(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記シード領域が、５’−ＵＣＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号７）であり、前記オリゴヌクレオチドが、１６ヌクレオチドからなり、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドを含み、ここで、
ａ．１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、５、６、９、１０、１１、１３、１５および１６位がＬＮＡであるか、または
ｂ．１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、２、６、８、１０、１１、１３、１５および１６位がＬＮＡである、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
３つ以下の連続ＬＮＡを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記非ロックトヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２’デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’キャップ構造および３’キャップ構造を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
１または複数のホスホロチオエート結合を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
親油性のペンダント基をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記１６マーが、ｍｉＲ−１４５のヌクレオチド配列と実質的にまたは完全に相補的である配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
対象における高血圧症を処置または防止する方法における使用のための請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記方法は、前記対象へと、前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記高血圧症が肺高血圧症であり、前記肺高血圧症が、特発性肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、遺伝性ＰＡＨもしくは家族性ＰＡＨ、または続発性肺高血圧症である、請求項８に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８００，７５５号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＭＩＲＧ  ４１  ０１ＷＯ  ＳｅｑＬｉｓｔ  ＳＴ２５．ｔｘｔ、保存日：２０１４年３月１３日、ファイルサイズ５キロバイト）。
【０００３】
本発明は一般に、ｍｉＲ−１４５阻害剤である化学的モチーフオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、対象へと投与されたときの効力、送達の効率、標的特異性、安定性および／または毒性において、有利でありうる。オリゴヌクレオチドは、それを必要とする対象の細胞内のｍｉＲ−１４５の発現または活性を阻害することにより、状態を処置および防止するために使用することができる。提供される方法は、それを必要とする対象における肺動脈高血圧症、高血圧症、新生内膜形成または再狭窄を、対象へとｍｉＲ−１４５の発現または活性の阻害剤を投与することにより、処置または防止するステップを含む。
【背景技術】
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）とは、特異的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）をターゲティングし、それらの分解または翻訳の抑制を誘導することにより、遺伝子発現を負に調節することが可能な、小型で内因性の非コードＲＮＡのクラスである（Ambros、２００４年；Bartel、２００９年）。近年の研究は、ｍＲＮＡの分解を、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ標的の主要な機構的効果と規定している（Guoら、２０１０年）。近年の複数の研究は、血管炎症および血管病態の発症におけるｍｉＲＮＡの直接的役割について評価している（KarthaおよびSubramanian、２０１０年；Urbichら、２００８年）。
【０００５】
ｍｉＲ−１４５は、血管壁内で多量に発現することが示された（Chengら、２００９年）。ｍｉＲ−１４５は、ヒト第５染色体（Lioら、２０１０年）上およびマウス第１８染色体上のｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の両方をコードする、長鎖ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写され、保存的ＳＲＦ（血清応答因子）結合性部位により調節される（Xinら、２００９年）。血管壁へのｍｉＲ−１４５の局在化は、外膜の線維芽細胞および内皮細胞と比較して、平滑筋層内の高度な発現を裏付けた（Chengら、２００９年）。この理由で、ｍｉＲ−１４５は、平滑筋細胞の表現型マーカーであり、平滑筋細胞（ＳＭＣ：ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）の成熟および増殖を調節し、その標的遺伝子ＫＬＦ−５およびその下流のシグナル伝達分子であるミオカルディンを介して、血管新生内膜の病変形成を調節することが可能な、モジュレーターであると考えられている（Chengら、２００９年；Eliaら、２００９年）。
【０００６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリー内のアゴニストは、Ｓｍａｄ依存性経路を介して、ｍｉＲ−１４３／１４５クラスターを活性化させることが示されている（Davis-Dusenberyら、２０１１年；Longら、２０１１年）。さらに、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、およびｍｉＲ−１４３／１４５ノックアウト（ｋｏ：ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ；−／−）マウスについての解析は、アクチンフィラメントの破壊により誘導されるＳＭＣサイズの低減に起因して、大動脈および他の末梢動脈の著しく薄い平滑筋層を示した（Eliaら、２００９年）。これは、ｍｉＲ−１４５−／−マウスにおいて、中等度の全身性低血圧および損傷に応答した新生内膜形成の非存在をもたらす（Xinら、２００９年）。さらに、単一ｋｏ動物および二重ｋｏ動物から単離された血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）は、過剰増殖活性と、ＶＳＭＣの公知の化学誘引物質である、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）へと移動する能力の増大とを示した（Eliaら、２００９年；Xinら、２００９年）。さらに、ｍｉＲ−１４３（１４５）ｋｏマウスの血管系についての薬理学的解析は、血管収縮性の刺激に対する応答の鈍化を明らかにした（Eliaら、２００９年；Xinら、２００９年）。まとめると、これらの知見は、ｍｉＲ−１４５  ｋｏマウスおよびｍｉＲ−１４３／１４５二重ｋｏマウスにおける、ＶＳＭＣの脱分化表現型を示す。
【０００７】
ｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５形態および成熟形態はまた、ＢＭＰＲ２遺伝子内に突然変異を伴う肺動脈高血圧症（ＰＡＨ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）患者から得られた肺組織内および単離肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）内でも、対照と比較して高量である。ＰＡＨの全ての形態に共通する、主要な組織病理学的特色のうちの１つは、末梢肺動脈内で平滑筋特異的α−アクチン（ＳＭＡ：ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  α−ａｃｔｉｎ）を発現させる細胞の蓄積である。これは、新生内膜内のＳＭＡ陽性細胞の出現と、通常は平滑筋を欠く、毛細血管前の肺細動脈への、ＳＭＡ陽性細胞の拡大とを含む（Mandegarら、２００４年）。このＰＡ（肺動脈）の遠位部分の筋肉化の一因となる細胞過程は明らかではないが、これらの観察は、ＰＡＨの発症における、ＰＡＳＭＣの中心的な役割を示唆する。
したがって、血管リモデリングにおける役割を伴うｍｉＲ−１４５は、新生内膜形成、再狭窄、高血圧症、全身性高血圧症およびＰＡＨなどにおける、異常な平滑筋細胞の増殖と関連する状態に有効な処置を開発するための治療標的を表す。しかし、ｍｉＲ−１４５をターゲティングするアンチセンスベースの治療剤の送達は、複数の難題を提起しうる。ｍｉＲ−１４５に対する結合アフィニティーおよび結合特異性、細胞内の取込みの効率、ならびにヌクレアーゼ耐性は全て、オリゴヌクレオチドベースの治療剤の送達および活性における因子である。例えば、オリゴヌクレオチドは、無傷細胞へと導入されると、ヌクレアーゼにより攻撃および分解され、活性の喪失がもたらされることが典型的である。したがって、有用なアンチセンス治療剤は、細胞外および細胞内のヌクレアーゼに対する耐性が大きいほか、細胞膜を透過することも可能であるべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍｂｒｏｓ  Ｖ．  Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏｒｎａｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００４；４３１：３５０−３５５
【非特許文献２】Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ．  Ｍｉｃｒｏｒｎａｓ：  Ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｃｅｌｌ．  ２００９；１３６：２１５−２３３
【非特許文献３】Ｇｕｏ  Ｈ，  Ｉｎｇｏｌｉａ  ＮＴ，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，  Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ．  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｒｎａｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ａｃｔ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｒｎａ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１０；４６６：８３５−８４０
【非特許文献４】Ｋａｒｔｈａ  ＲＶ，  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｓ．  Ｍｉｃｒｏｒｎａｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  ２０１０；３：２５６−２７０
【非特許文献５】Ｕｒｂｉｃｈ  Ｃ，  Ｋｕｅｈｂａｃｈｅｒ  Ａ，  Ｄｉｍｍｅｌｅｒ  Ｓ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｒｎａｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００８；７９：５８１−５８８
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｙａｎｇ  Ｊ，  Ｌｉｎ  Ｙ，  Ｘｕ  ＤＺ，  Ｌｕ  Ｑ，  Ｄｅｉｔｃｈ  ＥＡ，  Ｈｕｏ  Ｙ，  Ｄｅｌｐｈｉｎ  ＥＳ，  Ｚｈａｎｇ  Ｃ．  Ｍｉｃｒｏｒｎａ−１４５，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ，  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｌｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００９；１０５：１５８−１６６
【非特許文献７】Ｌｉｏ  Ａ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｙ，  Ｈｉｒａｔａ  Ｉ，  Ｎａｏｅ  Ｔ，  Ａｋａｏ  Ｙ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｅｍｂｒａｃｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｒｎａ−１４３／１４５  ｃｌｕｓｔｅｒ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１０；９：１３６
【非特許文献８】Ｘｉｎ  Ｍ，  Ｓｍａｌｌ  ＥＭ，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＬＢ，  Ｑｉ  Ｘ，  ＭｃＡｎａｌｌｙ  Ｊ，  Ｐｌａｔｏ  ＣＦ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＡ，  Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  Ｒ，  Ｏｌｓｏｎ  ＥＮ．  Ｍｉｃｒｏｒｎａｓ  ｍｉｒ−１４３  ａｎｄ  ｍｉｒ−１４５  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００９；２３：２１６６−２１７８
【非特許文献９】Ｅｌｉａ  Ｌ，  Ｑｕｉｎｔａｖａｌｌｅ  Ｍ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｃｏｎｔｕ  Ｒ，  Ｃｏｓｓｕ  Ｌ，  Ｌａｔｒｏｎｉｃｏ  ＭＶ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＫＬ，  Ｉｎｄｏｌｆｉ  Ｃ，  Ｃａｔａｌｕｃｃｉ  Ｄ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ  ＳＡ，  Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ  Ｇ．  Ｔｈｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｆ  ｍｉｒ−１４３  ａｎｄ  −１４５  ａｌｔｅｒｓ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２００９；１６：１５９０−１５９８
【非特許文献１０】Ｄａｖｉｓ−Ｄｕｓｅｎｂｅｒｙ  ＢＮ，  Ｃｈａｎ  ＭＣ，  Ｒｅｎｏ  ＫＥ，  Ｗｅｉｓｍａｎ  ＡＳ，  Ｌａｙｎｅ  ＭＤ，  Ｌａｇｎａ  Ｇ，  Ｈａｔａ  Ａ．  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｌｆ４  ｂｙ  ｍｉｒ−１４３／１４５  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｔｇｆ−｛ｂｅｔａ｝  ａｎｄ  ｂｍｐ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１；  ２８６：２８０９７−１１０
【非特許文献１１】Ｌｏｎｇ  Ｘ，  Ｍｉａｎｏ  ＪＭ．  Ｔｇｆ｛ｂｅｔａ｝１  ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｒｎａ  １４３／１４５  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１；  ２８６，  ３０１１９−３０１２９
【非特許文献１２】Ｍａｎｄｅｇａｒ  Ｍ，  Ｆｕｎｇ  ＹＣ，  Ｈｕａｎｇ  Ｗ，  Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ  ＣＶ，  Ｒｕｂｉｎ  ＬＪ，  Ｙｕａｎ  ＪＸ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ：  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００４；６８：７５−１０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、安定的で有効なオリゴヌクレオチドベースのｍｉＲ−１４５阻害剤のための化学修飾の改善が必要とされている。本発明は、この必要を満たし、また、関連する利点ももたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は部分的に、特異的な化学的パターンまたは化学的モチーフを伴う、ｍｉＲ−１４５に対するアンチセンスなどのｍｉＲ−１４５をターゲティングするオリゴヌクレオチドが、対象へと投与されたときの効力、送達の効率、標的特異性、安定性および／または毒性プロファイルの改善を増大させたという発見に基づく。本明細書では、ｍｉＲ−１４５に対するアンチセンスまたはｍｉＲ−１４５のａｎｔｉｍｉＲ（すなわち、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５）の送達、安定性、効力、特異性および／または毒性プロファイルを改善する潜在的可能性を伴う、特異的な化学反応パターンまたは化学反応モチーフが提供される。ｍｉＲ−１４５に対するアンチセンスのための化学反応パターンまたは化学反応モチーフは、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５の送達、安定性、効力、特異性および／または毒性プロファイルを改善することが可能であり、このようにして、治療的文脈においてｍｉＲ−１４５機能を効果的にターゲティングする。したがって、本発明は、平滑筋組織と関連する疾患または状態など、ｍｉＲ−１４５の発現または活性と関連する様々な疾患を処置するための新規の治療剤を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、配列が、少なくとも３つのロックト核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含み、オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも４つ、５つ、または６つのＬＮＡを含む。
【００１２】
オリゴヌクレオチドは、同じ配列およびＬＮＡ組成ならびに異なるＬＮＡモチーフを含む第２のオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を増大させることが可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと比較して、肺における有効性を増大させる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させ、発現の増大のｐ値は、＜０．０５である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、組織内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させ、発現の増大のｐ値は、＜０．０５である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドで処置された細胞は、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現が、生理食塩水対照と比べて１．０倍超の倍数変化をし、倍数変化のｐ値は、＜０．０５である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドで処置された組織は、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現が、生理食塩水対照と比べて１．０倍超の倍数変化をし、倍数変化のｐ値は、＜０．０５である。発現の倍数変化は、少なくとも約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、または約１．５倍でありうる。ｍｉＲ−１４５標的遺伝子は、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、またはＳｎｅｄ１でありうる。
【００１４】
オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に含みうる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続ＬＮＡを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６マーを含み、１６マーは、１６ヌクレオチドからなる。１６マーは、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含みうる。いくつかの実施形態では、１６マーは、少なくとも９つのＬＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１６マーは、５’末端から３’末端へ、１６マーの１、５、６、９、１０、１１、１３、１５、および１６位；１、２、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位；１、５、６、８、１０、１１、１３、１４、および１６位；１、３、４、５、６、８、１０、１３、および１６位；１、３、４、７、８、１０、１２、１４、および１６位；１、２、６、７、１０、１１、１２、１４、および１６位；１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１６位；１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６位；または１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位においてＬＮＡを有する。１６マーは、ｍｉＲ−１４５のヌクレオチド配列と実質的に相補的でありうる。いくつかの実施形態では、１６マーは、ｍｉＲ−１４５と完全に相補的である。
【００１６】
オリゴヌクレオチドは、２’デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、非ロックトヌクレオチドの全ては、２’デオキシである。オリゴヌクレオチドはまた、２’から４’のメチレン架橋を伴う、少なくとも１つのＬＮＡも含みうる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’キャップ構造および３’キャップ構造を有する。
【００１７】
オリゴヌクレオチドはまた、１または複数のホスホロチオエート結合も含みうる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合されている。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜３カ所のリン酸結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親油性のペンダント基を含む。オリゴヌクレオチドは、約１５〜５０ヌクレオチドの長さでありうる。
【００１８】
本発明の別の態様は、有効量の、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物である。薬学的に許容される担体は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含みうる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、生理食塩水から本質的になる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを使用するための方法を提供する。一実施形態では、細胞内のｍｉＲ−１４５の活性を低減または阻害するための方法であって、細胞を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法が提示される。いくつかの実施形態では、細胞は、平滑筋細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、肺細胞または心臓細胞である。また、平滑筋細胞の増殖を阻害ための方法であって、平滑筋細胞を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法も提供される。細胞は、哺乳動物細胞でありうる。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の場合もあり、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の場合もある。
【００２０】
本発明はまた、対象における肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を防止または処置するための方法であって、対象へと、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法も提供する。ＰＡＨは、特発性肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、遺伝性ＰＡＨもしくは家族性ＰＡＨ、または続発性肺高血圧症でありうる。続発性肺高血圧症は、肺塞栓、気腫、肺線維症、または先天性心疾患に由来しうる。対象は、骨形成タンパク質２型受容体をコードする遺伝子内に突然変異を有しうる。いくつかの実施形態では、対象は、肺高血圧症または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を伴うか、またはこれらを発症する危険性があると診断されている。対象は、ヒトなどの哺乳動物でありうる。
【００２１】
本発明はまた、対象における再狭窄または新生内膜形成を阻害または処置するための方法であって、対象へと、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法も提供する。本明細書ではまた、対象における高血圧症を処置または防止するための方法であって、対象へと、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法も提示される。いくつかの実施形態では、高血圧症は、全身高血圧症である。対象は、ヒトなどの哺乳動物でありうる。
【００２２】
医薬組成物は、対象へと、皮下、静脈内、動脈内、鼻腔内、経口を含む多様な経路を介して投与することもでき、肺内経路を介して（例えば、鼻腔または口腔による吸入を介して）投与することもできる。いくつかの実施形態では、新生内膜形成または再狭窄を阻害、防止、または処置することなどのために、医薬組成物を、非経口投与または心臓組織への直接注射により投与する。他の実施形態では、ＰＡＨを処置または防止することなどのために、医薬組成物を、非経口投与または肺組織への直接注射により投与する。一実施形態では、医薬組成物を、肺内送達デバイスを介して、吸入経路により投与する。このような実施形態では、医薬組成物を、乾燥粉末または液体エアゾールとして製剤化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、非経口投与により投与して、高血圧症を処置または防止する。
【００２３】
本発明の別の態様は、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドと、投与デバイスとを含むキットである。一実施形態では、キットは、肺動脈高血圧症の処置または防止のためのキットである。投与デバイスは、吸入器、ネブライザー、粉体噴霧器、点滴器、およびエアゾール噴霧器など、肺内送達のためにデザインすることができる。他の実施形態では、投与デバイスは、カテーテルなど、静脈内送達または動脈内送達のためにデザインすることができる。医薬組成物は、任意選択で、製剤化して、投与デバイス内で保管することができる。キットは、ＰＡＨを処置もしくは防止すること、再狭窄もしくは新生内膜形成を阻害または処置すること、または高血圧症を処置もしくは防止することなどのために、医薬組成物を、対象（例えば、ヒト）へと投与するための指示書をさらに含みうる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記シード領域が、５’−ＵＣＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号７）であり、前記配列が、少なくとも３つのロックト核酸（ＬＮＡ）を含み、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドを含み、同じ配列およびＬＮＡ組成ならびに異なるＬＮＡモチーフを含む第２のオリゴヌクレオチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を増大させるオリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記第２のオリゴヌクレオチドと比較して、肺における有効性を増大させる、項目１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３）
５’末端にＬＮＡを含む、項目１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目４）
３’末端にＬＮＡを含む、項目１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目５）
３つ以下の連続ＬＮＡを含む、項目１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６）
前記配列が、少なくとも４つのロックト核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目７）
前記配列が、少なくとも５つのロックト核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１から６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目８）
前記配列が、少なくとも６つのロックト核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドが、１６マーを含み、前記１６マーが、１６ヌクレオチドからなり、前記１６マーが、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な前記配列を含む、項目１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
前記１６マーが、少なくとも９つのＬＮＡを含む、項目９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、５、６、９、１０、１１、１３、１５、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、２、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１３）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、５、６、８、１０、１１、１３、１４、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１４）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、３、４、５、６、８、１０、１３、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１５）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、３、４、７、８、１０、１２、１４、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１６）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、２、６、７、１０、１１、１２、１４、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１７）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１８）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１９）
前記１６マーの５’末端から３’末端へ、前記１６マーの１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位が、ＬＮＡである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２０）
前記非ロックトヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２’デオキシである、項目１から１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２１）
前記非ロックトヌクレオチドの全てが、２’デオキシである、項目２０に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２２）
少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドが、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである、項目１から１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２３）
少なくとも１つのＬＮＡが、２’から４’のメチレン架橋を有する、項目１から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）
５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’キャップ構造および３’キャップ構造を有する、項目１から２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２５）
１または複数のホスホロチオエート結合を含む、項目１から２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６）
完全にホスホロチオエート結合された、項目２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２７）
１〜３カ所のリン酸結合を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２８）
親油性のペンダント基をさらに含む、項目１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２９）
約１５〜５０ヌクレオチドの長さである、項目１から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３０）
ｍｉＲＮＡ阻害剤である、項目１から２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３１）
前記１６マーが、ｍｉＲ−１４５のヌクレオチド配列と実質的に相補的である、項目９から３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３２）
前記１６マーが、ｍｉＲ−１４５と完全に相補的である、項目３１に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３３）
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、細胞内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させ、発現の前記増大のｐ値が、０．０５より小さい、項目１から３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３４）
前記オリゴヌクレオチドで処置された細胞は、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現が、生理食塩水対照と比べて１．０倍超の倍数変化をし、前記倍数変化のｐ値が、０．０５より小さい、項目１から３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３５）
発現の前記倍数変化が、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５倍である、項目３３から３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３６）
前記ｍｉＲ−１４５標的遺伝子が、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、またはＳｎｅｄ１である、項目３３から３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３７）
有効量の、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
（項目３８）
前記薬学的に許容される担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、項目３７に記載の医薬組成物。
（項目３９）
前記薬学的に許容される担体または希釈剤が、生理食塩水から本質的になる、項目３７に記載の医薬組成物。
（項目４０）
細胞内のｍｉＲ−１４５の活性を低減または阻害する方法であって、前記細胞を、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
（項目４１）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞が、平滑筋細胞である、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞が、肺細胞または心臓細胞である、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞である、項目４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、平滑筋細胞を、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
（項目４６）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞が、肺細胞または心臓細胞である、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞である、項目４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
対象における肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を防止または処置する方法であって、前記対象へと、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目５０）
前記肺高血圧症が、特発性肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、遺伝性ＰＡＨもしくは家族性ＰＡＨ、または続発性肺高血圧症である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記続発性肺高血圧症が、肺塞栓、気腫、肺線維症、または先天性心疾患に由来する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記対象が、哺乳動物である、項目４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ヒトが、骨形成タンパク質２型受容体をコードする遺伝子内に突然変異を有する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記医薬組成物を、非経口投与または肺組織への直接注射により投与する、項目４９から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記医薬組成物を、前記対象へと、吸入投与経路により投与する、項目４９から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記医薬組成物を、乾燥粉末として製剤化する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記医薬組成物を、液体エアゾールとして製剤化する、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
対象における再狭窄または新生内膜形成を阻害または処置する方法であって、前記対象へと、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目６０）
前記対象が、哺乳動物である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記医薬組成物を、非経口投与または心臓組織への直接注射により投与する、項目５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、項目５５または６２に記載の方法。
（項目６４）
前記医薬組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与する、項目４９から５４または５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記オリゴヌクレオチドを、２５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で送達する、項目４９から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
対象における高血圧症を処置または防止する方法であって、前記対象へと、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
（項目６８）
前記対象が、哺乳動物である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記医薬組成物を、非経口投与により投与する、項目６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記医薬組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与する、項目６７から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記オリゴヌクレオチドを、２５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の用量で送達する、項目６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する、項目６７に記載の方法。
（項目７５）
肺動脈高血圧症の処置または防止のためのキットであって、項目１から３６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、投与デバイスとを含むキット。
（項目７６）
前記オリゴヌクレオチドが、前記投与デバイス内に含有された粉末として製剤化された、項目７５に記載のキット。
（項目７７）
前記オリゴヌクレオチドが、前記投与デバイス内に含有された液体エアゾールとして製剤化された、項目７５に記載のキット。
（項目７８）
前記投与デバイスが、吸入器である、項目７５から７７のいずれか一項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１は、４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与による、表１からのａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物を注射したことを示す図である。組織は、注射の４８時間後に回収した。表示の、（Ａ）Ｋｌｆ４、（Ｂ）Ｋｌｆ５、（Ｃ）Ｌｒｒｃ７１、（Ｄ）Ｎｅｄｄ４ｌ、（Ｅ）Ｉｇｆ１ｒ、（Ｆ）Ｓｅｃ１４１２、（Ｇ）Ｍｅｇｆ６、（Ｈ）Ｆｍｏｄ、（Ｉ）Ａｎｋｒｄ１２、（Ｊ）Ｇｏｌｇａ１、（Ｋ）Ｇｐｂｐ１、（Ｌ）Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、（Ｍ）Ｒａｐｇｅｆ２、および（Ｎ）Ｓｎｅｄ１のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。
【図１−２】図１は、４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与による、表１からのａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物を注射したことを示す図である。組織は、注射の４８時間後に回収した。表示の、（Ａ）Ｋｌｆ４、（Ｂ）Ｋｌｆ５、（Ｃ）Ｌｒｒｃ７１、（Ｄ）Ｎｅｄｄ４ｌ、（Ｅ）Ｉｇｆ１ｒ、（Ｆ）Ｓｅｃ１４１２、（Ｇ）Ｍｅｇｆ６、（Ｈ）Ｆｍｏｄ、（Ｉ）Ａｎｋｒｄ１２、（Ｊ）Ｇｏｌｇａ１、（Ｋ）Ｇｐｂｐ１、（Ｌ）Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、（Ｍ）Ｒａｐｇｅｆ２、および（Ｎ）Ｓｎｅｄ１のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。
【図１−３】図１は、４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与による、表１からのａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物を注射したことを示す図である。組織は、注射の４８時間後に回収した。表示の、（Ａ）Ｋｌｆ４、（Ｂ）Ｋｌｆ５、（Ｃ）Ｌｒｒｃ７１、（Ｄ）Ｎｅｄｄ４ｌ、（Ｅ）Ｉｇｆ１ｒ、（Ｆ）Ｓｅｃ１４１２、（Ｇ）Ｍｅｇｆ６、（Ｈ）Ｆｍｏｄ、（Ｉ）Ａｎｋｒｄ１２、（Ｊ）Ｇｏｌｇａ１、（Ｋ）Ｇｐｂｐ１、（Ｌ）Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、（Ｍ）Ｒａｐｇｅｆ２、および（Ｎ）Ｓｎｅｄ１のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。
【００２５】
【図２】図２は、９つのｍｉＲ−１４５遺伝子標的および抑制解除についての、生理食塩水と比べたそれらの倍数変化を表すレーダープロットである。Ｍ−１１３１８は、表示の９つの遺伝子全てについての累積倍数変化値を表す最大の面積を示す。Ｍ−１１３１９は、２番目に大きな面積である。黒線で示される、対照のオリゴヌクレオチドであるＭ−１０５９１は、活性の化合物と比較して小さな標的抑制解除活性を示す。
【００２６】
【図３】図３は、Ｍ−１１３１８で処置された肺の全ＲＮＡおよび生理食塩水で処置された肺の全ＲＮＡを、マイクロアレイプロファイリングによる全ゲノムプロファイリングにかけたことを示す図である。Ｍ−１１３１８で処置された肺の全ＲＮＡを、生理食塩水で処置された全ＲＮＡと比較すると、ｍｉＲ−１４５シード含有遺伝子は、上方調節された遺伝子署名が強化される（示差的発現についてのｐ値＜０．０１）。強化についてのｐ値は、超幾何分布関数を使用して計算した。この結果は、Ｍ−１１３１８が、ｍｉＲ−１４５に特異的な、遺伝子標的の抑制解除を誘発することを指し示す。
【００２７】
【図４】図４は、４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、５、１０、または２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与によるＭ−１１３１８を注射したことを示す図である。組織は、注射の４８時間後に回収した。表示のｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムＰＣＲの結果は、ＫＬＦ５標的の抑制解除が、Ｍ−１１３１８による処置に対して用量反応性であることを示唆する。
【００２８】
【図５】図５は、４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、５、１０、または２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与によるＭ−１１３１８またはＭ−１１３１９を注射したことを示す図である。組織は、注射の４８時間後に回収した。表示のｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムＰＣＲの結果は、Ｎｅｄｄ４ｌ標的の抑制解除が、Ｍ−１１３１８およびＭ−１１３１９による処置に対して用量反応性であることを示唆する。
【００２９】
【図６−１】図６（Ａ）は、１６週齢の本態性高血圧ラット（ＳＨＲ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔ）を、ａｎｔｉｍｉＲの、毎週４回、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与にかけたことを示す図である。１８週間後、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ：Ｌ−ＮＧ−Ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）を、飲用水（５０ｍｇ／Ｌ）により投与し、２週間にわたり不断に施して、パルス波速度（ＰＷＶ）の測定における治療域を創出した。ラットが２０週齢となる研究の終了時に、終点パルス波速度、ベータ指数、および血圧を測定した。ＡＣＥ阻害剤であるペリンドプリルを、高血圧症の１つの標準治療についての基準として、研究に組み入れた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５（Ｍ−１０９３４）は、パルス波速度（Ｂ）、ベータ指数（Ｃ）、および平均全身血圧（Ｄ）の、統計学的に有意な低減を示した。他の２つの対照ａｎｔｉｍｉＲ（対照１および対照２）が、この用量およびレジメと同様の利益を示さなかったことは重要であり、これにより、この治療効果のマイクロＲＮＡに対する特異性が示される（Ｂ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の阻害が、ラットＳＨＲ／Ｌ−ＮＡＭＥによる高血圧症において、治療的利益を有することを裏付けた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、全身血圧および動脈硬化指数を低減した。
【図６−２】図６（Ａ）は、１６週齢の本態性高血圧ラット（ＳＨＲ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔ）を、ａｎｔｉｍｉＲの、毎週４回、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与にかけたことを示す図である。１８週間後、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ：Ｌ−ＮＧ−Ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）を、飲用水（５０ｍｇ／Ｌ）により投与し、２週間にわたり不断に施して、パルス波速度（ＰＷＶ）の測定における治療域を創出した。ラットが２０週齢となる研究の終了時に、終点パルス波速度、ベータ指数、および血圧を測定した。ＡＣＥ阻害剤であるペリンドプリルを、高血圧症の１つの標準治療についての基準として、研究に組み入れた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５（Ｍ−１０９３４）は、パルス波速度（Ｂ）、ベータ指数（Ｃ）、および平均全身血圧（Ｄ）の、統計学的に有意な低減を示した。他の２つの対照ａｎｔｉｍｉＲ（対照１および対照２）が、この用量およびレジメと同様の利益を示さなかったことは重要であり、これにより、この治療効果のマイクロＲＮＡに対する特異性が示される（Ｂ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の阻害が、ラットＳＨＲ／Ｌ−ＮＡＭＥによる高血圧症において、治療的利益を有することを裏付けた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、全身血圧および動脈硬化指数を低減した。
【図６−３】図６（Ａ）は、１６週齢の本態性高血圧ラット（ＳＨＲ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔ）を、ａｎｔｉｍｉＲの、毎週４回、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与にかけたことを示す図である。１８週間後、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ：Ｌ−ＮＧ−Ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ）を、飲用水（５０ｍｇ／Ｌ）により投与し、２週間にわたり不断に施して、パルス波速度（ＰＷＶ）の測定における治療域を創出した。ラットが２０週齢となる研究の終了時に、終点パルス波速度、ベータ指数、および血圧を測定した。ＡＣＥ阻害剤であるペリンドプリルを、高血圧症の１つの標準治療についての基準として、研究に組み入れた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５（Ｍ−１０９３４）は、パルス波速度（Ｂ）、ベータ指数（Ｃ）、および平均全身血圧（Ｄ）の、統計学的に有意な低減を示した。他の２つの対照ａｎｔｉｍｉＲ（対照１および対照２）が、この用量およびレジメと同様の利益を示さなかったことは重要であり、これにより、この治療効果のマイクロＲＮＡに対する特異性が示される（Ｂ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の阻害が、ラットＳＨＲ／Ｌ−ＮＡＭＥによる高血圧症において、治療的利益を有することを裏付けた。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、全身血圧および動脈硬化指数を低減した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は部分的に、ｍｉＲ−１４５をターゲティングするオリゴヌクレオチドの特異的な化学的パターンまたは化学的モチーフが、対象へと投与されたときの、オリゴヌクレオチドの効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性を改善しうることの発見に基づく。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５の発現または存在度を、特異的な様式で阻害することが可能である。特異的な化学的パターンまたは化学的モチーフを伴うオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列など、ｍｉＲ−１４５と相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５阻害剤またはａｎｔｉｍｉＲ−１４５でありうる。
【００３１】
ｍｉＲ−１４５は、マウス第１８染色体上およびヒト第５染色体上の遺伝子間領域内の、ｍｉＲ−１４３を伴うクラスター内に位置する。互いに対する相同性を有さないｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１４３は、単一の転写物として共転写される。ｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、成熟配列およびスター（すなわち、ミスマッチを含む）配列へとプロセシングされる。スター配列は、ステムループ構造の他のアームからプロセシングされる。マウスｍｉＲ−１４５およびヒトｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（例えば、ステムループ配列）、成熟配列、およびスター配列を、下記に示す。
【化１】
0006410791.tif 000002
【化２】
0006410791.tif 000003
【００３２】
上記の配列は、リボ核酸配列の場合もあり、デオキシリボ核酸配列の場合もあり、これら２つの組合せ（すなわち、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む核酸）の場合もある。本明細書で記載される配列のうちのいずれか１つを含む核酸は、ＤＮＡ配列では、ウリジン塩基の代わりにチミジン塩基を有し、ＲＮＡ配列では、チミジン塩基の代わりにウリジン塩基を有することが理解される。
【００３３】
ｍｉＲ−１４５と相補的な配列を含み、特定の化学的パターンまたは化学的モチーフを伴うオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、ヌクレオチド配列は同じであるが、化学的パターンまたは化学的モチーフは異なるオリゴヌクレオチドと比較して、増大させることが可能である。例えば、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは各々、ｍｉＲ−１４５をターゲティングする、同じヌクレオチド配列であって、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含むヌクレオチド配列を有する。第１のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと異なる化学的モチーフまたは化学的パターンを有する。第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのいずれも、ｍｉＲ−１４５の発現または存在度を低減することが可能である。しかし、ｍｉＲ−１４５標的の抑制解除の量により測定される通り、第１の化学的モチーフを伴う第１のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性は、化学的モチーフが異なる第２のオリゴヌクレオチドと比較して大きい。ｍｉＲ−１４５標的は、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、またはＳｎｅｄ１でありうる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞内または組織内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させ、発現の増大のｐ値は、０．０５より小さい。いくつかの実施形態では、発現の増大のｐ値は、０．０１より小さい。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドで処置された細胞または組織は、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現が、生理食塩水対照と比べて１．０倍超の倍数変化をし、倍数変化のｐ値は、０．０５より小さい。いくつかの実施形態では、倍数変化のｐ値は、０．０１より小さい。発現の倍数変化は、少なくとも約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、または約１．５倍でありうる。ｍｉＲ−１４５標的遺伝子は、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、またはＳｎｅｄ１でありうる。
【００３５】
ｍｉＲ−１４５の発現または存在度の低減におけるオリゴヌクレオチドの活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて決定することもでき、かつ／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて決定することもできる。例えば、ｍｉＲ−１４５活性の阻害を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて決定する場合、活性は、二重ルシフェラーゼアッセイを使用して決定することができる。市販品であるＰｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）により例示される二重ルシフェラーゼアッセイは、検出用タンパク質（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）のためのｍｉＲ認識部位の、遺伝子の３’ＵＴＲ内の配置を伴う。阻害剤活性を、シグナルの変化により決定しうるように、構築物を、ｍｉＲ−１４５と共に共発現させる。検出用タンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子も、同じプラスミドに組み入れることができ、シグナルの比を、候補オリゴヌクレオチドのａｎｔｉｍｉＲ−１４５活性の指標として決定する。オリゴヌクレオチドは、二重ルシフェラーゼ活性により決定されるこのような活性を、約５０ｎＭもしくはそれ未満、または他の実施形態では、約４０ｎＭもしくはそれ未満、約２０ｎＭもしくはそれ未満、または約１０ｎＭもしくはそれ未満の濃度で著明に阻害する。例えば、二重ルシフェラーゼ活性により決定される通り、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５活性の阻害についてのＩＣ５０が、約５０ｎＭもしくはそれ未満、約４０ｎＭもしくはそれ未満、約３０ｎＭもしくはそれ未満、または約２０ｎＭもしくはそれ未満でありうる。
【００３６】
代替的に、または加えて、ｍｉＲ−１４５の発現または存在度の低減におけるオリゴヌクレオチドの活性は、適切なマウスモデルまたはラットモデルであって、ｍｉＲ−１４５発現の阻害（例えば、少なくとも約５０％の）が、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量などのオリゴヌクレオチド用量で観察されるマウスモデルまたはラットモデルにより決定することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの活性を、その記載が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０１６９２４において記載されている動物モデルなどの動物モデルにおいて決定する。例えば、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５の少なくとも５０％の阻害を、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、約１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満などの用量で呈示しうる。このような実施形態では、オリゴヌクレオチドを、マウスへと静脈内投与または皮下投与することができ、オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化することができる。
【００３７】
また、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性も、適切なマウスモデルまたはラットモデルにより決定することができる。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５標的の少なくとも約５０％抑制解除を、５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満などの用量で呈示しうる。いくつかの実施形態ではまた、細胞内または組織内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現または倍数変化の、生理食塩水対照と比べた増大も、適切なマウスモデルまたはラットモデルにより決定することができる。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５標的の、少なくとも約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、または約１．５倍の発現の増大を、５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満などの用量で呈示しうる。細胞内または組織内のｍｉＲ−１４５標的の発現の増大または倍数変化についてのｐ値は、０．０５より小さいかまたは０．０１より小さい。ｍｉＲ−１４５標的は、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、またはＳｎｅｄ１でありうる。
【００３８】
このような実施形態では、オリゴヌクレオチドを、マウスへと静脈内投与または皮下投与することができ、オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化することができる。特異的なＬＮＡ／ＤＮＡパターンを伴うオリゴヌクレオチドは、肺など、特定の組織内の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、ヌクレオチド配列は同じであるが、ＬＮＡ／ＤＮＡパターンは異なるオリゴヌクレオチドと比較して、増大させることが可能である。いくつかの実施形態では、特異的なＬＮＡ／ＤＮＡパターンを伴うオリゴヌクレオチドは、細胞内または組織内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させる。さらに他の実施形態では、特異的なＬＮＡ／ＤＮＡパターンを伴うオリゴヌクレオチドで処置された細胞の、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現の変化は、生理食塩水対照で処置された細胞と比べて１．０倍を超える。
【００３９】
これらの実施形態または他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、投与後に安定的であることが可能であり、投与後少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、もしくは少なくとも６週間、またはこれを超えて、循環中および／または標的器官中で検出可能である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、より低頻度の投与、より低用量、および／またはより長期間にわたる治療効果をもたらしうる。
【００４０】
一般に、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１４５の発現または存在度を低減するような、長さならびに数および位置である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１４５の発現または存在度を、各々が記載されている通りに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのルシフェラーゼアッセイにおいて、約５０ｎＭまたはそれ未満のオリゴヌクレオチド濃度で、あるいは適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で低減するような、長さならびに数および位置である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックトヌクレオチドの数および位置は、本明細書で記載されているマウスモデルまたはラットモデルなどの、適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、または約２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で、標的の抑制解除により決定される通り、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１４５の活性を低減するような、長さならびに数および位置である。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１または複数のロックト核酸（ＬＮＡ）残基または「ロックトヌクレオチド」を含有する。ＬＮＡは、例えば、それらの全てが、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，３１６，１９８号、同第６，４０３，５６６号、同第６，７７０，７４８号、同第６，９９８，４８４号、同第６，６７０，４６１号、および同第７，０３４，１３３号において記載されている。ＬＮＡとは、リボース糖部分の２’炭素と４’炭素との間の余剰架橋を含有する、修飾ヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり、「ロックト」コンフォメーションおよび／または二環構造を結果としてもたらす。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、下記の構造Ａにより示される構造を有する１または複数のＬＮＡを含有する。代替的に、または加えて、オリゴヌクレオチドは、下記の構造Ｂにより示される構造を有する１または複数のＬＮＡも含有しうる。代替的に、または加えて、オリゴヌクレオチドは、下記の構造Ｃにより示される構造を有する１または複数のＬＮＡを含有する。
【化３】
0006410791.tif 000004
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチド内に組み込まれうる、他の適切なロックトヌクレオチドは、それらの両方が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４０３，５６６号および同第６，８３３，３６１号、において記載されているロックトヌクレオチドを含む。
【００４３】
例示的な実施形態では、ロックトヌクレオチドは、例えば、構造Ａにおいて示される、２’から４’のメチレン架橋を有する。他の実施形態では、架橋は、置換することが可能であり、２’位にエーテル結合を有する場合もあり、有さない場合もある、メチレン基またはエチレン基を含む。
【００４４】
オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５に対するアンチセンス配列を含む場合もあり、これらから本質的になる場合もあり、これらからなる場合もある。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５を指向するアンチセンス配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−１４５配列と少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、ヒト成熟ｍｉＲ−１４５配列と、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な配列を含みうる。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−１４５配列と１００％相補的な配列を含む。
【００４５】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５のヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５と相補的なヌクレオチド配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。この文脈では、「〜から本質的になる」は、さらなるヌクレオチドが、二重ルシフェラーゼアッセイまたはマウスモデルにおける、オリゴヌクレオチドによる、標的ｍｉＲＮＡ活性の阻害に実質的に影響を及ぼさない（ＩＣ５０の増大が約２０％以下であることにより規定される）限りにおいて、５’末端および３’末端の一方または両方におけるヌクレオチド（例えば、１つまたは２つの）の任意選択の付加を含む。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５に対するアンチセンス配列であって、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含むアンチセンス配列を含む場合もあり、これらから本質的になる場合もあり、これらからなる場合もある。シード領域とは、塩基２〜８にわたるｍｉＲＮＡの５’部分、すなわち、ヒト成熟ｍｉＲ−１４５では、５’−ＵＣＣＡＧＵＵＵ−３’（配列番号７）である。ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列は、ｍｉＲ−１４５のシード領域と実質的に相補的な場合もあり、これと完全に相補的な場合もあり、この場合、実質的に相補的な配列は、１〜４カ所のミスマッチ（例えば、１または２カ所のミスマッチ）を有しうる。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは一般に、成熟ｍｉＲ−１４５をターゲティングするようにデザインされたヌクレオチド配列を有する。オリゴヌクレオチドは、これらの実施形態または他の実施形態ではまた、ｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ形態またはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ形態もターゲティングするようにデザインされる場合もあり、代替的に、これらをターゲティングするようにデザインされる場合もある。ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−１４５配列と比べて、１〜５カ所（例えば、１、２、３、または４カ所）のミスマッチを含有する配列を有するようにデザインすることができる。ある種の実施形態では、このようなアンチセンス配列を、例えば、ステム部分およびループ部分を含有するｓｈＲＮＡ構造内または他のＲＮＡ構造内に組み込むことができる。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、約８〜約２０ヌクレオチドの長さ、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１８〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１０〜約１８ヌクレオチドの長さ、または約１１〜約１６ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１６ヌクレオチドの長さである。
【００４９】
一般に、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ−１４５の活性を低減するような、数および位置である。一実施形態では、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性を、ＬＮＡの数および／または位置が異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大させているような、数および位置である。いくつかの実施形態では、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドは、細胞内または組織内のｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させるような、数および位置である。さらに他の実施形態では、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドで処置された細胞の、ｍｉＲ−１４５標的遺伝子の発現の変化が、生理食塩水対照で処置された細胞と比べて１．０倍を超えるような、数および位置である。
【００５０】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ＬＮＡが４つを超えるかまたは３つを超える、ヌクレオチドの連なりを含有しない。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続ＬＮＡを含む。これらの実施形態または他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４５のシード領域と実質的に相補的であるかまたは完全に相補的な領域または配列を含むことが可能であり、この場合、領域または配列は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのロックト核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００５１】
オリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも５つ、少なくとも７つ、または少なくとも９つのＬＮＡを含有する。多様な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にＬＮＡから構成されるわけではない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡおよび非ロックトヌクレオチドのミックスを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つ、または少なくとも７つ、または少なくとも９つのロックトヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックトヌクレオチドとを含有しうる。多様な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９つのロックトヌクレオチドを含有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９つのロックトヌクレオチドと、少なくとも７つの非ロックトヌクレオチドとを含有しうる。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端におけるＬＮＡ、配列の３’末端におけるＬＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含みうる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端におけるＬＮＡ、配列の３’末端におけるＬＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含み、この場合、３つまたはこれより少数のヌクレオチドが連続ＬＮＡである。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続ＬＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、５’末端におけるＬＮＡ、３’末端におけるＬＮＡ、および３つ以下の連続ＬＮＡである、少なくとも５つのＬＮＡを伴う配列を含みうる。オリゴヌクレオチドは、５’末端におけるＬＮＡ、３’末端におけるＬＮＡ、および３つ以下の連続ＬＮＡである、少なくとも５つのＬＮＡを伴う配列を含むことが可能であり、この場合、配列は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６マーを含み、１６マーは、１６ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、１６マーは、ｍｉＲ−１４５のシード領域と相補的な配列を含む。１６マーは、少なくとも９つのＬＮＡを含みうる。いくつかの実施形態では、１６マーは、９つのＬＮＡおよび７つの非ロックトヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、１６マーの５’末端から３’末端へ、１６マーの１、５、６、９、１０、１１、１３、１５、および１６位；１、２、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位；１、５、６、８、１０、１１、１３、１４、および１６位；１、３、４、５、６、８、１０、１３、および１６位；１、３、４、７、８、１０、１２、１４、および１６位；１、２、６、７、１０、１１、１２、１４、および１６位；１、３、５、７、９、１１、１３、１５、および１６位；１、４、５、７、９、１０、１２、１４、および１６位；または１、５、６、８、１０、１１、１３、１５、および１６位は、ＬＮＡである。１６マーは、ｍｉＲ−１４５と実質的に相補的な場合もあり、これと完全に相補的な場合もあり、この場合、実質的に相補的な配列は、１〜４カ所のミスマッチ（例えば、１または２カ所のミスマッチ）を有しうる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｍ−１０９３４、Ｍ−１１２３９、Ｍ−１１２４１、Ｍ−１１２４２、Ｍ−１１２４４、Ｍ−１１３１８、Ｍ−１１３１９、Ｍ−１１３２０、またはＭ−１１３２１など、表１から選択される。
【００５４】
非ロックトヌクレオチドでは、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに対する２’修飾を含有しうる。例えば、２’修飾は、２’デオキシでありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチド内の２’−修飾ヌクレオチドの組込みは、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する耐性および相補的なＲＮＡに対するそれらの熱安定性の両方を増大させうる。２’位における多様な修飾は、ＲＮＡ標的との分子的相互作用または細胞機構を損なわずに、ヌクレアーゼへの感受性の増大をもたらす修飾から独立に選択することができる。このような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの効力の増大に基づき選択することができる。本明細書では、ｍｉＲ−１４５を阻害するための効力（例えば、ＩＣ５０）の増大を決定するための例示的な方法であって、二重ルシフェラーゼアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−１４５の発現または標的の抑制解除を含む方法が記載される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、２’修飾は、Ｏ−アルキル（これは、置換することが可能である）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から独立に選択することができる。非ロックトヌクレオチドの、実質的に全てまたは全ての２’位ヌクレオチドであって、ある種の実施形態では、例えば、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、ハロ（例えば、フルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから独立に選択される、２’位ヌクレオチドを修飾することができる。例えば、２’修飾は各々、Ｏ−メチルおよびフルオロから独立に選択することができる。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドの各々は、２’−ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドの各々は、２’−Ｆを有する。ある種の実施形態では、１〜約５カ所の２’位、または約１〜約３カ所の２’位を、非修飾のまま放置する（例えば、２’ヒドロキシルとして）。
【００５６】
本発明に従う２’修飾はまた、低分子の炭化水素置換基も含む。炭化水素置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキル［置換基中、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニル、およびアルキニルは、置換される場合もあり、非置換の場合もある］を含む。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３など、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、アルケニル、またはアルキニルでありうる。炭化水素置換基は、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから独立に選択しうる、１つまたは２つまたは３つの炭素以外の原子を含みうる。２’修飾は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルを、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとしてさらに含みうる。
【００５７】
本発明に従う例示的な２’修飾は、２’−Ｏ−アルキル置換（２’−ＯＭｅまたは２’−ＯＥｔなどのＣ１〜３アルキル置換）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換を含む。
【００５８】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなど、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）を含有する。いくつかの実施形態では、２’ハロ修飾は、フルオロである。オリゴヌクレオチドは、１〜約５カ所の２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１〜約３カ所の２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有しうる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非ロックト位置において、全ての２’−フルオロヌクレオチドを含有するか、または全ての非ロックトピリミジンヌクレオチド上に、２’−フルオロを含有する。ある種の実施形態では、２’−フルオロ基は独立に、ジメチル化２’−フルオロ基、トリメチル化２’−フルオロ基、または非メチル化２’−フルオロ基である。
【００５９】
オリゴヌクレオチドは、１または複数の２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルに代えたＨ）を有することが可能であり、いくつかの実施形態では、非ロックト位置において、２〜約１０カ所の２’−デオキシ修飾を含有するか、または全ての非ロックト位置において、２’デオキシを含有する。
【００６０】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非ロックト位置において、２’−ＯＭｅとして修飾された２’位を含有する。代替的に、非ロックトプリンヌクレオチドは、２’位において、２’−ＯＭｅとしても修飾され、非ロックトピリミジンヌクレオチドは、２’位において、２’−フルオロとしても修飾される。
【００６１】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１カ所の末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’キャップ構造および／または３’キャップ構造でありうる。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における（末端のリボヌクレオチドに対する）化学修飾を含み、５’末端における最後の２つのヌクレオチドと、３’末端における最後の２つのヌクレオチドとの間の結合における修飾を含む。本明細書で記載されるキャップ構造は、ｍｉＲＮＡ標的（すなわち、ｍｉＲ−１４５）との分子的相互作用または細胞機構を損なわずに、オリゴヌクレオチドのエクソヌクレアーゼに対する耐性を増大させうる。このような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの効力の増大に基づき選択することができる。キャップは、５’末端に存在する場合（５’キャップ）もあり、３’末端に存在する場合（３’キャップ）もあり、両方の末端に存在する場合もある。ある種の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、ホスホロチオエート一リン酸、脱塩基性残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、逆位ヌクレオチドまたは逆位脱塩基性部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエート一リン酸、およびメチルホスホネート部分から独立に選択される。キャップ構造の一部の場合のホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合は一般に、５’末端における２つの末端ヌクレオチドと、３’末端における２つの末端ヌクレオチドとの間に位置する。
【００６２】
ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエート一リン酸を有する。ホスホロチオエート一リン酸は、エクソヌクレアーゼの作用を阻害することにより、効力の増大を支援しうる。ホスホロチオエート一リン酸は、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に存在しうる。ホスホロチオエート一リン酸は、以下の構造：
【化４】
0006410791.tif 000005
［式中、Ｂは、塩基であり、Ｒは、上記で記載した２’修飾である］
により規定される。
【００６３】
キャップ構造が、ロックトヌクレオチドの化学反応を支援しうる場合、キャップ構造は、本明細書で記載されるＬＮＡを組み込みうる。
【００６４】
ホスホロチオエート結合は、いくつかの実施形態では、５’末端における最後の２つのヌクレオチドと３’末端（例えば、キャップ構造の一部としての）との間などに存在する場合もあり、ホスホジエステル結合と交互に存在する場合もある。これらの実施形態または他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端の一方または両方において、少なくとも１つの末端脱塩基性残基を含有しうる。脱塩基性部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの、一般に認知されたプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、このような脱塩基性部分は、１’位において、ヌクレオチド塩基を欠くか、または他のヌクレオチド塩基以外の化学基を有する。例えば、脱塩基性リバースホスホロアミダイトを、５’−アミダイト（３’−アミダイトの代わりに）を介してカップリングする結果として、５’−５’リン酸結合をもたらす場合、例えば、脱塩基性ヌクレオチドは、脱塩基性リバースヌクレオチドでありうる。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のための、リバース脱塩基性ヌクレオシドの構造を、下記に示す。
【化５】
0006410791.tif 000006
【化６】
0006410791.tif 000007
【００６５】
オリゴヌクレオチドは、１または複数のホスホロチオエート結合を含有しうる。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼによる切断に対して、より耐性とするのに使用されている。例えば、ポリヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエート結合することができ、例えば、ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合と交互に存在しうる。しかし、ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合されている。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜５カ所または１〜３カ所のリン酸結合を有する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ＰＣＴ／ＵＳ１１／５９５８８において記載されている１または複数のカルボキシアミド修飾された塩基を有し、これは、そこに開示されている複素環置換基を伴う全ての例示的なピリミジンのカルボキシアミド修飾に関するものを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
修飾ポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの、固相合成による合成は、周知であり、「New  Chemical  Methods  for  Synthesizing  Polynucleotides」、Caruthers  MH、Beaucage  SL、Efcavitch  JW、Fisher  EF、Matteucci  MD、Stabinsky  Y、Nucleic  Acids  Symp.  Ser.、１９８０年、（７号）：２１５〜２３頁において総説されている。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは、様々な高分子アセンブリー内または高分子組成物内に組み込むことができる。送達のためのこのような複合体は、患者への送達のために製剤化された、様々なリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを含みうる。複合体は、細胞膜への透過を誘発する、１または複数の融合性分子または親油性分子を含みうる。このような分子は、例えば、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号において記載されている。代替的に、オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／１２９６７２において記載されている親油性のペンダント基など、細胞内送達の一助となる親油性のペンダント基をさらに含みうる。
【００６９】
本発明はまた、細胞内のｍｉＲ−１４５の活性を低減または阻害するために、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを、細胞へと（例えば、本明細書で記載される組成物または処方物の一部として）送達するための方法も提供する。細胞は、平滑筋細胞でありうる。本明細書ではまた、平滑筋細胞の増殖を阻害ための方法であって、平滑筋細胞を、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法も提示される。細胞は、哺乳動物細胞でありうる。いくつかの実施形態では、細胞は、肺細胞または心臓細胞である。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞の場合もあり、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の場合もある。
【００７０】
本明細書ではまた、対象における状態の進行を処置、改善、または防止するための方法であって、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法も提示される。方法は一般に、オリゴヌクレオチドまたはこれを含む組成物を、対象へと投与するステップを含む。「対象」または「患者」という用語は、限定せずに述べると、ヒトおよび他の霊長動物（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種）を含む、任意の脊椎動物、農場動物（例えば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、愛玩用哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯動物）、および鳥類（例えば、愛玩用鳥類、野生鳥類、ならびにニワトリなどの闘鶏用鳥類、シチメンチョウ、および他の家禽、カモ、ガチョウなど）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００７１】
対象は、新生内膜形成または再狭窄など、ｍｉＲ−１４５の発現と関連するか、これにより媒介されるか、またはこれから生じる状態を有しうる。ｍｉＲ−１４５は、平滑筋組織内で濃縮され、平滑筋の増殖を調節しうる。一実施形態では、血管損傷の後などにおける、新生内膜形成または再狭窄を阻害するまたは低減するための方法は、オリゴヌクレオチドまたはこれを含む組成物を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む。
【００７２】
別の実施形態では、状態は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である。一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における肺高血圧症、特に、ＰＡＨを処置または防止する方法であって、対象へと、ｍｉＲ−１４５の発現および／または活性の阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。肺高血圧症は、肺内の肺動脈が、狭まるか、遮断されるか、または損傷して、動脈圧の増大を引き起こす場合に生じる。右心室への作業負荷の増強は、心筋への歪みを引き起こし、心不全をもたらしうる。ＰＡＨの症状は、最初は運動時であるが、最終的には休息時における息切れ、疲労感、めまいまたは失神発作、胸部圧迫感または胸痛、下肢末端（足首および脚部）および腹部における腫脹、皮膚および口唇の青みがかった色、ならびに速脈または心悸亢進を含むがこれらに限定されない。ｍｉＲ−１４５阻害剤の投与後において、処置を施されていない対象と比較して、ＰＡＨを患う対象における前述の症状のうちの１または複数を改善するかもしくは消失させるか、またはＰＡＨの発症を遅延させることが好ましい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４５阻害剤の投与後において、対象における、右心室の収縮期圧力が低減される。
【００７３】
本発明の方法で処置されうる肺高血圧症の形態は、特発性ＰＡＨ、遺伝性ＰＡＨ、または家族性ＰＡＨ、および続発性肺高血圧症（例えば、肺塞栓、気腫、肺線維症、および先天性心疾患から生じる高血圧症）を含むがこれらに限定されない。ＰＡＨの家族性形態または遺伝性形態は、ある種の遺伝子内の突然変異と連関している。例えば、ＰＡＨの遺伝性形態を伴う患者のうちの７０％は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ：ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２型受容体（ＢＭＰＲ２：ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｐｅ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする遺伝子内に突然変異を有する（Morrellら、２００１年）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法で処置される対象は、ＰＡＨを発症する危険性がある。一実施形態では、危険性がある対象（例えば、ヒト）は、ＢＭＰＲ２をコードする遺伝子内に突然変異を有する。
【００７４】
別の実施形態では、状態は、全身性高血圧症を含む高血圧症である。高血圧症は、原発性高血圧症または本態性高血圧症、続発性高血圧症、悪性高血圧症、孤立性収縮期高血圧症、または抵抗性高血圧症を含む任意の種類でありうる。原発性高血圧症とは、最も一般的な種類であり、同定可能な原因を有さないと考えられる。続発性高血圧症は一般に、可逆性の因子により引き起こされる。いくつかの実施形態では、続発性高血圧症は、腎臓損傷、腫瘍、副腎の過剰活性、甲状腺の機能不全、大動脈縮窄症、妊娠関連状態、睡眠時無呼吸、薬物、食物、または飲料により引き起こされる。悪性高血圧症は、最も重度の形態であり、進行性でありうる。場合によって、悪性高血圧症は、心不全、腎臓損傷もしくは脳出血、または死をもたらしうる。一般に、悪性高血圧症は、がんまたは悪性腫瘍により引き起こされない。孤立性収縮期高血圧症は、収縮期血圧が一貫して１６０ｍｍＨｇを上回り、拡張期血圧が９０ｍｍＨｇを下回り、動脈における年齢に関連する弾性の喪失であって、動脈硬化に起因しうる弾性の喪失に由来しうる場合の高血圧症である。三重の薬物レジメにも関わらず、１４０／９９ｍｍＨｇを下回って血圧を低減することができない場合、高血圧症は、抵抗性高血圧症として類別されることが典型的である。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における、原発性高血圧症、続発性高血圧症、悪性高血圧症、孤立性収縮期高血圧症、または抵抗性高血圧症などの高血圧症を処置または防止するための方法であって、対象へと、ｍｉＲ−１４５の発現および／または活性の阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。
【００７６】
本発明は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物もさらに提供する。臨床適用が想定される場合、医薬組成物は、意図される適用に適する形態で調製される。一般に、これは、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【００７７】
一実施形態では、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−１４５阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む。例えば、医薬組成物は、有効用量または有効量の、本発明のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む。オリゴヌクレオチドは、Ｍ−１０９３４、Ｍ−１１２３９、Ｍ−１１２４１、Ｍ−１１２４２、Ｍ−１１２４４、Ｍ−１１３１８、Ｍ−１１３１９、Ｍ−１１３２０、またはＭ−１１３２１など、表１から選択することができる。
【００７８】
「有効用量」とは、有益であるかまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇでありうる。有効用量と考えられる量の正確な決定は、患者の体格、年齢、種類、および肺動脈高血圧症の重症度を含む、各患者に個別の因子と、オリゴヌクレオチドの性質（例えば、溶融温度、ＬＮＡ含量など）とに基づきうる。したがって、当業者は、投与量を、本開示および当技術分野における知見から、たやすく確認することができる。いくつかの実施形態では、方法は、有効用量の医薬組成物を、毎日１、２、３、４、５、または６回投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、投与は、毎週１、２、３、４、または５回である。他の実施形態では、投与は、隔週または毎月である。
【００７９】
高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を、オリゴヌクレオチドによるｍｉＲ−１４５阻害剤機能のための送達媒体として使用することができる。ある種の実施形態では、ｍｉＲ−１４５阻害剤を、肺内送達のために製剤化する。本明細書で使用される「肺内送達」または「呼吸器内送達」とは、ｍｉＲ−１４５阻害剤の、対象への、口腔または鼻腔を介する吸入による、肺への送達を指す。例えば、ｍｉＲ−１４５阻害剤は、嗅ぎ薬、エアゾール、ネブライザーのための溶液として製剤化することもでき、粉体噴霧のための超微粒粉末として製剤化することもできる。ｍｉＲ−１４５阻害剤を、乾燥粉末として製剤化する実施形態では、活性化合物の粒子は、５０ミクロン未満、好ましくは、１〜５ミクロンの間または２〜５ミクロンの間など、１０ミクロン未満の直径を有しうる。
【００８０】
一般に、適切な塩および緩衝液を援用して、送達媒体を安定的とし、標的細胞による取込みを可能とすることが所望される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体中または水性媒質中に溶存または分散させた、阻害剤ポリヌクレオチドを含む有効量の送達媒体（例えば、リポソームまたは他の複合体もしくは発現ベクター）を含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という語句は、動物またはヒトへと投与される場合に、有害な反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない、分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、ヒトへの投与に適する医薬などの医薬の製剤化における使用のために許容可能な、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。当技術分野では、薬学的活性物質のための、このような媒質および薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒質または薬剤が、本発明の有効成分に不適合である場合を除き、治療用組成物中のその使用が想定される。また、補助的有効成分も、それらが組成物のオリゴヌクレオチドを不活化しない限りにおいて、組成物へと組み込むことができる。
【００８１】
本発明の活性組成物は、古典的な医薬調製物を含みうる。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織が、その経路を介して到達可能である限りにおいて、任意の一般的な経路を介しうる。これは、経口経路、鼻腔内経路、または口腔内経路を含む。代替的に、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、動脈内注射、または静脈内注射も介しうる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、肺組織または心臓組織への注射を指向する。
【００８２】
ある種の実施形態では、ｍｉＲ−１４５阻害剤を含む医薬組成物を、吸入により投与する。ｍｉＲ−１４５阻害剤を含む医薬組成物はまた、治療剤を心臓および肺へと送達するための、カテーテルシステムまたは冠動脈循環／肺内循環を摘出するシステムにより投与することもできる。当技術分野では、治療剤を心臓および冠動脈血管系へと送達するための多様なカテーテルシステムが公知である。本発明における使用に適するカテーテルベースの送達法または冠動脈摘出法のいくつかの非限定的な例は、それらの全てが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許公開第２００７／００６０９０７号において開示されている。このような組成物は通常、本明細書で記載される、薬学的に許容可能な組成物として投与される。
【００８３】
活性化合物はまた、非経口投与または腹腔内投与することもできる。例示を目的として述べると、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と共に適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中でのこれらの混合物中でも調製することができる。通常の保管状態下および使用状態下では、これらの調製物は一般に、微生物の成長を防止する保存剤を含有する。
【００８４】
注射用の使用、カテーテルによる送達、または吸入による送達に適する薬学的形態は、例えば、滅菌水溶液または滅菌水性分散液および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液（例えば、エアゾール溶液、ネブライザー溶液）の即席調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、容易な注射可能性またはエアゾール化／噴霧化がなされる程度に滅菌であり、かつ、流体である。調製物は、製造条件下および保管条件下で安定的であるものとし、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保存的であるものとする。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有しうる。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は、要請される粒子サイズを維持することにより、かつ、界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど、多様な抗菌剤および抗真菌剤によりもたらすことができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中で、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりもたらすことができる。
【００８５】
滅菌注射用溶液は、適量の活性化合物を溶媒へと、所望に応じて、他の任意の成分（例えば、上記で列挙した）と共に組み込んだ後、濾過滅菌を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、多様な滅菌有効成分を、基本分散媒と、例えば、上記で列挙した、他の所望の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた有効成分の粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥法を含む。いくつかの実施形態では、滅菌粉末は、例えば、粉体噴霧器または吸入デバイスにより、対象へと直接（すなわち、希釈剤中の再構成を伴わずに）投与することができる。
【００８６】
本発明の組成物は一般に、中性形態または塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）に由来する場合もあり、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来する場合もある。
【００８７】
製剤化したら、溶液は、剤形に適合的な様式で、かつ、治療的に有効となるような量で投与することが好ましい。処方物は、注射用溶液、薬物放出カプセル、単位用量吸入器など、様々な剤形で容易に投与することができる。例えば、水溶液による非経口投与では一般に、溶液を適切に緩衝処理し、液体の希釈剤を、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースにより、まず等張とする。このような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、動脈内投与、および腹腔内投与のために使用することができる。滅菌水性媒質は、特に、本開示に照らして、当業者に公知の通りに援用することが好ましい。例示を目的として述べると、単一の用量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶存させ、１０００ｍｌの皮下注入用流体へと添加することもでき、提起された注入部位に注射することもできる（例えば、「Remington's  Pharmaceutical  Sciences」、１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。処置される対象の状態に応じて、投与量の何らかの変化が必然的に生じる。いずれにせよ、投与の責任者が、個別の対象に適切な用量を決定することになる。さらに、ヒト投与では、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準により要請される、滅菌性、発熱物質性、一般的な安全性、および純度についての基準を満たすものとする。
【００８８】
組成物または処方物は、本明細書で記載される少なくとも１つの治療用オリゴヌクレオチドを含む、複数の治療用オリゴヌクレオチドを援用しうる。例えば、組成物または処方物は、本明細書で記載される、少なくとも２、３、４、または５つのｍｉＲ−１４５阻害剤を援用しうる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の治療モダリティーと組み合わせて使用することができる。組合せはまた、細胞を、複数の顕著に異なる組成物または処方物と同時に接触させることにより達成することもできる。代替的に、組合せは、逐次的に投与することもできる。
【００８９】
本発明の一実施形態ではａｎｔｉｍｉＲ−１４５を、他の治療モダリティーと組み合わせて使用する。組合せ療法の例は、前出のうちのいずれかを含む。組合せは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的処方物により達成することもでき、２つの顕著に異なる組成物または処方物であって、一方の組成物が、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５を含み、もう一方の組成物が他の薬剤を含む組成物または処方物の同時的な組合せにより達成することもできる。代替的に、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５を使用する治療は、数分間〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤の投与に先行する場合もあり、これに後続する場合もある。他の薬剤とａｎｔｉｍｉＲ−１４５とを、細胞へと個別に適用する実施形態では、薬剤とａｎｔｉｍｉＲ−１４５とが、有利に組み合わされた効果を細胞に対して及ぼすことがやはり可能であるように、各送達時点の間でそれほど長い時間が経過しないことが一般に確認される。このような場合は典型的に、細胞を、互いから約１２〜２４時間以内に、互いから約６〜１２時間以内に、または遅延時間を約１２時間に限って、両方のモダリティーと接触させることが想定される。しかし、それぞれの投与の間で、数日間（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過するいくつかの状況では、処置のための期間を著明に延長することが所望でありうる。
【００９０】
一実施形態では、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５または他の薬剤の複数回の投与が所望となる。この点で、多様な組合せを援用することができる。例示を目的として述べると、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５が「Ａ」であり、他の薬剤が「Ｂ」である場合、合計３回および４回の投与に基づく以下の順列：Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂを、例として提示する。他の組合せも同様に想定される。他の薬剤および治療の具体例を、下記に提供する。
【００９１】
本発明の一実施形態では、それを必要とする対象における、再狭窄または新生内膜形成を阻害、防止、または処置する方法は、対象へと、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５などのｍｉＲ−１４５阻害剤と、再狭窄または新生内膜形成を阻害する別の薬剤とを投与するステップを含む。心臓専門医は、再狭窄の危険性を減少させる多数の手法を試みている。ステント留置が、バルーンによる血管形成術に代わって、より常套的となりつつある。ステント留置手順では、血管再開通を施される動脈の動脈壁に対して、金属製のメッシュ（ステント）を配置する。他の手法は、局所放射線療法およびステント留置用メッシュ上にコーティングされた免疫抑制薬の使用を含む。一実施形態では、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５および低分子ｍｉＲ−１４５阻害剤など、異なるｍｉＲ−１４５阻害剤の組合せを投与する。したがって、組合せ療法の例は、前出のうちのいずれかを含む。
【００９２】
本発明の一実施形態では、それを必要とする対象における高血圧症を阻害、防止、または処置するための方法は、対象へと、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５などのｍｉＲ−１４５阻害剤と、高血圧症を阻害、防止、または処置する第２の薬剤とを投与するステップを含む。一実施形態では、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５および低分子ｍｉＲ−１４５阻害剤など、異なるｍｉＲ−１４５阻害剤の組合せを投与する。
【００９３】
本発明の一実施形態では、それを必要とする対象におけるＰＡＨを阻害、防止、または処置するための方法は、対象へと、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５などのｍｉＲ−１４５阻害剤と、ＰＡＨを阻害、防止、または処置する第２の薬剤とを投与するステップを含む。一実施形態では、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５および低分子ｍｉＲ−１４５阻害剤など、異なるｍｉＲ−１４５阻害剤の組合せを投与する。
【００９４】
一実施形態では、ＰＡＨを阻害、防止、または処置するための、第２の薬剤またはさらなる薬剤は、ｍｉＲ−２０４のアゴニストである。ヒトｍｉＲ−２０４−５ｐ配列は、５’−ＵＵＣＣＣＵＵＵＧＵＣＡＵＣＣＵＡＵＧＣＣＵ−３’（配列番号８）である。ヒトｍｉＲ−２０４−３ｐ配列は、５’−ＧＣＵＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＧＵ−３’（配列番号９）である。ｍｉＲ−２０４のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−２０４の配列を含むポリヌクレオチドでありうる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０４のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列の配列を含む。成熟ｍｉＲ−２０４配列、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０４配列、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。一実施形態では、ｍｉＲ−２０４アゴニストは、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１８〜約３０ヌクレオチドの長さ、約２０〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約１０〜約１４ヌクレオチドの長さでありうる。ｍｉＲ−２０４アゴニストは、ｍｉＲ−２０４の成熟配列、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列と、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一でありうる。一実施形態では、ｍｉＲ−２０４アゴニストは、配列番号１５または１６の配列を有する。ポリヌクレオチドであるｍｉＲ２０４アゴニストは、ロックト核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ修飾、および４’チオ修飾などの糖修飾など、１または複数の化学修飾、ならびに１または複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、またはホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾を含有しうる。一実施形態では、ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドを、コレステロールへとコンジュゲートさせる。ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ベクターから発現させることもでき、かつ／または上記で記載したプロモーターなどのプロモーターに作動可能に結合することもできる。
【００９５】
別の実施形態では、ｍｉＲ−２０４のアゴニストは、ｍｉＲ−２０４とは顕著に異なる薬剤であって、ｍｉＲ−２０４の機能を増大させるか、これを補充するか、またはこれを置きかえるように作用する薬剤でありうる。例えば、ＰＤＧＦ、エンドセリン−１、アンジオテンシンＩＩ、およびＳＴＡＴ３の発現または活性を阻害する薬剤を、ＰＡＨを処置または防止するｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用することができる。薬剤は、ポリペプチド、ペプチド、有機低分子、対象のポリペプチドをコードする核酸などの形態で送達することができる。ポリペプチドは、サイズおよびグリコシル化に関わらず、核酸の任意の翻訳産物でありうる。薬剤はまた、単純な薬物、ペプチド、ペプチド断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、または核酸の操作されたハイブリッド体、およびペプチドもしくはペプチド断片、または各々の誘導体の形態ででもありうる。
【００９６】
ＰＡＨ、新生内膜形成もしくは再狭窄、または高血圧症を阻害、処置、または防止するための組合せはまた、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と、エポプロステノールなどであるがこれらに限定されない、血管拡張剤（ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒ（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ））との組合せも含みうる。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と共に使用されうる他の薬剤は、ボセンタン、シタキセンタン、およびアンブリエセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、シルデナフィル、およびタダラフィルなどのホスホジエステラーゼ阻害剤；アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピンなどのカルシウムチャネル遮断剤；トレプロスチニル、イロプロスト、およびベラプロストなどのプロスタグランジン；硝酸イソソルビド；ならびにシナシグアトおよびリオシグアトなどのグアニル酸シクラーゼ活性化因子を含むがこれらに限定されない。
【００９７】
また、ワルファリンおよびトリペプチドモチーフであるＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇに基づく化合物など、例えばＬＹ２８７０４５など、トロンビンを遮断または阻害する抗凝固剤または抗凝固化合物も使用することができる。当技術分野では、イノガルテンおよびメラガルテンなど、多くの化合物が公知であり、また、使用することもできる。非限定的な例については、とりわけ、米国特許第６，３２６，３８６号；同第６，２３２，３１５号；同第６，２０１，００６号；同第６，１７４，８５５号；同第６，０６０，４５１号；および同第５，９８５，８３３号を参照されたい。
【００９８】
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と共に使用されうるさらなる薬剤は、アンジオテンシン転換酵素阻害剤；ニコチン受容体アゴニスト；一酸化窒素の濃度を増大させる薬剤、抗血管新生剤；ＴＧＦ−β受容体のアゴニスト；およびデスドメイン受容体リガンドを含む。
【００９９】
ＰＡＨを処置または防止するためにもまた、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用されうる、アンジオテンシン転換酵素阻害剤（ＡＣＥ−Ｉ）は、カプトプリル、ベナゼプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、イミダプリル、ペリンドプリル、エルブミン、およびトランドラプリルを含むがこれらに限定されない。ＡＣＥ受容体遮断剤はまた、ＡＣＥ阻害剤の代わりに使用することもでき、また、ＡＣＥ阻害剤として使用することもでき、これらは、ロサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、シレキセチル、およびバルサルタンを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
また、ＰＡＨを処置または防止することなどのために、ニコチン受容体アゴニスト、例えば、ニコチン（Ｓ−３−（１−メチル−２−ピロリジニル）ピリジン）、およびニコチン受容体に実質的に特異的に結合し、薬理学的効果をもたらす他の化合物も、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と組み合わせて使用することができる。ニコチン受容体アゴニストは、自然発生の化合物（自然発生の植物アルカロイドなどの低分子、ポリペプチド、ペプチドを含むがこれらに限定されない）、内因性リガンド（例えば、天然の供給源から精製された内因性リガンド、組換えにより作製された内因性リガンド、または合成の内因性リガンドであり、このような内因性リガンドの誘導体および変異体をさらに含む）、および合成により作製された化合物（例えば、低分子、ペプチドなど）を包摂する。「ニコチン」という用語は、ニコチンの任意の薬理学的に許容可能な誘導体または代謝物であって、ニコチンと同様の薬物療法的特性を呈示する誘導体または代謝物もさらに含む。当技術分野では、このような誘導体、代謝物、および代謝物の誘導体が公知であり、コチニン、ノルコチニン、ノルニコチン、ニコチンＮ−オキシド、コチニンＮ−オキシド、３−ヒドロキシコチニン、および５−ヒドロキシコチニン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩を含むがこれらに必ずしも限定されない。
【０１０１】
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５はまた、ＰＡＨを処置または防止するために、一酸化窒素を増大させる１または複数の薬剤と共に使用することもできる。一酸化窒素促進剤の例は、Ｓ−ニトロソペニシラミン、ニトロプルシドナトリウム、Ｎ−エチル−２−（１−エチル−２−ヒドロキシ−２ニトロソヒドラジノ）エタンアミン（ＮＯＣ１２）、および他の一酸化窒素促進剤を含むがこれらに限定されない。一酸化窒素の産生はまた、酵素である一酸化窒素シンターゼに対するそれらの効果に起因して、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２などのサイトカイン、および内毒素によりモジュレートすることもできる。ＮＯシンターゼの誘導的形態は、サイトカインにより増大し、構成的形態は、サイトカインにより減少すると考えられる。米国特許第６，１４７，１０９号（Liaoら）により記載されている通り、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、内皮細胞のＮＯＳ活性を上方調節することが見出されている。一酸化窒素シンターゼの形態のうちのいずれも、タンパク質として活用することもでき、タンパク質から導出された活性断片として活用することもでき、発現のためのＤＮＡ構築物として活用することもできる。
【０１０２】
また、ＰＡＨ、新生内膜形成、再狭窄、または高血圧症を処置または防止することなどのために、抗血管新生効果を伴う薬剤も、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と組み合わせて使用することができる。これらは、抗血管新生ポリペプチド：アンギオスタチン；エンドスタチン；および抗血管新生性抗トロンビンＩＩＩなどを含むがこれらに限定されず、機能的に活性の変異体およびそれらの誘導体もさらに含む。他の抗血管新生剤は、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、例えば、アミホスチン、ＷＲ−１０６５；マリマスタット、プリモマスタット、ａ−１抗トリプシン；スフィンゴシンなどを含む。
【０１０３】
また、ＴＧＦ−β受容体のアゴニストも対象でありうる。ＴＧＦ−β受容体受容体Ｉ型およびＩＩ型は、ＴＧＦ−βの大半の活性を媒介する。リガンドは、ＴＧＦ−β、ならびにその模倣体および生物学的に活性の誘導体を含む。
【０１０４】
ＰＡＨを処置または防止することなどのために、ａｎｔｉｍｉＲ−１４と共に使用するための、対象の他の薬剤は、化合物であり、通例ポリペプチド化合物である、デスドメイン受容体リガンドであって、哺乳動物のデスドメインまたはその相同体もしくはオルソログを含む細胞表面受容体に結合し、そのように結合することにより、アポトーシスのためのシグナルを細胞へと送達する、デスドメイン受容体リガンドを含む。これらの受容体により誘発される細胞内のタンパク質相互作用は、ＴＮＦ−Ｒ１のＣ末端の近傍の約８０アミノ酸のドメインと相同であり、シグナル伝達細胞傷害作用の一因となる、デスドメインの結合性相互作用に帰することができる。ＴＮＦ受容体のデスドメインファミリーは、ＴＮＦ−Ｒ１、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＲＡＭＰ（ｗｓＩ／Ａｐｏ−３／ＤＲ−３）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ−４）、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ−５、ＴＲＩＣＫ２、ＫＩＬＬＥＲ）を含む。デスドメインリガンドは、特異的なデスドメイン受容体に結合することにより、細胞内の増殖および分化を調節するタンパク質を含む。これらのリガンドは、ＴＮＦファミリー、例えば、ＴＮＦ、リンホトキシン、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、およびＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド）、ならびにこれらの相同体および類似体を含む。
【０１０５】
通常免疫抑制剤として使用されているが、近年また、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することも発見された、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス、およびエベロリムスなど、ラパマイシンの類似体もまた、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５と組み合わせて使用することができる。細胞複製の進行に極めて重要なタンパク質であるｃ−ｍｙｃの、アンチセンスによるノックダウンは、動脈壁内の細胞増殖を阻害する別の手法であり、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【０１０６】
一実施形態では、また、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用されうる、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、例えば、ＲｈｅｏＰｒｏを含む、抗血小板薬の共有結合的接合または非共有結合的接合も対象である。また、酸素治療などの処置または治療も、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５の投与と組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書で記載されるａｎｔｉｍｉＲ−１４５と、投与デバイスとを含むキットも含む。ある種の実施形態では、投与デバイスとは、ＰＡＨの処置または防止などのために、ｍｉＲ−１４５阻害剤を、鼻腔または口腔を介して肺へと送達するようにデザインされたデバイスである。例えば、肺内送達に適する投与デバイスは、点滴器、スワブ、エアゾール噴霧器、粉体噴霧器、ネブライザー、吸入器（例えば、エアゾールベースの用量計量型吸入器）、乾燥粉末分散デバイス、および手動作動型送達デバイス、高圧ガス型送達デバイス、超音波駆動型送達デバイスなどを含む、他の肺内送達デバイスを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、投与デバイス内に含有された粉末として製剤化されている。他の実施形態では、ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、投与デバイス内に含有された液体エアゾールとして製剤化されている。特定の実施形態では、投与デバイスは、吸入器である。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５を静脈内送達または動脈内送達する実施形態では、キットは、カテーテルまたは他の同様に適する投与デバイスを含みうる。キットは、有効用量のａｎｔｉｍｉＲ−１４５を、対象へと投与して、肺高血圧症、新生内膜形成、再狭窄、および／または高血圧症を阻害、処置、または防止するための指示書もさらに含みうる。いくつかの実施形態では、キットは、上記で記載した薬剤または治療など、１または複数のさらなる薬剤または治療も含む。
【０１０８】
本発明を、限定的とみなされるべきではない、以下のさらなる例によりさらに例示する。当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態に多くの変化を施すことができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、やはり同様または類似の結果を得うることを察知する。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性
肺内のｍｉＲ−１４５をターゲティングする化合物を最適化するために、肺内のｍｉＲ−１４５の直接的ｍＲＮＡ標的の抑制解除を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性についてのリードアウトとして使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーンを実施した。
【０１１０】
表１に描示される合計９例の異なるａｎｔｉｍｉＲデザインを、ラットにおいて調べた。
【表１】
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【表２】
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【０１１１】
表１の９例のａｎｔｉｍｉＲ化合物を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける標的の抑制解除についてアッセイした。４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、表１からのａｎｔｉｍｉＲ化合物を皮下注射した。生理食塩水ならびにＬＮＡ百分率およびＤＮＡ百分率が同様のオリゴヌクレオチド（９例／７例）を、対照として使用した。オリゴヌクレオチド対照である、分子番号Ｍ−１０５９１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ特異的なｍｉＲＮＡをターゲティングするようにデザインし、化学反応対照として使用した。肺組織は、注射の４８時間後に回収した。Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｌｒｒｃ７１、Ｎｅｄｄ４ｌ、Ｉｇｆ１ｒ、Ｓｅｃ１４１２、Ｍｅｇｆ６、Ｆｍｏｄ、Ａｎｋｒｄ１２、Ｇｏｌｇａ１、Ｇｐｂｐ１、Ｈｉｓｔ３ｈ２ａ、Ｒａｐｇｅｆ２、およびＳｎｅｄ１のｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果を、図１に、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。
【０１１２】
これらの実験からの結果は、Ｍ−１１３１８の有効性が最大であり、これに、Ｍ−１１３１９、Ｍ−１１３２１、およびＭ−１１２３９が続くことを示した。Ｍ−１１２４４とＭ−１１３２０とは、有効性が同様であり、Ｍ−１１２３９より有効性が小さかった。最後に、９例の化合物のうち、Ｍ−１０９３４、Ｍ−１１２４２、およびＭ−１１２４１は、有効性が最小であった。
【０１１３】
９つのｍｉＲ−１４５遺伝子標的および抑制解除についての、生理食塩水と比べた、それらの倍数変化を表すレーダープロットを、図２に描示する。Ｍ−１１３１８は、９つの遺伝子全てについての累積倍数変化値を表す面積のうちで最大の面積を示す。Ｍ−１１３１９は、２番目に大きな面積である。黒線で示される、対照のオリゴヌクレオチドであるＭ−１０５９１は、活性の化合物と比較して小さな標的抑制解除活性を示す。
【０１１４】
（実施例２）
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物のｍｉＲ−１４５特異性
４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、生理食塩水またはＭ−１１３１８を皮下注射した。Ｍ−１１３１８で処置されたラットの肺に由来する全ＲＮＡおよび生理食塩水で処置されたラットの肺に由来する全ＲＮＡを、マイクロアレイプロファイリングによる全ゲノムプロファイリングにかけた。Ｍ−１１３１８で処置されたラットの肺に由来する全ＲＮＡを、生理食塩水で処置されたラットの肺に由来する全ＲＮＡと比較すると、ｍｉＲ−１４５シード含有遺伝子は、上方調節された遺伝子署名が強化される（示差的発現についてのｐ値＜０．０１）。強化についてのｐ値は、超幾何分布関数を使用して計算した（図３）。これらの結果は、Ｍ−１１３１８が、ｍｉＲ−１４５に特異的な、遺伝子標的の抑制解除を誘発することを指し示す。
【０１１５】
（実施例３）
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物であるＭ−１１３１８による、用量依存的な標的抑制解除
４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの用量の生理食塩水；２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１０５９１；２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１０９３４；または５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１１３１８を皮下注射した。肺組織は、注射の７２時間後に回収した。Ｋｌｆ５のｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、図４に、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムＰＣＲの結果は、ＫＬＦ５標的の抑制解除が、Ｍ−１１３１８による処置に対して用量反応性であることを指し示す。
【０１１６】
（実施例４）
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５化合物であるＭ−１１３１８およびＭ−１１３１９による、用量依存的な標的抑制解除
４９〜５２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、２５ｍｇ／ｋｇの用量の生理食塩水；２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１０５９１；２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１０９３４；５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１１３１８；または５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭ−１１３１９を皮下注射した。肺組織は、注射の４８時間後に回収した。Ｎｅｄｄ４ｌのｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲにより、肺内全ＲＮＡ中で測定した。結果は、図５に、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムＰＣＲの結果は、Ｎｅｄｄ４ｌ標的の抑制解除が、Ｍ−１１３１８およびＭ−１１３１９による処置に対して用量反応性であることを指し示す。
【０１１７】
（実施例５）
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５は、全身血圧および動脈硬化指数を低減した
１６週齢の本態性高血圧ラット（ＳＨＲ）を、ａｎｔｉｍｉＲの、毎週４回、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与にかけた。１８週間後、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）を、飲用水（５０ｍｇ／Ｌ）により投与し、２週間にわたり不断に施して、パルス波速度（ＰＷＶ）の測定における治療域を創出した。ラットが２０週齢となる研究の終了時に、終点パルス波速度、ベータ指数、および血圧を測定した（図６Ａ）。ＡＣＥ阻害剤であるペリンドプリルを、高血圧症の１つの標準治療についての基準として、研究に組み入れた。
【０１１８】
ａｎｔｉｍｉＲ−１４５（Ｍ−１０９３４）は、パルス波速度（図６Ｂ）、ベータ指数（図６Ｃ）、および平均全身血圧（図６Ｄ）の、統計学的に有意な低減を示した。他の２つの対照ａｎｔｉｍｉＲ（対照１および対照２）が、この用量およびレジメと同様の利益を示さなかったことは重要であり、これにより、この治療効果のマイクロＲＮＡに対する特異性が示される（図６Ｂ〜６Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ−１４５の阻害が、ラットＳＨＲ／Ｌ−ＮＡＭＥによる高血圧症において、治療的利益を有することを裏付けた。
【０１１９】
本明細書で論じられ、引用された、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。開示された発明は、それらは変化しうるので、記載された特定の方法、プロトコール、および材料に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【０１２０】
当業者は、単に日常的な実験のみを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることが意図されている。
【化７】
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【化８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【配列表】
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