(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料のササクレヒトヨタケを、亜臨界水抽出にて抽出処理し、抽出液と原料残渣とに固液分離した後、前記抽出液を乾燥させることにより、
エルゴチオネインの分解物を含有し、
室温の水に対する溶解量が５．０ｇ／１００ｍｌ以上であり、
室温のエタノールに可溶性の成分の含有量が１．８質量％以上である、固形状のメラニン産生抑制活性を有するササクレヒトヨタケ抽出物を得ることを特徴とするササクレヒトヨタケ抽出物の製造方法。
【請求項２】
原料のササクレヒトヨタケを、亜臨界水抽出にて抽出処理し、抽出液と原料残渣とに固液分離した後、前記抽出液を乾燥させることにより、
エルゴチオネインの分解物を含有し、
室温の水に対する溶解量が５．０ｇ／１００ｍｌ以上であり、
室温のエタノールに可溶性の成分の含有量が１．８質量％以上である、固形状のチロシナーゼ阻害活性を有するササクレヒトヨタケ抽出物を得ることを特徴とするササクレヒトヨタケ抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はササクレヒトヨタケを原料とするササクレヒトヨタケ抽出物に関する。特に、水に対する溶解量が所定量以上であり、エタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ササクレヒトヨタケ（学名：Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｏｍａｔｕｓ）は、ハラタケ科ササクレヒトヨタケ属に属するキノコの一種であり、先端に丸みを帯びた円筒形で、その表面に灰白色ないしかすかにクリーム色を帯びた平たいささくれ状の鱗片が散在する白いかさを形成する。かさの開かない幼菌は従来美味な食用キノコとして採食されており、特にイタリアなどの欧州では高級食材として扱われている。
【０００３】
ササクレヒトヨタケおよびその抽出物は、抗酸化作用、美白作用、抗炎症作用などの様々な機能性を有することから、健康食品、化粧品素材、医薬品などとして使用されている。特に、ササクレヒトヨタケが他のキノコ類や植物などに比べて多量に含有する水溶性成分であるエルゴチオネインが、抗酸化作用および美白作用を示す有効成分として知られている。
【０００４】
ササクレヒトヨタケ抽出物を得る方法としては、熱水抽出および溶剤抽出が従来知られている。例えば、特許文献１には、ヒトヨタケ科に属するキノコの乾燥粉末から熱水にて抽出された抽出物が記載されている。特許文献２には、ササクレヒトヨタケ抽出物を得る際の溶媒として、水やメタノール、エタノールなどが記載されている。また、非特許文献１には、ササクレヒトヨタケのエタノール抽出物が高い抗酸化作用を有することなどが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２７５２３５号公報
【特許文献２】特開２０１２−０９２０８５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bo Li et al., Molecules,15,1473-1486,2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の熱水抽出により得られたササクレヒトヨタケ抽出物には、高い抗酸化作用を有するエタノール抽出物がほとんど含まれておらず、非特許文献１に記載された高い抗酸化作用を示す成分などの溶媒可溶性の成分は含まれていない。一方、溶剤抽出により得られたササクレヒトヨタケ抽出物には、溶媒可溶性の成分しか含有されておらず、水溶性のエルゴチオネインをほとんど含有しないという問題がある。また、両抽出方法を組み合わせた場合は、抽出操作等が煩雑となり、生産性に劣るという問題がある。
【０００８】
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であり、従来のササクレヒトヨタケ抽出物よりも抗酸化作用および美白作用において優れたササクレヒトヨタケ抽出物を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、室温の水に対する溶解量が５．０ｇ／１００ｍｌ以上であり、室温のエタノールに可溶性の成分の含有量が１．８質量％以上であるササクレヒトヨタケ抽出物に関する。
【００１０】
前記抽出物がササクレヒトヨタケの水抽出物であることが好ましい。
【００１１】
前記抽出物がササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出物であることが好ましい。
【００１２】
前記抽出物がエルゴチオネインの分解物を含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の所定の水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量を有するササクレヒトヨタケ抽出物によれば、従来のササクレヒトヨタケ抽出物に比べて高いスーパー・オキサイド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）様活性およびチロシナーゼ阻害活性を有し、塗布や服用により抗酸化作用および美白作用を発揮し得るササクレヒトヨタケ抽出物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例、比較例および参考例のＳＯＤ様活性を示すグラフである。
【図２】実施例、比較例および参考例のチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。
【図３】実施例、比較例および参考例のメラニン産生評価を示すグラフである。
【図４】参考例１、実施例３および比較例１のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜ササクレヒトヨタケ抽出物＞
本発明のササクレヒトヨタケ抽出物はササクレヒトヨタケを原料とする抽出物であり、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定の値以上であることを特徴とし、ササクレヒトヨタケ抽出物が有する機能性（ＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性）を効率的に発揮し得るササクレヒトヨタケ抽出物である。
【００１６】
ササクレヒトヨタケ抽出物の抽出成分は、水にのみ溶解する成分、水には不溶でエタノールなどの溶剤にのみ溶解する成分および水およびエタノールなどの溶剤のいずれにも溶解する成分の３つに大別することができる。
【００１７】
本発明のササクレヒトヨタケ抽出物は実質的に１００質量％が水に可溶な成分である。すなわち、本発明のササクレヒトヨタケ抽出物は不水溶性成分を含有しない抽出成分であり、実質的に水にのみ可溶な成分（エタノール不溶性成分ともいう）および水およびエタノールに可溶な成分（エタノール可溶性成分ともいう）からなる。
【００１８】
高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示す成分は概して水溶性であることから、本発明のササクレヒトヨタケ抽出物の室温（２５℃）の水に対する溶解量は、大きいほうが望ましく、十分な活性が得られるという理由から５．０ｇ／１００ｍｌ以上である。なお、水に対する溶解量の上限は特に限定されない。
【００１９】
前記の水にのみ可溶な成分（エタノール不溶性成分）は、抗酸化作用および美白作用を示す有効成分であるエルゴチオネインや後述するエルゴチオネインの分解物の一部などを含み、高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示す。
【００２０】
前記の水およびエタノールに可溶な成分（エタノール可溶性成分）は、後述するエルゴチオネインの分解生成物などを含み、高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示す。
【００２１】
本発明のササクレヒトヨタケ抽出物中のエタノール可溶性成分の含有量は、１．８質量％以上であり、１．９質量％以上がより好ましく、２．０質量％以上がさらに好ましい。エタノール可溶性成分の含有量が１．８質量％未満の場合は、ＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性の効果が確認されにくい傾向にある。また、エタノール可溶性成分の含有量は、１０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましい。１０質量％を超える場合は、水溶性成分の含有量が不十分となる恐れがある。
【００２２】
本発明のササクレヒトヨタケ抽出物はエルゴチオネインの分解物を含有することが、ＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性により優れるという理由から好ましい。エルゴチオネインの分解物とは、エルゴチオネインに対して亜臨界処理などを施すことによるエルゴチオネインの分解により生成する分解生成物であり、分解前のエルゴチオネインよりも高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示すことを発明者らが見出した。
【００２３】
エルゴチオネインの分解物について添付の図４を参照して説明する。図４の（Ｉ）は、後述の実施例３で得られたササクレヒトヨタケ抽出物（亜臨界水抽出物全体）のＨＰＬＣクロマトグラムである。同（ＩＩ）は、市販のエルゴチオネイン（シグマアルドリッチ社製）の亜臨界処理物のＨＰＬＣクロマトグラムである。また、同（ＩＩＩ）は、後述の比較例１で得られたササクレヒトヨタケ抽出物（水抽出物）のＨＰＬＣクロマトグラムである。各クロマトグラム中において「ＥＲＧ」と示す単独ピークがエルゴチオネインのピークである。ここで、（ＩＩ）に用いた市販のエルゴチオネインはほぼ１００％のエルゴチオネインであるが、亜臨界処理物であることから、エルゴチオネインのピーク以外に「▽」で示す複数のピークが確認できる。これらの「▽」のピークがエルゴチオネインの分解物のピークである。そして、（Ｉ）はエルゴチオネインを多く含有するササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出物であることから、エルゴチオネインのピークに加え、「▽」で示すエルゴチオネインの分解物のピークや他の成分のピークも確認できる。一方、（ＩＩＩ）は、ササクレヒトヨタケの熱水抽出物であることから、水溶性であるエルゴチオネインのピークは確認できるが、エルゴチオネインの分解物のピークは確認することができない。
【００２４】
エルゴチオネインの分解物は分解前のエルゴチオネインに比べて、高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示す（後述の参考例１および２との比較より）。また、図４の（Ｉ）および（ＩＩ）のクロマトグラムより、エルゴチオネインは水にのみ可溶な成分であり、エタノールには溶けにくい成分であるが、エルゴチオネインの分解物には水およびエタノールに可溶な成分が含まれることがわかる。つまり、ササクレヒトヨタケ抽出物におけるエタノール可溶性成分の含有量は、エルゴチオネインの分解物の含有量の指標となる値であり、そのササクレヒトヨタケ抽出物が、高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を示し、抗酸化作用および美白作用を発揮し得るササクレヒトヨタケ抽出物であるか否かを示す指標となる。
【００２５】
＜製造方法＞
本発明のササクレヒトヨタケの製造方法の一例として、原料のササクレヒトヨタケを抽出する抽出工程、および抽出液と原料残渣とを分離する固液分離工程を説明する。当該製造方法によれば、水にのみ可溶な成分ならびに水およびエタノールに可溶な成分からなるササクレヒトヨタケ抽出物であり、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物を製造することができる。
【００２６】
原料
本発明のササクレヒトヨタケ抽出の原料は、ハラタケ科ササクレヒトヨタケ属に属するササクレヒトヨタケ（学名：Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｏｍａｔｕｓ）である。その形態や状態は特に限定されず、生の状態のものや乾燥、粉末化したものなどが好適に用いられる。原料を使用する際には、抽出工程の前に土などの汚れを洗浄することが好ましい。
【００２７】
抽出工程
抽出工程は、ササクレヒトヨタケ原料を抽出処理することで抽出処理物を得る工程である。抽出に用いる抽出溶媒としては、水やエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノールおよびそれらの混合物などが挙げられ、水溶性成分の抽出効率や安全性の観点から水を用いることが最も好ましい。また、抽出処理方法としては、連続抽出、浸漬抽出、超臨界抽出、亜臨界水抽出などが挙げられるが、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物が効率的に得られるという理由から、亜臨界水抽出が好ましい。
【００２８】
亜臨界水抽出とは、所定温度および圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出剤としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明ではササクレヒトヨタケ）とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度および圧力の熱水を亜臨界水という。この亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００２９】
亜臨界水抽出に用いる抽出剤として水を用いる場合、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界水抽出の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水または水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にした、いわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器にササクレヒトヨタケと抽出剤である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる抽出物を亜臨界水抽出物とすることができる。
【００３０】
亜臨界水抽出に用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。抽出剤が水の場合の処理条件について次に説明する。
【００３１】
ササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出温度は、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物が効率的に得られやすくなるという理由から１４０〜２００℃の間が好ましく、１６０〜１９５℃の間がより好ましく、１８０〜１９５℃の間がさらに好ましい。亜臨界水抽出の温度が１４０℃未満の場合は、得られる抽出物のＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性が不十分となる傾向がある。また、亜臨界水抽出の温度が２００℃を超える場合は、過分解してしまい、得られる抽出物のＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性の効果が低下する傾向がある。
【００３２】
ササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上（その一例としては、１５０℃のときには０．６０ＭＰａ以上、１９０℃のときには１．３ＭＰａ以上）で行うことが好ましい。この圧力にすることにより、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物が効率的に得られやすくなる。なお、亜臨界水抽出の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが好ましい。
【００３３】
ササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出時間は、５〜６０分の間で行うことが好ましく、１０〜３０分の間で行うことがより好ましい。この処理時間の範囲にすることにより、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であるササクレヒトヨタケ抽出物が効率的に得られやすくなる。亜臨界水抽出時間が５分未満の場合は、得られる抽出物のＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性の効果が不十分となる傾向がある。また、亜臨界水抽出時間が６０分を超える場合は、過分解してしまい、得られる抽出物のＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性の効果が低下する傾向がある。
【００３４】
すなわち、抽出剤を水とした場合におけるササクレヒトヨタケの亜臨界水抽出による抽出条件としては、処理温度は１４０〜２００℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は５〜６０分で行うことが好ましい。この条件で行うことにより、水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であり、抗酸化作用および美白作用に優れたササクレヒトヨタケ抽出物を得ることができる。さらに、処理温度は１８０〜１９５℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は１０〜３０分で行うことが、エタノール可溶性成分の含有量が高くなり、より抗酸化作用および美白作用に優れたササクレヒトヨタケ抽出物を得ることができるという理由から好ましい。
【００３５】
固液分離工程および乾燥工程
前記抽出工程で得られたササクレヒトヨダケ亜臨界水抽出処理物は、亜臨界水抽出された液体物（以下、抽出液と呼ぶ）と、未反応の主に植物繊維よりなる固体成分（以下、原料残渣と呼ぶ）との混合物である。この処理物は抗酸化作用および美白作用に優れたササクレヒトヨタケ抽出物を含んでいるのでそのまま、もしくは乾燥させた状態で目的の使用に供することもできるが、より抗酸化作用および美白作用に優れた活性分を得るため、以下の固液分離工程を経ることが望ましい。
【００３６】
固液分離工程は、亜臨界水抽出物などの抽出処理物を抽出液と原料残渣（固体物）とに分離する工程である。具体的な固液分離工程としては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水などが挙げられる。なかでも、操作が簡便であり、分離効率に優れるという理由から、ろ過が好ましい。
【００３７】
固液分離工程により得られた抽出液は抗酸化作用および美白作用に優れたササクレヒトヨタケ抽出液としてそのまま、もしくは濃縮された状態で目的の使用に供することもできるが、より取り扱い性、保存性を高めるために乾燥させることが望ましい。抽出液を乾燥させることにより固形状のササクレヒトヨタケ抽出物が得られる。乾燥方法としては一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。一般的で簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。また、適宜、活性炭、イオン交換樹脂等の吸着剤を用いた脱色を乾燥工程の前に行ってもよい。このようにして得られたササクレヒトヨタケ抽出物はそのまま目的の使用に供することもできるし、他の成分を処方、配合して粉末、カプセル、錠剤の形態に加工してもよく、水、アルコールなどの可溶性溶媒に溶解させて液体の形態で使用してもよいのはもちろんのことである。
【００３８】
活性成分を特定するために、また、より機能性の高い成分を選択的に得るために固液分離工程および乾燥工程を経た抽出物に対し有機溶剤（アルコール類、ケトン類、アセトン類等）による抽出を行ってもよい。なかでも、人体への影響が少なく、食品および化粧品への使用が容易であるという理由からエタノールが好ましい。
【００３９】
亜臨界水抽出により得られるササクレヒトヨタケ抽出物
亜臨界水抽出により得られたササクレヒトヨタケ抽出物は、水に対する溶解量が所定量以上であり、エタノール可溶性成分の含有量が所定量以上であり、エルゴチオネインおよびエルゴチオネインの分解物を含み、従来のササクレヒトヨタケ抽出物よりも抗酸化作用および美白作用において優れたササクレヒトヨタケ抽出物である。
【実施例】
【００４０】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００４１】
＜試験用ササクレヒトヨタケ抽出物の調製＞
各実施例、比較例および参考例における試験用ササクレヒトヨタケ抽出物の調製工程を説明する。また、実施例および比較例の主な抽出条件を表１に示す。
【００４２】
実施例１（亜臨界水抽出）
亜臨界水処理缶に、乾燥ササクレヒトヨタケ（（株）ヘルスケアシステムズより購入）１００ｇを入れ、処理温度：１５０℃、処理圧力：０．５ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界水抽出を行った。亜臨界水抽出の終了後、処理缶内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）で吸引ろ過し、ろ液を凍結乾燥させることで試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ａ１を５５．９ｇ得た。
さらに、１０ｇの抽出物Ａ１を２５℃のエタノール２００ｍｌ（関東化学社製  純度９９．５％）に加え、２５℃で２時間抽出した。その後、セルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）でろ過し、ろ紙上の残渣を乾燥することで抽出物Ａ１中のエタノール不溶性成分Ａ２を得た。また、ろ液を凍結乾燥させることで抽出物Ａ１中のエタノール可溶性成分Ａ３を得た。エタノール可溶性成分Ａ３の重量は０．１８ｇであり、抽出物Ａ１を１０ｇ使用したことからエタノール不溶性成分Ａ２は９．８２ｇであることがわかった。
【００４３】
実施例２（亜臨界水抽出）
処理温度：１７０℃、処理圧力：０．８ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界水抽出を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｂ１を６９．６ｇ得た。
さらに、実施例１と同様にエタノール抽出を行い、１０ｇの抽出物Ｂ１から、エタノール不溶性成分Ｂ２を９．８１ｇ、エタノール可溶性成分Ｂ３を０．１９ｇ得た。
【００４４】
実施例３（亜臨界水抽出）
処理温度：１９０℃、処理圧力：１．３ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界水抽出を行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｃ１を６７．６ｇ得た。
さらに、実施例１と同様にエタノール抽出を行い、１０ｇの抽出物Ｃ１から、エタノール不溶性成分Ｃ２を９．７５ｇ、エタノール可溶性成分Ｃ３を０．２５ｇ得た。
【００４５】
比較例１（水抽出）
乾燥ササクレヒトヨタケ（（株）ヘルスケアシステムズより購入）５０ｇを８５℃の水２００ｍｌで熱水抽出（８５℃、２時間）を行った。処理物をセルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）でろ過し、ろ液を凍結乾燥させることで試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｄ１を２５．７ｇ得た。
さらに、実施例１と同様にエタノール抽出を行い、１０ｇの抽出物Ｄ１から、エタノール不溶性成分Ｄ２を９．８３ｇ、エタノール可溶性成分Ｄ３を０．１７ｇ得た。
【００４６】
比較例２（エタノール抽出）
乾燥ササクレヒトヨタケ（（株）ヘルスケアシステムズより購入）１０ｇを室温（２５℃）のエタノール２００ｍｌで溶剤抽出（２５℃、２時間）を行った。処理物をセルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）でろ過し、ろ液を凍結乾燥させることで試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｅ１を０．４１ｇ得た。
【００４７】
参考例１および２
市販のエルゴチオネイン試薬（シグマアルドリッチ社製  純度９８％以上）を試料Ｆ１（参考例１）とした。また、このエルゴチオネイン２０ｍｇを水１０ｍｌに溶解させた水溶液を亜臨界水処理缶に入れ、処理温度：１９０℃、処理圧力：１．３ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界処理を行い、凍結乾燥させたものを試料Ｆ２（参考例２）とした。
【００４８】
＜評価＞
得られた試験用ササクレヒトヨタケ抽出物および試料に対し、次の評価を行った。結果を表１〜３に示す。
【００４９】
エタノール溶解試験
得られた抽出物中のエタノール不溶性成分およびエタノール可溶性成分の含有量（質量％）を算出した。結果を表１に示す。
【００５０】
水溶解試験
表１に示す抽出物５．０ｇを２５℃の水１００ｍｌに加えて撹拌後、セルロース製ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ製の５Ｃ）でろ過し、ろ液の凍結乾燥物およびろ紙上の残渣の乾燥物の質量を測定した。得られた質量から水可溶性成分含有量（質量％）を算出した。結果を表１に示す。表１には水への溶解量が５ｇ／１００ｍｌ以上であるか否かも合わせて示す。
【００５１】
【表１】
0006305898.tif 000002
【００５２】
ＳＯＤ様活性
各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように溶媒に溶解させ、サンプル溶液を調製した。なお、エタノール可溶性成分はジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）製）を、その他は蒸留水を溶媒とした。得られたサンプル溶液のＳＯＤ様活性をＳＯＤ測定キット（（株）同仁化学研究所）を用いて測定し、ＳＯＤ阻害率を求め、ＩＣ５０値（終濃度）を算出した。ｎ＝３で測定した値の平均値を結果とし、表２および図１に示す。なお、図中のエラーバーは３回の測定の標準偏差を示す。
【００５３】
チロシナーゼ阻害活性
次の試薬を調製し、使用した。なお、全てのリン酸緩衝液はｐＨ＝６．７の同じものを使用した。
酵素溶液：参考例Ｆ１およびＦ２はチロシナーゼを３００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ含有するリン酸緩衝液、その他はチロシナーゼを３０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ含有するリン酸緩衝液
基質溶液：Ｌ−ＤＯＰＡを０．２ｍｇ／ｍｌ含有するリン酸緩衝液
サンプル溶液：各サンプルの濃度が１００ｍｇ／ｍｌとなるように溶媒（エタノール可溶性成分はジメチルスルホキシドを、その他は蒸留水を溶媒とした。）に溶解させ、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過した溶液
［サンプル（Ｓ）］
マイクロプレートの各ウェルに２５μｌの各サンプル溶液および１００μｌの酵素溶液を順に入れ、３７℃で１０分静置させた。その後、各ウェルに１２５μｌの基質溶液を加え、全量を２５０μｌとし、さらに３７℃で１０分静置させた。その後、吸光プレートリーダーマルチスキャンＪＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株））使用し、４９２ｎｍの吸光度（Ｓ）を測定した。
［コントロール（Ｃ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの各溶媒を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（Ｃ）を測定した。
［サンプルブランク（ＳＢ）］
１００μｌの酵素溶液に替えて１００μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＳＢ）を測定した。
［コントロールブランク（ＣＢ）］
２５μｌのサンプル溶液に替えて２５μｌの溶媒（エタノール可溶性成分はジメチルスルホキシドを、その他は蒸留水）を使用したこと、および１００μｌの酵素溶液に替えて１００μｌのリン酸緩衝液を使用したこと以外は（Ｓ）と同じ条件で反応させ、吸光度（ＣＢ）を測定した。
［チロシナーゼ阻害率とＩＣ５０値の算出］
各吸光度測定結果を用いて、下記の式により各試験用ササクレヒトヨタケ抽出物のチロシナーゼ阻害率（％）を算出し、ＩＣ５０値（終濃度）を求めた。ｎ＝３で測定した値の平均値を結果とし、表２および図２に示す。なお、図中のエラーバーは３回の測定の標準偏差を示す。
式：（（Ｃ−ＣＢ）−（Ｓ−ＳＢ））／（Ｃ−ＣＢ）×１００
【００５４】
メラニン産生評価
実施例３（試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｃ１）および比較例１（試験用ササクレヒトヨタケ抽出物Ｄ１）のサンプル溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製し、これらのメラニン産生抑制評価試験を行った。メラニン産生抑制試験は、ヒト由来メラノサイト細胞（クラボウ製、商品名：Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ(ＮＨＥＭ)ＡＤ）を用いて、該細胞の表面にサンプル溶液を載置して、メラニンの量を算出し、皮膚への美白評価とした。
［メラノサイト培養］
メラノサイト培養ヒト由来メラノサイト細胞を専用培地Ｄｅｒｍａ  Ｌｉｆｅ  ＭａＣｏｍｐ  ｋｉｔにて約２４時間事前培養を行った。その後、その細胞の入ったウェルに試験サンプルを５０μｌとＤｅｒｍａ  Ｌｉｆｅ  ＭａＣｏｍｐ  ｋｉｔを４５０μｌ添加して、培養３７℃、５％二酸化炭素濃度で７２時間培養した。比較としてサンプルの代わりに培地を５００μｌ添加した試験も行った（コントロール）。ｎ＝３で実施した。
［メラニン定量］
培養終了後、各ウェルの培地を吸引除去し、リン酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄し、０．２５％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液を１００μｌ添加し、３７℃で５分間静置した。その後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培地を添加して、トリプシンの活性を中和し、細胞を剥離後、遠心をして上澄みを全量除去した。その沈殿物に２００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加し細胞内のメラニンを溶出させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、あらかじめ合成メラニンを用いて作成した標準曲線からメラニン量を算出した。なお、メラニンの産生抑制率は、コントロールの吸光度の実測値を１として、それぞれ換算した値を示す。ｎ＝３で測定した値の平均値を結果とし、表２および図３に示す。なお、図中のエラーバーは３回の測定の標準偏差を示す。
【００５５】
【表２】
0006305898.tif 000003
【００５６】
表１および２ならびに図１〜３の結果より、本発明の水に対する溶解量およびエタノール可溶性成分の含有量が所定の値以上であるササクレヒトヨタケ抽出物は、高いＳＯＤ様活性およびチロシナーゼ阻害活性を有し、塗布や服用により抗酸化作用および美白作用を発揮し得るササクレヒトヨタケ抽出物であることがわかる。
【００５７】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
実施例３（抽出物Ｃ１）、参考例２（試料Ｆ２）および比較例１（抽出物Ｄ１）について下記条件のＨＰＬＣ分析を行った。移動相のグラジエント条件を表３に示す。得られた実施例３のＨＰＬＣクロマトグラムを図４（Ｉ）に、参考例２のＨＰＬＣクロマトグラムを図４（ＩＩ）に、比較例１のＨＰＬＣクロマトグラムを図４（ＩＩＩ）に示す。
測定装置：株式会社島津製作所製のＬＣ−２０１０ＨＴ
カラム：ナカライテスク株式会社製のＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）ＭＳ−ＩＩ  Ｗａｔｅｒｓ（φ４．６×２５０ｍｍ）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５０ｎｍ
カラム温度：３５℃
注入量：１０μｌ
移動相（Ａ）：水：ギ酸＝１００：０．１
移動相（Ｂ）：メタノール
【００５８】
【表３】
0006305898.tif 000004
【００５９】
各クロマトグラム中「ＥＲＧ」と示す単独ピークがエルゴチオネインのピークである。ここで、市販のエルゴチオネインに亜臨界処理を施した参考例２（試料Ｆ２）の結果であるクロマトグラム（ＩＩ）には、エルゴチオネインのピーク以外に「▽」で示す複数のピークが確認できることから、これら「▽」のピークはエルゴチオネインの分解物を示すピークであると考えられる。そして、（Ｉ）はエルゴチオネインを多く含有するササクレヒトヨタケに亜臨界処理を施して抽出した抽出物（実施例３）であることから、エルゴチオネインのピークに加え、「▽」で示すエルゴチオネインの分解物のピークや他の成分のピークも確認できる。一方、（ＩＩＩ）は、ササクレヒトヨタケの熱水抽出物（比較例１）であることから、水溶性であるエルゴチオネインのピークは確認できるが、エルゴチオネインの分解物のピークは確認できないことがわかる。
【図１】
0006305898.tif 000005
【図２】
0006305898.tif 000006
【図３】
0006305898.tif 000007
【図４】
0006305898.tif 000008