(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において、機能性ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＵＰＬ）３タンパク質の発現を障害する工程を含む、植物の耐乾燥性を対照植物と比較して改善する方法であって、
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号２、６、８および１０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株で発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、方法。
【請求項２】
植物、植物細胞または植物プロトプラストにおいて、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法であって、
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号２、６、８および１０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株で発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、方法。
【請求項３】
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号２、６、８および１０のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が、ＨＥＣＴドメインおよびスーパーファミリーＡＲＭリピートを含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号２、６、８および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
機能的ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する工程を含む、植物の耐乾燥性を対照植物と比較して改善する方法であって、
前記機能的ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号１、５、７および９のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株で発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、方法。
【請求項７】
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、配列番号１、５、７および９のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する前記工程が、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異導入することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列に変異導入することが、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を伴う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発現を障害する前記工程が、遺伝子サイレンシングを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物において２つ以上の機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
改善した耐乾燥性を有する植物から、植物を再生産するまたは植物性産物を作製する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
植物種における耐乾燥性のスクリーニングにおけるヌクレオチド配列の使用であって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１、５、７および９のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有し、
−植物種の植物細胞または植物の異型遺伝子性集団（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する工程、
−配列番号１、５、７および９のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する、前記植物種のＵＰＬ３をコードする配列を提供する工程であって、前記ＵＰＬ３をコードする配列は、機能性ＵＰＬ３タンパク質をコードし、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株で発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である工程、
−前記植物種の植物細胞または植物のＵＰＬ３遺伝子の少なくとも一部の配列を判定する工程、
−前記植物種の植物細胞または植物に由来する、判定されたＵＰＬ３配列を、提供されたＵＰＬ３をコードする配列と比較する工程、
−前記ＵＰＬ３配列が、提供されたＵＰＬ３をコードする配列と比較して変異を含む、前記植物種の植物細胞または植物を同定する工程
を含む使用。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号１、５、７および９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１５】
機能性ＵＰＬ３タンパク質であって、配列番号２、６、８および１０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＰＬ３タンパク質が、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、乾燥ストレス条件下で成長するために、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質であり、前記乾燥ストレス条件により、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されていない対照植物、植物細胞または植物性産物が、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害された植物、植物細胞、または植物性産物よりも早く乾燥ストレスの徴候、たとえばしおれの徴候を示す、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害された植物、植物細胞、または植物性産物の使用。
【請求項１６】
機能性ＵＰＬ３タンパク質であって、配列番号２、６、８および１０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＰＬ３タンパク質が、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害された、シロイヌナズナ、イネ、またはトマトの植物、植物細胞、または植物性産物。
【請求項１７】
破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を含む、請求項１６に記載のシロイヌナズナ、イネ、またはトマトの植物、植物細胞、または植物性産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の耐乾燥性を増加させる新規方法に関する。この方法は、前記植物における１つもしくは複数の遺伝子または機能性タンパク質（複数可）の発現の障害を包含する。前記遺伝子（複数可）または機能性タンパク質（複数可）の発現を障害するよう操作されていない植物と比較して、この植物は改善した耐乾燥性を示す。本発明による方法により得られる植物および植物性産物もまた記載される。
【背景技術】
【０００２】
非生物的ストレス、たとえば乾燥、塩分、極端な温度、化学毒性および酸化ストレスは、農業にとって脅威であり、世界中で作物損失の主因となっている（非特許文献１）。
【０００３】
当技術分野において、非生物的ストレスの生化学的、分子的および遺伝的背景を扱ったいくつかの報告がある（非特許文献１または非特許文献２）。非生物的ストレスに対処するための植物の改変は多くの場合、細胞成分の機能および構造を保護し維持する遺伝子の操作に基づく。しかしながら、非生物的ストレス条件に対する反応が遺伝的に複雑なために、かかる改変植物を制御し設計するのはさらに困難であると思われる。Wang（非特許文献１）は、とりわけ、設計の方略の１つが、シグナリングおよび制御経路に関連するか、または機能的および構造的保護剤、たとえばオスモライトおよび抗酸化剤の合成をもたらす経路に存在する酵素をコードするか、またはストレス耐性付与タンパク質をコードする、１つまたは複数の遺伝子の使用に依拠することを述べている。
【０００４】
非生物的ストレス耐性植物の提供における改善は報告されているが、その根底にある遺伝的に複雑なメカニズムの性質により、この分野におけるさらなる改善が絶えず必要とされている。たとえば、遺伝的に形質転換された耐乾燥性植物は一般に、発達および生理の不均衡により、より遅い成長および生物量の減少を示すことがあり（非特許文献３）、それゆえ形質転換されていない植物と比較して顕著な適応コストがかかることが報告されている（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
ストレス条件下で成長する植物を得るための、いくつかの生物工学的アプローチが提案されている。塩ストレスに対する耐性が増加した植物が、たとえば特許文献１に開示されている。この文献は、９−ｃｉｓ−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの核酸およびポリペプチドを利用することによる、塩ストレスに耐性のあるトランスジェニック植物を開示する。
【０００６】
耐乾燥性の増加した植物が、たとえば、特許文献２、特許文献３、および特許文献４に開示されている。特許文献２は、ＤＲ０２核酸の発現の変化により耐乾燥性表現型を示す植物を記載している。特許文献３は、ＤＲ０３核酸の発現の変化により耐乾燥性表現型を示す植物を記載しており、特許文献４は、孔辺細胞に発現するＡＢＣトランスポーターの活性の減少により、乾燥ストレスに対する耐性が増加した植物を記載している。別の一例は、Kasugaら(1999)による研究であり、トランスジェニック植物におけるＤＲＥＢ１ＡをコードするｃＤＮＡの過剰発現が、通常の成長条件下で多くのストレス耐性遺伝子発現を活性化させ、乾燥、塩負荷、および凍結に対する耐性の向上をもたらしたことを記載している。しかしながら、ＤＲＥＢ１Ａの発現はまた、通常の成長条件下で深刻な成長遅延をもたらした（非特許文献６）。非生物的ストレス、特に乾燥のような非生物的ストレスに対する耐性を増加させるための新規の、代替的および／または付加的な方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０２００１５
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０１４４８５０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２６６４５３号明細書
【特許文献４】ＷＯ２００２／０８３９１１
【特許文献５】ＷＯ２００７／０７３１７０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14
【非特許文献２】Kilian et al (2007) Plant J 50(2) 347-363
【非特許文献３】Serrano et al (1999) J Exp Bot 50:1023-1036
【非特許文献４】Kasuga et al. (1999) Nature Biot. Vol. 17
【非特許文献５】Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol.23 No.11
【非特許文献６】Kasuga (1999) Nat Biotechnol 17(3) 287-291
【非特許文献７】Sambrook et al.、Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N. Y.、1989
【非特許文献８】Ausubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987 and periodic updates
【非特許文献９】the series Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego
【非特許文献１０】COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk, A. M., ed.、Oxford University Press、New York、1988
【非特許文献１１】BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W., ed.、Academic Press、New York、1993
【非特許文献１２】COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.、Humana Press、New Jersey、1994
【非特許文献１３】SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987
【非特許文献１４】SEQUENCE ANALYSIS PRIMER；Gribskov, M. and Devereux, J., eds.、M Stockton Press、New York、1991
【非特許文献１５】Carillo, H., and Lipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073
【非特許文献１６】GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop, ed.、Academic Press、San Diego、1994
【非特許文献１７】Devereux, J., et al.、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387
【非特許文献１８】Atschul, S. F. et al.、J. Molec. Biol. (1990) 215:403
【非特許文献１９】Albert L. Lehninger、Principles of Biochemistry、at 793-800 (Worth Pub. 1982)
【非特許文献２０】Breeding rice for drought prone environments、Fischer et al.、2003
【非特許文献２１】Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize: from theory to practice、Banzinger et al、2000
【非特許文献２２】Snow and Tingey、1985、Plant Physiol、77、602-7
【非特許文献２３】Harb et al.、Analysis of drought stress in Arabidopsis、AOP 2010、Plant Physiology Review
【非特許文献２４】Huibregtse et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92、2563-2567
【非特許文献２５】Pickart (2001) Annu. Rev. Biochem. 70、503-533
【非特許文献２６】Downes et al. (2003、Plant J 35、729-742)
【非特許文献２７】The Pfam protein families database: R.D. Finn, et al Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222
【非特許文献２８】Quevillon et al. (2005) 33(2) W116-W120
【非特許文献２９】E. M. Zdobnov and R. Apweiler (2001) Bioinformatics、17、847-848
【非特許文献３０】Krysan et al. 1999 The Plant Cell、Vol 11. 2283-2290
【非特許文献３１】Kunze et al (1997) Advances in Botanical Research 27 341-370
【非特許文献３２】Chandlee (1990) Physiologia Planta 79(1) 105-115
【非特許文献３３】Kusaba et. al (2004) Current Opinion in Biotechnology 15:139-143
【非特許文献３４】Preuss and Pikaard (2003) in RNA Interference (RNAi)~Nuts & Bolts of siRNA Technology (pp.23-36)、(c)2003 by DNA Press, LLC Edited by: David Engelke, Ph.D.
【非特許文献３５】Bent et al.、2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103
【非特許文献３６】Ng and Henikoff、2003 - Nucl. Acids Res. 31: 3812-3814
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、植物の耐乾燥性を増加させる新規方法を提供することである。かかる植物により、たとえば、水の供給が低い条件／乾燥条件下で生育した場合に、本発明の方法に供されない植物と比較して、より多くの生物量および／またはより多くの収穫量ならびにそれらに由来する植物性産物を作製することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、植物において、少なくとも１つのＰＦ００６３２によるＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインおよび少なくとも１つのモデルＳＳＦ４８３７１によるスーパーファミリーＡＲＭリピートを含むアミノ酸配列を含むＵＰＬタンパク質の発現を障害し、任意選択で前記植物を再生産する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法を提供する。
【００１１】
別の一態様において、本発明は、植物、植物細胞または植物プロトプラストにおいて、配列番号２のアミノ酸配列との少なくとも３０％の同一性を含むアミノ酸配列を含む機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害し、任意選択で植物を再生産する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法を提供する。
【００１２】
前記機能性ＵＰＬ３タンパク質は、少なくとも１つのＰＦ００６３２によるＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインおよび少なくとも１つのモデルＳＳＦ４８３７１によるスーパーファミリーＡＲＭリピートを含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１３】
機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｔ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ４タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質であってもよい。
【００１４】
本発明はさらに、植物、植物細胞または植物プロトプラストにおいて、少なくとも１つのＰＦ００６３２によるＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインおよび少なくとも１つのモデルＳＳＦ４８３７１によるスーパーファミリーＡＲＭリピートを有するアミノ酸配列を含む機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害し、任意選択で植物を再生産する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法を対象とする。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１の核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸配列によりコードされる機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害し、任意選択で植物を再生産する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法に関する。
【００１６】
機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質であってもよい。
【００１７】
機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する工程は、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質をコードする核酸配列に変異導入することを含んでいてもよい。前記核酸配列に変異導入することが、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換を伴っていてもよい。発現を障害する工程は、遺伝子サイレンシングを含んでいてもよい。発現を障害する工程は、前記植物において２つ以上の機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害することを含んでいてもよい。
【００１８】
この方法はさらに、改善した耐乾燥性を有する植物から、植物を再生産することまたは植物性産物を作製する工程を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明はまた、植物における耐乾燥性のスクリーニングにおける、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号１の核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列の使用に関する。
【００２０】
本発明は、シロイヌナズナ植物における耐乾燥性のスクリーニングにおける、配列番号２を有するＵＰＬ３アミノ酸配列または配列番号１のＵＰＬ３核酸配列の使用を対象とする。
【００２１】
本発明はまた、耐乾燥性シロイヌナズナ植物の育種のためのマーカーとしての、配列番号１のＵＰＬ３核酸配列の少なくとも一部または配列番号２のＵＰＬ３アミノ酸配列の少なくとも一部の使用に関する。
【００２２】
本発明はさらに、植物の耐乾燥性を調節する、好ましくは増加させるための、本明細書において定義される機能性ＵＰＬ３タンパク質の使用を提供する。
【００２３】
別の一態様において、本発明は、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されている植物、植物細胞、または植物性産物の使用に関する。この機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、乾燥ストレス条件下で成長する際に前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である。前記乾燥ストレス条件において、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されていない対照植物、植物細胞または植物性産物が、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されている植物、植物細胞、または植物性産物よりも早く乾燥ストレスの徴候、たとえばしおれの徴候を示す。
【００２４】
本発明はまた、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されたトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、コムギ属種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、またはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物、植物細胞、または植物性産物を教示する。この機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である。前記植物、植物細胞または植物性産物は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１および２に記載された典型的実験の結果を示す写真の図である。
【図２】対照（野生型）植物の乾燥感受性表現型と比較した、ＵＰＬ３ノックアウト（シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ａｔ４ｇ３８６００挿入変異体）の耐乾燥性表現型を示す写真の図である。
【図３】Ａｔ４ｇ３８６００挿入変異体（ＵＰＬ３）の乾燥生存率を示すグラフの図である。シロイヌナズナＡｔ４ｇ３８６００挿入変異体は、野生型（Ｃｏｌ−０）植物またはＡｔ４ｇ３８６００のコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＣＤＳ）（配列番号１；陽性対照）およびシロイヌナズナ（配列番号３）、トマト（配列番号５および７）、もしくはイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（配列番号９）由来ホモログで補完したＡｔ４ｇ３８６００挿入変異体よりも有意に良く乾燥の中を生存した（ｐ＜０．０５）。この図は、ＵＰＬ３遺伝子における挿入変異が耐乾燥性表現型を生み出すことを示す。さらに、それはまた、単子葉植物および双子葉植物種に由来するこの遺伝子のホモログが、通常の乾燥感受性表現型を回復するよう作用することを示す。したがって、これらホモログは、それらのそれぞれの作物種における耐乾燥性において同じ機能を果たす。シロイヌナズナ属のＵＰＬ３挿入変異体に挿入された際に、単子葉植物および双子葉植物の両方のＵＰＬ３遺伝子が乾燥感受性を回復できるという観察は、ＵＰＬ３遺伝子によりコードされるタンパク質の活性の減少が、植物界全体にわたり耐乾燥性表現型をもたらすことを示唆する。したがって、（相同性検索ならびに特徴的なドメイン［ＨＥＣＴ］およびアルマジロリピート配列に基づく）ＵＰＬ３の予測は、植物種における植物ＵＰＬ３ホモログの同定を可能にするであろう。続いて、これら植物ホモログのタンパク質活性を減少させる良く知られた方法（たとえば変異誘発、ＴＤＮＡまたはトランスポゾン挿入、ＲＮＡｉ等）を使用して、耐乾燥性植物を得ることができる。灰色のバーは、黒色のバーよりも有意に低い数値を有する（ｐ＜０．０５）。
【図４】トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＵＰＬ３変異体の乾燥表現型を示す写真の図である。ホモ接合型、ヘテロ接合型および野生型対立遺伝子を含有する分離Ｍ２集団を乾燥実験に使用した。乾燥処置の開始２１日後に撮影した写真は、野生型トマト植物（右）およびＳｌｇ９８２４７においてＶ１５８Ｅ変異を有する植物（左）を示す。耐乾燥性表現型および乾燥処置の生存率は、野生型対立遺伝子と比較して、Ｓｌｇ９８２４７においてＶ１５８Ｅ変異を有する植物が有意に良く（ｐ＜０．１）、タンパク質のこの変更がトマトにおける耐乾燥性表現型をもたらすことを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
以下の記載および実施例において、いくつかの用語が使用される。かかる用語に与えられるべき範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するため、以下の定義を提供する。特に断りのない限り、使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する分野における当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明の方法において使用される従来技術の実施方法は、当業者にとって明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シークエンシングおよび関連分野における従来技術のプラクティスは、当業者に良く知られており、たとえば以下の参照文献において論じられている。すなわち、非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９。
【００２８】
この書面およびその請求項において、動詞「を含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形はその非限定的な意味において使用され、この語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も排除されないということを意味する。この語は、動詞「から本質的になる」および「からなる」を包含する。
【００２９】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈上明示されない限り、複数の指示対象を含む。たとえば、ＤＮＡ分子（“ａ”  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の単離方法は、上で使用されるとおり、複数の分子（たとえば何十個、何百個、何千個、何万個、何十万個、何百万個、またはそれ以上の数の分子）を単離することを含む。
【００３０】
アラインすることおよびアラインメント：用語「アラインすること」および「アラインメント」は、同一または類似ヌクレオチドの短いまたは長い一連の配列の存在に基づく、２つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。ヌクレオチド配列の複数のアラインメント方法が当技術分野において知られており、下でさらに説明する。
【００３１】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち、生物活性タンパク質もしくはペプチド（または活性なペプチド断片）へと翻訳可能であるＲＮＡに転写されるプロセスを指す。「異所性発現」とは、その遺伝子が通常発現しない組織における発現を指す。「タンパク質の発現」は、遺伝子の発現という用語と互換的に本明細書において使用する。それは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、ｍＲＮＡへと転写され、それが続いてタンパク質またはペプチド（または活性なペプチド断片）へと翻訳されるプロセスを指す。
【００３２】
「機能性」とは、ＵＰＬ３タンパク質（またはバリアント、たとえばオルソログもしくは変異体、および断片）との関連において、たとえば、植物における遺伝子の発現レベルを（たとえば過剰発現またはサイレンシングにより）改変することによる、（定量的および／または定性的な）耐乾燥性を改変する遺伝子および／またはコードされたタンパク質の能力を指す。たとえば、植物種Ｘから得られるＵＰＬ３タンパク質の機能性は、様々な方法により試験できる。好ましくは、タンパク質が機能性である場合には、たとえば遺伝子サイレンシングベクターを使用した、植物種Ｘにおけるタンパク質をコードする遺伝子のサイレンシングが、改善した耐乾燥性をもたらすと考えられ、これは本明細書において詳細に説明するとおり試験できる。また、機能性ＵＰＬ３タンパク質（またはＵＰＬ４遺伝子）でのＵＰＬ３ノックアウトの補完は、その特徴を回復または付与可能であり、この場合には、乾燥感受性を回復するであろう。当業者は、機能性を試験することに何の困難もないであろう。
【００３３】
用語「遺伝子」は、細胞内でＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）へと転写される、好適な調節領域（たとえばプロモーター）に作動可能に連結された領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された配列、たとえばプロモーター、たとえば翻訳開始と関連する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびたとえば転写終結配列部位を含む３’非翻訳配列（３’  ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでいてもよい。
【００３４】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡを意味する。相補的ＤＮＡは、ＲＮＡを相補的ＤＮＡ配列へと逆転写することにより作製される。したがって、ｃＤＮＡ配列は、遺伝子から発現するＲＮＡ配列に対応する。ｍＲＮＡ配列はゲノムから発現する際、細胞質内でタンパク質へと翻訳される前にスプライシングを受け得る、すなわち、ｍＲＮＡからイントロンがスプライシングされてエクソンが結合されるので、ｃＤＮＡの発現が、ｃＤＮＡをコードするｍＲＮＡの発現を意味することが理解される。したがって、ｃＤＮＡは、それが対応するゲノムＤＮＡ配列と同一でなくてもよい。なぜなら、ｃＤＮＡは、結合したエクソンからなる、あるタンパク質の完全オープンリーディングフレームのみをコードしてもよいが、一方で、ゲノムＤＮＡは、イントロン配列が散在するエクソンをコードするからである。したがって、ｃＤＮＡをコードする遺伝子を遺伝的に改変することは、ｃＤＮＡに対応する配列を改変することに関していてもよいだけでなく、それが遺伝子発現の障害をもたらす限り、ゲノムＤＮＡのイントロン配列および／またはその遺伝子の他の遺伝子調節配列に変異導入することを伴っていてもよい。
【００３５】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に配列は、最高次マッチ（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｏｒｄｅｒ  ｍａｔｃｈ）が得られるようにアラインされる。「同一性」それ自体は、技術分野において認められた意味を有し、公知技術を使用して計算され得る。たとえば、以下を参照のこと。すなわち、（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；および非特許文献１４）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するいくつかの方法が存在するのみならず、用語「同一性」は当業者に良く知られている（非特許文献１５）。２つの配列の間の同一性または類似性を判定するために一般に用いられる方法は、非特許文献１６、および非特許文献１５に開示のものを含むが、これに限られるものではない。同一性および類似性を判定する方法は、コンピュータープログラムにコードされる。２つの配列の間の同一性および類似性を判定する好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＣＳプログラムパッケージ（非特許文献１７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献１８）を含むが、これに限られるものではない。パーセンテージ同一性は、好ましくは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の全長にわたり判定される。
【００３６】
例示として、ある配列のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に対し少なくとも、たとえば、９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって意図されているのは、ポリヌクレオチド配列が参照ポリペプチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点変異を含んでいてもよいことを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるということである。したがって、参照ヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージは、参照ヌクレオチド配列の全長にわたり計算されるものである。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列内の５％までのヌクレオチドが欠失するか、および／もしくは別のヌクレオチドと置換されていてもよく、ならびに／または参照配列の全ヌクレオチドの５％までの一定数のヌクレオチドが参照配列内に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端部位、またはこれらの末端部位の間の任意の位置で生じていてもよく、参照配列のヌクレオチドの中で個別に、または参照配列内の１つもしくは複数の連続する群内に、散在して生じていてもよい。
【００３７】
同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列と少なくとも、たとえば、９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによって意図されているのは、ポリペプチド配列が配列番号２の参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸の変化を含んでいてもよいことを除き、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるということである。したがって、参照アミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、参照アミノ酸配列の全長にわたり計算されるものである。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列内の５％までのアミノ酸残基が欠失するか、もしくは別のアミノ酸と置換されていてもよく、または参照配列の全アミノ酸残基の５％までの一定数のアミノ酸が参照配列内に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端部位、またはそれらの末端部位の間の任意の位置で生じていてもよく、参照配列の残基の中で個別に、または参照配列内の１つもしくは複数の連続する群内に、散在して生じていてもよい。
【００３８】
本発明による核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくはそれぞれシトシン、チミン、およびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンの任意のポリマーまたはオリゴマーを含んでいてもよい（非特許文献１９を参照のこと。その全体があらゆる目的のため、本明細書に参照により組み込まれる）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、およびそれらの任意の化学的バリアント、たとえばこれら塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグリコシル化形態等を考慮に入れている。ポリマーまたはオリゴマーは、組成において異種または同種であってもよく、天然原料から単離されてもよく、または人工もしくは合成で作製されてもよい。加えて、核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの混合物であってもよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖、およびハイブリッド状態を含む、一本鎖または二本鎖形態で持続的または過渡的に存在してもよい。
【００３９】
本明細書において使用される用語「作動可能に連結された」は、機能的関係性におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、それが他の核酸配列との機能的関係性の中へと置かれる際に「作動可能に連結され」ている。たとえば、プロモーター、またはより正確には転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であることを意味していてもよい。
【００４０】
「植物」とは、植物全体または植物の一部、たとえば植物より得られる細胞、組織または器官（たとえば花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花芽、葯、果実等）と共に、これらの任意の派生物および自殖または交雑によりかかる植物に由来する後代を指す。「植物細胞（複数可）」は、プロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒等を、単離された状態または組織、器官もしくは生物体内で含む。
【００４１】
本明細書において使用される用語「プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するよう機能し、転写の方向に対して遺伝子の転写開始部位の上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するよう直接または間接に作用することが当業者に知られている任意の他のヌクレオチドの配列を含むが、これに限られない、任意の他のＤＮＡ配列の存在により、構造的に同定される核酸断片を指す。任意選択で、用語「プロモーター」は本明細書においてまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）を含む（たとえば、プロモーターは本明細書において、遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）の１つまたは複数の部分を含んでいてもよい。なぜなら、この領域は、転写および／または翻訳の調節において役割を果たしていてもよいからである。）。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの生理的および発生的条件下のほとんどの組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、生理的（たとえば何らかの化合物の外用により）または発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織または細胞でのみ活性である。「植物または植物細胞において活性なプロモーター」とは、植物または植物細胞内で転写を駆動するプロモーターの全般的能力を指す。これは、プロモーターの空間的−時間的活性について何の示唆もしない。
【００４２】
用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、互換的に使用され、アミノ酸鎖からなる分子を指し、特定の作用機序、サイズ、３次元構造または起源を指すことはない。したがって、タンパク質の「断片」または「部分」もまた、「タンパク質」として言及される。「単離タンパク質」は、もはやその天然環境にない、たとえばインビトロまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞内のタンパク質を指すために使用される。
【００４３】
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」は、本明細書において、たとえば内在性遺伝子またはその一部における非サイレント変異の導入により形質転換された植物または植物細胞を指す。かかる植物は、たとえば遺伝子における１つもしくは複数の変異、挿入および／もしくは欠失、ならびに／またはゲノムにおける遺伝子サイレンシング構築物の挿入を導入するよう遺伝的に改変されている。トランスジェニック植物細胞は、単離状態のまたは組織培養物内の植物細胞、あるいは、植物内または分化した器官もしくは組織内に含有される植物細胞を指してもよく、両方の可能性が具体的に本明細書に含まれる。したがって、本説明または特許請求の範囲における植物細胞への言及は、培養物中の単離細胞またはプロトプラストのみを指すことを意図せず、それがどこに位置していようとも、またはどのようなタイプの植物組織もしくは器官にそれが存在していようとも、任意の植物細胞を指す。
【００４４】
標的化ヌクレオチド交換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＴＮＥ）とは、染色体またはエピソーム遺伝子のある部位に対し部分的に相補的である合成オリゴヌクレオチドが、特定部位の単一のヌクレオチドと置き換わるプロセスである。ＴＮＥは、多様なオリゴヌクレオチドおよび標的を使用して記述されてきた。報告されたオリゴヌクレオチドのいくつかはＲＮＡ／ＤＮＡキメラであり、ヌクレアーゼ耐性を付与する末端の改変を含有する。
【００４５】
本明細書において使用される用語「乾燥ストレス」または「乾燥」は、植物への水の供給が限定された、最適最適ではない（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）環境条件を指す。水の供給の限定は、たとえば、降雨がないもしくは比較的少ないときおよび／または植物への給水の頻度が必要とされているよりも低いときに生じ得る。植物への水の供給の限定はまた、たとえば水が土壌に存在するが、植物により効率的に取り出され得ないときに生じる。たとえば、土壌が強力に水を捕捉するときまたは水の塩含有量が高いとき、植物が土壌から水を取り出すことはより困難であり得る。したがって、多くの要因が植物への水の供給の限定、すなわち乾燥をもたらす原因であり得る。植物を「乾燥」または「乾燥ストレス」に晒すことにより、植物の成長および／または発育が最適でなくなり得る。乾燥に晒される植物は、しおれの徴候を有し得る。たとえば、植物は少なくとも１５日の期間、たとえば降雨がないことおよび／または植物への水やりがないことで水が提供されない、特定の制御条件下に晒されてもよい。
【００４６】
用語「改善した耐乾燥性」は、改善した耐乾燥性が提供された際、乾燥または乾燥ストレスに晒された際に、影響を示さないか、または、改善した耐乾燥性を提供されていない植物において観察されるのと比べて、軽減された影響を示す植物を指す。通常の植物は、一定レベルの耐乾燥性を有する。植物が改善した耐乾燥性を有するかどうかは、一定期間後に対照植物において乾燥の徴候が観察できるように選択された制御条件下で、すなわち、植物が乾燥または乾燥ストレスに晒された際に、対照植物を改善した耐乾燥性を提供された植物と比較することにより容易に判定できる。改善した耐乾燥性を有する植物は、乾燥に晒されてきた徴候、たとえばしおれが、対照植物と比較して少ないおよび／または減少するであろう。当業者は、好適な条件、たとえば実施例における制御条件を選択する方法を理解し得る。植物が「改善した耐乾燥性」を有する場合、乾燥または乾燥ストレスに晒された際に、さもなければ通常の植物の成長および／または発育が減少したところ、正常成長および／または正常発育を維持することが可能である。したがって、「改善した耐乾燥性」は、植物を比較することにより決定される相対的な用語であり、乾燥ストレス下で（正常）成長を維持する能力が最もある植物が、「改善した耐乾燥性」植物である。当業者は、植物の耐乾燥性を判定する適切な条件を選択する方法および乾燥の徴候を測定する方法を良く認識しており、たとえばＩＲＲＩにより提供されるマニュアルである非特許文献２０、およびＣＩＭＭＹＴにより提供されるマニュアルである非特許文献２１に記載されている。植物における改善した耐乾燥性を判定する方法の例は、非特許文献２２および非特許文献２３において提供され、また下の実施例セクションに記載されるとおりである。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、植物において機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害することによる、植物の耐乾燥性の改善に関する。改善は、かかる改変が導入されていないか、または存在しておらず、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されていない対照植物との間での相対的な関係である。換言すれば、本発明による改変植物は、対照植物、すなわち非改変植物と比較して、水の供給が減少した条件、（一時的な）絶水または乾燥条件下で、より良く成長および生存できる。本発明によれば、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を改変すること、たとえばそれを障害することは、たとえばＵＰＬ３遺伝子発現の遺伝的改変または標的化ヌクレオチド交換を伴ってもよいことが理解される。
【００４８】
遺伝的改変は、目的の核酸配列における変異、挿入、欠失の導入、および／または、目的の核酸配列を標的とする遺伝子サイレンシング構築物の植物もしくは植物細胞のゲノム内への挿入を含む。核酸配列、たとえばｍＲＮＡをコードする遺伝子を遺伝的に改変することは、ｍＲＮＡ配列に対応するエクソン配列を改変することに関するだけでなく、ゲノムＤＮＡのイントロン配列および／またはその核酸配列、たとえば遺伝子の（他の）遺伝子調節配列に変異導入することを伴っていてもよい。
【００４９】
本発明の文脈において、機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ４遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株、たとえばＡｔ４ｇ３８６００ノックアウト株、たとえば、本明細書に記載のＳＡＬＫ＿０３７６３６Ｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｌｅｔｓ／ＴａｉｒＯｂｊｅｃｔ？ｔｙｐｅ＝ｓｔｏｃｋ＆ｉｄ＝３５０１６３１８９０）において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株、たとえば、Ａｔ４ｇ３８６００ノックアウト株、たとえば、ＳＡＬＫ＿０３７６３６Ｃの耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質であってもよい。
【００５０】
本明細書において使用される用語「破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子」は、たとえば、前記ＵＰＬ３遺伝子へのＴ−ＤＮＡ挿入により破壊された、たとえばそれにより割り込まれた、植物のゲノムに天然で存在するＵＰＬ３遺伝子を指す。前記内在性ＵＰＬ３遺伝子の破壊により、前記内在性ＵＰＬ３遺伝子の発現の非存在を、そしてそれゆえ、（機能性または非機能性の）内在性ＵＰＬ３タンパク質の欠失をもたらすことができる。
【００５１】
本明細書において使用される用語「対照植物」は、同種、好ましくは同品種、好ましくは同じ遺伝的背景の植物を指す。
【００５２】
本発明はまた、植物において機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を改変することによる、植物の耐乾燥性の調節に関する。調節は、かかる改変が導入されていないまたは存在しない同様の植物（好ましくは同種および／または同品種の植物、ならびに、好ましくは同じ遺伝的背景の植物）との間での相対的な関係である。
【００５３】
一態様において、本発明は、植物において、少なくとも１つのＰＦ００６３２によるＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインおよび少なくとも１つのモデルＳＳＦ４８３７１によるスーパーファミリーＡＲＭリピートを含むアミノ酸配列を含むＵＰＬタンパク質の発現を障害する工程を含む、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法を提供する。
【００５４】
別の一態様において、本発明は、対照植物と比較して改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法に関し、この方法は、前記植物において機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害する工程を含む。
【００５５】
本明細書において使用される「機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害すること」は、ＵＰＬ３遺伝子の発現が障害されていること、および／または、ＵＰＬ３遺伝子の発現は正常であるが、結果として得られるｍＲＮＡの翻訳が（たとえば、ＲＮＡ干渉により）阻害されるもしくは阻止されること、および／または、ＵＰＬ３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に記載のタンパク質のユビキチンタンパク質リガーゼ比活性と比較して、好ましくは生理的条件下、特に同一の生理的条件下で、そのユビキチンタンパク質リガーゼ比活性を減少させるように、変化していることを意味してもよい。あるいは、ＵＰＬ３タンパク質は、前記ＵＰＬ３タンパク質に特異的に結合し、そのことによりその比活性を減少させる抗体の同時発現により非機能性になってもよい。ＵＰＬ３タンパク質のユビキチンタンパク質リガーゼ比活性は、かかるタンパク質のユビキチンタンパク質リガーゼ比活性が、配列番号２に記載のタンパク質のユビキチンタンパク質リガーゼ比活性よりも統計的に有意に低い場合に、「減少した」ものとみなされてもよい。ＵＰＬ３タンパク質のユビキチンタンパク質リガーゼ比活性は、たとえば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上減少していてもよい。植物の内在性ＵＰＬ３遺伝子の発現の減少は、標的化変異誘発を使用して、たとえば、プロモーター配列を変更することにより達成されてもよい。
【００５６】
機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を（たとえば、発現および／または活性を低減、抑制または欠失させることにより）障害することが、たとえばＲＮＡ干渉による低発現の結果として、もしくは、ＵＰＬ３タンパク質の活性／機能性の減少の結果として、または上の１つもしくは複数の結果として、機能性ＵＰＬ３タンパク質の非存在またはそのレベルの減少をもたらし、この、機能性ＵＰＬ３タンパク質の前記非存在またはそのレベルの減少が、前記植物の水への要求を減少させ、または乾燥に対する改善した耐性をもたらすと、本発明者らは考えている。
【００５７】
ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｇａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＵＰＬ）は、酵母および動物の両方における調節タンパク質の選択的分解に関与することが知られている（非特許文献２４；非特許文献２５）。分解に供されるタンパク質は、複数のユビキチンの鎖で修飾され、次に２６Ｓプロテアソームにより認識される。これらユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質の重要なクラスの１つは、Ｃ末端のＨＥＣＴドメインと呼ばれる保存された３５０アミノ酸のドメイン（ヒトＥ６関連タンパク質（Ｅ６−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅ６−ＡＰ）のＣ末端との相同性に基づくを含むＨＥＣＴ  Ｅ３により形成される（非特許文献２４）。ＨＥＣＴドメインは、ユビキチン伝達を触媒するのに必要な位置不変のシステインを囲む、高度に保存された領域を含む。
【００５８】
非特許文献２６によれば、植物もまたＨＥＣＴ  Ｅ３を含有し、シロイヌナズナ属には以下の７つが存在する。すなわち、ＵＰＬ１、ＵＰＬ２、ＵＰＬ３、ＵＰＬ４、ＵＰＬ５、ＵＰＬ６、およびＵＰＬ７である。Downes et al.はさらに、ＵＰＬ１、ＵＰＬ２、ＵＰＬ３、ＵＰＬ４、ＵＰＬ５、ＵＰＬ６、およびＵＰＬ７が、対応する遺伝子のイントロン／エクソンの位置、タンパク質配列および長さ、ならびにＨＥＣＴドメインの上流の付加的タンパク質モチーフの存在に基づいて、構造により以下の４つのサブファミリーに分類できることを説明している。すなわち、ＵＰＬ１／２、ＵＰＬ３／４、ＵＰＬ５、およびＵＰＬ６／７である。ＨＥＣＴドメインの上流の多様なドメインの存在は、ＵＰＬ１〜ＵＰＬ７ファミリーの個々のメンバーが、別々の標的および機能のセットを有することを示唆する（異なるＵＰＬタンパク質の個別の特徴の詳細については、非特許文献２６、特にその図１を参照のこと）。
【００５９】
シロイヌナズナにおいて、ユビキチンタンパク質リガーゼ４は、たとえばユビキチンリガーゼ４のＣ末端から６５０アミノ酸の２２５残基領域の非存在により、ユビキチンタンパク質リガーゼ３と区別できる（非特許文献２６）。
【００６０】
シロイヌナズナに見出されるユビキチンタンパク質リガーゼ４は、ユビキチンタンパク質リガーゼ３と約５４％のアミノ酸配列同一性を有することが他の研究者により報告されている（非特許文献２６）。ユビキチンタンパク質リガーゼ３の遺伝子座名はＡｔ４ｇ３８６００／Ａｔ４ｇ３８６１０であり、ＯＲＦ名はＦ２０Ｍ１３．１６０／Ｆ２０Ｍ１３．１７０である（両方ともｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ６ＷＷＷ４による）。
【００６１】
シロイヌナズナのＵＰＬ３タンパク質は、（配列番号２に記載の）１８８８個のアミノ酸を含む。シロイヌナズナのＵＰＬ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、（配列番号１に記載の）４５０６個のヌクレオチドを含む。
【００６２】
本明細書において使用される「ＵＰＬ３タンパク質」は、配列番号２に記載のタンパク質、ならびにその断片およびバリアントを含む。ＵＰＬ３タンパク質のバリアントは、たとえば、配列番号２に対し、好ましくは全長にわたり、少なくとも３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、たとえば１００％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含む。アミノ酸配列同一性は、ニードルマン−ブンシュアルゴリズムおよび上に定義されたＧＡＰデフォルトパラメータを使用した、ペアワイズアラインメントにより判定される。ＵＰＬ３タンパク質は、ユビキチンタンパク質リガーゼ活性を有する場合、機能性であるとみなされてもよい。
【００６３】
ＵＰＬ３をコードする遺伝子においてＴ−ＤＮＡ挿入を有するシロイヌナズナ植物は、非特許文献２６により知られている。このＵＰＬ３変異体は、異常毛状突起形成を示す。
【００６４】
別の一態様において、改善した耐乾燥性を有する植物の作製方法が提供され、この方法は、前記植物においてＵＰＬ３タンパク質をコードする遺伝子の発現を障害する工程を含む。
【００６５】
本発明による「障害された発現」とは、機能性ＵＰＬ３タンパク質およびそれと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントの非存在または存在の減少を意味する。それはまた、少なくとも１つのＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインＰＦ００６３２、および少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピートモデルＳＳＦ４８３７１を含む、本明細書に記載のタンパク質の低下した存在の非存在をも意味する。当業者は、たとえば、転写レベルまたは翻訳レベルにおいて、遺伝子またはタンパク質の発現を障害するために当技術分野において利用可能な多くのメカニズムを良く認識している。
【００６６】
別の一態様において、植物の耐乾燥性の増加方法が提供され、この方法は、前記植物における遺伝子またはタンパク質の発現を障害する工程を含み、下に記載のとおり判定されるように、前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列（またはタンパク質）は、少なくとも１つのＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメイン（ＰＦ００６３２）および少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピート（モデルＳＳＦ４８３７１）を含む。「少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピートモデルＳＳＦ４８３７１」なる文言は、配列番号１に記載のＵＰＬ３遺伝子に由来する４つのアルマジロリピート配列を含むと理解される。したがって、「少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピートモデルＳＳＦ４８３７１」なる文言は、これら４つのアルマジロリピート配列を含むことを意味する。
【００６７】
本明細書において使用される「Ｐｆａｍ」または「ＰＦＡＭ」は、多くの共通タンパク質ファミリーをカバーするマルチプル配列アラインメントおよび隠れマルコフモデルの大規模なコレクションを指し、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／より利用可能である。Ｐｆａｍデータベースは、それぞれがマルチプルアラインメントにより表されるタンパク質ファミリーの大規模なコレクションを含有する。これらのアラインメントは、それぞれのタンパク質ドメインファミリーについて隠れマルコフモデル（ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ：ＨＭＭ）を構築するために使用されてきた。アラインメントは、進化的に保存された構造を表し、目的のタンパク質におけるドメインの存在は、その生物学的機能の指標であり得る。Ｐｆａｍアラインメントから構築されるプロファイル隠れマルコフモデル（プロファイルＨＭＭ）は、一見アラインメントによる相同性が低いようであっても、新規タンパク質が既存のタンパク質ファミリーに属するということを、自動的に認識するために有用である。同じタンパク質ファミリーの他のタンパク質は、ＨＭＭＥＲソフトウェアを使用して隠れマルコフモデルに対しタンパク質配列のアミノ酸配列をクエリすることにより同定される。ＨＭＭＥＲソフトウェア（バージョン３．０、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／より）は、このＨＭＭを新規配列におけるこのドメインの存在を検索するために使用できる。潜在的候補タンパク質のヒットは、デフォルトの含有閾値（ｄｅｆａｕｌｔ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超えたそれらの配列におけるＨＭＭＥＲのヒットのみを考慮することにより引き出された。
【００６８】
Ｐｆａｍバージョン２４．０（２００９年１０月）は、１１９１２のタンパク質ファミリーについてアラインメントおよびモデルを含有する（非特許文献２７を参照のこと）。Ｐｆａｍは、ＵｎｉＰｒｏｔリリース１５．６（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔリリース５７．６およびＳＰ−ＴｒＥＭＢＬリリース４０．６）に基づく、Ｐｆａｍｓｅｑと呼ばれる配列データベースに基づく。
【００６９】
Ｐｆａｍデータベースのアラインメントは、タンパク質の機能と関連し得る進化的に保存された構造を表す。Ｐｆａｍアラインメントから構築される隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、タンパク質が既存のタンパク質ファミリーに属するかどうかを確立するために有用である。これは、アラインメントによる相同性が低いと考えられる場合であってもそうである。たとえば、ある特徴（たとえば乾燥に対する感受性）に関与するタンパク質が認識され、たとえば、その発現の障害が増強された形質（たとえば、乾燥に対する耐性の増加）を付与するなら、同じタンパク質ファミリーの他のタンパク質が、（候補ＤＮＡによりコードされる）タンパク質のアミノ酸配列を、ＨＭＭＥＲソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／’ｖｅｒｓｉｏｎ。ＨＭＭＥＲバージョン３．０は、２０１０年３月２８日にリリースされた）を使用してＰｆａｍドメインを特徴づける隠れマルコフモデル（本発明においては、Ｐｆａｍ  ＨＥＣＴ  ＰＦ００６３２モデル）と比較することによって、当業者により同定され得る。
【００７０】
上述のＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメイン（ＰＦ００６３２）存在の確立後、候補タンパク質はまた、たとえばＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎアプリケーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｆａ／ｉｐｒｓｃａｎ／；非特許文献２８；非特許文献２９）を使用することにより確立できるように、少なくともスーパーファミリーＡＲＭリピート（ＨＭＭモデルＳＳＦ４８３７１；ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｆａｍ．ｏｒｇ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｃｏｐ．ｃｇｉ？ｉｐｉｄ＝ＳＳＦ４８３７１上に含むという要件を満たさなければならない。Quevillon et al.は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎが、ＩｎｔｅｒＰｒｏコンソーシアムメンバーデータベースからの異なるタンパク質シグネチャ認識方法を１つのリソースへと組み合わせたツールであり、アプリケーションに個別の公的に利用可能なデータベースを有することを記載している。タンパク質がＤＮＡ配列と共に解析され得る。ウェブベースバージョンが、学術的および商業的組織のためＥＢＩからアクセス可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ／）。
【００７１】
スーパーファミリーという注釈は、ＳＣＯＰスーパーファミリーレベルでの構造的タンパク質ドメインを表す、隠れマルコフモデルのコレクションに基づく。スーパーファミリーは、進化的関連性を有するドメインをグループ化する。注釈は、１４００を超える完全に配列決定されたゲノムから、タンパク質配列を隠れマルコフモデルに対してスキャンすることにより生成される。
【００７２】
すべてのソフトウェアがデフォルト設定で適用される。
【００７３】
要約すると、ＨＥＣＴドメインについての隠れマルコフモデル（ＰＦ００６３２モデル  ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｍｉｌｙ？ａｃｃ＝ＰＦ００６３２）を、Ｐｆａｍデータベース（バージョン２４  ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／から）から入手し、別ファイルに保存した。ＨＭＭＥＲソフトウェアを、アミノタンパク質配列がＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメインにより特徴づけられることを判定するために使用した。加えて、フィルタリングしたタンパク質セットを、ＡＲＭリピートを探し出すため、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎアプリケーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｆａ／ｉｐｒｓｃａｎ／）からのスーパーファミリーパッケージ（ＳＳＦ４８３７１モデルを使用  ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｆａｍ．ｏｒｇ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｃｏｐ．ｃｇｉ？ｉｐｉｄ＝ＳＳＦ４８３７１）を用いることによりさらに減らした。
【００７４】
両方の要件を満たす（Ｐｆａｍ  ＨＥＣＴ  ＰＦ００６３２ドメインおよびスーパーファミリーＳＳＦ４８３７１モデルＡｒｍリピートを有する）（植物）タンパク質が、本発明によるタンパク質であり、その発現の障害は、改善した／増加した耐乾燥性を植物に提供する際に有用であり得るのであり、かかるタンパク質およびｃＤＮＡの例を本明細書において開示する。当業者は、上で提供した情報に基づき判定し試験する方法について良く認識している。
【００７５】
理論に縛られることなく、本発明者らは、本発明によるタンパク質におけるこの組合せのドメインの存在が、乾燥に対する植物の感受性を増加させ、これらドメインを有するかかるタンパク質の発現の障害が、乾燥に対する植物の耐性を改善すると推測する。
【００７６】
転写レベルでの障害は、プロモーター、エンハンサー、開始、終結またはイントロンスプライシング配列を含む、転写調節配列における１つまたは複数の変異の導入の結果であり得る。これらの配列は一般に、本発明による遺伝子の５’、３’、またはコード配列内に位置する。独立して、または同時に、発現の障害はまた、遺伝子のコード領域のヌクレオチドの欠失、置換、再配列または挿入により提供され得る。
【００７７】
たとえば、コード領域において、ヌクレオチドは、置換されるか、挿入されるかまたは欠失することにより、１つ、２つまたはそれ以上の未成熟終止コドンの導入をもたらされてもよい。また、挿入、欠失、再配列または置換は、コードされるアミノ酸配列において改変をもたらし得、そのことにより機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害し得る。さらに、遺伝子の大部分が除去されてもよく、たとえば、遺伝子の（コード領域の）少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までを植物に存在するＤＮＡから除去し、そのことにより機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害してもよい。
【００７８】
あるいは、１、２、３のより多くのヌクレオチドが、ＵＰＬ３タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を導入して、たとえばフレームシフトをもたらすか、または、追加のアミノ酸をコードする配列の導入、もしくはアミノ酸をコードしない配列の導入、もしくは大きなインサートの導入をもたらし、そのことにより、機能性ＵＰＬ３タンパク質の提供／発現を障害してもよい。
【００７９】
換言すれば、上述のＵＰＬ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列内のヌクレオチド（複数可）の欠失、置換または挿入は、たとえば、フレームシフト、終止コドンの導入、またはナンセンスコドンの導入をもたらしてもよい。特に、終止コドンの導入およびフレームシフト変異の導入は、ノックアウト植物、すなわち、特定のタンパク質の発現および／または活性が低減した、抑制されたまたは欠失した植物を作製する効率的な方法として一般に受け入れられている。
【００８０】
フレームシフト変異（フレーミングエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、ヌクレオチド配列における３で割り切れない数のヌクレオチドのインデル（挿入または欠失）により引き起こされる遺伝的変異である。コドンによる遺伝子発現はトリプレットによるため、挿入または欠失は、リーディングフレーム（コドンの組分け）を変化させ、オリジナルとは完全に異なる翻訳をもたらし得る。配列内で欠失または挿入が生じるのが上流であるほど、作製されるタンパク質はより大きく変更される。フレームシフト変異は一般に、変異後のコドンの読みを、異なるアミノ酸をコードするようにするが、遺伝暗号の冗長性によりもたらされる例外があり得る。さらに、オリジナル配列内の終止コドン（「ＵＡＡ」、「ＵＧＡ」または「ＵＡＧ」）は、読まれず、代わりとなる終止コドンがより早いまたは遅い部位にもたらされ得る。作製されるタンパク質は、異常に短いまたは異常に長いものであり得る。
【００８１】
本明細書において定義されるＵＰＬ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列における終止コドンの導入は、翻訳の未成熟終止をもたらし得るのであり、これは一般に、短縮され、不完全で、非機能性のＵＰＬ３タンパク質をもたらす。好ましくは、終止コドンは、転写方向の上流で導入される。ヌクレオチド配列内で終止コドンが導入されるのが上流であるほど、作製されるタンパク質はより短くなり、より大きく変更される。ＵＰＬ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列におけるナンセンスコドンの導入は、たとえば１つのコドンがＵＰＬ３において天然に生じるアミノ酸をコードせず、たとえば、そのコドンがＵＰＬ３タンパク質が機能性であるのに必須のアミノ酸を通常コードするコドンである、ｍＲＮＡ転写物をもたらし得る。したがって、かかるＵＰＬ３タンパク質は機能性でないことがあり得る。
【００８２】
換言すれば、この障害は、本明細書において開示される遺伝子における１つまたは複数のヌクレオチドに変異導入することを含んでいてもよく、これは、タンパク質発現産物の存在の減少もしくはさらには完全な非存在（すなわち、本発明による遺伝子が上述のとおり改変されなかった際に得られるはずのタンパク質の非存在）、または非機能性タンパク質の存在をもたらす。
【００８３】
したがって、本明細書において開示される方法の一実施形態において、この障害は、前記遺伝子における１つまたは複数の変異の結果であり、これは、タンパク質発現産物の減少またはタンパク質発現産物の非存在をもたらす。
【００８４】
本明細書において使用される減少した阻害／存在という用語は、発現が障害されていない対照植物と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％までのタンパク質発現の減少に関する。用語「タンパク質発現の非存在」は、あらゆる発現産物の事実上の非存在、たとえば、対照と比較して５％、４％、３％、２％未満または１％未満ですらあることを指す。
【００８５】
当業者により理解されるように、変異はまた、変異原性化合物、たとえばエチルメタンスルホネート（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ：ＥＭＳ）またはヌクレオチド配列に変異を（ランダムに）導入可能な他の化合物の適用により、本明細書において定義されるＵＰＬ３をコードするヌクレオチド配列内に導入されてもよい。前記変異原性化合物または前記他の化合物は、ＵＰＬ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異を有する植物を作出する手段として使用してもよい。
【００８６】
あるいは、本発明による（ＵＰＬ３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列における変異の導入は、かかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列におけるトランスファー−ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）、たとえば、何らかの細菌種、たとえばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ：Ｔｉ）プラスミドのＴ−ＤＮＡの導入によりもたらされる。Ｔ−ＤＮＡ因子が前記ヌクレオチド配列に導入され、非機能性タンパク質またはタンパク質の発現の非存在をもたらされ、結果として、本発明の方法により得られる植物の水への要求を減少させてもよい（たとえば非特許文献３０を参照のこと）。同様の利点が、転移因子挿入の使用から得られる（たとえば非特許文献３１または非特許文献３２を参照のこと）。
【００８７】
好ましくは、本発明によるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することは、たとえば特許文献５に記載のとおり、標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）により実施される。ＴＮＥを適用することにより、ＵＰＬ３をコードするヌクレオチド配列において特定のヌクレオチドを変更でき、そのことにより、たとえば、終止コドンが導入され得るのであり、これはたとえば、ヌクレオチド配列を、活性が減少または消失した本発明による短縮タンパク質をコードするものとし得る。
【００８８】
別の一実施形態において、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現の障害が非機能性タンパク質の発現により引き起こされる、上述の方法が提供される。上で説明したとおり、当業者は、本発明による遺伝子の機能性を容易に判定し得る。たとえば、当業者は、何の改変もない対照遺伝子を、本発明によるタンパク質の発現が障害された植物に導入することにより、相補性研究を実施し、耐乾燥性を研究してもよい。
【００８９】
あるいは、当業者は、下の実施例に記載する実験と類似する実験を実施し、本発明による遺伝子において１つまたは複数の変異が導入された植物における耐乾燥性を、好適な対照／野生型植物と比較して判定してもよい。
【００９０】
障害はまた、たとえば未成熟終止コドンを導入することにより、または、たとえばタンパク質フォールディングに影響する翻訳後修飾により、翻訳レベルで提供できる。
【００９１】
そのメカニズムとは独立に、本発明による障害は、機能性ＵＰＬ３タンパク質の非存在または存在の減少により示される。上で説明したとおり、本明細書において使用される発現の阻害または存在の減少という用語は、発現が障害されていない対照植物と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％までのタンパク質発現の減少に関する。用語「タンパク質発現の非存在」は、ある発現産物の事実上の非存在、たとえば、対照と比較して５％、４％、３％、２％未満または１％未満ですらあることを指す。
【００９２】
別の一実施形態によれば、障害は、遺伝子サイレンシング、たとえばＲＮＡ干渉またはＲＮＡサイレンシングにより引き起こされる。
【００９３】
当業者が容易に利用可能な分子生物学的方法により、遺伝子の障害をまた、遺伝子サイレンシングにより、たとえばＲＮＡ干渉技術、ｄｓＲＮＡもしくは他の発現サイレンシング技術（たとえば、非特許文献３３、または非特許文献３４を参照のこと）、または、すでに上で論じたとおり、ノックアウトを使用して達成できる。
【００９４】
好ましい別の一実施形態において、すでに上で論じたとおり、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換により障害が引き起こされる、本発明による方法が提供される。たとえば、１個、２個、３個・・・１０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、１０００個、またはさらに多くのヌクレオチドが、本発明による遺伝子において、挿入され、欠失し、または置換されていてもよい。また考えられるのが、遺伝子のコード領域におけるまたは非コード領域における、挿入、欠失、および／または置換の組合せである。
【００９５】
本明細書において開示される方法の別の一実施形態において、この方法は、前記植物において、ＵＰＬ３タンパク質をコードする、１個より多い、たとえば２個、３個、４個、５個、またはすべての遺伝子の発現を障害する工程を含む。
【００９６】
この実施形態において、上述の１個より多く、特定の一植物に存在する遺伝子の発現が障害される。たとえば、一植物に存在する、ＵＰＬ３タンパク質をコードする、１個、２個、３個、４個またはすべての遺伝子の発現が障害される。上述のより多くの遺伝子の発現を（一植物に存在する際に）同時に障害することにより、さらに改善した耐乾燥性が得られる。
【００９７】
別の一実施形態において、本発明による方法により提供される植物を、さらなる植物およびまたはそれに由来する植物性産物の作製のために使用できる。用語「植物性産物」は、成長した植物から得られる物質を指し、果実、葉、植物器官、植物脂肪、植物油、植物デンプン、植物タンパク質画分を含み、これらは粉砕されているか、製粉されているか、またはそのままの形であるか、他の物質と混合されているか、乾燥されているか、凍結されているか、その他の処理をされている。一般に、かかる植物性産物は、たとえば、上で詳細に説明したとおりに機能性タンパク質の発現が障害されるように改変された、本明細書に開示の遺伝子の存在により認識され得る。
【００９８】
好ましくは、本発明によるＵＰＬ３タンパク質の発現および／または活性は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（菜種）を含むアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、トマトを含むナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ−ｆａｍｉｌｙ）、またはメロンおよびキュウリを含むウリ科（Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）、イネを含むイネ属（Ｏｒｙｚａ）を含むイネ科（Ｐｏａｃｅａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ）、またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（コーン（ｃｏｒｎ））を含むトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、または豆果、エンドウマメ、もしくはビーン（ｂｅａｎ）を含むマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）に属する植物において障害される（たとえば、低減され、抑制され、または欠失する）。好ましくは、本発明による方法は、トマト、イネ、トウモロコシ、メロン、またはキュウリに適用され、そのことにより、対応する非形質転換植物と比較して、水への要求が減少し、または乾燥に対する耐性が改善した植物を提供する。
【００９９】
また提供されるのは、本発明による方法により得られる植物細胞、植物またはそれらに由来する植物性産物であり、前記植物細胞、植物または植物性産物は、本発明による方法に供されない対照植物と比較して、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現の減少を示す。
【０１００】
また提供されるのが、植物細胞、植物またはそれらに由来する植物性産物において、ＵＰＬ３タンパク質をコードする少なくとも１つの、好ましくはすべての遺伝子の発現が障害される、植物細胞、植物またはそれらに由来する植物性産物であり、前記少なくとも１つの遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列が、配列番号１に示される配列を含み、もしくは前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡが、好ましくはその全長にわたり、配列番号１の配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する配列を含み、ならびに／または前記少なくとも１つの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号２に示される配列および配列番号２の配列と３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、ならびに／または前記少なくとも１つの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、上に定義した少なくとも１つのＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメイン（ＰＦ００６３２）および少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピート（モデルＳＳＦ４８３７１）を含む。好ましくは、植物は、実施例に記載のシロイヌナズナ属Ｔ−ＤＮＡ挿入変異体ではない。
【０１０１】
別の一態様において、本発明は、植物に増加した耐乾燥性を提供するための遺伝子またはヌクレオチド配列の使用を対象とし、前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡが、配列番号１に示される配列を含み、もしくは前記遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡが、それと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の同一性を有する配列を含み、ならびに／または前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号２に示される配列、およびそれと３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超える同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、ならびに／または前記遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、上に定義される少なくとも１つのＰｆａｍ  ＨＥＣＴドメイン（ＰＦ００６３２）および少なくとも１つのスーパーファミリーＡＲＭリピート（モデルＳＳＦ４８３７１）を含む。
【０１０２】
この実施形態において、述べられた遺伝子を、本明細書における開示に従い、植物における耐乾燥性を改善するための標的として使用でき、または、この遺伝子を、乾燥感受性および耐性に関与する新規タンパク質を同定するのに使用できる。
【０１０３】
別の一実施形態において、シロイヌナズナ植物の耐乾燥性のスクリーニングにおける、シロイヌナズナ種の配列番号１または２を有するＵＰＬ３配列の使用を提供する。加えて、ＵＰＬ３配列が他の植物種の配列番号１または２の類似配列であり、スクリーニングが他の植物種の植物におけるものである、使用を提供する。さらに、以下の工程を含む、改善した耐乾燥性を有する植物または植物細胞のスクリーニング方法を提供する。すなわち、
−シロイヌナズナ種の植物細胞または植物の異型遺伝子性集団（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する工程、
−配列番号１または２を有するＵＰＬ３配列を提供する工程、
−植物細胞または植物のＵＰＬ３遺伝子の少なくとも一部の配列を判定する工程、
−植物細胞または植物に由来する判定されたＵＰＬ３配列を、提供されたＵＰＬ３配列と比較する工程、
−ＵＰＬ３配列が変異を含む植物細胞または植物を同定する工程。
【０１０４】
あるいは、この方法において、提供される植物細胞または植物は他の種のものであり、提供されるＵＰＬ３遺伝子配列は、その種における類似配列である。
【０１０５】
したがって、シロイヌナズナ種のＵＰＬ３配列である配列番号１もしくは配列番号２、または他種由来のその類似配列を使用することにより、改善した耐乾燥性を提供し得る変異ＵＰＬ３配列をその植物種において同定できる。シロイヌナズナ種のＵＰＬ３配列である配列番号１または配列番号２の他種における類似配列は、それと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列として定義される。類似ＵＰＬ３タンパク質は、実質的に配列番号１または配列番号２と同じ機能を有し得る。
【０１０６】
この方法において、その種の植物細胞または植物の異型遺伝子性集団が提供される。異型遺伝子性集団は、たとえば、植物細胞にランダム変異を導入する変異原に晒し、そのことにより植物細胞の異型遺伝子性集団を提供することにより提供してもよい。したがって、異型遺伝子性集団は、単一の植物品種に由来してもよく、この品種は、後代で多様な変異を得ることにより異型遺伝子性集団を提供するため、ランダム変異誘発に晒される。当技術分野において多くの変異原、たとえばイオン放射、ＵＶ放射、および変異原性化学物質、たとえばアジド、エチジウムブロマイドまたはエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）が知られている。したがって、当業者は、植物または植物細胞の異型遺伝子性集団を提供する方法を知っている。また、当業者は、多様な植物、すなわち１種に由来する単一の品種ではない多様な植物を、異型遺伝子性集団として提供してもよい。多様な植物は、遺伝的多様性を示し、遺伝的に同一ではないが、これら植物は同種に由来するので、実質的には同一である。いずれにしろ、植物細胞または植物の異型遺伝子性集団は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９８％、９９％、９９．５％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有していてもよい。
【０１０７】
異型遺伝子性集団からの植物または植物細胞の配列で、ＵＰＬ３遺伝子配列の配列の少なくとも一部を判定し、続いてこれら配列を提供されたＵＰＬ３遺伝子配列（参照）と比較することにより、ＵＰＬ３遺伝子配列において変異を含む植物細胞または植物を同定できる。かかる比較を、配列のアラインメントにより行うことができ、変異は、その植物種の類似（参照）ＵＰＬ３配列における少なくとも１つの核酸またはアミノ酸位置に関する差異であることが理解される。こうして、ＵＰＬ３遺伝子に、改善した耐乾燥性を提供し得る変異（たとえば挿入、欠失、置換）を有する植物または植物細胞を同定する。
【０１０８】
好ましくは、すでに上で概説したように、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現の障害をもたらすと考えられる変異を有する植物が選択される。機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現を障害すると考えられる変異は、オープンリーディングフレームを破壊する（フレームシフトまたは終止コドンを導入する）、または、タンパク質の適切な機能に必須のアミノ酸をコードするコドンのヌクレオチドを変更することによりコードされたタンパク質の機能を破壊するもしくはさもなければ変更すると考えられ、そのことにより、非変更タンパク質と比較して、ドラフトに対する改変された（たとえば増加した）耐性をもたらす変異であってもよい。この方法はまた、たとえば、上で概説したとおり、ＵＰＬ３遺伝子配列を標的とする遺伝的改変に供された植物のスクリーニングおよび選択において使用してもよい。また、ＵＰＬ３配列を、植物の（異型遺伝子性）集団が乾燥に晒されるスクリーニングアッセイにおいて使用してもよい。改善した耐乾燥性を示す植物は、提供してもよい。
【０１０９】
別の一実施形態において、耐乾燥性シロイヌナズナ植物の育種のためのマーカーとしての、シロイヌナズナ種の配列番号１または配列番号２を有するＵＰＬ３の少なくとも一部の使用を提供する。また、ＵＰＬ３配列は、他種の類似配列であってもよく、マーカーは、他の植物種の耐乾燥性植物を育種するためのものである。
【０１１０】
本発明はまた、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されている植物、植物細胞、または植物性産物の使用に関する。この機能性ＵＰＬ３タンパク質は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、乾燥ストレス条件下で成長する際に前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である。前記乾燥ストレス条件により、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されていない対照植物、植物細胞または植物性産物が、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されている植物、植物細胞、または植物性産物よりも早く乾燥ストレスの徴候、たとえばしおれの徴候を示す。
【０１１１】
一態様において、本発明は、本明細書において教示される方法により得られるまたは得られた植物、植物細胞または植物性産物に関する。加えて、本発明は、かかる植物に由来する種子を提供する。
【０１１２】
本発明はまた、機能性ＵＰＬ３タンパク質が、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害された植物、植物細胞、または植物性産物に関する。前記植物、植物細胞または植物性産物は、たとえば、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を含んでいてもよい。
【０１１３】
植物、植物細胞または植物性産物は、任意の植物もしくは植物細胞であってもよく、または任意の植物に由来してもよく、たとえば単子葉植物または双子葉植物だが、最も好ましくは、植物はナス科に属する。たとえば、植物は、ナス属（トマトを含む）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）および他の属に属していてもよい。以下の宿主種が、好適に使用されてもよい。すなわち、タバコ（タバコ属種、たとえばベンサミアナタバコ（Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎ．  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、タバコ（Ｎ．  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）等）、野菜種、たとえばトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、たとえばチェリートマト、ｖａｒ．  ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ、カラントトマト、ｖａｒ．  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）またはツリートマト（Ｓ．  ｂｅｔａｃｅｕｍ，  ｓｙｎ．  Ｃｙｐｈｏｍａｎｄｒａ  ｂｅｔａｃｅａｅ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、ペピーノ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｕｒｉｃａｔｕｍ）、ココナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒｕｍ）およびナランジラ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｑｕｉｔｏｅｎｓｅ）、トウガラシ（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、キダチトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、アヒ・アマリージョ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ））、観賞植物種（たとえばペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ペチュニア・アクシラリス（Ｐｅｔｕｎｉａ  ａｘｉｌｌａｒｉｅｓ）、Ｐ．インテグリフォリア（Ｐ．  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））。
【０１１４】
あるいは、植物は、任意の他の科、たとえばウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）またはイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）に属していてもよい。好適な宿主植物は、たとえば、トウモロコシ／コーン（トウモロコシ属（Ｚｅａ）種）、コムギ（コムギ属種）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）（たとえばオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、カラスムギ（たとえばエンバク）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種、たとえばダイズ（Ｇ．  ｍａｘ））、ワタ（ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種、たとえばリクチメン、カイトウメン（Ｇ．  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（たとえばセイヨウアブラナ、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、メキャベツ（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラッシカ・ラパ等）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、サフラワー、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（ｒｉｃｅ）（イネ属種、たとえばインディカイネ（Ｏ．  ｓａｔｉｖａ  ｉｎｄｉｃａ）栽培品種群またはジャポニカイネ（Ｏ．  ｓａｔｉｖａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）栽培品種群）、飼料草、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ  ｍｉｌｌｅｔ）（チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）種、たとえばトウジンビエ（Ｐ．  ｇｌａｕｃｕｍ））、樹木種（マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポプラ、モミ、オオバコ等）、茶、コーヒー属（ｃｏｆｆｅａ）、アブラヤシ、ココナツ、野菜種、たとえばエンドウマメ、ズッキーニ、ビーン（たとえばインゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）種）、キュウリ、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、ニラネギ、レタス、タマネギ、ラディッシュ、カブラ、メキャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、ウイキョウ、ビート、多肉果結実植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、柑橘類、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツ等）、観賞植物種（たとえばバラ属（Ｒｏｓｅ）種、ペチュニア属種、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）種、ユリ属（Ｌｉｌｙ）種、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）種）、香草（ミント、パセリ、バジル、タイム等）、木質樹木（たとえばポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）の種）、繊維種、たとえばアマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）およびアサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、またはモデル生物、たとえばシロイヌナズナを含む。
【０１１５】
好ましい宿主は「作物植物」、すなわちヒトにより栽培および交配される植物種である。作物植物は、食料目的のために（たとえば農作物）、または観賞目的のために（たとえば切り花用の花や、芝生用の芝等の生産）栽培されてもよい。本明細書において定義される作物植物はまた、非食料産物、たとえば、燃料油、可塑性ポリマー、医薬製品、コルク等が収穫される植物を含む。
【０１１６】
好ましくは、本発明の植物、植物細胞または植物性産物は、シロイヌナズナまたはブラキポディウム植物、植物細胞または植物性産物ではない。
【０１１７】
本発明の植物、植物細胞または植物性産物は、たとえば、トマトまたはブラッシカ・ラパ植物、植物細胞または植物性産物であってもよい。
【０１１８】
したがって、本発明は、たとえば、機能性ＵＰＬ３タンパク質が、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有するシロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株において発現させたときに、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を有する前記シロイヌナズナＴ−ＤＮＡ挿入株であって、前記機能性ＵＰＬ３タンパク質が発現していない株の耐乾燥性と比較して、耐乾燥性が障害された植物をもたらすタンパク質である、機能性ＵＰＬ３タンパク質の発現が障害されたトマト、リクチメン、ダイズ、コムギ属種、オオムギ、エンバク、モロコシ、ライムギ、またはセイヨウアブラナ植物、植物細胞、または植物性産物に関する。前記植物、植物細胞または植物性産物は、破壊された内在性ＵＰＬ３遺伝子を含んでいてもよい。
【０１１９】
本明細書に記載されるすべての参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
【実施例１】
【０１２０】
乾燥試験
アグロバクテリウム・ツメファシエンスベクターｐＲＯＫ２で形質転換され、機能性ＵＰＬ３タンパク質の非存在をもたらされたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ：Ａｔ）種子（ＮＡＳＣ  ＩＤ：Ｎ６７０５５８、ＡＧＩコード  Ａｔ４ｇ３８６００およびＳＡＬＫ＿０３７６３６Ｃ；以下変異体種子または変異体植物と呼ぶ）を、ノッティンガムシロイヌナズナ保存センター（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ：ＮＡＳＣ；生物科学部、ノッティンガム大学、サットンボニントンキャンパス、ラフバラ、ＬＥ１２  ５ＲＤ  英国）から得た。対照として、Ａｔ  Ｃｏｌ−０（コロンビア、Ｎ６００００）；以下対照種子または植物と呼ぶ）を使用した。
【０１２１】
成長培地：
１部の砂およびバーミキュライトならびに２部のコンポストを含む土壌混合物を使用した（砂：バーミキュライト：コンポスト＝１：１：２）。この混合物は、水の浸透を増加させ、したがって、それぞれのポットによる均一な水取込みおよびより良い水はけを容易にする。播種前に、種子を４℃で３日間、暗く湿った条件下でストラティフィケーションのため維持した。
【０１２２】
変異体および対照種子の両方を、約４ｃｍの直径の８×５＝４０ポットを含有する長方形のトレーに、１ポット当たり５つの植物の密度で播種した。１０発芽後日数（ｄａｙｓ  ａｆｔｅｒ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ＤＡＧ）で栄養液（ＥＣ＝１．５）をすべての植物にトレーのポットの底から供給し、１５ＤＡＧで植物をポットから乾燥トレーに移すことより（１５、１６、１７または１８日間）乾燥に晒した。続いて、植物に水分補給し、１週間後に回復を観察した。
【０１２３】
それぞれの遺伝子型について３つの複製ポットを、前乾燥スクリーニングの対象とした。完全な試験に必要な総時間は、約３６〜３９日間だった。
【０１２４】
乾燥アッセイ検査
植物が２枚の本葉の段階に達したら、それらを間引いて１ポット当たり正確に５つの植物を維持した。１０ＤＡＧで、植物は栄養を受け（ＥＣ＝１．５）、１５ＤＡＧでそれぞれのポットを乾燥トレーに移動した。この日以降、植物は一切水を受けなかった。毎日植物、特に対照（または野生型）（Ｃｏｌ−０）を、しおれの徴候について観察した。１５乾燥日数（ｄａｙ  ｏｆ  ｄｒｏｕｇｈｔ：ＤＯＤ）で、Ｃｏｌ−０は完全にしおれ、水分補給をしても回復しなかった。本発明者らは、この日をその永久しおれ点（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｗｉｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ：ＰＷＰ）と判定した。この日以降、変異体からの１つの複製に水分補給をし、回復の徴候について観察し、写真を撮影した。変異体は、対照と比較して、乾燥下で少なくとも２日間長い生存を示し、さらなる厳密なスクリーニングにかけた。
【実施例２】
【０１２５】
乾燥試験
成長培地：
実施例１と同じ変異体および対照植物を、スクリーニング前の試験において、上述のものと同様のトレーセットアップで生育した。１５ＤＡＧから対照がそのＰＷＰに達するまで水を与えないことにより、植物にストレスをかけた。この期間中、隔日でポットをトレー内でシャッフルし、位置効果を減少させ、蒸発を均一にした。１５ＤＯＤで対照植物はＰＷＰに達し、水分補給をしても回復しなかった。変異体からの１つの複製ポットに、１５ＤＯＤ以降毎日水分補給し、乾燥ストレス回復をチェックした。写真を撮影し、回復をスコア化した。変異体は、対照がＰＷＰに達した後、少なくとも３日長く乾燥ストレスからの回復を示した。
【０１２６】
図１は、変異体および対照（左）を比較する写真を示し、乾燥ストレスに対する耐性に関する変異体（右列）の優れた効果を示す。
【実施例３】
【０１２７】
乾燥試験
植物材料。ＡＴ４Ｇ３８６００遺伝子（ＳＡＬＫ＿０３７６３６Ｃ）が破壊されたＴＤＮＡ挿入株を、ノッティンガムシロイヌナズナ保存センター（ＮＡＳＣ）から得た。フローラルディップ形質転換を使用したシロイヌナズナ植物の安定な形質転換（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、相補株を作製した（非特許文献３５）。シロイヌナズナ（ＡＴ４Ｇ３８６００）ＵＰＬ３遺伝子のホモログを、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト（ｔｏｍａｔｏ））およびイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ（ｒｉｃｅ））を含むいくつかの作物種ならびにモデル種シロイヌナズナ（ＵＰＬ４；ＡＴ５Ｇ０２８８０）から同定した。
【０１２８】
【表１】
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【０１２９】
【表２】
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乾燥アッセイ。野生型、ＴＤＮＡノックアウトおよび相補株を、２：１：１混合のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ８５２無土壌培地、細砂およびバーミキュライトを含有する５０セル実生トレー中に反復ブロックデザイン（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ）で播種した。植えたトレーを４℃で３日間、休眠状態を破るために置き、次に発芽および定着のため生育箱（１６ｈ  ２２／２２℃、５０％ｒＨ）に移した。相補株が十分に広がった子葉を有し、形質転換株のみが選択されたことを確かめたら、それらにグルホシネート調合物（２０ｍｇ  グルホシネート、２０μＬ  Ｓｉｌｗｅｔ界面活性剤、２００ｍＬ  水）を噴霧した。この処置後、それぞれのセルの実生が一本ずつとなるよう間引いた。植物が４〜６枚の本葉の段階に達したら、より高度の蒸気圧欠乏条件に順化させ、均等な乾燥ストレス（２８／２６℃、２５％ｒＨ）を促進し、乾燥処置前に除去するため、著しく小さい植物を同定した。植生トレーを水に浸し、次に排水し、すべてのセルをポットの容量とした。いずれかのトレーで野生型植物の半分が永久しおれ点にあるように見えたら（１．５〜２週の乾燥処置）、トレー全体に水を与えた。数日間にわたり植物が回復することを可能にし、生存を記録したが、事前に同定した異常に小さい植物は、さらなる分析から除外した。
【０１３０】
統計分析。この乾燥処置中に異なった生存確率の統計的有意性を、統計ソフトウェアプログラムであるＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）における等しいまたは所定の比の検定を適用することにより評価した。関数ｐｒｏｐ．ｔｅｓｔを、変異体と野生型との間（片側）、あるいは、相補的導入遺伝子を含有する挿入変異体株と含有しない挿入変異体株との間（両側）の生存植物の比が等しいという帰無仮説をテストするために使用した。
【０１３１】
結果
図２は、対照（野生型）植物の乾燥感受性表現型と比較した、ＵＰＬ３ノックアウト（シロイヌナズナ属Ａｔ４ｇ３８６００挿入変異体）の耐乾燥性表現型を示す。
【０１３２】
シロイヌナズナ属Ａｔ４ｇ３８６００挿入変異体は、野生型（Ｃｏｌ−０）植物またはＡｔ４ｇ３８６００のコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＣＤＳ）（配列番号１、陽性対照）およびシロイヌナズナ（Ａｔ５ｇ０２８８０；配列番号３）、トマト（配列番号５および配列番号７）、もしくはイネ（配列番号９）由来ホモログで補完したＡｔ４ｇ３８６００挿入変異体よりも有意に良く乾燥の中を生存した（ｐ＜０．０５）。図３は、ＵＰＬ３遺伝子における挿入変異が耐乾燥性表現型をもたらすことを示す。さらに、それはまた、単子葉植物および双子葉植物種に由来するこの遺伝子のホモログが、通常の乾燥感受性表現型を回復するよう作用することを示す。したがって、これらホモログは、それらのそれぞれの作物種における耐乾燥性において、同じ機能を果たすと考えられる。シロイヌナズナ属のＵＰＬ３変異体に挿入された際に、単子葉植物および双子葉植物の両方のＵＰＬ３遺伝子が乾燥感受性を回復できるという観察は、ＵＰＬ３遺伝子によりコードされるタンパク質の活性の減少が、植物界全体にわたり耐乾燥性表現型をもたらすことを示唆する。したがって、（相同性検索ならびに特徴的なドメイン［ＨＥＣＴ］およびアルマジロリピート配列に基づく）ＵＰＬ３の予測は、植物種における植物ＵＰＬ３ホモログの同定を可能にするであろう。続いて、これら植物ホモログのタンパク質活性を減少させる良く知られた方法（たとえば変異誘発、ＴＤＮＡまたはトランスポゾン挿入、ＲＮＡｉ等）を使用して、耐乾燥性植物を得ることができる。灰色のバーは、黒色のバーよりも有意に低い数値（ｐ＜０．０５）を有する。
【実施例４】
【０１３３】
トマトにおける耐乾燥性
植物材料。トマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ１０ｇ０５５４５０（Ｓｌｇ９８２４７；配列番号７）における新規変異をＥＭＳを使用して生成し、ＥＭＳスクリーニングにより同定した。この変異は、バリン（疎水性）のグルタミン酸（負荷電アミノ酸）へのアミノ酸変化（タンパク質の位置１５８）からなっていた。ホモ接合型、ヘテロ接合型および野生型対立遺伝子を含有する分離Ｍ２集団をすべての乾燥実験に使用した。
【０１３４】
第２の変異が同じトマト遺伝子に同定され、これはアスパラギン酸（負荷電アミノ酸）のグルタミン酸（負荷電アミノ酸）へのアミノ酸変化（タンパク質の位置１１４）を引き起こしていた。生化学的特性の類似性ゆえに、この変異はタンパク質特性に有意な変化を引き起こした可能性は低く、したがって乾燥アッセイにおいて陰性対照として使用された。Ｓｉｆｔ（非特許文献３６）解析は、この変異が許容される可能性が高いことを示した。ホモ接合型、ヘテロ接合型および野生型対立遺伝子を含有する分離Ｍ２集団をすべての乾燥実験に使用した。
【０１３５】
乾燥アッセイ。前述のＶ１５８Ｅ変異についてホモ接合型、ヘテロ接合型または野生型のトマト実生を、２：１：１混合のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ８５２無土壌培地、細砂およびバーミキュライトを含有する２．５インチプラスチックポット中で、生育箱内で生育した（１６ｈ  ２２／２０℃、５０％ｒＨ。定着の際、実生をより高度の蒸気圧欠乏条件に順化させ、均等な乾燥ストレス（２８／２６℃、２５％ｒＨ）を促進した。ポットを水に浸し、次に排水し、ポットの容量ですべての植物を置いた。植物を１週間の乾燥ストレス期間に晒し、次に水を与えて２４時間回復させ、生存を評価した。
【０１３６】
統計分析。この乾燥処置中に異なった生存確率の統計的有意性を、統計ソフトウェアプログラムであるＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）における等しいまたは所定の比の検定を適用することにより評価した。関数ｐｒｏｐ．ｔｅｓｔを、ホモ接合型と野生型変異体との間（片側）の生存植物の比が等しいという帰無仮説をテストするために使用した。
【０１３７】
結果
Ｓｌｇ９８２４７におけるＶ１５８Ｅ変異についてホモ接合型であるトマト植物は、野生型対立遺伝子と比較して有意に良く乾燥処置の中を生存し（ｐ＜０．１）、タンパク質のこの変更がトマトにおける耐乾燥性表現型をもたらすことを示唆した（図４）。予測されたとおり、Ｓｌｇ９８２４７における付加的変異（Ｄ１１４Ｅ）は、乾燥関連表現型を一切示さなかった（分離Ｍ２集団からの植物のすべてが等しく乾燥感受性であった）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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