(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１又は２以上のペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、のペプチド混合物。
【請求項２】
廃用性筋萎縮又は加齢性筋萎縮の抑制に用いられる請求項１に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の筋萎縮抑制剤と、薬学的に許容される担体とを含む、筋萎縮の予防又は治療用の医薬。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１又は２以上のペプチドを有効成分として含む筋萎縮抑制用飲食品：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、のペプチド混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド又はペプチド混合物を有効成分とする筋萎縮抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は、成人の身体重量の約４０％を占め、関節運動を協調させた円滑な動きや姿勢の維持に関与している。また、熱産生による体温の維持やインスリンの標的臓器として血糖調節にも重要な役割を果たしている。骨格筋は、加齢、不活動（ベッドレスト、ギプス固定）、無重力環境下暴露、除神経及び疾病等によって萎縮し、その機能が低下する。骨格筋の萎縮は運動能力の低下を招き、やがて日常生活の動作にも不具合をきたすようになり、生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ；ＱＯＬ）を低下させる。したがって、ＱＯＬの維持向上のために、筋萎縮の対策は重要な課題であると言える。
【０００３】
筋萎縮に対しては、筋力トレーニングによる運動療法が効果的である。しかしながら、筋萎縮によって運動能力が低下すると、身体的な運動に困難が伴うようになるため、効果的な筋力トレーニングを十分に行えない場合も多い。また、筋萎縮によって行動量が減少し、さらに病態を悪化させてしまうという悪循環を招くこともある。そのため、非力学的な治療法、すなわち、食品や医薬品の形態として摂取が可能な筋萎縮抑制に有効な成分が求められている。
【０００４】
これまでに、筋萎縮の抑制のために食品や医薬品の形態で摂取が可能なものとして、以下の発明が開示されている。例えば、特許文献１には、大豆ペプチドを有効成分として含むユビキチンリガーゼ阻害剤が開示されている。
特許文献２には、コラーゲンもしくはゼラチン又はこれらを加水分解して得られるペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤が開示されている。
また、特許文献３には、乳由来塩基性タンパク質画分又は乳由来塩基性タンパク質画分加水分解物を有効成分とする筋萎縮防止剤が開示されている。特許文献３に記載された発明によれば、分子量３，０００〜８０，０００Ｄａの範囲のタンパク質画分を投与することにより筋萎縮を抑制することが図られている。
さらに、特許文献４には、筋萎縮症の予防又は治療に用いられる、ラクトフェリン又はラクトフェリンの部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−０１３４６８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０３０５１４号
【特許文献３】特開２０１４−１９３８２１号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０５０１１６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のとおり、特許文献１〜３においては、筋萎縮抑制剤の有効成分としていくつかのタンパク質加水分解物が開示されている。しかしながら、タンパク質加水分解物中の如何なる成分が、筋萎縮に対して影響を及ぼしているのかについての検証は十分ではなかった。また、特許文献４は、システインプロテアーゼ阻害剤によって筋萎縮の治療を図るものであるが、近年では、システインプロテアーゼ阻害剤よりも優れた筋萎縮抑制剤への需要が存在する。
よって、本発明は、特定のアミノ酸配列からなるペプチド又はペプチド混合物を有効成分とし、優れた筋萎縮抑制効果を有する新規な筋萎縮抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者が鋭意研究を進めた結果、配列番号１で表される特定のアミノ酸配列を有する１０残基のペプチドが、優れた筋萎縮抑制作用を有することを見出した。また、前記１０残基ペプチドの一部のアミノ酸配列から構成されるペプチドであって、配列番号５で表される３残基のペプチドにも優れた筋萎縮抑制効果があることを見出した。さらに、意外なことに、前記１０残基ペプチドの一部のアミノ酸配列から構成されるペプチドであって、単独では筋萎縮抑制効果が見られない配列番号１７〜１９で表される５残基のペプチドが、これらを混合した場合には筋萎縮抑制効果を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、前記課題を解決する本開示における第一の発明は、以下の［１］を構成するものである。
［１］以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１又は２以上のペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、のペプチド混合物。
また、第一の発明は、廃用性筋萎縮又は加齢性筋萎縮の抑制に用いられることを好ましい態様としている。
前記課題を解決する本開示における第二の発明は、以下の［２］を構成するものである。
［２］前記第一の発明の筋萎縮抑制剤と、薬学的に許容される担体とを含む、筋萎縮の予防又は治療用の医薬。
【０００９】
また、本開示における発明は、以下の［３］及び［４］を採用することも可能である。
［３］前記第一の発明の筋萎縮抑制剤を含む飲食品。
［４］前記第一の発明の筋萎縮抑制剤を含む飼料。
【００１０】
さらに、本開示における発明は、以下の［５］及び［６］を採用することも可能である。
［５］以下の（１）〜（３）からなる群より選択される１又は２以上のペプチドを有効成分とするユビキチンリガーゼ阻害剤。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、のペプチド混合物。
［６］前記ユビキチンリガーゼがＭｕＲＦ１である、［５］に記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、筋萎縮抑制効果により優れた筋萎縮抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。なお、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１３】
＜筋萎縮＞
本明細書における「筋萎縮」とは、筋肉を構成する骨格筋タンパク質の生成と分解のバランスが分解側に傾くことによって、筋肉がやせることを意味する。また、「抑制」とは、適用対象における疾患の症状・状態の好転、疾患の症状・状態の悪化の防止若しくは遅延又は進行の逆転等を意味するものである。さらに、本明細書における「抑制」とは、適用対象における疾患の発症の防止若しくは発症の遅延、又は適用対象の疾患の発症の危険性を低下させる等の予防的な意味をも包含するものである。
【００１４】
＜ペプチド＞
本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分は、特定のアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドである。ペプチドが２種類以上含まれる場合は、これをペプチド混合物とも記載する。
すなわち、本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチド又はペプチド混合物は、以下の〔１〕〜〔３〕に記載のものである。
〔１〕配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
〔２〕配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
〔３〕配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとのペプチド混合物。
また、本発明のペプチドは、当該ペプチドの塩類であってもよい。ペプチドの塩を構成する塩類としては、例えば、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属類；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属類等が挙げられる。
【００１５】
本発明の前記ペプチド又はペプチド混合物は、筋萎縮抑制効果を有する。当該筋萎縮抑制効果は、本発明の有効成分であるペプチド又はペプチド混合物により発揮される。本発明における筋萎縮抑制効果は、例えば、ユビキチンリガーゼであるＭｕＲＦ１（Ｍｕｓｃｌｅ  ＲＩＮＧ−ＦｉｎｇｅｒＰｒｏｔｅｉｎ−１）の酵素活性を阻害する作用に基づくものである。ここで、前記ＭｕＲＦ１は、骨格筋タンパク質分解反応において、骨格筋タンパク質へのユビキチンの付加（ユビキチン化）に必要な酵素の一種である。骨格筋タンパク質に複数のユビキチンが付加する（ポリユビキチン化）ことが、骨格筋タンパク質の分解反応開始のシグナルとなる。
すなわち、本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチド又はペプチド混合物は、ＭｕＲＦ１の酵素活性を阻害することによって、骨格筋タンパク質のユビキチン化を阻害することができる。その結果、骨格筋タンパク質の分解反応が抑制されるため、筋萎縮を抑制することができる。
なお、本発明の筋萎縮抑制剤における筋萎縮抑制効果は、ＭｕＲＦ１以外のその他の筋萎縮関連ユビキチンリガーゼ（例えば、ａｔｒｏｇｉｎ−１、Ｃｂｌ−ｂ、Ｓｉａｈ−１Ａ等）に対する阻害効果であってもよい。
筋萎縮抑制効果を発揮するための本発明のペプチド又はペプチド混合物の添加量は、後述するＭｕＲＦ１阻害活性能評価試験に応じて適宜決定される。
【００１６】
本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドは、消化吸収性に優れることから、経口投与することにより、生体内で速やかに筋萎縮抑制効果を発揮することができる。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、前記ペプチドのうち特に低分子であることから、速やかな筋萎縮抑制効果の発揮という点で、より好適に用いることができる。
【００１７】
本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドは、例えば、（１）前記アミノ酸配列（配列番号１、５、１７、１８又は１９のいずれかのアミノ酸配列）からなるペプチドを含むように蛋白質やペプチドを加水分解酵素にて消化した後に得られるペプチド混合物より分離精製して得る方法、（２）ペプチドの化学合成方法にて前記アミノ酸配列（配列番号１、５、１７、１８又は１９のいずれかのアミノ酸配列）から構成されるペプチドを合成した後、得られた合成物から目的物を分離精製して得る方法、（３）前記ペプチド及びこれを含むペプチド等を生産する植物、動物や微生物から抽出し、得られた抽出物から分離精製する方法等により得ることができる。本明細書においては、前記の（２）の方法によりペプチドを製造する方法について、以下のとおり説明する。
【００１８】
すなわち、本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドの化学合成は、オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法または固相法によって行うことができる。合成されたペプチドは必要に応じて脱保護され、未反応試薬や副生物等を除去して、本発明の有効成分であるペプチドを単離することが可能である。
このようなペプチドの合成は、市販のペプチド合成装置を用いて行うことができる。
【００１９】
＜筋萎縮抑制剤＞
本発明の筋萎縮抑制剤は、ヒト又は哺乳動物に投与することによって、筋萎縮を良好に抑制することができる。
ここで、筋萎縮は、症状の原因等によって、いくつかの種類に分類されている。例えば、「廃用性筋萎縮」は、最も一般的にみられる筋萎縮であり、何らかの事情で筋肉が一定期間使用されなかったことによって、筋肉の容量が減退して起こるものである。これは、宇宙飛行等における無重力環境下や骨折時のギプスによる固定によって、一定期間筋肉の使用頻度が低下することにより発症する筋萎縮である。
【００２０】
また、加齢に伴い緩やかに進行する「加齢性筋萎縮」は、「サルコペニア」とも呼ばれ、廃用性筋萎縮とは区別される場合がある。
筋ジストロフィー、先天性ミオパチー代謝性筋疾患、ミトコンドリア病及び糖原病等の病態において観察される筋萎縮は、「筋原性筋萎縮」と呼ばれ、筋肉自体に何らかの障害が発生して発症するものである。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、乳児脊椎性筋萎縮症、シャルコ・マリー・ツース病、先天性ミエリン形成不全症等は、筋肉に指令や栄養を供給している運動ニューロンにおける何らかの障害が原因となって筋萎縮が誘発されるもので、「神経原性筋萎縮」と呼ばれている。
【００２１】
ここで、ユビキチンリガーゼであるＭｕＲＦ１は、廃用性筋萎縮や加齢性筋萎縮において特に活性化することが知られている（参考文献１：二川健、「廃用性筋萎縮のターゲットとしてのユビキチンリガーゼ」、生化学、平成２１年７月２１日発行、第８１巻第７号、第６１４−６１８頁。参考文献２：鈴木隆雄監修、「サルコペニアの基礎と臨床」、真興交易（株）医書出版部、２０１１年４月１０日第１版第１刷発行、第２６頁。）。一方で、筋萎縮症の治療剤として知られているシステインプロテアーゼ阻害剤による作用は、廃用性筋萎縮のモデルとして知られている懸垂ラットを用いた筋萎縮抑制試験においては、筋萎縮抑制効果を発揮しなかったという報告がある（参考文献３：二川建ら、「蛋白質分解酵素阻害剤による無重力下の筋萎縮および骨粗鬆症の治療」、［online］、宇宙環境利用に関する公募地上研究平成１１年度研究成果報告書［平成２７年２月１９日検索］、インターネット<URL:https://www.jsforum.or.jp/technic/su/public/report/1999/19970241nikawa/19970241nikawa_j.html>）。
本発明の筋萎縮抑制剤は、廃用性筋萎縮や加齢性筋萎縮との関連性があるユビキチンリガーゼＭｕＲＦ１の活性を阻害する効果を有するので、特に廃用性筋萎縮又は加齢性筋萎縮に対して好適に使用することができる。
【００２２】
＜医薬＞
本発明の筋萎縮抑制剤は、その一態様として、医薬として利用することができる。該医薬は、前記筋萎縮抑制剤をそのまま、又は前記筋萎縮抑制剤を薬学的に許容される担体と組合せて、製剤化することができる。すなわち、該医薬は、投与により筋萎縮抑制効果が発揮される程度に、前記ペプチドを含有するものであれば良い。該医薬は、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
ここで、該医薬の投与は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。また、製剤化に際しては、本発明の有効成分であるペプチドの他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、本発明の筋萎縮抑制剤を含有しているものであれば、公知の又は将来的に見出される筋萎縮に関連する疾患の改善効果を有する成分を、本発明の筋萎縮抑制剤と併用することもできる。
【００２３】
さらに、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、噴霧剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤等に製剤化することができる。
【００２４】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるペプチドのみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００２５】
製剤担体を配合する場合、筋萎縮抑制剤の量は特に限定されず、剤形に合わせて一日あたりの摂取量又は投与量に基づいて適宜選択される。例えば、筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドの前記医薬中の含有量は、好ましくは少なくとも０．００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００５質量％、さらに好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また、本発明の当該量の上限は、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下が例示される。
【００２６】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００２７】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００２８】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００２９】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００３０】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００３１】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００３２】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００３３】
本発明の筋萎縮抑制剤を含有する医薬は、筋萎縮抑制作用により、廃用性筋萎縮、サルコペニア、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー代謝性筋疾患、ミトコンドリア病、糖原病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、乳児脊椎性筋萎縮症、シャルコ・マリー・ツース病、先天性ミエリン形成不全症等の治療又は予防に使用することが出来る。
本発明の筋萎縮抑制剤を含有する医薬の投与量は、投与対象の年齢、性別等の条件により適宜選択することができる。例えば、ペプチドの量として、好ましくは０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．０２〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは０．２〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日となる量を目安にすることができる。また、当該投与量が得られる範囲で、１日複数回に分けて行ってもよい。
【００３４】
＜飲食品＞
本発明の筋萎縮抑制剤は、筋萎縮の抑制のための飲食品の有効成分としてこれらに配合して使用することができる。
本発明の筋萎縮抑制剤を飲食品に利用する場合、公知の飲食品に添加して筋萎縮抑制効果を有する飲食品を調製することができる。また、飲食品の原料中に混合して筋萎縮の抑制効果を有する新たな飲食品を製造することもできる。
【００３５】
前記飲食品は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料類、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００３６】
小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
【００３７】
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
【００３８】
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等が挙げられる。
【００３９】
また、本発明で定義される飲食品は、筋萎縮抑制用との保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
【００４０】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００４１】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００４２】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００４３】
なお、飲食品を製造する際に添加する本発明の筋萎縮抑制剤の含有量は特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドの前記飲食品中の含有量は、好ましくは少なくとも０．００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００５質量％、さらに好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また、本発明の当該量の上限は、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下が例示される。
本発明の筋萎縮抑制剤を含む飲食品を摂取させることにより、筋萎縮を良好に抑制することができる。
【００４４】
＜飼料＞
本発明の筋萎縮抑制剤は、筋萎縮の抑制のための飼料の有効成分としてこれらに配合して使用することができる。
本発明の筋萎縮抑制剤を飼料に利用する場合、公知の飼料に添加して筋萎縮の改善効果を有する飼料を調製することもできるし、飼料の原料中混合して筋萎縮の改善効果を有する新たな飼料を製造することもできる。
【００４５】
前記飼料の原料としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。また、前記飼料の形態としては、例えば、愛玩動物用飼料（ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００４６】
なお、飼料を製造する際に添加する本発明の筋萎縮抑制剤の含有量は特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、筋萎縮抑制剤の有効成分であるペプチドの前記飼料中の含有量は、好ましくは少なくとも０．００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００５質量％、さらに好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また、本発明の当該量の上限は、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下が例示される。
本発明の筋萎縮抑制剤を含む飼料を摂取させることにより、筋萎縮を良好に抑制することができる。
【００４７】
〔ＭｕＲＦ１阻害活性能評価試験〕
ここで、本発明の筋萎縮抑制剤の筋萎縮抑制効果は、前記ＭｕＲＦ１の阻害活性として、以下の方法により評価することができる。すなわち、ユビキチン、並びに、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）及びユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ＭｕＲＦ１を、ＡＴＰ及びＭｇ２＋の存在下で調製し、この系に基質タンパク質として骨格筋を構成するミオシン、及び試験試料を添加して反応させる。当該反応が十分に進んだ後、当該反応液をウエスタンブロット法等の常法により、ユビキチン化されたミオシンを検出・解析する。
解析の結果、検出されたユビキチン化ミオシンが多い程、前記試験試料が有するＭｕＲＦ１阻害活性は低いため、筋萎縮抑制効果が低いと評価することが出来る。一方、検出されたユビキチン化ミオシンが少ない程、前記試験試料のＭｕＲＦ１阻害活性は高いため、筋萎縮抑制効果が高いと評価することができる。
なお、本評価試験において、本発明のペプチド又はペプチド混合物を試験試料とする場合、その添加量は酵素等の使用量に応じて設定することができる。例えば、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を２０ｎＭ、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）を４００ｎＭ、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ＭｕＲＦ１を２００ｎＭ、ユビキチン４０００ｎＭ、Ｍｇ−ＡＴＰを８００ｎＭ及びミオシンを１０００ｎＭ含む反応系で行われる場合、本発明のペプチド又はペプチド混合物の添加量は、１μＭ〜１００ｍＭが好ましく、１０〜１００００μＭがより好ましく、１００〜２０００μＭがさらに好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［試験例１］
ＭｕＲＦ１阻害活性の評価１
ランダムなアミノ酸配列からなる１０残基のペプチドを合成し、当該１０残基のペプチドを対象として、ＭｕＲＦ１阻害作用の評価を行った。すなわち、当該ペプチドが、ＭｕＲＦ１の酵素活性部位に結合して、ＭｕＲＦ１の酵素活性を阻害する作用を有するか否かに関して評価を行った。
具体的には、前記ＭｕＲＦ１阻害活性能評価試験法に基づいて、合成したペプチドがＭｕＲＦ１の酵素活性を阻害する機能を有するか否かの評価を実施した。ユビキチン化システムの各成分Ｅ１、Ｅ２及びユビキチン（Ｌｉｆｅ  ｓｅｎｓｏｒ社製）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）ＭｕＲＦ１及びＭｇ−ＡＴＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ社製）に基質であるミオシン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．社製、「Ｍｙｏｓｉｎ  Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」）を加え、室温で１時間反応させた。当該反応系における各成分の濃度は、以下の表１のとおりとした。そして、前記反応系にペプチドの終濃度が５００μＭとなるように、ペプチドを添加した。また、ペプチドを添加しないものを陰性対照（コントロール）とした。
その後、Ａｎｔｉ−ユビキチン抗体を用いて、ウエスタンブロット法でユビキチン化ミオシンの検出を実施し、画像解析ソフトにより検出バンドの蛍光強度を数値化した。
【００５０】
【表１】
0006369990.tif 000002
【００５１】
その結果、陰性対照に対して、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを混合した反応系において、ユビキチン化ミオシン由来のバンドの蛍光強度が有意に低下した。
したがって、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ユビキチンリガーゼＭｕＲＦ１阻害活性を有するペプチドとして同定された。
【００５２】
［試験例２］
ＭｕＲＦ１阻害活性の評価２
前記試験例１にてＭｕＲＦ１阻害作用が確認された配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、ＭｕＲＦ１阻害活性を示す最小単位のアミノ酸配列を確認するための試験を実施した。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に由来する２乃至３残基のペプチドを合成し、これらのＭｕＲＦ１阻害活性を評価した。
配列番号１で表されるペプチドのアミノ酸配列由来のペプチドを対象として評価した。各ペプチドの合成は、試験例１と同様の手法で行った。なお、後述する表において、各ペプチドは、以下に記載するアミノ酸一文字表記で示す。ここで、アミノ酸一文字表記において、Ｗはトリプトファン残基（Ｔｒｐ）、Ｑはグルタミン残基（Ｇｌｎ）、Ｋはリジン残基（Ｌｙｓ）、Ｒはアルギニン残基（Ａｒｇ）、Ｍはメチオニン残基（Ｍｅｔ）、Ｃはシステイン残基（Ｃｙｓ）を示す。
＜評価対象ペプチド：アミノ酸一文字表記＞
〔１〕配列番号１で表されるペプチド：ＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫ
〔２〕配列番号２で表されるペプチド：ＣＲＲ
〔３〕配列番号３で表されるペプチド：ＲＲＷ
〔４〕配列番号４で表されるペプチド：ＲＷＱ
〔５〕配列番号５で表されるペプチド：ＷＱＷ
〔６〕配列番号６で表されるペプチド：ＱＷＲ
〔７〕配列番号７で表されるペプチド：ＷＲＭ
〔８〕配列番号８で表されるペプチド：ＲＭＫ
〔９〕配列番号９で表されるペプチド：ＣＲ
〔１０〕配列番号１０で表されるペプチド：ＲＲ
〔１１〕配列番号１１で表されるペプチド：ＲＷ
〔１２〕配列番号１２で表されるペプチド：ＷＱ
〔１３〕配列番号１３で表されるペプチド：ＱＷ
〔１４〕配列番号１４で表されるペプチド：ＷＲ
〔１５〕配列番号１５で表されるペプチド：ＲＭ
〔１６〕配列番号１６で表されるペプチド：ＭＫ
【００５３】
試験例１におけるＭｕＲＦ１阻害作用の評価と同様の手法で、ユビキチン化システムを調製し、この反応系に前記〔１〕〜〔１６〕の各ペプチドを終濃度５００μＭになるように添加した後、ａｎｔｉ−ユビキチン抗体を用いて、ウエスタンブロット法でユビキチン化ミオシンの検出を実施し、各ペプチドのＭｕＲＦ１阻害効果を評価した。なお、陽性対照として、基質タンパク質のユビキチン化を阻害する作用を有するＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；脱ユビキチン化酵素）を終濃度５００μＭとなるように加えたものも用意した。また、前記ペプチド及びＮＥＭのいずれも添加しない反応系を陰性対照（コントロール）とした。
ウエスタンブロット法により検出されたバンドを、画像解析ソフトにより解析して蛍光強度を数値化した。その結果を表２に示す。
【００５４】
陰性対照の蛍光強度に対する、各サンプル系におけるユビキチン化ミオシン由来のバンドの蛍光強度を、相対蛍光強度とした。ユビキチン化ミオシンの濃度（生成量）が高い程、検出されるバンドは濃く、蛍光強度は高くなる。したがって、蛍光強度が高い程、ユビキチン化ミオシンの濃度が高く、対象サンプルのＭｕＲＦ１阻害活性が低い。逆に、蛍光強度が低い程に対象サンプルのＭｕＲＦ１阻害活性が高いと判断することができる。
【００５５】
【表２】
0006369990.tif 000003
【００５６】
試験の結果、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（サンプルＮｏ．５）の相対蛍光強度が、陰性対照に対して０．２にまで低下した。この値は、陽性対照のＮＥＭ及び試験例１においてＭｕＲＦ１阻害活性が確認された配列番号１で表されるペプチドと同じ値であった。よって、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＭｕＲＦ１阻害活性を有することが確認された。
一方、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド以外のペプチドについては、蛍光強度の値が陽性対照のＮＥＭや配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと比較して倍以上の値であった。そのため、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド以外の前記２乃至３残基のペプチドには、ＭｕＲＦ１阻害活性が無いか、活性が弱いことが示唆された。
以上のことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＭｕＲＦ１阻害効果において、活性を示す最小単位の内部配列は、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ（アミノ酸一文字表記：ＷＱＷ）であることが確認された。
【００５７】
［試験例３］
ＭｕＲＦ１阻害活性の評価３
次に、試験例２において、最小単位の活性部位であると確認された配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドについて、Ｎ末端及びＣ末端にアミノ酸残基を付加した際に、同様の活性を維持するかどうかを確認するための試験を行った。
すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列に由来するペプチドであって、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであるＷＱＷの全部又は一部を含む以下の〔１７〕〜〔１９〕のアミノ酸配列からなる５残基のペプチドについてＭｕＲＦ１阻害活性試験を行った。
また、前記〔１７〕〜〔１９〕のアミノ酸配列からなる５残基のペプチド３種（配列番号１７−１９）を等量混合したペプチド混合物についても同様に試験を行った。
〔１７〕配列番号１７で表されるペプチド：ＲＷＱＷＲ
〔１８〕配列番号１８で表されるペプチド：ＣＲＲＷＱ
〔１９〕配列番号１９で表されるペプチド：ＱＷＲＭＫ
【００５８】
試験方法は、前記試験例２におけるＭｕＲＦ１阻害作用の評価と同様の手法で各ペプチドのＭｕＲＦ１阻害効果を評価した。なお、試験例２と同様に、陽性対照として、基質タンパク質のユビキチン化を阻害する作用を有するＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；脱ユビキチン化酵素）を終濃度５００μＭとなるように加えたものも用意した。また、前記ペプチド及びＮＥＭのいずれも添加しない反応系を陰性対照（コントロール）とした。
ウエスタンブロット法により検出されたバンドを、画像解析ソフトにより解析して蛍光強度を数値化した。陰性対照に対する蛍光強度を相対蛍光強度として算出した結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0006369990.tif 000004
【００６０】
試験の結果、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（サンプルＮｏ．１８）及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（サンプルＮｏ．１９）については、相対蛍光強度の低下は不十分であり、ＭｕＲＦ１阻害活性が無いか、活性が弱いことが確認された。
また、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列を完全に包含する配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（サンプルＮｏ．１７）については、相対蛍光強度は陰性対照と同等であり、ＭｕＲＦ１阻害活性が無いことがわかった。すなわち、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのアミノ酸配列について、Ｎ末端及びＣ末端にアルギニンが付加されると、ＭｕＲＦ１阻害活性が消失されることがわかった。
すなわち、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを包含するような、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであっても、共通するアミノ酸配列ＷＱＷのＮ末端側やＣに付加されるアミノ酸残基の種類や長さの違いによって、ＭｕＲＦ１に対する阻害活性の強さが異なることが判明した。
特に、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを内部配列に含む配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドにはＭｕＲＦ１に対する阻害活性が消失されていたことは意外な結果であり、ＭｕＲＦ１に対する阻害活性を有するペプチドには、固有のアミノ酸配列が必要であることが明らかとなった。
【００６１】
一方、単独ではＭｕＲＦ１阻害活性を示さない前記３種のペプチド（配列番号１７−１９）を等量混合したサンプルＮｏ．２０では、相対蛍光強度の低下がＮＥＭ及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと同等であり、ＭｕＲＦ１阻害活性を有することが認められた。
すなわち、単独ではそれぞれＭｕＲＦ１阻害活性は確認されないものの、３種を混合したペプチド混合物においてＭｕＲＦ１阻害活性が確認されたことは、極めて意外な結果であった。
【００６２】
本願発明によって明らかとなったペプチドによるＭｕＲＦ１阻害活性は、単に蛋白質を加水分解して得られたペプチドであったとしても、アミノ酸配列が共通しているだけではなく、具体的にペプチドの内部にどのようなアミノ酸配列を有するかによって、ＭｕＲＦ１阻害活性に大きな影響を及ぼすことを示唆するものである。すなわち、酵素による蛋白質の切断部位が、ＭｕＲＦ１阻害活性の発生に複雑に寄与するものと考えられる。
よって、本願発明は、ペプチドのアミノ酸配列が特定されていない特許文献１〜３に記載された発明を参酌したとしても、容易に想到できるものではない。
【００６３】
以上の結果より、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、並びに、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの３種のペプチドの混合物は、ＭｕＲＦ１阻害活性を有することが認められた。すなわち、これらのペプチド及び／又はペプチド混合物は、ＭｕＲＦ１の活性を阻害するので、骨格筋タンパク質の分解を抑制して、筋萎縮を抑制するのに有用なものである。
【００６４】
［実施例１］
前記配列番号１で表されるペプチド５０ｇに、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）７３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルトフレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ｋＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、前記配列番号１で表されるペプチドを含有するタブレット（筋萎縮抑制剤）１８００錠を製造した。タブレット１錠当りのペプチド含量は約５質量％であった。
【配列表】
0006369990000001.app