(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種のキャプシドタンパク質ｐＵＬ８６およびｐＵＬ８０．５、
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの少なくとも５種の表面タンパク質、その中に、少なくとも表面タンパク質ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａが存在する、および
少なくとも外被タンパク質ｐＵＬ８３
を含む、組換えウイルス様粒子。
【請求項２】
配列番号２、３、５、７のいずれか一つと、配列番号９−１８のいずれか一つの組み合わせによりコードされるタンパク質を含む、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のウイルス様粒子中に含まれるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のバキュロウイルスベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項１または２に記載の組換えウイルス様粒子を含むワクチン。
【請求項８】
ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる五量体複合体をさらに含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ１００、ｇｐＵＬ７３、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる群より選択される可溶性ＣＭＶタンパク質をさらに含む、請求項７または８に記載のワクチン。
【請求項１０】
ｐＵＬ８３、ＩＥ−１、ｐＵＬ９９、ｐＵＬ９１、ｐＵＬ８２、およびｐｐ１５０からなる群より選択される可溶性ＣＭＶタンパク質をさらに含む、請求項７、８または９に記載のワクチン。
【請求項１１】
タウン（Ｔｏｗｎｅ）、トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）、ＡＤ１６９、マーリン（Ｍｅｒｌｉｎ）、ＴＢ２０、およびＶＲ１８１４株からなる群より選択される異なるＣＭＶ株からのＣＭＶタンパク質を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャプシドタンパク質、サイトメガロウイルス表面タンパク質、および場合により外被タンパク質を含むウイルス様粒子、ならびにヒトサイトメガロウイルス感染に対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、世界中のあらゆる場所とあらゆる社会経済的な集団とで見出される。ヒトサイトメガロウイルスは成人人口の少なくとも６０％に感染し、いくつかの国々では地方病性の感染がすでに１００％に達している。通常、感染は、免疫が正常な個体では無症状であるが、ときどき単核症のような疾患が起こる場合がある。感染は常に、生涯にわたり安定して潜伏状態を保つが、場合によっては再活性化により遮られることもある。治療的または医原的に免疫抑制された移植／癌患者、新生児、およびＨＩＶ患者などの免疫不全の個体は、ＨＣＭＶ感染の結果として顕著な罹患率および死亡率を示す。
【０００３】
現行のＣＭＶ感染療法は、ガンシクロビル（バルガンシクロビル）、フォスカーネット、アシクロビル、シドフォビルまたはレフルノミドなどの抗ウイルス性試薬での処置である。このような抗ウイルス剤の適用は、移植受容者および免疫不全患者（例えばＨＩＶ患者）では承認されているが、妊娠した女性では承認されていない。そのような場合、高イムノグロブリン（hyper-immunoglobin）療法が好ましい。加えて、既存の抗ウイルス剤療法は短期間でしかウイルス耐性を引き起こさないか、または療法中において効果がなかった（McGregor A．ら、Expert Opin．Drug Metab．Toxicol．2011；7（10）：1245〜1265）。サイトメガロウイルス感染、特に先天性サイトメガロウイルス感染の予防が長い間調査されてきたが、市場で認可されたワクチンはない。米国の医学研究所によれば、予防ＨＣＭＶワクチンの開発が優先度の高い目標であることが認識されている（www.cdc.gov/cmv/overview.html、2011年10月）。ワクチンで誘導された免疫性から得られる可能性がある利益は、子宮内伝播に関して４０倍、先天的に感染させた乳児における中枢神経系のダメージの減少に関して２５〜３０倍であると推定されている（Britt W.J．ら、Trends Microbiol．1996；4:34〜38）。３０年にわたりワクチンを開発する努力がなされてきた。しかしながら、臨床研究データがないかまたは不完全であるために、これまでに近々認可が下りそうなものはないようである。生きた弱毒化ウイルスアプローチに加えて、可溶性タンパク質、特に、ＭＦ５９のようなアジュバントと組み合わせた、または組み合わせないトランケートされたｇｐＵＬ５５（ｇＢ）サブユニットワクチンを用いた試みも、長期にわたる免疫反応を達成しなかった（Zhang C．ら、J．Clin．Virol 2006；35:338〜41）。より高い有効性を達成するための新しいアプローチは調査中であり、糖タンパク質の組み合わせ、ＤＮＡおよびペプチドベースの候補、濃密体（ＷＯ２００８／１３８５９０）、およびウイルスベクターベースの候補、例えばカナリア痘瘡ウイルスベースの複製能を有するＡｌｖａｃ−ｇｐＵＬ５５５（ｇＢ）ワクチン（Bernstein D．I．ら、J．Infect．2002年12月；185：686〜90）を含む。Ａｌｖａｃワクチン（カナリア痘瘡ベースの粒子）と生きた弱毒化ウイルスとの組み合わせを用いた最初の臨床試験データによれば、適切な免疫反応が起こるものの長期にわたる作用は未だ調査中である。ウイルス様粒子は、それらの形状のために弱毒化ウイルスに類似した特性を取り込むことができ、優れたワクチン媒体として一般的に認められていることから、ウイルス様粒子はワクチン開発のための有望な選択肢である。ウイルス様粒子は、これまでＣＭＶに関しては開発されてこなかった。この３０年にわたり抗ＨＣＭＶワクチン開発のために蓄積した経験に基づいて、以下の目標：長期にわたる中和抗体の誘導、体液性および細胞性、特に細胞毒性Ｔ細胞応答の誘導、および副作用の最小化が満たせるものと予想される。
【０００４】
これまで開発されたワクチン候補の失敗または限られた有効性の原因は、様々な面がある。宿主の防御免疫メカニズムの解明が不十分である。それに対する主な原因の１つは、保護をもたらす主要因となるエフェクターの検証が可能な適切な動物モデルがないことである。上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ニューロン、および単球／マクロファージなどの多様な細胞型に侵入して複製し、結果的に様々な病状を引き起こすウイルスの能力によって、有力なエフェクターの決定が妨げられている。ウイルスの複雑さ、および特定の細胞型の感染に必要なタンパク質に関する知見の欠如のために、理想的なＨＣＭＶワクチンの組成は未だわかっていない。
【０００５】
ＣＭＶはベータ−ヘルペスウイルスであり、極めて複雑なウイルス配列を有するヘルペスウイルス科に属する。ＣＭＶビリオンは、約２３０ｎｍの直径を有し、３層の膜エンベロープを境界としてあまりよく構造化されていない外被層で取り囲まれたヌクレオキャプシドで構成される。ヒトヘルペスウイルスのなかでも直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子（２３６ｋｂｐ）が最も大きく、単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）のＤＮＡ分子と比べて５０％大きい。ビリオンに加えて、５つの他のタイプの、細胞内のエンベロープを有するおよびエンベロープを有さないウイルス粒子が、ＣＭＶ感染細胞から回収されている。ウイルスの成熟プロセスは様々なキャプシドタイプを包含し、その濃密体（ＤＢ）が、ワクチン開発において重要な役割を果たす可能性がある。濃密体（ＤＢ）は、大きく（約２５０〜６００ｎｍ）不均質である。濃密体は、外被タンパク質（すなわちｐＵＬ８３）および表面タンパク質ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）およびｇｐＵＬ５５（ｇＢ）を含有する、様々なタンパク質の固形の回転楕円状集合体である（Becke S．ら、Vaccine 2010；28:6191〜6198）。一定の基準に基づくＨＣＭＶタンパク質に関する命名法のルールが、Spaete R．ら、1994、J．Gen．Virol.、75、3287〜3308で公開されており、同定された各オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の文字数字式の名称を基礎として、その頭に、タンパク質のリン酸化状態がわかっていない場合は「ｐ」をつけ、リンタンパク質の場合は「ｐｐ」、糖タンパク質の場合は「ｇｐ」を付けることにより拡張される。小文字の名称は、タンパク質をコードする追加のＯＲＦを名付けるために接尾辞として使用される。本発明において、これまでに使用された名称は括弧内に示され、表および図でも同様に示される。
【０００６】
ＨＣＭＶの構造糖タンパク質のなかでも、これまで３つの主要な複合体（ｇＣＩ−ｇＣＩＩＩと名付けられる）が同定されている。これらの複合体は、ウイルス構造において異なる役割を有しており、ワクチン設計に関しても、治療抗体を開発するための標的として、または調査手段としての役割を有する。糖タンパク質Ｂ（ｇｐＵＬ５５、ｇＣＩ）は、単一の可溶性タンパク質としてはＨＣＭＶに対して長期にわたる免疫反応をもたらさなかった。それゆえに、ｇｐＵＬ５５を包含するさらなるタンパク質組成物を、ワクチン設計の考慮に入れるべきである。中和抗体生成に関する、さらにはワクチンの必須部分としての、ｇｐＵＬ１００（ｇＭ）、ｇｐＵＬ７３（ｇＮ）、および形成された複合体ｇＣＩＩの役割は、調査中である。ｇＣＩＩＩの構成成分は、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、およびｇｐＵＬ７４（ｇＯ）であり、これらはヘテロ三量体のジスルフィド結合した複合体を形成する（Huber M．T．およびCompton T．、J．Virol．1999；73（5）：3886〜3892）。これらのタンパク質は、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａなどのさらなるタンパク質と共にウイルスの浸入および複合体形成にとって最も重要な役割を果たす。上皮および内皮細胞へのＨＣＭＶの浸入は、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、およびｇｐＵＬ７４、またはｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１の組み合わせのエンドサイトーシスと複合体形成とを伴う（Wang D．およびShenk T.、PNAS 2005；102：18153〜18158）。加えてこれらのタンパク質は、インビボでのＨＣＭＶの伝播の主要な決定要素の一つである内皮細胞から白血球へのＨＣＭＶの移動に関与する。さらにこれらのタンパク質は、樹状細胞（ＤＣ）の作動において役割を果たすようであることから、Ｔ細胞が介在する免疫反応にとって重要な要素である。ＣＭＶは、別個の経路で様々な細胞型に侵入する。線維芽細胞への浸入の場合、ｇｐＵＬ７５／ｇｐＵＬ１１５（ｇＨ／ｇＬ）またはｇｐＵＬ７５／ｇｐＵＬ１１５／ｇｐＵＬ７４（ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ）を含有する複合体が必要である。これは、ｐＨ非依存性、エンドソーム非依存性の感染経路であり、タウン（Ｔｏｗｎｅ）株またはｇｐＵＬ５５（ｇＢ）アジュバント（ＭＦ５９）ベースのワクチンを接種した後に生成した中和抗体によってブロックされる可能性がある（Pass R.F.、J．Clin．Virol、2009；46（付録4）、S73〜76）。第二の重要な経路は、五量体複合体であるｇｐＵＬ７５／ｇｐＵＬ１１５／ｇｐＵＬ１２８／ｇｐＵＬ１３０／ｇｐＵＬ１３１（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）を必要とする上皮および内皮細胞のエンドソームによる感染プロセスである。この感染経路は、五量体複合体を標的とする中和抗体によってブロックが可能である（Manley K．ら、Cell Host & Microbe 2011；10：197〜209）。現状での知識から、広範な細胞性および体液性免疫反応を刺激する効率的なワクチンを生成するには、上記タンパク質の様々な組み合わせが必要である。しかしながら、正確な組み合わせはわかっていない。近年、五量体複合体のタンパク質の重要性が、Lilleri D．ら、PLoS One、2013年3月；8（3）：e59863、1〜13によって取り上げられた。
【０００７】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス由来の構造抗原から自己集合する安定に組織化された球体であることから、親ウイルスに類似した構造的な特徴および抗原性を有する。生きた弱毒化ウイルスとは対照的に、組換えＶＬＰは、ウイルスＤＮＡの複製を含まないために安全で非感染性である。それゆえに、ＶＬＰは、バイオセーフティーレベル１での生成が可能である。
【０００８】
ワクチンとして医薬開発用の外来抗原を発現させるのに、これまで数種の異なるウイルスベクター様のアデノウイルス、レトロウイルス、カナリア痘瘡、ワクシニア（ポックスウイルス）、および改変されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターが使用されてきた（Wang Z．ら、J．of Virology 2004；3965〜3976；Jie Zhongら、Plos One 2008；3（9）：e3256）。上述したベクターの多くが、複製能を有する、特にレトロウイルスベースのベクターである（Dalba C．ら、Mol．Ther．2007；15（3）：457〜466）。サブユニットまたは単一の組換えタンパク質と比較して、ＶＬＰはより高い免疫原性を有し、Ｂ細胞が介在する免疫反応、加えてＣＤ４増殖およびＣＴＬ応答を刺激することが可能である（Ludwig C．および Wagner R.、Curr．Opin．Biotechnol．2007；18：537〜545）。しかしながら組換えＶＬＰは、他のワクチンタイプが有するようなウイルス複製または不活性化に関連する危険がまったくない。ＶＬＰは、それらの粒子の性質に基づき、免疫原性および安定性に関して可溶性抗原に勝る固有の利点をもたらす。ＶＬＰのサイズは、エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスを介した樹状細胞（ＤＣ）による摂取、ならびに先天性および適応免疫反応の活性化にとって好都合のようである。ＶＬＰ、特にレトロウイルスのＶＬＰ（ｇａｇ−ＶＬＰ）は免疫原性エピトープを含有し、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路を介して細胞性免疫応答を刺激すると予想される（Deml L．ら、Mol．Immunol．2005；42：259〜277）。これらの免疫原性特性のために、ＶＬＰは、強力な免疫刺激を達成するのにアジュバントの使用を必要としないようである。ＶＬＰは、ワクチン（ＷＯ２００５／１２３１２５）およびウイルス血清学の試薬として広範に使用され、高い成功を収めている。
【０００９】
エンベロープウイルスの場合、ＶＬＰは、ウイルス粒子の構築のために少なくとも１種のキャプシドまたはマトリックスタンパク質を必要とする。このタンパク質は、小胞体（ＥＲ）、脂質ラフトまたは原形質膜などの異なる細胞内区画で構築され、そこで出芽が起こることから、ウイルスのリポタンパク質エンベロープを構築する細胞脂質を含有する。またＶＬＰも、宿主細胞のタンパク質、例えば脂質ラフトに結合したガングリオシドを包含する場合がある。ＶＬＰは、単一成分または多成分のキャプシドをベースとした外来エピトープおよび／または標的分子の提示に利用される可能性がある。抗原と融合したＢ型肝炎ウイルスのコア遺伝子により、ＶＬＰアプローチの初期の例がもたらされた（ＷＯ１９９９／０５７２８９）。これまで組換えＣＭＶのＶＬＰは生成されていない。生成され公開された最も大きいＶＬＰは、最大５種の異なるタンパク質を含有するインフルエンザ、ブルータング、およびロタウイルスのＶＬＰである。ＣＭＶキャプシドタンパク質をベースとした組換えＣＭＶ粒子を形成するにはどれだけ多くのタンパク質が、さらにはどのタンパク質が必要なのかは正確にはわかっていない。それに対して、多くの非ヘルペスウイルスのキャプシドタンパク質が、ＶＬＰを形成することが公知である。最も顕著な例は、レトロウイルスの前駆タンパク質ｇａｇ、特にＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）、およびＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）のｇａｇである。ｐｒ５５ＨＩＶ前駆タンパク質は、１００〜１２０ｎｍのサイズを有するＶＬＰを形成し、さらなるタンパク質のキャリアーとして役立つことが示された。免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、ＭｏＭｕＬＶ前駆タンパク質ｇａｇ（ｐｒ６５）は、１１５〜１５０ｎｍのサイズを有するＶＬＰを高収量で生成する。
【００１０】
バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、そのゲノムおよびウイルス構造から大きい外来遺伝子の挿入を可能にするために、ワクチンまたは他の生物製剤を生産するためのタンパク質の共感染および共発現に極めて好適である。ＢＥＶＳは、主に鱗翅目の種（ガやチョウ）に限られた狭い宿主域のために安全である。一次的な生産宿主は昆虫細胞であるが、バキュロウイルスは、哺乳動物細胞での組換え共発現にも適用される。世界中の研究所や民間の実験室で、バキュロウイルス系は広く使用されており、タンパク質発現にとって高度に効率的な系である（Roldao A．ら、Expert Rev．Vaccines、2010；9（10）：1149〜1176）。グラクソ・スミスクライン（GlaxoSmithKline）のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＶＬＰワクチンはＢＥＶＳで生産されており、米国および欧州連合で使用が承認されている（ＷＯ２００５／１２３１２５）。
【００１１】
ＷＯ２０１０／１２８３３８は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ポリエピトープをさらに含む、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）またはＨＳＶウイルス様粒子（ＨＳＶ  ＶＬＰ）を含むＣＭＶワクチンを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００８／１３８５９０
【特許文献２】ＷＯ２００５／１２３１２５
【特許文献３】ＷＯ１９９９／０５７２８９
【特許文献４】ＷＯ２０１０／１２８３３８
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】McGregor A．ら、Expert Opin．Drug Metab．Toxicol．2011；7（10）：1245〜1265
【非特許文献２】Britt W.J．ら、Trends Microbiol．1996；4:34〜38
【非特許文献３】Zhang C．ら、J．Clin．Virol 2006；35:338〜41
【非特許文献４】Bernstein D．I．ら、J．Infect．2002年12月；185：686〜90
【非特許文献５】Becke S．ら、Vaccine 2010；28:6191〜6198
【非特許文献６】Spaete R．ら、1994、J．Gen．Virol.、75、3287〜3308
【非特許文献７】Huber M．T．およびCompton T．、J．Virol．1999；73（5）：3886〜3892
【非特許文献８】Wang D．およびShenk T.、PNAS 2005；102：18153〜18158
【非特許文献９】Pass R.F.、J．Clin．Virol、2009；46（付録4）、S73〜76
【非特許文献１０】Manley K．ら、Cell Host & Microbe 2011；10：197〜209
【非特許文献１１】Lilleri D．ら、PLoS One、2013年3月；8（3）：e59863、1〜13
【非特許文献１２】Wang Z．ら、J．of Virology 2004；3965〜3976；Jie Zhongら、Plos One 2008；3（9）：e3256
【非特許文献１３】Dalba C．ら、Mol．Ther．2007；15（3）：457〜466
【非特許文献１４】Ludwig C．および Wagner R.、Curr．Opin．Biotechnol．2007；18：537〜545
【非特許文献１５】Deml L．ら、Mol．Immunol．2005；42：259〜277
【非特許文献１６】Roldao A．ら、Expert Rev．Vaccines、2010；9（10）：1149〜1176
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、１種またはそれより多くのキャプシドまたはキャプシド前駆タンパク質、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの３種、４種、５種またはそれより多くの異なる表面タンパク質、および場合により１種またはそれより多くの外被タンパク質を含む組換えウイルス様粒子に関する。
【００１５】
好ましくは、キャプシドタンパク質は、サイトメガロウイルス、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）などのヘルペスウイルスから、またはレトロウイルス、特にＨＩＶまたはＭｏＭｕＬＶから誘導される。好ましいキャプシドタンパク質は、ＨＩＶおよび／またはＭｏＭｕＬＶ前駆体ｇａｇタンパク質である。
【００１６】
表面タンパク質（エンベロープタンパク質ともいう）は、好ましくはＨＣＭＶから選択され、特に、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐ１００（ｇＭ）、ｇｐ７３（ｇＮ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる群より選択される。同様に外被タンパク質は、好ましくはＨＣＭＶから選択され、特に、ｐＵＬ３２、ｐＵＬ４５、ｐＵＬ４７、ｐＵＬ４８、ｐＵＬ６９、ｐＵＬ７１、ｐＵＬ７２、ｐＵＬ７６、ｐＵＬ７７、ｐＵＬ８３（ｐｐ６５）、ｐＵＬ８８、ｐＵＬ９３、ｐＵＬ９４、ｐＵＬ９５、ｐＵＬ９７、ｐＵＬ９９、およびｐＵＬ１０３からなる群より選択される。コアタンパク質は、特に、外被またはエンベロープタンパク質の特徴のいずれかを有するｐＵＬ２３、ｐＵＬ２４、ｐＵＬ３３、ｐＵＬ３６、ｐＵＬ３８、ｐＵＬ４３、ｐＵＬ７８、ｐＵＬ８２、ｐＵＬ９６、ＩＲＳ１、ＵＳ２２、およびＴＲＳ１からなる群より選択される。同様に調節タンパク質は、好ましくは、ＩＥ−１、ＵＬ５０、ＵＬ８０．５、ＵＬ４６、およびＵＬ４７からなる群より選択される。
【００１７】
本発明に係る組換えウイルス様粒子は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトープ、追加の外来の抗原配列、サイトカイン、ＣｐＧモチーフ、ｇ−ＣＭＳＦ、ＣＤ１９、およびＣＤ４０リガンドからなる群より選択されるタンパク質、ならびに／または蛍光タンパク質、粒子の精製目的または標識を付着させることに有用なタンパク質、ならびに／または輸送プロセスに必要なタンパク質様の構造をさらに含んでいてもよい。
【００１８】
さらに本発明は、本発明に係るウイルス様粒子に含まれるタンパク質をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡを含むベクター、特にバキュロウイルスベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞、ならびにバキュロウイルスベクターを使用した本発明に係るウイルス様粒子の製造方法に関する。
【００１９】
さらに本発明は、本発明に係る組換えウイルス様粒子を含むワクチン、特に、そのようなワクチンであって、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる五量体複合体、ならびに／またはｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ１００、およびｇｐＵＬ７３；もしくはｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａ；もしくはｐＵＬ８３、ＩＥ−１、ＵＬ９９、ＵＬ９１、およびｐｐ１５０からなる群より選択される可溶性ＣＭＶタンパク質をさらに含むワクチンに関する。このようなワクチンは、水酸化アルミニウム、アラム、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ、ＩＣ３１、非メチル化ＣｐＧ、ＡＤＶＡＸ、ＲＮＡ含有調合物、およびフロイント試薬からなる群より選択されるアジュバントをさらに含んでいてもよく、それに加えて上記で定義されたような本発明のＤＮＡも含んでいてもよい。
【００２０】
特定の実施態様において、本ワクチンは、タウン（Ｔｏｗｎｅ）、トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）、ＡＤ１６９、マーリン（Ｍｅｒｌｉｎ）、ＴＢ２０、およびＶＲ１８１４株からなる群より選択される異なるＣＭＶ株からのＣＭＶタンパク質を含む。
【００２１】
本発明に係る組換えウイルス様粒子を含むワクチンは、プライム−ブースト投与においてｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる五量体複合体で、ならびに／またはプライム−ブースト投与においてｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ１００、ｇｐＵＬ７３、ｐＵＬ８３、およびＩＥ−１からなる群より選択される可溶性ＣＭＶタンパク質で第二の免疫化を行うことにより、その宿主免疫反応の誘導においてさらに強化されていてもよい。
【００２２】
あるいは、本発明に係る組換えウイルス様粒子を含むワクチンは、ｇｐＵＬ７３、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１００、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる群からの少なくとも２種の異なる表面タンパク質からなる可溶性複合体を添加することにより、その宿主免疫反応（体液性および細胞性反応）の誘導においてさらに強化されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】図１は、ヘルペスウイルスまたは非ヘルペスウイルスのキャプシドのどちらかをベースとしたＣＭＶウイルス様粒子の異なる変異体を発現させるための、またはＣＭＶ−五量体複合体および可溶性ＣＭＶタンパク質を発現させるための組換えベクターの概略図である。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【図１−６】同上。
【図１−７】同上。
【図１−８】同上。
【図１−９】同上。
【図１−１０】同上。
【図１−１１】同上。
【図２】図２は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした、配列番号１４と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体である配列番号７の精製を示す図である。
【図３】図３は、配列番号１４と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号５のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【図４】図４は、配列番号１８と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号３のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【図５】図５は、配列番号１８と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【図６】図６は、配列番号１４と組み合わされた非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０のスクロース濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【図７】図７は、配列番号１８と組み合わされた非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０のスクロース濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【図８】図８は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された配列番号１４と組み合わされたＨｉｓ／ストレプトアビジンタグを有するＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号７の分析を示す図である。
【図９】図９は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された配列番号１４と組み合わされたＨｉｓ／ストレプトアビジンタグを有する非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０の分析を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｈｉｓ−タグを有する可溶性ＣＭＶ−五量体複合体の２つのアフィニティークロマトグラフィー工程、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる精製プロセスの分析を示す図である。
【図１１】図１１Ａは、ＨＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号７および配列番号１０の電子顕微鏡写真であり、図１１Ｂは、ＨＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号４８および配列番号１９の電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２Ａは、非ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０および配列番号１０の電子顕微鏡写真であり、図１２Ｂは、非ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号８８および配列番号１９の電子顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、配列番号５９および配列番号２２のそれぞれと配列番号１８とのワクチン組み合わせを用いたインビボでの研究に基づくマウス血清でのウイルス中和アッセイを示す図である。
【図１４】図１４は、配列番号５９に基づく体液性免疫反応を検証するための中和アッセイを示す図である。
【図１５】図１５は、可溶性複合体およびｒｅＶＬＰ（組換えＶＬＰ、配列番号１８を有する配列番号２２）を含有するワクチン候補の１つの構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の品質管理を示す図である。
【図１６】図１６は、コンフォメーション依存性抗体を使用した、可溶性複合体およびｒｅＶＬＰ（組換えＶＬＰ、配列番号２２／１８）を含有するワクチン候補の１つの構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の品質管理を示す図である。
【図１７】図１７は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いた非ヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号１８と組み合わされた配列番号２２）の確認を示す図である。
【図１８】図１８は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いた非ヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号１８と組み合わされた配列番号２２）の精製プロセスの特徴付けを示す図である。
【図１９】図１９は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いたヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰの特徴付けを示す図である。
【図２０】図２０は、非ヘルペスＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号２２／配列番号１８）と五量体ＣＭＶ複合体（配列番号５９）との組み合わせにより誘導された細胞性免疫応答を示す図である。
【図２１】図２１は、ヒトＣＭＶ陽性血清を使用するワクチンのための、ＣＭＶ  ＶＬＰおよび単一の構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図面の簡単な説明
図１は、ヘルペスウイルスまたは非ヘルペスウイルスのキャプシドのどちらかをベースとしたＣＭＶウイルス様粒子の異なる変異体を発現させるための、またはＣＭＶ−五量体複合体および可溶性ＣＭＶタンパク質を発現させるための組換えベクターの概略図である。
【００２５】
２つのプロモーター、Ｐ１およびＰ２
【００２６】
【化１】
0006294890.tif 000002
【００２７】
ならびに２つのターミネーター配列、Ｔ１およびＴ２（Ｔ）（これらは、ＳＶ４０およびＨＳＶｔｋである）を含有するバキュロウイルス発現系（ＢＥＶＳ）を使用した組換えタンパク質発現を目的としたベクター主鎖ｐＲＢＴ１３６に、異なる変異体が挿入される。酵母で増殖させるために、ベクターは、複製起点（Ｏ）、例えば２ミクロン、およびマーカー遺伝子（ｍ）、例えばＵＲＡ３を含有する。さらにベクターは、トランスファーベクターからの導入遺伝子をバクミド（bacmid）に転位させるための左のトランスポゾン部位（ＴＬ）および右のトランスポゾン部位（ＴＲ）、部位特異的な相同組換え（プラスミド融合）のためのｌｏｘＰ部位（Ｌ）、複製起点（Ｏ）、アンピシリン（Ａ）、クロラムフェニコール（Ｃ）、ならびにゲンタマイシン（Ｇ）耐性遺伝子、ならびに所定の制限部位を含有する。バキュロウイルスでの導入または一過性発現のいずれかによって哺乳動物細胞で発現させるために、ベクター主鎖ｐＲＢＴ３９３は、加えてｐＣＭＶ、ｉｅ１、およびｌｅｆ２から選択されるプロモーター、ならびにＳＶ４０ｐＡ、ＢＨＧ  ｐＡ、およびＨＳＶｔｋから選択されるターミネーターを含有する。
【００２８】
略語：ｃ：コンセンサス配列；Ｈ：Ｈｉｓ−タグ；ＳＨ：ストレプトアビジン−Ｈｉｓ−タグ；Ｖ：ＶＲ１８１４株、ｐｃＩ：プレシジョンプロテアーゼ、ｐｃＩＩ：プレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼ、ＤＴ：二量体化ツール、Ｔ：ターミネーター、Ｏ：複製起点、Ｇ：ゲンタマイシン耐性、Ｃ：クロラムフェニコール耐性、Ｌ：ｌｏｘＰ部位、ＴＬ：左側のトランスポゾン、ＴＲ：右側のトランスポゾン。以前のより短いＨＣＭＶの学術名（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、加えて接頭辞のない「ＵＬ」、および接尾辞「Ａ」のないＵＬ４８）が使用される。遺伝子は、それらの番号でのみ名付けられ、例えば「ＵＬ８３」の代わりに「８３」と名付けられる。
【００２９】
図２は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした、配列番号１４と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体である配列番号７の精製を示す図である。
（Ａ）グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製。タウン株からのキャプシド、機能的な外被および表面タンパク質であるＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ５０−ＵＬ４８Ａ−ＵＬ４６−ＵＬ７４（ｇＯ）−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７５（ｇＨ）−ＵＬ１１５（ｇＬ）−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号７および配列番号１４）を含むＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の様々な画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いて免疫ブロッティングによって分析した。外被タンパク質の検証のためにマウス抗ｐＵＬ８３（ウイルシー（Virusy））抗体を使用した。左側に、タンパク質標準をｋＤａで示す；レーン１〜１３：画分１〜１３（上から下への精留）、レーン１４：陽性対照。
【００３０】
（Ｂ）キャプシド（ＵＬ８６、ＵＬ８５）、外被（ＵＬ８３）および表面ＵＬ７５（ｇＨ１、ｇＨ２）タンパク質に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。２つのキャプシド、外被タンパク質（ＵＬ８３）、および表面タンパク質であるＵＬ７５（ｇＨ）の存在は、選択されたタンパク質（ＵＬ８６、ＵＬ８５、ｇＨ２：アラバマ大学（University of Alabama）、ｐＵＬ８３：ウイルシー；ｇＨ１：サンタクルーズ（Santa Cruz））への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質ｇｐ６４に対する抗体（ｅバイオサイエンス（eBioscience））を用いて検証した。ｘ軸の番号１〜１３は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号を示し（上から下へ分画される）、番号１４は陽性対照を示し、番号１５は陰性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。配列番号９、配列番号１０、および配列番号１３と組み合わされた変異体の配列番号７の発現および精製に関しても類似した結果が得られた。
【００３１】
図３は、配列番号１４と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号５のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
キャプシドタンパク質であるＵＬ８６およびＵＬ８５、外被タンパク質であるＵＬ８３（ＵＬ８３）および表面タンパク質であるＵＬ７５（ｇＨ）に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシド（ＵＬ８６、ＵＬ８５）、外被（ＵＬ８３）、および表面タンパク質であるＵＬ７５（ｇＨ）の存在は、選択されたタンパク質（ＵＬ８６、ＵＬ８５、ｇＨ１：アラバマ大学から提供された抗体、ＵＬ８３：ウイルシー；ｇＨ２：サンタクルーズ）への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質ｇｐ６４に対する抗体（ｅバイオサイエンス）を用いて検証した。ｘ軸の番号１〜１３は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号を示し（上から下へ分画される）、番号１４は陽性対照を示し、番号１５は陰性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。
【００３２】
配列番号５および配列番号１３で構成されるＣＭＶ  ＶＬＰからほぼ同一なデータが得られた。表面タンパク質の組成を検証するために、配列番号９または１０と組み合わされた配列番号５をベースとして生成したＣＭＶ  ＶＬＰを上述した方法で処置したところ、０．１〜０．３の範囲の類似したＯＤ値が示された。
【００３３】
図４は、配列番号１８と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号３のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
キャプシドタンパク質（ＵＬ８５）、外被（ＵＬ８３）、および表面（ＵＬ７５（ｇＨ）、ＵＬ５５（ｇＢ））タンパク質に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシド（ＵＬ８５）、外被（ｐＵＬ８３）、および表面タンパク質（ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ５５）の存在は、選択されたタンパク質（ＵＬ８５／ＵＬ５５（ｇＢ１）：アラバマ大学；ＵＬ８３／ＵＬ５５（ｇＢ２）：ウイルシー；ＵＬ７５（ｇＨ）：サンタクルーズ）への抗体結合により示すことができる。ｘ軸の番号１〜７は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号画分１〜７を示し（上から下へ分画される）、番号８は陰性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。配列番号３を配列番号９、１０、１６または１９と組み合わせることによって同じ無傷の組成物が観察され、ここでＯＤ値の検出は０．１〜０．４の範囲で異なっている。
【００３４】
図５は、配列番号１８と組み合わされたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
外被（ＵＬ８３）、および表面（ＵＬ７５、ＵＬ５５）タンパク質に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。外被タンパク質（ＵＬ８３）および表面タンパク質（ＵＬ７５、ＵＬ５５）の存在は、選択されたタンパク質（ＵＬ８３／ＵＬ５５（ｇＢ）：ウイルシー；ＵＬ７５（ｇＨ）：サンタクルーズ）への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質ｇｐ６４に対する抗体（ｅバイオサイエンス）を用いて検証した。ｘ軸の番号１は、スクロースクッションによる予備精製のサンプルを示し、ｘ軸のレーン２〜１４は、グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配の番号画分１〜１３を示し（上から下へ分画される）、番号１５はＶＬＰのための陰性対照を示し、番号１６はバキュロウイルスのための陰性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。キャプシドおよび外被に関しては配列番号２、表面タンパク質に関しては配列番号９、１０、１６または１９で構成されたＣＭＶ  ＶＬＰ変異体の場合と同様に、上述したのと同じタンパク質をＯＤ値０．１〜０．３の範囲で検証することができた。
【００３５】
図６は、配列番号１４と組み合わされた非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０のスクロース濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【００３６】
（Ａ）スクロース濃度勾配をベースとした精製。キャプシド（レトロウイルスの前駆体）タンパク質ｇａｇおよび表面タンパク質であるＵＬ７５（ｇＨ）−ＵＬ１１５（ｇＬ）−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号２０および配列番号１４）を含むＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の様々な画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いて免疫ブロッティングによって分析した。キャプシドタンパク質の検証のために、マウス抗ｇａｇ（ダコ・サイトメーション（DakoCytomation））抗体を使用した。画像の左に、タンパク質標準をｋＤａで示す；レーン１〜１３：画分１〜１３、レーン１４：陽性対照（ｇａｇタンパク質）。
【００３７】
（Ｂ）キャプシド（ｇａｇ）および表面（ＵＬ７５［ｇＨ］、ストレプトアビジンタグを有するｇＬ）タンパク質に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシドタンパク質（ｇａｇ）および表面タンパク質（ｇＨ、ストレプトアビジンタグを介したｇＬ）の存在は、選択されたタンパク質（ｇａｇ：ダコ・サイトメーション；ＵＬ７５（ｇＨ）：サンタクルーズ、ストレプトアビジン：ＡｂＤセロテック（AbD Serotec））への抗体結合により示すことができる。ｘ軸の番号１〜１３は、スクロース濃度勾配の番号画分１〜１３を示し（上から下へ分画される）、番号１４はＶＬＰのための陰性対照を示し、番号１５はバキュロウイルスのための陰性対照を示し、番号１６は陽性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。キャプシドタンパク質ｇａｇ（配列番号２０）を配列番号９、１０、１３、１５，１６または１９の外被および表面タンパク質と組み合わせることによって同じ共局在が観察できた。配列番号１９の包含は一般的により高いＯＤ値を示し、これはＣＭＶ  ＶＬＰの安定性がより優れていることを意味する。
【００３８】
図７は、配列番号１８と組み合わされた非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０のスクロース濃度勾配をベースとした精製を示す図である。
【００３９】
（Ａ）スクロース濃度勾配をベースとした精製。キャプシド（レトロウイルスの前駆体）タンパク質ｇａｇおよび表面タンパク質であるＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ−ＵＬ５５（配列番号２０および配列番号１８）を含むＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の様々な画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いて免疫ブロッティングによって分析した。キャプシドタンパク質の検証のために、マウス抗ｇａｇ（ダコ・サイトメーション）抗体を使用した。左側に、タンパク質標準をｋＤａで示す；レーン１〜１３は、上から下への精留の濃度勾配の画分１〜１３に対応し、レーン１４は陽性対照を示す。
【００４０】
（Ｂ）キャプシド（ｇａｇ）および表面タンパク質（ＵＬ７５［ｇＨ］、ＵＬ５５［ｇＢ］）に特異的な抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイによる免疫ブロットデータの検証。キャプシドタンパク質（ｇａｇ）および表面タンパク質（ＵＬ７５［ｇＨ］、ＵＬ５５［ｇＢ］）の存在は、選択されたタンパク質（ｇａｇ：ダコ・サイトメーション；ｇＢ：ウイルシー；ｇＨ：サンタクルーズ）への抗体結合により示すことができる。バキュロウイルスの存在を、タンパク質ｇｐ６４に対する抗体（ｅバイオサイエンス）を用いて検証した。ｘ軸の番号１〜１３は、スクロースの濃度勾配の番号画分１〜１３を示し（上から下へ分画される）、番号１４は、濃度勾配の負荷を示し、番号１５は陽性対照を示し、番号１６は陰性対照を示す。ｙ軸では、ＶＬＰにおける抗体のタンパク質への結合強度が光学密度（ＯＤ）として示される。同じ画分中に選択されたタンパク質が検出されたことから、それらが共局在していることが示され、それゆえに無傷のＣＭＶ−ＶＬＰであることが示された。配列番号２２および配列番号１８の発現に基づくさらなるＣＭＶ変異体から、タンパク質であるＵＬ８３による細胞性免疫応答の誘導を裏付ける利点と類似した結果が得られた。
【００４１】
図８は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された配列番号１４と組み合わされたＨｉｓ／ストレプトアビジンタグを有するＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号７の分析を示す図である。
【００４２】
キャプシド、機能的な外被および表面タンパク質であるＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ５０−ＵＬ４８Ａ−ＵＬ４６−ＵＬ７４−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７５−ＵＬ１１５（Ｈｉｓ／ストレプトアビジン）−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号７および配列番号１４）を含むＣＭＶ−ＶＬＰ変異体をアイマック（IMAC）法で精製した。
【００４３】
このアイマック精製の様々な工程を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いてマウス抗−ＵＬ８３抗体（ウイルシー）を使用した外被タンパク質（ＵＬ８３）に対する免疫ブロッティングによって分析した。左側に、タンパク質標準をｋＤａで示す。レーン１：精製前のＶＬＰ（ローディング）、レーン２：流出液（ＦＴ）、レーン３：洗浄；レーン４〜９：イミダゾール量を徐々に増加させながら（５５、１００、１５０、２３０、４８０、５００ｍＭ）の溶出、レーン１０：陰性対照としての昆虫細胞（Ｓｆ９）、レーン１１：陽性対照（感染したＳｆ９細胞）。外被タンパク質の存在を矢印で示す（ＵＬ８３）。
【００４４】
図９は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された配列番号１４と組み合わされたＨｉｓ／ストレプトアビジンタグを有する非ヘルペスウイルスのキャプシドベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０の分析を示す図である。
【００４５】
キャプシド（レトロウイルスの前駆体）タンパク質ｇａｇおよび表面タンパク質であるＵＬ７５−ＵＬ１１５（Ｈｉｓ／ストレプトアビジン）−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号２０および配列番号１４）を含むＣＭＶ−ＶＬＰ変異体をアイマックベースの手法で精製した。このアイマック精製の様々な工程を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いてマウス抗ｇａｇ抗体（ダコ・サイトメーション）を使用したキャプシドタンパク質（ｇａｇ、図９Ａ）に対する免疫ブロッティングおよびストレプトアビジン−Ｈｉｓタグを有する表面タンパク質であるＵＬ１１５に対する免疫ブロッティング（ｇＬ、図９Ｂ）によって分析した。左側に、タンパク質標準をｋＤａで示す、レーン１：精製前のＶＬＰ（ローディング）、レーン２：流出液（ＦＴ）、レーン３：洗浄；レーン４〜９：イミダゾール量を徐々に増加させながら（５５、１００、１５０、２３０、４８０、５００ｍＭ）の溶出、レーン１０：陰性対照としての昆虫細胞（Ｓｆ９）、レーン１１：陽性対照（感染したＳｆ９細胞）。キャプシドタンパク質（ｇａｇ）の存在、加えてストレプトアビジン−ヒスチジンタグを有する表面タンパク質ｇＬの存在を矢印で示す。
【００４６】
図１０は、Ｈｉｓ−タグを有する可溶性ＣＭＶ−五量体複合体の２つのアフィニティークロマトグラフィー工程、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる精製プロセスの分析を示す図である。
【００４７】
表面タンパク質であるＵＬ７５（Ｈｉｓタグ含有、ｇＨ）−ＵＬ１１５（ｇＬ）−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号５９）を含む五量体複合体を、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラムを使用した親和性ベースのクロマトグラフィー（アイマック）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＸＫ１６／６０スーパーデックス（Superdex）２００ｐｇ）によって精製した。
【００４８】
（Ａ）２回目のアイマック精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いてクーマシー染色によって分析した。タンパク質標準（レーン１）のサイズ（ｋＤａ）は左側に表示される。レーン２：１回目のアイマックのプール（２回目のアイマック過程のローディング）、レーン３：流出液、レーン４：洗浄、レーン５〜１４：最大５００ｍＭまでイミダゾール濃度を増加させて得られた溶出画分を示す。
【００４９】
（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、続いてクーマシー染色によるサイズ排除クロマトグラフィー精製の分析。タンパク質標準のサイズ（ｋＤａ）（レーン１）は左側に表示される。レーン１：溶出プールＩＶ−２、沈殿したもの；レーン２：溶出プールＩＶ−２、沈殿しなかったもの；レーン３：溶出プールＩＶ−３；レーン４：溶出プールＶ；レーン５：溶出プールＶＩ；レーン６：サイズマーカー。五量体複合体のタンパク質（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）は矢印で示される。
【００５０】
（Ｃ）ｇＨのＨｉｓ−タグに対する抗体を使用した免疫ブロット。レーン１は、溶出プールＩＶ−２（沈殿したもの）；レーン２は、溶出プールＩＶ−２（沈殿しなかったもの）；レーン３は、溶出プールＩＶ−３；レーン４は、溶出プールＶ；レーン５は、溶出プールＶＩ；レーン６は、陽性対照を示す。Ｈｉｓタグを有するｇＨタンパク質は右側に表示される。
【００５１】
図１１は、ＨＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号７および配列番号１０（Ａ）ならびに配列番号４８および配列番号１９（Ｂ）の電子顕微鏡写真である。
（Ａ）キャプシド、機能性タンパク質、外被タンパク質、および表面タンパク質であるＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ５０−ＵＬ４８Ａ−ＵＬ４６−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７４−ＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号７および配列番号１０）を含む組換えヒトＣＭＶ−ＶＬＰの、蛍光体のタングステン酸を用いた陰性染色による電子顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍに対応する。
【００５２】
（Ｂ）キャプシド、キャプシド構築物を支持するタンパク質、外被タンパク質、および表面タンパク質であるＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７４−ＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ−ＵＬ５５（配列番号４８および配列番号１９）を含む組換えヒトＣＭＶ−ＶＬＰの、蛍光体のタングステン酸を用いた陰性染色による電子顕微鏡写真。スケールバーは２００ｎｍに対応する。
【００５３】
図１２は、非ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の配列番号２０および配列番号１０（Ａ）ならびに配列番号８８および配列番号１９（Ｂ）の電子顕微鏡写真である。
【００５４】
（Ａ）キャプシド（レトロウイルスの前駆体）タンパク質ｇａｇおよび表面タンパク質であるＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８（ｃ）−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号２０および配列番号１０）を含む組換えヒトＣＭＶ−ＶＬＰの、蛍光体のタングステン酸を用いた陰性染色による電子顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍに対応する。
【００５５】
（Ｂ）キャプシド（レトロウイルスの前駆体）タンパク質ＭｏＭＵＬＶのｇａｇおよび表面タンパク質であるＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ−ＵＬ５５−ＵＬ８３（配列番号８８および配列番号１９）を含む組換えヒトＣＭＶ−ＶＬＰの、蛍光体のタングステン酸を用いた陰性染色による電子顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍに対応する。
【００５６】
図１３は、配列番号５９および配列番号２２のそれぞれと配列番号１８とのワクチン組み合わせを用いたインビボでの研究に基づくマウス血清でのウイルス中和アッセイを示す図である。
【００５７】
ｈＣＭＶ抗原を用いたプライム−ブースト−ブーストレジメンでＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。この中和アッセイのために選択された抗原は、可溶性複合体（配列番号５９）と、外被タンパク質であるＵＬ８３（配列番号２２）と組み合わせたレトロウイルスのキャプシドで構成されるＶＬＰと、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ５５−ＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａとのタンパク質ミックスである。８匹のマウスから得られた血清のプールの連続２倍希釈液（１：２０から１：２５６０）を、ＣＭＶプロモーター下でＥＧＦＰを発現する組換えのＢＡＣで再構成されたＶＲ１８１４ＨＣＭＶ株と混合した。ＭＲＣ−５線維芽細胞（２×１０４細胞／ウェル）を使用して、処置から９６時間後に細胞ベースの蛍光アッセイでこのウイルスの浸入を査定した。相対蛍光強度（ＲＦＩ、％）を、非ヘルペスＣＭＶ−ＶＬＰおよび五量体のＣＭＶ複合体の混合物で免疫化されたマウスからの選択された血清希釈液に対して表示する。対照として空のバキュロウイルスおよびＰＢＳを使用した。可溶性五量体複合体および非ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ  ＶＬＰのミックスで免疫化することにより、１：１６０から１：３２０の力価範囲内で中和抗体の生成が誘導され、これは、使用されたＥＧＦＰ−ウイルスに関して事前に評価されたＴＣＩＤ５０を使用したヒト血液ドナーの力価に匹敵していた。
【００５８】
１：血清なし、２：１：３２０、３：１：１６０、４：１：８０。ミックス：五量体およびＶＬＰ；ＢＶ：バキュロウイルス。
図１４は、配列番号５９に基づく体液性免疫反応を検証するための中和アッセイを示す図である。
【００５９】
ヒトＣＭＶ血液ドナーおよびマウス血清の中和抗体力価の比較。５人の陽性（グループＧ２、Ｄ６〜Ｄ１０）および５人の陰性（グループＧ１、Ｄ１〜Ｄ５）ＨＣＭＶ血液ドナーからの血清の連続２倍希釈液（１：２０から１：２５６０）を細胞ベースの蛍光中和アッセイで処理した。予め五量体複合体（配列番号５９）で免疫化された８匹のマウスから得られた血清のプールの１：３２０希釈液と同じ阻害作用を示した血清希釈液（ｓ．ｄ．）を示す。マウスの免疫化に使用された抗原ミックス中の構成要素の１つとしての可溶性五量体複合体の別の分析から、ヒト血液ドナーと比較したところ中和抗体の誘導が示された。
【００６０】
ＰＲ：五量体、免疫化前、ＰＯ：五量体、免疫化後、Ｇ１：陰性血液ドナー、Ｇ２：陽性血液ドナー。
図１５は、可溶性複合体およびｒｅＶＬＰ（組換えＶＬＰ、配列番号１８を有する配列番号２２）を含有するワクチン候補の１つの構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の品質管理を示す図である。
【００６１】
アイマックベースの精製で処理した後の異なる量のイミダゾールで溶出させた画分を示す。これらを、ＵＬ７５（ｇＨ）およびｇＨ上のＨｉｓタグの存在に関してテストした。シグナル強度が類似しているということは、ｇＨが損なわれていないこと、それゆえにＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ３０−ＵＬ１３１Ａで構成される複合体全体が損なわれていないことを明示する。１：ローディング、２：流出液、３：洗浄、４：２５０ｍＭイミダゾール、５〜８：３００ｍＭイミダゾール、９〜１３：３５０ｍＭイミダゾール、１４：陽性対照、１５：陰性対照。
【００６２】
図１６は、コンフォメーション依存性抗体を使用した、可溶性複合体およびｒｅＶＬＰ（組換えＶＬＰ、配列番号２２／１８）を含有するワクチン候補の１つの構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の品質管理を示す図である。
【００６３】
指定されたタンパク質の共存に関して、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで複合体の異なる生産バッチをテストした。抗ｇＨ１（ＵＬ７５）抗体でサンプルを捕捉し、抗ｇＨ２および抗Ｈｉｓ、加えて抗ＵＬ１３０／１３１Ａおよび抗ＵＬ１３０コンフォメーション依存性（ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）抗体で検出した。シグナルから、複合体中にタンパク質が共存すること、複合体が損なわれていないこと、加えてその生産の再現性が確認された。１：バッチ４５１−プール１、２：バッチ４５９−プール２、３：バッチ４５９−プール１（１５ｍＭのＥＤＴＡ）、４：バッチ４５９−プール１（２０ｍＭのＥＤＴＡ）、５：バッチ４５８（１５ｍＭのＥＤＴＡ）、６：陽性対照、７：陰性対照、８：内部標準。
【００６４】
図１７は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いた非ヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号１８と組み合わされた配列番号２２）の確認を示す図である。
指定されたタンパク質の共存に関して、異なる溶出画分をテストした。コンフォメーション依存性抗体（ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）でサンプルを捕捉したところ、表面タンパク質であるＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａは天然のコンフォメーションで存在することが示された。検出には、抗ｇＨ（ＵＬ７５）、抗ｇｐＵＬ８３（ｐｐ６５）、および抗キャプシド（ｇａｇ）抗体を使用した。シグナルからＶＬＰ上でのタンパク質の共存が確認され、いくつかのサンプルにおけるテストしたタンパク質の富化が解明される。
【００６５】
１：バルク、２：画分７、３：画分８、４：画分９、５：画分８＋９、６：陰性対照、ｎＯＤ：標準化したＯＤ、ｃａｐ：キャプシド。
図１８は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いた非ヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号１８と組み合わされた配列番号２２）の精製プロセスの特徴付けを示す図である。シグナルからＶＬＰ上でのタンパク質の共存が確認され、使用された膜吸着体（ｃ２）のより優れた性能が解明される。
【００６６】
指定されたタンパク質の共存に関して、２種の異なるクロマトグラフィーマトリックスからの溶出画分（モノリス：ｃ１および膜吸着体：ｃ２）をテストした。コンフォメーション依存性（ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）抗体でサンプルを捕捉し、抗ｇＨ、抗ｐｐ６５、抗ｇＢおよび抗ｇａｇ（キャプシド）抗体で検出した。
【００６７】
１：カラム１（ｃ１）からの溶出画分、２：カラム２（ｃ２）からの溶出画分、３：陽性対照、４：陰性対照。ｃａｐ：キャプシド（前駆体ｇａｇタンパク質）。
図１９は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いたヘルペスベースのＣＭＶ−ＶＬＰの特徴付けを示す図である。
【００６８】
２つ（図１９Ａ、ＵＬ８６およびＵＬ８０．５、配列番号２）または３つ（図１９Ｂ、ＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ８０．５、配列番号３）の異なるキャプシドタンパク質；同じ外被タンパク質であるＵＬ８３（ｐｐ６５）、および異なる表面タンパク質（ｇＨ−ｇＬ−ｇＢ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ、配列番号１８）でＶＬＰを生産し、それに続く精製工程からの溶出画分をサンドイッチＥＬＩＳＡで処理した。表面タンパク質に対するコンフォメーション依存性（ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）抗体でサンプルを捕捉し、外被および表面タンパク質に対する抗体（抗ｐｐ６５、抗ｇＨおよび抗ｇＢ）で検出した。両方のキャプシドタイプから、ただし異なる収量でＶＬＰを得た。ｇＢタンパク質の統合は、３種より多くのタンパク質からなるコアにとっては有益のようであった。１：バルク、２〜１０：画分４〜１２、１１：陰性対照。
【００６９】
図２０は、非ヘルペスＣＭＶ−ＶＬＰ（配列番号２２／配列番号１８）と五量体ＣＭＶ複合体（配列番号５９）との組み合わせにより誘導された細胞性免疫応答を示す図である。
【００７０】
脾臓細胞を、回収後２４時間に様々なペプチド（１〜７）で再刺激し、Ｔｈ１−タイプサイトカイン、ＩＦＮ−ｇ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）、Ｔｈ２−タイプサイトカイン、ＩＬ−４（Ｃ）、ＩＬ−５（Ｄ）およびＩＬ−１０（Ｅ）、ならびに炎症性サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｆ）およびＴＮＦａ（Ｇ）の放出を、製造元のプロトコール（インビトロジェン（Invitrogen））に従って多重アッセイで測定した。ペプチド２〜５は、（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムで）予測されたエピトープを有する九量体の混合物であり、それに対してペプチド６および７は、市販のもの（ＪＰＴ、予め規定されたペプチドのミックス）を購入した。再刺激の対照として空のバキュロウイルスおよびＰＢＳ（ｍｏｃｋ）を使用した。
【００７１】
１：ｍｏｃｋ、２：ｇＨ、３：ｇＢ、４：ＵＬ１２８／１３０、５：ＵＬ１３１／ｇＬ、６：ｐｐ６５、７：ｇａｇキャプシド、ミックス：五量体およびＶＬＰ；ＢＶ：バキュロウイルス。
【００７２】
図２１は、ヒトＣＭＶ陽性血清を使用するワクチンのための、ＣＭＶ  ＶＬＰおよび単一の構成要素（可溶性複合体、配列番号５９）の分析を示す図である。
非ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ  ＶＬＰ（配列番号１９と組み合わされた配列番号２２）、ヘルペスウイルスベースのＣＭＶ  ＶＬＰ（配列番号１９と組み合わされた配列番号４８）、および可溶性複合体（配列番号５９）を、ＣＭＶ陽性ドナーからのヒト抗体と反応するそれらの能力に関してサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでテストして、インビボでの実験を模擬した。異なるＣＭＶタンパク質（ｇＨ、ｇＢ、ＵＬ８３、ＵＬ８５、ＵＬ８６およびコンフォメーションベースのＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）、Ｇａｇ、およびＨｉｓに対応する抗体でプレートをコーティングした。プレートを可溶性五量体複合体またはＶＬＰのいずれかと共にさらにインキュベートし、その後、ＣＭＶ陽性ヒト血清（ＨＩＶ陰性ドナー）で処置した。ＨＲＰで標識されたヒト二次抗ＩｇＧを検出に使用した。
【００７３】
（Ａ）五量体複合体ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号５９）を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでヒト血清を用いて分析した。複合体中のｇＨおよびＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａは、ドナー血清（４人の異なる血清のミックス）中のヒト抗体によって認識される。１：五量体複合体；２：陰性対照（ｍｏｃｋ）；（３）陽性対照（Ｈｉｓ−発現タンパク質）。
【００７４】
（Ｂ）ｇａｇベースのＣＭＶ  ＶＬＰ  ｇａｇ−ＵＬ８３−ｇＬ−ｇＨ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ−ｇＢ−ＵＬ８３（配列番号１９と組み合わされた配列番号２２）を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでヒト血清を用いて分析した。これらのＶＬＰ中のＵＬ８３は、ドナー血清中のヒト抗体によって認識される。１：ＧａｇベースのＣＭＶ  ＶＬＰ；２：陰性対照（ｍｏｃｋ）。ＭｏＭＵＬＶのｇａｇキャプシド（配列番号１９と組み合わされた配列番号８８）をベースとしたＣＭＶ  ＶＬＰに関しても極めて類似した結果が得られた。
【００７５】
（Ｃ）ＣＭＶベースのＶＬＰ  ＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７４−ｇＬ−ｇＨ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ−ｇＢ−ＵＬ８３（配列番号１９と組み合わされた配列番号４８）を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでヒト血清を用いて分析した。これらのＶＬＰ中の全てのタンパク質がドナー血清中のヒト抗体によって認識され、ＵＬ８３、ｇＨ、ＵＬ８５、ＵＬ８６に関しては極めて明確なシグナルが生じた。１：ｇａｇベースのＣＭＶ  ＶＬＰ；２：陰性対照（ｍｏｃｋ）。ＣＭＶ−ＶＬＰおよび可溶性複合体製造中の残りのバキュロウイルスは、ヒト血清の存在下で抗体に結合しなかった。
【００７６】
発明の詳細な説明
本発明は、抗ＨＣＭＶワクチンとして使用するための、抗ＨＣＭＶ処置における治療抗体を開発するための、診断ツールとして、および研究開発ツールとしての新規のウイルス様粒子に関する。本発明は、体液性および細胞性免疫応答を引き起こす非感染性の組換えＣＭＶ粒子を生成するいくつかの可能性を説明している。望ましい特性を有する生成物を得るために、様々なタンパク質の組み合わせが作製される。より具体的には、本発明は、異なるタンパク質組成物の多成分ＶＬＰ変異体および組み合わせ、例えばＶＬＰ、タンパク質複合体、可溶性タンパク質、ならびに／またはＤＮＡベースの組成物、例えばベクターならびにペプチドなどに的を絞っている。
【００７７】
本発明の組換えＶＬＰは、１〜６種のタンパク質（構築物にとって、主要なキャプシド、重要ではないキャプシド、最も小さいキャプシドタンパク質、および必須のタンパク質）のＣＭＶキャプシドタンパク質の組み合わせのいずれかによって形成されたキャプシドをベースとするか、またはｏｎａレトロウイルスの前駆タンパク質、特にｇａｇ、および／もしくはｐｒ５５と名付けられたレンチウイルスのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のうち１種をベースとする。これらのキャプシドタンパク質に、ＣＭＶ外被タンパク質および表面タンパク質から選択されるさらなるタンパク質が付加される。このようにして形成されたＶＬＰは、分泌プロセス中に宿主細胞が供給するエンベロープで取り囲まれる。外被および表面タンパク質をそれらの天然のコンフォメーションで連結および／または埋め込むために、それら個々の膜アンカーが存在する。
【００７８】
ＣＭＶウイルスは、少なくとも５種のキャプシドタンパク質（ＵＬ４６、ＵＬ４８Ａ、ＵＬ８５、ＵＬ８６、ＵＬ１０４の遺伝子産物）、１９種の調節タンパク質、１７種の外被タンパク質（ＵＬ２５、ＵＬ４５、ＵＬ４７、ＵＬ４８、ＵＬ６９、ＵＬ７１、ＵＬ７２、ＵＬ７６、ＵＬ７７、ＵＬ８３、ＵＬ８８、ＵＬ９３、ＵＬ９４、ＵＬ９５、ＵＬ９７、ＵＬ９９、ＵＬ１０３の遺伝子産物）、５種の表面またはエンベロープタンパク質（ＵＬ５５［ｇＢ］、ＵＬ７３［ｇＮ］、Ｕ７４［ｇＯ］、ＵＬ７５［ｇＨ］、ＵＬ１００［ｇＭ］、ＵＬ１１５［ｇＬ］の遺伝子産物）、オープンリーディングフレームからの未分類の遺伝子産物であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ；１５種のベータ−ヘルペスウイルス特異的遺伝子からのタンパク質（ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３８、ＵＬ４３、ＵＬ７４［ｇＯ］、ＵＬ７８、ＵＬ８２、ＵＬ９６、ＩＲＳ１、ＵＳ２２、ＴＲＳ１）、ならびにオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からのいわゆる機能性タンパク質であるＵＬ５０、ＵＬ８０．５を含有することがこれまでわかっていることから、論理上最大１×１０６４種の組み合わせが可能であると予想され、最も大きいＶＬＰは４０種より多くのタンパク質を含有する可能性があることから、調節タンパク質は考慮されていない。このウイルスの複雑さのために、これまで、組換えＣＭＶ  ＶＬＰは存在していない。
【００７９】
本発明において、用語「表面タンパク質」が使用されるが、用語「エンベロープタンパク質」と同じ意味である。
本発明は、１種またはそれより多くのキャプシドまたはキャプシド前駆タンパク質、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの３種またはそれより多くの異なる表面タンパク質、および場合により１種またはそれより多くの外被タンパク質を含む組換えウイルス様粒子に関する。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様において、表面タンパク質は、ｐＵＬ８３（ｐｐ６５）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ１００（ｇＭ）、ｇｐＵＬ７３（ｇＮ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる群より選択され、好ましくはヒトＣＭＶから選択される。それでも非ヒトＣＭＶ株のタンパク質が使用される可能性もある。このような非ヒトＣＭＶタンパク質は、ＶＬＰにおいて免疫学的な機能ではなく構造的な機能をもたらす可能性がある。本発明に係る組換えＶＬＰは、ＨＳＶ（単純疱疹ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス）、およびＫＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）などの他のヘルペスウイルスファミリーからのタンパク質を含んでいてもよい。
【００８１】
種特異性、様々な細胞の指向性、および広範な免疫反応の誘導を引き起こすために、本発明のＶＬＰは、多数のキャプシドおよび外被タンパク質と組み合わせた、１種より多くの表面タンパク質を含有する。
【００８２】
他の好ましい実施態様において、ＣＭＶキャプシドタンパク質をベースとしたＶＬＰは、６種のタンパク質ｐＵＬ８６、ｐＵＬ８５、ｐＵＬ４８Ａ、ｐＵＬ４６、ｐＵＬ５０、およびｐＵＬ８０．５から選択される１種のタンパク質またはタンパク質の組み合わせ、例えばこれらのタンパク質のうち２種、３種、４種、５種、また６種の組み合わせで構成される。本発明のさらなる形態において、ＶＬＰは、タンパク質ｐＵＬ１０４を含む。
【００８３】
非ヘルペスウイルスのキャプシドは、レトロウイルスファミリーからのレトロウイルス科、アルファ−、ベータ、ガンマ、デルタおよびイプシロンレトロウイルス、レンチウイルスファミリーまたはスプーマウイルスファミリーから選ばれる。レンチウイルスファミリーのなかでも、トリ（ＳＩＶ）、ネコ（ＦＩＶ）、ウシ（ＢＩＶ）、およびヒト（ＨＩＶ）前駆タンパク質ｇａｇ（群特異的抗原）が、非ヘルペスウイルスベースのＶＬＰを生成するためのキャプシドとして使用され、加えてネコ白血病ウイルス（ＦＥＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）、トリ白血病ウイルス（ＳＬＶ）またはマウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）のようなガンマレトロウイルスからの前駆タンパク質ｇａｇも使用される。非ヘルペスウイルスのキャプシドをベースとしたＶＬＰは、好ましくはＨＩＶ前駆タンパク質ｇａｇ（ｐｒ５５）で構成され、このＨＩＶ前駆タンパク質ｇａｇは、マトリックス（ＭＡ、ｐ１７）、キャプシド（ＣＡ、ｐ２４）、ヌクレオキャプシド（ＮＣ、ｐ７）、および連結（ＬＩ、ｐ６）タンパク質部分で構成される前駆タンパク質である。
【００８４】
異なるレトロウイルスファミリーメンバーからのｇａｇ前駆タンパク質の構築物に大きな差はないことが知られている。ＨＩＶのｇａｇの他にも、同じサブユニットで構成されるＭｏＭＵＬＶのｇａｇ変異体が、ＣＭＶ  ＶＬＰ形成のために３種より多くの異なるＣＭＶ外被および／または表面タンパク質を有するレトロウイルスベースのキャプシドとして適しており、加えてワクチンの製造および規制当局による認可において有利である。ＭｏＭｕＬＶのｇａｇ前駆タンパク質をベースとしたＣＭＶ  ＶＬＰ変異体構築物は、ＨＩＶのｇａｇベースのＶＬＰ構築物に類似している。ＭｏＭＵＬＶのｇａｇベースのＣＭＶ−ＶＬＰの収量、より優れた形状およびコンフォメーションに関して大きな利点はない。しかしながら、ＨＩＶベースのＣＭＶ  ＶＬＰヒトワクチンとは対照的に、ＨＩＶに関する診断テストにおける偽陽性の結果が、ＭｏＭｕＬＶのｇａｇキャプシドをベースとしたＣＭＶ−ＶＬＰワクチンで予想されることはない。
【００８５】
好ましいＶＬＰは、それぞれのキャプシドタンパク質の上部に、ＵＬ８３、ＵＬ２５、ＵＬ３２（ｐｐ１５０）、およびＵＬ９９からなる群より選択される１または２種の外被タンパク質、および５〜８種の表面タンパク質を含む。表面タンパク質は、好ましくは、ＵＬ７５（ｇＨ）、ＵＬ１１５、（ｇＬ）、ＵＬ７４（ｇＯ）、ＵＬ５５（ｇＢ）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１ＡＡからなる群より選択される。本発明のさらなる実施態様において、ＶＬＰはさらに、ＵＬ１００（ｇＭ）およびＵＬ７３（ｇＮ）を含有していてもよい。本発明のＶＬＰにおけるＨＣＭＶの表面タンパク質は、それらの天然のコンフォメーションで組換えキャプシド構造に提示され埋め込まれるように、それらそれぞれの膜アンカーと共に選択される。
【００８６】
一実施態様において、ＣＭＶキャプシドは、主要なキャプシドタンパク質（ＵＬ８６）のみを含有する。他のあらゆる実施態様において、キャプシドは、１種より多くのタンパク質からなる。好ましい実施態様において、ＶＬＰは、ｐＵＬ８６−ｐＵＬ８５−ｐＵＬ８０．５を、外被タンパク質であるｐＵＬ８３およびｐｐＵＬ３２（ｐｐ１５０）、ならびに表面タンパク質であるｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａと組み合わせてを含有する。同様に、上述した外被および表面タンパク質を、ｐＵＬ８６−ｐＵＬ８５−ｐＵＬ４８Ａで構成されるキャプシド上で発現させることにより、コアを改善し、それゆえにＶＬＰ形状を改善することが好ましい。
【００８７】
他の好ましい実施態様において、ＶＬＰはさらに、表面タンパク質ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）を含む。それにより粒子形成が強化され、防御免疫応答を誘導するタンパク質の量が多くなる。
【００８８】
本発明のさらなる形態において、キャプシドおよび外被タンパク質は、別のヘルペスウイルス、例えば単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＨＶ−６（ロゼオロウイルス）またはＨＨＶ−７（バラ色粃糠疹）由来である。
【００８９】
本発明のさらなる形態において、ＶＬＰは、非ヒトＣＭＶ由来の少なくとも１種の外被タンパク質および／または１種の表面タンパク質を含む。
本発明の他の実施態様において、ＶＬＰは、コイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合した少なくとも２種の異なるタンパク質を含み、ここでコイルドコイルモチーフは、ジッパー機能を有し、対応するモチーフを有する前記少なくとも２種のタンパク質を連結するコイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合している。コイルドコイルモチーフを含むペプチドに融合した好ましいタンパク質は、キャプシドタンパク質のうち１種、好ましくはＵＬ８６、および表面タンパク質のうち１種、好ましくはｇｐＵＬ７５であり、それにより構築物を支持して機能的なＶＬＰを形成し、表面上の免疫原性タンパク質の量を増加させることができる。
【００９０】
本発明の一実施態様において、多成分の組換えＶＬＰを生成するためのタンパク質は、単一のＣＭＶ株から選ばれ、好ましくはタウン、トレド、ＡＤ１６９、マーリン、ＶＲ１８１４株、および／または臨床分離株から選択される。他の実施態様において、ＶＬＰを生成するためのタンパク質は、異なるＣＭＶ株から選択され、好ましくはタウン、トレド、ＡＤ１６９、マーリン、ＶＲ１８１４株、および／または異なる臨床分離株から選択される。
【００９１】
異なるＣＭＶ株からのタンパク質配列を含むＶＬＰは、数種の株に対する保護を付与し、類似の株による再感染および／または再活性化を予防する。考慮される異なるＣＭＶ株は、タウン、トレド、ＡＤ１６９、マーリン、ＴＢ２０、およびＶＲ１８１４株であり、それに加えて他の臨床分離株も考慮される。
【００９２】
これらの株は、タウンおよびトレド株を使用したワクチン候補での第ＩＩ相臨床試験の既存のデータ、よく特徴付けられたＡＤ１６９ベースのデータ、および製造プロセスを分析するための市販のツールなどのいくつかの根拠に基づき考慮される。さらに臨床分離株ＶＲ１８１４は、線維芽細胞および上皮／内皮細胞などの異なる細胞型への浸入に重要な機能的な複合体を含有する。細菌人工染色体（ＢＡＣ）から誘導され実験用に適合させたタウン株については、上皮細胞への浸入は、表面上の非機能的なタンパク質組成物のためにブロックされることが知られている。組換えＣＭＶ  ＶＬＰに異なる株を組み合わせることにより、天然の機能不全は回避される。マーリンおよびＴＢ２０は、参照株として現在頻繁に使用されている。次世代の配列決定などの新しい技術により、ＣＭＶ陽性ドナーからの免疫原性エピトープの決定が可能である。対応するウイルス（臨床分離株）の遺伝情報を使用して、改善されたワクチンを生成できる。それゆえにＣＭＶ  ＶＬＰは、異なるウイルス株からのタンパク質で構成される。
【００９３】
特にｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ、ならびにＣＭＶキャプシドタンパク質（複数可）またはレトロウイルスのｇａｇキャプシドタンパク質のいずれかで構成されるＶＬＰにおいて、タウンとＶＲ１８１４とのタンパク質配列の組み合わせが好ましい。
【００９４】
本発明のタンパク質組成物は、免疫原性タンパク質を含有し、したがって多数の異なるエピトープ、好ましくは体液性および細胞性免疫応答を刺激する種のエピトープを含有する。エピトープによって体液性免疫反応が活性化されると、このようなエピトープを含有するタンパク質に結合すると予想される抗体の生産が起こる。エピトープによって細胞性免疫応答が活性化されると、それらの表面上でこのようなエピトープを提示する細胞を殺す細胞毒性Ｔ細胞（また、ＴＣ、ＣＴＬ、Ｔ−キラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としも知られている）の生産が起こる。本明細書で理解されるようなエピトープは、反復エピトープでもよいし、より大きいタンパク質の一部、特に抗原の一部であってもよい。
【００９５】
本発明のエピトープを含む様々なタンパク質は、例えば、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐＵＬ１００（ｇＭ）、ｇｐＵＬ７３（ｇＮ）、ｐＵＬ８６、ｐＵＬ８５、ｐＵＬ８０．５、ｐＵＬ８２、ｐＵＬ８３、ｐＵＬ４６、ｐＵＬ４８Ａ、ｐＵＬ５０、ｐＵＬ３２、および前初期タンパク質ＩＥ−１である。
【００９６】
好ましい実施態様において、ＶＬＰは、より広範な免疫反応を誘導するために、Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトープと組み合わされた単一または異なるＨＣＭＶ株および／または非ヒトＣＭＶ株からのエピトープを含む。
【００９７】
本発明の他の形態は、ＣＤリガンド（例えばＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９Ｌ）の包有物を含むＶＬＰである。このようなＶＬＰは、結果的にＴｈ１またはＴｈ２応答を引き起こす別個の経路を介して免疫反応を誘導する。
【００９８】
本発明のさらなる形態は、ＣｐＧモチーフ、サイトカイン、および／またはベータグルカンを含むＶＬＰであり、このようなＶＬＰはＢ細胞活性化を直接開始させ、特異的なＨＣＭＶエピトープによって引き起こされる免疫反応を強化してその範囲を広げる。
【００９９】
他の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、完全なウイルス様表面を形成し、場合によりウイルスキャプシドタンパク質をさらに含むタンパク質からなる。本発明のウイルス様粒子は、蛍光タンパク質、粒子の精製目的または標識を付着させることに有用なタンパク質、および輸送プロセスに必要なタンパク質様構造をさらに含んでいてもよい。
【０１００】
本発明は、キャプシド、場合により非ヒトおよび／またはヒトサイトメガロウイルスからの外被および／または表面タンパク質の複数の組み合わせを様々な量で含む組換えウイルス様粒子に関する。これらの粒子は、少なくともキャプシドタンパク質、好ましくは主要なキャプシドタンパク質であるＵＬ８６、ｐｐＵＬ８３、ｐｐＵＬ３２、ｐＵＬ２５、およびＩＥ−１タンパク質からなる群より選択される外被タンパク質、ならびにｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、ｇｐＵＬ１３１Ａ、ｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐＵＬ１００（ｇＭ）、およびｇｐＵＬ７３（ｇＮ）からなる群より選択される表面タンパク質を含有する。表面タンパク質は、好ましくはヒトウイルス由来である。本発明のウイルス様粒子は、（ａ）１種のＨＣＭＶ株または（ｂ）異なるＨＣＭＶ株および／または（ｃ）非ヒトＣＭＶ様マウスまたはモルモットＣＭＶのいずれかから選択された様々なタンパク質を含む、１またはそれより多くの、例えば１〜１６種のタンパク質のいずれかからなる。好ましくは、単一のＨＣＭＶ株からの１種もしくはそれより多くの、好ましくは２種もしくはそれより多くの異なるタンパク質、または異なるＣＭＶ株からの異なるタンパク質を含む組換えウイルス様粒子である。同様に好ましくは、１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、外被タンパク質であるｐＵＬ８３およびｐｐＵＬ３２、ならびに表面タンパク質であるｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ならびに／またはｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる群より選択される五量体構造を形成するタンパク質を含む組換えウイルス様粒子である。本発明の組換えウイルス様粒子はまた、非ヘルペスウイルスのキャプシド、好ましくはレンチウイルスの前駆タンパク質ｇａｇをベースとしていてもよいし、さらにＣＭＶ表面タンパク質および場合によりＣＭＶ外被タンパク質で構成されていてもよい。
【０１０１】
好ましい実施態様において、本発明のウイルス様粒子は、以下を含む：
ａ．単一のＣＭＶ株または非ヘルペスウイルス株からの１種のキャプシドタンパク質；
ｂ．単一のＣＭＶ株からの２種またはそれより多くのキャプシドタンパク質のミックス；
ｃ．異なるＣＭＶ株からの２種またはそれより多くのキャプシドタンパク質のミックス；
ｄ．単一のＣＭＶ株からの１種のキャプシド、１種の外被および１種の表面タンパク質の組み合わせ；
ｅ．異なるＣＭＶ株からの１種のキャプシド、１種の外被および１種の表面タンパク質の組み合わせ；
ｆ．単一のＣＭＶ株からの１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質；１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｇ．異なるＣＭＶ株からの１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質；１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｈ．追加のＴ細胞エピトープを含む、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｉ．免疫回避に関与するタンパク質を排除した、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの、１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｊ．ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ発現の阻害に関与するタンパク質を排除した、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；および
ｋ．ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９Ｌ、サイトカインおよび非メチル化ＣｐＧモチーフからなる群より選択される免疫反応を強化するタンパク質および／またはモチーフをさらに含む、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｌ．例えばＨｉｓ−タグ、ストレプトアビジン−タグ、ｍｙｃ−タグ、フラグ−タグ、およびＳｎａｐ−タグからなる群より選択される精製および分析を容易にするタンパク質、ならびに例えばＧＦＰ、ＹＦＰおよびレッドチェリー（Red-cherry）からなる群より選択される蛍光タンパク質を有する、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの、１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ；
ｍ．化学物質および／または不活性なナノビーズとカップリングするためのさらなるタンパク質様構造または非タンパク質構造を含む、１種またはそれより多くのＣＭＶ株からの、１種またはそれより多くのキャプシドタンパク質、１種またはそれより多くの外被タンパク質、および１種またはそれより多くの表面タンパク質の組み合わせ。
【０１０２】
本発明において提供される大きく複雑なＣＭＶ  ＶＬＰを得るための方策としては、ＣＭＶキャプシド、外被および／または表面タンパク質に関する遺伝子を包含する単一のベクターからの複数の遺伝子の共発現、同様にこれらの共発現ベクターのうちいくつかの共感染が挙げられる。
【０１０３】
これらの新規の多成分ウイルス様粒子、タンパク質複合体、および可溶性タンパク質の生産は組換え構築技術（ｒｅＰＡＸとして知られている）に基づいており、この技術は、以下の工程：遺伝子の構築、様々な系のための発現コンストラクトの生成、タンパク質発現、精製、および生成物の特徴付けを包含する。プラットフォームとして好ましい発現系は、バキュロウイルス系（ＢＥＶＳ）または哺乳動物細胞系である。本発明の他の実施態様において、ＢａｃＭａｍとして知られている両方の系の組み合わせが使用される。
【０１０４】
ＶＬＰ、タンパク質複合体、および単一のタンパク質などの本明細書で説明されるタンパク質組成物は、特定の遺伝学的およびプロセス工学的なツールの使用により、より短時間で且つ無制限の量で生成される。例えば既述のｒｅＰＡＸ技術および遺伝子合成などの現代の分子生物学的方法によって必要な遺伝子を構築する能力により、コード化ＤＮＡベクターの迅速な構築が可能になる。これらの技術の使用は、ウイルス様粒子、タンパク質複合体、および可溶性タンパク質の開発、製造または投与中の、場合により危険な感染性または発癌性を有する元の材料の物理的な移動まったく必要としない。したがって本発明のワクチンは安全である。本発明のタンパク質組成物を構築するためには、ＮＣＢＩデータベースで入手可能なＨＣＭＶからのヌクレオチド配列を使用すれば十分である。
【０１０５】
本発明のＶＬＰを形成するタンパク質をコードするＤＮＡ、およびウイルス性またはプラスミドベースのいずれかでこのようなＤＮＡを含むベクターも、本発明の一部である。
ＢＥＶＳ系のための発現コンストラクトを生成するためには、好ましくは、大腸菌（E. coli）および酵母（例えばサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisae））で増殖させるための要素、ならびに昆虫細胞でタンパク質発現させるための用途を含有するベクター主鎖ｐＲＢＴ１３６が使用される。
【０１０６】
哺乳動物系で発現させるためには、遺伝子の構築、相同組換えのための要素を含有するベクター主鎖ｐＲＢＴ３９３が使用され、哺乳動物細胞で発現させるためには、好ましくはＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ヒト哺乳動物細胞（ＨＦＦ）、および上皮細胞が好ましく使用される。
【０１０７】
異なる遺伝子の並行の構築は、相同フランキング領域を有し、発現カセット（プロモーター−対象の遺伝子−ターミネーター）を含有するＰＣＲ産物、または口蹄疫ウイルス２Ａ切断部位などのプロテアーゼ切断部位と共に１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に融合した単一の遺伝子との相同組換えによって行われる。プロモーターは、好ましくは、ｐｏｌｈ、ｐ１０、およびｐＸＩＶ超後期（very late）バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／超後期ハイブリッドプロモーター、ｐｃａ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス初期プロモーター；ＣＭＶ−ＩＥ１、ＵＢｃ、ＥＦ−１、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、ｐＤＳ４７、Ａｃ５、ならびにＰＧＡＬおよびＰＡＤＨからなる群より選択される。ターミネーターは、好ましくは、ＳＶ４０、ＨＳＶｔｋ、およびＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）からなる群より選択される。
【０１０８】
本発明で好ましく使用されるベクター主鎖ｐＲＢＴ１３６は、大腸菌のための複製起点、例えばｐＢＲ３２２ｏｒｉ、および酵母のための複製起点、例えば２ミクロンｏｒｉ、昆虫細胞で発現させるためのｐｏｌｈおよびｐ１０プロモーター、ターミネーターＳＶ４０およびＨＳＶｔｋ、数種の耐性マーカー（アンピシリン、ゲンタマイシン）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、トランスポゾン部位（Ｔｎ）、ならびに多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。
【０１０９】
プロモーター−対象の遺伝子−ターミネーターを含有する発現カセットは、５’部位に３５〜４０ｎｔのオーバーハングを有する５’部位で、さらに追加の異なる３５〜４０ｎｔオーバーハングを有する３’部位でＰＣＲによって増幅される。同じ構成を有する第二の発現カセットでの相同組換えのために、ＰＣＲ産物は、５’部位に、前のＰＣＲ産物の３’部位に対して相補的な３５〜４０ｎｔのオーバーハングの配列を含有する。第一のＰＣＲ産物の５’部位および第二のＰＣＲ産物の３’部位における残りのオーバーハングは、それぞれ直線状になったベクター（ｐＲＢＴ１３６）の３’および５’末端と相同である。次いで、酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビジエ中で配列中の相同組換えが行われる。以前に説明した方策と並行して構築しようとする発現カセット／ＰＣＲ産物の数は、構築しようとする遺伝子の必要な数に従って増加する。これは、複数の遺伝子／発現カセットが並行して構築されることを意味する。構築された遺伝子は、トランスポゾン部位を両側に有する。これらは、バキュロウイルスゲノムへの遺伝子の転位に使用される。得られたバキュロウイルス共発現ベクターにより、遺伝子が確実に同じ単一の細胞から共発現されるようになる。収量および産物の組成はタンパク質および生産パラメーターの数に応じて様々である。細胞株、感染時の細胞数（ＣＣＩ）、組換えウイルス接種材料の量（重複感染度、ＭＯＩ）、および回収時間（ＴＯＨ）などの生産パラメーターは、マトリックスシステムおよび小規模の生産システム（２〜２０ｍｌ；Ries，C.、John C.、Eibl R．（2011）、A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes-a case study．In Eibl R.、Eibl D．（編集者）：Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture、207〜213、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、ニュージャージー州ホーボーケン）を使用した収量および初期の回収量に基づき決定される。次いで規定のパラメーターを使用して、それぞれの生成物をより大きいスケールで生産する。本発明の粒子は、高い製造能力をもたらす現代の使い捨ての組織培養技術を使用して製造される。
【０１１０】
本発明の好ましい生産細胞株は、昆虫細胞系であり、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ−５、バンキリン（Vankyrin）（ＶＥ−１、ＶＥ−２、ＶＥ−３）、エクスプレス（Express）Ｓｆ＋、およびＳ２シュナイダー（Schneider）細胞である。哺乳動物細胞、特にヒト細胞で発現させるためには、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＭＴ−２、ヒト哺乳動物細胞（ＨＦＦ）、骨髄線維芽細胞、一次神経細胞、または上皮細胞が使用される。酵母のＳ．セレビジエで発現させるためには、シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、またはピチア・パストリス（P. pastoris）細胞が使用される。
【０１１１】
本発明に係る宿主細胞の培養および増殖は、特定の宿主細胞にとって適切な条件をもたらすあらゆる容器、バイオリアクターまたは使い捨てのユニットでなされる。
本明細書で説明されるＣＭＶ粒子は、超遠心分離法ベースの典型的なグリセロール−酒石酸塩およびスクロースの濃度勾配、または現代のクロマトグラフィーベースの技術、好ましくは、膜吸着体およびモノリスなどの大きい多孔質マトリックスを使用した親和性（アイマック）およびイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
【０１１２】
本発明のウイルス様粒子は、治療および／または予防ワクチンとして使用される。さらに本発明のウイルス様粒子は、診断ツールにおける抗原として、および抗体生成のための抗原として使用される。
【０１１３】
両方のタイプのワクチン、すなわち予防ワクチンまたは治療ワクチンのどちらにとっても、抗原特異的なＣＤ８＋、細胞毒性Ｔ細胞応答、加えて抗原特異的なＣＤ４＋、Ｔヘルパー細胞応答が最も重要である。それゆえに、ＶＬＰのタンパク質組成物は、例えば公知のＴ細胞刺激因子であるｐＵＬ８３を発現することによってＴ細胞を誘導するように適合される。さらに予防ワクチンの様々な必要条件に対処するために、本発明は、ＶＬＰ、可溶性タンパク質複合体、および単一のタンパク質の組み合わせを含有する。ＶＬＰの組成物は、免疫原性糖タンパク質（ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ５５）および別個の複合体の形成に必要なタンパク質（ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、ｇｐＵＬ１３１Ａ）が含有されるように適合される。これらの組み合わせは、可溶性五量体複合体［ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、ｇｐＵＬ１３１Ａ］およびウイルス様粒子の組み合わせ、１種またはそれより多くの単一の可溶性タンパク質（例えばｐＵＬ８３、ｇｐＵＬ５５）およびウイルス様粒子の組み合わせ、ならびにウイルス様粒子、五量体複合体、および単一の可溶性タンパク質の組み合わせを含む。これらの組み合わせは、一般的に免疫反応を強化することを目的としており、中和抗体の生成および長期にわたる応答を誘導する。中和抗体の誘導について、糖タンパク質であるｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、およびｇｐＵＬ５５（ｇＢ）が必須の標的であり、したがって、ＣＭＶ−ＶＬＰ、好ましくはＨＣＭＶ−ＶＬＰの表面上で発現される。
【０１１４】
本発明のさらなる形態は、プライム−ブーストレジメンにおける、好ましくはＶＬＰでのプライムおよび五量体複合体でのブーストにおける、ＣＭＶ−ＶＬＰおよび可溶性五量体複合体（ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、ｇｐＵＬ１３１Ａ）の使用である。五量体複合体でのプライムおよびＶＬＰのブーストは、好適な接種スキームである。このようなプライム−ブーストシナリオにおけるＶＬＰと、可溶性タンパク質および／またはＶＬＰおよびＤＮＡとの組み合わせは、本発明の他の形態である。
【０１１５】
さらなる形態において、本発明は、上述したような組換えウイルス様粒子を含むワクチン、特に、そのようなワクチンであって、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａからなる五量体複合体、ならびに／またはｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ７４、ｇｐＵＬ１００、およびｇｐＵＬ７３；もしくはｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａ；もしくはｐＵＬ８３、ＩＥ−１、ＵＬ９９、ＵＬ９１、およびｐｐ１５０からなる群より選択される可溶性ＣＭＶタンパク質をさらに含むワクチンに関する。このようなワクチンは、水酸化アルミニウム、アラム、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ、ＩＣ３１、非メチル化ＣｐＧ、ＡＤＶＡＸ、ＲＮＡ含有調合物、およびフロイント試薬からなる群より選択されるアジュバントをさらに含んでいてもよく、それに加えて上記で定義されたような本発明のＤＮＡも含んでいてもよい。
【０１１６】
先天性疾患になる機会を低下させるためには、母親の最初のＣＭＶ感染を予防する予防ワクチンが望ましいが、それに対して母親が活動性ＣＭＶ感染と診断されているケースでは、有効な療法が求められる。
【０１１７】
予防方法において、本発明のＶＬＰの医薬組成物が使用される。ヒトへの接種方法は、ＶＬＰを含む本発明の医薬組成物を１０μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲で使用する。平均的な７０ｋｇのヒトは、少なくとも単回の接種を受けると考えられる。好ましくは、０週目、８週目、および２４週目に３回の用量を投与し、場合によりそれに続いて最後の免疫化の約１２〜２４ヶ月後に２回目の接種を行うことを含む投薬レジメンが選ばれる。好ましい投与経路は、皮下（ｓｃ）および筋肉内（ｉｍ）投与であるが、皮内および鼻腔内も好適な投与である。
【０１１８】
本発明のＶＬＰの医薬組成物は同様に、治療的処置方法でも使用される。処置目的でのヒトへの接種方法は、本発明のＶＬＰを含む医薬組成物を１０μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲で使用する。平均的な７０ｋｇのヒトは、少なくとも単回の接種を受けると考えられる。好ましくは、０週目、８週目、および２４週目に３回の用量を投与し、場合によりそれに続いて最後の免疫化の約１２〜２４ヶ月後に２回目の接種を行うことを含む投薬レジメンが選ばれる。本発明の医薬組成物は、女性の場合はＶＬＰを５μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲で含み、子供の場合はこの用量の半分である。
【０１１９】
処置のさらなる形態において、医薬組成物は、プライム−ブーストレジメンのための別々の、または組み合わされた医薬組成物として、ＶＬＰ、五量体複合体、および／または可溶性タンパク質を含む。各構成要素は、それぞれ１０μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲で使用される。ＶＬＰと五量体複合体および／または可溶性タンパク質との組み合わせの医薬組成物の各構成要素は、それぞれ１０μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲内である。同様に異なる比率の構成要素も考えられる。平均的な７０ｋｇのヒトは、少なくとも１回の単一の接種を受けると考えられる。好ましくは、０週目、８週目、および２４週目に３回の用量を投与し、場合によりそれに続いて最後の免疫化の約１２〜２４ヶ月後に２回目の接種を行うことを含む投薬レジメンが選ばれる。好ましい投与経路は、皮下（ｓｃ）および筋肉内（ｉｍ）投与であるが、皮内および鼻腔内も好適な投与である。
【０１２０】
本発明の処置方法は、固形臓器、骨髄、および／または幹細胞の移植受容者にとって特に重要である。これらの患者にとって、迅速且つ有効なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答が重要である。この問題を処理するためには、本発明の医薬組成物は、１０μｇ〜１０ｍｇ／用量の範囲である。平均的な７０ｋｇのヒトは、少なくとも一回の接種を受けると考えられる。好ましくは、移植から０週前、２週前、および４週前に３回の用量を投与し、場合によりそれに続いて移植の約１、４、８週間後に２回目の接種を行うことを含む投薬レジメンが選ばれる。
【０１２１】
本発明に係るワクチンは、組換えウイルス様粒子、五量体複合体、および／または可溶性タンパク質を水溶液中で含み、場合により、当業界公知の追加の粘度を調節する化合物、安定化化合物、および／または免疫原性を増加させるアジュバントも含む。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：組換え発現ベクターＲＢＴ１３６−７およびＲＢＴ１３６−９の構築
ＢＥＶＳ系のための発現コンストラクトを生成するために、大腸菌および酵母（例えばサッカロミセス・セレビジエ）で増殖させるための要素、ならびに昆虫細胞でタンパク質発現させるための要素を含有するベクター主鎖ｐＲＢＴ１３６が使用された。様々なＶＬＰ変異体に応じて、キャプシド、外被および表面タンパク質が提供されるように異なる遺伝子を選んだ。
【０１２３】
これらの遺伝子は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）に特異的に最適化された遺伝子合成によって生成され、以下のサイトメガロウイルス遺伝子のグループ：キャプシド区画からの第一のグループ、例えばｐＵＬ８６、ｐＵＬ８５、ｐＵＬ４６、ｐＵＬ４８、ｐＵＬ５０、およびｐＵＬ８０．５（ＵＬ８０Ａ）；外被部分からの第二のグループ、例えばｐＵＬ８３、ｐＵＬ２５、ｐｐＵＬ３２、およびｐＵＬ９９、ならびに表面部分からの第三のグループ、例えばｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐＵＬ１００（ｇＭ）、ｇｐＵＬ７３（ｇＮ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａから選ばれる。ＨＣＭＶキャプシドを構築するために、場合により機能的な遺伝子であるｐＵＬ４８ａおよびｐＵＬ５０と組み合わせた、ｐＵＬ８６、ｐＵＬ８５、ｐＵＬ４６、およびｐＵＬ８０ａの複数の遺伝子の組み合わせを使用した。選ばれた外被はｐＵＬ８３であり、それに対して表面はｇｐＵＬ５５（ｇＢ）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ）、ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）、ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａから製造した。
【０１２４】
１つの発現ベクターへのｐＵＬ８６−ｐＵＬ８５−ｐＵＬ５０−ｐＵＬ４８−ｐＵＬ４６−ｐＵＬ８３−ｐＵＬ８０．５−ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）の並行の構築、加えて第二の発現ベクター中でのｇｐＵＬ７５（ｇＨ）−ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）−ｇｐＵＬ１２８−ｇｐＵＬ１３０−ｇｐＵＬ１３１Ａの構築を、プロモーター−遺伝子−ターミネータータイプの様々な発現カセットを提示するＰＣＲ産物の相同組換えによって行った。ベクター主鎖ｐＲＢＴ１３６は、大腸菌および酵母のための複製起点、昆虫細胞で発現させるためのｐｏｌｈおよびｐ１０プロモーター、ターミネーターＳＶ４０およびＨＳＶｔｋ、数種の耐性マーカー（アンピシリン、ゲンタマイシン）、トランスポゾン部位（Ｔｎ）、および多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。プロモーター−ＵＬ８６−ターミネーターを含有する発現カセットを、プライマーＲＢＴ１５５（ＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＣ、配列番号６３）を有する５’部位と、３５〜４０ｎｔのオーバーハング（ＧＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡ、配列番号６４）を有する３’部位とでＰＣＲによって増幅した。プロモーター−ＵＬ８５−ターミネーターを含有する発現カセットでの相同組換えのために、ＰＣＲによって、前のＰＣＲ産物のＣ末端における３５〜４０ｎｔのオーバーハングと相補的な配列を有するＮ末端でこの部分を増幅した。酵母（サッカロミセス・セレビジエ）で相同組換えが起こった。一晩の培養物を５００×ｇで、２５℃で５分遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを水とトリス−ＥＤＴＡ−ＬｉＯＡｃ緩衝液で洗浄した。ベクターをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）で直線状にし、サケ精子ＤＮＡ（８μｌ）と発現カセットを提示するＰＣＲ産物（１〜４μｌ）とを５０μｌの洗浄された酵母に添加し、３０℃で３０分インキュベートし、続いて４２℃でヒートショックを与え、それぞれのアミノ酸欠失ウラシル非含有寒天プレートで平板培養し、３日間インキュベートした。酵母細胞を凍結（液体窒素、２分間）と融解（９５℃、１分間）により溶解させて、得られたベクターを酵母細胞から単離した。同体積のクロロホルムを添加した後、２倍体積のエタノールでベクターを沈殿させた。沈殿したベクター（５μｌ）を５０μｌのコンピテントＸＬ−１ブルー（ストラタジーン（Stratagene））に添加し、続いて製造元のプロトコールに従い形質転換を行った。氷上で３０分インキュベートし、続いて４２℃で４５秒ヒートショックを与え、４℃で２分コールドショックを与え、２００μｌの２ＹＴ培地を添加し、３７℃で１時間、２２０ｒｐｍでインキュベートした。次いで培養物を、１００μｇのアンピシリンおよび１００μｇのゲンタマイシンを含有する２ＹＴ寒天プレート上で平板培養した。増殖したクローンを、ＰＣＲスクリーニング、分析のための消化、および配列決定によって検証し、全ての構築された遺伝子の存在を証明した。
【０１２５】
遺伝子ＵＬ８３およびＵＬ８０．５をベクターｐＲＢＴ４に構築して、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えによってｐＵＬ８６−ｐＵＬ８５−ｐＵＬ５０−ｐＵＬ４８−ｐＵＬ４６−ｇｐＵＬ７４（ｇＯ）を含有するｐＲＢＴ１３６と組み合わせた。合計体積が１０μｌになるようにして１μｌのｃｒｅ−リコンビナーゼを５００ｎｇのｐＲＢＴ５およびｐＲＢＴ１３６に添加し、３７℃で３０分インキュベートした。７０℃で１０分、熱不活性化した後、ＸＬ−１ブルーコンピテント細胞での形質転換を上記で説明したようにして行った。ＰＣＲスクリーニング、分析のための消化、および配列決定によってクローンを検証した。対応するバキュロウイルスゲノム（バクミド）を生成するために、配列決定したプラスミドを使用した。Ｔｎ７に向けられた転位によるコンピテントＤＨ１０ＭＢ細胞への部位特異的な相同組換えによって、対象の遺伝子を移した。１０ｎｇの配列決定したプラスミドを１００μｌのコンピテントＤＨ１０ＭＢ細胞に添加し、４℃で３０分インキュベートした。４２℃で４５秒ヒートショックを与え、４℃で２分コールドショックを与えた後、４００μｌの２ＹＴ培地を添加し、３７℃で４時間、２２０ｒｐｍでインキュベートし、耐性マーカーおよび青白スクリーニング用のＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌに応じて抗生物質を含有する適切な２ＹＴ寒天プレート上で１：１０希釈液を平板培養した。正しいクローンを選択し、増殖させ、BirnboimおよびDolyの方法（Nucleic Acids Res．1979；7（6）：1513〜23）を使用してＤＮＡを単離した。フージーン試薬（３μｌ、ロシュ（Roche）、スイス）を使用した昆虫細胞の最初のトランスフェクション（Ｓｆ９、１×１０６細胞／６ウェル）のために４つの正しいバクミドクローン（各１μｇ）を選択し、組換え種ウイルス（Ｖ０）を生成した。このウイルスを、２００ｍｌの培養物で０．０５ｐｆｕ／細胞の重複感染度（ＭＯＩ）を使用して２回連続して増幅を行い、マスターの種ウイルス（Ｖ１）および作業用種ウイルス（Ｖ２）を生成した。作業用種ウイルスの感染力価を、典型的なプラークアッセイによって決定した。ウイルス希釈液（１０５〜１０８、体積１ｍｌ）を１×１０６細胞／６ウェルのＳｆ９細胞培養に添加し、２７℃で１時間インキュベートした。ウイルスを吸引した後、Ｓｆ９００−１．３培地中の４％アガロースを用いて細胞をその上に重ねて置き、続いて加湿したチャンバー中２７℃でインキュベートした。様々なコンストラクトの感染力価は、１〜５×１０７ｐｆｕ／細胞の範囲であった。
【０１２６】
細胞株、感染時の細胞数（ＣＣＩ）、組換えウイルス接種材料の量（重複感染度、ＭＯＩ）、および回収時間（ＴＯＨ）などの生産パラメーターを、５０ｍｌのバイオリアクター（カルティフラスク（Cultiflask）、ザルトリウス・ステディム（Sartorius Stedim））で２０ｍｌの昆虫細胞培養物を感染させることにより決定した。異なるＣＣＩのマトリックス（０．５；１、２×１０６細胞／ｍｌ）、ＭＯＩ（０．１、０．４、１、２、４）および回収時間（ＴＯＨ）を７日間行って、収量の観点で最良の生産パラメーターを決定した（Ries，C.、John C.、Eibl R．（2011）、A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes-a case study．In Eibl R.、Eibl D．（編集者）：Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture、207〜213、ジョン・ワイリー＆サンズ、ニュージャージー州ホーボーケン）。毎日のサンプリング、細胞数および生存率の決定によって生産を制御した。免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡによってサンプルを分析した。最高の強度（ドットブロット）および最高のＯＤ（ＥＬＩＳＡ）と評価された収量の観点で最良の生産パラメーターは、感染（ｐ．ｉ．）後３日目に達成され、共感染に使用された各ウイルスで感染細胞数（ＣＣＩ）は２×１０６細胞／ｍＬであり、ＭＯＩは０．２であった。
【０１２７】
免疫ブロッティングのために、１００μｌの細胞培養サンプルを、ドット−ブロットチャンバー（バイオ・ラッド（BioRAD））を使用してろ過することによりニトロセルロースメンブレン（バイオ・ラッド）に晒した。５％の脱脂粉乳を含むトリスＣｌ−トウィーン２０（０．１％）溶液で３０分、非特異的な結合部位ブロックした後、メンブレンを、外被タンパク質であるＵＬ８３に対する抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗マウス抗体とカップリングしたアルカリホスファターゼ（セル・シグナリング（Cell signaling））と共にインキュベートした後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（サーモフィッシャー（ThermoFisher））溶液を用いてタンパク質の検出を行った。
【０１２８】
ＥＬＩＳＡアッセイのために、９６ウェルの吸着処理済みＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（Nunc））で、１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）中で、収集された全ての細胞培養サンプルを１：１０に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡを１９５μｌ／ウェルで用いて室温で１時間ブロックした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中１μｇ／ｍｌの濃度で特異的な抗体を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。表面タンパク質であるｇＨの検出にはマウス抗ｇＨ（サンタクルーズ）抗体を使用し、それに対して外被タンパク質であるＵＬ８３の検証にはマウス抗ＵＬ８３抗体（ウイルシー）を用いた。３回洗浄工程を行った後、適切な二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７での１：１０００希釈液）と共に１時間インキュベートした。ＶＬＰへの特異的な抗体（ＵＬ８３、ｇＨ）の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、米国サンディエゴ；製造元のプロトコールに従った）を使用して検出し、その後、３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ測定を行った。
【０１２９】
以下に示すＣＭＶ−ＶＬＰ変異体生成のための発現ベクター（ｐＲＢＴ１３６−ｘ）を実施例１で説明されているようにして処理した。
略語：ｃ：コンセンサス配列；Ｈ：Ｈｉｓ−タグ；ＳＨ：ストレプトアビジン−Ｈｉｓ−タグ；Ｖ：ＶＲ１８１４、ｐｃＩ：プレシジョンプロテアーゼ、ｐｃＩＩ：プレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼ、ＤＴ：二量体化ツール。表１に記載の遺伝子の説明については、より短いＨＣＭＶ学術名（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、加えて接頭辞のない「ＵＬ」、および接尾辞「Ａ」のないＵＬ４８）を使用した。
【０１３０】
【表１−１】
0006294890.tif 000003
【０１３１】
【表１−２】
0006294890.tif 000004
【０１３２】
【表１−３】
0006294890.tif 000005
【０１３３】
【表１−４】
0006294890.tif 000006
【０１３４】
実施例２：発現ベクターｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−１；ｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−８、およびｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−２０
発現ベクターｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−１；ｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−８、およびｐＲＢＴ１３６ＣＭＶ−２０を得るために、対象の各遺伝子、すなわちＵＬ８６、ＵＬ５５（ｇＢ）、およびｇａｇを、ＢａｍＨＩ（５’）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３’）での消化および同じ酵素で切断した主鎖ｐＲＢＴ１３６へのライゲーションによってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターからサブクローニングした。２０μｌの総体積中の２μｇの切断されたｐＲＢＴ１３６、１０μｇのフラグメント、および１μｌのＴ４−リガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションを行い、続いて実施例１で説明されているようにしてコンピテントＸＬ−１ブルー細胞での形質転換を行った。
【０１３５】
実施例３：キャプシド変異体ｐＲＢＴＣＭＶ−２のための発現コンストラクト
ＣＭＶ−ＶＬＰを生成するためのキャプシド変異体ｐＲＢＴＣＭＶ−２の発現コンストラクトを得るために、ＵＬ８６を含有する発現カセットとＵＬ８３を有する別の発現カセットとを、実施例１で説明されているようにして並行して構築した。フォワードプライマーとしてＲＢＴ２０４（ＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＧＡＴＣＡＴＧＧ、配列番号６５）およびリバースプライマーとしてＲＢＴ１８９（ＧＴＡＧＣＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧ、配列番号６６）を使用して実施例２で説明されているようにしてライゲートすることにより、ＰＣＲ産物をライゲートしてＵＬ８０．５発現カセットの統合を行った。
【０１３６】
実施例４：キャプシド変異体ｐＲＢＴＣＭＶ−３のための発現コンストラクト
キャプシド変異体ｐＲＢＴＣＭＶ−３のための発現コンストラクトを生成するために、変異体ｐＲＢＴＣＭＶ−２のプラスミドを制限酵素ＡｖｒＩＩで切断した。遺伝子ＵＬ８５を有する発現カセットをプライマーｐＲＢＴ５２６（５’）およびｐＲＢＴ１８９（３’）で増幅し、実施例１で説明されているような相同組換えによってプラスミドｐＲＢＴＣＭＶ−２に導入した。
【０１３７】
実施例５：ＣＭＶ−ＶＬＰ変異体５の発現、精製、および特徴付け
系統的な最適化（実施例１）の後に規定されたタンパク質発現パラメーターに従って、ＵＬ８６−ＵＬ８５−ＵＬ５０−ＵＬ４８−ＵＬ４６−ＵＬ８３−ＵＬ８０．５−ＵＬ７４−ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、使い捨ての１Ｌ振盪フラスコ（培養体積３００ｍＬ）中で、それぞれ複数の遺伝子を含有する２種のバキュロウイルス（配列番号５および配列番号１２）の共感染によりヨトウムシ（fall army worm）であるスポドプテラ・フルギペルダの細胞（Ｓｆ９）で生産した。生産パラメーターは以下の通りであった：感染時の最初の細胞数（ＣＣＩ）は２×１０６細胞／ｍｌであり、各ウイルス０．２ｐｆｕ／ｍｌの場合の重複感染度（ＭＯＩ）は０．４ｐｆｕ／ｍｌであり、インキュベートは２７℃で１００ｒｐｍであった。感染後（ｐ．ｉ．）の３日目に生存率約８０％で回収を行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率の決定により生産を制御した。分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１００ｋＤａであり、フィルター領域が８０ｍｌ／分の流速で０．０２ｍ２であり（ザルトリウス・ステディム）、膜貫通圧力が１〜１．５ｂａｒのハイドロサート・サートコン・スライス（Hydrosart Sartocon Slice）２００カセットにより接線流ろ過を使用して、ＶＬＰを含有する上清を３倍濃縮した。２工程のグリセロール−酒石酸塩の濃度勾配超遠心分離によって保持液を精製した。第一の工程において、２５ｍｌの保持液を、６ｍＬの３０％スクロースクッション（ｗ／ｖ、５０ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）上に載せ、ＳＷ２８ローターを使用して、１６０００ｒｐｍおよび１６℃で１．５時間ペレット化した。ペレットを０．５ｍｌのＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配（１５〜３５％酒石酸塩と混合した３０％グリセロール、体積１２ｍｌ）を調製し、０．５ｍｌの精製前の材料に重ね合わせ、ＳＷ４１ローターを使用して２４０００ｒｐｍおよび１６℃で１６時間遠心分離した。濃度勾配を上から０．９ｍｌ量で分画し、精製したＶＬＰを生化学的方法によって分析した。製造元のプロトコールに従って１５０μｌの異なる濃度勾配画分を４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）にローディングし、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分間および１８０Ｖで４５分間泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン（SimplyBlue SafeStain）試薬（インビトロジェン）で一晩染色し、水で脱色した。
【０１３８】
免疫ブロッティングのために、半乾式装置（バイオ・ラッド）を使用して１９Ｖで１時間かけてニトロセルロースメンブレン（バイオ・ラッド）上にタンパク質を移した。非特異的な結合部位を５％脱脂粉乳含有トリスＨＣｌ−トウィーン２０（０．１％）溶液で３０分ブロックした後に、メンブレンを、外被タンパク質ｐＵＬ８３などの特異的なタンパク質に対する抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗マウス抗体とカップリングしたアルカリホスファターゼ（セル・シグナリング）と共にインキュベートした後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（サーモフィッシャー）溶液を用いてタンパク質の検出を行った。
【０１３９】
総タンパク質を、９６ウェルプレートの様式に合わせたブラッドフォードアッセイ（ＢＣＡ、ピアース（Pierce））によって決定した。２０μｌの未知のサンプルまたは標準サンプルを１８０μｌの緩衝液で希釈した。標準サンプルで３連で（純粋なウシ血清アルブミン）または未知のサンプルで連続２倍希釈を行った。ウェルごとに１００μｌの２×ストックブラッドフォード試薬（ピアース）を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーで５９５ｎｍで吸光度を測定した。グリセロール−酒石酸塩の濃度勾配での分画により得られた様々な画分中に含有されるＣＭＶ−ＶＬＰをさらに、外被ＵＬ８３（マウス抗ＵＬ８３、ウイルシー）および表面タンパク質であるｇＨ（マウス抗ｇＨ、サンタクルーズ）に特異的な抗体の結合を調査することによって分析した。それゆえに、９６ウェルの吸着処理済みＥＬＩＳＡプレート中で異なる濃度勾配の画分を１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）で１：１０希釈し、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、続いて１９５μｌ／ウェルの１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中１μｇ／ｍｌの濃度で特異的な抗体、抗表面抗体（抗ｇＨ）、加えて抗外被抗体（抗ＵＬ８３）を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、続いてさらに３回の洗浄工程を行った。検出のために適切な二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７での１：１０００希釈液）と共に１時間インキュベートした。ＶＬＰへの特異的な抗体の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス、米国サンディエゴ；製造元のプロトコールに従った）を使用して検出し、その後、３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ測定を行った。
【０１４０】
以下の表２は、実施例５で説明されているようにして発現、精製、および特徴付けられたＣＭＶ−ＶＬＰ変異体の概説である。表１で説明した遺伝学的コンストラクトは、対応するバキュロウイルスの生成などのさらなる操作にそれらを使用する前に配列決定することによって品質管理された。生成したバキュロウイルスの完全性は、単一の遺伝子それぞれの存在に関してＰＣＲベースで導入遺伝子を制御することによって品質管理された。表２に、タンパク質の、特にこれらＣＭＶ  ＶＬＰの免疫原性表面タンパク質の収量および共局在などに関する製造および規制当局による認可に関する最も重要な特性を記載する。
【０１４１】
【表２−１】
0006294890.tif 000007
【０１４２】
【表２−２】
0006294890.tif 000008
【０１４３】
実施例６：五量体のＣＭＶ複合体の発現、精製、および特徴付け
系統的な最適化（実施例１、ＶＬＰに関して）に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターによれば、使い捨ての２Ｌ振盪フラスコ（培養体積７００ｍｌ）中で、単一のバキュロウイルス（配列番号５９）からの共発現により、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞（Ｓｆ９）でｇｐＵＬ７５（ｇＨ−Ｈｉｓ）−ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）−ｇｐＵＬ１２８−ｇｐＵＬ１３０−ｇｐＵＬ１３１Ａを含む五量体のＣＭＶ複合体を生産した。生産パラメーターは以下の通りであった：感染時の最初の細胞数（ＣＣＩ）は２×１０６細胞／ｍｌであり、重複感染度（ＭＯＩ）は０．２５ｐｆｕ／ｍｌであり、インキュベートは２７℃で１００ｒｐｍでなされた。感染後（ｐ．ｉ．）の３日目に生存率約８０％で回収を行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率の決定によって生産を制御した。複合体を含有する上清を、２×５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））にローディングした。カラム体積の５０倍量（ＣＶ、５００ｍｌと等量）でゼロから５００ｍＭの直線的な濃度勾配のイミダゾールを使用して複合体を精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学的方法によって分析した。１５０μｌの様々な画分をアセトンで沈殿させて、３０μｌの２０ｍＭトリス，１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）にローディングするために、４×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分および１８０Ｖで４５分電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬（インビトロジェン）で一晩染色し、水で脱色した。濃縮しさらに精製するために、２回目のアイマッククロマトグラフィーを、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラムを使用して、５０のカラム体積にわたり０から５００ｍＭのイミダゾールの直線的な濃度勾配によって行った。１回目のアイマック工程と同様にクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓ抗体を使用した免疫ブロッティングによって様々な画分を分析した。全ての複合体を含有する分画をプールし、濃縮して、５０ｋＤａカットオフのアミコン（Amicon）フィルターユニット（ミリポア（Millipore））を使用して５ｍｌの最終容量にし、最終的な精製工程のためにサイズ排除カラム（ＸＫ１６／６９、スーパーデックス２００ｐｇ）にローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色および抗Ｈｉｓ抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。総タンパク質を、９６ウェルプレートの様式に合わせたブラッドフォードアッセイ（ＢＣＡ、ピアース）によって決定した。２０μｌの未知のサンプルまたは標準サンプルを１８０μｌの緩衝液で希釈した。標準サンプルで３連で（純粋なウシ血清アルブミン）または未知のサンプルで連続２倍希釈を行った。ウェルごとに１００μｌの２×ストックブラッドフォード試薬（ピアース）を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーで５９５ｎｍで吸光度を測定した。クロマトグラフベースの精製からの様々な画分中に含有される五量体のＣＭＶ複合体をさらに、ｇｐＵＬ７５に付加されたＨｉｓ−タグ（ｇＨ、��ウス抗Ｈｉｓ、ＡｂＤセロテック）およびｇｐＵＬ７５それ自身（ｇＨ、マウス抗ｇＨ、サンタクルーズ）に特異的な抗体の結合を調査することによって分析した。したがって異なるサンプルを、９６ウェルの吸着処理済みＥＬＩＳＡプレート中で、１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）で１：１０希釈し、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡを１９５μｌ／ウェルで用いて室温で１時間ブロックした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中１μｇ／ｍｌの濃度で特異的な抗体、抗Ｈｉｓ抗体（抗Ｈｉｓ）、加えて抗ｇｐＵＬ７５（抗ｇＨ）を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、続いてさらに３回の洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７での１：１０００希釈液）と共に１時間インキュベートした。五量体複合体への特異的な抗体の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス、米国サンディエゴ；製造元のプロトコールに従った）を使用して検出し、その後、３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ測定を行った。
【０１４４】
実施例７：生成した構築物の電子顕微鏡法による視覚的な検証
精製されたＶＬＰの形状を検証するために、電子顕微鏡法を行った。銅で被覆されたＥＭグリッド上で１滴１０μｌのＶＬＰサンプルを１０分インキュベートし、５μｌの蛍光体のタングステン酸で５〜１０分染色し、水で２回、１分脱色した。ワットマン（Whatman）ペーパーでグリッド上の液体を除去し、グリッドをＪＥＯＬ３０００顕微鏡に移し、粒子を調査しその写真を撮った。
【０１４５】
実施例８：サンドイッチＥＬＩＳＡの使用による結合アッセイ
結合アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、異なるｒｅＶＬＰ（組換えＶＬＰ）の表面タンパク質の存在および接近容易性を決定した。したがって３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中１μｇ／ｍｌの濃度で特異的な表面および／または外被抗体を、９６ウェルの吸着処理済みＥＬＩＳＡプレート中のコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）に添加し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡを１９５μｌ／ウェルで用いて室温で１時間ブロックした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中の１：１０希釈液中の異なるＶＬＰを添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７中１μｇ／ｍｌの濃度で特異的な抗体、抗表面抗体（抗ｇＨ、抗ｇＢ）、加えて抗外被抗体（抗ＵＬ８３）を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、続いてさらに３回の洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７での１：１０００希釈液）と共に１時間インキュベートした。ＶＬＰへの特異的な抗体の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス、米国サンディエゴ；製造元のプロトコールに従った）を使用して検出した。３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ測定を行った。
【０１４６】
実施例９：マウスにおけるインビボの研究
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。各グループは８匹のマウスで構成され、各マウスに注射１回あたり２０μｇのタンパク質を与えた。組み合わせるために（ＣＭＶ−ｒｅＶＬＰ＋五量体複合体）、総量４０μｇのタンパク質を注射した。マウス検疫（０日目）の１４日後に免疫前の血清を採取した。１０日後に１回目の注射を行い、続いて４２日目にブースター注射を行った。４９日目に第一の採血を行った。６１日目に２回目のブースター注射を行い、続いて７０日目にさらなる採血を行った。８５日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答を調査した。
【０１４７】
実施例１０：中和アッセイに基づく体液性免疫反応
実施例９からのマウス血清の中和アッセイによって、ＣＭＶ陰性およびＣＭＶ陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較して、ＣＭＶ−ｒｅＶＬＰ（ｖＲＢＴ−２０）および五量体複合体（配列番号：５９）の組み合わせをベースとしたワクチン候補の体液性免疫反応を調査した。分析上の理由（ｆｉｘ−ＥＧＦＰ）のためにＧＦＰ分子を有するＢＡＣ（細菌人工染色体）で再構成されたＶＲ１８１４株を、線維芽細胞（ＭＲＣ−５）および上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞に感染させるために使用して、実施例９からのマウス血清の中和能を可視化した。１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ培地中の９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルを植え付けた。８匹のマウスの血清プールを作製し、これを、１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ／ＦＣＳ培地中で、連続２倍希釈（１：２０〜１：２５６０）で添加した。上述したｆｉｘ−ＥＧＦＰ  ＶＲ１８１４ウイルスを、予備アッセイで決定された１０００ウイルス分子／ウェルの感染能のある用量（ＴＣＩＤ）で組織培養に添加した。９６ウェルプレートを、ＣＯ２制御された雰囲気中で３７℃で８日間インキュベートした。プレートリーダーで、以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った：フルオレセイン−フィルター［励起４８５／２０、放出５３０／２５）、ボトムリーディングモード、時間：０．１秒、９６時間インキュベート後に測定２５回／ウェル。５０％のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として中和効力を決定した。以下の対照：細胞対照（細胞＋ＰＢＳ）、ウイルス対照（感染させた細胞のみ）、ならびにヒト血液ドナーからの５種のＣＭＶ陽性および５種のＣＭＶ陰性血清を試験した。
【０１４８】
実施例１１：ＥｌｉＳｐｏｔデータ（多重アッセイ）に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究の８５日目に（実施例９）、マウスを殺し、１０種の異なるサイトカインを分析するために脾細胞を調製した。脾細胞の再刺激のために、ＣＭＶ−ｒｅＶＬＰ、加えて合成ペプチドのミックスを使用した。以下のタンパク質を検証した：ＨＩＶｇａｇ、ｐＵＬ８３、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０、およびｇｐＵＬ１３１Ａ。数種のバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して各タンパク質のエピトープ予測を行った。脾細胞の再刺激のために、タンパク質ごとに４種のペプチドのミックスを作製した。ＨＩＶｇａｇについては、市販の１３０種のペプチドのペプチドミックス（JPT、ベルリン）を使用した。サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｇＣＭＳＦ、およびＴＮＦアルファ）を、インビトロジェン製の多重アッセイキットによって、製造元のプロトコールに従い調査した。
【０１４９】
実施例１２：ＣＭＶ陽性血清中に存在する抗体の反応に基づく結合アッセイ
ワクチンの一部としての様々なＣＭＶ  ＶＬＰおよび可溶性複合体を特徴付けるために、サンドイッチＥＬＩＳＡ様式での二重結合アッセイを行った。精製されたモノクローナル抗体とＨＣＭＶ陽性血液ドナーの血清ミックス中に存在する抗体との組み合わせによって、様々なｒｅＶＬＰのキャプシド、外被および表面タンパク質の存在および接近容易性を調査した。したがって抗ｇＨ、抗ｇＢ、抗ＵＬ８３、抗ＵＬ８６、抗ＵＬ８５、抗ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ、抗ｇａｇ、抗Ｈｉｓなどの抗ＣＭＶモノクローナル抗体を、９６ウェルの吸着処理済みＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）中で、コーティング緩衝液（０．１、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）で最終濃度１μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０）で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳ溶液中の３％ＢＳＡを１９５μｌ／ウェルで用いて室温で１時間ブロックした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７で１：１０に希釈された様々なＣＭＶ  ＶＬＰおよび可溶性複合体を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。３回洗浄工程を行った後、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７で１：３００に希釈された４種のＣＭＶ陽性ヒト血清のミックスを添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、続いてさらに３回の洗浄工程を行った。
【０１５０】
検出のために、適切な二次抗体（抗ヒト−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７での１：１０００希釈液）と共に１時間インキュベートした。ＶＬＰおよび可溶性複合体で構成されるタンパク質へのヒト血清中に存在する抗体の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス、米国サンディエゴ；製造元のプロトコールに従った）を使用して検出した。３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでＯＤ測定を行った。一方の側におけるモノクローナル抗体への結合と他方の側におけるＣＭＶ陽性血清中に存在する抗体への結合とに基づくＣＭＶ  ＶＬＰおよび可溶性複合体の完全性を検証するために、この種のサンドイッチアッセイを選んだ。血清中でのヒト抗体への結合から、ＣＭＶ  ＶＬＰおよび可溶性複合体のタンパク質の接近容易性が示された。
【０１５１】
実施例１３：ＣＭＶ陽性ドナーからの血清を使用した様々なＣＭＶ−ｒｅＶＬＰおよび可溶性複合体の特徴付け
異なるＣＭＶ−ｒｅＶＬＰ変異体を実施例５で説明されているようにして生産し、スクロースクッションベースの超遠心分離法によって濃縮した。２５ｍｌの細胞培養上清を、６ｍＬの３０％スクロースクッション（ｗ／ｖ、５０ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）上に載せ、ＳＷ２８ローターを使用して２０，０００ｒｐｍおよび１６℃で１．５時間ペレット化した。ペレットを０．２〜０．４ｍｌのＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。５０μｌの再懸濁したペレットを、製造元のプロトコールに従って４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）上にローディングし、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分間および１８０Ｖで６０分間泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬（インビトロジェン）で一晩染色し、水で脱色した。
【０１５２】
免疫ブロッティングのために、半乾式装置（バイオ・ラッド）を使用して１９Ｖで１時間かけてニトロセルロースメンブレン（バイオ・ラッド）上にタンパク質を移した。非特異的な結合部位を５％脱脂粉乳含有トリスＣｌ−トウィーン２０（０．１％）溶液で３０分ブロックした後に、５％脱脂粉乳含有トリスＣｌ−トウィーン２０（０．１％）で１：５００希釈した、マウスからの血清（１グループあたり８匹のマウスのプール）または実施例１０に記載のヒト血液ドナーからの血清のいずれかと共にメンブレンを４℃で一晩インキュベートした。二次抗マウス抗体とカップリングしたアルカリホスファターゼ（セル・シグナリング）と共にインキュベートした後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（サーモフィッシャー）溶液を用いてタンパク質の検出を行った。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【配列表】
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