(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下によって表される化合物を含む、インテグリン陽性腫瘍細胞にＲＮＡｉトリガーをインビボで送達するための医薬組成物：
Ｒ−Ｌ−Ｐ−ＲＮＡｉトリガー
式中、Ｒは、ＲＧＤ模倣体を含み、該ＲＧＤ模倣体はアミド結合を介してグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結したグアニジニウム基を含み、Ｌは、構造：
Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート
（式中、Ａ１は、疎水性アミノ酸であり、Ａ２は、アミド結合を介してＡ１に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、該非荷電親水性アミノ酸は、中性ｐＨで非荷電である。）
を含む、生理学的に不安定な連結を含み、Ｐは両親媒性膜活性ポリアミンを含み、該両親媒性膜活性ポリアミンは、ペンダント第一級アミンを含有する少なくとも1つのモノマーおよびペンダント疎水性基を含有する少なくとも1つのモノマーを含む。
【請求項２】
前記インテグリンがαｖβ３インテグリンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ａ１が、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ａ２が、シトルリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択される、請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート−Ｐが、以下によって表される構造を有する、請求項4に記載の医薬組成物：
0006433001.tif 000106
式中、Ｒ４は、ＲＧＤ模倣体を含み、Ｒ１は、疎水性アミノ酸の側基であり、Ｒ２は、非荷電親水性アミノ酸の側基であり、ポリアミンは、膜活性ポリアミンＰである。
【請求項６】
前記ＲＧＤ模倣体が、以下によって表される構造を含む、請求項2に記載の医薬組成物：
0006433001.tif 000107
。
【請求項７】
前記グアニジニウムが、
0006433001.tif 000108
およびその共鳴構造、または
0006433001.tif 000109
およびその共鳴構造
より選択される、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
膜活性ポリアミンが可逆的に修飾されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物が、生理学的に不安定な可逆的共有結合を介して前記膜活性ポリアミンに連結したポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化合物が以下によって表される構造を有する、請求項9に記載の医薬組成物：
0006433001.tif 000110
式中、Ｎは、ＲＮＡｉトリガーであり、Ｌ１は、任意であり、存在する場合には、生理学的に不安定な連結であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールを含み、ｙは、ゼロより大きい整数であり、ｚは、ゼロより大きい整数である。
【請求項１１】
以下によって表される構造を含む、ＲＧＤ模倣体含有化合物：
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルボナート
式中、Ｒは、ＲＧＤ模倣体を含み、該ＲＧＤ模倣体はアミド結合を介してグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結したグアニジニウム基を含み、Ａ１は、疎水性アミノ酸であり、Ａ２は、アミド結合を介してＡ１に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、カルボナートは、アミンと反応でき、カルバマートを形成する、アミン反応性カルボナート部分を含む。
【請求項１２】
Ａ１が、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａ２が、シトルリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択される、請求項11に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルボナートが、以下によって表される構造を有する、請求項13に記載の化合物：
0006433001.tif 000111
式中、Ｒ１は、疎水性アミノ酸Ａ１の側基であり、Ｒ２は、非荷電親水性アミノ酸Ａ２の側基であり、Ｒ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｚであり、ここで−Ｚは、
0006433001.tif 000112
である。
【請求項１５】
前記ＲＧＤ模倣体が、以下によって表される構造を含む、請求項11に記載の化合物：
0006433001.tif 000113
ここで、該グアニジニウムは、
0006433001.tif 000114
およびその共鳴構造、または
0006433001.tif 000115
およびその共鳴構造から選択される。
【請求項１６】
前記ＲＧＤ模倣体が、ＰＥＧ連結部分を含む、請求項11に記載の化合物。
【請求項１７】
（ａ）Ｒ１が、−ＣＨ３、−（ＣＨ２）−フェニル、−ＣＨ−（ＣＨ３）２、−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３、およびトリプトファンからなる群より選択され、
（ｂ）Ｒ２が、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、および−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２からなる群より選択される、
請求項14に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ＲＮＡｉトリガーおよび他の実質的に細胞膜不透過性である化合物を生細胞中に送達することは、細胞の膜系が複雑なことから、非常に制限される。アンチセンス、ＲＮＡｉおよび遺伝子治療にて使用される薬物は、比較的大きな親水性ポリマーであり、高い負電荷を帯びていることが多い。これらの物理的特性の双方により、これらの物質が細胞膜を通過して直接的に分散することは著しく制限されている。したがって、ＲＮＡｉトリガー送達の主な障壁は、ＲＮＡｉトリガーを、細胞膜を通過させ、細胞の細胞質または核に送達することである。
【０００２】
インビトロでポリヌクレオチドをほぼ効率的に細胞に送達することができる、多数のトランスフェクション試薬も開発されてきた。しかしながら、同じトランスフェクション試薬を使用してのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、血清との不利な相互作用および標的化能の低下から、複雑であり、かつ効果的でない。インビトロで良好に働くトランスフェクション試薬であるカチオン性ポリマーおよび脂質は、一般に、大きなカチオン性静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロトランスフェクション試薬の正電荷は、電荷−電荷（静電）相互作用を介した核酸との会合を促進し、これにより、核酸／トランスフェクション試薬複合体を形成する。正電荷はまた、ビヒクルの細胞への非特異的結合および膜の融合、不安定化または破壊にも有益である。膜の不安定化により、実質的に細胞膜不透過性であるポリヌクレオチドが細胞膜を通過して送達されやすくなる。これらの特性は、インビトロでの核酸移動を促進するが、インビボにおいては、毒性をもたらし、標的化を無効にする。カチオン電荷は、血清成分との相互作用をもたらし、ポリヌクレオチド−トランスフェクション試薬相互作用の不安定化、バイオアベイラビリティの低減および標的化能の低下を招く。トランスフェクション試薬の膜活性は、インビトロでは効果的であり得るが、インビボでは毒性を生じることが多い。
【０００３】
インビボ送達のためには、ビヒクル（核酸および会合した送達物質）が直径で１００ｎｍ未満、好ましくは５０ｎｍ未満の小ささでなければならない。さらにより小さい複合体、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満の複合体は、より有用であろう。１００ｎｍより大きい送達ビヒクルは、インビボにおいて、血管細胞以外の細胞にはほとんど接近できない。静電相互作用によって形成された複合体は、生理学的塩濃度または血清成分にさらされると、凝集したり、崩壊する傾向がある。さらに、インビボ送達ビヒクルのカチオン電荷は、血清との不利な相互作用を生じるため、バイオアベイラビリティに劣る。興味深いことに、高い負電荷もまた、標的化に必要な相互作用、すなわち、標的化リガンドの細胞受容体への結合を妨げることによって、標的化インビボ送達を阻害し得る。したがって、インビボでの分布および標的化には、中性に近いビヒクルが望まれている。膜の破壊または不安定化作用は、慎重に調節しなければ、インビボで用いる場合、毒性である。ビヒクル毒性と核酸送達とのバランスは、インビボよりもインビトロのほうがより達成しやすい。
【０００４】
Ｒｏｚｅｍａら（米国特許公報第２００８０１５２６６１号（特許文献１）、同２０１１０２０７７９９号（特許文献２）、同２０１２０１６５３９３号（特許文献３）および同２０１２０１７２４１２号（特許文献４））は、ポリヌクレオチドのインビボ送達に適した結合体を開発した。これらの結合体は、生理学的に不安定な可逆的マスキングを用いた、膜活性ポリアミンの膜破壊活性の可逆的調節を特徴とした。Ｒｏｚｅｍａらは、標的化リガンドとして非電荷性ガラクトースまたはコレステロールを用いることで、これらの結合体を用いたポリヌクレオチドの肝細胞へのインビボ送達を明らかにした。これらの結合体をＲＮＡｉトリガーの癌細胞標的化に適応させることは、癌との戦いにおける別の治療法を提供と思われる。
【０００５】
インテグリンは、細胞接着を仲介する細胞表面糖タンパク質の一群である。インテグリンは、αおよびβのポリペプチドサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。現在、１１個の異なるαサブユニットと、６個の異なるβサブユニットが特定されている。種々のαサブユニットは、種々のβサブユニットと結合して異なるインテグリンを形成する。αｖβ３インテグリン（ビトロネクチンレセプター）は、腫瘍転移、固形腫瘍成長（新形成）および腫瘍性血管新生に関与することが示されている。インテグリンαｖβ３は、血管新生にて重要な役割を担っている。腫瘍内皮細胞上だけでなく、一部の腫瘍細胞上にも発現する。たとえば、Ｓｅｆｔｏｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９（１９９２）１５５７−１５６１）（非特許文献１）は、黒色腫浸潤におけるαｖβ３インテグリンの役割を明らかにした。Ｂｒｏｏｋｓら（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７９（１９９４）１１５７−１１６４）（非特許文献２）は、αｖβ３アンタゴニストの全身投与が組織学に異なる種々のヒト腫瘍の著しい退縮をもたらすことを実証した。
【０００６】
インテグリンαｖβ３の腫瘍細胞発現は、種々の腫瘍型における疾患進行と相関関係にある。αｖβ３インテグリンは、ヒト腫瘍生検サンプルの血管上で広く発現しているが、正常組織内の血管上では発現していない。乳癌において、αｖβ３インテグリンの過剰発現は、骨転移に関係し、オステオポンチンに対して、腫瘍の成長および浸潤の増大を誘発する。膠芽腫において、αｖβ３インテグリンは、腫瘍の侵襲性辺縁部で過剰発現し、フィブロネクチンの量が上昇する。これは、細胞運動性およびアポトーシス抵抗性の増大に関係する。膵臓腫瘍において、αｖβ３インテグリンの発現上昇は、ＭＭＰ−２の活性化およびリンパ節転移の増大に関係する。前立腺癌細胞において、αｖβ３インテグリンが発現すると、インテグリン間の結合、ならびにラミニン、フィブロネクチンおよびオステオポンチンが関与する接着および移動のプロセスのために、骨への転移がもたらされる。
【０００７】
αｖβ３インテグリンは、多数のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有マトリックス高分子に結合する。このＲＧＤペプチド配列は、αｖβ３インテグリン結合をもたらす他の様々な化合物と関連づけられている。したがって、ＲＧＤペプチドは、αｖβ３インテグリン陽性腫瘍に対する標的化合物として研究されている。しかしながら、多くのＲＧＤペプチドはまた、比較的親和性が低いことに加え、ＲＧＤ依存性インテグリンに対して比較的非選択的である。たとえば、αｖβ３に結合する大部分のＲＧＤペプチドは、αｖβ５、αｖβ１およびαＩＩｂβ３のインテグリンにも結合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許公報第２００８０１５２６６１号
【特許文献２】米国特許公報第２０１１０２０７７９９号
【特許文献３】米国特許公報第２０１２０１６５３９３号
【特許文献４】米国特許公報第２０１２０１７２４１２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｅｆｔｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９（１９９２）１５５７−１５６１
【非特許文献２】Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７９（１９９４）１１５７−１１６４）
【発明の概要】
【００１０】
ＲＮＡｉトリガーに共有結合した、インテグリンを標的にする可逆的にマスクした膜活性ポリアミンを含む、哺乳動物の腫瘍細胞にＲＮＡｉトリガーをインビボで送達するための組成物について記載する。本記載の組成物は、腫瘍細胞にＲＮＡｉトリガーを送達し、そのＲＮＡｉトリガーが細胞の内因性ＲＮＡ干渉経路と相互に作用して、標的遺伝子の発現を阻害する。
【００１１】
本発明は、マスクした両親媒性膜活性ポリアミン（送達ポリマー）およびＲＮＡｉトリガーを含み、ＲＮＡｉトリガーが送達ポリマーに共有結合している、腫瘍細胞にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーをインビボで送達するための組成物を特徴とする。本送達ポリマーは、両親媒性膜活性ポリアミンであって、１つまたは複数のＲＧＤジペプチドマスキング剤および任意で１つまたは複数のＰＥＧジペプチドマスキング剤を用いて、当該ポリマーアミンの少なくとも５０％または少なくとも８０％が修飾されるような、ポリマーアミンの可逆的修飾によりマスクされたポリアミンを含む。送達ポリマーのＲＮＡｉトリガーへの共有結合の好ましい連結は、生理学的に不安定な連結である。一実施形態において、この連結は、ジペプチドマスキング剤の連結に対して直交である。本送達結合体は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤中で哺乳動物に投与される。
【００１２】
好ましい実施形態において、ａ）ジペプチド−アミドベンジル−カルバマートの生理学的に不安定な可逆的連結を介して複数のＲＧＤリガンドおよび立体安定化剤と、ｂ）１つまたは複数の不安定な共有結合を介して１つまたは複数のＲＮＡｉトリガーとに共有結合している、両親媒性膜活性ポリアミンを含む組成物について記載する。一実施形態において、ジペプチド−アミドベンジル−カルバマートは、不安定な共有結合に対して直交である。本ＲＮＡｉトリガー−ポリマー結合体は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤中で哺乳動物に投与される。
【００１３】
好ましい実施形態において、可逆的にマスクした膜活性ポリアミン（送達ポリマー）は、ＲＧＤマスキング剤および立体安定化マスキング剤を用いて、ポリアミンのアミンの反応によって可逆的に修飾した、両親媒性膜活性ポリアミンを含む。ポリマーアミンとマスキング剤との反応により、アミンが可逆的に修飾されて、生理学的に不安定な可逆的共有結合が形成される。修飾基の切断によりアミンが復元するのであれば、アミンは可逆的に修飾されている。膜活性ポリアミンの可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に抑制し、ポリアミンと血清成分との相互作用を阻害し、これにより、循環特性を向上させ、ポリアミンが腫瘍細胞へとインビボで標的化される。可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、マスクした状態では、膜破壊活性を示さない。本膜活性ポリアミンの膜活性抑制および／またはインビボ標的化には、当該ポリマーアミンの５０％を超える修飾が必要である。最適な送達ポリマーを生成するために、ポリアミン上のアミンの５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超または９０％超のマスキング剤による可逆的修飾が必要とされ得る。
【００１４】
本発明の送達ポリマーの修飾ポリマーアミンは、以下の式によって表される。
0006433001.tif 000002
式中、Ｒ４は、ＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤を含み、Ｒ１およびＲ２は、アミノ酸側鎖である。Ｒ１は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基である。好ましい疎水性アミノ酸は、アラニンである。Ｒ２は、好ましくは、中性ｐＨで非荷電の親水性アミノ酸の側鎖である。好ましい非荷電親水性アミノ酸は、シトルリンである。ジペプチドの後のアミノ酸とアミドベンジル基との間にてインビボで酵素的切断が生じると、Ｒ４がポリマーから外れ、脱離反応が開始し、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
【００１５】
本送達ポリマーは、さらにＲＮＡｉトリガーに共有結合される。一実施形態において、ＲＮＡｉトリガーは、生理学的に不安定な結合を介して送達ポリマーに連結される。好ましい実施形態において、ＲＮＡｉトリガーと送達ポリマーを接続する不安定な結合は、マスキング剤とポリアミンを接続する不安定な結合に対して直交である。したがって、本発明の結合体は、以下の式によって表される一般式を有する可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンに共有結合したＲＮＡｉトリガーを含む。
0006433001.tif 000003
式中、Ｎは、ＲＮＡｉトリガーを含み、Ｌ２は、Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマートなどの生理学的に不安定な可逆的連結であり、Ｐは、両親媒性膜活性ポリアミンを含み、Ｒは、ＲＧＤリガンドを含み、それぞれは本明細書に記載する通りであり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールまたは他の立体安定化剤を含み、Ｌ１は、生理学的に不安定な連結であり、ｙは、ゼロより大きい整数であり、ｚは、ゼロ（０）より大きい整数であり、ｙとｚの和の値は、修飾されていない膜活性ポリアミン中のアミンの数により求めたポリアミンＰ上に存在するアミンの数の５０％よりも大きい。
【００１６】
本発明に係る化合物は、通常、有機化学または医薬品化学の当業者に知られている方法を用いて得ることができる。本発明のさらなる目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明を添付の図面とあわせて理解することで、明らかになるであろう。
【００１７】
好ましい実施形態において、−Ｌ２−Ｒおよび−Ｌ２−ＰＥＧのポリマー修飾は、以下の一般式を有する。
Ｒ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート−（式２ａ）
および
ＰＥＧ−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルバマート−（式２ｂ）
式中、Ａ１Ａ２はジペプチドであり、Ａ１はアミノ酸であり、Ａ２はアミノ酸である。ＲＧＤリガンドは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介してジペプチドに連結され得る。好ましい立体安定化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。Ａ１は、好ましくは、疎水性アミノ酸である。Ａ２は、好ましくは、非荷電親水性アミノ酸である。Ａ１およびＡ２は、好ましくは、アミド結合を介して連結される。好ましいアミドベンジル基は、ｐ−アミドベンジル基である。カルバマートは、カルボナートとポリマーアミンとの反応によって生成される。好ましいカルボナートは、活性化したアミン反応性カルボナートである。Ａ１Ａ２−アミノベンジル−カルバマート連結は、そのジペプチドが内因性プロテアーゼによりインビボで切断されるまで、したがって、立体安定化剤またはＲＧＤリガンドのポリアミンからの切断まで、安定である。ジペプチドの後（Ａ２とアミドベンジルの間）の酵素的切断後、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
【００１８】
一実施形態において、ＲＧＤリガンドは、ＲＧＤリガンドのジペプチドへの連結およびマスキング剤の可溶性を助長するリンカーを用いてジペプチドに連結される。好ましいマスキング剤は、一般式：ＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートを有する。各要素は、アミド結合の形成などの当該技術分野にて標準的な方法を用いて連結することができる。ジアリールヒドラゾンは、ＨｙＮｉｃ（ヒドラジノ−ニコチンアミド）とアリールアルデヒドとの反応によって生成することができる。ＰＥＧ１は、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを含み、ＰＥＧ２は（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを含む。ｎおよびｍは、独立して、４以上の整数であり、ｎとｍの和は、１２〜４８である。ＰＥＧ基は、ＲＧＤリガンドの溶解性および提示を助長し、これにより、修飾ポリアミンの腫瘍標的化が向上する。驚くべきことに、ジアリールヒドラゾンはまた、修飾ポリアミンのインビボ機能も向上させる。一実施形態において、アリールアルデヒド−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートを、初めにポリアミンと反応させて、アリールアルデヒド−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート−ポリアミンを生成する。次いで、この化合物をＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ＨｙＮｉｃと反応させて、ＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボマート−ポリアミンを生成する。
[本発明1001]
次式によって表される構造を含む、インテグリン陽性腫瘍細胞にＲＮＡｉトリガーをインビボで送達するための化合物：
Ｒ−Ａ1Ａ2−アミドベンジル−カルバマート−Ｐ
式中、Ｒは、ＲＧＤリガンドを含み、Ａ1は、疎水性アミノ酸であり、Ａ2は、アミド結合を介してＡ1に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、該非荷電親水性アミノ酸は、中性ｐＨで非荷電であり、Ｐは、膜活性ポリアミンを含む。
[本発明1002]
Ａ1が、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
Ａ2が、シトルリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される、本発明1001〜1002のいずれかの化合物。
[本発明1004]
前記インテグリンがαｖβ3インテグリンである、本発明1001〜1003のいずれかの化合物。
[本発明1005]
Ｒ−Ａ1Ａ2−アミドベンジル−カルバマート−Ｐが、次式によって表される構造を有する、本発明1001〜1004のいずれかの化合物：
0006433001.tif 000004
式中、Ｒ4は、ＲＧＤリガンドを含み、Ｒ1は、疎水性アミノ酸の側基であり、Ｒ2は、非荷電親水性アミノ酸の側基であり、ポリアミンは、膜活性ポリアミンＰである。
[本発明1006]
前記ＲＧＤリガンドがＲＧＤ模倣体を含む、本発明1001〜1005のいずれかの化合物。
[本発明1007]
前記ＲＧＤ模倣体が、アミド結合を介してグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結したグアニジニウム基を含む、本発明1006の化合物。
[本発明1008]
前記ＲＧＤ模倣体が、次式によって表される構造を含む、本発明1007の化合物：
0006433001.tif 000005
。
[本発明1009]
前記グアニジニウムが、
0006433001.tif 000006
およびその共鳴構造、ならびに
0006433001.tif 000007
およびその共鳴構造から選択される、本発明1008の化合物。
[本発明1010]
Ｒが、
ＲＧＤ模倣体−ＰＥＧ1−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ2を含み、
式中、
ＰＥＧ1は（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）ｎを含み、
ＰＥＧ2は（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）ｍを含み、
ｎおよびｍは、独立して、4以上の整数であり、
ｎとｍの和は、12〜48であり、
ＲＧＤ模倣体は、次式によって表される構造からなり、
0006433001.tif 000008
式中、Ｒ14は、
0006433001.tif 000009
およびその共鳴構造、ならびに
0006433001.tif 000010
およびその共鳴構造からなる群から選択される、
本発明1001〜1005のいずれかの化合物。
[本発明1011]
生理学的に不安定な可逆的共有結合を介して前記膜活性ポリアミンに連結したポリエチレングリコールをさらに含む、本発明1001〜1010のいずれかの化合物。
[本発明1012]
前記ＲＮＡｉトリガーが前記膜活性ポリアミンに共有結合している、本発明1001〜1011のいずれかの化合物。
[本発明1013]
次式によって表される構造を有する、本発明1012の化合物：
0006433001.tif 000011
式中、Ｎは、ＲＮＡｉトリガーであり、Ｌ1は、生理学的に不安定な連結であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールを含み、Ｌ2は、Ａ1Ａ2−アミドベンジル−カルバマートであり、ｙは、ゼロより大きい整数であり、ｚは、ゼロより大きい整数であり、ｙとｚの和の値は、修飾されていない膜活性ポリアミン上のアミンの数により求めた膜活性ポリアミンＰ上に存在するアミンの数の50％よりも大きい。
[本発明1014]
Ｐ−Ｌ2−Ｒが、
Ｒ−ＰＥＧ'−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ''−ＡＡ−アミドベンジルカルバマート−ポリアミンを含み、
式中、
Ｒは、次式によって表される構造を有し、
0006433001.tif 000012
ＰＥＧ'は、次式によって表される構造を有し、
0006433001.tif 000013
式中、Ｎ＝4〜44であり、
ジアリールヒドラゾンは、次式によって表される構造を有し、
0006433001.tif 000014
ＰＥＧ''は、次式によって表される構造を有し、
0006433001.tif 000015
式中、ｍは4〜44であり、
ＡＡ−アミドベンジルカルバマート−ポリアミンは、次式によって表される構造を有し、
0006433001.tif 000016
式中、ポリアミンは、膜活性ポリアミンＰである、
本発明1013の化合物。
[本発明1015]
以下の段階を含む、インテグリン陽性腫瘍細胞にＲＮＡｉトリガーをインビボで送達するための化合物を生成するために、膜活性ポリアミンを可逆的に修飾するための方法：
（ａ）前記ポリアミン上の1つまたは複数のアミンを、次式によって表される構造をそれぞれ有する1つまたは複数の第1の化合物と反応させることにより、前記1つまたは複数のアミンを可逆的に修飾する段階：
0006433001.tif 000017
式中、Ｒ3は、前記アミンと反応してカルバマートを生成することができるアミン反応性カルボナート部分を含み、Ｒ7は、前記アミン反応性カルボナートよりもアミン反応性の低い第1の反応性基を含み、Ｒ1は、疎水性アミノ酸の側基であり、Ｒ2は、非荷電親水性アミノ酸の側鎖であり、ならびに
（ｂ）Ｒ7を、次式によって表される構造を有する第2の化合物と反応させる段階：
0006433001.tif 000018
式中、Ｒ14は、
0006433001.tif 000019
からなる群から選択され、
Ａは、前記Ｒ7の第1の反応性基と反応して共有結合を形成することができる第2の反応性基に連結した、4〜44のエトキシ単位を有するポリエチレングリコールを含む。
[本発明1016]
Ｒ7が、4〜44のエトキシ単位を有するポリエチレングリコール基をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記ポリアミン上の1つまたは複数のアミンを、次式によって表される構造をそれぞれ有する1つまたは複数の化合物と反応させることにより、前記1つまたは複数のアミンを可逆的に修飾する段階をさらに含む、本発明1015〜1016のいずれかの方法：
ＰＥＧ−Ａ1Ａ2−アミドベンジル−カルボナート
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールを含み、Ａ1は、疎水性アミノ酸であり、Ａ2は、アミド結合を介してＡ1に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、該非荷電親水性アミノ酸は、中性ｐＨで非荷電である。
[本発明1018]
前記ポリアミン上のアミンの数の80％以上が可逆的に修飾され、該修飾されたポリアミンが膜活性でない、本発明1015〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
ＲＮＡｉトリガー分子が、生理学的に不安定な結合を介して前記ポリアミンに共有結合される、本発明1015〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記インテグリンがαｖβ3インテグリンである、本発明1015〜1019のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
（図１）（Ａ）ジペプチドマスキング剤または（Ｂ）ポリアミンに連結したジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。Ｒ１およびＲ２はアミノ酸のＲ基であり、Ｒ４はＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤を含み、−Ｘ−は−ＮＨ−、−Ｏ−または−ＣＨ２−であり、−Ｙ−は−ＮＨ−または−Ｏ−であり、−Ｒ５は２、４または６位であり、かつ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｚで、式中Ｚはカルボナートであり、−Ｒ６は、独立して、Ｒ５により占有されている位置を除く２、３、４、５または６位のそれぞれで、水素、アルキルまたはハロゲン化物である。
（図２Ａ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ａ）ＰＥＧ−ＧｌｙＧｌｙ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図２Ｂ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ｂ）ＰＥＧ−ＡｓｎＧｌｙ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図２Ｃ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ｃ）ＰＥＧ−ＰｈｅＬｙｓ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図２Ｄ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ｄ）ＰＥＧ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図２Ｅ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ｅ）ＰＥＧ−ＡｌａＡｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図２Ｆ）種々のＰＥＧジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。（Ｆ）ＰＥＧ−ＰｈｅＬｙｓ（ＣＨ３）２−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ。
（図３）ジペプチドマスキング剤を用いるポリアミンの可逆的修飾を示す図である。Ｒは、ＲＧＤリガンドまたはＰＥＧを含み、ＡＡは、ジペプチドであり（保護基ありまたは保護基なしのいずれか）であり、Ｒ３は、アミン反応性カルボナートであり、ポリアミンは、両親媒性膜活性ポリアミンである。
（図４）アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される脱離反応を示す図である。ＡＡ（Ａ１Ａ２）はジペプチドであり、Ｒ４はＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤を含む。
（図５）ＰＥＧジペプチドマスキング剤の合成を示す図である。ＲはＰＥＧを含み、Ａ１およびＡ２はアミノ酸（保護または非保護のいずれか）である。
（図６）（Ａ）ジペプチドのＮＨＳエステル、（Ｂ）Ｆｍｏｃ保護誘導体からのＨ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨのアミノ酸、ならびに（Ｃ）Ｆｍｏｃ−Ａ１Ａ２−ＯＨの生成を示す図である。Ａ、Ａ１およびＡ２はアミノ酸である。
（図７）（Ａ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＰＡＢＡおよびＦｍｏｃ−Ａ−ＰＡＢＡの生成、ならびに（Ｂ）Ｈ−Ｌｙｓ（ＣＨ３）２−ＰＡＢＡとＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳの結合を示す図である。
（図８）Ｈ−Ａ１Ａ２−ＰＡＢＡおよびＨ−Ａ１−ＰＡＢＡの生成を示す図である。
（図９）ＰＥＧｎ−Ａ１Ａ２−ＰＡＢＡの生成を示す図である。
（図１０）ＰＥＧ−ＡＡ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（Ａ）および（Ｂ）の生成を示す図である。
（図１１）Ｎ−Ｂｏｃ−エチルエトキシアクリラートとプロピルメタクリラートのＲＡＦＴ共重合を示す図である。
（図１２）アジド−ＰＥＧ−アミンを用いたポリマー末端修飾を示す図である。
（図１３）ＲＧＤマスキング剤の一例によって修飾したポリアミンを示す図である。ＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ジアミン−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボマート−ポリアミン。
0006433001.tif 000020
によって単位の一部（すなわち、ＲＧＤリガンド、ＰＥＧ１など）として明示されていない原子は、連結原子とみなされ、両側の表示を付けた単位の一部とみなされ得る。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、インテグリン発現腫瘍細胞にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーをインビボで送達するための結合体および方法を提供する。本記載の結合体は、送達対象のＲＮＡｉトリガーに共有結合した、インテグリンを標的にする可逆的に修飾した膜活性ポリアミンを含む。インテグリン標的化は、本明細書にて記載されるＲＧＤリガンドによってもたらされる。膜活性ポリアミンの可逆的修飾は、本明細書にて記載されるＲＮＡリガンドおよび立体安定化ペプチダーゼ切断可能マスキング剤によってもたらされる。ペプチダーゼで切断可能な連結は、プロテアーゼ不存在下での加水分解に対して安定であり、保存およびインビボ循環にて長期間の安定性をもたらす。循環における半減期の向上（長期化）により、腫瘍組織などの組織におけるＲＧＤリガンドを介した累積の可能性が時間的に広がりやすくなる。ＲＮＡｉトリガーのインビボ送達は、遺伝子発現の治療的阻害（ノックダウン）に有用である。
【００２１】
本発明は、以下の一般構造の結合体送達系を含む。
0006433001.tif 000021
式中、Ｎは、ＲＮＡｉトリガーであり、Ｌ１は、生理学的に不安定な連結であり、Ｐは、両親媒性膜活性ポリアミンであり、Ｍ１は、ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してＰに連結したＲＧＤリガンド（ＲＧＤマスキング剤）を含み、Ｍ２は、ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してＰに連結した立体安定化剤（ＰＥＧマスキング剤）を含む。ｙおよびｚはそれぞれ、いかなるマスキング剤もないポリアミンＰ上のアミンの量によって求めた場合で、ｙ＋ｚの値が、Ｐ上にある第一級アミンの数の５０％より大きい値、６０％より大きい値、７０％より大きい値、８０％より大きい値、または９０％より大きい値を有することを条件とし、ゼロより大きい整数である。Ｐは、修飾されていない状態において、膜活性ポリアミンである。送達ポリマーのＭ１ｙ−Ｐ−Ｍ２ｚは膜活性ではない。Ｍ１およびＭ２を連結することによるＰの第一級アミンの可逆的修飾は、Ｐの膜活性を可逆的に抑制または不活性化する。一部の小さな両親媒性膜活性ポリアミン、たとえばメリチンペプチドなどは、わずか３〜５個の第一級アミンしか含まないことに留意されたい。アミンのある百分率の修飾は、ポリマーの集団におけるアミンの百分率の修飾を反映することになる。Ｍ１およびＭ２が切断されると、ポリアミンのアミンが復元され、これにより、Ｐは、修飾されていない膜活性状態に戻る。
【００２２】
腫瘍送達のために、ｙは、ポリマーＰ上の第一級アミンの数の２〜２０％に相当する値を有する。より好ましくは、ｙは、ポリマーＰ上の第一級アミンの数の２〜１０％に相当する値を有する。したがって、ｚは、ポリマーＰ上の第一級アミンの数の８０〜９８％に相当する値を有する。ｙ（ＲＧＤ）：ｚ（立体安定化剤）の比は、好ましくは約１〜１２：５０、より好ましくは約１：２０である。
【００２３】
可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、マスクした状態では、膜破壊活性を示さない。膜活性を抑制し、細胞標的化機能をもたらすために、すなわち、可逆的にマスクした膜活性ポリマー（送達ポリマー）を生成するために、ポリアミン上のアミンの５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超または９０％超のジペプチドマスキング剤による可逆的修飾が必要とされ得る。
【００２４】
一実施形態において、ＲＮＡｉトリガーは、生理学的に不安定な共有結合を介して、本発明の送達ポリマーに連結される。生理学的に不安定な連結を用いることで、ＲＮＡｉトリガーがポリマーから切断され、ＲＮＡｉトリガーが放出されて、細胞成分との機能的相互作用への関与が可能になる。
【００２５】
マスキングは、本記載のマスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に連結させ、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性を抑制することに加えて、マスキング剤は、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増加させ、かつ／または細胞特異性相互作用、すなわち標的化能をもたらす。
【００２６】
全般的に、ポリマーの膜活性を抑制することがマスキング剤の本質的な特徴である。マスキング剤は、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し得る（血清相互作用を低減し、循環時間を増加させ得る）。膜活性ポリアミンは、非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性でない（不活化されている）。所望の不活性レベルを得るために、十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の連結による所望のポリマー修飾レベルは、適切なポリマー活性アッセイを用いて容易に決定される。たとえば、所与のアッセイでポリマーが膜活性を有するのであれば、そのアッセイにおいて、膜活性の所望の抑制レベルを達成するのに十分な量のマスキング剤がポリマーに連結されている。マスキングには、いかなるマスキング剤もないポリマー上の第一級アミンの量によって求めた場合で、ポリマー集団における第一級アミン基の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の修飾が必要である。マスクしたポリマーは、水溶性を保持していることが望ましい。
【００２７】
全般的に、送達ポリマーのαｖβ３インテグリン陽性腫瘍細胞への標的化がＲＧＤマスキング剤の本質的な特徴である。腫瘍細胞標的化を達成するために、十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。標的化には、いかなるマスキング剤もないポリマー上の第一級アミンの数によって求めた場合で、ポリマー集団における第一級アミン基の約２％〜約２０％、約２％〜約１０％または約３％〜約６％の修飾が必要であり得る。
【００２８】
一実施形態において、インテグリン標的化送達ポリマーを生成するためのポリアミンの修飾に好適なＲＧＤマスキング剤は、ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートに共有結合したＲＧＤリガンド（ＲＧＤジペプチドマスキング剤）を含む。同様に、インテグリン標的化送達ポリマーを生成するためのポリアミンの修飾に好適な立体安定化ジペプチドマスキング剤は、ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートに共有結合した立体安定化剤を含む。マスキング剤は、以下の一般式を有する。
（ＲまたはＰＥＧ）−Ａ１Ａ２−アミドベンジル−カルボナート
式中、Ｒは、ＲＧＤリガンドを含み、ＰＥＧは、他の立体安定化剤のポリエチレングリコールを含み、Ａ１Ａ２は、第１のアミノ酸Ａ１および第２のアミノ酸Ａ２を含むジペプチドであり、カルボナートは、活性化アミン反応性カルボナートである。マスキング剤カルボナートとポリマーアミンとの反応により、カルバマート連結が生じる。ＲＮＡリガンドまたは立体安定化剤は、カルボナートとポリマーアミンとの反応前またはカルバマート連結の生成後に、ジペプチドに接続され得る。マスキング剤は、そのジペプチドが内因性プロテアーゼによりインビボで切断されるまで、したがって、ＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤のポリアミンからの切断まで、ポリマーに安定的に連結している。ジペプチドの後（Ａ２とアミドベンジルの間）の酵素的切断後、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。ＲＧＤリガンドは、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介してジペプチドに連結され得る。好ましい立体安定化マスキング剤は、非荷電である。好ましい非荷電性立体安定化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましいジペプチドは、非荷電親水性アミノ酸（Ａ２）にアミド結合を介して連結した疎水性のアミノ酸（Ａ１）からなる。好ましいアミドベンジル基は、ｐ−アミドベンジル基である。好ましいカルボナートは、活性化アミン反応性カルボナートである。
【００２９】
本発明のインテグリン標的化送達ポリマーの生成に好適なマスキング剤は、以下の一般構造を有する。
0006433001.tif 000022
式中、Ｒ４は、ＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤を含み、Ｒ３は、アミン反応性カルボナート部分を含み、Ｒ１およびＲ２は、アミノ酸側鎖である。Ｒ１は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基である。好ましい疎水性アミノ酸は、アラニンである。Ｒ２は、好ましくは、非荷電親水性アミノ酸の側鎖である。好ましい非荷電親水性アミノ酸は、シトルリンである。好ましい活性化カルボナートは、パラ−ニトロフェノールである。しかしながら、パラ−ニトロフェノールの代わりに、当該技術分野にて知られている他のアミン反応性カルボナートを問題なく使用できる。以下で表されるように、活性化カルボナートとアミンとの反応により、ＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤が、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド−アミドベンジルカルバマート連結を介して、膜活性ポリアミンに接続される。
0006433001.tif 000023
式中、Ｒ４、Ｒ１およびＲ２は、上述の通りである。ジペプチドの後のアミノ酸とアミドベンジル基との間にて酵素的切断が生じると、Ｒ４がポリマーから外れ、脱離反応を誘発し、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
【００３０】
別の実施形態において、生理学的に不安定な可逆的連結を介したＲＧＤリガンドのポリアミンへの連結は、初めに、ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートを用いてアミンを可逆的に修飾することによって達成され、以下の一般構造を有する。
0006433001.tif 000024
式中、Ｒ７は、ＲＧＤリガンド含有部分との反応に適し、Ｒ３のカルボナートよりもアミン反応性が小さい反応性基を含む。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義した通りである。一実施形態において、Ｒ７は、ＰＥＧ連結部分（本明細書にてＰＥＧ２とも称される）をさらに含む。本発明者らは、ジペプチドと反応性基との間にＰＥＧ連結部分を挿入すると、組み合わせた後のＲＧＤマスキング剤の溶解性およびインビボ機能が向上することを見出した。好ましいＰＥＧ連結部分は、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）４−４４である。ポリマーアミンを反応性基（Ｒ７）含有ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートで修飾した後、反応性基Ｒ７との反応を介して、ＲＧＤリガンド含有部分を共有結合させる。ジペプチドとＲＧＤリガンド含有部分を連結させるのに適した例示の反応性基部分には、ＨｙＮｉｃおよびアルデヒド（アリールアルデヒドを含む）、「クリック」ケミストリー架橋剤（ある特定のアジドおよびアルキン）が挙げられるが、これらに限定されない。式３の例示的な分子は、（４−ホルミルベンズアルデヒド）−ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｃｉｔ−ａｒａ−アミノベンジルカルボナートである。
【００３１】
本明細書にてＡ１Ａ２（またはＡＡ）で表される、ジペプチドマスキング剤のジペプチドは、アミド結合を介して接続されたアミノ酸の二量体である。αおよびβアミノ酸を含むアミノ酸は、生物学および化学においてよく知られており、アミン基、カルボン酸基および種々のアミノ酸で異なる側鎖を含有する分子である。好ましいアミノ酸は、一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨ（式中、Ｒ（式３のＲ１およびＲ２）は、有機置換基または側基である）を有するＬ  α−アミノ酸である。好ましいＬ  α−アミノ酸は、非荷電の天然アミノ酸である。好ましいジペプチドにおいて、Ａ１は疎水性アミノ酸であり、Ａ２は、非荷電の親水性アミノ酸である。好ましい疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニンまたはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミンまたはシトルリンである。より好ましい疎水性アミノ酸は、アラニンまたはフェニルアラニンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸は、シトルリンである。ジペプチドが好ましいが、Ａ１とＲの間に、さらなるアミノ酸を挿入することも可能である。ジペプチドの代わりに、アミノ酸Ａ１をなくしてアミノ酸を１つだけ用いることもできる。本明細書中、本発明にて用いる天然アミノ酸はいずれもその一般的略語により示す。
【００３２】
好ましい実施形態において、両親媒性膜活性ポリアミンを、所望のジペプチド−アミドベンジル−カルボナートマスキング剤との反応により可逆的に修飾して、膜不活性の送達ポリマーを得る。ジペプチドマスキング剤は、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、循環時間を増加させ、特異的相互作用を増強し、毒性を阻害し、またはポリマーの電荷を変更する。
【００３３】
本発明の可逆的にマスクしたポリマーは、以下の構造を含む。
0006433001.tif 000025
式中、
Ｘは−ＮＨ−、−Ｏ−または−ＣＨ２−であり、
Ｙは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、
Ｒ１は、好ましくは、−（ＣＨ２）ｋ−フェニル（ｋは１、２、３、４、５、６であり、ｋ＝１の場合フェニルアラニン）、−ＣＨ−（ＣＨ３）２（バリン）、−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＨ３）２（ロイシン）、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３（イソロイシン）、−ＣＨ３（アラニン）、または
0006433001.tif 000026
であり、
Ｒ２は、好ましくは、水素（グリシン）、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２（シトルリン）、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２（アスパラギン）、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２（グルタミン）、−（ＣＨ２）４−Ｎ−（ＣＨ３）２（リシン（ＣＨ３）２）、−（ＣＨ２）ｋ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２（ｋは１、２、３、４、５、６である）、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ'Ｒ''（アスパラギン酸アミド）、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ'Ｒ''（グルタミン酸アミド）、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ'（アスパラギン酸エステル）または−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ'（グルタミン酸エステル）であり、式中、Ｒ'およびＲ''はアルキル基であり、
Ｒ４は、ＲＧＤリガンドまたはポリエチレングリコールを含み、
ポリアミンは、両親媒性膜活性ポリアミンである。
【００３４】
上記構造は、ポリマーに連結した１つのジペプチドマスキング剤を示しているが、本発明の実施において、ポリマーアミンの５０％〜１００％がジペプチドマスキング剤により修飾される。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明の可逆的にマスクしたポリマーは、以下の構造を含む。
0006433001.tif 000027
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびポリアミンは、上述の通りである。
【００３６】
本発明の可逆的にマスクしたポリマーは、本発明のジペプチドマスキング剤とポリマーのアミンとの反応により生成することができる。本発明のジペプチドマスキング剤は、以下の構造を有する。
0006433001.tif 000028
式中、
Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、上述の通りであり、
Ｒ５は、２、４または６位であり、かつ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｚであり、式中、Ｚは、
−ハロゲン化物、
0006433001.tif 000029
であり、
Ｒ６は、独立して、Ｒ５により占有されている位置を除く２、３、４、５または６位のそれぞれで、水素、アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３（式中ｎ＝０〜４）、−（ＣＨ２）−（ＣＨ３）２またはハロゲン化物である。
【００３７】
好ましい実施形態において、以下に示すように、Ｘは−ＮＨ−であり、Ｙは−ＮＨ−であり、Ｒ４はＲＧＤリガンドまたはＰＥＧ基を含み、Ｒ５は４位であり、Ｒ６は水素である。
0006433001.tif 000030
【００３８】
別の実施形態において、式４のＲ４は、Ｒ８−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｓ−Ｏ−Ｙ１−であり、式中、Ｒ８は水素、メチルまたはエチルであり、ｓは、１〜１５０の整数であり、Ｙ１は、ＰＥＧ基をジペプチドに接続するために当該技術分野において好適なリンカーである。好適なリンカーＹ１には、−（ＣＨ２）１−３−Ｃ（Ｏ）−、−Ｙ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｙ２は−（ＣＨ２）３−）および−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ｐは１〜２０の整数である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用する場合、ＲＧＤリガンドは、アルファｖ／ベータ３（αｖβ３またはαｖβ３）インテグリンに結合する（親和性を有する）、１５００ｋＤａ未満の大きさの双性イオンＲＧＤペプチドまたはＲＧＤ模倣体を含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、ＲＧＤペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のトリペプチドを含む。ＲＧＤペプチドは、そのＲＧＤ配列に、追加のアミノ酸アミノ末端またはカルボキシ末端をさらに含み得る。追加のアミノ酸が存在する場合、連続的なペプチド配列がＲＧＤペプチドを構成する。ＲＧＤペプチドは、立体配置的に制限され得る。立体配置的制限は、通常、システインアミノ酸をＲＧＤ配列のアミノ末端およびカルボキシ末端に加え、そのシステインチオールの間にジスルフィド結合を形成することなどのペプチドの環化によって行われる。好ましい制限ＲＧＤペプチドは、
0006433001.tif 000031
のアミノ酸配列からなり、式中、Ｘは天然アミノ酸であり、ｍはゼロ（０）または１であり、ｎ１〜ｎ６は独立して０、１、２または３である。存在する場合（ｎ＝１、２または３）、各Ｘの１つまたは複数のアミノ酸は、他の位置のアミノ酸の選択に依存しない。一実施形態において、ｍ、ｎ１、ｎ２およびｎ５はそれぞれ１であり、ｎ３、ｎ４およびｎ６はそれぞれゼロ（０）である。別の実施形態において、ｍは１であり、Ｘｎ１はアラニンであり、Ｘｎ２はアスパラギン酸であり、Ｘｎ５はフェニルアラニンであり、ｎ３、ｎ４およびｎ６はそれぞれゼロ（０）である
0006433001.tif 000032
。ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列に連結した非ペプチド成分を有し得る。たとえば、ペプチドのアミノ末端がアシル化されてもよいし、またはリンカーがペプチドのカルボキシ末端に接続していてもよい。別の実施形態において、ｍは１であり、Ｘｎ１はアシル化されたアラニンであり、Ｘｎ２はアスパラギン酸であり、Ｘｎ５はフェニルアラニンであり、ｎ３、ｎ４およびｎ６はそれぞれゼロ（０）である。
【００４１】
本明細書で使用する場合、ＲＧＤ模倣体は、ＲＤＧペプチド以外の非ペプチド合成分子であって、ＲＧＤペプチドの活性決定基、インテグリン結合タンパク質のインテグリン結合ＲＧＤ部分またはαｖβ３インテグリン結合ＲＧＤモチーフを生物学的に再現する分子である。ＲＧＤ模倣体は、アミド結合を介して連結した１つまたは２つの天然アミノ酸を含有し得る。ＲＧＤ模倣体は、修飾されたペプチドであってよく、特殊アミノ酸または特殊アミノ酸側鎖を含み得る。ＲＧＤ模倣体は、以下の構造によって表されるペプチド骨格を有し得る。
0006433001.tif 000033
式中、ｎは整数である。
【００４２】
一実施形態において、ＲＧＤリガンドは、グリシン−アスパラギン酸ジペプチドにアミド結合を介して連結したグアニジニウム基を含む。本発明のグアニジニウム基は、以下の式によって表される構造を有する。
0006433001.tif 000034
式中、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、水素またはアルキルであり、連結して環を形成してよい。Ｒ１１は、グアニジニウム基をグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結するリンカーである。グアニジニウム基は、上記で示した構造とその共鳴構造の両方を含む。好ましいリンカーは、
−（Ｃ１ＲＲ）−（Ｃ２ＲＲ）−（Ｃ３ＲＲ）−または−（Ｃ１ＲＲ）−（Ｃ２ＲＲ）−（Ｃ３ＲＲ）−（Ｃ４ＲＲ'）−
であり、式中、ａ）各Ｒは、独立して、任意であり、存在する場合は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、ｂ）Ｒ'は水素、アルキル、アリールまたはＮＨ２であり、ｃ）Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は、単結合、単結合と二重結合または芳香族結合によって連結され得る。
【００４３】
本明細書にて示すＲＧＤリガンド構造中には明記していないが、グアニジニウム基が中性または中性に近いｐＨ（ｐＨ６．５〜７．５）で正に帯電していることはよく知られており、そのように理解される。
0006433001.tif 000035
同様に、本明細書にて示すＲＧＤリガンド構造中には明記していないが、アミノ酸のアスパラギン酸が中性または中性に近いｐＨ（ｐＨ６．５〜７．５）で負に帯電していることはよく知られており、そのように理解される。
0006433001.tif 000036
【００４４】
ＲＧＤリガンドのアスパラギンアミノ酸に連結したフェノキシ基が、インビボでのポリアミンの腫瘍細胞標的化を向上させることがわかった。好ましいＲＧＤリガンドは、クアニジニウム−グリシン−アスパラギン酸−４−アミノフェノキシ化合物を含む。好ましいクアニジニウム−グリシン−アスパラギン酸−４−アミノフェノキシ化合物は、以下の式によって表される構造を含む。
0006433001.tif 000037
式中、Ｒ１３は、
0006433001.tif 000038
である。
【００４５】
好ましいグアニジニウムは、
0006433001.tif 000039
およびこれらの共鳴構造である。
【００４６】
別の実施形態において、ＲＧＤリガンド含有部分は、以下の式によって表される構造を含む。
0006433001.tif 000040
式中、
Ｒ１４は、
0006433001.tif 000041
であり、
Ａは、リンカーを含む。リンカーは、ＲＧＤ模倣体をジペプチドアミドベンジル−カルボナートなどの別の分子に接続するか、溶解性の向上をもたらすか、または別の分子への共有結合の手段を提供する。
【００４７】
一実施形態において、リンカーＡは、以下を含む。
0006433001.tif 000042
式中、
ｎは、０、１、２または３であり、
Ｙは、不在か、
0006433001.tif 000043
であり、
Ｚは、不在か、
0006433001.tif 000044
であり、
ｍは、０、１、２、３または４であり、
ＰＥＧ（図１３中のＰＥＧ１）は（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）４−４４であり、
Ｒ１２は、Ｒ７と反応して共有結合を形成できる反応性基を含む。
【００４８】
個別の要素、ＰＥＧ、反応性基などのそれぞれは、限定するものではないが、アミド結合の形成を含む、当該技術分野において容易に利用できる方法を用いて連結する（共有結合させる）ことが可能である。一実施形態において、反応性基Ｒ１２は、リシンなどのジアミンを介してＰＥＧと連結することができる。リシンのカルボキシル基は、固相担体への連結が可能であり、Ｒ ＧＤリガンドの合成に役立つ。次いで、末端およびεアミンを用いてＰＥＧ基と反応性基を連結する。反応性基Ｒ１２は、式３の反応性基Ｒ７と速やかに反応して、共有結合を形成するように選択される。Ｒ１２およびＲ７に使用するのに好適な反応性基のペアは、アジドとホスフィン、アジドとアルキン、ニトロンとアルキン、テトラジンとオクタン、テトラジンとシクロプロペン、テトラジンとイソニトリル、ジエンとアルケン、アルデヒドとヒドラジン、アルデヒドとアミノオキシ、アルデヒドとヒドラジド、ケトンとヒドラジン、ケトンとアミノオキシおよびケトンとヒドラジドからなるペアから選択することができる。好ましい反応性基は、
0006433001.tif 000045
である。
【００４９】
好ましい実施形態において、ＲＧＤリガンド含有部分は、以下の式によって表される構造を含む。
0006433001.tif 000046
式中、Ｒ１４、ｎ、Ｙ、Ｚ、ｍ、ＰＥＧおよびＲ１２はそれぞれ上記で定義した通りである。
【００５０】
反応性基Ｒ１２を用いて、ＲＧＤリガンドをジペプチドリンカーなどの生理学的に不安定な可逆的リンカーに連結させて、ＲＧＤマスキング剤を得ることができる。一実施形態において、ＲＧＤマスキング剤は、以下の式によって表される構造を含む。
0006433001.tif 000047
式中、Ｒ１４は、上記で定義したグアニジニウム含有部分であり、Ａ'は、ＰＥＧ含有リンカーを含み、Ｒ１は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基であり、Ｒ２は、好ましくは、（中性ｐＨで）非荷電の親水性アミノ酸の側鎖であり、Ｒ３は、アミン反応性カルボナートである。一実施形態において、リンカーＡ'は、４〜４８のエトキシ単位を有するＰＥＧ基を含む。別の実施形態において、リンカーＡ'は、ジアシルヒドラジンまたは他の連結化学により隔てられた、４〜４４のエチレン単位を有する第１のＰＥＧ（ＰＥＧ１）基と、４〜４４のエチレン基を有する第２のＰＥＧ（ＰＥＧ２）基とを含む。一実施形態において、ジアシルヒドラゾンは、リシンなどのジアミンを介して第１のＰＥＧ基と連結している。ジアリールヒドラゾンは、ＨｙＮｉｃ（ヒドラジノ−ニコチンアミド）とアリールアルデヒドとの反応によって生成することができる。
【００５１】
別の実施形態において、リンカーＡ'は、アジドとホスフィン、アジドとアルキン、ニトロンとアルキン、テトラジンとオクタン、テトラジンとシクロプロペン、テトラジンとイソニトリル、ジエンとアルケン、アルデヒドとヒドラジン、アルデヒドとアミノオキシ、アルデヒドとヒドラジド、ケトンとヒドラジン、ケトンとアミノオキシまたはケトンとヒドラジドの反応により形成される連結を含む。
【００５２】
ＲＧＤマスキング剤の連結により膜活性ポリアミンを修飾することにより、可逆的に修飾したポリアミンが得られる。一実施形態において、ＲＧＤマスキング剤により修飾した膜活性ポリアミンは、以下の式によって表される構造を含む。
0006433001.tif 000048
式中、Ｒ１４、Ｒ１、Ｒ２およびＡ'は、上記で定義した通りである。一実施形態において、ＲＧＤは、ジペプチドを両親媒性膜活性ポリアミンに連結した後、ジペプチドに連結する。一実施形態において、アリールアルデヒド−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートを、初めにポリアミンと反応させて、アリールアルデヒド−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート−ポリアミンを生成する。次いで、この化合物をＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ジアミン−ＨｙＮｉｃと反応させて、ＲＧＤリガンド−ＰＥＧ１−ジアミン−ジアリールヒドラゾン−ＰＥＧ２−ジペプチド−アミドベンジル−カルボマート−ポリアミンを生成する（図１３参照）。
【００５３】
本明細書で使用する場合、ペプチドという用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、ペプチド（アミド）結合、すなわち、１つのアミノ酸のカルボキシル基がもう１つのアミノ酸のアミノ基と反応して形成される共有化学結合によって連結された短鎖のＬ  αアミノ酸単量体を意味する。
【００５４】
本明細書で使用する場合、天然アミノ酸という用語は、当該技術分野における通常の意味を有する。本明細書で使用する場合、一般アミノ酸という語句は、当該技術分野における通常の意味を有し、遺伝子コード中のトリプレットコドンによって直接コードされた天然Ｌ  αアミノ酸を意味する。本発明による使用に好適な膜活性ポリマーの非限定的な例は、米国特許公開のＵＳ２００８０１５２６６１、ＵＳ２００９００２３８９０、ＵＳ２００８０２８７６３０、ＵＳ２０１１０２０７７９９、ＵＳ２０１３０１２１９５４およびＵＳ２０１３０３１７０７９に先に記載されている（これらの各特許公報は参照により本明細書に援用する）。好適な両親媒性膜活性ポリアミンはまた、メリチンペプチドなどの小さなペプチドであってもよい。
【００５５】
ポリマーアミンは、本明細書に記載のペプチダーゼ切断可能リンカーを用いて可逆的に修飾される。修飾基の切断によりアミンの再生がもたらされるのであれば、アミンは可逆的に修飾されている。図３に示すように、マスキング剤の活性化カルボナートとポリマーアミンとの反応により、ＲＧＤリガンドまたは立体安定化剤が、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド−アミドベンジルカルバマート連結を介して、ポリマーに接続される。
【００５６】
ＲＧＤリガンドとジペプチドマスキング剤の合成および結合の際には保護基を用いてよい。保護基が存在する場合、両親媒性膜活性ポリアミンの修飾前または修飾後にその保護基を除去することができる。
【００５７】
ジペプチドマスキング剤を用いたポリマーアミンの十分な百分率の可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を抑制する。ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結は、プロテアーゼ（またはペプチダーゼ）切断に感受性である。プロテアーゼの存在下で、アニリド結合が切断されて中間体を生じ、これが直ちに１，６脱離反応を起こし、遊離ポリマーを放出する（図４参照）。脱離反応後の遊離ポリマーは非修飾であり、膜活性が復元される。
【００５８】
膜活性ポリアミンは、過剰なマスキング剤の存在下にて、マスキング剤に結合され得る。過剰なマスキング剤は、送達ポリマーの投与前に、結合させた送達ポリマーから除去することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「立体安定化剤」とは、立体安定化剤を含有しないポリマーと比較して、立体安定化剤が連結しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成または非天然のいずれか）である。立体安定化剤は、立体安定化剤が連結しているポリマーの静電相互作用への関与を妨げる。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力に起因する２つまたはそれ以上の物質の非共有結合である。立体安定化剤は、血液成分との相互作用を阻害することができ、したがって、細網内皮系によるオプソニン作用、食作用および取込みを阻害することができる。このため、立体安定化剤は、立体安定化剤が連結している分子の循環時間を増加することができる。立体安定化剤はまた、ポリマーの凝集も阻害することができる。好ましい立体安定化剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体である。本明細書で使用する場合、好ましいＰＥＧは、約１〜５００または２〜２５のエチレングリコールグリコールモノマーを有し得る。本明細書で使用する場合、好ましいＰＥＧはまた、約８５〜２０，０００ダルトン（Ｄａ）、約８５〜１０００Ｄａの分子量平均を有する。本明細書で使用する場合、立体安定化剤は、立体安定化剤を含有しないポリマーと比較して、立体安定化剤が連結しているポリマーの水溶液中における分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
【００６０】
「リガンド」は、リガンドが連結している結合体の薬物動態または生体内分布の特性を向上させ、結合体の細胞または組織特異的分布および細胞特異的取込みを改善する。リガンドは、分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、リガンドは、リガンドが連結している結合体の薬物動態または生体内分布の特性を向上させ、結合体の細胞分布および細胞取込みを改善する。リガンドの細胞または細胞受容体への結合により、エンドサイトーシスが開始し得る。リガンドは、一価、二価、三価、四価またはそれ以上の結合価を有し得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、膜活性ポリアミンは、原形質膜またはリソソーム／エンドサイトーシス膜を破壊することができる。この膜活性は、ＲＮＡｉトリガーの細胞送達にとって必須の特徴である。しかしながら、膜活性は、そのポリマーをインビボで投与する場合、毒性をもたらす。ポリアミンはまた、インビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望ましくない生体内分布を招く。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングは、インビボ用途に必要である。
【００６２】
一実施形態において、膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマーと疎水性基含有モノマーとのランダム重合によって生成された両親媒性ポリマーを含む。アミン含有モノマーは、ペンダント第一級アミン基を含有する。疎水性モノマーは、ペンダント疎水性基を含有する。疎水性基は、１〜６個の炭素原子を有する低級疎水性基であってもよいし、６個を超える炭素原子を有する高級疎水性基であってもよい。好ましい疎水性基は、プロピル、ブチル、イソプロピルおよびイソブチルからなるリストから選択され得る。アミン基と疎水性基の比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを形成するように選択され、好ましくは疎水性モノマー１つ当たり１以上のアミンモノマーである。一実施形態において、本ポリマーは、５０〜８０％のアミンモノマー、より好ましくは５５〜７５％のアミンモノマーを有する。疎水性基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基およびアラルキニル基からなる群から選択され得、いずれも直鎖状、分枝状または環状であってよい。疎水性基は、好ましくは、炭素原子および水素原子のみを含有する炭化水素である。しかしながら、疎水性を維持し、たとえばフッ素を含む、置換またはヘテロ原子は許容され得る。
【００６３】
「両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）」または両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）ポリマーは、当該技術分野においてよく知られ、認識されており、親水性（極性、水溶性）と疎水性（非極性、親油性、非水溶性）の基または部分の両方を有するものである。
【００６４】
「親水性基」は、定性的な用語であり、化学的部分が水を好むことを示す。典型的には、かかる化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は、荷電または非荷電であり得る。荷電基は、正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（双性イオン）であり得る。親水性基の例には、炭水化物、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄およびヒドロキシルの化学的部分が挙げられる。
【００６５】
「疎水性基」は、定性的な用語であり、化学的部分が水を避けることを示す。通常は典型的には、かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性の基は、脂肪、油、脂質および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力をほとんど有していない。２つまたはそれ以上の炭素原子を含有する炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロールおよびコレステロール誘導体が疎水性の基および化合物の例である。
【００６６】
疎水性基は、好ましくは、炭素原子および水素原子のみを含有する炭化水素である。しかしながら、疎水性を維持し、たとえばフッ素を含む、非極性置換または非極性ヘテロ原子は許容され得る。当用語には、脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基およびアラルキニル基が挙げられ、いずれも直鎖状、分枝状または環状であってよい。疎水性基という用語はまた、ステロール、ステロイド、コレステロールならびにステロイド誘導体およびコレステロール誘導体も含まれる。
【００６７】
両親媒性ポリマーに関して、本明細書で使用する場合、ある部分であって、１つの共有結合が切断され、水素に置換されたときに誘導される分子として定義する。たとえば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素の間の結合が切れ、水素に置換されると、アンモニア（親水性）とブタン（疎水性）が生じる。１，４−ジアミノブタンが窒素−炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子は、同様にアンモニア（２×）とブタンである。しかしながら、１，４，−ジアミノブタンは、疎水性部分の形成に２つの結合の切断を要するため、両親媒性とはみなされない。
【００６８】
本明細書で使用する場合、表面活性ポリマーは、水の表面張力および／または他の相との界面張力を低減するものであり、これにより、液体／気体界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は、通常、その物質の分子が両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）または両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）であるという事実による。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「膜活性」ポリマーは、生体膜に対して、膜透過性でない分子を細胞に侵入もしくは膜通過させられる膜の改変もしくは破壊、膜の孔形成、膜の分断、または膜の破壊もしくは溶解の効果のうち１つまたは複数を誘起することができる表面活性両親媒性ポリマーである。本明細書で使用する場合、膜、すなわち細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の改変または破壊は、赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解およびエンドソーム放出の少なくとも１つのアッセイにて、ポリマーの活性により機能的に定めることができる。細胞膜の溶解を引き起こすことができる膜活性ポリマーはまた、膜溶解性ポリマーとも呼ばれる。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーは、エンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜への作用は、一過性であり得る。膜活性は、膜に対する親和性を有し、二重膜構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは、合成または非天然の両親媒性ポリマーであり得る。
【００７０】
本明細書で使用する場合、膜活性ポリマーは、細胞透過ペプチドと呼ばれるポリマー、すなわちＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質由来のアルギニンに富むペプチド、アンテナペディアペプチド、ＶＰ２２ペプチド、トランスポータン、アルギニンに富む人工ペプチド、小さいグアニジニウムに富む人工ポリマーなどの化合物によって表されるポリマーの種類とは異なる。細胞透過化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを要することなく、かつ膜の完全性を妨げることなく、一部の分子を、脂質二重膜の一方の側から脂質二重膜の他方の側へと膜を通過させて輸送すると思われるが、これらの機序はわかっていない。
【００７１】
ＲＮＡｉトリガーの細胞への送達は、原形質膜または内部小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化し（膜に孔を形成すること、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊することを含む）、これにより、小胞内の内容物を細胞質中に放出させる膜活性ポリマーによって仲介される。
【００７２】
本発明の両親媒性膜活性ポリアミンコポリマーは、２つまたはそれ以上のモノマー種の共重合の生成物である。一実施形態において、本発明の両親媒性膜活性ヘテロポリマーは、以下の一般構造を有する。
−（Ａ）ａ−（Ｂ）ｂ−
式中、Ａは、ペンダント第一級アミン官能基を含み、Ｂは、ペンダント疎水性基を含む。ａおよびｂは、０を超える整数である。ポリマーは、ランダム、ブロックまたは交互であってよい。追加モノマーの組み込みは、許容される。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「エンドソーム溶解性ポリマー」とは、溶解性酵素の存在などのエンドソーム特異的環境因子に応じて、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こすか、またはエンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜で囲まれた小胞からＲＮＡｉトリガーなどの通常は細胞膜非透過性である化合物の放出をもたらすことができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、エンドソーム中でその物理化学性質を変化させる。この変化は、電荷、疎水性または親水性の変化による、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜との相互作用能における変更であり得る。本発明の可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、エンドソーム溶解性ポリマーであるとみなされる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「メリチン」は、ハチ毒素中で自然発生する小さい両親媒性膜活性ペプチドである（米国特許公開第２０１２０１６５３９３号）。メリチンは、生物源から単離することもできるし、合成物であってもよい。合成ポリマーは、「人による」化学的プロセスによって配合または製造されるものであり、天然の生体内プロセスによって生成されるものではない。本明細書で使用する場合、メリチンは、たとえば、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、トウヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｃｅｒａｎａ）、クロスズメバチ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）、ツマアカスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｖｅｌｕｔｉｎａ  ｎｉｇｒｉｔｈｏｒａｘ）、アシナガバチ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ｓｐ．ＨＱＬ−２００１）、コミツバチ（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒａｅ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）、トウヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｃｅｒａｎａ  ｃｅｒａｎａ）、アシナガバチ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ）の種の毒素中に見出すことができるメリチン類の天然ハチ毒素ペプチドを包含する。本明細書で使用する場合、メリチンはまた、天然メリチンペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを包含する。具体的には、メリチンアミノ酸配列は、表１に示す配列を包含する。合成メリチンペプチドは、天然Ｌ型アミノ酸または鏡像異性のＤ型アミノ酸（インベルソ）を含み得る。しかしながら、メリチンペプチドは、本質的に全Ｌ型または本質的に全Ｄ型のいずれかのアミノ酸を含むべきであるが、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに付属した反対の立体中心のアミノ酸を有してもよい。メリチンアミノ酸配列は、逆であってもよい（レベルソ）。レベルソメリチンは、Ｌ型アミノ酸またはＤ型アミノ酸を有し得る（レトロインベルソ）。２つのメリチンペプチドを共有結合させてメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、組織標的化を向上させるか、またはインビボ循環を促進させる、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結させたマスキング剤以外の修飾基を有し得る。
【００７５】
連結または「リンカー」は、対象の１つの化学基またはセグメントを対象のもう１つの化学基またはセグメントに、１つまたは複数の共有結合を介して連結する、２つの原子の間の接続である。たとえば、連結は、マスキング剤、ポリヌクレオチドまたはＲＮＡｉトリガーをポリマーに接続することができる。不安定な連結は、不安定な結合を含む。連結は、つなぎ合わせた２つの原子の間の距離を増加させるスペーサを任意で含み得る。スペーサにより、連結に柔軟性および／または長さがさらに追加され得る。スペーサには、限定するものではないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基を挙げることができ、これらはいずれも１つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチドおよび糖類を含み得る。スペーサ基は、当該技術分野においてよく知られており、前述の列挙は本発明の範囲を制限する意図はない。
【００７６】
「不安定な結合」とは、水素原子への共有結合以外の共有結合であって、同一分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で、選択的に分解または切断することができる結合である。より具体的には、不安定な結合は、適切な条件下で、同一分子内の他の不安定でない共有結合に比べて安定性が低い（熱力学的）か、またはより速やかに分解される（動力学的）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断により、２つの分子が生成し得る。当業者では、結合の切断または不安定性は、通常、結合切断の半減期（ｔ1/2）（結合の半分が切断されるのに要する時間）を基準にして議論される。したがって、不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断され得る結合を包含する。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「生理学的に不安定な結合」とは、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件下または遭遇するものに類似の条件下にて切断され得る不安定な結合である。生理学的に不安定な連結基は、特定の生理学的条件下にあるときに化学的変化（たとえば切断）を生じるように選択される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、細胞生理学的に不安定な結合とは、哺乳動物の細胞内条件下にて切断可能である不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞内に見られるまたは当該細胞内で遭遇するものに類似する、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元の条件または物質および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素などの哺乳動物の細胞内に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。また、細胞生理学的に不安定な結合は、薬学的に許容可能な外因性物質の投与に反応して切断され得る。
【００７９】
「ポリヌクレオチド」または核酸もしくはポリ核酸という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを含有する重合体を指す技術用語である。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド重合体の単量体単位である。１２０未満の単量体単位を有するポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い。天然核酸は、デオキシリボース−またはリボース−リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で合成されるポリヌクレオチドであり、同じまたは類似の塩基を含有するが、天然リボースまたはデオキシリボース−リン酸骨格とは異なる型の骨格を有し得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野にて知られている任意の技術を用いて合成することができる。当該技術分野にて知られているポリヌクレオチド骨格には、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノおよび天然核酸のリン酸骨格の他の変異型が挙げられる。塩基にはプリンおよびピリミジンが挙げられ、これらにはアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンの天然化合物および天然類縁体がさらに含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、限定するものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびハロゲン化アルキルなどの新しい反応性基をヌクレオチド上に配置する修飾が挙げられるが、これらに限定されない。塩基という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類縁体のいずれかを包含する。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチドまたは任意の好適な組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、インビトロで重合してもよく、組み換えでもよく、キメラ配列またはこれらの基の誘導体を含み得る。ポリヌクレオチドは、５'末端、３'末端または５'と３'の両末端に末端キャップ部分を含み得る。キャップ部分には、逆向きデオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分または３'グリセリル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ＲＮＡｉトリガーは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを通じて遺伝子発現を阻害する。ＲＮＡｉトリガーは、通常１５〜５０の塩基対、好ましくは１８〜２５の塩基対を含有し、細胞内に発現した標的遺伝子のコード配列と同一（完全に相補的）またはほぼ同一（実質的に相補的）の核酸塩基を有する二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉトリガーには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックスおよびダイサ−基質（米国特許第８，０８４，５９９号、同第８，３４９，８０９号および同８，５１３，２０７号）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
ＲＮＡｉトリガーは、部分的、実質的または完全に互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。一実施形態において、２つのＲＮＡｉトリガー配列は、第１の配列を含有するセンス鎖と、第２の配列を含有するアンチセンス鎖とを含む。別の実施形態において、２つのＲＮＡｉトリガー配列は、第１の配列と、第２の配列を含有するアンチセンス鎖とを一緒に含む、２つのセンス鎖を含む。この場合、センス鎖とアンチセンス鎖は一緒にメロデュプレックスを形成する（表２および４）。ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して、センス鎖をアンチセンス鎖に接続してよい。
【００８２】
アンチセンス鎖は、標的遺伝子がコードするｍＲＮＡの一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、その相補性領域は、最も好ましくは、３０未満のヌクレオチド長である。ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、ＡＡＴ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。ＲＮＡｉトリガーは、標的遺伝子を発現する細胞に送達されると、インビトロまたはインビボで、当該標的遺伝子の発現を阻害する。
【００８３】
ＲＮＡｉトリガー分子は、天然ヌクレオチドから構成されてもよいし、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体から構成されてもよい。本発明のＲＮＡｉトリガーのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、当該技術分野において十分に確立されている方法により合成および／または修飾することができる。ＲＮＡｉトリガー分子のヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基は、リン酸含有（天然）または非リン酸含有（非天然）のヌクレオシド間共有結合により連結され得る。すなわち、ＲＮＡｉトリガー分子は、天然または非天然オリゴヌクレオチド骨格を有し得る。別の実施形態において、ＲＮＡｉトリガーは、ヌクレオチド塩基間に特殊（非リン酸）連結を含む。
【００８４】
修飾ヌクレオチドには、２'修飾、２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、２'−デオキシヌクレオチド、２'−アミノヌクレオチド、２'−アルキルヌクレオチド、３'−３'末端連結、逆向きデオキシチミジン、５'−ホスホロチオエート基、チオホスフェート連結、ホスホロジチオエート基を含有するヌクレオチド、非天然塩基含有ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、架橋型ヌクレオチド、ペプチド核酸、非ロックドヌクレオチド（本明細書中ＮＵＮＡと表す）、モルホリノヌクレオチド、および脱塩基ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。所与の化合物中のすべての位置が均一に修飾されている必要はない。逆に、２つ以上の修飾が単一のＲＮＡｉトリガー化合物中またはさらにその単一のヌクレオチド中に組み込まれてもよい。リボースの２'修飾と修飾ヌクレオシド連結とを組み合わせてもよい。
【００８５】
ＲＮＡｉトリガー分子はまた、突出、すなわち、本明細書にて定めるセンス鎖とアンチセンス鎖の対のコア配列によって通常形成される二重螺旋構造に直接関与しない、通常、突出した不対のヌクレオチドを含み得る。
【００８６】
ＲＮＡｉトリガーは、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれに独立して１〜５塩基の３'および／または５'突出を含み得る。一実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖の両鎖が３'および５'突出を含む。一実施形態において、一方の鎖塩基の３'突出ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５'突出ヌクレオチドと対になる。別の実施形態において、一方の鎖塩基の３'突出ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５'突出ヌクレオチドと対にならない。ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチド塩基を有してもよいし、有してなくてもよい。アンチセンス鎖およびセンス鎖は、５'末端のみが平滑末端を有するか、３'末端のみが平滑末端を有するか、５'と３'の両末端が平滑末端であるか、または５'末端も３'末端も平滑末端でない、二重構造を形成してよい。別の実施形態において、突出中のヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、チオホスフェート、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチドを逆向きにした（３'−３'連結）ヌクレオチドを含むか、修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドである。
【００８７】
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、特に、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒおよびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの研究機関によって管理されているデータベースにて確認することができる。公知の有効なｓｉＲＮＡ配列および同種の結合部位も関連文献にて詳しく示されている。ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野において知られている技術によって容易に設計され、作製される。さらに、有効かつ特異的な配列モチーフを見出す可能性を高めるコンピュータツールがある（Ｐｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｈｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００８８】
ＲＮＡｉトリガーは、遺伝子がコードするＲＮＡの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ＲＮＡｉトリガーは、十分な配列相同性を有する遺伝子の一種を標的にするように設計することができる。このため、ＲＮＡｉトリガーは、異なる遺伝子標的間で共有されている配列または特定の遺伝子標的に特有である配列に対して相補性を有する配列を含み得る。したがって、ＲＮＡｉトリガーは、複数の遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、これにより遺伝子ファミリーの複数の遺伝子（たとえば、異なる遺伝子のアイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異遺伝子など）を標的にするように設計することができる。別の実施形態において、ＲＮＡｉトリガーは、１つの遺伝子の特定のＲＮＡ配列に特有である配列を標的にするように設計することができる。
【００８９】
「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドが、従来のワトソン−クリックまたは他の非従来型のいずれかによって、もう１つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を指す。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子とその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、たとえば酵素的ｍＲＮＡ切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野においてよく知られている（Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８６，Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。相補性パーセントは、第２のポリヌクレオチド配列と水素結合（たとえば、ワトソン−クリック塩基対）を形成することができる第１のポリヌクレオチド分子における連続鎖中の塩基の百分率（たとえば、１０のうち５、６、７、８、９、１０である場合、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性）を示す。完全な相補とは、ポリヌクレオチド配列の連続鎖中のすべての塩基が、第２のポリヌクレオチド配列中の連続する同数の塩基と水素結合することを意味する。
【００９０】
遺伝子発現を阻害すること、下方調節することまたはノックダウンすることとは、遺伝子の発現が、遺伝子から転写されたＲＮＡのレベルまたはＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価して、本発明のＲＮＡｉトリガー結合体の不存在下にて観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物によって送達されるＲＮＡｉトリガーを用いる遺伝子発現の阻害、下方調節またはノックダウンは、好ましくは、対照の不活性核酸、スクランブル配列もしくは不活性化ミスマッチを有する核酸の存在下にて、またはマスクしたポリマーへのＲＮＡｉトリガーの結合の不存在下にて観察される量を下回るものである。
【００９１】
ＲＮＡｉトリガーの送達ポリマーへの連結
一実施形態において、ＲＮＡｉトリガーは、生理学的に不安定な結合またはリンカーを介して送達ポリマーに連結される。生理学的に不安定なリンカーは、特定の生理学的条件下にあるときに化学的変化（たとえば切断）を生じるように選択される（たとえば、細胞質の還元環境におけるジスルフィド結合の切断）。生理学的に不安定な連結の切断によるトリガーのポリマーからの放出は、トリガーと適切な細胞成分との活性のための相互作用を促す。
【００９２】
ＲＮＡｉトリガー−ポリマー結合体は、トリガーをポリマーに共有結合させることにより生成される。当該ポリマーは、反応性基Ａを含むように重合または修飾される。当該ＲＮＡｉトリガーも同じく、反応性基Ｂを含むように重合または修飾される。反応性基ＡおよびＢは、当該技術分野において知られている方法を用いて、可逆的共有結合を介して連結できるように選択される。
【００９３】
ＲＮＡｉトリガーのポリマーへの結合は、過剰のポリマーの存在下にて実施することができる。ＲＮＡｉトリガーおよびポリマーは、結合中に反対の電荷を帯びる場合があるため、過剰のポリマーを存在させることで、結合体の凝集を低減または排除することができる。あるいは、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを用いることができる。過剰なポリマーは、動物または細胞培養物への結合体の投与前に、結合させたポリマーから除去することができる。あるいは、過剰なポリマーは、動物または細胞培養物に、結合体とともに同時投与することができる。
【００９４】
インビボ投与
薬理学および毒物学において、投与経路とは、薬物、流体、毒または他の物質が体に接触する経路である。一般に、哺乳動物の治療のための薬物および核酸の投与方法は、当該技術分野においてよく知られており、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の好適な経路を介して、最も好ましくは非経口により、当該経路に適切に合わせた調製物で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注入により、たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内投与することができる。そのため、本発明はまた、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【００９５】
投与の非経口経路には、シリンジと針またはカテ−テルを用いる、脈管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、髄腔内、硬膜下、硬膜外およびリンパ管内の注入が挙げられる。本明細書における脈管内とは、体内で組織または器官に接続されている管と呼ばれる管状構造内を意味する。この管状構造の空洞内を、体液が体内部からまたは体内部へと流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液または胆汁が挙げられる。管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管および唾液腺または他の外分泌腺の管が挙げられる。脈管内経路には、動脈または静脈などの血管を介した送達が含まれる。血管循環系は、薬剤の全身拡散をもたらす。
【００９６】
本記載の組成物は、薬学的に許容可能な担体溶液中で注入される。薬学的に許容可能とは、薬理学的／毒物学的観点から哺乳動物にとって許容される特性および／または物質を指す。薬学的に許容可能という用語は、哺乳動物に投与されたときに、生理学的に耐容でき、通常、アレルギー性または他の有害性もしくは毒性反応を生じない分子体、組成物および特性を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、薬学的に許容可能という用語は、動物での使用、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
【００９７】
これらの担体はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順と、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方により確実になされ得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を本組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質の包含により、注入可能な薬剤の持続的吸収をもたらしてもよい。
【００９８】
治療効果
ＲＮＡｉトリガーは、研究目的のために、または細胞内に治療的である変化をもたらすために送達することができる。ＲＮＡｉトリガーのインビボ送達は、研究試薬として、ならびに種々の治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学および薬理ゲノムの各用途に有用である。本発明者らは、肝細胞において内因性遺伝子発現の阻害をもたらすＲＮＡｉトリガー送達を開示している。ＲＮＡｉトリガーの送達後に測定したレポータ（マーカ）遺伝子発現のレベルでは、他のＲＮＡｉトリガーの送達後における遺伝子発現と類似レベルの合理的な予想が示されている。当業者によって有益とみなされる治療レベルは、疾患ごとに異なる。たとえば、血友病ＡおよびＢはそれぞれＸ連鎖凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の欠乏によって引き起こされる。その臨床経過は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の正常血清レベルのパーセンテージに大きく左右され、２％未満は重症、２〜５％は中等症、５〜３０％は軽症とされる。したがって、重症患者における循環因子を正常レベルの１％から２％へ増加することは、有益であるとみなすことができる。６％を超えるレベルでは、自然出血を防げるが、手術または傷害に伴うものは防げない。同様に、遺伝子の阻害は、治療上の効果をもたらすために、１００％である必要はない。遺伝子治療の当業者であれば、十分なレベルのマーカ遺伝子の結果に基づいて、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカ遺伝子が発現されて第ＶＩＩＩ因子の正常レベルの２体積％に匹敵するレベルでタンパク質を産生する場合、第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現していることが合理的に予想できる。したがって、レポータまたはマーカ遺伝子は、細胞内タンパク質全体の発現の有用な実例として役立つ。
【００９９】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実用量レベルは、特定の患者、組成物および投与方法に関して、患者に対して毒性にならずに、所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分量を得るために変わり得る。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康および既往歴、ならびに医学分野でよく知られている同様の因子を含めた、種々の薬物動態学因子に依存する。
【０１００】
本明細書で使用する場合、インビボとは、生物内部で生じること、より具体的には、部分的なものまたは死滅したものではなく、哺乳動物などの生きている完全な多細胞生物（動物）の生きている組織内または組織上で行われるプロセスを意味する。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、本発明の結合体、薬学的担体または希釈剤および製剤に必要な任意の他の媒体または剤を含む。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「薬学的担体」は、生理学的に適合性のあるあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（たとえば注射または注入）に適するものである。
【実施例】
【０１０３】
実施例１  ＰＥＧプロテアーゼ（ペプチダーゼ）で切断可能なマスキング剤の合成
ＮａＨＣＯ３水溶液中のアミノ酸カップリングおよびシリル基の脱保護を除き、すべての反応を新しい無水溶媒を用いて無水条件で実施した。カラム精製は、明記した溶離液を用いてシリカゲル上で行った。質量スペクトル（ＭＳ）は、エレクトロスプレーイオン化を用いて取得した。
【０１０４】
ＰＥＧの活性ｐ−ニトロフェニル−ｐ−アシルアミドベンジルカルボナート誘導体（ＰＥＧ−ＡＡ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ）の調製において、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いてジペプチド−ｐ−アシルアミドベンジルアルコール前駆体のアミノ末端をアシル化した。続く工程で、ベンジルのヒドロキシル基をｐ−ニトロフェニルカルボナートに変換し、続いてアミノ酸から保護基を除去した。いくつかの用途において、特定のポリマーの修飾にパラニトロフェノール（ＰＮＰ）−カルボナートを用いた場合、保護基はポリマー修飾の前に除去した（図５参照）。
【０１０５】
当合成は、Ｈ−Ａ１Ａ２−ＰＡＢＡ（表２）誘導体の調製から開始する。これらの付加物は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（２００２）が記載した合成スキームに一部修正を加えたものを用いて取得した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸のＦｍｏｃ−Ａ１−ＯＨをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシククシンイミド（ＮＨＳ）との反応において、Ｎ−ヒドロキシククシンイミドエステルのＦｍｏｃ−Ａ１−ＮＨＳに変換することにより活性化した。これらの反応性ＮＨＳエステルを、アミノ基の反応性を保つために加えたＮａＨＣＯ３水溶液の存在下で、保護アミノ酸Ａ２にカップリングした。１ｅおよび１ｆ（表２）の調製では、ＮＨＳエステルの代わりに、市販のペンタフルオロフェニルエステル（ＯＰｆｐ）をカップリングのために用いた。
【０１０６】
Ｆｍｏｃ  ジペプチド１ａ〜ｈの合成
ａ）ＡＡのＮＨＳエステルを、対応するアミノ酸からＮＨＳおよびＤＣＣを用いて調製し、さらに精製することなく用いた（図５Ａ）。
【０１０７】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＮＨＳを得るために、ＤＣＭ（１３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（４１２ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（１６０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にＤＣＣ（２８６ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌し、次いで２０℃で１６時間撹拌した。固体のジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を濾去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０８】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＮＨＳを得るために、ＤＣＭ（１３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨ（２９８ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（８３ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にＤＣＣ（１４８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌し、次いで２０℃で１６時間撹拌した。固体のＤＣＵを濾去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０９】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨＳを得るために、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（８９１ｍｇ、３ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（３８０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）中で０℃にて５分間撹拌し、ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＤＣＣ溶液（６５０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）で処理した。冷却浴を３０分で取り除き、反応混合物を２０℃で１０時間攪拌した。固体のＤＣＵを濾去し、ＴＨＦで洗浄し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。この生成物を秤量し、ＤＭＥ中に溶解して０．２ｍＭ溶液を作製した。
【０１１０】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＮＨＳを得るために、ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（４８７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（１２７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にＤＣＣ（２１７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌し、次いで２０℃で１０時間撹拌した。後の処理は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨＳに関して記載した通りに行った。
【０１１１】
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳを得るために、ＤＣＭ（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（２．１１ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（６６４ｍｇ、５．７７ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にＤＣＣ（１．１８１ｇ、５．７２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌し、次いで２０℃で１０時間撹拌した。固体のＤＣＵを濾去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１１２】
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＮＨＳを得るために、ＤＣＭ（１３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（３３９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（１２７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にＤＣＣ（２２７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌し、次いで２０℃で１６時間撹拌した。固体のＤＣＵを濾去し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１１３】
ｂ）アミノ酸のＨ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨおよびＨ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨを入手可能なＦｍｏｃ保護誘導体から調製した（図５Ｂ参照）。
【０１１４】
Ｈ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨ。Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨ（５７６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９ｍｌ）中でＥｔ３Ｎ（３．７ｍｌ、２６．４ｍｍｏｌ）とともに１５時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をエーテル（３０ｍｌ）で３回トリチュレートし、減圧下で乾燥させた。収率２７１ｍｇ（９６％）。ＭＳ：６４３．６［３Ｍ＋１］＋；４５１．３［２Ｍ＋Ｎａ］＋；４２９．５［２Ｍ＋１］＋；２３６．７［Ｍ＋Ｎａ］＋；２１５．３［Ｍ＋１］＋；１３２．８［Ｍ−ＤＭＣＰ＋１］＋．
【０１１５】
Ｈ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨ。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨ（４．９０２ｇ、７．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）中でＥｔ３Ｎ（３２ｍｌ、３０当量、２２９．４ｍｍｏｌ）とともに１０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をエーテルで２回トリチュレートし、減圧下で乾燥させた。収率３．１ｇ（９７％）。ＭＳ（ネガティブモード）：４５５、４５３．３［Ｍ＋Ｃｌ］−；４１７．８［Ｍ−１］−．
【０１１６】
ｃ）Ｆｍｏｃ−Ａ１Ａ２−ＯＨの合成（図５Ｃ）
Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＧｌｙ−ＯＨ  １ａを得るために、グリシン（７５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）およびジメトキシエタン（ＤＭＥ）（５ｍｌ）中に溶解した。ＤＭＥ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨＳ溶液（５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＨＦ（２．５ｍｌ）を加え、混合物を超音波処理して均質にし、２０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏ中５％ＫＨＣＯ３溶液で処理した。生成物をＥｔＯＡｃで４回抽出し、ｐＨ＝３のブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、減圧下で乾燥させた。収率３２１ｍｇ（９０％）。ＭＳ：７７５．０［２Ｍ＋２Ｎａ］＋；３７７．４［Ｍ＋Ｎａ］＋；３５５．１［Ｍ＋１］＋．
【０１１７】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）Ｇｌｙ−ＯＨ  １ｂを得るために、グリシン（７５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（８４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２ｍｌ）、ＴＨＦ（４ｍｌ）およびＤＭＥ（５ｍｌ）の混合物中に溶解した。ＤＭＥ中Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＮＨＳ溶液（５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を加え、１０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、２０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝５）を加え、続いてＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）を加えた。この反応混合物を氷上で撹拌し、ＫＨＳＯ４の５％溶液でｐＨ＝５まで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃで４回抽出し、ｐＨ＝５のブラインですすぎ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、減圧下で乾燥させた。収率５２８ｍｇ（９６％）。ＭＳ：５６７［Ｍ＋Ｎａ］＋；５６２［Ｍ＋ＮＨ４］＋；５４５．０［Ｍ＋１］＋；４２７．１［Ｍ−２ＰｈｉＰｒ］＋．
【０１１８】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）Ｇｌｙ−ＯＨ  １ｃを、１ｂについて上述した通りに、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＮＨＳおよびＨ−Ｇｌｙ−ＯＨから調製した。収率９６％。ＭＳ：９８７．４［２Ｍ＋１］＋；５１６．３［Ｍ＋Ｎａ］＋；４９４．４［Ｍ＋１］＋；４１２．２［Ｍ−ＤＭＣＰ＋１］＋．
【０１１９】
Ｆｍｏｃ−ＰｈｅＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨ  １ｄを、１ｂについて上述した通りに、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳおよびＨ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＯＨから調製した。収率９４％。ＭＳ：７８８．５［Ｍ＋１］＋、２７３．１［Ｍ−ＭＭＴ＋１］＋．
【０１２０】
Ｆｍｏｃ−ＰｈｅＣｉｔ−ＯＨ  １ｅに関して：
ｉ）ＤＭＥ（４０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳ（４．９６ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ（４０ｍｌ）およびＴＨＦ（２０ｍｌ）の混合物中にＬ−シトルリン（１．８０ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（０．８６ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ）を含む溶液に加えた。反応物を１５時間撹拌した。活性化によるＤＣＣの残渣を濾過し、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物にＨ２Ｏ（１００ｍｌ）およびｉＰｒＯＨ（１０ｍｌ）を加えた。懸濁液を５％ＫＨＳＯ４でｐＨ＝３まで酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃ：ｉＰｒＯＨ＝９：１溶液（３×、５００ｍｌ）で抽出し、ブライン：ｉＰｒＯＨ＝９：１（２×、５０ｍｌ）の混合物で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して濃縮し、オイルポンプで乾燥させた。エーテルでトリチュレートして、純粋な生成物１ｅを得た。収率３．８４ｇ（６８％）。ＭＳ：５４５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋；５２８．５［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋；３０６．３［Ｍ−Ｆｍｏｃ＋Ｈ２Ｏ］＋．
【０１２１】
ｉｉ）ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ（５５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｈ２Ｏ（２．６ｍｌ）中のＨ−Ｃｉｔ−ＯＨ（１８４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（８８．２ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ＴＨＦ（２ｍｌ）を加えて溶液を均質にし、１０時間撹拌した。ＴＨＦをロータリーエバポレータで除去し、残留物をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）およびｉＰｒＯＨ（１ｍｌ）で希釈し、３％ＨＣｌでｐＨ＝１まで酸性化した。生成物をＥｔＯＡｃ：ｉＰｒＯＨ＝９：１溶液で５回抽出し、ブライン：ｉＰｒＯＨ＝９：１の混合物ですすぎ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。エーテルでトリチュレートして、３１３ｍｇの純粋な生成物１ｅを得た（５７％）。
【０１２２】
Ｆｍｏｃ−ＡｌａＣｉｔ−ＯＨ  １ｆを、１ｅ−（ａ）について上述した通りに、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＮＨＳおよびＨ−Ｃｉｔ−ＯＨから調製した。収率７７％。ＭＳ：９５９．８［２Ｍ＋Ｎａ］＋；９３８．１［２Ｍ＋１］＋；４９１．４［Ｍ＋Ｎａ］＋；４６９．９［Ｍ＋１］＋．
【０１２３】
粗製Ｆｍｏｃ−ＶａｌＣｉｔ−ＯＨ  １ｇを、１ｂについて上述した通りに、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＮＨＳおよびＨ−Ｃｉｔ−ＯＨから調製した。最終精製をエーテルでのトリチュレートによって行った。全収率７６％。ＭＳ：１０６０．３［２Ｍ＋３Ｎａ］＋；１０１５．７［２Ｍ＋Ｎａ］＋；５１９．７［Ｍ＋Ｎａ］＋；４９７．９［Ｍ＋１］＋．
【０１２４】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨ  １ｈを、１ｂについて上述した通りに、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＮＨＳおよびＨ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＯＨから調製した。収率９５％。ＭＳ：５３０．２［Ｍ＋Ｎａ］＋；５０８．２［Ｍ＋１］＋；４２６．０［Ｍ−ＤＭＣＰ＋１］＋．
【０１２５】
ｐ−アミノベンジルアルコールとのカップリング、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＰＡＢＡおよびＦｍｏｃ−Ａ−ＰＡＢＡ  ２ａ〜ｍの調製
生成物１ａ〜ｈを、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）の存在下で、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）とカップリングし、２ａ〜ｈを生成した。ＰＡＢＡ部分にアミノ酸を１つしか連結していない４つの代表的化合物３ｊ〜ｌも調製した（図７Ａ）。
【０１２６】
Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＧｌｙ−ＰＡＢＡ  ２ａを得るために、ＤＣＭ（１７ｍｌ）およびＭｅＯＨ（６ｍｌ）中の１ａ（３１８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２２０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（４４４ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）とともに１０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をＥｔ２Ｏでトリチュレートし、生成物を濾過し、減圧下で乾燥させた。収率３４８ｍｇ（８４％）。
【０１２７】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）Ｇｌｙ−ＰＡＢＡ  ２ｂを得るために、ＤＣＭ（１０ｍｌ）中の１ｂ（５２４ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（１４２ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（３５７ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）とともに１０時間撹拌した。後の処理は、２ａについて上述した通りに行った。収率４６２ｍｇ（７４％）。
【０１２８】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）Ｇｌｙ−ＰＡＢＡ  ２ｃを２ａについて上述した通りに調製した。収率６４％。ＭＳ：６２１．５［Ｍ＋２２］＋；５９９．３［Ｍ＋１］＋．
【０１２９】
Ｆｍｏｃ−ＰｈｅＬｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＡ  ２ｄを２ｂについて上述した通りに調製した。収率７０％。
【０１３０】
Ｆｍｏｃ−ＰｈｅＣｉｔ−ＰＡＢＡ  ２ｅを得るために、ＤＣＭ（１５０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中の１ｅ（５．９８ｇ、１０．９７ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２．７０ｇ、２１．９５ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（５．４３ｇ、２１．９５ｍｍｏｌ）で処理し、１５時間撹拌した。後の処理は、２ａについて上述した通りに行った。収率６．１４ｇ（８６％）。ＭＳ：６５０．７［Ｍ＋１］＋；５２７．３［Ｍ−ＰＡＢＡ＋１］＋．
【０１３１】
Ｆｍｏｃ−ＡｌａＣｉｔ−ＰＡＢＡ  ２ｆを得るために、ＤＣＭ（４５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（１５ｍｌ）中の１ｆ（２．８９ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（１．５２ｇ、１２．３４ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（３．０５ｇ、１２．３４ｍｍｏｌ）で処理し、１５時間撹拌した。後の処理は、２ａについて上述した通りに行った。収率４．５６ｇ（７４％）。ＭＳ（ＥＳ、ネガティブモード）：３０７．４［Ｍ−２６３．６−１］−；３４９．９［Ｍ−Ｆｍｏｃ−１］−；６１０、６０８．４［Ｍ＋ＨＣｌ−１］−．
【０１３２】
Ｆｍｏｃ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＡ  ２ｇを２ｂについて上述した通りに調製した。（９８％）．
【０１３３】
Ｆｍｏｃ−ＡｌａＡｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＰＡＢＡ  ２ｈを２ａについて上述した通りに調製した。収率５９％。ＭＳ：６１３．２［Ｍ＋１］＋；５３１．４［Ｍ−ＤＭＣＰ＋１］＋；４０８．２［Ｍ−２０５＋１］＋．
【０１３４】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＨ３）２−ＰＡＢＡ  ２ｉを得るために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＨ３）２−ＯＨ・ＨＣｌ塩（４３３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２４６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（１．５ｍｌ）中に溶解し、５℃に冷却し、ＥＥＤＱ（４９５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を取り除き、混合物を室温（ＲＴ）で１０時間攪拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をＥｔ２Ｏでトリチュレートし、粗生成物を濾過した。これをＤＣＭ（２ｍｌ）およびＭｅＯＨ（１ｍｌ）の混合物中に再度溶解し、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍｌ）中に滴加することにより再度沈殿させた。生成物を濾過し、減圧下で乾燥させた。収率４４８ｍｇ（８３％）。
【０１３５】
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＡＢＡ  ２ｊを得るために、ＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（３５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＥＥＤＱ（４９５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２２２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液を１０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をＥｔ２Ｏ（４０ｍｌ）中に溶解し、ドライアイス上で２時間冷却し、固体を遠心分離により分離した。得られた粗製材料をカラムによりＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（１〜２％）の溶離グラジエントで精製した。収率４４４ｍｇ（９７％）。ＭＳ：４５９．４［Ｍ＋１］＋．
【０１３６】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）−ＰＡＢＡ  ２ｋを２ｊについて上述した通りに調製した。後の処理において、ＤＣＭ除去後のカラム精製の代わりに、残留物をＥｔ２Ｏでトリチュレートし、０℃まで冷却し、粗生成物を濾過した。この処理をもう一度繰り返し、続いて減圧下で乾燥させた。収率７７％。ＭＳ：５４２．５［Ｍ＋１］＋．
【０１３７】
Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ  ２ｌを得るために、ＤＣＭ（１０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（４ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ（３４５．７ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２１４ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（４３０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）で処理し、１５時間撹拌した。固体生成物をエーテルで３回トリチュレートし、この生成物を濾過し、乾燥させた。収率２８８ｍｇ（６７％）。ＭＳ：５０２．３［Ｍ＋１］＋；４８５．５［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋１］＋；２６３［Ｍ−Ｆｍｏｃ−Ｈ２Ｏ＋１］＋；１７９．０［Ｍ−３０６＋１］＋；１２０．２［Ｍ−３６５．３＋１］＋．
【０１３８】
生成物２ｍをＨ−Ｌｙｓ（ＣＨ３）２−ＰＡＢＡ誘導体３とＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳのカップリングという異なるスキームを用いて調製した（図７Ｂ）。
【０１３９】
Ｆｍｏｃ−ＰｈｅＬｙｓ（ＣＨ３）−ＰＡＢＡ  ２ｍを得るために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＨ３）２−ＰＡＢＡ（２ｉ）（４４８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１１ｍｌ）中でＥｔ３Ｎ（３．５ｍｌ）とともに１０時間撹拌することによりＦｍｏｃを脱保護した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去し、粗生成物３ｉを得た。この生成物をＤＭＦ（７ｍｌ）中に溶解し、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＮＨＳ（４８２ｍｇ、０．９９６ｍｍｏｌ）と、続けてＤＩＥＡ（０．４２ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を１０時間撹拌した。ＤＩＥＡを含む溶媒をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去し、粗製物２ｍを得て、これをさらに精製することなく用いた。ＭＳ：５４９．４［Ｍ＋１］＋．
【０１４０】
Ｈ−ＡＡ−ＰＡＢＡ  ３ａ〜ｈ、ｍおよびＨ−Ａ−ＰＡＢＡ  ３ｊ〜ｌの調製（図７）
Ｆｍｏｃ誘導体２ａ〜ｈ、ｊ〜ｌを、３ｉについて上述した通りにＤＭＦ中でＥｔ３Ｎにより処置し、続いて濃縮し、減圧下にて乾燥させた。粗生成物をＤＭＦ中に溶解して０．１Ｍ溶液を作製し、さらに精製することなく用いた。
【０１４１】
（表２）Ｈ−Ａ１Ａ２−ＰＡＢＡ（１〜３）の中間体
0006433001.tif 000049
【０１４２】
プロテアーゼで切断可能なＰＥＧマスキング試薬の調製
Ｈ−ＡＡ−ＰＡＢＡ  ３ｂ、ｅ、ｇ、ｈ、ｊ、ｋ〜ｍのいずれかのアミノ基をＰＥＧ酸のＮＨＳエステルでアシル化して（ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、５〜１０時間）、２２ａ〜ｋを得た。次いで、生成物２２ａ〜ｋのヒドロキシル基をｐ−ニトロフェニルカルボナート（（ＰＮＰ）２ＣＯ、ジオキサンまたはＴＨＦ、４０〜６０℃、１０時間）に変換して２３ａ〜ｋを得た。２３ａ、ｄ、ｇを得るために、ＴＦＡ水溶液（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ＝３：１、５℃、２〜３時間）を用いる処理によりＡｓｎおよびＧｌｕから保護基を除去し、所望の生成物２４ａ〜ｃを得た。
【０１４３】
ＰＥＧｎ−ＡＡ−ＰＡＢＡ  ２２ａ〜ｋの調製（図９）
生成物２２ａ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＧｌｕＧｌｙ）。ＤＭＦ中の３ｂの０．１Ｍ溶液（３．５ｍｌ、０．３５ｍｍｏｌ）をＰＥＧ１１−ＮＨＳエステル（２４０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６１ｍｌ、０．３５ｍｍｏｌ）とともに１０時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプにて除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝３８：２：１で精製した。収率２７４ｍｇ（７８％）。ＭＳ：１０１５．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋、９９８．７［Ｍ＋１］＋．
【０１４４】
生成物２２ｂ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）。ＤＭＦ（３ｍｌ）中の３ｅ（０．８８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６７μｌ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＦ（３ｍｌ）中のＰＥＧ１１−ＮＨＳエステル（０．８０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。粗製物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（５ｍｌ）からＥｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させ、カラムによりＣＨＣｌ３中のＭｅＯＨ（１０〜１６％）のグラジエントで溶出して精製した。収率４２０ｍｇ（５３％）。ＭＳ：１０１５．９［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋；９９８．８［Ｍ＋１］＋；９８１．１［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋．
【０１４５】
生成物２２ｃ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＶａｌＣｉｔ）。生成物２２ｆを、２２ａについて記載した通りに、粗製物３ｇ（３００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌの２ｇから取得）、ＰＥＧ１１−ＮＨＳエステル（２９８ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０９ｍｌ、０．５２２ｍｍｏｌ）から調製した。ロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプにて濃縮した後、生成物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝１：１混合物（６ｍｌ）に懸濁し、超音波処理し、濾過し、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍｌ）中に沈殿させた。固体を分離し、この手順を再度繰り返した。残留溶媒を減圧下で除去した。収率２８３ｍｇ（６０％）。ＭＳ：９５１．５［Ｍ＋１］＋．
【０１４６】
生成物２２ｄ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＡｌａＡｓｎ（ＤＭＣＰ））。ＤＭＦ（３ｍｌ）中の３ｈ（０．５６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１１６μｌ、０．６７ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＦ（３ｍｌ）中のＰＥＧ１１−ＮＨＳエステル（０．５６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１混合物（５ｍｌ）に溶解し、冷却した（０°Ｃ）Ｅｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させた。固体をカラムによりＤＣＭ中のＭｅＯＨ（３〜１４％）の溶離グラジエントで精製した。収率２６１ｍｇ（４９％）。ＭＳ：９８３．７［Ｍ＋Ｎａ］＋；９７９．１［Ｍ＋ＮＨ４］＋；９６１．８［Ｍ＋１］＋；９４３．９［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋１］＋．
【０１４７】
生成物２２ｅ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＰｈｅＬｙｓ（Ｍｅ２））。生成物２２ｅを２２ａについて記載した通りに調製した。精製は、ＨＰＬＣカラムＮｕｃｌｅｏｄｕｒ  Ｃ−１８、２５０×４．６、溶離液ＡＣＮ−Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、勾配１５〜３０％を用いて行った。ＭＳ：９９８．１［Ｍ＋１］＋。単離した生成物をＤｏｗｅｘ  １×８樹脂、溶離液Ｈ２Ｏで脱塩した。収率４０％。
【０１４８】
生成物２２ｆ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ｌｅｕ）。生成物２２ｆを２２ａについて記載した通りに調製し、カラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝９：７：２：０．０４で精製した。収率４８％。ＭＳ：８２４．９［Ｍ＋ＮＨ４］＋．
【０１４９】
生成物２２ｇ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ａｓｎ（ＤＭＣＰ）。粗製物３ｋ（４１９ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌの２ｋから取得）、Ｐｅｇ１１ＮＨＳエステル（２００ｍｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６ｍｌ、０．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍｌ）中で１０時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレータで除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ  ＡｃＯＨ＝４．５：３．５：１：０．０２で精製した。収率２５４ｍｇ（３７％）。ＭＳ：８９１．１［Ｍ＋１］＋．
【０１５０】
生成物２２ｈ（ｎ＝１１  ＡＡ＝Ｃｉｔ）。ＤＭＦ（２．５ｍｌ）中の３ｌ（０．５０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１０４μｌ、０．６０ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＦ（２．５ｍｌ）中のＰＥＧ１１−ＮＨＳエステル（０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１混合物（５ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させた。沈殿をさらに２回繰り返し、生成物をさらに精製することなく用いた。収率３４０ｍｇ（８０％）。ＭＳ：８６９．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋；８５１．９［Ｍ＋１］＋．
【０１５１】
生成物２２ｉ（ｎ＝２３、ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）。ＤＭＦ（３ｍｌ）中の３ｅ（０．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１３０μｌ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＦ（３ｍｌ）中のＰＥＧ２３−ＮＨＳエステル（０．６０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１混合物（５ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させた。固体生成物をカラムによりＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（７〜１２％）の溶離グラジエントで精製した。収率４８７ｍｇ（５３％）。ＭＳ：１５５５．２［Ｍ＋Ｎａ］＋；１５４４．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１５２７．７［Ｍ＋１］＋．
【０１５２】
生成物２２ｊ（平均ＭＷ１０００のＰＥＧ、ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）。ｍＰＥＧ−１０００−アルコール（Ｆｌｕｋａ）（０．１７３ｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボナート（６２ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．１０１ｍｌ、０．７２６ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＣＮ（１ｍｌ）中で１６時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、粗残留物をＣＨＣｌ３（１０ｍｌ）に溶解した。有機層をＨ２Ｏ（１ｍｌ、ｐＨ＝５）と、次いでブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮してＰＥＧ−１０００−ＮＨＳカルボナートを得た。この生成物をＤＭＦ（１ｍｌ）中で３ｅ（０．１２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３０μｌ、０．１７３ｍｍｏｌ）とともに１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１混合物（５ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させた。沈殿をさらに２回繰り返し、生成物をさらに精製することなく用いた。収率１３４ｍｇ（７９％）。
【０１５３】
生成物２２ｋ（ｎ＝２３、ＡＡ＝ＶａｌＣｉｔ）。ＤＭＦ（４ｍｌ）中の３ｇ（１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１８３μｌ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液にＤＭＦ（４ｍｌ）中のＰＥＧ２３−ＮＨＳエステル（０．８７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去した。残留物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１混合物（５ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させた。沈殿をさらに２回繰り返し、生成物をさらに精製することなく用いた。収率１．０ｇ（７７％）。ＭＳ：１４９６．１［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１４７９．３［Ｍ＋１］＋．
【０１５４】
ＰＥＧ−ＡＡ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ  ２３ａ−ｋ（図１０Ａ）
生成物２３ａ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ｇｌｕ（２ＰｈｉＰｒ）Ｇｌｙ）を得るために、ＤＣＭ（１５ｍｌ）中の生成物２２ａ（２７４ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）を（ＰＮＰ）２ＣＯ（４１８ｍｇ、１．３７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．１４３ｍｌ、０．８２３ｍｍｏｌ）とともに暗所で１５時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレータで除去し、生成物をカラムによりＣＨＣｌ３中の４％ＭｅＯＨ、０．２％ＡｃＯＨの溶離液で精製した。収率２６０ｍｇ（８１％）。ＭＳ：１１８０．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋．
【０１５５】
生成物２３ｂ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）を得るために、ジオキサン（４ｍｌ）中の２２ｂ（４１９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、（ＰＮＰ）２ＣＯ（７６６ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２６３μｌ、１．５２ｍｍｏｌ）の溶液を暗所で５０℃にて１５時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。残留ＤＩＥＡをロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にてＤＭＦを２回連続蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（４．５：５：０．５）と、続いてＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（９：１）で精製した。収率３９０ｍｇ（８０％）。ＭＳ：１１８１．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋，１１６４．２［Ｍ＋１］＋．
【０１５６】
生成物２３ｃ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＶａｌＣｉｔ）を得るために、１，４−ジオキサン（２２ｍｌ）中の２２ｃ（２７３ｍｇ、０．２８７ｍｍｏｌ）、（ＰＮＰ）２ＣＯ（８７４ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．３ｍｌ、１．７２ｍｍｏｌ）の溶液を暗所で５０℃にて２４時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプにて除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１６：３：１と、続いてＣＨＣｌ３中１２〜１５％ＭｅＯＨで精製した。収率１６３ｍｇ（５１％）。ＭＳ：１１１６．０［Ｍ＋１］＋．
【０１５７】
生成物２３ｄ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＡｌａＡｓｎ（ＤＭＣＰ））を２３ｂの調製において記載した通りに調製した。生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９：２：１）で精製した。収率７７％。ＭＳ：１１４４．０［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１１２７．３［Ｍ＋１］＋．
【０１５８】
生成物２３ｅ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＰｈｅＬｙｓ（Ｍｅ）２）を２３ａについて記載した通りに調製し、カラムによりＣＨＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ、０．２％ＡｃＯＨの溶離液で精製した。収率６３％。ＭＳ：１１６３．１［Ｍ＋１］＋．
【０１５９】
生成物２３ｆ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ｌｅｕ）を、５当量の（ＰＮＰ）２ＣＯおよび３当量のＤＩＥＡのみを用いて、２４時間加熱し、２３ｃについて記載した通りに調製した。生成物をカラムによりＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（７〜１２％）の溶離グラジエントで精製した。収率７５％。ＭＳ：９７２［Ｍ＋１］＋．
【０１６０】
生成物２３ｇ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ａｓｎ（ＤＭＣＰ））を２３ｆについて記載した通りに調製し、粗生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。ＭＳ：１０７３．４［Ｍ＋１８］＋．
【０１６１】
生成物２３ｈ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ｃｉｔ）を得るために、ＤＣＭ（４ｍｌ）中の２２ｈ（３４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、（ＰＮＰ）２ＣＯ（６０８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２０８μｌ、１．２０ｍｍｏｌ）の溶液を暗所で３０℃にて１５時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。残留ＤＩＥＡをロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にてＤＭＦを２回連続蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（７：２．５：０．５）と、続いてＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（８〜１４％）のグラジエントで精製した。収率３９０ｍｇ（８０％）。ＭＳ：１０３４．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１０１６．９［Ｍ＋１］＋．
【０１６２】
生成物２３ｉ（ｎ＝２３、ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）を２３ｂの調製において記載した通りに調製し、カラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（４．５：５：０．５）と、続いてＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（６〜１２％）のグラジエントで精製した。収率８６％。ＭＳ：１７１１．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１６９４．４［Ｍ＋１］＋．
【０１６３】
生成物２３ｊ（ＰＥＧ１０００Ｋ  ＡＡ＝ＰｈｅＣｉｔ）を２３ｂの調製において記載した通りに調製し、カラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（４．５：５：０．５）と、続いてＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（６〜１２％）のグラジエントで精製した。収率７２％。
【０１６４】
生成物２３ｋ（ｎ＝２３、ＡＡ＝ＶａｌＣｉｔ）を２３ｂの調製において記載した通りに調製し、生成物をＨＰＬＣで精製した。カラム：Ｌｕｎａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）５ｕ、Ｃ−８、１００  Ａ。移動相：ＡＣＮ−Ｈ２Ｏ（Ｆ３ＣＯ２Ｈ０．０１％）、ＡＣＮグラジエント３０〜３７％、３１分。収率：５３０ｍｇ（４８％）。ＭＳ：１６６６．４［Ｍ＋Ｎａ］＋；１６４４．２［Ｍ＋１］＋．
【０１６５】
ＰＥＧ−ＡＡ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ  ２４ａ〜ｃ、ＡＡ脱保護（図１０Ｂ）
生成物２４ａ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＧｌｕＧｌｙ）。生成物２３ａ（２５０ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ３の３％ＴＦＡ溶液（１６ｍｌ）中で３５分間撹拌し、ロータリーエバポレータで濃縮し、減圧下にて乾燥させた。収率２２４ｍｇ（１００％）。（ＭＳ：１０６２．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋．；１０４５．９［Ｍ＋１］＋．
【０１６６】
生成物２４ｂ（ｎ＝１１、ＡＡ＝ＡｌａＡｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ）。化合物２３ｄをＴＦＡ：ＤＣＭ（３：１）の混合物中で１．５時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで２０℃にて除去した。生成物をカラムによりＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（６〜１２％）の溶離グラジエントで精製した。収率３０％。ＭＳ：１０６６．７［Ｍ＋Ｎａ］＋、１０６２．０［Ｍ＋ＮＨ４］＋；１０４５．２［Ｍ＋１］＋．
【０１６７】
生成物２４ｃ（ｎ＝１１、ＡＡ＝Ａｓｎ）。２３ｇ（１６０ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を含む反応フラスコを０℃まで冷却し、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９：１）の冷混合物（１２．５ｍｌ）を加えた。混合物を１．５時間撹拌し、冷Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）で希釈した。撹拌を２０℃で２０分間続けた。沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏですすいだ。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃にて除去し、生成物をカラムにより溶離液ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝４．５：３．５：１．２：０．０２で精製した。収率４３ｍｇ（３０％）。ＭＳ：９７４．０［Ｍ＋１］＋．
【０１６８】
（表３）結合体調製のために用いた最終ＰＥＧ−Ｌ−Ａ１Ａ２−ＰＡＢＣ
0006433001.tif 000050
【０１６９】
実施例２  ＲＧＤリガンドの合成
Ａ．ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート：
１．ＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ８−チオエート、ＭＷ９８２．１
0006433001.tif 000051
２．ＲＧＤ模倣体＃２−ＰＥＧ８−チオエート、ＭＷ１０２２．２
0006433001.tif 000052
３．ＲＧＤ模倣体＃３−ＰＥＧ８−チオエート、ＭＷ１０８０．２
0006433001.tif 000053
４．ＲＧＤ模倣体＃３−ＰＥＧ１２−チオエート、ＭＷ１２１２．４
0006433001.tif 000054
Ｂ．ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ：
１．ＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ１２−ＨｙＮｉｃ、ＭＷ１２７２
0006433001.tif 000055
２．ＲＧＤ模倣体＃１ａ−ＨｙＮｉｃ、ＭＷ８０２．８
0006433001.tif 000056
３．ＲＧＤ模倣体＃１ｂ−ＨｙＮｉｃ、ＭＷ８３０．９（ＲＧＤ）
0006433001.tif 000057
Ｃ．ＲＧＥ−ＰＥＧ１２−ＨｙＮｉｃ（対照）ＭＷ１２８２
0006433001.tif 000058
Ｄ．ＲＧＤペプチド−ＨｙＮｉｃ：ＲＧＤ４Ｃ、［ＮＨ２−ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−Ｌｙｓ（ｅ−６−ＨｙＮｉｃ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］、ＭＷ１４０７．８３
0006433001.tif 000059
【０１７０】
実施例３  両親媒性膜活性ポリアミンの可逆的修飾
プロテアーゼで切断可能なマスキング剤のアミン含有ポリマーへの連結−ｐ−アシルアミドベンジルカルバマート連結の形成
Ａ．ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、Ｃｙ３標識ポリマーをＳＰＤＰ−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ−パラ−ニトロフェノールと所望の比率で室温にて１時間合わせた。次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、ＳＰＤＰ−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ−修飾ポリマーをＰＥＧ１２−ＦＣｉｔと１：８（ポリマー：ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ）の重量比で室温にて１時間反応させた。その後、修飾したポリマーをｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。
0006433001.tif 000060
【０１７１】
ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート模倣体をヒドロキシルアミンを用いて、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で、１：５（ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート模倣体：ヒドロキシルアミン）のモル比で室温にて２時間脱アセチル化した。
【０１７２】
修飾したポリマーを脱アセチル化したＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート模倣体と、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で、１：１（ポリマー：ＲＧＤ）の重量比で室温にて最低４時間合わせ、ポリマーＲＧＤ結合体を生成した。ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いてポリマー−ＲＧＤ結合体を精製した。
【０１７３】
ポリマー−ＲＧＤ結合体の３４３ｎｍでの吸光度を測定し、ピリジン２−チオンの減衰係数８．０８×１０３Ｍ−１ｃｍ−１を用いることにより、結合の効率を定量化した。
0006433001.tif 000061
（＊ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０精製前）
0006433001.tif 000062
【０１７４】
ポリマー−ＲＧＤ結合体を等張グルコース溶液で所望の濃度まで希釈した。
0006433001.tif 000063
【０１７５】
Ｂ．ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃ
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、Ｃｙ３標識ポリマーをアルデヒド−ＰＥＧ１２／２４−ＴＦＰ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ＃１００８２）と所望の比率で室温にて１時間合わせた。次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、アルデヒド−ＰＥＧ１２／２４−ＴＦＰ−修飾ポリマーをＰＥＧ１２−ＦＣｉｔと１：８（ポリマー：ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ）の重量比で室温にて１時間反応させた。その後、修飾したポリマーをｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。
0006433001.tif 000064
【０１７６】
修飾したポリマーをＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣体と、５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．０緩衝液中で、１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ）の重量比で室温にて最低４時間合わせ、ポリマーＲＧＤ結合体を生成した。ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いてポリマー−ＲＧＤ結合体を精製した。
【０１７７】
ポリマー−ＲＧＤ結合体の３５４ｎｍでの吸光度を測定し、ビス−アリールヒドラゾン結合の減衰係数２．９×１０１Ｍ−１ｃｍ−１を用いることにより、結合の効率を定量化した。
0006433001.tif 000065
【０１７８】
ポリマー−ＲＧＤ結合体を等張グルコース溶液で所望の濃度まで希釈した。
0006433001.tif 000066
【０１７９】
実施例４  ＰＥＧプロテアーゼで切断可能なマスキング剤によるポリアミンの修飾
ｐ−アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化（アミン反応性）カルボナートをｐＨ＞８のＨ２Ｏ中で両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と反応させて、ｐ−アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
0006433001.tif 000067
Ｒ１はＰＥＧを含み、
Ｒ２は両親媒性膜活性ポリアミンであり、
ＡＡはジペプチド（保護ありまたは保護なしのいずれか）、
Ｚはアミン反応性カルボナートである。
【０１８０】
×ｍｇのポリマーに等張グルコース中の１２×ｍｇのＨＥＰＥＳ遊離塩基を加える。緩衝化ポリマー溶液にＤＭＦ中の２×〜１６×ｍｇの２００ｍｇ／ｍｌのジペプチドマスキング剤を加える。一部の用途において、２×ｍｇのジペプチドマスキング剤で修飾し、続いてｓｉＲＮＡを連結する。次いで、ポリマー−ｓｉＲＮＡ結合体を、６×〜８×ｍｇのジペプチドマスキング剤でさらに修飾する。
【０１８１】
実施例５  結合体形成
Ａ．ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエートおよびＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤を用いたｓｉＲＮＡ送達結合体の生成
示したポリマーを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０緩衝液中で、ＳＭＰＴと１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１８２】
次いで、ＳＭＰＴ修飾ポリマーをＳＰＤＰ−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔと所望の比率で室温にて１時間反応させた。その後、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＰＥＧ１２−ＦＣｉｔと１：２（ポリマー：ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＰＥＧ１２−ＦＣｉｔと１：６（ポリマー：ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ）の重量比で室温にて１時間反応させた。得られた結合体をｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。
【０１８３】
脱アセチル化したＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエートを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で、修飾ポリマーと１：１（ポリマー：ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオール）の重量比で室温にて最低４時間反応させることにより、修飾ポリマーに結合させ、ＲＧＤ−結合体を生成した。この結合体をｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。ＲＧＤ標的化リガンドの結合効率を上述の通りに求めると、４２Ｋの未修飾ポリマー当たり３．５および２１のＲＧＤリガンドであることがわかった。
【０１８４】
Ｂ．ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃおよびＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤を用いたｓｉＲＮＡ送達結合体の生成
１）プロトコール１。示したポリマーを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０緩衝液中で、ＳＭＰＴと１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１８５】
次いで、ＳＭＰＴ修飾ポリマーをアルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（アルデヒド−ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔまたはアルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と所望の比率で室温にて１時間反応させた。その後、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＰＥＧ１２−ジペプチドマスキング剤（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：２（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能ＰＥＧ（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔまたはＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：６（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。得られた結合体をｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。
【０１８６】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例２Ｂ）を、５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ５．０緩衝液中で、修飾ポリマーと１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣体）の重量比で室温にて最低４時間反応させることにより、修飾ポリマーに連結し、完全な送達結合体を生成した。この結合体をｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを用いて精製した。ＲＧＤリガンドの結合効率を上述の通りに求めた。
【０１８７】
２）プロトコール２
示したポリマーを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０緩衝液中で、ＳＭＰＴと１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１８８】
次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、ＳＭＰＴ修飾ポリマーをアルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で、ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：２（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能ＰＥＧ（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔまたはＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：６（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１８９】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例２Ｂ）を、６９ｍＭの塩化水素溶液（ＨＣｌ）中で、修飾ポリマーと１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ）の重量比で室温にて終夜反応させることにより、修飾ポリマーに連結し、完全な結合体を生成した。ＲＧＤリガンドの結合効率を上述の通りに求めた。
【０１９０】
３）プロトコール３
示したポリマーを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０緩衝液中で、ＳＭＰＴと１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１９１】
次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、ＳＭＰＴ修飾ポリマーをアルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で、ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：２（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能ＰＥＧ（ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔまたはＰＥＧ１２−ＡＣｉｔまたはＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：６（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１９２】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例２Ｂ）を、１００ｍＭのＭＥＳ遊離酸溶液中で、修飾ポリマーと１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣体）の重量比で室温にて終夜反応させることにより、修飾ポリマーに連結し、完全な送達結合体を生成した。ＲＧＤ標的化リガンドの結合効率を上述の通りに求めた。
【０１９３】
４）プロトコール４
示したポリマーを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０緩衝液中で、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳと１：０．０１５（ポリマー：アジド）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１９４】
次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、アジド修飾ポリマーをアルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で、ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔ）と１：２（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをアルキン−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：アルキン−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能ＰＥＧ（ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔ）と１：６（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１９５】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例２Ｂ）を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液ｐＨ５．０中で、修飾ポリマーと１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣体）の重量比で室温にて終夜反応させることにより、修飾ポリマーに連結し、完全な送達結合体を生成した。ＲＧＤ標的化リガンドの結合効率を上述の通りに求めた。
【０１９６】
５）プロトコール５
モノアジドポリマーを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ）と１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で、ＰＥＧ−ジペプチドマスキング剤（ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔ）と１：２（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをアルキン−ｓｉＲＮＡと１：０．２（ポリマー：アルキン−ｓｉＲＮＡ）の重量比で室温にて終夜反応させ、ｓｉＲＮＡを連結した。次に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ９．０緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能ＰＥＧ（ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔ）と１：６（ポリマー：ＰＥＧ）の重量比で室温にて１時間反応させた。
【０１９７】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例２Ｂ）を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液ｐＨ５．０中で、修飾ポリマーと１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣体）の重量比で室温にて終夜反応させることにより、修飾ポリマーに連結し、完全な送達結合体を生成した。ＲＧＤ標的化リガンドの結合効率を上述の通りに求めた。
【０１９８】
実施例６  インビトロ細胞結合
腫瘍細胞を２ｍｌ中５０，０００／ｍｌで６ウェルプレート中のカバーガラス上に２４時間播種した。５μｇ／ｍｌのＣｙ３標識ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエートまたはＣｙ３標識ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃ（プロトコール１〜５）修飾ポリマー（０．２ｍｇ／ｍｌの５０μｌ、ＲＧＤ−ＰＥＧ、ＲＧＤ＃１）を細胞に滴加し、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液で３０分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。
【０１９９】
細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（２単位／ｍｌ）およびＴｏＰｒｏ−３ヨウ化物（０．２μＭ）で２０分間染色してアクチンおよび核をそれぞれ染色し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。カバーガラスをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤とともにスライドに取り付け、次いで、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光シグナルを得た。ＲＤＧ修飾ポリアミンの細胞取込みを細胞内のＣｙ３蛍光の存在により決定した。各種腫瘍細胞におけるＣｙ３シグナル強度を以下の表４にまとめる（５：最大、１：最小）。
【０２００】
（表４）ＲＤＧ修飾ポリアミンの腫瘍細胞取込み
0006433001.tif 000068
【０２０１】
実施例７  インビボ腫瘍トラッキング
等張グルコース１００〜２００μｇ中のＣｙ３−標識ＲＧＤ（チオール−ＲＧＤ＃１）／ＰＥＧ修飾Ｌａｕ１００５−１１６Ｃ−１（エチルエトキシアミンアクリラート５４％／ブチルアクリラート４６％のＲＡＦＴコポリマー、分画１、保護基ありのＭＷ１０４ｋ、保護基なしのＭＷ７６ｋ、ＰＤＩ１．２）（０．５または１ｍｇ／ｍｌの２００μｌ）を、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに尾静脈投与により注入した。注入から４時間後、動物を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍全体を１０％ホルマリン溶液中で最低４時間インキュベーションして固定した。次いで、腫瘍を３０％スクロース溶液に終夜または平衡になるまで浸した。飽和した腫瘍を液体窒素で急速凍結し、スライドガラス（ＶＷＲ  ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ  ｍｉｃｒｏ  ｓｌｉｄｅ）上で７μｍスライスの凍結切片にした。次いで、切片をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ファロイジン（２単位／ｍｌ）およびＴｏＰｒｏ−３ヨウ化物（０．２μＭ）で室温にて２０分間染色した。染色後、切片をＰＢＳで２回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤を用いて上部にカバーガラスを取り付け、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０レーザー走査型レーザー共焦点顕微鏡で観察した。代表的な画像を撮り、組織およびＣｙ３蛍光の細胞分布を示した。Ａ４９８腫瘍モデルにおいて、ＲＧＤ修飾ポリマーは、腫瘍の移植場所（皮下、肝臓または腎臓）にかかわらず、腫瘍組織に深く浸透し、腫瘍細胞中に入っていた。対照ポリマー（ＲＧＤなし（ＰＥＧのみ）またはＲＧＥ修飾のいずれか）は、腫瘍細胞中に入ることなく、主に脈管構造中にとどまった。肝臓移植したＨｅｐＧ２腫瘍モデルにおいて、ＲＧＤ結合体の腫瘍組織への強い浸透が認められた。
【０２０２】
実施例８  インビボ腫瘍のｍＲＮＡノックダウン
等張グルコース中のＲＧＤ標的化結合体（５００μｇ、１．６７ｍｇ／ｍｌの３００μｌ）をヒト腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに尾静脈投与により注入した。注入から７２時間後、動物を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍組織をＴｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）中で均質化して全ＲＮＡを単離した。関連するｍＲＮＡノックダウンを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。
【０２０３】
実施例９  同所移植腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍マウスモデル
Ａ４９８細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。７８６−Ｏ  ＲＣＣ細胞（ＡＴＣＣ）を１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を回収し、計測し、氷上でマトリゲルマトリックスＨＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３０体積％）と混合した。
【０２０４】
メスの無胸腺ヌードマウスに約３％イソフルランで麻酔をかけ、右側臥位にして置いた。左脇腹に小さな０．５〜１ｃｍの腹部縦切開を施した。湿った綿棒を用いて、左腎臓を腹膜から引き上げ、ゆっくり固定した。注入の直前に、１．０ｍｌのシリンジに細胞／マトリゲル混合物を入れ、２７ゲージのニードルカテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次いで、充填したシリンジをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、モデルＰＨＤ２０００）に取り付け、空気を抜くためにプライミングした。シリンジに取り付けた２７ゲージのニードルカテーテルの先端を尾極近くの腎被膜の真下に挿入し、次いで、針の先端を腎被膜に沿って３〜４ｍｍ頭方に注意深く進めた。２．５：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）の約２００，０００細胞を含有する細胞／マトリゲル混合物の１０μｌのアリコートをシリンジポンプを用いて腎実質にゆっくり注入した。確実に注入が完了するように、針を１５〜２０秒腎臓内に残したままにした。その後、針を腎臓から抜き、注入部位に綿棒を３０秒間置いて、細胞の漏出または出血を防いだ。次いで、腎臓を腹部内にゆっくり戻し、腹壁を閉じた。移植から３週間後、腫瘍の進行を安楽死後の目視検査および測定により評価した。ほとんどの研究に関して、腫瘍測定値が概して約４〜８ｍｍであった移植後５〜６週間の腫瘍マウスを使用した。
【０２０５】
実施例１０  皮下（ＳＱ）腫瘍
ＳＱ腫瘍移植のために、マウスを導入室内に置くことにより３％イソフルランで麻酔を導入した。麻酔後、マウスをドレープ上に置き、３％イソフルランの麻酔をノーズコーンから追加した。マウスを腹臥位（右または左）にして置き、逆の脇腹に注入を施した。注入の直前に、１．０ｍｌのシリンジに細胞／マトリゲル混合物を入れ、２７ゲージのニードルカテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次いで、充填したシリンジをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、モデルＰＨＤ２０００）に取り付け、空気を抜くためにプライミングした。針を脇腹の皮膚層の真下に挿入し、細胞（１０μｌまたは２０μｌ）を毎分２５０μｌの速度で注入した。注入後、針を抜き、マウスを、ケージの下に配置されたウォータージャケット加熱パッドにより熱供給される回復ケージ内に置いた。通常の活動レベルに回復したら、動物を飼育ラックに戻した。
【０２０６】
実施例１１  肝臓腫瘍モデル
ＨｅｐＧ２細胞に、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ベクターｐＭＩＲ８５およびネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子ベクターｐＭＩＲ３の２つの発現ベクターをコトランスフェクトし、安定してＳＥＡＰを発現する細胞株を作製した。１０％ＦＢＳおよび３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ中で細胞を培養した。１０％ＦＢＳを添加したＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地中でＨＴ−２９結腸癌細胞を培養した。腫瘍移植のために、細胞を回収し、計測し、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、４０体積％）と混合した。無胸腺ヌードマウスに約３％イソフルランで麻酔をかけ、胸骨臥位にして置いた。剣状突起の直下に小さな１〜２ｃｍの腹部正中線切開を施した。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり収縮させ、シリンジ針を左葉の中央に挿入した。注入の直前に、１．０ｍｌのシリンジに細胞／マトリゲル混合物を入れ、２７ゲージのニードルカテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次いで、充填したシリンジをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、モデルＰＨＤ２０００）に取り付け、空気を抜くためにプライミングした。肝臓被膜のすぐ下約０．５ｃｍにシリンジ針を斜め下にして挿入した。１００，０００細胞を含有する細胞／マトリゲル混合物１０μｌをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。確実に注入が完了するように、針を１５〜２０秒肝臓内に残したままにした。その後、針を肝臓から抜き、注入部位に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防いだ。マトリゲル／細胞混合物は視認可能な塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉を腹部内にゆっくり戻し、腹壁を閉じた。ＨｅｐＧ２腫瘍マウスについては、腫瘍移植後、１週間に１回血清を採取し、腫瘍成長を観察するためにＳＥＡＰアッセイにかけた。ほとんどの研究に関して、ＳＥＡＰ値に基づいて、腫瘍測定値が約４〜８ｍｍと推定される移植後４〜５週間の腫瘍マウスを使用した。ＨＴ−２９腫瘍マウスについては、組織観察に基づいて、腫瘍が概して長さおよび幅４〜８ｍｍに達した移植後５〜６週間の腫瘍マウスを使用した。
【０２０７】
実施例１２  定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ
定量的ＰＣＲに備えて、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）中で均質化した組織サンプルから全ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、約５００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ヒト（腫瘍）Ａｈａ１発現には、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＶｅｒｉＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いる、ヒトＡｈａ１（アッセイＩＤ：Ｈｓ００２０１６０２＿ｍ１）およびＣｙｃＡ（Ｐａｒｔ＃：４３２６３１６Ｅ）用に事前に製造されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを３連のｂｉｐｌｅｘ反応に用いた。ヒト（腫瘍）ＥＧ５発現には、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＶｅｒｉＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いる、ヒトＥＧ５（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１８９６９８＿ｍ１）およびＣｙｃＡ（Ｐａｒｔ＃：４３２６３１６Ｅ）用に事前に製造されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを３連のｂｉｐｌｅｘ反応に用いた。定量的ＰＣＲは、７５００  ＦａｓｔまたはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ΔΔＣＴ法を用いて、相対遺伝子発現を算出した。
【０２０８】
実施例１３  腎細胞癌腫瘍細胞のインビボノックダウン
ＲＧＤ標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体をＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ−チオエートまたはＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃを用いて生成した。５００μｇのＬａｕ  ４１６４８−１０６ポリマーを８×ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ（プロトコール１を用いたＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃを含有）またはＳＰＤＰ−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ（ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエート含有）および１００μｇのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡで修飾した。腎臓ＲＣＣ腫瘍マウスを記載の通りに作製し、Ａｈａ１結合体の単回尾静脈注入により処置した。注入後７２時間でマウスを安楽死させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全ＲＮＡを腎臓腫瘍から調製した。相対Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより記載の通りに送達緩衝液のみで処置したマウスと比較して決定した。標的リガンドまたはＲＧＥ対照リガンドなしで生成した結合体は、２５〜３５％の遺伝子発現の減少を示した。ＲＧＤ標的化結合体は、腫瘍Ａｈａ１発現において、５０〜７０％の遺伝子減少を示した（ｎ＝３または４）。
【０２０９】
（表５）単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ結合体で処置した後のマウスにおける正所性腎臓ＲＣＣ腫瘍中の相対腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベル
0006433001.tif 000069
【０２１０】
非標的化結合体（リガンドなしまたはＲＧＥ模倣体（陰性対照リガンド）で処置した動物の遺伝子ノックダウンは、透過性および滞留性の亢進（ＥＰＲ）効果（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，２０１１）により、腫瘍中に結合体の受動的蓄積が生じたと思われる。結合体の長期の血清安定化および循環により、ＥＰＲを介した腫瘍中の有意な蓄積が可能となる。依然として、ＲＧＤ標的化結合体は、受動的標的化結合体に比べて、さらに２０〜４０％の遺伝子発現の減少を示した。
【０２１１】
実施例１４  腎細胞癌腫瘍細胞のインビボノックダウン
ＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧおよびプロトコール１を用いて、ＲＧＤ模倣体＃１標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体を生成した。５００μｇのＬａｕ  ４１６４８−１０６ポリマーを８×ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔおよび１００μｇのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡで修飾した。ＲＧＤ模倣体＃１−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃをこれらのサンプルの標的リガンドとして使用した。転移性（皮下）および正所性腎臓ＲＣＣ腫瘍の両方を有するマウスを上述の通りに作製し、Ａｈａ１結合体の単回尾静脈注入により処置した。注入後７２時間でマウスを安楽死させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全ＲＮＡを腎臓腫瘍から調製した。腫瘍移植部位における相対ヒト（腫瘍）Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより上述の通りに決定し、送達緩衝液のみを注入したマウスに対して正規化した。ＲＧＤ−標的化結合体は、腫瘍Ａｈａ１発現において４０〜５０％の遺伝子減少を示した（ｎ＝３または４）。
【０２１２】
（表６）単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ結合体で処置した後のマウスにおける正所性腎臓または転移性皮下ＲＣＣ腫瘍中の相対腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベル
0006433001.tif 000070
【０２１３】
実施例１５  複数の腫瘍型へのＲＤＧ標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体のｓｉＲＮＡ送達
肝臓に影響を及ぼす癌には、肝細胞（たとえば、肝細胞癌、ＨＣＣ）に由来する癌および結腸、肺、腎臓または胸部などの他の組織に由来する転移性癌が含まれる。αｖβ３インテグリンを発現することおよびＲＧＤ結合体にインビトロで結合することが知られている種々の癌細胞型を肝臓に移植した。ＲＧＤ標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体をＲＧＤ模倣体＃１−ＨｙＮｉｃまたはＲＤＧ模倣体＃１−ＰＥＧ−チオエートを用いて生成した。５００μｇのＬａｕ  ４１６４８−１０６ポリマーを８×ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ（プロトコール１または５）または８×ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ−／０．５×ＳＰＤＰ−ＰＥＧ２４−ＦＣｉｔ（ＲＧＤ−ＰＥＧ−チオエートプロトコール使用）および１００μｇのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡで修飾した。次いで、担腫瘍マウスに単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ送達結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後７２時間でマウスを安楽死させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全ＲＮＡを肝臓腫瘍から調製した。各腫瘍型について、腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。ＲＧＤ標的化結合体は、腫瘍Ａｈａ１遺伝子発現において５０〜６０％の減少を示した（ｎ＝３または４）。
【０２１４】
（表７）単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ結合体で処置した後のマウスにおける各種肝臓腫瘍中の相対腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベル
0006433001.tif 000071
【０２１５】
実施例１６  異なるポリマー種を用いたＲＧＤ結合体生成
ポリマーＥｍｉ  １０３４−６８Ｃ−１
ポリマーＥｍｉ  １０３４−８１Ｆ−１
ポリマーＬＨ  １０７３−２０Ｃ−１
ＲＧＤ模倣体＃１ｂおよびプロトコール２を用いて、ＲＧＤ模倣体＃１標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体を生成し、４００μｇのＥｍｉ  １０３４−６８Ｃ−１、Ｅｍｉ  １０３４−８１Ｆ−１またはＬＨ  １０７３−２０Ｃ−１ポリマーを８×ＰＥＧ１２ＡＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔおよび８０μｇのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡで修飾した。ＲＧＤ模倣体＃１ｂをこれらの生成物の標的リガンドとして使用した。次いで、正所性ＲＣＣ腫瘍マウスに単回用量のＡｈａ１結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後７２時間でマウスを安楽死させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全ＲＮＡを肝臓腫瘍から調製した。腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。
【０２１６】
（表８）単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ結合体で処置した後のマウスにおける正所性腎臓ＲＣＣ腫瘍中の相対腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベル
0006433001.tif 000072
【０２１７】
実施例１７  ＡＣｉｔまたはＦＣｉｔジペプチドマスキング試薬を用いたＲＧＤ複合体生成
ＲＧＤ模倣体＃１ｂおよびプロトコール２を用いて、ＲＧＤ模倣体＃１標的化ｓｉＲＮＡ送達結合体を生成した。８×ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ（ＦＣｉｔジペプチドでマスクした送達結合体の場合）または８×ＰＥＧ１２−ＡＣｉｔ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ２４−ＡＣｉｔ（ＡＣｉｔジペプチドでマスクした送達結合体の場合）および８０μｇのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡを用いて、４００μｇのＥｍｉ  １０３４−６８Ｃ−１ポリマーを修飾した。ＲＧＤ模倣体＃１ｂ−ＨｙＮｉｃをこれらの生成物の標的リガンドとして使用した。次いで、正所性ＲＣＣ腫瘍マウスに単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ送達結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後７２時間でマウスを安楽死させ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全ＲＮＡを肝臓腫瘍から調製した。腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。ＡＣｉｔまたはＦＣｉｔのｓｉＲＮＡ送達結合体の間で遺伝子ノックダウンの有効性に有意差はなかった。ＲＧＤ標的化結合体は、ＡＣｉｔまたはＦＣｉｔ結合体のそれぞれに関して、腫瘍Ａｈａ１遺伝子発現（ｎ＝３）において５１％または５３％の低減を示した。
【０２１８】
（表９）単回用量のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ結合体で処置した後のマウスにおける正所性腎臓ＲＣＣ腫瘍中の相対腫瘍Ａｈａ１  ｍＲＮＡレベル
0006433001.tif 000073
【０２１９】
実施例１８  ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、以下の配列を有していた。
ＡｈａＩ  ｓｉＲＮＡ：
0006433001.tif 000074
ｐ＝ホスフェート
ヌクレオチドの前のｄ＝２'−デオキシ
ｓ＝ホスホロチオエート連結
ヌクレオチドの後のｆ＝２'−Ｆ置換
小文字＝２'−Ｏ−ＣＨ３置換
【０２２０】
ＲＮＡ合成は、固相上で、ＡＫＴＡ  Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＭｅｒｍａｄｅ  １２（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ  Ｔｅｘａｓ）および固相担体として多孔性ガラス（ＣＰＧ）を用い、従来のホスホラミダイト化学により実施した。
【０２２１】
実施例１９  アルキンジスルフィドセンス鎖ＲＮＡ結合体の合成
５'にＣ−６アミノ修飾を有する粗製のセンス鎖ＲＮＡ（３．４ｍｇ、５０６ｎｍｏｌ）を−８０℃のＥｔＯＨ中の酢酸ナトリウム（０．３Ｍ）を用いて沈殿させ、凍結乾燥し、３００μＬの０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８〜９）中に溶解した。ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳ）、品番７６１５３２  Ａｌｄｒｉｃｈ）（２．８６ｍｇ、５０６０ｎｍｏｌ）を２８６μＬのＤＭＦ中に溶解し、ＲＮＡ溶液を加えた。反応混合物をよく混合し、室温で２時間進行させた。反応をＲＰ−ＨＰＬＣを用いてモニターした。反応完了後、反応混合物を乾燥させ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。ＲＮＡ結合体が収率４５％（２２９ｎｍｏｌ）で調製された。ＲＮＡ結合体の純度をＲＰ−ＨＰＬＣにより決定し（純度：９６．６％）、密度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦにより確認した（質量計算値：７１６４．０、質量実測値：７１６４．８）。
【０２２２】
実施例２０  ４−（Ｆｍｏｃ−４−アミノフェノキシ）酪酸の合成
0006433001.tif 000075
【０２２３】
Ａ．３の合成：ｐ−ニトロ−フェノール（２）（７．５ｇ、５３．９ｍｍｏｌ）を４−ブロモ酪酸エチル（８．４５ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（７５ｍｌ）中のＫ２ＣＯ３（７．５ｇ、５．４ｍｍｏｌ）と合わせ、１００℃で２時間撹拌した。ＤＭＦを除去し、粗製物を２Ｎ  ＮａＯＨおよびメタノールの３：１混合物の混合物に希釈し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を６Ｍ  ＨＣｌで酸性化した。白色沈殿物を回収した（１０．９ｇ  ９０％収率）。
0006433001.tif 000076
【０２２４】
Ｂ．４の合成：３（３７．１ｇ，ｍｍｏｌ）をギ酸アンモニウム（３５ｇ，ｍｍｏｌ）とともにＭｅＯＨ（１Ｌ）中に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｔｙｐｅ）（３．５ｇ）を加えた。混合物を６５℃で終夜還流させた。反応物をセライトで濾過し、赤褐色の固体を得た（３０．５ｇ、９５％収率）。
0006433001.tif 000077
【０２２５】
Ｃ．４−（Ｆｍｏｃ−４−アミノフェノキシ）酪酸（１）の合成：４（５．１ｇ、２６ｍｍｏｌ）を６：４の飽和重炭酸ナトリウム水溶液およびＴＨＦの混合物（３００ｍｌ）中に溶解し、白色のスラリーを作製した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（８．８２ｇ、２６．１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を４時間撹拌した。アセトンを除去し、反応物を酸性化し、オフホワイトの沈殿物を回収し、１Ｎ  ＨＣｌでトリチュレートし、９．６ｇの生成物を得た（収率８８％、分子量３８９．４００６６）。
0006433001.tif 000078
【０２２６】
用いた試薬：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、Ｈ２Ｏ（ＨＰＬＣ等級）、アセトン、ｐ−ニトロフェノール、４−ブロモ酪酸エチル、炭酸カリウム、Ｐｄ／Ｃ（Ｄｅｇｕｓｓａ  ｔｙｐｅ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そのまま使用した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０２２７】
実施例２１  グアナジノ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ−ＰＥＧ１２−ＨｙＮｉｃ−Ｂｏｃの合成
0006433001.tif 000079
【０２２８】
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（２）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＣＡＳ  ２９０２２−１１−５）（１．５７ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍｌ）中に溶解し、撹拌するために氷水浴中に置いた。ＮＨＳ（０．６６８ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（１．２ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）を溶液に加え、５分間撹拌し、氷浴を取り外した。反応混合物を２０℃で１６時間撹拌し、０℃まで１時間冷却し、次いで濾過し、濃縮し、真空下で乾燥させた。粗生成物をＴＨＦ（２０ｍｌ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）中のＨ−Ａｓｐ（２−ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（ＣＡＳ  ２００３３６−８６−３）（１．３２８ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（６００ｍｇ、７．１４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ、３０ｍｌ）を加えて溶液を均質にし、１６時間撹拌した。ＴＨＦおよびＤＭＥをロータリーエバポレータで除去し、残留物をＨ２Ｏ（１５０ｍｌ）で希釈し、３％ＨＣｌでｐＨ＝３まで酸性化し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＯＨ（２）を得た。生成物をＥｔＯＡｃで５回抽出し、ブラインですすぎ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、真空下で乾燥させた。収量２．５４ｇ。粗生成物を次工程で使用した。収率は１００％と推測される。
0006433001.tif 000080
【０２２９】
Ｂ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＢＡＰＯＡ−Ｂｏｃ（３）
ジペプチド２（１．１６８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍｌ）中に溶解し、撹拌するために氷水浴に置いた。ＮＨＳ（２９１ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（５２２ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ）を溶液に加え、０℃で５分間、次いで２０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を氷浴で１時間冷却し、濾過し、濃縮し、真空下で乾燥させた。取得したＮＨＳ誘導体をＤＣＭ（１５ｍｌ）中に溶解し、４−［３−（Ｂｏｃ−アミノ）プロパン−１−イルオキシ］−アニリン（ＡＰＯＡ−Ｂｏｃ、６４４ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ）（Ｑｕｅｌｅｖｅｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃ，ａｎｄ  ＫｒａｕｓＯｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（１０），１６７６−１６８３；２００３）およびＴＥＡ（１７５μｌ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応物を２０℃で３時間撹拌し、１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）を加えた。すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）中に溶解し、５％ＫＨＳＯ４（２×４０ｍｌ）、水（１×４０ｍｌ）、高濃度の重炭酸ナトリウム溶液（１×４０ｍｌ）およびブライン（１×４０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、次いで濃縮し、真空下で乾燥させた。収量１．７１４ｇ。粗生成物のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）−ＢＡＰＯＡ−Ｂｏｃ（３）を次工程で使用した。収率は１００％と推定される。
0006433001.tif 000081
【０２３０】
Ｃ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ  ＨＣｌ塩（４）
化合物３（８００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をＨＣｌのジオキサン中氷冷溶液（４Ｍ、２２ｍｌ）で処理し、０℃で４５分間撹拌した。冷却浴を取り外し、懸濁液を濃縮した。残留物をＣＨＣｌ３（２．５ｍｌ）中に懸濁し、ジエチルエーテル（４５ｍｌ）を加え、固体を分離した。４−［３−（アミノ）プロパン−１−イルオキシ］−アニリン（ＡＰＯＡ）誘導体のＨＣｌ塩の再沈殿手順を２回繰り返し、生成物を減圧下で乾燥させた。収率：５５７ｍｇ（９２％）。
0006433001.tif 000082
【０２３１】
Ｄ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ−ＰＥＧ１２−ＮＨ−Ｂｏｃ（５）
ＤＣＭ（８ｍｌ）中にＢｏｃ−Ｐｅｇ１２−ＣＯ２Ｈ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  １０７６１、８０３ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を含む０℃の溶液に、ＮＨＳ（１９３ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）と、続いてＤＣＣ（３４６ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を加えた。冷却を取り外し、２４時間撹拌し続けた。反応混合物を−２０℃まで冷却し、濾過し、濃縮した。ＮＨＳ誘導体をＤＭＦ（１４ｍｌ）中の化合物４（６６７ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１５４μｌ、０．８９ｍｍｏｌ）の溶液で処理し、１６時間撹拌し、濾過し、濃縮した。得られた粗残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィーによりＤＣＭ：ＭｅＯＨ：酢酸（９２．５：７：０．５）で溶出して精製した。収率：５７５ｍｇ（４１％）。
0006433001.tif 000083
【０２３２】
Ｅ．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ−ＰＥＧ１２−ＮＨ２（６）
化合物５（１４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（３ｍｌ）およびＨ２Ｏ（１ｍｌ）で処置した。混合物を２０分間撹拌し、冷Ｈ２Ｏで希釈し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。残留物をＥｔ２Ｏで３回トリチュレートし、減圧下で乾燥させ、さらに精製することなく使用した。収率：１１５ｍｇ（９０％）。
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【０２３３】
Ｆ．Ｈ２Ｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ−ＰＥＧ１２−ＨｙＮｉｃ−Ｂｏｃ（７）
ＤＣＭ（３ｍｌ）中に６（１０５ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３１μｌ、０．１８ｍｍｏｌ）を含有する溶液に、Ｂｏｃ−ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳ（Ａｂｒａｍｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｕｗｅｉｄ，Ｍ．，Ｔｅｎｋａｔｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ａ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ｍ．．Ｇａｕｌ，Ｆ．Ｅ．，Ｆｕｃｃｅｌｌｏ，Ａ．Ｊ．，Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｈ．Ｗ．，Ｆｉｓｃｈｍａｎｎ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１，２０２２−２０２８，１９９０．）（３５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。
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混合物を１６時間撹拌し、ＭｅＯＨ中のエチルアミン（３０μｌ、２．０Ｍ）で処理し、さらに３時間撹拌した（過剰の未反応Ｂｏｃ−ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳをクエンチした）。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。粗残留物をＤＭＦ（３ｍｌ）中に溶解し、次いでＴＥＡ（４００μｌ）で処置し、１６時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータでオイルポンプ減圧下にて除去した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより、Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（５ｕ、１００Å）を用いて、Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）中ＡＣＮ（０．１％ギ酸）のグラジエント（１８〜４３％）で３０分間かけて溶出して精製した。収率：３６ｍｇ（３４％）。
0006433001.tif 000086
【０２３４】
Ｇ．３−グアナジノ安息香酸−ＮＨＳエステル（１）
ＮＨＳ（５８９ｍｇ、５．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）中の３−グアニジノ安息香酸（１ｇ、４．６５ｍｍｏｌ；Ｃｈａｎｄｒａｋｕｍａｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．ＵＳ  Ｐａｔ．５，７７３，６４６）の撹拌溶液に加え、５分間撹拌し、次いで、ＤＣＣ（１．０５６ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。撹拌を２時間続け、次いで、この反応混合物を−２０℃に３０分間冷却し、生成物を濾過し、冷ＤＭＦで洗浄し、オイルポンプを用いて減圧下にて乾燥させた。収率：１．２８３ｇ（１００％）。
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【０２３５】
Ｈ．グアナジノ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＡＰＯＡ−ＰＥＧ１２−ＨｙＮｉｃ−Ｂｏｃ（８）
７（３６ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１３ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）を含むＨ２Ｏ（１ｍｌ）およびＴＨＦ（０．９ｍｌ）の混合物を３−グアナジノ安息香酸（１）（１９．５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）のＮＨＳエステルで処理し、２２時間撹拌した。次いで、混合物をＨ２Ｏで希釈し、ＴＨＦをロータリーエバポレータで除去した。残留物をｐＨ＝３（１％ＨＣｌ）の水（３ｍｌ）中に懸濁させ、固形不純物を濾去した。生成物を減圧下で濃縮し、粗残留物をＨ２Ｏ（０．８ｍｌ）、アセトン（０．８ｍｌ）およびＴＦＡ（１．８ｍｌ）の混合物で処理し、４０分間撹拌した。アセトン（２ｍｌ）による溶液の希釈が完了したら、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。得られた粗生成物を、分取ＨＰＬＣにより、Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（５ｕ、１００Å）を用いて、Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）中ＡＣＮ（０．１％ギ酸）のグラジエント（１８〜４３％）で３０分間かけて溶出して精製した。収率：３４ｍｇ（８９％）。
【０２３６】
実施例２２  ＲＧＤリガンドの固相合成
0006433001.tif 000088
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、Ｈ２Ｏ（ＨＰＬＣ等級）、アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＨＰＬＣ等級）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｆ３ＣＣＯ２Ｈ（ＴＦＡ）およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）。ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート）をＯａｋｗｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．から購入した。リンクアミドＭＢＨＡ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨをＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。４−（Ｎ−Ｆｍｏｃパラ−アミノフェノキシ）−酪酸およびジ−ｂｏｃ  ｍ−グアニジノ安息香酸を当該技術分野の標準的な技術を用いて合成した。フリット化ポリプロピレン製シリンジをＴｏｒｖｉｑから購入した。溶媒ＡはＨ２Ｏ：Ｆ３ＣＣＯ２Ｈ  １００：０．１ｖ／ｖであり、溶媒ＢはＣＨ３ＣＮ：Ｆ３ＣＣＯ２Ｈ  １００：０．１ｖ／ｖである。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＨｙＮｉｃ）−ＯＨを先に記載の通りに合成した。
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【０２３７】
Ａ．ペプチド合成
リンクアミドＭＢＨＡ樹脂をフリット化ポリプロピレン製シリンジ内に入れ、使用前にＤＣＭ中で２時間かき混ぜた。以下の標準固相ペプチド合成条件を用いた。Ｆｍｏｃ脱保護は、１０ｍｌ（樹脂１ｍｍｏｌ当たり）のピペリジン：ＤＭＦ溶液（２０：８０ｖ／ｖ）に２０分間浸すことにより実施した。アミドカップリングは、樹脂を、０．１Ｍ濃度のＤＭＦ中の４当量のＦｍｏｃアミノ酸、４当量のＰｙＢＯＰおよび１０当量のトリエチルアミンに４０分間浸すことにより実施した。
【０２３８】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＨｙＮｉｃ）−ＯＨ、４−（Ｎ−Ｆｍｏｃパラ−アミノフェノキシ）−酪酸、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−３−アミノ安息香酸を樹脂に順次カップリングさせた。アミドカップリングの経過は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いて確認した。Ｆｍｏｃ脱保護を確実に完了させるために、４−（Ｎ−Ｆｍｏｃパラ−アミノフェノキシ）−酪酸のＦｍｏｃ脱保護を４０分間実施した。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ残部を二重カップリングしてＦｍｏｃアスパラギン酸と４−（アミノフェノキシ）−酪酸残部のアミノ部分の間のアミド形成を確実にした。樹脂からの切断をＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ：アセトン（９２．５：２．５：２．５：２．５ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）溶液中で２時間行った。空気の吹き込みを用いてＴＦＡ溶液を約１０％体積まで減少させ、ペプチドをＥｔ２Ｏ中に沈殿させた。沈殿物をＡ：Ｂ（１：１ｖ／ｖ）溶媒混合物に再度溶解し、逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。
【０２３９】
Ｂ．ペプチド精製
精製（９０％を超える均質性まで）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８（２５０×２１．２ｍｍ、粒径５μｍ）カラムを備えた分取型Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣにより、１０〜３０％のＢ溶媒グラジエントを用いて２０分かけて実施した。Ｗａｔｅｒｓ  ｘＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）カラムを備える分析用Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣにより、１０〜６０％のＢグラジエントを用いて５０分間かけて、純度を評価した。ＨＰＬＣ分画の凍結乾燥により、ＴＦＡ塩の精製ペプチドを得た。
【０２４０】
実施例２３
Ａ．ＰＥＧ１２／２４−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＯＣ−ＰＮＰの合成
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１）ジペプチド前駆体の調製：
ａ）Ｆｍｏｃ−ＦＣｉｔ−ＯＨ
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ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ（ＥＭＤ  ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  ８５２２２６）（５５３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｈ２Ｏ（２．６ｍｌ）中のＨ−Ｃｉｔ−ＯＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ７６２９）（１８４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（８８．２ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ＴＨＦ（２ｍｌ）を加えて溶液を均質にし、１０時間撹拌した。ＴＨＦをロータリーエバポレータで除去し、残留物をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）およびｉＰｒＯＨ（１ｍｌ）で希釈し、３％ＨＣｌでｐＨ＝１まで酸性化した。生成物を９：１のＥｔＯＡｃ：ｉＰｒＯＨ溶液で５回抽出し、ブライン：ｉＰｒＯＨの９：１混合物ですすぎ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、減圧下で乾燥させた。エーテルでトリチュレートして、３１３ｍｇの純粋な生成物を得た（５７％）。類似の条件をＦｍｏｃ−ＡＣｉｔ−ＯＨの調製に用いることができる。
【０２４１】
ｂ）Ｆｍｏｃ−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ
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ＤＣＭ（１５０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−ＦＣｉｔ−ＯＨ（５．９８ｇ、１０．９７ｍｍｏｌ）およびＰＡＢＡ（２．７０ｇ、２１．９５ｍｍｏｌ）の溶液をＥＥＤＱ（５．４３ｇ、２１．９５ｍｍｏｌ）で処理し、２０℃で１５時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をＥｔ２Ｏでトリチュレートし、生成物を濾過し、減圧下で乾燥させた。収率６．１４ｇ（８６％）。類似の条件をＦｍｏｃ−ＡＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨの調製に用いることができる。
【０２４２】
ｃ）Ｈ２Ｎ−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（Ｈ２Ｎ−Ａ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨの調製についても同じ条件）
0006433001.tif 000094
Ｆｍｏｃ−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（０．８３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１１ｍｌ）中のＥｔ３Ｎ（３．５ｍｌ）とともに１０時間撹拌することによりＦｍｏｃ脱保護した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで４０℃／オイルポンプ減圧下にて除去し、粗生成物を得て、これをさらに精製することなく用いた。
【０２４３】
Ｂ．ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（ＦＣｉｔ＝フェニルアラニン−シトルリン）の調製
Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  製品番号：１０２６２
0006433001.tif 000095
Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  製品番号：１０３０４
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１．ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ
0006433001.tif 000097
ＤＭＦ（３ｍｌ）中のＨ２Ｎ−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（０．８８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６７μｌ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（３ｍｌ）中のＰＥＧ１２−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  １０２６２）またはＰＥＧ２４−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  １０３０４）（０．８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌し、濾過し、濃縮した。粗製物をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１：１、５ｍｌ）からＥｔ２Ｏ（４５ｍｌ）中に沈殿させ、さらに精製することなく用いた。収率：４２０ｍｇ（５３％）。
【０２４４】
ｉｉ）ＰＥＧ１２−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
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ジオキサン（４ｍｌ）中にＰＥＧ１２／２４−ＦＣｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（４１９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、（ＰＮＰ）２ＣＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  １６１６９１）（７６６ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２６３μｌ、１．５２ｍｍｏｌ）を含む溶液を暗所で５０℃にて１５時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留ＤＩＥＡをＤＭＦからの蒸発により除去した。生成物をカラムによりＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝４．５：５：０．５、続いてＣＨＣｌ３中ＭｅＯＨ（１２〜１５％）のグラジエントの溶出で精製した。収率：３９０ｍｇ（８０％）。
【０２４５】
実施例２４  両親媒性膜活性ポリアミンの合成
Ａ．Ｎ−Ｂｏｃ−エチルエトキシアクリラートとプロピルメタクリラートのＲＡＦＴ共重合（図１１）
他の膜活性ポリマーを得るために、Ａは、保護されたエチル、プロピルまたはブチルアミノアクリラートであってもよい。Ｂは、疎水性のより高い（１０〜２４個の炭素原子、Ｃ１８を示す）アクリラート、疎水性のより低い（１〜６個の炭素原子、Ｃ４を示す）アクリラートまたは疎水性の高いアクリラートと疎水性の低いアクリラートとの組み合わせであり得る。
【０２４６】
アミンアクリラート／Ｃ３メタクリラートからなるコポリマーを以下のように合成した。モノマーおよびＲＡＦＴ剤を秤量し、示した比率で酢酸ブチル中に加えた。ＡＩＢＮ（アゾビス−イソブチロニトリル）を加え、窒素を反応物に通して室温で１時間バブリングした。次いで、反応混合物を８０℃の油浴中に１５時間置いた。その後、ポリマーをヘキサンで沈殿させ、ＤＣＭ／ヘキサン溶媒系を用いてさらに分別沈殿させた（下記参照）。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ポリマーを酢酸中２Ｍ  ＨＣl７ｍｌで室温にて３０分間脱保護した。３０分後、水１５ｍｌを反応混合物に加え、この混合物を３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チューブに移した。ポリマーをＮａＣｌで終夜透析し、次いでｄＨ２Ｏでもう１日透析した。その後、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをｄＨ２Ｏ中に溶解した。
【０２４７】
Ｂ．Ｎ−Ｂｏｃ−エチルエトキシアクリラートおよびプロピルメタクリラートのランダム共重合
アミンアクリラート／Ｃｎメタクリラートからなるコポリマーを以下のように合成した。モノマーを秤量し、示した比率でジオキサン中に加えた。ＡＩＢＮ（アゾビス−イソブチロニトリル）を加え、窒素を反応物に通して室温で１時間バブリングした。次いで、反応混合物を６０℃の油浴中に３時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ポリマーをＧＰＣにより精製した。その後、ポリマー画分を酢酸中２Ｍ  ＨＣｌ７ｍｌで室温にて３０分間脱保護した。３０分後、水１５ｍｌを反応混合物に加え、この混合物を３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チューブに移した。ポリマーをＮａＣｌで終夜透析し、次いでｄＨ２Ｏでもう１日透析した。その後、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをｄＨ２Ｏ中に溶解した。
【０２４８】
Ｃ．水溶性両親媒性膜活性ポリ（ビニルエーテル）ポリアミンターポリマーの合成
Ｘｍｏｌ％のアミン保護ビニルエーテル（たとえば、２−ビニルオキシエチルフタルイミド）をオーブンで乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン中に窒素雰囲気下で加える。この溶液に、Ｙｍｏｌ％の低級疎水性基（たとえば、プロピル、ブチル）ビニルエーテルおよび任意でＺｍｏｌ％の高級疎水性基（たとえば、ドデシル、オクタデシル）ビニルエーテルを加える（図１）。溶液を−５０〜−７８℃の浴中に置き、２−ビニルオキシエチルフタルイミドを沈殿させる。この溶液に１０ｍｏｌ％のＢＦ３・（ＯＣＨ２ＣＨ３）２を加え、反応を−５０〜−７８℃で２〜３時間進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液の添加により重合を停止させる。ポリマーを減圧下で乾燥させ、次いで、１，４−ジオキサン／メタノール（２／１）に加える。フタルイミドに対して２０ｍｏｌ当量のヒドラジンを加えてアミンから保護基を除去する。溶液を３時間還流させ、次いで、減圧下で乾燥させる。得られた固体を０．５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌに溶解し、１５分間還流させてポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに１時間還流させる。次いで、溶液をＮａＯＨで中和し、室温まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水で透析し、凍結乾燥させる。サイズ排除または他のクロマトグラフィーを用いてポリマーをさらに精製することができる。ポリマーの分子量は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーおよび多角度光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を含めた標準的な手順に従ってカラムを用いて評価する。
【０２４９】
Ｄ．ポリマーＡｎｔ−４１６５８−１１１：
１）モノマー合成
２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、ラジカル反応開始剤）、４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＰＣＰＡ、ＲＡＦＴ剤）および酢酸ブチルをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。プロピルメタクリラートモノマー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を濾過して阻害剤を除去した。
【０２５０】
攪拌棒を取り付けた２Ｌの丸底フラスコ中で、２−（２−アミノエトキシ）エタノール（２１．１ｇ、２０２．９ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をジクロロメタン３５０ｍｌに溶解した。別の１Ｌフラスコ中で、ＢＯＣ無水物（３６．６ｇ、１６９．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン６６０ｍｌに溶解した。２Ｌの丸底フラスコに滴下漏斗を取り付け、ＢＯＣ無水物溶液をフラスコに６時間かけて添加した。反応物を終夜撹拌した。２Ｌの分液漏斗で、生成物を１０％クエン酸、１０％Ｋ２ＣＯ３、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌ各３００ｍｌで洗浄した。生成物のＢＯＣ保護２−（２−アミノエトキシ）エタノールをＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、重力濾過し、ＤＣＭをロータリーエバポレーションおよび高真空を用いて蒸発させた。
【０２５１】
攪拌棒を取り付け、アルゴンを流した５００ｍｌの丸底フラスコ中に、ＢＯＣ保護２−（２−アミノエトキシ）エタノール（２７．８３６ｇ、１３５．８ｍｍｏｌ）と、続いて無水のジクロロメタン２４０ｍｌを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（３５．５ｍｌ、２０３．７ｍｍｏｌ）を加え、この系をドライアイス／アセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル（１２．１ｍｌ、１４９．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をｄＨ２Ｏ、１０％クエン酸、１０％Ｋ２ＣＯ３、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ各１００ｍｌで洗浄した。生成物のＢＯＣ−アミノエチルエトキシアクリラート（ＢＡＥＥＡ）をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、重力濾過し、ＤＣＭをロータリーエバポレーションを用いて蒸発させた。生成物を直径７．５ｃｍカラムを用いる２９ｃｍのシリカによるカラムクロマトグラフィーで精製した。用いた溶媒系は、ヘキサン中３０％酢酸エチルであった。Ｒｆ：０．３０。分画を回収し、ロータリーエバポレーションおよび高真空を用いて溶媒を除去した。ＢＡＥＥＡを７４％の収率で得た。ＢＡＥＥＡを凍結機に保存した。
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【０２５２】
２）重合：酢酸ブチル中のＡＩＢＮ（１．００ｍｇ／ｍｌ）およびＲＡＦＴ剤の（４−シアノ−４（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＰＣＰＡ）、１０．０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製した。モノマーのモル供給比は、７５  ＢＡＥＥＡ：２５  プロピルメタクリラート（ＣＡＳ：２２１０−２８−８）と、０．１０８  ＣＰＣＰＡ  ＲＡＦＴ剤および０．０１６  ＡＩＢＮ触媒（合計０．００５６２ｍｏｌ）であった。
【０２５３】
ＢＡＥＥＡ（１．０９ｇ、４．２１ｍｍｏｌ）（Ａ）、プロピルメタクリラート（０．１８０ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）（Ｂ）、ＣＰＣＰＡ溶液（０．１７０ｍｌ、０．００６０９ｍｍｏｌ）（Ｃ）、ＡＩＢＮ溶液（０．１５０ｍｌ、０．０００９１５ｍｍｏｌ）および酢酸ブチル（５．６８ｍｌ）を攪拌子を入れた２０ｍｌガラスバイアルに加えた。バイアルをゴム栓で密閉し、長いシリンジ針と出口として第２の短いシリンジ針を用いて、溶液を窒素で１時間バブリングした。シリンジ針を外し、油浴を用いて系を８０℃で１５時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、５０ｍｌの遠心チューブに移した後、ヘキサン（３５ｍｌ）を溶液に加えた。溶液を４，４００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄み層を慎重にデカントし、下層（固体またはゲル様）をヘキサンですすいだ。次いで、下層をＤＣＭ（７ｍｌ）に再度溶解し、ヘキサン（３５ｍｌ）中に沈殿させ、もう一度遠心分離した。上澄みをデカントし、下層をヘキサンですすいだ後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：７３，０００（ＰＤＩ１．７）、Ｈ１ＮＭＲを用いて取得したポリマー組成：６９：３１  アミン：アルキル。
【０２５４】
分別沈殿
乾燥させた沈殿生成物をＤＣＭ（１００ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。曇点に到達する直後までヘキサンを加えた（約２０ｍｌ）。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層（約６０％のポリマーである濃稠な液体）を抽出し、ヘキサン中に完全に沈殿させた。ヘキサンをさらに添加することにより、残りの上部の溶液も同様に完全に沈殿させた。両方の分画を遠心分離にかけ、その後、ポリマーを単離し、減圧下で乾燥させた。分画１：ＭＷ８７，０００（ＰＤＩ１．５）、分画２：ＭＷ５２，０００（ＰＤＩ１．５〜１．６）。
【０２５５】
ＭＡＬＳ分析
約１０ｍｇのポリマーを０．５ｍｌの８９．８％ジクロロメタン、１０％テトラヒドロフラン、０．２％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散度（ＰＤＩ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに接続したＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用い、Ｊｏｒｄｉ  ５μ  ７．８×３００  Ｍｉｘｅｄ  Ｂｅｄ  ＬＳ  ＤＶＢカラムを用いて測定した。粗製ポリマー：ＭＷ：７３，０００（ＰＤＩ１．７），分画１：ＭＷ８７，０００（ＰＤＩ：１．５）、分画２：ＭＷ５２，０００（ＰＤＩ１．５〜１．６）
【０２５６】
精製したＢＯＣ保護ポリマーを酢酸中２Ｍ  ＨＣｌ（７ｍｌ）と０．５時間反応させてＢＯＣ保護基を除去し、アミンを生じさせた。ｄＨ２Ｏ１５ｍｌを反応物に加え、この溶液を３５００ＭＷカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で２４時間、次いでｄＨ２Ｏで１８時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ポリマー溶液を２〜８℃で保存した。
【０２５７】
Ｅ．モノマー供給比を７２．５  ＢＡＥＥＡ：２７．５  プロピルメタクリラートにした以外は、上述の通りにしてポリマーＬａｕ２４Ｂを調製した。
【０２５８】
Ｆ．以下のモノマーを用いた以外は、基本的に上述の通りにして、Ａｎｔ−１２９−１を作製した。
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【０２５９】
（表１０）Ａｎｔ−１２９−１ポリマー合成反応物
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【０２６０】
Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−プロピル−アクリラート（ＢＡＰＡ）を得るために、攪拌棒を取り付け、アルゴンを流した５００ｍｌの丸底フラスコ中に、３−（ＢＯＣ−アミノ）１−プロパノール（ＴＣＩ）（１３５．８ｍｍｏｌ）と、続いて無水のジクロロメタン２４０ｍｌを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（２０３．７ｍｍｏｌ）を加え、この系をドライアイス／アセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル（１４９．４ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をｄＨ２Ｏ、１０％クエン酸、１０％Ｋ２ＣＯ３、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ各１００ｍｌで洗浄した。生成物のＢＯＣ−アミノプロピルアクリラート（ＢＡＰＡ）をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、重力濾過し、ＤＣＭをロータリーエバポレーションを用いて蒸発させた。生成物を直径７．５ｃｍカラムを用いる２９ｃｍのシリカによるカラムクロマトグラフィーで精製した。用いた溶媒系は、ヘキサン中３０％酢酸エチルであった。Ｒｆ：０．３０。分画を回収し、ロータリーエバポレーションおよび高真空を用いて溶媒を除去した。ＢＡＰＡを７４％の収率で得た。ＢＡＰＡを凍結機に保存した。
【０２６１】
Ｇ．ポリマーＬａｕ４１６４８−１０６
モノマーのモル供給比は、８０  ＢＡＥＥＡ：２０  プロピルメタクリラート（ＣＡＳ：２２１０−２８−８）およびモノマーの合計モルを基準にして３％のＡＩＢＮ触媒であった。ＢＡＥＥＡ（６．５３ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）（Ａ）、プロピルメタクリラート（０．８０８ｇ、６．３ｍｍｏｌ）（Ｂ）、ＡＩＢＮ（０．１５５ｇ、０．９４５ｍｍｏｌ）およびジオキサン（３４．５ｍｌ）を攪拌子を入れた５０ｍｌのガラスチューブに加えた。化合物ＡおよびＢを実施例１６Ａｉにて前述した通りに調製した。反応は３連で設定した。各溶液を長いピペットを用いて窒素で１時間バブリングした。ピペットを外し、各チューブに慎重に栓をした。各溶液を油浴を用いて６０℃で３時間加熱した。各溶液を室温まで冷却し、丸底中で合わせた。粗製ポリマーを減圧下で乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：５５，０００（ＰＤＩ２．１）、Ｈ１ＮＭＲを用いて取得したポリマー組成：７４：２６  アミン：アルキル。
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【０２６２】
ＧＰＣ分別
乾燥させた粗製ポリマーを７５％ジクロロメタン、２５％テトラヒドロフランおよび０．２％トリエチルアミン中に５０ｍｇ／ｍｌで加えた。次いで、ポリマーをＪｏｒｄｉ  Ｇｅｌ  ＤＶＢ  １０４Å〜５００ｍｍ／２２ｍｍカラムで、流速５ｍｌ／分および注入１０ｍｌを用いて分別した。先の分画を１５〜１７分で回収し、後の分画を１７〜１９分で回収した。分画１５〜１７：ＭＷ１３８，０００（ＰＤＩ１．１）、分画１７〜１９：ＭＷ６４，０００（ＰＤＩ１．２）。
【０２６３】
ＭＡＬＳ分析
約１０ｍｇのポリマーを０．５ｍｌの８９．８％ジクロロメタン、１０％テトラヒドロフラン、０．２％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散度（ＰＤＩ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに接続したＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用い、Ｊｏｒｄｉ  ５μ  ７．８×３００  Ｍｉｘｅｄ  Ｂｅｄ  ＬＳ  ＤＶＢカラムを用いて測定した。粗製ポリマー：ＭＷ：５５，０００（ＰＤＩ２．１）、分画１５〜１７：ＭＷ１３８，０００（ＰＤＩ：１．１）、分画１７〜１９：ＭＷ６４，０００（ＰＤＩ１．２）
【０２６４】
精製したＢＯＣ保護ポリマーを酢酸中２Ｍ  ＨＣｌ（７ｍｌ）と０．５時間反応させてＢＯＣ保護基を除去し、アミンを生じさせた。ｄＨ２Ｏ１５ｍｌを反応物に加え、この溶液を３５００ＭＷカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で２４時間、次いでｄＨ２Ｏで１８時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ポリマー溶液を２〜８℃で保存した。
【０２６５】
Ｈ．ポリマーＤＷ１３６０
アミン／ブチル／オクタデシルポリ（ビニルエーテル）ターポリマーを、２−ビニルオキシエチルフタルイミド（５ｇ、２３．０２ｍｍｏｌ）、ブチルビニルエーテル（０．６６５ｇ、６．５８ｍｍｏｌ）およびオクタデシルビニルエーテル（０．４８８ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）のモノマーから合成した。２−ビニルオキシエチルフタルイミドを、電磁攪拌棒を入れ、オーブンで乾燥した２００ｍｌの丸底フラスコの無水ジクロロメタン３６ｍｌ中にアルゴン雰囲気下で加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびｎ−オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温（ＲＴ）で完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、この澄明溶液を含む反応容器を、ＡＣＳ等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの１：１溶液にドライアイスを添加することにより作製した−５０℃の浴中に置き、フタルイミドモノマーの視認可能な沈殿を生成させた。約１．５分間の冷却後、ＢＦ３・（ＯＣＨ２ＣＨ３）２（０．０５８ｇ、０．４１１ｍｍｏｌ）を加えて重合反応を開始した。重合が開始すると、フタルイミドモノマーが溶解した。反応を−５０℃で３時間進行させた。５ｍｌのメタノール中１％水酸化アンモニウムを添加することにより重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。
【０２６６】
その後、ポリマーを３０ｍｌの１，４−ジオキサン／メタノール（２／１）に溶解した。この溶液にヒドラジン（０．１４７ｇ、４６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間加熱還流させた。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、その後、得られた固体を２０ｍｌの０．５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌに加え、１５分間還流させ、２０ｍｌの蒸留水で希釈し、さらに１時間還流させた。次いで、この溶液をＮａＯＨで中和し、室温まで冷却し、３，５００分子量のセルロースチューブに移し、蒸留水で２４時間透析し（２×２０Ｌ）、凍結乾燥させた。
【０２６７】
Ｉ．ポリマーＥｍｉ  １０３４−６８Ｃ
モノマーのモル供給比は、５２．５  ＢＡＥＡＡ：４７．５  プロピルアクリラート（ＣＡＳ：９２５−６０−０）およびＣＴＡ（ＣＰＣＰＡ）の反応開始剤（ＡＩＢＮ）に対する比は、６．６６：１であった。ＢＡＥＡＡ（２．６８５１ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ）、プロピルアクリラート（１．０７４２ｇ、９．４１ｍｍｏｌ）、ＣＰＣＰＡ（０．０１０５ｇ、０．０３７５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（０．０００９２４ｇ、０．００５６３ｍｍｏｌ）および酢酸ブチル（１５．９ｍｌ）を攪拌子を入れた４０ｍｌのガラスバイアルに加えた。セプタムキャップ付きの長い皮下注射針を用いて、溶液を窒素で１時間バブリングした。針を外し、油浴を用いて溶液を８０℃で１６時間加熱した。各溶液を室温まで冷却した。粗製ポリマーをヘキサン（約８倍量）を用いて沈殿させ、遠心分離にかけた。溶媒をデカントし、ポリマーをヘキサンですすぎ、ＤＣＭ中に溶解した。溶解したポリマーをヘキサン（約８倍量）で再度沈殿させた。遠心分離後、溶媒をデカントし、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：５９，６４０（ＰＤＩ１．３２８）、Ｈ１ＮＭＲを用いて取得したポリマー組成：５５．４：４４．６  アミン：アルキル。
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【０２６８】
分別沈殿
５０ｍｌの遠心チューブ中で、６０％ヘプタン／４０％ジオキサンに、試料を溶媒１ｍｌ当たり試料２５ｍｇで超音波処理を用いて溶解した。試料を１０秒間ボルテックス処理し、４時間静置した。上部から溶媒をピペットで除き、沈殿したポリマーをヘキサンで２回すすいだ。試料を高真空を用いて乾燥させた。
【０２６９】
ＭＡＬＳ分析
少量のポリマーを１０ｍｇ／ｍｌで、７５％ＤＣＭ、２０％ＴＨＦおよび５％ＡＣＮに溶解した。分子量および多分散度（ＰＤＩ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに接続したＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用い、Ｐｈｅｎｏｇｅｌ  ５μ  Ｌｉｎｅａｒ（２）７．８×３００カラムを用いて測定した。粗製ポリマー：ＭＷ：５９，６４０（ＰＤＩ１．３２８）、分画１：ＭＷ８０，５４０（ＰＤＩ：１．１２０）。
【０２７０】
Ｂｏｃ脱保護
精製したＢＯＣ保護ポリマーを酢酸中２Ｍ  ＨＣｌ（７ｍｌ）と０．５時間反応させてＢＯＣ保護基を除去し、アミンを生じさせた。ｄＨ２Ｏ１５ｍｌを反応物に加え、この溶液を３５００ＭＷカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で２４時間、次いでｄＨ２Ｏで１８時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ポリマー溶液を２〜８℃で保存した。
【０２７１】
Ｊ．ポリマーＥｍｉ１０３４−８１Ｆ
モノマーのモル供給比は、６５  ＢＡＥＡＡ：３５  ブチルアクリラート（ＣＡＳ：１４１−３２−２）およびＣＴＡ（ＣＰＣＰＡ）の反応開始剤（ＡＩＢＮ）に対する比は、６．６６：１であった。ＢＡＥＡＡ（０．９８７６ｇ、３．８０９ｍｍｏｌ）、ブチルアクリラート（０．２６０７ｇ、２．０３４ｍｍｏｌ）、ＣＰＣＰＡ（０．００３５ｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（０．０００３０８ｇ、０．００１８８ｍｍｏｌ）および酢酸ブチル（５．３ｍｌ）を攪拌子を入れた２０ｍｌのガラスバイアルに加えた。セプタムキャップ付きの長い皮下注射針を用いて、溶液を窒素で１時間バブリングした。針を外し、油浴を用いて溶液を８０℃で１６時間加熱した。各溶液を室温まで冷却した。粗製ポリマーをヘキサン（約８倍量）を用いて沈殿させ、遠心分離にかけた。溶媒をデカントし、ポリマーをヘキサンですすぎ、ＤＣＭ中に溶解した。溶解したポリマーをヘキサン（約８倍量）で再度沈殿させた。遠心分離後、溶媒をデカントし、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：６３，２６０（ＰＤＩ１．３１８）、Ｈ１ＮＭＲを用いて取得したポリマー組成：６８．７：３１．３  アミン：アルキル。
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【０２７２】
分別沈殿
５０ｍｌの遠心チューブ中で、６０％ヘプタン／４０％ジオキサンに、試料を溶媒１ｍｌ当たり試料２５ｍｇで超音波処理を用いて溶解した。試料を１０秒間ボルテックス処理し、４時間静置した。上部から溶媒をピペットで除き、沈殿したポリマーをヘキサンで２回すすいだ。試料を高真空を用いて乾燥させた。
【０２７３】
ＭＡＬＳ分析
少量のポリマーを１０ｍｇ／ｍｌで、７５％ＤＣＭ、２０％ＴＨＦおよび５％ＡＣＮに溶解した。分子量および多分散度（ＰＤＩ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに接続したＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用い、Ｐｈｅｎｏｇｅｌ  ５μ  Ｌｉｎｅａｒ（２）７．８×３００カラムを用いて測定した。粗製ポリマー：ＭＷ：６３，２６０（ＰＤＩ１．３１８）、分画１：ＭＷ６５，９９０（ＰＤＩ：１．２４６）。
【０２７４】
Ｂｏｃ脱保護
精製したＢＯＣ保護ポリマーを酢酸中２Ｍ  ＨＣｌ（７ｍｌ）と０．５時間反応させてＢＯＣ保護基を除去し、アミンを生じさせた。ｄＨ２Ｏ１５ｍｌを反応物に加え、この溶液を３５００ＭＷカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で２４時間、次いでｄＨ２Ｏで１８時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、ＤＩ  Ｈ２Ｏに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ポリマー溶液を２〜８℃で保存した。
【０２７５】
Ｋ．ポリマーＬＨ１０７３−２０Ｃ−１：モノマー供給比は、５５  ＢＡＰＶＥ（Ｂｏｃ−アミノプロピルビニルエステル）：４５  酪酸ビニル（ＣＡＳ：１２３−２０−６）および連鎖移動剤（ＭＤＰＤ）の反応開始剤（ＡＩＢＮ）に対する比は、１０：１であった。ＢＡＰＶＥ（０．８ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）、ＭＤＰＤ（９．２６ｍｇ、０．０２２９ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（０．２１ｍｇ、０．００２２９ｍｍｏｌ）および酢酸ブチル（０．５ｍｌ）を攪拌子を入れた２０ｍｌのガラスバイアルに加えた。この溶液を、セプタムキャップ付きの長い皮下注射針を用いて、窒素で１時間バブリングした。個別のバイアルの過剰酪酸ビニルを同様に脱気した。針／窒素を取り除き、酪酸ビニル（０．３５ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）をハミルトンシリンジを用いて反応溶液に加えた。溶液を８０℃で４時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。得られた粘稠な溶液をＤＣＭ５ｍｌに溶解し、ポリマーをヘキサン４０ｍｌの添加により沈殿させた。遠心分離後、上部の溶媒をデカントし、ポリマーを５ｍｌのヘキサンですすいだ。すすいだポリマーをＤＣＭ５ｍｌに再度溶解し、ヘキサン４０ｍｌでもう一度沈殿させ、遠心分離し、上部の溶媒をデカントした。次いで、ポリマーを高真空下で乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：４２，２３０（ＰＤＩ１．２０５）、Ｈ１ＮＭＲを用いて取得したポリマー組成：５７．５：４２．５  アミン：アルキル。
【０２７６】
分別沈殿：５０ｍｌの遠心チューブ中で、ポリマーをＤＣＭ１０ｍｌに溶解し、十分なヘキサンを加えて、溶液が曇点を超えるようにした（約３０ｍｌ）。曇った混合物を遠心分離にかけると、２つの液体層を形成した。より粘稠な下層を取り出し、ＤＣＭ５ｍｌで希釈し、４０ｍｌのヘキサンで完全に沈殿させ、分画１を得た。この分画を遠心分離した後、溶媒をデカントし、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ＭＡＬＳにより得た分子量：６１，３５０（ＰＤＩ１．２０５）。
【０２７７】
ＭＡＬＳ分析：少量のポリマーを１０ｍｇ／ｍｌになるように、７５％ＤＣＭ、２０％ＴＨＦおよび５％ＡＣＮに溶解した。分子量および多分散度（ＰＤＩ）を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに接続したＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用い、Ｐｈｅｎｏｇｅｌ  ５ｕ  Ｌｉｎｅａｒ（２）７．８×３００カラムで測定した。分子量は上記を参照されたい。
【０２７８】
Ｂｏｃ脱保護：分画したＢＯＣ保護ポリマーを酢酸中２Ｎ  ＨＣｌ（５ｍｌ）と反応させ、１時間撹拌してＢＯＣ基を除去し、アミンを生じさせた。溶液を水（３０ｍｌ）で希釈し、ＮａＣｌ水溶液と、次いで脱イオン水で２日かけて透析した（３５００ＭＷＣＯセルロースチューブ）。内容物を凍結乾燥し、次いで、ＤＩ水に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ポリマーを２〜８℃で保存した。
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【０２７９】
Ｌ．メリチン
すべてのメリチンペプチドは、当該技術分野において標準的なペプチド合成技術を用いて作製した。好適なメリチンペプチドは、全Ｌ型アミノ酸、全Ｄ型アミノ酸（インベルソ）であり得る。Ｌ型またはＤ型とは別に、メリチンペプチド配列は逆であってよい（レトロ）。
【０２８０】
実施例２５  アジド−ＰＥＧ−アミンによるポリマー末端修飾
セプタムキャップおよび撹拌子を備えた４０ｍｌのシンチレーションバイアル中で、ポリマー（Ｅｍｉ  １０３４−６８Ｃ等級、１ｇ、０．０１４３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ）２０ｍｌに溶解した。ペンタフルオロフェノール（Ｓｉｇｍａ、２６．３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ、２９．５ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに加えた。脱気用のＮ２ガスラインおよび針を用いて、Ｎ２で系を約１０分間パージした。反応物を室温で終夜撹拌した。追加のペンタフルオロフェノール（Ｓｉｇｍａ、２６．３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ、２９．５ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、系をＮ２ガスでパージし、反応物を室温で３時間撹拌した。ポリマーをヘキサン（約１０倍量、Ｓｉｇｍａ）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを微量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（約１０倍量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを微量の酢酸エチル（Ｓｉｇｍａ）に溶解し、ヘキサン（約１０倍量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が一定の重量に達するまで高真空下で乾燥させた。
【０２８１】
セプタムキャップおよび撹拌子を備えた４０ｍｌのシンチレーションバイアル中で、先の工程のポリマー（Ｅｍｉ  １０３４−６８Ｃ等級、１ｇ、０．０１４３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン２０ｍｌに溶解した。アジドＰＥＧ４アミン（ＰｕｒｅＰｅｇ、３７．５ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｓｉｇｍａ、２０．３ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）を撹拌しながらフラスコに加えた。系をＮ２ガスで約１０分間パージし、反応物を室温で終夜撹拌した。追加のアジドＰＥＧ４アミン（ＰｕｒｅＰｅｇ、３７．５ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｓｉｇｍａ、２０．３ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、系をＮ２ガスでパージし、反応物を室温で３時間撹拌した。ポリマーをヘキサン（約１０倍量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを微量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（約１０倍量）で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が一定の重量に達するまで高真空下で乾燥させた（図１２）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006433001.tif 000131
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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