(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の予防又は治療のためのセドヘプツロース含有組成物。
【請求項２】
前記炎症が慢性炎症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記炎症が全ての臓器特異的症状、特に急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）を含む、特に多発外傷又は感染に応答した広範囲の全身性炎症と定義される全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は敗血症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記炎症が末梢血における炎症性サイトカイン、特に腫瘍壊死因子α若しくはインターロイキン−６、又は他の炎症マーカー、特にｃ反応性タンパク質若しくは血清アミロイドαのレベルの増大に反映される慢性（軽度）全身性炎症と定義され、老化、脂肪症、アテローム性動脈硬化症、耐糖能異常及び２型糖尿病、神経変性障害、特に認知症、大鬱病性障害（ＭＤＤ）及び癌に関与するメタ炎症又は炎症性老化である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記炎症が、因果的に又は別の面で、炎症関連障害、好ましくは脂肪症、耐糖能異常、真性糖尿病及び糖尿病合併症、メタボリック症候群、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎及びより奇異な病気、慢性ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎及び全てのステージの脂肪肝疾患を含む慢性炎症性肝疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び気管支喘息、中枢神経系の炎症性疾患、特に多発性硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病、又は末梢神経系の炎症性疾患、特に糖尿病性多発ニューロパチー、ギランバレー症候群及び関連の症候群、並びに自己免疫性コラーゲン組織疾患又は慢性感染と関連する神経炎／ニューロパチー、特にライム病、骨粗鬆症、骨関節炎、関節炎、特に関節リウマチ、又は剛直性脊椎炎及び他のリウマチ障害、特に自己免疫性結合組織障害及び筋炎、任意の病因及び兆候の血管炎、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）慢性炎症性皮膚障害、特に乾癬及びアトピー性皮膚炎、歯周炎、大鬱病性障害、並びに癌の発症機序に関与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記炎症が、癌の原因、進行、転移、治療に対する抵抗性、治療後の再発及び癌の兆候、特に癌に関連する悪液質、貧血、疲労及び抑鬱を含む癌の発症機序に関与する、請求項１、２、４及び５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記炎症が急性若しくは慢性移植片拒絶反応、特に同種肺、肝臓、腎臓、心臓、腸若しくは膵島細胞移植の拒絶反応、又は逆に自己、同系若しくは同種骨髄、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）若しくは臍帯血移植後の急性若しくは慢性移植片対宿主病に関与する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記炎症が特に腎代替療法に用いられる腹膜透析の結果としての脂肪組織の炎症、神経系の炎症、血管の炎症及び腹膜の炎症からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
セドヘプツロースが１日当たり０．００１ｇ〜３００ｇの量で投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
非経口、皮下、経口、静脈内、腫瘍内、筋肉内又は腹腔内注射により投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
０．００１ｇ〜３００ｇの量のセドヘプツロースを含有する粉末、粒状物、錠剤、ペレット、カプセル又はシロップとして投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ヘキソキナーゼ阻害剤、マンノヘプトース又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースと組み合わせて投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
患者に移植される臓器を、セドヘプツロースを含む保存液に保存する、臓器移植患者における炎症を低減する目的のために、移植目的の臓器を保存する方法。
【請求項１４】
前記保存液がセドヘプツロースを、移植される臓器に付着した又はそれを覆う全ての液体材料の濃度と定義される０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
セドヘプツロースを０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する、腹膜透析の結果としての炎症を予防するための、腹膜透析液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は炎症の予防又は治療である。
【背景技術】
【０００２】
炎症は病原体、損傷細胞又は刺激物等の有害な刺激に対する血管組織の複雑な生物学的応答の一部である。急性炎症の典型的な兆候は疼痛、熱、発赤、腫脹及び機能消失である。炎症は有害な刺激を取り除き、治癒過程を開始する生物の保護的試みである。炎症は常同的な応答であり、したがって各々の病原体に特異的な適応免疫と比べて先天免疫の機構とみなされる。
【０００３】
炎症は急性又は慢性に分類することができる。急性炎症は有害な刺激に対する身体の初期応答であり、血液から傷害組織への血漿及び白血球（特に顆粒球）の移動の増大によって達成される。生化学的事象のカスケードが伝播し、局所血管系、免疫系及び傷害組織内の様々な細胞が関与する炎症応答となる。慢性炎症として知られる長期の炎症は炎症部位に存在する細胞型の漸進的変化をもたらし、炎症過程の組織の同時の破壊及び治癒を特徴とする。
【０００４】
炎症異常（炎症性障害）は多種多様なヒト疾患の根底にある大きな障害群である。免疫系が炎症性障害に関わることが多く、アレルギー反応及び一部のミオパシーの両方で実証されており、多くの免疫系障害が異常炎症を引き起こす。炎症過程における病因源による非免疫疾患としては、癌、アテローム性動脈硬化症及び虚血性心疾患が挙げられる。炎症と関連する障害の例としては、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、類肉腫症、移植片拒絶反応、脈管炎、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、ミオパシー、白血球欠損及び癌が挙げられる。
【０００５】
急性及び慢性炎症の薬物治療はコルチコステロイド又は非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）を用いて行われている。
【０００６】
抗炎症食品も炎症の治療又は予防に提案されている。プロスタグランジンは身体に様々な形で影響を及ぼし、また炎症媒介を調節するホルモン様物質である。抗炎症食は身体内で炎症誘発プロスタグランジン（ＰＧＥ２）を生成する食品をあまり含まず、抗炎症性プロスタグランジン（ＰＧＥ１及びＰＧＥ３）を生成する食品を多く含む。炎症予防に提案されている食事は野菜に富み、単純糖質並びに飽和脂肪及びトランス脂肪等の脂肪が少ない食事である。抗炎症食品としては、大抵の有色（colourful）果物及び野菜、脂肪分の多い魚（より高レベルのω−３脂肪酸を含有する）、種実類（nuts, seeds）、並びにショウガ等の或る特定の香辛料が挙げられる。エクストラバージンオリーブ油は、イブプロフェンと同様に作用する化学物質オレオカンタールを含有する。ω−３脂肪酸は、ＧＰＲ１２０受容体に結合することによって炎症細胞のシグナル伝達経路を破壊することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、依然として炎症、特に慢性炎症の予防及び治療が必要とされている。かかる予防及び治療は重度の副作用なしに、又は好ましくは依存、代謝異常、有効性低下等の長期の不利な展開のリスクなしに与えられる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、炎症の予防又は治療に使用されるセドヘプツロースを提供する。
【０００９】
セドヘプツロース（ＣＡＳ番号：３０１９−７４−７；ＰｕｂＣｈｅｍ：５４５９８７９；ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ：４５７３６２０；ＭｅＳＨ：セドヘプツロース；ＣｈＥＢＩ：ＣＨＥＢＩ：１６８０２）又はＤ−ａｌｔｒｏ−ヘプツロースは、７個の炭素原子及びケトン官能基を有する単糖であるケトヘプトースである。セドヘプツロースは自然界に見られる幾つかのヘプトースの１つである。セドヘプツロースは天然源からの抽出又は化学合成によって生成可能である。セドヘプツロースは高純度（例えば６０％超の純度、好ましくは８５％超の純度、より好ましくは９０％超の純度、より好ましくは９５％超の純度、更により好ましくは９９％超の純度、特に９９．９％超の純度）まで精製することができる。
【００１０】
セドヘプツロースは、一次グルコース代謝の中間分子として認識されているそのリン酸化型であるセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）に比べて比較的知られていない代謝産物である。セドヘプツロースの天然の存在であるケトヘプトースは植物で初めて報告され、続いてヒト尿、血斑、また近年ではマウス細胞において同定されている。Ｓ７Ｐはリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）及びキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）のトランスケトラーゼ触媒変換に由来する。この反応はペントースリン酸経路の非酸化アームにおいて起こり、Ｓ７Ｐに加えて重要な解糖中間体であるグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を生成する。Ｇ３Ｐ及びＳ７Ｐは、トランスアルドラーゼによってもフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）及びエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）を基質として用いて産生される。このため、Ｓ７Ｐは非酸化的ＰＰＰの重要中間体であり、したがってＳ７Ｐバイオアベイラビリティが細胞炭素フラックスに寄与する。近年、幾つかのグループによるデータが、セドヘプツロースキナーゼが同様にセドヘプツロースの直接リン酸化によってＳ７Ｐを産生し得ることを示している（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。この発見により、細胞炭素代謝に積極的に参加する付加的な炭素源であるセドヘプツロースの予期せぬ存在が実証された。
【００１１】
遊離セドヘプツロースは果物及び野菜の食事に由来するか、又は内因的に産生されたＳ７Ｐの脱リン酸化によって形成され得る。これまで、特異的セドヘプツロース輸送体又はＳ７Ｐ特異的（正：specific）ホスファターゼは報告されていなかった。他の生物活性ヘプトースとしては、フェノール化合物７−Ｏ−ガロイル−セドヘプツロース（ＧＳ）、マンノヘプツロース及びグルコヘプトース（glucoheptose）が挙げられる。ＧＳは、炎症応答を緩和することによって腎臓の糖尿病性損傷を防ぐことが報告されている。マンノヘプツロース（様々な特許が出願中である）はセドヘプツロースの異性体であり、一般にアボカドに見られる強力なヘキソキナーゼ阻害剤である。グリコヘプトースは化学的性質が未だ特定されていないにもかかわらず、ウサギにおいて利用し得る糖質源となることが示されている。セドヘプツロサンはセドヘプツロースの無水物であり、同様に遊離セドヘプツロースの供給源となる可能性がある。
【００１２】
遊離セドヘプツロースは例えば植物オオベンケイソウ（sedum spectabile）から単離することができ、多量のヘプトース糖質を含有することが以前に報告されている。
【００１３】
セドヘプツロースキナーゼは遊離セドヘプツロースをリン酸化し、これにより細胞がヘキソキナーゼ及びグルコースと同様にセドヘプツロースを糖質代謝へ直接送ることが可能になる。本発明によると、セドヘプツロースは一次糖質異化及び同化に送り込まれる直接的な炭素源であり、ここでＣＡＲＫＬがその入り口点を構成する。したがって驚くべきことに、これらの化合物が全て遊離糖質及びリン酸化型として存在するため、セドヘプツロースはグルコース及びフルクトースと比較され得る。代謝に入るためには、遊離糖質は初期リン酸化事象によってエネルギー的に活性化される。ヘキソキナーゼはグルコースをリン酸化してＧ６Ｐを形成するものであり、細胞グルコースフラックスの重要な決定因子である。フルクトースはケトヘキソキナーゼによってリン酸化されてフルクトース−１−リン酸（Ｆ１Ｐ）を形成し、これが初めにアルドラーゼによってグリセルアルデヒド及びジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へと変換されるはずである。次いで、ＤＨＡＰは炭素サイクルに直接入ることができるが、グリセルアルデヒドは更にリン酸化されなくてはならない。ヘキソキナーゼによるグルコースからのＧ６Ｐ形成に類似した、セドヘプツロースキナーゼによるセドヘプツロースからのＳ７Ｐの形成によって、遊離セドヘプツロースが容易に異化系に入ることが可能となる。Ｆ６Ｐリン酸化が高Ｓ７Ｐ濃度の存在下で競合的に阻害されることも報告されている。興味深いことに、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）を含有する画分がセドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ（ＳＢＰアーゼ）活性を有することも報告されている。
【００１４】
したがって、本発明はヘキソース−及びヘプトース−（ビス）リン酸シャントの共存にも基づく。特に、高グルコースレベル又はＦ２，６ｂＰとのインキュベーションが、灌流ラット肝臓及びラット肝サイトゾルのそれぞれにおいてＳ１，７ｂＰ形成を増大させた。高グルコースとは対照的にグルカゴンはＳ１，７ｂＰ脱リン酸化、ひいてはＳ７Ｐ形成に有利に働いた。これらの結果から、セドヘプツロース代謝がホルモン制御に影響されやすいことが示される。
【００１５】
セドヘプツロース代謝は代謝調節に関与する。実際に、セドヘプツロースはグルコースとは独立してＳ７Ｐを供給することによって代謝フラックスを指向する。マウスマクロファージ細胞株におけるＣＡＲＫＬ発現の増大（ひいてはセドヘプツロース消費の増大）はＧ３Ｐ、Ｘ５Ｐ及びＲ５Ｐ定常状態レベルの低下をもたらし、ＣＡＲＫＬノックダウンは逆の効果を示した。特に、基礎セドヘプツロースレベルはＣＡＲＫＬ摂動によっては変化しなかった。Ｓ７Ｐレベルは過剰発現では変化しなかったが、ＣＡＲＫＬ喪失によって顕著に低下し、セドヘプツロースリン酸化が解糖によって誘導されるＧ３Ｐ分布の律速因子であることが示された。したがって、Ｓ７Ｐアベイラビリティの調節はＣＡＲＫＬ又は過剰量のセドヘプツロースが細胞代謝を調整する機構であり得る。
【００１６】
したがって、本発明は例えばＣ６（過剰）消費、肥満、糖尿病、免疫機能及び概して脊椎動物のエネルギー利用のバランスを保つためのＣ７の使用に関する。したがって、Ｃ７の補充は生理学的酸化還元調節、更には関連障害を管理する効果的な戦略も提供する。本発明により、高セドヘプツロース及び高セドヘプツロースキナーゼの両方がセドヘプツロース代謝回転の増強をもたらすことが判明した。さらに、セドヘプツロースキナーゼの組織発現から、肝臓又は脂肪組織等の代謝臓器がセドヘプツロースを消費する能力を有することが明らかである。さらに、褐色脂肪組織（多量の脂質を燃焼する）は白色脂肪組織よりもはるかに多くの（約２．５倍の）セドヘプツロースキナーゼを発現する。
【００１７】
炎症を有する又は炎症を患うリスクがある患者に投与されるセドヘプツロース（及び／又は他のヘプトース）は血糖負荷を最小限に抑え、例えば食事誘発性肥満及び／又は糖尿病の予防に積極的に寄与する。さらに、セドヘプツロース代謝増強モデルであるトランスジェニックセドヘプツロースキナーゼ動物によるデータから、高セドヘプツロース代謝が脂質酸化を増大する（より低いＲＱ値により示される）ことが示される。これはセドヘプツロース代謝回転の増強の有益な効果である。高セドヘプツロース代謝回転の動物ではエネルギー消費も低下する。さらに、ＣＡＲＫＬマウスは対照動物よりもインスリン感受性であるようである。総合すると、セドヘプツロース代謝が脊椎動物において代謝表現型を調節するのに効果的な手段であることも示される。
【００１８】
本発明により、特異的な驚くべき抗炎症効果が高セドヘプツロース代謝回転によって引き起こされると示すことができた。炎症の増強は、インスリン耐性のような肥満関連障害等の疾患の発症において重要な役割を果たす。マクロファージ活性化の新規の調節因子についての機能的キナーゼスクリーニングでは、セドヘプツロースキナーゼがリポ多糖（ＬＰＳ）により誘導される腫瘍壊死因子αの分泌を抑制することが見出された。同じスクリーニングにおいて、ヘキソキナーゼ、ケトヘキソキナーゼ及びホスホフルクトキナーゼの過剰発現（高グルコース／フルクトース代謝）は反対の効果を有していた。これにより、ヘプトースが炎症を阻害するというヘキソース糖質代謝とヘプトース糖質代謝との反対の効果が示される。さらに、ＣＡＲＫＬ発現の増大はＬＰＳ誘導マクロファージ活性化を抑制し、細胞内スーパーオキシド形成の鈍化をもたらす一方で、ＣＡＲＫＬの喪失（セドヘプツロース代謝の低下を模倣する）は細胞の炎症応答を増強した。
【００１９】
これらの効果に加えて、本発明を確立する過程で、野生型対照と比較したＣＡＲＫＬ過剰発現動物及びＣＡＲＫＬマウスの脂肪組織における（ＬＰＳ注射により誘発される）炎症後に、又はｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＡＲＫＬマウスの脂肪組織のセドヘプツロース補充によってサイトカイン産生が減少することが示された。まとめると、これによりセドヘプツロースの投与が炎症を抑え、したがって炎症性疾患、特に慢性炎症性疾患を有する又は炎症性疾患のリスクがある患者の健康管理に関する面で良好な影響を及ぼすことが示された。本発明による慢性炎症性疾患は、既知の（例えば持続感染）又は現在知られていない（例えばサルコイドーシス又は慢性鼻副鼻腔炎の殆どの症例）任意の病因の局所的又は全身的な持続炎症と定義される。
【００２０】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい炎症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、メタ炎症、炎症性老化、炎症関連障害の発症機序の炎症、急性又は慢性移植片拒絶反応の発症機序の炎症及びその過程の炎症である。したがって本発明によって予防又は治療されることが好ましい炎症では、炎症が全ての臓器特異的症状、特に急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）又は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）を含む、特に多発外傷又は感染に応答した広範囲の全身性炎症と定義されるＳＩＲＳ又は敗血症である。
【００２１】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい別の炎症では、炎症は末梢血における炎症性サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子α又はインターロイキン−６のようなもの）、又は他の炎症マーカー（例えばｃ反応性タンパク質又は血清アミロイドαのようなもの）のレベルの増大に反映される慢性（軽度）全身性炎症と定義され、老化、脂肪症、アテローム性動脈硬化症、耐糖能異常及び２型糖尿病、認知症のような神経変性障害、大鬱病性障害（ＭＤＤ）及び癌に関与するメタ炎症又は炎症性老化である。
【００２２】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい別の炎症では、炎症は、因果的に又は別の面で、炎症関連障害、特に脂肪症、耐糖能異常、真性糖尿病及び糖尿病合併症、メタボリック症候群、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎及びより奇異な病気）、慢性ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎及び全てのステージの脂肪肝疾患を含む慢性炎症性肝疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び気管支喘息、多発性硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む中枢神経系の炎症性疾患、又は糖尿病性多発ニューロパチー、ギランバレー症候群及び関連の症候群を含む末梢神経系の炎症性疾患、並びに例えば、自己免疫性結合組織障害及び筋炎のスペクトル全体を含む関節リウマチ、又は剛直性脊椎炎及び他のリウマチ障害のようなライム病、骨粗鬆症、骨関節炎、関節炎のような自己免疫性コラーゲン組織疾患又は慢性感染と関連する神経炎／ニューロパチー、任意の病因及び兆候の血管炎、乾癬及びアトピー性皮膚炎のような加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）慢性炎症性皮膚障害、歯周炎、大鬱病性障害、並びに癌の発症機序である。
【００２３】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい別の炎症では、炎症は、癌の原因、進行、転移、治療に対する抵抗性、治療後の再発及び癌の兆候、特に癌に関連する悪液質、貧血、疲労及び抑鬱を含む癌の発症機序に関与する。癌の発症機序における炎症の普遍的な関与を考えると、本発明は組織起源、分化又は局在化を問わず、全てのタイプの癌腫及び肉腫、黒色腫及び神経堤由来細胞の他の腫瘍、中枢神経系の腫瘍、白血病及びリンパ腫を含む全ての癌要素に適用可能である。
【００２４】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい別の炎症では、炎症は急性若しくは慢性移植片拒絶反応、特に同種肺、肝臓、腎臓、心臓、腸若しくは膵島細胞移植の拒絶反応、又は逆に自己、同系若しくは同種骨髄、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）若しくは臍帯血移植後の急性若しくは慢性移植片対宿主病に関与する。
【００２５】
本発明によって予防又は治療されることが好ましい別の炎症は、特に腎代替療法に用いられる腹膜透析の結果としての脂肪組織の炎症、神経系の炎症（神経炎症）、血管の炎症（血管炎症）及び腹膜の炎症からなる群から選択される。
【００２６】
一方、本発明はあらゆる種のセドヘプツロース欠乏の予防及び治療、すなわちセドヘプツロース欠乏に起因する障害を予防することができるようなセドヘプツロース欠乏の治療にも関する。かかるセドヘプツロース欠乏を治療するために、セドヘプツロース含有組成物を、かかるセドヘプツロース欠乏（又はセドヘプツロース欠乏症候群）を有するか又は発症するリスクがある患者に例えば栄養補給剤として、又は食品及び／又は飲料と組み合わせて投与することができる。
【００２７】
セドヘプツロースに毒性はなく、ヒト代謝の天然の糖質源である。したがって、セドヘプツロースを予期せぬ副作用又は有害反応のリスクなしに実質的に全ての医学的に妥当な方法で投与することができる。好ましい投与量、特に本発明の単回投与形態に従うと、セドヘプツロースは１日投与量が０．００１ｇ〜３００ｇの量、好ましくは１日投与量が０．５ｇ〜２００ｇの量、特に１日投与量が１ｇ〜１００ｇの量で投与される。
【００２８】
好ましいセドヘプツロースの投与は、非経口で（正：parenterally）、皮下に、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内若しくは腹腔内注射により行われ、特にセドヘプツロースは経口投与される。
【００２９】
セドヘプツロースは実質的に、薬学的に許容可能な賦形剤を含む殆どの医薬配合物形態に組み込むことができる。セドヘプツロースはセドヘプツロースを含有する粉末、粒状物、錠剤、ペレット、カプセル又はシロップとして投与するのが好ましい。
【００３０】
好ましい実施の形態によると、セドヘプツロースは０．００１ｇ〜３００ｇの量、好ましくは０．５ｇ〜２００ｇの量、特に１ｇ〜１００ｇの量で投与される。これらの投与量は例えば７０ｋｇ〜８０ｋｇの正常ヒト個体に対するものであるが、性別、炎症の程度（又はリスク）、他の治療計画、患者の生理学的状態／健康等に基づいて容易に適合させることができる。
【００３１】
好ましい実施の形態によると、セドヘプツロースはヘキソキナーゼ阻害剤、好ましくはマンノヘプツロース又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースと組み合わせて投与される。ヘキソキナーゼ阻害剤は当該技術分野で既知であり、本発明において従来技術で既知の又は提案されている量及び投与量で患者に適用することができる。例えば、阻害剤はセドヘプツロース含量に対して０．０００１％〜５０％（ｗ／ｗ）、特に０．００１％〜１％の量（例えば１００ｍｇのセドヘプツロースを投与する場合、０．０００１ｍｇ〜５０ｍｇ）で添加することができる。
【００３２】
別の実施の形態によると、本発明は、患者に移植される臓器を、セドヘプツロースを含む保存液に保存する、移植目的のヒト臓器を保存する方法に関する。本態様はセドヘプツロースの抗炎症能に基づき、（セドヘプツロースを同様に適用することができる）臓器移植患者において炎症を低減するという同じ目的を果たす。移植される臓器の含浸に使用されるセドヘプツロース保存液の抗炎症特性はまた、抗炎症保護が患者だけでなく、移植された臓器においても存在するように保存中、更には移植後の摘出臓器自体における炎症過程の低減又は防止を保つ。
【００３３】
本方法の好ましい実施の形態では、保存液はセドヘプツロースを０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度、特に０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、これは移植される臓器に付着した又はそれを覆う全ての液体材料（すなわち臓器を容器（containment）から取り出した後も臓器保存容器に残る溶液）の濃度と定義される。
【００３４】
別の態様によると、本発明は、セドヘプツロースを０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度、特に０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する腹膜透析液に関する。
【００３５】
本発明を以下の実施例及び図面で更に説明するが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】（Ａ）ニンジン又は室内で栽培したオオベンケイソウ植物の葉に由来するプールしたサンプルを、ガスクロマトグラフィーと組み合わせた質量分析によって分析し、相対グルコース（Ｃ６）及びセドヘプツロース（Ｃ７）レベルを特異的に測定した。それぞれのピーク面積を除算することによってＣ６／Ｃ７比を算出した。（Ｂ）セドヘプツロース及びグルコースレベルを、食品摂取前後の個体の血清におけるＧＣ−ＭＳによって更に評価し、食事由来のＣ７がヒト血流に入ることができるか否かを調査した。４人の一晩絶食した（絶食）個体のセドヘプツロース及びグルコースレベル（白いバー）を、主にニンジン（約７００ｇ）を幾らかのオリーブ油、塩及びコショウとともに含有する食事の２時間後に測定したレベル（食事供給、灰色のバー）と比較した。血清糖質レベルの変化を平均倍数変化（ｎ＝４、±Ｓ．Ｄ．）で表した。（Ｃ）グルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度を指定の飲料の糖質抽出物で測定した。４つのプールした技術的反復試験の平均値をブロットし（blotted）、抽出糖濃度を実証した。（Ｄ）さらに、グルコース及びフルクトース（Ｃ６）分子又は重量の総和をそれぞれのセドヘプツロース（Ｃ７）単位で除算することによってＣ６／Ｃ７（セドヘプツロース）比を確立した（Ｎ．Ａ．＝該当なし）。
【図２】（Ａ）マウス肝臓における４８時間にわたる正規化セドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）ｍＲＮＡ発現レベルのブロットを、公表されている「概日遺伝子発現データベース（Circadian Gene Expression Database）−ＣＩＲＣＡ」から得た。Ｙ軸は正規化遺伝子発現を表し、Ｘ軸は時間（時間）を表す。（Ｂ及びＣ）摂動ＣＡＲＫＬ発現を有する細胞の還元及び酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドレベルを、以前に記録されたメタボロミクスデータ（Haschemi et al., 15 (2012), 813-826）から算出した。ＣＡＲＫＬ媒介ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド調節を説明するために、（Ｂ）過剰発現により高ＣＡＲＫＬレベルを発現する又は（Ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉｒ発現により低ＣＡＲＫＬレベルを発現するＲＡＷ２６４．７細胞株を個々の対照細胞株と比較した。データは３回の個々の実験の平均倍数変化±ＳＥＭを表す。（Ｄ）ＣＡＲＫＬ  ｍＲＮＡレベルをマウスｃＤＮＡ組織ライブラリーにおいて測定した。データは、胸腺ＣＡＲＫＬ発現と比較した（β−アクチンに対して）正規化した平均ＣＡＲＫＬ発現を倍数変化（全組織のｎ＝３、Ｓ．Ｄ．）で表す。
【図３】（Ａ〜Ｅ）初代ヒト脂肪細胞を、グルコース及びフルクトース（ＧＦ、１．５ｇ／Ｌの各糖；全糖質３ｇ／Ｌ）又はＧＦＳと称されるセドヘプツロース添加培地（１ｇ／Ｌの各糖；全糖質３ｇ／Ｌ）の存在下で８日間の間質血管細胞画分の分化によって得た。続いて、（Ａ）ＣＡＲＫＬ、（Ｂ）アディポネクチン及び（Ｃ）脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価し、群間で比較した。脂肪細胞の（Ｄ）細胞酸素消費速度（ＯＣＲ）及び（Ｅ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、指定の糖質ミックスの存在下で記録した（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝９〜１１）。ＧＦ又はＧＦＳ糖質ミックスを含有する細胞培養培地で３日間培養した成熟マウス脂肪細胞の（Ｆ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）及び（Ｇ）インターロイキン６（ＩＬ−６）ｍＲＮＡ発現レベル、又は（Ｈ）初代マウス肝細胞におけるＩＬ−６発現、並びに初代骨髄由来マクロファージにおける（Ｉ）ＴＮＦａ及び（Ｊ）ＩＬ−６  ｍＲＮＡレベル（どちらの細胞型もＧＦ又はＧＦＳ培地中で２日間前培養した）を、それぞれの群間で比較した。２日間にわたる（Ｋ）ＴＮＦａ及び（Ｌ）ＩＬ−６サイトカインの分泌を、骨髄由来マクロファージの上清におけるＥＬＩＳＡによって測定した。マクロファージによるそれぞれの培地における（Ｍ）活性化の２時間後のＴＮＦａ及び（Ｎ）活性化の６時間後のＩＬ−６のＬＰＳ誘導（１００ｎｇ／ｍｌ）分泌を、同様にＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を表す。
【図４】活性読み取り値としてＡＤＰ形成を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、一定のＡＴＰ（１５０μＭ）濃度でのセドヘプツロース代謝回転率は、（Ａ）セドヘプツロース濃度の増大又は（Ｂ）律速酵素であるセドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）の量の増大によって増強した。（Ｃ〜Ｅ）野生型（正：wild-type）（ＷＴ）及びセドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ過剰発現マウスの肝細胞をＧＦＳ含有培地中で２日間前培養した後、これらの細胞の基礎（Ｃ）ＥＣＡＲ及び（Ｄ）ＯＣＲを記録した。（Ｅ）両遺伝系統（正：lineages）（ＣＡＲＫＬ及びＷＴ対照）に由来する肝細胞をＧＦ又はＧＦＳ含有培地中で培養した後、１時間予め飢餓状態にし（無糖質）、培養培地中１ｇ／Ｌの最終濃度に達するまでグルコースを添加することによってグルコース誘導ＥＣＡＲを測定した（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝７〜１１）。代謝ｉｎ  ｖｉｖｏ指標として、日中（８ａｍ〜４ｐｍ）及び夜間（８ｐｍ〜４ａｍ）における活動当たりの（Ｆ）呼吸商（ＲＱ）及び（Ｇ）エネルギー消費（ＥＥ、ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５）を間接熱量測定法により決定し、ＣＡＲＫＬと野生型（ＷＴ）同腹子とを比較した。データは平均値、ｎ＝３、±ＳＤを表す。（Ｈ）マウスにおけるインスリン耐性試験を、予め飢餓状態にした（４時間）雌性ＣＡＲＫＬ−トランスジェニック及び野生型同腹子対照に対し、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕのインスリンを腹腔内注射することによって行った。注射前（対照）並びに注射の１５分後、３０分後、４５分後及び６０分後に血糖を測定し、対照に対する％の相対値としてグラフにした。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３〜４を表す。
【図５】（Ａ）ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから単離し、制御培地（ＧＦ）中で培養した肝細胞における脂質沈着をＯｉｌ  Ｒｅｄ染色によって可視化した。代表的な顕微鏡写真は２０倍対物レンズを用いて取得した。（Ｂ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を、ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから単離し、制御培地（ＧＦ）中で２日間培養した肝細胞において測定した。矢印はＧ６ＰＤ活性の再局在化を示す。代表的な顕微鏡写真は１０倍対物レンズを用いて取得した。（Ｃ及びＤ）ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する破骨細胞を分化させ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏ  ＡｓｓａｙプレートにおいてＧＦ又はＧＦＳ含有培地中で７日間培養した。その吸収活性を、１ウェル当たりの倍率２０倍で目に見える全ての窩を計数することによって評価した。データは平均値、ｎ＝２〜３、±ＳＤを表す。（Ｄ）ＧＦ又はＧＦＳ含有培地で培養したＷＴ破骨細胞に見られる最大の吸収窩の２枚の代表的な画像を示す。顕微鏡写真は倍率４０倍で取得した。
【図６】（Ａ）セドヘプツロースキナーゼ過剰発現マウス（ＣＡＲＫＬ）及び対照同腹子の免疫系を亜致死リポ多糖注射（ＬＰＳ、７ｍｇ／ｋｇ）でチャレンジし、血清中の１９のサイトカインパネルを免疫活性化の２４時間後に測定した。データは、野生型（ＷＴ＝１００％）及びＣＡＲＫＬ血清においてｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｍａｐマウスサイトカインプロファイラーによって測定された個々のサイトカインの相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す（ｎ＝３、±ＳＤ）。ＷＴ及びＣＡＲＫＬマウスの（Ｂ及びＣ）皮下又は（Ｄ及びＥ）精巣上体白色脂肪組織から単離したマウス成熟脂肪細胞の単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）及びＴＮＦａ  ｍＲＮＡ発現。データは平均値、ｎ＝３、±ＳＤを表す。（Ｆ）脳卒中の発症率及びｒｓ４６５５６３遺伝子型。データをピアソンのχ２検定によって比較した。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｇ）初期無脳卒中生存の期間をカプラン−マイヤープロットによって評価した。ｒｓ４６５５６３について同型の個体：［Ｇ］−対立遺伝子は［Ａ］−対立遺伝子のキャリアよりも顕著に短い無症候時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３７】
材料及び方法
糖質
グルコース及びフルクトースはSigma Aldrichから購入した。セドヘプツロースは植物オオベンケイソウ又はムラサキベンケイソウ（sedum telephium）から単離し（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）、クロマトグラフィーによって更に精製した。
【００３８】
ニンジン及びヒト血清におけるグルコース及びセドヘプツロースの測定
オーストリアの「有機栽培保証認定」を有する新鮮なニンジンを小片にスライスし、液体窒素で急速凍結した。同じ手順を室内で栽培したオオベンケイソウ植物の採取したばかりの葉に適用した。各組織の３つのサンプルをプールし、ガラスビーズによって粉末までホモジナイズした。サンプルの糖質に富んだ画分を、１３Ｃ標準を混ぜた２０％Ｈ２Ｏ及び８０％ＭｅＯＨ抽出液によって単離し、質量分析と組み合わせた標準ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）のために処理した。グルコース及びセドヘプツロースをその個々の質量によって同定し、その相対量を１３Ｃ含量に対して正規化した個々の分析物の各々のピーク面積から導いた。グルコース及びセドヘプツロースを、一晩絶食した又はニンジンを供給した個体に由来する等量の血清においても測定した。ニンジンを蒸し、幾らかのオリーブ油、塩及びコショウを風味付けに使用した。ニンジン含有食の２時間前及び２時間後に、ヒト血清をＶＡＣＵＥＴＴＥ（商標）  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐチューブに血液から調製した。血清サンプルを先述のように処理し、上記及びRuiz-Matute AI et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2011) May 15 879(17-18)に詳述されるようにＧＣ−ＭＳによっても分析した。
【００３９】
飲料におけるグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度
指定の飲料は地元の食料品店で購入され、全てパック詰めされているものであった。（４回の技術的反復試験の各々について）各飲料から１ｍｌを取り出し、ＳｐｅｅｄＶａｃで減圧（正：vacuum）濃縮した。これに続いてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（８０：２０）沈殿及び遠心分離工程を行い、沈殿物から上清中の糖質画分を取り出した。各上清をＳｐｅｅｄＶａｃで再び凍結乾燥し、等量の水で再水和し、技術的反復試験試料をプールした。糖質分析のために、Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００  ＤＣ無金属システムをＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（２５０×４ｍｍ）及びＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１ガードカラム（どちらもDionex製）とともに１ｍＬ／分の流量で用いた。最初の２０分間は溶出を１６ｍＭ  ＮａＯＨによって均一濃度で行った。次いで、２０分〜４０分は１００ｍＭ  ＮａＯＨまでの線形勾配を適用し、続いて２分間かけて２００ｍＭまで増大し、４７分まで保持した。１６ｍＭ  ＮａＯＨによる開始条件を４９分の時点で再び達成し、７０分まで維持した。パルスアンペロメトリック検出のパラメーターは、Dionexの技術注記２１（Ｄｉｏｎｅｘ  ＥＤ４０電気化学的検出器を用いた糖質のパルスアンペロメトリック検出の最適設定）において推奨されるものと全く同じである。クロマトグラムを、各１００μＭの確かなグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース標準のクロマトグラムによって評価した。
【００４０】
ヒト脂肪細胞培養
腹部手術を受けた患者の皮下（正：subcutaneous）白色脂肪組織に由来する間質血管細胞画分（ＳＶＦ）を先述のように（Lindroos et al, Cell Metab. (2013), Jul 2;18(1):62-74.）単離した。簡潔に述べると、脂肪組織をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＩ（Worthington）で消化し、濾過した。ＳＶＦを遠心分離によって成熟脂肪細胞から分離した後、ＳＶＦ画分中の赤血球を溶解させた（Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ、Qiagen）。精製ＳＶＦをＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Life Technologies）中で培養した。細胞がコンフルエンスに達し次第、グルコース無含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Biowest）で洗浄し、培地を１．５ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース、又は各１ｇ／Ｌのグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースをそれぞれ含有する全糖質負荷が３ｇ／ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に置き換えた。コンフルエンスの２日後（０日目）に、１μＭデキサメタゾン、１．７４μＭインスリン、５μＭトログリタゾン、０．５μＭ  ＩＢＭＸ、１７μＭパントテン酸及び３３μＭビオチンを添加することによって分化を誘導した。２日後にＩＢＭＸ及びデキサメタゾンを除外し、４日目にインスリン及びトログリタゾンを除去した。６日目に培地の５０％を置き換えた。２日後に細胞をＲＮＡ単離のために採取した（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット、Qiagen）。
【００４１】
成熟マウス脂肪細胞の天井培養
前面及び後面皮下脂肪組織並びに精巣上体白色脂肪組織をトランスジェニックＣＡＲＫＬ−マウス及び野生型同腹子対照から単離した。脂肪組織をヒトサンプルについて上記したように消化した。遠心分離の後、浮遊成熟脂肪細胞の層を除去し、１００ｒｃｆで１０分間再遠心分離した。１５０μＬの充填脂肪細胞を６ウェルプレートにおいてＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ウシ血清（ＰＡＡ）中、浮動カバーガラス下で培養した。単離の２４時間後に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、培地を１．５ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース、又は各１ｇ／Ｌのグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースをそれぞれ含有する全糖質負荷が３ｇ／ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換した。３日後に、細胞をＲＮＡ単離のためにＴＲＩ試薬（Sigma）を用いて採取した。
【００４２】
肝細胞培養
肝細胞を雄性野生型及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから、マウスを肝臓ｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ灌流によって屠殺した後に単離した。灌流後、肝臓を迅速に取り出し、細片化し、セルストレーナー（Fisher Scientific, Inc）を通して５０ｍｌ容の滅菌チューブに濾過した。得られる濾液中の肝細胞を遠心分離工程によって非実質細胞から精製した。単離肝細胞を、１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌの指定の糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を含有する各ＤＭＥＭ培地１ｍｌ当たり０．２５×１０６の濃度でプレートに少なくとも２日間播種した後、実験を行った。
【００４３】
骨髄由来マクロファージ及び破骨細胞の培養
マウスの骨を雄性野生型及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから摘出し、骨髄をフラッシュし、洗浄し、溶解により赤血球を除去し、続いて２５ｍＭグルコース及び２０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ中で分化させた。４日後に、破骨細胞分化用の細胞を採取し、分化培地の入ったｃｏｒｎｉｎｇ  ｏｓｔｅｏ  ａｓｓａｙプレートに播種し（下記を参照されたい）、初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）のために培地を取り替え、更にＭ−ＳＣＦを２日間を添加した。次いで、分化ＢＭＤＭを１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌの指定の糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を含有する各ＤＭＥＭ培地に少なくとも２日間播種した後、実験を行った。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨吸収アッセイ
破骨細胞前駆体細胞（２０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦで４日間処理した骨髄細胞）を、２４ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏ  Ａｓｓａｙプレートに１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ）を含有するα−ＭＥＭ培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下でプレーティングした。培地を３日毎に取り替えた。７日後に、細胞を漂白剤によって取り出し、水で３回洗浄した後、Corning（技術審査）の標準プロトコルに従うＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を行い、無傷アッセイ表面と吸収窩とのコントラストを強調させた。各ウェルの全体を２０倍対物レンズを備えるＴｉｓｓｕｅＦａｘによって撮影し、目に見える全ての吸収窩を計数し、盲検で分析した。
【００４５】
細胞外酸性化速度及び酸素消費速度
ＸＦ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（Seahorse Bio.）を用いて、種々の糖質によって誘導される細胞代謝の変化を測定した。細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ、ｍｐＨ／分）及び酸素消費速度（ＯＣＲ、ｐｍｏｌ／分）を、初代ヒト脂肪細胞及び初代マウス肝細胞において製造仕様書に従って記録した。簡潔に述べると、細胞を脂肪細胞については１ウェル当たり１０４細胞、肝細胞については１ウェル当たり０．５×１０５細胞の密度でseahorseの細胞プレートに播種した。実験日に細胞を糖質無含有培地で洗浄し、糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を３ｇ／Ｌの濃度で含有する指定の培地中で１時間インキュベートした。グルコース誘導ＥＣＡＲを測定するために、細胞を炭素無含有培地で１時間飢餓状態にした後、自動注入によりグルコース（１ｇ／Ｌ）をウェルに添加した。グルコース誘導ＥＣＡＲをグルコース添加前のそれぞれのＥＣＡＲ（基礎＝１００％）に対して正規化した。種々の糖質源によって誘導される変化は、各炭素源の影響を示す相対変化（％）として表した。
【００４６】
遺伝子発現分析
簡潔に述べると、市販のキット（QIAGEN、Applied Biosystems）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲをＡｂｉＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴリアルタイムサイクラーでｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（BioRad）を用いて行い、ＣＡＲＫＬ、アディポネクチン、ＵＣＰ−１、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１及びβ−アクチンの発現を先述のように（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）測定した。標的遺伝子の発現をβ−アクチンの発現に対して正規化した。標的遺伝子の相対発現はΔΔＣＴ法によって算出した。
【００４７】
セドヘプツロースキナーゼアッセイ
ＡＤＰ  Ｑｕｅｓｔアッセイ（DiscoveRx）を用いて、ＡＤＰ蓄積による経時的なＳ７Ｐ形成を製造仕様書に従って間接的に測定した。組み換えセドヘプツロースキナーゼを大腸菌（E. coli）において予め産生させ、アフィニティー精製によって精製した（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。
【００４８】
間接熱量測定法
マウスの活動当たりの呼吸商（ＶＣＯ２産生／ＶＯ２消費）及びエネルギー消費（ＥＥ、ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５）を、代謝ケージ（Harvard Apperatus）において間接熱量測定法によって測定した。ＣＡＲＫＬトランスジェニックマウス又は野生型同腹子のいずれか１匹を、１つのケージに１日収容した後、日中（８ａｍ〜４ｐｍ）及び夜間（８ｐｍ〜４ａｍ）の活動当たりの平均呼吸商及びエネルギー消費の記録を開始した。
【００４９】
インスリン耐性試験
４時間予め飢餓状態にした雌性ＣＡＲＫＬ−トランスジェニックマウス及び野生型同腹子対照に、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕのインスリンを腹腔内注射した。血糖を注射前並びに注射の１５分後、３０分後、４５分後及び６０分後にワンタッチグルコースストリップ（Ａｃｃｕ  Ｃｈｅｃｋ、Roche）を用いて測定した。
【００５０】
Ｏｉｌ  Ｒｅｄ染色
簡潔に述べると、肝細胞を指定の通りに培養した後、培地を除去し、細胞を１０％ホルマリンで固定した。６０％イソプロパノールで洗浄した後、ウェルをＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液（Sigma-Aldrich）とともにインキュベートして１０分間染色し、水で４回洗浄した後、倍率２０倍で写真を撮影した。
【００５１】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ
細胞をポリスチレン容器組織培養処理ガラススライド上で成長させ、液体窒素で急速凍結し、−８０℃に維持した。酵素組織化学的手順はVan Noorden and Frederiksに記載のテトラゾリウム塩法に基づくものとした。Ｇ６ＰＤ活性の実証のためのインキュベーション培地は、０．１Ｍトリスマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）、１５ｍＭグルコース−６−リン酸、０．８ｍＭ  ＮＡＤＰ、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、０．４５ｍＭ  １−メトキシフェナジンメトスルフェート、５ｍＭアジ化ナトリウム及び５ｍＭテトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド中に１８％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（平均分子量７００００〜１０００００）を含有するものとした。培地はインキュベーションの直後に新たに調製した。対照反応物は４０ｍＭグルコサミン−６−リン酸を付加的に含有するものとした。細胞をオービタルシェーカーによる連続混合下、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を６０℃のリン酸緩衝食塩水で３×５分間洗浄し、乾燥させ、グリセロールゼラチンにマウントし、１日以内に倍率１０倍で撮影した。
【００５２】
免疫チャレンジ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン応答プロファイリング
亜致死マウスｉｎ  ｖｉｖｏ内毒素血症のために、７ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（Sigma Aldrich）を雄性ＣＡＲＫＬトランスジェニック又は野生型同腹子に腹腔内注射した。血清をＶＡＣＵＥＴＴＥ（商標）  ｍｉｎｉ  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐチューブによって全血から単離した。サイトカインを、ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｍａｐマウスサイトカインプロファイラーにより製造仕様書（Millipore）に従って測定した。全ての動物実験を、倫理動物使用許可プロトコル及びウィーン医科大学によって認可される規約（ＢＭＷＦ−６６．００９／０１４０−ＩＩ／１０ｂ／２０１０）に従って行った。
【００５３】
脳卒中リスクによるＣＡＲＫＬ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）関連研究
研究設計：２００３年３月までに集められたInflammation and Carotid Artery - Risk for Atherosclerosis Study（ＩＣＡＲＡＳ、Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.）の５７８人の神経学的に無症候の患者を本分析に選定した。選定及び除外基準は以前に公表されている。簡潔に述べると、第一の選定基準である無症候性頸動脈疾患は、過去１２ヶ月間に一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、一過性黒内障及び脳卒中又は残存症状がそれぞれないことと定義される。徹底的な健康診断（既往歴、身体状態及び血液検査を含む）に加えて、患者にベースライン時及び研究選定後６ヶ月〜９ヶ月の経過観察時に頸動脈の超音波検査を先述のように（Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.）行った。心血管イベントの発生率を２００６年１月まで記録した。この分析は地方倫理委員会によって認可され（ＥＣ−Ｎｏ．１９３３／２０１２）、ヘルシンキ宣言及びその修正条項に指定される倫理基準に従って行われた。
【００５４】
定義：動脈性高血圧は、１４０／９０ｍｍ  Ｈｇを超える安静時血圧の繰り返しと定義され、降圧薬を与えられる患者に見られると推定した。高脂血症は全血清コレステロールが２００ｍｇ／ｄＬを超えるか又はＬＤＬコレステロールが１３０ｍｇ／ｄＬを超える患者で診断され、脂質低下薬を服用する全ての患者に見られるとみなした。真性糖尿病は真性糖尿病の診断及び分類に関する専門委員会によって想定される通りに診断した。末梢動脈疾患はフォンテイン分類体系を用いて段階分けし、冠動脈疾患はカナダ循環器学会（ＣＣＳ）による分類に従って規定した。既往の心筋梗塞はAlpertに従って規定した。脳卒中は２４時間超持続する神経学的欠損によって規定し、修正ランキン脳卒中尺度に従って評価した。頸動脈アテローム性動脈硬化症の進行は、少なくとも１のＮＡＳＣＥＴ血管造影度での狭窄の増大と定義した。
【００５５】
遺伝子型決定：ＤＮＡをＥＤＴＡ抗凝固処理全血からスピンカラムベースの核酸精製を用いて単離した。遺伝子型決定をＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（商標）  ７９００ＨＴ  ｆａｓｔ−ｒｅａｌｔｉｍｅサーモサイクラー（Applied Biosystems，Rotkreuz，Switzerland）で５’−ヌクレアーゼアッセイを用いて行った［７］。このアッセイは標識ＤＮＡプローブの配列特異的結合を含む。各工程のアニーリング段階において、フルオロフォアを５’末端に含有する配列特異的プローブがそれぞれの対立遺伝子に結合する。フルオロフォアの蛍光を、伸長段階において５’−Ｔａｑ−ポリメラーゼによってこれらの化合物がその５’−エキソヌクレアーゼ活性により分離されるまで３’−クエンチャーによってマスクする。配列特異的な蛍光の強度のエンドポイント測定から、対応する対立遺伝子の存在が示される。本研究では、ｒｓ４６５５６３を１０μＬの全反応量で市販のＴａｑＭａｎ（商標）  ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（アッセイＩＤ：Ｃ＿＿＿＿７１７３５８＿１＿、Applied Biosystems）及びＴａｑＭａｎ（商標）  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）を用い、製造業者が提供する標準プロトコルに従って分析した。結果をＳＤＳ  ２．４配列検出ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて解釈した。
【００５６】
統計分析：連続データを、その分布に関して平均及び標準偏差又は中央値及び四分位範囲として示す。カテゴリーデータは数及びパーセンテージとして示す。サブグループ内の正規分布の存在はコロモゴロフ−スミノフ検定によって評価した。計量変数はマン−ホイットニーのＵ検定によって比較した。遺伝子型と研究エンドポイント及び相対リスクとの関係性は分割表及びピアソンのχ２検定によって推定した。無症候生存をカプラン−マイヤー分析によって推定し、データをログランク（マンテル−コックス）検定によってペアワイズ比較した。多変数モデルを二値ロジスティック回帰を用いて算出し、ＲＯＣ（受信者操作特性）プロットを描くことによって評価した。結果は特に指定のない限りｐ＜０．０５で統計的に有意とみなした。全てのｐ値は特に明記しない限り両側と解釈した。全ての統計的計算をＩＢＭ  ＳＰＳＳ  ２０．０（IBM Corporation，Armonk，USA）を用いて行った。
【００５７】
結果
ヒトにおける食事由来のセドヘプツロースの取込み
セドヘプツロースが代謝活性糖質となるのに極めて重要な工程である、栄養セドヘプツロースが食事から消化管を介してヒト血液に吸収されるか否かを決定するために、グルコース（Ｃ６）及びセドヘプツロース（Ｃ７）レベルをニンジン及びヒト血清において測定した。ニンジンにおけるＣ６／Ｃ７比を決定するために、植物組織をホモジナイズし、小分子画分を抽出し、同時に相対グルコース及びセドヘプツロース量をＧＣ−ＭＳによって測定した（図１Ａ）。高いセドヘプツロースレベルを有する多肉植物であるオオベンケイソウの葉を、陽性対照として並行して分析した。オオベンケイソウの葉はグルコース及びおよそ２倍多いセドヘプツロースを含有しており、およそ０．５のＣ６／Ｃ７比が得られた。新鮮な食品グレードの有機ニンジンでは、ほぼ同量のグルコース及びセドヘプツロースが検出され、したがってＣ６／Ｃ７比はおよそ１であった。ジャガイモはニンジンとは対照的に、セドヘプツロースを含有しないことが報告されており（Kardon et al., FEBS Lett. (2008) Oct 15, 582(23-24)）、したがって非常に高い（又は更には無限の）Ｃ６／Ｃ７比を有すると期待される。次に、ニンジンからの食事由来のセドヘプツロースがヒト血液に達するか否かについて、幾らかのオリーブ油、塩及びコショウとともに主に蒸したニンジンを含有する食事（成人男性で約７００ｇ）の前後にグルコース及びセドヘプツロースの血清レベルをモニタリングすることによって検討した。食事の２時間後に、セドヘプツロース血清レベルのおよそ２倍の増大がヒトで観察された（図１Ｂ）。この結果から、栄養セドヘプツロースがヒト消化管によって吸収され、血液に入り、その後の代謝で糖質として利用可能となることが明らかに示された。血清グルコースレベルは食品摂取後２時間以内に既に平常値に戻り、それによりヒトがセドヘプツロース及びグルコースを異なって代謝することが示唆される。
【００５８】
これらの結果から、健康に良い野菜であり、世界中の食事の構成要素であるとみなされるニンジンがヒトにとって天然のセドヘプツロース源であることが示される。興味深いことに、ニンジンがグルコース等の糖質を含有するにもかかわらず好適であり、糖尿病への良好な耐容性を示し、更には２型糖尿病に共通の遺伝的危険因子を有する人を保護することが言及される（Patel CJ et al., Hum Genet. 132 (2013): 495-508）。
【００５９】
天然の及び加工ヒト用食品におけるＣ６／Ｃ７比
次に、グルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度をＣｏｃａ−Ｃｏｌａ（商標）、Ｒｅｄ  Ｂｕｌｌ（商標）、オレンジジュース、リンゴジュース、トマトジュース及びニンジンジュースの糖質抽出物において測定し、一般的な飲料のＣ６／Ｃ７指数を確立し、それにより実際のヒトセドヘプツロース曝露について推定した。ソフトドリンク及び栄養ドリンクはグルコース及びフルクトースを含有したが、セドヘプツロースは含有しなかった（図１Ｃ）。フルーツジュースはソフト／栄養ドリンクと同量のＣ６（グルコース及びフルクトースの総和）を含有していたが（１００ｍＭ範囲）、ソフト／栄養ドリンクとは対照的にセドヘプツロースも１００μＭ範囲で含有していた。野菜ジュースではグルコース及びフルクトースレベルは低下し、セドヘプツロース濃度が大幅に増大することが見出された（ｍＭ範囲）。モル比及び重量比として算出された個々の飲料のＣ６／Ｃ７比を図１Ｄに示す。２つのフルーツジュースでおよそ２０００／１のＣ６／Ｃ７比が見出された。トマトジュース及びニンジンジュースでは、この比はそれぞれ７５／１及び２０／１であり、Ｃｏｃａ−Ｃｏｌａ（商標）及びＲｅｄ  Ｂｕｌｌ（商標）は検出可能な量のセドヘプツロースを含有していなかった。したがって、これらの飲料のＣ６／Ｃ７比は算出することができず、したがって付加的にＣ７を添加しない場合、かかる食品では該当なし（Ｎ．Ａ．）である。これらの発見から、加工食品が複合糖質、ひいてはセドヘプツロースを欠いていることが明らかに示される。特に、これらのデータは絶対数で、ニンジンジュースの天然炭素混合物がソフト／栄養ドリンクよりも選ばれる場合、９ｋｇの食事由来のグルコース当たり１ｋｇの食事由来のセドヘプツロースが消費されることを示し、バランスの悪いヒトの栄養摂取による慢性セドヘプツロース欠乏の結果は現在知られていない。
【００６０】
セドヘプツロースキナーゼは変動し、代謝的に活性な組織において高度に発現される
セドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ、ひいてはセドヘプツロース代謝が様々な哺乳動物組織でどのように分布及び制御されるかを理解するために、種々の組織をｍＲＮＡ発現レベルについて試験した。公表されている概日発現プロファイルのデータベース（ＣｉｒｃａＤＢ）では、ＣＡＲＫＬ発現はマウス肝臓（周期２０．０、図２Ａ）及び副腎（周期２４．０、データは示さない）において変動することが見出された。セドヘプツロース−７Ｐレベルは植物において変動し、リボース部分を再変換する炭素固定の再生期にピークに達することが以前に報告されている。哺乳動物の概日時計は一部酸化還元状態によって定められている。ＣＡＲＫＬ過剰発現ＲＡＷ２６４．７細胞により、高セドヘプツロースキナーゼ発現が還元ニコチンアミド、アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）のような酸化還元因子の４倍の増大、更にはグルタチオン（ＧＳＨ）レベルの増大を誘導することが示された（図２Ｂ及びHaschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。ＣＡＲＫＬの欠乏、ひいてはセドヘプツロース代謝回転の欠如は逆の効果を示した（図２Ｃ）。このデータから、セドヘプツロース代謝が概日リズムの制御下にあり、同時に細胞酸化還元状態の調節因子として作用することが示される。どの組織が栄養セドヘプツロースを消費するかを特定するために、セドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）のｍＲＮＡレベルをマウスｃＤＮＡ組織ライブラリーにおいて測定した（図２Ｄ）。セドヘプツロースキナーゼはセドヘプツロース代謝の律速酵素であり、肝臓、腎臓、褐色及び白色脂肪組織（ＢＡＴ及びＷＡＴ）、消化器、腺、男性生殖器系並びに脳において高度に発現された。これらの結果から、食事由来のセドヘプツロースが多くの組織、特に肝臓、腎臓及び脂肪組織等の代謝的に活性な臓器にとって全身性の糖質源となり得ることが実証される。
【００６１】
セドヘプツロース代謝は細胞の機能及び代謝健康に重要である
セドヘプツロースへの曝露の代謝結果を調査するために、全糖質負荷を一定に維持しながら培養培地中のヒト及びマウス細胞をフルクトースと組み合わせたグルコース（ＧＦ）又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ）に曝露した。脂肪細胞、肝細胞及びマクロファージの機能を試験して、栄養糖質負荷を補完するセドヘプツロースの重要性を評価した。これらの実験に用いたセドヘプツロースはムラサキベンケイソウ植物から単離した。
【００６２】
ヒト身体においては、脂肪細胞はエネルギーを脂質の形態で貯蔵するという重要な機能を果たし、したがって健康を維持する上で非常に重要な細胞である。代謝的に不健康な又は大半の病的肥満患者では、脂肪細胞は適切に機能せず、過度の脂質負荷の原因となる細胞サイズの増大を起こし、炎症性となり（メタ炎症、軽度であるが慢性型の炎症）、最終的にインスリン耐性又は心血管疾患のような障害の発症に寄与する。皮下前駆体細胞から分化したヒト脂肪細胞では、セドヘプツロースを培養培地に添加した場合にセドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ  ｍＲＮＡ発現の増大が見られた（図３Ａ）。さらに、２つの機能関連脂肪細胞マーカー遺伝子であるアディポネクチン及びＵＣＰ−１の発現の増大が、ＧＦ処理細胞と比較してＧＦＳ処理細胞において観察された（図３Ｂ及び（und）図３Ｃ）。細胞代謝の変化を試験するために、細胞酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をそれぞれミトコンドリア呼吸及び乳酸発酵の指標として測定した。セドヘプツロース含有培地で分化及び培養したヒト脂肪細胞はＷＴ対照と同等のＥＣＡＲを示したが、その細胞酸素消費速度は増大していた（図３Ｄ及び図３Ｅ）。
【００６３】
まとめると、これらのデータから、皮下脂肪細胞がグルコース及びフルクトースのみが生物燃料として存在する状況と比較して、セドヘプツロースの存在下でその機能（アディポネクチン、ＵＣＰ−１及び酸素消費の増大）を維持及び改善することが示される。
【００６４】
軽度の慢性炎症のような代謝的に不健康な状態の予防におけるセドヘプツロースの有益な役割をより良く規定するために、ＧＦ又はＧＦＳ培地で培養した初代成熟マウス脂肪細胞、初代マウス肝細胞、並びに未感作及びリポ多糖（ＬＰＳ）誘導活性化初代マクロファージのサイトカインプロファイルを測定した。セドヘプツロース含有培地で培養した成熟脂肪細胞は、グルコース及びフルクトース単独で培養した脂肪細胞よりも少ないＴＮＦａ及びＩＬ−６  ｍＲＮＡを産生した（図３Ｆ及び図３Ｇ）。これと同様に、肝細胞もセドヘプツロースとともに培養した場合により少ないＩＬ−６を産生した（図３Ｈ）。初代マクロファージでは、基礎ＴＮＦａ及びＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現並びにサイトカイン分泌がセドヘプツロース含有培地によって阻止されることが見出された（図３Ｉ〜図３Ｌ）。ＬＰＳ誘導マクロファージ活性化は、ＧＦ培養細胞においてＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６分泌の強い増強をもたらした（図３Ｍ及び図３Ｎ）。ＧＦＳ培地中で培養したＬＰＳ誘導マクロファージは、ＩＬ−６をＧＦ処理マクロファージと同等のレベルまで増大したが、そのＴＮＦａ分泌はおよそ４０％低減した。これにより、マクロファージへのセドヘプツロースの添加が一方ではＴＮＦａ及びＩＬ−６によって測定される基礎炎症状態を低減し、他方ではＩＬ−６に見られるような自然な免疫機能を保持することが示される。
【００６５】
結論として、培養培地へのセドヘプツロースの添加は皮下脂肪細胞の機能を顕著に増強し、細胞の炎症状態を低減し、それによりまた、代謝症候群に部分的にまとめられる肥満、２型糖尿病及び心血管疾患の発症機序に良好な影響を与え得る。
【００６６】
セドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ過剰発現
セドヘプツロースキナーゼを全身で遍在的に過剰発現するトランスジェニックマウスを、ＣＡＲＫＬを過剰発現する遺伝子組み換え初代細胞を単離し、セドヘプツロース代謝をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために生成した。ＣＡＲＫＬトランスジェニックマウスは任意の明らかな表現型を示さず、その臓器重量はＷＴ同腹子対照動物の臓器重量とは異なっていなかった（データは示さない）。セドヘプツロース代謝の増大が基質セドヘプツロース濃度の増大、又はその律速酵素であるセドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）のレベルの上昇によって達成され得ると仮定された。これをｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて試験するために、一定量の組み換えＣＡＲＫＬタンパク質を漸増用量のセドヘプツロースとともにインキュベートした。これにより、ＡＤＰ形成によって測定されるセドヘプツロース代謝回転率が増強した（図４Ａ）。同じ効果がＣＡＲＫＬタンパク質濃度の増大によっても観察されたが、セドヘプツロース濃度は一定に維持されていた（図４Ｂ）。これらの結果から、ＣＡＲＫＬ過剰発現がセドヘプツロース代謝の増大の効果を調査するのに有効なモデルであることが実証される。次に、肝臓組織がセドヘプツロースを内因的に代謝するようであったため（図２Ｄ）、増大させたＣＡＲＫＬ発現レベルでのＣ７及びＣ６代謝の効果を研究するために初代肝細胞を単離した。
【００６７】
肝細胞をＣ６／Ｃ７糖比が２：１の培地中で培養し、より一般的な代謝パラメーターとしてＥＣＡＲ及びＯＣＲを比較することによって代謝的に評価した。ＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する肝細胞は、ＷＴ対照細胞と比較して示されるＥＣＡＲ及びＯＣＲレベルの増大とともにその代謝率を顕著に増大した（図４Ｃ及び図４Ｄ）。セドヘプツロースはこれらの細胞においてより効率的な代謝を誘導するようであった。セドヘプツロース及びセドヘプツロースキナーゼ発現の互いの関連性を試験するために、ＷＴ及びＣＡＲＫＬマウスから単離した肝細胞をＧＦ及びＧＦＳ含有培養培地中でインキュベートし、そのグルコース誘導ＥＣＡＲを（１時間の糖質飢餓後に）細胞解糖を制御する手段として比較した。ＷＴ肝細胞では、グルコース誘導ＥＣＡＲはセドヘプツロース投与によって低減した（図４Ｅ）。このデータと一致して、ＧＦ（セドヘプツロースを含まない）で培養したＷＴ動物に由来するグルコース刺激肝細胞はより大部分のグルコースを乳酸発酵に送り、ＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する細胞は同じグルコースボーラスのバランスをより効率的に保つようであった。
【００６８】
これらの結果は以前のデータを更に支持し、セドヘプツロース代謝の増大が代謝健康に重要な細胞に対して明確かつ有益な効果を有することを明らかに指摘するものであった。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのセドヘプツロース代謝
肝細胞におけるセドヘプツロースキナーゼ過剰発現の細胞表現型を確認した後、生物全体に対するセドヘプツロース代謝回転の増大の代謝効果を、代謝の全身指標として日中及び夜間における間接熱量測定法によって測定される対照及びセドヘプツロースキナーゼトランスジェニックマウスの身体活動当たりの呼吸商（ＲＱ；ＲＱ＝呼気ＣＯ２／酸素消費）及びエネルギー消費を比較することによって調査した（図４Ｆ及び図４Ｇ）。セドヘプツロースキナーゼ過剰発現動物（ＣＡＲＫＬ）は、野生型（ＷＴ）同腹子と比較してより低いＲＱ値を有する。ＣＡＲＫＬマウスは酸素消費の増大、ひいてはＲＱ値の低下を示し、それにより細胞に対するセドヘプツロースの効果を一部反映していた。さらに、ＣＡＲＫＬマウスは対照マウスと比較してより低い活動当たりのＥＥを有する傾向がある。雌性ＣＡＲＫＬトランスジェニック及びＷＴマウスのインスリン感受性もインスリン耐性試験（ＩＴＴ）によって比較し、セドヘプツロース代謝がｉｎ  ｖｉｖｏでインスリンシグナル伝達にも影響を及ぼすか否かを調査した。インスリン注射（腹腔内）はセドヘプツロースキナーゼを過剰発現するマウスにおいてＷＴ対照よりも迅速に血糖レベルを低下させ、これらの動物においてセドヘプツロース代謝の増大によってもインスリン感受性が増大することが示された（図４Ｈ）。これに関連して、ＴＮＦａ及び低酸素症治療による成熟脂肪細胞におけるインスリン耐性の誘導がセドヘプツロースキナーゼ喪失を生じることに言及することが重要である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM1261655で利用可能な公開遺伝子発現包括データ）。
【００７０】
まとめると、これらの実験から、セドヘプツロース代謝の増大がｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏでも代謝を変化させることが示された。身体活動当たりのＥＥ低下の傾向及びインスリン感受性の増大を伴うＣＡＲＫＬマウスで観察されるＲＱ値の低下は、セドヘプツロース代謝の増大によって誘導することができるより効率的かつ持続的な代謝プログラムの指標となる。
【００７１】
肝臓脂質沈着はＣＡＲＫＬによって低減する
肝細胞における広範な脂質沈着は脂肪肝疾患を生じ、肝線維症、肝硬変、最終的には肝細胞癌腫を引き起こす炎症（すなわち非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））を伴い得る。ＷＴ及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する肝細胞の脂質含量を比較すると、ＣＡＲＫＬマウスに由来する肝細胞がそのＷＴ対照よりも少ない脂肪滴を含有することが見出された（図５Ａ）。
【００７２】
結論として、特に炎症を併発する脂肪細胞の機能異常を含む高肝臓脂肪含量は、２型糖尿病又は癌を含む多くの疾患のリスクを増大し、そのためセドヘプツロースによる炎症及び肝細胞の脂質蓄積の低減の両方がヒトの栄養摂取において特に有益であり得る（高いＣ７レベルを有する野菜から明らかである）。
【００７３】
ＣＡＲＫＬはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を調節する
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化アームの律速酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）は、すなわちヌクレオチド合成及び酸化還元当量のためのＣ５体を生成するものであり、ｐ５３（腫瘍抑制因子）によって直接阻害されることが以前に示されている（Jiang et al., Nat Cell Biol. (2011) Mar; 13(3):310-6）。ヒト腫瘍において最も頻繁に突然変異する遺伝子であるｐ５３の突然変異は、Ｇ６ＰＤの過活性化及び肝細胞における脂質蓄積を生じる。セドヘプツロースキナーゼはＰＰＰの非酸化的アームの律速キナーゼであり、少なくともマクロファージにおいて酸化的ＰＰＰフラックスを低減することが以前に示されている。セドヘプツロース代謝による肝細胞のＧ６ＰＤ活性の起こり得る調節を試験するために、ＷＴ及びＣＡＲＫＬ過剰発現細胞の酵素活性を比較した（図５Ｂ）。ＷＴ対照細胞では、Ｇ６ＰＤ活性は均等に分布することが観察され、ＣＡＲＫＬマウスに由来する細胞では細胞の内部空間におけるＧ６ＰＤの再局在化、ひいては活性の低減が観察された。興味深いことに、ＷＴ細胞を、セドヘプツロースを含む細胞培養培地中でインキュベートすることによって同じ表現型が達成された（図示せず）。セドヘプツロースキナーゼ過剰発現及びセドヘプツロースインキュベーションによるＧ６ＰＤの再局在化及び／又は阻害が、肝細胞における脂質蓄積の低減の原因であるか否か（図４Ａ）については未だ確立されていない。それにもかかわらず、このデータをマクロファージのデータと組み合わせることで、場合によっては少なくともＧ６ＰＤ活性を負に調節することによって、セドヘプツロースレベルの上昇が癌細胞におけるｐ５３喪失の対抗手段となり得ることが示される。別の例は、成長因子エストロゲンに応答してＣＡＲＫＬ発現が減少し（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/; ID: 53372898; GDS3285 / 219713_at / SHPKで利用可能な公開ＧｅｎｅＣｈｉｐ保存データ）、更にＧ６ＰＤ活性及び続く腫瘍成長の増大を生じ得るエストロゲン依存性乳癌細胞である。
【００７４】
また、このデータから、セドヘプツロース代謝がＧ６ＤＰ活性の調節及び今後の抗癌戦略に好適な標的とされる。
【００７５】
セドヘプツロース及び骨代謝
骨は極めて動的な組織である。骨の形成と吸収との絶妙なバランスは骨の適当な機械的安定性に極めて重要である。骨の形成と吸収と間の不均衡は、骨脆弱性及び病的骨折を引き起こす骨密度減少及び骨微細構造の障害の高度に蔓延する病態である骨粗鬆症の原因となる。骨吸収に関与する細胞である破骨細胞はその機能がセドヘプツロース代謝に強く影響を受ける単球系に由来するため、破骨細胞の機能がＣ６／Ｃ７比によって調整され得るか否かを試験した。
【００７６】
骨髄細胞を、細胞をＲＡＮＫＬと組み合わせたＭ−ＣＳＦに曝露することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで破骨細胞へと分化させた。細胞を、骨吸収活性の基質を供給する骨ミネラルマトリックスをウェルの底面にプレコートしたプレートで培養した。基質吸収の分析から、培養培地におけるＣＡＲＫＬ過剰発現及びＣ７含量の増大の両方が破骨細胞による窩形成を低減することが実証された（図５Ｃ）。興味深いことに、セドヘプツロースの非存在下でのみより大きな吸収窩が見られた（図５Ｄ）。
【００７７】
また、このデータはバランスの取れたＣ６／Ｃ７比が健康の維持に極めて重要であり、Ｃ７が病態生理学的状況、すなわちヒトにおける骨粗鬆症を緩和する可能性があるという本発明の概念を支持するものである。
【００７８】
セドヘプツロースキナーゼは動物の免疫応答を調節する
急性免疫活性化モデル及び成熟脂肪組織の軽度の炎症におけるＣＡＲＫＬ過剰発現、及びマウス免疫系に対するその影響のデータを本実施例によって提示する。ＣＡＲＫＬマウスにおいて急性炎症を亜致死リポ多糖（ＬＰＳ）注射によって誘発すると、野生型対照に比較したサイトカイン応答の抑制が生じた（図６Ａ）。１９のサイトカインパネルを、ＬＰＳ注射（７ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の２４時間後に単離したＷＴ及びＣＡＲＫＬマウス血清においてマウスサイトカインプロファイラーによって測定した。１２のサイトカインが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲＫＬ過剰発現によって調節されるサイトカインを強調するカットオフと定義される５０％平均変化の閾値に達した。ＩＬ−１３、ＭＩＰ１α、ＲＮＡＴＥＳ、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ１、ＫＣ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１５は、野生型同腹子と比較してＣＡＲＫＬマウスにおいて少なくとも５０％の平均変化で減少した。サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１５は更に７５％平均変化の閾値に達した。急性炎症に加えて、成熟脂肪組織における炎症性サイトカインの基礎レベルもＣＡＲＫＬ及びＷＴ対照マウスの２つの異なるデポー（皮下及び精巣上体脂肪組織）で評価した。ＬＰＳ誘導炎症、ＴＮＦａ及びＭＣＰ１のｍＲＮＡレベルの低減と一致して、マクロファージを脂肪組織に動員し、炎症性サイトカインに属する初代アディポカインがＣＡＲＫＬ過剰発現によって鈍化することが見出された（図６Ｂ〜図６Ｅ）。
【００７９】
このことから、セドヘプツロースを含有する栄養補給剤が急性及び軽度の慢性炎症を抑える可能性があることが示される。したがって、栄養的又は臨床的に適用されるセドヘプツロースによるＣ７代謝の標的化は、炎症及び関連障害を低減するのに効果的な手段のようである。
【００８０】
ＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は脳卒中のリスクと関連する
Inflammation and Carotid Artery - Risk for Atherosclerosis Study（ＩＣＡＲＡＳ、Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209）の５３５人の神経学的に無症候の患者をＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲにおけるｒｓ４６５５６３［Ａ］→［Ｇ］置換について遺伝子型決定した。３３人（６．２％）の患者が観察期間中に脳卒中を患った。これらの患者では、ｒｓ４６５５６３対立遺伝子の分布は残りの研究集団の対立遺伝子頻度と比較して顕著に異なっていた（χ２＝１２．６３９、ｄｆ＝２、ｐ＝０．００２、図６Ｆを参照されたい）。詳細には、［Ｇ］−対立遺伝子の同型のキャリアは［Ａ］−同型個体と比較して３．９３（９５％ＣＩ：１．７２〜９．０１）、異型個体と比較して３．１０（９５％ＣＩ：１．４０〜６．８７）の相対リスクをそれぞれ有していた。ｒｓ４６５５６３遺伝子型情報の統計的独立性を、年齢、性別、心筋梗塞及び脳卒中の病歴、ニコチン消費、体格指数並びに幾つかの併存疾患（脂質異常症、高血圧、真性糖尿病）を共変量とする二値ロジスティック回帰モデルによって評価した（モデル：χ２＝３０．４７６、ｄｆ＝１１、ｐ＝０．００１）。このモデルでは、［Ｇ］；［Ｇ］遺伝子型のキャリア状態（オッズ比＝５．０１５、９５％ＣＩ：１．８０３〜１３．９４３）が［Ａ］−対立遺伝子について同型の患者と比較した場合の有意な予測因子として与えられる。さらに、初期無脳卒中生存時間がｒｓ４６５５６３キャリア状態に依存するか否かを、カプラン−マイヤープロットを描くことによって評価した。実際に、［Ｇ］−対立遺伝子の同型キャリア（１５１８．３日、９５％ＣＩ：１４１９．２〜１６１７．４）は異型個体（１６１９．１日、９５％ＣＩ：１５８４．８〜１６５３．３、ｐ＝０．００５）及び［Ａ］；［Ａ］−遺伝子型のキャリア（１７８８．１日、９５％ＣＩ：１７５５．７〜１８２０．４、ｐ＝４．９〜１０−４）よりも顕著に短い無症候生存を示した（図６Ｇ）。ｒｓ４６５５６３：［Ｇ］−対立遺伝子について同型の個体は、［Ａ］−対立遺伝子のキャリアよりも顕著に短い無症候時間を示す。
【００８１】
この臨床的関連性の機構的背景は未だ明らかにされていない。しかしながら、マクロファージ分極化を調整するＣＡＲＫＬの能力並びにマクロファージ分極化のアテローム斑の形成及び進行における重要な役割を考えると、アテローム斑におけるマクロファージ分極化の調整によってｒｓ４６５５６３多型は心血管イベントのリスクに影響を与える可能性があるようである。この考えは、ＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲが主にマクロファージにおいて転写されるという本発明による観察によって支持される。
【００８２】
結論として、この関連性並びに脂肪細胞、肝細胞及びマクロファージの代謝及び機能に関する提示のデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症の低減及びインスリン感受性の増強と合わせて、セドヘプツロース（Ｃ７−糖）がヒトの栄養摂取において重要な要素であると同時に、すなわちＣ７欠乏（正：deficiencies）又は他の代謝的に不健康な疾患状態を治療する高度に関連する薬物療法であることを強く示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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