(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞透過性運搬ペプチドと有効成分とのコンジュゲートであって、
前記運搬ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチドであり、
前記運搬ペプチドは、前記有効成分の細胞内送達用のペプチドであり、
前記有効成分は、タンパク質、核酸、ペプチド、ミネラル、糖、ナノ粒子、生物学的製剤、造影剤、薬物及び化学物質のうちから選択される一つ以上である、
前記コンジュゲート。
【請求項２】
前記有効成分はＤＮＡまたはＲＮＡであり、ここで前記有効成分がＤＮＡであるとき、前記運搬ペプチドは、ポリリシンを介してＤＮＡと複合化される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記運搬ペプチドと有効成分とは、リンカーによって選択的に媒介されて共有結合で結合されるか、又は非共有結合で結合される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記有効成分は、タンパク質またはペプチドである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記有効成分は、サイトカイン、抗体、抗体断片、治療用酵素、可溶性受容体またはリガンドである、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記運搬ペプチドは、イソチオシアン酸フルオレセイン又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と結合される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記有効成分は、前記運搬ペプチドのＣ末端と結合される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記有効成分の効能標的が、癌細胞、免疫細胞または線維芽細胞である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記癌細胞は、肝臓癌細胞、乳房癌細胞及び白血病細胞からなる群から選択される少なくとも一つの癌細胞であり、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球、Ｂ細胞及び単核球からなる群から選択される少なくとも一つの免疫細胞である、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記有効成分は、細胞質への局所化のために必要な物質であり、前記運搬ペプチドは、細胞質への前記有効成分の局所送達を行う、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記有効成分は、ミトコンドリアに局所化される必要があり、前記運搬ペプチドは、前記有効成分のミトコンドリアへの局所送達を行う、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記造影剤は、放射線非透過性造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤及びＣＴ造影剤からなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記造影剤は、鉄系物質である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記造影剤は、フェロセンカルボン酸である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む造影剤。
【請求項１６】
前記造影剤は、細胞を造影するためのものである、請求項１５に記載の造影剤。
【請求項１７】
前記細胞は、幹細胞である、請求項１６に記載の造影剤。
【請求項１８】
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む、有効成分の細胞内送達用組成物。
【請求項１９】
前記有効成分は、疾病の治療または予防のための有効成分であり、前記組成物は、医薬組成物である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記有効成分は、機能性化粧品の有効成分であり、前記組成物は、化粧品組成物である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記有効成分は、機能性健康食品の有効成分であり、前記組成物は、健康食品組成物である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む細胞質ターゲッティング有効成分送達システムであって、
ここで前記運搬ペプチドは、細胞質に局所的に移動し、そして前記有効成分の細胞質局所送達を行うペプチドである、
前記細胞質ターゲッティング有効成分送達システム。
【請求項２３】
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを含むミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システムであって、
ここで前記運搬ペプチドは、ミトコンドリアに局所的に移動し、そして前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドである、
ミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システム。
【請求項２４】
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む、ミトコンドリア活性を調節するための組成物であって、
ここで前記運搬ペプチドは、細胞内ミトコンドリアに局所的に移動し、そして前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドである、
前記組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療、予防、進行の抑制または症状緩和のための医薬組成物であり、そして前記有効成分は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療、予防、進行の抑制または症状緩和のための成分である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
インビトロで有効成分を細胞内に送達するための方法であって、
請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載のコンジュゲートを、インビトロで細胞に投与するステップを含み、
ここで前記運搬ペプチドは、前記有効成分の細胞内送達を行う細胞透過性ペプチドである、前記方法。
【請求項２７】
前記有効成分を細胞内ミトコンドリアに局所送達するための方法である、請求項２６に記載の有効成分の細胞内送達方法。
【請求項２８】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物の製造における、配列番号１のアミノ酸配列から成る細胞透過性運搬ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テロメラーゼ由来の細胞透過性ペプチド、その細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲート、及び該コンジュゲートを含んだ組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子物質、核酸、タンパク質またはナノ粒子などは、分子レベルの治療物質として、大きい潜在力を有しているが、組織浸透及び細胞膜の浸透に対する抵抗性のために使用が制限されてしまう。前記物質を細胞内に移動させるシステムの開発は、分子的方法の治療において、イッシューとなってきた。低分子物質、核酸またはナノ粒子の場合、多様な試薬、電気穿孔法（electroporation）または熱衝撃（heat shock）などの方法で、細胞内輸送を可能としたが、タンパク質の場合、活性をそのまま維持しながら、細胞内に移動することは、非常に困難な問題であり、解決の糸口を見い出せないでいた。ところで、１９８０年代に、ＨＩＶの細胞膜を透過する研究過程で、特定１１個のアミノ酸配列からなるＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質が、細胞内への送達過程で、重要な役割を行うと明かされ、１９９０年代から、本格的にタンパク質の細胞内送達研究が進められた。
【０００３】
テロメア（telomere）は、染色体の末端に反復して存在する遺伝物質であり、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは、非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死亡する。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐため、癌細胞が死亡せず、続けて増殖可能であると知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドを提供するものである。
【０００５】
本発明の一側面は、細胞内有効成分送達体として有用なペプチドを提供するものである。
【０００６】
本発明の他の側面は、細胞内有効成分送達体として、特に、ミトコンドリアに局所送達する有用なペプチドを提供するものである。
【０００７】
本発明の他の側面は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の改善用、予防用または治療用の有効成分を、ミトコンドリアに局所送達する有用なペプチドを提供するものである。
【０００８】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とが複合化された（conjugated）コンジュゲート（conjugate）を提供するものである。
【０００９】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む組成物を提供するものである。
【００１０】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む医薬組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む機能性化粧品組成物を提供するものである。
【００１２】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む健康食品組成物を提供するものである。
【００１３】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む造影剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一側面によるコンジュゲートは、細胞透過性運搬ペプチド（carrier peptide）及び有効成分のコンジュゲート（conjugate）であり、前記運搬ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記配列と８０％超のアミノ酸配列相同性を有するペプチド、またはそれらの断片であり、前記８０％超のアミノ酸配列相同性を有するペプチド及び前記断片は、配列番号１の細胞透過性を維持するコンジュゲートである。
【００１５】
本発明の他の側面によるコンジュゲートにおいて、前記断片は、３個以上のアミノ酸で構成された断片でもある。
【００１６】
本発明の他の側面によるコンジュゲートにおいて、前記運搬ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されたペプチドでもある。
【００１７】
本発明の他の側面によるコンジュゲートにおいて、前記運搬ペプチドは、配列番号１の配列を有するペプチド、または前記ペプチド配列と８０％超の配列相同性を有するペプチドでもある。
【００１８】
本発明の一側面による造影剤は、前述のいずれか１つのコンジュゲートを含む造影剤でもある。
【００１９】
本発明の他の側面による造影剤は、細胞を造影するためのものであってもよい。
【００２０】
本発明の他の側面による造影剤において、前記細胞は、幹細胞でもある。
【００２１】
本発明の一側面による組成物は、前述のいずれか１つのコンジュゲートを含んでもよい。
【００２２】
本発明の他の側面による組成物において、前記有効成分は、疾病の治療または予防のための有効成分であり、前記組成物は、医薬組成物でもある。
【００２３】
本発明の他の側面による組成物において、前記有効成分は、機能性化粧品の有効成分であり、前記組成物は、化粧品組成物でもある。
【００２４】
本発明の他の側面による組成物において、前記有効成分は、機能性健康食品の有効成分であり、前記組成物は、健康食品組成物でもある。
【００２５】
本発明の一側面による細胞質ターゲッティング有効成分送達システムは、前述のいずれか１つのコンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞質内に局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分の細胞質局所送達を行うペプチドであり、８０％超のアミノ酸配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドの細胞質ターゲッティング能を保有した細胞質ターゲッティング有効成分送達システムでもある。
【００２６】
本発明の一側面によるミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システムは、前述のいずれか１つのコンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞内ミトコンドリアに局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドであり、８０％超の配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドのミトコンドリア・ターゲッティング能を維持したミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システムでもある。
【００２７】
本発明の一側面によるミトコンドリア活性調節用組成物は、前述のコンジュゲートののうちいずれか１つのコンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞内ミトコンドリアに局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドであり、８０％超のアミノ酸配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドのミトコンドリア・ターゲッティング能を維持したミトコンドリア活性調節用組成物でもある。
【００２８】
本発明の他の側面によるミトコンドリア活性調節用組成物において、前記組成物は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療用、予防用、進行の抑制用または症状緩和用の医薬組成物であり、前記有効成分は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療、予防、進行の抑制または症状緩和の機能を示す成分でもある。
【００２９】
本発明の一側面による方法は、有効成分を細胞内に送達するための方法として、前述のコンジュゲートののうちいずれか１つのコンジュゲートを、これを必要とする対象に投与することを含み、運搬ペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、前記有効成分の細胞内送達を行うペプチドであり、８０％超のアミノ酸配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドの細胞透過性を維持したものでもある。
【００３０】
本発明の他の側面による、有効成分を細胞内に送達するための方法は、有効成分を細胞内ミトコンドリアに局所送達するものでもある。
【００３１】
本発明の一側面による細胞透過性ペプチドは、配列番号１を含むペプチド、または配列番号１の断片であるペプチドであり、配列番号１の断片であるペプチドは、３個〜７個のアミノ酸から構成されたペプチドでもある。
【００３２】
前記ペプチドは、配列番号１を含む１７個超のアミノ酸から構成された細胞透過性ペプチドでもある。
【００３３】
本発明の一側面によるポリヌクレオチドは、前述の細胞透過性ペプチドをコードするポリヌクレオチドでもある。
【００３４】
本発明の一側面によるベクターは、前記ポリヌクレオチドを含むベクターでもある。
【００３５】
本発明の一側面による形質転換細胞は、前記ベクターを含む形質転換細胞でもある。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によるペプチド、または前記ペプチドと有効成分とが結合されたコンジュゲートを利用すれば、細胞内に透過され難い有効成分を容易に細胞内に送達することができる。これを介して、有効成分の効能を高め、その結果、投与量を減らすことができるので、薬物投与による副作用を最小化し、治療効率を高めることができる。特に、ミトコンドリアに局所送達することにより、ミトコンドリア関連の疾病または障害の改善、予防または治療の効能を高めることができる。化粧品の場合にも、極少量の有効成分だけでも、すぐれた効果を出すことができる。造影物質とのコンジュゲートを利用すれば、細胞治療での細胞移植過程、または移植された細胞をモニタリングするための造影剤に活用される。特に、生体内に注入された幹細胞のための造影剤として効果的に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】配列番号１（ｐｅｐ１）のペプチドと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：green fluorescent protein）とのコンジュゲート生産のためのプライマー配列を図式化した図面である。
【図２】配列番号１のペプチドと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とのコンジュゲート生産のためのベクターを図式化した図面である。
【図３】ＣＨＯ細胞株にＦＩＴＣ（ＣＨＯ−Ｆ、対照群、青色線）、ＴＡＴ、ＦＩＴＣに接合させたＣＨＯ−ＴＡＴ−Ｆ（薄緑色線）、ｐｅｐ１のＮ末端にＦＩＴＣを接合させたＣＨＯ−Ｆ−ｐｅｐ−１（水色線）、及びｐｅｐ１のＣ末端リシン（lysine）にＦＩＴＣを接合させたＣＨＯ−ｐｅｐ１−Ｆ（ピンク色線）を処理し、１時間培養し、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）を利用して、cellular uptake様相を分析した結果である。赤色線は、ＣＨＯ細胞株をそのまま分析したものであり、背景（background）値に該当する。
【図４】ＨｅｐＧ２細胞株にＦＩＴＣ（ＨｅｐＧ２−Ｆ、対照群、青色線）、ＴＡＴ、ＦＩＴＣに接合させたＨｅｐＧ２−ＴＡＴ−Ｆ（薄緑色線）、ｐｅｐ１のＮ末端にＦＩＴＣを接合させたＨｅｐＧ２−Ｆ−ｐｅｐ１（オレンジ色線）、及びｐｅｐ１のＣ末端リシンにＦＩＴＣを接合させたＨｅｐＧ２−ｐｅｐ１−Ｆ（水色線）を処理して１時間培養し、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）を利用して、cellular uptake様相を分析した結果である。赤色線は、ＨｅｐＧ２細胞株をそのまま分析したものであり、背景値に該当する。
【図５】ＣＨＯ細胞において、ＦＩＴＣ、ＴＡＴにＦＩＴＣに接合させたＴＡＴ−Ｆ、ｐｅｐ１のＮ末端にＦＩＴＣを接合させたＦ−ｐｅｐ１、及びｐｅｐ１のＣ末端リシンにＦＩＴＣを接合させたｐｅｐ１−Ｆを処理して１時間培養し、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）で分析した結果、細胞uptakeされた細胞の数を示した図面である（対照群は、ＣＨＯ細胞株背景値に該当する）。
【図６】ＨｅｐＧ２細胞において、ＦＩＴＣ、ＴＡＴにＦＩＴＣに接合させたＴＡＴ−Ｆ、ｐｅｐ１のＮ末端にＦＩＴＣを接合させたＦ−ｐｅｐ１、及びｐｅｐ１のＣ末端リシンにＦＩＴＣを接合させたｐｅｐ１−Ｆを処理して１時間培養し、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）で分析した結果、細胞uptakeされた細胞の数を示した図面である（対照群は、ＨｅｐＧ２細胞株背景値に該当する）。
【図７】配列番号１のペプチドにＦＩＴＣを結合させた後、それぞれＨｅＬａ細胞株に処理し、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）で分析した結果、細胞uptakeされた細胞の数を示した図面である。対照群はＦＩＴＣのみを処理したものである。
【図８】配列番号１のペプチドにＦＩＴＣを結合させた後、それぞれＨｅＬａ細胞株に処理して培養した後、細胞生存率及び毒性を測定した結果である。
【図９】ｐｅｐ１のＨｕｈ７細胞株での流細胞分析を介した細胞浸透能分析結果である。
【図１０】ｐｅｐ１のＨｕｈ７細胞株での流細胞分析を介した細胞浸透能分析結果である。
【図１１】ｐｅｐ１のヒトＴリンパ球細胞株での流細胞分析を介した細胞浸透能分析結果である。
【図１２】ｐｅｐ１のヒトＴリンパ球細胞株での流細胞分析を介した細胞浸透能分析結果である。
【図１３】ＰＥＰ１のＦＩＴＣ合成位置による流細胞分析結果である。
【図１４】ＰＥＰ１のＦＩＴＣ合成位置による共焦点顕微鏡分析を介した細胞浸透能分析結果である。
【図１５】ＭＣＦ７，Ｈｕｈ７，ＨｅｐＧ２細胞株において、ＴＡＴペプチドとＰＥＰ１との細胞内吸収様相が異なるということを示すために共焦点顕微鏡分析を実施した結果である。
【図１６】ＭＣＦ７，Ｈｕｈ７，ＨｅｐＧ２細胞株において、ＴＡＴペプチドとＰＥＰ１との細胞内吸収様相が異なるということを示すために共焦点顕微鏡分析を実施した結果である。
【図１７】ＭＣＦ７，Ｈｕｈ７，ＨｅｐＧ２細胞株において、ＴＡＴペプチドとＰＥＰ１との細胞内Pearson’s Coeff．の平均の分散を示したグラフである。
【図１８】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果である。
【図１９】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果ある。
【図２０】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果ある。
【図２１】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果ある。
【図２２】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果ある。
【図２３】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株でのＰＥＰ１濃度による分析結果ある。
【図２４】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株での経時的分析結果である。
【図２５】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株での経時的分析結果である。
【図２６】Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株での経時的分析結果である。
【図２７】富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による処理を行い、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析によって細胞浸透能を分析した結果である。
【図２８】富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による処理を行い、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析によって細胞浸透能を分析した結果である。
【図２９】富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による処理を行い、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析によって細胞浸透能を分析した結果である。
【図３０】富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による処理を行い、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析によって細胞浸透能を分析した結果である。
【図３１】富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による処理を行い、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析によって細胞浸透能を分析した結果である。
【図３２】ヒトＰＢＭＣにおいて、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による流細胞分析結果である。
【図３３】ヒトＰＢＭＣにおいて、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による流細胞分析結果である。
【図３４】ヒトＰＢＭＣにおいて、ｐｅｐ１の濃度、温度、時間による流細胞分析結果である。
【図３５】ヒトＰＢＭＣ及びJurkatでの化学処理剤による流細胞分析を実施した結果である。
【図３６】ヒトＰＢＭＣ及びJurkatでの化学処理剤による流細胞分析を実施した結果である。
【図３７】さまざまな抗体によるｐｅｐ１の細胞浸透能比較分析を行うために、ＨＳＰ７０抗体、エノラーゼ抗体、ＧＡＰＤＨ（santacruz）抗体、ＨＳＰ９０抗体を処理した後、流細胞分析を実施した結果である。
【図３８】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１（ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１）を神経幹細胞に処理した後、経時的状態を測定した写真である。
【図３９】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を神経幹細胞に処理した後、ＤＡＰＩで細胞核を染色した後、共焦点レーザスキャニングシステム（confocal laser scanning system）で神経幹細胞透過状態を測定した写真である。
【図４０】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１自体の毒性実験結果であり、セル計数キット−８（ＣＣＫ：cell counting kit−８）アッセイ及びラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ：lactate dehydrogenase）活性アッセイを利用して、それぞれ細胞生存率及び細胞毒性率の変化を示す。
【図４１】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を処理した神経幹細胞を移植した群（stem cells with ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真である。
【図４２】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を処理していない神経幹細胞を移植した群（stem cells without ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真である。
【図４３】フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を移植した群（ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真である。
【図４４】生理食塩水を移植した群（saline群）の脳をＭＲＩ撮影した写真である。
【図４５】配列番号１のペプチドと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とのコンジュゲートを製造するためのｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Promega）を示した図面である。
【図４６】ｐＥＴ−２８ａ vector模式図を示した図面である。
【図４７】クローニング模式図である。
【図４８】ｐＥＴ−ＧＦＰのクローニングを介した過発現過程を図示した図面である。
【図４９】ＩＰＴＧ inductionの原理を図示した図面である。
【図５０】多様な細胞株において、ｐｅｐ１が結合されたＧＦＰタンパク質の細胞浸透能を蛍光顕微鏡で分析した結果である。
【図５１】さまざまな細胞株において、ｐｅｐ１が結合されたＧＦＰタンパク質の変化による流細胞分析結果を示したグラフである。
【図５２】ＤＮＡ（poly−lysine）−ＣＰＰコンジュゲート製造で使用されたペプチドの一次構造である。
【図５３】図５２のペプチドの模式図である。
【図５４】ペプチドと結合されたＤＮＡのmobilityを示した図面である。
【図５５】さまざまな細胞株において、poly−lysineが結合されたｐｅｐ１によるＤＮＡの細胞浸透能を分析した結果である。
【図５６】poly−lysine−ｐｅｐ１−ＦＩＴＣが結合されたｓｉＲＮＡの細胞内輸送能を分析した結果である。
【図５７】Ｈｕｈ７細胞株でのｐｅｐ１ luciferase ｓｉＲＮＡ活性分析結果である。
【図５８】ＣＨＯ細胞株でのｐｅｐ１ luciferase ｓｉＲＮＡ活性分析結果である。
【図５９】ｐｅｐ１−ＦＩＴＣコンジュゲートと、ミトコンドリア局所化マーカーであるmitotracker（登録商標） deep red ＦＭ６４４／６６５ｎｍ（Invitrgen）とで染色した結果であり、（Ａ）ＭＣＦ−７細胞にｐｅｐ１−ＧＦＰコンジュゲートを単独処理、（Ｂ）ミトコンドリア局所化マーカーであるmitotracker（登録商標） deep red ＦＭ６４４／６６５ｎｍ（Invitrgen）単独処理、（Ｃ）細胞の位相差対比（phase contrast）、（Ｄ）ＡとＢとのイメージの結合イメージである。
【図６０】ｐｅｐ１−ＧＦＰコンジュゲートをヒト乳房癌由来のＭＣＦ７（human breast adenocarcinoma）付着細胞株に処理した後、ミトコンドリアのｈｓｐ７０抗体でウェスタンブロットを行った結果である。
【図６１】ｐｅｐ１−ＧＦＰのＨｅｐＧ２細胞株へのuptakeを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の望ましい具体例は、次の通りである：
１．細胞透過性運搬ペプチド（carrier peptide）と有効成分とのコンジュゲート（conjugate）であり、前記運搬ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドの配列と８０％超の配列相同性を有するペプチド、またはそれらの断片であり、前記８０％超の配列相同性を有するペプチド及び前記断片は、配列番号１ペプチドの細胞透過性を維持する、前記コンジュゲート。
【００３９】
２．前記断片は、３個以上のアミノ酸から構成された断片であるコンジュゲート。
【００４０】
３．前記運搬ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されたコンジュゲート。
【００４１】
４．前記運搬ペプチドは、配列番号１の配列を有するペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドであるコンジュゲート。
【００４２】
５．前記有効成分は、タンパク質、核酸、ペプチド、脂質、糖脂質、ミネラル、糖、ナノ粒子、生物学的製剤 (biological products)、造影剤（contrast agent）、薬物（drugs）及び化学物質（chemical compounds）のうちから選択された一つ以上であるコンジュゲート。
【００４３】
６．前記有効成分は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるコンジュゲート。
【００４４】
７．前記運搬ペプチドと有効成分は、共有結合によって、選択的にリンカーによって媒介されることによって、接合されたコンジュゲート。
【００４５】
８．前記運搬ペプチドと有効成分は、非共有結合によって接合されたコンジュゲート。
【００４６】
９．前記有効成分は、タンパク質またはペプチドであるコンジュゲート。
【００４７】
１０．前記有効成分は、サイトカイン、抗体、抗体断片、治療用酵素、可溶性受容体、またはリガンドであるコンジュゲート。
【００４８】
１１．前記運搬ペプチドは、イソチオシアン酸フルオレセイン（fluorescein isothiocyanate）と結合したコンジュゲート。
【００４９】
１２．前記運搬ペプチドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：green fluorescen tprotein）と結合したコンジュゲート。
【００５０】
１３．前記有効成分は、前記運搬ペプチドのＣ末端に結合したコンジュゲート。
【００５１】
１４．前記有効成分は、その効能標的が、癌細胞、免疫細胞または線維芽細胞であるコンジュゲート。
【００５２】
１５．前記癌細胞は、肝臓癌細胞、乳房癌細胞及び白血病細胞から構成された群から選択された一つ以上の癌細胞であり、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球、Ｂ細胞及び単核球から構成された群から選択された一つ以上の免疫細胞であるコンジュゲート。
【００５３】
１６．前記有効成分は、細胞質に局所化される必要があり、前記運搬ペプチドは、前記有効成分の細胞質への局所送達を行うコンジュゲート。
【００５４】
１７．前記有効成分は、ミトコンドリアに局所化される必要があり、前記運搬ペプチドは、前記有効成分のミトコンドリアへの局所送達を行うコンジュゲート。
【００５５】
１８．前記造影物質は、放射線非透過性造影物質（radiopaque contrast agent）、常磁性（paramagnetic）造影物質、超常磁性（superparamagnetic）造影物質、及びＣＴ造影物質から構成された群から選択されるコンジュゲート。
【００５６】
１９．前記造影物質は、鉄系物質であるコンジュゲート。
【００５７】
２０．前記造影物質は、フェロセンカルボン酸であるコンジュゲート。
【００５８】
２１．前記コンジュゲートを含む造影剤。
【００５９】
２２．前記造影剤は、細胞を造影するためのものである造影剤。
【００６０】
２３．前記細胞は、幹細胞である造影剤。
【００６１】
２４．前記コンジュゲートを含む組成物。
【００６２】
２５．前記有効成分は、疾病の治療または予防のための有効成分であり、前記組成物は、医薬組成物である組成物。
【００６３】
２６．前記有効成分は、機能性化粧品の有効成分であり、前記組成物は、化粧品組成物である組成物。
【００６４】
２７．前記有効成分は、機能性健康食品の有効成分であり、前記組成物は、健康食品組成物である組成物。
【００６５】
２８．細胞質ターゲッティング有効成分送達システムとして、前記有効成分送達システムは、前記コンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞質に局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分の細胞質局所送達を行うペプチドであり、８０％以上の配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドの細胞質ターゲッティング能を保有した細胞質ターゲッティング有効成分送達システム。
【００６６】
２９．ミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システムであって、前記有効成分送達システムは、前記コンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞内ミトコンドリアに局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドであり、８０％以上の配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドのミトコンドリア・ターゲッティング能を保有したミトコンドリア・ターゲッティング有効成分送達システム。
【００６７】
３０．ミトコンドリア活性調節用組成物であって、前記組成物は、前記コンジュゲートを含み、運搬ペプチドは、細胞内ミトコンドリアに局所的に移動するペプチドであり、前記有効成分のミトコンドリア局所送達を行うペプチドであり、８０％以上の配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドのミトコンドリア・ターゲッティング能を保有したミトコンドリア活性調節用組成物。
【００６８】
３１．前記組成物は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療用、予防用、進行の抑制用または症状緩和用の医薬組成物であり、前記有効成分は、ミトコンドリア関連の疾病または障害の治療、予防、進行の抑制または症状緩和の機能を示す成分であるミトコンドリア活性調節用組成物。
【００６９】
３２．有効成分を細胞内に送達するための方法であって、前記コンジュゲートを、これを必要とする対象に投与することを含み、運搬ペプチドは、細胞透過性ペプチドであり、前記有効成分の細胞内送達を行うペプチドであり、８０％以上の配列相同性を有するペプチド及び断片は、配列番号１ペプチドの細胞透過性を保有した有効成分の細胞内送達方法。
【００７０】
３３．前記方法は、有効成分を細胞内ミトコンドリアに局所送達する、有効成分の細胞内送達方法。
【００７１】
３４．細胞透過性ペプチドであり、前記ペプチドは、配列番号１を含む１７ａａ以上のペプチドから構成された細胞透過性ペプチド。
【００７２】
３５．細胞透過性ペプチドであり、前記ペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドであり、３個〜７個のアミノ酸から構成された細胞透過性ペプチド。
【００７３】
３６．前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７４】
３７．前記ポリヌクレオチドを含むベクター。
【００７５】
３８．前記ベクターを含む形質転換細胞。
【００７６】
タンパク質、核酸、ペプチドまたはウイルスなどは、治療物質として大きい潜在力を有しているが、分子レベルの大きさを有するので、組織及び細胞膜を侵透することができず、その使用が非常に制限的であった。また、小サイズの物質であるとしても、その性質や構造上、細胞膜の脂質二重層を透過することができない場合が多い。そのため、電気穿孔法（electroporation）または熱衝撃（heat shock）などにより、タンパク質、核酸、ペプチドまたはウイルスなどを細胞内に移動させる試みがあったが、細胞膜に損傷を与えずに、同時に前記物質の活性をそのまま維持しながら、前記物質を細胞内に移動させることは困難であった。そのような中、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ：human immuno-deficiency virus）由来のＴＡＴ（trans-activating transcriptional activator）タンパク質が、巨大活性物質を細胞内に移動させることができる細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide）として作用することができるということが明らかになりつつ、これに対する研究が活発に進められた。具体的には、細胞内毒性を引き起こすと知られたＴＡＴタンパク質とは異なり、生体内毒性を引き起こさず、さらに効果的に、タンパク質、核酸、ペプチドまたはウイルスのような巨大分子を、標的細胞内に移動させることができる物質に対する研究が進められた。それにより、本発明者らは、持続的な研究を介して、テロメラーゼ由来のペプチドが、細胞毒性がほとんどなく、かつ細胞透過性ペプチドとしてすぐれた効果を有するということを発見した。
【００７７】
配列番号１に記載されたペプチドは、下記表１の通りである。配列番号２は、ヒトテロメラーゼ全長タンパク質の配列である。配列番号１は、テロメラーゼ由来のペプチドであり、１６個アミノ酸から構成されたペプチドである。下記表１の「名称」は、ペプチドを区別するために名付けたものである。本発明の他の一側面で、配列番号１に記載されたペプチドのうち一つ以上のペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。本明細書において、「ｐｅｐ」というのは、配列番号１の配列を有するペプチド、またはその配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、または前記配列の断片を総称する用語である。
【００７８】
【表１】
0006272853.tif 000002
【００７９】
ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋立体構造の維持におけるそれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷または疎水性の維持におけるそれらの効果、または（ｃ）側鎖のバルク維持におけるそれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することによって行われる。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに区分される：
【００８０】
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００８１】
非保存的置換は、それら部類のうち１つの構成員を、他の部類で交換することによって行われる。ペプチドの適当な立体構造の維持と関連がないいかなるシステイン残基も、一般的にセリンで置換され、前記分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止することができる。逆に言えば、システイン結合を、前記ペプチドに加え、その安定性を向上させることができる。
【００８２】
ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化したもである。変化という意味は、ペプチドで発見された一つ以上の炭水化物残基の欠失、及び（または）ペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を示す。
【００８３】
ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−連結されたり、あるいはＯ−連結されたものである。Ｎ−連結されたということは、炭水化物残基がアスパラギン残基の側鎖に付着したということをいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。従って、それらトリペプチド配列のうち一つがポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−連結されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸に付着させることをいう。最も一般的には、セリンまたはトレオニンに付着させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。
【００８４】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上の前述のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ−連結されたグリコシル化部位の場合）。そのような変化は、一つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、あるいはそれら残基で置換することによってもなされる（Ｏ−連結されたグリコシル化部位の場合）。
【００８５】
本発明の一側面は、細胞透過性ペプチドであって、配列番号１、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを提供する。本発明の一側面は、一つ以上の有効成分を送達するための薬物送達体として、配列番号１を含むペプチドまたはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを含む医薬組成物を提供する。配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、安全でありながらも、すぐれた細胞透過性ペプチドとして作用するので、薬物と結合し、薬物を細胞内に効果的に送達することができる。
【００８６】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドと、移動対象である有効成分とが、互いにコンジュゲーションされたコンジュゲートを提供する。本発明の一側面において、有効成分は、タンパク質、核酸、ペプチド、脂質、糖脂質、ミネラル、糖、造影物質、薬物（drugs）及び化学物質（compounds）のうちから選択された一つ以上である。本発明の一側面において、前記有効成分は、ペプチドでもある。本発明の一側面において、前記有効成分であるペプチドは、サイトカイン、抗体、抗体断片、治療用酵素、可溶性受容体、またはリガンドでもある。
【００８７】
本明細書において、「細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ：cell penetrating peptide）」は、インビトロ（in vitro）及び／またはインビボ（in vivo）で、移動対象（cargo）を細胞内に移動させることができるペプチドを意味する。本明細書において、「移動対象」は、細胞透過性ペプチドと結合し、細胞内に移動することができる物質をいずれも含み、例えば、細胞透過効率を高めることを所望する全ての物質、具体的には、薬物、化粧品または健康食品の有効物質、さらに具体的には、一般的な経路を介しては、細胞内への移動が容易ではない物質、一層具体的には、タンパク質、核酸、ペプチド、ミネラル、ブドウ糖を例として挙げることができる、糖、ナノ粒子、生物学的製剤、ウイルス、造影物質、またはその他化学物質を含むが、それらに制限されるものではない。本明細書において、「薬物」は、疾病、傷または特定症状を緩和、予防、治療または診断するための物質を含む広範囲な概念である。
【００８８】
本明細書において、「運搬ペプチド（carrier peptide）」は、有効成分と結合し、有効成分を、所望する部位に移動させる役割を行うペプチドを意味する。
【００８９】
本発明の一側面において、移動対象としてのタンパク質またはペプチドは、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達タンパク質（または、ペプチド）、抗体及びワクチンのうち一つ以上を含むが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面において、核酸は、自然発生的または人工的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子でもあり、一本鎖または二本鎖でもある。核酸分子は、一つ以上でもあるが、同一類型（例えば、同一ヌクレオシド配列を有する）の核酸分子でもあり、他の類型として、核酸分子でもある。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、decoy ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＰＮＡ、アンチセンスオリゴマー（antosense oligomer）、プラスミド（plasmid）、及びその他変形された核酸のうち一つ以上を含むが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面において、ウイルスは、ウイルス全体、またはウイルスの核酸を含むウイルスコアを含んでもよい。本発明の一側面において、化学物質は、薬物として機能することができる化学物質を含む広範囲な概念であり、天然または合成の化学物質を含む。
【００９０】
遺伝子の発現過程において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、特定遺伝子発現が調節される現象を、ＲＮＡ干渉現象（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ interference）という。このような現象は、Ｃ．elegansにおいて、１９９８年初めて発見されて以来で、植物、ショウジョウバエ、哺乳動物にも共通して存在するという事実が明らかにされた（Fire et al., Nature, 391: 806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430: 161-164, 2004）。
【００９１】
ＲＮＡ干渉現象の起こる過程は、１９−２５ｂｐのｄｓＲＮＡが細胞内に入れば、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−induced silencing complex）複合体と結合し、アンチセンス（ガイド）鎖だけが、ｍＲＮＡと塩基配列相補的に結合し、ＲＩＳＣ複合体に存在するエンドヌクレアーゼドメインにより、標的ｍＲＮＡを分解すると知られている（Rana, T. M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8: 23-36, 2007; Tomari, Y. and Zamore, P. D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005）。すなわち、ｓｉＲＮＡは、特定タンパク質の生産を抑制することにより、遺伝子発現を妨害することによってＲＮＡ干渉に関与する。１９〜２３個のヌクレオシドから構成されたｓｉＲＮＡは、特定伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、二本鎖ＲＮＡ（double-stranded ＲＮＡ）を形成するように、ｍＲＮＡの相補的な順序に合わせて塩基対を形成する。その後、そのような二本鎖ＲＮＡは、細胞から伝令ＲＮＡを除去すると同時に、特殊に分解される。ｓｉＲＮＡは、最近、動物細胞において、特定遺伝子の発現を阻害させるのに卓越した効果を示すと明かされ、遺伝子治療剤として脚光を浴びている物質であり、その高い活性及び精密な遺伝子選択性によって、これまでの２０年間研究され、現在、治療剤として活用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドを代替する治療剤として期待されている。そのため、多くの製薬会社によって、ｓｉＲＮＡに基づく治療剤開発が行われている。ｓｉＲＮＡは、既存のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べ、１０倍ほど少ない量でも、遺伝子発現を阻害することができ、遺伝子選択性にさらにすぐれ、標的遺伝子のみを阻害することができると知られている。特に、治療を目的として、ｓｉＲＮＡ技法は、他の医薬品に比べ、容易にデザインが可能であり、高い目標選択性特徴と、特定遺伝子の発現を阻害する特徴とを有するので、非常な長所を有する。また、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現抑制は、生体内で自然に存在するメカニズムを利用するものであるので、毒性が低い。しかし、ｓｉＲＮＡは、生体内での安定性が低く、短時間内に分解されて陰イオンを呈するので、細胞膜を容易に透過し難く、細胞内への送達効率が落ちるという短所を有している。そのような短所は、本明細書に開示された運搬ペプチドが、ｓｉＲＮＡと接合することによって解決されるのである。
【００９２】
本発明の一側面において、移動対象である有効成分は、その効能標的が、癌細胞、免疫細胞または線維芽細胞でもある。具体的には、前記癌細胞は、肝臓癌細胞、乳房癌細胞及び白血病細胞から構成された群から選択された一つ以上の癌細胞であり、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球、Ｂ細胞及び単核球から構成された群から選択された一つ以上の免疫細胞でもある。
【００９３】
本発明の一側面において、前記有効成分は、細胞質に局所化される必要があり、前記運搬ペプチドは、前記有効成分細胞質への局所送達を行うものでもある。
【００９４】
本発明の一側面において、前記有効成分は、ミトコンドリアに局所化される必要があり、前記運搬ペプチドは、前記有効成分のミトコンドリアへの局所送達を行うものでもある。
【００９５】
本発明の一側面において、細胞透過性ペプチドによって細胞内に送達する薬物は、リポソーム、ミセル、ナノ粒子、磁性粒子または量子ドットのような薬物送達体をさらに含んでもよい。
【００９６】
本明細書において、「造影物質」というのは、医学的映像撮影（imaging）において、生体内構造または流体の造影のために使用される全ての物質を含む広範囲な概念である。適する造影物質は、放射性非透過造影物質（radiopaque contrast agent）、常磁性造影物質（paramagnetic contrast agent）、超常磁性造影物質（superparamagnetic contrast agent）、ＣＴ（computed tomography）造影物質及びその他造影物質を含むが、それらに制限されるものではない。例えば、放射性非透過造影物質（Ｘ線映像用）は、無機ヨード化合物及び有機ヨード化合物（例えば、ジアトリゾ酸）、放射性非透過金属及びその塩（例えば、銀、金、白金など）、並びにその他放射性非透過化合物（例えば、カルシウム塩、硫酸バリウムのようなバリウム塩、タンタル及び酸化タンタル）を含む。適する常磁性造影物質（ＭＲ映像用）は、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ：gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid）及びその誘導体、並びにその他のガドリニウム、マンガン、鉄、ジスプロシウム（dysprosium）、銅、ユロピウム（europium）、エルビウム（erbium）、クロム、ニッケル及びコバルトの複合体、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”、Ｎ'''−四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ、−Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（Ｄ０３Ａ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１０−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”、Ｎ'''−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシベンジルエチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）などを含む。適する超常磁性造影物質（ＭＲ映像用）は、磁鉄鉱（magnetite）、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ：super-paramagnetic iron oxide）、超小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ：ultrasmall superparamagnetic iron oxide）及び単結晶性（monocrystailine）酸化鉄を含む。他の適する造影物質は、ヨード化及び非ヨード化（non-iodinated），イオン性及び非イオン性のＣＴ造影物質、並びにスピン標識（spin-label）のような造影物質、またはその他診断活性剤（diagnostically effective agent）である。
【００９７】
造影物質の他の例は、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むが、それらに限定されないものではない、細胞で発現される場合、容易に検出可能なタンパク質をコードするマーカー遺伝子を含む。放射線核種（radionuclide）、蛍光物質（fluor）、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）のような多様な標識が利用される。
【００９８】
本発明の一実施例において、造影物質は、下記化学式２のフェロセンカルボン酸（ferrocenecarboxylic acid）でもある。フェロセンの構造は、化学式１に示されている。
【００９９】
【化１】
0006272853.tif 000003
【０１００】
【化２】
0006272853.tif 000004
【０１０１】
本発明の一実施例において、細胞透過性ペプチドと造影物質とのコンジュゲートは、下記化学式３のフェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１（ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１）でもある。
【０１０２】
【化３】
0006272853.tif 000005
【０１０３】
本発明の一側面において、ペプチドまたは組成物は、一つ以上の検出可能な標識（label）と融合される。該標識は、化学的、物理的、または酵素的な反応において、検出可能な化合物または信号を、直接的または間接的に発生させる化合物でもある。標識及びその後の検出は、当業界に公知の方法によって遂行される（例えば、Sambrook, J., and Russel, D. W. (2001); Lottspeich, F., and ZorbasH. (1998), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany）。該標識は、蛍光標識、酵素標識、発色（chromogenic）標識、発光標識、放射線標識、ハプテン、ビオチン、金属複合体、金属及び金コロイドを含むが、それらに制限されるものではない。そのような全ての類型の標識は、当業界に周知されており、多様な供給メーカーから商業的に入手可能である。
【０１０４】
本発明の一側面において、ペプチドに、移動対象（cargo）を直接結合させることができる。本発明の他の一側面において、共有結合または非共有結合を例として挙げることができる多くの結合方法を介して、ペプチドに移動対象を結合させることができる。移動対象は、例えば、本発明の一側面によるペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合することができる。例えば、ジスルフィド（disulfide）結合、あるいはペプチドＮ−グルタメート（Ｅ）のアルファアミン（alpha-amine）、またはＣ末端リシン（Ｋ）残基のアミンに移動対象を結合させる共有結合を介して、ペプチドに移動対象を結合させることができる。または、ペプチドと移動対象とのうちいずれか一つが他の一つを、カプセル状を例として挙げることができる形態に覆い包む非共有結合を介して、ペプチドと移動対象とを結合させることができる。
【０１０５】
本発明の他の一側面において、リンカー（linker）を介して、ペプチドと移動対象とを結合させることができる。例えば、ペプチドＮ−グルタメートのアルファアミン、またはＣ末端リシン残基のアミンに、６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（hynic：６−hydrazinopyridine−３−carboxylic acid）リンカーのようなリンカーを導入した後、リンカーに移動対象を結合させることにより、ペプチドに移動対象を結合させることができる。
【０１０６】
本発明のさらに他の一側面において、移動対象がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ペプチドには、ＳＨ基（チオール基）を導入し、ＤＮＡまたはＲＮＡには、マレイミド基（maleimide group）を導入した後、ペプチドのＳＨ基と、ＤＮＡまたはＲＮＡのマレイミド基とを結合させることによって、ペプチドに移動対象を結合させることができる。
【０１０７】
本発明のさらに他の一側面において、移動対象がタンパク質またはペプチドである場合、移動対象を発現するＤＮＡに、運搬ペプチドを発現するＤＮＡを結合させた後、それを発現させることによって、移動対象とペプチドとの融合タンパク質形態で、運搬ペプチドと移動対象とを結合させることができる。融合タンパク質による結合の具体的な例は、次の通りである：融合タンパク質を生産するためのプライマー（primer）作製時、移動対象を発現するヌクレオチドの前に、運搬ペプチドをコードするヌクレオチドを付けた後、得られたヌクレオチドを、制限酵素としてｐＥＴベクターを例として挙げることができるベクターに挿入し、ＢＬ−２１（ＤＥ３）を例として挙げることができる細胞に導入（transformation）して発現させる。そのとき、ＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）のような発現誘導剤を処理し、融合タンパク質を効果的に発現させることができる。その後、His tag精製（purification）のような方法を介して発現させた融合タンパク質を精製した後、ＰＢＳを利用して透析し、キットに入れ、例えば、２，０００〜４，０００ｒｐｍで、５〜２０分ほど遠心分離して濃縮させることができる。
【０１０８】
本発明の一側面において、運搬ペプチドは、染色物質または蛍光物質、具体的には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と結合することができる。本発明の一側面において、ＦＩＴＣは、運搬ペプチドのＮ末端ＬｙｓまたはＣ末端Ｌｙｓのアミノ基（ＮＨ3+）と結合することができる。末端にＬｙｓが存在しないペプチドである場合、Ｌｙｓを含むリンカーにより、ペプチドとＦＩＴＣとを結合させることができる。
【０１０９】
運搬ペプチドとして機能する本明細書に開示された、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、移動対象と１：１のモル比で結合することができるが、それ以外のモル比で結合することも可能である。例えば、ＣＰＰ：移動対象のモル比が２：１以上でもある。具体的には、２：１以上、３：１以上、４：１以上、５：１以上、６：１以上、７：１以上、８：１以上、９：１以上または１０：１以上である。これは、複数個分子の運搬ペプチドが１つの移動対象分子と結合することができるということを意味する。複数個の運搬ペプチド分子は、互いに直列または並列に連結される。直列に連結されるということは、運搬ペプチドの末端アミノ酸部位で、互いに結合するということを意味し、並列に連結されるということは、運搬ペプチドの末端アミノ酸以外の部分で、互いに結合するということを意味する。反対に、運搬ペプチド：移動対象のモル比が１：２以上でもある。これは、１つの運搬ペプチド分子に、複数個の移動対象分子が結合することができるということを意味する。例えば、運搬ペプチド：移動対象のモル比が１：２でもある。具体的には、１：２以上、１：３以上、１：４以上、１：５以上、１：６以上、１：７以上、１：８以上、１：９以上または１：１０以上である。
【０１１０】
イソチオシアン酸フルオレセインと結合したペプチドは、その移動経路を容易に把握することができるので、本発明の一側面による運搬ペプチドは、細胞イメージング用または細胞内薬物送達経路追跡用に活用される。
【０１１１】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドの、一つ以上の有効成分を送達するための薬物送達体としての用途を提供する。前記用途は、治療的用途でもあり、非治療的用途でもある。
【０１１２】
本発明の一側面は、薬物、及び配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを含む組成物を対象に適用することを含む、対象の細胞内に薬物を送達する方法を提供する。
【０１１３】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、及び造影物質を対象に適用することを含む、対象の適用薬物送達経路追跡方法を提供する。
【０１１４】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドと造影物質とのコンジュゲートを、対象に適用することを含む、対象の適用薬物送達経路追跡方法を提供する。
【０１１５】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、及び移動対象である薬物のコンジュゲートを含む組成物、並びに組成物の投与量、投与経路、投与回数及び適応症のうち一つ以上を開示した指示書を含む、対象の細胞内薬物送達用キットを提供する。
【０１１６】
本発明の一側面は、有効成分、及び配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを含む化粧品または食品組成物を提供する。本発明の他の側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含む、化粧品または食品組成物を提供する。
【０１１７】
本発明の一側面は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドと有効成分とのコンジュゲートを含み、有効成分を細胞内に送達する効果にすぐれる薬学、化粧品または食品組成物を提供する。
【０１１８】
ミトコンドリアは、有核細胞のエネルギー代謝の中心器官であり、ヒト疾病との関連性が最初に明らかにされた細胞内器官である（Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Ernster L, Afzelius B: A case o fsevere hypermetabolism of nonthyroid origin with a defect in the maintenance o fmitochondrial respiratory control: a correlated clinical, biochemical, and morphological study, J Clin Invest 41: 1776-804, 1962）。
【０１１９】
ミトコンドリアは、細胞のエネルギー代謝と細胞死滅（apoptosis）との調節に重要な役割を行うので、多様な治療薬物の主な標的として作用する。また、その器官は、細胞内カルシウム濃度調節に関与し、ミトコンクリド呼吸チェーンは、エネルギー生産に重要な電子伝達系として作用し、活性酸素の生産を引き起こす。結果として、ミトコンドリア機能異常は、糖尿病、心筋病症、不妊、失明、腎臓／肝臓疾患、脳卒中などの成人疾病と密接な関係がある（Modica-Napolitano KS, Singh KK: April mitochondria as targets for detection and treatment of cancer, Expert Rev Mol Med 11: 1-19, 2002）。同時に、ミトコンドリア遺伝子の突然変異は、老化、退行性神経疾患、癌疾患などの発病に関与する可能性が提起されている。
【０１２０】
本明細書において、「ミトコンドリア関連疾病」は、以下を含むが、それらに制限されるものではない：ハンチントン疾患；筋萎縮側の硬化症；ＭＥＬＡＳ（mitochondrial encephalomyopathy with lactic academia and stroke-like episodes；乳酸酸性血症、及び発作類似エピソードを有するミトコンドリア脳心筋病）；ＭＥＲＲＦ（myoclonus, epilepsy, and myopathy with ragged red fibers；断片化されたレッドファイバーを有する間代性筋痙攣の癲癇及び筋障害）；ＮＡＲＰ／ＭＩＬＳ（neurogenic muscular weakness, ataxia, retinitis pigmentosa／maternally inherited Leigh syndrome；神経性筋肉弱化、失調症及び色素性網膜炎／母系遺伝性ライ症侯群）；ＬＨＯＮ（Lebers hereditary optic neuropathy；レーバーの遺伝的視神経病、ミトコンドリア盲症）；ＫＳＳ（Kearns-Sayre syndrome；カーンズ・セイヤー症侯群）；ＰＭＰＳ（Pearson marrow-pancreas syndrome；ピアソン骨髄・膵臓症侯群）；ＣＰＥＯ（chronic progressive external opthalnoplegia；慢性進行性外眼筋麻痺）；ライ症侯群；アルパース症侯群；多発性ｍｔＤＮＡ欠損症侯群；ｍｔＤＮＡ消耗症侯群；複合体Ｉ欠陥；複合体ＩＩ（ＳＤＨ）欠陥；複合体ＩＩＩ欠陥；シトクロムｃ酸化酵素（ＣＯＸ、複合体ＩＶ）欠陥；複合体Ｖ欠陥；アテニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）欠陥；ピルピン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）欠陥；乳酸酸性血症を有するエチルマロン酸酸性尿症；乳酸酸性血症を有する３−メチルグルタコン酸酸性尿症；感染の間に衰微を示す無反応性癲癇；感染の間に衰微を示すアスパージャー症候群；感染の間に衰微を示す自閉症；注意欠如多動性疾患（ＡＤＨＤ）；感染の間に衰微を示す脳性マヒ；感染の間に衰微を示す失読症；母系遺伝性血小板減少症；白血病；ＭＮＧＩＥ（mitochondrial myopathy, peripheral and autonomic neuropathy, gastrointestinal dysfunction, and epilepsy；ミトコンドリア筋障害、末梢神経障害及び自律神経障害、胃腸機能不全、及び癲癇）；ＭＡＲＩＡＨＳ症侯群（mitochondrial ataxia, recrudescent infection, aphasia, hypouricemia/hypomyelination, seizure and dicarboxylic acid aciduria ミトコンドリア失調症、再発性感染、失語症、低尿酸血症／低髄鞘症、急発作、及びジカルボン酸性尿症）；ＮＤ６異緊張症；感染の間に衰微を示す循環性嘔吐症侯群；乳酸酸性血症を有する３−ヒドロキシイソ酪酸酸性尿症、乳酸酸性血症を有する糖尿病；ウリジン反応性神経性症侯群（ＵＲＮＳ）；家族性両側線条体壊死（ＦＢＳＮ）；アミノグリコシド関連難聴；弛緩された心筋障害；脾臓リンパ腫；ウォルフラム症侯群；多発性ミトコンドリアＤＮＡ欠損症侯群；及び腎細尿管性酸症／糖尿／失調症症侯群。
【０１２１】
他の様態において、本発明は、前記ポリペプチッドをコードする、核酸分子を提供し、その塩基配列は例えば、GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA配列（配列番号３）を有する。核酸分子は、当業者に公知の技法によって、宿主細胞内に導入される。例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム、電気穿孔法、ウイルスと細胞とを接触させることによる形質転換、または直接細胞内にマイクロ注射する方法などがある。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば、哺乳類細胞、または下級真核細胞、例えば、酵母細胞、または原核細胞、例えば、バクテリア細胞でもある。形質転換に適する原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、マイクバクテリア属に属する種を例として挙げることができる。
【０１２２】
前記核酸分子を含むベクターは、一般的に、組換え発現ベクターであり、宿主細胞の形質転換が可能にする複製起源及び選択可能なマーカー（例えば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、または大腸菌でのテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性、またはＳ．Cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子）、及びタンパク質コーティング配列の転写を調節するプローモーターを含んでもよい。使用される有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０；ｐｃＤＮＡの誘導体；ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Smith, et al., Gene 67: 31-40 (1988)）のような公知のバクテリアプラスミド；ｐＭＢ９及びその誘導体ＲＰ４のようなプラスミド；ＮＭ９８９のようなファージＩの数多い誘導体のようなファージＤＮＡ；Ｍ１３、及びフィラメント型一本鎖のファージＤＮＡのようなファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、ファージＤＮＡｂ、または発現制御配列を使用するために変形されたプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されたベクターなどがある。哺乳類発現ベクターは、複製起源、適するプローモーター及びエンハンサーを含む。また、必須リポソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体及びスプライス受容体の部位、転写終結配列、及び５’プランキング非転写配列を含んでもよい。哺乳類発現ベクターは、誘導性プローモーター、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼプローモーターを含むベクター、ＤＨＦＲ発現カセットを含むあらゆる発現ベクター、またはｐＥＤのようなＤＨＦＲ／メトトレキサート共増幅ベクター（Randal J, Kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current Protocols in Molycular Biology, 16, 12 (1991)）を含む。または、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えば、ｐＥＥ１４（Celltech）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、または核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下で、エピソーム性発現を指示するベクター、例えば、ｐＲＥＰ４（Invitrogen）、ｐＣＥＰ４（Invitrogen）、ｐＭＥＰ４（Invitrogen）、ｐＲＥＰ８（Invitrogen）、ｐＲＥＰ９（Invitrogen）及びｐＥＢＶＨｉｓ（Invitrogen）が使用される。選択性哺乳類発現ベクターとしては、Ｒｃ／ＣＭＶ（Invitrogen）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen）などがある。本発明に使用されるワクチニアウイルス哺乳類発現ベクターは、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓなどがある。
【０１２３】
本発明に使用される酵母発現システムとしては、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Invitrogen）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（Invitrogen）、ｐＲＳベクターなどがある。
【０１２４】
前記ベクターは、多様な哺乳類細胞、特に、ヒト由来細胞や、バクテリア、酵母、真菌、昆虫、線虫類及び植物細胞に導入することができる。適する細胞の例としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１、ＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞及びＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ６３６１、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７１１及びＣｖ１細胞、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ７０などがある。
【０１２５】
本発明に使用される他の適する細胞としては、原核宿主細胞菌株、例えば、大腸菌（例えば、ＤＨ５−α菌株）、枯草菌、ネズミチフス菌、またはシュードモナス属、ストレプトマイセス属及びブドウ球菌属に属する菌株がある。
【０１２６】
本発明の一側面による組成物は、配列番号１を含むペプチド、またはその断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドを、０．１μｇ／ｍｇ〜１ｍｇ／ｍｇ、具体的には、１μｇ／ｍｇ〜０．５ｍｇ／ｍｇ、さらに具体的には、１０μｇ／ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｇ含量で含んでもよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すのに適切なだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、コスト対比効果の側面でも、前記範囲で含むことが適切である。
【０１２７】
本発明の一側面による組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に適用されてもよい。
【０１２８】
本発明の一側面による医薬組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下などに投与されてもよい。
【０１２９】
経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。
【０１３０】
本発明の一側面による医薬組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一側面による医薬組成物は、当業界の一般的な方法によって製造される。
【０１３１】
本発明の一側面による医薬組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路、または処方者の判断によって異なる。そのような因子に基づいた適用量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｇ／ｋｇ／日、具体的には１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日になるが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面による医薬組成物は、１日１回〜３回投与されるが、それに制限されるものではない。
【０１３２】
本発明の一側面による化粧品組成物は、局所適用に適する全ての剤形として提供される。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（foam）またはエアロゾールの剤形で提供される。そのような剤形は、当該分野の一般的な方法によって製造される。
【０１３３】
本発明の一側面による化粧品組成物は、主効果を損傷させない範囲内で、望ましくは、主効果に相乗効果を与えることができる他の成分を含んでもよい。また、本発明の一側面による化粧品組成物は、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機または無機の顔料、香料、冷感剤または制汗剤をさらに含んでもよい。前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で、当業者が容易に選定可能であり、その配合量は、化粧品組成物全体重量を基準に、０．０１〜５重量％、具体的には０．０１〜３重量％でもある。
【０１３４】
本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特別に限定されるものではないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などで剤形化される。各剤形は、有効成分以外に、当該分野で一般的に使用される成分を剤形または使用目的によって、当業者が困難なしに、適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こるのである。
【０１３５】
前記有効成分の投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には５０μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日でもあるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。
【０１３６】
本明細書で使用された用語は、特定具体例について説明するための目的のみに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すものである。用語である「含む」、「有する」及び「含有する」は、開かれた用語と解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。
【０１３７】
数値の範囲を言及するのは、ただその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりとする容易な方法だからであり、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさに個別的に明細書に言及されているように本明細書に統合される。全ての範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【０１３８】
本明細書に言及された全ての方法は、異なって明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順で遂行されてもよい。ある一実施例及び全ての実施例、または例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求の構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されてはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、通常理解されるような意味を有する。
【０１３９】
本発明の望ましい具体例は、本発明を遂行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行記載を読めば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用することを期待し、本明細書に記載されたところと異なる方式で本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されるように、添付された特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせでも、ここで反対に明示するか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照し、具体的に示されて記述されたが、当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチドを、従来公知の固相ペプチド合成法によって製造した。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron、Ｉｎｃ．，大韓民国大田所在）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）を介して、Ｃ末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着したものを使用した。例えば、次の通りである：
【０１４１】
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｌａ−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−chloro−Trityl Resin
【０１４２】
ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−termがＦｍｏｃによって保護され、残基は、いずれも酸で除去されるＴｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−butylester）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−pentamethyl dihydro−benzofuran−５−sulfonyl）などによって保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：
【０１４３】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−Mercaptoaceticacid
【０１４４】
カップリング試薬（coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Benzotriazole−１−yl）−１，１，３，３−tetamethylaminium hexafluorophosphate］／ＨＯＢｔ［Ｎ−Hydroxxybenzotriazole］／ＮＭＭ［４−Methylmorpholine］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を利用した。合成されたペプチドをResinから分離し、残基の保護基を除去するためには、切断カクテル（cleavage cocktail）［ＴＦＡ（trifluoroacetic acid）／ＴＩＳ（triisopropylsilane）／ＥＤＴ（ethanedithiol）／Ｈ2Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。
【０１４５】
アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬで精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。
【０１４６】
配列番号１のＰＥＰ １の具体的な合成過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resinに保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
【０１４７】
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
【０１４８】
３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin）を作った。
【０１４９】
４）切断（cleavage）：合成が完了したペプチドResinに、切断カクテル（cleavage cocktail）を加え、ペプチドを樹脂から分離した。
【０１５０】
５）得られた混合物（mixture）に、cooling diethyl etherを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。
【０１５１】
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。
【０１５２】
実施例２：ＣＰＰ−ＦＩＴＣコンジュゲートの細胞透過能実験
１．コンジュゲートの製造
（１）ＦＩＴＣ−ＣＰＰコンジュゲートの製造
配列番号１のペプチドをＦＩＴＣと接合させたコンジュゲートを、次のように製造した。例えば、配列番号１のｐｅｐ１とＦＩＴＣとのコンジュゲート、すなわち、ＦＩＴＣ−linker−ｐｅｐ１を次のように製造した。
前記実施例１のようにして得られたペプチッド基本骨格ＮＨ2−linker−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−trityl樹脂）に、ＦＩＴＣを反応させた。具体的には、フルオレセイン−５−イソシオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein−５−isothiocyanate）（８当量）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−diisopropylethylamine）（１６当量）とをＤＭＦに溶かして添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。その結果、ＦＩＴＣ−linker−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−trityl樹脂を得た。ここで、リンカーは、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ：６−aminohexanoic acid）である。前記合成が完了したペプチド樹脂に、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ＝９５／２．５／２．５を加え、コンジュゲートを樹脂から分離させた。得られた混合物に、クーリングジエチルエーテル（cooling diethyl ether）を加えた後、遠心分離して得られたコンジュゲートを沈澱させた。その後、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、分析的（analytical）ＨＰＬＣで純度を確認し、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認した。分子量確認を介して得られた物質が、ＦＩＴＣ−ｐｅｐ１であるということが立証された。その後、凍結乾燥を行った。
【０１５３】
（２）ＣＰＰ−ＦＩＴＣコンジュゲートの製造
前記実施例２の１．（１）のように、ペプチド基本骨格（ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｄｄｅ）−２−chloro−trityl樹脂）を製造した。製造されたペプチド基本骨格のＣ−ｔｅｒｍに、ＦＩＴＣを選択的に導入するために、Ｎ−ｔｅｒｍをＢｏｃで保護した。その後、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３０当量）とＤＩＰＥＡ（３０当量）とをＤＭＦに溶かして添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。その結果、Ｂｏｃ−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｄｄｅ）−２−chloro−trityl樹脂を得た。その後、Ｃ−ｔｅｒｍ Ｋの残基にＦＩＴＣを付けるために、２％ ＤＭＦ中のヒドラジン（hydrazine in ＤＭＦ）を処理し、Ｃ−ｔｅｒｍ Ｌｙｓの残基保護基であるＤｄｅを除去した。その結果、Ｂｏｃ−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（ＮＨ２）−２−chloro−trityl樹脂を得た。その後、ＦＩＴＣ（８当量）とＤＩＰＥＡ（１６当量）とをＤＭＦに溶かして添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。その結果、Ｂｏｃ−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（ＦＩＴＣ）−２−chloro−trityl樹脂を得た。前記合成が完了したペプチド樹脂に、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ＝９５／２．５／２．５を加え、ペプチドを樹脂から分離した。得られた混合物にクーリングジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させた。その後、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、分析的（analytical）ＨＰＬＣで純度を確認し、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認した。その結果として得られた物質がｐｅｐ１−ＦＩＴＣであるということが立証された。その後、乾燥を行った。
【０１５４】
２．一次実験
（１）細胞株の培養
中国ハムスターの卵巣細胞株ＣＨＯ（Chinese hamster ovary cell line）、ヒト肝細胞癌の細胞株であるＨｕｈ７（human hepatocellular carcinoma cell lien）、ＨｅｐＧ２（human hepatocellular carcinoma cellline）、ヒト乳房癌細胞株ＭＣＦ７（human breast adenocarcinpma cell line）、サル腎臓線維芽細胞株ＣＯＳ７（monkey kidney fibroblast cell line）の付着細胞株と、ヒトＴリンパ球細胞株Jurkat（human Ｔ−cell leukemia cell line）、ヒトＢ細胞株Raji（human Ｂ cell line）、ヒト単核球細胞株ＴＨＰ１（human monocyte cell line）、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２（human leukemia cell line）の富化細胞株を使用した。また、ヒト線維芽細胞の滑液細胞及び滑液組織に由来した細胞を得て、一次培養細胞株を作り、ネズミの骨髄に由来した樹枝状細胞ｂｍＤＣｓ（bone marrow deriveddendritccells）の細胞株を使用した。Ｈｕｈ７，ＭＣＦ７，Jurkat，Raji，ＴＨＰ１，Ｋ５６２細胞株は、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＣＨＯ細胞株は、ＤＭＥＭ培地、ＨｅｐＧ２細胞株は、ＭＥＭ培地を使用する。それぞれの培地には、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で培養した。
【０１５５】
ｂｍＤＣｓは、マウス骨髄から細胞を得て、ＧＭ−ＣＳ（２０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とを入れたＲＰＭＩ １６４０培地で樹枝状細胞で分化させる。２４ウェルプレートに、細胞を１ｘ１０6分周し、２日に１回ずつ培地を替え、７日目になる日の成熟した樹枝状細胞を使用する。
【０１５６】
ヒト由来ＰＢＭＣ及びリンパ球（lymphocyte）分離は、健常者から血液を採血（５０ｍｌ）した後、Biocoll Separating Solution（Biochrom ＡＧ、ベルリン、ドイツ）を使用して、ＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cells）層及びリンパ球を回収する。
【０１５７】
ＨｅＬａ細胞株は、ＭＥＭ（minimum essential medium）に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、Earle’s salts、non-essential amino acids、ピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で培養して細胞株を準備した。
【０１５８】
前述の全ての細胞株は、ＡＴＣＣ（American Type Cell Culture）から購入した細胞株である。
【０１５９】
（２）in vitroでのｐｅｐ１−ＦＩＴＣのuptake分析
前記細胞株に、ｐｅｐ１（配列番号１）を処理し、既存の公知のＨＩＶのＰＴＤであるＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号１０）とのuptake程度を比較するために、流細胞分析器（flow cytometry）と共焦点顕微鏡（confocal microscopy）との分析を実施した。
【０１６０】
流細胞分析（flow cytometry）
付着細胞株は、プレートに細胞株が９０〜１００％分周され、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養する。培地を除去し、ＰＢＳ洗浄後、細胞飢餓のために、それぞれのウェルに、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １ｍＬを入れ、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１時間培養する。ＯＰＴＩ−ＭＥＭで１回洗浄した後、１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに１０μＭ濃度のＦＩＴＣと結合されたペプチドを処理した後、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１時間培養する。培地除去した後、１Ｘ ＰＢＳで洗浄を３回行った後、トリプシン／ＥＤＴＡで離した後、ＦＡＣＳチューブに入れ、さらにＰＢＳで洗浄を３回する。処理していない細胞株を対照群にし、ＦＩＴＣと、残りのＦＩＴＣコンジュケートされたペプチドとのcellular uptake様相を比較分析する（図３〜図６参照）。
本実施例の結果から、従来公知のＴＡＴより、ｐｅｐ１が細胞内透過効率が高いということを確認し、特に、Ｃ末端に存在するリシン残基にＦＩＴＣが接合された場合、細胞内透過効率が最良であるということを確認した。
【０１６１】
共焦点顕微鏡（confocal microscopy）分析
前記培養された細胞株を、チャンバウェルに分周し、培地に１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加した培地に、細胞株が２−chamber glass slide（ＮＵＮＣ，Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に５０％占めるように分周し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養する。
【０１６２】
培地除去した後、ＰＢＳで洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １ｍｌで１時間の飢餓を行わせる。処理する５μＭのＦＩＣＴ結合されたペプチドを各チャンバに５０μｌ入れ、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で２時間培養する。培地除去した後、ＰＢＳ洗浄を３回行う。各チャンバに、０．５ｍＬ４％パラホルムアルデヒドを入れ、室温で２０分間固定させる。ＰＢＳで迅速に４％ＰＦＡを２回洗浄する。ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３ヨード６４２／６６１ｎｍ（Invitrogen）を５００ｎＭ（Invitrogen）処理し、１０分間室温で細胞核を染色する。溶液除去した後、１Ｘ ＰＢＳ洗浄を３回行った後、プラスチックチャンバを除去し、スライド上に、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標） mounting medium（Vector Laboratories）を落とし、Ｎｏ．１．５ thickness cover slipを気泡が生じないように覆う。cover slipのエッジに透明ネールポリッシュを塗り、サンプルを作る。フルオレセンを見る前のサンプルを、４℃で光を避けて保管した後、共焦点レーザ走査システム（confocal laser scanning system）で比較分析した。分析には、ＦＶ１０００レーザ走査共焦点顕微鏡（Olympus）を使用した。
【０１６３】
（ｉ）ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）分析
Ｐｅｐ１を処理した前記細胞株は、ＰＢＳ緩衝溶液を使用して２回洗浄し、沈殿物は、５０ｍＭ Tris ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、０．１％ ＮＰ ４０、１００ｇ／μｌロイペプチン、１００ｇ／μｌアプロチニンを混ぜて作った分解緩衝溶液（lysis buffer）に再富化させた。
【０１６４】
富化された細胞を超音波粉砕器（sonicator ultrasonic processor，Misonix，ＮＹ、米国）を利用して、氷において、１５秒間２回超音波粉碎した後、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液（細胞溶解質）を獲得した。ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Bradford protein assay，Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を利用して、タンパク質濃度を定量して蛍光ＥＬＩＳＡを実施した。
【０１６５】
３．二次実験
（１）ＨｅＬａ細胞株での細胞浸透能
準備された前記細胞株に、実施例２．１から準備されたｐｅｐ１とＦＩＴＣとのコンジュゲート（ＣＰＰ）を処理し、公知のＨＩＶのＰＴＤ（protein transduction domain）であるＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）とのuptake程度を比較するために、流細胞分析器（flow cytometry）と共焦点顕微鏡（confocal microscopy）との分析を実施した。
【０１６６】
細胞株を６ウェルプレートに分周し、培地に１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ＭＥＭ（minimum essential medium）で１時間飢餓を行わせる。各運搬ペプチド２０μＭを処理し、３７℃に１時間培養した。ＰＢＳで洗浄過程を３回反復し、トリプシンＥＤＴＡを３７℃で１０分間処理し、細胞外側に付いた運搬ペプチドを除去する。冷蔵されたＰＢＳで細胞を収去した後、３回洗浄過程を、遠心分離を介して反復した。その後、４％パラホルムアルデヒドが含まれた０．５ｍｌ ＰＢＳで懸濁させ、ＦＡＣＳ Calibur（Becton Dickinson）で蛍光を分析した。処理されていない細胞（対照群）と、多様なＦＩＴＣ接合ペプチドとのcellular uptake様相をＭＦＩ（mean fluorescence intensity）で比較分析した。
【０１６７】
前記培養された細胞株をチャンバウェルに分周し、培地に１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養した。ＰＢＳ洗浄後、ＭＥＭ（minimum essential medium）で１時間飢餓をさせた。各運搬ペプチド１０μＭを処理し、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳで洗浄過程を３回反復し、２％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定させた後、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で常温で核を染色し、共焦点顕微鏡で観察して比較分析した。
【０１６８】
その結果は、図７に示されている通りである。
【０１６９】
一方、細胞生存率及び毒性分析のために、前記培養された細胞株を９６ウェルプレートに分周し、培地に１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養した。ＰＢＳ洗浄後、ＭＥＭ（minimum essential medium）で１時間飢餓をさせた。各運搬ペプチド２０μＭを処理し、３７℃で２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイ法を利用して、細胞生存率及び毒性を分析した。その結果は、図８に示されている通りである。
【０１７０】
（２）Ｈｕｈ７細胞株での流細胞分析を介した細胞浸透能分析
ＰＥＰ１の細胞浸透能を調べるために、ＰＥＰ１を処理したＨｕｈ７細胞で、流細胞分析を行った。分析方法は、前記（１）のＨｅＬａ細胞株分析において記載された通りである。分析結果、ＰＥＰ１は、ＴＡＴに比べ、低い細胞浸透能を示すが、対照群に比べ、高い細胞浸透能を示すと確認された（図９、図１０）。
【０１７１】
（３）ヒトＴリンパ球細胞株の細胞浸透能分析
ＰＥＰ１の細胞浸透能を確認するために、ペプチドをヒトＴリンパ球に処理し、流細胞分析方法として、ＦＡＣＳ分析を行った。分析方法は、前記（１）のＨｅＬａ細胞株分析において記載された通りである。分析結果、ｐｅｐ１が対照群（対照群ＦＩＴＣ）に比べ、約２５倍の浸透能を示し、これは、ＨＩＶ由来のＴＡＴに比べ、約６倍以上高いと観察された（図１１、図１２）。
【０１７２】
（４）ＰＥＰ１のＦＩＴＣ合成位置による流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析を介した細胞浸透能
ＰＥＰ１に、ＦＩＴＣをＮ末端及びＣ末端に結合したコンジュゲートを利用して、多くの細胞株での浸透能を確認するために、流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析を実施した。使用された分析法は、前記（１）のＨｅＬａ細胞株分析において記載された通りである。使用された細胞株は、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＣＨＯ、ｂｍＤＣである。その結果、全ての細胞株で、Ｃ末端にＦＩＴＣが結合されたＰＥＰ１において、およそ３倍から１０倍ほど高い細胞浸透能を観察することができた（図１３）。また、蛍光顕微鏡で観察したとき、Ｎ末端に結合されたペプチドに比べ、Ｃ末端にＦＩＴＣが結合されたＰＥＰ１の方が細胞質内への浸透能が高いと観察された（図１４）。
【０１７３】
（５）多様な細胞株でのＴＡＴとＰＥＰ１との共焦点顕微鏡分析を介した細胞浸透能
ＴＡＴペプチドとＰＥＰ１との細胞内吸収様相が異なるということを示すために、共焦点顕微鏡分析を、細胞株（ＭＣＦ７、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２）別に実施した。図１５及び図１６は、分析結果イメージである。グリーン（４８８ｎｍ）染色は、ＦＩＴＣを示し、ＴＯＰＲＯ−３で染色されたレッド（６３３ｎｍ）部分は、細胞内核を示している。核とペプチドとの共局在（colocalization）を示すために、核部分をレッドと指定した。イメージにおいて、共局在を示すようになれば、緑色と赤色とが合わさったオレンジ色を示す。実験の結果、ＴＡＴを処理した核部分のオレンジ色を示す部分が、ペプチドと細胞核とが共局在しているということを意味する。それに比べ、ＰＥＰ１を処理した細胞内核では、オレンジ色を示す部分がない。
【０１７４】
このような結果は、ＰＥＰ１が細胞内で、ＴＡＴとは異なる位置に吸収されるということを意味する。これを数値化して示したグラフが図１７である。
【０１７５】
全ての共焦点顕微鏡分析イメージは、ＦＶ１０００レーザ走査共焦点顕微鏡（Olympus）を使用したものである。共局在を意味するPearson’s Coeff．を使用して、図面に提示した。それぞれの細胞株ＭＣＦ７，Ｈｕｈ７，ＨｅｐＧ２で、ＲＯＩ（region of interest）を指定し、Pearson’s Coeff．の平均分散を示している。Ｐ値は、全ての細胞株において、０．０００１より低い結果が出て、それを介して、ＴＡＴは、細胞核に局在する一方、ＰＥＰ１は細胞核に局在せず、細胞質に留まるという事実を確認することができる。このように、ＰＥＰ１が細胞の細胞質に局所化されるという特性は、ＴＡＴを含んだ既存のＣＰＰに比べ、差別化される最も重要な点であるといえる。
【０１７６】
実施例３：環境条件による浸透能分析
（１）さまざまな細胞株でのＰＥＰ１ペプチドの濃度、経時的流細胞分析
さまざまな細胞株を利用して、ＰＥＰ１を、濃度、時間によって処理し、浸透能を確認した。細部的な分析方法は、実施例２に記載されたところによる。分析結果、Ｈｕｈ７，ｂｍＤＣ（マウス骨髄由来樹枝状細胞株），ＣＨＯ，ＣＯＳ７細胞株のいずれにもおいて、ＴＡＴと同様に、濃度によって上昇する傾向を示した。ＨｅｐＧ２の場合、ＴＡＴは上昇する一方、ＰＥＰ１は、５０μＭ濃度で、多少低下する様相が観察され、ＭＣＦ細胞株では、他の細胞と異なり、１０μＭ以下の濃度でも、ｐｅｐ１がＴＡＴに比べ、約４倍以上上昇するということが観察され、やはり濃度によって上昇するということを確認することができた（図１８〜図２３）。経時的に観察したときも、Ｈｕｈ７細胞株、ＭＣＦ細胞株、ＨｅＬａ細胞株のいずれにおいても上昇するが、特に、ＭＣＦ７細胞株において、５μＭを処理したとき、全ての時間において、約１０倍以上上昇した細胞浸透能が観察された（図２４〜図２６）。
【０１７７】
（２）富化細胞株での濃度、温度、時間による流細胞分析及び共焦点顕微鏡分析を介した細胞浸透能分析
富化細胞株として、ヒトＴ細胞株であるJurkat、ヒト単核球細胞株であるＴＨＰ１、Ｂ細胞株であるRaji細胞株、ヒト白血病細胞株であるＫ５６２細胞株を利用して、ペプチドの濃度、温度、時間による処理を行い、分析した。その結果、Jurkat細胞株及びＴＨＰ１細胞株では、ＴＡＴに比べ、ＰＥＰ１が、それぞれ１．５倍、２倍以上高い浸透能を示したが、Ｂ細胞株であるRaji細胞株とＫ５６２細胞株は、ＴＡＴがさらに高い浸透能を示すということを確認した。濃度によっては、全ての細胞において上昇する傾向を観察することができ、経時的には、Jurkatは、持続的に３倍以上上昇するが、ＴＨＰ１は、時間が過ぎるにつれ、多少低下するということを観察することができ、温度によっては、全ての細胞株で差を見い出すことができなかった。そのような分析結果から、ＰＥＰ１は、Ｔ細胞及び単核球細胞株での浸透能がさらにすぐれているということを確認することができる（図２７〜図３１）。
【０１７８】
（３）ヒトＰＢＭＣでの濃度、温度、時間による流細胞分析
ヒト血液から分離されたＰＢＭＣを利用して、ペプチドの濃度、時間によって処理を行って分析した。その結果、全体ＰＢＭＣにおいて、ＴＡＴに比べ、ＰＥＰ１が１．４倍高い浸透能を示し、濃度と時間とにより、ＴＡＴ及びＰＥＰ１いずれも上昇する傾向を示し、リンパ球では、ＰＥＰ１がおよそ１．８倍の上昇を示したが、単核球では、ＴＡＴと類似した浸透能であると観察された。濃度によっては、リンパ球でも単核球でもいずれも上昇様相を示し、経時的には、リンパ球、単核球いずれも上昇する傾向が観察されたが、特に、単核球は、経時的にＰＥＰ１の浸透能が上昇し、３時間までは、ＴＡＴと同様に上昇するが、５時間目には、ＴＡＴに比べ、約２０％さらに上昇すると確認することができた（図３２〜図３４）。
【０１７９】
（４）ヒトＰＢＭＣ及びJurkatでの化学処理剤による流細胞分析
ヒト血液から分離されたＰＢＭＣを利用して、浸透メカニズム研究を確認することができる化学的処理剤利用分析を実施した。本細胞浸透メカニズムを確認するための化学処理剤は、２００３年ＪＢＣ（２７８（３６）、３４１４１−３４１４９）で報告された資料を参考にして濃度を決めた。化学処理剤は、ＰＥＰ１ペプチド処理する１時間前に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭであらかじめ処理した後、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＥＰ１ペプチドを処理した後、流細胞分析を行った。
【０１８０】
分析結果、全体ＰＢＭＣにおいて、ＴＡＴに比べ、ＰＥＰ１がplasma membrane cholesterol extractionであるＭａｔＣＤを処理したとき、浸透能を抑制させる傾向を示し、他の処理剤は、類似している傾向を示した。それに比べ、ＴＡＴは、全ての処理剤において、むしろさらに上昇する傾向を示した。Jurkat細胞株において、ＭａｔＣＤが浸透能を抑制させる傾向を示し、ＰＥＰ１については、全ての処理剤が抑制する傾向を示す一方、ＴＡＴは、影響がないという結果を示した。これを基に、ＰＥＰ１は、ＰＢＭＣやJurkatにおいて、プラズマメンブレンを介して、移動（translocation）したと確認することができる（図３５及び図３６）。
【０１８１】
（５）さまざまな抗体を利用したＰＥＰ１の細胞浸透能分析
Ｐｅｐ１のＣＰＰ機能に対して、ＨＳＰ７０／９０が重要な役割を行うということをＨＳＰ７０／９０抗体を利用して分析した。分析のために、ヒト血液から分離したＰＢＭＣ、リンパ球及びJurkat、ＴＨＰ１細胞株において、ＧＡＰＤＨ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びエノラーゼの抗体を処理して流細胞分析を実施した。ＧＡＰＤＨ及びエノラーゼの抗体は、対照群として使用されたものである。抗体を利用して、ｐｅｐ１とＨＳＰ７０／９０との結合及び相互作用を抑制した場合、ｐｅｐ１の細胞透過能が顕著に低下するということを裏付ける。
【０１８２】
さまざまな抗体による細胞浸透能を比較分析するために、ＨＳＰ７０、エノラーゼ、ＧＡＰＤＨ（santacruz）、ＨＳＰ９０抗体を使用して行った。細胞は、ペプチドで培養する１時間前に、ヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）、メチルベータシクロデキストリン（５ｍＭ）、ノコダゾール（２０μＭ）、ブレフェルジンＡ（１０μＭ）、サイトカラシンＦ（５μＭ）またはクロロキン（１００μＭ）で処理した。その後、ＰＢＳで洗浄した後、ペプチド処理は、実施例２において記載されたような方法で、流細胞分析を進めた。抗ＨＳＰ７０、抗エノラーゼそして抗ＧＡＰＤＨの抗体は、Santacruzから購入し、抗ＨＳＰ９０抗体は、Ａｂｃａｍから購入した。細胞内浸透に、それぞれのタンパク質がいかなる役割を行うかということを分析するために、それに該当するタンパク質の抗体を全ての細胞に同じ方法で処理した。
【０１８３】
図３７から分かるように、ＨＳＰ７０特異的抗体とＨＳＰ９０特異的抗体を処理したとき、ＧＶ１００１−ＦのｈＰＢＭＣ内への吸収が著しく減少し、その一方、ＧＡＰＤＡ特異的抗体またはエノラーゼ特異的抗体を処理した場合には、影響を受けないということを発見した。
【０１８４】
また、ＴＡＴペプチドの細胞内浸透能は、ＨＳＰ７０特異的抗体とＨＳＰ９０特異的抗体との処理に影響を受けないように見られるが、これは、ＨＳＰがＧＶ１００１の細胞内浸透（細胞質）に特異的な役割を行うということを証明している。それと類似した傾向は、ＴＨＰ−１、ヒトリンパ球そしてJurkat細胞を利用した実験でも観察された。
【０１８５】
ＨＳＰ９０とＨＳＰ７０との過剰発現（遺伝子及びタンパク質表現）は、多種の癌で報告されてきた。従って、ＧＶ１００１は、正常細胞より癌細胞において、一層効率的に結合された物質を（cargoes）細胞内に取り込み、そのために、ＧＶ１００１は、ＨＳＰ７０またはＨＳＰ９０が過剰発現される癌細胞に、特異的に標的することができる能力をある程度有するといえる。
【０１８６】
実施例４：フェロセンカルボン酸（ferrocenecarboxylic）−ＣＰＰコンジュゲートの細胞透過能実験
１．フェロセンカルボン酸（ferrocenecarboxylic）−ＣＰＰコンジュゲートの製造
カップルリングのためにＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−２−クロロ−トリチル樹脂に保護されたアミノ酸（８当量）と、カップルリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶かして添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ脱保護（deprotection）のために、２０％ ＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。前記反応を反復して行い、ペプチド基本骨格（ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｄｄｅ）−２−クロロ−トリチル樹脂）を作った。ここに、２％ ＤＭＦ中のヒドラジン（hydrazine in ＤＭＦ）を処理し、Ｃ末端Ｌｙｓの残基保護基のＤｄｅを除去した。その後、フェロセンカルボン酸（ferrocenecarboxylic acid）（Sigma Aldrich ｃａｔ．＃４６２６４、１６当量）と、カップルリング試薬ＨＢＴＵ（１６当量）／ＨＯＢｔ（１６当量）／ＮＭＭ（３２当量）とをＤＭＦに溶かして添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。合成が完了したペプチド樹脂に、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ＝９５／２．５／２．５を加え、ペプチドを樹脂から分離した。得られた混合物に、クーリングジエチルエーテル（cooling diethyl ether）を加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させた。これをＨＰＬＣで精製した後、ＭＳで確認して凍結乾燥した。
【０１８７】
２．神経幹細胞透過実験
実験には、ラット（ＳＤ：Sprague−Dawley）（Orient bio，Kyungki、韓国）妊娠１３日目の胎児の頭から大脳皮質を分離し、Ｃａ2+／Ｍｇ2+−free ＰＢＳ（GIBCO，Grand Island，ＮＹ、米国）中のpoly−Ｌ−オルニチン／フィブロネクチンでコーティングしておいたプレートに、２ｘ１０4cells／ｃｍ2で分周し、Ｎ2培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、４．４ ＩＭインシュリン、１００ｍｇ／ｌトレンスフェリン、３０ｎＭセレナイト、０．６ ＩＭプトレシン（putrescine）、２０ｎＭプロゲステロン、０．２ｍＭアスコルビン酸、２ｎＭ Ｌ−グルタミン、８．６ｍＭＤ（＋）グルコース、２０ｎＭ ＮａＨＣＯ3（Sigma，Ｓｔ．Louis，ＭＯ））に、毎日、基本線維芽細胞成長因子（ＢＦＧＦ：basic fibroblast growth factor）（Ｒ＆Ｄ Systems，Minneapolis，ＭＮ）１０ｎｇ／ｍｌを処理し、３７Ｃ、５％ ＣＯ2環境で、４−６日後、９５％以上の神経幹細胞を得た。
【０１８８】
前記得られた神経幹細胞を、チャンバウェルプレートに１ｘ１０5に分周した。ここに、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を１０μＭ処理し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で、０〜２４時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドで室温で２０分間固定させた後、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）マウント培地（mount medium with ＤＡＰＩ）（Vetor Laboratories，ＣＡ、米国）で細胞核を染色した。その後、共焦点レーザスキャニングシステムで、それぞれ４３０−５００ｎｍのブルー波長、６２０−７００ｎｍのレッド波長、及びその２つの統合波長で比較分析した。
【０１８９】
その結果は、図３８及び図３９に示されている。
【０１９０】
図３８は、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を神経幹細胞に処理した後、経時的状態を測定した写真である。
【０１９１】
図３８に示されているように、神経幹細胞に、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を処理した後、比較分析した結果、１０μＭの濃度のフェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１が、２時間目から細胞内に侵透するということを確認することができ、経時的にさらに多くの量が細胞内に侵透するということを確認した。
【０１９２】
図３９は、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を神経幹細胞に処理した後、ＤＡＰＩで細胞核を染色した後、共焦点レーザスキャニングシステムで、神経幹細胞透過状態を測定した写真である。図３９で、４３０−５００ｎｍの波長において、ブルーで示す部分がＤＡＰＩに染色された核であり、６２０−７００ｎｍの波長において、レッドで示す部分がフェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１である。２つの波長の統合写真に示されているように、細胞核周辺に、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１が集まっていることから見て、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１が細胞内に侵透し、細胞質内に移動したということが分かる。
【０１９３】
３．毒性試験
フェロセンカルボン酸（ferrocenecarboxylic acid）とコンジュゲートされたｐｅｐ１自体の毒性実験のために、神経幹細胞を、９６ウェルプレート及び２４ウェルプレートに、それぞれ４ｘ１０4と２．５ｘ１０5とに分周し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で最小１２時間培養した。フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を、それぞれ０，０．０１，０．１，１，１０，１００μＭ濃度で処理し、培養器で２４時間まで培養した後、セル計数キット−８（ＣＣＫ−８：cell counting kit−８）アッセイ、及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ：lactate dehydrogenase、ＬＤＨ）活性アッセイを利用して、それぞれ細胞生存率及び細胞毒性率の変化を確認した。その結果は、図４０に示されている。
【０１９４】
図４０に示されているように、神経幹細胞では、１００μＭまで細胞生存率と細胞毒性とに影響がないということを確認した。
【０１９５】
４．in vivo実験
Ａ．神経幹細胞の準備
前記（２）で得られた神経幹細胞を、１００ｍｍディッシュに、５ｘ１０6に分周した。フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を１０μＭを処理し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で２４時間培養した後、ＴｒｙｐＬＥ（GIBCO）でプレートから細胞を分離させ、フリー培地（free media）で洗浄した後でカウンティングし、１匹当たりフェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１が標識された神経幹細胞を３ｘ１０5 １０μｌ準備した。
【０１９６】
Ｂ．フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１処理された神経幹細胞（ＮＳＣ）の移植
本明細書に記載された全ての動物実験は、大韓民国漢陽大学校（Hanyang University）ＩＡＣＵＣの承認を得た後で進めた。８週齢のＳＤラットを購入し、１週間の適応期間を経た後、２９０ｇ＋／−１５ｇほどの体重になったラットを本実験に使用した。該動物は、４群に分けて実験を進めたが、ＮＳＣｓ with ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群、ＮＳＣｓ  without ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群、ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群、生理食塩水群（saline群）にした。各群に、細胞、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１あるいは生理食塩水を移植するとき、stereotaxic surgeryを利用して、ＳＤラットの脳内に移植した。移植手術前、ケタミン（ketamin）とロンプン（rompun）とを利用して麻酔を施し、頭皮を剃った後、頭蓋骨を一部割って除去した。その後、座標ＡＰ＝＋０．７，Ｒ＝＋２，Ｖ＝−５．５に定位するように（stereotaxic）移植した。
【０１９７】
Ｃ．ＭＲＩ撮影
移植されたＮＳＣｓとフェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１との生体内観察のために、ＭＲＩを利用して確認した。ＭＲＩは、移植後、３日が経過して行われ、PhilipsのBest ３Ｔ ＭＲＩ装備を利用して撮影した。麻酔は、やはりケタミン（ketamin）とロンプン（rompun）とを使用し、ＭＰＧＲ（multiplanar gradient-recalled）パルスシーケンス（ＴＲ＝５９６ｍｓ、ＴＥ＝１６ｍｓ、セクション厚＝０．７ｍｍ、インプレーン解像度（in-plane resolution）：２９２ｘ２９０μｍ（画素サイズ０．０５９３ｍｍ3）、及びnumber of acquisitions＝１）を利用して撮影した。
【０１９８】
その結果は、図４１〜図４４に示されている。図４１は、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を処理した神経幹細胞を移植した群（stem cells with ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真であり、図４２は、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を処理していない神経幹細胞を移植した群（stem cells without ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真であり、図４３は、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を移植した群（ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１群）の脳をＭＲＩ撮影した写真であり、図４４は、生理食塩水を移植した群（saline群）の脳をＭＲＩ撮影した写真である。図４１〜図４４に示されているように、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１で処理された神経幹細胞の生体内検出が非常にすぐれているということが分かった。図４１及び図４２を比較すれば、ferrocenecarboxylic−ｐｅｐ１で処理されていない神経幹細胞が検出されない一方、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１で処理された神経幹細胞は、検出が非常にすぐれている。一方、生理食塩水のみを移植した群（図４４）に比べ、フェロセンカルボン酸−ｐｅｐ１を移植した群（図４３）の方がはるかにすぐれているということが分かる。
【０１９９】
実施例５：メクロ分子（タンパク質、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ）の輸送機能確認
１．ＣＰＰ−ＧＦＰコンジュゲートの細胞透過能実験
（１）ＣＰＰ−ＧＦＰコンジュゲートの製造
配列番号１のペプチドと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とのコンジュゲートを、次のような方法で製造した。
【０２００】
まず、図４５に図示されているように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号６、配列番号７）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Promega）でクローニングするために、プライマーを作製した。プライマーは、５’にＥｃｏＲＩ切断部位、３’にHindＩＩＩ切断部位を含み、前記ＥｃｏＲＩ部位の後部には、ＧＦＰ前半部配列約２１ｂｐを含み、HindＩＩＩ部位の後ろには、終結コドンを含むように作製した。ＧＦＰ−ＣＰＰタンパク質遺伝子の作製のためには、５’側は、ＧＦＰと同一であるが、ＧＦＰの先に、ＣＰＰをコードする配列を含むように作製した。例えば、配列番号１（Ｐｅｐ１）ペプチドの場合、次の配列を含むように作製した：ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＡＡ（配列番号３）。比較例として、ＴＡＴ−ＧＦＰを製造するために、ＧＦＰの前に「ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ（配列番号１１）」配列を付けた。
【０２０１】
ＥＧＦＰは、図４５に図示されたベクターをテンプレートとしてＰＣＲして得る。ＥＧＦＰ−１６Ｐは、プライマー作製時、ＥＧＦＰの前に１６Ｐを付ける（１６Ｐ（ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＡＡ）。ＥＧＦＰ−ＴＡＴは、プライマー作製時、ＥＧＦＰの前にＴＡＴを付ける（ＴＡＴ（ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＴ）。
【０２０２】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、発現させる場合、前述の１６Ｐ、ＴＡＴを、Ｅ．ｃｏｌｉ codon usageに合うように変形させる。
【０２０３】
図４６は、ｐＥＴ−２８ａベクター模式図を示したものである。図４７は、クローニング模式図である。
【０２０４】
次に、前記プライマーを使用して、ｐＥＴ−２８ａ−ＧＦＰベクターをテンプレートに、フォワード（forward）プライマーは、ＣＰＰコード配列後に、２１個のＧＦＰ配列を添加して作製し、リバース（reverse）プライマーは、ＧＦＰのＣ末端配列一部を添加して作製した後、ＰＣＲを行った。９５℃ ５分、３０サイクルの９５℃ ５分（変性（denaturation））、６３℃ ３０分（アニーリング）、７２℃ １分（elongation）、７２℃ ７分の条件でＰＣＲし、各プライマーは、１０ｐｍｏｌで使用した。そのようなＰＣＲ条件を利用して、ＧＦＰ断片、ＧＦＰ−ＣＰＰＤＮＡ断片を増幅した後、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターのＥｃｏＲＩ部位及びHindＩＩＩ部位にクローニングし、ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＣＰＰを発現するベクターを得た（図４７）。
【０２０５】
次に、前記ベクターをバクテリアに形質転換してタンパク質が分離した。具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Invitrogen，Carlsbad，ＣＡ、米国）を、前記各ベクターで形質転換させた後、５ｍｌＬＢ／カナマイシン培地で育てた後、１００ｍｌ培地に移して培養した。その場合、カナマイシンを１／１，０００体積比で添加した。次に、３７℃で約２−３時間撹拌培養した後、吸光度を測定し、約０．６−０．８範囲内まで育てた後、ＩＰＴＧ（isopropylベータ−Ｄ−１−thiogalactopyranoside）１ｍＭで処理した。次に、３−４時間さらに培養した後、該細胞を５，０００ｒｐｍで５分遠心分離した（図４８）。
【０２０６】
ここで、ＩＰＴＧ １ｍＭで処理するが、その原理は、次の通りである。処理条件は、ＩＰＴＧの処理前、ＢＬ−２１ transformant（１００ｍｌ）を３７℃で約２−３時間育て、Ｏ．Ｄ約０．６−０．８前後に育てた後、ＩＰＴＧ １ｍＭで処理した後、３７℃で約３−４時間さらに育てた後、タンパク質を抽出すればよい。ＥＧＦＰ−ＴＡＴの場合には、ＩＰＴＧ処理後、１６℃でｏ／ｎする。そのようにして得られたサンプルは、Hisタグ精製という方法を利用して、所望する精製タンパク質を得ることができる（図４９）。
【０２０７】
発現させたタンパク質は、遠心分離の結果、細胞が緑色光を帯びるようになれば、過剰発現していると肉眼で確認することができる。これを、Ｈｉｓタッグ精製キットであるタンパク質分離キット（Ｐｒｏｄ，＃２１２７７，Thermo Scientific，ＩＬ、米国）のメーカー案内通りに分離した。
【０２０８】
分離後、タンパク質を透析して精製して濃縮した。具体的には、滅菌された４℃ ＰＢＳを使用して透析した。まず、透析バッグを、あらかじめＰＢＳで平衡化させた後、ここに、５ｍｌ注射器を利用して、前述のように分離したタンパク質溶液を取り、透析バッグに入れた後、撹拌しながら、４℃で一晩透析した。次に、タンパク質の濃度を高め、不要な物質を除去するために、ＢＩＢＡＳＰＩＮ ２０（Ｐｒｏｄ，＃ＶＳ２０９２，Sartorius Stedin biotech、ドイツ）に、透析したタンパク質を入れ、３，０００ｒｐｍで４℃で遠心分離する方法で濃縮した。
【０２０９】
（２）細胞株の培養（cell culture）
ＡＴＣＣから得られた肝細胞癌の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（human hepatocellular carcinoma cells）を利用して、細胞株を６ウェルプレートに、５ｘ１０5に分周した後、ＭＥＭ培地に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養した。ＣＨＯ（Chinese hamster ovary cells）、ＨｅＬａ（human cervical cancer cells）、Ｈｕｈ７（human hepatocellular carcinoma cells）及びＭＣＦ７（human breast cancer cells）の細胞株は、それぞれＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で培養した。
【０２１０】
（３）蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）
細胞株をＰＢＳで洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで１時間の飢餓を行わせた。ＧＦＰ（配列番号６、配列番号７）、ＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）−ＧＦＰ（実施例５．１（１）で製造される）、ｐｅｐ１−ＧＦＰ（実施例５．１（１）で製造される）の１μＭで処理し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１８時間培養した。細胞株をＰＢＳで洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳで分周された状態で、光源４８８ｎｍで観察した。蛍光顕微鏡分析では、ＴＡＴは、細胞浸透して核に位置する一方、ｐｅｐ１は、細胞質に位置するところが観察された。従って、本研究結果から見て、ｐｅｐ１は、ＭＣＦ細胞株において、ＴＡＴに比べて高い浸透率を示し、細胞に侵透して細胞質に位置するということが観察される（図５０）。
【０２１１】
（４）流細胞分析（flow cytometry）
細胞株をＰＢＳで洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで１時間の飢餓を行わせた。ＧＦＰ、ＴＡＴ−ＧＦＰ、１６ｍｅｒＧＦＰの１μＭで処理し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で２時間培養した。ＰＢＳで洗浄過程を３回反復した後、０．５ｍｌ １Ｘ ＦＡＣＳバッファに懸濁させ、ＦＡＣＳ Calibur（Becton Dickinson）で蛍光発光（fluorescence）を分析した。処理していない細胞株を対照群にして、ＧＦＰ、ＴＡＴ−ＧＦＰ、ｐｅｐ１−ＧＦＰのcellular uptake様相を比較分析した。さまざまな細胞株を利用して、ｐｅｐ１が結合されたＧＦＰタンパク質を処理して流細胞分析した。その結果、ＭＣＦ７細胞株では、ＴＡＴに比べ、ｐｅｐ１が約二倍さらに増加した傾向を示したが、他の細胞株では、ＴＡＴに比べて増加率は高くなかった（図５１）。
【０２１２】
２．ＤＮＡコンジュゲートの細胞透過能実験
（１）ＤＮＡ（poly−lysine）−ＣＰＰの製造
既存において、細胞浸透能があると知られているペプチド（ＧＧＧ，ＴＡＴ）と、テロモラアゼ由来ペプチドであるｈＴＥＲＴとにリシン１５ｍｅｒを結合した。ポリリシンは、陽イオンが多いので、陰イオンを呈するＤＮＡと良好に結合する。ペプチド合成は、ペプトロン（Peptron）に依頼し、合成されたペプチドは、蒸溜水に１ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した。図５２は、本実験に使用されたペプチドの一次構造である。
【０２１３】
図５３は、本実験に使用されたペプチドの模式図である。
【０２１４】
（２）細胞株培養（cell culture）
ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｈｕｈ７細胞株及びＭＣＦ７細胞株は、それぞれＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地及びＲＰＭＩ １６４０培地に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリンと１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で培養した。
【０２１５】
（３）電気泳動（electgrophoresis）
ペプチドＤＮＡ複合体の結合程度を確認するために、０．０５−５μｇのペプチドを０．５μｇのGeneruler １ｋｂ ＤＮＡ ladder（Fermentas）に混ぜ、常温で１０分間待機した。ペプチドＤＮＡ複合体を、０．５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）が含まれた１％アガロースゲルに注入し、１ｘ ＴＡＥバッファで１００Ｖ、３０分間反応させた。
【０２１６】
ペプチドＤＮＡ複合体の電気泳動の結果、全てのペプチドは、ＤＮＡと良好に結合するということが確認された（図５４）。ペプチド及びＤＮＡが良好に結合すれば、ＤＮＡがneutralizeされ、ＤＮＡのimmobilizationが起こるが、本実験の結果によれば、ＤＮＡ対比ペプチドの比率（ｗ／ｗ）が１以上であるとき、immobilizationが確認された。
【０２１７】
（４）ｐｅｐ１ペプチドを利用したルシフェラーゼＤＮＡ輸送能分析
前述の細胞株を、１２ウェルプレートで、５ｘ１０4〜１ｘ１０5／ウェルで培養し、翌日ＰＢＳで洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに培地を替えた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにおいて、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにルシフェラーゼ遺伝子を挿入して作製したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰルシフェラーゼベクター２μｇと各ペプチドとを、１，２，４，８倍数（ｗ／ｗ）で混ぜ、最終容量１００μｌ／ウェルの複合体を作製した。作製されたペプチドＤＮＡ複合体を各ウェルに注入し、３７℃でＣＯ2 ５％の条件で４時間培養した。該細胞の洗浄後、complete mediaで替えた後、３７℃でＣＯ2 ５％条件で、さらに２０時間培養した。ペプチドＤＮＡ複合体の注入して２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｘ lysisバッファ５０μｌ／ウェルを注入し、常温で１５分間shakingした後で獲得された細胞溶解物（cell lysate）に対して、ルシフェラーゼアッセイを実施した。１００μｌのルシフェラーゼ基質（substrate）に細胞溶解物２０μｌを入れ、発光（luminescence）を測定した。実験結果は、ＢＳＡアッセイに標準化された平均値を記録した。
【０２１８】
ルシフェラーゼアッセイの結果、ｈＴＥＲＴ−ｐＫは、全ての濃度で比較グループ（ＴＡＴ−ｐＫ，ＧＧＧ−ｐＫ）より高いルシフェラーゼ発現が確認された。ｈＴＥＲＴ−ｐＫは、濃度が依存的（dependent）であるルシフェラーゼ発現活性化（luciferase expression activity）を示し、特に、ＤＮＡ対比８倍の濃度で、ＴＡＴ−ｐＫ、ＧＧＧ−ｐＫと比較するとき、有意レベル（ＧＧＧ−ｐＫ対比）の結果が確認された（図５５）。
【０２１９】
３．ｓｉＲＮＡ−ＣＰＰコンジュゲートの細胞透過能実験
（１）ｓｉＲＮＡ−ＣＰＰコンジュゲートの製造
前記実施例１と同一方法で、ペプチド基本骨格Ｔｒｔ−mercaptoacetyl−Ａｈｘ−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−trityl樹脂）を製造した。ここで、Ａｈｘは、６−アミノヘキサン酸（６−aminohexanoic acid）を意味する。製造されたＴｒｔ−mercaptoacetyl−Ａｈｘ−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−trityl樹脂）は、ＨＰＬＣ分析及び質量分析を介して、その合成を確認した。
【０２２０】
前記合成されたｐｅｐ１に、ｓｉＲＮＡの配列をコンジュゲーションさせ、ｓｉＬｕｃ−ｐｅｐ１［ｓｉＬｕｃ conjugation with mercaptoacetyl−Ａｈｘ−ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ］コンジュゲートを製造した。具体的には、ｐｅｐ１にコンジュゲーションさせるｓｉＲＮＡ配列には、下のような配列を使用した。
【０２２１】
ＳｉＬｕｃセンス（５’→３’）：ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ（ｄＴｄＴ）（配列番号：４）
【０２２２】
ＳｉＬｕｃアンチセンス（５’→３’）：ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧ（ｄＴｄＴ）（配列番号：５）
【０２２３】
その製造方法は、ｐｅｐ１を Bionia（大韓民国）から供給されたmaleimide modified ＳｉＬｕｃ（７５ｕｍｏｌ）とＰＢＳバッファ（１Ｘ１ｍｌ）とに溶かし、常温で２時間反応させ、コンジュゲーションさせた。コンジュゲーションは、ペプチド上のチオール（thiol）基と、ｓｉＲＮＡ上のマレイミド（maleimide）基との反応を介して行われる。コンジュゲーション反応は、エルマン試薬（Ellman’s reagent）（ＤＴＮＢ：５，５’−dithiobis−（２−nitrobenzoic acid））を利用して確認した。エルマン試薬は、サンプル中のチオール（thiol）基の数または濃度を定量するために使用されるケミカルである。
【０２２４】
実験に使用されたｓｉＲＮＡの配列は、ルシフェラーゼ遺伝子を目的にして、ペプトロン（Peptron）に合成を依頼して提供された、以下のようなｓｉＬｕｃ−scrambled ｐｅｐ１［ｓｉＬｕｃ conjugation with mercaptoacetyl−Ａｈｘ−ＬＲＡＬＰＫＲＰＦＩＳＲＬＴＥＡ］、ｓｉＬｕｃ−Ｔａｔ（４７−５７）［ｓｉＬｕｃ conjugation with mercaptoacetyl−Ａｈｘ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ］、ｓｉＬｕｃ−penetratin［ｓｉＬｕｃ conjugation with mercaptoacetyl−Ａｈｘ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ］、ｓｉＬｕｃ−ｐｅｐ１［ｓｉＬｕｃ conjugation with mercaptoacetyl−Ａｈｘ−ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ］のｓｉＲＮＡを使用した。対照群として、ｓｉＣｏｎｔ−scrambled ｐｅｐ１、ｓｉＣｏｎｔ−Ｔａｔ（４７−５７）、ｓｉＣｏｎｔ−penetratin、ｓｉＣｏｎｔ−ｐｅｐ１を使用した。前記ｓｉＲＮＡは、いずれも前記実施例５の製造方法のようにして製造した。陽性対照群として、Bioniaから商業的に販売しているルシフェラーゼｓｉＲＮＡと、陰性対照群として、negative ｓｉＲＮＡ（Ｃａｔ＃：ＳＮ−１０１２，ＡｃｃｕＴａｒｇｅｔ Negative control ｓｉＲＮＡ）を使用した。
【０２２５】
ｓｉＲＮＡの配列は次の通りである。
【０２２６】
ＳｉＬｕｃセンス（５’→３’）：ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ（配列番号：４）
【０２２７】
ＳｉＬｕｃアンチセンス（５’→３’）：ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ（配列番号：５）
【０２２８】
ＳｉＣｏｎｔの配列は次の通りである。
【０２２９】
ＳｉＣｏｎｔセンス（５’→３’）：ＧＣＡＣＣＵＡＵＡＡＣＡＡＣＧＧＵＡＧｄＴｄＴ（配列番号：８）
【０２３０】
ＳｉＣｏｎｔアンチセンス（５’→３’）：ＣＵＡＣＣＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＧＵＧＣｄＴｄＴ（配列番号：９）
【０２３１】
（２）細胞株培養（cell culture）
ヒト由来肝細胞癌細胞株ＡＴＣＣから得たＨｕｈ７（human hepatocellular carcinoma）は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Hyclon）に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen Ｃｏ．，Carlsbad，ＣＡ、米国）、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で培養した。
【０２３２】
（３）ルシフェラーゼ活性測定（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｈｕｈ７細胞を、２４ウェルプレートに、２ｘ１０5個ずつ注入して育てた後、ルシフェラーゼ目的遺伝子２μｇを、lipofectamin ２０００（Invtrogen Ｃｏ．，Carlsbad，ＣＡ、米国）を利用して、一時的トレンスフェクション（transient transfection）を行った。４時間後、lipofectamin ２０００を、完璧にＰＢＳに何回も洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Invtrogen Ｃｏ．，Carlsbad，ＣＡ、米国）５００μｌで、ｓｉＲＮＡを最終濃図４００ｎＭに処理した後、３７℃細胞培養器で１６時間反応させた。反応終結するために、ＰＢＳで洗浄した後、Reporter Lysis Buffer（Promega Ｃｏ．，Madison，ＷＩ、米国）溶液を利用して、タンパク質を溶解した後、ルシフェラーゼ試薬（reagent）（Promega Ｃｏ．，Madison，ＷＩ、米国）を利用して、luminometer（Turner BioSystem，Sunnyvale，ＣＡ、米国）で測定した。ｓｉＲＮＡ効率を補正するために、Bradfordアッセイを利用したタンパク質定量で補正した。
【０２３３】
ｐｅｐ１の細胞浸透能を確認するために、ルシフェラーゼを目的とするｓｉＲＮＡを作製し、ヒト由来肝細胞癌細胞株であるＨｕｈ７細胞株とＣＨＯ細胞株とを利用して、ルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、Ｈｕｈ７細胞株では、ペネトラチンとｐｅｐ１とがルシフェラーゼと結合されたｓｉＲＮＡにおいて、ペネトラチンとｐｅｐ１とが対照群と結合されたｓｉＲＮＡに比べ、約２８％、２０％ほど低下した活性が示された一方、scrambledとＴａｔとが、対照群とルシフェラーゼとが結合されたｓｉＲＮＡは、特別な活性の差を示していない。また、ルシフェラーゼが結合されたscrambled、Ｔａｔ、ペネトラチン、ｐｅｐ１のｓｉＲＮＡのルシフェラーゼ活性の違いを比較するとき、それぞれ２７％、５５％、４０％の活性抑制を観察することができた（図５７）。
【０２３４】
ＣＨＯ細胞株では、他のｓｉＲＮＡと異なり、ｐｅｐ１が結合されたｓｉＲＮＡにおいて、約３０％ルシフェラーゼ活性が抑制されるということが観察された。このように、ｓｉＲＮＡを利用したｐｅｐ１のルシフェラーゼ活性抑制を観察することにより、ＧＶ１００１の細胞浸透能があるということを確認することができた（図５８）。
【０２３５】
（４）流細胞分析（flow cytometry）を介したｓｉＲＮＡ輸送能分析
実験に使用されたｓｉＲＮＡの配列は、ＨＢｘ遺伝子を標的とし、（ｓｉＨＢＶ、センス−５’ＧＡＧ ＧＡＣ ＵＣＵ ＵＧＧ ＡＣＵ ＣＵＣ Ａ ｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）、アンチセンス−５’ＵＧＡ ＧＡＧ ＵＣＣ ＡＡＧ ＡＧＵ ＣＣＵ Ｃ ｄＴｄＴ−３’）３’（配列番号１３）にフルオレセインを結合した。ｓｉＲＮＡ合成は、Bioniaに依頼し、合成されたｓｉＲＮＡは、ＨＰＬＣによって精製された。
【０２３６】
前日２４ウェルプレートに、１ｘ１０5／ウェルで培養されたＨｅｐＧ２に対して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで培地を替えた。４時間培養後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ ３００μｌに、ＦＩＴＣ−labeled ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＢＶ）と、各濃度別（molar ratio）ペプチドとを良好に混ぜて複合体を作製した。ｓｉＲＮＡの最終濃度が１０μＭになるように注入し、３７℃でＣＯ2 ５％条件で１時間培養した。トリプシンで処理し、常温で５分待機した後、ＰＢＳで３回洗浄し、５００μｌ／ウェルＦＡＣＳバッファを注入した後、３００ｒｐｍ、４℃の条件で、遠心分離を３回反復し、細胞外の蛍光物質を除去した。ＦＩＴＣ蛍光発光（fluorescence）は、flow cytometry（ＢＤＦＡＣＳ Calibur System，Becton Dickinson、フランス）によって、全１０，０００個の細胞が測定された。流細胞分析を利用したcellular uptake実験の結果、ｈＴＥＲＴ−ｐＫは、２０ molar ratio以上の濃度で、比較グループ（ＲＧＤ−ｐＫ、ＧＧＧ−ｐＫ）より約２．５倍高いＦＩＴＣ−labeled ｓｉＲＮＡcellular uptakeが確認された（図５６）。
【０２３７】
実施例６：ＣＰＰ−ＦＩＴＣコンジュゲートのミトコンドリア局所送達効能実験
１．顕微鏡分析
（１）細胞培養
ＡＴＣＣから得たヒト乳房癌由来のＭＣＦ７（human breast adenocarcinoma）付着細胞株を使用した。細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００units／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地（Sigma）で培養された（３７℃、５％ ＣＯ2）。
【０２３８】
ＦＩＴＣが配列番号１のペプチドのＣ末端に結合されたコンジュゲートは、前記実施例２によって製造された。
【０２３９】
（２）共焦点顕微鏡分析
前記細胞株を、２−チャンバスライドグライサ（ＮＵＮＣ，Ｌａｂ−Ｔｅｋ）の表面の５０％を占めるように分周し、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で１２時間培養した。次に、培地除去した後、１Ｘ ＰＢＳで洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Sigma）１ｍｌで１時間培養し、飢餓させた。次に、１００μＭのＦＩＴＣが、配列番号１のペプチドのＣ末端に結合されたコンジュゲートを、前記各チャンバの５０μｌ（１０μＭ）に追えた後、３７℃、５％ ＣＯ2培養器で２時間培養した。
【０２４０】
次に、培地除去した後、１Ｘ ＰＢＳ（phosphate buffered saline；ｐＨ７．４）で３回洗浄した。各チャンバに、０．５ｍＬ４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を入れ、室温で２０分間固定させた。次に、１Ｘ ＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡで迅速に２回洗浄した。
【０２４１】
次に、前記細胞にＴＯ−ＰＲＯ−３ヨード６４２／６６１ｎｍ（Invitrogen）で５００ｎＭ処理し、１０分間室温で細胞核を染色し、mototracker（登録商標） deep red ＦＭ ６４４／６６５ｎｍ（Invitrogen）２５０ｎＭで、１５分間室温で処理し、ミトコンドリアを染色した。溶液除去した後、１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄した後、プラスチックチャンバを除去し、スライドの上にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ mounting medium（Vector Laboratories）を落とし、スライドグラスを覆った後、遮光して保管した後、共焦点レーザシステムを利用して、ＦＴＩＣは、４８８ｎｍ波長で、ＴＯ−ＰＲＯＲ−３ヨード（Invitrogen）とmitotrackerＲ deep red（Invitrogen）は、６３３ｎｍ波長で測定した。
【０２４２】
結果は、図５９に示されている。ＦＩＴＣが、配列番号１のペプチドのＣ末端に結合されたコンジュゲートと、ミトコンドリア局所化マーカーであるmototracker（登録商標） deep redＦＭ ６４４／６６５ｎｍ（Invitrogen）とで染色した結果、（Ａ）ＭＣＦ−細胞に、ＦＩＴＣが、配列番号１のペプチドのＣ末端に結合されたコンジュゲート単独処理、（Ｂ）ミトコンドリア局所化マーカーであるmototracker（登録商標） deep red ＦＭ６４４／６６５ｎｍ（Invitrogen）単独処理、（Ｃ）細胞の位相差対比（phase contrast）、（Ｄ）ＡイメージとＢイメージとの結合イメージである。前記結果から、テロメラーゼ由来ペプチドがミトコンドリアに局所化するということを確認することができた。
【０２４３】
２．抗体結合実験
実施例５．１（１）によって製造されたｐｅｐ１−ＧＦＰコンジュゲートを、ＡＴＣＣから得られた２Ｘ１０7個のヒト乳房癌由来のＭＣＦ７（human breast adenocarcinoma）付着細胞株に処理した後、ミトコンドリアのｈｓｐ７０抗体でウェスタンブロットを行った。比較例として、ＧＦＰだけの処理、１１ｍｅｒ−ＧＦＰ処理、ｃｃｇ−ＧＦＰ処理を行い、同一にミトコンドリアのｈｓｐ７０抗体でウエスタンブロッを行った。具体的には、下記ような方法で行った。
【０２４４】
２ｘ１０7個のＭＣＦ７細胞株を準備し、ミトコンドリア分離キット（Themo science，ｂ＃８９８７４）を使用して、当該プロトコル通りに、ミトコンドリアを分離した。具体的には、細胞ペレットに、Reagent Ａ ８００μｌを入れ、中間ほどの強度で、５秒間ボルテックスを行った。その次に、氷に２分間放置した後、細胞懸濁液をDounce組織グラインダ（tissue grinder）に移し、氷の上で砕いた。lysisされた細胞を、本来のチューブに移して入れた。ここに、Reagent Ｃを８００μｌ入れ、グラインダに２００μｌ Reagent Ａを入れてすすいだ。弱く混合し（gently mix）、７００ｇを４℃で１０分遠心分離した。上澄み液を新たなチューブに移し、さらに３，０００ｇ、１５分遠心分離した。上澄み液を捨て、ミトコンドリアがあるペレットに、５００μｌ Reagent Ｃを入れ、１２，０００ｇで５分間遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを氷にさした。ＴＢＳ（２５ｍＭ Tris、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に、２％ ＣＨＡＰＳを入れたバッファを１００μｌ入れ、１分間ボルテックスした。１２，０００ｇで２分間遠心分離し、その上澄み液（soluble mitochondria protein）をテストタンパク質と共に、下記のように免疫沈降させた。
【０２４５】
テストタンパク質は、実施例５．１（１）によって製造されたｐｅｐ１−ＧＦＰコンジュゲートであり、対照群として、ＧＦＰ、１１ｍｅｒ−ＧＦＰ、ｃｃｇ−ＧＦＰを使用した。１１ｍｅｒ−ＧＦＰは、ＨＢＶ由来の１１個ａａから構成された１１ｍｅｒタンパク質がＧＦＰとコンジュゲーションされたものである。ｃｃｇは、Hepatitis Ｂ ウイルスの複製起源（replication origin）である。
【０２４６】
前記テストタンパク質と対照群タンパク質とをそれぞれ樹脂に付けるために、６ｘＨｉｓが標識されたコバルト（cobalt）樹脂を準備した（Ｐｒｏｄ．＃８９９６４，Thermo Scientific，ＵＬ、米国）。カラムに５０−１００μｌの樹脂を入れ、洗浄バッファで５００μｌずつ５回洗浄した。ここに、各発現タンパク質を入れ、４℃で回しながら、３０分〜１時間良好に混じるように放置した。その後、さらに洗浄バッファで、発現タンパク質・樹脂重合体を５００μｌずつ５回洗浄した。次に、ここに前述のように準備したミトコンドリア上澄み液を追えた後、４℃で一晩回しながら放置した。翌日、樹脂を洗浄バッファと同じ方法で洗浄し、溶出（elution）バッファ２００μｌを入れて最終溶出た。その結果は、図６０に示されている。その結果、ミトコンドリアのｈｓｐ７０抗体がｐｅｐ１−ＧＦＰにのみ結合したということが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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