(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）応答性プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を有する遺伝子コンストラクトを含み、当該遺伝子コンストラクトが安定的に組み込まれているＳａｏｓ−２細胞株であって、前記ＨＩＦ応答性プロモーターが、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子中に見出されるＨＲＥ配列の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を４つ含み、ここでＨＩＦ応答性プロモーターが、レポーター遺伝子の上流にあり、タンデムリピートで４つのＨＲＥを含む、前記Ｓａｏｓ−２細胞株。
【請求項２】
レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質のルシフェラーゼ、または、化学反応を触媒する酵素から選択される、請求項１に記載のＳａｏｓ−２細胞株。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼである、請求項２に記載のＳａｏｓ−２細胞株。
【請求項４】
細胞においてＨＩＦ応答をアッセイするための方法であって、
ａ．請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞株を提供する、
ｂ．前記細胞株を０と５％Ｏ２との間でインキュベートする、
ｃ．ここで、レポーター遺伝子発現が、前記細胞におけるＨＩＦ応答に対応する、
ステップを含む、前記方法。
【請求項５】
さらに、対照細胞株を１０と２１％Ｏ２との間でインキュベートするステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＦ応答の調節因子を同定するためのスクリーニング方法であって、請求項４または５に記載の方法を実施すること、および、０と５％Ｏ２との間でのインキュベート後の細胞株を、ＨＩＦシグナリングの調節因子であることが疑われる化合物に接触させることを含み、ここで、未処置対照と比較したレポーター遺伝子発現の増加が、前記化合物がＨＩＦ応答のアゴニストであることを示し、未処置対照と比較したレポーター遺伝子発現の減少が、前記化合物がＨＩＦ応答のアンタゴニストであることを示す、前記方法。
【請求項７】
細胞においてＨＩＦ応答を試験するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞株を含む、前記キット。
【請求項８】
ＨＩＦ応答試験を実施するための取扱説明書ならびに／または緩衝液および溶液をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、新しい低酸素誘導因子（ＨＩＦ）応答性レポーター遺伝子コンストラクトの構築、それを含有する遺伝的コンストラクトおよびベクターに関する。さらに、本発明は、ＨＩＦ応答性レポーターコンストラクトを含む安定した細胞株、ならびに、ＨＩＦ活性の調節因子を同定するための、方法および独創的なコンストラクトおよび細胞株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
組織低酸素に対する初期応答は、細胞の酸素濃度の変化に応じて遺伝子発現の変化を仲介する、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写活性化因子である低酸素誘導因子（ＨＩＦ）の誘導である。酸素が低下した状態である低酸素は、肺が危険にさらされるか、または血流が低下したときに起こり得る。血流の減少である虚血は、血の塊（血栓）によるか、もしくは外来の循環物（塞栓）のいずれかによる動脈または静脈の閉塞、あるいはアテローム性動脈硬化などの血管障害によりもたらされ得る。
【０００３】
現代の創薬は、細胞ベースのアッセイの使用により加速された。現在、これらのアッセイは、リードの同定、薬剤用量の最適化ならびに標的の検証に利用される。スモールスケール技術、さらにはハイスループット技術の使用は、これらの細胞ベースのアッセイを、薬剤スクリーニングのためにより効率的かつ安価にする。これらのアッセイは、対象とする薬剤標的に対する細胞の機能的応答を直接与えるので、これらは他のin vitroの方法より好ましい。これは、標的に対する生理的および薬理学的な応答のより明確な理解を可能にする。
【０００４】
現在、ＨＩＦ活性を定量化するためのアッセイへの需要がとても大きい。これは、増殖、アポトーシスからがん発生まで多様な細胞調整に包含される以外に、ＨＩＦがまた、幹細胞の再生および分化にも包含されることが示されたという事実による（Keith and Simon, 2007）。この１０年間の幹細胞調査の高まりは、特にＨＩＦ関連の薬剤スクリーニングにおける、ＨＩＦ活性を測定するための、より着実な細胞ベースのアッセイシステムへの必要性をもたらした。不幸にも、現在利用可能なシステムは、非常に非効率的であり、コストがかかり、時間を浪費するものであり、最も重要なことには、感度が制限されている。また、細胞株の選択肢も、制約される。
【０００５】
細胞ベースのＨＩＦアッセイシステムの開発は、以前に報告されている（Woldemichael et al., 2006; Ji et al., 2008）。しかしながら、今まで、わずか２種のＨＩＦアッセイ細胞株しか市販されていない。一方は、「CellSensor（登録商標）HRE-bla ME-180 Cell Line」（cat# K1644）と命名されたInvitrogenからのものである。他方は、「Stable Cell Line: NIH3T3/HIF-luc」（cat # RC0017）の名称の下、Panomicsからのものである。Qiagen社のSABiosciencesはまた、ＨＩＦアッセイキットも販売しているが、しかしながら、これらのキットは、すぐに形質導入する準備のできた(ready-to-transduce)レンチウイルス粒子またはすぐにトランスフェクトする準備のできた(ready-to-transfect)プラスミドの形態である。近年、The Emory UniversityおよびThe University of Rochesterはまた、それらの技術移転カタログにおいて、ＨＩＦ活性アッセイのためのレポーター細胞株の開発をも報告した。市販のcellSensor HRE-bla（Invitrogen）における低酸素対正常酸素のシグナル比は、ちょうど１３倍である。Liらよって別のシステムが開発されたが（2008）、１４倍の差を与えたに過ぎなかった。細胞ベースのアッセイにおける好ましくないシグナル対ノイズ比の場合、かかる低い誘導能は、薬剤スクリーニングのためのハイスループット形式におけるそれらのシステムの適用を不可能にする虞がある。
【発明の概要】
【０００６】
上記の知られているＨＩＦ活性のレポーターコンストラクトを考慮し、具体的には低酸素に応答して、ＨＩＦ活性化に対するより高い誘導性および特異性を示すＨＩＦ応答性システムを提供することが、本発明の目的である。したがって、本発明のさらなる目的は、例えばハイスループット形式に適用されるのが好適なシステム等、ＨＩＦ応答の調節因子の薬剤スクリーニングのための新規な手段を提供することである。
【０００７】
上記の問題は、第１の側面において、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）応答性プロモーターの制御下に組み込まれたレポーター遺伝子を有する遺伝子コンストラクトにより解決され、ここで、ＨＩＦ応答性プロモーターが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子に由来する、少なくとも１つの低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を含む。
【０００８】
本発明による遺伝子コンストラクトは、レポーター遺伝子の発現を可能にするいくつかの機能的なエレメントから構成される核酸分子を指すものとする。本発明に照らして使用される核酸は、一本鎖または二本鎖であり得；ＤＮＡまたは当該技術分野において知られている他の核酸分子であり得る。
【０００９】
プロモーターは、構造遺伝子の転写を指示する核酸配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’領域に位置する。本発明のプロモーターは、ＨＲＥエレメント（単数または複数）を含む。加えて、プロモーターは、上流のエレメントを含んでよい。かかるエレメントは、ＵＡＲと、任意に、合成の上流エレメントまたはエンハンサーなどの構造遺伝子の転写に影響を与える他の核酸配列とを含む。
【００１０】
コアプロモーターまたはミニマルプロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよび転写の開始を含む、操作可能に連結された(operable linked)コード配列の発現のための必須のヌクレオチド配列を含有する。この定義によって、コアプロモーターは、活性を高めても、組織特異的活性を与えてもよい特異的配列がないとき、検出可能な活性をもっていても、いなくてもよい。
【００１１】
本発明の一態様において、遺伝子コンストラクトのプロモーターは、少なくとも４つのＨＲＥを含む。コンストラクト中のＨＲＥは、好ましくは、タンデムリピートで位置し、最も好ましくは、プロモーターがレポーター遺伝子の上流にある。レポーター遺伝子の上流は、プロモーター配列がレポーター遺伝子の開始コドンの５’に位置し、さらにより好ましくは、本発明のＨＲＥが、レポーター遺伝子の開始コドンのＴＡＴＡボックス上流の５’に位置することを意味するものとする。好ましい態様において、本発明のコンストラクトは、図２において略図が描かれる。
【００１２】
本発明の別の好ましい態様は、ＨＲＥが、ヒトＥＰＯプロモーター領域に由来するコンストラクトに関する。
【００１３】
本発明に照らして、当業者に知られるいずれのレポーター遺伝子も使用されてよく、上記のＨＲＥエレメントに、操作可能に連結されてよい。視覚的に同定可能な特性をもたらす一般的に使用されるレポーター遺伝子は、通常、蛍光タンパク質および発光タンパク質を包含する。例として、クラゲ緑色蛍光タンパク質質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子（該タンパク質は、それを発現する細胞に青色光下で緑色を発せさせる）、酵素ルシフェラーゼ（これは、ルシフェリンとの反応を触媒することによって、光を産生させる）、および遺伝子ｄｓＲｅｄからの赤色蛍光タンパク質を含む。細菌における共通のレポーターは、タンパク質ベータガラクトシダーゼをコードする、E. coliのｌａｃＺ遺伝子である。この酵素は、基質類似体Ｘ−ｇａｌを含有する培地で生育されるとき、その遺伝子を発現する細菌を、青色に見えるようにさせる。細菌においてもまたレポーターである選択可能なマーカーの例は、抗生物質クロラムフェニコールへの耐性を与えるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子である。同様のマーカーも、脊椎動物の細胞株において働くことが知られている。本発明に照らして最も好ましくは、ルシフェラーゼの使用であり、最も好ましくは、レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼである。
【００１４】
別の好ましい態様において、本発明は、ＴＡＴＡボックスの上流にヒトＥＰＯのＨＲＥの配列を正確に４回と、レポーター遺伝子とを含む、遺伝子コンストラクトに関する。
【００１５】
本発明の上記の目的は、別の側面において、本明細書に記載されるような遺伝子コンストラクトまたは核酸配列を含むベクターにより、解決される。本発明の意図の範囲内にあるベクターは、細胞内に導入されることが可能な核酸である。導入される核酸にコードされるタンパク質が、ベクターの導入の際に、細胞内で発現されることが好ましい。好ましい態様において、本発明のベクターは、組換えベクター、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、ウイルス、特にこれに限定されないがウイルス由来アンプリコンベクターを含む。
【００１６】
本発明の目的は、さらに、本発明の多様な態様に記載されるような、遺伝子コンストラクトまたはベクターを含む細胞株によって解決される。遺伝子コンストラクトまたはベクターは、該細胞内に一過的にも安定的にもトランスフェクト(または形質導入)されてよい。トランスフェクションのために使用される細胞は、脊椎動物、最も好ましくは哺乳動物またはヒトの細胞であることが好ましい。
【００１７】
一態様において、本発明の細胞株は、安定的に組み込まれた本発明の遺伝子コンストラクトおよび／またはベクターを含むことが好ましい。
【００１８】
最も好ましい態様において、細胞株は骨肉腫細胞株であり、好ましくは細胞株がＳａｏｓ−２である。
【００１９】
本発明において、本発明者らは、ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２を使用したが、他は、ＭＥ−１８０頸部癌細胞株（Invitrogen）およびＮＩＨ−３Ｔ３マウス胚線維芽細胞株（Panomics）を使用した。ラット神経膠腫細胞株もまた使用された(Research Tools catalog, Emory University)。本研究において、乳腺がんＭＣＦ７細胞株、子宮頸がんＨｅＬａ細胞株、腎がん７８６−Ｏ細胞株および骨肉腫Ｓａｏｓ−２細胞株を含むいくつかのヒトがん細胞株がスクリーニングされた。低酸素誘導の際に我々のレポーターコンストラクトによって産生されたルシフェラーゼのシグナルは、Ｓａｏｓ−２細胞において最も高かった。これらの新規な知見に基づいて、Ｓａｏｓ−２を使用して安定した低酸素レポーターコンストラクト細胞株の開発が行なわれた。
【００２０】
提起される問題は、さらに、細胞におけるＨＩＦ応答をアッセイするための方法によって解決され、以下のステップ：
ａ．請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを該細胞内に導入すること、
ｂ．低酸素状態で該細胞をインキュベートすること、
ｃ．任意に、正常酸素状態で対照細胞をインキュベートすること、
ｄ．レポーター遺伝子発現が、該細胞のＨＩＦ応答に対応することを確かなものにすること
を含む。
【００２１】
この側面における、別の好ましい態様において、該細胞が骨肉腫細胞である。
【００２２】
さらに、本発明の態様は、上記の方法に関し、ここで遺伝子コンストラクトが、該細胞内へ形質導入またはトランスフェクトされ、好ましくは、ここで該遺伝子コンストラクトが、該細胞内へ安定的に形質導入またはトランスフェクトされる。
【００２３】
本発明に照らして、用語「低酸素」は、０と５％Ｏ２との間、好ましくは０．０１と１％Ｏ２との間、より好ましくは０．０１と０．３％Ｏ２との間の雰囲気における酸素（Ｏ２）濃度を指すものとする。最も好ましい態様において、低酸素は、約０．３％Ｏ２の酸素の濃度を指す。
【００２４】
他方、本発明に照らして、用語「正常酸素」は、５と２１％Ｏ２との間、好ましくは１０と２１％Ｏ２との間、より好ましくは１０と２０％Ｏ２との間の酸素濃度を示すものとする。最も好ましい態様において、「正常酸素」は、通常の大気酸素濃度を指す。
【００２５】
本発明の問題は、さらに、本発明の上記の方法を実施することと、ＨＩＦシグナルの調節因子と疑われる化合物に該細胞を接触することとを含む、ＨＩＦ応答の調節因子を同定するためのスクリーニング方法によって解決され、ここで、未処置の対照と比較したレポーター遺伝子発現における増加が、化合物がＨＩＦ応答のアゴニストであることを示し、ここで、未処置の対照と比較したレポーター遺伝子発現の減少が、化合物がＨＩＦ応答のアンタゴニストであることを示す。
【００２６】
本発明に照らして、使用のための好適な試験化合物は、化合物ライブラリに含まれる小分子である。代わりに、タンパク質またはペプチドが使用され得る。
【００２７】
また、核酸分子は、本明細書に記載されるスクリーニング方法のための候補化合物として使用され得る。これらのうち、阻害性のＲＮＡを、特に対象とする。これは、アンタゴミア(antagomir)、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであってもよい。ハイスループット形式でのスクリーニングアプローチに好適なライブラリにおけるインヒビターＲＮＡ分子は、市販されている。
【００２８】
さらに、本発明は、上記のスクリーニング方法によって得られる、低酸素応答を調節する化合物を提供する。
【００２９】
別の側面において、本発明は、細胞におけるＨＩＦ応答を試験するためのキットに関し、該キットは、本明細書に記載される本発明の態様のいずれかに従う、遺伝子コンストラクトまたはベクターまたは細胞を含む。
【００３０】
任意に、本発明のキットは、本発明の方法の実施の仕方の取扱説明書および／またはＨＩＦ応答試験を実施するための緩衝液および／または溶液を含んでもよい。
【００３１】
さらに、本発明は、本明細書中に示されるような、独創的な材料、具体的には、ＨＩＦに媒介される応答または低酸素により誘導される応答の調節因子に対するスクリーニング方法における独創的な遺伝子コンストラクト、ベクター、細胞またはキットの使用に関する。
【００３２】
本発明は、その好ましい態様のいくつかに従って、具体的に記載されているが、以下の例は、本発明を説明するに過ぎず、最も広い解釈およびその同等な構成の原理および範囲内に本発明を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図面の説明
【図１】図１：ＡＴＣＣから得られたＳａｏｓ−２細胞は、典型的な類上皮の形態を呈した。
【図２】図２：Ｓａｏｓ−２細胞内にコトランスフェクトされたプラスミドのマップ。
【図３】図３：４ＸＥＰＯ−ＨＲＥを持つｐＬＵＣ−ＭＣＳおよびネオマイシン耐性遺伝子を備えるｐＣＤＮＡ３を用いたコトランスフェクト、続く抗生物質の処置の後の、種々の日数でのＳａｏｓ−２における形態変化の代表的な画像。
【図４】図４:低酸素誘導の際、安定したトランスフェクタントの一塊の集団(mass population)によって産生される生物発光の強度。
【図５】図５:単一の単離細胞から細胞集団への発育における代表的な画像。
【図６】図６:低酸素誘導の際の４つのクローン各々における生物発光強度における倍の差。
【図７】図７：クローン３細胞は、３７℃で加湿したＣＯ２インキュベーター中１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地での培養後に親のＳａｏｓ−２細胞と同様な形態を呈した。
【図８】図８：細胞数が異なっても、低酸素誘導後の生物発光強度において、同様の倍の差を与えた。
【図９】図９：市販のＨＩＦ活性のインヒビターであるボルテゾミブおよびシスプラチンは、レポーターシグナルの強度低下を引き起こした。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の詳細な説明
例１：ＨＩＦレポーター遺伝子コンストラクトおよび安定的にトランスフェクトされた細胞
最初に、このＨＩＦ細胞をベースとしたスクリーニングアッセイを、Ｓａｏｓ−２骨肉腫細胞株（ＡＴＣＣ）内への、４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ−ＦＬｕｃプラスミドと抗生物質耐性遺伝子を持つｐｃＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen）とのコトランスフェクションによって確立した。プラスミドで安定的にトランスフェクトされた細胞の亜集団を、後にＧ４１８抗生物質選択によって得た。単一の細胞クローンを、限界希釈クローニング戦略を使用し、安定したトランスフェクタントの一塊の集団から単離した。最も高いレポーター活性を有する単一のクローンを、ＨＩＦの知られているインヒビターを使用して、概念実証研究のために使用した。これらのインヒビターは、市販の薬剤、ボルテゾミブ（Velcade）およびシスプラチンである。
【００３５】
４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ−ＦＬｕｃプラスミドのコンストラクトは、ＥＰＯ遺伝子の４コピーのＨＲＥを含有した。一方、ｐｃＤＮＡ３ベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ。Ｓａｏｓ−２細胞内へのこれらのプラスミドのコトランスフェクションを、Lipofectamine 2000（Invitrogen）融合剤を使用して、１０：１の比（４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ−ＦＬｕｃ：ｐｃＤＮＡ３）で、実施した。最初に、８．３×ｌ０５個のＳａｏｓ−２細胞を、Ｔ−２５フラスコ中の１０％ＦＢＳを有する抗生物質フリーのＤＭＥＭに２４時間播種した。次の日に、プラスミド混合物を、６２５μｌの血清フリーかつ抗生物質フリーのＤＭＥＭに、１１．４μｇの４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ−ＦＬｕｃおよび１．１４μｇのｐｃＤＮＡ３を加えることで調製した。同時に、トランスフェクション試薬混合物を、６０６．２５μｌの血清フリーかつ抗生物質フリーＤＭＥＭ中へ１８．７５μｌのLipofectamine 2000を加えることで調製した。試薬混合物を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。インキュベート後、プラスミド混合物と試薬混合物とを合わせて、ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした。複合物をインキュベートしている間に、終夜のＴ−２５フラスコＳａｏｓ−２細胞から、培養された培地を捨て、細胞を、５ｍｌの血清フリーかつ抗生物質フリーのＤＭＥＭで１回洗浄した。２０分間のインキュベーション終了時に、１２５０μｌのプラスミド−Lipofectamine 2000複合物を、細胞中へ加えた。その後、フラスコを旋回させ、続いて３７５０μｌの血清フリーかつ抗生物質フリーのＤＭＥＭを加えた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２が供給される加湿したインキュベーター中、６時間インキュベートした。１０％血清を有し、かつ抗生物質フリーのＤＭＥＭの５ｍｌを、終濃度が５％に低減された血清のＤＭＥＭを作製するために、６時間後にフラスコ中へ加えた。１０％ＦＢＳを有する抗生物質フリーのＤＭＥＭの５ｍｌを、その後、終濃度が５％に低減された血清のＤＭＥＭを作製するために、加えた。
【００３６】
上記のトランスフェクトされた細胞から、Ｓａｏｓ−２細胞の安定的にトランスフェクトされた集団の選択を、Ｇ４１８抗生物質を使用し、実施した。４８時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地混合物を、細胞から除去した。それらを、その後、１×ＰＢＳで２回洗浄し、続いて１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを加えた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２が供給される加湿したインキュベーター中、もう３日間インキュベートし続けた。インキュベーション期間の後、使用済みの培地を除去し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する新鮮な培地で置換し、１０％ＦＢＳを加えた。この培地置換を３日毎、３週間の期間行った。３週間後、安定的にトランスフェクトされたネオマイシン耐性の親細胞の一塊の集団を構成する生存細胞をさらに増殖させた。この親集団を、その後、低酸素誘導の際に、ルシフェラーゼレポータータンパク質を上方調整するその能力について試験した。
【００３７】
ネオマイシン耐性の親集団のＨＩＦレポーター活性を確認するために、単一ルシフェラーゼアッセイ(single luciferase assay)を実行した。最初に、２．５×１０４個の細胞を、４８ウェルプレートのウェルに、１０％ＦＢＳを有する抗生物質フリーのＤＭＥＭ中、１６時間、蒔いた。その後、プレートの１つを、加湿したＣＯ２インキュベーター中、正常酸素（２１％Ｏ２）の気体雰囲気で、２４時間インキュベートし、他方を、酸素調節器（ProOx model 110, BioSpherix, USA）によって制御される低酸素チェンバー（BioSpherix, USA）中、低酸素（０．５％Ｏ２）の気体環境で、インキュベートした。２４時間の異なる酸素濃度への曝露後、Bright-Glo（商標）Luciferase Assay（Promega, USA）を、ＨＩＦレポーター活性を分析するために、実行した。最初に、各ウェル中の成長培地を捨て、細胞を、３００μｌの１×ＰＢＳで１回すすいだ。室温で平衡化されたGlo Lysis Buffer（ＧＬＢ；６０μｌ）を、その後、ウェル中へ加えた。プレートを、その後、室温で５分間シェーカー上で穏やかに振とうした。細胞溶解を、光学顕微鏡下で、４８ウェルプレートのウェルを観察することで、視覚的に確認した。その結果得られた細胞溶解物の３０マイクリロリットルを、その後、個々のガラスバイアル中へ移した。Bright-Glo（商標）Assay Reagentを、その後、１：１（ｖ／ｖ）の比で、各チューブ中へ加えた。発光強度を、Luminometer（Sirius-2, Titertek- Berthold）で直ちに読み取り、記録した。
【００３８】
安定した親のネオマイシン耐性細胞の一塊の集団におけるＨＩＦレポーター活性の確認後、単一細胞のクローニングを、限界連続希釈(limiting serial dilution)クローニング戦略を使用し、実施した。親細胞を、９６ウェルプレートの第１列のウェル（Ａ１〜Ａ８）に、２４時間、１．５×１０４個の細胞数で播種した。終夜インキュベーション後、ウェル中の使用済み培地を慎重にピペットで除き、細胞を５０μｌの１×ＰＢＳで洗浄した。細胞のトリプシン処理を、３７℃で１分間、各ウェルに５０μｌの１×トリプシン−ＥＤＴＡを加えることで行った。細胞を剥離した後、各ウェルに、その容量が１００μｌになるまで、Ｇ４１８と１０％ＦＢＳとで補充されたＤＭＥＭをつぎ足した。同じ培地の１００マイクロリットルを、残り９列の空のウェル中にピペットで入れた。第１のウェルからの細胞懸濁液（１００μｌ）を、その後、隣接したウェル中へ移し、混合物をピペットで上下させた。同じ容積の細胞懸濁液を、その後、このウェルから次のへと移した。この過程を、２倍の段階希釈した細胞懸濁液を得るために、繰り返した。最後のウェルからの全ての細胞懸濁液（２００μｌ）を、Ｇ４１８と１０％ＦＢＳとで補充された１０ｍｌの条件ＤＭＥＭで希釈した。混合物を、その後、細胞が均一に分布したことを確かなものにするために、上下に転倒した。この細胞懸濁液（１００μｌ）を、９６ウェルプレートのウェル中に等分した。プレートを、その後、３７℃で５時間、４５°傾斜させた位置でインキュベートした。これは、各ウェル夫々の端に単一細胞が付着したことを確かなものにするために行った。インキュベーション後、各ウェルを、単一の付着細胞が存在するか検査した。単一細胞を含有するウェルを、適切に標識した。プレートを、３７℃で７〜１４日間のさらなるインキュベーションに供した。ウェル中の個々の細胞を、細胞培養培地のかく乱を抑制するため、毎日４日間のみ可視化した。可視化の間、細胞の画像を撮った。
【００３９】
７〜１４日間のインキュベーション後、生存し、かつコロニーへ成長した単一細胞をトリプシン処理し、４８ウェルプレートのウェル中へ移した。細胞数が徐々に増えてきたので、二次培養を、より大きな組織培養コンテナ中で実施した。細胞の増殖およびスケールアップのためのパラメーターを表１に要約した。各細胞のクローン集団を、その後、長期保管のため凍結保存した。
【００４０】
【表１】
0006309520.tif 000002
【００４１】
純粋で安定した細胞クローンを得た後、ＨＩＦ誘導に対するそれらのレポーター活性を、上記の単一ルシフェラーゼアッセイを使用し、再試験した。また細胞は、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用し、マイコプラズマ汚染がないことも確認した。
【００４２】
ＨＩＦ活性アッセイに使用するのに最適な細胞密度を決定するために、２．７×１０４個、３．３×１０４個および４．０×１０４個の細胞を、４８ウェルプレートのウェル中で、２４時間播種した。播種した細胞を、その後、上記のように、正常酸素状態または低酸素状態のいずれかに、２４時間曝露した。Bright-Glo Assay Reagentによる溶解および混合に続いて、生物発光強度を、先の方法において記載したとおりに分析した。
【００４３】
ＨＩＦ活性を測定するためのアッセイシステムとして、安定した単一細胞の集団の特性を検証するために、概念実証研究を、市販され、知られているＨＩＦインヒビターにより実施した。これらのインヒビターは、ボルテゾミブ（Velcade）およびシスプラチンである。あるがん細胞にこれらの薬剤を処置することによって、細胞死が引き起こされる。我々の細胞アッセイシステムにおける生物発光の阻害が、この細胞毒性作用よりはむしろＨＩＦ阻害が原因であることを確認するために、我々は、同時に、阻害アッセイのために使用される各薬剤の多様な濃度下で、細胞の生存率を決定した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイを使用した。細胞を、９６ウェルプレート中のウェルあたり１．５×１０４個の細胞で２４時間播種し、続いて、選択した濃度のボルテゾミブおよびシスプラチンで処置した。細胞を、その後、正常酸素状態または低酸素状態のいずれかで、２４時間インキュベートした。処置後、細胞培養培地を、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含有する、新鮮で血清フリーのＤＭＥＭで置換した。３７℃で加湿したＣＯ２インキュベーターにおける４時間のインキュベート後、ホルマザン沈殿物を１００μｌのＤＭＳＯで溶解した。その結果生じた反応を、基準波長としての５７０ｎｍの吸光度および６３０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダーを使用し、読み取った。各薬剤の、細胞に対する阻害濃度の最大半量（ＩＣ５０）を、Graphpad Prism 5ソフトウェアを使用し、グラフをプロットすることで、決定した。試験した薬剤の多様な濃度における、ＨＩＦ阻害作用もまた、単一ルシフェラーゼアッセイシステムを使用し、測定した。細胞生存率に対する薬剤の作用とＨＩＦ阻害との間の相関を、その後、評価した。
【００４４】
例２：スクリーニングシステムの評価
典型的な類上皮の形態を示したＳａｏｓ−２骨肉腫細胞（図１）に、組換え４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ（４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ−ＦＬｕｃ）を持つｐＬＵＣ−ＭＣＳおよびネオマイシン耐性遺伝子を備えるｐＣＤＮＡ３プラスミド（図２）で、コトランスフェクトした。その結果得られたトランスフェクタントを、その後、Ｇ４１８抗生物質で処置した。処置を通して、細胞培養における変化を、光学顕微鏡下で監視した。処置の間の選択した時刻で観察した形態変化の代表的な画像を、図３に示す。３日までに、培養中の細胞のほとんどが寄せ集まり、浮かんだ。これは、それらがＧ４１８処置に感受性があることを示唆する。他方、薬剤に耐性があるように思われる細胞は、増殖し続けた。処置の２０日後、この耐性のある細胞集団は、組織培養フラスコ中、コンフルエントになった。「一塊の集団」と表されるこれらの細胞を、さらなる選択のために増殖させ、将来の使用のために保管した。
【００４５】
細胞の一塊の集団を、それらのルシフェラーゼ発現レベルを測定することによって、低酸素刺激に対して応答するそれらの能力について、評価した。低酸素の細胞が、正常酸素の細胞と比較して、９０倍より高いルシフェラーゼシグナルを産生することができることを見出した（図４）。したがって、我々は、この一塊の集団がこれらの４ＸＥＰＯ−ＨＲＥ遺伝子コンストラクトを保持し、それらが低酸素に応答するものと推論する。限界連続希釈クローニング戦略を、その後、これらの細胞に対し実施した。
【００４６】
多くの単一細胞を得た。これらのうちの４つが増殖し、細胞コロニーを形成した。培養の種々の時刻でのクローン＃３の代表的な画像を図５に示す。２１日までに、各クローンは、培養フラスコ中、コンフルエントな集団になった。マイコプラズマ汚染が、この過程の間、導入されないことを確かなものにするために、細胞を、ＤＡＰＩ染色方法を使用し、染色した。得られた結果により、それらに、汚染がないことが示された（図６）。
【００４７】
各細胞クローンの低酸素応答性ルシフェラーゼシグナルのレベルを試験するために、それらを低酸素曝露に供した。全ての比較を、正常酸素培養対照に対して行った。４つのクローンのうち、クローン３は、最も高いルシフェラーゼシグナルを与え、これは、正常酸素対照より、５１７倍高かった（図７）。我々の知り得る限りでは、これは、これまで得られた最も高い低酸素特異的シグナルである。以前に、ＶＥＧＦプロモーターコンストラクトを使用して、Woldemichaelらは、４０倍のシグナル強度を得た（2006）。しかしながら、同様のプロモーターを使用したBoらは、１４倍に増加したシグナルをなんとか得ただけだった（2008）。最小のＨＩＦ結合配列のタンデムリピートを含有する新規なＨＩＦレポーターコンストラクトを使用しても、Zhouらは、低酸素下で、ちょうど１００倍大きいルシフェラーゼシグナルを得た（2011）。我々のクローン１は、彼らの知見に匹敵する、倍の違いを与えた。しかしながら、我々のクローン２、３および４は全て、優れた感度を与えた。感度におけるこの増加は、多様な実験条件のシグナル対ノイズ比を大いに改善するであろう。
【００４８】
４つの安定したＳａｏｓ−２クローンの全ての顕微鏡観察は、それらの親細胞と比較して、形態学的な差を示さなかった（図７）。高い細胞密度は、ある細胞株において、ＨＩＦ活性が上昇する因子であることが知られている（kaluz et al., 2006）。細胞密度が、我々のクローン３のシグナル感度に影響を与えるかどうかを試験するために、細胞を異なる細胞数で培養し、その後、低酸素に曝露した。結果は、２．７×１０４〜４．０×１０４の密度で、シグナルにおける統計学的に有意な変動が観察されなかったことを示した（図８）。それ故、我々は、この安定したＳａｏｓ−２クローンによって産生される低酸素応答性シグナルが、種々の細胞密度において、一貫したままであると推論する。我々はまた、継代数が増加したときのクローン３のシグナル安定性も試験した。これまで、我々の知見は、シグナル強度が、３０回の継代まで、依然として安定的であることを示した（データを示さず）。我々は、継代数が、時間とともに増加するとき、さらにシグナルを監視する。
【００４９】
概念実証研究を、ボルテゾミブおよびシスプラチンである、知られているＨＩＦのインヒビターを使用して、行った。プロテアソームインヒビターであるボルテゾミブは、ＨＩＦ１−１αのＣ末端の活性化ドメインに対する特異的作用を介して、ＨＩＦ−１の転写活性を阻害することを示した（Kaluz et al., 2006）。５００ｎＭまでの濃度でのボルテゾミブの処置により、細胞生存率に影響を与えることなく、我々のクローン３細胞の低酸素誘導ルシフェラーゼシグナルが有意に低下した（図９）。より高い濃度で、阻害は、細胞死と関連した。ボルテゾミブに加えて、シスプラチンもまた、ＨＩＦを阻害することを示した。しかしながら、阻害のメカニズムは、ＨＩＦ１−１αタンパク質発現の抑止を介して達成された（Duyndam et al., 2007）。今日の研究において、２５μΜの濃度でのシスプラチンの添加は、低酸素のクローン３において、ルシフェラーゼシグナルのほぼ６０％阻害を引き起こした。また細胞の生存率も低下した。以前の研究は、シスプラチン処置によってＨＩＦ阻害およびアポトーシス細胞死もまた、もたらされることを示した（Tanaka et al., 2005）。要約すれば、ボルテゾミブおよびシスプラチンを使用した我々の概念実証は、我々のクローン３の集団における低酸素誘導シグナルが、これらの薬剤の阻害性作用に応答すること示した。これは、アッセイシステムの信頼性と感度を示唆した。
【００５０】
参考文献
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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