(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子挿入プロトコールに従い処理されたゲノムの配列データを電子的に受け取るステップと、
少なくとも発現ベクターに関係する１つまたは複数の参照データ配列を電子的に受け取るステップであって、１つまたは複数の参照データ配列が、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターから選択される、ステップと、
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて、前記配列データおよび少なくとも１つの参照データ配列の間の最高の配列類似性および整列長を決定するステップと、
前記配列データと参照データ配列のうちの少なくとも１つの間の関連に基づき、前記配列データの少なくとも１つの参照データ配列のそれぞれの位置を決定するステップと、
少なくとも１つの参照データ配列のそれぞれの決定された位置に応じて導入遺伝子隣接配列を同定するステップと、
導入遺伝子の１つまたは複数の挿入部位のそれぞれの位置を決定するために、ゲノム内の同定された導入遺伝子隣接配列を検索するステップと、
前記検索ステップで１つまたは複数の挿入部位のそれぞれの決定された位置が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートするステップと、
さらなる分析および可視化の少なくとも１つのためのアノテーションを含むアノテートされたデータを得るステップと、
を含む、分析方法。
【請求項２】
参照データが、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つにさらに関係している、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
参照データが、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターにさらに関係している、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
配列データ内の第１の参照データ配列を検索するステップと、
前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項５】
第２の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
第１の参照データ配列が発現ベクターであり、第２の参照データ配列がアダプターである、請求項４に記載の分析方法。
【請求項７】
第１の参照データ配列および第２の参照データ配列が、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される、請求項４に記載の分析方法。
【請求項８】
導入遺伝子隣接配列および参照データを可視化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ゲノム内の１つまたは複数の挿入部位を可視化するステップをさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１０】
挿入部位の上流および下流のゲノムの配列情報を特徴付けるステップをさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１１】
挿入部位の１０キロ塩基対上流および１０キロ塩基対下流のゲノムの配列情報が特徴付けられる、請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させるステップと、
整列された配列の定性分析を行うステップと
をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１３】
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させるステップと、
整列された配列の定量分析を行うステップと
をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１４】
ゲノムが、植物ゲノムの少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けるステップが、配列データに対して参照データ配列の少なくとも１つをマッチさせるアルゴリズムを使用することを含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１６】
アルゴリズムがＬＡＳＴＺアルゴリズムである、請求項１５に記載の分析方法。
【請求項１７】
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索するステップが、少なくとも１つの挿入部位の上流および下流の配列をゲノムとともに特定するアルゴリズムを使用することを含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１８】
アルゴリズムがＢＬＡＳＴアルゴリズムである、請求項１７に記載の分析方法。
【請求項１９】
導入遺伝子挿入プロトコールに従い処理されたゲノムの配列に関係した配列データを受け取るためのモジュールと、
少なくとも発現ベクターに関係した１つまたは複数の参照配列を受け取るためのモジュールであって、１つまたは複数の参照データ配列が、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターから選択される、モジュールと、
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて、前記配列データおよび少なくとも１つの参照データ配列の間の最高の配列類似性および整列長を決定するステップと、
前記配列データと参照データ配列の少なくとも１つの間の関連に基づき、少なくとも１つの参照データ配列のそれぞれの位置を決定し、
少なくとも１つの参照データ配列のそれぞれの決定された位置に応じて導入遺伝子隣接配列を同定し、
ゲノム内の同定された導入遺伝子隣接配列を検索し、
導入遺伝子隣接配列の検索結果に基づいて導入遺伝子の１つまたは複数の挿入部位のそれぞれの位置を決定し、
１つまたは複数の挿入部位の決定された位置が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートし、
さらなる分析および可視化の少なくとも１つのためのアノテーションを含むアノテートされたデータを与える、
ように作動可能な計算モジュールと、
を含む、分析システム。
【請求項２０】
参照配列が、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つにさらに関係している、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２１】
参照配列が、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターにさらに関係している、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２２】
前記計算モジュールが、
配列データ内の第１の参照データ配列を検索し、
前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索する
ようにさらに作動可能である、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２３】
第２の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される、請求項２２に記載の分析システム。
【請求項２４】
第１の参照データ配列が発現ベクターであり、第２の参照データ配列がアダプターである、請求項２２に記載の分析システム。
【請求項２５】
第１および第２の参照データ配列が、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される、請求項２２に記載の分析システム。
【請求項２６】
導入遺伝子隣接配列と、左クローニングベクター、発現ベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つとを可視化するためのモジュールをさらに含む、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２７】
ゲノム内の１つまたは複数の挿入部位を可視化するためのモジュールをさらに含む、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２８】
前記計算モジュールが、挿入部位の上流および下流のゲノムの配列情報を特徴付けるようにさらに作動可能である、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項２９】
前記計算モジュールが、挿入部位の１０キロ塩基対上流および１０キロ塩基対下流のゲノムの配列情報を特徴付けるように作動可能である、請求項２８に記載の分析システム。
【請求項３０】
前記計算モジュールが、
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させ、
整列された配列の定性分析を行う、
ように作動可能である、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項３１】
前記計算モジュールが、
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させ、
整列された配列の定量分析を行う、
ように作動可能である、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項３２】
ゲノムが、植物ゲノムの少なくとも一部である、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項３３】
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けることが、配列データに対して参照データ配列の少なくとも１つをマッチさせるアルゴリズムを使用することを含む、
請求項１９に記載の分析システム。
【請求項３４】
アルゴリズムがＬＡＳＴＺアルゴリズムである、請求項３３に記載の分析システム。
【請求項３５】
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索することが、少なくとも１つの挿入部位の上流および下流の配列をゲノムとともに特定するアルゴリズムを使用することを含む、請求項１９に記載の分析システム。
【請求項３６】
アルゴリズムがＢＬＡＳＴアルゴリズムである、請求項３５に記載の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／５９６，５４０号、および２０１２年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／６０１，０９０号の利益を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれている。
【０００２】
本開示は、シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データのコンピューター分析に部分的に関する。より具体的には、本開示は、導入遺伝子挿入部位などのゲノム修飾を同定および分析するコンピューター化されたプロセスに部分的に関する。
【背景技術】
【０００３】
導入遺伝子隣接配列の同定および特徴付けは、導入遺伝子配列を含む生成物の商業化および登録に必要とされる場合がある。導入遺伝子隣接配列の同定および特徴付けは、ＥＸＺＡＣＴ（商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙブランドのゲノム修飾技術によって生じるイベントの特徴付けのように、他のタイプの活性にとっても重要であり得る。例えば、ＥＸＺＡＣＴ（商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙブランドのゲノム修飾技術は、ゲノム修飾に関する最先端の多用途でロバストなツールキットである。これは、配列特異的ＤＮＡ配列に結合するように設計することができるタンパク質である亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）の設計および使用に基づく。ＥＸＺＡＣＴ（商標）ブランドの技術を使用して、生物のゲノム内でＺＦＮ促進二本鎖切断を生じさせ、それによって、ＤＮＡ配列中の対象とする特定の遺伝子座で導入遺伝子の標的化挿入をもたらすことができる。
【０００４】
導入遺伝子隣接配列は、ゲノム組込み部位の染色体隣接領域、および組み込まれた導入遺伝子からなる。導入遺伝子隣接配列は、染色体の特定の位置への導入遺伝子の組込みから生じる欠失、反転、または挿入を含み得る。導入遺伝子ＤＮＡ、シークエンシングで使用されるクローニングベクター、導入遺伝子隣接領域配列を単離するのに使用されるプライマーおよび／またはアダプター、導入遺伝子が組み込まれた染色体配列、ならびに予期しない再配列を介してゲノム内に挿入された他の無関係なＤＮＡ断片の間に、核酸類似の領域が存在する場合がある。
【０００５】
導入遺伝子隣接領域配列を単離するのに、様々な方法を使用することができる。次いでこの導入遺伝子隣接領域配列を、従来のジデオキシシークエンシング法、鎖停止シークエンシング法を使用して、または次世代シークエンンシング（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法を介して配列決定することができる。
【０００６】
Ｂｒａｕｔｉｇｍａら、２０１０年、に記載されたように、ＤＮＡ配列分析は、単離および増幅された断片のヌクレオチド配列を決定するのに使用することができる。増幅された断片は、単離し、ベクター中にサブクローン化し、チェーンターミネーター法（サンガーシークエンシングとも呼ばれる）または色素−ターミネーターシークエンシングを使用して配列決定することができる。さらに、単位複製配列を次世代シークエンシングで配列決定することができる。ＮＧＳ技術は、サブクローニングステップを必要とせず、複数のシークエンシング読み取りを単一反応内で完了することができる。３つのＮＧＳプラットフォーム、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ製Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ、Ｓｏｌｅｘａ製Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」の頭字語）が市販されている。さらに、現在開発されている２つの単一分子シークエンシング法が存在する。これらとしては、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  ＴｉｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＲＴ）がある。
【０００７】
４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅが販売しているＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸは、シークエンシング読み取りを生じさせるのにエマルジョンＰＣＲおよびピロシークエンシングを使用するロングリードＮＧＳである。３００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片、または３〜２０ｋｂｐの断片を含むライブラリーを使用することができる。反応により、２５０〜４００メガベースの全収率について、１実行当たり約２５０〜４００塩基の１００万を超える読み取りが生じ得る。この技術は、最も長い読み取りを生じさせるが、１実行当たりの総配列出力は、他のＮＧＳ技術と比較して低い。
【０００８】
Ｓｏｌｅｘａが販売するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒは、蛍光色素標識可逆性ターミネーターヌクレオチドを用いた合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）手法を使用し、固相架橋ＰＣＲ（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ＰＣＲ）に基づくショートリードＮＧＳである。最大１０ｋｂのＤＮＡ断片を含むペアエンドシークエンシングライブラリーの構築を使用することができる。反応により、１億回を超える、長さが３５〜７６塩基である短い読み取りが生じる。このデータは、１実行当たり３〜６ギガベースを生成することができる。
【０００９】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが販売するＯｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システムによるシークエンシングは、ショートリード技術である。このＮＧＳ技術は、長さが最大１０ｋｂｐである断片化された二本鎖ＤＮＡを使用する。このシステムは、色素標識オリゴヌクレオチドプライマーのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびエマルジョンＰＣＲによるシークエンシングを使用して、１０億の短い読み取りを生じさせ、それは、１実行当たり最大３０ギガベースの総配列出力をもたらす。
【００１０】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｔＳＭＳおよびＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴは、配列反応に単一ＤＮＡ分子を使用する異なる手法を適用する。ｔＳＭＳ  Ｈｅｌｉｃｏｓシステムは、最大８億の短い読み取りを生じさせ、それは、１実行当たり２１ギガベースをもたらす。これらの反応は、「合成時解読」手法として記載されている蛍光色素標識仮想ターミネーターヌクレオチドを使用して完了される。
【００１１】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが販売するＳＭＲＴ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムは、リアルタイム合成時解読を使用する。この技術は、可逆性ターミネーターによって制限されない結果として、長さが最大１０００ｂｐの読み取りを生じることができる。二倍体ヒトゲノムの１倍のカバー率に等価である生の読み取りスループットを、この技術を使用して１日当たりに生じさせることができる。
【００１２】
導入遺伝子ＤＮＡ配列が染色体ＤＮＡ隣接配列および任意の染色体再配列と区別される場合のＤＮＡシークエンシングデータの分析は、特に、多数の配列データセットについて手作業で行われる場合、時間がかかる。導入遺伝子ＤＮＡ配列を手作業で同定およびアノテートし、これらの配列を、ゲノム内に導入遺伝子を組み込むことから生じる再配列、欠失、および付加と区別することは、労力を要する、困難なタスクであり、その結果は、人為的エラーを起こしやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
導入遺伝子がゲノム中に組み込まれていることを確認するため、およびランダムな組込みによって挿入され、または相同的組換えを介して部位特異的遺伝子座に標的化される場合、導入遺伝子の特定の染色体位置を同定するために、ハイスループット法が必要とされる。配列データを分析し、生物のゲノム内の導入遺伝子挿入部位を定義するための柔軟なハイスループット導入遺伝子隣接配列分析システムが提供される。本方法は、一実施形態では、例えば、下記に限定されないが、完全ゲノムの連続したＤＮＡ断片内で、導入遺伝子、および染色体隣接配列を含む導入遺伝子隣接配列を同定およびアノテートするステップを含む。分析システムは、一実施形態では、グラフィカルユーザーインターフェース、解析パイプライン、および入力配列のためのサマリー表示を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
例示的な実施形態では、本開示は、分析方法を含む。本方法は、配列データを電子的に受け取るステップと、少なくとも発現ベクターに関係する１つまたは複数の参照データ配列を電子的に受け取るステップと、参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて導入遺伝子隣接配列を同定するステップと、ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索するステップと、１つまたは複数の挿入部位が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートするステップとを含む。
【００１５】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、少なくとも１つのプライマーにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、少なくとも１つのアダプターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、少なくともプライマーおよびアダプターに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、少なくとも１つのクローニングベクターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、右クローニングベクターおよび左クローニングベクターにさらに関係している。
【００１６】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データは、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、右クローニングベクター、および導入遺伝子発現ベクター配列の少なくとも１つにさらに関係している。
【００１７】
上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照データは、クローニングベクター、プライマー、およびアダプターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照データは、左クローニングベクター、右クローニングベクター、プライマー、およびアダプターにさらに関係している。
【００１８】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、本方法は、配列データ内の第１の参照データ配列を検索するステップと、前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索するステップとをさらに含む。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１の参照データ配列は、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクター配列からなる群から選択される。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第２の参照データ配列は、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクター配列からなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１の参照データ配列は、発現ベクターであり、第２の参照データ配列は、アダプターである。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１の参照データ配列および第２の参照データ配列は、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される。
【００１９】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データ配列と配列データを関連付けるステップは、参照データ配列の正確な配列を見つけることを含む。上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照データ配列と配列データを関連付けるステップは、参照データ配列中の塩基対の５パーセントの誤差の範囲内で配列を見つけることを含む。
【００２０】
追加の例示的な実施形態では、本開示は、分析システムを含む。本実施形態では、本システムは、配列データを受け取るためのモジュール、少なくとも発現ベクターに関係した１つまたは複数の参照配列を受け取るためのモジュール、ならびに参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて、導入遺伝子隣接配列を同定し、ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索し、１つまたは複数の挿入部位が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートするように作動可能な計算モジュールを含む。
【００２１】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、少なくとも１つのプライマーにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、少なくとも１つのアダプターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、少なくともプライマーおよびアダプターに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、少なくとも１つの発現ベクター配列にさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、少なくとも１つのクローニングベクターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、右クローニングベクターおよび左クローニングベクターにさらに関係している。
【００２２】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照配列は、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、右クローニングベクター、および発現ベクター配列の少なくとも１つにさらに関係している。
【００２３】
上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照配列は、少なくともクローニングベクター、プライマー、およびアダプターにさらに関係している。上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照配列は、少なくとも右クローニングベクター、左クローニングベクター、プライマー、およびアダプターにさらに関係している。
【００２４】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、計算モジュールは、配列データ内の第１の参照データ配列を検索し、前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索するようにさらに作動可能である。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１の参照データ配列は、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクター配列からなる群から選択される。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第２の参照データ配列は、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクター配列からなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１の参照データ配列は、発現ベクターであり、第２の参照データ配列は、アダプターである。上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、第１および第２の参照データ配列は、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される。
【００２５】
上記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、参照データ配列と配列データを関連付けることは、参照データ配列の正確な配列を見つけることを含む。上記実施形態のいずれかの別のさらなる実施形態では、参照データ配列と配列データを関連付けることは、参照データ配列中の塩基対の５パーセントの誤差の範囲内で配列を見つけることを含む。
【００２６】
本開示の追加の特徴および利点は、本発明を実施する最良モードを例示する例示的な実施形態の以下の詳細な説明を考慮すると、当業者に明らかとなるであろう。
【００２７】
図面の詳細な説明は、特に添付の図面に言及するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】本開示の実施形態による、左クローニングベクター、プライマー、発現ベクター、導入遺伝子隣接領域配列、アダプター、および右クローニングベクターを含む、生成される一般的な配列を示す例示的な図である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態による、ゲノム配列のセクション同士間に挿入される、発現ベクター、プライマー配列、および導入遺伝子隣接領域配列を含むゲノム内の導入遺伝子挿入を示す例示的な図である。
【図２Ａ】本開示の実施形態による、試料入力から分析システムへのデータおよび試料のフローを示す図である。
【図２Ｂ】本開示の実施形態による、データ分析方法を示す流れ図を示す図である。
【図３】本開示の実施形態によるデータ分析器の系統図である。
【図４】本開示の実施形態による、データ分析の方法を示す流れ図である。
【図５Ａ】図４の流れ図による、隣接配列同定処理配列または方法を示す流れ図である。
【図５Ｂ】導入遺伝子隣接配列を同定およびマークする方法を示す流れ図である。
【図５Ｃ】図５Ａの流れ図によって導入遺伝子隣接配列を同定する方法の別の実施形態を示す流れ図である。
【図６】本開示の実施形態による例示的な配列の図である。
【図７】本開示の実施形態による同定システムの例示的な入力画面の図である。
【図８】本開示の実施形態による分析システムからの例示的な出力の図である。
【図９Ａ】発現ベクター、アダプター、プライマー、および導入遺伝子隣接配列の場所を示す例示的な画面の図である。
【図９Ｂ】図９Ａでグラフィカルに同定された入力配列の図である。
【図９Ｃ】図９Ａでグラフィカルに同定された導入遺伝子発現ベクター１０３の配列の図である。
【図９Ｄ】図９Ａでグラフィカルに同定されたアダプター配列の図である。
【図９Ｅ】図９Ａでグラフィカルに同定されたプライマー配列の図である。
【図９Ｆ】図９Ｂの入力配列から同定された導入遺伝子に隣接するゲノム配列の図である。
【図１０】プライマーを含むが、右クローニングベクターをまったく含まない導入遺伝子隣接配列を示す例示的な画面の図である。
【図１１】発現ベクター配列を含むが、クローニングベクターをまったく含まない導入遺伝子隣接配列を示す例示的な画面コピーの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
対応する参照文字は、いくつかの図にわたって対応する部分を示す。本明細書で提示した例示は、本開示の例示的な実施形態を説明し、このような例示は、いずれの様式でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００３０】
本明細書に記載の本開示の実施形態は、網羅的であることを、または開示した正確な形態に本開示を限定することを意図していない。むしろ、説明のために選択した実施形態は、当業者が本開示の主題を実行することを可能にするように選ばれている。本開示は、分析システムの特定の構成を記載するものであるが、本明細書に提示の概念は、本開示と一致する他の様々な構成において使用され得ることが理解されるべきである。さらに、導入遺伝子隣接配列の分析が論じられているが、本明細書の教示は、他の配列の分析に適用することができる。記載したシステムおよび方法は、導入遺伝子隣接配列を同定し、特徴付けるための任意の分子法からの出力に適用可能であり得、本システムおよび方法は、ゲノム内の１つまたは複数の導入遺伝子挿入部位を特定する自動化された方法を提供する。一実施形態では、本方法およびシステムは、挿入部位におけるまたはその付近の局所環境内で再配列が存在するか否かを判定するために、近隣配列、および挿入部位の周囲の局所環境も提供する。
【００３１】
理想的な単離された挿入配列は、図１Ａを参照して示す実施形態によれば、左クローニングベクター１０１、プライマー１０５、導入遺伝子隣接領域配列１０７、導入遺伝子発現ベクター配列１０３、アダプター１０９、および右クローニングベクター１１１を含む。左クローニングベクター１０１および右クローニングベクター１１１は、クローニングベクターの一部であり、これは、ＤＮＡの第２の配列が中に挿入され得るＤＮＡの第１の配列である。ＤＮＡの第２の配列を挿入すると、クローニングベクターが右（３’部分）クローニングベクター１１１および左（５’部分）クローニングベクター１０１に分けられる。一実施形態では、クローニングベクターの消化は、制限酵素によって、または当技術分野で公知の別の方法を介して完了され、それによって切断されたＤＮＡ断片がもたらされる。単一特異的部位でクローニングベクターを消化すると一般に、既知の左クローニングベクター１０１および右クローニングベクター１１１の配列が生じる。ゲノム配列中に挿入される挿入配列を、図１Ｂに関して示す。発現ベクター１０３は、標的細胞内に遺伝子を導入するのに使用される配列である。プライマー１０５は、ＤＮＡ合成のプロセスを始めるのに使用される短いＤＮＡ配列である。発現ベクター１０３は一般に、ゲノム中に導入遺伝子を組み込むのに使用される配列である。導入遺伝子隣接領域配列１０７は、導入遺伝子挿入部位のすぐ上流または下流のゲノム配列であり、本実施形態では、この配列は、既知であっても、未知であってもよい。アダプター１０９は、導入遺伝子隣接配列１０７の末端にライゲートまたはアニールされる短いオリゴヌクレオチド配列である。本実施形態では、アダプター１０９の配列は既知であり、配列の末端をマークするのに使用され、未知の導入遺伝子隣接配列１０７を増幅またはシークエンス（配列決定）するのに使用することもできる。導入遺伝子隣接配列１０７は、組み込まれた導入遺伝子に隣接するゲノム組込み部位の染色体隣接領域からなる。導入遺伝子隣接配列は、染色体の特定の位置内に導入遺伝子を組み込むことから生じる欠失、反転、または挿入を含み得る。一実施形態では、単離された配列は、図１Ａに例示したように左クローニングベクター１０１、プライマー１０５、発現ベクター配列１０３、導入遺伝子隣接領域配列１０７、アダプター１０９、および右クローニングベクター１１１として並べられているが、配列の順序は、図１Ａおよび図１Ｂに例示したものに限定されない。
【００３２】
図１Ｂに示したように、プライマー１０５、発現ベクター１０３、導入遺伝子隣接領域配列１０７は、ゲノム配列中に挿入され、ゲノム配列内に現れる。アダプター配列は、導入遺伝子隣接配列を単離するのに使用される方法の一部として、後に組み入れられる。次いで、図１Ａに表した得られた導入遺伝子隣接配列は、以下に示すデータ分析法を使用して引き続いて分析される。理想的な配列では、左クローニングベクター１０１、発現ベクター１０３、プライマー１０５、アダプター１０９、および右クローニングベクター１１１の配列は、すべて既知である。実際には、理想的な配列のセクションの１つまたは複数は、欠損している場合があり、または変化を含む場合がある。
【００３３】
図２Ａは、試料入力から分析システム２０７へのデータおよび試料のフローを示す。図２Ｂは、本開示の実施形態によるデータ分析の方法を示す流れ図２２０を示す。ボックス２２１では、入力試料２０１が、例えば、かつ以下に限定されないが、ＺＦＮ開始導入遺伝子挿入プロトコールを用いて準備される。このプロトコールでは、既知配列の１つまたは複数の部分、例えば、プライマー１０５またはアダプター１０９などが、配列も既知である標的ゲノムに付加される。試料は、導入遺伝子挿入の他の方法によっても準備することができる。導入遺伝子挿入プロセスにより、ゲノム中の１つまたは複数の部位で挿入を有する修飾配列が作られる。例示的な修飾配列を図１Ｂに示す。
【００３４】
ボックス２２３では、１つまたは複数のシーケンサー（配列決定装置）２０５により、１つまたは複数の入力試料２０１から配列データが生成される。シーケンサー２０５は、ゲノム中の挿入の位置を同定するのに使用される導入遺伝子隣接領域配列を判定し、導入遺伝子挿入の特定配列を確認する。試料データは、本実施形態では、配列データを含む１つまたは複数のテキストファイルの形態である。
【００３５】
入力試料２０１は、シーケンサー２０５のプロトコールまたは取扱説明書に従って、シーケンサー２０５内に装填される。例えば、Ｓｏｌｅｘａ  ＩＬＬＵＭＩＮＡブランドの配列決定機（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）またはＲｏｃｈｅ４５４ブランドの配列決定機を使用することができる。シーケンサー２０５は、配列２０１に関係するデータを生成する。データは、以下に限らないが、入力試料２０１中のＤＮＡ鎖の配列に関係する情報を含有する、１つまたは複数のテキストファイル、標準フローグラム形式（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ）（「ＳＦＦ」）もしくは同様のファイル、画像ファイル、または他のデータファイルを含み得る。一実施形態では、配列情報は、信頼度データも含み、その結果、配列中の各塩基は、それに関連する信頼区間を有することができ、または各配列は、それに関連する信頼区間を有する。信頼区間は、シーケンサーによって計算される数学的計算であり、シーケンサー２０５による特定の塩基の読み取りの強度を含み得る。例示的な一例では、信頼区間は、１〜９の整数である。この例では、１の信頼区間は、シーケンサー２０５が、報告された塩基がＤＮＡ鎖中の塩基であったことの相対的に低い信頼度を有することを示す。９の信頼区間は、シーケンサー２０５が、報告された塩基がＤＮＡ鎖中の塩基であったことの相対的に高い信頼度を有することを示す。一実施形態では、シーケンサー２０５は、信頼区間に加えて他の情報も報告する。例えば、シーケンサー２０５は、塩基をいつ読み取ることができなかったかを報告することができる。
【００３６】
シーケンサー２０５からのデータは、分析システム２０７に提供される。一実施形態では、データは、シーケンサーと分析システム２０７との間のネットワークもしくは専用接続によって、またはシーケンサーから分析システム２０７へのリムーバブル記憶装置によって、提供される。別の実施形態では、シーケンサーは、画面またはプリンターにデータをプリントし、データは、例えば、以下に限定されないが、キーボードまたはスキャナーから分析システム２０７に入力される。一実施形態では、分析システム２０７は、シーケンサーの一部である。
【００３７】
ボックス２２５では、参照試料情報２０３が分析システム２０７に伝送される。参照試料情報２０３は、以下に限らないが、単一配列として提供され得る左クローニングベクターおよび右クローニングベクター、発現ベクター１０３、プライマー１０５、ならびにアダプター１０９の配列を含み得る。配列情報は、一実施形態では、ネットワークを介して分析システム２０７に移される。別の実施形態では、参照試料情報２０３は、シーケンサー２０５からの配列情報とともに分析システム２０７に伝送される。
【００３８】
ボックス２２７では、以下により十分に記載するが、分析システム２０７は、１つまたは複数のシーケンサー２０５から配列データを受け取り、この配列データを分析する。分析システム２０７は、入力として参照試料データ２０３も採用する。参照試料データ２０３は、例えば、以下に限定されないが、アダプター１０９、プライマー１０５、左クローニングベクター１０１および／もしくは右クローニングベクター１１１、発現ベクター１０３の配列情報、または標的ゲノム配列情報を含み得る。一実施形態では、標的ゲノム配列データ全体が分析システム２０７に提供される。別の実施形態では、標的ゲノム配列全体のサブセットが分析システム２０７に提供される。さらに別の実施形態では、分析システム２０７は、標的ゲノム配列のすべてまたは一部についての要求を別のシステムに送る。分析システム２０７によって生成されるマッチした配列データおよび他のデータは、追加の処理を受ける。追加の処理として、以下に限らないが、可視化、定量化、他の試料もしくは他の試行からのデータの集合、または標的ゲノム配列との比較を挙げることができる。追加の処理は、一実施形態では、別のシステムによって実施される。別の実施形態では、分析システム２０７が追加の処理のすべてまたは一部を実施する。追加の処理を以下に記載する。
【００３９】
図３は、本開示の実施形態による分析システム２０７のコンポーネントビューを示す。分析システム２０７は、入力モジュール３０３、計算モジュール３０５、出力モジュール３０７、および可視化モジュール３１１を含むことができ、これらは、一実施形態では、分析システム２０７のメモリー３１５内に存在する。モジュールは、分析システム２０７の制御装置３２５によって実行することができる。一実施形態では、制御装置３２５は、１つまたは複数のプロセッサであり、制御装置３２５は、制御装置３２５およびメモリー３１５へのアクセスを制御するためのオペレーティングシステムソフトウェアを含む。メモリー３１５は、コンピューター可読媒体を含む。コンピューター可読媒体は、分析システム２０７の１つまたは複数のプロセッサによってアクセスされ得る任意の利用可能な媒体とすることでき、揮発性媒体および非揮発性媒体の両方を含む。さらに、コンピューター可読媒体は、リムーバブル媒体および非リムーバブル媒体の一方または両方であり得る。例として、コンピューター可読媒体として、以下に限らないが、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリー、もしくは他のメモリー技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、もしくは他の光ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置、もしくは他の磁気記憶装置、または所望の情報を記憶するのに使用することができ、分析システム２０７によってアクセスされ得る任意の他の媒体を挙げることができる。分析システム２０７は、単一システムであってもよく、または互いに連通している２つ以上のシステムであってもよい。一実施形態では、分析システム２０７は、１つまたは複数の入力デバイス、１つまたは複数の出力デバイス、１つまたは複数のプロセッサ、および１つまたは複数のプロセッサに関連したメモリーを含む。１つまたは複数のプロセッサに関連したメモリーとして、以下に限らないが、モジュールの実行に関連したメモリーおよびデータの記憶に関連したメモリーを挙げることができる。一実施形態では、分析システム２０７は、１つまたは複数のネットワークと関連付けられており、１つまたは複数のネットワークを介して１つまたは複数の追加のシステムと連通している。モジュールは、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはハードウェアおよびソフトウェアの組合せの中で実装することができる。一実施形態では、分析システム２０７は、分析システム２０７が入力デバイス、出力デバイス、プロセッサ、メモリー、およびモジュールにアクセスすることを可能にするための追加のハードウェアおよび／またはソフトウェアも含む。モジュール、またはモジュールの組合せは、例えば、別個のシステム上の異なるプロセッサおよび／またはメモリーと関連付けることができ、システムは、互いに別々に設置することができる。一実施形態では、モジュールは、１つまたは複数のプロセスまたはサービスとして同じシステム上で実行される。モジュールは、互いに連通するように、かつ情報を共有するように作動可能である。モジュールは、互いに別々で異なるものとして記載されているが、２つ以上のモジュールの機能は、同じプロセス内で、または同じシステム内で代替として実行され得る。
【００４０】
入力モジュール３０３は、入力デバイス３０１からデータを受け取る。入力モジュール３０３はまた、別のシステムからネットワークを介してデータを受け取ることができる。例えば、以下に限定されないが、入力モジュール３０３は、１つまたは複数のネットワークを介してコンピューターから１つまたは複数の信号を受け取る。入力モジュール３０３は、入力デバイス３０１からデータを受け取り、データを再配列または再処理して、計算モジュール３０５によって認識できる形式にすることができ、その結果、データは、計算モジュール３０５によって解釈され得る。入力デバイス３０１は、一実施形態では、分析システム２０７に信号を送り、それから信号を受け取るようにユーザーが情報交換するクライアント３０４でありうる。クライアント３０４は、１つまたは複数のネットワーク３０２を介して分析システム２０７と連通することができる。
【００４１】
ネットワーク３０２は、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、ＩＥＥＥ８０２．１１ｘ通信プロトコールを使用する無線ネットワークなどの無線ネットワーク、ケーブルネットワーク、ファイバーネットワークもしくは他の光ネットワーク、トークンリングネットワークのうちの１つもしくは複数を含んでもよく、または任意の他の種類のパケット交換ネットワークを使用してもよい。ネットワーク３０２は、インターネットを含んでもよく、または任意の他のタイプのパブリックネットワークもしくはプライベートネットワークを含んでもよい。用語「ネットワーク」の使用は、ネットワークを単一のスタイルもしくはタイプのネットワークに限定せず、または１つのネットワークが使用されることを暗示する。任意の通信プロトコールまたはタイプのネットワークの組合せを使用してもよい。例えば、２つ以上のパケット交換ネットワークを使用してもよく、またはパケット交換ネットワークは、無線ネットワークと連通していてもよい。
【００４２】
入力デバイス３０１は、専用接続または任意の他のタイプの接続を介して入力モジュール３０３と連通することができる。例えば、以下に限定されないが、入力デバイス３０１は、ユニバーサルシリアルバス（「ＵＳＢ」）接続を介して、入力モジュール３０３へのシリアル接続もしくはパラレル接続を介して、または入力モジュール３０３への光リンクもしくは無線リンクを介して入力モジュール３０３と連通していてもよい。伝送は、１つまたは複数の物理的対象を介して行うこともできる。例えば、シーケンサーは、１つまたは複数のファイルを生成し、シーケンサーまたはユーザーは、ＵＳＢ記憶装置またはハードドライブなどのリムーバブル記憶装置に１つまたは複数のファイルをコピーし、ユーザーは、シーケンサーからリムーバブル記憶装置を取り出し、分析システム２０７の入力モジュール３０３にこれを取り付けることができる。入力デバイス３０１と入力モジュール３０３との間で連通するのに、任意の通信プロトコールを使用することができる。例えば、以下に限定されないが、ＵＳＢプロトコールまたはブルートゥースプロトコールを使用することができる。
【００４３】
一実施形態では、入力デバイス３０１は、シーケンサーである。シーケンサーは、１つまたは複数の試料を分析し、１つまたは複数の試料に関する配列データを生成する。シーケンサーは、無線または有線接続を介して入力モジュール３０３に配列データを通信することができる。
【００４４】
一実施形態では、データは、１つまたは複数のファイルの形態であり、またはシーケンサーは、データを画面またはプリンターにプリントすることができ、データは、例えば、以下に限定されないが、キーボード、マウス、またはスキャナーによって分析システム２０７に入力される。一実施形態では、シーケンサーは、試料を記述する追加のデータも含む。
【００４５】
計算モジュール３０５は、入力モジュール３０３から入力を受け取り、入力に基づいて１つまたは複数の処理シーケンスを実行する。例えば、以下に限定されないが、計算モジュール３０５は、配列についての配列情報および参照試料情報を受け取る。試料データは、配列情報、例えば、以下に限定されないが、プライマー１０５、左クローニングベクターおよび／もしくは右クローニングベクター１１１、発現ベクター１０３、ならびに／または標的ゲノムを含む。試料データは、ユーザー、シーケンサー、第三者システム、分析システム２０７と関連した別のシステム、これらの入力または他の適当な源の２つ以上の組合せによって分析システム２０７に提供され得る。試料データは、標準形式のテキストファイルとして分析システム２０７に提供され得る。例えば、以下に限定されないが、テキストファイルは、ＦＡＳＴＡ形式でフォーマットすることができる。別の実施形態では、試料データ情報は、１つまたは複数のテキスト入力フィールドに情報をタイプし、または貼り付けることによって分析システム２０７に入力することができる。情報は、ＦＡＳＴＡ形式、または別の標準化形式でフォーマットすることができる。別の実施形態では、他の形式を使用することができる。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）形式、または別の形式を使用することができる。分析システム２０７は、特定の形式で試料データを受け取ることができ、分析システム２０７によってさらに分析されるようにデータをフォーマットすることができる。
【００４６】
計算モジュール３０５は、入力配列内のベクターおよび／またはアダプター１０９を同定し、入力配列の配向を同定し、入力配列内のベクターおよび／またはアダプター１０９に基づいて入力配列内の導入遺伝子隣接配列の位置を確認するために、１つまたは複数のアルゴリズムを適用し、可能である場合、入力配列に関係するゲノム情報を受け取り、ゲノムに隣接配列をマッピングするように試みる。アルゴリズムは、入力配列に関係する追加の定量的および定性的データを生成する。さらに、一実施形態では、入力配列は、アノテートおよび分析され、かつ／または可視化される。入力配列を同定およびアノテートするのに使用されるアルゴリズムおよびプロセスは、図４、図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃに示した流れ図に関して記載されている。
【００４７】
計算モジュール３０５は、出力として、例えば、配列およびゲノム中のこれらの場所に関するデータ、ならびに／または配列の１つまたは複数を可視化するために可視化モジュールによって使用される追加のデータを提供する。
【００４８】
可視化モジュール３１１は、計算モジュール３０５から入力配列およびアノテーションに関する入力としてデータを受け取る。可視化モジュール３１１は、ユーザーが配列および／またはアノテーションを可視化および／または操作するのを可能にする。一実施形態では、可視化モジュール３１１は、Ｇｂｒｏｗｓｅ、またはＧｂｒｏｗｓｅの改良版を使用することができる。他の配列可視化ソフトウェアプログラムも、追加の実施形態において使用することができる。ユーザーは、標的配列、または標的配列およびゲノム、の視覚表示を操作する能力を有することができる。可視化モジュールは、ユーザーがゲノム中の標的配列の位置、またはゲノム内の対象とする他の配列の位置を閲覧することを可能にする。可視化ステップは、ユーザーがゲノム内の標的配列、およびゲノムの他の配列に対する位置または変化を特定することを可能にする。この可視化は、導入遺伝子隣接配列を分析するのに有用であり得る。
【００４９】
出力モジュール３０７は、入力を受け取り、入力を出力デバイス３０９に伝送する。一実施形態では、出力モジュール３０７は、計算モジュール３０５、可視化デバイス３１１、または計算モジュール３０５および可視化デバイス３１１の両方から入力を受け取る。受け取られるデータは、英数字データの形態であってもよく、出力デバイス３０９に理解可能な形式にデータを再フォーマットし、出力デバイス３０９にデータを伝送する。出力モジュール３０７および出力デバイス３０９は、互いに連通している。例えば、以下に限定されないが、出力モジュール３０７および出力デバイス３０９は、ネットワークを介して連通しており、または専用接続、例えば、ケーブルもしくは無線リンクなどを介して連通している。出力モジュール３０７は、計算モジュール３０５から受け取ったデータを、出力デバイス３０９が使用できる形式に再フォーマットすることもできる。例えば、出力モジュール３０７は、出力デバイス３０９が読み取ることができる１つまたは複数のファイルを作ることができる。
【００５０】
出力デバイス３０９は、一実施形態では、可視化システム、別のデータ分析システム２０７、またはデータ記憶システムである。出力モジュール３０７は、１つまたは複数の電子ファイルを出力デバイス３０９に伝送することによって、出力デバイス３０９と通信する。伝送は、専用リンク、例えば、ＵＳＢ接続もしくはシリアル接続を介して行うことができ、または１つまたは複数のネットワーク接続を介して行うことができる。伝送は、１つまたは複数の物理的対象を介して行うこともできる。例えば、出力モジュール３０７は、１つまたは複数のファイルを生成することができ、ＵＳＢ記憶装置またはハードドライブなどのリムーバブル記憶装置に１つまたは複数のファイルをコピーすることができ、ユーザーは、分析システム２０７からリムーバブル記憶装置を取り出し、可視化システム、別のデータ分析システム２０７、またはデータ記憶システムにこれを取り付けることができる。
【００５１】
図４は、本開示の実施形態によるデータ分析の方法を示す流れ図を示す。ボックス４０１では、１つまたは複数の準備プロトコールに従って試料が準備され、未知の試料が導入遺伝子を挿入して作られる。
【００５２】
ボックス４０３では、未知の試料が配列決定される。配列決定（シークエンシング）は、シーケンサーのプロトコールまたは取扱説明書に従って行うことができる。例えば、Ｓｏｌｅｘａ  ＩＬＬＵＭＩＮＡブランドの配列決定機またはＲｏｃｈｅ４５４ブランドの配列決定機を使用することができる。シーケンサーは、配列に関係するデータを生成する。データは、以下に限らないが、試料中のＤＮＡ鎖の配列に関係する情報を含む１つまたは複数のテキストファイルまたは他のデータファイルを含み得る。一実施形態では、配列情報は、信頼度データも含み、その結果、配列中の各塩基は、それに関連する信頼区間を有することができ、または各配列は、それに関連する信頼区間を有する。信頼区間は、シーケンサーによって計算される数学的計算であり、シーケンサーによる特定の塩基の読み取りの強度を含み得る。例示的な一例では、信頼区間は、１〜９の整数である。この例では、１の信頼区間は、シーケンサーが、報告された塩基がＤＮＡ鎖中の塩基であったことの相対的に低い信頼度を有することを示す。９の信頼区間は、シーケンサーが、報告された塩基がＤＮＡ鎖中の塩基であったことの相対的に高い信頼度を有することを示す。一実施形態では、シーケンサーは、信頼区間に加えて他の情報も報告する。例えば、シーケンサーは、塩基をいつ読み取ることができなかったかを報告することができる。
【００５３】
ボックス４０５では、シーケンサーからのデータが、分析システム２０７内に入力され、このシステムは、配列決定された入力配列のそれぞれの中の隣接配列を特定し、同定する。隣接配列は、入力配列のそれぞれの中に存在しない場合があり、またはシステムは、入力配列中の隣接配列の位置を同定することができない場合がある。隣接配列が特定され、同定されている配列は、システムによって記録され、隣接配列が特定されていない配列、または隣接配列が特定されているが、同定されていない配列も、システムによって記録される。システムは、配列データ、およびシステムによって行われた分析に基づいて、出力データを生成する。配列データの例示的な分析はまた、図５Ａ〜５Ｃを参照して以下に記載されている。
【００５４】
ボックス４０７では、システムは、配列データ、およびシステムによって決定された隣接配列位置情報に対する処理後分析を実施する。配列データ、標的ゲノム、および／または隣接配列位置情報は、可視化することができ、定性的測定を、データを用いて行うことができ、かつ／または定量的測定を、データを用いて行うことができる。
【００５５】
図５Ａは、隣接配列同定に関して分析システム２０７によって実行される例示的な方法を示す流れ図である。ボックス５０１では、入力配列を生成するプロトコールの一部として使用される発現ベクター１０３が、システム中に入力される。いくつかの実施形態では、右クローニングベクターおよび左クローニングベクター、プライマー１０５、ならびに／またはアダプター１０９の配列の１つまたは複数も提供される。より特定の実施形態では、右クローニングベクターおよび左クローニングベクター、プライマー１０５、ならびにアダプター１０９の配列のそれぞれも提供される。クローニングベクター、発現ベクター１０３、プライマー１０５、およびアダプター１０９の配列は、一般に既知であり、その結果、これらは、ゲノム内で同定し、特定することができる。既知配列の情報がシステム中に入力されて、入力配列と比較される際に配列の同定が可能になる。
【００５６】
ボックス５０３では、入力配列が、シーケンサー、または１つもしくは複数のファイルから受け取られる。１つまたは複数のファイルは、例えば、ネットワークを介してシステムに伝送することができ、または別の方法でシステムに提供されることができる。配列情報がシーケンサーから受け取られる場合、これは、例えば、ネットワークを介してシステムに伝送することができる。一実施形態では、配列情報は、システムに伝送することができ、システムが読み取ることができる電子形態である。配列情報は、一実施形態では、配列情報が伝送中に破損または変更されていないことを保証するための検証データまたは他の追加のデータを含み得る。別の実施形態では、配列情報は、１つまたは複数のデータベース中に記憶され、１つまたは複数のデータベースからシステムに、例えば、ネットワークを介して伝送される。さらに、ゲノム情報は、ネットワークを通じて別のデータベースから受け取られ得る。例えば、ゲノム情報は、公的にアクセス可能なデータベース、または個人的にアクセス可能なデータベース中に記憶することができ、ゲノム情報をシステムが要求することができ、ゲノム全体、またはゲノムの要求された部分は、要求の少なくとも一部基づいてシステムに伝送することができる。
【００５７】
ボックス５０５では、分析システム２０７は、発現ベクター１０３を含む既知配列との類似性について入力配列を検索する。ステップ５０１で提供されている場合、分析システム２０７は、クローニングベクター、プライマー１０５、および／またはアダプター１０９の配列との類似性をさらに検索することができる。これらの配列の１つまたは複数がステップ５０１で提供されていない場合、分析システム２０７は、その配列を見つからなかったとして処理する。分析システム２０７は、異なる配列を検索するのに異なる検索パラメータを使用することができる。例えば、一実施形態では、分析システム２０７は、プライマー１０５およびアダプター１０９を同定するのに、より厳しいセットの検索パラメータを使用することができ、その理由は、これらがより短い配列であり、修飾されている可能性が低いためである。分析システム２０７は、入力配列中の他の配列を検索するのに、比較的それほど厳しくない検索パラメータを使用することができ、その理由は、これらがより長く、かつ／またはゲノム中に導入遺伝子を組み込む間に変更されている可能性が高いためである。一実施形態では、分析システム２０７は、発現ベクター１０３を同定するのに正確な配列を見つけなければならない。別の実施形態では、発現ベクター１０３の配列が誤差の範囲内で見つかる場合、分析システム２０７は、発現ベクター１０３を同定する。例えば、誤差の範囲は、発現ベクター１０３の配列中の塩基対の５パーセントとすることができる。別の実施形態では、誤差の範囲は、５パーセント超またはそれ未満である。
【００５８】
一実施形態では、分析システム２０７は、入力配列と、クローニングベクター、導入遺伝子発現ベクター１０３、プライマー１０５、および／またはアダプター１０９の配列からなる既知配列との間の配列類似性を検索するのに、ＬＡＳＴＺ整列プログラムおよびアルゴリズムを使用する。ＬＡＳＴＺプログラムは、Ｈａｒｒｉｓ、Ｒ．Ｓ．（２００７）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．、博士論文、ペンシルベニア州立大学に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＬＡＳＴＺプログラムは、２種類の配列類似性検索を実施する。第１の種類の配列類似性検索は、ＬＡＳＴＺプログラムの特定のパラメータ設定である、「正確な検索（ｅｘａｃｔ  ｓｅａｒｃｈ）」である。「正確な検索」は、９５％の同一性、配列中にギャップのないこと、および配列内で少なくとも１５の完全な文字の一致を必要とする。配列の「スコア」を決定するのにスコアリングマトリックスが使用され、このマトリックスは、標的配列とのマッチについての１、および標的配列とのミスマッチについての−１０を含む。この検索は、提供される場合、入力配列内のプライマー１０５およびアダプター１０９を同定するのに使用され、その理由は、プライマー１０５およびアダプター１０９の配列は、短く、したがって実験中に修飾されている可能性が低いために、入力配列中のプライマー１０５およびアダプター１０９は、プライマー１０５およびアダプター１０９の試料配列と正確に同じであることが予期されるためである。第２の種類の配列類似性検索は、「緩い検索（ｌｏｏｓｅ  ｓｅａｒｃｈ）」である。「緩い検索」は、「正確な検索」と同じ厳しい要求事項を有さない。この検索は、ＬＡＳＴＺのデフォルトのパラメータを使用し、入力配列中の導入遺伝子発現ベクター１０３およびクローニングベクターの配列類似性を見つけるのに展開される。「緩い検索」は、導入遺伝子発現ベクター１０３およびクローニングベクターの配列のために使用され、その理由は、これらがより長く、したがって実験中に修飾されている可能性が高いためである。
【００５９】
参照データ配列と配列類似性を共有する、入力配列内の部分配列は、「タイプ」と標識される。本実施形態では、４つの可能な「タイプ」、すなわち、プライマー１０５、アダプター１０９、導入遺伝子発現ベクター１０３、およびクローニングベクターがある。プライマー１０５、アダプター１０９、導入遺伝子発現ベクター１０３、およびクローニングベクターの１つまたは複数が、ステップ５０１で提供されていない場合、ステップ５０３および５０５は、そのタイプについて省略される。例えば、入力配列と選択されたプライマー１０５の配列のいずれかとの間で高度に類似の配列は、「プライマー１０５タイプ」と標識され、または関連付けられる。同様に、ユーザーが、分析に含められるべき１５の導入遺伝子発現ベクター１０３の配列を選択し、それぞれが入力配列内の部分配列と３０の相同性を有する場合、４５０すべての配列がタイプ「導入遺伝子発現ベクター１０３」と関連付けられる。
【００６０】
ボックス５０７に示したように、プライマー１０５の配列と最高レベルの配列類似性および整列長で整列する配列は、「プライマー１０５タイプ」と分類される。同様に、アダプター１０９の配列と最高レベルの配列類似性および整列長で整列する配列は、「アダプター１０９タイプ」と分類される。整列長および整列スコアが入力配列中のアダプター１０９とプライマー１０５との間で同じである場合には、配列「タイプ」は、同記録となった配列のすべてから自由裁量で選ばれる。これらの２つの配列、「プライマー１０５タイプ」および「アダプター１０９タイプ」が最初に同定される。これらは、これらのモチーフの位置が、どの配列が増幅されたか、およびどのようにそれが配向しているかを示すので、最初に同定される。これらの２つの配列タイプを特定できる場合、これらの場所は、導入遺伝子およびクローニングベクター配列の位置を同定することになる。
【００６１】
ボックス５０９に示したように、プライマー１０５およびアダプター１０９の配列類似性についての検索が完了した後、分析システム２０７は、最も配列類似性を共有する導入遺伝子発現ベクター１０３について入力配列を検索する。この検索は、プライマー１０５に類似する配列が同定されたか否かに応じて、２つの異なる方法の１つで行われる。プライマー１０５の配列が入力配列中で同定された場合、プライマー１０５を含む最良のマッチが同定される。一実施形態では、プライマー１０５がステップ５０１で提供されていなかった、もしくはステップ５０７で同定されなかった場合、または導入遺伝子発現ベクター１０３の配列のいずれも、「プライマー１０５タイプ」と類似性を共有する配列を含まない場合、最良の全体的なマッチが考慮され、最高の配列類似性を有する導入遺伝子発現ベクター１０３が選ばれる。この文脈における「最良の全体的なマッチ」は、最高レベルの配列類似性および整列長を有するマッチを選ぶことを意味する。
【００６２】
導入遺伝子発現ベクター１０３が特定され、同定された後、既知のクローニングベクターとの配列類似性の整列を介したクローニングベクター配列の特定および同定が試みられる。推定上の導入遺伝子発現ベクター１０３の配列が同定された後、この配列の上流および下流の配列がさらに特徴付けられる。開始座標および終了座標において配列類似性を共有するクローニングベクターを同定するために、上流のクローニングベクター配列が照会される。先にアノテートされた配列（導入遺伝子発現ベクター１０３、プライマー１０５、およびアダプター１０９）は、照会されない。したがって、分析システム２０７は、先に同定された特徴から上流の領域との配列類似性について、すべての可能なクローニングベクターを検索する。次いで、分析システム２０７は、類似の様式で、先に同定された特徴クローニングベクターから下流の領域との配列類似性について、同定されたクローニングベクター配列情報を検索する。ベクターは、最高レベルの配列類似性および整列長を有するマッチを選ぶことによって同定される。
【００６３】
ボックス５１１に示したように、入力配列の配向が、可能な場合、同定される。比較およびさらなる計算を促進するために、分析システム２０７は、左手から右手の配向で、すなわち、左側に配列の５’末端および右側に配列の３’末端を伴って、入力配列を並べる試みをする。場合によっては、シーケンサーは、ＤＮＡのアンチセンス鎖を配列決定した場合があり、この場合、配列は、逆相補されなければならない。入力配列内の各「タイプ」（すなわち、プライマー１０５、アダプター１０９、クローニングベクター、および導入遺伝子発現ベクター１０３）の配列が同定された後、システムは、この情報を使用して、入力配列を同定し、かつ／またはこれを配向付ける。配向は、プライマー１０５およびアダプター１０９の配列の位置によって決定される。プライマー１０５がアダプター１０９の前に位置している順配向が、可視化の容易さのために好適である。
【００６４】
アンチセンス鎖からの入力配列の例を図６に示す。図６では、プライマー１０５の配列は、「ＴＡＡＡＣＡ」として分析システム２０７に知られている。一実施形態では、入力配列６０５が分析システム２０７によって読み取られる場合、分析システム２０７は、入力配列６０５中のプライマー６０３の配列のいずれかも最初に見つけられない場合がある。分析システム２０７は、入力配列６０５を逆相補して逆相補配列６０７を解明し、プライマー１０５を逆相補配列６０７と比較する。分析システム２０７は、本例では、逆相補配列６０７内の部分配列に対するプライマー６０３の正確なマッチを見つける。分析システム２０７は、既知のプライマー６０３から配列６０９を単離し、逆相補配列６０７の分析を進める。一実施形態では、分析システム２０７は、代替として、既知のプライマー６０３の逆相補配列を配列６０５と比較し、逆相補プライマー配列６０３を同定した後、配列全体を逆相補して逆相補配列６０７を得ることができ、逆相補配列６０７を用いた処理を進めることができる。
【００６５】
ボックス５１３に示したように、導入遺伝子隣接配列は、入力配列、または配列が先のステップで逆相補された場合、逆相補配列の中で特定される。例示的な特定法は、図５Ｂおよび図５Ｃに関してより完全に記載されている。
【００６６】
ボックス５１５に示したように、導入遺伝子隣接配列は、先のステップで見つかった場合、ゲノム内で特定される。導入遺伝子隣接配列は、ゲノム内の組込み部位中で特定され、導入遺伝子挿入部位の上流または下流であり、発現ベクター配列と連続している。組込み部位は、マッチングアルゴリズムを使用して求められる。例えば、ベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆら、「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９０年１０月５日；２１５（３）：４０３〜１０に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ検索の入力は、導入遺伝子隣接配列およびゲノムである。ＢＬＡＳＴ検索は、可能な場合、ゲノム中への導入遺伝子隣接配列の組込みの１つまたは複数の部位を特定する。ＢＬＡＳＴ検索の出力は、可能な組込み部位のリスト、および適合のためのスコアである。可能な限り多くの組込み部位を同定するために、すべてのマスキングおよび低複雑性フィルタリングは、この相同性検索に関して無効にされる。検索が実施された後、出力は、解析されて、適合についての最高スコアを有するトップヒットが見つけられる。トップヒットが同定された後、この領域は、導入遺伝子の推定上の組込み部位と見なされる。
【００６７】
所与の導入遺伝子組込み部位について、ゲノム中でアノテートされた、連結した内因性の上流および下流の遺伝子が、コンピュータースクリプトを使用して同定される。ゲノムアノテーションの入力ファイルが解析され、遺伝子が染色体によってインデックスされ、開始座標によって選別される。組込み部位が求められているとき、システムは、遺伝子座標の適切なリストを同定し、組込み部位についての正確な挿入点を同定するために二分検索を実施する。導入遺伝子組込み部位の座標の選別されたリストが現れる。この点から、組込み部位から１０キロ塩基対超の配列が特定されるまで、リストが順方向に検索される。次いで、組込み部位から１０キロ塩基（ｋｂ）対超の配列が特定されるまで、リストが逆方向に検索される。このようにして、組込み部位の上流および下流のゲノム中の遺伝子が、さらなる分析のためにアノテートされる。距離パラメータは、例えば、以下に限定されないが、組込み部位の１０ｋｂ超または１０ｋｂ未満に変更することができる。組込み部位からの他の範囲も使用することができる。
【００６８】
導入遺伝子組込み部位が入力配列について発見された場合、導入遺伝子と染色体隣接配列との間の配列が再配列、挿入、または欠失を含むか否かを判定することが重要である。組込み部位が変更されていない、すなわち、組込み部位の配列が、導入遺伝子組込みプロセスの間に再配列または修飾されて欠失または挿入をもたらしていないという信頼度をユーザーに与えるために、分析システム２０７は、染色体隣接配列と、先に述べたプロセスのいずれかにおいて使用された任意の他の配列「タイプ」との間に存在する重なりの量を計算する。この尺度は、ユニークかつ任意の他の配列類似性によって重なっていない入力配列類似性における塩基の数（ｕｎｉｑｕｅ＿ｂａｓｅｓ）と、入力配列類似性における塩基の総数（ｔｏｔａｌ＿ｂａｓｅｓ）との比として計算される。
【００６９】
【数１】
0006314091.tif 000002
この比は、組込み部位に定量値を与える。
【００７０】
図５Ａ中の先のボックスからのアノテートされたデータは、一実施形態では、ボックス５１７中の目視検査のために提示することができる。可視化の例を図９Ａおよび図１０に示す。さらに、入力配列、導入遺伝子隣接配列、および／またはクローニングベクター、発現ベクター１０３、プライマー１０５、アダプター１０９、もしくは入力配列に関する追加の情報が、可視化のために提示される。導入遺伝子隣接配列、クローニングベクター、発現ベクター１０３、プライマー１０５、アダプター１０９、または入力配列に関するデータは、１つまたは複数の電子ファイルにも保存される。
【００７１】
図５Ｂは、導入遺伝子隣接配列８５０をマークする一般的な方法を示す流れ図である。ボックス８５２では、入力配列を生成するためのプロトコールの一部として使用される発現ベクター１０３がシステム中に入力される。いくつかの実施形態では、右クローニングベクターおよび左クローニングベクター、プライマー１０５、導入遺伝子発現ベクター配列１０３、およびアダプター１０９の配列の１つまたは複数も提供される。より特定の実施形態では、右クローニングベクターおよび左クローニングベクター、プライマー１０５、導入遺伝子発現ベクター配列１０３、およびアダプター１０９の配列のそれぞれも提供される。クローニングベクター、発現ベクター１０３、プライマー１０５、およびアダプター１０９の配列は、一般に既知であり、その結果、これらは、入力未知配列内で同定し、特定することができる。既知配列の情報は、システム中に入力されることによって、入力配列と比較される際に、配列の同定が可能になる。
【００７２】
ボックス８５４では、入力配列は、シーケンサー、または１つまたは複数のファイルから受け取られる。１つまたは複数のファイルは、例えば、ネットワークを介してシステムに伝送することができ、または別の方法でシステムに提供することができる。配列情報がシーケンサーから受け取られる場合、これは、例えば、ネットワークを介してシステムに伝送することができる。一実施形態では、配列情報は、システムに伝送することができ、システムが読み取ることができる電子形態である。配列情報は、一実施形態では、配列情報が伝送中に破損または変更されていないことを保証するための検証データまたは他の追加のデータを含み得る。別の実施形態では、配列情報は、１つまたは複数のデータベース中に記憶され、１つまたは複数のデータベースからシステムに、例えば、ネットワークを介して伝送される。さらに、ゲノム情報は、ネットワークを通じて別のデータベースから受け取られ得る。例えば、ゲノム情報は、公的にアクセス可能なデータベース、または個人的にアクセス可能なデータベース中に記憶することができ、ゲノム情報をシステムが要求することができ、ゲノム全体、またはゲノムの要求された部分は、要求の少なくとも一部に基づいてシステムに伝送することができる。
【００７３】
ボックス８５６では、分析システム２０７は、第１の参照配列、例示的には発現ベクター１０３を含む既知配列との類似性について入力配列を検索する。発現ベクター１０３がボックス８５８内で見つからない場合、本方法は、ボックス８６０に進む。発現ベクター１０３の欠如は、入力配列の作成または処理におけるエラーを示し得る。ボックス８６０では、入力配列は、失敗としてマークされ、ゲノムに対してマッチされない。一実施形態では、配列は、可視化される際に赤色としてマークされる。
【００７４】
発現ベクター１０３がボックス８５８内で発見された場合、方法８５０は、ボックス８６２に進む。一実施形態では、分析システム２０７は、ボックス８６２に進むために、発現ベクター１０３の正確な配列を見つけなければならない。別の実施形態では、分析システム２０７は、発現ベクター１０３の配列が誤差の範囲内で発見された場合、ボックス８６２に進むことができる。例えば、誤差の範囲は、発現ベクター１０３の配列中の塩基対の５パーセントとすることができる。別の実施形態では、誤差の範囲は、５パーセント超またはそれ未満である。
【００７５】
ボックス８６２では、分析システム２０７は、第２の参照配列、例示的にはアダプター配列１０９を含む既知配列との類似性について入力配列を検索する。アダプター配列１０９がボックス８６４内で発見された場合、本方法は、ボックス８６６に進む。アダプター配列１０９がボックス８６４内で発見されない場合、本方法は、ボックス８８０に進む。一実施形態では、分析システム２０７は、ボックス８６６に進むために、アダプター配列１０９の正確な配列を見つけなければならない。別の実施形態では、分析システム２０７は、アダプター配列１０９の配列が誤差の範囲内で発見された場合、ボックス８６６に進むことができる。例えば、誤差の範囲は、アダプター配列１０９の配列中の塩基対の５パーセントとすることができる。別の実施形態では、誤差の範囲は、５パーセント超またはそれ未満である。
【００７６】
アダプター配列が発見された場合、方法５５０は、ボックス８６６に進む。ボックス８６６では、分析システム２０７は、ボックス８５４内で入力された未知配列を同定するように試みる。一実施形態では、既知のアダプターは、さらなる処理の前に未知配列から取り出される。別の実施形態では、既知のアダプターは、さらなる処理の前に未知配列から取り出されない。未知配列が同定されている場合、本方法は、ボックス８７０に進む。未知配列が同定されていない場合、本方法は、ボックス８７８に進む。未知配列を同定することができないことは、配列の作成または処理におけるエラーを示し得る。ボックス８７８では、入力配列は、処理の失敗としてマークされる。一実施形態では、配列は、可視化される際に赤色としてマークされる。
【００７７】
ボックス８７０では、入力配列は、ゲノムに対して検索される。一実施形態では、低減された入力配列をゲノムにマッチさせるように試みるために、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムが使用される。ボックス８７２では、入力配列がゲノムに対してマッチする場合、本方法は、ボックス８７４に進む。低減された入力配列がゲノム中のいずれの場所にもマッチしない場合、本方法は、ボックス８７６に進む。
【００７８】
ボックス８７４では、入力配列は、ゲノムの一部に対してマッチする。分析システム２０７は、ゲノム中の入力配列の位置を記録し、その位置の近隣領域中の対象とする領域も記録する。一実施形態では、分析システム２０７は、その位置の２００キロ塩基対以内の対象とする領域を記録する。他の実施形態では、分析システム２０７は、より多い、またはより少ない量の塩基対以内の対象とする領域を記録する。一実施形態では、ユーザーは、分析システム２０７がその位置の周囲で記録する近隣領域のサイズを指定することができる。一実施形態では、配列は、可視化される際に緑色としてマークされる。
【００７９】
ボックス８７６では、入力配列は、ゲノムに対してマッチするのに失敗したとしてマークされる。低減された入力配列は、配列決定中に損傷されている場合があり、または不正確に配列決定されている場合がある。一実施形態では、配列は、可視化される際に橙色としてマークされる。
【００８０】
前述のように、ボックス８６４においてアダプター配列１０９が発見されない場合、方法８５０は、ボックス８８０に進む。ボックス８８０では、分析システム２０７は、ボックス８５４内で入力された未知配列を同定するように試みる。未知配列がボックス８８２で同定されている場合、本方法は、ボックス８８６に進む。未知配列が同定されていない場合、本方法は、ボックス８８４に進む。未知配列を同定するができないことは、配列の作成または処理におけるエラーを示し得る。ボックス８８４では、入力配列は、処理の失敗としてマークされる。一実施形態では、配列は、可視化される際に赤色としてマークされる。
【００８１】
ボックス８８６では、入力配列は、ゲノムに対して検索される。一実施形態では、低減された入力配列をゲノムにマッチさせるように試みるために、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムが使用される。ボックス８８８では、入力配列がゲノムに対してマッチする場合、本方法は、ボックス８９０に進む。低減された入力配列がゲノム中のいずれの場所にもマッチしない場合、本方法は、ボックス８９２に進む。
【００８２】
ボックス８９０では、入力配列は、ゲノムの一部に対してマッチする。分析システム２０７は、ゲノム中の入力配列の位置を記録し、その位置の近隣領域中の対象とする領域も記録する。一実施形態では、分析システム２０７は、その位置の２００キロ塩基対以内の対象とする領域を記録する。他の実施形態では、分析システム２０７は、より多い、またはより少ない量の塩基対以内の対象とする領域を記録する。一実施形態では、ユーザーは、分析システム２０７がその位置の周囲で記録する近隣領域のサイズを指定することができる。一実施形態では、配列は、可視化される際に緑色としてマークされる。
【００８３】
ボックス８９２では、入力配列は、ゲノムに対してマッチするのに失敗したとしてマークされる。低減された入力配列は、配列決定中に損傷されている場合があり、または不正確に配列決定されている場合がある。一実施形態では、配列は、可視化される際に橙色としてマークされる。
【００８４】
図５Ｃは、プライマー１０５、アダプター１０９、または両方の既知配列がステップ５０１で提供されている図５Ａの流れ図に従って導入遺伝子隣接配列５０７をマークする別の方法を示す流れ図である。ボックス５５１では、分析システム２０７は、入力配列中のプライマー１０５およびアダプター１０９として同定された配列を検索する。
【００８５】
ボックス５５３では、分析システム２０７は、入力配列内のアダプター１０９およびプライマー１０５を検索する。アダプター１０９およびプライマー１０５の配列の両方がステップ５０１で提供され、入力配列内で発見された場合、本方法は、ボックス５５９に進む。アダプター１０９またはプライマー１０５の配列のいずれかが入力配列内で発見されない場合、またはアダプター１０９またはプライマー１０５の配列のいずれかがステップ５０１で提供されていない場合、本方法は、ボックス５５５に進む。一実施形態では、分析システム２０７は、ボックス５５９に進むために、アダプター１０９およびプライマー１０５の配列の両方の正確な配列を見つけなければならない。別の実施形態では、アダプター１０９およびプライマー１０５の配列が誤差の範囲内で発見された場合、分析システム２０７は、ボックス５５９に進むことができる。例えば、誤差の範囲は、アダプター配列１０９またはプライマー１０５の配列中の塩基対の５パーセントとすることができる。別の実施形態では、誤差の範囲は、５パーセント超またはそれ未満である。別の実施形態では、プライマー１０５の誤差の範囲とアダプター１０９の誤差の範囲は異なる。
【００８６】
ボックス５５９では、アダプター１０９およびプライマー１０５の既知配列が入力配列から取り出され、その結果、入力配列は、アダプター１０９とプライマー１０５との間の配列へと低減される。低減された入力配列がゲノムに対して検索される。一実施形態では、低減された入力配列をゲノムにマッチさせるように試みるために、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムが使用される。
【００８７】
ボックス５６３において、低減された入力配列がゲノムに対してマッチする場合、本方法は、ボックス５７１に進む。低減された入力配列がゲノム中のいずれの場所にもマッチしない場合、本方法は、ボックス５６５に進み、この入力配列は、ゲノムに対してマッチするのに失敗したとしてマークされる。低減された入力配列は、配列決定中に損傷されている場合があり、または不正確に配列決定されている場合があり、またはアダプター１０９およびプライマー１０５は、低減された入力配列をまったく残さないで、配列内で互いに隣接している場合がある。一実施形態では、配列は、可視化される際に橙色としてマークされる。
【００８８】
ボックス５７１では、低減された入力配列は、ゲノムの一部に対してマッチする。分析システム２０７は、ゲノム中の入力配列の位置を記録し、その位置の近隣領域中の対象とする領域も記録する。一実施形態では、分析システム２０７は、その位置の２００キロ塩基対以内の対象とする領域を記録する。他の実施形態では、分析システム２０７は、より多い、またはより少ない量の塩基対以内の対象とする領域を記録する。一実施形態では、ユーザーは、分析システム２０７がその位置の周囲で記録する近隣領域のサイズを指定することができる。一実施形態では、配列は、可視化される際に緑色としてマークされる。
【００８９】
アダプター１０９およびプライマー１０５の両方が入力配列内で発見されない、またはアダプター１０９およびプライマー１０５の配列が、分析システム２０７もしくはユーザーによって設定された許容範囲内で発見されない場合、本方法は、ボックス５５３からボックス５５５に進む。ボックス５５５では、分析システム２０７は、アダプター１０９またはプライマー１０５の配列のいずれかが入力配列中で発見されたか否かを判定する。アダプター１０９またはプライマー１０５の配列のいずれかが入力配列中で発見された場合、本方法は、ボックス５６１に進む。アダプター１０９およびプライマー１０５の配列の両方が入力配列中で発見されない場合、本方法は、ボックス５５７に進む。
【００９０】
ボックス５５７では、アダプター１０９もプライマー１０５も、入力配列内で発見されていない。プライマー１０５およびアダプター１０９がないことは、入力配列の作成または処理におけるエラーを示し得る。入力配列は、失敗としてマークされ、ゲノムに対してマッチされない。一実施形態では、配列は、可視化される際に赤色としてマークされる。
【００９１】
ボックス５６１では、アダプター１０９またはプライマー１０５の配列のいずれかが、入力配列内で発見されている。一実施形態では、アダプター１０９またはプライマー１０５の配列が、誤差の範囲内で入力配列内に発見されている。アダプター１０９またはプライマー１０５の配列が欠損していることは、入力配列の入力配列が、入力配列の５’または３’末端に及び、したがって、入力配列が入力配列の配列全体を捕捉していないことを示す。既知のアダプター１０９または既知のプライマー１０５は、どちらが入力配列中に存在しても、入力配列から取り出され、その結果、入力配列は、アダプター１０９とプライマー１０５との間の配列に低減される。ボックス５６７に示したように、低減された入力配列がゲノムに対して検索される。一実施形態では、低減された入力配列をゲノムにマッチさせるように試みるために、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムが使用される。
【００９２】
ボックス５６７において、低減された入力配列がゲノムに対してマッチする場合、本方法は、ボックス５７３に進む。低減された入力配列がゲノム中のいずれの場所にもマッチしない場合、本方法は、ボックス５６９に進み、この入力配列は、ゲノムに対してマッチするのに失敗したとしてマークされる。低減された入力配列は、配列決定中に損傷されている場合があり、または不正確に配列決定されている場合があり、またはアダプター１０９およびプライマー１０５は、低減された入力配列をまったく残さないで、配列内で互いに隣接している場合がある。一実施形態では、配列は、可視化される際に橙色としてマークされる。
【００９３】
ボックス５７３では、低減された入力配列は、ゲノムの一部に対してマッチする。分析システム２０７は、ゲノム中の入力配列の位置を記録し、その位置の近隣領域中の対象とする領域も記録する。一実施形態では、分析システム２０７は、その位置の２００キロ塩基対以内の対象とする領域を記録する。他の実施形態では、分析システム２０７は、より多い、またはより少ない量の塩基対以内の対象とする領域を記録する。一実施形態では、ユーザーは、分析システム２０７がその位置の周囲で記録する近隣領域のサイズを指定することができる。対象とする領域は、遺伝子をコードする配列、または他のゲノム情報を含み得る。対象とする領域は、第三者システム、例えば、分析システム２０７がゲノム配列情報を受け取ったシステムから受け取られ得る。一実施形態では、配列は、可視化される際に黄色としてマークされる。
【００９４】
図７は、分析システム２０７の試料入力画面を示す。ユーザーは、ボックス７０１で、一連の入力配列を選択することができる。入力配列は、配列情報を提供するための標準形態であり得、または分析システム２０７が解析および同定することができる形態とすることができる。ユーザーは、入力配列をマッピングするための生物のゲノムも選択することができる。ゲノムは、分析システム２０７によって提供することができ、その結果、ユーザーは、分析システム２０７に利用可能な１つまたは複数のゲノムを同定し、またはユーザーは、生物のゲノムについての配列情報を含む電子ファイルへの経路を提供することができる。ゲノムは、完全であっても、部分的であってもよい。ユーザーは、ボックス７０５において、実験で使用された、かつ入力配列中に存在するはずである１つまたは複数の発現ベクター１０３を選択する。ユーザーは、ボックス７０７、７０９、および７１１において、実験で使用された、かつ入力配列中に存在するはずであるベクター配列、プライマー１０５の配列、およびアダプター１０９の配列をそれぞれ選択する。次いでユーザーは、「サブミット」ボタンを押して、データインポートプロセスおよび分析を開始する。
【００９５】
図８は、本開示の実施形態による分析システム２０７の例示的な出力を示す。本実施形態では、「１」と標識された表の行は、染色体隣接配列が分析システム２０７によって正確に同定された入力配列を示す。これらの行は、他の行と区別するために色分けされ、例えば、緑色で色分けされていてもよい。「２」と標識された表の行は、染色体隣接配列は、同定されたが、検索されたすべての既知配列を同定することができず、その結果、例えば、アダプター１０９を入力配列内で特定することができなかったために、分析が異常を含む入力配列を示す。これらの行は、「１」と標識された表の行と異なる色としてコード化することができる。「３」と標識された表の行は、染色体隣接配列を同定することができなかった入力配列を示す。これらの行は、赤色として色分けされる。近隣という列は、組込み部位に近接するゲノム配列に由来する遺伝子を示す。
【００９６】
図９Ａは、例示的なダイズイベント４１６からの特定の入力配列についての組込み部位分析のグラフ表示を提供する分析システム２０７のサマリー表示を示す。画像の頂部に、入力配列の座標が表示されている。このサマリー表示内に示されている残りの配列は、これらの座標と比べてアノテートされている。入力参照配列は、例示的な画面では、プライマー１０５および導入遺伝子発現ベクター１０３が画面の左手側に現れ、ゲノム隣接配列およびアダプター１０９が画面の右手側に現れるように配向されている。このグラフ表示は、イベント４１６（配列番号１）の入力配列を示し（図９Ｂとして示されている）、これは、その中の導入遺伝子発現ベクター１０３（「ｐＤＡＢ４４６８」；配列番号２）（図９Ｃとして示されている）、アダプター１０９（「Ｓｏｙｂｅ−」；配列番号３）（図９Ｄとして示されている）、およびプライマー１０５（「ダイズ＿プライマー」；配列番号４）（図９Ｅとして示されている）の配列を同定するようにアノテートされている。同定された染色体隣接配列は、実線（配列番号５）（図９Ｆとして示されている）としてアノテートされている。分析システム２０７は、この例では、染色体隣接配列をグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）ゲノムと整列させた。染色体隣接配列は、７８０の配列類似性スコアで染色体４の領域４６００３２４８、４６００４０３０；９６の配列類似性スコアで染色体６の領域１１８２５４３０、１１８２５５５９；２９の配列類似性スコアで染色体１５の領域２４５１７４０７、２４５１７４３５；および２８の配列類似性スコアで染色体５の領域３７３２３４２５、３７３２３４５２に対して整列する。入力配列、導入遺伝子発現ベクター１０３、アダプター１０９、およびプライマー１０５は、図中で、グラフで表されている。
【００９７】
図１０は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において使用するための分析システム２０７の適用を示す。入力配列についての組込み部位分析の直観的なグラフ表示を提供する分析システム２０７のサマリー表示が例示されている。画像の頂部に、入力配列の座標が表示されている。このサマリー表示内に示されている残りの配列は、これらの座標と比べてアノテートされている。グラフ表示は、クローニングベクター（「ｐＣＲ２．１−ＴＯＰ」）およびアダプター１０９（「１ｍＡｄｐ−Ｐｒｉ」）を同定するようにアノテートされているイベントの入力配列を示す。同定された染色体隣接配列は、実線としてアノテートされている。分析システム２０７は、染色体隣接配列をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノム配列と整列させた。染色体隣接配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ゲノム配列識別子１２２９０９０、１２３００１５の特定領域に対して整列され、９１３の配列類似性スコアが報告されている。図１０は、プライマー１０５を含むが、右クローニングベクター１１１をまったく含まない導入遺伝子隣接配列を示す。
【００９８】
図１１は、トウモロコシに使用するための分析システム２０７の適用を示す。入力配列についての組込み部位分析の直観的なグラフ表示を提供する分析システム２０７のサマリー表示が例示されている。画像の頂部に、入力配列の座標が表示されている。このサマリー表示内に示されている残りの配列は、これらの座標と比べてアノテートされている。グラフ表示は、発現ベクター１０３（「ｐＥＰＳ１０２７」）を同定するようにアノテートされているイベントの入力配列を示す。同定された染色体隣接配列は、実線としてアノテートされている。分析システム２０７は、染色体隣接配列をトウモロコシゲノム配列と整列させた。染色体隣接配列は、トウモロコシ属ゲノム配列識別子５３３７７３１、５３３８１２４の特定領域に対して整列され、７２８の配列類似性スコアが報告されている。図１１は、発現ベクター１０３を含むが、右クローニングベクターまたは左クローニングベクター１０１、１１１をまったく含まない導入遺伝子隣接配列を示す。
【００９９】
本開示を、例示的な設計を有するものとして記載してきたが、本開示は、本開示の趣旨および範囲内でさらに改変することができる。したがって、本願は、その一般的原理を使用して、本開示の任意のバリエーション、使用、または適応に及ぶことを意図している。さらに、本願は、本開示が属する当技術分野における公知の、または慣例的な実践の範囲内に入り、添付の特許請求の範囲の制限内に入るものとして、本開示からのこのような逸脱に及ぶことを意図している。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１]
配列データを電子的に受け取るステップと、
少なくとも発現ベクターに関係する１つまたは複数の参照データ配列を電子的に受け取るステップと、
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて導入遺伝子隣接配列を同定するステップと、
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索するステップと、
前記検索ステップで１つまたは複数の挿入部位が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートするステップと
を含む、分析方法。
［２]
参照データが、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つにさらに関係している、［１］に記載の分析方法。
［３]
参照データが、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターにさらに関係している、［１］に記載の分析方法。
［４]
配列データ内の第１の参照データ配列を検索するステップと、
前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索するステップと
をさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［５]
第１の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択される、［４］に記載の分析方法。
［６]
第２の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される、［５］に記載の分析方法。
［７]
第１の参照データ配列が発現ベクターであり、第２の参照データ配列がアダプターである、［４］に記載の分析方法。
［８]
第１の参照データ配列および第２の参照データ配列が、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される、［４］に記載の分析方法。
［９]
導入遺伝子隣接配列および参照データを可視化するステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１０]
ゲノム内の１つまたは複数の挿入部位を可視化するステップをさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［１１]
挿入部位の上流および下流のゲノムの配列情報を特徴付けるステップをさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［１２]
挿入部位の１０キロ塩基対上流および１０キロ塩基対下流のゲノムの配列情報が特徴付けられる、［１１］に記載の分析方法。
［１３]
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させるステップと、
整列された配列の定性分析を行うステップと
をさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［１４]
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させるステップと、
整列された配列の定量分析を行うステップと
をさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［１５]
ゲノムが、植物ゲノムの少なくとも一部である、［１］に記載の方法。
［１６]
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けるステップが、配列データに対して参照データ配列の少なくとも１つをマッチさせるアルゴリズムを使用することを含む、［１］に記載の分析方法。
［１７]
アルゴリズムがＬＡＳＴＺアルゴリズムである、［１６］に記載の分析方法。
［１８]
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索するステップが、少なくとも１つの挿入部位の上流および下流の配列をゲノムとともに特定するアルゴリズムを使用することを含む、［１］に記載の分析方法。
［１９]
アルゴリズムがＢＬＡＳＴアルゴリズムである、［１８］に記載の分析方法。
［２０]
配列に関係した配列データを受け取るためのモジュール、
少なくとも発現ベクターに関係した１つまたは複数の参照配列を受け取るためのモジュール、ならびに
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けて、導入遺伝子隣接配列を同定し、
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索し、
１つまたは複数の挿入部位が発見された場合に、ゲノムとゲノム内の１つまたは複数の挿入部位とをアノテートする
ように作動可能な計算モジュール、
を含む、分析システム。
［２１]
参照配列が、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つにさらに関係している、［２０］に記載の分析システム。［２２]
参照配列が、左クローニングベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターにさらに関係している、［２０］に記載の分析システム。
［２３]
前記計算モジュールが、
配列データ内の第１の参照データ配列を検索し、
前記第１の参照データ配列が特定された場合に、配列データ内の第２の参照データ配列を検索する
ようにさらに作動可能である、［２０］に記載の分析システム。
［２４]
第１の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択される、［２３］に記載の分析システム。
［２５]
第２の参照データ配列が、発現ベクター、アダプター、プライマー、およびクローニングベクターからなる群から選択され、第１の参照データ配列とは独立に選択される、［２４］に記載の分析システム。
［２６]
第１の参照データ配列が発現ベクターであり、第２の参照データ配列がアダプターである、［２３］に記載の分析システム。
［２７]
第１および第２の参照データ配列が、プライマーおよびアダプターからなる群から独立に選択される、［２３］に記載の分析システム。
［２８]
導入遺伝子隣接配列と、左クローニングベクター、発現ベクター、プライマー、アダプター、および右クローニングベクターの少なくとも１つとを可視化するためのモジュールをさらに含む、［２０］に記載の分析システム。
［２９]
ゲノム内の１つまたは複数の挿入部位を可視化するためのモジュールをさらに含む、［２０］に記載の分析システム。
［３０]
前記計算モジュールが、挿入部位の上流および下流のゲノムの配列情報を特徴付けるようにさらに作動可能である、［２０］に記載の分析システム。
［３１]
前記計算モジュールが、挿入部位の１０キロ塩基対上流および１０キロ塩基対下流のゲノムの配列情報を特徴付けるように作動可能である、［３０］に記載の分析システム。
［３２]
前記計算モジュールが、
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させ、
整列された配列の定性分析を行う、
ように作動可能である、［２０］に記載の分析システム。
［３３]
前記計算モジュールが、
配列データを参照データ配列の１つまたは複数と整列させ、
整列された配列の定量分析を行う、
ように作動可能である、［２０］に記載の分析システム。
［３４]
ゲノムが、植物ゲノムの少なくとも一部である、［２０］に記載の分析システム。
［３５]
参照データ配列の少なくとも１つと配列データを関連付けることが、配列データに対して参照データ配列の少なくとも１つをマッチさせるアルゴリズムを使用することを含む、［２０］に記載の分析システム。
［３６]
アルゴリズムがＬＡＳＴＺアルゴリズムである、［３５］に記載の分析システム。
［３７]
ゲノム内の導入遺伝子隣接配列の１つまたは複数の挿入部位を検索することが、少なくとも１つの挿入部位の上流および下流の配列をゲノムとともに特定するアルゴリズムを使用することを含む、［２０］に記載の分析システム。
［３８]
アルゴリズムがＢＬＡＳＴアルゴリズムである、［３７］に記載の分析システム。
【符号の説明】
【０１００】
１０１  左クローニングベクター
１０３  発現ベクター
１０５  プライマー
１０７  導入遺伝子隣接領域配列
１０９  アダプター
１１１  右クローニングベクター
２０１  入力試料
２０３  参照試料データ
２０５  シーケンサー
２０７  分析システム
２０９  遠隔システム
２２０  流れ図
２２１  試料を準備する
２２３  試料を処理して配列を得る
２２５  参照試料情報を受け取る
２２７  参照試料情報に基づいて配列を分析する
３０１  入力デバイス
３０２  ネットワーク
３０３  入力モジュール
３０４  クライアント
３０５  計算モジュール
３０７  出力モジュール
３０９  出力デバイス
３１１  可視化モジュール
３１３  オペレーティングシステムソフトウェア
３１５  メモリー
３１７  試料データ
３２５  制御装置
４０１  試料および分析方法を準備する
４０３  シークエンシング
４０５  隣接配列を同定する
４０７  データを後処理する
５０１  既知のベクター、アダプター、および／またはプライマー配列を選択する／受け取る
５０３  未知の入力配列を受け取る
５０５  相同性および配列類似性の検索
５０７  既知のプライマーおよびアダプターとの類似性の高い配列の同定
５０９  発現ベクターの類似性
５１１  入力配列の配向を同定する
５１３  導入遺伝子隣接配列を特定して出力する
５１５  ゲノムに隣接配列をマッピングする
５１７  隣接配列の位置を可視化する
５５１  プライマーおよびアダプターの検索
５５３  プライマー及びアダプターは発見されたか？
５５５  プライマー又はアダプターは発見されたか？
５５７  処理を失敗した配列−赤色でマークする
５５９  既知配列を取り出し、ゲノムに対して未知なものを検索する
５６１  既知配列を取り出し、ゲノムに対して未知なものを検索する
５６３  ゲノム中で未知か？
５６５  処理を失敗した配列−橙色でマークする
５６７  ゲノム中で未知か？
５６９  処理を失敗した配列−橙色でマークする
５７１  ゲノム中の配列の位置を記録し、緑色でマークする
５７３  ゲノム中の配列の位置を記録し、黄色でマークする
６０３  プライマー
６０５  入力配列
６０７  逆相補配列
６０９  配列
７０１  ボックス（一連の入力配列を選択する）
７０３  シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）
７０５  ボックス（実験で使用された、かつ入力配列中に存在するはずである１つまたは複数の発現ベクター１０３を選択する）
７０７  ボックス（ベクター配列を入力する）
７０９  ボックス（プライマー１０５の配列を入力する）
７１１  ボックス（アダプター１０９の配列を入力する）
８５０  方法
８５２  入力未知配列を提供する
８５４  入力参照配列を提供する
８５６  未知配列内の発現ベクターを検索する
８５８  発現ベクターは発見されたか？
８６０  処理を失敗した配列−赤色でマークする
８６２  未知配列内のアダプター配列を検索する
８６４  アダプター配列は発見されたか？
８６６  未知配列の同定を試みる
８６８  配列は同定されたか？
８７０  ゲノムに対して未知なものを検索する
８７２  ゲノム中で未知か？
８７４  ゲノム中の配列の位置を記録し、緑色でマークする
８７６  処理を失敗した配列−橙色でマークする
８７８  処理を失敗した配列−赤色でマークする
８８０  未知配列の同定を試みる
８８２  配列は同定されたか？
８８４  処理を失敗した配列−赤色でマークする
８８６  ゲノムに対して未知なものを検索する
８８８  ゲノム中で未知か？
８９０  ゲノム中の配列の位置を記録し、緑色でマークする
８９２  処理を失敗した配列−橙色でマークする
【図１Ａ】
0006314091.tif 000003
【図１Ｂ】
0006314091.tif 000004
【図２Ａ】
0006314091.tif 000005
【図２Ｂ】
0006314091.tif 000006
【図３】
0006314091.tif 000007
【図４】
0006314091.tif 000008
【図５Ａ】
0006314091.tif 000009
【図５Ｂ】
0006314091.tif 000010
【図５Ｃ】
0006314091.tif 000011
【図６】
0006314091.tif 000012
【図７】
0006314091.tif 000013
【図８】
0006314091.tif 000014
【図９Ａ】
0006314091.tif 000015
【図９Ｂ】
0006314091.tif 000016
【図９Ｃ】
0006314091.tif 000017
【図９Ｄ】
0006314091.tif 000018
【図９Ｅ】
0006314091.tif 000019
【図９Ｆ】
0006314091.tif 000020
【図１０】
0006314091.tif 000021
【図１１】
0006314091.tif 000022
【配列表】
0006314091000001.app