(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する第１医薬組成物と、
Ｍｅｔチロシンキナーゼを阻害する第２医薬組成物で構成されることを特徴とする前記第１医薬組成物に対して耐性を有した慢性骨髄性白血病の治療用組成物。
【請求項２】
前記第１医薬組成物が、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブ、バフェチニブから選ばれる少なくとも１つの医薬組成物であり、
前記第２医薬組成物が、カボザンチニブ、クリゾチニブ、フォアチニブ、ＢＭＳ７７７６０７、ゴルバチニブ、ＭＫ−２４６１、ＭＧＣＤ−２６５、ＭＫ−８０３３、アムバチニブ、ＴＡＳ−１１５、Ｓ４９０７６、ＢＭＳ−７５４８０７、ＢＭＳ−７９４８３３、ＬＹ２８０１６５３、ＣＫＩ２７／ＲＧ７３０４／ＲＯ５１２６７６６／ＣＨ５１２６７６６、ＢＩ８４７３２５、ＰＨＡ−６６５７５２、ＥＭＤ１２１４０６３、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−４２１７９０３、ＳＧＸ５２３、ＩＮＣＢ−０２８０６０、チバンチニブ、ＳＡＲ１２５８４４、ボリチニブ、ＡＭＧ−４５８、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２、ＳＵ１１２７４、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ３３７から選ばれる少なくとも１つの医薬組成物であることを特徴とする請求項１に記載された前記第１医薬組成物に対して耐性を有した慢性骨髄性白血病の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病の治療用組成物に関するもので、特に従来の治療薬に対して耐性を有する患者に対しても有効な治療用組成物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、造血幹細胞を発症起源とする骨髄増殖性疾患である。フィラデルフィア染色体として知られる染色体転座による造血幹細胞の遺伝子の後天的異常が原因とされる。造血幹細胞が分化・成熟能を保ったまま自律的な増殖をし、白血球や血小板が増加する血液腫瘍である。この疾患は成人白血病の約１５％を占めるといわれている。
【０００３】
慢性骨髄性白血病の治療薬としては、フィラデルフィア染色体の遺伝子産物であるＢｃｒ−Ａｂｌに対するチロシンキナーゼ阻害薬（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＫＩ）であるメシル酸イマチニブ（以後単に「イマチニブ」ともいう。）が開発され、骨髄増殖性疾患患者の治療成績は著しく改善した。この薬は、Ｂｃｒ−Ａｂｌを標的とするため、分子標的薬と呼ばれている。
【０００４】
しかし、イマチニブを用いた治療を行うと、その患者がイマチニブに対する耐性獲得することが臨床上の重大な問題となっている。このため、耐性を獲得した患者に対しても、効果を発揮するダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブといった第二世代のＡｂｌチロシンキナーゼ阻害剤が開発されている。
【０００５】
一方、癌治療薬において分子標的薬耐性が生じることは他の疾患でも知られている。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子変異を有した肺がんに対するＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）やＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を有する肺がんに対するＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤（ＡＬＫ−ＴＫＩ）は、きわめて高い著効性を示す。しかし、ほとんど例外なく１年から数年で耐性が獲得され再発するとされる（非特許文献１）。
【０００６】
非特許文献１では、分子標的薬耐性獲得の原因として、標的自身の二次的変異、側副経路の活性化といった原因が開示されている。特に側副経路として肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）がリガンドとなるＭｅｔタンパク質が活性化することで耐性を誘導することが紹介されている。
【０００７】
また、特許文献１では、癌治療のための新規なｃ−Ｍｅｔ阻害剤が開示されている。特許文献１は、このｃ−Ｍｅｔ阻害剤にさらに第２の化学療法剤を組み合わせた医薬組成物が記載されている。その一群の第２の化学療法剤の一つとしてイマチニブが挙げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−２４１４５８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「特集：次世代シグナル伝達研究−先駆的基礎解析と臨床・創薬への展開−  がんの分子標的治療と耐性シグナル」矢野聖二、生化学、第８５巻、第６号、ｐｐ．４７５−４８５、２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１は、イマチニブとｃ−Ｍｅｔ阻害剤を組み合わせた医薬組成物が記載されているものの、どのような症例に対して用いることができたのか、またその効果についての記載は何もない。
【００１１】
また、非特許文献１も分子標的薬の耐性獲得について一般的な知見の開示はあるものの、慢性骨髄性白血病に対するイマチニブの耐性獲得について言及されたものではない。つまり、現在なお、慢性骨髄性白血病に対するイマチニブの耐性獲得という問題に対して、第二世代Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤以外の薬剤は存在していない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＧＦ−Ｍｅｔ受容体系阻害物質を有する医薬組成物、またはＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害物を含有する医薬組成物は、分子標的薬に耐性を示す慢性骨髄性白血病の治療薬であるイマチニブに対する感受性を増強させ、耐性を克服することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
より具体的に本発明に係るＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する医薬組成物に対して耐性を有した慢性骨髄性白血病の治療用組成物は、
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害する第１医薬組成物と、
Ｍｅｔチロシンキナーゼを阻害する第２医薬組成物で構成されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、イマチニブやダサチニブ、バフェチニブ、ポナチニブなどの分子標的薬に耐性を示す骨髄性慢性白血病の当該分子標的薬に対する感受性を増強若しくは、耐性の克服が可能な医薬組成物を提供することができる。
【００１５】
また、イマチニブやダサチニブ、バフェチニブ、ポナチニブなどの分子標的薬に耐性を示す慢性骨髄性白血病に対して有効な癌治療薬を提供することができる。本発明は、致命的なＴＫＩ耐性の治療方法を提案し、社会的意義は極めて大きなものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、イマチニブの添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図２】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、ニロチニブの添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図３】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、ダサチニブの添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図４】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、ポナチニブの添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図５】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、バフェチニブの添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図６】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、抗リン酸化Ｍｅｔ抗体、抗Ｍｅｔ抗体、抗β−ａｃｔｉｎ抗体に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図７】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、イマチニブとＰＨＡ−６６５７５２（ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤）を併用した時の添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図８】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体、リン酸化ＳＴＡＴ３抗体、ＳＴＡＴ３抗体に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、イマチニブとＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）を併用した時の添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図１０】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、イマチニブとＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）を併用した時の添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図１１】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、イマチニブとＡＧ４９０（ＪＡＫ２阻害剤）を併用した時の添加量と細胞生存率の関係を示すグラフである。
【図１２】通常細胞（Ｋ５６２）とイマチニブ耐性細胞で、抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体、抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）抗体、抗Ｍｅｔ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗β−ａｃｔｉｎ抗体に対するイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明に係る慢性骨髄性白血病の治療薬について説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。
【００１８】
本発明に係る慢性骨髄性白血病の治療薬は、慢性骨髄性白血病の原因と言われるＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を選択的に阻害する第１医薬組成物と、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をリガンドとする受容体チロシンキナーゼのＭｅｔを阻害する第２医薬組成物を混合したものである。
【００１９】
また、第２医薬組成物としては、Ｍｅｔ／ＭＥＫ／ＥＲＫのシグナル経路を阻害するものでもよい。
【００２０】
慢性骨髄性白血病の治療薬としては、イマチニブが知られている。ところが、イマチニブを服用していると、やがて薬剤耐性が生じる。これは、イマチニブが結合していたチロシンキナーゼドメインが変位することで、イマチニブが結合しにくくなるためと考えられた。そのため、第２世代の慢性骨髄性白血病の治療薬として開発されたニロチニブは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼにより強く選択的に結合し、活性を阻害する。
【００２１】
しかし、イマチニブ耐性細胞についてより詳しく調べてみると、イマチニブ耐性を持たない細胞（以下「通常細胞」という）では、活性化していないＭｅｔチロシンキナーゼが活性状態にあることがわかった。つまり、イマチニブ耐性細胞では、Ｂｃｒ−Ａｂｌによるシグナル経路以外に、Ｍｅｔによるシグナル経路によって、細胞が存続している結果を得た。
【００２２】
そこで、本発明は、慢性骨髄性白血病の治療薬として、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの阻害剤と、Ｍｅｔ阻害剤を併用することで、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤の耐性を克服しようとするものである。
【００２３】
より具体的に、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤（第１医薬組成物）としては、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブ、バフェチニブ等が好適に利用される。
【００２４】
また、Ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤（第２医薬組成物）としては、カボザンチニブ（：Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）（１）、クリゾチニブ（：Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）（２）、フォアチニブ（：Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）（３）、ＢＭＳ７７７６０７（４）、ゴルバチニブ（：Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ）（５）、ＭＫ−２４６１（６）、ＭＧＣＤ−２６５（７）、ＭＫ−８０３３（８）、アムバチニブ（：Ａｍｕｖａｔｉｎｉｂ）（９）、ＴＡＳ−１１５（１０）、Ｓ４９０７６（１１）、ＢＭＳ−７５４８０７（１２）、ＢＭＳ−７９４８３３（１３）、ＬＹ２８０１６５３（１４）、ＣＫＩ２７／ＲＧ７３０４／ＲＯ５１２６７６６／ＣＨ５１２６７６６（１５）等のマルチ・キナーゼ阻害剤が利用できる。以下のそれぞれの分子構造を示す。また、ＢＩ８４７３２５と呼ばれるマルチ・キナーゼ阻害剤も用いることができる。
【００２５】
【化１】
0006267619.tif 000002
【００２６】
【化２】
0006267619.tif 000003
【００２７】
【化３】
0006267619.tif 000004
【００２８】
【化４】
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【００２９】
【化５】
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【００３０】
【化６】
0006267619.tif 000007
【００３１】
【化７】
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【００３２】
【化８】
0006267619.tif 000009
【００３３】
【化９】
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【００３４】
【化１０】
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【００３５】
【化１１】
0006267619.tif 000012
【００３６】
【化１２】
0006267619.tif 000013
【００３７】
【化１３】
0006267619.tif 000014
【００３８】
【化１４】
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【００３９】
【化１５】
0006267619.tif 000016
【００４０】
また、ＰＨＡ−６６５７５２（１６）、ＥＭＤ１２１４０６３（１７）、ＪＮＪ−３８８７７６０５（１８）、ＰＦ−４２１７９０３（１９）、ＳＧＸ５２３（２０）、ＩＮＣＢ−０２８０６０（２１）、チバンチニブ（：Ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ）（２２）、ＳＡＲ１２５８４４（２３）、ボリチニブ（：Ｖｏｌｉｔｉｎｉｂ）（２４）、ＡＭＧ−４５８（２５）、ＮＶＰ−ＢＶＵ９７２（２６）、ＳＵ１１２７４（２７）、ＡＭＧ２０８（２８）等のＭｅｔ選択阻害剤が利用できる。以下のそれぞれの分子構造を示す。また、ＡＭＧ３３７と呼ばれるＭｅｔ選択阻害剤も用いることができる。
【００４１】
【化１６】
0006267619.tif 000017
【００４２】
【化１７】
0006267619.tif 000018
【００４３】
【化１８】
0006267619.tif 000019
【００４４】
【化１９】
0006267619.tif 000020
【００４５】
【化２０】
0006267619.tif 000021
【００４６】
【化２１】
0006267619.tif 000022
【００４７】
【化２２】
0006267619.tif 000023
【００４８】
【化２３】
0006267619.tif 000024
【００４９】
【化２４】
0006267619.tif 000025
【００５０】
【化２５】
0006267619.tif 000026
【００５１】
【化２６】
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【００５２】
【化２７】
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【００５３】
【化２８】
0006267619.tif 000029
【００５４】
また、第２医薬組成物は、Ｍｅｔ／ＭＥＫ／ＥＲＫのシグナル経路を阻害するものであればよく、ＭＥＫ阻害剤であってもよい。より具体的には、セルメチニブ（：ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）（２９）、レファメチニブ（：ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）（３０）、ピマセルチブ（：ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）（３１）、ＭＥＫ１６２／ＡＲＲＹ−１６２（３２）、ＡＺＤ８３３０／ＡＲＲＹ−４２４７０４（３３）、コビメチニブ（：ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）（３４）、ＧＤＣ−０６２３／ＲＧ７４２１／ＸＬ５１８（３５）、ＣＩＦ／ＲＧ７１６７／ＲＯ４９８７６５５（３６）、Ｅ６２０１（３７）、ＴＡＫ−７３３（３８）、ＰＤ−０３２５９０１（３９）、ＣＩ−１０４０／ＰＤ１８４３５２（４０）、ＡＳ７０３０２６（４１）、ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４２）、ＰＤ３１８０８８（４３）、ＰＤ９８０５９（４４）、ＳＬ３２７（４５）、トラメチニブ（：Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）（４６）、Ｕ０１２６（４７）等のＭＥＫ選択阻害剤を用いることができる。以下それぞれの分子構造を示す。また、ＡＳ７０３９８８／ＭＳＣ２０１５１０３Ｂ、ＷＸ−５５４、ＲＲＹ−３００と呼ばれるＭＥＫ選択阻害剤を用いることもできる。
【００５５】
【化２９】
0006267619.tif 000030
【００５６】
【化３０】
0006267619.tif 000031
【００５７】
【化３１】
0006267619.tif 000032
【００５８】
【化３２】
0006267619.tif 000033
【００５９】
【化３３】
0006267619.tif 000034
【００６０】
【化３４】
0006267619.tif 000035
【００６１】
【化３５】
0006267619.tif 000036
【００６２】
【化３６】
0006267619.tif 000037
【００６３】
【化３７】
0006267619.tif 000038
【００６４】
【化３８】
0006267619.tif 000039
【００６５】
【化３９】
0006267619.tif 000040
【００６６】
【化４０】
0006267619.tif 000041
【００６７】
【化４１】
0006267619.tif 000042
【００６８】
【化４２】
0006267619.tif 000043
【００６９】
【化４３】
0006267619.tif 000044
【００７０】
【化４４】
0006267619.tif 000045
【００７１】
【化４５】
0006267619.tif 000046
【００７２】
【化４６】
0006267619.tif 000047
【００７３】
【化４７】
0006267619.tif 000048
【００７４】
また、より下流シグナル経路を阻害するものであってもよい。具体的には、ＢＶＤ−５２３（４８）、ＳＣＨ７７２９８４（４９）、ＶＴＸ１１ｅ（５０）、ＡＥＺＳ−１３１／ＡＥＺＳ−１３４（５１）、ＦＲ１８０２０４（５２）といったＥＲＫ１／２選択阻害剤を用いることができる。以下それぞれの分子構造を示す。また、ＭＫ−８３５３／ＳＣＨ９０００３５３と呼ばれるＥＲＫ１／２選択阻害剤を用いることもできる。
【００７５】
【化４８】
0006267619.tif 000049
【００７６】
【化４９】
0006267619.tif 000050
【００７７】
【化５０】
0006267619.tif 000051
【００７８】
【化５１】
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【００７９】
【化５２】
0006267619.tif 000053
【００８０】
これらの医薬組成物（第１医薬組成物および第２医薬組成物）は、いずれも、薬学的に許容される塩を含んでもよい。より具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩および酒石酸塩を含む酸付加塩；Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋などのアルカリ金属カチオン、ＭｇもしくはＣａなどのアルカリ土類金属塩または有機アミン塩を含むことができる。
【実施例】
【００８１】
以下に実施例を示しながら本発明に係る慢性骨髄性白血病用の治療用組成物について説明する。
【００８２】
（実施例１）＜イマチニブ耐性獲得因子の検討＞
Ｋ５６２細胞（白血病細胞株、ＪＣＲＢ細胞バンクでの細胞番号：ＪＣＲＢ００１９）とイマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、イマチニブを最終濃度が０、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０μＭになるように添加した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌ（０μＭ  イマチニブ）に対する細胞生存率として評価した。
【００８３】
イマチニブ添加による細胞生存率の結果を図１に示す。横軸はイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）の添加量（μＭ）を示し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はＫ５６２細胞を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【００８４】
イマチニブの添加量が多くなるに従い、Ｋ５６２細胞の生存率は低下した。また、イマチニブが１０μＭ以上添加された場合は、Ｋ５６２細胞の細胞生存率はゼロであった。しかし、イマチニブ耐性細胞では、イマチニブの添加量が増加しても、細胞生存率はほぼ１００％であった。なお、以後のグラフを含め、グラフ中「Ｐ」は有意確率を示す。
【００８５】
以上のことから、Ｋ５６２細胞においてイマチニブによって細胞死を誘導する濃度において、イマチニブ耐性細胞に細胞死が誘導されないことを認めた。この結果から、作製したイマチニブ耐性細胞はイマチニブ耐性を示すことが明らかとなった。
【００８６】
（実施例２）＜イマチニブ耐性細胞におけるニロチニブ耐性の確認＞
Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、ニロチニブを最終濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２  μＭになるように添加した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌ（０μＭ  ニロチニブ）に対する細胞生存率として評価した。
【００８７】
ニロチニブ添加による細胞生存率の結果を図２に示す。横軸はニロチニブ（Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）の添加量（μＭ）を示し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はＫ５６２細胞を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【００８８】
ニロチニブの添加量が多くなるに従い、Ｋ５６２細胞の生存率は低下した。また、ニロチニブが０．２μＭ以上添加された場合は、Ｋ５６２細胞の細胞生存率はゼロであった。しかし、イマチニブ耐性細胞では、ニロチニブの添加量が増加しても、細胞生存率はほぼ１００％であった。なお、イマチニブ耐性細胞は、ニロチニブの添加量が２μＭまで増加した時に細胞生存率が約６０％まで低下した。
【００８９】
以上のことから、Ｋ５６２細胞においてニロチニブによって細胞死を誘導する濃度においても、イマチニブ耐性細胞に細胞死が誘導されないことを認めた。この結果から、作製したイマチニブ耐性細胞はニロチニブ耐性をも示すことが明らかとなった。
【００９０】
（実施例３）＜イマチニブ耐性細胞におけるダサチニブ耐性の確認＞
Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、ダサチニブを最終濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２μＭになるように添加した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌ（０μＭ  ダサチニブ）に対する細胞生存率として評価した。
【００９１】
ダサチニブ添加による細胞生存率の結果を図３に示す。横軸はダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）の添加量（μＭ）を示し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はＫ５６２細胞を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【００９２】
ダサチニブの添加量が多くなるに従い、Ｋ５６２細胞の生存率は低下した。また、ダサチニブが０．２μＭ以上添加された場合は、Ｋ５６２細胞の細胞生存率はゼロであった。しかし、イマチニブ耐性細胞では、ダサチニブの添加量が増加しても、細胞生存率はほぼ１００％であった。なお、イマチニブ耐性細胞は、ダサチニブの添加量が２μＭまで増加した時に細胞生存率が約８０％まで低下した。
【００９３】
以上のことから、Ｋ５６２細胞においてダサチニブによって細胞死を誘導する濃度において、イマチニブ耐性細胞に細胞死が誘導されないことを認めた。この結果から、作製したイマチニブ耐性細胞はダサチニブ耐性をも示すことが明らかとなった。
【００９４】
（実施例４）＜イマチニブ耐性細胞におけるポナチニブ耐性の確認＞
Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、ポナチニブを最終濃度が０、５、１０、２０、１００、２５０、５００、１０００ｎＭになるように添加した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌ（０μＭ  ポナチニブ）に対する細胞生存率として評価した。
【００９５】
ポナチニブ添加による細胞生存率の結果を図４に示す。横軸はポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）の添加量（μＭ）を示し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はＫ５６２細胞を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【００９６】
ポナチニブの添加量が多くなるに従い、Ｋ５６２細胞の生存率は低下した。また、ポナチニブが５００ｎＭ以上添加された場合は、Ｋ５６２細胞の細胞生存率はゼロであった。しかし、イマチニブ耐性細胞では、ポナチニブの添加量が増加しても、細胞生存率はほぼ１００％であった。
【００９７】
以上のことから、Ｋ５６２細胞においてポナチニブによって細胞死を誘導する濃度において、イマチニブ耐性細胞に細胞死が誘導されないことを認めた。この結果から、作製したイマチニブ耐性細胞はポナチニブ耐性をも示すことが明らかとなった。
【００９８】
（実施例５）＜イマチニブ耐性細胞におけるバフェチニブ耐性の確認＞
Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、バフェチニブを最終濃度が０、５、１０、５０、１００、５００、１０００、２５００ｎＭになるように添加した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌ（０μＭ  バフェチニブ）に対する細胞生存率として評価した。
【００９９】
バフェチニブ添加による細胞生存率の結果を図５に示す。横軸はバフェチニブ（Ｂａｆｅｔｉｎｉｂ）の添加量（μＭ）を示し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はＫ５６２細胞を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【０１００】
バフェチニブの添加量が多くなるに従い、Ｋ５６２細胞の生存率は低下した。また、バフェチニブが２５００ｎＭ以上添加された場合は、Ｋ５６２細胞の細胞生存率はゼロであった。しかし、イマチニブ耐性細胞では、バフェチニブの添加量が増加しても、細胞生存率はほぼ１００％であった。なお、バフェチニブの添加量が２５００ｎＭになると、イマチニブ耐性細胞の細胞生存率は、約８０％まで低下した。
【０１０１】
以上のことから、Ｋ５６２細胞においてバフェチニブによって細胞死を誘導する濃度において、イマチニブ耐性細胞に細胞死が誘導されないことを認めた。この結果から、作製したイマチニブ耐性細胞はバフェチニブ耐性をも示すことが明らかとなった。
【０１０２】
（実施例６）＜イマチニブ耐性獲得因子の検討＞
作製したイマチニブ耐性細胞を用いて、耐性に関与する因子をイムノブロッティング解析にて検討した。
【０１０３】
Ｋ５６２細胞、イマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔＫ５６２）を１５０ｃｍ２フラスコに播種した後、７２時間培養したものから細胞溶解液にてタンパク質を抽出し、サンプルとした。また、タンパク定量はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１０４】
各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ  （Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ  （Ｔｙｒ１３４９）抗体、抗Ｍｅｔ抗体  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）、及び抗β−ａｃｔｉｎ抗体  （Ｓｉｇｍａ）を用いてＭｅｔのリン酸化を検討した。
【０１０５】
イムノブロッティングの結果を図６に示す。図６では、各抗体毎に、Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞のイムノブロッティング結果の写真を示す。発光は写真上黒い影として映っている。抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体において、Ｋ５６２細胞の影よりも、イマチニブ耐性細胞の影の方が濃い影であった。
【０１０６】
また抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）抗体においては、Ｋ５６２細胞は、薄く確認できる程度であったが、イマチニブ耐性細胞は、明らかにＫ５６２細胞の場合より濃い影であった。つまり、チロシンキナーゼドメイン内にあるＴｙｒ１２３４／１２３５もＣ末端にあるＴｙｒ１３４９でもイマチニブ耐性細胞のイムノブロッティングの結果はＫ５６２細胞の場合より、濃い影であった。
【０１０７】
抗ｍｅｔ抗体では、Ｋ５６２細胞、イマチニブ耐性細胞共に明確に黒い影であった。ただし、イマチニブ耐性細胞の方が黒い影が小さかった。抗β−ａｃｔｉｎ抗体は、Ｋ５６２細胞およびイマチニブ耐性細胞共に明確な黒い影が観察された。
【０１０８】
以上のことより、Ｋ５６２細胞におけるリン酸化Ｍｅｔの発現と比較し、イマチニブ耐性細胞ではリン酸化Ｍｅｔが著しく増加していることが明らかになった。これは、イマチニブ耐性細胞では、ｍｅｔによるシグナル伝達が活性化していることを示唆するものである。なお、β−ａｃｔｉｎはＫ５６２細胞もイマチニブ耐性細胞も同程度有していると観察されたので、このイムノブロッティングの結果は正しいと判断できる。
【０１０９】
（実施例７）＜Ｍｅｔ阻害剤によるイマチニブ耐性克服効果の検討＞
イマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、イマチニブを最終濃度が５μＭになるように添加した。また、それとは別にイマチニブと併用してＰＨＡ−６６５７５２（Ｍｅｔ阻害剤）を最終濃度が１、２、２．５、３μＭになるように添加した。
【０１１０】
Ｃｏｎｔｒｏｌとして薬剤を溶解した溶媒を添加したものを同様に培養した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌに対する細胞生存率として評価した。
【０１１１】
Ｍｅｔ阻害剤併用による結果を図７に示す。横軸はイマチニブおよびＰＨＡ−６６５７５２の量の違いを表し、縦軸は細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はｃｏｎｔｒｏｌ（Ｋ５６２細胞）を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。イマチニブ、ＰＨＡ−６６５７５２が単独で添加された場合は、ＰＨＡ−６６５７５２を３μＭ添加したときも、細胞生存率は約７０％あった。
【０１１２】
一方、イマチニブ５μＭとＰＨＡ−６６５７５２を組み合わせて使用すると、ＰＨＡ−６６５７５２の添加量にしたがって、細胞生存率は減少し、ＰＨＡ−６６５７５２  ３μＭの添加で細胞生存率は０％になった。
【０１１３】
このことより、イマチニブ耐性細胞においてＭｅｔ阻害剤の濃度依存的にイマチニブ耐性が克服されることが認められた。これらの結果から、Ｍｅｔがイマチニブ耐性に関与することが明らかとなった。
【０１１４】
（実施例８）＜Ｍｅｔ下流シグナル伝達因子におけるイマチニブ耐性因子の検討＞
イマチニブ耐性株において活性化が確認されたＭｅｔの下流シグナルのＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３の活性動態について、イムノブロッティングで検討を行った。
【０１１５】
Ｋ５６２細胞、イマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を１５０ｃｍ２フラスコに播種した後、７２時間培養したものから細胞溶解液にてをタンパク質を抽出し、サンプルとした。また、タンパク定量はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１１６】
各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−  ＳＴＡＴ３抗体、及び抗ＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を用いてＥＲＫ１／２、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３のリン酸化を検討した。
【０１１７】
イムノブロッティングの結果を図８に示す。図８では、Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞のイムノブロッティングの結果をそれぞれの抗体毎に並べて示した。図８によれば、抗ＥＲＫ１／２抗体、抗Ａｋｔ抗体、および抗ＳＴＡＴ３抗体では、Ｋ５６２細胞とイマチニブ耐性細胞は、同程度の黒い影が映っている。一方、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体、抗リン酸化Ａｋｔ抗体、および抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体ではＫ５６２細胞よりもイマチニブ耐性細胞の黒い影の方が明らかに濃い。
【０１１８】
さらに詳説すると、抗ＥＲＫ１／２抗体においては、上下に２つの影があるのが確認できる。上側の影がＥＲＫ１で、下側の影はＥＲＫ２に相当する。Ｋ５６２細胞もイマチニブ耐性細胞もＥＲＫ１／２の両方を有していることを示している。
【０１１９】
一方、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体の場合は、Ｋ５６２細胞では、リン酸化ＥＲＫ２の影は薄く、リン酸化ＥＲＫ１は殆ど影がない。これに比較し、イマチニブ耐性細胞ではリン酸化ＥＲＫ１は薄いながら影を確認でき、リン酸化ＥＲＫ２は明らかに濃い影がある。
【０１２０】
以上のことから、Ｋ５６２細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１／２、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＳＴＡＴ３の発現と比較し、イマチニブ耐性細胞ではリン酸化ＥＲＫ１／２、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＳＴＡＴ３が著しく増加していることが明らかになった。
【０１２１】
このことは、イマチニブ耐性細胞では、イマチニブが主として阻害するＢｃｒ−Ａｂｌ活性によるシグナル経路だけでなく、ＥＲＫ−ＭＡＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路といったシグナル経路も活性化していることを示唆する。
【０１２２】
（実施例９）＜ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤によるイマチニブ耐性克服効果の検討＞
イマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間前培養した。その後、イマチニブを最終濃度が５μＭになるように添加した。また、それとは別にイマチニブと併用してＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）を最終濃度が０．１、１、１０μＭ、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）を最終濃度が０．１、１、１０μＭ、ＡＧ４９０（ＪＡＫ２阻害剤）を最終濃度が１、５、１０μＭになるように添加した。
【０１２３】
Ｃｏｎｔｒｏｌとして薬剤を溶解した溶媒を添加したものを同様に培養した。７２時間培養した後の細胞数の変化をトリパンブルー色素排除染色試験法により算定し、この測定値をｃｏｎｔｒｏｌに対する細胞生存率として評価した。
【０１２４】
各種阻害剤併用による結果を図９〜図１１に示す。図９〜図１１のグラフにおいて、横軸はイマチニブおよびＵ０１２６（図９）、イマチニブとＬＹ２９４００２（図１０）、イマチニブとＡＧ４９０（図１１）の量の違いを表し、縦軸はいずれのグラフにおいても細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ：％）を示す。また白棒はｃｏｎｔｒｏｌ（Ｋ５６２細胞）を表し、黒棒はイマチニブ耐性細胞を表す。
【０１２５】
図９を参照して、イマチニブとＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）が単独で添加された場合は、Ｕ０１２６を１０μＭ添加したときも、細胞生存率は約７０％あった。一方、イマチニブ５μＭとＵ０１２６を組み合わせて使用すると、Ｕ０１２６の添加量にしたがって、細胞生存率は明らかに減少した。なお、イマチニブ５μＭとＵ０１２６を１０μＭ併用したときは、細胞生存率は約３５％まで低下した。
【０１２６】
図１０を参照して、イマチニブとＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の組み合わせの場合は、それぞれを単独で用いた時も、これらを併用したときも、細胞生存率に大きな変化はなかった。なお、イマチニブ５μＭとＬＹ２９４００２を１０μＭ併用したときも細胞生存率は約７５％程度あった。
【０１２７】
図１１を参照して、イマチニブとＡＧ４９０（ＪＡＫ２阻害剤）の組み合わせの場合は、それぞれを単独で用いた時も、これらを併用したときも、細胞生存率に大きな変化はなかった。なお、イマチニブ５μＭとＬＹ２９４００２を１０μＭ併用したときも細胞生存率は約９０％程度あった。
【０１２８】
以上のことから、イマチニブ耐性細胞において５μＭのイマチニブと、１０μＭのＵ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）併用時にイマチニブ耐性が克服されることが認められた。これらの結果から、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路がイマチニブ耐性に関与することが明らかとなった。
【０１２９】
（実施例１０）＜Ｍｅｔ阻害剤によるＥＲＫ抑制効果の検討＞
イマチニブ耐性細胞においてリン酸化Ｍｅｔの増加が耐性獲得に関与していることが示唆された（実施例６、図６参照）ため、Ｍｅｔ阻害剤添加時におけるＭｅｔおよび下流シグナルの発現変化についてイムノブロッティングにて検討した。
【０１３０】
Ｋ５６２細胞、イマチニブ耐性細胞（Ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｋ５６２）を１５０ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で４８時間培養したものおよびイマチニブ耐性細胞を１５０ｃｍ２フラスコに播種し、２４時間前培養後、イマチニブ耐性細胞にＰＨＡ−６６５７５２を最終濃度が１、２、２．５μＭになるように添加し３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。この培養液から細胞溶解液にてタンパク質を抽出し、サンプルとした。
【０１３１】
また、タンパク定量はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて行った。各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ  （Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ  （Ｔｙｒ１３４９）抗体、抗Ｍｅｔ抗体、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２抗体、及び抗ＥＲＫ１／２抗体を用いてＭｅｔ、ＥＲＫ１／２のリン酸化を検討した。なお、各細胞サンプルに対して抗β−ａｃｔｉｎ抗体を作用させ、イムノブロッティングの妥当性を確認した。
【０１３２】
イムノブロッティングの結果を図１０に示す。写真横方向には、Ｋ５６２細胞の場合と、イマチニブ耐性細胞の場合を並べて示し、イマチニブ耐性細胞では、ＰＨＡ−６６５７５２の添加量（μＭ）を数字で示した。写真縦方向には、各抗体毎の結果（写真）を示した。
【０１３３】
抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体の写真では、イマチニブ耐性細胞におけるＰＨＡ−６６５７５２が０μＭの時に最も黒い影が濃かった。イマチニブ耐性細胞では、ＰＨＡ−６６５７５２の増加にしたがって、黒い影は薄くなった。Ｋ５６２細胞の黒い影は、イマチニブ耐性細胞にＰＨＡ−６６５７５２を２μＭ添加した場合と同じ程度の濃さであった。
【０１３４】
抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）抗体の写真でもほぼ同様の結果であった。ただし、抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）抗体は、抗リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）抗体と比べて全体的に影の濃さは薄かった。
【０１３５】
抗Ｍｅｔ抗体では、イマチニブ耐性細胞はＰＨＡ−６６５７５２の添加量に係らず、ほぼ同じ濃さの影であった。Ｋ５６２細胞の写真は、イマチニブ耐性細胞の影より一回り大きな影であった。
【０１３６】
抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体では、Ｋ５６２細胞の写真では、ＥＲＫ２にわずかな影が映っただけであった。濃さも薄かった。イマチニブ耐性細胞では、Ｋ５６２よりも明確に黒い大きな影がＥＲＫ１、ＥＲＫ２のいずれにもあった。また、ＰＨＡ−６６５７５２の添加にしたがい、黒い影は薄くなった。
【０１３７】
抗ＥＲＫ１／２抗体では、Ｋ５６２細胞の影がイマチニブ耐性細胞の影より一回り小さな影であったが、濃さは充分黒かった。イマチニブ耐性細胞では、ＰＨＡ−６６５７５２の添加量に係らず、大きく濃い陰影が観察された。
【０１３８】
β−ａｃｔｉｎでは、Ｋ５６２細胞もイマチニブ耐性細胞もほぼ変化がなく、いずれも黒い大きな影が観察された。
【０１３９】
Ｋ５６２細胞ではリン酸化ＥＲＫ１のバンドが観察されなかった。一方、イマニチブ耐性細胞ではリン酸化ＥＲＫ１のバンドが確認され、リン酸化ＥＲＫ２のバンドもＫ５６２細胞と比較し強くなっていた。つまり、Ｋ５６２細胞では、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路は活性ではないのに対し、イマチニブ耐性細胞は、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路が活性になっていたことを示した。
【０１４０】
このイマチニブ耐性細胞に、Ｍｅｔ阻害剤（ＰＨＡ−６６５７５２）を添加していくと、リン酸化ＥＲＫ１のバンドが無くなり、リン酸化ＥＲＫ２のバンドも薄くなり、Ｋ５６２細胞の状態に近づいていた。
【０１４１】
以上のことから、Ｍｅｔ阻害剤ＰＨＡ−６６５７５２により、リン酸化Ｍｅｔが阻害されていることを確認した。実施例９で、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路がイマチニブ耐性に関与することが明らかであった。したがって、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害よりイマチニブ耐性が克服されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明に係る慢性骨髄性白血病の治療用組成物は、慢性骨髄性白血病に劇的に効果があるとされたＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤に対して、耐性を有する原因はＭｅｔ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路が原因であることを明らかにし、この経路の阻害剤とＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤と併用することで、耐性を克服するものである。したがって、イマチニブよりよりＢｃｒ−Ａｂｌとの結合性が高いとされるダサチニブやニロチニブに対が耐性を獲得した患者に対しても、耐性克服することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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