(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸、骨形成タンパク質４及びコラーゲンの存在下に培養することを特徴とする脂肪組織由来幹細胞の表皮角化前駆細胞への分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮角化前駆細胞の誘導法及び脂肪組織由来幹細胞を用いた皮膚疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症熱傷、皮膚潰瘍、分節型尋常性白斑等の皮膚疾患に対する治療手段として、自家および他家（同種）培養皮膚、色素細胞の移植が行なわれている。また、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞（非特許文献１）、間葉系幹細胞（非特許文献２、３）、Ｍｕｓｅ細胞（非特許文献４、５）等を皮膚の再生医療に用いる試みもなされつつある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】PLoS One, 2012:7(12):e52787
【非特許文献２】Am. J. Pathol. 173:803-814,2008
【非特許文献３】Immunotherapy 4:1859-1867, 2012
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:8639-8643, 2010
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:9875-9880, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の表皮角化細胞への分化は誘導率が低く、また、腫瘍形成の可能性の問題がある。骨髄間葉系細胞は採取が容易でない等の問題がある。
従って、容易に入手可能な細胞を用いた治療方法の開発が望まれており、本発明は新たな表皮角化細胞の分化誘導法ならびに細胞治療法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、容易に採取が可能な皮下脂肪組織に着目して検討してきたところ、脂肪組織から脂肪組織由来幹細胞が多量に採取でき、当該脂肪組織由来幹細胞を線維芽細胞、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下に培養すれば、効率良く表皮角化前駆細胞に分化誘導できること、またこの培養をコラーゲン併用下に行えばさらに表皮角化前駆細胞への分化誘導効率が上昇することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下に培養することを特徴とする脂肪組織由来幹細胞の表皮角化前駆細胞への分化誘導方法。
〔２〕前記培養系に、さらにコラーゲンを存在させることを特徴とする〔１〕記載の分化誘導方法。
〔３〕〔１〕又は〔２〕の方法により誘導された表皮角化前駆細胞を有効成分とする皮膚疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明で用いる脂肪組織由来幹細胞は、脂肪組織１ｇから約５×１０3個と骨髄組織由来幹細胞に比べて５００倍多く採取可能であり、入手が容易である。また、脂肪組織由来幹細胞は抗原性が低く、免疫抑制作用を有することから、これらから分化誘導される表皮角化前駆細胞も抗原性が低く、皮膚に移植が可能である。脂肪組織由来幹細胞は皮膚角化前駆細胞を含むことから、種々の皮膚疾患部位に移植すれば、皮膚疾患の再生医療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】脂肪組織由来幹細胞と線維芽細胞の共培養の手順を示す。
【図２】培養後の細胞のデスモグレイン３の発現性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の脂肪組織由来幹細胞から表皮角化前駆細胞への分化誘導方法は、脂肪組織由来幹細胞を、線維芽細胞、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下に培養することを特徴とする。
【００１１】
原料である脂肪組織由来幹細胞は、脂肪組織、例えば皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理後、遠心分離により間質血管細胞群を分離することにより採取することができる。
得られた脂肪組織由来幹細胞であることは、（１）この細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５陽性であること、（２）この細胞を、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ビオチン、パントテン酸塩、ロシグリタゾン、デキサメサゾン、インスリン等の存在下に培養して脂肪細胞へ分化すること、を確認すればよい。
脂肪組織由来幹細胞は、患者に対して拒絶反応を生じないヒトを含む動物由来であればよいが、自家細胞が望ましい。
【００１２】
脂肪組織由来幹細胞は、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下で単独培養しても表皮角化前駆細胞へは分化しないが、線維芽細胞を共存させて、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４添加系で培養すれば、表皮角化前駆細胞へと分化誘導される。
【００１３】
線維芽細胞は、結合組織から採取することができ、例えば、皮膚を径５ｍｍ大で切り取り、その真皮成分より採取することができる。
【００１４】
線維芽細胞の使用量は、脂肪組織由来幹細胞とほぼ同量（細胞数）であるのが好ましく、具体的には、０．５〜２．０倍量用いるのが好ましく、さらに０．８〜１．２倍量用いればよい。また、脂肪組織由来幹細胞を表皮角化前駆細胞へ分化誘導した後、この表皮角化前駆細胞のみを採取する必要があることから、線維芽細胞と脂肪組織由来幹細胞とは分離して培養するのが望ましい。例えば、培養ウエルの内部に、トランスウエルで形成した内部ウエルを挿入した二重ウエルを設置し、内部ウエルの下側に線維芽細胞を含有させ、トランスウエル内に脂肪組織由来幹細胞を含有させるのが好ましい（図１参照）。
【００１５】
レチノイン酸は、培養液中、１μＭ〜３μＭ含有させるのが好ましい。また、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、培養液中に２５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ含有させるのが好ましい。
【００１６】
さらに、培養系には、分化誘導効率を向上させる点から、コラーゲンを共存させるのが好ましく、コラーゲンの培養系中の含有量は１〜１０μｇ／ｍＬ、特に５μｇ／ｍＬが好ましい。また、コラーゲンとしては、IV型コラーゲンが好ましい。なお、コラーゲンは、脂肪組織由来幹細胞と接触しているのが好ましい。例えば、トランスウエルで形成した内部ウエルの内部にコラーゲンを添加し、そのコラーゲンの上に脂肪組織由来幹細胞を含有させるのが好ましい（図１参照）。
【００１７】
培養は、例えば１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、９５％ＣＯ2下、２４〜３００時間行うのが好ましい。
【００１８】
培養により脂肪組織由来幹細胞が皮膚角化前駆細胞に分化誘導されたかどうかを確認するには、脂肪組織由来幹細胞はデスモグレイン３の発現が変化せず、皮膚角化前駆細胞はデスモグレイン３の発現が増加するので、デスモグレイン３の発現の増加を検出すればよい。
【００１９】
得られた脂肪組織由来幹細胞は、分化誘導された皮膚角化前駆細胞を含むため、これを熱傷や種々の皮膚疾患等により皮膚が欠落した部分に移植すれば、表皮が再生する。皮膚角化前駆細胞の移植は、例えば局所に塗布、局所注射、あるいは血管内注射によって病変部に投与すればよい。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２１】
参考例１
（脂肪組織由来幹細胞の採取）
（１）皮下脂肪組織を採取し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。コラゲナーゼに浸した後１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地にてコラゲナーゼを中和した。
（２）４０μｍのナイロンメッシュを通して残渣を除去した。１２００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿物を回収した。再び１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地５ｍｌに溶解し、培養プレートに播種して数日間培養し、培養プレート底面に接着したものが脂肪由来幹細胞である。
（３）フローサイトメトリーにてＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性であることを確認した。
（４）得られた細胞を播種して１０％仔ウシ血清含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地にて培養後、３％仔ウシ血清および３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、ビオチン、ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ、ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、デキサメサゾン、ヒトインスリン含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地に変えて３日間培養した。次に前記培地より３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅを除いたものに変更後、３日ごとに培地を交換し、約１２日間培養する。本細胞をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色にて脂肪細胞に分化していることを確認した。以上の手順（３）、（４）によって本細胞が脂肪組織由来幹細胞であることを確認した。
【００２２】
参考例２
（脂肪組織由来幹細胞から分化誘導した脂肪細胞はｐ６３、デスモグレイン３発現が低下する）
（１）未分化な脂肪組織由来幹細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。１０％血清にて１時間ブロッキングした。次に抗ｐ６３抗体および抗デスモグレイン３抗体にて反応させた。さらに二次抗体にて反応させた。蛍光顕微鏡にて確認するとｐ６３およびデスモグレイン３に染色され、未分化な脂肪組織由来幹細胞にこれらのマーカーが存在することが確認される。
（２）脂肪組織由来幹細胞を培養し、細胞固定した。メタノールを添加後３０分間静置した。１％ウシ血清アルブミンにて１０分間処理した。次いで抗ｐ６３抗体、抗デスモグレイン３抗体にて３０分間反応後に二次抗体反応をおこない、フローサイトメトリーにて解析すると免疫染色の結果と同様にｐ６３、デスモグレイン３は陽性である。
（３）参考例１（４）に従い脂肪組織由来幹細胞を脂肪細胞に分化誘導した。あわせて未分化な脂肪組織由来幹細胞も用意した。それぞれの全ＲＮＡを回収し、逆転写反応をおこないＲＮＡ２μｇをｃＤＮＡに変換した。１μｇのｃＤＮＡをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにてｐ６３、デスモグレイン３について４５サイクル増幅反応をおこなう。その産物を、ｆｏｒｍｕｌａ  ２ΔΔＣｔを用いてｍＲＮＡの比較定量をおこなう。その結果、未分化な脂肪由来幹細胞と比べて脂肪細胞に分化した細胞では、ｐ６３とデスモグレイン３は低下していることが確認される。
（４）参考例１（４）に従い脂肪組織由来幹細胞を脂肪細胞に分化誘導した。あわせて未分化な脂肪組織由来幹細胞も用意した。それぞれをタンパク溶解液に溶解した。１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ／ＰＡＧＥにてタンパクを分離し、メンブレンに転写した。３％ウシ血清アルブミンにてブロッキング後、メンブレンを抗ｐ６３一次抗体、抗デスモグレイン３一次抗体にて反応させ、次いで二次抗体にて反応させた。画像解析をすると、参考例２（３）と同様に脂肪に分化すると脂肪由来幹細胞におけるｐ６３、デスモグレイン３は低下している。
【００２３】
実施例１
（１）脂肪組織由来幹細胞の単層培養
プレートにコラーゲンゲルを流し込み、３７℃、３０分間で固化させる。次に脂肪組織由来幹細胞をゲルの上に播種して、２４時間培養する。
【００２４】
（２）トランスウエルを用いた脂肪組織由来幹細胞と線維芽細胞の共培養
１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を添加した６ウエルプレートに線維芽細胞５．０×１０4細胞／２ｍＬを播種し、９５％ＣＯ2下３７℃で２４時間培養した。次に、トランスウエルのメンブレンにIV型コラーゲンをコーティングした。このトランスウエルを線維芽細胞のプレートにのせた。次に、トランスウエル内に脂肪組織由来細胞１．０×１０5細胞／２ｍＬ及び１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を入れ、９５％ＣＯ2下３７℃で２４時間培養した。
次いでレチノイン酸を添加し、９５％ＣＯ2下３７℃で７２時間培養した。さらに、骨形成タンパク質４を添加して９５％ＣＯ2下３７℃で４日間培養した（図１参照）。
【００２５】
（３）参考例１、２と同様にして、培養した細胞のデスモグレイン３発現量の変化を検討した。
その結果、図２に示すように、脂肪組織由来幹細胞の単層培養では、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４を添加してもデスモグレイン３の発現は変化しなかった。これに対し、脂肪組織由来幹細胞と線維芽細胞とを、レチノイン酸及び骨形成タンパク質４の存在下で共培養すると、デスモグレイン３の発現が増強され、皮膚角化前駆細胞に分化誘導することが確認された。また、当該分化誘導は、コラーゲン共存下でさらに効率が良くなることがわかる。
【図１】
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【図２】
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