(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性を有する、前記デザイナー細胞。
0006330028.tif 000066
【請求項２】
配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり15倍から26倍高い活性を有する、請求項１に記載のデザイナー細胞。
【請求項３】
配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、下記式3の化合物の還元についてCRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から275倍高い活性を有する、請求項１に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000067
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
【請求項４】
配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、下記式4の化合物の還元についてCRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から180倍高い活性を有する、請求項１に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000068
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
【請求項５】
配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元について単位細胞質量当たり約3倍から15倍高い活性を有する、請求項１に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000069
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
0006330028.tif 000070
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
【請求項６】
配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9又は11から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化についてGDHポリペプチドの単位質量当たり200倍から250倍強化された活性を有する、前記デザイナー細胞。
0006330028.tif 000071
【請求項７】
配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9又は11から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり11倍から24倍強化された活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化について単位細胞質量当たり9倍から31倍強化された活性を有する、請求項６に記載のデザイナー細胞。
【請求項８】
配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式3の化合物の還元についてCRSポリペプチドの単位質量当たり約55倍から270倍高い活性を有する、請求項６に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000072
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
【請求項９】
配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式4の化合物の還元についてCRSポリペプチドの単位質量当たり約40倍から156倍高い活性を有する、請求項６に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000073
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
【請求項１０】
配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元について単位細胞質量当たり約３倍から２４倍高い活性を有する、請求項６に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000074
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
0006330028.tif 000075
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
【請求項１１】
組換え大腸菌（Escherichia coli）BL21(DE3)、又は組換え大腸菌C41(DE3)、又は組換
え大腸菌C43(DE3)から調製される、請求項１又は６に記載のデザイナー細胞。
【請求項１２】
カルボニルレダクターゼ活性を示す、配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
カルボニルレダクターゼ活性を示す配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、及びGDH活性を示す配列番号:9又は11のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１４】
約100％鏡像体過剰の下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの製造の
ための請求項1又は６に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000076
【請求項１５】
下記式5の化合物の製造のための請求項１又は６に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000077
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
【請求項１６】
下記式６の化合物の製造のための請求項１又は６に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000078
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
【請求項１７】
約100％鏡像体過剰で下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを製造する方法であって、
0006330028.tif 000079
前記方法が、
ａ．下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程、
0006330028.tif 000080
ｂ．該エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを、請求項１又は６に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させる工程、
ｃ．工程（b）で得られる反応混合物に、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテルから成る群から選択される有機溶媒を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
ｄ．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
ｅ．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて当該生成物エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
光学的に濃縮された下記式5の脂肪族アルコールを製造する方法であって、
0006330028.tif 000081
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）、
前記方法が、
ａ．下記式3のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000082
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基であり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、及びm＝1−8である。）
ｂ．工程（a）で提供される式3のケトンを、請求項３又は８に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
ｃ．工程（b）で得られる反応混合物に、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテルから成る群から選択される有機溶媒を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
ｄ．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
ｅ．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式5の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
光学的に濃縮された下記式6のアリールアルコールを製造する方法であって、
0006330028.tif 000083
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）、
前記方法が、
ａ．下記式４のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000084
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基であり、及びn＝1から5である。）
ｂ．工程（a）で提供される式４のケトンを、請求項４又は９に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
ｃ．工程（b）で得られる反応混合物に、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテルから成る群から選択される有機溶媒を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
ｄ．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
ｅ．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式6の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
アクセッション番号MTCC No.5806、MTCC No.5807、MTCC No.5808、MTCC No.5809、MTCC No.5810、MTCC No.5811、MTCC No.5812、MTCC No.5813、MTCC No.5814、MTCC No.5815、MTCC No.5816及びMTCC No.5817のいずれかを有する、請求項１又は６に記載のデザイナー細胞。
【請求項２１】
配列番号１、３、５又は７のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター構築物であって、カルボニルレダクターゼ酵素の天然に存在しない配列を含みかつ細胞表面上で高活性のカルボニルレダクターゼを発現できることを特徴とする組換えベクター構築物。
【請求項２２】
配列番号１、３、５又は７及び配列番号９又は１１のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター構築物であって、酵素カルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを細胞表面で一緒に共同発現することができる組換えベクター構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全細胞生物触媒及びエナンチオ濃縮アルコールの効率的製造における前記の使用に関する。より具体的には、本発明は“デザイナー細胞”と本明細書で称する全細胞生物触媒の開発に関し、前記細胞は、種々のケトンのそれらの高鏡像体過剰アルコールへの不整還元のために極めて強化された変換速度を有する。特に、本発明はデザイナー細胞の開発に関し、前記細胞は下記式1で表されるエチル4-クロロ-3-オキソブチレートの効率的変換のために極めて強化された変換速度を有し、99.9％を超える鏡像体過剰で下記式2で表されるエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを生成する（後者は、ヒドロキシメチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）レダクターゼ阻害剤の製造のためにキラル構築ブロック及び中間体として有用である）：
【０００２】
【化１】
0006330028.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
従来技術では、種々の供給源から単離した野生型全細胞生物触媒を使用して、工業的に重要な光学活性アルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）を調製する方法例が記載されている。前記種々の供給源は、例えばゲオトリチュム・カンジズム（Geotrichum candidum）（Sundby, E.et al.Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2003, 21, 63-66）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）（Kaliaperumal, T.et al.Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2010, 37, 159-165）、カンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）（Yasohara, Y.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 1999, 51, 847-851）、シリンドロカルポン・スクレロチゲヌム（Cylindrocarpon sclerotigenum）（Saratani, Y.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2001, 65, 1676-1679）、クルベロミセス・ラクチス（Kluveromyces lactis）（Yamamoto, H., et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2002, 66, 1775-1778）、クルベロミセス・アエスツアリイ（Kluyveromyces aestuarii）（Yamamoto, H.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68, 638-649）、アウレオバシジウム・プルーランス（Aureobasidium pullulans）（He, J.Y.et al.Process Biochemistry 2006, 41, 244-249）、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）（Ye, Q.et al.Biotechnology Letters 2009, 31, 537-542）、及びストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）（Wang, L.J.et al.Bioresource Technology 2011, 102, 7023-7028）である。さらにまた、野生型全細胞生物触媒を使用するエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの製造方法が、米国特許99/5891685号；米国特許97/5700670号；米国特許96/5559030号；米国特許95/5413921号；米国特許90/4933282号；及び米国特許号87/4710468に開示されている。カルボニル基を対応するアルコールに還元する野生型微生物の使用を記述した方法はあるが、これらの方法は欠点（例えば低効率、低基質濃度、低光学純度など）を有する。したがって、工業的に重要な光学活性アルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）を野生型の天然の全細胞生物触媒を用いて合成することは実際的ではない。
【０００４】
さらにまた、工業的に重要な光学活性アルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）の光学純度を改善する公知の方法は、手を加えられていない例えば以下の供給源から精製された酵素の使用を含む：カンジダ・マグノリアエ（Wada, M.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 1998, 62, 280-285）、スポロボロミセス・サルモニコロル（Sporobolomyces salmonicolor）（Kita, K.et al.Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 1999, 6, 305-313）、クルベロミセス・ラクチス（Yamamoto, H.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2002, 66, 1775-1778）、クルベロミセス・アエスツアリイ（Yamamoto, H.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68, 638-649）、ピキア・スチピチス（Ye, Q., et al.Bioresource Technology 2009, 100, 6022-6027）、及びストレプトミセス・コエリコロル（Wang, L.J.et al.Bioresource Technology 2011, 102, 7023-7028）。
【０００５】
カルボニルレダクターゼ活性を有する精製酵素又は形質転換体がケトン（エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートを含む）のカルボニル基を還元するとき、前記は、工業的に重要な光学活性アルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）の調製に補酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を要求する。反応が進行するにつれて、補酵素はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）に変換される。補因子再生系が存在しない場合、理論量の増量補因子が要求される。しかしながら、反応が補因子再生系の存在下で行われるとき、増量される補酵素の量は大幅に削減される。補因子再生系は典型的には、その基質の存在下でニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（NADH）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）に変換する酵素から成る。補酵素再生能力は、精製酵素の使用によって達成されるか（Yasohara, Y.et al.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2000, 64, 1430-1436；Kaluzna, I.A.et al.Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 12827-12832；Zhu, D.et al.The Journal of Organic Chemistry 2006, 71, 4202-4205；Ye, Q.et al.Biotechnology Letters 2009, 31, 537-542）、又はその細胞質で補酵素再生能力を有する形質転換体を使用することによって達成され得る（Xu, Z.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2006, 70, 40-46；Zhang, J.et al.Chemical Communications 2006, 398-400）。
【０００６】
複数の方法（例えば遺伝子シャッフリングを用いるin vitro遺伝子進化）を利用して、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートを不整還元するケトレダクターゼの活性が約13倍改善され、さらに基質としてグルコースを用い補因子（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH））をリサイクルするグルコースデヒドロゲナーゼの能力が対応する野生型酵素と比較して約7倍改善された（Steve K.Ma et al.Green Chemistry 2010, 12, 81-86米国特許10/0028972号；米国特許10/7816111号）。
しかしながら、単離酵素の使用は追加の工程（例えば酵素の単離、精製及び安定化）を要求し、前記は、コストの追加をもたらし、さらに光学活性アルコールの製造の全プロセスの経済的魅力を損なう。そのうえ、基質及び／又は生成物による酵素の阻害が時に生じ得る。2つの酵素（1つはカルボニル化合物の還元用及び他方は補因子リサイクリング用）を2つの基質（各酵素について1つの基質）と一緒に使用することは当該反応において全体の複雑な消長動態をもたらす。総合すれば、これらの要因は、鏡像体的に濃縮されたアルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）の調製で全細胞を使用する場合と比べて単離酵素の使用の価値を低下させる。
【０００７】
野生型株に付随する低効率の問題を克服するために、カルボニルレダクターゼ活性をコードする遺伝子を推論し、宿主細胞で過剰発現させることができる。鏡像体濃縮アルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）を製造するために、全細胞生物触媒の更なる効率改善が、同じ宿主細胞の細胞質でカルボニルレダクターゼ及び補酵素再生能力の両方を共同発現させることによって達成される（Kizaki, N.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595, Kataoka, M.et al.Enzyme and Microbial Technology 2006, 38, 944-951; Ye, Q.et al.Bioresource Technology 2010, 101, 6761-6767）。
しかしながら、カルボニルレダクターゼ能力が存在する形質転換体又はカルボニルレダクターゼ及び補酵素再生能力の両方が細胞の細胞質に存在する形質転換体のいずれかを使用する方法では、複数の欠点（例えば形質膜によって強制される障壁による基質取り込み及び生成物流出における低効率、全プロセスの複雑な消長動態）に悩まされる。
結果として、光学的に純粋なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレート及び他の光学的に濃縮されたアルコールを製造する現行方法は、欠点（例えば低効率、低生産性など）を抱え、したがって前記は製造コストの上昇を生じる。
【０００８】
タンパク質（酵素を含む）を細胞の表面で発現させる技術は周知であり（Lee, S.Y.et al.Trends in Biotechnology 2003, 21, 45-52）、広範囲のバイオテクノロジー及び工業における応用で用いられている。前記応用は、例えばバイオ変換のための全細胞生物触媒（Shimazu, M.et al.Protein.Biotechnology Progress 2001, 17, 76-80；Shimazu, M.et al.Biotechnology and Bioengineering 2001, 76, 318-324）、有害な化学物質及び重金属を除去するバイオ吸着材（Bae, W.et al.Biotechnology and Bioengineering 2000, 70, 518-524；Bae, W.et al.J Inorg Biochem 2002, 88, 223-227；Sousa, C.et al.J.Bacteriol.1998, 180, 2280-2284；Xu, Z.et al.Appl Environ Microbiol 1999, 65, 5142-5147）、ヒト抗体ライブラリーのスクリーニング（Chao, G.et al.Nat.Protocols 2006, 1, 755-768）、変異の検出（Aoki, T.et al.Analytical Biochemistry 2002, 300, 103-106）、酵素、受容体又は他のシグナル感受性成分を固着させることによるバイオセンサーの開発（Dhillon, J.K.et al.Letters in Applied Microbiology 1999, 28, 350-354; Shibasaki, S.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 57, 702-707; Shibasaki, S.S.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 57, 528-533）である。
【０００９】
もっと最近では、標的タンパク質（デヒドロゲナーゼを含むがカルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを含まない）の同時ディスプレーのための方法が米国特許11/7897366号に開示された。通常では、標的ペプチド又はタンパク質（パッセンジャータンパク質）に融合させた細胞表面タンパク質又はそれらの切端形（担体タンパク質）が、表面でのタンパク質のディスプレーに用いられる。グラム陰性（大腸菌（Escherichia coli））、グラム陽性（枯草菌（Bacillus subtilis）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）株）細菌及び酵母（サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））が、表面での異種タンパク質発現のディスプレーのために開発されている。グラム陽性細菌の細胞壁の硬質構造は当該細菌を適切な宿主とするが、しかしながらグラム陰性大腸菌は最も人気があり、細胞表面ディスプレーのために大いに開発されてきた。大腸菌の必須タンパク質（例えばLamB、FhuA並びにポリンOmpA、OmpC及びOmpX（前記は外膜に構造的な硬さを与える））が、細胞外ループに短いアミノ酸配列（60アミノ酸まで）を挿入し細胞表面でディスプレーするために重点的に用いられている。外膜リポタンパク質は小さな脂質改変アミノ末端によって膜に固着される。最初のリポタンパク質系細胞表面ディスプレーはLpp-OmpAキメラであり、前記は20アミノ酸シグナル配列及び成熟大腸菌リポタンパク質の最初の9つのN-末端残基から成り、大腸菌外膜タンパク質A（OmpA）の残基46−159がパッセンジャータンパク質のN-末端に融合された。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する大腸菌を提供し、前記細胞は、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍強化された変換速度を有する。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の不整還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から275倍強化された変換速度を有する。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して単位細胞質量当たり約3倍から26倍強化された変換速度を有する。
別の特徴では、本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株の提供を目的とし、前記は、大腸菌細胞の細胞質でCRS及びGDHを同時に発現する大腸菌株と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たりのエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに還元する変換速度は250倍から300倍強化され、さらにGDHポリペプチドの単位質量当たりのグルコースをグルコネートに酸化する能力は200倍から250倍強化される。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株は、種々のケトンの還元のために細胞の細胞質でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、CRSタンパク質の単位質量当たりの変換速度は約50倍から270倍強化される。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の還元のために細胞の細胞質でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、単位細胞質量当たりの変換速度は約3倍から24倍強化される。
【００１１】
ある実施態様では、種々のケトンは式3で表される脂肪族化合物であり、式中R1はCH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2はH、X又はCH3(CH2)nであり、さらにR3はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、XはCl又はBrであり、さらにnは1−4であり、mは1−8である。
より好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、さらにR3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3である。
別の実施態様では、種々のケトンは一般式4で表される芳香族化合物であり、式中R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、さらにR6はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、nは1から5である。
ある実施態様では、大腸菌は、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)、又は大腸菌C43(DE3)から選択される。
【００１２】
好ましい実施態様では、補因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を用いるエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換の速度は、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する大腸菌株BL21(DE3)を、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する大腸菌株C41(DE3)に取り替えると1.3倍高い。
別の好ましい実施態様では、補因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を用いるエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換の速度は、細胞の表面でCRSポリペプチドのみを発現し補因子リサイクリングのために外部GDHの添加を必要とする大腸菌株BL21(DE3)と比較して、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する大腸菌株C41(DE3)で約1.6倍高い。
具体的な実施態様では、本発明は、工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを高い生産性及び少なくとも150gl-1の生成物蓄積とともに約100％の鏡像体過剰で生産する製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】基質として適切な化合物の例である。
【図２】生成物として適切な化合物の例である。
【図３】配列番号:1、3、5又は7に対応する“CRSポリペプチド”構築物の模式図である。配列は、（i）成熟大腸菌リポタンパク質（Lpp）の最初の9つのN-末端残基と連結されたN-末端20アミノ酸のシグナル配列、（ii）大腸菌外膜タンパク質A（OmpA）の残基46−159（前記はそのC末端に融合されるパッセンジャータンパク質を膜を通過して輸送すると期待される）、及び（iii）CRSの完全配列（ここでCRSは、カンジダ・マグノリアエの野生型カルボニルレダクターゼ（配列番号:13）又は改変カルボニルレダクターゼ（配列番号:15、17又は19（前記はいくつかのアミノ酸置換を有することで配列番号:13と異なる））である）から成る。最初の29アミノ酸残基（シグナル＋Lppペプチド）はGly-Ileリンカーを介して114アミノ酸のOmpA残基と連結され、前記リンカーは続いてGly-Ile-Pro-Glyを介してCRSのN-末端に貼付される。
【図４】配列番号:9又は11に対応する“GDHポリペプチド”構築物の模式図である。配列は、（i）成熟大腸菌リポタンパク質（Lpp）の最初の9つのN-末端残基と連結されたN-末端20アミノ酸のシグナル配列、（ii）大腸菌外膜タンパク質A（OmpA）の残基46−159（前記はそのC末端に融合されるパッセンジャータンパク質を膜を通過して輸送すると期待される）、及び（iii）GDHの完全配列（ここでGDHはバシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）の野生型グルコースデヒドロゲナーゼ（配列番号:21）又は改変グルコースデヒドロゲナーゼ（配列番号:23（前記はいくつかのアミノ酸置換を有することで配列番号:21と異なる））である）から成る。最初の29アミノ酸残基（シグナル＋Lppペプチド）はGly-Ileリンカーを介して114アミノ酸のOmpA残基と連結され、前記リンカーは続いてGly-Ile-Pro-Glyを介してGDHのN-末端に貼付される。
【図５】組換えベクターpET23(a)-omp-CRSに関する方法及び構造である。
【図６】組換えベクターpETDuet1-omp-CRS, omp-GDHに関する方法及び構造である。
【図７】大腸菌細胞の表面でCRSを発現する‘デザイナー全細胞生物触媒’の透過型電子顕微鏡写真である。細胞をウサギ抗CRSポリクローナル抗体で続いてナノゴールド標識ヤギ抗ウサギIgG（全分子）二次抗体でプローブ精査した。矢印は金粒子を指す。図7aは、大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)（すなわち陰性コントロール（金標識を全く示さない））のTEMである。図7bは、大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRSを発現する（強烈な金標識を示す））のTEMを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は種々の改変及び／又は代替プロセス及び／又は組成物に鋭敏ではあるが、その具体的な実施態様は絵図/図及び表における実例によって示されてあり、さらに下記に詳細に記載されるであろう。しかしながら、本発明を特定のプロセス及び／又は開示組成物に限定しようとするものではないことは理解されるべきであり、反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲内に含まれる全ての改変、等価物及び代替物をカバーしようとするものである。
グラフ、図、表及びプロトコルは、適切な場合には絵図での通常的な表現によって表されているが、それらは、本明細書の記載が役立つ当業者には容易に明瞭となる詳細な開示を不明確にしないように、本発明の実施態様の理解に適切な具体的詳細を単に示す。
以下の記載は単に典型的な実施態様であり、本発明の範囲、応用性又は構成をいかなる態様においても制限しようとするものではない。そうではなく、以下の記載は本発明の典型的な実施態様を実行する便利な例示を提供する。記載した実施態様に対する多様な変更を記載した成分の機能及び配置において本発明の範囲から逸脱することなく実施できる。
“comprises”、“comprising”という用語又は前記用語の任意の他の変型は非排他的包含をカバーし、したがって、“comprises...a”に続く1つ以上のプロセス又は組成物又は系又は方法は、それ以上の拘束を受けずに他のプロセス、サブプロセス、組成物、サブ組成物、マイナーな若しくはメジャーな組成物又は他の成分又は他の構造物、又は追加のプロセス若しくは組成物、又は追加の成分、又は追加の特色、又は追加の特徴、又は追加の属性を排除しない。
【００１５】
定義
本発明の目的のために、下記用語はそこで特定される意味を有するであろう。
“CRSポリペプチド”は、図3に模式的に示されるアミノ酸配列を指す。
“GDHポリペプチド”は、図4に模式的に示される配列を指す。
“カルボニルレダクターゼ”及び“CRS”は互換的に用いられ、ケトン及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を対応するアルコール及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）に変換するポリペプチドを指す。
“グルコースデヒドロゲナーゼ”及び“GDH”は互換的に用いられ、グルコース及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）をグルコネート及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）に変換するポリペプチドを指す。
本記述では、“デザイナー細胞”という用語は本明細書では大腸菌の組換え株を指し、前記は、還元剤として還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）の触媒量を用い、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）への酸化のための外部補因子リサイクリング系の存在下又は非存在下で種々のケトンの不整還元を触媒して鏡像体濃縮アルコールを生成する。
【００１６】
さらにまた、“補因子リサイクリング系”は、本明細書では使用済み補因子を反応前の状態に戻すために反応に添加される試薬一式を指す。例えば、CRSによるケトンからアルコールへの変換では、補因子ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）（使用済み補因子）に変換される。試薬、GDH及びグルコースの反応への添加は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）からニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の再生をもたらすであろう。
さらにまた、“CRSポリペプチド”という用語は図3に模式的に示されるアミノ酸配列を指し、前記図では、CRSは、カンジダ・マグノリアエの野生型カルボニルレダクターゼ配列番号:13又はいくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:13とは異なる改変カルボニルレダクターゼ、例えば配列番号:15（P14A、S42N、A194V、I275V）又は配列番号:17（P14A、S42N、V147A、A194V、E234G）又は配列番号:19（E9G、P14A、N20S、S42N、T190A、A194V、E234G）である。
さらにまた、GDHポリペプチドは図4に模式的に示される配列を指し、前記図では、GDHは、バシルス・メガテリウムの野生型グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号:21又はいくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:21とは異なる改変グルコースデヒドロゲナーゼ、例えば配列番号:23（S16T、E170K、P194T、A197K、E222D、S237C）である。
【００１７】
本明細書で用いられるように、“カルボニルレダクターゼ”及び“CRS”という用語は互換的に用いられ、ケトン及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を対応するアルコール及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）に変換するポリペプチドを指す。さらにまた、“グルコースデヒドロゲナーゼ”及び“GDH”という用語は互換的に用いられ、グルコース及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）をグルコネート及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）に変換するポリペプチドを指す。
本発明は、“デザイナー細胞”と本明細書で称する全細胞生物触媒を提供する。前記は、種々のケトンのそれらの高鏡像体過剰アルコールへのエナンチオ選択性変換のために極めて強化された変換速度を有する。特に本発明はデザイナー細胞の開発に関し、前記細胞は、式1によって表されるエチル4-クロロ-3-オキソブチレートを効率的に変換して、99.9％を超える鏡像体過剰で式2によって表されるエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを生成するために極めて強化された変換速度を有する（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートはヒドロキシメチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）レダクターゼ阻害剤の製造のためにキラル構築ブロック及び中間体として有用である）。
【００１８】
本発明は、カルボニルレダクターゼポリペプチド（CRS）の細胞表面での発現を提供する。さらにまた、本発明は、カルボニルレダクターゼポリペプチド（CRS）及びグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）の細胞表面での共同発現もまた提供する。したがって、本発明は細胞質でカルボニルレダクターゼを発現する全細胞系の既存の欠点を克服し、カルボニルレダクターゼポリペプチド（CRS）は細胞の表面に固着され、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートを工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに変換するために同じ細胞宿主の細胞質で発現されるカルボニルレダクターゼと比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり予想を超える驚異の強化変換速度を示す。同様に、本発明はまた細胞質でCRS及びGDH酵素を共同発現する全細胞系の既存の欠点を克服し、共同発現は予想を超える驚異の強化発現を示す。さらにまた、そのような態様で発現される酵素は、純粋な固定化酵素に類似する態様を示し、それによって該酵素のコスト集約的な単離、精製及び安定化の要請を不要にすると期待される。さらにまた、消長動態は、細胞質膜を通過する基質の取り込み及び生成物の流出がこの場合には不要であるという事実のためにはるかに単純であることが予想される。
【００１９】
驚くべきことに、本発明は、デザイナー細胞の効率性はCRS及びグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）活性の双方が同じ宿主で共同発現される場合に一層改善され得るという仮説により機能し、これは多分、そのような生物触媒とともに、補因子（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）/ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP））は溶液中に完全に遊離されるのではなく、むしろ該補因子は細胞の表面で非常に近接して配置されるCRSとGDHとの間を水路で運ばれるためであろう。
したがって、本発明は、酵素カルボニルレダクターゼ及び補酵素再生系（例えばグルコースデヒドロゲナーゼ）が細胞の表面で一緒に共同発現される設計された形質転換体を提供し、前記形質転換体は、細胞の表面でCRSのみを発現しエチル(S)-4-クロロ-3-オキソブタノエートからエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換に補酵素リサイクリング系のためのGDHの外部添加を必要とする形質転換体と比較して、効率が数倍改善される。
本発明は、高生産性及び少なくとも150gl-1の生成物蓄積を示す、工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの約100％鏡像体過剰の製造方法を提供する。
本発明はまた、種々のケトンの不整還元を触媒して鏡像体濃縮アルコールを製造する、大腸菌の組換え株である‘デザイナー細胞’を提供し、前記は、還元剤として還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）の触媒量を、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）からニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）への酸化のための補因子リサイクリング系の添加下又は非添加下で用いる。カンジダ・マグノリアエの当該株はAKU4643であり、バシルス・メガテリウムはDSM2894である。
【００２０】
本発明は、配列番号:1、3、5又は7に対応する“CRS”ポリペプチド構築物を含むデザイナー細胞を提供する。本発明に記載するデザイナー細胞は、（a）成熟大腸菌リポタンパク質（Lpp）の最初の9つのN-末端残基に連結されたN-末端20アミノ酸シグナル配列；（b）大腸菌外膜タンパク質A（OmpA）の残基46−159（前記はそのC-末端に融合されたパッセンジャータンパク質を当該膜を通過して輸送すると期待される）；及び（c）CRSの全配列を有し、ここで、CRSは、カンジダ・マグノリアエの野生型カルボニルレダクターゼ、配列番号:13又は改変カルボニルレダクターゼ、配列番号:15、17又は19（いくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:13と異なる）である。最初の29アミノ酸残基のシグナル＋LppペプチドはGly-Ileリンカーを介して114アミノ酸のOmpA残基に連結され、前記は続いてCRSのN-末端にGly-Ile-Pro-Glyを介して貼り付けられた（図3）。いくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:13と異なる改変カルボニルレダクターゼは、例えば配列番号:15（P14A、S42N、A194V、I275V）又は配列番号:17（P14A、S42N、V147A、A194V、E234G）又は配列番号:19（E9G、P14A、N20S、S42N、T190A、A194V、E234G）である。
【００２１】
本発明はまた、配列番号:9又は11に対応する“GDH”ポリペプチド構築物を含むデザイナー細胞を提供する。本発明に記載するデザイナー細胞は、（a）成熟大腸菌リポタンパク質（Lpp）の最初の9つのN-末端残基に連結されたN-末端20アミノ酸シグナル配列；（b）大腸菌外膜タンパク質A（OmpA）の残基46−159（前記はそのC-末端に融合されたパッセンジャータンパク質を当該膜を通過して輸送すると期待される）；及び（c）GDHの全配列を有し、ここで、GDHは、バシルス・メガテリウムの野生型グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）、配列番号:21又は改変カルボニルレダクターゼ、配列番号:23（前記はいくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:21と異なる）である。最初の29アミノ酸残基のシグナル＋LppペプチドはGly-Ileリンカーを介して114アミノ酸のOmpA残基と連結され、前記リンカーは続いてGly-Ile-Pro-Glyを介してCRSのN-末端に貼付された（図3）。いくつかのアミノ酸置換を有することによって配列番号:21と異なる改変グルコースデヒドロゲナーゼは、例えば配列番号:23（S16T、E170K、P194T、A197K、E222D、S237C）である。
本発明はまた、使用済み補因子をその反応前の状態に戻すために反応に添加される補因子リサイクリング系（本明細書では一式の試薬を指す）を提供する。例えば、デザイナー細胞によるケトンからアルコールへの変換で、補因子ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）（使用済み補因子）に変換される。試薬、GDH及びグルコースの反応への添加は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）からニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の再生をもたらすであろう。
【００２２】
本明細書に提示する発明は多数の特徴を有する。ある特徴では、本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株の構築を目的とし、前記組換え大腸菌は、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートのエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したときCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍強化された変換速度を有する。CRSの相対的な量は免疫ブロットによって決定した（実施例7）。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の変換のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したときCRSタンパク質の単位質量当たり約50倍から275倍強化された変換速度を有する。相対的なCRSタンパク質含有量は免疫ブロットによって決定した（実施例7）。
【００２３】
ある実施態様では、ケトンは下記式3によって表される脂肪族化合物である：
【００２４】
【化２】
0006330028.tif 000003
【００２５】
式中R1はCH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2はH、X又はCH3(CH2)nであり、R3はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、XはCl又はBrであり、nは1−4であり、さらにmは1−8である。
好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、R3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、R3はCH2CH3である。
【００２６】
別の実施態様では、ケトンは下記式4で表される芳香族化合物である:
【００２７】
【化３】
0006330028.tif 000004
【００２８】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
本明細書で記述するように、CRS活性の比較に用いられる従来技術の大腸菌は、カンジダ・マグノリアエの野生型カルボニルレダクターゼ配列番号:13又は改変カルボニルレダクターゼポリペプチド配列番号:15、配列番号:17又は配列番号:19を細胞質で発現する大腸菌株を指す。これらの大腸菌株は米国特許2010/0028972で開示される技術を用いて構築された。
【００２９】
別の特徴では、本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株の構築を目的とし、前記は、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートのエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したとき単位細胞質量当たり15倍から26倍強化された変換速度を有する。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の還元のために細胞の細胞質でCRSを発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したとき単位細胞質量当たり約3倍から26倍強化された変換速度を有する。
ある実施態様では、ケトンは式3で表される脂肪族化合物であり、式中R1はCH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2はH、X又はCH3(CH2)nであり、さらにR3はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、XはCl又はBrであり、さらにnは1−4であり、mは1−8である。
より好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、R3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、R3はCH2CH3である。
別の実施態様では、ケトンは一般式4で表される芳香族化合物であり、式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００３０】
なお別の特徴では、本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株の構築を目的とし、前記は、大腸菌細胞の細胞質でCRS及びGDHを同時に発現する大腸菌株と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たりのエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに還元する変換速度は250倍から300倍強化され、さらにGDHポリペプチドの単位質量当たりのグルコースをグルコネートに酸化する能力は200倍から250倍強化される。CRS活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定した。相対的なCRSポリペプチドの量は免疫ブロットによって決定した（実施例7）。GDH活性及び相対的なGDHポリペプチド量は実施例11に記載するように決定した。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の還元のために細胞の細胞質でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したときCRSタンパク質の単位質量当たり約50倍から270倍強化された変換速度を有する。相対的なCRSたんぱく質含有量は免疫ブロットによって決定した（実施例7）。
ある実施態様では、ケトンは式3で表される脂肪族化合物であり、式中R1はCH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2はH、X又はCH3(CH2)nであり、さらにR3はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり（式中nは1−8である）、XはCl又はBrであり、nは1−4であり、さらにmは1−8である。
より好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、R3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、R3はCH2CH3である。
別の実施態様では、ケトンは一般式4で表される芳香族化合物であり、式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００３１】
本明細書に記述するように、CRS及びGDH活性の比較に用いられる従来技術の大腸菌は、カンジダ・マグノリアエの野生型カルボニルレダクターゼ配列番号:13及びバシルス・メガテリウムの野生型グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号:21を細胞質で共同発現する大腸菌株に該当する。これらの大腸菌株は以下の文献に開示された技術を用いて構築された（Kizaki, N.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595）。さらにまた、前記は、配列番号:15、配列番号:17又は配列番号:19から選択される変種カルボニルレダクターゼ、及び配列番号:21配列番号:23から選択される変種グルコースデヒドロゲナーゼを細胞質で共同発現する大腸菌株に該当する。これらの大腸菌株は、ペプチド配列、これらペプチド配列をコードする対応ヌクレオチド配列及び発現ベクターに関して以下の文献に開示された情報に基づいて構築された：Applied and Microbial Technology, 55:5590-595(2001)；米国特許2010/0028972及び米国特許2010/7816111。
【００３２】
別の特徴では、本発明は、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株の構築を目的とし、前記は、大腸菌細胞の細胞質でCRS及びGDHを同時に発現する大腸菌株と比較して、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの還元について単位細胞質量当たり11倍倍から24倍強化された活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化について単位細胞質量当たり9倍から31倍強化された活性を有する。CRS活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定した。GDH活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定した（実施例11）。
ある実施態様では、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する組換え大腸菌株は、種々のケト化合物の還元のために細胞の細胞質でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する従来技術の対応する大腸菌株と比較して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収の低下によって測定したとき単位細胞質量当たり約3倍から24倍強化された変換速度を有する。
ある実施態様では、ケトンは式3で表される脂肪族化合物であり、式中R1はCH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2はH、X又はCH3(CH2)nであり、さらにR3はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり（式中nは1−8である）、XはCl又はBrであり、nは1−4であり、さらにmは1−8である。
より好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、R3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、R3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、R3はCH2CH3である。
別の実施態様では、ケトンは一般式4で表される芳香族化合物であり、式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００３３】
したがって、本発明の目的は、配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択され配列リストの配列番号:1、3、5又は7のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、形質転換体の表面で発現されるアミノ酸配列を有し、カルボニルレダクターゼ活性を有するデザイナー細胞を提供することである。
上記ポリペプチドをコードする本発明のDNAは、配列リストの配列番号:2、4、6又は8から選択されるヌクレオチド配列を有する。
上記ポリペプチドをコードする本発明のプラスミドはpET23(a)-omp-CRSである。
本記載中では、アミノ酸配列は奇数を割り当てられている。具体的なアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は直ぐ次の偶数を割り当てられている。例えば、配列番号:1のアミノ酸については、対応するコードヌクレオチド配列は配列番号:2の配列を割り当てられている。
形質転換体を作製するために本発明にしたがって用いられる細胞は、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)から選択される。
本発明にしたがって用いられる形質転換細胞は、上記プラスミドpET23(a)-omp-CRSで形質転換される細胞の形質転換体である。
好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSである。
より好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌C41(DE3)+pET23(a)-omp-CRSである。
【００３４】
好ましい実施態様では、デザイナー細胞は、配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、形質転換体の表面で発現される配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列を有し、カルボニルレダクターゼ活性を有する。
上記ポリペプチドのDNAは配列番号:2のヌクレオチド配列を有する。
上記ポリペプチドをコードする本発明のプラスミドはpET23(a)-omp-CRSである。
形質転換体を作製するために本発明にしたがって用いられる細胞は、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)から選択される。
本発明にしたがって用いられる形質転換細胞は、上記プラスミドpET23(a)-omp-CRSで形質転換される細胞の形質転換体である。
好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSである。
より好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌C41(DE3)+pET23(a)-omp-CRSである。
【００３５】
工業的に重要で光学的に純粋なアルコール（エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）を製造するために基質（エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートを含む）のカルボニル基を不整還元する、本発明の形質転換体は補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を要求する。反応が進行するにつれて、補酵素は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）に変換される。酸化型から還元型への変換は、補酵素再生能力を有する別の酵素（例えばグルコースデヒドロゲナーゼ）を必要とする。
ある実施態様では、グルコースデヒドロゲナーゼはバシルス・メガテリウムから誘導される。
本発明の別の目的は、形質転換体の表面で2つのポリペプチド（一方はCRS活性を有し、他方はGDH活性を有する）を共同発現するデザイナー細胞を提供することである。前記CRS活性を有するポリペプチドは、配列リストの配列番号:1、3、5又は7のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択されるアミノ酸配列を有し、前記は効率的にエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを還元し、さらに他方のポリペプチドは、配列リストの配列番号:9又は11のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、配列リストの配列番号:9又は11から選択されるアミノ酸配列を有し、光学的に純粋なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの製造のために補酵素再生活性を有する。
【００３６】
カルボニルレダクターゼ活性を有する上記ポリペプチドをコードする本発明のDNAは、配列リストの配列番号:2、4、6又は8から選択されるヌクレオチド配列を有し、補酵素再生酵素をコードする本発明のDNAは配列リストの配列番号:10又は12から選択されるヌクレオチド配列を有する。
カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生能力を有する両ポリペプチドをコードする本発明のプラスミドはpETDuet1-omp-CRS,omp-GDHである。
本発明にしたがって用いられる形質転換細胞は、上記プラスミドpETDuet1-omp-CRS,omp-GDHで形質転換される細胞の形質転換体である。
カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生能力の双方を有する形質転換体を作製するために本発明にしたがって用いられる細胞は、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)から選択される。
好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌BL21(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDHである。
より好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDHである。
【００３７】
好ましい実施態様では、形質転換体の表面で2つのポリペプチド（一方はCRS活性を有し、他方はGDH活性を有する）を共同発現する形質転換体は、配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列を有し、前記は効率的にエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを還元し、さらに他方のポリペプチドは、配列リストの配列番号:9のアミノ酸配列に1つ又はいくつかのアミノ酸の欠失、置換又は付加を含む、配列リストの配列番号:9のアミノ酸配列を有し、光学的に純粋なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの製造のために補酵素再生活性を有する。
カルボニルレダクターゼ活性を有する上記ポリペプチドをコードする本発明のDNAは、配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列を有し、補酵素再生酵素をコードする本発明のDNAは配列リストの配列番号:10のヌクレオチド配列を有する。
カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生能力を有する両ポリペプチドをコードする本発明のプラスミドはpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHである。
本発明にしたがって用いられる形質転換細胞は、上記プラスミドpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHで形質転換される細胞の形質転換体である。
好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌BL21(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDHである。
カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生能力の双方を有する形質転換体を作製するために本発明にしたがって用いられる細胞は、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)から選択される。
より好ましい実施態様では、形質転換細胞は大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDHである。
【００３８】
本発明の別の目的は、工業的に重要で光学的に活性なアルコールを製造するための製造方法を提供することであり、前記は、形質転換体の培養条件、培養の採集、カルボニル基を有する基質のための反応条件、及び製造された光学的に活性なアルコールの採集を含む。
ある実施態様では、ケトンは式3で表される脂肪族化合物であり、生成される光学的に活性なアルコールは下記式5で表される：
【００３９】
【化４】
0006330028.tif 000005
【００４０】
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。
より好ましい実施態様では、R1はCH2Clであり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCH2Clであり、R2はHであり、さらにR3は(CH2)7CH3であるか、又はR1はCH3であり、R2はClであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1はCF3であり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3であるか、又はR1は(CH3)2CHであり、R2はHであり、さらにR3はCH2CH3である。
別の実施態様では、ケトンは式4で表される芳香族化合物であり、生成される光学的に活性なアルコールは下記式6で表される：
【００４１】
【化５】
0006330028.tif 000006
【００４２】
式中R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6はアルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、さらにnは1から5である。
【００４３】
デザイナー全細胞生物触媒は遠心分離又はろ過によって発酵ブロスから単離できる。単離された生物触媒はそのようなものとして又は凍結乾燥粉末として用いることができる。カルボニル化合物からヒドロキシル化合物へのバイオ転換のために、生物触媒は、pH5.0−9.0（最適にはpH6.5）の適切な緩衝剤中に、10−45℃（最適には30℃）の温度で懸濁させることができる。最適には、溶剤（例えばジエチルエーテル、ジ-n-ブチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチルなど）を反応混合物に添加できる。内容物をオービタルシェーカー上で活発に混合又は震盪することができる。
好ましい実施態様では、反応は、カルボニル化合物を全細胞生物触媒とジ-n-ブチルエーテルを含む30℃のリン酸緩衝液（pH6.5）中で接触させることによって実施される。
【００４４】
具体的な実施態様では、本発明は、工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰で製造するための製造方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
（i）エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程、及び
（ii）前記エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートを、細胞の表面でCRSポリペプチドを発現する大腸菌株BL21(DE3)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）、グルコースデヒドロゲナーゼ及び緩衝溶液と接触させて、エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートをエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに変換するための反応混合物を形成する工程。場合によって、有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を前記反応混合物に添加することができる。
なお別の具体的な実施態様では、本発明は、工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰及び高収量で、エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートのデザイナー全細胞生物触媒還元を介して製造する製造方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
（i）エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程、及び
（ii）前記エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートを、細胞の表面でCRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを同時に発現する大腸菌株BL21(DE3)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び緩衝溶液と接触させて、エチル(S)-4-クロロ-3-オキソブチレートをエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに変換するための反応混合物を形成する工程。場合によって、有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を前記反応混合物に添加することができる。
【００４５】
好ましい実施態様では、補因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NAPDH）を用いる、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換速度は、CRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現する大腸菌株BL21(DE3)を、CRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現する大腸菌株C41(DE3)で取り替えると1.3倍高い。
好ましい実施態様では、補因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NAPDH）を用いる、エチル-4-クロロ-3-オキソブチレートからエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換速度は、CRSポリペプチドのみを細胞の表面で発現し補因子リサイクリング用外部GDHの添加を要求する大腸菌株BL21(DE3)と比較して、CRSポリペプチド及びGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現する大腸菌株C41(DE3)で約1.6倍高い。
具体的な実施態様では、本発明は、工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰で、高い生産性及び少なくとも150gl-1の生成物蓄積で製造する製造方法を提供する。
【００４６】
したがって、本発明の主要な実施態様はデザイナー細胞を提供し、前記デザイナー細胞は、配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、下記式1のエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性を有する：
【００４７】
【化６】
0006330028.tif 000007
【００４８】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、式1のエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり約275倍高い活性を有する。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、式1のエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して単位細胞質量当たり15倍から26倍高い活性を有する。
【００４９】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、式1のエチル-4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して単位細胞質量当たり少なくとも15倍高い活性を有する。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、下記式3の化合物の還元のために配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から275倍高い活性を有する：
【００５０】
【化７】
0006330028.tif 000008
【００５１】
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、下記式4の化合物の還元のために配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から180倍高い活性を有する：
【００５２】
【化８】
0006330028.tif 000009
【００５３】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元のために配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して単位細胞質量当たり約3倍から15倍高い活性を有する：
【００５４】
【化９】
0006330028.tif 000010
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8であって；
【００５５】
【化１０】
0006330028.tif 000011
【００５６】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００５７】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9又は11から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化についてGDHポリペプチドの単位質量当たり200倍から250倍強化された活性を有する：
【００５８】
【化１１】
0006330028.tif 000012
【００５９】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり約270倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化についてGDHポリペプチドの単位質量当たり約225倍強化された活性を有する。
【００６０】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9又は11から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり約11倍から24倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化について単位細胞質量当たり9倍から31倍強化された活性を有する。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり約24倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化について単位細胞質量当たり約31倍強化された活性を有する。
【００６１】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、下記式3の化合物の還元のために配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり約55倍から270倍高い活性を有する：
【００６２】
【化１２】
0006330028.tif 000013
【００６３】
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、下記式4の化合物の還元のために配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較してCRSポリペプチドの単位質量当たり約40倍から156倍高い活性を有する：
【００６４】
【化１３】
0006330028.tif 000014
【００６５】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、前記細胞は、配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元のために配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応する対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して単位細胞質量当たり約3倍から24倍高い活性を有する：
【００６６】
【化１４】
0006330028.tif 000015
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8であって；
【００６７】
【化１５】
0006330028.tif 000016
【００６８】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００６９】
本発明の別の実施態様は本発明に記載するデザイナー細胞を提供し、ここで、前記デザイナー細胞は組換え大腸菌BL21(DE3)又は組換え大腸菌C41(DE3)又は組換え大腸菌C43(DE3)である。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有しカルボニルレダクターゼ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有しカルボニルレダクターゼ活性を示すポリペプチド、及び配列番号:9又は11のアミノ酸配列を有しGDH活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明のなお別の実施態様は、下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの約100％鏡像体過剰の製造における、本発明に記載するデザイナー細胞の使用を提供する：
【００７０】
【化１６】
0006330028.tif 000017
【００７１】
本発明のなお別の実施態様は、式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの約100％鏡像体過剰の製造における、請求項8に記載のデザイナー細胞の使用を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、下記式5の化合物の製造における、本発明に記載するデザイナー細胞の使用を提供する：
【００７２】
【化１７】
0006330028.tif 000018
【００７３】
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。
【００７４】
本発明のなお別の実施態様は、下記式5の化合物の製造における、本発明に記載するデザイナー細胞の使用を提供する：
【００７５】
【化１８】
0006330028.tif 000019
【００７６】
式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。
本発明のなお別の実施態様は、下記式6の化合物の製造における、本発明に記載するデザイナー細胞の使用を提供する：
【００７７】
【化１９】
0006330028.tif 000020
【００７８】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
本発明のなお別の実施態様は、下記式6の化合物の製造における、本発明に記載するデザイナー細胞の使用を提供する：
【００７９】
【化２０】
0006330028.tif 000021
【００８０】
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。
【００８１】
本発明の別の実施態様は、アクセッション番号MTCC No.5806、MTCC No.5807、MTCC No.5808及びMTCC No.5809を有するデザイナー細胞を提供し、ここで、前記デザイナー細胞は配列番号:2、4、6及び8を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号:2、4、6及び8を有する前記ヌクレオチド配列は配列番号:1、3、5及び7を有するアミノ酸配列を発現することができる。
本発明の別の実施態様は、アクセッション番号MTCC No.5810、MTCC No.5811、MTCC No.5812、MTCC No.5813、MTCC No.5814、MTCC No.5815、MTCC No.5816及びMTCC No.5817を有するデザイナー細胞を提供し、ここで、MTCC No.5810は配列番号:2及び配列番号:10を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5811のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:2及び配列番号:12を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5812のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:4及び配列番号:10を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5813のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:4及び配列番号:12を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5814のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:6及び配列番号:10を有するヌクレオチドを含み、MTCC No.5815のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:6及び配列番号:12を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5816のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:8及び配列番号:10を有するヌクレオチド配列を含み、MTCC No.5817のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:8及び配列番号:12を有するヌクレオチド配列を含み、さらに、MTCC No.5810のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:1及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5811のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:1及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5812のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:3及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5813のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:3及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5814のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:5及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5815のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:5及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5816のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:7及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現でき、MTCC No.5817のアクセッション番号を有するデザイナー細胞は配列番号:7及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現できる。
【００８２】
本発明の別の実施態様は、下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰で製造するプロセスを提供し：
【００８３】
【化２１】
0006330028.tif 000022
【００８４】
前記プロセスは以下の工程を含む：
a．下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程：
【００８５】
【化２２】
0006330028.tif 000023
【００８６】
b．前記エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを、本発明1に記載するデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させる工程；
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程；
d．前記反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程；
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて前記生成物エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを単離する工程。
【００８７】
本発明の別の実施態様は、pHが好ましくは6.5である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、温度が好ましくは30℃である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、有機溶媒が好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、本発明に記載するプロセスを提供する。
【００８８】
本発明の別の実施態様は、本発明に記載する下記式5の光学的に濃縮された脂肪族アルコールを製造するプロセスを提供し：
【００８９】
【化２３】
0006330028.tif 000024
【００９０】
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である）、
前記プロセスは以下の工程を含む：
a．下記式3のケトンを提供する工程：
【００９１】
【化２４】
0006330028.tif 000025
【００９２】
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である）；
b．工程（a）で提供される式3のケトンを、本発明に記載するデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程；
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程；
d．前記反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程；
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式5の化合物を単離する工程。
【００９３】
本発明の別の実施態様は、pHが好ましくは6.5である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、温度が好ましくは30℃である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、有機溶媒が好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、本発明に記載するプロセスを提供する。
【００９４】
本発明の別の実施態様は、本発明に記載する下記式6の光学的に濃縮されたアリールアルコールを製造するプロセスを提供し：
【００９５】
【化２５】
0006330028.tif 000026
【００９６】
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である）、
前記プロセスは以下の工程を含む：
a．下記式4のケトンを提供する工程：
【００９７】
【化２６】
0006330028.tif 000027
【００９８】
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である）；
b．工程（a）で提供される式3のケトンを、本発明に記載するデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程；
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程；
d．前記反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程；
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式6の化合物を単離する工程。
【００９９】
本発明の別の実施態様は、pHが好ましくは6.5である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、温度が好ましくは30℃である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、有機溶媒が好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、本発明に記載するプロセスを提供する。
本発明の別の実施態様は、デザイナー細胞が好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、本発明に記載するプロセスを提供する。
【０１００】
本発明の別の実施態様は、アクセッション番号MTCC No.5806、MTCC No.5807、MTCC No.5808及びMTCC No.5809を有するデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様はデザイナー細胞を提供し、前記デザイナー細胞は、アクセッション番号MTCC No.5806−5807を有し、配列番号:1、3、5及び7を有するアミノ酸配列を発現する。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1、3、5、7を有するアミノ酸配列が配列番号:2、4、6及び8を有するヌクレオチド配列に一致する、本発明に記載するデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1−8がカルボニルレダクターゼの天然に存在しない配列であるデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、高活性のカルボニルレダクターゼを細胞表面で発現することができるデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1−8を含み、さらに前記を発現することができる組換えベクター構築物を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、カルボニルレダクターゼ酵素の天然に存在しない配列を含む組換えベクター構築物を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、高活性のカルボニルレダクターゼを細胞表面で発現することができる、本発明に記載する組換えベクター構築物を提供する。
【０１０１】
本発明のなお別の実施態様は、アクセッション番号MTCC No.5810、MTCC No.5811、MTCC No.5812、MTCC No.5813、MTCC No.5814、MTCC No.5815、MTCC No.5816及びMTCC No.5817を有するデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は以下のようなデザイナー細胞を提供する：MTCC No.5810のアクセッション番号を有し配列番号:1及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5811のアクセッション番号を有し配列番号:1及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5812のアクセッション番号を有し配列番号:3及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5813のアクセッション番号を有し配列番号:配列番号:3及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5814のアクセッション番号を有し配列番号:5及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5815のアクセッション番号を有し配列番号:5及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5816のアクセッション番号を有し配列番号:7及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞；MTCC No.5817のアクセッション番号を有し配列番号:7及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現するデザイナー細胞。
【０１０２】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1、3、5、7、9及び11を有するアミノ酸配列が配列番号:2、4、6、8、10及び12を有するヌクレオチド配列に一致する、デザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、酵素カルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを細胞の表面で一緒に同時発現することができるデザイナー細胞を提供する。
本発明のなお別の実施態様は、配列番号:1、3、5、7、9及び11を有するアミノ酸配列並びに配列番号:2、4、6、8、10及び12を有するヌクレオチド配列を含み、さらに前記を発現することができる組換えベクターを提供する。
本発明の別の実施態様は、酵素カルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを細胞表面で一緒に共同発現することができる、本発明に記載する組換えベクター構築物を提供する。
本発明の別の実施態様は、本発明の例えばここに記載するように式5又は式6又は式2の化合物を製造する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明の例えばここに記載するように式3を有するケトンを提供する工程；（b）工程（a）の式3のケトンを、配列番号:1−12を単独で又は本発明の例えばここに記載するように組み合わせて含む本発明の例えばここに記載するデザイナー細胞、並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）、場合によって必要ならば100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程；（c）工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程；（d）前記反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、及び工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式5又は式6又は式2の化合物を単離する工程。
【０１０３】
本発明の利点
1．本発明は全細胞生物触媒を提供し、前記生物触媒は、エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを工業的に重要なエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに変換する従来技術の生物触媒と比較して、CRSの単位質量当たり少なくとも250倍改善された変換速度を有する。
2．本発明は全細胞生物触媒を提供し、前記生物触媒は、同じ細胞の表面にレダクターゼ及び補酵素再生活性の両方が存在するが故に補因子ローディングに対しより高い効率を有する。そのような系では、補因子ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）/ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）は、細胞の表面で非常に近接して配置されるCRSとGDH酵素との間を水路で運ばれる。
3．鏡像体的に濃縮されたアルコールが顕著に高い変換速度で製造される。より具体的には、エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートは、顕著に高い変換速度で少なくとも150gl-1の生成物蓄積とともに約100％の鏡像体過剰で生成される（前記は、ヒドロキシメチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）レダクターゼ阻害剤の製造のためにキラル構築ブロック及び中間体として有用である）。
【０１０４】
プラスミド及び形質転換体
本発明の発現プラスミドはpET23(a)-omp-CRSを含み、前記は配列番号:1又は3又は5又は7によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（カルボニルレダクターゼ活性を示す）をコードする、配列リストの配列番号:2又は4又は6又は8によって表されるDNA配列を有する。
本発明の発現プラスミドはpETDuet1-omp-CRS; omp-GDHを含み、前記は、配列番号:1又は3又は5又は7によって表されるアミノ酸配列を有するCRSポリペプチド（カルボニルレダクターゼ活性を示す）をコードする配列番号:2又は4又は6又は8によって表されるDNA配列、及び配列番号:9又は11によって表されるアミノ酸配列を有するGDHポリペプチド（GDH活性を示す）をコードする配列番号:10又は12によって表されるDNA配列を有する。
本発明のDNAを含むプラスミドは化学的にコンピテントな宿主細胞に公知の方法によって導入できる。大腸菌DH5αをクローニング宿主として、さらに大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)及び大腸菌C43(DE3)を発現宿主として用いた。
本発明の形質転換体の例として、大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSを記載することができる。
より具体的には、本発明の形質転換体の例として、大腸菌C41(DE3)+pET23(a)-omp-CRSを記載することができる。
【０１０５】
カルボニルレダクターゼ活性を有する形質転換体
カルボニルレダクターゼ活性を有する形質転換体が、基質（エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを含む）のカルボニル基及び補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）と反応すると、前記はカルボニル基を有する化合物（エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを含む）を不整還元して、光学的に純粋な対応するアルコール（エチル(S)4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを含む）を生成する。発現プラスミドpET23(a)-omp-CRS及びpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを有する上記に記載する本発明の形質転換体はカルボニルレダクターゼ活性を有する。より正確には、発現プラスミドpET23(a)-omp-CRS及びpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを有する上記に記載する本発明の形質転換体は、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドを細胞の表面で発現した。
【０１０６】
カルボニルレダクターゼ及び補酵素再生活性の両方を有する形質転換体
CRS及びGDH発現プラスミドを一緒に含む（すなわちpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを含む）、上記に記載する本発明の形質転換体は、カルボニルレダクターゼ及び補酵素再生活性の両方を示す。より正確には、発現プラスミドpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを有する上記に記載する本発明の形質転換体は、カルボニルレダクターゼ及び補酵素再生活性の両方を有するポリペプチドを細胞の表面で発現した。
【０１０７】
株の呼称及び寄託の詳細
“CRSポリペプチド”及び“GDHポリペプチド”を発現する合成した組換え大腸菌株を下記の国際寄託機関に寄託した：International Depository Authority, Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC), Institute of Microbial Technology, Sector 39A, Chandigarh 160036, India。前記株の呼称及び割り当てられたアクセッション番号は以下に提供する。株MTCC 5806、5807、5808及び5809は“CRSポリペプチド”配列番号:1、3、5及び7をそれぞれ発現する。株MTCC 5810から5817は“CRSポリペプチド”（配列番号:1、3、5及び7）及び“GDHポリペプチド”（配列番号:9及び11）を共同発現する。説明中でアミノ酸配列には奇数が割り当てられている。個々のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は直ぐ次の偶数が割り当てられている。例えば、配列番号:1のアミノ酸については、対応するコードヌクレオチド配列には配列番号:2が割り当てられている。
【０１０８】
0006330028.tif 000028
【０１０９】
大腸菌表面でのCRS発現の提示
CRSを発現する組換え細胞を溶解させ、遠心分離によって細胞屑を除去し、続いて膜分画及び可溶性分画の分離のために上清を4℃で1,000,000gにて2時間超遠心分離に付した。膜分画を含む沈降物を緩衝液で洗浄し、膜可溶化緩衝液（25 mMトリスHCl、20％グリセロース及び2％トリトンX100（pH7.5））に再懸濁させた。3つの分画全て（無細胞抽出物、膜分画及び可溶性タンパク質分画）の活性を基質としてエチル4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを用いてアッセイした。活性の大半は膜分画から回収された。
大腸菌細胞の表面におけるCRSの存在は、大腸菌の超薄切片で実施したEM免疫金標識試験によってさらにまた確認された。抗CRSポリクローナル抗体は精製CRSに対してウサギで作製し、それらの特異性についてはウェスタンブロッティングによってアッセイした。精製CRSを還元条件下でSDS-PAGE上で泳動し、ニトロセルロース膜へ電気的にブロッティングした後でウサギ抗CRSポリクローナル抗体を用いてプローブし、前記をさらにアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（全分子）二次抗体でプローブした。続いて、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP, 0.15mg/mL）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT, 0.30mg/mL）、トリスHCl（100mM）及びMgCl2（5mM）（pH9.5）を含む基質溶液に前記を10分間浸漬することによってブロットをデベロップさせた。純粋なCRSを特異的に標識するポリクローナル抗体はまたomp-CRSを特異的に標識することができた。
数回の脱水工程の後で、大腸菌細胞をLR白色樹脂に包埋し、続いて前記を固定液として0.2％グルタルアルデヒドを用い数工程で脱水した。ウルトラミクロトームを用いて切り出した薄い切片を、ウサギ抗CRSポリクローナル抗体、続いてナノゴールド標識ヤギ抗ウサギIgG（全分子）二次抗体とともにインキュベートし、透過型電子顕微鏡下で可視化した。種々の視野を観察し、金粒子は細胞の表面に重点的に存在することが見出された（図7）。陰性コントロールとしての細胞では標識は生じなかった。
【０１１０】
形質転換体の使用
カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを含む本発明の形質転換体を用いるとき、光学的に純粋なアルコールを製造することができる。さらにまた、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドを発現する発現プラスミドpET23(a)-omp-CRSを有する形質転換体が用いられるならば、光学的に純粋なアルコールを製造することができる。カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生活性を有するポリペプチドを発現する発現ベクターpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを有する形質転換体が用いられるとき、光学的に純粋なアルコールを製造することができる。特に、カルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生活性を有するポリペプチドを発現する発現ベクターpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを有する形質転換体が用いられるとき、光学的に活性なアルコールはより効率的に製造され得る。
本発明のカルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方を含む形質転換体は、本発明のカルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方を単一ベクターに導入することによって入手できる。
カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方が導入されたベクターの例として、pETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを記載することができる。
さらにまた、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方を含む形質転換体の例として、大腸菌BL21(DE3)を該当ベクターで形質転換することによって入手される大腸菌BL21(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを記載することができる。
さらにまた、カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方を含む形質転換体の例として、大腸菌C43(DE3)を該当ベクターで形質転換することによって入手される大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを記載することができる。
カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを含む形質転換体、並びにカルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA及び補酵素再生能力を有するポリペプチドをコードするDNAの両方を含む形質転換体の培養は、一般的に用いられている、炭素原、窒素原、無機塩及び有機栄養物などを含有する液体栄養培地で（前記転換体が増殖するかぎり）実施することができる。
【０１１１】
酵素活性のアッセイ方法
カルボニルレダクターゼ活性を有するポリペプチドを発現する形質転換体の活性は通常の方法で測定できる。例えば、カルボニルレダクターゼの活性は、50mMのリン酸緩衝液（pH6.5）中の1mLの反応混合物で入手できる。前記反応混合物は、2mMのECAA、0.2mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び5−20μLの全細胞生物触媒又は5−10μgの精製タンパク質又は106−107の全細胞生物触媒を含み、反応は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の酸化について分光光度計によって15から60分間340nm（分子吸収係数6.22mM-1cm-1）でモニターされた。
補酵素再生活性を有するポリペプチドを発現する形質転換体の活性は通常の方法で測定できる。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼの活性は、100mMのトリスHCl緩衝液（pH8.0）中の1mLの反応混合物で入手できる。前記反応混合物は、10mMグルコース、0.5mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）及び5−20μLの全細胞生物触媒又は5−10μgの精製タンパク質又は106−107の全細胞生物触媒を含み、反応は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）の還元について分光光度計によって15から60分間340nm（分子吸収係数6.22mM-1cm-1）でモニターされた。
【０１１２】
光学的に活性なアルコールの製造
カルボニルレダクターゼ活性を有する形質転換体及び市場で入手できるグルコースデヒドロゲナーゼ、又はカルボニルレダクターゼ活性及び補酵素再生活性の両方を有する形質転換体のどちらかを用いる光学的に活性なアルコールの製造は、基質として適切なカルボニル基を含む化合物（エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを含む）、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）及びグルコースを適切な溶媒に添加し、pHを調節しつつ該混合物を攪拌することによって実施できる。
反応は、水性溶媒又は水性溶媒と有機溶媒の混合物中で実施できる。有機溶媒の例には、酢酸n-ブチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル、ジ-n-ブチルエーテルなどが含まれる。好ましくは、反応は30℃で実施でき、反応溶液のpHは、5NのNaOHで6.5に維持される。
【０１１３】
基質及び生成物
基質として適切なカルボニル基を有する脂肪族化合物の例には、下記式1で表されるエチル4-クロロ-3-オキソブチレート、下記式7で表されるエチル-3-オキソブタノエート、下記式8で表されるエチル4-メチル-3-オキソペンタノエート、下記式9で表されるオクチル4-クロロ-3-オキソブタノエート、下記式10で表されるエチル4,4,4-トリフルオロ-3-オキソブタノエート、及び下記式11で表されるエチル2-クロロ-3-オキソブチレートが含まれる：
【０１１４】
【化２７】
0006330028.tif 000029
【０１１５】
基質として適切なカルボニル基を有する芳香族化合物の例には、下記の式12で表されるアセトフェノン、式13で表される1-(4-フルオロフェニル)エタノン、式14で表される1-(4-クロロフェニル)エタノン、式15で表される1-(4-ブロモフェニル)エタノン、式16で表される1-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)エタノン、式17で表される1-p-トリルエタノン、式18で表される1-(4-メトキシフェニル)エタノン及び式19で表されるインドリン-2,3-ジオンが含まれる：
【０１１６】
【化２８】
0006330028.tif 000030
【０１１７】
上述の反応条件下で、基質として上記式1で表されるエチル4-クロロ-3-オキソブチレートが用いられるとき、下記式2で表されるエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを入手できる。
基質として上記式7で表されるエチル-3-オキソブタノエートが用いられるとき、下記式20で表されるエチル(R)-3-ヒドロキシブタノエートを入手できる。
基質として上記式8で表されるエチル4-メチル-3-オキソペンタノエートが用いられるとき、下記式21で表されるエチル(S)-3-ヒドロキシ-4-メチルペンタノエ−トを入手できる。
基質として上記式9で表されるオクチル4-クロロ-3-オキソブタノエートが用いられるとき、下記式22で表されるオクチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブタノエートを入手できる。
基質として上記式10で表されるエチル4,4,4-トリフルオロ-3-オキソブタノエートが用いられるとき、下記式23で表されるオクチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブタノエートを入手できる。
基質として上記式11で表されるエチル2-クロロ-3-オキソブタノエートが用いられるとき、下記式24で表される(2R,3R)-エチル2-クロロ-3-ヒドロキシブタノエートを入手できる。
【０１１８】
【化２９】
0006330028.tif 000031
【０１１９】
基質として上記式12で表されるアセトフェノンが用いられるとき、下記式25で表される (R)-1-フェニルエタノールを入手できる。
基質として上記式13で表される1-(4-フルオロフェニル)エタノンが用いられるとき、下記式26で表される(R)-1-(4-フルオロフェニル)エタノールを入手できる。
基質として上記式14で表される1-(4-クロロフェニル)エタノンが用いられるとき、下記式27で表される(R)-1-(4-クロロフェニル)エタノールを入手できる。
基質として上記式15で表される1-(4-ブロモフェニル)エタノンが用いられるとき、下記式28で表される(R)-1-(4-ブロモフェニル)エタノールを入手できる。
基質として上記式16で表される1-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)エタノンが用いられるとき、下記式29で表される(R)-1-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)エタノールを入手できる。
基質として上記式17で表される1-p-トリルエタノンが用いられるとき、下記式30で表される(R)-1-p-トリルエタノールを入手できる。
基質として上記式18で表される1-(4-メトキシフェニル)エタノンが用いられるとき、下記式31で表される(R)-1-(4-メトキシフェニル)エタノールを入手できる。
基質として上記式9で表される1-(4-ニトロフェニル)エタノンが用いられるとき、下記式32で表される(R)-1-(4-ニトロフェニル)エタノールを入手できる。
【０１２０】
【化３０】
0006330028.tif 000032
【０１２１】
精製及び分析
前記反応によって製造される光学的に純粋なアルコールは、通常的方法、例えば前記方法によって生成された光学的に純粋なアルコールを含む反応混合物を有機溶媒の酢酸エチルで抽出し、減圧下で蒸留して有機溶媒を除去し、生成混合物を蒸留、再結晶化又はクロマトグラフィープロセスに付すことによって精製することができる。
生成物の光学的純粋性は、ダイセル化学工業（Daicel Chemical Industries）の製品のキラセル（Chiracel）OB-H、キラセルOD-H、キラセルOJを用い高速液体クロマトグラフィーによって測定した。
全ての化合物の構造をNMRで確認した。NMRは溶媒としてCDCl3、CD3OD又はCD3SOCD3を用いて実施した。化学的シフトは内部標準として用いたTMSからのダウンフィールドとして報告される。カップリング定数Jの値はHzで報告される。
【０１２２】
分析データ
ケトンの生物触媒還元から得られたアルコールは、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製された。
式2の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.28 (3H, t, J = 7.2 Hz); 2.63 (3H, m); 3.61 (2H, dd, J = 7.2, 5.4 Hz); 4.18 (2H, q, J = 7.2 Hz); 4.23 (1H, m).HPLC: キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール 96:4, 1 mL/分．保持時間 13.2分(R) 及び 14.3 分(S).[α]D25 = -22.1 (c = 8.72, CHCl3)。
式20の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.21 (3H, d, J = 6.5 Hz); 1.26 (3H, t, J = 6.8 Hz); 2.46 (2H, m); 3.00 (1H, bs); 4.16 (3H, m).HPLC: キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール 96:4, 1 mL/分．保持時間 9.4 分(S)及び10.5分 (R).[α]D25 = -44.2 (c = 2.03, CHCl3)。
式21の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.90 and 0.93 (各3H, 各t, J = 6.8 Hz); 1.26 (3H, t, J = 7.2 Hz); 1.69 (1H, m); 2.38 (1H, dd, J = 9.6, 16.5 Hz); 2.52 (1H, dd, J = 2.8, 16.5 Hz); 2.94 (1H, bs); 3.75 (1H, m,); 4.14 (2H, q, J = 7.2 Hz).HPLC: キラセルOD-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール95:5, 1 mL/分．保持時間 5.3 分(S) 及び7.7分(R).[α]D25 = -40.8 (c = 2.56, CHCl3)。
式22の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz, H2 CH3); 1.27 (10H, m, 5 x CH2); 1.61 (2H, m); 2.62 (2H, m); 3.60 (2H, m); 4.11 (2H, t, J = 6.8 Hz); 4.14 (1H, m, H3).HPLC: キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール 96:4, 1 mL/分．保持時間 5.7分(R) 及び7.6 分(S).[α]D25 = -15.9 (c = 4.60, CHCl3)。
式23の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29 (3H, t, J = 7.2 Hz); 2.70 (2H, m); 4.21 (2H, q, J = 7.2 Hz); 4.43 (1H, m).[α]D25 = -20.3 (c = 1.87, CHCl3)。
式24の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.34 (m, 6H); 4.25 (m, 4H).de = >96％ by GC: FactorfourTM (Varian, 30m x 0.25mm, 140℃, N2 1 kg/分), 保持時間9.98 (syn), 8.85 (anti); >99% anti.Ee.>98％ GC betaDexTM (Supelco, 30m x 0.25mm, 140℃, N2 1 kg/分), 文献による旋光性の比較に基づいて一時的に割り当てた (2R, 3R) 立体配置 [α]D25 = -3.8 (c = 1.13, CHCl3)。
式25の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.10 (1H, bs); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.35 (5H, m).HPLC:キラセル OB-H, λ217, ヘキサン:iイソプロパノール 96:4, 1 mL/分.保持時間6.2分(R)及び9.2分(S).[α]D25 = +54.8 (c = 2.74, CHCl3)。
式26の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.03 (1H, bs); 4.89 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.01 and 7.03 (各2H, 各 d, J = 8.6 Hz).HPLC: キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール96:4, 1 mL/分.保持時間7.8分 (S)及び8.8 分(R).[α]D25 = +48.8 (c = 1.4, CHCl3)。
式27の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.1 (1H, bs, OH); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.31 (4H, s).HPLC: キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール96:4, 1 mL/分.保持時間8.9分(S)及び10.5分(R).[α]D25 = +49.2 (c = 1.83,エーテル)。
式28の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.08 (1H, bs); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.25及び7.47 (各2H, 各, J = 8.7 Hz).HPLC:キラセルOB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール96:4, 1 mL/分.保持時間9.4分(S)及び11.4分 (R).[α]D25 = +38.3 (c = 1.55, CHCl3).
式29の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.5 (3H, d, J = 6.51 Hz); 2.33 (1H, bs); 4.98 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.48及び7.60 (各2H, 各d, J = 8.2 Hz).[α]D25 = +27.2 (c 2.08, MeOH).
式30の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.48 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.01 (1H, bs); 2.38 (1H, s); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.15及び7.26 (各2H, 各d, J = 7.9 Hz).HPLC:キラセル OB-H, λ217, ヘキサン:イソプロパノール95:5, 1 mL/分.保持時間10.1分(S)及び12.9分(R).[α]D25 = +52.1 (c = 1.98, CHCl3)。
式31の化合物：1H NMR(300 MHz, CDCl3): 1.46 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.08 (1H, bs); 3.80 (3H, s); 4.84 (1H, q, J = 6.5 Hz); 6.86及び7.28 (各2H, 各d, J = 8.2).[α]D22= +51.4 (c 1.72, CHCl3)。
式32の化合物：1H NMR (300 MHz, CDCl3): 1.52 (3H, t, J = 6.5 Hz, CH3); 2.50 (1H, bs, OH); 5.02 (1H, q, J = 6.5 Hz, CH); 7.54及び8.12 (各2H, 各d, J = 8.9 Hz,アリール).[α]D25 = +31.4 (c = 3.99, CHCl3)。
【０１２３】
下記の記載は単に実施態様の見本であり、本発明に対しその範囲、応用性又は構成をいかなる態様でも制限することを意図せず、むしろ以下の記載は、本発明の典型的な実施態様の実行のための便利な例示を提供し、記載した実施態様に対する種々の変更を本発明の範囲を逸脱することなく記載の成分の機能及び構成において実施することが可能である。
実施例
以下の実施例で用いられる組換えDNA技術に関する具体的な操作方法は以下の文献に記載されている：Sambrook, J.et al.Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989; Vol.2。
【実施例１】
【０１２４】
大腸菌の表面でカルボニルレダクターゼを発現する発現プラスミドpET23(a)-omp-CRSの構築
本発明のDNAを有する人工的な注文合成プラスミドpUC19-omp-CRSは、配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列をコードする配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列を有する。前記プラスミドをNde1及びEcoR1で二重消化し、生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。1.3KbのDNAフラグメントは配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列を有し、前記をゲルから切り出しキアクイックキット（Qiaquick kit（Qiagen））を用いて精製した。プラスミドpET23(a)を別にNde1及びEcoR1で消化し、続いて自家結合を回避するためにウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化を実施した。Nde1及びEcoR1（NEB Ltd, UK）消化1.3Kb DNAフラグメントは配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列を有し、pET23(a)がT4DNAリガーゼ（NEB Ltd, UK）を用いて連結され、大腸菌DH5αを形質転換した。生成クローンをアンピシリン（100mg/mL）含有LBブロスで増殖させ、プラスミドを単離し、続いて前記をNde1及びEcoR1で二重消化した。二重消化後にプラスミドは3.6KbのpET23(a)骨格及び1.3KbのDNA挿入物を生じ、配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列がpET23(a)のlacプロモーターの下流でクローニングされ、4.9KbのプラスミドpET23(a)-omp-CRSを生じたことを示唆した。
プラスミドpET23(a)-omp-CRSの制限マップは図5に示されている。
大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)が、プラスミドpET23(a)-omp-CRSで形質転換された（前記プラスミドは形質転換体の表面でカルボニルレダクターゼを発現する）。
【実施例２】
【０１２５】
形質転換体の細胞質でカルボニルレダクターゼを発現する発現ベクターpET23(a)-CRSの構築
前記を米国特許2010/0028972に開示された情報を用いて構築した。クローニング用CRSF（配列番号:26）及びCRSR（配列番号:28）プライマーは、配列リストの配列番号:14で表されるカルボニルレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて合成された（配列番号:14は配列リストの配列番号:13のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）。注文合成pUC19-omp-CRSプラスミドを1反応30サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に付した。PCR条件は、95℃で5分の最初の変性、続いて以下の30サイクル（95℃で60秒、58℃で60秒及び72℃で60秒とともに72℃で5分の最後の伸長工程）であった。精製PCR生成物をNde1及びXho1で消化し、1％アガロースゲル上で泳動した。0.87KbのNde1及びXho1消化フラグメントをゲルから切り出し、キアクイックキット（Qiagen）を用いて精製した。プラスミドpET23(a)を別にNde1及びXho1で消化し、続いて自家結合を回避するためにウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化を実施した。Nde1及びXho1消化0.87Kb は配列リストの配列番号:14のヌクレオチド配列を有し、pET23(a)がT4DNAリガーゼを用いて連結され、大腸菌DH5αを形質転換した。生成クローンをアンピシリン含有LBブロスで増殖させ、プラスミドを単離し、続いて前記をNde1及びXho1で二重消化した。二重消化後にプラスミドは3.6KbのpET23(a)骨格及び0.87Kbの挿入物を生じ、0.87Kb遺伝子はpET23(a)のlacプロモーターの下流でクローニングされ、4.4KbのプラスミドpET23(a)-CRSを生じたことを示唆した。
大腸菌BL21(DE3)がプラスミドpET23(a)-CRSで形質転換された（前記プラスミドは細胞質でカルボニルレダクターゼを発現する）。
【実施例３】
【０１２６】
カルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを形質転換体の表面で共同発現する発現ベクターpETDuet1-omp-CRSの構築
発現ベクターpETDuet1-omp-CRSは2つのポリペプチドを共同発現する。前記ポリペプチドの一方は、配列リストの配列番号:１のアミノ酸配列を有し、カルボニルレダクターゼ活性を示し、他方のポリペプチドは配列リストの配列番号:９のアミノ酸配列を有し形質転換体の表面で補酵素再生活性を示す。前記発現ベクターの構築という目標を達成するために、発明者らは、2つのマルチクローニングサイトを含むプラスミドpETDuet1を選択した（前記マルチクローニングサイトの各々でT7プロモーター/lacオペレーター及びリボソーム結合部位（rbs）が先行する）。omp-CRS及びomp-GDH遺伝子をpETDuet1プラスミドでクローニングした（前記は二段工程である）。
第一の工程では、本発明のDNA（配列リストの配列番号:1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列リストの配列番号:2のヌクレオチド配列を有する）をプラスミドpUC19-omp-CRSから増幅した（前記はプライマーoc1F（配列番号:30）及びoc1R（配列番号:32）によるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の鋳型として用いられた）。PCR条件は、95℃で5分の最初の変性、続いて以下の30サイクル（95℃で60秒、55℃で60秒及び72℃で90秒とともに72℃で5分の最後の伸長工程）であった。精製PCR生成物をNco1及びHind3で消化し、1％アガロースゲル上で泳動した。1.3KbのNco1及びHind3消化フラグメントをゲルから切り出し、キアクイックキット（Qiagen）を用いて精製した。プラスミドpETDuetを別にNco1及びHind3で消化し、続いて自家結合を回避するためにウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化を実施した。T4DNAリガーゼを用いてNco1及びHind3消化omp-CRS及びpETDuet1を連結し、大腸菌DH5αを形質転換した。生成クローンをアンピシリン（100μg/mL）含有LBブロスで増殖させ、前記からプラスミドを単離し、続いてNco1及びHind3で二重消化した。二重消化後にプラスミドは〜5.4KbのpETDuet1骨格及び1.3Kbの配列番号:2の挿入物を生じ、配列番号:2はpETDuet1のlacプロモーターの下流の第一のマルチクローニングサイトでクローニングされ、6.7KbのプラスミドpETDuet1-omp-CRSを生じたことを示唆した。
第二の工程では、本発明のDNA（配列リストの配列番号:９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列リストの配列番号:１０のヌクレオチド配列を有する）を人工的な注文製作プラスミドpUC19-omp-GDHから増幅した（前記はプライマーogF（配列番号:34）及びogR（配列番号:36）によるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の鋳型として用いられた）。PCR条件は、95℃で5分の最初の変性、続いて以下の30サイクル（95℃で60秒、55℃で60秒及び72℃で90秒とともに72℃で5分の最後の伸長工程）であった。精製PCR生成物をNde1及びXho1で消化し、アガロースゲル上で泳動した。1.2KbのNde1及びXho1消化フラグメントをゲルから切り出し、キアクイックキット（Qiagen）を用いて精製した。上記記載のように構築した6.7KbプラスミドpETDuet1-omp-CRSを別にNde1及びXho1で消化し、続いて自家結合を回避するためにウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化を実施した。T4DNAリガーゼを用いてNde1及びXho1消化配列番号:4及びpETDuet1-omp-CRSを連結し、大腸菌DH5αを形質転換した。生成クローンをアンピシリン含有LBブロスで増殖させ、前記からプラスミドを単離し、続いてNde1及びXho1で二重消化した。二重消化後にプラスミドは〜6.7KbのpETDuet1-omp-CRS骨格及び1.2Kbのomp-GDH挿入物を生じ、omp-GDHはpETDuet1-omp-CRSのlacプロモーターの下流の第二のマルチクローニングサイトでクローニングされ、7.8KbのプラスミドpETDuet1-omp-CRS,omp-GDHを生じたことを示唆した。
プラスミドpETDuet1-omp-CRS,omp-GDHの制限マップは図6に示されている。
大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)又は大腸菌C43(DE3)が、プラスミドpETDuet1-omp-CRS,omp-GDHで形質転換された（前記は形質転換体の表面でカルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを共同発現する）。
【実施例４】
【０１２７】
形質転換体の調製
実施例1で構築した組換えプラスミドpET23(a)-omp-CRSを用いて、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)及び大腸菌C43(DE3)の形質転換受容性細胞を形質転換して、表面でカルボニルレダクターゼを発現する大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS、大腸菌C41(DE3)+pET23(a)-omp-CRS及び大腸菌C43(DE3)+pET23(a)-omp-CRSを得た。
同様に、実施例3で構築した組換えプラスミドpETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを用いて、大腸菌BL21(DE3)、大腸菌C41(DE3)及び大腸菌C43(DE3)の形質転換受容性細胞を形質転換して、表面でカルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼの両方を発現する大腸菌BL21(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDH、大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDH及び大腸菌C43(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDHを得た。
実施例2で構築した組換えプラスミドpET23(a)-CRSを用いて、大腸菌BL21(DE3)の形質転換受容性細胞を形質転換して、細胞の細胞質でカルボニルレダクターゼを発現する大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRSを得た。
実施例2で構築した組換えプラスミドpET23(a)-CRS及び下記のように構築されるpET29(a)-GDHを用いて、大腸菌BL21(DE3)の形質転換受容性細胞を形質転換して、細胞の細胞質でカルボニルレダクターゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRS,pET29(a)-GDHを得た。大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRS,pET29(a)-gdhは、Kizakiらの文献に開示された技術を用いて構築した（Kizaki, N.et al.Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595）。
【０１２８】
組換えプラスミドpET29(a)-GDHの構築：クローニング用gdhF（配列番号:38）及びgdhR（配列番号:40）プライマーを、配列リストの配列番号:26で表されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて合成した（配列番号:26は配列リストの配列番号:25のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）。注文合成pUC19-omp-gdhプラスミドを1反応30サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に付した。PCR条件は、95℃で5分の最初の変性、続いて以下の30サイクル（95℃で60秒、52℃で60秒及び72℃で60秒とともに72℃で5分の最後の伸長工程）であった。精製PCR生成物をNde1及びXho1で消化し、1％アガロースゲル上で泳動した。0.81Kb のNde1及びXho1消化フラグメントをゲルから切り出し、キアクイックキット（Qiagen）を用いて精製した。プラスミドpET29(a)を別にNde1及びXho1で消化し、続いて自家結合を回避するためにウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化を実施した。Nde1及びXho1消化0.81Kb は配列リストの配列番号:26のヌクレオチド配列を有し、pET29(a)がT4DNAリガーゼを用いて連結され、大腸菌DH5αを形質転換した。生成クローンをカナマイシン含有LBブロスで増殖させ、プラスミドを単離し、続いて前記をNde1及びXho1で二重消化した。二重消化後にプラスミドは5.4KbのpET29(a)骨格及び0.81Kbの挿入物を生じ、0.81Kb遺伝子はpET29(a)のlacプロモーターの下流でクローニングされ、6.0KbのプラスミドpET29(a)-GDHを生じたことを示唆した。
【実施例５】
【０１２９】
形質転換体での遺伝子の発現
プラスミドを保持する組換え大腸菌の新鮮な培養を、抗生物質を含む10mLのルリアベルタニ（Luria Bertani）HiVegブロス培地（1％HiVegヒドロラーゼ、0.5％酵母抽出物、1％塩化ナトリウム（pH7.5））にて37℃で増殖させ、6時間の増殖後、1mLの培養を抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなど、単独又は組み合わせて）を含む100mLの新鮮なLB培地に接種し、200rpmの震盪状態下にて37℃で増殖させた。600nmのODが0.5−0.6に達したとき、最終濃度0.2mMのIPTGで培養を誘発し、前記を200rpmの震盪状態下にて20℃でさらに16時間増殖させた。
【実施例６】
【０１３０】
形質転換大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS、配列番号:1）表面でのカルボニルレダクターゼの発現の提示
形質転換大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSを100mLの培地で上記実施例5に記載したように増殖させた。遠心分離によって細胞を単離し、50mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した。続いて前記細胞を5mLの溶解緩衝液（50 mM NaH2PO4、150 mM NaCl、1mg mL-1リゾチーム（pH8.0））に4℃で30分懸濁した。続いて前記細胞懸濁物を4℃で20分超音波処理した（30秒パルスON及び30秒パルスOFF）。14,000rpmで30分遠心分離することによって細胞屑を除去した。続いて膜分画及び可溶性分画を分離するために上清（無細胞抽出物）を4℃、1,000,000gで2時間の超遠心分離に付した。膜分画を含む沈殿物を同じ緩衝液で洗浄し、膜可溶化緩衝液（25 mMトリスHCl、20％グリセロール及び2％トリトンX100（pH7.5））に再懸濁した。3つの分画全て（無細胞抽出物、膜分画及び可溶性タンパク質分画）を、エチル4-クロロ-3-オキソブチレートをエチル4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートに還元する活性についてアッセイした。例えば、50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中の標準反応混合物（1mL）（0.2mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）、2.0mMのECOB及び1−50μLのサンプルを含む）を30℃でインキュベートし、全活性を決定した。結果は表1に要約されている。期待したように、活性の大半は膜分画から回収された。有意義なことに、大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)（陰性コントロール）は活性を全く欠いていた。
【０１３１】
表1：大腸菌BL21(DE3)+ｐET23(a)及び大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS, 配列番号:1）から得られた種々の分画のカルボニルレダクターゼ（CRS）活性
0006330028.tif 000033
大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSの表面にCRSが存在することは、さらにまた大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-cr1細胞の超薄切片を用いて実施されるEM免疫金標識試験で確認された。抗CRSポリクローナル抗体を精製CRSに対してウサギで作製し、ウェスタンブロットによってそれら抗体の特異性についてアッセイした。精製CRSを還元条件下のSDS-PAGEで泳動し、ニトロセルロース膜への電気的ブロッティングの後でウサギ抗CRSポリクローナル抗体を用いてプローブし、前記をさらにアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（全分子）二次抗体でプローブした。続いて、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP, 0.15mg/mL）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT, 0.30mg/mL）、トリスHCl（100mM）及びMgCl2（5mM）（pH9.5）を含む基質溶液に前記を10分間浸漬することによってブロットをデベロップさせた。純粋なCRSを特異的に標識するポリクローナル抗体はまたomp-CRSを特異的に標識することができた。
数回の脱水工程の後で、組換え大腸菌BL21(DE3)+ｐET23(a)（陰性コントロール）及び大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSをLR白色樹脂に包埋し、続いて固定液として0.2％グルタルアルデヒドを用い数工程で脱水した。ウルトラミクロトームを用いて切り出した薄い切片を、ウサギ抗CRSポリクローナル抗体、続いてナノゴールド標識ヤギ抗ウサギIgG（全分子）二次抗体とともにインキュベートし、透過型電子顕微鏡下で可視化した。種々の視野を観察し、金粒子は細胞の表面に重点的に存在することが見出された（図7）。陰性コントロールとしての細胞では標識は生じなかった。
【実施例７】
【０１３２】
形質転換大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS, 配列番号:1）における細胞質及び表面発現CRSの相対的発現レベル
組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRS（CRS, 配列番号:1）及び大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS, 配列番号:1）の新鮮培養を増殖させ、各クローンの全細胞プロテオームを調製した。種々の濃度の細胞から入手したプロテオームを還元状態下の12.5％SDS-PAGEで泳動した。ニトロセルロース膜への電気的ブロッティングの後で、前記をウサギ抗CRSポリクローナル抗体によりプローブし、さらにアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG抗体でプローブした。抗体によるプローブ後に、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP, 0.15mg/mL）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT, 0.30mg/mL）、トリスHCl（100mM）及びMgCl2（5mM）（pH9.5）を含む基質溶液に前記を10分間浸漬することによってブロットをデベロップさせた。CRSの発現は、対応するクローンのバンド強度をソフトウェア（Scion Image）によって分析して決定した。強度を採取細胞量に対してプロットし、細胞内発現及び表面発現の勾配（dy/dx）を比較した。Omp-CRS融合タンパク質としての細胞の表面におけるCRSの発現は、細胞質で発現されるCRSと比較して17.9倍少ないことが見出された。
【実施例８】
【０１３３】
表面発現CRSは細胞質CRSと比較してエチル4-クロロ-3-オキソブチレートの還元について275倍の増加活性を示した
組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRS（CRS, 配列番号:1）及び大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS 配列番号:1）の新鮮培養を増殖させ、カルボニルレダクターゼ活性の測定に用いた。アッセイは、基質としてエチル4-クロロ-3-オキソブチレート及び補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）を用いて実施した。カルボニルレダクターゼ活性の初速は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）のλ340の吸収低下をモニターすることによって決定した。50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中の標準反応混合物（1mL）は、0.2mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）、106−108の組換え大腸菌細胞、及び2.0mMのエチル(S)-4-クロロ-3-オキソブタノエートを含んでいた。活性1ユニットは、特定の条件下で1分毎に1μmolのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の酸化を触媒する乾燥細胞の重量と定義した。表面でomp-CRSを発現する組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS 配列番号:1）の活性は、156.20ｘ103nmol/分/gm乾燥細胞と決定された。対比して、細胞質でCRSを発現する組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRS（CRS, 配列番号:1）の活性は、10.16ｘ103nmol/分/gm乾燥細胞と決定された。したがって、等量の細胞では、表面提示CRSは15.4倍高い活性を示した。しかしながら、我々は、等量の細胞では組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-CRSは、組換え大腸菌BL21+pET23(a)-omp-CRSと比較して17.9倍多くのタンパク質を発現することを示した。したがって、組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSの単位タンパク質当たりの活性は、組換え大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRSよりも275倍高かった。結果は表2に要約されている。
【０１３４】
表2：omp-CRS融合タンパク質としてCRS（CRS配列番号:1）を表面で発現する組換え大腸菌と細胞質でCRS（CRS配列番号:1）を発現する組換え大腸菌の相対的活性
0006330028.tif 000034
*DCW＝乾燥細胞重量
#陰性コントロール大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)はいかなる活性も生じなかった。
【実施例９】
【０１３５】
種々のケトンの還元について表面発現CRSは細胞質CRSと比較して50倍から275倍増加活性を示した
アッセイは96ウェルELISAプレートで実施した。50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中に、0.2mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）、2.0mMの基質、50μg/mLの大腸菌細胞（細胞集合物の計算のために、OD600＝1の細胞懸濁物が0.25mg/mLの乾燥細胞重量と等しいとみなした）から成る反応混合物を30℃で基質の消費に応じて約30分から12時間インキュベートした。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の消費はλ340の吸収低下によってモニターした。結果は表3及び3に要約されている。期待したように、表面発現CRS（CRS配列番号:1）は、種々の脂肪族及び芳香族ケトンの還元において細胞内で発現されるCRS（CRS配列番号:1）よりもはるかに効率的であった。一般的に、活性の増加は、これらの条件下ではCRSタンパク質1ユニット当たり50倍から275倍の範囲であった。CRSの相対的濃度は実施例7に記載したように決定した。
【０１３６】
表3：omp-CRS融合タンパク質としてCRS（CRS配列番号:1）を表面で発現する組換え大腸菌と細胞質でCRS（CRS配列番号:1）を発現する組換え大腸菌の種々のケトンaでの相対的活性
0006330028.tif 000035
a補因子リサイクルのために外部GDHをアッセイ混合物に添加した。
*DCW＝乾燥細胞重量
#DCW1グラム当たりのCRS発現は、細胞質発現CRSと比較して表面発現CRSで17.9倍低かった（実施例7）。
【０１３７】
表4：omp-CRS融合タンパク質及びomp-GDHタンパク質としてCRS（配列番号:1）及びGDH（配列番号:9）を表面で共同発現する組換え大腸菌と細胞質でCRS（配列番号:1）及びGDH（配列番号:1）を共同発現する組換え大腸菌の種々のケトンにおける相対的活性
0006330028.tif 000036
*DCW＝乾燥細胞重量
#DCW1グラム当たりのCRS発現は、細胞質発現CRSと比較して表面発現CRSで17.9倍低かった。
【実施例１０】
【０１３８】
形質転換大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号:9）の表面におけるグルコースデヒドロゲナーゼ発現の提示
形質転換大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号:9）を100mLの培地で上記実施例5に記載したように増殖させた。遠心分離によって細胞を単離し、50mMのリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した。続いて前記細胞を5mLの溶解緩衝液（50 mM NaH2PO4、150 mM NaCl、1mg mL-1リゾチーム（pH8.0））に4℃で30分懸濁した。続いて前記細胞懸濁物を4℃で20分超音波処理した（30秒パルスON及び30秒パルスOFF）。14000rpmで30分遠心分離することによって細胞屑を除去し、上清（無細胞抽出物）を更なる分析のために採取した。以前に記載したように膜分画及び可溶性分画を上清（無細胞抽出物）から分離した。3つの分画全て（無細胞抽出物、膜分画及び可溶性タンパク質分画）をグルコースからグルコネートに酸化する能力についてアッセイした。例えば、100mMトリスHCl緩衝液（pH8.0）中の標準反応混合物（1mL）（0.5mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）（7.78mg/mLの50μL）、5mMグルコース（180mg/mLの25μL）及び1−50μLのサンプルを含む）を30℃でインキュベートし、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の生成をλ340でモニターすることによって活性を決定した。結果は表5に要約されている。期待したように、活性の大半は膜分画から回収された。大腸菌C41(DE3)+pETDuet1（陰性コントロール）は活性を全く欠いていた。
【０１３９】
表5：大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS;omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号:9）及び大腸菌C41(DE3)+pETDuet1の種々の分画におけるグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）活性
0006330028.tif 000037
【実施例１１】
【０１４０】
大腸菌C41(DE3)における細胞質発現及び表面発現GDH（配列番号:9）の相対的発現レベル
組換え大腸菌C41(DE3)+pET29(a)-CRS+pET29(a)-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号:9）及び大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号:9）のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を、基質としてグルコースを用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）の吸収増加を分光光度計により340nmでモニターすることによって決定した。50mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）中の反応混合物（1mL）は、0.5mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)+、106−108細胞及び5.0mMグルコースを含んでいた。活性1ユニットは、これらの条件下で1分毎に1μmolのNADPの還元を触媒する細胞量（乾燥細胞重量）と定義された。細胞の表面でomp-GDH融合タンパク質としてGDHを発現する組換え大腸菌は683.52ｘ103nmol/分/gm乾燥細胞の活性を示し、一方、細胞質でGDHを発現する大腸菌は41.87ｘ103nmol/分/gm乾燥細胞の活性を示した。表面及び細胞質で発現されるGDHの相対的発現レベルはSDS-PAGEから概算した。細胞質発現は、組換え大腸菌の表面発現タンパク質と比較して約13.8倍高いと概算された。大腸菌C41(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDHは、組換え大腸菌C41(DE3)+pET29(a)-CRS+pET29(a)-GDHと比較して225倍高かった。結果は表6に要約されている。
【０１４１】
表6：omp-GDP（配列番号:9）融合タンパク質としてGDHを発現する組換え大腸菌及び細胞質でGDH（配列番号:9）を発現する組換え大腸菌の相対的活性
0006330028.tif 000038
*DCW＝乾燥細胞重量
#陰性コントロール大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)はいかなる活性も生じなかった。
【実施例１２】
【０１４２】
生物触媒として形質転換大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS, 配列番号:1）又はC41(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（CRS, 配列番号:1）を用いるエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの生成
反応は、補助溶媒としてオートタイトレーター（718 STAT Titrino, Metrohm, スイス）中のジエチルエーテルを用い2相系で実施した。大腸菌BL21(DE3)+pET23(a)-omp-CRS細胞又はC41(DE3)+pET23(a)-omp-CRS（1.38g；乾燥細胞重量基準）を20mLのリン酸緩衝液（100mM、pH6.5）に懸濁した。15mLのジブチルエーテル中のグルコース（9g、50mmol）、グルコースデヒドロゲナーゼ（3600U）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）（18mg、0.02mmol）及びECOB（6g、36.5mmol）を前記懸濁物に添加し、内容物を磁気攪拌装置上にて穏やかに30℃で攪拌した。5MのNaOHで反応物のpHを6.5に維持した。反応の進行は以下のように1時間間隔でモニターした。各々0.2mLアリコットを取り出し、2mLの酢酸エチルで抽出した。有機相を遠心分離により分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ溶媒を除去して残留物を残し、前記を1H NMRによって分析した。1H NMRでは、ECOB中のCH2Clに対応するメチレン基はδ3.65の一重項として出現し、一方、前記は還元生成物ECHBでは3.60でddとして出現した。これらのピークは1H NMRで十分に分解されたセグメントとして出現するので、2つの化合物の混合物ではそれらの相対的濃度は、δ3.60及び3.65における共鳴の相対的積分値を比較することによって容易に算出できる。
出発物質が存在しないことが反応混合物で示されたら、内容物を酢酸エチルで抽出した。有機相を遠心分離により分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ溶媒を除去してエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを得た。エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの光学的純度を高速液体クロマトグラフィーで以下を用いて測定した：キラセルOB-H（ダイセル化学工業（Daicel Chemical Industries）の製品）；溶剤：ヘキサン/イソプロパノール＝96/4；流速：1mL/分；検出：217nm；カラム温度：室温。
【実施例１３】
【０１４３】
生物触媒として形質転換大腸菌BL21(DE3)+pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号：9）又は大腸菌C41(DE3)+pET Duet1-omp-CRS,omp-GDH（CRS, 配列番号:1；GDH, 配列番号：9）を用いるエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの生成
生成方法は、グルコースデヒドロゲナーゼが反応物に添加されなかったことを除き実施例12に記載した方法と同じであった。
本発明の好ましい態様は以下の通りである。
１．配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性を有する、前記デザイナー細胞：
0006330028.tif 000039
２．配列リストの天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチド配列番号:1を細胞の表面で発現し、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり約275倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
３．配列リストの配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するカルボニルレダクターゼを式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、単位細胞質量当たり15倍から26倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
４．配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、単位細胞質量当たり少なくとも15倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
５．配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを下記式3の化合物の還元のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から275倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000040
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
６．配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、配列リストの配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを下記式4の化合物の還元のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり50倍から180倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000041
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
７．配列リストの配列番号:1の天然に存在しないカルボニルレダクターゼポリペプチドを細胞の表面で発現し、配列番号:13の対応するカルボニルレダクターゼを下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元のために細胞の細胞質で発現するデザイナー細胞と比較して、単位細胞質量当たり約3倍から15倍高い活性を有する、上記1に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000042
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8であって；
0006330028.tif 000043
式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
８．配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9又は11から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現するデザイナー細胞であって、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり250倍から300倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化についてGDHポリペプチドの単位質量当たり200倍から250倍強化された活性を有する、前記デザイナー細胞。
0006330028.tif 000044
９．配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換についてCRSポリペプチドの単位質量当たり約270倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化についてGDHポリペプチドの単位質量当たり約225倍強化された活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
１０．配列番号:1、3、5又は7から選択される配列の天然に存在しないCRSポリペプチド、及び配列リストの配列番号:9、11、13又は15から選択される配列の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面で同時に発現し、配列リストの配列番号:13又は15又は17又は19の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21又は23の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり約11倍から24倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化について単位細胞質量当たり9倍から31倍強化された活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
１１．配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートから式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートへの変換について単位細胞質量当たり約15倍高い活性、及びグルコースからグルコネートへの酸化につい単位細胞質量当たり約16倍強化された活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
１２．配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを下記式3の化合物の還元のために細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり約55倍から270倍高い活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000045
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
１３．配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを下記式4の化合物の還元のために細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、CRSポリペプチドの単位質量当たり約40倍から156倍高い活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000046
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
１４．配列番号:1の天然に存在しないCRSポリペプチド及び配列リストの配列番号:9の天然に存在しないGDHポリペプチドを細胞の表面に同時に発現し、配列リストの配列番号:13の対応するCRS及び配列リストの配列番号:21の対応するGDHを下記式3の化合物又は下記式4の化合物の還元のために細胞の細胞質で同時に発現するデザイナー細胞と比較して、単位細胞質量当たり約2倍から15倍高い活性を有する、上記8に記載のデザイナー細胞。
0006330028.tif 000047
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
0006330028.tif 000048
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
１５．デザイナー細胞が、組換え大腸菌（Escherichia coli）BL21(DE3)、又は組換え大腸菌C41(DE3)、又は組換え大腸菌C43(DE3)である、上記1から14に記載のデザイナー細胞。
１６．カルボニルレダクターゼ活性を示す、配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
１７．カルボニルレダクターゼ活性を示す配列番号:1又は3又は5又は7のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及びGDH活性を示す配列番号:9又は11のアミノ酸配列有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
１８．下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの約100％鏡像体過剰の製造のための上記1に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000049
１９．式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの約100％鏡像体過剰の製造のための上記8に記載のデザイナー細胞の使用。
２０．下記式5の化合物の製造のための上記1に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000050
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
２１．下記式5の化合物の製造のための上記8に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000051
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
２２．下記式6の化合物の製造のための上記1に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000052
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
２３．下記式6の化合物の製造のための上記8に記載のデザイナー細胞の使用。
0006330028.tif 000053
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
２４．下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰で製造する方法であって、
0006330028.tif 000054
前記方法が、
f．下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程、
0006330028.tif 000055
g．該エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを、上記1に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させる工程、
h．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
i．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
j．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて当該生成物エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを単離する工程を含む、前記方法。
２５．pHが、好ましくは6.5である、上記24に記載の方法。
２６．温度が、好ましくは30℃である、上記24に記載の方法。
２７．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記24に記載の方法。
２８．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記24に記載の方法。
２９．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記24に記載の方法。
３０．下記式2のエチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを約100％鏡像体過剰で製造する方法であって、
0006330028.tif 000056
前記方法が、
a．下記式1のエチル4-クロロ-3-オキソブチレートを提供する工程、
0006330028.tif 000057
b．該エチル4-クロロ-3-オキソブチレートを、上記8に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させる工程；
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程；
d．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程；
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて当該生成物エチル(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを単離する工程を含む、前記方法。
３１．pHが、好ましくは6.5である、上記30に記載の方法。
３２．温度が、好ましくは30℃である、上記30に記載の方法。
３３．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記30に記載の方法。
３４．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記30に記載の方法。
３５．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)である、上記30に記載の方法。
３６．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記30に記載の方法。
３７．光学的に濃縮された下記式5の脂肪族アルコールを製造する方法であって
0006330028.tif 000058
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）、
前記方法が、
f．下記式3のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000059
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
g．工程（a）で提供される式3のケトンを、上記1に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
h．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
i．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
j．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式5の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
３８．pHが、好ましくは6.5である、上記37に記載の方法。
３９．温度が、好ましくは30℃である、上記37に記載の方法。
４０．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記37に記載の方法。
４１．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記37に記載の方法。
４２．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記37に記載の方法。
４３．光学的に濃縮された下記式6のアリールアルコールを製造する方法であって、
0006330028.tif 000060
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）、
前記方法が、
f．下記式4のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000061
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である。）
g．工程（a）で提供される式3のケトンを、上記1に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及び100から500単位のグルコースデヒドロゲナーゼ及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
h．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
i．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
j．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式6の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
４４．pHが、好ましくは6.5である、上記43に記載の方法。
４５．温度が、好ましくは30℃である、上記43に記載の方法。
４６．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記43に記載の方法。
４７．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記43に記載の方法。
４８．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記43に記載の方法。
４９．光学的に濃縮された下記式5の脂肪族アルコールを製造する方法であって、
0006330028.tif 000062
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）、
前記方法が、
a．下記式3のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000063
（式中、R1＝CH3、CH2X、(CH3)2CH、CF3又はCH3(CH2)nであり、R2＝H、X又はCH3(CH2)nであり、R3＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)mであり、X＝Cl又はBrであり、n＝1−4であり、さらにm＝1−8である。）
b．工程（a）で提供される式3のケトンを、上記8に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
d．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式5の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
５０．pHが、好ましくは6.5である、上記49に記載の方法。
５１．温度が、好ましくは30℃である、上記49に記載の方法。
５２．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記49に記載の方法。
５３．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記49に記載の方法。
５４．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記49に記載の方法。
５５．光学的に濃縮された下記式6のアリールアルコールを製造する方法であって、
0006330028.tif 000064
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である）、
前記方法が、
a．下記式4のケトンを提供する工程、
0006330028.tif 000065
（式中、R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H、CH3、F、Cl、Br、I、CF3、NO2又はOCH3であり、R6＝アルキル基、例えばCH3又はCH3(CH2)nであり、n＝1から5である）、
b．工程（a）で提供される式3のケトンを、上記8に記載のデザイナー細胞並びに0.005から0.02モル％のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（NADPH）及びpH5.0から9.0の緩衝溶液と接触させて反応混合物を形成する工程、
c．工程（b）で得られる反応混合物に有機溶媒（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルn-ブチルエーテル又はジ-n-ブチルエーテル）を10：1から1：1の範囲の比率で添加する工程、
d．該反応混合物を磁気攪拌装置上で活発に20から40℃の一定の温度で混合する工程、
e．工程（d）で得られる生成物を酢酸エチル中で抽出し、続いて式6の化合物を単離する工程を含む、前記方法。
５６．pHが、好ましくは6.5である、上記55に記載の方法。
５７．温度が、好ましくは30℃である、上記55に記載の方法。
５８．有機溶媒が、好ましくはジ-n-ブチルエーテルである、上記55に記載の方法。
５９．デザイナー細胞が、組換え大腸菌BL21(DE3)、組換え大腸菌C41(DE3)、及び組換え大腸菌C43(DE3)から選択される組換え大腸菌株である、上記55に記載の方法。
６０．デザイナー細胞が、好ましくは組換え大腸菌C41(DE3)である、上記55に記載の方法。
６１．アクセッション番号MTCC No.5806、MTCC No.5807、MTCC No.5808及びMTCC No.5809を有するデザイナー細胞。
６２．アクセッション番号MTCC5806−5809を有するデザイナー細胞が配列番号:1、3、5及び7を有するアミノ酸配列を発現する、上記61に記載のデザイナー細胞。
６３．配列番号:1、3、5及び7を有するアミノ酸配列が配列番号:2、4、6、8を有するヌクレオチド配列と一致する、上記61−62に記載のデザイナー細胞。
６４．配列番号:1−8が、天然に存在しないカルボニルレダクターゼ酵素配列である、上記61−63に記載のデザイナー細胞。
６５．細胞表面で高活性のカルボニルレダクターゼを発現することができる、上記61−64に記載のデザイナー細胞。
６６．配列番号:1−8を含みかつ該配列を発現することができる組換えベクター構築物。
６７．天然に存在しないカルボニルレダクターゼ酵素配列を含む、上記66に記載の組換えベクター構築物。
６８．細胞表面で高活性のカルボニルレダクターゼを発現することができる、上記66−67に記載の組換えベクター構築物。
６９．アクセッション番号MTCC No.5810、MTCC No.5811、MTCC No.5812、MTCC No.5813、MTCC No.5814、MTCC No.5815、MTCC No.5816及びMTCC No.5817を有するデザイナー細胞。
７０．デザイナー細胞が、MTCC No.5810のアクセッション番号を有し配列番号:1及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5811のアクセッション番号を有し配列番号:1及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5812のアクセッション番号を有し配列番号:3及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5813のアクセッション番号を有し配列番号:配列番号:3及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5814のアクセッション番号を有し配列番号:5及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5815のアクセッション番号を有し配列番号:5及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5816のアクセッション番号を有し配列番号:7及び配列番号:9を有するアミノ酸配列を発現する、デザイナー細胞がMTCC No.5817のアクセッション番号を有し配列番号:7及び配列番号:11を有するアミノ酸配列を発現する、上記69に記載のデザイナー細胞。
７１．配列番号:1、3、5、7、9及び11を有するアミノ酸配列が、配列番号:2、4、6、8、10及び12を有するヌクレオチド配列と一致する、上記69−70に記載のデザイナー細胞。
７２．酵素カルボニルレダクターゼ及びグルコナーゼデヒドロゲナーゼを細胞表面で一緒に共同発現することができる、上記65−67に記載のデザイナー細胞。
７３．上記71に記載の配列を含み、さらに前記を発現することができる組換えベクター。
７４．酵素カルボニルレダクターゼ及びグルコナーゼデヒドロゲナーゼを細胞表面で一緒に共同発現することができる、上記73に記載の組換えベクター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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