(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合を実質的に促進することなく成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進するために使用する第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、該第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、該第１及び第２の炭素系材料は電極を形成しており、
前記第１の材料は、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、又はグラフェン、ナノチューブ若しくはダイヤモンド上のナノチューブからなる群より選択され、その表面にはペプチドコーティングが実質的になく、該第１の炭素系材料は少なくとも約0.01 S.cm-1の導電率を有し、
前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は、前記第１の炭素系材料と同一であるか又は異なり、該第２の炭素系材料は、成熟グリア細胞の増殖、少なくとも成熟グリア細胞の直接接合を促進するようにペプチドコーティングを提示し、該第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料は、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、グラフェン又はナノチューブ、ナノチューブをグラフトしたダイヤモンドからなる群より選択される、第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料。
【請求項２】
前記成熟ニューロンが網膜、視床、皮質、前庭系、蝸牛、脳幹、中脳、小丘、視床下核、内淡蒼球、不確帯、淡蒼球遠心性線維、水道周囲灰白質、脳室周囲灰白質、内包、後外側腹側核及び後内側腹側核、膝下部帯状回、側坐核、腹側内包/腹側線条、下視床脚、外側手綱迷走神経、求心性神経、脊髄、大後索、筋活動を制御する神経からなる群より選択される組織に見出される、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、請求項１に記載の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料。
【請求項３】
前記電極が、貫入電極様の形状であるか、又はニードル様の形状であり得る貫入支持体上に配置される、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、請求項１又は２に記載の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料。
【請求項４】
前記第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が個々の貫入電極の先端又は電極アレイの貫入電極先端を構成し、前記第２の炭素系材料がプロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面を構成する、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料。
【請求項５】
前記ペプチドが細胞外マトリクスに由来する、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料。
【請求項６】
当該材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合を実質的に促進することなく成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進するための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料を含んでなり、該第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合した電極であって、前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は、前記第１の炭素系材料と同一であるか又は異なり、前記第２の炭素系材料は、成熟グリア細胞の増殖、少なくとも成熟グリア細胞の直接接合を促進するようにペプチドコーティングを提示し、前記第１及び第２の炭素系材料は、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、又はグラフェン、ナノチューブ若しくはダイヤモンド上のナノチューブからなる群より選択される、電極。
【請求項７】
貫入電極様の形状であるか、又はニードル様の形状であり得る貫入支持体上に配置される、請求項６に記載の電極。
【請求項８】
前記第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が個々の貫入電極の先端又は電極アレイの貫入電極先端を構成し、前記第２の炭素系材料がプロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面を構成する、請求項６又は７に記載の電極。
【請求項９】
前記ペプチドが細胞外マトリクスに由来する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の電極。
【請求項１０】
以下の工程：
ａ．導電性で生体適合性の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場を製造する工程
ｂ．任意に、前記Ｈ末端化炭素系材料の足場を酸素化して第１の炭素系材料を得る工程
ｃ．任意に、前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の第２の部分に、ホウ素、リン又は窒素をドープして、部分的にドープされた第２の部分を得る工程
ｄ．前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の任意にドープされていてもよい前記第２の部分に、ペプチドを被覆して、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料を得る工程
を含んでなり、前記第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料及び前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が電極を構成する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の電極又はニードルの製造方法。
【請求項１１】
前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料足場の前記第１の部分に、ホウ素、リン又は窒素をドープする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の前記第１の部分がナノ結晶ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド又はグラフェンである請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の前記第２の部分がナノ結晶ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド又はグラフェンである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
成熟ニューロンの成長又は少なくとも成熟ニューロンの直接接合を促進し、該成熟ニューロンを刺激する傾向があるインプラント又はプロテーゼの実施のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極。
【請求項１５】
前記電極が
(i)刺激電極を囲むグリッド形状の共通対電極を有する平面アレイ、
(ii)遠位対電極を有する平面電極アレイ、
(iii)対電極として働くグリッドに刺激電極が囲まれている三次元電極；又は
(iv)電極間距離が100μmに維持され、3Dモデルのウェル深さが30μmである、遠位対電極
を有する三次元電極である、請求項１〜９のいずれか１項又は請求項１４に記載の電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新たな生体適合性炭素系電極、その使用及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工内耳の成功及びパーキンソン病患者に対する深部脳刺激の成功以来、ニューロプロテーゼ及び脳-機械インタフェースに急激な発展がみられている(Lebedev and Nicolelis，2006)。ニューロプロテーゼは、電極が皮質などの神経組織のグリア表面に単に接触していることを意味する表面電極か、脳内のより深い神経構造に達する貫入電極かのいずれかであり得る。皮質インプラントにより数か月後に機能を獲得することが示されているが、残念ながら、後に活動を完全に喪失することが頻繁にある(Dobelleら，1974)。この機能性の喪失は、移植後数か月以内にプロテーゼ又は電極の周囲に起こる大きなグリオーシスに帰し得る(Maynardら，2000)。ニューロプロテーゼに関する別の挑戦は、別個の神経領域をより正確に刺激するように個々の電極の分解能を向上させることである。この目的により、グリアの反応を制限しかつニューロンとの直接相互作用を向上させる新たな生体適合性材料の開発が動機付けられる。
【０００３】
近年、網膜プロテーゼにより盲目患者が短文を読んだり、明暗が際立った物体を特定し、地面の通路線を追跡することができるようになることを示す臨床試験で、網膜プロテーゼの概念が実証された(Humayunら，2009；Zrennerら，2011)。光受容体を喪失した患者において視力回復を目的とするこれら網膜プロテーゼは、網膜下腔内にか、又は網膜上側で、共にミュラーグリア細胞が形成する外境界膜又は内境界膜に直接接してのいずれかに配置される。第１の構成において、網膜下インプラントは、光受容体に対して通常シナプス後のニューロンである網膜双極細胞を刺激する一方(Zrennerら，2011)、網膜上インプラントは、その軸索を介して視神経を通って脳に視覚情報を伝送するスパイクニューロンである網膜神経節細胞を標的としている(Humayunら，2009)。これらインプラントは既に患者において幾らかの視覚機能を回復しているが(Humayunら，2009；Zrennerら，2011)、回復した視覚性能を更に向上させて顔認識、文章を読むこと又は独立歩行を達成するには、電極分解能の増大が必要となる。この目的を達成するため、既に、インプラントにピラー(Butterwickら，2009)又はウェル(Djilasら，2011)を利用する異なる3Dデザインが提案されている。
【０００４】
見込みある新たな生体材料のうち、ダイヤモンドがニューロプロテーゼにおける使用について大いに注目を集めている。なぜならば、ホウ素をドープしたダイヤモンドは半導体性を示すからである。ダイヤモンドの生体適合性は骨芽細胞培養で(Grausova L，2009)、そして胚性皮質ニューロンにおいてさえ(Spechtら，2004；Thalhammerら，2010)既に示されている。胚性ニューロンは、ダイヤモンド表面に印されたタンパク質パターン上で選択的に増殖することが見出されているが(Spechtら，2004)、研磨した多結晶ダイヤモンド層の直接上でもナノ結晶ダイヤモンド層の直接上でも、これら層がペプチドで又は分散ナノダイヤモンド粒子でコーティングされていない限り、増殖できなかった(Thalhammerら，2010)。更に、電極としてのダイヤモンドの使用は、細胞株を使用してニューロン活動を記録することにより証明されている(Arianoら，2009)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的の１つは、成熟ニューロンの成長を促進するか又はグリア細胞の接着性を増大させる新たな生体適合性炭素系電極の使用である。
別の１つの目的は、そのような新たな生体適合性炭素系電極を提供することである。
更に別の１つの目的は、前記電極の製造方法を提供することである。
更に別の１つの目的は、グリオーシスを予防できるインプラント又はニューロプロテーゼを実施するための前記のような電極の使用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、
当該材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合(direct interface)を実質的に促進することなく成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進するために使用する第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、該第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、該第１及び第２の炭素系材料は電極を形成しており、前記第１の材料は、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、又はグラフェン、ナノチューブ若しくはダイヤモンド上のナノチューブからなる群より特に選択され、その表面にはペプチドコーティングが実質的になく、該第１の炭素系材料は少なくとも約0.01 S.cm-1の導電率性を有し、前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は、前記第１の炭素系材料と同一であるか又は異なり、該第２の炭素系材料は、成熟グリア細胞の増殖、少なくとも成熟グリア細胞の直接接合を促進するようにペプチドコーティング、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを提示し、該第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料は、特にホウ素がドープしたナノ結晶ダイヤモンド、特にホウ素をドープした水素末端化又は酸素化ダイヤモンド、グラフェン又はナノチューブ、特にナノチューブをグラフトしたダイヤモンドからなる群より特に選択される、第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料
を提供する。
【０００７】
別の１つの目的で、成熟ニューロンが網膜、視床、皮質、前庭系、蝸牛、脳幹、中脳、小丘、視床下核、内淡蒼球、不確帯、淡蒼球遠心性線維、水道周囲灰白質、脳室周囲灰白質、内包、後外側腹側核及び後内側腹側核、膝下部帯状回、側坐核、腹側内包/腹側線条、下視床脚、外側手綱迷走神経、求心性神経、脊髄、大後索、筋活動を制御する神経(例えば歩行運動又は括約筋開放のための神経)からなる群より選択される組織に見出される、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、上記の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料が提供される。
【０００８】
別の１つの目的で、電極が、貫入電極様、例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様の形状であるか、又はニードル様、特に三次元ニードル様の形状であり得る貫入支持体上に配置され、具体的には、複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成し、より具体的には前記電極又は電極アレイは支持体に固定されてインプラント又はプロテーゼを形成しており、特に前記穿通ニードル及び/又は貫入電極の長さは約10μmから約１〜２cmまでであり、直径は20μmから約500μmまでである、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、上記の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料が提供される。
【０００９】
別の１つの目的で、第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が個々の貫入電極の先端又は電極アレイの貫入電極先端を構成し、前記第２の炭素系材料がプロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面を構成する、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、上記の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料が提供される。
【００１０】
別の１つの目的で、前記ペプチドが細胞外マトリクスに由来し、具体的にはポリリジン、特にポリ-Ｄ-リジン、ポリオルニチン、ラミニン又はそれらの組合せからなる群より選択され、特にペプチドコーティングの厚さが約0.5μg/cm2から約５μg/cm2までである、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、第１及び第２の炭素系材料が電極を形成する、上記の使用のための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料が提供される。
【００１１】
本発明は、以下の工程：
ａ．導電性で生体適合性の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場を製造する工程
ｂ．任意に、前記Ｈ末端化炭素系材料の足場を酸素化して第１の炭素系材料を得る工程
ｃ．任意に、前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の第２の部分に、特にホウ素、リン又は窒素をドープして、前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の部分ドープされた第２の部分を得る工程
ｄ．前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の任意にドープされていてもよい前記第２の部分に、ペプチド、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを被覆して、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料を得る工程
を含んでなり、前記第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料及び前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が電極を構成し、特に前記ペプチドは、ポリリジン、特にポリ-Ｄ-リジン、ポリオルニチン又はラミニンからなる群より選択される、上記の電極又はニードルの製造方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、電極が
(i)刺激電極を囲むグリッド形状の共通対電極を有する平面アレイ、
(ii)遠位対電極を有する平面電極アレイ、
(iii)対電極として働くグリッドに刺激電極が囲まれている三次元電極、特に三次元電極アレイ；又は
(iv)電極間距離が100μmに維持され、3Dモデルのウェル深さが30μmである、遠位対電極を有する三次元電極
である、上記説明に従う電極を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】ペプチドコーティング有り又は無しのガラス基体及びダイヤモンド基体の細胞標識及び細胞計数を示す。
【図１−２】双極ニューロン細胞(Ｇ)及びマクログリア細胞(Ｈ)の異なる基体上での細胞計数を示す。
【図２】Ｏ末端化ダイヤモンド及びガラス上での純粋な成熟網膜神経節細胞ニューロンの生存を示す。
【図３】ペプチドパターン化基体を用いるダイヤモンドに対するグリア及びニューロンの独特な選好性を示す。
【図４−１】ダイヤモンド上のポリ-Ｄ-リジンコーティングの特徴決定を表す。
【図４−２】ダイヤモンド上のポリ-Ｄ-リジンコーティングの特徴決定を表す。
【図５】インビトロで６日目に固定された、グラフェン及びガラス上の混合(成熟)網膜細胞培養物を示す。
【図６−１】被覆した及び裸のグラフェン及びガラス上の成熟RGCの、エピ蛍光で可視化したカルセイン染色。
【図６−２】(左から右へ)被覆した及び裸のグラフェン及びガラスについての細胞生存(パーセンテージで6divと1divとの間の生存の比率)、平均細胞体面積(μm2)、総伸長(μm)、総突起の定量を表す。
【図７−１】被覆した及び裸のグラフェン、サファイア及びガラス上のp7 RGCの、エピ蛍光で可視化したカルセイン染色。
【図７−２】(左から右へ)被覆した及び裸のグラフェン、サファイア及びガラスについての細胞数、平均細胞体面積(μm2)、総伸長(μm)、総突起数の定量を表す。
【図８】サファイア/グラフェン線形パターン上で培養した純粋な新生網膜神経節細胞(p7)。
【図９】CVDグラフェンの特徴決定を表す。
【図１０】サファイア/グラフェンパターン上で培養した純粋な新生網膜神経節細胞(p7)を示す。
【図１１】グラフェンの電気特性に対するポリ-Ｄ-リジン/ラミニンコーティングの影響を評価した。
【図１２】本発明の炭素系材料(例えば、ダイヤモンド又はグラフェン)の電極を複数有して構成されたインプラントの例を示す。
【図１３】25×25画素へダウンサンプリングし、４グレースケールレベルに色調を減少させる前(Ａ)及び後(Ｂ)のエイブラハム・リンカーンの画像を表す。
【図１４】４つの模擬モデルについて、電極アレイの20μm上の電流密度プロットを表す。
【図１５】可撓性ダイヤモンドインプラントの製作を表す。
【図１６】ポリイミドデバイス(Ａ)、ダイヤモンドデバイス(Ｂ)及び金属製デバイス(Ｃ)を移植したP23Hラットの眼底を表す。
【図１７】ポリイミドインプラント(Ａ、Ｄ)、ダイヤモンドインプラント(Ｂ、Ｅ)及び金属インプラント(Ｃ、Ｆ)の走査型電子顕微鏡写真を表す。
【図１８】インプラントに接触している染色網膜の共焦点撮像及び各材料についての3D電極内の双極細胞の定量を表す。
【図１９】3D電極ジオメトリ及び対応する半断面を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、当該材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合を実質的に促進することなく成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進するための、表面にペプチドコーティングが実質的になく、少なくとも約0.01 S.cm-1、特に１S.cm-1、好ましくは10 S.cm-1、より好ましくは100 S.cm-1の導電率を有する第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料の使用に関する。
【００１５】
表現「炭素系材料」とは、95％を超えて炭素原子のみで構成され、必要な場合、残りの割合がドーピング種に対応する材料をいう。
表現「Ｈ末端化炭素系材料」とは成長したままの炭素系材料をいい、「酸素末端化炭素系材料」とは化学的に酸素化した炭素系材料をいう。
ダイヤモンドに半導体性を与えるために、そのマトリクス中に第３の元素、例えばホウ素、リン又は窒素を１ppm〜５％の濃度で使用することができる。
用語「生体適合性」とは、特定の状況において、それが使用される生体媒質(特に、生体中の生体媒質)に干渉することも、これを劣化させることもなく、適切な宿主応答でもって機能する材料の能力をいう。生体適合性は非免疫原性材料もいう。
【００１６】
上記材料を「第１の」材料と名付けたのは、「第２の」部分と名付けた別の部分に結合することができる、材料の第１の部分を表すからである。
本明細書を通して、表現「第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料」は、「炭素系材料の第１の部分」又は「材料の第１の部分」又は単に「第１の部分」とも呼ばれ、同義である。
表現「ペプチドコーティングが実質的にない」は、当該材料がペプチドコーティングを提示していないか、提示している場合は、そのペプチドコーティング(特に、細胞外マトリクスに由来するペプチドコーティング)が表面被覆率で１％未満の比であることを意味する。
表現「成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進する」とは、当該材料がその上でのニューロンの発生を可能にするか、又はニューロンが発生できない場合には少なくとも、その上へのニューロンの接着を可能にすることを意味する。
【００１７】
成熟ニューロンとは、１ヶ月齢を超える動物から事前に採集したニューロンをいい、胚性ニューロンは胚から事前に採集しており、したがって未だ成熟していない。
用語「成熟」は本明細書中において「成体の」又は「分化した」と互換可能である。
表現「材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合を実質的に促進することなく」とは、当該材料が、その上で増殖したか又はそれに接着したグリア細胞による表面被覆率として５％未満を示すことを意味する。
【００１８】
本発明に使用する材料は導電性を示し、したがって専らガラスから構成され得るものではない。
ダイヤモンドのような材料に関して、導電率は少なくとも0.01S.cm-1であり、又は0.01S.cm-1以上であり、特には１S.cm-1であり、有利には10S.cm-1であり、より有利には100S.cm-1以上である。
１つの有利な実施形態では、導電率は10S.cm-1〜1000S.cm-1であり、好ましくは100S.cm-1〜500S.cm-1であり、より好ましくは100S.cm-1に等しい。
しかし、グラフェンのような材料については、導電率は遥かにより高く、約1E4 S.cm-1程度に高くあり得る。
【００１９】
本発明者らは、ペプチドが被覆されていない導電性炭素系材料が、当該材料上での成熟ニューロンの成長又は接着又は接合を可能にできると同時に、当該材料上でのグリア細胞の増殖も接着も接合も防止し、よってグリア細胞の増殖であるグリオーシス及び該材料の機能性(その導電性により該材料がニューロンを刺激する機能)の喪失を回避できることを予想外にも見出した。
【００２０】
１つの有利な実施形態では、本発明は、上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、又はグラフェン、ナノチューブ若しくはダイヤモンド上のナノチューブからなる群より選択される材料の使用に関する。
【００２１】
「ナノ結晶ダイヤモンド」とは、その組成が平均粒径範囲５〜100nmの粒状構造を示す純粋ダイヤモンドである層を意味する。
「多結晶ダイヤモンド」とは、その組成が粒径範囲100nm〜50マイクロメートルの粒状構造を示す純粋ダイヤモンドである層を意味する。
「グラフェン」とは、グラファイトを構成するsp2結合炭素原子の絶縁単原子平面シートを意味する。
「ナノチューブ」とは、円筒を形成するように丸まっている、グラファイトを構成するsp2結合炭素原子から作られている空洞円筒形分子を意味する。ナノチューブは、その電気特性に対する影響を伴って、１つのカーボンチューブから作ることも(単層ナノチューブ)、又は複数のカーボンチューブから作られることもできる(多層ナノチューブ)。
「ダイヤモンド上のナノチューブ」とは、ナノチューブがダイヤモンド基体上で成長した構造を意味する。
ダイヤモンドのような材料は、それ自体半導体ではなく、半導体になるにはドーピングの必要がある。しかし、グラフェンのような材料はそれ自体で半導体であり、ドーピングの必要がない。
【００２２】
１つの有利な実施形態では、本発明は、上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、ナノダイヤモンド粉、特にナノ結晶ダイヤモンド上、多結晶ダイヤモンド上若しくは他の材料上のナノダイヤモンド粉とは異なるか、又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なる材料の使用に関する。
したがって、この実施形態では、単分散ナノダイヤモンド粉又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドのような材料は、幾つかの観点の本発明の範囲から除外される。
にもかかわらず、ナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なるダイヤモンド上のナノチューブは、本発明の範囲から除外されないことに留意しなければならない。
【００２３】
１つの有利な実施形態では、成熟ニューロンが網膜、視床、皮質、前庭系、蝸牛、脳幹、中脳、小丘、視床下核、内淡蒼球、不確帯、淡蒼球遠心性線維、水道周囲灰白質、脳室周囲灰白質、内包、後外側腹側核及び後内側腹側核、膝下部帯状回、側坐核、腹側内包/腹側線条、下視床脚、外側手綱迷走神経、求心性神経、脊髄、大後索、筋活動を制御する神経(例えば歩行運動又は括約筋開放のためのもの)からなる群より選択される組織に見出される、上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料の使用に関する。
【００２４】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合し、該第２の材料と電極を形成する上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記第２の炭素系材料が成熟グリア細胞の増殖、少なくとも成熟グリア細胞の直接接合を促進するようにペプチドコーティング、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを提示する、第１の材料の使用に関する。
よって、第２の炭素系材料は、上記の第２の部分に相当し、上記の第１の部分及び上記の第２部分の結合により電極が構成される。
【００２５】
本明細書を通して、表現「第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料」は、「炭素系材料の第２の部分」又は「材料の第２の部分」又は単に「第２の部分」と呼ぶこともでき、これらは同義である。
第１の部分及び第２の部分は、材料に関して類似であることも同一であることもできる。すなわち、構成される電極が依然として導電性であり得ること条件として、第１の部分及び第２の部分は同一の材料で構成されるが、ただし、第１の部分は常にペプチドコーティングで被覆されておらず、第２の部分は常にペプチドコーティングで被覆されている。
第１の部分及び第２の部分は、材料に関して異なることもできる。すなわち、構成される電極が依然として導電性であり得ること条件として、第１の部分及び第２の部分は、異なる材料で構成されるが、ただし、第１の部分は常にペプチドコーティングで被覆されておらず、第２の部分は常にペプチドコーティングで被覆されている。
【００２６】
よって、本発明者らは、類似する、同一の又は異なる炭素系材料の２つの部分の結合により、
１)第１の部分に起因して、第１の部分上での成熟ニューロンの成長又は接着又は接合を促進しつつ、第１部分上でのグリア細胞の増殖又は接着又は接合を防止し、よってグリア細胞の増殖であるグリオーシス及び第１の部分の機能性の喪失を回避することができると同時に
２)第２の部分に起因して、第２の部分の環境中で局所的にグリア細胞の増殖を促進することができるが、第１の部分では促進せず、よって炭素系材料のこの２つの部分の間の相乗作用が導かれる(なぜならば、グリア細胞はニューロンの生存に不可欠であるからである)ことを見出した。
１つの有利な実施形態では、第２の炭素系材料に結合した第１の炭素系材料は、少なくとも６ヶ月間安定的である。
用語「安定」は、第２の炭素系材料に結合した第１の炭素系材料が６ヶ月以上後も常に機能的な電極を構成することを意味する。
【００２７】
本発明の別の１つの利点は、前記電極の両部分の構成に起因して従来技術の電極のものより長い寿命を有し、よってグリオーシスを回避して従来技術では電極の頻繁な変化を導く組織のイオン恒常性変化を防止する外側グリア関門の連続性を再構築し、しかも電極の機能性の喪失を回避する電極を提供することである。
材料の第１の部分及び第２の部分は、柔軟支持体(ポリイミド、パリレン…)上、又はシリコン、ガラス若しくは石英から作られる剛性基体又は金属基体(白金合金又はチタン合金、金又はチタン、炭化ケイ素…)上に配置できる。
【００２８】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記第２の炭素系材料が特にホウ素をドープしたナノ結晶ダイヤモンド、特にホウ素をドープした水素末端化又は酸素化ダイヤモンド、グラフェン又はナノチューブ、特にナノチューブをグラフトしたダイヤモンドからなる群より選択される、第１の炭素系材料の使用に関する。
【００２９】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、第１及び第２の炭素系材料が類似又は同一である、第１の炭素系材料の使用に関する。
よって、この実施形態では、炭素系材料の両方の部分が同じ材料で構成されるが、第１の部分は被覆されておらず、第２の部分は被覆されている。
【００３０】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であるか、又はニードル様(特に三次元ニードル様)の形状であり得る貫入支持体上に配置されている、第１の炭素系材料の使用に関する。
「貫入電極」とは、組織(例えば、上記の組織)を穿通しやすい電極を意味する。
例として、加齢黄斑変性症(AMD)又は網膜色素変性症などの病状の場合、光受容体が劣化した網膜のニューロンを刺激するために電極は網膜を穿通する。
【００３１】
神経組織は常に、物理的障壁として作用するグリア細胞層に囲まれているので、従来技術の貫入電極は、穿通する組織のグリア障壁を破壊するという短所を有する。
本発明の別の１つの利点は、上記の問題を解決する貫入電極を提供することである。当該電極は、グリア細胞の増殖を促進しやすい第２の部分から構成され、よって穿通ニードル又は貫入電極により生じた穴を迅速に密封することができる、
電極の基底部での適切な密封は、刺激電極が配置された電極先端の周囲での更なるグリオーシスを防止する。ニューロンと電極との間の直接接触又は至近距離により、最少の電流強度で最良の電気刺激が提供される。
電極はニードルであり得る。
【００３２】
１つの有利な実施形態では、ニードル又は電極は三次元的である。本発明の目的のため、用語「三次元」は、ニードル又は電極が平面でも平坦でもなく、３つの寸法：長さ、厚さ(幅及び高さ)に従って規定されることを意味する。三次元(3D)デバイスは、２マイクロメートルを超える厚さ(例えば、幅)を有するデバイスを意味する。
本発明では、電極又はニードルは、円筒又はポリトープの形状を有していてもよい。ポリトープは、超平面が境界をなすｎ次元空間の有限領域である。具体的には、ポリトープは、少なくとも６つの平行四辺形により形成される三次元図形である。
【００３３】
特定の実施形態では、ポリトープ又は円筒は平面状又は平坦である。ポリトープ又は円筒は、三次元であり、最大長が５μm〜１mmで、１つの厚さが２μm未満の正方形又は長方形である。
１つの特定の実施形態では、電極は長さ及び直径に従って規定される。
１つの有利な実施形態では、電極は平面電極又は平面ニードルであり得る。平坦若しくは平面の電極又は平坦若しくは平面のニードルは、(幅)厚さを規定する寸法が２マイクロメートル未満、又は２〜0.001マイクロメートルである三次元図形を意味することはよく理解されている。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は、
(i)刺激電極を囲むグリッド形状の共通対電極を有する平面アレイ
(ii)遠位対電極を有する平面電極アレイ
(iii)対電極として働くグリッドに囲まれた刺激電極を有する三次元電極アレイ、及び
(iv)電極間距離が100μmに維持され、三次元モデルのウェル深さが30μmである遠位対電極を有する三次元電極
を提供する。
本発明に従う電極は、最大長が５μm〜１mmの円形、楕円形、正方形、長方形のいずれかである。
電極は、最大長が５μm〜１mmの円形、楕円形、正方形、長方形のいずれかである。
【００３５】
インプラントは、１つの厚さが２μm未満の平面である。インプラントは、厚さが２μmを超えると、三次元(3D)とみなす。厚さの差により、刺激電極と参照電極又は接地グリッドとを分離することができる。更に、厚さの差は、電極及び接地面を分離する壁を表すこともある。厚さの差は２μmを超え、通常20μm〜１mmの範囲であるが、標的構造が脳中のように器官の奥深くにある場合には、この厚さの差は数センチメートルに達することがある。三次元構造は、ピラー、矢状、ニードル、ウェル、又は立方体、多角形、円筒形若しくは円錐形の空洞からの種々の形状(可能なすべての組合せ及び中間物を含む)を取ることができる。
【００３６】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であり、複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成している、第１の炭素系材料の使用に関する。
【００３７】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であり、複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成しており、前記電極又は電極アレイが支持体に固定されてインプラント又はプロテーゼを形成している、第１の炭素系材料の使用に関する。
例及び説明として、電極アレイは、最終的には、図12に示す立体構造を示し得る。
【００３８】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であり、複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成しており、前記電極又は電極アレイが支持体に固定されてインプラント又はプロテーゼを形成しているか、又は前記電極又は電極アレイは支持体に固定されておらず、第１の炭素系材料は電極アレイの先端を構成し、第２の炭素系材料がプロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面を構成する、第１の炭素系材料の使用に関する。
【００３９】
組織を穿通する電極又は電極アレイにおいて、被覆されていない第１の部分は、該第１の部分上に接合するか又は該第１の部分上で成長するニューロンを刺激する電極先端でなければならず、第２の部分は、穿通の間に形成される穴を密封するようにグリア細胞の増殖を促進し、第１の部分のニューロンの成長及び/又は生存を援助する、プロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面でなければならない。
インプラント又はニューロプロテーゼの表面は、平坦である必要はなく、ウェル中及び/又は上面に電極及び/又は帰還グリッドを有するウェル形状を示すことができる。
貫入電極を有するアレイにおいて、ペプチド被覆炭素系材料は、ニューロンの直接接合が意図されていなか、又はそのことがグリア鞘の連続性を回復させるグリオーシスに起因して可能でない、貫入構造(例えば、穿通ニードル)の基部を覆い得る。
【００４０】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記ペプチドが細胞外マトリクスに由来し、具体的には、ポリリジン(特にポリ-Ｄ-リジン)、ポリオルニチン、ラミニン又はそれらの組合せからなる群より選択される、第１の炭素系材料の使用に関する。
細胞外マトリックスに由来するこれらペプチドは、細胞接着、したがって生存を促進するためにインビトロで使用され、インビボで支持体役を果たす。これらペプチドの存在は、グリア細胞の維持に特に有用である。
【００４１】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、ペプチドコーティングの厚さが約0.5μg/cm2から約５μg/cm2までである、第１の炭素系材料の使用に関する。
【００４２】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であり、穿通ニードル及び/又は貫入電極の長さが約10μmから約１〜２cmまでであり、直径が20μmから約500μmまでである、第１の炭素系材料の使用に関する。
貫入電極の長さは、貫入電極を設置しなければならない組織に応じて異なる。
例として、電極の長さは、蝸牛用については約１mmであり、筋活動を制御する神経用(歩行運動又は括約筋の解放用)については約１cmである。
【００４３】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の炭素系材料に類似するか、これと同一か又は異なる第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合している上記の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料であって、前記電極が貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であり、穿通ニードル及び/又は貫入電極の長さが約10μmから約１〜２cmまでであり、直径が20μmから約500μmまでであり、長さの比(第１の炭素系材料/第２の炭素系材料)が0.1〜10である、第１の炭素系材料の使用に関する。
【００４４】
別の１つの観点において、本発明は、当該材料上でグリア細胞の増殖及び直接接合を実質的に促進することなく成熟ニューロンの成長又は少なくとも直接接合を促進するための第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料を含んでなり、該第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料は第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料に結合した電極であって、前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した生体適合性炭素系材料は、上記で規定されるような前記第１の炭素系材料に類似するか、これと同一であるか又は異なり、前記第２の炭素系材料は、成熟グリア細胞の増殖、少なくとも成熟グリア細胞の直接接合を促進するようにペプチドコーティング、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを提示する、電極に関する。
【００４５】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が成熟グリア細胞の増殖を促進するペプチドコーティング、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを提示する、上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、非細胞毒性である上記の電極に関する。
使用する材料、ドーピング、コーティングのいずれもが非細胞毒性であり、よって電極を構成する全ての化合物は生体適合性であり、免疫原性ではない。
１つの有利な実施形態では、本発明は、少なくとも６ヶ月間安定である上記の電極に関する。
用語「安定」は、電極が６ヶ月以上の後も常時機能すること、すなわち、グリオーシスは電極を変化させておらず、電極は当該組織の成熟ニューロンを常時刺激できることを意味する。
【００４６】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１及び第２の炭素系材料は、半導体となるようにホウ素、リン若しくは窒素のいずれかをドープしたナノ結晶ダイヤモンド、又はグラフェン、ナノチューブ若しくはダイヤモンド上のナノチューブからなる群より特に選択される上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料及び第２の第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が類似しているか又は同一である上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、貫入電極様(例えば穿通ニードル様、特に三次元ニードル様)の形状であるか、又はニードル様(特に三次元ニードル様)の形状であり得る貫入支持体上に配置されている上記の電極に関する。
【００４７】
１つの有利な実施形態では、本発明は、複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成している上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、電極又は電極アレイが支持体に固定されてインプラント又はプロテーゼを形成している上記の電極に関する。
【００４８】
１つの有利な実施形態では、本発明は、前記電極が貫入電極様の形状であるか、又は複数の電極が組み合わされて電極アレイを形成しており、第１の炭素系材料が個々の貫入電極の先端若しくは電極アレイの貫入電極の先端を構成し、第２の炭素系材料がプロテーゼ又はインプラントと神経構造のグリア表面との間の接合面を構成する上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、ペプチドがポリリジン(特にポリ-Ｄ-リジン)、ポリオルニチン又はラミニンからなる群より選択される上記の電極に関する。
【００４９】
１つの有利な実施形態では、本発明は、ペプチドコーティングの厚さが0.5μg/cm2から約５μg/cm2までである上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、穿通ニードル及び/又は貫入電極の長さが約10μmから約１〜２cmまでであり、その直径が20μmから約500μmまでである上記の電極に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、長さの比(第１の炭素系材料/第２の炭素系材料)が0.1〜10である上記の電極に関する。
【００５０】
１つの有利な実施形態では、本発明は、第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料がナノダイヤモンド粉、特にナノ結晶ダイヤモンド上、多結晶ダイヤモンド上若しくは他の材料上のナノダイヤモンド粉とは異なるか、又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なる上記の電極に関する。
したがって、この実施形態では、単分散ナノダイヤモンド粉又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドのような材料は、幾つかの観点の本発明の範囲から除外される。
にもかかわらず、ナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なるダイヤモンド上のナノチューブは、本発明の範囲から除外されないことに留意しなければならない。
【００５１】
別の観点で、本発明は、以下の工程：
ａ．導電性で生体適合性の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場を製造する工程
ｂ．任意に、前記Ｈ末端化炭素系材料の足場を酸素化して第１の炭素系材料を得る工程
ｃ．任意に、前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の第２の部分に、特にホウ素、リン又は窒素をドープして、前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の部分ドープされた第２の部分を得る工程
ｄ．前記化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の任意にドープされていてもよい前記第２の部分に、ペプチド、特に細胞外マトリクス由来のペプチドを被覆して、第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料を得る工程
を含んでなり、前記第１の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料及び前記第２の化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料が電極を構成する、上記の電極の製造方法に関する。
【００５２】
第１の工程ａは、使用する材料に応じて、材料(例えばダイヤモンド)が導電性となるようにドープする必要があれば、行う。
したがって、ダイヤモンドの場合、ドーピング(特に、ホウ素、リン又は窒素を用いるドーピング)を同時に実施する。
グラフェンの場合、ドーピングは行わない。
【００５３】
ダイヤモンドの合成は、通常、CVD(化学蒸着)反応器を用いて行う。反応器中で、マイクロ波又はRF又は熱フィラメント励起により気相中の種を解離させて、加熱基体上でのダイヤモンドの成長を開始させる。この技術は、前駆体ガス、通常、炭素供給源(例えば、メタン)並びに水素及び/又はアルゴンを必要とする。典型的には、成長は500℃〜1000℃で起こり、よって軟質の医療用補綴インプラントの製造に通常好ましいとされるような軟質ポリマー基体上での従来の成長には高温すぎる。したがって、軟質インプラントを製造するためには、犠牲層(ガラス、アルミニウムその他の金属を成功裡に使用することができる)が準備された、シリコン、ガラス又は金属基体から作られた剛性基体上にCVDダイヤモンドを堆積させる技術が必要となる。ダイヤモンド層の成長及びそれに続く将来の電極の形状へのパターニング後に、従来の低温プロセスを用いて、ウェハを後述するポリマーで被覆することができる。その後、ダイヤモンドの成長前に準備された犠牲層からのリフトオフにより、ポリマー上のダイヤモンドの脱離が可能となり、よって軟質インプラントの作製が可能となる。このことはFR2960787号に詳述されている。
【００５４】
更に、ダイヤモンド成長前に基体ウェハを予備加工することにより、軟質インプラントの製造前にモールドの作製が可能となり、よって三次元幾何形状の取得が可能となる。当初のウェハを加工して、最終インプラント上で突出ダイヤモンド電極を導く空洞形状を取得することができる。アスペクト比が高い場合、このアプローチにより、本発明で示したようなプロテーゼ電極の作製に非常に有益である3Dニードルが導かれる。モールドに加え、マイクロメートル以下のスケールの高い表面粗さを示す3D加工基体から開始する(よって、電極粗さを高める)ことも可能である。表面比の増大に起因する電極キャパシタンスの向上を可能とする技術である。
【００５５】
複数工程(積層させるか又は空間に分布させる)を用い、ドープした又はしていない層を含ませて成長を行う場合、最終ダイヤモンドニューロプロテーゼ内で導電性の高い領域及び低い領域の混成が可能である。
第２の工程ｂは、第１のＨ末端化炭素系材料から第１の酸素末端化炭素系材料を得るために材料を酸素化させる必要がある場合に実施する。
【００５６】
酸素末端化表面は種々の条件(例えば、400℃を超える空気若しくは酸素中でのアニーリング、又は高温(＞80℃)の強酸化性の酸性浴中で化学的に、又はRF若しくはMW励起下で発生させた酸素プラズマへの暴露)下で製造することができる
同様に、選択的に準備する領域(組織及び細胞成長が優先的に好む領域)に対する関心に応じて、表面末端をＨ末端化又はO末端化のいずれかに改変するために、水素リッチ環境中でマイクロ波、RF又はホットフィラメント技法を用いる短い(数秒〜１時間の)プラズマ処理に炭素表面を暴露しつつ水素末端もまた準備する。
同様に、得られるナノ結晶又は多結晶ダイヤモンドインプラントを、RFプラズマ反応器において従来技法を用いるその後の炭素ナノチューブの成長に使用し、又はその表面上にグラフェンシートを置くために使用して、それらの材料特性の恩恵を享受し得る。
【００５７】
１つの有利な実施形態では、本発明は、化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の第１の部分にホウ素、リン又は窒素をドープする上記の電極の製造方法に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の足場の部分ドープした第１の部分を酸素化する上記の電極の製造方法に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、ペプチドがポリリジン、特にポリ-Ｄ-リジン、ポリオルニチン又はラミニンからなる群より選択される上記の電極の製造方法に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の第１の部分がナノ結晶ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド又はグラフェンである上記の電極の製造方法に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の第２の部分がナノ結晶ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド又はグラフェンである上記の電極の製造方法に関する。
【００５８】
１つの有利な実施形態では、本発明は、化学的に酸素末端化又はＨ末端化した炭素系材料の第１及び/又は第２の部分が、ナノ結晶ダイヤモンド上若しくは多結晶ダイヤモンド上若しくは他の材料上の単分散ナノダイヤモンド粉、又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なる、上記の電極の製造方法に関する。
したがって、この実施形態では、単分散ナノダイヤモンド粉又はナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドのような材料は、幾つかの態様で本発明の範囲から除外される。
にもかかわらず、ナノチューブが部分的に埋め込まれたナノ結晶ダイヤモンドとは異なるダイヤモンド上のナノチューブは、本発明の範囲から除外されないことに留意しなければならない。
【００５９】
別の１つの観点において、本発明は、成熟ニューロンの成長又は少なくとも成熟ニューロンの直接接合を促進しやすく、成熟ニューロンを刺激しやすいインプラント又はプロテーゼを実現するための上記電極の使用に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、ニューロンが網膜ニューロンであり、インプラントが網膜インプラントである上記の電極の使用に関する。
１つの有利な実施形態では、本発明は、電極がグリア細胞を更に含んでなる上記の電極の使用に関する。
【００６０】
図面の説明
図1A〜1Gは、ペプチドコーティング有り又は無しのガラス基体及びダイヤモンド基体の細胞標識及び細胞計数を示す。
図1A〜1Eは、ペプチドコーティング有り(Ａ、Ｃ、Ｅ)及び無し(Ｂ、Ｄ、Ｆ)のガラス基体(Ａ〜Ｂ)及びダイヤモンド基体(Ｃ〜Ｆ)上の細胞標識を示す。混合網膜細胞培養物中のグリア細胞及び双極細胞が抗GFAP抗体(緑：星形状又はワイヤー状)及び抗Goα抗体(赤：ドット状)で同定されている。
図1A：ペプチド被覆ガラス
図1B：非被覆ガラス
図1C：ペプチド被覆Ｈ(水素)末端化ダイヤモンド
図1D：非被覆Ｈ末端化ダイヤモンド
図1E：ペプチド被覆Ｏ(酸素)末端化ダイヤモンド
F：非被覆Ｏ末端化ダイヤモンド
図1G及び1Hは、双極ニューロン細胞(Ｇ)及びマクログリア細胞(Ｈ)の異なる基体上での細胞計数を示す。非被覆基体上でのグリア細胞の減少は双極細胞のものより大きいことに注目すべきである。スケールバー50μm。
ｘ軸：左側３つのヒストグラム：左から右へ、被覆ガラス、Ｈ-ダイヤモンド、Ｏ-ダイヤモンド
右側３つのヒストグラム：左から右へ、非被覆のガラス、Ｈ-ダイヤモンド、Ｏ-ダイヤモンド
Ｙ軸：細胞数
【００６１】
図2A〜2Fは、Ｏ末端化ダイヤモンド及びガラス上での純粋成熟網膜神経節細胞ニューロンの生存を示す。
ペプチドコーティング有り(Ａ、Ｃ)又は無し(Ｂ、Ｄ)のガラス基体(Ａ〜Ｂ)及びダイヤモンド基体(Ｃ〜Ｄ)上の純粋成熟網膜神経節細胞の生存能。
図2A：被覆ガラス
図2B：非被覆ガラス
図2C：被覆Ｏ末端化ダイヤモンド
図2D：非被覆Ｏ末端化ダイヤモンド
図2E：インビトロでの１日目の数に対して規格化した、インビトロでの６日目の生存網膜神経節細胞の細胞定量
図2F：インビトロでの６日目の純粋網膜神経節細胞における神経突起伸長の定量(神経突起長[μm])
細胞生存は、ペプチドコーティング無しのガラス基体及びダイヤモンド基体上で有意に高く、神経突起伸長は、被覆基体より非被覆ダイヤモンド及びガラスで非常に有意に大きい(ｎ＝４の実験(３サンプル/群/実験)の平均±s.e.m.)。分散分析は、二元配置ANOVAに続くBonferroni事後検定により実施した(*** ｐ＜0.001、* ｐ＜0.05)。スケールバー50μm。
【００６２】
図3A〜3Dは、ペプチドパターン化基体を用いるダイヤモンドに対するグリア及びニューロンの独特な選好性を示す。
ペプチドパターン化ガラス基体(Ａ)又はペプチドパターン化Ｏ末端化ダイヤモンド基体(Ｂ)上の純粋な出生後(p7)網膜神経節細胞(RCG)。RCGは、ペプチドパターン(緑：Ａについては斜方向マトリクス、Ｂについては水平垂直マトリクス)上の抗NF200免疫標識(赤色蛍光)により顕在化されている。
(Ｃ)ダイヤモンド上のペプチドパターンに対するグリアの選好性を示す混合網膜細胞培養物。(Ｄ)RGCがペプチドパターンに重なっているガラス及びダイヤモンド上のペプチドパターン表面の定量。(ｎ＝４の実験の平均±s.e.m.)
ｘ軸：左から右へ、ガラス、パターン化ガラス、Ｏ末端化ダイヤモンド、パターン化Ｏ末端化ダイヤモンド
ｙ軸：パターンと共存するRGC領域のパーセンテージ。
分散分析は、二元配置ANOVAに続くDunns事後検定により実施した(*** ｐ＜0.001)。スケールバー50μm。
【００６３】
図4A〜4Bは、ダイヤモンド上のポリ-Ｄ-リジンコーティングの特徴決定を表す。
図4A：２つのＨ末端化及び２つのＯ末端化ダイヤモンドサンプルについての偏光解析測定。水又はポリ-Ｄ-リジン(pDL)の45分間のインキュベーション後に、偏光解析法により測定した見掛けのダイヤモンド厚の変動(ｙ軸：nm)。
ｘ軸：
左：Δ厚さ(水)：左から右へ、Ｏ末端化ダイヤモンド、Ｏ末端化ダイヤモンド、Ｈ末端化ダイヤモンド、Ｈ末端化ダイヤモンド
右：Δ厚さ(pDL)：左から右へ、Ｏ末端化ダイヤモンド、Ｏ末端化ダイヤモンド、Ｈ末端化ダイヤモンド、Ｈ末端化ダイヤモンド
図4B：水素末端化ダイヤモンド表面についてのXPSスペクトル。ポリ-Ｄ-リジン被覆Ｈ末端化ダイヤモンドのN1sコアレベル。データはｎ＝３の実験の平均±s.e.m.を表わす。
ｘ軸：結合エネルギー(eV)
ｙ軸：強度(a.u.)
【００６４】
図5A〜5Hは、インビトロで６日目に固定された、グラフェン及びガラス上の混合(成熟)網膜細胞培養物を示す。
図5A〜5D：NBA+：左から右へ、被覆ガラス、非被覆ガラス、被覆グラフェン及び非被覆グラフェン。
図5E〜5H：NBA、10％血清：左から右へ、被覆ガラス、非被覆ガラス、被覆グラフェン及び非被覆グラフェン。
免疫染色：双極細胞用の抗Goalpha(ドット状)/グリア細胞用の抗GFAP(星形状又はワイヤー状)。各条件につき３サンプル
【００６５】
図6A〜6Hは、裸の又はポリ-Ｄ-リジン及びラミニンで被覆したグラフェン及びガラス上での純粋成熟網膜神経節細胞(８週齢)の生存を示す。
図6A〜6D：被覆した及び裸のグラフェン及びガラス上の成熟RGCの、エピ蛍光で可視化したカルセイン染色。
図6E〜6Hは、それぞれ、(左から右へ)被覆した及び裸のグラフェン及びガラスについての細胞生存の定量(6 divと1 divとの間での生存比(パーセンテージ))、平均細胞体面積(μm2)、総伸長(μm)、総突起の定量を表す。データは、ｎ＝４の独立実験の平均±s.e.m.を表す。
** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05；分散分析は、二元配置ANOVAに続くBonferroni事後検定により実施した。スケールバー50μm。
【００６６】
図7A〜7Jは、裸の又はポリ-Ｄ-リジン及びラミニンで被覆したグラフェン、ガラス及びサファイア上での純粋な新生網膜神経節細胞(p7)の生存を表す。
図7A〜7F：被覆した及び裸のグラフェン、サファイア及びガラス上のp7 RGCの、エピ蛍光で可視化したカルセイン染色。
図7G〜7J：それぞれ、(左から右へ)被覆した及び裸のグラフェン、サファイア及びガラスについての細胞数、平均細胞体面積(μm2)、総伸長(μm)、総突起数の定量を表す。結果は、ｎ＝４の独立実験の平均±s.e.m.を表す。
*** ｐ＜<0.001、** ｐ＜0.01、* ｐ＜0.05；分散分析は、二元配置ANOVAに続くBonferroni事後検定により実施した。スケールバー50μm。
【００６７】
図8A〜8F：サファイア/グラフェン線形パターン上で培養した純粋な新生網膜神経節細胞(p7)。
グラフェン線上の神経突起伸長について観察された異なる状況を表す微分干渉コントラスト(DIC)画像(図8a〜b)及び蛍光画像(図8d〜e)。
DIC画像において、グラフェン領域(10μm幅のストライプ)は、サファイア領域(20又は30μm幅のストライプ)より暗く見える。パターン化領域と非パターン化領域との間の端部に位置する細胞凝集体のDIC画像(図8c)。グラフェン領域を赤色で示した着色した走査型電子顕微鏡画像(図8f)は図8c中で印しを付した３細胞の凝集体の領域に対応する(図10A及び10Bも参照)。
【００６８】
図9A〜9DはCVDグラフェンの特徴決定を表す。
図9a：本実験で使用したCVDグラフェンのラマンスペクトル。グラフェンの存在を確証する明瞭なＧ及び2Dピークが観察される。2Dピーク：Ｇピークの比及びピークのローレンツ形状は、単層グラフェンによる高い表面被覆率を示す。小さなＤピークは低めの欠陥密度を示唆する。
図9b：原子間力顕微鏡写真。典型的なシワはグラフェン明確な徴候である。移動過程による点状の残留汚れが依然として観察できる。
図9c：パターン化サンプルの走査型電子顕微鏡写真。細胞培養後に、グラフェン(10μm幅、明部)及び裸のサファイア(20μm幅、暗部)の明瞭な縞模様(alternating lines)が依然として観察できる。
図9d：溶液ゲート型グラフェントランジスタの電気的特徴決定。ドレイン-ソース電流をゲートソース電圧に対してプロットしている。ドレイン-ソース電流は、グラフェン中の両価電荷輸送に典型的な「ディップ(dip)」挙動を示す。これら測定から、8000 cm2V-1s-1より高い移動度を算出することができる。
【００６９】
図10a〜10bは、サファイア/グラフェンパターン上で培養した純粋な新生網膜神経節細胞(p7)を示す。
図10a：図8cのDIC画像に対応する、パターン化領域と非パターン化領域との間の境界近傍の細胞凝集体の走査型電子顕微鏡画像。上の四角は図3eのSEM画像に対応する。
図10b：図10a中の下の四角でマークされた細胞凝集体のSEM画像。
【００７０】
図11：グラフェンの電気特性に対するポリ-Ｄ-リジン/ラミニンコーティングの影響を評価した。他(Dankerlら，2010)に記載されたように製作されたグラフェン溶液ゲート型電界効果トランジスタ(SGFET)を被覆の前後で特徴決定した。pH７のリン酸緩衝化生理食塩水(５mM)を含む水性電解質中でこのトランジスタの特徴決定を行った。調べた全てのトランジスタについて、−60mVのディラック点の平均シフトが観測された。これは、正に荷電したポリ-Ｄ-リジンコーティングにより誘導されると予測されるシフトと一致する。このシフトは、1012電荷/cm2の荷電密度にほぼ相当する。コーティング前後とも、このトランジスタは(ドレイン-ソース電圧による規格化後)３〜４mS.V-1のトランスコンダクタンスに達する。このことは、キャリア移動性がコーティング後も変化しないままであることを示唆し、よってポリ-Ｄ-リジン/ラミニンコーティングがグラフェンの電気特性に影響しないことを確証する。
【００７１】
図12は、本発明の炭素系材料(例えば、ダイヤモンド又はグラフェン)の複数の電極を有して構成されたインプラントの例を示す。
上向き矢印は、(被覆していない)第１の炭素系材料に対応し、下向き矢印は(被覆した)第２の炭素系材料に対応する。
図12に記載した各第１及び第２の炭素系材料の長さは、例示目的のためだけに示されたものであり、本発明はこの長さに限定されない。
第１及び第２の炭素系材料は電極を構成する。
このような電極は、ニューロンを刺激しやすいインプラント又はプロテーゼを構成するように組み立てることができる。
よって、２つの隣り合う電極間のスペースも被覆しなければならない。
【００７２】
図13は、25×25画素へダウンサンプリングし、４グレースケールレベルに色調を減少させる前(Ａ)及び後(Ｂ)のアブラハム・リンカーンの画像を表す。
図14は、４つの模擬モデル(それぞれのスライドビューで赤線で可視化される)について、電極アレイの20μm上の電流密度プロットを表す。
Ａ：周囲の対電極を有する平面
Ｂ：右下隅に位置する遠隔対電極を有する平面
Ｃ：ウェルを囲む対電極を有する三次元
Ｄ：Ｂと同じ場所に位置する対電極を有する三次元
【００７３】
図15は、可撓性ダイヤモンドインプラントの製作を表す。Ａ：微細加工工程の概略；Ｂ：マスクの絵(黄色：KOH構造、赤色：インプラントの形状)；Ｃ：シリコンモールドのSEM写真；Ｄ：インビボ評価用の最終ダミーインプラント。
図16は、ポリイミドデバイス(Ａ)、ダイヤモンドデバイス(Ｂ)及び金属製デバイス(Ｃ)を移植したP23Hラットの眼底を表す。
図17は、ポリイミドインプラント(Ａ、Ｄ)、ダイヤモンドインプラント(Ｂ、Ｅ)及び金属インプラント(Ｃ、Ｆ)の走査型電子顕微鏡写真を表す。
【００７４】
図18は、インプラントに接触している染色網膜の共焦点撮像及び各材料についての3D電極内の双極細胞の定量を表す。
図19(A)及び(B)(Djilasら，2011より引用)は、3D電極ジオメトリ及び対応する半断面を表す。三次元表示中の破線は半断面の形状を明らかにする。各電極半断面は、セグメント長を表す５つのパレメータ(p1〜p5)で規定される。
空洞壁傾斜は両ジオメトリについて54.7°である。活性電極セグメント(半断面中で太線)は、絶縁セグメント(半断面中で細線)によって分離されている。
【実施例】
【００７５】
実施例
実施例１：ダイヤモンド材料
実施例1-1：ダイヤモンドの成長及びサンプル調製
ナノ結晶ダイヤモンド薄膜をCorning社製ガラス1737-F(６×６×１mm3)上に作製した。これらガラス板上に、水中分散型デトネーションダイヤモンドナノ粒子(６nm)(0.1％ wg)をスピンコーティングにより塗布した。次に、SEKI TECHNOTRON CORPの AX6500マイクロ波プラズマ化学蒸着(MPCVD)システムにおいて、300mm厚のナノ結晶ダイヤモンド薄膜を低温で成長させた。成長パラメータを表１に示す。次に、これら水素末端化ダイヤモンド表面を、98％濃硫酸及び過剰の硝酸カリウムを含む沸騰溶液(H2SO4/KNO3)中に30分間浸漬して酸素化させた。ガラス基体上のダイヤモンドは水素プラズマ処理に暴露して再使用した。この処理は、ダイヤモンド成長に使用した同じ反応器中で、表２に記載した条件下で達成した。この研究のため、細胞培養研究の実施用に、生物学者に統計的に代表する数(代表的には100)のサンプルを提供するために、成長後にサンプルを６×６mm2片に切断した。水素末端化ダイヤモンドは、反応器から取り出した直後に無菌ペトリ皿に保管し、無菌培養培地で濯いだ後にその上に細胞を播種した。
【００７６】
【表１】
0006280565.tif 000002
【００７７】
【表２】
0006280565.tif 000003
【００７８】
実施例1-2：ペプチドパターンのマイクロコンタクトプリンティング
マイクロスタンプはフォトリソグラフィー及び成形により作製した(Mrksichら，1997；Chang JC，2001)。電子ビームライタにより傾斜構造(gradient structure)をクロムマスクに転換した。UVフォトリソグラフィーを応用して、0.6mm厚のシリコンウェハ上で５〜12.5μm厚のポジティブフォトレジスト(AZ5206)層を使用してマスタースタンプを作製した。深堀反応性イオンエッチング(深さ2.5μm)によりパターン転写を達成した。最後に、プラストマーの容易な脱離及びモールドの再使用を可能とするために、モールドを、蒸着(Mrksichら，1997)プロセスにおいて、その表面に(トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン層を共有結合することよって不動態化した。Sylgard 184(Dow Corning，Midland，USA)をこのマスター上で硬化させ、続いて55℃で48時間硬化させることによってポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)マイクロスタンプを作製した。マスタースタンプの脱離後、最終硬化を110℃にて１時間行った。共にハンクス平衡塩溶液(HBSS)中に希釈した、２μg/mlのラミニン(マウス肉腫由来、Sigma L2020)と混合した10μg/mlのFITC-(フルオレセインイソチオシアネート)結合ポリ-Ｌ-リジン(FITC-PLL)(Sigma、Germany)にスタンプを20分間浸漬することにより、インクが充填された(inking)。このスタンプを窒素流中で乾燥させ、70％エタノールpAで予め殺菌したダイヤモンド基体上に２分間押付けた。
【００７９】
実施例1-3：NCD薄膜の分析：偏光解析及びXPS測定
偏光解析及びXPS測定を用いて、ペプチドコーティング有り又は無しの酸素化及び水素化ダイヤモンド基体を特徴付けた。水素末端化は空気中でのダイヤモンドの自然酸化により変更するので、半工業的マイクロ波プラズマ化学蒸着(MPCVD)反応器SEKI AX6500内で偏光解析特徴付けの直前に表面水素化を行った。実験条件は、マイクロ波電力2200W、圧力25mbar、水素流200SCCM、温度650℃であった。
【００８０】
UV-Vis分光エリプソメータ(Horiba Jobin-Yvon，UVISEL)を固定角70°で使用してダイヤモンド膜の粗さと厚さを特徴付けた。酸素化表面及び水素化表面の両方について、常に同一領域が特徴付けられるようにダイヤモンドサンプルをエリプソメータに固定した。「裸」の表面で３回測定した後、脱イオン水又は0.1mg/mlのポリ-Ｄ-リジンの液滴20μlをサンプル上に堆積させた。室温で45分後、サンプルを脱イオン水で十分に濯ぎ、アルゴンで乾燥させた。最後に、「被覆」サンプルの同一領域で更に３回測定した。実験データの良好なフィットを得るためには(表面粗さ/ダイヤモンド/シリコン)、３層ミクロ構造モデルの使用が必要である(Lionsら，2009)。光学定数のモデリングのために、タウク-ローレンツ分散則を用いてフィットさせた(Guptaら，2008)。「裸」のサンプル及び「被覆」サンプルの両方について、同一モデルを使用した。ダイヤモンド厚及び見掛けのダイヤモンド厚をそれぞれ導き出した。その後、被覆前に関する表面被覆後の見掛けのダイヤモンド厚の差をプロットした。
【００８１】
表面分析をこれらサンプルについてＸ線光電子分光法(XPS)により実施した。供給されたスペクトロメータアノードは半球アナライザ及びA1-Kモノクロメータが備わっていた。結合エネルギーは、83.6eVに位置するAu4f7/2ピークを基準とした。曲線フィッティング手順を平滑化スペクトルについて行い、それぞれ0.2eV及び0.6eVのローレンツ半値幅を有するVoigt関数を用いてN1sスペクトル中の成分を抽出した。
【００８２】
実施例1-4：動物
細胞培養に使用したLong‐EvansラットはJanvier(Le Genest Saint-Isle，France)から購入した。全ての実験は、眼科学及び視覚研究における動物使用についての欧州共同体理事会指令(European Community Council Directive)(86/609/EEC)及びARVO(視覚眼科学研究協会；Association for Research in Vision and Ophthalmology)の声明に従って実施した。
【００８３】
実施例1-5：初代網膜細胞培養
混合網膜細胞
網膜細胞の初代混合培養物を成体Long Evansラット(８週齢)の網膜から単離した。動物を麻酔して犠牲にした。眼を摘出してCO2非依存性培地(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)の溶液中に置いた。網膜を約２mm2片に切断してリンゲル培地中で２回濯いだ。次いで、網膜片を、予めリンゲル培地中で37℃にて30分間活性化させた２UI/mlのパパイン(Worthington，Lakewood，NJ，USA)溶液中で37℃にて25分間インキュベートした。次に、これを10％ウシ胎仔血清(FBS；Sigma)及び2.5％のDNAse(DNAse，Sigma)を含むNeurobasal-A培地(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)で濯いだ。この培地中で、網膜を４ステップ(各ステップでNeurobasal-A培地と10％FBSとの溶液１mlを添加し、１mlのコーンを使用して)解離した。細胞懸濁物を室温で６分間、115ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを２mMのＬ-グルタミン(Life Technologies)及び２％のB27(Life Technologies)を含むNeurobasal-A培地(Life Technologies)に再懸濁した。最後に、10％のトリパンブルー(Life Technologies)を添加し、マラッセヘマトサイトメータを用いて細胞を計数した。細胞は、ポリ-Ｄ-リジン(２μg/cm2、45分間、Sigma-Aldrich)及びラミニン(１μg/cm2、一晩、Sigma-Aldrich)で続けて被覆した又は被覆していない、直径８mmのガラスカバースリップ上又は６×６mm2のダイヤモンドサンプル上で同じ培地(NBA
+)中２×104細胞/cm2の初期密度にて播種した。
【００８４】
NBA＝Neurobasal = 培地
NBA+＝２％のB27及び１％グルタミンを含むNBA
B27の組成は下記の通り。
ビオチン、セレン
Ｌ-カルニチン、T3(トリヨード-１-サイロニン)
コルチコステロン、DL-α-トコフェロール(ビタミンＥ)
エタノールアミン、DL-α-トコフェロール酢酸
Ｄ(+)ガラクトース、タンパク質
グルタチオン(還元)、ウシアルブミン
リノール酸、インスリン
リノレン酸、カタラーゼ
プロゲステロン、スーパーオキシドジスムターゼ
プトレシン、トランスフェリン
酢酸レチニル
【００８５】
純粋網膜神経節細胞(RGC)
RGCは、若齢ラット(Barresら，1988)及び成体動物(Fuchsら，2005a)において以前に記載されたプロトコールに従って、イムノパニング技法を用いて成体Long Evansラット(８週齢)の網膜から単離した。混合培養と同様に、細胞を、全面の又はパターンとしてのペプチドコーティング有り又は無しのガラスカバースリップ及びダイヤモンドサンプル上に２×104細胞/cm2の初期密度で播種した。
【００８６】
実施例1-6：生存試験
細胞生存を緑色蛍光として検出されるカルセインAMで生存細胞を標識することから本質的になる「生死」試験(Life Technologies)を用いて評価した一方、死細胞は赤色蛍光を生じるヨウ化エチジウムで標識した。簡潔には、カバースリップをインキュベータ(湿潤チャンバー、37℃、５％CO2)においてカルセインAM及びエチジウムホモダイマー-１の混合物(PBS媒質に希釈)中で１時間インキュベートした。エピ蛍光が装備されている顕微鏡(Leica DM 5000B，Solms，Germany)を使用して各カバースリップ上で等しく選択された７視野から生存するRGCのみを計数した。インビトロでの１日目(1DIV；days in vitro)及び６日目(6DIV)で生存RGCを計数した。異なる材料の効果を評価するとき、結果を1DIVでの細胞生存に対する6DIVでの細胞生存のパーセンテージとして示した。
【００８７】
実施例1-7：免疫細胞化学及び蛍光画像化
細胞培養物を、PBS(Sigma)中４％パラホルムアルデヒド(Sigma)で室温(20℃)で15分間固定した。細胞培養物を濯ぎ、0.1％Triton X100(Sigma)を含むPBS中で10分間透過化し、３％BSA(Sigma)、10％正常ヤギ血清(Sigma-Aldrich)及び0.1％Triton X100を含むPBSで１時間、前処理して非特異標識を減少させた。一次抗体を細胞培養物に室温で２時間適用した(双極細胞染色用には1/1000に希釈した抗G0α、グリア細胞染色用には1/500に希釈した抗GFAP)。数回の洗浄後、細胞培養物を1/500に希釈したAlexaTM 488(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)及びAlexaTM 594(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)に結合したヤギ抗ウサギIgG抗体と室温で１時間インキュベートした。核標識は、二次抗体を含むDAPI溶液中で細胞培養物をインキュベートすることにより行った。細胞培養物を、マウントする前に、PBS-Triton 0.1％で４回、PBS単独で１回、最後に蒸留水で１回濯いだ。蛍光標識は、エピ蛍光照明を有するライカDM5000顕微鏡(AlexaTM 488：励起フィルター480±40nm；AlexaTM 594：励起フィルター560±40nm)を使用して観察した。
【００８８】
実施例1-8：定量：細胞生存、神経突起発芽及び共存
インビトロ６日目(6DIV)のカルセインAM陽性生存細胞を、エピ蛍光顕微鏡(ライカDM5000B)下で各カバースリップ上で等しく選択した７視野から計数することにより純粋培養RGCの密度を評価した。MetaMorphソフトウエア(Ropper scientific)を使用して、(i)純粋RGC培養物についての神経突起発芽及び(ii)タンパク質パターン上の細胞及び神経突起の共存を自動的に定量するために、ガラスカバースリップ及びダイヤモンドサンプル全面をデジタル化した(10×倍率用に約300視野)。＜神経突起伸長＞適用では、細胞体の直径、神経突起の幅及びバックグランドを超える強度を考慮に入れる。
パターンとの細胞共存については、異なる顕微鏡視野の画像を閾値化し、両画像(細胞及びパターン)の共存領域をパーセンテージで表した。
混合培養物については、Metamorphソフトウエアを使用し、GFAPで染色された領域のみを定量する自動閾値を画像上で用いてグリア細胞領域を測定した。
【００８９】
実施例1-9：統計解析
データは平均±s.e.m.で表わす。分散分析には一元配置ANOVAを使用し、有意性がある場合、続いてBonferroni事後検定(ガウス分布)又はDunns事後検定(非ガウス分布)のいずれかを行い、各群の平均を比較した。差は、* ｐ＜0.05、** ｐ＜0.01及び*** ｐ＜0.001で有意であるとみなした。
【００９０】
結論
更に、本研究は、神経組織細胞がダイヤモンド上で成長できることを確証する。今や、純粋成熟網膜ニューロンは非被覆ダイヤモンド上で生存できる一方、グリア細胞はペプチド被覆ダイヤモンドを好むことが証明された。純粋ニューロンは、裸のダイヤモンド上でペプチド被覆ダイヤモンド上より長い神経突起を生成しさえする。両方の下地が存在する場合、これら神経突起は、ペプチド被覆ガラス 対 裸のガラスの場合とは対照的に、裸のダイヤモンドより遥かに有意にはペプチド被覆ダイヤモンドを選択しない。したがって、これら結果は、ニューロプロテーゼにおけるダイヤモンドの使用に関して幾つかのヒントを強調する。
【００９１】
神経組織細胞に関するダイヤモンドの生体適合性
この点を、胚性皮質ニューロン細胞の培養物を用いる２つの研究により調べた(Spechtら，2004；Thalhammerら，2010)。これら研究では、ダイヤモンド層(研磨した多結晶又はナノ結晶)は、ニューロン成長についてガラスと同等の基体を提供するようであった。実際、ダイヤモンド層は全て、ペプチド被覆されているか又は分散ナノダイヤモンド粒子で覆われているときにのみ、ニューロン成長を可能にした。これら研究では、ニューロンをグリア細胞と混合したが、両細胞タイプとも、非被覆の研磨多結晶又はナノ結晶ダイヤモンド層の直接上では生存しなかった。しかし、ニューロンの生存はグリア細胞の存在又はグリア馴化培地の添加に依拠することがしばしば報告されているので(Fuchsら，2005b)、非被覆ダイヤモンド上での不良なニューロン生存が特異的なのか又はグリア細胞増殖の不在に間接的に関係しているのかは不明なままである。
同様に、本発明では、混合網膜細胞の生存に関してガラスとダイヤモンドとの間に大きな差は見出されかった。これら研究とは対照的に、非被覆ガラス上と同様に、非被覆ナノ結晶ダイヤモンド層上でもグリア細胞及び双極ニューロン細胞の両方が観察された。
【００９２】
グリア細胞及び双極ニューロン細胞を計数すると、グリア細胞の減少は、非被覆ダイヤモンド層上でのニューロンの減少より大きかった。この結果は、グリア細胞が培養基体に対してニューロンより感受性であることを示唆した。更に、直線状ペプチドコーティングに沿って伸びる突起を有する、パターン化基体上のグリア細胞の四角形状によって、ペプチドコーティングに対する強い選好性が確証された。したがって、材料へのグリア細胞接着が必要な場合には、ダイヤモンド層のペプチドコーティングが強く推奨される。ダイヤモンド表面上でのペプチドコーティングのためには、Ｈ末端化ダイヤモンドを選好すべきである。なぜならば、表面状態測定で示されるように、ペプチドコーティングがＨ末端化ダイヤモンド基体上ではＯ末端化ダイヤモンド基体上より厚くなるからである。
【００９３】
分散ナノダイヤモンド粒子は、胚性ニューロン培養物がこれら粒子上で非常に良好に生存したので(Thalhammerら，2010)、ペプチドコーティングの代替物としてと考えられる。実際には、これら粒子は基体に結合しておらず、したがって食細胞に飲み込まれ、他の組織に移動し得るので、これら粒子単独をインプラントコーティング用として考慮するのは困難であろう。しかし、これら分散ナノダイヤモンド粒子上での胚性ニューロン培養物の成長(Thalhammerら，2010)は、粒子製造の間に起こるダイヤモンド表面の化学的又は物理的改変がグリア細胞との細胞相互作用を変化させることがあることを示唆する。したがって、更なる研究により、ダイヤモンドの化学的又は物理的改変がどの様にグリア細胞の接着及び増殖を改変するかを調べなければならない。
【００９４】
胚性細胞培養物を用いる以前の研究(Spechtら，2004；Thalhammerら，2010)とは対照的に、ダイヤモンド基体の直接上で生存する成熟ニューロンがしばしば観察された。このことは、成熟ニューロンがダイヤモンド又はガラスとの界面にペプチドコーティングを必要としないことを示す。しかし、これらの混合培養物では、ニューロンは、ダイヤモンド及びガラス上で、ペプチド被覆基体上より密度が低かった。グリア細胞はニューロンの生存に重要な因子を放出することが知られているので(Fuchsら，2005b)、実際には、生存ニューロン数のこの減少はグリア細胞数の減少に起因し得る。このグリア変量を排除するため、成熟網膜神経節細胞の精製後の純粋網膜ニューロンを用いてニューロン生存を評価した。この調製物により、ペプチドコーティングはニューロン細胞の生存に影響せず、ガラス上及びダイヤモンド上の両方で神経突起伸長を抑制しさえすることが示された。これら観察により、ニューロン/ダイヤモンドの直接接合は、ニューロン細胞の生存及び神経突起発達と適合性であることが示唆される。このような直接接合はニューロプロテーゼにおける刺激効率の向上に非常に重要であり得る。ニューロン突起は非被覆ガラス上でよりも長いが、両方の下地が利用可能であるときにはペプチド被覆ガラス上での成長を選択した。胚性ニューロン細胞培養物を用いても同様に、ニューロン細胞突起は、ペプチド被覆ダイヤモンド基体上で優先的に成長することが報告されている(Spechtら，2004)。我々の方法では、ペプチド被覆ダイヤモンド基体に対するこの厳格な選好性は、純粋成熟網膜神経節細胞をもちいたときに再現しなかった。この結果により、成熟ニューロンはダイヤモンドの直接上で良好に生存し神経突起を成長させることができることが確証された。
【００９５】
ニューロプロテーゼにおけるダイヤモンド
ニューロン刺激のためには、組織/インプラント接合は、インプラント表面でのイオン拡散を制限するように、できる限り密着していなければならないが、このことにより、個々の電極の分解能、及びニューロン活性化閾値に到達するために注入されるべき電流強度が制限される。事実、神経組織は、物理的障壁として働くグリア細胞層に常に囲まれている。したがって、ニューロプロテーゼは、このグリア表面上に配置することができるか、又は神経組織中に侵入する貫入電極を有することができる。したがって、表面インプラントについては、インプラント及び電極に対するグリア細胞の接着性を増大させることが重要である。したがって、ダイヤモンド電極の使用を考慮する場合、これら結果により、ペプチド被覆ダイヤモンドを選択しなければならないことが示唆される。このことは、共にグリアミュラー細胞が形成する内境界膜(網膜上インプラント)又は外境界膜(網膜下インプラント)と直接接触することになる網膜インプラントについて特に当てはまる。事実、外境界膜は、光受容体の内側セグメント及び外側セグメントの消失後には、光受容体側で網膜を覆っている。
【００９６】
貫入インプラントの場合、大規模なグリア応答が２、３か月内に電極周囲に生じることが判明した(Maynardら，2000)。この大規模なグリオーシスにより、皮質プロテーゼと同じような移植２、３か月以内に起こる電気刺激の消失が説明される。この大規模なグリオーシスは、イオン恒常性に関する組織変化を防止する外部グリア障壁の連続性を再構築するために起こる可能性がある。このことは、穿通ニードル又は貫入電極によって生じた穴が迅速に塞がれることを示唆する。これら穴の密封は、穿通ニードルの基部又はインプラントソケットにグリア細胞接着を促進する分子を適用することで達成され得る。例えば、この材料は、ペプチド被覆ダイヤモンドのような任意のペプチド被覆材料であり得る。電極基部での適切な密封により、刺激電極が配置されたニードル先端の周囲での更なるグリオーシスが防止される。実際、ニューロンと電極との間の直接接触又は至近距離は、最小電流強度での最良の電気刺激を提供すると期待される。したがって、本発明者らの結果は、グリア細胞の接着を制限し、代わりにニューロン突起への直接接触に好ましくあるように、ペプチドコーティングなしの裸のダイヤモンドを、刺激電極が位置しているニードル先端で使用すべきことを示唆している。
【００９７】
結論
本研究により、ニューロン及びグリア細胞に対するダイヤモンドの生体適合性が確証される。したがって、このことにより、神経組織の刺激が求められる適用について魅力的な電極材料としてダイヤモンドを考慮するニーズが強調される。
【００９８】
実施例２：グラフェン材料
実施例2-1：グラフェンの製造及び加工
グラフェンの成長及び転移。単層グラフェンを化学蒸着(CVD)により作製した。銅箔を水素流下(35sccm)に1000℃で15分間アニールした後、ガス組成を水素/メタン混合物(10sccm/35sccm)に変化させて、銅箔上にグラフェンを1000℃で30分間成長させた。既報[Liら，2009]のとおり、これら条件[Hessら，2011]下で高い表面被覆率の単層グラフェンが得られる。サファイアへのグラフェンの湿式転移のために、銅/グラフェン薄膜を転移用のポリ(メチル２-プロペン酸メチル)(PMMA)層で覆った。この積層物をFeCl3溶液(0.5Ｍ)に置いて銅をエッチングした。その後、グラフェン/PMMA薄膜をサファイア基体に移し、PMMAを溶剤で剥離させた。最後に、表面汚染を低減させるためにサンプルをUHV中でアニールした。
サファイア基体上のグラフェンの線形パターン。UVフォトリソグラフィー及びその後の酸素プラズマ処理を用いてサファイア基体上に10μm幅のグラフェン線をパターン化した。
【００９９】
実施例2-2：初代網膜細胞培養物：網膜神経節細胞(RGC)の精製
細胞培養物をJanvier(Le Genest Saint-Isle，France)から購入したLong-Evansラットから調製した。全ての実験は、眼科学及び視覚研究における動物使用についての欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)及びARVO(視覚眼科学研究協会)の声明に従って実施した。
RGCは、若齢ラット[Barresら，1988]及び成体動物[Fuchsら，2005b]において以前に記載されたプロトコールに従って、イムノパニング技法を用いて成体及び新生(８週齢及び生後７日目)のLong-Evansラットの網膜から単離した。
細胞を、成熟細胞については２mMのＬ-グルタミン(Life Technologies)及び２％のB27(Life Technologies)を含むNeurobasal-A培地(Life Technologies)中、新生細胞についてはND-G培地[Barresら，1988]中にて、ポリ-Ｄ-リジン(２μg/cm2、45分間、Sigma-Aldrich)及びラミニン(１μg/cm2、一晩、Sigma-Aldrich)で続けて被覆したか、又は被覆していないガラスカバースリップ、グラフェン及びサファイアサンプル上に２×104細胞/cm2の初期密度で播種した。補強情報に記述したように、ポリ-Ｄ-リジン/ラミニンコーティングは、グラフェンの電気特性に影響しない。
【０１００】
実施例2-3：生存試験
細胞生存を緑色蛍光として検出されるカルセインAMで生存細胞を標識することから本質的になる「生死」試験(Life Technologies)を用いて評価した一方、死細胞は赤色蛍光を生じるヨウ化エチジウムで標識した。各実験において、被覆条件及び非被覆条件の両方に、２つのガラスプレート、３つのグラフェン及び３つのサファイア基体を含めた。培養６日後、これらを、インキュベータ(湿潤チャンバー、37℃、５％CO2)においてカルセインAM及びエチジウムホモダイマー-１の混合物(PBS媒質に希釈)中で１時間インキュベートした。10×対物レンズを用いるエピ蛍光顕微鏡(ライカDM5000B、Solms、Germany)下で、固定した15の独立した位置にて、カルセインAM陽性生存細胞のデジタル画像(630μm×750μm)を得た。生存RGCの数を、ペプチド被覆ガラス上でインビトロ１日目(1DIV)に生存している細胞数に対して規格化した。全ての定量値(細胞数、細胞サイズ、神経突起長、突起数)は、デジタル画像から、MetaMorph(Ropper scientific)の特定のアプリケーションを用いて自動的に得た。次に、各実験を、コーティングあり又はなしの全ての基体で４回繰り返した。
【０１０１】
実施例2-4：インビトロ６日目に固定した、グラフェン及びガラス上の混合(成熟)網膜培養物
使用した方法は実施例1‐5と同様である。
結果を図5A〜5Hに示す。
【０１０２】
実施例2-5：統計解析
全てのデータは平均±s.e.m.で表わす。分散分析には二元配置ANOVAを使用し、有意性がある場合、続いてBonferroni事後検定を行い、各群の平均を比較した。差は、* ｐ＜0.05、** ｐ＜0.01及び*** ｐ＜0.001で有意であるとみなした。
【０１０３】
結論
図６は、ペプチド被覆グラフェン上及び裸のグラフェンの直接上でのインビトロで６日後の成熟網膜ニューロンの生存を示す。全ての生存ニューロンは、ペプチド被覆基体上及びペプチド非被覆基体上のいずれでも神経突起伸長を示す(図6a-d)。反復実験で生存率を定量したが、ペプチド被覆ガラス基体とペプチド被覆グラフェンとの間に統計学的有意差は認められなかった。驚くべきことに、細胞培養に関する共通見解に反して、ペプチドコーティングはガラス上での生存率を上昇させなかった[Clarkら，1997；Frickeら，2011]。他方、裸のグラフェン上では、生存細胞は、ガラス基体上又はペプチド被覆基体上より僅かに数が少ない；この差は、小さくとも、統計学的に有意である(図6e参照)。しかし、裸のグラフェン上での細胞数の僅かな減少にもかかわらず、この裸の基体上で神経突起が伸長したニューロンの存在により、グラフェンの高度細胞適合性が強く確証される。ガラス基体とグラフェン基体との間の差をさらに調べるため、異なる基体上での細胞サイズ、神経突起伸長を含む幾つかのパラメータを定量した。ペプチドを被覆したときには、ガラスとグラフェンに差はなかった。しかし、コーティングなしの場合には、細胞サイズは、グラフェンでガラスより小さかった。このことから、細胞は、裸のグラフェン上に接着し、その上で広がるのがより困難であることが示唆される(図6f)。また、細胞接着のこの差は、神経突起長が、裸のグラフェン上で、他の全ての基体と比べて有意に減少したことを説明し得る(図6g)。加えて、差が統計学的に有意でない場合でさえ突起数の見掛けの減少についての解釈を提供し得る(図6h)。これらの観察は、成熟ニューロンが、裸の(すなわち非ペプチド被覆)グラフェンと直接接触して良好に生存し、神経突起を成長させることができることを示す。
【０１０４】
グラフェン上及びグラフェンパターン上での神経突起発芽を更に評価するため、成長因子、ホルモン及びビタミンを含むNeurobasalベースの培地で維持した生後網膜神経節細胞(生後７日)を使用した[Barresら，1988]。生後細胞の成長段階では、当該細胞は、このような神経突起伸長を特にしやすい[Adlerら，1990]。細胞成長に対するグラフェンパターンの効果を調べるため、サファイアも評価した。なぜならば、サファイアはグラフェンを堆積する基体として使用からである。３日後に全ての基体で観察された数多くの細胞体及び非常に高密度の細胞プロセス(図7a-f)は、上記で論じた成熟ニューロンに関するグラフェンの細胞適合性と一致する。
【０１０５】
しかし、基体のペプチドコーティングは、見掛けの細胞数の２倍増加(図7g)及び見掛けの神経突起長の10倍増加(図7i)を生じることが判明した。事実、細胞形態は、細胞体サイズの見掛けの増加(図7h)を伴う(これは細胞の凝集を示す)裸の基体上で異なっていた。よって、非被覆基体についての細胞数の見掛けの減少(図7g)は、細胞集塊中のこの細胞凝集により部分的に影響される。さらに、非被覆グラフェン及びサファイア上での細胞突起はより厚かった。このことは、神経突起束の生成[Watkinsら，2008](よって見掛けの神経突起長の大幅な減少(図7i)に繋がる)を示唆する。この研究により、若いニューロン及びその神経突起は裸の基体上で凝集する傾向を有することが示される。したがって、ペプチドコーティングは細胞体、神経突起及びその成長円錐の細胞接着を向上させ得る(無い場合には、これら構造はすべて再編成する傾向がある)。
【０１０６】
基体としての裸のグラフェンの潜在的な競争上の優位性を更に調べるため、生後網膜神経節細胞を、サファイア上のサファイア(20又は30μm幅)及びグラフェン(10μm幅)の交互線形パターン上で成長させた(図８)。基体の潜在的なマスキング効果を避けるために、細胞培養前にペプチドコーティングを適用しなかった。細胞形態を、蛍光生/死アッセイにより正確に明らかにしつつ、微分干渉コントラスト顕微鏡を使用してグラフェンパターンの位置を同定した。上記のとおり、細胞体は凝集して細胞集塊を形成する。同様に、大きな神経突起束はこれら細胞集塊から出てくるのが観察された。図８は、グラフェンパターン上での神経突起伸長の異なる状況を示す。興味深いことに、神経突起束は、しばしば、線上を時々交差するグラフェンパターンの端部に追従する。幾つかの場合では、細胞神経突起は、パターンから独立してさまよっているように見える(図8a)。しかし、別の場合では、神経突起発芽は非常に厳密に線に追従し、線を横切り得る(図8b)。図8eは、グラフェン上及びサファイア上の両方に接着する３つの細胞体の凝集をよく示している一方、この凝集体から生じた２つの神経突起は、隣接するグラフェン線に沿って伸びている。このことは、対応するSEM画像で確認できる図8e(図10も参照)。頻繁に観察される、グラフェン端部での神経突起の誘導(図8b)は、物理的段差(高さが約１nmのオーダーである)よりむしろ化学的組成に起因しているかもしれない。サファイア/グラフェンパターンの作製に用い技術に起因して、グラフェン端部は酸素基で修飾されている蓋然性が非常に高い一方、端部から遠く離れると当該基の存在は期待されない。かかる親水性表面は、おそらく向上した細胞接着性により、ニューロン生存を向上させることが示されている[Jungら，2001、Liuら，2006、Khan and Newaz，2010]。
【０１０７】
ポリリジン被覆グラフェン上の混合グリア/ニューロン細胞[Liら，2011]の生存、又はラミニン被覆グラフェン上での若しくはグラファイトナノ材料(グラフェン層)とインキュベートした増殖神経細胞(幹細胞、PC12細胞株)の生存を調べた以前の研究がある[Parkら，2011、Zhangら，2010、Yenら，2011]。この研究の独創性は、成熟の及び/又は分化した精製網膜ニューロンの使用にある。加えて、これらニューロンの生存は、基体のペプチドコーティングなしでグラフェンの直接上で評価された。類似又は同一の炭素系材料上のペプチドコーティングの重要性は、ペプチドコーティングのパターンを使用しても示されており、ペプチドコーティングパターンの使用により、胚性皮質ニューロンはダイヤモンドの直接上よりむしろラミニンコーティング上を好んで成長することが可能となった[Spechtら，2004]。グラフェンについてのインビトロ細胞適合性研究に関しては、コーティングは短期培養において幾らかのバイアスをもたらす可能性がある。しかし、長期培養又はインビボインプラントでは、コーティングは、２、３週間後には最終的に溶解/分解することになり、このことは、グラフェン表面をマスクする被覆タンパク質の存在により隠されていた毒性を顕現させるかもしれない。
【０１０８】
このことは本試験では該当しない。なぜならば、短期培養の場合でも、裸のグラフェン及びタンパク質で被覆したグラフェンの両方を調べているからである。本研究の第２の重要な新規観点は、胚性又は新生組織から得た培養物に関して報告した以前の研究とは対照的に、グラフェン上で成熟ニューロンの培養物を使用することである。ニューロプロテーゼデバイス用材料の試験を目的とした成熟ニューロンを用いる細胞適合性研究は、これらプロテーゼは成人患者に移植される予定であるので、より現実的なモデルシステムを提供する。
これら結果は、成熟ニューロンが裸の(すなわち、非ペプチド被覆)グラフェン上で培養されたとき、生存し、神経突起を成長させることができることを証明する。これにより、ニューロンを電気デバイスと接続(interface)する生体適合性材料としての大きな可能性が確証される。最近の進歩では、グラフェントランジスタアレイを使用して、心筋細胞から活動電位を記録することに成功している[Hessら，2011、Cohen-Karniら，2010]。
【０１０９】
実施例３：コーティングプロトコール
２μg/cm2のポリ-Ｄ-リジン溶液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に調製する。このポリ-Ｄ-リジン溶液の一滴(典型的には、インプラントのサイズに依存して100L〜１mLの間)を電極基部に(電極先端が浸らないように)堆積し、45分間インキュベートする。次いで、電極基部をPBS中で濯ぎ、１μg/cm2のラミニン溶液を電極基部に塗布する。インキュベーション工程を湿潤チャンバ(37℃、５% CO2)中で行う。
【０１１０】
実施例４：電極
電極は、Djilasら(2011)に以前に記載されたように作製し、被覆装置を提供する上記プロセスに従い被覆した。
簡潔には、3D電極ジオメトリ及び対応する半断面は、図19(A)及び(B)に示したとおりである。3D表示中の破線は半断面の形状を明らかにする。各電極半断面は、セグメント長を表す５つのパレメータ(p1〜p5)で規定される。
空洞壁傾斜は両ジオメトリについて54.7°である。活性電極セグメント(半断面中で太線)は、絶縁セグメント(半断面中で細線)によって分離されている。
【０１１１】
ここでは、２つのインプラントモデルを記載する。これらは、空洞が存在する導電性平面からなる。刺激電極は空洞の底部に存在する一方、対極は空洞周囲の導電性平面である。２つの活性電極表面は、空洞内の絶縁性側壁による分離することができる。両電極構造は軸対称であり、よって半断面で規定することができる(図19(A)及び(B))。
この２つのモデルは、配置並びに空洞内の活性表面と絶縁性表面が異なる。一方の構成では、刺激電極は空洞底部全体に及んでいない；刺激電極と空洞側壁との間に絶縁セクションが存在する。構成Ｂでは、刺激電極は空洞底部全体に及んでおり、空洞壁の下部にまで拡がる。両構成とも、対電極は上面から空洞内の側壁にまで拡がる。
【０１１２】
半断面は、モデルジオメトリを構成するセグメントの個々の長さである５つのパレメータ(p1〜p5)を用いて規定することができる。電気活性電極表面は厚いセグメントである一方、絶縁性表面は薄いセグメントである。
構成Ａについては、これら５つのパラメータは以下のとおりである：(p1)刺激電極半径、(p2)刺激電極端部から空洞側壁までの距離、(p3)空洞側壁上の絶縁性セグメントの長さ、(p4)空洞側壁にまで拡がる対電極セグメントの長さ、及び(p5)対電極の水平セグメントの長さ。
構成Ｂについては、これらパラメータは以下のとおりである：(p1)刺激電極の水平セグメントの長さ、(p2)空洞側壁にまで拡がる刺激電極セグメントの長さ、(p3)刺激電極から対電極までの距離、(p4)空洞側壁にまで拡がる対電極セグメントの長さ、及び(p5)対電極の水平セグメントの長さ。
構成Ａでは、刺激電極は、絶縁性層(p2)により囲まれたウェルの底部(パラメータp1)に存在する一方、帰還グリッドはインプラントの表面(p5)に存在し、下行ウェル壁上に拡がり得る(パラメータp4)。
構成Ｂでは、刺激電極及び帰還グリッドは共に、ウェル壁に拡がる(それぞれパラメータp2及びp4)。
【０１１３】
電極は、古典的なシリコンウエットエッチングプロセスを用いて微細加工する。この理由から、空洞側壁の傾斜を(100)シリコン用のエッチング角(54.7°)に固定した。
有限要素モデルは、Comsol Multiphysics Modeling and Simulationソフトウェアパッケージ(Comsol AB)を使用して作成してもよい。シミュレーションで使用する物理モデルは、下記関係で規定する二次元軸対称DC導電性媒質モデルである。
Ｊ＝σE、
∇Ｊ＝Ｑ、
Ｑ＝−∇(σ∇Ｖ)、
ここで、Ｊは電流密度ベクトルであり、Ｅは電界ベクトルであり、σは媒質の導電率であり、Ｑは電荷であり、Ｖは電位である。
【０１１４】
電極ジオメトリは、MATLAB(The Mathworks)を使用して最適化して、最良の刺激選択性をもたらす最適モデルパラメータを見つける。最適化は、電気活性電極表面に対応する加工マスク開口部が少なくともｆμm離れていなければならず、空洞の深さは50μmを越えないという付加的な制約の下で実施する。ウェル深さ30μm及びウェル直径30μm(電極アレイの共通平面レベルで測定)に対応する最適化パラメータを有するインプラントを作製した。
選択性は空洞深さの増加に伴い向上する。(刺激標的ゾーンの下端に対応する)最大20μmの深さでは２つの構成Ａ及びＢの間にほとんど差はない。
電極の選択性は、両構成とも30μmの深さでピークに達する。構成Ｂは、全ての刺激電極サイズについて、構成Ａより良好な選択性をもたらす。
【０１１５】
差は、より小さな刺激電極サイズ(例えばp1=５μm)について最も顕著であり、最適ジオメトリＢを最適ジオメトリＡと比較したときには選択性は約３倍増加しており、最適ジオメトリＢを最適な平面電極構造と比較したときには選択性は約10倍増加している。
最終的に限定空間にできる限り多くの電極を詰め込むため、パラメータp1及びp5をできる限り小さくすることが肝要である。
これにより、最小サイズの単一電極が得られ、したがってアレイ中で電極間中心距離も得られる。
【０１１６】
実施例4-1：網膜プロテーゼシステム内の25×25刺激電極アレイの４つのバリエーションについての有限要素モデル
網膜プロテーゼシステム内の25×25刺激電極アレイの４つのバリエーションについての有限要素モデルを作成した：(i)刺激電極を囲むグリッド状の共通対電極を有する平面アレイ、(ii)遠位対電極を有する平面電極アレイ、(iii)対電極として作用するグリッドに囲まれた刺激電極を有する三次元電極アレイ、(iv)遠位対電極を有する三次元電極。全て、本発明に従って被覆した。
電極間距離は100μmに維持し、3Dモデルのウェル深さは30μmであった。他の全てのモデルパラメータは、Djilasら(2011)又はWO2011135273(A1)(これらの方法及びプロセスは本明細書に参考として組み込まれる)に記載されたものと同じであった。
次に、刺激目的に、エイブラハム・リンカーンの画像をクロッピングして、25×25平方の画像にダウンサンプリングし、色調(color palette)を256から３色：白、グレイ及び黒に減少させた(図13(A)及び(B)を参照)。その後、刺激電極に、クロッピングした画像の色に比例する電流密度を割り当てることにより、この得られた画像を有限要素モデルにマッピングした：白色には０、グレイには1000A/m2、黒色には2000A/m2。
【０１１７】
実施例4-2：インプラント製作
本研究で使用したインプラントテンプレートはポリイミド製であった。或いは、幾つかのインプラントは、比較のために、ホウ素をドープしたダイヤモンド(BDD)又は白金電極を用いて作製した。他の２、３のインプラントは電極無しのブランクのままとした。
BDD電極を含むインプラントは、以下の通りに作製した：KOHウエットエッチングを利用してシリコンモールドを作製した：角錐台を達成するため、110及び100配向結晶面のエッチングスピードを補償する構造を追加した特殊なデザインを必要とした。シリコンモールドの空洞が典型的には高さ30μmに達したらこのプロセスを停止した。最終的なモールドを図15に示す。
図14は電極モデリングの例を示す。この観測結果は、刺激された平面電極の側面図を示すパネル(当該パネル上で、隣接する２つの電極間のクロストークがより多いようにみえる)により確証される。実際、このクロストークは3D電極により格段に低減され、3D構成で作成した画像の画素はより高い解像度を示す(Djilasら，2011)。
【０１１８】
基体上へのBDD電極の選択的成長を可能にする特定プロセスを、他に記載されたとおりに使用した(Girardら，2009)。このプロセスは、基体上にナノダイヤモンドのシード(直径約５nm)を堆積させることからなる。次に、基体上にアルミニウムマスクをスパッタし、フォトリソグラフィーでパターン化する。最後に、非保護ナノダイヤモンドを、酸素プラズマ下での反応性イオンエッチング(RIE)によりエッチングして除き、アルミニウムマスクをウエットエッチングで除去する。マイクロ波プラズマ促進化学蒸着(MPECVD)反応器を使用して、他(Kiranら，2012，12，7669)に記載された成長条件を用いてメタン(CH4)と水素(H2)とトリメチルボロン(TMB)とのガス混合物中で、ホウ素がドープされたダイヤモンドを合成する。
得られたダイヤモンド層の厚さは約300nmであり、ドーピングレベルは2.5×1021ホウ素at.cm-3のオーダーであった。
１つの特定の実施形態では、得られたダイヤモンド層の厚さは500nm未満、好ましくは300nm未満、より好ましくは300〜180nmである。
ドーピングレベルは0.01〜100×1021ホウ素at.cm-3、好ましくは１〜10×1021ホウ素at.cm-3、より好ましくは2.5×1021ホウ素at.cm-3である。
【０１１９】
次に、ポリイミド(PI 2611)を基体上にスピンコートして10μm厚のポリマー層を得た。その後、窒素流下に450℃で６時間ポリイミドを硬化させ、500nm厚のアルミニウム薄膜をスパッタした。最後に、AZ4562(Clariant，Muttenz，Switzerland)厚膜フォトレジストをウェハ上にスピンコートしてインプラント形状を規定し、現像後、ウェハを塩素RIE中に置いてアルミニウム層をエッチングした。インプラントの最終形状を達成するため、マスクされていないポリマーをO2 RIEによりエッチングして除去した。犠牲酸化物層にエッチングし、個々のインプラントを脱離させるため、ウェハをフッ化水素酸(HF)中に浸漬した。最後に、インプラントをDI水で濯ぎ、乾燥させた。
【０１２０】
白金電極を有するインプラントを作製するために使用したプロセスは類似するものであった。ここで、BDD電極堆積工程は、基体上にスパッタし、標準的なフォトリソグラフィーによりパターン化したPt電極の堆積で置き換えられた。第３のシリーズのインプラントは、インプラント上に電極を堆積させなかったことを除き、同様な方法で作製した。
電子顕微鏡撮像は、加速電圧２kVで稼動する電界放出型走査電子顕微鏡(SEM)ZEISS Supra-40を使用して実施した。インプラントは移植期間後にSEMで撮像した。SEM撮像を実施するため、網膜/インプラントアセンブリをパラホルムアルデヒド中で固定し、網膜を剥離させ、インプラントを水中の漸増濃度のエタノール(50％、70％、90％、100％)浴で脱水した。
【０１２１】
実施例4−2：手術手順及びインビボ撮像
ホモ接合型P23Hラット(Lewinら，1998；Machidaら，2000)を、12時間の明/暗周期にて餌及び水を自由摂取として飼育した。全ての実験は、眼科学及び視覚研究における動物使用についての欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)及びARVO(視覚眼科学研究協会)の声明に従って実施した。動物はCO2鎮静作用及び頸椎脱臼により犠牲にし、苦痛を最小限とするあらゆる努力を行った。
プロトタイプを移植するために使用した手術手順は、以前に詳細に記載されたものであった(Salzmannら，2006)。簡潔には、P23H盲目ラットを、ケタミン-キシラジンの4:1混合液(ケタミン100mg/kg、キシラジン10mg/kg)(Ketamine 500：Virbac，Carros，France；xylazine 2%：Rompun(登録商標)，Bayer Pharma，Puteaux，France)の腹腔内注射により麻酔した。スリットナイフで角膜輪部の背後で径方向の小さな強膜切開(1.5mm長)を実施した。限局された網膜剥離を得るため、Viscoat(登録商標)Intraocular viscoelastic Injection(Alcon Laboratories，Hunenberg，Switzerland)を、27Gカニューレで網膜下腔中に強膜切開を通じて注入した。網膜剥離の誘発後、インプラントを網膜下腔に挿入した。手術直後、インプラントの正しい位置は、間接検眼法(フロスト及びレンズ)を用いてインビボで制御した。
手術の１週間後及びその６週間後(犠牲の直前)にインビボ撮像を実施して内視鏡検査で眼底を観察した。ラットプローブを用い、StreamPix Vソフトウエアを備えたMicronIII計量内視鏡(numerical endoscope)(Phoenix Research Laboratories，Pleasanton，California)を眼底撮像に使用した。
【０１２２】
実施例4-3：免疫染色、共焦点撮像及び定量
６〜８週間後、動物はCO2鎮静作用及び頸椎脱臼により犠牲にした。眼を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.1M、pH7.4)中に入れ、解体してインプラントを含む組織断片のみを保管した。この断片をパラホルムアルデヒド(４％ wt/vol)を含むPBS中に４℃で一晩固定し、その後PBS中で濯いだ。
免疫標識については、網膜断片をブロッキング溶液(10％ウシ血清アルブミン(Sigma，St. Louis，Missouri)、１％ Triton X-100(Sigma)、0.5％ Tween 20(Sigma)及び0.1g/Lチメロサール(Sigma)を含むPBS)中で１時間室温(室温は22℃〜25℃であり、特に20℃である)にてインキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液中(希釈1:2)で室温にて２日間インキュベートした。ポリクローナル抗体は、ニワトリGFAPを指向するもの(1:100，LSBio，Seattle，Washington)及びウサギPKCα(C-20)を指向するもの(1:1000，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas)であった。モノクローナル抗体は、マウスGoαを指向するもの(1:200，Chemicon，Darmstadt，Germany)であった。この断片を濯いだ後、二次抗体としてのAlexa(商標)633、Alexa(商標)594及びAlexa(商標)488にそれぞれ結合したヤギ抗ニワトリIgG、ヤギ抗マウスIgG及びヤギ抗ウサギ抗体(1:500，Molecular Probes，Invitrogen，Eugene，Oregon)と１日間インキュベートした。最終のインキュベーション期間中に添加された4',6-ジアミジノ-２-フェニルインドール(DAPI)で細胞核を顕現させた。
【０１２３】
次に、網膜/インプラントアセンブリを濯ぎ、正立型共焦点顕微鏡(Olympus，France)下で視覚化すされる顕微鏡スライド上に、Permanent Mounting medium(MMFrance)とともにマウントした。
3D構造インプラントのウェル内の双極細胞の存在を、各材料について、ウェルあたりの細胞核総数に対する双極細胞の比として定量し、Imarisソフトウェア(Bitplane AG，Zurich，Switzerland))を用いて半自動的に計数した。
【０１２４】
実施例4-4：統計解析
定量のため、３つのポリイミドインプラント、５つのダイヤモンドインプラント、３つの白金インプラントからの結果を、インプラントあたり４〜９ウェルから値を取得して集めた。全てのデータは平均±s.e.m.で表す。生データのガウス分布をShapiro-Wilk正規性検定を用いて検定した。一元配置ANOVAを分散分析を使用し、有意性がある場合、続いてBonferroni事後検定(ガウス分布)又はDunns事後検定(非ガウス分布)のいずれかを行い、各群の平均を比較した。差は、* ｐ＜0.05、** ｐ＜0.01及び*** ｐ＜0.001で有意であるとみなした。
【０１２５】
実施例4-5：可撓性ホイル上のダイヤモンド電極
網膜のような軟組織の湾曲に適合する可撓性基体を作製できる可能性は重要である。ダイヤモンド成長を可能にする合成技法は、軟性基体のほとんどのタイプと適合性のない、高温及びマイクロ波プラズマ技術に依拠している。
軟組織の湾曲に適合する基体を提供することが、本発明の１つの目的である。
本発明者らが開発した解決法は、パターン化ダイヤモンド層に支持を提供するために該パターン化ダイヤモンド層の頂部に堆積させた軟質ポリマーを使用するリフトオフプロセスに基づくものである。パターン化ダイヤモンド層の頂部に堆積した軟質ポリマーであって、該ダイヤモンド層を支持する軟質ポリマーが提供される。
【０１２６】
ポリマー及び本発明による装置の軟度又は硬度を決定することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、ナノスケールレベルでの材料の機械的特性(特に硬度)を評価するためには、高分解能ナノインデンター又は深さ検知インデンテーション(DSI)技法を用いてもよい。
このプロセスを図15(A)に示す。このデバイスは、図15(B)に示したマスクに基づき作製した。
簡潔には、これは、剛性犠牲基体(図15Cのシリコンモールド)上でのダイヤモンド電極の選択的成長(この上に、プロセスの終時に基体から脱離されるポリイミド構造を作製する)により可能になった。図15Dから明らかなように、このアプローチにより、大きな寸法の作製が可能になる。
基体(特にシリコンモールド)上のダイヤモンド電極の選択的成長、ポリイミド構造の作製、任意に、該基体からの該ポリイミド構造の脱離を含んでなるプロセスが提供される。
【０１２７】
実施例4-6：インビボ撮像
ダイヤモンド電極及び金属電極を有する軟質ポリイミドインプラントをP23Hラット(光受容体変性の動物モデル)の網膜下腔に６〜８週間挿入して、組織反応を評価した。MicronIII計量内視鏡を使用して正確なインプラント挿入をインビボで制御した(図16の眼底像を参照)。デバイス上方に網膜血管が存在することにより、インプラントが網膜下に位置していることが確証された。また、この検査により、網膜下インプラントを導入するために生じた網膜下小疱(bleb)の再吸収が目視できた。
【０１２８】
実施例4-7：ダイヤモンドインプラントの特徴決定
原型の作製プロセスにより、ダイヤモンド又は白金で被覆されたか又は被覆されていない幾つかの3Dウェルを提示する軟質インプラントの作製が可能になった。ダイヤモンドの場合、コーティングは、図17B及びEの写真に見られるインプラント上の全面(空洞の壁及び底を含む)を覆う一方、白金の場合、金属被覆範囲はパネルＣ及びＦに薄灰色で現れている。インプラントの物理的安定性を評価するため、移植の６〜８週間後、移植した電極の表面を走査電子顕微鏡(SEM)で観察した。試験した３材料について結果を図17に示す。ポリイミドインプラント(Ａ、Ｄ)では、材料表面は移植前と同様であり、欠陥は認められなかった。図17Aに見られる白色トレースは、SEM撮像中の絶縁表面上での電荷蓄積が原因であることに留意する。同様に、ダイヤモンド薄膜(Ｂ、Ｅ)は不連続性を示さず、適切な表面被覆率を示し、よってポリイミドへのダイヤモンドの良好な接着が示唆される。ダイヤモンド表面は、従来の多結晶BDDとは対照的に、非常に滑らかに見えた。これは、組織に実際に曝されるダイヤモンドの側部が元はシリコン表面に接触していた平滑面となるインプラント作製方法に起因する。
【０１２９】
最後に、金属インプラント(Ｃ、Ｆ)では、白金に対応する薄灰色領域もまた、有意な欠陥がないように見え、有機物(残留細胞)のためにより濃く見える。したがって、ダイヤモンド及び白金の両方の表面は移植期間中に損傷していない。これら全てのインプラントに関して、幾らかの細胞又は組織はインプラント上で見え続け、拡大図(Ｄ〜Ｆ)では空洞内に特に集中している。網膜ニューロン、特に双極細胞の存在を確認するため、免疫染色及び共焦点撮像により3D構造内に残留しているこれら細胞の性質を調べた。結果は下記セクションに示す。
【０１３０】
実施例4-8：双極細胞遊走
組織とプロテーゼデバイスとの接合を調べるため、切片化の前にデバイスを除去するか又はしないで切片を通例のように作製した。しかし、この組織学的手順は、ポリイミドプロトタイプに関する以前の研究でも実施できたが(Salzmanら，2006；Djilasら，2011)、金属電極及びBDD電極の存在のため、このアプローチは、観察試料の劣化なしには非現実的であった。事実、一部のポリイミドプロトタイプの機械的剛性によれば、インプラントの凍結切片化は、上記で説明したような試料の解離をしばしば誘導した(Djilasら，2011)。本インプラント上での金属電極又はダイヤモンド電極の存在のため、より大きい困難が見込まれた。したがって、生物学的試料を維持するため、共焦点顕微鏡観察に基づき、組織/インプラント接合の直接観察を可能にする革新的なアプローチを開発した。網膜及びインプラントの両方を含む全載標本(wholemount preparation)として網膜双極ニューロン及びグリア細胞を免疫標識した。網膜組織内で距離100μmにわたって抗体拡散を可能にしつつ、この相互作用を維持するように免疫染色プロトコルを適合させた。図18は、ダイヤモンドインプラントについての組織/インプラント界面の共焦点画像(Ａ〜Ｂ)を、細胞定量のための画像処理(Ｃ〜Ｅ)と併せて示す。
【０１３１】
細胞核はDAPI染色(青)で標識した一方、グリア細胞及び網膜双極ニューロンはGFAP抗体(灰色)並びにGoα抗体及びPKCα抗体(緑及び赤)でそれぞれで免疫標識した。網膜/インプラント全載標本の20倍拡大表示(Ａ)により、25の全ての空洞中での核染色の存在の目視が可能になる。また、40倍拡大画像(パネルＢ)により、空洞を満たす双極細胞の形態がより良好に観察できるようになる。垂直網膜切片に類似する側面図(X-Z軸)により、底部までの空洞全体を満たす緑色の網膜双極ニューロンが示された。上面図(X-Y軸)により、双極細胞が材料にかかわらず各ウェル内に高密度で存在することが確証された。
材料の生体適合性を更に評価するため、空洞内の細胞核数(Ｄ)及び各空洞内の全細胞核に対する双極ニューロンのパーセンテージ(Ｅ)を定量した。この定量には、単一ウェル中の全画素を分離し、この中で双極細胞核の免疫標識に対応する球体を規定して計数することが必要であった(Ｃ)。図18は、異なる材料のウェル中の全てのON双極細胞の細胞計数を説明する。この画像は、残存網膜が、3Dインプラントウェルの形状を形作るように非常に可塑性のままである証拠を提供する。更に、ウェル内に広範な線維性炎症反応がなく、むしろ双極ニューロンが存在することは、本発明による異なる材料がニューロンに対して毒性でないことを示唆する。
【０１３２】
結論：
P23Hラットの網膜下腔に挿入した3Dプロトタイプを用いた結果により、網膜が、その空洞内で双極細胞ニューロンが十分に統合されているウェルの形状になることを示す。本発明は刺激の物理的限局を提供する。また、これら実験により、平面電極を有するインプラントと比較して、3Dプロトタイプを有するインプラントと組織との組織/インプラント接合の増大した安定性が示された。結果として、このようなウェル中での双極細胞の刺激は、隣接ウェルにより活性化される隣接網膜カラムとは独立に、網膜カラムを活性化する。したがって、本発明による網膜下インプラントの三次元デザインにより、各電極を独立画素と考えることができるようになる。
この結果は、ダイヤモンドが可撓性インプラント作製法と適合性であること、ダイヤモンド電極との接触による組織瘢痕化が低いこと、隣接電極とは独立に各電極近傍のニューロンを選択的に刺激することが可能であることを示す。この研究は、ナノ結晶ダイヤモンドが、慢性移植の間、網膜組織(より一般的にはグリア細胞及びニューロン)にとって安全であることを明白に証明している。
したがって、本発明の目的は、従来技術で開示されているものと比較して大幅な向上である。
本研究により、刺激の分解能を大幅に向上させる網膜インプラントという構想のための3D構造電極の有益性が確証される。また、このことは、ニューロプロテーゼ(特に、可撓性ニューロプロテーゼ)用の魅力的な電極材料としてのダイヤモンドの提供を強調する。
【０１３３】
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【図１−１】
0006280565.tif 000004
【図１−２】
0006280565.tif 000005
【図２】
0006280565.tif 000006
【図３】
0006280565.tif 000007
【図４−１】
0006280565.tif 000008
【図４−２】
0006280565.tif 000009
【図５】
0006280565.tif 000010
【図６−１】
0006280565.tif 000011
【図６−２】
0006280565.tif 000012
【図７−１】
0006280565.tif 000013
【図７−２】
0006280565.tif 000014
【図８】
0006280565.tif 000015
【図９】
0006280565.tif 000016
【図１０】
0006280565.tif 000017
【図１１】
0006280565.tif 000018
【図１２】
0006280565.tif 000019
【図１３】
0006280565.tif 000020
【図１４】
0006280565.tif 000021
【図１５】
0006280565.tif 000022
【図１６】
0006280565.tif 000023
【図１７】
0006280565.tif 000024
【図１８】
0006280565.tif 000025
【図１９】
0006280565.tif 000026