(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無処置の全血試料を分析する方法であって、
バッファー、無処置の全血試料、及び内部標準をシリンジアセンブリに順次投入するステップと、
マルチポート弁を投入位置に切り替えるステップと、
順次投入された前記内部標準及び無処置の全血試料を二重領域試料ループの第１の領域に注入するステップと、
前記無処置の全血試料の細胞成分を破砕するのに十分なエネルギーを前記二重領域試料ループの第１の領域内の前記無処置の全血試料に加えて、細胞破砕血液を生成するステップと、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量の前記バッファーを前記二重領域試料ループに注入するステップと、
前記マルチポート弁を注入位置に切り替えるステップと、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループから固相抽出カラムに流すステップと、
前記細胞破砕血液の成分を前記固相抽出カラムから液体クロマトグラフィー用カラムに溶出させるステップと、を備える、方法。
【請求項２】
前記細胞破砕血液の成分を前記液体クロマトグラフィー用カラムから質量分析装置に溶出させるステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、前記細胞破砕血液の成分を特定するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ前記全血試料が前記第１の領域に滞在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記全血試料が、前記第１の領域を通して連続して移動し、
前記第１の領域の流量及び容量が、前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な、前記第１の領域内の前記全血試料の滞留時間を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バッファーを注入して前記細胞破砕血液を前記第２の領域に移動させる前に、前記全血試料が、前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ前記第１の領域内で停止する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
全血分析システムであって、
注入シリンジアセンブリと、
マルチポート弁と、
第１の領域及び第２の領域を備える二重領域試料ループと、
固相抽出カラムと、
制御装置と、を備え、
前記制御装置は、
バッファー、無処置の全血試料、及び内部標準を前記シリンジアセンブリに順次投入し、
前記マルチポート弁を投入位置に切り替え、
順次投入された前記内部標準及び全血を二重領域試料ループの第１の領域に注入し、    前記無処置の全血試料の細胞成分を破砕して細胞破砕血液を生成するのに十分な熱を前記二重領域試料ループの第１の領域内の無処置の全血試料に加え、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量のバッファーを前記二重領域試料ループに注入し、
前記マルチポート弁を注入位置に切り替え、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループから固相抽出カラムに流して前記細胞破砕血液から成分のサブセットを分離する、ように構成されている、システム。
【請求項８】
液体クロマトグラフィー用カラムをさらに備える、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記制御装置が、前記液体クロマトグラフィー用カラムに成分の前記サブセットを流して溶出させるようにさらに構成されている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
質量分析装置をさらに備える、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記細胞破砕血液の成分を前記液体クロマトグラフィー用カラムから前記質量分析装置に溶出させるようにさらに構成されている、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記制御装置が、保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、前記細胞破砕血液の成分を特定するようにさらに構成されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記制御装置が、前記第１の領域を通して連続した流れで前記全血試料を移動させるように構成されており、
前記第１の領域の流量及び容量が、前記全血試料の前記細胞成分を破砕するのに十分な、前記第１の領域内の前記全血試料の滞留時間を生じる、請求項７に記載のシステム。
【請求項１４】
前記制御装置が、前記全血試料を前記第１の領域に注入した後、かつ前記バッファーを注入する前に、流れを停止させるように構成されており、この流れが、前記全血試料が前記第１の領域内にある間に、前記全血試料の前記細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ停止される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１５】
前記マルチポート弁が前記投入位置にあるとき、流体の流れが、前記シリンジアセンブリから前記第１の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第１の端に入り、前記第２の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第２の端から出て廃棄され、
前記マルチポート弁が前記注入位置にあるとき、流体の流れが、ポンプから前記二重領域試料ループの第１の端に入り、前記二重領域試料ループの第２の端から前記固相抽出カラムへ出る、請求項７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、細胞破砕血液の生成システム及び方法を含む、質量分析方法の分野に関する。
【０００２】
生体液から試料内の分析物を特定及び定量化することは、全血内の赤血球、白血球及び血小板などの流体試料から細胞成分を除去するために、複雑かつ面倒な前処理工程を必要とする場合がある。血液試料を分析するために、これらの細胞成分を、遠心分離、濾過、沈殿などの前処理工程によって除去し、かつ／または化学試薬または機械処理を使用した溶解によって均質化しなければならない場合がある。しかしながら、これらの工程は、自動試験形式に統合するのが困難である場合がある。これは、標的分析物が赤血球内の免疫抑制剤など、細胞成分内に存在する状況においても当てはまる。本事例では、細胞成分を、溶解試薬を加える前に遠心分離及び／または濾過によって単離または濃縮させることができ、あるいはそれらを、元の試料、例えばＺｎＳＯ4とアセトニトリルとの混合物に変性剤を加えることによって変性させることができ、または元の試料は、−２０〜−１７０℃の温度で処理される。
【０００３】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用して混合物内の成分を分離し、各成分を特定し、かつ各成分を定量化することができる。試料混合物を含有する加圧液体溶剤を、固体吸着材を充填したカラムに通過させることは、ポンプに依存する。試料内の各成分は、吸着材とわずかに違う相互作用を行い、異なる成分に対して異なる移動速度を生じ、かつそれらがカラムから流出するときに成分の分離をもたらす場合がある。
【０００４】
質量分析方法（ＭＳ）は、試料内の成分を特定及び定量化するのに広く使用されている。質量分析方法では、イオンを、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って分離し、イオン存在度を、ｍ／ｚの関数として測定する。一般に、質量分析装置は、３つの主な成分、イオン生成用イオン源、ｍ／ｚによってイオンを分離する質量分析装置、及びｍ／ｚで分離されたイオンを検出する検出器を有する。
【０００５】
質量分析方法（ＬＣ−ＭＳ）と組み合わされた液体クロマトグラフィーは、最初にクロマトグラフィーカラムを通して異なる移動速度に基づいて成分を分離し、次に質量分析装置を用いて試料の成分を特定及び定量化する、複合試料の自動分析を提供し得る。しかしながら、細胞成分を含む生体試料は、細胞成分または断片を除去するための前処理を必要とすることなどによって、試料内の成分の全自動分析に混乱を生じさせる可能性がある。全血を処理して残存細胞断片を分解し、かつ除去するインラインシステムが望ましいだろう。
【０００６】
その全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７９９，５７９号が、細胞成分を破砕するが、試料の粘性の有意な増加を避ける条件下で、生体試料を熱処理するプロセスを開示している。試料を６０℃〜９０℃の温度で１０〜４０秒間維持することによって、生体試料の細胞成分を、流体成分の実質的な沈殿、沈降、変性、凝集、またはゲル化を生じることなく、実質的に定性的に破砕する。
【０００７】
以上により、細胞破砕血液を生成し、かつ全血の全自動分析を提供することができる改善されたシステム及び方法が必要であることが理解されるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、全血試料を分析する方法が、バッファー、全血試料、及び内部標準をシリンジまたはシリンジループに投入することと、マルチポート弁を投入位置に切り替えることと、内部標準及び全血を二重領域試料ループの第１の領域に注入することと、全血試料の細胞成分を破砕して細胞破砕血液を生成するのに十分な熱またはエネルギーを全血に適用することと、細胞破砕血液を二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量のバッファーを二重領域試料ループに注入することと、を含み得る。本方法は、マルチポート値を注入位置に切り替えることと、細胞破砕血液を二重領域試料ループから固相抽出カラムに流動させることと、細胞破砕血液の成分を固相抽出カラムから液体クロマトグラフィー用カラムに溶出させることと、をさらに含み得る。
【０００９】
第１の態様の種々の実施形態では、本方法は、細胞破砕血液の成分を液体クロマトグラフィー用カラムから質量分析装置に溶出させることをさらに含み得る。
【００１０】
第１の態様の種々の実施形態では、本方法は、保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、細胞破砕血液の成分を特定することをさらに含み得る。
【００１１】
第１の態様の種々の実施形態では、全血試料は、全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間、第１の領域内に滞在し得る。
【００１２】
第１の態様の種々の実施形態では、全血試料は、第１の領域を通して連続して移動し得る。第１の領域の流量及び容量は、全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な第１の領域内の全血試料の滞留時間を生じ得る。
【００１３】
第１の態様の種々の実施形態では、全血試料は、バッファーを注入して細胞破砕血液を第２の領域に移動させる前に、全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間、第１の領域内で停止し得る。
【００１４】
第２の態様では、全血分析システムが、注入シリンジと、マルチポート弁と、投入ポンプと、第１の領域及び第２の領域を備える二重領域試料ループと、固相抽出カラムとを含み得る。
【００１５】
第２の態様の種々の実施形態では、本システムは、液体クロマトグラフィー用カラムをさらに含み得る。
【００１６】
第２の態様の種々の実施形態では、本システムは、質量分析装置をさらに含み得る。
【００１７】
第２の態様の種々の実施形態では、本システムは、バッファー及び全血試料をシリンジに投入することと、マルチポート弁を投入位置に切り替えることと、全血試料をシリンジから二重領域試料ループの第１の領域を通して二重領域試料ループの第２の領域に流動させることと、を行うように構成された制御装置をさらに含み得る。第１の領域内で、全血試料は、全血試料の細胞成分を破砕して細胞破砕血液を生成するのに十分な時間、十分な熱またはエネルギーを被り得る。制御装置は、マルチポート値を投入位置に切り替えることと、投入ポンプを作動させ、細胞破砕血液を二重領域試料ループから固相抽出カラムを通して流動させて細胞破砕血液から成分のサブセットを分離することと、を行うようにさらに構成され得る。
【００１８】
第２の態様の種々の実施形態では、マルチポート弁は、投入位置にあるときに、シリンジから第１の領域に隣接する二重領域試料ループの第１の端に入り、第２の領域に隣接する二重領域試料ループの第２の端から出て廃棄されるように流体の流れを案内し、かつ投入位置にあるときに、投入ポンプから第１の端に入り、第２の端から固相抽出カラムへと出るように流体の流れを案内するように構成され得る。
【００１９】
第３の態様では、全血分析システムが、注入シリンジと、マルチポート弁と、第１の領域及び第２の領域を備える二重領域試料ループと、固相抽出カラムと、制御装置とを含み得る。制御装置は、バッファー、全血試料、及び内部標準をシリンジに投入することと、マルチポート弁を投入位置に切り替えることと、内部標準及び全血を二重領域試料ループの第１の領域に注入することと、全血試料の細胞成分を破砕して細胞破砕血液を生成するのに十分な熱またはエネルギーを第１の領域内の全血に適用することと、細胞破砕血液を二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量のバッファーを二重領域試料ループに注入することと、を行うように構成され得る。制御装置は、マルチポート値を注入位置に切り替えることと、細胞破砕血液を二重領域試料ループから固相抽出カラムに流動させて細胞破砕血液の液体部分を細胞破砕血液の固体部分から分離することと、を行うようにさらに構成され得る。
【００２０】
第３の態様の種々の実施形態では、本システムは、液体クロマトグラフィー用カラムをさらに含み得る。特定の実施形態では、制御装置は、固相抽出カラムから液体クロマトグラフィー用カラムに成分のサブセットを流動させるようにさらに構成され得る。
【００２１】
第３の態様の種々の実施形態では、本システムは、質量分析装置をさらに含み得る。特定の実施形態では、制御装置は、細胞破砕血液の成分を液体クロマトグラフィー用カラムから質量分析装置に溶出させるようにさらに構成され得る。さらに、制御装置は、保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、細胞破砕血液の成分を特定するようにさらに構成され得る。
【００２２】
第３の態様の種々の実施形態では、制御装置は、全血試料を第１の領域を通して連続した流れで移動させるようにさらに構成され得る。第１の領域の流量及び容量は、全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な第１の領域内の全血試料の滞留時間を生じ得る。
【００２３】
第３の態様の種々の実施形態では、制御装置は、全血試料を第１の領域に注入した後、かつバッファーを注入する前に流れを停止させるように構成され得る。流れは、全血試料が第１の領域内にある間に、全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間、停止され得る。
【００２４】
第３の態様の種々の実施形態では、マルチポート弁が投入位置にあるとき、流体が、シリンジから第１の領域に隣接する二重領域試料ループの第１の端に入り、第２の領域に隣接する二重領域試料ループの第２の端から出て廃棄されるように流動し、かつマルチポート弁が注入位置にあるとき、ポンプから第１の端に入り、第２の端から固相抽出カラムへと出るように流動する。
【００２５】
本明細書で開示された原則、及びそれらの利点をより完全に理解するために、添付の図と関連させた下記の説明をこれより参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】種々の実施形態による全血を分析する例示的なシステムを図示したブロック図である。
【図２】種々の実施形態による全血試料から細胞破砕血液を生成する例示的なシステムの図である。
【図３】種々の実施形態による全血試料を分析する例示的な方法のフロー図である。
【図４】種々の実施形態による例示的な質量分析装置を図示したブロック図である。
【図５】種々の実施形態による例示的なコンピュータシステムを図示したブロック図である。
【００２７】
図は必ずしも縮尺通りに描かれておらず、図内の物体が互いに対する関係において必ずしも縮尺通りに描かれていないことを理解すべきである。図は、本明細書で開示された装置、システム、及び方法の種々の実施形態に対する明確さ及び理解をもたらすことを意図した描写である。可能な限り、同じ参照番号が、同じまたは同様の部品を参照するように、図全体に渡って使用される。さらに、図が、本発明の教示の範囲をいかなる方法でも限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
細胞破砕血液を生成するシステム及び方法の実施形態を本明細書に記載する。
【００２９】
本明細書で使用された節の見出しは、構成目的のためのものであって、記載された主題事項をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきでない。
【００３０】
種々の実施形態のこの詳細な記載では、説明の目的のために、多くの特定の詳細を、開示された実施形態の全体的な理解を提供するために記載する。しかしながら、これら種々の実施形態を、これら特定の詳細と共に、またはそれなしに、実行し得ることを当業者であれば理解するだろう。他の例では、構造及び装置をブロック図の形態で示している。さらに、方法が提示されかつ実行される特定の順序は例示であって、本順序は、本明細書で開示された種々の実施形態の趣旨及び範囲内で可変であり、かつ未だ維持され得るものと考えられることを、当業者であれば容易に理解し得る。
【００３１】
それらに限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページを含む、本願で引用された全ての文献及び同様の資料が、任意の目的でそれら全体が参照によって明示的に組み込まれる。別段記載されない限り、本明細書で使用された全ての技術及び科学用語は、本明細書で記載された種々の実施形態が属する当業者によって共通して理解されるものとしての意味を有する。
【００３２】
本発明の教示において議論された温度、濃度、時間などの前に、黙示の「約」があり、その結果、わずかで実体のない偏差が本発明の教示の範囲内にあることが理解されるだろう。本願では、単数の使用は、別段記載されない限り、複数を含む。また、「備える」、「備える」、「備える」、「含有する」、「含有する」、「含有する」、「含む」、及び「含む」は、限定することを意図していない。前述の一般的な記載及び下記の詳細な記載は、例示的かつ説明的なものであるだけであって、本発明の教示を限定するものではないことを理解すべきである。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「１つ」または「１つ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」のことを指す場合もある。また、「または」の使用は包括的なものであり、その結果「ＡまたはＢ」の成句は、「Ａ」が該当するとき、「Ｂ」が該当するとき、または「Ａ」及び「Ｂ」の両方が該当するときに該当する。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。
【００３４】
「システム」は、各成分が全体内の少なくとも１つの他の成分と相互作用し、またはそれと関連する全体を含む、成分、実際、または抽象のセットを記載する。
【００３５】
全血分析システム
図１は、全血試料１０２を分析するシステム１００を図示したブロック図である。システム１００は、シリンジ及び保持ループ１０４を含み得る。シリンジ及び保持ループ１０４が、試料１０２の少なくとも一部を作成し得る。種々の実施形態では、シリンジ及び保持ループ１０４が、人手を介さずに複数の分析用試料を順次処理するように構成されたオートサンプラーの一部であり得る。シリンジ及び保持ループ１０４が、マルチポート弁１０８を経由して、全血試料を二重領域試料ループ１０６に供給し得る。二重領域試料ループ１０６が、第１の領域１１０及び第２の領域１１２を含み得る。熱またはエネルギーが、第１の領域内の全血試料に供給され得る。種々の実施形態では、熱またはエネルギーが、第１の領域を囲む温水の浴槽または加熱した乾浴槽を使用することによって、全血試料に供給され得る。代替的に、第１の領域の誘導または抵抗加熱を使用し得る。またさらなる実施形態では、マイクロ波または赤外線エネルギー源を使用し得る。種々の実施形態では、試料の均一な加熱が、試料またはその一部を凝固させずに細胞成分の破砕を達成するために重要である場合がある。マルチポート弁１０８が、二重領域試料ループから廃棄部１１４へと、置換された液体を案内し得る。
【００３６】
試料１０２の一部が試料ループ１０６内にある状態で、弁１０８は位置を変更し、投入ポンプ１１６は試料を固相抽出カラム１１８に押し出すことができる。試料１０２からの着目成分が固相抽出カラム１１８によって保持され、他の材料が弁１２０によって廃棄部１１４に案内され得る。着目成分が固相抽出カラム１１８から出るとき、弁１２０は、流れをクロマトグラフィーカラム１２２に再案内し得る。
【００３７】
着目成分がクロマトグラフィーカラム１２２に投入された状態で、弁１２０は、クロマトグラフィーポンプ１２４からクロマトグラフィーカラム１２２を通して流れを案内することができる。クロマトグラフィーカラム１２２は着目成分を分離し、弁１２６は着目成分を質量分析装置１２８に案内することができる。弁１２６は、クロマトグラフィーカラム１２２から廃棄部１１４へ、着目成分を含有しない流れの一部を案内することができる。質量分析装置１２８は、着目成分を特定及び定量化することができる。
【００３８】
図２は、図１に図示されたシステム１００の一部として組み込まれ得る、細胞破砕血液を生成するために全血を熱処理するシステム２００を図示した図である。システム２００は、シリンジアセンブリ２０２と、マルチポート弁２０４と、二重領域注入ループ２０６とを含み得る。シリンジアセンブリ２０２は、バレル及びプランジャー２０８と、保持ループ２１０と、ソレノイド２１２とを含み得る。二重領域注入ループ２０６は、第１の領域２１４と、第２の領域２１６とを含み得る。
【００３９】
シリンジアセンブリ２０２は、内部標準２１８、全血試料２２０、及びローディングバッファー２２２を保持ループ２１０に投入し得る。さらに、バレル及びプランジャー２０８ならびに保持ループの一部に、置換流体２２４を充填し得る。空気量２２６、２２８、及び２３０を使用して、内部標準２１８、全血試料２２０、ローディングバッファー２２２、及び置換流体２２４を互いから単離し得る。種々の実施形態では、全血試料２２０を内部標準２１８及びローディングバッファー２２２から単離することで、拡散を防ぐことができ、全血試料２２０が既知の容量内に含有されることを確実にし得る。種々の実施形態では、ソレノイド２１２が、シリンジアセンブリ２０２内の置換流体２２４の容量を調節し、かつ注入値及びループを洗浄するのに有用であり得る。
【００４０】
図３は、全血試料を分析する方法３００を示す例示的なフロー図である。３０２で、全血試料を、オートサンプラーなどによってシリンジに投入し得る。種々の実施形態では、シリンジが試料ループを含み、全血試料をシリンジの試料ループ部分に投入し得る。ある容量の空気により全血試料から分離されたままであり得る内部標準を、シリンジにさらに投入し得る。さらに、ある容量の空気によって全血試料から分離されたある容量のロードバッファーを、シリンジにさらに投入し得る。種々の実施形態では、後入れ先出し（ＬＩＦＯ）順序でシリンジに投入され、その結果最初にロードバッファーが、続いてある容量の空気、全血試料、別の容量の空気、及び内部標準が取り出される。
【００４１】
３０４で、マルチポート弁を投入位置に切り替え得る。投入位置は、シリンジからの流体を二重領域試料ループに流れ込むことを可能にする。さらに、シリンジからの流体によって置換された二重領域試料ループ内の任意の液体を、マルチポート弁の廃棄ポートに案内し得る。投入位置は、第１の領域に最も近い二重領域試料ループの第１の端に液体を流れ込ませ、液体が第２の領域の最も近くの他の端から出て廃棄されるように構成され得る。
【００４２】
３０６で、全血試料を、二重領域試料ループの第１の領域に注入し得る。種々の実施形態では、最初に内部標準を、続いて全血試料を注入し、それらの間のある容量の空気によって分離を維持し得る。二重領域試料ループの第１の領域では、３０８で示されるように、試料を凝固またはゲル化することなく、全血の細胞成分を破砕して細胞破砕血液試料を生成するのに十分な熱またはエネルギーに全血は曝される。
【００４３】
種々の実施形態では、二重領域試料ループの第１の領域を囲む温水の浴槽または加熱した乾浴槽から、熱またはエネルギーを供給し得る。代替的に、第１の領域の誘導加熱または抵抗加熱によって、エネルギーを供給し得る。試料またはその一部を凝固またはゲル化することなく、細胞成分の最大破砕を達成するために、ホットスポットを避け、均一の加熱を確実にするための注意を払う場合がある。他の実施形態では、マイクロ波源または赤外線源などのエネルギー源を使用して第１の領域内の全血試料にエネルギーを供給し得る。
【００４４】
種々の実施形態では、供給されたエネルギーの量が、エネルギー投入レート及び第１の領域内の試料の滞留時間の両方の関数であり得る。例示として、約６４℃〜約７４℃の温度で、滞留時間は約８〜約５１秒であり、例えば、７０℃で１７秒である。しかしながら、試料ループの内径、壁の厚さ、及びに材料、エネルギー源の種類など多様な要因が、最適な熱伝達を達成するために必要な時間及び温度に影響を与える場合があり、最適な結果に対する時間及び温度を実験的に判定する必要がある。種々の実施形態では、エネルギー投入レートが、温水の浴槽または加熱した乾浴槽の温度の関数であり得る。他の実施形態では、エネルギー投入レートが、エネルギー源の強度の関数であり得る。第１の領域の容量及び流量を調節することによって、第１の領域を通る連続した流れの間に滞留時間を達成し得る。代替的に、第１の領域内に試料を停止させることによって少なくとも部分的に、滞留時間を達成し得る。
【００４５】
３１０で、ロードバッファーを二重領域試料ループに流れ込ませることによって、細胞破砕血液試料を、二重領域試料ループの第１の領域から第２の領域に移動させることができる。前述のように、細胞破砕血液試料の移動が連続して起こる場合があり、その結果試料の滞留時間が、第１の領域の容量及び流量に基づいて達成され、または血液試料が第１の領域内にある間に流れを停止させ、かつ血液試料が第１の領域で十分な時間を費やした後に流れを再開させることによって、エネルギーの印可に続いて移動が生じ得る。
【００４６】
種々の実施形態では、試料ループに注入されたロードバッファーの容量は、第１の領域から第２の領域に試料を移動させるのには十分であり得るが、試料または内部標準を試料ループから廃棄部へと移動させるほど十分ではない場合がある。さらに、シリンジに引き込まれたロードバッファーの容量は、試料ループに注入される容量を提供するのに十分であり得る。
【００４７】
３１２で、マルチポート弁を注入位置に切り替え得る。注入位置で、投入ポンプからの液体が、二重領域試料ループを通して固相抽出カラムへと流れ得る。注入位置は、第１の領域の最も近くの二重領域試料ループの第１の端に液体を流れ込ませ、液体を第２の領域の最も近くの他の端から固相抽出カラムへと出すように構成され得る。このように、二重領域試料ループが、先入れ先出し（ＦＩＦＯ）配置で構成され得る。
【００４８】
３１４で、投入ポンプからのバッファーは、内部標準及び細胞破砕血液を試料ループから固相抽出カラムへ押し出し得る。細胞破砕血液及び内部標準からの着目成分が、固相抽出カラムに吸収される一方で、固体細胞内材料が濾過され、他の成分が水相で固相抽出カラムを通過する。種々の実施形態では、堆積した固体細胞内材料は、固相抽出カラムを通る流体の流れを逆転させ、かつ流れを廃棄物へと配向することによって、フィルター及び固相抽出カラムから除去され得る。
【００４９】
３１６で、着目成分が、固相抽出カラムから溶出され、液体クロマトグラフィー用カラムへと流れ込む。種々の実施形態では、ｐＨ、塩濃度、または溶媒極性を改変することなど、固相抽出カラムに適用された溶剤を改変することによって、溶出を達成し得る。さらに、着目成分が、クロマトグラフィーカラムのカラム材料に吸着され得る。
【００５０】
３１８で、着目成分が、クロマトグラフィーカラムから溶出され得る。種々の実施形態では、成分のカラム材料への吸着の差に基づいて、着目成分を分離し得る。種々の実施形態では、１つの溶剤条件から別のものへの急速な変化による段階的な、または第１の溶剤と第２の溶剤との相対濃度が時間を経て変化する勾配をもって、溶剤条件を変化させることにより成分を溶出し得る。他の実施形態では、溶出条件が同じ状態のままであり得る。着目成分がカラムから溶出すると、それらを質量分析装置に案内することができる。質量分析装置は、着目成分から生成されたイオンの質量を分析することができ、かつ各成分の容量を定量化することができる。３２０で、液体クロマトグラフィー用カラム内の保持時間、イオンの質量、着目成分からのイオンの断片化によって生成されたイオンの質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、各着目成分の正体を判定し得る。
【００５１】
質量分析方法のプラットフォーム
質量分析方法のプラットフォーム４００の種々の実施形態は、図１に図示した質量分析装置１２８の全てまたは一部を形成し得る図４のブロック図に表示された要素を含み得る。種々の実施形態によると、質量分析装置４００は、イオン源４０２と、質量分析装置４０４と、イオン検出器４０６と、制御装置４０８とを含み得る。
【００５２】
種々の実施形態では、イオン源４０２は、試料から複数のイオンを生成する。イオン源は、それらに限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）源、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源、誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）源、電子イオン化源、光イオン化源、グロー放電イオン化源、熱スプレーイオン化源などを含み得る。
【００５３】
種々の実施形態では、質量分析装置４０４は、イオンの質量電荷比に基づいて、イオンを分離し得る。例えば、質量分析装置４０４は、四重極質量フィルター分析装置、飛行時間（ＴＯＦ）分析装置、四重極イオントラップ分析装置、静電トラップ（例えば、オービトラップ）質量分析装置などを含み得る。種々の実施形態では、質量分析装置４０４は、イオンを断片化し、質量電荷比に基づいて、断片化されたイオンをさらに分離するようにも構成され得る。
【００５４】
種々の実施形態では、イオン検出器４０６は、イオンを検出し得る。例えば、イオン検出器４０６は、電子増倍器、ファラデーカップなどを含み得る。質量分析装置を離れたイオンは、イオン検出器によって検出することができる。種々の実施形態では、イオン検出器は、イオンの正確な計数を判定し得るように定量的である。
【００５５】
種々の実施形態では、制御装置４０８は、イオン源４０２、質量分析装置４０４、及びイオン検出器４０６と通信し得る。例えば、制御装置４０８は、イオン源を構成し、またはイオン源を有効／無効にし得る。さらに、制御装置４０８は、検出する特定の質量範囲を選択するように質量分析装置４０４を構成し得る。さらに、制御装置４０８は、利得を調節することなどによって、イオン検出器４０６の感度を調節し得る。さらに、制御装置４０８は、検出されたイオンの極性に基づいて、イオン検出器４０６の極性を調節し得る。例えば、イオン検出器４０６は、陽イオンを検出するように構成され得、または陰イオンを検出するように構成され得る。
【００５６】
コンピュータ実装システム
図５は、本発明の教示の実施形態が実装され得るコンピュータシステム５００を図示したブロック図であり、図４に図示した質量分析方法のプラットフォーム４００の制御装置４０８の全部または一部を形成し得る。種々の実施形態では、コンピュータシステム５００は、情報を通信するためのバス５０２または他の通信機構と、情報を処理するためにバス５０２と連結された処理装置５０４とを含み得る。種々の実施形態では、コンピュータシステム５００は、ベースコールを判定するためにバス５０２に連結された、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶装置であり得るメモリ５０６、及び処理装置５０４によって実行される指示も含み得る。メモリ５０６を使用して、処理装置５０４によって実行される指示の実行中に、テンポラリ変数または他の中間情報を記憶することもできる。種々の実施形態では、コンピュータシステム５００は、静的情報及び処理装置５０４に対する指示を記憶するためにバス５０２に連結された読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）５０８または他の静的記憶装置をさらに含み得る。磁気ディスクまたは光学ディスクなどの記憶装置５１０は、情報及び指示を記憶するために提供されバス５０２に連結される。
【００５７】
種々の実施形態では、処理装置５０４は、複数の論理ゲートを含み得る。論理ゲートは、ＡＮＤゲート、ＯＲゲート、ＮＯＴゲート、ＮＡＮＤゲート、ＮＯＲゲート、ＥＸＯＲゲート、ＥＸＮＯＲゲート、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ＡＮＤゲートは、入力の全てが高い場合のみ高出力を生成することができる。ＯＲゲートは、入力のうちの１つ以上が高い場合に高出力を生成することができる。ＮＯＴゲートは、入力が低いときに高い値を出力するなど、出力と入力の反転形態を生成することができる。ＮＡＮＤ（ＮＯＴ−ＡＮＤ）ゲートは、反転されたＡＮＤ出力を生成することができ、入力のいずれもが低い場合に出力が高くなる。ＮＯＲ（ＮＯＴ−ＯＲ）ゲートは、反転されたＯＲ出力を生成することができ、入力のいずれもが高い場合にＮＯＲゲートの出力が低くなる。ＥＸＯＲ（排他的ＯＲ）ゲートは、いずれかであるが両方ではない入力が高い場合に高出力を生成することができる。ＥＸＮＯＲ（排他的ＮＯＲ）ゲートは、反転されたＥＸＯＲ出力を生成することができ、いずれかであるが両方ではない入力が高い場合に出力が低くなる。
【表１】
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【００５８】
論理ゲートを多様な組み合わせで使用して、比較、演算などを行う場合があることを、当業者であれば理解するだろう。さらに、本明細書で記載されたプロセスなど、複雑なプロセスを行うために論理ゲートの多様な組み合わせの使用の順序を決める方法を、当業者であれば理解するだろう。
【００５９】
一例では、２つの入力が同じであるときのみ結果が高いため、ＸＮＯＲゲートを使用して、５ビット２進比較を行い得る。各対のビットを比較するために複数のＸＮＯＲゲートを使用し、かつ使用するＸＮＯＲゲートとＡＮＤゲートの出力を組み合わせることによって、２つのマルチビット値の比較を行うことができ、各対のビットが同じ値を有するときのみ結果が真であり得る。任意の対のビットが同じ値を有しない場合、対応するＸＮＯＲゲートの結果は低くなり、低入力を受信するＡＮＤゲートの出力が低くなる。
【００６０】
別の例では、ＡＮＤゲートとＸＯＲゲートとの組み合わせを使用して、５ビット加算器を実装し得る。具体的には、５ビット加算器が、３つの入力、加算される２つのビット（Ａ及びＢ）及びキャリービット（Ｃｉｎ）、ならびに２つの出力、サム（Ｓ）及びキャリーアウトビット（Ｃｏｕｔ）を受信し得る。２つの１ビット値を加算するために、Ｃｉｎビットを０に設定することができ、またはＣｉｎビットを使用して下位の加算器からＣｏｕｔを受信することによって、２つのマルチビット値を加算するために複数の５ビット加算器を共に連結することができる。例示的な実施形態では、Ａ及びＢの入力をＸＯＲゲートに適用し、次に結果及びＣｉｎを別のＸＯＲゲートに適用することによって、Ｓを実装し得る。Ａ及びＢの入力をＡＮＤゲートに適用し、ＳＵＭ及びＣｉｎからのＡ−Ｂ  ＸＯＲの結果を別のＡＮＤに適用し、かつＡＮＤゲートの入力をＸＯＲゲートに適用することによって、Ｃｏｕｔを実装し得る。
【表２】
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【００６１】
種々の実施形態では、コンピュータのユーザに情報を表示するための陰極線管（ＣＲＴ）または液晶表示器（ＬＣＤ）などの表示器５１２に、バス５０２を介してコンピュータシステム５００を連結し得る。英数字及び他のキーを含む入力装置５１４を、情報及び指令選択を処理装置５０４に通信するためにバス５０２に連結することができる。別の種類のユーザ入力装置は、方向情報及び指令選択を処理装置５０４に通信し、かつ表示器５１２上のカーソル移動を制御するための、マウス、トラックボール、またはカーソル方向キーなどのカーソル制御５１６である。この入力装置は、典型的に、装置が平面内の位置を特定することを可能にする、２つの軸、第１の軸（すなわち、ｘ）及び第２の軸（すなわち、ｙ）内の２自由度を有する。
【００６２】
コンピュータシステム５００は、本発明の教示を実行し得る。本発明の教示の実装と一致して、メモリ５０６に含まれる１つ以上の指示の１つ以上のシーケンスを処理装置５０４が実行することに応じて、コンピュータシステム５００によって結果を提供することができる。かかる指示を、記憶装置５１０などの別のコンピュータ可読媒体からメモリ５０６に読み取ることができる。メモリ５０６に含まれる指示のシーケンスの実行により、処理装置５０４は本明細書に記載されたプロセスを行うことができる。種々の実施形態では、メモリ内の指示が、本明細書に記載されたプロセスを実行するために処理装置内で使用可能な論理ゲートの多様な組み合わせの使用を順序付けることができる。代替的に、配線回路をソフトウェア指示の位置で、またはそれと組み合わせて使用して本発明の教示を実装することができる。種々の実施形態では、本明細書で記載されたプロセスを行うための必要なシーケンスで動作する配線回路が、必要な論理ゲートを含むことができる。よって、本発明の教示の実装は、ハードウェア回路とソフトウェアとの任意の特定の組み合わせに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「コンピュータ可読媒体」という用語は、実行用処理装置５０４に指示を提供することに関わる任意の媒体のことをいう。かかる媒体は、それらに限定されるものではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、及び伝送媒体を含む、多数の形態を取り得る。不揮発性媒体の例が、それらに限定されるものではないが、記憶装置５１０などの光学または磁気ディスクを含み得る。揮発性媒体の例が、それらに限定されるものではないが、メモリ５０６などの動的メモリを含み得る。伝送媒体の例が、それらに限定されるものではないが、バス５０２を備えるワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバーを含み得る。
【００６４】
非一時的なコンピュータ可読媒体の共有の形態が、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、孔のパターンを有する任意の他の物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、またはコンピュータが読み取り可能な任意の他の有形的表現媒体を含む。
【００６５】
種々の実施形態によると、方法を実行する処理装置によって実行されるように構成された指示を、コンピュータ可読媒体上に記憶する。コンピュータ可読媒体が、デジタル情報を記憶する装置であり得る。例えば、コンピュータ可読媒体が、ソフトウェアを記憶するための技術上既知のコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）を含む。実行されるように構成された指示を実行するのに適した処理装置によって、コンピュータ可読媒体にアクセスする。
【００６６】
種々の実施形態では、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｇなどの従来型のプログラミング言語で書かれたソフトウェアプログラム及びアプリケーションで、本発明の教示の方法を実装し得る。
【００６７】
本発明の教示を種々の実施形態と併せて記載するが、本発明の教示をかかる実施形態に限定することを意図していない。対照的に、本発明の教示は、当業者が理解し得る場合、多様な変更例、変形例、及び等価物を包含する。
【００６８】
さらに、種々の実施形態を記載する際、本明細書が、方法及び／またはプロセスを特定の順序のステップとして提示している場合がある。しかしながら、本方法またはプロセスが本明細書で記載された特定の順序のステップに依存しない範囲で、本方法またはプロセスを、記載された特定の順序のステップに限定するべきではない。当業者が理解し得る場合、他の順序のステップが可能であり得る。したがって、本明細書に記載された特定の順序のステップを、特許請求の範囲についての限定と解釈するべきではない。加えて、本方法及び／またはプロセスを対象とする特許請求の範囲を、書かれた順序でのそれらのステップの実行に限定するべきではなく、また順序が可変であり、かつ種々の実施形態の趣旨及び範囲内に未だ維持され得ることを当業者であれば容易に理解することができる。
【００６９】
手持ち装置、マイクロプロセッサシステム、マイクロプロセッサに基づく、またはプログラム可能な家電、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータなどを含む他のコンピュータシステム構成を用いて、本明細書に記載された実施形態を実行し得る。ネットワークを通して連動された遠隔処理装置によってタスクを実行するコンピューティング環境を分散させることで、実施形態を実行することもできる。
【００７０】
本明細書で記載された実施形態が、コンピュータシステムに記憶されたデータを伴う多様なコンピュータ実装動作を用いる場合があることも理解するべきである。これらの動作は、物理量の物理操作を必要とするものである。通常、必ずではないが、これらの量が、記憶、伝送、組み合わせ、比較、及びさもなければ操作することができる電気または磁気信号の形態を取る。さらに、実行される操作は、用語で、生成する、特定する、判定する、または比較するなどのことをいう。
【００７１】
本明細書に記載された実施形態の一部を形成する動作のいずれも、有用な機械動作である。本明細書で記載された実施形態は、これらの動作を実行するためのデバイスまたは装置のことも指す。本明細書に記載されたシステム及び方法が、必要な目的に対して特別に構築される場合があり、あるいはそれがコンピュータに記憶されたコンピュータプログラムによって選択的に作動または構成された汎用コンピュータである場合がある。具体的には、多様な汎用機械が、本明細書の教示に従って書かれたコンピュータプログラムと共に使用される場合があり、あるいはより特殊な装置を構築して必要な動作を行う方が都合がよい場合がある。
【００７２】
一定の実施形態が、コンピュータ可読媒体上のコンピュータ可読コードとして具現化される場合もある。コンピュータ可読媒体は、データを記憶することができ、その後コンピュータシステムによって読み取り可能である任意のデータ記憶装置である。コンピュータ可読媒体の例が、ハードドライブ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、磁気テープ、及び他の光学または非光学式データ記憶装置を含む。コンピュータ可読媒体を、ネットワークに連結されたコンピュータシステム上に分散させることもでき、その結果コンピュータ可読コードを分散して記憶及び実行する。
【００７３】
結果
１／１６インチの外径及び０．０２０インチの内径を有するステンレスＨＰＬＣグレードの鋼管の試料ループを試験する。２５ｃｍの試料ループを高温の浴槽に浸漬させて加熱領域を形成し、５０．６μＬの計算量を提供する。浴槽は、３００ｍＬのポリエチレングリコール４００を含有する機械攪拌された恒温槽である。結果を表１に要約する。
【表３】
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以下に本発明の実施態様を記載する。
（実施態様１）全血試料を分析する方法であって、
バッファー、全血試料、及び内部標準をシリンジアセンブリに投入するステップと、
マルチポート弁を投入位置に切り替えるステップと、
前記内部標準及び前記全血試料を二重領域試料ループの第１の領域に注入するステップと、
前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分なエネルギーを前記全血試料に加えて、細胞破砕血液を生成するステップと、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量の前記バッファーを前記二重領域試料ループに注入するステップと、
前記マルチポート値を注入位置に切り替えるステップと、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループから固相抽出カラムに流すステップと、
前記細胞破砕血液の成分を前記固相抽出カラムから液体クロマトグラフィー用カラムに溶出させるステップと、を備える、方法。
（実施態様２）前記細胞破砕血液の成分を前記液体クロマトグラフィー用カラムから質量分析装置に溶出させるステップをさらに備える、実施態様１に記載の方法。
（実施態様３）保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、前記細胞破砕血液の成分を特定するステップをさらに備える、実施態様１に記載の方法。
（実施態様４）前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ前記全血試料が前記第１の領域に滞在する、実施態様１に記載の方法。
（実施態様５）前記全血試料が、前記第１の領域を通して連続して移動し、
前記第１の領域の流量及び容量が、前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な、前記第１の領域内の前記全血試料の滞留時間を生じる、実施態様１に記載の方法。
（実施態様６）前記バッファーを注入して前記細胞破砕血液を前記第２の領域に移動させる前に、前記全血試料が、前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ前記第１の領域内で停止する、実施態様１に記載の方法。
（実施態様７）全血分析システムであって、
注入シリンジアセンブリと、マルチポート弁と、投入ポンプと、第１の領域及び第２の領域を備える二重領域試料ループであって、前記第１の領域が全血試料にエネルギーを供給するように動作可能である、二重領域試料ループと、固相抽出カラムと、を備えるシステム。
（実施態様８）液体クロマトグラフィー用カラムをさらに備える、実施態様７に記載のシステム。
（実施態様９）質量分析装置をさらに備える、実施態様７に記載のシステム。
（実施態様１０）制御装置さらに備え、この制御装置は、
バッファー及び全血試料を前記シリンジアセンブリに投入し、
前記マルチポート弁を投入位置に切り替え、
前記全血試料を前記シリンジアセンブリから前記二重領域試料ループの第１の領域を通して前記二重領域試料ループの第２の領域に流し、前記全血試料の細胞成分を破砕するのに十分なエネルギーが前記全血試料に加えられて細胞破砕血液が生成され、
前記マルチポート値を注入位置に切り替え、
前記投入ポンプを作動させ、前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループから固相抽出カラムを通して流して前記細胞破砕血液から成分のサブセットを分離する、ように構成されている、実施態様７に記載のシステム。
（実施態様１１）前記マルチポート弁が、
投入位置にあるときに、前記シリンジアセンブリから前記第１の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第１の端に入り、前記第２の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第２の端から出て廃棄されるように流体の流れを案内し、
注入位置にあるときに、前記投入ポンプから前記第１の端に入り、前記第２の端から前記固相抽出カラムへと出るように流体の流れを案内するように構成されている、実施態様７に記載のシステム。
（実施態様１２）全血分析システムであって、
注入シリンジアセンブリと、マルチポート弁と、第１の領域及び第２の領域を備える二重領域試料ループと、固相抽出カラムと、制御装置と、を備え、
前記制御装置は、
バッファー、全血試料、及び内部標準を前記シリンジアセンブリに投入し、
前記マルチポート弁を投入位置に切り替え、
前記内部標準及び全血を二重領域試料ループの第１の領域に注入し、
前記全血試料の細胞成分を破砕して細胞破砕血液を生成するのに十分な熱を全血に加え、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループの第２の領域に移動させるのに十分な容量のバッファーを前記二重領域試料ループに注入し、
前記マルチポート値を注入位置に切り替え、
前記細胞破砕血液を前記二重領域試料ループから固相抽出カラムに流して前記細胞破砕血液から成分のサブセットを分離する、ように構成されている、システム。
（実施態様１３）液体クロマトグラフィー用カラムをさらに備える、実施態様１２に記載のシステム。
（実施態様１４）前記制御装置が、前記液体クロマトグラフィー用カラムに成分の前記サブセットを流して溶出させるようにさらに構成されている、実施態様１３に記載のシステム。
（実施態様１５）質量分析装置をさらに備える、実施態様１４に記載のシステム。
（実施態様１６）前記細胞破砕血液の成分を前記液体クロマトグラフィー用カラムから前記質量分析装置に溶出させるようにさらに構成されている、実施態様１５に記載のシステム。
（実施態様１７）前記制御装置が、保持時間、質量、断片化質量、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて、前記細胞破砕血液の成分を特定するようにさらに構成されている、実施態様１６に記載のシステム。
（実施態様１８）前記制御装置が、前記第１の領域を通して連続した流れで前記全血試料を移動させるように構成されており、
前記第１の領域の流量及び容量が、前記全血試料の前記細胞成分を破砕するのに十分な、前記第１の領域内の前記全血試料の滞留時間を生じる、実施態様１２に記載のシステム。
（実施態様１９）前記制御装置が、前記全血試料を前記第１の領域に注入した後、かつ前記バッファーを注入する前に、流れを停止させるように構成されており、この流れが、前記全血試料が前記第１の領域内にある間に、前記全血試料の前記細胞成分を破砕するのに十分な時間だけ停止される、実施態様１２に記載のシステム。
（実施態様２０）前記投入位置で、流体が、前記シリンジアセンブリから前記第１の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第１の端に入り、前記第２の領域に隣接する前記二重領域試料ループの第２の端から出て廃棄されるように流れ、
前記注入位置で、流体が、ポンプから前記第１の端に入り、前記第２の端から前記固相抽出カラムへ出るように流れる、実施態様１２に記載のシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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