(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物とリガンドを含む複合体を有する造影剤の製造方法であって、
前記化合物と前記リガンドを反応させて前記複合体を得る反応工程と、
未反応の前記化合物を水中で吸着材に吸着させる精製工程と、を有し、
前記精製工程が、前記吸着材に吸着した未反応の前記化合物を除去する工程を有し、
前記化合物を除去する工程において、沈降、遠心分離、もしくはフィルターろ過の少なくとも１つの手段によって、前記吸着材に吸着した未反応の前記化合物が除去されることを特徴とする造影剤の製造方法。
【化１】
0006395461.tif 000012
（上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに独立にＣＨ、またはＣＲ１５であり、Ｒ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよく、
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ａ１１およびＢ１１は、互いに独立に直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキレン基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｘ１１およびＹ１１は、互いに独立にスルホ基またはリンカー基であり、前記リンカー基は−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。）
【請求項２】
前記吸着材が疎水性の材料を有することを特徴とする請求項１に記載の造影剤の製造方法。
【請求項３】
前記吸着材が、アリール基を有する材料、炭素数４以上のアルキル基を有する材料、アクリル基を有する材料からなる群より選択される少なくとも１種を有することを特徴とする請求項１または２に記載の造影剤の製造方法。
【請求項４】
前記吸着材がアリールアガロース、アリール有機ポリマー樹脂、アルキルアガロース、アルキル有機デキストランおよびアクリル基を有する樹脂、からなる群より選択される少なくとも１種を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の造影剤の製造方法。
【請求項５】
前記吸着材がフェニルアガロース、ブチルアガロース、オクチルアガロース、アリルデキストランおよびメチレンビスアクリルアミドゲルからなる共重合体およびエチレングリコールおよびメタクリレートからなる共重合体、からなる群より選択される少なくとも１種を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の造影剤の製造方法。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物とリガンドを含む複合体を有する造影剤の製造方法であって、
前記化合物とリガンドを反応させて複合体を得る反応工程と、
未反応の前記化合物を水中で吸着材に吸着させる精製工程と、を有し、
前記吸着材がアリールアガロース、アリール有機ポリマー樹脂、アルキルアガロース、アルキル有機デキストランおよびアクリル基を有する樹脂、からなる群より選択される少なくとも１種を有することを特徴とする造影剤の製造方法。
【化２】
0006395461.tif 000013
（上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに独立にＣＨ、またはＣＲ１５であり、Ｒ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよく、
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ａ１１およびＢ１１は、互いに独立に直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキレン基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｘ１１およびＹ１１は、互いに独立にスルホ基またはリンカー基であり、前記リンカー基は−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。）
【請求項７】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物とリガンドを含む複合体を有する造影剤の製造方法であって、
前記化合物と前記リガンドを反応させて複合体を得る反応工程と、
未反応の前記化合物を水中で吸着材に吸着させる精製工程と、を有し、
前記吸着材がフェニルアガロース、ブチルアガロース、オクチルアガロース、アリルデキストランおよびメチレンビスアクリルアミドゲルからなる共重合体およびエチレングリコールおよびメタクリレートからなる共重合体、からなる群より選択される少なくとも１種を有することを特徴とする造影剤の製造方法。
【化３】
0006395461.tif 000014
（上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに独立にＣＨ、またはＣＲ１５であり、Ｒ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよく、
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ａ１１およびＢ１１は、互いに独立に直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキレン基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｘ１１およびＹ１１は、互いに独立にスルホ基またはリンカー基であり、前記リンカー基は−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。）
【請求項８】
前記化合物がインドシアニングリーンであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の造影剤の製造方法。
【請求項９】
前記リガンドが、合成高分子、タンパク質、糖類の少なくとも一つから選ばれることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の造影剤の製造方法。
【請求項１０】
前記リガンドが、ポリエチレングリコール、アルブミンの少なくともいずれか一方である請求項１から９のいずれか１項に記載の造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造影剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に診断ができる光学イメージング方法として、蛍光イメージング法や光音響イメージング法が注目されている。
【０００３】
蛍光イメージング法は蛍光色素に光を照射し、色素が発する蛍光を検出する方法で、広く用いられている。光音響イメージング法は、光を照射された測定対象の分子が放出する熱が起こす体積膨張により生じる音響波の強度と音響波の発生位置を検出することで、測定対象の画像を得る方法である。蛍光イメージング法や光音響イメージング法において、測定対象部位からの蛍光の強度や音響波の強度を大きくするための造影剤として光吸収体が用いられる。ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。例えば、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。造影に用いる光としては照射した際の人体への影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光が好ましい。ＩＣＧは近赤外波長領域の光をよく吸収することから、光学イメージングにおける造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の式１で示される化合物を指す。ただし、対イオンはＮａ＋に限定されず、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。
【化１】
0006395461.tif 000002
【０００４】
ここで、造影剤は、腫瘍などのターゲット部位に集積しやすくするために、蛍光や音響波などの信号を発する物質にリガンドを結合させることがある。
特許文献１には蛍光性官能基を含む診断用マーカに関する材料として、ＩＣＧに類似の構造を有する疎水性色素と、リガンドとして機能すると考えられるタンパク質とからなる複合体を含む造影剤が開示されている。特許文献１では、複合体を得るために、疎水性色素（下記式３）と、ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）とを水溶液中で結合させ、その後、ＰＤ−１０を用いたゲル濾過法によって未反応色素を分離精製している。
【化２】
0006395461.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１２７１１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、本発明者らは特許文献１について課題をみいだした。すなわち、特許文献１に記載の疎水性色素（上記式３）と、リガンドとして、血清由来アルブミンタンパク質を用いて複合体を合成し、ＰＤ−１０による分離を試みた。その結果、未反応色素と複合体との溶出体積差が見られずに両者を分離すことができなかった。これは、精製する際に水中で疎水性色素が凝集して見かけの分子量が大きくなり、特許文献１のように、疎水性色素と、それにリガンドが結合した複合体との分子量の差を利用した精製ができないためと考えられる。
【０００７】
そこで本発明では、疎水性色素とリガンドとを反応させた複合体を含む造影剤を、水中で良好に精製できる造影剤の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、疎水性色素とリガンドを含む複合体を有する造影剤の製造方法であって、
疎水性色素とリガンドを反応させて複合体を得る反応工程と、未反応の前記疎水性色素を水中で吸着剤に吸着させる精製工程と、を有する造影剤の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の吸着剤を用いる吸着工程を適用することで、係る疎水性色素の水中での精製が可能となる。本発明に係る造影剤の製造方法によれば、疎水性色素とリガンドとを反応させた複合体を含む造影剤を、水中で吸着材を用いることで未反応の疎水性色素を吸着させ、複合体の純度の高い造影剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】複合体（シアニン系色素−ＰＥＧ化学結合体）と未反応シアニン系色素の精製の効果を示す電気泳動結果である。
【図２】複合体（シアニン系色素−ＰＥＧ化学結合体）と未反応シアニン系色素のゲルろ過クロマトグラフィー（ＰＤ−１０）によるシアニン系色素の溶出パターンを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
疎水性色素とリガンドとを含む複合体を有する造影剤の製造方法であって、疎水性色素とリガンドとを反応させて複合体を得る反応工程と、未反応の疎水性色素を水中で吸着剤に吸着させる精製工程と、を有する。
疎水性色素とリガンドとは共有結合していてもよいし、水素結合、疎水性結合など非共有結合であってもよい。
【００１２】
前記精製工程は、未反応の疎水性色素を吸着剤に吸着させる工程と、吸着材に吸着した未反応の疎水性色素を除去する工程からなることを特徴とすることができる。
【００１３】
未反応の疎水性色素を吸着剤に吸着させる工程と、吸着材に吸着した未反応の疎水性色素を除去する工程とは、同時、あるいは前後して行われる。
【００１４】
前記吸着材に吸着した未反応のシアニン系色素を除去する工程において、吸着材に吸着した未反応のシアニン系色素の除去が沈降、遠心分離、もしくはフィルターろ過の少なくとも１つの手段から選択されることを特徴とすることができる。
【００１５】
また、吸着材は、疎水性色素を吸着させるために疎水性の材料を有することが好ましい。ここで疎水性の材料とは、例えば、実施例で後述する色素回収率が０．１未満となる程度に疎水性の高い材料である。
【００１６】
また、吸着材が、アリール基を有する材料、炭素数４以上のアルキル基を有する材料、アクリル基を有する材料からなる群より選択される少なくとも１種を有することが好ましい。これらの材料は疎水性が高いからである。
【００１７】
また、吸着材が、アリールアガロース、アリール有機ポリマー樹脂、アルキルアガロース、アルキル有機デキストランおよびアクリル基を有する樹脂、からなる群より選択される少なくとも１種を有することが好ましい。
【００１８】
また、吸着材の具体例として、フェニルアガロース、ブチルアガロース、オクチルアガロース、アリルデキストランおよびメチレンビスアクリルアミドゲルからなる共重合体およびエチレングリコールおよびメタクリレートからなる共重合体、からなる群より選択される少なくとも１種を有することが好ましい。
【００１９】
また、本発明のような水中で色素同士が凝集するという課題は、ナフタレン構造のような疎水性の高い構造を有する色素において生じやすい。ナフタレン構造を有する疎水性色素の例としてシアニン系色素が挙げられる。また、シアニン系色素は近赤外波長帯域に吸収極大を有する物質があり、造影剤として好適に用いられる。シアニン系色素としては、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、より具体的にはＩＣＧまたはその誘導体が例示される。
【化４】
0006395461.tif 000004
【００２０】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに独立にＣＨ、またはＣＲ１５であり、Ｒ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよく、
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４に互いに独立に水素原子、または直鎖もしくは分岐の炭素数１乃至１８のアルキル基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ａ１１およびＢ１１は、互いに独立に直鎖または分岐の炭素数１乃至１８のアルキレン基であり、
上記一般式（Ｉ）において、Ｘ１１およびＹ１１は、互いに独立にスルホ基またはリンカー基であり、リンカー基は−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。
上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、Ｘ１１およびＹ１１を介してリガンドと互いに独立に化学的に結合され得る。リガンドは天然物あるいは非天然物から任意に選択される分子である。
【００２１】
本発明の本発明の一実施形態に係る造影剤の製造方法は以下の工程を有する。
（ａ）反応工程
疎水性色素とリガンドを反応させて複合体を得る反応工程。
（ｂ）精製工程
（ａ）で得た複合体を含む溶液から、未反応の疎水性色素を水中で吸着剤に吸着させる。
【００２２】
非特許文献１（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２２０，Ｉｓｓｕｅ  ３，ｐ．３７３−３８４（１９９７））には、疎水性色素であるＩＣＧの水中での凝集性について記載されている。またＩＣＧは水中で分散状態では７８５ｎｍ付近に吸収極大を示すが、水中で凝集すると、７００ｎｍ付近でも同等以上の吸収を示すようになる。ＩＣＧを界面活性剤やメタノール等の有機溶媒中に溶解させると７００ｎｍ付近の吸収が抑えられ、これらの溶液中では、ＩＣＧは分散性が向上することが示唆される。
【００２３】
しかし、リガンドとなりうるタンパク質等の分子は界面活性剤や有機溶媒に曝されると不可逆的な変性を示し、本来の機能を発揮することが出来なくなる場合があるため、水中の温和な環境下におくことが好ましい。また、診断用マーカとして用いる場合、シアニン系化合物は水溶液の形状で血液中へ投与することが想定される。したがって、水系溶媒中で精製を実施できる本発明の製造方法が有効である。
【００２４】
（反応工程）
本実施形態における反応工程は、疎水性色素とリガンドを含む複合体を有する造影剤を得られるものであれば、反応は特に限定されない。本発明での疎水性色素とは疎水性色素とリガンドとが縮合反応等によって共有結合を形成するような骨格の化学結合体であっても構わない。また、疎水性色素とリガンドとが共有結合を介さない物理的な相互作用を保持力として有する非共有結合複合体の形態でも構わない。
【００２５】
本発明で疎水性色素とリガンドが共有結合を形成する構成においては反応工程で得られる疎水性色素が近赤外に吸収特性（後述）を有していることに加えて、疎水性色素が吸着材と相互作用するものでなければ用いるリガンドに制限はない。
【００２６】
本発明で疎水性色素を含有する非共有結合の複合体を形成する構成においては疎水性色素とリガンドとが共有結合を介さない物理的な相互作用で複合体を形成している。非共有結合の複合体として例えば、静電気な相互作用、疎水的な相互作用、水素結合などの親和力により疎水性色素同士、もしくは疎水性色素素と他の材料とが集合体を形成された物を示す。具体的にはホスファチジルコリンやコレステロールなどのリン脂質から形成されるリポソーム中に上記一般式（Ｉ）のシアニン系色素を内包したものが挙げられる。その他、Ｔｗｅｅｎ−２０などの合成界面活性剤分子で形成されるエマルション中に上記一般式（Ｉ）の疎水性色素を内包したものなどが一例として挙げられる。すなわち、原料となる疎水性色素が吸着材と相互作用をもち、反応工程で得られる疎水性色素が吸着材と相互作用するものでなければ用いるリガンドに制限はない。
【００２７】
本発明におけるリガンドとは、疎水性色素に結合するための分子を指し、リガンドは特に制限はなく、天然物や非天然物から任意に選択することができる。典型的には、リガンドは特定の受容体に特異的に結合する物質のことを指すが、本願明細書では、リガンドが結合することで、ターゲットに到達しやすくなる物質全般を指す。すなわち、一例としては抗体のように腫瘍のような特定ターゲットに結合する物質、腫瘍マーカに結合する物質が挙げられる。その他に、複合体の分子量を大きくすることでＥＰＲ効果を高め、腫瘍に到達、集積しやすくする高分子化合物（合成高分子、タンパク質、糖類など）もリガンドの例として挙げられる。高分子化合物の分子量は特に限定されないが、例えば１０ｋ以上である。なお、リガンドとして生体親和性の高いポリエチレングリコール、アルブミンが好適である。
【００２８】
天然物の一例としては細胞、抗体やアルブミン、コラーゲン、プロテアーゼ、ペプチドやアプタマーなどのタンパク質、アミノ酸や遺伝子配列、デキストランやグルコースなどの糖類、リン脂質やコレステロールなど脂質、などを挙げることができる。加えて天然物には前記で例示された物質を改変したり設計したりした物も含まれる。具体的には酵素処理等で一部分を取り除いたものや別の材料と組み合わせたもの、遺伝工学的な手法で改変処理を施した物なども含まれる。さらにシアニン系化合物が化学結合体である場合には分子に化学結合のための置換基が元来含まれているものであっても化学結合のための置換基をさらに導入したものからも選択することができる。非天然物の一例としてはポリエチレングリコールやポリ乳酸などの合成高分子や界面活性剤、鉄、金、炭素、等の酸化物などの無機化合物などから任意に選択することができる。
【００２９】
本発明の反応工程は必ずしも水溶媒系で実施する必要はない。しかし、次工程の精製工程は水系で行う必要があるため、仮に有機溶媒を用いた場合には有機溶媒を除去する工程を反応工程にさらに含む場合がある。
【００３０】
（精製工程）
本実施形態における精製工程は、疎水性色素とリガンドを反応させた反応液から、未反応の疎水性色素を水中で吸着剤を用いて精製することができれば精製の形態は特に限定されることはない。
【００３１】
本発明における精製工程の一例として下記式４のシアニン系色素と、下記式５のポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと呼ぶことがある）誘導体との縮合反応で下記式６のシアニン系化合物を得る場合を挙げる。この反応系においては、目的物である下記式６の化合物に加えて、原料である下記式４、下記式５および下記式４の水中での副生成物として下記式７の化合物の存在が想定される。例示した反応系において下記式４のシアニン系色素のカルボキシル基と下記式５の化合物の末端のアミノ基とが１：１で縮合する結果としてアミド結合を形成する。そこで一般に下記式５の化合物に対して大過剰量の下記式４の化合物を系中に入れておけば原理的に下記式５の化合物の存在は無視することができるため下記式６の化合物の精製工程としては下記式４の化合物および下記式７の化合物と分離することが必要となる。
【化４】
0006395461.tif 000005
【化５】
0006395461.tif 000006
【化６】
0006395461.tif 000007
【化７】
0006395461.tif 000008
【００３２】
精製工程の一例として、ＩＣＧ（上記式１）内包粒子の精製を挙げられる。この場合に精製の対象となるのは粒子内に内包されていないＩＣＧ分子である。
【００３３】
本発明における精製工程においては吸着剤を用いることにより原料の疎水性色素の吸着除去を行う。具体的な例として上記一般式（Ｉ）で表されるようなナフタレン構造を有するシアニン系色素と吸着材との相互作用を利用した除去を挙げられる。この例においては、シアニン系色素骨格のナフタレン構造に代表される疎水性基と吸着材の疎水性基との疎水性相互作用による吸着現象を利用するものである。
【００３４】
本発明における好適な吸着剤としては疎水性置換基を有する材料であり、シリカ粒子、疎水性ポリマー（ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレンなど）、もしくは水溶性ユニット中に疎水性ユニットがパッチ上に存在するポリマーが好ましい。
【００３５】
一方、タンパク質等をリガンドとして用いる場合など、反応系にタンパク質を含む場合、精製工程中にタンパク質を変性させないために、吸着剤は水溶性骨格中に疎水性ユニットがパッチ上に存在するポリマーであることが特に望ましい。また精製工程で目的物と吸着材との分離を容易にするために目的物との比重差が十分大きいものであることがさらに特に望ましい。
【００３６】
本発明中における好適な水溶性骨格としては、アガロース、デキストラン、カルボキシデキストラン、アリルデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリメチルメタクリレート、ポリグリコリド、プルロニック、セルロース、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロキシブチレート、の群の少なくとも１種類以上のポリマーから選択される。さらに本発明中における好適な疎水性ユニットとしてはブチル基、プロピル基、オクチル基、フェニル基、アリル基、アリール基、アクリルアミド基、アクリル基、アルキル基からなる群の少なくとも１種類以上から選択されることを特徴とする。
【００３７】
以上から、本発明における水溶性骨格中に疎水性ユニットがパッチ上に存在するポリマーからなる吸着材とは、両者の組み合わせから構成されるものであるアルキルアガロース、アリール−アガロース、アルキル有機デキストランおよびアリール有機ポリマー樹脂からなる群の少なくとも１種類以上から選択されることが好ましい。より好ましくは、本発明の溶性骨格中に疎水性ユニットがパッチ上に存在するポリマーからなる吸着材は、ブチル、フェニルならびにオクチルアガロース、エチレングリコール／メタクリレート共重合体、アリルデキストラン／メチレンビスアクリルアミドゲル共重合体、アクリルアミドアガロース、ポリアクリルアミドを挙げることができ、さらに、このような吸着材の一例としては市販のゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィー用レジンを用いることもできる。市販品としてはＳｕｐｅｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌｓ（バイオラッドラボラトリー製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ（メルク・ミリポア製）、Ｕｌｔｒａｇｅｌ（ポール製）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、ＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ-５ＰＷ（東ソー製）、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（東ソー製）、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ（東ソー製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ（東ソー製）などを例として挙げることができる。
【００３８】
本発明の精製工程は反応に未反応の疎水性色素と吸着材との吸着工程および、反応に残存する未反応の疎水性色素の除去工程とを含み得る。吸着工程と除去工程は同時に行ってもよいし、前後して行ってもよいし、その場合は両工程を行う時間が一部重なっていてもよい。具体的には疎水性色素と吸着材との接触を攪拌等による均一系で吸着工程を実施する形態では、吸着工程に引き続いて自然沈降、遠心分離あるいはフィルター処理等の手段により疎水性色素と吸着材と吸着物の除去（工程）が行われる。また吸着材による吸着工程と除去行程との間に吸着剤を洗浄する工程をさらに含んでもよい。さらに、吸着材に疎水性色素を吸着させた後にメタノール等の有機溶媒を用いて吸着した疎水性色素を回収し、当該吸着材を再生する工程をさらに含むこともできる。
【００３９】
一方で吸着剤をクロマト管などに充填したカラム形状で精製を実施する形態においては、前記カラム内を通過した水溶液を回収することで目的の疎水性色素材料を得ることができる。そのためにこのような場合には吸着工程と除去工程が同時に行われている。このように、必ずしも吸着工程と除去行程は明確に分けることはできない場合もあるが、そのような構成も本発明に含まれる。
【００４０】
（疎水性色素）
本実施形態における、疎水性色素の一例として挙げた、ナフタレン構造、およびカルボキシル基もしくはその塩を有する上記一般式（Ｉ）で表されるシアニン系化合物について説明する。
なお、本実施形態における疎水性色素は、メチン鎖と該メチン鎖の両端にＮを含む５員環が結合してなる構造を基本骨格として有する。
【００４１】
本実施形態における疎水性色素は、近赤外領域である６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲に含まれる波長の光を吸収するものであればよく、さらに好ましくは７００ｎｍ乃至９００ｎｍに吸収特性を示すものであればさらに好ましい。本実施形態における疎水性色素は、モル吸光係数が１００ｋ（１００，０００）を超えることが好ましい。本発明中の疎水性色素とは上記の光学特性を有する物質一般を指す場合もあるが、吸着材を用いた精製工程で水中の系から除去されるもの、すなわち吸着剤と相互作用を示す物質を指す場合もある。一方、本発明中の疎水性色素とは、上記の光学特性を示す物質の中で特に吸着材との相互作用を示さない物質を明示的に指す。また、本発明中では説明の便宜上、疎水性色素化合物を疎水性色素骨格の化学結合体と呼ぶ場合がある。
【００４２】
また、本実施形態に係る疎水性色素において、一般式（Ｉ）が、下記の式（ｉ）で表されるインドシアニングリーンおよびその誘導体であることがさらに好ましい。
【化８】
0006395461.tif 000009
【００４３】
上記式（ｉ）において、ＡおよびＢは、互いに独立に、１乃至２０の整数である。
上記式（ｉ）において＊１および＊２は、互いに独立にスルホ基あるいはリンカー基Ｌを介してリガンドが互いに独立に化学的に結合されたものである。Ｌは−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。リガンドは天然物あるいは非天然物から任意に選択することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例に沿って本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１から実施例５］
（吸着剤のシアニン系色素の吸着能評価）
本実施例では様々な吸着剤のシアニン系色素に対する捕捉能力を比較した。本実施例における吸着剤としては市販ゲルレジン（以下、ゲルと呼ぶことがある）を選択した。吸着材としては具体的にはオクチル基が測鎖に修飾されたアガロースであるＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、アリルデキストランおよびメチレンビスアクリルアミドゲルからなる共重合体であるＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、およびエチレングリコールおよびメタクリレートからなる共重合体であるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｓ（東ソー製）、比較例としてアガロースからなるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、デキストランからなるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、および、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）、を用いた。シアニン系色素としてはＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（同仁化学研究所製；Ｉ２５４）を用いた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕは上記式２の構造を有する化合物である。
【００４６】
ゲルを各１ｍＬチューブに取り、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）を１０ｍＬ加えて遠心分離（１０００Ｇ、５分）でゲルを沈降させ、上清を除去した。この操作を３回繰り返してゲルの溶媒を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）に置換したゲル水溶液を得た。このゲル水溶液にＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを３２ナノモル加えて、ローテーター（アズワン製）で３０分、室温下で回転撹拌した。その後、再び遠心分離（１０００Ｇ、５分）でゲルを沈降させてから上清を回収した。そこへ回収した液量と同量の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）を再度加えてゲルを洗い、遠心分離で上清を回収した。その後に回収液の液量を０．１ｍＬまで濃縮した上で色素由来の吸光度の計測し、投与した色素の吸光度とから色素回収率を算出した。ここで算出したシアニン系色素回収率が低いということは、遠心分離操作で沈降したゲルにシアニン系色素が捕捉されているということを示しており、それはすなわち吸着剤としての機能（吸着能）が高いということを意味する。
【００４７】
本実施例において色素回収率は下記式（１）に基づいて算出した。
｛（遠心上清の色素吸光度）／（投入したシアニン系色素吸光度）｝×１００  式（１）
【００４８】
各種吸着材によるシアニン系色素回収率を算出した結果を表１に示す。表１に示す対照とは、ゲルを用いずに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）１ｍＬにＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを３２ナノモル加えて回転撹拌、遠心操作をしたサンプルのことである。色素回収率とは、対照のサンプルで算出した上記式（１）の値を１００とした場合の相対値を示したものである。その結果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、および、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０を除く全てのゲル材料において濃縮後の遠心上清の吸光度は計測感度以下であり、色素回収率は０であった。すなわち、投入したシアニン系色素がゲルに捕捉されていたことが示唆される。一方で比較例として用いたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、および、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０では濃縮後の遠心上清の吸光度は計測感度以上であった。結果として前述の材料に比べてシアニン系色素の捕捉能が低い結果であった。さらに今回吸着剤の特性を示したゲル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００）を用いて上記式１の化合物であるＩＣＧ（（財）日本公定書協会製）を用いて前記と同様の試験を行った。その結果遠心上清の吸光度は感度以下であった。上記式１の化学構造を有するも上記のシアニン系色素に対する吸着剤の捕捉能力の結果はＩＣＧに対しても同様の傾向にあると考えられる。
【００４９】
本実施例でシアニン系色素に対する高い捕捉能力を示した材料に共通する特徴として疎水性の高い官能基を有することが挙げられる。例えば、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのアルキル鎖やＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００の架橋部位であるアクリルアミド構造とシアニン系色素の芳香環の疎水部との間に働く疎水性相互作用により材料にシアニン系色素が捕捉されることが考えられる。一方でＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、および、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０などの材料では疎水性官能基が少ないためにシアニン系色素捕捉能が弱かったことが考えられる。なお、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５よりＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０のシアニン系色素捕捉能が異なった要因に関しては、両者の水との相互作用の違いが関係していることが示唆される。例えば１ｇの乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘに対する水性溶媒の吸収量はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５とＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０でそれぞれ２．５ｇと１．０ｇであり、両者を比較するとＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０の方が相対的に疎水性の高いことが示唆される。以上の結果からもシアニン系色素保持能に材料の疎水性（疎水性相互作用）が関与していることが示唆される。
【００５０】
【表１】
0006395461.tif 000010
【００５１】
［実施例６から実施例９］
（シアニン系化合物の精製１）
モノアミン直鎖状ＰＥＧ（日油製；ＭＥ−２００ＥＡ）１０ｍｇを秤量し、１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）０．８ｍＬに溶解しＰＥＧ溶液とした。シアニン系色素としてＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（同仁化学研究所製；Ｉ２５４）０．９３ｍｇを秤量しジメチルスルホキシド０．１２ｍＬに溶解し色素溶液とした。上記のＰＥＧ溶液に上記色素溶液を添加し、撹拌子を加えてマグネチックスターラ―で撹拌（２００ｒｐｍ、２時間、室温）することによりシアニン系色素とＰＥＧの縮合体を含む反応溶液を得た。
【００５２】
先の実施例で有効な吸着材であったＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｓを各１ｍＬチューブに取り、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）を１０ｍＬ加えて遠心分離（１０００Ｇ、５分）でゲルを沈降させ、上清を除去した。この操作を３回繰り返してゲルの溶媒を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）に置換したゲル水溶液を得た。このゲル水溶液に前記の反応溶液からシアニン系色素１６ナノモル分を加えローテーター（アズワン製）で３０分、室温下で回転撹拌した。その後、再び遠心分離（１０００Ｇ、５分）でゲルを沈降させてから上清を回収した。そこへ回収した液量と同量の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ＝７．１）を再度加えてゲルを洗い、遠心分離で上清を回収した。その後に回収液の液量を０．１ｍＬまで濃縮した上で色素由来の吸光度の計測し、投与した色素の吸光度とから色素回収率を算出した。その結果を表２に示す。色素回収率にわずかな誤差を生じたものの色素回収率は吸着材の種類によらず、概ね２０から３０％であった。
【００５３】
本実施例で吸着剤に対して投入した色素量は先の実施例でシアニン系色素のみを加えた場合の半分量の色素であったにも関わらず本実施例では吸着材に吸着されなかった色素成分が存在した。これは未反応シアニン色素の原料成分以外の成分が吸着されなかったことを示唆している。
【００５４】
【表２】
0006395461.tif 000011
【００５５】
上記の処理で吸着されなかった成分を回収して、電気泳動評価を実施した。電気泳動は回収した成分の内、色素量１ｐｍｏｌ分を電気泳動用のポリアクリルアミドゲルに投入して行なった。対照として無処理の反応溶液（色素量１ｐｍｏｌ）も用いた。そして電気泳動後のゲルを近赤外蛍光スキャナ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）で撮影した。
【００５６】
図１にゲルの撮影結果を示す。精製処理を行わない未精製の試料を泳動したレーン（左側）では高分子量と低分子量にそれぞれ蛍光画分が確認された。ゲル中の移動度に基づいて分子量を求めると、これらは、それぞれＰＥＧ−色素結合体（シアニン系化合物）と未反応のシアニン系色素であると確認された。一方で、カラム処理後の試料を泳動したレーン（右側）では未反応色素の画分に比べてＰＥＧ−色素結合体の強い蛍光が観察された。この結果からカラム投入口付近の着色画分は未反応色素であることが示唆され、未反応色素をゲルに捕捉させることにより目的物であるＰＥＧの色素結合体が分離されていることが強く示唆される結果となった。以上の結果から、未反応色素を捕捉させる方法が精製法として有効であると判断した。
【００５７】
［実施例１０］
（シアニン系化合物の精製２）
カラム容器（バイオラッドラボラトリー製；７３２−１０１０）に吸着剤としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ゲル（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）を１５ｍＬ投入した。そして、カラム体積に対して２倍以上の体積の１０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）でカラム内の溶媒置換を行なった。
【００５８】
前述のカラムに先の実施例と同様の方法で得られたシアニン系色素とシアニン系化合物の混合物である反応溶液を全量加えて、１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を溶出液として流した。その結果、溶出体積が７ｍＬ付近で着色画分が溶出されることを確認した。一方で、カラム投入口付近にも着色画分が確認された。このカラム投入口付近の着色画分を溶出させるためにさらにカラム体積に対して１０倍量以上の１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を溶出させた。しかし、この操作によっても着色画分の移動は確認されなかったことから投入口付近の着色画分のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ゲルへの捕捉されたことを示唆している。
【００５９】
さらに先の実施例と同様な電気泳動の結果から、溶出画分において未反応色素量が有意に減少していることから、本発明の精製法が有効であると判断した。
【００６０】
［比較例５］
（シアニン系化合物のゲル濾過精製評価）
実施例２の色素材料を用いてゲル濾過による分離を試みた。ゲル濾過精製カラムとしてＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）を用いた。ＰＤ−１０カラムは、実施例１で用いたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲルを充填したゲルろ過用のカラムデバイスである。本実施例ではＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの水溶液、およびＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとモノアミン直鎖状ＰＥＧ（ＭＥ−２００ＥＡ）の反応溶液をそれぞれ用いた。上記ＰＤ−１０カラムに前述した色素材料を１．３マイクロモル添加し、各々の色素のカラムを０．５ｍＬずつサンプルリングし、各サンプルでの色素由来の吸光度を計測することにより色素の溶出位置を観察した。
【００６１】
ＰＤ−１０カラムでのシアニン系色素およびシアニン系化合物の溶出結果を図２に示す。グラフの縦軸、横軸はそれぞれ相対色素量と溶出体積である。相対色素量は色素単独を流した場合の最大色素溶出量を１とした場合の相対値である。この結果、両者とも溶出体積が３ｍＬ付近の重なった位置に着色成分が観察された。すなわち色素単独であるシアニン系色素と色素化合物であるＰＥＧ−色素結合体とをＰＤ−１０で分離することは困難であった。本実験で用いたシアニン系色素は分子量が１、０００程度で、ＰＥＧ−色素結合体は分子量が２１、０００程度である。ＰＤ−１０での分子量の分離特性から考えると両者を分離することは可能であることが予想されるが、実際には溶出位置が重なってしまい両者を分離することは困難であった。これは本実施例のシアニン系色素が水中で凝集体を形成し、見かけ上の分子量が大きくなったために溶出位置が変わってしまったことが原因の一つとして考えられる。以上のことから、水中で凝集傾向を示すような色素に対して分子ふるい効果を利用して精製することは極めて困難であると判断した。
【図１】
0006395461.tif 000015
【図２】
0006395461.tif 000016