(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治療に用いる、創傷部位に塗布するための外用剤であって、分子量分布がＭｗ／Ｍｎ＝２．０〜５．０である加水分解フィブロイン２〜１０ｗｔ％と、油性成分と、水性成分とを含み、
前記油性成分として、オリーブオイル２０〜３０ｗｔ％及びミツロウ５〜１０％を含み、
前記水性成分として、水及び１，３−ブチレングリコールを５５〜６５ｗｔ％含む、
外用剤。
【請求項２】
軟膏又はクリームである、請求項１に記載の外用剤。
【請求項３】
界面活性剤を含まない、請求項１又は２に記載の外用剤。
【請求項４】
（１）沸騰した塩化カルシウム又は臭化リチウムの４０〜６０ｗｔ％水溶液中で、セリシンを除去したシルク材料を４０〜７０分間加熱する工程、
（２）（１）で得られた溶液を透析により脱塩する工程、
（３）（２）で得られた溶液の濃度を調整した後、静置し、分子量分布がＭｗ／Ｍｎ＝２．０〜５．０である加水分解フィブロインペーストを得る工程、及び、
（４）（３）で得られた加水分解フィブロインペーストと、オリーブオイル及びミツロウである油性基剤とを撹拌混合して、加水分解フィブロイン２〜１０ｗｔ％、オリーブオイル２０〜３０ｗｔ％、ミツロウ５〜１０ｗｔ％、及び、水性成分５５〜６５ｗｔ％を含む軟膏製剤を得る工程、を含む、軟膏製剤の製造方法。
【請求項５】
軟膏製剤が、創傷治癒促進剤である、請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は加水分解フィブロインを含む外用剤、特に、創傷治癒促進効果を有する、加水分解フィブロインを含む軟膏及びその製造方法に関する。
【０００２】
加水分解シルクは、カイコ（家蚕、Bombyx mori）によって産生される天然シルク繊維を、酸、アルカリ、濃塩液等で処理することによって得られる、タンパク質加水分解物の混合物である。いわゆる加水分解シルクとは、シルク繊維を構成するタンパク質であるフィブロイン及びセリシンの加水分解物を総称するものである。
【０００３】
加水分解シルクは様々な生理作用を有することが知られている。例えば特許文献１は、ポリビニルアルコールと加水分解シルクタンパク質との混合物に対して放射線照射することによって、ゴム状の弾性があり、長時間保水性を保持できるハイドロゲルを得られることや、この材料を創傷被覆材として用いることを開示している。
【０００４】
特許文献１の発明は、ポリビニルアルコールに放射線を照射して作製されるハイドロゲルの耐熱性や強度を向上させることを課題としており、加水分解シルクタンパク質をポリビニルアルコールに添加することによって、強度及び保水性に優れたハイドロゲルが得られることが開示されている。また特許文献１には、ハイドロゲルの生体適合性には加水分解シルクタンパク質の添加が有効であるとの記載がある。
【０００５】
また特許文献２には、Ｌ−アスコルビン酸及びその誘導体類と、加水分解シルクタンパク質とを含有する皮膚外用剤が開示されている。この皮膚外用剤は、色素沈着や乾燥、肌荒れなどを予防ないし改善する効果を有し、皮膚に総合的な美粧効果を付与しうるものである。特許文献２の発明は、美白効果を有するＬ−アスコルビン酸に加水分解シルクタンパク質を配合し、かつｐＨを５〜８の範囲に設定することによって、美白効果が相乗的に増強されるとともに、安定で、安全上の問題のない皮膚外用剤が得られることを見出したものである。
【０００６】
一方で、特許文献３には、所定濃度のカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンを用いることで、未分解絹フィブロインを未分解のまま長期保存可能にすることが開示されている。また、未分解絹フィブロインはヒト皮膚由来の線維芽細胞を生育促進する作用があることから、当該未分解絹フィブロインを含む剤は軟膏やクリーム状の創傷被覆材、創傷治癒材、化粧品等に用いられることが記載されている。
【０００７】
また一方で、特許文献４には、シリコーンゴムの表面をシルクタンパク質（シルクフィブロイン）で被覆した複合体は、細胞の付着・増殖性が高いことが開示されている。特許文献４は、不活性かつ非親水性の材料であるシリコーンゴムの表面にシルクフィブロインを付与することによって、表面が親水化され、表面における細胞付着性・細胞増殖性が向上したことを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１６９７３６号公報
【特許文献２】特開２００７−２７７１１９号公報
【特許文献３】特開２００３−２８９８号公報
【特許文献４】特開平３−１２３５６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、加水分解シルクが生体適合性に優れることや、皮膚に対して美容的効果を有することは公知であったが、皮膚の損傷（創傷）に対する効果については知られていなかった。また、シルクフィブロインからなる被膜やシルクフィブロインフィルムが線維芽細胞の付着や増殖を促進することは公知であったが、創傷の治癒過程における効果については知られていなかった。さらに、創傷に対して適用する場合の適切な剤形や濃度、安定性等は全く検討されていなかった。
上記に鑑み本発明は、加水分解シルクを含む製剤であって、創傷の治癒を促進する効果を有し、刺激性、安定性、取扱性などの実用的条件をも満たすものを提供すること課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、上記課題を解決するために検討する中で、セリシンを除いた加水分解シルク（加水分解フィブロイン）を成分とする軟膏をマウスの創傷部位に適用すると、当該成分を含有しない軟膏と比較して、創傷治癒が促進されることを見出した。さらに、加水分解フィブロインはそれ自体が界面活性効果を有するため、界面活性剤を使用することなく、加水分解フィブロインと油性成分と水性成分とを用いて安定に製剤化することが可能で、刺激性が低く、安定性、取扱性にも優れた実用的価値の高い製剤が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、創傷治療に用いる、創傷部位に塗布するための外用剤であって、加水分解フィブロインと、油性成分と、水性成分とを含む外用剤に関する。
本発明の外用剤は、軟膏又はクリームであることが好ましい。
【００１２】
また本発明の外用剤には、有効成分である加水分解フィブロインが、１〜４０ｗｔ％含有されていることが好ましい。
また、前記の外用剤は、界面活性剤を含まないことが好ましい。油性成分は植物オイル、パラフィン又はゴマ油、オリーブ油、シアバター、コメ胚芽油、スクワランオイルのいずれか１以上であることが好ましく、水性成分は多価アルコールを含むことが好ましい。
【００１３】
また本発明は、
（１）塩化カルシウム又は臭化リチウムの４０〜６０ｗｔ％水溶液中で、セリシンを除去したシルク材料を４０〜７０分間加熱する工程、
（２）（１）で得られた溶液を透析により脱塩する工程、
（３）（２）で得られた溶液の濃度を調整した後、静置し、加水分解フィブロインペーストを得る工程、及び、
（４）（３）で得られた加水分解フィブロインペーストと油性基剤とを撹拌混合する工程、
を含む、軟膏製剤の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の外用剤は、創傷治癒促進剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は創傷治癒促進効果を有する外用剤、特に創傷治癒促進効果を有する軟膏やクリームを提供する。本発明の外用剤は、天然成分である加水分解フィブロインを有効成分として含有しており、創傷治癒促進効果を有すると同時に、界面活性剤を含まず、低刺激性で安定性、取扱性にも優れた外用剤を提供することができる。本発明の軟膏を適用した全層欠損創は、コントロール群と比較して、肉芽組織の形成、創厚み、再上皮化において有意に良好な結果を示し、高い創傷治癒促進効果を有することが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例及び比較例の軟膏を適用したマウス創傷断面のＨＥ染色像である。
【図２】本発明の実施例及び比較例の軟膏を適用したマウス創傷における、肉芽組織の面積を示す図である。
【図３】本発明の実施例及び比較例の軟膏を適用したマウス創傷における、創中央の厚みを示す図である。
【図４】本発明の実施例及び比較例の軟膏を適用したマウス創傷における、再上皮化率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の外用剤は加水分解フィブロインを有効成分として含有し、加水分解フィブロインと油性成分及び水性成分とが一体に混合されている。加水分解フィブロインは、ゲル濾過で測定した数平均分子量が１００００〜１０００００、重量平均分子量が５００００〜１５００００のものを使用することができ、数平均分子量が２００００〜３００００、重量平均分子量が８００００〜９５０００であればより好ましい。また、加水分解フィブロインの分子量分布はほぼ正規分布のものを用いることが好ましい。特定の理論に拘束されるものではないが、幅広い分子量分布を有する加水分解フィブロインを用いることで、各分子量の加水分解フィブロインが複層的に作用し、その結果として良好な創傷治癒を得られうる。分子量分布の目安として例えば、Ｍｗ／Ｍｎが２．０〜５．０のものを用いることができる。加水分解フィブロインは、外用剤中に１〜４０ｗｔ％含有され、１〜２０ｗｔ％が好ましく、２〜１０ｗｔ％含有されることがより好ましい。
【００１８】
加水分解フィブロインとしては、市販品を利用してもよいし、調製して用いてもよい。フィブロインはセリシンと共に絹を構成するタンパク質であり、加水分解フィブロインは、絹からセリシンを除去してフィブロインのみとし、さらに加水分解することによって得られるタンパク質分解物（ポリペプチド）である。
【００１９】
油性成分は外用剤の基剤成分であり、植物オイル、パラフィン成分、炭化水素類、エステル類等がある。植物オイルは、植物を原料とする油であり、具体的には、大豆油、米油、菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、アーモンド油、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、椿油、ヒマワリ油、パーム油、アマ油、シソ油、シア油、ヤシ油、ホホバ油、グレープシード油、アボガド油等が挙げられるが、これに制限されるものではない。なかでも、酸化されにくいオレイン酸を比較的多く含むことから、オリーブ油、ゴマ油が好ましく用いられる。
【００２０】
パラフィン成分は、高級脂肪酸と高級アルコールのエステルを意味する。具体的には、ミツロウ、鯨ロウ、ラノリン、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、木ロウ等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、ミツロウを用いると融点が高いため好ましい。
【００２１】
油性成分として、上記の植物オイル、パラフィン成分の他に、炭化水素類やエステル油を含んでもよい。炭化水素類とは、炭素と水素とから成る化合物であり、具体的には流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、α−オレフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、パラフィン、白色ワセリン、黄色ワセリン等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
エステル油類とは、アルコールと脂肪酸のエステルであり、具体的にはパルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、ミリスチン酸イソプロピル、イソノナン酸イソノニル、中鎖脂肪酸トリグリセリド、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル等があげられる。
【００２３】
上述の油性成分は、主に製品の安定性、取扱性（粘度、伸展性など）の観点から選択される。例えば、植物油とパラフィン成分を併用することが好ましく、特に、植物油とミツロウとを併用することが好ましい。植物油は１５〜３５％、好ましくは２０〜３０％含有することが好ましい。パラフィン成分は１〜１５％、好ましくは５〜１０％含有することが好ましい。この範囲であれば、他の成分と混合されて適切な粘度と伸展性を有する軟膏が得られる。
【００２４】
水性成分としては水のほか、多価アルコール、低級アルコール等が挙げられ、水と共に多価アルコールを含むことが好ましい。多価アルコールとしては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、１，３−ブチレングリコールが好ましい。低級アルコールとしてはエタノール、メタノール等が挙げられる。水性成分は、４０〜７０％含有され、５５〜６５％であれば好ましい。
【００２５】
外用剤には、上記の加水分解フィブロイン、油性成分、水性成分の他に、公知の各種添加剤を含んでよい。添加剤としては例えば、界面活性剤、防腐剤（防菌剤、防黴剤）、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、安定化剤、増粘剤等が挙げられる。これらの添加剤を含む場合、添加剤の合計量は０．１〜１％とすることができ、０．２〜０．５％であることがより好ましい。但し、本発明の外用剤では、有効成分である加水分解フィブロイン自体が界面活性作用を有しているため、界面活性剤を用いずに安定な軟膏、クリームを得ることができることが特徴である。
【００２６】
本発明の外用剤は塗布によって適用可能な剤形、具体的には軟膏又はクリームであることが好ましい（以下、特に記載が無い限り、「軟膏」の中にクリームも含むものとする。）。軟膏が乳化状態である場合、乳化の態様は油中水型であっても水中油型であってもよい。また乳化以外に、製剤中で加水分解フィブロインがコロイド状や分散状態で基剤中に存在していてもよい。いずれの場合も基剤としては公知の基剤組成によることができる。
【００２７】
本発明の外用剤が適用される創傷としては、裂傷、擦過傷、外科的切開創、皮膚潰瘍、火傷等が挙げられる。また本発明の外用剤は、創傷治癒過程における肉芽形成と再上皮化とのいずれも促進する効果を有すると考えられており、表皮が損傷された表皮欠損創、表皮及び真皮が損傷された全層欠損創のいずれにも適用されうる。
【００２８】
本発明の外用剤は創傷部位に塗布され、塗布量は公知の範囲から適宜選択することができ特に制限されないが、例えば、直径５ｍｍの円形の創傷に対して０．０１ｍＬ〜１ｍＬとすることができ、０．０１ｍＬ〜０．２０ｍＬが好ましい。塗布方法は、創面に直接塗布するのでもよいし、ガーゼやフィルムに軟膏を塗布し、塗布面が創面と接触するようにガーゼやフィルムを貼付するのでもよい。直接塗布する場合、軟膏を塗布した全体を伸縮性ポリウレタンフィルムやガーゼ等で被覆し、創面の環境を維持することも好ましい。また、本発明の軟膏と、公知の各種の創傷被覆材を併用してもよい。
【００２９】
＜製造方法＞
（１）加水分解フィブロインの製造
加水分解フィブロインの製造は、例えば、天然シルク（糸、繭）からアルカリ処理によってセリシンを除去し、残ったフィブロインを３０〜７０ｗｔ％の濃塩水中で加熱することで可溶化、分解し、次いで透析や限外ろ過によって塩と低分子量物を除去することによって得られる。
【００３０】
原料としては、家蚕の繭や市販の精練糸、未精練糸等を使用することができる。繭や未精練糸を用いる場合、まずはアルカリ精練（石鹸、炭酸ソーダ）、酵素精練等の公知の方法でセリシンを除去する。続いて、塩化カルシウム、臭化リチウム等の濃厚溶液に、セリシンを除去したシルクを投入し、４０〜７０分程度加熱することで溶解する。続いて、得られた溶解液を透析膜に入れ、水に対して透析を行うことで脱塩し、同時に低分子成分を除去する。
【００３１】
続いて、脱塩後の溶解液を所定の濃度まで加熱濃縮し、所定量の防腐剤と多価アルコールを添加して静置する。１８℃〜３０℃で５〜２０日程度静置することによって、加水分解フィブロインペーストを得る。
【００３２】
（２）軟膏の製造
上記で得た加水分解フィブロインペーストと防腐剤とを撹拌する。次いで、別途溶解混合しておいた植物油及びパラフィン成分を添加してさらに撹拌混合し、軟膏を得る。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］
（１）加水分解フィブロインの調製
水５０００ｃｃと塩化カルシウム５０００ｇを混合し、沸騰させた中に、精練糸１Ｋｇを投入し、５０分間加熱した。続いて水３０００ｃｃを投入し、再度沸騰させて加熱を終了し、フィブロイン溶解物を得た。
ステンレス製漉し器を通したフィブロイン溶解物を、透析膜（分画分子量１４０００、ポアサイズ５０Å）に入れ、４日間流水にて透析を行い、脱塩した。
脱塩後、加熱し、重量が５８％程度になるまで水分を蒸発させた。
加熱後、温度６０℃程度にて、防腐剤（メチルパラベン１Ｋｇを１，３−ブチレングリコール３６Ｌに溶解した溶解液）を防腐剤が０．４％となるように添加し、撹拌した。
ステンレス製漉し器を通して粗大物を除去し、ステンレス製蓋付容器に移し、室温１８度〜３０度で約１０日間静置し、加水分解フィブロインペーストを得た。加水分解フィブロインペーストの分子量の測定をゲル濾過によって行ったところ、数平均分子量（Ｍｎ）は２３７５０、重量平均分子量（Ｍｗ）は８６７５０、Ｍｗ／Ｍｎは３．６５であった。
【００３４】
（２）加水分解フィブロイン軟膏の調製
上記（１）で得た加水分解フィブロインペースト４００ｇに防腐剤２７ｇを添加し、フードプロセッサーにて２分間撹拌した。
オリーブオイル２００ｃｃとミツロウ５０ｇを湯煎混合し、４回に分けて上記のフードプロセッサーに投入し、５〜１０分間撹拌し、加水分解フィブロイン軟膏を得た。
上記によって得られた加水分解フィブロイン軟膏の組成は次のとおりである。
【００３５】
【表１】
0006369783.tif 000002
【００３６】
＜防腐、防カビ試験＞
上記で得られた加水分解フィブロイン軟膏について、（１）標準細菌混合菌、（２）排水混合菌、（３）真菌混合菌に対する防腐、防カビ試験を行った。各混合菌は次のとおりである。
【表２】
0006369783.tif 000003
【００３７】
加水分解フィブロイン軟膏２０ｇを滅菌バイアル瓶にとり、各試験菌液をそれぞれに１％量（０．２ｍＬ）接種した。標準細菌混合菌及び排水混合菌は３０℃、真菌混合菌は２５℃で保存し、７、１４、２１日後に生菌数の測定を行った。
生菌数は、細菌はＳＣＤＬＰ寒天培地混釈法、真菌はＧＰＬＰ寒天培地混釈法で測定した。
【００３８】
試験開始時の菌数値（表３）、接種菌数（表４）、接種後の菌数経時変化（表５）は次のとおりであった。
【表３】
0006369783.tif 000004
【００３９】
【表４】
0006369783.tif 000005
【００４０】
【表５】
0006369783.tif 000006
【００４１】
上表のとおり、本発明の加水分解フィブロイン軟膏は良好な防腐効力を示した。真菌はやや生残菌数が高かったが、増殖はないため、実用上の障害はないと判断された。
【００４２】
＜創傷治癒試験＞
試験動物：マウス（BALB/c、メス、8-12週）６匹
試験対象薬剤：加水分解フィブロイン軟膏（実施例２、試験群）及び加水分解フィブロイン非含有軟膏（比較例、コントロール群）。加水分解フィブロイン軟膏としては実施例１で得たものを使用した。比較例の軟膏の組成は次表のとおりである。
【００４３】
【表６】
0006369783.tif 000007
【００４４】
試験方法：マウス背部を剃毛し、トレパン（直径５ｍｍ）を用いて、左右２箇所ずつ合計４箇所の全層欠損創を作成した。２１Ｇ注射針を用いて実施例２もしくは比較例の軟膏を創部に０．０３ｍＬ充填し、粘着性ウレタンフィルム（アルケア株式会社製、マルチフィックス）で全体を被覆した。さらにマウス胴体部に自着弾力包帯を巻き、ウレタンフィルムの脱落を防止した。なお、１匹のマウスに対して、左右いずれかの２箇所に実施例２の軟膏、残る２箇所に比較例の軟膏をそれぞれ適用した。
４日目、８日目、１２日目にそれぞれ２匹のマウスの創部を目視観察のうえ創部全体を採取し、創部断面切片のＨＥ染色を行った。ＨＥ染色組織切片像より、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトを用いて肉芽の形成面積、創中央の厚み、上皮の再生率を測定した。肉芽の形成面積及び創厚みは実測値である。再上皮化率は、（上皮化した部分の表皮の長さ÷創全体の径）×１００＝（％）で算出した。結果を図１〜図４に示す。
【００４５】
図２〜４に示されるとおり、加水分解フィブロイン軟膏を適用した群は、コントロール群と比較して、４、８及び１２日目の時点で肉芽組織の面積、創中央の厚み、再上皮化のいずれもが優れていた。つまり、加水分解フィブロインを含有する本発明の軟膏は肉芽組織の形成と上皮の再生のいずれも促進させることが確認された。
【図１】
0006369783.tif 000008
【図２】
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【図３】
0006369783.tif 000010
【図４】
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