(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加している組換えアデノウイルスであって、前記アデノウイルスが癌細胞において腫瘍溶解効果を有し、前記組換えアデノウイルスがアデノウイルスのE1B遺伝子の配列に突然変異を有し、E1B遺伝子における突然変異が、アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)又はいずれかの他のアデノウイルス血清型における3216と等価な位置におけるグアニン点突然変異である、前記組換えアデノウイルス。
【請求項２】
アデノウイルスがアデノウイルス血清型Ad5である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
アデノウイルスがアデノウイルス血清型Ad5pTG3602株である、請求項１又は２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
E1B遺伝子が、配列番号1に従うポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-496Rアイソフォームと比較して増加している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
E1B-496Rアイソフォームの割合が、野生型レベルと比較して減少している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-93Rアイソフォームと比較して増加している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-84Rアイソフォームと比較して増加している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
E1B-93Rアイソフォームの割合が、野生型レベルと比較して減少している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
E1B-156Rアイソフォームの割合が、少なくとも2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍又は10,000倍増加している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
E1B-496Rアイソフォームの割合が、少なくとも2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍又は10,000倍減少している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、又はE1B-84Rアイソフォームの割合が：
a)発現されるアイソフォームタンパク質のレベル；及び/又は
b)転写されるアイソフォームmRNAのレベルを指す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
E1B-156Rアイソフォームが配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
E1B-156Rアイソフォームが配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
E1B-496Rアイソフォームが配列番号4と少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
E1B-496Rアイソフォームが配列番号5と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１７】
E1B-93Rアイソフォームが配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１８】
E1B-93Rアイソフォームが配列番号7と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１９】
E1B-84Rアイソフォームが配列番号8と少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
E1B-84Rアイソフォームが配列番号9と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
癌細胞が、腫瘍性細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
腫瘍溶解効果が：
a)細胞のウイルス感染；
b)癌細胞における優先的ウイルス媒介細胞溶解、及びさらなる感染事象に関するウイルス粒子の放出をもたらす、癌細胞におけるウイルスゲノムの選択的複製によって測定される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
宿主細胞内でのアデノウイルス生産に適したベクターである、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２６】
癌の治療における使用のための、組換えアデノウイルスを含む組成物であって、治療が：
a)組換えアデノウイルスの用量を投与すること；
b)前記癌の腫瘍性細胞に前記組換えアデノウイルスが感染するのに十分な時間を与えること；
を含み、前記組換えアデノウイルスが、E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加していることを特徴とし、前記アデノウイルスが癌細胞において腫瘍溶解効果を有し、
前記組換えアデノウイルスがアデノウイルスのE1B遺伝子の配列に突然変異を有し、E1B遺伝子における突然変異が、アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)又はいずれかの他のアデノウイルス血清型における3216と等価な位置におけるグアニン点突然変異である、
前記組成物。
【請求項２７】
治療がさらなる用量の組換えアデノウイルスを投与することを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
治療剤としての使用のための、組換えアデノウイルスを含む組成物であって、前記組換えアデノウイルスが、E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加していることを特徴とし、前記アデノウイルスが癌細胞において腫瘍溶解効果を有し、
前記組換えアデノウイルスがアデノウイルスのE1B遺伝子の配列に突然変異を有し、E1B遺伝子における突然変異が、アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)又はいずれかの他のアデノウイルス血清型における3216と等価な位置におけるグアニン点突然変異である、
前記組成物。
【請求項２９】
癌を有する患者の治療における使用のための、組換えアデノウイルスを含む組成物であって、前記組換えアデノウイルスが、E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加していることを特徴とし、前記アデノウイルスが癌細胞において腫瘍溶解効果を有し、
前記組換えアデノウイルスがアデノウイルスのE1B遺伝子の配列に突然変異を有し、E1B遺伝子における突然変異が、アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)又はいずれかの他のアデノウイルス血清型における3216と等価な位置におけるグアニン点突然変異である、
前記組成物。
【請求項３０】
等価な野生型アデノウイルスにおけるレベルと比較してE1B-156Rアイソフォームのレベルを増加させるようにE1B遺伝子の配列を改変することによって、アデノウイルスを腫瘍溶解性にする方法であって、前記E1B遺伝子が、アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)又はいずれかの他のアデノウイルス血清型における3216と等価な位置におけるグアニン点突然変異である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性アデノウイルス、及び腫瘍性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、E1B遺伝子のスプライシングアイソフォームのレベルを調節し、それによって腫瘍溶解性アデノウイルスの治療指数を改善するE1B遺伝子の突然変異に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルス療法は、癌療法の新たな治療プラットフォームである。腫瘍溶解性ウイルスは、特異的発癌表現型を有する癌細胞で選択的に複製し、それによって正常細胞を維持しながら癌細胞を殺傷するウイルスである。初期の研究は天然に存在する非病原性ウイルスに注目していたが、これらの研究は限定的な成功しか示さなかった。腫瘍増殖は減速することが観察され、正常組織は損傷を受けなかったが、疾患の経過には変化がみられなかった。
【０００３】
したがって近年の研究は、癌細胞を選択的に標的化する改変組換えウイルスに注目している。このクラスの改変ウイルスの一例は、ウイルスゲノムのE1B領域が突然変異したアデノウイルスである。
【０００４】
アデノウイルスE1B及びp53
哺乳動物腫瘍サプレッサータンパク質p53の一つの機能は、DNA損傷又は外来DNA合成に応じた細胞周期の停止及び/又はアポトーシスを媒介することである。したがって、アデノウイルスなどの幾つかのウイルスは、効率的なウイルス複製を可能にするために、感染細胞においてp53を不活性化するタンパク質をコードする。これらのタンパク質の一つ、アデノウイルスのE1B領域由来の55キロダルトンのタンパク質(E1B-55K又はE1B-496R)はp53と結合し、それによってp53の実質的な消失を引き起こす。結果として、これが感染細胞のp53媒介アポトーシスを妨げる。したがってE1B-496Rは、機能的p53を含有する細胞におけるアデノウイルス複製に必要不可欠である。
【０００５】
ヒト腫瘍細胞は突然変異した(例えば置換、欠失、フレームシフト突然変異した)p53対立遺伝子に関してホモ接合型若しくはヘテロ接合型であることが多く、細胞周期の正常制御に必要なp53機能を欠いている(Hollsteinら(1991)Science253:49;Levineら.(1991)Nature;351(6326):453〜6)。したがって、腫瘍性細胞が十分なレベルのp53を欠くためか、及び/又は実質的なp53機能を果たすことができない突然変異型p53を腫瘍性細胞が発現するために、多くの腫瘍性細胞はp53(-)である。
【０００６】
E1B突然変異アデノウイルス
腫瘍性細胞と正常細胞の間のp53機能性の違いを利用した、腫瘍溶解性アデノウイルスが設計されている。E1B-496Rタンパク質を突然変異させp53との結合相互作用を除去することにより、又はE1B遺伝子座内に様々な欠失を作製することにより(例えば、米国特許第5,677,178号参照)、生じるアデノウイルスは複製することができ、正常p53機能を有する細胞ではなく、p53機能を実質的に欠く癌細胞を最終的に溶解させることができる。
【０００７】
一例は、(元はdl1520という名称であり、H101とも呼ばれる)ONYX-015、E1B-496Rタンパク質を発現しない突然変異アデノウイルスである(Heiseら.(1997)Nat. Med. 3(6):639〜645)。このウイルスは翻訳開始コドンの直後に停止コドンを含有し、E1B-496Rコード配列の大きな欠失もある。結果として、このウイルスはp53と結合し不活性化する能力を欠き、したがって腫瘍性細胞及び腫瘍などのp53機能に欠損がある細胞においてのみ効率良く複製することができる。残念ながらE1B-496Rは、p53と結合して不活性化することに加えて、他の機能も実行する(Eagerら.(2001)Cancer Gene Ther. 18(5):305〜317)。したがってONYX-015ウイルスは、ウイルス後期mRNAの細胞質蓄積、宿主細胞での後期mRNAのシャットオフ及び翻訳に欠損がある。したがってONYX-015における突然変異は、腫瘍細胞中で自己再生する突然変異ウイルスの能力を損なわせる。他の問題は、大きな欠失によってウイルスゲノムが不安定状態になることである。
【０００８】
他の例は、p53とのその結合を妨げるE1B-496Rタンパク質に点突然変異(それぞれR240AとH260A)を含有する突然変異アデノウイルスであるONYX-051とONYX-053である。これらの突然変異は、p53機能に欠損がある細胞中で複製するウイルスの能力を損なわずに、そのような細胞中でウイルスが選択的に複製することを可能にする(Shenら.(2001)J. Virol. 75(9):4297〜4307及び米国特許第7,785,887号)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,677,178号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hollsteinら、(1991)Science253:49
【非特許文献２】Levineら、(1991)Nature;351(6326):453〜6
【非特許文献３】Heiseら、(1997)Nat. Med. 3(6):639〜645
【非特許文献４】Eagerら、(2001)Cancer Gene Ther. 18(5):305〜317
【非特許文献５】Shenら.(2001)J. Virol. 75(9):4297〜4307
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、腫瘍溶解能力を増大させた、癌の療法に有用な改善された突然変異ウイルスが依然として強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ここで、E1B遺伝子から発現されたE1B遺伝子産物のスプライシングアイソフォームのレベル及びタイプを調節することによって、このようなウイルスの腫瘍溶解活性を高めることができることが本発明者により見出された。したがって本発明の第一の態様は、野生型レベルと比較してE1B-156Rアイソフォームの割合を増加させた組換えアデノウイルスであって、癌細胞において腫瘍溶解効果を有するアデノウイルスを提供する。この組換えアデノウイルスは、アデノウイルスが癌細胞において腫瘍溶解効果を有するように、野生型レベルと比較してE1B-156Rアイソフォームの割合を増大させるような突然変異を有していてもよい。突然変異はアデノウイルスのE1B遺伝子の配列中に存在していてもよい。したがって本発明によるウイルスは、非腫瘍細胞中では複製阻害されるが、機能的p53を実質的に欠く腫瘍性細胞を含めた腫瘍性細胞において複製表現型を発現することができる。
【００１３】
本明細書に記載されるアデノウイルスの特定の例では、E1B-156Rの過剰発現は、アデノウイルスのE1B遺伝子における突然変異93Rスプライス部位により引き起こされる不均衡であると考えられる。156Rは496R機能のいくつかを補うことはできるが、腫瘍選択性に必要不可欠なものではない。類似したタイプの従来技術のウイルスとは対照的に、本発明によるウイルスは、より良いin vivo効率のための機能的E3B領域を含む。例えば、Onyx-015はE3Bを欠く。実際、本発明によるウイルスは全ての点で、Onyx-015ウイルス及びその選択性をはるかに上回る。さらに本発明者は、正常細胞において本発明に従い調製したウイルスを試験しており、その結果は、本発明によるウイルスが、特に周知のウイルスOnyx-015と比較して、顕著な安全性プロファイルを有することを示す。
【００１４】
本明細書中、用語「複製阻害ウイルス」又は「複製欠陥」は、癌又は腫瘍状態に形質転換した所定の細胞集団において、細胞増殖を優先的に阻害するか又はアポトーシスを誘導するウイルスを指す。このようなウイルスは、非複製、非形質転換細胞に特徴的な正常p53機能レベルを含む細胞では、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、又は複製表現型を発現することが実質的にできない。このような形質転換細胞は、p53機能を実質的欠き得、このことが、ウイルス複製表現型の発現を支持している。しかしながら、腫瘍性組織に対する本発明によるウイルスの選択性は、p53の状態だけに関連するのではなく、より一般的であり得、このような形質転換状態は選択の基盤となり得る。例えば、ONYX-015ウイルスで観察される腫瘍溶解選択性は、E1B-496R欠失のために正常細胞中でONYX-015において失われる機能である、核からの後期ウイルスRNA放出を支持するいくつかの癌細胞系の能力に起因し得ることが示唆されている。類似したメカニズムが、低減したレベルのE1B-496Rタンパク質を有する本発明の組換えアデノウイルスにおいて作用し得る。本発明の組換えアデノウイルスにおけるE1B-156Rレベルの増加がどのようにして腫瘍溶解選択性をもたらすかは、まだ正確には明らかになっていない。
【００１５】
典型的には、本発明による複製阻害ウイルスは、正常p53機能を含む細胞においてプラーク形成効率の実質的な減少を示す(適切なアッセイに関しては、Wang, Y.、G. Halldenら. (2003). 「E3 gene manipulations affect oncolytic adenovirus activity in immunocompetent tumor models.」Nature biotechnology 21(11):1328〜1335を参照)。使用され得る適切なアッセイの別の例は、例えばMTT、XTT、MTS又はWSTなどのテトラゾリウム色素を使用する、生存細胞の消失を測定するための細胞毒性アッセイである(Berridgeら、Biotechnology Annual Review、11:127〜152(2005)を参照)。
【００１６】
本明細書で使用する用語「複製表現型」は、複製阻害アデノウイルスなどのウイルスに感染した細胞の、以下の表現型特性の1つ以上を指す：(1)カプシドタンパク質(例えば、アデノウイルスペントンベースポリペプチド)などの後期遺伝子産物の実質的な発現、又はウイルス後期遺伝子プロモーターから始まるRNA転写、(2)ウイルスゲノムの複製又は複製中間体の形成、(3)ウイルスカプシド又はパッケージビリオン粒子の構築、(4)感染細胞における細胞変性効果(CPE)の出現、(5)ウイルス溶解サイクルの終了、及び(6)典型的には機能性腫瘍タンパク質をコードする野生型の複製能力があるDNAウイルスに感染した非腫瘍細胞における、p53機能の排除に付随する他の表現型変化。本発明による複製表現型は、前述の表現型特性の少なくとも1つ、好ましくは該表現型特性の2つ以上、例えば2、3、4、5、6つ又はそれ以上の特性を含む。
【００１７】
これらの表現型を測定するための技法は当業者に公知である。例えば、CPEの出現を評価するための方法は本明細書の実施例中に記載されており、50%組織培養感染量(TCID50)及びプラーク形成単位(pfu)/細胞(感染日における細胞数)の数値を使用して評価する。
【００１８】
用語「腫瘍性細胞」は比較的自発的な増殖を示す細胞を指し、したがってそれらは、細胞増殖制御の実質的な消失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す。腫瘍性細胞は、活発に複製中であるか又は一時的非複製休止状態(G1又はG0)であり得る細胞を含み、同様に腫瘍性細胞は、高分化な表現型、低分化分な表現型を有する細胞、又は両タイプの細胞の混合型を含み得る。したがって、全ての腫瘍性細胞が、必ずしも所与の時点で複製している細胞というわけではない。腫瘍性細胞として本明細書で定義する細胞セットは、良性新生物における細胞及び悪性(又は明らかな)新生物における細胞からなる。明らかな腫瘍性細胞は、内胚葉若しくは外胚葉組織起源の細胞に由来する場合は癌、典型的には癌腫、又は中胚葉由来の細胞タイプに由来する場合は肉腫と呼ばれることが多い。腫瘍性細胞及び癌細胞という用語は、本明細書中では互換的に使用される。
【００１９】
本明細書中、用語「p53機能」は、p53遺伝子によってコードされる本質的に正常なレベルのポリペプチドを有する性質を指し(即ち、同じ組織タイプの非腫瘍細胞と比較して)、この場合p53ポリペプチドは野生型アデノウイルスE1B-496Rポリペプチドと結合することができる。例えばp53機能は、不活性(即ち突然変異)型のp53の生成、又はp53ポリペプチドの実質的減少若しくは発現の完全な消失によって失われ得る。野生型ポリペプチドをコードするp53対立遺伝子を含む腫瘍性細胞において、p53機能は実質的に存在しないものであり得る：例えば、p53の異常な細胞内プロセシング又は局在をもたらす突然変異(例えば、核ではなく主に細胞質におけるp53の局在をもたらす突然変異)などのp53遺伝子座外の遺伝子変化は、p53機能の消失をもたらし得る。したがって、腫瘍性細胞が実質的なレベルのp53を有さないか、及び/又はそれらが実質的なp53機能を果たすことができない突然変異型p53を発現するかのために、多くの腫瘍性細胞がp53(-)である。本発明の内容において、p53の重要な機能は、DNA損傷又は外来DNA合成に応じて細胞周期の停止を媒介する及び/又はアポトーシスを媒介する能力である。p53機能の前記低減が細胞周期とアポトーシスの正常な制御を妨げる場合、腫瘍性細胞は機能的p53を欠く。これは、同じタイプの対応する非腫瘍細胞と比較した、正確にプロセシングされ、局在化され、発現された、E1B-496Rと結合できるp53の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、又は100倍以上の減少を構成し得る。したがって、これらの細胞を「p53(-)」と呼ぶ。
【００２０】
p53と複合体形成する能力を欠くが他の必須ウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠陥アデノウイルス種は、p53機能に欠損がある細胞(例えば、実質的に欠失したp53対立遺伝子に関してホモ接合型である細胞、又は本質的に非機能的である突然変異p53タンパク質を含む細胞)において複製表現型を示すが、非複製、非腫瘍細胞では複製表現型を実質的に示さないと考えられる。このような複製阻害アデノウイルス種は、本明細書では便宜上E1B-p53(-)複製欠陥アデノウイルスと呼ぶ。
【００２１】
「腫瘍溶解性ウイルス」は、癌細胞に優先的に感染し溶解するウイルスである。癌細胞と正常細胞における有効性を比較したとき、腫瘍溶解効果が見られる。溶解癌細胞と非癌細胞の比が2:1、4:1、10:1、20:1、50:1、100:1又はそれ以上である場合、ウイルスは腫瘍溶解性であると考えられる。好ましくは、腫瘍溶解指数(以下参照)を評価することにより、ウイルスを腫瘍溶解性と同定する。本明細書では、腫瘍溶解効果は、a)細胞のウイルス感染；b)(p53欠損であり得る)癌細胞における優先的ウイルス媒介細胞溶解、及びさらなる感染事象に関するウイルス粒子の放出をもたらす、(p53機能欠損)癌細胞におけるウイルスゲノムの選択的複製を含む。腫瘍溶解効果は様々なアッセイを使用して測定することができる。これらのアッセイでは、野生型/天然型であることが多い対照ウイルスを使用すべきである。したがって、以下のアッセイ例のいずれかを使用することができる：MTS(細胞毒性)、TCID50(複製能力)、LDHアッセイ(乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)は、全ての細胞タイプに存在し、原形質膜の損傷により細胞培養培地に迅速に放出される安定な酵素である)、FACS(細胞選別)、ウエスタンブロット、及びQPCR(後期遺伝子発現又はゲノムコピー数)。他の例は当業者には明らかであろう。
【００２２】
本発明によるウイルスの利点は、このようなウイルスは遺伝子異常が最小であることである。好ましくは、本発明によるウイルスは、(挿入、欠失、付加、及び置換を含めた)点突然変異の型などにおいて、その遺伝子配列が突然変異しており；ウイルスの健全性のためには、点突然変異がより好都合である。より大きな変化は、ウイルスに進化的負荷を加える。さらに、ゲノムサイズと完全性が重要であり得る。
【００２３】
本発明によるウイルスは、H101ウイルスなどの入手可能な既存の腫瘍溶解性ウイルスと比較して一層改善された、癌選択指数又は腫瘍溶解指数を有する(この2つの用語は互換的である)。これは癌細胞と比較した正常細胞における複製能力を指し、以下の式に従い表すことができる。
(OVc/OVn)/(WTc/WTn)=癌選択指数
式中、OV=腫瘍溶解性ウイルスの複製能力、WTは対照ウイルスの複製能力であり、cは癌細胞であり、nは正常細胞である。
【００２４】
本発明によるウイルスは、細胞のタイプに応じて、2と10,000の間、好ましくは5と5000の間、10と1000の間、又は50と500の間の癌選択指数を有し得る。本発明によるウイルスの代表例であるIxovexの場合、このウイルスはHeLa細胞において3.5、A549細胞において14、H1299細胞において2000及びH460細胞において450の対照に対する癌選択指数を示す。同じ細胞タイプでは、Ixo-ctrlに対するOnyx-015ウイルスの値は、HeLa=0.1x;A549=0.1x;H1299=0.05x;及びH460=0.004xである。
【００２５】
したがって、本発明によるウイルスを大部分の腫瘍タイプに適用することができる。一つの理論は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスが、p53陰性状態及び急激に複製する細胞に選択的であるということである。
【００２６】
さらに、本発明によるウイルスは宿主免疫防御に対処され最終的に排除されるが、これは腫瘍が完全に根絶される前である。これは、それ自体を、ウイルスを除去してウイルス過負荷の結果としてのあらゆる肝臓毒性を打ち消す方法として提示するだけでなく、腫瘍中のウイルスの存在によって免疫系が変更されるために宿主中で抗癌性免疫応答を誘導する機会も与える。
【００２７】
アデノウイルス
本発明によるウイルスは、組換えアデノウイルスである。執筆時に、7種(ヒトアデノウイルスA〜G)に分布したヒトにおける65を超える記載された血清型(HAdV-1〜65)、並びに他の哺乳動物及び鳥類に由来する多くの血清型が存在している(The Adenoviruses(1984)編. Ginsberg、451〜596頁Plenum Press、New York中のStrauss、「Adenovirus infections in humans」を参照)。アデノウイルスの生物学の一般的な記載に関しては、Virology、第2版、編. Fields及びKnipe. 2巻、1651〜1740頁、Raven Press、New York)を参照されたい。本明細書で使用する用語「アデノウイルス」は、これらのアデノウイルス種のいずれか一つを包含する。好ましくは、本発明によるアデノウイルスは、サブファミリーグループCのヒトアデノウイルス、即ち血清型1、2、5、6、又は57の一つである。より好ましくは、用語アデノウイルスは、2種のヒト血清型、Ad2とAd5に適用する。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態では、アデノウイルスはアデノウイルス血清型Ad5である。アデノウイルスはアデノウイルス血清型Ad5pTG3602株であってよい。pTG3602株は35,000ヌクレオチドアデノウイルスゲノム全体に散在した約15の点突然変異を有するが、しかしながら、これらの突然変異はいずれもE1B遺伝子の範囲内にない。本明細書ではアデノウイルスタイプ5が、E1Bウイルス遺伝子領域のウイルスポリヌクレオチドのヌクレオチドナンバリング慣例とウイルスコードポリペプチドのアミノ酸ナンバリングに関する共通の参照点を提供する。当業者であれば、他のアデノウイルス血清型において対応する位置を容易に特定する。本明細書中、用語「組換え」は、一部分がヒトによって意図的に改変されたポリヌクレオチド構築物(例えば、及びアデノウイルスゲノム)が作製されたことを示す。
【００２９】
E1B遺伝子
本発明によるウイルスは、E1B遺伝子の配列中に突然変異を有することが好ましい。全ての血清型は血清型を越えて、DNA複製の初期の遺伝子産物をコードする、初期領域1B(E1B)と呼ばれる遺伝子をコードする。本明細書中「E1B遺伝子」は、任意のアデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルスにおけるE1B遺伝子の完全長転写単位を指す。E1B遺伝子の代表例は、配列番号1に従うポリヌクレオチド配列を有するアデノウイルスタイプ5(Ad5)由来の遺伝子である。他の例は当業者には知られており、詳細は例えばEntrez Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)などの一般的に使用されるデーターベースで見ることができる。ヒトアデノウイルスタイプ5では、E1Bコード領域はゲノムヌクレオチド番号1714で始まり、ゲノムヌクレオチド番号4043でE1BポリA部位において終了する。類似した領域が、例えば、ヒツジ、ヘビ及びさらにコウモリアデノウイルスの様に多様な種を含む、これまで試験した全てのアデノウイルス中に存在する。
【００３０】
ヒトアデノウイルスのE1B転写単位は少なくとも5個の異なるスプライシングアイソフォームをコードしている(図2参照)(Takayesuら.(1994)J. Gen. Virol. 75:789〜798)。再度、Ad5の例を挙げると、主要2.28kbのE1B前駆体mRNAは、2つの重複リーディングフレームである、176残基のE1B-19Kタンパク質に関するフレーム(E1B-176R)、及びE1B-55Kタンパク質に関する他のフレーム(496残基;E1B-496R)をコードしている。(発現産物中のアミノ酸の数にちなんで名付けられた)E1B-156R、E1B-93R、E1B-84Rアイソフォームは、共通スプライスドナー(SD1)と3個のスプライスアクセプター部位(SA1〜3)の1個の間の、E1B-496Rに関する前駆体mRNAのオルタナティブスプライシングによって作製される。生じるmRNAはE1B-496RのN末端の79アミノ酸をコードしており、一方E1B-93RとE1B-84Rは独自のC末端を有しており、E1B-156RはE1B-496Rの77のC末端残基によって終了する。オルタナティブスプライシングは、Kelemen, O.、P. Convertini,ら.(2012). 「Function of alternative splicing.」Gene中で説明される。他のアデノウイルス血清型におけるE1Bアイソフォームは、Ad5に関して前に論じた長さと若干異なる長さを有し得ることは当業者には明らかであろう(例えば、Ad2におけるE1B-156Rの等価物は155アミノ酸長であり、したがって、しばしば155Rと呼ばれる)。本明細書中、アイソフォームの名称E1B-156R、E1B-93R、E1B-84R、E1B-176R及びE1B-496Rは、等価なアイソフォームにおける実際のアミノ酸数に関わらず、全てのアデノウイルスにおいてほぼ同じサイズの等価なアイソフォームを指す。
【００３１】
それぞれ各々のE1B-55k遺伝子に特異的な開始及び停止プライマーを使用したPCRを使用し、E1B-156Rに特異的なcDNAを増幅することによって、E1B-156Rアイソフォームが広範囲のアデノウイルス変異体に存在することが確認された(図14)。本発明者らの実験は、異なる属のそれぞれに由来する代表的ウイルスにおける類似したスプライシングパターンを示す(A-Ad12、B1-Ad3、B2-Ad11、C-Ad5、D-Ad37、E-Ad4及びF-Ad40)。実際、Adlwt及びAd57wtは同一のE1B-156Rタンパク質配列を有し、Ad2wtとAd6wtも同一の配列を有し、Ad5wtはこれら全てと若干異なる。これによって、合計5箇所の単一アミノ酸位置で、及び内部ポリアラニン区間の長さにおいて異なるサブファミリーC全体において、3個の異なるE1B-156Rタンパク質配列のみが生じる。したがって、本明細書中血清型Ad2及びAd5において実証された結果は、他のアデノウイルス変異体に反映されることが充分予想される。
【００３２】
いくつかの補完実験が実施され、E1B-156Rの増加は観察された腫瘍溶解指数(OI)の増加の(少なくとも部分的に)原因であり、したがってAd5-156Rの過剰発現は一般にアデノウイルスのOIの強力な増加をもたらすことが示されている。本明細書中の図11A、B及びC及び図12では、アデノウイルスタイプ5のE1B-156Rは、サブファミリーグループCにおいてOIの強力なエンハンサーであることが示される。さらに、Ad2wt由来のE1B-156R等価物はAd5wtのOIに正の効果を有することが示されており、この影響が特定の一アデノウイルス血清型に限られないと思われることを意味する。
【００３３】
本明細書中、ヒトAd5のE1B-156Rアイソフォームは、配列番号2に従うポリヌクレオチド配列及び配列番号3に従うポリペプチド配列を有する。本明細書中、496Rアイソフォームは、配列番号4に従うポリヌクレオチド配列及び配列番号5に従うポリポリペプチド配列を有する。本明細書中、E1B-93Rアイソフォームは、配列番号6に従うポリヌクレオチド配列及び配列番号7に従うポリペプチド配列を有する。本明細書中、E1B-84Rアイソフォームは、配列番号8に従うポリヌクレオチド配列及び配列番号9に従うポリペプチド配列を有する。ある程度の配列変異が天然に存在するウイルス変異体に存在することは、当業者によって理解され；したがって本発明は、言及される参照配列に記載された特定の配列とは異なっているが、一般的な配列アラインメントプログラム、例えばヌクレオチドBLAST(blastn)又はタンパク質BLAST(blastp)であり得るBLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)により計算した場合、これらの配列と80%、85%、90%、95%、98%、99%又はそれ以上相同であるか若しくは同一であるアイソフォーム配列を包含する。配列の1つが他の配列に対して十分高度な同一性又は類似性を有する場合、その用語を本明細書中で使用するとき、2つの配列は「相同」であると言われる。「同一性」は、アライメントされた配列中の任意の特定の位置において、ヌクレオチドが配列間で同一であることを示す。「類似性」は、アライメントされたポリペプチド配列中の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを示す。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる(Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing. Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993;Computer Analysis of Sequence Data、第1部、Griffin, A. M.、及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987;並びにSequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991)。
【００３４】
したがって、本発明の実施形態は、E1B-156Rアイソフォームが配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列及び配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し、E1B-496Rアイソフォームが配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列及び配列番号5と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し、E1B-93Rアイソフォームが配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列及び配列番号7と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し、且つE1B-84Rアイソフォームが配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列及び配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、変異体組換えアデノウイルスを含む。変異体E1B-156Rアイソフォーム配列の代表例を本明細書中に与える(図13)。Ad5E1B-156Rと等価な配列に含まれるのは、(Ad5に関して前に記載したように)図13中に示される配列と80%、85%、90%、95%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有する配列である。
【００３５】
操作処理によるアイソフォームレベルの調節
本発明に従い、E1B遺伝子から発現されたE1B遺伝子産物のスプライシングアイソフォームのレベル及び/又はタイプが改変され、結果としてウイルスは腫瘍溶解性となる。E1Bアイソフォームのレベル及び/又はタイプは、任意の手段、例えば選択位置でE1BアイソフォームmRNAを特異的に切断するよう設計したリボザイムを使用し、それによって機能性ポリペプチドへのmRNAの翻訳を妨げることによって調節することができる。代替の方法は当業者には明らかであるが、E1B遺伝子配列又はE1B-156Rをコードする形態の多数コピーの挿入；例えばプロモーター又はエンハンサー配列の調節によるE1B遺伝子発現又はE1B-156Rをコードする形態の制御の活性化；制御配列の挿入などが挙げられる。
【００３６】
本明細書中、本発明者らは、本発明による変異体アデノウイルスの特定の例として、この効果を達成するE1B遺伝子のスプライシング領域に1以上の突然変異を含むアデノウイルスを提供する。スプライセオソームによるスプライス部位認識はmRNAの二次構造によって影響を受けることが知られているので、そのmRNAの二次構造に影響を与えるE1B遺伝子の突然変異はE1Bアイソフォームのレベルとタイプも調節し得る。例えば突然変異は、E1B遺伝子のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を変化させることによりスプライス部位を除去し得、又はE1B遺伝子のポリヌクレオチド配列を変化させ元のポリペプチド配列を保持することによりスプライス部位を除去し得る。
【００３７】
一実施形態では、a)スプライスドナー部位1(SD1)；E1B-93Rスプライスアクセプター(SA1)；c)E1B-156Rスプライスアクセプター(SA2)；d)E1B-84Rスプライスアクセプター(SA3)：及び/又はe)スプライスドナー部位2(SD2)を含むスプライシング認識領域の1以上においてE1B遺伝子が突然変異するとき、この効果が達成され得る。
【００３８】
Ad5の例の場合、これらのスプライス部位は以下の位置に存在し、以下の配列を有する：SD1は、Ad5ゲノムの位置2251〜2255(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置2256〜2260及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置543〜547)に配列GTGGCを有する。E1B-93Rスプライスアクセプター(SA1)は、Ad5ゲノムの位置3218〜3222(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3213〜3217及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1500〜1504)に配列AACAGを有する。E1B-156Rスプライスアクセプター(SA2)は、Ad5ゲノムの位置3276〜3280(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3271〜3275及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1558〜1562)に配列TTGAGを有する。E1B-84Rスプライスアクセプター(SA3)は、Ad5ゲノムの位置3595〜3599(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3590〜3594及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1877〜1881)に配列TGCAGを有する。スプライスドナー部位2(SD2)は、Ad5ゲノムの位置3506〜3510(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3511〜3515及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1798〜1802)に配列GTACTを有する。他のヒト血清型における等価な位置の等価な部位は当業者には容易に明らかとなり、本発明の教示に組み込む。
【００３９】
したがって本発明の一態様は、E1B遺伝子スプライシング認識領域がAd5ゲノムにおける以下の位置：a)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3216(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)；b)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3218(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1505)；及び/又はc)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3221(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1508の1以上で突然変異した組換えアデノウイルスである。E1B遺伝子は、以下の突然変異：a)アデノウイルスAd5ゲノムにおけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)；b)アデノウイルスAd5ゲノムにおけるG3218A(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1505)；及び/又はc)アデノウイルスAd5ゲノムにおけるG3221A(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1508)の1以上を含有し得る。本明細書中、全ての点突然変異の位置はAd5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)に従いナンバリングする。
【００４０】
以下の表によって、Ad5ゲノムにおけるE1B遺伝子のスプライシング認識領域の配列及び位置を特定する。「Ad5ゲノム位置」及び「E1B遺伝子位置」は、スプライスドナー部位(SD1及びSD2)のすぐ上流、及びスプライスアクセプター部位(SA1、SA2及びSA3)のすぐ下流の5残基に相当する。
【００４１】
【表１】
0006388593.tif 000002
【００４２】
E1B遺伝子のスプライシング認識領域内のウイルス配列の突然変異は、a)E1B遺伝子のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列を変化させることによりスプライス部位を除去すること；又はb)E1B遺伝子のポリヌクレオチド配列を変化させることによりスプライス部位を除去すること及び元のポリペプチド配列を保持すること、のいずれかを含み得る。当業者が理解しているように、遺伝子コードには重複性があり、即ち、いくつかのアミノ酸は多数のコドンによってコードされている。スプライス部位の配列は、これらの部位でポリヌクレオチド配列がコードしているアミノ酸の代替コドンを使用して対応するアデノウイルスDNAを突然変異させることによって、転写されたE1BmRNAから除去することができる。したがって、生じる翻訳タンパク質はいかなるアミノ酸変化も含有しないことが好ましい。コドン表は遺伝子コードの重複性を示す。
【００４３】
【表２】
0006388593.tif 000003
【００４４】
好ましい実施形態では、E1B遺伝子における突然変異93Rスプライス部位の結果として、E1B-156Rアイソフォームの増加したレベルが達成される。
【００４５】
好ましい実施形態では、E1B遺伝子のスプライシング認識領域は、以下の位置の1以上：a)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3216(例えば、cagGAGG->cggGAGG)；b)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3218；及び/又はc)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3221で突然変異する。他のアデノウイルス血清型における等価な突然変異は当業者に明白であろう。
【００４６】
より好ましい実施形態では、E1B遺伝子は、それぞれE1B遺伝子(配列番号1)の位置1503、1505及び1508に相当する、以下の突然変異：a)A3216G(cagGAGG->cggGAGG)；b)G3218A；及び/又はc)G3221Aの1以上を含有する。他のアデノウイルス血清型における等価な突然変異は当業者に明白であろう。
【００４７】
アイソフォームのレベル
アデノウイルスゲノムの配列中に導入される任意の突然変異は、E1Bスプライシングアイソフォーム、E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、及びE1B-84Rの少なくとも1個(及びもしかすると2個、3個、又は4個全てのアイソフォーム)の割合を、同様の条件下で野生型中に存在するレベルに関して変化させるという効果を有するべきである。好ましくは、E1B-496Rアイソフォームの割合は野生型レベルと比較して減少するか、又はさらに完全に消失する。或いは、E1B-156Rアイソフォームの割合はE1B-496Rアイソフォームと比較して増大し、E1B-156Rアイソフォームの割合はE1B-93Rアイソフォームと比較して増加し、及び/又はE1B-156Rアイソフォームの割合はE1B-84Rアイソフォームと比較して増加する。これらの特定のアイソフォームのレベルの変化には腫瘍溶解を高める効果があり、これは腫瘍溶解指数の向上として表すこともできる。
【００４８】
E1B-156Rアイソフォームのレベルは、同等の野生型アデノウイルス配列におけるE1B-156Rと比較して増加し得る。本明細書中「増加」は、E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して少なくとも2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1,000倍又は10,000倍増加することを意味する。
【００４９】
本明細書中「減少」は、E1B-496Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して少なくとも2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1,000倍又は10,000倍減少することを意味する。
【００５０】
本明細書中「野生型レベル」は、E1B遺伝子参照配列(即ち配列番号1)に突然変異がない野生型アデノウイルスからの、これらのタンパク質の発現により明らかであるE1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、及びE1B-84Rアイソフォームのレベルを指す。例えば、突然変異Ad5E1B-156Rアイソフォームの割合は野生型Ad5アデノウイルスにおけるレベルと比較して増加し得、したがって突然変異アデノウイルスは癌細胞において腫瘍溶解効果を有する。突然変異Ad2E1B-156Rアイソフォームは野生型Ad2アデノウイルスにおけるレベルと比較して増加し得る。
【００５１】
本発明による好ましいウイルスは、E1B-93Rの低減又は阻害された発現を有し得、E1B-93Rを発現しないことが好ましい。本明細書において、「発現しない」とは、E1B-93R配列の検出可能レベルが等価な条件下での野生型アデノウイルスにおけるE1B-93R配列のレベルの50%、10%、1%未満、好ましくは0.1%未満、0.01%未満又はさらにそれ未満であることを意味する。これにはE1B-156Rの発現を増加させる効果がある。
【００５２】
好ましくは、E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、及びE1B-84Rアイソフォームタンパク質レベルの最適比は、野生型ウイルスに関する約5:70:10:15と比較して約67:0:0:33のラインに従い存在する。しかしながら、当業者が理解しているように、このタイプのおよその相対レベルは評価する感染サイクルのポイント、即ち初期/中期/後期に依存するため、それらを正確にすることは困難又は不可能である。この比は(非スプライシング状態の完全長RNAである)496Rを犠牲にしたより短いスプライス型のため変わる。特に、E1B-156RアイソフォームとE1B-496Rアイソフォームの好ましい比は2:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、1000:1又は10,000:1以上である。100:1以上の比が好ましい。
【００５３】
本明細書中、E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、又はE1B-84Rアイソフォームの「割合」への言及は：a)発現されるアイソフォームタンパク質のレベル；及び/又はb)生成されるアイソフォームmRNAのレベルを指す。
【００５４】
例えば核酸増幅、例えばPCR、RT-PCR、TaqManベースの方法、RNase保護、ノーザンブロッティング及びin situハイブリダイゼーション技法、及びこれらの方法の定量型バージョンなどの、ポリヌクレオチドの定量化のための、mRNAレベルを測定するための技法は当業者に知られている。mRNA発現レベルの変化は時間的、空間的又は定量的性質であり得る。各E1BアイソフォームmRNAのコピー数を計算し、参照、例えばβアクチン若しくはGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子又は特異的な「対象のアンプリコン」を有するプラスミドと比較することができる。
【００５５】
ポリペプチドレベルをモニタリングする場合、ラジオイムノアッセイ(RIA)、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析、FACS及び酵素結合免疫吸着(ELISA)アッセイを含めた、特異的ポリペプチドのレベルを決定することができる、任意のアッセイ技法を使用することができる。例えば、特定のスプライシングアイソフォームと特異的に結合する抗体を使用することができる。抗体は、修飾有り又は無しで使用することができ、抗体を、放射性同位体、蛍光分子若しくは酵素若しくは他のレポーター分子などの分析により検出可能な試薬と共有結合的に若しくは非共有結合的に連結することによって標識することができる。当技術分野で知られている広範囲のレポーター分子を使用することができる。
【００５６】
E1Bアイソフォーム
E1B-156R、E1B-93R、E1B-84Rアイソフォームに関してはほとんど知られていない。異なるE1BmRNAの生成は感染プロセス中で制御される。主に2.28kb型が感染初期に生成される一方で、より短くスプライシングされたmRNAの割合は経時的に増加し、E1B-84R転写産物は感染の後期で優勢状態になる。アイソフォームタンパク質発現はmRNAの転写パターンにほぼ従う(Chowら(1979)J Mol. Biol. 134:265〜303;Montellら(1984)Mol. Cell. Biol. 4:966〜972;Spectorら(1978)J. Mol. Biol. 126:395〜414;Virtanen及びPettersson(1985)J. Virol. 54:383〜391;Wilson及びDarnell(1981)J. Mol. Biol. 148:231〜251)。
【００５７】
N末端を介して様々なスプライセオタイプ(spliceotypes)が互いに異種及び同種と相互作用することができ、C末端は別のE1Bスプライセオタイプによって補うことができない特異的機能を有するはずであることが示されている。特異的スプライセオタイプの発現を欠くウイルスに感染させるとき、対応するスプライセオタイプの発現プラスミドによるコトランスフェクションによって生存能力消失を補うことができる。別のスプライセオタイプによるコトランスフェクションが消失を補うことはない。
【００５８】
突然変異アデノウイルス
以下の表は、いくつかの実験対照ウイルスと共に、本発明の教示の例として与えるいくつかの代表的なアデノウイルス突然変異体の詳細を要約する。
【００５９】
【表３】
0006388593.tif 000004
【００６０】
本明細書でIxovexウイルスと称されるアデノウイルスは、E1B-93Rの発現が低減又は阻害されており、好ましくはE1B-93Rを発現しない。「発現しない」とは、本明細書において、E1B-93R配列の検出可能レベルが等価な条件下での野生型アデノウイルスにおけるE1B-93R配列のレベルの50%、10%、1%未満、好ましくは0.1%未満、0.01%未満又はさらにそれ未満であることを意味する。これにはE1B-156Rの発現を増加させる効果がある。
【００６１】
さらに、このウイルスでは、完全長E1Bタンパク質E1B-496Rは不安定化される。「不安定化される」とは、突然変異のためにタンパク質が実質的に検出不可能になることを意味する。それにより496リーディングフレームからE1B-156R及びE1B-84Rのみを依然として発現したままにする。E1B-55kの不安定性はGablerら. 1998 J. Virol. ;及びGonzalez 2002、J. Virol中で論じられている。
【００６２】
H101と比較したIxovexの有効性は、E1B-496RとE1B-156Rがある程度重複した機能を有することを示唆する(Sieberら.(2007)J. Virol. 81(1):95〜105)。E1B-496RとE1B-156Rは多くの類似因子に結合することが分かっている。E1B-156Rは、E1B-496Rがその重要な機能の大部分を利用する結合パートナーであるE4orf6と結合することができる。興味深いことに、低い親和性ではあるが、E1B-156Rはp53とも結合することが分かっている。細胞形質転換実験において、E1B-156RはE1B55kを置換することができる。さらにE1B-156Rは、E1Aと一緒に過剰発現されるとin vivoモデルにおいて腫瘍を誘導する。具体的には、E1B-156Rスプライセオマー(spliceomer)は、E1B-496Rタンパク質とは別の細胞形質転換能力を有することがここで発見された。
【００６３】
本発明の利点は、上述した腫瘍関連効果を得るために、本発明によるウイルスは、E1B遺伝子全体の欠失を必要としないことである。
【００６４】
組換えウイルスを作製する方法
本発明は、任意に宿主細胞内でのウイルス生産に適したベクター内にコードされる、組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６５】
本発明は、組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【００６６】
本発明は、アデノウイルスを腫瘍溶解性にする方法も含む。このような方法は、等価な野生型アデノウイルスにおけるレベルと比較してE1B-156Rアイソフォームのレベルを増加させるようにE1B遺伝子の配列が改変されている、突然変異アデノウイルスを操作処理することを含む。アデノウイルスタイプは前に記載したタイプのいずれであってもよく、好ましくはサブファミリーグループC、即ち血清型1、2、5、6、又は57の1つのヒトアデノウイルスであり、さらにより好ましくは、用語アデノウイルスは2つのヒト血清型、Ad2とAd5に当てはまる。同様に突然変異は、前に記載したか又は本明細書中に例示する任意のものであってよい。特定の実施形態では、例えば一アデノウイルス変異体由来のE1B-156Rが別のアデノウイルス変異体において発現される、ハイブリッドウイルスを操作処理し得る。例えば、Ad2E1B-156RをAd5アデノウイルスにおいて発現させ得、Ad2E1B-156RをAd5に加えることにより腫瘍溶解活性が10倍増加することが本明細書中で示されている。
【００６７】
別のアデノウイルスにおいて突然変異を操作処理するのに適した技法は当業者に知られている。好ましい方法は、広く使用されているpShuttleシステム(Agilent Technologies)を使用すること、又はpSuperShuttleシステム(Ingemarsdotter, C. K.、S. K. Baird、C. M. Connell、D. Oberg、G. Hallden、及びI. A. McNeish. 2010. Low-dose paclitaxel synergizes with oncolytic adenoviruses via mitotic slippage and apoptosis in ovarian cancer. Oncogene 29:6051〜6063参照)を使用したDr. Oberg(IXOvexの発明者でありIXOgenの委員会メンバーである)により開発された方法の使用であり得る。これによって、アデノウイルスゲノムの末端領域に限られるが、pShuttleが不可能なアデノウイルス内のあらゆる場所における任意の配列の挿入又は突然変異が可能になる。手短には、対象の領域の隣接配列(左アームと右アーム)を、抗生物質選択遺伝子(ASG)の各側でpSuperShuttleプラスミドにクローニングすることができる。何らかの種類の突然変異(置換、欠失又は付加)が望ましい場合、それを一方のアームに組み込むことができる。対象の遺伝子又は完全発現カセットをウイルスに挿入するため、ASGの各側に広範囲のマルチクローニングサイトを使用することができる。完全pSuperShuttle構築物を配列決定したとき、それを相同組換えによりウイルスと融合させる準備が整う。挿入したASGにより陽性選択が可能になる。ASGは消化除去され、独自の制限酵素部位の形で小さな傷痕が残り、これはウイルスの後の修飾において使用することができる。この技法に関する他の適切な変形は当業者に知られている。
【００６８】
アデノウイルスE1B-55K突然変異体の構築
アデノウイルス突然変異体を構築するための方法は当技術分野で一般に知られている。Mittal(1993)Virus Res.、28:67〜90及びHermistonら、Methods in Molecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols(1999)編、Wold、Humana Pressを参照されたい。さらに、アデノウイルス5のゲノムはNCBI参照配列:AC_000008.1として登録されており、このウイルスは、受託番号:VR-1516の下、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Md.、U.S.Aから入手可能である。
【００６９】
一般に、アデノウイルスベクターの構築は、アデノウイルスゲノム、好ましくは標準技法を使用したプラスミドカセットにおけるAd5ゲノムの所望領域の初期欠失又は修飾を含む。
【００７０】
アデノウイルス突然変異体を構築するために使用されるいくつかの材料及び方法が、Hankeら.(1990)Virology、177:437〜444及びBettら(1993)J. Virol. 67:5911〜5921により、並びにPCT/CA96/00375中に記載されている。アデノウイルス突然変異体を構築するために使用される多くの材料は商業的に提供されている。Hermistonら、Methods in Molecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols(1999)編. Wold、Humana Pressも参照されたい。他の詳細は本明細書中で提供する。
【００７１】
本明細書に記載される実験を実施するために使用した細胞系は、承認された寄託機関から容易に入手することができる。例えば、以下の細胞系：H1299、FaDu、H460、A549、HeLa、Hek293、JH293及びNHBEを本明細書で使用し細胞毒性を評価した。
【００７２】
本発明のアデノウイルスE1B遺伝子突然変異体を構築するのに好ましい手順は、本明細書で言及する十分確立された分子生物学の技法、又はこれらの技法の改変型を使用して、プラスミドカセットにおいてアデノウイルスゲノムに部位特異的突然変異を作製することである。様々な材料及び方法を使用して、これを実現することができる。
【００７３】
癌を治療する方法
本発明は、癌細胞において腫瘍溶解効果をもたらす組換えアデノウイルスを提供する。癌細胞は腫瘍性細胞であり得る。本発明は、腫瘍性細胞により特徴付けられる癌を治療する新規の方法も提供する。腫瘍性細胞は、好ましくはp53機能を実質的に欠き得る(p53(-))。このような方法は：
a)E1B遺伝子に突然変異を有する本発明による組換えアデノウイルスの用量を、治療を必要とする患者に投与すること；
b)前記癌の腫瘍性細胞に組換えアデノウイルスが感染するのに十分な時間を与えること、ここで該突然変異アデノウイルスは非腫瘍細胞と比較して癌細胞に選択的な腫瘍溶解効果を有する；及び
c)任意にさらなる用量の組換えアデノウイルスを投与すること
を含み得る。
【００７４】
癌細胞又は腫瘍性細胞はp53機能を実質的に欠いていてもよい。
【００７５】
本発明は、癌を有する患者の治療における治療剤としての使用のための組換えアデノウイルスを提供する。好ましくは、癌は腫瘍性細胞により特徴付けられる。好ましくは、これらの腫瘍性細胞はp53機能を実質的に欠く。
【００７６】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを含む組成物も提供する。
【００７７】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルスを含む医薬組成物を提供する。
【００７８】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルスと薬学的に許容される担体を組合せることを含む、医薬組成物を作製するための方法も提供する。
【００７９】
組成物は化学療法剤をさらに含むことができる。
【００８０】
本発明は、非腫瘍細胞において実質的に複製欠陥があり腫瘍性細胞において少なくとも部分的な複製表現型を示す組換えアデノウイルスを腫瘍性細胞に感染させることにより、腫瘍性細胞を除去するためのいくつかの新規な方法及び組成物を提供する。腫瘍性細胞と非腫瘍細胞における本発明のアデノウイルス構築物の複製表現型の違いは、ウイルスベースの癌療法の生物学的ベースとなる。
【００８１】
p53機能を欠く腫瘍性細胞の亜集団及び本質的に正常なp53機能を発現する非腫瘍細胞の亜集団を含む(混合細胞培養物、ヒト癌患者又は非ヒト哺乳動物対象などの)細胞集団は、感染条件(即ち、細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件)の下で、感染用量のE1B-p53(-)複製阻害アデノウイルスを含む組成物と接触させることが可能である。このような接触ステップは、細胞集団のE1B-p53(-)複製欠陥アデノウイルスによる感染をもたらす。この感染によって、p53機能を欠く腫瘍性細胞の亜集団を含む有意な割合の細胞において複製表現型の優先的発現が生じるが、本質的に正常なp53機能を有する非腫瘍細胞の亜集団における複製表現型の実質的発現は生じない。感染p53(-)細胞における複製表現型の発現は、細胞変性効果(CPE)、細胞溶解、アポトーシスなどによる細胞死をもたらし、又は同様に、細胞集団からの腫瘍性p53(-)細胞の選択的除去をもたらす。
【００８２】
突然変異ウイルスは複製能力があり、他の細胞に拡散し感染し得る突然変異ウイルスゲノムを含有する感染性ビリオンを形成することから、初期用量の突然変異ウイルスの抗腫瘍作用が増幅することが望ましい。
【００８３】
本明細書中、p53(-)腫瘍性細胞の選択的殺傷に適したE1B-p53(-)複製阻害アデノウイルス構築物は、前に記載した構築物である。
【００８４】
候補となる抗腫瘍性アデノウイルス突然変異体は、同等の腫瘍性細胞移植を有する未処置マウスと比較して、p53機能を欠く腫瘍性細胞の移植を有するnu/nuマウスにおいて腫瘍形成又は腫瘍性細胞負荷を低減するそれらの能力によって、さらに評価することができる。
【００８５】
抗腫瘍性複製欠陥アデノウイルス突然変異体は、腫瘍性疾患を有する患者への治療的、予防的、及び潜在的に診断的投与のために製剤化することができる。治療的又は予防的使用で、薬理学的有効用量の一種以上の抗腫瘍性複製阻害アデノウイルス突然変異体を含有する滅菌組成物を、腫瘍性状態を治療するため患者に投与する。薬学的に許容される担体又は賦形剤を、このような滅菌組成物において用いることが多い。様々な水溶液、例えば水、緩衝水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどを使用することができる。これらの溶液は滅菌状態であり、所望のアデノウイルスビリオン以外の粒子状物質を一般に含まない。組成物は、おおよその生理的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えばpH調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増大する賦形剤を含めることができる。
【００８６】
腫瘍性疾患の療法は、本発明の複製欠陥アデノウイルスを含む組成物を、患者又は対象へ投与することによって提供され得る。p53機能を欠く細胞を含む様々なヒト及び哺乳動物新生物は、複製阻害アデノウイルス構築物を用いて治療することができる。例えば(限定するものではないが)、気管支原性癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、肺腺癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、又はリンパ球性白血病を有するヒト患者又は非ヒト哺乳動物を、有効な抗腫瘍用量の適切な複製阻害アデノウイルスを投与することにより治療することができる。
【００８７】
感染アデノウイルス粒子の懸濁液を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、及び局所を含めた様々な経路により腫瘍性組織に施用することができる。1ml当たり約103〜1015以上のビリオン粒子(例えば1ml当たり約105〜1012以上のビリオン粒子、1ml当たり約107〜1010以上のビリオン粒子、又は1ml当たり約109のビリオン粒子)を含有する、アデノウイルス懸濁液、好ましくは水性懸濁液を、(例えば、気管支原性癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌又は喉頭癌を治療するための肺送達用の)ミストとして吸入させ得る。或いは、このような懸濁液は、腫瘍(例えば、気管支原性癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌)を治療するため腫瘍部位に直接塗布することもでき、又は(例えば、卵巣癌を治療するため腹腔内への、肝臓癌又は他の原発性非肝臓癌から肝臓への転移を治療するため門脈への)注入、又は腫瘍塊(例えば乳房腫瘍)への直接注射、浣腸(例えば結腸癌)、若しくはカテーテル(例えば膀胱癌)を含めた他の適切な経路によって投与することもできる。
【００８８】
複製阻害ウイルスはリポソーム又はイムノリポソーム送達により腫瘍性細胞に送達することもできる；このような送達は、腫瘍性細胞集団に存在する細胞表面の性質(例えば、イムノリポソーム中の免疫グロブリンと結合する細胞表面タンパク質の存在)に基づいて、腫瘍性細胞を選択的に標的化することができる。例えば、従来の方法によって、複製阻害アデノウイルスビリオンの懸濁液をミセルに封入しイムノリポソームを形成することができる(例えば、米国特許第5,043,164号、米国特許第4,957,735号、米国特許第4,925,661号、Connor及びHuang(1985)J. Cell Biol. 101:582;Lasic DD(1992)Nature 355:279;Novel Drug Delivery(1989)編.Prescott及びNimmo、Wiley、New York、並びにReddyら.(1992)J. Immunol. 148:1585を参照)。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原(例えば、CALLA、CEA)と特異的に結合する抗体を含むイムノリポソームを使用して、これらの細胞にビリオンを標的化することができる。
【００８９】
本発明の抗腫瘍性複製欠陥アデノウイルス又はそのカクテルを含有する組成物は、腫瘍性疾患の予防的及び/又は療法的処置のために投与することができる。療法適用では、特定腫瘍性疾患に既に罹患している患者に、その状態及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量の組成物を投与する。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」又は「有効量」と定義される。この使用に有効な量は、状態の重症度、患者の一般的状態、及び投与の経路に依存する。
【００９０】
予防適用では、抗腫瘍性複製阻害アデノウイルス又はそのカクテルを含有する組成物を、現在腫瘍性疾患状態にない患者に投与して、新生物の再発に対する患者の耐性を高めるか又は寛解期を延長する。このような量は、「予防有効量」と定義される。この用途では、ここでも正確な量は、患者の健康状態及び免疫の一般レベルに依存する。
【００９１】
組成物の一回又は複数回投与は、治療する医師により選択された用量レベル及びパターンで実施することができる。いかなる場合においても、医薬製剤は、患者を有効に治療するのに十分な本発明の抗腫瘍性複製阻害アデノウイルスの量を供給するべきである。
【００９２】
本発明の抗腫瘍性複製阻害アデノウイルス療法は、従来の化学療法などの他の抗腫瘍性プロトコールと組合せることができる。
【００９３】
一般
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」及び「からなる(consisting)」を包含する。例えば、Xを「含む」組成物は、排他的にXからなっていてもよいし、又は何か別のものを含んでいてもよく、例えばX+Yである。
【００９４】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物はYを完全に含まないものであり得る。必要に応じて、語句「実質的に」は本発明の定義から除かれ得る。
【００９５】
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者のスキルの範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の従来の技法を用いる。
【００９６】
最も一般的な分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の技法は、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(2001)Cold Habor-Laboratory Press、Cold Spring Habor、N. Y.又はAusubelら、Current protocols in molecular biology(1990)John Wiley and Sons、N. Y.において見ることができる。
【００９７】
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加している組換えアデノウイルスであって、癌細胞において腫瘍溶解効果を有する、前記アデノウイルス。
２．E1B-156Rアイソフォームの割合が野生型レベルと比較して増加するような突然変異を有する、上記１に記載の組換えアデノウイルス。
３．突然変異が、アデノウイルスのE1B遺伝子の配列に存在する、上記１又は２に記載の組換えアデノウイルス。
４．E1B遺伝子が：
a）Ad5ゲノムの位置2251〜2255(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置2256〜2260及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置543〜547)に配列GTGGCを有するスプライスドナー部位1（SD1）；
b）Ad5ゲノムの位置3218〜3222(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3213〜3217及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1500〜1504)に配列AACAGを有するE1B-93Rスプライスアクセプター(SA1)；
c）Ad5ゲノムの位置3276〜3280(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3271〜3275及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1558〜1562)に配列TTGAGを有するE1B-156Rスプライスアクセプター(SA2)；
d）Ad5ゲノムの位置3595〜3599(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3590〜3594及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1877〜1881)に配列TGCAGを有するE1B-84Rスプライスアクセプター(SA3)；及び／又は
e）Ad5ゲノムの位置3506〜3510(Ad5ゲノム受託番号AC_000008.1(配列番号41)の位置3511〜3515及びE1B遺伝子(配列番号1)の位置1798〜1802)に配列GTACTを有するスプライスドナー部位2(SD2)
を含むスプライシング認識領域の1以上において突然変異している、上記１〜３のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
５．E1B遺伝子スプライシング認識領域が以下の位置：
a)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3216(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)；
b)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3218 (E1B遺伝子(配列番号1)の位置1505)；及び/又は
c)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)のヌクレオチド3221(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1508)
の1以上において突然変異している、上記１〜４のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
６．突然変異が、
a）E1B遺伝子のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を変化させることによりスプライス部位を除去するか；又は
b）E1B遺伝子のポリヌクレオチド配列を変化させることによりスプライス部位を除去し、元のポリペプチド配列を保持する、
上記１〜５のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
７．E1B遺伝子が、以下の突然変異：
a)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるA3216G(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1503)；
b)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるG3218A(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1505)；及び/又は
c)アデノウイルスAd5ゲノム(受託番号AC_000008.1)(配列番号41)におけるG3221A(E1B遺伝子(配列番号1)の位置1508)
の1以上を含有する、上記１〜６のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
８．アデノウイルスがアデノウイルス血清型Ad5である、上記１〜７のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
９．アデノウイルスがアデノウイルス血清型Ad5pTG3602株である、上記１〜８のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１０．E1B遺伝子が、配列番号1に従うポリヌクレオチド配列を有する、上記１〜９のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１１．E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-496Rアイソフォームと比較して増加している、上記１〜１０のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１２．E1B-496Rアイソフォームの割合が、野生型レベルと比較して減少している、上記１〜１１のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１３．E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-93Rアイソフォームと比較して増加している、上記１〜１２のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１４．E1B-156Rアイソフォームの割合が、E1B-84Rアイソフォームと比較して増加している、上記１〜１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１５．E1B-156Rアイソフォームの割合が、少なくとも2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍又は10,000倍増加している、上記１〜１４のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１６．E1B-496Rアイソフォームの割合が、少なくとも2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍又は10,000倍減少している、上記１〜１５のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１７．E1B-156R、E1B-496R、E1B-93R、又はE1B-84Rアイソフォームの割合が：
a)発現されるアイソフォームタンパク質のレベル；及び/又は
b)転写されるアイソフォームmRNAのレベルを指す、上記１〜１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１８．E1B-156Rアイソフォームが配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、上記１〜１７のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
１９．E1B-156Rアイソフォームが配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、上記１〜１８のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２０．E1B-496Rアイソフォームが配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、上記１〜１９のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２１．E1B-496Rアイソフォームが配列番号5と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、上記１〜２０のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２２．E1B-93Rアイソフォームが配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、上記１〜２１のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２３．E1B-93Rアイソフォームが配列番号7と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、上記１〜２２のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２４．E1B-84Rアイソフォームが配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する、上記１〜２３のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２５．E1B-84Rアイソフォームが配列番号9と少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、上記１〜２４のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２６．癌細胞が、p53機能を実質的に欠く腫瘍性細胞である、上記１〜２５のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２７．腫瘍溶解効果が：
a)細胞のウイルス感染；
b)(p53欠損)癌細胞における優先的ウイルス媒介細胞溶解、及びさらなる感染事象に関するウイルス粒子の放出をもたらす、(p53欠損)癌細胞におけるウイルスゲノムの選択的複製を含む、上記１〜２６のいずれかに記載の組換えアデノウイルス。
２８．任意に宿主細胞内でのアデノウイルス生産に適したベクターである、上記１〜２７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチド。
２９．上記１〜２７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
３０．治療を必要とする患者において、p53機能を実質的に欠く腫瘍性細胞により特徴付けられる癌を治療する方法であって：
a)上記１〜２７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの用量を投与すること；
b)前記癌の腫瘍性細胞に前記組換えアデノウイルスが感染するのに十分な時間を与えること；及び
c)任意にさらなる用量の組換えアデノウイルスを投与すること
を含む、前記方法。
３１．治療剤としての使用のための、上記１〜２７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスを含む組成物。
３２．p53機能を実質的に欠く腫瘍性細胞により特徴付けられる癌を有する患者の治療における使用のための、上記１〜２７のいずれかに記載の組換えアデノウイルスを含む組成物。
３３．等価な野生型アデノウイルスにおけるレベルと比較してE1B-156Rアイソフォームのレベルを増加させるようにE1B遺伝子の配列を改変することによって、アデノウイルスを腫瘍溶解性にする方法。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】腫瘍溶解性ウイルスの概略図。
【図２】代替E1B遺伝子産物を示すE1Bスプライスマップ。完全長E1B転写産物はE1B-176R及びE1B-496Rオープンリーディングフレーム(ORF)を有する。E1B-496RのORFにおける代替スプライシングによって、別の3個のタンパク質、E1B-93R、E1B-156R及びE1B-84Rが発現される。より小さいタンパク質は、E1B-496RとインフレームでスプライシングされるE1B-156R以外、カルボキシ末端は異なるがE1B-496Rと共通の79アミノ末端アミノ酸を有する。
【図３】IxovexにおけるE1B-55kタンパク質のアミノ酸変化がその発現を阻害する。A549細胞に5pfu/細胞でそれぞれのウイルスを感染させ、全細胞溶解物を感染後48時間(hpi)で回収した。ポリクローナルα-カプシドタンパク質Ab6982抗体(上図)、モノクローナルα-E1B-55k抗体2A6(中央図)、及びローディング対照としてモノクローナルα-アクチン抗体I-19-SC(下図)で染色したウエスタンブロットを示す。
【図４】IxovexにおけるE1B55kオープンリーディングフレームの点突然変異が93Rスプライスアクセプターへのスプライシングを阻害する。A549細胞に5pfu/細胞でそれぞれのウイルスを感染させ、全RNAを48hpiで回収した。cDNAはオリゴ-dTプライマーを使用して作製した。PCRは、55kスプライスドナー上流の共通センスプライマー、及びそれぞれのスプライスアクセプター下流の特異的プライマーを使用して実施した。PCR反応は、GelRedで染色した2%アガロースTBEゲルで実施した。
【図５】Ixovexはp53の分解の誘導において阻害される。A549細胞に5pfu/細胞でそれぞれのウイルスを感染させ、細胞溶解物を48hpiで回収した。モノクローナルα-p53抗体#9282CS(上図)、及びローディング対照としてモノクローナルα-アクチン抗体I-19-SC(下図)で染色したウエスタンブロットを示す。
【図６】癌細胞株における複製アッセイ。それぞれの細胞株に、5pfu/細胞でそれぞれのウイルスを感染させた。細胞と培地は24、48及び72hpiで採取し、限界希釈アッセイによって分析した。CPEは10日後に視覚的に示され、材料及び方法中に記載したようにTCID50(pfu/細胞)の結果を計算した。
【図７】癌細胞におけるIxovex、Ad5野生型及びOnyx-015ウイルスの相対細胞毒性。それぞれの細胞株は5倍希釈系において示したウイルスに感染させた。細胞毒性はMTSアッセイを使用して感染後6日(dpi)で測定し、EC50値を計算した。
【図８】正常ヒト気管支上皮細胞における複製効率。それぞれの細胞株に、5pfu/細胞でそれぞれのウイルスを感染させた。細胞と培地は24、48及び72hpiで採取し、限界希釈アッセイによって分析した。CPEは10日後に視覚的に示され、本明細書中に記載したようにTCID50(pfu/細胞)の結果を計算した。
【図９】非修飾ウイルス(Ad5野生型)と比較して、Ixovexは、正常細胞に対して500倍よりも低い細胞毒性を示す。Ad5野生型に関する細胞毒性の阻害倍数(下行)及び未処理EC50値(上行)を示す。細胞毒性はMTSアッセイを使用して6dpiで測定した。
【図１０】E1B-156Rタンパク質はIxovexによって過剰発現される。ウエスタンブロットは、10pfu/細胞のIxovex又はAd5野生型を感染させたH1299細胞から48hpiで抽出した全タンパク質で実施した。
【図１１Ａ】Ad5-及びAd2-156Rタンパク質が、正常細胞と比較し癌細胞において腫瘍溶解指数(OI)を高めた。A)Ad5-及びAd2-156R発現プラスミドを、Ad5野生型感染HeLa細胞及びNHBE細胞にトランスフェクトした。平行して、別の癌細胞株(H460、大細胞肺癌)をAd5-156R補足実験中に含めた。B)Ad5-156RをONYX-015感染細胞にトランスフェクトした。C)Ad5-156RをAd2野生型感染細胞にトランスフェクトした。細胞は2.5pfu/細胞で感染させ、各E1B-156R用の発現プラスミドを補足又は相互補足した。示したhpiにおいて、Burst(ウイルス複製)アッセイを用いてサンプルを分析した。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続き。
【図１１Ｃ】図１１Ａの続き。
【図１２】(72hpiで回収したH460のデータポイント以外の)図11A〜Cに関する48hpiのデータポイント、及びOI=((a/b)/(c/d))、a=pfu/細胞、癌細胞+156R、b=pfu/細胞、正常細胞+156R、c=pfu/細胞、癌細胞-156R、d=pfu/細胞、正常細胞-156Rである腫瘍溶解指数の計算。
【図１３】血清型のサブファミリーB、D及びEに関する配列とアライメントされたアデノウイルスサブファミリーCの血清型に関するE1B-156Rのタンパク質配列。網掛け部分：グループC内の類似性。ギャップは、それらが異なるところを示す。Ad5における下線：サブファミリーC中の他のE1B-156Rタンパク質からAd5-156Rを選び出すアミノ酸。
【図１４】Ad2、Ad4及びAd11においてE1B-156Rに相当する増幅cDNAバンドを示すDNAゲル。ゲル中の全てのバンドはTopo-II PCR Bluntベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、示されたバンドが各それぞれのウイルスのE1B-156Rに相当したことを確認した。
【実施例】
【００９９】
材料及び方法
ウイルス構築
アデノウイルス血清型5(Ad5)のヌクレオチド1〜5055を、Ad5start(配列番号15-ccacctcgagttaattaacatcatcaataatataccttattttg)及びAd5wt5055as(配列番号16-gtgggtttaaacggatttggtcagggaaaacatg)オリゴヌクレオチドを使用してPhusion PFUポリメラーゼを用いてPCR増幅した。CsCl精製Ad5バッチから抽出したウイルスゲノムDNAを鋳型として使用した。制限酵素NotI及びPmeI(NEB)を使用してPCR産物をpShuttle(Stratagene)にクローニングした。pShuttle-5055においてE1B93Rスプライス部位突然変異を生成するため、オリゴヌクレオチドMut93Rs(配列番号17-ccttgcatttgggtaatagaagaggagtgttcctaccttaccaatg)及びMut93Ras(配列番号18-cattggtaaggtaggaacactcctcttctattacccaaatgcaagg)を、製造者の説明書に従いPCR Mutagenesis XL反応(Stratagene)で使用した。クローンをスクリーニングし配列決定用に送った。PmeI(NEB)を使用して5μgの適正なクローンを直鎖状にし、フェノール/クロロホルム処置し、エタノール沈殿させた。200ngを100ngのpTG3602プラスミドと一つに混合した。混合物をBJ5183セル(Stratagene)にエレクトロポレーションし、カナマイシン(25μg/ml)含有寒天培地プレートに播種した。クラッキングゲルでのサイズ排除によりクローンをスクリーニングした。手短には、1ml細菌培養物のペレットを50μlの水に再懸濁し、50μlのフェノール/クロロホルムで処置した。混合物を13,000rpmで1分間遠心分離し水相を回収した。細菌由来の全てのDNAとRNAを含有する水相は、RNaseHを含有するDNAローディングダイで5分間処置し、次いで0.7%アガロースゲルで泳動した。選択されたクローンからDNAを調製し(Qiagen Maxi Prepキット)、配列決定し正しい突然変異が導入されたことを確認した。5μgの正しいpT3602突然変異体をPacIで消化しウイルスゲノムを切り出し、フェノール/クロロホルム処置し、エタノール沈殿させた。2μgの消化プラスミドを、Transfectene(Biorad)を使用し6ウェルプレートにおいて、10e5Hek293細胞にトランスフェクトした。5日後に細胞を回収し、3回凍結/解凍させ、感染細胞溶解物を増やすためA549細胞で80%サブコンフルエントなT175容器に入れた。
【０１００】
CF-10(Thermo Scientific)にHek293細胞を播種し、80%のコンフルエンシーで細胞溶解物の3分の1を感染させた。3日後にCF-10を回収した。細胞ペレットは3回凍結/解凍し、遠心分離して溶解物を透明にし、1.25/1.4g/ml CsCl勾配に供し、超遠心分離器で25,000rpmで遠心分離した。ウイルスバンドを21Gシリンジで回収し、1.35g/ml CsClカラムに分配した。カラムは一晩40,000rpmで遠心分離し、ウイルスバンドを21Gシリンジで回収した。抽出したウイルスはSlide-A-Lyzer(Thermo Scientific)カセットに注入し、50mMのTRIS、pH7.8、150mMのNaCl、1mMのMgCl2、10%グリセロールに4℃で一晩透析した。その後、50%組織培養感染量(TCID50)(pfu/ml)により評価されるウイルス活性を、以下のウイルス複製の節で記載するように、JH293細胞を使用することにより決定した。ウイルスのDNAは少量のアリコートから精製し、1μl当たりのウイルスゲノムの数(粒子/μl)は分光光度計を使用して決定した。本明細書で使用した全てのウイルスの粒子と活性の比は20未満であった。Ixo-ctrlウイルスは、アデノウイルス血清型5pTG3602株由来の野生型クローンである。
【０１０１】
平行して、製造者の推奨に従いPCR Mutagenesis XLキット(Stratagene)を使用して、E1B-496Rタンパク質のアミノ酸配列を変えずに全てのスプライス部位が個別に突然変異した、pShuttleプラスミドを作製した。
【０１０２】
【表４】
0006388593.tif 000005
【０１０３】
これら全てのpShuttleプラスミドを相同組換えで使用しウイルスの多くのセットを作製した(表1参照)。
【０１０４】
【表５】
0006388593.tif 000006
【０１０５】
組織培養
全ての細胞を37℃及び5%CO2で培養し、マイコプラズマ汚染に関して定期的に試験した。この試験で使用した細胞系を以下に列挙する。
【０１０６】
【表６】
0006388593.tif 000007
【０１０７】
細胞毒性アッセイ
本発明者らは、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)アッセイ(CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay;Promega、Wisconsin、USA)を使用して、Ixovexと対照ウイルスの細胞毒性を評価した。第6日において細胞をコンフルエントにするため、(増殖率に応じて)1,000〜4,000細胞/ウェルを、96ウェルプレートにおいて、5%FCS及び90μl培地中に播種した。18時間後、(5%FCS及び10μl培地中の)ウイルスを、(細胞のみでウイルスを含まない)陽性対照及び(培地のみで細胞を含まない)陰性対照と一緒に、10,000ウイルス粒子(vp)/細胞から開始して1:10の連続希釈を9回行って加えた。
【０１０８】
感染後第6日で、MTSアッセイを使用して生存を決定した。MTSはフェナジンメトサルフェート(PMS)と20:1の割合で混合し細胞に加えた。3時間のインキュベーション後、Opsys MR96ウェルμプレートリーダー及びRevelation Quicklink 4.04ソフトウエア(Dynex Technologies、Virginia、USA)を使用して、490nmで吸光度を測定した。それぞれの希釈ごとに値を確定し、陰性対照(細胞死100%)、及び陽性対照(細胞死0%)と比較した。EC50値(50%の細胞を殺傷するための半最大有効濃度、EC50)は、以下の式を利用して、GraphPad Prism(GraphPadソフトウエア、California、USA)を使用し非線形回帰分析(S字状用量応答曲線)により計算した。
Y=最小値+(最大値-最小値)/1+10[log10EC50-X])xHill slope]
Yはレスポンス値であり、S字状曲線形式で「最小値」から始まり「最大値」に至る。
全ての実験は三連で実施された。
【０１０９】
ウイルス複製アッセイ
細胞を感染24時間前に、10%FCSを含む培地中で6ウェルプレートに播種した。100vp/細胞を使用して、2%FCS培地において80%コンフルエントな細胞を感染させた。感染2時間後、培地を10%FCS培地(一次感染)と交換した。(それぞれの図中に示した)感染後の時間で、(かき取りによって)培地及び細胞を回収し、それぞれ液体窒素及び37℃で、3回凍結及び解凍し、使用するまで-80℃で保存した。JH293細胞は5%FCSを含む200μl培地中に、96ウェルプレートにおいて、ウェル当たり10,000細胞で播種した。TCID50の第一行では、異なるサンプルの初回希釈はhpiとウイルスに応じて非希釈〜1:1000であり、一次感染からのこれらの希釈を使用しJH293細胞を感染させた。最終行は陰性対照として非感染状態にした。第9日と第11日の間に、細胞変性効果(CPE)に関してプレートを調べた。50%組織培養感染量(TCID50)とpfu/細胞の数値(感染日の細胞数)を、Reed-Muench累積法を使用して計算した。以下の例を参照されたい。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
pfu/細胞に関しては、6ウェルプレートの各ウェルに加えたウイルスの体積(2ml)を前述の値にかけて、感染日の細胞数(例えば2.4×105)で割る。(2.27×107×2)/2.4×105=189pfu/細胞。
【０１１２】
ウエスタンブロット
A549細胞又はH1299細胞を5pfu/細胞で感染させ、RIPAバッファーを使用し感染後48時間で全タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はBradford試薬を使用して決定した。各サンプルから20μgの全タンパク質を10%PAGEゲルに供した。タンパク質はウェットブロッティングによりPVDF(BioRad)膜に移した。膜は1時間3%BSATBS溶液を使用してブロッキングした。使用した一次抗体は、Adカプシドタンパク質(AbCam-6982)、E1B-55k(2A6、Sarnow、Sullivan Levine 1982、希釈率1:500)、EIA(Santa cruz、M73)、アクチン(Santa cruz、I-19)及びp53(Cell Signalling、#9282)であった。全ての抗体を推奨通りに1.5%BSATBSに希釈した。膜を一次抗体と共に4℃で15〜24時間インキュベートし、その後それらを1×TBS3%Tween-20で10分間3回洗浄した。それぞれの一次抗体に対するHRP結合二次抗体を1.5%BSATBSで1:5000に希釈し1時間膜に適用した。抗体希釈を除去した後、膜を1×TBS3%Tween-20で10分間3回洗浄した。それぞれの膜を1分間ECL Plus(GE、RPN2132)に曝した。プラスチックホイルで包んだ後、膜をHyperfilm(GE)と共にHypercassette中に置き、選択した時間間隔でフィルムを現像した。或いは、LI-CORからのIRDyesで標識した二次抗体を使用した。分析はOdyssey Imagerを使用して実施した。
【０１１３】
RT-PCR
A549細胞に5pfu/細胞の各ウイルスを感染させ、Trizol(Invitrogen)を使用して感染後48時間で全RNAを抽出した。RNAはDNAse処理(NEB、DNaseI)、フェノール/クロロホルム処理し、エタノール沈殿させた。1μgの全RNAを使用して、製造者の推奨に従ってcDNAを合成した(Invitrogen、SuoerScript(登録商標)III)。PCR(NEB Taq DNAポリメラーゼ)反応において、共通センスオリゴヌクレオチド(55kセンス、配列番号29-gcctgctactgttgtcttccg)、及び以下のアンチセンスヌクレオチド、93Ras、配列番号30-cacccccctcctgtacaac、156Ras、配列番号31-gacatgctctcgggctgtacaac又は84Ras、配列番号32 caaacgagttggtgctcatgのいずれかと共にcDNAを鋳型として使用した。それぞれのアンプリコン長は約200ヌクレオチドであった。PCR反応を20サイクル後に停止させ、2%アガロースゲル上にアリコートを適用した。
【０１１４】
アデノウイルスE1B-93Rスプライス部位アクセプター突然変異体の作製
Ad5野生型ゲノム(NCBI参照配列:AC_000008.1)の最初の5000ヌクレオチドをPCR増幅し(プライマーAd5wt5000start、配列番号15-ccacctcgagttaattaaCATCATCAATAATATACCTTATTTTG、Ad5wt5000as、配列番号16-gtgggtttaaacGGATTTGGTCAGGGAAAACATG)、アガロースゲルで精製した。精製した産物を制限酵素NotI及びPmeI(New England Biolabs)で消化し、pShuttleプラスミド(Stratagene)にクローニングし、相同組換え用に既存の左アームを置換し、Agilent Technologies、AdEasy、http://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?Page Type=Product&SubPage Type=ProductData&PageID=592と同様にpShuttle-LAを作成した。このプラスミドを、BJ5183組換えコンピテントセルを使用するそのAdEasyシステムにおいてAgilent Technologiesにより推奨されるように、完全Ad5野生型ゲノムを含有するプラスミドpTG3602と再度結合させた。組換え後、BJ5183細菌を、カナマイシンを含有する寒天培地プレートに播種した。単種コロニーを採取し増殖させ、大培養物からDNAを調製した。それぞれのDNA調製物を、正しい組換え事象に関してスクリーニングした。ゲノムの消化はPacI(New England Biolabs)を用いて実施した。正しいクローンを寒天培地プレートで増殖させた後、ゲノムを消化除去し、製造者の説明書に従いTransfectinトランスフェクション試薬(Bio-Rad)を使用しHek293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後4日で、ウイルス溶解物を回収した。[培地を一緒にかき取ることにより細胞を回収し、15mlファルコンチューブ中に回収した。サンプルを3回凍結/解凍し、Hek293細胞で約90%コンフルエントなT175容器に感染させるために用いた。3日後、細胞及び培地を回収し、3回凍結/解凍し]、次いでそれらを使用してCF-10s(Nunc)と称されるウイルス製造所を感染させた。これらは40のT175容器に近い表面積、即ち7000cm2を有し、多数のウイルスを生産するための多数の細胞の増殖に用いられる。手短には、4つのコンフルエントなT175容器の細胞を1Lの5%FCSDMEM培地、CF10に移した。25ml(1/40)の細胞含有培地を、増殖対照として新たなT175に入れた。T175が90%コンフルエントであった日、CF10は同じ段階にあった。次いで細胞溶解物の半分をCF10に注入し、均一に分布するように培地を移動させた。3日後CF10を振とうし、ウイルス感染のためまだ浮遊し始めていなかった細胞を取り除いた。CF10を空の状態にし、細胞を遠心分離し、PBS中で洗浄し最後に50mMのTris-HCl、pH7.8中に懸濁した。精製は、塩化セシウムによるバンド固定により実施された。次いでウイルスを精製し、力価(粒子)及び活性(pfu)に関して分析した。全ウイルスに関するvp:pfu単位の比(vp:pfu単位)は10と20の間であった。ウイルスクローンの1つの配列決定から、それがE1B-93Rスプライスアクセプター部位に点突然変異があったことが示された。
【０１１５】
Ad2、Ad4及びAd11におけるE1B-156Rの存在の確認
A549細胞に5pfu/細胞の各ウイルスを感染させた。48hpiで全RNAを抽出し、Superscript-II(Invitrogen)及びランダムヘキサマーを使用して1μgをcDNAに変換した。全50mlの1μlを、血清型特異的プライマー(Ad2センス、配列番号33-ctcgaggaattcgccaccatggagcgaagaaacccatc、Ad2アンチセンス、配列番号34-cacttctagatcaatctgtatcttcatcgctag、Ad4センス、配列番号35-ggagatttggacggtcttgg、Ad4アンチセンス、配列番号36-ggatcccatcacattttgacg、Ad11センス、配列番号37-catccatggaggtttgggc、Ad11アンチセンス、配列番号38-ccttaaaagaagcgtttccac)を用いたPCRにおける鋳型として使用した。図14は、cDNAバンドを示し、E1B-156RのcDNAに相当するバンドを強調するDNAゲルを示す。ゲル上の全てのバンドを精製し(NucleoSpin Gel及びPCR Clean-up、Macherey-Nagel)、Topo-II PCR Bluntベクター(Invitrogen)にクローニングした。クローンを配列決定用に送った。Ad2-156RとAd5-156Rを、EcoRIとXbaIを使用してp3xFlag-CMV-14ベクターにクローニングした。
【０１１６】
E1B-156Rタンパク質が腫瘍溶解指数を高めるかどうかの試験
Ad2とAd5由来のE1B-156Rに関するcDNAを、前述したように、それぞれ個々のE1B-55kに特異的な開始及び停止プライマーを使用してPCR増幅した。プライマーは、開始プライマーにEcoRI部位及び停止プライマーにXbaI部位を含んでいた。PCR断片を該2つの酵素で消化しp3xFlag-CMV-14(Sigma-Aldrich)に連結させた。正確な挿入のため構築物を配列決定した。
【０１１７】
癌細胞(HelaとH460)及び正常細胞(NHBE)を2μgのAd2-156R又はAd5-156R発現プラスミド(又は対照プラスミド)でトランスフェクトし、Ad5野生型、ONYX-015又はAd2野生型を同時感染させた。トランスフェクションは、製造者の説明書に従いJetPRIME試薬(POLYPlus)を使用し実施された。ウイルスによる感染を前述したようにして実施した。手短には、6ウェルプレート中のそれぞれのウェルに、2μlのJetPRIME試薬と200μlのトランスフェクション緩衝液を用いてトランスフェクトした。対照ウェルは、pUC19の型の2μgの挿入プラスミドでトランスフェクトした。
【０１１８】
ウイルスの複製は、上記アッセイを使用して、感染後の様々なタイムポイントで測定した。データは図11A、B及びC中に示す。腫瘍溶解指数は図12中に示すように計算した。
【０１１９】
結果
E1B-55kタンパク質が消失する
Ad5野生型、Onyx-015、Ixovex及びIxo-ctrl感染A549細胞由来の全タンパク質溶解物によって、48hpiで全てのウイルスが後期タンパク質を発現した(図3、上図)、即ちアデノウイルス複製の後期に到達したことが示された。IxovexウイルスとOnyx-015ウイルスの両方が、Ad5野生型とIxo-ctrlより少量の後期タンパク質を発現し、これはA549細胞に関して図6中で見られた複製効率の低下を反映していた。E1B-55kタンパク質の位置400でアミノ酸をアルギニンからグリシンに変化させるIxovexの単一ヌクレオチド点突然変異(SNP、ゲノム位置3216)は、その不安定化を誘導した(図3、中央図)。Ad5野生型と比較したIxo-ctrlにおけるE1B-55k量の減少は、A549細胞におけるIxo-ctrlの若干低い複製効率を反映する(図6、A549の図)。
【０１２０】
E1Bスプライスアクセプターの使用における動態
SNPは、CAG:GAからCGG:GAに推定スプライスアクセプター配列を変化させることによって、E1B-93Rスプライスアクセプターの使用も阻害した(図4、第二図)。興味深いことに、93Rスプライス部位の阻害に対する二次効果として、E1B-156Rスプライスアクセプターを使用するための代償スイッチが存在する(図4、中央図)。E1B-93Rスプライスアクセプター突然変異の不在下、即ちIxo-ctrlでは、Ad5野生型ウイルスと比較して(図4、上図)、93Rスプライス部位の相対的使用は保持される(図4、下図)。この実験中Onyx-015を使用することはできなかった。このウイルスはE1B-55k遺伝子領域全体に欠失があるからである。
【０１２１】
Ixovexはp53の分解を誘導することができない
ウエスタンブロット解析により、IxovexにおけるSNPは、このウイルスがp53の分解を誘導するのを阻害したことを示した(図5)。E1B-93Rスプライスアクセプター突然変異の不在下(即ちIxo-ctrl)では、p53を阻害するこのウイルスの能力は保持された。興味深いことに、Onyx-015感染細胞ではp53の一層高い発現があった。
【０１２２】
癌細胞における複製効率
A549、HeLa、H460、H1299及びFaDu細胞においてAd5野生型、Onyx-015、Ixovex及びIxo-ctrlウイルスを使用して複製アッセイを実施した。FaDu細胞では、全ウイルスの複製効率は検出限界未満であった。A549細胞とHeLa細胞では、全ウイルスがAd5野生型ウイルスより最大で二桁低い複製効率を示した(図6、上図)。H460細胞とH1299細胞では、複製の低下は見られず、又はあまり顕著ではなかった(図6、下図)。二種以上の許容癌細胞株において、Onyx-015と比較して100〜1000倍を超えるIxovexウイルスが生成した。
【０１２３】
癌細胞における細胞毒性
図7は、癌細胞においてAd5野生型ウイルスと比較したOnyx-015ウイルスとIxovexウイルスの細胞毒性を示す。Onyx-015と比較して、Ixovexは試験した全細胞においてより有効であった(Onyx-015が2.5倍を超えて毒性であったH460細胞以外)。Ixovexウイルスの細胞毒性はA549、HeLa及びH1299癌細胞株においてAd5野生型ウイルスと同等であった(又はそれよりはるかに高かった)。
【０１２４】
正常細胞における毒性プロファイル
Ad5野生型、Onyx-015、Ixovex及びIxo-ctrlウイルスの細胞毒性をNHBE細胞(正常ヒト気管支上皮細胞)において測定した。図9中に見られるように、Ad5野生型、Onyx-015、及びIxo-ctrlウイルスは、癌細胞と比較して正常細胞中で比較的毒性がある。しかしながらIxovexウイルスは、A549、HeLa及びH1299癌細胞株におけるそのEC50値より高い23pfu/細胞のEC50値を示した。Ad5野生型ウイルスとIxo-ctrlウイルスはそれぞれ0.042と0.031pfu/細胞のEC50値を有しており、一方Onyx-015は0.63pfu/細胞を有していた。したがって、Ixovexより、Ad5野生型は500倍を超える、Ixo-ctrlは700倍を超える、Onyx-015は35倍を超える正常細胞に対するより高い毒性があった。
【０１２５】
NHBE細胞における複製効率
48hpiでは、ウイルス活性は、Ixovexウイルスと比較して、Ixo-ctrlとOnyx-015において30倍高く、Ad5野生型においては500倍高かった(図8)。これらの差は72hpiではより一層顕著であり、この場合ウイルス活性はIxo-ctrlとOnyx-015において50倍高く、Ad5野生型においては2000倍を超えて高かった。Ixovexの複製は全てのタイムポイントで検出限界にかろうじて達するため、実際、これらの差はより一層顕著であり得る。
【０１２６】
IxovexはE1B-156Rタンパク質を過剰発現した
Ad5野生型及びIxovex感染H1299細胞により発現されたE1B-156R、アデノウイルスカプシドタンパク質及びE1Aのタンパク質レベルを、ウエスタンブロットにより分析した。図10は、そのレベルがAd5野生型と比較して20倍を超えて増大したE1B-156Rタンパク質以外、Ixovexが同等量の全ウイルスタンパク質を発現したことを示す。
【０１２７】
E1B-156Rタンパク質は腫瘍溶解指数を高める
本発明者らは、E1B-156Rタンパク質が腫瘍溶解効果を担う場合、E1B-156Rタンパク質をイントランスで加えるとAd5野生型に関する腫瘍溶解指数(OI)が高まり得るとの仮説を立てた。Ad5-156R発現プラスミドのトランスフェクション及びAd5野生型の同時感染により、HeLa細胞とNHBE細胞を使用してOIが4倍増加した(図11A及び図12)。別の癌細胞株、H460(大細胞肺癌)で同じ実験を実施したときも、腫瘍溶解指数の増加を観察した。Ad5野生型感染細胞へのAd5-156Rの添加もウイルス複製に対する効果を高めた(図11A)。E1B-156R遺伝子を完全に欠くONYX-015ウイルスを同時感染させた細胞に、Ad5-156Rをトランスフェクトした。Ad5-156Rの添加は、48hpiのタイムポイントで5倍を超えてONYX-015のOIを増加させた(図11B及び図12)。同様に、Ad2感染細胞へのAd5-156Rの添加は15倍OIを増加させた。同じサブファミリー由来のアデノウイルス血清型は、比較するとタンパク質配列に非常に小さな差がある(図13)。Ad5に最も近いアデノウイルスファミリーのメンバーはAd2である。Ad5野生型感染細胞へのAd2-156Rの添加は、OIを約3倍OI増加させた。
【０１２８】
考察
アデノウイルスE1B遺伝子領域から発現されたRNAが、複雑なスプライシングパターンを有していたことが初期に発見された。この完全長2.28kb長RNAは、2つの重複リーディングフレームを有するポリシストロン性である。初期微弱又は強力下流翻訳開始部位のいずれかの代替使用によって、それぞれE1B-19kとE1B-55kが生成する(Perricaudet、Akusjarviら. 1979;Bos、Polderら. 1981)。55kORFにおける初期共通スプライスドナーを使用して、3つの代替スプライスアクセプター、93R SA、156R SA及び84R SAがスプライシングされる(Anderson、Schmittら. 1984;Virtanen及びPettersson 1985;Anderson、Maudeら. 1987)。93R ASは、C末端に15アミノ酸を加え55kORFをアウトオブフレームでスプライシングする。156R ASは、340の中央アミノ酸を除去しE1B-55kをインフレームでスプライシングする。84R SAは、共通N末端に6アミノ酸を加えた下流部位である。
【０１２９】
野生型アデノウイルス血清型5pTG3602株ベースで遺伝子改変ウイルスの多くのセットを作製したとき、1つのウイルスクローンをE1B-55k遺伝子領域内の単一ヌクレオチド位置(SNP)で突然変異させた。突然変異はE1B-93Rのスプライスアクセプター配列内に作製し、又はより正確には、それによって推定部位がcag/gaからcGg/gaに変化した。突然変異はスプライス部位を変化させただけでなく、E1B-55kアミノ酸400もアルギニンからグリシンに変化させた。このウイルスはIxovexと名づけられている。本発明者らは、腫瘍溶解能力、即ち、癌細胞では複製能力と細胞毒性を保持する一方、正常細胞中ではどちらのアカウントも阻害される、ということについて、このウイルスを特徴づけた。
【０１３０】
本発明者らの結果は、この突然変異が感染細胞中で発現されるE1B-55kタンパク質の欠如をもたらすことを示す(図3)。本発明者らは、これはアミノ酸の変化によりE1B-55kタンパク質が不安定状態になるためであると考える。他者はE1B-55kにアミノ酸変化を導入し、これらのいくつかによってタンパク質レベルが不安定になった。さらに、本発明者らの突然変異はE1B-55kスプライスアクセプター部位93R中の重要なヌクレオチドを変化させ、これによってその特定スプライス部位に対するスプライシングが無効になる(図4)。これを補うため、スプライシングはE1B-156Rスプライスアクセプターを再度対象とするようである。感染細胞におけるE1B-55kの欠如のため、p53の発現を阻害するIxovexの能力は著しく低下する(図5)。Onyx-015と比較したIxovexにより誘導されるp53レベルの低下は、A549細胞におけるIxovexの若干低い複製効率のため、即ち細胞があまり影響を受けず、したがって少量のp53が発現されるためであった可能性がある。或いは、本発明者の考えでは、156Rスプライスアクセプターに対するスプライシングの増加(図4)によって、E1B-156Rタンパク質の発現も増加し得るということである。156Rスプライシングは、E1B-55kのC-(カルボキシ)末端部分をインフレームでスプライシングする。これは中央の340アミノ酸を除去し、N-(アミノ)末端の79アミノ酸と融合したC末端の78アミノ酸を残す。Dobner研究所(Sieber及びDobner 2007)は、E1B-156Rタンパク質が、そのC末端を介してp53を阻害するある程度の能力を保持することを示した。E1B-156RがE1B-55kタンパク質の他の機能を保持することも可能である。
【０１３１】
E1B-55k及びE1B-156Rタンパク質は多くの類似因子と相互作用する(Sieber及びDobner 2007;Schreiner、Wimmerら. 2010; Schreiner、Wimmerら. 2011;Wimmer、Blanchetteら. 2012)。E1B-55kには、p53の分解の媒介以外に、いくつかの機能が割り当てられている。それは、後期ウイルスRNAの選択的核外輸送の制御(Dobner及びKzhyshkowska 2001;Flint及びGonzalez 2003)、及びウイルスRNA翻訳を促進しながらの細胞RNAの翻訳の阻害(Blackford及びGrand 2009)とも関係がある。タンパク質が別のウイルスタンパク質、E4orf6と複合体形成するとき、E1B-55kの主な機能が媒介される。興味深いことに、E1B-156Rタンパク質はE4orf6タンパク質と相互作用することが示されている(Sieber及びDobner 2007)。E1B-156Rはこれらの機能のいくつかを補うことができ、それはIxovexによるE1B-156Rの発現の増加に適合する。
【０１３２】
正常細胞において、各ウイルスの毒性はそれぞれの複製能力を大きく反映した。正常細胞における毒性の欠如と複製のほぼ完全なシャットダウンは、Ixovexの驚くべき安全性プロファイルを示す。Onyx-015ウイルスが正常細胞においてIxovexよりよく複製したことは、Onyx-015ウイルスが有する欠如がE1B-55k、-93R及び-156Rタンパク質を発現する全ての可能性を排除することを考慮すると興味深い(Barker及びBerk 1987)。これは、他のウイルスと比較した正常細胞におけるIxovexの弱毒化に広範囲の影響を与えたのは、E1B領域内の発現の不均衡であることを示す。興味深いことに、一方でOnyx-015とIxo-ctrl及び他方でIxovexとの間の正常細胞における複製の違いは癌細胞では見られなかった。これは、正常細胞におけるIxovex感染が非許容なること、即ち、ウイルスを除去する時間を細胞に与える主要な遮断が感染初期におそらく存在する一方、形質転換状態の癌細胞がいくつかのE1B-55k機能の欠如を補うことを示している。
【０１３３】
癌細胞における不均衡なE1B発現の影響は癌細胞株に応じて異なった。二つの高度に複製許容な細胞株H1299及びH460におけるIxovexの細胞毒性は低く、一方で複製減弱細胞株、A549及びHeLaにおける細胞毒性は高かった。この理由はおそらく毒性のために、多数のウイルスを生成する前に細胞が死滅したためである。
【０１３４】
アデノウイルスファミリーは、合計65を超える異なる血清型を有する、A〜Gの名称の7つの属に分けられる。血清型5(Ad5)はC属に属する。本発明者らは、Ad5において見られるスプライシングパターンは全てのアデノウイルス血清型中で保たれ、Ad5に非常に有利な腫瘍選択性をもたらすスプライス部位の突然変異による不均衡は、他の血清型の全てではないとしても大部分で反映されるだろうと考える。本発明者らの予備実験は、各々異なる属由来の代表的ウイルス(A-Ad12、B1-Ad3、B2-Ad11、C-Ad5、D-Ad37、E-Ad4及びF-Ad40)における類似したスプライシングパターンを示す。
【０１３５】
全ての他のウイルスに対するAd5野生型ウイルスの全体的高効率は、おそらくIxovexとIxo-ctrlのゲノム骨格として使用した野生型pTG3602株(Oberg、Yanoverら. 2010)のためである。この骨格は、ゲノム全体に散在した数個の点突然変異を有する。本発明者らのIxo-ctrlウイルスは実際本質的にpTG3602である。Ixovex中のSNPは野生型状態に戻りIxo-ctrlウイルスを生成した。pTG3602が利用された多くの実験において、Ad5野生型と比較して一定の低い効率が見られた。
【０１３６】
類似手法の特許されたアデノウイルスベクターと比較したIxovexの別の利点は、Onyx-015(Heise、Sampson-Johannesら. 1997)、Onyx -051及びOnyx -053(Shen、Kitzesら. 2001)はいずれもウイルスのE3B遺伝子領域がないことである。この領域は、Onyx-015の安全性プロファイルを高めるためにもともと欠失している。この領域が排除されていることによって、免疫防御機構により腫瘍からベクターが時期尚早に除去されることが後に見出された(Wang、Halldenら. 2003)。
【０１３７】
H1299細胞での感染に関するウエスタンブロット解析によって、Ad5野生型と同じレベルでIxovexが複製しウイルスタンパク質を発現することが示された。E1B-55kのN末端領域に特異的な抗体(マウス-m2A6)を使用したとき、これらのウイルス間で唯一の違いであるE1B-156Rスプライス型のE1B-55kタンパク質の劇的な増加が見られた(図10)。本発明者らは、E1B-156Rの増加が実際に腫瘍溶解指数(OI)の増加の原因であり得るかどうか確認するため、いくつかの補完実験を実施することを決めた。図11A、B及びC並びに図12において、本発明者らは、アデノウイルスタイプ5のE1B-156RがサブファミリーグループC内でOIの強力なエンハンサーであることを示す。Ad2野生型由来のE1B-156R等価物も、Ad5野生型のOIに対してプラスの影響を有することが示された。興味深いことに、Ad5野生型感染H460細胞にAd5-156Rを加えることによりウイルスの複製が増加し、これはH460細胞において(E1B-156R遺伝子が欠失した)ONYX-015ウイルスと比較したIxovexのはるかに高い複製レベルと一致した(図6参照)。
【０１３８】
E1B-156Rをウイルス感染細胞に補充したこれらの実験は、Ixovex又はE1B-156Rを発現する別の改変ウイルスによる感染を完全に模倣しているわけではないことに注目することが重要である。例えば、Ixovexによるウイルス感染中、ウイルスが複製するとAd5-156Rレベルが増加する、即ち発現鋳型(ウイルスDNA)の量が増加する。対称的に、補完実験では一定鋳型レベルでE1B-156Rを提供する。即ち、細胞が感染初期中に分裂し続けると、E1B-156R遺伝子を有するプラスミドは希釈される。したがって、(ウイルスコピーの場合と同様に)ウイルスが複製を開始すると、E1B-156R発現が指数関数的に増大することにはならない。しかしながら、これらの実験は、E1B-156Rの添加には腫瘍溶解指数を増加させる効果があることを明らかに示し、E1B-156Rがこの効果を担うことを示唆する。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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