(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法であって、少なくとも以下の、
（ａ）血液試料を提供するステップ、
（ｂ）抗酸化物質を含むフィルターに前記試料を与えて前記試料から血液細胞を分離するステップ、
（ｃ）前記標的分子を検出するステップ、
を含み、
前記標的分子の検出は、少なくとも以下の、
（ｃ１）第１の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第１の結合分子は磁気粒子に付着させられ、さらに、前記第１の結合分子は前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ、
（ｃ２）第２の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第２の結合分子はセンサ表面に付着させられ、さらに、前記第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ、及び、
（ｃ３）前記センサ表面上の前記磁気粒子を検出するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ１）及び（ｃ２）は同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法における抗酸化物質の使用。
【請求項４】
血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するためのアッセイ装置内に挿入するためのカートリッジであって、抗酸化物質を含む、血液細胞を除去するためのフィルターを含むカートリッジ。
【請求項５】
（ｉｉｉ）磁気粒子に付着させられる第１の結合分子、及び、
（ｉｖ）センサ表面に付着させられる第２の結合分子、
をさらに含み、
前記第１の結合分子及び前記第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、請求項４に記載のカートリッジ。
【請求項６】
前記抗酸化物質は前記フィルター内に組み込まれる、請求項４又は５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
還元剤をさらに含む、請求項４、５又は６に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記アッセイ装置は、ハンドヘルド式アッセイ装置である、請求項４、５、６又は７のうちいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記標的分子は副甲状腺ホルモンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗酸化物質はフェノール性抗酸化物質である、請求項１、２又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗酸化物質は、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、エトキシフェノール、フェニルサリチレート、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ＢＳＡ、メラトニン、アルファカロチン、ベータカロチン、Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６及びＩｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０を含む群から選択される、請求項１、２、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的分子は副甲状腺ホルモンである、請求項３に記載の使用。
【請求項１３】
前記標的分子は副甲状腺ホルモンである、請求項４、５、６、７又は８に記載のカートリッジ。
【請求項１４】
前記抗酸化物質はフェノール性抗酸化物質である、請求項３又は１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗酸化物質はフェノール性抗酸化物質である、請求項４、５、６、７、８又は１３に記載のカートリッジ。
【請求項１６】
前記抗酸化物質は、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、エトキシフェノール、フェニルサリチレート、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ＢＳＡ、メラトニン、アルファカロチン、ベータカロチン、Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６及びＩｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０を含む群から選択される、請求項３、１２又は１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗酸化物質は、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、エトキシフェノール、フェニルサリチレート、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ＢＳＡ、メラトニン、アルファカロチン、ベータカロチン、Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６及びＩｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０を含む群から選択される、請求項４、５、６、７、８、１３又は１５に記載のカートリッジ。
【請求項１８】
前記第１の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項１、２、９、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項１、２、９、１０、１１又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項３、１２、１４又は１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記第１の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項２２】
前記第２の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項３、１２、１４、１６又は２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記第２の結合分子は、抗体又はその断片である、請求項５又は２１に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法に関する。本発明は、血液試料内の少なくとも１つの標的分子を検出するプロセスにおける抗酸化物質の使用、並びに、血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するためのアッセイ装置内に挿入するためのカートリッジにも関する。
【背景技術】
【０００２】
体外診断用医薬品は、より効果的で能率的な医療に対する増加する需要のためますます重要である。一方で、そのような診断テストは、専門家的技術者によって操作される多くの種類の機器を保管（ｈｏｓｔ）する中央研究所において行われ、もう一方で、そのような診断テストは、例えば手術室において、医院にて、病院のベッドサイドにて、救急車において又は患者の家にて等、研究室環境外でポイントオブケアの設定で行われる。ポイントオブケアテストは、迅速であることに加えて、特定疾患のバイオマーカーに対する検査は検出がピコモル濃度の範囲で完了するよう要求するため感受性が高いよう要求される。サンドイッチイムノアッセイにおいてラベルとして磁気粒子を使用することは、この目的に対して適していると証明されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
研究室環境外での検査のために、テストが、かなりの使用し易さと組み合わされて緻密であり且つ頑強であることがさらに不可欠である。従って、可能な限り少ないユーザ支援のステップを有するポイントオブケアの設定を提供することが強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、これらの要求に取り組み、さらに、血液試料における少なくとも１つの標的分子の迅速且つ使い易い検出のための手段及び方法を提供する。
【０００５】
上記の目的は、特に、血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法によって成し遂げられ、当該方法は、少なくとも以下の：（ａ）血液試料を提供するステップ；（ｂ１）前記試料を抗酸化物質に接触させ、さらに、前記試料をフィルターに与えて前記試料から血液細胞を分離するステップ；及び／又は（ｂ２）抗酸化物質を含むフィルターに前記試料を与えて前記試料から血液細胞を分離するステップ；（ｃ）標的分子を検出するステップ；を含む。標的分子の検出は、（ｃ１）カートリッジのチャンバにおいて第１の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第１の結合分子は磁気粒子に付着させられ、さらに、前記第１の結合分子は前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ；（ｃ２）第２の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第２の結合分子はセンサ表面に付着させられ、さらに、前記第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ；及び、（ｃ３）センサ表面上の磁気粒子を検出するステップ；を含む。
【０００６】
１つの利点は、血液試料における標的分子の検出を、遠心分離ステップなしで行うことができるということである。血液細胞は、濾過によって血液試料から取り除かれる。従って、テストに必要な全ての前処理及び試薬がすでに与えられているカートリッジに血液試料を加えることのみをユーザが必要とするように、ハンドヘルド式のアッセイ装置内に挿入することができる使い捨てのカートリッジには、献身的なフィルターが備わっていてもよい。
【０００７】
しかし、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）等の標的分子に対して、血液試料の濾過は、遠心分離によって得られる血漿と比較してアッセイ反応を減らし得るということが観察されてきた。試料への抗酸化物質の添加が、濾過される血液試料に対するアッセイ反応を増やすということがわかっている。特に、本願の例は、抗酸化物質の添加が、血液及び血漿から得られるテスト結果に対して約１の相関関数をもたらすということを実証している。それは、アッセイ反応が、濾過によって血液細胞を除去することにより得られる血液、及び、遠心分離によって得られる血漿に対して同じであるということを意味している。
【０００８】
理論に縛られるものではないが、濾過される血液試料のアッセイパフォーマンスにおける観察された減少に対する１つの可能な説明は、フィルター及び／又は濾過中に濃縮される血液細胞との標的分子の接触後に、標的分子が酸化され、且つ、結果として、例えば結合分子によってもはや認識されない等、検出するのがより困難であるということである。その方法で、標的分子は、試料容器内で生じているアッセイにおいて認識されない。血液試料に添加される抗酸化物質は、酸化から標的分子を保護する。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、上記の方法のステップ（ｃ１）及び（ｃ２）は同時に行われる。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、血液試料内の少なくとも１つの標的分子を検出するプロセスにおける抗酸化物質の使用に関し、磁気粒子に付着させられる第１の結合分子、及び、センサ表面に付着させられる第２の結合分子を含み、前記第１の結合分子及び前記第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するためのアッセイ装置への挿入のためのカートリッジに関し、（ｉ）抗酸化物質及び（ｉｉ）血液細胞を取り除くためのフィルターを含む。一実施形態において、カートリッジは、（ｉｉｉ）磁気粒子に付着させられる第１の結合分子、及び、（ｉｖ）センサ表面に付着させられる第２の結合分子をさらに含んでもよく、前記第１の結合分子及び第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗酸化物質は、上記のカートリッジのフィルター内に組み込まれる。
【００１３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記のカートリッジは、還元剤をさらに含む。
【００１４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、上記のカートリッジは、ハンドヘルド式のアッセイ装置において使用するためにある。
【００１５】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジの好ましい実施形態において、前記１つの標的分子は副甲状腺ホルモンである。
【００１６】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジの別の好ましい実施形態において、前記抗酸化物質はフェノール性抗酸化物質である。
【００１７】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジのさらに別の好ましい実施形態において、前記抗酸化物質は、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、エトキシフェノール、フェニルサリチレート（ｐｈｅｎｙｌ  ｓａｌｉｃｙｌａｔ）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ＢＳＡ、メラトニン、アルファカロチン、ベータカロチン、Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６及びＩｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０を含む群から選択される。
【００１８】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジのさらに好ましい実施形態において、前記第１の結合分子は、抗体又はその断片である。
【００１９】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジのさらに別の好ましい実施形態において、前記第２の結合分子は、抗体又はその断片である。
【００２０】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジのさらに好ましい実施形態において、前記磁気粒子は、１０から１０００ｎｍのサイズを有する。
【００２１】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジの別の好ましい実施形態において、前記磁気粒子は、超常磁性の粒子である。
【００２２】
本明細書において先に述べた本発明の方法、使用又はカートリッジのさらに別の好ましい実施形態において、前記検出は、内部全反射を使用して実行される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】血液試料内の少なくとも１つの標的分子の検出に適した例証的な光磁気装置の概略（側面）図である。そのような装置は、典型的には、入力光ビーム（ｉｎｐｕｔ  ｌｉｇｈｔ  ｂｅａｍ）を放つ光源（ＬＥＤ）、出力光ビーム（ｏｕｔｐｕｔ  ｌｉｇｈｔ  ｂｅａｍ）を検出及び測定するための光検出器（光検波器）、及び、そこに接続される評価ユニットを含む。入力光ビームは、ガラス又は透明なプラスチックから作製されるセンサ表面を含む試料容器（典型的にはカートリッジ内に置かれる）内に放たれる。さらに、試料容器は、テストされることになる流体試料、及び、例えば超常磁性のビーズ等の磁気粒子を含み、磁気粒子は、標的分子を検出するための結合分子で官能性を持たされ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）、さらに、上方の磁石（洗浄磁石）及び下方の磁石（結合磁石）によって磁気的に作動させることができる。センサ表面での磁気ビーズの存在は、光ビームの全反射を「阻止」し、試料容器のセンサ表面の近く又はその上に位置する磁気粒子の数に比例して反射される光を減らす。
【図２】実施例１に記載される実験から生じる信号変化（％）を示した図である。抗酸化物質のメタ重亜硫酸ナトリウムの添加は、濾過された血液試料に対するアッセイ反応の有意な増加を引き起こし、約１の血液−血漿相関関数をもたらす。参照試料は、抗酸化物質の非存在下で血液−血漿相関関数はたったの約０．５であるということを示している。
【図３】実施例２に記載される実験から生じる信号変化（％）を示した図である。抗酸化物質のアスコルビン酸の添加は、濾過された血液試料に対するアッセイ反応の有意な増加を引き起こし、約１の血液−血漿相関関数をもたらす。参照試料は、抗酸化物質の非存在下で血液−血漿相関関数はたったの約０．５であるということを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、少なくとも１つの標的分子を検出するために血液試料を直接使用するための方法及び手段に関する。
【００２５】
本発明は特定の実施形態に関して記載されるけれども、この記載は、限定的な意味で解釈されることはない。
【００２６】
本発明の例証的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するのに重要な定義が与えられる。
【００２７】
本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の不定冠詞は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【００２８】
本発明と関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的に、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。
【００２９】
「含む」という用語は限定的ではないということが理解されたい。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【００３０】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」又は「（a）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」又は「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書において記述又は例示された順序以外の順序で作動させることができるということが理解されたい。
【００３１】
「第１」、「第２」、「第３」又は「（a）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」又は「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等の用語が方法又は使用又はアッセイのステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において上記又は下記に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。
【００３２】
本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないことが理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されたい。定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３３】
研究室環境外で検査するために、理想的には、使用者は、使い捨てのカートリッジに試料を添加することのみを必要とし、さらに、テストに必要な全ての前処理及び試薬は、カートリッジ内にすでに存在している。従って、シンプルで信頼できる血液ベースのポイントオブケアテストを行うことが可能であるために、血液細胞は、遠心分離ステップなしで分離される必要がある。この目的のため、カートリッジには献身的なフィルターが装備される。そのようなポイントオブケア設定に対する要求は、約１の血液−血漿相関関数である。これは、アッセイ反応が、濾過によって血液細胞を除去することにより得られる血液、及び、遠心分離によって得られる血漿に対して同じであると意味する。
【００３４】
しかし、本発明者等は、副甲状腺ホルモンの検出に対して、血液と血漿との相関関数は、定量的な血液ベースの適用には不十分である約０．５であるということを発見した。本発明者等は、抗酸化物質を添加することによって、血液に対するアッセイ信号の大幅な増加が生じて、血液及び血漿に対する類似のアッセイパフォーマンスもたらし、それによって、約１の血液−血漿相関関数をもたらすということを発見した。
【００３５】
先に述べてきたように、本発明は、一態様において、血液試料における少なくとも１つの標的分子を検出するための方法に関係し、当該方法は、少なくとも以下の：（ａ）血液試料を提供するステップ；（ｂ１）前記試料を抗酸化物質に接触させ、さらに、前記試料をフィルターに与えて前記試料から血液細胞を分離するステップ；及び／又は（ｂ２）抗酸化物質を含むフィルターに前記試料を与えて前記試料から血液細胞を分離するステップ；（ｃ）標的分子を検出するステップ；を含む。検出は、異なるアプローチによって生じてもよい。例えば、検出は、ダイレクトアッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ等によって達成されてもよく、上記アッセイのうち全てが、異なる結合分子を使用してもよい。例えば、標的分子に特異的なラベルされた抗体又はラベルされたリガンド等の結合分子を使用して、標的分子を直接検出してもよい。ラベルは、例えば、蛍光ラベル、放射活性ラベル、発光検出のための化学的ラベル、親和タグラベル等であってもよい。別のアプローチにおいて、標的分子は、抗体又はリガンド等のラベルの付いていない結合分子と接触させられてもよい。標的分子とラベルの付いていない結合分子との確立された相互作用は、次に、例えば、標的分子とラベルの付いていない結合分子との相互作用と競合するとして既知のラベルされた化合物との競合によって検出されてもよい。そのようなラベルされた化合物は、ラベルされた抗体、リガンド、小分子等であってもよく、上記化合物のうち全てが、ラベルの付いていない結合分子よりも高い親和性で標的分子に結合する。ラベルは、上記のものと同じであってもよい。さらなる実施形態において、標的分子の異なる部位を認識する２つの結合分子を使用したサンドイッチアッセイを使用して標的分子を検出することができる。例えば２つの異なる抗体を使用するそのようなサンドイッチアッセイを、例えば磁気ビーズによる促進された検出に対して利用することができる。一実施形態において、標的分子の検出は、従って、少なくとも（ｃ１）第１の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第１の結合分子は磁気粒子に付着させられ、さらに、前記第１の結合分子は前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ；（ｃ２）第２の結合分子に前記試料を接触させるステップであり、前記第２の結合分子は検出表面に付着させられ、さらに、前記第２の結合分子は、前記少なくとも１つの標的分子に特異的に結合する能力を持つ、ステップ；及び、（ｃ３）センサ表面上の磁気粒子を検出するステップ；を含む。
【００３６】
本明細書において使用される場合「標的分子」は、結合分子によって結合することができるいかなる分子であってもよく、例えば、生体分子、複合体、細胞分画、又は複数の細胞等、生物学的物質であってもよい。好ましくは、本発明と関連した標的分子は、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド等、核酸である。さらにより好ましいのは、ペプチド、タンパク質、薬物分子、小分子又はビタミン等の標的分子である。本発明の特定の好ましい実施形態において、「標的分子」は、バイオマーカーであってもよい。
【００３７】
本明細書において使用される場合「バイオマーカー」という用語は、通常の生物学的プロセス、発症プロセス、又は、治療的介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定及び評価される特徴として定義することができる。本発明によって考察されるバイオマーカー分子は、疾患関連のバイオマーカー又は薬物関連のバイオマーカー等、当技術分野において既知のいかなるバイオマーカーでもあり得る。疾患関連のバイオマーカーは、疾患がすでに存在している（診断バイオマーカー）場合に、患者に対する治療の有望な効果の指標（リスク指標又は予測バイオマーカー）を提供するか、又は、どのようにしてそのような疾患が、治療のタイプに関係なく個々の症例において発達し得るかの指標（予後バイオマーカー）を提供する。予測バイオマーカーは、一般的に、特定の治療に対する最も可能性が高い反応を評価するのに寄与するのに対して、予後マーカーは、治療した又は治療しない疾患の進行をモニターするために使用される。対照的に、薬物関連のバイオマーカーは、薬物が特定の患者において効果的であるかどうか、及び、どのようにして患者の体はそれを処理するのかを示す。当業者は、種々の且つはっきりと特定される医療分野において使用される数多くの新規のバイオマーカーを認識している。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態において、バイオマーカーは、核酸、タンパク質及び代謝物から選択される群から選択される。バイオマーカーは、従って、血液試料において測定される分子、好ましくはタンパク質を意味してもよく、その濃度は、一部の疾患の状態の重症度又は存在を反映する。このように、バイオマーカーは、特定の疾患の状態の指標として、又は、生物の生理学的状態の指標としても使用することができる。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、標的分子はホルモンである。ホルモンの好ましい例は、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン、抗ミュラー管ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、アディポネクチン、アンジオテンシン、アンジオテンシノーゲン、抗利尿ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、成長ホルモン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インヒビン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、黄体ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、リラキシン、セクレチン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ニューロペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レンニン及びエンケファリンである。原則として、本明細書において記載される方法、使用及びカートリッジは、酸化に感受性の標的分子を検出するのに適している。副甲状腺ホルモンは、標的分子として好ましくあり得る。
【００４０】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の検出方法又は使用を受けるか、又は、本明細書において記載されるカートリッジの助けをかりて検出されることになる標的分子は副甲状腺ホルモンである。
【００４１】
本明細書において使用される場合「血液試料」は、本明細書において規定される標的分子を含む血液試料を意味する。そのような試料は、例えば、個体又は患者から採取される試料を含んでもよい。血液試料は全血であってもよく、全血試料は、無処置であり得るか、又は、抗凝血剤を含有してもよい等、処置することができる。血液試料の遠心分離によって得られる血漿が血液試料として理解されることはない。
【００４２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、血液試料は個体から採取され、血液試料は、無処置の全血試料である。
【００４３】
一部の実施形態において、バイオマーカー等の標的分子は、血液試料から直接得られる。他の状況において、試料は第一に、例えば、標的分子をより結合パートナーに到達可能にする、すなわち、本明細書において規定される第１及び第２の結合分子に到達可能にする部分精製を含む例えば標準的なプロトコルに基づく試料調製技術を受けてもよい。他の好ましい実施形態において、標的分子をより結合パートナーに到達可能にするか、又は、アッセイ反応の定量化に必要とされる添加剤が血液試料に添加される。
【００４４】
本明細書において使用される場合「血液試料を提供する」という表現は、血液試料がヒト又は動物の体外に提供されるということを意味する。
【００４５】
本明細書において使用される「抗酸化物質」は、他の分子の酸化を遅くするか又は防ぐ能力を持つ分子を意味する。本発明の好ましい実施形態において、抗酸化物質はフェノール性抗酸化物質である。フェノール性抗酸化物質に対する例は、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０である。本発明の別の好ましい実施形態において、抗酸化物質は、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、エトキシフェノール、フェニルサリチレート、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ＢＳＡ、メラトニン、アルファカロチン、ベータカロチン、Ａｓｐｉｒｉｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｎｏｌ（登録商標）ＯＣ、Ｉｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０７６、Ｉｏｎｏｘ（登録商標）２２０、Ｅｔｈａｎｏｘ（登録商標）３３０、Ｃｙａｎｏｘ（登録商標）２２４６又はＩｒｇａｎｏｘ（登録商標）１０１０である。本発明は、当業者には既知であるか又は適した文献供給源から得ることができるさらなる抗酸化物質も考察する。本発明は、まだ知られていないか又は将来当業者には既知になり得る抗酸化物質も考察する。
【００４６】
本明細書において使用される場合「フィルター」は、血液試料から血液細胞を分離する能力を持つフィルターを意味する。典型的にそのようなフィルターは、フィルターにおける血液細胞の優れた分離、少ない溶血反応、標的分子の保持力の欠如及び標的分子の改変の欠如を示す。好ましい実施形態において、フィルターは、ＰＡＬＬ社からのＶｉｖｉｄ（登録商標）血漿分離用ＧＦメンブレンである。フィルターは、処置されてもよく又は無処置でもよい。好ましい実施形態において、フィルターは、フィルター処理用緩衝液（ｆｉｌｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ）で処置される。この処理に対して適した緩衝液は、当業者には既知であり、糖、塩、緩衝剤、タンパク質及び界面活性物質を含む。処理緩衝液が別の好ましい実施形態である特に好ましい実施形態において、フィルターは、アッセイパフォーマンスを改善するために試薬をさらに含んでもよい。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、血液試料をフィルターに与える前に、抗酸化物質が血液試料に接触させられる。代わりの実施形態において、フィルターが、抗酸化物質をすでに含んでいてもよい。試料における抗酸化物質の最終濃度は、１±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％という関心のある標的分子に対する血液−血漿の回収率（ｂｌｏｏｄ−ｐｌａｓｍａ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）をもたらす範囲内にあってもよい。
【００４８】
本明細書において使用される場合「血液−血漿の回収率」という用語は、一方で血液から、もう一方で血漿から生じる２つのアッセイ反応間の関係の程度を描く１つの数字を意味する。本明細書において使用される場合「血漿」という用語は、血液試料の遠心分離によって得られる血漿試料を意味する。本明細書において使用される場合「血液」という用語は、血液試料がフィルターに与えられて血液細胞を分離した後に得られる血液試料の液体部分を意味する。血液−血漿の回収率は、血液から生じた定量的アッセイ反応を、血漿から生じた定量的アッセイ反応で割ることによって決定される。例証的に、定量的アッセイ反応は、センサ表面の近く又はその上の磁気粒子の位置から生じる光信号における変化であってもよく、又は、標的分子の計算される濃度であってもよい。血液−血漿の回収率は、２つのアッセイ反応が同じ範囲内にある場合に約１である。血液−血漿の回収率は、血漿から生じるアッセイ反応が、血液から生じるアッセイ反応よりも約２倍多い場合に約０．５である。標的分子は、好ましくは、副甲状腺ホルモン等のホルモンであり得る。
【００４９】
好ましい実施形態において、試料における抗酸化物質の最終濃度は、約０．０１Ｍから約５Ｍ、好ましくは、例えば約０．０５Ｍ、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．７Ｍ、約１．０Ｍ、約１．２Ｍ、約１．５Ｍ、約１．７Ｍ又は約２．０Ｍの濃度等、約０．０５Ｍから約２Ｍの範囲にある濃度である。特に好ましい実施形態において、試料における抗酸化物質の濃度は０．１２Ｍである。
【００５０】
好ましい実施形態において、例証的には献身的な血液チューブ又はピペットにおいて、カートリッジに血液試料を与える前に、抗酸化物質が血液試料に接触させられる。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、抗酸化物質は、カートリッジ内に統合させられる。
【００５２】
本発明の特定の実施形態において、抗酸化物質は、フィルター処理用緩衝液に抗酸化物質を添加することによって、フィルター内に組み込まれてもよい。
【００５３】
さらに好ましい実施形態において、抗酸化物質は、（例えばＮ２流下等）酸化しない環境におけるフィルターの処理によってフィルター内に組み込まれてもよい。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、抗酸化物質は、乾燥した形状でフィルターに添加される。
【００５５】
本発明のさらに別の実施形態において、抗酸化物質は、カートリッジ内の別の位置に添加される。例証的に、抗酸化物質は、ビーズ乾燥緩衝液（ｂｅａｄ  ｄｒｙｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に添加されてもよい。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、血液試料との抗酸化物質の接触は、１±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％という血液−血漿の回収率をもたらす。
【００５７】
本発明の別の特定の実施形態において、抗酸化物質は、メタ重亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸である。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態において、メタ重亜硫酸ナトリウムは、０．１２Ｍの最終濃度で血液試料に添加される。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態において、アスコルビン酸は、０．１２Ｍの最終濃度で血液試料に添加される。
【００６０】
本明細書において使用される場合「還元剤」は、他の分子を還元する能力を持つ分子を意味する。例えば、酸化させられた標的分子は、還元剤によって還元することができる。本発明の好ましい実施形態において、還元剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸及びＬ−システインである。本発明は、当業者には既知であるか、又は、適した文献の供給源から得ることができるさらなる還元剤も考察する。本発明は、まだ知られていないか、又は、将来当業者には既知になり得る還元剤も考察する。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、本発明によるカートリッジは、還元剤をさらに含む。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態において、還元剤は、カートリッジのいかなる部分においても組み込まれ、例えば、還元剤はフィルター内に組み込まれる。
【００６３】
本明細書において使用される場合「磁気粒子」は、小さな局在化した対象物を意味し、体積又は質量等の物理的性質によって生じたものとみなすことができる。「磁気粒子」という用語は、永久磁気粒子も磁化可能粒子（ｍａｇｎｅｔｉｓａｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）も含むものとする。さらに、粒子は、本質的に、その移送及び性質という点で単元全体として行動する。磁気粒子は、従って、対称、球状、本質的に球状若しくは球形の形状のものであってもよく、又は、ふぞろいで非対称の形状若しくは形のものであってもよい。
【００６４】
本発明によって考察される磁気粒子のサイズは、典型的には、３ｎｍから５０μｍに及ぶ。好ましいのは、ナノメートルから数マイクロメートルまでに及ぶマイクロメートルの範囲にある磁気粒子である。さらにより好ましいのは、１０から１０００ｎｍのサイズの粒子である。特に好ましいのは、例えば約１０から７００ナノメートルの直径の粒子等の磁気ナノ粒子である。特に好ましいのは、例えば１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１５０ｎｍ、１７０ｎｍ、２００ｎｍ、２２０ｎｍ、２５０ｎｍ、２７０ｎｍ、３００ｎｍ、３２０ｎｍ、３５０ｎｍ、３７０ｎｍ、４００ｎｍ、４２０ｎｍ、４５０ｎｍ、４７０ｎｍ、５００ｎｍ、５２０ｎｍ、５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、６００ｎｍ、６２０ｎｍ、又は、その間のいかなる値等、約１０から６００ｎｍの直径を有し得るナノ粒子である。さらにより好ましいのは、約５００ｎｍの直径を有するナノ粒子である。
【００６５】
好ましい実施形態において、磁気粒子は、超常磁性の粒子である。特に好ましい実施形態において、磁気粒子は、超常磁性のビーズである。
【００６６】
本明細書において使用される場合「超常磁性」という用語は、小さい強磁性又は強磁性のナノ粒子に現れる磁性の形を記載している。十分に小さいナノ粒子において、温度の影響下で磁化が無作為に向きを反転することは当技術分野において既知である。２つの反転間の時間は、ネール緩和時間と呼ばれる。外部磁場の非存在下で、ナノ粒子の磁化を測定するために使用される時間がネール緩和時間よりもはるかに長い場合、磁化は、平均ゼロである、すなわち、常磁性状態にあるようにみえる。そのような状態において、外部磁場は、常磁性体と同様にナノ粒子を磁化することができる。しかし、磁化率は、常磁性体の磁化率よりもはるかに大きい。
【００６７】
本発明による磁気粒子は、第１の結合分子で官能性を持たされ、第１の結合分子は、直接又は間接的に、すなわちスペーサー若しくはリンカーを介して磁気粒子に付着させることができる。
【００６８】
本明細書において使用される場合「センサ表面」は、検出のための領域を画定しており、典型的には、試料容器内に置かれてもよい。試料容器は、カートリッジ内に置かれてもよい。センサ表面は、血液試料内の少なくとも１つの標的分子の検出に貢献することができ、典型的には、ガラス又は透明なプラスチックから作製される。そのような少なくとも１つの標的分子の検出のために、センサ表面は、第２の結合分子で官能性を持たされ、第２の結合分子は、直接又は間接的に、すなわちスペーサー若しくはリンカーを介してセンサ表面に付着させることができる。センサ表面の近く又はその上の磁気粒子の位置によって、光信号における変化が引き起こされる。
【００６９】
本明細書において使用される場合「光信号における変化」という用語は、光学手段によって検出される、磁気粒子からの反射される光における差を意味する。例えば、そのような方法は、散乱光の検出、又は、全反射（ＴＩＲ）又は内部全反射（ＦＴＩＲ）に基づく検出等の方法を含んでもよい。好ましくは、光信号における変化は、センサ表面の近く又はそこにある磁気粒子のみを意味する。そのような測定は、典型的には、検出の領域内の磁気粒子がその動きを妨害される、すなわち、実質的に固定化されたか、又は、可動性を全体的に失ったということを要求する。磁気粒子の非存在下で、屈折は発生せず、さらに、光源からの光ビームは完全に反射される。磁気粒子がセンサ表面の近くにあるか、又は、センサ表面と接触している場合、光線は粒子によって阻止されていると言われ、さらに、その時点での反射はもはや全反射ではない。
【００７０】
全反射の信号の減少として定義されてもよい信号は、計算することができる。信号は、センサ表面上の粒子の濃度（表面密度
［外１］
0006272327.tif 000002
）にほぼ一次従属している。信号は、
【００７１】
【数１】
0006272327.tif 000003
として表すことができ、ここで、Ｓは、％で表される測定された信号変化であり、さらに、βは、表面密度から信号変化への変換係数である。
【００７２】
１つの試料が、異なる同時の又は適時に分けられた検出アッセイを受けるということが本発明によって考察される。この目的のため、試料容器は、一様に官能性を持たされた磁気粒子を含んでもよく、すなわち、全ての磁気粒子が、標的を捕獲するための同じ第１の結合分子で被覆される。或いは、試料容器は、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はいくつか差次的に官能性を持たされた粒子も含んでよい。従って、センサ表面は、そのような多数の検出プラットフォームを実行するよう適応されなければならない。
【００７３】
本明細書において使用される場合「結合分子」という用語は、第２の分子、すなわち、相互作用パートナーに対して高い結合親和性を有するいかなる分子も意味する。本発明という意味での結合分子は、典型的に、特異的な標的分子、好ましくはバイオマーカーに結合する能力を持つか、或いは、例えばウイルス、又は、細胞若しくは細胞断片、又は、組織由来の材料等、分子含有標的実体に結合する能力を持つ結合又は捕獲部分を含む。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、結合分子は、アプタマー、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及び分子インプリントポリマーを含む群から選択され、前記結合分子は、好ましくは、抗体又はその断片である。
【００７５】
結合分子と関連して使用される場合「アプタマー」は、本明細書において規定される標的分子に結合する能力を持つ、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ若しくはＡＮＡ分子等の短い核酸分子、又は、当業者には既知のいかなる他の適した核酸型式であってもよい。さらに、本発明は、ペプチドアプタマー、すなわち、１つ又は複数の特定のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドに特異的に結合することができるアプタマーを考察する。典型的に、１つ又は複数のペプチドアプタマーは、例えば１０から２０のアミノ酸を含む１つ又は複数の可変のペプチドループである。本発明と関連して、１つ又は複数のペプチドアプタマーは、特定の実施形態において、１つ又は両方の末端にて、足場構造体に付着させることができる。足場構造体は、いかなる分子、好ましくは、例えば、優れた溶解特性を有するタンパク質等のタンパク質であってもよい。適した足場分子は、当業者には既知であるだろう。本発明と関連して使用されることになる適した足場分子の例は、細菌タンパク質のチオレドキシンＡである。アプタマーペプチドループは、好ましくは、足場分子の還元活性部位内に挿入することができる。或いは、ブドウ球菌プロテインＡ及びそのドメイン、並びに、プロテインＺ又はリポカリン等のこれらのドメインの誘導体を、本発明と関連して足場構造体として使用してもよい。核酸又はペプチドアプタマーは、例えばＰＣＲ若しくは分子合成アプローチ、又は、酵母ツーハイブリッドアプローチを介して等、当業者には既知のいかなる適した方法に従っても作製することができる。
【００７６】
結合分子と関連して使用される場合「ペプチド」は、２から３５のアミノ酸、アミノ酸誘導体又はその混合物のひと配列を含んでもよい。ペプチドは、直線的、分枝状、環状又はその混合であってもよい。ペプチド結合も、本明細書において先に規定された足場構造体に付着させることができる。
【００７７】
結合分子と関連して使用される場合「タンパク質」は、約３５を超えるアミノ酸、アミノ酸誘導体又はその混合物のひと配列を含んでもよい。タンパク質は、直線的、分枝状、環状の形を有してもよく、又は、これらの形の混合を含んでもよい。タンパク質結合分子も、本明細書において先に規定された足場構造体に付着させることができる。
【００７８】
結合分子と関連して使用される場合「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、好ましくは、約１５から６０ヌクレオチドのひと配列等、約５から１２０ヌクレオチドのひと配列を含んでもよい。オリゴヌクレオチドアフィニティー分子は、好ましくは、ＲＮＡ分子若しくはＤＮＡ分子、又は、その混合物であってもよい。
【００７９】
本明細書において使用される場合「分子インプリントポリマー」という用語は、後に抽出され、相補的な空洞を残す分子の存在下で形成したポリマーを意味する。典型的には、分子インプリントポリマーは、元の分子に対する特定の化学的親和性を示す。分子インプリントポリマーは、当業者には既知のいかなる適したポリマー単位（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｕｎｉｔ）で構成されてもよい。その生成に対する技術は、塊状重合、沈殿重合、乳化重合、懸濁重合、分散重合、ゲル重合、及び、多段階膨潤重合等の重合技術を含む。特に好ましいのは、階層的インプリンティング法である。
【００８０】
結合分子と関連して使用される場合「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意味し、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ等）いかなるタイプ、（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２等）クラス、又は、サブクラスの免疫グロブリン分子でもあり得る。本発明の抗体は、認識若しくは特異的に結合する本発明のポリペプチドの１つ又は複数のエピトープ若しくは一部の観点から記載又は特定されてもよい。特異的なエピトープ及びその抗体との相互作用は、当業者には既知であるだろう。本明細書において使用される場合「特異的に結合する」という用語は、免疫特異的な検出、及び、抗原エピトープに対する抗体の結合を意味する。「特異的に結合する」という用語は、非特異的な結合を除くが、他の抗原、特に、存在する抗体によって検出される同じ抗原エピトープを含む抗原との交差反応性を必ずしも除くというわけではない。
【００８１】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多選択性抗体、ヒト抗体、ヒト化若しくはキメラ抗体、単鎖抗体であってもよく、又は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成されるフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、完全長免疫グロブリン分子、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ＶＨＨ含有抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び、上記のいずれかの１つ又は複数のいかなるエピトープ結合フラグメントを構成してもよい。最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、さらに、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、並びに、ＶＬ又はＶＨドメインを含むフラグメントを含む。
【００８２】
本発明による抗体は、鳥類及び哺乳類を含むいかなる動物由来であってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ（例えばマウス及びラット）、ロバ、サル、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体である。
【００８３】
本発明による抗体は、単一特異性、二特異性、三特異性の抗体、又は、さらなる多選択性のものであってもよい。多選択性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよく、又は、本発明のポリペプチドに対しても、異種ポリペプチド等の異種エピトープ又は固体の支持材料に対しても特異的であってもよい。好ましいのは、単一特異性の抗体である。
【００８４】
本明細書において使用される場合「試料容器」は、試料が測定される容器を意味する。本明細書において記載される磁気粒子は、試料容器内にすでに存在していてもよい。試料容器は、典型的にはガラス又は透明なプラスチックから作製されるセンサ表面をさらに含む。試料容器は、さらに、交換可能なカートリッジ内、すなわち、センサ装置とは分けられた独立型の要素内に置かれてもよい。試料でのあり得る汚染のため、そのようなカートリッジは、通常、例えば射出成形によってプラスチックから作製された使い捨てのアイテムである。
【００８５】
バイオセンサアッセイは、「少なくとも１つの標的分子を検出する」ために使用される。そのようなアッセイは、迅速で感受性が高く且つ使用し易い分子診断に対して、特に、生物学的標的を検出するために使用することができる。そのようなアッセイは、試料における生物学的標的を認識し且つ該標的に結合する能力を持つ第１の結合分子で官能性を持たされた磁気粒子に対して作用する磁力を含んでもよい。
【００８６】
そのようなアッセイの第１相において、第１の結合分子で被覆された磁気粒子は、効果的な標的分子捕獲のために試料溶液中を移動する。後に、作動磁石が、結合のためにセンサ表面まで高速で磁気粒子を移動させる且つ移送するように機能させられる。典型的には、センサ表面に付着させられるのは、同様に生物学的標的に結合する能力を持つ第２の結合分子である。その後、一連の細かく調整された磁気パルスが、標的分子を捕獲した磁気粒子の最適な結合及び混合を促進するように印加される。粒子がセンサ表面に結合した後で、本明細書において洗浄磁石とも呼ばれる、センサ表面とは反対に方向づけられた磁場を印加することによって、遊離の非特異的に結合した粒子が迅速に除去される。センサ表面にて結合した磁気粒子の存在及び／又は量は光学的に検出することができ、結合した磁気粒子の数は、試料内に存在する標的分子の量に正比例又は逆比例して関連づけられ、好ましくは、光学検出は、内部全反射（ＦＴＩＲ）に基づく。本発明によって考察される好ましい検出アッセイは、競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイ等、抗体に基づくイムノアッセイである。
【００８７】
「競合イムノアッセイ」という用語は、試料内の標的分子がラベルされた標的分子と競合して抗体又は結合分子に結合するイムノアッセイを意味する。抗体又は結合分子に結合したラベルされた標的分子の量が次に測定される。この方法において、反応は、試料内の標的分子の濃度に反比例して関連づけられる。これは、反応が多いほど、少ない試料内の標的分子がラベルされた標的分子と競合するのに利用可能であったということを意味する。
【００８８】
「サンドイッチイムノアッセイ」とも呼ばれる「非競合イムノアッセイ」という用語は、テストされることになる試料内の標的分子が第１の抗体又は結合分子に結合し、さらに、第２の抗体又は結合分子に結合するイムノアッセイを意味する。本明細書に記載の検出原理を使用することによって、第２の抗体又は結合分子に結合した磁気粒子の量は、標的分子の量を決定するための適した尺度である。競合的方法とは対照的に、非競合的方法の結果は、標的分子の濃度に正比例することになる。
【００８９】
本発明の別の好ましい実施形態において、第１の結合分子は、本明細書において先に規定された抗体又はその断片である。
【００９０】
本発明のさらに好ましい実施形態において、第２の結合分子は、抗体又はその断片である。第２の結合分子の好ましい例は、第１の結合分子によって捕獲される標的分子、好ましくはバイオマーカー分子に特異的に結合する、本明細書において先に規定された抗体若しくは抗体断片又は変異体である。第１の結合分子が抗体である場合、その抗体は、第１の結合分子とは異なる標的分子のエピトープに結合することができるか、又は、第１の結合分子への標的分子の特異的結合によって生成されるエピトープを検出することができる。
【００９１】
本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも１つの標的分子の検出は、サンドイッチイムノアッセイを使用して行われる。
【００９２】
さらに、本発明のさらに好ましい実施形態において、少なくとも１つの標的分子の検出は、１ステップサンドイッチイムノアッセイを使用して行われる。
【００９３】
本明細書において使用される場合「アッセイ装置」は、典型的には、光磁気バイオセンサ装置である。本発明による検出方法に対して適した装置は、例えばＷＯ２００８／１５５７１６において以前に開示されている。好ましい実施形態において、アッセイ装置は、ハンドヘルド式アッセイ装置である。本発明の特に好ましい実施形態において、Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（登録商標）バイオセンサシステムが使用される。しかし、本発明の根底にある検出原理はＭａｇｎｏｔｅｃｈ（登録商標）システムに限定されないということが正しく理解されることになる。原則として、図１において描かれている最低基準を満たすいかなる他の光磁気検出システムも使用することができる。典型的に、適した光磁気システムは、入力光ビームを放つ光源（ＬＥＤ）、出力光ビームを検出及び測定するための光検出器（光検波器）、及び、そこに接続される評価ユニットを含んでもよい。当該装置は、試料を導入及び測定するためのカートリッジをさらに含む。カートリッジは、磁気粒子をさらに含んでもよい試料容器をさらに含み、磁気粒子は、血液試料内の１つ又は複数の標的分子の検出のために抗体等の結合分子で官能性を持たせることができる。典型的に、光磁気装置は、ビーズの磁気作動のために少なくとも２つの磁石を含む。例証的な構成において、バイオセンサ装置は、好ましくは上方磁石（洗浄磁石）及び下方磁石（結合磁石）を含む磁場生成装置を含んでもよい。試料容器におけるセンサ表面での磁気ビーズの存在は、そのような光磁気センサシステムを使用して検出することができる。
【００９４】
以下の実施例及び図は、例示目的のために提供される。従って、実施例及び図は限定的であるとして解釈されることはないということが理解される。当業者は、本明細書において立案される原理のさらなる変更を明確に考察することができる。
【実施例１】
【００９５】
血液−血漿相関関数に対するメタ重亜硫酸ナトリウムの影響の決定
本発明による血液試料内の標的分子の例証的な検出は、内部全反射（ＦＴＩＲ）に基づく検出を使用したＭａｇｎｏｔｅｃｈ（登録商標）バイオセンサシステム上で実行される。当該システムは、ハンドヘルド式分析機器及び使い捨ての自蔵カートリッジを含む。標的分子の検出に必要な全てのアッセイ試薬は、カートリッジ内に含有される。試料の液滴が与えられると、毛管力によって試料は自動的にカートリッジ内に導かれる。そこで、抗体で官能性を持たされた磁気ナノ粒子が、標的分子に結合し、さらに、検出のためのラベルとして役立つ。磁力が、磁気ナノ粒子をセンサ表面まで移送するために使用され、センサ表面も、標的分子が結合することができる抗体で官能性を持たされている。実験準備が、図１において描かれている。磁気粒子の磁気作動が、２つの磁石、すなわち上方磁石（洗浄磁石）及び下方磁石（結合磁石）の交互の作用を介して発生する。光が、臨界角よりもわずかに狭い角度でカートリッジの表面上に放出され、カメラセンサ上で画像処理される反射を引き起こす。ナノ粒子がセンサ表面上で結合する場合、光の一部が反射且つ散乱され、磁気粒子の非存在下での測定と比較して強度を減らす。
【００９６】
超常磁性のビーズは、５００ｎｍの直径を有し、抗Ｎ末端ＰＴＨ抗体で官能性を持たされ、さらに、センサ表面は、抗Ｃ末端ＰＴＨ抗体で官能性を持たせた。
【００９７】
健康なドナーからの血液試料に、４００ｐｇ／ｍｌのＰＴＨを加え、さらに、メタ重亜硫酸ナトリウムを、０．０１２５Ｍから０．２Ｍまでの濃度（０．０１２５Ｍ、０．０２５Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ及び０．２Ｍ）で添加した。これらの試料を、血液分離フィルターを含むカートリッジに添加した。メタ重亜硫酸ナトリウムのない血液試料は、参照として役立たせた。参照を、２つの異なる方法でさらに処理し、血液試料の遠心分離によって「血漿」を生成し、且つ、「血液」は、血液試料の濾過によって得た液体部分を意味する。ＰＡＬＬ社からのＶｉｖｉｄ（登録商標）血漿分離ＧＦメンブレンを、フィルターとして使用した。血液試料をメンブレンに与える前に、メンブレンを緩衝液で前処理した。次に、遠心分離又は濾過によって生成した試料のそれぞれを、上記のカートリッジに与え、さらに、上記のハンドヘルド式分析機器において測定した。試料がカートリッジ内に導びかれた後すぐに、作動が開始され、さらに、ラベルされた標的分子が、８分後にカートリッジの表面上で検出される。センサ表面への磁気粒子の結合から生じる信号変化は、標的分子の量に比例しており、血液−血漿の回収率を決定するために使用される。
【００９８】
図２は、０．１２Ｍの濃度でメタ重亜硫酸ナトリウムを添加した血液試料の測定を例証的に示している。加えて、メタ重亜硫酸ナトリウムなしの参照を測定した。各試料タイプ（メタ重亜硫酸ナトリウムありの血漿、メタ重亜硫酸ナトリウムなしの血漿、メタ重亜硫酸ナトリウムありの血液、メタ重亜硫酸ナトリウムなしの血液）に対して、標的分子ＰＴＨの測定を三回行った。血液−血漿相関関数を、血液から生じた平均信号変化を、血漿から生じた平均信号変化で割ることによって決定した。参照（すなわち、メタ重亜硫酸ナトリウムなしの血液及び血漿）に対して、相関関数は約０．５である。しかし、メタ重亜硫酸ナトリウムを試料に添加した場合、血液に対するアッセイ信号の大幅な増加を観察した。このように、血液及び血漿に対するアッセイパフォーマンスは類似しており、さらに、約１の相関関数を達成することができる。
【００９９】
０．１２Ｍの濃度だけでなく、０．０５Ｍ及び０．１Ｍの濃度のメタ重亜硫酸ナトリウムの添加も、約１の血液−血漿相関関数をもたらした。
【実施例２】
【０１００】
血液−血漿相関関数に対するアスコルビン酸の影響の決定
実施例１において例証されたのと同じ測定を、メタ重亜硫酸ナトリウムの代わりにアスコルビン酸を使用して実行することができる。
【０１０１】
図３は、０．１２Ｍの濃度でアスコルビン酸を添加した血液試料の測定を例証的に示している。加えて、アスコルビン酸なしの参照を測定した。各試料タイプ（アスコルビン酸ありの血漿、アスコルビン酸なしの血漿、アスコルビン酸ありの血液及びアスコルビン酸なしの血液）に対して、標的分子ＰＴＨの測定を三回行った。血液−血漿相関関数を、上記のように決定した。ここでも、参照（すなわち、アスコルビン酸なしの血液及び血漿）に対して、相関関数は約０．５である。アスコルビン酸を試料に添加した場合、血液に対するアッセイ信号の大幅な増加を観察した。このように、血液及び血漿に対するアッセイパフォーマンスは類似しており、さらに、約１の相関関数を達成することができる。
【０１０２】
０．１２Ｍの濃度だけでなく、０．０５Ｍ及び０．１Ｍの濃度のアスコルビン酸の添加も、約１の血液−血漿相関関数をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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