(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号42、配列番号34、配列番号38、配列番号32、または配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項４】
ポリペプチドが配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項５】
ポリペプチドが配列番号32に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項６】
ポリペプチドが配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項７】
ポリペプチドがＮ−グリコシル化される、請求項1〜6のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項８】
ポリペプチドが、Ｆｃ融合またはアルブミン融合を含み、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、該ポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項1〜7のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項９】
アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミン変異体、またはヒト血清アルブミン断片である、請求項8記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項１０】
アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン変異体、またはウシ血清アルブミン断片である、請求項8記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項１１】
アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン変異体、またはカニクイザル血清アルブミン断片である、請求項8記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項１２】
アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端にコンジュゲートされている、請求項9〜11のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか１項記載のポリペプチドを含む、ＧＤＦ１５変異タンパク質ホモ２量体。
【請求項１４】
配列番号42、配列番号34、配列番号38、配列番号32、または配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、任意で該ポリペプチドをコードする該核酸分子のインビトロ、細胞内、またはインビボでの発現を付与する発現制御エレメントに機能的に連結されている、核酸分子。
【請求項１５】
請求項14記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項1〜13のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質を発現する、形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項1〜12のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質または請求項13記載のＧＤＦ１５変異タンパク質ホモ２量体と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項17記載の薬学的組成物を含む、減菌容器。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質または請求項13記載のＧＤＦ１５変異タンパク質ホモ２量体を含む、哺乳類の対象における肥満を処置するための薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項1〜12のいずれか１項記載のＧＤＦ１５変異タンパク質または請求項13記載のＧＤＦ１５変異タンパク質ホモ２量体を含む、哺乳類の対象における高血糖を処置するための薬学的組成物。
【請求項２１】
対象がヒトである、請求項19または20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
処置が対象における体重の減少を含む、請求項19〜21のいずれか１項記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
処置が対象による食物摂取量の減少を含む、請求項19〜22のいずれか１項記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
処置が対象における血中グルコースの減少を含む、請求項19〜23のいずれか１項記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月３０日に出願された米国仮出願第６１／７５８，４５６号、及び２０１３年９月２５日に出願された米国仮出願第６１／８８２，５４２号の恩典を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特に、肥満、糖尿病、及び他の代謝関連障害の処置に有用である増殖分化因子の変異タンパク質及びその修飾に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
肥満は、最も一般的には、限られたエネルギー消費及び／または身体運動の欠如に加えて過剰な食物摂取に起因する。肥満は、真性糖尿病、高血圧、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、睡眠時無呼吸、痛風、リウマチ、及び関節炎などの様々な疾患を発症する可能性を増加させる。さらに、例えば、４０を超える肥満度指数は平均して推定寿命を１０年超減少させるため、死亡のリスクは肥満と直接相関する。
【０００４】
現在の薬理学的処置モダリティは、受容体クラス（例えば、ＣＢ１、５−ＨＴ２Ｃ、及びＮＰＹ）を標的とする食欲抑制剤、視床下部及びグレリンの分子作用における食欲回路の制御因子、ならびにリパーゼを標的とする栄養吸収阻害剤を含む。残念ながら、現在のモダリティのいずれも、いくつかは非常に重篤であり得る有害な作用をもたらすことなく肥満を効果的に処置することは示されていない。
【０００５】
高血中グルコースレベルは、膵β細胞によるインスリンの分泌を刺激する。インスリンは同時に、グルコースの筋肉及び脂肪細胞への侵入を刺激し、グリコーゲン及びトリグリセリドの貯蔵及びタンパク質の合成をもたらす。様々な細胞型におけるインスリン受容体の活性化は、グルコースの取り込み及び利用を増加させることにより、及び肝グルコース排出を減少させることにより、循環グルコースレベルを減少させる。この制御ネットワーク内の崩壊は、糖尿病及び関連する病的症候群（その影響を受けるのは人口の大部分であり、その割合は増加している）をもたらし得る。
【０００６】
グルコース代謝障害を有する患者は、高血糖、高インスリン血症、及び／またはグルコース不耐性に罹患する可能性がある。異常なグルコース及び／またはインスリンのレベルに関連することが多い障害の例は、肝臓、脂肪、及び筋肉の細胞が正常な血中インスリンレベルに応答するそれらの能力を失うインスリン抵抗性である。
【０００７】
現在の処置選択肢の欠点に加えて、肥満、糖尿病、ならびに関連する代謝及び非代謝障害の有病率及び重症度を考慮すると、例えば、食欲、グルコース、及び／またはインスリンレベルを調節し、患者における変動するグルコースレベルに対する生物学的応答を増強する代替の処置モダリティは依然として関心の対象である。
【０００８】
加えて、薬科学の分野において、関心の処置モダリティ（例えば、タンパク質、ペプチド、もしくは疎水性分子）のより多くの物理的性質のうちの１つ、及び／またはそれが投与される様式を改善することがしばしば有益であり、時折必須である。物理的性質の改善は、例えば、水溶性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び／もしくは薬効半減期（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させる；免疫原性及び／もしくは生物学的活性を調節する；ならびに／または循環時間を延長する方法を含む。そのような改善は、処置モダリティの生物活性に悪影響を及ぼすことなく与えられなければならない。このため、肥満、糖尿病、ならびに関連する代謝及び非代謝障害のための現在の処置選択肢に対する代替が、１つまたは複数の改善された物理的性質を有することが有利であり得る。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本開示は、様々な疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状を処置する、及び／または予防するための、本明細書に記載される薬剤及びその組成物の使用を想定する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状は、グルコース代謝障害及び他の代謝関連障害に関し、一方、他の実施形態では、それらは体重障害に関する。例として、薬剤及びその組成物は、真性糖尿病（例えば、２型糖尿病）、インスリン抵抗性、ならびにインスリン抵抗性を特徴とする疾患、障害、及び状態、インスリン産生の減少、高血糖、低インスリン血症、ならびに代謝症候群の処置及び／または予防に使用され得るが、これらに限定されない。薬剤及びその組成物は、例えば、食欲抑制をもたらすことにより、肥満及び他の体重障害の処置及び／または予防にも使用され得る。
【００１０】
ある実施形態では、薬剤は、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）関連ポリペプチド、ならびにそのホモログ、変異体（例えば、変異タンパク質）、断片、及び他の修飾形態である。特定の実施形態では、本開示により想定される薬剤は、修飾されたヒトＧＤＦ１５分子であり、一方、他の実施形態では、薬剤は、修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質である。本開示は、前述のものをコードする核酸分子も想定する。便宜上、以降で説明される修飾されたヒトＧＤＦ１５分子及び修飾されたＧＤＦ１５変異体（例えば、変異タンパク質）は、まとめて「ポリペプチド」と称される。本開示のポリペプチド及び核酸分子に関連する「ヒト」へのいかなる言及も、ポリペプチドまたは核酸が得られる様式または供給源に関して限定されるものではなく、むしろそれは天然のヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応する場合があるため、配列に関してのみであることを留意するべきである。ヒトのポリペプチド及びそれらをコードする核酸分子に加えて、本開示は他の種からのＧＤＦ１５関連ポリペプチド及び対応する核酸分子を想定する。
【００１１】
本開示は、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる他のＧＤＦ１５関連薬剤、及び／またはポリペプチドの活性を増強することができる薬剤も想定する。
【００１２】
本開示のいくつかの実施形態では、１つもしくは複数のポリペプチドにより処置可能な疾患もしくは障害を有する、またはそれを有するリスクがある対象は、疾患または障害を処置するために効果的な量で投与を受ける。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インスリン血症、グルコース不耐性、または代謝症候群である。他の実施形態では、疾患または障害は体重障害（例えば、肥満）であり、一方、また他の実施形態では、ポリペプチドは、少なくともある程度、食欲抑制をもたらす。
【００１３】
本開示の他の態様は、細胞系発現系、ベクター、操作された細胞系統、ならびに前述のものに関連する方法及び使用を含む。
【００１４】
以後詳細に記載されるように、本開示の一実施形態は、
ａ）図１Ｂ（配列番号３）に示される配列に対して少なくとも１つの修飾を含むポリペプチドであって、修飾が、該ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない、ポリペプチド、または
ｂ）図１Ｂ（配列番号３）に示される配列の変異タンパク質ポリペプチドであって、該変異タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない少なくとも１つの修飾を含む、変異タンパク質ポリペプチド
を含む、ポリペプチドに関し、ａ）及びｂ）に記載される修飾は、ポリペプチドまたは変異タンパク質ポリペプチドの少なくとも１つの物理的性質を改善する。
【００１５】
本開示のある実施形態において、ポリペプチドは、例えば、図３、５、６、及び１３に示される配列のうちのいずれか１つの変異タンパク質ポリペプチドを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約１０個のアミノ酸〜約１１３個のアミノ酸の長さを有する。他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、１００個より少ないアミノ酸残基、７５個より少ないアミノ酸残基、５０個より少ないアミノ酸残基、２５個より少ないアミノ酸残基、または２０個より少ないアミノ酸残基を有し得る。
【００１７】
またさらなる実施形態では、本開示のポリペプチドは、図１Ｂ（配列番号３）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％のアミノ酸同一性、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、少なくとも９３％のアミノ酸同一性、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、少なくとも９７％のアミノ酸同一性、少なくとも９８％のアミノ酸同一性、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本開示によると、ポリペプチドは、組換えにより産生され得る。
【００１９】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する修飾は、ペグ化、グリコシル化、ポリシアル酸化、ＨＥＳ化、アルブミン融合、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合、Ｆｃ融合、またはＰＥＧ模倣体との融合を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、ポリペプチドに対する修飾は、グリコシル化を含み、それらの実施形態のうちの一部では、グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化である。Ｎ−グリコシル化は、ポリペプチドの２つ以上のアミノ酸残基で生じ得る。
【００２１】
他の実施形態では、ポリペプチドに対する修飾は、アルブミン融合を含み、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ポリペプチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト血清アルブミン変異体、またはヒト血清アルブミン断片であり、一方、他の実施形態では、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン変異体、またはウシ血清アルブミン断片である。
【００２２】
完全長ＨＳＡは、１８個のアミノ酸
0006272907.tif 000002
のシグナルペプチド、続いて、６個のアミノ酸（ＲＧＶＦＲＲ；配列番号１６５）のプロドメインを有し、この２４個のアミノ酸残基ペプチドは、プレ−プロドメインと称され得る。成熟ＨＳＡポリペプチドは、図１Ｃ（配列番号５）に示される配列の残基Ｄ２５〜Ｌ６０９にまたがる。本明細書において提示される実験データを生成するために使用される構築物において、内因性シグナルペプチドをヒトＩｇＫシグナルペプチドで置換し、内因性プロドメインは完全に除外した。
【００２３】
またさらなる実施形態では、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端とアミノ末端の両方、または内部にコンジュゲートされている。特定の実施形態は、ポリペプチドのアミノ末端へのアルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片のコンジュゲーションを伴う。
【００２４】
特定の実施形態では、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、３０８アミノ酸ＧＤＦ１５前駆体ポリペプチドの１６７アミノ酸プロドメイン及び１１２アミノ酸成熟ドメインを含むポリペプチドにコンジュゲートされ、このため、本開示は、図１Ａ（配列番号１）に示される配列の約アミノ酸残基３０〜約アミノ酸残基３０８の長さを有するＧＤＦ１５ポリペプチドを想定する。
【００２５】
本開示は、哺乳類組織培養からの分泌を付与するために適切な長さのシグナルペプチドを使用して、１６７アミノ酸プロドメインなしで、図１Ｂ（配列番号３）に示されるようなＧＤＦ１５の１１２アミノ酸成熟ドメインの直接発現及び産生を想定する。発現及び分泌を促進するために好適なシグナルペプチドの例としては、ＩｇＫが挙げられる。当該技術分野は、他の適切なシグナルペプチドを特定することができる機構を説明している［例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊａｎ．２０１３）"Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ．"，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９（１）：３４７−５６；Ｃｈｏｕ（２００１）"Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｂｓｉｔｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４（２）：７５−７９；Ｌｅｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｕｌｙ  ２００９）"Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１５５（７）：２３５７−８３；及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）"Ｓｉｇｎａｌ−３Ｌ：ａ  ３−ｌａｙｅｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３６３：２９７−３０３を参照されたい］。
【００２６】
本開示は、アルブミン融合分子を想定し、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ポリペプチドに、リンカーを介してコンジュゲートされている。好適なリンカーの例は、本明細書において記載される。例として、リンカーは、例えば、４〜６アミノ酸のペプチドリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、非切断性リンカー（例えば、３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー；配列番号６４）である。他の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーであり、さらなる実施形態では、切断可能なリンカーはプロテアーゼによって切断され得る（例えば、２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（
0006272907.tif 000003
（Ｘは、ＥまたはＤのいずれかであり得る）（配列番号２２１））。
【００２７】
特定の実施形態では、アルブミン融合分子のアルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、アルブミン融合分子が細胞から分泌される前に切断され、一方、他の実施形態では、アルブミン融合分子は、アルブミン融合分子が細胞から分泌された後に切断される。
【００２８】
本開示は、記載されるポリペプチドの物理的性質が、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期、薬効半減期、循環時間、及び免疫原性から成る群より選択される実施形態を包含する。特定の実施形態では、物理的性質は、溶解度である。
【００２９】
さらに、本開示は、前述のポリペプチドをコードする核酸分子を想定する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ポリペプチドをコードする核酸分子のインビトロ、細胞内、またはインビボでの発現を付与する発現制御エレメントに機能的に連結されている。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、ウイルスベクター）は核酸分子のうちの１つまたは複数を含有する。
【００３１】
いくつかの実施形態は、前述のポリペプチドのうちの１つまたは複数を発現する形質転換細胞または宿主細胞を含む。
【００３２】
本開示の特定の実施形態では、前述のポリペプチドのうちの１つまたは複数は、薬学的組成物を得るために製剤化され、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤も含む。ある実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤も含む。
【００３３】
本開示のまたさらなる実施形態は、前述の変異タンパク質ポリペプチドのうちの１つに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、別個のポリペプチドまたは単一のポリペプチドに存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。本開示の抗体は、ある実施形態では、約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性でポリペプチドに結合する。また他の実施形態では、抗体は、アイソフォームＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。追加の実施形態では、抗体は検出可能に標識され、一方、他の実施形態では、抗体はＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、またはＦａｂ'である。
【００３４】
本開示は、共有結合的に連結された非ポリペプチドポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマー）を含む抗体も想定する。他の実施形態では、抗体は、脂質部分、脂肪酸部分、多糖部分、及び炭水化物部分から選択される共有結合的に連結された部分を含む。
【００３５】
抗体は、いくつかの実施形態では、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体であり、ｓｃＦｖは、他の実施形態では、多量体化される。
【００３６】
本開示の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはヒト化抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００３７】
さらに、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と共に製剤化される、上述の抗体を含む薬学的組成物を想定する。そのような薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤も含有し得る。
【００３８】
本開示のある実施形態は、上述の薬学的組成物のうちの１つ、及び任意で１つまたは複数の追加の成分を含有する減菌容器を想定する。例として、減菌容器はシリンジであり得るが、これに限定されない。またさらなる実施形態では、減菌容器はキットの１成分であり、キットは、例えば、少なくとも１つの予防剤または治療剤を含有する第２の減菌容器も含有し得る。
【００３９】
本開示は、対象に治療有効量のポリペプチドを投与することにより、対象（例えば、ヒト）におけるグルコース代謝障害を処置または予防する方法も想定する。いくつかの方法では、処置または予防は、対象における血漿グルコースの減少、対象における血漿インスリンの減少、体重及び／もしくは食物摂取量における減少、または対象におけるグルコース耐性の増加をもたらす。特定の実施形態では、グルコース代謝障害は真性糖尿病である。いくつかの実施形態では、対象は肥満である、及び／または体重障害を有する。
【００４０】
任意の特定の投与経路または投薬レジメンに限定されないが、いくつかの実施形態では、投与は非経口（例えば、皮下）注射によるものである。
[本発明1001]
ａ）図1Ｂ（配列番号3）に示されるポリペプチドに対して少なくとも1つの修飾を含むポリペプチドであって、前記修飾が前記ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない、ポリペプチド、または
ｂ）図1Ｂ（配列番号3）に示される配列の変異タンパク質ポリペプチドであって、前記変異タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない少なくとも1つの修飾を含む、変異タンパク質ポリペプチド
を含み、
前記修飾が、前記ポリペプチドまたは前記変異タンパク質ポリペプチドの少なくとも1つの物理的性質を改善する、
ポリペプチド。
[本発明1002]
図3に示される配列のうちのいずれか1つの変異タンパク質ポリペプチドを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
図5に示される配列のうちのいずれか1つの変異タンパク質ポリペプチドを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
図6に示される配列のうちのいずれか1つの変異タンパク質ポリペプチドを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
図13に示される配列のうちのいずれか1つの変異タンパク質ポリペプチドを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1006]
前記変異タンパク質ポリペプチドが、図1Ｂ（配列番号3）に示される配列に対して少なくとも85％のアミノ酸同一性を有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1007]
前記変異タンパク質ポリペプチドが、図1Ｂ（配列番号3）に示される配列に対して少なくとも90％のアミノ酸同一性を有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1008]
前記変異タンパク質ポリペプチドが、図1Ｂ（配列番号3）に示される配列に対して少なくとも95％のアミノ酸同一性を有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1009]
約10個のアミノ酸〜約113個のアミノ酸の長さを有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1010]
図1Ｂ（配列番号3）に示されるポリペプチドに対してＮ末端が欠損している変異タンパク質ポリペプチドを含む、本発明1001〜1005のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
75個より少ないアミノ酸残基を有する、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
50個より少ないアミノ酸残基を有する、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
25個より少ないアミノ酸残基を有する、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
組換えにより産生された、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
前記修飾が、前記ポリペプチドのグリコシル化を含む、本発明1001〜1014のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
前記グリコシル化がＮ−グリコシル化である、本発明1015のポリペプチド。
[本発明1017]
前記Ｎ−グリコシル化が、前記ポリペプチドの2つ以上のアミノ酸残基に存在する、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1018]
前記修飾がアルブミン融合を含み、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、前記ポリペプチドにコンジュゲートされている、本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1019]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミン変異体、またはヒト血清アルブミン断片である、本発明1018のポリペプチド。
[本発明1020]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、ウシ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン変異体、またはウシ血清アルブミン断片である、本発明1018のポリペプチド。
[本発明1021]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン変異体、またはカニクイザル血清アルブミン断片である、本発明1018のポリペプチド。
[本発明1022]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、前記ポリペプチドのカルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端とアミノ末端の両方、または内部にコンジュゲートされている、本発明1018〜1020のいずれかのポリペプチド。
[本発明1023]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、前記ポリペプチドのアミノ末端にコンジュゲートされている、本発明1022のポリペプチド。
[本発明1024]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、前記ポリペプチドに、リンカーを介してコンジュゲートされている、本発明1018〜1023のいずれかのポリペプチド。
[本発明1025]
前記リンカーが、切断可能なリンカーである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1026]
前記切断可能なリンカーが、プロテアーゼによって切断され得る、本発明1025のポリペプチド。
[本発明1027]
前記リンカーが、非切断性リンカーである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1028]
前記アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片が、細胞から分泌される前にアルブミン融合物から切断される、本発明1018〜1026のいずれかのポリペプチド。
[本発明1029]
前記物理的性質が、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期、薬効半減期（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）、循環時間、及び免疫原性から成る群より選択される、本発明1001〜1028のいずれかのポリペプチド。
[本発明1030]
前記物理的性質が溶解度である、本発明1029のポリペプチド。
[本発明1031]
ｐＨ7．0のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において、少なくとも1ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する、本発明1030のポリペプチド。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1033]
前記ポリペプチドをコードする前記核酸分子のインビトロ、細胞内、またはインビボでの発現を付与する発現制御エレメントに機能的に連結されている、本発明1032の核酸分子。
[本発明1034]
本発明1032または本発明1033の核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1035]
ウイルスベクターを含む、本発明1034のベクター。
[本発明1036]
本発明1001〜1033のいずれかのポリペプチドを発現する、形質転換細胞または宿主細胞。
[本発明1037]
本発明1001〜1033のいずれかのポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
[本発明1038]
少なくとも1つの追加の予防剤または治療剤をさらに含む、本発明1037の薬学的組成物。
[本発明1039]
本発明1001〜1033のいずれかの変異タンパク質ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
[本発明1040]
本発明1037または本発明1038の薬学的組成物を含む、減菌容器。
[本発明1041]
シリンジである、本発明1040の減菌容器。
[本発明1042]
本発明1041の減菌容器を含む、キット。
[本発明1043]
少なくとも1つの追加の予防剤または治療剤を含む第2の減菌容器をさらに含む、本発明1042のキット。
[本発明1044]
対象におけるグルコース代謝障害または体重障害を処置または予防する方法であって、前記対象に、本発明1001〜1031のいずれかのポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、方法。
[本発明1045]
前記処置または予防が、前記対象における血中グルコースの減少を含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記処置または予防が、前記対象における体重の減少を含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記処置または予防が、前記対象における食物摂取量の減少を含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記グルコース代謝障害が真性糖尿病である、本発明1044の方法。
[本発明1049]
前記対象がヒトである、本発明1044の方法。
[本発明1050]
前記対象が肥満である、本発明1044の方法。
[本発明1051]
前記投与が非経口注射によるものである、本発明1044の方法。
[本発明1052]
前記非経口注射が皮下である、本発明1051の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】ヒトＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列、及びヒトＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列をコードする対応する核酸を示す。
【図１Ｂ】成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列、及び成熟ヒトＧＤＦ１５をコードする対応する核酸配列を示す。
【図１Ｃ】内因性シグナルペプチド及びプロドメインならびに成熟ヒト血清アルブミン（Ｄ２５〜Ｌ６０９）を含むヒト血清アルブミン前駆体配列、ならびに対応する核酸配列；ならびにＩｇＫシグナルペプチド及び成熟ヒト血清アルブミン（Ｄ２５〜Ｌ６０９）を含むヒト血清アルブミン前駆体配列、及び対応する核酸配列を示す。
【図１Ｄ】成熟ヒト血清アルブミンアミノ酸配列（ＩｇＫシグナルペプチドを欠く図１Ｃのアミノ酸配列のサブ配列、及び対応する核酸配列）を示す。
【図１Ｅ】ＩｇＫシグナル配列を有するヒト血清アルブミンアミノ酸配列が、プロテアーゼ感受性２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子、及び融合分子をコードする対応する核酸を示す。
【図１Ｆ】成熟ヒト血清アルブミンアミノ酸配列が、プロテアーゼ感受性２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子、及び融合分子をコードする対応する核酸を示す。
【図１Ｇ】ＩｇＫシグナル配列を有するヒト血清アルブミンアミノ酸配列が、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子、及び融合分子をコードする対応する核酸を示す。
【図１Ｈ】成熟ヒト血清アルブミンアミノ酸配列が、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子、及び融合分子をコードする対応する核酸を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、示される濃度（ＰＢＳ（ビヒクル）、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、及び１．２ｍｇ／ｋｇ）における単回皮下用量としての図１Ｈに示される融合分子の投与後の、ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重（図２Ａ）、食物摂取量（ｆｏｏｄ  ｔａｋｅ）（図２Ｂ）、及び血中グルコース（図２Ｃ）に対する効果を示す。図で述べられるように、示されるパラメータは、２２日間にわたり様々な日に判定された。マウスの各群において、ｎ＝７及びｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）は、各指定される時点において、ビヒクル対照群に対して、様々な濃度で、体重、食物摂取量、及び血中グルコース群を比較する、スチューデントの対応のないＴ検定によって判定した。
【図３】成熟ヒトＧＤＦ１５内の予測される溶媒アクセス可能疎水性残基の突然変異誘発によって生成されるＧＤＦ１５変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。各ＧＤＦ１５変異タンパク質配列が、図１Ｈに示されるリンカー（非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー；（配列番号６４））を介してＨＳＡに融合された、融合分子を生成した；図３に記載される配列は、融合分子のＨＳＡ成分もリンカー成分も示していない。
【図４】図３に記載される各ＧＤＦ１５変異タンパク質が、ジスルフィド連結ホモ２量体として分泌されるかどうかを要約する表である。
【図５】ＧＤＦ１５に対する、物理的性質のそれらの改善の評価のための、アラニン置換を有するＧＤＦ１５変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６】ＧＤＦ１５に対する、改善された物理的性質の評価のための、Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス部位（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の導入のための単一点グリコシル化変異タンパク質及び追加のジグリコシル化変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。各ＧＤＦ１５変異タンパク質配列が、図１Ｅに示されるリンカー（因子Ｘａ切断可能リンカー）を介してＨＳＡに融合された、融合分子を生成した；図６に記載される配列は、融合分子のＨＳＡ成分もリンカー成分も示していない。
【図７】図６に記載される操作された各Ｎ−グリコシル化ヒトＧＤＦ１５変異タンパク質について、Ｎ−グリカン部位占有とともに、分泌及び２量体形成データの要約を提供する。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、発現及び精製後の、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して改善された物理的性質を有する、操作されたヒトＧＤＦ１５変異タンパク質を記載する。
【図９Ａ】０．３ｍｇ／ｋｇの成熟ヒトＧＤＦ１５、Ｎ−グリコシル化ヒトＧＤＦ１５変異タンパク質、及びビヒクル（ＰＢＳ）対照の単回皮下急性投与後の、ｏｂ／ｏｂマウスにおける終夜食物摂取量の減少に対する効果を示す。マウスの各群において、ｎ＝７及びｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）は、ビヒクル対照群に対して、ＧＤＦ１５変異タンパク質で処置したマウスの食物摂取量を比較する、スチューデントの対応のないＴ検定によって判定した。
【図９Ｂ】１．０ｍｇ／ｋｇの成熟ヒトＧＤＦ１５、Ｎ−グリコシル化ヒトＧＤＦ１５変異タンパク質、及びビヒクル（ＰＢＳ）対照の単回皮下急性投与後の、ＤＩＯマウスにおける終夜食物摂取量の減少に対する効果を示す。マウスの各群において、ｎ＝９及びｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）は、ビヒクル対照群に対して、ＧＤＦ１５変異タンパク質で処置したマウスの食物摂取量を比較する、スチューデントの対応のないＴ検定によって判定した。
【図１０】溶出時間を測定する分析ゲル濾過クロマトグラフィによって判定される際、ＧＤＦ１５  Ｎ−グリカン変異タンパク質の流体力学半径が、成熟ヒトＧＤＦ１５に対して増加することを示す。
【図１１Ａ】２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して成熟ＧＤＦ１５ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の種オルソログのＮ末端に融合された、ＩｇＫシグナル配列を有するＨＳＡを含む融合分子のアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｂ】２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して成熟ヒトＴＧＦ−β１及び成熟ヒトＢＭＰ２のＮ末端に融合された、ＩｇＫシグナル配列を有するＨＳＡを含む融合分子のアミノ酸配列を示す。
【図１２】切断可能なリンカーを介して成熟ＧＤＦ１５の種オルソログのＮ末端または成熟ヒトＴＧＦ−β１もしくはヒトＢＭＰ２のＮ末端のいずれかに融合されたＨＳＡを含む融合分子についての分泌及び２量体形成の要約を提供する。
【図１３】アラニンスキャンによって生成された成熟ヒトＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端に、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して融合された、ＩｇＫシグナル配列を有するＨＳＡを含む融合分子のアミノ酸配列（ｓｅｑｅｎｃｅ）を提供する。
【図１４】非切断性リンカーを介して成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端に融合されたＨＳＡアミノ酸配列を含む融合分子を使用したＧＤＦ１５のアラニンスキャンについての分泌及び２量体形成の要約を提供する。この要約は、ＧＤＦ１５の折り畳みまたは分泌パラメータに影響を及ぼさない突然変異誘発に利用可能な部位に関するテンプレートを提供する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｅは、様々なリンカーを介した成熟ＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端への融合を含む、溶解度が増強された半減期延長分子の多数の配列を提供する。図１５Ａ）：不定のリンカーを介して成熟ＧＤＦ１５のＮ末端に融合された、Ｆｃ（ＩｇＧ）、ＡＢＤ、及びＭＢＤに融合されたシグナル配列を含む融合分子の概略図；図１５Ｂ）：３×（Ｇｌｕ−３Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカーを含有するＦｃＧＤＦ１５；図１５Ｃ）：Ｆｃ（＋）−３×（Ｇｌｕ−３Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＧＤＦ１５及びｈＦｃ（−）を含有する、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５／Ｆｃ（−）荷電対；図１５Ｄ）：５×Ｇｌｙリンカー（ＡＢＤ−ＧＤＦ１５）を含有するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）；ならびに図１５Ｅ）：エンテロキナーゼで切断可能な５×Ｇｌｙリンカーを含有するマルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）（ＭＢＤ−ＧＤＦ１５）。
【図１６】（Ａ）成熟ＧＤＦ１５に対する、図１５に記載されるそれぞれの融合構築物の各々のＰＢＳ緩衝剤における溶解度の改善；及び（Ｂ）成熟ＧＤＦ１５とのアルブミン結合ドメイン融合物（ＡＢＤ−ＧＤＦ１５）３ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射後のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける体重の減少の要約を提供する。
【図１７Ａ】組換えカモノハシ（Ｏａ）成熟ＧＤＦ１５を生成するために利用されるアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｂ】成熟ＯａＧＤＦ１５の０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与後の、ＤＩＯマウス（ｎ＝８）における終夜食物摂取量及び体重減少に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本開示の方法及び組成物をさらに説明する前に、本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されないことが理解され、また本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図していないことも理解される。
【００４３】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値及び下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００４４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。このため、例えば、「そのヒトポリペプチド」への言及は、１つまたは複数のヒトポリペプチドへの言及を含むなどである。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」限定の使用のための先行詞となるよう意図される。
【００４５】
本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明という理由でそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００４６】
概要
本開示は、様々な疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状を処置する、及び／または予防するための、本明細書に記載される薬剤及びその組成物の使用を想定する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び状態、ならびに／またはそれらの症状は、グルコース代謝障害に関連し、一方、他の実施形態では、それらは体重障害に関連する。例として、薬剤及びその組成物は、２型糖尿病、インスリン抵抗性、ならびにインスリン抵抗性を特徴とする疾患、障害、及び状態、インスリン産生の減少、高血糖、代謝症候群、または肥満の処置及び／または予防に使用され得るが、これらに限定されない。
【００４７】
特定の実施形態では、本開示により想定される薬剤は、修飾されたヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）であり、一方、他の実施形態では、薬剤は、修飾されたＧＤＦ１５変異体（例えば、変異タンパク質）である。修飾されたヒトＧＤＦ１５及び修飾されたＧＤＦ１５変異体（例えば、変異タンパク質）は、それらがＧＤＦ１５受容体に結合する能力を有し、例えば、体重の減少及び／または本明細書に記載される他の生理学的作用をもたらすシグナル伝達経路を開始するように、ヒトＧＤＦ１５に対して十分な相同性を有する。本開示は、前述のものをコードする核酸分子も想定する。上に示されるように、これ以降記載される修飾されたヒトＧＤＦ１５分子及び修飾されたＧＤＦ１５変異体は、まとめて「ポリペプチド」と称される。
【００４８】
修飾され得る様々なＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＧＤＦ１５アミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換される。他の実施形態では、１つまたは複数のＧＤＦ１５ネイティブリジン残基は、別のアミノ酸で置換される（しかしながら、Ｋ６２Ｑを含む変更は、不活性である）。本開示のいくつかの実施形態では、アラニンスキャニングは、ＧＤＦ１５変異タンパク質を生成するために使用され得、次いで、それらの変異タンパク質への修飾が、変異タンパク質自体の１つまたは複数の望ましい性質を増強するその能力に関して評価され得る。修飾されたＧＤＦ１５分子及び修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。
【００４９】
本開示は、ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質への修飾を想定し、例えば、ペグ化、グリコシル化、及びアルブミンコンジュゲートを含む。特定の実施形態では、戦略は、ペグ化が特定のリジン残基でのみもたらされる（すなわち、部位特異的ペグ化）ように採用される。他の実施形態では、アルブミン融合が生成され得、それにより、成熟アルブミン、またはその変更形態（例えば、断片）は、ＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質に、直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）コンジュゲートされる。上に示されるように、修飾は、例えば、ポリペプチドの血清半減期及び／または溶解度を改善し得る。特定の修飾されたＧＤＦ１５分子及び修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質の例は、以下に記載される。
【００５０】
定義
用語「患者」または「対象」は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、哺乳類）を指すように互換的に使用される。
【００５１】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、対象を苦しめる疾患、障害、もしくは状態の基礎原因のうちの少なくとも１つ、または対象を苦しめる疾患、障害、状態に関連する症状のうちの少なくとも１つを、一時的または永久的のいずれかで排除する、減少させる、抑制する、緩和する、または寛解させるために、疾患、障害、もしくは状態、またはその症状が診断された、観察された後等に開始される一連の行動（ポリペプチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物の投与など）を指す。よって、処置は、活動性疾患を（例えば、血流中のインスリン及び／もしくはグルコースのレベルを減少させるために、グルコースレベルの変動を最小にするようにグルコース耐性を増加させるために、ならびに／またはグルコース恒常性の崩壊により生じる疾患を防ぐために）阻害する（すなわち、疾患、障害、もしくは状態、またはそれに関連する臨床症状の発症もしくはさらなる進行を停止させる）ことを含む。
【００５２】
本明細書で使用される、用語「処置を必要とする」とは、対象が必要とする、もしくは処置から利益を得るという医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師のまたは介護者の専門知識の領域である様々な要因に基づき行われる。
【００５３】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」等とは、対象の疾患、障害、状態等の発症のリスク（例えば、臨床症状の不在により決定される）を、一時的または永久的のいずれかで予防する、抑制する、阻害する、もしくは減少させる、または一般的に特定の疾患、障害、または状態を有する傾向にある対象の状況においてその発現を遅延させるような様式で（例えば、疾患、障害、状態、またはその症状の発現前に）開始される一連の行動（ポリペプチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物の投与など）を指す。ある場合では、本用語は、疾患、障害、または状態の進行を遅くする、または有害な、もしくはさもなければ望ましくない状態へのその進行を阻害することも指す。
【００５４】
本明細書で使用される、用語「予防を必要とする」とは、対象が必要とする、もしくは予防的ケアから利益を得るという医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師のまたは介護者の専門知識の領域である様々な要因に基づき行われる。
【００５５】
句「治療有効量」とは、患者に投与されたとき、疾患、障害、または状態の任意の症状、態様、または特性に対して任意の検出可能な好ましい作用を有することができる量で、単独または薬学的組成物の一部のいずれかとして、及び単回用量または一連の用量の一部のいずれかとして、対象に薬剤を投与することを指す。治療有効量は、関連する生理学的作用を測定することにより確認することができる。例えば、高血糖状態の場合では、血中グルコースの低下もしくは減少、またはグルコース耐性試験における改善は、薬剤の量が高血糖状態を処置するのに効果的であるかを決定するために使用され得る。例えば、治療有効量は、空腹時の血漿グルコース（ＦＰＧ）の任意のレベル（例えば、ベースラインレベル）を減少させる、または低減させるのに十分な量であり、例えば、その量は２００ｍｇ／ｄｌより大きいＦＰＧレベルを２００ｍｇ／ｄｌ未満に減少させるのに十分である、その量は、１７５ｍｇ／ｄｌ〜２００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分である、その量は、１５０ｍｇ／ｄｌ〜１７５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分である、その量は、１２５ｍｇ／ｄｌ〜１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを開始レベル未満に減少させるのに十分であるなど（例えば、ＦＰＧレベルを１２５ｍｇ／ｄｌ未満、１２０ｍｇ／ｄｌ未満、１１５ｍｇ／ｄｌ未満、１１０ｍｇ／ｄｌ未満等に減少させるなど）である。ＨｂＡＩｃレベルの場合では、有効量は、レベルを約１０％〜９％超、約９％〜８％超、約８％〜７％超、約７％〜６％超、約６％〜５％超等減少させる、または低減させるのに十分な量である。より具体的には、ＨｂＡＩｃレベルを約０．１％、０．２５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上減少させる、または低減させることが、本開示により想定される。治療有効量は、投薬レジメン及び対象の状態の診断分析等に関連して調節され得る。
【００５６】
句「変化をもたらすのに十分な量」とは、前に測定された指標のレベル（例えば、ベースラインレベル）と特定の療法の施与後との間に検出可能な差があることを意味する。指標は、任意の客観的パラメータ（例えば、グルコースもしくはインスリンのレベル）、または主観的パラメータ（例えば、対象の満足感）を含む。
【００５７】
本明細書で使用される、句「グルコース耐性」とは、グルコース摂取が変動したとき、対象が血漿グルコース及び／または血漿インスリンのレベルを制御する能力を指す。例えば、グルコース耐性は、約１２０分以内に血漿グルコースのレベルを減少させ、グルコースの摂取前に測定されたレベルに戻す対象の能力を包含する。
【００５８】
概して、用語「糖尿病」及び「糖尿病性」とは、インスリンの不適切な産生または利用を伴い、しばしば高血糖及び糖尿を特徴とする炭水化物代謝の進行性疾患を指す。用語「糖尿病前症」及び「前糖尿病性」とは、対象が糖尿病において典型的に観察される特性、症状等を有しないが、処置せずに放置した場合、糖尿病に進行する可能性がある特性、症状等を有する状況を指す。これらの状態の存在は、例えば、空腹時の血漿グルコース（ＦＰＧ）試験または経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）のいずれかを用いて決定され得る。両方とも、対象が試験開始前少なくとも８時間絶食することが要求される。ＦＰＧ試験では、対象の血中グルコースは、絶食の終了後に測定される。一般的に、対象は一晩絶食し、血中グルコースは、対象が食事を取る前の朝に測定される。健康な対象は一般に、約９０〜約１００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」の対象は一般に、約１００〜約１２５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病」の対象は一般に、約１２６ｍｇ／ｄｌを上回るＦＰＧレベルを有する。ＯＧＴＴでは、対象の血中グルコースは、絶食後、及びグルコースが豊富な飲料を飲んだ２時間後に測定される。グルコースが豊富な飲料を摂取した２時間後、健康な対象は一般に、約１４０ｍｇ／ｄｌを下回る血中グルコース濃度を有し、前糖尿病性対象は一般に、約１４０〜約１９９ｍｇ／ｄｌの血中グルコース濃度を有し、糖尿病性対象は一般に、約２００ｍｇ／ｄｌ以上の血中グルコース濃度を有する。前述の血糖値は、ヒト対象に関連するが、正常血糖、中程度の高血糖、及び明白な高血糖は、マウス対象においては尺度が異なっている。４時間の絶食後の健康なマウス対象は一般に、約１００〜約１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」のマウス対象は一般に、約１７５〜約２５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し「糖尿病」のマウス対象は一般に、約２５０ｍｇ／ｄｌを上回るＦＰＧ濃度を有する。
【００５９】
本明細書で使用される、用語「インスリン抵抗性」は、正常な量のインスリンが正常な生理学的または分子応答を生成することができない状態を指す。いくつかの場合では、内因的に生成されるか、または外因的に投与されるかのいずれかの過剰なインスリンの生理学的量は、全体的にまたは部分的にインスリン抵抗性を克服し、生物学的応答を生成することができる。
【００６０】
用語「代謝症候群」は、高インスリン血症、異常なグルコース耐性、肥満、腹部または上体区画への脂肪の再分布、高血圧、異常フィブリノゲン血症（ｄｙｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、ならびに高トリグリセリド、低値の高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、及び高値の小型高密度低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を特徴とする脂質異常症を含むが、これらに限定されない関連する一群の形質を指す。代謝症候群を有する対象は、２型糖尿病及び／または他の障害（例えば、粥状動脈硬化）を発症するリスクがある。
【００６１】
句「グルコース代謝障害」は、健康な個体と比べて対象における上昇したグルコースのレベル及び／もしくは上昇したインスリンのレベルに関連する臨床症状または臨床症状の組み合わせを特徴とする任意の障害を包含する。上昇したグルコース及び／またはインスリンのレベルは、次の疾患、障害、及び状態において示され得る：高血糖、２型糖尿病、妊娠糖尿病、１型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高インスリン血症、グルコース代謝不良、糖尿病前症、他の代謝障害（Ｘ症候群とも称される代謝症候群等）、ならびに肥満など。本開示のポリペプチド及びその組成物は、例えば、グルコース恒常性を達成する、及び／または維持するために、例えば、健康な対象に見られる範囲に血流中のグルコースのレベルを減少させる、及び／またはインスリンのレベルを減少させるために使用され得る。
【００６２】
本明細書で使用される、用語「高血糖」とは、健康な個体と比べて上昇したグルコースの量が対象の血漿中に循環している状態を指す。高血糖は、本明細書に記載される空腹時の血中グルコースレベルの測定を含む、当該技術分野に既知の方法を用いて診断され得る。
【００６３】
本明細書で使用される、用語「高インスリン血症」とは、血中グルコースレベルが上昇しているかまたは正常であるかのいずれかであるとき、同時に、循環インスリンのレベルが上昇している状態を指す。高インスリン血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高い低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び低い高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）などの脂質異常症、高尿酸レベル、多嚢胞性卵巣症候群、２型糖尿病、ならびに肥満に関連するインスリン抵抗性に起因し得る。高インスリン血症は、約２μＵ／ｍＬより高い血漿インスリンレベルを有するときに診断され得る。
【００６４】
本明細書で使用される、句「体重障害」とは、過剰な体重及び／または食欲増進に関連する状態を指す。対象が、対象の年齢、身長、性別、及び健康状態を含む参照の健康な個体と比較して体重超過であるか否かを決定するために様々なパラメータが使用される。例えば、対象は、対象のキログラムでの体重を対象のメートルでの身長の２乗で割ることによって計算される対象の肥満度指数（ＢＭＩ）の評価により体重超過または肥満と見なされ得る。約１８．５〜約２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する成人は正常な体重を有するとみなされ、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は体重超過（前肥満）とみなすことができ、約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は肥満とみなすことができる。食欲増進は、過剰体重の一因であることが多い。例えば、不眠症に関連することが多い、朝の食欲不振及び夜の過食を特徴とするが、視床下部の損傷に関係する可能性がある夜食症候群を含む、食欲増進に関連する状態がいくつかある。
【００６５】
用語「活性化剤」とは、例えば、１つまたは複数のポリペプチドの機能または活性を刺激する、増加させる、活性化させる、促進する、活性化を増強する、感受性を増加させる、または上方制御する薬剤を指す。加えて、活性化剤は、ポリペプチドと同じ作用機構を通じて動作する薬剤（すなわち、ポリペプチドと類似する様式で、ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）を含み、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる。活性化剤の例としては、小分子化合物などのアゴニストが挙げられる。
【００６６】
用語「調節因子」とは、ポリペプチド及び活性化剤をひとまとめにして指す。
【００６７】
用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」等は、薬剤（例えば、活性化剤）が直接的もしくは間接的のいずれかで１つもしくは複数のポリペプチド（もしくはそれらをコードする核酸分子）の機能もしくは活性を増加させる能力、または薬剤が１つもしくは複数のポリペプチドの効果に匹敵する効果を生成する能力を指す。
【００６８】
本明細書で互換的に使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、遺伝的にコードされた及び遺伝的にコードされていないアミノ酸、化学的にもしくは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。本用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有しない、異種及び同種リーダー配列を有する融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質等を含むがこれらに限定されない融合タンパク質を含む。
【００６９】
本開示を通して、１文字または３文字記号に従うアミノ酸を参照することが理解される。読者の便宜上、１文字及び３文字のアミノ酸記号が以下に提供される。 
0006272907.tif 000004
【００７０】
本明細書で使用される、用語「変異体」は、天然の変異体（例えば、ホモログ及び対立遺伝子変異体）及び非天然の変異体（例えば、変異タンパク質）を包含する。天然の変異体は、ホモログ、すなわち、種によって、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸及びポリペプチドを含む。天然の変異体は、対立遺伝子変異体、すなわち、種内で個体によってそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸及びポリペプチドを含む。非天然の変異体は、配列における変化が人工的に導入される、例えば、変化がヒトの介入（「ヒトの手」）により研究室または他の施設において生成される、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化を含む核酸及びポリペプチドを含む。
【００７１】
ＧＤＦ１５に関して、用語「ネイティブ」とは、生物学的に活性な天然のＧＤＦ１５変異体を含む、生物学的に活性な天然のＧＤＦ１５を指す。この用語は、１１２アミノ酸ヒトＧＤＦ１５成熟配列を含む。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「変異タンパク質」とは、突然変異した組換えタンパク質、すなわち、アミノ酸配列において人工的に導入された変化、例えば、ヒトの介入（ヒトの手」）により研究室または他の施設において生成されたアミノ酸配列における変化を含むポリペプチドを広く指す。これらのタンパク質は、通常、単一または複数のアミノ酸置換を保有し、部位特異的もしくはランダム突然変異誘発を受けたクローン化された遺伝子、または完全に合成された遺伝子にしばしば由来する。このため、本開示の「変異タンパク質」は、参照ポリペプチドに対する、例えば成熟ヒトＧＤＦ１５に対する、例えばアミノ酸置換及び／またはアミノ酸欠失（例えば、１、２、３、４、５、または６個、またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠損）を包含する。
【００７３】
ネイティブヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質に関して本明細書で使用される、用語「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」、「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」等は、ヒトＧＤＦ１５、天然のＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質の所望の性質を増強する１つまたは複数の変化を指し、該変化は、ＧＤＦ１５の一次アミノ酸配列を変更しない。「修飾」は、ＧＤＦ１５ポリペプチド自体の一次アミノ酸配列を変更しない共有結合性化学修飾を含む。そのような所望の性質は、例えば、溶解度の増強、循環半減期の延長、安定性の増加、クリアランスの減少、免疫原性またはアレルゲン性の変更、製造可能性の態様（例えば、費用及び効率）の改善、ならびに検出アッセイに使用するための特定の抗体の発生を可能にすること（例えば、独特なエピトープの導入により）を含む。実行することができるヒトＧＤＦ１５、天然のＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質に対する変化は、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子またはその誘導体の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアル酸化、及びＨＥＳ化；マルトース結合タンパク質融合；アルブミン融合（例えば、ＨＳＡ融合）；例えば、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ融合；ならびにＰＥＧ模倣体との融合を含むが、これらに限定されない。いくつかの特定の実施形態は、ポリエチレングリコールを含む修飾を伴い、他の特定の実施形態は、アルブミンを含む修飾を伴い、さらに他の特定の修飾は、グリコシル化を含む修飾を伴う。
【００７４】
用語「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」等は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指すように、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直線状及び環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマー等が挙げられる。
【００７５】
用語「プローブ」とは、関心の遺伝子または配列に対応するＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指し、本断片は、放射性標識（例えば、３２Ｐもしくは３５Ｓを組み込むことにより）されているか、またはビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはフルオレセインなどのいくつかの他の検出可能な分子を用いて標識されている。ＤＮＡまたはＲＮＡのストレッチは相補的配列とハイブリダイズするため、プローブは、例えば、ウイルスプラーク、細菌コロニー、または関心の遺伝子を含有するゲル上のバンドを標識するために使用することができる。プローブはクローン化されたＤＮＡであるか、または合成ＤＮＡ鎖であってよく、後者は、例えば、タンパク質の一部をミクロシークエンシングする、タンパク質をコードする核酸配列を推定する、その配列を保有するオリゴヌクレオチドを合成する、配列を放射標識する、及びそれをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることにより、単離したタンパク質からｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得るために使用され得る。
【００７６】
用語「異種」とは、異なる供給源に由来する構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、ポリペプチドの文脈では、「異種」ポリペプチドは、異なるポリペプチド（例えば、組換えポリペプチドを含む第１の成分及びネイティブＧＤＦ１５ポリペプチドに由来する第２の成分）に由来する機能的に連結されたアミノ酸配列を含み得る。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種」ポリヌクレオチドは、異なる遺伝子（例えば、本明細書に開示される実施形態に従うポリペプチドをコードする核酸からの第１の成分及びキャリアポリペプチドをコードする核酸からの第２の成分）に由来し得る機能的に連結された核酸配列を含み得る。他の例示的な「異種」核酸は、コード配列を含む核酸が、コード配列とは異なる遺伝的起源に由来する制御エレメント（例えば、プロモーター）に機能的に連結されている発現構築物を含む（例えば、プロモーター、コード配列、またはその両方とは異なる遺伝的起源であり得る関心の宿主細胞において発現を提供するため）。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたＴ７プロモーターは異種核酸と言われる。組換え細胞の文脈では、「異種」とは、核酸が存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起源のものである核酸（またはポリペプチドなどの遺伝子産物）の存在を指し得る。
【００７７】
用語「機能的に連結される」とは、所望の機能を提供するための分子間の連結を指す。例えば、核酸の文脈では、「機能的に連結される」とは、核酸配列間の機能的連結を指す。例として、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または多くの転写因子結合部位など）は、第２のポリヌクレオチドに機能的に連結され得、発現制御配列は、第２のポリヌクレオチドの転写及び／または翻訳に影響を与える。ポリペプチドの文脈では、「機能的に連結される」とは、ポリペプチドの記載される活性を提供するための、アミノ酸配列間の（例えば、異なるドメイン間の）機能的連結を指す。
【００７８】
ポリペプチドの構造の文脈で本明細書で使用される、「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」（または「アミノ末端（ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」）及び「Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」（または「カルボキシル末端（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」）とは、それぞれ、ポリペプチドのアミノ最端及びカルボキシル最端を指し、一方、用語「Ｎ末端側（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」及び「Ｃ末端側（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」とは、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端に向かうポリペプチドのアミノ酸配列の相対的位置を指し、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端の残基を含み得る。「すぐＮ末端側」または「すぐＣ末端側」とは、第１及び第２のアミノ酸残基が、連続するアミノ酸配列を提供するように共有結合されている、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。
【００７９】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドに「由来する」アミノ酸配列）の文脈では、「〜に由来する」とは、ポリペプチドまたは核酸が参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然のＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５をコードする核酸）に基づく配列を有することを意味し、タンパク質または核酸が作製される供給源または方法について限定することを意味しない。例として、用語「〜に由来する」は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列のホモログまたは変異体を含む。
【００８０】
ポリペプチドの文脈において、用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ポリペプチドが天然である場合、ポリペプチドが天然に生じ得る環境とは異なる環境にある関心のポリペプチドを指す。「単離された」とは、関心のポリペプチドが実質的に濃縮されている、及び／または関心のポリペプチドが部分的にまたは実質的に精製されているサンプル内に存在するポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが非天然である場合、「単離された」は、ポリペプチドが、合成または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
【００８１】
「濃縮された」とは、関心のポリペプチドがａ）生物学的サンプルなどの開始サンプル（例えば、ポリペプチドが天然に生じているサンプル、またはポリペプチドが投与後に存在しているサンプル）中のポリペプチドの濃度より大きい濃度（例えば、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも６４倍大きい、またはそれ以上大きい）で、またはｂ）ポリペプチドが作製された環境（例えば、細菌細胞中のような）より大きい濃度で存在するように、サンプルが非天然に操作される（例えば、科学者または臨床医により）ことを意味する。
【００８２】
「実質的に純粋」とは、成分（例えば、ポリペプチド）が組成物の総量の約５０％超、典型的には、総ポリペプチド含量の約６０％超を構成することを示す。より典型的には、「実質的に純粋」とは、総組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ以上が関心の成分である組成物を指す。いくつかの場合では、ポリペプチドは、組成物の総量の約９０％超、または約９５％超を構成する。
【００８３】
用語「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とは、同一の構造特性を有する糖タンパク質を指す。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を呈するが、免疫グロブリンは抗原特異性を欠く抗体及び他の抗体様分子の両方を含む。抗体は以下に詳細に記載される。
【００８４】
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質の抗体の集団から得た抗体を指す、つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含み得るポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。
【００８５】
抗体の文脈において、用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、その天然環境の混入成分から分離された、及び／または回収された抗体を指し、そのような混入成分は、抗体の診断または治療の使用に干渉する可能性がある物質を含み、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。
【００８６】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）
ＭＩＣ−１（マクロファージ阻害性サイトカイン−１）としても知られるＧＤＦ１５、ＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＮＡＧ−１、ＴＧＦ−ＰＬ、及びＰＴＧＦＢは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。フューリン様プロテアーゼにより後に切断される６２ｋＤａ細胞内前駆体タンパク質として合成されるＧＤＦ１５は、２５ｋＤａジスルフィド連結タンパク質として分泌される。［例えば、Ｆａｉｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ  ６５：２−５（１９９９）を参照されたい］。ＧＤＦ１５  ｍＲＮＡは、肝臓、腎臓、膵臓、結腸、及び胎盤を含むいくつかの組織において見られ、肝臓におけるＧＤＦ１５発現は、肝臓、腎臓、心臓、及び肺などの臓器の損傷中に顕著に上方制御され得る。
【００８７】
ＧＤＦ１５前駆体は、２９アミノ酸シグナルペプチド、１６７アミノ酸プロドメイン、及びフューリン様プロテアーゼによってプロドメインから切断される１１２アミノ酸の成熟ドメインを含有する、３０８アミノ酸ポリペプチド（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＰ＿００４８５５．２）である。３０８アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチドは「完全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと称され、１１２アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、図１Ａに示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９７〜３０８）は、「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドである。特に記載のない限り、用語「ＧＤＦ１５」とは、１１２アミノ酸成熟配列を指す。加えて、特定のＧＤＦ１５残基に対する数的参照は、１１２アミノ酸成熟配列を指す（すなわち、残基１はＡｌａ（Ａ）であり、残基１１２はＩｌｅ（Ｉ）である（図１Ｂを参照されたい））。留意すべきは、ＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列は３つの切断部位を予測し、３つの推定形態の「成熟」ヒトＧＤＦ１５（すなわち、１１０、１１２、及び１１５アミノ酸）をもたらす一方で、１１２アミノ酸成熟配列が正しいとして受け入れられる。
【００８８】
本開示の範囲は、マウス（ＮＰ＿０３５９４９）、チンパンジー（ＸＰ＿５２４１５７）、オランウータン（ＸＰ＿００２８２８９７２）、アカゲザル（ＥＨＨ２９８１５）、ジャイアントパンダ（ＸＰ＿００２９１２７７４）、テナガザル（ＸＰ＿００３２７５８７４）、モルモット（ＸＰ＿００３４６５２３８）、フェレット（ＡＥＲ９８９９７）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３２２７）、ブタ（ＮＰ＿００１１６７５２７）、イヌ（ＸＰ＿５４１９３８）、及びカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ；ＡＦＶ６１２７９を含む、他の哺乳類種からのＧＤＦ１５オルソログ、及びその修飾された形態ならびにそれらの使用を含む。ヒトＧＤＦ１５の成熟形態は、マウスオルソログに対して約６７％のアミノ酸同一性を有する。
【００８９】
Ａ．所望の物理的性質を有する修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質
本開示は、一部において、修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質を想定し、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基は、１つまたは複数の他の残基で置換される。例えば、修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質のＧＤＦ１５変異タンパク質成分は、Ｋ６２Ｑを含有するＧＤＦ１５変異タンパク質が不活性であることを除き、任意の他のアミノ酸でのネイティブリジン残基（すなわち、残基６２、６９、９１、及び１０７）の１つまたは複数の置換を含み得る。したがって、Ｋ６２Ｑを含有する修飾されたＧＤＦ１５は、本開示のＧＤＦ１５変異タンパク質から具体的に除外され得る。Ｋ６２を維持するが、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、及び／またはＫ１０７Ｒの任意の組み合わせを組み込むＧＤＦ１５変異タンパク質は、成熟ヒトＧＤＦ１５対照と同等のレベルに体重を低下させることにおいて活性がある。
【００９０】
他のＧＤＦ１５変異タンパク質では、１つまたは複数のＧＤＦ１５残基は、例えば、次の置換を含む、別のアミノ酸で置換される：Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、またはＶ２０Ｌ。そのようなＧＤＦ１５変異タンパク質は、１つまたは複数の固有の物理的性質（例えば、安定性、血清半減期、ならびに検出アッセイ及びタンパク質精製における使用のための特定の抗体の生成）を改善するための修飾のための候補である。
【００９１】
他の候補ＧＤＦ１５変異タンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
変異タンパク質ｖ１）Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１６６）；
変異タンパク質ｖ２）Ｋ６２Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１６７）；
変異タンパク質ｖ３）Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１６８）；
変異タンパク質ｖ４）Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号１６９）；
変異タンパク質ｖ５）Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１７０）；
変異タンパク質ｖ６）Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１７１）；
変異タンパク質ｖ７）Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号１７２）；
変異タンパク質ｖ８）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１７３）；
変異タンパク質ｖ９）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ９１Ｒ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１７４）；
変異タンパク質ｖ１０）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ１０７Ｒ（配列番号１７５）；及び
変異タンパク質ｖ１１）Ｈ１８Ｑ、Ｔ１９Ｓ、Ｖ２０Ｌ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６９Ｑ、Ｋ９１Ｒ（配列番号１７６）。
【００９２】
ＧＤＦ１５変異タンパク質のさらなる例としては、Ｒ２、Ｎ３、Ｇ４、Ｄ５、Ｈ６、Ｐ８、Ｌ９、Ｇ１０、Ｐ１１、Ｇ１２、Ｒ１３、Ｒ１６、Ｌ１７、Ｈ１８、Ｔ１９、Ｖ２０、Ｒ２１、Ｓ２３、Ｌ２４、Ｅ２５、Ｄ２６、Ｌ２７、Ｇ２８、Ｗ２９、Ｄ３１、Ｗ３２、Ｖ３３、Ｌ３４、Ｓ３５、Ｒ３７、Ｅ３８、Ｖ３９、Ｑ４０、Ｖ４１、Ｔ４２、Ｍ４３、Ｉ４５、Ｐ４９、Ｓ５０、Ｑ５１、Ｆ５２、Ｒ５３、Ｎ５６、Ｍ５７、Ｈ５８、Ｑ６０、Ｉ６１、Ｔ６３、Ｓ６４、Ｈ６６、Ｒ６７、Ｌ６８、Ｋ６９、Ｐ７０、Ｄ７１、Ｔ７２、Ｖ７３、Ｐ７４、Ｐ７６、Ｖ７９、Ｐ８０、Ｓ８２、Ｎ８４、Ｐ８５、Ｍ８６、Ｖ８７、Ｌ８８、Ｉ８９、Ｑ９０、Ｋ９１、Ｔ９２、Ｄ９３、Ｔ９４、Ｇ９５、Ｖ９６、Ｓ９７、Ｌ９８、Ｑ９９、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｄ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｋ１０７、Ｄ１０８、Ｈ１１０、及びＩ１１２のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含む、ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されず、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得る。一例では、ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｒ２、Ｎ３、Ｇ４、Ｄ５、Ｈ６、Ｐ８、Ｌ９、Ｇ１０、Ｐ１１、Ｇ１２、Ｒ１３、Ｒ１６、Ｌ１７、Ｈ１８、Ｔ１９、Ｖ２０、Ｒ２１、Ｓ２３、Ｌ２４、Ｅ２５、Ｄ２６、Ｌ２７、Ｇ２８、Ｗ２９、Ｄ３１、Ｗ３２、Ｖ３３、Ｌ３４、Ｓ３５、Ｒ３７、Ｅ３８、Ｖ３９、Ｑ４０、Ｖ４１、Ｔ４２、Ｍ４３、Ｉ４５、Ｐ４９、Ｓ５０、Ｑ５１、Ｆ５２、Ｒ５３、Ｎ５６、Ｍ５７、Ｈ５８、Ｑ６０、Ｉ６１、Ｔ６３、Ｓ６４、Ｈ６６、Ｒ６７、Ｌ６８、Ｋ６９、Ｐ７０、Ｄ７１、Ｔ７２、Ｖ７３、Ｐ７４、Ｐ７６、Ｖ７９、Ｐ８０、Ｓ８２、Ｎ８４、Ｐ８５、Ｍ８６、Ｖ８７、Ｌ８８、Ｉ８９、Ｑ９０、Ｋ９１、Ｔ９２、Ｄ９３、Ｔ９４、Ｇ９５、Ｖ９６、Ｓ９７、Ｌ９８、Ｑ９９、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｄ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｋ１０７、Ｄ１０８、Ｈ１１０、及びＩ１１２のうちの１つ、２つ３つ、４つ、またはそれ以上を置換するアラニンを含有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｐ３６、Ｇ４６、Ｋ６２、Ｌ６５、及び／またはＹ８３において、アミノ酸置換を有しない。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｃ７、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ４４、Ｃ４８、Ｃ７７、Ｃ７８、Ｃ１０９、及び／またはＣ１１１において、アミノ酸置換を有しない。
【００９３】
上に示され、以下により詳細に記載されるように、ネイティブＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質は、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子またはその誘導体の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）；ポリシアル酸化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清アルブミン、もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ融合；ＰＥＧ模倣体との融合を通じて修飾され得る。ある実施形態では、修飾は、部位特異的様式で導入される。他の実施形態では、修飾は、リンカーを含む。
【００９４】
特定の実施形態では、本開示は、アルブミンとのコンジュゲーションによる、成熟ヒトＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質の修飾を想定する。他の実施形態では、本開示は、Ｎ−グリコシル化を介した成熟ヒトＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質修飾を想定する。アルブミン及びそのＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質コンジュゲート（例えば、融合タンパク質）、ならびにＮ−グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質の特徴は、以下でさらに記載される。
【００９５】
実施例１は、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して成熟ヒトＧＤＦ１５のＮ末端に融合された成熟ＨＳＡを含む融合分子の、体重、食物摂取量、及び空腹時血中グルコースに対する効果を示す。融合分子の投与（非コンジュゲート組換えヒトＧＤＦ１５に対して、改善された半減期、発現、分泌、及び溶解度を呈した）は、ビヒクル対照と比較して、体重（図２Ａ）、食物摂取量（図２Ｂ）、及び非空腹時血中グルコース（図２Ｃ）の有意な改善をもたらした。これらのデータは、ＧＤＦ１５とのＨＳＡ融合物が活性であること、及びそのような融合分子が、ＧＤＦ１５変異タンパク質のある有益な性質を増強するための実行可能なアプローチを表すことを実証する。データはまた、示されたパラメータの測定値が、変異タンパク質のハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームとして有用であり得ることを示す。
【００９６】
実施例２は、成熟ヒトＧＤＦ１５の物理的性質（例えば、溶解度及び安定性）を改善するための手段を特定するために使用される方法論を記載する。表面アクセス可能であると予測される１組の６つの疎水性残基を、表面疎水性を増加させる手段としてのアラニンへの突然変異に供した。６つのＧＤＦ１５変異タンパク質配列の各々が、図１Ｈに示されるリンカー（非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介してＨＳＡに融合された、融合分子を生成した；図３に記載される配列は、融合分子のＨＳＡ成分もリンカー成分も示していない。
【００９７】
その後、融合分子を、分泌ジスルフィド連結ホモ２量体としての発現に関してモニターした（図４を参照されたい）。実施例に記載されるように生成されたデータを使用して、成熟ヒトＧＤＦ１５の配列に沿ったＮ−連結グリコシル化コンセンサス部位の導入に起因する溶解度を評価し、かつ成熟ヒトＧＤＦ１５に固有の表面疎水性及び親水性に関連する溶解度制限に対処した。評価は、因子Ｘａタンパク質分解感受性の切断可能なリンカーを含有する、ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質−Ｎ末端ＨＳＡ融合分子の構築物を伴った。各変異タンパク質は、ＩｇＫシグナルペプチドとともにｈＧＤＦ１５成熟配列を使用して、非ＨＳＡ融合物として生成された。５つのＧＤＦ１５変異タンパク質（ｗ２９、ｗ３２、ｗ５２、ｗ６８、及びｗ８９；図３を参照されたい）の表面疎水性の減少は、アラニンへの疎水性残基の選択的突然変異誘発によって評価され、変異タンパク質は、因子Ｘａタンパク質分解感受性の切断可能なリンカーを含有するＨＳＡ融合物として、またはＮ末端メチオニンを含有する成熟ｈＧＤＦ１５変異タンパク質の１１２アミノ酸配列を含有する細菌リフォールドとしてのいずれかで生成された。成熟ヒトＧＤＦ１５に対する、これらの５つの変異タンパク質の溶解度の比較は、ｗ５２及びｗ８９が、改善された溶解度を呈する唯一の変異タンパク質であったことを示した。
【００９８】
加えて、以下の５つのＧＤＦ１５変異タンパク質配列の表面親水性（図５を参照されたい）を、アラニンへの酸性残基の選択的突然変異誘発によって評価した：ｗ１１３、ｗ１１４、ｗ１１５、ｗ１１６、及びｗ１１７。成熟ヒトＧＤＦ１５に対するこれらの５つの変異タンパク質の相対的溶解度の比較は、ｗ１１６が、改善された溶解度を呈する唯一の変異タンパク質であったことを示した。
【００９９】
次いで、成熟ヒトＧＤＦ１５配列を、Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス部位の導入に対応するその能力に関して評価した。この文脈では、単一のアミノ酸置換は、成熟ヒトＧＤＦ１５配列内で所要のコンセンサス部位を与え、Ｎ−連結グリコシル化のためのコンセンサス部位は、「Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」として定義され、ここで「Ｘｘｘ」は、プロリン残基ではあり得ない。成熟ヒトＧＤＦ１５配列のスキャンに基づき、１４種の可能な単一点変異タンパク質が、Ｎ−グリカンコンセンサス部位の導入に対応するであろうことが特定された。図６は、１４種のモノグリコシル化変異タンパク質、ならびに追加のコンビナトリアルジグリコシル化変異タンパク質の配列を示す。これらの操作されたＮ−グリカン変異タンパク質の各々は、Ｎ−グリカン部位占有、及び哺乳類組織培養培地への折り畳まれたＧＤＦ１５ホモ２量体としての分泌の両方について評価された。図７に記載されるように、１４種のモノグリコシル化変異タンパク質のうちの１０種は、折り畳まれたＧＤＦ１５ホモ２量体として分泌され、一方、４種（ｗ１２３、ｗ１２５、ｗ１２７、及びｗ１２９）は、２量体形成をもたらさなかった。ホモ２量体として分泌された１０種のモノグリコシル化変異タンパク質のうち、２種（ｗ１２１及びｗ１２４）は、低い占有を呈し、それらの溶解度は、その後評価しなかった（図７を参照されたい）。
【０１００】
ホモ２量体としても分泌され、かつコンセンサス部位内で高いグリカン占有も有した、操作されたヒトモノグリコシル化ＧＤＦ１５変異タンパク質は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して、改善された溶解度を呈した（実施例３；図８を参照されたい）。これらのＧＤＦ１５変異タンパク質は、それらが食物摂取量の減少に影響を及ぼす能力について評価され、データは、図９Ａに記載される。
【０１０１】
最後に、成熟ヒトＧＤＦ１５に対する、操作されたＧＤＦ１５  Ｎ−グリカン変異タンパク質の流体力学半径が、分析ゲル濾過クロマトグラフィを利用して評価された（実施例４を参照されたい）。図１０に示されるように、Ｎ−連結グリカン変異タンパク質の各々は、ヒトＧＤＦ１５ジスルフィド連結２量体の流体力学半径を増加させた。このため、各変異タンパク質は、例えば、好ましいインビボ半減期を有する分子を生成するための開始点として潜在的に作用し得る。
【０１０２】
成熟ヒトＧＤＦ１５に対して、物理的性質における最も実質的な改善（例えば、溶解度の増強、及び流体力学半径の増加）を呈しつつ、有効な食物摂取量減少を維持する、Ｎ−グリコシル化変異タンパク質の多くは、ヒトＧＤＦ１５の特定のエピトープ／領域に位置すると見られる。具体的には、Ｎ−グリコシル化（Ｇｌｙｃｏｙｓｌａｔｉｏｎ）コンセンサス部位の導入をもたらす突然変異誘発は、Ｇｌｎ９０からＬｅｕ９８にまたがるエピトープ／領域において許容されると見られた。このため、突然変異誘発に対して好ましい領域の理解は、本開示を実践するためには必要とされないが、このエピトープ／領域は、Ｎ−グリコシル化コンセンサス部位の導入に有利であると考えられる。
【０１０３】
次いで、切断可能な融合及び発現パートナーとしてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、図１１Ａ、１１Ｂ、及び１２に述べられるように、様々な異なるＧＤＦ１５オルソログ及びＢＭＰ／ＴＧＦファミリーメンバーの産生及び精製のためにさらに利用した。分泌構築物の発現プロファイリング及び特性評価に基づき、融合パートナーとしてのヒト血清アルブミン（ＩｇＫ−ＨＳＡ−２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＩＥＧＲ−ＧＤＦ１５（配列番号１２）の標準化された発現テンプレートのように）は、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列によく適していると見られる。発現テンプレートは、ヒトＧＤＦ１５、ならびに成熟ヒトＧＤＦ１５のアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％  少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を維持するオルソログに対して最適化される。
【０１０４】
アミノ酸置換に適応できる特定の残基は、成熟ヒトＧＤＦ１５の１１２アミノ酸配列のアラニンスキャニング突然変異誘発によって特定され、結果は、図７、８、９、及び１０に示される。ヒト血清アルブミン発現融合を利用して、突然変異誘発を許容しない領域を特定した。システイン残基は、システインノット折り畳み（Ｃ７、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ４４、Ｃ４８、Ｃ７７、Ｃ７８、Ｃ１０９、及びＣ１１１）を維持するために、突然変異には供されなかった。５つの部位は、アラニンへの突然変異誘発を許容しないと特定された：ｗ３６、ｗ４６、ｗ６２、ｗ６５、及びｗ８３（図１３及び１４に記載されるＰ３６、Ｇ４６、Ｋ６２、Ｌ６５、及びＹ８３）。各アラニン変異タンパク質の結果として得られる発現及び精製は、凝集状態及びホモ２量体化忠実性について評価され、結果として、ＧＤＦ１５の折り畳みまたは生物学的機能を損失せずに、突然変異誘発に適応できる残基を特定した。アミノ酸置換に適応できる残基の例としては、Ｎ３Ａ、Ｎ３Ｑ、Ｎ３Ｅ、Ｎ３Ｓ、Ｎ３Ｔ、Ｇ４Ｐ、Ｄ５Ｓ、Ｄ５Ｔ、Ｑ４０Ａ、Ｑ４０Ｅ、Ｑ４０Ｄ、Ｑ４０Ｈ、Ｍ４３Ａ、Ｍ４３Ｖ、Ｍ４３Ｆ、Ｑ５１Ａ、Ｑ５１Ｅ、Ｑ５１Ｌ、Ｑ５１Ｈ、Ｎ５６Ａ、Ｎ５６Ｓ、Ｍ５７Ａ、Ｍ５７Ｉ、Ｍ５７Ｔ、Ｑ６０Ａ、Ｑ６０Ｌ、Ｎ８４Ａ、Ｎ８４Ｅ、Ｎ８４Ｑ、Ｎ８４Ｔ、Ｍ８６Ａ、Ｍ８６Ｖ、Ｑ９０Ａ、Ｑ９０Ｅ、Ｑ９０Ｅ、Ｑ９０Ｈ、Ｑ９５Ａ、Ｑ９５Ｅ、Ｑ９５Ｄ、Ｑ９５Ｈ、Ｑ９５Ｔ、Ｑ９５Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＧＤＦ１５への修飾は、様々な望ましくない効果、例えば、残基Ｎ３における脱アミド化及び／または残基Ｒ２におけるタンパク質分解に対処するように設計された。Ｎ３における脱アミド化に対処することに加え、修飾（例えば、置換）はまた、脱アミド化を防止するために、成熟ＧＤＦ１５内の他のアスパラギン残基（例えば、Ｎ８４）にも行われた。
【０１０６】
実施例６でさらに述べられるように、Ｎ３が、活性を実質的に損失せずに突然変異誘発に適応できる（本明細書に記載されるＮ３Ａ突然変異によって示されるように）ことを実証したため、Ｎ３Ｑ、Ｎ３Ｅ、Ｎ３Ｔ、またはＮ３Ｓなどの他のアミノ酸の置換が、この部位でなされ得ることを予測することが妥当である。当業者は、置換を許容するアミノ酸残基、及びネイティブ配列におけるアミノ酸残基を置換し得るアミノ酸残基を特定するための技術（例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５の非ヒトＧＤＦ１５オルソログとのアライメント）に精通している。
【０１０７】
ポリペプチドの他の修飾が、本明細書において想定される。例えば、Ｎ３における脱アミド化は、非天然のアスパラギン酸残基を創出することがあり、これは、脱アミド化事象に対するすぐＣ末端側のＧ４の存在（すなわち、Ａｓｐ−Ｇｌｙ部位）により、イソアスパラギン酸異性化をもたらし得る。Ｎ３における脱アミド化は、Ａｓｐ−Ｇｌｙ対合を妨害するために異性化パートナーＧｌｙをＰｒｏ（Ｇ４Ｐ）に突然変異させることによって防止され得る。さらに、脱アミド化は、例えば、Ｄ５ＴまたはＤ５ＳへのＤ５の突然変異誘発を介した、Ｎ３におけるＮ−連結グリコシル化部位の創出を介して防止することができる。
【０１０８】
本開示の他の実施形態は、Ｎ末端における残基の欠損を通じた、成熟ＧＤＦ１５のＮ３における脱アミド化の排除を想定する。特定の実施形態では、最初の３つの残基が、Ｎ末端から除去され、さらなる実施形態では、最初の４つの残基が除去され、尚さらなる実施形態では、最初の５つの残基が除去され、追加の実施形態では、６つまたはそれ以上の残基が除去される。そのような欠損は、Ｒ２におけるタンパク質分解を修正するさらなる利益を有する（その位置におけるアルギニン残基は切断されているため）。
【０１０９】
本開示は、上で記載される修飾（例えば、Ｎ末端におけるアミノ酸残基の欠損）とＣ末端から残基３までの１つまたは複数の他の修飾との組み合わせを想定する。
【０１１０】
最後に、実施例７は、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のＮ末端への遺伝的融合の操作を記載する。これらの構築物は、ヒトＦｃドメイン、アルブミン結合ドメイン、及びマルトース結合ドメイン（図１５及び１６を参照されたい）を含有する融合物の設計及び実施を含む。各場合において、発現された構築物は、適切な一過性発現系からの分泌忠実性について評価され、かつ物理的性質の評価のために精製された。アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）及びマルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）の場合、薬学的薬剤としてのこれらの分子に対する製剤考慮（すなわち、最大の製剤化可能な用量）に直接影響を与える、最大溶解度の実質的な増加が観察された。さらに、図１６Ｂは、ＧＤＦ１５に融合されたＡＢＤ（ＡＢＤ−ＧＤＦ１５）の、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける３ｍｇ／ｋｇの単回急性投与後の２週間の有効性（体重減少）を示す。ＡＢＤ−ＧＤＦ１５のＰＫプロファイリングは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける２４時間を越える半減期を実証し、ＧＤＦ１５の薬学的性質の望ましい改善を実証した。
【０１１１】
天然の及び非天然のアイソフォーム、対立遺伝子変異体、及びスプライス変異体を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子が、本開示により想定される。前述のように、ポリペプチドは、保存ドメインを維持し、天然のポリペプチドと同じ生物学的活性を有する一方で、アミノ酸残基に１つまたは複数の変更（例えば、変異体または種にわたって保存されない位置で）を有するポリペプチドも指す。本開示は、天然のＤＮＡ配列と１つまたは複数の塩基において異なるが、遺伝的コードの縮重により、ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に尚翻訳される核酸配列も包含する。例えば、ＧＤＦ１５は、１つまたは複数の保存的置換、タグ、またはコンジュゲートにより天然の配列とは異なるアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド）を指し得る。
【０１１２】
よって、天然のＧＤＦ１５ポリペプチドに加えて、本開示は、置換が通常保存的アミノ酸置換である、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸置換、または通常２０個以下、１０個以下、または５個以下のアミノ酸置換を有すること（例えば、ポリペプチド）を想定する。
【０１１３】
「保存的アミノ酸置換」とは、一般的に、以下の群内でのアミノ酸残基の置換を指す：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；及び６）Ｄ、Ｅ。保存的アミノ酸置換は、タンパク質のアミノ酸を、酸性度、塩基性度、電荷、極性、または側鎖サイズが類似した側鎖を有するアミノ酸と置換することによりタンパク質の活性を保存する。置換、挿入、または欠失の誘導は、異なる変異体タンパク質または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づき得る。
【０１１４】
本開示は、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５変異タンパク質に由来する連続するアミノ酸残基を含有するポリペプチドの活性断片（例えば、サブ配列）も想定する。ペプチドまたはポリペプチドのサブ配列の連続するアミノ酸残基の長さは、サブ配列が由来する特定の天然のアミノ酸配列により異なる。一般に、ペプチド及びポリペプチドは、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約７５個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸〜最大で全長ペプチドまたはポリペプチドであり得る。
【０１１５】
加えて、ポリペプチドは、連続するアミノ酸の定義された長さにわたる参照配列（例えば、「比較ウィンドウ」）と比較して、定義された配列同一性を有し得る。比較のための配列のアライメント方法は当該技術分野において公知である。比較のための最適な配列のアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行、または手動アライメント、及び視覚検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。
【０１１６】
例として、好適なポリペプチドは、図１、３、５、及び６に示されるアミノ酸配列のうちの１つの約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１２個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、約４５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸〜１１２個のアミノ酸または１１３個のアミノ酸の連続するストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１１７】
ポリペプチドは天然源（例えば、その天然の環境以外の環境）から単離され得、組換えによっても（例えば、細菌、酵母、ピキア、昆虫の細胞等の遺伝的に修飾された宿主細胞において）作製され得、ここで、遺伝的に修飾された宿主細胞は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で修飾されている。ポリペプチドは、合成によっても生成することができる（例えば、細胞なしの化学合成により）。生成方法は以下により詳細に記載される。
【０１１８】
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードすることができる構築物を提供するために、当該技術分野において既知の異なるＧＤＦ１５関連核酸を操作するように、組換え技法を用いて生成され得る。特定のアミノ酸配列が提供されるとき、当業者は、例えば、個体の分子生物学の背景及び経験を考慮して、そのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を認識することが理解される。
【０１１９】
Ｂ．調節因子
用語「調節因子」とは、ポリペプチド及び活性化剤の両方を指す。上に示されるように、活性化剤は、例えば、１つまたは複数のポリペプチドの機能または活性を刺激する、増加させる、活性化させる、促進する、活性化を増強する、感受性を増加させる、または上方制御する薬剤である。加えて、活性化剤は、ポリペプチドと同じ作用機構を通じて動作する薬剤（すなわち、ポリペプチドと類似する様式で、ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）を含み、ポリペプチドと同等の（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる。活性化剤は、例えば、小分子アゴニスト化合物、または他の生物有機分子であり得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、活性化剤は、小分子アゴニスト化合物である。小分子化合物の多くのライブラリ（例えば、コンビナトリアルライブラリ）が市販されており、そのような活性化剤を特定するための開始点として作用することができる。当業者は、所望の性質を有する１つまたは複数の化合物を特定するためにそのような化合物ライブラリがスクリーニングされ得る、１つまたは複数のアッセイ（例えば、生化学または細胞系アッセイ）を開発することができ、その後、熟練の医療化学者が、例えば、その類似体及び誘導体を合成及び評価することにより、そのような１つまたは複数の化合物を最適化することができる。合成及び／または分子のモデル化研究は、活性化剤の特定においても利用され得る。
【０１２１】
またさらなる実施形態では、活性化剤は、ポリペプチドとは構造的に識別可能であるが、同等の活性を有するアゴニストポリペプチドである。当業者は、所望の性質を有するそのようなポリペプチドを特定することができる。
【０１２２】
アミド結合置換
いくつかの場合では、ポリペプチドは、ペプチド結合以外の１つまたは複数の連結を含み、例えば、少なくとも２つの隣接するアミノ酸はアミド結合以外の連結を介して結合される。例えば、望ましくないタンパク質分解、または他の分解手段を減少させる、もしくは排除する、及び／または血清の安定性を増加させる、ならびに／または構造的柔軟性を制限する、もしくは増加させるために、ポリペプチドの骨格内の１つまたは複数のアミド結合が置換され得る。
【０１２３】
別の実施例では、ポリペプチドにおける１つまたは複数のアミド連結（−ＣＯ−ＮＨ−）は、−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、または−ＣＨ２ＳＯ−などのアミド連結のアイソスターである連結で置換され得る。ポリペプチドにおける１つまたは複数のアミド連結は、例えば、減少されたアイソスター偽ペプチド結合によっても置換され得る。Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４を参照されたい。そのような置換及びどのように作用するかは当業者に既知である。
【０１２４】
アミノ酸置換
１つまたは複数のアミノ酸置換はポリペプチドにおいて行うことができる。以下は非限定的な例である：
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、または分枝状、環状、及び直鎖状のアルキル、アルケニル、またはアルキニル置換を含むＣ１−Ｃ１０炭素からの脂肪族側鎖により置換された他の単純なα−アミノ酸を含む、アルキル置換された疎水性アミノ酸の置換；
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む、芳香族置換された疎水性アミノ酸の置換（アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、またはアルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）置換された上述の芳香族アミノ酸の形態を含み、その例示的な例は、２−、３−、または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−、または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−、または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−、または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−、または５−メトキシトリプトファン、２'−、３'−、または４'−アミノ−、２'−、３'−、または４'−クロロ−、２、３、または４−ビフェニルアラニン、２'−、３'−、または４'−メチル−、２−、３−、または４−ビフェニルアラニン、及び２−または３−ピリジルアラニンである）；
ｃ）置換基がヘテロ原子（α窒素、または遠位窒素、または窒素など）上、または例えば、プロＲ位置のα炭素上にあるか否かに関わらず、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む、塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換（前のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換された（Ｃ１−Ｃ１０分枝状、直線状、または環状からの）誘導体を含む）。例示する例として機能する化合物は、Ｎ−ε−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−γ、γ'−ジエチル−ホモアルギニンを含む。アルキル基がα−炭素のプロ−Ｒ位置を占める場合、α−メチル−アルギニン、α−メチル−２，３−ジアミノプロピオン酸、α−メチル−ヒスチジン、α−メチル−オルニチンなどの化合物も含まれる。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基は単独でまたは組み合わせで１つまたは複数の窒素、酸素、または硫黄の原子を有する）カルボン酸、または酸塩化物、活性エステル、活性アゾリド（ａｚｏｌｉｄｅ）、及び関連する誘導体などの多くの周知の活性化誘導体のいずれか、ならびにリジン、オルニチン、または２，３−ジアミノプロピオン酸から形成されるアミドも含む；
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、及び２，４−ジアミノプロピオン酸、オルニチン、またはリジンのヘテロアリールスルホンアミド、ならびにテトラゾール置換されたアルキルアミノ酸を含む、酸性アミノ酸の置換；
ｅ）アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギンもしくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体を含む、側鎖アミド残基の置換；ならびに
ｆ）セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、及びセリンもしくはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換された誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
【０１２５】
いくつかの場合では、ポリペプチドは、アミノ酸の１つまたは複数の天然の非遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、またはＤ−エナンチオマーを含む。例えば、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみを含み得る。例えば、ポリペプチドは、次の残基のうちの１つまたは複数を含み得る：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、ｒｈｏ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、及び２，３−ジアミノ酪酸。
【０１２６】
さらなる修飾
システイン残基またはシステイン類似体は、ジスルフィド連結を介して別のペプチドに連結を提供するために、またはポリペプチドの環化を提供するために、ポリペプチドに導入され得る。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第８，０６７，５３２号を参照されたい。
【０１２７】
ポリペプチドは環化され得る。１つまたは複数のシステインまたはシステイン類似体は、導入されるシステインまたはシステイン類似体が第２の導入されるシステインまたはシステイン類似体とジスルフィド結合を形成することができる場合、ポリペプチドに導入することができる。環化の他の手段は、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含む（例えば、米国特許第８，０４４，１７５号を参照されたい）。環化結合を形成することができるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組み合わせが使用される、及び／または導入され得る。環化結合は、アミノ酸と（またはアミノ酸及び−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−または−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）架橋の導入を可能にする官能基との任意の組み合わせにより生成することができる。いくつかの例としては、ジスルフィド、ジスルフィド模倣体、例えば−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）、ならびにエステル及びエーテルを含有する架橋である。これらの例では、ｎは任意の整数であり得るが、往々にして１０未満である。
【０１２８】
他の修飾は、例えば、Ｎ−アルキル（またはアリール）置換（ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタム及び他の環状構造を構築するための骨格架橋を含む。本開示の調節因子化合物の他の誘導体は、アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換されたアミドを含む、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、Ｏ−修飾誘導体（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、Ｎ末端修飾誘導体を含む。
【０１２９】
いくつかの場合では、ポリペプチドにおける１つまたは複数のＬ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸で置換される。
【０１３０】
いくつかの場合では、ポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である。Ｓｅｌａ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９。レトロ−インベルソペプチド類似体は、アミノ酸配列の方向が逆転し（レトロ）、Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を用いて、１つまたは複数のアミノ酸のキラリティ、Ｄ−またはＬ−が反転されている（インベルソ）直線状ポリペプチドの異性体である。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４、及びＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２を参照されたい。
【０１３１】
ポリペプチドは、脂質２重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜を横断するのを容易にする有機もしくは無機の化合物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または炭水化物を指す「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含み得る。別の分子に結合されたＰＴＤは、分子が膜を横断する、例えば、細胞外の空間から細胞内の空間へ、または細胞質ゾルから細胞小器官内へ行くのを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合的に連結され、一方、他の実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合的に連結される。例示的なタンパク質形質導入ドメインは、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（
0006272907.tif 000005
を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）、細胞への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ショウジョウバエタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）；
0006272907.tif 000006
；トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）
0006272907.tif 000007
を含むが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤは、これらに限定されないが、
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；３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含み；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、これらに限定されないが、次のうちのいずれかを含む：
0006272907.tif 000009
。
【０１３２】
ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）で、またはナトリウム、カリウム、もしくはカルシウム塩などの生理学的に許容されるアルカリまたはアルカリ土類塩の形態で存在し得る。カルボキシル基はまた、例えば、メタノール、分枝状もしくは非分枝状Ｃ１−Ｃ６−アルキルアルコール、例えば、エチルアルコールもしくはｔｅｒｔ−ブタノールなどの１級、２級、または３級アルコールでエステル化もされ得る。カルボキシル基はまた、アンモニア、分枝状もしくは非分枝状Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミン、またはＣ１−Ｃ６ジ−アルキルアミン、例えば、メチルアミンもしくはジメチルアミンなどの１級または２級アミンでアミド化もされ得る。
【０１３３】
ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離形態（Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝Ｈ）で、または例えば、塩化物もしくは酢酸塩などの生理学的に許容される塩の形態で存在し得る。アミノ基はまた、Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルであるように、酸でアセチル化もされ得る。アミノ基は、例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、またはＡｌｌｏｃなどのペプチド化学に従来使用されるアミノ保護基によって保護された形態で存在し得る。アミノ基は、Ｎ−アルキル化され得、Ｒ１及び／もしくはＲ２＝Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはＣ２−Ｃ８アルケニル、またはＣ７−Ｃ９アラルキルである。アルキル残基は、直鎖、分枝状、または環状（例えば、それぞれ、エチル、イソプロピル、及びシクロヘキシル）であり得る。
【０１３４】
ＧＤＦ１５機能を増強する及び／または模倣するための特定の修飾
ポリペプチドは、治療のために製剤化されるタンパク質において望ましい性質（例えば、血清半減期）を増強する、検出アッセイに使用するための抗体の発生を可能にする（例えば、エピトープタグ）、タンパク質精製の容易性を提供する、等の、１つまたは複数の修飾を含むことができる。そのような修飾は、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子またはその誘導体の共有結合）；グリコシル化（Ｎ−及びＯ−連結）；ポリシアル酸化；アルブミン融合；共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ融合タンパク質；及びＰＥＧ模倣体との融合を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
本明細書に記載されるように、本開示は、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５）、またはＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチド（例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５の変異タンパク質）を含む、融合分子を想定し、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチドは、そのアミノ酸配列を変更しない少なくとも１つの修飾を含み、修飾は、ポリペプチドまたは変異タンパク質ポリペプチドの少なくとも１つの物理的性質を改善する。一実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチド修飾は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））とのコンジュゲーションを含む。いくつかの実施形態では、物理的性質は、溶解度である。
【０１３６】
融合分子が、修飾されたＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチド（これらはいずれも、アルブミンとコンジュゲートしている）を含む実施形態では、融合分子の溶解度は、非コンジュゲート組換えヒトＧＤＦ１５に対して改善される。ある実施形態では、融合分子は、ｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。他の実施形態では、融合分子は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも５ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。他の実施形態では、融合分子は、ｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。特定の実施形態では、融合分子は、１０ｍｇ／ｍＬより大きい溶解度を有する。
【０１３７】
ペグ化：タンパク質治療薬の臨床的効果は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解を受けやすいことにより制限されることが多い。様々な治療用タンパク質（例えば、フィルグラスチム）の研究は、そのような困難が、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかにポリペプチド配列をコンジュゲートする、または連結する（例えば、典型的には、タンパク質と非タンパク質性ポリマー、例えば、ＰＥＧの両方に共有結合する連結部分を介して）ことを含む、様々な修飾により克服され得ることを示した。そのようなＰＥＧコンジュゲート生体分子は、良好な物理的及び熱的安定性、酵素分解への感受性に対する保護、溶解度の増加、より長いインビボ循環半減期、及びクリアランスの減少、免疫原性及び抗原性の減少、ならびに毒性の減少を含む、臨床的に有用な性質を保有することを示した。
【０１３８】
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに好適なＰＥＧは一般的に室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは、１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般的に１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされるＰＥＧは直線状または分枝状であり得る。分枝状ＰＥＧ誘導体、「ｓｔａｒ−ＰＥＧ」、及び多腕ＰＥＧが、本開示により想定される。本開示に使用されるＰＥＧの分子量は、任意の特定の範囲に限定されないが、ある実施形態は、５００〜２０，０００の分子量を有し、一方、他の実施形態は、４，０００〜１０，０００の分子量を有する。
【０１３９】
本開示は、コンジュゲートの組成物も想定し、ＰＥＧは異なるｎ値を有し、よって、様々な異なるＰＥＧが特定の割合で存在する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３、または４のコンジュゲートの混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１のコンジュゲートのパーセンテージは１８〜２５％であり、ｎ＝２のコンジュゲートのパーセンテージは５０〜６６％であり、ｎ＝３のコンジュゲートのパーセンテージは１２〜１６％であり、ｎ＝４のコンジュゲートのパーセンテージは最大５％である。そのような組成物は、当該技術分野に公知の反応条件及び精製方法により生成され得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィは、コンジュゲートを分離するために使用され得、次に、例えば所望の数のＰＥＧが結合された精製されたコンジュゲートを含有し、非修飾タンパク質配列及び他の数のＰＥＧが結合されたコンジュゲートを含まない画分が特定される。
【０１４０】
ＰＥＧは、末端反応基（「スペーサー」）を介して本開示のポリペプチドに結合され得る。スペーサーは、例えば、ポリペプチド配列及びポリエチレングリコールのうちの１つまたは複数の遊離アミノ基またはカルボキシル基間の結合を媒介する末端反応基である。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミドで活性化させることにより調製され得るＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合され得る別の活性化されたポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを塩化シアヌルと反応させることにより調製され得る２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合される活性化されたポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
【０１４１】
スペーサーを有するＰＥＧへの本開示のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数のコンジュゲーションは、様々な従来の方法により実行され得る。例えば、コンジュゲーション反応は、５〜１０のｐＨ、４℃〜室温の温度で、３０分〜２０時間の間、４：１〜３０：１の試薬 対 タンパク質のモル比を利用して、溶液中で実行され得る。反応条件は、主に所望の程度の置換の生成に向かって反応を方向付けるように選択され得る。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、及び短い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を減少させる傾向があり、一方、高温、中性〜高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、及び長い反応時間は、結合されるＰＥＧの数を増加させる傾向がある。反応を停止させるために、当該技術分野に既知の様々な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、反応は、反応混合物を酸性化し、かつ例えば−２０℃で凍結することにより停止する。
【０１４２】
本開示はＰＥＧ模倣体の使用も想定する。いくつかの追加の有利な性質を付与する一方で、ＰＥＧの特質（例えば、増強された血清半減期）を維持する組換えＰＥＧ模倣体が開発された。例として、ＰＥＧに類似する伸長した立体構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒを含む）は、既に関心のペプチドまたはタンパク質薬物に融合された状態で、組換えにより産生され得る（例えば、Ａｍｕｎｉｘ'ＸＴＥＮ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。これは、製造過程中にさらなるコンジュゲーションステップの必要性を取り除く。さらに、確立された分子生物学技法は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、免疫原性及び製造性質の最適化を可能にする。
【０１４３】
グリコシル化：本開示の目的のため、「グリコシル化」は、グリカンをタンパク質、脂質、または他の有機分子に結合する酵素過程を広く指すことを意味する。本開示と関連した用語「グリコシル化」の使用は、一般的に、１つまたは複数の炭水化物部分を付加する、または欠失させる（潜在するグリコシル化部位を除去することによるか、または化学及び／もしくは酵素手段によりグリコシル化を欠失させることによるかのいずれか）、ならびに／またはネイティブ配列に存在しても存在しなくてもよい１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。加えて、この句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び比率の変化を伴うネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０１４４】
グリコシル化は、タンパク質の物理的性質に劇的に影響を与える可能性があり、タンパク質の安定性、分泌、及び細胞内局在化にも重要であり得る。実際、本明細書に記載されるＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質関連ポリペプチドのグリコシル化は、それらの物理的性質に有益な改善を与える。例として、これに限定されないが、ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質の溶解度は、グリコシル化によって改善することができるが、そのような改善は、実質的であり得る（実施例を参照されたい）。そのような修飾されたＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質によって呈される溶解度の改善は、例えば、薬剤投与に対して、非グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質よりも好適な製剤の生成を可能にすることができる。グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチドはまた、増強された安定性を呈し得る。さらに、ポリペプチドは、半減期などの１つまたは複数の薬物動態性質を改善し得る。
【０１４５】
適切なグリコシル化は、生物学的活性に必須であり得る。実際、真核生物からのいくつかの遺伝子は、グリコシル化タンパク質の細胞過程を欠く細菌（例えば、大腸菌）において発現されるとき、それらのグリコシル化の欠失の理由により、ほとんど、または全く活性がなく回収されるタンパク質をもたらす。
【０１４６】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することにより達成され得る。ポリペプチドの変更は、例えば、１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ−連結グリコシル化部位に関して）、またはアスパラギン残基（Ｎ−連結グリコシル化部位に関して）の付加、またはそれによる置換により行うことができる。各種類に見られるＮ−連結及びＯ−連結オリゴ糖及び糖残基の構造は、異なってもよい。両方に一般的に見られる糖の種類の１つは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以後シアル酸と称する）である。シアル酸は、通常、Ｎ−連結及びＯ−連結オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負の電荷により、糖タンパク質に酸性の性質を付与することができる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成及び使用を含む。
【０１４７】
本開示のポリペプチド配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基でポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることにより、任意に変更することができる。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学または酵素結合による。炭水化物の除去は、化学的に、もしくは酵素的に、またはグリコシル化されるアミノ酸残基をコードするコドンの置換により達成され得る。化学的脱グリコシル化技法は公知であり、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素切断は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０１４８】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換え糖タンパク質の生成のために、一般的に使用される宿主細胞である。これらの細胞は、酵素β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってα−２，６連結におけるシアル酸を、これらの細胞で生成された糖タンパク質のＮ−連結オリゴ糖に付加しない。
【０１４９】
ポリシアル酸化：本開示はまた、ポリシアル酸化の使用、安定性及びインビボ薬物動態を改善するための、天然の生分解性α−（２→８）連結ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）へのペプチド及びタンパク質のコンジュゲーションも想定する。ＰＳＡは、高度に親水性である生分解性、非毒性の天然ポリマーであり、血中においてその血清半減期を増加させる大きな見かけ上の分子量を付与する。加えて、ペプチド及びタンパク質の治療薬の範囲のポリシアル酸化は、著しく減少したタンパク質分解、インビボ活性の維持、ならびに免疫原性及び抗原性の減少をもたらした（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ３００（１−２）：１２５−３０を参照されたい）。他のコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ）による修飾と同様に、部位特異的ポリシアル酸化の様々な技法が利用可能である（例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０８（１８）７３９７−７４０２（２０１１）を参照されたい）。
【０１５０】
融合タンパク質。本開示は、野生型成熟ＧＤＦ１５（例えば、ヒトＧＤＦ１５）の融合タンパク質、ならびに本開示のポリペプチド（例えば、修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ヒトＧＤＦ１５の変異タンパク質、修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質等）の融合タンパク質を想定する。そのような融合タンパク質は、概して、非ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）またはその断片：ＡＢＤ；Ｆｃポリペプチド；ＭＢＤから成り、本明細書において、野生型ＧＤＦ１５ポリペプチドまたは本開示のポリペプチドにそのＮ末端もしくはＣ末端でコンジュゲートされる、「融合パートナー」と称され得る。任意で、融合パートナーは、リンカーポリペプチドを介して、野生型ＧＤＦ１５またはポリペプチドにコンジュゲートされ得る。リンカーポリペプチドは、任意で、切断可能なリンカー、例えば、酵素的に切断可能なリンカーであり得る。融合パートナーの例は、本明細書において以下に記載される。
【０１５１】
アルブミン融合：コンジュゲーションのための追加の好適な成分及び分子としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンが挙げられる。
【０１５２】
約２０日の血清半減期を有する、成熟ＨＳＡ（図１Ｄを参照されたい）、５８５アミノ酸ポリペプチド（約６７ｋＤａ）は、主に、血液膠質浸透圧（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の維持、血液ｐＨ、ならびに多数の内因性及び外因性リガンドの輸送及び分布を担う。タンパク質は、３つの構造的に相同のドメイン（ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を有し、ほぼ完全にαヘリックスの構造にあり、１７のジスルフィド架橋により高度に安定化される。アルブミンの３つの主要な薬物結合領域は、サブドメイン内の３つのドメインＩＢ、ＩＩＡ、及びＩＩＩＡの各々に位置する。
【０１５３】
アルブミン合成は、肝臓で行われ、これは、短寿命の一次産物であるプレプロアルブミンを生成する。このため、全長ＨＳＡは、１８個のアミノ酸のシグナルペプチド
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、続いて、６個のアミノ酸のプロドメイン（ＲＧＶＦＲＲ；配列番号１６５）を有し、この２４個のアミノ酸残基のペプチドは、プレ−プロドメインと称され得る。ＨＳＡは、プレ−プロドメインとしてのその内因性シグナルペプチドを使用して、発現及び分泌され得る（図１Ｃを参照されたい）。代替的に、ＨＳＡは、成熟構築物（配列番号５のＤ２５〜Ｌ６０９）に融合されるＩｇＫシグナルペプチド（配列番号５３）を使用して発現及び分泌され得、本明細書に提示される実験データを生成するために使用された構築物において、内因性シグナルペプチドは、ヒトＩｇＫシグナルペプチドで置換され、内因性プロドメインは完全に除外された。同様に、プレプロアルブミンは、そのアミノ末端で、小胞体内腔において、素早く共翻訳的に切断されて、安定した６０９アミノ酸前駆体ポリペプチド、プロアルブミンを生成する（図１Ｃを参照されたい）。次いで、プロアルブミンは、ゴルジ装置へと通過し、ここで、それは、フューリン依存性アミノ末端切断により、５８５アミノ酸成熟アルブミンに変換される。特に記載のない限り、「アルブミン」または「成熟アルブミン」への言及は、ＨＳＡを指すことを意味する。
【０１５４】
アルブミンの一次アミノ酸配列、構造、及び機能は、アルブミン合成及び分泌のプロセスであるために、種にわたり高度に保存される。ＨＳＡと同等のアルブミン血清タンパク質は、例えば、カニクイザル、ウシ、イヌ、ウサギ、及びラットに見出される。非ヒト種のうち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＨＳＡに最も構造的に類似している。［例えば、Ｋｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９６（１１）：３１１７−２４（Ｎｏｖ  ２００７）を参照されたい］。本開示は、例えば、薬物開発プロセスにおいて上に記載されるものを含むが、これらに限定されない、非ヒト種からのアルブミンの使用を想定する。ある実施形態では、非ヒト種は、ウシである。他の実施形態では、非ヒト種は、カニクイザルである。
【０１５５】
本開示によると、アルブミンは、薬物分子（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド）のカルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端とアミノ末端の両方、および内部にコンジュゲートされ得る（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号及び米国特許第７，０５６，７０１号を参照されたい）。さらに、本開示は、２つ以上の同種（例えば、複数のＧＤＦ１５変異タンパク質分子）または異種（例えば、ＧＤＦ１５変異タンパク質分子及び別個の抗糖尿病薬剤）薬物分子を含む、アルブミン融合タンパク質を想定する。
【０１５６】
本開示により想定されるＨＳＡ−薬物分子コンジュゲートにおいて、アルブミン分泌プレ配列及びその変異体、その断片及び変異体、ならびにＨＳＡ変異体などの様々な形態のアルブミンが使用され得る。そのような形態は、概して、１つまたは複数の所望のアルブミン活性を有する。追加の実施形態では、本開示は、直接もしくは間接的にアルブミン、アルブミン断片、及びアルブミン変異体などに融合されるポリペプチド薬物分子を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、非融合薬物分子よりも高い血漿安定性を有する、及び／または融合タンパク質は、非融合薬物分子の治療活性を維持する。いくつかの実施形態では、間接的融合は、ペプチドリンカーまたはその修飾された型などのリンカーによってもたらされる。
【０１５７】
特定の実施形態では、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミン断片は、３０８アミノ酸ＧＤＦ１５前駆体ポリペプチドの１６７アミノ酸プロドメイン及び１１２アミノ酸成熟ドメインを含むポリペプチドにコンジュゲートされ、このため、本開示は、図１Ａ（配列番号１）に示される配列の約アミノ酸残基３０〜約アミノ酸残基３０８の長さを有するＧＤＦ１５ポリペプチドを想定する。
【０１５８】
本開示は、哺乳類組織培養からの分泌を付与するために適切な長さのシグナルペプチドを使用して、１６７アミノ酸プロドメインなしで、図１Ｂに示されるようなＧＤＦ１５の１１２アミノ酸成熟ドメインの直接発現及び産生を想定する。発現及び分泌を促進するために好適なシグナルペプチドの例としては、ＩｇＫが挙げられる。上に示されるように、当該技術分野は、他の適切なシグナルペプチドを特定することができる機構を説明している。
【０１５９】
また他の実施形態では、アルブミンは、薬物分子の発現のための細胞内シャペロンとして作用する。例えば、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）は、細胞に導入され得る。細胞導入は、当該技術分野において既知の任意の手段（例えば、遺伝子導入または電気穿孔）によることができる。発現されたＨＳＡ−ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質融合タンパク質は、任意で、リンカーを介してコンジュゲートされてもよい。好適なリンカーの例は、本明細書において記載される。いくつかの実施形態は、例えば、４〜６アミノ酸のペプチドリンカーを想定する。
【０１６０】
融合タンパク質がリンカーを含む実施形態では、リンカーは、非切断性リンカーであってもよい。例えば、一実施形態では、本開示は、ＨＳＡ前駆体アミノ酸配列が、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子を想定し（例えば、図１Ｇを参照されたい）、別の実施形態では、本開示は、成熟ＨＳＡアミノ酸配列が、非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子を想定する（例えば、図１Ｈを参照されたい）。
【０１６１】
融合タンパク質がリンカーを含む他の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。例えば、本開示は、ＨＳＡ前駆体アミノ酸配列が、プロテアーゼ感受性２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子を想定する（例えば、図１Ｅを参照されたい）。他の実施形態では、本開示は、成熟ＨＳＡアミノ酸配列が、プロテアーゼ感受性２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６）を介して、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合された、融合分子を想定する（例えば、図１Ｆを参照されたい）。
【０１６２】
ＨＳＡ−切断可能リンカー−成熟組換えＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質分子の構築物、ならびに成熟組換えＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質−切断可能リンカー−ＨＳＡ融合分子の構築物は、例えば、溶解度の評価、及びＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質のインビボ有効性の判定を容易にするために使用されてもよい。そのような実施形態では、ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質は、細胞内切断を通じて、またはインビトロ酵素切断を通じて、ＨＳＡシャペロンから切断され得る。いくつかの実施形態では、切断は、任意の実行可能プロテアーゼを使用した、切断可能なリンカーのタンパク質分解性消化によってもたらされる。他の実施形態では、ＧＤＦ１５変異タンパク質はまた、図１Ｂに示されるように、成熟１１２アミノ酸配列に融合されたシグナルペプチドの構築物を介して、非ＨＳＡ融合物として生成することができる。
【０１６３】
細胞内切断は、例えば、フューリンまたはカスパーゼによって酵素的に行われてもよい。細胞は、低レベルのそれらの内因性酵素を発現し、これは、融合分子の一部分を細胞内で切断することが可能であり、このため、ポリペプチドのうちのいくつかは、ＨＳＡにコンジュゲートされることなく細胞から分泌されるが、一方、ポリペプチドのうちのいくつかは、ＨＳＡを含む融合分子の形態で分泌される。本開示の実施形態は、様々なフューリン融合構築物の使用を想定する。例えば、配列
0006272907.tif 000011
を含む構築物が、設計されてもよい。そのような構築物は、以下の一般形態を有してもよい：Ｉｇｋ−ＨＳＡ（配列番号５のＤ２５〜Ｌ６０９）−２×（Ｇ４Ｓ）−フューリン配列−ｈＧＤＦ１５（配列番号１のＡ１９７〜Ｉ３０８）。
【０１６４】
本開示はまた、細胞外切断（すなわち、エクスビボ切断）を想定し、それにより、融合分子は、細胞から分泌され、精製に供され、次いで、切断される（例えば、例えば、因子Ｘａタンパク質分解感受性リンカーまたはエンテロキナーゼを使用して）。切断は、成熟ＧＤＦ１５もしくはＧＤＦ１５変異タンパク質からＨＳＡ−リンカー複合体全体、またはＨＳＡ−リンカー複合体全体未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ＨＳＡ−ｌｉｎｋｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を解離し得ることが理解される。
【０１６５】
上で示唆されるように、本開示の１つまたは複数のポリペプチドへのアルブミンの融合は、例えば、ＨＳＡをコードするＤＮＡまたはその断片が１つまたは複数のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに結合されるような遺伝的操作により達成され得る。その後、好適な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように、例えば、好適なプラスミドの形態の融合されたヌクレオチド配列で形質転換されるか、またはそれを遺伝子導入され得る。発現は、例えば、原核細胞もしくは真核細胞からインビトロで、または例えば、遺伝子導入生物からインビボでもたらされ得る。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳類の細胞系、例えば、ＣＨＯ細胞系において実施される。形質転換は、本明細書において、その外界から、及び細胞膜を通して取り込まれる外因性の遺伝的物質（外因性ＤＮＡ）の直接的な取り込み、組み込み、及び発現によって生じる細胞の遺伝的変更を指すように広く使用される。形質転換は、いくつかの細菌種において天然に生じるが、他の細胞において人工的な手段によってももたらされ得る。
【０１６６】
さらに、アルブミン自体は、その循環半減期を延長するように修飾され得る。修飾されたアルブミンの、１つまたは複数のポリペプチドへの融合は、上述の遺伝的操作法により、または化学的コンジュゲーションにより達成され得、得られた融合分子は、未修飾アルブミンとの融合物の半減期を超える半減期を有する。［国際公開第ＷＯ２０１１／０５１４８９号を参照されたい］。
【０１６７】
よく確立された技術プラットフォームが、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド）及び組換えアルブミンの遺伝的融合及び化学的コンジュゲーションのために存在する。例として、ＡＬＢＵＦＵＳＥ（登録商標）フレックスプラットフォーム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、１つまたは複数の組換えアルブミン分子の、１つまたは複数のポリペプチドへの遺伝的融合をもたらし、それにより、ポリペプチド及びアルブミンをコードする連続するｃＤＮＡを生成して、単一の同質のタンパク質を生成することができる。プラットフォームは、例えば、酵母及び哺乳類宿主発現系とともに使用することができる。さらなる例として、ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮ（登録商標）フレックスプラットフォーム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、アルブミンのいかなるさらなる誘導体化も伴わずに、組換えアルブミンへの本開示のポリペプチの化学的コンジュゲーションをもたらすことができる。コンジュゲーションは、いくつかのアミノ酸残基（例えば、リジン及びチロシン）において実施され得るが、Ｃｙｓ３４における遊離チオールは、より同質の最終生成物をもたらす部位特異性により、一般的な戦略である。
【０１６８】
代替的なアルブミン結合戦略：いくつかのアルブミン結合戦略が、共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）を含む、直接融合の代替物として開発されている。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるため、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドは、小タンパク質治療薬の半減期の延長に使用されている。例えば、承認された糖尿病の製品であるインスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｍｉｒ）（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、遺伝的に修飾されたインスリンにコンジュゲートされたミリスチル鎖を含み、長期作用インスリン類似体をもたらす。
【０１６９】
本開示はまた、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列、及び本明細書に記載されるポリペプチドの１つまたは複数の配列を含む、融合タンパク質を想定する。本明細書または文献に記載されるいずれのＡＢＤポリペプチド配列も、融合タンパク質の成分であり得る。融合タンパク質の成分は、任意で、本明細書に記載されるそれらのリンカーなどのリンカーを介して、共有結合させることができる。本開示の実施形態のうちのいくつかでは、融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＡＢＤポリペプチド配列、及びＣ末端部分としての本明細書に記載されるポリペプチドを含む。
【０１７０】
本開示はまた、アルブミン結合ポリペプチドの断片を含む融合タンパク質を想定し、断片は、実質的に、アルブミン結合を維持するか、または単量体単位としての少なくとも２つのアルブミン結合ポリペプチドもしくはそれらの断片を含む、アルブミン結合ポリペプチドもしくはそれらの断片の多量体を維持する。
【０１７１】
いかなる理論にも束縛されることを望むことなく、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＡＢＤポリペプチド配列に結合し、それにより、対象においてポリペプチドを隔離して、対象における作用の持続時間の増加を導くと考えられる。
【０１７２】
ＡＢＤ及び関連技術の一般考察に関しては、国際公開第ＷＯ２０１２／０５０９２３号、第ＷＯ２０１２／０５０９３０号、第ＷＯ２０１２／００４３８４号、及び第ＷＯ２００９／０１６０４３号を参照されたい。
【０１７３】
マルトース結合タンパク質とのまたはその断片との融合タンパク質：本開示はまた、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはその断片、及び本明細書に記載されるポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質を想定する。いくつかの実施形態では、ＭＢＰ断片は、マルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む。本明細書に記載される、または当該技術分野において既知のいずれのＭＢＰ、またはその断片、またはＭＢＤポリペプチド配列も、本開示の融合タンパク質の成分であり得る。融合タンパク質の成分は、任意で、本明細書に記載されるそれらのリンカーなどのリンカーを介して、共有結合させることができる。本開示の実施形態のうちのいくつかでは、融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＭＢＰ、またはその断片、またはＭＢＤポリペプチド配列、及びＣ末端部分としての本明細書に記載されるポリペプチドを含む。
【０１７４】
本開示はまた、ＭＢＰもしくはＭＢＤポリペプチドの断片を含む融合タンパク質を想定し、断片は、実質的に、マルトース結合活性を維持するか、または単量体単位としての少なくとも２つのマルトース結合ポリペプチドもしくはその断片（例えば、２つ以上のＭＢＤポリペプチド）を含む、マルトース結合ポリペプチドもしくはその断片の多量体（例えば、ＭＢＤの多量体）を維持する。
【０１７５】
ＭＢＰ及びＭＢＤならびに関連技術の一般考察に関しては、例えば、Ｋａｐｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ８（８）：１６６８−７４を参照されたい。
【０１７６】
Ｆｃ融合タンパク質
本開示はまた、Ｆｃポリペプチドまたはその断片、ならびに本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、修飾されたヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異タンパク質、及び修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質（ｍｕｔｉｅｉｎｓ））の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質を想定する。本明細書に記載される、または当該技術分野において既知のいずれのＦｃポリペプチド配列も、本開示の融合タンパク質の成分であり得る。融合タンパク質の成分は、任意で、本明細書に記載されるそれらのリンカーなどのリンカーを介して、共有結合させることができる。本開示の実施形態のうちのいくつかでは、融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＦｃポリペプチド配列、及びＣ末端部分としての本明細書に記載されるポリペプチドを含む。
【０１７７】
本開示はまた、Ｆｃポリペプチド融合パートナー、及びそのようなものを含む融合タンパク質を想定し、Ｆｃポリペプチド融合パートナーは、荷電Ｆｃ対の１つのパートナーに修飾される。「荷電Ｆｃ対のパートナー」は、（ｉ）「負荷電」Ｆｃ配列（任意でヒンジ領域を欠く）、及び荷電対突然変異を含むこと、または（ｉｉ）「正荷電」Ｆｃ配列（任意でヒンジ領域を欠く）、及び荷電対突然変異を含むことを指す。「正荷電」及び「負荷電」は、Ｆｃ配列における荷電対突然変異の性質を説明するための言及の容易性のために本明細書において使用され、全体の配列または構築物が正または負荷電を必ず有することを示すわけではない。本開示のポリペプチド構築物（例えば、ＧＤＦ１５変異タンパク質、修飾されたＧＤＦ１５変異タンパク質）における使用に好適な荷電Ｆｃアミノ酸配列は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号に記載される。
【０１７８】
正荷電Ｆｃ（「Ｆｃ（＋）」）の例としては、ヒンジ領域を欠くＦｃ配列のアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ）−リジン突然変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタミン酸−リジン突然変異（Ｄ３９９Ｋ）を含むＦｃが挙げられる。負荷電Ｆｃ（「Ｆｃ（−）」）の例としては、ヒンジ領域を欠くＦｃ配列における２つのリジン−アスパラギン酸突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含むＦｃが挙げられる。Ｃ末端リジン（Ｋ４７７）もまた、任意で欠失されてもまたよい。Ｆｃ（＋）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ変異タンパク質融合タンパク質）、及びＦｃ（−）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（−）ＧＤＦ変異タンパク質融合タンパク質）ＧＤＦ変異タンパク質がともにインキュベートされる時、アスパラギン酸残基は、静電気力を通じてリジン残基と会合し、ポリペプチド融合タンパク質のＦｃ（＋）とＦｃ（−）配列との間のＦｃヘテロ２量体の形成を促進する。
【０１７９】
本開示はまた、「ヘミ」または「ヘミＦｃ」構築物と指定される構築物を想定し、これは、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続するリンカーによって、縦に並んで接合された２つのＦｃ配列を含む。いくつかの実施形態では、単量体は、ＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する第１のリンカーによって、第１のＦｃ配列に連結されたポリペプチド（例えば、修飾された成熟ＧＤＦ１５または変異タンパク質ＧＤＦ１５）配列を含み、第１のＦｃ配列は、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続する第２のリンカーによって、第２のＦｃ配列に連結されている。第１及び第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって会合される。２つのそのような単量体は、会合して、２量体を形成し、その中で、単量体は、２つのポリペプチド配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結される。本開示のＧＤＦ変異タンパク質との使用に好適なヘミＦｃポリペプチドの例に関しては、国際公開第ＷＯ２０１３／１１３００８号を参照されたい。
【０１８０】
本開示はまた、荷電Ｆｃ対（例えば、Ｆｃの多量体）のパートナーを含む、Ｆｃポリペプチドまたはその断片の多量体を有する、融合タンパク質を想定する。
【０１８１】
他の分子とのコンジュゲーション：コンジュゲーションのための追加の好適な成分及び分子は、例えば、チログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリアミノ酸（ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）など）；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスヌクレオタンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ならびにＢ型肝炎コアタンパク質及び表面抗原、または前述の任意の組み合わせを含む。
【０１８２】
このため、本開示は、別のタンパク質（例えば、対象タンパク質とは異種であるアミノ酸配列を有するタンパク質）などのポリペプチド配列のＮ末端及び／もしくはＣ末端での、１つもしくは複数の追加の成分もしくは分子、または担体分子のコンジュゲーションを想定する。よって、例示的なポリペプチド配列は、別の成分または分子とのコンジュゲートとして提供され得る。
【０１８３】
コンジュゲート修飾は、第２の分子のさらなるもしくは相補的な機能または活性を伴う活性を維持するポリペプチド配列をもたらすことができる。例えば、ポリペプチド配列は、例えば、溶解度、貯蔵、インビボもしくは保存半減期（ｓｈｅｌｆ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）または安定性、免疫原性の減少、インビボでの遅延または制御された放出等を促進するように、分子にコンジュゲートされてもよい。他の機能または活性は、非コンジュゲートポリペプチド配列に対して毒性を減少させるコンジュゲート、非コンジュゲートポリペプチド配列より効率的にある種類の細胞もしくは臓器を標的とするコンジュゲート、または本明細書に記載される障害もしくは疾患（例えば、糖尿病）に関連する原因もしくは作用にさらに対抗する薬物を含む。
【０１８４】
ポリペプチドは、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリマー性アミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活性化されたウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子からのトキソイドなどの不活性化された細菌性毒素；不活性化された細菌；及び樹状細胞などの、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子にもコンジュゲートされ得る。そのようなコンジュゲートされた形態は、所望される場合、本開示のポリペプチドに対して抗体を生成するように使用され得る。
【０１８５】
コンジュゲーションのためのさらなる候補成分及び分子は、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例としては、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体（例えば、プラスチックもしくはポリスチレンのビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験片、及び膜を含む）を含む分子などの結合分子が挙げられる。
【０１８６】
カチオン交換クロマトグラフィなどの精製方法は、コンジュゲートをそれらの様々な分子量に効率的に分離する電荷の差によってコンジュゲートを分離するために使用され得る。例えば、カチオン交換カラムは、充填され、次に約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約４で洗浄され、次に約３〜５．５のｐＨ、例えば、ｐＨ約４．５で緩衝された（０Ｍ〜０．５Ｍ）ＮａＣｌの直線的な濃度勾配で溶出され得る。カチオン交換クロマトグラフィによって得られた画分の内容物は、例えば、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの従来の方法、または分子量により分子実体を分離するための他の公知の方法を用いて、分子量により特定され得る。
【０１８７】
Ｆｃ融合分子：ある実施形態では、本開示のポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端は、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合されて、融合コンジュゲート（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合コンジュゲートは、生物製剤の全身半減期を増加することが示され、よって、生物製剤製品は、頻繁な投与をあまり必要としない可能性がある。
【０１８８】
Ｆｃは、血管を覆う内皮細胞の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合によりＦｃ融合分子は分解から保護され、循環内に再放出され、分子をより長く循環内に保つ。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を維持する機構であると考えられる。より最近のＦｃ融合技術は、従来のＦｃ融合コンジュゲートと比較して、生物薬剤の薬物動態及び薬力学の性質を最適化するために、生物薬剤の単一コピーを抗体のＦｃ領域に連結する。
【０１８９】
他の修飾：本開示は、現在既知である、または将来開発される、１つまたは複数の性質を改善するためのポリペプチドの他の修飾の使用を想定する。循環半減期を延長する、安定性を増加させる、クリアランスを減少させる、または本開示のポリペプチドの免疫原性もしくは抗原性を変更するためのそのような方法の１つは、分子の特性を修飾するために、他の分子に連結されたヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用するＨＥＳ化によるポリペプチド配列の修飾を伴う。ＨＥＳ化の様々な態様は、例えば、米国特許出願第２００７／０１３４１９７号及び第２００６／０２５８６０７号に記載されている。
【０１９０】
本開示はまた、融合タグとしてのＳＵＭＯを含む融合分子を想定する（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）。本明細書に記載されるポリペプチドのＳＵＭＯへの融合は、発現の増強、溶解度の改善、及び／または精製方法の開発の支援を含む、ポリペプチドへのいくつかの有益な効果をもたらし得る。ＳＵＭＯプロテアーゼは、ＳＵＭＯの三次構造を認識し、ＳＵＭＯのＣ末端で融合タンパク質を切断し、よって、所望のＮ末端アミノ酸を伴う本明細書に記載されるポリペプチドを放出する。
【０１９１】
リンカー：リンカー及びそれらの使用は、上に記載されている。本開示のポリペプチド配列を修飾するために使用される前述の成分及び分子のいずれも、リンカーを介して任意にコンジュゲートされ得る。好適なリンカーは、一般的に、修飾されたポリペプチド配列と連結された成分及び分子との間のある程度の移動を可能にするのに十分な長さのものである「柔軟なリンカー」を含む。リンカー分子は一般的に、約６〜５０個の原子の長さである。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。好適なリンカーは、容易に選択することができ、１（例えば、Ｇｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）などの任意の好適な長さであり得る。
【０１９２】
例示的な柔軟なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ、及びＧＧＧＳｎ、ここで、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び他の柔軟なリンカーを含む。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造不定であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能することができる。例示的な柔軟なリンカーは、
0006272907.tif 000012
を含むが、これらに限定されない。
【０１９３】
いくつかの場合では、リンカーは、切断可能なリンカー、例えば、酵素的に切断可能なリンカーである。他の場合では、リンカーは、非切断性リンカー、例えば、インビボで通常の生理学的条件下で酵素的に切断されないリンカーである。
【０１９４】
好適なリンカーの例は、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは、１〜約１０の整数である）（配列番号１８７）（例えば、ｎ＝３）；
0006272907.tif 000013
（ここで、ｎは、１〜約１０の整数である）（配列番号１９０）（例えば、ｎ＝３）を含む。
【０１９５】
例えば、タンパク質分解的に切断可能な架橋剤は、マトリクスメタロプロテイナーゼ切断部位、例えば、コラゲナーゼ−１、−２、及び−３（ＭＭＰ−１、−８、及び−１３）、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及び−９）、ストロメライシン１、２、及び３（ＭＭＰ−３、−１０、及び−１１）、マトリリシン（ＭＭＰ−７）、ならびに膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰの切断部位であり得る。例えば、ＭＭＰ−９の切断配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（ここで、Ｘは任意の残基を表す；Ｈｙ、疎水性残基）（配列番号１９１）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（配列番号１９２）、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号１９３）、またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（配列番号１９４）である。プロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノーゲンアクチベーター切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の具体的な例は、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列を含む。別の例は、トロンビン切断部位、例えば、
0006272907.tif 000014
である。プロテアーゼ切断部位を含む追加の好適なリンカーは、以下のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数を含むリンカーを含む：１）カテプシンＢによって切断される
0006272907.tif 000015
；エプスタイン・バーウイルスプロテアーゼによって切断される
0006272907.tif 000016
；ＭＭＰ−３（ストロメライシン）によって切断される
0006272907.tif 000017
；ＭＭＰ−７（マトリリシン）によって切断される
0006272907.tif 000018
；ＭＭＰ−９によって切断される
0006272907.tif 000019
；サーモリシン様ＭＭＰによって切断される
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；マトリクスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）によって切断される
0006272907.tif 000021
；カテスピン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｌによって切断される
0006272907.tif 000022
；カテプシンＤによって切断される
0006272907.tif 000023
；マトリクスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）によって切断される
0006272907.tif 000024
；ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターによって切断される
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；膜型１マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）によって切断される
0006272907.tif 000026
；ストロメライシン３（もしくはＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ、及びストロメライシン−１によって切断される
0006272907.tif 000027
；マトリクスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ−３）によって切断される
0006272907.tif 000028
；組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）によって切断される
0006272907.tif 000029
；ヒト前立腺特異的抗原によって切断される
0006272907.tif 000030
；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断される
0006272907.tif 000031
；好中球エラスターゼによって切断される
0006272907.tif 000032
；ならびにカルパイン（カルシウム依存性中性プロテアーゼ）によって切断される
0006272907.tif 000033
。
【０１９６】
ポリペプチドの生成方法
本開示のポリペプチドは、組換え方法及び非組換え方法（例えば、化学合成）を含む任意の好適な方法により生成され得る。
【０１９７】
Ａ．化学合成
ポリペプチドが化学的に合成される場合、液相または固相を介して合成を続行することができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然のアミノ酸及び／またはペプチド／タンパク質骨格の修飾の組み込みを可能にする。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃなどのＳＰＰＳの様々な形態は、本開示のポリペプチドの合成に利用可能である。化学合成の詳細は当該技術分野において既知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０；及びＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【０１９８】
固相ペプチド合成は、以下に記載されるように実施され得る。α官能基（Ｎα）及び任意の反応性側鎖は、酸不安定性基または塩基不安定性基で保護される。保護基は、連結アミド結合の条件下で安定しているが、形成されたペプチド鎖を損なうことなく容易に切断され得る。α−アミノ官能基に好適な保護基は、次を含むがこれらに限定されない：ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）等。
【０１９９】
好適な側鎖保護基は、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣＩＺ）、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３−６−トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリル、及びトリチル（Ｔｒｔ）を含むが、これらに限定されない。
【０２００】
固相合成では、Ｃ末端アミノ酸は好適な支持体材料に結合される。好適な支持体材料は、試薬ならびに段階的凝縮の反応条件及び合成過程の切断反応に対して不活性であるもの、ならびに使用される反応媒質に溶解しないものである。市販の支持体材料の例としては、反応基及び／もしくはポリエチレングリコールで修飾されたスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、ヒドロキシメチル化もしくはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー等が挙げられる。ペプチド酸を調製することが意図される場合、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン、または４−ベンジルオキシベンジル−アルコール（Ｗａｎｇ−アンカー）で誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、または２−クロロトリチルクロリドが使用され得る。ペプチドアミドの場合、ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン、または５−（４'−アミノメチル）−３'，５'−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−アンカー）もしくはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）が使用され得る。
【０２０１】
ポリマー支持体への連結は、室温または高温（例えば、４０℃〜６０℃）、及び例えば、２〜７２時間の反応時間で、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、または類似する溶媒中の活性化試薬の添加により、Ｃ末端Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を支持体材料と反応させることにより達成され得る。
【０２０２】
Ｎα保護されたアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）のＰＡＬ、ＷａｎｇもしくはＲｉｎｋアンカーへの結合は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在下または同様に不在下で、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）もしくは他のカルボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）もしくは他のウロニウム塩、ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）もしくは他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミド、もしくはオキシムなどの結合試薬の補助により、例えば、ＨＯＢｔの添加によるＴＢＴＵの補助により、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン、もしくはＮ−メチルモルホリンなどの塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミンを添加して、または添加することなく、２〜７２時間の反応時間で（例えば、１．５〜３倍過剰のアミノ酸及び結合試薬で３時間、例えば、２倍過剰で、約１０℃〜５０℃の温度、例えば、２５℃で、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、またはジクロロメタンなどの溶媒中、例えば、ジメチルホルムアミド中で）実行され得る。
【０２０３】
結合試薬の代わりに、上述の条件下で、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニル等）、Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物、または酸フッ化物を使用することも可能である。
【０２０４】
Ｎα保護されたアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、１０〜１２０分、例えば、２０分の反応時間で、ＤＩＥＡの添加により、ジクロロメタン中の２−クロロトリチル樹脂に結合され得るが、この溶媒及びこの塩基の使用に限定されない。
【０２０５】
保護されたアミノ酸の連続結合は、ペプチド合成の従来の方法に従い、典型的には自動ペプチド合成機において実行され得る。例えば、ジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％〜５０％）で５〜２０分、例えば、ＤＭＦ中の５０％のピペリジンで２×２分、及びＤＭＦ中の２０％のペリジンで１×１５分で処理することによる、固相上に結合されたアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基の切断後、３〜１０倍過剰、例えば、１０倍過剰の次の保護されたアミノ酸が、約１０℃〜５０℃、例えば、２５℃の温度で、ジクロロメタン、ＤＭＦ、またはその２つの混合物などの不活性で非水性の極性溶媒中で前のアミノ酸に結合される。第１のＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、Ｗａｎｇ、またはＲｉｎｋアンカーへ結合するための前述の試薬は、結合試薬として適している。保護されたアミノ酸の活性エステル、または塩化物、もしくはフッ化物、またはそれらの対称無水物も代替物として使用することができる。
【０２０６】
固相合成の終わりに、ペプチドは支持体材料から切断され、同時に側鎖保護基を切断する。切断は、５％〜２０％Ｖ／Ｖのジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノール、または水などのスカベンジャーの添加により、例えば、１５％ｖ／ｖのジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１の添加により、０．５〜３時間以内、例えば、２時間、トリフルオロ酢酸または他の強酸媒質を用いて実行され得る。完全に保護された側鎖を有するペプチドは、２−クロロトリチルアルコールを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で切断することによって得られる。保護されたペプチドはシリカゲルによるクロマトグラフィにより精製され得る。ペプチドがＷａｎｇアンカーを介して固相に連結される場合、及びそれがＣ末端アルキルアミド化によって得ることが意図される場合、切断はアルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを用いたアミノリシスによって実行され得る。アミノリシスは、約−１０℃〜５０℃（例えば、約２５℃）の温度、及び約１２〜２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で実行される。加えて、ペプチドは、例えば、メタノールを用いた再エステル化により支持体から切断され得る。
【０２０７】
得られた酸性溶液は、ペプチドを沈殿させ、したがってエーテルに残っているスカベンジャー及び切断された保護基を分離するために、３〜２０倍量の氷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば、１０倍過剰のジエチルエーテルと混合され得る。さらなる精製は、氷酢酸から数回ペプチドを再沈殿させることにより実行され得る。得られた沈殿物は、水もしくはｔｅｒｔ−ブタノールまたはその２つの溶媒の混合物、例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール／水の１：１の混合物に吸収され、凍結乾燥され得る。
【０２０８】
得られたペプチドは、酢酸塩形態の弱塩基性樹脂に対するイオン交換、非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）による疎水性吸着クロマトグラフィ、シリカゲルによる吸着クロマトグラフィ、例えば、カルボキシメチルセルロースによるイオン交換クロマトグラフィ、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５による分配クロマトグラフィ、向流分配クロマトグラフィ、または高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、例えば、オクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相による逆相ＨＰＬＣを含む、様々なクロマトグラフ法により精製され得る。
【０２０９】
Ｂ．組換え生成
ポリペプチドが組換え技法を用いて生成される場合、ポリペプチドは、任意の好適な構築物、及び細菌（例えば、大腸菌）または酵母宿主細胞などの、それぞれ、原核細胞または真核細胞であり得る任意の好適な宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質として、または分泌タンパク質として生成され得る。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び／または植物細胞が挙げられる。哺乳類宿主細胞が使用される場合、それらは、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９、及びＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）、霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７、及びＣＶ１）、及びハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含み得る。
【０２１０】
ポリペプチドの発現に好適な様々な宿主−ベクター系が当該技術分野に公知の標準的な手順に従い採用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照されたい。遺伝子材料を宿主細胞に導入するための方法は、例えば、形質転換、電気穿孔、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法等を含む。トランスファーのための方法は、導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定した発現を提供するように選択され得る。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性のエピソームエレメント（例えば、プラスミド）として提供されるか、またはゲノムに統合され得る。関心のポリペプチドの生成に使用するための様々な適切なベクターは商業的に入手可能である。
【０２１１】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供するか、または宿主細胞のゲノムへの統合を提供することができる。発現ベクターは転写及び翻訳の制御配列を提供し、コード領域が転写開始領域ならびに転写及び翻訳の停止領域の転写制御下で機能的に連結されている場合、誘導性または構成的発現を提供することができる。一般に、転写及び翻訳の制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的または誘導性のいずれかであり得、強い構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
【０２１２】
発現構築物は一般的に、関心のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列付近に位置する簡便な制限部位を有する。発現宿主において作動的な選択可能なマーカーは、ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために存在し得る。さらに、発現構築物はさらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有し得、よって、発現のために生物、例えば、哺乳類または昆虫の細胞において、ならびにクローン化及び増幅のために原核宿主においてそれを維持することが可能である。加えて、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る。選択可能な遺伝子は当該技術分野において公知であり、使用される宿主細胞により変動する。
【０２１３】
タンパク質の単離及び精製は、当該技術分野において公知の方法に従い達成され得る。例えば、タンパク質は、タンパク質を構成的に及び／または誘導時に発現するように遺伝的に修飾された細胞の可溶化液から、またはサンプルを抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的に結合した材料を除去するために洗浄し、特異的に結合したタンパク質を溶出することを一般的に伴う免疫親和性精製による合成反応混合物から単離され得る。単離されたタンパク質は、透析及びタンパク質精製方法に通常採用される他の方法によりさらに精製され得る。一実施形態では、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィ方法を用いて単離され得る。タンパク質は、単離を容易にするために修飾を含有し得る。
【０２１４】
ポリペプチドは、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製され得る。ポリペプチドは、存在し得る他の成分に対して（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）、ポリペプチドに関して濃縮された組成物中に存在し得る。例えば、精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在するように提供され得、例えば、組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が他の発現タンパク質で構成されている。
【０２１５】
抗体
本開示は、ＧＤＦ１５ポリペプチド、例えば、本開示のＧＤＦ１５変異タンパク質に特異的に結合する単離された抗体を含む抗体を提供する。用語「抗体」は、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ）'２を含む抗体結合断片を包含するが、但し、それらが所望の生物学活性を呈することを条件とする。基本的な全抗体構造単位は４量体を含み、各４量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。対照的に、各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒトの軽鎖はκ及びλとして分類され、一方、ヒトの重鎖はμ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体のアイソフォームを定義する。結合断片は、組換えＤＮＡ技法により、または無傷抗体の酵素もしくは化学切断により生成される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、及び単鎖抗体を含む。
【０２１６】
各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そのもう一方の端に定常ドメインを有し、この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。軽鎖及び重鎖内の可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。抗体の鎖はすべて、同じ一般構造である、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を呈する。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、特定のエピトープに結合することができる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。
【０２１７】
無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は２つの結合部位を有し、２機能性または２重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同一である。２重特異性または２機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対、及び２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。２重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ'断片の連結を含む様々な方法により生成され得る。
【０２１８】
上述のように、結合断片は、無傷抗体の酵素または化学切断により生成され得る。抗体の酵素パパインによる消化は、「Ｆａｂ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片、及び抗原結合活性を有しない「Ｆｃ」断片をもたらす。抗体の酵素ペプシンによる消化は、抗体分子の２つの腕が連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ'）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ'）２断片は抗原を架橋する能力を有する。
【０２１９】
本明細書で使用される、用語「Ｆａｂ」とは、軽鎖の定常ドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとを含む抗体の断片を指す。
【０２２０】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」とは、抗原認識及び抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。２本鎖Ｆｖ種において、この領域は非共有結合会合において１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの２量体を含む。単鎖Ｆｖ種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種に類似する「２量体」構造において会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのはこの構成である。集合的に６つのＣＤＲは抗体に対して抗原結合特異性を付与するが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的である３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０２２１】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、特定のリガンドに接触し、その特異性を決定する免疫受容体の一部を指す。
【０２２２】
用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に、ＣＤＲからのアミノ酸残基、及び／または「超可変ループ」からのそれらの残基を含む。
【０２２３】
本明細書で使用される、用語「エピトープ」とは、タンパク質抗原上の抗体の結合部位を指す。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面分類、ならびに特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を含む。抗体は、解離定数が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、または≦１０ｎＭであるとき、抗体に結合すると言われている。平衡定数（「ＫＤ」）の増加は、エピトープと抗体との間の親和性が低いことを意味し、一方、平衡定数の低下は、エピトープと抗体との間の親和性が高いことを意味する。ある量を「超えない」ＫＤを有する抗体は、抗体が所与のＫＤでまたはそれより強くエピトープに結合することを意味する。ＫＤはエピトープ及び抗体の結合特性を説明するが、「効力」は抗体の機能に関する抗体自体の有効性を説明する。平衡定数と効力との間に必ずしも相関がある必要はなく、よって、例えば、比較的低いＫＤは、自動的に高い効力を意味するわけではない。
【０２２４】
抗体に関して、用語「選択的に結合する」とは、抗体が単一の物質にのみ結合することを意味するのではなく、むしろ第１の物質に対する抗体のＫＤが第２の物質に対する抗体のＫＤより低いことを意味する。エピトープにのみ排他的に結合する抗体はその単一エピトープに結合する。
【０２２５】
ヒトに投与されるとき、げっ歯類（すなわち、マウスまたはラット）可変及び／または定常領域を含有する抗体は時折、例えば、身体からの迅速なクリアランス、または抗体に対する身体による免疫応答の発生に関連する。げっ歯類由来の抗体の利用を避けるために、完全ヒト抗体は、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、げっ歯類へのヒト抗体機能の導入を通じて生成され得る。本明細書において特に特定されない限り、「ヒト」及び「完全ヒト」抗体は互換的に使用され得る。用語「完全ヒト」は、部分的にのみヒトである抗体を、全く、または完全にヒトである抗体と識別するときに有用であり得る。当業者は、完全ヒト抗体を生成する様々な方法を分かっている。
【０２２６】
可能なヒト抗マウス抗体応答に対処するために、キメラまたはさもなければヒト化抗体が利用され得る。キメラ抗体は、ヒト定常領域及びマウス可変領域を有し、したがって、ヒト抗キメラ抗体応答が一部の患者において観察され得る。したがって、ありうるヒト抗マウス抗体応答またはヒト抗キメラ抗体応答を避けるために、多量体酵素に対する完全ヒト抗体を提供することが有利である。
【０２２７】
完全ヒトモノクローナル抗体は、例えば、当業者に既知の技法により、ハイブリドーマ細胞系を生成することにより調製され得る。他の調製方法は、ＣＨＯ細胞などの好適な哺乳類宿主細胞の形質転換のための、特定の抗体をコードする配列の使用を伴う。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクターの中）にパッケージングし、ウイルス（またはベクター）を宿主細胞に形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞の中に導入するための任意の既知の方法により、または当該技術分野に公知の遺伝子導入手順により行うことができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞の中に導入するための方法は当該技術分野において周知であり、デキストラン媒介遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソーム内への封入、及びＤＮＡの核内への直接微量注入を含む。発現の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当該技術分野において周知であり、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、及びヒト肝細胞癌細胞を含むが、これらに限定されない。
【０２２８】
抗体は本開示のポリペプチドを検出するために使用され得る。例えば、抗体は、検出されたレベルを、標準的な対照レベルまたは前に決定された対象のベースラインレベル（例えば、任意の病気前）のいずれかと比較することにより、対象の本開示の１つまたは複数のポリペプチドのレベルを検出することにより診断法として使用され得る。
【０２２９】
本開示の別の実施形態は、１つまたは複数のヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）の使用を伴う。ｄＡｂは、ヒト抗体（ＩｇＧ）の最も小さい機能結合単位であり、好ましい安定性及び溶解度特性を有する。本技術は、ＨＳＡにコンジュゲートされたｄＡｂ（それによって、「ＡｌｂｕｄＡｂ」を形成する、例えば、欧州特許第ＥＰ１５１７９２１Ｂ号、国際公開第ＷＯ２００５／１１８６４２号及び第ＷＯ２００６／０５１２８８号を参照）、及び関心の分子（例えば、本開示のポリペプチド配列）を伴う。ＡｌｂｕｄＡｂは、細菌または酵母などの菌発現系において製造するのがポリペプチドの血清半減期を延長するために使用される現在の技術より小さく、簡単であることが多い。ＨＳＡは約３週間の半減期を有するため、得られたコンジュゲート分子は関心の分子の半減期を改善する。ｄＡｂ技術の使用は、関心の分子の有効性も増強することができる。
【０２３０】
治療的及び予防的使用
本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはその組成物を投与することにより、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、グルコース代謝障害、肥満、及び他の体重障害、ならびに他の代謝及び代謝関連の疾患、障害、及び状態を処置する、または予防するための方法を提供する。そのような方法は、例えば、症状の重篤度または頻度を減少させることにより、疾患、障害、または状態に関連する１つまたは複数の症状に対して有利な作用も有し得る。
【０２３１】
対象が、本明細書に提供される方法による高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、及び／もしくはグルコース障害の処置または予防の候補であり得るか否かを決定するために、当該技術分野に公知の様々な診断方法が利用され得る。そのような方法は、本明細書の別の箇所に記載されるもの（例えば、空腹時の血漿グルコース（ＦＰＧ）の評価及び経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ））を含む。
【０２３２】
対象が、本明細書に提供される方法による体重障害（例えば、肥満）の処置または予防の候補であり得るか否かを決定するために、これらに限定されないが、対象の状態の原因及び程度（例えば、対象が参照の健康な個体と比較してどのくらい体重超過であるか）などのパラメータが評価されるべきである。例えば、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は、体重超過（前肥満）とみなすことができ、一方約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は、肥満とみなすことができる。体重超過である、及び／または食事に問題がある（例えば、脂肪及びカロリーが高い食事）対象に関して、本開示のポリペプチドのうちの１つまたは複数を含む治療過程を開始する前に、変更された食事習慣及び／または運動レジメンを最初に実施し、それらの作用を評価することが一般的である。本明細書に論じられるように、ポリペプチドは食欲の抑制をもたらすことができる。
【０２３３】
薬学的組成物
本開示の調節因子（例えば、ポリペプチド）は、対象に投与するのに適した組成物の形態であり得る。一般に、そのような組成物は、１つもしくは複数の調節因子、及び１つもしくは複数の薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む「薬学的組成物」である。ある実施形態では、調節因子は治療的に許容される量で存在する。薬学的組成物は、本開示の方法において使用され得、よって、例えば、薬学的組成物は、本明細書に記載される治療法及び予防法ならびに使用を実践するために、エクスビボまたはインビボで対象に投与され得る。
【０２３４】
本開示の薬学的組成物は、意図される方法または投与経路に適合するように製剤化され得、例示的な投与経路は本明細書に記載される。さらに、薬学的組成物は、本開示により想定される疾患、障害、及び状態を処置する、または予防するために、本明細書に記載される、他の治療的に活性な薬剤または化合物（例えば、グルコース低下剤）と組み合わせて使用され得る。
【０２３５】
薬学的組成物は、典型的には、治療有効量の本開示により想定される調節因子のうちの少なくとも１つ（例えば、ポリペプチド）と、１つまたは複数の薬学的及び生理学的に許容される製剤用薬剤とを含む。好適な薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及び重硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルもしくはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、洗剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤、及び／またはアジュバントを含むが、これらに限定されない。例えば、好適なビヒクルは、生理食塩溶液またはクエン酸緩衝食塩水であってよく、可能であれば非経口投与用の薬学的組成物に一般的な他の材料が補充される。さらなる例示的なビヒクルは、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水である。当業者は、薬学的組成物及び投与形態に使用することができる様々な緩衝剤を容易に認識するだろう。典型的な緩衝剤は、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。例として、緩衝剤の成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの塩などの水溶性材料であり得る。許容される緩衝剤は、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む。
【０２３６】
薬学的組成物が製剤化された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水、もしくは凍結乾燥された粉末として減菌バイアルに保管され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要とする液体形態、または他の許容される形態のいずれかで保管され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単回使用容器（例えば、単回使用バイアル、アンプル、シリンジ、または自動注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似する））で提供され、一方、多回使用容器（例えば、多回使用バイアル）は他の実施形態において提供される。任意の薬物送達装置は、ポリペプチドを送達するために使用され得、移植片（例えば、移植可能なポンプ）及びカテーテル系を含み、その両方は当業者に周知である。一般的に皮下または筋肉内投与されるデポ剤注射も、定義された期間にわたり、本明細書に開示されるポリペプチドを放出するために利用され得る。デポ剤注射は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記載される製剤成分のうちの少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポ剤注射の可能な製剤及び使用に精通している。
【０２３７】
薬学的組成物は、減菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、本明細書に記載されるそれらの好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いた、既知の技術分野に従い製剤化され得る。減菌の注射可能な調製物も、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の減菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。採用され得る許容される希釈剤、溶媒、及び分散媒質は、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含む。加えて、減菌の固定油は、溶媒または懸濁媒質として常用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が採用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射可能物の調製に用途を見出す。特定の注射可能製剤の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことにより達成され得る。
【０２３８】
活性成分を含有する薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップ、溶液、ミクロビーズ、またはエリキシル剤として、経口使用に好適な形態であり得る。経口使用を目的とする薬学的組成物は、薬学的組成物の製造の分野に公知の任意の方法に従い調製され得、そのような組成物は、薬学的に洗練され、味の良い調製物を提供するために、例えば、甘味剤、風味剤、着色剤、及び防腐剤などの１つまたは複数の薬剤を含有することができる。錠剤、カプセル等は、錠剤の製造に適する非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの賦形剤は、希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど）、顆粒剤及び崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。
【０２３９】
経口投与に適した錠剤、カプセル等は、消化管における崩壊及び吸収を遅らせ、それによって持続作用を提供するための既知の技法によりコーティングされても、されなくてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放化材料が採用され得る。それらは、当該技術分野に公知の技法によりコーティングされ、制御放出用の浸透性治療錠剤を形成することができる。さらなる薬剤は、投与した組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、もしくはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの生分解性もしくは生体適合性粒子またはポリマー物質を含む。例えば、経口剤は、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの使用により、それぞれ、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、あるいはコロイド薬物送達系に封入され得る。コロイド状分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロ球体、ミクロビーズ、及び脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合されたミセル、及びリポソームを含む）を含む。リポソームを調製する方法は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、及び第４，８３７，０２８号に記載されている。上述の製剤を調製するための方法は当業者に明らかである。
【０２４０】
経口使用のための製剤はまた、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン、または微結晶セルロースと混合される硬ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が、水、または油性媒質、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセルとして、提示されてもよい。
【０２４１】
水性懸濁液は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガムであり、分散剤もしくは湿潤剤は、天然のホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤も含み得る。
【０２４２】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中に、または流動パラフィンなどの鉱物油中に懸濁させることによって製剤化され得る。油性懸濁液は、糊剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有し得る。上述のものなどの甘味剤及び風味剤は、味の良い経口調製を提供するために添加され得る。
【０２４３】
水の添加によって水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び１つまたは複数の防腐剤との混合物中に活性成分を提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤、及び懸濁剤は、本明細書において例示される。
【０２４４】
本開示の薬学的組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、例えば、流動パラフィン、またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然のガム（例えば、アカシアガムもしくはトラガントガム）、天然のホスファチド（例えば、大豆、レシチン、及び脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル）、ヘキシトール無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに部分エステルとエチレンオキシドの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。
【０２４５】
製剤は、移植片、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、及びミクロ封入された送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な分解または身体からの排除に対して組成物を保護するための担体も含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリル、もしくはステアリン酸グリセリルなどの徐放化材料が単独でまたは蝋との組合せで採用され得る。
【０２４６】
本開示は、薬物の直腸投与用の坐剤の形態での調節因子の投与を想定する。坐剤は、薬物を、通常の温度では固体であるが、直腸温度で液体であり、従って薬物を放出するために直腸で融解する好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得る。そのような材料は、ココアバター及びポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【０２４７】
本開示により想定される調節因子は、現在既知の、また将来開発される任意の他の好適な薬学的組成物の形態（例えば、鼻または吸入用途のためのスプレー）であり得る。
【０２４８】
製剤中のポリペプチドまたはその断片の濃度は、広く変動し得（例えば、約０．１質量％未満、通常約２質量％または少なくとも２質量％〜２０質量％程度〜５０質量％またはそれ以上）、主に、例えば、選択される特定の投与形態による、流体量、粘度、及び対象に基づく要因に基づき、通常選択される。
【０２４９】
投与経路
本開示は、任意の適切な様式での、開示される調節因子（例えば、ポリペプチド）、及びその組成物の投与を想定する。好適な投与経路は、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射または移植片）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）、及び脳室内）、経口、経鼻、経膣、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば、経皮）、舌下、及び吸入を含む。
【０２５０】
一般的に皮下または筋肉内投与されるデポ剤注射も、定義された期間にわたり、本明細書に開示される調節因子を放出するために利用され得る。デポ剤注射は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記載される製剤成分のうちの少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポ剤注射の可能な製剤及び使用に精通している。
【０２５１】
抗体に関して、例示的な実施形態では、本開示の抗体または抗体断片は、注射用の減菌の等張水性食塩溶液に１０ｍｇ／ｍｌで４℃で保管され、対象に投与する前に、注入のために１００ｍｌまたは２００ｍｌのいずれかの０．９％の塩化ナトリウムに希釈される。抗体は、０．２〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１時間にわたり静脈注射により投与される。他の実施形態では、抗体は、１５分〜２時間の期間にわたり静脈注入により投与される。また他の実施形態では、投与手順は、皮下ボーラス注射による。
【０２５２】
併用療法
本開示は、１つまたは複数の活性治療剤または他の予防または治療モダリティと併用した、調節因子（例えば、ポリペプチド）の使用を想定する。そのような併用療法では、様々な活性剤は、往々にして、異なる作用機構を有する。そのような併用療法は、薬剤のうちの１つまたは複数の用量減少を可能にし、それによって、薬剤のうちの１つまたは複数に関連する有害な作用を減少させる、または排除することにより特に有益であり、さらにそのような併用療法は、基礎疾患、障害、または状態に対して相乗治療または予防作用を有し得る。
【０２５３】
本明細書で使用される「併用」とは、別個に投与され得る、例えば、別個に投与するために別個に製剤化される（例えば、キットに提供され得るような）療法、及び単一の製剤で一緒に投与され得る（すなわち、共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））療法を含むことが意味される。
【０２５４】
ある実施形態では、調節因子は、順次投与されるか、または適用され、例えば、１つの薬剤が１つまたは複数の他の薬剤の前に投与される。他の実施形態では、調節因子は、同時に投与され、例えば、２つ以上の薬剤が同時にまたはほぼ同時に投与され、２つ以上の薬剤は、２つ以上の別個の製剤に存在するか、または単一製剤に組み合わされ得る（すなわち、共製剤化）。２つ以上の薬剤が順次にまたは同時に投与されるか否かに関わらず、それらは本開示の目的のために併用して投与されると考えられる。
【０２５５】
本開示の調節因子は、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、及び他のグルコース代謝障害に罹患している対象に通常投与されるものを含む、本明細書に記載される疾患、障害、または状態の処置、予防、抑制、または寛解に有用な他の薬剤と併用して使用され得る。
【０２５６】
本開示は、多くの薬剤（及びそのクラス）との併用療法を想定し、１）インスリン、インスリン模倣体、及び、スルホニル尿素を含む、インスリン分泌の刺激を伴う薬剤（例えば、クロロプロパミド、トラザミド、アセトへキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）及びメグリチニド（例えば、レパグリニド（ＰＲＡＮＤＩＮ）及びナテグリニド（ＳＴＡＲＬＩＸ））；２）ビグアニド（例えば、メトホルミン（ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ））ならびにグルコース利用を促進すること、肝グルコース産生を減少させること、及び／もしくは腸管グルコース排出を減少させることにより作用する他の薬剤；３）α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボーズ及びミグリトール）ならびに炭水化物消化、及びその結果として腸からの吸収を遅くさせ、食後の高血糖を減少させる他の薬剤；４）インスリンの作用を増強し（例えば、インスリン増感作用により）、よって末梢組織でのグルコース利用を促進する、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン、ダルグリタゾン；５）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えば、ビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ）及びシタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ））を含むグルカゴン様ペプチド、及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにＧＬＰ−１アゴニスト及び類似体（例えば、エキセナチド（ＢＹＥＴＴＡ及びＩＴＣＡ６５０（１２ヶ月の期間にわたりエキセナチド類似体を送達する皮下に挿入される浸透圧ポンプ；Ｉｎｔａｒｃｉａ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））；６）ならびにＤＰＰ−ＩＶ耐性類似体（インクレチン模倣体）、ＰＰＡＲγアゴニスト、２重作用ＰＰＡＲアゴニスト、汎作用（ｐａｎ−ａｃｔｉｎｇ）ＰＰＡＲアゴニスト、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、ＳＧＬＴ阻害剤、インスリン分泌促進物質、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤、免疫調節因子、β−３アドレナリン受容体アゴニスト、１１β−ＨＳＤ１阻害剤、及びアミリン類似体を含む。
【０２５７】
さらに、本開示は、代謝を刺激する、または食欲を減少させる薬剤などの体重減少を促進するための薬剤及び方法、ならびに体重減少を促進するための食事の変更及び／または運動レジメンとの併用療法を想定する。
【０２５８】
本開示の調節因子は、状況下に適切な任意の様式で、１つまたは複数の他の薬剤と併用して使用され得る。一実施形態では、少なくとも１つの活性剤及び少なくとも１つの本開示の調節因子を用いた処置は、一定の時間にわたり保持される。別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減されるか、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた処置は一定の投薬レジメンで保持される。さらなる実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減されるか、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた処置は削減される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減されるか、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方、本開示の調節因子を用いた処置は増加される（例えば、高用量、投薬頻度の増加、または処置レジメンの延長）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は保持され、本開示の調節因子を用いた処置は削減されるか、または中断される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は保持され、本開示の調節因子を用いた処置は削減されるか、または中断される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。
【０２５９】
投薬
本開示の調節因子（例えば、ポリペプチド）は、例えば、投与の目標（例えば、所望される消散の程度）、処置される対象の年齢、体重、性別、ならびに健康及び身体状態、調節因子の性質、及び／または投与される製剤、投与経路、ならびに疾患、障害、状態、またはその症状（例えば、グルコース／インスリンの調節不全の重篤度、及び障害の段階）に依存する量で対象に投与され得る。投薬レジメンは、投与される薬剤に関連する任意の有害作用の存在、性質、及び程度も考慮に入れることができる。有効投与量及び投与レジメンは、例えば、安全性及び用量漸増試験、インビボ研究（例えば、動物モデル）、及び当業者に公知の他の方法により容易に決定することができる。
【０２６０】
一般に、投薬パラメータは、対象に不可逆的に有害であり得る量未満（すなわち最大許容量、「ＭＴＤ」）の投与量であり、対象に対して測定可能な作用を生成するために必要とされる量未満ではないことを必要とする。そのような量は、投与経路及び他の要因を考慮に入れる、例えば、吸収、分布、代謝、及び排出に関連する（「ＡＤＭＥ」）薬物動態及び薬力学パラメータにより決定される。
【０２６１】
有効量（ＥＤ）は、それを服用する対象のある一定の割合において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。薬剤の「半有効量」またはＥＤ５０は、それを投与される集団の５０％において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は通常、薬剤の作用の妥当な予測の手段として使用されるが、臨床医がすべての関連要因を考慮に入れた、適切であると判断し得る用量とは限らない。よって、いくつかの場合では、有効量は計算されたＥＤ５０超であり、他の場合では、有効量は計算されたＥＤ５０未満であり、また他の場合では、有効量は計算されたＥＤ５０と同じである。
【０２６２】
加えて、本開示の調節因子の有効量は、対象に１つまたは複数の用量で投与されたとき、健康な対象に対して所望の結果を生成する量であり得る。例えば、有効量は、高血漿グルコース及び／または血漿インスリンを有する対象に投与されたとき、健康な対象に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超、所望の減少を達成するものであり得る。
【０２６３】
適切な投与レベルは一般的に、１日当り患者の体重の１ｋｇにつき約０．００１〜１００ｍｇであり、単回量または多回量で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与レベルは、１日当り約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇであり、他の実施形態では、１日当り約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇである。適切な投与レベルは、１日当り約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１日当り約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当り約０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投与量は、１日当り０．００５〜０．０５、０．０５〜０．５、または０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０２６４】
経口剤の投与に関して、組成物は、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、及び１０００．０ミリグラムの活性成分を含有する、錠剤、カプセル等の形態で提供され得る。調節因子は、例えば、１日１〜４回、多くの場合１日１回または２回のレジメンで投与され得る。
【０２６５】
本開示の調節因子の投与は、調節因子の薬物動態（例えば、半減期）及び薬力学応答（例えば、調節因子の治療作用の持続時間）により、１日１回〜３ヶ月に１回の範囲であり得る、適切な頻度で繰り返され得る。調節因子が抗体もしくはその断片、ポリペプチドもしくはその変異体であるいくつかの実施形態では、投薬は１週間に１回〜３ヶ月に１回の間で頻繁に繰り返される。他の実施形態では、そのような調節因子は、約１ヶ月に１回投与される。
【０２６６】
ある実施形態では、開示される調節因子の投与量は、「単位投与形態」で含有される。句「単位投与形態」とは、物理的に分離した単位を指し、各単位は、単独または１つもしくは複数の追加の薬剤との併用のいずれかで、所望の作用を生成するのに十分な既定量の本開示の調節因子を含有する。単位投与形態のパラメータは、達成される特定の薬剤及び作用に依存することが理解される。
【０２６７】
キット
本開示は、開示される調節因子（例えば、ポリペプチド）、及びその薬学的組成物を含むキットも想定する。キットは一般的に、以下に記載される様々な成分を収容する物理的構造の形態であり、例えば、上述の方法を実践する（例えば、グルコース恒常性の回復を必要とする対象への調製因子の投与）のに利用され得る。
【０２６８】
キットは、対象に投与するのに適した薬学的組成物の形態であり得る、本明細書に開示される調節因子のうちの１つまたは複数を含み得る（例えば、減菌容器に提供される）。調節因子は、すぐに使用できる形態で、または例えば、投与前に再構成または希釈を必要とする形態で提供され得る。調節因子がユーザによって再構成される必要がある形態であるとき、キットは、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤等も含み、調節因子と一緒に、または別個にパッケージされ得る。併用療法が想定されるとき、キットは別個にいくつかの薬剤を含有するか、またはそれらはキットに既に組み合わされていてよい。キットの各成分は、個々の容器内に密閉され得、様々な容器のすべては単一のパッケージ内にあり得る。本開示のキットは、その中に収容された成分を適切に保持するのに必要な状態（例えば、冷却または凍結）に設計され得る。
【０２６９】
キットは、その中の成分についての情報及びそれらの使用説明書（例えば、作用機構、薬物動態及び薬力学、有害作用、禁忌等を含む、活性成分の投薬パラメータ、臨床薬理）を特定することを含むラベルまたは添付文書を含み得る。ラベルまたは文書は、ロット番号及び使用期限などの製造情報を含み得る。ラベルまたは添付文書は、例えば、成分を収容する物理的構造に統合されるか、物理的構造内に別個に収容されるか、またはキットの成分（例えば、アンプル、チューブ、またはバイアル）に添付され得る。例示的な説明書は、開示の調節因子、及びその薬学的組成物を用いた血中グルコースの減少または低下、高血糖の処置、糖尿病の処置等のための説明書を含む。
【０２７０】
ラベルまたは文書は、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、光学ディスク（ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなど）、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電気記憶媒体（ＲＡＭ及びＲＯＭなど）、またはこれらのハイブリッド（磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨメディア、もしくはメモリ型カードなど）などのコンピュータ可読媒体をさらに含むか、それに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、実際の説明書は、キットに存在しないが、例えば、インターネットを介して遠隔源から説明書を得るための手段が提供される。
【実施例】
【０２７１】
実験
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラー及び偏差が計上されるはずである。
【０２７２】
別途示されない限り、部は、質量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度（℃）であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。以下を含む標準的な略語が使用される：ｂｐ＝塩基対、ｋｂ＝キロベース、ｐｌ＝ピコリットル、ｓもしくはｓｅｃ＝秒、ｍｉｎ＝分、ｈもしくはｈｒ＝時間、ａａ＝アミノ酸、ｋｂ＝キロベース、ｎｔ＝ヌクレオチド、ｎｇ＝ナノグラム、μｇ＝マイクログラム、ｍｇ＝ミリグラム、ｇ＝グラム、ｋｇ＝キログラム、ｄｌもしくはｄＬ＝デシリットル、μｌもしくはμＬ＝マイクロリットル、ｍｌもしくはｍＬ＝ミリリットル、ｌもしくはＬ＝リットル、μＭ＝マイクロモル、ｍＭ＝ミリモル、Ｍ＝モル、ｋＤａ＝キロダルトン、ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）、ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）、ｓ．ｃ．＝皮下（に）、ｂｉｄ＝１日２回、ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィ、ＢＷ＝体重、Ｕ＝単位、ｎｓ＝統計的に有意ではない、ＰＧ＝空腹時の血漿グルコース、ＦＰＩ＝空腹時の血漿インスリン、ＩＴＴ＝インスリン耐性試験、ＰＴＴ＝ピルビン酸耐性試験、ｏＧＴＴ＝経口グルコース耐性試験、ＧＳＩＳ＝グルコース刺激されたインスリン分泌、ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水、ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地、ＧＣ＝ゲノムコピー、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸。
【０２７３】
材料及び方法
以下の方法及び材料は以下の実施例において使用された。
【０２７４】
動物。雄、７〜１５週齢、Ｂ６．Ｖ−ＬＥＰｏｂ／Ｊ（レプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ））マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、以降に記載される実験で使用した。マウスは、高圧減菌蒸留水を自由に摂取し、市販のマウス餌（Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（タンパク質げっ歯類食餌）、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＶＡ）を自由に採食した。食事誘発性肥満（ＤＩＯ）の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、６０ｋｃａｌ％の脂肪、２０ｋｃａｌ％のタンパク質、及び２０ｋｃａｌ％の炭水化物を含有する高脂肪食（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）で１２〜２０週間保持した。すべての動物研究は、施設内動物実験委員会により承認された。
【０２７５】
核酸及びアミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０００５２９．２は、ヒトＧＤＦ１５変異体をコードするＯＲＦのｃＤＮＡを示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４８５５．２は、ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を示す。ホモ・サピエンス血清アルブミンｃＤＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（ＳＣ３１９９３７）から購入した。ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．３、ＮＰ＿０００４６８）。
【０２７６】
ＨＳＡ及びヒトＧＤＦ１５についての融合ＰＣＲ断片は、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）酵素によって生成し、ゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化されたヒトＩｇＫシグナルペプチドを含有するｐＴＴ５ベクターへとアセンブルした。２つのＰＣＲ断片が、クローン化のために生成され、１つ目は、ＨＳＡをコードし、２つ目は、ヒトＧＤＦ１５をコードした。以下のプライマーを、ＨＳＡを増幅させるために使用した：順方向プライマー：
0006272907.tif 000034
；逆方向プライマー：
0006272907.tif 000035
。以下のプライマーを、ＧＤＦ１５を増幅させるために使用した：順方向プライマー：
0006272907.tif 000036
；逆方向プライマー：
0006272907.tif 000037
。
【０２７７】
コロニーをプレーティングし、配列を確認した。プライマーは、関心の領域を突然変異させるように設計され、突然変異誘発は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。配列確認したコロニーを増幅させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ−Ｍａｘｉ調製キットを使用して精製した。
【０２７８】
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５変異タンパク質融合分子の発現。全ての変異タンパク質は、Ｅｘｐｉ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において一時的に遺伝子導入された。細胞は、Ｅｘｐｉ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定期的に継代し、様々なサイズの振とうフラスコにおいて懸濁培養として維持した。典型的に、細胞は、５ｅ５生存細胞／ｍｌの細胞密度で継代し、３日間増殖させた後に継代した。フラスコは、１１０ＲＰＭの撹拌速度で、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ振とう器プラットフォーム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）上で、加湿したＣＯ２インキュベータ（３７℃及び５％  ＣＯ２）に維持した。
【０２７９】
遺伝子導入は、培養物の細胞密度が９５％超の生存率で２．５ｅ６生存細胞／ｍＬに達した時に実施した。典型的に、５０ｍＬの遺伝子導入に対して、２．５ｅ６細胞／ｍＬ×５０ｍＬの細胞を、培養物容積４２．５ｍＬの２５０ｍＬ振とうフラスコにおいて播種した。関心の遺伝子を含有する発現ベクターから成る５０マイクログラム（５０μｇ）プラスミドＤＮＡを、最初に、２．５ｍＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈した。同時に、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ遺伝子導入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．６７倍の容積（プラスミドＤＮＡの量の）もまた、２．５ｍＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ低血清培地に希釈した。室温で５分のインキュベーション後、希釈した遺伝子導入試薬を、希釈したプラスミドＤＮＡにゆっくりと添加して、遺伝子導入能力を有する複合体を形成した。室温でさらに２０分のインキュベーション後、５ｍＬの遺伝子導入複合体を、４２．５ｍＬの細胞培養物に添加した。次いで、遺伝子導入細胞を、１１０ＲＰＭで維持される軌道振とう器上の加湿したＣＯ２インキュベータに配置した。遺伝子導入２４時間後に、遺伝子導入培養物に、２５０μＬのエンハンサー１溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２．５ｍＬのエンハンサー２溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を与えた。次いで、培養物を、軌道振とう器上の加湿したＣＯ２インキュベータに再配置した。遺伝子導入６〜７日後に、培養物を、０．２μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過する前に、３０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離によって採取した。次いで、サンプルを、発現に関して、クーマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色ゲル上で分析した。
【０２８０】
ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合分子の切断。ヒト血清アルブミンｈＧＤＦ１５融合構築物を９５％超の均質性まで精製した。変異タンパク質は、１：５００（ｗ／ｗ）添加（１×リン酸緩衝食塩水中）を使用して、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐ８０１０）から得た因子Ｘａを使用して、室温での終夜消化によって切断した。切断後、ＧＤＦ１５変異タンパク質を９５％超の均質性まで精製した。
【０２８１】
成熟ＧＤＦ１５融合分子の生成。ｈＧＤＦ１５変異タンパク質もまた、構築され、ＧＤＦ１５の成熟（１１２アミノ酸）配列（図１Ｂ）に融合されたＩｇＫシグナルペプチドの利用によって、非ＨＳＡ融合物として精製された。成熟変異タンパク質は、９５％超の均質性まで培地から直接精製した。
【０２８２】
細菌によってリフォールディングされた成熟非グリコシル化分子の生成。図４に記載されるｈＧＤＦ１５変異タンパク質（ｗ２９、ｗ３２、ｗ５２、ｗ６８、及びｗ８９）もまた、封入体からの細菌リフォールドとして生成され、Ｎ末端メチオニンを伴うＧＤＦ１５の成熟（１１２アミノ酸）配列（図１Ｂ）を含有する、９５％超の均質性まで精製された。
【０２８３】
ヒトＧＤＦ１５変異タンパク質の溶解度評価。ＧＤＦ１５変異タンパク質の溶解度は、２つの補助アッセイを使用して評価し、その結果は、互いに酷似していた。１つのアッセイ様式では、変異タンパク質を１×リン酸緩衝食塩水に透析し、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  １０，０００  ＮＭＷＬ（ＵＦＣ９０１０９６）から成るＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓを使用して濃縮した。濃縮後、溶解度評価は、２８０ｎｍ波長の吸光度及びベールの法則（吸光係数＝１４４００、分子量＝１２，２８７Ｄａ）を使用して、１×リン酸緩衝食塩水でブランクしたＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計において実施した。第２のアッセイ様式では、変異タンパク質を０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（ｐＨ２．０）に透析し、最大及び２０ｍｇ／ｍＬ超までＲｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  １０，０００  ＮＭＷＬ（ＵＦＣ９０１０９６）から成るＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓを使用して濃縮した。各変異タンパク質についての開始濃度は、２８０ｎｍ波長の吸光度及びベールの法則（吸光係数＝１４４００、分子量＝１２，２８７Ｄａ）を使用して判定した。次いで、各変異タンパク質を０．０１％ギ酸に２倍に連続希釈し、９０μＬの各々の希釈物を９６ウェルプレートに添加した。１０μＬの１０×ＰＢＳを各ウェルに添加し、ｐＨは７．３であると確認した。振とうしながら終夜、室温でインキュベートした後、濁度を３７０ｎｍで測定した。濁りが発生し始める変曲点は、各変異タンパク質についての最大溶解度として受け入れられる。
【０２８４】
血中グルコースアッセイ。マウスの尾の切れ目からの血中グルコースを、製造者の指示に従い、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫアクティブメーター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって読み取られるＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ活性試験片を用いて測定した。
【０２８５】
血清ＧＤＦ１５変異タンパク質曝露レベルアッセイ。マウスの尾の切れ目からの全血（約５０μｌ／マウス）を普通の毛細管チューブ（ＢＤ  Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ  ＳｕｒｅＰｒｅｐ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に収集した。血清及び血液細胞は、チューブをＡｕｔｏｃｒｉｔ  Ｕｌｔｒａ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）中で回転させることにより分離した。血清中のＧＤＦ１５曝露レベルは、製造者の指示に従い、Ｈｕｍａｎ  ＧＤＦ−１５  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定された。
【０２８６】
分析ゲル濾過。操作されたヒトＧＤＦ１５変異タンパク質の流体力学半径の増加は、１ｍＬ／分の流速の１×リン酸緩衝食塩水で事前平衡化されたＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣ溶出時間（分）上のＡ２８０溶出吸収によってモニターされた。
【０２８７】
成熟カモノハシ（Ｏａ）ＧＤＦ１５分子の生成。図１７Ａを参照すると、成熟ＯａＧＤＦ１５は、シグナル配列、プロドメイン（フューリン切断部位に下線）、続いて成熟ＯａＧＤＦ１５（太字）を含有する前駆体アミノ酸配列から構築した（図１７Ａを参照）。
【０２８８】
ＯａＧＤＦ１５構築物は、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５変異タンパク質融合分子に関して本明細書に記載されるような様式で、Ｅｘｐｉ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に一時的に遺伝子導入された。分泌されたＯａＧＤＦ１５を細胞培地から９５％超の均質性まで精製した。成熟形態のＯａＧＤＦ１５のＮ末端を、ＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。
【０２８９】
実施例１：体重、食物摂取量、及び空腹時血液に対する、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合分子の効果
組換えヒトＧＤＦ１５に融合された組換えＨＳＡを有する皮下投与された融合分子の、体重、食物摂取量、及び空腹時血中グルコースに対する効果を、送達後２２日間にわたり評価した。簡潔に述べると、図１Ｈに示される融合分子（非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカーを介して成熟ヒトＧＤＦ１５のＮ末端に融合された成熟ＨＳＡ（配列番号６４）を、様々な用量で、単回、皮下ボーラス注射として、７〜１５週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウス（約４４ｇの体重で、約３４０ｍｇ／ｄｌの非空腹時グルコース血清レベルを有する）に投与した。０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、及び１．２ｍｇ／ｋｇの用量での融合分子またはビヒクル対照（ＰＢＳ）の投与後、示されるパラメータを、２２日間にわたって０、２、３、６、８、１５、及び２２日目に判定した。血清曝露は、製造者の指示に従い、Ｈｕｍａｎ  ＧＤＦ１５  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によりモニターした。
【０２９０】
融合分子は、非コンジュゲート組換えヒトＧＤＦ１５についての２時間の半減期と比較して、３７時間の改善された半減期を実証した。さらに、ヒトＧＤＦ１５の溶解度は、ビヒクル対照緩衝剤（１×ＰＢＳ）において０．２ｍｇ／ｍＬ未満であるが、融合分子は、ビヒクル対照緩衝剤（１×ＰＢＳ）において５０ｍｇ／ｍＬ超まで溶解度を改善した。
【０２９１】
図２に示されるように、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、及び１．２ｍｇ／ｋｇの用量での融合分子の投与は、ビヒクル対照と比較して、体重（図２Ａ）、食物摂取量（図２Ｂ）、及び非空腹時血中グルコース（図２Ｃ）の有意な改善をもたらした。マウスの各群において、ｎ＝７及びｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）は、各指定される時点において、ビヒクル対照群に対して、様々な濃度で、体重、食物摂取量、及び血中グルコース群を比較する、スチューデントの対応のないＴ検定によって判定した。
【０２９２】
図２Ａを参照すると、ビヒクル対照の投与後２２日目（ＰＢＳ注射されたｏｂ／ｏｂマウス（５２．５ｇ））と比較して、示される用量での融合分子の投与後２２日目は、以下の体重減少をもたらした：０．０４ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては３．２％（ｎｓ）の低減率を成す１．７ｇの低減；０．１２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては３．５％（ｎｓ）の低減率を成す１．８ｇの低減；０．４０ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては３．６％（＊、ｐ＜０．０５）の低減率を成す１．９ｇの低減；及び１．２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては６．１％（＊＊、ｐ＜０．０１）の低減率を成す３．２ｇの低減。
【０２９３】
ビヒクル対照または融合分子を示される用量で投与されたｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量（グラム／動物／日）は、２２日の投与後観察期間中の様々な時間で評価した。図２Ｂの９〜１５日の期間を参照すると、ビヒクル対照（ＰＢＳ）を注射されたｏｂ／ｏｂマウス（７．８８ｇ／動物／日）に対する平均食物摂取量は、以下の通りであった：平均食物摂取量は、０．０４ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては３．０％（ｎｓ）の低減率を成す０．２４ｇ／動物／日の低減；０．１２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては１１．７％（ｎｓ）の低減率を成す０．９２ｇ／動物／日の低減；０．４０ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては２１．５％（＊＊、ｐ＜０．０１）の低減率を成す１．７０ｇ／動物／日の低減；ならびに１．２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては２９．３％（＊＊、ｐ＜０．０１）の低減率を成す２．３１ｇ／動物／日の低減であった。
【０２９４】
ビヒクル対照または融合分子を示される用量で投与されたｏｂ／ｏｂマウスの非空腹時血中グルコース（ｍｇ／ｄＬ）は、２２日の投与後観察期間中の様々な時点で評価した。図２Ｃを参照すると、８日目の非空腹時血中グルコースレベルは、ビヒクル対照（ＰＢＳ）を注射されたｏｂ／ｏｂマウス（８日目＝３５７．４ｍｇ／ｄＬ）に対して、０．０４ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては１．１％（ｎｓ）の低減率を成す３．９ｍｇ／ｄｌの低減；０．１２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては１７．５％（ｎｓ）の低減率を成す６２．７ｍｇ／ｄＬの低減；０．４０ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては２９．７％（＊、ｐ＜０．０５）の低減率を成す１０６．１ｍｇ／ｄＬの低減；及び１．２ｍｇ／ｋｇ用量群に関しては５３．５％（＊＊、ｐ＜０．０１）の低減率を成す１９１．１ｍｇ／ｄＬの低減を実証した。
【０２９５】
図２のデータは、ＧＤＦ１５とのＨＳＡ融合物が活性であること、及びそのような融合分子が、ＧＤＦ１５変異タンパク質のある有益な性質を増強するための実行可能なアプローチを表すことを実証する。データはまた、示されたパラメータの測定値が、変異タンパク質のハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームとして有用であり得ることを示す。
【０２９６】
実施例２：表面疎水性の減少を介したＧＤＦ１５の性質の改善
成熟ヒトＧＤＦ１５の物理的性質（例えば、溶解度及び安定性）を改善するための手段を特定するために、表面アクセス可能であると予測される１組の６つの疎水性残基を、表面疎水性を増加させる手段としてのアラニンへの突然変異に供した。
【０２９７】
６つのＧＤＦ１５変異タンパク質配列の各々が、図１Ｈに示されるリンカー（非切断性３×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（配列番号６４）を介してＨＳＡに融合された、融合分子を生成した；図３に記載される配列は、融合分子のＨＳＡ成分もリンカー成分も示していない。
【０２９８】
次いで、融合分子を、分泌ジスルフィド連結ホモ２量体としての発現に関してモニターした。図４は、各融合分子についてのデータを要約する。最初の２つの列は、突然変異された成熟ヒトＧＤＦ１５の残基を特定し、３列目は、アラニンによって置換されたそれらのネイティブ残基を特定し、４列目は、得られた各融合分子が分泌２量体として発現されたかどうかを示す。６つの疎水性減少変異タンパク質のうちの５つが、ジスルフィド連結ホモ２量体として発現及び分泌され、物理的性質の改善についてさらに評価された（ｗ６５はホモ２量体として発現されず、さらなる追跡は行われなかった）。
【０２９９】
実施例３：改善された溶解度特性を伴うヒトＧＤＦ１５変異タンパク質
実施例２に記載されるデータを使用して、成熟ヒトＧＤＦ１５に固有の表面疎水性に関連する溶解度制限に対処した。加えて、成熟ヒトＧＤＦ１５の配列に沿ったＮ−連結グリコシル化コンセンサス部位の導入の、溶解度に対する効果を評価した。
【０３００】
溶解度の評価及びインビボ有効性の判定を容易にするために、成熟組換えヒトＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質は、因子Ｘａ消化を使用してＨＳＡシャペロンからのＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質の切断を可能にするように、因子Ｘａタンパク質分解感受性リンカー（図１Ｆに記載されるように、２×（４Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）因子Ｘａ切断可能リンカー（配列番号５６））を含有するＮ末端ＨＳＡ融合分子として構築された。成熟組換えヒトＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質はまた、ｈＧＤＦ１５（図１Ｂ）の成熟１１２アミノ酸配列、もしくは関心の変異タンパク質配列と直接融合されるシグナルペプチドとしてのＩｇＫを利用して、またはＮ末端メチオニンを伴う変異タンパク質の細菌リフォールドとして構築された。溶解度評価は、変異タンパク質の溶解度の改善を成熟ヒトＧＤＦ１５（１×ＰＢＳ中、＜０．２ｍｇ／ｍＬの最大の観察された溶解度を有する）に対して評価することができる、ストリンジェントな緩衝剤である、１×ＰＢＳにおいて実施した。
【０３０１】
溶解度の評価は、吸光係数（成熟ヒトＧＤＦ１５＝１４，４００／単量体）及び分子量（成熟ヒトＧＤＦ１５＝１２，２７８Ｄａ／単量体）を使用して計算されるベールの法則を使用して、２８０ｎｍの吸光度に基づいて判定した。変異タンパク質は、その溶解度のレベルによって５つの群のうちの１つに分類した：０．０〜０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋；０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬ＝＋＋；０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋；１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋；及び＞５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋＋。
【０３０２】
図５に記載されるＧＤＦ１５変異タンパク質の５つ（ｗ２９、ｗ３２、ｗ５２、ｗ６８、及びｗ８９）の表面疎水性の減少は、アラニンへの疎水性残基の選択的突然変異誘発によって評価した。成熟ヒトＧＤＦ１５に対する、これらの５つの変異タンパク質の相対的溶解度の比較は、ｗ５２及びｗ８９が、成熟ヒトＧＤＦ１５（＋）に対して改善された溶解度（＋＋）を呈した、このクラスにおける唯一の変異タンパク質であることを示した。他の３つの変異タンパク質は、成熟ヒトＧＤＦ１５と同じ範囲内の溶解度を呈した。
【０３０３】
ヒトＧＤＦ１５の表面親水性の減少は、酸性残基のアラニンへの選択的突然変異誘発によって評価され、５つの配列、ｗ１１３、ｗ１１４、ｗ１１５、ｗ１１６、及びｗ１１７は図５に示され、以降で要約される。成熟ヒトＧＤＦ１５に対する、これらの５つの変異タンパク質の相対的溶解度の比較は、ｗ１１６が、成熟ヒトＧＤＦ１５（＋）に対して改善された溶解度（＋＋）を呈した、このクラスにおける唯一の変異タンパク質であることを示した。他の４つの変異タンパク質のうち、ｗ１１３及びｗ１１５は、成熟ヒトＧＤＦ１５と同じ範囲内の溶解度を呈した一方、変異タンパク質ｗ１１４及びｗ１１７は、採用された条件下では不溶性であった。
【０３０４】
次に、成熟ヒトＧＤＦ１５配列を、Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス部位の導入に対応するその能力に関して評価した。この文脈では、単一のアミノ酸置換は、成熟ヒトＧＤＦ１５配列内で所要のコンセンサス部位を与え、Ｎ−連結グリコシル化のためのコンセンサス部位は、「Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」として定義され、ここで「Ｘｘｘ」は、プロリン残基ではあり得ない。成熟ヒトＧＤＦ１５配列のスキャンに基づき、１４種の可能な単一点変異タンパク質が、Ｎ−グリカンコンセンサス部位の導入に対応するであろうことが特定された。図６は、１４種のモノグリコシル化変異タンパク質、ならびに追加のコンビナトリアルジグリコシル化変異タンパク質の配列を示す。
【０３０５】
溶解度に関して評価される前に、図６に記載される操作されたＮ−グリカン変異タンパク質の各々を、哺乳類組織培養培地への折り畳まれたＧＤＦ１５ホモ２量体としての分泌、及びＮ−グリカン部位占有の両方について評価した。図７に記載されるように、１４種のモノグリコシル化変異タンパク質のうちの１０種は、折り畳まれたＧＤＦ１５ホモ２量体として分泌され、一方、変異タンパク質ｗ１２３、ｗ１２５、ｗ１２７、及びｗ１２９は、２量体形成をもたらさなかった。次いで、ホモ２量体として分泌された１０種のモノグリコシル化変異タンパク質を、ＬＣ／ＭＳ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシフトによって評価して、コンセンサス部位上のＮ−グリカン基の占有を判定した；これらの変異タンパク質のうちの２種（ｗ１２１及びｗ１２４）は、低い占有を呈し、それらの溶解度は、その後評価されなかった。
【０３０６】
ホモ２量体として分泌され、かつコンセンサス部位内で高いグリカン占有も有した、操作されたＮ−グリカンＧＤＦ１５変異タンパク質は、成熟ヒトＧＤＦ１５に対する溶解度の改善に関してモニターした。図８Ａに示されるように、遠心アッセイ様式を使用して評価したＮ−グリカンＧＤＦ１５変異タンパク質の各々は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して、改善された溶解度を呈した：
0006272907.tif 000038
図８Ｂが示すように、濁度（ｔｕｂｉｄｉｔｙ）アッセイ様式を使用して評価したＮ−グリカンＧＤＦ１５変異タンパク質の各々は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して、改善された溶解度を呈した：
0006272907.tif 000039
【０３０７】
急性インビボ有効性は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して改善された溶解度を示したそれらのヒトモノグリコシル化ＧＤＦ１５変異タンパク質に関して確認された。
【０３０８】
図９Ａを参照すると、７〜１５週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝７）への単回０．３ｍｇ／ｋｇ用量の成熟ヒトＧＤＦ１５またはＮ−グリカン変異タンパク質の皮下投与後、１６時間の終夜の期間にわたる食物摂取量（グラム／動物）を、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群に対してモニターした。マウスの３つのコホートを評価し、ｐ値を対応のないスチューデントＴ検定によって判定した。
【０３０９】
図９Ａに示されるように、マウスの第１のコホートにおいて、食物摂取量は、成熟ヒトＧＤＦ１５用量群については平均０．８２ｇ／動物（１７．３％（＊＊＊、ｐ＜０．００１）の低減率）；ｗ１２０用量群については０．１６ｇ／動物（３．４％（ｎｓ）の低減率）；ｗ１２８用量群については０．８７ｇ／動物（１８．３％（＊＊＊、ｐ＜０．００１）の低減率）；ｗ１３０用量群については０．７７ｇ／動物（１６．２％（＊＊＊、ｐ＜０．００１）の低減率）；及びｗ１３１用量群については０．４５ｇ／動物（９．４％（＊、ｐ＜０．０５）の低減率）低減した。ビヒクル対照用量群についての平均食物摂取量は、４．７６ｇ／動物であった。
【０３１０】
図９Ａに示されるマウスの第２のコホートに関して、食物摂取量は、野生型ヒトＧＤＦ１５用量群については平均０．７７ｇ／動物（１７．１％（＊、ｐ＜０．０５）の低減率）；ｗ１１８用量群については０．３５ｇ／動物（７．９％（ｎｓ）の低減率）；及びｗ１２６用量群については０．５９ｇ／動物（１３．０％（＊、ｐ＜０．０５）の低減率）低減した。ビヒクル対照用量群についての平均食物摂取量は、４．５３ｇ／動物であった。
【０３１１】
図９Ａに示されるマウスの第３のコホートに関して、食物摂取量は、野生型ヒトＧＤＦ１５用量群については平均１．１０ｇ／動物（２３．４％（＊＊＊、ｐ＜０．００１）の低減率）；及びｗ１２２用量群については１．２９ｇ／動物（２７．４％（＊＊＊、ｐ＜０．００１）の低減率）低減した。ビヒクル対照用量群についての平均食物摂取量は、４．７０ｇ／動物であった。
【０３１２】
図９Ｂを参照すると、８時間の絶食後、単回１．０ｍｇ／ｋｇ用量のＰＢＳビヒクル、成熟ヒトＧＤＦ１５、またはＮ−グリカン変異タンパク質の皮下投与が、１７週齢の雄のＤＩＯマウス（ｎ＝９）に与えられた。１６時間の終夜の期間にわたる再給餌後の食物摂取量（グラム／動物）を、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群に対してモニターした。Ｐ値は、対応のないスチューデントＴ検定によって判定した。図９Ｂを参照すると、食物摂取量の低減がモニターされた。食物摂取量の低減をＰＢＳビヒクルに対して報告する。成熟ヒトＧＤＦ１５用量群については（＊＊＊；ｐ＝０．００００００３）、ｗ１２２については（＊＊＊；ｐ＝０．０００００６）、ｗ１２０については（＊＊＊；ｐ＝０．００００３）、ｗ１１８については（＊＊＊；ｐ＝０．０００００１）、ｗ１２６については（＊＊＊；ｐ＝０．０００００８）、ｗ１２８については（ｎｓ；ｐ＞０．０５）、ｗ１３０については（＊＊＊；ｐ＝０．００００００５）、及びｗ１３１については（ｎｓ；ｐ＞０．０５）。
【０３１３】
実施例４：操作されたＮ−グリカンＧＤＦ１５変異タンパク質の分析ゲル濾過分析
ＧＤＦ１５  Ｎ−グリカン変異タンパク質の流体力学半径を、分析ゲル濾過クロマトグラフィを使用して、成熟ヒトＧＤＦ１５に対して評価した（図１０を参照）。１ｍＬ／分の流速の１×リン酸緩衝食塩水で事前均衡化されたＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、５μｍ）分析サイズカラムを、評価において使用した。各ＧＤＦ１５変異タンパク質の２μｇを２０μＬ容積に注入し（０．１ｍｇ／ｍＬ）、溶出時間を、２８０ｎｍでの測定による吊り鐘型曲線の溶出の間の最大吸収において記録した。
【０３１４】
成熟ヒトＧＤＦ１５の分析ゲル濾過クロマトグラフィは、１０．８３７分で溶出する、非凝集のジスルフィド連結ホモ２量体を示した（図１０）。Ｎ−連結グリカン変異タンパク質の各々は、ヒトＧＤＦ１５ジスルフィド連結２量体の流体力学半径を増加させた。このため、各変異タンパク質は、例えば、好ましいインビボ半減期を有する分子を生成するための開始点として潜在的に作用し得る。
【０３１５】
実施例５：融合パートナーとしてＨＳＡを利用するＧＤＦ１５オルソログの発現
実施例５に記載されるデータは、ＧＤＦ１５オルソログ及び他のＢＭＰファミリーメンバーの発現及び精製のための融合パートナーとしてのＨＳＡの実用性を強調する。
【０３１６】
図１１Ａは、切断可能なリンカー（太字及び下線；配列番号５６）を介して成熟ＧＤＦ１５ハツカネズミ（太字；配列番号５４）及びアカゲザル（太字；配列番号５５）の種オルソログのＮ末端に融合された、ＩｇＫシグナル配列（シグナル配列に下線；配列番号５３）を有するＨＳＡを含む、融合分子のアミノ酸配列を示す。図１１Ｂは、切断可能なリンカー（太字及び下線；配列番号６１）を介して成熟ヒトＴＧＦ−β１（太字；配列番号５９）及び成熟ヒトＢＭＰ２（太字；配列番号６０）のＮ末端に融合された、ＩｇＫシグナル配列（シグナル配列に下線；配列番号５３）を有するＨＳＡを含む融合分子のアミノ酸配列を示す。
【０３１７】
マウスＧＤＦ１５（ＮＰ＿０３５９４９．２）及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ＧＤＦ１５（ＥＨＨ２９８１５．１）についてのプロファイルは、ＨＳＡ融合物の文脈において、それらが、折り畳まれたホモ２量体として発現及び精製されたという点で、ヒトＧＤＦ１５に関して観察されたものに酷似した。精製されたＨＳＡ融合構築物の因子Ｘａ切断、及びＧＤＦ１５オルソログの放出／精製は、ヒト配列（データは図示せず）のものと同等の物理的性質を伴うホモ２量体を明らかにした。ヒト配列に対する、マウス及びマカク属ＧＤＦ１５分子の各々の成熟形態の相同性は、それぞれ６７％及び９５％であり、ＨＳＡ融合分子テンプレートが、ＧＤＦ１５融合パートナーの配列多様性に対応することができることを示す。
【０３１８】
折り畳み及び分泌性質は、ＢＭＰクラス及びＴＧＦ−βクラスの分子などのファミリーメンバーについて、ヒトＧＤＦ１５と比較してより低い相同性の配列のために変更されると見られる。実際、発現が、ヒトＧＤＦ１５、マウス、及びマカク属ＧＤＦ１５について頑強であった分泌のためのＨＳＡテンプレートにおいて試行された時、ヒトＢＭＰ２（ヒトＧＤＦ１５に対して２７％の％配列同一性）及びヒトＴＧＦ−β１（ヒトＧＤＦ１５に対して２２％の％配列同一性）は、乏しい折り畳み及び分泌性質を示した（図１２）。
【０３１９】
完全に機能的で、かつ生物学的に活性な分子として発現及び分泌されるヒトＧＤＦ１５の能力は、ヒトＧＤＦ１５に対する４５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド（例えば、マウス及びマカク属ＧＤＦ１５など）を使用して達成することができる。不定の長さ及び組成のリンカーを含有するヒトＧＤＦ１５（または密接に関連する分子）のＮ末端に融合されたＨＡＳを発現及び精製する能力は、溶解度、発現プロファイル、処方、及び安定性などのＧＤＦ１５の薬学的性質の有益な改善にむけて直接的な影響を有する。
【０３２０】
実施例６：改善された物理的性質のための操作を可能にするためのヒトＧＤＦ１５内の突然変異誘発に適応できる残基の特定
包括的アラニンスキャンが実施され、その中で、ヒトＧＤＦ１５の成熟配列内の各アミノ酸が、アラニンに個々に突然変異された（ＧＤＦ１５のシステイン−ノット構造／折り畳みを維持するようにシステイン残基を除いて）。各変異タンパク質についての配列は図１３に記載され、発現結果は図１４に詳述される。図１４に記載される各変異タンパク質は精製され、ホモ２量体折り畳み及び凝集状態を含む、物理的性質に関して評価された。
【０３２１】
アラニンスキャンの結果は、ヒトＧＤＦ１５が、５つの変異タンパク質；ｗ３６、ｗ４６、ｗ６２、ｗ６５、及びｗ８３（または図７に定義されるような新規グリコシル化コンセンサス部位のさらなる導入：ｗ１２３、ｗ１２５、ｗ１２７、もしくはｗ１２９）を除いて、全ての残基において突然変異誘発に適応できることを示した。全ての他の変異タンパク質は、野生型ヒトＧＤＦ１５と類似する様式で、発現し、折り畳まれ、及び分泌された。
【０３２２】
本明細書に記載される突然変異に対応することができるＧＤＦ１５内の特定の残基の特定は、改善された物理的性質を伴うＧＤＦ１５分子の設計及び操作を支援する。これらの性質は、インビボ及び／もしくはインビトロタンパク質分解の望ましくない部位；ならびに／または脱アミド化、脱水、スクシンイミド形成などの化学的不均質性の部位、ならびに／または酸化の部位（薬物不活化及び／もしくは活性の低減につながり得る）の修正を含むが、これらに限定されない。
【０３２３】
ヒトＧＤＦ１５の成熟配列の安定性加速試験（データは図示せず）から生じる実験的に定義された化学的不均質性は、部位Ｎ３、Ｑ４０、Ｑ５１、Ｎ５６、Ｑ６０、Ｎ８４、Ｑ９０、及びＱ９５で生じる脱アミド化事象、ならびに部位Ｗ２９、Ｗ３２、Ｍ４３、Ｍ５７、及びＭ８６で生じる酸化事象の証拠を実証した。
【０３２４】
アラニンスキャンからの及び突然変異誘発に利用可能な部位の特定からの結果は、実証された化学的不均質性を改善及び修正するように、操作された構築物を生成するために使用することができる。
【０３２５】
例えば、突然変異誘発に適応できる部位の特定は、ＧＤＦ１５の成熟配列内のＮ３で生じる脱アミド化事象を修正するために使用することができる。Ｎ３が、上に記載されるＮ３Ａ突然変異によって示されるように、損失を伴わずに突然変異誘発に適応できることが実証されたため、Ｎ３Ｑ、Ｎ３Ｅ、Ｎ３Ｔ、またはＮ３Ｓなどの他のアミノ酸の置換が、この部位でなされ得ることを予測することが妥当である。置換に好適なアミノ酸は、例えば、非ヒトオルソログ（例えば、ガラゴ属原猿（Ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ）（ＸＰ＿００３７９６６１２．１；例えば、Ｎ３Ｔ）またはイエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）（ＸＰ＿００３９８２１２５．１；例えば、Ｎ３Ｓ）とのヒトＧＤＦ１５のアライメントによって特定することができる。最後に、Ｎ３での脱アミド化事象は、３位で非天然のアスパラギン酸残基を創出し、これは、脱アミド化事象に対するすぐＣ末端側のＧ４の存在（すなわち、Ａｓｐ−Ｇｌｙ部位）により、イソアスパラギン酸異性化をもたらし得る。部位Ｎ３での脱アミド化は、Ａｓｐ−Ｇｌｙ対合を妨害するために異性化パートナーＧｌｙをＰｒｏ（Ｇ４Ｐ）に突然変異させることによって防止され得る。さらに、脱アミド化は、Ｄ５からＤ５ＴまたはＤ５Ｓのいずれかへの突然変異誘発を介した、Ｎ３におけるＮ−連結グリコシル化部位の創出を介して防止することができる。さらに、脱アミド化は、最初の３つの残基（ΔＡ１〜Ｎ３）、４つの残基（ΔＡ１〜Ｇ４）、５つの残基（ΔＡ１〜Ｄ５）、６つの残基（ΔＡ１〜Ｈ６）またはそれ以上の除去による、成熟ＧＤＦ１５のＮ末端の欠損により防止することができる。
【０３２６】
上に記載されるアラニンスキャニング突然変異誘発結果に基づき、かつ部位Ｎ３に適用されるような類似の分析を適用すると、ヒトＧＤＦ１５の成熟配列内の不均質性の他の観察された部位への修正突然変異は、Ｎ３Ａ、Ｎ３Ｑ、Ｎ３Ｅ、Ｎ３Ｓ、Ｎ３Ｔ、Ｇ４Ｐ、Ｄ５Ｓ、Ｄ５Ｔ、Ｑ４０Ａ、Ｑ４０Ｅ、Ｑ４０Ｄ、Ｑ４０Ｈ、Ｍ４３Ａ、Ｍ４３Ｖ、Ｍ４３Ｆ、Ｑ５１Ａ、Ｑ５１Ｅ、Ｑ５１Ｌ、Ｑ５１Ｈ、Ｎ５６Ａ、Ｎ５６Ｓ、Ｍ５７Ａ、Ｍ５７Ｉ、Ｍ５７Ｔ、Ｑ６０Ａ、Ｑ６０Ｌ、Ｎ８４Ａ、Ｎ８４Ｅ、Ｎ８４Ｑ、Ｎ８４Ｔ、Ｍ８６Ａ、Ｍ８６Ｖ、Ｑ９０Ａ、Ｑ９０Ｅ、Ｑ９０Ｅ、Ｑ９０Ｈ、Ｑ９５Ａ、Ｑ９５Ｅ、Ｑ９５Ｄ、Ｑ９５Ｈ、Ｑ９５Ｔ、Ｑ９５Ｓを含むが、これらに限定されない。
【０３２７】
実施例６に記載されるデータは、非切断性リンカーを伴って成熟ＧＤＦ１５のＮ末端に融合されるＨＳＡを含む融合タンパク質として発現される時、ＧＤＦ１５の折り畳みまたは分泌に著しく影響を及ぼさないように、突然変異誘発に適応できる残基を強調する。
【０３２８】
実施例７：ＧＤＦ１５のＮ末端融合物を含む、溶解度が改善され半減期が延長された分子の発現
成熟ヒトＧＤＦ１５のＮ末端への遺伝的融合の導入の、溶解度に対する効果を評価した。実施例７に記載されるデータは、図１５Ａに概略的に示され、かつ図１５Ｂ〜１５Ｅに記載されるアミノ酸配列を有する、いくつかの融合構築物を使用して生成した。
【０３２９】
図１５Ｂは、３×（Ｇｌｕ−３Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカー（太字及び下線）を介して成熟ＧＤＦ１５（太字）のＮ末端に融合されたシグナル配列（下線）−Ｆｃを含む融合分子である。
【０３３０】
図１５Ｃは、Ｆｃ（＋）−３×（Ｇｌｕ−３Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＧＤＦ１５及びＦｃ（−）を含有する、シグナル配列［下線］−（Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５／Ｆｃ（−）荷電対を含む、融合分子であり、ここで、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５／Ｆｃ（−）荷電対は、Ｆｃドメイン（（Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ）、図１５Ｃで下線及び太字）に負荷電突然変異を含有するＦｃ（−）ドメインとともに共遺伝子導入され得る、Ｆｃドメイン（Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ、図１５Ｃで下線及び太字）に正荷電突然変異を含有するＦｃ（＋）ＧＤＦ１５融合物として設計された。
【０３３１】
図１５Ｄは、５×Ｇｌｙリンカー（太字及び下線）を介してＧＤＦ１５のＮ末端（太字）に融合されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む融合分子であり、Ｎ末端メチオニンには下線が付されている。
【０３３２】
図１５Ｅは、エンテロキナーゼで切断可能な５×Ｇｌｙリンカー（太字及び下線）を介してＧＤＦ１５のＮ末端（太字）に融合されたシグナル配列（下線）−マルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む、融合分子である。
【０３３３】
上に記載される融合構築物を参照すると、Ｆｃ及びＭＢＤを含有するものは、一時的に遺伝子導入された２９３細胞培養物から直接精製された。ＡＢＤ融合物は、細菌で発現された封入体から、成熟ＧＤＦ１５と類似する様式で発現及び精製された。
【０３３４】
ホモ２量体Ｆｃ融合構築物（ＦｃＧＤＦ１５）の場合、観察された分泌された形態は、培養培地における高分子量の酸化凝集体から成った。この観察された凝集を回避するために、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５／Ｆｃ（−）荷電対が、Ｆｃドメイン（Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ）に負荷電突然変異を含有するＦｃ（−）ドメインとともに共遺伝子導入される、Ｆｃドメイン（Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ）に正荷電突然変異を含有するＦｃ（＋）ＧＤＦ１５融合物として設計された。
【０３３５】
ＡＢＤ−ＧＤＦ１５、ＭＢＤ−ＧＤＦ１５、及びヒトＧＤＦ１５（対照）の溶解度評価は、変異タンパク質の溶解度の改善を成熟ヒトＧＤＦ１５（＜０．２ｍｇ／ｍＬの最大溶解度を有する）に対して評価することができる、ストリンジェントな緩衝剤である、１×ＰＢＳにおいて実施した。溶解度の評価は、それぞれの各融合分子についての吸光係数及び分子量を使用して計算されるベールの法則を使用して、２８０ｎｍの吸光度に基づいて判定した。Ａ２８０濃度は、ＢＳＡ標準対照に対する、５９５ｎｍでのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量で確認された。融合分子は、それらの溶解度のレベルに依存して５つの群のうちの１つに分類した：０．０〜０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋；０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬ＝＋＋；０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋；１．０〜５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋；及び＞５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋＋。評価された発現及び精製された融合分子の各々は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して、改善された溶解度を呈した：ｈＧＤＦ１５：＋；ＡＢＤ−ＧＤＦ１５：＋＋＋＋＋；ＭＢＤ−ＧＤＦ１５：＋＋＋＋（図１６（パネルＡ）を参照されたい）。
【０３３６】
１５日にわたる体重の減少は、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して改善された溶解度を示したＡＢＤ融合物に関して、インビボで確認された。１０週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝６）への単回３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＢＤ−ＧＤＦ１５の皮下投与後、１５日間にわたる体重（グラム／動物）を、ビヒクル対照群に対してモニターし、ｐ値は、二元ａｎｏｖａ分析によって判定した（＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。ＡＢＤ−ＧＤＦ１５の場合、体重の有意な低減が１５日目に観察され、延長された有効性を伴う分子を示す。０．３ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ皮下投薬でのｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＢＤ−ＧＤＦ１５分子の、２週間にわたってとられた時点でモニターされた追跡ＰＫプロファイリング（データは図示せず）は、５４．２時間（０．３ｍｇ／ｋｇ）及び２８．４時間（３ｍｇ／ｋｇ）のＴ１／２を実証した（かつ図１６（パネルＢ）を参照されたい）。
【０３３７】
実施例８：カモノハシＧＤＦ１５オルソログ組換えタンパク質の発現、ならびにＤＩＯマウスにおける食物摂取量及び体重に対する効果
実施例８に記載されるデータは、シグナルペプチド及びフューリン切断可能プロドメインを使用した、生物学的に活性なＧＤＦ１５オルソログの構築及び発現の実用性を例示する。
【０３３８】
成熟カモノハシＧＤＦ１５（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ（Ｏａ）；ＡＦＶ６１２７９）は、図１７Ａに示される構築物を使用して、本明細書に記載されるように組換えによって産生した。成熟カモノハシＧＤＦ１５ポリペプチドは、成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドに対して約４５％の同一性を呈する。
【０３３９】
終夜食物摂取量及び体重減少に対する効果は、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０ｍｇ／ｋｇの成熟ＯａＧＤＦ１５の単回皮下投与後、１７週齢のＤＩＯマウス（ｎ＝８）において判定した。成熟カモノハシＧＤＦ１５ポリペプチドは、成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドに対して４５％の配列同一性を呈するにすぎないが、インビボ効果は、それぞれ投薬前対投薬後２４（２４  ｐｏｓｔ−ｄｏｓｅ）の相違に基づき、食物摂取量減少（ＯａＧＤＦ１５＝０．０３ｍｇ／ｋｇ；ｈＧＤＦ１５＝０．０４ｍｇ／ｋｇ）、及び体重減少（ＯａＧＤＦ１５＝０．０４ｍｇ／ｋｇ；ｈＧＤＦ１５＝０．０１ｍｇ／ｋｇ）において観察された（図１７Ｂを参照されたい（ヒトＧＤＦ１５に関する結合曲線は図示せず）。
【０３４０】
本発明を実行するために発明者が知る最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が本明細書において説明される。前述の説明を読むことにより、開示される実施形態の変形は当業者に明らかとなり、当業者はそのような変形を適切に採用することができることが期待される。したがって、本発明が本明細書に特別に記載したものとは別な方法で実践され、本発明が、適用法令に認められる、添付の請求項に記載される対象の全ての修正及び等価物を含むことが意図される。さらに、上記に示される要素の、それらの全ての可能な変形の、どのような組み合わせも、本明細書中に特に記載されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【０３４１】
本明細書に記述される全ての刊行物、特許出願、アクセッション番号、及び他の参照文献は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｃ−３】
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【図１Ｃ−４】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図１Ｆ−１】
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【図１Ｆ−２】
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【図１Ｇ−１】
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【図１Ｇ−２】
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【図１Ｈ−１】
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【図１Ｈ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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