(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸をペプチドへカップリングする方法において、改良が、
アミノ酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、塩基（活性化されるアミノ酸の量と比べて１当量未満の量の塩基）とを合わせ；そして
カップリングを６０℃〜１１０℃の温度で実施する
ことを含む方法。
【請求項２】
１０分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
４分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
塩基が、ＤＩＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰ、ＴＥＡ及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
塩基の量が、存在するアミノ酸の量を基にして０．２当量以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
塩基の量が、存在するアミノ酸の量を基にして０．１当量以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カルボジイミドが、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
活性化添加剤が、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カップリングが少なくとも７５℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
カップリングが少なくとも９０℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
活性化及びカップリングが６０℃を超える温度で実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
カルボン酸とアミンとのカップリング法において、改良が、
カルボン酸と、アミンと、カルボジイミドと、活性化添加剤と、塩基（アミンの量と比べて１当量未満の量の塩基）とを合わせ；そして
カップリングを６０℃〜１１０℃の温度で実施する
ことを含む方法。
【請求項１４】
１０分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
４分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
２分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
塩基が、ＤＩＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰ、ＴＥＡ及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
塩基の量が、存在するアミンの量を基にして０．２当量以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
塩基の量が、存在するアミンの量を基にして０．１当量以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
カルボジイミドが、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
活性化添加剤が、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カップリングが少なくとも７５℃の温度で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
カップリングが少なくとも９０℃の温度で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸をペプチドへカップリングする固相方法において、改良が、
ペプチドと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、アミノ酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、塩基（活性化されるアミノ酸の量と比べて１当量未満の量の塩基）とを合わせ；そして
カップリングを６０℃〜１１０℃の温度で実施する
ことを含む方法。
【請求項２５】
塩基が、活性化されるアミノ酸の量と比べて０．２当量以下の量で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
塩基が、活性化されるアミノ酸の量と比べて０．１当量以下の量で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
リンカーが、２−クロロトリチル及びトリチルからなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
カルボジイミドが、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
活性化添加剤が、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
カップリングが９０℃〜１１０℃の温度で実施される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明はペプチド合成に関し、特に、高速で進行し、望まざる副反応の少ない、そして良好な結果をもたらす固相ペプチド合成（“ＳＰＰＳ”）における改良された活性化及びカップリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]固相ペプチド合成は、追加のアミノ酸が成長するペプチド鎖に加えられるごとに反復されるいくつかの基本的工程を組み込んでいる。“固相”とは、初期アミノ酸、ひいては成長するペプチド鎖が結合される樹脂（レジン）粒子のことを言う。ペプチド鎖が粒子に結合されているので、ペプチド鎖をあたかも固体粒子の集まりであるかのごとく取り扱うことができ(特に、洗浄及び分離工程、例えばろ過工程に関して)、ゆえに、多くの場合、純粋溶液合成より方法全体が容易になる。
【０００３】
[0003]ＳＰＰＳの反復工程は、脱保護、活性化及びカップリングを含む。脱保護：各サイクルの開始前、ペプチド鎖上の最後の酸は“保護”されたままである。すなわち、その“アミノ”末端は、酸を望まざる反応から保護する官能基に連結されている。従って、次の酸を加えようとするときに、この“保護基”は除去される(“脱保護”工程）。
【０００４】
[0004]活性化：ペプチド鎖上の脱保護された酸にカップリングしやすい中間アミノ酸種を生成させるために、化合物(“活性化剤”) が反応に添加される。
[0005]カップリング：活性化された種が既存のペプチド鎖に連結される。
【０００５】
[0006]カルボジイミド活性化法
[0007]おそらく、ペプチド合成のために最も一般的に使用され研究されている活性化法は、カルボジイミドの使用に基づく。ペプチド合成におけるそれらの使用は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）がアミド結合形成を促進するために使用された１９５５年に遡る。カルボジイミドは、２個のわずかに塩基性の窒素原子を含有し、これが図１に示すようにアミノ酸誘導体のカルボン酸と反応して、高反応性のＯ−アシルイソ尿素化合物を形成する。形成されたＯ−アシルイソ尿素は、次いで直ちにアミンと反応し、ペプチド結合を形成できる（すなわち、図１で水平に示されている経路）。それとは別に、Ｏ−アシルイソ尿素は他の反応性種に変換されることもある。
【０００６】
[0008]しかしながら、Ｏ−アシルイソ尿素のこれらの別の選択肢の反応の一部は、ペプチド結合形成に至ることも至らないこともある望ましくない経路を促進する。これらの望ましくない経路も図１に示す。非反応性のＮ−アシル尿素（図１、左下）に変換されるとカップリングが妨げられる一方、オキサゾロン形成（右下）を通ると活性化キラルアミノ酸のエピマー化が起こりうる。カルボジイミドに比して過剰のアミノ酸を使用することにより、より望ましい高反応性の対称性無水物を形成することができる（図１、左上）。しかしながら、この手法は追加アミノ酸当量を消費するので望ましくない。
【０００７】
[0009]１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をカルボジイミド活性化の最中に添加剤として配合すると、カルボジイミド活性化法に顕著な改良が起きた。ＨＯＢｔはＯ−アシルイソ尿素を高反応性のＯＢｔエステル（図１、右上）に迅速に変換するが、望ましくないＮ−アシルイソ尿素及びオキサゾロンの形成は防止する。後に、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）が、７位の窒素の隣接基効果のために、ＨＯＢｔの有益な代替であることが示された［１６１］。ＨＯＢｔ及びＨＯＡｔの代わりに他の多くの添加剤が使用できる。いくつかの一般的な例を挙げると、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ）、エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ、ＥＣＨＡ）、及び１−ヒドロキシ−２，５−ピロリジンジオン（ＮＨＳ）などである。
【０００８】
[0010]典型的には、アミノ酸及びカルボジイミドの量と比べて１当量の添加剤が使用される。しかしながら、最近の研究で、添加剤の量を１当量未満に低減することが有用でありうることが示唆された。Ｓ．Ｎｏｚａｋｉ，“過剰の添加剤が引き起こすカップリングの遅延(Delay of coupling caused by excess additives）”，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１４７−１５３，２００６。著者は、アシル化反応がアミンと添加剤間の塩形成によって妨害されうることを見出した。しかしながら、著者は、添加剤を１当量未満に低減することは活性化速度を落とし、セグメントカップリングにおけるエピマー化をわずかに増大させることも見出した。
【０００９】
[0011]Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ)がペプチド活性化のための好適なカルボジイミドとしてＤＣＣに大きく取って代わっている。ＤＣＣは、望ましくないことに、ＴＦＡにしか溶解しない尿素を生成するので、このことがＦｍｏｃ化学でのその使用を困難にしている。さらに、ＤＣＣは、取扱いが困難となりうるワックス状固体であり、アレルギー反応を引き起こすことも報告されている。他方、ＤＩＣは、その生成尿素の有機溶媒中での改良された溶解性、報告されたアレルギー反応の低発生率、及び比較的低コストといった利益を提供する。ＤＩＣ／ＨＯＢｔの組合せは、日常的に効果的なカップリングを提供しながらも低コスト及び最小限の副反応のため、普及している。
【００１０】
[0012]１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（“ＥＤＣ”）は別の人気の選択肢を表し、これらの反応の大部分は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、及びＥＤＣの一つ又は複数を用いて実施される。
【００１１】
[0013]ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、及び６−Ｃｌ−ＨＯＢｔなどのベンゾトリアゾール系添加剤の最近の分析により、それらはクラス１爆発物と再分類されることとなった。Ｋ．Ｗｅｈｒｓｔｅｄｔ，Ｐ．Ｗａｎｄｒｅｙ及びＤ．Ｈｅｉｔｋａｍｐ，“１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの爆発性(Explosive properties of 1-hydroxybenzotriazoles)，”Ｊ．Ｈａｚａｒｄ  Ｍａｔｅｒ，ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．１−７，２００５。ベンゾトリアゾール添加剤のこの望ましくない特徴のため、ベンゾトリアゾール添加剤に代わる適切な代替品の開発に関心が高まっている。例えば、Ｏｘｙｍａ（エチル  ２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセテート）で、１９７３年に最初に報告された（Ｍ．Ｉｔｏｈ，“ペプチド．ＩＶ．エチル−２−ヒドロキシイミノ−２−シアノアセテート及びそのアミドの使用によるラセミ化の抑制(Peptides. IV. Racemization Suppression by the Use of Ethyl-2-Hydroximino-2-cyanoacetate and Its Amide)，”Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２２１９−２２２１，１９７３）。さらに最近、Ｏｘｙｍａの爆発性について、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)のほか加速速度熱量測定（ＡＲＣ，accelerating rate calorimetry）でも試験され、ＨＯＢｔに比べて好ましい結果が得られた。Ｒ．Ｓｕｂｉｒｏｓ−Ｆｕｎｏｓａｓ，Ｒ．Ｐｒｏｈｅｎｓ，Ｒ．Ｂａｒｂａｓ，Ａ．Ｅｌ−Ｆａｈａｍ及びＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，“Ｏｘｙｍａ: ベンゾトリアゾール系ＨＯＢｔ及びＨＯＡｔに代わる爆発危険性の低いペプチド合成用の効率的な添加剤(An Efficient Additive for Peptide Synthesis to Replace the Benzotriazole-Based HOBt and HOAt with a Lower Risk of Explosion)，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．９３９４−９４０３，２００９。
【００１２】
[0014]別の潜在的不利益として、室温合成条件下でのカルボジイミドに基づく活性化法の使用は、比較的遅い活性化過程及びより酸性のカップリング環境の両方に由来する高レベルの欠失をもたらしうる。
【００１３】
[0015]オニウム塩活性化
ＤＩＣ活性化の潜在的不利益を回避するため、より最近ではオニウム塩に基づく活性化法の開発が行われるようになった。オニウム塩に基づく活性化は塩基の使用を必要とする。塩基は、カルボン酸をまず脱プロトン化してカルボキシレートアニオンを生成させ、これがオニウム塩活性化剤と反応する。多くのオニウム塩で、改良されたカップリングが実証されている。例えば、室温条件下でのカルボジイミドに基づく活性化と比較した場合、とりわけ、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）；２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）；（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）；（３−ヒドロキシ−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジナト−Ｏ）トリ−１−ピロリジニル−ホスホラスヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）；及び２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）が挙げられる。
【００１４】
[0016]図２にオニウム塩に基づく活性化経路を示す。
[0017]カルボジイミド型活性化での塩基の使用
[0018]少数の報告ではあるが、カルボジイミドに基づくカップリング時の塩基の存在について、室温カップリング条件下で検討されている。Ｂｅｙｅｒｍａｎｎら（Ｍ．Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ，Ｐ．Ｈｅｎｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｋｌｏｓｅ，Ｒ．Ｓｏｈｒ及びＭ．Ｂｉｅｎｅｒｔ，“カルボジイミド媒介ペプチド合成に及ぼす第三アミンの影響(Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis)，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２５２−２５６，１９９１）は、以前、室温条件下でのカルボジイミドに基づく活性化は、ヒンダードアミン塩基の存在によって妨げられることを示した。これは、塩基の優先的プロトン化により、カルボジイミドのプロトン化が阻害されることによって起こるのであろう。カルボジイミドのプロトン化は、カルボジイミドに基づく活性化技術においてＯ−アシルイソ尿素を生成させるのに必要な第一歩である。しかしながら、Ｂｅｙｅｒｍａｎｎらは、アミノ酸と比べて１当量の同じヒンダードアミン塩基は、それが活性化過程の完了後に添加されると、室温でのカップリング過程を増強できることも示した。要するに、１当量の塩基を加えることにより、Ｂｅｙｅｒｍａｎｎは、オニウム塩活性化法とカルボジイミド活性化法のその後のアシル化条件を似せることができたため、類似した結果がもたらされた。
【００１５】
[0019]Ｃａｒｐｉｎｏら（Ｌ．Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｅｌ−Ｆａｈａｍ  ａｎｄ  Ａ．，“ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール系：セグメントカップリング及び逐次ペプチドアセンブリ(The Diisopropylcarbodiimide/1-Hydroxy-7-azabenzotriazole System: Segment Coupling and Stepwise Peptide Assembly)，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．６８１３−６８３０，１９９９）は、後に、カルボジイミドに基づくカップリングにおいて、アミノ酸と比べて１又は２当量の、２，４，６−トリメチルピリジン（ＴＭＰ）のような著しく弱い塩基が存在すると、カルボジイミドのプロトン化を妨害することなく、活性化及びカップリング工程の両方を改良できることを示した。同じ研究で、Ｃａｒｐｉｎｏら（１９９９）は、アミノ酸に対し３又は４当量の強塩基ＤＩＥＡを使用すると、難しい５マー配列において、弱塩基のＴＭＰよりもその後のペプチドのアシル化工程に著しく効果的であったことも示した。Ｃａｒｐｉｎｏら（１９９９）は、（Ｂｅｙｅｒｍａｎｎらとも一致して)強塩基の存在は活性化過程を妨害するので、その後のアシル化工程中にのみ存在すべきであることも示した。
【００１６】
[0020]このように、Ｃａｒｐｉｎｏら（１９９９）もＢｅｙｅｒｍａｎｎらも、場合によっては、室温でのカルボジイミドに基づくカップリング法は、予備活性化工程とその後のＤＩＥＡのような強塩基の存在下（活性化アミノ酸に対して１〜４当量の量で存在する）でのアシル化を使用することにより、最適な結果が得られることを教示している。理論的には、活性化アミノ酸と比べて少なくとも１当量の塩基を使用すれば、２当量の塩基が典型的には使用されるオニウム塩に基づく技術が模倣される。オニウム塩の場合、１当量目は活性化中に必要なカルボキシレートアニオンの形成に必要とされるが、２当量目はその後のアシル化工程を増強するために存在する。
【００１７】
[0021]それでも、Ｂｅｙｅｒｍａｎｎらは、この方法は、オニウム塩（ＢＯＰ、ＴＢＴＵ）で観察される合成結果にのみ匹敵すると記しているが、Ｃａｒｐｉｎｏ（１９９９）は、オニウム塩カップリングと塩基の存在下でのカルボジイミドに基づくカップリング間の直接比較を行っていない。従って、Ｃａｒｐｉｎｏ（１９９９）及びＢｅｙｅｒｍａｎｎらは共に、室温で類似の量の塩基を配合することにより、カルボジイミドに基づく活性化後のアシル化工程が、オニウム塩に基づく活性化後のアシル化工程と同様に実施できることを教えている。
【００１８】
[0022]しかしながら、カップリング過程中の塩基の使用は、望ましくない副反応を招きうるので理想的とは言えない。Ｃｏｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ）(High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis)，”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）は、何の塩基も存在しないカルボジイミドに基づくカップリング法下、９０℃で最小限のシステインのエピマー化を示した。Ｐａｌａｓｅｋら（Ｓ．Ｐａｌａｓｅｋ，Ｚ．Ｃｏｘ及びＪ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，“マイクロ波増強Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成における限定的ラセミ化及びアスパルチミド形成(Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis)，”Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１４３−１４８，２００７）は、ＤＩＥＡ及びＮＭＭが２当量存在すると、オニウム塩活性化法下では著しいシステインのエピマー化が起こりうることを示した。さらに、Ｆｍｏｃ保護基はＤＩＥＡに対して徐々に不安定となり、この不安定さは高温で増大しうるので、望ましくない挿入配列（分離が困難でありうる）をもたらす。
【００１９】
[0023]別の研究で、Ｐｅｒｉｃｈら（Ｊ．Ｐｅｒｉｃｈ，Ｎ．Ｅｄｅ，Ｓ．Ｅａｇｌｅ及びＡ．Ｂｒａｙ，“Ｍｕｌｔｉｐｉｎ法によるホスホペプチドの合成：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｂｚｌ，Ｈ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｂｚｌ，Ｈ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ３Ｂｚｌ，Ｈ）−ＯＨの組込みのためのカップリング法の評価(Synthesis of phosphopeptides by the Multipin method: Evaluation of coupling methods for the incorporation of Fmoc-Tyr(PO3Bzl,H)-OH, Fmoc-Ser(PO3Bzl,H)-OH and Fmoc-Thr(PO3Bzl,H)-OH)，”Ｌｅｔｔ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６，ｐｐ．９１−９７，１９９９）は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ（１：１）及びＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（１：１：１）活性化系を、３種類の１０マーホスホペプチドの室温合成において、様々なオニウム塩法と比較した。彼らは、両カルボジイミド法ともＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ及びＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ／ＤＩＥＡに劣ると結論付けた。
【００２０】
[0024]連結及び切断（切り出し）
[0025]ＳＰＰＳにおける基本的な初期工程は、当然ながら、第一のアミノ酸を、選択されたポリマー樹脂に、そうするための中間化合物（“リンカー”）を用いて接続（“連結(linking)”）する工程である。この初期連結工程は特別な条件を必要とすることがある。そのような変更された条件は、典型的には、カップリングのための求核試薬として働かねばならないヒドロキシル基を特徴とする標準的酸リンカーに必要とされる。アルコールのアセチル化は難しく、典型的には、アルコールのためのアセチル化触媒として働く４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）によって促進される；［Ｘ．Ｓｈａｎｇｊｉｅ，Ｉ．Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｋｅｍｐｆ，Ｈ．Ｍａｙｒ，Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ及びＨ．Ｚｉｐｓｅ，“アルコールのＤＭＡＰ触媒アセチル化−機構研究(The DMAP-Catalyzed Acetylation of Alcohols - A Mechanistic Study)，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．４７５１−４７５７，２００５。酸リンカーの例は、とりわけ、広く使用されているＨＭＰＡ及びＷａｎｇリンカーなどである。これらの場合、変更されたカルボジイミド型カップリング技術が使用され、添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、及びＯｘｙｍａ）の不在下、カップリングを促進するために添加される１当量以下のＤＭＡＰで、高反応性の対称性無水物が生成する。ＤＭＡＰは活性化過程中には避けるべきである。なぜならば、活性化を劇的に緩徐化しがちだからである（Ｃａｒｐｉｎｏら及びその他に示されている通り）。この手順はよく知られており、文献に記載されている（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ及びＢ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，“活性化されウレタン保護されたアミノ酸のｐ−ジメチルアミノピリジンによるラセミ化。固相ペプチド合成における意義(Racemization of Activaterd, Urethane-protected Amino-acids by p-Dimethylaminopyridine. Significance in Solid-phase Peptide Synthesis)，”Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，ｐｐ．３３６−３３７，１９８１；Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｔａｍ，Ｂ．Ｗａｎｇ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，“４−ジメチルアミノピリジンによるペプチドカップリング反応の増強(Enhancement of peptide coupling reactions by 4-dimethylaminopyridine)，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．４５９−４６７，１９８１；Ｍ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，“困難なカップリングを改良するための手順(Procedures to Improve Difficult Couplings)，”Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −  ｖｏｌ．３５，ニュージャージー州トトワ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐ．１０）。残念なことに、方法は、室温でも広範なエピマー化を起こすことが知られており、システイン及びヒスチジンのような感受性アミノ酸誘導体を樹脂にローディング（連結）するのに問題がある。
【００２１】
[0026]加熱、高温、及びマイクロ波照射
[0027]別の因子として、近年、ＳＰＰＳ中にＳＰＰＳ及びアミノ酸カップリングを改良するための方法として加熱工程又はマイクロ波照射工程が広く適用されている。マイクロ波照射又はその他の公知慣用加熱法は、標準的なカルボジイミド及びオニウム塩カップリング法の両方で使用されている。しかしながら、カップリング工程中に高温を使用することは、ペプチド合成にいくつかの課題を提示する。オニウム塩に基づく活性化法の間にはシステイン誘導体のエピマー化が実質的に増大する。このエピマー化は、高温での塩基（典型的にはＤＩＥＡ、ＮＭＭ）の存在に起因する。さらに、活性化中にアルギニンのδ−ラクタム形成の増大が観察され、ある配列では主なアルギニン欠失をもたらす；Ｐ．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＺ．Ｃｏｘ，“従来式合成及びマイクロ波支援合成の比較研究(Comparative study of conventional and microwave assisted synthesis)，”第１９回米国ペプチドシンポジウム，カリフォルニア州サンジエゴ，２００５。
【００２２】
[0028]最近、Ｃｏｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）は、非常に迅速で効率的なカップリングが、何の塩基もなしに９０℃で現場カルボジイミドに基づくカップリングにより実施できることを示した。このことは、マイクロ波照射が、遅い活性化過程とその後のアシル化工程を共に９０℃で２分間で促進できることを示した。Ｃｏｌｌｉｎｓのカップリング法の間、存在する何らかの塩基を回避することは、活性化がＣａｒｐｉｎｏ（１９９９）及びＢｅｙｅｒｍａｎｎらによる記述のような様式で妨害されず、カップリング環境がエピマー化からより安全であるという利益を提供する。実際、Ｃｏｌｌｉｎｓらは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨが、室温法と比べてエピマー化の増大なしに９０℃でカップリングできることを示した。従って、Ｃｏｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）は、高温でカルボジイミド化学を最適に使用すれば塩基の使用が回避されることを教えている。
【００２３】
[0029]しかしながら、欠点として、（オニウム塩と比べて）低反応性のカルボジイミドの活性化を推進するために必要とされる高温でより酸性の環境は、超酸感受性リンカー（例えば２−クロロトリチル）に結合されたペプチドの早期切断を招きがちである。そのような早期切断は、樹脂からのペプチドの全体的損失をもたらしうるほか、このクラスのリンカーと共に適用できる温度を著しく制限しうる。
【００２４】
[0030]しかしながら、超酸感受性リンカーは、より大きいペプチド配列の構築を可能にするペプチドフラグメントの縮合を可能にするので、ペプチド合成において大いに重要である。嵩高い超酸リンカー（例えば２−クロロトリチル）も、ジケトピペラジン形成などの重要な副反応の回避、樹脂ローディング中のＤＭＡＰの回避、及び酸リンカーに連結されたｃ−末端システイン残基のベータ脱離のために、独自の重要性を持つ。
【００２５】
[0031]部分的であるかもしれないが手短にまとめると、高温又はマイクロ波支援ＳＰＰＳの利益は、いくつかの不利益によって相殺される。一つの不利益として、ＤＩＣ活性化剤、酸性環境、及びある種の樹脂の組合せは、（ｉ）早期（望ましくない）切断；及び（ii）活性化後の遅いカップリングをもたらす。
【００２６】
[0032]別の不利益として、オニウム活性化剤は、各酸を加えるために少なくとも１当量の塩基を必要とするが、余分の塩基は一部の酸をラセミ化しがちであり、そしてまた、その他を分解する。
【００２７】
[0033]第三の可能性ある不利益として、塩基は高温でアミノ酸の安定性に影響を及ぼす。これは、特にアルギニンなどのある種の酸の反応時間枠を短縮する要因となる。
[0034]このように、ペプチド化学者は、カルボジイミド又はオニウム塩に基づく活性化法のいずれかを用いるペプチド合成において、カップリング工程に高温を適用する場合、多数の、そして時に競合する制限に直面する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Ｓ．Ｎｏｚａｋｉ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１４７−１５３，２００６
【非特許文献２】Ｋ．Ｗｅｈｒｓｔｅｄｔ，Ｐ．Ｗａｎｄｒｅｙ及びＤ．Ｈｅｉｔｋａｍｐ，Ｊ．Ｈａｚａｒｄ  Ｍａｔｅｒ，ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．１−７，２００５
【非特許文献３】Ｍ．Ｉｔｏｈ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２２１９−２２２１，１９７３
【非特許文献４】Ｒ．Ｓｕｂｉｒｏｓ−Ｆｕｎｏｓａｓ，Ｒ．Ｐｒｏｈｅｎｓ，Ｒ．Ｂａｒｂａｓ，Ａ．Ｅｌ−Ｆａｈａｍ及びＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．９３９４−９４０３，２００９
【非特許文献５】Ｍ．Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ，Ｐ．Ｈｅｎｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｋｌｏｓｅ，Ｒ．Ｓｏｈｒ及びＭ．Ｂｉｅｎｅｒｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２５２−２５６，１９９１
【非特許文献６】Ｌ．Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｅｌ−Ｆａｈａｍ  ａｎｄ  Ａ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．６８１３−６８３０，１９９９
【非特許文献７】Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４
【非特許文献８】Ｓ．Ｐａｌａｓｅｋ，Ｚ．Ｃｏｘ及びＪ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１４３−１４８，２００７
【非特許文献９】Ｊ．Ｐｅｒｉｃｈ，Ｎ．Ｅｄｅ，Ｓ．Ｅａｇｌｅ及びＡ．Ｂｒａｙ，Ｌｅｔｔ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．６，ｐｐ．９１−９７，１９９９
【非特許文献１０】Ｘ．Ｓｈａｎｇｊｉｅ，Ｉ．Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｋｅｍｐｆ，Ｈ．Ｍａｙｒ，Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ及びＨ．Ｚｉｐｓｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．４７５１−４７５７，２００５
【非特許文献１１】Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ及びＢ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，ｐｐ．３３６−３３７，１９８１
【非特許文献１２】Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｔａｍ，Ｂ．Ｗａｎｇ及びＲ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．４５９−４６７，１９８１
【非特許文献１３】Ｍ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −  ｖｏｌ．３５，ニュージャージー州トトワ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐ．１０
【非特許文献１４】Ｐ．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＺ．Ｃｏｘ，第１９回米国ペプチドシンポジウム，カリフォルニア州サンジエゴ，２００５
【発明の概要】
【００２９】
[0035]本発明は、高温での標準的なカルボジイミド及びオニウム塩に基づく両方法によるカップリングの制限を克服する、ＳＰＰＳのための改良されたカップリング法である。本方法は、塩基の使用を特徴とする変形カルボジイミド活性化戦略である。アミノ酸と比べて１当量未満（以下）で添加された強塩基が活性化及びカップリング過程全体を通じて存在しながらも、全体的カップリング反応を増強し、可能性ある副反応を回避し、合成速度を増強し、そして得られたペプチドの純度を増大することができる。
【００３０】
[0036]一側面において、改良は、アミノ酸、カルボジイミド、活性化添加剤、及び塩基（活性化されるアミノ酸の量と比べて１当量未満（以下）の量の塩基）を混合する工程と、そして活性化及びカップリング工程を３０℃より高い温度で実施する工程とを含む。
【００３１】
[0037]別の側面において、本発明は、カルボン酸とアミンのカップリング法における改良である。改良は、カルボン酸、アミン、カルボジイミド、活性化添加剤、及び塩基（酸と比べて１当量未満の塩基）を混合する工程と、そして活性化及びカップリングを３０℃より高い温度で実施する工程とを含む。
【００３２】
[0038]さらに別の側面において、改良は、超酸感受性リンカー（ペプチドと固相樹脂を連結する）、アミノ酸、カルボジイミド、活性化添加剤、及び塩基を混合する工程と；そして活性化及びカップリングを３０℃より高い温度で実施する工程とを含む。
【００３３】
[0039]本発明の上記及びその他の目的及び利点、ならびに本発明が達成される様式は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を基にすることにより、より明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】[0040]図１は、カルボジイミドに基づく活性化の、よく理解された、可能性ある経路を示す図である。
【図２】[0041]図２は、オニウム塩に基づく活性化の、よく理解された反応経路を示す略図である。
【図３】[0042]図３は、２当量の塩基の存在下でのオニウム塩活性化後９０℃で実施されたチモシン合成のＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムである。
【図４】[0043]図４は、Ｏｘｙｍａの存在下、しかし何の塩基も使用せずに９０℃で実施されたチモシン合成のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】[0044]図５は、Ｏｘｙｍａの存在下、しかし何の塩基も使用せずに９０℃で実施されたチモシン合成の質量スペクトルである。
【図６】[0045]図６は、Ｏｘｙｍａ及び１当量の塩基の存在下、９０℃で実施されたチモシン合成のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】[0046]図７は、Ｏｘｙｍａを用い、０．１当量の塩基の存在下、９０℃で実施されたチモシン合成のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】[0047]図８は、Ｏｘｙｍａを用い、０．１当量の塩基の存在下、１００℃で実施されたチモシン合成のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】[0048]図９は、Ｏｘｙｍａを用い、０．１当量の塩基の存在下、１００℃で実施されたチモシン合成の質量スペクトルである。
【図１０】[0049]図１０は、９０℃で実施されたカップリング反応について、含まれる塩基の量に対するペプチドの純度を比較するプロットである。
【図１１】[0050]図１１は、固相ペプチド合成におけるシステインの一つのラセミ化経路を示す図である。
【図１２】[0051]図１２は、アルギニンに特異的な、ＳＰＰＳにおける可能性あるラクタム形成反応を示す。
【図１３】[0052]図１３は、ＨＢＴＵ及び２当量の塩基を使用し、９０℃で実施されたＡＢＲＦ  １９９２ペプチドのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）クロマトグラムである。
【図１４】[0053]図１４は、ＤＩＣ及びＯｘｙｍａを使用し、しかし何の塩基も使用せずに９０℃で実施されたＡＢＲＦ  １９９２ペプチドのＵＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】[0054]図１５は、図１４と同じ反応の質量スペクトルである。
【図１６】[0055]図１６は、図１４と同じ反応であるが、０．１当量の塩基を使用した場合のＵＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
[0056]広い意味において、本発明は、高温で実施されるＳＰＰＳを改良する様式で塩基を取り入れている。おそらく、多くの異なる種類の塩基が本方法に使用できるであろう。本明細書において、“１当量の塩基”又は“０．１当量の塩基”という語句は、文脈中で他の何らかの意味が明示されていない限り、常に、存在するアミノ酸の量と比べた、存在する塩基の量のことを言う。添付の実施例中に示されている塩基のほかに、出願人らは、トリエチルアミン（“ＴＥＡ”）も、同一又は類似の状況において有用であろうと考えている。
【００３６】
[0057]さらに、当業者であれば、本発明及びその利益は、カルボン酸とアミンの反応の観点からも表現できることは分かるであろう。
[0058]オニウム塩に基づく方法の制限は、活性化を完了するためにアミノ酸と比べて少なくとも１当量の塩基と活性化剤を必要とすることである。これは、図２に示されているように、カルボキシレートアニオンがオニウム塩活性化剤に対して求核攻撃を実施できるように、活性化される各アミノ酸上で生成されねばならないからである。我々は、公知の困難な２８マーペプチド（チモシン）を、表１に示すような様々な量の塩基（ＤＩＥＡ）を用いて合成することにより、塩基の必要性を検証した。図３は、活性化にＨＢＴＵと、塩基として２当量のＤＩＥＡを使用した実験のＵＰＬＣクロマトグラムである（エントリー５）。図３は、多数の（望ましくない）フラグメント及び全体的な純度不足を示している。
【００３７】
【表１】
0006348102.tif 000002
【００３８】
[0059]実験条件
ペプチド配列（チモシン）＝ＳＤＡＡＶＤＴＳＳＥＩＴＴＫＤＬＫＥＫＫＥＶＶＥＥＡＥＮ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ（１：０．９：変数）
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0060]これに対し、この同じペプチド（チモシン）は、何ら塩基の存在なしに、カルボジイミドに基づく活性化（ＤＩＣ）及び一般的な活性化添加剤Ｏｘｙｍａを用いて、より高純度（６３％；表２、エントリー１１）で合成できた。
【００３９】
[0061]次に、我々は、活性化及びその後のアシル化工程全体を通じて、活性化されるアミノ酸と比べて１〜２当量の塩基を添加してみた。これらの手法の結果、塩基なしの対照実験と比べて純度は低下か又は同様のいずれかであった。
【００４０】
[0062]Ｂｅｙｅｒｍａｎｎら及びＣａｒｐｉｎｏ（１９９９）は、塩基を活性化の完了後に加えることによって純度を多少増大できることを示唆し、Ｏ−アシルイソ尿素の形成が室温条件下でいかに強塩基の存在によって妨害されうるかについて記載した。しかしながら、活性化後に塩基を加えることは、自動化の可能性をより複雑にするほか、全体的カップリング過程を減速することなく、必要な操作工程（これも何らかの対応する自動化工程の複雑さを増大しうる）を増大することなく実施することも困難である。さらに、これらの実験で使用された高温で、我々は、カップリング過程全体においてＴＭＰの存在から得られる有意の利益を観察しなかった。比較として、Ｃａｒｐｉｎｏ（１９９９）は、カルボジイミドに基づくカップリング法の改良を提供するために室温条件下でＴＭＰを使用した。
【００４１】
【表２】
0006348102.tif 000003
【００４２】
[0063]実験条件
ペプチド配列（チモシン）＝ＳＤＡＡＶＤＴＳＳＥＩＴＴＫＤＬＫＥＫＫＥＶＶＥＥＡＥＮ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／添加剤（１：１：１）
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0064]図４及び６は、表２の各クロマトグラムであり、図５は、図４の実験に対応する質量スペクトルである。これらは、高温でのカルボジイミドに基づくカップリングの場合、塩基なし（図４、６３％）と１当量の塩基（図６、５９％）の間では成果が一般的に類似していることを示している。
【００４３】
[0065]先行技術の努力と比較して有利なことに、本発明の使用は、ごく少量の塩基（ＤＩＥＡ）（具体的にはアミノ酸の量と比べて１当量よりはるかに少なく）と、カルボジイミド活性化剤を使用することにより、純度を７３％まで上げた。本発明を使用すれば、低過剰の塩基の存在は、高温でＯ−アシルイソ尿素の形成を著しく妨害せず、同時にその後のアシル化工程も改良する。
【００４４】
[0066]表３に、高温でいくつかの異なる量の塩基（すべて１当量未満）を用いたこれらの結果の一部を分類する。
【００４５】
【表３】
0006348102.tif 000004
【００４６】
[0067]実験条件
ペプチド配列（チモシン）＝ＳＤＡＡＶＤＴＳＳＥＩＴＴＫＤＬＫＥＫＫＥＶＶＥＥＡＥＮ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：１：１）
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0068]図７、８及び９は、表３の結果のＵＰＬＣクロマトグラム及び質量スペクトルであり、様々な温度でのチモシン合成について本発明の改良を示している。図７は９０℃で０．１当量の塩基を用いて７０％の純度を示しており；図８は１００℃で０．１当量の塩基を用いて７３％の純度を示しており；図９は図８の実験の質量スペクトルである。
【００４７】
[0069]ごく少量の塩基しか存在しない合成でこのような改良を達成できる能力は、驚くべきことであり、他に類を見ない価値を有する。多量の塩基は室温条件下でアシル化反応を完了へと推進することが示されているが、本発明で使用される少量の塩基は直観に反する。実際、Ｃａｒｐｉｎｏ（１９９９）は、困難なアシル化反応は、困難なペプチドの室温合成中、存在する塩基（ＤＩＥＡ）の量を４当量まで増大させるに従って改良されたことを示した。
【００４８】
[0070]発明者らは何らかの理論にとらわれることを望まないが、本発明の結果は、高温が、活性化されたアミノ酸誘導体の安定性に及ぼす効果から得られているようである。この可能性を評価するために、我々は、予備活性化された代表的Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、様々な高温条件で一連の実験を実施した。設計された時間間隔の予備活性化直後、活性化アミノ酸誘導体を室温に冷却し、次いで、全例で同様の条件下、樹脂上の４マーペプチドに１当量で添加した。これにより、高温での活性化過程をくぐり抜けた活性化アミノ酸の量が示され、ひいては相対安定性が示される。
【００４９】
[0071]表４に示されているように、高温では、活性化アミノ酸誘導体の安定性と存在する塩基の量との間に負の相関関係が存在する。これは、カップリング反応中に存在する塩基の量が多いほど活性化アミノ酸種のより速い分解を招き、それによってその後のアシル化効率が低下することを示している。アシル化過程は酸性の活性化添加剤を再生することに注意すべきである。従って、活性化アミノ酸種は、酸性添加剤が活性化と同時に再生される現場活性化過程では多少長い寿命を有するはずなので、塩基の存在を部分的に相殺するのであろう。
【００５０】
【表４】
0006348102.tif 000005
【００５１】
[0072]実験条件
ペプチド配列＝ＤＹＩＮＧ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを除くすべてのアミノ酸）＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：１：１）
カップリング（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）＝アミノ酸は、表４に記載のように予備活性化され、カップリングの前に室温に冷却された。その後のカップリングは９０℃で２分間実施された。
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0073]水
[0074]Ｔｏｆｔｅｎｇら［Ａ．Ｔｏｆｔｅｎｇ，Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｓｔａｅｒｋ及びＫ．Ｊｅｎｓｅｎ，“ペプチド合成において試薬及び反応中間体の半減期に及ぼす残留水及びマイクロ波加熱の影響(Effect of Residual Water and Microwave Heating on the Half-Life of the Reagents and Reactive Intermediates in Peptide Synthesis)，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．９０２４−９０３１，２０１２］は、最近、水中での活性化アミノ酸の安定性に及ぼす水の影響について調べた。著者らは、ＤＭＦ中の様々な量の水（５０〜１８，０００ｐｐｍ）を基に、ある種のカップリング試薬と活性化エステルの安定性の間の相関に気付いた。さらに、著者らは、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ／ＤＩＥＡ（１：１：２）対ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：１）の効率も比較し、１０マーペプチドの合成純度における有意の差を観察しなかった。
【００５２】
[0075]我々は、活性化エステルは、追加の水を加えない場合（表４、エントリー３）９０％無傷であったのに対し、大量の水（例えば３００，０００ｐｐｍを超える）の存在下でも９０℃で２分間（表４、エントリー４）の後もまだ３６％無傷であったことを見出した。この差は、エステルが、追加水は何も存在しないが１当量のＤＩＥＡは存在する場合（表４、エントリー６）よりも、３００，０００ｐｐｍを超える水の存在下で高い安定性を有することを示唆していた。３００，０００ｐｐｍを超える水と１当量のＤＩＥＡが存在する場合（表４、エントリー７）は５％の生存率しか示さなかった。
【００５３】
[0076]オニウム塩に基づくカップリングは、塩基の存在下、高温で、活性化エステルの不安定性の更なる指標を提供した。オニウム塩ＰｙＡＯＰから生成したエステルは、２当量の塩基の存在下（表４、エントリー１）、９０℃で２分間の後、１％しか無傷でなかった。安定性は、塩基の当量を１に低減することによって４０％に増大できた（表４、エントリー２）。しかしながら、この方法（水の添加なし）は、困難なチモシン配列の合成には効果的でなかった（表１、エントリー６）。
【００５４】
[0077]理論にとらわれることなく、これらの結果は、カップリング過程中の塩基の存在は、高温で活性化アミノ酸種の安定性に影響を及ぼす主要因であることを示している。ｐＨは、活性化アミノ酸種の分解を促進できる強力な非求核塩基（例えば、ＤＩＥＡ、又はトリエチルアミン；“ＴＥＡ”）に強く影響される。具体的には第三アミンの非求核性は、存在する何らかの水からプロトンを誘引でき、それにより水酸化物（ＯＨ−１）イオンが生成する。これらの水酸化物イオンは迅速に（そして望ましくなく）活性化エステルを加水分解するので、所望のカップリングが抑制される。第二に、非求核塩基は、溶媒（例えばジメチルアミン）中に存在するアミンからの攻撃を触媒できる。さらに塩基の妨害（立体障害）も活性化種に対するその分解的作用に影響しうる。例えば、塩基のＮＭＭはＤＩＥＡよりも著しく弱いが、低妨害性である。これらの要因が合わさって、ＮＭＭは、その塩基度のみに基づいて予想される以上に活性化種の安定性を低下させているようである。
【００５５】
[0078]塩基の塩基度及び立体障害のどちらも、ペプチド合成においてエピマー化を起こすその能力に役割を果たしうることは前に言及されている（Ｌ．Ｃａｒｐｉｎｏ及びＡ．Ｅｌ−Ｆａｈａｍ，“Ｏ−ベンゾトリアゾリルウロニウム塩誘導ペプチドセグメントカップリングに及ぼす第三塩基の作用(Effect of Teriary Bases on O-Benzotriazolyuronium Salt-Induced Peptide Segment Coupling)，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５９，ｐｐ．６９５−６９８，１９９４）。従って、本発明の重要な特徴は、カルボジイミドカップリング法において、高温で活性化アミノ酸種の安定性に影響を及ぼす鍵となる変数を確認し、そして、ごく最少量の塩基の存在で合成品質を独自に改良する改良法を提供することである。塩基の量を最少化することによって、そうしなければ高温で求電子活性化種とすぐに反応し、それを破壊しかねないその他の求核試薬の生成が制限される。
【００５６】
[0079]カップリング反応中の塩基の役割をさらに調べるために、公知の非常に困難なカップリング反応について研究した。具体的には、上記Ｔｏｆｔｅｎｇが以前に研究した反応であるＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ残基を別のＡｉｂ残基にカップリングさせる反応である。我々は、Ｔｏｆｔｅｎｇの結果を再現でき、７５℃で２０分間のカップリングで９２％の純度を達成することができた。しかしながら、改良として、我々は、０．１当量のＤＩＥＡの存在下、９０℃でわずか６分間でこの結果にほぼ匹敵させることができた。０．１当量のＤＩＥＡの存在は、試験した各カップリング時間で０及び１．０当量のＤＩＥＡのどちらよりも優れていた。例えば表５及び図１０（そこでは塩基が主な変数であり、すべての反応は９０℃又は１００℃のいずれかで実施された）。これらの結果は、１当量未満の塩基は、活性化アミノ酸の安定性とアシル化を促進するための塩基性環境との間の最適なバランスを提供するため、高温カップリングに独自に適していることを示している。
【００５７】
【表５】
0006348102.tif 000006
【００５８】
[0080]実験条件
ペプチド配列＝Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−Ａｉｂ−ＩＤＹＩＮＧ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：１：１）
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0081]システイン
[0082]アミノ酸は活性化エステルに変換されると、アルファ（α）−炭素のプロトンの酸度が増大することは文書で十分に立証されている。システイン誘導体は、図１１に示すように、側鎖の硫黄原子の電子求引効果のために、特にエピマー化を受けやすい。オニウム塩活性化戦略を用いた高温カップリング条件下ではシステインの顕著なエピマー化が観察されている。ＤＩＥＡ又はＮＭＭをよりヒンダード塩基のＴＭＰで置き換えると、ＨＢＴＵカップリング中のシステインのエピマー化レベルが低下することが示されている（Ｐａｌａｓｅｋ）。しかしながら、ＴＭＰは、困難なカップリングにはあまり有効でないようなので、ＤＩＥＡの標準的代替品としては推奨されない。カップリング温度を５０℃以下に下げると、システインのエピマー化は減少したが、排除されることはなかった。しかしながら、低いカップリング温度は不完全なカップリング及び長い反応時間をもたらしうるので、低温は理想的でない。最近、Ｃｏｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）は、何の塩基も存在しないカルボジイミドに基づく活性化法（ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ）を使用すると、９０℃もの高さのカップリング温度でもシステインのエピマー化が最少化したことを示した。しかしながら、本発明者らは、システインのエピマー化を著しく増大することなく少量の塩基をこの同じ方法に添加できることを見出した（表６、エントリー２及び６）。これは、Ｐａｌａｓｅｋ及びＣｏｌｌｉｎｓら（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｓ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｖａｎｉｅｒ，“高効率固相ペプチド合成（ＨＥ−ＳＰＰＳ），”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．９４０−９４３，２０１４）が以前に研究した、システインカップリングを含有し、エピマー化を受けやすい同じペプチド配列で試験された。表６にこれらの結果をまとめた。
【００５９】
【表６】
0006348102.tif 000007
【００６０】
[0083]実験条件
ペプチド配列（ＡＢＣ  ２０マー）＝ＶＹＷＴＳＰＦＭＫＬＩＨＥＱＣＮＲＡＤＧ−ＮＨ２
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ポリスチレン樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のＡＡ／ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（１：１：１）
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
エピマー化分析＝加水分解／ジュウテリウム標識を用いた誘導体化後、ＧＣ−ＭＳ（Ｃ．Ａ．Ｔ．ＧｍｂＨ）
[0084]アルギニン
[0085]カップリング反応中、アルギニンの求核性側鎖がδ−ラクタムを形成しやすいことはよく知られている［Ｍ．Ｃｅｚａｒｉ及びＬ．Ｊｕｌｉａｎｏ，“Ｎ  アルファ−Ｎ  オメガ保護アルギニン誘導体のカップリング手順中のラクタム形成に関する研究(Studies on lactam formation during coupling procedures of N alpha-N omega-protected arginine derivatives)，”Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．８８−９１，１９９６］。図１２に示されているように、カルボン酸の活性化は、高塩基性δ−グアニジノ基（ｐＫａ＝１２．５）による攻撃を促進する。この非可逆的反応は、活性化剤の放出により活性化アルギニン誘導体を不活性種に変換する。この分子内副反応は高温で増大し、顕著なアルギニン欠失をもたらす（Ｐ．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＺ．Ｃｏｘ，“従来式合成及びマイクロ波支援合成の比較研究”，第１９回米国ペプチドシンポジウム，カリフォルニア州サンジエゴ，２００５）。可能性ある代替法として、アルギニンを室温で最初に長時間（例えば約３０分間）、次いで高温で短時間カップリングさせてもよい。Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，“ペプチド、タンパク質、及びペプチドミメティックのマイクロ波増強合成(Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics),”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  第３版中，Ｍｉｃｒｏｗａｖｅｓ，ドイツ・ワインハイム，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＆  Ｃｏ．ＫＧａＡ，２０１３，ｐｐ．８９７−９６０。しかしながら、この方法は不都合なことに遅く、カップリングを反復せねばならないため、２倍のアルギニンを必要とする。
【００６１】
[0086]これに対し、本発明は、アルギニンカップリングに関して、これまでに報告されていない高温でのカルボジイミドカップリング法の利益を提供する。特に、アルギニンは、標準的なカルボジイミドカップリング化学を用いて、顕著なδ−ラクタムの形成なしに非常に高温で（９０℃まで）カップリングさせることができる。これは、標準的カルボジイミドカップリング法のより酸性のカップリング環境によるもののようである。酸性の環境は、求核性アルギニン側鎖による求核攻撃の傾向を低減する。類似の効果は、塩基の存在下でのＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（１：１：１）及びＰｙＢＯＰ／ＤＩＥＡの両活性化系を用いたオルニチン誘導体の環化反応でも観察されている（Ｔ．Ｌｅｓｃｒｉｎｉｅｒ，Ｒ．Ｂｕｓｓｏｎ，Ｈ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｃ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｇ．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｃ．Ｐａｎｎｅｃｏｕｑｕｅ，Ｊ．Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ａ．Ａｅｒｓｃｈｏｔ及びＰ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，“ペプチド合成用ビルディングブロックとしてのオルニチンから誘導されたａ−アミノ酸(a-Amino acids derived from ornithine as building blocks for peptide synthesis)，”Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．１８３−１８９，１９９７）。発明者らは、活性化法から塩基を排除することは、分子内副反応の排除に有益であることに気付いた。特別な利点として、ごく少量の塩基を加えても、アルギニンはまだ顕著なδ−ラクタムの形成なしに９０℃でカップリングできた。添加された塩基の量が最小限だったので、全体的ｐＨは標準的なオニウム塩カップリング法よりも低かった。低塩基性の条件は、得られるカップリング挙動をδ−ラクタムの形成に関して標準的なカルボジイミドカップリング化学に似せることを可能にしながら、同時にこのカップリング法のその他の利益も提供する。
【００６２】
【表７】
0006348102.tif 000008
【００６３】
[0087]実験条件
ペプチド配列（ＡＢＲＦ  １９９２）＝ＧＶＲＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰＹ
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のアミノ酸
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析（エントリー１）＝ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ）にて、２１４ｎｍで、５〜７０％ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）のグラジエントを用い、０〜２０分間分析された。質量分析は、ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  イオントラップ質量分析計を用い、エレクトロスプレーイオン化により実施された（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製）。
分析（エントリー２〜４）＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0088]図１３〜１６は、表７に掲載された実験のデータを反映している。特に、図１３は、高温で２当量の塩基を使用した場合の比較的不良な結果を示しているが、図１６は、同じ温度で０．１当量の塩基を使用した場合のはるかに良好な結果を示している。
【００６４】
[0089]カルボジイミドに基づく活性化に対する本発明の変更は、高温での超酸感受性リンカーの早期切断といった、カルボジイミドに基づくカップリングの望ましくない特徴を回避するためにｐＨを上げている。しかしながら、少量の塩基を添加するだけであれば、カルボジイミドに基づくカップリングの独自の性質は維持される(活性化エステルの長寿命、システイン誘導体の最少のエピマー化、及びアルギニン誘導体のδ−ラクタム形成の回避）。これは、カップリング反応の全体的ｐＨが７付近に維持されているためである。このｐＨは、塩基性及び酸性で触媒される副反応の両方を回避するのに理想的であるが、同時にｐＨを多少上げることでアシル化の速度が増大する。
【００６５】
[0090]超酸感受性リンカー 
[0091]ＳＰＰＳにおける２−クロロトリチル及びトリチルのような超酸感受性リンカーは、主な副反応を克服し、ペプチド縮合反応に有用な十分保護されたペプチドフラグメントを生成する能力を有する。それでも、これらのリンカー結合の早期切断は、高温における懸念事項である（それらの不安定性が増すため）。ＳＰＰＳで使用される一般的な活性化剤（ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ）は酸性なので、一般的な切断酸(cleavage acid)（例えば酢酸）のように作用でき、ペプチド−樹脂結合を早期に切断する；Ｒ．Ｅ．−Ｆ．Ａ．ａ．Ａ．Ｆ．Ｓｕｂｉｒｏｓ−Ｆｕｎｏｓａｓ，“塩基により推進される副反応の防止に使用されるｐＨ調節剤としてのＯｘｙｍａの使用及び２−クロロトリチルクロリド樹脂に対するその影響(Use of Oxyma as pH modulatory agent to be used in the prevention of base-driven side reactions and its effect on 2-chlorotrityl chloride resin)，”Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．８９−９７，２０１２。高温は、酸性の活性化添加剤による早期切断を増大しがちである。
【００６６】
[0092]６０℃までの高温での標準的カルボジイミドカップリング化学は、早期切断の回避に成功している。Ｆｒｉｌｉｇｏｕら（Ｉ．Ｆｒｉｌｉｇｏｕ，Ｅ．Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，Ｄ．Ｇａｔｏｓ，Ｊ．Ｍａｔｓｏｕｋａｓ及びＴ．Ｔｓｅｌｉｏｓ，“２−クロロトリチル樹脂上でのヒトプレイオトロフィンの６０〜１１０ドメインのマイクロ波支援固相ペプチド合成(Microwave-assisted solid-phase peptide synthesis of the 60-110 domain of human pleiotrophin on 2-chlorotrityl resin)，”Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，ｖｏｌ．４０，ｐｐ．１４３１−１４４０，２０１１）は、６０℃の最大温度で５分間のＤＩＣ／ＨＯＢｔ（１：１）活性化による５１マーペプチドの合成の成功を報告した。所望生成物は、３０時間で、６０％の粗純度及び５１％の粗収率で得られた。従って、温度を６０℃以下に制限すると、超酸感受性樹脂を使用した場合の早期カップリングが回避されるようである。Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，“ペプチド、タンパク質、及びペプチドミメティックのマイクロ波増強合成，”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  第３版中，Ｍｉｃｒｏｗａｖｅｓ，ドイツ・ワインハイム，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＆  Ｃｏ．ＫＧａＡ，２０１３，ｐｐ．８９７−９６０。
【００６７】
[0093]しかしながら、カップリング温度を６０℃に制限することには二つの主な欠点がある。第一に、６０℃の温度は、困難なカップリングを完了させるための十分なエネルギーを供給できない。第二に、低温でのカップリングは、より長い反応時間を必要とするので、それによって合計の合成時間が著しく増大する。一例として、Ｆｒｉｌｉｇｏｕらの方法は、難しいチモシンペプチド（表２、エントリー１〜２）を合成する場合、低純度に終わった。しかしながら、この同じペプチドを９０℃のカップリング温度で合成すると、著しく高い粗純度及び合成時間の短縮がもたらされた。従って、超酸感受性リンカーを用い、高温で高収率を可能にする方法は大きな価値があるであろう。
【００６８】
[0094]発明者らは、少量の塩基の添加で、よく知られた６５−７４ＡＣＰペプチドの収率が、２−クロロトリチルリンカー上９０℃で合成された場合、著しく向上することを見出した（表８）。０．１当量のＤＩＥＡの添加は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔの場合、収率を１３４％、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ活性化の場合１７６％増大した。
【００６９】
【表８】
0006348102.tif 000009
【００７０】
[0095]実験条件
ペプチド配列（６５−７４ＡＣＰ）＝ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−クロロトリチル−樹脂（０．６８ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法＝９０℃で１分間
洗浄＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のアミノ酸
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0096]発明者らは、少量の塩基の添加で、よく知られた６５−７４ＡＣＰペプチドの収率が、トリチルリンカー上９０℃で合成された場合、著しく向上することも見出した（表９）。０．１当量のＤＩＥＡの添加は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ及びＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ活性化の両方で完全な安定性をもたらした。これは、ＤＩＣ／ＨＯＢｔの場合、３５％の収率増大、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａの場合１５３％の収率増大に表れている。一般に、トリチルリンカーの方がこれらの高温での条件下では２−クロロトリチルよりも多少安定性が高いようである。
【００７１】
【表９】
0006348102.tif 000010
【００７２】
[0097]実験条件
ペプチド配列（６５−７４ＡＣＰ）＝ＶＱＡＡＩＤＹＩＮＧ
合成規模＝０．１ｍｍｏｌ
樹脂＝Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＴ−樹脂（０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）
装置＝Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）
脱保護＝ＥｔＯＨ：ＮＭＰ（１：９）中１０％（ｗ／ｖ）ピペラジン３ｍＬ
マイクロ波脱保護法（エントリー１）＝室温で５分間＋１０分間
マイクロ波脱保護法（エントリー２〜６）＝９０℃で１分間
洗浄（エントリー１）＝脱保護後（５×５ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝（５×５ｍＬ−ＤＭＦ）
洗浄（エントリー２〜６）＝脱保護後（２ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ−ＤＭＦ）；カップリング後＝なし
カップリング＝４ｍＬ溶液中５倍過剰のアミノ酸
切断（切り出し）＝Ａｃｃｅｎｔ  ＭＷ  切断装置（ＣＥＭ  Ｃｏｒｐ．社製、ノースカロライナ州マシューズ）中３８℃で３０分間、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤｔ（９２．５：２．５：２．５：２．５）
分析＝ペプチドは、３１００シングル四重極ＭＳを備えたＷａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣ  ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓにて、溶媒系としてアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ入り）を用い、Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１×１００ｍｍ）で分析された
[0098]表１０及び１１に、本発明の比較利益をまとめる。
【００７３】
【表１０】
0006348102.tif 000011
【００７４】
【表１１】
0006348102.tif 000012
【００７５】
本発明の態様
態様１  カルボン酸とアミンのカップリング法において、改良が、
アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、カルボン酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを合わせ；そして
活性化及びカップリングを３０℃を超える温度で実施する
ことを含む方法。
態様２  態様１に記載の固相ペプチド合成法。
態様３  リンカーがアミノ酸を樹脂に連結している、態様１に記載の方法。
態様４  塩基を、活性化されるカルボン酸と比べて１当量未満の量で混合することを含む、態様１に記載の方法。
態様５  塩基の量が、存在するアミノ酸の量を基にして０．２当量以下である、態様４に記載の方法。
態様６  塩基の量が、存在するカルボン酸の量を基にして０．１当量以下である、態様１に記載の方法。
態様７  リンカーが、２−クロロトリチル及びトリチルからなる群から選ばれる、態様１に記載の方法。
態様８  リンカーがペプチドを樹脂に連結している、態様１に記載の方法。
態様９  １０分未満の総カップリング時間内で実施される、態様１に記載の方法。
態様１０  ４分未満の総カップリング時間内で実施される、態様１に記載の方法。
態様１１  ２分未満の総カップリング時間内で実施される、態様１に記載の方法。
態様１２  塩基が、ＤＩＥＡ、ＮＭＭ、ＴＭＰ、ＴＥＡ及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、態様１に記載の方法。
態様１３  カルボジイミドが、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、態様１２に記載の方法。
態様１４  活性化添加剤が、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、ＮＨＳ及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、態様１３に記載の方法。
態様１５  活性化及びカップリングが約３０℃〜１１０℃の温度で実施される、態様１に記載の方法。
態様１６  活性化及びカップリングが少なくとも約６０℃の温度で実施される、態様１に記載の方法。
態様１７  活性化及びカップリングが少なくとも約７５℃の温度で実施される、態様１に記載の方法。
態様１８  活性化及びカップリングが少なくとも約９０℃の温度で実施される、態様１に記載の方法。
態様１９  アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、カルボン酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを合わせ；そして
活性化及びカップリングを３０℃を超える温度で実施する
ことによって製造されたアミンとカルボン酸の反応生成物を含む組成物。
態様２０  ペプチドを樹脂に連結する超酸感受性リンカーと、アミノ酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを合わせ；そして
活性化及びカップリングを３０℃を超える温度で実施する
ことによって製造されたペプチド。
態様２１  アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、
カルボン酸と、
カルボジイミドと、
活性化添加剤と、そして塩基とを含み；
３０℃を超える温度で維持された混合物。
態様２２  カルボン酸とアミンのカップリング法であって、カルボン酸と、アミンと、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを合わせ、ここで塩基は酸と比べて１当量未満の量であり；そして活性化及びカップリングを３０℃を超える温度で実施することを含む方法。
[0099]図面及び明細書において、本発明の好適な態様を説明してきた。また、特定の用語を使用してきたが、それらは一般的及び説明的意味でのみ使用されたものであり、制限を目的としていない。本発明の範囲は特許請求の範囲において定義されている。
【図１】
0006348102.tif 000013
【図２】
0006348102.tif 000014
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006348102.tif 000019
【図８】
0006348102.tif 000020
【図９】
0006348102.tif 000021
【図１０】
0006348102.tif 000022
【図１１】
0006348102.tif 000023
【図１２】
0006348102.tif 000024
【図１３】
0006348102.tif 000025
【図１４】
0006348102.tif 000026
【図１５】
0006348102.tif 000027
【図１６】
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