(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型骨ゼラチンの酵素的加水分解により生成されるコラーゲン加水分解物であって、ここで前記コラーゲン加水分解物が、少なくとも５０重量％の、１，５００Ｄａ〜１３，５００Ｄａの分子量を有し、そして４，５００〜６，０００の範囲の平均分子量を有するペプチドから形成される、コラーゲン加水分解物を含む、骨の健康を維持し及び／又は改善するための組成物。
【請求項２】
前記骨ゼラチンが、脊椎動物の骨由来のコラーゲンのアルカリ分解によって生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記骨ゼラチンが５．５未満の等電点を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、１５％未満のグルタミン残基及び／又はグルタミン酸残基、及びアスパラギン残基及び／又はアスパラギン酸残基の全体のアミド化レベルを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記コラーゲン加水分解物の２０重量％の水溶液が、２５℃で、５ｍＰａ．ｓ超の粘度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記コラーゲン加水分解物が、３００ｐｐｍ未満のアンモニウム、硫黄及びリン酸塩含量をそれぞれ有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記コラーゲン加水分解物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼで前記ゼラチンを加水分解することにより生成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記コラーゲン加水分解物が、４０℃〜６０℃の温度で、２０分間〜４０分間、前記エンドプロテアーゼの作用を介して生成される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
閉経後骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記コラーゲン加水分解物が、栄養サプリメントとして処方される、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
１ｇ〜１５ｇの前記コラーゲン加水分解物の１日の経口摂取を提供する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物及び１つ以上のプレバイオティクスを含む栄養サプリメント。
【請求項１４】
前記プレバイオティクスが、オリゴ糖及び／又は多糖類から選択される、請求項１３に記載の栄養サプリメント。
【請求項１５】
クエン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム及びそれらの混合物から選択される１つ以上の可溶性カルシウム塩をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の栄養サプリメント。
【請求項１６】
ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＤ3、ビタミンＥ、ビタミンＫ及びそれらの代謝物から選択される１つ以上のビタミンをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の栄養サプリメント。
【請求項１７】
フッ化塩、カリウム塩及びマグネシウム塩から選択される１つ以上のミネラルをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の栄養サプリメント。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を生成するための方法であって、以下のステップ：
５重量％〜２０重量％の濃度でＢ型骨ゼラチンの水溶液を生成し、
ゼラチンの量に対して、１重量％〜４重量％の量で枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを添加し、
４０℃〜６０℃の温度で、そして５．５〜６．５のｐＨ値で、２０分間から４０分間、ゼラチンにエンドプロテアーゼを作用させ、そして
エンドプロテアーゼを熱不活性化する
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新規コラーゲン加水分解物に関する。本願発明はまた、骨の健康を維持し及び／又は改善するための、特に骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための活性成分としての本新規コラーゲン加水分解物の使用に関する。本発明はさらに、本コラーゲン加水分解物を含む栄養サプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の骨及び従ってまたヒトの骨は、それらの高い強度及び機械的安定性について、骨芽細胞（骨細胞）によって合成された骨基質の特殊構造の恩恵を受けている。骨基質の２つの不可欠な構成要素は、第一に、架橋コラーゲンのフレームワークであり、ここで、特に骨基質の場合、これはＩ型コラーゲンである。この架橋は、基本的に、アミノ酸のリシン及びヒドロキシリシンによって行われる。第二の構成要素は、骨基質中に取り込まれるヒドロキシアパタイト（またアパタイト‐（ＣａＯＨ）として知られる）である。骨のこの構造は、おおよそ鋼鉄で補強されているコンクリートに匹敵し、ここで、鉄鋼の骨組み（コラーゲンに相当する）及びコンクリート（ヒドロキシアパタイトに相当）の特性は、非常に安定な構造を形成すると同時に、また、お互いに補完し合う。
【０００３】
骨は、多くの他の組織タイプとは対照的に、相対的に高い再生能を有し、すなわち、細胞外骨基質は、断続的に構築され、そして分解される。この均衡の乱れが発生した場合（すなわち、新しい骨基質の不十分な構築）、骨量の減少が起こる。この骨密度の減少は、骨粗鬆症として知られ、そしてさまざまな原因を有し得る。典型的に、骨粗鬆症は、加齢に伴って発症し（大抵は、５０代から始まる）、特にしばしば、閉経後の女性で発症する（閉経後骨粗鬆症）。
【０００４】
骨粗鬆症における骨密度の減少は、コラーゲン加水分解物の経口投与によって防ぐことができることが以前から知られている。コラーゲン加水分解物は、そしてそれは、動物コラーゲンの酵素加水分解によって得られ、さまざまな鎖長及び分子量を有するペプチドの混合物を含む。欧州特許第０７７７４９１ Ｂ１は、例えば、閉経後骨粗鬆症の処置のために、平均分子量１，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａを有するコラーゲン加水分解物の使用を開示し、そしてそれは、皮膚コラーゲンの酵素加水分解によって生成される。骨の健康に対するコラーゲン加水分解物のこの有利な効果は、同様にインビボにおいて軟骨細胞で以前に示されたように、骨芽細胞によるＩ型コラーゲン及び他の基質タンパク質の生合成の刺激に基づくと考えられる（Ｓ．Ｏｅｓｓｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｓｅｉｆｆｅｒｔ（２００３），Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（３１１）３９３‐３９９）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
さまざまなコラーゲン加水分解物は、出発原料及び生成方法に依存して、それらが含むペプチドの分子量の分布、それらのアミノ酸配列及び他のパラメータに関して異なる。骨の健康の維持及び／又は改善に関して特に良い有効性を有するコラーゲン加水分解物を提案することが本願発明の目的である。
【０００６】
この目的は、Ｂ型骨ゼラチンの酵素加水分解によって生成されるコラーゲン加水分解物を有する本願発明により達成され、ここで、コラーゲン加水分解物は、少なくとも５０重量％が１，５００Ｄａ〜１３，５００Ｄａの分子量を有し、そして４，０００Ｄａ〜８，０００Ｄａの範囲で平均分子量を有するペプチドから形成される。
【０００７】
本願発明者等によって行われたインビトロでの骨芽細胞による基質タンパク質の合成の刺激についての研究は、そしてそれは以下により詳細に記載されるが、驚くべきことに、この型のコラーゲン加水分解物が、さまざまな他の加水分解物と比較して、特にＩ型コラーゲンの合成に対する顕著に優れた刺激効果を有することを示した。少なくとも７０重量％のペプチドが１，５００Ｄａ〜１３，５００Ｄａの分子量を有し、及び／又は４，５００〜６，０００Ｄａの範囲における平均分子量を有する、コラーゲン加水分解物が特に有利であることを示す。
【０００８】
この結果で特に興味深いことは、特に先行技術から、動物の皮膚（主に、ブタの皮膚からだけでなく魚の皮も）由来のコラーゲン又はゼラチン由来の加水分解物の使用はかなり知られているので、特に骨ゼラチン由来のコラーゲン加水分解物の高い有効性である。一般的に、コラーゲンの変性可溶形であるゼラチンは、酵素加水分解のために非常に適した出発原料である。加水分解物のための出発原料として本願発明の文脈において使用される骨ゼラチンは、Ｂ型ゼラチンであり、好ましくは、脊椎動物の骨由来のコラーゲンのアルカリ分解によって生成され、好ましくは、オセインである。オセインは、脱脂及び脱灰された骨を含む。好ましくは、ウシの骨由来のオセインが使用される。
【０００９】
出発原料として使用する骨ゼラチンの等電点（ＩＥＰ）は、好ましくは、５．５以下である。対照的に、コラーゲンの酸分解によって生成されるＡ型ゼラチンは、約７の等電点を有する。
【００１０】
本願発明のコラーゲン加水分解物では、ペプチドは、好ましくは、グルタミン残基及び／又はグルタミン酸残基の、及びアスパラギン残基及び／又はアスパラギン酸残基の１５％未満の、好ましくは１０％未満の全体的なアミド化レベルを有する。アミド化レベルは、従って、ペプチド中のグルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基及びアスパラギン酸残基のモル比によって、グルタミン残基及びアスパラギン残基のモル比を割ることによって計算される。後者の値は、コラーゲンの天然のアミノ酸組成によって与えられ、そして典型的に、約１．１２ｍｍｏｌ／ｇである。グルタミン残基及びアスパラギン残基のモル比は、アミドの酸加水分解及びそこから形成されたアンモニアの決定によって決定し得る。ペプチドの低いアミド化レベルは、特に、使用されるゼラチン（Ｂ型）のアルカリ分解を通じて達成し得る。
【００１１】
興味深いことに、骨芽細胞による基質タンパク質合成の刺激の研究は、また、本願発明による４，６００Ｄａ〜６，０００Ｄａの好ましい平均分子量を有するコラーゲン加水分解物が、さまざまな低分子加水分解物よりもより優れた有効性を有することを示す。コラーゲン加水分解物の粘度は、また、得られたペプチドの分子量と相関関係がある。これに関連して、２０重量％のコラーゲン加水分解物の水溶液が、２５℃で。５ｍＰａ．ｓ超、より好ましくは、６ｍＰａ．ｓ超の粘度を有する場合が好ましい。
【００１２】
本願発明によるコラーゲン加水分解物は、好ましくは、３００ｐｐｍ未満のアンモニウム、硫黄及びリン酸塩含量をそれぞれ有し、特に、１００ｐｐｍ未満である。同様に、低塩濃含量が、加水分解で使用される骨ゼラチンの生成において既に維持し得る。
【００１３】
コラーゲン加水分解物の酵素生成のために、さまざまなプロテアーゼ、特に微生物起源のものが、使用し得、ここで、特定のアミノ酸に対するそれらの異なる特異性が、結果として生じるペプチドの分子構造に直接影響を及ぼし、従って、また、それらの有効性にも直接影響を及ぼす。骨芽細胞の刺激に関して、特に効果的なコラーゲン加水分解物が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼでゼラチンを加水分解することにより好ましくは生成し得ることが見出された。
【００１４】
本願発明の好ましい実施態様によれば、コラーゲン加水分解物は、４０℃〜６０℃の温度で、好ましくは約５０℃で、２０分〜４０分間、特に約３０分間にわたって、エンドプロテアーゼの作用を介して生成される。
【００１５】
上記のようなコラーゲン加水分解物に加えて、本願発明はまた、特に、骨の健康を維持し及び／又は改善するための、特に、骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための活性成分としてのその使用に関する。骨芽細胞による基質タンパク質の合成に対する本願発明によるコラーゲン加水分解物の顕著な刺激効果に起因して、そしてそれは、インビトロ試験によって示されるが、骨形成と分解の間の均衡の崩壊が、コラーゲン加水分解物の経口投与を介して防止され得る。
【００１６】
本願発明の不可欠な態様は、閉経後の骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための活性成分としてのコラーゲン加水分解物の使用に関する。試算によれば、５０歳以上の女性の約５０％が、このタイプの骨の減少に冒されており、閉経後の最初の５年間で、骨質の最大２０％が失われ得る。
【００１７】
従って、本願発明は、骨粗鬆症、特に閉経後骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するための方法に関し、ここで、本方法は、患者、特に５０歳以上の女性患者への、本願発明によるコラーゲン加水分解物の経口投与を含む。
【００１８】
動物又は植物タンパク質由来の加水分解物について、医薬品としての承認が必要ではないので、本願発明によるコラーゲン加水分解物は、栄養補助剤として好ましく処方し得る。コラーゲン加水分解物は、例えば、粉末、顆粒、溶液又は懸濁液などの形態で、又は錠剤、カプセル、カプレット又はサチェットなどの形態で、適切な場合、適切な添加物又は不活性成分と組み合わせて存在し得る。あるいは、コラーゲン加水分解物はまた、食品に直接添加されてもよい。
【００１９】
１日あたりの経口摂取は、好ましくは、１ｇ〜１５ｇのコラーゲン加水分解物の範囲、好ましくは、２ｇ〜１０ｇ、より好ましくは２ｇ〜７ｇ、及び特に好ましくは、２．５ｇ〜５ｇの範囲である。適切な量が、好ましくは、一回用量として処方され得る。
【００２０】
本願発明のさらに好ましい実施態様は、本願発明のコラーゲン加水分解物に加えて、１つ以上のプレバイオティクスを含む栄養補助食品に関する。コラーゲン加水分解物と１つ以上のプロバイオティクスとの組み合わせは、骨質の特に有効な再生のために、十分な量で、コラーゲン及び他の間質タンパク質の生合成だけでなく、ヒドロキシアパタイトの形成及び取り込みを可能にする必要があるという事項に基づいている。本願明細書中の制限要因は、カルシウムの骨基質への供給であり、栄養とのカルシウムの十分な摂取が問題ではないが（バランスの取れた食事、これは一般的に保証されている）、むしろ、特に難溶性のカルシウム塩の形成に起因して制限される消化管で吸収されたカルシウムの十分な再吸収が問題である。
【００２１】
カルシウムの再吸収及び従って骨の石灰化が、プレバイオティクスの投与によって改善され得ることを見出した。プレバイオティクスは、一般的に、腸内微生物叢の特定の微生物の成長及び／又は活性を刺激する消化されない食品成分であり、そしてその結果、健康に対して好ましい効果を有する。プロバイオティクスのこの効果が、カルシウムの再吸収に有利な影響を及ぼすことによる正確な機序は完全には説明されていないが、上記の良い効果は、例えば、約１２歳からの子供へのフルクタンの投与に見られる（Ａｂｒａｍｓら（２００５）,Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（８２）４７１‐４７６）。
【００２２】
コラーゲン加水分解物及びプレバイオティクスの共同投与を介して、骨基質の２つの不可欠な構成要素の形成が刺激され、そしてそれにより、骨の健康、特に骨粗鬆症の予防及び処置に関して、相乗効果か達成される。
【００２３】
本願発明の栄養補助剤は、原則として、任意の重量比のコラーゲン加水分解物及びプロバイオティクス又はプレバイオティクス（複数）を含み得る。両方の成分の十分な供給を保証するために、しかしながら、コラーゲン加水分解物及びプレバイオティクス又はプレバイオティクス（複数）の比率は、それぞれ、約２０重量％〜約８０重量％であり、そしてより好ましくは、約４０重量％〜約６０重量％である場合が好ましい。栄養サプリメントは、特に、約１：１の重量比で、２つの成分の混合物を含み得る。
【００２４】
本願発明による栄養サプリメントで使用されるプレバイオティクス又はプレバイオティクス（複数）は、好ましくは、オリゴ糖及び／又は多糖類から選択される。オリゴ糖及多糖類は、既知のプロバイオティクスの活性物質の大多数を構成し、ここで、そのような物質の使用を介して、栄養サプリメントの風味が、純粋なコラーゲン加水分解物と比較して、著しく改善されるという付加的な有利な効果が生じる。無味として通常は記載されるコラーゲン加水分解物は、該当する方法によって生成し得るが、多くのユーザーは、「粘着性」として記載される不利な風味効果を理解する。驚くべきことに、コラーゲン加水分解物の良くない風味成分は、プロバイオティクスオリゴ糖及び／又は多糖類との組み合わせによって、ほぼ完全に除去し得る。
【００２５】
プレバイオティクス又はプレバイオティクス（複数）は、好ましくは、イヌリン、フルクタン、ガラクト‐オリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクト‐オリゴ糖（ＦＯＳ）、難消化性デキストリン、ポリデキストロース及びそれらの混合物から選択される。これらは、天然及び合成的に生成された多糖類の両方を含む。イヌリンは、最大１００フルクトース単位まで及び独立したグルコース単位を含むフルクタンである。フルクト‐オリゴ糖及びガラクト‐オリゴ糖は、フルクトース又はガラクトース単位（通常は１０まで）を専ら含み、そしてポリデキストロースは、グルコース、ソルビトール及びクエン酸単位から作られる合成多糖類である。
【００２６】
栄養サプリメントが、さらなる成分として、少なくとも１つの可溶性カルシウム塩を含む場合がさらに好ましい。この方法により、彼／彼女の他の栄養習慣にかかわらず、同時に、ユーザーへのカルシウムの十分な供給を保証する。
【００２７】
原則として、これは、毒性がなく又は他の不利な効果を有する、すべての可溶性カルシウム塩を含み得る。好ましくは、少なくとも１つの可溶性カルシウム塩は、クエン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム及びそれらの混合物から選択される。
【００２８】
本願発明による栄養サプリメントは、組み合わせ調製物として、骨の健康に良い効果を有する、又は一般的に栄養サプリメントとして有用であるさらなる成分を含み得る。栄養サプリメントが、また、例えば、１つ以上のビタミンＣ，ビタミンＤ、ビタミンＤ3、ビタミンＥ、ビタミンＥ、ビタミンＫ及びそれらの代謝物を含む場合が好ましい。
【００２９】
さらに本願発明による栄養サプリメントは、また、さまざまなミネラル、例えば、フッ化塩、カリウム塩及びマグネシウム塩で強化し得る。腸壁によるそのようなミネラルの摂取は、また、短鎖脂肪酸で促進し得る。
【００３０】
さらなる有利な添加は、骨中のカルシトニン含量の増加をもたらし得るオメガ‐３脂肪酸である。抗炎症作用はまた、それらによるものである。
【００３１】
大豆イソフラボンはまた、骨密度に対して良い効果を有するであろうし、そして本願発明による栄養サプリメント中に使用され得る。
【００３２】
最後に、スパイス又はそれらの活性成分、例えば、クルクミン及びチリが、そしてそれらは、それらの抗炎症及び免疫調節作用で、本願発明による栄養サプリメントの有利な効果に寄与し得るが、また、言及し得る。
【００３３】
骨の健康に対する本願発明によるコラーゲン加水分解物の良い効果を通じて、栄養サプリメントとしてのその投与が、ある状況下では、閉経後骨粗鬆症を予防し及び／又は処置するために、この目的ために使用される他の薬剤なしで済まし、又はこの目的ために使用される他の薬剤の用量を低減することを可能にし得る。
【００３４】
そのような医薬有効成分の例は、時々その使用に問題があるが、選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭｓ）、パラトルモン及びそのアナログテリパラチド、他のホルモン（特に、エストロゲン及び成長ホルモン）、ビスホスホネート及びモノクローナル抗体である。
【００３５】
本願発明のさらなる目的は、本願発明によるコラーゲン加水分解物を生成するための方法であり、以下のステップ：
５重量％〜２０重量％の濃度、好ましくは約１０重量％の濃度でＢ型骨ゼラチンの水溶液を生成し、
ゼラチンの量に対して、１重量％〜４重量％の量、好ましくは約２重量％の量で枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを添加し、
４０℃〜６０℃の温度で、好ましくは、約５０℃の温度で、そして５．５〜６．５のｐＨ値で、好ましくは、約６のｐＨ値で、２０分間から４０分間、好ましくは約３０分間、ゼラチンにエンドプロテアーゼを作用させ、そして
エンドプロテアーゼを熱不活性化する
ことを含む。
【００３６】
本願発明による方法の特定の利点及び好ましい実施態様は、本願発明によるコラーゲン加水分解物と共に既に記載されている。本願発明を、以下の実施例を使用し、そして図面を参照して、さらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本願発明によるコラーゲン加水分解物及び対照加水分解物の分子量分布を有するゲル浸透クロマトグラムを示す。
【図２】図２は、本願発明のコラーゲン加水分解物及び対照加水分解物によるＩ型コラーゲン及びオステオカルシンの合成の刺激に関する図を示す。
【図３】図３は、本願発明によるコラーゲン加水分解物及び４つの異なる対照加水分解物によるさまざまな基質タンパク質及び酵素の合成の刺激に関する図を示す。
【実施例】
【００３８】
コラーゲン加水分解物の生成
本願発明によるコラーゲン加分解物の生成（実施例）及び本願発明によらない４つのコラーゲン加水分解物の生成（比較例１〜４）を以下に記載する。
【００３９】
２つの異なるゼラチン、具体的には、ウシ骨由来のＢ型ゼラチン（骨ゼラチンとして以下に特定）及びＡ型ブタ皮膚ゼラチンを出発原料として使用した。それらの不可欠なパラメータを、表１に示す。
【００４０】
【表１】
0006272891.tif 000002
【００４１】
実施例
２００ｇウシゼラチンを、１８００ｇ蒸留水に、３０分間、室温で浸漬した。予め浸漬したゼラチンを５８±２℃に加熱し、撹拌しつつ溶解した。ｐＨ値を水酸化ナトリウム溶液で６．０±０．２に調節した。２重量％（ゼラチンに対して）の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを、その後添加した。３０分の加水分解継続後、酵素失活のために８５℃で加熱した。
【００４２】
比較例１
２００ｇ骨ゼラチンを、１８００ｇ蒸留水に、３０分間、室温で浸漬した。予め浸漬したゼラチンを４９±２℃に加熱し、そして撹拌しつつ溶解し、その後、１．６４ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを添加した。ｐＨ値を水酸化ナトリウム溶液で６．０±０．２に調整した。その後、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを、０．６重量％（ゼラチンに対して）を添加した。３０分の加水分解継続後、０．２重量％（ゼラチンに対して）のバチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを添加した。１８０分の全加水分解継続後、酵素失活のために８５℃で溶液を加熱し、そしてその後、乾燥させた。
【００４３】
比較例２
２００ｇ骨ゼラチンを、１８００ｇ蒸留水に、３０分間、室温で浸漬した。予め浸漬したゼラチンを４９±２℃に加熱し、そして撹拌しつつ溶解し、その後、０．４ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを添加した。ｐＨ値を水酸化ナトリウム溶液で６．５±０．２に調整した。その後、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを、０．６重量％（ゼラチンに対して）を添加した。６０分の全加水分解継続後、０．２重量％（ゼラチンに対して）のショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来のエキソプロテアーゼを添加した。７時間の加水分解継続後、酵素失活のために８５℃で溶液を加熱し、そしてその後、乾燥させた。
【００４４】
比較例３
２００ｇブタ皮膚ゼラチンを、１８００ｇ蒸留水に、３０分間、室温で浸漬した。予め浸漬したゼラチンを５７±２℃に加熱し、撹拌しつつ溶解した。ｐＨ値を水酸化ナトリウム溶液で６．０±０．２に調節した。その後、０．３重量％（ゼラチンに対して）の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性エンドプロテアーゼを添加した。１８０分後、酵素失活のために８５℃で加熱し、そしてその後、乾燥させた。
【００４５】
比較例４
２００ｇブタ皮膚ゼラチンを、１８００ｇ蒸留水に、３０分間、室温で浸漬した。予め浸漬したゼラチンを５８±２℃に加熱し、撹拌しつつ溶解した。ｐＨ値を水酸化ナトリウム溶液で７．０±０．２に調節した。その後、２重量％（ゼラチンに対して）のバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルカリエンドプロテアーゼを添加した。１８０分後、酵素失活のために８５℃で加熱し、そしてその後、乾燥させた。
【００４６】
分子量分布の決定
異なるコラーゲン加水分解物のペプチドの分子量分布を、ゲル浸透クロマトグラフィーで、以下のパラメータを使用して決定した。
固定相：ＴＳＫ ２０００ ＳＷ ＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）
移動相：０．４ｍｏｌ／ｌ リン酸一ナトリウム ｐＨ５．３
流速：０．５ｍｌ／分
キャリブレーション標準：規定のＩ型コラーゲン断片（ＦＩＬＫ，Ｆｒｅｉｂｅｒｇ）
検出：ＵＶ検出器 Ｋｎａｕｅｒ Ｋ‐２５０１（２１４ｎｍ）
【００４７】
表２は、異なるコラーゲン加水分解物の、予め決定された重量分率によるそれぞれの分子量分布、平均分子量、粘度及びｐＨ値（それぞれ２０重量％及び２５℃）及びアミド化レベルを含む。
【００４８】
【表２】
0006272891.tif 000003
【００４９】
図１は、実施例のような本願発明によるコラーゲン加水分解物及び比較例４によるコラーゲン加水分解物の分子量分布を有するゲル浸透クロマトクラムを示す。分子量を、横軸に対数尺度で入れた。
【００５０】
インビトロでの基質タンパク質及び酵素の合成の刺激
本願発明によるコラーゲン加水分解物の特定の有効性の証拠として、基質の構築及び石灰化に役立つ、基質タンパク質及び酵素の合成に対するそれらの刺激効果を、骨芽細胞を使用してインビトロで研究した。これを、リアルタイムＰＣＲ及び半定量分析（全くコラーゲン加水分解物を含まない対照に関して）を用いて、関連するｍＲＮＡの発現を決定することによって行った。
【００５１】
ヒト骨芽細胞を膝関節から単離し、骨材料を、７ｍｇ／ｍｌ ヒアルロニダーゼＩ及びＩＩＩ‐Ｓ型及び５ｍｇ／ｍｌ プロナーゼを補充したＨａｎｋｓ溶液において、１時間３７℃での激しい撹拌下で、インキュベートした。その後、分解を、１６ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＣＬＳ ＩＶ型を補充したＨａｎｋｓ溶液において、３７℃で３〜５時間、継続した。酵素による分解後、初代骨芽細胞を、１０％ウシ胎児血清、２０Ｕ／ｍｌペニシリン ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌパートリシン（Ｐａｒｔｒｉｃｉｎ）、０．０５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸及び０．１５ｍｇ／ｍｌグルタミンを補充したＨＡＭｓ Ｆ１２培地に播種した。
【００５２】
実際の研究のために、ヒト骨芽細胞の単層細胞培養物を、０．５ｍｇ／ｍｌの関係するコラーゲン加水分解物（実施例又は比較例の１つによる）を補充した培地中で、２４時間インキュベートした。それぞれの場合について、対照を、加水分解物を含まない培地でインキュベートした。続いて、関係するｍＲＮＡ発現の決定を、上記のように行った。
【００５３】
Ｉ型コラーゲン及びオステオカルシンの合成の刺激についての結果を、図２に示し、それぞれの場合について、左側が実施例で、右側が比較例４である。縦軸に示されるのが、対照（＝１）と比較した、ｍＲＮＡ発現である（少なくとも１２の独立した試験からの平均値及び標準偏差）。Ｉ型コラーゲンは、骨の材料の間違いなく最も重要な基質タンパク質であるのに対して、オステオカルシンは、基質の分化に関わる酵素であり、その高められた発現はまた、基質の構築に有利に働く。
【００５４】
両方の場合において、本願発明による顕著な刺激効果があり、具体的には、平均で、コラーゲンのｍＲＮＡ発現の増強は、約２．７倍であり、そして平均で、オステオカルシンのｍＲＮＡ発現の増強は、約２．０倍である。興味深いことに、そこから明瞭であるように、比較例４による加水分解物は、そしてそれは、異なる出発原料から生成されそして低い平均分子量を有し、実際２つのｍＲＮＡの発現の低下を引き起こし、そしてそれは、本願発明によるコラーゲン加水分解物の高い特異性を示している。
【００５５】
Ｉ型コラーゲン、バイグリカン、バーシカン及びアルカリホスファターゼの合成の刺激についての対応する結果を、図３に示し、それぞれ左側から、本願発明による実施例、比較例１、２及び３の結果である（少なくとも１２の独立した試験からの平均値及び標準偏差）。バイグリカン及びバーシカンは、骨基質の構造的組織化に役立つプロテオグリカンである。アルカリホスファターゼは、他の機能と同時に、骨基質の分化においてオステオカルシンと同じように関与する。
【００５６】
ここでまた、４つのすべてのタンパク質について、本願発明によるコラーゲン加水分解物が、比較例の全てよりも、より良い効果を有することが理解され得る。後者の中で、比較例３のみが、Ｉ型コラーゲンの合成に対してわずかに刺激効果を有するが（約１．３倍）、一方で、他のすべての場合において、全く効果がないか、又は悪影響さえ及ぼす（すなわち、ｍＲＮＡ合成の低減）。バイグリカン、バーシカン及びアルカリホスファターゼで、本願発明のコラーゲン加水分解物の効果はまた、相対的に弱いが、他の加水分解物のものよりもそれぞれの場合で、より良好である。
【００５７】
さまざまな他の加水分解物と比較した、本願発明によるコラーゲン加水分解物の改善された有効性は、従って、研究した全ての基質タンパク質及び酵素に関して、確認され、これらの高められた発現は、骨基質の構築を促進する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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