(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたペプチドであって、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＧＲＮ）又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＫＭＧＲＮ）からなり、遊離酸の形態であるか又はカルボキシ末端でアミド化されているか又はアミン末端で脂質化されている、ペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、 ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＧＲＮ）又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＫＭＧＲＮ）であり、カルボキシ末端でアミド化されているか又はアミン末端で脂質化されている、請求項１のペプチド。
【請求項３】
Ｌ−アミノ酸エナンチオマーとＤ−アミノ酸エナンチオマーのどちらか一方又は両方を含む、請求項１のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の少なくとも一種のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項５】
ペプチドは、０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、又は０．１μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項４の組成物。
【請求項６】
組成物は、エアロゾル、エマルジョン、液体、ローション、溶液、ゲル、マイクロカプセル、クリーム、ペースト、軟膏、粉末又はフォームの形態である、請求項４の組成物。
【請求項７】
ペプチドが、 ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＧＲＮ）又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＫＭＧＲＮ）であり、カルボキシ末端でアミド化されているか又はアミン末端で脂質化されている、請求項４の組成物。
【請求項８】
哺乳動物の皮膚又は粘膜組織の創傷を治療するために用いられる製剤であって、前記製剤が、ペプチドを含む組成物を含み、前記ペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＥＫＭＧ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＭＧＲＮ）又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＫＭＧＲＮ）である、製剤。
【請求項９】
ペプチドが、 Ｌ−アミノ酸エナンチオマーとＤ−アミノ酸エナンチオマーのどちらか一方又は両方を含むか、又は担体分子に共役化されているか、アミド化されるか若しくは脂質化されている、請求項８の製剤。
【請求項１０】
ペプチドが遊離酸の形態である、請求項８の製剤。
【請求項１１】
創傷が、擦過傷、水疱、火傷、裂傷、潰瘍、打撲、発疹、瘡痕、ストレッチマーク又は老化又は環境曝露に起因する創傷である、請求項８の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、2013年2月14日に出願された米国仮特許出願第61/764,913号の優先権を主張し、該仮特許出願は引用を以てその全体が本願に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、生物学的活性、化粧用活性及び治療用活性を有するペプチドに関する。具体的には、本発明は、ケラチノサイト細胞の増殖及び移動を刺激するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｌ（ＥＫＭＧＲＮ）の４〜６個の連続アミノ酸残基を有する短鎖ペプチドに関する。本発明は、さらに、これらペプチドを使用して、創傷治癒の促進と、皮膚及びその他の関連する体表面(例えば、口腔等)に悪影響を及ぼす様々な外傷の治療を行なう方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚は体の中で最も大きな器官であり、環境と我々の体内生態との界面である。皮膚は、最も外側の層である表皮と、表皮の直ぐ下にある真皮との２つの主要層から構成される。ケラチノサイトは、表皮の９５％を構成する主細胞である。基底上のケラチノサイトは、蛋白質と、セラミド、コレステロール及び脂肪酸を含む脂質で囲まれた化学的及び物理的抵抗性の角質層に分化する(differentiate)。この角質化された上皮の上面層が自然に又か強制的に除去されると、下にある細胞による代謝回転が刺激され、損傷又は喪失した細胞を置き換える。この角質化層は、人体と環境との間で保護機能及び遮水機能を有する。ケラチノサイトの主たる機能は、化学的、物理的及び機械的障害物、微生物の侵入、熱、ＵＶ照射並びに水分喪失に対して人体を保護するバリアを形成することである［Proksch et al., 2008］。ケラチノサイトはまた、表皮に連続する粘膜組織の主たる構成要素でもある［Presland and Dale, 2000］。
【０００４】
創傷は、皮膚上皮の完全性が損なわれることと定義される。正常な創傷治癒は、複雑で動的であるが非常に組織化された事象を伴い、炎症、新たな組織の形成及び組織の再構築を含む。創傷治癒は、組織が負傷した時に開始し、上皮形成の正確な調整及び真皮の修復を必要とする。この上皮形成プロセスは、最終的に、ケラチノサイトの移動、増殖及び分化の能力に依存する［Singer and Clark, 1999］。上皮形成中、創傷周囲にあるケラチノサイトが移動し増殖して、創傷の上に単一層を形成する。ケラチノサイトがさらに増殖及び分化すると、正常層を含む表皮層が形成される。ケラチノサイトは正常な真皮線維芽細胞と共に、ｍＲＮＡをコラーゲンＩ型及びIII型に対して上方調節し、線維芽細胞の増殖を増加し、細胞外マトリクスを蓄積及び再構築して、組織の構造及び機能を修復することによって治癒を完了させる［Bergers G and Coussens LM, 2000］。それゆえ、ケラチノサイトの増殖能力は、皮膚表面におけるこれらプロセスを実行する上で重要である。創傷治癒中に、ある程度の成長因子が必然的に関与することは知られていることから、創傷の治療に、成長因子をベースにした方法の開発が行われている［Mustoe et al., 1994; Steed, 1995］。しかしながら、これら方法を利用した試みの殆んどは、臨床的に良好な結果を達成することはできなかった。その理由の一部は、大サイズの蛋白質を治療用蛋白質として用いることの困難さにある。また、成長因子を用いた治療は複雑であり、大蛋白質の製造コストが高い。宿主防御ペプチド(ＨＤＰｓ)は、抗菌ペプチドとしても知られており、皮膚の創傷治癒の制御因子として考えられている。これらは小サイズであるため、これら短鎖活性ペプチドは、治療方法の開発において注目を集めている［Zhang and Falla, 2006］。
【０００５】
ＨＤＰｓは自然界に豊富に存在し、真核生物の自然免疫系の中心的要素を形成する。ＨＤＰｓは、病原体除去のエフェクターとしての自然宿主防御、並びに、組織再生及び修復を促進するための宿主細胞挙動の調節に重要である。正常な創傷修復は、炎症、上皮形成、組織の肉芽化及び再形成の正確な組織化を伴う。宿主防御ペプチドは、これらの挙動の全てに影響を及ぼすことが示されている。カテリシジンＰＲ−３９は、好中球オキシダーゼ活性を阻害することによる抗炎症機能を有し、創傷修復に重要なシンデカン、ヘパリンスルフェートプロテオグリカンを誘発する［Gallo et al., 1994; Shi J., Ross, CR. et al., 1996］。また、カテリシジンファミリーの宿主防御ペプチドについても、器官培養におけるヒト皮膚創傷の上皮再形成に影響を及ぼすことが示されている［Heilborn JD, et al., 2003］。ヒトの好中球デフェンシンは、間質コラゲナーゼの発現を阻害しつつ、Ｉ型コラーゲンの発現を促進する［Oono T., et al., 2002］。さらにまた、ヒトのカテリシジンＬＬ−３７とヒトのβ−デフェンシンは、極端に異なるが、上皮細胞移動の刺激、血管形成の促進、炎症誘発応答の抑制を含む活性を促進する［Steinstraesser et al., 2008, 2009］。それらは、好中球、単球，マスト細胞及びＴリンパ球を引きつけると共に、多くの細胞種の中で好中球及び単球化学誘引物質の生成を誘起する。最近では、ＨＤＰｓは、炎症、血管形成並びに外部組織堆積及び再形成を調整することから、皮膚創傷修復のレギュレータとして考えられている。創傷修復に対するＨＤＰｓの影響は、抗菌作用には依存せず、ＨＤＰｓに対する新規な臨床用途の可能性があることが示されている。発明者らによる以前の報告では、セクロピンＢに由来する非抗菌性宿主防御ペプチドＨＢ１０７(ＭＰＫＥＫＶＦＬＫＩＥＫＭＧＲＮＩＲＮ)は、マウスモデルの創傷修復の作用を有する能力を保持し、ＨＢ１０７に観察された利点は、成長因子ｒｈＰＤＧＦで治療した創傷と区別ができなかった［Lee, et al., 2004］。ＨＢ１０７で治療した創傷の組織学的分析結果では、ＨＢ１０７で治療した創傷の表皮過形成が増加したことを示しており、ＨＢ１０７がケラチノサイトの増殖又は移動に影響を及ぼす可能性のあることが報告されている［Lee PH., et al., 2004］。ＨＤＰｓの新グループの合成変異体であり、自然防御レギュレータと称されるＩＤＲｓは、多剤耐性細菌による全身感染に対して広範囲の保護をもたらすことが最近報告されている［Easton DM., et al., 2009］。例えば、ＩＤＲ−１及びＩＤＲ１００２は、宿主の自然免疫防御を高めることにより、有害な過剰免疫応答を抑えつつ、微生物攻撃から保護する［Easton et al., 2009; Nijnik A., et al., 2010］。
【発明の概要】
【０００６】
＜発明の要旨＞
本発明は、哺乳動物の傷治癒を促進するのに有用な生物活性短鎖ペプチドに関する。単離ペプチドが標的とする傷は、好ましくは、皮膚及び関連する粘膜表面に影響を及ぼす傷である。どんな具体的機構に限定されるものでないが、本発明のペプチドは、細胞の増殖及び移動を刺激することにより、傷の治癒に影響を及ぼすことができる。本発明のペプチドは、インビトロ及びインビボの両方で有用であり、ケラチノサイトの前記活性を誘起することができる。
【０００７】
本発明の一実施態様は、ＨＢ１０７(ＭＰＫＥＫＶＦＬＫＩＥＫＭＧＲＮＩＲＮ)の１１位と１６位の間に位置する４〜６個の連続アミノ酸残基、即ちＥＫＭＧＲＮ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｌ)に向けられている。単離ペプチドは、Ｌ−エナンチオマ型アミノ酸又はＤ−エナンチオマ型アミノ酸又はその両方のアミノ酸を含むことができる。本発明の他の実施態様では、キャリア蛋白質に共役化される(conjugated)ことができるし、又は脂肪酸によるＣ−末端アミド化又はＮ−末端アセチル化により改質(即ち、脂質化)されることができる。これらの追加は、皮膚及び皮膚傷に適用されたとき、ペプチドの生物活性を向上させる。
【０００８】
本発明の幾つかの好ましい実施態様において、単離ペプチドは全てメチオニンを含んでいる。単離ペプチドの特定の実施態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４及び５を含んでおり、これらは全て細胞の増殖及び移動に対して刺激活性を示し、傷の修復に作用する。
【表Ａ】
0006348126.tif 000002
【０００９】
本発明の他の実施態様は、治療用又は化粧用として許容される担体及び一種又は二種以上の前記ペプチドを含む治療用又は化粧用組成物の製造に関連している。前記組成物は、哺乳動物の皮膚傷を治癒させるための薬剤又は化粧品用として有用である。このような組成物に含まれるペプチドの濃度は、好ましくは、約０．１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、又は約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲である。組成物の好ましい形態は、エアロゾル、エマルジョン、液体、溶液、ローション、クリーム、ペースト、軟膏、粉末、ゲル及びフォームである。
【００１０】
さらにまた、本発明のペプチド及び該ペプチドを含む組成物は、スキンケア及び化粧用製剤の有用な含有物として供されることができる。前記製剤として、例えば、様々な皮膚化粧料、皮膚クリーム、ローション、日焼け止め剤の他、レーザー照射後のケアに用いられる抗アクネ用製剤の如き治療用ローション又はクリームがある。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物における傷の治癒に用いられる前記組成物を使用する方法に関連している。治療方法は、一般的には、傷、特に、皮膚(表皮)及び関連する粘膜組織の傷に対して、有効量のペプチド含有組成物を有効時間に亘って投与する必要がある。このような傷として、しわ、皮膚のたるみ及び光損傷を含む老化及び環境曝露による体内及び体外効果に起因する外科的創傷、擦過傷、水疱、火傷、裂傷、潰瘍、打撲、吹き出物、傷跡、脂肪線及び皮膚損傷が挙げられる。
【００１２】
＜発明の詳細な説明＞
米国特許第5,962,410号、第5,861,478号及び第7,696,174号は、本発明を理解する上で有用な開示を提供しており、それらの全体を引用を以て本願に組み込まれるものとする。ペプチドＨＢ１０７（ＭＰＫＥＫＶＦＬＫＩＥＫＭＧＲＮＩＲＮ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）自体は、蛾に存在する抗菌性蛋白質であるセクロピンＢのフラグメントを構成する。ＨＢ−１０７は、由来する蛋白質の静菌性効果を示さないが、表皮の傷治癒クォリティを向上させる［Lee et al., 2004］。この１９アミノ酸残基ペプチドは、創傷治癒に重要なケラチノサイトの増殖及び移動、スクラッチ傷閉鎖及び抗炎症活性を刺激する多官能性免疫モジュレータである。
【００１３】
発明者らは、この原理に基づいて、ＨＢ１０７について現在研究中の１１〜１６位置の中でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＨＢ２２６５）、ＥＫＭＧＲＮで表される６アミノ酸伸長(stretch)に焦点を当てることにした。
ＨＢ１０７の中に位置し、４〜６個の連続アミノ酸残基からなるペプチドの概要を以下に示す。
【表Ｂ】
0006348126.tif 000003
【００１４】
発明者らは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から３〜５個の連続アミノ酸残基からなるペプチドをさらに作製し、これらをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２，３，４，５，６，７，８及び９で表す。新たに開発したペプチドが傷治癒活性を有するかどうかを評価するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１，２，３，４，５，６，７，８及び９のペプチドについて、活性化合物が傷閉鎖を促進する能力を評価するためのアッセイとして広く認められているケラチノサイトのスクラッチ創傷テストを行なった。表１を参照すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１，２，３，４及び５のペプチドは、１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度で、スクラッチ創傷閉鎖にすぐれることを示している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１，２，３，４及び５のペプチドによってもたらされた傷閉鎖の割合は、ＰＢＳで治療したものを１００％としたとき、１８２〜２１８％であった。しかしながら、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＨＢ２２６８）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＨＢ２２６９）並びにテトラペプチドＨＢ２２３２で示されるペプチドは全て、スクラッチ創傷閉鎖をもたらさなかった(表１参照)。アミノ酸メチオニン残基（ＧＲＮＩＲＮ）を含まないペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＨＢ１０６２）もまた、同じインビトロのケラチノサイトのスクラッチ創傷テストにおいて、スクラッチ創傷閉鎖を促進することができなかった(表１参照)。それゆえ、観察された傷治癒活性に必要な重要な２種類の要素がある。第１は、少なくとも４種類の連続アミノ酸残基が必要であり、第２は、指定された配列の中にメチオニン残基を含まねばならない。ＨＢ２２３２（ＫＩＥＫ）とＨＢ１０６２（ＧＲＮＩＲＮ）が両方とも、スクラッチ創傷閉鎖の促進に不活性であるとい事実は、メチオニン残基が傷治癒活性を促進するために４以上の連続アミノ酸残基の中にアミノ酸の１つとして存在しなければならない交換不能なアミノ酸である。それゆえ、発明者らの結論として、４〜６個の連続アミノ酸残基が、メチオニン残基を含み、ＥＫＭＧＲＮ内の１１位〜１６位からＨＢ１０７の中心領域に位置するとき、傷修復を促進すると考える。活性がペプチドのケラチノサイトに対する毒性によるものでなかったことを確認するために、全てのペプチドについてＭＴＴ細胞毒性試験を行なった。試験したどのペプチドも、濃度５００μｇ／ｍｌ以下のインビトロで、正常な皮膚ケラチノサイトに対して細胞毒性を示さなかった。
【００１５】
インビトロでのスクラッチ創傷閉鎖に対して観察された活性は、インビトロでのケラチノサイト増殖アッセイで示されるように、ペプチドの増殖活性と密接な関連性を有する(表２)。増殖活性は、濃度が低くなると顕著である。ケラチノサイト増殖活性を刺激するのに必要な最適濃度はペプチド毎に異なるが、一般的には、０．６２５〜５μｇ／ｍｌの範囲内である(表２)。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＨＢ２２６５）は２．５〜５μｇ／ｍｌの活性を示し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＨＢ２２６２）は、試験した０．６２５〜５μｇ／ｍｌの全ての濃度でケラチノサイト増殖を刺激し、ＳＥＱ  ＩＤ３（ＨＢ２２６３）、ＳＥＱ  ＩＤ４（ＨＢ２２３４）及びＳＥＱ  ＩＤ５（ＨＢ２２３５）は、０．６２５〜２．５μｇ／ｍｌの比較的低い濃度で前記活性を有する。トリペプチドＨＢ２２６８（ＫＭＧ）及びＨＢ２２６９（ＧＲＮ）は、試験した全ての濃度で増殖活性を示していない。また、トリペプチドＨＢ２２３２もケラチノサイト増殖を誘起していない(表２)。これらから、本発明のペプチドは、皮膚ケラチノサイト増殖に対する調節活性を有し、この活性は皮膚の創傷修復に重要であることが結論づけられる。
【００１６】
メカニズムをより良く理解するために、ＳＵＮＮＹ  ＢＩＯＤＩＳＣＯＶＥＲＹ(登録商標)(Santa Paula, CA)遺伝子プロファイリングによって行なわれる遺伝子プロファイリング研究に、代表的なペプチドとしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＨＢ２２３５）を適用した。この研究では、組織等価材ＥＰＩＤＥＲＭ(登録商標)(MatTek, Ashland MA)が用いられる。皮膚等価材は、一晩かけて平衡し、ペプチド又は対照水による治療を行なう前に、２０Ｇニードルで全厚刺し傷の２つの試料を２４時間かけて形成した。創傷組織と正常組織との間の遺伝子プロファイリング変化を調べるために、２組の正常組織セットを対照(control)として用いた。治療の終わりに、ＲＮＡを抽出し、ＰＣＲアレイ分析を行なった。第１の比較は、治療していない創傷組織と、創傷がなく治療していない組織との間で行ない、傷に対する反応として遺伝子の発現プロファイルを調べた。次に、治療していない創傷組織と、ＨＢ２２３５で治療した創傷組織との比較を行なった。表３は、創傷治癒カスケードの異なるシグナル経路に有意の影響を受けた幾つかの遺伝子を列挙している。影響を受けた遺伝子とは、コラーゲンやインテグリン等のマトリクス蛋白質をエンコードする遺伝子、サイトカインやケモカイン受容体等の炎症促進性カスケード中の遺伝子、マトリクスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性剤及びプロテアーゼ阻害剤等の組織再構築に関係する遺伝子、創傷治癒に関係するその他遺伝子を表す。創傷治癒が功を奏するのは、多くの細胞種、繊維素(fibrin)やコラーゲン等の無細胞成分、及び生物学的に活性な化学種の混合物(cocktail)に関して、調和のとれたプロセスである。それは重複するプロセスの連続的カスケードであるけれども、炎症、増殖及び再構築の３段階に分かれることもある。表３に示されるように、重大な創傷又は負傷の後は、傷のない正常な皮膚組織と比べて、炎症促進性サイトカイン及びケモカイン受容体に正常な関連性のある遺伝子に有意の上方制御(up-regulation)が認められる。例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインリガンド２及び５は、夫々、４．２９倍及び２．９３倍であった(表３)。ファクター２を刺激する顆粒球マクロファージコロニー及びインターロイキン−６シグナルトランスデューサもまた、夫々、１．８７倍及び１．９３倍以下である。炎症段階で、負傷部の血小板凝集の後、好中球等の白血球及びマクロファージが創傷部に浸潤し、その間に、繊維素リッチの血塊がさらなる出血を防止するために形成され、創傷部への初期細胞移動の骨格として作用する。創傷が生じた後、炎症シグナルを２４時間観察(正常組織に対する創傷組織)したところ、炎症シグナルは一定であり、これは、好中球及びマクロファージを、生理学的に負傷状態にある部位に引きつけるのに重要である。繊維素リッチの血塊は、最終的には、プラスミン等の蛋白質により、後の段階で分解される。プラスミンの生成は、プラスミノーゲンを、マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰｓ)の機能と密接に関連するプラスミンへ転換する蛋白質である組織プラスミノーゲン活性剤の存在によって支配される。これは、表３に明確に示されているように、創傷から２４時間経過後、ＭＭＰｓ(ＭＭＰ−１)の他に、組織プラスミノーゲン活性剤(ＰＬＡＴ)及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性剤(ＰＬＡＵ)の両方をエンコードする遺伝子の上方制御がある。正常な創傷治癒プロセスにおいて、再構築段階は、長い時間スケールで起こり、終了するまで数週間を要し、コラーゲンを合成し再構築するケラチノサイト及び線維芽細胞の急速な増殖段階を要する。ＨＢ２２３５で治療した創傷組織を綿密に検査してみると、創傷治癒カスケードには、ＨＢ２２３５による作用を受けて調節が行われている幾つかの重要な段階があることが観察された。第１に、ペプチドは、初期炎症段階の時間が明確に短縮する。これは、炎症促進性サイトカイン及びケモカイン受容体をエンコードする遺伝子が、ＨＢ２２３５による治療の２４時間後の調節が有意に低下してことによって示される。炎症シグナルの調節低下と一致して、抗炎症サイトカインＩＬ−１０が上方制御される(表３)。炎症時間の長さ又は時間が低減されると創傷治癒を有意に促進する数多くの研究があり、創傷治癒の遅延は、創傷治癒の全ての段階を通じて重度の炎症と関連することは明白である［Leitch et al., 2009; Wang et al., 2006］。第２に、ＨＢ２２３５は、治療２４時間後にプラスミノーゲン活性剤及びＭＭＰｓをエンコードする遺伝子の調節を有意に低下させて、組織の肉芽化プロセスを加速させることを示している。第３に、細胞の移動及び増殖活性に重要な成長因子(ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ等)をエンコードする遺伝子を調節することにより、ペプチドは、上皮再形成及び組織再構築活性の促進に明確に関連があり、その間に新たに形成された組織は、創傷領域の被覆を開始し、組織修復が完了する。最も注目すべきことは、ＨＢ２２３５で治療された組織は、ビトロネクチン(ＶＴＮ)の５倍以上の上方制御を示したことである(表３)。ＶＴＮは、細胞外マトリクスに存在する豊富な糖蛋白質であり、ケラチノサイトの接着、増殖及び移動を促進することが広く知られている［Upton et al., 2008］。第４に、細胞の増殖及び移動活性に一致して、ＨＢ２２３５は、上皮再形成及び組織再構築に重要なコラーゲン及びインテグリン等のマトリクス蛋白質をエンコードする遺伝子の上方制御を刺激する(表３)。遺伝子アレイ分析では、ペプチドが、細胞の増殖及び移動並びにマトリクス再構築及びコラーゲン刺激を促進することにより、上皮形成プロセスを加速することを裏付けている。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１，２，３，４及び５を含む本発明のペプチドは、ケラチノサイトが存在する上皮組織における創傷治癒プロセスで重要なケラチノサイトの移動及び増殖の上方制御に重要な活性を示す。本発明が開示するペプチドは、新規であり、以前に開示された配列よりも短鎖である。本発明のペプチドが誘発する生物学的活性は、細胞の増殖と移動であり、その両方とも、創傷治癒機能を媒介する上で大きな役割を有する。
【００１８】
例えば本発明の４個のアミノ酸残基を有するペプチドは小サイズであるため、製造が容易で、費用効率が高い。また、大きなペプチドと比べて、本発明のペプチドは、化学的改質の操作が容易であり、溶解度問題も少ない。これらの取扱い容易性により、使用される賦形剤(vehicle)及びその適用方法等の薬物デリバリーの選択肢の数を増やすことができる。本発明のペプチドは、サイズが小さく、溶解性が大きいので、創傷部位での吸収及び保持の向上により、また、局所におけるケラチノサイト及び他の細胞が高濃度ペプチドに曝露される時間が長くなることにより、治癒能力を高めることができる。
【００１９】
本発明のペプチドは全て、標準のＦｍｏｃ(９−フルオレニルメトキシカルボニル)固相化学を用いて合成されることができる。上記ペプチドの各々は、Ｌ又はＤアミノ酸光学異性体を含むことができる。ペプチドのカルボキシ末端は、酸性化(−ＣＯＯＨ)又はアミド化(例えば、 −ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＯＮＲ２)されることができる。カルボキシ端末のアミド化は、本発明のペプチドがプロテアーゼ分解を起こり難くし、遊離酸と比べてそれらの極性を大きくするので、治療効果を高めることができる。なお、Ｎ末端脂質化又はアセチル化は、ペプチドの生物活性機能を変化させることなく、ペプチドの皮膚透過を向上させることが報告されている［Samah A, 2011］。それゆえ、ペプチドも脂質化されることで、皮膚透過の向上に供されることができる。本発明に係る化合物の成分Ｃ１２−１８脂質を得るために用いられることができる飽和又は不飽和脂肪酸の例として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸及びリノール酸を挙げることができる。
【００２０】
ペプチドは、必要に応じて可溶性を改質するために、また、標的組織におけるペプチドの局部濃度を高めるために、可溶性又は不溶性担体分子に共役結合されることができる。可溶性担体分子の例として、ポリエチルグリコール(ＰＥＧ)及びポリビニルピロリドンのポリマーを挙げることができる。不溶性ポリマーの例として、ケイ酸塩、ポリスチレン及びセルロースを挙げることができるが、これらに限定されない。ペプチドは、安定性を高めるために、また、放出制御を行なうために適用中及び適用後の安定性を高めるために、リポソーム技術又はナノ技術を用いてマイクロカプセル化されることができる。
【００２１】
本発明は、例えば製剤(formulations)の中に又は治療剤として、前述したペプチドを用いる方法に向けられる。これらの方法は、単一のペプチド又は複数のペプチドを組み合わせて使用することを含んでいる。幾つかの実施態様において、本発明の組成物は、皮膚の上又は皮膚の中に配置されるデバイスの内部に用いられることができる。そのようなデバイスとして、経皮パッチ、インプラント又はインジェクションがあり、これらは、受動的又は能動的放出の何れかの放出機構により皮膚又は髪の毛包に接触するように物質を放出する(release)。本発明の方法でペプチドを送達(deliver)するのに用いられる組成物は、エアロゾル、エマルジョン、液体、ローション、溶液、ゲル、マイクロカプセル、クリーム、ペースト、軟膏、粉末、フォーム又は他の薬学上許容される製剤の形態であってよい。さらに、ペプチドは、例えば、脱イオン水、蒸留水、ＰＢＳ又は食塩水等のような関与度の低い物質を用いて送達されることができる。
【００２２】
製剤は、所望により、美容的魅力を有することができるし、及び／又は、例えば、レチノイド、ビタミンＣの他に、本発明ペプチドの治療作用の補助剤として作用することができる他のペプチドの如き作用剤を含むことができる。最大の治癒プロセスを達成できるように、感染防止のために、抗生物質を製剤に加えることもできる。
【００２３】
製剤は、プロテアーゼ阻害剤を含むことができる。プロテアーゼ阻害剤は、選択された生物活性ペプチドを分解させる(degrade)ことが期待される具体的な標的プロテアーゼに合わせて選択されることができ、そのような選択は、生物活性ペプチドの長さ及び／又は配列に基づいて決定されることになる。しかしながら、プロテアーゼ阻害剤の選択は、必ずしも特定のいかなる方法に限られる必要はない。例えば、２種以上の阻害剤が含まれるプロテアーゼ阻害剤カクテルを本発明に用いられることができる。本発明で用いられることができるプロテアーゼ阻害剤には、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、アスパルテートプロテアーゼインヒビター、メタロプロテイナーゼインヒビター、チオールプロテアーゼインヒビター及びスレオニンプロテアーゼインヒビターがある。本発明で用いられるプロテアーゼ阻害剤は、ペプチド又は蛋白質又は化学剤であってよい。そのような阻害剤の例としてセルピンがあり、アルファ−１−アンチトリプシン、補体１−インヒビター、アンチトロンビン、アルファ−１−アンチキモトリプシン、プラスミノーゲン活性剤インヒビター１及びニューロセルピンが含まれるが、これらに限定されるものでない。また、化学剤には、本発明のペプチドの治療作用の補助剤として作用するウルソール酸及びトラキサム酸が含まれるが、これらに限定されるものでない。
【００２４】
本発明のペプチドは、皮膚の創傷を治療するために用いられることができる。皮膚の表皮は、主にケラチノサイトから作られ、きわめて動的に重層された上皮から構成される。線維芽細胞等の他の細胞種も表皮に存在する(populate)。新たに分化するケラチノサイトは、表皮の増殖性基底層から連続的に出現して、上部層を補充し、外部の角質化された被膜及び角質剥離した被膜の中に徐々に分化する。ケラチノサイトはまた、表皮と連続する粘膜組織の主たる構成要素である［Presland and Date, 2000］。このような組織は、表皮の角質化された不透過性層がなく、口、鼻、喉、耳、肛門及び性器に関連付けられた内側ライニング表面を形成する。皮膚と同じように、粘膜表面もまた、身体の様々な組織に病原菌が侵入するのを防止するのに重要であり、それゆえ、それら組織種に対する損傷は個人の健康を損なう(compromise)かもしれない。皮膚と粘膜組織の損傷は、表皮層が、例えば、裂傷、火傷又は水膨れによって破壊されるときに起こる。負傷は、破砕又は損傷を伴い、組織の損傷を伴うが表皮の亀裂は同時に起こらない。皮膚感染の他、癌等の慢性疾患及び自己免疫疾患もまた、表皮表面を損なうことがある。糖尿病に影響を与える疾患又は褥瘡に関連する疾患等の潰瘍も皮膚損傷の他の形態である。これらの創傷には、かなり難治性のものがあり、炎症を起こし、感染し易く、治癒プロセスに長期間を要するものがある。潰瘍又は他の種類の慢性創傷が持続するのは、治癒に関与する細胞過程の障害による。創傷治癒における障害は、損傷を上皮で覆うことができないためであり、その理由の一部は、創傷部境界にあるケラチノサイトが移動せず、原因箇所に接近し被覆することができないことによる［Enoch and Price, 2004］。皮膚及び粘膜創傷の治癒は、部分的には、基本ケラチノサイトの活性を通じて調整される。創傷周辺にあるケラチノサイトが活性化すると、ケラチノサイトは増殖し移動して、上皮形成と称されるプロセスにおいて単一層が創傷に形成される。ケラチノサイトがさらに増殖して分化すると、正常な層が重なって形成された層を含む表皮層が形成される［Enoch and Price, 2004］。それゆえ、本発明は、粘膜組織において、ケラチノサイトに関連する損傷を治療するのに用いられることができる。「関連のある粘膜組織(associated mucosal tissues」という語は、皮膚と同じように組織化されたあらゆる組織に関するもので、上皮細胞／ケラチノサイトを含む。そのような組織の例として、口腔、鼻咽喉、耳及び泌尿器の表面の他、目の眼瞼結膜がある。これらの組織に影響を及ぼすことができ、本発明のペプチドでの治療に適した創傷又は損傷の例として、剥離、水膨れ、火傷、裂傷、刺し傷、潰瘍、打撲、発疹及び瘢痕がある。手術後の精神的外傷(trauma)についても、ペプチドで治療されることができる。
【００２５】
表皮損傷の他の形態に、いわゆる老化皮膚があり、少しずつ長期間経て起こり、結果的に皮膚機能が損なわれる。皮膚の老化は、遺伝的プログラムの他、環境的及び内在性障害の蓄積によって影響され、個人の生涯を通じて起こる。皮膚の老化を引き起こすプロセスには、太陽光から保護された皮膚の内因性老化(経時老化)と、太陽光に曝される領域での外因性老化(光老化)の２つの主なプロセスがある。内因性老化は、遺伝的性質を反映し、時間に依存する。また、老化皮膚は、しわ、細線、色素沈着、放射輝度の喪失、滑らかさ、弾力、肌の張り具合及び均一性、毛穴の変化の少なくとも１つを伴う。これら可視的兆候の根本には、遺伝的素因に加えて、紫外線(ＵＶ)及び汚染等の環境的刺激に対する急激な又は慢性的な曝露によって引き起こされる様々な組織学的及び細胞学的変化がある。美容的問題には、老化に加えて、しわ、乾燥度、ひ薄化、弛み、損傷及び日焼けの高感受性等があり、これらは表皮損傷の通常の外的兆候であり、紫外線や汚染等の損傷要因に長期間曝されると早い時期に起こる。研究結果では、皮膚老化の最も知られた形態学的変質は皮膚組織の進行性消失であることが示唆されている。皮膚組織のこの喪失は、細胞の喪失及び細胞増殖の減少等の幾つかの要因がある。表皮のような自己複製組織において、細胞の数は、増殖、末端分化及びアポトーシスにおける微妙なバランスによって厳重に調節される［Robert L, Labat-Robert J and Robert AM. 2009］。それゆえ、本発明のペプチドは、内因性及び外因性の両方の刺激によって生じる皮膚老化に関係する問題において、老化の影響を防いだり食い止めるために用いられることができる。同じように、ペプチドは、太陽光の如き様々な外部因子に曝されて損傷を受けた組織に適用されることができる。本発明はまた、皮膚をより若顔及び若組織にすると共により優れた機能を発揮する化粧品として用いられることができる。短鎖ペプチドは、化学的改質及び／又は特別な送達を通じて、それ自体は変化することなく作られることができるので、皮膚のひ薄化(thinning)、しわ、脆弱及び荒れ／硬化を生じさせるプロセスに対抗するために、表皮を通じて浸透させることができる。ケラチノサイトは表皮表面の主要素であるが、老化し損傷を受けた皮膚では減少するので、ペプチド刺激によってケラチノサイトを補充することは、上記問題を食い止めることが期待される。
【００２６】
皮膚は比較的弾性を有するが、その伸び能力には限界がある。ストレッチマーク(stretch marks)、即ち皮膚線条(striae)は、皮膚に色合いの悪い瘢痕化形態である。これらは、真皮の裂傷によって生じ、時間が経つと小さくなつが、完全には消滅しない。最初は、赤みを帯びた又は紫色の線であるが、徐々に明るい色に色あせていく傾向がある。ストレッチマークは、体重の急速な増加又は減少による皮膚の急速な伸びの結果である場合がある。ストレッチマークは、著しい伸び又は過度な膨張を受けていない身体部位のどこにでも現れる。最も一般的な場所は、腹部、胸、上腕、下腕、背中、太腿部、腰、臀部である。ストレッチマークは、思春期や妊娠のような人生のある段階でのホルモン変化によって生じることもあるが、ストレッチマークは、コルチコステロイド治療、肥満、美容外科手術及び激しいボディビルディングによっても生じる。コルチコステロイドの作用下では、ケラチノサイトと線維芽細胞は両方ともその成長は著しく損なわれるため、コラーゲンＩ及びＩＩＩの合成並びに線維芽細胞の合成は、正常な皮膚に比べて９０％を超えるまで減少する［Rogalski et al., 2002］。真皮／上皮部位におけるケラチノサイトの機能の修復及び回復は、ストレッチマークの修正の鍵となり得る。本発明のペプチドは、ケラチノサイトの増殖と移動を促進するものであり、それゆえ、ストレッチマークの治療に理想的である。
【００２７】
一般的に、薬学的に許容される製剤は、人間の皮膚用に適した担体(carrier)であればいかなる担体でも含むことができる。そのような薬学的及び美容的に許容される担体として、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、シリカ、アルミナ、スターチ並びにこれらの等価物である担体及び希釈剤がある。製剤は、所望により、美容的魅力を有することができるし、及び／又は、例えば、レチノイド、ビタミンＣの他に、本発明ペプチドの治療作用の補助剤として作用することができる他のペプチドの如き作用剤を含むことができる。感染を防止し、最大の治癒プロセスを達成できるように、抗生物質を製剤に加えることもできる。組成物中のペプチドの濃度は、 約０．１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ又は約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである。しかしながら、用いられる最終濃度は、創傷／組織状態の性質、本発明ペプチドの生物活性、及び組成物の吸収を高めるためのあらゆる補助剤又は技術の使用によっては、これらの範囲から外れてもよい。
【００２８】
本発明の望ましい実施態様において、組成物はヒトのケラチノサイト組織との接触状態におかれる場合、本発明ペプチドの他に追加されるいかなる成分も、ケラチノサイト組織への適用に適したものであるべきである。そのような他の成分が組成物の中に含まれると、正常な医学判断の範囲内で、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等を生じることもある。スキンケア産業で一般的に用いられている様々な化粧用及び医薬用成分がＣＴＦＡ(Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992)に記載されており、これらは本発明の組成物での使用に適している。これら成分の例として、研磨材、吸収剤、美容関連成分(香料、顔料、着色剤／染料、エッセンシャルオイル、皮膚知覚剤、収斂剤等(例えば、丁子油、メントール、樟脳、ユーカリ油、ユージノール、乳酸メンチル、マンサク蒸留物))、にきび抑制剤、凝固防止剤、泡消し剤、抗菌剤(例えば、ヨードプロピルブチルカルバマート)、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝剤、充填剤、キレート剤、化学添加剤、化粧用殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、外用鎮痛剤、成膜剤又は成膜材料、不透明化剤、ｐＨ調節剤、発射剤、還元剤、封鎖剤、皮膚美白剤(例えば、ハイドロキノン、コウジ酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビルグルコサミン)、皮膚調整剤(例えば、湿潤剤)、皮膚緩和及び／又は治癒剤(例えば、パンテノール及びその誘導体、アロエベラ、パントテン酸及びその誘導体、アラントイン、ビサボロール及びグリチルリチン酸２カリウム)、皮膚治療剤、粘稠剤、ビタミン及びその誘導体があるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明のペプチド及び関連する組成物は、全ての哺乳動物を含むヒト及び動物に投与することができる。組成物は、組織移植、皮膚代替、組織培養製品及びドレッシング(包帯剤)等の代表的及び／又は経験的に用いられている材料と共に適用されることができる。ドレッシングの例として、ガーゼ(織布及び非織布、浸透性、非接着性、パッキング、創傷清拭)、圧縮包帯、創傷フィラー及びクレンザー、コンタクト層、コラーゲン、羊水メンブレン、無細胞ヒト真皮、無細胞マトリクス及び複合製品、その他一般的に用いられている様々なドレッシングを挙げることができるが、これらに限定されるものでない。
【００３０】
一般的に用いられているドレッシングのリストを次に示す。なお、表の中で、＊印は、個々の会社商標をさしている。
【表Ｃ】
0006348126.tif 000004
【００３１】
一般的に、組成物の投与は、局所的、経口、経皮的、全身的、又は本発明ペプチドを標的組織に送達するのに有用であることが当該分野で知られたあらゆる他の方法によって行なうことができる。組成物は、インビトロすなわち生体外(ex vivo)で、例えば培養液中で成長する細胞又は患者移植片のどちらかに塗布されることができる。
【００３２】
本発明の組成物は、スキンケア活性を有する１又は２種以上の追加剤を含むことができる。本発明は、生物活性ペプチド成分の他に、他の活性成分、例えば、ヒアルロン酸、ナイアシンアミド、フィタントリオール、ファルネソール、ビサボロール、サリチル酸、レチノール、レチノイン酸、アルファヒドロキシ酸、アスコルビン酸及びアルグロニック酸を含むことができる。追加の活性成分は、生物活性ペプチド成分と相乗作用を発揮したり、製剤の保存寿命を向上させることが期待される。
【００３３】
アミノ酸について、従来より使用されている略語は次の通りである。
【表Ｄ】
0006348126.tif 000005
【００３４】
医薬の調製及び投与の技術に関する詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.)の最新版に記載されている。送達は局所的に行われることが好ましいが、他の送達手段として、例えば、経口、非経口、エアロゾル、筋肉内、皮下、経皮、骨髄、髄腔内、心室内、静脈、腹腔内又は鼻孔内の投与も可能である。本発明は、数多くの担体ビークルの中で調製されることができる。該担体ビークルとして、スプレー、水ー油系エマルジョン、油−水系エマルジョン、フェイス又はボディクリーム、サン又はアフターサンローション又は他の局所投与用ビークルがある。また、本発明のペプチド及び該ペプチドを含む組成物は、例えば、様々なスキン化粧品、スキンクリーム、ローション、日焼け止め剤、にきび抑制剤等の治療用ローション又はクリーム等の一般的なスキンケア及び化粧用剤における有用な含有物として供されることができる。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本発明の望ましい実施態様を例示するために含められる。
【００３６】
＜実施例１：細胞の移動及びスクラッチ創傷の傷口閉鎖を刺激するペプチドの特定＞
ヒトの皮膚ケラチノサイト(ATCC CRL-2404)を、無血清ケラチノサイト成長培地の中で成長させた。培地には、ヒト組換体上皮成長因子(ＥＧＦ)(Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.)が５ｎｇ／ｍｌ補給されている。細胞を１２ウェルプレートに播種し、１００％コンフルエント(confluent)に達することができた。細胞単層を２４時間飢餓させた後、Ｐ２００(２００μｌ)ピペットチップを用いてスクラッチ創傷(scratch wound)を作った。スクラッチ創傷を洗浄し、時間０の時に写真撮影した。ペプチドを加えた。ペプチドの最終濃度は４０μｇ／ｍｌである。細胞は、画像撮影のために短時間室温に置いた以外は、培養器の中に保持した。培養器は、３７℃、ＣＯ２５％、湿度＞９０％である。スクラッチ創傷の傷口閉鎖は処理後７〜８時間後であり、その結果を表１に示す。
表１は、培養されたケラチノサイトにおけるスクラッチ創傷の傷口閉鎖を示す。処理７時間後のＰＢＳ試料の傷口閉鎖を１００％とし、ＰＢＳ試料に対するペプチド試料の傷口閉鎖を算出した。なお、表の中で、＊印は顕著(significant)であることを表す。
【表１】
0006348126.tif 000006
【００３７】
＜実施例２＞  正常なヒトの皮膚ケラチノサイトに対する細胞毒性
ペプチドが細胞に対して毒性を有しないことを確認するための試験を行なった。正常なヒトの表皮ケラチノサイトを９６ウェルプレートに播種した。プレートは、３７℃の温度で、５％ＣＯ２の存在下にて、細胞を＞９５％コンフルエントに成長させた。ペプチドは濃度が、５０、１００、２００及び５００μｇ／ｍｌの保存溶液の中で希釈した。細胞培地を様々な濃度のペプチドを含む新しい培地と取り替えた後、３７℃の温度及び５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。処理の終了時、ＡＴＣＣ(Manassas VA)から購入したＭＴＴアッセイキットを用いて細胞生存率を測定した。結果を表１に示す。ＭＴＴアッセイを用いて測定結果では、５０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で細胞生存率に変化はなかった。
【００３８】
＜実施例３＞  細胞の増殖を刺激するペプチドの特定
正常なヒトの皮膚ケラチノサイト(ATCC CRL-2404)を、無血清ケラチノサイト成長培地の中で成長させた。培地には、ヒト組換体上皮成長因子(ＥＧＦ)(Life Technologies Corporation, Grand Island, N.Y.)が５ｎｇ／ｍｌ補給されている。細胞の検査を、毎日、顕微鏡写真を撮影して行なった。培養物が５０〜７５％コンフルエントになったとき、プレート内の培養物を吸引し(aspired)、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを加えた。細胞が球形になり分離されると、新しい培地を加えてトリプシンを中和した。細胞は次に遠心分離され、ペレットは新しい培地の中で再懸濁した。血球計を用いて、懸濁した細胞を計数し、各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加えて、細胞の合計数をウェル当たり約５００〜１０００に調節した。中央の６０ウェルを使用し、外側のウェルは蒸発を最少にするために、新しい培地が満たされた。６〜８時間培養後、細胞が各ウェルの中に付着したとき、ＰＢＳ又はペプチドを所望濃度の２倍含む新しい培地１００μｌを加えたものを３つ作った。マイクロプレートは、次に、３７℃の温度及び５％ＣＯ２の条件で４８〜７２時間培養した。
【００３９】
培養の終わりに、細胞について、ＣＹＴＯＳＣＡＮ(登録商標)ＳＲＢの細胞毒性アッセイ(GBiosciences Company, St. Louis, MO)を、製造者のインストラクションに基づいて行なった。このアッセイでは、細胞は、スフォローダミンＢ(ＳＲＢ)染色前に固定される。さらに洗浄後、色は、可溶性緩衝剤を用いて可溶化される。マイクロプレートリーダを使用し、５６５ｎｍで吸収度を測定した。結果は表１に示されている。なお、表１に示す結果は、処理した３つの試料の平均値であり、１２０を超える値のものを顕著(significant)と評価している。
表２は、本発明ペプチドについて、正常なヒト表皮のケラチノサイト増殖の調節を示す。なお、表の中で、＊印は顕著であることを表す。
【表２】
0006348126.tif 000007
【００４０】
＜実施例４＞  遺伝子増殖の分析
８４遺伝子をエンコードする創傷治癒、細胞外マトリクス及び接着分子を、Sunny Biodiscovery, Inc(Santa Paula, CA)によるＰＣＲアレイを用いて分析した。これは、ＥＰＩＤＥＲＭ(登録商標)の代用皮膚は、MatTek(Ashland, MA)により入手し、製造者のインストラクションに基づいて操作した。一晩かけて平衡させた後、培地を変更し、２０Ｇニードルにより１０の全層刺創傷を作った。ＨＢ２２３５(３３０μｇ／ｍｌ)又は対照としての水を皮膚組織の上に塗布したものを２つ作り、２時間処理した。創傷のない正常な組織２つについても対照として用い、創傷と正常組織との間の遺伝子プロファイルを調べた。処理の終わりに、組織を集めて、ＲＮＡｌａｔｅｒ(登録商標)(Ambion, Austin, TX)の安定化溶液の中に保存した。ＲＮＡを、Illustra mini RNAspin kit(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いて抽出し清浄化した。清浄化された全てのＲＮＡを、Agilent HP-8452Aダイオードアレイ分光光度計により２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで評価した。試料全体のＲＮＡ濃度を均一にし、対象とする遺伝子の発現を測定した。測定は、１本鎖合成キットと共にPCR arrays PAHS-121Aを使用し、BioRad iCycler iQ Detection Systemを有するリアルタイム定量ＰＣＲにより行なった。SYBR Green master mix及びＰＣＲの運転状況はQiagenから得た。５つのハウスキーピング遺伝子に対する遺伝子発現の正規化を、RT2 Profiler PCR Arra Data analysis version 3.5ソフトウエアを用いて行なった後、結果を、EfficiencyΔΔCt法を用いて定量化した。２つの試料において、発現量が合理的に高く(検出するのに３０サイクルより少ない)、調節(modulation)が１．５以上のとき、遺伝子の発現量が異なるとみなした。
表３は、選択された遺伝子発現プロファイリングを示しており、創傷皮膚組織と創傷の無い対照との関係、ＨＢ２２３５で処理した創傷と処理していない創傷との関係を、倍率変化(fold change)として表している。
【表３】
0006348126.tif 000008
【００４１】
この明細書に開示し権利請求する組成物又は方法は全て、本発明の開示を参照することにより、過度の実験を行うことなく実施されることができる。本発明の組成物及び方法を望ましい実施態様に基づいて説明したが、組成物及び／又は方法について、また、ここに記載した方法のステップ又はステップの順序について、当業者であれば、発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく変形をなし得るであろう。例えば、化学的及び生理学的の両方に関係する製剤については、この明細書に記載した製剤と置き換えることにより、同一又は同様な結果を達成できるであろう。当業者であれば、これらの置換及び変形が、本発明の範囲内に含まれることは明らかであろう。
【００４２】
この明細書の中で言及した全ての特許及び刊行物は、引用を以て、それらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【００４３】
引用した参考文献は次の通りである。
Bergers G, Coussens LM (2000). Extrinsic regulators of epithelial tumor progression: metalloproteinases. Curr Opin Genet Dev. 10: 120-127 
【００４４】
Easton DM, Nijnik A, Mayer ML, Hancock RE (2009). Review Potential of immunomodulatory host defense peptides as novel anti-infectives. Trends Biotechnol. 27(10):582-90. 
【００４５】
Enoch S, Price P (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. (worldwidewounds.com/2004/august/Enoch/Pathophysiology-Of- Healing.html) 
【００４６】
Gallo RL, Ono M. et al., (1994). Syndecans, cell surface heparin sulfate proteoglycans, are induced by a proline-rich antimicrobial peptide from wounds. Proc Natl Acad Sci USA. 91 : 11035-9 
【００４７】
Heilborn JD, Nilsson MF. et al., (2003). The cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120: 379-89 
【００４８】
Lee PH, Rudisill BA et al., (2004). HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerate murine wound repair. Wound Rep Reg 12: 351-8. 
【００４９】
Leitch VD, Strudwick XL, Matthaei KI, Dent LA, Cowin AJ. (2009). IL-5- overexpressing mice exhibit eosinophilia and altered wound healing through mechanisms involving prolonged inflammation. Immunol Cell Biol. 87(2): 131-40. 
【００５０】
Mustoe TA, Cutler NR, Allman RM, Goode PS, et al., (1994) A phase II study to evaluate recombinant platelet-derived growth factor-BB in the treatment of stage 3 and 4 pressure ulcers. Ach Surg 129: 213-9. 
【００５１】
Nijnik A, Madera L, Ma S, Waldbrook M, Elliott MR, Easton DM, Mayer ML, Mullaly SC, Kindrachuk J, Jenssen H, Hancock RE (2010). Synthetic cationic peptide IDR-1002 provides protection against bacterial infections through chemokine induction and enhanced leukocyte recruitment. J Immunol.184(5):2539-50. 
【００５２】
Oono T, Shirafuji Y. et al., (2002). Effects of human neutrophil peptide-1 on the expression of interstitial collagenase and type I collagen in human dermal fibroblasts. Arch Dermatol Res 294: 185-9 
【００５３】
Presland RB, Dale BA (2000). Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease. Crit, Rev. Oral Bio. Med. 11 :383-408 
【００５４】
Proksch E, Brandner JM, Jensen JM (2008). The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17: 1063-72.
【００５５】
Robert L, Labat- Robert J and Robert AM (2009) Physiology of skin aging. Pathol Biol (Paris). 57(4):336-41. 
【００５６】
Rogalski C et al., 2002. Extensive striae distensae as a result of topical corticosteroid therapy. Acta Derm Venereol, 83:54-55 
【００５７】
Samah A (2011). Topically applied KTTKS: a review. Int J Cosmet Sci. 33: 483-90. Shi J, Ross CR, Leto TL, and Blecha F (1996) PR-39, a proline-rich antibacterial peptide that inhibits phagocyte NADPH oxidase activity by binding to Src homology 3 domains of p47 phox. Proc Natl Cad Sci USA. 93:6014-8 
【００５８】
Singer, A. I, Clark, R. A. (1999). Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746
【００５９】
Steed DL (1995). Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic ulcer study group. J Vase Surg 21 :71-8. 
【００６０】
Steinstraesser L, Koehler T, Jacobsen F, Daigeler A, Goertz O, Langer S, Resting M, Steinau H, Eriksson E, Hirsch T (2008). Host defense peptides in wound healing. Mol Med. 14(7-8):528-37. 
【００６１】
Steinstraesser L, Kraneburg UM, Hirsch T, Resting M, Steinau HU, Jacobsen F, Al- Benna S (2009). Host defense peptides as effector molecules of the innate immune response: a sledgehammer for drug resistance? Int J Mol Sci. 10(9):3951-70. 
【００６２】
Upton Z, Cuttle L, Noble A, Kempf M, Topping G, Malda J, et al., (2008) Vitronectin: growth factor complexes hold potential as a wound therapy approach. J Invest Dermatol. 128: 1538-1544. 
【００６３】
Wang, XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y and Li AG (2006). Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 11 (1): 112-7. 
【００６４】
Zhang L, Falla TJ (2006). Antimicrobial peptides: therapeutic potential. Expert Opin Pharmacother. 7(6):653-63. 
【配列表】
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