(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経又はニューロン再生の促進のために、一過性神経伝導障害、軸索断裂若しくは神経断裂から選択される神経損傷、神経に対する直接の物理的損傷によって引き起こされる末梢神経系の損傷、又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している対象に使用するための、少なくともトラセミド及びバクロフェン、又はそれらの塩若しくはそれらの徐放性製剤を含む組成物。
【請求項２】
スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、若しくはブロモクリプチン、又はそれらの塩若しくはそれらの徐放性製剤から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バクロフェンとトリメタジジンとトラセミド、
バクロフェンとシナカルセトとトラセミド、
バクロフェンとアカンプロセートとトラセミド、
バクロフェンとアカンプロセートとトラセミドとジエチルカルバマジン、又は
バクロフェンとアカンプロセートとトラセミドとイフェンプロジル、のうちの少なくとも１組の化合物併用を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
薬学的に許容可能である担体又は賦形剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物における前記化合物は、共に、個別に、又は連続して投与されるように製剤化される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物は繰り返して前記対象に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
４ｍｇ未満のトラセミドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１５０ｍｇ未満のバクロフェンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
５０ｍｇ未満のバクロフェンを含む、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経疾患及び障害の処置のための組成物及び方法に関しており、より詳しくは、本発明はアルツハイマー病及び関連疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ニューロパチー、アルコール依存症、アルコール離脱症、ハンチントン病、及び脊髄損傷を含むそのような疾病のための新規の併用療法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害に特徴づけられる原型的な皮質認知症であり、皮質連合野の関与に起因し得る、不全失語症（発話及び発話理解における機能障害がある言語障害）、協調運動障害（運動または知覚機能の欠失により、所定の目的のある動作及び身ぶりを調和させ、行う能力の欠如）、並びに失認（もの、ひと、音、かたち、または匂いを認識する能力の欠如）を伴う（参考文献１〜４）。
【０００３】
現在、アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の最も一般的な病因である。臨床的には、認知機能の全体的な低下によって特徴づけられており、徐々に進行し、末期患者は寝たきり、及び失禁するようになり、療護が必要になる。診断後、平均して９年で死に至る（参考文献５）。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）の発症率は、年齢とともに急激に増加する。国際連合の人口予測では、８０歳以上の人口は、２０５０年までに３７０万人に達すると推定されている。現在は、８５歳以上の人口の５０％がＡＤに苦しめられていると推測される。故に、全世界で１００万人以上の人々が５０年内に認知症に罹患するであろう。継続的な介護及び他のサービスを必要とする非常に多数の人々が、医療的、経済的、及び人的資源に深刻な影響を与えると考えられる（参考文献６）。記憶障害は疾患の初期症状であり、エピソード記憶（日々の出来事の記憶）に関連する。意味記憶（言語及び視覚の理解からくる記憶）は疾患の後期に関わる。ＡＤの病理学的特徴は、ベータアミロイド（Ａベータ）を含むアミロイド斑、タウ並びにニューロン及びシナプスの機能障害及び低下を含む神経原線維変化（ＮＦＴ）を包含する（参考文献７〜９）。この１０年間で、ＡＤの病因についての２つの主要な仮説が示されており、その1つである「アミロイド・カスケード説」は、神経変性プロセスが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常プロセスにより引き起される一連のイベントであることを提示しており（参考文献１０）、もう１つの「ニューロン細胞骨格変性説」は、細胞骨格の変化がきっかけとしてのイベントであることを示す（参考文献１１）。ＡＤ進行の解釈として最も広く受け入れられている仮説は、依然として「アミロイド・カスケード説」であり（参考文献１２〜１４）、ＡＤ研究者は、主に、Ａベータタンパク質に関連した毒性をもたらすメカニズムを特定することに注力している。そして微小血管透過性及びリモデリング、血管新生異常、並びに血液脳関門の機能停止が、アミロイド・カスケードにおけるＡＰＰ毒性の原因となる主要なイベントであると特定された（参考文献１５）。それに対し、タウタンパク質は、機能及び実用的関心の両面から医薬産業ではアミロイドほど重要視されていない。さらに、シナプス密度の変化は他の２つより認知障害に関係の深い病変である。
【０００５】
研究において、アミロイド病変は、コリン作動性末端が最も傷つきやすく、続いてグルタミン酸末端、最後はＧＡＢＡ性末端であるという神経伝達物質特異的方法において進行するようであるということが明らかになった（参考文献９）。グルタミン酸は哺乳類の神経系において最も豊富な興奮性神経伝達物質である。病的状態のもとでは、シナプス間隙のグルタミン酸異常蓄積がグルタミン酸受容体の過剰活性を引き起す（参考文献１６）。シナプス間隙のグルタミン酸異常蓄積は、グルタミン酸受容体の過剰活性を引き起し、病的プロセスそして最終的にニューロン細胞死という結果を招く。このプロセスは興奮毒性と名付けられ、急性及び慢性的神経疾患において、一般的にニューロン組織に見受けられる。
【０００６】
興奮毒性は、様々な病因における複数の疾患の発病に関わるということが明らかになってきており、その疾患とは、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、聴力損失、アルコール依存症、アルコール離脱症、アルコール性神経障害、又は神経障害性疼痛、並びに多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、及びハンチントン病などの神経変性疾患などである（参考文献１７〜１９）。これらの疾患に対する効果的な治療法の開発は、疾患の発生率及び治癒的処置の欠如から、主要な公衆衛生の問題点として残存する。
【０００７】
この受容体の様々な部位を標的とするＮＭＤＡＲアンタゴニストは、興奮毒性に対抗するためにテストされてきた。非競合のＮＭＤＡＲアンタゴニストは、イオンチャネル細孔を標的とし、シナプス後ニューロンへのカルシウムの侵入を減少させる。いくつかのＮＭＤＡＲアンタゴニストは承認状況に至った。例として、メマンチンは、現在、中等度から重度のアルツハイマー病への使用が承認されている。また興奮毒性成分を有する他の適応症において臨床的に試験されており、その対象は、アルコール依存（第２段階）、筋萎縮性側索硬化症（第３段階）、パーキンソンに伴う認知症（第２段階）、てんかん、ハンチントン病（第４段階）、多発性硬化症（第４段階）、パーキンソン病（第４段階）、及び外傷性脳損傷（第４段階）などである。しかしながら、ほとんどのアルツハイマー病患者にとってこの分子の効果は限定的であり、これは症状への効果が大きくはないためである。興奮毒性を抑える他の方法はグルタミン酸のシナプス前放出を抑制することである。現在、筋萎縮性側索硬化症に対して承認されているリルゾールは、虚血及び外傷性脳損傷モデルにおいて励みになる結果を示している（参考文献２０〜２３）。初期の多発性硬化症、パーキンソン病（プラセボほどの結果は示していない）、及び脊髄損傷における第２段階のテストが現在おこなわれている。リルゾールは、１９９５年に筋萎縮性側索硬化症の処置の、及び１９９６年にはハンチントン病の処置のためのオーファンドラッグになるに至った。
【０００８】
国際公開第２００９／１３３１２８号、国際公開第２００９／１３３１４１号、国際公開第２００９／１３３１４２号、及び国際公開第２０１１／０５４７５９号は、神経疾患の処置のための組成物に使用され得る分子を開示している。
【０００９】
この分野の活発な研究にかかわらず、神経疾患に対する代替または改良された効果的な治療が依然として必要とされており、その神経疾患は、特にグルタミン酸及び／またはアミロイドベータ毒性と関連した神経疾患のことである。本発明は、そのような中枢神経系（ＣＮＳ）、及び末梢神経系（ＰＮＳ）の神経疾患のための新規の処置を提示する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、神経疾患の処置のための新規の治療的方法を提供することである。
【００１１】
本発明は、特に発明者らによる予期せぬ発見をもとにしており、その偶然の発見とは、単独又は併用のトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、及びモキシフロキサシンが、神経疾患の処置にのための新規の効果的な治療を提示するということである。
【００１２】
故に、本発明は、特にＡＤ及び関連疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ニューロパチー（例として神経障害性疼痛又はアルコール性神経障害）、アルコール依存症又はアルコール離脱症、末梢神経系の損傷、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄損傷、である神経疾患の処置のための新規の組成物及び方法を提供する。
【００１３】
より具体的には、本発明は、少なくともトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン若しくはブロモクリプチン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤を含む、神経疾患の処置に用いられる組成物に関する。
【００１４】
本発明のさらなる目的は以下の組成物に関しており、該組成物は、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択される少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択され、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物と、の併用を含み、これらは共に、個別に又は連続して投与される。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の処置に用いられる組成物に関しており、該組成物は、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択された少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択され、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物と、の併用を含み、これらは共に、個別に又は連続して投与される。
【００１６】
また、本発明は、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、及びブロモクリプチン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択された少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択され、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物、との併用、並びに薬学的に許容される賦形剤を含み、共に、個別に又は連続して投与される組成物に関する。
【００１７】
最も好ましい薬剤組成物は１、２、３、４又は５つの異なる薬剤、さらに好ましくは２、３又は４つの異なる薬剤を含む。さらに前述の薬剤組成物は、神経疾患を有する対象者に有効１つ若しくは複数の追加薬剤又は処置とさらに併用して使用されてもよい。
【００１８】
また、本発明は神経疾患を処置する方法にも関しており、該方法は、その処置を必要とする対象者に上記に開示された薬剤又は組成物を投与することを含む。
【００１９】
本発明のさらなる目的は神経疾患の処置方法に関しており、該方法は、その処置を必要とする対象者に上記に開示された併用薬剤を、共に、個別に又は連続して投与することを含む。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の処置のための薬剤の製造における、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤からなる群より選択された少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、神経疾患の処置のための薬剤の製造における、上記に開示された併用薬剤の使用に関する。
【００２２】
本発明は、疾患のいかなる段階においても、あらゆる哺乳類対象者、特にヒト対象者に使用されることができる。
【００２３】
図１〜図２７において、＊はｐ＜０．０５であり、対照群と有意に異なり（中毒はない）、「ｎｓ」は有意な効果はない（分散分析＋ダネットのポストホックテスト）ことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＨＢＭＥＣにおけるヒトＡβ１−４２傷害に対する、選択薬剤での前処理の効果を示す。薬剤スクリーニングに用いられる実験モデルの検証において、１時間の、１０ｎＭのＶＥＧＦ前処理により、毛細血管網はアミロイド傷害から有意に保護された（アミロイド中毒と比較して＋７０％の毛細血管網）（Ａ）。トラセミド（Ｂ）及びブロモクリプチン（Ｃ）は、それぞれ４００ｎＭ及び３．２ｐＭの低用量において中毒を有意に抑制した一方で、より高い用量及びより低い用量において効果はない又は弱いということが理解される。◎：ｐ＜０．０５、アミロイド中毒と有意差がある。
【図２】図２は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析におけるＬＤＨ放出に対する、選択薬剤での前処理の効果を示す。薬剤スクリーニングに用いられる実験モデルの検証において、1時間のエストラジオール（１５０ｎｇ／ｍｌ）前処理によりアミロイド傷害からニューロンが有意に保護された（−７０％）（Ａ）。これは神経を保護する陽性対照群と考えられる。すべての実験において、Ａβ１−４２はビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ブロモクリプチン（４０ｎＭ、−２９％）（Ｂ）、トリメタジジン（４０ｎＭ、−９４％）（Ｃ）、イフェンプロジル（６００ｎＭ、−９４％）（Ｄ）、メキシレチン（３．２ｎＭ、−７３％）（Ｅ）、モキシフロキサシン（２０ｎＭ、−６３％）（Ｆ）により、有意に抑制される。他の薬剤濃度では、より高い用量及びより低い用量において効果はない又は弱いと理解されたことは注目すべきである。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図３】図３は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するバクロフェンとトラセミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒はバクロフェンとトラセミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のバクロフェン（Ｂ）及びトラセミド（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図４】図４は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するスルフィソキサゾールとトラセミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、スルフィソキサゾールとトラセミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のスルフィソキサゾール（Ｂ）及びトラセミド（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図５】図５は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するエプレレノンとトラセミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒はエプレレノンとトラセミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のトラセミド（Ｂ）及びエプレレノン（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図６】図６は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するブロモクリプチンとスルフィソキサゾールとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して、４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ブロモクリプチンとスルフィソキサゾールとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のブロモクリプチン（Ｂ）及びスルフィソキサゾール（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図７】図７は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対する、アカンプロセートとイフェンプロジルとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はアカンプロセートとイフェンプロジルとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のアカンプロセート（Ｂ）及びイフェンプロジル（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図８】図８は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するバクロフェンとメキシレチンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、バクロフェンとメキシレチンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のバクロフェン（Ｂ）及びメキシレチン（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＝０．０５１、Ａβ１−４２中毒と異なる。
【図９】図９は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するバクロフェンとトリメタジジンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はバクロフェンとトリメタジジンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のバクロフェン（Ｂ）及びトリメタジジン（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１０】図１０は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するシナカルセトとメキシレチンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、シナカルセトとメキシレチンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のシナカルセト（Ｂ）及びメキシレチン（Ｃ）は、中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１１】図１１は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するシンナリジンとトリメタジジンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はシンナリジンとトリメタジジンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のシンナリジン（Ｂ）及びトリメタジジン（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１２】図１２は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するトリメタジジンとゾニサミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はトリメタジジンとゾニサミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のトリメタジジン（Ｂ）及びゾニサミド（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１３】図１３は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するテルビナフィンとトラセミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、テルビナフィンとトラセミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のテルビナフィン（Ｂ）及びトラセミド（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１４】図１４は、ベータアミロイド中毒化されたＨＢＭＥＣ培養物における毛細血管網の全長に対するシナカルセトとメキシレチンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して４０％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒は、シナカルセトとメキシレチンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のシナカルセト（Ｂ）及びメキシレチン（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１５】図１５は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するバクロフェンとトラセミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はバクロフェンとトラセミドとの併用で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のバクロフェン及びトラセミドは中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１６】図１６は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するトラセミドとスルフィソキサゾールとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、トラセミドとスルフィソキサゾールとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のトラセミド（Ｂ）及びスルフィソキサゾール（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１７】図１７は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するモキシフロキサシンとトリメタジジンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はモキシフロキサシンとトリメタジジンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる。モキシフロキサシンの添加は、トリメタジジン単独（Ｃ）で観測される効果を１００％増加させる一方で、同じ濃度の単独のモキシフロキサシン（Ｂ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１８】図１８は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するモキシフロキサシンとバクロフェンとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシンとバクロフェンとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のモキシフロキサシン（Ｂ）及びバクロフェン（Ｃ）は、中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図１９】図１９は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するモキシフロキサシンとシナカルセトとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシンとシナカルセトとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のモキシフロキサシン（Ｂ）及びシナカルセト（Ｃ）は、中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２０】図２０は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するモキシフロキサシンとゾニサミドとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、モキシフロキサシンとゾニサミドとの併用（Ａ）で有意に抑えられる。モキシフロキサシンの添加は、ゾニサミド単独（Ｃ）で観測される効果を８１％増加させる一方で、同じ濃度の単独のモキシフロキサシン（Ｂ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２１】図２１は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するモキシフロキサシンとスルフィソキサゾールとの併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はモキシフロキサシンとスルフィソキサゾールとの併用（Ａ）で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のモキシフロキサシン（Ｂ）及びスルフィソキサゾール（Ｃ）は中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２２】図２２は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性におけるＬＤＨ放出に対するメキシレチン（ＭＥＸ）とイフェンプロジル（ＩＦＮ）との併用療法の効果を示す。凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、メキシレチン２５．６ｐＭとイフェンプロジル２４ｎＭとの併用で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のメキシレチン及びイフェンプロジルは中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．０５７２、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２３】図２３は、ベータアミロイド中毒化された皮質ニューロンにおける神経突起網の全長に対するバクロフェン（ＢＣＬ）とトラセミド（ＴＯＲ）との併用療法の効果を示す。ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）は、ビヒクルで処理された細胞と比較して１５％を超える重大な中毒を引き起こす。この中毒はトラセミドとバクロフェンとの併用で有意に抑えられる。さらにこの併用により神経突起の成長が促進される。◎：ｐ＜０．０５、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２４】図２４は、ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸毒性に対するシナカルセトとメキシレチンとの併用療法の効果を示す。グルタミン酸中毒は、シナカルセト（６４ｐＭ）とメキシレチン（２５．６ｐＭ）との併用で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のシナカルセト及びメキシレチンは中毒に対する有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある（分散分析＋ダネットポストホックテスト）。
【図２５】図２５は、ニューロン皮質細胞におけるグルタミン酸毒性に対するスルフィソキサゾールとトラセミドとの併用療法の効果を表す。グルタミン酸中毒は、スルフィソキサゾール（６．８ｎＭ）とトラセミド（４００ｎＭ）との併用で有意に抑えられる一方で、それらの濃度の単独のスルフィソキサゾール及びトラセミドは、中毒に有意な効果を有しない。◎：ｐ＜０．００１、グルタミン酸中毒と有意差がある（分散分析＋ダネットポストホックテスト）。
【図２６】図２６は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析のＬＤＨ放出におけるトラセミド（ＴＯＲ）前処理の効果を示す。Ａβ１−４２はビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒はトラセミド（２００ｎＭ、−９０％）によって有意に抑えられる。○：ｐ＜０．０００１、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２７】図２７は、ラットの一次皮質細胞のヒトＡβ１−４２毒性分析のＬＤＨ放出におけるアカンプロセートとその誘導体であるホモタウリンとの前処理の比較を表す。Ａβ１−４２は、ビヒクルで処理されたニューロンと比較して重大な中毒を引き起こす。この中毒は、ホモタウリン及びアカンプロセートによって等しく有意に抑えられる（９９％、８ｎＭ）。○：ｐ＜０．０００１、Ａβ１−４２中毒と有意差がある。
【図２８】図２８は、毒性の非存在下で培養された皮質ニューロンの神経突起網の全長ににおけるバクロフェン（ＢＣＬ）とトラセミド（ＴＯＲ）との併用の効果を示す。バクロフェン（４００ｎＭ）とトラセミド（８０ｎＭ）との組合せが培地に添加されると神経突起網の長さの増大が観測される。さらに、この併用により神経突起の成長が促進される一方で、単独のバクロフェン及びトラセミドは神経突起網の長さについて有意な効果を有しない（ｎｓ）。＊ｐ＜０．００５、対照と有意差がある。
【図２９】図２９は、神経挫滅後の神経再生の促進におけるバクロフェン（ＢＣＬ）とトラセミド（ＴＯＲ）との併用の効果を示す。［Ａ］バクロフェンとトラセミドとの併用で処置される神経損傷（神経挫滅）を有する動物は、神経挫滅から７日目及び３０日目に、損傷を受けた坐骨神経に刺激を受けると、シャム手術を受けた動物（白い棒グラフ）又はビヒクルで処置された動物と比較して、ＣＭＡＰにおける有意に小さい潜時を示す。［Ｂ］坐骨神経刺激における筋誘発電位の信号の振幅は、神経挫滅から７日目及び３０日目の両方において、シャム手術を受けた動物と比較して神経損傷を受けた動物において有意に小さい。ＣＭＡＰ振幅における有意な増加は、１日２回、バクロフェン（３ｍｇ／ｋｇ）・トラセミド（４００μｇ／ｋｇ）（用量３）で処置をされた動物において、神経挫滅から３０日目に観察された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０００１、ビヒクルで処置された動物（黒い棒グラフ）と有意差がある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、神経疾患の処置のための新しい組成物を提供する。本発明は、そのような疾患を効果的に改善することができ、且つ患者の処置に用いられ得る薬剤の新規の適用又は新規の併用薬剤を開示する。本発明は、中枢又は末梢を問わず任意の神経疾患、特にアミロイド又はグルタミン酸興奮毒性が関わる疾患の処置に適する。そのような疾患の具体的な例として、アルツハイマー病及び関連疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患、又は、ニューロパチー（例として、アルコール性神経障害、若しくは神経障害性疼痛）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、及び脊髄損傷などの他の神経疾患を含む。「ニューロパチー」は、末梢神経系の神経の損傷状態に関し、遺伝的因子、炎症性疾患によって、薬剤（ビンクリスチン、オキサリプラチン、エチルアルコール）を含む化学物質によって、又は神経に対する直接の物理的損傷によって引き起される末梢神経系の損傷を含む。また、ニューロパチーの処置は神経障害性疼痛の処置も含む。
【００２６】
末梢神経系の損傷はニューロン損傷の段階から順位を付けることが可能である。本発明は、一過性神経伝導障害（神経のシグナル伝達能のみが損なわれた状態）から、軸索断裂（神経の周囲の結合組織を損なうことのない軸索の損傷を示唆する傷害）、神経断裂（軸索と結合組織とを損傷する傷害）に順位付けされる神経損傷の処置に適する。
【００２７】
軸索又は周囲組織（ミエリンなど）の変化は遺伝的原因によるものであり得る。遺伝的に継承されるニューロパチーの例として、いわゆるシャルコー・マリー・トゥース家族病がある。シャルコー・マリー・トゥース病は、変化する特定の遺伝子によって識別される末梢神経に影響を及ぼす、進行性の障害である。変異は軸索の障害を引き起こし、軸索は、神経インパルスを伝達するか、及び／又は神経インパルスの伝達の速さに関与するシュワン細胞によるミエリン鞘の形成に影響を及ぼすものである。ＣＭＴには複数のタイプ（臨床的特性の作用として分類される）及びサブタイプ（遺伝子的分類に相当する）がある。ＣＭＴのタイプは、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２、ＣＭＴ３、ＣＭＴ４、ＣＭＴ５、ＣＭＴ６、ＣＭＴＤＩ、ＣＭＴＲＩ、ＣＭＴＸである。関連する末梢性ニューロパチーは、例えば、ＨＮＰＰ（遺伝性圧脆弱性ニューロパチー）、重度の脱髄性ニューロパチーＤＳＳ（デジュリーヌ・ソッタス症候群）、ＣＨＮ（先天性ミエリン形成不全性ニューロパチー）である。ＣＭＴ１（脱髄型）及びＣＭＴ２（軸索型）はＣＭＴ患者の約７０％を占める。
【００２８】
本発明は、ＡＤ及び関連疾患の処置に特に適する。本発明の文脈では、「ＡＤの関連疾患」という用語は、アルツハイマー型老年性認知症（ＳＤＡＴ）、レビー小体型認知症（Ｌｅｗｉｓ  ｂｏｄｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、血管性認知症、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、及び加齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）を含む。
【００２９】
本明細書で用いられるように、「処置」は、上記疾患若しくは障害によって引き起された症状又は疾患若しくは障害の原因の、治療、抑止、予防、遅延、又は低減を含む。処置という用語は、病気の進行及び関連症状の管理を特に含む。処置という用語は、処置される対象者における、ｉ）アミロイドベータを原因とする毒性に対する防御、又は該毒性の低減若しくは遅延、及び／又は、ｉｉ）グルタミン酸興奮毒性に対する防御、又は該毒性の低減若しくは遅延を特に含む。また処置という用語は、認知症状の改善又はニューロン細胞の保護も表す。ニューロパチーに関して、処置という用語は、再ミエリン化や、新しいニューロン、グリア、軸索、ミエリン若しくはシナプスの形成を包含する神経再生も含む。
【００３０】
本発明の文脈内において、特定の化合物の指示は、具体的に名前を挙げた分子だけでなく、薬学的に許容される任意の、そして任意の純度の、それらの塩、水和物、誘導体（例として、エステル、エーテル）、異性体、ラセミ体、複合体、又はプロドラッグを含むことを意図している。
【００３１】
本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は本発明の化合物の任意の機能性誘導体（又は前駆体）に関し、生体系へ投与されると、例えば自然化学反応（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、酵素触媒化学反応、及び／又は、代謝化学反応などのため前述の化合物が生成される。プロドラッグは、通常、不活性であるか又は生じる薬剤より低活性であり、例えば、薬剤の物理化学的特性の改善、特定組織への薬剤の標的化、薬剤の薬剤動態及び薬力学的特性の改善、並びに／又は、望ましくない副作用の低減などに使用可能である。プロドラッグは典型的に構造Ｘ薬剤を有し、Ｘは不活性担体部分であり且つ薬剤は活性化合物であり、プロドラッグは薬剤よりも低活性であり且つ薬剤はインビボにおいて担体から放出される。プロドラッグの設計に適し、よく使用される官能基の一部として、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミン基、リン酸／ホスホン基およびカルボニル基が含まれるが、これらに限定されない。これらの基の修飾によって通常製造されるプロドラッグは、エステル類、炭酸塩類、カルバメート類、アミド類及びリン酸塩類を含むが、これらに限定されない。適切なプロドラッグを選択するための詳細な技術ガイダンスは技術常識である（参考文献２４〜２８）。加えて、プロドラッグの調製は当業者には既知の従来の方法によっておこなわれることが可能である。その他のプロドラッグを合成するために使用可能な方法は、本主題の数多くの先行文献に記載されている（参考文献２５、２９〜３５）。例を挙げると、アルバクロフェン・プラカルビルは、ＣｈｅｍＩＤ  ｐｌｕｓ  Ａｄｖａｎｃｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍ．ｓｉｓ．ｎｌｍ.ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｈｅｍｉｄｐｌｕｓ／）に掲載されており、アルバクロフェン・プラカルビルはバクロフェンのプロドラッグとしてよく知られている（参考文献３６及び４３）。
【００３２】
化合物の「誘導体」という用語は、その化合物に機能上及び／又は構造上関連する任意の分子を含み、そのような化合物の酸、アミド、エステル、エーテル、アセチル化変異体、ヒドロキシル化変異体、又はアルキル化（Ｃ１−Ｃ６）変異体などのことである。また誘導体という用語は、先に挙げたような１つ以上の置換基を失った状態の構造上関連した化合物も含む。例として、ホモタウリンはアカンプロセートの脱アセチル化誘導体である。化合物の好ましい誘導体は、既知の方法で定められるような、前記化合物に実質的な程度の類似性を有する分子である。親分子との類似性指標を伴う類似化合物は、ＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｅａｒｃｈ／）又はＤｒｕｇＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／）など、数多くのデータベースに見受けられる。より好ましい実施形態では、誘導体は、親薬剤に対して、０．４を超える、好ましくは０．５を超える、より好ましくは０．６を超える、さらにより好ましくは０．７を超える谷本類似性指標（Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を有する必要がある。谷本類似性指標は、２分子間の構造的類似の程度を測定するために広く用いられている。また谷本類似性指標は、インターネット上で使用可能なｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｕｂｇｒａｐｈ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｈｏｒｎｔｏｎ−ｓｒｖ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＳＭＳＤ／）（参考文献３７〜３８）などのソフトウェアにより解析可能である。好適な誘導体は構造上及び機能上の両面において親化合物に関連する必要がある、言い換えると、誘導体は親薬剤の活性の少なくとも一部を保持し、より好ましくは、誘導体はＡβ又はグルタミン酸毒性に対する保護活性を示す必要もある。
【００３３】
誘導体という用語は、例えば、組織への投与後に通常は特別な酵素系を通過する薬剤における（生化学的）変化又は作用の結果であり、またその薬剤の生物活性を示すか又は保持する分子などの、薬剤の代謝物も含む。代謝物は親薬剤の治療的作用の多くを担っていることが開示されている。特定の実施形態では、本明細書で使用される「代謝物」は、親薬剤の活性の少なくとも一部を保持する改変又は作用後の薬剤を指し、好ましくは、Ａβ毒性又はグルタミン酸毒性に対する保護活性を示す改変又は作用後の薬剤を指す。代謝物の例として、薬剤の肝代謝の結果としてのトラセミドのヒドロキシル化形態を含む（Ｄｒｕｇ  ｂａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ、参考文献３９）。
【００３４】
用語「塩」は、薬学的に許容され、比較的非毒性である、本発明における化合物の無機又は有機酸付加塩に関する。医薬塩の形成では、酸性、塩基性、又は双性イオン性の薬剤分子を対イオンとペアリングさせて薬剤の塩型を生成する。幅広い種類の化学種が中和反応において使用されることができる。このように本発明の薬学的に許容される塩は、塩基として機能する主化合物を無機又は有機酸と反応させて塩を形成することにより得られる塩を含み、例として、酢酸、硝酸、酒石酸、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、又はクエン酸の塩が挙げられる。また、本発明の薬学的に許容される塩は、主化合物が酸として機能し、適切な塩基と反応させて、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩又はコリン塩などを形成する塩も含む。所定の活性原理の塩の大部分は生物学的に同等であるが、とりわけ、一部の塩は溶解性又は生物学的利用能が増加し得る。現在、塩の選択は、Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ  Ｗｅｒｍｕｔｈのハンドブックによる教示のように、薬剤開発過程において一般的な標準作業になっている（参考文献４０）。
【００３５】
「併用」又は「併用処置・療法」という用語は、少なくとも２つ以上の薬剤が対象に共に投与されて生物学的作用を引き起こす処置を指す。本発明の併用療法では、少なくとも２つの薬剤が一緒に若しくは個別に、共にもしくは連続して投与されてもよい。また、この少なくとも２つの薬剤は異なる経路及びプロトコルにより投与されてもよい。結果として、少なくとも２つの薬剤が一緒に製剤化されることも、併用薬剤が個別に製剤化されることもできる。
【００３６】
実施例に開示されるように、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシンは、神経疾患に関わる生物学的プロセスに予想外である強い作用を有する。さらに、これらの化合物はまたそのような疾患の症状の改善に大変効能があることをインビボで示した。したがって、これらの分子は単独又は併用療法で神経疾患の処置のための新しい方法を提示しており、その神経疾患とは、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ニューロパチー（例としては、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、及び脊髄損傷などである。これらの薬剤と他の選択化合物との併用（表２参照）は特に有効であり、それは薬剤単独では実質的に効果がない用量で、それら化合物が驚くべき且つ予想外の相乗効果を生むからである。またこの効能のため、本明細書で開示された併用薬剤は低用量にて使用されることが可能であり、これはさらに大きな実質的利点になる。
【００３７】
つまり、特定の実施形態において、本発明は、ＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例としては、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の処置に使用するための組成物に関しており、該組成物は少なくともトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、若しくはモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体若しくはそれらの徐放性製剤を含む。
【００３８】
各化合物の具体的なＣＡＳ番号が下記表１に提示される。また表１は、本発明の組成物に使用される化合物の一般的な塩、ラセミ体、プロドラッグ、代謝物又は誘導体にも非制限的に言及する。
【００３９】
【表１】
0006395838.tif 000002
上記分子は、最大限の臨床上の効果を得るために、単独又は好ましくは併用療法にて用いられてもよい。これに関し、好ましい実施形態において、本発明は、望ましくはＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例としては、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷である神経疾患の処置に用いられる組成物に関しており、該組成物は、上記化合物のうちのいずれか１つと、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、モキシフロキサシン、ブロモクリプチン若しくはトラセミド、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択される少なくとも１つの異なる化合物との併用を含む。
【００４０】
以下の表２において、表１の化合物とは異なる、別の追加的各化合物の具体的なＣＡＳ番号が提示される。
【００４１】
【表２】
0006395838.tif 000003
バクロフェンのプロドラッグの具体的な例は、２０１１年のＨａｎａｆｉ等による文献（参考文献４１）に掲載されており、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）を標的にした特定指向性を持つバクロフェンエステル及びバクロフェンエステルカルバメートである。したがって、そのようなプロドラッグは本発明の組成物に特に適している。前述されたアルバクロフェン・プラカルビルも既知のプロドラッグであり、本発明の組成物においてバクロフェンの代替に使用されてもよい。バクロフェンのその他のプロドラッグは、国際公開第２０１０／１０２０７１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７９５８号、国際公開第２００９／０９６９８５号、国際公開第２００９／０６１９３４号、国際公開第２００８／０８６４９２号、米国特許出願公開第２００９／０２１６０３７号、国際公開第２００５／０６６１２２号、米国特許出願公開第２０１１／００２１５７１号、国際公開第２００３／０７７９０２号、国際公開第２０１０／１２０３７０号の特許出願に見受けられる。
【００４２】
アカンプロセートの有用なプロドラッグである、アカンプロセートのパントイン酸エステルネオペンチルスルホニルエステル、ネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグ、又は潜在性カルボキシレートネオペンチルスルホニルエステルプロドラッグなどは、特に、国際公開第２００９／０３３０６９号、国際公開第２００９／０３３０６１号、国際公開第２００９／０３３０５４号、国際公開第２００９／０５２１９１号、国際公開第２００９／０３３０７９号、米国特許出願公開第２００９／００９９２５３号、米国特許出願公開第２００９／００６９４１９号、米国特許出願公開第２００９／００８２４６４号、米国特許出願公開第２００９／００８２４４０号、及び米国特許出願公開第２００９／００７６１４７号に挙げられている。
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明は、神経疾患の処置においてその処置を必要とする対象者に使用されるための、
トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択される少なくとも１つの第１の化合物と、その併用における、
スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの任意の化学的純度の誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤から選択される、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物と、を含む組成物に関する。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＤ又は関連疾患の処置のために、その処置を必要とする対象者において、それらの薬剤又は組成物を使用することに関する。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明は、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の処置のために、その処置を必要とする対象者において、それらの薬剤又は組成物を使用することに関する。
【００４６】
実施例において開示されるように、上述の薬剤のうちの１つ以上を用いる組成物療法は、アルツハイマー病及び他の神経疾患の効果的改善を導く。実験の項で示されるように、少なくともトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン、及びモキシフロキサシンを含む組成物は、ヒト細胞におけるアミロイドβ（Ａβ）タンパク質又はペプチドの毒性作用の抑制に、実質的な治療的及び生物学的作用を提供する。さらに、インビボにおいて、これらの組成物は、認知症状の改善、及びグルタミン酸興奮毒性内のＡβ中毒から引き起こされる分子経路の抑止を導く。したがって、組成物療法はそのような疾患の処置に対して新規且つ有力な方法を示す。さらに、実験の項では、上記組成物は、ｉ）ニューロン細胞をグルタミン酸毒性からインビトロにおいて相乗的に保護し、そしてｉｉ）グルタミン酸興奮毒性に関する疾患に対し、インビトロモデルにおいて臨床的効果をもたらす、という点で効果的であるということも示される。
【００４７】
より好ましくは、本発明の薬剤組成物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の併用処置を必要とする対象者におけるその併用処置のための、１、２、３、４又は５つの異なる薬剤、さらにより好ましくは２、３又は４つの異なる薬剤を含んでもよい。好ましい実施形態において、本発明の薬剤は、最大限の効果を提供するように、組合せ、個別又は連続投与のために併用されて用いられる。
【００４８】
特定の実施形態において、本組成物は、（ｉ）トラセミド、並びに（ｉｉ）ブロモクリプチン、バクロフェン、スルフィソキサゾール、エプレレノン若しくはテルビナフィンから選択された化合物、又は前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、若しくは徐放性製剤を含む。
【００４９】
別の特定の実施形態において、本組成物は、（ｉ）トリメタジジン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シンナリジン、ゾニサミド若しくはモキシフロキサシンから選択された化合物、又は前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、若しくは徐放性製剤を含む。
【００５０】
さらなる特定の実施形態では、本組成物は、（ｉ）モキシフロキサシン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シナカルセト、ゾニサミド、スルフィソキサゾール、若しくはトリメタジジンから選択された化合物、又は前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、若しくは徐放性製剤を含む。
【００５１】
別のさらなる特定の実施形態において、本組成物は、（ｉ）メキシレチン並びに（ｉｉ）バクロフェン、シナカルセト、イフェンプロジル、若しくはレボシメンダンから選択された化合物、又は前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、若しくは徐放性製剤を含む。
【００５２】
また、特定の実施形態は、（ｉ）イフェンプロジル並びに（ｉｉ）アカンプロセート、レボシメンダン、若しくはメキシレチンから選択された化合物、又は前述の化合物（ｉ）及び（ｉｉ）の塩、プロドラッグ、誘導体、若しくは徐放性製剤を含む組成物に関する。
【００５３】
本発明の好ましい組成物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの神経疾患の処置に用いるために、組合せ、個別又は連続して投与される下記併用薬剤、
‐バクロフェン及びトラセミド、
‐エプレレノン及びトラセミド、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐スルフィソキサゾール及びトラセミド、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトラセミド、
‐モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、又は
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
のうちの１つを含む。
【００５４】
組合せ、個別又は連続の投与のための少なくとも３つの化合物の組合せを含む、本発明にかかる好ましい組成物の例は、
‐バクロフェン及びトリメタジジン及びトラセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトラセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、又は
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン、である。
【００５５】
組合せ、個別又は連続の投与のための少なくとも４つの化合物の組合せを含む、本発明にかかる好ましい組成物の例は、
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトラセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトラセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド及びジエチルカルバマジン、又は
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド及びイフェンプロジル、である。
【００５６】
実験の項で開示されるように、本発明の上記併用療法は、Ａβ毒性に対する強力な神経保護作用を誘引し、行動特性及びインビボの生化学分析において有効な結果を示す。この結果は、本発明の組成物が、ｉ）インビボにおいてＡβ凝集体が引き起こす分子経路を効果的に改善し、ｉｉ）ニューロン生存又はシナプス結合として、罹患動物に見られる神経生理学的機能障害の改善を導くことを示す。さらに本結果では、上述の併用療法が、グルタミン酸興奮毒性(図２４及び図２５、表８)に対し、ＡＤ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの様々な神経疾患に関する経路に対し、重要な相乗的神経保護作用を示すことも表す。これらの療法は、これら疾患のインビボ又はインビトロモデルにおいて有効な結果を示している。加えてインビボの結果は、本発明の組成物によって、一部の神経疾患で損傷されることが知られる血液脳関門の完全性が効果的に回復されることを示す。
【００５７】
従って、本発明の目的は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの神経疾患の処置のための上述のような組成物にもある。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの神経疾患の処置を目的とする薬剤製造のための上述のような組成物の使用にある。
【００５９】
さらに本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの神経疾患の処置のための方法を提供し、上記開示された組成物の有効量を、処置を必要とする対象者に投与することを含む。
【００６０】
前述されたように、本発明の併用処置又は組成物における化合物は、一緒に又は個別に製剤されてもよく、そして一緒に、個別に又は連続して、及び／又は繰り返して投与されてもよい。
【００６１】
つまり、本発明の所定の目的は、対象者のＡＤ、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷を処置するための方法であり、そのような処置を必要とする対象者に、上記に開示された組成物の有効量を、共に、個別に又は連続して投与することを含む方法である。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象者における、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の処置方法に関し、有効量のトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン若しくはモキシフロキサシン、又はそれらの塩、若しくはそれらのプロドラッグ、若しくはそれらの誘導体、若しくはそれらの徐放性製剤を、好ましくは上記に開示されたような組合せで対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象者における、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の処置方法であって、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤からなる群より選択される少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤から選択される、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物と、を併用して、対象者に、共に、個別に又は連続して投与することを含む方法に関する。
【００６４】
さらなる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の処置方法であって、トラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、イフェンプロジル、ブロモクリプチン及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤からなる群より選択される少なくとも１つの第１の化合物と、スルフィソキサゾール、メチマゾール、プリロカイン、ジフィリン、キナクリン、カルベノキソロン、アカンプロセート、アミノカプロン酸、バクロフェン、カベルゴリン、ジエチルカルバマジン、シナカルセト、シンナリジン、エプレレノン、フェノルドパム、レフルノミド、レボシメンダン、スロデキシド、テルビナフィン、ゾニサミド、エトミデート、フェンホルミン、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル、トラセミド、及びモキシフロキサシン、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤から選択される、前述の第１の化合物とは異なる少なくとも１つの第２の化合物と、を併用して、処置を必要とする対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６５】
実施例において開示されるように、バクロフェン・トラセミド療法は、ニューロンをグルタミン酸毒性から保護することに有効であることに加え、毒性薬剤又は条件に対するいずれの曝露もなくとも、ニューロン細胞の成長促進に特に有効でもある。さらに、この併用療法は、インビボにおいて、神経損傷に続く神経信号伝達の欠失を改善させる。故に、バクロフェン・トラセミドの併用は、上述されるようなニューロパチー、神経損傷、及び脊髄損傷を処置するための新規且つ有力な療法を示す。
【００６６】
つまり、特定の実施形態において、本発明は、例えば末梢神経損傷又は脊髄損傷であるニューロパチーを処置するための方法であって、バクロフェン及びトラセミド、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤を含む組成物を、処置を必要とする対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６７】
他の特定の実施形態において、本発明は、例えばＣＭＴ疾患として遺伝的に継承されるニューロパチーであるニューロパチーを処置するための方法であって、バクロフェン及びトラセミド、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤を含む組成物を、処置を必要とする対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６８】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＣＭＴ１又はＣＭＴ２疾患を処置するための方法であって、バクロフェン及びトラセミド、又はそれらの塩、それらのプロドラッグ、それらの誘導体、若しくはそれらの任意の製剤を含む組成物を、処置を必要とする対象者に投与することを含む方法に関する。
【００６９】
また、本発明の特定の目的は、例えば末梢神経損傷又は脊髄損傷であるニューロパチーを処置するための方法であって、上述されたようなバクロフェン及びトラセミドの有効量を、そのような処置を必要とする対象者に、共に、個別に、又は連続して、及び／又は繰り返して投与することを含む方法でもある。
【００７０】
本発明の方法と組成物とは、インビトロ又はインビボで非常に有効であるが、対象者又は特定の条件次第で、対象者において処置される神経性症状に有益な追加的薬剤又は処置とさらに併用して用いられてもよい。つまり、特定の実施形態において、本発明にかかる薬剤又は組成物はイチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物とさらに併用されてもよい。適切な抽出物は、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物、改良型イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物（例として、活性成分を濃縮若しくは混入物質を減少させたもの）、又はイチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物を含有する任意の薬剤を、非制限的に含む。
【００７１】
イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物は、少なくともトラセミド、トリメタジジン、メキシレチン、ブロモクリプチン、イフェンプロジル及びモキシフロキサシンを含む組成物に使用されてもよい。
【００７２】
好ましい実施形態において、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  Ｂｉｌｏｂａ）抽出物は、以下の併用薬剤、
‐アカンプロセート及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びメキシレチン、
‐バクロフェン及びトラセミド、
‐バクロフェン及びトリメタジジン、
‐ブロモクリプチン及びスルフィソキサゾール、
‐シナカルセト及びメキシレチン、
‐シンナリジン及びトリメタジジン、
‐エプレレノン及びトラセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトラセミド、
‐トリメタジジン及びゾニサミド、
‐レボシメンダン及びメキシレチン、
‐レボシメンダン及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びモキシフロキサシン、
‐テルビナフィン及びトラセミド、
‐モキシフロキサシン及びバクロフェン、
‐モキシフロキサシン及びシナカルセト、
‐モキシフロキサシン及びゾニサミド、
‐モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
‐メキシレチン及びイフェンプロジル、
‐バクロフェン及びトリメタジジン及びトラセミド、
‐バクロフェン及びシナカルセト及びトラセミド、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド、
‐スルフィソキサゾール及びトリメタジジン及びトラセミド及びゾニサミド、
‐スルフィソキサゾール及びメキシレチン及びトラセミド及びシナカルセト、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド及びジエチルカルバマジン、
‐バクロフェン及びアカンプロセート及びトラセミド及びイフェンプロジル、
‐レボシメンダン及びバクロフェン及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びアミノカプロン酸及びトリメタジジン、
‐レボシメンダン及びテルビナフィン及びトリメタジジン、又は
‐レボシメンダン及びスルフィソキサゾール及びトリメタジジン、のうちのいずれか１つと併用されて用いられる。
【００７３】
本発明の薬剤又は併用薬剤とともに用いられる他の療法は、アルツハイマー病、ＡＤ関連疾患、ＭＳ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＨＤ、ニューロパチー（例として、神経障害性疼痛若しくはアルコール性神経障害）、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷の症状を改善する１つ以上の薬剤、或いはこれらの疾患の緩和的処置に使用され得る薬剤を含むとよい。
【００７４】
例としては、本発明における併用は、ドネペジル（ＣＡＳ：１２００１４−０６−４）、ガバペンチン（ＣＡＳ：４７８２９６−７２−９、６０１４２−９６−３）、ガランタミン（３５７−７０−０）、リバスチグミン（１２３４４１−０３−２）、又はメマンチン（ＣＡＳ：１９９８２−０８−２）と共に用いられることができる。
【００７５】
本発明のさらなる目的は、前記挙げられた疾患の処置を目的とする薬剤製造のための、上記に開示されたような化合物又は化合物の組合せの使用であって、処置を必要とする対象者に、組み合わせて、個別に、又は連続して投与されることによる使用に関する。
【００７６】
本発明のさらなる目的は、医薬組成物の調製方法であって、上記化合物を適切な賦形剤又は担体に混合することを含む方法である。
【００７７】
本療法の継続期間は、処置される疾患若しくは障害の段階、使用される組合せ、患者の年齢及び状態、並びに患者の処置に対する反応の様子に依拠する。併用される各成分の投与用量、投与頻度及び投与方式は独立して管理されることができる。例として、１つの薬剤が経口で投与され、一方で第２の薬剤が筋肉内に投与されてもよい。併用療法は、患者の身体があらゆる予期せぬ副作用から回復する時間がとれるように休止期間をはさんだ断続的周期でおこなわれてもよい。また、薬剤は、１回の投与ですべての薬剤を送達するように一緒に製剤化されてもよい。
【００７８】
併用される各薬剤の投与は、他の成分との組合せで、患者の状態を改善することができるか、又は疾患若しくは障害を効果的に処置できる薬剤の濃度をもたらす任意の適切な手段でおこなわれるとよい。
【００７９】
併用される活性成分が純粋な化学物質として投与されることは可能であるが、それらを医薬組成物（この文脈では、医薬製剤としても言及される）として提供することが好ましい。可能な組成物としては、経口投与、経直腸投与、（経皮、経口腔及び舌下投与を含む）局所投与、又は（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内投与を含む）非経口投与に適切なものが含まれる。
【００８０】
更に一般的には、これらの医薬製剤は、いくつかの単位用量を含む「患者用パック」にして、又は個別の処置期間に単一包装（通常はブリスターパック）において使用される計量単位用量を投与するための他の手段で、患者に処方される。患者用パックは、患者が常に患者用パックに含まれる添付文書を利用できる（従来処方では普通は紛失している）という点で、薬剤師が医薬の患者供給分をバルク供給分から分ける従来の処方よりも利点がある。この添付文書の封入により、医師の指示に対する患者コンプライアンスが改善されることが示されている。従って、本発明は、製剤に適切な包装材料を組み合わせた、本明細書に前述されたような医薬製剤を更に含む。このような患者用パックにおいて、併用療法の製剤の意図される使用は、その処置に最も適切に製剤を使用することを補助するための指示、使いやすさ、提供性、適合性及び／又は他の手段によって推察されることができる。このような評価基準により、患者用パックは本発明の併用を用いる処置に使用するために特に適切且つ適応する。
【００８１】
薬剤は、任意の適量で、組成物の総重量の１〜９９重量％の量で存在し得る任意の適切な担体物質（例えば、賦形剤、ビヒクル、補助剤）に含まれるとよい。組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内）、経直腸、経皮、経鼻、経膣、吸入、皮膚（パッチ）、又は経眼の投与経路に適する投与剤形として提供されることができる。すなわち、組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ヒドロゲルを含むゲル剤、泥膏、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、飲薬、浸透圧送達装置、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、又はエアゾール剤の剤形を取るとよい。
【００８２】
本医薬組成物は、従来の製薬の実施法に従い製剤化されることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．）、ｅｄ．  Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００並びにＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ及びＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ、１９８８〜１９９９、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００８３】
本発明にかかる医薬組成物は、投与後に実質的に直ちに、又は投与後の任意の所定の時間若しくは期間に、活性薬剤を放出するように製剤化されることができる。
【００８４】
放出制御製剤は、（ｉ）長時間にわたり体内で薬剤の実質的な一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉ）所定の遅延時間後に長時間にわたり体内で薬剤の実質的な一定濃度をもたらす製剤、（ｉｉｉ）活性薬剤物質の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えて、体内で比較的一定の有効薬剤レベルを維持することにより、所定の期間、薬剤作用を持続させる製剤、（ｉｖ）例えば、患部組織若しくは臓器の近く、又はその中に放出制御組成物を空間配置することにより、薬剤作用を局在化させる製剤、及び（ｖ）薬剤を特定の標的細胞型に送達するために担体又は化学的誘導体を使用することにより、薬剤作用を標的化させる製剤、を含む。
【００８５】
放出制御製剤の形態における薬剤の投与は、その薬剤が、単独または併用のいずれかで、（ｉ）低い治療指数（即ち、有害な副作用又は毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との間の差が小さい。一般には、治療指数（ＴＩ）は、５０％有効量（ＥＤ５０）に対する５０％致死量（ＬＤ５０）の比として定義される）、（ｉｉ）狭い消化管吸収域、又は（ｉｉｉ）非常に短い生物学的半減期（これにより、血漿レベルを治療レベルに維持するために１日に頻回の投与が必要となる）を有する場合に特に好ましい。
【００８６】
対象の薬剤の放出速度が代謝速度を上回る放出制御を得るために、多数の方策のいずれも追求されることができる。放出制御は、例えば放出制御組成物及びコーティングの様々なタイプを含む、種々の製剤パラメータ及び成分の適切な選択により得られる。即ち、薬剤は、適切な賦形剤で、投与により薬剤を制御放出する医薬組成物に製剤化される（単独又は複数単位の錠剤又はカプセル剤組成物、油性液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソーム）。
【００８７】
＜経口使用のための固体投与剤形＞
経口使用のための製剤は、薬学的に許容される非毒性の賦形剤との混合物中に活性成分を含む錠剤を包含する。これらの賦形剤は、例として、不活性希釈剤又は充填剤（例えばショ糖、微結晶性セルロース、バレイショデンプンを包むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム）、顆粒剤及び崩壊剤（例えば微結晶性セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネイト、又はアルギン酸）、結合剤（例えばアカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール）、並びに潤滑剤、滑剤、及び粘着防止剤（例えばステアリン酸、シリカ、又はタルク）であってよい。他の薬学的に許容される賦形剤は、着色剤、香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。
【００８８】
錠剤は、素錠か、又は任意的に消化管での崩壊及び吸収を遅延させることにより長時間にわたる持続作用を提供するために、既知の手法によりコーティングされていてもよい。コーティングは、活性薬剤物質を既定のパターン（例えば、放出制御製剤を得るため）で放出するようにつくるか、又は胃の通過後まで活性薬剤物質を放出しないようにつくる（腸溶性コーティング）ことができる。コーティングは、糖衣、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコール及び／若しくはポリビニルピロリドンに基づく）、又は腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、及び／若しくはエチルセルロースに基づく）であってよい。時間遅延物質として、例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどを利用することができる。
【００８９】
固体の錠剤組成物は、不要な化学変化（例えば活性薬剤物質の放出に先立つ化学分解）から組成物を保護するように適応されたコーティングを含んでもよい。コーティングは、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されるものと同様の方法で固体投与剤形に適用されることができる。
【００９０】
複数の薬剤が、錠剤中に混合されていても、又は仕切られていてもよい。例として、第１の薬剤の放出前に第２の薬剤の大部分が放出されるように、第１の薬剤は錠剤の内側に、そして第２の薬剤は外側に包含される。
【００９１】
また、経口使用のための製剤は、チュアブル錠として、或いは活性成分が不活性固体希釈剤（例えばバレイショデンプン、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリン）と混合された硬ゼラチンカプセル剤として、或いは活性成分が水性又は流動パラフィン若しくはオリーブ油などの油性媒体と混合された軟ゼラチンカプセル剤として提供されることもできる。散剤及び顆粒剤は、錠剤及びカプセル剤について上記で述べた成分を用いて、従来法で調製されるとよい。
【００９２】
経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性薬剤物質の溶解及び／または拡散を制御することにより活性薬剤を放出するように構成されるとよい。
【００９３】
溶解制御放出又は拡散制御放出は、薬剤の錠剤製剤、カプセル剤製剤、ペレット製剤、若しくは顆粒製剤に適切なコーティングを施すことにより、又は薬剤を適切なマトリックスに組み込むことにより得ることができる。放出制御コーティングは、上記のコーティング物質のうちの１種以上、並びに／又は、例えば、セラック、ミツロウ、グリコワックス（ｇｌｙｃｏｗａｘ）、硬化ヒマシ油（ｃａｓｔｏｒ  ｗａｘ）、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、及び／若しくは、ポリエチレングリコールを含むとよい。放出制御マトリックス製剤において、マトリックス物質は、例えば水和メチルセルロース、カルナウバロウ及びステアリルアルコール、カーボポール９３４（ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９３４）、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、及び／又は、ハロゲン化フルオロカーボンを含んでもよい。
【００９４】
また、本願に記載の組合せにおける１種以上の薬剤を含む放出制御組成物は、浮揚性錠剤又はカプセル剤（即ち、経口投与されると、所定の時間、胃の内容物上に浮いている錠剤又はカプセル剤）の剤形であってもよい。薬剤の浮揚性錠剤の製剤は、賦形剤及び２０〜７５％（ｗ／ｗ）の親水コロイド（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）と薬剤の混合物を顆粒化することにより調製されることができる。得られた顆粒は次に錠剤へと圧縮されることができる。この錠剤は、胃液と接触すると、その表面周囲に、実質上水不透過性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは１未満の密度を維持することに貢献し、それによって錠剤が胃液中で浮揚性を保持できる。
【００９５】
＜経口投与用液剤＞
水の添加による水性懸濁液の調製に適する散剤、分散性散剤、又は顆粒剤は、経口投与に適した投与剤形である。懸濁液としての製剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び１種以上の保存剤との混合物において活性成分を提供する。適切な懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどである。
【００９６】
＜非経口投与用組成物＞
本医薬組成物はまた、従来の非毒性の薬学的に許容される担体及びアジュバントを含む、投与剤形、製剤で、又は適切な送達装置若しくはインプラントを介して、注射、点滴又は注入（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（静脈内、筋肉内、皮下など）によって非経口投与されてもよい。このような組成物の製剤及び調製は医薬品製剤における当業者には周知である。
【００９７】
非経口使用の組成物は、適切な保存剤が添加され得る（以下を参照のこと）単位投与剤形として（例えば、単回投与用アンプルとして）、又は数回の用量を含むバイアルとして提供されることができる。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、点滴装置、若しくはインプラント用の送達装置の剤形をとることが可能であり、又は使用前に水若しくは別の適切なビヒクルで再構成されるドライパウダーとして提供してもよい。本組成物は、活性薬剤の他に、非経口投与に許容される適切な担体及び／又は賦形剤を含むことができる。活性薬剤は、放出制御のためにマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム，又は同様のものに組み込まれることができる。本組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、及び／又は分散剤を含んでもよい。
【００９８】
本発明の医薬組成物は無菌注射に適した剤形であり得る。このような組成物を調製するために、適切な活性薬剤は非経口投与に許容される液体ビヒクルに溶解又は懸濁される。利用可能で許容されるビヒクル及び溶媒には、水、適切なｐＨに調整するために適量の塩酸、水酸化ナトリウム若しくは適切な緩衝剤を添加した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。また、水性製剤は１種以上の保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ?ヒドロキシ安息香酸エチル、又はｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）を含んでもよい。薬剤の１つが水にあまり溶けないか又はわずかに溶ける場合に、溶解増強剤もしくは可溶化剤を添加することができ、或いはこの溶媒は１０〜６０％（ｗ／ｗ）のプロピレングリコールなどを含むことが可能である。
【００９９】
放出制御非経口組成物は、水性懸濁剤、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油性液剤、油性懸濁剤、または乳剤の剤形であってよい。代替的に、活性薬剤は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または点滴装置に組み込まれることができる。マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用される物質は、例えば、ポリグラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）などの、生分解性／生浸食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）ポリマーである。放出制御非経口製剤を製剤化するときに使用され得る生体適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質、又は抗体である。インプラントに使用される物質は、非生分解性（例えばポリジメチルシロキサン）、又は生分解性（例えばポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）若しくはポリ（オルトエステル））であり得る。
【０１００】
＜その他の経路＞
好ましさや便利さには欠けるが、他の投与経路、及びそのための他の製剤が考慮され得る。これに関して、直腸内適用では、組成物に適する投与剤形は、坐剤（乳剤又は懸濁剤型）、及び直腸用ゼラチンカプセル剤（液剤又は懸濁剤）を含む。通常の坐剤製剤では、活性薬剤は、適切な薬学的に許容される坐剤基剤（カカオバター、エステル化脂肪酸、グリセリンゼラチンなど）及びポリエチレングリコールなどの種々の水溶性又は分散性基剤と組み合わせられる。種々の添加剤、増強剤、又は界面活性剤が組み込まれてもよい。
【０１０１】
また、本医薬組成物は、マイクロスフェア及びリポソームを含む慣習的に非毒性の薬学的に許容される担体及び賦形剤を含有する投与剤形又は製剤として、経皮吸収のために皮膚上に局所投与されることができる。この製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、液剤、懸濁剤、スティック剤、噴霧剤、泥膏、硬膏剤、及び他の種類の経皮薬物送達システムを含む。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、乳化剤、酸化防止剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護剤を含むとよい。
【０１０２】
保存剤、保湿剤、浸透促進剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのパラベン類、及び塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素などであってよい。
【０１０３】
また、皮膚への局所投与のための上記の医薬組成物は、処置される身体の部分への、又はその近傍への局所投与に関連して使用されることができる。組成物は、包帯、若しくは代替的な硬膏、パッド、スポンジ、ストリップ、又は他の形態の適切な可撓性の材料などの特別な薬物送達手段によって、直接的な適用又は適用に適合されることができる。
【０１０４】
＜用量及び処置の期間＞
併用薬剤は、同一若しくは異なる医薬品製剤のいずれかで共に、又は連続して投与されるとよいということが理解される。連続投与であるならば、第２の（又は追加の）活性成分の投与における遅延時間は、活性成分の併用の有効な作用の恩恵を失わないようにすべきである。本記載の併用にとって最小限の要件は、活性成分の併用における有効作用の恩恵を有する併用の使用が、併用の目的とされる必要があるということである。併用の意図される使用は、本発明の併用の使用を補助する使いやすさ、提供性、適合性及び／又は他の手段により推察されることができる。
【０１０５】
本発明の活性薬剤は、分割用量で、例えば１日２回又は３回投与されることができるが、併用される各薬剤の１日１回服用が好ましく、単一医薬組成物（単位投与剤形）にした全ての薬剤の１日１回服用が最も好ましい。
【０１０６】
「単位投与剤形」という用語は、ヒト対象のための単位用量に適した物理的に個別のユニット（カプセル剤、錠剤、または充填済み注射シリンジなど）に関し、各ユニットは、必要とされる製剤担体に関連して、所望の治療的効果を生み出すように算出された所定量の活性物質を含む。
【０１０７】
投与は通常繰り返しておこなわれる。投与は、数日〜数年にわたって１日１〜数回であり得、患者の生涯にわたることさえある。長期投与又は少なくとも定期的に反復される長期投与が多くの症例において提示される。
【０１０８】
さらに、特定の患者についての薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学又は有効性プロファイルにおける遺伝子型の影響）情報が、使用する用量に影響し得る。
【０１０９】
高用量が必要とされ得る特に障害のある症例の対応時を除いて、併用される各薬剤の好ましい用量は、通例、長期維持療法に通常処方されるか又は第３段階臨床試験において安全が証明された量を超えない用量の範囲内である。
【０１１０】
本発明の格別に顕著な一利点は、併用療法において、組合せで実質的な臨床的有効性を患者にもたらしながら、各化合物を低用量で使用できることである。併用療法は、化合物が個々には実質的な作用を持たない用量で、実際に有効になりうる。したがって、本発明の所定の利点は、各化合物の準最適用量、すなわち、通常処方される治療用量より低い用量、好ましくは治療用量の１／２、より好ましくは治療用量の１／３、１／４、１／５、又は更により好ましくは治療用量の１／１０で使用可能なことにある。特定の実施例において、治療用量の１／２０、１／３０、１／５０、１／１００の低用量が、又はさらに低い用量が用いられる。
【０１１１】
このような準最適用量では、単独の化合物は実質的に不活性である一方で、本発明の併用は十分に有効である。
【０１１２】
好ましい用量は、長期維持療法に通常処方される量の１％〜５０％の量に相当する。
【０１１３】
最も好ましい用量は、長期維持療法に通常処方される量の１％〜１０％の量に相当するとよい。
【０１１４】
本発明において使用される薬剤用量の具体例は、
‐経口における、１日当たり約０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは１日当たり５ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり２．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり１ｍｇ未満の、ブロモクリプチン（このような用量は経口投与に特に適する）、
‐経口における、１日当たり約０．４〜６ｍｇ、好ましくは１日当たり３ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０．７５ｍｇ未満の、イフェンプロジル（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約６〜１２０ｍｇ、好ましくは１日当たり６０ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり３０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり１５ｍｇ未満の、メキシレチン（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約４〜４０ｍｇ、好ましくは１日当たり２０ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１０ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり５ｍｇ未満の、モキシフロキサシン（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約０．０５〜４ｍｇ、好ましくは１日当たり２ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０.５ｍｇ未満の、トラセミド（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約０．４〜６ｍｇ、好ましくは１日当たり３ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり１．５ｍｇ未満、さらにより好ましくは１日当たり０．７５ｍｇ未満の、トリメタジジン（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約１〜４００ｍｇのアカンプロセート、
‐経口における、１日当たり約０．１〜２．４ｇのアミノカプロン酸、
‐１日当たり０．０１〜１５０ｍｇ、好ましくは１日当たり１００ｍｇ未満、より好ましくは１日当たり５０ｍｇ未満、最も好ましくは１日当たり５〜４０ｍｇ、さらにより好ましくは１日当たり３５ｍｇ未満、典型的には１日当たり１５ｍｇ、１日当たり１２ｍｇ、１日当たり２４ｍｇ、１日当たり３０ｍｇの、バクロフェン（このような用量は特に経口投与に適する）、
‐経口における、１日当たり約０．６〜６００ｍｇのジエチルカルバマジン、
‐経口における、１日当たり約０．３〜３６ｍｇのシナカルセト、
‐経口における、１日当たり約０．６〜２３ｍｇのシンナリジン、
‐経口における、１日当たり約０．２５〜１０ｍｇのエプレレノン、
‐経口における、１日当たり約０．１〜１０ｍｇのレフルノミド、
‐経口における、１日当たり約０．０４〜０．８ｍｇのレボシメンダン、
‐経口における、１日当たり約２０〜８００ｍｇのスルフィソキサゾール、
‐経口における、１日当たり約０．０５〜４０ｍｇのスロデキシド、
‐経口における、１日当たり約２．５〜２５ｍｇのテルビナフィン、
‐経口における、１日当たり約０．５〜５０ｍｇのゾニサミド、
である。
【０１１５】
実際に投与される薬剤の量は、処置される疾患、投与される的確な組成物、個々の患者の年齢、体重及び反応、患者の症状の重症度、並びに選択される投与経路を含む関連する状況に照らして、医師により決定されるということが理解される。したがって、上記用量範囲は、本明細書における教示のための一般的なガイダンス及びサポートを提供するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１６】
以下の実施例は、例示を目的として述べるもので、限定する目的ではない。
【０１１７】
［実施例］
動物の管理と維持、並びに実験は、Ｉ．Ａ．Ｓ．Ｐ．の研究・倫理問題委員会のガイドライン（１９８３年）に準じておこなわれた。
【０１１８】
（Ａ）Ａβ毒性に関する疾患の処置
この一連の実験では、候補化合物がヒトＡβ１−４２の毒性作用を抑止又は低減する能力をテストした。Ａβ１−４２は、ＡＤに罹患するヒト患者の生体組織検査において見られる凝集体を構成する完全長ペプチドである。薬剤は最初に個別にテストされ、続いてそれらの併用作用の分析がおこなわれる。作用は種々の細胞型において測定され、ＡＤの異なる生理学的特徴を示すインビトロモデルにおいて、化合物の活性をさらに例証する。また、インビボにおける実験は、ｉ）動物の認知行動、及びｉｉ）ＡＤの分子的特徴（アポトーシス誘発、酸化ストレス誘発、炎症経路誘発）における化合物の作用を評価することでＡＤについての防御作用を検証するために、マウスモデルでおこなわれる。
【０１１９】
Ｉ．ヒトＡβ１−４２の毒性を抑止する化合物
Ｉ．１．ヒトの脳微小血管内皮細胞モデルにおけるＡβ１−４２毒性に対する保護
ヒトの脳微小血管内皮細胞の培養を、Ａβ１−４２毒性における候補化合物による保護研究に用いた。
【０１２０】
ヒトの脳微小血管内皮脳細胞（ＨＢＭＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社  Ｒｅｆ：１０００、１０パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ１０）で凍結）を、＋３７℃の水浴で急速に解凍した。その上澄みを、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ社  ｒｅｆ：１０２７０−１０６）を含む９ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  ｒｅｆ：Ｐ０４−０３６００）に直ちに加えた。細胞懸濁液を、＋４℃で１０分間、１８０ｘ  ｇで遠心分離し、ペレットを、１．６％無血清ロケットフューエル（ＲｏｃｋｅｔＦｕｅｌ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｒｅｆ：ＳＦ−４Ｚ０−５００−Ｒ、バッチ５４１０２）、１０．０００Ｕ／ｍｌの２％ペニシリン、及び１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＳ、  Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  ｒｅｆ：Ｐ０６−０７１００、バッチ１３３０８０８０８）を含むＣＳＣ無血清培地（ＣＳＣ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｒｅｆ：ＳＦ−４Ｚ０−５００−Ｒ、バッチ  ５１４０７−４）において懸濁し、１００μｌの最終量で、９６ウェルプレート（マトリゲル層バイオコートアンジオジェネシスシステム、ＢＤ社、Ｒｅｆ  ３５４１５０、バッチＡ８６６２）に、１ウェルにつき２０，０００細胞の密度で播種した。マトリゲルの補助により、内皮脳細胞は、毛細血管網の形態形成プロセスを自然に開始した（参考文献３３）。
【０１２１】
３つの別の培養を条件毎におこない、１つの条件につき６ウェルでおこなった。
【０１２２】
＜候補化合物及びヒトアミロイド‐β１−４２処理＞
短時間に、Ａβ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ社、ｒｅｆ：Ｈ１３６８、バッチ１０１０５３３）は、２０μＭで既定培地において再構成され（母液）、凝集のために、暗所で３日間、＋３７℃で、ゆっくりと振動させた。対照培地を同じ条件で調製した。
【０１２３】
３日後、この凝集ヒトアミロイドペプチドを、対照培地における２．５μＭ希釈で、ＨＢＭＥＣに用いた（最適培養時間）。Ａβ１−４２ペプチドを、１８時間のインキュベーションのために、マトリゲル上でのＨＢＭＥＣ播種の２時間後に加えた。
【０１２４】
マトリゲルへのＨＢＭＥＣ播種の１時間後、テスト化合物及びＶＥＧＦ−１６５を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解し、そして、Ａβ１−４２適用前にＨＢＭＥＣと共に１時間のプレインキュベートをした（培養ウェルにつき１００μｌの最終量で）。テスト化合物又はＶＥＧＦインキュベーションの１時間後（マトリゲルの細胞播種の２時間後）に、１００μｌＡβ１−４２ペプチドを、さらなる薬剤希釈を避けるために、テスト化合物又はＶＥＧＦ（２００μｌ全量／ウェル）の存在下で対照培地において２．５μＭ希釈の最終濃度になるように加えた。
【０１２５】
＜培養プレートの構成＞
ＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進アイソフォームとして知られるＶＥＧＦ−１６５は、参照化合物として本研究のすべての実験に用いられた。ＶＥＧＦ−１６５は、血管新生に関わる最も豊富なＶＥＧＦアイソフォームうちの１つである。ＶＥＧＦは参照テスト化合物として１０ｎＭで用いられた。
【０１２６】
次の条件、
・陰性対照：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ、
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（２．５μＭ）、１８時間、
・陽性対照：ＶＥＧＦ−１６５（１０ｎＭ）（1参照化合物／培養）、１８時間のインキュベーション時間のためのＡβ１−４２（２．５μＭ）の添加の１時間前、
・テスト化合物：テスト化合物、１８時間のインキュベーション時間のためのＡβ１−４２（２．５μＭ）添加の１時間前、
を評価した。
【０１２７】
＜毛細血管網の定量化＞
ウェル毎に、ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、光透過にて、４倍のレンズを用いて２枚の写真を撮影した。すべての画像を同じ条件で撮影した。血管新生網分析を、ディベロッパソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いておこない、毛細血管網の全長を測定した。
【０１２８】
＜データ処理＞
すべての値を、３培養の平均±標準誤差（ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍｅａｎ）として表す（１条件に付きｎ＝６）。統計分析は、異なる条件において、分散分析、可能なら続いてダネットテストによっておこなわれた（Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）。グラフに挿入された値(％表示)はアミロイド毒性放出を示す。実際には、アミロイド毒性は１００％であり、テスト化合物の作用は、このアミロイド毒性に対する比率として算出された。
【０１２９】
＜結果＞
図１は結果を示す。この結果は、単独でテストをされた薬剤が、Ａβペプチド１−４２を原因とする毒性に対し、実質的な保護作用をもたらすことを示し、低用量の、例えば４００ｎＭのトラセミドは強い保護作用をもたらし、また低用量の、例えば３．２ｎＭのブロモクリプチンは強い保護作用をもたらす。
【０１３０】
また、本結果は、予想外に、上記の薬剤濃度と比較してより高い又はより低い薬剤濃度が、このモデルのＡβ１−４２毒性において作用がほとんどない、作用がない、又は悪化をまねく可能性があることを示す。
【０１３１】
Ｉ‐２．一次皮質ニューロン細胞におけるＡβ１−４２毒性に対する保護
＜テスト化合物及びヒトアミロイド‐β１−４２処理＞
ラットの皮質ニューロンを、Ｓｉｎｇｅｒ等（参考文献４２）の記載のように培養した。妊娠１５日の妊娠期間のメスのラット（ウィスターラット）を、短時間で、頚椎脱臼により安楽死させ、その胎児を子宮から取り出した。皮質を取り出し、そして、１０．０００Ｕ／ｍｌの２％ペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、氷温のリーボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培地（Ｌ１５）に配置した。皮質をトリプシンにより、２０分間、３７oＣで解離した（０．０５％）。反応は、ＤＮａｓｅ１グレードＩＩ及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の添加により停止した。その後、細胞を１０ｍｌピペットを用いて連続的に３回ピペッティングして機械的に解離し、＋４℃で、１０分間、５１５ｘ  ｇで遠心分離した。上澄みは廃棄され、細胞のペレットを、Ｂ２７（２％）、Ｌ−グルタミン（０．２ｍＭ）、２％ＰＳ溶液、及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで補完したＮｅｕｒｏｂａｓａｌからなる既定培地に再懸濁した。生存細胞を、トリパンブルー排除法を用いて、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメータで数えた。細胞を、９６ウェルプレート(ウェルはポリ‐Ｌ‐リジン（１０μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされた)において３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、そして加湿空気（９５％）／ＣＯ２（５％）環境において、＋３７℃で培養した。
【０１３２】
短時間に、Ａβ１−４２ペプチドを、既定培地において４０μＭで再構成し（母液）、凝集のために暗所で３日間、＋３７℃で、ゆっくりと振動させた。対照培地を同様の条件で調製した。
【０１３３】
３日後、溶液を以下のように一次皮質ニューロンに用いた。
【０１３４】
ニューロン培養の１０日後に、薬剤を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解し、Ａβ１−４２適用前に、ニューロンと共に１時間のプレインキュベートをした（培養ウェルにつき１００μｌの最終量で）。薬剤インキュベーションの１時間後、１００μｌのＡβ１−４２ペプチドを、さらなる薬剤希釈を避けるために、薬剤の存在下で１０μＭ希釈の最終濃度になるように加えた。皮質ニューロンを２４時間中毒化した。３つの別の培養を条件毎におこない、１つの条件につき６ウェルでおこなわれた。
【０１３５】
ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びエストラジオール‐β（１５０ｎＭ）をそれぞれ陽性対照及び参照化合物として用いた。
【０１３６】
＜培養プレートの構成＞
１５０ｎＭのエストラジオール‐βを陽性対照として用いた。
【０１３７】
エストラジオール‐βを培地に溶解し、凝集アミロイド‐β１−４２適用前に１時間のプレインキュベートをした。
【０１３８】
下記の条件を評価した。
【０１３９】
‐  対照プレート：１２ウェル／条件
・陰性対照：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（１０μＭ）、２４時間
・参照化合物：エストラジオール（１５０ｎＭ）、１時間
‐  薬剤プレート：６ウェル／条件
・陰性対照：単独培地＋０．１％ＤＭＳＯ
・中毒性：アミロイド‐β１−４２（１０μＭ）、２４時間
・薬剤：薬剤を１時間、続いてアミロイド‐β１−４２（１０μＭ）を２４時間
＜乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性分析＞
中毒化２４時間後に上澄みを取り出し、細胞毒性検出キット（ＬＤＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ｒｅｆ：１１６４４７９３００１、バッチ：１１８００３００）で分析した。この細胞毒性の定量化のための比色分析は、死細胞のサイトゾルから上澄み中に放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の測定に基づく。
【０１４０】
＜データ処理＞
すべての値を３培養の平均±標準誤差として表す（１条件に付きｎ＝６)。統計分析を異なる条件においておこなった（分散分析、可能なら続いてダネットテスト（Ｓｔａｔｖｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０））。
【０１４１】
＜結果＞
一次皮質ニューロン細胞の毒性分析において個別の選択薬剤から得られた結果を、図２、図２６、及び図２７に示す。この結果は、単独でテストをされた薬剤が、Ａβペプチド１−４２を原因とする毒性に対する実質的な保護作用をもたらす。
【０１４２】
・低用量の、例えば４０ｎＭのトリメタジジンは強い保護作用をもたらす。
【０１４３】
・３．２ｎＭの低用量のメキシレチンは強い保護作用をもたらす。
【０１４４】
・４０ｎＭの低用量のブロモクリプチンは強い保護作用をもたらす。
【０１４５】
・６００ｎＭの低用量のイフェンプロジルは強い保護作用をもたらす。
【０１４６】
・２０ｎＭの低用量のモキシフロキサシンは強い保護作用をもたらす。
【０１４７】
・２００ｎＭの用量のトラセミドは強い保護作用をもたらす。
【０１４８】
・８ｎＭの用量のホモタウリンは強い保護作用をもたらす。
【０１４９】
また、得られた結果は、予想外に、上記に示されたものより高い又はより低い薬剤濃度が、ニューロン細胞のＡβ１−４２毒性において、保護作用がほとんどない、保護作用がない、又は悪化をまねく可能性があるということを示す。
【０１５０】
ＩＩ．ヒトＡβ１−４２毒性を抑止する併用療法
ＩＩ．１．  ヒトＨＢＭＥＣ細胞のヒトＡβ１−４２ペプチド毒性における併用療法の効果
本発明の併用薬剤の有効性をヒト細胞において評価する。これらの分析で用いられる手順は上記Ｉ．１節に記載されたものと同様である。
【０１５１】
＜結果＞
テストされた併用薬剤のすべては、以下の表３に示され、図３〜図６及び図１３〜図１４に例示されるように、ＨＢＭＥＣモデルにおいてヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対し保護作用を示す。この結果は、凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）による中毒が本発明の併用により有意に抑止される一方で、単独薬剤は、上記記載の実験の条件において、それらの濃度では中毒に対する有意な作用を有しないことを明らかに示す。
【０１５２】
【表３】
0006395838.tif 000004
図３〜図６、図１３〜図１４に例示されるように、以下の併用薬剤、
・バクロフェン及びトラセミド、
・スルフィソキサゾール及びトラセミド、
・トラセミド及びエプレレノン、
・スルフィソキサゾール及びブロモクリプチン、
・テルビナフィン及びトラセミド、又は
・シナカルセト及びメキシレチン
は、中毒化されたＨＢＭＥＣ細胞におけるヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して特に興味深い保護作用を示す。
【０１５３】
ＩＩ．２．  一次皮質ニューロン細胞におけるヒトＡβ１−４２ペプチド毒性における併用療法の効果
本発明の併用薬剤の有効性を一次皮質ニューロン細胞において評価する。この分析で用いられる手順は、上記Ｉ．２．節に記載されたものと同様である。
【０１５４】
＜結果＞
テストされた併用薬剤のすべては、下記表４に示され、図７〜図１２及び図１６〜図２２に例示されるように、一次皮質ニューロン細胞においてヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対し保護作用を示す。この結果は、凝集ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、１０μＭ）による毒性が、本発明の併用により有意に抑止される一方で、単独薬剤は、上記記載の実験の条件において、それらの濃度では中毒に対する有意な作用を有しないことを明らかに示す。
【０１５５】
【表４】
0006395838.tif 000005
図７〜図１２及び図１５〜図２２に例示されるように、次の併用薬剤、
・アカンプロセート及びイフェンプロジル、
・バクロフェン及びメキシレチン、
・バクロフェン及びトラセミド、
・バクロフェン及びトリメタジジン、
・シナカルセト及びメキシレチン、
・シンナリジン及びトリメタジジン、
・トリメタジジン及びゾニサミド、
・メキシレチン及びイフェンプロジル、
・モキシフロキサシン及びバクロフェン、
・モキシフロキサシン及びシナカルセト、
・モキシフロキサシン及びトリメタジジン、
・モキシフロキサシン及びスルフィソキサゾール、
・モキシフロキサシン及びゾニサミド、又は
・トラセミド及びスルフィソキサゾール
は、中毒化された一次皮質ニューロン細胞におけるヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して特に興味深い保護作用を示す。
【０１５６】
ＩＩ．４．Ａβ１−４２毒性に対する神経突起伸長の保護
＜テスト化合物及びＡβ１−４２処理＞
ラットの一次皮質ニューロンを前述のように培養する。
【０１５７】
培養の１０日後、細胞を薬剤と共にインキュベートする。１時間後、細胞は、ＢＤＮＦを含まないが薬剤を含む、既定の培地で２．５μＭのベータアミロイド（１−４２、Ｂａｃｈｅｍ社）により中毒化される。皮質ニューロンは２４時間中毒化される。ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は陽性（神経保護）対照として用いられる。３つの別の培養を条件毎におこない、１つの条件は６ウェルでおこなわれる。
【０１５８】
＜神経突起長＞
２４時間の中毒化の後、上澄みを除き、皮質ニューロンをエタノール（９５％）及び酢酸（５％）の低温溶液によって５分間固定する。０．１％のサポニンで透過処理後、細胞を１％のウシ胎児血清を含むＰＢＳで２時間ブロックする。その後、細胞を抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２、Ｓｉｇｍａ社）と結合するモノクローナル抗体と共にインキュベートする。この抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗−マウスＩｇＧ（分子プローブ）で検出する。ニューロンの核を蛍光マーカ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社）で標識した。
【０１５９】
ウェル毎に、ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、２０倍で１０枚の写真を撮影した。すべての写真を同じ条件で撮影した。神経突起網分析をディベロッパソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いておこない、神経突起網の全長を測定した。
【０１６０】
＜結果＞
バクロフェンとトラセミドとの併用は、図２３に示されるように一次皮質ニューロン細胞において、ヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対する有意な保護作用をもたらす（神経突起網を５３１％改善）。この結果は、ヒトアミロイドペプチド（Ａβ１−４２、２．５μＭ）による中毒が併用により有意に抑止されること、さらには、対照と比較して、この併用が神経突起網を増進させることを明らかに示す。
【０１６１】
従って、この併用により、皮質ニューロン細胞及び細胞ニューロンネットワークがヒトＡβ１−４２ペプチド毒性に対して効果的に保護されることが可能である。さらに、このような神経突起網の拡張は、脊髄損傷などの神経障害におけるこれら薬剤の有効性を裏付ける。
【０１６２】
ＩＩＩ．インビボにおいてヒトＡβ２５−３５毒性を抑止する化合物
＜動物＞
オスのスイスマウスを当該研究全体で用いる。動物を、行動実験時を除き、実験室の飼料と水に自由に行き来できるプラスチックのケージで飼育し、そして１２時間ごとの明暗周期のもと管理環境で飼育した（午前８時に点灯)。行動実験は防音及び空調制御された実験室でおこなわれ、マウスは各実験の少なくとも３０分前にこの実験室に慣らされている。
【０１６３】
＜アミロイドペプチドの調製及び注入＞
Ａβ２５−３５ペプチド及びスクランブルＡβ２５−３５ペプチドを殺菌２重蒸留水に溶解し、使用するまで−２０℃で保管した。光学顕微鏡観察では、Ａβ２５−３５ペプチドの培養（スクランブルＡβ２５−３５ペプチドではない）は、２タイプの不溶性沈殿物、複屈折原線維状の構造物、及び不定形球状凝集体をもたらすことを示した。そして、β‐アミロイドペプチドを脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与した。短時間に、各マウスにエーテルで軽く麻酔をかけ、規格のステンレス鋼針を、両眼球及び両耳から等距離のところで、頭蓋骨面に垂直に、各眼球から等距離の正中線の右片側１ｍｍに挿入する。ペプチド又はビヒクルは約３秒以内で徐々に送達される。マウスは注射後１分以内では通常行動を示す。投与場所は、予備実験において墨汁を注入して確認された。針の挿入も、ビヒクルの注入も、生存、行動反応若しくは認知機能に有意な影響を与えない。
【０１６４】
＜薬剤処置＞
前日、つまりＡβ２５−３５ペプチド注射の２４時間前に、薬剤、併用薬剤、又はビヒクル溶液を、１日に２回、強制経口投与する（午前８時及び午後６時)。
【０１６５】
当日（午前１０時）に、マウスはＡβ２５−３５ペプチドまたはスクランブルＡβ２５−３５ペプチド（対照）を３μ１の最終量（３ｍＭ）で脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）に注射される。
【０１６６】
当日から７日目まで、薬剤、併用薬剤、又はビヒクル溶液を１日に１回若しくは２回、強制経口投与する（午前８時及び午後６時)。１つの動物群は、ドネペジル（参照化合物  １ｍｇ／ｋｇ／日）を、単回の注射で強制経口投与される（午前８時）。薬剤は、各強制投与直前に水に溶解され、新しく調製される。
【０１６７】
７日目に、すべての動物について、空間作業記憶の指標としてＹ迷路試験で自発的交替行動をテストする。
【０１６８】
７日目及び８日目に、動物の前後関係の長期記憶を、ステップダウン型受動的回避法を用いて評価する。
【０１６９】
８日目に動物は犠牲となる。動物の脳を解剖し、さらなる分析のために−８０℃で保存する。
【０１７０】
Ａβ２５−３５ペプチドのｉｃｖ注射の７日後に行われた行動及び生化学分析では、特に表５に挙げられた併用において、有益な結果を得た。
【０１７１】
【表５】
0006395838.tif 000006
ＩＶ．中毒化された動物における行動及び認知行動を改善する化合物
動物を、上記節の記載のように中毒化する。
【０１７２】
＜自発的交替行動‐Ｙ迷路試験＞
７日目に、すべての動物について、空間作業記憶の指標として、Ｙ迷路において自発的交替行動をテストする。Ｙ迷路は灰色のポリ塩化ビニル製である。各アームは、底部が長さ４０ｃｍ、高さ１３ｃｍで、幅３ｃｍ、上部は幅１０ｃｍで、等角度で連結する。各マウスは１つのアームの端部に置かれ、８分間のテスト中は、迷路の中を自由に動き回れる。同じアームに戻る可能性を含む一連のアーム進入は視覚的に確認される。交替反応は３つのアームすべてに連続的に進入する場合と定める。したがって、最大の交替回数はアームへの総進入回数引く２であり、交替反応率は（実際の交替数／最大の交替数）ｘ１００で算出される。パラメータは交替反応率（記憶指標）及びアームへの総進入回数（探査指標）を含む。極端な行動を示す動物は除く（交替反応率＜２５％、若しくは＞８５％又はアームへの進入回数＜１０）。これは通常、動物のうち０〜５％を占める。このテストは、Ａβ２５‐３５注入によりマウスに引き起こされる影響及び記憶喪失作用の行動レベルの分析に付随的に役立つ。
【０１７３】
＜受動的回避テスト＞
装置は２つの区画に仕切られた（１５ｃｍ×２０ｃｍ×高さ１５ｃｍ）箱で、１区画は白いポリ塩化ビニルの壁で明るく、もう１区画は黒いポリ塩化ビニルの壁で暗くなっており、格子状の床を有する。ギロチン戸は各区画を隔てる。装置の４０ｃｍ上に配置された６０Ｗの照明は実験中に白い区画を照らす。格子状床には、ショック発生スクランブラ（ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｓｃｒａｍｂｌｅｒ）（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＵＳＡ）を用いて、無作為のフットショック（０．３ｍＡで３秒間）がおこなわれる。ギロチン戸は、訓練セッション時には最初に閉じられている。各マウスを白い区画に配置し、５秒後に戸が上がる。マウスが暗い区画に入り、四肢が格子床に着いたとき、戸は閉まり、３秒間のフットショックがおこなわれる。ステップスルー待ち時間、つまり暗い区画に入るのにかかる待ち時間、及び発声回数を記録する。記憶テストは、訓練の２４時間後におこなわれる。各マウスは再び白い区画に配置される。５秒後に戸が上がり、ステップスルー待ち時間、及び脱出待ち時間、即ち白い区画内に戻るのにかかる時間を、３００秒上限で記録する。
【０１７４】
表６に挙げられるテストされた併用のそれぞれにおいて、有益な結果が得られる。
【０１７５】
【表６】
0006395838.tif 000007
Ｖ．本発明の化合物の、神経疾患の神経生理学的問題の改善
Ａβ中毒のインビボモデルにおいて併用療法をテストする。神経疾患に影響するいくつかのパラメータ、
・アポトーシスの指標と考えられるカスパーゼ３及び９の発現レベル、
・酸化ストレスレベルのマーカと考えられる脂質過酸化反応、
・脳の炎症レベルのマーカと考えられるＧＦＡＰ発現分析、
・血液脳関門の完全性、
・全体的なシナプス完全性（シナプトフィジンＥＬＩＳＡ）
における作用を評価する。
【０１７６】
＜血液脳関門の完全性＞
Ａβによる動物の中毒化についての実験デザインは、ＩＩＩ部と同様である。
【０１７７】
血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性における併用療法の潜在的保護作用は、オリゴマーアミロイド−β２５−３５ペプチド（Ａβ２５−３５）、又はスクランブルＡβ２５−３５ペプチド対照（Ｓｃ．Ａβ）を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）に注入したマウスにおいて、注入の７日後に分析された。
【０１７８】
Ａβ２５−３５注入後７日目に、ＢＢＢ完全性を評価するため、ＥＢ（エバンスブルー）法を用いて動物をテストした。ＥＢ色素は、末梢への注入後に血清アルブミンと結合することで知られており、血清アルブミントレーサとして使用されている。
【０１７９】
経心臓灌流に３時間先立ち、ＥＢ色素（生理食塩水で２％、４ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入する。そしてマウスは前混合された２００μｌのケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）に麻酔され、開胸される。マウスは、右心房からの流動体が無色になるまで約１５分間、２５０ｍｌの生理食塩水で経心臓灌流される。頚椎を切り離した後、脳は取り除かれ、大脳皮質（左＋右）、海馬（左＋右）、間脳の３部位に解剖される。そして、各脳の部位は、ＥＢ‐アルブミン溢出の定量測定のために重量を測定される。
【０１８０】
サンプルをリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において均質化し、タンパク質を沈殿させるために、６０％トリクロロ酢酸を添加後ボルテックスミキサーにかける。サンプルを４℃で冷却し、４℃、１０，０００ｇで、３０分間遠心分離する。上澄みは、分光光度計を用いてＥＢの吸収度を６１０ｎｍで測定される。
【０１８１】
ＥＢは、
・既知のＥＢ‐アルブミン濃度から得られた標準曲線を用いて、脳組織のμｇ／ｍｇとして、
・タンパク質のμｇ／ｍｇとして、
の両方で定量化される。
【０１８２】
表７の示されるように、本発明の併用療法は、未処置の中毒状態の動物と比較して、ＢＢＢ完全性の維持に有効である。
【０１８３】
＜全体的なシナプスの完全性（シナプトフィジンＥＬＩＳＡ）＞
シナプトフィジンはシナプスの完全性のマーカとして選択され、市販のＥＬＩＳＡキット（ＵＳＣＮ、Ｒｅｆ．Ｅ９０４２５Ｍｕ）を用いて分析される。サンプルを海馬組織から準備し、製造業者及び参考文献に記載される特定の抽出緩衝剤において均質化する。
【０１８４】
組織を氷温のＰＢＳ（０．０２ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）内ですすいで余分な血液を完全に取り除き、重量を量った後、窒素凍結し、−８０℃で保管する。組織は小片に切り分けられ、ガラスホモジナイザーを用いて、１ｍｌの氷温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液において均質化される。生じた懸濁液は超音波細胞破砕器で分解されるか、又はさらに細胞膜を破壊するため２回の凍結・解凍循環をおこなう。そして、ホモジネートは５，０００ｇで５分間遠心分離され、上澄みは直ちに分析される。
【０１８５】
すべてのサンプルは３重分析される。
【０１８６】
タンパク質の定量化は、抽出実績を評価し、標準化するため、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅｆ♯２３２２７）を用いておこなわれる。
【０１８７】
そして、タンパク質総濃度は希釈標準曲線から算出され、ＥＬＩＳＡの結果の標準化に使用される。
【０１８８】
結果（表７）は、併用療法が、未処置の中毒状態の動物と比較して、処置後動物の脳における総シナプトフィジンレベルの維持に有効であるということを示す。
【０１８９】
＜酸化ストレス分析＞
マウスは頚椎切断により犠牲になり、そして両海馬をすばやく取り除き、重量を測定し、分析まで液体窒素内で保存する。解凍後、海馬は冷メタノール（１／１０ｗ／ｖ）において均質化され、１、０００ｇで５分間遠心分離されて、上澄みをエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに入れる。各ホモジネートの反応量を１ｍＭのＦｅＳＯ４、０．２５ＭのＨ２ＳＯ４、１ｍＭのキシレノールオレンジに添加し、室温で３０分間インキュベートする。吸収度を５８０ｎｍ（Ａ５８０  １）で観測後、１０μｌの１ｍＭクメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）をサンプルに添加し、室温で３０分間インキュベートして最大酸化レベルを測定する。吸収度は５８０ｎｍ（Ａ５８０  ２）で測定される。脂質過酸化レベルはＣＨＰ当量（ＣＨＰＥ）として、ＣＨＰＥ＝Ａ５８０  １／Ａ５８０  ２×［ＣＨＰ］によって決定され、組織重量毎のＣＨＰ当量及び対照群データの百分率として表される。
【０１９０】
結果（表７）は、併用療法が、未処置の中毒状態の動物と比較して、処置後動物の脳におけるＡβにより引き起こされる総酸化ストレスを低減することに有効であることを示す。
【０１９１】
＜カスパーゼ経路誘発分析及びＧＦＡＰ発現分析＞
マウスは頚椎切断により犠牲になり、そして両海馬をすばやく取り除き、氷温のＰＢＳ（０．０２ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）内ですすいで余分な血液を完全に取り除き、重量を測定し、分析まで液体窒素内に保存する。組織は小片に切り分けられ、ガラスホモジナイザーを用いて１ｍｌの氷温ＰＢＳ内で均質化される。生じた懸濁液は超音波細胞破砕器で分解されるか、又は２回の凍結・解凍循環にかけてさらに細胞膜を破壊する。そして、ホモジネートは５、０００ｇで５分間遠心分離され、上澄みは直ちに分析される。
【０１９２】
実験は、市販の分析キット、Ｃａｓｐａｓｅ−３（ＵＳＣＮ‐Ｅ９０６２６Ｍｕ）、Ｃａｓｐａｓｅ−９（ＵＳＣＮ‐Ｅ９０６２７Ｍｕ）、ＧＦＡＰ（ＵＳＣＮ‐Ｅ９００６８）でおこなわれる。
【０１９３】
タンパク質の定量化は、抽出実績を評価し、標準化するため、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅｆ♯２３２２７）でおこなわれる。
【０１９４】
結果（表７）は、併用療法が、未処置の中毒状態の動物と比較して、処置後動物の脳におけるアポトーシス及び炎症のマーカにおいて有益な作用を有することを示す。
【０１９５】
【表７】
0006395838.tif 000008
（Ｂ）ニューロン細胞におけるグルタミン酸毒性の抑止
このさらなる実験一式で、候補化合物はニューロン細胞におけるグルタミン酸毒性の毒性作用を抑止又は低減する能力についてテストされた。グルタミン酸毒性は、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ニューロパチー、アルコール依存症若しくはアルコール離脱症、又は脊髄損傷などの神経疾患又は障害の病因に関わる。薬剤は、最初に個別にテストされ、続いて併用作用の分析をおこなう。
【０１９６】
＜方法＞
本発明の併用薬剤の効能は一次皮質ニューロン細胞において評価される。これらの分析で使用されるプロトコルは、上記（Ａ）Ｉ．２項の記載されたものと同様である。
【０１９７】
＜グルタミン酸毒性分析＞
化合物の神経保護作用は、特にグルタミン酸作動性ニューロンを示す神経突起網（ニューロフィラメント免疫染色（ＮＦ））の定量化により評価される。
【０１９８】
ニューロン培養の１２日後、候補併用薬剤を培地（＋０．１％ＤＭＳＯ）に溶解する。そして、候補組合せを、グルタミン酸傷害の前にニューロンとともに１時間プレインキュベートする。さらなる薬剤希釈を避けるため、インキュベーションの１時間後に、候補組合せの存在下で、４０μＭの最終濃度になるように、グルタミン酸を２０分間加える。インキュベーションの最後に、培地をグルタミン酸を除いた候補組合せの培地に変える。培養は、グルタミン酸傷害後２４時間固定される。ＭＫ８０１（ジゾシルピン水素マレイン酸塩（Ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｍａｌｅａｔｅ）、７７０８６−２２−７、２０μＭ）は陽性対照として用いられる。
【０１９９】
サポニン（Ｓｉｇｍａ社）で透過処理後、細胞を１０％のヤギ血清を含むＰＢＳで２時間ブロックし、細胞をニューロフィラメント抗体（ＮＦ、Ｓｉｇｍａ社）に対するマウスモノクローナル一次抗体と共にインキュベートする。この抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗-マウスＩｇＧで示される。
【０２００】
細胞核は、蛍光マーカ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社）により標識化され、神経突起網を定量化する。条件毎に６ウェルが用いられて３つの異なる培養におけるニューロンの生存を評価する。
【０２０１】
＜結果＞
テストされた併用薬剤はすべて、皮質ニューロン細胞におけるグルタミン酸毒性に対する保護作用を示す。結果を以下表８に示す。
【０２０２】
図２４及び図２５で例示されるように、本発明の併用により、上記記載の実験の条件下で、ニューロンはグルタミン酸毒性から強力に保護される。単独で使用される薬剤が有意な作用を有しない、又は低い保護作用しか有しない薬剤濃度を用いても保護効果があることが分かったことは注目すべきである。
【０２０３】
【表８】
0006395838.tif 000009
（Ｃ）本発明の併用を用いる、グルタミン酸興奮毒性に関する他の障害の改善
上記記述された、インビトロにおける、本発明の薬剤及び併用薬剤のグルタミン酸毒性に対する保護作用は、本明細書においていくつかのＡＤモデルで例示された保護作用と同時に起こり、発明者に、ＭＳ、ＡＬＳ及び神経障害性疼痛などのグルタミン酸毒性も関連する病因において、疾患のいくつかのモデルでこれら薬剤及び併用のテストを促した。
【０２０４】
Ｉ）  多発性硬化症のインビボモデルにおける併用の保護作用
慢性の進行性ＥＡＥを有する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質免疫化（ＭＯＧ免疫化）されたマウスのモデルは、多発性硬化症処置における本発明の組成物の有益な作用を示すために用いられた。
【０２０５】
＜動物と化学物質＞
Ｃ５７Ｌ／６Ｊメスマウス（生後８週）をＪａｎｖｉｅｒ（仏国）から購入した。２週間の馴化後、メスマウス（生後１０週）は、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）ペプチドで免疫性付与後、慢性麻痺を発症する。実験上の脳脊髄炎は、ＥＡＥ誘導のためのＨｏｏｋｅキット、ＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ＰＴＸ（百日咳毒素）で誘導される（ＥＫ−０１１０、ＥＫ−０１１５、Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。対照キットはＣＫ−０１１５（Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）である。
【０２０６】
＜実験手順＞
実験上の脳脊髄炎は以下の手順により誘導される。
【０２０７】
実験当日、各０．１ｍｌの２回の皮下注射がおこなわれ、１つはマウスの背中の上部、もう１つはマウスの背中の下部におこなわれる。各注射は１００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）、２００μｇの不活性結核菌Ｈ３７Ｒａを含み、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｈｏｏｋｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）内で乳化される。乳剤は、ＭＯＧ特異的自己免疫型Ｔ細胞の増殖及び分化に必要とされる抗原を提供する。
【０２０８】
ＰＢＳ（Ｈｏｏｋｅキット）内における５００ｎｇ百日咳毒素の２回の腹腔内注射を、ＭＯＧ注射後２時間（当日）及び２４時間（１日目）におこなう。百日咳毒素は、添加アジュバントによりＥＡＥ発症を促進する。
【０２０９】
マウスは免疫付与後８日目にＥＡＥを発症し、実験期間中、慢性麻痺状態になる。免疫付与後、ブラインド試験でマウスの臨床症状を毎日観測する。動物は、従来型無菌施設で飼育され、すべての実験は、生命倫理学の現地常設委員会により規定及び認定されたガイドラインに従っておこなわれる。
【０２１０】
＜実験群及び薬剤処置＞
開示のメスマウス群は、免疫付与の前に体重により均一化される。
【０２１１】
・対照群には、ＥＡＥマウスの条件と同様にビヒクル注射（実験前日より２８日目まで、プラセボを毎日投与）がおこなわれる。
【０２１２】
・ＥＡＥ群には、ＭＯＧ注射（当日）と百日咳毒素注射（当日及び１日目）とがおこなわれ、実験前日より２８日目まで、プラセボを毎日経口投与する。
【０２１３】
・ＥＡＥ＋陽性対照には、ＭＯＧ注射（当日）と百日咳毒素を注射（当日及び１日目）、実験前日より２８日目まで、デキサメタゾンを毎日経口投与する。
【０２１４】
・ＥＡＥ＋処置群には、ＭＯＧ注射（当日）と百日咳毒素の注射（当日及び１日目）とがおこなわれる。処置は免疫付与の１日前に開始され、２８日目まで継続される。
【０２１５】
臨床スコアは当日、５日目、８日目、９日目、１２日目、１４日目、１６日目、１９日目、２１日目、２３日目、２６日目、２８日目に測定される。
【０２１６】
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（Ｓｔａｔｓｏｆｔ  Ｉｎｃ．）を統計分析全体に利用する。分散分析及びスチューデントｔ検定を臨床疾患スコア分析に使用する。Ｐ＜０．０５は有意と考えられる。
【０２１７】
疾患出現の遅延、臨床スコア及び死亡の遅延は、カプランマイヤー曲線及びコックスモデル（Ｒパッケージ「ｓｕｒｖｉｖａｌ」）で、各群と参照「免疫」群との間で比較された。結果のｐ値は片側性であり、参照「免疫」群より優れるという仮説の検証になる。
【０２１８】
総臨床スコアは、下記記載の尾スコア、後足スコア、前足スコア及び膀胱スコアからなる。
【０２１９】
尾スコア
0006395838.tif 000010
後足スコア
0006395838.tif 000011
前足スコア
0006395838.tif 000012
膀胱スコア
0006395838.tif 000013
各動物の総スコアは上記記載の区分すべての加算により決定される。生存動物の最大スコアは１０である。
【０２２０】
＜結果：併用療法はＭＳモデルにおいて有効である＞
総臨床スコアの有意な向上が「ＥＡＥ＋処置群」のマウスにおいて観察され、特に表９に挙げた組合せに見られる。
【０２２１】
【表９】
0006395838.tif 000014
ＩＩ．ＡＬＳモデルにおける併用の保護作用
本発明の併用療法は、インビトロでは共培養モデルで、そしてインビボではＡＬＳマウスモデルでテストされる。プロトコル及び結果をこの項で示す。
【０２２２】
ＩＩ．１．  神経・筋共培養の一次培養におけるグルタミン酸毒性に対する保護効果
＜神経及び筋肉細胞の一次共培養＞
ヒト筋肉を、健康な患者の生検の部分から先述の方法にしたがって準備する（参考文献４４）。筋肉細胞を、解離細胞（１ウェル毎に１００００細胞）から株化し、４８ウェルプレート上において０．１％ゼラチン被膜に配置し、そしてＭＥＭ培地及びＭ１９９培地の混合からなる増殖培地において成長させる。
【０２２３】
外套細胞融合後直ちに、生後１３日のウィスターラットの、後根神経節（ＤＲＧ）に付随した胚脊髄の全体横断面を、筋肉単層上に、１ウェルにつき１外植片（中央エリアに）配置する。ＤＲＧは、神経支配の好比率を得るために必要である。神経支配された培養物は混合培地において維持される。通常の共培養において２４時間後、脊髄外植片から伸びる神経炎が観察される。神経炎は筋管細胞に接触して、８日後に最初の収縮を引き起こす。その後直ちに、脊髄外植片に近接する神経支配された筋肉繊維は、実質的には連続的に収縮する。神経支配された繊維は、形態的及び空間的に非神経支配繊維と区別され、容易に識別可能である。
【０２２４】
１つの共培養をおこなう（１条件に付き６ウェル）。
【０２２５】
＜グルタミン酸傷害＞
２７日目に、共培養物を、グルタミン酸中毒（６０μＭ）の１時間前に、候補化合物又はリルゾールと共に２０分間インキュベートする。そして、共培養物を洗浄し、候補化合物又はリルゾールをさらに４８時間添加する。このインキュベーション時間後、固定されていない共培養物を、５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度である、Ａｌｅｘａ  ４８８と結合されたα−ブンガロトキシンとともに、室温で１５分間インキュベートする。そして、共培養物を室温で２０分間、ＰＦＡにより固定する。０．１％のサポニンで透過後、共培養物は抗ニューロフィラメント抗体（ＮＦ）と共にインキュベートされる。
【０２２６】
これらの抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ヤギ抗-マウスＩｇＧ（分子プローブ）で検出される。ニューロンの核を蛍光マーカ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で標識する。
【０２２７】
評価項目は（１）総神経突起長、（２）運動単位数、（３）総運動単位野であり、これらは運動ニューロンの生存及び機能性の指標である。
【０２２８】
各条件において、ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてウェル毎の２×１０の写真を、２０倍の拡大率で撮影する。すべての画像を同様の条件で撮影する。
【０２２９】
＜結果＞
本発明の薬剤は、共培養モデルにおいて運動ニューロン及び運動単位を有効に保護する。さらに、薬剤を表１０に挙げた併用薬剤の組合せで使用する場合、保護の向上が見受けられる。
【０２３０】
【表１０】
0006395838.tif 000015
ＩＩ．２．  ＡＬＳマウスモデルにおける併用療法の有効性
実験はオスマウスでおこなわれる。トランスジェニックオスマウスであるＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒ／Ｊマウス、及びそれらの対照（それぞれＳＮ２７２６及びＳＮ２２９７、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（バーハーバー、米国）、仏国ではＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社より流通)は、再現ＡＬＳの実験一式において選択される。
【０２３１】
罹患マウスは、内因性ヒトＳＯＤ１プロモーターにより駆動される、変異型ヒトＳＯＤ１遺伝子（コドン９３におけるグリシンからアラニンの単一アミノ酸置換）で設計された、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａトランス遺伝子を発現する。対照マウスは対照ヒトＳＯＤ１遺伝子を発現する。
【０２３２】
＜薬剤投与＞
マウスは、生後６０日目から死亡まで、ビヒクル希釈の候補薬剤処置を受ける。候補薬剤の希釈溶液は，投与開始の直前に、室温において水で調製される。
【０２３３】
＜＜飲料水＞＞
リルゾールを、５％シクロデキストリンで溶解し、６ｍｇ／ｍｌの最終濃度（各群の平均体重に調整)になるように飲料水に添加する。マウスは１日につき約５ｍｌ飲むので、推定投与量は、マウスの生存期間の伸びを示す用量である３０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２３４】
シクロデキストリンは、原液（シクロデキストリン２０％）から室温の水に希釈され、５％の最終濃度でビヒクルとして用いられる。
【０２３５】
＜＜経口投与（ｐｅｒ  ｏｓ）＞＞
併用薬剤を、毎日経口投与する。
【０２３６】
シクロデキストリンは、原液（シクロデキストリン２０％）から室温の水に希釈され、５％の最終濃度でビヒクルとして用いられる。
【０２３７】
＜臨床観察＞
各マウスの臨床観察は、処置初日（生後６０日）から死亡（又は犠牲時）まで毎日おこなわれる。臨床観察は、麻痺の開始、「開脚の低下（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｐｌａｙ）」、「立ち直り反射の低下」、及び通常の歩行観察、の行動テスト調査を含む。
【０２３８】
麻痺の開始において、観察は各足の麻痺の観察からなる。麻痺の開始は麻痺の最初の兆候の日に相当する。
【０２３９】
開脚の低下（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｐｌａｙ）テストは、震え若しくは振動の認識、及びマウスが尾でぶら下げられたときの後足の位置（下がっているまたは広がっている）からなる。
【０２４０】
立ち直り反射の低下テストでは、いずれかの側に返されてから３０秒以内に自身を正方向に戻すマウスの能力が評価される。マウスが自身を正常に戻せなければ立ち直り反射は低下している。立ち直り反射の低下は疾患の最終段階を示し、自身を正方向に戻せないマウスは安楽死させる。
【０２４１】
＜結果：併用療法はインビボモデルのＡＬＳにおいて有効＞
疾患の改善は、本発明の薬剤及び併用薬剤で処置された罹患動物において観察された。特に、表１１に挙げられた併用薬剤は、疾患の異なる段階でこれら動物の臨床スコアを効果的に向上させる。
【０２４２】
【表１１】
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ＩＩＩ．神経障害性疼痛のインビボモデルとしてのオキサリプラチン誘導ニューロパチーにおける本発明の併用の保護作用
本発明の併用療法は、末梢ニューロパチーの適切なモデル、即ち、オキサリプラチン誘導ニューロパチーの急性モデル及び慢性モデルにおいて、インビボでテストされる。動物、プロトコル及び結果についてこの項に提示される。
【０２４３】
＜動物の管理＞
オキサリプラチン処置実験開始時（当日）に体重が１５０ｇ〜１７５ｇのスプラーグドーリーラット（ＣＥＲＪ、仏国）を使用する。動物は、実験の間に標準的なペレット状の実験用飼料と水とに自由にアクセスできる、１２時間ごとの明暗周期であり、温度（１９．５℃〜２４．５℃）及び相対湿度（４５％〜６５％）管理された部屋において、アクセス制限付き動物設備で飼育される。動物はケージ毎に４又は５匹飼育され、テストの前に１週間の順応期間を設ける。
【０２４４】
＜実験設計＞
以下の４群のラットがすべての実験に用いられる。
【０２４５】
＜＜対照群＞＞
１群：オキサリプラチンのビヒクル（蒸留水）、腹腔内／候補の組合せのビヒクル（蒸留水）経口、毎日。
【０２４６】
２群：オキサリプラチン（蒸留水）、腹腔内／候補の組合せのビヒクル（蒸留水）経口、毎日。
【０２４７】
３群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／単独薬剤（蒸留水）、経口、毎日×９。
【０２４８】
＜＜テスト組成物群＞＞
４群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／候補の組合せ（蒸留水）、経口、毎日×９。
【０２４９】
５群：オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内／ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）（蒸留水）、経口、テスト日（つまり、１日目及び８日目）。
【０２５０】
ビヒクル及びテスト剤は、前日から７日目（テスト最終日の前日）まで毎日投与される一方で、ガバペンチンはテスト日（テストの１２０分前）に投与される。すべての処置は、可能であれば符号の順番及び無作為の順番におこなわれる。用量は遊離の活性物質に関して表される。
【０２５１】
＜ニューロパチー誘導＞
急性ニューロパチーは、オキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射により誘導される。慢性末梢ニューロパチーは、当日、２日目、４日目及び７日目に、オキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を反復的に腹腔内注射することにより誘導される（ＣＤ＝１２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）。ヒトの慢性ニューロパチーも累積性であり、オキサリプラチンの総用量の５４０ｍｇ／ｍ２又は５４０ｍｇ／ｍ２を超えて投与された患者に最も一般的に見受けられ、この用量はラットの累積用量として、〜１５ｍｇ／ｋｇに相当する（Ｃｅｒｓｏｓｉｍｏ  Ｒ．Ｊ．、２００５年）。
【０２５２】
オキサリプラチン誘導による、ラットの疼痛性ニューロパチーは、オキサリプラチン処置をされた患者の疼痛症状を再現する。最初期症状は熱痛覚過敏であり、アセトンテスト又は尾の浸水テストにより測定できる。機械的痛覚過敏は後に現れる。これは、フォンフライテストまたは足の圧力テストによって定量化できる。
【０２５３】
＜動物への投薬及びテスト＞
すべての併用薬剤は、オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇの最初の腹腔内注射の前日から投与され（前日）、７日目まで毎日経口投与を続ける。テスト日には（つまり、１日目及び７日目）、併用薬剤をテスト後に投与する。参考処置群（ガバペンチン）の動物はテスト日のみ投与される。
【０２５４】
＜アセトンテスト＞
冷感異痛は、１日目（オキサリプラチン３ｍｇ／ｋｇの最初の注射の約２４時間後（オキサリプラチンの急性作用））、及び８日目（オキサリプラチンの慢性作用）に、熱非侵害受容刺激への反応を測定するアセトンテスト用いて評価する。
【０２５５】
アセトンテストでは、両後足の足底表面に１滴のアセトンを適用後、後足を引っ込める待ち時間を測定し（反応時間）、反応の強さを記録する（コールドスコア）。アセトンの冷却作用に対する反応時間は、アセトン適用後２０秒内（カットオフ）に測定される。また、アセトンへの反応は、０（反応なし）、１（迅速に引っ込める、足がぴくぴく動く）、２（引っ込める時間の延長、又は足が著しくぴくぴく動く）、３（足が反復してぴくぴく動き、舐めたり噛んだりを伴う）の４段階でも評価される。
【０２５６】
各実験群において、結果は、
・反応時間は、足の反応を引き起こすのに必要とされる、秒単位で表される時間として定義される（各ラット合わせて６回の測定の平均±標準誤差）、
・累積コールドスコアは、各ラット合わせて６スコアの合計±標準誤差として定義される。最小スコアは０（６回の試験のいずれも反応なし）であり、最大可能スコアは１８である（６回の各試験で、足がぴくぴく動く及び足を舐める若しくは噛むを繰り返す）、というように表される。
【０２５７】
＜統計分析＞
スチューデント検定、片側性、タイプ３をおこなう。有意差はＰ＜０．０５に設定する。すべての群は疾患＋ビヒクル群（オキサリプラチン処置群）と比較される。平均値及び標準誤差は図に示される。
【０２５８】
＜結果＞
オキサリプラチンは、アセトン適用後、時間経過に伴い、足を引っ込める反応時間において顕著な減少を導いた（疾患群＋ビヒクル）。この減少は、ビヒクル群と比較して、１日目（オキサリプラチン誘導ニューロパチーの急性モデル）から８日目（慢性モデル）まで進行的であり、顕著である。
【０２５９】
＜＜オキサリプラチン誘導ニューロパチーの急性モデルにおける抗異痛作用＞＞
オキサリプラチン誘導ニューロパチーの急性モデルにおいてテストされた併用薬剤は、アセトンテストで評価された。表１２は、オキサリプラチンビヒクル処置群（２群）と比較して、累積コールドスコアで顕著な低下を、そして反応時間の顕著な増加を導く併用薬剤（４群）を示す。つまり、これらの併用薬剤はオキサリプラチンによって誘導される急性ニューロパチーから動物を保護する。
【０２６０】
【表１２】
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＋は、オキサリプラチン誘導の急性モデルにおいて、アセトンテストの累積コールドスコア分析及び反応時間分析後に、４群のラットにおいて得られた抗異痛作用を示す。
【０２６１】
＜＜オキサリプラチン誘導ニューロパチーの慢性モデルにおける抗異痛作用＞＞
オキサリプラチン誘導ニューロパチーの慢性モデルに用いられる併用薬剤は、アセトンテストで評価される。
【０２６２】
表１３は、４群（併用薬剤及びオキサリプラチンで処置をされた動物）において測定されたアセトンテストの反応時間及びコールドスコアが、オキサリプラチンビヒクル処置群（２群）と比較して、ニューロパチーの慢性モデルの処置後に、それぞれ顕著に増加及び減少することを示す併用薬剤を表す。結果として、これらの併用薬剤は、オキサリプラチン誘導の慢性ニューロパチーから動物を保護する。
【０２６３】
【表１３】
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＋は、オキサリプラチン誘導の慢性モデルにおいて、アセトンテストの累積コールドスコア分析及び反応時間分析後に、４群のラットにおいて得られた抗異痛作用を示す。
【０２６４】
ＩＶ．非中毒化細胞における神経再生を促進するバクロフェン及びトラセミド含有組成物
＜インビトロにおけるバクロフェンとトラセミドとの併用の神経栄養作用＞
＜＜神経突起の長さ分析＞＞
ラットの皮質細胞の１０日以内の培養における神経突起伸長評価を、細胞がいずれの毒性にも曝露されていないという例外を伴って、Ａ）ＩＩ．４の項に言及されたようにＭＡＰ−２抗体を用いておこなった。１０日目の細胞培養を、分析前に、薬剤と共に１日間インキュベートした。
【０２６５】
＜＜結果＞＞
図２８に示されるように、バクロフェンとトラセミドとの併用は顕著な神経栄養作用（＋１１％）を示すが、個別の薬剤が単独で用いられる際に、いずれの実質的な神経栄養作用も有しない。実際に、バクロフェンとトラセミドとの併用（それぞれ４００ｎＭと８０ｎＭ）に曝露すると、ニューロンネットワーク内の総神経突起伸長における顕著な増加（ＭＡＰ２−２ラベル）が観測される。特に、併用も薬剤単独もニューロンの数に影響を与えないので、神経突起網におけるこの増加は、現存する神経突起の伸長及び新しいニューロン細胞伸長の促進に関わるということが強調される。
【０２６６】
これらの結果において、バクロフェンとトラセミドとの併用が軸索伸長の促進に有効であり、脊髄損傷及びその他の神経損傷の処置に有効であるということが認められる。また、併用が軸索、脱髄、又は軸索及び脱髄成分のいずれかを含む遺伝性ニューロパチーの処置に有効であることも確認される。実際に、脱髄は、主に脱髄形成によるものと考えられるニューロパチーにおいてすら見受けられる軸索変性をもたらす軸索の不安定化を引き起こすことを考慮する必要がある。
【０２６７】
＜インビボにおいて神経再生の促進に有効であるバクロフェン及びトラセミド含有組成物＞
坐骨神経挫滅は、末梢神経損傷及び神経再生評価用の有効なモデルとして広く受け入れられている。このモデルにおいて、神経損傷は、損傷した坐骨神経の刺激によって生成される誘発筋活動電位（ＣＭＡＰｓ）の測定によって証拠づけられるように、神経機能を急速に破壊する。
【０２６８】
神経損傷は、ＣＭＡＰ生成のさらなる遅延並びに増幅及び持続時間の減少をもたらす活動電位の強度低下の結果である、信号の神経伝導の低下によって特徴づけられる
通常は、神経機能の回復における最初の兆候が２週間以内にあり、損傷後の４週目までには、軸索の顕著な再ミエリン化が坐骨神経において組織構造から観察される（参考文献４５）。
【０２６９】
＜＜神経挫滅＞＞
マウスは、イソフルラン（空気中に２．５〜３％）を用いて麻酔される。右腿を剃り、坐骨神経を中腿の位置で露出させ、坐骨神経の分岐に５ｍｍの近傍でで挫滅させる。神経は、マイクロ鉗子（Ｈｏｌｔｅｘ社、番号Ｐ３５３１１）を用いて２回、各挫滅間で９０°回転させて、１０秒間挫滅される。シャム手術を受けた動物では、坐骨神経は露出されるが挫滅はされない。最後に皮膚切開を創傷クリップで固定する。挫滅の日を当日と捉える。
【０２７０】
＜＜投与計画＞＞
挫滅の日において、化合物の最初の投与が挫滅の３０分後におこなわれる。
【０２７１】
化合物はその後、挫滅の翌日から、４２日にわたって毎日２回投与される。１日のうちに、薬剤の投与は少なくとも６時間の間隔をあけておこなわれる。
【０２７２】
テストの日（７日目及び３０日目）に、マウスにはテストの１時間半前に投与する。投与量は、０．２５％ＤＭＳＯ／滅菌水において１０ｍｌ／ｋｇである。
【０２７３】
【表１４】
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＜＜筋電図＞＞
電気生理的記録を、７日目及び３０日目に、キーポイント筋電図（ＥＭＧ）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、仏国）を用いておこなった。マウスは、空気中に２．５〜３％のイソフルランによって麻酔された。刺激及び記録するために単極の針電極を皮下に用いた。２ｍｓの持続時間である、過最大（１２．８ｍＡ）の矩形波パルスを用いて、坐骨神経を刺激した。坐骨切痕に適用される単独のパルスで、右坐骨神経（同側）を刺激した。ＣＭＡＰは腓腹筋肉に配置された針電極により記録された。ミリ秒で表されるＣＭＡＰ信号の発生（遅延）は、神経伝導速度を推定するために用いられる。つまり、遅延は軸索のミエリン形成の程度を表す。活動電位（μＶ）の増幅も測定され、これは筋肉の除神経及び神経再支配のレベルを示す。現在、ＣＭＡＰの増幅は再生運動軸索の数に対する比例数として得られる。誘発活動電位の持続も測定される。誘発筋電位の増幅及び持続は筋の神経再支配にさらに関連する。遅延及び増幅は、より一般に、神経再生をおこなうときに最も重要な評価項目として認識される。データは、両側性、タイプ３であるスチューデントｔ検定を用いて分析され、有意差はｐ＜０．０５で設定される。
【０２７４】
＜＜結果＞＞
バクロフェン・トラセミド併用は有効であり、神経損傷から７日目になると、テストされた用量すべてで、ビヒクル処置された動物と比較して信号遅延時間が顕著に改善される（図２９、Ａ）。有意差は、通常は自発的回復の開始が見受けられるとき、神経挫滅から３０日目においても観察される。
【０２７５】
信号の増幅における統計的に有意な改善も、神経挫滅から３０日目に、用量３において観察される（図２９、Ｂ）。そのような改善は、用量１及び用量２においても観察されるがより小さい。信号の持続の測定において同様の結果が見受けられる。
【０２７６】
全体として、これらのインビボにおける結果は、再ミエリン形成及び筋神経再支配を介した神経再生の促進におけるバクロフェン・トラセミド併用の有効性を示す。故に、インビボの実験データにより、インビトロにおいて観察されるバクロフェン・トラセミドの神経栄養作用と、末梢神経系の神経が損傷を受けるニューロパチー（即ち、本明細書において定義されるニューロパチー）や、脊髄損傷の処置におけるその有用性とが認められる。
【０２７７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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