(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号１９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む、ＦＸＩａに結合しうるヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ＣＤＲＨ１としての配列番号２１、ＣＤＲＨ２としての配列番号２２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号２３、ならびにＣＤＲＬ１としての配列番号２４、ＣＤＲＬ２としての配列番号２５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号２６を含む、ＦＸＩａに結合しうるヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２７および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む、ＦＸＩａに結合しうるヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
ＣＤＲＨ１として配列番号２１を含み、ＣＤＲＨ２として配列番号２２を含み、ＣＤＲＨ３として配列番号２３を含み、ＣＤＲＬ１として配列番号２４を含み、ＣＤＲＬ２として配列番号２５を含み、ＣＤＲＬ３として配列番号２８を含む、ＦＸＩａに結合しうるヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固因子ＸＩおよび／またはその活性化形態因子であるＸＩａに結合しうる抗体、ならびにその使用方法、特に、血小板凝集を抑制し、これにより血栓形成を抑制する物質としての使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９６４年に、ＭａｃｆａｒｌａｎｅおよびＤａｖｉｅ  ＆  Ｒａｔｎｏｆｆ［Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ＲＧ．Ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  １９６４；２０２：４９８−９．；Ｄａｖｉｅ  ＥＷ，Ｒａｔｎｏｆｆ  ＯＤ．Ｗａｔｅｒｆａｌｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６４；１４５：１３１０−２．］は血液凝固の過程に関する彼らのカスケード仮説を紹介した。それ以来、インビボでの凝固の機能の我々の知見は増大した。過去数年において、最終的にトロンビン生成およびフィブリン沈着を引き起こす、共通の経路に収束していく２つの異なる凝固開始経路の学説、すなわち、いわゆる、外因性経路および内因性経路の学説が修正された。現在のモデルにおいては、凝固の開始は、血漿プロテアーゼ活性化因子ＶＩＩが組織因子（ＴＦ）と接触し、これにより組織因子との複合体を形成する際に生じる。この組織因子−ＦＶＩＩａ複合体はチモーゲンＦＸをその活性形態ＦＸａへと活性化し、これは、その働きにより、プロトロンビン（凝固因子ＩＩ）をトロンビン（ＩＩａ）に変換しうる。そして、凝固における中心的作用因子であるトロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒しうる。また、トロンビンは、血小板により発現される特異的受容体を活性化し、これは血小板の活性化を引き起こす。活性化された血小板はフィブリンと共に血餅形成に不可欠であり、したがって、正常な止血の基本的作用因子である。第２の増幅経路は凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）により生じる。ＦＸＩは、凝固カスケードのその他のメンバーと同様に、インビボの血液凝固の開始段階と増幅段階との橋渡しにおける中心的役割を有する血漿セリンプロテアーゼ  チモーゲンであることが、十分に確認されている［Ｄａｖｉｅ  ＥＷ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｋｉｓｉｅｌ  Ｗ．Ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ：ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１；３０：１０３６３-７０；Ｇａｉｌａｎｉ  Ｄ，Ｂｒｏｚｅ  Ｊｒ  ＧＪ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５３：９０９−１２；Ｋｒａｖｔｓｏｖ  ＤＶ，Ｍａｔａｆｏｎｏｖ  Ａ，Ｔｕｃｋｅｒ  ＥＩ，Ｓｕｎ  ＭＦ，Ｗａｌｓｈ  ＰＮ，Ｇｒｕｂｅｒ  Ａら，Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：４５２−８．３−５］。ＦＸＩ欠損症は、通常、特発性出血を引き起こさないが、止血困難を伴う出血のリスクの増加に関連しており、一方、出血の重症度とＦＸＩの血漿レベルの相関性は低い。ヒトにおける重篤なＦＸＩ欠損症は血栓性疾患からの一定の防御効果を有する［Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｏ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＤＭ，Ｚｕｃｋｅｒ  Ｍ，Ｖａｒｏｎ  Ｄ，Ｚｉｖｅｌｉｎ  Ａ，Ｓｅｌｉｇｓｈｏｎ  Ｕ．Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｈａｖｅ  ａ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｅｐ−ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１１；１０５：２６９−７３；Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｏ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＤＭ，Ｋｏｒｅｎ−Ｍｏｒａｇ  Ｎ，Ｔａｎｎｅ  Ｄ，Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ  Ｕ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：４１１３−７］。さらに、高レベルのＦＸＩは血栓事象に関連づけられている［Ｍｅｉｊｅｒｓ  ＪＣ，Ｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ  ＷＬ，Ｂｏｕｍａ  ＢＮ，Ｂｅｒｔｉｎａ  ＲＭ，Ｒｏｓｅｎｄａａｌ  ＦＲ．Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００；３４２：６９６−７０１］。したがって、ＦＸＩの抑制は、利益−リスク比の改善を達成するための新規抗血栓症物質の開発における新規アプローチとして提示されている。したがって、止血を妨げることなく血管内血栓症を有効に阻止する抗血栓症、抗血小板薬に対する高い医学的必要性が尚も存在する。
【発明の概要】
【０００３】
発明の簡潔な概要
近年、新規抗血栓症物質の開発は大きな進歩を遂げている。それでも、これらの物質により引き起こされる望ましくない出血事象は尚も重大な問題である。したがって、血栓症を理想的に抑制するが止血を維持する最適な抗血栓化合物が見出される必要がある。凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ／ＦＸＩａ）は血小板受容体ａｐｏＥＲ２と相互作用する。本発明は、せん断流条件下でのＦＸＩ／ＦＸＩａ活性阻害が病的血小板活性化および血小板凝集の過程を妨げることを初めて実証するものである。エクスビボ血栓症モデルにおいては、ＦＸＩ／ＦＸＩａの抑制はＣＤ６２Ｐのような血小板活性化マーカーの有意な低減およびコラーゲン表面上の生理的流動条件下の全血中の下流微小凝集の減少を招く。したがって、ＦＸＩａの抑制は、血小板依存性動脈型血栓形成の霊長類モデルにおいて、血小板依存性一次止血を妨げることなく血小板沈着を減少させる。顕著な抗血小板作用にもかかわらず、組織因子依存性一次止血血栓形成に必要な血管外マトリックスタンパク質と血小板の初期相互作用は、驚くべきことに、影響を受けなかった。したがって、ＦＸＩ／ＦＸＩａ活性の抑制は、出血関連副作用を引き起こすことなく抗血栓症活性を示す理想的な薬理学的原理を表現する。明瞭化のために、止血を妨げることなくとは、凝固因子ＸＩおよび／またはＸＩａの抑制が、他の抗凝固化合物および／または抗血小板化合物の存在下であっても、望ましくない測定可能な出血事象を引き起こさないことを意味する。血友病Ｃ患者に関して示されているとおり、出血は集中的な手術および／または重度の外傷の場合のみに生じる。
【０００４】
チモーゲン形態および／または活性化形態である凝固因子ＸＩａの形態の凝固因子ＸＩに対する、抗体または抗原結合性フラグメントまたはそれらの変異体が、血小板の凝集を抑制または低減することにより、およびこれにより微小凝集物および／または血栓凝塊の生成を抑制または低減することにより、抗血小板活性を示すことを明らかにするための組成物および方法を提供する。これらの抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体、抗原結合性抗体フラグメント、ならびに本発明の抗体およびフラグメントの変異体の使用は血小板凝集を抑制し、これにより、止血を妨げることなく血栓を抑制する。また、本明細書には、該抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体の投与は中和抗体であること、ならびにこれらの抗体、抗原結合性抗体フラグメント、および本発明の抗体およびフラグメントの変異体は、抗凝固抗血栓療法として、望ましくない出血事象のリスクの増加を引き起こさないことも記載されている。本発明は、血漿因子ＸＩの活性化形態ＦＸＩａに選択的に結合し、それにより、止血を妨げることなく血小板凝集および関連血栓症を抑制しうるヒトモノクローナル抗体を提供する。組成物は、凝固因子ＸＩの重鎖および／または凝固因子ＸＩａの軽鎖の一定のエピトープに結合しうる抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体を含む。これらの抗体は、凝固因子ＸＩａのタンパク質分解活性を阻止することにより、および／または凝固因子ＦＸＩＩａおよび／またはトロンビンを介した凝固因子ＸＩからその活性化形態凝固因子ＸＩａへの変換の抑制により、中和活性を示す。好ましい実施形態においては、本発明は更に、ヒト以外の他の種、主にウサギからの凝固因子ＸＩおよび／またはＸＩａに対する抗体の交差反応性を含み、広範な薬理学的および毒物学的分析を可能にする。もう１つの好ましい実施形態においては、抗薬物抗体の発生のリスクを低減するために本発明の組成物の免疫原性を最適化し低減するための方法を用いる。本発明は更に、本明細書に記載されている抗体の１つと競合するヒト抗体を含む。また、組成物は、抗原結合性抗体フラグメント、ならびに本発明の抗体およびフラグメントの変異体、これらの抗体を産生する細胞系、ならびにこれらの抗体のアミノ酸をコードする単離された核酸を含む。本発明はまた、抗凝固因子ＸＩおよび／または抗凝固因子ＸＩａ抗体、あるいは抗原結合性抗体フラグメント、ならびに本発明の抗体およびフラグメントの変異体を、医薬上許容される担体および／または溶液中に含む医薬組成物を含む。本発明の方法は、血小板凝集を抑制し、これにより、血栓症を抑制し、血栓症の治療におけるいずれかの他の抗凝固物質または抗血栓症物質の必要用量を減少させ、急性炎症反応を治療し、または癌を治療し、または凝固カスケードの活性化に関連したいずれかの他の疾患を治療するために、前記組成物を、その投与を要する対象に投与することを含む。抗凝固因子ＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体、または抗原結合性抗体フラグメント、ならびに本発明の抗体およびフラグメントの変異体の製造方法も提供する。
【０００５】
発明の詳細な説明
定義
止血：止血なる語は、損傷部位における血液の流動を停止させるための、および創傷治癒中に血管開通性を回復させるための主要メカニズムを表す。正常止血および病的血栓症中に、以下の３つのメカニズムが同時に活性化される：血管壁との活性化血小板の相互作用を意味する一次止血、フィブリンの形成、およびフィブリン溶解と称される過程［Ａｒｔｈｕｒ  Ａ．Ｓａｓａｈａｒａ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｌｏｓｃａｌｚｏ（２００２）Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０７９５−８］。
【０００６】
凝固および凝固カスケード：凝固カスケードと称される、タンパク質に基づく系は、形成した血餅を安定化し、更に創傷を閉じるように働く。凝固経路はタンパク質分解カスケードである。該経路の各酵素はチモーゲン（不活性化形態）として血漿中に存在し、これは、活性化されると、タンパク質分解切断を受けて、該前駆体分子から活性因子を放出する。該凝固カスケードは、活性化過程を制御する一連の正および負のフィードバックループとして機能する。該経路の最終的な目的は、トロンビンを産生させることであり、ついでトロンビンは可溶性フィブリノーゲンを、血餅を形成するフィブリンに変換しうる。トロンビンの生成の過程は以下の３つの段階に分けられうる：活性凝固因子ＦＸａ（活性化因子Ｘ）の生成のための代替経路を与える内因性および外因性経路、ならびにトロンビン形成をもたらす最終共通経路［Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｍ．Ｍ．およびＭｏｎｒｏｅ  Ｄ．Ｍ．（２００５）Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｒｅｐ．４：３９１−３９６；Ｊｏｈｎｅ  Ｊ，Ｂｌｕｍｅ  Ｃ，Ｂｅｎｚ  ＰＭ，Ｐｏｚｇａｊｏｖａ  Ｍ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ｍ，  Ｓｃｈｕｈ  Ｋ，Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｕ，Ｒｅｎｎｅ  Ｔ．（２００６）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃａｓｃａｄｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３８７：１７３−１７８］。
【０００７】
血小板凝集：血管の破壊が生じたら、通常は血流に直接接触していない物質が露出される。これらの物質（主にコラーゲンおよびフォンビルブラント因子）は、血小板が破壊表面に付着することを可能にする。血小板が該表面に付着したら、それは、追加的血小板を損傷領域に誘引する化学物質を放出する（これは血小板凝集と称される）。これらの２つの過程は、出血を停止させるための最初の応答である。
【０００８】
凝固因子ＸＩおよび凝固因子ＸＩａ
凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）は肝臓内で合成され、高分子量キニノーゲンと複合体形成したジスルフィド結合二量体として血漿中に循環する。この二量体の各ポリペプチド鎖は約８０ｋＤである。チモーゲン因子ＸＩは、血液凝固の接触段階により、または血小板表面上のトロンビン媒介性活性化により、その活性形態である凝固因子ＸＩａ（ＦＸＩａ）に変換される。因子ＸＩのこの活性化中に、それらの２つの鎖のそれぞれにおいて内部ペプチド結合が切断されて活性化因子ＸＩａを与え、これは、ジスルフィド結合により結合した２本の重鎖および２本の軽鎖から構成されるセリンプロテアーゼである。このセリンプロテアーゼＦＸＩａは凝固因子ＩＸをＩＸａに変換し、ついでこれは凝固因子Ｘ（Ｘａ）を活性化する。ついでＸａは凝固因子ＩＩ／トロンビンの活性化を引き起こしうる。この因子の欠損はローゼンタール症候群（血友病Ｃとしても公知である）を招き、これは、損傷からの長時間の出血、頻繁な又は重度の鼻血、尿中の微量の血液、および女性における重度の月経出血により特徴づけられる血液凝固異常である。本明細書中で用いる「凝固因子ＸＩ」、「因子ＸＩ」または「ＦＸＩ」は、該タンパク質を発現するいずれかの哺乳類種からのいずれかのＦＸＩを意味する。例えば、ＦＸＩは、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ）、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、ならびに血流の調節、凝固および／または血栓症に関与する凝固因子ＸＩを示すいずれかの他の種のものでありうる。凝固因子ＸＩＩａによる凝固因子ＸＩの活性化のための切断部位は各ペプチド鎖内のＡｒｇ−３６９とＩｌｅ−３７０との間の内部ペプチド結合である［Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｃｈｕｎｇ  ＤＷ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＬＥ，Ｄａｖｉｅ  ＥＷ．（１９８６）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ，ａ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｕｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４］。凝固因子ＸＩａの各重鎖（３６９アミノ酸）は、Ａｐｐｌｅドメイン（Ａ１〜Ａ４と称される）と呼ばれる、９０〜９１アミノ酸の、４つの縦列反復配列と、短い接続ペプチドとを含有する［Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｃｈｕｎｇ  ＤＷ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＬＥ，Ｄａｖｉｅ  ＥＷ．（１９８６）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ，  ａ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｕｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４；Ｓｕｎ  ＭＦ，Ｚｈａｏ  Ｍ，Ｇａｉｌａｎｉ  Ｄ．（１９９９）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｐｐｌｅ  ３  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４：３６３７３−３６３７８］。凝固因子ＸＩａの軽鎖（それぞれ２３８アミノ酸）は、セリンプロテアーゼのトリプシンファミリーに典型的な配列を有する、該酵素の触媒部分を含有する［Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｃｈｕｎｇ  ＤＷ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＬＥ，Ｄａｖｉｅ  ＥＷ．（１９８６）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ，  ａ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｆｏｕｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：２４１７−２４２４］。活性化因子ＸＩａは、因子ＩＸを活性化することにより、血液凝固の内因的経路の中間段階を誘発する。
【０００９】
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載されている抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体が製造されうる。個々のアミノ酸の特性を考慮すると、幾つかの合理的置換が当業者により認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行われうる。例えば、（ａ）無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ、（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ、（ｃ）正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれ、（ｄ）負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、グループ（ａ）〜（ｄ）内で行われうる。また、グリシンおよびプロリンは、それらがα−ヘリックスを破壊しうることに基づいて、別のアミノ酸の代わりに用いられうる。同様に、あるアミノ酸、例えばアラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンは、αヘリックスにおいて、より一般的に見出され、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびトレオニンは、βプリーツシートにおいて、より一般的に見出される。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンはこの順でよく見出される。幾つかの好ましい置換は以下のグループ内で行われうる：（ｉ）ＳおよびＴ、（ｉｉ）ＰおよびＳ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。既知遺伝暗号ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を用いて、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することが可能である。本明細書中で用いる、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるアミノ酸の百分率を示す。「配列相同性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の百分率を示す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％または８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の、ＣＤＲ領域内の配列同一性を有する。好ましい抗体はまた、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の、ＣＤＲ領域内の配列相同性を有する。
【００１０】
本発明のＤＮＡ分子
本発明はまた、本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子に関する。これらの配列は、配列番号１〜１８に記載されているＤＮＡ分子を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のＤＮＡ分子は、本明細書に開示されている配列に限定されず、それらの変異体をも含む。本発明におけるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を示すことにより記載されうる。ＤＮＡは、その相補体を特定するために、そしてＤＮＡは二本鎖であるため、その等価体またはホモログを特定するために、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて使用されうる、と当業者は認識するであろう。ハイブリダイゼーションは１００％未満の相補性でも生じうると認識されるであろう。しかし、条件を適当に選択すれば、ハイブリダイゼーション技術は、ＤＮＡ配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて区別するために用いられうる。そのような条件についての指針に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）］およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９５［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ］を参照されたい。２つのポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、それらの２つの配列が互いにハイブリダイズする条件の「ストリンジェンシー」の関数として表されうる。本明細書中で用いる「ストリンジェンシー」なる語は、その条件がハイブリダイゼーションを妨げる度合を意味する。ストリンジェント条件はハイブリダイゼーションを強く妨げ、そのような条件下では、最も構造的に関連した分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェント条件は、構造的関連性がより低い分子のハイブリダイゼーションを促進する。したがって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは２つの核酸配列の構造的関連性に直接的に相関する。ハイブリダイゼーションおよび関連性を相関させる際には以下の関係が有用である（ここで、Ｔｍは核酸二本鎖の融解温度である）。
【００１１】
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二本鎖ＤＮＡのＴｍはミスマッチ塩基対の数における１％の増加ごとに１℃低下する。
【００１２】
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５  ｌｏｇ１０μ２／μ１
（ここで、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である）。
【００１３】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、全ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する物質の存在を含む多数の因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、より長いプローブサイズおよび水素結合を破壊する物質の非存在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、２つの段階、すなわち、「結合」段階および「洗浄」段階で行われる。第１に、結合段階においては、ハイブリダイゼーションを促進する条件下、プローブが標的に結合する。ストリンジェンシーは、通常、温度を変化させることにより、この段階で制御される。高いストリンジェンシーの場合、温度は、短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブが使用されない限り、通常、６５℃〜７０℃である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト液および１００μｇの非特異的担体ＤＮＡを含む［１５を参照されたい］。勿論、多数の異なるが機能的には等価なバッファー条件が公知である。関連性の度合がより低い場合、より低い温度が選択されうる。低いストリンジェンシーの結合温度は約２５℃〜４０℃である。中等度のストリンジェンシーは少なくとも約４０℃〜約６５℃未満である。高いストリンジェンシーは少なくとも約６５℃である。第２に、過剰なプローブを洗浄により除去する。通常、よりストリンジェントな条件が適用されるのは、この段階である。したがって、ハイブリダイゼーションによる関連性の決定において最も重要なのは、この「洗浄」段階である。洗浄溶液は、典型的には、より低い塩濃度を含有する。１つの典型的な中等度ストリンジェンシー溶液は２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含有する。高いストリンジェンシーの洗浄溶液は約０．２×ＳＳＣ未満の（イオン強度における）等価体を含有し、好ましいストリンジェント溶液は約０．１×ＳＳＣを含有する。種々のストリンジェンシーに関連した温度は、「結合」に関して前記で説明したものと同じである。また、該洗浄溶液は、典型的には、洗浄中に数回交換される。例えば、典型的な高いストリンジェンシーの洗浄条件は５５℃で３０分間の２回の洗浄および６０℃で１５分間の３回の洗浄を含む。したがって、本発明の対象は、本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列である。本発明のもう１つの実施形態は、本発明の抗体をコードする前記の単離された核酸配列である。したがって、本発明は、高いストリンジェンシーの結合および洗浄条件において、記載されている分子にハイブリダイズする核酸分子を含み、ここで、そのような核酸分子は、本明細書に記載されている特性を有する抗体またはその機能的フラグメントをコードする。（ｍＲＮＡの観点から）好ましい分子としては、本明細書に記載されているＤＮＡ分子の１つに対して少なくとも７５％または８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものが挙げられる。該ＤＮＡは、凝固因子ＸＩからその活性形態因子ＸＩａへの変換を低減および／もしくは抑制する、ならびに／または凝固因子ＸＩ��の触媒活性を直接的に阻止する分子をコードする。
【００１４】
組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明は更に、本発明のヌクレオチド配列の１以上を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されるベクター、例えばプラスミド、ファジミド、ファージまたはウイルスベクターと共に使用される。コードされる遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ］に記載されている技術により製造されうる。あるいは、該ＤＮＡ配列は、例えば合成装置を使用して化学合成されうる。例えば、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ［Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）“Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｄｅｒｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ］（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている技術を参照されたい。当業者は、可変ドメインをコードするＤＮＡを、種々のヒトＩｇＧイソタイプまたはそれらの誘導体（突然変異体または非突然変異体）の定常領域をコードする遺伝子フラグメントと融合させることが可能である。当業者は、グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンを３回含有する１５アミノ酸伸長のようなリンカーを使用して可変ドメインの両方を一本鎖形態に融合させるために、組換えＤＮＡ技術を適用することが可能である。本発明の組換え構築物は、コード化ＤＮＡのＲＮＡおよび／またはタンパク質産物を発現しうる発現ベクターに組込まれる。該ベクターは更に、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に機能的に連結されたプロモーターを含む調節配列を含みうる。該ベクターは更に、選択マーカー配列を含みうる。挿入標的遺伝子コード配列の効率的な翻訳には、特異的な開始および細菌分泌シグナルも要求されうる。本発明は更に、本発明のＤＮＡの少なくとも１つを含有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、対応発現ベクターが利用可能な実質的にあらゆる細胞でありうる。それは、例えば、高等真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞、下等真核宿主細胞、例えば酵母細胞であることが可能であり、原核細胞、例えば細菌細胞であることが可能である。宿主細胞内への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはファージ感染により行われうる。
【００１５】
細菌発現
細菌での使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対する機能的な読取相で挿入することにより構築される。該ベクターは１以上の表現型選択マーカー、ならびに該ベクターの維持を確保するための及び所望により宿主内の増幅をもたらすための複製起点を含むであろう。形質転換のための適当な原核宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の種々の種が含まれる。細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはファジミドに基づくものでありうる。これらのベクターは、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の要素を典型的に含有する商業的に入手可能なプラスミドからの細菌複製起点および選択マーカーを含有しうる。適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度までの該宿主株の増殖の後、選択されたプロモーターを適当な手段（たとえば、温度変化または化学的誘導）により脱抑制／誘導し、更なる期間にわたって細胞を培養する。細胞を典型的には遠心分離により集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために取っておく。細菌系においては、発現されるタンパク質に意図される用途に応じて、幾つかの発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、抗体の製造のために又はペプチドライブラリーをスクリーニングするために、大量のそのようなタンパク質を産生させたい場合には、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましいかもしれない。したがって、本発明の目的は、本発明の新規抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
【００１６】
哺乳類発現およびタンパク質精製
哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））ならびにポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウイルス調節要素およびその配列の更なる説明に関しては、Ｓｔｉｎｓｋｉ，Ｕ．Ｓ．５，１６８，０６２；Ｂｅｌｌら，Ｕ．Ｓ．４，５１０，２４５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｕ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択マーカーをも含みうる［Ｂｅｌｌら，Ｕ．Ｓ．４，５１０，２４５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｕ．Ｓ．４，９６８，６１５；Ａｘｅｌら，Ｕ．Ｓ．４，３９９，２１６］。適当な選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物に対する耐性を、該ベクターが導入された宿主細胞に付与する遺伝子を含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキセートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与する。
【００１７】
宿主細胞内への該発現ベクターのトランスフェクションは、標準的な技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションを用いて行われうる。
【００１８】
本発明において提供される抗体、抗原結合性部分またはそれらの誘導体を発現させるための適当な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えば、Ａｘｅｌら，Ｕ．Ｓ．５，１７９，０１７に記載されているＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ａｘｅｌ，Ｕ．Ｓ．４，６３４，６６５に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む］が含まれる。幾つかの実施形態においては、該発現ベクターは、宿主細胞を増殖させる培地内に発現タンパク質が分泌されるように設計される。該抗体、その抗原結合性部分または誘導体は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培地から回収されうる。
【００１９】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホ−セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー（これらに限定されるものではない）を含むよく知られた方法により、組換え細胞培養から回収され精製されうる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いられうる［Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ，Ｃｈａｓｉｎ  ＬＡ．（１９８０）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．７７：４２１６−４２２０；例えば第１，４，６，８，９，１０章（それぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントには、天然精製産物、化学合成法の産物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む真核宿主から組換え技術により製造された産物が含まれる。組換え製造法において使用される宿主に応じて、本発明の抗体はグリコシル化されることが可能であり、あるいはグリコシル化されないことが可能である。そのような方法は多数の標準的な実験マニュアルに記載されている［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，第１０，１２，１３，１６，１８および２０章を参照されたい］。したがって、本発明の目的は該ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞でもあり、ここで、該宿主細胞は、高等真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞、下等真核宿主細胞、例えば酵母細胞であることが可能であり、また、原核細胞、例えば細菌細胞でありうる。本発明のもう１つの目的は、該宿主細胞を適当な条件下で培養し、該抗体を回収することを含む、抗体および抗原結合性フラグメントを製造するための、該宿主細胞の使用方法である。したがって、本発明のもう１つの目的は、本発明の宿主細胞で製造され、少なくとも９５重量％の均一性まで精製された抗体００５−Ｃ０４である。
【００２０】
アフィニティ
「アフィニティ」または「結合アフィニティ」ＫＤは、しばしば、平衡会合定数（Ｋａ）および平衡解離定数（ｋｄ）を測定し、ｋｄ対ｋａの商（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を計算することにより決定される。「免疫特異的」または「特異的に結合する」なる語は、該抗体が、１０−６Ｍ（一価アフィニティ）以下のアフィニティＫＤで、凝固因子ＸＩおよび／またはその活性化形態である凝固因子ＸＩａに結合することを意味する。「高いアフィニティ」なる語は、該抗体が、１０−７Ｍ（一価アフィニティ）以下のアフィニティＫＤで、凝固因子ＸＩおよび／またはその活性化形態である凝固因子ＸＩａに結合することを意味する。該抗体は、他の無関係な分子と比較して標的抗原に対して実質的により大きなアフィニティを有しうる。該抗体は、ホモログと比較して標的抗原に対して実質的により大きなアフィニティ、例えば、標的抗原に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０−３倍、１０−４倍、１０−５倍、１０−６倍以上の相対アフィニティを有しうる。そのようなアフィニティは、通常の技術を用いて、例えば、平衡透析により、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置を使用して、製造業者により概説されている一般的手法を用いて、放射能標識標的抗原を使用するラジオイムノアッセイにより、または当業者に公知の別の方法により、容易に決定されうる。該アフィニティデータは、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．（１９８２）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｎａ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されている方法により分析されうる。
【００２１】
抗体
本明細書中で用いる「凝固因子ＦＸＩおよび／またはその活性化形態である凝固因子ＸＩａを遮断する抗体」なる表現は、凝固因子ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ活性の完全または部分的な抑制を招く、本発明の抗体によるＦＸＩおよび／またはＦＸＩａの遮断を示す意である。そのアミノ酸配列には、配列番号１９〜３６に記載されているアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
「抗体」なる語は最も広い意味で用いられ、完全に構築された抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、該抗原に結合しうる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ジアボディ）、カメル・ボディ（ｃａｍｅｌ  ｂｏｄｙ）、および所望の生物活性を示す前記のものを含む組換えペプチドを含む。抗体は、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４イソタイプ（後記を参照されたい）に由来するその重鎖上の異なる定常ドメイン（Ｆｃドメイン）を保持しうる。エフェクター機能の修飾のための突然変異が導入されうる。補体タンパク質Ｃ１ｑおよびＦｃ受容体との相互作用において主要な役割を果たすＦｃ−ドメイン内のアミノ酸残基が特定されており、エフェクター機能に影響を及ぼす突然変異が記載されている［総説としては、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）を参照されたい］。特に、ＩｇＧ１のアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、アミノ酸２９７位のアスパラギンをアラニンに、またはアスパラギンをグルタミンに突然変異させることにより達成可能であり、これは抗体誘導性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を損なうと報告されている［Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ，Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ．（２００８）Ｗｈｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ｅｎｏｕｇｈ：ｎｏｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７９−４８５］。３２２位におけるアラニンによるリシンの置換はＡＤＣＣの低下および補体誘導性細胞傷害性（ＣＤＣ）の排除を招き、一方、２３４および２３５位における２つのロイシンの、アラニンによる同時置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの回避を引き起こす［Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ＳＬ，Ｏｔｔ  ＲＧ，Ｓｉｌｖｅｒ  ＮＷ，Ｔｉｄｏｒ  Ｂ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ，Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ．（２００８）Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｇａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０５：２０１６７−２０１７２］。アビディティを保有するインビボ二価治療剤としてＩｇＧ４イソタイプを適用するために、「コアヒンジ領域」［Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ，Ｖａｎ  Ｒｅｅ  Ｒ，Ｐｅｒｄｏｋ  ＧＪ，Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎ  ＨＲ，Ｔａｎ  ＫＹ，Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ．（１９９９）Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ４  ｉｓ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ：ｉｔ  ｈａｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．９７：６９３−６９８］内のセリンからプロリンへの置換のような修飾が導入されうる。異種共有結合二量体を形成するヒトＩｇＧ２分子の傾向は、１２７、２３２および２３３位のシステインの１つをセリンに置換することにより妨げられうる［Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＬＣ，Ｒｅｉｌｌｙ  Ｄ，Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ  Ｌ，Ｒａｊｕ  ＴＳ，Ｍｅｎｇ  Ｇ，Ｓｉｍｓ  Ｐ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，Ｄａｍｉｃｏ  ＬＡ，Ｒａｎｃａｔｏｒｅ  Ｐ，Ｙａｎｓｕｒａ  ＤＧ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６３：１３３−１４７］。エフェクター機能の低下を伴うもう１つの形態は、４つのＩｇＧ４特異的アミノ酸残基変化を含有するＩｇＧ２に由来するＩｇＧ２ｍ４形態でありうる［Ｈｅｚａｒｅｈ  Ｍ，Ｈｅｓｓｅｌｌ  ＡＪ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＲＣ，ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ＪＧ，Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．（２００１）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−１２１８］。抗体フラグメントは組換えＤＮＡ技術により、または完全抗体の酵素的もしくは化学的切断により製造可能であり、後記に更に詳しく記載されている。モノクローナル抗体の非限定的な例には、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体およびＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンから誘導された配列を有するキメラ融合タンパク質、またはそれらのムテインもしくは誘導体（それぞれは後記に更に詳しく記載されている）が含まれる。化学的誘導体化抗体を含む、無傷分子および／またはフラグメント（断片）の多量体または凝集物も想定される。
【００２３】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は単一抗原部位に対して高特異的である。更に、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、種々の特異性および特性を有する他の免疫グロブリンにより汚染されずに均一培養により合成される点で、有利である。
【００２４】
「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら［Ａｌｌｅｎ  ＭＪ，Ｇｕｏ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｔ，Ｈａｎ  Ｍ，Ｆｌｙｎｎ  ＧＣ，Ｗｙｐｙｃｈ  Ｊ，Ｌｉｕ  ＹＤ，Ｓｈｅｎ  ＷＤ，Ｄｉｌｌｏｎ  ＴＭ，Ｖｅｚｉｎａ  Ｃ，Ｂａｌｌａｎｄ  Ａ．（２００９）Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｂｅｄ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４８：３７５５−３７６６］により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造可能である［Ａｎ  Ｚ，Ｆｏｒｒｅｓｔ  Ｇ，Ｍｏｏｒｅ  Ｒ，Ｃｕｋａｎ  Ｍ，Ｈａｙｔｋｏ  Ｐ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ，Ｖｉｔｅｌｌｉ  Ｓ，Ｚｈａｏ  ＪＺ，Ｌｕ  Ｐ，Ｈｕａ  Ｊ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＣＲ，Ｈａｒｖｅｙ  ＢＲ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｄ，Ｚａｌｌｅｒ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｆ，Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．（２００９）ＩｇＧ２ｍ４，ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｆｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＭＡｂｓ．１：５７２−５７９を参照されたい］。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換えモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）、または抗体フラグメントでありうる。
【００２５】
「免疫グロブリン」または「天然抗体」は四量体糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンにおいては、各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアから構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の「可変」領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能をもたらす定常領域を定める。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラスに帰属されうる。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして、抗体のイソタイプを定める。イソタイプが異なれば、それが有するエフェクター機能も異なる。例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプは、しばしば、ＡＤＣＣ活性を有する。ヒト軽鎖はカッパ（Ｋ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖においては、可変領域と定常領域とが約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合しており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む［一般的には、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．（１９７５）Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−４９７］。本明細書における抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、抗原結合性領域を保有する、抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合性領域」は、典型的には、抗体の、１以上の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２および／または−３において見出されるが、可変「フレームワーク」領域も、例えば、ＣＤＲにスカフォールド（骨格）を提供することにより、抗原結合において重要な役割を果たしうる。好ましくは、「抗原結合性領域」は、少なくとも、可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４〜１０３および可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５〜１０９、より好ましくは、ＶＬのアミノ酸残基３〜１０７およびＶＨのアミノ酸残基４〜１１１を含み、特に好ましいのは完全なＶＬおよびＶＨ鎖である［ＶＬのアミノ酸１〜１０９位およびＶＨの１〜１１３位；アミノ酸位置の番号づけはＫａｂａｔデータベース（米国特許第４，８１６，５６７号）によっている］。本発明において使用される免疫グロブリンの好ましいクラスはＩｇＧである。
【００２６】
「超可変」領域なる語は、抗原結合をもたらす、抗体または機能的フラグメントの可変ドメインＶＨおよびＶＬのアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」またはＣＤＲからのアミノ酸残基、すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）および８８−９７（ＬＣＤＲ３）、および重鎖可変ドメイン内の残基２９−３６（ＨＣＤＲ１）、４８−６６（ＨＣＤＲ２）および９３−１０２（ＨＣＤＲ３）、および／または超可変ループからの残基、すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６−３２（ＬＣＤＲ１内）、５０−５２（ＬＣＤＲ２内）および９１−９６（ＬＣＤＲ３内）、および重鎖可変ドメイン内の残基２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５３−５５（ＨＣＤＲ２内）および９６−１０１（ＨＣＤＲ３内）［Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されているとおり］を含む。抗体フラグメントの非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖状抗体［Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ，Ｗｕ  ＴＴ．（２０００）Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：３０  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｐｌｏｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１４−２１８］；キレート化組換え抗体、トリボディまたはビボディ、イントラボディ、ナノボディ、スモールモジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰｓ）、抗原結合性ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらのムテインもしくは誘導体、および特異的抗原結合をもたらすのに十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド、例えばＣＤＲ配列（ただし、該抗体は所望の生物活性を保有していなければならない）；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．（１９８７）Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｚａｐａｔａ  Ｇ，Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  Ｊ，Ｏｓａｋａ  Ｇ，Ｗｏｎｇ  ＷＬ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＧＬ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．（１９９５）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２］が含まれる。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、同一であるその結合部位のそれぞれを有すると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメイン間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように操作されうる。抗体のパパイン消化は２つの同一の抗原結合性フラグメント（これらは「Ｆａｂ」フラグメントと称され、それぞれは単一の抗原結合部位を有する）と、残りの「Ｆｃ」フラグメント（その名称は、それが容易に結晶化しうることを表している）とを生成する。ペプシン処理は、２つの「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを与える。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、強固に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定めるように各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用するのは、この立体配置においてである。合せて６個のＣＤＲが抗原結合特異性を抗体にもたらす。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのみのＣＤＲを含む、Ｆｖの半分）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２７】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。
【００２８】
好ましくは、Ｆｖポリペプチドは更に、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの総説としては、Ｃ．Ａ．Ｋ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編，（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００２９】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を含有するＦａｂ’を表す本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、ヒンジシステインを相互間に有するＦａｂ’フラグメントのペアとして得られた。
【００３０】
「フレームワーク」またはＦＲ残基は超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３１】
「定常領域」なる語は、エフェクター機能をもたらす、抗体分子の部分である。
【００３２】
「ムテイン」または「変異体」なる語は互換的に用いられることが可能であり、可変領域または可変領域と等価な部分における少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を意味し、ただし、ムテインまたは変異体は所望の結合アフィニティまたは生物活性を保有する。
【００３３】
ムテインは親抗体に実質的に相同または実質的に同一でありうる。
【００３４】
「誘導体」なる語は、ユビキチン化、治療用または診断用物質へのコンジュゲート化、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素での標識）、重合体の共有結合、例えばペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術により、共有結合により修飾された抗体を意味する。
【００３５】
「ヒト」抗体または機能的ヒト抗体フラグメントは、本明細書においては、キメラ体でも「ヒト化体」でもなく、（全体的または部分的に）非ヒト種からのものでないものと定義される。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントはヒトから誘導可能であり、あるいは合成ヒト抗体でありうる。「合成ヒト抗体」は、本明細書においては、既知抗体配列の分析に基づいて合成配列から全体的または部分的にインシリコで誘導された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを分析し、それから得られたデータを利用してポリペプチド配列を案出することにより達成されうる。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントのもう１つの例は、ヒト由来の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によりコードされるものである（すなわち、そのようなライブラリーは、ヒト天然源から採取された抗体に基づく）。ヒト抗体の例には、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．およびＤｕｅｂｅｌ  Ｓ．編，（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇならびにＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ，Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  Ｅ．（２００１）ｎ−ＣｏＤｅＲ  ｃｏｎｃｅｐｔ：ｕｎｉｑｕｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．１：１０２−１０８に記載されている、ｎ−ＣｏＤｅＲに基づく抗体が含まれる。
【００３６】
「ヒト化抗体」または機能的ヒト化抗体フラグメントは、本明細書においては、（Ｉ）非ヒト（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖系列に基づくもの、または（ＩＩ）ＣＤＲグラフト化体（ここで、可変ドメインのＣＤＲは非ヒト由来であり、一方、可変ドメインの１以上のフレームワークはヒト由来であり、定常ドメインは（存在する場合には）ヒト由来である）として定義される。
【００３７】
本明細書中で用いる「キメラ抗体」なる語は、典型的には異なる種に由来する２つの異なる抗体から誘導された配列を含有する抗体を意味する。最も典型的には、キメラ抗体はヒト抗体フラグメントおよびマウス抗体フラグメント、一般的には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００３８】
本発明の抗体は組換え抗体遺伝子ライブラリーから誘導されうる。組換えヒト抗体遺伝子のレパトワの作製、および繊維状バクテリオファージの表面上のコード化抗体フラグメントの提示のための技術の開発は、ヒト抗体を直接的に製造し、選択するための組換え手段を提供しており、これはヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体またはムテイン抗体にも適用されうる。ファージ技術により製造される抗体は、通常はＦｖまたはＦａｂフラグメント抗原結合性フラグメントとして、細菌において製造され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は以下の２つの方法の１つにより導入されうる。該フラグメントは、哺乳類細胞内での発現のために完全抗体へと、あるいはエフェクター機能を誘発しうる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントへと操作されうる。典型的には、Ｆｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および抗体の軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲにより別々にクローニングし、組合せ（コンビナトリアル）ファージディスプレイライブラリーにおいてランダムに組換え、ついでそれを特定の抗原への結合に関して選択することが可能である。Ｆａｂフラグメントは、ファージ表面上で、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結されて発現される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択はＦａｂコード配列を同時選択し、ついで該配列は増幅されうる。パンニングと称される数ラウンドの抗原結合および再増幅により、該抗原に特異的なＦａｂが富化され、最終的に単離される。
【００３９】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導するための種々の方法が記載されている。そのようなライブラリーは単一マスターフレームワーク上で構築されることが可能であり、米国特許第６，９８９，２５０号、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているとおり、それに対して、多様なインビボ形成（すなわち、ヒト誘導）ＣＤＲが組換え可能となる。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、合成的に作製される核酸によりコードされるインシリコで設計されたアミノ酸配列に基づくものでありうる。抗体配列のインシリコ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、それから得られたデータを利用してポリペプチド配列を案出することにより達成される。インシリコ作製配列を設計し、入手するための方法は記載されており、以下のものを参照されたい：Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ，Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  Ｅ．（２００１）ｎ−ＣｏＤｅＲ  ｃｏｎｃｅｐｔ：ｕｎｉｑｕｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．１：１０２−１０８；米国特許第６，９８９，２５０号；Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ，Ｇｅ  Ｌ，Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ，Ｐａｃｋ  Ｐ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｍ，Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ  Ｇ，Ｈｏｅｓｓ  Ａ，Ｗｏｌｌｅ  Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ，Ｖｉｒｎｅｋａｓ  Ｂ．（２０００）Ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ＣＤＲｓ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６。ファージディスプレイ技術の総説としては、Ｋｒｅｂｓ  Ｂ，Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ，Ｒｅｉｆｆｅｒｔ  Ｓ，Ｒｏｔｈｅ  Ｃ，Ｔｅｓａｒ  Ｍ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  Ｅ，Ｃａｏ  Ｍ，Ｄｒｅｉｅｒ  Ｔ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，Ｈｏｓｓ  Ａ，Ｉｎｇｅ  Ｌ，Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ，Ｍａｒｇｅｔ  Ｍ，Ｐａｃｋ  Ｐ，Ｍｅｎｇ  ＸＱ，Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ，Ｓｏｈｌｅｍａｎｎ  Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｌｅ  Ｊ，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｔ．（２００１）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４を参照されたい。
【００４０】
あるいは、本発明の抗体は動物に由来しうる。そのような抗体はヒト化またはヒト操作（Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されうる［Ｋｒｅｂｓ  Ｂ，Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ，Ｒｅｉｆｆｅｒｔ  Ｓ，Ｒｏｔｈｅ  Ｃ，Ｔｅｓａｒ  Ｍ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  Ｅ，Ｃａｏ  Ｍ，Ｄｒｅｉｅｒ  Ｔ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，Ｈｏｓｓ  Ａ，Ｉｎｇｅ  Ｌ，Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ，Ｍａｒｇｅｔ  Ｍ，Ｐａｃｋ  Ｐ，Ｍｅｎｇ  ＸＱ，Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ，Ｓｏｈｌｅｍａｎｎ  Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｌｅ  Ｊ，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｔ．（２００１）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４に要約されている］。そのような抗体はトランスジェニック動物に由来しうる［Ｋｒｅｂｓ  Ｂ，Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｒ，Ｒｅｉｆｆｅｒｔ  Ｓ，Ｒｏｔｈｅ  Ｃ，Ｔｅｓａｒ  Ｍ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ  Ｅ，Ｃａｏ  Ｍ，Ｄｒｅｉｅｒ  Ｔ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｄ，Ｈｏｓｓ  Ａ，Ｉｎｇｅ  Ｌ，Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ，Ｍａｒｇｅｔ  Ｍ，Ｐａｃｋ  Ｐ，Ｍｅｎｇ  ＸＱ，Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ，Ｓｏｈｌｅｍａｎｎ  Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｌｅ  Ｊ，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｔ．（２００１）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４を参照されたい］。本明細書中で用いる異なる「形態」の抗原、例えば、凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａは、本明細書においては、異なる翻訳および翻訳後修飾、例えば、一次ＦＸＩ転写産物のスプライシングにおける相違、グリコシル化における相違および翻訳後タンパク質分解切断における相違（これらに限定されるものではない）により生じた異なるタンパク質分子として定義される。
【００４１】
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合しうるいずれかのタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。２つの抗体が「同一エピトープに結合する」と言えるのは、１つの抗体が、当業者によく知られた方法のいずれかによる競合結合アッセイにおいて、もう１つの抗体と競合することが示される場合、そして好ましくは、該エピトープの全アミノ酸がそれらの２つの抗体に結合する場合である。「成熟抗体」または「成熟抗原結合フラグメント」（例えば、成熟Ｆａｂ変異体）なる語は、より強力な、および／または改善された、所定抗原（例えば、ＦＸＩ）への結合（すなわち、増加したアフィニティでの結合）を示す、抗体または抗体フラグメントの誘導体を含む。成熟は、このアフィニティ増加を招く、抗体または抗体フラグメントの６個のＣＤＲにおける少数の突然変異を特定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体内への突然変異の導入のための分子生物学的方法と、改善された結合体を特定するためのスクリーニングとの組合せである。
【００４２】
医薬組成物および投与
本発明はまた、ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体を、単独で、または少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と共に含みうる医薬組成物に関する。これは、塩類液、緩衝塩類液、デキストロースおよび水（これらに限定されるものではない）を含むいずれかの無菌生体適合性医薬担体中で投与されうる。これらの分子はいずれも、それが賦形剤または医薬上許容される担体と混合された医薬組成物中で、単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと共に、患者に投与されうる。本発明の１つの実施形態においては、医薬上許容される担体は医薬上不活性である。本発明はまた、医薬組成物の投与に関する。そのような投与は非経口的に行われる。非経口的運搬の方法には、局所、動脈内（腫瘍へ直接的に）、筋肉内、皮下、脊髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内または鼻腔内投与が含まれる。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬上使用されうる製剤への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む適当な医薬上許容される担体を含有しうる。製剤化および投与のための技術に関する更なる詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版において見出されうる。
【００４３】
非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射の場合には、本発明の医薬組成物は、水溶液中、好ましくは、生理的に許容されるバッファー、例えば、ハンクス液、リンガー液または生理緩衝塩類液（生理緩衝食塩水）中で製剤化されうる。水性注射懸濁剤は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射懸濁剤として製造されうる。適当な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、該懸濁剤は、適当な安定剤、または高濃縮溶液の製造を可能にする、該化合物の溶解度を増加させる物質をも含有しうる。局所または鼻腔内投与の場合には、浸透すべき個々のバリヤに適した浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は一般に当技術分野で公知である。非経口投与はまた、動脈内、筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内および心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内または鼻腔内投与をも含む非経口運搬の方法を含む。
【００４４】
キット
本発明は更に、本発明の前記組成物の成分の１以上が充填された１以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。そのような容器には、ヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売の機関による承認を示す、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた通知が添付されている。
【００４５】
もう１つの実施形態においては、該キットは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を含有しうる。好ましくは、これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、宿主細胞内へのトランスフェクションおよび宿主細胞による発現に適したプラスミド中で提供される。該プラスミドは、宿主細胞における該ＤＮＡの発現を調節するプロモーター（しばしば、誘導プロモーター）を含有しうる。該プラスミドは、種々の抗体を製造するための該プラスミド内への他のＤＮＡ配列の挿入を促進する適当な制限部位をも含有しうる。該プラスミドはまた、コード化タンパク質のクローニングおよび発現を促進する多数の他の要素を含有しうる。そのような要素は当業者によく知られており、例えば、選択マーカー、開始コドン、終結コドンなどを含む。
【００４６】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖剤製造、水ひ、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥法による、当技術分野で公知の方法で製造されうる。該医薬組成物は、使用前にバッファーと一緒にされる、４．５〜５．５のｐＨ範囲の１ｍＭ〜５０ｍＭ  ヒスチジン、０．１％〜２％  スクロース、２％〜７％  マンニトール中の凍結乾燥粉末として提供されうる。許容される担体中で製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物が製造されたら、それらは適当な容器内に配置され、適応状態の治療に関してラベル表示されうる。抗凝固因子ＸＩおよび／または抗凝固因子ＸＩａ抗体の投与の場合、そのようなラベル表示は投与の量、頻度および方法を含むであろう。
【００４７】
ＩＣ５０／ＥＣ５０
ＦＤＡによれば、ＩＣ５０は、与えられた生物学的プロセスの５０％抑制に必要な化合物の濃度を表す。本発明の抗体は１００μＭ、好ましくは１μＭ、より好ましくは０．１μＭ、より好ましくは０．０１μＭ、より好ましくは０．００１μＭ、より好ましくは０．０００１μＭのＩＣ５０値を示す。
【００４８】
治療的有効量
本発明における使用に適した医薬組成物には、意図される目的、すなわち、凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａにより特徴づけられる個々の病態の治療を達成するための有効量の有効成分を含有する組成物が含まれる。有効量の決定は十分に当業者の技量の範囲内である。
【００４９】
治療的有効量は、症状または状態を改善する、タンパク質またはその抗体、アンタゴニストまたはインヒビターの量を意味する。そのような化合物の治療効力および毒性は細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）により決定されうる。治療効果と毒性効果との用量比は治療係数であり、それは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表されうる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の設定において用いられる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与量、患者の重症度および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【００５０】
厳密な投与量は、使用される患者を考慮して、個々の医師により選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を与えるように、または所望の効果を維持するように調節される。考慮されうる追加的な因子には、病態の重症度、患者の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性、ならびに療法に対する耐性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物は、個々の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日ごとに、毎週、または２週間に１回、または１カ月に１回投与されうるであろう。
【００５１】
通常の投与量は、投与経路に応じて、約２ｇまでの合計用量で、０．１〜１００，０００マイクログラムで変動しうる。個々の投与量および運搬方法に関する指針は文献に記載されている［米国特許第６，３００，０６４号を参照されたい］。当業者は、ポリヌクレオチドの場合には、タンパク質またはそれらのインヒビターの場合とは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの運搬は個々の細胞、状態、位置などに特異的であろう。放射能標識抗体に関する好ましい比活性は０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質の範囲でありうる［ＷＯ０８／０２２２９５，ＵＳ．４，６５７，７６０；ＵＳ  ５，２０６，３４４；ＵＳ  ５，２２５，２１２；Ｒｉｖａ  Ｐ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ  Ｇ，Ｆｒａｔｔａｒｅｌｌｉ  Ｍ，Ｌａｚｚａｒｉ  Ｓ，Ｒｉｖａ  Ｎ，Ｇｉｕｌｉａｎｉ  Ｇ，Ｃａｓｉ  Ｍ，Ｓａｒｔｉ  Ｇ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ  Ｇ，Ｇｉｏｒｇｅｔｔｉ  Ｇ，Ｇｅｎｔｉｌｅ  Ｒ，Ｓａｎｔｉｍａｒｉａ  Ｍ，Ｊｅｒｍａｎｎ  Ｅ，Ｍａｅｋｅ  ＨＲ．（１９９９）Ｌｏｃｏ−ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ９０Ｙ：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５（１０  Ｓｕｐｐｌ）：３２７５ｓ−３２８０ｓ］。
【００５２】
本発明は以下の実施例により更に詳細に説明される。該実施例は、特定の実施形態に関して本発明を例示するものであるに過ぎない。これらの例示は、本発明の或る特定の態様を例示するものであり、限定を示すものではなく、また、開示されている本発明の範囲を制限するものでもない。
【００５３】
全ての実施例は、詳細に特記されていない限り、当業者によく知られており常套的である標準的な技術を用いて行った。以下の実施例の通常の分子生物学的技術は、標準的な実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡに記載されているとおりに行われうる。
【００５４】
バッファー中の凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａの阻害の測定
前記の物質の因子Ｘａ阻害を決定するために、ヒト因子ＸＩａの酵素活性を決定するために因子ＸＩａ基質の変換を用いる生物学的試験系を構築する。該決定はマイクロタイタープレート内で行われる。
【００５５】
抗凝固活性の決定
試験物質の抗凝固活性をヒト血漿および／またはウサギ血漿および／またはラット血漿においてインビトロで決定する。この目的のために、０．１１モル濃度のクエン酸ナトリウムを受容物として使用して、血液を１／９のクエン酸ナトリウム／血液の混合比で採取する。血液採取の直後に、それを十分に混合し、約４０００ｇで１５分間遠心分離する。上清をピペットで除去する。
【００５６】
市販の試験キット（Ｒｏｃｈｅ（かつては、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＮｅｏｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）またはＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＨｅｍｏｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＲｅｃｏｍｂｉＰｌａｓｔｉｎ）を使用して、種々の濃度の試験物質または対応溶媒の存在下、プロトロンビン時間（ＰＴ，同義語：トロンボプラスチン時間、迅速試験）を決定する。試験化合物を該血漿と共に３７℃で３分間インキュベートする。ついでトロンボプラスチンの添加により凝固を開始させ、凝固が生じる時間を決定する。プロトロンビン時間の倍加をもたらした試験物質の濃度を決定する。
【００５７】
市販の試験キット（Ｒｏｃｈｅのトロンビン試薬）を使用して、種々の濃度の試験物質または対応溶媒の存在下、トロンビン時間（ＴＴ）を決定する。試験化合物を該血漿と共に３７℃で３分間インキュベートする。ついで該トロンビン試薬の添加により凝固を開始させ、凝固が生じる時間を決定する。トロンビン時間の倍加をもたらす試験物質の濃度を決定する。
【００５８】
市販の試験キット（ＲｏｃｈｅのＰＴＴ試薬）を使用して、種々の濃度の試験物質または対応溶媒の存在下、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を決定する。試験化合物を該血漿および該ＰＴＴ試薬（セファリン、カオリン）と共に３７℃で３分間インキュベートする。ついで２５ｍＭ  塩化カルシウムの添加により凝固を開始させ、凝固が生じる時間を決定する。ａＰＴＴの倍加をもたらす試験物質の濃度を決定する。本発明の抗体の濃度は１００μＭの濃度、好ましくは１μＭの濃度、より好ましくは０．１μＭの濃度、より好ましくは０．０１μＭの濃度、より好ましくは０．００１μＭの濃度、より好ましくは０．０００１μＭの濃度、より好ましくは０．００００１μＭの濃度でａＰＴＴの倍加を招く。
【００５９】
治療用途
本発明の抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体は、凝固カスケードの阻害および血小板凝集の抑制および血栓症の抑制が有益である任意の対象に投与されうる。したがって、本発明の抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体はヒトおよび動物における凝固関連疾患の治療および／または予防に適している。「血栓塞栓疾患」なる語は、心筋梗塞（ＭＩ）または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）（ＥＣＧ上のＳＴ上昇を伴う及び伴わないもの）（ＳＴＥＭＩおよび非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症および不安定狭心症、血管形成術後または冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）のような冠状動脈介入後の再閉塞および再狭窄、末梢血管塞栓症（ＰＡＯＤ）、肺塞栓症（ＰＥ）、深在性静脈血栓症（ＤＶＴ）および腎静脈血栓症、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、血栓性卒中および血栓塞栓性卒中のような疾患を含む。
【００６０】
これらの抗体は、脳虚血、卒中発作および全身性血栓塞栓症のような心原性血栓塞栓症の治療および予防、不規則心拍または異常心リズムを有する患者、例えば心房細動を有する患者、人工心臓弁を有する心臓弁膜症を有する患者の治療にも有用である。更に、これらの抗体は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する患者の治療に役立ちうるであろう。
【００６１】
血栓塞栓性合併症は、急性血栓性閉塞を招きうる、血管壁のアテローム性動脈硬化病変、特に、内皮機能の障害により引き起こされうる。アテローム性動脈硬化症は、多数の心血管リスク因子に基づく多因性障害である。臨床研究は、抗凝固物質での予防が動脈血管障害の経過に明確には影響を及ぼさないことを示している。したがって、抗血栓療法と組合されたリスク因子の標的化治療は有利である。冠状動脈、末梢および脳血管障害のリスク因子は、例えば、血清コレステロールレベルの上昇、動脈高血圧、喫煙および糖尿病である。予防医学の原理はこれらのリスク因子の排除に基づいている。生活習慣の改変に加えて、薬理学的手段、例えば、抗高血圧療法、脂質低下薬または血栓症予防も含まれる。また、冠状動脈治療剤との組合せは、冠状動脈心疾患の既に存在する場合の治療に適している。
【００６２】
血栓塞栓性合併症は、細血管障害性溶血性貧血（ＭＡＨＡ）、血液透析および大動脈弁置換術のような体外血液循環に関わっている。
【００６３】
また、本発明の抗体は関節リウマチ（ＲＡ）のような炎症疾患、またはアルツハイマー病（ＡＤ）のような神経疾患の治療または予防に有用である。更に、これらの抗体は、癌および転移、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎障害および他の微小血管疾患の治療に有用でありうるであろう。
【００６４】
本発明の抗体は、腫瘍患者の手術後の、あるいは化学療法および／または放射線療法を受けている腫瘍患者における血栓塞栓性合併症の治療にも有用である。
【００６５】
本発明の抗体は、透析患者の治療および／または予防、特に、血液透析におけるシャント血栓症のチミノ（Ｃｉｍｉｎｏ）フィステルの予防にも有用である。血液透析は、天然動静脈フィステル、合成ループ移植片、大きな内径の中心静脈カテーテル、または人工表面からなる他の装置を使用して行われうる。本発明の抗体の投与は、透析中およびその直後の両方における、フィステル内の血餅の形成（および肺動脈内の塞栓血餅の伝達）を妨げるであろう。本発明の抗体は、心肺バイパス手術（例えば、ＥＣＭＯ：体外膜型肺）後の心臓内および肺内血栓症の患者の治療および／または予防にも有用である。全身抗凝固ならびに装置の機械的安定性および持続が要求されるなかで、心室補助人工心臓の大きな欠点は高頻度の血栓閉塞事象である。したがって、本発明の抗体は、左心補助循環装置を装着している患者の治療および／または予防にも有用である。透析患者においては、この集団における静脈血栓閉塞（ＶＴＥ）および心房細動（例えば、血液透析患者における最終段階の腎疾患）の頻度が高く、望ましくない出血事象のリスクを増加させない抗凝固が大いに必要とされている。本発明の抗体はこれらのタイプの患者の治療および／または予防にも有用である。本発明の抗体は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＰＴ）に冒された患者の治療および／または予防にも有用である。これらの患者は、一般集団と比較して増加した血栓症リスクを有する。凝固因子ＦＸＩの濃度は、ＩＴＰ患者においては、対照と比較して有意に高く、ａＰＴＴは、ＩＴＰ患者においては、有意に、より長い。本発明の抗体は肺高血圧の治療および／または予防にも有用である。
【００６６】
「肺高血圧」なる語は、世界保健機関ＷＨＯ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ｖｅｎｉｃｅ  ２００３）により定義された指針に従い、例えば、肺動脈高血圧、左室疾患により引き起こされる肺高血圧、肺疾患および／または低酸素症により、血餅、動脈狭窄および慢性血栓塞栓肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）のような他の疾患により引き起こされる肺高血圧を含む。
【００６７】
「肺高血圧」なる語は、特発性肺動脈高血圧ＩＰＡＨ、家族性肺動脈高血圧（ＦＰＡＨ）、関連肺動脈高血圧（ＡＰＡＨ）のような疾患をも含み、これらは、甲状腺疾患、グリコーゲン蓄積病（ＧＳＤ）、ゴーシェ病（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｇａｕｃｈｅｒ）、遺伝性出血性毛細血管拡張および／または骨髄増殖性障害のような疾患と共に、膠原病、先天性全身性肺シャントビチア（ｓｈｕｎｔ  ｖｉｔｉａ）、ＨＩＶ感染または或る薬物の投与に関連づけられうるであろう。
【００６８】
本発明の抗体は、肺静脈閉塞病、肺毛細血管血管腫症（ＰＣＨ）、および新生児遷延性肺高血圧症のような疾患の治療および／または予防に有用である。
【００６９】
「肺高血圧」なる語はまた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＤＰ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、睡眠時無呼吸、肺胞過換気、高山病および体質性異形成のような疾患を含む。
【００７０】
慢性血栓塞栓性肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）により引き起こされる疾患は、近位および／または遠位肺動脈閉塞、あるいは癌、寄生生物または汚染物のような非血栓性肺閉塞に関連づけられうる。
【００７１】
更に、本発明の抗体は、サルコイドーシス、組織球症Ｘおよびリンパ管腫症により引き起こされる肺高血圧の治療および／または予防に使用されうる。
【００７２】
また、本発明の抗体は肺および／または肝線維症の治療および／または予防に有用でありうる。
【００７３】
本発明の抗体は、敗血症、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、臓器機能不全、多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の治療および／または予防にも有用である。
【００７４】
「敗血症」なる語は、感染の、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）の発生を意味する。ＳＩＲＳは主に感染により誘発されるが、損傷、熱傷、ショック、手術、虚血、膵炎、蘇生または腫瘍疾患の後でも生じうる。敗血症の経過中、播種性血管内凝固または略してＤＩＣと称される過程である凝固カスケードが活性化されうる。これは微小血栓の形成および二次合併症を招きうる。
【００７５】
また、敗血症またはＳＩＲＳは内皮機能不全を招いて、血管透過性の増加を招きうる。敗血症またはＳＩＲＳの経過中、幾つかの臓器の合併不全、例えば腎不全、肝不全、肺不全、心血管系の不全が生じうる。
【００７６】
敗血症またはＳＩＲＳを誘発する病原性生物としては、グラム陽性およびグラム陰性細菌、真菌、ウイルスならびに／または真核性病原体が挙げられる。
【００７７】
ＤＩＣおよび／またはＳＩＲＳは敗血症と共に生じうるが、手術、腫瘍疾患、熱傷または他のタイプの損傷によっても生じうる。
【００７８】
ＤＩＣ中に、損傷血管または他のタイプの組織の表面において凝固カスケードの活性化が生じる。これは微小血栓の形成を招き、それにより小血管の閉塞が生じる。
【００７９】
１つの実施形態においては、該抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体は、前記疾患の治療および／または予防のための他の薬物と組合せて使用される。
【００８０】
以下に、適当な組合せの例を一覧する。したがって、これらは好ましい例が記載されている。
【００８１】
・脂質低下化合物、特に、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡレダクターゼのインヒビター、例えば、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（メバコール（Ｍｅｖａｃｏｒ）；ＵＳ  ４，２３１，９３８）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（ゾコール（Ｚｏｃｏｒ）；ＵＳ  ４，４４４，７８４）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）；ＵＳ  ４，３４６，２２７）、フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（レスコール（Ｌｅｓｃｏｌ）；ＵＳ  ５，３５４，７７２）およびアトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ；ＵＳ  ５，２７３，９９５）との組合せ。
【００８２】
・冠状動脈疾患の治療に適した化合物および／または血管拡張活性を示す化合物、特に、アンジオテンシン変換酵素のインヒビター、例えば、カプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ）、リシノプリル（Ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、エナラプリル（Ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、ラミプリル（Ｒａｍｉｐｒｉｌ）、シラザプリル（Ｃｉｌａｚａｐｒｉｌ）、ベナゼプリル（Ｂｅｎａｚｅｐｒｉｌ）、フォシノプリル（Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）、キナプリル（Ｑｕｉｎａｐｒｉｌ）およびペリンドプリル（Ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ）、またはアンジオテンシンＩＩ受容体のアンタゴニスト、例えば、エンブサルタン（Ｅｍｂｕｓａｒｔａｎ）（ＵＳ  ５，８６３，９３０）、ロサルタン（Ｌｏｓａｒｔａｎ）、バルサルタン（Ｖａｌｓａｒｔａｎ）、イルベサルタン（Ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、カンデサルタン（Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）、エプロサルタン（Ｅｐｒｏｓａｒｔａｎ）およびテミサルタ（Ｔｅｍｉｓａｒｔａ）、またはβ−アドレナリン作動性受容体のアンタゴニスト、例えば、カルベジロール（Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ）、アルプレノロール（Ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）、ビソプロロール（Ｂｉｓｏｐｒｏｌｏｌ）、アセブトロール（Ａｃｅｂｕｔｏｌｏｌ）、アテノロール（Ａｔｅｎｏｌｏｌ）、ベタキソロール（Ｂｅｔａｘｏｌｏｌ）、カルテオロール（Ｃａｒｔｅｏｌｏｌ）、メトプロロール（Ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、ナドロール（Ｎａｄｏｌｏｌ）、ペンブトロール（Ｐｅｎｂｕｔｏｌｏｌ）、ピンドロール（Ｐｉｎｄｏｌｏｌ）、プロパノロール（Ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）およびチモロール（Ｔｉｍｏｌｏｌ）との組合せ、あるいはアルファ１アドレナリン作動性受容体のアンタゴニスト、例えば、プラゾシン（Ｐｒａｚｏｓｉｎ）、ブナゾシン（Ｂｕｎａｚｏｓｉｎ）、ドキサゾシンン（Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）およびテラゾシン（Ｔｅｒａｚｏｓｉｎ）との組合せ。
【００８３】
・利尿剤ヒドロクロロチアジド（Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ）、フロセミド（Ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）、ブメタニド（Ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、ピレタニド（Ｐｉｒｅｔａｎｉｄｅ）、トラセミド（Ｔｏｒａｓｅｍｉｄｅ）、アミロリド（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）およびジヒドララジン（Ｄｉｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）との組合せ。
【００８４】
・カルシウムチャネルのインヒビター、例えば、ベラパミル（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ）およびジルチアゼム（Ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、ジヒドロピリジン誘導体、例えば、ニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎ）（アダラート（Ａｄａｌａｔ））、ニトレンジピン（Ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎ）（バヨテンシン（Ｂａｙｏｔｅｎｓｉｎ））、イソソルビド−５−モノニトラート、イソソルビド−ニジトラートおよびグリセロールトリニトラート（Ｇｌｙｃｅｒｏｌｔｒｉｎｉｔｒａｔ）との組合せ。
【００８５】
・環状グアノシンモノホスファート（ｃＧＭＰ）の濃度の増加を招く化合物、例えば、可溶性グアニラートシクラーゼの刺激物質（ＷＯ  ９８／１６２２３，ＷＯ  ９８／１６５０７，ＷＯ  ９８／２３６１９，ＷＯ  ００／０６５６７，ＷＯ  ００／０６５６８，ＷＯ  ００／０６５６９，ＷＯ  ００／２１９５４，ＷＯ  ００／６６５８２，ＷＯ  ０１／１７９９８，ＷＯ  ０１／１９７７６，ＷＯ  ０１／１９３５５，ＷＯ  ０１／１９７８０，ＷＯ  ０１／１９７７８，ＷＯ  ０７／０４５３６６，ＷＯ  ０７／０４５３６７，ＷＯ  ０７／０４５３６９，ＷＯ  ０７／０４５３７０，ＷＯ  ０７／０４５４３３）との組合せ。
【００８６】
・凝固カスケードの他のインヒビター、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター（血栓溶解物質／フィブリン溶解物質）、ならびに血栓溶解および／またはフィブリン溶解を増強する化合物、またはプラスミノーゲンアクチベーターのインヒビターまたはトロンビン活性化フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩインヒビター）のインヒビター、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ（Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）およびウロキナーゼとの組合せ。
【００８７】
・抗凝固物質、例えば、非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）および／またはアルガトロバン（Ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）との組合せ。
【００８８】
更なる組合せ療法としては、抗生物質療法、抗真菌療法剤および抗ウイルス療法剤との抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体の共投与が挙げられる。
【００８９】
更なる抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体の組合せ。
【００９０】
・昇圧薬、例えば、ノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）およびバソプレッシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）との組合せ。
【００９１】
・変力療法、例えば、ドブタミン（Ｄｏｂｕｔａｍｉｎｅ）。
【００９２】
・コルチコステロイド、例えば、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎ）またはフルドロコルチゾン（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）。
【００９３】
・組換え発現された活性化プロテインＣ。
【００９４】
・血液製剤、例えば、新鮮凍結血漿、赤血球濃縮物および／または血小板濃縮物。
【００９５】
本発明のもう１つの実施形態は、凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａを含有する血液プローブ、血液保存、他の血漿製品または生物学的サンプルのための抗凝固物質としての、抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体の使用である。これらのサンプルは、インビトロ凝固を回避するために有効濃度の該抗体が加えられていることにより特徴づけられる。
【００９６】
本発明の抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体は、エクスビボ凝固の抑制のために、例えば、血液カテーテルまたは他の医学的添加物もしくは装置の調製のため、インビボの人工表面のコーティングのために、ならびに凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａを含有する、エクスビボで使用される医学的添加物、装置または他の生物学的サンプルにも使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ヒトＦＸＩａを抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号１９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の用量反応曲線（ＥＣ５０はＩＣ５０と同一である）。この抗体はＣＤＲＨ１としての配列番号２１、ＣＤＲＨ２としての配列番号２２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号２３を含む。この抗体は更に、ＣＤＲＬ１としての配列番号２４、ＣＤＲＬ２としての配列番号２５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号２６を含む。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。関連ＤＮＡ配列を配列番号１〜配列番号８として示す。
【図２】ウサギＦＸＩａを抑制する抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ウサギＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図３】ヒトＦＸＩａを抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２７および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２０を含む抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄの用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図４】抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄの用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、ウサギＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するその能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図５】凝固因子ＸＩＩａを介したヒトＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号２９および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列として配列番号３０を含む抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。この抗体は、ＣＤＲＨ１としての配列番号３１、ＣＤＲＨ２としての配列番号３２、およびＣＤＲＨ３としての配列番号３３を含む。この抗体は更に、ＣＤＲＬ１としての配列番号３４、ＣＤＲＬ２としての配列番号３５、およびＣＤＲＬ３としての配列番号３６を含む。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。関連ＤＮＡ配列を配列番号１１〜配列番号１８として示す。
【図６】凝固因子ＩＩａによるヒトＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図７】凝固因子ＸＩＩａによるウサギＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図８】凝固因子ＩＩａによるウサギＦＸＩからＦＸＩａへの変換を抑制する抗ＦＸＩ抗体０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の用量反応曲線。パンニング／スクリーニング法において特定された抗体を、チモーゲンＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへの変換を抑制するそれらの能力に関して、示されている濃度において試験した。
【図９】ヒトＦＸＩａの触媒ドメインへの０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の結合および遮断活性。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４はヒトＦＸＩａのタンパク質分解活性を抑制するが、０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７はそのような活性を示さない。このことは、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４がＦＸＩａの触媒ドメインに結合することを示している。
【図１０】ラインウィーバー−バークプロットを用いる０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の結合様式の特徴づけは、この抗体が競合型阻害活性を示すことを示している。
【図１１】ＣＤ６２Ｐ発現および血小板微小凝集物形成に関するフローサイトメトリー分析。光散乱とＦＩＴＣ−ＣＤ４１／ＣＤ６１（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）蛍光との組合せにより、単一血小板が検出された。（Ａ）ＦＩＴＣ−ＣＤ４１およびＰＥ−ＣＤ６２Ｐ蛍光でのドットプロットによるＣＤ６２Ｐ発現の決定。潅流の前（左）および後（右）のゲートされた血小板を示す。（Ｂ）血小板微小凝集物形成が、円内に示されているサイズ増加（前方散乱）により特徴づけられた。潅流の前（左）および後（右）に集められたサンプルのドットプロットを示す。
【図１２】血小板ＣＤ６２Ｐ発現がＦＸＩ（ａ）抗体により減少した。全血を（Ａ）０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および（Ｂ）０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７で処理し、再石灰化の直後にコラーゲン被覆表面上で潅流した。並行して、全血サンプルをビヒクルまたはインヒビターで処理した後に集め、ＴＲＡＰ６（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で５分間インキュベートした。図１１に示されているとおり、血小板ＣＤ６２Ｐ発現をフローサイトメトリーにより分析した。データは、少なくとも５つの実験のゲートされた集団におけるＣＤ６２Ｐ陽性血小板の平均±ＳＥＭ％として示されている。各処理における５分間の潅流中の最大ＣＤ６２Ｐ発現レベルがグラフに示されている。
【図１３】血小板微小凝集物形成はＦＸＩ（ａ）抗体により抑制された。全血を（Ａ）  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および（Ｂ）０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７で処理し、再石灰化の直後にコラーゲン被覆表面上で潅流した。血小板微小凝集物を、図１３に示されているとおりにフローサイトメトリーにより分析し、表示した。データは、少なくとも５つの実験の１０４個のゲートされた単一血小板に対する平均±ＳＥＭ凝集物数として示されている。各処理における５分間の潅流中の最大凝集物数がグラフに示されている。
【図１４】塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４のインビボ効果。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４は、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１５】塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄのインビボ効果（実施例ｘｘｘに記載されている）。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄは、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１６】インビボ効果は、塩化第二鉄誘発性血栓症（ａ）および耳出血時間（ｂ）に対する０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の効果（実施例ｘｘｘに記載されている）を示している。０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７は、耳出血時間を増加させることなく血栓重量を用量依存的に減少させることを示すことができた。
【図１７】この図は、ＦＸＩａ（上部）と複合体形成したＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（下部）のポンチ絵表示を示す。
【図１８ａ】この図はＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓに対するＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（ポンチ絵）の結合エピトープの詳細図を示す。ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓは表面表示として示されている。
【図１８ｂ】この図は、表面表示として示されたＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの重ね合せペプチドＸ線構造を伴うＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を示す。活性部位間隙が赤色楕円形で強調されている。
【図１９ａ】この図は、重ね合されたＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を伴うチモーゲンＦＸＩ（ｏｄｂエントリー２Ｆ８３）の結晶構造を示す。
【図１９ｂ】この図は同じ図を示すが、チモーゲンのＦＸＩの触媒ドメインがＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４：ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ複合体構造のＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの触媒ドメインにより置換されている。ＦＸＩおよびＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの触媒ドメインは表面表示として示されており、全ての他のドメインはポンチ絵として示されている。Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４との境界における適切に秩序だっていないループが図１９において強調されている。
【図２０】０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与の後にヒヒから集められた血漿サンプルにおいて決定されたインビトロａＰＴＴ血餅形成時間の増加。
【図２１】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の、投与後５分から投与後５０４時間までのＡＣＴ測定値。
【図２２】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の最初の２４時間のＡＣＴ測定値。
【図２３】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の、投与後５分から投与後５０４時間までのａＰＴＴ測定値。
【図２４】２．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与（ｉ．ｖ．ボーラス）の後の最初の２４時間のａＰＴＴ測定値。
【図２５】２ｍｍ  ｉ．ｄ．コラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ血管移植片における血小板沈着。
【図２６】実施例１２に記載されているコラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ血管移植片における血小板沈着。
【図２７】実施例１２に記載されている静脈成長チャンバー（およびコラーゲン被覆移植片とシリコンチャンバーとの間の連結部）における血小板沈着。
【図２８】０７６Ｄ−Ｍ００７−ＨＯ４の投与の後でヒヒ血漿において測定されたＴＡＴレベル。
【図２９】０．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および２ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（２４時間後）単独で、あるいはチュアブル・アスピリンを３２ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた後に処理されたヒヒにおける出血時間。
【００９８】
実施例１：抗体の特定
ファージ選択に使用される手段：
本発明のヒト抗体の単離に使用したタンパク質は、表１に一覧されている種々の入手源から入手した。約２倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．ＮＯ：２１３４７）を製造業者の説明に従い使用して、タンパク質をビオチン化し、ゼバ（Ｚｅｂａ）脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．ＮＯ：８９８８９）を使用して、脱塩した。
【表１】
0006348900.tif 000002
【００９９】
ファージ選択：
本発明のヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントの単離は、天然多様性および合成多様性を併せ持つＦａｂライブラリーであるＤＹＡＸのヒトＦａｂ抗体ライブラリーＦＡＢ−３１０（ＤＹＡＸ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｈｏｅｔら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００５，２３：３４４−８に記載されている）を使用するファージディスプレイ技術により行った。表２〜６は、複数のエピトープをカバーする抗体を選択するために用いた種々の方法を要約する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１００】
この実施例において使用した標準的なバッファーは以下のものである：
１×ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ（Ｄ５６５２−５０ｌ）から入手
ＰＢＳＴ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｐ７９４９）で補足された１×ＰＢＳ
ブロッキングバッファー：３％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ４５０３）で補足されたＰＢＳＴ
沈殿バッファー：２．５Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％  ＰＥＧ６０００（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，５２８８７７）
細胞パンニングバッファー：３％  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ，１００８２）および０．０１％  ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ，７１２８９）で補足されたＰＢＳ。
【０１０１】
ライブラリー選択に用いた一般的方法はＨｏｅｔら（Ｈｏｅｔ  ＲＭ，Ｃｏｈｅｎ  ＥＨ，Ｋｅｎｔ  ＲＢ，Ｒｏｏｋｅｙ  Ｋ，Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ  Ｓ，Ｈｏｇａｎ  Ｓ，Ｒｅｍ  Ｌ，Ｆｒａｎｓ  Ｎ，Ｄａｕｋａｎｄｔ  Ｍ，Ｐｉｅｔｅｒｓ  Ｈ，ｖａｎ  Ｈｅｇｅｌｓｏｍ  Ｒ，Ｎｅｅｒ  ＮＣ，Ｎａｓｔｒｉ  ＨＧ，Ｒｏｎｄｏｎ  ＩＪ，Ｌｅｅｄｓ  ＪＡ，Ｈｕｆｔｏｎ  ＳＥ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ，Ｋａｓｈｉｎ  Ｉ，Ｄｅｖｌｉｎ  Ｍ，Ｋｕａｎｇ  Ｇ，Ｓｔｅｕｋｅｒｓ  Ｍ，Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ  Ｍ，Ｎｉｘｏｎ  ＡＥ，Ｓｅｘｔｏｎ  ＤＪ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲ，Ｌａｄｎｅｒ  ＲＣ．（２００５）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ−ｒｅｇｉｏｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４−３４８）により記載されている。簡潔に説明すると、１／５体積の沈殿バッファーを加え、ついで氷上での１時間のインキュベーションおよび遠心分離工程（５５００ｒｐｍで１時間）を行うことにより、Ｆａｂ抗体ライブラリーを沈殿させる。ついで該沈殿ライブラリーを１ｍｌのブロッキングバッファーに再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートする。その間、ストレプトアビジン被覆ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１２０６Ｄ）のアリコートを、ＰＢＳＴで３回洗浄することにより調製した。その後、表２〜６に示されているとおり、幾つかのアリコートをビオチン化カリクレイン／プレカリクレイン（５００ｎＭ）またはビオチン化ｈＦＸＩ（５００ｎＭ）と混合し、一方、残りをビオチン化標的タンパク質と混合した。該混合物をエンド・ツー・エンド（ｅｎｄ  ｔｏ  ｅｎｄ）ローテーター上で４℃でインキュベートし、ついで１ｍｌのＰＢＳＴ中で５回洗浄した。最後に被覆ビーズを、１ｍｌのブロッキングバッファー中の再懸濁によりブロッキングし、５つのチューブにアリコート化し、ついで該ビーズを集め、上清を除去した。
【０１０２】
ビオチン化カリクレイン／プレカリクレイン（５００ｎＭ）またはビオチン化ｈＦＸＩ（５００ｎＭ）で被覆されたブロッキングされたダイナビーズに、ブロッキングされたライブラリー（前記）を加えることにより、示されているとおりに５回の連続的な枯渇工程を行い、それを回転させながら室温で１０分間インキュベートした。該ビーズを磁気ラック上で集めた後、遠心分離により上清を清澄化し、標的タンパク質で被覆されたブロッキングされたダイナビーズと混合した。エンド・ツー・エンド・ロテーター上での３０分間のインキュベーションの後、該サンプルをブロッキングバッファーで３回洗浄し、ついでＰＢＳＴで９回洗浄した。ついで、表２〜６に記載されている方法に従い、次の選択ラウンドにおいて使用する新たなファージストックを調製するために、富化ファージを含有する再懸濁ビーズの半分を使用して、指数関数的に増殖している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手）に感染させた。より詳細に説明すると、６ｍｌのＴＧ１培養に５００μｌのダイナビーズ／ファージ懸濁液を、振とうすることなく３７℃で３０分間感染させた。その後、出力滴定のためにアリコートを採取した。残りの培養を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られたペレットを２ｍｌの２×ＹＴに再懸濁させ、寒天プレート（２×ＹＴ、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２％  グルコース）上でプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーションの後、細胞を５ｍｌの２×ＹＴ中に擦り落とし、０．０５のＯＤ６００で、２０ｍｌの２×ＹＴ（１００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ）の新鮮培養に感染させるために、およびグリセロールストックの調製のために、それを使用した。０．５〜０．８のＯＤ６００に達するまで、該新鮮液体培養を３７℃で約２時間振とうさせ、ついで５ｍｌの培養を約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でＭ１３  ヘルパーファージＭ１２３Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  ４２０３１１）と混合した。３７℃で３０分間、ゆっくり振とうした後、予め加温された３０ｍｌの２×ＹＴ（１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２０μｇ／ｍｌ  カナマイシン、ｆ．ｃ．）を加え、該培養を３０℃で振とうした。翌朝、上清を６０００ｒｐｍの遠心分離により集め、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（０，２２μｍ；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  ＳＣＧＰ００５２５）での濾過により清澄化した。ついでファージを前記のとおりに沈殿させ、次の選択ランドにおける使用のために１ｍｌのブロッキングバッファー（または細胞パンニングバッファー）に再懸濁させた。入力力価の決定のためにアリコートを使用した。
【０１０３】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
ファージＥＬＩＳＡ：
種々のラウンドの選択の後のファージプールを、ビオチン化標的タンパク質に関するＥＬＩＳＡにより、特異的結合体の富化に関して分析した。簡潔に説明すると、グリセロールストックからのアリコートを２×ＹＴ（１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン、１％  グルコース）上で３７℃でプレーティングした。単一コロニーを、１００μｌの培地（２×ＹＴ、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、１％  グルコース）を含有するＭＴＰのウェル内に拾い入れ、３７℃で一晩振とうした。１０μｌの一晩の培養を、ヘルパーファージＭ１２３Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  ４２０３１１）を含有する１９０μｌの新鮮培養（１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンで補足された２×ＹＴ）に加え、〜０．５のＯＤ６００に達するまで９６ウェルＭＴＰ内で２００ｒｐｍ、３７℃でインキュベートすることにより、ファージ発現を行った。
【０１０４】
ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，１５５００）で予め被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ  ビオチン化標的タンパク質で４℃で一晩被覆した。翌日、プレートをＰＢＳＴで７回洗浄し、ブロッキング試薬で処理し、再びＰＢＳＴで３回洗浄した。その間に、ＯＮファージ培養を１００μｌのブロッキングバッファーと混合した。その後、１００μｌの該ブロッキングファージをウェルごとに移し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで７回洗浄した後、ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２７−９４２１−０１；ＰＢＳＴ中で１：２５００希釈）に結合した抗Ｍ１３抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ウェルを再び７回洗浄した。発色反応を、１００μｌのＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２０２３）を加えることにより現像し、１００μｌのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ，１１２０８０１０００）を加えることにより５〜１５分後に停止させた。比色反応をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０ｎＭにおいて記録した。
【表７】
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【０１０５】
ｓＦａｂスクリーニングのためのＧｅｎＩＩＩ除去によるｓＦａｂの再クローニング
可溶性Ｆａｂフラグメント（ｓＦａｂ）の作製のために、選択ラウンド２、３および４からのファジミドＤＮＡを単離し、制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｌｏａｂｓ，Ｒ０１９８Ｌ）で供給業者の説明に従い消化した。遺伝子ＩＩＩ含有断片を取り出すために、該ベクターを遺伝子抽出し、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１１１Ｓ）での切断に付した。ＥｔＯＨ沈殿後、得られた断片を再連結させ、標準的な方法を用いて、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０内に構築物を形質転換した。
【０１０６】
実施例２：抗凝固因子ＸＩ抗体および／または抗凝固因子ＸＩａ抗体
本発明の抗体、抗原結合性抗体フラグメントならびに該抗体およびフラグメントの変異体は軽鎖可変領域および重鎖可変領域から構成される。本発明において想定される抗体または抗原結合性フラグメントの変異体は、凝固因子ＸＩおよび／または凝固因子ＸＩａに対する該抗体または抗原結合性フラグメントの結合活性が維持されている分子である。
【０１０７】
本発明は、
・可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列が、可変軽鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１およびアミノ酸配列としては配列番号１９に対して、そして可変重鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号２およびアミノ酸配列としては配列番号２０に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である、あるいは
・これらの抗体の成熟形態に関しては、可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列が、それらに対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である、
・ＣＤＲのアミノ酸配列が、重鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号３、４および５ならびにアミノ酸配列としては配列番号２１、２２および２３に対して、そして可変軽鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号６、７および８ならびにアミノ酸配列のとしては配列番号２４、２５および２６に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％同一である、抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１０８】
更に、本発明は、
・可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列が、可変軽鎖に関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号９およびアミノ酸配列としては配列番号２７に対して、そして可変重鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号２およびアミノ酸配列としては配列番号２０に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である；あるいは
・これらの抗体の成熟形態に関しては、可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列が、それらに対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である；
・ＣＤＲのアミノ酸配列が、可変軽鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１０およびアミノ酸配列としては配列番号２８に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％同一である、抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１０９】
本発明はまた、
・可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列が、可変軽鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１１およびアミノ酸配列としては配列番号２９に対して、そして可変重鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１２およびアミノ酸配列としては配列番号３０に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である、あるいは
・これらの抗体の成熟形態に関しては、可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列が、それらに対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％または９０％、より一層好ましくは９５％同一である、
・ＣＤＲのアミノ酸配列が、重鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１３、１４および１５ならびにアミノ酸配列としては配列番号３１、３２および３３に対して、そして可変軽鎖ドメインに関しては、ＤＮＡ配列としては配列番号１６、１７および１８ならびにアミノ酸配列としては配列番号３４、３５および３６に対して、少なくとも６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％同一である、抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１１０】
実施例３：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを用いる抗凝固活性の決定
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを用いることにより、抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄおよび０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の抗凝固活性を試験した。ヒトおよびウサギ血漿におけるａＰＴＴの倍加に必要な濃度の値を表８に示す。
【表８】
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【表９】
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【０１１１】
実施例４：ＦＸＩａ抗体の抗凝固活性の決定
流動条件下の血小板活性化の測定のために、ガラススライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ  ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ  ７６×２６ｍｍ；Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｍｅｎｚｅｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をコラーゲン（１５０μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩被覆し、ついでＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）でブロッキングした後、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のステージ上の流動系内に組み入れた。クエン酸添加全血をＧＰＲＰ（最終的に３ｍＭ）およびビヒクルまたはＦＸＩ抗体と共に３７℃で１０分間インキュベートした。ＣａＣｌ２（５ｍＭ）の添加後、直ちに血液を１０００秒−１の初期せん断速度で５分間にわたってコラーゲン被覆スライド上で潅流させた。前記のとおりの全血の潅流の後、それぞれ１分の時点でチャンバー後全血をクエン酸ナトリウム（１：１０  ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に集めた。チャンバー前血液もサンプル採取し、陽性対照（１０μｇ／ｍｌ）としてのＴＲＡＰ６の存在下または非存在下で５分間処理した。
【０１１２】
チャンバー前および後血液サンプルをＣｅｌｌ  Ｗａｓｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で希釈し、抗体と共に４℃で２０分間インキュベートした。氷冷Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈを加えることにより抗体反応を停止させ、測定まで全サンプルを氷上で維持した。１００００個の単一血小板をＦＩＴＣコンジュゲート化血小板マーカー（ＣＤ４１ａまたはＣＤ６１ａ）の陽性性およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による特徴的光散乱パターンで決定した。ＣＤ６２Ｐ発現に関しては、単一血小板を、未標識対象サンプルで妥当性評価されたＰＥ−ＣＤ６２Ｐ蛍光閾値を用いて別の散乱プロットへゲートした。該閾値を超える血小板集団を活性化体とみなし、定量化した。血小板微小凝集は前方散乱（ＦＳＣ）およびＦＩＴＣ−蛍光に関する任意閾値で定められた。
【０１１３】
実施例５：ウサギにおけるＦｅＣｌ２誘発性血栓および耳出血時間
０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄおよび０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の抗血栓活性を動脈血栓症モデルにおいて決定した。０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇ，１ｍｇ／ｋｇ，２ｍｇ／ｋｇ）、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄ（０．１ｍｇ／ｋｇ，０．３ｍｇ／ｋｇ，１ｍｇ／ｋｇ）または０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７（０．０７５ｍｇ／ｋｇ，０．１５ｍｇ／ｋｇ，０．３ｍｇ／ｋｇ）の静脈内ボーラス投与の１５分後に、ウサギにおける塩化第二鉄による頚動脈の化学的損傷により血栓症を誘発させた。雄ウサギ（Ｃｒｌ：ＫＢＬ（ＮＺＷ）ＢＲ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、筋肉内注射により投与されたキシラジンとケタミンとの混合物（ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ），Ｂａｙｅｒ  ５ｍｇ／ｋｇおよびケタベット（Ｋｅｔａｖｅｔ）  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  ＧｍｂＨ，４０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。右耳の縁静脈における該麻酔混合物の注入により、補足的麻酔薬を投与した。右総頚動脈の露出の後、血流が影響を受けないように、該右総頚動脈下のＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（２５ｍｍ×１２ｍｍ）の細片上に１枚の吸取紙（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を配置することにより、血管損傷を引き起こさせた。該吸取紙を１００μｌのＦｅＣｌ２（塩化鉄（ＩＩ）四水和物、１３％（Ａ．ｄｉｓ中）、Ｓｉｇｍａ）で飽和させた。５分後、濾紙を除去し、該血管を０．９％  ＮａＣｌで２回洗浄した。該損傷の３０分後、該頚動脈を除去し、血栓を取り出し、直ちに秤量した。各群に５〜７匹の動物を使用した。該ＦｅＣｌ２損傷の２分後に耳出血時間を決定した。左耳を剃毛し、標準化された切開（長さ３ｍｍ）を、耳の長軸に平行に、外科用ブレード（番号１０−１５０−１０，Ｍａｒｔｉｎ，Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。視認可能な血管の損傷を避けるように注意した。該創傷との接触を注意深く避けながら、切開部位を３０秒間隔で濾紙で吸取った。血液がもはや該濾紙に染みなくなるまでの該切開からの時間を測定することにより、出血時間を決定した。
【０１１４】
実施例６：ウサギにおけるＦｅＣｌ２誘発性血栓症および耳出血時間の決定
図１４に示されているとおり、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４は血栓重量を用量依存的に減少させ、耳出血時間を延長させない。図１５は、耳出血時間の増加を伴わない０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４−ＣＤＲＬ３−Ｎ１１０Ｄの抗血栓効果を示す。図１６においては、０７６Ｄ−Ｍ０２８−Ｈ１７の抗血栓効果および出血時間の非延長が示されている。
【０１１５】
実施例７：Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４：ＦＸＩａ複合体の複合体形成、結晶化およびＸ線構造決定
複合体形成および結晶化
ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ（アミノ酸３８８−６２５）がＰｒｏｔｅｒｏｓ  Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓにより購入された。精製されたＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４をＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓと１：１の比で混合した。複合体形成を可能にするために、該溶液を氷上で１８時間保存した。該複合体溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １６／６０カラム上にローディングし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および７５ｍＭ  ＮａＣｌ中の２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで更に濃縮した。Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４とＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓとを含むタンパク質複合体の結晶を、シッティング・ドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）法を用いて、２０℃で成長させ、等体積のタンパク質複合体溶液およびウェル溶液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．２５，０．０５％  ＰＥＧ２００００）および沈殿剤としての２．４Ｍ  ＮＨ４ＳＯ４を混合することにより結晶化させた。約５日後にロゼット様結晶が出現した。
【０１１６】
データ収集および処理
低温バッファーを使用することなく液体窒素中で結晶を急速冷凍した。ＭＡＲ  ＣＣＤ検出器でビームライン（ｂｅａｍｌｉｎｅ）ＢＬ１４．１，ＢＥＳＳＹシンクロトロン（Ｂｅｒｌｉｎ）において結晶のデータを集めた。データを索引生成させ、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５−１３２）で統合させ、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳでのスケーリングのために調製し、ＳＣＡＬＡ（Ｐ．Ｒ．Ｅｖａｎｓ，（２００５）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６２，７２−８２）でスケーリングした。該結晶は２．７オングストロームまで回折し、非対称単位内に１個のＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４：ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ複合体および格子定数ａ＝６１．９，ｂ＝７０．７，ｃ＝１８５．９を有する斜方晶空間群Ｐ２（１）２２（１）を有する。
【０１１７】
構造決定および精密化
ＦＸＩａおよびモノクローナル抗体Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の複合体構造を種々の工程の分子置換により解析した。まず、検索モデルとしてｐｄｂコード３ＧＪＥを用いて、ＢＡＬＢＥＳ（Ｆ．Ｌｏｎｇ，Ａ．Ｖａｇｉｎ，Ｐ．ＹｏｕｎｇおよびＧ．Ｎ．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ（２００８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６４，１２５−１３２）を使用して、Ｈ鎖を配置した。ついで、検索モデルとして内部ＦＸＩａ結晶構造を用いて、プログラムＭｏｌＲｅｐを使用して、ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓを加えた。ＲＥＦＭＡＣ５．５（Ｇ．Ｎ．Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら（１９９７）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５３，２４０−２５５）での初期精密化はＲ１＝３９．４％およびＲｆｒｅｅ＝４４．１％を与えた。最後に、検索モデルとしてのｐｄｂエントリー３ＩＤＸのＬ鎖、ならびに初期精密化Ｈ鎖およびＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ溶液の固定座標を使用して、Ｈ鎖を配置した。反復ラウンドのＣＯＯＴ（Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙら（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６：４８６−５０１）でのモデル構築およびＲＥＦＭＡＣ５．５を使用する最尤精密化により該モデルを完成させた。データセットおよび精密化統計を表１０に要約する。
【表１０】
0006348900.tif 000041
【０１１８】
実施例８：Ｘ線構造に基づくエピトープマッピング
Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４とＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓとの複合体（図１７）は非対称単位当たりに１コピーの該複合体として結晶化した。ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ（エピトープ）と接触しているＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（パラトープ）の残基を決定し、表ＸａおよびＸｂに示す。ＣＣＰ４プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（Ｐ．Ｊ．Ｂｒｉｇｇｓ（２０００）ＣＣＰ４  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  Ｎｏ．３８）を使用して、埋もれた表面、ならびにそれぞれ、結合Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（表１１ａ）およびＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓの存在下および非存在下で計算された総エリア相違（ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を示す残基を分析した。
【表１１】
0006348900.tif 000042
0006348900.tif 000043
【０１１９】
要約すると、ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓエピトープは以下の残基により形成されている：ＨＩＳ  Ａ  ４０６，ＰＲＯ  Ａ  ４１０，ＴＨＲ  Ａ  ４１１，ＧＬＮ  Ａ  ４１２．ＡＲＧ  Ａ  ４１３，ＨＩＳ  Ａ  ４１４，ＡＳＮ  Ａ  ４５０，ＧＬＮ  Ａ  ４５１，ＳＥＲ  Ａ  ４５２，ＩＬＥ  Ａ  ４５４，ＬＹＳ  Ａ  ４５５，ＡＲＧ  Ａ  ５２２，ＬＹＳ  Ａ  ５２３，ＬＥＵ  Ａ  ５２４，ＡＲＧ  Ａ  ５２５，ＡＳＰ  Ａ  ５２６，ＬＹＳ  Ａ  ５２７，ＩＬＥ  Ａ  ５２８，ＧＬＮ  Ａ  ５２９，ＡＳＮ  Ａ  ５３０，ＴＨＲ  Ａ  ５３１。
【０１２０】
Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４はアロステリック競合インヒビターとして作用する。それはＦＸＩａの活性部位を直接的には遮断せず、その隣接部に結合する。この隣接結合はＦＸＩａの活性部位の部分の再構成を誘発して、活性化ＦＸＩａに天然基質が結合するのを妨げる（図１８）。
【０１２１】
これとは対照的に、Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４はチモーゲンＦＸＩには結合しない。チモーゲンＦＸＩの報告されているｘ線構造（ｐｄｂエントリー２Ｆ８３）においては、Ｆａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４に対するエピトープおよび活性部位を構成する種々のループは適切に秩序だったものではない。特に、該エピトープ領域はＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４：ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ複合体においては十分に構造化されている。
【０１２２】
実施例９：水素／重水素交換質量分析に基づくエピトープマッピング
エピトープマッピングの、異なる分析が、契約研究機関ＥｘＳＡＲ［ＥｘＳＡＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；１１  Ｄｅｅｒ  Ｐａｒｋ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  １０３；Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ  ０８８５２；ＵＳＡ］により行われている。この場合、それぞれ、ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ（アミノ酸３８８−６２５；Ｐｒｏｔｅｒｏｓ  Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓにより購入）と０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４および０７６Ｄ−Ｍ０４９−Ｏ１５の精製Ｆａｂとの相互作用が差次的水素／重水素交換質量分析法により分析されている［概説としては、Ｐｅｒｃｙ  ＡＪ，Ｒｅｙ  Ｍ，Ｂｕｒｎｓ  ＫＭ，Ｓｃｈｒｉｅｍｅｒ  ＤＣ．（２０１２）Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．７２１：７−２１を参照されたい］。それにおいては、１０％を超える重水素レベルの相違は対応抗原のＦａｂによる強力な防御を示す。５〜１０％の値は弱い結合を示し、５％未満の重水素レベルの相違は無防御を示す。
【０１２３】
表１２ａおよび表１２ｂは、それぞれ、ＦＸＩａに接触しているＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４およびＦａｂ  ０７６Ｄ−Ｍ０４９−Ｏ１５の残基を要約している。
【表１２】
0006348900.tif 000044
0006348900.tif 000045
【０１２４】
これらのデータは、ＦＸＩａ内の２００アミノ酸（ＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓのアミノ酸４０８−６０９）のエピトープの遮蔽がＦＸＩａのタンパク質分解活性の抑制を招くことを明らかに示している。
【０１２５】
実施例１０：本発明の抗体によるＦＸＩａの機能的中和
特異的な発蛍光標識基質（Ｉ−１５７５，Ｂａｃｈｅｍ，最終濃度２５μＭ）の切断を測定することにより、ヒトＦＸＩａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＨＣＸＩＡ−０１６０）活性を決定し、ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、３６０／４６５ｎｍにおいて連続的に該蛍光をモニターする。該抑制活性を試験するために、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％  ＢＳＡを含有するバッファー中、１０ｎＭの最終濃度のＦＸＩａと共に、該抗体を３７℃で６０分間プレインキュベートする。このインキュベーション工程の後、基質Ｉ−１５７５を加え、該反応からのシグナルを測定する。図１、図２、図３および図４に示されているとおり、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを分析する。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示されている。幾つかの実験では、完全長ヒトＦＸＩａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＨＣＸＩＡ−０１６０）の代わりに、単離触媒ドメインであるＦＸＩａ  Ｃ５００Ｓ（アミノ酸３８８−６２５；Ｐｒｏｔｅｒｏｓ  Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓにより購入）を使用する。全ての他の条件は前記のとおりである。
【０１２６】
実施例１１：本発明の抗体による、ＦＸＩからその活性形態ＦＸ  Ｉａへの変換の機能的中和
ＦＸＩＩａまたはトロンビン（トロンビンはＩＩａである）によるＦＸＩ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＨＣＸＩＡ−０１５０）からその活性形態ＦＸＩａへの変換の抑制を試験するために、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％  ＢＳＡ中、種々の濃度の該抗体と共に１０ｎＭのヒトＦＸＩを３７℃で１時間インキュベートする。次の工程において、最終濃度１０ｎＭのヒトＦＸＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号ＨＦＸＩＩａ  １２１２ａ）または最終濃度１単位／ｍｇのトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号ＨＴ  １００２ａ）を加え、３７℃で２４時間インキュベートする。次に、最終濃度２００ｎＭのトウモロコシ・トリプシン・インヒビター（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＴＩ）および発蛍光標識基質（Ｉ−１５７５，Ｂａｃｈｅｍ，最終濃度２５μＭ）を加える。ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、蛍光を３６０／４６５ｎｍにおいて連続的にモニターする。ＦＸＩのＦＸＩＩａ媒介性変換に関しては図５および図７に、ならびにＦＸＩからその活性形態ＦＸＩａへのトロンビン誘発性変換に関しては図６および図８に示されているとおり、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを分析する。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示されている。
【０１２７】
実施例１２：霊長類における実験的血栓症インビボモデルにおける抗ＦＸＩａ抗体０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の抗トロンビン活性の評価
実験方法
体重９〜１１ｋｇの非抗凝固覚醒若年ヒヒにおいて実験を行った。これらの動物は、記載されているとおり（Ｈａｎｓｏｎら（１９９３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９２：２００３−２０１２）、大腿動脈および静脈の間に配置された長期的体外露出動脈−静脈（ＡＶ）シャントを有していた。全ての研究動物において、ベースラインシャント血流は２５０ｍｌ／分を超えた。低用量ケタミン（＜２ｍｇ／ｋｇ／時間）で不安感に対処した。該実験の前および後に全血細胞数を毎日測定した。いずれの実験日においても、計算血液減少は全血液体積の４％を超えなかった。既に記載されているとおりに（Ｈａｎｓｏｎら［１９９３］Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３−２０１２）、人工血管移植片（ｅＰＴＦＥ，ＷＬ  Ｇｏｒｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｆｌａｇｓｔａｆｆ，Ａｒｉｚ．）の血栓生成性セグメントを介在させることにより、ヒヒＡＶシャント内で血栓形成を開始させた。血小板依存性血栓形成を一貫して誘発するために、該臨床的移植片セグメントを固定化コラーゲンで被覆した。２または４ｍｍの内径（ｉ．ｄ．）を有する長さ２０ｍｍの移植片にウマＩ型コラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｒｚｅｎｍｉｔｔｅｌ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１５分間にわたって満たし、ついでそれを無菌気流下で一晩乾燥させた。この方法は、走査電子顕微鏡法により判定された場合に、移植片腔内の均一コラーゲン被覆をもたらした。また、幾つかの実験においては、平均的な静脈および動脈せん断速度をモデル化するために、それぞれ、内径９ｍｍ、長さ２０ｍｍのチャンバーを内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍの移植片の後で使用した。ついで該血栓生成性コラーゲン被覆移植片をシリコンラバーチューブのセグメント間に組込み、ＡＶシャント内に配置した。該移植片を血液に６０分間まで露出させた。各実験中に、近位シリコンラバーシャントセグメントをクランプで締める（クランプ化）ことにより、該移植片を通る血液流速を１００ｍｌ／分に制限し、それにより、該４ｍｍ移植片においては２６５／秒の平均壁せん断速度（ＭＷＳＲ）を得、一方、該２ｍｍ移植片においては初期ＭＷＳＲは２１２０／秒であった。超音波流動メーター（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｔｈａｃａ，Ｎ．Ｙ．）を使用して、流速を連続的にモニターした。該４ｍｍ移植片は閉塞を引き起こさず、該血栓生成性移植片セグメントが６０分の時点で除去されるまで律動的流速は１００ｍｌ／分で維持された。ベースライン血流は各実験後に永久的シャントにより回復した。該２ｍｍ径移植片においては、血栓形成により血液流速は次第に低下した。流速が１００ｍｌ／分から２０ｍｌ／分未満に低下したら（これは切迫性閉塞を示す）、該移植片を該ＡＶシャントから除去した。血流の開始から移植片除去（＜２０ｍｌ／分の流速）までの時間を閉塞時間とみなした。血小板沈着のイメージングのために、既に記載されているとおりに（Ｈａｎｓｏｎら［１９９３］Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３−２０１２）、自己ヒヒ血小板を１ｍＣｉの１１１Ｉｎ−オキシンで標識した。標識血小板を注入し、研究を行うまでに少なくとも１時間循環させた。血栓生成性移植片およびシリコンチャンバー上への標識血小板の蓄積を、ガンマシンチレーションカメラを使用して、５分間隔で測定した。同種１２５Ｉ標識ヒヒフィブリノーゲン（４μＣｉ，＞９０％  血餅形成可能）を各研究前に１０分間注入し、血栓内の該標識フィブリンの取り込みを、１１１Ｉｎの崩壊が可能となるように＞３０日後に、ガンマカウンターを使用して評価した。沈着放射活性（ｃｐｍ）を、最初の研究の時点で採取されたサンプルの、血餅形成可能なフィリビン（フィブリノーゲン）の放射活性（ｃｐｍ／ｍｇ）により割り算した。高い初期壁せん断速度（１００ｍｌ／分のクランプ化血流で２１２０／秒）を示した長さ２０ｍｍ、内径２ｍｍのコラーゲン被覆装置を使用して、閉塞研究を行った。該２ｍｍ血栓生成性移植片上への標識血小板の蓄積を、ガンマシンチレーションカメラを使用して、３分間隔で測定した。可能な場合には近位クランプ化により、流動を１００ｍｌ／分で維持し、ついで、伝播血栓が該装置を閉塞につれて、減少させた。２０ｍｌ／分の最終血液流速を閉塞に関するカットオフとして用いた。なぜなら、完全閉塞血栓、および該装置を通る血流の欠如は、該シャントの閉塞、および該動物の血液の有意な喪失を招きうるからである。
【０１２８】
血液サンプル分析
マイクロ６０自動細胞カウンター（Ｈｏｒｉｂａ−ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、血液細胞数を決定した。最終濃度０．３２％のクエン酸ナトリウム中に血液サンプルを集めた。全てのサンプルを１２，９００ｇで５分間遠心分離し、血漿を集め、マイナス８０℃で保存した。トロンビン−抗トロンビン複合体を決定するために、交差反応性ＥＬＩＳＡアッセイを用いた（ＴＡＴ，Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ−ＴＡＴ，Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ；ＬＯＤ：２ｎｇ／ｍＬ）。これらの研究に使用した全てのＥＬＩＳＡ試験キットはヒヒマーカーに対する感受性を既に示している。遮断研究（内径４ｍｍのコラーゲン被覆移植片のみ）においては、この抗体が急性血栓増加を遮断しうるかどうかを決定するために、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を研究の３０分前にボーラス投与した（０．５ｍｇ／ｋｇ，１０秒間にわたる静脈内ボーラス）。閉塞研究（内径２ｍｍのコラーゲン被覆移植片のみ）においては、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４を実験の３時間前にボーラス投与した（０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与の２４時間後に０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）。予防研究（内径４ｍｍのコラーゲン被覆移植片およびそれに続く内径９ｍｍのシリコンチャンバー）においては、０７６−Ｍ００７−Ｈ０４を実験の１時間前にボーラスとして投与した（０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与の２４時間後に０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ）。
【０１２９】
止血評価
標準的テンプレート皮膚出血時間試験（Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ（登録商標），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐ）を用いて、ヒヒにおける一次止血に対するＦＸＩａ抑制の効果を評価した。実験的には、この試験および類似試験（例えば、Ｓｉｍｐｌａｔｅ出血時間）はヒトおよび非ヒト霊長類における治療用抗凝固物質、抗血小板物質および凝固異常の効果に対して感受性であることが示されている（Ｇｒｕｂｅｒら［２００７］Ｂｌｏｏｄ  １０９：３７３３−３７４０；Ｓｍｉｔｈら［１９８５］Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．８３：２１１−２１５；Ｐａｙｎｅら［２００２］Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３５：１２０４−１２０９）。全出血時間測定は同一専門技術者により行われた。止血の間接評価のために、ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間；ＳｙｎｔｈＡＳｉｌ，ＨｅｍｏｓＩＬ；Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）およびＡＣＴ（活性化血餅形成時間，ＬｕｐｏＴｅｋ  ＫＣＴ；ｒ２  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮ）の測定も、該実験の前、途中および後の種々の時点で行った。
【０１３０】
インビトロａＰＴＴ
種々の濃度の０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４をａＰＴＴアッセイの開始の前に１０分間にわたって血漿中でインキュベートした。図２０に示されているとおり、「前」時点、すなわち、いずれかの処理が投与される前に、ヒヒから集めた血漿サンプルにおいて、ａＰＴＴ血餅形成時間を決定した。結果は、該血栓症研究において使用された全６頭の実験用ヒヒからの血漿において、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４が抗凝固物質であったことを示している。
【０１３１】
インビボ血餅形成研究
これらの研究においては３頭のヒヒを使用した。２頭のヒヒには３２ｍｇ／ｋｇのチュアブル・アスピリンの投与の後で０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（２．５ｍｇ／ｋｇ  Ｈ０４，静脈内ボーラス）を投与し、１頭のヒヒには０．５ｍｇ／ｋｇ  ０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（静脈内ボーラス）を投与し、ついで２４時間後に２ｍｇ／ｋｇ用量（静脈内ボーラス）を投与した。投与後の種々の時点でＡＣＴ（図２１および図２２）およびａＰＴＴ（図２３および図２４）を測定した。
【０１３２】
シャント実験中の血小板沈着
血栓症閉塞実験
０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４処理が小血管の閉塞を予防し、または閉塞までの時間を延長させうるかどうかを評価するために使用した血栓生成性装置は、内径２ｍｍ、長さ２０ｍｍのコラーゲン被覆移植片からなるものであった。図２５に示されているとおり、血小板沈着は６０分間、または適用可能な場合には移植片閉塞の時点まで示される。１４個中１２個の対照装置が６０分以内に閉塞し、一方、５個中２個の０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇ）装置および５個中２個の０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇ＋２ｍｇ／ｋｇ）装置が閉塞した。データは平均±ＳＥＭである。
【０１３３】
血栓症予防実験
血栓開始および増加に対する０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の効果を評価するために使用した血栓生成性装置は内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのコラーゲン被覆ｅＰＴＦＥ移植片およびそれに続く内径９ｍｍ、長さ２０ｍｍのシリコンラバーチャンバーからなるものであった。図２６に示されている血小板沈着の勾配は抗血小板活性の指標である。血栓形成の開始からの種々の時点の血小板沈着の速度の減少により示されるとおり、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ、ついで２４時間後に２ｍｇ／ｋｇ）の両方の用量が効力を示した。該データは、実験間の血小板数変動を相殺するために標準化されている。データは平均±ＳＥＭである。図２７に示されているとおり、血栓形成の開始からの種々の時点における該シリコンチャンバーにおける血小板沈着速度の顕著な減少により示されるとおり、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ、ついで２４時間後に２ｍｇ／ｋｇ）の両方の用量が効力を示した。データは平均±ＳＥＭである。
【０１３４】
トロンビン抗トロンビン複合体
ＦＸＩの抑制は、トロンビン媒介性血小板活性化およびフィブリン形成を抑制すること並びに／又は血栓溶解を増強することの両方により、インビボの血栓形成を低減しうるため、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用してトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）のレベルを測定した。図２８に示されているとおり、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ、ついで２４時間後に２ｍｇ／ｋｇ）でのヒヒの前処理はＴＡＴレベルの増加を妨げた。このことは、ＦＸＩａ活性の非存在下におけるトロンビン生成の顕著な低減を示唆している。
【０１３５】
出血時間
小児および成人における使用に関してＦＤＡにより承認されている成人用サージカット（Ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ）装置（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｔｃｍｅｄ／ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｕｒｇｉｃｕｔｔ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ−ｔｉｍｅ−ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、一次止血を評価した。出血時間（ＢＴ）を手動で記録した。再出血に関して３０分間にわたって創傷を観察し、翌日、挫傷、点状出血、血腫および広汎性出血に関して皮膚を評価した。これらの止血評価の１以上は実質的に全ての市販抗血栓物質（抗血小板薬、抗凝固剤、血栓溶解剤）の抗止血効果に対して感受性であり、該効果を予測するものであることが示されている。
【０１３６】
０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４（０．５ｍｇ／ｋｇ、ついで２４時間後に２ｍｇ／ｋｇ）を、単独で、またはチュアブル・アスピリン（ＡＳＡ，３２ｍｇ／ｋｇ）の投与後に、ヒヒに投与した。図２９に示されているとおり、０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４処理のいずれに関しても、ベースラインと比較して出血時間の増加は認められなかった。アスピリン処理動物への０７６Ｄ−Ｍ００７−Ｈ０４の投与は、アスピリンの単独処理と比較して、出血時間を更には増加させないようであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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