(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および哺乳類Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００のアミノ酸１２８４〜１６７３からなる少なくとも１つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインを含む融合タンパク質であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが染色体配列に結合する、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、５〜７個のジンクフィンガーを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記転写開始部位が、Ｏｃｔ４、ＰＥＤＦ、又はＳｏｘ２をコードする染色体配列と関連する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
細胞における標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化するためのインビトロの方法であって、前記方法が、前記細胞を融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、前記融合タンパク質が、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、および哺乳類Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００のアミノ酸１２８４〜１６７３からなる少なくとも１つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインを含み、前記ＤＮＡ結合ドメインが前記標的染色体位置の配列に結合したら、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインが、前記標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化するようになっている、方法。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、５〜７個のジンクフィンガーを含む、請求項７に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、又はヒストンＨ４である、請求項７または８に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するドメインが、ヒストンＨ３のリジン１８、ヒストンＨ３のリジン２７、又はこの両方をアセチル化する、請求項７〜９のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
前記標的染色体位置の染色体配列の転写が増大する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
前記細胞が、ヒト細胞、哺乳類細胞、哺乳類以外の脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、又は単細胞真核生物である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する、請求項７に記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
前記転写開始部位が、Ｏｃｔ４、ＰＥＤＦ、又はＳｏｘ２をコードする染色体配列と関連する、請求項１３に記載のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は広くは、標的染色体位置のヒストンタンパク質をアセチル化する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンのアセチル化が、真核細胞における転写活性と関連することは十分に確立されている。アセチル化されたコアヒストンは、クロマチンの転写活性と優先的に関連することが知られている。アセチル化は、ヒストンタンパク質のアミノ末端テールのリジン残基で行われ、これにより、ヒストンテールの陽電荷を中和し、ヒストンのＤＮＡに対する親和性を低下させる。従って、ヒストンのアセチル化は、ヌクレオソームのコンフォメーションを変化させ、それによって、転写制御タンパク質のクロマチンテンプレートへの到達性を向上させる。
【０００３】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性又はヒストンデアセチラーゼ活性を有する数多くのタンパク質の同定、及びそれらのタンパク質が遺伝子発現を調節する役割の解析の進歩にもかかわらず、特定の位置のヒストンのアセチル化を改変する方法は今のところ存在しない。酪酸ナトリウムを用いて、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することによって、間接的にヒストンのアセチル化を増大させているが、このヒストンアセチル化法は、包括的かつ非特異的である。本質的にすべての位置でのアセチル化が改変される。従って、ヒストンのアセチル化の標的化に対するニーズが存在する。特に、目的の染色体配列と関連するヒストンタンパク質をアセチル化できるように、ヒストンアセチラーゼ活性を特定の染色体配列に導入する手段に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
従って、本開示は、標的染色体位置のヒストンタンパク質をアセチル化する手段を提供する。本開示の１つの態様は、ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。ある１つの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインである。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインである。ある１つの実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約５〜約７個のジンクフィンガーを含む。さらなる実施形態では、ＨＡＴドメインは、哺乳類ｐ３００タンパク質に由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞透過性ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、又はこれらの組み合わせをさらに含む。ある１つの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、約５〜約７個のジンクフィンガーを含む組換えジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであり、融合タンパク質のＨＡＴドメインは、ヒトｐ３００タンパク質に由来する。ある１つの実施形態では、融合タンパク質の組換えジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、又はＰＥＤＦをコードする染色体配列の転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する。
【０００５】
本開示は、本明細書に開示されている融合タンパク質をコードする単離された核酸も提供する。
【０００６】
本開示のさらなる態様は、細胞における標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化する方法を提供する。この方法は、その細胞を融合タンパク質、又はその融合タンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、この融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのｐ３００ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを含む。ＤＮＡ結合ドメインが、標的染色体位置の配列に結合したら、ｐ３００ＨＡＴドメインが、標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化する。ある１つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、及び／又はヒストンＨ４をアセチル化する。特定の例示的実施形態では、融合タンパク質は、ヒストンＨ３のリジン１８、及び／又はヒストンＨ３のリジン２７をアセチル化する。さらなる実施形態では、標的染色体配列の近くに位置する遺伝子は、転写レベルが増大している。様々な実施形態において、本発明の方法で用いる細胞は、ヒト細胞、哺乳類細胞、哺乳類以外の脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、幹細胞、胚、又は単細胞真核生物である。例示的実施形態では、この細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、約５〜約７個のジンクフィンガーを含む組換えジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであり、融合タンパク質のＨＡＴドメインは、ヒトｐ３００タンパク質に由来する。別の実施形態では、融合タンパク質の組換えジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、又はＰＥＤＦをコードする染色体配列の転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列に結合する。
【０００７】
本開示のその他の態様及び反復について、以下でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】融合タンパク質ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００によるＨＥＫ２９３細胞における標的ヒストンのアセチル化を示す図である。記載されている処理条件下での、標的部位及び標的部位＋２００ｂｐにおけるＨ３Ｋ１８及びＨ３Ｋ２７のアセチル化の増加倍率がプロットされている。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）は、ＯＣＴ４の転写開始部位から＋１８１ｂｐ下流の配列を標的とする。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の酪酸ナトリウム（Ｎａｂｕｔ）で処理した細胞をポジティブコントロールとして用いた。ｐ３００ＨＡＴドメイン（ＺＦドメインは含まない）又はＧＦＰをトランスフェクションした細胞をネガティブコントロールとして用いた。
【０００９】
【図２】融合タンパク質ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００によるＨＥＫ２９３細胞におけるＯｃｔ４の発現の活性化を示す図である。記載されている処理条件下でのＯＣＴ４の発現の増加倍率がプロットされている。各棒は、トリプリケートＲＴ−ＰＣＲのＯＣＴ４／シクロフィリンＡ比の平均値（±ＳＤ）を表している。ＺＦ−ｐ６５融合タンパク質を発現する細胞をポジティブコントロールとして用いた（ｐ６５は、転写因子ＮＦ−κＢの構成要素である）。ｐ６５、ｐ３００、又はＧＦＰのみを発現する細胞をネガティブコントロールとして用いた。融合タンパク質ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００を発現する細胞は、ネガティブコントロール細胞に対して、ＯＣＴ４の発現の顕著な活性化を示した（＞２５倍）。
【００１０】
【図３】融合タンパク質ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ３００によるＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＤＦの発現の活性化を示す図である。記載されている処理条件下でのＰＥＤＦの発現の増加倍率がプロットされている。各棒は、トリプリケートＲＴ−ＰＣＲのＰＥＤＦ／シクロフィリンＡ比の平均値（±ＳＤ）を表している。ＤＮＡ結合ドメインＺＦ６９６１は、ＰＥＤＦ遺伝子を標的とする。ＺＦ６９６１−ｐ６５融合タンパク質を発現する細胞をポジティブコントロールとして用いた。ｐ６５、ｐ３００、又はＧＦＰのみを発現する細胞をネガティブコントロールとして用いた。融合タンパク質ＺＦ６９６１−ｐ３００を発現する細胞では、ＰＥＤＦの発現が向上した（Ｐ＜０．００１）。
【００１１】
【図４】融合タンパク質ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ＧＣＮ５が、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＥＤＦの発現を活性化しなかったことを示す図である。記載されている処理条件下でのＰＥＤＦの発現の増加倍率がプロットされている。各棒は、トリプリケートＲＴ−ＰＣＲのＰＥＤＦ／シクロフィリンＡ比の平均値（±ＳＤ）を表している。ＤＮＡ結合ドメインＺＦは、ＰＥＤＦ遺伝子を標的とする。ＺＦ−ｐ６５融合タンパク質を発現する細胞をポジティブコントロールとして用いた。ｐ６５のみを発現する細胞をネガティブコントロールとして用いた。融合タンパク質ＺＦ−ＧＣＮ５を発現する細胞は、ＰＥＤＦの発現の向上を示さなかった。
【００１２】
【図５】一連のＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質の存在下におけるＯＣＴ４の発現を示す図である。各融合タンパク質は、ＯＣＴ４の転写開始部位（ＴＳＳ）から約−２．５ｋｂ上流〜約１．５ｋｂ下流に位置する特定の配列を標的としていた。
【００１３】
【図６】ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質が、複数の細胞においてＯＣＴ４の発現を活性化したことを示す図である。コントロール条件下、又は２つの異なる下流配列を標的とする融合タンパク質の存在下でのＨＥＫ２９３細胞（６Ａ）及びＫ５６２細胞（６Ｂ）におけるＯＣＴ４の発現の増加倍率がプロットされている。
【００１４】
【図７】ＨＥＫ２９３細胞（７Ａ）及びＫ５６２細胞（７Ｂ）におけるＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質による標的ヒストンのアセチル化を示す図である。ＺＦ（Ｏｃｔ４＋２８６）−ｐ３００又はＺＦ（Ｏｃｔ４＋４２０）−ｐ３００融合タンパク質の非存在下（コントロール）又は存在下での、示されている位置でのＨ３Ｋ２７のアセチル化の増加倍率がプロットされている。コントロールの位置は、ＳＯＸ２のＴＳＳから＋２００下流である。
【００１５】
【図８】一連のＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合タンパク質の存在下でのＳＯＸ２の発現を示す図である。各融合タンパク質は、ＳＯＸ２のＴＳＳから−０．５ｋｂ上流〜約１．５ｋｂ下流に位置する特定の配列を標的とした。
【００１６】
【図９】ＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合タンパク質が複数の細胞においてＳＯＸ２の発現を活性化したことを示す図である。コントロール条件下、又は２つの異なる下流配列を標的とするＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合タンパク質の存在下でのＨＥＫ２９３細胞（９Ａ）及びＫ５６２細胞（９Ｂ）におけるＳＯＸ２の発現の増加倍率がプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、特定の染色体位置のヒストン及びその他のタンパク質をアセチル化する手段を提供する。特に、本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン及びヒストンアセチラーゼ活性を呈する少なくとも１つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。ＤＮＡ結合ドメインは、目的の染色体配列内の特定の配列を認識して、その配列に結合することができ、ＨＡＴドメインは、ヒストン又はその他の染色体タンパク質のリジン残基をアセチル化できる。従って、本明細書に開示されている融合タンパク質を用いて、ＤＮＡ結合ドメインの標的となる特定の配列と関連するタンパク質をアセチル化できる。標的タンパク質のアセチル化を用いて、目的の染色体配列における転写活性又は染色体タンパク質のアセチル化のその他の効果を調節してよい。
【００１８】
（Ｉ）融合タンパク質
本開示の１つの態様は、ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインを、含む融合タンパク質を提供する。ＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列を認識して、その配列に結合するので、融合タンパク質を細胞染色体における特定の配列に導く。その特定の配列に結合したら、融合タンパク質のＨＡＴドメインが、細胞染色体におけるその特定の配列と関連する少なくとも１つのタンパク質をアセチル化する。
【００１９】
（ａ）ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に開示されている融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含み、このドメインは、ＤＮＡの特定の配列を認識して、その配列に結合する少なくとも１つのモチーフを含む。ＤＮＡ結合ドメインは、２本鎖ＤＮＡ及び／又は１本鎖ＤＮＡに結合できる。概して、ＤＮＡ結合ドメインは、細胞染色体の２本鎖ＤＮＡにおける特定の配列を認識して、その配列に結合する。
【００２０】
様々なＤＮＡ結合ドメインが、本発明の融合タンパク質に含めるのに適している。好適なＤＮＡ結合ドメインの非限定例としては、ＡＴフックドメイン、塩基性ロイシンジッパードメイン、βシートドメイン、Ｂ３ドメイン、ヘリックスループヘリックスドメイン、ヘリックスターンヘリックスドメイン、ホメオドメイン、ＨＭＧボックスドメイン、免疫グロブリンフォールドドメイン、ロイシンジッパードメイン、ステロイド受容体ドメイン、転写活性因子様エフェクター（ＴＡＬ）エフェクタードメイン、ウイングドヘリックスドメイン、ウイングドヘリックスターンヘリックスドメイン、及びジンクフィンガードメインが挙げられる。本発明のＤＮＡ結合ドメインは、天然のタンパク質に由来することができる。例えば、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、天然の転写因子又はＤＮＡ結合タンパク質に由来することができる。あるいは、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、組換え又は人造ポリペプチド又はタンパク質であることができる。
【００２１】
（ｉ）ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン
例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２つ、３つ、又はそれ以上のジンクフィンガーモチーフ（すなわち「ジンクフィンガー」）のタンデムリピートを含む。各ジンクフィンガーでは、亜鉛（又は別のイオン）が配位結合しており、約３個の連続するヌクレオチド残基と相互作用する。様々なジンクフィンガーが知られており、亜鉛と配位結合している残基の種類と順序によって分類することができる（例えばＣｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｃｙｓ４、及びＣｙｓ６）。
【００２２】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、天然のタンパク質に由来することができる。あるいは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択したいずれかの核酸配列を認識して、その配列に結合するように組み換えることができる。例えば、組換えＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーアレイは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０、Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８、及びＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。
【００２３】
組換えジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。組換え方法としては、ラショナルデザイン及び各種の選択が挙げられるが、これらに限らない。ラショナルデザインは例えば、ヌクレオチドのダブレット配列、トリプレット配列、及び／又はクアドラプレット配列と、個々のジンクフィンガーアミノ酸配列とを含むデータベースを用いることを含み、ヌクレオチドの各ダブレット配列、トリプレット配列、又はクアドラプレット配列は、その特定のトリプレット配列又はクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されているアルゴリズムを用いて、所定の配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計できる。非縮重認識コード表を用いるラショナルデザインのような代替的な方法を用いて、特定の配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計することもできる（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列における潜在的な標的部位を同定するための公共のウェブベースツール、及びジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公共のウェブベースツールは、当該技術分野において既知である。例えば、ＤＮＡ配列における潜在的な標的部位を同定するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇで見出すことができる。ジンクフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴで見出すことができる。（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５も参照されたい。）
【００２４】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的方法としては、ファージディスプレイ及びツーハイブリッド系が挙げられ、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、及び同第６，２４２，５６８号、並びに、国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、及び英国特許第２，３３８，２３７号に開示されており、これらの各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の向上については、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。
【００２５】
本明細書に開示されている融合タンパク質に含めるように設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは典型的には、少なくとも約１２個のヌクレオチドのＤＮＡ配列を認識して、その配列に結合するように組み換えられている。例示的実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレオチド長が約１５〜約２１の範囲であるＤＮＡ配列を認識して、その配列に結合するように組み換えられている。従って、本明細書に開示されているジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも４つのジンクフィンガーを含む。例示的実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約５〜約７個のジンクフィンガーを含む。１つの例示的実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含む。別の例示的実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含む。さらに別の例示的実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、７個のジンクフィンガーを含む。
【００２６】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び／又はマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えばアミノ酸長が５以上であるリンカーを含む好適なリンカー配列を用いて結合できる。アミノ酸長が６以上のリンカー配列の非限定例については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号を参照されたい（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されているジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、好適なリンカーの組み合わせを含むことができる。
【００２７】
（ｉｉ）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン
別の実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインである。ＴＡＬエフェクターは、病原菌が各種の植物種に感染すると、その病原菌によって分泌される転写因子である。これらのタンパク質は、リピート数が様々である約３４個のアミノ酸リピートからなる中央のリピートドメインを介して、植物のＤＮＡ配列を認識することによって、細菌感染を補助する植物遺伝子の発現を活性化する。従って、ＴＡＬエフェクターの中央のリピートドメインはＤＮＡ結合ドメインである。各リピート内の２つの重要なアミノ酸による標的ＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチドの認識は、単純に１対１で対応していると見られる。従って、人造ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、いずれかの目的のＤＮＡ配列を認識して、その配列に結合するように組み換えることができる。概して、本明細書に開示されている融合タンパク質に含めるように設計されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、約２〜約４０個のリピートを含む。具体的な実施形態では、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、約１２〜約２５個のリピートを含む。
【００２８】
（ｉｉｉ）特定のＤＮＡ結合ドメイン
概して、本発明の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、目的の染色体配列における特定の配列を認識して、その配列に結合するように組み換えられている。好適な標的配列の非限定例としては、リプログラミング因子（例えばＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、ｍｉＲＮＡ３０２−３６７クラスター、Ｚｆｐ２９６など）、増殖因子（例えばＡｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、Ｉ−ｌＧＦ１、Ｉ−ｌＧＦ２、ＧＤＦ８、ＮＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＥＤＦ、ＰＩＧＦなど）、サイトカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン、ＥＰＯ、ＴＰＯ、など）、増殖因子又はサイトカイン受容体（例えばＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＥＰＯＲ、ＥｒｆＢＧＦＲ、ＳＣＦＲ、ＴＧＦＲ、ＢＭＰＲなど）、癌抑制因子（例えばｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、ＶＨＬ、ＣＤＨ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＳＴ１４など）、及び細胞周期制御因子（例えばＡＮＡＰＣ２、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＢＣＣＩＰ、ＢＣＬ２、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＦ、ＣＣＮＨ、ＣＣＮＴ１、ＣＤＣ１６、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＣ６、ＣＤＫ１（ＣＤＣ２）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５Ｒ１、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦ１）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ＫＩＰ１）、ＣＫＳ１Ｂ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＫＮＴＣ１、ＭＫＩ６７、ＲＡＤ９Ａ、ＲＢ１、ＳＫＰ２、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＷＥＥ１など）、活性因子／阻害剤、遺伝子標的などをコードする配列が挙げられる。
【００２９】
ＤＮＡ結合ドメインが認識して結合する特定の配列は概して、転写開始部位の上流又は下流に位置する。例えば、特定の配列は、転写開始部位から数塩基対以内に存在することも、転写開始部位から数十、数百、数千、数万、又は数十万塩基対上流又は下流に位置することもできる。例えば、特定の配列は、転写開始部位から約１〜１００、１００〜３００、３００〜１，０００、１，０００〜３，０００、３，０００〜１０，０００、１０，０００〜３０，０００、又は３０，０００〜１００，００塩基対分上流又は下流以内に位置してよい。さらなる実施形態では、特定の配列は、転写開始部位から１００，０００を超える塩基対分上流又は下流に位置できる。
【００３０】
１つの例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＯＣＴ４遺伝子の転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。例えば、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ＯＣＴ４の転写開始部位から約−２０００塩基対（ｂｐ）〜約＋３０００ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。特定の例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＯＣＴ４の転写開始部位から約−１７００塩基対（ｂｐ）〜約＋１５００ｂｐ（例えば、ＯＣＴ４の転写開始部位から約−１００ｂｐ〜約＋９００ｂｐを含む）に位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。具体的な例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＯＣＴ４の転写開始部位から＋１８１ｂｐ、＋２８６ｂｐ、又は＋４２０ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。
【００３１】
別の例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥＤＦ遺伝子の転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。例として、本発明のＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥＤＦの転写開始部位から約−１０００ｂｐ〜約＋２０００ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。特定の例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥＤＦの転写開始部位から約−１００ｂｐ〜約＋５００ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。１つの具体的な例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥＤＦの転写開始部位から−９２ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。
【００３２】
別の例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＳＯＸ２遺伝子の転写開始部位の上流又は下流に位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。例えば、ＤＮＡ結合ドメインは、ＳＯＸ２の転写開始部位から約−１０００ｂｐ〜約＋２０００ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。特定の例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＳＯＸ２の転写開始部位から約−１００ｂｐ〜約＋５００ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合できる。具体的な例示的実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＳＯＸ２の転写開始部位から＋１８５ｂｐ又は＋４７５ｂｐに位置する特定の配列を認識して、その配列に結合する。
【００３３】
（ｂ）ＨＡＴドメイン
本明細書に開示されている融合タンパク質は、少なくとも１つのＨＡＴドメインも含む。ＨＡＴドメインは、タンパク質アセチラーゼ活性を呈する。例えば、ＨＡＴドメインは、ヒストンアセチラーゼ活性を呈することができ、すなわち、アセチルＣｏＡからアセチル基を移転して、ε−Ｎ−アセチルリジンを形成させることによって、ヒストンタンパク質におけるリジン残基をアセチル化できる。好適なヒストンタンパク質としては、コアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４、並びにリンカーヒストンＨ１が挙げられる。ＨＡＴドメインは、染色体的に関連するその他のタンパク質に対するアセチラーゼ活性も呈することができる。染色体的に関連するタンパク質としては、クロマチン構造に関わるヒストン以外のタンパク質、並びに、転写、複製、及びその他の本質的なプロセスに関与する酵素及びタンパク質因子が挙げられる。
【００３４】
様々なＨＡＴドメインが、本発明の融合タンパク質に含めるのに適している。融合タンパク質が２つ以上のＨＡＴドメインを含む実施形態では、それらのＨＡＴドメインは、同じであっても異なってもよい。好適なＨＡＴドメインの非限定例は、ＣＲＥＢＢＰ（すなわちＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＣＤＹ１、ＣＤＹ２、ＣＤＹＬ１、ＣＬＯＣＫ、ＥＬＰ３、ＥＰ３００（すなわちＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００）、ＥＳＡ１、ＧＣＮ５（ＫＡＴ２Ａ）、ＨＡＴ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＡＴ５、ＭＹＳＴ１、ＭＹＳＴ２、ＭＹＳＴ３、ＭＹＳＴ４、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ３、ＮＣＯＡＴ、Ｐ／ＣＡＦ、Ｔｉｐ６０、ＴＡＦＩＩ２５０、又はＴＦ３Ｃ４に由来するものである。ある１つの実施形態では、ＨＡＴドメインは、ＳＲＣ１又はＳＲＣ１関連タンパク質ではない。別の実施形態では、ＨＡＴドメインはＧＣＮ５（ＫＡＴ２Ａ）ではない。ある例示的実施形態では、ＨＡＴドメインは、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来し、このタンパク質は、ｐ３００、ＥＰ３００、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、Ｅ１Ａ関連タンパク質、又はＫＡＴ３Ｂとしても知られている。
【００３５】
ＨＡＴドメインは、哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、又は単細胞真核生物由来のものであることができる。いくつかの実施形態では、ＨＡＴドメインは、哺乳類由来のｐ３００タンパク質である。例示的実施形態では、Ｈatドメインは、ヒト由来のｐ３００タンパク質である。ある１つの実施形態では、ＨＡＴドメインは、哺乳類ｐ３００タンパク質の１０００位前後のアミノ酸〜２０００位前後のアミノ酸に及ぶ。別の実施形態では、ＨＡＴドメインは、哺乳類ｐ３００タンパク質の１１００位前後のアミノ酸〜１７５０位前後のアミノ酸に及ぶ。さらなる実施形態では、ＨＡＴドメインは、哺乳類ｐ３００タンパク質の１２８４位前後のアミノ酸〜１６７３位前後のアミノ酸に及ぶ。
【００３６】
ＨＡＴドメインは、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端又はＣ末端側に位置してもよい。２つ以上のＨＡＴドメインが存在する実施形態では、ＨＡＴドメインは、タンデムに配置されていても、ＤＮＡ結合ドメインに隣接しても、又はこれらの組み合わせであってもよい。ＨＡＴドメイン（単一又は複数）とＤＮＡ結合ドメインは、連続していても、リンカー配列（単一又は複数）によって隔てられていてもよい。好適なアミノ酸リンカー配列は、当該技術分野において周知である。
【００３７】
（ｃ）任意のドメイン
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、融合タンパク質を核の中に導くように促すアミノ酸配列であり、この核の中で、融合タンパク質が標的ヒストンのアセチル化を媒介する。核局在化シグナルは、当該技術分野において既知である（例えばＭａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７を参照されたい）。例えば、ＮＬＳは、ＳＶ４０Ｔ−抗原、ヌクレオプラスミン、ｃ−ｍｙｃ、ｈｎＲＮＰＡ１、Ｍａｔα２などのような天然のタンパク質に由来することができる。あるいは、ＮＬＳは、多くのＮＬＳ配列に由来するコンセンサス配列であることができる。ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又は内部の位置に位置することができる。
【００３８】
追加の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの細胞透過性ドメインも含むことができる。細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質に由来する細胞透過性ペプチド配列、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する細胞透過性ペプチド配列、単純ヘルペスウイルスに由来する細胞透過性ペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列であることができる。細胞透過性ドメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又は内部の位置に位置することができる。
【００３９】
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのマーカードメインを含むことができる。好適なマーカードメインとしては、蛍光タンパク質、可視レポーター、選択マーカー、エピトープタグ、アフィニティタグなどが挙げられる。好適な蛍光タンパク質の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、又はその他のいずれかの好適な蛍光タンパク質が挙げられる。可視レポーターの非限定例としては、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、及びこれらの変異体が挙げられる。好適な選択マーカーの例としては、これらに限らないが、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ネオマイシン、ハイドロマイシン、フレオマイシンなどのような抗生物質選択マーカーが挙げられる。好適なエピトープタグとしては、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍａｌｔｏｓｅ結合タンパク質、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ＢＣＣＰ、及びカルモジュリンが挙げられるが、これらに限らない。アフィニティタグの非限定例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。マーカードメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、ＨＡＴドメイン（単一又は複数）、及び／又は追加のドメインのＮ末端又はＣ末端側であることができる。
【００４０】
（ＩＩ）融合タンパク質をコードする核酸
本開示の別の態様は、上記の項（Ｉ）に記載されている融合タンパク質をコードする単離された核酸を包含する。融合タンパク質をコードするこの核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２本鎖、１本鎖、直鎖状、又は環状であることができる。核酸がＲＮＡである実施形態では、そのＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であることができる。このｍＲＮＡは、５’末端にキャップを有し、及び／又は３’末端がポリアデニル化されていることができる。キャッピング（又はポリアデニル化）は、インビトロ合成反応中に行うことができ、あるいは、キャッピング（又はポリアデニル化）は、転写後に特定の反応を介して行うことができる。
【００４１】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、目的の細胞において発現させるための少なくとも１つのプロモーター制御配列に機能可能に結合できる。いくつかの実施形態では、この核酸は、真核細胞における発現のためのプロモーター制御配列に機能可能に結合している。プロモーター制御配列は、構成性であることも、調節性（すなわち誘導性又は組織特異的）であることもできる。好適な構造性プロモーター制御配列としては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）−αプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの断片、又は上記のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。好適な誘導性プロモーター制御配列の非限定例としては、抗生物質によって調節されるもの（例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター）、及び金属イオンによって調節されるもの（例えばメタロチオネイン−１プロモーター）、ステロイドホルモンによって調節されるもの、小分子によって調節されるもの（例えばアルコール調節性プロモーター）、熱ショックによって調節されるものなどが挙げられる。組織特異的プロモーターの非限定例としては、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、及びＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は野生型であることができ、あるいは、より効率的又は有効な発現のために、改変することができる。
【００４２】
代替的な実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする配列は、その融合タンパク質を単離及び／又は精製できるように、細菌又は真核細胞において発現させるための少なくとも１つのプロモーター制御配列に機能可能に結合できる。従って、融合タンパク質は、目的の細胞に単離されたタンパク質として導入できる。好適な細菌プロモーターとしては、これらに限らないが、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、これらの改変体、及びこれらの組み合わせが挙げられる。例示的細菌プロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとのハイブリッドであるｔａｃである。好適な真核生物プロモーターの非限定例は、上に列挙されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、ベクターに存在することができる。好適なベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人造／ミニクロモソーム、トランスポゾン、及びウイルスベクターが挙げられる。例示的実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、プラスミドベクターに存在するＤＮＡである。好適なプラスミドベクターの非限定例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びこれらの変異体が挙げられる。ベクターは、追加の発現制御配列（例えばエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。追加の情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３、又は“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１に見出すことができる。
【００４４】
（ＩＩＩ）標的ヒストンのアセチル化法
本開示のさらなる態様は、細胞における標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化する方法を提供する。この方法は、細胞を融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、この融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも１つのＨＡＴドメインを含む。融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが標的染色体位置の特定の配列に結合したら、融合タンパク質のＨＡＴドメインが、標的染色体位置の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化する。
【００４５】
（ａ）融合タンパク質との接触
上記の方法は、単離された融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸との接触を含む。融合タンパク質は、上記の項（Ｉ）に詳述されており、融合タンパク質をコードする核酸は、上記の項（ＩＩ）に説明されている。
【００４６】
融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸は、様々な手段によって細胞に導入できる。好適な送達手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション、光トランスフェクション、独自の作用剤による核酸取り込みの増強、及びリポソームを介した送達、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人造ビリオンが挙げられる。ある具体的な実施形態では、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸は、ヌクレオフェクションによって細胞に導入する。
【００４７】
概して、細胞は、細胞の増殖及び／又は維持に適切な条件下で維持する。好適な細胞培養条件は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４、Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１、及びＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載されている。細胞を培養する方法は当該技術分野において既知であり、細胞種によって様々であり得るとともに、様々となることは当業者には明らかである。いずれのケースでも、通常の最適化を用いて、特定の細胞種に最適の技法を割り出してよい。
【００４８】
融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが標的配列に結合したら、融合タンパク質のＨＡＴドメインが、標的配列の少なくとも１つのヒストンタンパク質をアセチル化する。少なくとも１つのリジン残基がアセチル化されるヒストンタンパク質は、コアヒストン（すなわちＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）のうちの１つ以上であることができる。ある１つの実施形態では、融合タンパク質は、ヒストンＨ３の少なくとも１つのリジン残基をアセチル化する。ヒストンＨ３における例示的リジン（Ｋ）残基としては、Ｋ４、Ｋ９、Ｋ１４、Ｋ１８、Ｋ２３、Ｋ２７、Ｋ４２、及びＫ５６が挙げられる。例示的実施形態では、融合タンパク質は、ヒストンＨ３のリジン１８及びリジン２７をアセチル化する。ヒストンタンパク質における特定のリジン残基のアセチル化度は、約１．２倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又は１０倍超増大できる。当業者は、ヒストンタンパク質のアセチル化レベルを決定する手段を熟知している（例えば実施例１を参照されたい）。
【００４９】
概して、ヒストンのアセチル化の増大により、標的染色体配列の転写が増大する。転写は、約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２２倍、２４倍、２６倍、２８倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、又は１００倍超増大し得る。発現のレベルを測定する好適な手段は、当該技術分野において周知である（例えば実施例２を参照されたい）。
【００５０】
（ｂ）細胞種
様々な細胞が、本発明の方法で用いるのに適している。様々な実施形態において、細胞は、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類細胞、哺乳類以外の脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は単細胞真核生物であることができる。様々な胚が、本発明の方法で用いるのに適している。例えば、胚は、ヒト以外の哺乳類１細胞胚であることができる。１細胞胚を含む例示的哺乳類胚としては、これらに限らないが、マウス胚、ラット胚、ハムスター胚、げっ歯類胚、ウサギ胚、ネコ胚、イヌ胚、ヒツジ胚、ブタ胚、ウシ胚、ウマ胚、及び霊長類胚が挙げられる。さらに別の実施形態では、細胞は幹細胞であることができる。好適な幹細胞としては、これらに限らないが、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、万能性幹細胞、誘導万能性幹細胞、多能性幹細胞、少能性幹細胞、単能性幹細胞、及びその他の幹細胞が挙げられる。例示的実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。
【００５１】
好適な哺乳類細胞の非限定例としては、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）、ヒトＫ５６２細胞、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞、サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞、アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウスミエローマＮＳ０細胞、マウス胎児線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウスメラノーマＢ１６細胞、マウス筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞、マウスミエローマＳＰ２／０細胞、マウス胎児間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、マウス腫瘍ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳腺ＥＭＴ６細胞、マウス肝細胞癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウスミエローマＪ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞、マウスメラノーマＸ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞、ラット神経膠肉腫９Ｌ細胞、ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞、ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞、ラット肝細胞癌細胞（ＨＴＣ）、バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞、ラット骨肉腫Ｄ１７細胞、及びラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞が挙げられる。哺乳類細胞株の広範なリストは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）に見出すことができる。
【００５２】
定義
別段の定めのない限り、本明細書で用いられているいずれの専門用語及び科学用語も、本発明の属する技術分野の者によって広く理解されている意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）という参考文献は、当業者に、本発明で用いられている多くの用語の一般的な定義を示している。本明細書で使用する場合、下記の用語は、別段の指定のない限り、その用語のものとされている意味を有する。
【００５３】
本開示又はその好ましい実施形態（単一又は複数）の要素を取り上げるとき、単数形、「その」、及び「前記」という冠詞は、その要素が１つ以上存在することを意味するように意図されている。「含む」、「挙げられる」、及び「有する」という用語は、包括的であるように意図されており、列挙されている要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
【００５４】
「ＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、特定のＤＮＡ配列を認識して、その配列に結合する少なくとも１つのモチーフを含むタンパク質ドメインを指す。
【００５５】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソン及びイントロンを含む）、並びに、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（このような調節配列が、コード配列及び／又は転写配列に隣接するか否かは問わない）を指す。従って、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限らない。
【００５６】
「ＨＡＴドメイン」という用語は、ヒストンアセチラーゼ活性を呈するタンパク質ドメイン又はその機能的変異体を指す。
【００５７】
「核酸」という用語は、直鎖状又は環状構造、かつ１本鎖又は２本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的上、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類縁体、並びに、その塩基、糖、及び／又はリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含できる。概して、特定のヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類縁体は、Ｔ又はＴの類縁体と塩基対合することになる。
【００５８】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」というという用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す目的で、同義的に用いる。
【００５９】
「上流」及び「下流」という用語は、一定の位置に対する核酸配列での位置を指す。本明細書で使用する場合、「上流」は、遺伝子の転写開始部位の５’末端側の位置を指し、負数（例えば−１００ｂｐ、−５００ｂｐなど）で表され、「下流」は、遺伝子の転写開始部位の３’末端側の位置を指し、正数（例えば＋１００ｂｐ、＋５００ｂｐなど）で表される。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、特許請求する発明を限定ではなく、例示するために含まれている。
【００６１】
実施例１．ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質は、Ｏｃｔ４遺伝子と関連するヒストンをアセチル化した。
ヒトＯＣＴ４遺伝子の転写開始部位に近い特定の配列を標的とするように、融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質は、ジンクフィンガー（ＺＦ）ＤＮＡ結合ドメイン及びヒトｐ３００ＨＡＴドメインを含んでいた。ＺＦ結合ドメインは、ＯＣＴ４の転写開始部位から＋１８１下流のヌクレオチドから始まる５’−ＧＧＡＧＧＧｃＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号１）という特定の配列に結合するように設計した。このＺＦ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）という、は、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＮＤＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＡＫＷＮＬＤＡＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＡＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＨＬＳＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号２）。ＨＡＴドメインは、ヒトｐ３００（登録番号：ＮＭ＿００１４２９）のアミノ酸１２８４〜１６７３に相当した。
【００６２】
融合タンパク質ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００をコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ネガティブコントロール細胞には、ＧＦＰ又はｐ３００ＨＡＴドメイン（ＺＦは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の酪酸ナトリウム（Ｎａｂｕｔ）で処理した細胞をポジティブコントロールとして用いた。Ｏｃｔ４プロモーター部位におけるヒストンＨ３Ｌｙｓ１８（Ｈ３Ｋ１８）及びヒストンＨ３Ｌｙｓ２７（Ｈ３Ｋ２７）のヒストンアセチル化を分析し、トランスフェクション／処理後４８時間に比較を行った。Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用説明に従って、細胞をクロスリンクし、クロマチンを超音波処理した。ＣｈＩＰ法で用いた抗体はα−Ｈ３Ｋ１８ａｃ及びα−Ｈ３Ｋ２７ａｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ）であった。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによって定量ＰＣＲを行った。コントロールの「ＺＦ標的部位」に特異的なプライマーは５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号４）であり、「ＺＦ標的部位＋２００ｂｐ」（すなわちｏｃｔ４＋１８１）に特異的なプライマーは５’−ＣＧＧＣＴＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号５）及び５’−ＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧ’３’（配列番号６）であった。図１は、融合タンパク質ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００が、Ｈ３Ｋ１８及びＨ３Ｋ２７の両方のアセチル化を増大させたことを示している。
【００６３】
実施例２．ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００融合タンパク質は、Ｏｃｔ４の発現を増大させた。
ＯＣＴ４の転写開始部位から−７２０又は−６１５上流のヌクレオチドに位置する配列を標的とするさらなるＺＦ−ｐ３００融合タンパク質を設計した：ＺＦ（Ｏｃｔ４−７２０）−ｐ３００及びＺＦ（Ｏｃｔ４−６１５）−ｐ３００。ポジティブコントロールとして用いるために、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５を含む第２の組のコントロール融合タンパク質も構築した：ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ６５及びＺＦ（Ｏｃｔ４−７２０）−ｐ６５。
【００６４】
ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００又は上記のコントロール融合タンパク質の１つをコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。コントロール細胞には、ＧＦＰ、ｐ６５（ＺＦは含まない）、又はｐ３００（ＺＦは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。４８時間後に、細胞を回収し、全ＲＮＡを単離した。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（カリフォルニア州カールスバッドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、ＯＣＴ４のｍＲＮＡ及び内在性コントロールシクロフィリンＡ（すなわちＰＰＩＡ）のｍＲＮＡのレベルを測定した。ＯＣＴ４の発現を正規化するのに、ＯＣＴ４／ｃｙｃ比を用いた。図２に示されているように、ＺＦ（Ｏｃｔ４＋１８１）−ｐ３００融合タンパク質も、ＯＣＴ４の発現を２５倍超増大させた。すなわち、ＯＣＴ４遺伝子と関連するヒストンのアセチル化の増大によって、ＯＣＴ４の転写が増大した。
【００６５】
実施例３：ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ３００融合タンパク質は、ＰＥＤＦの発現を増大させた。
ｐ３００ＨＡＴドメインを含むＺＦ融合タンパク質が、他の遺伝子を活性化できるか調べるために、ヒトＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）遺伝子を標的とするように、ＺＦ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体を設計した。ＰＥＤＦをコードする配列の転写開始部位から−９２上流のヌクレオチドから始まる特定の配列５’−ＧＧＡＴＧＧｔＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号７）に結合するように、ＺＦ結合ドメインを設計した。このＺＦ（ＰＥＤＦ）ＤＮＡ結合ドメインはＺＦ６９６１といい、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＧＱＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＨＬＳＲＨＴＫＩＨＴＧＧＧＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＱＳＡＴＲＩＴＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号８）。ＺＦ（ＰＥＤＦ）ＤＮＡ結合ドメインをｐ３００ＨＡＴドメイン又はＮＦ−κＢサブユニットｐ６５のいずれかに結合させた。
【００６６】
ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ３００又はＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ６５をコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。コントロール細胞には、ＧＦＰ、ｐ６５（ＺＦは含まない）、又はｐ３００（ＺＦは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。７２時間後に全ＲＮＡを単離し、ＰＥＤＦのｍＲＮＡ及び内在性コントロールシクロフィリンＡのｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＰＥＤＦの発現を正規化するのに、ＰＥＤＦ／ｃｙｃ比を用いた。結果は図３に示されている。融合タンパク質ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ３００は、ＰＥＤＦの発現を約２．５倍超増大させた。
【００６７】
実施例４：ＺＦ（ＰＥＤＦ）−ＧＣＮ５は、ＰＥＤＦの発現に影響を及ぼさなかった。
別のヒストンアセチルトランスフェラーゼのＨＡＴドメインがｐ３００の代わりになり得るかを決定するために、ＧＣＮ５のＨＡＴドメインを含む融合タンパク質の組を構築した。このＨＡＴドメインは、ヒトＧＣＮ５（登録番号：ＮＭ＿０２１０７８）のアミノ酸４９１〜６６２に相当した。ＣＧＮ５のＨＡＴドメインをＺＦ（ＰＥＤＦ）に結合して、ＺＦ−ＧＣＮ５を作製するか、又はＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ６５に結合してＧＣＮ５−ＺＦ−ｐ６５を作製するかのいずれかを行った。細胞に、ＺＦ−ｐ６５（すなわちＺＦ（ＰＥＤＦ）−ｐ６５）、ＺＦ−ＧＣＮ５）、又はＧＣＮ５−ＺＦ−ｐ６５を発現するベクターをトランスフェクションした。コントロール細胞には、ｐ６５（ＺＦは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。７２時間後に全ＲＮＡを単離し、ＰＥＤＦのｍＲＮＡ及び内在性コントロールシクロフィリンＡのｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＰＥＤＦの発現を正規化するのにＰＥＤＦ／ｃｙｃ比を用いた。図４に示されているように、ＺＦ−ＧＣＮ５は、ＰＥＤＦの発現を活性化しなかった。実際、ＺＦ−ｐ６５による活性化は、ＧＣＮ５との融合により弱まった。
【００６８】
実施例５：ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質を最適化するためのスクリーニング
ＯＣＴ４の転写開始部位周辺の配列を体系的に標的とするように、一連のＺＦ−ｐ３００融合タンパク質を設計した。ヒトＯＣＴ４遺伝子の転写開始部位から約−２．５ｋｂ上流〜約＋１．５ｋｂ下流に位置する配列を標的とするように、標準的な手順を用いてＺＦドメインを設計及び構築した。各ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合体をコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ネガティブコントロール細胞には、ＧＦＰ又はｐ３００ＨＡＴドメイン（ＺＦドメインは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞の各集団において、ＯＣＴ４のｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定し、本質的に上記の実施例２に説明されているように、ＯＣＴ４の発現をシクロフィリンＡの発現に対して正規化した。
【００６９】
ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質の各々によって誘導されたＯＣＴ４の発現のレベルは、図５に示されている。ＯＣＴ４の発現を約２０倍超増大させた融合タンパク質は、転写開始部位の約−１００ｂｐ〜約＋５００ｂｐに位置する配列を標的とするように設計した。
【００７０】
実施例６：ＺＦ（Ｏｃｔ４）−ｐ３００融合タンパク質は、複数の細胞種において、Ｏｃｔ４の発現を活性化し、Ｏｃｔ４と関連するヒストンをアセチル化した。
実施例５で、ＯＣＴ４の発現を活性化することが確認された２つの融合タンパク質を他の細胞種で調べた。このタンパク質は：ＺＦ（Ｏｃｔ４＋２８６）−ｐ３００及びＺＦ（Ｏｃｔ４＋４２０）−ｐ３００であった。ＺＦ（Ｏｃｔ４＋２８６）−ｐ３００のＤＮＡ結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＡＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＡＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＳＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＮＲＤＲＩＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号９）。ＺＦ（Ｏｃｔ４＋４２０）−ｐ３００のＤＮＡ結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＨＬＳＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＨＬＳＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＮＬＡＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号１０）。
【００７１】
ＨＥＫ２９３細胞及びＫ５６２細胞に、それぞれの融合タンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクションし、上に詳述されているように、ＯＣＴ４の発現を測定した。図６に示されているように、両方の融合タンパク質とも、ＨＥＫ２９３細胞においてＯＣＴ４の発現を少なくとも９０倍増大させ、Ｋ５６２細胞においてＯＣＴ４の発現を少なくとも２０倍増大させた。
【００７２】
両方の細胞種において、ＯＣＴ４の転写開始部位のいずれかの側の別個の領域におけるＨ３Ｋ２７のヒストンのアセチル化をＣｈＩＰによって分析した。上記の実施例１に記載されているように、トランスフェクション後４８時間に細胞を回収し、クロスリンクし、クロマチンを超音波処理した。特定の領域（例えば−１７００ｂｐ、−５００ｂｐ、−１００ｂｐ、＋３００ｂｐ、＋７００ｂｐ、＋１５００ｂｐ、＋３０００ｂｐ、及び＋４５００ｂｐ）を増幅するためのプライマー対を用いて、定量ＰＣＲをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによって行った。ＣｈＩＰで用いた抗体はα−Ｈ３Ｋ２７ａｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｂｃａｍ）であった。
【００７３】
図７に示されているように、ＺＦ（Ｏｃｔ４＋２８６）−ｐ３００及びＺＦ（Ｏｃｔ４＋４２０）−ｐ３００は、ＨＥＫ２９３細胞では、ＯＣＴ４の転写開始部位から約−１７００ｂｐ〜約＋３０００ｂｐの位置で、Ｋ５６２細胞では、ＯＣＴ４の転写開始部位から約−１００ｂｐ〜約＋９００ｂｐの位置で、Ｈ３Ｋ２７をアセチル化した。従って、ＯＣＴ４の開始部位周辺のＨ３Ｋ２７のアセチル化の増大は、遺伝子の転写増大と関連していた。
【００７４】
実施例７：ＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合タンパク質を同定するためのスクリーニング
ＳＯＸ２の転写開始部位周辺の配列を体系的に標的とするように、一連のＺＦ−ｐ３００融合タンパク質を設計した。ヒトＳＯＸ２遺伝子の転写開始部位から約−５００ｂｐ上流〜約＋１５００ｂｐ下流に位置する配列を標的とするように、標準的な手順を用いて、ＺＦドメインを設計及び構築した。各ＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合体をコードする発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ネガティブコントロール細胞には、ＧＦＰ又はｐ３００ＨＡＴドメイン（ＺＦドメインは含まない）をコードするベクターをトランスフェクションした。ＳＯＸ２のｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定し、トランスフェクションした細胞の各組において、ＳＯＸ２の発現をシクロフィリンＡの発現に対して正規化した。
【００７５】
ＺＦ（Ｓｏｘ２）−ｐ３００融合タンパク質の各々によって誘導されたＳＯＸ２の発現のレベルは、図８に示されている。ＳＯＸ２の発現を最も増大させた融合タンパク質は、転写開始部位から約−１００ｂｐ〜約＋５００ｂｐに位置する配列を標的とするように設計されていた。
【００７６】
ＳＯＸ２の発現を活性化した２つの融合タンパク質を他の細胞種で調べた。これらのタンパク質は：ＺＦ（Ｓｏｘ２＋１８５）−ｐ３００及びＺＦ（Ｓｏｘ２＋ｒ４７５）−ｐ３００（「ｒ」は逆鎖を示す）であった。ＺＦ（Ｓｏｘ２＋１８５）−ｐ３００のＤＮＡ結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＤＬＳＫＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＮＤＤＲＫＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号１１）。ＺＦ（Ｓｏｘ２＋ｒ４７５）−ｐ３００のＤＮＡ結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有していた：ＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＡＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＤＲＫＴＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＨＷＹＬＫＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤＡＡＲ（配列番号１２）。
【００７７】
ＨＥＫ２９３細胞及びＫ５６２細胞に、各融合タンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクションし、上に詳述されているように、ＳＯＸ２の発現を測定した。図９に示されているように、両方の融合タンパク質とも、ＨＥＫ２９３細胞ではＳＯＸ２の発現を少なくとも１．５倍増大させ、Ｋ５６２細胞では、ＳＯＸ２の発現を２倍近く又はそれ以上増大させた。
【図１】
0006309461.tif 000002
【図２】
0006309461.tif 000003
【図３】
0006309461.tif 000004
【図４】
0006309461.tif 000005
【図５】
0006309461.tif 000006
【図６Ａ】
0006309461.tif 000007
【図６Ｂ】
0006309461.tif 000008
【図７Ａ】
0006309461.tif 000009
【図７Ｂ】
0006309461.tif 000010
【図８】
0006309461.tif 000011
【図９Ａ】
0006309461.tif 000012
【図９Ｂ】
0006309461.tif 000013
【配列表】
0006309461000001.app