(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬質材料で作られる上部プレートと、弾性材料から作られるパッキンと、前記上部プレートと共に前記パッキンを密封する硬質材料から作られる下部プレートとを備えた積層構造体を有し、前記積層構造体内に流路を備えた検出用カセットであって、
前記流路は、サンプル核酸を鋳型として、複数種類のプライマーセットを用いて増幅反応を行う増幅部と、前記増幅部からの増幅産物と核酸プローブとを反応させ、生じたハイブリダイズ信号を得ることによって複数種類のターゲットＤＮＡを検出する検出部とを備え、
前記増幅部は、
隣同士をインターバル流路によって液絡され、当該インターバル流路の幅よりも大きい幅を有する複数のウェルと、
前記ウェルの内壁に遊離可能に種類毎に固定化された、複数種類のプライマーセットと、を備え、当該インターバル流路で連結され、前記流路に沿って隣り合う当該プライマーセットが固定化された２つの当該ウェルの一方の中心から前記流路の軸を通り他方の中心までの距離が、４ｍｍ以上であることを特徴とする核酸検出カセット。
【請求項２】
前記距離が６ｍｍ以上であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出カセット。
【請求項３】
前記ウェルの幅が、前記インターバル流路の幅よりも１．５倍〜３．０倍大きいことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸検出カセット。
【請求項４】
前記ウェルの幅が、前記インターバル流路の幅よりも１．７倍〜２．３倍大きいことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸検出カセット。
【請求項５】
前記核酸検出カセットが、更に前記流路に所望の液体を送る送液部を備えることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸検出カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、核酸検出カセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では、遺伝子による病気の診断、或いは、予防が可能となりつつある。これは遺伝子診断と呼ばれ、これによれば病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、或いは、遺伝子変化を検出することで病気の発症前、若しくは、極めて初期段階での病気の診断、或いは、予測をすることが可能となる。また、ヒトゲノムの解読とともに、遺伝子型と疫病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出並びに遺伝子型の決定を簡便に行うことが非常に重要となっている。
【０００３】
核酸検査装置として、ＤＮＡチップを用いたデバイスが知られている。ＤＮＡチップは、核酸プローブが固定化された複数のセンサ部から成る検出領域を基板上に備え、一度に多数の核酸配列を検出できる特徴を備えている。一般的に、核酸プローブは、液体に溶解された状態で、各センサ部上に滴下されることによってセンサ表面に固定化される。また、センサ部毎に互いに異なる核酸プローブを固定化するため、センサ部間で液滴同士が接触することは避けなければならないとされている。
【０００４】
一方、１つのデバイス内において、複数の試薬が関わる複数の反応を順次行うことのできるμ−ＴＡＳと呼ばれるデバイスが盛んに研究開発されている。μ−ＴＡＳは、試薬保持領域、核酸の反応領域や検出領域などから成り、それらをつなぐ流路を備えている。
【０００５】
更に、上記電流検出方式のＤＮＡチップを内蔵した核酸検出カセットを用いて核酸を検出するための核酸検査装置も開発されている。このようなデバイス内で核酸検出を行う場合、複数の試薬を使用し、所定の条件下において複数の処理および反応、例えば、抽出、精製、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などを行う必要がある。これらの試薬は、一般的に高価であるため、可能な限り使用量を低減し、そのような少ないサンプル溶液から多くの情報を得ることが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−６０９２５号公報
【特許文献２】特開２００９−１０９３３４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４１３９７号公報
【特許文献４】ＷＯ２００８／０８７８２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、複数種類の核酸を同時または並行して増幅し、得られた増幅産物中の複数種類のターゲットＤＮＡを同時または並行して検出することが可能な核酸検出カセットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、実施形態の核酸検出カセットは、サンプル溶液や挿入剤液を貯蔵する複数のシリンジと、前記サンプル溶液中のＤＮＡを増幅して増幅産物を生成する増幅部と、この増幅部から前記増幅産物を供給するように前記増幅部に接続され、供給された前記増幅産物を検出する検出部と、前記複数のシリンジの内、前記サンプル溶液が貯蔵されているシリンジと前記増幅部と前記検出部とを接続する第１の流路と、前記複数のシリンジの内、前記挿入剤液が貯蔵されているシリンジと前記検出部とを接続する第２の流路と有する。前記増幅部を通過する前記第１の流路の通過部分には、流路の幅よりも大きい幅を有する複数のウェルを備え、隣り合う当該ウェルは一方のウェル中心から前記流路の軸を通り他方のウェル中心まで所定間隔を設けられて配設されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施形態に係る核酸検査装置を概略的に示すブロック図である。
【図２】図１に示される核酸検査装置に装着される核酸検出カセットの外観を概略的に示す斜視図である。
【図３】図２に示される核酸検出カセットを分解して概略的に示す分解斜視図である。
【図４】図２に示される核酸検出カセットを透視して内部構造を概略的に示す透視平面図である。
【図５】図２に示される核酸検出カセット内に設けられる流路および流路に連結される各部を概略的示す平面図である。
【図６】図２に示される核酸検出カセット内に設けられる流路および流路に連結される各部を概略的に示す斜視図である。
【図７】図２に示される核酸検出カセットの増幅部の形態を概略的に示す平面図である。
【図８】図２に示される核酸検出カセットのＤＮＡチップの平面構造を概略的に示す平面図である。
【図９】図２に示される核酸検出カセットからキャップおよびカバーを取り外した外観を概略的に示す斜視図である。
【図１０】図３に示される核酸検出カセットの上部プレートとパッキンとを組み立て位置を合わせて概略的に示す背面側からの斜視図である。
【図１１】図１０に示される上部プレートの背面にパッキンを取り付けた構造を概略的に示す斜視図である。
【図１２】図１１に示されるパッキンを取り付けた上部プレートを下部プレートに取り付ける工程を概略的に示す斜視図である。
【図１３】図２に示される核酸検出カセットの常開バルブおよびロッド穴を概略的に示す平面図。
【図１４】図２に示される核酸検出カセットの常開バルブおよびロッド穴を概略的に示す断面図。
【図１５】図２に示される核酸検出カセットの常開バルブ、ロッド穴、常開バルブロッドを概略的に示す断面図。
【図１６】図１示される核酸検査装置の内部構造を概略的に示す側面図である。
【図１７】図１に核酸検査装置におけるサンプルの電気化学的に検査の過程を示すフローチャートである。
【図１８】図６に示される核酸検出カセット内の増幅部へのサンプルの供給を概略的に示す平面図である。
【図１９】図６に示される核酸検出カセット内の増幅部への第１洗浄液の供給および検出部へのサンプルの供給を概略的に示す平面図である。
【図２０】図６に示される核酸検出カセット内の検出部への第２洗浄液の供給を概略的に示す平面図である。
【図２１】図６に示される核酸検出カセット内の検出部への挿入剤の供給を概略的に示す平面図である。
【図２２】実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、実施形態に係る核酸検出カセットついて、図面を参照して詳細に説明する。
【００１１】
［核酸検査装置の概略構成］
図１は、実施形態に係る核酸検査装置８のブロックを示している。この核酸検査装置８は、サンプルの増幅からサンプルの電気化学反応の検出までを完全に自動化可能に構成されている。核酸検査装置８は、液密に密閉された核酸検出カセット１０と、この核酸検出カセット１０と電気的に接続される測定部１２、核酸検出カセット１０内に設けられた流路系を外部から物理的に駆動制御する送液制御機構１６および核酸検出カセット１０の各部を温度制御する温度制御機構１４等を備える。核酸検出カセット１０は、後に詳述するように、その内部にＤＮＡチップ６が収納されている。このＤＮＡチップ６上には、後に詳細に説明するように、サンプル等の溶液が流れる検出流路が設けられている。ＤＮＡチップ６上の検出流路には、ハイブリダイズ信号を取り出すための複数の電極が配置されている。これらの電極には、検出されるべき塩基配列に相補的な配列を含む核酸プローブが固定化された作用電極、対向電極および参照電極が含まれる。対向電極および参照電極は、作用電極に対向されるような配置でそれぞれ少なくとも１つが設けられている。図１に示す測定部１２は、ＤＮＡチップ６に接続され、ＤＮＡチップ６内の作用電極および対向電極間への入力電圧の印加に応じて参照極の電圧をフィードバック（負帰還）させる３電極方式のポテンシオ・スタットとして構成されている。従って、この測定部１２によれば、核酸検出カセット１０におけるセル内の電極、或いは、溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加することができ、電気化学的反応による電流（以下において「電気化学的電流」と言う。）を電気化学的に測定することができる。
【００１２】
上述した測定部１２、温度制御機構１４および送液制御機構１６は、装置制御部１８に接続され、装置制御部１８は、インタフェース（図示せず）を介して核酸検査装置８外のコンピュータ４に接続されている。コンピュータ４からの動作指示等のコマンドに応答して、装置制御部１８は、内蔵プログラムに従って測定部１２、温度制御機構１４および送液制御機構１６を制御している。装置制御部１８は、送液制御機構１６を制御してサンプル等の溶液を送液させ、温度制御機構１４を制御してサンプル溶液の温度を制御して、核酸の増幅反応、ハイブリダイズ反応および電気化学反応を生じさせている。また、装置制御部１８は、測定部１２を制御してハイブリダイズ反応に続く電気化学反応を検出し、得られた検出信号を検出データとしてコンピュータ４に転送している。コンピュータ４では、転送された検出データを解析してサンプル溶液中の核酸の存在を特定している。図１に示される核酸検査装置８は、サンプル溶液中の核酸の増幅からの電気化学反応の検出までを自動化し、サンプルが収納されている核酸検出カセット１０の装着のみでサンプル溶液中に含まれる核酸の塩基配列についてのデータを獲得することができる。
【００１３】
［核酸検出カセットの基本構造］
図２に示すように、核酸検出カセット１０は、矢印５に示す方向で核酸検査装置８に装着され、また、取り出される矩形カセット形状の外観を有している。ここで、核酸検出カセット１０は、核酸検査装置８に装着する際の向きを定める為に、その一部に切欠部２２を設けている。図２に示す実施形態では、装置への挿入（装着）方向５を基準に矩形核酸検出カセット１０における前方右側のコーナが切欠されて切欠部２２が設けられている。ユーザ（オペレータ）は、この切欠部２２を先端側として確認することによって核酸検出カセット１０を正しく核酸検査装置８に装着することができる。尚、このようにコーナを切欠する形態に限らず、他の箇所が切欠されて矩形核酸検出カセット１０の上面が特定され、核酸検出カセット１０の装着方向が特定されても良い。以下の説明において、核酸検出カセット１０の切欠部２２を先端側とする装着方向を基準に、先端側と反対側を後方と称し、核酸検出カセット１０にキャップ２０が取り付けられた面を上面と称する。
【００１４】
この核酸検出カセット１０は、図３に分解して示すように、内部に流路を備える積層構造体である。核酸検出カセット１０は、下部プレート３０、パッキン４０、上部プレート５０、カバープレート６０およびキャップ２０から構成されている。下部プレート３０は、硬質材料、例えば、ポリカーボネート等の硬質樹脂材料で作られ、ＤＮＡチップ６が収納されるチップ用窪み１３０が形成され、核酸プローブ固定化領域を含むように流路が形成される領域である流路形成部１００Ａの面が上面に向けられるようにＤＮＡチップ６がこの窪み１３０に嵌め込み固定されている。下部プレート３０には、ＤＮＡチップ６上に形成される検出流路１００に連通される送液系の流路チャネルの為のチャネル溝１３２が形成され、また、送液系を定める為のシリンジ用窪み１３４およびタンク用窪み１３６が形成されている。
【００１５】
パッキン４０は、弾性材料、例えば、エラストマ等のゴム弾性材料で作られ、下部プレート３０上に載置されている。このパッキン４０には、下部プレート３０の窪み１３４に対応して送液系を定める為の膨出部１４４、送液チャネル用貫通孔１４２および縦長貫通溝１４６が形成されている。また、このパッキン４０には、ＤＮＡチップ６上に検出流路１００を定める為のチャネル溝１１１が設けられている。更に、パッキン４０には、液注入孔を定める為の開口突起１４１、１４３が設けられ、空気抜き孔を定める為の開口突起１４５、１４７が形成されている。更にまた、ＤＮＡチップ６の電極パッド部を外部からアクセスすることを可能にする為の縦長貫通溝１４９が形成されている。
【００１６】
上部プレート５０は、硬質材料、例えば、ポリカーボネート等の硬質樹脂材料で作られ、パッキン４０上に載置され、パッキン４０が上部プレート５０および下部プレート３０間に加圧されて挟み込まれる。より詳細には、上部プレート５０の下面には、複数のスタッドピン１５６、１５８が突出して設けられ、上部プレート５０の周辺に配置されたスタッドピン１５６は、下部プレート３０の周辺に設けた周辺スタッド孔１３８Ａに直接に挿通される。また、パッキン４０に対向するように上部プレート５０に設けられたスタッドピン１５８は、パッキン４０の中央部に設けられた挿通孔１４８を通って下部プレート３０の上面に設けたスタッド孔１３８Ｂに挿通される。これらスタッドピン１５６、１５８の先端は、熱カシメされて抜け止めボスに変形されて下部プレート３０に固定される。このスタッドピン１５６、１５８によって上部プレート５０、パッキン４０および下部プレート３０が一体化されている。この構造においては、上部プレート５０がパッキン４０を加圧するように下部プレート３０に固定されて、上部プレート５０およびパッキン４０間に液密な送液系が定められ、下部プレート３０およびパッキン４０間にも同様に液密な送液系が定められる。上部プレート５０には、パッキン４０に形成された膨出部１４４、貫通孔１４２および縦長溝１４６等に対応して縦長貫通溝１５４、貫通孔１４２に連通する溝(図示せず）および縦長貫通溝１４９に連通する縦長貫通溝１５９等が形成されている。また、上部プレート５０には、パッキン４０の開口突起１４１、１４３、１４５、１４７が挿通される貫通孔１５１、１５３、１５５、１５７が形成されている（図３）。
【００１７】
上部プレート５０は、後方領域１５０および前方領域１５２に区分され、後方領域１５０および前方領域１５２がステップ１６９を介して連接されている。上部プレート５０の後方領域１５０には、カバープレート６０が取り外し不能に装着されている。カバープレート６０は、硬質材料、例えば、ポリカーボネート等の硬質樹脂材料で作られ、キャップ２０を嵌め込み可能な切欠部１６０が形成されている。この切欠部１６０にキャップ２０が取り付けられている。カバープレート６０には、上部プレート５０の後方領域１５０に形成されている縦長溝１５４等に対応し、且つ仕切り１６５を有する縦長溝１６４が設けられている。
【００１８】
上部プレート５０の後方領域１５０に対向するカバープレート６０の下面周辺には、係合突起１６２が下方に向けて延出され、この係合突起１６２は、この係合突起１６２に対応して設けられた上部プレート５０の挿通孔１６６を通して、下部プレート３０に設けられた係合孔１３１に取り外し不能に係合されている。
【００１９】
［核酸検出カセット内の送液系］
核酸検出カセット内の送液系を図４、図５および図６を参照して説明する。図４は、核酸検出カセット１０の内部に設けられる送液系を透視して示している。また、図５および図６は、図４に示す核酸検出カセット１０内に形成される送液系の配置を示している。
【００２０】
図４に示すように核酸検出カセット１０は、シリンジ部７０、増幅部８０および検出部９０から構成され、その送液系は、シリンジ部７０、増幅部８０および検出部９０を連通するように構成されている。シリンジ部７０は、カバープレート６０およびキャップ２０で覆れ、上部プレート５０の後方領域１５０に対応する核酸検出カセット１０中に設けられている。増幅部８０および検出部９０は、上部プレート５０の前方領域１５２に対応する核酸検出カセット１０中に設けられている流路により構成される。
【００２１】
シリンジ部７０には、サンプル溶液が入れられたサンプルシリンジ７０２、第１の洗浄液が充填された第１洗浄液シリンジ７０４、挿入剤が充填された挿入剤シリンジ７０６および第２洗浄液シリンジ７０８が核酸検出カセット１０の短辺方向に沿って配置されている。これらシリンジ７０２、７０４、７０６および７０８は、核酸検出カセット１０の長手方向に延出した筒状空間として形成され、この筒状空間は、夫々下部プレート３０の窪み１３４をパッキン４０の膨出部１４４で覆うことにより窪み１３４と膨出部１４４と間に定められる。
【００２２】
図４に示すようにサンプルシリンジ７０２は、サンプル液が流入される流路７１２を介してサンプル液を注入するサンプル注入孔７１０に連通され、また、空気抜き用の流路７１４を介して空気抜き開口７１６に連通されている。また、流路７１２は、サンプルシリンジ７０２の流入側で分岐され、常閉バルブ７１８に連通されている。第１洗浄液シリンジ７０４も流路７２４を介して第１洗浄液供給孔７２０に連通され、また、常閉バルブ７２８に連通されている流路７２２から分岐された流路を介して空気抜き開口７２６に連通されている。第１洗浄液は、第１洗浄液供給孔７２０から加圧されて第１洗浄液シリンジ７０４に供給され、第１洗浄液シリンジ７０４内の空気は、空気抜き開口７２６を介して外部に放出される。同様に、挿入剤シリンジ７０６も流路７３４を介して挿入剤供給孔７３０に連通され、また、常閉バルブ７３８に連通されている流路７３２から分岐された流路を介して空気抜き開口７４６に連通されている。挿入剤は、挿入剤供給孔７３０から加圧されて挿入剤シリンジ７０６に供給され、挿入剤シリンジ７０６内の空気は、空気抜き開口７３６を介して外部に放出される。更に、第２洗浄液シリンジ７０８も流路７２４を介して第２洗浄液供給孔７４０に連通され、また、常閉バルブ７４８に連通されている流路７４２から分岐された流路を介して空気抜き開口７４６に連通されている。第２洗浄液は、第２洗浄液供給孔７４０から加圧されて第２洗浄液シリンジ７０８に供給され、第２洗浄液シリンジ７０８内の空気は、空気抜き開口７４６を介して外部に放出される。ここで、第２洗浄液は、第１洗浄液と同一組成の洗浄液として用意されている。
【００２３】
ここで、シリンジ７０２、７０４、７０６および７０８は、その内部に充填されたサンプル溶液、洗浄液或いは試薬を保存するタンクとしての機能を有すると共にその内部に充填されたサンプル溶液、洗浄液或いは試薬を流路７１２、７２２、７３２、７４２に送り出すポンプの機能を有している。即ち、シリンジ７０２、７０４、７０６および７０８は、弾性を有する膨出部１４４によってその内部が空洞に形成され、検査装置８の送液制御機構１６に設けられたシリンジロッドによって弾性を有する膨出部１４４を押し潰すことによって、その内部のサンプル溶液、洗浄液或いは試薬を流路７１２、７２２、７３２、７４２に送り出すことができる。また、常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８は、シリンジ７０２、７０４、７０６および７０８内にサンプル溶液、洗浄液或いは試薬の保存を維持する機能を有し、検査が開始されると、これらの常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８は、検査装置８の送液制御機構１６に設けられたバルブロッドによって順次開放され、開放されたままに維持される。供給孔７１０、７２０、７３０、７４０および空気抜き開口７１６、７２６，７３６、７４６は、パッキン４０に設けられた開口突起１４１、１４３、１４５、１４７で形成され、サンプル溶液、洗浄液或いは試薬をシリンジ７０２、７０４、７０６および７０８に外部から注入するために設けられている。供給孔７２０、７３０、７４０および空気抜き開口７２６、７３６、７４６は、洗浄液或いは試薬がシリンジ７０４、７０６および７０８に注入された後に、カバープレート６０を上部プレートに取り付けられている。カバープレート６０はパッキン４０に設けられた開口突起１４１、１４７を圧縮変形して閉塞する。従って、洗浄液或いは試薬のシリンジ７０４、７０６および７０８への注入後、洗浄液或いは試薬が核酸検出カセット１０外に漏れ出ることが防止される。また、サンプル注入孔７１０および空気抜き開口７１６は、サンプル溶液がサンプルシリンジ７０２に注入された後に、キャップ２０によりパッキン４０の開口突起１４３、１４５を圧縮変形して閉塞する。従って、サンプル溶液のサンプルシリンジ７０２への注入後、サンプル溶液が核酸検出カセット１０外に漏れ出ることが防止される。
【００２４】
増幅部８０には、入力ポート側および出力ポート側に常開バルブ８１０、８２０が設けられている。入力ポート側の常開バルブ８１０、８２０は、互いに直列に連通されている増幅流路８１２、８１６のうちの増幅流路８１２の始端側に接続され、出力ポート側の常開バルブ８２０は増幅流路８１６の終端側に接続されている。入力ポート側の常開バルブ８１０は、シリンジ部７０の常閉バルブ７１８および７２８に共通に連結された流路８０２に接続されている。また、出力ポート側の常開バルブ８２０は、流路８０６に接続されている。シリンジ部７０の常閉バルブ７３８および７４８は、流路８０４に共通に連結されている。更に、流路８０４および流路８０６は、共通接続されて検出部９０の流路９０８に連通されている。ここで、出力ポートとは、下部プレートから上部プレートへと出るポートであり、入力ポートとは、上部プレートから出て下部プレートへと戻るポートである。
【００２５】
図４の実施形態の増幅部を図７に拡大して示す。そこに示されるように、各増幅流路８１２、８１６のパターンは、流路長を大きくする為のメアンダー流路がＵ字状に折り返された形態に形成されている。そして、このＵ字状のメアンダーパターン（meander pattern）を有する増幅流路８１２、８１６は、両者間の中心軸８１８に関して線対称に配置されて両者が一方向流通路を形成するように連通されている。増幅流路８１２、８１６が対称パターンを有することから、検査装置８内に設けられた温度制御機構１４のヒータは、増幅流路８１２、８１６を比較的に均一に加熱するように設計することができる。
【００２６】
各増幅流路８１２、８１６には、ウェル８３０が流路に沿って一定長以上の間隔を空けるように配置されている。図７に示した例では、メアンダー状の増幅流路８１２、８１６において、略一定の流路長を空けてウェル８３０が配置されることから、増幅部８０内に複数のウェル８３０が直線上に点在して配置されている。ウェル８３０が直線上に点在して配置されることから、同様に、温度制御機構１４のヒータは、これらのウェル８３０を比較的に均一に加熱するように設計することができる。
【００２７】
更に詳しくは、増幅部８０に配置された増幅流路８１２、８１６は、複数のウェル８３０と、ウェル間を繋ぐインターバル流路と、増幅部８０の外部から最も上流のウェル８３０へと続く上流流路と、最も下流のウェル８３０から増幅部８０の外部へと続く下流流路とを含む。核酸検出カセットに含まれる流路において、流路の幅とは、流路の軸方向に直交する方向での長さである。ウェルの幅とは、ウェル８３０を含む増幅流路８１２、８１６の軸方向に直交する方向での長さである。ウェル８３０の幅は、インターバル流路の幅、上流流路および下流流路のそれぞれの幅よりも大きい。インターバル流路の幅、上流流路および下流流路の幅は、例えば、それぞれ約０．０５ｍｍ〜約１．５ｍｍであってもよく、好ましくは約０．５ｍｍである。ウェル８３０の幅は、インターバル流路の幅、上流流路および下流流路のそれぞれの幅よりも大きければよく、例えば、約０．２ｍｍ〜約３．０ｍｍであってよい。例えば、インターバル流路の幅が約０．５ｍｍである場合、ウェル８３０の幅は約１ｍｍであることも好ましい。また例えば、ウェル８３０の幅は、インターバル流路の幅よりも１．５倍〜３．０倍大きくてもよく、好ましくはウェル８３０の幅は、インターバル流路の幅よりも１．７倍〜２．３倍大きくてもよい。
【００２８】
増幅部８０内に設けられた複数のウェル８３０には、ウェル毎に互いに異なる種類のプライマーセット８３２が遊離可能に固定されている。増幅部８０内に１又は複数のサンプルＤＮＡ（塩基配列）を含むサンプル溶液が供給されると、固定されたプライマーセット８３２がサンプル溶液中に遊離する。そして、この増幅部８０が温度制御機構１４のヒータによって加熱されると、複数のサンプルＤＮＡは、複数種類のプライマーセット８３２によりマルチ増幅される。各ウェル８３０には、目的とする１種類のサンプルＤＮＡを増幅するために必要な複数のプライマーにより構成される１種類のプライマーセットが固定されている。
【００２９】
図７に増幅流路８１２の一部分を更に拡大して示し、これを参照しながらウェル８３０の配置について説明する。ウェル８３０２は、インターバル流路８１２２と８１２４との間に形成されている。ウェル８３０２の下流側には、インターバル流路８１２４が形成されており、更にインターバル流路８１２４の下流にはウェル８３０４が形成されている。ウェル８３０２を規定するウェル壁面８３０２２、８３０２４は、インターバル流路８１２２、８１２４の幅を規定する流路壁よりも外側に向けて突き出している。図７においてウェル壁面８３０２２、８３０２４を上方から見ると、それらは、それぞれ円の一部を直線で切り取ったときに得られる弧である曲線を示す。そして、ウェル壁面８３０２２、８３０２４の両端部は、インターバル流路８１２２、８１２４の末端にそれぞれ連結している。ウェル壁面８３０２２、８３０２４の末端と流路８１２２、８１２４の末端との連結は、図７に示すような曲線と直線との連結であってもよく、或いはそれらの末端が互いに滑らかに続く曲線によって連結されていてもよい。ここでは、ウェル壁面８３０２２、８３０２４を上方から見た形状が円弧である例を示したが、これに限定するものではない。例えば、ウェル壁面８３０２２、８３０２４の上方から見た形状が、楕円を直線で切断したときに得られる楕円弧であってもよく、また、複数の直線、複数の曲線、または直線と曲線とを組み合わせた形状であってもよい。好ましくは、ウェル壁面の上方から見た形状は、楕円弧または円弧などの略円弧形状である。
【００３０】
ウェル８３０２、８３０４の壁面には、増幅されるべき１種類のサンプルＤＮＡを増幅するために必要なプライマーセット８３２がそれぞれ遊離可能に固定化されている。例えば、増幅方法がＰＣＲ法である場合、プライマーセットはフォワードプライマーとリバースプライマーとを含めばよい。例えば、増幅方法がＬＡＭＰである場合、プライマーセットは、ＦＩプライマー、ＢＩプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを含めばよい。
【００３１】
ウェル８３０２、８３０４内へのプライマーセット８３２の固定は、プライマーセットを含む溶液をウェル８３０２、８３０４内に滴下し、それを乾燥させることによって行われる。流路にではなく、ウェル８３０２、８３０４内にプライマーセット溶液が滴下されるので、所望する位置により正確にプライマーセットが固定できる。
【００３２】
増幅流路８１２、８１６に形成された２つのウェル８３０の間隔は、インターバル流路で連結された２つのウェルの一方のウェル中心からインターバル流路の軸を通り他方のウェル中心までの距離（即ち、ピッチ）である。例えば、ウェル８３０２の中心８３０４と、ウェル８３０４の中心８３０６との距離８３０４Ｄがウェル８３０の間隔である。或いは、インターバル流路で連結され、流路に沿って隣り合うプライマーセットが固定化されている２つのウェルの一方の中心から流路の軸を通り他方の中心までの距離である。この場合、プライマーセットが固定化されており、流路に沿って隣り合う２つのウェルの間にプライマーセットが固定化されていないウェルが存在してもよい。ウェル８３０の間隔は、約４ｍｍ以上、即ち、約４ｍｍピッチであればよく、好ましくは約６ｍｍ以上、即ち、約６ｍｍピッチ以上、より好ましくは約８ｍｍ以上、即ち、約８ｍｍピッチ以上である。このような間隔で増幅流路８１２、８１６にウェル８３０を配置にすることにより、複数種類のプライマーセットを使用して、サンプルＤＮＡに含まれる複数種類の増幅されるべき塩基配列を同時または並行して増幅することが可能となる。そして、同時または並行して行われる複数の増幅反応は、何れの反応も良好に進むので、得られた増幅産物に含まれる複数のターゲットＤＮＡを何れも検出することが可能となる。これにより、検出結果に偽陰性が発生するのを防止することができる。それによってより正確な検査を行うことが可能となる。ここで、上記ように複数種類の増幅されるべき塩基配列を１つの流路内で同時または並行して増幅することをマルチ増幅という。
【００３３】
増幅流路８１２、８１６がこのようなウェル８３０とインターバル流路とを備えることにより、プライマーセット８３２の固定、増幅流路８１２、８１６への液体の供給、増幅反応後の増幅産物を含むサンプル溶液の検出部への送液、検出流路１００での検出反応を何れも良好に行うことが可能である。
【００３４】
このサンプルＤＮＡの増幅に際しては、増幅部８０の入力ポート側の常開バルブ８１０および出力ポート側の常開バルブ８２０は、検査装置８内に設けられたバルブロッドで閉鎖される。従って、サンプルＤＮＡの増幅時に増幅部８０に与えられる熱によって、膨張されるサンプル溶液が増幅部８０の入力ポートおよび出力ポートより外側の流路８０２、８０６に流出して試薬等に混合されるような事態を防止することができる。
【００３５】
検出部９０には、図８に拡大して示すＤＮＡチップ６が配置されている。ＤＮＡチップ６には、1対のＵ字状の流路を連通した検出流路１００が設けられている。この検出流路１００には、パッキン４０に互いに連通する1対のＵ字状の溝１１１が設けられている。溝１１１がＤＮＡチップ６上の検出流路１００に重ね合わされ、パッキン４０がＤＮＡチップ６に液密に密着されることによって、ＤＮＡチップ６とパッキン４０との間に検出流路１００が定められる。この検出流路１００は、ＤＮＡチップ６上の入力ポート９１０および出力ポート９１４に連結されている。図６に示すように入力ポート９１０は、流路９２２を介して出力ポート９１２に接続され、出力ポート９１２には、流路９０８の終端が連結されている。また、出力ポート９１４は、流路９２４を介して入力ポート９１６に接続されて、入力ポート９１６には流路９２６の始端が連結されている。従って、増幅部８０での増幅反応により生じた増幅産物を含むサンプル溶液は、増幅部８０から流路８０６、９０８、出力ポート９１２、流路９２２および入力ポート９１０を介してＤＮＡチップ６の検出流路１００に流入される。
【００３６】
上述した流路構成において、第１洗浄液シリンジ７０４に充填された第１洗浄液を増幅流路８１２、８１６に送液することにより、増幅産物を含むサンプル溶液が増幅流路８１２、８１６から押し出されてＤＮＡチップ６の検出流路１００に流入される。図６に示すように、この後、シリンジ７０６および７０８に充填された挿入剤および第２洗浄液を夫々流路７３２および流路７４２を介して流路８０４に供給する。流路８０４に供給された挿入剤或いは第２洗浄液は、流路９０８、出力ポート９１２、流路９２２および入力ポート９１０を介してＤＮＡチップ６の検出流路１００に流入される。
【００３７】
特に、増幅産物を含むサンプル溶液は第１洗浄液の送液で増幅部８０の増幅流路８１２、８１６を介して流路８０４が合流される流路９０８に押し出されてＤＮＡチップ６の検出流路１００に流入されている。第１洗浄液の送液は、サンプル溶液を確実に増幅部８０の増幅流路８１２、８１６からＤＮＡチップ６の検出流路１００に送液することができる。しかも、挿入剤および第２洗浄剤が流入する流路８０４は、増幅流路８１２、８１６とは、分離され、流路９０８で合流されている。従って、挿入剤および第２洗浄剤が増幅流路８１２、８１６を介さず検出流路１００に流入され、挿入剤が増幅部８０のサンプル溶液と混ざることを回避し、同時に増幅部８０における残余の熱で加熱されることも防止される。
【００３８】
検出部９０には、ＤＮＡチップ６からの廃液を溜める廃液タンク９３０および補助廃液タンク９３２が設けられている。廃液タンク９３０は、ＤＮＡチップ６の出力ポート９１４、流路９２４、入力ポート９１６および流路９２６を介して連通されている。また、廃液タンク９３０は、流路９２６を介して補助廃液タンク９３２に連通されている。補助廃液タンク９３２には、好ましくは、補助廃液タンク９３２内の空気を排気するための排気孔９３４が設けられ、ＤＮＡチップ６から廃液が廃液タンク９３０に流入した際に補助廃液タンク９３２内の空気が排気される。
【００３９】
第２洗浄液が第２洗浄液シリンジ７０８から送液されると、検出流路１００内の未反応サンプルは、この第２洗浄液によって検出流路１００から廃液として押し出され、廃液タンク９３０に流入される。その後、挿入剤が挿入剤シリンジ７０６からから送液されると、検出流路１００内の第２洗浄液は、この挿入剤によって検出流路１００から廃液として押し出され、廃液タンク９３０に同様に流入される。
【００４０】
ここで、一連の検査工程で生ずる廃液は、廃液タンク９３０に流入されてその内に留められ、補助廃液タンク９３２には、殆ど流入することがないか、或いは、僅かな廃液が流路９２６を介して流入するにすぎない。しかも、供給孔７１０、７２０、７３０、７４０および空気抜き開口７１６、７２６、７３６、７４６は、サンプル溶液がサンプルシリンジ７０２に注入された後には、閉塞され、これら供給孔７１０、７２０、７３０、７４０および空気抜き開口７１６、７２６、７３６、７４６と補助廃液タンク９３２の排気孔９３４との間の送液系は、液密に維持されている。従って、一連の検査工程で送液系が加熱されたとしても、廃液が補助廃液タンク９３２の排気孔９３４から漏れ出るような事態を防止することができる。
【００４１】
これら廃液タンク９３０、９３２は、下部プレート３０に形成された窪み１３６、パッキン４０の縦長溝１４６および上部プレート５０の裏面に形成した窪み１３６に対応する窪み(図示せず）で定められる縦長の空間として形成される。特に、廃液タンク９３０は、シリンジ７０２、７０４、７０６および７０８から押し出されたサンプル溶液、第１洗浄液、挿入剤および第２洗浄液の全てを受け入れることができる容積を有することが好ましい。
【００４２】
上述した送液系における流路７１２、７１４、７２２、７２４、７３２、７３４、７４２、７４４、８０２、８０４、８０６、９０８、９２６は、下部プレート３０に形成された溝１３２をパッキン４０で覆うことによって溝１３２とパッキン４０の平坦な下面との間に定められている流路である。同様に、増幅流路８１２、８１６も下部プレート３０に形成されたウェル８３０を有するメアンダー状の溝１３２をパッキン４０で覆うことによって溝１３２とパッキン４０の平坦な下面との間に定められている流路である。ＤＮＡチップ６の検出流路１００は、ガラス製或いはシリコン製の平坦な基板にＵ字状流路が電極配列で定められる。この基板上のＵ字状流路がパッキン４０に設けたＵ字状の溝１１１に位置合わせされ、平坦な基板をパッキン４０で覆うことによって検出流路１００がパッキン４０のＵ字状の溝と基板の平坦な上面との間に定められる流路である。
【００４３】
ＤＮＡチップ６のポート９１０および９１４は、パッキン４０に穿けられた貫通孔（符号９１０および９１４に相当する。）に対応している。また、流路９０８の出力ポート９１２および流路９２６の入力ポート９１６もパッキン４０に穿けられた貫通孔（符号９１２および９１６に相当する。）に対応している。そして、出力ポート９１２およびポート９１０間の流路９２２並びに入力ポート９１６およびポート９１４間の流路９２４は、上部プレート５０の下面に形成された溝（図示せず）をパッキン４０で覆うことによって、この溝とパッキン４０の平坦な上面との間に定められる。従って、ＤＮＡチップ６のポート９１０および９１４に至る流路は、ＤＮＡチップ６の上面側で連通される。ＤＮＡチップ６のポート９１０および９１４では、上部プレート５０が下部プレート３０に向けて押し付けられ、パッキン４０で両者間が液密とされている。それ故、ＤＮＡチップ６が硬質の基板構造であっても、ＤＮＡチップ６がパッキン４０に密着された状態に維持され、ＤＮＡチップ６の検出流路１００が下部プレート３０とパッキン４０との間に形成される送液系流路に確実に連通される。ＤＮＡチップ６の検出流路１００が加熱されてもＤＮＡチップ６の検出流路１００からサンプル溶液等が漏れ出すことが防止される。
【００４４】
［ＤＮＡチップ］
ＤＮＡチップ６について、図３および図９を参照しながら説明する。図３に示すように、ＤＮＡチップ６は、パッキン４０の背面の溝１１１によってガラス製或いはシリコン製の基板の平坦面上の流路形成部１００Ａを覆うように定められる検出流路１００およびこの検出流路１００の両側に配置された電極パッド領域１１０、１１２を有している。この検出流路１００には、図９に示すように、一定間隔で作用電極９４０が設けられている。また、電極パッド領域１１０、１１２には、電極パッド９４２が配列され、この電極パッド９４２が夫々対応する作用電極９４０に電気的に接続されている。また、検出流路１００のＵ字形の頂部には、参照電極９４４および対向電極９４６、９４８が設けられ、夫々対応する電極パッド９４２に接続されている。図９においては、図を簡略化する目的から、電極パッド９４２と作用電極９４０、参照電極９４４および対向電極９４６、９４８との間の結線を省略している。
【００４５】
作用電極９４０は、検出されるべき核酸の塩基配列に相補的な配列を含む核酸プローブ、例えば、ＳＮＰ（１）〜ＳＮＰ（Ｎ）（一塩基多型：Single Nucleotide Polymorphism）を検出する為の核酸プローブが、電極、例えば、金電極に種類毎に固定されて構成されている。核酸プローブは、作用電極９４０毎に種類毎に複数本固定されている。加熱下において、サンプル溶液中に相補的な塩基配列（即ち、ターゲットＤＮＡ）があると、それは固定された核酸プローブに対してハイブリダイゼーション反応によって結合される。ハイブリダイゼーション反応によって結合されなかった未反応のサンプル溶液は、上述したように第２の洗浄液によって検出流路１００から押し出されて除去され、作用電極９４０が第２の洗浄液で洗浄される。その後、挿入剤が検出流路１００に供給されて第２の洗浄液が除去される。作用電極９４０が挿入剤中に浸漬された状態で、作用電極９４０および対向電極９４６、９４８間に一定の電圧が印加される。ここで、挿入剤は、作用電極９４０上にハイブリダイゼーション反応により生じた２本鎖部分を認識してそこに入り込み、電気化学的に活性化する物質を含む。電圧の印加に起因して、ハイブリダイゼーション反応により２本鎖となった核酸プローブの固定されている作用電極９４０からは、信号電流が検出される。この信号電流は、上述の図１に示す測定部１２に含まれる電流プローブが電極パッド９４２に物理的に接触されて検出される。検出された電流は、増幅されて測定部１２のバッファに格納され、外部のコンピュータ４で検出データとして出力される。
【００４６】
ここで、参照電極９４４は、作用電極９４０および対向電極９４６、９４８間の印加電圧をモニタし、帰還回路を介して作用電極９４０および対向電極９４６、９４８間の印加電圧を一定にする作用を有している。
【００４７】
［核酸検出カセットの上面構造］
再び図２を参照し、また、新たに図９を参照して核酸検出カセット１０の上面構造について、より詳細に説明する。図９は、図２に示す核酸検出カセット１０からカバープレート６０が取り外された外観を示している。
【００４８】
図２および図３を参照して説明したように、核酸検出カセット１０の後方領域には、矩形核酸検出カセット１０に嵌め込み固定されたカバープレート６０が設けられ、このカバープレート６０には、キャップ２０が装着されている。このキャップ２０は、矩形上面平坦部２１およびこの上面平坦部２１から核酸検出カセット１０の後方側面に沿って延出する側部２３を有するＬ字形に形成されている。また、キャップ２０を開閉する為の軸部２５が平坦部２１の側部に設けられ、側部２３には、下部プレート３０の係合溝（図示せず）に係合固定される係合部２７が設けられている。カバープレート６０には、キャップ２０の平坦部２１を受容する切欠部１６０が形成され、また、キャップ２０の軸部２５を軸支するための軸支孔（図示せず）が平坦部２１の切欠部側面に形成されている。軸部２５を支点としてキャップ２０が閉じられると、キャップ２０の矩形上面平坦部２１がカバープレート６０の上面に連接して略平坦な面を核酸検出カセット１０に与えるようにキャップ２０が核酸検出カセット１０に嵌め込まれる。この嵌め込みに際しカバープレート６０にキャップ２０を押し付けると、キャップ２０の係合部２７が下部プレート３０の係合溝（図示せず）に係合される。その結果、キャップ２０が下部プレート３０に取り外し不能に固定される。サンプル溶液がサンプル注入孔７１０を介してサンプルシリンジ７０２内に注入された後に、キャップ２０が嵌め込み装着されると、キャップ２０の下面でサンプル注入孔７１０および空気抜き開口７１６が圧接変形されてサンプル注入孔７１０および空気抜き開口７１６が閉塞される。従って、核酸検出カセット１０は、液密に密閉され、サンプルの増幅或いはサンプルの電気化学反応の検出において、核酸検出カセット１０が加熱されても核酸検出カセット１０から外部にサンプルが漏れ出ることが防止される。
【００４９】
このように、核酸検出カセット１０にサンプルを充填する前においては、キャップ２０は、軸部２５でカバープレート６０に軸支されたまま、カバープレート６０に対して開放され、軸部２５の周りに回動可能に維持された状態で取り付けられている。核酸検出カセット１０にサンプルが充填された後においては、上述したように、キャップ２０が核酸検出カセット１０に取り外し不能に固定される。キャップ２０の核酸検出カセット１０への取り外し不能な固定は、ユーザに対して核酸検出カセット１０へのサンプルの収納が成されていること明示することとなり、再度サンプルを誤って核酸検出カセット１０へ注入するような事態を防止することができる。
【００５０】
カバープレート６０には、核酸検出カセット１０の幅方向に沿って縦長溝１６４が並列して配置され、その内部には、シリンジ７０２、７０４、７０６、７０８が縦長溝１６４内に膨出するように設けられている。また、カバープレート６０には、核酸検出カセット１０の幅方向に沿ってＴ字形窪み４１、４２、４４、４６が設けられ、この窪み４１、４２、４４、４６の背後に常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８の片持ちはり構造が設けられている（図４）。送液制御機構１６のバルブロッドによってカバープレート６０背面側からこの片持ちはり構造が開放操作されると、この窪み４１、４２、４４、４６の背後の常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８が開放される。シリンジ７０２、７０４、７０６、７０８が配置される縦長溝１６４は、指が入り込まないような幅を有し、また、縦長長が大きな縦長溝１６４には、図２に示すように仕切り１６５が設けられて長手方向における指の進入を防止するようにしている。
【００５１】
尚、図２に示す核酸検出カセット１０は、カバープレート６０が設けられた上部プレート５０および下部プレート３０の幅方向の両側面に滑り止め用の凹凸溝１３９が設けられ、ユーザが確実に核酸検出カセット１０を把持することを可能としている。
【００５２】
図２に示す核酸検出カセット１０のカバープレート６０は、図３に示すようにカバープレート６０の上面がこの前方領域１５２に面一となるように上部プレート５０に取り付け固定される。上部プレート５０の前方領域１５２には、増幅部領域を固定する為に矩形状の窪み５１が形成され、この窪み５１の両側に常開バルブ８１０、８２０を操作するロッド穴５２、５４が設けられている。このロッド穴５２、５４に送液制御機構１６のバルブロッドが挿入されて常開バルブ８１０、８２０にその先端が押し付けられることによって常開バルブ８１０、８２０が開放される。また、ＤＮＡチップ６の電極パッドが配列された電極パッド領域１１０、１１２に電流プローブを装着する為の縦長なプローブ孔５６、５８が上部プレート５０の前方領域１５２に並列して形成されている。
【００５３】
カバープレート６０が取り外されて露出される、上部プレート５０の後方領域１５０には、パッキン４０に設けられた第１洗浄液供給孔７２０、挿入剤供給孔７３０、第２洗浄液供給孔７４０の為の開口突起１４１の先端および空気抜き開口７２６、７３６、７４６の為の開口突起１４７の先端が露出されている。核酸検出カセット１０の製造工程では、図９に示すようなカバープレート６０が取り外された状態で、第１洗浄液供給孔７２０を介して第１洗浄液が第１洗浄液シリンジ７０４に注入され、挿入剤供給孔７３０を介して挿入剤が挿入剤シリンジ７０６に注入され、第２洗浄液供給孔７４０を介して第２洗浄液が第２洗浄液シリンジ７０８に注入される。その後、カバープレート６０が上部プレート５０の後方領域１５０に取り外し不能に取り付け固定される。この取り付け固定に際しては、カバープレート６０の下面が開口突起１４１および開口突起１４７に押し付けられ、開口突起１４１および開口突起１４７がカバープレート６０の下面に圧接される。従って、カバープレート６０が上部プレート５０に取り付けられると、第１洗浄液供給孔７２０、挿入剤供給孔７３０、第２洗浄液供給孔７４０および空気抜き開口７２６、７３６、７４６が閉塞される。
【００５４】
［核酸検出カセットの組み立て］
図１０、図１１および図１２を参照して図２に示す核酸検出カセットの組み立て工程について説明する。
【００５５】
始めに図１０に示すように、上部プレート５０の下面が上方に向けられて配置され、この上部プレート５０の下面に取り付けられるパッキン４０が用意される。上部プレート５０の下面に設けたスタッドピン１５８がパッキン４０に設けられた挿通孔１４８に挿入されて図１１に示すように上部プレート５０の下面にパッキン４０が載置される。ここで、上部プレート５０の外周に設けられたスタッドピン１５６は、図１１に示すようにパッキン４０の周囲に配置される。
【００５６】
次に、図１１に示す上部プレート５０とパッキン４０の組み立て体が裏返されて、図１２に示すように、ＤＮＡチップ６が載置された下部プレート３０の上面上にパッキン４０および上部プレート５０が載置される。組み立て体のスタッドピン１５６、１５８が下部プレート３０のスタッド孔１３８に挿通される。その後、スタッドピン１５６、１５８の先端を下部プレート３０に熱カシメすることにより上部プレート５０、パッキン４０および下部プレート３０が一体化される。
【００５７】
［常開バルブの構造］
増幅部８０には、既に説明したように、増幅流路８１２、８１６の入力ポート側及び出力ポート側には、常開バルブ８１０、８２０が設けられている。この常開バルブ８１０、８２０は、図１３及び図１４に示すように上部プレート５０のロッド穴５２、５４内に可撓性パッキン４０の筒状部５５として形成されている。パッキン４０には、上部プレート５０のロッド穴５２、５４に一致される窪み５７が形成され、その窪み５７内に筒状部５５が配置されている。筒状部５５とこの筒状部５５が配置される下部プレート３０の上面との間に常開バルブ８１０、８２０の為の空洞部が形成され、この空洞部は、流路８０２及び増幅流路８１２或いは増幅流路８１６及び流路８０６を連通している。この構造から明らかなように、筒状部５５は、窪み５７内にパッキン４０と一体に形成されていることから、パッキン４０の膜厚Ｔ１よりも十分薄く、より好ましくは、膜厚Ｔ２（Ｔ１＞Ｔ２）よりも薄く形成される。ここで、膜厚Ｔ１は、凸部領域及び凹部領域で形成されるパッキン４０の凸部領域膜厚に相当し、膜厚Ｔ２は、凹部領域膜厚に相当している。従って、図１５に示すように筒状部５５の内部に設けた空洞部を外部から挿入されたロッド５９で押し潰すことができ、筒状部５５を押し潰すことで空洞部を閉塞することができる。空洞部を閉塞によって、流路８０２と増幅流路８１２との間の流路或いは増幅流路８１６と流路８０６との間の流路が遮断される。また、筒状部５５が可撓性を有することから、増幅部８０が加熱されてサンプル内のターゲットＤＮＡが増幅された後に、ロッド５９を退避することによって、押し潰された筒状部５５を再びその内に空洞が形成させるような原形状の筒状部に戻すことができる。従って、この筒状部５５内の空洞を介して流路８０２及び増幅流路８１２或いは増幅流路８１６及び流路８０６を連通させることができる。
【００５８】
［常閉バルブ構造］
常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８は、図１５に示される常開バルブがカバープレート６０の裏面に設けた突起部４３によって閉塞されて構成されている。より詳細には、常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８は、突起部４３が上部プレート５０に設けた貫通孔を介してパッキン４０に設けた溝に進入され、この溝内の可撓性筒状部を押し潰して筒状部の流路を閉塞するように構成される。カバープレート６０の裏面に設けた突起部４３は、基部がカバープレート６０に枢支固定され、基部から延びる舌片が可動可能にカバープレート６０に切欠支持された片持梁構造に形成される。常閉バルブ７１８、７２８、７３８、７４８の開放時には、片持梁構造の舌片がロッドで持ち上げられて突起部４３が筒状部から取り除かれて筒状部に流路が確保されることによって開放される。
【００５９】
［検査装置］
図１６は、図２に示される核酸検出カセット１０が装着される検査装置の内部構造を示している。この検査装置内には、装着された核酸検出カセット１０の背面側に、増幅部８０を加熱する為のヒータ８５０およびＤＮＡチップ６の検出流路１００を反応温度に維持する為のペルチェ素子８５２が夫々リフト機構８５４，８５６によって矢印で示すように上下動可能に設けられている。ヒータ８５０およびペルチェ素子８５２並びにリフト機構８５４，８５６は、図１に示す温度制御機構１４を構成している。
【００６０】
また、核酸検出カセット１０の上面側に、ＤＮＡチップ６の電極パッド領域１１０、１１２内の電極パッド９４２に電気的に接続されて検出電流を取り出す電流プローブ９６０が上下動可能に設けられている。この電流プローブ９６０は、信号処理の為のプロセッサを含む回路基板９６２に電気的に接続され、図１に示す測定部１２を構成している。
【００６１】
更に、核酸検出カセット１０の上面側には、シリンジ７０２、７０４、７０６、７０８からサンプル溶液、洗浄液或いは挿入剤を送り出すためのシリンジロッド７５０が設けられ、また、常開バルブ５２、５４を閉じる為の常開バルブロッド５９が設けられている。核酸検出カセット１０の下面側には、常閉バルブ７１８、７２８、７３８および７４８を開放する為の常閉バルブロッド７５２が設けられている。これらシリンジロッド７５０、常開バルブロッド５９および常閉バルブロッド７５２は、送液制御機構１６を構成している。
【００６２】
これら測定部１２、温度制御機構１４および送液制御機構１６を構成する各部は、制御部１８に格納されたプログラムによって制御されて図１７に示されるサンプルの電気化学的な検査が実行される。
【００６３】
［サンプルの電気化学的検査］
図１７に示されるフローチャートおよび図１８から図２１に示される送液動作を参照して、図１に示される核酸検査装置におけるサンプルの電気化学的検査を説明する。
【００６４】
核酸検出カセット１０の製造時に、第１洗浄液シリンジ７０４に第１洗浄液が充填され、挿入剤シリンジ７０６に挿入剤が充填され、第２洗浄液シリンジ７０８に第２洗浄液が充填されて核酸検出カセット１０が用意される。その後、ユーザ(オペレータ）がサンプル溶液をサンプルシリンジ７０２に注入する。その後、核酸検出カセット１０が核酸検査装置８に装着されて検査が開始される（ステップＳ１０）。サンプル溶液のサンプルシリンジ７０２への注入に際しては、ユーザ（オペレータ）が核酸検出カセット１０を把持し、マイクロシリンジや医療用シリンジ等を利用してサンプル注入孔７１０にサンプル溶液が注入される。サンプルシリンジ７０２へのサンプル溶液の注入が完了すると、核酸検出カセット１０にキャップ２０が取り付けられる。キャップ２０は、核酸検出カセット１０に取り外し不能に取り付けることによりサンプル注入孔７１０および空気抜き開口７１６が閉塞される。
【００６５】
核酸検出カセット１０が検査装置８に装着されると、電流プローブ９６０が核酸検出カセット１０に向けて降下され、ＤＮＡチップ６の電極パッド領域１１０、１１２内の電極パッド９４２に電気的に接触され、検出流路１００における反応電流の検出が可能になる。
【００６６】
検査が開始されると、始めに、常閉バルブロッド７５２がサンプルシリンジ７０２に連通されている常閉バルブ７１８に押し付けられ、この常閉バルブ７１８が開放される。その後、サンプルシリンジ７０２がシリンジロッド７５０で押し潰され、その内部のサンプル溶液が図１８に示されるように、流路８０２を介して増幅流路８１２、８１６に供給される（ステップＳ１２）。増幅流路８１２、８１６がサンプル溶液で満たされると、常開バルブロッド５９が常開バルブ８１０、８２０を押し潰してこのロット孔５２、５４を閉鎖する。また、ヒータ８５０が核酸検出カセット１０の増幅部８０に押し付けられて増幅部８０の増幅流路８１２、８１６がヒータによって加熱され、一定温度に維持される。従って、閉塞された増幅流路８１２、８１６内で、サンプル溶液に含まれる複数種類のターゲットＤＮＡは、増幅流路８１２、８１６の壁面から遊離した対応する複数種類のプライマーセットによってマルチ増幅される（ステップＳ１４）。
【００６７】
次に、常開バルブロッド５９が常開バルブ８１０、８２０から離れて元の位置に戻ることにより、この常開バルブ８１０、８２０が再び開放される。つづいて、常閉バルブロッド７５２が第１洗浄液シリンジ７０４に連通される常閉バルブ７２８に押し付けられ、この常閉バルブ７２８が開放される。その後、第１洗浄液シリンジ７０４がシリンジロッド７５０で押し潰されてその内部の第１洗浄液が図１９に示されるように、流路８０２を介して増幅流路８１２、８１６に供給される。このとき、増幅流路８１２、８１６内の増幅産物を含むサンプル溶液は、流路８０６、９０８、９２２を介して検出部９０の検出流路１００に供給される（ステップＳ１６）。ここで、第１洗浄液が流路７２２内の空気を押し出して増幅産物を含むサンプル溶液を増幅流路８１２、８１６から検出流路１００に送液している。従って、増幅産物を含むサンプル溶液と第１洗浄液とは、空気層を介して接することとなり、互いに混じり合うことなく、流路８０２、増幅流路８１２、８１６内を送液される。
【００６８】
増幅産物を含むサンプル溶液が検出流路１００に送液されると、核酸検査装置８のペルチェ素子８５２が核酸検出カセット１０に向けて上昇されて検出部９０に接触される。そして、ペルチェ素子８５２によって検出流路１００がハイブリダイゼーション反応に最適な温度に制御される。検出流路１００内では、サンプル溶液中の増幅産物に含まれるターゲットＤＮＡが核酸プローブとハイブリダイズにより結合する（ステップＳ１８）。その後、常閉バルブロッド７５２が第２洗浄液シリンジ７０８に連通されている常閉バルブ７４８に押し付けられ、この常閉バルブ７４８が開放される。その後、第２洗浄液シリンジ７０８がシリンジロッド７５０で押し潰され、その内部の第２洗浄液が図２０に示されるように、流路８０４、９０８、９２２を介して検出流路１００に供給される（ステップＳ２０）。従って、検出流路１００内のハイブリダイズされない未反応のＤＮＡを含むサンプル溶液は、検出流路１００から流路９２４、９２６を介して廃液タンク９３０に送液される。ここで、ペルチェ素子８５２によって検出流路１００が洗浄に最適な温度に制御され、検出流路１００内が洗浄される（ステップＳ２２）。尚、第２洗浄液が流路８０４に供給されると、第２洗浄液が空気層を介してサンプル溶液を押し出すこととなる。ここで、流路８０４と流路８０６とが流路９０８で連通されているが、流路８０４および流路９０８に送液圧力が空気層を介して付加され、流路８０６には、逆送圧力が空気層を介して付加される。従って、第１洗浄液が第２洗浄液中に混じることがなく、第２洗浄液が検出流路１００に供給され、サンプル溶液は、検出流路１００から廃液タンク９３０に送液される。
【００６９】
洗浄が完了すると、常閉バルブロッド７５２が挿入剤シリンジ７０６に連通される常閉バルブ７３８に押し付けられ、この常閉バルブ７３８が開放される。その後、挿入剤シリンジ７０６がシリンジロッド７５０で押し潰され、その内部の挿入剤が図２１に示されるように、流路８０４、９０８、９２２を介して検出流路１００に供給される（ステップＳ２４）。ここで、流路８０４および流路９０８に送液圧力が空気層を介して付加され、流路８０６には、逆送圧力が空気層を介して付加される。従って、第１洗浄液が挿入剤中に混じることがなく、挿入剤が検出流路１００に供給される。また、検出流路１００内の第２洗浄液は、検出流路１００から流路９２４、９２６を介して廃液タンク９３０に送液される。
【００７０】
挿入剤の検出流路１００への供給後、ペルチェ素子８５２によって検出流路１００が挿入剤反応に最適な温度に制御され、検出流路１００内で挿入剤反応が生起される（ステップＳ２６）。ここで挿入剤反応においては、例えば、挿入剤により２本鎖部分が認識され、認識された２本鎖部分に挿入剤が入り込み、電気化学的に活性化され、電気信号が発生する。この挿入剤反応は、電圧の印加の下でＤＮＡチップ６の電極パッド領域１１０、１１２内の電極パッド９４２を介して電流プローブ９６０で検出される(ステップＳ２８）。電流プローブ９６０で検出された測定電流は、回路基板９６２のプロセッサで処理されて測定データとしてコンピュータ４に送られ、解析される。
【００７１】
以上のように、実施形態によれば、高集積化され、サンプルの増幅からサンプルの電気化学反応の検出までを完全に自動化されている核酸検査装置に利用可能な核酸検出カセットを提供することができる。
【００７２】
［例］
図２に示した実施形態の核酸検出カセットを製造した。この核酸検出カセットを使用して核酸検出試験を行った。
【００７３】
１．核酸検出カセットの準備
１−１．ＤＮＡチップの準備
まず、互いに塩基配列の異なる９種類の核酸プローブを用意した。これらのプローブ名は、それぞれ核酸プローブＡ、核酸プローブＢ、核酸プローブＣ、核酸プローブＤ、核酸プローブＥ、核酸プローブＦ、核酸プローブＧ、核酸プローブＨ、核酸プローブＩであり、それらの塩基配列は表１に示す。
【表１】
0006400392.tif 000002
【００７４】
核酸を検出するためのＤＮＡチップ用の基板上に配置された各電極に、これらの９種類の核酸プローブを固定化した。具体的には次の通りに行った。核酸プローブＡ、核酸プローブＢ、核酸プローブＣ、核酸プローブＤ、核酸プローブＥ、核酸プローブＦ、核酸プローブＧ、核酸プローブＨおよび核酸プローブＩをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液を調製した。これらのプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ１００ｎＬずつ作用極上にスポットした。核酸プローブ毎に３つの作用極を割り当てた（表２参照）。その後、これを４０℃にて乾燥した。これにより核酸プローブがチップ基板上の電極に固定され、ＤＮＡチップが得られた。ここで、核酸プローブＧは、ネガティブコントロール用の核酸プローブである。
【表２】
0006400392.tif 000003
【００７５】
１−２．核酸検出カセットの組立て
核酸検出カセットを作るために上部プレート、下部プレートおよびパッキンを用意した。これらの部材を積層し、固定することによって積層構造体を形成した。上部プレート、下部プレートおよびパッキンは、積層構造体の内部に流路、増幅部および１−１．のＤＮＡチップを取り付けて構成する検出部、試薬を封入するシリンジが形成されるように凹部、凸部および溝などの形成や穿孔がなされている。また、流路にサンプルを注入するためのサンプル注入孔を設けるために、流路の一端が積層構造体の外部に開口されている。増幅部の流路には複数のウェルが形成されており、各ウェルの内壁にはプライマーセットが１種類ずつ遊離可能に固定化されている。
【００７６】
固定化された増幅用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による増幅反応用に設計したものである。それぞれのプライマーセットに含まれるプライマーＤＮＡの塩基配列を表３−１および表３−２に示す。
【表３−１】
0006400392.tif 000004
【００７７】
【表３−２】
0006400392.tif 000005
【００７８】
プライマーセットは、セットＡ、セットＢ、セットＣ、セットＤ、セットＥ、セットＦ、セットＨ、セットＩを用意した。各プライマーセットは、それぞれＦＩプライマー（ＦＩＰ）、ＢＩプライマー（ＢＩＰ）、Ｆ３プライマー（Ｆ３）、Ｂ３プライマー（Ｂ３）、ループプライマー（ＬＰＦまたはＬＰＢ）を含むように設計した。各プライマーセットを含むプライマー溶液を調製するために、それぞれ２００μＭでＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３、並びにＬＰＦまたはＬＰＢをそれぞれに含むプライマー溶液を準備した。そのようにして得たＦＩＰ溶液、ＢＩＰ溶液、Ｆ３溶液、Ｂ３溶液およびＬＰＦ溶液（またはＬＰＢ）をそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬずつ混合した。それにより、それぞれ１種類のターゲットＤＡＮを増幅するために必要な全てのプライマーを含む、総量０．１００μＬのプライマーセット溶液を調製した。各プライマーセット溶液を増幅部のウェル内に滴下し、４０℃で２分間乾燥することにより、増幅部に固定した。ここで、プライマーセットのウェルへの固定は、２ｍｍピッチ、４ｍｍピッチまたは８ｍｍピッチで行った。２ｍｍピッチを２枚、４ｍｍピッチを２枚および８ｍｍピッチを２枚の計６枚の核酸検出カセットを作成した。
【００７９】
２．核酸の検出
２−１．サンプル溶液の準備
鋳型ＤＮＡとして使用する８種類の核酸、即ち、遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ、遺伝子Ｅ、遺伝子Ｆ、遺伝子Ｈおよび遺伝子Ｉを準備した。遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ、遺伝子Ｅ、遺伝子Ｆ、遺伝子Ｈおよび遺伝子Ｉに含まれる鋳型ＤＮＡの配列を表４−１および表４−２に示した。鋳型ＤＮＡは、上記のプライマーセットによって増幅される配列であり、これらは、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＨおよびＩにそれぞれ対応する鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈおよび鋳型Ｉである。
【表４−１】
0006400392.tif 000006
【００８０】
【表４−２】
0006400392.tif 000007
【００８１】
核酸検出カセットに注入するサンプル溶液として、上記８種類の核酸とＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスを含む溶液を調製した。サンプル溶液の具体的な組成を表４に示した。サンプル溶液は、蒸留水（即ち、ＤＷ）を添加して総量を５０μＬとした。
【表５】
0006400392.tif 000008
【００８２】
以下の試験において使用される核酸検出カセットは、次のような反応を進行させるように設計されている。
【００８３】
サンプル溶液中には、鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈおよび鋳型Ｉが含まれる。このサンプル溶液を核酸検出カセットの流路にサンプル注入孔から添加する。核酸検出カセットの増幅部のウェルには、プライマーセットＡ、プライマーセットＢ、プライマーセットＣ、プライマーセットＤ、プライマーセットＥ、プライマーセットＦ、プライマーセットＨ、プライマーセットＩがセット毎に２つのウェルに遊離可能に固定化されている。即ち、プライマーセットＡは、ウェルＡ１およびウェルＡ２、プライマーセットＢは、ウェルＢ１およびウェルＢ２、プライマーセットＣは、ウェルＣ１およびウェルＣ２、プライマーセットＤはウェルＤ１およびウェルＤ２、プライマーセットＥはウェルＥ１およびウェルＥ２、プライマーセットＦはウェルＦ１およびウェルＦ２、プライマーセットＨはウェルＨ１およびウェルＨ２、プライマーセットＩはウェルＩ１およびウェルＩ２にそれぞれ固定化されている。
【００８４】
増幅部に送液されたサンプル溶液により、これらのプライマーセットが遊離する。増幅部の加熱下で、以下のように、それぞれのウェルにおいて対応するプライマーセットによる鋳型ＤＮＡの増幅が行われる。ウェルＡ１およびウェルＡ２では、プライマーセットＡにより鋳型Ａが増幅される。ウェルＢ１およびウェルＢ２では、プライマーセットＢにより鋳型Ｂが増幅される。ウェルＣ１およびウェルＣ２では、プライマーセットＣにより鋳型Ｃが増幅される。ウェルＤ１およびウェルＤ２では、プライマーセットＤにより鋳型Ｄが増幅される。ウェルＥ１およびウェルＥ２では、プライマーセットＥにより鋳型Ｅが増幅される。ウェルＦ１およびウェルＦ２では、プライマーセットＦにより鋳型Ｆが増幅される。ウェルＨ１およびウェルＨ２では、プライマーセットＨにより鋳型Ｈが増幅される。ウェルＩ１およびウェルＩ２では、プライマーセットＩにより鋳型Ｉが増幅される。このように増幅部で生じた増幅産物を含むサンプル溶液は、検出部に送られる。
【００８５】
検出部には、核酸プローブＡ、核酸プローブＢ、核酸プローブＣ、核酸プローブＤ、核酸プローブＥ、核酸プローブＦ、核酸プローブＧ、核酸プローブＨおよび核酸プローブＩが固定化されている。検出部に送液された増幅産物を含むサンプル溶液には、鋳型Ａ、鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈおよび鋳型Ｉにそれぞれ由来する増幅産物Ａ、増幅産物Ｂ、増幅産物Ｃ、増幅産物Ｄ、増幅産物Ｅ、増幅産物Ｆ、増幅産物Ｈおよび増幅産物Ｉが含まれる。これらの増幅産物は、対応する核酸プローブとハイブリダイズする。核酸検出カセットにおける試験では、このハイブリダイズにより生じたハイブリダイズ信号を検出することにより、サンプル溶液中に対応する遺伝子が存在しているか否かが判定される。具体的には、増幅産物Ａ、増幅産物Ｂ、増幅産物Ｃ、増幅産物Ｄ、増幅産物Ｅ、増幅産物Ｆ、増幅産物Ｈおよび増幅産物Ｉは、核酸プローブＡ、核酸プローブＢ、核酸プローブＣ、核酸プローブＤ、核酸プローブＥ、核酸プローブＦ、核酸プローブＨおよび核酸プローブＩとそれぞれハイブリダイズするように設計されている。核酸プローブＡ、核酸プローブＢ、核酸プローブＣ、核酸プローブＤ、核酸プローブＥ、核酸プローブＦ、核酸プローブＨおよび核酸プローブＩが固定されている電極からの信号を検出することにより、遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃ、遺伝子Ｄ、遺伝子Ｅ、遺伝子Ｆ、遺伝子Ｈおよび遺伝子Ｉが試験に供されたサンプル溶液に含まれているか否かが判定できる。
【００８６】
２−２．鋳型溶液の添加
２−１にて準備した５０μＬの鋳型溶液を反応領域、即ち、増幅部、次いで検出部に送液した。
【００８７】
２−３．核酸の反応
以下の表６に示す条件にて、反応領域を加熱および冷却して各種反応を行った。
【表６】
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【００８８】
２−４．核酸の検出
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、核酸プローブと増幅産物により形成された２本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。
【００８９】
結果
図２２には、核酸検出カセットの増幅部に対して、２ｍｍピッチ、４ｍｍピッチおよび８ｍｍピッチでプライマーセットを固定化した様子を模式的に示した。この核酸検出カセットにおいてウェルの形成は、基本的に２ｍｍピッチでなされている。従って、２ｍｍピッチの場合には、隣り合うウェルにプライマーセットを固定化している（図２２左欄参照）。４ｍｍピッチの場合には、間にプライマーセットを固定化しないウェルを配置させている（図２２中央欄参照）。８ｍｍピッチの場合には図２２右欄に示すように、ピッチが８ｍｍになるように配置されたウェルにプライマーセットを固定化している。
【００９０】
このような核酸検出カセットにより得られた結果を表７に示す。
【表７】
0006400392.tif 000010
【００９１】
ネガティブコントロールと比較して、有意に大きな電流値が得られた核酸プローブを陽性として陽性率を算出した。核酸プローブを２ｍｍピッチで固定化した場合は陽性率が低く、４ｍｍピッチまたは８ｍｍピッチで核酸プローブを固定化することによって陽性率が１００％となった。これらの結果から、４ｍｍピッチ以上の間隔でプライマーセットを固定化することにより、複数の異なる鋳型を含むサンプル溶液についてのマルチ増幅を良好に行うことが可能となることが明らかとなった。従って、４ｍｍピッチ以上の間隔でプライマーセットが固定化された核酸検出カセットにより、複数のターゲット核酸を同時により正確に検出できることが証明された。即ち、実施形態の核酸検出カセットによれば、サンプル溶液に含まれる互いに異なる複数の遺伝子を確実に検出できることが証明された。
【符号の説明】
【００９２】
４  コンピュータ      ６  ＤＮＡチップ      ８  核酸検査装置      １０  核酸検出カセット      １２  測定部      １４  温度制御機構      １６  送液制御機構      １８  装置制御部      ２０  キャップ      ２１  矩形上面平坦部      ２３  側部      ２２  切欠部      ２５  軸部      ２７  係合部      ３０  下部プレート      ４０  パッキン      ５０  上部プレート      ５１  窪み      ５２、５４  ロッド孔      ５５  筒状部      ５７  窪み      ５６、５８  プローブ孔      ５９  常開バルブロッド      ６０  カバープレート      ７０  シリンジ部      ８０  増幅部      ９０  検出部      １００Ａ  流路形成部      １００  検出流路      １００Ｂ  流路形成領域      １１０、１１２  電極パッド領域      １３０  チップ用窪み      １３１  係合孔      １１１、１３２  溝      １３４  シリンジ用窪み      １３６  タンク用窪み      １３８Ａ  周辺スタッド孔      １３８Ｂ  スタッド孔      １３９  凹凸溝      １４４  膨出部      １４４Ｃ  スリット      １４１、１４３、１４５、１４７  開口突起      １４１Ａ、１４３Ａ、１４５Ａ、１４７Ａ  貫通孔      １４２  送液流路用貫通孔      １４４Ｂ、１４６Ｂ  フレーム部      １４６、１４９、１５４、１５９、１６４  縦長貫通溝      １４８  挿通孔      １５０  後方領域      １５１、１５３、１５５、１５７  貫通孔      １５２  前方領域      １５５  スタッドピン、１５６、１５８  スタッドピン      １６９  ステップ      １６０  切欠部      １６２  係合突起      １６６  挿通孔      ７０２  サンプルシリンジ      ７０４  第１洗浄液シリンジ      ７０６  挿入剤シリンジ      ７０８  第２洗浄液シリンジ      ７１０  サンプル注入孔      ７２０  第１洗浄液供給孔      ７３０  挿入剤供給孔      ７４０  第２洗浄液供給孔      ７１２、７１４、７２２、７２４、７３２、７３４、７４２、７４４  流路      ７１８、７２８、７３８、７４８  常閉バルブ      ７５０  シリンジロッド      ７５２  常閉バルブロッド      ７１６、７２６、７３６、７４６  空気抜き開口      ８０２、８０４、８０６  流路      ８１０、８２０  常開バルブ      ８１２、８１６  増幅流路      ８３０  ウェル      ８３２  プライマーセット      ９０２  流路      ９１０、９１２  入力ポート      ９１４、９１６  出力ポート      ９０８、９２２、９２４、９２６、９２８  流路      ８５０  ヒータ      ８５２  ペルチェ素子      ８５４、８５６  リフト機構      ９３０  廃液タンク      ９３２  補助廃液タンク      ９４０  作用電極      ９４４  参照電極      ９４６、９４８  対向電極      ９６０  電流プローブ      ９６２  回路基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006400392.tif 000019
【図１０】
0006400392.tif 000020
【図１１】
0006400392.tif 000021
【図１２】
0006400392.tif 000022
【図１３】
0006400392.tif 000023
【図１４】
0006400392.tif 000024
【図１５】
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【図１６】
0006400392.tif 000026
【図１７】
0006400392.tif 000027
【図１８】
0006400392.tif 000028
【図１９】
0006400392.tif 000029
【図２０】
0006400392.tif 000030
【図２１】
0006400392.tif 000031
【図２２】
0006400392.tif 000032
【配列表】
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