(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で処理された細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が未成熟樹状細胞に比べて２倍以上増加したことを確認する工程を含む、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、またはＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質をコードする遺伝子発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の製造方法。
【請求項２】
前記準成熟樹状細胞は、ＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が追加で増加していることを特徴とする請求項１に記載の準成熟樹状細胞の製造方法。
【請求項３】
前記自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の処理時間は３〜１０時間であることを特徴とする請求項１に記載の準成熟樹状細胞の製造方法。
【請求項４】
前記自己抗原は、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）、フィブリノーゲンα、フィブリノーゲンβ、コラーゲンＩＩ、ヒストンＢ、アグリカン、フィブリン、リウマトイドファクター（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＰＩ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらのシトルリン化ペプチドおよびタンパク質で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の準成熟樹状細胞の製造方法。
【請求項５】
前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とする請求項１に記載の準成熟樹状細胞の製造方法。
【請求項６】
前記前記ＰＧＥ２の処理濃度は、０．０５〜５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１に記載の準成熟樹状細胞の製造方法。
【請求項７】
下記の工程を含む、自己免疫疾患治療または予防用準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂのタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する方法：
（ａ）未成熟樹状細胞を自己抗原、サイトカインおよびＰＧＥ２で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）未成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；
（ｃ）前記製造された準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；および
（ｄ）前記（ｂ）工程および（ｃ）工程で測定されたＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を比較する工程。
【請求項８】
前記自己免疫疾患は、第１型糖尿病、リウマチ関節炎、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｒｕｅ）、ＩｇＡ欠乏（ＩｇＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合性結合組織病、元発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑病、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチャー症候群、水泡性類天疱瘡、円板状紅斑ループス、潰瘍性大腸炎または高密度沈着病であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を追加で測定することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の処理時間は３〜１０時間であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己抗原は、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）、フィブリノーゲンα、フィブリノーゲンβ、コラーゲンＩＩ、ヒストンＢ、アグリカン、フィブリン、リウマトイドファクター（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＰＩ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらのシトルリン化ペプチドおよびタンパク質で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＧＥ２の処理濃度は、０．０５〜５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
下記の工程を含む、準成熟樹状細胞を含有した自己免疫疾患治療または予防用細胞治療剤の製造方法：
（ａ）未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）前記準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が未成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現に比べて２倍以上増加したことを確認する工程；および
（ｃ）前記ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞を含有する細胞治療剤を剤形化する工程。
【請求項１５】
前記準成熟樹状細胞は、ＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が追加で増加していることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）、サイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の処理時間は３〜１０時間であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記自己抗原は、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）、フィブリノーゲンα、フィブリノーゲンβ、コラーゲンＩＩ、ヒストンＢ、アグリカン、フィブリン、リウマトイドファクター（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＰＩ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらのシトルリン化ペプチドおよびタンパク質で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記ＰＧＥ２の処理濃度は、０．０５〜５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、特にリウマチ関節炎治療のための準成熟樹状細胞の製造方法および前記方法を利用して製造された樹状細胞を有効成分として含む自己免疫疾患の治療または予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は１８６８年ランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）により皮膚で初めて発見されて、１９７３年コーン（Ｃｏｈｎ）とスタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ）により免疫補助細胞として機能が知らされるようになった。また、１９９０年代には強力な抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；ＡＰＣ）として機能が明らかになってから免疫誘導および免疫調節における重要な役割を担っているとのことを知るようになった。人体内の樹状細胞は、全循環白血球のわずか約０．３％を占めるだけであるが、大食細胞とは区別される表現型を有する異質な集団で構成されている。樹状細胞は、比較的弱い抗原提示能力を有するＢ細胞や大食細胞とは違って強力な抗原提示細胞という点で差別化される。樹状細胞は、抗原と接したことがないナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ）を刺激させることができる一次免疫応答（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）誘導能力を有し、また免疫記憶を誘導できる特性を有する唯一の免疫細胞である。樹状細胞が強力な免疫反応活性化機能を行うことができるのは、抗原提示細胞（ＡＰＣ，Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ）として細胞表面にＭＨＣ分子（Ｉ／ＩＩ）だけでなく、副刺激分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、例えば、ＣＤ−８０およびＣＤ−８６と接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、例えばＩＣＡＭ−１等を高濃度で発現して、様々なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ＩＦＮ−ａｌｐｈａ，ＩＬ−１２，ＩＬ−１８等）を分泌するためであると知られている。樹状細胞は、細胞表面に抗原提示分子（ＭＨＣ分子と副刺激分子）を多く発現して、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２等様々ンなサイトカインを分泌するため、抗原特異細胞キラーＴ細胞の生成、Ｔｈ１細胞の増殖および活性化を誘導することができると知られている。
【０００３】
このように、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）は、最も強力な抗原前月細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）であって、生体内極めて少ない数で存在するが、Ｔ細胞免疫を調節する機能が非常に優れるため、特異抗原に対する免疫を誘導するための臨床研究で癌または感染疾患の治療剤として研究されている。組織または血液から分離した樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原で刺激させた後、成熟した樹状細胞形態でｉｎ  ｖｉｖｏに再び注入する場合、免疫原性を示すことが確認されて、癌または病原菌の特異抗原に対する免疫を誘導するための細胞ワクチンとしてその応用価値が非常に大きい（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，３．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４７９，１９９３；Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１９７，１９９０；Ｈｓｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：５２，１９９６）。樹状細胞を収得して、成熟化させる技術は、様々な文献に記載されていて、マクロファージまたは樹状細胞特性中いずれか一つを発現する能力を有する分化多能性細胞から由来した未成熟樹状細胞から成熟した樹状細胞を産生して、未成熟樹状細胞を、ＩＦＮ−αを含んだ樹状細胞成熟化因子と接触させる方法（ヨーロッパ特許第９２２，７５８号）、ヒトＣＤ３４＋造血細胞を（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦと（ii）ＴＮＦ−αおよびＩＬ−３とまたは（iii）ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αと培養して、ＣＤ１ａ＋造血細胞の形成を誘導して、前記培養物から前記ＣＤ１ａ＋ヒト樹状細胞を回収する方法（ヨーロッパ特許第６６３，９３０号）、末端血液細胞を分離して、ＣＤ３４抗原を発現する血液前駆細胞を浮遊化させて前記細胞を造血成長因子およびサイトカインの組み合わせに拡張する方法（ＷＯ９５／２８４７９）等がある。
【０００４】
しかし、既存の文献および特許は、未成熟樹状細胞に非特異的抗原を感作させた成熟樹状細胞を産生する方法に関するだけで、未成熟樹状細胞に選別過程を経た特定自己抗原を感作させた準成熟樹状細胞の産生方法に関しては言及していない。
【０００５】
そこで、本発明者等は、抗原特異的準成熟（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ）樹状細胞が免疫慣用的反応を誘導するという事実に基づいて、リウマチ関節炎患者から発現率が高い特定自己抗原を選別した後、これを未成熟樹状細胞に感作させる過程を介して製造された準成熟樹状細胞が特定遺伝子の発現を高めることによって準成熟細胞集団製造時処理された自己抗原と同じ自己抗原に対する反応性を保有したリウマチ関節炎患者の治療効能を高めることができることを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、未成熟樹状細胞に特定自己抗原を処理して特定遺伝子の発現が増加した準成熟樹状細胞の製造方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記方法によって製造された準成熟樹状細胞を含む細胞治療剤を提供して前記自己抗原と同じ自己抗原に対する反応性を保有している自己免疫疾患の治療率を高めた、細胞治療剤およびこれの製造方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、特定自己抗原処理によって発現が特異的に増加する遺伝子またはタンパク質の発現程度を測定する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は、未成熟樹状細胞を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）とサイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理する工程を含む、未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、前記製造方法によって製造された準成熟樹状細胞を有効成分として含む、前記準成熟樹状細胞製造時処理された自己抗原と同じ自己抗原に対する反応性を保有している自己免疫疾患治療用細胞治療剤を提供する。
【０００９】
本発明はまた、
（ａ）未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）とサイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）前記準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が未成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現に比べて２倍以上増加したことを確認する工程；および
（ｃ）前記ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞を含有する細胞治療剤を剤形化する工程；
を含む、準成熟樹状細胞を含有した自己免疫疾患治療または予防用細胞治療剤の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、
（ａ）未成熟樹状細胞を自己抗原とサイトカインおよびＰＧＥ２で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）未成熟樹状細胞ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；
（ｃ）前記製造された準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；および
（ｄ）前記（ｂ）工程および（ｃ）工程で測定されたＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を比較する工程；
を含む、自己免疫疾患治療または予防用準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂのタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】準成熟樹状細胞に感作させるための特定自己抗原を選別するために健常者とリウマチ関節炎患者の血液を利用して自己抗原に対するＴ  ｃｅｌｌ反応性（ＩＦＮ−γ）を確認した実験結果である。
【図１Ｂ】準成熟樹状細胞に感作させるための特定自己抗原を選別するために健常者とリウマチ関節炎患者の血液を利用して自己抗原に対する自己抗体反応性を確認した実験結果である。
【図２Ａ】ＴＮＦ−α＋ＰＧＥ２処理時間による特定遺伝子の発現率を示す実験結果である。
【図２Ｂ】ＰＧＥ２処理濃度別特定遺伝子の発現率を示す実験結果である。
【図３Ａ】ＴＮＦ−α＋ＰＧＥ２処理時間によるＩＬ−１０分泌量を示す実験結果である。
【図３Ｂ】ＰＧＥ２処理濃度によるＩＬ−１０分泌量を示す実験結果である。
【図４】特定遺伝子発現とＩＬ−１０分泌との相関を示す実験結果である。
【図５Ａ】本発明の製造過程による準成熟樹状細胞が発現するＮＲ４Ａ２遺伝子がＩＬ−１０分泌を調節することを示す実験結果である。
【図５Ｂ】本発明の製造過程による準成熟樹状細胞が発現するＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子がＩＬ−１０分泌を調節することを示す実験結果である。
【図６Ａ】本発明の製造過程による準成熟樹状細胞がＩＬ−１０分泌を媒介にＴ  ｃｅｌｌの免疫寛容を誘導することを示す実験結果で、様々な刺激条件による準成熟樹状細胞のＩＬ−１０分泌量を示す実験結果である。
【図６Ｂ】ＩＬ−１０を媒介とした準成熟樹状細胞のＴ−ＩＦＮγ分泌抑制を示す実験結果である。
【図６Ｃ】ＩＬ−１０を媒介とした準成熟樹状細胞のｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ誘導を示す実験結果である。
【図７Ａ】本発明の製造過程によって産生されて特定遺伝子の発現とＩＬ−１０分泌が高まった準成熟樹状細胞の遺伝子発現によるリウマチ関節炎治療の有効性結果を示す実験結果である。
【図７Ｂ】本発現の製造過程によって産生された準成熟樹状細胞によるリウマチ関節炎治療の有効性結果による特定遺伝子の発現とＩＬ−１０の分泌結果を示す実験結果である。
【図８】準成熟樹状細胞を１２人の患者に容量別５回ずつ投与した患者に対する１４週間と２４週間の間の臨床的有効性を示す結果である（ＮＡ：浮腫み関節数がｂａｓｅｌｉｎｅ時点０個でＡＣＲ評価が不可能な患者を示す）。
【図９Ａ】準成熟樹状細胞を投与した患者のＴ  ｃｅｌｌ反応性（ＩＦＮ−γ）変化をＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙで測定して示した実験結果である。
【図９Ｂ】準成熟樹状細胞を投与した患者のＴ  ｃｅｌｌ反応性（ＩＦＮ−γ）変化をＩＦＮ−γＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｓｓａｙで測定して示した実験結果である。
【図１０】１２人の患者に準成熟樹状細胞を投薬してから１４週が経過した後、特定自己抗体の減少変化（シトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチン）を示した実験結果である。
【図１１】特定自己抗原を１種以上保有した９人の患者に準成熟樹状細胞を投薬した後、１４週が経過した時点で測定した経時自己抗体（シトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチン）の減少を示す実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１３】
本発明は、一観点で、未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）とサイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理する工程を含む、未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の一実施例では、健常者またはリウマチ関節炎患者の末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ，ＰＢＭＣ）を分化させて製造した未成熟樹状細胞に、選別された特定自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）とサイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）を処理する工程を含む準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を製造した。
【００１５】
本明細書で用語「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）」とは、樹状細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を含む意味で、抗原を細胞内部へ吸収してこれを処理して抗原または抗原から由来したペプチドをＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ複合体またはＭＨＣクラスII複合体と共に提示する専門的抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を意味する。本発明での樹状細胞は、Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６，１９９１およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２，１９９８．に開示された樹状細胞の典型的な表現型と特性を有する細胞を意味する。樹状細胞は、免疫性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）および免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）抗原提示細胞を全て含み、成熟度に応じて未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｉｍＤＣ」）、準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉ−ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｓｍＤＣ」）および成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｍＤＣ」）に分類する。
【００１６】
本明細書で用語「未成熟樹状細胞」とは、成熟樹状細胞と同様にＣＤ１４のような細胞表面マーカーを発現せず、ＣＣＲ７および細胞質タンパク質ＤＣ−ＬＡＭＰを低い水準で発現して、共同刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を低い水準で発現して、ＣＤ１ａおよびＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ１を通常の水準で発現する樹状細胞をいう。
【００１７】
本明細書で用語「成熟樹状細胞」とは、未成熟樹状細胞が成熟化されて形成された細胞を意味する。成熟樹状細胞は、ＤＣ−ＬＡＭＰだけでなくＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の増加した発現を示して、親炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を放出して、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で原始同種異系Ｔ細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）および同種同系Ｔ細胞（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の増殖の増加および／または樹状細胞サイトカインの増加した生成を発生させる能力を有することを特徴とする。成熟樹状細胞は、典型的にＣＣＲ７およびＣＸＣＲ４を高い水準で発現する。
【００１８】
本明細書で用語「準成熟樹状細胞」とは、未成熟樹状細胞の特性の一部を喪失して、成熟樹状細胞の表現型の一部特性を有する樹状細胞であって、部分的に（ｐａｒｔｉａｌｌｙ）または不完全に（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）成熟した形態および表現型的特性を示す樹状細胞を意味する。準成熟樹状細胞は、一般に自己−抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）に対応して免疫寛容反応を誘導する能力を有する。
【００１９】
本発明の好ましい具現例によると、健常者またはリウマチ関節炎患者から単核球細胞を得た後、この細胞を適切な支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で培地（好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦで補充された培地）を利用して一次培養（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）する。全能性細胞または多能性細胞から未成熟樹状細胞への分化を促す物質、特にＧＭ−ＣＳＦは米国特許第５，８５１，７５６号および第５，９９４，１２６号に開示されていて、これらの内容は本明細書に参照として取り入れられる。前記基板は、好ましくは細胞が付着できる基板を含み、好ましくは組織培養に使用されるプラスチックである。
【００２０】
未成熟樹状細胞の収率を増加させるために、ＧＭ−ＣＳＦ以外に、非樹状細胞タイプの細胞増殖を防ぐか抑制する因子を培養培地に添加することができる。前記因子は、例えば大食細胞を抑制するＩＬ−４および／またはＩＬ−１３を含む。前記因子は、樹状細胞前駆細胞の増殖を促す反面非樹状細胞タイプの細胞の成長を抑制することによって、培地で未成熟樹状細胞の数を増加させる。
【００２１】
本発明で自己抗原は、例えば、α−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）、フィブリノーゲンα、フィブリノーゲンβ、コラーゲンＩＩ、ヒストンＢ、アグリカン、フィブリン、リウマトイドファクター（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＰＩ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ペプチドおよびタンパク質、およびこれのシトルリン化ペプチドおよびタンパク質で構成された群から選択された１種以上であり得る。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によると、ＥＬＩＳＰＯＴ反応が有効なリウマチ関節炎患者（９人）または健常者（２人）から抽出した末梢血液単核球にシトルリンされたフィラグリン（ＪＷクレアジェン）、ＰＡＤ４（ＪＷクレアジェン）、ＲＡ３３（ＪＷクレアジェン）、ビメンチン（ＪＷクレアジェン）、フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩｇＧＦｃ（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）の７抗原を感作させてａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ反応率が５０％以上であるものを選別する方法で特定自己抗原をスクリーニングした。また、リウマチ関節炎韓国人患者１００人を対象にシトルリンされた或いはされなかったフィラグリン（ＪＷクレアジェン）、ＰＡＤ４（ＪＷクレアジェン）、ＲＡ３３（ＪＷクレアジェン）、ビメンチン（ＪＷクレアジェン）、フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＰＩ（ＪＷクレアジェン）、コラーゲン（Ｇｅｎｗａｙ）の９種の自己抗体をスクリーニングして健常者のＯＤ値の１．５倍以上を示す場合を陽性として抗原−抗体反応率を測定する方法で特定自己抗原をスクリーニングした。
【００２３】
その結果、抗原−抗体反応率が３０％以上で（図１Ａ）、ＩＦＮ−γを分泌する末梢血液単核細胞の反応率が５０％以上である（図１Ｂ）自己抗原は、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）およびビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）であることを確認することができた。
【００２４】
従って本発明において、未成熟樹状細胞に処理される特定自己抗原はシトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）およびビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする製造方法であり得る。
【００２５】
本発明の自己抗原特異的準成熟樹状細胞は、前記特定抗原が準成熟樹状細胞によって細胞表面から提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）されるのに十分な時間および条件下で互いに「接触」させることによって製造することができる。好ましくは前記「接触」は「共同培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）」である。
【００２６】
前記共同培養時間は、好ましくは３〜１０時間であり、より好ましくは３〜８時間であり、最も好ましくは３〜４時間である。前記ＰＧＥ２の処理濃度は、好ましくは０．０１〜５μｇ／ｍＬで最も好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬである。前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とし、処理濃度は１〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌである。
【００２７】
本発明の準成熟樹状細胞は、ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が増加することを確認した。場合により、本発明の準成熟樹状細胞でＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が追加で増加できて、増加する場合、未成熟樹状細胞に比べて２倍以上増加することができる。
【００２８】
ＮＲ４Ａ２タンパク質は、転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）としてＦｏｘｐ３のプロモーターとエンハンサーに結合して他の転写因子と共に作用して、これによりＣＤ４＋  ＴのＴｒｅｇ分化を誘導して、抗炎症反応まで誘導することができる。また、ドーパミン神経細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ）が炎症環境によって損傷してパーキンソン病が誘発されるが、ｇｌｉａとａｓｔｏｃｙｔｅのＮＲ４Ａ２発現調節によってＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＮＯ、ＲＯＳの分泌が抑制されながら神経細胞保護効果が誘発され得る。
【００２９】
ＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質は、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌにＰＧＭ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎを有するが、これはＰＧＭ／ＡｃＰ酵素と進化的に類似して、機能的にもリン酸化酵素活性を有する。このようなＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質は、Ｔ  ｃｅｌｌの活性化されたＳｒｃ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎされる）を脱リン酸化させて、結果Ｔ  ｃｅｌｌをｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎすることができる。
【００３０】
ＰＴＧＳ２タンパク質を発現するＭＬＮ−ＤＣは、Ｔｈ２分化を妨げて、Ｔｒｅｇの発達に重要な役割をして、ＤＣにＩＶ  ＩＧを処理した時ＤＣのＰＧＥ２分泌が増加して、Ｃｏｘ２発現が増加しながらＴｒｅｇも共に増加して、ＥＡＥ  ｓｃｏｒｅを減少させることができる。
ＩＤＯタンパク質は、Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅの機能を行う酵素であって、必須アミノ酸であるＬ−トリプトファンの分解に関与する。
【００３１】
本発明において、ＮＲ４Ａ２遺伝子（ＮＭ_００６１８６：配列番号１１）、ＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子（ＮＭ_０３２８７３：配列番号１２）、ＰＴＧＳ２遺伝子（ＮＭ_０００９６３：配列番号１３）およびＩＤＯ遺伝子（ＮＭ_００２１６４：配列番号１４）は、各々ＮＲ４Ａ２タンパク質、ＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、ＰＴＧＳ２タンパク質およびＩＤＯタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００３２】
前記タンパク質の発現は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、組織免疫染色、免疫沈降分析法、補体結合分析法またはＦＡＣＳ等により測定でき、前記遺伝子発現は、ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲまたはＲＴ  ＰＣＲ等により測定できるが、これに制限されない。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の準成熟樹状細胞で発現する特定遺伝子をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した結果、ＰＧＥ２の処理濃度が０．０１〜５μｇ／ｍＬの場合、ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現が未成熟樹状細胞に比べて２倍以上増加することを確認することができた。また、前記準成熟樹状細胞は、ＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯ遺伝子発現が追加で増加、例えば２倍以上増加することを確認することができた。具体的に調べると、本発明の準成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞に比べて、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現は２倍以上、ＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現は５倍以上、ＰＴＧＳ２遺伝子の発現は４倍以上、ＩＤＯ遺伝子の発現は２倍以上増加したことを確認することができた（図２）。
【００３４】
一方、本発明の準成熟樹状細胞の特徴を確認して、既存治療剤に比べて本発明がリウマチ関節炎患者に優れた治療効能を有する原因を解明するためには、本発明に特徴的に増加している特定遺伝子の発現量を測定することが重要といえる。
【００３５】
従って、本発明は他の観点で、
（ａ）未成熟樹状細胞を自己抗原とサイトカインおよびＰＧＥ２で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）未成熟樹状細胞ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；
（ｃ）前記製造された準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する工程；および
（ｄ）前記（ｂ）工程および（ｃ）工程で測定されたＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を比較する工程；
を含む、自己免疫疾患治療または予防用準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂのタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現程度を測定する方法を提供する。
【００３６】
本発明において、タンパク質および遺伝子の発現程度を測定する方法は通常の方法を使用することができ、これの具体的な例は先述したとおりである。本発明でタンパク質および遺伝子の発現程度を測定する方法は、例えば特定遺伝子は配列番号１〜１０で表示されるｐｒｉｍｅｒを使用して増幅した後、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定することができβ−ａｃｔｉｎでｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎされた前記特定遺伝子の発現を未成熟樹状細胞の発現基準で分けた相対的値で分析する過程を介して行われる。β−ａｃｔｉｎは、細胞の骨格を成すｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎの主な構成要素であって多くの細胞で均一に発現してその性格上外部条件により変わり難く一定程度の高い発現値を見せる。このような遺伝子をｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅというが、特定遺伝子の発現の差を比較する時に基準値として使用される。β−ａｃｔｉｎ発現程度を基準値にして準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現程度を測定して、これを対照群である未成熟樹状細胞全体のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現量で割った値を測定した結果、ＰＧＥ２の処理濃度が０．０５〜５μｇ／ｍＬである場合に未成熟樹状細胞に比べて、ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現が各々２倍以上および５倍以上増加したことを確認することができた。
【００３７】
また、本発明は、ＰＴＧＳ２および／またはＩＤＯ遺伝子の発現を追加で測定することを特徴とする。
【００３８】
本発明に処理されるＰＧＥ２の濃度は、０．０５〜５μｇ／ｍｌで未成熟樹状細胞に処理される前記ＰＧＥ２および自己抗原とサイトカインの処理時間は３〜１０時間であることを特徴とし、前記自己抗原は、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）およびビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）で構成された群から選択された１種以上であってもよく、前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とする。
【００３９】
また好ましい具現例によると、本発明の組成物が適用される疾病または疾患は、リウマチ関節炎であることを特徴とするか、必ずしもこれに限定されるのではない。すなわち、本発明の準成熟樹状細胞を含む組成物によって治療が可能な自己免疫疾患は、生体内における自己免疫反応によって誘発される全ての疾病または疾患を含む。例えば、第１型糖尿病、リウマチ関節炎、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｒｕｅ）、ＩｇＡ欠乏（ＩｇＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、皮膚硬化症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合性結合組織病、元発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アジソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少紫斑病、肝硬変症、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチャー症候群、水泡性類天疱瘡、円板状紅斑ループス、潰瘍性大腸炎および高密度沈着病などがある。
【００４０】
また、本発明の他の実施例では、本発明の臨床的効果を確認するために特定自己抗原に感作された準成熟樹状細胞を活動性リウマチ関節炎患者１２人に投与した。６人ずつ二つのグループで分けた後、各々５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ、１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／１．５ｍＬの濃度で各々皮下注射した。最初４週までは２週間隔で計３回を投与して、４週の休薬期を置いた後、２週間隔で計２回を投与して、計１０週間投薬した。投与前と投与後８週、１４週が経過した時点で前記リウマチ関節炎患者の血液を採血して自己抗体とＴ  ｃｅｌｌ反応性を測定した。
【００４１】
その結果、特定自己抗原（シトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチン）に対する自己抗体が減少することを確認することができた（図１０、図１１）。
【００４２】
従って、本発明はさらに他の観点で、本発明の製造方法によって製造された準成熟樹状細胞を有効成分として含む、前記準成熟樹状細胞製造時処理された自己抗原と同じ自己抗原に対する反応性を保有している自己免疫疾患治療用細胞治療剤を提供する。
【００４３】
本発明で前記「細胞治療剤」とは、細胞と組織の機能を復元させるために生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖・選別したり、その他の一方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を介して治療、診断および予防の目的で使用される医薬品をいう。米国は１９９３年から、韓国は２００２年から細胞治療剤を医薬品として管理している。このような細胞治療剤は大きく二つの分野に分類することができ、その一番目は、組織再生あるいは臓器機能回復のための「幹細胞治療剤」であり、二番目は、生体内免疫反応の抑制あるいは免疫反応の亢進など免疫反応調節のための「免疫細胞治療剤」である。
【００４４】
本発明の細胞治療剤組成物は、疾患の治療のために治療学的に有効な量の細胞治療剤を含むことができる。「治療学的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、研究者、獣医師、医師またはその他臨床によって考えられる組織系、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の組成物に含まれる細胞治療剤は、所望の効果により変わることは当業者に明らかである。従って、最適な細胞治療剤含有量は、当業者によって容易に決定され、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた他の成分の含有量、剤形の種類、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬品をはじめとする種々の因子により調節され得る。
【００４５】
本発明の一実施例によると、リウマチ関節炎患者１２人に本発明の準成熟樹状細胞を各々５×１０６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ、１．５×１０７ｃｅｌｌ／１．５ｍＬずつ投与した結果、特定抗原に対する反応性を有する患者に投与時自己抗体を減少させるように作用して治療効果があることを確認することができた（図１０、図１１）。従って、前記要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を設定して見ると、本発明の細胞治療剤には５×１０６〜１．５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞が含まれて、より好ましくは１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞が含まれ得る。
【００４６】
本発明の準成熟樹状細胞の治療効果と発現する特定遺伝子間の相関を確認して、関連機序を解明するために前記樹状細胞のＩＬ−１０分泌の有無および特定遺伝子の機能を確認した。ＩＬ−１０は、Ｔｈ２、調節Ｔ細胞、樹状細胞などで分泌されるサイトカインで自己の組織を攻撃する免疫細胞を抑制させて免疫寛容を誘導する役割をすると知られている。
【００４７】
本発明の一実施例により、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔで定量した結果、本発明の準成熟樹状細胞が、ＰＧＥ２処理時間および濃度に応じてＩＬ−１０を分泌するのを確認することができた（図４）。本発明のさらに他の実施例では、前記ＩＬ−１０の分泌が特定遺伝子、特にＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子によるものであることを各遺伝子に対するｓｉＲＮＡを１０〜１００ｐｍｏｌ（１０、５０、１００ｐｍｏｌ）の濃度でｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした対照群との比較を介して確認することができた（図５）。また、ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現によってＩＬ−１０の分泌が高まった本発明に係る準成熟樹状細胞が有効にリウマチ関節炎治療効果を示すことを確認することができた（図７Ａ、７Ｂおよび８）。さらに、本発明の準成熟樹状細胞がＩＬ−１０を媒介にしてＴ  ｃｅｌｌの免疫寛容を誘導することをさらに他の実施例を介して確認した（図６、図９）。
【００４８】
従って本発明は、ＩＬ−１０分泌を増加させてＴ  ｃｅｌｌからＩＦＮ−γの分泌を減少させて、自己抗体生成を減少させる作用をすることを特徴とする自己免疫疾患治療用細胞治療剤に関する。
【００４９】
一方、本発明の準成熟樹状細胞は、細胞治療に一般に使用される薬剤学的担体と共に適切な形態で剤形化され得ることは当業者にとって自明な事実である。
【００５０】
従って、本発明はさらに他の観点で、
（ａ）未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を自己抗原（ａｕｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）とサイトカインおよびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）で処理して準成熟樹状細胞を製造する工程；
（ｂ）前記準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が未成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現に比べて２倍以上増加したことを確認する工程；および
（ｃ）前記ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が２倍以上増加した準成熟樹状細胞を含有する細胞治療剤を剤形化する工程；
を含む、準成熟樹状細胞を含有した自己免疫疾患治療または予防用細胞治療剤の製造方法を提供する。
【００５１】
本発明において、前記樹状細胞は、ＰＴＧＳ２またはＩＤＯ遺伝子発現がさらに増加したことを特徴とする。増加する場合、未成熟樹状細胞に比べて２倍以上増加することができる。
【００５２】
本発明で発現する特定遺伝子は、配列番号１〜１０で表示されるｐｒｉｍｅｒを使用して増幅した後、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定することができ、β−ａｃｔｉｎでｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎされた前記特定遺伝子の発現を未成熟樹状細胞の発現基準で分けた相対的値で分析する過程を介して実行される。具体的に説明すると、外部条件によって変わり難く一定程度の高い発現値を見せるｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの一種類であるβ−ａｃｔｉｎ発現程度を基準値にして準成熟樹状細胞のＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現程度を測定してこれを対照群である未成熟樹状細胞全体のＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現量で割った値を測定する。その結果、ＰＧＥ２の処理濃度が０．０５〜５μｇ／ｍＬである場合に、未成熟樹状細胞に比べて、ＮＲ４Ａ２およびＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現が各々２倍以上および５倍以上増加したのを確認することができた。前記のような方法で測定時、ＰＧＥ２の処理濃度が０．０５〜５μｇ／ｍＬである場合、未成熟樹状細胞に比べて、ＰＴＧＳ２およびＩＤＯ遺伝子の発現は各々４倍以上および２倍以上増加したのを確認することができた。
【００５３】
本発明の細胞治療剤を剤形するために必要とする「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物のことをいう。薬学的に許容される担体としては、例えば水、適切なオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどといった非経口投与用担体などがあって、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−または、プロピル−パラベンおよびクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【００５４】
本発明の自己免疫疾患治療または予防用細胞治療剤を製造する過程で、自己抗原とサイトカインおよびＰＧＥ２の処理時間は３〜１０時間であることを特徴とし、前記自己抗原は、例えばα−エノラーゼ（α−ｅｎｏｌａｓｅ）、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）、フィブリノーゲンα、フィブリノーゲンβ、コラーゲンＩＩ、ヒストンＢ、アグリカン、フィブリン、リウマトイドファクター（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＰＩ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、およびビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ペプチドおよびタンパク質、およびこれのシトルリン化ペプチドおよびタンパク質で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とし、前記サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）であることを特徴とする。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５６】
実施例１：自己抗体確認を介した抗原スクリーニングまたは免疫反応モニタリング
健常者と比較してＲＡ患者に高く存在する血しょう内自己抗体を探索したり準成熟樹状細胞をＲＡ患者に投与した後自己血しょうの変化を確認（免疫反応モニタリング）するために次のようなアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。準成熟樹状細胞をリウマチ関節炎患者に投与した後、自己血しょうの変化を確認（免疫反応モニタリング）するために、次のようなアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。トルリンされた或いはされなかったフィラグリン（ＪＷクレアジェン）、ＰＡＤ４（ＪＷクレアジェン）、ＲＡ３３（ＪＷクレアジェン）、ビメンチン（ＪＷクレアジェン）、フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＧＰＩ（ＪＷクレアジェン）、コラーゲン（Ｇｅｎｗａｙ）等計９種類の抗原を各々１μｇ／ｍＬずつ９６ウェルプレートに分注した後、２４時間が経過すると０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳで該当プレートを１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。１時間後、リウマチ関節炎患者１００人と健常者１４人の血しょうを各々１：１０または１：５０で希釈して５０μＬずつｄｕｐｌｉｃａｔｅで分注して２時間常温で反応させた。２時間後プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄して１：２０００割合でＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎされた抗ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳに添加して、これを５０μＬずつ各プレートウェルに分注した。１時間後、プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄して１μｇ／ｍＬ−ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μＬずつプレートウェルに分注した。発色が進行されると、５０μＬずつ０．２Ｍ水酸化ナトリウムを各プレートウェルに分注して反応を終了し、各ウェルの４０５ｎｍに対する吸光度をＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒを介して確認した。
【００５７】
その結果、シトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチンの抗原−抗体反応率が３０％以上であることを確認することができた（図１Ｂ）。抗原−抗体反応率とは、１００人のリウマチ関節炎患者中＜健常者平均吸光度×１．５＞以上の値を有する患者の％を意味する。
【００５８】
実施例２：ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを介した抗原スクリーニングまたは免疫反応モニタリング
自己抗原中健常者に比べてＲＡ患者の血液内ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌのＩＦＮγ反応を高める抗原を探索したり、準成熟樹状細胞をリウマチ関節炎患者に投与した後、自己抗原に対するａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌのＩＦＮ−γ反応性変化（免疫反応モニタリング）を確認するためのアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ａｓｓａｙは、実験方法ガイドラインに従って行った。１００μＬ  ｃａｐｔｕｒｅ抗体を各ＥＬＳＩＳＰＯＴ９６ウェルプレートに分注して４℃で２４時間反応させた後、プレートを１０％ＦＢＳが含まれたＰＢＳで２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わった後、リウマチ関節炎患者（９人）または健常者（２人）から抽出した末梢血液単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ，ＰＢＭＣ）２×１０５ｃｅｌｌにシトルリンされたフィラグリン（ＪＷクレアジェン）、ＰＡＤ４（ＪＷクレアジェン）、ＲＡ３３（ＪＷクレアジェン）、ビメンチン（ＪＷクレアジェン）、フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩｇＧＦｃ（Ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）計７種類の抗原を各々１０μｇ／ｍＬ添加した後、１０％ヒトＡＢ  ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０で懸濁してウェルにｄｕｐｌｉｃａｔｅで分注した。３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄してｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎされたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を各ウェルに１００μＬずつ分注して２時間常温で反応させた。２時間後０．０５％ＰＢＳ−Ｔで洗浄して１：１００に希釈されたＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎされたａｖｉｄｉｎを１００μＬずつ各ウェルに分注して１時間常温で反応させた。１時間後、ＰＢＳで洗浄してＡＥＣ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１００μＬずつ各ウェルに分注して発色を確認して前記自己抗原を処理しなかった対照群の発色程度と比較した。各ウェルのｓｐｏｔは、ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ−ＥＬＩＳＰＯＴ  ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して分析した。
【００５９】
その結果、ＩＦＮ−γを分泌する末梢血液単核細胞の反応率が５０％以上である抗原は、シトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチンであることを確認することができた（図１Ａ）。ＩＦＮ−γ反応は、９人のＲＡ患者中＜健常者平均吸光度×１．５＞以上の値を有する患者の％を意味する。
【００６０】
実施例１と実施例２の結果をまとめて考慮して抗原−抗体反応率が３０％以上で、ＩＦＮ−γを分泌する末梢血液単核細胞の反応率が５０％以上である抗原であるシトルリン化フィラグリン、ＰＡＤ４、ＲＡ３３、ビメンチンを準成熟樹状細胞に感作させる特定自己抗原として選別した。
【００６１】
実施例３：準成熟樹状細胞の製造
健常者またはリウマチ関節炎患者から抽出した末梢血液単核細胞をプラスチック培養容器に一定量分注して３０分〜１時間培養した後、浮遊細胞は取り除いて底についた単核球を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（ＪＷクレアジェン）と３０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（ＪＷクレアジェン）が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）培地で３日間３７℃、ＣＯ２培養後、浮遊する未成熟樹状細胞を回収した（この中一部未成熟樹状細胞は、特異遺伝子発現確認試験のための対照群として使用）。回収された未成熟樹状細胞は、前記ＣｅｌｌＧｒｏ培地で懸濁して新しいプレートに一定量再分注した後、実施例１および２で選別された自己抗原（ＪＷクレアジェン）を各々５〜１０μｇ、ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．０５〜５μｇ／ｍＬ添加して３〜１０時間刺激した。刺激が終わった準成熟樹状細胞は、凍結液、５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５％ぶどう糖（緑十字）が含まれたヒト血しょうアルブミン（ＪＷ  ｐｈａｒｍ．）で凍結した。
【００６２】
実施例４：準成熟樹状細胞の特定遺伝子発現確認
実施例３で得られた特定自己抗原で感作された準成熟樹状細胞を解凍してＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）で洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してｍＲＮＡを分離して定量した後、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（ＡＢ）の方法により各ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは、ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）を利用して配列番号１〜１０のｐｒｉｍｅｒと混合した後、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ）を行って、β−ａｃｔｉｎでｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎされた各遺伝子の発現を未成熟樹状細胞の発現基準で分けた相対的値で分析した。
【００６３】
その結果、ＰＧＥ２を０〜４８ｈ処理したが、特に３〜１０ｈ処理時準成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２遺伝子（ＮＭ_００６１８６）の発現が２倍以上、ＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子（ＮＭ_０３２８７３）の発現が５倍以上、ＰＴＧＳ２遺伝子（ＮＭ_０００９６３）の発現が３倍以上増加したことを確認することができ、ＩＤＯ遺伝子（ＮＭ_００２１６４）は１０〜４８ｈ処理時間で発現が約６０倍以上増加したことを確認することができた（図２Ａ）。
【００６４】
また、ＰＧＥ２を０．０１〜５μｇ／ｍＬ処理した準成熟樹状細胞は未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２遺伝子（ＮＭ_００６１８６）の発現が２倍以上、ＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子（ＮＭ_０３２８７３）の発現が５倍以上、ＰＴＧＳ２遺伝子（ＮＭ_０００９６３）の発現が４倍以上、ＩＤＯ遺伝子（ＮＭ_００２１６４）の発現が２倍以上増加したことを確認することができた（図２Ｂ）。
【００６５】
【表１】
0006434139.tif 000002
【００６６】
実施例５：準成熟樹状細胞のＩＬ−１０分泌確認
実施例３の方法によりＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｇ／ｍＬ添加して３〜４８時間刺激した準成熟樹状細胞および０、０．０５、０．５および５μｇ／ｍＬのＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して刺激した準成熟樹状細胞を解凍した後、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）を利用して洗浄した。前記細胞集団２×１０５ｃｅｌｌを１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２００ｕｎｉｔ／ｍＬのＩＦＮγ（ＬＧ）が含まれたか、０．１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｕｎｉｔ／ｍＬのＩＦＮγ（ＬＧ）または１μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が含まれた１０％ｈｕｍａｎ  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ（Ｌｏｎｚａ）が入ったＲＰＭＩ１６４０で９６ウェルプレートでｄｕｐｌｉｃａｔｅで２４時間３７℃、ＣＯ２培養した。２４時間後培養液を回収してＩＬ−１２とＩＬ−１０に対するＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）使用法に従って培養液内のＩＬ−１２とＩＬ−１０を定量した。
【００６７】
実験結果、ＰＧＥ２で感作された準成熟樹状細胞でＰＧＥ２を３〜１０ｈで処理する場合、ＩＬ−１０分泌が増加することを確認することができた（図３Ａ）。また、自己抗原ＰＧＥ２処理濃度０．０５〜５μｇ／ｍＬ（Ｐ（０．０５）、Ｐ（０．５）およびＰ（５）に該当）でＩＬ−１０分泌増加することを確認することができた（図３Ｂ）。
【００６８】
実施例６：特異遺伝子の機能確認のためのｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
実施例５の実験結果で確認された特定自己抗原で感作された準成熟樹状細胞が分泌するＩＬ−１０と実施例４で確認された特定遺伝子発現間の相関を確認するために、特定遺伝子に対するｓｉＲＮＡをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしてｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎさせた後、準成熟樹状細胞のＩＬ−１０分泌とＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌変化を確認した。準成熟樹状細胞に対するｓｉＲＮＡをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせる方法は下記のとおりである。ヒト由来末梢血液単核細胞をプラスチック培養容器に一定量分注して３０分〜１時間付着させた後、浮遊細胞は取り除いて底についた単核球を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（ＪＷクレアジェン）と３０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（ＪＷクレアジェン）が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）培地で２日間培養して浮遊する未成熟樹状細胞を回収した。前記ＣｅｌｌＧｒｏ培地で懸濁した未成熟樹状細胞は５×１０５〜１０×１０５／ウェル（６ウェルプレート）に分注した。ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで製作したＮＲ４Ａ２、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＧＡＰＤＨ（陽性対照群）、Ｎ．Ｃ．（陰性対照群）に対するｓｉＲＮＡ  １０〜１００ｐｍｏｌとｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒであるＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−５μＬを培養液１００μＬに混合して該当ウェルに静かにｄｒｏｐｐｉｎｇした後２４〜３６時間培養した。２４時間経過後、５〜１０μｇ／ｍＬの特定自己抗原（ＪＷクレアジェン）と１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５μｇ／ｍＬのＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して４時間刺激後凍結した。製造された準成熟樹状細胞を解凍した後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２００ｕｎｉｔ／ｍＬのＩＦＮγ（ＬＧ）が含まれたか、０．１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、または１μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が含まれた１０％ｈｕｍａｎ  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ（Ｌｏｎｚａ）が入ったＲＰＭＩ１６４０で培養した。培養液を回収してＩＬ−１０に対するＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）使用法に従って培養液内のＩＬ−１０を定量した。
【００６９】
実験結果、本発明の準成熟樹状細胞が発現する特定遺伝子とＩＬ−１０の分泌が相関が高いことを確認して（図４）、特にＮＲ４Ａ２遺伝子がＩＬ−１０分泌を調節して（図５Ａ）、ＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子がＩＬ−１０分泌を調節することを確認することができた（図５Ｂ）。
【００７０】
実施例７：準成熟樹状細胞のＴ細胞調節確認
Ｎｙｌｏｎ  ｗｏｏｌ  ｃｏｌｕｍｎを利用してヒト末梢血液単核細胞から純度９０％以上のＣＤ３  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌを分離して１０％ｈｕｍａｎ  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ（Ｌｏｎｚａ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）で懸濁して４８ウェルプレートに１×１０６ずつ分注した。実施例３の方法で製造されて凍結した、準成熟樹状細胞を解凍した後、ＲＰＭＩ１６４０を利用して洗浄して同じ培養液で懸濁してウェルに１×１０５ｃｅｌｌずつ分注して３７℃、ＣＯ２培養した。２日後、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇａｍ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５００ｎｇ／ｍＬのｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇａｍ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μＬ／ｍＬのｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４時間刺激して、細胞集団を回収して抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と抗ヒトＣＤ４抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳ染色した。表面染色が終わったＦＡＣＳサンプルは、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用法に従ってｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎして、抗ヒトＩＦＮ−γ抗体に対して細胞内サイトカインＦＡＣＳ染色を行った。完了したＦＡＣＳサンプルは、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を利用してＴ細胞内サイトカイン分泌を分析した。調節Ｔ細胞を誘導するために前記のような方法でＴ細胞を分離してＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で懸濁して７日間各実験群と共に３７℃、ＣＯ２培養した。７日後、各実験群のＴ細胞を回収して抗ヒトＣＤ４抗体とＣＤ２５抗体で１次ＦＡＣＳ染色して表面染色が終わったＦＡＣＳサンプルはＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の使用法に従ってｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎした。抗ヒトＦｏｘｐ３抗体に対して核内ＦＡＣＳ染色を行った後、各サンプルはＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を利用して調節Ｔ細胞の誘導％を確認した。
【００７１】
実験結果、Ｔ  ｃｅｌｌの免疫寛容は、本発明の製造方法によって製造された準成熟樹状細胞が分泌するＩＬ−１０を媒介として行われることが分かった（図６）。
【００７２】
また、実施例２に記載された方法と同じ条件で準成熟樹状細胞をリウマチ関節炎患者に投与した後、自己抗原に対するａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌのＩＦＮ−γ反応性変化（免疫反応モニタリング）を確認するためのアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。シトルリンされたフィラグリン（ＪＷクレアジェン）、ＰＡＤ４（ＪＷクレアジェン）、ＲＡ３３（ＪＷクレアジェン）、ビメンチン（ＪＷクレアジェン）抗原（１０μｇ／ｍＬ）を利用して、各ウェルのｓｐｏｔは、ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ−ＥＬＩＳＰＯＴ  ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して分析した。
【００７３】
実験結果、本発明の準成熟樹状細胞を処理した場合、処理時間に比例してＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌が抑制されて調節Ｔ細胞誘導のような免疫寛容性質が増加することを確認することができた（図９）。
【００７４】
実施例８：準成熟樹状細胞の投与方法および免疫反応モニタリングのための採血
リウマチ関節炎患者の末梢血液単核細胞から抽出した未成熟樹状細胞に実施例１または２で選別された特定自己抗原（ＪＷクレアジェン）を各々７μｇ／ｍＬ、ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬ、ＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｇ／ｍＬ添加して４時間各抗原で刺激した準成熟樹状細胞を１：１：１：１の割合で混合して、０．５×１０７／０．５ｍＬまたは１．５×１０７／１．５ｍＬで凍結した。前記凍結した準成熟樹状細胞を含むバイアルを解凍して低容量または高容量投与群に該当するリウマチ関節炎患者１２人に６人ずつ二つのグループで各々５×１０６ｃｅｌｌ／０．５ｍＬ、１．５×１０７ｃｅｌｌ／１．５ｍＬずつ大腿部の両側に皮下注射した。以後２週と４週、８週、１０週目に同量、同法で前記の準成熟樹状細胞を投与して投与前０週と投与後８週、１４週目に前記リウマチ関節炎患者の血液を採血して有効性評価および免疫反応モニタリングを行った。
【００７５】
有効性評価結果、ＮＲ４Ａ２および／またはＵＢＡＳＨ３Ｂ遺伝子の発現によってＩＬ−１０の分泌が高まった本発明に係る準成熟樹状細胞が有効にリウマチ関節炎治療効果を示すことを確認することができた（図７Ａ、７Ｂおよび８）。
【００７６】
また、免疫反応モニタリング結果、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ＰＡＤ４（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｅｉｍｉｎａｓｅ  ４）、ＲＡ３３（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２）およびビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）抗原に対する自己抗体が有意に減少して本発明の特定自己抗原に感作された準成熟樹状細胞がリウマチ関節炎治療に効果的であることを確認することができた（図１０、図１１）。
【００７７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によると、ヒトから由来した未成熟樹状細胞を選別された特定自己抗原とサイトカインおよびＰＧＥ２で処理して、未成熟樹状細胞に比べてＮＲ４Ａ２またはＵＢＡＳＨ３Ｂタンパク質、または前記タンパク質をコードする遺伝子の発現が２倍以上増加してＩＬ−１０分泌が増加して、これによって免疫寛容性質が増加した準成熟樹状細胞を製造することができる。
本発明による準成熟樹状細胞を含む自己免疫疾患治療または予防用細胞治療剤は、準成熟樹状細胞を製造する過程で処理された特定自己抗原と同じ自己抗原に対する反応性を見せる患者に投与時、既存の自己免疫疾患治療法に比べて優れた効果を示すので、患者一人一人の特性を考慮した細胞治療を可能にする効果がある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
0006434139.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0006434139.tif 000011
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006434139.tif 000013
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
0006434139.tif 000015
【図７Ｂ】
0006434139.tif 000016
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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