(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノグロブリン結合ドメインとして、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5ドメインのみを５〜１０個有し、プロテインＬ固定化カラム1mLあたりに結合できたIgGの量を測定したときに野生型プロテインＬの1.5倍以上の抗体結合能を有するプロテインＬ変異体。
【請求項２】
イムノグロブリン結合ドメインとして、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5ドメインのみを５個有する、請求項１記載のプロテインＬ変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプロテインＬ変異体に抗体を結合させ、次いで抗体を溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型プロテインLの抗体結合能を維持し、アルカリ耐性能が向上したプロテインL変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインL、プロテインA等の抗体に特異的に結合するタンパク質が知られており、プロテインLは抗体軽鎖κドメインと結合するため、Fabや１本鎖抗体（scFv）等の低分子抗体の精製に有用である。
【０００３】
上記の抗体に特異的に結合するタンパク質を用いて抗体を精製する場合、該タンパク質を固相化したカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行うが、固相化カラムを洗浄する場合に、アルカリ溶液を用いることがあった。しかしながら、前記抗体に結合するタンパク質はアルカリ耐性が小さく、アルカリ溶液により抗体結合能が低下してしまう。
【０００４】
プロテインAについては、アルカリ耐性が向上した変異体が知られていた（特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
一般的には、タンパク質のアルカリ溶液に弱いアミノ酸残基としてアスパラギン残基が知られ、特にその隣の残基がグリシンの場合（NG配列）、最も分解を受けやすいことが報告されていた（特許文献４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2005-538693号公報
【特許文献２】特表2010-504754号公報
【特許文献３】特開2006-304633号公報
【特許文献４】特表2002-527107号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、野生型プロテインLの抗体結合能を維持し、アルカリ耐性能が向上したプロテインL変異体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、アルカリ溶液による洗浄によっても抗体結合能が低下しないプロテインLの開発に鋭意検討を行った。そこで、プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を検討し、イムノグロブリン結合ドメインの１つであるB1-5のアミノ酸配列において他のイムノグロブリン結合ドメインがNG配列を有しているのに対して、B1-5ドメインはNG配列を有していないことに着目した。
【０００９】
本発明者らは、プロテインLのイムノグロブリン結合ドメインをすべてB1-5にすることにより、該プロテインL変異体において抗体結合能が低下しないで維持され、かつアルカリ溶液耐性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  イムノグロブリン結合ドメインとして配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5ドメインのみを少なくとも１つ含み、抗体結合能を有するプロテインL変異体。
[２]  野生型プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインがすべて配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5ドメインである、[１]のプロテインL変異体。
[３]  野生型プロテインLの1.5倍以上の抗体結合能を有する[２]のプロテインL変異体。
[４]  配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの１〜８量体である、[１]のプロテインL変異体。
[５]  ５量体である、[４]のプロテインL変異体。
[６]  [１]〜[５]のいずれかのプロテインL変異体に抗体を結合させ、次いで抗体を溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の、イムノグロブリン結合ドメインとして、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインのみを含むプロテインL変異体は、抗体結合能を維持しており、なおかつアルカリ溶液耐性が向上している。特に、野生型プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインをすべて配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインとしたプロテインL変異体は野生型プロテインLよりも高い抗体結合能を有し、なおかつアルカリ溶液耐性が向上していた。
【００１２】
本発明のプロテインL変異体は、抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いた後にアルカリ溶液を用いて洗浄しても分解せず抗体結合能も低下しないので、繰り返し抗体の精製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プロテインLの構造を示す図である。
【図２】プロテインLの各イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインそれぞれの抗体に対する親和性を示す図である。
【図４】プロテインＬの５つのイムノグロブリン結合ドメインそれぞれをアルカリに暴露した際に、分解されなかった割合を示した図である。図中、括弧内の数字は配列中のNG配列の個数を示す。
【図５】野生型および変異体プロテインＬ固定化カラムの抗体結合量に対するアルカリ洗浄の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、野生型プロテインLの抗体結合能を維持し、アルカリ耐性能が向上したプロテインL変異体である。プロテインLはFinegoldia magnaが産生するイムノグロブリン結合タンパク質であり、種々の動物種のIgG、IgM、IgA、IgE、IgDを含むクラスの抗体に結合する。また、1本鎖抗体(ScFv)やFab とも結合することができる。
【００１５】
プロテインLとしては、Finegoldia magnaの２つの株由来のものが知られている。１つは3316株由来のプロテインLであり、もう１つの312株由来のプロテインLである。3316株由来のプロテインL及び312株由来のプロテインLは図１に示す構造を有している。すなわち、3316株由来のプロテインLは４つのイムノグロブリン結合ドメインを有し、312株由来のプロテインLは５つのイムノグロブリン結合ドメインを有している。
【００１６】
312株由来のプロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインをB1-1からB1-5と呼ぶ。それぞれのアミノ酸配列を図２に示し、さらにB1-1からB1-5のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜５に示す。また、B1-1からB1-5のアミノ酸配列をコードするDNA配列を配列番号６〜１０に示す。
【００１７】
本発明のプロテインL変異体は、５つのイムノグロブリン結合ドメインがすべてB1-5であるプロテインLである。すなわち、B1-1、B1-2、B1-3及びB1-4がB1-5に置換されたプロテインLである。図２に示すように、B1-1のアミノ酸配列の５０及び５１番目の配列はNGであり、各イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列をアラインメントしたときのB1-1のNG配列に相当する配列はB1-2、B1-3およびB1-4では同様にNG配列であるが、B1-5ではHGである。さらにB1-1のアミノ酸配列の２０及び２１番目の配列もNGであるが、B1-1以外のドメインではDGである。これらのように配列にNGを含んでいないB1-5はアルカリ溶液耐性が大きく、従って、イムノグロブリン結合ドメインとしてB1-5のみを含むプロテインLはアルカリ溶液耐性が大きい。3316株由来のプロテインLは４つのイムノグロブリン結合ドメインの対応するアミノ酸配列はすべてNGである。
【００１８】
野生型プロテインLのDNA配列を配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。配列番号１２において、86番目のThrから156番目のLysがB1-1（配列番号１）、159番目のThrから228番目のLysがB1-2（配列番号２）、231番目のThrから300番目のLysがB1-3（配列番号３）、303番目のThrから372番目のLysがB1-4（配列番号４）、377番目のLysから445番目のLysがB1-5（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
本発明のプロテインL変異体は、イムノグロブリン結合ドメインとして配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5のみを含むプロテインL変異体である。野生型プロテインLは５つのイムノグロブリン結合ドメインを含むが、本発明のプロテインL変異体におけるB1-5イムノグロブリン結合ドメインの数は限定されず、少なくとも１つのB1-5を含んでいればよい。好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは２〜８個、さらに好ましくは３〜７個、さらに好ましくは４〜６個、特に好ましくは５個のB1-5を含む。５個のB1-5を含むプロテイン変異体は、野生型プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインが総て配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5になったプロテインL変異体であり、野生型プロテインLのB1-1からB1-4の４つのイムノグロブリン結合ドメインがB1-5に置換されたプロテインL変異体である。野生型プロテインLの５つのイムノグロブリン結合ドメインが総て配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5になったプロテインL変異体のDNA配列を配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。配列番号１６のアミノ酸配列において、86番目のLysから154番目のLys、157番目のLysから225番目のLys、228番目のLysから296番目のLys、299番目のLysから367番目のLys及び372番目のLysから440番目のLysがB1-5の配列を示す。
【００２０】
本発明のプロテインL変異体は、上記の312株由来の配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるB1-5からなるタンパク質も含む。該プロテインL変異体は、少なくともB1-5からなり、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは２〜８個、さらに好ましくは３〜７個、さらに好ましくは４〜６個、特に好ましくは５個のB1-5からなる。該プロテインL変異体は、B1-5の１量体、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体等の多量体である。B1-5はタンデムに連結されており、B1-5ドメインとB1-5ドメインの間にはリンカー配列が含まれていてもよい。リンカー配列としては、１〜１５個のアミノ酸配列が挙げられる。例えば、Glu-Lysで表わされる配列やLys-Val-Asp-Gluで表わされるアミノ酸配列をリンカーとして用いることができるが、これらの配列には限定されない。
【００２１】
本発明のプロテインL変異体が含むB1-5ドメインは、配列番号５で表わされるアミノ酸配列の４８番目と４９番目のHG以外のアミノ酸において、１または数個のアミノ酸において欠失、置換または付加があってもよい、１または数個は、５個以下、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個、特に好ましくは１個である。
【００２２】
また、アミノ酸配列が配列番号５で表わされるアミノ酸配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を有する。
【００２３】
5個のB1-5ドメインを含むプロテインL変異体は、野生型プロテインLと同等又は野生型プロテインLよりも高い抗体結合能を有する。
【００２４】
ここで、抗体結合能は、プロテインLに抗体を結合させて、結合させた抗体を酸性条件下で溶出し、溶出した抗体量を測定することにより決定することができる。溶出した抗体量は抗体結合容量で表すことができる。B1-5ドメインを５つ有するプロテインL変異体は、野生型プロテインLに対して、少なくとも1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは1.7倍以上、特に好ましくは1.8倍以上の抗体結合能を有する。
【００２５】
また、B1-5ドメインからなるB1-5多量体であるプロテインL変異体は、B1-5以外のイムノグロブリン結合ドメインの多量体と同等の抗体結合能を有する。
【００２６】
本発明のプロテインL変異体は、アミノ酸配列情報またはDNA配列情報に基づいて製造することができ、例えば、遺伝子工学の手法を利用して、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
【００２７】
本発明のプロテインL変異体はアルカリ溶液に対する耐性が大きい。アルカリ溶液に対する耐性が大きいことを、アルカリ感受性が低いともいう。
【００２８】
アルカリ溶液耐性が大きいとは、アルカリ溶液中で分解されずに、抗体結合能を保持し得ることをいい、アルカリ溶液耐性が大きいかどうかは、例えば、プロテインL変異体を水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液に添加し、一定時間放置した後に分解されずに残存したプロテインL量を測定することにより決定することができる。プロテインLの量は、例えば、SDS-PAGEを行いバンドの強度をデンシトメーターで測定することにより決定することができる。
【００２９】
例えば、プロテインL変異体に50mM水酸化ナトリウム溶液を添加し、37℃で24時間放置した後にSDS-PAGEを行った場合に、バンド強度はアルカリ溶液を添加しなかったプロテインL変異体と同等である。
【００３０】
プロテインLを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより抗体の精製を行う場合、使用後プロテインLを0.01〜0.1Nの水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて洗浄する。野生型プロテインLはアルカリ溶液を用いた洗浄により、分解し抗体結合能が低下するが、本発明のプロテインL変異体はアルカリ溶液を用いた洗浄によっても抗体結合能が低下しないため繰り返しアフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製に用いることができる。
【００３１】
本発明のプロテインL変異体は、抗体のアフィニティー精製に用いることができる。プロテインL変異体は、抗体軽鎖κドメインに結合するためκ鎖ドメインを有する抗体または抗体の機能的ドメイン等の低分子抗体のアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いることができる。κ鎖ドメインを有する抗体または抗体の機能的ドメインとしては、Fab、Fab’、１本鎖抗体（ScFv）等が挙げられる。
【００３２】
アフィニティー精製は、精製しようとする抗体をプロテインL変異体を固定化した担体と結合させ、その後溶出すればよい。
【００３３】
担体としては、Sepharose、Sephadex、Cellulofine等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂が挙げられる。これらの担体へのプロテインL変異体の結合は公知の方法で行うことができる。
【００３４】
本発明は、本発明のプロテインL変異体を固定化した抗体精製用担体および該担体を充填したアフィニティークロマトグラフィー用カラムも包含する。
【００３５】
本発明は、本発明のプロテインL変異体を用いて抗体を精製する方法も包含する。例えば、プロテインL変異体を結合させた担体を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加し、プロテインL変異体に抗体を結合させ、ついで洗浄した後に、溶出液を添加し、抗体を溶出し回収すればよい。具体的には例えば、以下の方法で行うことができる。
【００３６】
アフィニティー精製はバッチ法で行ってもよいし、プロテインL変異体を担体に結合させ、カラムに詰めアフィニティーカラムを製造して行ってもよい。例えば、アフィニティーカラムを用いて精製を行う場合、あらかじめカラムをpH6.0〜8.5の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等がある。また、該緩衝液は0〜4.0Mまでの塩化ナトリウムや塩化カリウムを含んでいてもよい。例えば、10〜100mM、好ましくは20mMリン酸ナトリウムおよび0〜4.0M、好ましくは0.15M塩化ナトリウムを含有する緩衝液を用いることができる。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の量にもよるが、例えば長さ1〜30cmのものを用いればよい。精製しようとする抗体が含有した混合物をアプライした後に緩衝液、例えばpH6.0〜8.5、好ましくはpH7.0の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液は好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。また、この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。次いで、pH2.0〜pH4.0、好ましくはpH2.5の緩衝液、例えばグリシン緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液で抗体をカラムから溶出する。この際の溶出用緩衝液の濃度は、10〜100mMが好ましい。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で溶出。溶出液中に目的の抗体が含まれているので回収すればよい。
【００３７】
カラムを用いた後、0.01〜0.1Nの水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて洗浄することにより、再度用いることができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
プロテインLイムノグロブリン結合ドメインB1-1からB1-5タンパク質の発現
図２に記載のプロテインLイムノグロブリン結合ドメインB1-1からB1-5（以下、PLB1からPLB5とする）のアミノ酸配列をコードする合成遺伝子（それぞれ、配列番号６〜１０）を人工遺伝子合成メーカーから入手した。当該合成遺伝子の５’側には制限酵素BamHI認識配列を、３’側には制限酵素XhoI認識配列をあらかじめ付与しておき、BamHI/XhoIで処理したpET21ベクター（Novagen）にT4 DNA ligaseを用いて連結後、大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行なった。得られた形質転換体からコロニーPCR法、DNAシーケンス法により陽性クローンを選別し、プラスミドミニキット（FastGene）により、発現用プラスミドpET21-PLB1〜pET21-PLB5を得た。
【００４０】
発現用プラスミドpET21-PLB1〜pET21-PLB5それぞれを用いて、大腸菌BL21(DE3)の形質転換を行ない、１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢプレートに塗布、37℃で一晩培養した。出現したコロニーを１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ培地に移し、３７℃で一晩培養した。培養液１００μＬを１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＴＢ培地１０ｍＬに移し、３７℃で３時間培養した後に、ＩＰＴＧ（終濃度0.5mM）を添加し、２０℃で１８時間培養した。培養終了後、３，０００ｇ、１０分間の遠心により菌体を回収し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。懸濁した菌体を超音波処理により破砕、１０，０００ｇ、１０分間の遠心により、可溶性画分を得た。設計したプロテインLイムノグロブリン結合ドメインはＣ末端にヒスチジンタグを保有するので、可溶性画分からHisSpin Trap（GEヘルスケア）を用いて、精製PLB1〜PLB5タンパク質溶液を得た。このタンパク質溶液は透析法により蒸留水に溶媒置換を行ない、凍結保存した。
【００４１】
（実施例２）
PLB1からPLB5の抗体結合能
調製したPLB1からPLB5を９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに１ウェルあたり４〜１０００ｎｇ加え、４℃で一晩放置することで、固相化を行なった。加えた溶液を除去した後に、３％ウシ血清アルブミン／ＴＢＳ溶液を加え、室温で２時間放置し、ウェルのブロッキングを行なった。0.05％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液にて、ウェルを３回洗浄した後に、５，０００倍希釈したＨＲＰ標識ＩｇＧを各ウェルに加え、室温で１時間抗体結合反応を行なった。0.05％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ溶液にて、ウェルを３回洗浄した後に、ＴＭＢパーオキシダーゼＥＩＡ複合体基質キット（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いた発色反応を行なう。３％硫酸で反応を停止させた後に、４５０ｎｍでの吸光度を測定することで抗体の結合量を定量した。図３に示すように、PLB1からPLB5それぞれにおいて、抗体との親和性に関する相違は認められなかった。
【００４２】
（実施例３）
PLB1からPLB5のアルカリ耐性能
調製したPLB1からPLB5に終濃度５０ｍＭとなるように水酸化ナトリウム溶液を添加し、３７℃で２４時間放置した。２４時間後、酢酸を加えて中性にし、水酸化ナトリウム未処理のものとともに、SDS-PAGEを行なった。水酸化ナトリウム溶液処理前後のPLB1からPLB5のバンド強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて定量、水酸化ナトリウム溶液処理後のバンドの残存率を算出した。図２に示すように、アルカリに対して感受性の高い配列とされるAsn-Gly（NG）配列はPLB1に２ヶ所、PLB2からPLB4には１ヶ所あり、PLB5には存在しない。図４に示すように、水酸化ナトリウム溶液処理後のPLB1からPLB5のバンドの残存率はNG配列の個数に依存していた。
【００４３】
（実施例４）
野生型プロテインLの発現
野生型プロテインLの配列をコードする合成遺伝子を人工遺伝子合成メーカーから入手した。配列番号１１にDNA配列を示し、配列番号１２にアミノ酸配列を示す。その際、Brevibacillus choshinensis用発現ベクターpNY326に導入するために、５’側に制限酵素NcoI配列を含むｃｃａｔｇｇｃｔｔｔｃｇｃｔ（配列番号１３）を、３’側に終止コドンと制限酵素HindIII配列を含むｔａｇａａｇｃｔｔ（配列番号１４）を付与しておいた。NcoI/HindIIIで処理したpNY326に同処理を行なった野生型プロテインL遺伝子をT4 DNA ligaseを用いて連結後、Brevibacillus choshinensis HPD31株の形質転換を行なった。得られた形質転換体からコロニーPCR法、DNAシーケンスにより陽性クローンを選別し、プラスミドミニキット（FastGene）により、野生型プロテインL発現用プラスミドpNY326-PLwtを得た。
【００４４】
pNY326-PLwtにて形質転換したBrevibacillus choshinensis HPD31株をＴＭＮ培地（1％ ポリペプトン、0.5％ 肉エキス、0.2％ 酵母エキス、0.001％ FeSO47H2O、0.0001% ZnSO47H2O、0.001% MnSO47H2O、1％ グルコース、50μg/mL ネオマイシン）で３０℃、４８時間培養を行なう。培養終了後、１０，０００ｇ、１０分間の遠心により培養上清を回収し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行なった。滅菌後の培養上清から、IgG sepharose（ＧＥヘルスケア）を用いて、分泌生産された野生型プロテインLタンパク質の精製を行ない、蒸留水に溶媒置換したものを野生型プロテインL溶液とし、使用まで凍結保存した。
【００４５】
（実施例５）
プロテインL変異体の発現
野生型プロテインLのイムノグロブリン結合ドメインがすべてB1-5に置換された変異体プロテインLの配列をコードする合成遺伝子を人工遺伝子合成メーカーから入手した。配列番号１５にDNA配列を示し、配列番号１６にアミノ酸配列を示す。野生型プロテインLと同様の手順で、プロテインL変異体発現プラスミドpNY326-PLmut、並びにプロテインL変異体溶液を得た。
【００４６】
（実施例６）
プロテインL固定化カラムの作製と抗体結合容量の測定
５ｍｇの野生型または変異体プロテインLを１ｍＬのNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（ＧＥヘルスケア）と２５℃、３０分間反応させた。トリス緩衝液で未反応のＮＨＳ基をブロックした後に、ＰＢＳに置換した。作製したプロテインL固定化カラム１ｍＬに対して、ウサギ標準血清を１０ｍＬ加え、１時間放置する。ＰＢＳで洗浄した後に、２５ｍＭ  グリシン緩衝液（pH2.5）によって、プロテインLに結合した抗体を溶出した。溶出された抗体はトリス緩衝液（pH9.0）添加により中性にした後、２８０ｎｍの吸光度を測定することで、定量した。表１には、野生型プロテインL固定化カラムとプロテインＬ変異体固定化カラムの抗体結合容量の比較を示した。表中の数字はプロテインＬ固定化カラム1mLあたりに結合できたIgGの量（mg）である。野生型に比べ、プロテインL変異体を固定化したカラムの抗体結合容量は１．８倍と高い値を示した。
【００４７】
【表１】
0006369807.tif 000002
【００４８】
（実施例７）
プロテインL固定化カラムのアルカリ耐性能
上記のように作製した野生型およびプロテインL変異体固定化カラムがアルカリ洗浄に対し、どの程度の耐性があるか調べるため、抗体の結合、洗浄、酸溶出、蒸留水に置換、アルカリ溶液での長時間洗浄（１５ｍＭ水酸化ナトリウム溶液に５０分間暴露）蒸留水に置換、ＰＢＳに置換という工程を１サイクルとして繰り返し、各サイクルで溶出された抗体の定量を行なった。対照として、市販のプロテインL固定化カラム（CaptoL、ＧＥヘルスケア）を用い、１サイクル目の抗体溶出量を100％として、その量がどのように変化したかを示したものが、図５である。野生型プロテインL固定化カラムおよびCaptoLは５サイクル目で１サイクル目の50％程度の抗体結合能を示し、アルカリ洗浄工程に脆弱であることが示された。それに対し、プロテインL変異体固定化カラムは１０サイクル目でも１サイクル目と同程度の抗体結合を示し、野生型と比べ、アルカリに対して耐久性が高まったとの結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のプロテインL変異体を用いて抗体を繰り返し精製することができ、効率的な抗体精製が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列番号１３および１４  合成
【図１】
0006369807.tif 000003
【図２】
0006369807.tif 000004
【図３】
0006369807.tif 000005
【図４】
0006369807.tif 000006
【図５】
0006369807.tif 000007
【配列表】
0006369807000001.app