(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む免疫原組成物：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバントであって、
該抗ＣＤ３２部分が、ＣＤ３２に結合するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり；
該ＴＬＲ９リガンドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド  クラスＡ、Ｂ及びＣからなる群より選択されるＴＬＲ９アゴニストである、
上記指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに巻き付いた第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
【請求項２】
ペプチド免疫原が下記のものを含むかまたは下記のものからなる線状ペプチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ６のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ７、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ８のアミノ酸配列；または
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２もしくは９のアミノ酸配列；
請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項３】
第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した少なくとも２つのペプチド免疫原、好ましくは２、３または４つのペプチド免疫原を含む、請求項１または２に記載の免疫原組成物。
【請求項４】
第１および第２−アルファ−ヘリックスがそれぞれ、３〜５個のアミノ酸のリピートのアミノ酸モチーフ、特に互いに１０−６未満のＫｄで結合するものを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項５】
抗ＣＤ３２部分が、抗ＣＤ３２抗体および抗ＣＤ３２抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項６】
好ましくはグリシンおよび／またはセリンおよび／またはリジン残基から構成される１以上のリンカー配列、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  １２または１３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  １０またはＳＥＱ  ＩＤ  １１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原組成物、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、ワクチン。
【請求項９】
下記の成分を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原組成物を調製するためのキット：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバントであって、
該抗ＣＤ３２部分が、ＣＤ３２に結合するタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり；
該ＴＬＲ９リガンドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド  クラスＡ、Ｂ及びＣからなる群より選択されるＴＬＲ９アゴニストである、
上記指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスにマッチする第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
【請求項１０】
ガストリン依存性疾患、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌、胃潰瘍、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）または肥満症に罹患している対象の処置に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１１】
プライム−ブースト方式を用いて組成物を有効量で対象に投与する、請求項１０に記載の免疫原組成物。
【請求項１２】
組成物を１回当たり０．０００１〜２ｍｇの範囲の有効量で対象に投与する、請求項１０または１１に記載の免疫原組成物。
【請求項１３】
対象をさらに化学療法により処置する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【請求項１４】
対象において、ヒト  ガストリン−１７に対して好ましくは少なくとも１／１０００の血清ＩｇＧ力価を伴なう防御免疫応答を誘発する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫原組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガストリンペプチド免疫原およびＴＬＲ９リガンドに連結した抗ＣＤ３２部分を含む免疫原組成物、そのような免疫原組成物組成物を含むワクチン、ならびにガストリン依存性の病状の処置におけるそれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性新生物として医学的に知られている癌は、すべてが無調節な細胞増殖を伴なう広域グループの多様な疾患である。癌において、細胞は無制御に分裂および増殖して悪性腫瘍を形成し、近辺の身体部分に侵入する。癌はリンパ系または血流を通してより離れた身体部分へも拡散する可能性がある。すべての腫瘍が癌性であるとは限らない。良性腫瘍は無制御には増殖せず、隣接組織に侵入せず、全身に拡散することはない。ヒトを冒す２００種類を超える既知の癌がある。
【０００３】
癌を引き起こすものの判定は複雑である。喫煙、特定の感染症、放射線、身体活動の欠如、肥満症、および環境汚染物質を含めた多数のものが癌のリスクを高めることが知られている。これらは直接的に遺伝子に損傷を与え、あるいは細胞内の既存の遺伝子障害と一緒になって疾患を引き起こす可能性がある。ほぼ５〜１０パーセントの癌は完全に遺伝性である。
【０００４】
癌は、特定の徴候および症状の存在、スクリーニング検査、または医学的造影を含めた、多数の方法で検出できる。癌の可能性が検出されると、組織試料の顕微鏡検査によりそれを診断する。癌は通常は化学療法、放射線療法および外科処置で処置される。疾患から生存する機会は、癌のタイプおよび位置、ならびに処置の開始時における疾患の程度によって大きく異なる。癌はあらゆる年齢の人々を冒す可能性があり、少数のタイプの癌は小児においてより一般的ではあるが、癌を発症するリスクは一般に年齢と共に増大する。２００７年に、癌は世界中のヒトの死亡の約１３％（７９０万人）の原因となった。発展途上国でより多くの人々が高齢になるまで生存するのに伴なって、かつ質的なライフスタイルの変化が起きるのに伴なって、割合は上昇しつつある。
【０００５】
免疫系はそれが遭遇する環境要因に対して自己と非自己の識別に基づいて応答するので、癌の発症の結果として生じる多くの種類の腫瘍細胞は多かれ少なかれ患者自身の免疫系によって寛容される；腫瘍細胞は本質的に患者自身の細胞が適正な調節制御なしに増殖、分裂および拡散するものだからである。
【０００６】
免疫寛容または免疫学的寛容は、免疫系が抗原を攻撃しないプロセスである。自然免疫寛容または自己免疫寛容において、身体は自己抗原に対する免疫応答をマウントしない。それは３つの形態で起きる：中枢性免疫寛容、末梢性免疫寛容および後天性免疫寛容。
【０００７】
中枢性免疫寛容１：
中枢免疫寛容はリンパ球の発生に際して起き、胸腺および骨髄で作動する。この場合、自己抗原を認識するＴおよびＢリンパ球はそれらが発生して完全な免疫適格細胞になる前に欠失して、自己免疫性が阻止される。このプロセスは胎児期に最も活発ではあるが、未成熟リンパ球が産生されるのに伴なって生涯を通じて持続する。
【０００８】
末梢性免疫寛容２：
末梢性免疫寛容は、ＴおよびＢ細胞が成熟して末梢に進入した後に発生する免疫寛容である。胸腺を離れる細胞は、完全にではないが比較的安全である。あるものは、Ｔ細胞が胸腺では遭遇しなかった、“弱い”受容体に結合できるほど高い濃度で存在する自己抗原（たとえば、ランゲルハンス島、脳または脊髄にある組織特異的分子）に応答することができる受容体（ＴＣＲ）をもつであろう。胸腺における胸腺内ネガティブ選択を逃れるそれらの自己反応性Ｔ細胞は、それらが末梢組織において欠失されるかまたは効果的に沈黙させられない限り、細胞傷害を与える可能性がある。そのような潜在的自己反応性Ｔ細胞を沈黙させるための幾つかのフィードバック機序が存在することが知られている。それらには下記のものが含まれる：アネルギー、活性化誘導による細胞死(Activation-induced cell death)、末梢抑制。
【０００９】
後天性免疫寛容３：
後天性または誘導性の免疫寛容は、外部抗原に対する免疫系の適応であって、他の状況では細胞仲介性または体液性の免疫を誘導するであろう特定の抗原に対するリンパ組織の特異的な非反応性を特徴とするものを表わす。最も重要な自然な種類の後天性免疫寛容のひとつは妊娠における免疫寛容であり、その場合は胎児および胎盤が母体免疫系により寛容されなければならない。
【００１０】
腫瘍関連抗原をターゲティングする免疫療法：
癌の免疫療法は、癌を排除するために免疫系を利用するものである。主要な前提は、その疾患に関与している悪性腫瘍細胞を攻撃するように患者の免疫系を刺激することである。これは下記のいずれかによることができる；患者の能動免疫化による（たとえば、細胞性癌ワクチン、たとえばプロベンジ(Provenge)、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ，米国ワシントン州シアトルの投与による）４：この場合は腫瘍細胞を破壊すべきターゲットとして認識するように患者自身の免疫系をトレーニングする；あるいは療法用抗体を薬物として投与することによる：この場合は療法用抗体により患者の免疫系を補充して腫瘍細胞を破壊する。腫瘍に対する患者の免疫系を活性化するための他の方法は、いわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を利用することである；これは、ある程度は健康な正常細胞に発現しているけれども腫瘍細胞には過剰発現する自己タンパク質である５。これらのタンパク質は自己のものであるという事実にもかかわらず免疫系が応答を形成するように、これらのＴＡＡを免疫原の形で配合して身体に提示する。明らかに、この方法は、それに対して患者が末梢性または後天性の免疫寛容を発現したＴＡＡについて有効であるにすぎないであろう。そのＴＡＡを認識するＴ細胞およびＢ細胞が免疫レパトアから欠失していると、能動癌免疫療法は選択肢ではない。
【００１１】
ガストリン：
胃腸癌、たとえば膵臓癌の処置のためのターゲットとして利用できる自己抗原の例は、リトルガストリン(little gastrin)（Ｇ１７）である６−９。さらに、Ｇ１７の中和は下記のものを含めたいずれかのガストリン関連病状にも有益な可能性がある；胃潰瘍、胃食道逆流症(Gastro Esophageal Reflux Disease)（ＧＥＲＤ）１０：胃のｐＨはガストリンにより調節されるので；末期腎不全(End Stage Renal Failure)（ＥＳＲＦ）１１：ＥＳＲＦ患者においてはガストリンが正常より高い濃度で循環しているので。
【００１２】
US5023077には、胃および十二指腸の潰瘍性疾患の治療および予防のための免疫原組成物および方法が記載され、その免疫原組成物はガストリンペプチドを基礎とし、それらが免疫原キャリヤー、たとえばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペット  ヘモシニアン、またはウシ血清アルブミンにカップリングしている。
【００１３】
ガストリンは胃腸管において幾つかの重要な機能をもち、２つ最も重要なものは胃腸管における酸分泌の刺激および細胞増殖の刺激である。このホルモンは、各分子中のアミノ酸残基（“ＡＡ”）の数に従って命名された少なくとも２つの分子形態、ヘプタデカガストリン(heptadecagastrin)、いわゆるリトルガストリン（“Ｇ１７”）、およびテトラトリアコンタガストリン(tetratriacontagastrin)（“Ｇ３４”）で存在し、Ｇ１７はＧ３４の１７個のアミノ末端（“Ｎ末端”）残基を構成する。
【００１４】
US5609870には、哺乳動物においてそれ自身のＧ１７に対する抗体（Ｇ３４とは反応しない）を産生する抗Ｇ１７免疫原の調製方法であって、Ｇ１７のアミノ酸残基数１２までのＮ末端アミノ酸配列のフラグメントに相当する配列からなるペプチドを、それのＣ末端により、免疫原キャリヤー、たとえばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホール  リンペット  ヘモシニアン、またはウシ血清アルブミンにコンジュゲートしたスペーサーペプチドにコンジュゲートさせることを含む方法が記載されている。
【００１５】
免疫均衡：
Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ細胞により調節される免疫均衡は、免疫療法の発展において重要な部分をなしている。
【００１６】
Ｔｈ１細胞（１型ヘルパーＴ細胞）は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−βなどの炎症性サイトカインの産生を特徴とする。Ｔｈ１細胞は細胞性免疫に関与する。Ｔｈ１細胞により産生されるサイトカインは、微生物病原体の食作用および破壊を誘発する。幾つかの慢性炎症性疾患、すなわち多発性硬化症、糖尿病およびリウマチ性関節炎がＴｈ１優性疾患として記載されている。
【００１７】
Ｔｈ２細胞（２型ヘルパーＴ細胞）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の産生を特徴とする。Ｔｈ２細胞はアレルギー応答において役割を果たすと考えられる。ＩＬ−４などのサイトカインは、一般に抗体の産生を刺激する。ＩＬ−５は、同様に免疫応答の一部である好酸球応答を刺激する。アトピーおよびアレルギーはＴｈ２優性状態であると考えられる。
【００１８】
Ｔｈ１／Ｔｈ２またはＴｈ１７／Ｔｒｅｇ免疫の不均衡は種々の免疫疾患の原因になる。
【００１９】
アレルギーは環境中のタンパク質に対する過敏反応であると考えられる。アレルゲンは、それに対してアトピー患者がＩｇＥ抗体応答で応答し、続いてアレルギー反応を生じる、抗原である。複合体または融合タンパク質中の抗原は、環境アレルゲン（たとえば、ハウスダストのダニ、カバ花粉、草本花粉、ネコ抗原、ゴキブリ抗原）、もしくは食物アレルゲン（たとえば、牛乳、ピーナツ、エビ、ダイズ）、または両者の組合わせである可能性がある。ＩｇＥ分子は、エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球および好酸球）活性化におけるそれらの役割のため重要である。ＩｇＥは、低親和性受容体（ＣＤ２３）および高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）の両方を通じてＢ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の抗原捕獲能をアップレギュレートすることにより、アレルギー性疾患の誘導期においても重要な役割を果たすことが一般に受け入れられている。ＩｇＥ抗体の負の機能は、たとえばアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体により対抗できる；それらは免疫応答をＢ細胞から遠ざけて単球およびＤＣへ向けるからである。さらに、それらはアレルゲン結合部位についてＩｇＥ分子と競合する。したがって、アレルギーはアレルゲン特異的ＩｇＧ分子の誘導により治療、治癒および予防することができる。
【００２０】
ＩｇＥ分子についてのほぼ３日と比較して、ＩｇＧ分子は約３週間の血清半減期をもつ。ＩｇＥ分子は、（ナイーブ）Ｂ細胞と、Ｔｈ２細胞、すなわち記憶Ｂ細胞および形質細胞においてＩｇＥへのクラススイッチを誘導するのに必要なＩＬ−４およびＩＬ−１３ならびにＣＤ４０Ｌ発現をもたらす細胞との相互作用により誘導される。これに対し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生するＴｈ１細胞は、ＩｇＧへのクラススイッチを誘導する。したがって、アレルギー性疾患の予防、治療および治癒にとって、Ｔｈ１の誘導はアレルゲンに対するＴｈ２ヘルパーＴ細胞応答よりむしろ有益である。
【００２１】
WO 97/07218には、アレルゲン−抗ＣＤ３２  融合タンパク質が記載されている。この刊行物において、特異的ＩｇＧ分子の単離およびＣＤ３２に対するこれらのＩｇＧ抗体の低親和性の問題が回避され、完全“ＩｇＥ結合性”アレルゲンを用いる古典的免疫療法のリスク因子が低減する。
【００２２】
WO 2007098934A1には、ＴＬＲ９およびＣＤ３２に結合できる分子であって少なくとも１種類の抗原の少なくとも１つのエピトープを含む分子、それの製造、ならびに特にアレルギーの処置のための医薬におけるそれの使用が記載されている。
【００２３】
ＴＬＲ９の役割：
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫系において鍵となる役割を果たすタンパク質のクラスである。それらは１回膜貫通−非触媒作用受容体であり、通常は細胞の表面、ならびにセンチネル（監視）細胞(sentinel cell)、たとえばマクロファージおよび樹状細胞のエンドサイトーシスコンパートメントに発現する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン(pathogen-associated molecular pattern)（ＰＡＭＰ）、すなわち構造的に保存された微生物由来の分子を認識し、先天性免疫およびそれに続く適応免疫に必要なサイトカインの産生を誘導するシグナル伝達を開始させる。
【００２４】
種々のＴＬＲが異なる発現パターンを示す。この遺伝子は、免疫細胞に富む組織、たとえば脾臓、リンパ節、骨髄および末梢血白血球に優先的に発現する。
【００２５】
１３種類のＴＬＲ（単純にＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と命名されている）がヒトおよびマウスにおいて共に検出され、これらの多くのものと同等な形態が他の哺乳動物種に発見されている。しかし、必ずしもマウスにおけるすべてのＴＬＲ受容体がヒトにもみられるわけではなく、逆も同様である。さらに、必ずしもすべてのＴＬＲ受容体についてリガンドおよび機能が分かっているわけではなく、たとえばＴＬＲ１０は機能未知のオーファン受容体である。
【００２６】
ＴＬＲ受容体の活性化は種々の疾患の処置に利用されており、たとえば医薬製剤によるＴＬＲ９の活性化はアレルギーおよび腫瘍の処置に有益であることが示されている。マウスおよびヒトにおける研究は、ＴＬＲ９の天然リガンドがＤＮＡ分子中の非メチル化ＣｐＧ配列であることを指摘している。ＣｐＧ部位は、脊椎動物ゲノムでは細菌ゲノムまたはウイルスＤＮＡと比較して相対的に稀である（約１％）。ＴＬＲ９は免疫系の多数の細胞、たとえば樹状細胞、Ｂリンパ球、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により発現する。しかし、健康なヒトではＴＬＲ９発現は形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cell)（ｐＤＣ）およびＢ細胞に限定される。その発現は細胞内、すなわちエンドソームコンパートメント内であり、ＣｐＧモチーフに富むＤＮＡに結合することによりウイルス感染症および細菌感染症の免疫系を覚醒する機能をもつ。しかし、病的条件下では細胞の細胞表面にもＴＬＲ９発現が報告されている１２−１４。
【００２７】
多数の異なる合成ＴＬＲ９アゴニスト分子が報告されている。それらのアゴニストリガンド（ＴＬＲ９を活性化するもの）は３グループに分類される：
ＣｐＧクラスＡ、特にＣｐＧ−Ａ（Ｄ）１５  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなるグループ；“Ｄ”タイプＯＤＮとしても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは強いＩＦＮａ誘導および最小の樹状細胞成熟を誘導し、本明細書中で“グループ１”ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。一例はＯＤＮ２２１６である１６：
ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ４６）；
ＣｐＧクラスＢ、特にＣｐＧ−Ｂ（Ｋ）１５  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなるグループ；“Ｋ”タイプＯＤＮとしても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは弱いＩＦＮａ誘導および樹状細胞成熟を誘導し、本明細書中で“グループ２”ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。一例はＯＤＮ２００６である１７，１８：
ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ４７）；
ＣｐＧクラスＣからなるグループ；ＣｐＧ−Ｃ１５  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）としても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、ＩＦＮａ、および未成熟樹状細胞の成熟を誘導し、本明細書中で“グループ３”ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。一例はＯＤＮＭ３６２である１５：
ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４８）。
【００２８】
現在までに記載されているＴＬＲ９に対するすべてのリガンドはヌクレオチドに基づく。ＴＬＲ９に特異的な抗体が報告され、受容体の存在および位置を立証するために用いられているが、これらの分子はＴＬＲ９に対するリガンドとしては記載されておらず、ＴＬＲ９の活性化または活性阻害は何ら報告がなかった。
【００２９】
ＣＤ３２の役割：
ＣＤ３２は単球／樹状細胞およびＢ細胞に強く発現する；したがって、Ｂ細胞による抗原提示を阻止し、一方で特に樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示を促進する意図で、これらの重要な免疫細胞に対する免疫応答を指令する分子が設計されている；後者は、十分に刺激されると抗原に対するＴｈ１応答を導く。少なくとも２タイプのＤＣ：骨髄様樹状細胞（ｍＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）があり、このことがＤＣ１細胞およびＤＣ２細胞という新たな概念を導いた。この概念において、ＤＣ１細胞は抗原特異的刺激後のＴｈ１細胞発生の誘導を促進し、ＤＣ２細胞はＴｈ２細胞の発生を支持する。単球由来ＤＣ（またはｍＤＣ）は一般にＤＣ１タイプであると考えられ、これに対しｐＤＣはＤＣ２タイプであると考えられている。両タイプのＤＣがＣＤ３２ａを発現し、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するであろう；しかし、その結果としてＴｈ１タイプが生じるという保証はない。事実、アレルギー性ドナーにおいてはＴｈ２応答の方が生じやすい。重要なことに、ｐＤＣは、ＣｐＧ−ＯＤＮ（非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ））を結合するＴＬＲ９受容体を発現する。ｐＤＣにおけるこの受容体の活性化はきわめて強いＩＦＮ−アルファおよびＩＬ−１２の発現を導き、それがＴｈ１誘導を促進し、こうして潜在ＤＣ２細胞をＤＣ１細胞に変換する。
【００３０】
したがって、そのような分子はｐＤＣにおけるＴＬＲ９受容体の活性化を抗原特異的Ｔｈ１細胞の特異的刺激および誘導と結びつけることができる。
【００３１】
腫瘍の免疫療法には、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に加えて腫瘍抗原特異的Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を用いるという特別な目標がある。
【００３２】
コイルドコイル：
コイルドコイルは、タンパク質において２〜７つのアルファ−ヘリックスがロープの鎖のように互いに巻き付いた構造モチーフからなる；ダイマーおよびトリマーが最も一般的なタイプである。コイルドコイルヘリックスは、Ｆｖ抗体フラグメントを安定化してヘテロダイマー型のコイルドコイルドメインを生じさせるために用いられている１９。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３３】
【特許文献１】US5023077
【特許文献２】US5609870
【特許文献３】WO 97/07218
【特許文献４】WO 2007098934A1
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Mathis,D. and C.Benoist. 2004. Back to central tolerance. Immunity 20:509-516.
【非特許文献２】Miller,J.F.A.P. and G.Morahan. 1992. Peripheral T cell tolerance. Annu. Rev. Immunol. 10:51-69.
【非特許文献３】Tafuri,A., J.Alferink, P.Moller, G.J.Hammerling, and B.Arnold. 1995. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science 270:630-633.
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【非特許文献１４】Tanaka,J., K.Sugimoto, K.Shiraki, M.Tameda, S.Kusagawa, K.Nojiri, T.Beppu, K.Yoneda, N.Yamamoto, K.Uchida, T.Kojima, and Y.Takei. 2010. Functional cell surface expression of toll-like receptor 9 promotes cell proliferation and survival in human hepatocellular carcinomas. Int. J Oncol. 37:805-814.
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【非特許文献１６】Tversky,J.R., A.P.Bieneman, K.L.Chichester, R.G.Hamilton, and J.T.Schroeder. 2010. Subcutaneous allergen immunotherapy restores human dendritic cell innate immune function. Clin. Exp. Allergy. 40:94-102.
【非特許文献１７】Abel,K., Y.Wang, L.Fritts, E.Sanchez, E.Chung, P.Fitzgerald-Bocarsly, A.M.Krieg, and C.J.Miller. 2005. Deoxycytidyl-deoxyguanosine oligonucleotide classes A, B, and C induce distinct cytokine gene expression patterns in rhesus monkey peripheral blood mononuclear cells and distinct alpha interferon responses in TLR9-expressing rhesus monkey plasmacytoid dendritic cells. Clin Diagn. Lab Immunol 12:606-621.
【非特許文献１８】Puig,M., K.W.Tosh, L.M.Schramm, L.T.Grajkowska, K.D.Kirschman, C.Tami, J.Beren, R.L.Rabin, and D.Verthelyi. 2012. TLR9 and TLR7 agonists mediate distinct type I IFN responses in humans and nonhuman primates in vitro and in vivo. J Leukoc. Biol. 91:147-158.
【非特許文献１９】Arndt,K.M., K.M.Muller, and A.Pluckthun. 2001. Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled-coil domain. J Mol. Biol. 312:221-228
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
ガストリンおよびガストリン依存性の病状をターゲティングする改良された免疫療法を提供することに対するニーズがある。したがって本発明の目的は、特定のガストリンエピトープに対する免疫応答を調節するための改善された免疫原性、安定性および構造を備えたワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
この目的は特許請求の範囲に記載する対象事項により解決される。
【００３７】
本発明によれば、下記のものを含む免疫原組成物が提供される：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに巻き付いた第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
【００３８】
具体的には、ペプチド免疫原は下記のものを含むかまたは下記のものからなる線状ペプチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ６のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ７、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ８のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２もしくは９のアミノ酸配列。
【００３９】
本発明の免疫原組成物は、第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した少なくとも２つのペプチド免疫原、好ましくは２、３または４つのペプチド免疫原を含む。
【００４０】
２以上のペプチド免疫原が第２アルファ−ヘリックスに結合している場合、それらのペプチド免疫原は、たとえば連続してアルファ−ヘリックスにコンジュゲートしていてもよい；すなわち、ペプチド免疫原は一列に並んで連結しており、たとえば第１ペプチド免疫原のＣ末端が第２ペプチド免疫原のＮ末端に連結し、それらの第１および第２ペプチド免疫原は互いに同一であるかまたは異なる。
【００４１】
あるいは、またはさらに、さらなるペプチド免疫原を架橋により本発明の免疫原組成物に取り込ませることができる；たとえば、互いに同一であるかまたは異なる２以上のペプチド免疫原を、化学反応、たとえば分子間架橋の樹立を可能にする化学的架橋により、たとえばアジプイミド酸ジメチル(Dimethyl adipimidate)（ＤＭＡ）、スベルイミド酸ジメチル(Dimethyl suberimidate)（ＤＭＳ）またはグルタルアルデヒドなどのホモ二官能性試薬を用いて、同一のアルファ−ヘリックスに連結させる。たとえば、そのような架橋は、それぞれアルファ−ヘリックスまたはスペーサー／リンカーの遊離リジン基によるグルタルアルデヒド架橋を用いて実施できる。それにより、本発明に従って用いる２以上のペプチド免疫原が並行または並列でアルファ−ヘリックスにカップリングする。
【００４２】
本発明の特定の観点によれば、第１および第２−アルファ−ヘリックスはそれぞれ、３〜５個のアミノ酸のリピートのアミノ酸モチーフ、特に互いに１０−６未満のＫｄ、好ましくは１０−７未満のＫｄ、より好ましくは１０−８未満または１０−９未満のＫｄで結合するものを含む。
【００４３】
本発明のさらなる特定の観点によれば、抗ＣＤ３２部分は、抗ＣＤ３２抗体、抗体フラグメントおよびペプチド、好ましくはＣＤ３２ａをターゲティングするものからなる群から選択される。抗体フラグメントは、具体的にはたとえばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２もしくはＦｃａｂフラグメント、またはそれが受容体に特異的に結合して結合後にインターナリゼーションする限り他のいずれの可能な結合性要素であってもよい。
【００４４】
具体的には、抗ＣＤ３２部分はＣＤ３２ａを、好ましくはＫｄ≦１０−６Ｍ、より好ましくは１０−７Ｍ未満または１０−８Ｍ未満の高親和性でターゲティングする。
【００４５】
より具体的には、抗ＣＤ３２部分は特異的または選択的なＣＤ３２ａ結合剤であり、すなわちＣＤ３２ｂをターゲティングしないか、あるいはＫｄ＞１０−６Ｍ、好ましくは１０−５Ｍより高い、より好ましくは１０−４Ｍより高い、低親和性でＣＤ３２ｂをターゲティングする。ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂへの結合の親和性の差は、Ｋｄ値において好ましくは少なくとも１  ｌｏｇ、より好ましくは少なくとも２  ｌｏｇ、または少なくとも３  ｌｏｇ以上の差である。
【００４６】
ＣＤ３２ｂよりむしろＣＤ３２ａを結合する抗ＣＤ３２部分の特に好ましい高親和性または高い親和性差は、一般に、さらにアゴニスト作用性ＴＬＲ９リガンドを用いる免疫刺激ワクチンに利用される。
【００４７】
ＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｂのいずれかを特異的に、またはＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂの両方をターゲティングする抗ＣＤ３２部分の結合親和性は、適切なアッセイ法、たとえば一般的なＥＬＩＳＡで、市販のＨＩＳタグ付き組換え形ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂをＮｉ−ＮＴＡ  ＥＬＩＳＡプレートにコートしたもの、たとえばＮｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＳｏｒｂプレート（Ｑｉａｇｅｎ，オーストリア）を用いて判定できる。抗ＣＤ３２部分をビオチニル化し、したがってストレプトアビジン−ＨＲＰまたはストレプトアビジンＡＰおよび適宜な基質を用いて検出できる。あるいは、それらの部分をＦＡＣＳアッセイで、ＣＤ３２ａを発現するけれどもＣＤ３２ｂを発現しないＵ９３７細胞（たとえば、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ  １５９３）、およびＣＤ３２ｂを発現し、ＣＤ３２ａを発現しない、ＥＢＶ形質転換したＢ細胞、たとえばＣＦＢ４：２(van Reijsen et al２０により記載)を用いて試験することができる。
【００４８】
本発明のさらなる特定の観点によれば、ＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド  クラスＡ、ＢおよびＣ、またはいずれかのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを模倣する免疫刺激ペプチドからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである。
【００４９】
本発明の特定の観点によれば、ＴＬＲ９リガンドはＣｐＧ  クラスＡからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニスト、特にＣｐＧ−Ａ（Ｄ）１７  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、これは“Ｄ”型ＯＤＮとしても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは強いＩＦＮａ誘導および最小の樹状細胞成熟を誘導し、本明細書中で“グループ１”  ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５０】
本発明の他の特定の観点によれば、ＴＬＲ９リガンドはＣｐＧ  クラスＢからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニスト、特にＣｐＧ−Ｂ（Ｋ）２１  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、これは“Ｋ”型ＯＤＮとしても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは弱いＩＦＮａ誘導および樹状細胞成熟を誘導し、本明細書中で“グループ２”  ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５１】
本発明の他の特定の観点によれば、ＴＬＲ９リガンドはＣｐＧ  クラスＣからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストであり、これはＣｐＧ−Ｃ１５，２１  オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）としても知られる。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、ＩＦＮａ、および未成熟樹状細胞の成熟を誘導し、本明細書中で“グループ３”  ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５２】
ＩＦＮａの誘導は、ＩＦＮａ発現のレベル、および基準レベルに対するそれぞれの増大により判定できる。非刺激細胞に対比した増大は、グループ１、２または３  ＴＬＲ９リガンドにより定めた各タイプのＣｐＧについて確立された基準品により誘導される誘導レベルと比較することができ、一般にそれぞれの基準の３０％〜３００％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも２５０％である。
【００５３】
未成熟樹状細胞の成熟は、マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６のいずれかの発現レベルにより判定できる。非刺激細胞に対比したそれぞれの増大は、グループ１、２または３  ＴＬＲ９リガンドにより定めた各タイプのＣｐＧについて確立された基準品により誘導される誘導レベルと比較することができ、一般にそれぞれの基準の３０％〜３００％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも２５０％である。
【００５４】
具体的には、グループ１および３のＴＬＲ９アゴニストはＩＦＮａ発現の増大をもたらし、グループ２および３のＴＲＬ９アゴニストはＤＣ成熟因子ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６のいずれかの発現増大を導くであろう。ＴＬＲ９アンタゴニストは、グループ１〜３のいずれかのＴＬＲ９アゴニストの存在下ですら、ＩＦＮａ発現の低下、ならびにＤＣ成熟因子ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６のいずれかの発現低下をもたらすであろう。
【００５５】
前記のポリヌクレオチド系のＴＬＲ９リガンドに代わるものとして、アゴニスト作用をもつ他のいずれかのＴＬＲ９結合剤、たとえばペプチド系結合剤またはタンパク質系結合剤を使用でき、それには抗体または抗体フラグメントが含まれる。
【００５６】
本発明のさらなる特定の観点によれば、免疫原組成物は、好ましくはグリシンおよび／またはセリンおよび／またはリジン残基から構成される１以上のリンカー配列、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  １２または１３のアミノ酸配列を含む。リンカー配列は線状または分枝状であってよく、たとえば２以上のペプチドまたはポリペプチド要素間に連結または架橋をもたらす。
【００５７】
本発明のさらなる特定の観点によれば、免疫原組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  １０またはＳＥＱ  ＩＤ  １１のアミノ酸配列を含み、あるいはそれからなる。
【００５８】
本発明によれば、さらに、本発明の免疫原組成物および医薬的に許容できるキャリヤーを含むワクチンが提供される。そのようなワクチンは、一般に免疫刺激ワクチンであり、たとえば体液性およびＴ細胞性（Ｔｈ１）免疫応答を刺激する。
【００５９】
好ましい態様によれば、体液性およびＴ細胞性（Ｔｈ１）免疫応答は一過性であり、たとえば一般にワクチン接種して２〜８週間以内に、ワクチン接種に際して誘導される特異的な最大ＩｇＧ力価が達成され、続いてワクチン接種して６か月以内、好ましくは５か月以内、または４か月以内、または３か月以内、または２か月以内に、力価が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大で１００％低下する。ブースター注射すると、そのような低下した力価を再び増大させることができる。一連のワクチン接種において、一過性の免疫応答はおそらく免疫原組成物またはワクチンの最終注射に際して判定される。一過性免疫応答は、たとえば必要に応じて処置を中断または終止できる制御された処置の利点をもつ。
【００６０】
本発明によれば、さらに、下記の成分を含む、本発明の免疫原組成物を調製するためのキットが提供される：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスにマッチする第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
【００６１】
このキットは、特に、予め形成された指向性アジュバントを、対象グループまたは個々の対象のニーズに従って提供できる免疫原との組合わせに使用することにより、ワクチンの製造を容易にするために使用できる。
【００６２】
本発明によれば、さらに、ガストリン依存性の疾患または病状に罹患している対象の処置に使用するための免疫原組成物が提供される。そのような疾患または病状は、主に対象における内因性ガストリンの産生または過剰産生により引き起こされ、あるいはそれらに関連する。ガストリン依存性の疾患または病状には、ガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌もしくは胃腸癌、胃潰瘍、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）または肥満症が含まれる。
【００６３】
したがって、本発明は特に、有効量の本発明の免疫原組成物またはワクチンを、予防的に、たとえば疾患もしくは病状の発生または疾患の進行を阻止するために、あるいは治療的に、たとえば疾患または病状を改善するために対象に投与することにより、ガストリン依存性疾患、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌もしくは胃腸癌、胃潰瘍、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）または肥満症に罹患している対象を処置する方法を提供する。
【００６４】
特に、プライム−ブースト方式を用いて組成物を有効量で対象に投与する。
【００６５】
具体的には、有効量は投与１回当たり０．０００１〜２ｍｇ、好ましくは１回当たり０．００１〜２ｍｇの範囲である。
【００６６】
本発明の特定の態様によれば、たとえばガストリン依存性癌の処置コースにおいて対象をさらに化学療法により処置する。
【００６７】
具体的には、本発明の免疫原組成物は、対象において、ヒト  ガストリン−１７に対して好ましくは少なくとも１／１０００、好ましくは少なくとも１／１０４、好ましくは少なくとも１／１０５、好ましくは少なくとも１／１０６、またはそれより低い（したがってより高い希釈度で検出できる）血清ＩｇＧ力価を伴なう防御免疫応答を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の抗体（ＩｇＧ誘導）を示す。０日目、１４日目および２８日目の３回、ワクチン（ＴＹＧ１００＿２ＲＭ）を注射した後の、ＩｇＧ  抗Ｇ１７誘導の時間曲線。ＳｃＦＶ−コイル１およびＧ１７ＲＭおよびＧ１７Ｈに対して有意のＩｇＧ誘導がみられた。類似の分子量の対照ペプチドに対して、あるいは弾頭(warhead)が存在しないＧ１７ＲＭ＿２で動物を免疫化した場合、応答がみられなかった。すべての特異的力価が最終免疫化の４週後に減退し、これはＩｇＧレベルを維持するためにはブースター注射が必要であることを示す。さらに、天然Ｇ１７ＲＭの存在は応答をブーストせず、Ｇ１７ＲＭに対するＩｇＧの減少はＳｃＦＶ−コイル１のものより有意に大きいので、誘導された免疫応答は可逆的であると結論できる。
【図２】図２は、抗ガストリン免疫化に際しての体重減少を示す。ＴＹＧ１００＿２ＲＭで免疫化した後、６匹中４匹の動物が有意の時間依存性体重減少を示した。これらの動物は普通の日常食における関心を失うことなくそれらの午後のスナックに対する食欲を失ったことが動物飼育者により観察された。そのような所見は他のワクチンでは決して得られなかったので、本発明の抗ガストリンワクチンは肥満症の管理に使用できる。
【図３−１】図３は、下記の配列情報を示す：  ＳＥＱ  ＩＤ  １：ヒト  リトルガストリン，Ｇ１７；  ＳＥＱ  ＩＤ  ２：ヒト  ガストリンペプチド，リトルガストリンの最初の（Ｎ末端）１２個のＡＡ（アミノ酸），Ｇ１２；  ＳＥＱ  ＩＤ  ３：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）４個のＡＡ，点変異をもつ具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ４：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）４個のＡＡ，点変異をもつ、より具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ５：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）１２個のＡＡ，点変異をもつ具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ６：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）１２個のＡＡ，点変異をもつ、より具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ７：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）１３個のＡＡ，点変異をもつ具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ８：リトルガストリンのＮ末端エピトープ，最初の（Ｎ末端）１３個のＡＡ，点変異をもつ、より具体的な機能活性バリアントを含む；  ＳＥＱ  ＩＤ  ９：ヒト  ガストリンペプチド，リトルガストリンの最初の（Ｎ末端）１３個のＡＡ（アミノ酸），Ｇ１３；  ＳＥＱ  ＩＤ  １０：ＴＹＧ１００＿１Ｈの免疫原成分：ＳＥＱ  ＩＤ  ９のヒト  ガストリンペプチド１つ、リンカー配列、およびペプチド  アルファ−ヘリックスを含む本発明の免疫原組成物（ＴＹＧ１００＿１Ｈ）の一部。この部分を適切な指向性アジュバントにコイルドコイル連結により連結させることができる。太字はペプチド免疫原、イタリックはリンカー、下線を施したのはコイルである。  ＳＥＱ  ＩＤ  １１：ＴＹＧ１００＿２Ｈの免疫原成分：ＳＥＱ  ＩＤ  ９のヒト  ガストリンペプチド２つ、分枝リンカー配列、およびペプチド  アルファ−ヘリックスを含む本発明の免疫原組成物の一部（ＴＹＧ１００＿２Ｈ）。この部分を適切な指向性アジュバントにコイルドコイル連結により連結させることができる。太字はペプチド免疫原、イタリックはリンカー、下線を施したのはコイルである。  ＳＥＱ  ＩＤ  １２：線状リンカー配列；  ＳＥＱ  ＩＤ  １３：分枝リンカー配列。
【図３−２】同上
【図３−３】同上
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本明細書全体を通して用いる特定の用語は、下記の意味をもつ。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“アジュバント”は、ワクチンの統合成分または共投与成分を意味するものとする：
−  それは、特定の免疫原、たとえば抗原またはハプテンに対する免疫応答を高める。その免疫応答は、一般にアジュバントなしで投与される同等量の免疫原組成物により誘発される免疫応答より大きい；
および／または
−  アジュバントは、免疫原に対する特定のタイプまたはクラスの免疫応答、たとえばＴｈ１またはＴｒｅｇタイプの免疫応答を指向するために用いられ、本明細書において“指向性アジュバント(directed adjuvant)”として理解される。
【００７１】
本発明のアジュバントの“有効量”は、具体的には免疫原に対する免疫応答を増強する量であり、したがって、たとえば目的とするクラスの有効な免疫応答を誘発するために必要な免疫原組成物はより少ない量またはより少ない投与回数になる。
【００７２】
本発明による指向性アジュバントは、効果的な免疫応答を仲介するだけでなく、目的とする様式で免疫応答を調節する。免疫原をインターナリゼーションおよびさらなるプロセシングのために適切な免疫細胞へ指向させることにより、特にグループ３のＴＬＲ９アゴニストであるＴＬＲ９リガンドを用いる場合、Ｔｈ２免疫応答よりむしろＴｈ１免疫応答が誘導される。グループ１のＴＬＲ９アゴニストを、ＣＤ３２ｂを結合する抗ＣＤ３２部分と組み合わせれば、通常はＴｒｅｇ細胞の誘導が予想される。
【００７３】
たとえば本発明のワクチンに用いる免疫原組成物の“有効量”は、ワクチン接種計画の一部として投与した場合、処置される対象において有意の有益性を示すのに十分な量を表わす。ある態様において、特定の組成物が具体的な投与計画に際して投与される単位剤形に適した量を含有すれば、単一の単位剤形として投与した場合にそのような量が有意の有益性を達成するのに不十分な可能性があるとしても、それは予防または治療に有効な量を含有するとみなすことができることは、当業者に認識されるであろう。さらに、たとえば目的とする生物学的エンドポイント、組成物の性質、投与経路、処置される対象の健康状態、体格および／または年齢などの要因に応じて、免疫原組成物の有効量がその組成物を投与される異なる対象について異なる可能性があることも、当業者に認識されるであろう。ある態様において、有効量は、特定の投与計画、たとえば１回投与または“ブースター”計画などの一連の投与の一部として投与した場合に、有益な効果と相関性があった量である。
【００７４】
本明細書中で用いる用語“ペプチド  アルファ−ヘリックス”は、多数のリピート（コイルリピートとも呼ばれる）を含むペプチド配列に基づくコイル状構造モチーフを意味するものとする。そのようなアルファ−ヘリックスは、適合アルファ−ヘリックス(matching alpha-helix)とも呼ばれる同一タイプの他の相手と結合して、ダイマー、トリマーまたはさらなるオリゴマーを形成でき、これらはコイルドコイルとも呼ばれる。
【００７５】
コイルドコイルはポリペプチドまたはペプチドの構造モチーフであり、それらにおいては２〜７つのアルファ−ヘリックスがロープの鎖のように互いに巻き付いている。ある態様において、ワクチンのコイルドコイルは２つのアルファ−ヘリックスが互いに巻き付いたものである。そのようなアルファ−ヘリックス領域はコイルドコイル構造を形成しやすく、適切なコイルドコイル相互作用結合アッセイで測定したコイルリピートのオリゴマー化に関与する可能性がある。
【００７６】
具体的には、アルファ−ヘリックスのダイマーは、２つのモノマーを接触させることにより形成でき、それによってそれら２つのアルファ−ヘリックスのコイルドコイルドメインとの相互作用によりダイマーが形成される。ある態様において、コイルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４または１６（コイルとアンチ−コイル）に示すアミノ酸配列をもつペプチドを含み、ｘ個のリピートを含む。
【００７７】
ＥＶＳＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  １４）
Ｅ５：  ＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫ−ＮＨ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  １５）
ＫＶＳＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  １６）
Ｋ５：  ＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥ−ＮＨ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  １７）
あるいは、Chao et al２２もしくはLitowsky et al２３，２４により記載されるいずれかの配列または機能均等物であって特定のコイルドコイルタイプの連結を生成するもの、たとえば下記の表に示すものを使用でき、そのバリアント、たとえばコイルタイプ中に異なる数のリピートまたは１、２もしくは３つの点変異をもつものが含まれる：
【００７８】
【表１】
0006395816.tif 000002
【００７９】
本発明の目的に好ましいタイプのコイルドコイルは下記のいずれかのダイマーである：異なるけれどもマッチする（適合する）２つのヘリックス、すなわちコイルリピート配列中の少なくとも１個のアミノ酸が異なるもののヘテロダイマー（ヘテロコイル）、または同一の適合する２つのヘリックス、すなわちマッチするコイルリピート配列を含むもののホモダイマー（“コイル”）。
【００８０】
コイルリピートの好ましい数は３〜５、好ましくは３＋３、３＋４、３＋５、４＋４、４＋５、５＋５、４＋３、５＋３または５＋４のいずれかの組合わせである。
【００８１】
ヘプタッド(heptad)リピート（７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列のリピート，７−ｍｅｒ）の代わりに、６−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、または９−ｍｅｒを使用できる。
【００８２】
ホモダイマー型コイルドコイルの場合、望ましくない構造ミスマッチを避けるために、一般的なコイルリピート数は特に５を越えない。ヘテロダイマー型コイルドコイルの場合、一般に少なくとも３コイルをもつ長さのペプチド配列を用いることが望ましい。それにより、ワクチンの成分、すなわち指向性アジュバントと免疫原成分の、Ｋｄ  １０−７Ｍ未満、より好ましくは１０−８Ｍ未満または１０−９Ｍ未満の好ましい高親和性を備えた相互結合が一般に達成される。ただし、リピートがより多いほど親和性が増大するが、これはホモダイマー形成が増大するという犠牲においてである可能性がある。
【００８３】
本発明の免疫原組成物の成分には、抗ＣＤ３２部分および／またはＴＬＲ９リガンドならびに場合によりエピトープ（ペプチド免疫原の）をそれぞれコイルリピートと連結させるための、ペプチドスペーサーも含めることができる。たとえば、ペプチドスペーサーはコイルドコイルの一端または両端にあってもよい。ペプチドスペーサーはそれぞれ、コイルドコイルの単一のアルファヘリックス  コイルドコイル  ドメインに結合することができる。
【００８４】
ペプチドスペーサーは、たとえばアミノ酸５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個またはそれ以上のペプチドであり、線状、またはたとえば２、３、４もしくはそれ以上の分枝をもつ分枝状であってもよい。ペプチドスペーサー中のアミノ酸の数は、ある態様において、個々の配列およびコイル長さに応じて２０個のアミノ酸またはそれより最大で１０個多いかもしくは少ないアミノ酸であってもよい。
【００８５】
本明細書中で用いる用語“抗ＣＤ３２部分”は、細胞ターゲットＣＤ３２、すなわちＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂのいずれか、またはＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂの両方に特異的に結合するリガンドを意味するものとする。この部分は、いずれかの結合構造、たとえばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに由来するものであってもよく、それには抗体および抗体フラグメント、または結合部を備えた複合分子が含まれる。本発明の分子または分子複合体の結合部は、タンパク質、たとえば抗体または抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２、ミニボディ、小さな変異した免疫グロブリンドメイン、または他の生物学的結合剤、たとえば可溶性Ｔ細胞受容体、Ｄａｒｐｉｎなどから構成できる。抗体ならびに抗体のフラグメントおよび誘導体を作製し、既知の方法、たとえばハイブリドーマ法、Ｂ細胞クローニング、抗体ライブラリーのファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または細胞表面ディスプレイ、バリアント抗体のアレイスクリーニングに従って、ＣＤ３２への結合について選択することができる。代表的な抗ＣＤ３２部分は、抗ＣＤ３２モノクローナル抗体ＡＴ−１０２５、ＩＶ．３２６、２Ｅ１２７または他のいずれかのａＣＤ３２モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖである。
【００８６】
特異的結合は、適切な結合アッセイ、たとえば一般的なイムノアッセイで判定できる。イムノアッセイで結合を検出するための当技術分野で知られている多数の方法がある。当技術分野で知られている多様なイムノアッセイ法を使用でき、それにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、イムノラジオメトリーアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウェスタンブロット法、ＢＩＡｃｏｒｅなどの手法を用いる競合および非競合アッセイ系が含まれる。
【００８７】
本明細書中で抗原または抗体に関して用いる用語“交差反応性”は、異なる由来の、たとえばヒト、アカゲザルまたはマウスに由来する抗原間で共有されるエピトープを表わすものとする。Ｇ１７の最初の４個のＡＡから構成されるかまたはそれらを含むＮ末端エピトープは種々の由来のペプチドにおいて交差反応性であり、そのエピトープは免疫応答を誘発し、そのエピトープと交差反応性であるＩｇＧ抗体を誘導することが見出された。
【００８８】
本発明の免疫原組成物は、過剰のガストリンに関連するガストリン依存性の疾患または病状、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌、胃潰瘍、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）または肥満症を処置するために特に有用である。
【００８９】
本明細書中で用いる用語“ガストリン依存性腫瘍”は、たとえばガストリン依存性結腸直腸腺癌および他のガストリン依存性癌、たとえば胃癌、肝癌、膵臓癌、および肺の小細胞癌などの腫瘍またはそれに関連する疾患もしくは病状を表わすものとする。この用語は、本明細書中で特に腫瘍性疾患の進行の阻止、プラスの腫瘍応答、または腫瘍縮小のために腫瘍を処置することに関して用いられる。この用語は、残留疾患を最小化すること（それは処置が成功したことであろう）、たとえば循環腫瘍細胞をターゲティングしてそれらの数を一定の閾値未満、たとえば検出限界未満に減少させることにも適用される。
【００９０】
胃潰瘍性疾患は、胃酸の増加、および普通は胃酸による損傷から胃粘膜を保護する複雑な胃の防御の破壊により引き起こされる可能性がある。これら２つの状態は異なる病因をもつが、両方とも胃酸分泌の低減が有益である。胃酸は特殊な胃細胞である壁細胞において産生される。壁細胞は、アセチルコリン、ヒスタミンおよびガストリンがそれぞれ細胞表面の特異的受容体と結合した際にこれらの化合物により刺激されて酸を分泌することができる。これらのうち最も有効な酸分泌刺激物質は、ペプチドホルモンのガストリンである。本明細書に記載する抗ガストリン免疫療法は、胃潰瘍性の病状を改善するであろう。
【００９１】
本明細書中で用いる用語“ガストリン−１７ペプチド”または“Ｇ１７ペプチド”または“Ｇ１７”は、ガストリンのＮ末端１７個のＡＡからなるリトルガストリンＧ１７を表わすものとする。Ｇ１７ペプチドは、ヒト由来のもの、またはアカゲザルもしくはマウスを含めた他の哺乳動物に由来するものであってもよく、したがってヒトまたは他の哺乳動物の配列をもち、あるいは人工構築体であってもよく、したがってたとえば天然（native, naturally occurring）Ｇ１７配列中のアミノ酸残基のタイプおよび／または配列を改変することにより得られる人工配列を含む。この用語は、特にＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列をもつヒトＧ１７のバリアント、またはそのフラグメントであって、ただし異なる種の相同配列に由来するという点でそれのペプチド配列とは異なるものを含むものとする。これらは天然のバリアントまたはアナログと呼ばれる。用語“アナログ”は、２以上の起源に由来するキメラ構築体をも表わすものとし、その際、少なくとも１つの部分、たとえばペプチド免疫原の主要部分（少なくとも５０％）を構成する部分は天然であり、他の部分はそれと異なり、天然または合成（人工）のいずれかである。
【００９２】
この用語には、特にＧ１７のフラグメントまたは機能活性バリアント、たとえば１以上の点変異を含むもの、あるいは１以上の追加のアミノ酸残基または配列によってＮ末端またはＣ末端を延長することによりＧ１７のほかにさらなるアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドが含まれるものとする。Ｃ末端の延長は、たとえば同一もしくは異なるＧ１７配列の繰返しを含むもの、またはガストリンのさらなるアミノ酸配列を含むものが好ましい。
【００９３】
この用語には、特に１以上の修飾アミノ酸残基を含むペプチドが含まれるものとする。一般的な修飾には、リン酸化、メチル化、アセチル化、アミド化、ピロリドンカルボン酸の形成、異性化、ヒドロキシル化、硫酸化、フラビン結合、システイン酸化およびニトロシル化が含まれる。本明細書に記載する代表的な修飾は、Ｇ１７のＮ末端グルタミン酸、すなわち位置１のｐｙｒｏＧｌｕであって“ピロリドンカルボン酸（Ｇｌｕ）”またはｐＧｌｕまたはｐＥとしても知られるものの修飾である。
【００９４】
本明細書中で本発明のペプチド免疫原に関して用いる用語“機能活性バリアント”は、たとえば１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によるこの配列（親配列）の修飾から、たとえばアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基、またはコーディングヌクレオチド配列内のヌクレオチド（またはその配列の一端もしくは両端において）の組換え法または化学的誘導体化により生じる配列であって、その修飾がこの配列の活性に影響を与えない（特に、損傷を与えない）ものを意味するものとする。ターゲットであるガストリンに対する特定の免疫応答を誘発するペプチド免疫原の場合、ペプチド免疫原の機能活性バリアントはなお抗原決定基またはエピトープを含むけれども、たとえば免疫原性を高めるためにこれを変化させることができる。特に、Ｇ１７ペプチド免疫原の機能活性バリアントまたはそのフラグメント、たとえばＧ１２もしくはＧ１３フラグメントは、処置された対象においてＩｇＧ  抗ガストリン抗体を誘導する効力をもち、それらの抗体はその対象の内因性ガストリンと交差反応する。
【００９５】
機能活性バリアントは、たとえば親ペプチド、たとえばヒト、アカゲザルまたはマウスのＧ１７ペプチド、またはそのフラグメント、たとえばＧ１２もしくはＧ１３ペプチドの配列を、交差反応性エピトープに実質的に損傷を与えない１以上の修飾の導入によって変化させて、実質的に同一の免疫原性をもつ分子を得ることにより得られる。本明細書中で用いる用語“実質的に同一の免疫原性”は、その免疫原組成物で処置した対象において誘導された免疫応答または抗ガストリンＩｇＧ抗体の量が、好ましくは親ペプチドについて測定した量の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、あるいはさらには少なくとも１００％または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、たとえば２００％に及ぶ量であることを表わす。
【００９６】
好ましい態様において、親ペプチドの機能活性バリアントは、
ａ）そのペプチドから少なくとも１個のアミノ酸の置換、挿入（付加）および／または欠失により誘導され、たとえば１以上の点変異を含み、その際、機能活性バリアントは親分子に対して特定の配列同一性、たとえば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性をもつ；および／または
ｂ）そのペプチドおよびさらにそのペプチドに対してヘテロロガスな少なくとも１個のアミノ酸からなる。
【００９７】
機能活性バリアントは、そのペプチド配列における配列改変により、たとえば１以上の点変異により得ることができ、その際、本発明に従って使用した場合にその配列変異は変異していないペプチド配列の機能を実質的に保持している。そのような配列改変または点変異には下記のものを含めることができるが、それらに限定されない：（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入、たとえば１、２、３もしくは４個のアミノ酸の改変、または１個ないし数個のアミノ酸、たとえば１、２、３もしくは４個のアミノ酸の付加もしくは挿入によるもの、または１個ないし数個、たとえば１、２、３もしくは４個のアミノ酸の化学的誘導体化によるもの、またはその組合わせ、好ましくは連続していない点変異によるもの。アミノ酸残基の置換は保存的置換であってもよく、たとえば１個の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置き換える。
【００９８】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連するアミノ酸のファミリー内で行なうものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖をもつアミノ酸、酸性側鎖をもつもの、非極性脂肪族側鎖をもつもの、非極性芳香族側鎖をもつもの、非荷電極性側鎖をもつもの、小型の側鎖をもつもの、大型の側鎖をもつものなどである。
【００９９】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表わす。これに関して、アミノ酸とは６４のトリプレットコドンによりコードされる２０種類の天然アミノ酸を表わす。これら２０種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷をもつものに分類できる：
“中性”アミノ酸をそれらの各３文字コードおよび１文字コードならびに極性と共に下記に示す：
アラニン：  （Ａｌａ，Ａ）  非極性，中性；
アスパラギン：  （Ａｓｎ，Ｎ）  極性，中性；
システイン：  （Ｃｙｓ，Ｃ）  非極性，中性；
グルタミン：  （Ｇｌｎ，Ｑ）  極性，中性；
グリシン：  （Ｇｌｙ，Ｇ）  非極性，中性；
イソロイシン：  （Ｉｌｅ，Ｉ）  非極性，中性；
ロイシン：  （Ｌｅｕ，Ｌ）  非極性，中性；
メチオニン：  （Ｍｅｔ，Ｍ）  非極性，中性；
フェニルアラニン：  （Ｐｈｅ，Ｆ）  非極性，中性；
プロリン：  （Ｐｒｏ，Ｐ）  非極性，中性；
セリン：  （Ｓｅｒ，Ｓ）  極性，中性；
トレオニン：  （Ｔｈｒ，Ｔ）  極性，中性；
トリプトファン：  （Ｔｒｐ，Ｗ）  非極性，中性；
チロシン：  （Ｔｙｒ，Ｙ）  極性，中性；
バリン：  （Ｖａｌ，Ｖ）  非極性，中性；および
ヒスチジン：  （Ｈｉｓ，Ｈ）  極性，正（１０％）  中性（９０％）．
“正”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アルギニン：  （Ａｒｇ，Ｒ）  極性，正；および
リジン：  （Ｌｙｓ，Ｋ）  極性，正．
“負”に荷電したアミノ酸は下記のものである：
アスパラギン酸：  （Ａｓｐ，Ｄ）  極性，負；および
グルタミン酸：  （Ｇｌｕ，Ｅ）  極性，負。
【０１００】
本明細書に記載するペプチド配列に関して“アミノ酸配列同一パーセント（％）”は、配列をアラインさせ、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要ならばギャップを導入した後の、特定のペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義され、保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。当業者はアラインメントを測定するための適宜なパラメーターを決定でき、それには比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムが含まれる。
【０１０１】
希望する位置に点変異を含む機能活性バリアントはいずれか既知の変異形成法により得ることができ、たとえばランダム化法により得られる。ある場合には、たとえばペプチド配列のランダム化のために可能ないずれかのアミノ酸、または好ましい選択したアミノ酸について、位置をランダムに選択する。これに関して、用語“変異形成”は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための当技術分野で認識されているいずれかの手法を表わす。
【０１０２】
本明細書中で用いる用語“免疫原”または“ペプチド免疫原”は、ペプチド構造をもつ抗原または免疫原、特に特定のアミノ酸配列のペプチドを含むかまたはそれからなる免疫原を意味するものとし、それは線状ペプチドまたは分枝ペプチドとして提供され、天然アミノ酸残基、あるいは修飾したもの、たとえば修飾または化学的誘導体化により、たとえばリン酸化、メチル化、アセチル化、アミド化、ピロリドンカルボン酸の形成、異性化、ヒドロキシル化、硫酸化、フラビン結合、システイン酸化およびニトロシル化により得られる誘導体を含む。
【０１０３】
ペプチド免疫原は、対象において免疫応答を誘発するように特別に設計され、特に１以上の抗原決定基を含み、それはおそらく抗体の結合部位により認識でき、あるいはＨＬＡ  クラスＩもしくはクラスＩＩ分子または他の抗原提示分子、たとえばＣＤ１のペプチド溝に結合でき、したがって特定のＴ細胞に対する刺激物質として作用することができる。ターゲット抗原はターゲット分子全体として、またはそのような分子のフラグメント、特にターゲットの部分構造、たとえば一般に“エピトープ”と呼ばれるポリペプチドまたは炭水化物構造、たとえばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープとして認識される；これらは免疫に関係し、すなわち天然抗体またはモノクローナル抗体が認識することもできる。本発明においてはＢ細胞エピトープの使用が好ましい。
【０１０４】
本発明に従って本明細書中で用いる用語“エピトープ”は、特に、抗体の結合部位に対して特異的結合パートナーを完全に構成するか、あるいは特異的結合パートナーの一部となることができる、分子構造体を表わすものとする。化学的には、本発明のペプチド免疫原のエピトープは、通常は少なくとも３個のアミノ酸残基、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸を含むペプチドエピトープであってもよい。ペプチドの長さに対する厳密な上限はなく、タンパク質のアミノ酸配列の全長すら含むことができる。
【０１０５】
同一抗原または異なる抗原の１以上のエピトープを本発明に従って使用できる。
【０１０６】
本発明のペプチド免疫原は、特に自己抗原であると解釈される。本明細書中で用いる用語“自己抗原”は、正常で健康な対象により産生されるいずれかの抗原、特にポリペプチドまたはペプチドであって、そのままでは免疫応答を誘発しないものを意味する。これらの自己抗原は、癌性疾患を含めた特定の病状では異常または高いレベルで産生される可能性がある；いわゆる腫瘍関連抗原(tumour associated antigen)（ＴＡＡ）。本発明において、ヒト  ガストリンまたはヒトＧ１７は、ヒト対象における自己抗原、特にガストリン依存性腫瘍に罹患している対象におけるＴＡＡであると解釈される。
【０１０７】
本発明に従って用いられる自己抗原は天然のもの、組換えまたは合成により産生されたものであってもよいと解釈される。自己抗原は天然抗原と同一である必要はなく、むしろそれに対するバリエーションであって特定の配列同一性、類似性または相同性をもつものを含むことができるとも解釈される。
【０１０８】
本発明によるワクチンに用いるペプチド免疫原または免疫原組成物は、通常はワクチン中に有効量で含有され、それは本発明において特に“免疫学的有効量”であると解釈される。“免疫学的有効量”とは、その量を対象に１回量として、または一連の投与量の一部として投与することが治療または予防の目的に基づいて有効であることを意味する。この量は、処置される対象の健康状態および身体条件、年齢、対象の免疫系が抗体を合成する能力、目的とする免疫応答の程度、ワクチンの配合、ならびに他の条件に応じて異なるであろう。
【０１０９】
本発明はまた、対象を処置する方法または対象において免疫応答を発生させる方法であって、免疫学的有効量の本発明のペプチド免疫原、免疫原組成物またはワクチンを投与する工程を含む方法を提供する。
【０１１０】
その必要がある対象、たとえば成人対象に投与する免疫原組成物の有効量または投与量は、０．０００１から２ｍｇまで、たとえば０．００１〜２ｍｇの範囲であってもよい。有効量の免疫原組成物は、患者において内因性の成熟Ｇ１７および前駆体Ｇ１７を結合および中和するのに有効なレベルの抗体価の免疫応答を、たとえば免疫化後１〜３か月間誘発することができる。療法の有効性は、対象から採取した血液試料における抗ガストリン抗体価によりアッセイできる。
【０１１１】
本明細書中で用いる用語“ＴＬＲ９リガンド”は、下記のように解釈される：
Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）はメチル化されていない細菌性ＣｐＧ  ＤＮＡを認識して、炎症性サイトカインの産生をもたらすシグナル伝達カスケードを開始させる。ＴＬＲ９のリガンドとして作用すること、すなわちこの受容体に結合し、それによりＴＬＲ９を活性化する（刺激する，アップレギュレートする，ＴＬＲ９アゴニスト）、または失活させる（ダウンレギュレートする，ＴＬＲ）アンタゴニスト）ことが示された多数の構造体または配列がある。たとえば、微生物ＤＮＡ、または合成ＤＮＡ、たとえば合成ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＣｐＧダイマーの数および位置、ならびにＣｐＧダイマーを囲む厳密な塩基配列のバリエーションに応じて、ＴＬＲ９を刺激することができる。合成ＣｐＧ  ＯＤＮは、それらが一般的なホスホジエステル主鎖の代わりに部分的または完全ホスホロチオエート化された主鎖をもついう点で微生物性ＤＮＡと異なり、３’末端、５’末端、または両方にポリＧテイルがある場合と無い場合がある。
【０１１２】
ＴＬＲ９リガンドと関連して本明細書中で用いる用語“アゴニスト”は、特に細胞ベースのアッセイにおけるＴＬＲ９の結合および活性化に関係するものとする。
【０１１３】
ヌクレオチド配列から構成されるＴＬＲ９リガンドを、一般に本発明の免疫原組成物の指向性アジュバント成分に、たとえばＳｏｌｕｌｉｎｋから市販されているキットを用いる化学的カップリングによりカップリングさせる。ペプチド系ＴＬＲ９リガンドは、標準的なペプチド化学を用いてカップリングさせることができ、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて統合させることができる。
【０１１４】
代表的なＴＬＲ９リガンドは、ＯＤＮ  ２２１６２８（グループ１）、ＯＤＮ  ２００６／ＯＤＮ  ２００７２１（グループ２）およびＣｐＧ−Ｍ３６２１９（グループ３）である。
【０１１５】
さらなる代表的なＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニストの作用を模倣するペプチド、たとえばペプチドライブラリーにより同定されるかまたはそれから得られ、ＴＬＲ９を結合する親和性について選択され、かつアゴニスト活性が立証されたもの、あるいは特異的抗体を含めたタンパク質系リガンドであってもよい。
【０１１６】
ＴＬＲ９のリガンドまたはアゴニストの機能は、適切なアッセイ法で、たとえば下記の方法で判定できる：ｐＤＣをTel et al２９の記載に従って健康なドナーの血液から精製し、次いで適宜な濃度のＬＲ９リガンドと共にインキュベートする。２４時間後、上清中のＩＦＮａを標準ＥＬＩＳＡプロトコルにより測定する。細胞の成熟状態を判定するために、ＬＲ９リガンドとのインキュベーションの前および後に市販の特異的抗体による標準ＦＡＣＳ法を用いてＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６発現についてｐＤＣを染色する。
【０１１７】
本発明によるワクチンに曝露された際に活性化される反応性Ｔ細胞の数は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＦＡＣＳ分析、サイトカイン放出、またはＴ細胞増殖アッセイを含めた多数の方法により測定できる。
【０１１８】
本明細書中で用いる用語“特異性”または“特異的結合”は、不均質な分子集団中の目的とするコグネイトリガンドの決定要因である結合反応を表わす。したがって、指定した条件（たとえば、イムノアッセイ条件）下で、１以上の抗原に結合剤のそれぞれの結合部位（単数または複数）が結合し、その結合剤は試料中に存在する他の分子に有意量では結合しない。特異的結合とは、選択に応じて、ターゲット同一性、高い、中等度もしくは低い結合親和性または結合力(avidity)に関して結合が選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は結合定数または結合動態が少なくとも１０倍の差である場合に達成され、その差は好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である。この用語が１種類以上の異なる抗原を特異的に認識する交差反応性または多重特異性の結合剤をも表わすことは十分に理解される。
【０１１９】
本明細書中で用いる用語“処置”は、常に、対象を予防目的で処置すること（すなわち、感染症および／または病状を阻止すること）または治療目的で処置すること（すなわち、疾患をそれらの病因に関係なく処置すること）を表わすものとする。対象の処置は、ガストリン依存性腫瘍またはガストリン依存性癌を含めた癌性の病状の場合は一般に治療的であろう。しかし、疾患進行のリスクまたは二次的病状もしくは副作用の発生のリスクをもつ一次疾患、たとえば内因性ガストリン産生のガストリン作用に依存する疾患に罹患している患者の場合は、その処置は予防的である可能性がある。
【０１２０】
処置は、本発明による免疫原組成物またはワクチンを唯一の予防剤または治療剤として、あるいはたとえば化学療法を含むいずれか適切な手段、または制酸剤の使用と組み合わせて、行なうことができる。
【０１２１】
癌療法の場合、追加の療法処置には、たとえば外科的切除、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、抗腫瘍ワクチン、抗体ベースの療法、全身照射、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、および化学療法剤の投与が含まれる。
【０１２２】
これに関して、たとえば化合物または処置の組合わせについて本明細書中で用いる用語“組合わせ”は、具体的には対象を随伴、同時、並行または連続処置することを表わす。
【０１２３】
処置のために、本発明による免疫原組成物またはワクチンを一度に投与することができ、あるいは個々の構成要素に分割して、および／またはより少ない用量で多数回に分割して時間間隔をおいて投与することができる。ワクチンは一般に０．１〜５００μｇ／ｍＬの濃度で、たとえば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、経口、吸入により、または鼻腔内に、ミョウバンなどの追加アジュバントと共に、またはアジュバントなしで投与される。厳密な投与量および処置期間が処置される疾患の関数であり、既知の試験プロトコルを用いるかまたはインビボもしくはインビトロ試験データからの外挿により経験的に決定できることは理解される。
【０１２４】
本発明の免疫原組成物またはワクチンは、いずれか適切な手段およびそれぞれの配合物により投与でき、それには非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）注射、または関節などの患部内、または腫瘍内もしくはその周囲への局所注射のためのものが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、ワクチンは筋肉内、皮下または皮内注射用の配合物で提供される。
【０１２５】
本発明はまた、本発明によるワクチンを予め装填した送達デバイス、たとえば注射器を提供する。
【０１２６】
一般に対象を本発明によるワクチンの初回注射により初回抗原刺激する際、１回以上のブースター注射をある期間にわたって同一または異なる投与経路で実施できる。多数回注射を採用する場合、後続注射は前回の注射の１〜５２週間以内、またはさらにそれ以上で行なうことができる。
【０１２７】
ワクチンは一般に、希釈剤、たとえば水、塩類溶液、グリセロール、エタノールなどを含有することができる。さらに、助剤、たとえば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などが賦形剤中に存在してもよい。一般に、本発明によるワクチンは、注射用として液剤もしくは懸濁液剤で、または投与前に液体ビヒクルに溶解もしくは懸濁するのに適した固体剤形で、調製される。製剤は乳化またはリポソーム封入されてもよい。
【０１２８】
本発明によるワクチンの投与は、免疫応答を増強するために、適切にはさらにいずれかのＴＬＲ９アゴニストおよび／またはさらなるアジュバント手段と、たとえば同一配合物中の別個のものとして、または別個の配合物として組み合わせることができる。
【０１２９】
Ｔｈ１免疫応答の増強には、Ｔｈ１免疫応答に関連する１種類以上のサイトカイン（たとえば、ＩＦＮγ）の増加、および活性化マクロファージの増加を含めることができる。
【０１３０】
Ｔｈ１免疫応答の増強には、１種類以上の抗原特異的ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体の増加を含めることができる。
【０１３１】
たとえば、本発明による免疫原組成物またはワクチンを、１種類以上のアジュバントおよび／または医薬的に許容できる賦形剤と一緒にすることができる（たとえば、化学的に、または組換えにより連結させる、親和性結合により結合させる、または別個の成分の混合物）。本発明によるワクチンは、１種類以上の医薬的に許容できる賦形剤またはビヒクル、たとえば水、塩類溶液、グリセロール、エタノールなどを含有することができる。さらに、助剤、たとえば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などがそのようなビヒクル中に存在してもよい。アジュバントは、具体的にはワクチンの有効性を高めるために使用できる。アジュバントをワクチン組成物に直接添加してもよく、あるいは別個に、ワクチン投与と同時または直後に投与してもよい。
【０１３２】
適切なアジュバントには、免疫原に対する免疫応答を編成するのに役立つサイトカインおよび類似の化合物が含まれる。本明細書中で用いる用語“サイトカイン”は、ナノモルないしピコモル濃度で体液性調節物質として作用し、正常状態または病的状態のいずれかで個々の細胞および組織の機能活性を調節する広域グループの可溶性タンパク質およびペプチドに対する総称として用いられる。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接仲介し、細胞外環境で起きるプロセスを調節する。
【０１３３】
サイトカインの例には、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦが含まれる。
【０１３４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドも、各エピトープの提示と組み合わせてアジュバントとして使用できる。他のアジュバントには、ミョウバン、（不）完全フロイントアジュバント、百日咳菌(B. pertussis)、またはそれの毒素ＩＣ３１などが含まれる。
【０１３５】
免疫原組成物の成分、すなわち指向性アジュバント成分、たとえばＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバント、ならびに免疫原成分、たとえば第１ペプチド  アルファ−ヘリックスにマッチする第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したペプチド免疫原、ならびに免疫原組成物もしくはワクチン、またはそれのいずれかの結合部分もしくはリガンド、ならびに免疫原（コイルリピートを含むもの、または含まないもの）は、当技術分野で既知の多様な方法により、たとえば細胞培養からの精製もしくは単離、組換え技術、または化学合成により得ることができる。
【０１３６】
特定の態様によれば、免疫原組成物ならびに／あるいはその指向性アジュバント成分および／または免疫原成分は、組換えポリペプチドとして、たとえば組換えＤＮＡ技術により調製される。本明細書中で用いる用語“組換え体”は、宿主細胞に天然には存在しない分子または構築体を表わす。ある態様において、組換え核酸分子は、天然では起きない様式で互いに連結した２以上の天然配列を含む。組換えタンパク質は、組換え核酸によりコードおよび／または発現されるタンパク質を表わす。ある態様において、“組換え細胞”は、計画的な人的介入により、天然（すなわち、非組換え）形態の細胞内に同一形態ではみられない遺伝子を発現し、ならびに／あるいは他の場合には異常に過剰発現、過小発現し、および／または全く発現しない天然遺伝子を発現する。組換え細胞は、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。“組換え(recombination)”、“組み換える(recombining)”、および“組換え(recombined)”核酸の作製は、一般に少なくとも２つの核酸フラグメントのアセンブリーを包含する。特定の態様において、組換えタンパク質および組換え核酸は機能性を維持する；すなわち、宿主細胞においてそれらの活性を保持し、または増強された活性を示す。
【０１３７】
したがって本発明はさらに、免疫原組成物またはその成分の調製、およびそのような調製のための組換え手段に関するものであり、それにはそのアミノ酸配列をコードする核酸、発現すべきアミノ酸配列をコードする核酸を含む発現カセット、ベクターまたはプラスミド、およびいずれかのそのような手段を含む宿主細胞が含まれる。適切な標準的組換えＤＮＡ法は当技術分野で既知であり、特にSambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989), 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory press)に記載されている。
【０１３８】
本明細書中で、用語“対象”は、ヒト、または家畜、愛玩動物および実験動物を含めた哺乳動物対象、特にヒトを含むと解釈され、それらは特定の病状に罹患している患者または健康な対象のいずれかである。
【０１３９】
本発明はさらに、本発明の免疫原組成物を調製するための成分のキット、たとえばそれらの成分を充填した１以上の容器を含む医薬キットを提供する。それらのキットを前記方法に使用できる。特定の態様において、キットはさらに、免疫原組成物の成分または調製した本発明の免疫原組成物もしくはワクチンを使用するための指示を含む。
【０１４０】
具体例によれば、本発明によるワクチンは下記の組換えポリペプチドを含む：
【０１４１】
【化１】
0006395816.tif 000003
【０１４２】
下線を施したＮ末端：ＣＤ３２ａに特異的に結合するＳｃＦＶの配列；
イタリック：リンカー；ｓｃＦｖの作製に一般に用いられる他のいずれかのリンカーを使用できる；
太字：精製のためのＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩ；他のいずれかのタグ、たとえばｆｌａｇタグまたはＨＩＳタグを使用でき、あるいはタグなしでもよく、その場合は精製にはヘプタッドリピート  アルファヘリックスを利用する；
二重下線を施したＣ末端：免疫原中の対応ヘプタッドリピート  アルファヘリックス（ｐｅｐＫ）と共にコイルドコイルを形成するヘプタッドリピート  アルファヘリックス（ｐｅｐＥ）。
【０１４３】
この例（ＳＥＱ  ＩＤ  ４０）には、５つのリピートが用いられている；より多数のリピートは自己凝集を引き起こす可能性があり、より少数のリピート（この場合は４つのリピートを用いた）は親和性が低減する可能性がある。用いたコイルに好ましいリピートの最小関数は３であり、好ましい最大関数は５である２２−２４が、用いるアルファヘリックスのタイプによってはより多数のリピートが可能である。限界はホモダイマー化を誘導し始めるリピート数であろう。こうして、ホモダイマー化を特異的に排除する。
【０１４４】
類似のポリペプチドは、リーダー配列、特異的抗ＣＤ３２部分のアミノ酸配列（たとえば組換えｓｃＦｖ）、リンカー、精製目的のタグ、およびペプチド  アルファ−ヘリックスｐｅｐＥを含むことができる。この構築体（ＴＬＲ９リガンドを含めて、または含めずに）は“弾頭(warhead)”とも呼ばれ、次いでそれを対アルファヘリックスｐｅｐＫに連結した免疫原との組合わせによりワクチンの構築に使用できる。
【０１４５】
他の特定の例によれば、抗ＣＤ３２部分はＳＥＱ  ＩＤ  ４１：ＡＤＧＡＷＡＷＶＷＬＴＥＴＡＶＧＡＡＫの配列をもつ抗ＣＤ３２ａペプチド３０であり、ＳｃＦｖの代わりに用いられる。
【０１４６】
さらなる例によれば、安定なコイルドコイルが弾頭ＳｃＦｖと免疫原の間で樹立する。
【０１４７】
ＰＢＭＣをそのような免疫原またはワクチンで効果的に刺激できることが証明された。
【０１４８】
さらなる例において、弾頭は抗原提示の増強を仲介することが示された。コイル（ｐｅｐＫコイル）をもつ免疫原が、対応コイル（ｐｅｐＥコイル）をもつ弾頭と相互作用した場合、Ｔ細胞が効果的に刺激された。
【０１４９】
さらなる例には、コイルドコイルによりＧ１２ペプチド免疫原に連結した抗ＣＤ３２  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３２ａペプチドのいずれかを用いた弾頭を使用した、マウスモデルおよびアカゲザルモデルにおける膵臓癌の処置を記載する。アカゲザルモデルにおける食欲低減および食欲管理を記載する。
【０１５０】
したがって、本発明は新規な免疫原組成物およびワクチンならびにそれぞれの用途を提供する。
【０１５１】
以上の記載は、以下の例を参照するとより十分に理解されるであろう。ただし、それらの例は本発明の１以上の態様を実施する方法の代表例にすぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：代表的な結合剤
ＣＤ３２結合領域，本明細書中で抗ＣＤ３２部分またはＣＤ３２結合剤とも呼ぶ：
ＣＤ３２ａ結合剤：ＣＤ３２ａに特異的に結合する抗体：ｍＡｂ  ＩＶ．３３１
ｍＡｂ  ＩＶ．３に由来するＳｃＦＶ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４２）
【０１５３】
【化２】
0006395816.tif 000004
【０１５４】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
普通タイプのセット：フレキシブルリンカー（いずれのリンカーであってもよい）
抗ＣＤ３２ａペプチド：３０
（ＳＥＱ  ＩＤ  ４３）：  ＡＤＧＡＷＡＷＶＷＬＴＥＴＡＶＧＡＡＫ
グループＣＤ３２ａ＋ｂ結合剤：
ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂに特異的に結合する抗体：ｍＡｂ  ＡＴ−１０（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ＡＴ−１０に由来するＳｃＦＶ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４４）
【０１５５】
【化３】
0006395816.tif 000005
【０１５６】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
普通タイプのセット：フレキシブルリンカー（いずれのリンカーであってもよい）
ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４５）
【０１５７】
【化４】
0006395816.tif 000006
【０１５８】
（  ）内はヒンジ領域であり、除外してもよい
下線：ＣＨ２ドメイン
太字：ＣＨ３ドメイン
ＴＬＲ９結合領域または結合部分，本明細書中でＴＬＲ９結合剤またはＴＬＲ９リガンドとも呼ぶ
ＣｐＧクラスＡ
グループＣｐＧ−Ａ：
ＯＤＮ２２１６：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４６）：  ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
ＣｐＧクラスＢ
グループＣｐＧ−Ｂ：
天然リガンド：
ＯＤＮ２００６：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４７）：  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ
ＣｐＧクラスＣ
グループＣｐＧ−Ｃ：
ＯＤＮＭ３６２：（ＳＥＱ  ＩＤ  ４８）：  ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ
コイルを含む代表的なＣＤ３２結合用生成物
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）：  （ＳＥＱ  ＩＤ  ４９）
【０１５９】
【化５】
0006395816.tif 000007
【０１６０】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
普通タイプのセット：フレキシブルリンカー（いずれのリンカーであってもよい）
イタリック：ｐｅｐＥコイル  ＋  Ｃ’  ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩ配列および“ＧＰ”リンカー（いずれのフレキシブルリンカーであってもよい）（ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩを排除してもよく、あるいはＨＩＳタグまたは他のいずれかのタグにより置き換えてもよい）
ＳｃＦＶ−コイル２（ＡＴ１０）：（ＳＥＱ  ＩＤ  ５０）
【０１６１】
【化６】
0006395816.tif 000008
【０１６２】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
普通タイプのセット：フレキシブルリンカー（いずれのリンカーであってもよい）
イタリック：ｐｅｐＥコイル  ＋  Ｃ’のＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩ配列および“ＧＰ”リンカー（いずれのフレキシブルリンカーであってもよい）（ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩを排除してもよく、あるいはＨＩＳタグまたは他のいずれかのタグにより置き換えてもよい）
ペプチド−コイル：（ＳＥＱ  ＩＤ  ５１）
【０１６３】
【化７】
0006395816.tif 000009
【０１６４】
イタリック：ｐｅｐＥコイル  ＋  “ＧＰ”リンカー（いずれのフレキシブルリンカーであってもよい）
ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント−コイル：（ＳＥＱ  ＩＤ  ５２）
【０１６５】
【化８】
0006395816.tif 000010
【０１６６】
（  ）内はヒンジ領域であり、除外してもよい
下線：ＣＨ２ドメイン
太字：ＣＨ３ドメイン
イタリック：ｐｅｐＥコイル  ＋  “ＧＰ”リンカー（いずれのフレキシブルリンカーであってもよい）。
【０１６７】
ＣＤ３２結合剤に化学架橋するためのＳＨ基をもつ代表的なＴＬＲ９結合生成物
グループＣｐＧ−Ａ：
【０１６８】
【化９】
0006395816.tif 000011
【０１６９】
太字：ＳｃＦＶ−コイルに化学架橋するためのＳＨ基をもつフレキシブルリンカー（いずれかのリンカー、および化学架橋に適したいずれかの化学反応基、たとえばＮＨ２であってもよい）
グループＣｐＧ−Ｂ：
天然リガンド：
【０１７０】
【化１０】
0006395816.tif 000012
【０１７１】
太字：ＳｃＦＶ−コイルに化学架橋するためのＳＨ基をもつフレキシブルリンカー（いずれかのリンカー、および化学架橋に適したいずれかの化学反応基、たとえばＮＨ２であってもよい）
グループＣｐＧ−Ｃ：
【０１７２】
【化１１】
0006395816.tif 000013
【０１７３】
太字：ＳｃＦＶ−コイルに化学架橋するためのＳＨ基をもつフレキシブルリンカー（いずれかのリンカー、および化学架橋に適したいずれかの化学反応基、たとえばＮＨ２であってもよい）。
【０１７４】
代表的な弾頭、すなわちＣＤ３２結合剤およびＴＬＲ９結合剤を含む構造体
ＣＤ３２結合剤のグループからのいずれかの代表例をいずれかの方法によりＴＬＲ９結合剤のグループの代表例と化学結合させたもの；好ましくは、ＴＬＲ９結合剤をたとえばＣＤ３２結合剤中にある複数のリジン（Ｋ）にカップリングさせる。種々のＴＬＲ９結合剤、たとえば天然またはペプチド系のＣｐＧ−Ｂ結合剤の混合物をカップリングさせることもできる。
【０１７５】
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ４９）
【０１７６】
【化１２】
0006395816.tif 000014
【０１７７】
コイル構造（イタリック）中の複数のリジンが好ましい
または
ペプチド−コイル：（ＳＥＱ  ＩＤ  ５１）
【０１７８】
【化１３】
0006395816.tif 000015
【０１７９】
コイル構造中の複数のリジン（イタリック）が好ましい。
【０１８０】
実施例２：腫瘍学におけるテクノロジープラットフォームの利用
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）  ＋  ＯＤＮＭ３６２に基づく弾頭、ならびにアカゲザルおよびカニクイザルに由来する免疫原Ｇ１７（Ｇ１７ＲＭ）。以下においてｐＥはｐｙｒｏＧｌｕであると解釈する。
【０１８１】
ヒト免疫原リトルガストリンの配列（Ｇ１７Ｈ，最初の１３個のＡＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ９）：
【０１８２】
【化１４】
0006395816.tif 000016
【０１８３】
アカゲザルおよびカニクイザル免疫原リトルガストリンの配列（Ｇ１７ＲＭ，最初の１３個のＡＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ５３）：
ｐＥＧＰＷＭＥＥＥＥ  ＡＡＹＧ
マウス免疫原リトルガストリンの配列（Ｇ１７Ｍ，最初の１３個のＡＡ，ＳＥＱ  ＩＤ  ５４）：
【０１８４】
【化１５】
0006395816.tif 000017
【０１８５】
太字はＧ１７ＲＭに対する相異。
【０１８６】
最終生成物免疫原Ｇ１７ＲＭ＿１−コイルおよびＧ１７Ｈ＿１−コイル：
Ｇ１７ＲＭ＿１−コイル，ＳＥＱ  ＩＤ  ５５：
【０１８７】
【化１６】
0006395816.tif 000018
【０１８８】
Ｇ１７Ｈ＿１−コイル，ＳＥＱ  ＩＤ  ５６
【０１８９】
【化１７】
0006395816.tif 000019
【０１９０】
太字：リンカー（いずれのリンカーであってもよい）
イタリック：弾頭との相互作用のためのｐｅｐＫコイル
そのまま使用できる（最終生成物）ＴＹＧ１００＿１ＲＭおよびＴＹＧ１００＿１Ｈ
前記の弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１  ＩＶ．３に基づくもの）と、Ｇ１７ＲＭ＿１−コイルまたはＧ１７Ｈ＿１−コイルとを、Ｇ１７遊離免疫原が存在することなく１００％の弾頭がＧ１７ＲＭ＿１−コイルまたはＧ１７Ｈ＿１−コイルと複合体形成することを示す比率（約１：１のモル比）で混合し、ミョウバン上に配合する。それにより、ＴＹＧ１００＿１ＲＭおよびＴＹＧ１００＿１Ｈが生成する。
【０１９１】
実施例３  ガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌を処置するためのＴＹＧ１００＿１ＲＭ：
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、０日目、１４日目および３５日目の３回、アカゲザルＧ１７を含むＴＹＧ１００＿１ＲＭまたはＧ１７＿１ＲＭ（弾頭なし）で免疫化した（５８，４μｇ／ショット，０．５ｍｌ中）。最終免疫化の２週間後、血清を採取し、Ｇ１７ＲＭ、Ｇ１７ＨおよびＧ１７Ｍ（＝マウス由来Ｇ１７）に対するＩｇＧ抗体の存在を分析した。
【０１９２】
【表２】
0006395816.tif 000020
【０１９３】
表１は、すべてのマウスがワクチンの２成分（弾頭およびＧ１７ＲＭ）に対するＩｇＧで応答したことを示す。重要なことに、すべてのマウスが、ヒトＧ１７と交差反応し、かつより軽度にマウスＧ１７（Ｇ１７Ｍ）と交差反応する、ＩｇＧを産生した。後者は注目に値する；マウスＧ１７の最初の１３個のアミノ酸
【０１９４】
【化１８】
0006395816.tif 000021
【０１９５】
はＧ１７ＲＭと３個のアミノ酸が異なり（相異を太字で示し、下線を施した）、Ｇ１７Ｍはマウスにとって自己抗原だからである。したがって、Ｇ１７Ｍを認識する抗体は自己抗体であり、これはＴＹＧ１００＿１ＲＭが自己抗原Ｇ１７Ｍに対する自然免疫寛容を破壊できたことの指標となる。弾頭なしのＧ１７ペプチドで免疫化した場合はＧ１７に対する応答がなかった。
【０１９６】
ワクチンが自己免疫応答を誘導する能力は、抗癌ワクチンの前提条件である；この場合、すべての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、過剰発現した、たとえば腫瘍細胞に過剰発現した、自己抗原である。したがって、ＴＹＧ１００＿１ＲＭの弾頭を免疫原としてのヒトＧ１７と組み合わせたものからなるワクチンは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓癌を処置するためのワクチンとして使用できる。
【０１９７】
実施例４：ペプチド免疫原のダイマーを含む代表的生成物
最終生成物  免疫原Ｇ１７ＲＭ＿２−コイルおよびＧ１７Ｈ＿２−コイル：
Ｇ１７ＲＭ（リトルガストリンの最初の１３個のＡＡ）のダイマーを、これら２つのペプチドを１つのｐｅｐＫコイルに連結させる特殊なフレキシブルリンカーを用いて化学合成した。
【０１９８】
Ｇ１７ＲＭ＿２−コイル：（ＳＥＱ  ＩＤ  ５７：  ＳＥＱ  ＩＤ  ５３のアカゲザル  ガストリンペプチド２つ、分枝リンカー配列、およびペプチド  アルファ−ヘリックスを含む、本発明の免疫原（ＴＹＧ１００＿２ＲＭ）の一部。この部分をコイルド−コイル連結によって適切な指向性アジュバントに連結させることができる）
【０１９９】
【化１９】
0006395816.tif 000022
【０２００】
太字：特殊なフレキシブルリンカー（３種類のペプチドを結合するいずれのリンカーであってもよい）
イタリック：弾頭との相互作用のためのｐｅｐＫコイル
Ｇ１７Ｈ＿２−コイル：（ＳＥＱ  ＩＤ  １１：  ＳＥＱ  ＩＤ  ９のヒト  ガストリンペプチド２つ、分枝リンカー配列、およびペプチド  アルファ−ヘリックスを含む、本発明の免疫原（ＴＹＧ１００＿２Ｈ）の一部。この部分をコイルド−コイル連結によって適切な指向性アジュバントに連結させることができる）
【０２０１】
【化２０】
0006395816.tif 000023
【０２０２】
太字：特殊なフレキシブルリンカー（３種類のペプチドを結合するいずれのリンカーであってもよい）
イタリック：弾頭との相互作用のためのｐｅｐＫコイル
最終生成物  ＴＹＧ１００＿２ＲＭおよびＴＹＧ１００＿２Ｈ
前記の弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１；ＩＶ．３に基づくもの）と、Ｇ１７ＲＭ＿２−コイルまたはＧ１７Ｈ＿２−コイルとを、Ｇ１７遊離免疫原が存在することなく１００％の弾頭がＧ１７ＲＭ＿２−コイルまたはＧ１７Ｈ＿２−コイルと複合体形成することを示す比率で混合し（約１：１のモル比）、ミョウバン上に配合する。それにより、ＴＹＧ１００＿２ＲＭおよびＴＹＧ１００＿２Ｈが生成する。
【０２０３】
実施例５  ガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌を処置するためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、０日目、１４日目および３５日目の３回、アカゲザルＧ１７の最初の１３個のイムノ酸を含むＴＹＧ１００＿２ＲＭで免疫化した（６６．８μｇ／ショット，０．５ｍｌ中）。最終免疫化の２週間後、血清を採取し、Ｇ１７ＲＭ、Ｇ１７ＨおよびＧ１７Ｍ（＝マウス由来Ｇ１７）に対するＩｇＧ抗体の存在を分析した。
【０２０４】
【表３】
0006395816.tif 000024
【０２０５】
表２は、すべてのマウスがワクチンの２成分（弾頭およびＧ１７ＲＭ）に対するＩｇＧで応答したことを示す。重要なことに、すべてのマウスが、ヒトＧ１７と交差反応し、かつより軽度にマウスＧ１７（Ｇ１７Ｍ）と交差反応する、ＩｇＧを産生した。後者は注目に値する；マウスＧ１７の最初の１３個のアミノ酸
【０２０６】
【化２１】
0006395816.tif 000025
【０２０７】
はＧ１７ＲＭと３個のアミノ酸が異なり（相異を太字で示し、下線を施した）、Ｇ１７Ｍはマウスにとって自己抗原だからである。したがって、Ｇ１７Ｍを認識する抗体は自己抗体であり、これはＴＹＧ１００＿２ＲＭが自己抗原Ｇ１７Ｍに対する自然免疫寛容を破壊できたことの指標となる。弾頭なしのＧ１７ペプチドで免疫化した場合はＧ１７に対する応答がなかった。
【０２０８】
ワクチンが自己免疫応答を誘導する能力は、抗癌ワクチンの前提条件である；この場合、すべての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、腫瘍細胞に過剰発現した自己抗原である。したがって、ＴＹＧ１００＿２ＲＭの弾頭を免疫原としてのヒトＧ１７と組み合わせたものからなるワクチンは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓癌の処置のためのワクチンとして使用できる。ＴＹＧ１００＿２ＲＭにより誘導された、３タイプすべてのＧ１７に対する応答がＴＹＧ１００＿１ＲＭにより誘導されたもの（表１）より強力であり、これはワクチンにおいてダイマーが好ましいことの指標となる。
【０２０９】
実施例６  ガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌を処置するためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
０日目、１４日目および２８日目に、６匹のカニクイザルをＴＹＧ１００＿２ＲＭで免疫化し、６匹をＧ１７ＲＭ＿２−コイルで免疫化した。０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に、血清を自己リトルガストリン（Ｇ１７ＲＭ）、ヒト由来のリトルガストリン（Ｇ１７Ｈ）、ガストリンと類似のＭＷをもつ無関係な対照ペプチド（対照ペプチド）に対する、または弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１）に対するＩｇＧ抗体の存在について、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）の多重ＥＬＩＳＡシステムを用いて、ＭＳＤマニュアルに従って分析した。
【０２１０】
図１において、６匹すべての動物が弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１）ならびにＧ１７ＲＭおよびＧ１７Ｈに対して強い時間依存性ＩｇＧ応答を示し、対照ペプチドに対しては応答がみられなかったたことが分かる。３回の免疫化後のＧ１７ＲＭに対する応答は、ＳｃＦＶ−コイル１に対する応答の７５％であった。Ｇ１７ＲＭはわずか約１．２ｋＤａの１００％自己タンパク質であるのに対してＳｃＦＶ−コイル１は＞３０ｋＤａの１００％同種異系タンパク質であるので、これは驚異的である。抗Ｇ１７ＲＭ抗体はＧ１７Ｈと強く交差反応する。弾頭なしのＧ１７ＲＭ＿２−コイルペプチドを用いた場合、Ｇ１７ＲＭに対する応答はなかった。４２日目と５６日目の間でのＩｇＧ力価の低下は、ＳｃＦＶに対するものよりＧ１７ＲＭに対する方がより大きく、これはＩｇＧ抗体のその部分が内因性Ｇ１７により中和されたことの指標となる。重要なことに、内因性Ｇ１７の存在はＧ１７ＲＭに対する免疫応答をブーストしなかった。
【０２１１】
図１のデータは、ワクチンが可逆性の真正自己抗体応答を誘導できたことを示す。これは抗癌ワクチンの前提条件である；腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、過剰発現した、たとえば腫瘍細胞に過剰発現した自己抗原であるが、より低いレベルで正常で健康な細胞にも存在するからである。したがって、ＴＹＧ１００＿２ＲＭまたはＴＹＧ１００＿２Ｈなどのワクチンは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓癌の処置に使用できる。癌が完全に治癒すると処置を停止することができ、誘導された抗Ｇ１７抗体は循環から消失するであろう。定常状態を維持するために（処置期間中）、ワクチンの反復注射により自己免疫応答をブースターする必要がある。このタイプのワクチンで、不可逆的な自己免疫疾患が誘導されることはない。
【０２１２】
実施例７：肥満症の処置のためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
実施例３からの動物をそれらの食欲についてモニターし、０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に体重を測定した。ＴＹＧ１００＿２ＲＭを２回注射した後、６匹中４匹の動物がそれらの毎日のスナック（ビスケット）に関心を失ない、それに対して基本的な食物摂取は正常なままであった。これに伴なって有意の体重減少が生じた（図２）が、望ましくない副作用は記録されなかった。これまで、そのような所見は弾頭とコイルドコイルの相互作用に基づくワクチンを用いた他のワクチン接種、たとえばガストリン免疫原以外の免疫原をターゲティングするもの（データは示していない）では決して得られなかった。
【０２１３】
これらのデータは、ＴＹＧ１００＿２ＲＭが健康な生活に必要な基本的食物摂取に影響を及ぼすことなくスナック（食間）に対する欲求を低減することの指標となる。動物は普通に活動し、満足そうであった。したがって、ＴＹＧ１００＿２ＲＭは肥満症の処置に使用できる。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］下記のものを含む免疫原組成物：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに巻き付いた第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
［態様２］ペプチド免疫原が下記のものを含むかまたは下記のものからなる線状ペプチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ６のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ７、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ８のアミノ酸配列；または
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２もしくは９のアミノ酸配列；
態様１に記載の免疫原組成物。
［態様３］第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した少なくとも２つのペプチド免疫原、好ましくは２、３または４つのペプチド免疫原を含む、態様１または２に記載の免疫原組成物。
［態様４］第１および第２−アルファ−ヘリックスがそれぞれ、３〜５個のアミノ酸のリピートのアミノ酸モチーフ、特に互いに１０−６未満のＫｄで結合するものを含む、態様１〜３のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様５］抗ＣＤ３２部分が、抗ＣＤ３２抗体、抗体フラグメントおよびペプチド、好ましくはＣＤ３２ａをターゲティングするものからなる群から選択される、態様１〜４のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様６］ＴＬＲ９リガンドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド  クラスＡ、ＢおよびＣ、またはいずれかのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを模倣する免疫刺激ペプチドからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである、態様１〜５のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様７］好ましくはグリシンおよび／またはセリンおよび／またはリジン残基から構成される１以上のリンカー配列、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  １２または１３のアミノ酸配列を含む、態様１〜６のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様８］ＳＥＱ  ＩＤ  １０またはＳＥＱ  ＩＤ  １１のアミノ酸配列を含む、態様１〜７のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様９］態様１〜８のいずれか１に記載の免疫原組成物、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、ワクチン。
［態様１０］下記の成分を含む、態様１〜８のいずれか１に記載の免疫原組成物を調製するためのキット：
ａ．  少なくとも、ＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結した抗ＣＤ３２部分を含む、指向性アジュバント；ならびに
ｂ．  第１ペプチド  アルファ−ヘリックスにマッチする第２ペプチド  アルファ−ヘリックスに連結したガストリン−１７ペプチド免疫原であって、下記のいずれかであるペプチド免疫原；
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １のアミノ酸配列を含むヒト  ガストリン−１７、もしくはそのフラグメントであってＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列を含むもの、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２の少なくとも４個のＮ末端アミノ酸；
（ｉｉ）（ｉ）のアナログであって、好ましくはアカゲザルもしくはネズミに由来するもの；および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかの機能活性バリアントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ２のアミノ酸配列に１、２、３もしくは４つの点変異をもつもの。
［態様１１］ガストリン依存性疾患、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性癌、たとえば膵臓癌、胃潰瘍、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）または肥満症に罹患している対象の処置に使用するための、態様１〜８のいずれか１に記載の免疫原組成物。
［態様１２］プライム−ブースト方式を用いて組成物を有効量で対象に投与する、態様１１に従って使用するための免疫原組成物。
［態様１３］組成物を１回当たり０．０００１〜２ｍｇの範囲の有効量で対象に投与する、態様１１または１２に従って使用するための免疫原組成物。
［態様１４］対象をさらに化学療法により処置する、態様１１〜１３のいずれか１に従って使用するための免疫原組成物。
［態様１５］対象において、ヒト  ガストリン−１７に対して好ましくは少なくとも１／１０００の血清ＩｇＧ力価を伴なう防御免疫応答を誘発する、態様１１〜１４のいずれか１に従って使用するための免疫原組成物。
【０２１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【配列表】
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