平均チャネルサイズは、１ミクロン未満から１０ミクロンを超える範囲とすることができる。固体材料は、さらに、例えば、粒子が網状マトリックスに埋め込まれた、膜に挟まれた、又はその両方である複合構築物からなり得る。
【０１８１】
「過飽和ウレイド」とは、特定のタンパク質調製物において一般的な条件下でその最大溶解性を超える量のウレイドを含有する溶液を指す。ある実施形態においては、方法は、かかるウレイドの一部が試料中に溶解していない形で存在するように、かかる試料の条件下でかかる試料中のかかるウレイドの溶解性よりも多い量で存在するウレイドを試料に供給する。
【０１８２】
「界面活性剤」は、それらを両親媒性と称されるようにする疎水性部分と親水性部分を一般に含むあるクラスの有機分子などの「表面活性剤」を含む。水溶液における十分な濃度では、界面活性剤は、自己会合してクラスターを形成することができ、疎水性部分は中央に濃縮されて、水との接触が最小限に抑えられ、親水性部分は外向きに放射状に広がって水との接触（ｃｏｎｔｒａｃｔ）を最大にする。生物学的調製物、特に、疎水性を有する、又は疎水性の領域を有する材料を含む生物学的調製物の存在下では、界面活性剤の疎水性部分が、界面活性剤の親水性部分の影響によって、疎水性材料の一部と自発的に会合し、その溶解性を高める傾向がある。それらを使用して、どちらも水系溶媒に溶解した異なる疎水性材料間の疎水性相互作用を調節することもできる。ある実施形態の実施に適した界面活性剤の例としては、ポリソルベート界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、及びＴｗｅｅｎ８０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）、Ｔｒｉｔｏｎ（例えば、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）などの非イオン界面活性剤、及びＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）、オクチルグルコシド（例えば、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール）などの両性イオン性界面活性剤が挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１８３】
「ウレイド」とは、１個以上の尿素部分を含む天然又は合成起源の環式又は非環式の有機分子又はその誘導体を指す。ある実施形態においては、方法は、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（ＣＡＳ番号９７−５９−６；アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモカン、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素）、プリンなどのウレイド、及びその誘導体を提供する。ある実施形態においては、方法は、式Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２又はＲ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’又はＲ’Ｒ”ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ’”Ｒ””の有機分子を提供する。ここで、関連する「Ｒ基」は、Ｈ又は任意の有機部分とすることができる。
【０１８４】
「ウイルス」又は「ビリオン」とは、生きている宿主、主に細菌、植物及び動物の細胞内でのみ複製する極微の（直径ほぼ２０から３００ｎｍ）代謝的に不活性な感染病原体を指し、ＲＮＡ又はＤＮＡコア、タンパク質外被、及びより複雑なタイプでは、周囲のエンベロープで構成される。
【０１８５】
本明細書に開示した方法の実施に使用される固体材料は、クロマトグラフィの実施に一般に使用される多孔質微粒子など、ただしそれだけに限定されない天然又は合成起源の不溶性粒子を含むことができる。かかる粒子は、抗体など、ただしそれだけに限定されないタンパク質が拡散流入可能な大きい細孔を含むことができ、又は塩、糖、ヘテロ凝集体解離剤などの小さい化学種が拡散流入可能であるが、抗体などのタンパク質が流入するには小さすぎる小さい細孔を含むことができる。
【０１８６】
あるいは、固体材料は、非多孔質粒子、膜又はモノリス、多孔質壁中空繊維を含めた繊維、多孔質膜、及び／又は上記要素の組合せを用いた複合構築物とすることができる。
【０１８７】
ある実施形態の実施に用いられる混合化学特性の粒子としては、特に、不溶性有機粒子が挙げられる。かかる粒子は非多孔質でも多孔質でもよい。多孔質の場合、それらは、抗体など、ただしそれだけに限定されないタンパク質が拡散流入可能な大きい細孔を含むことができ、又は塩、糖、ヘテロ凝集体解離剤などの小さい化学種が拡散流入可能であるが、抗体などのタンパク質が流入するには小さすぎる小さい細孔を含むことができる。かかる粒子によって具体化される化学特性の混合は、混合化学特性の可溶性多価カチオン剤を捕捉する電気陰性官能性を含むことができ、さらに、凝集体含有量を低減するその能力を高めることができる、及び／又は可溶性薬剤の捕捉を容易にすることができる、電気陽性、水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合及び金属配位を含めて、ただしそれだけに限定されない１つ以上の化学官能性を含むことができる。所与のリガンドが１種類を超える電荷を含む場合、電荷は平衡であり、電気的中性状態を作り出しているか、又は一方若しくは他方の電荷が支配的であり、その正味電荷が金属親和性官能性を有する固体表面と同じであると理解される。
【０１８８】
電気陽性基は、いわゆる強いアニオン交換基及び／又はいわゆる弱いアニオン交換基を含むことができる。強弱混合アニオン交換（ｍｉｘｅｄ  ｓｔｒｏｎｇ−ｗｅａｋ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）の電気陽性基は、より高い凝集体減少度を達成するその能力に有益であり得る。凝集体を除去する能力が高いかかる弱強混合アニオン交換基の非限定的例は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）である。混合化学特性は、単一の複合化学基、単一タイプの表面上、異なる表面上の特性の異なる別々の化学基、又は上記の任意の組合せに帰することができる。強いイオン交換基との組み合わせを含めて、弱いイオン交換基は、強いイオン交換基に比べて、水素結合を形成するその高い能力のためにも有用であり得る。
【０１８９】
電気陰性基としては、いわゆる強いカチオン交換基、いわゆる弱いカチオン交換基、又は強弱混合カチオン交換基の電気陰性基が挙げられる。かかる基は、溶解金属イオンとの配位相互作用に関与し、適用した生物試料から混入金属イオンを除去する望ましい結果を生じるその能力のために有用である。カチオン交換基の非限定的例としては、スルホ、カルボキシ、ホスホリル、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）及びニトリロ酢酸（ＮＴＡ）基が挙げられる。強いイオン交換基との組み合わせを含めて、弱いイオン交換基は、強いイオン交換基に比べて、水素結合を形成するその高い能力のためにも有用であり得る。
【０１９０】
ある実施形態においては、電気陽性又は電気陰性材料の表面は、脂肪族及び／又は芳香族性の疎水性基も含むことができる。後者は、いわゆるパイ−パイ結合に関与するその能力のために有用であり得る。混合化学特性は、単一の複合化学基、単一タイプの表面上、異なる表面上の特性の異なる別々の化学基、又は上記の任意の組合せに帰することができる。
【０１９１】
個々の特性が異なる化学官能性は、特定の試料組成物の必要性に応じて種々の比で利用することができる。例えば、精製細胞培養上清の処理のための組合せは、過剰の電気陽性表面を含むことができ、エタクリジン、メチレンブルーなどの電気陽性ヘテロ凝集体解離剤で既に処理された上清の処理のための組合せは、過剰の電気陰性表面を含むことができる。
【０１９２】
ある実施形態の実施に用いられる混合化学特性の可溶性多価カチオンは、少なくとも１個の正電荷、及び水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力をもたらす部分などの混合化学特性を付与する追加の機能を有する有機分子を含むことができる。これらの特性を含む多価カチオンの例としては、ポリエチレンイミン、エタクリジン、メチレンブルー、臭化セチルトリメチルアンモニウム、クロルヘキシジン及び多数の他の多価カチオンが挙げられる。かかる薬剤は、０．００１％から１．０％の濃度で適用することができるが、一般に、０．０１から０．１０％、特に０．０２から０．０６％又は０．０２％から０．０５％の濃度で使用すると凝集体低減とタンパク質産物回収の平衡が保たれる。
【０１９３】
ある実施形態の実施に用いられる混合化学特性の可溶性多価アニオンは、少なくとも１個の負電荷、及び水素結合、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、金属配位及びインターカレーションに関与する能力をもたらす部分などの混合化学特性を付与する追加の機能を有する有機分子を含むことができる。これらの特性を含む多価アニオンの例としては、ヘプタン酸、オクタン酸、オクテン酸、ノナン酸、ノネン酸、デカン酸、ポリアスパラギン酸、及び多数の他の有機酸が挙げられる。かかる薬剤は、約０．００５％から約５％の濃度で適用することができるが、一般に、約０．０５から約１％、特に約０．２％から約０．５％の濃度で使用すると凝集体低減とタンパク質産物回収の有益な平衡が保たれる。
【０１９４】
ある実施形態においては、方法の凝集体低減性能、及び／又は所望のタンパク質の回収は、他の実施形態と同じレベルの凝集体低減が得られる十分な化学的作用を単独では持たない可溶性有機薬剤の同時添加によって高めることができる。かかる追加の薬剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒｉｊ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、オクチルグルコシドなどの非イオン性又は両性イオン性界面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの有機ポリマー、及び一般に１０００ダルトン未満の分子量を有する；エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、フェノキシエタノールなどの有機溶媒；炭水化物；並びに尿素、ヒダントイン及びアラントインを含めたウレイドが挙げられるが、それだけに限定されない。例としては、とりわけ、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルー及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）を含めて、ウイルスの不活性化など、ただしそれだけに限定されない別の目的のために添加される可溶性非多価カチオン剤も挙げられる。ある実施形態における例としては、０．００２５％を超える量の尿酸、０．５６％を超える量のアラントインなどの過飽和量のウレイドが挙げられる。
【０１９５】
ある実施形態においては、混合化学特性の多価イオンと粒子は、凝集体低減を成し遂げるのに十分な期間一緒に存在しなければならない。それらは一緒に添加することができ、又は可溶性薬剤をあらかじめ不定の期間添加することができる。一部の実施形態においては、多価イオンを前もって添加すると、より良好な結果をもたらし得るが、別の形式が多数の用途で妥当な結果をもたらす。本明細書に開示した方法の実施に必要な時間は、多価カチオンの濃度、粒子の割合、及びより少ない程度にタンパク質調製物の凝集体含有量に直接依存する。
【０１９６】
ある実施形態においては、方法は、第１及び第２の成分の混合化学特性の可溶性固体薬剤の添加のための試料を調製する方法ステップを提供する。条件は、多価イオン又は粒子との相互作用によって目的タンパク質の実質的な減少を防止する性質のものとすべきである。かかる条件は、目的タンパク質と多価イオン又は粒子の強い電荷相互作用を停止するのに十分高い伝導率値を含み、別のタイプの化学相互作用を調節する別の添加剤を含むことができる。
【０１９７】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、効果的な凝集体低減、及びかなり高い伝導率（塩濃度）における可溶性薬剤の除去を予想外にもたらす。荷電粒子は、特に、その性能が低伝導率、典型的には１０ｍＳ／ｃｍ未満、ほとんどの場合５ｍＳ／ｃｍ未満の水溶液環境に依存することが知られている。これらの値は、それぞれ１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  ＮａＣｌにほぼ対応する。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、２０〜３０ｍＳ、しばしば最高４０ｍＳ／ｃｍ、時折最高１００ｍＳ／ｃｍ、又はそれ以上の伝導率値における効果的な凝集体低減、及び可溶性薬剤の除去を助ける。ある実施形態においては、ヘテロ凝集体の解離は、より高い塩濃度で増加する。
【０１９８】
ある実施形態においては、方法は、後続の精製方法に使用されるクロマトグラフィカラムを汚染する可能性がある試料成分を除去する。例えば、ＩｇＧ抗体は、固定化プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィによって精製されることが非常に多い。有効ではあるが、この方法の実施に使用されるクロマトグラフィ媒体は、非常に高価であり、その有効なサイクル寿命は、粗製試料の適用によってかなり短くなるおそれがある。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法によって処理された試料は、光学的に透明であり、プロテインＡ又は別のクロマトグラフィ媒体の機能を損ない得る懸濁細片がない。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法による試料の精製は、プロテインＡのＩｇＧ結合能を最高１０％以上増加させ、他の捕捉又は後続のクロマトグラフィ法に対して同様に有益な効果をもたらす。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法を使用すると、プロテインＡは混入宿主タンパク質含有量を１／１０から１／１００以下に低減することができる。
【０１９９】
ある実施形態においては、他の方法では未精製源からの初期の抗体捕捉に実用的でない程度にさえ試料成分によって損なわれる後続の精製方法を可能にし得る方法を提供する。宿主細胞ＤＮＡは、例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体よりも強くアニオン交換体及びヒドロキシアパタイト媒体に結合する。これは、その抗体結合能力と精製性能の両方を低下させ、初期の捕捉方法としてのその適合性を損なう。ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、試料をこれらの後続の方法にかける前にＤＮＡの大部分の除去を促進し、アニオン交換体とヒドロキシアパタイト媒体の両方を初期抗体捕捉／精製の実用ツールにする。
【０２００】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法の使用に備えて、処理する試料の組成を評価することが得策である。第１の主要な変数は、試料の凝集体含有量である。これは、サイズ排除クロマトグラフィによる分析によって、更に特に２５４〜２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長における同時モニタリングによって分画をモニターすることによって、容易に求めることができる。さらに、この方法は、抗体−ＤＮＡ複合体を含むヘテロ凝集体の流体力学的サイズが精製抗体に近いときでも、その検出に好都合である。高い凝集体レベルを含む、又は２５４／２８０比が０．５以上である凝集体を含む、又は２５４／２８０比が高い抗体−ＤＮＡヘテロ凝集体を含む試料は、混合化学特性の表面に試料を曝す前に凝集体の解離を促進するために、エタクリジン及び／又はメチレンブルーなど、ただしそれだけに限定されない混合化学特性の可溶性薬剤による試料処理の好ましい候補である。「高凝集体レベル」という用語は、全精製プロセスにおいて試料が由来する場所に依存するので、相対的であると理解される。細胞培養上清における「高」凝集体レベルは、抗体に比べて最高５０％以上とすることができ、初期精製後の「高」凝集体レベルは、５％を超えるレベル、又は５％未満のレベルさえ含むことができる。
【０２０１】
ある実施形態においては、精製されるタンパク質本来の化学特性を評価することも得策である。ＩｇＧ抗体は、電荷中性〜アルカリ性（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｅｕｔｒａｌ−ｔｏ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）である傾向があり、電気陽性表面に結合する傾向が弱い又はないが、電気陰性表面に結合する傾向が軽度から中程度である。ＩｇＭ抗体は、アルカリ性から酸性の範囲であり、一般に、電気陽性表面に結合する傾向が強く、電気陰性表面に結合する傾向が軽度から中程度である。抗体の表面特性の実用的な測定は、抗体をカチオン交換体にｐＨ７．０で適用し、線形塩勾配で溶出させ、同じ条件下でアニオン交換体に適用し、溶出させる一組みの単純な実験によって行うことができる。抗体が各交換体から溶出する塩濃度は、電気陰性又は電気陽性表面に結合する抗体の相対的傾向の好都合な指標であり、かかる相互作用を制御するのに必要な塩濃度を与える。かかる特性分析を複数のｐＨ値で実施して、目的とする特定のタンパク質の帯電特性をより完全に理解することができる。
【０２０２】
ある実施形態においては、混合化学特性の１種類以上の多価カチオンを選択することが望ましい。実験データによれば、一般に、多価カチオンの疎水性が低いほど、目的タンパク質の回収率が高い。さらに、疎水性が低いほど、所望のタンパク質の大きな損失なしに多価カチオンを適用することができる濃度範囲が広く、高い。したがって、疎水性の弱いＰＥＩは、より疎水性のエタクリジン、又は更により疎水性のクロルヘキシジンよりも優れた候補とみなすことができる。しかし、生成物回収に加えて、他の問題も考慮する必要があり得る。ＰＥＩは、周知の細胞傷害性を含み、精製プロセス過程を通して試料からその除去を容易に確認する十分な感度で検出することが困難である。エタクリジンは、血しょうタンパク質分画の分野でその長い歴史のために有用であり、抗ウイルス剤として有用であり得る。さらに、その明黄色及び固有の蛍光によって、所与の試料中のその含有量の高感度の測定を容易にし、それによって方法実施後のその除去の考証（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を助ける。その上、異なる多価カチオンは、所望の効果を媒介するその能力に関係した異なる第２の化学官能性を含むことができる。例えば、ＰＥＩは、主に静電相互作用及び水素結合によってＤＮＡに結合すると理解される。エタクリジンは、両方の相互作用の機会が少ないが、ＤＮＡをインターカレートすることが知られている。実験結果によれば、それも、一般に、より有効な凝集体低減を助ける。
【０２０３】
ある実施形態においては、エタクリジン、メチレンブルー、クロルヘキシジン、ポリエチレンイミンなどの薬剤は、抗体の特性及び試料の組成に応じて、０．００１％未満から１％の濃度で効果的に適用することができる。高濃度は可溶性薬剤を除去するのに必要な混合化学特性の電気陰性固体の量を増加させ得るので、最低有効濃度がほとんどの場合に有益であり得る。実験データによれば、この理想を果たす濃度は０．０１から０．１％であり、特に０．０２から０．０６％又は０．０２％から０．０５％である。最も有効な薬剤及び作用濃度を各具体例に対して決定し、調整することができる。当業者には明らかであるように、上記薬剤の幾つかは、ウイルスを不活性化するその能力が知られており、ＤＮＡ及びエンドトキシンの除去を増大させる追加の利点を有する。１種類を超える多価カチオンを使用することができる。多価カチオンによる試料の前処理は、一部の実施形態においては凝集体レベルを低減する本明細書に開示した方法の能力を高めることができる。
【０２０４】
ある実施形態においては、所望のタンパク質及びそれが存在する供給流れの特性を調節する種々の特性の固体電気陽性及び／又は電気陰性基質を評価することが得策であり得る。例えば、ある場合には、第四級アミン官能基を有する電気陽性材料は、凝集体及び／又は別の混入物を低減する能力に劣り得るが、所望のタンパク質のより高い回収を助けることができる。一方、ＴＲＥＮの形の電気陽性材料は、逆の結果を支持することができる。ある場合には、所望の一タンパク質に有用である電気陽性表面が、他よりも劣ると判断され得る。例えば、ＴＲＥＮはＩｇＧ抗体に有用であり得るが、第四級アミンはＩｇＭの方が良好であり得る。基質上のリガンドの密度も、試料成分と化学表面（単数又は複数）の第２の相互作用などによって、ある実施形態の性能に影響を及ぼし得る。例えば、実験データによれば、ある実施形態においては、高密度のＴＲＥＮを有する基質は、低密度のＴＲＥＮを有する基質よりも性能が優れている場合もある。
【０２０５】
ある実施形態においては、試料に対して５％固体の混合体積比で混合化学特性の粒子の同等にバランスの取られた混合物から始めることが好都合であり得る。系を最適化して特定の試料の必要性に対応する過程を通して、特定の試料／処理系に対する有効性しきい値を求めるために、固体と試料体積の比を減少させることができる。表面（単数又は複数）に含まれる第２の化学官能性の選択に応じて、電気陰性と電気陽性官能基の比も変わり得る。これらの変化を評価する実験作業負荷は、統計に基づく実験計画法（いわゆるＤｏＥ）を適用することによってかなり削減することができる。混合化学特性の好都合な粒子は、市販のアニオン交換体及びカチオン交換体、キレート樹脂、疎水性樹脂、並びにいわゆる混合モードクロマトグラフィを実施するために市販されている製品を含むことができる。
【０２０６】
ある実施形態においては、初期評価条件は、種々の表面との結合によって抗体損失を防止するｐＨ及び伝導率値で実施すべきであるが、さらに、実験は、より高い伝導率レベルを特に評価すべきである。というのは、それによって、凝集体及び／又は抗体−混入物複合体の解離の増大を助けることができるからである。便宜上、ＩｇＧ抗体を用いた初期の実験は、ｐＨ６．５〜７．５及び伝導率約１０から約１５ｍＳ／ｃｍで実施することができる。ＩｇＭ抗体を用いた初期の実験は、同じｐＨで伝導率２０〜３０ｍＳ／ｃｍで実施することができる。各々を用いた後続の実験は、凝集体低減と抗体回収の相補的組合せを支持する条件を特定するために、より高い及びより低い伝導率、及び／又はより高い若しくはより低いｐＨ値で実施することができる。宿主細胞タンパク質混入物のレベルを低減することが本明細書に開示した方法の第一の目的ではないが、それはこの点に関して、特に高度にアルカリ性及び／又は高度に酸性の宿主混入物の含有量に関して、重要な寄与をすることができる。
【０２０７】
ある実施形態においては、混合化学特性の可溶性固体薬剤が存在すべき期間は、試料をある時間、例えば、１０分ごとに１時間、又は以下に示す実施例のデータによって示される別の増分及び持続時間、ＳＥＣによって分析する単純な実験で求めることができる。
【０２０８】
当業者には明らかであるように、ホモ凝集体及びヘテロ凝集体の含有量を低減することに加えて、ある実施形態は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、エンドトキシン及びウイルスの含有量も実質的に低減することができる。
【０２０９】
ある実施形態においては、第１及び第２の成分の固体材料は、使用後、浄化し、再利用することができる。別の実施形態においては、それらを使用後廃棄することができる。
【０２１０】
ある実施形態においては、本明細書に開示した方法は、別のクロマトグラフィステップ前に実施することができる。この実施は、クロマトグラフィ媒体を細胞培養培地成分による汚染から保護すること、及び標的生成物を未処理試料中よりも均一な状態に置くことによって精製品質を向上させることの２つの利点がある。
【０２１１】
ある実施形態においては、方法は、混合され、中性材料によって封入された、中性材料に埋め込まれた、又は静電気帯電粒子と同じ電荷を有する材料によって封入された若しくは埋め込まれた、静電気帯電粒子及び／又は静電気的に中性な粒子の使用のために提供することができる。ある実施形態においては、電気陰性及び／又は電気陽性表面は、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合及び金属親和性に関与する能力を含めて、ただしそれだけに限定されない追加の化学官能性を含むことができる。
【０２１２】
ある実施形態においては、開示した方法によって処理されたタンパク質調製物を更に処理して、凝集体含有量を低減することができる。
【０２１３】
本明細書に開示した方法の更なる目的及び効果は、以下の記述である程度説明され、以下の記述からある程度明らかになるはずであり、又は方法の実施によって習得することができる。本明細書に開示した方法の目的及び効果は、特許請求の範囲に明記された要素及び組合せによって理解され、達成されるはずである。
【０２１４】
上記一般的記述と以下の詳細な記述のどちらも、単なる例示及び説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載の方法を限定するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【０２１５】
以下の実施例は、ある実施形態の有効性を示す原型を説明するものである。
【０２１６】
実施例１
ＨＥＲ２抗原に特異的なＩｇＧモノクローナル抗体約１ｇ／Ｌを含む細胞培養収集物１Ｌを１％アラントインで処理した。伝導率は約１３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは約６．８であった。添加剤は、沈降を加速する効果があった。固体材料をろ過除去し、光沢のある透明（ｓｐａｒｋｉｎｇ  ｃｌｅａｒ）抗体含有ろ液を得た。抗体回収率は９９％であった。２０ｍＬのＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮ  ｈｉ−ｓｕｂ、アガロース多孔質粒子系電気陽性金属親和性材料をカラム（１．６×１０ｃｍ）に充填し、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にした。精製ろ液をカラムに線流速２００ｃｍ／ｈで通した。最初の収集物は、特に少なくとも１０％のいわゆる高分子量凝集体を含む、２０％を超える凝集体を含んだ。処理試料は、０．０５％未満の高分子量凝集体及び４％未満の全凝集体を含んだ。蛍光色素アッセイによって測定されたＤＮＡは９８％超低減したが、ｑＰＣＲによれば、減少は実際に９９．９９９％を超えた。ヒストンタンパク質は少なくとも９８％減少し、Ｃｙｇｎｕｓ  ＥＬＩＳＡで測定した一般宿主タンパク質レベルは６２％減少した。抗体回収率は９９％であった。
【０２１７】
実施例２
ＴＲＥＮと疎水性電気陽性粒子材料Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２の１：１混合物の代わりにＴＲＥＮを用いた以外は実施例１の手順を繰り返した。抗体回収率が９５％に低下し、実施例１後に明らかになった２種類の強い疎水性混入物が除去されたことが分析サイズ排除クロマトグラフィによって示された以外は、すべての結果が表面上同じであった。
【０２１８】
実施例３
１％アラントインに加えて０．０５％オクタン酸で細胞含有収集物を処理した以外は、実施例２の手順を繰り返した。宿主タンパク質混入は７０％超減少し、抗体回収率は９０％に減少した。オクタン酸は処理試料中に検出されず、固体材料（単数又は複数）に結合していると考えられた。凝集体は３％未満に減少した。ＤＮＡ及びヒストン含有量は９９％減少した。
【０２１９】
実施例４
伝導率２０ｍＳ／ｃｍになる濃度までＮａＣｌを細胞含有収集物に添加し、ｐＨを６．０に調節した以外は、ＩｇＭモノクローナル抗体を用いて実施例２の手順を繰り返した。未処理収集物の凝集体含有量は３０％を超えた。カラムを５０ｍＭ  ＭＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡にした。ＤＮＡ及びヒストンの９９％をすべての高分子量凝集体と一緒に除去した。総凝集体含有量は約２％に減少した。抗体回収率は８４％であった。全宿主タンパク質は６７％減少した。伝導率２０ｍＳ／ｃｍを得るのに添加した濃度に加えて５０ｍＭ増分の塩化ナトリウムの添加に対応する伝導率２５ｍＳ／ｃｍで実験を繰り返した。抗体回収率が９８％に増加し、他の測定値はすべて同じであった。伝導率４０ｍＳ／ｃｍで実験を繰り返した。宿主タンパク質の減少は約４７％に低下したが、他の性能測定値はすべて不変であった。
【０２２０】
実施例５
オクタン酸の代わりに０．０２５％エタクリジンを用い、金属親和性リガンドイミノ二酢酸を有するアクリル酸系多孔質粒子（Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ  １００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１：１混合物を充填したカラムを使用した以外は、実施例３の手順を繰り返した。処理試料は黄色味がなく、クロマトグラフィ媒体は濃い黄色であり、エタクリジンが除去されたことを示した。ＤＮＡ、ヒストン及びヌクレオソームは９９％減少し、抗体回収率は９９％であった。高分子量凝集体は完全に除去され、全凝集体は２％未満に減少した。分析ＳＥＣによっても強い疎水性混入物の除去が実証された。全宿主タンパク質混入は６３％減少した。
【０２２１】
実施例６
Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ及びＣｈｅｌｅｘと１：１：１比で混合した負に帯電した疎水性相互作用粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｔ−ｂｕｔｙｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むこと以外は実施例５の形態を繰り返した。処理試料は黄色味がなく、クロマトグラフィ媒体は濃い黄色であり、エタクリジンが除去されたことを示した。ＤＮＡ、ヒストン及びヌクレオソームは９９％減少し、抗体回収率は９９％であった。高分子量凝集体は完全に除去され、全凝集体は２％未満に減少した。分析ＳＥＣによっても強い疎水性混入物の除去が実証された。全宿主タンパク質混入は６４％減少した。
【０２２２】
実施例７
動的結合実験を固定化プロテインＡ（ｒＡＦプロテインＡ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ、東ソー）上で実施し、遠心分離及び精密ろ過によって精製された収集物を実施例２の処理と比較した。精密ろ過材料上の動的結合能は２８ｍｇ／ｍＬであった。実施例３の材料上の動的結合能は３５ｍｇ／ｍＬであった。プロテインＡ精製後の精密ろ過材料の宿主タンパク質含有量は７９２ｐｐｍであった。実施例３処理材料の宿主タンパク質含有量は１ｐｐｍ未満であった。したがって、開示した方法を実施すると、ＩｇＧ結合能が約２０％、ＩｇＧ純度がほぼ８００倍増加した。
【０２２３】
実施例８
作用ｐＨを８．０に上げ、試料を水２部で希釈して細胞培養上清の伝導率を４．７に下げ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含むように緩衝剤を再処方した以外は、実施例２の手順を再現した。性能は、一般宿主タンパク質除去率が８３％であった以外は実施例２と表面上同じであった。
【０２２４】
実施例９
粒子の全割合を２％から５％に増加させた以外は実施例２の手順を再現した。結果は、抗体回収率が８４％に減少した以外は表面上不変であった。全粒子の割合が２％であり、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２で表される割合がＴＲＥＮ含有量のそれぞれ２５％及び１２．５％に減少した後続の実験においては、抗体回収率がそれぞれ９７及び９８％に増加した。疎水性混入物の除去は、低Ｄｏｗｅｘレベルでも依然効果的であった。他の結果はすべて実施例２と表面上同じであった。
【０２２５】
実施例１０
水２部で希釈して試料の伝導率を約５に低下させた以外は実施例１の形態を繰り返した。すべてのサイズの凝集体の割合は、ほぼ２倍になった。
【０２２６】
実施例１１
Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２をＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑで置き換えた以外は実施例２の手順を繰り返した。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑは、残留エタクリジンをより効果的に除去した。結果はその他の点では同様であった。
【０２２７】
実施例１２
カプリル酸を０．４％に増加させ、作用ｐＨを５．２に下げ、ＴＲＥＮ粒子の添加前に２時間インキュベートし、次いで固体除去前に４時間インキュベートした以外は、実施例３の手順を繰り返した。凝集体含有量は０．１％未満に減少した。宿主タンパク質は９９．９％減少した。
【０２２８】
実施例１３
作用ｐＨ５．６を除いて、実施例１２の材料及び条件をＩｇＭモノクローナル抗体を含む細胞培養収集物に適用した。凝集体は非凝集抗体に比べて当初の２２％から０．１％未満に減少した。宿主タンパク質は９８％超減少した。
【０２２９】
実施例１４
２５９，２１８ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２１％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は３０８ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０５％未満に減少した。
【０２３０】
実施例１５
２４３，９９７ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２４％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は３０５ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０５％未満に減少した。
【０２３１】
実施例１６
２４３，９９７ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２４％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．６を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は３，５５１ｐｐｍに減少し、凝集体は０．５％未満に減少した。
【０２３２】
実施例１７
３１９，２３０ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２２％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は２３７ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０１％未満に減少した。試料を多モード疎水性カチオン交換体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＨＣＸ）にｐＨ７．０で載せ、漸増ＮａＣｌ勾配で溶出させた。宿主タンパク質混入は３７ｐｐｍに減少した。試料を多モード疎水性アニオン交換体に１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で載せ、漸減ＮａＣｌ勾配で溶出させ、宿主タンパク質混入を１ｐｐｍに削減した。あるいは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡にし、空隙排除モードで動作させたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカラムにｐｏｓｔ−ＨＣＸ試料をかけて、宿主タンパク質混入を検出限界以下のレベルに削減した。
【０２３３】
実施例１８
２８７，６２１ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１９％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は５１０ｐｐｍに減少し、凝集体は０．１％未満に減少した。コンディショニングした収集物をカチオン交換体（ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＨＲＳに載せ、漸増ＮａＣｌ勾配で溶出させた。宿主タンパク質混入は１ｐｐｍ未満に減少したが、凝集体は０．２％をわずかに超える量に増加した。続いて、試料をヒドロキシアパタイト（ＣＨＴタイプＩ、４０ミクロン）のカラム上で分画し、リン酸勾配で溶出させ、凝集体を０．０１％未満に、宿主タンパク質を検出限界以下のレベルに削減した。
【０２３４】
実施例１９
２０６，９９４ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１８％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物をプロテインＡカラム（Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）にかけ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いで１００ｍＭ酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は１，９１７ｐｐｍに減少し、凝集体は１．８％に減少した。カラムを５０ｍＭリン酸塩、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質は５２７ｐｐｍに減少し、凝集体は１．６％に減少した。２８７，６６１ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１９％凝集体を含む別のＩｇＧ含有細胞培養収集物をプロテインＡカラム（Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）にかけ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いで１００ｍＭ酢酸で溶出させた。宿主タンパク質混入は１，３３７ｐｐｍに減少し、凝集体は２．１％に減少した。
【０２３５】
実施例２０
２８７，６２１ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１９％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物を２つの部分に分割した。第１の部分に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は１６７ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０１％未満に減少した。コンディショニングした収集物をプロテインＡカラム（Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）にかけ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いで１００ｍＭ酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は検出限界以下のレベルに減少した。カラムを５０ｍＭリン酸塩、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質はやはり検出限界以下のレベルに減少した。第２の部分に１％アラントイン及び０．０２５％エタクリジンを添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は２，９８５ｐｐｍに減少し、凝集体は０．１％未満に減少した。コンディショニングした収集物をプロテインＡカラム（Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）にかけ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いで１００ｍＭ酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は１ｐｐｍに減少した。カラムを５０ｍＭリン酸塩、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質はやはり１ｐｐｍに減少した。
【０２３６】
実施例２１
２５１，８５２ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１８％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は１３１ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０１％未満に減少した。試料をＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅにかけると、宿主タンパク質は３ｐｐｍに減少した。試料をＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓにかけると、宿主タンパク質は１ｐｍに減少した。
【０２３７】
実施例２２
１９１，１８０ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１６％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで０．４５ミクロン膜上の精密ろ過によって固体を除去して、宿主タンパク質を２，０６３ｐｐｍに、凝集体を１．２％に削減した。次いで、試料を電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）に通して、宿主タンパク質を１９６ｐｐｍに、凝集体を０．０１％未満に削減した。空隙排除モードで動作させたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を１ｐｐｍに削減した。あるいは、空隙排除モードで動作させたＮｕｖｉａ  Ｑのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を１ｐｐｍに削減した。０．４％カプリル酸の代わりに０．２％カプリン酸を用いた以外はすべての詳細が同じ平行シリーズの実験において、宿主タンパク質は膜ろ過後に１，９２０ｐｐｍに減少し、深層ろ過後に１３２ｐｐｍに減少し、両方のアニオン交換ステップ後に１ｐｐｍ未満に減少した。
【０２３８】
実施例２３
１７６，２４４ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び１４％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．２を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで０．４５ミクロン膜上の精密ろ過によって固体を除去して、宿主タンパク質を２，０６３ｐｐｍに、凝集体を１．２％に削減した。次いで、試料を電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）に通して、宿主タンパク質を１９６ｐｐｍに、凝集体を０．０１％未満に削減した。空隙排除モードで動作させたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を１ｐｐｍに削減した。あるいは、空隙排除モードで動作させたＮｕｖｉａ  Ｑのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を１ｐｐｍに削減した。０．４％カプリル酸の代わりに０．２％カプリン酸を用いた以外はすべての詳細が同じ平行シリーズの実験において、宿主タンパク質は膜ろ過後に１，９２０ｐｐｍに減少し、深層ろ過後に１３２ｐｐｍに減少し、両方のアニオン交換ステップ後に１ｐｐｍ未満に減少した。
【０２３９】
実施例２４
２４３，９９７ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２４％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に１％アラントイン、０．４％カプリル酸、ｐＨ５．６を添加してコンディショニングし、２時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を４％の量添加し、さらに４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は３，５５１ｐｐｍに減少し、凝集体は０．５％未満に減少した。硫酸アンモニウム沈殿によって、宿主タンパク質含有量は１，４２３ｐｐｍに減少し、凝集体は０．１％未満に減少した。ＱＡモノリス上の後続のアニオン交換クロマトグラフィステップによって、宿主タンパク質は２ｐｐｍに減少した。遠心分離及び精密ろ過によって精製された収集物に対して行われた硫酸アンモニウム沈殿によって宿主タンパク質は３０，１１４ｐｐｍに減少した。アニオン交換によって更に４１１ｐｐｍに減少した。これらの結果は、クロマチン除去の利点が沈殿方法にも当てはまることを示し、その利点が第１のステップから後続のクロマトグラフィステップに波及することも示した。
【０２４０】
実施例２５
２５６，４８２ｐｐｍ宿主タンパク質混入物及び２１％凝集体を含むＩｇＧ含有細胞培養収集物に４％の量の電気陽性金属親和性粒子（ＴＲＥＮ  ４０  ｈｉｇｈ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ）を添加してコンディショニングし、４時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）によって固体を除去した。宿主タンパク質は１，１８３ｐｐｍに減少し、凝集体は０．４％未満に減少した。Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅに試料をかけると、宿主タンパク質は１４７ｐｐｍに減少し、凝集体は０．０５％未満に減少した。空隙排除モードで動作させたＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ上の後続のアニオン交換クロマトグラフィステップによって宿主タンパク質は３ｐｐｍに減少した。
【０２４１】
当業者には明らかであるように、細胞の多様性を考慮すると、任意の所与の細胞培養培地で産生され、特定の細胞死亡率範囲内で収集される任意の所与のタンパク質を調節する細胞培養処方、生成物特性及び発現レベル、並びに収集時の相対細胞死亡率は、特定のタイプの粒子、その相対体積及び特定の条件が個々に実験的に構築されなければならないことを求めている。さらに、本明細書の実施例及び指針に基づいて、材料及び条件の最適な組合せを決める試行錯誤があり得ることは当業者の範囲内であることも明らかである。
【０２４２】
使用後、すべての固体材料を、場合によっては、当業者に既知の標準技術に従って廃棄又は再生することができる。
【０２４３】
本実施形態は、所望の精製レベルを得るために、種々の精製方法と組み合わせることができる。例としては、プロテインＡ及び別の形式のアフィニティクロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ、別の混合モードクロマトグラフィ法などの抗体の精製に一般に使用される他の方法が挙げられるが、それだけに限定されない。種々の方法に適切な条件を構築し、それらを本明細書の方法と統合して、特定の抗体の必要な精製を行うことは当業者の範囲内である。
【０２４４】
本明細書で引用する全ての参考文献は、個々の刊行物又は特許又は特許出願が参照によりその全体が援用されるように具体的かつ個々に示されたと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。参照により援用する刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する範囲では、本明細書は、こうした矛盾を無効にし、及び／又は矛盾に優先するものとする。
【０２４５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分量、クロマトグラフィ条件などを表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されることを理解されたい。したがって、それに反しない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本実施形態によって得ようとする所望の性能に応じて変わり得る近似値である。
【０２４６】
当業者には明らかなように、本明細書に開示した方法は、その精神及び範囲から逸脱することなく、種々改変及び変更することができる。本明細書に記載した具体的実施形態は、単なる例示にすぎず、何ら限定することを意味するものではない。本明細書及び実施例は単なる例示と考えられるものであり、方法の正確な範囲及び精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものである。