(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号４４のアミノ酸配列によって定義される抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と、
抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体または断片であって、
該ＶＬ領域のＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１３を含み、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１４を含み、ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号１５を含む、
抗体または断片。
【請求項２】
前記ＶＬ領域が、配列番号４６の残基番号１００に対応するアミノ酸位置（Ｋａｂａｔ位置１００）でグリシンを含む、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項３】
前記ＶＬ領域が、配列番号４６の残基番号１００に対応するアミノ酸位置（Ｋａｂａｔ位置１００）でグルタミンを含む、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項４】
前記ＶＬ領域の第４のフレームワーク領域が配列番号４６のアミノ酸９８〜１０７を含む、請求項２に記載の抗体または断片。
【請求項５】
前記ＶＬ領域の第４のフレームワーク領域が配列番号９のアミノ酸９８〜１０７を含む、請求項３に記載の抗体または断片。
【請求項６】
ＶＬ領域が配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項１、２および４のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項７】
ＶＬ領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１、３、および５のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項８】
ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭからなる群から選択される抗体サブタイプに由来する抗体定常重鎖（ＣＨ）領域をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項９】
前記ＩｇＧサブタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群からさらに選択される、請求項８に記載の抗体または断片。
【請求項１０】
前記ＩｇＧサブタイプがＩｇＧ１である、請求項９に記載の抗体または断片。
【請求項１１】
前記ＩｇＧサブタイプが、Ｆｃドメイン機能を変更させる少なくとも１つの突然変異を含む、請求項９に記載の抗体または断片。
【請求項１２】
前記抗体または断片の重鎖が配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体または断片。
【請求項１３】
抗体定常軽鎖（ＣＬ）領域をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項１４】
前記ＣＬ領域がカッパまたはラムダＣＬ領域である、請求項１３に記載の抗体または断片。
【請求項１５】
前記抗体または断片の軽鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗体または断片。
【請求項１６】
前記ＶＨ領域が配列番号４３の核酸配列によってコードされている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項１７】
結合能が少なくとも１０−６ＭのＫｄ値でＧＤＦ−８と結合する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項１８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、Ｆｖ、および二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項１９】
形質移入細胞によって産生される前記抗体の量が、ＶＨ領域がＫａｂａｔ位置１０８でメチオニンを含む点以外は同一の抗体の、同様の条件下で産生される量よりも多い、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
形質移入細胞によって産生される前記抗体の量が、同様の条件下で産生される前記点以外は同一の抗体の量を、少なくとも１．５倍超える、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号５８のアミノ酸配列によって定義される抗体重鎖および配列番号５９のアミノ酸配列によって定義される抗体軽鎖を含む、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体。
【請求項２２】
配列番号５８のアミノ酸配列によってそれぞれ定義される２本の抗体重鎖、および配列番号５９のアミノ酸配列によってそれぞれ定義される２本の抗体軽鎖からなる、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体またはその断片の少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードしている核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記抗体または断片が、
配列番号４４のアミノ酸配列によって定義される抗体可変重鎖（ＶＨ）領域と、
抗体可変軽鎖（ＶＬ）領域とを含む抗体または断片であって、
該ＶＬ領域のＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１３を含み、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１４を含み、ＶＬ  ＣＤＲ３が配列番号１５を含む、
単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＶＨ領域をコードしている核酸配列が配列番号４３または配列番号４９の核酸配列であり、ＶＬ領域をコードしている核酸配列が配列番号４５または配列番号５１の核酸配列である、請求項２４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ヒト抗体ＣＨ領域をコードしている核酸配列をさらに含む、請求項２４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ヒト抗体ＣＬ領域をコードしている核酸配列をさらに含む、請求項２４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ＣＬ領域が配列番号１６の核酸配列によってコードされている、請求項２４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３０】
調節配列と作動可能に連結された請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項３０に記載の宿主細胞を培養するステップと、それによって産生された抗体または断片を回収するステップとを含む、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体またはその断片を生成する方法。
【請求項３２】
哺乳動物の筋肉量または筋力を増加させるための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
筋肉が骨格筋または心筋である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
骨格筋が呼吸中に活動するものである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
筋障害を処置するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
筋障害が、筋ジストロフィー、筋萎縮、筋肉減少症、悪液質、筋消耗症候群、加齢関連の筋肉量または筋力の低下、および虚弱からなる群から選択される、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
筋障害が筋ジストロフィーである、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
筋障害を有する対象の６分間歩行試験の成績を増加させるための、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
糖質コルチコイドを用いた処置も行われている対象に投与するための、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
筋障害を予防するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
筋障害が、筋ジストロフィー、筋萎縮、筋肉減少症、悪液質、筋消耗症候群、加齢関連の筋肉量または筋力の低下、および虚弱からなる群から選択される、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
筋障害が筋ジストロフィーである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
神経筋障害を処置または予防するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
神経筋障害がＡＬＳである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
代謝障害を処置または予防するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
代謝障害が、２型真性糖尿病、代謝症候群、Ｘ症候群、インスリン抵抗性、および耐糖能異常からなる群から選択される、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
脂肪組織障害を処置または予防するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
脂肪組織障害が肥満である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
骨減少障害を処置または予防するための、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
骨減少障害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、および骨粗鬆症関連骨折からなる群から選択される、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
配列番号４４からなる抗体ＶＨ領域および配列番号４６からなる抗体ＶＬ領域を含み、
同様の条件下で、配列番号７からなるＶＨ領域および配列番号９からなるＶＬ領域を含む点以外は同一の第２の抗体と比較してより高いレベルで発現される、
ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体。
【請求項５４】
前記第２の抗体と比較して、少なくとも１．５倍高い量で発現される、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
ＣＯＳ細胞中で発現させた場合に前記第２の抗体よりも１２倍高く発現される、請求項５４に記載の抗体。
【請求項５６】
ＣＨＯ細胞中で発現させた場合に前記第２の抗体よりも６倍高く発現される、請求項５４に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年６月１５日出願の米国仮出願第６１／６６０，２３２号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表の参照
米国特許法施行規則§１．８２１の下で本明細書と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でファイル名ＰＣ０７１９１４＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして提出したコンピュータ読取可能形式（ＣＲＦ）の配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは２０１３年５月１４日に作成され、７１キロバイトのファイルサイズである。
【０００３】
生物学的寄託物
本開示の代表的な材料は、２０１２年６月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、２０１１０−２２０９、米国に寄託されている。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２９８０を有するベクターＯＧＤ１．０．０−ＨＣはＯＧＤ１．０．０重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２９８１を有するベクターＯＧＤ１．０．０−ＬＣはＯＧＤ１．０．０軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドである。
【０００４】
寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定およびそれに従う規制（「ブダペスト条約」）の下で行われている。これは、寄託物の生きた培養物の維持を寄託日から３０年間保証する。寄託物はブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣの下で利用可能となり、また、関連する米国特許が発行された際または任意の米国もしくは外国特許出願が一般に公開された際のいずれか早い方にて、寄託培養物の子孫の一般への永久的かつ無制限な利用可能性を保証し、米国特許法§１２２およびそれに準ずる長官の規則（米国特許法施行規則§１．１４が含まれ、特に８８６ＯＧ６３８を参照）に従ってその権利を有すると米国特許商標庁長官によって決定された者への子孫の利用可能性を保証する、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．とＡＴＣＣの間の合意に従属する。
【０００５】
本出願の譲受人は、適切な条件下で培養した場合に、寄託されている材料の培養物が死滅または損失または破壊した場合は、通知を行い材料を即座に同じもので交換することに合意している。寄託された材料の利用可能性は、政府のその特許法に従った権限下で付与される権限に違反して本発明を実施する許諾として解釈されるべきではない。
【背景技術】
【０００６】
ミオスタチンとしても知られる成長および分化因子−８（ＧＤＦ−８）は分泌タンパク質であり、構造的に関連する成長因子のトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは成長調節および形態形成の特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、８：１３３〜４６、Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５〜７２）。ヒトＧＤＦ−８は、ホモ二量体複合体を形成する３７５個のアミノ酸の前駆タンパク質として合成される。プロセッシング中に、「潜伏期関連ペプチド」（ＬＡＰ）として知られるアミノ末端プロペプチドが切断され、ホモ二量体との非共有結合が保たれて「小潜伏性複合体」と命名された不活性の複合体を形成し得る（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６４０７〜１５、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：７６４６〜５４、Ｂｒｏｗｎら（１９９９）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３：３５〜４３、Ｔｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜５９、Ｇｅｎｔｒｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：６８５１〜５７、Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７０１〜０５、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２：５９７〜６４１）。また、フォリスタチンなどのタンパク質およびその類縁体も、成熟ＧＤＦ−８ホモ二量体と結合し、ＧＤＦ−８生物活性を阻害する（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２〜３２）。
【０００７】
様々な種の推定ＧＤＦ−８アミノ酸配列のアラインメントが、ＧＤＦ−８が高度に保存的であることを実証している（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜６１）。ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリのＧＤＦ−８の配列はＣ末端領域内で１００％同一である一方で、ヒヒ、ウシ、およびヒツジのＧＤＦ−８はＣ末端でわずか３個のアミノ酸が異なる。種にわたるＧＤＦ−８の高度の保存は、ＧＤＦ−８が必要不可欠な生理的機能を有することを示唆している。
【０００８】
ＧＤＦ−８は、筋芽細胞および衛星細胞の増殖および分化をどちらも阻害することによって、筋肉の発生および恒常性の調節において主要な役割を果たすことが示されている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、９：６０４〜０７、ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１６２：１１３５〜４７）。これは、発生中の骨格筋内で初期に発現され、成体の骨格筋、優先的には速筋型のもの中で発現され続ける。さらに、成体マウスにおいて過剰発現されるＧＤＦ−８は顕著な筋肉喪失をもたらす（Ｚｉｍｍｅｒｓら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：１４８６〜８８）。また、ＧＤＦ−８遺伝子を不活性化させる天然の突然変異は、動物およびヒトのどちらにおいても肥厚および過形成をどちらも引き起こすことが示されている（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（１９９７）上記）。たとえば、ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の著しい肥厚および過形成ならびに皮質骨構造の変質によって特徴づけられている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ、３８７：８３〜９０、Ｈａｍｒｉｃｋら（２０００）Ｂｏｎｅ、２７：３４３〜４９）。骨格筋量の同様の増加が、畜牛における天然のＧＤＦ−８突然変異において明白である（Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ、３８：５０１〜０７、Ｓｗａｔｌａｎｄら（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．、３８：７５２〜５７、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、上記、Ｋａｍｂａｄｕｒら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：９１０〜１５）。さらに、様々な研究が、増加したＧＤＦ−８発現がＨＩＶ誘導性の筋消耗と関連していることを示している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１４９３８〜４３）。また、ＧＤＦ−８は筋特異的酵素（たとえばクレアチンキナーゼ）の産生および筋芽細胞増殖にも関連づけられている（ＷＯ００／４３７８１号）。
【０００９】
その成長調節および形態形成の特性に加えて、ＧＤＦ−８は、２型糖尿病発生中のグルコース恒常性、耐糖能異常、代謝症候群（すなわち、たとえば、人を２型糖尿病および／または心疾患の高い危険にさらす、インスリン抵抗性、腹部肥満、異常脂質血症、高血圧、慢性炎症、血栓形成促進性状態などが含まれ得る健康状態群の同時発生を含むＸ症候群などの症候群）、インスリン抵抗性（たとえば、火傷などの外傷または窒素不均衡によって誘導される抵抗性）、ならびに脂肪組織障害（たとえば、肥満、異常脂質血症、非アルコール性脂肪肝疾患など）を含めた、数々の他の生理的プロセスに関与していると考えられている（Ｋｉｍら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２８１：９０２〜０６）。
【００１０】
いくつかのヒトおよび動物の障害が、機能的に障害のある筋組織、たとえば、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、筋ジストロフィー（「ＭＤ」、デュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる）、筋萎縮、臓器萎縮、虚弱、鬱血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、筋肉減少症、悪液質、ならびに他の疾患および状態によって引き起こされる筋消耗症候群に関連づけられている。現在、これらの障害を処置するための信頼性のあるまたは有効な治療はわずかしか存在しない。これらの疾患の病理は、これらの疾患を処置するための標的としての、ＧＤＦ−８シグナル伝達の潜在的な役割を示している。
【００１１】
ＡＬＳは、中枢神経系の変性および筋萎縮に特徴づけられている晩期発症型かつ致命的な神経変性疾患である。ＡＬＳは、典型的には歩行異常および器用さの喪失から始まり、その後、肢および横隔膜の麻痺へと進行する。ＡＬＳのほとんどの事例は散発性であり、未知の病因のものであるが、事例のうちの５〜１０％は、優性家族性（ＦＡＬＳ）遺伝の結果生じることが示されている。ＦＡＬＳの約１０〜２０％の事例がＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子中の突然変異に起因している（Ｂｒｕｉｊｎら（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２７：７２３〜４９中に総説）。ＳＯＤ１は、スーパーオキシドから過酸化水素および二原子酸素への反応を触媒するヘテロ二量体の金属タンパク質であり、ＳＯＤ１の損失は運動ニューロン疾患をもたらさないため（Ｒｅａｕｍｅら（１９９６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１３：４３〜４７）、疾患は毒性がある機能獲得型によって誘導されると考えられている（Ｂｒｕｉｊｎら、上記中に総説）。ＳＯＤ１誘導性の神経細胞死の具体的な機構は不明確であり、軸索輸送の変更、誤って折り畳まれたタンパク質に対する細胞性応答、ミトコンドリアの機能不全、および興奮毒性を含み得る（Ｂｒｕｉｊｎら、上記）。
【００１２】
ＡＬＳにおいて観察される運動ニューロンの変性は、運動ニューロンによる栄養因子の取り込みまたは輸送の破壊を含めた複数の機構を介して起こり得る（Ｈｏｌｚｂａｕｒ（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１４：２３３〜４０中に総説）。したがって、ＡＬＳは、最適な生存環境を提供することによって変性中のニューロンを回復させる治療によって処置し得る。神経の環境には、運動ニューロンによって神経支配されるグリアおよび筋肉細胞などの非神経細胞が含まれる。この環境が、ニューロンによって飲食され、逆行性軸索輸送を介して細胞体へと輸送される栄養因子および成長因子を提供する（Ｃｈａｏ（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ、３９：１〜２、Ｈｏｌｚｂａｕｒ、上記）。
【００１３】
ＦＡＬＳは、突然変異ＳＯＤ１の過剰発現によって、マウスおよびラットのどちらにおいてもモデリングされている（Ｈｏｗｌａｎｄら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：１６０４〜０９）。突然変異ＳＯＤ１のＧ９３Ａ型を過剰発現するトランスジェニックマウスは９０〜１００日齢までに筋力の低下および萎縮を示し、典型的にはほぼ１３０日齢で死亡する（Ｇｕｒｎｅｙら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１７７２〜７５）。しかし、握力低下および神経筋接合部の喪失を含めた、根底にあるＳＯＤＧ９３Ａ誘導性の病理は、早くも５０日齢で顕著である（Ｆｒｅｙら（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０：２５３４〜４２、Ｆｉｓｈｅｒら（２００４）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．、１８５：２３２〜４０、Ｌｉｇｏｎら（２００５）ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、１６：５３３〜３６、Ｗｏｏｌｅｙら（２００５）Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、３２：４３〜５０）。ＳＯＤＧ９３Ａ突然変異を発現するトランスジェニックラットは同様の変性の時間経過に従う（Ｈｏｗｌａｎｄら、上記）。最近の研究は、病理の発生が細胞自律的ではないことを示唆しており、これは、ＡＬＳにおいて観察される運動ニューロンの変性は、運動ニューロンによる栄養因子の取り込みおよび輸送の破壊を含めた複数の機構を介して起こるという仮説と一貫している（上記参照）。Ｃｌｅｍｅｎｔおよび共同研究者らは、キメラマウスを使用して、野生型非神経細胞が突然変異ＳＯＤ１を発現する運動ニューロンの生存を延長できることを示している（Ｃｌｅｍｅｎｔら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０２：１１３〜１７）。これらの観察は、生存のための最適微小環境を提供することによって神経の変性を遅延させ得る治療の調査へとつながっている。たとえば、ウイルス発現させた成長因子（ＩＧＦ−１、ＧＤＮＦおよびＶＥＧＦが含まれる）の直接筋肉内注射を介したＳＯＤＧ９３Ａマウスの処置は、動物の生存を延ばす（Ｋａｓｐａｒら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１：８３９〜４２、Ａｚｚｏｕｚら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ、４２９：４１３〜１７、Ｗａｎｇら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：６９２０〜２８）。さらに、局所的なＩＧＦ−１特異的アイソフォーム（ｍＩＧＦ−１）の筋特異的発現は、ＳＯＤＧ９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて神経筋接合部を安定化させ、運動ニューロンの生存を増強させ、疾患の発症および進行を遅延させ、これは、筋肉に対する直接効果がトランスジェニックＳＯＤ１動物における疾患の発症および進行に影響を与える場合があることを示している（Ｄｏｂｒｏｗｏｌｎｙら（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６８：１９３〜９９）。また、筋肉の代謝亢進と運動ニューロンの脆弱性との間の関連づけもＡＬＳマウスにおいて報告されており、これは、筋肉内の欠陥が疾患の病因に寄与し得るという仮説を支持している（Ｄｕｐｏｉｓら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０１：１１１５９〜６４）。したがって、筋肉成長の増強が、運動ニューロンの局所的支持の改善を提供し、したがって治療上の利点をもたらすであろう。
【００１４】
ミオスタチン発現の阻害は筋肉の肥厚および過形成をどちらももたらす（ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、上記、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、上記）。ミオスタチンは傷害後の筋肉再生を負に調節し、ＧＤＦ−８ヌルマウスにおけるミオスタチンの欠乏は筋肉再生の加速をもたらす（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、（２００５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１１８：３５３１〜４１）。ミオスタチン中和抗体は、野生型マウス（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３００：９６５〜７１）および筋ジストロフィーモデルであるｍｄｘマウス（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ、４２０：４１８〜２１、Ｗａｇｎｅｒら（２００２）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５２：８３２〜３６）において、体重、骨格筋量、ならびに骨格筋の筋肉の大きさおよび筋力を増加させる。さらに、これらのマウスにおけるミオスタチン抗体は、ＡＬＳの病因中にやはり標的となる筋肉である横隔膜への損傷を減少させた。筋肉に対するＨＧＦなどの成長因子の作用はミオスタチン発現の阻害が原因である場合があり（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら（２００５）、上記）、したがって、再生と変性との間の「押し引き」、すなわちバランスを正の方向にシフトさせることを助けると仮定されている。したがって、ＧＤＦ−８阻害は、ＡＬＳ、筋ジストロフィー（ＭＤ）、および他のＧＤＦ−８関連障害、たとえば、筋肉の量、筋力、大きさなどを増加させることが望ましい神経筋障害を処置するための潜在的な薬理学的標的として提示される。ＡＬＳの動物モデル（マウスおよびラット）が利用可能であるため、２つの異なる種において治療剤を試験することが可能であり、したがって、ヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果の信頼度が増加する。
【００１５】
ヒトにおける神経筋障害に加えて、主に高齢者および／または閉経後の女性に影響を与える、骨粗鬆症および骨関節炎などの骨減少に関連する成長因子関連の状態も存在する。さらに、代謝性の骨の疾患および障害には、慢性糖質コルチコイド治療、未熟性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏、続発性副甲状腺機能亢進、栄養障害、および神経性無食欲症が原因の低骨量が含まれる。これらの状態のための多くの現在の治療は骨吸収を阻害することによって機能するが、骨形成を促進する治療は有用な代替処置となるであろう。ＧＤＦ−８は骨発生および筋発生において役割を果たすため、ＧＤＦ−８の調節も、骨変性疾患を処置するための優れた薬理学的標的である。
【００１６】
ＧＤＦ−８を特異的に拮抗するマウスモノクローナル抗体は、他の生物学的効果のなかでとりわけ、ＡＬＳのげっ歯類モデルにおいて筋肉量および筋力を増加すると以前に記載されている。Ｈｏｌｚｂａｕｒ，ＥＬら、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｓｌｏｗｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２００６）２３（３）：６９７〜７０７。したがって、このマウス抗体およびそのヒト化対応物は、ＡＬＳ患者、ならびに、上述のものなどの過剰量のＧＤＦ−８によって特徴づけられるまたは媒介される他の疾患および障害によって影響を受ける患者において、筋肉量および筋力を増加させるために有効であると予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述のマウス抗ＧＤＦ−８抗体のヒト化型は、多くのモノクローナル抗体および他のタンパク質に基づく治療剤と同様、典型的にはその製造に生きた哺乳動物細胞中での産生を必要とするため、製造が困難かつ高価である。したがって、この抗体、または同様の特異性を有する他の抗体の収率の改善は、より少ない投入で同じ量の活性薬物の生成を可能にするであろう。このことは、製造コストを低下させると同時に、限られた製造施設を、他の生物薬を生成するために解放するという二重の利点を有するであろう。どちらの利点も、患者の治療的抗ＧＤＦ−８抗体および他の生物製剤の利用可能性を増加させる目的を増進するであろう。従って、当分野では、哺乳動物細胞においてより高い生成収率を有する、抗ＧＤＦ−８抗体の改善された型の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本開示は、ヒト化抗ＧＤＦ−８抗体またはその抗原結合断片であって、同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を共有するそのような抗体の以前の型と比較してより高いレベルで宿主細胞中にて発現されることができる、ヒト化抗ＧＤＦ−８抗体またはその抗原結合断片を提供する。また、本開示の方法において使用するための、そのような抗体を含む組成物も提供する。
【００１９】
特定の実施形態では、これらの抗体は、ＣＤＲ１が配列番号１０または配列番号２０のアミノ酸配列によって定義され、ＣＤＲ２が配列番号１１または配列番号２１のアミノ酸配列によって定義され、ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列によって定義され、Ｋａｂａｔ位置１０８のアミノ酸がメチオニンの代わりにロイシンであるであるように改変されている、可変重鎖（ＶＨ）領域を有する。他の実施形態では、これらの抗体は、同じＣＤＲを含むＶＨ領域を有しており、ＶＨ領域の第４のフレームワーク領域は配列番号４４のアミノ酸１０６〜１１６を含む。これらの抗体のさらに他の実施形態では、ＣＤＲをヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＤＰ−４７上に移植し、その後、ＪＨ４ヒト重鎖Ｊセグメント遺伝子と接合させる。さらに他の実施形態では、これらの抗体のＶＨ領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
上記例示したものなどの、Ｋａｂａｔ位置１０８にロイシンを有する本開示の抗体は、メチオニンが同じ位置に存在する型と比較して増加した発現レベルによって特徴づけられている。特定の実施形態では、前者の型は、同様の条件下で、後者と比較して約５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１２００％、１４００％、１６００％、１８００％、またはさらには２０００％を超える量のより高いレベルで発現される。
【００２１】
本開示の抗体の他の実施形態によれば、以前の段落中に記載されているＶＨ領域は、ＣＤＲ１が配列番号１３のアミノ酸配列によって定義され、ＣＤＲ２が配列番号１４のアミノ酸配列によって定義され、ＣＤＲ３が配列番号１５のアミノ酸配列によって定義され、ＶＬ領域のＫａｂａｔ位置１００のアミノ酸がグリシンまたはグルタミンのどちらかである可変軽鎖（ＶＬ）領域と対にし得る。他の実施形態では、ＶＨ領域は、軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＶＬ遺伝子セグメントＤＰＫ−９上に移植し、その後、ＪＫ４ヒト軽鎖Ｊセグメント遺伝子と接合させたＶＬ領域と対にする。これらの抗体の一部の他の実施形態によれば、既に記載したＶＨ領域は、既に記載したＶＬ領域のＣＤＲを保有しており、ＶＬ領域の第４のフレームワーク領域が配列番号９または配列番号４６のどちらかのアミノ酸９８〜１０７を含む、ＶＬ領域と対にする。さらに他の実施形態では、既に記載したＶＨ領域は、配列番号９または配列番号４６のどちらかのアミノ酸配列を含むＶＬ領域と対にする。
【００２２】
一部の他の実施形態では、上述のＶＨ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭを含めたヒト抗体サブタイプの重鎖定常領域と接合させる。重鎖定常領域がＩｇＧのものである場合、さらに他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧサブタイプであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである。重鎖定常領域は、配列番号５７に例示するように、たとえば、１つまたは複数のＦｃドメインのエフェクター機能を抑止するために改変することができる。他の実施形態では、上述のＶＬ領域は、ラムダまたはカッパサブタイプのものであり得る軽鎖定常領域と接合させる。
【００２３】
他の実施形態によれば、配列番号４４のＶＨ領域を、配列番号５７のアミノ酸配列の改変した重鎖領域と接合させて、配列番号５８のアミノ酸配列の完全長抗体重鎖を作製する。逆に、他の実施形態では、配列番号４６のＶＬ領域を、配列番号１７のアミノ酸配列のカッパ定常軽鎖と接合させて、配列番号５９のアミノ酸配列の完全長抗体軽鎖を作製することができる。他の実施形態では、その後、それぞれ２本の完全長抗体重鎖および軽鎖を組み合わせて、２つの抗原結合部位を有する抗ＧＤＦ−８抗体を作製することができる。さらに他の実施形態では、抗体は、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、Ｆｖ、および二重特異性抗体を含めた、そのような完全長のインタクトな抗体の断片または誘導体を含むことができる。
【００２４】
本開示の抗体は、たとえば約５０００ｎＭ、またはさらに高い、たとえば、少なくとも約４０００ｎＭ、３０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、もしくは０．００１ｎＭの、ＧＤＦ−８に対する結合親和性の範囲を有することができる。
【００２５】
また、本開示は、抗ＧＤＦ−８抗体をコードしている核酸、そのような核酸配列を含む発現ベクター、および抗体を発現させるための宿主細胞も提供する。
【００２６】
また、本開示は、患者において、筋肉量または筋力の減弱によって特徴づけられる筋障害の処置または予防に有用な方法も提供する。そのような方法は、そのような障害の処置または予防を必要としている患者に、治療または予防有効量の、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を投与することによって実施する。これらの方法に有用な抗体には、上述のものおよび本開示全体にわたって記載されているものが含まれる。
【００２７】
特定の実施形態によれば、本開示の抗体組成物は、治療または予防有効量で、筋ジストロフィー、筋萎縮、筋肉減少症、悪液質、筋消耗症候群、加齢関連の筋肉量または筋力の低下、および虚弱からなる群から選択されるものを含めた筋障害の処置または予防を必要としている患者に投与することができる。他の実施形態では、筋障害は癌によって引き起こされた悪液質である。さらに他の実施形態では、筋障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。後者の実施形態のうちの特定のものでは、抗ＧＤＦ−８抗体の投与は、６分間歩行試験における患者の成績を改善させるために有効である。
【００２８】
また、一部の実施形態では、本開示の抗体を含む組成物を、筋ジストロフィーを処置するために有効な別の薬剤の前、それと同時に、またはその後に投与することによって、筋ジストロフィー、たとえばデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている患者を処置することも有用である。特定の実施形態では、そのような薬剤はプレドニゾンなどの糖質コルチコイドである。
【００２９】
また、哺乳動物に、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を、哺乳動物の筋肉量または筋力を増加させるために有効な量で投与することによる、哺乳動物の筋肉量または筋力を増加させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、筋肉は、呼吸中に活動する１つもしくは複数のものを含めた骨格筋、または心筋である。
【００３０】
また、神経筋障害の処置または予防を必要としている対象に、治療または予防有効量の本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を投与することによる、神経筋障害を処置または予防するための方法も提供する。特定の実施形態では、処置または予防する神経筋障害はＡＬＳである。
【００３１】
また、代謝障害の処置または予防を必要としている対象に、治療または予防有効量の本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を投与することによる、代謝障害を処置または予防するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、処置または予防する代謝障害には、２型真性糖尿病、代謝症候群、Ｘ症候群、インスリン抵抗性、および耐糖能異常が含まれる。
【００３２】
また、脂肪組織障害の処置または予防を必要としている対象に、治療または予防有効量の本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を投与することによる、脂肪組織障害を処置または予防するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、処置または予防する脂肪組織障害には肥満および異常に高い体重指数が含まれる。
【００３３】
また、骨減少障害の処置または予防を必要としている対象に、治療または予防有効量の本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を投与することによる、骨減少障害を処置または予防するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、処置または予防する骨減少障害には、骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、および骨粗鬆症関連骨折が含まれる。
【００３４】
一部の他の実施形態では、本開示の方法に有用な抗ＧＤＦ−８抗体には、その機能または特徴を有用に改変する、たとえば、それだけには限定されないが血清半減期を増加させる部分とコンジュゲートさせた抗体が含まれる。さらに他の実施形態では、同様の目的、または他の目的のためにアミノ酸の変更を行うことができる。
【００３５】
本開示の方法において使用するための抗体組成物は、それだけには限定されないが皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、注入投与、またはボーラス投与が含まれる、それだけには限定されないが様々な経路による投与のための水性懸濁液を含めた、様々な製剤として調製することができる。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体の有効用量の範囲は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇであり、これは、１回の投与で、または複数の間隔を空けた投与にわたって与え得る。
【００３７】
また、本開示は、患者への抗ＧＤＦ−８抗体組成物の投与を容易にするための、臨床家および他の者が使用するための医薬キットも提供する。一部の実施形態では、キットには、凍結乾燥形態または水溶液のどちらかとしての本開示の抗ＧＤＦ−８抗体と、薬学的グレードの水または緩衝液などの希釈剤と、シリンジおよび針などの抗プロガストリン抗体を投与するための装置とが含まれる。他の実施形態では、キットには、第２の治療剤がさらに含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１−１】図１Ａ  マウス抗体ＶＨ領域ならびにマウス重鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＶＨ領域ＤＰ−４７内に移植することによって作製した２つのヒト化抗体ＶＨ領域（すなわちＶＨ０およびＶＨ１）を含めた、本開示の特定の抗ＧＤＦ−８抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する図である。また、さらなるヒト化ＶＨ領域ＶＨ２〜ＶＨ５のアミノ酸配列のアラインメントも提供する。重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、太字の下線フォントを使用して強調する。Ｋａｂａｔ位置１０８のアミノ酸は、アスタリスクの下に太字を使用して強調する。
【図１−２】図１Ｂ  マウス抗体ＶＬ領域ならびにマウス軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＶＬ領域ＤＰＫ−９内に移植することによって作製した２つのヒト化抗体ＶＬ領域（すなわちＶＬ０およびＶＬ１）を含めた、本開示の特定の抗ＧＤＦ−８抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する図である。また、さらなるヒト化ＶＬ領域ＶＬ２〜ＶＬ５のアミノ酸配列のアラインメントも提供する。軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、太字の下線フォントを使用して強調する。Ｋａｂａｔ位置１００のアミノ酸は、アスタリスクの下に太字を使用して強調する。
【図２−１】図２Ａ  ビヒクル対照と比較した、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で２週間処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの腓腹筋量（ＧＡＳ）および四頭筋量（ＱＵＡＤ）の増加を示すグラフを提供する図である。
【図２−２】図２Ｂ  図２Ａと同じデータを、対照と比較した、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置したマウスにおける筋肉量のパーセンテージ増加として報告する図である。同じ抗体処置および対照マウスの群の長趾伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）の筋肉量のパーセンテージ増加をさらに示す。
【図３】ビヒクル対照と比較した、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で２週間処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの、ＥＤＬ筋肉によって生じた総強縮力の増加を示すグラフを提供する図である。
【図４−１】図４Ａ  週に１回で４週間、ＰＢＳビヒクル、ならびに０．３、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体を用いて処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの腓腹筋量（Ｇａｓｔｒｏｃ）および四頭筋量（Ｑｕａｄ）の用量応答性の増加を示すグラフを提供する図である。データは、４週間の終わりに測定した筋肉量を表す。
【図４−２】図４Ｂ  図４Ａと同じデータを、対照と比較した、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置したマウスにおける腓腹筋量および四頭筋量のパーセンテージ増加として報告する図である。
【図５−１】図５Ａ  週に１回で４週間、ＰＢＳビヒクル、ならびに０．３、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体を用いて処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける全除脂肪体重の用量応答性の増加を示すグラフを提供する図である。データは、４週間にわたって各週の終わりに測定した除脂肪質量を表す。
【図５−２】図５Ｂ  週に１回で４週間、ＰＢＳビヒクル、ならびに０．３、１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体を用いて処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの、４週間の研究の終わりでの全除脂肪体重の増加を示すグラフを提供する図である。
【図６−１】図６Ａ  ＰＢＳビヒクルを投与した対照ｍｄｘマウスと比較した、週に１回で８週間、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で処置したｍｄｘマウスにおける全除脂肪体重の増加を示すグラフを提供する図である。
【図６−２】図６Ｂ  ＰＢＳビヒクルを投与した対照ｍｄｘマウスと比較した、週に１回で８週間、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で処置したｍｄｘマウスの最大ピーク把持力の増加を示すグラフを提供する図である。
【図７−１】図７Ａ  ＰＢＳビヒクルを投与した対照マウスと比較した、週に１回で８週間、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で処置したｍｄｘマウスおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスの、腓腹筋量および四頭筋量の増加を示すグラフを提供する図である。データは、８週間の終わりに測定した筋肉量を表す。
【図７−２】図７Ｂ  図７Ａと同じデータを、対照と比較した、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置したｍｄｘマウスにおける腓腹筋量および四頭筋量のパーセンテージ増加として報告する図である。
【図８】０、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で処置したカニクイザルにおける全除脂肪体重および脚除脂肪質量の用量応答性の増加を示すグラフを提供する図である。
【図９】１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体のどちらで処置したカニクイザルの全除脂肪体重の増加も、抗体を用いた処置を中断した後も数週間持続したことを示すグラフを提供する図である。
【図１０−１】図１０Ａ  １０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で８週間処置したカニクイザルのＬ３〜Ｌ５椎骨の表面を覆う軸上筋肉の体積が、ＰＢＳビヒクルを投与した対照動物と比較して増加したことを示すグラフを提供する図である。
【図１０−２】図１０Ｂ  図１０Ａと同じデータを、対照と比較した、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置したカニクイザルにおける筋肉の体積のパーセンテージ増加として報告する図である。
【図１１】ＯＧＤ１．０．０抗体を用いた４週間の処置の前および後の例示的な動物対象の軸上筋肉の３Ｄレンダリングを提供する図である。
【図１２−１】図１２Ａ  本明細書中でＶＨ０と呼ぶ可変重鎖領域を含有する例示的な抗ＧＤＦ−８抗体重鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【図１２−２】図１２Ｂ  本明細書中でＶＬ０と呼ぶ可変軽鎖領域を含有する例示的な抗ＧＤＦ−８抗体軽鎖のアミノ酸配列を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示は、抗体の以前の型と比較してはるかに高いレベルで細胞中にて発現されることができる、ヒト化抗ＧＤＦ−８抗体の改善された型を提供する。従って、本明細書中に記載の抗ＧＤＦ−８抗体の改善された型は、より初期の型と比較して、同じ投入を与えた場合により大量でかつより安価な原価で生成されることが可能であると予想される。また、本開示は、改善された抗体を使用した処置または予防の様々な方法も記載している。したがって、特定の例示的な非限定的な実施形態では、改善された抗ＧＤＦ−８抗体を使用して、筋ジストロフィー、悪液質、および対象の筋肉量または筋力を増加させることが治療上の利点を与えると予想される他の障害を処置することができる。
【００４０】
抗体の構造および多様性
本明細書中で使用する用語、抗体とは、インタクトな免疫グロブリン（Ｉｇ）またはその任意の抗原結合断片、部分もしくは一部分をいい、とりわけ、少なくとも一部の抗原結合特異性を保持する完全または部分的な抗原結合部位を含む任意のポリペプチドが包含される。また、抗体とは、インタクトな抗体に由来する抗原結合断片、部分または一部分と、異なる抗体、Ｉｇスーパーファミリーからのタンパク質、または免疫系に由来しないタンパク質もしくは他の分子種を含めた別の分子との組合せをいう場合もある。そのような抗体誘導体には、タンパク質性でない一部分または部分が含まれ得る。
【００４１】
抗原とは、抗体が特異的に結合することができる、タンパク質またはその他の物質をいう。抗原は、抗体によって結合される抗原の一部分である抗原決定基またはエピトープを複数有し得る。
【００４２】
免疫グロブリン（Ｉｇ）とは、それぞれ約５０ｋＤａの２本の重鎖およびそれぞれ約２５ｋＤａの２本の軽鎖を含むヘテロ四量体タンパク質である。それぞれの鎖は複数のＩｇドメインを含む。アミノ末端から開始して、重鎖は単一の可変領域（ＶＨ）を含有し、続いて、Ｉｇサブタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および存在する場合はＣＨ４と呼ばれる３個または４個の定常領域が続く。同様に、軽鎖中では、単一の可変領域（ＶＬ）がポリペプチドのアミノ末端に配置されており、単一の定常領域（ＣＬ）が続く。ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間には、アイソタイプに応じて可変長のヒンジ領域が存在し、これは分子に柔軟性を与える。ヒンジを含めたＣＨ１の重鎖カルボキシ末端、ＣＨ２、ＣＨ３および存在する場合はＣＨ４が、Ｆｃ領域を構成する。それぞれの可変または定常領域は単一のＩｇドメインを含む。
【００４３】
Ｉｇ軽鎖はＩｇ重鎖と結合し、Ｉｇ重鎖の対は、ジスルフィド結合によって互いに結合する。非共有的相互作用も、重鎖と軽鎖間および対にした重鎖間の鎖間の四次構造の安定化に寄与し得る。インタクトなＩｇ分子では、対にした重鎖および軽鎖のＶＨおよびＶＬ領域は互いに隣接して配置され、相互作用および協同して抗原結合部位を形成する。インタクトなＩｇ分子は２対の対にした重鎖および軽鎖、すなわち合計２本の重鎖および２本の軽鎖を含有するため、Ｉｇ分子が２つの抗原結合部位を含有する。ヒンジ領域の存在は、抗原結合部位と分子の残りの部分との間に柔軟性を与える。
【００４４】
重鎖および軽鎖定常領域は、抗原認識には直接関与しない。しかし、重鎖、特にＦｃ領域は、エフェクター分子および免疫系の細胞と相互作用することができる配列を含有しており、それにより、重鎖定常領域がＩｇ分子の重要な生物学的機能を媒介することを可能としている。
【００４５】
重鎖および軽鎖の可変領域はどちらも、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、アミノ酸の可変性が増大した３つの間隔を空けた領域を含有し、これは、ＣＤＲ周辺のより高度に保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と比較して、様々なＩｇ分子を横断して大規模に変動する。可変領域のアミノ末端から、ＦＲおよびＣＤＲの順番および付番は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４である。フレームワーク領域が、可変領域Ｉｇドメインの三次構造の決定を主に司っている。対照的に、ＣＤＲは、それぞれの可変領域から外側に延びるループを形成する。隣接するＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲは、協同して、特定のＩｇ分子の抗原結合特異性の定義を主に司っている抗原結合表面を形成する。
【００４６】
抗体の構造および機能を研究している研究者らは、任意の特定のＶＨまたはＶＬ領域のアミノ酸配列内に存在する重鎖および軽鎖ＣＤＲを同定するための様々なスキーマを開発している。これらのスキーマの多くは、可変重鎖および軽鎖領域の周辺フレームワークに関連する不変またはほぼ不変のパターンに従ってＣＤＲを同定する。その後、ＣＤＲを、ＶＨおよびＶＬ領域のコンテキスト内におけるその構成残基の位置に対応する数値範囲を使用して定義する。ＣＤＲ、特に第３のＣＤＲは、長さが変動する場合があるため、スキームは、構成残基を定義するために文字も使用する場合がある。最初のそのようなスキームの１つはＫａｂａｔ付番システムとして知られており、これは、その時に知られているＶＨおよびＶＬ配列をアラインメントして、より高度に保存的なフレームワーク領域のコンテキスト内における可変ＣＤＲ部分配列の位置を決定することに基づく。ＣＤＲを定義するための他のスキーマには、ＡｂＭ付番システムおよびＣｈｏｔｈｉａ付番システムが含まれる。他のスキーマも可能である。たとえば、ＣＤＲは、そのような残基が、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ付番スキームなどの、ＣＤＲのより形式化された定義にはきれいに当てはまらない場合でさえも、抗原と接触する可変領域残基として定義し得る。たとえば、参照により組み込まれるＹ．Ｏｆｒａｎら、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤＲｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８  １１月１日、１８１（９）：６２３０〜５を参照されたい。Ｋａｂａｔ付番スキームおよび特定の他の抗体付番スキームは、たとえば、参照により組み込まれるｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２００７）、Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫｇａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ中により詳細に記載されている。
【００４７】
可変重鎖および軽鎖領域のＣＤＲ内のアミノ酸は抗原中の残基と接触し、抗原に対する抗体の結合特異性の定義を主に司っている。研究下にある抗体−抗原の対に応じて、すべてまたはすべてよりも少ないＣＤＲ残基が抗原と直接接触し得る。さらに、特定の接触は、他のものよりも特異性および／または親和性の定義に寄与し得る。
【００４８】
抗体および抗原のどちら中の接触残基も、それが何であるかは、Ｘ線結晶構造解析または当業者に知られている他の方法を使用して決定することができる。必ずしもではないが、多くの場合、そのような接触残基の突然変異は、抗原結合の特異性および／または親和性に負の影響を与える。逆に、抗原結合の特異性または親和性に実質的な影響を与えずに、非接触ＣＤＲ残基およびＦＲ残基を突然変異させることが可能であり得る。保存的アミノ酸の変更は抗原結合の特異性および親和性を保存する可能性が高いと予想されるが、任意の特定のＣＤＲまたはフレームワークの突然変異の実際の効果は、当分野の技術者が精通した技法を使用して経験的に決定することができる。
【００４９】
ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲが、そのそれぞれのフレームワーク領域によって支援されて、抗原結合の特異性および親和性の確立を典型的には司っているが、例外も存在し得る。たとえば、特定のＩｇ分子では、ＦＲ残基も抗原結合に寄与する場合があり、他方で、特定の他のＩｇ分子では、ＣＤＲのうちの１つまたは複数が抗原と直接接触しない場合がある。さらに、さらに他のＩｇ分子では、単離したＶＨ領域およびＶＬ領域のＣＤＲは、それが通常対となるであろう対応する可変領域が存在しない場合でも、実質的な抗原結合特異性を保有する場合がある。抗原と特異的に結合する、特定の単離Ｉｇ分子可変領域の能力は、対にした重鎖を含むが軽鎖を含まないサメまたはラクダ抗体の抗原結合特異性に類似している。
【００５０】
特定の種のＩｇ分子は、様々なアイソタイプに従って分類することができる。たとえば、ヒトでは、ＩｇアイソタイプにはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭが含まれる。さらに、ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプは、それぞれＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４と呼ばれるサブタイプへと分類することができる。アイソタイプおよびサブタイプは、重鎖定常領域のアミノ酸配列の相違によって定義される。その結果、様々なアイソタイプおよびサブタイプは様々な免疫細胞上の様々なエフェクター分子と相互作用することができ、それによって様々なエフェクター機能が与えられる。たとえば、ＩｇＡ分子は粘膜（ｍｕｓｃｏｓａｌ）免疫に寄与する一方で、ＩｇＥ分子は特定の寄生生物に対する免疫に寄与する。ＩｇＭおよびＩｇＥの重鎖は、アミノ末端のＣＨ領域から開始してＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４と付番される４個の直列に配置されたＣＨ  Ｉｇドメインを含有する。しかし、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧは３個の直列に配置されたＣＨ領域しか含有しない。軽鎖定常領域は、知られている生物学的エフェクター機能を有さない、カッパおよびラムダと呼ばれる２つのアイソタイプを含む。天然に存在するＩｇ分子は単一の軽鎖定常領域アイソタイプのみを保有する。
【００５１】
抗体重鎖および軽鎖を発現する遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして知られる複数の遺伝子再編成によってｉｎ  ｖｉｖｏで構築される。このプロセスは、ゲノム中に存在する遺伝子配列の比較的限定的なレパートリーから、抗原結合タンパク質の大きなレパートリーを作成することを担っている。このプロセスに関するさらなる情報は、全体として参照により組み込まれるＡｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．、Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．およびＰｉｌｌａｉ，Ｓ．、２０１０、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、第８章、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、ペンシルベニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。
【００５２】
ヒト生殖系列ＤＮＡでは、３つの別個の遺伝子座位が、免疫グロブリン重鎖、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖を構築するために必要なエクソンをコードしている。重鎖座位は第１４染色体上に存在し、カッパ鎖座位は第２染色体上に存在し、ラムダ鎖座位は第２２染色体上に存在する。それぞれの座位の５’末端には、それぞれ約３００塩基対の長さの複数の可変（Ｖ）遺伝子セグメントが位置しており、これは、第１および第２の相補性決定領域（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）をどちらも含めた、抗体重鎖および軽鎖の可変領域を構成するアミノ酸の大多数をコードしている。ヒトでは、重鎖座位中に約１００個のＶ遺伝子が存在し、カッパ鎖座位中に約３５個のＶ遺伝子が存在し、ラムダ鎖座位中に約３０個のＶ遺伝子が存在する。Ｖ遺伝子セグメントはイントロンによって互いに隔てられている。
【００５３】
ヒト重鎖座位およびカッパ軽鎖座位中のＶセグメントの下流かつ定常（Ｃ）遺伝子セグメントの上流には、典型的には約３０〜５０塩基対の長さであり、互いにならびに隣接のＶおよびＣ遺伝子から非コード配列によって隔てられている、接合（Ｊ）セグメントのクラスターが位置する。重鎖座位は、様々なＩｇアイソタイプに関連づけられている９個の機能的なＣ遺伝子から上流に６個の機能的なＪセグメントのクラスターを含有し、カッパ軽鎖座位は、単一のＣκ遺伝子の上流に５個のＪセグメントのクラスターを含有する。また、ヒトラムダ軽鎖座位は４個の機能的なＪセグメントも含有するが、そのそれぞれは、４個の対応する機能的なＣλ遺伝子のうちの１つの５’側に位置する。また、ヒト重鎖座位は、Ｖ遺伝子の下流かつＪセグメントクラスターの上流に位置する、２０個を超える多様性（Ｄ）遺伝子セグメントのクラスターも含有する。軽鎖座位はどちらもＤ遺伝子セグメントを含有しない。
【００５４】
成熟Ｉｇ軽鎖遺伝子では、Ｖ領域はＶおよびＪ遺伝子セグメントによってコードされている一方で、Ｉｇ重鎖では、Ｖ領域はＶ、ＪおよびＤ遺伝子セグメントによってコードされている。重鎖および軽鎖のどちら中のＣＤＲ１およびＣＤＲ２も、Ｖ遺伝子セグメントによってコードされている。しかし、ＣＤＲ３の構築はより複雑である。重鎖では、ＣＤＲ３は、ＤおよびＪセグメントならびに接合部残基を含めたＶＤＪ接合部によってコードされている。同様に、軽鎖のＣＤＲ３は、Ｊセグメントおよび接合部残基を含めたＶＪ接合部によってコードされている。
【００５５】
未成熟Ｂ細胞では、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントはすべて生殖系列中で別々に位置しており、機能的なＩｇタンパク質を発現させるために使用することができない。その代わりに、Ｂ細胞が成熟するにつれて、遺伝子セグメントは、ランダムに選択された重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントまたは軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントを隣接させる、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして知られる複雑なＤＮＡ再編成プロセスを受ける。Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの接合中、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの実施を担っている分子が、セグメント間のヌクレオチドのランダムな付加または除去を行う。このようにして、完全可変領域エクソンが成熟Ｂ細胞のゲノム中で作製され、その後、これが、機能的なＩｇ重鎖および軽鎖タンパク質をコードしているｍＲＮＡ中で、Ｃ領域をコードしているものを含めた他のエクソンと組み合わせられる。
【００５６】
Ｖ領域エクソンを構築するための様々なＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントのランダムな組合せ、ならびに接合する遺伝子セグメント間のヌクレオチドのランダムな付加または除去はどちらも、免疫系が抗原結合部位の多大な多様性を生じる重要な機構である。これらの現象はそれぞれコンビナトリアル多様性および接合部多様性と呼ばれる。ＣＤＲ３は、重鎖の場合はＶ、ＤおよびＪセグメント、または軽鎖の場合はＶおよびＪセグメントによって寄与された配列から形成されているため、接合部多様性は、ＣＤＲ３が３つのＣＤＲのうちで最も可変性であり、典型的には抗原と最も広範囲の接触を行う理由を説明している。
【００５７】
Ｉｇ分子の構造は、本質的に、異なる領域が異なる機能を行うモジュール式であるため、ＧＤＦ−８結合能力を保持する抗ＧＤＦ−８抗体の断片または誘導体を調製することが可能である。そのような断片または誘導体は、本明細書中で使用する用語抗体によって包含される。Ｉｇ分子から調製される抗原結合断片または誘導体の非限定的な例には、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域を含む一価断片であるＦａｂ断片、ヒンジ領域を介して互いに接合させた２つのＦａｂを含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２、ＶＨおよびＣＨ１領域を含むＦｄ断片、ＶＬおよびＶＨ領域を含むＦｖ断片、ＶＨまたはＶＬ領域を含むｄＡｂ断片が含まれる。別の例は、単一ポリペプチド鎖中で直列に配置され、ポリペプチドリンカーによって隔てられて、可変領域が会合して一価の抗原結合部位を形成することを可能にしているＶＨおよびＶＬ領域を含む、単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）である。単鎖Ｆｖ領域は、ＶＨ領域がＶＬ領域の前に位置する、あるいはＶＬ領域がＶＨ領域の前に位置するように設計し得る。リンカーの非限定的な例は１５残基の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチド（配列番号３４）である。他のリンカーも可能である。他の断片または誘導体には、Ｆａｂ’、サロボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、およびサメ抗体もしくはラクダ化抗体またはナノボディなどの単一ドメイン抗体が含まれる。他の断片または誘導体も可能である。本明細書中に記載したものなどの抗原結合断片、部分または一部分は、組換えによって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成し得る。
【００５８】
例示的な抗ＧＤＦ−８抗体
ＧＤＦ−８とは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである成長および分化因子−８をいう。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列を配列番号１に記載する。
【００５９】
以前の調査により、ＧＤＦ−８と特異的に結合し、その生物活性を中和させる能力を有するマウスモノクローナル抗体が同定されている。この抗体は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のマウスモデルを含めたマウスにおいて筋肉量および筋力を増加させることが実証されている。全体として参照により組み込まれるＷＯ２００７／０２４５３５号を参照されたい。マウス抗体のＶＨ領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、そのＶＬ領域は配列番号４のアミノ酸配列を有する。これらのＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ図１Ａおよび図１Ｂ中に示し、ＶＨおよびＶＬ領域のそれぞれのＣＤＲのアミノ酸配列を太字で示す。ＫａｂａｔおよびＡｂＭ付番システムの両方におけるそれぞれのＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲに関連する配列番号を、以下に記載の表１中に列挙する。Ｋａｂａｔ付番システムの下で定義したＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３にはそれぞれ配列番号１０、１１および１２を割り当てた一方で、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３にはそれぞれ配列番号１３、１４、および１５を割り当てた。ＡｂＭ付番システムの下では、ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３にはそれぞれ配列番号２０、２１、および２２を割り当てた一方で、ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３にはそれぞれ配列番号２３、２４、および２５を割り当てた。
【００６０】
【表１−１】
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【００６１】
【表１−２】
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【００６２】
【表１−３】
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【００６３】
ＷＯ２００７／０２４５３５号中にさらに記載されているように、ＣＤＲ移植によってマウス抗体をヒト化した。具体的には、ヒト生殖系列可変重鎖（ＶＨ）遺伝子ＤＰ４７（ＶＨ３−２３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０１９４３９）をヒトアクセプターフレームワークとして使用し、それ上にマウスＶＨ  ＣＤＲを移植することによって、マウスＶＨ領域をヒト化した。ＤＰ４７のアミノ酸配列（配列番号３３）を図１Ａに示す。ヒト生殖系列カッパ可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子ＤＰＫ９（Ｏ１２ｍ  Ｖｋ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５９３１５）をヒトアクセプターフレームワークとして使用し、それ上にマウスＶＬ  ＣＤＲを移植することによって、マウスＶＬ領域をヒト化した。ＤＰＫ９のアミノ酸配列（配列番号３２）を図１Ｂに示す。
【００６４】
ＤＰ４７およびＤＰＫ９  Ｖ領域の配列は、組み換えたＶ領域遺伝子ではなく生殖系列に由来するため、ヒト化プロセスには、ＣＤＲ３のカルボキシ末端側にそれぞれの部分的に、ヒト化されたＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列をコードしているヒトＪ遺伝子セグメントを選択する必要もあった。ＷＯ２００７／０２４５３５号に記載されているように、ヒト化は、ＶＨ領域ではＪＨ３重鎖Ｊセグメント（配列番号３５）を使用して、（すなわちＤＰ４７／ＪＨ３）、ＶＬ領域ではＪＫ１軽鎖Ｊセグメント（配列番号３９）を使用して（すなわちＤＰＫ９／ＪＫ１）完成させた。これらのＪセグメント遺伝子によってコードされているアミノ酸配列は、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂ中に示す配列アラインメント中でＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３の直後に出現する。
【００６５】
本明細書中で使用する、ＷＯ２００７／０２４５３５号に記載のようにＤＰ４７およびＪＨ３を使用して構築したヒト化抗ＧＤＦ−８抗体ＶＨ領域は、ＶＨ１（配列番号７）と呼ぶ一方で、ＤＰＫ９およびＪＫ１を使用して構築したヒト化抗ＧＤＦ−８抗体ＶＬ領域はＶＬ１（配列番号９）と呼ぶ。また、本明細書中で使用する、ＶＨ１およびＶＬ１を含むヒト化抗ＧＤＦ−８抗体は、ＯＧＤ１．１．１と呼ぶ。この命名法では、ＶＨ領域番号が抗体名「ＯＧＤ１」の直後に続き、ＶＬ領域番号がＶＨ領域番号の直後に続く。したがって、たとえば、抗体名ＯＧＤ１．０．１はＶＨ０領域およびＶＬ１領域を有する抗体をいう一方で、抗体名ＯＧＤ１．１．０はＶＨ１領域およびＶＬ０領域を有する抗体をいう。マウスＶＨとＶＬ領域、ヒト化ＶＨ１とＶＬ１領域、およびＤＰＫ９とＤＰ４７遺伝子配列によってコードされているアミノ酸との間のアラインメントを、図１Ａおよび図１Ｂに例示する。
【００６６】
ＯＧＤ１．１．１よりも実質的に高いレベルで細胞によって発現される一方で、高い親和性でＧＤＦ−８と特異的に結合し、ＧＤＦ−８活性を中和する能力を保持するという驚くべき特性を有する、ヒト化抗ＧＤＦ−８抗体の新規型が本明細書中に記載されている。
【００６７】
これらの新規抗体の特定の実施形態では、異なる重鎖Ｊセグメント、すなわちＪＨ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００２５６）（配列番号３７）をＶＨ領域中のＣＤＲ３の後に使用した。この変化の結果、Ｋａｂａｔ付番スキームを使用して、ＶＨ１と比較して、ＶＨ領域位置１０８のＭｅｔ（Ｍ）をＬｅｕ（Ｌ）で置き換えられる。本明細書中で使用する、ＬがＫａｂａｔ位置１０８に出現するこの新規ヒト化ＶＨ領域は、ＶＨ０と呼ばれる。ＶＨ０のアミノ酸配列（配列番号４４）を図１Ａの配列アラインメントに例示する。
【００６８】
Ｋａｂａｔ付番スキームでは、可変長のＣＤＲを示すために一部の同じ数字に付記された文字を使用するため、残基のＫａｂａｔ番号とポリペプチド中の残基配列のその物理的位置とは必ずしも一対一に対応していない。このため、ＶＨ領域のＫａｂａｔ位置１０８は、配列番号４４（すなわちＶＨ０）および本明細書中に開示した他のヒト化ＶＨ領域のアミノ酸配列中のアミノ酸番号１１１に等しい。
【００６９】
本開示の抗体の他の実施形態では、異なる軽鎖Ｊセグメント、すなわちＪＫ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００２４２）（配列番号４１）をＶＬ領域中のＣＤＲ３の後に使用した。この変化の結果、Ｋａｂａｔ付番スキームを使用して、ＶＬ１と比較して、ＶＬ領域の位置１００のＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｙ（Ｇ）で置き換えられる。本明細書中で使用する、ＧがＫａｂａｔ位置１００に出現するこの新規ヒト化ＶＬ領域は、ＶＬ０と呼ばれる。ＶＬ０のアミノ酸配列（配列番号４６）を図１Ｂの配列アラインメントに例示する。
【００７０】
本明細書中で使用する、ＶＨ０を含む重鎖およびＶＬ０を含む軽鎖を含むヒト化抗ＧＤＦ−８抗体は、ＯＧＤ１．０．０と呼ばれる。
【００７１】
上述のＶＨおよびＶＬの実施形態に関連する遺伝子セグメント、配列および用語を以下の表２中に要約する。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
実施例中にさらに記載するように、驚くべきことに、ＶＨ０を含む抗ＧＤＦ−８抗体は、ＶＨ１を含む抗ＧＤＦ−８抗体と比較してはるかに高いレベルで細胞によって発現されることが見出された。たとえば、実施例１に記載の非限定的な一実施形態では、驚くべきことに、ＶＨ０およびＶＬ０を含むインタクトな免疫グロブリン（すなわちＯＧＤ１．０．０）は、ＶＨ１およびＶＬ１を含む同様の抗体（すなわちＯＧＤ１．１．１）よりも１２倍を超える高いレベルで一過的に発現されたことが実証された。また、実施例２に記載のように、安定発現レベルもはるかにより高かった。興味深いことに、実施例３中で調査したように、増強された発現は、ＶＨ０をＶＬ０またはＶＬ１のどちらと対にしたかにかかわらず起こり、また、ＶＬ０をＶＨ０と対にした際は起こったが、ＶＨ１では起こらなかったため、増強された発現はＶＨ０の存在に起因することが見出された。
【００７４】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、可変重鎖領域がＶＨ０であり、可変軽鎖領域がＶＬ０（ＯＧＤ１．０．０）またはＶＬ１（ＯＧＤ１．０．１）である完全長重鎖および軽鎖を含む、インタクトなヘテロ四量体Ｉｇ分子である一方で、他の実施形態では、抗体は、そのような完全長抗体のＧＤＦ−８特異的結合断片または誘導体である。
【００７５】
一部の実施形態によれば、本開示の抗体のＶＨ領域は、配列番号４４のアミノ酸配列またはそのマウス対応物である配列番号３中に存在する３つの重鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、Ｋａｂａｔ位置１０８のアミノ酸はロイシンである。他の実施形態では、ＶＨ領域は配列番号４４のアミノ酸配列（すなわちＶＨ０）を含む。他の実施形態では、本開示の抗体のＶＬ領域は、配列番号４６のアミノ酸配列またはそのマウス対応物である配列番号５中に存在する３つの軽鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、Ｋａｂａｔ位置１００のアミノ酸はグリシンまたはグルタミンである。他の実施形態では、ＶＬ領域は配列番号４６（すなわちＶＬ０）または配列番号４８（すなわちＶＬ１）のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
本開示の抗体では、抗体重鎖アイソタイプは、ヒトＩｇアイソタイプまたはサブタイプ、すなわち、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭのうちのいずれかであることができる。抗体軽鎖アイソタイプはカッパまたはラムダであることができる。特定の非限定的な実施形態では、抗体定常重鎖は配列番号１９または配列番号５７のアミノ酸配列であり、これらはどちらもＩｇＧ１サブタイプのものである。配列番号１９は、ヒンジ領域中に、免疫細胞上のＦｃ受容体との結合を妨げる２個の置換突然変異を含有する一方で、配列番号５７は追加のヒンジ領域突然変異を含有し、同様の表現型を有するものが合計で３個となる。別の特定の非限定的な実施形態では、軽鎖ＣＨ領域は、カッパアイソタイプである配列番号１７のアミノ酸配列である。
【００７７】
本開示の特定の非限定的な実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列による完全長抗体重鎖および配列番号５９のアミノ酸配列による完全長抗体軽鎖を含む。前者の配列はＶＨ０および配列番号５７のアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む一方で、後者の配列はＶＬ０および配列番号１７のアミノ酸配列の軽鎖カッパ定常領域を含む。別の例示的な非限定的な実施形態によれば、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体は、配列番号５８および配列番号５９のアミノ酸配列による２本の抗体重鎖および２本の抗体軽鎖からなるインタクトなヘテロ四量体抗体を含む（すなわちＯＧＤ１．０．０）。
【００７８】
上述のように、さらに他の実施形態では、本開示の抗体には、ＶＨ０を含む抗ＧＤＦ−８免疫グロブリンの抗原結合断片または誘導体が含まれる。断片または誘導体の特定の実施形態では、ＶＨ０をＶＬ０またはＶＬ１と対にし得る。本開示による断片または誘導体の非限定的な例には、ＶＨ０を含む、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、およびサメ抗体もしくはラクダ化抗体またはナノボディなどの単一ドメイン抗体が含まれる。他の断片または誘導体も可能である。本開示によるＩｇ誘導体の特定の非限定的な例には、ＶＬ０がＶＨ０のアミノ末端側に直列に配置されているｓｃＦｖである配列番号６３が含まれる。別の非限定的な例は、Ｖ領域が逆転しており、ＶＨ０がＶＬ０のアミノ末端側に直列に配置されているｓｃＦｖである配列番号６５である。
【００７９】
本開示の抗体は、マウス抗ＧＤＦ−８抗体の重鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＶＨ領域ＤＰ４７上に移植した免疫グロブリンによって例示したが、本開示のヒト化抗ＧＤＦ−８抗体はその可変領域の使用だけに限定されない。したがって、たとえば、抗体には、インタクトな免疫グロブリン、および、マウス重鎖ＣＤＲ（すなわち配列番号１０〜１２または２０〜２２）をＤＰ４７とは異なるヒトＶＨ領域上に移植し、生じるＶＨ領域ポリペプチドにはＫａｂａｔ位置１０８にＬｅｕ（Ｌ）が含まれるように改変した、その断片もしくは誘導体も含まれる。他のヒト生殖系列ＶＨ領域の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、またはＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）もしくはＶＢＡＳＥ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）を含めた様々な公的に利用可能なインターネットデータベースを検索することによって見つけることができる。
【００８０】
実施例１０にさらに記載するように、ＯＧＤ１．０．０と、ＧＤＦ−８と結合したそれぞれ配列番号３および配列番号５のマウスＶＨおよびＶＬ領域を含むキメラ抗ＧＤＦ−８抗体との共結晶構造を解析し、抗原結合を担っている抗体中の接触残基を同定するために使用した。この情報を使用して、かつ実施例１１にさらに記載するように、ＣＤＲ中の非接触残基を、ヒト生殖系列可変配列中の同じ位置に存在する残基に一致するように突然変異させることによって、ＶＨおよびＶＬ領域をさらにヒト化した。図１Ａ中に示すように、さらなるヒト化可変重鎖領域はＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４およびＶＨ５と呼ばれる。図１Ｂ中に示すように、さらなるヒト化可変軽鎖領域はＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４およびＶＬ５と呼ばれる。
【００８１】
本開示の抗体の特定の実施形態では、ヒト化ＶＨ領域のうちのいずれかをヒト化ＶＬ領域のうちのいずれかと対にして、インタクトな抗ＧＤＦ−８抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体を生じ得る。たとえば、特定の実施形態では、ＶＨ０を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。他の実施形態では、ＶＨ１を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。他の実施形態では、ＶＨ２を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。他の実施形態では、ＶＨ３を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。他の実施形態では、ＶＨ４を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。特定の他の実施形態では、ＶＨ５を、ＶＬ領域であるＶＬ０、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、またはＶＬ５のうちのいずれかと対にし得る。
【００８２】
上述のように、ＣＤＲおよびフレームワーク領域内の非接触残基の突然変異はＧＤＦ−８の結合特異性および／または親和性に最小限の影響しか与えないと予想される一方で、接触残基の突然変異はより大きな影響を与えると予想される。突然変異、特に接触残基のものは結合特異性および／または親和性を低下させ得るが、一部の事例では、突然変異がＧＤＦ−８に対する特異性および／または親和性を増加させることが観察されるであろう。特異性または親和性に対する任意の特定の突然変異の実際の効果は、当業者が精通した技法、たとえば表面プラズモン共鳴または他の技法を使用して決定することができる。
【００８３】
前述の原理に鑑みて、特定の実施形態では、本開示の抗体の１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲまたはフレームワーク領域内の１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの非接触残基を異なるアミノ酸残基で保存的または非保存的に置換しても、ＧＤＦ−８に対する実質的な特異性および結合親和性を保持することができる。他の実施形態では、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ内の１つ、２つ、３つまたはそれより多くの接触残基を保存的に置換しても、実質的なＧＤＦ−８の特異性および結合親和性を保持することができる。さらに他の実施形態では、非接触残基または接触残基の突然変異は、ＧＤＦ−８に対する改善された特異性および／または親和性をもたらす。
【００８４】
本開示の抗体の他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列は、本明細書中に具体的に列挙した配列から様々なパーセンテージで異なっていても、実質的なまたは改善さえされた、ＧＤＦ−８に対する特異性および／または親和性を保持し得る。したがって、特定の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体のＶＨ領域は、ＶＨ０、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、またはＶＨ５のアミノ酸配列から８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％異なることができる。他の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体のＶＬ領域は、ＶＬ０、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、またはＶＨ５のアミノ酸配列から８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％異なることができる。さらに他の実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、同様のパーセンテージで本明細書中に具体的に列挙したものと異なっている一方で、実質的なまたは改善さえされた、ＧＤＦ−８の特異性および／または結合親和性を保持することができる。
【００８５】
また、本開示の抗体は、その特性を変更する、またはその機能を改善させるために、誘導体化、共有的修飾、または他の分子とコンジュゲートさせることもできる。たとえば、いかなる様式でも限定するものではないが、誘導体化抗体には、たとえば、グリコシル化、フコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、既知の保護／遮断基による誘導体化、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾された抗体が含まれる。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＤＦ−８抗体の重鎖のＣ末端リシンを切断および除去し得る。したがって、たとえば、本開示の特定の実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、Ｃ末端リシンを欠く配列番号１９もしくは配列番号５７の重鎖定常領域を含むか、または、Ｃ末端リシンを欠く配列番号５８の抗体重鎖を含むことができる。
【００８７】
抗ＧＤＦ−８抗体の構造への特定の修飾は、それらが産生される細胞の種類の結果として天然に起こり得る。非限定的な例では、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞中での抗体の合成は、抗体鎖中の１つまたは複数のアミノ酸でのグリコシル化をもたらし得る。抗ＧＤＦ−８抗体の例示的な非限定的な実施形態では、重鎖中のアミノ酸Ｎ２９６がグリコシル化されている。他の部位でのグリコシル化も可能であり得る。当業者には理解されるように、一部の他の種類の細胞、たとえば細菌細胞中での抗体の産生は、グリコシル化されていない抗体鎖をもたらす場合がある。他の種類の抗体修飾は、天然に、または抗体精製中もしくはその後に行われる化学的もしくは酵素的修飾によって非天然に起こり得る。
【００８８】
あるいは、可変または定常領域中の特定のアミノ酸を変更して、機能を変化または改善させることができる。非限定的な一例では、抗体のＦｃ領域中のアミノ酸残基を変更して、ＦｃＲｎとのその結合を増加させることによって抗体の血清半減期を増加させ得る。たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０００／００９５６０号を参照されたい。他の非限定的な例では、抗体のアミノ酸を変化させて、１つまたは複数のＦｃ受容体、補体、またはＩｇの生物学的エフェクター機能を媒介する他の免疫受容体との結合を低下させることができる。別の非限定的な例では、ＣＤＲ、フレームワーク領域または定常領域中のアミノ酸を変化させて、ＧＤＦ−８の結合親和性を増加させ得るまたは免疫原性を低下させ得る。特定の非限定的な例では、本開示の抗体のＶＨまたはＶＬ領域の特定のヒトフレームワーク残基を、それぞれ配列番号２６および配列番号２７のアミノ酸配列のように、そのマウス対応物へと変化させて戻し得る。
【００８９】
他の実施形態では、抗体を検出可能な部分で標識し、検出することができ、これらはどちらも当業者が精通した方法に従って行う。そのような標識は、本開示の抗体と直接または間接的にコンジュゲートさせることができる。標識は、それ自体が直接検出可能であるか（たとえば、放射性核種もしくは蛍光標識）、または検出可能な分子（たとえば、基質が直接検出可能な生成物を生じることを触媒する酵素標識）を生成するその能力によって間接的に検出可能であることができる。検出可能な標識の例には、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）、補欠分子族（たとえばビオチンなど）、蛍光色素もしくは部分（たとえば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、ルミネセント部分、生物発光性部分、放射性核種（たとえば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、陽電子放射原子もしくはイオン、磁気原子もしくはイオン、常磁性金属原子もしくはイオン、または他の抗体によって特異的に結合されることができるペプチドエピトープが含まれる。一部の実施形態では、抗原結合部位との潜在的な立体障害を低下または防止するために、様々な長さのスペーサーを使用して標識を付着させ得る。
【００９０】
本開示の抗体は、哺乳動物タンパク質の発現を維持することができる任意の細胞種から、培養物中または動物内で発現させることができる。非限定的な例には、ヒト細胞、マウス、ラットもしくは他のげっ歯類細胞、他の哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、または他の真菌の細胞、植物細胞、もしくは細菌細胞が含まれる。Ｉｇ分子またはその断片もしくは誘導体をコードしているＤＮＡを発現ベクター内にクローニングし、その後、細胞をそのようなベクターで一過的または安定に形質移入するために有用な技法は、当分野で周知である。抗体発現レベルを最大にするために培養条件を変更することができる。また、抗体を当業者が精通した技法を使用して動物内で発現させ、その後、乳または他の体液から精製することもできる。また、抗体は完全にまたは部分的に合成であってもよい。
【００９１】
本開示の抗体は、高い親和性、たとえば、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８、１×１０−９、１×１０−１０、１×１０−１１Ｍまたはそれより高い平衡解離定数（ＫＤ）でＧＤＦ−８と結合する。ＧＤＦ−８に対する抗ＧＤＦ−８抗体のＫＤは、当業者が精通した様々な方法に従って決定することができる。そのような技法の非限定的な例には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＥＬＩＳＡが含まれる。当業者が精通しているように、結合活性効果により、２つ以上の抗原結合部位を有する抗ＧＤＦ−８抗体の見かけの結合親和性は一価の抗原結合部位を有する抗体断片よりも高い場合がある。
【００９２】
本開示の抗体はＧＤＦ−８に特異的であるが、そのような抗体は、認識されるエピトープまたは複数のエピトープに応じて、ＧＤＦ−１１として知られる密に関連する成長および分化因子とも高い親和性で結合できる場合がある。したがって、ＧＤＦ−８に特異的な抗体は、ＧＤＦ−１１分子と結合することができる抗体を必ずしも排除しない。
【００９３】
本明細書中で使用する中和抗ＧＤＦ−８抗体とは、非特異的な対照抗体または他の適切な対照と比較してＧＤＦ−８の生物活性を低下させるものである。任意の特定の動作理論に束縛されることを望まずに、抗ＧＤＦ−８抗体がＧＤＦ−８によって媒介される生物学的機能を中和し得る方法の少なくとも１つは、成熟ＧＤＦ−８とその高親和性受容体、たとえばＡｃｔＲＩＩＢ、またはその低親和性受容体のうちの１つもしくは複数との結合を防止することである。しかし、抗ＧＤＦ−８中和抗体がＧＤＦ−８生物活性を妨害し得る他の機構も可能である。
【００９４】
本開示の中和抗体によって低下させ得る、ＧＤＦ−８によって媒介される数々の生物活性が当分野で知られている。非限定的な例には、たとえばＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して測定することができる、ＧＤＦ−８のＡｃｔＲＩＩＢとの結合が含まれる。別の例には、たとえば、いわゆるＣＡＧＡ要素を含めた形質移入したレポーター遺伝子を使用して検出することができる、ＧＤＦ−８によるその細胞性シグナル伝達経路の活性化が含まれる。たとえば、参照により組み込まれるＬｅｅら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＮＡＳ（２００５）１０２：１８１１７〜１８１２２およびＴｈｉｅｓら、ＧＤＦ−８  Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ＧＤＦ−８  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＧＤＦ−８  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（２００１）１８：２５１〜５９を参照されたい。さらに別の例には、ＧＤＦ−８に媒介されるシグナル伝達を細胞表面のＧＤＦ−８受容体から核内へと運搬することを担っているＳＭＡＤタンパク質のリン酸化が含まれる。たとえば参照により組み込まれるＰｈｉｌｉｐら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＤＦ−８  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐ３８  ＭＡＰＫ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（２００５）１７：３６５〜３７５を参照されたい。ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化は、たとえば、抗ホスホＳＭＡＤ抗体を使用した定量的ウエスタンブロッティングで検出することができる。また、通常はＧＤＦ−８によって活性化または抑圧されている遺伝子の、下流遺伝子発現のモジュレーションも検出することができる。本発明の中和抗体を使用して低下させることができる、ＧＤＦ−８に媒介される活性のさらに別の例は、筋肉量または筋力の負の調節。他の活性も可能である。
【００９５】
本開示の中和抗体は、抗体や抗原の濃度および結合親和性、ならびに他のものなどの当業者が精通した変数に応じて、ＧＤＦ−８によって媒介される生物活性を様々な度合まで低下させることができる。ＧＤＦ−８と結合する抗体によって引き起こされるＧＤＦ−８に媒介される生物活性における、例示的な非限定的なパーセンテージ低下には、適切な対照と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより高い低下が含まれる。
【００９６】
抗ＧＤＦ−８抗体によるＧＤＦ−８に媒介される生物活性の阻害は、選択されたどのようなアッセイ条件下でも、生物活性の５０％を阻害することができるそのような抗体の濃度として好都合に表すことができる。この濃度はＩＣ５０とも呼ばれる。特定の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体は、約５００ｎＭ以下、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ以下、またはそれ未満のＩＣ５０値を有する。
【００９７】
分泌リーダー配列
特定の実施形態によれば、抗体重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に、新しく合成されたタンパク質を分泌区画へと向かわせるアミノ末端分泌リーダーペプチドをコードしている配列を提供することができる。その後、翻訳後プロセッシングによりリーダーペプチドが除去された後に、成熟抗体が細胞から分泌される。本開示の抗体の特定の非限定的な実施形態では、ＶＨ０、ＶＨ１、ＶＬ０およびＶＬ１領域に、１９個のアミノ酸の長さの分泌リーダーペプチドを提供する。リーダー配列を含めたこれらのＶ領域に以下の配列識別番号を割り当てる：ＶＨ０（配列番号５０）、ＶＬ０（配列番号５２）、ＶＨ１（配列番号５４）、およびＶＬ１（配列番号５６）。他の分泌リーダー配列も使用し得る。非限定的な例には、マウスＶＨ領域の最初の１９個のアミノ酸およびそのリーダー配列（配列番号２９）、ならびにマウスＶＬ領域の最初の２０個のアミノ酸およびリーダー配列（配列番号３１）が含まれる。
【００９８】
抗ＧＤＦ−８抗体の発現
実施例中にさらに詳細に記載するように、ＯＧＤ１．０．０は、哺乳動物細胞においてＯＧＤ１．１．１よりも実質的に高いレベルで発現された。たとえば、ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１を、一過的に形質移入したＣＯＳ細胞中で発現させた場合、ＯＧＤ１．０．０はＯＧＤ１．１．１よりも約１２倍高いレベルで発現された。同様に、これらの抗体を安定に形質移入したＣＨＯ細胞中で発現させた場合、ＯＧＤ１．０．０はＯＧＤ１．１．１よりも約６倍高いレベルで発現された。また、実施例中に記載するように、発現レベルの相違は、抗体中にＶＨ１の代わりにＶＨ０が存在することに主に起因していると考えられる。
【００９９】
したがって、ＶＨ０を含む本開示の抗体は、同様の条件下で発現させた場合に、ＶＨ１を含む同様の抗体よりも高い発現を示す。たとえば、特定の実施形態では、ＶＨ０を含む抗体の発現レベルは、同様の条件下で発現させたＶＨ１を含有する同様の抗体のそれよりも、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれより多い量で高い。抗体間の発現レベルの相違の程度は、たとえば、抗体を発現させるために使用した宿主細胞の種類、たとえばＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞、または、宿主細胞を一過的にもしくは安定に形質移入したかに依存し得る。ＶＨ０またはＶＨ１可変重鎖領域を含有する抗体の比較発現レベルは、他の成長条件を変化させることに伴って変動する場合があり、当業者が精通した方法を使用して決定することができる。
【０１００】
他の実施形態では、ＶＨ０抗体発現のレベルは、同様の条件下で発現させたＶＨ１を含有する同様の抗体のそれよりも、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％またはそれより多い量で高い。本明細書中に列挙したパーセンテージ間などの、発現レベルの他の相違も可能である。
【０１０１】
抗体発現レベルは、当業者が精通した技法を使用して測定することができる。非限定的な一例では、抗体発現レベルは、定量的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定することができる。当業者の知識に従って他の定量的アッセイも使用し得る。
【０１０２】
抗ＧＤＦ−８抗体をコードしている核酸分子
また、本開示は、抗ＧＤＦ−８抗体をコードしている核酸分子またはポリヌクレオチドも提供する。核酸は、ＤＮＡ、またはＤＮＡ核酸塩基配列中でＵがＴを置き換えるＲＮＡを含み得る。また、核酸は、非標準核酸塩基（たとえば５メチルシトシン）または修飾された主鎖（たとえばホスホロチオエート）などの修飾も含有し得る。他の修飾が可能である。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、細胞または全生物などのように天然源から入手し得る。天然源の核酸の非限定的な例には、ゲノムＤＮＡ、増幅したプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡが含まれる。あるいは、核酸を合成し得る。合成核酸の非限定的な例には、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、または核酸合成機で合成した核酸が含まれる。
【０１０３】
特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＶＨ０を含む抗体重鎖またはその断片もしくは誘導体のアミノ酸配列をコードしている。他の実施形態では、核酸は、ＶＬ０を含む抗体軽鎖またはその誘導体もしくは断片のアミノ酸配列をコードしている。さらに他の実施形態では、ＶＨ０およびＶＬ０またはＶＬ１などのＶＬ領域をコードしている核酸配列は、異なるまたは同じ単離ポリヌクレオチド中に存在する。
【０１０４】
本開示は、抗ＧＤＦ−８抗体またはその断片もしくは誘導体をコードしている具体的な核酸配列を提供するが、当業者には、遺伝暗号の縮重が原因でそのような配列は単に例示的なものであり、限定的であると解釈されるべきでないことが理解されよう。したがって、マウス抗ＧＤＦ−８抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードしている例示的な核酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４である。ＶＨ１をコードしている例示的な核酸配列は配列番号６および配列番号４７である。ＶＬ１をコードしている例示的な核酸配列は配列番号８および配列番号４８である。ＶＨ０をコードしている例示的な核酸配列は配列番号４３である。ＶＬ０をコードしている例示的な核酸配列は配列番号４５である。２個のヒンジ領域突然変異を含有するＩｇＧ１のＣＨ領域を含む、配列番号１９のアミノ酸配列をコードしている例示的な核酸配列は、配列番号１８である。ヒトカッパＣＬ領域を含む配列番号１７のアミノ酸配列をコードしている例示的な核酸配列は、配列番号１６である。リーダー配列によって先行される、マウス抗ＧＤＦ−８抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードしている例示的な核酸配列は、それぞれ配列番号２８および配列番号３０である。リーダー配列によって先行される、ＶＨ０、ＶＬ０、ＶＨ１およびＶＬ１領域のアミノ酸配列をコードしている例示的な核酸配列は、それぞれ配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５５である。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、核酸分子は、以下の配列番号のうちのいずれかのアミノ酸をコードしている核酸配列を含む：７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６３または６５。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６３または６５と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。さらに他の実施形態では、核酸分子は、ＶＨ０（配列番号４４）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、Ｋａｂａｔ位置１０８がロイシンであるアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、核酸分子は、以下の配列番号のうちのいずれかの核酸配列を含む：６、８、１６、１８、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９、５１、５３、５５、６２または６４。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号６、８、１６、１８、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９、５１、５３、５５、６２または６４の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含む。さらに他の実施形態では、核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号６、８、１６、１８、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９、５１、５３、５５、６２または６４の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１０７】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、ハイブリダイズさせる核酸を、１×ＳＳＣ中で６５℃、または１×ＳＳＣおよび５０％のホルムアミド中で４２℃にてインキュベーションし、次いで０．３×ＳＳＣ中で６５℃にて洗浄することである。ストリンジェンシー条件のさらなる例は、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第９章および第１１章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）中に提供されている。
【０１０８】
当業者には理解されるように、本開示の核酸のうちの特定のものをインフレームで一緒にライゲーションさせて、複合核酸配列を作製し得る。たとえば、ＶＨ０をコードしている核酸を、ＣＨ領域をコードしている核酸とインフレームでライゲーションさせて、完全重鎖をコードしている複合核酸を作製することができる。非限定的な例では、ＶＨ０をコードしている配列番号４３の核酸配列を、エフェクター機能に影響を与える３個の突然変異を含有するヒトＩｇＧ１重鎖の定常部分である、配列番号５７のアミノ酸配列をコードしている核酸配列とインフレームでライゲーションさせることができる。軽鎖を作製するための同様のライゲーションが可能であり、本明細書中に記載の核酸の他の複合体を作製するための他のライゲーションも可能である。
【０１０９】
ベクター
当分野の技術者に周知の技法を使用して、本開示の核酸をベクター内に取り込ませ得る。特定の実施形態では、ベクターには、プラスミド、一般的には細菌プラスミド、真核エピソーム、酵母人工染色体およびウイルスゲノムが含まれる。例示的な非限定的なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ならびにカリフラワーモザイクウイルスおよびタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルスが含まれる。他の種類のベクターが可能である。一部の実施形態では、ベクターは、適切な宿主中で自律複製が可能である。他の実施形態では、ベクターは、宿主中において染色体外で維持されるか、または宿主のゲノム内に組み込まれることができ、ベクターが宿主のゲノムと共に複製されることが可能となる。遺伝子ならびに遺伝子の転写および翻訳を維持するために十分な制御配列を含むベクターは発現ベクターと呼ばれる。本開示によるベクターは、当分野の技術者の知識に従って、細菌細胞、他の原核細胞、酵母細胞、他の真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、およびヒト細胞などを含めた、Ｉｇ遺伝子の発現を支援することができる任意の細胞腫中で機能するように選択または設計し得る。
【０１１０】
ベクターは、１つまたは複数の制御配列を任意選択で含有し得る。複製起点などの特定の制御配列が複製を許可する。プロモーター、エンハンサー、および転写終結部位などの他の制御配列が転写を制御またはモジュレートする。プロモーターまたはエンハンサーの非限定的な例は、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、またはポリオーマウイルスに由来するものである。さらなる例には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、構成的活性型のプロモーターおよびエンハンサー、誘導性のプロモーターおよびエンハンサー、Ｉｇ遺伝子プロモーターおよびエンハンサーならびにアクチンプロモーターおよびエンハンサーが含まれる。他のプロモーターおよびエンハンサーも可能である。
【０１１１】
スプライシングおよびポリアデニル化シグナルまたはｍＲＮＡの安定性を増加もしくは減少させるシグナルなどの特定の制御配列は、転写後ＲＮＡプロセッシングを制御またはモジュレートする。さらに他の制御配列は、タンパク質翻訳（翻訳開始配列（たとえばコザックコンセンサス配列）など）、翻訳後プロセッシング（宿主細胞から出ていく遺伝子産物の分泌を指示するシグナルペプチド配列など）、またはタンパク質の安定性を制御またはモジュレートする。シグナルペプチド配列は、免疫グロブリン、またはＩｇスーパーファミリーの一部ではない分泌タンパク質に由来することができる。他の制御配列も可能である。
【０１１２】
また、ベクターには、ベクターを取り込んだ宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子も含めることができる。非限定的な例には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートを使用した選択を可能にする、ｄｈｆｒ−宿主細胞で使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８または同様の薬物を用いた選択を可能にする）、ｈｐｈ遺伝子（ハイグロマイシンＢを用いた選択を可能にする）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子（メチオニンスルホキシミンを用いた選択を可能にする）などの薬物耐性表現型を与える選択マーカー遺伝子が含まれる。
【０１１３】
一部の実施形態では、ベクターは、単一のＩｇ重鎖もしくは軽鎖またはその抗原結合断片をコードしているが、同じベクター中で両方の鎖はコードしていない核酸配列を含むことができる。典型的には、そのようなベクターからのインタクトな抗体の発現は、重鎖および軽鎖を含む別々のベクターを同じ細胞内に導入することを含む。他の実施形態では、ベクターは、重鎖および軽鎖Ｉｇ鎖またはその抗原結合断片の両方を同じベクター中でコードしている核酸配列を含むことができる。
【０１１４】
本開示の核酸分子、またはそのような核酸を含むベクターを、抗体発現を支援することができる１つまたは複数の種類の宿主細胞内に導入し得る。核酸またはベクターを適切な宿主細胞内に導入する方法は当業者に周知である。非限定的な例には、標的宿主細胞の一過性および安定形質移入、形質転換、形質導入およびウイルス感染症が含まれる。他の例には、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム中へのカプセル封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれる。例示的な非限定的な方法は、たとえば、参照により組み込まれる米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号に記載されている。また、植物細胞を形質転換させる方法も当分野で周知であり、たとえば、アグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、電気穿孔およびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換させる方法も当分野で周知である。
【０１１５】
宿主細胞
特定の実施形態では、本開示の抗体またはその断片もしくは誘導体をコードしている核酸を、発現を目的として適切な宿主細胞内に導入する。抗体を発現することができる細胞には、細菌、真菌、植物、動物、および哺乳動物細胞が含まれる。当業者の知識に従って他の種類の細胞も使用し得る。
【０１１６】
抗体発現のための宿主として適切な哺乳動物細胞系は当分野で知られている。例示的な非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（たとえば、ＣＯＳ、ＣＶ−１またはＶｅｒｏ細胞）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえばＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、Ａ４３１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞などを含めた、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）または他の供給源から入手可能な特定の不死化細胞系が含まれる。抗体発現のための宿主として適切な他の動物、昆虫、または哺乳動物細胞が可能である。
【０１１７】
他の実施形態では、昆虫、植物、細菌または真菌からの細胞系を使用し得る。例示的な非限定的な昆虫細胞には、しばしばバキュロウイルスベクター発現系と併せて使用されるＳｆ９またはＳｆ２１細胞が含まれる。例示的な非限定的な植物細胞には、タバコ（ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、トウモロコシ、コムギ、およびジャガイモ種のものが含まれる。例示的な非限定的な細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株が含まれる。例示的な非限定的な真菌には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母株、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）酵母株が含まれる。他の昆虫、植物、細菌および真菌細胞が可能である。
【０１１８】
様々な種類の宿主細胞を抗体発現に寄与する条件下で成長および維持する方法は当分野で周知である。抗体発現が起こった後、そのような発現させた抗体を、その後に当業者の知識に従って宿主細胞から精製することができる。たとえば、分泌された抗体を、宿主細胞を成長させた培地から精製することができる。あるいは、一部の実施形態では、特に宿主細胞が細胞壁を有する場合は、宿主細胞を機械的、化学的または酵素的に破壊して開放して、細胞内に隔離された発現抗体を放出させることができる。抗体精製の例示的な非限定的な方法には、イオン交換クロマトグラフィー、塩析、およびゲル濾過が含まれる。他の実施形態では、親和性クロマトグラフィーを使用し得る。たとえば、ヒト定常領域の配列を認識するマウス抗体を精製カラムに固定することができる。あるいは、親和性タグと密に結合する特定の抗体または他の分子を用いた精製のために、抗体を、エピトープタグ、またはマルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、およびチオレドキシンなどのより大きな親和性タグと融合させて発現させることができる。それ以降、エピトープまたは親和性タグを、当業者が精通した技法を使用して切断し、抗体を、本明細書中に開示したものなどの他の技法を使用して精製することができる。抗体を培地および宿主細胞から精製する他の技法も可能である。また、場合によっては、抗体を適正製造基準または他の規制上の要件に従ってさらに精製するために、抗体を追加の処理ステップに供することもできる。適切な精製およびそれらを実施するためのステップは当業者の知識範囲内にある。
【０１１９】
トランスジェニック動物および植物
また、本開示の抗体は、遺伝子改変した非ヒト動物または植物中でも産生させ得る。そのような生物における抗体の発現は構成的または誘導性であり得る。その後、そのような生物中で発現された抗体を、当業者に知られている技法を使用して単離することができる。抗体およびその抗原結合断片をトランスジェニック非ヒト生物中で発現させる方法は当分野で周知である。非限定的な例では、本開示の抗体は、ヤギ、ウシ、または他の非ヒト哺乳動物の乳中で産生させ、それから回収することができる。たとえば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２７，６９０号、第５，７５６，６８７号、第５，７５０，１７２号、および第５，７４１，９５７号を参照されたい。抗体が生産され得るトランスジェニック哺乳動物の他の非限定的な例は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、またはウマである。抗体を単離し得る体液のさらなる非限定的な例は血液である。他の体液も可能である。また、本開示の抗体は、植物中で産生させ、それから回収してもよい。たとえば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４１７，４２９号、第６，０４６，０３７号、および第５，９５９，１７７号を参照されたい。
【０１２０】
医薬組成物
本開示の治療的および予防的方法で使用するためには、本明細書中に開示した抗体を組成物として製剤化することができる。任意選択で、組成物は、ＧＤＦ−８媒介性障害に対して治療上または予防上有効である、本明細書中に開示したものとは異なるＧＤＦ−８エピトープと結合する抗体を含めた、１つまたは複数の追加の薬剤を含むことができる。組成物は、通常は、一般に薬学的に許容できる担体が含まれる無菌的な医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、それを患者に投与するための所望の方法に応じて、任意の適切な形態であることができる。
【０１２１】
本開示の抗体は、様々な経路によって、典型的には非経口的に、たとえば、皮下、静脈内、腹腔内または筋肉内注射を介して、対象に投与することができる。投与は、１回もしくは複数回のボーラス注射として、または１回もしくは複数回の注入として達成することができる。当分野の技術者の知識に従って他の投与経路も可能である。任意の所定の事例における投与に最も適切な経路は、投与する具体的な組成物、および処置する障害、年齢または性別などの対象の特徴に依存し得る。
【０１２２】
医薬組成物は、１用量あたり事前に決定した量の抗体を含有する単位剤形で好都合に提示することができる。そのような単位は、たとえば、それだけには限定されないが、５ｍｇ〜５ｇ、１０ｍｇ〜１ｇ、または２０〜５０ｍｇを含有することができる。本開示において使用するための薬学的に許容できる担体は、たとえば投与経路に応じて、様々な形態をとることができる。
【０１２３】
本開示の医薬組成物は、所望の度合の純度を有する抗体を、任意選択の、当分野において典型的に用いられる薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤（すべて本明細書中で「担体」と呼ぶ）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤、および他の種々雑多な添加剤と混合することによって、貯蔵のために凍結乾燥製剤または水溶液として調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ編、１９８０）を参照されたい。そのような添加剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに対して無毒性でなければならない。
【０１２４】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近似の範囲に維持することを助ける。これらは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。本開示において使用するための適切な緩衝剤には、クエン酸塩緩衝液（たとえば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（たとえば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝液（たとえば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝液（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸塩緩衝液（たとえば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝液（たとえば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝液（たとえば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、および酢酸塩緩衝液（たとえば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）等の、有機および無機酸のどちらも、ならびにその塩が含まれる。さらに、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。
【０１２５】
保存剤は、微生物の成長を遅らせるために加えることができ、０．２％〜４％（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えることができる。本開示において使用するための適切な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンズアルコニウムハロゲン化物（たとえば、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、ならびに３−ペンタノールが含まれる。時折「安定化剤」としても知られる等張化剤は、本開示の液体組成物の等張性を確実にするために加えることができ、多価（ｐｏｌｈｙｄｒｉｃ）糖アルコール、たとえば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが含まれる。安定化剤とは、充填剤から、治療剤を可溶化させるまたは変性もしくは容器壁への付着の防止を助ける添加剤までにわたって機能することができる、広義の分類の賦形剤をいう。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（上記に列挙）、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールを含めた、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、低分子量ポリペプチド（たとえば１０個以下の残基のペプチド）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖、ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖、ラフィノースなどの三糖、ならびにデキストランなどの多糖であることができる。安定化剤は、活性タンパク質の１重量部あたり０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在することができる。
【０１２６】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、抗体および含め得る任意の他の治療剤を、撹拌誘導性の凝集に対抗して可溶化することを助けるために加えることができ、これは、タンパク質の変性を引き起こさずに組成物が剪断表面応力に曝されることも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（商標）−８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、たとえば約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在することができる。
【０１２７】
さらなる種々雑多な賦形剤には、キレート化剤（たとえばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれることができる。
【０１２８】
例示的な非限定的な実施形態では、本開示の抗体は、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、８５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＳ−８０、０．０５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、ｐＨ５．８を含む溶液中で製剤化する。他の実施形態では、この製剤中の抗体の濃度は１００ｍｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、この製剤中の抗体を凍結乾燥する。
【０１２９】
医薬キット
特定の実施形態では、本発明は、臨床家または他の者が使用するための医薬キットを提供する。医薬キットとは、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体（たとえば凍結乾燥形態または水溶液のどちらかとして）と、以下のうちの１つまたは複数とを含むパッケージである：本開示中の他の箇所に記載されている少なくとも第２の治療剤、抗体を投与するための装置、たとえば針および／またはシリンジ、ならびに抗体が凍結乾燥または濃縮形態である場合は、抗体を再懸濁または希釈するための薬学的グレードの水または緩衝液。また、キットには、抗体組成物を調製するため、および／または組成物を患者に投与するための指示も含まれ得る。
【０１３０】
抗ＧＤＦ−８抗体組成物のそれぞれの単位用量は別々に包装することができ、キットは１つまたは複数の単位用量（たとえば、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、７単位用量、８単位用量、１０単位用量、またはそれより多く）を含有することができる。一実施形態では、１つまたは複数の単位用量はシリンジ中にそれぞれ格納されており、別の実施形態では、１つまたは複数の単位用量は、Ｉ．Ｖ．ラインに接続するために適したバッグまたは同様の容器中にそれぞれ含有されている。
【０１３１】
処置および予防の方法
本開示は、ＧＤＦ−８活性を低下させることが治療上の利点を直接または間接的にもたらす、状態および障害を処置および予防する方法を提供する。そのような方法は、対象に、有効量の抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することを含む。これらの実施形態のうちの特定のものでは、抗体は、ＯＧＤ１．０．０、またはそのＧＤＦ−８結合断片、部分、一部分もしくは誘導体である。
【０１３２】
抗ＧＤＦ−８抗体組成物を投与することができる対象は、非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（たとえば、サル、チンパンジー、類人猿もしくはヒト）などの哺乳動物であり得る。対象は成人患者または小児患者などのヒトであることができる。
【０１３３】
本開示の抗体組成物で処置することができる状態および障害は、少なくとも部分的にＧＤＦ−８によって媒介されるもの、または対象においてＧＤＦ−８活性を低下させることが治療上の利点を与えるであろうことを示唆する科学的な理論的根拠が存在する場合である。
【０１３４】
治療上の利点は、具体的な状態または障害に部分的に依存するが、対象においてＧＤＦ−８活性を低下させることが、状態もしくは障害の症状、兆候もしくは重症度のいかなる寛解をももたらす場合、または、そのような症状、兆候もしくは重症度の進行性の悪化を停止もしくは遅延させる場合に、治療上の利点が存在する。ＧＤＦ−８活性を低下させることが対象の平均余命、快適さまたは生活の質を増加させる場合に、治療上の利点がさらに存在する。また、ＧＤＦ−８活性を低下させることが、対象の１つもしくは複数の身体的もしくは生理的機能の増悪を改善、すなわち停止もしくは遅延させる場合、またはそのような機能を反映する試験における対象の成績を改善させる場合にも、治療上の利点が存在する。
【０１３５】
治療上の利点は、対象が特定の課題を行うのを観察すること、対象に気分に関する質問を尋ねること、または、ベッドサイドで対象に対して、もしくは実験室において対象から得た試料に対して１つもしくは複数の試験を行うことによって推論することができる。また、治療上の利点は、ＧＤＦ−８阻害のマーカーによっても証明し得る。限定ではなく、例として、処置下の対象からの筋肉の生検を行い、ＧＤＦ−８によって刺激されるシグナル伝達経路の下方制御に関連するマーカーの存在または非存在、たとえば、リン酸化されたＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３タンパク質のレベルの低下について試験し得る。本開示の抗体を含む組成物を用いた処置下の対象において治療上の利点を検出するために適切な他の試験は、当分野の技術者の知識範囲内にある。処置または予防している状態または障害の完全な治癒または逆転が望ましい一方で、治療上の利点が存在するために必須ではない。
【０１３６】
特定の実施形態では、本開示の抗体を含む組成物を使用して、骨格筋の量および／もしくは筋力の喪失によって特徴づけられた、またはそのような筋肉量および／もしくは筋力の増加が治療上の利点を与える、状態または障害を処置または予防することができる。これらの実施形態のうちの特定のものでは、抗体は、ＯＧＤ１．０．０、またはそのＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。
【０１３７】
本明細書中に開示した抗体を投与することによって処置または予防可能である、筋肉量および／または筋力の減弱に関連する状態または障害には、それだけには限定されないが、加齢関連の筋肉量または筋力の低下、虚弱、筋肉減少症、ならびに、傷害、除神経、または無重力環境への持続的曝露の後などの、筋萎縮、不動または廃用によって引き起こされる筋肉量または筋力の低下が含まれる。他の実施形態では、処置または予防することができる状態または障害には、特に高齢者または股関節骨折もしくは他の骨の骨折などの骨折を起こしやすい他の者における骨折、あるいは、関節置換を安定化させることが含まれる。一部の他の実施形態では、処置または予防することができる状態または障害は、原疾患プロセスに起因し得るものを含めた筋消耗症候群である。筋消耗症候群の非限定的な例には、癌、無食欲症または他の種類の栄養失調によって引き起こされるものなどの悪液質、ならびに、ＡＩＤＳ、敗血症、火傷、慢性腎不全、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）によって引き起こされる筋消耗が含まれる。
【０１３８】
限定ではなく、例として、本開示の抗体を含む組成物を投与した対象における治療上の利点は、全般的または特定の筋肉の筋肉量または筋力の増加によって実証することができる。抗ＧＤＦ−８抗体を用いた処置によってその筋肉量および／または筋力を増加させることができる筋肉の非限定的な例には骨格筋および心筋が含まれる。他の例には、横隔膜および肋間筋を含めた呼吸を制御する筋肉、ならびに胸鎖乳突筋、斜角筋を含めた吸気の副筋などが含まれる。骨格筋のさらに他の例には、腓腹筋、後脛骨筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、長筋、短筋、大殿筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、腸腰筋、大腿四頭筋、股関節内転筋、肩甲挙筋、僧帽筋、腹直筋、腹横筋、外腹斜筋、内腹斜筋、脊柱起立筋、大胸筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、上腕筋、円回内筋、腕橈骨筋、菱形筋、三角筋、および広背筋が含まれる。本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を用いた処置によってその筋肉量および／または筋力を増加させることができる他の骨格筋も可能である。
【０１３９】
筋肉量または筋力の増加は、力に抵抗するもしくは重りを持ち上げる対象の能力を観察することなどによって直接、または、ＭＲＩ、ＣＴもしくは二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）を使用して対象の身体を走査することによって間接的に評価することができる。他の技法も可能である。
【０１４０】
あるいは、治療上の利点は、そうでなければ進行的に悪化する症状の重症度の低下から推論することができる。また、利点は、筋電図検査などの筋肉機能の生理的試験、生検を行った筋肉構造の組織病理学的試験、および損傷した筋肉によって放出される酵素である血清クレアチンキナーゼの存在などの生化学的試験を使用して実証することもできる。治療上の利点を検出するために有用な他の筋肉構造および機能の試験も可能である。
【０１４１】
筋肉量および／または筋力に関連する他の実施形態では、本開示は、そのような処置または予防を必要としている患者に、抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することによって、筋ジストロフィー（「ＭＤ」）を処置および予防する方法を提供する。この方法の一部の実施形態では、抗体はＯＧＤ１．０．０またはその抗ＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。特定の実施形態によれば、対象は筋ジストロフィーを患っているヒト小児患者であり、他の実施形態では、対象は筋ジストロフィーに罹患しているヒト成人患者である。
【０１４２】
当分野で知られているように、遺伝子病変の性質または疾患の原因となる病変、および根底にある遺伝的欠陥から生じる表現型が異なる、様々な種類の筋ジストロフィーが存在しており。本開示の抗体を含む組成物の投与によって処置または予防し得る筋ジストロフィーの種類の非限定的な例には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）（仮性肥大型ＭＤとしても知られる）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドジー−デジェリーヌ型ＭＤとしても知られる）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）（ＤＭまたはシュタイネルト病としても知られる）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）（三好型ＭＤとしても知られる）、および先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が含まれる。
【０１４３】
上述した筋肉量および／または筋力の改善を評価するための技法に加えて、ＭＤに罹患している対象に本開示の抗体を含む組成物を投与すること治療上の利点は、６分間歩行試験（「６ＭＷＴ」）を使用して定量することができる。たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｔｈｅ  ６−ｍｉｎｕｔｅ  ｗａｌｋ  ｔｅｓｔ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ（２０１０）４１：５００〜５１０を参照されたい。
【０１４４】
６ＭＷＴでは、対象を、事前に設定されたコースに沿って６分間以内にどれだけ遠くまで歩行できるかを決定するために試験する。典型的には、対象を、ベースラインを確立するために処置を開始する前に試験し、それ以降は処置が進行するにつれて一定間隔で試験する。治療上の利点は、６ＭＷＴにおけるＭＤ対象の成績が一定である、もしくは処置に伴って実際に改善される場合、または、対象の成績が平均の非処置の対象のように急速に下降しない場合に見られる。６ＭＷＴの成績の例示的な非限定的な改善には、非処置またはプラセボで処置した対照と比較して約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより高いパーセンテージ改善が含まれる。また、６ＭＷＴは、ＭＤ以外の歩行運動に影響を与える状態または障害について処置中の対象において治療上の利点を検出するためにも使用し得る。
【０１４５】
他の実施形態では、本開示は、そのような処置または予防を必要としている患者に、抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することによって、運動ニューロン疾患を処置および予防する方法を提供する。この方法の一部の実施形態では、抗体はＯＧＤ１．０．０またはその抗ＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。本開示の抗体を含む組成物の投与によって処置または予防し得る運動ニューロン疾患の種類の非限定的な例には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ルーゲーリック病としても知られる）、１型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ１）（ウェルドニッヒ−ホフマン病としても知られる）、２型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ２）、３型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ３）（クーゲルベルク−ヴェランダー病としても知られる）、および脊髄延髄性筋萎縮（ＳＢＭＡ）（ケネディ病としても知られる）が含まれる。
【０１４６】
以前の研究では、マウス抗ＧＤＦ−８抗体が、ヒトＡＬＳの小動物モデルであるＳＯＤ１マウスおよびラットにおいて筋肉量および筋力を増加させるために有効であったことが実証されている。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０２４５３５号およびＨｏｌｚｂａｕｅｒら、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｓｌｏｗｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２００６）２３：６９７〜７０７を参照されたい。報告されているように、マウス抗体を用いた処置は、ＰＢＳで処置した対照と比較して、ＳＯＤ１マウスおよびラットの横隔膜および骨格筋において筋肉量を増加させた。同様に、抗体処置は、ＰＢＳを受けた対照と比較して、ＳＯＤ１マウスにおいて腓腹筋および横隔膜の筋萎縮を軽減させた。抗体処置の栄養性効果は、疾患プロセスの末期とは対照的に主に初期中に主に明白であったが、横隔膜萎縮の阻害はどちらの時期中にも明白であった。また、抗体処置は、四肢筋力、ならびにＳＯＤ１マウスおよびラットにおける全体的な体重も増加させることが観察されたが、抗体はビヒクル単独で処置した対照動物と比較して生存を延長させなかった。ＯＧＤ１．０．０などの本開示のヒト化抗ＧＤＦ−８抗体は上述のマウス抗体と同じ抗原結合決定因子を共有するため、これらがヒトにおいてＡＬＳを処置または予防するためにも有効であろうことが予想される。
【０１４７】
また、筋肉の量、機能および／または筋力に影響を与える、筋肉、中枢神経系および末梢神経系の他の先天性または後天性の疾患および障害も、それを必要としている対象に、本開示の抗体を含む組成物を投与することによって処置または予防し得る。
【０１４８】
また、本開示は、代謝障害の処置を必要としている患者に、抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することによる、代謝障害を処置および予防する方法も提供する。これらの実施形態のうちの特定のものでは、抗体は、ＯＧＤ１．０．０、またはそのＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。
【０１４９】
本開示の抗体を投与することによって処置または予防することができる代謝障害の非限定的な例には、２型真性糖尿病、Ｘ症候群などの代謝症候群、インスリン抵抗性、および耐糖能異常が含まれる。
【０１５０】
他の実施形態では、本開示は、そのような障害の処置を必要としている患者に、抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することによる、脂肪組織障害を処置および予防する方法を提供する。これらの実施形態のうちの特定のものでは、抗体は、ＯＧＤ１．０．０、またはそのＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。
【０１５１】
本開示の抗体を投与することによって処置または予防することができる脂肪組織障害の非限定的な例には、肥満ならびに特定の対象の性別、年齢および身長には正常よりも高い体重指数（ＢＭＩ）が含まれる。
【０１５２】
他の実施形態では、本開示は、そのような障害の処置を必要としている患者に、抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物を投与することによる、骨減少障害を処置および予防する方法を提供する。これらの実施形態のうちの特定のものでは、抗体は、ＯＧＤ１．０．０、またはそのＧＤＦ−８結合断片もしくは誘導体である。
【０１５３】
本開示の抗体を投与することによって処置または予防することができる骨減少障害の非限定的な例には、骨粗鬆症、ホルモン関連骨粗鬆症、骨減少症、骨関節炎、および骨粗鬆症関連の骨折が含まれる。
【０１５４】
組合せ療法
本開示のこの方法の特定の実施形態によれば、抗ＧＤＦ−８抗体は、単独療法として組成物中で、または少なくとも第２の治療剤との組合せ療法として投与することができる。すべての事例ではないが、典型的には、第２の治療剤は、抗ＧＤＦ−８抗体によって標的とされるものと同じ状態または障害を処置または予防するために選択する。他の実施形態では、しかし、第２の薬剤は、異なる状態または障害を処置または予防するために選択することができる。組合せ療法において使用するための抗体および第２の治療剤の用量は、有効性を最大限にし、副作用を最小限にするために、当分野の技術者の知識に従って選択される。
【０１５５】
本開示の抗ＧＤＦ−８抗体組成物は、第２の治療剤と同じまたは異なる投与様式で対象に投与することができる。抗ＧＤＦ−８抗体および第２の治療剤の化学的および物理的特徴に応じて、これらを同じ組成物中で一緒に組み合わせてもよい。代替実施形態では、これらを別々の組成物として投与する。抗体および第２の治療剤の組成物は、本開示によるキット中に好都合に含めることができる。
【０１５６】
組合せ療法として投与する場合、抗体および第２の治療剤は、同時に、逐次に、または別個に投与し得る。
【０１５７】
同時投与は、２つ以上の薬剤を同時に投与した場合に起こり、それぞれの投与は重複するが、異なる時点で開始または終了する場合でもそうである。逐次投与は、２つ以上の薬剤を同じ日に、たとえば同じ外来日中であるが同時ではないように対象に投与した場合に起こる。
【０１５８】
逐次投与は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間またはそれより長い間隔で起こり得る。抗ＧＤＦ−８抗体組成物を最初に投与し、続いて第２の薬剤を投与し得るか、またはその逆も可能である。
【０１５９】
別個投与は、薬剤を異なる日に対象に投与した場合に起こる。薬剤の別個投与間の例示的な間隔は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間もしくは１カ月間またはそれより長くてもよい。逐次投与と同様、抗ＧＤＦ−８抗体組成物の投与は、第２の薬剤の別個の投与の前または後であることができる。
【０１６０】
本開示の特定の他の実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体組成物および第２の治療剤は、逐次または別個に投与するかにかかわらず、交互のパターンで繰り返して投与することができる。
【０１６１】
代謝障害を処置または予防する方法では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を、そのような障害を処置または予防するために有効な第２の薬剤と組み合わせることができる。この目的のために有効な第２の薬剤の非限定的な例には、メトホルミン、スルホニル尿素、インスリン、プラムリンチド、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンなどのチアゾリジンジオン、エクセナチドなどのＧＬＰ−１類似体、ならびにビルダグリプチンなどのＤＰＰ−ＩＶ阻害剤が含まれる。
【０１６２】
骨減少障害を処置または予防する方法では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を、そのような障害を処置または予防するために有効な第２の薬剤と組み合わせることができる。この目的のために有効な第２の薬剤の非限定的な例には、アレンドロン酸塩およびリセドロン酸塩などのビスホスホネート、カルシトニン、ラロキシフェン、ならびにエストロゲンまたは副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などのホルモン剤が含まれる。
【０１６３】
筋ジストロフィーを処置または予防する方法では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を、コルチコステロイドなどの、筋ジストロフィーを処置または予防するために有効な第２の薬剤と組み合わせることができる。筋ジストロフィーを処置または予防するために有効な他の薬剤は当分野で知られている。筋ジストロフィーを処置するために有効なコルチコステロイドの非限定的な例には、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ベータメタゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、コルチゾール、デキサメタゾン、フルチカゾン、プレドニゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、およびその誘導体が含まれる。他の実施形態では、抗ＧＤＦ−８抗体は、ＤＭＤ患者、特に高齢のＤＭＤ患者においてしばしば起こる心筋症を処置するための薬剤と共に投与することができる。そのような薬剤には、必ずしもそれだけには限定されないが、ベータアドレナリン作動性遮断剤およびアンジオテンシン変換酵素の阻害剤が含まれる。
【０１６４】
ＡＬＳを処置または予防する方法では、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を、必ずしもそれだけには限定されないが、リルゾール、タラムパネル、グリコピロレート、ベンズトロピン、スコポラミン、アトロピン、塩酸トリヘキシフェニジル、アミトリプチリン、フルボキサミン、バクロフェン、チザニジン、ダントロレン、ジアゼパム、キニーネ、フェニトイン、ベンゾジアゼピン、ガバペンチン、抗攣縮剤、抗鬱剤、またはモルヒネもしくは他の鎮痛剤を含めた、ＡＬＳを処置または予防するために有効な第２の薬剤と組み合わせることができる。
【０１６５】
さらに他の実施形態によれば、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物は、限定ではなく、例として、運動、理学療法、呼吸療法、呼吸支援、心臓病治療法、および栄養サプリメントを含めた非薬物ベースの療法と共に投与することができる。
【０１６６】
有効用量
上述のように、本開示の抗ＧＤＦ−８抗体を含む組成物は、特定の状態または障害の処置または予防を必要としている対象に、所望の治療上の利点を少なくとも部分的に達成するために有効な用量で投与し得る。
【０１６７】
すべてのＧＤＦ−８と結合することは、治療上の有効性を達成するために必ずしも必要ではない。むしろ、血液または血清などの体液内、あるいは筋肉または他の体組織もしくは器官などの体組織内の成熟した活性ＧＤＦ−８の濃度を低下させることも有効であり得る。
【０１６８】
当分野の技術者の知識に従って、投与の事前に決定された時間後での目的の組織または体液中の活性ＧＤＦ−８濃度を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、または約５％〜１０％、約１０％〜４５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７０％〜７５％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、または前述の値のうちのいずれかの間の範囲の、活性ＧＤＦ−８濃度のパーセンテージ低下だけ低下させるために、抗ＧＤＦ−８抗体組成物の用量を患者において滴定することができる。
【０１６９】
対象に投与する抗ＧＤＦ−８抗体の量は、処置または予防する状態または障害、対象の大きさおよび重量、投与の形態、経路および部位、治療レジメン（たとえば第２の治療剤を使用するかどうか）、特定の対象の年齢および状態、処置開始前に前記対象の目的の組織または体液中で検出される活性ＧＤＦ−８のレベル、ならびに抗体組成物の効果に対する対象の応答性または感度を含めた様々な要因に依存する。適切な用量は、当業者が容易に決定することができる。最終的には、臨床家または同様の介護提供者が使用する適切な用量を決定する。この用量は必要なだけ頻繁に繰り返すことができる。副作用が発生した場合は、通常の臨床診療に従って用量の量および／または頻度を変更または減らすことができる。適正な用量および治療レジメンは、当業者に知られている方法を使用して治療の進行をモニタリングすることによって確立することができる。
【０１７０】
有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。たとえば、動物で使用するための初期用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定して、ＧＤＦ−８に対する抗体の結合親和性以上の、抗ＧＤＦ−８抗体の循環血液または血清濃度を達成するように製剤化し得る。その特定の抗体の生体利用度を考慮してそのような循環血液または血清濃度を達成するための用量を計算することは、当業者の能力範囲内に十分ある。手引きには、読者は「Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」のＰａｒｔ  １：Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、第１１版、Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．ら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌおよびその中で引用されている参考文献を参照されたい。また、初期用量は動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏデータからも推定することができる。当業者は、そのような情報を常法に従って適応させて、ヒト投与に適切な用量を決定することができる。
【０１７１】
特定の実施形態では、抗体組成物を投与する前の数日間または数週間のうちに、血清、筋肉または他の目的の体液もしくは組織中の活性ＧＤＦ−８濃度を数回測定して、飽和させる抗ＧＤＦ−８抗体の量、すなわち、本質的にすべての活性ＧＤＦ−８と結合するために十分であろう量を計算することによって、個々の対象について用量を決定し得る。当業者には理解されるように、血清、筋肉または他の箇所における所定量のＧＤＦ−８の飽和を達成するために必要な任意の特定の抗体の量は、部分的に、ＧＤＦ−８に対する特定の抗体の親和性に依存する。必要な場合は特定の抗体の薬物動態学的特性および生体利用度を考慮して、特定の抗ＧＤＦ−８抗体の飽和量を計算する方法は、当分野で周知である。飽和を確実にするために、計算された飽和量よりも多い量を投与し得る、たとえば、計算された飽和量よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、またはさらには１０倍多い量を投与し得る。
【０１７２】
抗ＧＤＦ−８抗体組成物の有効用量は、たとえば上述の処置または予防する状態または障害などの要因に応じて、単回（たとえばボーラス）投与、複数回投与もしくは連続（たとえば注入）投与あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲、またはそれ内の任意の有効な範囲もしくは値であることができる。
【０１７３】
特定の実施形態では、それぞれの用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約４．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ〜約２２．５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２２．５ｍｇ／ｋｇ〜約２７．５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ〜約５５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ〜約６５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ〜約８５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ〜約９５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ〜約１０５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ〜約１７５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ〜約２２５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。他の用量範囲も可能である。
【０１７４】
投与の量、頻度、および持続期間は、対象の年齢、重量、および病状などの様々な要因に依存する。したがって、非限定的な例では、投与の治療レジメンは、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、１週間以上、２週間から無期限、２週間〜６カ月間、３カ月間〜５年間、６カ月間〜１または２年間、８カ月間〜１８カ月間など続くことができる。任意選択で、治療レジメンは、反復投与、たとえば、１日に２回、１日に１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、週に１回、２週間に１回、または月に１回を提供する。反復投与は同じ用量または異なる用量であることができる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれより多く繰り返すことができる。治療有効量の抗ＧＤＦ−８抗体組成物は、単回用量として、または治療レジメンにわたって、たとえば、１週間、２週間、３週間、１カ月、３カ月間、６カ月間、１年、もしくはそれより長くにわたって投与することができる。特定の対象において有効用量の抗ＧＤＦ−８抗体組成物を構成するものは、対象の状態が変化するにつれて、または他の健康問題が生じることに伴って、経時的に変動し得る。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）
ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１の一過性発現分析
インタクトなヘテロ四量体ＯＧＤ１．１．１およびＯＧＤ１．０．０の一過性発現をＣＯＳ−１  Ｍ６細胞中で試験し、ＯＧＤ１．０．０が実質的により高いレベルで発現されたことが実証された。
【０１７６】
手短に述べると、ＶＨ０およびＶＨ１をコードしているＤＮＡ（それぞれ配列番号４９および５３）を哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター内にクローニングして、ＶＨ領域が、エフェクター機能を抑止する３個の突然変異（配列番号５７）が含まれる、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖領域をコードしている核酸配列とそれぞれインフレームで接合されて、ＶＨ０またはＶＨ１が含まれる完全長抗体重鎖を発現するようにした。同様に、ＶＬ０およびＶＬ１をコードしているＤＮＡ（それぞれ配列番号５１および５５）を哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター内にクローニングして、ＶＬ領域が、配列番号１７のヒトカッパ定常軽鎖領域をコードしている核酸配列とそれぞれインフレームで接合されて、ＶＬ０またはＶＬ１が含まれる完全長抗体軽鎖を発現するようにした。
【０１７７】
発現ベクターを作製した後、標準の技法を使用してｍａｘｉｐｒｅｐ  ＤＮＡを調製した。細胞を１００ｍｍの組織培養皿上に蒔き、その後、重鎖および軽鎖発現ベクターを用いて一過的に同時形質移入した（すなわち、ＶＨ０およびＶＬ０を１つのプレート中で組み合わせ、ＶＨ１およびＶＬ１を第２のプレート中で組み合わせた）。ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ  ＭＩＲ２３０６）形質移入試薬（４０μｌ）を２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ増殖培地＋グルタミン（２ｍＭの最終濃度）に室温で加え、渦撹拌によって混合し、その後、室温で１５分間インキュベーションした。Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ（重鎖および軽鎖ＤＮＡをそれぞれ８μｇ）を混合物に加え、室温で１５分間インキュベーションした。その後、形質移入溶液を、８ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ、ＨＩＦＢＳ、ｐｅｎ、ｓｔｒｅｐ、グルタミン）を含有する組織培養皿に加えた。２４時間、３７℃、１０％のＣＯ２でインキュベーションした後、細胞をＲ１ＣＤ１無血清増殖培地で洗浄し、その後、４８時間、３７℃、１０％のＣＯ２で、１０ｍｌのＲ１ＣＤ１（ｐｅｎ、ｓｔｒｅｐ、グルタミンを添加）中で成長させた。馴化培地を培地から除去し、遠心分離して細片をペレット化し、上清を新しいチューブへと取り出した。
【０１７８】
一過的に形質移入したＣＯＳ−１細胞によって産生された抗体の濃度を、全ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的ＥＬＩＳＡを使用して定量した。手短に述べると、１００μｌのＰＢＳ中の抗体（１μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、終夜、室温でインキュベーションすることによって、平底ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  ３１１２５）でコーティングした。プレートを１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の０．０２％カゼイン溶液で３〜２４時間、室温で遮断し、その後、洗浄した。標準および試料をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中に０．５％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０）で連続希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）に分注し、３〜２４時間、室温でインキュベーションした。洗浄後、アッセイ緩衝液で１：５０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  ３１４１３）を分注し（１００μｌ／ウェル）、プレートを１５分間、室温でインキュベーションした。洗浄後、ＢｉｏＦＸ  ＴＭＢ（ＴＭＢＷ−０１００−０１）（１００μｌ／ウェル）を加えることによってプレートを展開させた。０．１８ＮのＨ２ＳＯ４（１００μｌ／ウェル）で反応を停止させた後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｖＭａｘプレートリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍで読み取った。標準の希釈系列から決定された曲線の直線範囲を使用して試料濃度を計算した。
【０１７９】
一過性形質移入実験の結果を以下の表中に示し、ＰＯＩは、タンパク質Ａ精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による目的ピークを表す。ＰＯＩは、高分子量凝集体または分解生成物とは対照的に、細胞によって発現されたインタクトな完全長の抗体の割合を表す。
【０１８０】
予想外に、ＯＧＤ１．０．０抗体は、一過性形質移入に同じ条件下でＯＧＤ１．１．１抗体よりもはるかに高い（すなわち１０倍よりも高い）レベルで発現された。重要なことに、ＰＯＩ値によって示されるように、観察された大きく増加した発現レベルは、高分子量複合体または分解生成物とは対照的に、インタクトな完全長の抗体とほぼ完全に関連している。この発現の相違は、ＯＧＤ１．０．０とＯＧＤ１．１．１との間には、ＶＨ領域のＫａｂａｔ位置１０８（すなわち、配列番号４４および７の残基番号１１１）で１個のアミノの相違ならびにＶＬ領域のＫａｂａｔ位置１００（すなわち、配列番号４６および９の残基番号１００）で１個のアミノ酸の相違しか存在しないという事実に鑑みて、さらにより驚くべきである。図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい。
【０１８１】
上述のように、これらの構造的および機能的な相違は、ＶＨ１およびＶＬ１と比較してそれぞれＶＨ０およびＶＬ０中で様々なＪセグメントを使用することに起因し得る。以下に説明するように、最も重要な相違はＶＨ領域への変化であると考えられる。注目すべきことに、これは、ヒト化抗体を構築するために使用したＪセグメントの選択が、本明細書中で観察された劇的に増加した程度は言うまでもなく、少しでも抗体発現レベルに影響を与えることができるという、最初の実証であると考えられる。これはＯＧＤ１．０．０を生成するために必要な商品原価を顕著に低下させると予想されるため、この発見は特に重要である。この発見なしでは、この抗体を市場に出すために必要な量で生成するには経済的ではなく、それを用いて治療することで利益を受け得る患者集団への不利益となるであろう。
【０１８２】
【表３】
0006433889.tif 000006
【０１８３】
（実施例２）
ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１の安定発現分析
ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１の安定発現をＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞中で試験した。手短に述べると、細胞を８０％のコンフルエンシーまで成長させ、その後、リポフェクタミン形質移入試薬を使用して、以前の実施例中に記載したそれぞれ２５μｇの重鎖および軽鎖発現ベクター（合計５０μｇ）（すなわち、一組の細胞にはＶＨ０およびＶＬ０、別の細胞の組にはＶＨ１およびＶＬ１）を用いて同時形質移入した。形質移入後、安定プールが確立されている間は３〜４日毎に、消費された培地を新鮮なＲ１ＣＤ１培地＋１０％のＦＢＳで交換した。
【０１８４】
安定な形質移入体が確立された後、付着細胞として無血清Ｒ５ＣＤ１培地中で成長させた場合に、細胞が抗ＧＤＦ−８抗体を発現する能力を試験した。これらの条件下では、ＯＧＤ１．０．０を発現する細胞は９６時間の成長後に４７．３ｍｇ／Ｌの抗体を発現した一方で、ＯＧＤ１．１．１を発現する細胞は７２時間の成長後に４１ｍｇ／Ｌの抗体を発現した。１ｍＬのタンパク質Ａカラムを使用して抗体を精製し、その後、ＨＰＬＣを使用して濃度を定量した。
【０１８５】
付着細胞を無血清培地中での懸濁成長に適応させた後、ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１抗体の発現を再度決定した。ＡＳ１無血清培地に３．０×１０５個の生細胞／ｍＬを播種し、３７℃でインキュベーションした。４日目にｐＨを７．３に調節し、供給濃縮物を加え、インキュベーション温度を３１℃まで下げ、さらに３日間成長させた。ＯＧＤ１．０．０発現細胞は１００Ｌの培養体積で成長させた一方で、ＯＧＤ１．１．１発現細胞は５０ｍＬの培養体積で成長させた。すべての他の成長条件は細胞間で同じであった。７日目に、タンパク質Ａ精製およびＨＰＬＣ定量によって決定して、ＯＧＤ１．０．０を発現する細胞は６６．１２ｍｇ／Ｌの抗体を発現した一方で、ＯＧＤ１．１．１を発現する細胞は１０．６ｍｇ／Ｌの抗体を発現した。細胞を１００Ｌの培養にて３１℃で５日間を含めた９日間成長させることによって、ＯＧＤ１．０．０細胞を使用した実験を繰り返した際、抗体濃度は２０７．２ｍｇ／Ｌまで増加した。ＯＧＤ１．０．０発現細胞を２５Ｌの培養にて３１℃で７日間を含めて１１日間成長させた別の実験では、抗体濃度は１４５ｍｇ／Ｌであった。ＯＧＤ１．１．１発現細胞を無血清Ｒ５ＣＤ１培地中で５０ｍＬの培養にて３１℃で３日間を含めて７日間成長させた別個の実験では、抗体濃度は３９．３ｍｇ／Ｌであった。
【０１８６】
安定形質移入実験の結果を以下の表中に示し、ＰＯＩは、タンパク質Ａ精製後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による目的ピークを表す。ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１を一過的に形質移入したＣＯＳ−１細胞中で発現させた場合に得られた結果と一貫して、ＯＧＤ１．０．０抗体の発現レベルは、安定に形質移入したＣＨＯ細胞中で、同様の条件下でＯＧＤ１．１．１の発現よりも実質的に高かった。この驚くべき結果は、上記の一過性形質移入実験で観察された発現レベルの増加と一貫している。また、この結果は、接着であるか懸濁液中であるかの発現細胞を培養する様式、および細胞種は、ＯＧＤ１．１．１と比較して増強されたＯＧＤ１．０．０抗体の発現に実質的な影響を与えないことも示唆している。
【０１８７】
【表４】
0006433889.tif 000007
【０１８８】
（実施例３）
ＯＧＤ１．０．１およびＯＧＤ１．１．０の一過性発現分析
重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれ中のＪセグメントを変化させたため、観察された著しくより高いＯＧＤ１．０．０の発現レベルを引き起こすためにはどちらかの変化が単独で十分であり得るのか、または場合によっては両方の変化が増加した抗体発現に寄与したのかが不明確であった。
【０１８９】
このことを研究するために、本出願者らは上述の一過性形質移入実験を繰り返したが、さらに、１つのプレート中でＶＨ０およびＶＬ１構築体を組み合わせ、別のプレート中でＶＨ１およびＶＬ０構築体を組み合わせ、その後、ＥＬＩＳＡを使用して抗体発現レベルを定量した。以下の表中に示す実験の結果は、ＶＨ領域中のＪＨ３  ＪセグメントをＪＨ４で置換することが、本出願者らによって観察された大きく増加した抗体発現を与えるために十分であることを実証している。逆に、カッパＪセグメントを変化させること（すなわちＪＫ１をＪＫ４で置換）は、発現レベルに実質的な影響を与えるとは考えられなかった。
【０１９０】
【表５】
0006433889.tif 000008
【０１９１】
（実施例４）
抗ＧＤＦ−８抗体によるＧＤＦ−８結合
親マウス抗体、キメラマウス−ヒト抗体（マウス可変ドメインとヒト定常ドメイン）、ならびにヒト化抗体ＯＧＤ１．０．０およびＯＧＤ１．１．１によるＧＤＦ−８結合を、定量的ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析した。ＥＬＩＳＡ実験では、ＧＤＦ−８とその同族の高親和性受容体ＡｃｔＲＩＩＢとの結合を阻害する抗体の能力を、ＩＣ５０値を計算することによって決定した。ＳＰＲ分析を使用して見かけのＫＤ値を計算した。結果を表６中に示す。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡには、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質（０．２Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液中に１μｇ／ｍｌ）を９６ウェル平底アッセイプレート上に終夜、４℃でコーティングした。その後、コーティングしたプレートを、ＰＢＳ  ０．１％のＴｗｅｅｎ中の１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（２００μｌ／ウェル）を用いて１時間の室温または終夜の４℃で遮断し、その後、洗浄した。様々な抗体濃度を１０ｎｇ／ｍｌのビオチンとコンジュゲートさせたＧＤＦ−８と組み合わせ、４５分間、室温でインキュベーションした。インキュベーション後、試験溶液を遮断したＥＬＩＳＡプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、１時間、室温でさらにインキュベーションした。ウェルを洗浄した後、対照と比較した、固定したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと結合したＧＤＦ−８の量を、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（３０分間のインキュベーション）およびＴＭＢで検出した。４５０ｎｍでの比色測定をマイクロプレートリーダーで記録した。マウスおよびキメラ抗体を使用した実験をそれぞれ４回繰り返し、平均をとった。
【０１９３】
ＳＰＲは、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）機器を使用して２５℃で行った。マウス抗体は抗マウスＩｇＧ抗体を使用して捕捉した一方で、ヒト化抗体はタンパク質Ａを使用して捕捉した。アミンカップリング化学を使用して、タンパク質ＡをＣＭ５センサーチップの４つすべてのフローセル上に固定した。０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ−ジメチル−アミノ−プロピル−カルボジイミド（ＥＤＣ）および５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を７分間注入することによって表面を活性化させた。タンパク質Ａを１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０で５０μｇ／ｍｌに希釈し、３分間、１０μｌ／分の流速で注入した。その後、表面を１Ｍのエタノールアミン（ＥＴＨ）で７分間遮断した。タンパク質Ａの最終固定レベルは１０００〜１２００応答ユニット（ＲＵ）であった。表面を平衡化させるために、固定手順に次いでランニング緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＰ２０）を用いて数回洗浄した。抗体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で０．２５μｇ／ｍｌに希釈した。それぞれの抗体の溶液（５μｌ）をタンパク質Ａでコーティングしたフローセル２、３または４上に１０μｌ／分の速度で注入し、約２００ＲＵの捕捉された抗体が得られた。ＧＤＦ−８滴定系列（４．０ｎＭから０．１２５ｎＭまでの２倍希釈）を０．０１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＰ２０中で調製した。後者の溶液もランニング緩衝液として使用した。ＧＤＦ−８溶液を捕捉された抗体上に２分間、５０μｌ／分の流速で注入し、３０分間解離させた。注入および捕捉の各サイクル後、センサーチップの表面を、３０μｌの１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５を用いて５０μｌ／分の流速で再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をデータ分析に使用した。緩衝液および参照表面が寄与するシグナルを減算することによってデータを二重参照した。ラングミュアー１：１モデルを使用してセンサーグラムデータを包括的に当てはめ、ＫＤ値を計算した。ＯＧＤ１．０．０を使用した実験をそれぞれ３回繰り返し、平均をとった。
【０１９４】
ＥＬＩＳＡを使用して決定されたＩＣ５０値は試験した抗体型間で比較できるほどであった。より正確なＳＰＲアッセイでは、ＯＧＤ１．０．０は、ＧＤＦ−８に対してＯＧＤ１．１．１よりも実質的に高い結合親和性を有していた。
【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
（実施例５）
ＯＧＤ１．０．０抗体のＧＤＦ−８の中和能力
ＧＤＦ−８に媒介されるシグナル伝達を中和する抗ＧＤＦ−８抗体の能力を、レポーター遺伝子アッセイを使用して確認した。ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２と呼ばれるレポーター構築体は、ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で、１２個のＣＡＧＡボックスをＴＡＴＡボックスおよびアデノウイルス主要後期プロモーターからの転写開始部位の上流に配置することによって構築した。ＰＡＩ−１遺伝子のプロモーター中に見つかるＣＡＧＡボックスは、ＧＤＦ−８にも応答するＴＧＦβ応答要素である。ヒト横紋筋肉腫細胞系Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）をｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一過的に形質移入し、９６ウェルプレート中、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１０％のウシ胎児血清を添加したＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で１６時間培養した。抗体を、ＧＤＦ−８（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加した培地中で１時間、室温でプレインキュベーションした。その後、細胞を、試験試料ならびにＧＤＦ−８を含まない対照およびＧＤＦ−８（１０ｎｇ／ｍｌ）が含まれ抗体を加えない対照と共に、６時間、３７℃で処理した。ルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。マウスおよびキメラ抗体を使用した実験をそれぞれ２回繰り返し、平均をとった一方で、ＯＧＤ１．０．０を実験はそれぞれ３回繰り返し、平均をとった。レポーター遺伝子アッセイを使用して決定されたＥＣ５０値は試験した抗体型間で比較できるほどであった。
【０１９７】
【表７】
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【０１９８】
（実施例６）
ＯＧＤ１．０．０抗体はマウスにおいて筋肉量、筋力および除脂肪質量を増加させる
８週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスを週に１回で２週間、ＯＧＤ１．０．０（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照（ＰＢＳ）を用いて腹腔内（ＩＰ）で投薬した。合計８匹のマウスを各群に使用した。１４日目に、完全除脂肪体重を小動物ＮＭＲイメージングによって決定した。除脂肪質量を決定した後、動物を安楽死させ、腓腹筋、四頭筋、および長趾伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）を解剖し、秤量した。また、ＥＤＬ筋肉は、ｅｘ  ｖｉｖｏで力を生じるその能力についても試験した。
【０１９９】
２週間の処置の後、対照動物の除脂肪質量は１．６６±０．５６ｇ増加した一方で、ＯＧＤ１．０．０で処置した動物の除脂肪質量は３．３６±０．６２ｇ増加し、これは対照を超えて１０２％の増加を表す。
【０２００】
図２Ａおよび図２Ｂ中に示すように、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置した動物において、四頭筋量は対照と比較して１４．８％増加し、腓腹筋量は対象と比較して１０．３％増加し、ＥＤＬ筋量は対象と比較して１０．８％増加した。図３中に示すように、ＯＧＤ１．０．０抗体で処置した動物では、ＥＤＬ筋肉によって発揮された総強縮力は、ビヒクル対照で処置したマウスからのＥＤＬ筋肉によって生じられた力と比較して１４．８％増加した。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【０２０１】
また、ＯＧＤ１．０．０処置に応答した、全除脂肪体重ならびに四頭筋および腓腹筋の筋肉量の用量応答性も決定した。これらの実験では、１２週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスを群に分け（ｎ＝６匹）、週に１回、ビヒクルまたは０．３、１、３、１０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０を用いて４週間処置した。処置期間の７、１４、２１および２８日目に、ＮＭＲイメージングを使用して除脂肪質量を決定した。研究期間の終わりに、試験動物を安楽死させた後、四頭筋および腓腹筋を解剖し、秤量した。図４Ａおよび図４Ｂ中に示すように、四頭筋および腓腹筋の筋肉量は、約１０ｍｇ／ｋｇまで、上昇する抗体用量に伴って増加した。同様に、図５Ａおよび図５Ｂ中に示すように、全除脂肪体重は、約１０ｍｇ／ｋｇまで、上昇する抗体用量に伴って増加した。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【０２０２】
（実施例７）
ＯＧＤ１．０．０抗体はｍｄｘマウスにおいて筋肉量および除脂肪質量を増加させる
Ｘ連鎖ジストロフィン遺伝子（Ｄｍｄ）のｍｄｘ突然変異はＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎマウス中で自発的に生じ、エクソン内の遺伝子位置３１８５でグルタミンコドンを終止コドンへと変換する点突然変異を引き起こし、ジストロフィンタンパク質の未熟な終了をもたらす。その結果、ｍｄｘマウスは機能的なジストロフィンを欠き、ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィーの小動物モデルとして役割を果たす。約３週間から開始されて、一部の明白な筋力低下を伴った筋肉壊死が発生する。骨格四肢筋は持続性かつ進行性の変性および壊死によって特徴づけられるが、これは、衛星細胞および筋肉肥厚によって活性化される再生応答によって相殺される。ｍｄｘ突然変異体の筋肉は弾性の全体的な低下を有しており、それにより、これらは、延長活性化が原因の傷害をより受けやすくなる。突然変異マウスの脚筋は、最初は正常に発生するが、再生された筋管の、速線維および遅線維種の両方への分化は顕著に阻害される。ｍｄｘマウスの比較的穏やかな表現型は、部分的に、ジストロフィン関連タンパク質ユートロフィン補償機能に起因する場合があり、これは、成体ｍｄｘ突然変異体における再生中の筋線維で高度にアップレギュレーションされている。四肢筋とは対照的に、ｍｄｘマウスの横隔膜筋は顕著な再生期を受けず、連続的なジストロフィーが年齢と共にこれらの筋肉を弱らせる。特異的攣縮力、特異的強縮力および最大力はすべて、ｍｄｘ突然変異体の横隔膜において低下している。
【０２０３】
８週齢の雄のｍｄｘおよび対照Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを週に１回で８週間、ＯＧＤ１．０．０（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照（ＰＢＳ）を用いて腹腔内（ＩＰ）で投薬した。これらの実験では、１０匹のｍｄｘマウスを抗体で処置し、８匹にビヒクル対照を投与し、それぞれ６匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスを抗体またはＰＢＳで処置した。処置期間の終わりに、完全除脂肪体重、握力、および筋肉量を測定した。完全除脂肪体重は小動物ＮＭＲイメージングによって決定した。握力は、試験動物をワイヤーグリッド上に置き、すべての肢でメッシュを掴ませ、その後、尾を引っ張って、動物がその掴みを離す際の最大ピーク力を測定することによって試験した。動物１匹あたりのデータを３〜５回の試験から平均した。除脂肪体重および握力を測定した後、マウスを安楽死させ、四頭筋および腓腹筋を解剖し、秤量した。
【０２０４】
図６Ａ中に示すように、ＯＧＤ１．０．０抗体を用いた処置は、ｍｄｘマウスにおける除脂肪質量を、ＰＢＳで処置したｍｄｘマウスにおける平均４．８３±０．４ｇと比較して、平均７．２８±０．４ｇ増加させた。差異はｐ＜０．０５と統計的に有意であった。したがって、除脂肪質量は、８週間の研究中に、ｍｄｘマウスにおいて、ビヒクルで処置した対照を超えて５０％±８．２％増加した。図６Ｂ中に示すように、抗体処置は、ｍｄｘマウスにおいて、ビヒクルで処置した対照と比較して握力も増加させた。差異はｐ＜０．０５と統計的に有意であった。
【０２０５】
図７Ａ中に示すように、抗体処置は、ｍｄｘおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける腓腹筋量および四頭筋量を、ＰＢＳで処置した同じ種類のマウスと比較して増加させた。増加は統計的に有意であった（ｍｄｘの四頭筋および腓腹筋ではそれぞれｐ＝０．００５およびｐ＝０．００２、Ｃ５７Ｂｌ／６の四頭筋および腓腹筋ではそれぞれｐ＝０．００１およびｐ＝０．００３）。図７Ｂ中に示すように、抗体で処置したｍｄｘマウスからの腓腹筋量および四頭筋量は、ビヒクルで処置した対照マウスと比較してそれぞれ１２．２％および１２．１％増加した。また、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの同じ種類の筋肉の質量も、抗体で処置した後に、ビヒクルで処置した対照と比較して１５．２％および１２．８％増加した（示さず）。
【０２０６】
（実施例８）
ＯＧＤ１．０．０抗体は非ヒト霊長類において筋肉体積および除脂肪質量を増加させる
カニクイザルにおける除脂肪体重および筋肉体積に対するＯＧＤ１．０．０抗体投与の効果を調査する２つの研究を設計し、実施した。
【０２０７】
それぞれの研究は８週間持続し、その間、週に１回、ＩＶ投与によって動物に抗体を投薬し、正の窒素バランスを確実にするために過剰な食糧を提供した。第１の研究では、３匹の雄および３匹の雌の対象のそれぞれに、ＰＢＳビヒクルまたは３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇの用量のＯＧＤ１．０．０抗体を投与した。最初の処置の前、ならびにその後は４週目および８週目に、動物を麻酔し、その後、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）、コンピュータＸ線断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用してイメージングして、除脂肪質量および脂肪含有量を含めた体組成を検出および測定した。その後、研究１からの対象動物を、安楽死させ、検死した。第２の研究では、雄の対象のみを使用し、ビヒクル単独（ｎ＝５匹）または１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量のＯＧＤ１．０．０抗体（それぞれｎ＝５匹およびｎ＝３匹の対象）を与えた。対象動物を第１の研究と同様に８週間でイメージングした。それ以降、動物を補強食餌で維持し、１２、１７および２６週間目に再度イメージングした。
【０２０８】
両研究からのＤＥＸＡによって測定した除脂肪体重の８週間のデータを組み合わせ、分析した。結果を図８中に示し、これは、ＯＧＤ１．０．０抗体を用いた８週間の処置の後に全除脂肪質量および脚除脂肪質量の用量応答性の増加が存在していたことを実証している。データは平均±ＳＥＭとして表す。研究に含められた対象の数は、ビヒクルのみではｎ＝１１匹、３ｍｇ／ｋｇの抗体ではｎ＝６匹、１０ｍｇ／ｋｇでは、ｎ＝１０匹、３０ｍｇ／ｋｇではｎ＝８匹であった。ビヒクルで処置した対照を超える全除脂肪体重および脚除脂肪質量の増加は、試験したすべて抗体用量において統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇを超える、３０ｍｇ／ｋｇで処置した対象における脚除脂肪質量の増加も、統計的有意性に達することが見出された（ｐ＜０．０５）。
【０２０９】
興味深いことに、図９中に示すように、第２の研究において１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で処置した対象に共通した除脂肪体重の増加は、７週間目の最後の抗体用量に続く数週間の間持続した。データは、それぞれの時点での、ＰＢＳビヒクルと比較した差異として示す。より高用量での対照に対する増加は、示したすべての週においてｐ＜０．０５と統計的に有意であった。より低用量での増加は、４および８週目にｐ＜０．０９と統計的に有意であった。
【０２１０】
腰椎Ｌ３〜Ｌ５の上の脊柱の背側に位置する軸上筋肉の体積に対するＯＧＤ１．０．０抗体処置の効果をＣＴスキャンによって測定した。図１０Ａおよび図１０Ｂ中に示すように、軸上筋肉の体積は、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５匹）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３匹）のＯＧＤ１．０．０抗体で８週間処置した対象動物において、ＰＢＳを投与した対照と比較して実質的に増加した。筋肉体積の増加はｐ＜０．０５と統計的に有意であった。
【０２１１】
図１１は、３０ｍｇ／ｋｇのＯＧＤ１．０．０抗体で４週間処置した後の、例示的な試験対象からの軸上筋肉の３Ｄレンダリングである。ベースライン（左）と比較して、視覚的に明白である生じる筋肉体積の増加（右）は２２％であった。
【０２１２】
（実施例９）
ＯＧＤ１．０．０抗体はＦｃドメインのエフェクター機能を欠く
Ｆｃγ受容体のパネルと結合する、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を抑止することが知られているＦｃ領域中に３個の突然変異が含まれるＯＧＤ１．０．０抗体による結合を、表面プラズモン共鳴を使用して試験した。すべての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を使用して行った。手短に述べると、約１００ＲＵのＯＧＤ１．０．０抗体が捕捉されたビオチンタグを介して１００ＲＵのＧＤＦ−８がセンサーチップ−ＳＡ上に捕捉され、次いで、ＣＤ３２ａ−１３１Ｈ、ＣＤ１６ａ−１５８Ｖ、ＣＤ３２ｂでは０〜２１μＭ、ＣＤ６４では０〜２７０ｎＭの濃度範囲のＦｃγＲを流した。それぞれのＦｃγＲ結合実験において、注入は単一サイクル動力学モードを使用して連続して実施した。会合および解離期はそれぞれ１２０秒間持続した。最後の注入に次いだ解離期の終わりに、０．１％のＴＦＡ溶液の２０秒間のパルシングを使用してＧＤＦ−８を含有する表面を再生した。
【０２１３】
ＣＤ１６、ＣＤ３２ａおよびＣＤ６４との結合は観察されなかった。対照的に、ＣＤ３２ｂとの結合が観察されたが、試験した最も高い濃度（２１μＭ）でのみ観察された。２１μＭを超えるデータ点が欠乏しているため、正確なＫｄは決定されなかったが、２１μＭを超えると仮定することができ、これは野生型ＩｇＧ１分子のＫｄ（すなわち２〜４μＭ）と比較すると非常に弱いとみなされる。これらの結果は、ＯＧＤ１．０．０抗体は、エフェクター機能を誘導する能力がない、または実質的に低下していることを示している。
【０２１４】
（実施例１０）
ＧＤＦ−８と結合した抗ＧＤＦ−８抗体の結晶構造
本実施例中に説明するように、ヒトＧＤＦ−８と結合したキメラマウスおよびヒト化抗ＧＤＦ−８抗体の結晶構造を解析し、抗体およびＧＤＦ−８内の互いに接触するアミノ酸が何であるかを決定するために使用した。
【０２１５】
Ｆａｂ断片を、ヒトＩｇＧ１定常領域と接合させたマウスＶＨおよびＶＬ領域（それぞれ配列番号３および配列番号５）を含有するキメラ抗ＧＤＦ−８抗体から調製した。その後、Ｆａｂ断片をヒトＧＤＦ−８タンパク質と混合して結合複合体を形成した。タンパク質複合体を５０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ７．５および１００ｍＭの塩化ナトリウム中で１０．７５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。結晶は、懸滴方法を使用して、２０％のＰＥＧ  ＭＭＥ５０００および１００ｍＭのビス−トリス、ｐＨ６．５を含有する溶液に対する１８℃での平衡化を用いて形成させた。ヒト化抗ＧＤＦ−８抗体ＯＧＤ１．０．０およびＧＤＦ−８から調製したＦａｂを含有する結晶を、タンパク質溶液を２０％のＰＥＧ３３５０および２００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する非緩衝溶液に対して平衡化した以外は同様に調製した。
【０２１６】
それぞれの結晶の単一波長（１．０Å）データをＳＥＲ−ＣＡＴ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにてＩＤビームライン上で収集した。−１８０℃まで冷却した単一の結晶をそれぞれのデータセットに使用した。データはＤＥＮＺＯおよびＳｃａｌｅｐａｃｋを使用して処理した（Ｚ．ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＷ．Ｍｉｎｏｒ、「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２７６巻：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、パートＡ、ページ３０７〜３２６、１９９７、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））（参照により組み込まれる）。ＧＤＦ−８と複合体形成したキメラ抗体の構造はプログラムＡＭＯＲＥを使用した分子置換によって解析した（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．（２００１）．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＡＭｏＲｅ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、５７、１３６７〜１３７２）（参照により組み込まれる）。分子置換検索において使用したプローブはＰＤＢ  ｅｎｔｒｙ  １ＨＺＨであった。精密化の前に、データの５％をランダムに選択し、精密化の進行をモニタリングするためのＲｆｒｅｅ試験組と指定した。その後、それぞれの複合体の構造を、Ｃｏｏｔ内で一連の省略マップを利用して再構築した（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．およびＣｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６０、２１２６〜２１３２）（参照により組み込まれる）。精密化からの統計学を表８中に列挙する。ＧＤＦ−８と複合体形成したヒト化ＯＧＤ１．０．０の構造を、使用したプローブがキメラ抗体の構造であったこと以外は同様に解析した。
【０２１７】
【表８】
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【０２１８】
共結晶構造に基づいて互いに接触すると推論される抗体およびＧＤＦ−８中の残基を表９中に列挙し、ＶＨ鎖の抗体残基は「Ｈ」を前置し、配列番号３に関連して付番されている。ＶＬ鎖の残基は「Ｌ」を前置し、配列番号５に関連して付番されている。成熟ヒトＧＤＦ−８の番号は、配列番号１に関連して付番されている。残基は、少なくとも一対の接触する原子を含有する場合に、互いに接触すると定義された。原子は、接触比Ｃ＜１．３［式中、Ｃ＝Ｄ１２÷（Ｒ１＋Ｒ２）であり、Ｄ１２は原子間の距離であり、Ｒ１は原子１のｖｄＷ半径であり、Ｒ２は原子２のｖｄＷ半径である］を有する場合に、接触すると定義された。実際には、接触原子間の平均距離は約４．７Åであったが、任意の特定の事例における実際の距離は当該の原子の種類に応じて変動した。
【０２１９】
【表９】
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【０２２０】
（実施例１１）
抗体ＶＨおよびＶＬ領域のさらなるヒト化
ＧＤＦ−８と共結晶化した抗ＧＤＦ−８抗体の配列解析および構造に基づいて、その配列をさらにヒト化する試みとして抗体ＶＨおよびＶＬ領域を改変した。さらなるヒト化ＶＨ領域の配列アラインメントを図１Ａ中に示す。さらなるヒト化ＶＬ領域の配列アラインメントを図１Ｂ中に示す。新しいＶＨおよびＶＬ領域を含有する発現構築体を作製した後、抗体を一過的に形質移入したＣＯＳ−１細胞中で産生させ、標準の技法を使用して精製した。その後、抗体のＧＤＦ−８に対する結合親和性および中和活性を本明細書中で上述したように試験した。結果を表１０中に報告する。
【０２２１】
ヒト化ＶＨ０およびＶＬ０領域のＣＤＲ２アミノ酸配列（マウス抗体に由来）を、それぞれヒト生殖系列ＶＨ領域ＤＰ−４７およびＶＬ領域ＤＰＫ−９からのＣＤＲ２配列と比較した。ヒト配列とは異なる、ＶＨ０およびＶＬ０のＣＤＲ２配列中のすべての残基をヒトへと変化させた。新しいＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれＶＨ２（配列番号６６）およびＶＬ２（配列番号６７）と命名した。ＶＨ２とＶＬ０領域およびＶＨ０とＶＬ２領域を使用して生成されたインタクトな抗体を、競合ＥＬＩＳＡ実験においてＧＤＦ−８との結合について試験した。結果により、ＶＨ  ＣＤＲ２を完全にヒト化することはＧＤＦ−８結合を実質的に低下させた一方で、ＶＬ  ＣＤＲ２を完全にヒト化することは抗原結合の損失をもたらさなかったことが示された。
【０２２２】
ＶＨおよびＶＬ領域のさらなるヒト化は共結晶構造に基づいていた。ここでは、ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ中のマウス由来の残基は、共結晶構造中でＧＤＦ−８残基と接触することが観察された場合にのみ保持した。そうでなければ、すべてのＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ残基をそれぞれＤＰ−４７およびＤＰＫ９中の対応するヒト残基へと変化させて、ＶＨ３（配列番号６８）およびＶＬ３（配列番号６９）を生成した。競合ＥＬＩＳＡ実験では、ＶＨ３およびＶＬ０を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．３．０）は活性の顕著な損失を示した一方で、ＶＨ０およびＶＬ３を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．０．３）は完全な活性を保持していると考えられた。
【０２２３】
ＶＬ２中のＣＤＲ２の配列に基づいて、ＶＬ３の位置５０をアラニンに置換して（すなわちＳ５０Ａ）、ＶＬ４（配列番号７１）を作製した。このＶＬ領域を使用して調製したＶＨ０およびＶＬ４を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．０．４）は実質的な活性を保持していた。別の突然変異Ｗ９６ＬをＶＬ３のＣＤＲ３内に導入してＶＬ５（配列番号７３）を作製した。しかし、このＶＬ領域を使用して調製したＶＨ０およびＶＬ５を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．０．５）は、ＯＧＤ１．０．０と比較して低下した活性を実証した。
【０２２４】
また、新しい突然変異を重鎖可変領域中にも導入した。２個の置換、すなわちＭ９９ＦおよびＮ１０１ＤをＣＤＲ３内に導入して、ＶＨ４（配列番号７０）を形成した。このＶＨ領域を使用して調製したＶＨ４およびＶＬ０を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．４．０）は、実質的に低下した活性を有しており、これは、ＧＤＦ−８に対する低下した結合親和性と相関していた。ＣＤＲ２では、Ｇ５３Ｓ置換を行ってＶＨ５（配列番号７２）を作製した。このＶＨ領域を使用して調製したＶＨ５およびＶＬ０を含む抗体（すなわちＯＧＤ１．５．０）は実質的な活性を保持していた。
【０２２５】
【表１０】
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【０２２６】
本出願中に引用されているすべての出版物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により組み込まれると個々に示されている場合と同程度に、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
様々な具体的な実施形態を例示および記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【受託番号】
【０２２８】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２９８０
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２９８１
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ８６３５５
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ８６３５５
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２５６
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２５６
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２４２
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２４２
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２４２
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２４２
Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ０１９４３９
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ５９３１５
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２５６
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ００２４２
ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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