(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体を介したエンドサイトーシスに供される抗原である、腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体、および受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物。
【請求項２】
ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、ダイナミンGTPase阻害剤およびダイナミン環安定剤から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞表面抗原が腫瘍関連抗原である、請求項1または２に記載の組成物。
【請求項４】
腫瘍関連抗原がEGFRおよびHer2/neuから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量、および受容体を介したエンドサイトーシスに供される抗原である、腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体の有効量の使用であって、該医薬が、対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するために有効な量で該阻害剤および該抗体を対象に同時に投与するために製剤化されている、使用。
【請求項６】
増強された免疫応答が、増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
増強された免疫応答が、腫瘍細胞の表面上のMHCクラスIIの発現を刺激することまたは増強することを含む、請求項５または請求項６に記載の使用。
【請求項８】
対象においてがんを処置または予防するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量、およびがんに関連する腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する、抗体の有効量の使用であって、該医薬が、対象のがんの処置または予防に有効な量で該阻害剤および該抗体を対象に同時に投与するために製剤化されている、使用。
【請求項９】
腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体の効力を、対象において増強するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスのダイナミン依存性の阻害剤の有効量の使用であって、該医薬が、対象において抗体の効力を増強するのに有効な量で該阻害剤を対象に投与するために製剤化されている、使用。
【請求項１０】
抗体感受性サブタイプまたは抗体抵抗性サブタイプから選択されるサブタイプに腫瘍を分類する方法によって、腫瘍が分類されている、請求項５〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
腫瘍を分類する方法が、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を分析する段階を含み、ここで、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態から、腫瘍が抗体感受性サブタイプであることが示され、かつここで、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の状態から、腫瘍が抗体抵抗性サブタイプであることが示される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
細胞表面抗原のリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90%が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の90%未満が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
医薬が、抗体抵抗性サブタイプに分類されている腫瘍を有する対象に、阻害剤および抗体を同時投与するために製剤化されている、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍が、細胞表面抗原陽性の腫瘍である、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
腫瘍が、前がん性、非転移性、転移性、およびがん性の腫瘍から選択される、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
腫瘍が、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病、およびリンパ性悪性疾患から選択されるがんに関連している、請求項１５または請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
がんが、肺がん、肝細胞がん、胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんから選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
腫瘍が上皮由来のものである、請求項５〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
がんが肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および皮膚がんから選択される、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
がんが扁平上皮がん(SCC)である、請求項１８〜20のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
抗体に対する応答者および抗体に対する非応答者から選択される処置亜群に対象を層別化する方法によって、対象が層別化されている、請求項１０〜21のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
対象を層別化する方法が、
請求項１０〜21のいずれか一項に特定される、腫瘍を分類する方法にしたがって、対象の腫瘍を分類する段階、および
対象の腫瘍が、損なわれたもしくは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する応答者と特定する段階、または対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する非応答者と特定する段階
を含む、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
医薬が、抗体に対する非応答者として層別化されている対象に、阻害剤および抗体を同時投与するために製剤化されている、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
腫瘍を分類する方法、および／または対象を層別化する方法が、対象から得た腫瘍サンプルによって実施される、請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
対象が、補助的がん療法を施行されている、請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
補助的療法が、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、および抗体以外の免疫療法から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
腫瘍を分類する方法、および／または対象を層別化する方法の全部または一部が処理システムによって行われる、請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年10月26日付で出願された「Agents for Cancer Therapy or Prophylaxis and Uses Therefor」という名称のオーストラリア仮出願第2012904722号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は広くは、がんを処置または予防するための薬剤に関する。より詳細には、本発明は、がん関連受容体陽性のがんを含むがんを処置するための、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤およびダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤を含む、エンドサイトーシス阻害剤の使用に関する。具体的な態様において、エンドサイトーシス阻害剤は、がんに対する免疫応答を増強するために免疫療法剤と組み合わせて用いられる。
【０００３】
本明細書において数字により言及されている各種引用の書誌的詳細が説明の終わりに記載されている。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
抗体療法は、自己免疫疾患およびがんを含むいくつかの疾患に対処するのに有望な治療戦略として幅広い支持を得てきた。抗体単独療法および併用処置を開発するうえでの急速かつ素晴らしい進展にもかかわらず、そのような病気に起因する疾患の負担は、あまり緩和されていない。そのような疾患に関連した正常なおよび病的な免疫学的プロセスの複雑性は、抗体処置に対する抵抗性または獲得抵抗性と相まって、良好な患者転帰の進展に対する障害の一部であり続けている。
【０００５】
例えば、EGFRに特異的な抗体は、現在、いくつかの悪性腫瘍向けに臨床で使用されている。その炎症促進性の副作用にもかかわらず、単独療法または放射線療法もしくは化学療法との組み合わせのいずれかで、抗EGFR抗体により処置された一部の患者では有望な結果が示されている(1)。しかしながら、かなりの割合の処置患者が、まだ十分に解明されていない理由で応答できないでいる。Nature Medicine (2)にある素晴らしい新しい研究によって、患者のなかには、セツキシマブの結合を妨げるが、パニツムマブの結合を妨げないEGFRの変異を保有しているものもおり、かくして、さらなる割合の患者がスクリーニングされ、適切な抗EGFR抗体で処置されうることが示されている。しかしながら、これによって、観察されたほとんどの患者抵抗性は回避されない。顕著な抵抗性の機構を究明するために、多数の研究が行われている。EGFRの発現は、増幅、遺伝子発現の獲得、およびEGFR活性化変異率の増大を含む、いくつかの異なる機構により扁平上皮がんおよび他の上皮腫瘍において増大している。
【０００６】
EGFRの数または機能の特定の変化は処置応答に影響を与えるものと予測されていたが、臨床試験において相関は認められていない(3〜7)。EGFR標的療法に抵抗性の患者のおよそ10%において、腫瘍におけるKRASのようなEGFRの下流のシグナル伝達構成要素における特異的な活性化変異が存在している。セツキシマブに対して応答のないことと、KRAS状態との間に有意な関連性がある(8〜10)。BRAFの点突然変異V600Eは、細胞において最も一般的な発がん性変異の1つであり、転移性結腸直腸がんを有する患者の遡及的分析(11)から、BRAF変異腫瘍がセツキシマブまたはパニツムマブに応答しないことが示された。KRASおよびBRAF変異状態の分析は、現在、抗EGFR抗体の使用の前には当たり前になっており、応答する可能性が低い患者を選び出して、抗VEGF療法のような代替処置を提供することを可能にしている。しかしながら、これらの変異は抵抗性患者の10%に関与するにすぎない。EGFR阻害剤による処置に応答する患者を予測するために、応答性に対する抵抗性患者由来の患者腫瘍プロテオームの質量分析プロファイリング(3)も使われているが、現在のところ、そのアルゴリズムは患者分析で用いるのに十分に強力というわけではない。腫瘍抵抗性をEGFRファミリーの遺伝子における特異的な変異と関連付ける試みでは、現在、多くの遺伝子の同時プロファイリングを伴い、これには時間と費用がかかる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一つには、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性EGFR内部移行(本明細書において「調節不全EGFR」または「調節不全EGFR状態」ともいわれる)を有するEGFR陽性腫瘍が抗EGFR抗体療法(例えば、セツキシマブ、パニツムマブなど)に感受性であるのに対し、損なわれていないリガンド誘導性EGFR内部移行(本明細書において「損なわれていないEGFR」または「損なわれていないEGFR状態」ともいわれる)を有するEGFR陽性腫瘍が抗EGFR抗体療法に抵抗性または不応性であるという判定に基づいている。本発明者らは、調節不全EGFRを持つ腫瘍を有する患者が、損なわれていないEGFRを持つ腫瘍を有する患者と比べて、抗EGFR抗体療法に応じていっそう良好な臨床転帰を示すことも見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、例えば、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を用いて腫瘍におけるリガンド誘導性EGFR内部移行を阻害することで、抗EGFR抗体に対して増強された感受性が得られるという仮説を立てた。驚いたことに、改善された感受性に加えて、本発明者らは、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害が腫瘍に対する、増強された抗体依存性細胞毒性(ADCC)応答を含めて、増強された免疫応答をもたらすことを見出した。本発明者らは、細胞内区画への、EGFRのような腫瘍細胞表面抗原の損なわれた輸送が、腫瘍細胞の表面上にいっそう多くの腫瘍抗原を生じ、これが今度は、表面抗原に対するいっそう多くの抗体と結合し、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強することを広く提唱する。
【０００８】
したがって、本発明は、抗体療法とともに、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を同時投与することによって抗体療法に対する腫瘍抵抗性の問題に対処する。これは、がんの管理のための現行の技術に比べて重要な進歩を意味する。
【０００９】
したがって、1つの局面において、本発明は、対象において腫瘍に対する増強された免疫応答(例えば、増強された抗体依存性細胞毒性応答)を刺激するための組成物を提供する。これらの組成物は概して、受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体(本明細書において「治療用抗体」ともいわれる)、および受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。いくつかの態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤はクラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤であり、その説明に役立つ実例としては、メチル-B-シクロデキストリン、フェノチアジン、モノダンシルカダベリン、クロロキン、モネンシンおよびダイナミン阻害剤が挙げられる。いくつかの態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤はダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤であり、その説明に役立つ実例としては、ダイナミンGTPase阻害剤およびダイナミン環安定剤が挙げられる。適当には、細胞表面抗原は腫瘍関連抗原(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her2/neu、CD20などのような受容体)である。受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤および抗体は、各々が薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む1つまたは複数の組成物の形態で適当に投与される。組成物は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強するのに有効である期間にわたっておよび量で、注射により、局所適用によりもしくは持続放出性の投与方法を含む経口経路により、またはそれらの組み合わせにより投与されうる。いくつかの態様において、増強された免疫応答は、腫瘍細胞の表面上のMHCクラスIIおよびクラスIの発現を刺激することまたは増強することを含む。
【００１０】
本発明の別の局面は、対象において腫瘍に対する免疫応答(例えば、増強された抗体依存性細胞毒性応答)を増強するための方法を提供する。これらの方法は広くは、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)の有効量と、受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体の有効量とを対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる。関連する局面において、本発明は、対象においてがんを処置または予防するための方法であって、広くは、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と、がんに関連する腫瘍細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体とを、該阻害剤および該抗原が、がんの処置または予防に有効な量で、対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる該方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の局面は、対象において、腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体の効力を増強するための方法を提供する。これらの方法は広くは、抗体の効力を増強するのに有効な量で、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)を対象に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる。
【００１２】
いくつかの態様において、上記で広く述べられた方法は、腫瘍を、抗体感受性サブタイプまたは抗体抵抗性サブタイプから選択されるサブタイプに分類する段階、および腫瘍が抗体抵抗性サブタイプに分類されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階をさらに含む。この種の説明に役立つ実例では、分類は、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を分析する段階を含む方法により行われ、ここで、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態から、腫瘍が抗体感受性サブタイプであることが示され、かつここで、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の状態から、腫瘍が抗体抵抗性サブタイプであることが示される。いくつかの態様において、細胞表面抗原のリガンドの存在下において、適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90% (例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)が細胞の原形質膜(例えば、側底膜)に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示される。いくつかの態様において、細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において、適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の100%未満(例えば、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%またはさらにそれ未満)が細胞の原形質膜(例えば、側底膜)に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示される。
【００１３】
腫瘍は一般に、細胞表面陽性の腫瘍であり、前がん性、非転移性、転移性、およびがん性の腫瘍(例えば、早期がん)を含む。代表的ながんは、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病、およびリンパ性悪性疾患から選択される。いくつかの態様において、がんは、肺がん、肝細胞がん、胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんから選択される。具体的な態様において、腫瘍は上皮由来のものであり、その非限定的な例としては、肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および皮膚がん(例えば、扁平上皮がん(SCC))が挙げられる。
【００１４】
関連する局面において、上記で広く述べられた方法は、対象を、抗体に対する応答者および抗体に対する非応答者から選択される処置亜群に層別化する段階、および対象が非応答者として層別化されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階を任意でさらに含んでもよい。この種の説明に役立つ実例では、層別化は、上記で広く述べられた腫瘍分類方法にしたがって腫瘍を分類する段階、および対象の腫瘍が、損なわれたもしくは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する応答者と特定する段階、または対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する非応答者と特定する段階を含む方法により行われる。いくつかの態様において、本方法は、分析のために対象から腫瘍サンプルを得る段階をさらに含む。
【００１５】
処置亜群への対象の層別化のための上記の方法は、必要ではない。したがって、本発明は、対象が応答者もしくは非応答者であるか、応答者もしくは非応答者であることが分かっているか、または応答者もしくは非応答者であることが疑われるかどうかにかかわらず、治療用抗体および受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を対象に同時投与することをさらに企図する。というのは、阻害剤の投与は対象における抗体応答者の状態の進展を刺激するか、対象における抗体応答者の状態を増強するか、または別の方法で維持するからである。
【００１６】
いくつかの態様において、本方法は、対象に補助的がん療法を同時施行する段階をさらに含む。いくつかの態様において、補助的療法は、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および抗体以外の免疫療法から選択される。
【００１７】
本発明のさらに別の局面は、任意で、対象において腫瘍に対する免疫応答(例えば、増強された抗体依存性細胞毒性応答)を増強するためのまたは対象においてがんを処置もしくは予防するための医薬の製造における、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)および受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体の使用を提供する。
【００１８】
本発明は同様に、任意の適当なスクリーニング方法によって特定された受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤の使用にまで及ぶ。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、(1) (i) ダイナミンポリペプチドの少なくとも生物学的に活性な断片に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド; または(ii) ダイナミン遺伝子もしくはその部分の転写産物が産生可能であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または(iii) レポーター遺伝子に機能的に連結されているダイナミン遺伝子の発現を調節する遺伝子配列の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドを含む調製物を、試験薬剤と接触させる段階; および(2) 試験薬剤の非存在下での基準レベルまたは機能活性と比べて、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはレポーター遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の変化を検出する段階を含む。試験薬剤の非存在下での正常もしくは基準レベルおよび/または機能活性と比べて、ポリペプチド、転写産物もしくは転写産物部分またはレポーター遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性における検出された低減から、該薬剤がダイナミン阻害剤であることが示唆される。この種の説明に役立つ実例では、これは、試験薬剤が、任意で細胞表面受容体に対する抗体との組み合わせで、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her/neu2、CD20など)を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するかどうか分析または判定することにより確認される。
【００１９】
いくつかの態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、ダイナミン環安定化をアッセイする方法により特定される。これらの方法は、ダイナミン環の形成に適した条件の下で、ダイナミンポリペプチドとともに試験薬剤をインキュベートする段階; ならびに試験薬剤がダイナミン環の蓄積を促進するかどうか、および/またはダイナミン環の分解を阻害するかどうか、基礎ダイナミンGTPase活性を高めるダイナミン環の蓄積および/またはダイナミン環の分解の阻害について評価する段階を含みうる。試験薬剤がダイナミン環の蓄積を促進するかどうか、またはダイナミン環の分解を阻害するかどうかの評価は、基礎ダイナミンGTPase活性の増加、および/またはダイナミン環分解を示すダイナミンの放出についてアッセイする段階を含むことができる。
【００２０】
本発明のさらに別の局面は、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her/neu2、CD20など)を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するための薬剤を産生する方法を提供する。これらの方法は広くは、上記でおよび本明細書の他の箇所で広く記述されている受容体を介したエンドサイトーシスを阻害することが疑われる薬剤を試験する段階; ならびに阻害について検査で陽性と出たことに基づいて該薬剤を合成する段階を含む。適当には、本方法は、薬剤を誘導体化する段階、ならびに誘導体化された薬剤を薬学的に許容される担体および/または希釈剤とともに任意で処方して、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するための薬剤の効力を改善する段階をさらに含む。
[本発明1001]
受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体、および受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物。
[本発明1002]
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤である、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、メチル-B-シクロデキストリン、フェノチアジン、モノダンシルカダベリン、クロロキン、モネンシン、およびダイナミン阻害剤から選択される、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤である、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤が、ダイナミンGTPase阻害剤およびダイナミン環安定剤から選択される、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
細胞表面抗原が腫瘍関連抗原である、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
腫瘍関連抗原がEGFRおよびHer2/neuから選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
対象において腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法であって、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤の有効量と、受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原に結合する抗体の有効量とを対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1009]
増強された免疫応答が、増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
増強された免疫応答が、腫瘍細胞の表面上のMHCクラスIIの発現を刺激することまたは増強することを含む、本発明1008または本発明1009の方法。
[本発明1011]
対象においてがんを処置または予防するための方法であって、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と、がんに関連する腫瘍細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体とを、がんの処置または予防に有効な量で、対象に同時に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1012]
腫瘍の細胞表面抗原であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される該抗原に結合する抗体の効力を対象において増強するための方法であって、抗体の効力を増強するのに有効な量で受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を対象に投与する段階を含むか、その段階からなるか、またはその段階から本質的になる、該方法。
[本発明1013]
腫瘍を、抗体感受性サブタイプまたは抗体抵抗性サブタイプから選択されるサブタイプに分類する段階、および腫瘍が抗体抵抗性サブタイプに分類されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階をさらに含む、本発明1008〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
分類が、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を分析する段階を含む方法によって行われ、ここで、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態から、腫瘍が抗体感受性サブタイプであることが示され、かつここで、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の状態から、腫瘍が抗体抵抗性サブタイプであることが示される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
細胞表面抗原のリガンドの存在下において、少なくとも10分後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90%が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、本発明1014の方法。
[本発明1016]
細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において、少なくとも10分後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の90%未満が、細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を示す、本発明1014の方法。
[本発明1017]
腫瘍が、細胞表面抗原陽性の腫瘍である、本発明1008〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
腫瘍が、前がん性、非転移性、転移性、およびがん性の腫瘍から選択される、本発明1008〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
腫瘍が、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病、およびリンパ性悪性疾患から選択されるがんに関連している、本発明1017または本発明1018の方法。
[本発明1020]
がんが、肺がん、肝細胞がん、胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんおよび子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんから選択される、本発明1019の方法。具体的な態様において、腫瘍は上皮由来のものであり、その非限定的な例としては、肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および皮膚がんが挙げられる。
[本発明1021]
がんが扁平上皮がん(SCC)である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
対象を、抗体に対する応答者および抗体に対する非応答者から選択される処置亜群に層別化する段階、および対象が非応答者として層別化されていることに基づいて、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤と抗体とを同時投与する段階をさらに含む、本発明1013〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
層別化が、
本発明1013〜1021のいずれかの腫瘍分類方法にしたがって腫瘍を分類する段階、および
対象の腫瘍が、損なわれたもしくは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する応答者と特定する段階、または対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると分析される場合、対象を抗体に対する非応答者と特定する段階
を含む方法によって行われる、本発明1022の方法。
[本発明1024]
分析のために対象から腫瘍サンプルを得る段階をさらに含む、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
対象に補助的がん療法を施行する段階をさらに含む、本発明1013〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
補助的療法が、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、および抗体以外の免疫療法から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
本発明1013〜1023のいずれかの方法で用いるための試薬を含むキット。
[本発明1028]
試薬が、細胞表面抗原のリガンドである、本発明1027のキット。
[本発明1029]
試薬が、細胞表面抗原に結合する抗体である、本発明1027のキット。
[本発明1030]
方法の全部または一部が処理システムによって行われる、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】EGF添加前後のEGFRのAlexa-fluor標識によって、細胞株での受容体のエンドサイトーシスを示す写真表示である。
【図１Ｂ】代表的な皮膚腫瘍サンプルでのEGF取り込みに対する調節不全を示す写真およびグラフ表示である。パネルAおよびBはDAPI染色された核を示し、パネルCおよびDは緑色発光チャネルでのEGF-Alexa488を示し、パネルEおよびFは重ね合わせた画像を示す。パネルCはサンプル1での内部移行したEGFを示すのに対し、パネルDはサンプル2での内部非移行性の、原形質膜に局在化したEGFを示す。パネルGは、サンプル1 (画像1)およびサンプル2 (画像2)について示された30分刺激時点の、内部移行型と比較した原形質膜結合型のEGFの定量化を示す。
【図２】H&Eおよび共焦点顕微鏡検査によって示された浸潤性SCCを描く写真表示である。表皮が肥厚し、異形成している。DAPIで染色された核が示されたRCM画像において、核の組織崩壊および浸潤をはっきりと見ることができる。真皮内に高密度な炎症性浸潤が認められる。この場合にはいずれの画像でも角質層がほとんど可視化されていない。
【図３】正常皮膚サンプルパネル、RCM 63×を示す写真表示である。核はDAPIで染色されている。角質細胞エンベロープは赤色発光スペクトルにおいて強力に自己蛍光を発する。パネルAはDAPI染色を示し、パネルBは赤色発光チャネルを示し、パネルCは2つのチャネルの重ね合わせ画像を示す。核は異形成サンプルと比べて希薄であり、広い間隔である。表皮は薄く、通常の角質化した薄層が存在している。境界の明瞭な基底層が存在し、目に見える浸潤または炎症性浸潤はない。
【図４】SCCおよび正常皮膚における核定量化を示す写真およびグラフ表示である。平均断面積およびアスペクト比の評価はまた、正常および異形成ケラチン生成細胞の核間で予想された差異を実証する。より大きなアスペクト比は、完全な円から離れた偏差を示す。上段パネルはSCC核、定量化のために選んだ拡大域および定量化のために画像化ソフトウェアが選定した領域を示す。中段パネルは対照の「正常」皮膚サンプルについても同じことを示す。左グラフは2つのサンプルの核領域の定量化を示し、右グラフは核アスペクト比の定量化を示す。
【図５】正常皮膚対照を含む病変3例からの核形態計測データの例を示すグラフ表示である。各病変に対する核断面積は、その適合対照皮膚サンプルとはかなり違っていた(P<0.05)。ここで、正常皮膚は全3つの対照サンプルからのデータの平均として示されている。病変は、浸潤性の増加とともに核領域の予測された増大を示すが、これは有意ではなかった。
【図６】正常なリガンド誘導性の受容体を介したEGFエンドサイトーシスを実証する腫瘍の例を示す写真表示である。A. DCB177033は老人男性の背部由来の高分化型SCCである。腫瘍は深部真皮にまで及んでいた。腫瘍切片と、隣接する非病変部皮膚との間の核密度および組織崩壊の差異は明らかである。少量の特異的なEGF-488結合が15分の時点で認められる。正常なリガンド誘導性のEGF内部移行が30分の時点で認められる。セツキシマブはEGFの取り込みを妨げる。30分の時点でさえも対照皮膚におけるEGF-488の取り込みが最小限であることが認められる。B. DCV299052は女性の前腕由来のIECである。病変の隣接部由来の対照皮膚は、著しいバラツキを示した。領域のなかには肉眼的外観が正常に思われるものもあり、これらはわずかなEGF-488取り込みまたはEGFR陽性を実証した。C. 正常皮膚の他の切片は核外観が非定型であって、増大されたEGFR陽性およびEGF取り込みを実証した。正常皮膚は腫瘍のすぐ近隣から採取され、裸眼のみで非病変部であると判定されたので、腫瘍組織がこれらの対照サンプルにおいても見出される可能性がある。これはまた、いっそう多くの曝露を受けた身体部位で認められる重篤な光損傷を反映しうる。この場合もやはり、組織がセツキシマブで最初に処理されないかぎり、30分まで正常なEGF-488内部移行が認められる。
【図７】「調節不全」と名付けられた、リガンド誘導性のEGFRエンドサイトーシスの喪失を実証する腫瘍の例を示す写真表示である。EGF-Alexa488は、30分の時点で原形質膜の位置に局在化したままである。DCM2710056は60歳男性の前腕由来のSCCであり、DCB238043は80歳女性の頸部由来のSCCである。対照の正常皮膚サンプルにおいて有意なEGFは認められない。
【図８】表皮全体のEGFR発現を示す写真表示である。表皮におけるEGFR発現は、左側のオリジナル画像中に赤色で示されている。発現は核なしにグレイスケールでさらに明確に見ることができる。最後の画像ではEGFR強度を閾値処理し、表皮の上限レベルにおける染色を除外した。それでもなお、強力な発現をいくつかの領域での表皮基底層において見ることができる。角質層は赤色チャネルにおいて明るい自己蛍光を示すが、EGFRを発現していない。
【図９】腫瘍の前縁および基底層における主要な取り込みを示す写真および図の表示である。さまざまなサブタイプパターンが認められた。極性化されていないものもあれば、細胞の基底極への取り込みの強い極性化を示すものもある。EGFRシグナル伝達は、転移および細胞質分裂移動に関与することが知られており、これは有意な所見でありうる。
【図１０】上皮病変の輸送状態を示す写真表示である: 円グラフ。捕捉は、EGFRがもはやリガンド誘導性のエンドサイトーシスを受けておらず、原形質膜に局在化したままである腫瘍を示している。内部移行は、EGFRがリガンド誘導性の受容体を介したエンドサイトーシスを受け、15分または30分の時点でEGFRがエンドソームに局在化している腫瘍を示す。
【図１１】輸送状態および病変タイプによる腫瘍データセットを示すグラフ表示である。調節不全IECは特定されなかった。
【図１２】輸送状態および腫瘍悪性度の頻度を示すグラフ表示である。非浸潤性の前駆病変は病理学的悪性度を割り当てられておらず、したがって該当なし(NA)である。全ての低分化型サンプルの輸送状態を特定することができたが、その他全ての群においては少なくとも1つの病変が、可視化されずという範疇に入った。
【図１３】輸送状態および腫瘍タイプを浸潤の深さによって示すグラフ表示である。
【図１４】輸送状態および多因子リスク層別化との相関を示すグラフ表示である。
【図１５】以下を示すグラフ表示である: A サンプル集団における既往SCC数のプロット。ピークは、ゼロおよび5つ、の位置に認められ、3つの亜群をもたらしている。B. SCC既往歴の亜群と比べた輸送状態。調節不全腫瘍は、既往SCCのない患者では認められなかった。調節不全は、5つまたはそれより多い既往SCCを有する患者において最も多く見られた。EGFR内部移行性の腫瘍は、頻度群全体にわたり安定した頻度で生じていた。高リスク腫瘍を別に考慮する場合、これらは内部移行性の事例の3分の1超の病歴において認められたが、調節不全腫瘍を有する患者はこの範疇に入らなかった。
【図１６】腫瘍切片の免疫蛍光の定量化によって全EGFRの発現を示すグラフ表示である。類似の組織病理学的な腫瘍特徴を有する内部移行性および調節不全の腫瘍の適合対において表皮基底層を分析した。全EGFR発現レベルは、腫瘍の浸潤性または悪性度の増加とともに増加しなかった。輸送状態とEGFR全発現レベルとの間に相関は認められなかった。
【図１７】SCC細胞単層における15分の刺激後のEGF-Alexa488の分布がSCC由来マウス異種移植片に匹敵することを示す写真表示である。(A, B) 15分間EGF-Alexa488でともに刺激されたCa127細胞株およびCa127に由来する異種移植片の画像。核は青色で示され、EGF-Alexa488は緑色で示されている。(A.1, B.1) それぞれ、画像AおよびBに対応するボックスで示された、選択細胞のEGF-Alexa488のさらに高倍率像。(C, D) 15分間EGF-Alexa488でともに刺激されたDetroit細胞株およびDetroit細胞に由来する異種移植片の画像。(C.1, BA) それぞれ、画像CおよびDに対応する挿入図で示された、選択細胞のEGF-Alexa488のさらに高倍率像。(E, F) 15分間EGF-Alexa488でともに刺激されたKJD細胞株およびKJD細胞に由来する異種移植片の画像。(E.1, F.1) それぞれ、画像EおよびFに対応する挿入図で示された、選択細胞のEGF-Alexa488のさらに高倍率像。(細胞株: n=3; 異種移植片: n=2、代表的な画像を示した)。(スケールバー、20μm)。
【図１８】EGF-Alexa488の内部移行が患者SCC間で異なることを示す写真表示である。(A) 15分および30分の刺激後の患者SCCにおけるEGF-Alexa488分布。挿入図は、さらに小さなボックスで示した領域のさらに高倍率である。エンドソーム構造へのEGFの取り込みが認められ、この表現型が患者のおよそ40%において認められる(表1参照)。(B) 15分および30分の刺激後の患者SCCにおけるEGF-Alexa488分布。挿入図は、さらに小さなボックスで示した領域のさらに高倍率像である。EGFの原形質膜結合が認められるが、内部移行はほとんどない。これは患者のおよそ60%を代表する(表1参照)。対応する正常患者上皮組織におけるEGF-Alexa488分布が30分の時点で示されている。(C) EGF添加の前にセツキシマブで前処理することで、EGF結合が阻害される。固定化後に抗ヒトAlexa 594二次抗体を用いてセツキシマブを標識した。重ね合わせた画像において、セツキシマブは赤色で、EGFは緑色で、および核は青色で示されている。(D) 重ね合わせた画像において示されたEGFR (赤色)の固定化後の標識は、EGFリガンド(緑色)と共局在化している。(スケールバー、20μm)。
【図１９】H&E染色によって特定された患者SCCサンプル内の異形成細胞が、EGFRを過剰発現することを示す写真表示である。(A, B) 倍率4×で撮影された患者腫瘍由来の4μmの切片のH&E染色(スケールバー、200μm)。(C, D) それぞれパネルAおよびBにおいて白色のボックスで示された領域の倍率25×の画像。(E, F) EGFR (緑色)で蛍光標識され、DAPI (青色)染色されたCおよびDの連続切片(スケール、50μm)。
【図２０】SCC細胞株におけるEGF内部移行の速度が可変であり、初期取り込みの調節不全を示すことを示すグラフ表示および写真表示である。(A) ビオチン-EGFの取り込みを、表示した時点についてSCC細胞株において行った。エンドサイトーシスを、15分の時点でアビジンの接近不可能性として全体に対する割合として測定した。アッセイ法は、材料および方法に記述されているように行われた。示したデータは、3回の実験の平均 +/- SEMである。(B) SCC細胞株におけるEGFR発現のレベルは、HEK細胞と比べて増加している。等しいタンパク質濃度のSCCおよびHEK細胞溶解物を、EGFRレベルに関するELISAアッセイ法に供した(材料および方法)。示したデータは、対応のないT検定による3回の実験の平均 +/- SEMである。＊＊＊: P<0.001; ＊＊: P<0.01; ＊: P<0.05。ns: 有意差なし。(CおよびD) EGF内部移行の5分(C)および15分(D)の時点の、内部移行EGF (y軸)とEGFR発現レベル(x軸)の相関グラフ。(EおよびF) EGF-Alexa488 (E)またはTfn-Alexa594の取り込みは、材料および方法に記述されているようにSCC細胞株において行われた。カバースリップを固定し、15分の時点で共焦点顕微鏡検査によって画像化した。
【図２１】SCC細胞株がEGFRおよび下流経路のシグナル伝達標的のさまざまなレベルの活性化を示すことを例証する写真表示である。(A) SCC細胞溶解物のウエスタン分析。1ウェルあたり、表示した細胞溶解物10μgを負荷した。EGFR発現のレベルがチューブリン負荷対照とともに示されている。(B) EGFRリン酸化、全AKTに対するAKTリン酸化および全ERKに対するERKリン酸化のレベルのウエスタン分析。細胞を無血清培地中で4時間のインキュベーションによって基底化(basalled)するかまたは基底化(basalled)し、その後、低濃度のEGF (1 ng/mL)で15分間刺激し、次に冷PBS中で洗浄した。細胞溶解物を方法に記述されているように調製し、SDS-PAGEおよびウエスタン分析に供した。全時間的経過の刺激を完了し、分析した。
【図２２】EGFリガンドで刺激された患者サンプルにおけるエンドサイトーシスの差異を可視化するためのマーカーとしてEGFR染色を使用できることを示す写真表示である。固定化およびEGFR標識の前に、サンプルDP5およびEG7を30分間EGFリガンドで刺激した。EGFRの固定化後の標識が示されている。挿入図は、さらに小さなボックスで示された領域のさらに高倍率である。(スケールバー、20μm)。
【図２３】阻害されたEGFRエンドサイトーシスとMHCクラスIおよびクラスII状態との間の相関の実例パネルを示す写真表示である。(A) ダイナミン阻害剤を用いたEGFR輸送の操作を示す免疫蛍光。A431細胞を3時間血清飢餓にし、その後、異なる濃度のDynasore(0、60および100μM)で0.5および24時間処理した。15分のEGF-Alexa488 (100 ng/mL)の取り込みを行って、(緑色の)リガンド結合EGFRの輸送をモニタリングした。核は青色で示されている。(B) EGFR輸送の変化によって引き起こされたMHCクラスIおよびクラスII分布の変化を示す免疫蛍光。A431細胞を異なる濃度のDynasore(0、60および100μM)で0.5時間処理し、その後に固定化および透過処理を行った。MHCクラスIおよびクラスIIをその後、それぞれ一次抗体PE-HLA-ABCおよびPE-HLA-DRで標識し、その後に二次抗体標識(Alexa594)を行った。MHC IおよびIIは赤色で示されており、その一方で核は青色で示されている。
【図２４】セツキシマブは明らかな増殖阻害効果を示さなかったが、A431細胞に対する抗体依存性細胞毒性(ADCC)を誘発したことを示すグラフ表示である。(A) 増殖阻害アッセイ法の場合、A431細胞(1ウェルあたりの数=1000、2500および5000個)をさまざまな濃度のセツキシマブ(0、3、10、30、60および100μg/mL)とともに48時間インキュベートした。MTSアッセイ法を行って、490 nmでの吸光度を測定した。細胞生存性は、処理されていない生存細胞に対する割合として提示されている。(B-I, II) ADCCアッセイ法の場合、A431細胞(1ウェルあたりの数=5000個)を48時間、60μg/mLのセツキシマブの存在下において50/1および100/1の異なるE/T比で新鮮PBMCとともにインキュベートした。(B-I) MTSアッセイ法を行って、490 nmでの吸光度を測定した。(B-II) 標的細胞の生存性は、処理されていない生存細胞に対する割合として提示され、下記式:非処理細胞の割合(%) = (実験OD - PBMC OD) / (A431 最大OD - 中間OD)×100%にしたがって計算されている。
【図２５】ダイナミン阻害剤であるDyngo4aがエフェクタ細胞の生存性の低減を引き起こさずにセツキシマブ媒介性のADCC効果を増強することを示すグラフ表示である。(AI〜III) セツキシマブ媒介性のADCCに及ぼすDyngo4aの効果を試験するため、A431細胞2500個を新鮮PBMC (E/T=100/1)および60μg/mLのセツキシマブとともに24時間インキュベートした。Dyngo4a (0および30μM)をインキュベーションの終わりに加えた。細胞死対照のためPBMCとの24時間のインキュベーション後にA431細胞に10% Tritonを加えた。MTSアッセイ法によってADCCの効果を測定した。490 nmでのOD値として細胞生存性を提示した。バックグラウンドから放出されたOD値の平均をエフェクタ細胞対照(A-II)および標的/エフェクタ試験(A-III)から差し引いた。(A-II) Dyngo4aの添加はエフェクタ細胞の生存性の低減を引き起こさなかった。(C-III) Dyngo4aの添加はセツキシマブ媒介性のADCCを増強する。
【図２６】A431およびKJD細胞株における、EGFR全発現レベルおよびEGFRエンドサイトーシスの速度を示すグラフ表示および写真表示である。(A) SCC細胞株におけるEGF内部移行の速度は可変であり、初期取り込みの調節不全を示す。(パネルA) ビオチン-EGFの取り込みを、表示した時点についてSCC細胞株において行った。エンドサイトーシスを15分の時点でアビジンの接近不可能性として全体に対する割合として測定した。アッセイ法は、オンラインメソッドに記述されているように行われた。示したデータは、3回の実験の平均 +/- SEMである。(B) A431およびKJDの両方のSCC細胞株におけるEGFR発現のレベルは、HEK細胞と比べて増している。等しいタンパク質濃度のSCCおよびHEK細胞溶解物を、EGFRレベルに関するELISAアッセイ法に供した(オンラインメソッド)。示したデータは、対応のないT検定による3回の実験の平均 +/- SEMである。(C) A431およびKJD細胞を固定化の前に60μg/mLのセツキシマブ抗EGFRモノクローナル抗体とともに4時間37℃でインキュベートし、固定化の後に抗ヒト-CF647で標識した。表面に結合したセツキシマブは依然として、A431細胞において明確に視認できるが、原形質膜に曝露されたセツキシマブはKJD細胞において低減されている。
【図２７】ダイナミン阻害剤によるEGFR輸送の操作がセツキシマブ感受性の細胞においてADCCの増大をもたらすことを示す、多変量FACS分析の写真表示およびグラフ表示である。(A) A431細胞におけるセツキシマブ輸送状態の免疫蛍光画像化。(B) A431細胞を0.5 nM CFSEで標識し、その後、表示した条件の下で新鮮PBMC (E/T=50/1)とともにインキュベートした: 4時間セツキシマブ(60 μg/mL)処理; Dyngo4a (30μM)の添加、その後に4時間セツキシマブ(60μg/mL)との同時インキュベーション; Dyngo4a (30μM)の添加、その後に4時間セツキシマブ(60μg/mL)との同時インキュベーションおよび最後の2時間2回目のDyngo4a (30μM)処理; 3時間セツキシマブ(60μg/mL)処理、その後に1時間の同時インキュベーションの間にDyngo4a (30μM)の添加。7-AADを4時間のアッセイ法の終わりに添加して、FACS分析の前に死細胞を標識した。特異的な標的細胞死の評価のために用いたゲーティング戦略が示されている。FITCはCFSEを示し、その一方でPerCP-Cy5.5は7-AADを示す。死滅した標的細胞は右上象限において、CFSE着色および7-AAD陽性であるように思われる。(C.1) 異なる条件下でのA431細胞死。(C.2) 特異的なA431細胞死の割合を計算した。示したデータは、ボンフェローニ事後検定とともに二元配置ANOVAによる3回の実験の平均 +/- SEMである。＊＊＊＊: P≦0.0001; ＊＊＊: P≦0.001; ＊＊: P≦0.01; ＊: P≦0.05。ns: 有意差なし。
【図２８】ダイナミン阻害剤によるEGFR輸送の操作がセツキシマブ非感受性の細胞においてADCCの改善をもたらすことを示す多変量FACS分析の写真表示およびグラフ表示である。(A) KJD細胞におけるセツキシマブ輸送状態の免疫蛍光画像化。(B) KJD細胞を0.5 nM CFSEで標識し、その後、表示した条件の下で新鮮PBMC (E/T=50/1)とともにインキュベートした: 4時間セツキシマブ(60μg/mL)処理; Dyngo4a (30μM)の添加、その後に4時間セツキシマブ(60μg/mL)との同時インキュベーション; Dyngo4a (30μM)の添加、その後に4時間セツキシマブ(60μg/mL)との同時インキュベーションおよび最後の2時間2回目のDyngo4a (30μM)処理; 3時間セツキシマブ(60μg/mL)処理、その後に1時間の同時インキュベーションの間にDyngo4a (30μM)の添加。7-AADを4時間のアッセイ法の終わりに添加して、FACS分析の前に死細胞を標識した。(B) 特異的な標的細胞死の評価のために用いたゲーティング戦略。FITCはCFSEを示し、その一方でPerCP-Cy5.5は7-AADを示す。死滅した標的細胞は右上象限において、CFSE着色および7-AAD陽性であるように思われる。(C.1) 異なる条件下でのKJD細胞死。(C.2) 特異的なKJD細胞死の割合を計算した。示したデータは、ボンフェローニ事後検定とともに二元配置ANOVAによる3回の実験の平均 +/- SEMである。＊＊＊＊: P≦0.0001; ＊＊＊: P≦0.001; ＊＊: P≦0.01; ＊: P≦0.05。ns: 有意差なし。
【図２９】Dyngo4aによるEGFRエンドサイトーシス阻害を示す写真表示である。ダイナミン阻害剤Dyngo4aは、リガンド誘導性のEGFRエンドサイトーシスに対する阻害効果を示す。免疫蛍光を行って、Dyngo4aを用いたEGFR輸送の操作について確認した。A431細胞を3時間血清飢餓にし、その後、異なる濃度の(A)Dyngo4a(0および30μM)で30分間処理した。15分のEGF-Alexa488 (100 ng/mL)の取り込みを行って、(緑色の)リガンド結合EGFRの輸送をモニタリングした。核は青色で示されている。
【図３０】ダイナミン阻害剤Dyngo4aおよびピリミジン-7によるEGFR輸送の操作がセツキシマブ感受性および非感受性の細胞においてADCCの増大をもたらすことを示す、多変量FACS分析のグラフ表示である。セツキシマブ依存性のADCCアッセイ法は、本質的には図27および28に概説されている手順にしたがって行われた。(A) 非ADCC細胞死について試験するためにPBMCの非存在下、セツキシマブとともにダイナミン阻害剤の存在下での特異的なA431細胞死の割合を示す。(B) (I) PBMCの存在下、Dyngo4a阻害剤およびセツキシマブの非存在下および存在下での特異的なA431細胞死の割合を示す。(II) PBMCの存在下、ピリミジン-7阻害剤およびセツキシマブの非存在下および存在下での特異的なA431細胞死の割合を示す。(C) ダイナミン阻害剤のみの存在下での特異的なKJD細胞死の割合を示す。(D) ダイナミン阻害剤およびセツキシマブの存在下での特異的なKJD細胞死の割合を示す。(E) MTSアッセイ法をPBMCの非存在下で行って、ADCCの非存在下での化合物の毒性について評価した。グラフEは、セツキシマブ感受性A431細胞の試験を示す。セツキシマブと組み合わせたDyngo4aは、A431細胞に対する有意な毒性を及ぼさないが、ピリミジン-7はADCCの非存在下でA431細胞の有意な死を示す。最大の細胞死の対照としてTriton X100が加えられている。(F) MTSアッセイ法をPBMCの非存在下で行って、ADCCの非存在下での化合物の毒性について評価した。グラフFは、セツキシマブ非感受性KJD細胞の試験を示す。セツキシマブと組み合わせたDyngo4aは、KJD細胞に対する有意な毒性を及ぼさないが、ピリミジン-7はADCCの非存在下でKJD細胞の有意な死を示す。最大の細胞死の対照としてTriton X100が加えられている。(G) MTSアッセイ法を行って、PBMC細胞に対するダイナミン阻害剤の毒性の可能性について評価した。このデータから、Dyngo4aはPBMC生存性に有意な毒性または影響を及ぼさないが、ピリミジン-7は毒性を示すことが明らかである。最大の細胞死の対照としてTriton X100が加えられている。
【図３１】Dyngo4aによるEGFR輸送の操作がハーセプチン感受性および非感受性細胞においてADCCの増強をもたらすことを示す多変量FACS分析のグラフ表示である。セツキシマブに関しては、A431細胞はいくらかのErbB2受容体を発現し、これは、EGFR (ErbB1)よりも低いレベルではあるが、原形質膜に発現されるので、ハーセプチン媒介性のADCCに感受性である。KJD細胞は、内部細胞区画に大部分が局在化しているErbB2を低レベル発現し、それゆえKJDはハーセプチン媒介性のADCCに非感受性である。Dyngo4aの添加によってADCCアッセイ中に原形質膜へErbB2受容体を移行させることにより、感受性A431細胞におけるADCCが改善され、また、KJDはハーセプチン媒介性のADCCに感受性となるようにされる。
【図３２】ヒト腫瘍EGFRエンドサイトーシスの超解像顕微鏡法を示す写真表示である。(A) EGFRが正常なリガンド誘導性の内部移行を受けていない(原形質膜にブロック化された)ヒトSCC、およびEGFRがリガンド誘導性の内部移行機能を保持しているヒトSCCの超解像顕微鏡法。この解像度で、2つのサンプルにおけるEGF-Alexa488の異なる分布を明確に観察することができた。核は白点線で示されている。ヒト組織中のエンドソーム構造は、組織培養細胞において認められる類似の構造と比べてかなり大きいように思われる。スケールバー: 5μm。(B) 腫瘍AC3PおよびDP5におけるクラスリンおよび内部移行EGF-Alexa488の同時局在。
【００２２】
図およびテキストのなかには色彩表現または実体を含むものもある。カラー図解は依頼によって出願人から、または適切な特許庁から利用可能である。特許庁から入手する場合、特許料が課されうる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
1. 定義
特に明記していなければ、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における記述と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を記述する。本発明の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。
【００２４】
本出願において明記されているさまざまな範囲における数値の使用は、他に明示的に示されていない限り、言及した範囲内の最小値および最大値の前に「約」という単語がともに付いているかのように、近似として言及されている。このように、言及した範囲を上回るおよび下回るわずかな変化(例えば、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%に満たないまたは等しい)を、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するように用いることができる。また、これらの範囲の開示は、最小値と最大値の間のあらゆる値を含む連続的な範囲と意図される。
【００２５】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は本明細書において、冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多いこと(すなわち、少なくとも1つ)をいうように用いられる。例として、「1つの要素」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
【００２６】
「同時に投与」または「同時に投与する」または「同時投与する」などの用語は、2つ以上の活性物質を含有する単一の組成物の投与、または個別の組成物としての各活性物質の投与、および/または有効な結果が、そのような全ての活性物質が単一の組成物として投与される場合に得られる結果と同等である、短い十分な期間内で同時期もしくは同時もしくは連続的のいずれかで個別の経路によって送達される各活性物質の投与をいう。「同時に」とは、活性薬剤が実質的に同時に投与される、望ましくは同じ製剤中で一緒に投与されることを意味する。「同時期に」とは、活性薬剤が近い時間で投与されること、例えば、1つの薬剤が、別の薬剤の投与前または後に約1分以内から約1日以内で投与されることを意味する。いかなる同時期の時間も有用である。しかしながら、同時に投与されない場合にもこのことはしばしば当てはまり、薬剤は、約1分以内から約8時間以内に投与され、適当には約1時間未満から約4時間未満で投与される。同時期に投与される場合、薬剤は適当には対象の同じ部位に投与される。「同じ部位」という用語には正確に同じ位置が含まれるが、約0.5〜約15センチメートルの範囲内、好ましくは約0.5〜約5センチメートルの範囲内でありうる。本明細書において用いられる「別々に」という用語は、薬剤がある間隔で、例えば、約1日〜数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性薬剤は、いずれの順で投与されてもよい。本明細書において用いられる「連続的に」という用語は、例えばある間隔で、または数分、数時間、数日もしくは数週間の間隔で、薬剤が順に投与されることを意味する。適切であれば、活性薬剤は定期的な繰り返しサイクルで投与されてもよい。
【００２７】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗体断片、または任意の他の抗原結合分子を、それらが所望の生物学的活性を示す限り網羅する。
【００２８】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団由来の抗体をいい、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じる可能性のある変種であって一般に少量で存在する該変種を除いて、同一でありかつ/または同じエピトープと結合する。そのようなモノクローナル抗体には、典型的には、標的(例えば、標的抗原)と結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれるが、その標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組み換えDNAクローンのプールのような、複数のクローンから唯一のクローンを選択することでありうる。当然のことながら、選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減させる、多重特異性抗体を作製するなどのために、さらに改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示のモノクローナル抗体である。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、概ね他の免疫グロブリンの混入がないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要求するものと解釈されるべきでない。例えば、本発明によって用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)中)、組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)、ファージディスプレイ法(例えば、Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; およびLee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132を参照のこと)、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術(例えば、WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551; Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann et al. (1993) Year in Immuno. 7:33; 米国特許第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,591,669号(全てGenPharmの); 米国特許第5,545,807号; WO 1997/17852; 米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; および同第5,661,016号; Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779-783; Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Morrison (1994) Nature, 368: 812-813; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-85; Neuberger (1996) Nature Biotechnology 14: 826; およびLonberg and Huszar (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93を参照のこと)を含む、種々の技法によって作製することができる。
【００２９】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、鎖の残りの部分が別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物的活性を有する限り、そのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; およびMorrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)を特に含む。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿など)に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含んだ「霊長類化」抗体、ならびに「ヒト化」抗体を含む。
【００３０】
非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてまたはドナー抗体において見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつFRの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを任意で含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照されたい。
【００３１】
「抗体断片」はインタクトな抗体の一部分を含み、適当にはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片; ダイアボディ; 線状抗体; 一本鎖抗体分子; ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００３２】
関心対象の抗原(例えば、EGFRのような腫瘍表面抗原)「と結合する」抗体とは、その抗体が、抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療薬剤として有用であるような十分な親和性で抗原と結合し、かつ、他のタンパク質とは有意には交差反応しないものである。そのような態様において、「非標的」タンパク質に対する抗体の結合の程度は、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析または放射免疫沈降法(RIA)による判定で、その特定の標的タンパク質に対する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合の約10%未満である。抗体の標的分子との結合に関して、特定のポリペプチド、または特定のポリペプチド標的上のエピトープ「との特異的結合」または「と特異的に結合する」または「に対して特異的」であるという用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度で異なる結合のことを意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を、一般に結合活性を持たない類似構造の分子である対照分子の結合と比べて判定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰量の非標識標的との競合によって判定することができる。この場合、特異的結合は、プローブに対する標識標的の結合が過剰量の非標識標的によって競合的に阻害される場合に示される。
【００３３】
「抗体依存性細胞介在性毒性」および「ADCC」は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的な細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応をいう。ADCCを媒介する主要な細胞であるNK細胞がFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcRの発現は、Ravetch and Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-92の464頁の表3にまとめられている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記述されたものなどの、インビトロADCCアッセイ法を行うことができる。そのようなアッセイ法のために有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性をインビボで、例えば、Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されたものなどの動物モデルで評価することができる。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「抗体感受性腫瘍」は、抗体が結合する細胞表面抗原を発現する、腫瘍中の細胞の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または最大100%までが、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を有する腫瘍をいう。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「抗体抵抗性腫瘍」は、抗体が結合する細胞表面抗原を発現する、腫瘍中の細胞の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または最大100%までが、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を有する腫瘍をいう。
【００３６】
本明細書において用いられる「抗原」という用語は、特異的抗体と反応性である分子を意味する。
【００３７】
「抗原結合分子」とは、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、および抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークにまで及ぶことが理解されよう。
【００３８】
本明細書において用いられる「細胞表面抗原を発現している細胞」という用語は、その表面に抗原を発現する細胞をいう。「細胞表面抗原発現」とは、細胞表面抗原をコードする遺伝子によってコードされる情報の、メッセンジャーRNA (mRNA)への、次いで細胞表面抗原ポリペプチドへの変換をいう。
【００３９】
本明細書において用いられる「細胞表面抗原陽性の腫瘍」という用語は、例えば免疫組織化学検査によって検出される、少なくとも1%、特に少なくとも2%、3%、4%または5%、特に少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の細胞表面抗原を発現している細胞を含む腫瘍をいう。具体的な態様において、細胞表面抗原陽性の細胞は、細胞表面抗原を過剰発現する。「細胞表面抗原の過剰発現」などとは、患者の特定の組織または器官由来の正常細胞における発現レベルと比べて、その組織または器官内の腫瘍由来の細胞における細胞表面抗原の異常な発現レベルを意味するように意図される。細胞表面抗原の過剰発現によって特徴付けられるがんを有する患者は、例えば上記のように、当技術分野において公知の標準的なアッセイ法により判定することができる。細胞表面抗原陽性の腫瘍によって特徴付けられるがんは、本明細書において「細胞表面抗原陽性のがん」といわれる。
【００４０】
「含む(comprise)」、「含む(comprises)」および「含む(comprising)」という単語は、本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、明記されている段階もしくは要素または段階もしくは要素の群を包含するが、任意の他の段階もしくは要素または段階もしくは要素の群を排除するものではないことを意味することが理解されよう。したがって、「含む(comprising)」などの用語の使用は、列挙されている要素が必要または必須であること、しかし他の要素が任意的であり、存在しても存在しなくてもよいことを示す。「からなる(consisting of)」とは、「からなる(consisting of)」という語句の後に続くものは何でも含むが、それに限定されないことを意味する。したがって、「からなる(consisting of)」という語句は、列挙されている要素が必要または必須であること、他の要素が存在しなくてよいことを示す。「から本質的になる(consisting essentially of)」とは、この語句の後に列挙されている任意の要素を含み、列挙されている要素に関する本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる(consisting essentially of)」という語句は、列挙されている要素が必要または必須であること、しかし他の要素が任意的であり、それらが列挙されている要素の活性または作用に影響を与えるか否かに依って存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００４１】
疾患または状態(例えば、がん)の処置または予防との関連で、「有効量」とは、疾患または状態の処置または予防に有効な、単回用量でのまたは一連もしくは徐放性のシステムの一部としての、対象への活性薬剤の量の投与を意味する。有効量は、対象の健康・身体状態および処置される個体の分類群、組成物の処方、医学的状況の評価、ならびに他の関連要因に依って変化するであろう。
【００４２】
「損なわれたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行」または「損なわれた細胞表面抗原の内部移行」という用語は、細胞表面抗原に同族リガンド(例えば、細胞表面抗原としてのEGFRの場合、同族リガンドはEGF、TGF-α、アンフィレグリン、ヘパリン結合性EGF様増殖因子、ベタセルリンおよびエピレグリンから選択されうる)が結合する場合の腫瘍由来の細胞表面抗原陽性の細胞における細胞表面抗原の低減または抑止された内部移行を、細胞表面抗原に同じリガンドが結合する場合の正常細胞表面抗原を発現している細胞における細胞表面抗原の内部移行と比べて、いう。具体的な態様において、細胞表面抗原リガンドの存在下において適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の少なくとも90% (例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)が細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合(例えば、側底膜局在化)、細胞表面抗原の損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示される。それに反して、「損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行」または「損なわれていない細胞表面抗原の内部移行」とは、細胞表面抗原に同族リガンドが結合する場合の腫瘍由来の細胞表面抗原陽性または陰性細胞における細胞表面抗原の同じ、類似のまたはより高い内部移行を、細胞表面抗原に同じリガンドが結合する場合の正常細胞表面抗原を発現している細胞における細胞表面抗原の内部移行と比べて、いう。いくつかの態様において、細胞表面抗原リガンドの存在下において適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ未満)後に、腫瘍の細胞における細胞表面抗原の90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%未満またはさらにそれ以下が細胞の原形質膜に局在化しているか、または局在化したままである場合(例えば、側底膜局在化)、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示される。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「標識」および「検出可能な標識」という用語は、検出可能な分子をいい、このような分子には、放射性同位体、蛍光体(発蛍光団)、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン)、インターカレーティング色素などが含まれるが、これらに限定されることはない。「蛍光体」または「発蛍光団」という用語は、検出可能な範囲の蛍光を示すことが可能な物質またはその一部分をいう。
【００４４】
本明細書において用いられる「リガンド」という用語は、細胞表面抗原(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her2/neu、CD20などのような受容体)に結合する天然または合成化合物をいう。細胞表面抗原への結合によって、リガンドは一般に、細胞表面抗原の活性の調節をもたらす。この用語は、天然化合物、合成化合物および/または組み換えにより産生された化合物を包含するように意図される。本明細書において用いられる場合、この用語はアゴニスト、アンタゴニスト、およびインバースアゴニストを包含しうる。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「リガンド誘導性の内部移行」、「リガンド誘導性の受容体内部移行」、「リガンド誘導性の受容体を介したエンドサイトーシス」、「リガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行」、「リガンド誘導性の細胞表面抗原を介した」などの用語は、リガンドが細胞膜の表面上の、一般的には受容体である細胞表面抗原に結合し、結果的に生じたリガンド-細胞表面抗原複合体が細胞によって内部移行され、すなわち、細胞(例えば、がん細胞)の細胞質または細胞の細胞質内の区画(エンドソーム、小胞など)へ移動するも、細胞膜への回復困難な損傷を引き起こすことのないプロセスをいうように互換的に用いられる。内部移行の後に、細胞質内の、結果的に生じた複合体の解離が行われうる。
【００４６】
本明細書において互換的に用いられる「患者」、「対象」、「宿主」または「個体」という用語は、治療または予防が望まれる任意の対象、詳細には脊椎動物対象、およびさらにより詳細には哺乳動物対象をいう。本発明の範囲内に含まれる適当な脊椎動物は、霊長類(例えば、ヒト、サルおよび類人猿、ならびにマカク属(例えば、マカクザル(cynomologus monkey)、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、および/または赤毛猿(rhesus monkeys) (アカゲザル(Macaca mulatta))およびヒヒ(チャクマヒヒ(Papio ursinus)、ならびにマーモセット(マーモセット属(Callithrix)からの種)、リスザル(リスザル属(Saimiri)からの種)およびタマリン(タマリン属(Saguinus)からの種)、ならびに類人猿からの種、例えばチンパンジー(chimpanzee)(チンパンジー(Pan troglodytes)からのもののようなサルの種を含む)、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウサギ目の動物(例えば、ウサギ、野ウサギ)、ウシ亜科の動物(例えば、ウシ)、ヒツジ科の動物(例えば、ヒツジ)、ヤギ科の動物(例えば、ヤギ)、ブタ科の動物(例えば、ブタ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、イヌ科の動物(例えば、イヌ)、ネコ科の動物(例えば、ネコ)、鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ペットの鳥、例えばカナリア、セキセイインコ)、海洋哺乳動物(例えば、イルカ、クジラ)、爬虫類(ヘビ、カエル、トカゲ)、および魚類を含む脊索動物亜門の任意のメンバーを含むが、これらに制限されることはない。具体的な態様において、対象はヒトのような霊長類である。しかしながら、上記の用語は、症状が存在することを意味するものではないことが理解されよう。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防された」または「予防すること」という用語は、疾患もしくは状態の発症に対する対象の抵抗性を増加させる予防的処置、または換言すれば、その対象が疾患もしくは状態を発症する可能性を減少させる予防的処置、ならびに疾患もしくは状態を低減するもしくはすっかり排除するための、または疾患もしくは状態が悪化するのを防ぐための疾患もしくは状態が始まってからの処置をいう。これらの用語はまた、その範囲のなかに、疾患もしくは状態にかかりやすい素因を持ちうるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患もしくは状態が発生するのを防ぐことを含む。
【００４８】
タンパク質「発現」は、遺伝子にコードされる情報の、メッセンジャーRNA (mRNA)への、次いでタンパク質への変換をいう。本明細書において、関心対象のタンパク質(例えば、EGRFのような細胞表面抗原)を「発現する」サンプルまたは細胞は、該タンパク質をコードするmRNA、または該タンパク質の断片を含めて、該タンパク質がサンプルまたは細胞中に存在すると判定されているものである。
【００４９】
本明細書において用いられる「受容体」という用語は、活性化されると、細胞内でのシグナル伝達カスケードをもたらす、細胞の表面に通常見出されるタンパク質(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her2/neu、CD20など)をいう。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、がんとの関連で、「応答者」という用語は、EGFRアンタゴニストによる処置の後に有益な臨床応答を示すまたは示す可能性がより高い患者をいう。それに反して、本明細書において用いられる「非応答者」という用語は、EGFRアンタゴニストによる処置の後に有益な応答を示さないまたは示す可能性がより低い患者をいう。本明細書において用いられる場合、EGFRアンタゴニストによる処置に対する患者応答との関連で、「有益な応答」、「有益な患者応答」および「臨床的に有益な応答」、「臨床有益性」などの用語は、互換的に用いられ、好ましくない応答、すなわち、有害事象とは対照的に薬物に対する好ましい患者応答をいう。個々の患者において、有益な応答は、検出可能な腫瘍の消失(完全応答、CR)、腫瘍サイズおよび/もしくはがん細胞数の減少(部分応答、PR)、腫瘍成長停止(安定疾患、SD)、腫瘍の退縮もしくは拒絶を引き起こす可能性のある抗腫瘍免疫応答の増強; 腫瘍に関連した1つもしくは複数の、ある程度までの、緩和; 処置後の生存期間の長さの増大; ならびに/または処置後の所与の時点での死亡率の低下を含む、いくつかの臨床パラメータの観点から表現することができる。腫瘍サイズおよび/またはがん細胞数および/または腫瘍転移の持続的増加は、処置に対する有益な応答の欠如を示す。疾患の症状および/または重症度を評価するうえでの患者の査定は、当技術分野において公知であるさまざまな方法によって行われうる。査定では、適当な生化学的、生理学的、および/または行動的要因によって判定される、多数の基準を考慮に入れてもよい。
【００５１】
本明細書において用いられる「可逆的阻害剤」という用語は、水素結合、疎水性相互作用およびイオン結合のような非共有結合性相互作用で標的タンパク質(例えば、受容体を介したエンドサイトーシスに関与するタンパク質)と結合する化合物をいう。阻害剤と活性部位との間の複数の弱い結合を組み合わせて、強力かつ特異的な結合をもたらす。基質および不可逆的阻害剤とは対照的に、可逆的阻害剤は一般に、酵素への結合時に化学反応を受けず、希釈または透析によって容易に除去されうる。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、「処置」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得るために、薬剤を投与すること、または手順(例えば、放射線照射、外科的手順など)を施すことをいう。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であってもよく、かつ/または疾患および/もしくはその疾患の症状のための部分的なもしくは完全な治癒を達成するという観点から治療的であってもよい。効果は、疾患もしくは状態(例えば、がん)および/または疾患もしくは状態に起因する有害作用のための部分的なまたは完全な治癒という観点から治療的であってもよい。これらの用語はまた、哺乳類における、特にヒトにおける状態または疾患の任意の処置を網羅し、(a) (例えば、原発性疾患に関連しうる、もしくは原発性疾患によって引き起こされうる疾患を含む)疾患にかかりやすい素因を持ちうるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患もしくは疾患の症状が生じることを予防すること; (b) 疾患を阻害すること、すなわち、その発達を停止させること; (c) 疾患を緩和すること、すなわち、疾患の軽減を引き起こすこと; (d) 疾患の症状の重症度を低減すること、および/または(e) 疾患もしくは状態の症状の頻度を低減することを含む。
【００５３】
本明細書において用いられる「腫瘍」という用語は、悪性であるか良性であるかに関わらず、任意の新生物性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織をいう。「がん」および「がん性」という用語は、一つには無秩序な細胞成長によって典型的には特徴付けられる、哺乳類における生理学的条件をいい、または記述する。本明細書において用いられる場合、「がん」という用語は、早期および末期がんを含めて、非転移性および転移性がんをいう。「前がん性」という用語は、典型的にはがんに先立つまたは進展する状態または成長をいう。「非転移性」とは、良性であるがん、あるいは原発部位にとどまり、リンパ管もしくは血管系または原発部位以外の組織へ浸透していないがんを意味する。一般的に、非転移性がんは、ステージ0、I、またはIIのがん、場合によってステージIIIのがんのいずれかのがんである。「早期がん」とは、浸潤性もしくは転移性ではなく、またはステージ0、I、またはIIのがんに分類されるがんを意味する。「末期がん」という用語は一般に、ステージIIIまたはステージIVのがんをいうが、ステージIIのがんまたはステージIIのがんのサブステージをいうこともできる。当業者は、早期がんまたは末期がんのいずれかとしてのステージIIのがんの分類が特定のタイプのがんに依ることを認識するであろう。がんの説明に役立つ実例としては、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、肝細胞がん、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路のがん、甲状腺がん、腎臓がん、がん腫、黒色腫、脳腫瘍、非小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、直腸がん、および食道がんが挙げられるが、これらに限定されることはない。例示的な態様において、がんは扁平上皮がんである。
【００５４】
本明細書において用いられる「腫瘍サンプル」という用語は、がん患者から得られた腫瘍材料を含むサンプルを意味する。この用語は、臨床サンプル、例えば外科的切除によって得られる組織および生検、例えばコア生検または細針生検などによって得られる組織を包含する。この用語はまた、原発腫瘍以外の部位から得られた腫瘍細胞、例えば、循環血中の腫瘍細胞を含むサンプル、および保存された腫瘍サンプル、例えばホルマリン固定され、パラフィン包埋された腫瘍サンプルまたは凍結された腫瘍サンプルを包含する。この用語は、患者の腫瘍細胞の後代である細胞、例えば、原発腫瘍細胞または循環血中の腫瘍細胞に由来する細胞培養サンプルを包含する。この用語は、インビボ、例えば、骨髄、血液、血漿、血清などの腫瘍細胞から脱落したタンパク質または核酸材料を含みうるサンプルを包含する。この用語はまた、腫瘍細胞が濃縮されているか、またはその獲得後に別の方法で操作されているサンプル、ならびに患者の腫瘍材料から得られるポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを含むサンプルを包含する。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「腫瘍関連抗原」または「TAA」という用語は、腫瘍細胞により、または腫瘍と同じ系統の細胞上に発現可能な抗原をいう。腫瘍におけるTAAは、非腫瘍(正常)細胞対応物と比べて通常よりも多い量で発現され、あるいは類似のレベルで、またはTAAをコードする遺伝子が腫瘍細胞において下方制御される場合には特に、正常細胞対応物よりも低いレベルで発現されうる。腫瘍関連抗原は、その発現が免疫細胞または免疫分子(例えば、抗体)と腫瘍細胞との相互作用を促進する抗原分子である。TAAは、免疫標的化分子(すなわち、免疫細胞上の受容体、抗体など)が結合する分子または分子の部分である。先に論じたように、TAAは正常細胞中にまたは正常細胞上に存在しうる; 腫瘍TAA発現はしかし、正常(非腫瘍)対応物の細胞(例えば、TAAを発現していない正常細胞、腫瘍細胞よりも少ないTAAを発現している正常細胞、または腫瘍と同じもしくは腫瘍よりも多いTAAを発現している正常細胞)から逸脱する必要はなくてもよい。しかしながら、本発明の実践において適当であるTAAは、それらが抗体(例えば、治療用抗体)と結合できるように腫瘍細胞の表面に発現されまたは発現可能(すなわち、細胞表面TAA)である。腫瘍関連抗原は、細胞の初期発生段階または異なる分化段階の間に発現されうる; 発生段階を経て進行した後に、TAAの発現は典型的には変化する。
【００５６】
本明細書において記述される各態様は、特に記載のない限り、ありとあらゆる態様に準用されるべきである。
【００５７】
2. 略語
0006348115.tif 000002
【００５８】
3. 腫瘍に対する増強された免疫応答を刺激するための組成物
本発明は、対象において腫瘍に対する増強された抗体依存性細胞毒性応答を含む増強された免疫応答を刺激するための組成物を提供する。これらの組成物は概して、(1) 受容体を介したエンドサイトーシスに供される腫瘍細胞表面抗原と結合する治療用抗体、および(2) 受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を利用する。
【００５９】
3.1 細胞表面抗原および抗体
抗体が標的とする細胞表面抗原は、適当には腫瘍関連抗原であり、その説明に役立つ実例としては、Her2/neu、EGFR、Epcam、VEGFR、FGFR、MUC-I、CA 125、CEA、MAGE、CD20、CD19、CD40、CD33、A3、A33抗体に特異的な抗原、BrE3抗原、CD1、CD1a、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD21、CD22、CD23、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD45、CD46、CD52、CD54、CD74、CD79a、CD126、CD138、CD154、B7、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR (例えば、HLA-DR10)、NCA95、NCA90、HCGおよびサブユニット、CEA (CEACAM5)、CEACAM-6、CSAp、EGP-I、EGP-2、Ba 733、KC4抗原、KS-I抗原、KS1-4、Le-Y、MUC2、MUC3、MUC4、P1GF、ED-Bフィブロネクチン、NCA 66a-d、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、SlOO、TAG-72、TlOl、TAG TRAIL-R1、TRAIL-R2、p53、テネイシン、インスリン増殖因子-1 (IGF-I)、Tn抗原などが挙げられる。
【００６０】
治療法において使用可能であり、かつ腫瘍によって発現される細胞表面抗原と結合する任意の適当な抗体が、本発明の実践で用いるために企図される。そのような抗体の非限定的な例としては、MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)、MAb 455 (ATCC CRL HB8507)、MAb 225 (ATCC CRL 8508)、MAb 528 (ATCC CRL 8509) (米国特許第4,943,533号、Mendelsohn et al.を参照のこと)およびそれらの変種、例えば、キメラ化225 (C225またははセツキシマブ; ERBITUX(商標))および再形成ヒト225 (H225) (WO 96/40210, Imclone Systems Inc.を参照のこと); IMC-11F8、完全ヒトEGFR標的化抗体(Imclone); II型変異体EGFRと結合する抗体(米国特許第5,212,290号); 米国特許第5,891,996号に記述されているEGFRと結合するヒト化およびキメラ抗体; およびEGFRと結合するヒト抗体、例えばABX-EGFまたはパニツムマブ(WO98/50433, Abgenix/Amgen参照); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (マツズマブ)、EGFR結合についてEGFおよびTGF-αの両方と競合するEGFRに向けられるヒト化EGFR抗体(EMD/Merck); ヒトEGFR抗体、HuMax-EGFR (GenMab); E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3およびE7.6.3として知られ、米国第6,235,883号に記述されている完全ヒト抗体; MDX-447 (Medarex Inc); ならびにmAb 806またははヒト化mAb 806 (Johns et al. (2004) J. Biol Chem. 279(29):30375-30384); 抗HER2抗体を含むが、これらに限定されないような抗EGFR抗体が挙げられ、その説明に役立つ実例としては、HERCEPTIN(商標) (トラスツズマブ) (Genentech, Calif.); マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX(商標) (Glaxo Wellcome/Centocor); マウス抗イディオタイプ(GD3エピトープ) IgG抗体であるBEC2 (ImClone System); ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標)(Applied Molecular Evolution/Medimmune); ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03 (Leukosite); ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195 (Protein Design Lab/Kanebo); キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN(商標) (リツキシマブ) (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE(商標) (Immunomedics); ヒト化抗ICAM3抗体であるICM3 (ICOS Pharm); 放射性標識マウス抗CD20抗体であるZEVALIN(商標) (IDEC/Schering AG); および霊長類化抗CD23抗体であるIDEC-152 (ルミリキシマブ) (IDEC/Seikagaku)が挙げられる。
【００６１】
3.2 受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤
本発明によって企図される受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、治療用抗体が対象にする細胞表面抗原のエンドサイトーシスまたは内部移行を任意の手段によって阻害または抑止する任意の薬剤を包含する。適当には、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、可逆性の受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤である。具体的な態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤であり、その説明に役立つ実例としては、メチル-β-シクロデキストリン(β-CD)、疎水性アミン(フェノチアジン、モノダンシルカダベリンおよびクロロキンのような)、モネンシン、高張性スクロースならびにDynasoreが挙げられる。フェノチアジンには、クロルプロマジン、フルフェナジン、メソリダジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、プロマジン、チオリダジン、トリフルオペラジンおよびトリフルプロマジンが含まれるが、これらに限定されることはない。β-CDは、原形質膜からコレステロールを選択的に除去することによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。疎水性アミンは、クラスリンおよびクラスリンコート小胞の機能に影響を与えることによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。モネンシンは、プロトン勾配をなくすことによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。高張性スクロースは、クラスリンおよびアダプタが相互作用するのを防ぐことによってクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する。Dynasoreは、被覆ピットの形成を促進するダイナミンGTPaseを阻害する。
【００６２】
具体的な態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤である。この種の非限定的な例において、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤はダイナミンGTPase阻害剤であり、その説明に役立つ実例は、参照により全体が本明細書に明示的に組み入れられる米国特許出願公開第2007/0225363号においてMcCluskeyらにより記述されている化合物から選択され、これらの化合物は、式(I)、または生理学的に許容されるその塩によって表される:
M-Sp-M' (I)
式中、
MおよびM'は、各々独立して式II：
0006348115.tif 000003
の部分であり、同じものまたは異なるものであり、
Spはスペーサーであり;
VはCまたはCHであり;
WはCHまたはリンカー基であり;
Yは、水素、シアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換C1〜C3基もしくはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基であり; あるいは
W、VおよびYが、Zと縮合された5員または6員置換または非置換複素環または炭素環を形成し、ここで複素環は、O、NおよびSから選択される1〜3個のヘテロ原子を含み、炭素環または複素環は、置換時に、シアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、硫黄、または非置換C1〜C3基もしくはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基から選択される少なくとも1つの置換基を有し;
Rは、CH2R'、CXR'またはCHX'R'であり;
XはOまたはSであり;
X'は、シアノ、ニトロ、アミノ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシ、または非置換C1〜C3基またはシアノ、ニトロ、NH、アミノ、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、カルボキシ、チオカルボキシおよび硫黄から独立して選択される少なくとも1つの基で置換されたC1〜C3基であり;
R'はスペーサーに結合されたNH、OまたはSであり; 
Zは以下から選択され:
(a) O、NおよびSから選択される最大3個までのヘテロ原子を含む5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる非置換複素環基;
(b) 5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる非置換炭素環基;
(c) O、NおよびSから選択される最大3個までのヘテロ原子を含む5員環または6員環を独立して有する1つまたは2つの環からなる複素環基、ここで、この複素環基は、以下から独立して選択される1つまたは複数の置換基を有し:
(i) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシル;ならびに
(ii) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシルから選択される少なくとも1つの置換基を有するC1〜C2アルキルまたはC1〜C2アルケニル基;ならびに
(d) 5員環もしくは6員環を独立して有する1つもしくは2つの環、ならびに、Wが、CHもしくはリンカー基であるか、またはW、VおよびYが、非置換炭素環基を形成する場合には、少なくとも2つの置換基、あるいはW、VおよびYが複素環基を形成する場合に、以下から独立して選択される、少なくとも1つの置換基からなる炭素環基:
(i) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシル;ならびに
(ii) ニトロ、NH、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、硫黄、スルフヒドリル、C1〜C2アルコキシおよびC1〜C2アシルから選択される少なくとも1つの置換基を有するC1〜C2アルキルまたはC1〜C2アルケニル基;
ここでMまたはM'の一方のZが(b)から選択される場合、MまたはM'の他方のZは(a)、(c)または(d)から選択される。
【００６３】
具体的な態様において、式Iの化合物は二量体チルホスチンである。
【００６４】
他の態様において、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤は、ダイナミン環安定剤から選択され、これはダイナミン環分解を阻害し、それによってダイナミン環寿命を延長させ、ダイナミン環蓄積を促進させる。例示的なダイナミン環安定剤は、例えばRobinsonらにより米国特許出願公開第2012/0122968号において開示されており、これはその全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。Robinsonらにより開示される代表的な化合物は、らせん状ダイナミンGTPase阻害剤、二量体チルホスチン、二量体ベンジリデンマロニトリルチルホスチン、イミノクロメン、単量体チルホスチンおよび3-置換ナフタレン-2-カルボン酸(ベンジリデン)ヒドラジドから選択され、その非限定的な例としては、以下が挙げられる。
【００６５】
ビス-チルホスチン-22 (Bis-T-22)は二量体チルホスチンであり、ダイナミンがホスファチジルセリン(PS)リポソームにより活性化され、集合して柔軟ならせんを構築する場合の、強力なインビトロのダイナミン阻害剤である。PSリポソームの非存在下においては、ダイナミンは集合して単環を構築することしかできない。驚いたことに、Bis-T-22がらせん状ダイナミンの活性を阻害する間に、それはまた、ダイナミン環の分解を防ぐことによって基礎ダイナミンGTPase活性を一意的に同時刺激する。Bis-T-22の構造を以下に示す。Bis-Tは、Bis-T-22と同じ構造を有するが、各末端フェニル基のC5炭素原子上にさらなるヒドロキシル置換基を有する。
0006348115.tif 000004
【００６６】
ダイナミン環安定剤として有用な特に適した二量体チルホスチンには、少なくとも1つの末端フェニル環のC3〜C5炭素原子の2つがヒドロキシル(OH)置換基を、適当にはカテコール配列で(例えば、Bis-T-22の場合のように)、有するか、または炭素原子の3つ全てがヒドロキシルで(例えば、Bis-T-23の場合のように)置換されているBis-T化合物が含まれる。そのような化合物の説明に役立つ実例としては、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-エチル}-3-(3,-4-ジヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-エチル}-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-エチル}-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-プロピル}-3-(3-,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリルアミド(Bis-T-22)、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-プロピル}-3--(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリルアミド(Bis-T-23)、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-プロピル}-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ブチル}-3-(3,-4-ジヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ブチル}-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ブチル}-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ペンチル}-3-(3-,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ペンチル}-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ペンチル}-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ヘキシル}-3-(3,-4-ジヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ヘキシル}-3-(3,4,5-トリヒドロキシフェニル)-アクリルアミド、および2-シアノ-N-{3-[2-シアノ-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリロイルアミノ]-ヘキシル}-3-(3,4-ジヒドロキシ-5-メトキシフェニル)-アクリルアミドが挙げられる。
【００６７】
さらなるダイナミン環安定剤には、Bis-T化合物の少なくとも1つの末端フェニル環のC2炭素原子および隣接するシアニル基(CN)が占有する位置の置換基が、参照により全体が本明細書に組み入れられるWO 2005/049009において記述されているように環化されているものが含まれる。例えば、置換基がヒドロキシである場合、ヒドロキシ基はシアニル基と反応して、以下のようにイミノクロメンを形成することができる:
0006348115.tif 000005
式中、例えば、R1はOHであり、R2はOHであり、かつR3はHであり; R1はHであり、R2はOHであり、かつR3はOHであり; またはR1、R2およびR3はOHであり; nは通常0、1、2または3、および最も通常は1である。
【００６８】
Robinsonらにより開示されているダイナミン環安定剤の他の非限定的な例としては、3-ヒドロキシナフタレン-2-カルボン酸(3,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド(Dynasore)およびその類似体が挙げられる。Dynasoreの構造は次の通りである。
0006348115.tif 000006
【００６９】
Dynasoreのさらなる3-置換ナフタレン-2-カルボン酸(ベンジリデン)ヒドラジド類似体(Dyngo化合物と名付けられた)の例は、Robinsonらにより開示されており、これらはDynasoreと比べて、改善されたダイナミン阻害能を示すと記述されている。これらの類似体は、以下に示されており、下記表Aに示されている。
【００７０】
（表Ａ）Dyngo化合物
0006348115.tif 000007
【００７１】
さらなるダイナミン環安定剤はRobinsonらによって開示されており、これはまた、クラスリン依存性の受容体を介したエンドサイトーシスおよびダイナミン依存性の受容体を介したエンドサイトーシスを含む、受容体を介したエンドサイトーシスを阻害するために本発明によって包含される。
【００７２】
本発明は、受容体を介したエンドサイトーシス(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)の公知の阻害剤を包含するだけでなく、任意の適当なスクリーニングアッセイ法によって特定された受容体を介したエンドサイトーシス阻害剤も包含する。したがって、本発明は、受容体を介したエンドサイトーシスを阻害するために、および、順に、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her/neu2、CD20など)を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するために有用である調節剤をスクリーニングする方法にまで及ぶ。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、(1) (i) ダイナミンポリペプチド(例えば、GenBankアクセッション番号AAA88025に例えば記載されているアミノ酸配列を含むダイナミンポリペプチド)の少なくとも生物学的に活性な断片に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド; または(ii) ダイナミン遺伝子(例えば、GenBankアクセッション番号L36983に例えば記載されているヌクレオチド配列を含むダイナミン遺伝子)もしくはその部分の転写産物が産生可能であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または(iii) レポーター遺伝子に機能的に連結されているダイナミン遺伝子の発現を調節する遺伝子配列(例えば、プロモーター)の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドを含む調製物を、試験薬剤と接触させる段階; および(2) 試験薬剤の非存在下での基準レベルまたは機能活性と比べて、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはレポーター遺伝子の発現産物のレベルまたは機能活性の変化を検出する段階を含む。試験薬剤の非存在下での正常もしくは基準レベルおよび/または機能活性と比べて、ポリペプチド、転写産物もしくは転写産物部分またはレポーター遺伝子の発現産物のレベルおよび/または機能活性における検出された低減から、該薬剤がダイナミン阻害剤であり、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her/neu2、CD20など)を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するために潜在的に有用であることが示唆される。適当には、これは、試験薬剤が、任意で細胞表面受容体に対する抗体との組み合わせで、受容体を介したエンドサイトーシスに供される細胞表面受容体(例えば、EGFR、VEGFR、FGFR、Her/neu2、CD20など)を有する腫瘍に対する抗体依存性細胞毒性応答を増強するかどうか分析または判定することにより確認される。
【００７３】
具体的な態様において、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤は、例えばMcCluskeyら(上記)によって記述されているように、ダイナミン環安定化をアッセイする方法により特定され、それは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。これらの方法は広くは、ダイナミン環の形成に適した条件の下で、ダイナミンポリペプチド(例えば、GenBankアクセッション番号AAA88025に例えば記載されているアミノ酸配列を含むダイナミンポリペプチド、または生物学的に活性なその断片)とともに試験薬剤をインキュベートする段階; ならびに試験薬剤がダイナミン環の蓄積を促進するかどうか、および/またはダイナミン環の分解を阻害するかどうか、基礎ダイナミンGTPase活性を高めるダイナミン環の蓄積および/またはダイナミン環の分解の阻害について評価する段階を含む。試験薬剤がダイナミン環の蓄積を促進するかどうか、またはダイナミン環の分解を阻害するかどうかの評価は、基礎ダイナミンGTPase活性の増加、および/またはダイナミン環分解を示すダイナミンの放出についてアッセイする段階を含むことができる。
【００７４】
本発明の範囲内に入る調節因子には、受容体を介したエンドサイトーシスを媒介するポリペプチド(例えば、クラスリン、ダイナミンなど)の多糖およびリポ多糖阻害剤のほかに、アンタゴニスト抗体、抗体断片、阻害性ペプチド断片、アンチセンス分子、リボザイム、RNAi分子および共抑制分子を含む、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)が含まれる。
【００７５】
候補薬剤は、典型的には、有機分子、好ましくは50ダルトン超かつ約2,500ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物であるが、多数の化学的クラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの官能化学基を含む。候補薬剤は、1つまたは複数の上記の官能基で置換された環状炭素もしくはヘテロ環状構造または芳香族もしくは多芳香族構造を含むことが多い。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体または組み合わせを含むが、これらに限定されない、生体分子の中に見出される。
【００７６】
受容体を介したエンドサイトーシスの小(非ペプチド)分子阻害剤(例えば、クラスリン依存性のエンドサイトーシス阻害剤、ダイナミン依存性のエンドサイトーシス阻害剤など)は、特に有利である。この関連において、小分子が望ましい。というのは、そのような分子は、いっそう大きな、タンパク質に基づく医薬剤よりも経口投与後に容易に吸収され、潜在的な抗原決定基が少なく、また細胞膜を横断する可能性が高いからである。有機小分子はまた、適切な細胞へ侵入する能力を持ち、遺伝子の発現に(例えば、遺伝子発現に関与する調節領域もしくは転写因子と相互作用することによって)影響を及ぼし; またはアクセサリ分子の結合を阻害もしくは増強することによって遺伝子の活性に影響を及ぼしうる。
【００７７】
あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが、利用可能であり、または容易に産生される。さらに、天然または合成により産生されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変され、コンビナトリアルライブラリを産生するために用いられうる。公知の薬理学的物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、特異的またはランダムな化学的改変に供して、構造的類似体を産生してもよい。
【００７８】
スクリーニングは、公知の薬理学的に活性な化合物およびその化学的類似体を対象にしてもよい。
【００７９】
化合物を動物モデルにおいてさらに試験し、最も強力なインビボの効果を有する化合物を特定してもよい。これらの分子は、例えば、化合物を逐次的改変、分子モデリング、および合理的薬物設計に利用される他の日常的手順に供することにより、さらなる医薬開発用の「リード化合物」として役立ちうる。
【００８０】
概して、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤および治療用抗体(本明細書においてまとめて「治療剤」ともいわれる)は、薬学的に許容される担体、賦形剤および/または安定剤を任意で含んでもよい薬学的組成物の形態で投与される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。これらの組成物は概して、凍結乾燥製剤または水溶液の形態である。抗体結晶も企図される(米国特許出願第2002/0136719号参照)。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、利用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム; 塩化ヘキサメトニウム; 塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム; フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール; メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン; カテコール; レゾルシノール; シクロヘキサノール; 3-ペンタノール; およびm-クレゾールなどの); 低分子量(約10残基未満)ポリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質; ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸; グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖質; EDTAなどのキレート剤; スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖; ナトリウムなどの塩形成対イオン; 金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体); および/またはTWEEN (商標)、PLURONICS (商標)もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。凍結乾燥抗体製剤は、WO 97/04801に記述されている。
【００８１】
薬学的組成物は、処置される特定の徴候に関する必要に応じて活性化合物、望ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する活性化合物を含有する。そのような分子は、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在することが適当である。
【００８２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に、封入されてもよい。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【００８３】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適当な例としては、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性基材が挙げられ、該基材は成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出基材の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(メタクリル酸2-ヒドロキシエチル)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸との共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT (商標) (乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドで構成される注射用ミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸共重合体、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【００８４】
本発明の組成物はしたがって、がんと診断された個体、がんを有する疑いがある個体、がんの発症を起こしやすいことが分かっている個体およびがんを発症する可能性が高いと考えられる個体、または過去に処置されたがんを再発する可能性が高いと考えられる個体を処置するのに適している。
【００８５】
いくつかの態様において、および意図した投与方法に依って、組成物は概して、約0.000001%〜90%、約0.0001重量%〜50重量%、または約0.01重量%〜約25重量%の受容体を介したエンドサイトーシス阻害剤を含有し、残りは治療用抗体および適当な薬学的担体または希釈剤などであろう。いくつかの態様において、および意図した投与方法に依って、組成物は概して、約0.000001重量%〜90重量%、約0.0001重量%〜50重量%、または約0.01重量%〜約25重量%の治療用抗体を含有し、残りは受容体を介したエンドサイトーシス阻害剤および適当な薬学的担体または希釈剤などであろう。受容体を介したエンドサイトーシス阻害剤および治療用抗体の投与量は、投与方法、罹患対象の種、年齢、性別、体重および一般的健康状態のような、種々の要因に依ることができ、当業者は標準的なプロトコルを用いてこれを容易に判定することができる。投与量には、受容体を介したエンドサイトーシス阻害剤およびその標的分子に対する治療用抗体の結合親和性、その生物学的利用能ならびにそのインビボおよび薬物速度論的特性の結合親和性も考慮に入れられよう。この関連において、投与のための薬剤の正確な量は、実践者の判断に依ることもできる。過剰増殖性細胞障害の処置または予防において投与される薬剤の有効量を判定するうえで、医師または獣医師は疾患または状態の進行を経時的に評価しうる。いずれにしても、当業者は、過度の実験なしに本発明の薬剤の適当な投与量を容易に判定しうる。患者に投与される活性物質の投与量は、過剰増殖性細胞の増殖、移動、浸潤、生存もしくは生存可能性の改善もしくは抑止などの経時的な患者での、ならびに/または過剰増殖性細胞障害の処置および/もしくは予防での、有益な応答をもたらすのに十分でなければならない。投与量は、血液悪性腫瘍の症状を改善するために適した間隔で投与されうる。そのような間隔は、当業者に公知の日常的な手順を用いて確定することができ、利用される活性薬剤のタイプおよびその製剤に依って異なることができる。例えば、間隔は毎日、1日おき、毎週、2週間ごと、毎月、2月ごと、年4回、年2回または毎年でありうる。
【００８６】
本発明の方法において用いられる任意の化合物の場合、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養において判定されたIC50 (例えば、リガンドによって誘導される細胞表面抗原の最大の内部移行の半分の阻害を達成する、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤の濃度)を含む循環血中濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトを含む、哺乳類において有用な用量をより正確に判定することができる。
【００８７】
投与量および間隔は、受容体を介したエンドサイトーシス阻害効果を維持するのに、および/または治療用抗体の効果を維持するのに十分である活性薬剤の血漿中レベルを提供するために個別に調整されうる。全身投与のための通常の患者投与量は、1〜2000 mg/日、一般的には1〜250 mg/日、および典型的には10〜150 mg/日に及ぶ。患者体重に関して述べると、通常の投与量は0.02〜25 mg/kg/日、一般的には0.02〜3 mg/kg/日、典型的には0.2〜1.5 mg/kg/日に及ぶ。患者体表面積に関して述べると、通常の投与量は0.5〜1200 mg/m2/日、一般的には0.5〜150 mg/m2/日、典型的には5〜100 mg/m2/日に及ぶ。
【００８８】
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤および/または治療用抗体のいずれかの2回以上の投与が所望されることも考えられる。受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が「A」であり、治療用抗体が「B」である場合、以下に例示されるように、さまざまな組み合わせを利用することができる。
0006348115.tif 000008
【００８９】
他の組み合わせが企図される。かさねて、両方の薬剤は同量の治療用抗体のみの投与と比べて、がんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強するのに有効な組み合わせた量で対象に送達される。
【００９０】
受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤および治療用抗体は、対象におけるがんの発症もしくは進行を元に戻すかもしくは阻害するまたは症状を処置もしくは改善する少なくとも1つの補助的療法と同時に投与されうる。阻害剤および抗体は、補助的療法の後に治療的に用いられてもよく、または該療法が施される前にもしくは該療法と一緒に用いられてもよい。したがって、本発明は、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤、治療用抗体および同時施行の補助的療法(例えば、医学的処置)を利用する併用療法を企図し、その非限定的な例としては、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および免疫療法が挙げられる。
【００９１】
3.3 放射線療法
放射線療法には、DNA損傷を引き起こす放射線および波動、例えば、γ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体などが含まれる。治療法は、局所腫瘍部位に上記の形態の放射線照射を照射することによって達成されうる。これらの因子は全てDNAに、DNAの前駆体に、DNAの複製および修復に、ならびに染色体の構築および維持に広範囲の損傷を及ぼす可能性が最も高い。
【００９２】
X線の線量範囲は長時間(3〜4週間)の場合の50〜200レントゲンの日々線量から2000〜6000レントゲンの単一線量に及ぶ。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。
【００９３】
放射線療法の非限定的な例としては、原体外部ビーム放射線療法(conformal external beam radiotherapy) (4〜8週間にわたり分割して50〜100 Grey与えられる)、シングルショットまたは分割照射のいずれか、高線量率近接照射療法(high dose rate brachytherapy)、永久組織内近接照射療法(permanent interstitial brachytherapy)、全身放射性同位体(例えば、ストロンチウム89)が挙げられる。いくつかの態様において、放射線療法は放射線増感剤と組み合わせて施されてもよい。放射線増感剤の説明に役立つ実例としては、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオソール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、およびチラパザミンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００９４】
3.4 化学療法
化学療法剤は、以下のカテゴリのいずれかの1つまたは複数から選択されうる。
【００９５】
(i) 内科的腫瘍学において用いられている、抗増殖/抗新生物薬およびそれらの組み合わせ、例えばアルキル化剤(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびニトロソウレア); 代謝拮抗剤(例えば、抗葉酸剤、例えば5-フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシウレア; 抗腫瘍抗生物質(例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン); 有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにパクリタキセルおよびドセタキセルのようなタキソイド); およびトポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシドおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトテシンのようなエピポドフィロトキシン)。
【００９６】
(ii) 細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン)、エストロゲン受容体下方制御剤(例えばフルベストラント)、抗アンドロゲン(例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよびシプロテロンアセテート)、UHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト(例えば、ゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン)、プロゲストゲン(例えば、メゲストロールアセテート)、アロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン)および5α-レダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリド。
【００９７】
(iii) がん細胞浸潤を阻害する薬剤(例えば、マリマスタットおよびウロキナーゼプラスミノゲン活性化物質受容体機能阻害剤のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤)。
【００９８】
(iv) 増殖因子機能の阻害剤、例えばそのような阻害剤は増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体(例えば、抗erbb2抗体トラスツマブ[ハーセプチン(商標)]および抗erbb1抗体セツキシマブ[C225])、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MEK阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮細胞増殖因子ファミリーの阻害剤(例えば他のEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えばN-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(ゲフィチニブ, AZD1839)、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン(エルロチニブ, OSI-774)および6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(CI1033))、例えば血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤および例えば肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤。
【００９９】
(v) 抗血管新生剤、例えば血管内皮細胞増殖因子の効果を阻害するもの、(例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ[アバスチン(商標)]、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856およびWO 98/13354)に開示されているものなどの化合物および他の機構により働く化合物(例えば、リノマイド(linomide)、インテグリンαvβ3機能およびアンギオスタチンの阻害剤)。
【０１００】
(vi) 血管傷害因子、例えばコンブレタスタチンA4ならびに国際特許出願WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434およびWO02/08213に開示されている化合物。
【０１０１】
(vii) アンチセンス治療、例えば上記の標的に対するもの、例えばISIS 2503、抗rasアンチセンス。
【０１０２】
(viii) 例えば異常遺伝子、例えば異常p53を置き換えるための手法または異常GDEPT (遺伝子特異的酵素プロドラッグ治療(gene-directed enzyme pro-drug therapy))手法、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるもの、および化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を増加させるための手法、例えば多剤耐性遺伝子治療を含む、遺伝子治療法。
【０１０３】
3.5 免疫療法
免疫治療法には、例えば患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるためのエクスビボおよびインビボ手法、例えばインターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインでのトランスフェクション、T細胞アネルギーを減少させるための手法、サイトカインでトランスフェクションされた樹状細胞のようなトランスフェクションされた免疫細胞を用いた手法、サイトカインでトランスフェクションされた腫瘍細胞株を用いた手法および抗イディオタイプ抗体を用いた手法が含まれる。これらの手法は一般に、がん細胞を標的化し破壊する免疫エフェクタ細胞および分子の使用に依る。免疫エフェクタは、例えば、悪性細胞表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体のみで治療のエフェクタとなりえ、または抗体は他の細胞を動員して、細胞死滅を実際に容易にし得る。抗体は、薬物または毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合され、単に標的化薬剤として働いてもよい。あるいは、エフェクタは悪性細胞標的と、直接的にまたは間接的に、相互作用する表面分子を保有しているリンパ球でありうる。さまざまなエフェクタ細胞が細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。
【０１０４】
3.6 他の治療法
他のがん治療法の例としては、光線療法、凍結療法、毒素療法またはアポトーシス促進療法が挙げられる。当業者は、この一覧が、がんおよび他の過形成病変に利用可能な治療法のタイプを網羅するものではないことを承知しているであろう。
【０１０５】
4. 腫瘍を分類し、その分類にしたがって対象を層別化する方法
本発明は同様に、治療用抗体に対する非応答者である対象をより良好に管理するために、腫瘍を治療用抗体感受性および治療用抗体抵抗性のサブタイプに分類する方法の使用を企図する。本発明によれば、これらの分類方法は、腫瘍のリガンド誘導性細胞表面抗原(例えば、受容体)の内部移行状態を分析することを含む。対照(例えば、正常な細胞表面抗原発現細胞)と比べて損なわれまたは抑止されている、検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行から、腫瘍が治療用抗体感受性と分類されるのに対し、対照と同じであるか、対照と同様であるか、または対照よりもさらに高い、検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行から、腫瘍が治療用抗体抵抗性と分類される。いくつかの態様において、細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるEGFRの少なくとも90% (例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%)が細胞の原形質膜(例えば、側底膜)に局在化しているか、もしくは局在化したままである場合; (b) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞の原形質膜に局在化している細胞表面抗原と、それらの細胞の細胞内区画(例えば、細胞質、核など)において局在化している細胞表面抗原との比率が90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1もしくは100:0から選択される場合; または(c) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%未満である場合、損なわれたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示唆される。
【０１０６】
いくつかの態様において、細胞表面抗原に対するリガンドの存在下において適当には少なくとも10分(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40分またはそれ以上)後に: (a) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞における細胞表面抗原の100%未満(例えば、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%もしくはさらにそれ未満)が細胞の原形質膜(例えば、側底膜)に局在化しているか、もしくは局在化したままである場合; (b) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞の原形質膜に局在化している細胞表面抗原と、それらの細胞の細胞内区画(例えば、細胞質、核など)において局在化している細胞表面抗原との比率が99:1; 98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65; 30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95もしくは0:100から選択される場合; (c) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量と比べて10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%未満だけ異なる場合; または(d) 腫瘍細胞表面抗原発現細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞におけるリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量よりも大きい場合、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が示される。
【０１０７】
いくつかの態様において、本方法は、(a) 1種または複数種の細胞表面抗原を発現している腫瘍細胞または推定上の細胞表面抗原を発現している腫瘍細胞を含んだ腫瘍サンプルを提供する段階、(b) 腫瘍細胞を細胞表面抗原に対する標識リガンドと接触させて、細胞表面抗原および標識リガンドを含む標識複合体を形成させる段階、ならびに(c) 標識複合体の細胞位置を検出することによって腫瘍細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行をモニタリングする段階を含む。典型的には、本方法は、腫瘍細胞の表面に結合された標識複合体の量および腫瘍細胞内部(例えば、細胞質、核、エンドソームなどを含むが、これらに限定されない、腫瘍細胞の細胞内区画)の標識複合体の量を比較することによってリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度を判定する段階をさらに含む。いくつかの態様において、リガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、腫瘍細胞の表面上の標識複合体の減少を定性的にもしくは定量的に検出することによって、および/または腫瘍細胞内部の標識複合体の増加を定性的にもしくは定量的に検出することによって検出される。通常、腫瘍細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、少なくとも10分かつ60分未満の間、通常は少なくとも20分かつ40分未満の間モニタリングされる。
【０１０８】
概して、本方法は、1種または複数種の細胞表面抗原を発現している対照細胞(例えば、正常細胞)を含んだ正常サンプルを提供する段階、(b) 正常細胞を、腫瘍細胞の接触に用いたものと一般に同じものである細胞表面抗原に対する標識リガンドと接触させて、細胞表面抗原および標識リガンドを含む標識複合体を形成させる段階、ならびに(c) 標識複合体の細胞位置を検出することによって対照細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行をモニタリングする段階をさらに含む。典型的には、これらの方法は、対照細胞の表面に結合された標識複合体の量および対照細胞内部(例えば、細胞質、核、エンドソームなどを含むが、これらに限定されない、腫瘍細胞の細胞内区画)の標識複合体の量を比較することによってリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度を判定する段階をさらに含む。通常、対照細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、腫瘍細胞に利用される同一時間モニタリングされる。
【０１０９】
いくつかの態様において、対照細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度または量を、腫瘍細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度または量と比較して、腫瘍細胞が、損なわれたまたは損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行を有するかどうかを判定する。この種の説明に役立つ実例では、腫瘍細胞中での損なわれたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、腫瘍細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が、細胞表面抗原を発現している正常細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度または分量の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%未満である場合に判定される。他の説明に役立つ実例では、腫瘍細胞中での損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、腫瘍の細胞表面抗原を発現している細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量と比べて10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%未満だけ異なる場合に; または腫瘍の細胞表面抗原を発現している細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量が、細胞表面抗原を発現している正常細胞中でのリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行の程度もしくは分量よりも大きい場合に判定される。
【０１１０】
いくつかの態様において、本方法は、がん、適当には細胞表面抗原陽性のがんを有する対象から腫瘍サンプルを得る段階をさらに含む。サンプルは、例えば、新鮮な生検サンプル、固定されたサンプル、例えばホルマリン固定された、パラフィン包埋(FFPE)サンプル、または凍結されたサンプルでありうる。細胞表面抗原陽性のがんの非限定的な例としては、扁平上皮がん(例えば、上皮扁平細胞がん)、小細胞肺がん(SCLC)、非小細胞肺がん(NSCLC)、肺腺がんおよび肺扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃がん(gastric cancer)または胃がん(stomach cancer)、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん(転移性乳がんを含む)、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんが挙げられる。腫瘍は転移性または非転移性腫瘍でありうる。
【０１１１】
適当には、本方法は、腫瘍細胞中での検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が対照細胞と比べて損なわれもしくは抑止されている場合、腫瘍を治療用抗体感受性腫瘍と分類する段階、または腫瘍細胞中での検出されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行が対照細胞と同じであるか、対照細胞と同様であるか、または対照細胞よりもさらに高い場合、腫瘍を治療用抗体抵抗性腫瘍と分類する段階をさらに含む。
【０１１２】
リガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行は、任意の適当な手段によって行われうる。受容体内部移行アッセイ法は、当技術分野において周知であり、その代表的な例は、Fukunaga et al. (2006) Life Sciences 80(1): 17-23; Bernhagen et al. (2007) Nature Medicine 13:587-596; natureprotocols.com/2007/04/18/receptor_internalization_assay.php)に記述されている。受容体内部移行を判定するための1つの周知の方法は、リガンドに蛍光標識、例えば、蛍光もしくは蛍光色素、例えばAlexa Fluor 488、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein; GFP)、または他の適当な標識薬剤をタグ付けすることである。受容体へのリガンドの結合により、蛍光顕微鏡検査法を用いて、受容体内部移行を可視化することができる。同様に、受容体(例えば、EGFR)に標識薬剤をタグ付けすることができ、蛍光顕微鏡検査法を用いて、受容体内部移行を可視化することができる。リガンド誘導性の受容体内部移行が試験細胞において低減される場合、それらの細胞において適切な対照細胞と比べて減少した蛍光内部移行が観察されよう(例えば、リガンドがエンドソームまたは小胞中ではなく受容体に結合する細胞の辺縁部でのみ蛍光が観察されうる)。もちろん、化学発光化合物、例えばルシフェリン; 2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノール; 放射性標識、例えば3H、125I、35S、14C、もしくは32P; 酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび免疫アッセイ法において一般的に用いられる他の酵素、ならびに比色標識、例えばコロイド金もしくは着色ガラスまたはプラスチックビーズ、例えばポリスチレン、ポリプロピレンもしくはラテックスを含めて、他の標識が蛍光標識の代わりに利用されてもよい。
【０１１３】
いくつかの態様において、受容体内部移行アッセイ法は、免疫学的結合アッセイ法を用いた細胞表面抗原の検出または定量化を含みうる(例えば、受容体内部移行アッセイ法の間に細胞表面上の細胞表面抗原または細胞表面抗原に対するリガンドの量を検出するために放射性標識抗体を用いる場合)。免疫学的結合アッセイ法は、当技術分野において広く記述されている(例えば、米国特許第4,366,241号; 同第4,376,110号; 同第4,517,288号; および同第4,837,168号を参照のこと)。一般的な免疫アッセイ法の概説については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Ten, eds., 7th ed. 1991)も参照されたい。一般的に用いられる免疫アッセイ法には、非競合アッセイ法、例えば、サンドイッチアッセイ法、および競合アッセイ法が含まれる。
【０１１４】
有利な態様において、本発明の腫瘍分類方法に用いられる受容体内部移行アッセイ法は、実施例において記述されているものである。
【０１１５】
細胞表面抗原/受容体(例えば、Her2/neu、EGFR、Epcam、VEGFR、FGFR、MUC-I、CA 125、CEA、MAGE、CD20、CD19、CD40、CD33、A3、A33抗体に特異的な抗原、BrE3抗原、CD1、CD1a、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD21、CD22、CD23、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD45、CD46、CD52、CD54、CD74、CD79a、CD126、CD138、CD154、B7、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR (例えば、HLA-DR10)、NCA95、NCA90、HCGおよびサブユニット、CEA (CEACAM5)、CEACAM-6、CSAp、EGP-I、EGP-2、Ba 733、KC4抗原、KS-I抗原、KS1-4、Le-Y、MUC2、MUC3、MUC4、P1GF、ED-Bフィブロネクチン、NCA 66a-d、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、SlOO、TAG-72、TlOl、TAG TRAIL-R1、TRAIL-R2、p53、テネイシン、インスリン増殖因子-1 (IGF-I)、Tn抗原など)の内部移行をアッセイするために必要とされる不可欠な材料および試薬(例えば、標識、抗体、リガンドなど)の全てが、キット内にともに集められてもよい。キットは、標識の検出に適した試薬、陽性および陰性対照、洗浄溶液、ブロッティング膜、マイクロタイタープレート、希釈用緩衝液などを任意で含んでもよい。そのようなキットは概して、適当な手段で、各個々の試薬用の別個の容器も含む。キットは、本明細書において記述されるアッセイ法の1つを行うためのさまざまな装置および試薬; ならびに/または受容体内部移行をアッセイするためにキットを用いるための印刷された使用説明書を特徴とすることもできる。
【０１１６】
いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、少なくとも一つには、適当にプログラムされたコンピュータシステムのような、処理システムによって行われる。マイクロプロセッサがアプリケーション・ソフトウェアを実行し、上記の方法を実施可能にするスタンドアローン型コンピュータが用いられてもよい。あるいは、本方法は、少なくとも一つには、分散型アーキテクチャの部分として稼働する1つまたは複数の処理システムによって行われてもよい。例えば、処理システムを用いて、受容体内部移行をアッセイすることができる。処理システムを用いて、腫瘍のリガンド誘導性の受容体内部移行状態、および/もしくは腫瘍の受容体治療用抗体感受性を判定することもでき、ならびに/または受容体内部移行状態に基づいて、対象を、受容体治療用抗体の応答者および非応答者から選択される処置亜群に層別化することもできる。いくつかの例において、使用者によって処理システムに入力されたコマンドは、これらの判定を行ううえで処理システムを補助する。
【０１１７】
1つの例において、処理システムは、バスによって相互接続された、少なくとも1つのマイクロプロセッサ、メモリ、入力/出力装置、例えばキーボードおよび/またはディスプレイ、ならびに外部インターフェースを含む。外部インターフェースは、処理システムを通信ネットワーク、データベース、または記憶装置のような、周辺装置に接続するために利用することができる。マイクロプロセッサは、メモリに保存されたアプリケーション・ソフトウェアの形式で命令を実行して、プロセス(例えば、リガンド誘導性の受容体内部移行状態の判定、および/もしくは腫瘍の治療用抗体感受性の判定、ならびに/または治療用抗体の応答者および非応答者から選択される処置亜群への対象の層別化)を実施可能にすることも、コンピュータシステムとの通信などの、任意の他の必要なプロセスを実施可能にすることもできる。アプリケーション・ソフトウェアは、1つまたは複数のソフトウェア・モジュールを含んでもよく、オペレーティング・システム環境などのような、適当な実行環境で実行されてもよい。
【０１１８】
本発明の腫瘍分類方法は、がんに罹患した対象を、治療用抗体の応答者および治療用抗体の非応答者に層別化するのに有用である。したがって、対象の腫瘍が、損なわれたまたは抑止されたリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると判定される場合、対象は治療用抗体療法に対する応答者と層別化される。逆に、対象の腫瘍が、損なわれていないリガンド誘導性細胞表面抗原の内部移行状態を有すると判定される場合、対象は治療用抗体療法に対する非応答者と層別化される。いくつかの態様において、この層別化が、今度は、がんに罹患した対象のより良好な管理を可能にし、その管理においては、治療用抗体とともに、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤が非応答者に同時投与される。しかしながら、対象を処置亜群に層別化するためのこれらの方法は、必要ではない。したがって、本発明は、対象が応答者もしくは非応答者であるか、応答者もしくは非応答者であることが分かっているか、または応答者もしくは非応答者であることが疑われるかどうかにかかわらず、治療用抗体および受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤を対象に同時投与することをさらに企図する。というのは、受容体を介したエンドサイトーシスの阻害剤の投与は対象における抗体応答者の状態の進展を刺激するか、対象における抗体応答者の状態を増強するか、または別の方法で維持するからである。
【０１１９】
本発明を容易に理解し、実践に移すことができるように、特に好ましい態様をこれから、以下の非限定的な例によって記述する。
【実施例】
【０１２０】
実施例1 ケラチン生成細胞腫瘍におけるEGFRの調節不全
材料および方法
材料
細胞株には、舌、咽頭および下咽頭に由来する例を含めてHNSCC由来の7種の株; SCC-9、SCC-15、SCC-25、Detroit-562、Cal 27、FaDu、およびColo-16が含まれる。加えて、さらに2種の株、形質転換されたヒト上皮ケラチン生成細胞に由来するKJD、および外陰部SCCに由来しかつEGFRを過剰発現することが知られているA-431を用いた。細胞株の同一性をSNP分析によって検証した。細胞はマイコプラズマを含まなかったが、定期的に試験した。細胞をHam's F-12培地: 10% FBS、10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM (Gibco, Invitrogen)中で増殖させた。基本条件の場合、細胞を完全培地中で、しかし10% FBSなしで3時間増殖させた。他の試薬には、Alexa488標識EGF (Invitrogen)、EGFR (クローン31G7; Invitrogen) Alexa-594ヤギ抗マウスIgG (A11005; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗マウスIgG (A10547; Invitrogen)、マウス抗フロチリン-1 IgG (610821; BD Transduction Laboratories)が含まれた。
【０１２１】
サンプル取得
SCCまたは表皮内がん(IEC)の疑いのある患者を医師が特定する。生きている組織サンプルを氷上で解剖病理学部に搬送し、そこで熟練した病理学者がサンプルを解剖し、実験室内試験に適した組織部分を提供する。日光角化症は通常は切除されないため本試験には特に要求されないものの、日光角化症(AK)であることが後に判明する任意の生検病変が含まれている可能性があり、非病変部の皮膚組織は切除標本の辺縁に由来する。
【０１２２】
EGFR刺激および取り込み研究
手短に言えば、サンプル調製に用いられる技法は、以下の通りである。患者より切除直後に臨床領域から組織サンプルを回収する。病理医が、小さい、代表的な切片を提供し、特定の方法でこれを薄片にする。サンプルを垂直に切って厚さがおよそ1 mmの切片を作製し、いずれの皮下脂肪も薄片作製の前に切除して少なくし、標本の全層を包含しうるように、ペトリ皿の中でサンプルの向きを定める。薄片作製は外科用メスまたはかみそりの刃を用いて手作業で行う。サンプルをその後、冷無血清培地の洗浄液中で最大1時間処理する。EGF (EGF-Alexa Fluor 488 -Invitrogen)をSFMに加え、さまざまな時点についてサンプルを37℃でインキュベートする。サンプルのなかには、対照としてEGFが加えられていないものもあれば、最初にセツキシマブが加えられているものもあり、リガンド結合が遮断されるべき対照としてのEGFの添加の前に30分間インキュベートする。適切な時点についてのインキュベーションの後、氷中で冷却し、0.1% Triton X-100を含む冷PBS (PBTx)中で洗浄することによって取り込みを停止させる。数回の洗浄の後、サンプルを4%パラホルムアルデヒド中で終夜固定する。
【０１２３】
ホールマウント免疫蛍光
デントの脱色液(Dent's bleach)、その後にサンプルを水性に戻すためのメタノール系列を用いてサンプルを脱色プロトコルに供する。次いで、さまざまな抗体を用い、PBTx中10%のウマ血清中でのインキュベーションによって過剰な結合をブロックして、免疫蛍光を行うことができる。ほとんどの場合、抗EGFR抗体(マウス抗EGFR、クローン31G7-Invitrogen)を用いて、受容体を可視化するが、複数の切片が利用可能な大きい腫瘍サンプルの場合、抗EEA1抗体および抗クラスリン抗体のような他の抗体をさらに用いてもよい。この後に、Alexaを結合した適切な二次抗体を用い、核染色のためにDAPIを加える。一部のサンプルは、二次抗体にだけ曝露させ、染色対照とする。サンプルを次に、ProLong Gold(商標)抗フェードマウンティング試薬(Invitrogen)を用いて中心がくぼんだスライド上にマウントし、Zeiss共焦点顕微鏡での画像化の前に密封する。
【０１２４】
画像化
Zeiss 510 Metaレーザー共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×でZen 2008ソフトウェアを用いてスライドを画像化した。組織学的特徴についてスライドを調べて、63×と25×の両方で表皮への局在化を確認した。気付いた特徴は、表皮真皮接合部および基底膜の存在、自己蛍光コラーゲンおよび細胞不足を伴う典型的な真皮外観、重層扁平上皮を伴うおよび異形成組織における表皮の典型的な外観、核多形性を伴う不規則さであった。表皮の厚さは、表皮肥厚として重要であり、過形成は異形成病変の特徴である。角質層においても、ともに異形成病変の特徴である肥厚を、不全角化と同様に認めることができる。表皮または浸潤性ケラチン生成細胞巣の複数の領域を63×で画像化して、EGF488の分布を明示する。可能な場合、代表的な腫瘍領域でzスタック画像を撮る。画像を倍率25×で撮ってまたはタイルを63×でスキャンして、標本の全体的な特徴を示す。
【０１２５】
画像分析
画像は経験豊富な研究者が細胞免疫蛍光法(スーパーバイザーFS)を用いて再検査し、Alexa-EGF488の分布の原則外観に基づいて「内部移行」または「調節不全」のいずれかに分類した。内部移行していた腫瘍のサンプルは、核からさまざまな距離のエンドソーム構造にグループ分けされる内部移行受容体に対応した点状の染色パターンを主に示す。EGF-488による刺激から30分後、調節不全の例では、原形質膜の位置と一致した分布で点状または半集密の染色を示す(図1)。
【０１２６】
Photoshopソフトウェアを用いて取り込みの程度の定量化を行った。このプロセスはデータ出力を提供するため、これを図式化して、利用できるだけの多くの画像に基づいて腫瘍サンプルごとに内部移行対調節不全の程度を示すことができる。
【０１２７】
Image Jソフトウェアを用いて核形態計測分析を行った。63×で撮影した、142.6×142.6マイクロメートルのサイズを有する共焦点像を利用した。EGF-488またはEGFR陽性を示す腫瘍の代表的部分から腫瘍像を撮影した。2500μm2の各像から、通常は50×50μm2の形態で標準的なサイズ域を撮った。サンプリングされた領域には、可能な場合、最も高いレベルのEGF取り込みが認められた基底細胞層の一部分が含まれた。真皮の領域または低い細胞性の他の領域ならびに自己蛍光によって引き起こされるような、異常または非特異的に見える着色の高いレベルを有するものを領域から除外した。画像は、可能な限り多くの核全てを強調し、次いで二値へ変換されるように閾値処理された。流域ツールを用いて、核の間に境界を挿入した。得られた画像をオリジナルの画像との類似性について調べた。適切な二値画像をその後、自動的に分析した。これによって、含まれた全ての核の付番および形態計測データセットの生成が得られた。これらには、核断面積、外周、最適楕円データ(外径および内径の長さならびに画像のx軸からの主軸の角度)、Feretデータ(最長カリパス/フェレ距離)、ならびに主にアスペクト比の形状パラメータ(内径の長さで割った最適楕円の外径の長さ)が含まれた。この分析から生成されたデータをプロットし、Graphpad Prism(商標) 5'ソフトウェアパッケージを用いて分析した。腫瘍組織と隣接皮膚対照との間のおよび異なる腫瘍間の比較は、対応のないデータについてのマンホイットニーU検定を用いて行われた。
【０１２８】
EGFR発現は、特異的抗体による免疫蛍光後に腫瘍および対照組織の画像に関してデジタル評価された。ソフトウェアパッケージNIS-elements(商標) (Nikon)を、高EGFR発現性のSCCおよび超低発現性の対照皮膚サンプルの例に対して標準化された設定で用いた。
【０１２９】
結果
腫瘍分析およびEGF取り込み
ホールマウント共焦点像による皮膚サンプル分析の最適化に取り組んだ。手作業による注意深い薄片作製は、加工処理されマウントされたサンプルに関して全ての皮膚垂直領域を明示するのに十分であった。これにより、対応する病理学的診断のうちの限定された一連の組織学的特徴について各切片を評価することが可能になった(図2および3)。これに加えて、核形態計測の初期分析により、腫瘍組織と正常皮膚との間の有意差(図4)や、異なる病理タイプの扁平病変間での核領域における有意ではないが、差異(図5)が実証された。
【０１３０】
サンプルごとに、記述した方法を用いて新鮮な腫瘍標本に関してEGF取り込み研究を行った。利用可能である場合、対照皮膚サンプルもプロトコルに供した。スーパーバイザー(FS)を用いてサンプル画像を再検査し、30分の時点で標識EGFの優勢な局在性に関して判定した(図6)。少数の事例では、適切な30分のサンプルを利用できなかったので、15分の時点のサンプルに関して判定を行った。適切な30分の時点の結果のある大抵の事例では、判定を15分の時点で行うことができたが、それは30分の結果と一致していた。結果として、腫瘍は、EGFが検査にて感知できるほどにエンドサイトーシスを受けている場合「内部移行」(図7)に、またはEGFが原形質膜に主に蓄積されているように思われた場合「調節不全」(図8)に分類された。
【０１３１】
予想通り、EGFR発現は腫瘍の浸潤縁の位置でおよび基底層中で最も強力であった(図9)。EGF-488が通常可視化されたのは、この領域中であった。最も基礎的なケラチン生成細胞層においてEGF局在性のいくつかの異なるサブタイプが顕著であった(図10)。特に、いくつかの腫瘍によって、基底部での著しいEGF取り込みの局在化が実証された。これは、これらの病変の浸潤性および浸潤能と一致している。
【０１３２】
検査のために病変29例を提供した患者は26人存在していた。患者は全て、色白タイプI〜IIIのものであった。基本的な個体群統計学的情報を、病歴の重要なデータとともに集めた。データが利用可能であれば、SCC発症の、および進行性、再発性または転移性SCCのリスク因子を記録した。患者の皮膚がん病歴に関する重要な情報も記録した。全ての患者が既往の皮膚悪性腫瘍を有していたが、全てが既往のSCCを有していたわけではなかった。0〜4の既往SCCが最も多く見られ、患者11人が5超の既往SCCを有し、最大は18であった。既往の高リスクSCCの病歴は、表1に概説されている腫瘍特異的な高リスク因子のいずれかを示した病変と定義された。
【０１３３】
（表１）皮膚扁平上皮がんにおける再発、転移または死亡のリスク因子(CRANMER ET AL., 2010; WOLLINA, 2012)
0006348115.tif 000009
【０１３４】
サンプル特徴は表2にまとめられている。
【０１３５】
（表２）患者特徴
0006348115.tif 000010
【０１３６】
腫瘍EGFR輸送分析の結果
上記のように病態およびEGFの取り込み状態に関して気が付いた悪性度または浸潤段階にしたがって腫瘍を特徴付けた。8症例(27%)では、EGF-488が認められず、これらは内部移行しているかまたは調節不全とされたかを判定することができなかった。組織が研究室に到達し、取り込み研究を行う時までに組織が生きていなかったことを含めて、いくつかの可能性がある。残りの症例のうち、17例(59%)ではEGFが内部移行していることが認められたが、4例(14%)では調節不全とされた(図11)。腫瘍タイプおよび患者リスク因子ならびに輸送状態の要約は、表3に示されている。
【０１３７】
（表３）腫瘍特徴
強調表示された病変コードは、単色で表された単一患者由来の病変を示す。腫瘍リスク因子は紫色で強調表示され、患者の高リスク因子は薄紫色で強調表示されている。EGFR輸送状態は内部移行(I)、調節不全(D)または可視化されず(N)として表されている。
0006348115.tif 000011
HR=高リスクSCC、Ag=侵襲性SCC、PNI=神経周囲の浸潤、IS=免疫抑制、PS=場合により再発性SCC (確認されない限りHRの独自の証拠と見なされない)
【０１３８】
3例のうち1例のAKおよび19例のうち3例のSCCは、調節不全とされた表現型のものであった(図11)。5例が内部移行および2例が可視化されずとなり、7例のIECのうちのどれも調節不全ではなかった。SCCのうちの5例も、可視化されずという範疇に入った。大部分の腫瘍は中分化型と分類された。エンドサイトーシス性またはそうでないと分類できなかったサンプルの大部分は、高分化度の腫瘍の中に入った(図12)。低分化型腫瘍は全て、分類することができた。これは、腫瘍組織のEGFR発現または他の特定の特徴のいずれかに関連しうる。3例の調節不全SCCのうち、各々が異なる悪性度の腫瘍の中に入った。組織像において浸潤レベルから深部レベルと報告されていなかったSCC 12例のうち、2例が調節不全とされ、7例の深部浸潤SCCのうち1例が調節不全とされた(図13)。およそ半分(15/29)の腫瘍は、腫瘍または患者因子のいずれかに基づき「高リスク」と分類することができた(図14)。調節不全腫瘍のうちの1例のみ(25%)が、17例の内部移行性の病変(internalizing lesion)のうちの8例(47.1%)とは対照的に腫瘍因子によって高リスクであった。しかしながら、調節不全腫瘍のうちの半分(2例)は、内部移行性の病変のわずか23.5% (4例)とは対照的に高リスク患者において生じていた。
【０１３９】
SCC病歴を評価した場合、データは、既往病変の数のピークに基づく3つの亜群への分割に役立った(図15A)。既往IECおよびAKは、これらのデータを得るのが極めて難しいので、考慮されなかった。調節不全腫瘍のどれも、既往SCCを有していない患者においては発生しなかった。調節不全腫瘍の4分の3は、5つまたはそれ以上のSCCの病歴を有する患者において見出され、調節不全腫瘍のどれも、既往の高リスクSCCを有する患者においては発生しなかった(図15B)。
【０１４０】
ケラチン生成細胞の基底領域および浸潤領域におけるEGFRの全発現レベルのデジタル分析を、内部移行腫瘍および調節不全腫瘍の、対応する対に関して行った(図16)。これにはAK、つまり高分化型SCCおよび中分化型から低分化型SCCの各部類内の1つの例が含まれた。輸送状態と全EGFR発現との間には相関関係がなかった。
【０１４１】
結論
生きているヒト組織のEGF取り込み研究を行った。分析は、ホールマウントレーザー共焦点蛍光画像法によって行われた。この技法を用いて、早期SCCおよび前駆病変における輸送状態を判定することができる。病理学的特徴を判定することができ、異形成ケラチン生成細胞集団を主観的および客観的尺度によって判定した。このデータセットから、以下の結論を下すことができる:
> 調節不全はSCCの発生における初期事象でありうる;
> 調節不全は、低リスクの特徴を有するSCCにおいてより多く見られる;
> 調節不全は、既往SCCを有していた患者において発生し、複数の既往SCCを有する患者においてより多く見られる;
> 調節不全は、SCCのリスクが高い患者において発生する;
> 調節不全は、EGFR全発現レベルに依らない。
【０１４２】
それゆえ、以下のことが提唱される:
> 調節不全は、既往SCCを有する高リスク個体において発生する可能性があり、より低侵襲性の腫瘍が優勢であることに関連している;
> 調節不全は、侵襲性腫瘍の特徴と強い相関があるようには思われず、全EGFR発現レベルと無関係である。
【０１４３】
実施例2 EGRFエンドサイトーシスはヒト扁平上皮がんにおいて調節不全とされる
材料および方法
細胞株
細胞株の同一性はSNP分析によって検証された。細胞はマイコプラズマ不含であり、定期的に試験された。細胞は、Ham's F-12培地: 10% FBS、10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM (Gibco, Invitrogen)中で増殖させた。新生児包皮由来の正常ヒト胎児ケラチン生成細胞(HEK)は、(11)において記述されているように培養された。EGF 2.5μgおよびBPE 25 mgを補充した低カルシウム無血清KC培地(Gibco, Invitrogen)中でHEK培養物を増殖させ、維持した。基本条件の場合、細胞を完全な、しかし10% FBS不含の培地中で3時間増殖させた。
【０１４４】
抗体
一次Ab: AKT (C67E6; Cell Signaling Technology)、クラスリン(BF-06; EXBIO) EGFR (528; Cell Signaling Technology)、EGFR (31G7; Invitrogen)、ERK2 (c-14; Santa Cruz)、ホスホ-EGFR (Tyr1068, D7A5; Cell Signaling Technology)、ホスホ-AKT (Ser473, D9E; Cell Signaling Technology)、ホスホ-44/42 MAPK (ERK1/2, Thr202/Tyr204, E10, Cell Signaling Technology)およびβ-チューブリン(2-28-33, Zymed)。二次Ab: Alexa 488ヤギ抗マウスIgG (A11001; Invitrogen)、Alexa 594ロバ抗ウサギIgG (A21207; Invitrogen)、Alexa 594ヤギ抗ヒトIgG (A11014; Invitrogen)、Alexa 594ヤギ抗マウスIgG (A11005; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗マウス(F21453; Invitrogen)、HRP結合ヤギ抗ウサギ(A10547; Invitrogen)。
【０１４５】
マウス異種移植片および患者SCCサンプルに対する蛍光EGF内部移行アッセイ法
PA Hospitalの同意および倫理承認を得て、PAH Pathology (手術後)からまたは処置室(生検)から氷上に、腫瘍サンプルを回収した。サンプルをおよそ1 mmのサイズに薄く切り、4℃にて基本培地中で10分間3回洗浄し、20 ng/mLのEGF-Alexa488 (E-13345; Invitrogen)を最終洗浄液に5分、15分または30分間加えておき、37℃に置いた。さらに、サンプルを処理しないまま放置し、15分間のEGF添加前の30分間25μg/mLのセツキシマブ(Erbitux; MerckSerono)で処理し、または10μg/mLのTfn-Alexa555 (Invitrogen, T-35352)もしくは10μg/mLのDextran-Alexa594 (Invitrogen, D-22913)で処理した。サンプルを30分間PBS + 0.1% Triton X-100 (PBTX)中で4℃にて5回洗浄し、その後、4℃にて4% PFA/PBS中で終夜(O/N)固定した。サンプルをPBS中で2回洗浄し、2時間4℃にて100% MeOH中に置いた。室温(RT)で2時間デントの漂白液(4 MeOH: 1 DMSO: 1 30% H2O2) (12)を用いて組織の自己蛍光を低減させた。メタノール/PBTX系列を用いてサンプルを再水和させた。サンプルを10分間DAPI (50 mM)とともにインキュベートし、PBTXで2時間洗浄し、PBS中で2回洗浄し、H2Oですすぎ、凹面顕微鏡スライド上にProlong Gold (Invitrogen)中にてマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×でZen 2008ソフトウェアを用いて画像を取得した。
【０１４６】
患者SCCサンプルに対するホールマウント免疫蛍光(IF)
ホールマウントサンプルを上記のように、しかし脱色段階の後に加工処理し、サンプルを10%ウマ血清/PBTX中で4時間ブロッキングし、4℃にてO/N、ブロック液中の一次Abとともにインキュベートした。PBTX中で5×20分の洗浄後、ブロック液中の、対応するAlexa Fluor 594二次AbをRTで1時間適用した。サンプルを10分間 DAPI (50 mM)とともにインキュベートし、マウントし、上記のように画像化した。
【０１４７】
切片IFおよびH&E染色
ホルムアルデヒド固定された腫瘍サンプルをパラフィン包埋し、4μmで薄片作製した。切片を再水和の前に1時間、加熱オーブン(56℃)中でインキュベートした。IFの場合、切片をキシレン処理し、標準的なアルコール系列を通じて再水和した。pH 9.0 Tris-EDTA緩衝液を用いた抗原回復の後に、切片をRTにて1時間4%ウマ血清/1% BSA/PBS中でブロッキングし、一次Abを4℃にてO/Nインキュベートした。ブロック液中での洗浄後に、Alexa fluor 488二次AbをRTにて1時間加えた。洗浄後、切片を上記のようにDAPI染色し、マウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ25×でZen 2008ソフトウェアを用いて画像を取得した。PA HospitalのPathology Queenslandによって標準的なH&E染色プロトコルが行われ、Nikon Eclipse 50i顕微鏡にて対物レンズ4×または20×を用い画像を取得した。
【０１４８】
定量的EGF内部移行アッセイ法
SCC細胞株を80%の密集度で100 mmのディッシュにプレーティングした。(13)において記述されているリガンド内部移行アッセイ法の修正版を行って、EGFの内部移行を測定した。基底化(basaling)の後、細胞を0、5、15または30分間37℃にて1 ng/mLのBiotin-EGF (E3477; Invitrogen)で処理した。細胞を氷上に置き、氷冷PBSで洗浄することによって内部移行を停止させた。1μg/mLのアビジン(Sigma)での洗浄、引き続き10μg/mLのビオチン(Sigma)でのクエンチングによって内部非移行型および膜結合型のビオチン-EGFをブロッキングした。非アビジン-ビオチン・ブロッキング対照を含めて、15分の時点での全EGFレベルを判定した。細胞をその後、冷PBS中で3回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)を含有するRIPA緩衝液150μL中で溶解させた。いくぶん修正を加えながらHuman EGF ELISA Kit (KHG0061; Invitrogen)を用いてEGFレベルを測定した。サンプル希釈液中のタンパク質溶解物(10μg)および2倍希釈系列(1 ng/ml〜15.6 pg/mL)のビオチン-EGF (標準曲線)を、ヒトEGFコーティング96ウェルプレート上にプレーティングし、2時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン-HRPを加え、プレートをRTで30分間インキュベートした。安定化色素原を洗浄後に加え、プレートを暗所中でインキュベートした。30分後、停止溶液を各ウェルに加えて、吸光度を450 nmで読み取った。アッセイ法は技術的2つ組として3回行った。
【０１４９】
蛍光EGF/Tfn内部移行アッセイ法
細胞をカバースリップ上に80%の集密度でプレーティングした。基底化(basaling)の後、細胞を5、15もしくは30分間37℃にて10 ng/mLのEGF-Alexa488もしくは25μg/mlのTFN-Alexa555で処理し、または処理しないまま放置した。細胞を冷PBS中で3回洗浄し、3% PFA中で固定した。さらなる洗浄の後、細胞をDAPI染色し、スライドグラスの上にマウントし、Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像化した。
【０１５０】
EGFRレベルのElisaアッセイ法
SCC細胞株およびHEKを100 mmのディッシュにプレーティングした。細胞を冷PBS中で3回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)を含有するRIPA緩衝液1501.11中に溶解した。STAR EGFR ELISA Kit (Millipore)を用いて全タンパク質溶解物12〜15μgからEGFRレベルを測定した。アッセイ法は技術的2つ組として3回行った。対応のないスチューデントのt検定を行って、GraphPad Prizm 5を用いHEKと比べて各SCC株のEGFRのレベルを比較した。
【０１５１】
免疫ブロッティング
SCC細胞株を100 mmディッシュ中に80%の集密度でプレーティングした。基底化(basaling)の後、細胞を5、15もしくは30分間37℃にて1 ng/mLのEGF-Alexa488で処理し、または処理しないまま放置した(対照およびEGFR)。細胞をその後、冷PBS中で3回洗浄し、溶解用緩衝液[50 Mm Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、1% Triton X-100、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(Calbiochem)] 4 mL中に溶解した。免疫ブロッティングのため、BCAアッセイ法(Pierce)によって判定された、等濃度のタンパク質溶解物をSDS-PAGEによって分離し、PDVF膜(Millipore)へセミドライ転写した。膜をTBS+0.1% Tween-20 (TBST)中2%のBSAの中でブロッキングし、4℃にて終夜(O/N)一次Abでプローブし、その後、10分間3回TBSTで洗浄した。膜を1時間、ブロック液中の対応する二次Abとともにインキュベートした。洗浄後、膜をECL (1:1のSupersignal West PicoおよびSupersignal Dura; Thermo Scientific)とともにインキュベートし、フィルム(FUGI)に曝露した。各実験を3回行った。
【０１５２】
結果
リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスは、生きているヒト腫瘍ではこれまでに調べられていなかった。それゆえ、本発明者らは、リアルタイムで、生きているヒト腫瘍においてEGFRエンドサイトーシスを画像化できる方法を開発しようとした。過去の研究によっては、二次元組織培養系での樹立細胞株モデルにおいてEGFRエンドサイトーシスが特徴付けられている(12)。しかしながら、これらは、インビトロにおいて認められた受容体輸送の生物学がインビボにおける受容体輸送を反映しえないことを示唆している報告である(13)。インビボにおいて、腫瘍細胞は、非形質転換細胞および結合組織要素で取り囲まれた三次元の微小環境内に存在する。腫瘍細胞とその間質環境(細胞性および非細胞性)との間の相互作用が、細胞挙動を決定付け、受容体生物学に影響を与える可能性が高いと考えられる。それゆえ、本発明者らは、新鮮な、生きているヒト腫瘍のエクスビボサンプルにおける、リガンド依存性のEGFRエンドサイトーシスを調べるための方法を開発した。
【０１５３】
リガンド刺激性のEGFRの取り込みは、生きた異種移植片組織において可視化することができる
ヒト腫瘍を用いる前に、本発明者らは、NOD/SCIDマウスへ注射された樹立SCC細胞株の異種移植片モデルを用いてその方法論を最適化した(14)。本実施例の材料および方法において記述されているように腫瘍を切除し、加工処理した。取り込み後、記述されているように組織を固定し、漂白した。サンプルをその後、顕微鏡検査ウェル中にマウントし、共焦点顕微鏡検査によって分析した(図17)。全ての異種移植片腫瘍が、インビトロにおいておよびインビボにおいて15分の時点で特異的なEGF結合およびさまざまな程度の受容体内部移行を実証した(図17)。異種移植片腫瘍は、単層培養されたその対応物と同様の取り込みを示した。
【０１５４】
EGFRリガンド誘導性のエンドサイトーシスは、およそ60%のヒトSCCにおいて調節不全とされる
その方法を異種移植片において検証してから、本発明者らは、ヒト腫瘍においてリガンド依存性のEGFR内部移行を分析した(図18)。ここでは、手術時に切除されたまたはコア生検から得られた、生きているSCC腫瘍サンプル8例について調べた。これらの態様において、組織は、取り込みが行われるために非凍結、非固定かつ非壊死とされなければならない。8例中3例の患者において、エンドソーム構造へのEGFの取り込みが、患者AC3Pについて示されたように、認められた(図18A)。8例中5例の腫瘍はEGFの原形質膜結合を示すも、ほとんど内部移行を示さず(図18B、表4)、とはいえ、30分後にわずかな細胞亜集団(全腫瘍細胞のおよそ2〜5%)においては内部移行が認められる。内部移行の欠如は、患者サンプルの生存性の喪失に起因しえない。というのは、本発明者らは、これらの同じサンプルにおいてデキストランの取り込みおよび/またはトランスフェリン受容体(TfnR)の内部移行の両方を示すことができたからである。非生存性のサンプルでは、組織の自己蛍光レベルを上回る結合または取り込みは示されなかった。対照には、EGF添加なしおよび4℃を含めた。EGF蛍光の特異性をさらに検証するため、腫瘍サンプルを高濃度のセツキシマブ、つまりEGFRのリガンド結合ドメインに結合し、かつSCC治療において用いられるモノクローナル抗体とともにプレインキュベートした。事前のセツキシマブの結合によって、EGF-Alexa488の結合および取り込みが抑止されることが分かった(図18C)。サンプル固定化後の抗EGFRによる標識によって、EGF-Alexa488の同時局在が示された(図18D)。最後に、認められたEGFの結合および取り込みが異形成/腫瘍形成細胞においてのみ行われたことを確認するため、患者AC3PおよびDP5に対する未処理組織(切除時にホルマリン固定された)サンプルの連続切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)または蛍光標識された抗EGFR Abで染色した。H&E染色(図19)によって示されるように、異形成細胞においてのみ検出可能なレベルまでのEGFR染色が実証可能であった。
【０１５５】
（表４）腫瘍特徴
0006348115.tif 000012
a 非特定化された患者コード
b 腫瘍が切除された部位
c EGF刺激後のリガンド誘導性のEGFRエンドサイトーシスの状態
【０１５６】
SCC細胞株におけるEGFR内部移行は、初期受容体濃度およびエンドサイトーシスの動員段階において調節不全とされる
次に、本発明者らは、リガンド依存性のEGFR輸送状態とEGFR発現レベルまたはリガンド誘導性のシグナル伝達との間に相関関係が存在するかどうか調べた。ヒトSCCサンプルも樹立ヒトSCC細胞株もともに、さまざまな程度のリガンド依存性EGFR内部移行の機能不全を呈することが示された(図17および18)。したがって、SCC細胞株は、EGFR内部移行の機能不全とEGFR発現またはシグナル伝達活性との間の相関関係を調べるのに有用なモデルである。低濃度の組み換えEGFリガンドを用いて、取り込みがクラスリン被覆ピットによって媒介されたことを確認した(15)。表示した細胞株の各々について、記述(実施例2の材料および方法)されているように標準的なエンドサイトーシスアッセイ法を用いてビオチン化EGFの内部移行を測定した。15分の時点の全EGF結合に対する割合としての、受容体内部移行を、細胞株ごとに30分の時間的経過にわたって測定した(図20A)。全結合の測定の時点として15分を選んだ。というのは、この時点の後に、受容体の分解が増すからである。最初の5分におけるリガンド刺激性のEGFR内部移行は、リガンド結合の初速度およびリガンド結合が受容体エンドサイトーシスを刺激する効率の推定値を提示する。対照的に、15分の時点で測定された内部移行は、EGFRを結合させ内部移行させる、細胞の相対能力を反映している。8例のヒトSCC細胞株は、5分以内にリガンドを結合させ内部移行させるその能力がかなり異なっており、興味深いことに、ヒト腫瘍サンプルよりも低い調節不全を示し、異種移植片または腫瘍モデルとは対照的に、培養下の細胞株の応答間でこれまでに認められた差異を反映していた(16)。
【０１５７】
EGFR内部移行の調節不全は、初期段階においてEGFR発現レベルと相関しない
各細胞株におけるEGFR発現レベルを、ELISAアッセイ法によって測定した(図20B)。EGFR発現とEGF依存性の受容体内部移行の初速度(5分)との間には相関がなかった(図20C)。しかしながら、EGFR発現レベルとEGFRを内部移行させる細胞株の全能力(15分)との間には関連性があった(図20D)。EGF-Alexa488を生化学的実験におけるビオチン-EGFの場合のようにカバースリップ上の細胞に加えた。時点を固定し、画像化した。各細胞株における免疫蛍光の取り込みは、取り込みのアッセイレベルと相関していた(図20E)。したがって、リガンド結合および内部移行の初速度定数は、受容体数と無関係であるように思われ、リガンド結合と内部移行の連関に付随する直接の効果がSCCにおいて調節不全とさせうることを示唆している。
【０１５８】
調節不全はどの単一のシグナル伝達障害とも相関しないが、経路障害と相関する
EGFR発現と初期内部移行速度が連関しないことは、クラスリン被覆小胞(CCV)へのリガンド誘導性の動員の障害またはCCV形成の調節不全を示唆する。しかしながら、TfnR内部移行の分析からは正常な取り込みが示され、エンドサイトーシスの障害がSCC細胞株におけるEGFRのリガンド誘導性の取り込みに特異的であることを示唆していた(図20F)。これらのデータから、調節不全は、リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスの全般的な障害ではないことが示される。リガンド依存性の受容体エンドサイトーシスの障害は、リガンド誘導性のシグナル伝達事象の障害を反映しているものと予想された。それゆえ、ウエスタンブロッティングにより全ての細胞株のシグナル伝達のアウトプットについて調べた(図21)。細胞を、同じ時間的経過にわたり上記のエンドサイトーシスアッセイ法について記述されたようにEGFで刺激した。生物学的3つ組みを、時点ごとにおよび細胞株ごとにプローブした。溶解物をEGFR、ホスホEGFR、チューブリン、全ERK、ホスホERK、全AKTおよびホスホAKTについてプローブした(図21)。細胞株間でシグナル伝達の大きなバラツキが認められたが、これとEGFRレベルとの間の相関は認められず、単一のシグナル伝達の変化はエンドサイトーシスの障害と相関していなかった。
【０１５９】
分析から、EGFRの構成的リン酸化とEGFR内部移行の速度または能力との間には明らかな相関関係のないことが示唆された(図21)。EGF結合に応答するERKおよびAKTの能力とEGFR内部移行の速度または能力との間に関連性はなかった(図21)。全AKTまたはERKレベルの発現とEGFR内部移行の速度または能力との間には相関関係がなかった(図21)。ホスホAKTに対する免疫組織化学によって調べられた異種移植片サンプルにおいて類似の関連性が認められた。これらのデータから、リガンド依存性のEGFR内部移行はリガンド刺激性のEGFRリン酸化またはリガンド結合ERKおよびAKTシグナル伝達の、単一の障害によるものではないことが示唆される。
【０１６０】
しかしながら、EGFR内部移行の変化を示した各細胞株はまた、シグナル伝達の1つまたは複数の変化を有していた; かくしてEGFR内部移行の変化は、複雑なフィードバック機構によるシグナル伝達経路の破壊に対する全般的バイオマーカーでありうる。
【０１６１】
EGF内部移行の調節不全は、予め刺激された組織の固定化後のEGFR標識を用いて可視化することができる
最後に、本発明者らは、腫瘍サンプルにおける受容体輸送の障害が正常な組織病理学的標本において可視化されうるかどうか調べた。詳細には、ここでは、15分間EGFで刺激された腫瘍サンプルの固定化後の標識について試験し、本実施例の材料および方法において記述されているように組織を加工処理し、サンプルを抗EGFR Abで標識した(図22)。刺激は、単に無血清培地中の新鮮腫瘍サンプルにEGFを加えることによって行われた。固定化後の標識によって観察されたEGFRの局在性は、本発明者らがEGFリガンドの直接画像化で観察した結果を反映していた(図18AおよびB)。かくして、刺激後、EGFの直接標識とは対照的に二次Ab標識からの蛍光の増大という利点を伴って、EGFRの標識を用いてもSCCを、エンドサイトーシス能有りまたは調節不全に分類することができる。
【０１６２】
考察
抗EGFR療法に対する患者応答と腫瘍生物学との間の相関関係を判定しようと、相当な国際的努力がプロテオミクス、ゲノミクスおよびトランスクリプトミクスに費やされてきた。しかしながら、ヒト腫瘍における受容体の輸送および時空的調節を特徴付けることは可能ではなかった。本発明者らは、エクスビボの状況においてヒト腫瘍サンプルにおけるリガンド結合および受容体を介したEGF/EGFRエンドサイトーシスを調べるための方法を開発した。ここでは、EGFRエンドサイトーシスがヒトSCCにおいて高い頻度で調節不全とされていることが実証された。ヒトSCC細胞株の調査からも、EGFRのリガンド誘導性の動員の初期段階に影響を与えるものと思われたEGFRエンドサイトーシスの調節不全が明らかにされた。最後に、EGFRエンドサイトーシスの機能不全は、EGFR発現レベル、EGFRリン酸化との、またはAKTもしくはERKのような下流のエフェクタの活性化との、単一の相関関係がないことが示されたが、EGFRエンドサイトーシスの調節不全は全般的なシグナル伝達機能不全のバイオマーカーでありうる。これによって今回、EGFR輸送と、予後、腫瘍進行、EGFR阻害剤抵抗性および獲得抵抗性との間の潜在的な関係を上皮腫瘍において調べることが可能になる。
【０１６３】
詳細には、本発明者らは、ヒトSCC腫瘍の60%においてEGFRがリガンド誘導に応じてエンドサイトーシスを受けないことを見出した。受容体チロシンキナーゼ(RTK)の発がん活性化におけるエンドサイトーシスの機能停止が、最近になって詳細に再調査されており(17)、RTK METを介した腫瘍形成の増強がそのエンドサイトーシスの速度および局在性に依存することを示す最近の報告のなかで取り上げられている(18)。EGFRレベルが原形質膜の位置で濃縮されるような細胞においては、EGF刺激がMAPKおよびPI3Kの両方の経路の持続的活性化をもたらす(17)。低酸素状態の下で、多くのRTKが持続的活性化を示し、この機構は不明であるが、その効果は発がんの増大である(19)。したがって、EGFR内部移行の阻害は発がんまたは進行の機構であるかもしれない。
【０１６４】
SCC細胞株におけるエンドサイトーシスの即時分析から、EGFR取り込みの主な調節不全が、リガンド添加後の最初の5分で起きることが明らかである。これは、原形質膜からの受容体を介したEGFR内部移行が行われないといったヒト腫瘍における本発明者らの所見と一致する。刺激の初期段階は、膜ドメインからCCVへの活性化EGFRの動員に要する時間に相当し、EGFRオリゴマー化、ユビキチン化、皮質アクチンの変化および脂質に富むドメインから離れるEGFRの拡散を包含する。これと一致して、構成的にエンドサイトーシスを受けたTfnRの内部移行の変化は見出されず、クラスリン媒介性のエンドサイトーシスが機能的に完全なままであることを示唆していた。
【０１６５】
SCC細胞株におけるEGFR発現レベルおよびシグナル伝達の本分析から、エンドサイトーシスの調節不全が動員相におけるEGFR発現レベルと相関しないことが示唆される。正常なエンドサイトーシスを有する細胞は、正常なシグナル伝達のアウトプットも示す傾向があったが、内部移行の調節不全を有する細胞は、シグナル伝達のアウトプットを乱していた。しかしながら、単一のシグナル伝達のアウトプットをエンドサイトーシスの調節不全に関連付けることはできなかった。他のErb-B受容体ファミリーメンバーの発現の増大および脂質ラフトの増大につながるコレステロールレベルの変化も、原形質膜上でのEGFR保持に影響を与えると考えられる。治療法はEGFRそれ自体に向けられるので、EGFRの局在性および露出のこの変化は治療応答に影響を与える可能性が高く(20)、上皮がんでのリガンド結合に応じたEGFRのエンドサイトーシス能の診断は、治療応答および腫瘍進行の変化をもたらすいくつかの細胞内変化の全般的バイオマーカーとして機能するかもしれない。
【０１６６】
実施例3 抗EGFRモノクローナル抗体療法を改善するためのEGFR輸送の操作
材料および方法
セツキシマブ媒介性の増殖阻害MTSアッセイ法
セツキシマブ媒介性の増殖阻害効果をCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)によって測定した。A431細胞(1ウェルあたりの数=1000、2500および5000個)を96ウェル平底プレート中に播種し、終夜インキュベートして接着させた。細胞を次いで48時間、0から100μg/mLに及ぶさまざまな濃度のセツキシマブに曝露した。MTS試薬20μLを各ウェルの中に加え、2時間、5% CO2中37℃でインキュベートした。マイクロプレート分光光度計により490 nmで光学密度(OD値)を読み取った。非処理対照と比べて処理細胞のOD値の比較により、細胞増殖率を示した。
【０１６７】
セツキシマブ媒介性のADCC MTSアッセイ法
セツキシマブ媒介性のADCC効果をCellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)によって測定した。標的細胞(A431、1ウェルあたりの数=2,500個)を96ウェル丸底プレート中に播種し、2時間定着させた。標的細胞を次に、エフェクタ細胞(PBMC)とともに50/1のE/T (エフェクタ/標的)比でセツキシマブ(60μg/mL)あり/なしとし5% CO2中37℃にてインキュベートした。24時間のインキュベーション後、MTS試薬20μLを各ウェルの中に加え、2時間、5% CO2中37℃にてインキュベートした。マイクロプレート分光光度計により490 nmで光学密度(OD値)を読み取った。非処理細胞と比べてセツキシマブ処理細胞の比較により、細胞生存率を示した。
【０１６８】
フローサイトメトリーに基づくADCCアッセイ法
フローサイトメトリーを処理ごとに三つ組の試験管にて行った。標的細胞を収集し、10分間0.5μM CFSE (Life technologies)で標識し、その後に洗浄して過剰な色素を除去した。CFSE標識された標的細胞を次に、試験管あたり細胞20,000個の濃度でプレーティングし、60μg/mLのセツキシマブおよび新鮮PBMC (E/T=50/1)とともに4時間インキュベートした。30μMのDyngo4aを図の説明に記述されているように所与の時点で加えた。インキュベーション後、7-AAD (BD Pharmingen) 5 ulを各試験管の中に加えて、死滅した標的細胞を示した。サンプルをフローサイトメトリー(BD FACSCanto)によって分析した。以下の式:
0006348115.tif 000013
を用いて特異的な標的細胞死の割合を計算した。
【０１６９】
Dyngo4a阻害効果の免疫蛍光
A431細胞を12ウェルプレート内のカバースリップ上に播種し、80%の密集度に達するまで終夜インキュベートした。細胞を3時間の血清飢餓後に30分間、異なる濃度のDynasore(0および30μM)で処理し、続けて15分のEGF-Alexa488 (100 ng/mL)の取り込みを行った。EGFの取り込みは氷冷PBS中での3回の洗浄によって停止した。細胞を30分間4% PFA/PBS中で固定し、30分のDAPI染色の前にPBS中で3回洗浄した。カバースリップを、スライド上にProlong Gold (Life technologies)中でマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像を取得した。
【０１７０】
セツキシマブ-EGFR内部移行の免疫蛍光
A431細胞を12ウェルプレート内のカバースリップ上に播種し、80%の密集度に達するまで終夜インキュベートした。細胞を4時間、60μg/mLのセツキシマブとともにインキュベートした。30μMのdyngo4aを図の説明に記述されているように所与の時点で加えた。細胞をその後、氷冷PBS中で3回洗浄し、30分間4% PFA/PBS中で固定し、その後に20分間、0.1% TritonX/PBS (PBTX)中での透過処理を行った。セツキシマブを1時間の二次抗体(Alexa647ヤギ抗ヒトIgG, Life technologies)とのインキュベーションによって標識し、引き続き2% BSA/PBSでのブロッキングおよび30分のDAPI染色を行った。カバースリップを、スライド上にProlong Gold (Life technologies)中でマウントした。Zeiss 510 Meta共焦点顕微鏡により、対物レンズ63×で画像を取得した。
【０１７１】
結果
MHC分子が免疫系の腫瘍細胞回避において重要な役割を果たすので、本発明者らは、SCC細胞におけるEGFR輸送とMHC I & II発現とを関連付けた。詳細には、ここでは、HeLa細胞と比べA431細胞において、エンドサイトーシスの阻害がMHC I & IIのレベルおよび/または分布の変化を引き起こすかどうかを免疫蛍光(IF)によって試験した。これらの細胞株を選んだ理由は、A431が、高いEGFR発現レベルを有するSCC細胞株であり、発がん的にRTKシグナル伝達に高度に依存しているからである。A431細胞はまた、増殖の阻害に関してセツキシマブ感受性細胞株のモデルとして使用される(21, 22)。HeLa細胞は、EGFRの上方制御を有しない非SCC細胞株である。
【０１７２】
細胞透過性ダイナミン阻害剤であるDynasore(23, 24)を用いて、EGFR輸送を操作した。ラージGTPaseであるダイナミンは、原形質膜の位置でのクラスリン被覆小胞形成における重要なメディエータとして機能するので、エンドサイトーシスにとって重要である(23)。Dynasoreは、ダイナミンのGTPase活性を阻害する小分子であり、それゆえ、原形質膜に小胞を止めることによって中間段階でダイナミン依存性のエンドサイトーシスを完全に遮断することができる(24)。Dynasoreは、エンドサイトーシスの研究においてよく用いられており(23〜26)、Dynasoreは、速く(数秒で)作用し、インビトロにおいてその阻害効果は洗い流しによって元に戻されうる(23)。Dynasoreプロトコルは、HeLa細胞におけるDynasore媒介性のエンドサイトーシス阻害が15μM前後のIC50で用量依存的であったという過去の研究にしたがって、デザインされた(23)。EGF-Alexa488の取り込みを行って、リガンド誘導性の内部移行におけるEGF結合EGFRの移行をモニタリングした。
【０１７３】
図23Aは、Dynasoreがエンドサイトーシス阻害剤としてうまく機能し、Dynasore陰性対照と比べて原形質膜上に蓄積しているEGFRのレベルの増大を引き起こしたことを示す。図23Bの上段パネルは、Dynasoreの添加の増大とともにMHCIシグナルが増大することを示し、下段パネルはMHCIIシグナルの減少を示す。複数のパネルを含む、EGF、Dynasore、IFNγおよびTriton透過処理ありまたはなしを含めて、異なる実験条件の分析にわたって、本発明者らは以下を結論付けた。
【０１７４】
A431細胞において:
・ IFNγの添加は、得られた全体の結果に影響を及ぼさなかったが、MHC発現の全レベルを増大させ、いっそう容易な可視化を可能にした。
・ MHCIの原形質膜染色のわずかな減少がEGF刺激後に認められた。MHCIの原形質膜レベルは、EGF刺激をDynasore阻害と連関させた場合にはもはや検出できなかった。これは興味深かった。というのは、SCCにおける高レベルのEGFR発現がMHCIの表面発現の喪失につながり、腫瘍回避を増大させうるからである。
【０１７５】
Dynasore 24時間処理:
・ A431細胞において、24時間を超えるDynasore処理は、細胞核凝縮を示し(図24A下段パネル)、その一方でHeLa細胞はアポトーシスまたは細胞質分裂の欠陥を有するように思われた。
【０１７６】
細胞株でのセツキシマブ誘導性応答の主なエフェクタについて調べるため、本発明者らは、単一の処理として、また免疫エフェクタ細胞の存在下において、腫瘍細胞に及ぼすセツキシマブの効果について試験した。過去の研究においてセツキシマブ感受性の細胞株として用いられたA431細胞を、48時間セツキシマブのみに最初に暴露した。細胞生存性をMTSアッセイ法により測定して、増殖阻害効果を示した。全体でセツキシマブは用量依存的に有意な細胞生存性の低減を誘導しなかった(図24A)。セツキシマブは、細胞数の増加とともにA431に対していっそう高い阻害効果を示したが、これは、処置中に100%の集密度に達し、増殖の接触阻害を引きこした細胞培養によるものでありうる。その後、A431細胞を48時間、健常ボランティアの新鮮全血から分離されたPBMC (末梢血単核細胞)の存在下においてセツキシマブで処理した。細胞生存性をMTSアッセイ法によって測定し、ADCC効果を示した。図25Bは、セツキシマブがA431細胞に対してADCC効果を誘導したことを示す。興味深いことに、100μg/mLのセツキシマブは、60μg/mlと比べて有意に増大した細胞生存性の低減を引き起こさなかった。これは、実験において用いられた濃度が、文献(27)において報告されている有効な濃度(10〜0.01μg/mL)よりも共にずっと高かったという事実によるかもしれず、用量の最適化のためにはさらなる実験が必要とされうることを示唆している。上記の結果は、セツキシマブの効果が本発明者らのA431細胞においてシグナル伝達阻害依存性というよりもむしろ、免疫応答依存性であるという結論につながる。
【０１７７】
次に、本発明者らは、MTSアッセイ法を用いて、ダイナミン阻害剤dyngo4aの存在下でのA431細胞に対するセツキシマブ媒介性のADCCについて試験した。注目すべきことに、Dyngo4aのみでおよびセツキシマブによって、陰性かつ細胞死(10% Triton)対照と比べて、PBMCの細胞生存性の大きな低減を引き起こさなかった(図25A-II)が、セツキシマブおよびDyngo4aを組み合わせて加えた場合、セツキシマブ単一の処理と比べて、細胞はより多くの生存性を失った(図25A-III)。
【０１７８】
実施例4 ダイナミン阻害剤DYNGO4Aは、EGFR内部移行の増大を有する細胞に対して抗EGFRモノクローナル抗体療法の効力を大幅に改善させる
セツキシマブ結合性の細胞株A431 (図26、図27A)、および低レベルの原形質膜結合セツキシマブを示した細胞株KJD (図26、図28A)に関しても、さらなる分析のために比較実験を行った。本発明者らの仮説では、EGF刺激性のEGFR輸送が阻害された場合、EGFRの原形質膜レベルの比例的増大と、ADCCの類似した比例的増大をもたらすものと予測された。したがって、ダイナミンの可逆的な低分子量阻害剤Dyngo4aの効果を、A431細胞およびKJD細胞の両方において、セツキシマブ誘導性のADCCに関して試験した。図27Aは、A431細胞においてADCCアッセイ法の4時間の時間的経過にわたりセツキシマブが原形質膜と内部移行構造の両方に局在化されうることを示す。セツキシマブは4時間の時点で依然として表面に曝露されており、これによってADCCが可能であると考えられる。Dyngo4aの添加は、セツキシマブの表面レベルを増加させ、内部移行レベルを減少させる。図27Bおよび27Cは、A431のおよそ38%がセツキシマブ誘導性のADCCの結果として死滅したことを示す。予想通り、Dyngo4aによるEGFRエンドサイトーシスの阻害は、EGFRの原形質膜レベルを増加させ、セツキシマブ誘導性ADCCのレベルの増大をもたらした。ADCCアッセイ法の繰り返し実験は、複数アッセイにわたって統計分析を可能とするように、特異的な最高の腫瘍細胞死滅率に対する割合(%)として表現された。このデータから、特異的な腫瘍細胞死の有意な増加がDyngo4a添加の複数のプロトコルにわたって認められ、4時間のADCCアッセイ法のうちの最後の1時間中の高度に可逆性であるDygno4aの添加が最も高い効率を示したことが明らかである。KJD細胞は、セツキシマブ媒介性のADCCに抵抗性である。予想通り、セツキシマブとの4時間のインキュベーション後であっても原形質膜上に低レベルのEGFRを発現するKJD細胞(図28A)は、比較的低レベルのセツキシマブ誘導性ADCCを示す(およそ10%の細胞死滅; 図28C.1およびC.2)。セツキシマブの代わりにIgGアイソタイプ対照を加えることでは、PBMC単独を上回って改善されたADCCは示されなかった(データは示されていない)。意義深いことに、Dyngo4aとのインキュベーションは、EGFRの原形質膜発現を増加させ(図28A)、40%超の細胞死滅にまでセツキシマブ誘導性のADCCを増加させた(図28C1および4C2)。Dyngo4a単独ではやはり、腫瘍細胞を死滅させなかった。A431細胞にて認められた効果と同様に、KJD細胞死の増大は、4時間のADCCアッセイ法のうちの最後の1時間にだけDyngo4aを加えた場合に最大であった。免疫蛍光分析(図29)から、Dyngo4aがリガンド誘導性のEGFRエンドサイトーシスに阻害効果を及ぼすことが明らかである。
【０１７９】
実施例5 ダイナミン阻害剤DYNGO4Aおよびピリミジン-7は、セツキシマブ感受性細胞およびセツキシマブ抵抗性細胞に対する抗EGFRモノクローナル抗体療法の効力を増強する
化合物Dyngo4aおよびピリミジン-7を、実施例4に記述されているように多変量FACS分析アッセイ法においても、MTTアッセイ法によっても試験した。詳細には、化合物をセツキシマブ感受性A431細胞およびセツキシマブ抵抗性KJD細胞に対する、セツキシマブ依存性ADCCの改善と単剤毒性について試験した。多変量FACS分析により、Dyngo4aもピリミジン-7もともに、セツキシマブ依存性ADCCを改善することが分かった(図30A〜D)。Dyngo4aの場合、ADCCの改善は全て、セツキシマブおよびPBMCの存在に依存していた(図30B)。ピリミジン-7を導入した場合、セツキシマブの非存在下においてADCCにより細胞死のいくらかの増加が認められた(図30C)。PBMC、KJDまたはA431細胞のいずれかに加えられた場合に、Dyngo4aが単剤としての毒性を持たないことがMTTアッセイ法から示された(図30E〜F)。ピリミジン-7は、腫瘍細胞株およびPBMCの両方に対して単剤毒性を示した(図30E〜F)。このように、Dyngo4aはこれらの実験において最小の単一化合物毒性を示し、両ダイナミン阻害剤はセツキシマブ媒介性ADCCを改善することができる。
【０１８０】
実施例6 ダイナミン阻害剤は、ハーセプチン感受性細胞およびハーセプチン抵抗性細胞に対する抗ハーセプチン・モノクローナル抗体療法の効力を増強する
Dyngo4aを、実施例4および5に記述されているように多変量FACS分析アッセイ法において、A431細胞およびKJD細胞に対するセツキシマブ依存性およびハーセプチン依存性ADCCの改善について試験した。注目すべきことに、Dyngo4aはA431細胞およびKJD細胞のセツキシマブ依存性およびハーセプチン依存性の両方のADCCを増強することがわかった(図31A〜B)。セツキシマブ依存性ADCCと同様に、Dyngo4aは、A431細胞のハーセプチン依存性ADCCよりもKJD細胞のハーセプチン依存性ADCCをさらになお増強することが分かった。というのは、KJD細胞がその表面にA431細胞よりも少ないHer2受容体を有し、その結果として、ハーセプチン媒介性のADCCに対してA431細胞よりもさらに抵抗性だからである。
【０１８１】
実施例7 三次元構造化照明(超解像)顕微鏡法(3D-SIM)によるEGFR輸送の分析
材料および方法
超解像顕微鏡法
三次元構造化照明顕微鏡法(3D-SIM)の場合、Deltavision OMX V3 Imaging System (Applied Precision)、EMCCDカメラ(CascadeII 512×512 Photometrics)、および60× 1.4-NA UplanSApo油浸対物レンズ(Olympus)を屈折率1.524の油とともに用い、画像を捕捉した。画像は10%のレーザー出力にて、3〜6.5μmの厚さにわたって23〜53段階でZステップ0.125μmにより取得された。画像は、Deltavision SoftWorX6.0 Beta19 (Applied Precision)を用いてコンピュータにより再構築された。
【０１８２】
結果
本発明者らはまた、患者サンプル内でのEGFR輸送差をより明確に示すために三次元構造化照明(超解像)顕微鏡法(3D-SIM)によって腫瘍サンプルを分析した。図32Aは、EGFRがEGF誘導性の内部移行を起こさず、原形質膜局在だけが観察されうる患者を示し、その一方で図32Aはまた、正常に内部移行しているEGFRの患者を示し、この場合にはヒト細胞エンドソームが明確に観察されうる。EGFRとクラスリンとの同時局在(図32B)から、EGFRを内部移行できない患者サンプルでは、膜へのクラスリンの動員がEGFRリガンド刺激に応じて減少し、トランスゴルジ網への分布の増大を有するように思われることが実証された。
【０１８３】
要約
要約すると、本発明者らは本明細書において、生きているヒト腫瘍サンプルにおいてEGF誘導性のEGFR内部移行をモニタリングするための新規の画像化アッセイ法について記述する。これは、ヒトSCCを、EGFR輸送能あり、またはEGFR輸送能無しのいずれかに分類できることを示す。加えて、それらは、EGFR輸送状態がEGFR原形質膜発現レベルに寄与しえ、これが今度は、標的SCC細胞のセツキシマブ誘導性ADCCの予測となることを示す。さらに、本発明者らは、ダイナミンの阻害剤(Dyngo4aのようなダイナミンの可逆的阻害剤を含む)のようなエンドサイトーシス阻害剤を用いて、セツキシマブ感受性のSCC細胞において特異的な腫瘍細胞死滅を増大させることができ、重要なことには、セツキシマブ誘導性のADCCに対して非感受性であるSCC細胞を、セツキシマブ誘導性のSCCに対して感受性である細胞に変換させることができることを示す。これらの所見に基づき、EGFR受容体が原形質膜にトラップされている患者は、モノクローナル抗体療法に最もよく応答するものと予測される。本発明者らはまた、患者におけるセツキシマブとのエンドサイトーシス阻害剤の同時投与が、EGFRの原形質膜発現およびセツキシマブ感受性を増強するように作用しうることを提唱する。本発明者らは、この主作用が、例えば実施例6において証明されるように、抗VEGFR、抗FGFR、抗CD20および抗Her2/neu (例えば、ハーセプチン)抗体療法のような他の抗体療法に当てはまることを提唱する。
【０１８４】
本明細書において引用されたあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８５】
本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参照が、本出願に対して「先行技術」として利用できると認めたと解釈されるべきではない。
【０１８６】
本明細書を通して、目的は、本発明の好ましい態様を説明することであり、本発明を任意の1つの態様にまたは特色の特異的なコレクションに限定することではない。それゆえ、当業者は本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、実例となる特定の態様においてさまざまな修正および変更を行うことができることを理解するであろう。そのような修正および変更は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれると意図される。
【０１８７】
参考文献
0006348115.tif 000014
0006348115.tif 000015
0006348115.tif 000016
【図１】
0006348115.tif 000017
【図２】
0006348115.tif 000018
【図３】
0006348115.tif 000019
【図４】
0006348115.tif 000020
【図５】
0006348115.tif 000021
【図６Ａ】
0006348115.tif 000022
【図６Ｂ】
0006348115.tif 000023
【図６Ｃ】
0006348115.tif 000024
【図７Ａ】
0006348115.tif 000025
【図７Ｂ】
0006348115.tif 000026
【図８】
0006348115.tif 000027
【図９】
0006348115.tif 000028
【図１０】
0006348115.tif 000029
【図１１】
0006348115.tif 000030
【図１２】
0006348115.tif 000031
【図１３】
0006348115.tif 000032
【図１４】
0006348115.tif 000033
【図１５】
0006348115.tif 000034
【図１６】
0006348115.tif 000035
【図１７】
0006348115.tif 000036
【図１８】
0006348115.tif 000037
【図１９】
0006348115.tif 000038
【図２０】
0006348115.tif 000039
【図２１】
0006348115.tif 000040
【図２２】
0006348115.tif 000041
【図２３】
0006348115.tif 000042
【図２４】
0006348115.tif 000043
【図２５】
0006348115.tif 000044
【図２６】
0006348115.tif 000045
【図２７Ａ】
0006348115.tif 000046
【図２７Ｂ】
0006348115.tif 000047
【図２７Ｃ】
0006348115.tif 000048
【図２８Ａ】
0006348115.tif 000049
【図２８Ｂ】
0006348115.tif 000050
【図２８Ｃ】
0006348115.tif 000051
【図２９】
0006348115.tif 000052
【図３０−１】
0006348115.tif 000053
【図３０−２】
0006348115.tif 000054
【図３０−３】
0006348115.tif 000055
【図３１】
0006348115.tif 000056
【図３２】
0006348115.tif 000057