(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるＴＬＲ８依存性の免疫応答を阻害するための、薬学的に受容できる賦形剤と、有効量のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、式：５’−ＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜３０の整数であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字はＤＮＡを示し、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、組成物。
【請求項２】
個体における免疫応答を阻害するための、薬学的に受容できる賦形剤と、有効量のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、式：５’−ＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜３０の整数であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字はＤＮＡを示し、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのヌクレオチド間連結がリン酸修飾連結であるか、またはすべてのヌクレオチド間連結がホスホロチオエート連結である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｘ５Ｘ６が、ＧＩである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Ｘ５Ｘ６が、ＩＩである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが３０塩基または塩基対未満の長さである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１４からなる群のうちの１つからなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１４からなる群のうちの１つからなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１０からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが５’−ＧＧＧＧ−３’を含まない、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが５’−ＧＩＧＧ−３’を含まない、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドがアンチセンス配列でもＲＮＡｉ分子でもない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
滅菌等張性溶液を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１４からなる群のうちの１つからなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１４からなる群のうちの１つを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫応答が、自己免疫疾患または炎症性障害と関連する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫応答を阻害することにより、前記自己免疫疾患の１または複数の症状を改善する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、膵炎、混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、過敏性腸疾患、Ｉ型糖尿病、およびシェーグレン病からなる群から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫応答を阻害することにより、前記炎症性障害の１または複数の症状を改善する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記個体が、ヒトである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記個体におけるＴＬＲ７依存性の免疫応答の阻害におけるさらなる使用のための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０からなる群のうちの１つからなる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４４、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０からなる群のうちの１つからなる、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の後援でなされた研究に関する言明
本発明は、米国国立衛生研究所の米国国立アレルギー感染症研究所により与えられた助成金第１Ｒ４３ＡＩ０９６６４１号の下で、政府援助によりなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の引用
本願は、２０１２年９月２９日に出願した米国仮出願第６１／７０７，８８７号、２０１３年２月５日に出願した米国仮出願第６１／７６１，２１４号、および２０１３年３月１５日に出願した米国出願第１３／８４２，８６１号の利益を主張する。これらの出願はすべて、その全体が参照により援用される。
【０００３】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表（ファイル名：  377882005440SeqList.txt、２０１３年９月２７日付で記録、サイズ：３６ＫＢ）のコンピュータで読取り可能な形態（ＣＲＦ）。
【０００４】
発明の分野
本出願は、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）阻害剤、および自己免疫疾患または炎症性障害を有する個体における使用のための方法に関する。本開示のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌、ウイルス、および真菌由来の様々な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するＩ型膜貫通タンパク質である。このように、ＰＡＭＰは、侵入する病原体に対する防御の最前線として働く。ヒトＴＬＲは、細胞の発現および下流におけるシグナル伝達経路の活性化の差異に起因して、重複するが異なる生物学的応答を誘発しうる（Akiraら、Adv  Immunol、７８巻：１〜５６頁、２００１年）。ＴＬＲは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）からなるエクトドメインおよびＴｏｌｌ／インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインとして公知の細胞質ドメインを特徴とする。ＬＲＲ含有エクトドメインが、ＰＡＭＰの認識の一因となるのに対し、細胞質ドメインは、下流のシグナル伝達に要求される。研究により、ＬＲＲ８が、ＤＮＡおよびＲＮＡ認識に関与しているのに対し、ＬＲＲ１７は、核酸の結合に関与することが示されている（Smitsら、Oncologist、１３巻：８５９〜８７５頁、２００８年）。
【０００６】
細胞膜内に位置するＴＬＲが、細菌膜構成成分を認識するのに対し、核酸ベースのリガンドを検出するＴＬＲは、エンドソーム区画内に優勢に位置する。核酸感知型ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９を含む。ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡおよびウイルス性ＤＮＡのほか、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチドも認識する（AkiraおよびHemmi、Immunol  Lett、８５巻：８５〜９５頁、２００３年）。
【０００７】
ＴＬＲ８は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９と同じサブファミリーに属し、ＴＬＲ７と高度に相同である（Liuら、Mol  Immunol、４７巻：１０８３〜９０頁、２０１０年）。そのようであってもなお、ＲＮＡおよび核酸に関連する構造を伴う合成低分子に対するＴＬＲ８の特異性は、ＴＬＲ７の特異性と同一ではない（Medzhitovら、Immunol  Rev、１７３巻：８９〜９７頁、２０００年）。例えば、反復的Ａ／Ｕモチーフを含有する一部のｓｓＲＮＡ合成配列は、ＴＬＲ８を特異的に活性化させることが可能であるが、ＴＬＲ７を特異的に活性化させることは可能でない（Gordenら、J  Immunol、１７４巻：１２５９〜６８頁、２００５年）。さらに、ヒトにおいて、ＴＬＲ８が、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、および好中球において高度に発現するのに対し、血液細胞内のＴＬＲ７は、形質細胞系樹状細胞（ｐＤＣ）、Ｂ細胞、および好中球において主に発現する。この細胞発現の差異のために、血液中のＴＬＲ７を介するＲＮＡによる惹起作用が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生によって支配される応答をもたらすのに対し、ＴＬＲ８を介する活性化は、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１など、複数の炎症促進性サイトカインを誘導する（Barratら、J  Exp  Med、２０２巻：１１３１〜９頁、２００５年；およびGordenら、J  Immunol、１７４巻：１２５９〜６８頁、２００５年）。
【０００８】
ＴＬＲは、多様な自己免疫疾患および炎症性疾患に関与しており、最も明白な例は、全身性エリテマトーデスの発症機序においてＴＬＲ９およびＴＬＲ７が果たす役割である（BarratおよびCoffman、Immunol  Rev、２２３巻：２７１〜２８３頁、２００８年）。加えて、ＴＬＲ８多型は、関節リウマチとも関連している（Enevoldら、J  Rheumatol、３７巻：９０５〜１０頁、２０１０年）。多様なＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、およびＴＬＲ９阻害剤が記載されているが、さらなるＴＬＲ阻害剤が所望される。特に、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを有するポリヌクレオチドが、対象（例えば、自己免疫疾患または炎症性障害を有する患者）における免疫応答を正確に阻害するのに必要とされている。
【０００９】
加えて、マウス脾臓細胞によるＲ８４８誘導性サイトカインの分泌を阻害する、いくつかのポリヌクレオチドも同定されている。しかし、マウスＴＬＲ８は、それらの全てがヒトＴＬＲ８を活性化させることが示されている、ｓｓＲＮＡリガンド、ＲＮＡウイルス、または低分子に応答する能力を欠く（Heilら、Science、３０３巻：１５２６〜９頁、２００４年;  Jurkら、Nat  Immunol、３巻：４９９頁、２００２年;  Hemmiら、Nat.  Immunol、３巻：１９６〜２００頁、２００２年；およびLundら、PNAS、１０１巻：５５９８〜６０３頁、２００４年）。さらに、アミノ酸配列を比較することにより、マウスのＴＬＲ８およびラットのＴＬＲ８は、ヒトにおけるリガンド認識に要求される５アミノ酸の配列を欠くことが判明した（Liuら、Mol  Immunol、４７巻：１０８３〜９０頁、２０１０年）。したがって、ヒト対象における使用のための、ヒトＴＬＲ８に対する阻害性モチーフを有するポリヌクレオチドが所望される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Akiraら、Adv  Immunol、７８巻：１〜５６頁、２００１年
【非特許文献２】Smitsら、Oncologist、１３巻：８５９〜８７５頁、２００８年
【非特許文献３】AkiraおよびHemmi、Immunol  Lett、８５巻：８５〜９５頁、２００３年
【非特許文献４】Liuら、Mol  Immunol、４７巻：１０８３〜９０頁、２０１０年
【非特許文献５】Medzhitovら、Immunol  Rev、１７３巻：８９〜９７頁、２０００年
【非特許文献６】Gordenら、J  Immunol、１７４巻：１２５９〜６８頁、２００５年
【非特許文献７】Barratら、J  Exp  Med、２０２巻：１１３１〜９頁、２００５年
【非特許文献８】BarratおよびCoffman、Immunol  Rev、２２３巻：２７１〜２８３頁、２００８年
【非特許文献９】Enevoldら、J  Rheumatol、３７巻：９０５〜１０頁、２０１０年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）阻害剤および自己免疫疾患または炎症性障害を有する個体における使用のための方法が提供される。本開示のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。「〜を含む」という表現と共に記載されている本開示の態様および実施形態はまた、態様および実施形態「からなる」こと、ならびに態様および実施形態「から本質的になる」ことも含むことを理解されたい。
【００１２】
本開示は、ポリヌクレオチドおよび個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害におけるポリヌクレオチドの使用であって、ポリヌクレオチドが、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ただし、ポリヌクレオチドは、配列番号９（ＤＶ１９７）を含まない、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用を提供する。一部の実施形態では、Ｘ３およびＸ４は独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＩである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＩである。一部の実施形態では、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、GAGI、GAGA、GGGI、TTGA、IAII、GTGI、AAII、IAIA、AIIA、IIII、ICII、IGII、ITII、CAII、TAII、CCII、TTIIおよびGGIIからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、TTGAGI、TTGAGA、TTGGGI、CCTTGA、TTIAII、TTGTGI、TTAAII、TTIAIA、TTAIIA、AGIAII、TTIIII、TTICII、TTIGII、TTITII、TTCAII、TTTAII、TTCCII、TTTTII、TTGGII、IIIAII、CCIAII、GGIAII、AAIAII、CIIAII、およびIIAIIAからなる群のうちの１つである。本開示は、個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあり、ただし、Ｘ５Ｘ６がＧＩまたはＧＡである場合は、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣであるポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施形態では、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩである。本開示はまた、個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあるポリヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９（ＤＶ１９７）を含まない。一部の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｃ類似体またはＧ類似体を含まない（例えば、７−デアザグアノシンを含まない）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾糖を含まない。一部の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、アンチセンス配列またはＲＮＡｉ分子ではない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの範囲内に、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドの位置において、トリヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’も５’−ＧＩＧＧ−３’も含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含まず、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇ、デアザＧ、またはＩ（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む（または５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含む［式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇ、デアザＧ、またはＩである］）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含み、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含み、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含み、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇ、デアザＧ、またはＩ（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）である。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｇである。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｉである。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｉである。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ａである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＩである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＡである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＩである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＡである。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｇではないか、Ｘ５は、Ｉではないか、Ｘ６は、Ｉではないか、またはＸ６は、Ａではない。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＩではないか、Ｘ５Ｘ６は、ＧＡではないか、Ｘ５Ｘ６は、ＩＩではないか、またはＸ５Ｘ６は、ＩＡではない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含まず、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇであるか、またはＧ四重鎖の形成を阻止し、かつ／もしくはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子である。これらの実施形態のサブセットでは、Ｇ四重鎖の形成を阻止し、かつ／またはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子は、イノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−２’−デオキシアントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシネブラリン、イソデオキシグアノシン、または８−オキソ−２’−デオキシグアノシンなどのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、TTGA、IAII、AAII、IAIA、AIIA、IIII、ICII、IGII、ITII、CAII、TAII、CCII、TTIIおよびGGIIからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、CCTTGA、TTIAII、TTAAII、TTIAIA、TTAIIA、AGIAII、TTIIII、TTICII、TTIGII、TTITII、TTCAII、TTTAII、TTCCII、TTTTII、TTGGII、IIIAII、CCIAII、GGIAII、AAIAII、CIIAII、およびIIAIIAからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、およびＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、ポリヌクレオチドは、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号24、配列番号26、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つを含む。一部の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、およびＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、ポリヌクレオチドは、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105および配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。本開示は、個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、（ａ）ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、およびＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号24、配列番号26、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、  配列番号101、配列番号102、配列番号103、
配列番号104、配列番号105、  配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つ；または（ｂ）やはりポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、およびＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、ポリヌクレオチドの３’末端におけるジヌクレオチド以外の１つまたは２つの主要な塩基が各々、主要な塩基の自然発生もしくは非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含むポリヌクレオチドもさらに提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。一部の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０塩基または塩基対（ヌクレオチド）未満の長さである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであるか、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであるか、またはポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、リン酸修飾連結を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結だけを含有する。一部の実施形態では、Ｎｘは、非核酸スペーサー部分を含む。あるいは、言い換えれば、一部の実施形態では、ＮｘのあるＮを、非核酸スペーサー部分により、Ｎｘの別のＮへと接続する。これらの実施形態のサブセットでは、非核酸スペーサー部分は、ヘキサ（エチレングリコール）を含む。また、上記で記載したポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。加えて、本開示は、個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する方法であって、医薬組成物を、個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１３】
さらに、本開示は、ポリヌクレオチドおよび個体におけるＴＬＲ７依存性免疫応答の阻害におけるポリヌクレオチドの使用であって、式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０、１または２であり、このポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用も提供する。本開示はまた、式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０、１または２であり、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、式は、５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’である。他の実施形態では、式は、５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。ポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物もさらに提供される。加えて、本開示は、個体におけるＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害する方法であって、医薬組成物を、個体におけるＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１４】
さらに、本開示は、ポリヌクレオチドならびに個体におけるＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害におけるポリヌクレオチドの使用であって、式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用も提供する。本開示はまた、式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字（添え字中のｘおよびｙ以外の小文字）は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。ポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物もさらに提供される。加えて、本開示は、個体におけるＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する方法であって、医薬組成物を、個体におけるＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１５】
さらに、本開示は、ポリヌクレオチドならびに個体におけるＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答の阻害におけるポリヌクレオチドの使用であって、式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用も提供する。本開示はまた、式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物もさらに提供される。加えて、本開示は、個体におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する方法であって、医薬組成物を、個体におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１６】
さらに、本開示は、ポリヌクレオチドならびに個体におけるＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答の阻害におけるポリヌクレオチドの使用であって、式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用も提供する。本開示はまた、式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物もさらに提供される。加えて、本開示は、個体におけるＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する方法であって、医薬組成物を、個体におけるＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１７】
さらに、本開示は、個体における免疫応答を阻害する方法であって、前出の段落のうちのいずれかのポリヌクレオチドを含む医薬組成物を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、免疫応答は、自己免疫疾患と関連する。一部の実施形態では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患の１または複数の症状を改善する。一部の好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、膵炎、混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、過敏性腸疾患、Ｉ型糖尿病、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、シェーグレン症候群である。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、ＲＮＡ含有免疫複合体（またはカチオン性ペプチドなどのペプチドへと結合したＲＮＡ由来の炎症）と関連する。一部の実施形態では、免疫応答は、炎症性障害と関連する。一部の実施形態では、免疫応答を阻害することにより、炎症性障害の１または複数の症状を改善する。一部の実施形態では、炎症性障害は、ＴＬＲ８発現の上昇（またはＴＬＲ８シグナル伝達の異常）と関連する。一部の実施形態では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患または炎症性障害を処置する。一部の実施形態では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患または炎症性障害の発症を防止するかまたは遅延させる。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒトである。
【００１８】
本開示はまた、自己免疫疾患または炎症性障害を処置または防止するために医薬を調製するための、前出の段落のうちのいずれかのポリヌクレオチドも提供する。一部の実施形態では、医薬は、自己免疫疾患の１または複数の症状を改善するのに有効な量のポリヌクレオチドを含む。一部の好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、膵炎、混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、過敏性腸疾患、Ｉ型糖尿病、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、シェーグレン症候群である。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、ＲＮＡ含有免疫複合体（またはカチオン性ペプチドなどのペプチドへと結合したＲＮＡ由来の炎症）と関連する。一部の実施形態では、免疫応答は、炎症性障害と関連する。一部の実施形態では、医薬は、炎症性障害の１または複数の症状を改善するのに有効な量のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、炎症性障害は、ＴＬＲ８発現の上昇（またはＴＬＲ８シグナル伝達の異常）と関連する。一部の実施形態では、医薬は、自己免疫疾患または炎症性障害を処置する。一部の実施形態では、医薬は、自己免疫疾患または炎症性障害の発症を防止するかまたは遅延させる。一部の好ましい実施形態では、自己免疫疾患または炎症性障害を有する個体は、ヒトである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：
５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、前記ポリヌクレオチドの３’末端にあり、ただし、Ｘ５Ｘ６がＧＩまたはＧＡである場合は、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣである、ポリヌクレオチド。
（項目２）
ＣＧジヌクレオチドを含まない、項目１に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目３）
アンチセンス配列でもＲＮＡｉ分子でもない、項目１または項目２に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含まない、項目１から３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目５）
前記ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目６）
５’−ＧＧＧＧ−３’も５’−ＧＩＧＧ−３’も含まない、項目１から５のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目７）
５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む、項目１から５のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目８）
前記ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置する、ＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含み、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目９）
Ｘ５が、Ｇである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１０）
Ｘ５が、Ｉである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１１）
Ｘ６が、Ｉである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１２）
Ｘ６が、Ａである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１３）
Ｘ５Ｘ６が、ＧＩである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１４）
Ｘ５Ｘ６が、ＧＡである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌ
クレオチド。
（項目１５）
Ｘ５Ｘ６が、ＩＩである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１６）
Ｘ５Ｘ６が、ＩＡである、項目１から８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１７）
配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、  配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、および配列番号１１５からなる群のうちの１つを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１８）
配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、および配列番号１１５からなる群のうちの１つを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目１９）
個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、およびＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、
配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、および配列番号１１５からなる群のうちの１つ、または
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの３’末端における前記ジヌクレオチド以外の１つまたは２つの主要な塩基が各々、前記主要な塩基の自然発生もしくは非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体
を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２０）
（ａ）の前記類似体を含み、ここで、前記ジヌクレオチド以外の前記主要な塩基のうちの１つが前記自然発生の修飾で置きかえられている、項目１９に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目２１）
（ａ）の前記類似体を含み、ここで、前記ジヌクレオチド以外の前記主要な塩基のうちの１つが前記非自然発生の修飾で置きかえられている、項目１９に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目２２）
配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、および配列番号１１５からなる群のうちの１つを含む、項目１９に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目２３）
４０、３５、３０、２５、または２０塩基または塩基対未満の長さである、項目１から２２のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目２４）
リン酸修飾連結を含有するか、またはホスホロチオエート連結だけを含有する、項目１から２３のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
（項目２５）
式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、前記ポリヌクレオチドの３’末端にあり、ただし、Ｘ５Ｘ６がＧＩまたはＧＡである場合は、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣである、ポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２５に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目２７）
個体におけるＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する方法であって、項目２６に記載の医薬組成物を、前記個体における前記ＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目２８）
式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０であり、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、ポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目２８に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目３０）
個体におけるＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害する方法であって、項目２９に記載の医薬組成物を、前記個体における前記ＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目３１）
式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０であり、ｚは、０であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、ポリヌクレオチド。
（項目３２）
項目３１に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目３３）
個体におけるＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性の免疫応答を阻害する方法であって、項目３２に記載の医薬組成物を、前記個体における前記ＴＬＲ７依存性および前記ＴＬＲ８依存性の免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目３４）
式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０であり、ｚは、０であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、ポリヌクレオチド。
（項目３５）
項目３４に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目３６）
個体におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する方法であって、項目３５に記載の医薬組成物を、前記個体における前記ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目３７）
式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、前記ポリヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まない、ポリヌクレオチド。
（項目３８）
項目３７に記載のポリヌクレオチドと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目３９）
個体におけるＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性の免疫応答を阻害する方法であって、項目３８に記載の医薬組成物を、前記個体における前記ＴＬＲ８依存性および前記ＴＬＲ９依存性の免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目４０）
個体における免疫応答を阻害する方法であって、項目２６、２９、３２、３５、および３８のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記個体における前記免疫応答を阻害するのに有効な量で前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目４１）
前記免疫応答が、自己免疫疾患と関連する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記免疫応答を阻害することにより、前記自己免疫疾患の１または複数の症状を改善する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、膵炎、混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、過敏性腸疾患、Ｉ型糖尿病、およびシェーグレン病からなる群から選択される、項目４１または項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記自己免疫疾患が、シェーグレン病である、項目４１または項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記自己免疫疾患が、ＲＮＡ含有免疫複合体と関連する、項目４１または項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記免疫応答が、炎症性障害と関連する、項目４０に記載の方法。
（項目４７）
前記免疫応答を阻害することにより、前記炎症性障害の１または複数の症状を改善する、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記炎症性障害が、ＴＬＲ８発現の上昇と関連する、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記個体が、ヒトである、項目２７、２８、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルスで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の、３０ｎＭの濃度のポリヌクレオチドＣ９５４、ＤＶ１９７、およびＤＶ１３４による阻害百分率を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導およびＴＬＲ８に媒介されたＩＬ−１β誘導の、０．９、０．２３７、および０．０６μＭの濃度のポリヌクレオチドＣ９５４、ＤＶ１９７、およびＤＶ１３４による阻害百分率を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導およびＴＬＲ８に媒介されたＩＬ−１β誘導の、０．７５〜０．０４７μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶ１９７およびＤＶＸ１０による阻害百分率を示す。
【図４】図４は、静脈内単独で、または皮下で施されるＤＶ１９７（１００ｍｃｇ）との組合せで施される、３００ｍｃｇのＯＲＮ８Ｌを注射されたｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスにおける、ＴＬＲ８に媒介されたＩＬ−１２誘導を示す。
【図５】図５は、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導の、０．７５〜０．０４７μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶ１９７、ＤＶＸ１、ＤＶＸ２、ＤＶＸ３、およびＤＶＸ４による阻害百分率を示す。
【図６】図６は、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導の、１．５〜０．０４７μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶ１９７、ＤＶＸ６、ＤＶＸ７、ＤＶＸ８、およびＤＶＸ９による阻害百分率を示す。
【図７】図７は、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導の、０．７５〜０．０４７μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶ１９７、ＤＶＸ２０、ＤＶＸ２１、ＤＶＸ２４、ＤＶＸ２５、およびＤＶＸ２６による阻害百分率を示す。
【図８】図８は、１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで刺激された単球における、ＴＬＲ８に媒介されたＴＮＦ−α誘導の、０．７５〜０．０４７μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶ１９７、ＤＶＸ１１、ＤＶＸ１２、ＤＶＸ１３、ＤＶＸ１４、ＤＶＸ１５、およびＤＶＸ１６による阻害百分率を示す。
【図９】図９は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルスで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の、０．１２５〜０．０１５μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＣ９５４、ＤＶＸ８９、ＤＶＸ９０、ＤＶＸ９１、ＤＶＸ９２、およびＤＶＸ９３による阻害百分率を示す。
【図１０】図１０は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルスで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の、１．０〜０．０５μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＣ９５４、ＤＶＸ３５、およびＤＶＸ４２による阻害百分率を示す。
【図１１】図１１は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルス単独、または１〜０．００２μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶＸ８１との組合せで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導を示す。
【図１２】図１２は、１μＭのＣｐＧ−ＴＬＲ９Ｌ  １０１８ＩＳＳ（配列番号４）単独、または２．０〜０．０３μＭの範囲にわたる濃度のＣ９５４、もしくはＤＶＸ８１で刺激されたＢ細胞における、ＴＬＲ９に媒介されたＩＬ−６誘導を示す。
【図１３】図１３は、３例の関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の血漿もしくは３例の健常（Ｈ）個体由来の血漿単独、または１μＭの濃度のＤＶＸ４２もしくはＤＶ１９７との組合せで刺激されたＰＢＭＣによる平均ＩＬ−８産生を示す。ＰＢＭＣは、３例の健常ヒト対象から得た。
【図１４】図１４は、８例の関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の血漿単独、または１μＭの濃度のＤＶＸ８１との組合せで刺激されたＰＢＭＣによる平均ＩＬ−８産生を示す。ＰＢＭＣは、３例の健常ヒト対象から得た。
【図１５】図１５は、関節リウマチ患者由来の１５％滑液（ＳＮ）単独、または１μＭの濃度のＤＶ１９７との組合せで刺激された精製ヒト単球による、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、およびＶＥＧＦの産生を示す。
【図１６】図１６は、静脈内で施される２２０ｍｃｇのＯＲＮ８Ｌを、単独で、または静脈内で施される１００ｍｃｇのＤＶＸ８１との組合せで注射されたｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの２時間後および一晩後（Ｏ／Ｎ）における、ＴＬＲ８に媒介されたＩＬ−１２誘導を示す。
【図１７】図１７、図１８、および図１９は、Ｃ９５４に関連する異なるポリヌクレオチドの、ヒトＢ細胞による非特異的ＩＬ−６産生に対する効果を示す。
【図１８】図１７、図１８、および図１９は、Ｃ９５４に関連する異なるポリヌクレオチドの、ヒトＢ細胞による非特異的ＩＬ−６産生に対する効果を示す。
【図１９】図１７、図１８、および図１９は、Ｃ９５４に関連する異なるポリヌクレオチドの、ヒトＢ細胞による非特異的ＩＬ−６産生に対する効果を示す。
【図２０】図２０は、Ｃ９５４に関連する異なるポリヌクレオチドの、ラット脾臓細胞による非特異的ＩＬ−６産生に対する効果を示す。
【図２１】図２１は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルス単独（ＰＲ８）、または０．２５もしくは０．０６のμＭの濃度のポリヌクレオチドＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、もしくはＤＶＸ９９との組合せで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の量を示す。
【図２２】図２２は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルス単独（ＰＲ８）、または０．５〜０．０１５μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＣ９５４、ＤＶＸ４２、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ９８、もしくはＤＶＸ９９との組合せで刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の量を示す。
【図２３】図２３は、２ＭＯＩの不活化インフルエンザウイルス（ＰＲ８）で刺激されたＰＤＣにおける、ＴＬＲ７に媒介されたＩＦＮ−α誘導の、１〜０．００２μＭの範囲にわたる濃度のポリヌクレオチドＤＶＸ９９、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、およびＤＶＸ１０５による阻害百分率を示す。
【図２４】図２４は、１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスに、静脈内単独で、または皮下で施されるＣ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、もしくはＤＶＸ９９（１００ｍｃｇ）との組合せで施される、２５０ｍｃｇのＯＲＮ７Ｌを注射した２時間後における、ＴＬＲ７に媒介されたＩＬ−１２誘導を示す。
【図２５】図２５は、１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスに、静脈内単独で、または皮下で施されるＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、またはＤＶＸ９９（１００ｍｃｇ）との組合せで施される、２５０ｍｃｇのＯＲＮ７Ｌを注射した６時間後における、ＴＬＲ７に媒介されたＩＬ−１２誘導に対する効果を示す。
【図２６】図２６Ａは、食塩水、または１００ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ１０２、もしくはＤＶＸ１０３を投与した後のマウスによる、経時的な体重の増大／減少を示す。図２６Ｂは、食塩水、または１００ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ１０２、もしくはＤＶＸ１０３を投与した後のマウスによる、経時的な体重パーセントの変化（１日目における体重に対する）を示す。
【図２７】図２７Ａは、食塩水、または８５ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ１０３、およびＤＶＸ１０４を投与した後におけるラットによる、経時的な体重の増大／減少を示す。図２７Ｂは、食塩水、または２５ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ１０３、もしくはＤＶＸ１０４を投与した後におけるラットによる、経時的な体重の増大／減少を示す。
【図２８】図２８は、食塩水、または９０ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、またはＤＶ１８５を投与した後におけるラットによる、経時的な体重の増大／減少の履歴を示す。
【図２９】図２９は、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓における、ｈＴＬＲ８、ｍＩＦＮ−γ、ｍＴＮＦ−α、ｍＩＬ−１８、ｍＩＬ−１２ｐ４０、ｍＩＬ−１α、ｍＭＭＰ９、およびｍＩＰ−１０の相対レベルを、野生型マウス、およびＤＶＸ８２またはＤＶＸ９９（２．２ｍｇ／ｋｇ、毎週２回５週間にわたる）による処置後におけるヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスと比較して示す。
【図３０】図３０は、ＰＢＳ、ＤＶＸ８２、またはＤＶＸ９９により処置したヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓疾患スコアを、野生型マウス（ＷＴ）と比較して示す。
【図３１】図３１は、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓における、ｍＩＦＮ−γ、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−２３、ｍＩＬ−１β、ｍＬＴ−α、ｍＩＬ１−ＲＡ、ｍＭＭＰ−１、ｍＭＭＰ−９、ｍＭＭＰ−７、ｍＭＭＰ−１０、ｈＴＬＲ８、ｍＣＤ４、ｍＣＤ８、およびｍＣＤ１１βの相対レベルを、野生型マウスおよびＤＶＸ１０３（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ、毎週１回１０週間にわたる）による処置後におけるヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスと比較して示す。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、抗ＬＢＰＡ抗体が、ヒト単球における炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を誘導することを示す。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、１μｇ／ｍＬの抗ＬＢＰＡ抗体単独で、または１μＭのＤＶＸ８２との組合せで刺激された単球におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の誘導を示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、マウスＴＬＲ７遺伝子（ＴＬＲ７．６）を過剰発現するマウスの腎臓における、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−１β、ｍＴＮＦ−α、ｍＩＦＮ−γ、ｍＭＭＰ−７、ｍＣＤ１１βの相対レベルを、野生型マウス（ＷＴ）、およびＰＢＳまたはＤＶＸ１０３（１ｍｇ／ｋｇ、毎週１回１５週間にわたる）による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスと比較して示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、マウスＴＬＲ７遺伝子（ＴＬＲ７．６）を過剰発現するマウスの腎臓における、ｍＣＤ８、およびｍＣＤ４の相対レベルを、野生型マウス（ＷＴ）、およびＰＢＳまたはＤＶＸ１０３（１ｍｇ／ｋｇ、毎週１回１５週間にわたる）による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスと比較して示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、野生型マウス、およびＰＢＳまたはＤＶＸ１０３（１ｍｇ／ｋｇ、毎週１回１５週間にわたる）による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスにおける脾臓樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の数を示す。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓における、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−１β、ｍＬＴ−β、ｍＭＩＧ、およびｍＦ４／８０の相対レベルを、野生型マウス（ＷＴ）、および食塩水またはＤＶＸ１０５（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ、毎週１回８週間にわたる）による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスと比較して示す。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、野生型マウス、およびＰＢＳまたはＤＶＸ１０５（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ、毎週１回８週間にわたる）による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスにおける脾臓樹状細胞（ＤＣ）の数を示す。
【図３６】図３６は、初回のコラーゲン注射後における経時的な、野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、およびＰＢＳまたはＤＶＸ１０５で処置されたＴＬＲ８トランスジェニックマウス（ＴＬＲ８ＴＧＣＬ８）によるコラーゲン誘導型関節リウマチ（ＣＩＡ）モデルにおける疾患スコアを示す。処置（ＰＢＳまたはＤＶＸ１０５；１ｍｇ／ｋｇの皮下処置）は、１、７、１４、２０、２４、２８、３１、３５、４２、４９、および５３日目において投与した。
【図３７】図３７は、１０１８ＩＳＳ（配列番号４；１μＭ）単独で、または１μＭ〜０．０３μＭの範囲にわたる濃度のＣ９５４、ＤＶＸ１０７、ＤＶＸ１０８、ＤＶＸ１０９、もしくはＤＶＸ１０３との組合せで刺激されたＢ細胞における、ＴＬＲ９に媒介されたＩＬ−６誘導を示す。
【図３８】図３８は、５例のシェーグレン症候群（ＳＪ）患者由来の血清もしくは３例の健常個体由来の血清単独で、または１μＭの濃度のＤＶＸ９９との組合せで刺激されたＣＤ１４＋単球による平均ｈＩＬ−１α産生、平均ｈＩＬ−１β産生、平均ｈＴＮＦ−α産生、平均ｈＧＭ−ＣＳＦ産生、および平均ｈＧ−ＣＳＦ産生を示す。単球は、健常ヒト対象から得た。示される結果は、３回の実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書では、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）阻害剤、および個体におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答の阻害における使用のための方法が提供される。一部の実施形態では、個体は、自己免疫疾患または炎症性障害を有する。本開示のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。本明細書では、本開示の以下の態様：一般的技法；定義、組成物、方法、およびキットについて、より詳細に記載する。
【００２１】
Ｉ．一般的技法
本開示の実施では、別段に指し示されない限りにおいて、当技術分野の範囲内にある、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、化学、生化学、および免疫学の従来の技法を援用する。このような技法は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版(Sambrookら.、1989);  Oligonucleotide  Synthesis  (Gait編,1984);  Animal  Cell  Culture  (Freshney編,  1987);  Handbook  of  Experimental  Immunology  (Weir  &  Blackwell編);  Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (Miller  &  Calos編,1987);  Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (Ausubelら.編,1987);  PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction  (Mullisら編,1994);  Current  Protocols  in  Immunology  (Coliganら編,1991);  The  Immunoassay  Handbook  (Wild編,Stockton  Press  NY,  1994);  Bioconjugate  Techniques  (Hermanson編,Academic  Press,  1996);  and  Methods  of  Immunological  Analysis  (Masseyeff,  Albert,  and  Staines編,Weinheim:  VCH  Verlags  gesellschaft  mbH,  1993)などの文献において十分に説明されている。
【００２２】
ＩＩ．定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオシド、またはこれらの組合せを含む。ポリヌクレオチドは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、環状に構成される場合もあり、ポリヌクレオチドは、１または複数の直鎖状セグメント、分枝状セグメント、および／または環状セグメントを含有する場合もある。ポリヌクレオチドとは、一般に、ホスホジエステル連結を介してつなぎ合わされたヌクレオシドのポリマーであるが、また、ホスホロチオエートエステルなどの代替的な連結も使用することができる。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）、またはこれらの誘導体）塩基またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、もしくはウラシル（Ｕ）、またはこれらの誘導体）塩基からなる。ＤＮＡ内の４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、およびデオキシシチジンと呼ばれる。ＲＮＡ内の４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、アデノシン、グアノシン、ウリジン、およびシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００２３】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、受容体を介するシグナル伝達を活性化させる任意の分子を含む。例えば、ＴＬＲ８アゴニストは、ＴＬＲ８受容体に結合し、ＴＬＲ８シグナル伝達経路を活性化させる。
【００２４】
「アンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、アゴニストの生物学的活性を遮断する任意の分子を含む。例えば、ＴＬＲ８アンタゴニストは、ＴＬＲ８シグナル伝達経路を抑制する。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫阻害性配列」および「ＩＩＳ」という用語は、測定可能な（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて測定される）免疫応答を阻害する核酸配列を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「免疫刺激性配列」および「ＩＳＳ」という用語は、測定可能な（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて測定される）免疫応答を刺激する核酸配列を指す。本開示の目的では、ＩＳＳという用語は、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む核酸配列を指す。
【００２７】
ポリヌクレオチドの、ＴＬＲ依存性免疫応答に対する効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ポリヌクレオチドの存在下および非存在でＴＬＲアゴニストと接触させた免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、および樹状細胞などの白血球）の応答を測定することにより決定することができる。例示的な方法については、実施例３で記載する。本明細書で言及される通り、ＴＬＲ阻害剤とは、５００ｎＭ未満のＩＣ５０（５０％阻害濃度）でＴＬＲ依存性免疫応答を阻害するポリヌクレオチドである。ＩＣ５０が２００ｎＭ未満のポリヌクレオチドは、活性が大きなＴＬＲ阻害剤であると考えられる。ＩＣ５０が２０１〜５００ｎＭのポリヌクレオチドは、活性が中程度のＴＬＲ阻害剤であると考えられる。ＩＣ５０が５００ｎＭを超えるポリヌクレオチドは、本質的に不活性である（例えば、ＴＬＲ阻害剤ではない）と考えられる。
【００２８】
測定可能な免疫応答の例は、抗原特異的な抗体の産生、サイトカインの分泌、リンパ球の活性化、およびリンパ球の増殖を含むがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用される「アンチセンス」および「アンチセンス配列」という用語は、ｍＲＮＡのコード鎖と相補的な配列を有するポリヌクレオチドの非コード鎖を指す。好ましい実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、アンチセンス配列またはＲＮＡｉ分子（ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）ではない。すなわち、好ましい実施形態では、本開示のＴＬＲ阻害剤は、それらが使用される哺乳動物対象の転写物（または遺伝子）に対して、著明な相同性（または相補性）を有さない。例えば、ヒト対象におけるＴＬＲ依存性免疫応答を阻害するための、本開示のポリヌクレオチドは、その長さにわたり、ヒトゲノムの核酸配列に対して、８０％未満同一である（例えば、２０塩基のヒトＴＬＲ８阻害剤であれば、２０塩基のうちの１６塩基以下を、ｔｌｒ８  ｍＲＮＡを含むがこれらに限定されないヒト転写物と共有するであろう）。とりわけ、ＴＬＲ阻害剤は、哺乳動物対象（例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、農場動物、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど）の核酸配列と８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％未満同一である。
【００３０】
「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの相補的な配列に結合し、それらのサイレンシングを結果としてもたらすことが典型的な、短鎖（約２２ヌクレオチド）ＲＮＡ配列の形態にある転写後調節因子のクラスを指す。「低分子干渉ＲＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、および「ｓｉＲＮＡ」という用語は、相補的なヌクレオチド配列を伴う遺伝子の発現に干渉する、２０〜２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを指す。
【００３１】
応答またはパラメータの「刺激」は、対象のパラメータを除き、他の点では同じ条件と比較した場合の、その応答またはパラメータの誘発および／もしくは増強、または、代替的に、別の条件と比較したその応答またはパラメータの誘発および／もしくは増強（例えば、ＴＬＲアゴニストの非存在下と比較した、ＴＬＲアゴニストの存在下におけるＴＬＲシグナル伝達の増大）を含む。例えば、免疫応答の「刺激」とは、応答の誘発および／または増強から生じうる、応答の増大を意味する。同様に、サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、および／またはＴＮＦ−αなど）産生の「刺激」または細胞型（ＣＴＬなど）の「刺激」とは、サイトカインまたは細胞型の量の増大またはレベルの上昇を意味する。
【００３２】
応答またはパラメータの「抑制」または「阻害」は、対象のパラメータを除き、他の点では同じ条件と比較した場合の、その応答もしくはパラメータの減少、または、代替的に、別の条件と比較した、その応答もしくはパラメータの減少（例えば、ＴＬＲアンタゴニストの非存在下におけるＴＬＲアゴニストの存在下と比較した、ＴＬＲアゴニストおよびＴＬＲアンタゴニストの存在下におけるＴＬＲシグナル伝達の増大）を含む。
【００３３】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫細胞または潜在的子孫細胞も指すと理解される。後続の世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一であることが可能ではないが、やはり本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。
【００３４】
「個体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指す。個体は、ヒト、ウシ科、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類、または霊長類対象を含むがこれらに限定されない。
【００３５】
「トランスジェニック動物」とは、マイクロ注射または組換えウイルスの感染によるなど、細胞未満レベルの意図的な遺伝子操作により直接的または間接的に施される遺伝子情報を保有する１または複数の細胞を含有する動物である。導入されたこのＤＮＡ分子は、染色体内に組み込まれる場合もあり、染色体外で複製されるＤＮＡの場合もある。
【００３６】
１または複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、任意の順序における同時的（共時的）投与および逐次的投与を含む。
【００３７】
「長期」投与とは、短期的方式に対して、初期の治療効果（活性）を長期にわたり維持するような、持続的方式による薬剤（複数可）の投与を指す。「間欠的」投与とは、中断を伴わずには逐次的および／または持続的になされない処置を指し、周期的な性格の投与である。
【００３８】
本明細書で開示される薬剤の「有効量」とは、具体的に言明された目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、言明された目的に照らして、経験的に、かつ、日常的な様式で決定することができる。
【００３９】
「治療有効量」という用語は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）における疾患または障害「を処置する」のに有効な薬剤（例えば、ＴＬＲ阻害剤）の量を指す。自己免疫疾患の場合、治療有効量の薬剤は、自己免疫疾患の徴候または症状を軽減する。例えば、関節リウマチの処置に関して、治療有効量の薬剤（例えば、ＴＬＲ阻害剤）は、患者における関節リウマチの徴候または症状を軽減し、これによりまた、骨および軟骨に対する損傷の速度も低減することができる。
【００４０】
疾患「を処置すること」または疾患の「処置」という用語は、疾患の徴候または症状を緩和しようとする試みにおいて、１または複数の薬物を個体（ヒトまたは他の個体）へと投与することを含みうる、プロトコールを実行することを指す。したがって、「〜を処置すること」または「処置」は、徴候または症状の完全な緩和を要求せず、治癒を要求せず、とりわけ、個体に対して最低限の効果を及ぼすに過ぎないプロトコールも含む。
【００４１】
本明細書で用いられ、当技術分野で十分に理解されている通り、「処置」とは、臨床的結果を含む、有益または所望の結果を得るための手法である。有益または所望の臨床的結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、１または複数の症状の緩和または改善、疾患の広がり縮小、疾患状態の安定（すなわち、非増悪）、疾患の拡大の阻止、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を施さない場合に予測される生存と比較した生存の延長も意味しうる。
【００４２】
本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（そして記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」についての記載を含む。
【００４３】
本明細書および付属の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形の「ある」、「または」、および「その」は、文脈により別段に指示されない限りにおいて、複数形の指示対象を含む。
【００４４】
「を含む」として本明細書で記載される態様および実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」の態様および実施形態を含むことが理解される。
【００４５】
ＩＩＩ．組成物
本明細書では、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチド（ＴＬＲ阻害剤）が提供される。また、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおける使用のためのＴＬＲ阻害剤も提供される。本明細書で記載される各免疫阻害性配列（ＩＩＳ）は、少なくとも１つの阻害性モチーフを含む。阻害性モチーフを含むＴＬＲ阻害剤は一本鎖ＤＮＡの場合もあり、二本鎖ＤＮＡの場合もあるほか、一本鎖ＲＮＡの場合もあり、二本鎖ＲＮＡの場合もあり、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド体の場合もある。ＴＬＲ阻害剤は、１または複数のリボヌクレオチド（リボースを唯一の糖構成成分または主要な糖構成成分として含有する）および／またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシリボースを主要な糖成分として含有する）を含む。ＴＬＲ阻害剤内に組み込まれる複素環塩基または核酸塩基は、自然発生の主要なプリン塩基およびピリミジン塩基（すなわち、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニン）でありうる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの３’末端におけるジヌクレオチド以外の１つまたは２つの主要な塩基を各々、主要な塩基の自然発生もしくは非自然発生の修飾で置きかえる。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾を含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾塩基を含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾糖を含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、２’−デオキシイノシンを含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、Ｃ類似体またはＧ類似体を含まない（例えば、７−デアザグアノシンを含まない）。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾糖を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾糖を含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｃ類似体またはＧ類似体（例えば、７−デアザグアノシンを含まない）を含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。好ましい実施形態では、ＩＩＳを含む本開示のポリヌクレオチドは、アンチセンス配列またはＲＮＡｉ分子（ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）ではない。
【００４６】
本明細書で提供される方法または組成物のうちのいずれかについてのある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾を含む。ある特定の実施形態では、修飾は、２’糖修飾である。ある特定の実施形態では、２’糖修飾は、２’−Ｏ−メチル糖修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、全ての２’−デオキシリボポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドと、２’糖修飾とのキメラ配列である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドと、２’−Ｏ−メチル糖リボポリヌクレオチドとのキメラ配列である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドと、２’−Ｏ−メトキシエチル（methyoxyethyl）糖リボポリヌクレオチドとのキメラ配列である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾リン酸連結を含む、少なくとも１つのヌクレオチドを有する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結だけを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結およびホスホジエステル連結だけを含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾塩基を含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、修飾糖を含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、２’−デオキシイノシンを含む。ある特定の実施形態では、１または複数のヌクレオチドは、Ｃ類似体またはＧ類似体を含まない（例えば、７−デアザグアノシンを含まない）。本明細書で用いられる「ヌクレオチド類似体」という用語は、それが誘導されたヌクレオチドの同一性を本質的に保持する化合物を指す。例えば、７−ｄＧは、Ｇ類似体であり、Ｎ４−エチル−ｄＣは、Ｃ類似体である。他方、ヌクレオチド修飾または塩基修飾とは、ヌクレオチドまたは塩基の同一性を保持することが可能でない化合物も指す。すなわち、修飾という用語は、ヌクレオチドまたは塩基の、異なる自然発生または非自然発生のヌクレオチドまたは塩基による置換も包含する。例えば、修飾という用語は、ＡによるＧの置換も包含する。明らかに伝わる通り、本明細書で記載される式については、任意のパラメータおよび全てのパラメータは、独立に選択されることが理解される。例えば、変数ｘおよびｙを含む式では、ｘ＝０〜２である場合、ｙは、ｘ（または式中で選択可能な他の任意のパラメータ）の値に関わらず、独立に選択することができる。
【００４７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド長（塩基単位または塩基対単位の）：約100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8または7のうちのいずれか未満である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド長（塩基単位または塩基対単位の）：約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95のうちのいずれかを超える。すなわち、ポリヌクレオチドは、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8または7を上限とし、独立に選択された6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95を下限とし、下限が上限未満である範囲のサイズのうちのいずれかであることが可能である。
【００４８】
ＴＬＲ７阻害剤
本明細書では、本明細書で記載される方法（例えば、ＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害または抑制する方法）のうちのいずれかにおける使用のためのＴＬＲ７阻害剤が提供される。ＴＬＲ７阻害剤は、少なくとも１つのＴＬＲ７阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。
【００４９】
本開示のＴＬＲ７阻害剤は、式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０、１、または２である。本明細書では、ＴＬＲ７依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０、１、または２である、ポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、式：５’−ＱｚＴＩＣＮｘ−３’または５’−ＱｚＴＴＣＮｘ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、ＱおよびＮの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、３〜５０の整数であり、ｚは、０、１または２であり、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。これは、ｚが、３ではなく、Ｑｚが、ＴＧＣまたはｕｇｃではなく、ＱｚＴＩＣが、ＴＧＣＴＩＣまたはｕｇｃＴＩＣではなく、ＱｚＴＴＣが、ＴＧＣＴＴＣまたはｕｇｃＴＴＣではないこと［式中、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表す］を意味する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾ＣＧジヌクレオチドを含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含まない［式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇであるか、またはＧ四重鎖の形成を阻止し、かつ／もしくはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子である］。さらなる実施形態では、Ｇ四重鎖の形成を阻止し、かつ／またはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子は、イノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−２’−デオキシアントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシネブラリン、イソデオキシグアノシン、または８−オキソ−２’−デオキシグアノシンなどのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含む。一部の実施形態では、Ｎｘは、非核酸スペーサー部分を含む。さらなる実施形態では、非核酸スペーサー部分は、ヘキサ（エチレングリコール）を含む。
【００５０】
本明細書で記載される通り、ｘは、３〜５０の間の整数である。これは、ｘが、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50であることを意味する。一部の実施形態では、ｘは、３〜４５の間、３〜４０の間、３〜３５の間、３〜３０の間、３〜２５の間、３〜２０の間、３〜１５の間、３〜１０の間、または３〜５の間である。一部の実施形態では、ｘは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０を超えるが、５０以下である。一部の実施形態では、ｘは、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４未満であるが、３以上である。
【００５１】
本明細書で記載される通り、ｚは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｚは、０である（５’−ＴＩＣ−３’または５’−ＴＴＣは、ポリヌクレオチドの５’末端にある）。一部の実施形態では、ｚは、１である。一部の実施形態では、ｚは、２である。
【００５２】
例示的なＴＬＲ７阻害剤は、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの５’末端において、ＴＩＣおよびＴＴＣからなる群から選択されるトリヌクレオチドを保有するという条件で、
5’-TIC  TGC  TCC  TTG  AGI-’  (配列番号36);
5’-TTC  TGC  TCC  TTG  AGI-’  (配列番号38);
5’-TIC  TIC  TCC  TTI  AII-’  (配列番号44);
5’-TTC  TTC  TCC  TTT  ATT-’  (配列番号46);
5’-TIC  TCC  TTG  AGI-’  (配列番号48);
5’-TTC  TCC  TTG  AGI-’  (配列番号50);
5’-TIC  TCC  TTI  AAI-’  (配列番号55);
5’-TIC  TCC  TTI  AIA-’  (配列番号56);
5’-TIC  TCC  TTI  AAA-’  (配列番号57);
5’-TIC  TCC  TTI  IAI-’  (配列番号58);
5’-TIC  TCC  TTA  IIA-’  (配列番号59);
5’-TIC  AGI  TTI  AII-’  (配列番号60);
5’-TIC  AGI  AGI  AII-’  (配列番号61);
5’-TIC  TIC  TII  TTI  AII-’  (配列番号62);
5’-TIC  TCC  TTI  AII-’  (配列番号63);
5’-TIC  TCC  TTI  III-’  (配列番号64);
5’-TIC  TCC  TTI  CII-’  (配列番号65);
5’-TIC  TCC  TTI  GII-’  (配列番号66);
5’-TIC  TCC  TTI  TII-’  (配列番号67);
5’-TIC  TIC  TCC  TII  TTI  CII-’  (配列番号85);
5’-TIC  TIC  TCC  AGI  TTI  CII-’  (配列番号86);
5’-TIC  TIC  TCC  TCC  TTI  CII-’  (配列番号87);
5’-TIC  TIC  TTG  AGI  TTI  CII-’  (配列番号88);
5’-TIC  TIC  TCC  TCC  TTI  CII  AII-’  (配列番号90);
5’-TIC  TCC  TCC  TTI  CII  AII-’  (配列番号91);
5’-TIC  TIC  TCC  TTI  CII-’  (配列番号95);
5’-TTC  TTC  TCC  TTI  CII-’  (配列番号97);
5’-TIC  TCC  TCC  TTI  CII  AII  A-’  (配列番号99);
5’-TIC  TIC  TTG  AGI  TTI  CII  AII-’  (配列番号103);
5’-TIC  TTG  AGI  TTI  CII  AII-’  (配列番号104);  
5’-TIC  TCC  TTG  AGI  AII-’  (配列番号108);  
5’-TIC  TCC  TCC  TTG  AGI  AII-’  (配列番号109);
5’-TIC  TTC  TCC  TTG  AGI  AII-’  (配列番号110);
5’-TIC  TCC  TCC  TTG  IIA  II-’  (配列番号111);
5’-TIC  TCC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号114);および
5’-TIC  TTC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号115);
［配列中、Ｉ＝２’−デオキシイノシンであり、大文字は、ＤＮＡを表す］
からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの５’末端において、ＴＩＣおよびＴＴＣからなる群から選択されるトリヌクレオチドを保有するという条件で、配列番号36、配列番号38、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号90、配列番号91、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号103、配列番号104、配列番号108、配列番号109、配列番号110;  配列番号111、配列番号114および配列番号115からなる群のうちの１つ；または
（ｂ）ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの５’末端において、ＴＩＣおよびＴＴＣからなる群から選択されるトリヌクレオチドを保有するという条件で、ポリヌクレオチドの３’末端におけるジヌクレオチド以外の１つまたは２つの主要な塩基が各々、主要な塩基の自然発生もしくは非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体
を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０塩基または塩基対（ヌクレオチド）未満の長さである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、リン酸修飾連結を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結だけを含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１または複数のホスホロチオエート連結を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結およびホスホジエステル連結だけを含有する。一部の実施形態では、Ｎｘは、非核酸スペーサー部分を含む。あるいは、言い換えれば、一部の実施形態では、ＮｘのあるＮを、非核酸スペーサー部分により、Ｎｘの別のＮへと接続する。さらなる実施形態では、非核酸スペーサー部分は、ヘキサ（エチレングリコール）を含む。
【００５４】
ＴＬＲ８阻害剤
本明細書では、本明細書で記載される方法（例えば、ＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害または抑制する方法）のうちのいずれかにおける使用のためのＴＬＲ８阻害剤が提供される。ＴＬＲ８阻害剤は、少なくとも１つのＴＬＲ８阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。
【００５５】
本開示のＴＬＲ８阻害剤は、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであり、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡである。すなわち、Ｍｙは、ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。また、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであるＴＬＲ８阻害剤であって、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあり、ただし、Ｘ５Ｘ６がＧＩまたはＧＡである場合は、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣであるＬＲ８阻害剤も提供される。加えて、本明細書では、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであるＴＬＲ８阻害剤であって、式中、Ｎは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にある、ＴＬＲ８阻害剤が提供される。本明細書では、ＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡである、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書ではさらに、ＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあり、ただし、Ｘ５Ｘ６がＧＩまたはＧＡである場合は、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣである、ポリヌクレオチドも提供される。本明細書では加えて、ＴＬＲ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−３’のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、式中、Ｎは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ３およびＸ４の各々は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、ｘは、０〜５０の整数であり、Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にある、ポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｃ類似体またはＧ類似体（例えば、７−デアザグアノシンを含まない）を含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾糖を含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置するＴＧＣまたはｕｇｃトリヌクレオチドを含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置するＴＧＣまたはｕｇｃトリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含まない。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含まず、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇであるか、またはＧ四重鎖の形成を阻止し、かつ／もしくはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子である。さらなる実施形態では、Ｇ四重鎖の形成を阻止し、かつ／またはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子は、イノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−２’−デオキシアントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシネブラリン、イソデオキシグアノシン、または８−オキソ−２’−デオキシグアノシンなどのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９を含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−３’を含み、式中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４は独立に、Ｇであるか、またはＧ四重鎖の形成を阻止し、かつ／もしくはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子である。さらなる実施形態では、Ｇ四重鎖の形成を阻止し、かつ／またはフーグスティーン型塩基対合を阻止することが可能な分子は、イノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−２’−デオキシアントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシネブラリン、イソデオキシグアノシン、または８−オキソ−２’−デオキシグアノシンなどのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端から０、１、または２ヌクレオチドに位置するＴＧＣまたはＵＧＣトリヌクレオチドを含み、５’−ＧＧＧＧ−３’または５’−ＧＩＧＧ−３’を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端において、ＧＴジヌクレオチド、ＧＵジヌクレオチド、またはＧＧジヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、アンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列ではない。一部の実施形態では、Ｘ３およびＸ４は独立にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＩである。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の各々は独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＩである。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｇである。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｉである。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｉである。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ａである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＩである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＡである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＩである。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＡである。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｇではない。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ｉではない。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｉではない。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ａではない。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＩではない。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＧＡではない。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＩではない。一部の実施形態では、Ｘ５Ｘ６は、ＩＡではない。一部の実施形態では、ｙは、０である。一部の実施形態では、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、ＧＡＧＩ、ＧＡＧＡ、ＧＧＧＩ、ＴＴＧＡ、ＩＡＩＩ、ＧＴＧＩ、ＡＡＩＩ、ＩＡＩＡ、ＡＩＩＡ、ＩＩＩＩ、ＩＣＩＩ、ＩＧＩＩ、ＩＴＩＩ、ＣＡＩＩ、ＴＡＩＩ、ＣＣＩＩ、ＴＴＩＩ、およびＧＧＩＩからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、ＴＴＧＡ、ＩＡＩＩ、ＡＡＩＩ、ＩＡＩＡ、ＡＩＩＡ、ＩＩＩＩ、ＩＣＩＩ、ＩＧＩＩ、ＩＴＩＩ、ＣＡＩＩ、ＴＡＩＩ、ＣＣＩＩ、ＴＴＩＩ、およびＧＧＩＩからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、TTGAGI、TTGAGA、TTGGGI、CCTTGA、TTIAII、TTGTGI、TTAAII、TTIAIA、TTAIIA、AGIAII、TTIIII、TTICII、TTIGII、TTITII、TTCAII、TTTAII、TTCCII、TTTTII、TTGGII、IIIAII、CCIAII、GGIAII、AAIAII、CIIAII、およびIIAIIAからなる群のうちの１つである。一部の実施形態では、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、CCTTGA、TTIAII、TTAAII、TTIAIA、TTAIIA、AGIAII、TTIIII、TTICII、TTIGII、TTITII、TTCAII、TTTAII、TTCCII、TTTTII、TTGGII、IIIAII、CCIAII、GGIAII、AAIAII、CIIAII、およびIIAIIAからなる群のうちの１つである。
【００５６】
本明細書で記載される通り、ｘは、０〜５０の間の整数である。これは、ｘが、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50であることを意味する。一部の実施形態では、ｘは、３〜４５の間、３〜４０の間、３〜３５の間、３〜３０の間、３〜２５の間、３〜２０の間、３〜１５の間、３〜１０の間、または３〜５の間である。一部の実施形態では、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０を超えるが、５０以下である。一部の実施形態では、ｘは、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ｘは、０である。
【００５７】
本明細書で記載される通り、ｙは、０または１である。一部の実施形態では、ｙは、０である（Ｘ５Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にある）。一部の実施形態では、ｙは、１である。
【００５８】
例示的な実施形態では、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、またはＩＡが、ポリヌクレオチドの３’末端から０または１ヌクレオチドの位置にあるという条件で、ポリヌクレオチドは、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号24、配列番号26、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つを含む。一部の実施形態では、ＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、またはＩＡが、ポリヌクレオチドの３’末端から０または１ヌクレオチドの位置にあるという条件で、ポリヌクレオチドは、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端から０または１ヌクレオチドの位置にあるＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、ＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号24、配列番号26、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、  配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群のうちの１つ；または
（ｂ）ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端から０または１ヌクレオチドの位置にあるＧＩ、ＧＡ、ＩＩ、ＩＡからなる群から選択されるジヌクレオチドを保有するという条件で、ポリヌクレオチドの３’末端におけるジヌクレオチド以外の１つまたは２つの主要な塩基が各々、主要な塩基の自然発生もしくは非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体
を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、ジヌクレオチド以外の主要な塩基のうちの１つが、非自然発生の修飾で置きかえられた、（ａ）の類似体を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０塩基または塩基対（ヌクレオチド）未満の長さである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、リン酸修飾連結を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結だけを含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１または複数のホスホロチオエート連結を含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結およびホスホジエステル連結だけを含有する。一部の実施形態では、Ｎｘは、非核酸スペーサー部分を含む。さらなる実施形態では、非核酸スペーサー部分は、ヘキサ（エチレングリコール）を含む。
【００６０】
ＴＬＲ７／８組合せ阻害剤
本明細書では、本明細書で記載される方法（例えば、ＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害または抑制する方法）のうちのいずれかにおける使用のための、ＴＬＲ７阻害性モチーフおよびＴＬＲ８阻害性モチーフを含むポリヌクレオチド（以下「ＴＲＬ７／８組合せ阻害剤」と称する）が提供される。
【００６１】
本明細書では、式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、ＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであるＴＬＲ７／８組合せ阻害剤が提供される。本明細書では、ＴＬＲ７依存性およびＴＬ８依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾ＣＧジヌクレオチドを含まない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、式：５’−ＱｚＴＧＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−ＮｘＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表す。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。
【００６２】
本明細書で記載される通り、ｘは、０〜５０の間の整数である。これは、ｘが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０であることを意味する。一部の実施形態では、ｘは、３〜４５の間、３〜４０の間、３〜３５の間、３〜３０の間、３〜２５の間、３〜２０の間、３〜１５の間、３〜１０の間、または３〜５の間である。一部の実施形態では、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０を超えるが、５０以下である。一部の実施形態では、ｘは、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ｘは、０である。
【００６３】
本明細書で記載される通り、ｙは、０または１である。一部の実施形態では、ｙは、０である（例えば、Ｘ５Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあるヌクレオチド配列である）。一部の実施形態では、ｙは、１である。
【００６４】
本明細書で記載される通り、ｚは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｚは、０である（例えば、５’−ＴＩＣ−３’または５’−ＴＴＣは、ポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチド配列である）。一部の実施形態では、ｚは、１である。一部の実施形態では、ｚは、２である。
【００６５】
ＴＬＲ７阻害性モチーフおよびＴＬＲ８阻害性モチーフは有するが、ＴＬＲ９阻害性モチーフは有さない、例示的なＴＬＲ７／８組合せ阻害剤は、以下の配列：
5’-ugcTGCTCCTTGAGA-’  (配列番号10);  
5’-ugCTGCTCCTTGAGI-’  (配列番号15);
5’-uGCTGCTCCTTGAGI-’  (配列番号16);
5’-TGCTGCTCCTTGAGI-’  (配列番号17);
5’-ugcugcTCCTTGAGI-’  (配列番号18);
5’-ugcTGCTCCTTGAGIT-’  (配列番号20);
5’-ugcTGCTCCTTGA-’(配列番号24);
5’-ugcTICTCCTTIAII-’  (配列番号26);
5’-TGCTGCTGGTTGTGI-’  (配列番号30);
5’-ugcugcuccuugagI-’  (配列番号34);
5’-TGCTCCTTGAGI-’  (配列番号35);
5’-TICTGCTCCTTGAGI-’  (配列番号36);
5’-TTCTGCTCCTTGAGI-’  (配列番号38);
5’-TGCTICTCCTTIAII-’  (配列番号40);
5’-TICTICTCCTTIAII-’  (配列番号44);
5’-TICTCCTTGAGI-’  (配列番号48);
5’-TTCTCCTTGAGI-’  (配列番号50);
5’-TICTCCTTIAIA-’  (配列番号56);
5’-TICTCCTTAIIA-’  (配列番号59);
5’-TICAGITTIAII-’  (配列番号60);
5’-TICAGIAGIAII-’  (配列番号61);
5’-TICTICTIITTIAII-’  (配列番号62);
5’-TICTCCTTIAII-’  (配列番号63);
5’-TICTCCTTICII-’  (配列番号65);
5’-TICTCCTTITII-’  (配列番号67);
5’-TICTICTCCTIITTICII-’  (配列番号85);
5’-TICTICTCCAGITTICII-’  (配列番号86);
5’-TICTICTCCTCCTTICII-’  (配列番号87);
5’-TICTICTTGAGITTICII-’  (配列番号88);
5’-TICTICTCCTCCTTICIIAII-’  (配列番号90);
5’-TICTCCTCCTTICIIAII-’  (配列番号91);
5’-TGCTCCTCCTTICIIAII-’  (配列番号92);
5’-TGCTTGTCCTCCTTICII-’  (配列番号93);
5’-TGCTGCTCCTTICII-’  (配列番号94);
5’-TICTICTCCTTICII-’  (配列番号95);
5’-TTCTTCTCCTTICII-’  (配列番号97);
5’-TICTCCTCCTTICIIAIIA-’  (配列番号99);
5’-TGCTCCTGGAGGTTICII-’  (配列番号100);
5’-TGCTCCTGGAGGTTICIIAII-’  (配列番号101);
5’-TGCTCCTGGATTICIIAII-’  (配列番号102);
5’-TICTICTTGAGITTICIIAII-’  (配列番号103);
5’-TICTTGAGITTICIIAII-’  (配列番号104);
5’-TGCTICTTGAGITTICIIAII-’  (配列番号105);  
5’-TGCTTGAGITTICIIAII-’  (配列番号106);  
5’-TICTCCTTGAGIAII-’  (配列番号108);
5’-TICTCCTCCTTGAGIAII-’  (配列番号109);
5’-TICTTCTCCTTGAGIAII-’  (配列番号110);  および
5’-TICTCCTCCTTGIIAII-’  (配列番号111);
［配列中、Ｉ＝２’−デオキシイノシンであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表す］のうちの１つからなるポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０９を含む。
【００６６】
ＴＬＲ８／９組合せ阻害剤
本明細書ではまた、本明細書で記載される方法（例えば、ＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害または抑制する方法）のうちのいずれかにおける使用のための、ＴＬＲ８阻害性モチーフおよびＴＬＲ９阻害性モチーフを含むポリヌクレオチド（以下「ＴＲＬ８／９組合せ阻害剤」と称する）も提供される。
【００６７】
本明細書では、式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであるＴＬＲ８／９組合せ阻害剤が提供される。本明細書ではまた、ＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、式：５’−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。
【００６８】
本明細書で記載される通り、ａは、０〜２０の間の整数である。これは、ａが、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20であることを意味する。一部の実施形態では、ａは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９を超えるが、２０以下である。一部の実施形態では、ａは、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ａは、０である。
【００６９】
本明細書で記載される通り、ｘは、０〜５０の間の整数である。これは、ｘが、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50であることを意味する。一部の実施形態では、ｘは、３〜４５の間、３〜４０の間、３〜３５の間、３〜３０の間、３〜２５の間、３〜２０の間、３〜１５の間、３〜１０の間、または３〜５の間である。一部の実施形態では、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０を超えるが、５０以下である。一部の実施形態では、ｘは、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ｘは、０である。
【００７０】
一部の実施形態では、ｙは、０または１である。一部の実施形態では、ｙは、０である（例えば、Ｘ５Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあるヌクレオチド配列である）。一部の実施形態では、ｙは、１である。
【００７１】
ＴＬＲ８阻害性モチーフおよびＴＬＲ９阻害性モチーフは有するが、ＴＬＲ７阻害性モチーフは有さない、例示的なＴＬＲ８／９組合せ阻害剤は、以下の配列：
5’-TAC  TCC  TTG  GII-’  (配列番号81);および
5’-TCC  TGG  AGG  GGT  TIA  II-’  (配列番号112);
［配列中、Ｉ＝２’−デオキシイノシンであり、大文字は、ＤＮＡを表す］
のうちの１つからなるポリヌクレオチドである。
【００７２】
ＴＬＲ７／８／９組合せ阻害剤
本明細書では、本明細書で記載される方法（例えば、ＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害または抑制する方法）のうちのいずれかにおける使用のための、ＴＬＲ７阻害性モチーフ、ＴＬＲ８阻害性モチーフ、およびＴＬＲ９阻害性モチーフを含むポリヌクレオチド（以下「ＴＲＬ７／８／９組合せ阻害剤」と称する）が提供される。
【００７３】
本明細書では、式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドであるＴＬＲ７／８／９組合せ阻害剤が提供される。本明細書ではまた、ＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答の阻害における使用のためのポリヌクレオチドであって、式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表し、このポリヌクレオチドがＣＧジヌクレオチドを含まないポリヌクレオチドも提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、式：５’−ＱｚＴＧＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−Ｑｚｕｇｃ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、５’−ＱｚＴＩＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’、または５’−ＱｚＴＴＣ−Ｎｘ−Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓ４−Ｐａ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｍｙ−３’のヌクレオチド配列からなり、式中、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＭの各々は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、ａは、０〜２０の整数であり、ｘは、０〜５０の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、０、１または２であり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４の各々は、ＧまたはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＩであり、Ｘ６は、ＩまたはＡであり、大文字は、ＤＮＡを表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを表す。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。
【００７４】
本明細書で記載される通り、ａは、０〜２０の間の整数である。これは、ａが、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20であることを意味する。一部の実施形態では、ａは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９を超えるが、２０以下である。一部の実施形態では、ａは、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ａは、０である。
【００７５】
本明細書で記載される通り、ｘは、０〜５０の間の整数である。これは、ｘが、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50であることを意味する。一部の実施形態では、ｘは、３〜４５の間、３〜４０の間、３〜３５の間、３〜３０の間、３〜２５の間、３〜２０の間、３〜１５の間、３〜１０の間、または３〜５の間である。一部の実施形態では、ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０を超えるが、５０以下である。一部の実施形態では、ｘは、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２未満であるが、１以上である。一部の実施形態では、ｘは、０である。
【００７６】
一部の実施形態では、ｙは、０または１である。一部の実施形態では、ｙは、０である（例えば、Ｘ５Ｘ６は、ポリヌクレオチドの３’末端にあるヌクレオチド配列である）。一部の実施形態では、ｙは、１である。
【００７７】
一部の実施形態では、ｚは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｚは、０である（例えば、５’−ＴＧＣ−３’、５’−ｕｇｃ−３’、５’−ＴＩＣ−３’、または５’−ＴＴＣ−３’はポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチド配列である）。一部の実施形態では、ｚは、１である。一部の実施形態では、ｚは、２である。
【００７８】
ＴＬＲ７阻害性モチーフ、ＴＬＲ８阻害性モチーフ、およびＴＬＲ９阻害性モチーフを有する、例示的なＴＬＲ７／８／９組合せ阻害剤は、以下の配列：
5’-ugc  TGC  TCC  TTG  GGI-’  (配列番号14);  
5’-TIC  TCC  TTI  III-’  (配列番号64);
5’-TIC  TCC  TTI  GII-’  (配列番号66);
5’-TGC  TCC  TGG  AGG  GGT  TIA  II-’  (配列番号113);
5’-TIC  TCC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号114);  および
5’-TIC  TTC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号115);
［配列中、Ｉ＝２’−デオキシイノシンであり、大文字は、ＤＮＡを表す］
のうちの１つからなるポリヌクレオチドである。
【００７９】
ポリヌクレオチドの修飾
本開示は、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤（例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含む免疫阻害性ポリヌクレオチド）であって、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むＴＬＲ阻害剤もさらに提供する。少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、修飾塩基、修飾糖、および／または修飾リン酸でありうる。一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、自然発生の修飾でありうる。一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、合成修飾でありうる。一部の実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与することができる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、１または複数の修飾ヌクレオシドを含む。本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオシド「類似体」またはヌクレオチド「類似体」を包含する。「ヌクレオチド類似体」という用語は、それが誘導されたヌクレオチドの同一性を本質的に保持する化合物を指す。例えば、７−ｄＧは、Ｇ類似体であり、Ｎ４−エチル−ｄＣは、Ｃ類似体である。本明細書で用いられる「修飾ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオシド」はまた、ヌクレオチドまたは塩基の同一性を保持することが可能でない化合物も包含する。すなわち、修飾という用語は、ヌクレオチドまたは塩基の、異なる自然発生または非自然発生のヌクレオチドまたは塩基による置換も包含する。例えば、修飾という用語は、ＡによるＧの置換も包含する。
【００８０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの１または複数のヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾を含む（例えば、ヌクレオチドは、修飾を含む）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの１または複数のヌクレオチドは、修飾（例えば、配列Ｎｘは、修飾を含む）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、修飾された各ヌクレオチドについて同じ修飾である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが、修飾されており、修飾は、２’−Ｏ−メチル糖修飾である（すなわち、ヌクレオチドＮは、修飾からなり、修飾は、２’−Ｏ−メチル糖修飾である）。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、複数の異なる種類のヌクレオチドの修飾を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、修飾塩基を含む。塩基修飾の例は、電子吸引部分の、ポリヌクレオチドのシトシンのＣ−５および／またはＣ−６への付加を含むがこれらに限定されない。好ましくは、電子吸引部分は、ハロゲン、例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシンである。一部の実施形態では、塩基修飾は、電子吸引部分の、免疫阻害性ポリヌクレオチドのウラシルのＣ−５および／またはＣ−６への付加を含むがこれらに限定されない。好ましくは、電子吸引部分は、ハロゲンである。このような修飾ウラシルは、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルを含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、塩基修飾は、１または複数のチオール基の、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、および４−チオ−ウラシルを含むがこれらに限定されない塩基への付加を含む。一部の実施形態では、塩基修飾は、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、および５−ヒドロキシシトシンを含むがこれらに限定されない。例えば、Kandimallaら、（２００１年）、Bioorg.  Med.  Chem.、９巻：８０７〜８１３頁を参照されたい。一部の実施形態では、ＩＩＳは、２’−デオキシウリジンおよび／または２−アミノ−２’−デオキシアデノシンを含みうる。一部の実施形態では、修飾塩基は、メチル化修飾を含む。一部の実施形態では、メチル化修飾は、５’−メチル−シトシン修飾を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、複数の塩基修飾を含む。一部の実施形態では、塩基修飾は、同じである。一部の実施形態では、塩基修飾は、異なる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つの異なる塩基修飾のうちのいずれかを含む。塩基修飾はまた、修飾ＴＬＲ阻害剤を調製するときに、任意のリン酸修飾および／または糖修飾と共に施し、組み合わせることもできる。
【００８２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、修飾リン酸を含む。一部の実施形態では、修飾リン酸は、ホスホジエステル連結修飾である。例えば、リン酸修飾は、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホアミデート（phosphoamidates）、ホスホルアミデート（架橋形成型または非架橋形成型）、ホスホトリエステル、およびホスホロジチオエートを含みうるがこれらに限定されず、任意の組合せで使用することができる。一部の実施形態では、修飾リン酸は、３’末端のヌクレオチド間ホスホジエステル連結修飾である。例えば、３’末端のヌクレオチド間ホスホジエステル連結修飾は、アルキルホスホトリエステル連結修飾もしくはアリールホスホトリエステル連結修飾、ホスホン酸アルキル連結修飾もしくはホスホン酸アリール連結修飾、ホスホン酸水素連結修飾、ホスホルアミデート連結修飾、および／またはホスホロセレネート連結修飾を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、３’末端のヌクレオチド間ホスホジエステル連結修飾は、ホスホルアミデート修飾である。一部の実施形態では、修飾リン酸は、リン酸を、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｒ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［式中、各ＲまたはＲ’は独立に、Ｈであるか、または任意選択で、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルキル（araldyl）を含有する、置換アルキルもしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である］で置きかえる実施形態を含むがこれらに限定されない。
【００８３】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤のポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格だけを含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤のポリヌクレオチドは、１または複数のホスホロチオエート骨格を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格だけを含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ホスホジエステル連結とホスホロチオエート連結との組合せを含むがこれらに限定されない、リン酸骨格内のリン酸連結の組合せを含みうる。
【００８４】
ＴＬＲ阻害剤は、それらのうちのいくつかがポリヌクレオチドを安定化させうる、リン酸修飾ポリヌクレオチドを含有しうる。したがって、一部の実施形態は安定化させた免疫阻害性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、複数のリン酸修飾を含む。一部の実施形態では、リン酸修飾は、同じである。一部の実施形態では、リン酸修飾は、異なる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つの異なるリン酸修飾のうちのいずれかを含む。リン酸修飾はまた、修飾ＴＬＲ阻害剤を調製するときに、任意の塩基修飾および／または糖修飾と共に施し、組み合わせることもできる。
【００８５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの修飾は、修飾糖を含む。本開示で使用されるＴＬＲ阻害剤は、１または複数の修飾糖または糖類似体を含みうる。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、および糖「類似体」であるシクロペンチル基でありうる。糖は、ピラノシル形態の場合もあり、フラノシル形態の場合もある。ＴＬＲ阻害剤では、糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、または２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであることが好ましい。一部の実施形態では、糖は、αアノマー配置またはβアノマー配置で、それぞれの複素環塩基へと結合させることができる。一部の実施形態では、通常存在するヒドロキシル基を置きかえることにより、糖を修飾する。糖内に通常存在するヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基またはリン酸基であるがこれらに限定されない基で置きかえることができる。加えて、５’末端および３’末端のヒドロキシル基も、リン酸化するか、またはアミンまたは１〜２０個の炭素原子による有機キャッピング基部分で置換することができる。一部の実施形態では、修飾糖は、２’−アルコキシＲＮＡ類似体、２’−アミノＲＮＡ類似体、２’−フルオロＤＮＡ、および２’−アルコキシＲＮＡ／ＤＮＡキメラまたは２’−アミノＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含むがこれらに限定されない２’糖修飾である。一部の実施形態では、修飾糖は、２’−Ｏ−メチル糖修飾、２’−Ｏ−アリル糖修飾、または２’−アジド糖修飾を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、２’修飾糖は、２’−Ｏ−メチル糖修飾である。一部の実施形態では、２’修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾である。例えば、ＩＩＳ内の糖修飾は、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルチミジン、２’−Ｏ−メチルアデニン、２’−Ｏ−メチルグアニン、または２’−Ｏ−メチルシチジンを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、糖修飾ヌクレオチドは、１または複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。これらの糖または糖類似体、およびこのような糖または類似体を複素環塩基（核酸塩基）自体へと結合させたそれぞれの「ヌクレオシド」の調製は公知であり、このような調製が、任意の具体例にどの程度関与しうるのかを除き、本明細書で記載する必要はない。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、複数の糖修飾を含む。一部の実施形態では、糖修飾は、同じである。一部の実施形態では、糖修飾は、異なる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つの異なる糖修飾のうちのいずれかを含む。糖修飾はまた、修飾ＴＬＲ阻害剤を調製するときに、任意の塩基修飾および／またはリン酸修飾と共に施し、組み合わせることもできる。
【００８６】
本明細書で記載される修飾ポリヌクレオチドのうちのいずれも、ポリヌクレオチド配列内のいずれかの位置において、修飾を含みうる。一部の実施形態では、修飾が、ポリヌクレオチド配列の５’末端におけるヌクレオチドの修飾またはこの近傍におけるヌクレオチドの修飾である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。一部の実施形態では、修飾が、ポリヌクレオチド配列の３’末端におけるヌクレオチドの修飾またはこの近傍におけるヌクレオチドの修飾である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の３’末端において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の３’末端において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端におけるヌクレオチドまたはこの近傍におけるヌクレオチド、およびポリヌクレオチド配列の３’末端におけるヌクレオチドまたはこの近傍におけるヌクレオチドの両方を修飾する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端において、かつ、ポリヌクレオチド配列の３’末端において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端において、かつ、ポリヌクレオチド配列の３’末端において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのうちのいずれかを修飾する。
【００８７】
ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９を抑制するのに有効なポリヌクレオチドの他の例は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３０４９４、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１２２２０、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４０７８８において見出され、それらの配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、修飾ＴＬＲ阻害剤のウリジン（Ｕ）ヌクレオシドを、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドで置換することができる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の全てのウリジン（Ｕ）ヌクレオシドを、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドで置換することができる。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、修飾ＴＬＲ阻害剤のチミジン（Ｔ）ヌクレオシドを、ウリジン（Ｕ）ヌクレオシドで置換することができる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の全てのチミジン（Ｔ）ヌクレオシドを、ウリジン（Ｕ）ヌクレオシドで置換することができる。一部の実施形態では、修飾ＴＬＲ阻害剤は、ウリジン（Ｕ）ヌクレオシドおよびチミジン（Ｔ）ヌクレオシドの両方を含みうる。
【００８９】
本開示は、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤であって、免疫阻害活性を有し、本明細書で記載される方法における使用のための、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むＴＬＲ阻害剤をさらに提供する。本明細書で提供されるＴＬＲ阻害剤は、１または複数の核酸部分および１または複数の非核酸スペーサー部分を含有する。ＴＬＲ阻害剤としての使用には、下記の式Ｉ〜ＶＩＩで記載されるコア構造を含む、様々な構造式に従う化合物が想定される。式Ｉ〜ＩＩＩは、「直鎖状ＴＬＲ阻害剤」のコア配列を示す。式ＩＶ〜ＶＩは、「分枝状ＴＬＲ阻害剤」のコア配列を示す。式ＶＩＩは、「単一スペーサー型ＴＬＲ阻害剤」のコア構造を示す。
【００９０】
本明細書で提供される各式では、「Ｎ」は、核酸部分（５’〜３’の配向性または３’〜５’の配向性に配向させた）を表し、「Ｓｐ」は、非核酸スペーサー部分を表す。破線（「−」）は、核酸部分と、非核酸スペーサー部分との間の共有結合を表す。二連破線（「−−」）は、非核酸スペーサー部分と、少なくとも２つの核酸部分との間の共有結合を表す。三連破線（「−−−」）は、非核酸スペーサー部分と、複数の（すなわち、少なくとも３つの）核酸部分との間の共有結合を表す。添え字を使用して、位置の異なる核酸または非核酸スペーサー部分を表す。しかし、異なる核酸部分を識別するための添え字の使用は、部分が異なる構造または配列を必ず有することを指し示すように意図するものではない。同様に、異なるスペーサー部分を識別するための添え字の使用は、部分が異なる構造を必ず有することを指し示すように意図するものではない。例えば、前出の式ＩＩにおいて、Ｎ１およびＮ２と表された核酸部分は、同じ配列を有する場合もあり、異なる配列を有する場合もあり、Ｓ１およびＳ２と表されたスペーサー部分は、同じ構造を有する場合もあり、異なる構造を有する場合もある。さらに、さらなる化学的部分（例えば、リン酸、モノヌクレオチド、さらなる核酸部分、アルキル基、アミノ基、チオール基、またはジスルフィド基もしくは連結基、および／またはスペーサー部分）を、コア構造の末端において共有結合的に結合させうることも想定される。
【００９１】
直鎖状ＴＬＲ阻害剤は、コア構造内の非核酸スペーサー部分を、２つ以下の核酸部分に共有結合的に結合させた構造を有する。
【００９２】
例示的な直鎖状ＴＬＲ阻害剤は、以下の式：
【数１】
0006395266.tif 000002
［式中、Ａは、１〜約１００の間の整数であり、［Ｎｖ−Ｓｐｖ］は、非核酸スペーサー部分へとコンジュゲートさせた核酸部分のさらなるＡ回の反復を指し示す。添え字「ｖ」は、ＮおよびＳｐが、「［Ｎｖ−Ｓｐｖ］」の各回の反復において独立に選択されることを指し示す。「Ａ」は、場合によって１〜約１０の間、場合によって１〜３の間であり、場合によってちょうど１、２、３、４、または５である。一部の実施形態では、Ａは、１、２、３、４、または５の下限と、独立に選択された１０、２０、５０または１００（例えば、３〜１０の間）の上限とにより規定される範囲内の整数である］
に従う。
【００９３】
例示的な直鎖状ＴＬＲ阻害剤は、
【数２】
0006395266.tif 000003
を含み、式中、ＨＥＧは、ヘキサ（エチレングリコール）を指す。ＴＥＧとは、テトラ（エチレングリコール）を指す。Ｎ１およびＮ２；ならびにＳｐ１およびＳｐ２は、−［Ｎｖ−Ｓｐｖ］Ａを含有しない例において独立に選択される。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’−デオキシリボポリヌクレオチド配列である。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’デオキシリボポリヌクレオチドおよび／または２’−Ｏ−Ｍｅ糖ポリヌクレオチドによるキメラ配列である。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、修飾リン酸連結を含む、少なくとも１つのヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ホスホロチオエート連結だけを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの１または複数のヌクレオチドは、修飾を含む。一部の実施形態では、修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート骨格修飾を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結だけを含む。一部の好ましい実施形態では、修飾は、２’糖修飾を含む。これらの実施形態のサブセットでは、２’糖修飾は、２’−Ｏ−メチル糖修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を含む。分枝状ＴＬＲ阻害剤は、少なくとも３つの核酸部分に共有結合的に結合させた多価スペーサー部分（ｍＳｐ）を含む。
【００９４】
例示的な分枝状ＴＬＲ阻害剤は、以下の式：
【数３】
0006395266.tif 000004
［式中、ｍＳｐは、量「Ａ」の、独立に選択された核酸部分Ｎｖ、Ｓｐｖ−Ｎｖ（核酸部分に共有結合的に結合させたスペーサー部分を含む）に共有結合的に結合させた多価スペーサーである。末端における「［Ｓｐｖ−Ｎｖ］」または「［Ｎｖ−Ｓｐｖ］」の反復は、Ｎｖだけを含みうる。式ＩＶおよびＶでは、Ａは、少なくとも３である］により記載される。式ＩＶおよびＶについての多様な実施形態では、Ａは、３〜１００の間の整数（両端を含む）であるが、Ａは、約３、５、１０、５０、または１００の下限と、独立に選択された約５、７、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または５００の上限とにより規定される範囲内の整数の場合もあり、代替的に、Ａは、５００を超える場合もある。式ＶＩでは、Ａは、少なくとも２であり、２、５、１０、５０、または１００の下限と、独立に選択された５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、もしくは５００、または５００を超える上限とにより規定される範囲内の整数である。
【００９５】
例示的な分枝状ＴＬＲ阻害剤は、
【数４】
0006395266.tif 000005
を含み、式中、ＨＥＧは、ヘキサ（エチレングリコール）を指す。ＴＥＧは、テトラ（エチレングリコール）を指す。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’−デオキシリボポリヌクレオチド配列である。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’デオキシリボポリヌクレオチドおよび／または２’−Ｏ−Ｍｅ糖ポリヌクレオチドによるキメラ配列である。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、修飾リン酸連結を含む、少なくとも１つのヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ホスホロチオエート連結だけを含む。好ましい分枝状ＴＬＲ阻害剤は、（５’−Ｎ１−３’−ＨＥＧ）２−グリセロール−ＨＥＧ−５’−Ｎ１−３’および（５’−Ｎ１−３’−ＨＥＧ）２−グリセロール−ＨＥＧ−５’−Ｎ１’を含む。
【００９６】
単一スペーサー型ＴＬＲ阻害剤は、単一の核酸部分を単一のスペーサー部分へと共有結合的にコンジュゲートさせた構造、すなわち、
Ｎ１−Ｓｐ１      （ＶＩＩ）
を含む。
【００９７】
好ましい変化形では、Ｓ１は、例えば、前出で記載したエステル連結（例えば、ホスホジエステル連結またはホスホロチオエートエステル連結）により接続されることが典型的な、小型の単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボース、Ｃ２アルキル〜Ｃ１２アルキルのサブユニットなど）を含む多量体の構造を有する。例えば、前出の式ＶＩＩａを参照されたい。多量体は、ヘテロマーの場合もあり、ホモマーの場合もある。１つの変化形では、スペーサーは、エステル連結（例えば、ホスホジエステル連結またはホスホロチオエートエステル連結）により連結される、単量体単位のヘテロマー（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボース、Ｃ２アルキル〜Ｃ１２アルキルのリンカーなど）である。例えば、前出の式ＶＩＩｂを参照されたい。
【００９８】
例示的な単一スペーサー型ＴＬＲ阻害剤は、
【数５】
0006395266.tif 000006
を含み、式中、ＨＥＧは、ヘキサ（エチレングリコール）を指す。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’−デオキシリボポリヌクレオチド配列である。ＴＬＲ阻害剤のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、２’デオキシリボポリヌクレオチドおよび／または２’−Ｏ−Ｍｅ糖ポリヌクレオチドによるキメラ配列である。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、修飾リン酸連結を含む、少なくとも１つのヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ホスホロチオエート連結だけを含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の末端構造を、共有結合的につなぎ合わせる（例えば、核酸部分−核酸部分、スペーサー部分−スペーサー部分、または核酸部分−スペーサー部分）結果として、環状コンフォメーションをもたらす。
【０１００】
本明細書で提供される免疫阻害性組成物における使用のためのＴＬＲ阻害剤は、少なくとも１つの核酸部分を含む。本明細書で使用される「核酸部分」という用語は、ヌクレオチド単量体（すなわち、モノヌクレオチド）、またはヌクレオチドポリマー（すなわち、少なくとも２つの連続ヌクレオチドを含む）を指す。本明細書で用いられるヌクレオチドは、（１）リン酸基へとエステル連結された糖へと連結されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基、または（２）塩基および／または糖および／またはリン酸エステルを、例えば、前出で記載した類似体で置きかえた類似体を含む。複数の核酸部分を含むＴＬＲ阻害剤では、核酸部分は、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【０１０１】
免疫阻害性組成物中に組み込まれるＴＬＲ阻害剤で使用される核酸部分は、本明細書で開示される阻害性モチーフのうちのいずれかを含むことが可能であり、加えて、６塩基対以下の配列でもありうる。複数の核酸部分を含むＴＬＲ阻害剤では、核酸部分は、同じ長さの場合もあり、異なる長さの場合もあることが想定される。ＴＬＲ阻害剤が複数の核酸部分を含む一部の実施形態では、阻害性モチーフを含む必要がある部分は１つだけである。複数の核酸部分を含むＴＬＲ阻害剤では、核酸部分は、同じ長さの場合もあり、異なる長さの場合もあることが想定される。したがって、多様な実施形態では、免疫阻害性組成物へと組み込まれるＴＬＲ阻害剤は、（ａ）配列が同じ核酸部分、（ｂ）複数回にわたる核酸部分の反復、または（ｃ）２つ以上の異なる核酸部分を含む。加えて、単一の核酸部分は、核酸部分内のさらなるヌクレオチド塩基と隣接する場合もあり、これらと重複する場合もあり、これらにより隔てられる場合もある複数の阻害性モチーフを含みうる。
【０１０２】
ＴＬＲ阻害剤は、１または複数の核酸部分に共有結合的に結合させた非核酸スペーサー部分を含む。本明細書では、場合によって便宜上、非核酸スペーサー部分を、単に「スペーサー」または「スペーサー部分」と称する。スペーサーの分子量は一般に、約５０〜約５０，０００であり、典型的には約７５〜約５０００であり、約７５〜約５００であることが最も多く、多様な実施形態では、１つ、２つ、３つ、または３を超える核酸部分に共有結合的に結合させる。様々な薬剤が、核酸部分を接続するのに適する。例えば、研究文献で「非核酸リンカー」、「非ヌクレオチドリンカー」、または「結合価プラットフォーム分子」と称される様々な化合物を、ＩＲＣ内のスペーサーとして使用することができる。ある特定の実施形態では、スペーサーは、複数の共有結合的に接続されるサブユニットを含み、ホモポリマー構造またはヘテロポリマー構造を有しうる。モノヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、非核酸スペーサーの定義内に含まれず、この除外がなければ、核酸部分と隣接する非核酸スペーサー部分との間には差異が認められないことが察知されるであろう。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、スペーサーは、１または複数の塩基脱落ヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド塩基を欠くが、糖部分およびリン酸部分を有する）を含みうる。例示的な塩基脱落ヌクレオチドは、１’２’−ジデオキシリボース、１’−デオキシリボース、１’−デオキシアラビノース、およびこれらのポリマーを含む。
【０１０４】
他の適切なスペーサーは、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたポリグリコール、任意選択で置換されたポリアミン、任意選択で置換されたポリアルコール、任意選択で置換されたポリアミド、任意選択で置換されたポリエーテル、任意選択で置換されたポリイミン、任意選択で置換されたポリホスホジエステル（ポリ（１−ホスホ−３−プロパノールなど）などを含む。任意選択の置換基は、アルコール、アルコキシ（メトキシ、エトキシ、およびプロポキシなど）、直鎖状アルキルまたは分枝鎖状アルキル（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルなど）、アミン、アミノアルキル（アミノＣ１〜Ｃ１２アルキルなど）、ホスホルアミダイト、リン酸、チオリン酸、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン、（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩなど）、アミド、アルキルアミド（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミドなど）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、イミド酸エステル、イソシアン酸、イソチオシアン酸、ハロギ酸、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、ＮＲ１Ｒ２を含み、式中、Ｒ１Ｒ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（マンノース、ガラクトース、およびグルコースなど）、α，β−不飽和カルボニル、水銀剤アルキル、α，β−不飽和スルホンである。
【０１０５】
適切なスペーサーは、フェニル環またはシクロヘキシル環を含有する多環分子などの多環分子を含みうる。スペーサーは、ポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのポリエーテル、置換される場合もあり、修飾される場合もあり、ポリエーテルと多環分子との組合せの場合もある、二官能性ペンタレン、二官能性インデン、二官能性ナフタレン、二官能性アズレン、二官能性ヘプタレン、二官能性ビフェニレン、二官能性アシムインダセン、二官能性シム−インダセン、二官能性アセナフチレン、二官能性フルオレン、二官能性フェナーレン、二官能性フェナントレン、二官能性アントラセン、二官能性フルオランテン、二官能性アセフェナントリレン（acephenathrylene）、二官能性アセアントリレン、二官能性トリフェニレン、二官能性ピレン、二官能性クリセン、二官能性ナフタセン、二官能性チアントレン、二官能性イソベンゾフラン、二官能性クロメン、二官能性キサンテン、二官能性フェノキサチインなどの二官能性多環分子でありうる。多環分子は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基、Ｃ６アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシアルキル基、ハロゲン基、またはハロアルキル基で置換または多置換することができる。窒素含有多複素環分子（例えば、インドリジン）は、適切なスペーサーではないことが典型的である。スペーサーはまた、グリセロールまたはペンタエリトリトールなどのポリアルコールでもありうる。１つの変化形では、スペーサーは、１−（ホスホプロパン）３−リン酸または１−（ホスホプロパン）４−リン酸（また、テトラホスホプロパンジオールおよびペンタホスホプロパンジオールとも呼ばれる）を含む。１つの変化形では、スペーサーは、誘導体化された２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤＡ）を含む。
【０１０６】
ＴＬＲ阻害剤において有用な非核酸スペーサーの具体例は、Cloadら（１９９１年）、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１３巻：６３２４頁;  Richardsonら（１９９１年）、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１３巻：５１０９頁;  Maら（１９９３年）、Nucleic  Acids  Res.、２１巻：２５８５頁;  Maら（１９９３年）、Biochemistry、３２巻：１７５１頁;  McCurdyら（１９９１年）、Nucleosides  &  Nucleotides、１０巻：２８７頁;  Jaschkeら（１９９３年）、Tetrahedron  Lett.、３４巻：３０１頁;  Onoら（１９９１年）、Biochemistry、３０巻：９９１４頁；および国際公開第ＷＯ８９／０２４３９号により記載されている「リンカー」を含む。
【０１０７】
他の適切なスペーサーは、Salunkheら（１９９２年）、J.  Am.  Chem.  Soc.、１１４巻：８７６８頁;  Nelsonら（１９９６年）、Biochemistry、３５巻：５３３９〜５３４４頁;  Bartleyら（１９９７年）、Biochemistry、３６巻：１４５０２〜５１１頁;  Dagneauxら（１９９６年）、Nucleic  Acids  Res.、２４巻：４５０６〜１２頁;  Durandら（１９９０年）、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：６３５３〜５９頁;  Reynoldsら（１９９６年）、Nucleic  Acids  Res.、２４巻：７６０〜６５頁;  Hendryら（１９９４年）、Biochem.  Biophys.  Acta、１２１９巻：４０５〜１２頁;  Altmannら（１９９５年）、Nucleic  Acids  Res.、２３巻：４８２７〜３５頁により記載されているリンカーを含む。さらに他の適切なスペーサーについては、欧州特許第ＥＰ０３１３２１９Ｂ１号および米国特許第６，１１７，６５７号において記載されている。
【０１０８】
例示的な非核酸スペーサーは、オリゴエチレングリコール（例えば、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールスペーサー、および最大で約１０、約２０、約４０、約５０、約１００、または約２００エチレングリコール単位を含む他のポリマー）、アルキルスペーサー（例えば、プロピルスペーサー、ブチルスペーサー、ヘキシルスペーサー、および、例えば、通常、Ｃ２〜Ｃ１０アルキルであり、Ｃ２〜Ｃ６アルキルであることが最も多い、他のＣ２〜Ｃ１２アルキルスペーサー）、塩基脱落ヌクレオチドスペーサー、グリセロール、ペンタエリトリトール、または１，３，５−トリヒドロキシシクロヘキサン（例えば、本明細書で記載される、対称性二重スペーサー部分および対称性三重スペーサー部分）に由来する、対称性または非対称性スペーサーを含む。スペーサーはまた、前述の化合物のヘテロマー性オリゴマーまたはホモマー性オリゴマーおよびポリマー（例えば、アミド連結、エステル連結、エーテル連結、チオエーテル連結、ジスルフィド連結、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、ホスホルアミデート連結、ホスホトリエステル連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホン酸メチル連結、または他の連結により連結される）も含みうる。
【０１０９】
適切なスペーサー部分は、ＴＬＲ阻害剤に、電荷および／または疎水性をもたらすことが可能であり、ＴＬＲ阻害剤に、好適な薬物動態特性（例えば、安定性の改善、血液中の滞留時間の延長）をもたらすことが可能であり、かつ／またはＴＬＲ阻害剤の、特定の細胞または臓器へのターゲティングを結果としてもたらすことが可能である。スペーサー部分は、所望の薬物動態特性または所望の投与方式（例えば、経口投与）に対する適性に合わせてＴＬＲ阻害剤を調整するように選択または修飾することができる。簡便さのために、読者は、ＴＬＲ阻害剤が実際には、化合物と、隣接する核酸部分または他のスペーサー部分の構成成分とのコンジュゲートを含むことを理解しつつも、スペーサー（またはスペーサー構成成分）が場合によって、スペーサー構成成分が由来する化合物の化学名（例えば、ヘキサエチレングリコール）により言及されることを理解されたい。
【０１１０】
複数のスペーサー部分を含むＴＬＲ阻害剤では、スペーサーは、同じ場合もあり、異なる場合もある。したがって、１つの変化形では、ＴＬＲ阻害剤内の非核酸スペーサー部分の全てが、同じ構造を有する。１つの変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ以上の異なる構造を伴う非核酸スペーサー部分を含む。
【０１１１】
一部の想定される実施形態では、ＴＬＲ阻害剤のスペーサー部分は、ある特定の構造を除外するように規定される。したがって、一部の実施形態では、スペーサーは、塩基脱落ヌクレオチドまたは塩基脱落ヌクレオチドのポリマー以外である。一部の実施形態では、スペーサーは、オリゴ（エチレングリコール）（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧなど）またはポリ（エチレングリコール）以外である。一部の実施形態では、スペーサーは、Ｃ３アルキルスペーサー以外である。一部の実施形態では、スペーサーは、ポリペプチド以外である。したがって、一部の実施形態では、免疫原性分子、例えば、タンパク質またはポリペプチドは、スペーサー部分の構成成分として適さない。しかし、前出で論じた通り、ある特定の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、「タンパク質性ＴＬＲ阻害剤」（すなわち、ポリペプチドを含むスペーサー部分を含む）であることが想定される。しかし、一部の実施形態では、スペーサー部分は、タンパク質性ではなく、かつ／または抗原ではない（すなわち、スペーサー部分は、ＴＬＲ阻害剤から単離されるならば、抗原ではない）。
【０１１２】
一般に、適切なスペーサー部分は、それらが構成成分であるＴＬＲ阻害剤を、水溶液中で不溶性としない（例えば、ＰＢＳ；ｐＨ７．０）。したがって、スペーサーの定義は、マイクロ担体またはナノ担体を除外する。加えて、ドデシルスペーサーなど、可溶性が低いスペーサー部分（ジアルコール前駆体である１，１２−ジヒドロキシドデカンとして測定される場合の可溶性＜５ｍｇ／ｍｌ）は、ＩＲＣの親水性および活性を低減しうるため、好ましくない。ジアルコール前駆体として測定される場合の、スペーサー部分の可溶性は、５ｍｇ／ｍｌを大きく超える（例えば、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌ、または≧１００ｍｇ／ｍｌ）ことが好ましい。
【０１１３】
ＴＬＲ阻害剤の電荷は、核酸部分内のリン酸、チオリン酸、または他の基のほか、非核酸スペーサー部分内の基によってももたらすことができる。一部の実施形態では、非核酸スペーサー部分は、正味の電荷（例えば、ｐＨ７で測定する場合の正味の正電荷または正味の負電荷）を保有する。１つの有用な変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、正味の負電荷を有する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるスペーサーサブユニットを、その電荷を増大させるように誘導体化させることにより、ＴＬＲ阻害剤内のスペーサー部分の負電荷を増大させる。例えば、グリセロールを、２つの核酸部分に共有結合的に結合させ、残りのアルコールを、活性化させたホスホルアミダイトと反応させた後、酸化または硫黄化を施して、それぞれ、リン酸またはチオリン酸を形成することができる。ある特定の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤内の非核酸スペーサー部分によりもたらされる負電荷（すなわち、複数のスペーサーが存在する場合の電荷の合計）は、ＴＬＲ阻害剤の核酸部分によりもたらされる負電荷を超える。電荷は、分子式に基づき計算することもでき、実験により、例えば、キャピラリー電気泳動（Li編、１９９２年、「Capillary  electrophoresis、Principles、Practice  and  Application」、Elsevier  Science  Publishers、Amsterdam、The  Netherlands、２０２〜２０６頁）により決定することもできる。
【０１１４】
前出で触れた通り、適切なスペーサーは、本明細書で記載される化合物であって、それ自体スペーサーとして有用であり、非ヌクレオチド「リンカー」と一般に称される化合物を含む化合物など、小型の非核酸（例えば、非ヌクレオチド）化合物のポリマーでありうる。このようなポリマー（すなわち、「マルチユニットスペーサー」）は、ヘテロマーの場合もあり、ホモマーの場合もあり、エステル連結（例えば、ホスホジエステル連結またはホスホロチオエートエステル連結）により連結される単量体単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボースなど）を含むことが多い。したがって、１つの変化形では、スペーサーは、非ヌクレオチド単位（例えば、２〜約１００単位、代替的に、２〜約５０単位、例えば、２〜約５単位、代替的に、例えば、約５〜約５０単位、例えば、約５〜約２０単位）のポリマー（例えば、ヘテロポリマー）構造を含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、スペーサー部分は、多価の非核酸スペーサー部分（すなわち、「多価スペーサー」）である。この文脈で使用されるＴＬＲ阻害剤は、３つ以上の核酸部分に共有結合的に結合させたスペーサーを含有する多価スペーサーを含有する。当技術分野では場合によって、多価スペーサーを「プラットフォーム分子」と称する。多価スペーサーは、ポリマーの場合もあり、非ポリマーの場合もある。適切な分子の例は、グリセロールまたは置換グリセロール（例えば、２−ヒドロキシメチルグリセロール、レブリノイル（levulinyl）−グリセロール）；テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、１，３，５−トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリトリトールおよびペンタエリトリトールの誘導体、テトラアミノペンタエリトリトール、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（サイクレン）、ポリエチレンイミン、１，３−ジアミノ−２−プロパノールおよび置換誘導体、プロピルオキシメチル］エチル化合物（例えば、「三重」）、いわゆる「Ｓｔａｒ  ＰＥＧ」および「ｂＰＥＧ」（例えば、Gnanouら（１９８８年）、Makromol.  Chem.、１８９巻：２８８５頁；  Reinら（１９９３年）、Acta  Polymer、４４巻：２２５頁；米国特許第５，１７１，２６４号を参照されたい）などのポリエチレングリコール誘導体、ならびにデンドリマーを含む。
【０１１６】
デンドリマーは、当技術分野で公知であり、一般に、多官能性単量体の段階的反応または反復的反応により、分枝状構造を得るように調製される、化学的に規定された球状分子である（例えば、Tomaliaら（１９９０年）、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.、２９巻：１３８〜７５頁を参照されたい）。様々なデンドリマー、例えば、アミン終端ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンイミンデンドリマー、およびポリプロピレンイミンデンドリマーが公知である。例示的な有用なデンドリマーは、米国特許第４，５８７，３２９号；同第５，３３８，５３２号；および同第６，１７７，４１４号において記載されている、いわゆる「ポリ（アミドアミン）（「ＰＡＭＡＭ」）デンドリマー」を含むデンドリマーなどの「デンススター」ポリマーまたは「スターバースト」ポリマーを含む。使用に適する、さらに他の多量体スペーサー分子は、米国特許第５，５５２，３９１号；ならびにＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／７５１０５号、同第ＷＯ９６／４０１９７号、同第ＷＯ９７／４６２５１号、同第ＷＯ９５／０７０７３号、および同第ＷＯ００／３４２３１号において開示されている多量体スペーサー分子など、化学的に規定された、非ポリマーの結合価プラットフォーム分子を含む。他の多くの適切な多価スペーサーも使用することができ、当業者にも公知であろう。
【０１１７】
核酸部分のプラットフォーム分子へのコンジュゲーションは、核酸部分およびプラットフォーム分子上の１または複数の架橋形成剤および官能基を伴うことが典型的ないくつもの様式で実施することができる。連結基は、標準的な合成化学法を使用して、プラットフォームへと付加する。連結基は、標準的な合成法を使用して、核酸部分へと付加することができる。
【０１１８】
様々な結合価を伴う多価スペーサーは、有用であり、多様な実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の多価スペーサーを、約３〜約４００、しばしば３〜１００、場合によって３〜５０、多くは３〜１０の間の核酸部分に結合させ、場合によって、４００を超える核酸部分に結合させる。多様な実施形態では、多価スペーサーを、１０を超える、２５を超える、５０を超える、または５００を超える核酸部分（同じ場合もあり、異なる場合もある）へとコンジュゲートさせる。ＴＬＲ阻害剤が多価スペーサーを含むある特定の実施形態では、本明細書において、分子構造がわずかに異なるＴＬＲ阻害剤の集団が提供されることを理解されたい。例えば、ＴＬＲ阻害剤を、結合価の大きな多価スペーサーとしてのデンドリマーを使用して調製する場合は、分子のある程度異質な混合物、すなわち、各デンドリマー分子へとつなぎ合わされた、異なる数（決定可能な範囲内の数または主に決定可能な範囲内の数）の核酸部分を含む混合物が作製される。
【０１１９】
核酸部分への連結を可能とするように誘導体化された多糖は、ＴＬＲ阻害剤内のスペーサーとして使用することができる。適切な多糖は、自然発生の多糖（例えば、デキストラン）および合成多糖（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標））を含む。例えば、アミノエチルカルボキシメチル−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標））は、Inman（１９７５年）、J.  Imm.、１１４巻：７０４〜７０９頁の方法により調製することができる。次いで、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、６−マレイミドカプロン酸アシルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性架橋形成試薬と反応させ、次いで、チオールで誘導体化した核酸部分へとコンジュゲートさせることができる（Leeら（１９８０年）、Mol.  Imm.、１７巻：７４９〜５６頁を参照されたい）。他の多糖も、同様に修飾することができる。
【０１２０】
日常的な方法を使用してＴＬＲ阻害剤を調製することは、本明細書および当技術分野における知見により導かれた当業者の能力の範囲内に十分に収まるであろう。核酸部分（例えば、オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド）を作り出すための技法は公知である。核酸部分は、酵素的方法および化学的方法ならびに酵素的手法と化学的手法との組合せを含むがこれらに限定されない技法を使用して合成することができる。例えば、ホスホジエステル連結を含有するＤＮＡまたはＲＮＡは、適切なヌクレオシドホスホルアミダイトを、３’末端において固体支持体へと結合させた、成長しつつあるオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基へと逐次的にカップリングした後で、中間体である亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルへと酸化させることにより、化学的に合成することができる。ＤＮＡ合成に有用な固体支持体は、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ポリスチレンビーズマトリックス（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＴｅｎｔＧｅｌ（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。所望のオリゴヌクレオチド配列を合成したら、オリゴヌクレオチドを支持体から除去し、リン酸トリエステル基を、リン酸ジエステルへと脱保護し、ヌクレオシド塩基を、含水アンモニアまたは他の塩基を使用して脱保護する。
【０１２１】
例えば、ホスホジエステル連結を含有するＤＮＡポリヌクレオチドもしくはＲＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド体ポリヌクレオチド（核酸部分）は一般に、以下のステップ：ａ）３’−固体支持体に結合させたヌクレオシドまたは核酸の５’−ヒドロキシル基からの保護基の除去、ｂ）活性化させたヌクレオシドホスホルアミダイトの、５’−ヒドロキシル基へのカップリング、ｃ）亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化、およびｄ）未反応５’−ヒドロキシル基のキャッピングの繰り返しの反復により合成する。ホスホロチオエート連結を含有するＤＮＡまたはＲＮＡは、酸化ステップを硫黄化ステップで置きかえることを除き、上記で記載した通りに調製する。所望のオリゴヌクレオチド配列を合成したら、オリゴヌクレオチドを支持体から除去し、リン酸トリエステル基を、リン酸ジエステルへと脱保護し、ヌクレオシド塩基を、含水アンモニアまたは他の塩基を使用して脱保護する。例えば、Beaucage（１９９３年）、「Oligodeoxyribonucleotide  Synthesis」、「PROTOCOLS  FOR  OLIGONUCLEOTIDES  AND  ANALOGS、SYNTHESIS  AND  PROPERTIES」（Agrawal編）、Humana  Press、Totowa、NJ；  Warnerら（１９８４年）、DNA、３巻：４０１頁;  Tangら（２０００年）、Org.  Process  Res.  Dev.、４巻：１９４〜１９８頁;  Wyrzykiewicaら（１９９４年）、Bioorg.  &  Med.  Chem.  Lett.、４巻：１５１９〜１５２２頁;  Radhakrishnaら（１９８９年）、J.  Org.  Chem.、５５巻：４６９３〜４６９９頁；および米国特許第４，４５８，０６６号を参照されたい。指定された配列の核酸部分を自動的に合成するプログラム可能な機器が広く利用可能である。例は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９自動式ＤＮＡ合成器（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｒａｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）；ＡＢＩ  ３９４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；およびＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含む。
【０１２２】
ポリヌクレオチドは、例えば、酸不安定性５’−保護基および３’−ホスホルアミダイトを含有する塩基保護ヌクレオシド（単量体）を使用して、３’〜５’方向にアセンブルすることができる。このような単量体の例は、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）保護ヌクレオシド−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）２−シアノエチルホスホルアミダイトを含み、保護ヌクレオシドの例は、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−ベンゾイルシチジン、Ｎ２−イソブチリル（isobutryryl）グアノシン、Ｎ２−イソブチリルチミジン、およびＮ２−イソブチリルウリジンを含むがこれらに限定されない。この場合、使用される固体支持体は、３’−連結された保護ヌクレオシドを含有する。代替的に、ポリヌクレオチドは、酸不安定性３’−保護基および５’−ホスホルアミダイトを含有する塩基保護ヌクレオシドを使用して、５’〜３’方向にアセンブルすることができる。このような単量体の例は、３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）保護ヌクレオシド−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）２−シアノエチルホスホルアミダイトを含み、保護ヌクレオシドの例は、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−ベンゾイルシチジン、Ｎ２−イソブチリル（isobutryryl）グアノシン、Ｎ２−イソブチリルチミジン、およびＮ２−イソブチリルウリジン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を含むがこれらに限定されない。この場合、使用される固体支持体は、５’−連結された保護ヌクレオシドを含有する。環状核酸構成成分は、組換え法を介して単離、合成することもでき、化学合成することもできる。化学合成は、文献において記載されている任意の方法を使用して実施することができる。例えば、Gaoら（１９９５年）、Nucleic  Acids  Res.、２３巻：２０２５〜２０２９頁；およびWangら（１９９４年）、Nucleic  Acids  Res.、２２巻：２３２６〜２３３３頁を参照されたい。
【０１２３】
非核酸スペーサー部分の付加は、日常的な方法を使用して達成することができる。当技術分野では、特定のスペーサー部分を付加するための方法が公知であり、例えば、前出で引用された参考文献において記載されている。例えば、Durandら（１９９０年）、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：６３５３〜６３５９頁を参照されたい。スペーサー部分と核酸部分との間の共有結合的連結は、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、アミド連結、エステル連結、エーテル連結、チオエーテル連結、ジスルフィド連結、ホスホルアミデート連結、ホスホトリエステル連結、ホスホロジチオエート連結、ホスホン酸メチル連結、および他の連結を含む、いくつかの種類のうちのいずれかでありうる。核酸部分を合成するために使用される同じホスホルアミダイト型化学を使用して、スペーサー部分（複数可）と核酸部分（複数可）とを組み合わせると簡便であることが多いであろう。例えば、本明細書で記載されるＩＲＣは、ホスホルアミダイト化学反応（例えば、Beaucage、１９９３年、前出；「Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry」、前出を参照されたい）を使用する自動式ＤＮＡ合成器（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９；Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｒａｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を使用して合成とすると簡便でありうる。しかし、当業者は、所望の場合、自動式ＤＮＡ合成器により実行される同じ（または同等な）合成ステップはまた、手作業で実行することもできると理解するであろう。このような合成では、スペーサー（または多量体スペーサーのためのスペーサーサブユニット）の一方の末端を、４，４’−ジメトキシトリチル基で保護する一方で、他の末端は、ホスホルアミダイト基を含有することが典型的である。
【０１２４】
必須の保護基および反応基を伴う様々なスペーサー、例えば、
【数６−１】
0006395266.tif 000007
【数６−２】
0006395266.tif 000008
が市販されている。
【０１２５】
これらの保護スペーサー部分前駆体および多種多様な他の保護スペーサー部分前駆体（例えば、ＤＭＴおよびホスホルアミダイト基による保護基を含む）は、購入することもでき、本明細書で開示されるＩＲＣの調製における使用のための日常的な方法を使用して合成することもできる。装置は、製造業者の指示書に従い、ヌクレオチド単量体およびスペーサーを所望の順序で付加するようにプログラムする。
【０１２６】
ホスホルアミダイト化学反応の使用は、ある特定のＴＬＲ阻害剤を調製するのに簡便であるが、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤は、任意の特定の合成法または調製法により調製される化合物に限定されないことを理解されたい。
【０１２７】
１つの変化形では、多価スペーサーを複数種類の核酸部分へとコンジュゲートさせたＴＬＲ阻害剤を調製する。例えば、２つのマレイミド基（チオール含有ポリヌクレオチドと反応しうる）および２つの活性化エステル基（アミノ含有核酸と反応しうる）を含有するプラットフォームが記載されている（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９５／０７０７３号を参照されたい）。これらの２つの活性化基は、互いと独立に反応させることができる。これは、各配列２つずつで合計４つの核酸部分を含有するＴＬＲ阻害剤を結果としてもたらすであろう。
【０１２８】
また、上記で記載した対称性の分枝状スペーサーおよび従来のホスホルアミダイト化学反応を使用して（例えば、手作業による方法または自動式の方法を使用して）、多価スペーサーを伴い、２つの異なる核酸配列を含有するＴＬＲ阻害剤も調製することもできる。対称性の分枝状スペーサーは、ホスホルアミダイト基と、同じであり、同時に除去される２つの保護基とを含有する。１つの手法では、例えば、第１の核酸を合成し、対称性の分枝状スペーサーへとカップリングし、保護基をスペーサーから除去する。次いで、２つのさらなる核酸（同じ配列の）を、スペーサー上で合成する（各ステップで単一の核酸部分を合成するために使用される試薬の二倍量を使用する）。
【０１２９】
同様の方法を使用して、３つの異なる核酸部分（下記で核酸Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩと称する）を、多価プラットフォーム（例えば、非対称分枝状スペーサー）へと接続することができる。これは、自動式ＤＮＡ合成器を使用して実行するのが最も簡便である。１つの変化形では、非対称分枝状スペーサーは、ホスホルアミダイト基と、独立に除去しうる２つの直交保護基とを含有する。まず、核酸Ｉを合成し、次いで、非対称分枝状スペーサーを、核酸Ｉへとカップリングし、次いで、保護基の１つの選択的除去を行った後、核酸ＩＩを付加する。核酸ＩＩを脱保護し、キャッピングし、次いで、スペーサー上の他の保護基を除去する。最後に、核酸ＩＩＩを合成する。
【０１３０】
一部の実施形態では、核酸部分（複数可）を合成し、標準的な合成化学法を使用して、反応性連結基（例えば、アミノ基、カルボキシレート基、チオール基、ジスルフィド基など）を付加する。反応性連結基（結果として得られるスペーサー部分の一部を形成すると考えられる）を、さらなる非核酸化合物へとコンジュゲートさせて、スペーサー部分を形成する。連結基は、文献において記載されているかまたは市販されている様々な試薬を援用する、核酸合成のための標準的な方法を使用して、核酸へと付加する。例は、保護されたアミノ基、カルボキシレート基、チオール基、またはジスルフィド基およびホスホルアミダイト基を含有する試薬を含む。これらの化合物を、活性化ホスホルアミダイト基を介して核酸へと組み込み、脱保護すると、これらにより、核酸には、アミノ反応性、カルボキシレート反応性、またはチオール反応性がもたらされる。
【０１３１】
長さが可変的な親水性リンカーは、例えば、核酸部分とプラットフォーム分子とを連結するのに有用である。様々な適切なリンカーが公知である。適切なリンカーは、限定なしに述べると、エチレングリコールの直鎖状オリゴマーまたは直鎖状ポリマーを含む。このようなリンカーは、式：Ｒ１Ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｍＣＯ２Ｒ２によるリンカーを含み、式中、ｎ＝０〜２００であり、ｍ＝１または２であり、Ｒ１＝Ｈまたはトリチルなどの保護基であり、Ｒ２＝Ｈまたはアルキルまたはアリール、例えば、４−ニトロフェニルエステルである。これらのリンカーは、チオエーテルなどを介してハロアセチル（haloaceyl）、マレイミド（maleiamide）などのチオール反応性基を含有する分子を、アミド結合を介してアミノ基を含有する第２の分子へと接続するのに有用である。結合の順序は、変化させることができる、すなわち、チオエーテル結合は、アミド結合を形成する前に形成することもでき、アミド結合を形成した後で形成することもできる。他の有用なリンカーは、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．品番２２３２２；スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−［イプシロン−マレイミドカプロイロキシルスルホスクシンイミドエステル）：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．品番２２３０７；スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．品番２２３２４（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、および一般式をマレイミド−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳエステルとする同様の化合物を含み、式中、Ｒ＝アルキル、周期的アルキル、エチレングリコールのポリマーなどである。
【０１３２】
核酸部分を多価スペーサーに共有結合的につなぎ合わせるのに特に有用な方法については、前出で引用された参考文献において記載されている。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、複数の核酸部分を共有結合的にコンジュゲートさせる多価スペーサー部分としてポリペプチドを使用して、直接またはリンカーを介して、「タンパク質性ＴＬＲ阻害剤」を形成する。ポリペプチドは、担体（例えば、アルブミン）でありうる。タンパク質性担体は、少なくとも１つであり、通常いくつかまたは多くの核酸部分であって、（ａ）２〜７ヌクレオチドの間の長さであり、４〜７ヌクレオチドの間の長さであることがより多く、代替的に、２〜６、２〜５、４〜６、もしくは４〜５ヌクレオチドの間の長さである核酸部分、および／または（ｂ）ＴＬＲ阻害性モチーフを含む長鎖のポリヌクレオチド（例えば、少なくとも８ヌクレオチドの長さの）と比較して単独の免疫調節活性が劣る核酸部分を含むことが典型的である。本開示をよく検討すれば、当業者には、タンパク質性ＴＬＲ阻害剤を作り出す方法が明らかであろう。核酸は、例えば、当技術分野で公知の方法により、核酸部分の３’末端または５’末端の間の連結（または核酸部分内の内部の位置において適切に修飾された塩基）、および適切な反応性基を伴うポリペプチド（例えば、シトシン残基のＮ４アミノ基と直接反応させうるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含む、ポリペプチドスペーサー部分へと共有結合的にコンジュゲートさせることができる。さらなる例として述べると、ポリペプチドは、核酸部分へと組み込まれたアミン基、チオール基、またはカルボキシル基を介して、核酸部分の遊離の５’末端へと結合させることができる。代替的に、ポリペプチドは、本明細書で記載されるスペーサー部分へとコンジュゲートさせることができる。さらに、連結基は、一方の末端において、保護されたアミン、チオール、またはカルボキシルを含み、ホスホルアミダイトは、ポリヌクレオチドのヒドロキシル基へと共有結合的に結合させることができ、脱保護に続いて、官能性を使用して、ＴＬＲ阻害剤を、ペプチドへと共有結合的に結合させることができる。
【０１３４】
ポリヌクレオチドの単離および合成
本明細書ではまた、本明細書で記載される、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドを作り出す方法も提供される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾ＴＬＲ阻害性モチーフ配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、非修飾ＴＬＲ阻害性モチーフ配列を含む。方法は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかでありうる。例えば、方法は、ＴＬＲ阻害剤の合成（例えば、固体状態合成を使用する）であることが可能であり、任意の精製ステップ（複数可）をさらに含みうる。当技術分野では、精製法が公知である。
【０１３５】
また、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含む免疫阻害性ポリヌクレオチド（ＴＬＲ阻害剤）を単離および合成するための方法も提供される。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、修飾ＴＬＲ阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、非修飾ＴＬＲ阻害剤である。
【０１３６】
当技術分野では、ポリヌクレオチドおよび修飾ポリヌクレオチドを作り出すための技法が公知である。ホスホジエステル連結を含有する、自然発生のＤＮＡまたはＲＮＡは一般に、適切なヌクレオシドホスホルアミダイトを、３’末端において固体支持体へと結合させた、成長しつつあるオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基へと逐次的にカップリングした後で、中間体である亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルへと酸化させることにより合成する。所望のポリヌクレオチド配列を合成したら、ポリヌクレオチドを、支持体から除去し、リン酸トリエステル基を、リン酸ジエステルへと脱保護し、ヌクレオシド塩基を、含水アンモニアまたは他の塩基を使用して脱保護する。例えば、Beaucage（１９９３年）、「Oligodeoxyribonucleotide  Synthesis」、「Protocols  for  Oligonucleotides  and  Analogs、Synthesis  and  Properties」（Agrawal編）、Humana  Press、Totowa、NJ;  Warnerら（１９８４年）、DNA、３巻：４０１頁；および米国特許第４，４５８，０６６号を参照されたい。
【０１３７】
当技術分野ではまた、修飾リン酸連結または非リン酸連結を含有するポリヌクレオチドの合成も公知である。総説については、Matteucci（１９９７年）、「Oligonucleotide  Analogs:  an  Overview」、「Oligonucleotides  as  Therapeutic  Agents」（D.J.  ChadwickおよびG.  Cardew編）、John  Wiley  and  Sons、New  York、NYを参照されたい。ポリヌクレオチド内の糖部分または糖類似体部分へと結合させうるリン誘導体（または修飾リン酸基）は、モノリン酸、ジリン酸、トリリン酸、アルキルホスホン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどでありうる。また、上記で言及したリン酸類似体の調製、およびそれらのヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドへの組込み自体も公知であり（Peyrottesら（１９９６年）、Nucleic  Acids  Res.、２４巻：１８４１〜１８４８頁;  Chaturvediら（１９９６年）、Nucleic  Acids  Res.、２４巻：２３１８〜２３２３頁；およびSchultzら（１９９６年）、Nucleic  Acids  Res.、２４巻：２９６６〜２９７３頁）、本明細書で詳細に記載する必要はない。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化ステップを硫黄化ステップで置きかえることを除き、自然発生のオリゴヌクレオチドについて上記で記載した合成と同様である（Zon（１９９３年）、「Oligonucleoside  Phosphorothioates」、「Protocols  for  Oligonucleotides  and  Analogs、Synthesis  and  Properties」（Agrawal編）、Humana  Press、１６５〜１９０頁）。同様に、ホスホトリエステル（Millerら（１９７１年）、JACS、９３巻：６６５７〜６６６５頁）、非架橋形成型ホスホルアミデート（Jagerら（１９８８年）、Biochem.、２７巻：７２４７〜７２４６頁）、Ｎ３’−Ｐ５’間ホスホルアミデート（Nelsonら（１９９７年）、JOC、６２巻：７２７８〜７２８７頁）およびホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号）など、他のリン酸類似体の合成もまた記載されている。他の非リンベースの修飾オリゴヌクレオチドもまた、使用することができる（Stirchakら（１９８９年）、Nucleic  Acids  Res.、１７巻：６１２９〜６１４１頁）。
【０１３８】
当技術分野では、多様な複素環塩基部分および多様な糖部分（および糖類似体）を含む多数の「合成」非天然ヌクレオシドが利用可能であり、本開示の他の基準を満たす限りにおいて、ＴＬＲ阻害剤は、自然発生の核酸の主要な５つの塩基構成成分以外の、１つまたはいくつかの複素環塩基も含みうることを当業者は認識するであろう。ＴＬＲ阻害剤内の複素環塩基は、ウラシル−５−イル基、シトシン−５−イル基、アデニン−７−イル基、アデニン−８−イル基、グアニン−７−イル基、グアニン−８−イル基、４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル基、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル基、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含むことが好ましいがこれらに限定されず、式中、プリンは、９位を介してＴＬＲ阻害剤の糖部分へと結合させ、１位を介してＴＬＲ阻害剤のピリミジンへと結合させ、７位を介してピロロピリミジンへと結合させ、１位を介してピラゾロピリミジンへと結合させる。
【０１３９】
塩基修飾ヌクレオシドの調製、および塩基修飾ヌクレオシドを前駆体として使用する修飾オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、米国特許第４，９１０，３００号、同第４，９４８，８８２号、および同第５，０９３，２３２号において記載されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、それらを、化学合成により、オリゴヌクレオチドの末端位置または内部位置へと組み込みうるようにデザインされている。このような塩基修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端位置または内部位置に存在し、ペプチドを結合させるための部位として用いることができる。また、それらの糖部分内のヌクレオシド修飾についても記載されており（例えば、米国特許第４，８４９，５１３号、同第５，０１５，７３３号、同第５，１１８，８００号、同第５，１１８，８０２号を含むがこれらに限定されない）、同様に使用することができる。
【０１４０】
ＴＬＲ阻害剤複合体
ＴＬＲ阻害剤は、個体へと直接投与することもでき、ＴＬＲ阻害剤の細胞への送達および／またはＴＬＲ阻害剤の細胞による取込みを増強する組成物または複合体により投与することもできる。組成物または複合体はまた、２つ以上の異なるＴＬＲ阻害剤の、細胞への共送達を増強するのにも使用することができる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の混合物は、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を送達するために複合体化することができる。
【０１４１】
このような送達組成物または送達複合体は、本明細書で記載される封入複合体およびコロイド分散系を含むがこれらに限定されず、当技術分野でも公知である。このような送達組成物の例は、水中油エマルジョン、ミセル、およびリポソームを含む。送達組成物または送達複合体はまた、本明細書で記載される、リンカー分子、プラットフォーム分子、ナノ粒子、またはマイクロ粒子へと連結されたＴＬＲ阻害剤も含む。このような連結は、共有結合的連結および非共有結合的連結の両方を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用を含む様々な様式で、ＴＬＲ阻害剤を、リンカー分子とコンジュゲートする。
【０１４３】
ポーションの間の連結は、ＴＬＲ阻害剤の３’末端または５’末端において施すこともでき、ＴＬＲ阻害剤内の内部位置の適切に修飾された塩基において施すこともできる。リンカーが、ペプチドであり、適切な反応性基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含有する場合は、これを、シトシン残基のＮ４アミノ基と直接反応させることができる。ＴＬＲ阻害剤内のシトシン残基の数および位置に応じて、１または複数の残基における特異的なカップリングを達成することができる。
【０１４４】
代替的に、当技術分野で公知の修飾オリゴヌクレオシドなどの修飾オリゴヌクレオシドを、ＴＬＲ阻害剤内の末端に組み込むこともでき、内部位置に組み込むこともできる。これらは、ブロック解除されると、対象のリンカー上に存在する場合もあり、対象のリンカーへと結合させる場合もある、様々な官能基と反応性となるブロックされた官能基を含有しうる。
【０１４５】
リンカーがペプチドである場合は、固体支持体化学反応を介して、コンジュゲートのこのポーションを、ＴＬＲ阻害剤の３’末端へと結合させることができる。例えば、ＴＬＲ阻害剤ポーションは、支持体上であらかじめ合成されたペプチドポーションへと付加することができる（Haralambidisら（１９９０年ａ）、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：４９３〜４９９頁；およびHaralambidisら（１９９０年ｂ）、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：５０１〜５０５頁）。代替的に、ＴＬＲ阻害剤は、３’末端から伸長する切断可能なリンカーを介して、固体支持体へと接続されるように合成することもできる。ＴＬＲ阻害剤が支持体から化学的に切断されると、末端のチオール基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に残される（Zuckermannら（１９８７年）、Nucleic  Acids  Res.、１５巻：５３０５〜５３２１頁；およびCoreyら（１９８７年）、Science、２３８巻：１４０１〜１４０３頁）か、または末端のアミノ基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に残される（Nelsonら（１９８９年）、Nucleic  Acids  Res.、１７巻：１７８１〜１７９４頁）。アミノ修飾されたＴＬＲ阻害剤の、ペプチドのアミノ基へのコンジュゲーションは、Benoitら（１９８７年）、Neuromethods、６巻：４３〜７２頁において記載されている通りに実施することができる。チオール修飾されたＴＬＲ阻害剤の、ペプチドのカルボキシル基へのコンジュゲーションは、Sinahら（１９９１年）、「Oligonucleotide  Analogues:  A  Practical  Approach」、IRL  Pressにおいて記載されている通りに実施することができる。付属のマレイミドを保有するオリゴヌクレオチドの、ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖へのカップリングもまた記載されている（Tungら（１９９１年）、Bioconjug.  Chem.、２巻：４６４〜４６５頁）。
【０１４６】
コンジュゲートのペプチドリンカーポーションは、その合成時においてオリゴヌクレオチドへと組み込まれたアミン基、チオール基、またはカルボキシル基を介して、ＴＬＲ阻害剤の５’末端へと結合させることができる。オリゴヌクレオチドが固体支持体へと固定されている間、連結基は、一方の末端において、保護されたアミン、チオール、またはカルボキシルを含み、他方の末端におけるホスホルアミダイトは、５’−ヒドロキシルへと共有結合的に結合させることが好ましい（Agrawalら（１９８６年）、Nucleic  Acids  Res.、１４巻：６２２７〜６２４５頁;  Connolly（１９８５年）、Nucleic  Acids  Res.、１３巻：４４８５〜４５０２頁;  Kremskyら（１９８７年）、Nucleic  Acids  Res.、１５巻：２８９１〜２９０９頁;  Connolly（１９８７年）、Nucleic  Acids  Res.、１５巻：３１３１〜３１３９頁;  Bischoffら（１９８７年）、Anal.  Biochem.、１６４巻：３３６〜３４４頁;  Blanksら（１９８８年）、Nucleic  Acids  Res.、１６巻：１０２８３〜１０２９９頁；および米国特許第４，８４９，５１３号、同第５，０１５，７３３号、同第５，１１８，８００号、および同第５，１１８，８０２号）。脱保護に続き、アミン官能基、チオール官能基、およびカルボキシル官能基を使用して、オリゴヌクレオチドをペプチドへと共有結合的に結合させることができる（Benoitら（１９８７年）；およびSinahら（１９９１年））。
【０１４７】
ＴＬＲ阻害剤コンジュゲートはまた、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、および／またはファンデルワールス引力などの非共有結合的相互作用を介して形成することもできる。
【０１４８】
非共有結合的に連結されたコンジュゲートは、ビオチン−ストレプトアビジン複合体などの非共有結合的相互作用を含みうる。ビオチニル基は、例えば、ＴＬＲ阻害剤の修飾塩基へと結合させることができる（Rogetら（１９８９年）、Nucleic  Acids  Res.、１７巻：７６４３〜７６５１頁）。ストレプトアビジン部分の、ペプチドポーションへの組込みは、ストレプトアビジンをコンジュゲートさせたペプチドと、ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドとを非共有結合的に結合させた複合体の形成を可能とする。
【０１４９】
非共有結合的会合はまた、オリゴヌクレオチドと相互作用しうる帯電残基を含むリンカーポーションの使用を介する、ＴＬＲ阻害剤を伴うイオン性相互作用を介しても生じうる。例えば、非共有結合的コンジュゲーションは一般に、負に帯電したＴＬＲ阻害剤と、ペプチドリンカーの正に帯電したアミノ酸残基、例えば、ポリリシン残基、ポリアルギニン残基、およびポリヒスチジン残基との間で生じうる。
【０１５０】
ＴＬＲ阻害剤の脂質への連結は、標準的な方法を使用して形成することができる。これらの方法は、オリゴヌクレオチド−リン脂質コンジュゲート（Yanagawaら（１９８８年）、Nucleic  Acids  Symp.  Ser.、１９巻：１８９〜１９２頁）、オリゴヌクレオチド−脂肪酸コンジュゲート（Grabarekら（１９９０年）、Anal.  Biochem.、１８５巻：１３１〜１３５頁；およびStarosら（１９８６年）、Anal.  Biochem.、１５６巻：２２０〜２２２頁）、およびオリゴヌクレオチド−ステロールコンジュゲート（Boujradら（１９９３年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：５７２８〜５７３１頁）の合成を含むがこれらに限定されない。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドのオリゴ糖への連結は、公知の標準的な方法を使用して形成することができる。これらの方法は、オリゴ糖が、免疫グロブリンの部分であるオリゴヌクレオチド−オリゴ糖コンジュゲートの合成（O’Shannessyら（１９８５年）、J.  Applied  Biochem.、７巻：３４７〜３５５頁）を含むがこれらに限定されない。
【０１５２】
環状ＴＬＲ阻害剤の、ペプチドリンカーへの連結は、いくつもの様式で形成することができる。組換え法または化学的方法を使用して環状ＴＬＲ阻害剤を合成する場合は、修飾ヌクレオシドが適する（Ruth（１９９１年）、「Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach」、IRL  Press）。次いで、標準的な連結技術を使用して、環状ＴＬＲ阻害剤をペプチドへと接続することができる（Goodchild（１９９０年）、Bioconjug.  Chem.、１巻：１６５頁）。組換え法または化学的方法を使用して環状ＴＬＲ阻害剤を単離または合成する場合は、ペプチドへと組み込まれた反応性基（例えば、カルベン、ラジカル）を化学的に活性化させるか、または光活性化させることことにより連結を形成することができる。
【０１５３】
ペプチドおよび他の分子を、オリゴヌクレオチドへと結合させるためのさらなる方法は、米国特許第５，３９１，７２３号；Kessler（１９９２年）、「Nonradioactive  labeling  methods  for  nucleic  acids」、Kricka（編）、「Nonisotopic  DNA  Probe  Techniques」、Academic  Press；およびGeogheganら（１９９２年）、Bioconjug.  Chem.、３巻：１３８〜１４６頁において見出すことができる。
【０１５４】
ＴＬＲ阻害剤は、他の様式で近接会合させることもできる。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、封入により近接会合させる。他の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、プラットフォーム分子へと連結することにより近接会合させる。「プラットフォーム分子」（また、「プラットフォーム」とも称する）とは、ＴＬＲ阻害剤の結合を可能とする部位を含有する分子である。他の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、表面、好ましくは担体粒子への吸着により近接会合させる。
【０１５５】
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、ＴＬＲ阻害剤と会合させた封入剤を援用する。組成物は、ＴＬＲ阻害剤を含み、封入剤は、アジュバント水中油エマルジョン、マイクロ粒子、および／またはリポソームの形態であることが好ましい。より好ましくは、ＴＬＲ阻害剤を封入するアジュバント水中油エマルジョン、マイクロ粒子、および／またはリポソームは、約０．０４μｍ〜約１００μｍのサイズ、好ましくは以下の範囲：約０．１μｍ〜約２０μｍ；約０．１５μｍ〜約１０μｍ；約０．０５μｍ〜約１．００μｍ；約０．０５μｍ〜約０．５μｍのうちのいずれかの粒子の形態である。
【０１５６】
マイクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプセルなどのコロイド分散系、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームなど、脂質ベースの系は、ＴＬＲ阻害剤含有組成物の有効な封入をもたらしうる。
【０１５７】
封入組成物は、多種多様な構成成分のうちのいずれかをさらに含む。これらは、アラム、脂質、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにポリペプチド、グリコペプチド、および多糖など、他のポリマーを含むがこれらに限定されない。
【０１５８】
封入構成成分に適するポリペプチドは、当技術分野で公知の任意のポリペプチドを含み、脂肪酸結合タンパク質を含むがこれらに限定されない。修飾ポリペプチドは、グリコシル化、ホスホリル化、ミリスチル化、硫黄化、およびヒドロキシル化を含むがこれらに限定されない、様々な修飾のうちのいずれかを含有する。本明細書で使用される、適切なポリペプチドは、その免疫阻害活性を保存するように、ＴＬＲ阻害剤含有組成物を保護するポリペプチドである。結合タンパク質の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびエンドウ豆アルブミンなどのアルブミンを含むがこれらに限定されない。
【０１５９】
他の適切なポリマーは、医薬の技術分野で公知の任意のポリマーであることが可能であり、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、および多糖、ならびに合成ポリマーなど、自然発生のポリマーを含むがこれらに限定されない。自然発生のポリマーの例は、タンパク質、グリコペプチド、多糖、デキストラン、および脂質を含む。さらなるポリマーは、合成ポリマーでありうる。使用に適する合成ポリマーの例は、ＰＥＧなどのポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などのポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタン、およびポリホスファゼンを含むがこれらに限定されない。合成ポリマーはまた、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、置換されている場合もあり、非置換の場合もあり、ホモポリマーの場合もあり、２つ以上の異なる合成単量体のコポリマーまたはブロックコポリマーの場合もある。
【０１６０】
封入組成物における使用のためのＰＥＧは、化学物質供給業者から購入するか、または当業者に公知の技法を使用して合成する。
【０１６１】
任意選択のコロイド分散系は、リポソームである。本明細書で使用される「リポソーム」または「脂質ベシクル」とは、少なくとも１つの脂質二重層膜により、おそらくは複数の脂質二重層膜により境界づけられた小胞である。リポソームは、超音波処理、射出、または脂質−洗浄剤複合体からの洗浄剤の除去を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の技法により、リン脂質、糖脂質、脂質、コレステロールなどのステロイド、関連分子、またはこれらの組合せから人工的に作り出される。リポソームはまた任意選択で、組織ターゲティング構成成分などのさらなる構成成分も含みうる。「脂質膜」または「脂質二重層」は、もっぱら脂質からなる必要はなく、加えて、コレステロール、および他のステロイド、脂質可溶性化学物質、任意の長さのタンパク質、および、膜の一般構造が、疎水性コアを挟み込む２つの親水性表面のシートであるという条件における、他の両親媒性分子を含むがこれらに限定されない他の任意の適切な構成成分も含有しうることが理解される。膜構造の一般的な考察については、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、J.  Kendrew（１９９４年）を参照されたい。適切な脂質については、例えば、Lasic（１９９３年）、「Liposomes:  from  Physics  to  Applications」、Elsevier、Amsterdamを参照されたい。
【０１６２】
当技術分野では、ＴＬＲ阻害剤組成物を含有するリポソームを調製するための工程が公知である。脂質ベシクルは、当技術分野で公知の任意の適切な技法により調製することができる。方法は、マイクロ封入、顕微溶液化、ＬＬＣ法、エタノール注射、フェロン注射、「バブル」法、洗浄剤透析、水和、超音波処理、および逆相蒸発を含むがこれらに限定されない。Watweら（１９９５年）、Curr.  Sci.、６８巻：７１５〜７２４頁において総説されている。ベシクルに最も所望される属性をもたらすために、技法を組み合わせることができる。
【０１６３】
本明細書では、組織ターゲティング構成成分または細胞ターゲティング構成成分を含有するリポソームなど、脂質二重層の使用が提供される。このようなターゲティング構成成分は、インタクトな動物、臓器、または細胞培養物へと投与されると、他の組織部位または細胞部位に優先した、ある特定の組織部位または細胞部位における蓄積を増強する。ターゲティング構成成分は一般に、リポソームの外側からアクセス可能であり、したがって、外表面へと結合させるかまたは外側の脂質二重層へと挿入することが好ましい。ターゲティング構成成分は、とりわけ、ペプチド、大きなペプチドの領域、細胞表面分子もしくは細胞表面マーカーに特異的な抗体、またはその抗原結合性断片、核酸、炭水化物、複合体炭水化物の領域、特殊な脂質、前述の分子のうちのいずれかへと結合させた薬物、ホルモン、またはハプテンなどの低分子でありうる。当技術分野では、細胞型特異的細胞表面マーカーに対する特異性を伴う抗体が公知であり、当技術分野で公知の方法により容易に調製される。
【０１６４】
リポソームは、治療的処置を方向付けようとする任意の細胞型、例えば、免疫応答を調節することが可能な細胞型および／または免疫応答に関与する細胞型へとターゲティングすることができる。このような標的細胞および標的臓器は、マクロファージ、樹状細胞、およびリンパ球などのＡＰＣ、リンパ節および脾臓などのリンパ構造、ならびに非リンパ構造、特に、樹状細胞が見出される非リンパ構造を含むがこれらに限定されない。
【０１６５】
本明細書で提供されるリポソーム組成物は加えて、界面活性剤も含みうる。界面活性剤は、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両親媒性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤でありうる。界面活性剤の好ましいクラスは、非イオン性界面活性剤であり、水溶性の非イオン性界面活性剤が特に好ましい。
【０１６６】
ＴＬＲ阻害剤をプラットフォーム分子へと連結することにより近接会合させる、一部の実施形態では、プラットフォームは、タンパク質性の場合もあり、非タンパク質性（すなわち、有機）の場合もある。タンパク質性プラットフォームの例は、アルブミン、ガンマグロブリン、免疫グロブリン（ＩｇＧ）およびオボアルブミンを含むがこれらに限定されない（Borelら（１９９０年）、Immunol.  Methods、１２６巻：１５９〜１６８頁;  Dumasら（１９９５年）、Arch.  Dematol.  Res.、２８７巻：１２３〜１２８頁;  Borelら（１９９５年）、Int.  Arch.  Allergy  Immunol.、１０７巻：２６４〜２６７頁;  Borelら（１９９６年）、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、７７８巻：８０〜８７頁）。プラットフォームは、複数のＴＬＲ阻害剤への結合に応じる多価（すなわち、複数の結合部位または連結部位を含有する）プラットフォームである。したがって、プラットフォームは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上の結合または連結部位を含有しうる。ポリマープラットフォームの他の例は、デキストラン、ポリアクリルアミド、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、およびポリＤ−グルタミン酸／Ｄ−リシンである。
【０１６７】
一部の実施形態では、プラットフォームは、ポリマープラットフォームである。一部の実施形態では、ポリマーは、デキストラン、ポリアクリルアミド、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、またはポリＤ−グルタミン酸／Ｄ−リシンである。一部の実施形態では、ポリマープラットフォームは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）である。一部の実施形態では、ポリマープラットフォームは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００である。一部の実施形態では、ポリマープラットフォームは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）７０である。一部の実施形態では、ポリマープラットフォームは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ７０（ポリ（スクロース−ｃｏ−エピクロルヒドリン））である。一部の実施形態では、ポリマープラットフォームは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００である。一部の実施形態では、約１〜約２００、約１〜約１５０、約１〜約１２５、約１〜約１００、約１〜約７５、約１〜約５０、または約１〜約２５の間のうちのいずれかのＴＬＲ阻害剤を、ポリマープラットフォームへと連結する。
【０１６８】
当技術分野では、プラットフォーム分子を使用する原理が十分に理解されている。一般に、プラットフォームは、ＴＬＲ阻害剤に適する結合部位を含有するか、またはこれを含有するように誘導体化される。加えて、または、代替的に、ＴＬＲ阻害剤は、適切な連結基をもたらすように誘導体化される。例えば、単純なプラットフォームは、ペプチドなどの二官能性リンカーである（すなわち、２つの結合部位を有する）。さらなる例については下記で論じる。
【０１６９】
プラットフォーム分子は、生物学的に安定化させることができる、すなわち、プラットフォーム分子は、治療有効性を付与するのに、数時間〜数日間〜数カ月間であることが多い、ｉｎ  ｖｉｖｏ排出半減期を呈示し、規定された組成物の合成単鎖からなることが好ましい。それらの分子量は一般に、約２００〜約１，０００，０００の範囲であり、好ましくは、以下の範囲：約２００〜約５００，０００；約２００〜約２００，０００；約２００〜約５０，０００（または３０，０００など５０，０００以下）のうちのいずれかである。結合価プラットフォーム分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；分子量が約２００〜約８０００であることが好ましい）、ポリ−Ｄ−リシン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｄ−グルタミン酸およびＤ−リシン（３：２の比の）などのポリマーである（またはポリマーを含む）。使用しうる他の分子は、アルブミンおよびＩｇＧである。
【０１７０】
使用に適する他のプラットフォーム分子は、米国特許第５，５５２，３９１号において開示されている、化学的に規定された、非ポリマーの結合価プラットフォーム分子である。他の同種で化学的に規定された、使用に適する結合価プラットフォーム分子は、誘導体化された２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤＡ）およびトリエチレングリコール（ＴＥＧ）である。
【０１７１】
さらなる適切な結合価プラットフォーム分子は、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）および１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（サイクレン）を含むがこれらに限定されない。
【０１７２】
一般に、これらのプラットフォームは、標準的な化学合成法により作り出す。ＰＥＧは、誘導体化しなければならず、多価としなければならないが、これは、標準的な技法を使用して達成する。ＰＥＧ、アルブミン、およびＩｇＧなど、コンジュゲートの合成に適するいくつかの物質は、市販されている。
【０１７３】
ＴＬＲ阻害剤のプラットフォーム分子へのコンジュゲーションは、いくつもの様式で実施することができ、ＴＬＲ阻害剤上およびプラットフォーム分子上に１または複数の架橋形成剤および官能基を伴うことが典型的である。プラットフォームおよびＴＬＲ阻害剤は、適切な連結基を有さなければならない。連結基は、標準的な合成化学法を使用して、プラットフォームへと付加する。連結基は、標準的な固相合成法または組換え法を使用して、ポリペプチドプラットフォームおよびＴＬＲ阻害剤へと付加することができる。組換え法は、リンカーを結合させるために翻訳後修飾を要求する場合もあるが、当技術分野では、このような方法が公知である。
【０１７４】
例として述べると、ポリペプチドは、ポリペプチドをプラットフォームへとカップリングするための部位として働く、アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基などの官能基を含有するアミノ酸側鎖部分を含有する。ポリペプチドがこれらの基をいまだ含有していない場合は、このような官能基を有する残基を、ポリペプチドへと付加することができる。このような残基は、それらのいずれもがペプチド合成の技術分野で周知である、固相合成法または組換え法により組み込むことができる。ポリペプチドが、炭水化物側鎖（複数可）を有する場合（またはプラットフォームが炭水化物である場合）は、従来の化学反応により、アミノ官能基、スルフヒドリル官能基、および／またはアルデヒド官能基を、その中に組み込むことができる。例えば、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下において、酸化糖をエチレンジアミンと反応させることにより、第一級アミノ基を組み込むことができ、システアミン二塩酸塩反応の後、標準的なジスルフィド還元剤で還元することにより、スルフヒドリルを導入することができるのに対し、アルデヒド基は、過ヨウ素酸酸化の後で生成させることができる。また、適切な官能基をいまだ保有しない場合も同様の形で、官能基を含有するように、プラットフォーム分子を誘導体化することもできる。
【０１７５】
長さが可変的な親水性リンカーは、ＴＬＲ阻害剤をプラットフォーム分子へと接続するのに有用である。適切なリンカーは、エチレングリコールの直鎖状オリゴマーまたは直鎖状ポリマーを含む。このようなリンカーは、式：Ｒ１Ｓ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｍＣＯ２Ｒ２によるリンカーを含み、式中、ｎ＝０〜２００であり、ｍ＝１または２であり、Ｒ１＝Ｈまたはトリチルなどの保護基であり、Ｒ２＝Ｈまたはアルキルまたはアリール、例えば、４−ニトロフェニルエステルである。これらのリンカーは、チオエーテルなどを介してハロアセチル、マレイミドなどのチオール反応性基を含有する分子を、アミド結合を介してアミノ基を含有する第２の分子へと接続するのに有用である。これらのリンカーは、結合の順序に関して柔軟である、すなわち、チオエーテルは、最初に形成することもでき、最後に形成することもできる。
【０１７６】
ＴＬＲ阻害剤を、表面への吸着により近接会合させる実施形態では、表面は、無機コアまたは有機コアと共に作り出した担体粒子（例えば、ナノ粒子）の形態でありうる。このようなナノ粒子の例は、ナノ結晶粒子、アルキルシアノアクリレートの重合により作り出されるナノ粒子、およびメチリデンマロネートの重合により作り出されるナノ粒子を含むがこれらに限定されない。ＴＬＲ阻害剤を吸着させうるさらなる表面は、活性化炭素粒子およびタンパク質−セラミックナノプレートを含むがこれらに限定されない。本明細書では、担体粒子の他の例も提供される。
【０１７７】
当技術分野では、吸着させた分子の細胞への送達を目的とする、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの表面への吸着が周知である。例えば、Douglasら（１９８７年）、Crit.  Rev.  Ther.  Drug.  Carrier  Syst.、３巻：２３３〜２６１頁；  Hagiwaraら（１９８７年）、In  Vivo、１巻：２４１〜２５２頁;  Bousquetら（１９９９年）、Pharm.  Res.、１６巻：１４１〜１４７頁；およびKossovskyら、米国特許第５，４６０，８３１号を参照されたい。吸着材表面を含む材料は、生体分解性であることが好ましい。ＴＬＲ阻害剤の表面への吸着は、イオン性相互作用および／または疎水性相互作用を含む非共有結合的相互作用を介して生じうる。
【０１７８】
一般に、表面電荷、粒子サイズ、および分子量など、ナノ粒子などの担体の特徴は、重合工程における重合条件、単量体濃度、および安定化剤の存在に依存する（Douglasら、１９８７年）。担体粒子の表面は、ＴＬＲ阻害剤の吸着を可能とするかまたは増強するように、例えば、表面コーティングで修飾することができる。ＴＬＲ阻害剤を吸着させた担体粒子は、他の物質でさらにコーティングすることもできる。このような他の物質を付加することにより、例えば、対象へと一度投与された粒子の半減期を延長することもでき、かつ／または粒子を本明細書で記載される特異的な細胞型または組織へとターゲティングすることもできる。
【０１７９】
ＴＬＲ阻害剤を吸着させうるナノ結晶表面は、記載されている（例えば、米国特許第５，４６０，８３１号を参照されたい）。ナノ結晶コア粒子（直径を１μｍ以下とする）は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／または他の医薬剤の吸着を促進する表面エネルギー修飾層でコーティングする。別の吸着材表面は、アルキルシアノアクリレートの重合により作り出されるナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン重合工程により、酸性化させた水性媒質中で重合することができる。重合条件に応じて、小型粒子のサイズは、２０〜３０００ｎｍの範囲となる傾向があり、特異的な表面特徴を伴い、特異的な表面電荷を伴うナノ粒子を作り出すことが可能である（Douglasら、１９８７年）。例えば、オリゴヌクレオチドは、テトラフェニルホスホニウムクロリドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミドなどの第四級アンモニウム塩など、疎水性カチオンの存在下で、ポリイソブチルシアノアクリレートナノ粒子およびポリイソヘキシルシアノアクリレート（polyisohexlcyanoacrylate）ナノ粒子へと吸着させることができる。これらのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの吸着は、核酸鎖の負に帯電したリン酸基と、疎水性カチオンとの間のイオン対の形成により媒介されると考えられる。例えば、Lambertら（１９９８年）、Biochimie、８０巻：９６９〜９７６頁;  Chavanyら（１９９４年）、Pharm.  Res.、１１巻：１３７０〜１３７８頁;  Chavanyら（１９９２年）、Pharm.  Res.、９巻：４４１〜４４９頁を参照されたい。別の吸着材表面は、メチリデンマロネートの重合により作り出されるナノ粒子である。
【０１８０】
ＴＬＲ阻害剤は、マイクロ担体（ＭＣ）複合体の形態で投与することができる。したがって、本明細書では、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体を含む組成物が提供される。ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、マイクロ担体の表面へと結合させたＴＬＲ阻害剤（すなわち、ＴＬＲ阻害剤は、ＭＣ内に封入されない）を含み、各マイクロ担体へと結合させたＴＬＲ阻害剤の複数の分子を含むことが好ましい。ある特定の実施形態では、マイクロ担体を、複数のＴＬＲ阻害剤種に結合させるように、異なるＴＬＲ阻害剤の混合物を、マイクロ担体と複合体化することができる。ＴＬＲ阻害剤とＭＣとの間の結合は、共有結合的な場合もあり、非共有結合的な場合もある。当業者により理解される通り、ＴＬＲ阻害剤は、修飾または誘導体化することができ、所望のＴＬＲ阻害剤に対する所望の種類の結合／ＭＣ複合体の形成に応じるように、マイクロ担体の組成物を、選択および／または修飾することができる。
【０１８１】
有用なマイクロ担体は、約１５０、１２０、または１００μｍ未満のサイズであり、より一般に、約５０〜６０μｍ未満のサイズであり、好ましくは、約１０μｍ未満のサイズであり、純水中で不溶性である。使用されるマイクロ担体は、好ましくは、生体分解性であるが、非生体分解性マイクロ担体も許容可能である。マイクロ担体は一般に、「ビーズ」または他の粒子などの固相であるが、生体分解性ポリマーまたは油を含む水中油エマルジョンなどの液相マイクロ担体もまた想定される。当技術分野では、マイクロ担体としての使用のために許容される、多種多様な生体分解性材料および非生体分解性材料が公知である。
【０１８２】
本明細書で記載される組成物または方法における使用のためのマイクロ担体は一般に、約１０μｍ未満のサイズであり（例えば、平均直径が、約１０μｍ未満であるか、または少なくとも粒子のうちの約９７％が、１０μｍのスクリーンフィルターを通り抜け）、ナノ担体（すなわち、約１μｍ未満のサイズの担体）を含む。サイズが、約９、７、５、２、もしくは１μｍ、または９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、もしくは１００ｎｍの上限と、独立に選択される、約４、２、もしくは１μｍ、または約８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、もしくは１０ｎｍの下限との間であって、下限が上限未満であるマイクロ担体を選択することが好ましい。一部の実施形態では、マイクロ担体のサイズは、約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍまたは約０．９〜１．６μｍである。ある特定の好ましい実施形態では、マイクロ担体のサイズは、約１０ｎｍ〜約５μｍ、または約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍもしくは約４．５μｍである。マイクロ担体が、ナノ担体である場合、好ましい実施形態は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ、または約２００ｎｍのナノ担体を含む。
【０１８３】
固相の生体分解性マイクロ担体は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびこれらのコポリマー（ブロックコポリマーを含む）のほか、ポリ（乳酸）とポリ（エチレングリコール）とのブロックコポリマー；３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）に基づくポリマーなどのポリオルトエステル；セバシン酸など、比較的親水性の単量体に基づくポリ（無水物）ポリマーなどのポリ無水物；グリシンまたはアラニンなどのアミノ酸（すなわち、アミノ末端の窒素を介するイミド結合によりセバシン酸へと連結された）を組み込むセバシン酸由来単量体に基づくポリ無水物ポリマーなどのポリ無水物イミド；ポリ無水物エステル；ポリホスファゼン、とりわけ、カルボン酸基の生成を介するポリマー骨格の分解を触媒しうる加水分解感受性のエステル基を含有するポリ（ホスファゼン）（Schachtら（１９９６年）、Biotechnol.  Bioeng.、１９９６巻：１０２頁）；およびポリ（乳酸−ｃｏ−リシン）などのポリアミドなどの生体分解性ポリエステルを含むがこれらに限定されない、生体分解性ポリマーから作製することができる。
【０１８４】
また、マイクロ担体を作製するのに適する、多種多様な非生体分解性材料も公知であり、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、ラテックス、金、および強磁性材料または常磁性材料を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態は、金、ラテックス、および／または磁気ビーズを除外する。ある特定の実施形態では、マイクロ担体は、第２の材料（例えば、ポリスチレン）と共に封入された第１の材料（例えば、磁性材料）から作り出すことができる。
【０１８５】
固相マイクロスフェアは、当技術分野で公知の技法を使用して調製する。例えば、それらは、エマルジョン溶媒抽出／蒸発法により調製することができる。一般に、この技法では、ポリ無水物、ポリ（アルキル−シアノアクリレート）、およびポリ（ヒドロキシエステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（カプロラクトン）などの生体分解性ポリマーを、塩化メチレンなどの適切な有機溶媒中に溶存させて、エマルジョンの分散相（ＤＰ）を構成する。ＤＰは、溶存させた界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有する過剰容量の水性連続相（ＣＰ）への高速ホモジナイゼーションにより乳化させる。ＣＰ中の界面活性剤は、個別かつ適切なサイズのエマルジョン液滴の形成を確保するためのものである。次いで、有機溶媒を、ＣＰへと抽出し、続いて、系の温度を上げることにより蒸発させる。次いで、遠心分離または濾過により固体のマイクロ粒子を分離し、例えば、４℃における保存の前に、凍結乾燥または真空の適用により乾燥させる。
【０１８６】
乾燥させたマイクロスフェアの平均サイズ、サイズ分布、および表面電荷などの物理化学的特徴を決定することができる。サイズ特徴は、例えば、動的光散乱法により決定するが、表面電荷は、ゼータポテンシャルを測定することにより決定した。
【０１８７】
液相マイクロ担体は、リポソーム、ミセル、油滴、および生体分解性ポリマーまたは油を組み込む他の脂質または油ベースの粒子を含む。ある特定の実施形態では、生体分解性ポリマーは、界面活性剤である。他の実施形態では、液相マイクロ担体は、スクアレンまたは植物油など、生体分解性油の組入れに起因して、生体分解性である。１つの好ましい液相マイクロ担体は、水中油エマルジョン内の油滴である。好ましくは、マイクロ担体として使用される水中油エマルジョンは、スクアレンなどの生体分解性置換基を含む。
【０１８８】
共有結合的に結合させたＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、当技術分野で公知である、任意の共有結合的架橋形成技術を使用して連結させることができる。ＴＬＲ阻害剤ポーションは、さらなる部分（例えば、遊離アミン基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基）を組み込むか、または修飾された（例えば、ホスホロチオエートで修飾された）ヌクレオチド塩基を組み込んで、ＴＬＲ阻害剤ポーションをマイクロ担体へと連結しうる部位をもたらすように修飾することが典型的である。ＴＬＲ阻害剤と複合体のＭＣポーションとの間の連結は、ＴＬＲ阻害剤の３’末端または５’末端において施すこともでき、ＴＬＲ阻害剤内の内部位置の適切に修飾された塩基において施すこともできる。マイクロ担体はまた一般に、それを介して共有結合的連結を形成しうる部分を組み込むようにも修飾するが、マイクロ担体上に通常存在する官能基もまた活用しうる。ＴＬＲ阻害剤／ＭＣは、ＴＬＲ阻害剤を、共有結合的複合体の形成を可能とする条件下で（例えば、架橋形成剤の存在下において、またはＴＬＲ阻害剤との共有結合を形成する活性化部分を含む活性化マイクロ担体を使用することにより）、マイクロ担体と共にインキュベートすることにより形成する。
【０１８９】
当技術分野では、多種多様な架橋形成技術が公知であり、アミノ基、カルボキシル基、およびスルフヒドリル基と反応性の架橋形成剤を含む。当業者に明らかな通り、架橋形成剤および架橋形成プロトコールの選択は、ＴＬＲ阻害剤およびマイクロ担体の立体配置のほか、所望の最終的なＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体の立体配置にも依存するであろう。架橋形成剤は、ホモ二官能性の場合もあり、ヘテロ二官能性の場合もある。ホモ二官能性架橋形成剤を使用する場合、架橋形成剤は、ＴＬＲ阻害剤上およびＭＣ上の同じ部分を利用する（例えば、アルデヒド架橋形成剤を使用して、それらのいずれもが１または複数の遊離アミンを含む、ＴＬＲ阻害剤とＭＣとを共有結合的に連結することができる）。ヘテロ二官能性架橋形成剤は、ＴＬＲ阻害剤上およびＭＣ上の異なる部分を活用し（例えば、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、ＴＬＲ阻害剤上の遊離スルフヒドリルとＭＣ上の遊離アミンとを共有結合的に連結することができる）、マイクロ担体間結合の形成を最小化することが好ましい。大半の場合において、マイクロ担体上の第１の架橋形成部分と、マイクロ担体上に存在しない、ＴＬＲ阻害剤上の第２の架橋形成部分とを架橋することが好ましい。ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体を作製する１つの好ましい方法は、ヘテロ二官能性架橋形成剤と共にインキュベートし、次いで、反応に適する条件下で、ＴＬＲ阻害剤と活性化ＭＣとをインキュベートすることを介してＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体を形成することにより、マイクロ担体「を活性化させること」である。架橋形成剤は、反応性部分の間に「スペーサー」アームを組み込むこともでき、架橋形成剤内の２つの反応性部分を直接連結することもできる。
【０１９０】
１つの好ましい変化形では、ＴＬＲ阻害剤ポーションが、マイクロ担体へと架橋形成するために、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル（例えば、５’−チオール修飾塩基またはリンカーによりもたらされる）を含むのに対し、マイクロ担体は、遊離アミン基を含む。スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートなど、これらの２つの基（例えば、架橋形成剤は、マレイミド基およびＮＨＳ−エステルを含む）と反応性のヘテロ二官能性架橋形成剤を使用して、ＭＣを活性化させ、次いで、ＴＬＲ阻害剤を共有結合的に架橋して、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体を形成する。
【０１９１】
結合対がＴＬＲ阻害剤とＭＣとを連結する場合にそうである通り、非共有結合的ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、イオン（静電）結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、または２つ以上の異なる相互作用の組合せを含む、任意の非共有結合的結合または相互作用により連結することができる。
【０１９２】
好ましい非共有結合的ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、疎水性相互作用もしくは静電（イオン性）相互作用、またはこれらの組合せ（例えば、ＴＬＲ阻害剤と結合対のＭＣへと結合させたポリヌクレオチドとの間の塩基対合を介する）により複合体化することが典型的である。ポリヌクレオチド骨格の親水性の性質に起因して、複合体を形成するのに疎水性相互作用に依拠するＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は一般に、高度な疎水性部分を組み込むのに、複合体のＴＬＲ阻害剤ポーションの修飾を要求する。疎水性部分は、組成物が意図される個体において、生体適合性であり、非免疫原性であり、自然発生である（例えば、哺乳動物、特に、ヒトにおいて見出される）ことが好ましい。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、コレステロールなどのステロール、およびテルペンを含む。疎水性部分をＴＬＲ阻害剤へと連結する方法は、当然ながら、ＴＬＲ阻害剤の立体配置および疎水性部分の同一性に依存する。疎水性部分は、ＴＬＲ阻害剤内の任意の簡便な部位において、好ましくは、５’末端または３’末端において付加することができ、コレステロール部分をＴＬＲ阻害剤へと付加する場合、コレステロール部分は、従来の化学反応を使用して、ＴＬＲ阻害剤の５’末端へと付加することが好ましい（例えばGodardら（１９９５年）、Eur.  J.  Biochem.、２３２巻：４０４〜４１０頁を参照されたい）。疎水性部分を組み込むように修飾された親水性材料もまた活用しうるが、疎水性結合により連結されるＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロ担体は、油滴または疎水性ポリマーなどの疎水性材料から作り出すことが好ましい。マイクロ担体が、リポソームまたは管腔を含む他の液相マイクロ担体であり、ＴＬＲ阻害剤をＭＣの外表面と会合させることが所望される場合は、ＭＣ調製工程におけるＴＬＲ阻害剤の封入を回避するために、ＭＣを調製した後でＴＬＲ阻害剤とＭＣとを混合することにより、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体を形成する。
【０１９３】
静電結合により結合させた非共有結合的ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチド骨格の高度な負電荷を利用することが典型的である。したがって、非共有結合的に結合させたＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロ担体は一般に、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約６．８〜７．４）で、正に帯電させる（カチオン性である）。マイクロ担体は、正電荷を内在的に保有しうるが、正電荷を通常保有しない化合物から作り出されたマイクロ担体は、正に帯電させる（カチオン性となる）ように誘導体化することもでき、他の形で修飾することもできる。例えば、マイクロ担体を作り出すのに使用されるポリマーは、第一級アミンなど、正に帯電した基を付加するように誘導体化することができる。代替的に、製造時において、正に帯電させた化合物を、マイクロ担体の製剤中に組み込むこともできる（例えば、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）コポリマーの製造時において、正に帯電させた界面活性剤を使用して、結果として得られるマイクロ担体粒子に正電荷を付与することができる）。
【０１９４】
例えば、カチオン性マイクロスフェアを調製するために、これらの相中のそれらの可溶性に従い、カチオン脂質またはポリマー、例えば、１，２−ジオレオイル−１，２，３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはポリリシンを、ＤＰまたはＣＰへと付加する。
【０１９５】
ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチドと粒子との、好ましくは、水性混合物中のインキュベーションを介して、カチオン性マイクロスフェアへと吸着させることによりあらかじめ形成することができる。このようなインキュベーションは、周囲温度（室温）（例えば、約２０℃）または冷凍下（例えば、４℃）を含む任意の所望の条件下で実行することができる。カチオン性マイクロスフェアとポリヌクレオチドとは、比較的急速に会合するため、インキュベーションは、５、１０、１５分間以上にわたるインキュベーション、一晩にわたるインキュベーション、および長時間にわたるインキュベーションなどを含む、任意の簡便な時間にわたりうる。例えば、ＴＬＲ阻害剤は、ポリヌクレオチドと粒子との、４℃で一晩にわたる水中のインキュベーションにより、カチオン性マイクロスフェアへと吸着させることができる。しかし、カチオン性マイクロスフェアとポリヌクレオチドとは、自発的に会合するため、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチドとＭＣとの単純な共投与により形成することができる。マイクロスフェアは、ポリヌクレオチドを会合させる前およびポリヌクレオチドを会合させた後において、サイズおよび表面電荷について特徴づけることができる。次いで、選択されたバッチを、例えば、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）アッセイおよびマウス脾臓細胞アッセイにおいて、適切な対照に対して、活性について査定することができる。製剤はまた、適切な動物モデルにおいて査定することもできる。
【０１９６】
ヌクレオチド塩基対合により連結される非共有結合的ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、従来の方法を使用して作製することができる。一般に、塩基対合させたＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体は、ＴＬＲ阻害剤と少なくとも部分的に相補的なポリヌクレオチド（「捕捉ポリヌクレオチド」）の結合、好ましくは、共有結合的な結合を含むマイクロ担体を使用して作製する。ＴＬＲ阻害剤と捕捉ヌクレオチドとの間の相補性セグメントは、少なくとも６、８、１０、または１５の連続塩基対、より好ましくは、少なくとも２０の連続塩基対であることが好ましい。捕捉ヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法によりＭＣへと結合させることができ、５’末端または３’末端において、ＴＬＲ阻害剤に共有結合的に結合させることが好ましい。
【０１９７】
他の実施形態では、結合対を使用して、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体内のＴＬＲ阻害剤とＭＣとを連結することができる。結合対は、受容体およびリガンドの場合もあり、抗体および抗原（またはエピトープ）の場合もあり、高アフィニティーで結合する他の任意の結合対（例えば、Ｋｄを約１０〜８未満とする）の場合もある。好ましい結合対の１つの種類は、極めて緊密な複合体を形成するビオチンおよびストレプトアビジンまたはビオチンおよびアビジンである。ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体の結合を媒介するのに結合対を使用する場合は、ＴＬＲ阻害剤を、典型的には共有結合的連結を介して、結合対の１つのメンバーにより誘導体化し、ＭＣを、結合対の他のメンバーにより誘導体化する。２つの誘導体化された化合物の混合物は、ＴＬＲ阻害剤／ＭＣ複合体の形成を結果としてもたらす。
【０１９８】
医薬製剤
また、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤も提供される。ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、特異的な転帰を達成するのに有効な量の組成物により、個体へと投与することができる。医薬製剤は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバント、および、任意選択で、他の治療用成分を日常的に含有しうる。一部の態様では、医薬製剤は、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を含む。
【０１９９】
医薬製剤は、例えば、注射もしくは吸入のための水溶液または食塩水を含むか、またはマイクロ封入するか、エンコクリエートするか、顕微金粒子へとコーティングするか、リポソーム内に含有させるか、噴霧するか、エアゾールとするか、皮膚へと実装するためのペレットとするか、皮膚をひっかくための鋭利物上で乾燥させることもできる。医薬製剤はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、または活性化合物の徐放を伴う調製物も含み、例えば、上記で記載した通り、それらの調製物中では通例、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、腫脹薬剤、滑沢剤、芳香剤、甘味剤、もしくは可溶化剤などの賦形剤ならびに添加剤および／または補助剤を使用する。医薬製剤は、様々な薬物送達系における使用に適する。薬物送達のための例示的な方法に対する簡略な総説については、参照により本明細書に組み込まれる、Langer、Science、２４９巻：１５２７〜３３頁（１９９０年）を参照されたい。
【０２００】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含む。本明細書では、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤について記載するが、当技術分野でも周知である（例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、２０版、Mack  Publishing、２０００年を参照されたい）。生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤の例は、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、薬学的に許容できる担体は、クエン酸である。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、非経口投与に適する。許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、リン酸緩衝食塩水、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油も、溶媒または懸濁媒として従来援用されている。この目的では、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の銘柄の鉱物固定油または非鉱物固定油も援用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製において使用されている。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、皮下送達、筋内送達、腹腔内送達、または静脈内送達に適する。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、徐放性医薬製剤、遅延放出性医薬製剤、または持続放出性医薬製剤である。持続放出性医薬製剤は、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物など、ポリマーベースの系を含む。前出の、薬物を含有するポリマーによるマイクロカプセルについては、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号において記載されている。非ポリマー性医薬製剤は、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、および脂肪酸、またはモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質；ハイドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠；部分的に融合させたインプラントなどを含みうる。
【０２０３】
ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、生理学的に許容される軟膏、クリーム、洗浄液、エマルジョン、ローション、溶液、ペースト、およびゲルを含むがこれらに限定されない外用適用に適しうる。
【０２０４】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤は、経皮投与のために製剤化された医薬製剤である。経皮投与は、例えば、クリーム、洗浄液、またはゲルを適用することにより達成する。一部の実施形態では、医薬製剤は、消化管投与経路のために製剤化された医薬製剤である。一部の実施形態では、消化管経路用の医薬製剤は、経口摂取のための、薬学的に許容できる粉末、丸剤、または液体、および直腸内投与のための坐剤を含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、鼻咽頭内投与および肺内投与のために製剤化された医薬製剤である。エアゾールを形成するための液体懸濁液のほか、乾燥粉末吸入送達系のための粉末形態を含むがこれらに限定されない、鼻咽頭内投与および肺内投与に適する医薬製剤が提供される。
【０２０５】
ＩＶ．使用法
本明細書では、個体における免疫応答を阻害するための方法であって、有効量のＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ９阻害剤（例えば、ＴＬＲ阻害剤）を個体に投与するステップを含む方法が提供される。本開示のＴＬＲ阻害剤は、１または複数のヒトＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する。別段に言及されない限りにおいて、ＴＬＲ阻害剤という用語は、本明細書で開示されるＴＬＲ阻害剤のうちのいずれか１つを指す。一部の好ましい実施形態では、個体は、ヒト患者である。
【０２０６】
本開示では、免疫調節法が提供され、免疫応答を含むがこれらに限定されない免疫応答を抑制および／または阻害する免疫調節法を含む。本開示はまた、自己免疫と関連した症状を含むがこれらに限定されない、望ましくない免疫活性化と関連した症状を改善するための方法も提供する。本明細書で記載される方法による免疫の抑制および／または阻害は、免疫応答の望ましくない活性化と関連した障害を患う個体を含む個体に対して実施することができる。本開示はまた、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９により誘導された応答（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）を阻害するための方法も提供する。一部の変化形では、細胞を、免疫応答に寄与する細胞からの応答を阻害するのに有効な量で、ＴＬＲ阻害剤と接触させる。
【０２０７】
ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９の阻害は、サイトカインに応答性の様々な疾患または障害を処置および／または防止するのに有用でありうる。ＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ９阻害剤を処置として使用しうる状態は、自己免疫疾患および炎症性障害を含むがこれらに限定されない。本明細書では、個体における疾患または障害を処置または防止する方法であって、有効量のＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ９阻害剤を個体に投与するステップを含む方法が提供される。さらに、疾患または障害と関連した症状を改善するための方法であって、有効量のＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ９阻害剤を、疾患または障害を有する個体に投与するステップを含む方法も提供される。本明細書ではまた、疾患または障害の発症を防止するかまたは遅延させるための方法であって、有効量のＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数の阻害剤を、疾患または障害を有する個体に投与するステップを含む方法も提供される。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、配列番号10、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号24、配列番号26、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、および配列番号115からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、配列番号１０８を含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、配列番号１０９を含むポリヌクレオチドである。
【０２０８】
本明細書では、個体における免疫応答を阻害するための方法であって、本明細書でにおいて開示される少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の変化形では、免疫応答は、自己免疫疾患と関連する。さらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患の１または複数の症状を改善する。なおさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患を処置する。またさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、自己免疫疾患の発症を防止するかまたは遅延させる。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する。一部の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害する。一部の態様では、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で投与する。
【０２０９】
本明細書ではまた、個体における自己免疫疾患を処置または防止する方法であって、有効量のＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ９阻害剤を個体に投与するステップを含む方法も提供される。一部の態様では、自己免疫疾患は、関節痛、抗核抗体陽性、頬部発疹、または円板状発疹を特徴とする。一部の態様では、自己免疫疾患は、皮膚、筋組織、および／または結合組織と関連する。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、個体において、皮膚症状、筋組織症状、および／または結合組織症状を証拠としない。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、全身性である。自己免疫疾患は、限定なしに述べると、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性膵臓炎（ＡＩＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、硬化性胆管炎、全身性関節炎、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、強皮症、シェーグレン病、白斑、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、自己免疫性肝炎、下垂体機能低下症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫性皮膚疾患、ブドウ膜炎、悪性貧血、および副甲状腺機能低下症を含む。自己免疫疾患はまた、限定なしに述べると、多発性血管炎重複症候群、川崎病、サルコイドーシス、糸球体腎炎、および寒冷過敏症も含みうる。医療技術分野では、これらの状態が周知であり、例えば、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine、１４版、Fauciら編、New  York：  McGraw-Hill、１９９８年において記載されている。一部の態様では、自己免疫疾患は、関節炎、膵臓炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、紅斑性狼瘡、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、全身性関節炎、および過敏性腸症候群からなる群から選択される。他の態様では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、自己免疫性皮膚疾患、および多発性硬化症からなる群から選択される。他の態様では、自己免疫疾患は、膵炎、糸球体腎炎、腎盂炎、硬化性胆管炎、およびＩ型糖尿病からなる群から選択される。一部の態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。一部の態様では、自己免疫疾患は、自己免疫性膵臓炎（ＡＩＰ）である。一部の態様では、自己免疫疾患は、糸球体腎炎である。一部の態様では、自己免疫疾患は、腎盂炎である。一部の態様では、自己免疫疾患は、硬化性胆管炎である。一部の態様では、自己免疫障害は、乾癬である。一部の態様では、自己免疫疾患は、リウマチ様疾患またはリウマチ様障害である。一部の態様では、リウマチ様疾患またはリウマチ様障害は、関節リウマチである。一部の態様では、疾患は、糖尿病および／または糖尿病関連疾患または糖尿病関連障害である。一部の態様では、自己免疫疾患は、ＲＮＡ含有免疫複合体と関連する。一部の態様では、自己免疫疾患は、シェーグレン病である。
【０２１０】
本明細書では、個体における免疫応答を阻害するための方法であって、本明細書でにおいて開示される少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の変化形では、免疫応答は、炎症性障害と関連する。本明細書で使用される「炎症性障害」という用語は、自己免疫疾患のほか、公知の自己免疫構成成分を伴わない炎症性状態（例えば、アテローム性動脈硬化、喘息など）を包含する。さらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、炎症性障害の１または複数の症状を改善する。なおさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、炎症性障害を処置する。またさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、炎症性障害の発症を防止するかまたは遅延させる。一部の態様では、炎症性障害は、非リウマチ様関節炎、腎線維症、および肝線維症からなる群から選択される。一部の態様では、炎症性障害は、界面皮膚炎である。一部のさらなる態様では、界面皮膚炎は、扁平苔癬、苔癬様発疹、扁平苔癬様角化症、線条苔癬、慢性苔癬様角化症、多形性紅斑、固定薬疹、苔癬状粃糠疹、光毒性皮膚炎、放射線皮膚炎、ウイルス性発疹、皮膚筋炎、第二期梅毒、硬化性萎縮性苔癬、菌状息肉腫、水疱性類天疱瘡、黄色苔癬、汗孔角化症、慢性萎縮性肢端皮膚炎、および退行性黒色腫からなる群から選択される。一部の態様では、炎症性状態とは、アトピー性皮膚炎（湿疹）などの皮膚障害である。一部の態様では、炎症性障害は、薬物誘導性肝臓および／または膵臓炎などの非感染性炎症性状態である。一部のさらなる態様では、炎症性疾患は、炎症性肝臓障害である。一部の他のさらなる態様では、炎症性疾患は、炎症性膵臓障害である。
【０２１１】
本明細書では、個体における免疫応答を阻害するための方法であって、本明細書でにおいて開示される少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の変化形では、免疫応答は、長期にわたる病原体による刺激と関連する。一部の変化形では、免疫応答は、ＨＩＶによる感染と関連する。さらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、ＨＩＶによる感染から生じるウイルス性疾患またはウイルス性障害の１または複数の症状を改善する。なおさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、ＨＩＶによる感染から生じるウイルス性疾患またはウイルス性障害を処置する。またさらなる態様では、免疫応答を阻害することにより、ＨＩＶによる感染から生じるウイルス性疾患またはウイルス性障害の発症を防止するかまたは遅延させる。本明細書で提供される他の変化形は、ＨＩＶへと曝露されるかまたはＨＩＶに感染した個体の免疫阻害による治療に関する。ＴＬＲ阻害剤の、ＨＩＶへと曝露されるかまたはＨＩＶに感染した個体への投与は、ＨＩＶにより誘導されるサイトカイン産生の抑制を結果としてもたらす。一部の態様では、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、ＨＩＶへと曝露されるかまたはＨＩＶに感染した個体における、ＨＩＶにより誘導されるサイトカイン産生を抑制するのに有効な量で投与する。
【０２１２】
本明細書では、個体におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するための方法であって、ＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の変化形では、免疫応答は、自己免疫疾患と関連する。一部の態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、関節リウマチの１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の態様では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、多発性硬化症の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の態様では、自己免疫疾患は、紅斑性狼瘡である。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、紅斑性狼瘡の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の態様では、自己免疫疾患は、膵臓炎である。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、膵臓炎の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の態様では、自己免疫疾患は、糖尿病である。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、糖尿病の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の態様では、疾患は、シェーグレン病である。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、シェーグレン病の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の変化形では、免疫応答は、炎症性障害と関連する。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、炎症性障害の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の変化形では、免疫応答は、長期にわたる病原体による刺激と関連する。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、長期にわたる病原体による刺激の１または複数の症状を抑制するのに有効である。一部の変化形では、免疫応答は、ＨＩＶによる感染から生じるウイルス性疾患と関連する。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤は、ＨＩＶによる感染から生じるウイルス性疾患の１または複数の症状を抑制するのに有効である。任意の変化形では、ＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含むポリヌクレオチドである。
【０２１３】
本明細書における方法は、予防的処置、治療的処置、またはこれらの両方をもたらす。本明細書で使用される予防的処置とは、症状の観察および／または状態の原因物質（例えば、病原体または発がん物質）への曝露の疑いの前に開始される処置を指す。一般に、予防的処置は、（ａ）処置を施される個体が状態を発症する可能性を低減し、かつ／または（ｂ）万一対象が状態を発症した場合の症状の持続期間を短縮し、かつ／もしくは重症度を軽減しうる。本明細書で使用される治療的処置とは、症状の観察および／または状態の原因物質への曝露の疑いの後で開始される処置を指す。一般に、治療的処置は、状態と関連した症状の重症度を軽減し、かつ／または持続期間を短縮しうる。
【０２１４】
本明細書で裏付けられる通り、特定のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性細胞応答、ＴＬＲ８依存性細胞応答、および／またはＴＬＲ９依存性細胞応答を阻害する、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含む。一部の実施形態では、ある特定のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ４依存性細胞応答を阻害しない。一部の実施形態では、ある特定のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ１依存性細胞応答、ＴＬＲ２依存性細胞応答、ＴＬＲ３依存性細胞応答、ＴＬＲ４依存性細胞応答、ＴＬＲ５依存性細胞応答、ＴＬＲ６依存性細胞応答、ＴＬＲ１０依存性細胞応答、ＴＬＲ１１依存性細胞応答、ＴＬＲ１２依存性細胞応答、および／またはＴＬＲ１３依存性細胞応答を阻害しない。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて決定される、測定可能な免疫応答を阻害および／または抑制する、本明細書で記載される、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のうちの１または複数に対する阻害性モチーフを含む。
【０２１５】
本明細書で記載される通り、新規に規定されるＴＬＲ７阻害性モチーフを伴う、一部のＴＬＲ阻害剤は、特に、ＴＬＲ７依存性細胞応答を抑制するのに有効である。このようなＴＬＲ阻害剤は、配列番号３６、３８、４４、４６、４８、５０、５５〜６７、８５〜８８、９０、９１、９５、９７、９９、１０３、１０４、１０８〜１１１、１１４、および１１５を含むがこれらに限定されない。
【０２１６】
本明細書で記載される通り、新規に規定されるＴＬＲ８阻害性モチーフを伴う、一部のＴＬＲ阻害剤は、特に、ＴＬＲ８依存性細胞応答を抑制するのに有効である。このようなＴＬＲ阻害剤は、配列番号１０、１４〜１８、２０、２４、２６、３０〜４０、４４、４８〜５３、５６、５９〜７３、７７〜８１、および８４〜１１５を含むがこれらに限定されない。
【０２１７】
本明細書で記載される通り、一部のＴＬＲ阻害剤は、特に、ＴＬＲ７依存性細胞応答およびＴＬＲ８依存性細胞応答を抑制するのに有効である。このようなＴＬＲ阻害剤は、配列番号１０、１５〜１８、２０、２４、２６、３０、３４〜３６、３８、４０、４４、４８、５０、５６、５９〜６３、６５、６７、８５〜８８、９０〜９５、９７、９９〜１０６、および１０８〜１１１を含むがこれらに限定されない。
【０２１８】
本明細書で記載される通り、一部のＴＬＲ阻害剤は、特に、ＴＬＲ８依存性細胞応答およびＴＬＲ９依存性細胞応答を抑制するのに有効である。このようなＴＬＲ阻害剤は、配列番号８１、および１１２を含むがこれらに限定されない。
【０２１９】
本明細書で記載される通り、一部のＴＬＲ阻害剤は、特に、ＴＬＲ７依存性細胞応答、ＴＬＲ８依存性細胞応答、およびＴＬＲ９依存性細胞応答を抑制するのに有効である。このようなＴＬＲ阻害剤は、配列番号１４、６４、６６、および１１３〜１１５を含むがこれらに限定されない。
【０２２０】
ＴＬＲ阻害剤の個体への投与を伴う方法（例えば、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患または炎症性障害などを処置または防止する方法）のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、治療的に許容される安全性プロファイルを有する。ＴＬＲ阻害剤は、例えば、存在する場合でも許容される程度に低い、肝臓、腎臓、膵臓、または他の臓器の毒性を含む、治療的に許容される組織学的プロファイルを有しうる。場合によって、ポリヌクレオチドは、肝臓、腎臓、および膵臓などのある特定の臓器に対する毒性と関連している。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、予測外で有利な安全性プロファイルを有する。一部の実施形態では、安全性プロファイルは、毒性、組織学プロファイル、および／または壊死（例えば、肝臓、腎臓、および／または心臓）の査定を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の毒性は、治療的に許容されるレベルである。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤の毒性レベルは、別のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤）と比較して低減されている。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、処置される個体の初期の体重と比較して、治療的に許容される体重の減少を誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、全体重の５％、７．５％、１０％、１２．５、または１５％未満の減少を誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、治療的に許容される組織学プロファイルを有する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、組織学プロファイルが、例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤と比較して良好である（例えば、重症度スコアが低い）。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、例えば、肝臓、腎臓、および／または心臓について査定したときの組織学プロファイルが良好である（例えば、重症度スコアが低い）。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、治療的に許容される壊死スコアを有する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤と比較して、壊死が軽減され、かつ／または壊死スコアが良好である（例えば、低い）。一部の実施形態では、平均壊死スコアは、約３以下である。一部の実施形態では、平均壊死スコアは、約２．０以下である。一部の実施形態では、平均壊死スコアは、約１以下である。一部の実施形態では、平均壊死スコアは、約０以下である。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、腎細胞壊死および／もしくは肝細胞壊死が、例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤と比較して軽減されており、かつ／または腎細胞壊死スコアおよび／もしくは肝細胞壊死スコアが良好である。
【０２２１】
ＴＬＲ阻害剤の個体への投与を伴う方法（例えば、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患または炎症性障害などを処置または防止する方法）のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、治療的に許容される薬物動態（ＰＫ）または薬物代謝および薬物動態（ＤＭＰＫ）を有する。方法のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ＰＫプロファイルまたはＰＫが、別のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤）と同様である。一部の実施形態では、治療的に許容される安全性プロファイルを、マウスまたはラットにおいて決定する。一部の実施形態では、治療的に許容される安全性プロファイルを、ラットにおいて決定する。
【０２２２】
ＴＬＲ阻害剤の個体への投与を伴う方法（例えば、免疫応答を阻害し、自己免疫疾患または炎症性障害などを処置または防止する方法）のうちのいずれかについての一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、治療的に許容されるレベルのＢ細胞活性化を誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、陽性対照のポリヌクレオチド（例えば、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む、ＩＳＳともまた称する免疫刺激性配列）と比較して低レベルのＢ細胞活性化を誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、Ｂ細胞活性化が小さいことが公知の別のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４など、基準のＴＬＲ阻害剤）と同等であるかまたはこれより著明に高くはない、低レベルのＢ細胞活性化を誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、Ｂ細胞活性化を、Ｂ細胞活性化が小さいことが公知の別のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４）と比較して、約１分の１、１．５分の１、２分の１、２．５分の１、または３分の１の著明に低いレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、Ｂ細胞活性化を、陽性対照のポリヌクレオチド（例えば、ＩＳＳ）より著明に低いレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ細胞活性化を、陽性対照のポリヌクレオチド（例えば、ＩＳＳ）と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満のレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤によるＢ細胞活性化を、陽性対照のポリヌクレオチド（例えば、ＩＳＳ）へと標準化する。一部の実施形態では、複数のＴＬＲ阻害剤の標準化結果を比較する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、Ｂ細胞活性化を、第２のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号１１６のＤＶ１８５）より著明に低いレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、細胞培養アッセイにおけるＢ細胞活性化を、培地単独より著明に高いレベル、またはＢ細胞活性化が小さいことが公知の基準のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４）のレベルへと誘導しない。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、細胞培養アッセイにおけるＢ細胞活性化を、Ｂ細胞活性化が小さいことが公知の第２のＴＬＲ阻害剤（例えば、配列番号７のＣ９５４）と比較して約１分の１、１．５分の１、２分の１、２．５分の１、または３分の１のレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、細胞培養アッセイにおけるＢ細胞活性化を、陽性対照のポリヌクレオチド（例えば、ＩＳＳ）より著明に低いレベルへと誘導する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、例えば、約４０００ｎＭ〜約１５ｎＭの範囲にわたり、濃度依存性のＢ細胞活性化を示す。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤は、例えば、約１０００ｎＭ〜約１５ｎＭの範囲にわたり、Ｂ細胞活性化をほとんど〜全く示さない。
【０２２３】
ＴＬＲ阻害剤の投与および免疫応答の評価
免疫応答を阻害するための全ての組成物についてと同様、特定のＴＬＲ阻害剤製剤を投与するときの有効量およびＴＬＲ阻害剤製剤を投与する方法も、個体、どのような状態を処置するのか、および当業者に明らかな他の因子に基づき変化させることができる。
【０２２４】
一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤の投与量は、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、および／またはＴＬＲ９アゴニストに対する応答の抑制、ＴＬＲ７依存性免疫応答の抑制、ＴＬＲ８依存性免疫応答の抑制、ＴＬＲ７依存性およびＴＬＲ８依存性免疫応答の抑制、ＴＬＲ８依存性およびＴＬＲ９依存性免疫応答の抑制、ＴＬＲ７依存性、ＴＬＲ８依存性、およびＴＬＲ９依存性免疫応答の抑制、自己免疫疾患の１または複数の症状の改善、慢性炎症性疾患の症状の改善、ＨＩＶに応答するサイトカイン産生の減少、ならびに／またはＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／もしくはＴＬＲ９により媒介される疾患もしくは障害の１もしくは複数の症状の処置および／もしくは阻止に十分である。一部の態様では、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で投与する。
【０２２５】
適切な投与量の範囲は、免疫応答の所望の調節（例えば、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、および／もしくはＴＬＲ９アゴニストの抑制、またはＩＦＮの抑制、またはＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、および／もしくはＴＬＲ９アゴニストに応答する他のサイトカイン産生の抑制）をもたらす範囲である。一般に、投与量は、個体に投与されるＴＬＲ阻害剤の量により決定する。ＴＬＲ阻害剤を含む組成物の有用な投与量の範囲は、例えば、以下：０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、または１〜２０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかでありうる。各個体へと施される絶対量は、バイオアベイラビリティー、クリアランス速度、および投与経路などの薬理学的特性に依存する。
【０２２６】
個体を処置するには、薬剤の活性、投与の様式、投与の目的（すなわち、予防目的または治療目的）、障害の性質および重症度、個体の年齢および体重、異なる用量に応じることが必要でありうる。投与量は一般に、医師または他の医療ケア従事者が、症状の重症度、個体の既往歴など、当技術分野で公知の様々なパラメータに従い選択する。一部の実施形態では、有効量のＴＬＲ阻害剤を、本明細書で記載される方法において使用することができる。
【０２２７】
施される用量の投与は、個別の用量単位の形態の単回投与により実行することもでき、いくつかの小用量単位で実行することもできる。また、数日間隔てた一定の間隔、数週間隔てた一定の間隔、または数カ月間隔てた一定の間隔で反復された複数回にわたる用量の投与も想定される。
【０２２８】
特定のＴＬＲ阻害剤製剤を投与するときの有効量およびＴＬＲ阻害剤製剤を投与する方法は、個別の患者、所望の結果および／または障害の種類、病期、ならびに当業者に明らかな他の因子に基づき変化させることができる。当業者には、特定の適用において有用な投与経路が明らかである。投与経路は、外用経路、皮内経路、経皮経路、経粘膜経路、表皮経路、非経口経路、消化管経路、および鼻咽頭内経路、ならびに気管支内経路および経肺胞経路を含む肺内経路を含むがこれらに限定されない。適切な投与量の範囲は、血液レベルで測定される、約１〜５０μＭの組織濃度を達するのに十分なＴＬＲ阻害剤含有製剤をもたらす範囲である。各患者へと施される絶対量は、バイオアベイラビリティー、クリアランス速度、および投与経路などの薬理学的特性に依存する。
【０２２９】
本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤のうちのいずれが１つを、全身（例えば、非経口）投与または局所（例えば、外用注射または病変内注射）投与により投与することができる。一部の実施形態では、医薬製剤を、外用投与、非経口投与、経口投与、膣内投与、子宮内投与、鼻腔内投与、または吸入投与する。本明細書で記載される通り、望ましくない免疫活性化が生じつつあるか、または望ましくない免疫活性化が生じる可能性が高い組織は、ＴＬＲ阻害剤に対する好ましい標的である。したがって、ＴＬＲ阻害剤の、ウイルスへと曝露されたリンパ節、脾臓、骨髄、血液ならびに組織への投与は、好ましい投与部位である。
【０２３０】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を含む医薬製剤を非経口投与する。非経口投与経路は、経皮注射、経粘膜注射、鼻咽頭注射、肺内注射、および直接注射を含むがこれらに限定されない。注射による非経口投与は、ボーラスおよび注入（例えば、急速注射および緩徐注射）を含む静脈内（ＩＶ）経路、腹腔内（ＩＰ）経路、筋内（ＩＭ）経路、皮下（ＳＣ）経路、および皮内（ＩＤ）経路を含むがこれらに限定されない、任意の非経口注射経路を介しうる。経皮投与および経粘膜投与は、例えば、担体（例えば、ジメチルスルホシキド：ＤＭＳＯ）を組み入れることにより達成することもでき、電気的インパルス（例えば、イオントフォレーシス）を適用することによりにより達成することもでき、これらの組合せにより達成することもできる。使用しうる経皮投与には、様々なデバイスが利用可能である。非経口投与に適するＴＬＲ阻害剤製剤は一般に、ＵＳＰ水中または注射用水中で製剤化し、ｐＨ緩衝剤、塩、増量剤、保存剤、および他の薬学的に許容できる賦形剤をさらに含みうる。非経口注射用の免疫阻害性ポリヌクレオチドは、注射用の食塩水およびリン酸緩衝食塩水など、薬学的に許容できる滅菌等張性溶液中で製剤化することができる。
【０２３１】
経皮投与は、ＴＬＲ阻害剤が皮膚に浸透し、血流に入ることを可能としうるクリーム、洗浄液、ゲルなどを適用することにより達成する。経皮投与に適する組成物は、皮膚へと直接適用されるか、または経皮デバイス（いわゆる「パッチ」）などの保護担体へと組み込まれる、薬学的に許容できる懸濁液、油、クリーム、および軟膏を含むがこれらに限定されない。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えば、Physician’s  Desk  Referenceにおいて見出すことができる。経皮透過はまた、イオントフォレーシスにより、例えば、それらの生成物を、完全な皮膚を介して、数日間以上にわたり持続的に送達する市販のパッチを使用して達成することもできる。この方法の使用は、比較的高濃度における医薬組成物の制御透過を可能とし、組合せ薬物の注入を許容し、吸収促進剤の共時的使用を可能とする。経皮経路および経粘膜経路を介する投与は、持続投与の場合もあり、パルス投与の場合もある。
【０２３２】
消化管投与経路は、経口摂取経路および直腸内経路を含むがこれらに限定されず、例えば、経口摂取のための、薬学的に許容できる粉末、丸剤、または液体、および直腸内投与のための坐剤の使用を含みうる。
【０２３３】
鼻咽頭投与および肺内投与は、吸入により達成し、鼻腔内経路、気管支内経路、および経肺胞経路などの送達経路を含む。エアゾールを形成するための液体懸濁液のほか、乾燥粉末吸入送達系のための粉末形態を含むがこれらに限定されない、吸入による投与に適するＴＬＲ阻害剤製剤も提供される。ＴＬＲ阻害剤製剤の吸入による投与に適するデバイスは、アトマイザー、気化器、ネブライザー、および乾燥粉末吸入送達デバイスを含むがこれらに限定されない。呼吸器粘膜への他の送達法は、点鼻薬によるなど、液体製剤の送達を含む。吸入による投与は、個別の用量で（例えば、計量型吸入器を介して）達成することが好ましいが、注入と同様の送達も、ネブライザーの使用を介して達成することができる。
【０２３４】
本明細書で記載される通り、望ましくない免疫活性化が生じつつあるか、または望ましくない免疫活性化が生じる可能性が高い組織は、ＴＬＲ阻害剤の適切な標的である。したがって、ウイルスへと曝露されたリンパ節、脾臓、骨髄、血液ならびに組織へのＴＬＲ阻害剤組成物の投与は、好ましい投与部位である。
【０２３５】
当技術分野で周知である通り、本明細書で記載される投与経路に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、等張性を調整するための薬剤のうちの任意の１または複数を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル内、ディスポーザブルのシリンジ内、または複数回投与用のバイアル内に封入することができる。
【０２３６】
当技術分野で周知である通り、注射用に適する医薬組成物は、滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与に適する担体は、食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体であるものとする。組成物は、製造条件下および保存条件下で安定であるものとし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒およびこれらの適切な混合物でありうる。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合は、要求される粒子サイズを維持することにより維持することができ、界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。組成物中に等張性薬剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合もある。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に組み入れることによりもたらすことができる。
【０２３７】
当技術分野で周知である通り、滅菌注射用溶液は、活性化合物を、適切な溶媒中に要求される量で、要求に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本分散媒および上記で列挙した成分由来の要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと活性化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液由来の、有効成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす、真空乾燥法および凍結乾燥である。
【０２３８】
本明細書で記載される方法のうちのいずれかでは、ＴＬＲ阻害剤は、免疫応答を阻害するのに十分な量で投与することができる。本明細書で記載される通り、免疫応答は、体液性の場合もあり、かつ／または細胞性の場合もあり、当技術分野で標準的であり、かつ、本明細書で記載される技法を使用して測定する。一部の態様では、本明細書では、ＴＬＲ７依存性細胞刺激、ＴＬＲ８依存性細胞刺激、および／またはＴＬＲ９依存性細胞刺激（例えば、ＴＬＲを発現する細胞内のＴＬＲシグナル伝達）を抑制、低減、および／または阻害するための方法が提供される。一部の態様では、少なくとも１つのＴＬＲ阻害剤を、個体における免疫応答を阻害するのに有効な量で投与する。
【０２３９】
本明細書で裏付けられる通り、一部のＴＬＲ阻害剤は、ＴＬＲ７依存性免疫応答、ＴＬＲ−８依存性免疫応答、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、個体におけるＴＬＲ７依存性免疫応答、ＴＬＲ−８依存性免疫応答、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するための方法であって、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤を、個体におけるＴＬＲ７依存性サイトカイン産生、ＴＬＲ−８依存性サイトカイン産生、および／またはＴＬＲ９依存性サイトカイン産生を抑制するのに十分な量で投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＴＬＲ７依存性免疫応答、ＴＬＲ−８依存性免疫応答、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答は、生得免疫応答である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７依存性免疫応答、ＴＬＲ−８依存性免疫応答、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答は、後天免疫応答である。
【０２４０】
一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、単球、マクロファージ、骨髄性樹状細胞、調節的Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球の応答を阻害する。一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物により阻害される免疫応答は、細胞によるＩＬ−１β、および／またはＴＮＦなど、サイトカイン産生の阻害、細胞成熟の阻害、および／または細胞増殖の阻害を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、ＴＬＲ７依存性細胞応答、ＴＬＲ−８依存性細胞応答、および／またはＴＬＲ９依存性細胞応答を阻害する。
【０２４１】
上述の組成物および投与法は、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤製剤を投与する方法について記載することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではない。多様な組成物およびデバイスを作製する方法は、当業者の能力の範囲内にあり、したがっては、本明細書では詳細に記載しない。
【０２４２】
組合せ治療
本開示のＴＬＲ阻害剤は、１または複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。本明細書で記載される通り、ＴＬＲ阻害剤は、生理学的に許容される担体と組み合わせることができる。本明細書で記載される方法は、抗炎症剤の投与など、障害のための標準治療を構成する他の療法と組み合わせて実施することもできる。
【０２４３】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、コルチコステロイドと組み合わせて投与する。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、グルココルチコステロイドである。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、鉱質コルチコイドである。コルチコステロイドは、コルチコステロンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体、コルチゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｃｏｒｔｏｎｅ）、アルドステロンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体、デキサメタゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｄｅｃａｄｒｏｎ）、プレドニゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｐｒｅｌｏｎｅ）、フルドロコルチゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、ＦＬＯＲＩＮＥＦ（登録商標））、ハイドロコルチゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、コルチゾールまたはＣｏｒｔｅｆ）、ヒドロキシコルチゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体、ベータメタゾンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ）、ブデソニドならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｅｎｔｏｃｏｒｔ  ＥＣ）、メチルプレドニゾロンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｍｅｄｒｏｌ）、プレドニゾロンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ、Ｃａｒｔａｎ、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ、Ｏｒａｓｏｎｅ、またはＳｔｅｒａｐｒｅｄ）、トリアミノロンならびにその誘導体、プロドラッグ、異性体、および類似体（すなわち、ＫｅｎａｃｏｒｔまたはＫｅｎａｌｏｇ）などを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、フルドロコルチゾンまたはその誘導体、プロドラッグ、異性体、もしくは類似体である。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、フルドロコルチゾンである。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、ヒドロキシコルチゾンまたはその誘導体、プロドラッグ、異性体、もしくは類似体である。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、ヒドロキシコルチゾンである。
【０２４４】
一部の実施形態では、コルチコステロイドは、１日当たり約０．００１ｍｇ〜１ｍｇ、０．５ｍｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜２ｍｇ、２ｍｇ〜２０ｍｇ、２０ｍｇ〜４０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、８０〜１２０ｍｇ、１２０ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、または５００ｍｇ〜１０００ｍｇのうちのいずれかの間で投与する。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ〜３５ｍｇ／ｋｇ、または３５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの間で投与する。
【０２４５】
一部の実施形態では、送達されるＴＬＲ阻害剤の量で施される組合せ治療において使用されるＴＬＲ阻害剤は、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、または１〜２０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかでありうる。
【０２４６】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、コルチコステロイド（同時投与）を含むがこれらに限定されない、１または複数のさらなる治療剤と同時に投与する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、コルチコステロイドを含むがこれらに限定されない、さらなる治療剤と共に逐次的に投与する（逐次投与）。一部の実施形態では、逐次投与は、ＴＬＲ阻害剤またはさらなる治療剤を、約１分間、５分間、３０分間、１時間、５時間、２４時間、４８時間、または１週間のうちのいずれか以内に投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、さらなる治療剤と同じ投与経路で投与する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、さらなる治療剤と異なる投与経路で投与する。一部の実施形態では、さらなる治療剤を、非経口投与（例えば、中心静脈ライン注射、動脈内注射、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、皮内注射、または皮下注射）、経口投与、消化管投与、外用投与、鼻咽頭内投与、および肺内投与（例えば、吸入投与または鼻腔内投与）する。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、コルチコステロイドである。
【０２４７】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、１または複数のさらなる治療剤と組み合わせることにより、ＴＬＲ阻害剤またはさらなる治療剤を単独で投与する場合に投与される有効量と比較して同じ結果を達成するように、投与されるＴＬＲ阻害剤および／または１もしくは複数のさらなる治療剤の有効量を低減する（投与される投与容量、投与濃度、および／または総薬物用量を含むがこれらに限定されない）。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、コルチコステロイドと組み合わせることにより、投与されるコルチコステロイドの有効量を、単独で投与されるコルチコステロイドと比較して低減する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、さらなる治療剤と組み合わせることにより、治療剤の投与頻度を、さらなる治療剤の単独での投与と比較して低減する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、さらなる治療剤と組み合わせることにより、処置の総持続期間を、さらなる治療剤の単独での投与と比較して短縮する。一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤を、さらなる治療剤と組み合わせることにより、さらなる治療剤の単独での投与と関連した副作用を軽減する。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、コルチコステロイドである。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、フルドロコルチゾンまたはその誘導体、プロドラッグ、異性体、もしくは類似体である。一部の実施形態では、コルチコステロイドは、フルドロコルチゾンである。一部の実施形態では、有効量のＴＬＲ阻害剤の、さらなる治療剤との組合せは、有効量のＴＬＲ阻害剤単独またはさらなる治療剤単独と比較して有効である。
【０２４８】
ＴＬＲ阻害剤はまた、例えば、ウイルス性生免疫原、細菌性生免疫原、または寄生虫性生免疫原；ウイルス性不活化免疫原、腫瘍由来不活化免疫原、原虫性不活化免疫原、生物由来不活化免疫原、真菌性不活化免疫原、または細菌性不活化免疫原、トキソイド、毒素；自己抗原；多糖；タンパク質；糖タンパク質；ペプチド；細胞ワクチン；ＤＮＡワクチン；組換えタンパク質；組換え糖タンパク質；組換えペプチドなど、体液性免疫応答および／または細胞介在性免疫応答をモジュレートする任意の材料を伴う使用のためのワクチンアジュバントとしても有用でありうる。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤とワクチンとの組合せを含むがこれらに限定されない組合せ治療を、自己免疫疾患または炎症性障害の処置において使用する。一部の態様では、ＴＬＲ阻害剤とワクチンとの組合せを含むがこれらに限定されない組合せ治療を、感染性疾患の処置において使用する。
【０２４９】
一部の実施形態では、ＴＬＲ阻害剤とコルチコステロイドとの組合せを含むがこれらに限定されない組合せ治療を、自己免疫疾患または炎症性障害の処置において使用する。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性皮膚疾患、多発性硬化症、膵炎、糸球体腎炎、腎盂炎、硬化性胆管炎（Sslerosing  cholangitis）、およびＩ型糖尿病から選択されるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、シェーグレン病である。
【０２５０】
Ｖ．キット、バイアル、および単位剤形
本明細書ではまた、ＴＬＲ阻害剤を含むキット、ならびにＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９依存性免疫応答を阻害するための方法における使用のための指示書も提供される。
【０２５１】
キットは、ＴＬＲ阻害剤（またはＴＬＲ阻害剤を含む製剤）を含む１または複数の容器と、一般に書面による指示書であるが、指示書を含有する電子保存媒体（例えば、磁気ディスケットまたは光ディスク）もまた許容可能である指示書のセットであって、ＴＬＲ阻害剤の使用および投与量または意図される処置（例えば、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、および／もしくはＴＬＲ９アゴニストに対する応答の抑制、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／もしくはＴＬＲ９依存性免疫応答の抑制、自己免疫疾患の１もしくは複数の症状の改善、慢性炎症性疾患の症状の改善、ウイルスに応答するサイトカイン産生の減少、ならびに／またはＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／もしくはＴＬＲ９により媒介される疾患もしくは障害の１もしくは複数の症状の処置および／もしくは阻止）のための製剤に関する指示書のセットとを含みうる。キットにより含まれる指示書は一般に、意図される処置のための投与量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。ＴＬＲ阻害剤（またはＴＬＲ阻害剤を含む製剤）のための容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回投与用パッケージ）、または単位未満用量でありうる。キットは、アジュバントを含む容器をさらに含みうる。
【０２５２】
キットの容器は、構成成分を入れ、好ましくは、適切にアリコート分割しうる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器を含みうる。キット内に複数の構成成分が存在する場合、キットは、さらなる構成成分を個別に入れうる、第２の容器、第３の容器、または他のさらなる容器を含有しうる。しかし、構成成分の多様な組合せは、バイアル内にも含まれうる。キットはまた、容器を、市販のための緊密な密封状態で含有するための構成成分も含むことが典型的であろう。このような容器は、所望のバイアルを保持する射出成形によるプラスチック容器またはブロー成形によるプラスチック容器を含みうる。
【０２５３】
キットの構成成分を１および／または複数の液体溶液により提供する場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌の水溶液が特に好ましい。キットの構成成分はまた、乾燥粉末（複数可）として提供することもできる。試薬および／または構成成分を、乾燥粉末として提供する場合、粉末は、適切な溶媒を付加することにより再構成することができる。また、溶媒を別の容器手段により提供することも想定される。
【０２５４】
キットのＴＬＲ阻害剤製剤構成成分は、任意の簡便で適切なパッケージングによりパッケージングすることができる。例えば、ＴＬＲ阻害剤が凍結乾燥製剤である場合は通常、弾性の止栓を介して流体を注入することにより、ＴＬＲ阻害剤を容易に再構成しうるように、弾性の止栓を伴うバイアルを使用する。非弾性で取り外し可能な密栓（例えば、密封ガラス）または弾性の止栓を伴うアンプルが、ＴＬＲ阻害剤の注射用形態に使用するのに最も簡便である。また、キットがＴＬＲ阻害剤の液体製剤を備える場合は、あらかじめ充填されたシリンジも使用することができる。キットは、適切なパッケージング内の外用製剤用の軟膏中にＴＬＲ阻害剤を含有しうる。また、吸入器、鼻腔内投与デバイス（例えば、アトマイザー）、経皮投与デバイス、または注入デバイスなど、ミニポンプなど、特殊なデバイスとの組合せにおける使用のためのパッケージも想定される。
【０２５５】
キットは、キットの構成成分を援用するための指示書のほか、キット内に含まれない他の任意の試薬（複数可）の使用を含みうる。指示書は、実装されうる実施形態を含みうる。
【０２５６】
また、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤または製剤のうちのいずれか１つを含むバイアル（例えば、密封バイアル）も提供される。一部の実施形態では、治療剤を含むバイアルと組み合わせた、ＴＬＲ阻害剤を含むバイアルが提供される。一部の実施形態では、バイアルをキットにより提供する。
【０２５７】
また、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９により媒介される疾患または障害を処置および／または防止するための単位剤形であって、本明細書で記載されるＴＬＲ阻害剤または製剤のうちのいずれか１つを含む剤形も提供される。一部の実施形態では、治療剤の単位剤形と組み合わせた、ＴＬＲ阻害剤を含む単位剤形も提供される。一部の実施形態では、剤形をキットにより提供する。
【実施例】
【０２５８】
略号：ＡＰＳ（抗リン脂質抗体症候群）；ＣＴ（閾値サイクル）；ＣＴＲＬ（対照）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）；ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取法）；ｈＴＬＲ８Ｔｇ（ヒトＴｏｌｌ様受容体８トランスジェニック）；ＩＣ５０（５０％阻害濃度）；ＩＩＳ（免疫阻害性配列）；ＫＯ（ノックアウト）；ｍｃｇまたはμｇ（マイクログラム）；ＭＣＴＤ（混合性結合組織病）；ＭＤＣ（骨髄性樹状細胞）；ＭＯＩ（感染多重度）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＤＣ（形質細胞系樹状細胞）；ＰＮ（ポリヌクレオチド）；ＲＡ（関節リウマチ）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＳＦ（滑液）；ｓｌａｎＤＣ（６−スルホＬａｃＮＡｃ樹状細胞）；ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）；およびＷＴ（野生型）。
【０２５９】
（実施例１）
ＴＬＲ８発現
ＴＬＲ８発現を、ヒト細胞サブセットにおいて解析した。製造業者の指示書に従い、形質細胞系樹状細胞（ｐＤＣ）、単球、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および好中球を、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を介して精製した。製造業者の指示書に従い、ＲＮＡを、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＲＮＡからのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により作り出した。各遺伝子のＣＴ（閾値サイクル）値は、式：相対ＣＴ＝１．８（Ａｖｇ  ＣＴ  Ｕｂｉ  −  ＣＴ  Ｇｅｎｅ）×１００，０００［式中、Ａｖｇ  ＣＴ  Ｕｂｉは、ハウスキーピング遺伝子についての３連ランの平均ＣＴであり、Ａｖｇ  ＣＴ  Ｇｅｎｅは、対象の遺伝子についての２連ランの平均ＣＴであり、１００，０００は、全ての値が１を超えるようにするための係数として任意に選択される］を使用して、ハウスキーピング遺伝子であるユビキチンに照らして標準化した。ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＭ＿１３８６３６．４のヒトＴＬＲ８コード配列を、配列番号１：
【化１】
0006395266.tif 000009
として示す。
【０２６０】
好中球が示したＴＬＲ８発現の最高レベルに、単球、ｍＤＣ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴＬＲ８発現レベルが続いた（例えば、好中球＞＞単球＞ｍＤＣ＞ＣＤ４＋Ｔ細胞）。ｐＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞では、感知可能なＴＬＲ８発現が検出されなかった。
【０２６１】
（実施例２）
ヒト細胞およびマウス細胞においてＲＮＡポリヌクレオチド（ＰＮ）を使用するＴＬＲ７およびＴＬＲ８の活性
ＰＮベースのＴＬＲ７リガンド安定化免疫調節性ＲＮＡ（５’−ＵＲＣＵＲＣＵＵＣＵＲ−／グリセロール／−ＲＵＣＵＵＣＲＵＣＲＵ−５’で、Ｒ＝７−デアザグアノシンとし、以下「ＴＬＲ７アゴニスト」と称し、配列番号２−／グリセロール／−配列番号１１７として示す）およびＰＮベースのＴＬＲ８リガンド安定化免疫調節性ＲＮＡ（５’−Ｍ２ＵＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧ−／グリセロール／−ＧＵＧＵＵＣＧＵＣＧＵＭ２−５’で、Ｍ２＝Ｃ６リンカーとし、以下ＯＲＮ８Ｌまたは「ＴＬＲ８アゴニスト」と称し、配列番号３−／グリセロール／−配列番号１１８として示す）については、既に記載されている（Lanら、PNAS、１０４巻：１３７５０〜１３７５５頁、２００７年）。ＴＬＲ７刺激性ＲＮＡ  ＰＮおよびＴＬＲ８刺激性ＲＮＡ  ＰＮの効果は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびヒト単球におけるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生を測定することにより査定した。ヒト健常ドナー由来の約５×１０５個のＰＢＭＣまたは２×１０５個の単球を、２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、または２００μｇ／ｍＬのＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ７アゴニストで刺激した。２４時間後、上清を、標準的なＥＬＩＳＡ手順により、炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦ−αについて評価した。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニストは、ＰＢＭＣ内のＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生を刺激し、単球内のＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生をより低度に刺激した。
【０２６２】
ＴＬＲ７刺激性ＲＮＡ  ＰＮおよびＴＬＲ８刺激性ＲＮＡ  ＰＮの効果はまた、ＴＬＲ８陰性であるヒトｐＤＣにおいて、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−αの産生を測定することによっても査定した。ヒト健常ドナー由来の約１×１０５個のｐＤＣを、１００μｇ／ｍＬのＴＬＲ８アゴニストもしくはＴＬＲ７アゴニスト（Lanら、PNAS、１０４巻：１３７５０〜１３７５５頁、２００７年）または培地単独で刺激した。２４時間後、標準的なＥＬＩＳＡ手順により、上清を、炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αについて評価した。ＴＬＲ７アゴニストは、ヒトｐＤＣによるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−αの産生を刺激したが、ＴＬＲ８アゴニストはこれを刺激しなかった。したがって、ＴＬＲ８アゴニストは、ＴＬＲ８に特異的である。
【０２６３】
ＴＬＲ７刺激性ＲＮＡ  ＰＮおよびＴＬＲ８刺激性ＲＮＡ  ＰＮの効果は、マウス細胞においても、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生を測定することによりさらに査定した。マウス脾臓細胞およびＰＢＭＣを、１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌ野生型マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）およびＴＬＲ７ＫＯマウスから調製した。約５×１０５個の細胞を、１００μｇ／ｍｌのＴＬＲ８アゴニストまたはＴＬＲ７アゴニストで刺激した。ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、標準的な技法を使用して、ＥＬＩＳＡで測定した。ＴＬＲ７アゴニストは、マウス脾臓細胞およびマウスＰＢＭＣによるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生を刺激したが、ＴＬＲ８アゴニストはこれを刺激しなかった。
【０２６４】
（実施例３）
ＴＬＲ７特異的阻害、ＴＬＲ８特異的阻害、およびＴＬＲ９特異的阻害についてのスクリーニングアッセイ
以下のＴＬＲ７特異的スクリーニングアッセイ、ＴＬＲ８特異的スクリーニングアッセイ、およびＴＬＲ９特異的スクリーニングアッセイを使用して、被験ポリヌクレオチド（ＰＮ）の阻害活性を査定した。最小で３例のドナーからの平均結果を、サイトカインレベルまたは阻害％として報告した。阻害パーセントは、
［１−（Ｒｉ／Ｒｏ）］×１００％［式中、Ｒｉ＝被験ＰＮ＋刺激剤のサイトカインレベルであり、Ｒｏ＝刺激剤だけのサイトカインレベルである］
として計算した。
【０２６５】
十分な滴定点を伴うアッセイのためには一般に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５ソフトウェアを使用して、最小で約１０−３の桁数のＩＣ５０値（５０％阻害濃度）を計算した。これらのアッセイでは初代細胞を使用するため、刺激のために使用されるアゴニストおよびＴＬＲ阻害剤の両方に応じて、ドナーにある程度の変化をもたせた。したがって、アッセイ間の定性的比較は、異なるドナーを使用して行ったが、定量的比較は、同じドナーのセットで試験するＰＮだけについて行った。
【０２６６】
ヒト形質細胞系樹状細胞（ＰＤＣ）におけるＴＬＲ７特異的阻害についてのスクリーニングアッセイ
インフルエンザウイルス株ＰＲ／８（ＡＴＣＣ）で刺激されたヒトＰＤＣは、ＩＦＮ−αを産生することにより応答する。この応答は、ＴＬＲ７シグナル伝達に依存し、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９には依存しない。
【０２６７】
ヒトＰＤＣは、製造業者の指示書に従い、Ｍｅｌｔｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（カタログ番号１３０−０９０−５３２）製の陽性選択キットを使用して単離した。初代ヒトＰＤＣ（ウェル１つ当たり３〜５×１０４個の細胞）を、単独であるか、または被験ＰＮの存在下にある、完全培地中の感染多重度（ＭＯＩ）を２とする熱不活化インフルエンザで、３７℃で１８〜２４時間にわたり刺激した。被験ポリヌクレオチドの濃度は、０．００２μＭ〜１μＭの範囲としたが、全ての濃度を全ての実験で使用したわけではなかった。１８〜２４時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２６８】
ヒト単球におけるＴＬＲ８特異的阻害についてのスクリーニングアッセイ
ＴＬＲ８特異的アゴニストであるＯＲＮ８Ｌで刺激されたヒト単球は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６を産生することにより応答する。この応答は、ＴＬＲ８シグナル伝達に依存し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９には依存しない。
【０２６９】
ヒト単球は、製造業者の指示書に従い、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（カタログ番号１４０６８）製の陰性枯渇キットを使用して単離した。初代ヒト単球（ウェル１つ当たり５×１０５個の細胞）を、単独であるか、または被験ＰＮの存在下にある、完全培地中に１５０μｇ／ｍＬのＯＲＮ８Ｌで、３７℃で１６〜１８時間にわたり刺激した。被験ポリヌクレオチドの濃度は、０．００２μＭ〜１μＭの範囲としたが、全ての濃度を全ての実験で使用したわけではなかった。１６〜１８時間後、上清を回収し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６のレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。ＴＮＦ−αレベル、ＩＬ−１βレベル、およびＩＬ−６レベルを測定することから決定されたＰＮの阻害性応答は同じ傾向を示したので、各実験について全てのサイトカインを測定したわけではなかった。
【０２７０】
ヒトＢ細胞およびヒトＰＤＣにおけるＴＬＲ９特異的阻害についてのスクリーニングアッセイ
ＴＬＲ９特異的阻害についてのスクリーニングアッセイを、ヒトＢ細胞、ヒトＰＤＣ、またはこれらの両方において実施した。ＣｐＧ含有免疫刺激性配列（ＩＳＳ）で刺激されたヒトＢ細胞は、ＩＬ−６を産生することにより応答する。この応答は、ＴＬＲ９シグナル伝達に依存し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８には依存しない。ＣｐＧ含有免疫刺激性配列（ＩＳＳ）で刺激されたヒトＰＤＣは、ＩＦＮ−αを産生することにより応答する。この応答は、ＴＬＲ９シグナル伝達に依存し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８には依存しない。
【０２７１】
ヒトＢ細胞は、製造業者の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（カタログ番号１３０−０５０−３０１）製の陽性選択キットを使用して単離した。初代ヒトＢ細胞（ウェル１つ当たり２×１０５個の細胞）を、単独であるか、または被験ＰＮの存在下にある、完全培地中に１μＭのＴＬＲ９Ｌ  ＣｐＧ−ＩＳＳ  １０１８（配列番号４として示される５’−ＴＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  Ａ−３’）で、３７℃で４０〜４８時間にわたり刺激した。被験ポリヌクレオチドの濃度は、０．０３μＭ〜２μＭの範囲としたが、全ての濃度を全ての実験で使用したわけではなかった。４０〜４８時間後、上清を回収し、ＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２７２】
ヒトＰＤＣは、製造業者の指示書に従い、Ｍｅｌｔｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（カタログ番号１３０〜０９０〜５３２）製の陽性選択キットを使用して単離した。初代ヒトＰＤＣ（ウェル１つ当たり３〜５×１０４個の細胞）を、単独であるか、または被験ＰＮの存在下にある、完全培地中に０．５μＭのＴＬＲ９Ｌ  ＣｐＧ−ＩＳＳ  Ｃ２７４（配列番号５として示される５’−ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ−３’）で、３７℃で１８〜２４時間にわたり刺激した。被験ポリヌクレオチドの濃度は、０．００２μＭ〜１μＭの範囲としたが、全ての濃度を全ての実験で使用したわけではなかった。１８〜２４時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２７３】
（実施例４）
ポリヌクレオチド（ＰＮ）配列
表４−１は、本開示を通して言及されるＰＮの配列を示す。大文字は、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を表し、小文字は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ）を表す。別段に言及されない限りにおいて、ヌクレオチド間連結は全て、ホスホロチオエートであった。ＰＮは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）による標準的な固相ＤＮＡ合成手順を使用して合成した。「Ｉ」は、２’−デオキシイノシンを表す。
【表４−１−１】
0006395266.tif 000010
【表４−１−２】
0006395266.tif 000011
【表４−１−３】
0006395266.tif 000012
【０２７４】
（実施例５）
ＴＬＲ７阻害剤は、ＴＬＲ８を必ずしも阻害するわけではない
公知のＴＬＲ７阻害剤を、実施例３で記載したＴＬＲ７特異的阻害アッセイおよびＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおいて試験した。予測される通り、ＭＯＩを２とする不活化インフルエンザウイルスで刺激されたＰＤＣでは、３０ｎＭの濃度のＣ９５４、ＤＶ１９７、およびＤＶ１３４の全てが、ＴＬＲ７に媒介されるＩＦＮ−α産生の良好な阻害を示した（図１Ａおよび図１Ｂ）。しかし、ＯＲＮ８Ｌで刺激された単球では、ＤＶ１９７だけが、ＴＬＲ８に媒介されるＴＮＦ−α産生およびＩＬ−１β産生の良好な阻害を示した（図２Ａおよび図２Ｂ）。既に、５’−ＴＧＣおよび５’−ｕｇｃは、ＴＬＲ７／８阻害性モチーフであることが報告されていた（例えば、米国公開第２００７／０２３８６７８号；および米国公開第２０１１／０００３８８５号を参照されたい）。加えて、３’−ＧＴおよび３’−ｇｕ［配列中、Ｇは、グアニンまたは７−デアザグアノシンである］も、ＴＬＲ８阻害性モチーフであることが既に報告されていた（例えば、米国公開第２００５／０２３９７３３号を参照されたい）。したがって、本開示の展開において、これらの推定ＴＬＲ８モチーフが、ＴＬＲ８を阻害するのに十分ではないことは、驚くべきことであった。とりわけ、ＤＶ１９７は、ＰＮの３’末端において、３’−ＧＩを含有するが、Ｃ９５４、ＤＶ１３４、およびＤＶＸ１０は、これを含有しない。したがって、本明細書で裏付けられる通り、３’−ＧＴおよび３’−ｇｕは、ＴＬＲ８を阻害するのに十分ではない。加えて、ＤＶ１９７、Ｃ９５４、ＤＶ１３４、およびＤＶＸ１０はいずれも５’−ＴＧＣまたは５’−ｕｇｃを含有するが、強力なＴＬＲ８阻害剤はＤＶ１９７だけである（図３Ａおよび図３Ｂ）。したがって、本明細書で裏付けられる通り、５’−ＴＧＣまたは５’−ｕｇｃは、ＴＬＲ８を阻害するのに十分ではない。
【０２７５】
（実施例６）
ＤＶ１９７は、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトＴＬＲ８トランスジェニックマウスにおいて、ＴＬＲ８活性化を阻害する  
ヒトＴＬＲ８トランスジェニックマウスを、既に記載されている（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３１３０７号）通りに作り出した。１〜２コピーのｈＴＬＲ８をゲノムへと組み込んだクローン８のキメラマウスは、交配および生殖細胞系列の伝達が可能であった。したがって、ＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスを、さらなる研究に使用した。
【０２７６】
ＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスに、単独で、または皮下投与されるＤＶ１９７（１００ｍｃｇ）と組み合わせて、３００ｍｃｇのＯＲＮ８Ｌ（ＴＬＲ８アゴニスト）を静脈内注射した。６時間後、マウスから採血し、ＩＬ−１２を、ＥＬＩＳＡで測定した。図４に示される通り、ＤＶ１９７は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴＬＲ８活性化を阻害することが可能である。
【０２７７】
（実施例７）
３’−ヌクレオチドの同一性は、ＴＬＲ８阻害活性に重要である
３’末端において、Ｉの代わりに、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣを含有するＤＶ１９７類似体（それぞれ、ＤＶＸ１、ＤＶＸ２、ＤＶＸ３、およびＤＶＸ４）を、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおいて試験した。図５に示される通り、３’−ヌクレオチドは、ＴＬＲ８阻害活性に極めて重要であり、３’−Ｉまたは３’−Ａが最も活性である。また、３’末端において、ＤＶ１９７のようなＧＡＧＩの代わりに、ＧＧＧＩを含有するＤＶＸ５も、ＴＬＲ８阻害活性を保持した（０．７５μＭにおいて約９０％の阻害）。
【０２７８】
（実施例８）
ＤＮＡ  ＰＮおよびキメラ２’−Ｏ−メチルＲＮＡ／ＤＮＡ  ＰＮは、ＴＬＲ８阻害活性を有する
５’末端において、異なる量の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ修飾を含有するＤＶ１９７類似体（ＤＶＸ６、ＤＶＸ７、ＤＶＸ８、ＤＶＸ９、ＤＶＸ２４、ＤＶＸ２５、およびＤＶＸ２６）を、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおいて試験した。図６および図７に示される通り、ＤＮＡヌクレオチドだけを含有するＤＶＸ８およびＤＶＸ２６は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡがＴＬＲ８阻害活性に要求されないことを示す。加えて、ＤＶＸ２５における２’−Ｏ−メチルＲＮＡに対する完全な修飾は、ＴＬＲ８阻害活性を低減するが、キメラ２’−Ｏ−メチルＲＮＡ／ＤＮＡ  ＰＮも、ＴＬＲ８阻害活性を有する。
【０２７９】
（実施例９）
３’末端への付加および３’末端からの欠失の、ＴＬＲ８阻害活性に対する効果
１つ、２つ、もしくは３つのチミジン（Ｔ）ヌクレオチドを３’末端へと付加したＤＶ１９７類似体（それぞれ、ＤＶＸ１１、ＤＶＸ１２、およびＤＶＸ１３）、または１つ、２つ、もしくは３つのヌクレオチドを３’末端から欠失させたＤＶ１９７類似体（ＤＶＸ１４、ＤＶＸ１５、およびＤＶＸ１６）を、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおいて試験した。図８に示される通り、ＴＬＲ８阻害活性をほとんど喪失させずに、１つのヌクレオチドを３’末端へと付加することができる。さらに、欠失シリーズも、３’−Ａが、ＴＬＲ８阻害活性に、３’−Ｇを凌いで好ましいことを裏付ける（図８）。これらの結果により、３’末端がＴＬＲ８阻害活性に重要であることが確認される。
【０２８０】
（実施例１０）
ＴＬＲ８阻害性モチーフの規定
さらなるＰＮをデザインして、最小限のＴＬＲ８阻害性モチーフおよびポリヌクレオチド長を規定するほか、最適のＴＬＲ８阻害性配列を同定した。新たなＰＮを、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおいて試験した。結果を表１０−１にまとめる。
【表１０−１−１】
0006395266.tif 000013
【表１０−１−２】
0006395266.tif 000014
【表１０−１−３】
0006395266.tif 000015
【０２８１】
ＤＶ１９７配列またはＤＶＸ８配列において、ＧをＩで置きかえる結果として、ＴＬＲ８阻害活性が同様であるかまたはＴＬＲ８阻害活性を増大させたＰＮがもたらされた。他方、ＤＶＸ８配列内のＡ、Ｃ、またはＴを置きかえたＰＮは、不活性であった（図１０および表１０−１；実験Ａ）。
【０２８２】
５’−ＴＧＣの代わりに、５’−ＴＩＣ、５’−ＴＡＣ、５’−ＴＴＣ、または５’−ＴＣＣを含有するＤＶＸ２６類似体はいずれも、同様のＴＬＲ８阻害活性を示したことから、５’−ＴＧＣは、ＴＬＲ８の阻害に要求されないことが確認される。また、これらの結果により、ＰＮの５’末端が、ＴＬＲ８阻害活性に重要ではないことも確認された（表１０−１；実験Ｂ）。
【０２８３】
加えて、表１０−１の実験Ｃ〜Ｇにより、３’末端における４つのヌクレオチドの、ＴＬＲ８阻害活性に対する重要性を査定した。これらの結果を、本開示の展開においてなされた前出の観察と組み合わせることにより、３’末端においてＩＩ、ＩＡ、ＧＩ、またはＧＡを伴うＰＮは、良好なＴＬＲ８阻害活性を有したことが示される。
【０２８４】
表１０−１の実験Ｈ〜Ｊにより、ＰＮの３’末端におけるＩＩを維持しながら、ヌクレオチドの中央部の、ＴＬＲ８阻害活性に対する重要性を査定した。これらの実験における全ての被験ＰＮは、ＴＬＲ８阻害活性を有した。
【０２８５】
表１０−１の実験Ｋにより、ＰＮがＴＬＲ８阻害活性を維持するための最小限の長さを査定した。ＤＶＸ６１は、３’末端においてＩＩを含有する６マーであり、良好なＴＬＲ８阻害活性を示した。
【０２８６】
表１０−１の実験Ｌ、Ｎ、およびＯにより、３’末端においてＩＩを含有する、様々な１８マー〜２１マーのＴＬＲ８阻害活性を査定した。この実験における全ての被験ＰＮは、良好なＴＬＲ８阻害活性を有した。しかし、いくつかの差異も観察されたことから、ＰＮ内の他のヌクレオチドが、ＴＬＲ８阻害活性に効果を及ぼす場合もあることが指し示される。加えて、ＰＮが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３’−エクソヌクレアーゼにより分解されると、ＴＬＲ８阻害性モチーフが再生するように、ＤＶＸ８６、ＤＶＸ９６、ＤＶＸ９７、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ１００、およびＤＶＸ１０１もデザインした。例えば、これらのＰＮの各々は、３’末端において、５’−ＩＩＡＩＩ−３’という配列を有する。３’−エクソヌクレアーゼにより逐次的な分解がなされれば、ＰＮの３’末端において、以下の配列：５’−ＩＩＡＩ−３’、５’−ＩＩＡ−３’、および５’−ＩＩ−３’が残されるであろう。これらのうち、５’−ＩＩＡＩ−３’を除く全ては、ＴＬＲ８阻害性モチーフである。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３’−エクソヌクレアーゼにより分解されると、ＴＬＲ８阻害性モチーフを再生させるようにデザインされたＰＮのＴＬＲ８阻害の半減期は、単一のＴＬＲ８阻害性モチーフだけを含有するＰＮの半減期より長いことが予測される。
【０２８７】
表１０−１の実験ＰおよびＱにより、ＴＬＲ８阻害性モチーフを含有する、さらなるポリヌクレオチドのＴＬＲ８阻害活性を査定した。ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、ＤＶＸ１０５、ＤＶＸ１０６、ＤＶＸ１０７、ＤＶＸ１０８、およびＤＶＸ１０９はいずれも、良好なＴＬＲ８阻害活性を示した。
【０２８８】
（実施例１１）
ＴＬＲ７だけの阻害活性を伴うポリヌクレオチド、ＴＬＲ８だけの阻害活性を伴うポリヌクレオチド、またはＴＬＲ７／８の阻害活性を伴うポリヌクレオチド
本開示の展開において決定される通り、ＴＬＲ７阻害性モチーフとＴＬＲ８阻害性モチーフとは異なる。したがって、ＰＮは、固有のモチーフを組み入れたり除外したりすることにより、ＴＬＲ７だけの阻害活性、ＴＬＲ８だけの阻害活性、またはＴＬＲ７／８の阻害活性を有するようにデザインすることができる。これを裏付けるため、実施例３で記載したＴＬＲ７特異的アッセイおよびＴＬＲ８特異的阻害性アッセイにおいて、ＴＬＲ７モチーフだけを含有するＰＮ、ＴＬＲ８モチーフだけを含有するＰＮ、またはＴＬＲ７モチーフおよびＴＬＲ８モチーフの両方を含有するＰＮを試験した。
【０２８９】
実施例５で記載した通り、Ｃ９５４およびＤＶ１３４は、ＴＬＲ７阻害性モチーフは含有するが、ＴＬＲ８阻害性モチーフは含有せず、ＴＬＲ７阻害活性だけを有する。表１０−１の実験Ｍおよび図９は、ＤＶＸ８９、ＤＶＸ９０、およびＤＶＸ９２は、ＴＬＲ７阻害活性およびＴＬＲ８阻害活性を有するが、ＤＶＸ９１およびＤＶＸ９３は、ＴＬＲ８阻害活性だけを有することを示す。同様に、表１０−１の実験ＡおよびＢならびに図１０は、ＤＶＸ３５は、ＴＬＲ７阻害活性およびＴＬＲ８阻害活性は有するが、ＤＶＸ４２は、ＴＬＲ８阻害活性だけを有することも示す。ＤＶＸ８９、ＤＶＸ９０、ＤＶＸ９１、ＤＶＸ９２、ＤＶＸ９３、ＤＶＸ３５、およびＤＶＸ４２のいずれも、ＴＬＲ８阻害性モチーフ（３’末端におけるＩＩまたはＧＩ）を含有したため、ＴＬＲ８阻害活性の保持が予測された。これに対し、５’−ＴＩＣおよび５’−ＴＴＣは、ＴＬＲ７阻害性モチーフであることが見出された。前出の研究では、５’−ＴＧＣは、ＴＬＲ７阻害性モチーフとして記載されたが、５’−ＴＩＣまたは５’−ＴＴＣはＴＬＲ７阻害性モチーフとして記載されなかったため、後者の観察は驚くべきことである。本開示の展開では、非特異的ＴＬＲ７／８アゴニストであるＲ８４８で刺激されたマウス脾臓細胞とは対照的に、部分的には、選択的ＴＬＲ７アゴニスト（インフルエンザウイルス）で刺激されたヒトＰＢＭＣの使用を介して、２つの新たなＴＬＲ７阻害性モチーフについての記載が可能となった。これは、ヒトＴＬＲ８を発現させる細胞においてＴＬＲ８阻害剤について試験することの重要性を強調する。
【０２９０】
他の多くのＰＮの中でも、ＤＶ１９７およびＤＶＸ８１など、ＴＬＲ７阻害性モチーフおよびＴＬＲ８阻害性モチーフの両方を含有するさらなるＰＮはまた、ＴＬＲ７／８阻害活性を有することも示された（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、１１、２１、２２、および２３、ならびに表１０−１の実験Ｌ、Ｎ、Ｏ、およびＰ）。ＴＬＲ７阻害性アッセイにおけるＤＶＸ８１のＩＣ５０は、１２ｎＭであり、ＴＬＲ８特異的阻害アッセイにおけるＩＣ５０はそれぞれ、２６ｎＭ（ＴＮＦα）および５８ｎＭ（ＩＬ−１β）であった。さらなる例示的なＴＬＲ７／８阻害剤は、表１０−１の実験Ｐおよび図２３に示される通り、5’-TIC  TCC  TTG  AGI  AII-’  (DVX103;  配列番号108);  5’-TIC  TCC  TCC  TTG  AGI  AII-’(DVX104、配列番号109);  5’-TIC  TTC  TCC  TTG  AGI  AII-’(DVX105、配列番号110);および  5’-TIC  TCC  TCC  TTG  IIA  II-’(DVX106、配列番号111)である。
【０２９１】
さらなる例示的なＴＬＲ８だけの阻害剤は、表１０−１の実験Ｐおよび図２２に示される通り、5’-TCC  TCC  TTG  AGI  AII  -’  (DVX102;  配列番号107)である。
【０２９２】
ＴＬＲ７／８阻害性応答の選択性は、実施例３に記載されている通り、Ｂ細胞を使用するＴＬＲ９特異的阻害性アッセイにおいて、ＤＶＸ８１を査定することにより裏付けられた。ＤＶＸ８１は、ＴＬＲ９阻害性モチーフを含有しない。ＴＬＲ７阻害性モチーフおよびＴＬＲ９阻害性モチーフを含有するＣ９５４を、陽性対照として使用した。図１２に示される通り、ＤＶＸ８１は、ＴＬＲ９を阻害しない。
【０２９３】
（実施例１２）
ＴＬＲ８／９阻害活性を伴うポリヌクレオチドまたはＴＬＲ７／８／９阻害活性を伴うポリヌクレオチド
ＴＬＲ７阻害性モチーフと、ＴＬＲ８阻害性モチーフと、ＴＬＲ９阻害性モチーフとは異なるので、ＰＮはまた、固有のモチーフを組み入れたり除外したりすることにより、ＴＬＲ８／９阻害活性またはＴＬＲ７／８／９阻害活性を有するようにもデザインすることができる。これを裏付けるため、ＴＬＲ８モチーフおよびＴＬＲ９モチーフを含有するＰＮを、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害性アッセイおよびＴＬＲ９特異的阻害性アッセイにおいて試験した。加えて、ＴＬＲ７モチーフ、ＴＬＲ８モチーフ、およびＴＬＲ９モチーフを含有するＰＮまた、ＴＬＲ７特異的阻害性アッセイ、ＴＬＲ８特異的阻害性アッセイ、およびＴＬＲ９特異的阻害性アッセイにおいて試験した。例示的なＴＬＲ８／９阻害剤は、5’-TAC  TCC  TTG  GII-’  (配列番号81);および5’-TCC  TGG  AGG  GGT  TIA  II-3  (配列番号112)である。例示的なＴＬＲ７／８／９阻害剤は、5’-ugc  TGC  TCC  TTG  GGI-’  (配列番号14);  5’-TIC  TCC  TTI  GII-’  (配列番号66);  5’-TGC  TCC  TGG  AGG  GGT  TIA  II-’  (配列番号113);  5’-TIC  TCC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号114);および5’-TIC  TTC  TCC  TTG  GGI  AII-’  (配列番号115)である。
【０２９４】
ＤＶＸ１０７（配列番号１１２）は、ＴＬＲ８／９阻害剤としてデザインし、ＤＶＸ１０８（配列番号１１３）は、ＴＬＲ７／８／９阻害剤としてデザインした。ＰＮを、実施例３で記載したＴＬＲ８特異的阻害性アッセイおよびＴＬＲ９特異的阻害性アッセイにおいて試験した。表１０−１の実験Ｑにおける結果は、いずれのＰＮもＴＬＲ８を阻害することを示す。図３７における結果は、ＤＶＸ１０７およびＤＶＸ１０８がまた、ＴＬＲ９も阻害することを示す。さらに、ＤＶＸ１０８は、ＴＬＲ７を阻害することが公知の５’−ＴＧＣモチーフ（実施例１１を参照されたい）も含有する。
【０２９５】
（実施例１３）
健常ＰＢＭＣのＲＡ患者の血漿による刺激は、ＴＬＲ７／８依存性に依存する
３例の健常ドナー由来の約７×１０５個のＰＢＭＣ細胞を、２００μＬの培地中、１マイクロモルの濃度のＴＬＲ阻害剤の非存在下または存在下で、３例の関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の血漿３０μＬ、または３例の正常個体由来の血漿３０μＬと共にインキュベートした。上清をＥＬＩＳＡにより、１６〜１８時間後におけるＩＬ−８濃度について査定した。被験阻害剤は、ＤＶ１９７（ＴＬＲ７／８阻害剤）およびＤＶＸ４２（ＴＬＲ８だけの阻害剤）であった。
【０２９６】
図１３に示される通り、ＲＡ患者由来の血漿は、ＩＬ−８を刺激するが、正常個体由来の血漿は、ＩＬ−８を刺激しない。ＲＡ患者の血漿によるＩＬ−８の刺激は、ＤＶ１９７およびＤＶＸ４２の両方により阻害された。ＴＬＲ７阻害性モチーフおよびＴＬＲ８阻害性モチーフの両方を含有するＤＶ１９７は、ＤＶＸ４２より高度にＩＬ−８分泌を阻害した。これらの結果は、健常ＰＢＭＣの、ＲＡ患者の血漿による刺激が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方に依存することを裏付ける。
【０２９７】
第２の研究は、８例の個別のＲＡ患者由来の血漿を刺激のために使用し、ＤＶＸ８１（ＴＬＲ７／８阻害剤）を、阻害剤として使用することを除き、上記で記載した通りに実施した。結果は、平均し、ウィルコクソンマッチドペアｔ検定を使用してＰ値を決定した。図１４に示される通り、ＴＬＲ７／８二重阻害剤であるＤＶＸ８１は、ＲＡ血漿で刺激されたＰＢＭＣによるＩＬ−８分泌を阻害する。健常患者の血漿は、ＩＬ−８を刺激しなかった（データは示さない）。
【０２９８】
（実施例１４）
ＲＡ患者由来のＳＦによるヒト単球の刺激は、ＴＬＲ７／８に依存する
無傷ＣＤ１４＋単球は、製造業者の指示書に従い、陰性選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、カタログ番号１４０６８）を使用して、バフィーコートから単離した。純度は日常的に、９８％を超えた。約３×１０５個の細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ）中、単独であるか、またはＤＶ１９７（１μＭ）と組み合わせた、関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の１５％滑液（ＳＦ）の存在下でインキュベートした。滑液は、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得た。１４〜１６時間後、上清を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、サイトカインレベルについてアッセイした。データは、滑液単独のサイトカインレベルパーセントとして表し、各サイトカインの平均レベルを、ＳＦバーの上方に指し示す。データは、少なくとも３例の独立の健常単球ドナーについて試験した、７例の滑液による累積データである。Ｐ値は、ウィルコクソンマッチドペア符号順位検定を使用して決定した。
【０２９９】
図１５に示される通り、ＲＡ患者由来のＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−α、およびＶＥＧＦの産生を刺激し、ＳＦで刺激されたサイトカイン産生は、ＴＬＲ７／８阻害剤であるＤＶ１９７により阻害することができる。
【０３００】
（実施例１５）
ＤＶＸ８１は、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトＴＬＲ８トランスジェニックマウスにおいて、ＴＬＲ８活性化を阻害する
ｉｎ  ｖｉｖｏのＤＶＸ８１の活性は、ｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスにおいて査定した。ｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスに、静脈内で施される２２０ｍｃｇのＯＲＮ８Ｌを、単独で、またはこれもまた静脈内で施されるＤＶＸ８１（１００ｍｃｇ）との組合せで注射した。ＴＬＲ８に媒介されるＩＬ−１２誘導に対する効果は、２時間後または一晩後（Ｏ／Ｎ）において、ＥＬＩＳＡで測定した。図１６に示される通り、ＤＶＸ８１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴＬＲ８活性化を阻害することが可能である。
【０３０１】
（実施例１６）
ポリヌクレオチドの存在下で培養されたヒトＢ細胞
ポリヌクレオチドの、非特異的ヒトＢ細胞活性に対する効果は、ＩＬ−６についてアッセイすることにより決定した。ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結に起因して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける何らかのヒトＢ細胞応答を誘導するが、霊長動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏのＢ細胞活性化の証拠は示されていない。
【０３０２】
ヒトＢ細胞アッセイのために、磁気ビーズ（ＣＤ１９陽性）を使用して、Ｂ細胞を、健常ドナーから得られる血液細胞から精製した。細胞は、新鮮な培地（１０％のウシ胎仔血清、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２ｍＭのグルタミンを伴うＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させた。次いで、細胞を、０．０１５μＭ〜４．０μＭの表示のポリヌクレオチドと共にインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、ＩＬ−６を、免疫アッセイにより測定した。被験ポリヌクレオチドは、Ｃ９５４、ＤＶ１８５、ＤＶＸ８１、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ４２、ＤＶＸ１０２、およびＤＶＸ１０３であった。Ｃ９５４は、低レベルのＩＬ−６を刺激することが公知であるが、ＤＶ１８５は、高レベルのＩＬ−６を刺激することが公知である。各ポリヌクレオチドにより誘導されるＩＬ−６の量を、Ｃ９５４により誘導されるＩＬ−６の量で割って、Ｃ９５４と比べたＩＬ−６誘導の大きさを決定した。
【０３０３】
図１７、図１８、および図１９は、異なるポリヌクレオチドが、ヒトＢ細胞によるある範囲のＩＬ−６応答を誘導することを示す。予測される通り、ＤＶ１８５は、Ｃ９５４より著明に多くのＩＬ−６を誘導した。驚くべきことに、ＤＶＸ８２は、同じＴＬＲ７／８モチーフ、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および多数のヌクレオチドを有するにもかかわらず、ＤＶＸ８１より著明に少ないＩＬ−６を誘導した。ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ４２、ＤＶＸ１０２、およびＤＶＸ１０３は、ヒトＢ細胞による低レベルのＩＬ−６を誘導した。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９により媒介される応答を阻害するための組成物内に組み入れ、自己免疫疾患または炎症性障害を処置または防止するための医薬内に組み入れるには、ヒトＢ細胞を最小限に活性化させるだけのポリヌクレオチドが好ましい。
【０３０４】
（実施例１７）
ポリヌクレオチドの存在下で培養されたラット脾臓細胞
８〜９週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット由来の脾臓細胞を採取し、消化された断片を、金属製の篩を通して押し出すことにより、機械的に分散させた。分散させた脾臓細胞は、遠心分離によりペレット化し、次いで、新鮮な培地（１０％のウシ胎仔血清に、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、および０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させた。次いで、細胞を、０．０６μＭ〜４．０μＭの多様なポリヌクレオチドと共にインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、ＩＬ−６を、免疫アッセイにより測定した。被験ポリヌクレオチドは、Ｃ９５４、ＤＶ１８５、ＤＶＸ８１、およびＤＶＸ８２であった。Ｃ９５４は、低レベルのＩＬ−６を刺激することが公知であるが、ＤＶ１８５は、高レベルのＩＬ−６を刺激することが公知である。各ポリヌクレオチドにより誘導されるＩＬ−６の量を、Ｃ９５４により誘導されるＩＬ−６の量で割って、Ｃ９５４と比べたＩＬ−６誘導の大きさを決定した。
【０３０５】
図２０は、異なるポリヌクレオチドが、ラット脾臓細胞によるある範囲のＩＬ−６応答を誘導することを示す。ラット脾臓細胞を使用して得られた結果は、ヒトＢ細胞を使用して得られた結果と矛盾しなかった。ＴＬＲ７により媒介される応答、ＴＬＲ８により媒介される応答、および／またはＴＬＲ９により媒介される応答を阻害するための組成物内に組み入れ、自己免疫疾患または炎症性障害を処置または防止するための医薬内に組み入れるには、ラット脾臓細胞を最小限に活性化させるだけのポリヌクレオチドが好ましい。
【０３０６】
（実施例１８）
ＴＬＲ７阻害性モチーフを伴うポリヌクレオチドは、マウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏの、ＴＬＲ７に媒介される免疫応答を阻害する
１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスに、静脈内で施される２５０ｍｃｇのＯＲＮ７リガンド（ＴＬＲ７アゴニスト）を、単独で、または皮下で施されるＣ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、またはＤＶＸ９９（１００ｍｃｇ）との組合せで注射した。２時間後、マウスから採血し、ＩＬ−１２を、ＥＬＩＳＡで測定した。図２４に示される通り、Ｃ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、およびＤＶＸ９９は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＴＬＲ７に媒介されるＩＬ−１２誘導を阻害することが可能である。
【０３０７】
同様に、１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスに、静脈内で施される２５０ｍｃｇのＯＲＮ７リガンド（ＴＬＲ７アゴニスト）を、単独で、または皮下で施されるＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、またはＤＶＸ９９（１００ｍｃｇ）との組合せで注射した。６時間後、マウスから採血し、ＩＬ−１２を、ＥＬＩＳＡで測定した。図２５に示される通り、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、およびＤＶＸ９９は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＴＬＲ７に媒介されるＩＬ−１２誘導を阻害することが可能である。
【０３０８】
（実施例１９）
ＴＬＲ阻害性モチーフを伴うポリヌクレオチドは、オフターゲット効果を呈示しない
ポリヌクレオチドであるＤＶＸ３６（ＴＬＲ７モチーフ、ＴＬＲ８モチーフ、またはＴＬＲ９モチーフを伴わない）、ＤＶＸ９８（ＴＬＲ７／８モチーフを伴う）、ＤＶＸ１０２（ＴＬＲ８モチーフを伴う）、ＤＶＸ１０３（ＴＬＲ７／８モチーフを伴う）、およびＣ９５４（ＴＬＲ７／９モチーフを伴う）を、オフターゲット効果について試験した。ヒトＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）法を使用して、健常ドナーから得られる全血液細胞から単離した。細胞は、新鮮な培地（１０％のウシ胎仔血清、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２ｍＭのグルタミンを伴うＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させた。
【０３０９】
ポリヌクレオチドの、ＴＬＲ４シグナル伝達に対する効果について試験するために、ヒトＰＢＭＣを、単独であるか、または対象の１μＭもしくは４μＭのポリヌクレオチドと組み合わせた、５μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＩＬ−６を、免疫アッセイにより測定した。ＤＶＸ３６、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、およびＣ９５４は、ＬＰＳにより刺激された、ＴＬＲ４に媒介されるＩＬ−６産生を阻害しなかった。
【０３１０】
ポリヌクレオチドの、ＴＬＲ２／１シグナル伝達に対する効果について試験するために、ヒトＰＢＭＣを、単独であるか、または対象の１μＭもしくは４μＭのポリヌクレオチドと組み合わせた、０．１μｇ／ｍｌのＰＡＭ３ＣＳＫ４（合成トリアシル化リポタンパク質）で刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＩＬ−６を、免疫アッセイにより測定した。ＤＶＸ３６、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、およびＣ９５４は、ＰＡＭ３ＣＳＫ４により刺激された、ＴＬＲ２／１に媒介されるＩＬ−６産生を阻害しなかった。
【０３１１】
ポリヌクレオチドの、ＴＬＲ５シグナル伝達に対する効果について試験するために、ヒトＰＢＭＣを、単独であるか、または対象の１μＭもしくは４μＭのポリヌクレオチドと組み合わせた、１μｇ／ｍｌのフラジェリンで刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＩＬ−６を、免疫アッセイにより測定した。ＤＶＸ３６、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、およびＣ９５４は、フラジェリンにより刺激された、ＴＬＲ５に媒介されるＩＬ−６産生を阻害しなかった。
【０３１２】
ポリヌクレオチドの、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ：ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  １）に対する効果について試験するために、３×１０５個の単球を、単独であるか、または対象の１μＭもしくは４μＭのポリヌクレオチドと組み合わせた、希釈率１〜１００倍のセンダイウイルス（ＳｅＶ：Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）で刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−αを、免疫アッセイにより測定した。ＤＶＸ３６、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、およびＣ９５４は、ＳｅＶにより刺激された、ＲＩＧ−Ｉに媒介されるＩＦＮ−α産生を阻害しなかった。
【０３１３】
（実施例２０）
高投与量のポリヌクレオチドの、マウスへの投与
高投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）のポリヌクレオチド（Ｃ９５４、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、ＤＶＸ９９、ＤＶＸ１０２、およびＤＶＸ１０３）または対照（食塩水）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりのｎ＝６）へと、毎週２回２週間にわたり皮下投与した。ポリヌクレオチドは、２、５、９、および１２日目に投与した。図２６Ａおよび図２６Ｂに指し示される通り、投与前（０日目）およびそれ以後にマウスの体重を量った。研究の終了時に臓器を摘出し、臓器重量を決定した。加えて、Ｃ９５４で処置されるマウス、ＤＶＸ９９で処置されるマウス、およびＤＶＸ１０３で処置されるマウスについて、腎臓の組織学的査定も実施した。
【０３１４】
研究期間において、ＤＶＸ１０２、ＤＶＸ１０３、またはＣ９５４で処置されたマウスが、体重の変化を示さないか、または体重のわずかな増大を示したのに対し、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、またはＤＶＸ９９で処置されたマウスは、体重の著明な減少を示した（図２６）。研究の終了時において、Ｃ９５４、ＤＶＸ１０２、またはＤＶＸ１０３で処置されたマウスが、正常の外見を呈したのに対し、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、またはＤＶＸ９９で処置されたマウスは、わずかにやせた外見を呈し、ＤＶＸ９８で処置されたマウスが最悪の効果を示した。群の全てのマウスの臓器重量が増大したわけではなく、ＤＶＸ８２、ＤＶＸ９８、またはＤＶＸ９９で処置されたマウスの肝臓および腎臓は、正常より減衰していた。１５日目における、１日目と比較した、腎尿細管の変化および体重変化パーセントについての重症度スコアの概要を、Ｃ９５４で処置されるマウス、ＤＶＸ９９で処置されるマウス、およびＤＶＸ１０３で処置されるマウスについて表２０−１に示す。全ての被験動物において、主に被膜下領域内の尿細管の変化であって、細胞質の空胞化；尿細管腔内のアモルファスの好酸性物質の存在；罹患細胞の、わずかな着色変化を伴う、核のわずかな肥大からなる変化を特徴とする腎臓の変化が注目された。尿細管の変化は、食塩水を施されたマウスでは最小限（１．０）であり、他の全ての群では、わずかに増大した。
【表２０−１】
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【０３１５】
（実施例２１）
高投与量のポリヌクレオチドの、ラットへの投与
８５ｍｇ／ｋｇもしくは２５ｍｇ／ｋｇの投与量のポリヌクレオチド（Ｃ９５４、ＤＶＸ１０３、またはＤＶＸ１０４）、または対照（食塩水）を、８〜９週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１群当たりｎ＝５）へと、０、４、７、および１１日目に皮下投与した。図２７Ａおよび図２７Ｂに指し示される通り、０日目の投与前およびそれ以後にラットの体重を量った。研究の終了時に臓器を摘出し、臓器重量を決定した。加えて、肝臓、腎臓、および心臓の組織学的査定も実施した。
【０３１６】
２５ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ１０３、もしくはＤＶＸ１０４、または８５ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、または食塩水で処置されたラットについて、体重の増大が観察された。８５ｍｇ／ｋｇのＤＶＸ１０３またはＤＶ１０４で処置されたラットは、全体的な体重の変化を示さなかった。これは、９０ｍｇ／ｋｇのＤＶ１８５で処置されたラットにおいて観察された体重の著明な減少（図２８）と対照的である。２５ｍｇ／ｋｇまたは８５ｍｇ／ｋｇのＣ９５４、ＤＶＸ１０３、またはＤＶＸ１０４で処置されたマウスの肝臓、腎臓、脾臓、または心臓の臓器重量に著明な差異は認められなかった。
【０３１７】
肝臓、腎臓、および心臓についての組織学的査定の概要を、表２１−１に示す。臓器についての組織病理学的解析により、腎臓が標的臓器として確認された。大半の群で、軽度の尿細管の変化が評定された。最高用量のＣ９５４は、軽度の変化（重症度スコア２）を履歴的に示した。
【表２１−１】
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【０３１８】
（実施例２２）
ＴＬＲ７／８阻害剤は、ヒトＴＬＲ８トランスジェニックマウスの膵臓における炎症性遺伝子の発現を減少させる
実施例６で記載したヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスは、膵臓において高レベルで発現する炎症性遺伝子により部分的に指し示される通り、膵炎を発症する。剖検時に膵臓を摘出し、製造業者の指示書に従い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｒｎｅａｓｙ抽出キットにより、ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ＲＮＡから作り出し、ＴＡＱＭＡＮアッセイを使用して、遺伝子発現レベルを査定した。図２９は、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウス由来の膵臓における、ｈＴＬＲ８レベル、ｍＩＦＮ−γレベル、ｍＴＮＦ−αレベル、ｍＩＬ−１８レベル、ｍＩＬ−１２ｐ４０レベル、ｍＩＬ−１αレベル、ｍＭＭＰ９レベル、およびｍＩＰ−１０レベルの、野生型マウスと比べた上昇を、ＣＴで示す。
【０３１９】
７０〜８０日齢であるヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスに、２．２ｍｇ／ｋｇのＤＶＸ８２、ＤＶＸ９９またはＰＢＳを、毎週２回５週間にわたり注射した。図２９に示される通り、ＤＶＸ８２、およびＤＶＸ９９はいずれも、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓において発現する炎症性遺伝子のレベルを低下させることが可能であった。加えて、ＤＶＸ８２、またはＤＶＸ９９で処置されたヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウス由来の膵臓は、疾患スコアの、ＰＢＳで処置されたマウスと比べて軽減を示した（図３０）。
【０３２０】
第２の実験では、６０〜６７日齢であるヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスに、１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇのＤＶＸ１０３、または食塩水を、毎週１回１０週間にわたり注射した。図３１は、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓におけるｍＩＦＮ−γ、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−２３、ｍＩＬ−１β、ｍＬＴ−α、ｍＩＬ１−ＲＡ、ｍＭＭＰ−１、ｍＭＭＰ−９、ｍＭＭＰ−７、ｍＭＭＰ−１０、ｈＴＬＲ８、ｍＣＤ４、ｍＣＤ８、およびｍＣＤ１１βの、野生型マウスおよびＤＶＸ１０３による処置の後におけるヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスと比較した相対レベルを示す。図３１に示される通り、ＤＶＸ１０３は、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスの膵臓において発現する炎症性遺伝子のレベルを低下させることが可能であった。
【０３２１】
（実施例２３）
ＴＬＲ７／８阻害剤は、ヒト単球において、抗ＬＢＰＡ抗体により誘導される炎症性サイトカインを減少させる
抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）は、カルジオリピン、β２−糖タンパク質１、およびエンドソーム脂質リゾビスホスファチジン酸（ＬＢＰＡ）などのリン脂質関連タンパク質を指向する抗体を含む抗リン脂質抗体を特徴とする。初代ヒト単球を、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬの、市販されている抗ＬＢＰＡ抗体（クローン６Ｃ４；ｅｃｈｅｌｏｎ）（Kobayashiら、Nature、３９２巻：１９３〜１９７頁、１９９８年）で刺激した。６時間後または一晩後（ＯＮ）において、上清を回収し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。図３２Ａおよび図３２Ｂは、抗ＬＢＰＡ抗体が、ヒト単球による炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を誘導することを示す。
【０３２２】
第２の実験では、初代ヒト単球を、単独であるか、または１マイクロモルのＤＶＸ８２（例示的なＴＬＲ７／８阻害剤）と組み合わせた、１μｇ／ｍＬのクローン６Ｃ４の抗ＬＢＰＡ抗体で刺激した。一晩にわたるインキュベーションの後、上清を回収し、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６のレベルを、ＥＬＩＳＡで測定した。図３３Ａおよび図３３Ｂは、ヒト単球において、ＤＶＸ８２抗ＬＢＰＡ抗体により誘導されるＩＬ−６レベルおよびＴＮＦレベルが低減されることを示す。これらの結果は、抗ＬＢＰＡ抗体の刺激が、ＴＬＲ７／８に少なくとも部分的に依存することを示す。
【０３２３】
（実施例２４）
健常ＰＢＭＣの、混合性結合組織病を有する患者由来の血清による刺激
混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）を有する患者は、ＰＤＣ内のＴＬＲ７および単球内のＴＬＲ８の強力な活性化因子である、高レベルのＵ１−ＲＮＰ自己抗体を有する。（Kattahら、Immunol  Rev、２３３巻：１２６〜１４５頁、２０１０年；およびVollmerら、J  Exp  Med、２０２巻：１５７５〜１５８５頁、２００５年）。
【０３２４】
健常ドナー由来の約７×１０５個のＰＢＭＣ細胞または３×１０５個の単球を、２００μＬの培地中、ＴＬＲ阻害剤の非存在下または存在下で、ＭＣＴＤを有する患者由来の３０μＬの血清、または正常個体由来の血清と共にインキュベートする。上清は、ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮ−α濃度、ＴＮＦ−α濃度、ＩＬ−６濃度、ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−８濃度（複数可）について査定する。ＭＣＴＤ患者由来の血清が、サイトカイン産生を刺激するのに対し、正常個体由来の血清は、サイトカイン産生を刺激しないことが予測される。また、ＭＣＴＤ血清誘導性サイトカイン産生は、ＴＬＲ７阻害剤および／またはＴＬＲ８阻害剤により阻害されることも予測される。
【０３２５】
（実施例２５）
健常ＰＢＭＣの、シェーグレン症候群を有する患者由来の血漿または血清による刺激
シェーグレン症候群とは、外分泌腺における、進行性の単核細胞インフレーションを特徴とする慢性自己免疫疾患である。口渇（口内乾燥症）およびドライアイ（乾性角結膜炎）が、シェーグレン症候群患者に影響を及ぼす、主要な臓器関連臨床特徴である。シェーグレン症候群は、抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体および抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体など、ＲＮＰ自己抗体の存在を特徴とする。シェーグレン症候群は、ＰＤＣによるＴＬＲ７の活性化、およびＰＤＣの浸潤により産生されるＩ型ＩＦＮの増大と明らかに関連している（Baveら、Arthritis  Rheum、２００５年、５２巻：１１８５〜９５頁、２００５年；およびGottenbergら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、１０３巻：２７７０〜５頁、２００６年）。抗Ｒｏ／ＳＳＡ自己抗体および抗Ｌａ／ＳＳＢ自己抗体はまた、ＴＬＲ８も活性化させる。実のところ、ＴＬＲ８はまた、これらの患者の唾液腺においても過剰発現する。
【０３２６】
健常ドナー由来の約７×１０５個のＰＢＭＣ細胞または３×１０５個の単球を、２００μＬの培地中、ＴＬＲ阻害剤の非存在下または存在下で、シェーグレン症候群を有する患者由来の血漿もしくは血清または正常個体由来の血漿もしくは血清と共にインキュベートする。上清は、ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮ−α濃度、ＴＮＦ−α濃度、ＩＬ−６濃度、および／またはＩＬ−１β濃度、および／またはＩＬ−８濃度について査定する。シェーグレン症候群を有する患者由来の血清が、サイトカイン産生を刺激するのに対し、正常個体由来の血清は、サイトカイン産生を刺激しないことが予測される。また、シェーグレン症候群関連サイトカイン産生は、ＴＬＲ７阻害剤および／またはＴＬＲ８阻害剤により阻害されることも予測される。
【０３２７】
（実施例２６）
ＴＬＲ阻害剤の、ＴＬＲ８に媒介される唾液腺炎症、ならびに膵臓疾患、腎臓疾患、および関節疾患に対する効果の決定
ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン１２マウスは、高レベルのヒトＴＬＲ８を発現させ、自発性の重度の唾液腺炎症、ならびに膵臓疾患、腎臓疾患、および関節疾患を発症する。ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８は、低レベルのヒトＴＬＲ８を発現させ、やはり、自発性の膵臓炎症および唾液腺炎症を発症するが、他の臓器は、それほど影響を受けない。規定された処置スケジュールを使用して、ヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン１２またはヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８に、複数回用量のＴＬＲ７阻害剤および／もしくはＴＬＲ８阻害剤および／もしくはＴＬＲ９阻害剤またはＰＢＳを注射する。唾液腺内、腎臓内、および／または関節内の炎症性遺伝子レベルは、ＴＡＱＭＡＮを使用して決定する。モニタリングされうる遺伝子は、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IL1α、IL12p40、mTLR9、MAC1、TLR7、human  TLR8、IP-10、MMP9、IFN-g、MMP3、IL1-RAIL-23、Lta、MIP3a、MIP3B、MIG、MMP8、MMP10CD4、CD8、CCR2、CCR6、MPO、NOS2、MMP12、TLR2、MMP1、およびMMP7を含む。ＴＬＲ阻害剤で処置されたｈＴＬＲ８Ｔｇクローン１２マウスまたはｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスは、標的臓器内の炎症性遺伝子レベルの、ＰＢＳで処置されたｈＴＬＲ８Ｔｇクローン１２マウスまたはｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウス内で見出されるレベルと比較した低下を示すことが予測される。加えて、ＴＬＲ阻害剤で処置されたヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン１２マウスまたはヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウス由来の標的臓器についての組織病理学的解析も、ＰＢＳだけで処置されたヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン１２マウスまたはヒトＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスと比べた疾患スコアの軽減を示すことが予測される。
【０３２８】
（実施例２７）
ＴＬＲ７／８に媒介される６−スルホＬａｃＮＡｃ樹状細胞の刺激の、ＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／またはＴＬＲ７／８阻害剤による阻害
６−スルホＬａｃＮＡｃ樹状細胞（ｓｌａｎＤＣ）は、ヒト血液中の樹状細胞（ＤＣ）の大半を占め、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、およびＩ−１βを産生するそれらの能力を特徴とする通り、炎症促進性が高い（Schakelら、Immunity、２５巻：７６７頁、２００６年）。ｓｌａｎＤＣは、炎症組織内で速やかに動員される（Hanselら、J  Allergy  Clin  Immun、１２７巻：７８７頁、２０１１年）。ｓｌａｎＤＣは、尋常性乾癬、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、皮膚エリテマトーデスを有する患者の真皮、および関節リウマチのパンヌス組織に浸潤する。
【０３２９】
ｓｌａｎＤＣが、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方を共発現させるのに対し、ヒトにおける他の種類の骨髄性ＤＣであるＣＤ１ｃ＋ＤＣは、ＴＬＲ８だけを発現させる（Hanselら、Autoimmunity、４０巻：１〜８頁、２０１３年）。ｓｌａｎＤＣは、それらの多くが乾癬性皮膚内および皮膚エリテマトーデス性皮膚内に存在し、高レベルのＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６など、炎症促進性サイトカインを産生する、ＬＬ３７−ＲＮＡ複合体により、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介して活性化する（Hansel、前出）。これらのＬＬ３７−ＲＮＡ複合体は、乾癬および皮膚エリテマトーデスなどの皮膚疾患の発症機序において中心的であると考えられる（Gangulyら、J  Exp  Med、２０６巻：１９８３頁、２００９年；およびGillietら、Nat  Rev  Immun、８巻：５９４頁、２００８年）。
【０３３０】
健常ドナーから精製されたｓｌａｎＤＣを、単独であるか、またはＴＬＲ７阻害剤、ＴＬＲ８阻害剤、および／もしくはＴＬＲ７／ＴＬＲ８阻害剤の存在下における、ＬＬ３７−ＲＮＡ複合体で刺激する。上清は、ＥＬＩＳＡにより、ＴＮＦ−α濃度、ＩＬ−２３濃度、および／またはＩＬ−６濃度（複数可）について査定する。一官能性ＴＬＲ７阻害剤および一官能性ＴＬＲ８阻害剤のいずれも、ＬＬ３７−ＲＮＡ複合体に対する応答を減衰させ、二官能性ＴＬＲ７／８阻害剤は、応答を、一官能性阻害剤の組合せより強力に減衰させることが予測される。
【０３３１】
（実施例２８）
テープストリッピングを施されたマウスにおける炎症応答へのＴＬＲ８の寄与の決定
マウスにおけるテープストリッピングは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９に依存する炎症応答を引き起こす（Guiducciら、J  Exp  Med、２０７巻：２９３１〜２９４２頁、２０１０年）。皮膚炎症におけるヒトＴＬＲ８の寄与を決定するために、ｈＴＬＲ８Ｔｇクローン８マウスを、一官能性ＴＬＲ７阻害剤、一官能性ＴＬＲ８阻害剤、および／もしくは一官能性ＴＬＲ９阻害剤、ならびに／または二官能性ＴＬＲ７／９阻害剤二官能性および／もしくはＴＬＲ７／８阻害剤、ならびに／または三官能性ＴＬＲ７／８／９阻害剤で、マウスにテープストリッピングを施した直後に皮下処置する。１つのマウス群は、非処置のまま放置されて、対照として用いられた。皮膚生検は、テープストリッピングの２４時間後にサンプリングし、Ｉ型ＩＦＮにより調節される遺伝子および炎症性遺伝子の遺伝子発現をＴＡＱＭＡＮ解析により査定する。炎症応答へのＴＬＲ８の寄与は、異なるＴＬＲ阻害剤を使用する結果を比較することにより決定する。この免疫応答は、少なくとも部分的にはＴＬＲ８により媒介され、ＴＬＲ８阻害剤を投与することにより、還元Ｉ型ＩＦＮにより調節され、かつ、炎症性である遺伝子の発現が低減されることが予測される。
【０３３２】
（実施例２９）
ＴＬＲ７／８阻害剤は、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓における炎症性遺伝子の発現を減少させる
マウスＴＬＲ７遺伝子（ＴＬＲ７．６）を過剰発現するマウスについては、既に記載されている（Deaneら、Immunity、２７巻：８０１〜８１０頁、２００７年）。ＴＬＲ７．６マウスは、炎症性細胞のインフレーションおよび炎症性サイトカインの産生の増大を特徴とする、自己抗体介在性糸球体腎炎を発症する。加えて、ＴＬＲ７．６マウスは、脾腫も発症し、骨髄性細胞の増殖も増大させる。
【０３３３】
２〜３カ月齢であるＴＬＲ７．６マウスに、１ｍｇ／ｋｇのＤＶＸ１０３またはＰＢＳを、毎週１回１５週間にわたり注射した。腎臓内の炎症性遺伝子発現は、ＴＡＱＭＡＮアッセイにより決定した。図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓における、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−１β、ｍＴＮＦ−α、ｍＩＦＮ−γ、ｍＭＭＰ−７、ｍＣＤ１１ｂβ、ｍＣＤ８、およびｍＣＤ４の相対レベルを、野生型マウスおよびＤＶＸ１０３による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスと比較して示す。ＤＶＸ１０３は、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓において発現する炎症性遺伝子のレベルを低下させることが可能であった（図３４Ａを参照されたい）。
【０３３４】
実験の終了時において、マウスから脾臓を摘出した。機械的破壊の後、脾臓細胞の総数を、細胞計数により決定した。樹状細胞の数（ＤＣ）は、ＣＤ１１ｃ細胞を標識する抗体を使用するフローサイトメトリーにより決定した。図３４Ｃは、ＴＬＲ７．６マウスのＤＶＸ１０３による処置により、ＴＬＲ７．６マウスにおける骨髄性細胞の増殖が正常化されることを示す。
【０３３５】
第２の実験では、５〜６カ月齢であるＴＬＲ７．６マウスに、１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇのＤＶＸ１０５、または食塩水を、毎週１回８週間にわたり注射した。腎臓内の炎症性遺伝子発現は、ＴＡＱＭＡＮアッセイにより決定した。図３５Ａは、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓における、ｍＩＬ−１α、ｍＩＬ−１β、ｍＬＴ−β、ｍＭＩＧ、およびｍＦ４／８０の相対レベルを、野生型マウスおよびＤＶＸ１０５による処置後におけるＴＬＲ７．６マウスと比較して示す。ＤＶＸ１０５は、ＴＬＲ７．６マウスの腎臓において発現する炎症性遺伝子のレベルを低下させることが可能であった（図３５Ａを参照されたい）。
【０３３６】
実験の終了時において、マウスから脾臓を摘出した。機械的破壊の後、脾臓細胞の総数を、細胞計数により決定した。樹状細胞および好中球の数（ＤＣ）は、それぞれ、ＣＤ１１ｃおよびＬＹ６Ｇを標識する抗体を使用するフローサイトメトリーにより決定した。図３５Ｂは、ＴＬＲ７．６マウスのＤＶＸ１０５による処置により、ＴＬＲ７．６マウスにおける骨髄性細胞の増殖が正常化されることを示す。
【０３３７】
（実施例３０）
ラットにおける、高用量の阻害性ポリヌクレオチドおよび低用量の阻害性ポリヌクレオチドの活性
高投与量（ｈｉ＝４０ｍｇ／ｋｇ）または低投与量（ｌｏ＝１０ｍｇ／ｋｇ）のポリヌクレオチド（Ｃ９５４、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、およびＤＶＸ１０５）を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１群当たりｎ＝５）へと、毎週１回８週間にわたり皮下投与した。表３０−１に指し示される通り、投与前（０日目）およびそれ以後にラットの体重を量った。研究の終了時に臓器を摘出し、臓器重量を決定した。加えて、肝臓および腎臓の組織学的査定も実施した。Ｃ９５４は、履歴的対照として研究に組み入れるもので、良好な毒性プロファイルを伴うポリヌクレオチドを表す。
【０３３８】
Ｃ９５４、ＤＶＸ１０３、ＤＶＸ１０４、またはＤＶＸ１０５で処置されたラットも、体重の同様の増大を示した。全ての群の動物の臓器重量は、同様であった。肝臓および腎臓における変化を反映する重症度スコアの概要を、表３０−１に示す。臓器の組織病理学的検討により、腎臓が標的臓器として確認された。ラットでは、肝臓の髄外造血がまれではない。これは、ＰＢＳ処置群を含む全ての群において観察されたので、著明なポリヌクレオチド関連の所見とは考えられなかった。肝臓では、他の著明な変化は観察されなかった。腎臓では、軽度の尿細管の変化が大半の群で見出された。この長期投与状況で試験した全てのポリヌクレオチドが高用量で示した腎臓内の変化は軽度（４０ｍｇ／ｋｇ；約２の重症度スコア）であったが、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）では、最小限の変化が観察された。
【表３０−１】
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【０３３９】
（実施例３１）
ＴＬＲ７／８阻害剤は、関節リウマチのコラーゲン誘導モデルにおける疾患スコアを軽減する
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＴＬＲ８トランスジェニックマウス（ＷＯ２０１２／１３５５４９において記載されているＴＬＲ８ＴＧＣＬ８）を、公表されている免疫化スケジュールおよび免疫化プロトコール（Campbell、Eur  J  Immunol、３０巻：１５６８〜１５７５頁、２０００年）に従い免疫化した。コラーゲンによる免疫化の０日目において、コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製のニワトリＩＩ型コラーゲン；２ｍｇ／ｍＬ）を、完全フロイントアジュバント（５ｍｇ／ｍＬのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａを含有する、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製のＣＦＡ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ）により、以下の通りに乳化させた：
（ｉ）１容量のＣＦＡを、等量のコラーゲン溶液と混合し；
（ｉｉ）混合は、安定した硬質のエマルジョンが結果として得られるまで続け；
（ｉｉｉ）エマルジョンの所望の安定性を確認するため、１滴のエマルジョンを水で満たしたビーカーへと添加し（水中に固体として保持されれば、エマルジョンは、安定であると考えられた）；
（ｉｖ）１００μｌを、尾の基部に皮下注射した。
【０３４０】
２回目の注射は、２１日目に投与した。動物を、四肢の発赤および腫脹について評価し、各マウスの累積スコアは、四肢の各々について得られるスコアの合計とした。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｏｒｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、以下の通りであった。０：正常；１＝足首もしくは手首の軽度であるが明瞭な発赤および腫脹、または罹患した指の数に関わらない、個々の指に限定された、明らかな発赤および腫脹；２＝足首または手首の中程度の発赤および腫脹；３＝指を含む脚部全体の重度の発赤および腫脹；ならびに４＝複数の関節に及び、臨床スコアが割り当てられた、四肢の最大限の炎症。
【０３４１】
ｈＴＬＲ８ＴｇＣＬ８マウスを、ＰＢＳまたはＴＬＲ７／８阻害剤であるＤＶＸ１０５で、１、７、１４、２０、２４、２８、３１、３５、４２、４９、および５３日目に処置した（１ｍｇ／ｋｇの皮下処置）。図３６に示す通り、ｈＴＬＲ８ＴｇＣＬ８マウスにおける疾患スコアは、野生型（ＷＴ）マウスの疾患スコアと比較して増悪した。ｈＴＬＲ８ＴｇＣＬ８マウスの、ＤＶＸ１０５による処置は、疾患スコアを減少させた。この研究は、ｈＴＬＲ８が、関節炎の増悪において役割を果たし、ＴＬＲ７／８阻害剤が、ｈＴＬＲ８を発現させる対象における関節炎を減衰させることを裏付ける。
【０３４２】
（実施例３３）
シェーグレン症候群患者由来の血清によるヒト単球の刺激は、ＴＬＲ７／８に依存する
ＣＤ１４＋単球は、製造業者の指示書に従い、陰性選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、カタログ番号１４０６８）を使用して、バフィーコートから単離した。純度は日常的に、９８％を超えた。約３×１０５個の細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ）中、単独であるか、またはＴＬＲ７／８阻害剤であるＤＶＸ９９（１μＭ）と組み合わせた、健常対象（ｎ＝３）由来の７．５％の血清または活性の疾患を伴うシェーグレン症候群患者（ｎ＝５）由来の７．５％の血清の存在下でインキュベートした。シェーグレン症候群患者由来の血清は、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＫ）から得た。１４〜１６時間後、上清を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、サイトカインレベルについてアッセイした。図３８に示される通り、シェーグレン症候群患者由来の血清は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦの産生を刺激し、このサイトカイン産生は、ＴＬＲ７／８阻害剤であるＤＶＸ９９により阻害することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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