(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
作動的に連結されたシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）エレメント、及びキメライントロンを含み、
該ＭＡＲエレメントが、配列番号４０又は４１によって表され、
該キメライントロンが、配列番号２５によって表され、
図１９に開示されるｐＭＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ又はｐＭＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣのベクターマップを有する（ただし、前記ベクターマップに含まれたＥＲ２ＬＣ及びＥＲ２ＨＣは前記プロモーターによって発現が調節される標的遺伝子に置換される）、発現ベクター。
【請求項２】
前記ＳＶ４０プロモーターが、配列番号１２によって表される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
配列番号１５又は１６によって表される遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）エレメントを更に含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記標的遺伝子が、
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子、上皮増殖因子受容体ファミリー抗体遺伝子、インスリン遺伝子、インターロイキン遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、インターフェロン遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、ケモカイン遺伝子、エリスロポイエチン遺伝子、α−フェトプロテイン遺伝子、ａ−グルコシダーゼ遺伝子、α１−アンチトリプシン遺伝子、アンチトロンビン遺伝子、リポタンパク質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子、フィブリノゲン遺伝子、グルコセレブロシダーゼ遺伝子、ハプトグロビン遺伝子、プラスミノゲン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、及びトランスフェリン遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクターによって形質転換された細胞。
【請求項６】
前記細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳ１細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＢＨＫ細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現ベクターによって形質転換された細胞を培養して標的タンパク質を発現させる工程と、
該標的タンパク質を回収する工程と
を含む、標的タンパク質を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現が改善された発現ベクター、その発現ベクターによって形質転換された細胞、及びその形質転換細胞を使用することによって標的タンパク質を大量産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療的組換えタンパク質及び抗体の産生は、殆どの場合動物細胞を使用することによって行われており、産生の効率を高める試みが続いている。
【０００３】
例えば、無血清培地に予め適応させた懸濁宿主細胞株が、高産生細胞株を迅速に選択するために使用されてきた。また、遺伝子増幅に必要とする時間を除く又は短縮するために高発現ベクター及び高産生細胞株が継続的に開発されてきた。細胞株の初期選択において自動細胞選択装置を使用することによる効果的な方法の開発も試みられてきた。
【０００４】
高産生細胞株は、遺伝子増幅なしでも３０〜８０ｐｃｄの発現レベルを示し、高産生細胞株は、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、又はＭＡＲと類似の遍在性クロマチンオープニングエレメント（ubiquitous chromatin opening element）（ＵＣＯＥ）に基づく高発現ベクターを使用することにより４カ月以内に調製することができる。
【０００５】
最近の研究は、６カ月以内に３〜５ｇ／Ｌの抗体生産性を達成するにはベクターの最適化が必要であることを示している。近年では、二重ＭＡＲ、複数ＭＡＲ、トランスＭＡＲ等のようなＭＡＲエレメントの最適化による生産性強化の可能性が示唆されているが、５’ＵＴＲ又はイントロンエレメントの導入によって得ることができる、産生効率が改善された安定なベクターが、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、標的タンパク質を大量に発現及び産生するための発現ベクターを提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
上記の発現ベクターによって形質転換された細胞を提供することが、本発明の別の目的である。
【０００８】
形質転換細胞を使用することによって標的タンパク質を大量に産生する方法を提供することが、本発明の更に別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の本発明の目的を達成するために、作動的に連結されたシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、足場付着領域（ＳＡＲ）又はマトリックス結合領域（ＭＡＲ）エレメント、及びキメライントロンを含む発現ベクターが、提供される。
【００１０】
上記の本発明の別の目的を達成するために、上記の発現ベクターによって形質転換された細胞が、提供される。
【００１１】
上記の本発明の更に別の目的を達成するために、形質転換細胞を培養することによって標的タンパク質を大量産生する方法が、提供される。
【００１２】
本発明による発現ベクターは、従来の発現ベクターと比較して優れた遺伝子発現を示し、従って、外来性遺伝子のタンパク質発現を有意に高めることができる。
【００１３】
本発明の上記の及び他の目的及び特徴は、添付の図面と併用して本発明の以下の説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＭＡＲ候補エレメントに関するルシフェラーゼベクターの概念図である。
【図２】ＭＡＲ候補エレメントのルシフェラーゼ発現結果を示す図である。
【図３】比較プロモーター試験のルシフェラーゼ発現結果を示す図である。
【図４】ＬＣＲ（遺伝子座制御領域）候補エレメントに関するルシフェラーゼベクターの概念図である。
【図５】Ａｌｂ  Ｅ６４×４  ＬＣＲエレメントを調製するためのＰＣＲ戦略を示す図である。
【図６−７】ＬＣＲ候補エレメントのルシフェラーゼ発現結果を示す図である。
【図８】ｄＣＦＨ（ヒト補体因子Ｈの欠失形態）の調製過程を示す図である。
【図９】ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるｄＣＦＨの発現レベルを示す図である。
【図１０】２９３Ｆ細胞におけるｄＣＦＨの発現レベルを示す図である。
【図１１】ＣＨＯ−ＤＧ４４安定細胞におけるｄＣＦＨの発現レベルを示す図である。
【図１２−１３】ＦＩＸ発現ベクター組１の概念図及びそれぞれの発現結果を示す図である。
【図１４−１５】ＦＩＸ発現ベクター組２の概念図及びそれぞれの発現結果を示す図である。
【図１６】ピューロマイシン発現系の制限酵素地図を示す図である。
【図１７】一対の新規ベクター、ｐＭＳ−Ｐ−ＭＣＳ及びｐＭＳ−Ｄ−ＭＣの構造を示す図である。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ＥＲ２抗体発現のための第１の一対の新規ベクター（「新規ベクター対Ｉ」）（ｐＭＳ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）及び一対のＭＡＲベクター（ｐＭＳＧｎｅｏ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳＧｎｅｏ−ＥＲ２ＨＣ）の構造をそれぞれ示す図である。
【図１９】ＥＲ２抗体発現のための第２の一対の新規ベクター（「新規ベクター対ＩＩ」）（ｐＭＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）の構造を示す図である。
【図２０Ａ−２０Ｂ】それぞれ一対のプロモーターベクター（ｐＳ）（ｐＳ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＳ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）、及び一対のイントロンベクター（ｐＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）の構造を示す図である。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ＣＨＯ付着細胞ＣＨＯ−Ｋ１及びＤＧ４４それぞれにおけるＥＲ２抗体発現レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等における外来性遺伝子の発現の産生効率が改善された安定発現ベクターを調製するために、遺伝子発現レベルを高め得るエレメントを、様々なＭＡＲエレメント、足場付着領域（ＳＡＲ）エレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）及びイントロンエレメントの中から同定する。
【００１６】
従って、本発明は、作動的に連結されたシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、足場付着領域（ＳＡＲ）又はマトリックス結合領域（ＭＡＲ）エレメント、及びキメライントロンを含む発現ベクターを提供する。
【００１７】
本明細書では、用語「プロモーター」とは、コード領域の上流にある非翻訳核酸配列のことを指し、その配列はポリメラーゼの結合部位を含み、下流の遺伝子に対するｍＲＮＡの転写開始活性を有する。具体的には、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始するために機能するＴＡＴＡボックス又はＴＡＴＡ様の領域を含むが；その周りの領域に制限されず；ＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質と結合して発現を調節するのに必要な領域を含むことができる。
【００１８】
本発明において、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター又はそのバリアント、好ましくは配列番号１２によって表されるＳＶ４０プロモーターを含むことができる。プロモーターバリアントとは、遺伝子発現を高めるために、プロモーター配列の特定の部分が、付加、欠失又は置換によって修飾されているバリアントのことを指す。
【００１９】
本発明の一実施形態によると、ＳＶ４０プロモーターを使用する本発明の発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターと比較して約４倍の発現増加を示す（実施例１−１を参照のこと）。
【００２０】
加えて、そのようなプロモーターは、外来性遺伝子である標的遺伝子に作動的に連結されており；本明細書では「作動的に連結される」とは、標的遺伝子の発現を調節する核酸配列と標的タンパク質をコードする核酸配列とが、一般的な機能を実行できるように機能的に連結されることを意味する。組換えベクターへの作動可能な連結は、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して実現することができ；部位特異的ＤＮＡ切断及び連結を、当業者に一般に公知の酵素を使用して行うことができる。
【００２１】
本発明において、遺伝子発現増加エレメントに、ＳＡＲ又はＭＡＲエレメントを含めることができる。そのようなエレメントがプロモーターの５’末端；３’末端；若しくは５’及び３’末端の両方に存在できるように、ＳＡＲ又はＭＡＲエレメントを含めて、発現ベクターを構成することができる。
【００２２】
本明細書では、「ＭＡＲエレメント」とは、転写活性のあるＤＮＡループドメインを核マトリックスに一時的に付着させるＤＮＡ配列のことを指し（Ｐｉｅｎｔａら、［１９９１年］Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓ．、１：３５５〜３８５頁）、ＭＡＲ配列の例は当業者に公知である。
【００２３】
本発明において、遺伝子発現増加エレメントを選択するために、二重（５’及び５’＋３’）及びｃｉｓ＋ｔｒａｎｓ関連試験を、ヒトβ−グロビンＭＡＲ（Ｙｕ，Ｊ．、Ｂｏｃｋ，Ｊ．Ｈ．、Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．及びＶｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．、Ｇｅｎｅ  １３９［２］、１３９〜１４５頁［１９９４年］、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｌ２２７５４）及びヒトＣＳＰ−Ｂ遺伝子隣接ＳＡＲ（Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．及びＬｅｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｌｏｏｄ、７９［３］、６１０〜６１８頁［１９９２年］、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ６２７１６）についてルシフェラーゼアッセイを使用して実行し；その結果、特定の所望のエレメントを選択した（実施例１−１を参照のこと）。
【００２４】
上記のＭＡＲ又はＳＡＲエレメントは、配列番号３９で表されるヒトＣＳＰ−Ｂ  ＳＡＲ；ヒトβグロビンＭＡＲから単離された配列番号４０で表されるＭＡＲ２．２又は配列番号４１で表されるＭＡＲ３．０であってよい。エレメントがプロモーターの５’末端；３’末端；若しくは５’及び３’末端の両方で存在できるように、ＳＡＲ又はＭＡＲエレメントを含めることができる。
【００２５】
本発明の一実施形態によると、エレメントは、５’ＭＡＲ２．２、５’ＭＡＲ３．０、３’ＭＡＲ２．２、３’ＭＡＲ３．０、５’３’ＭＡＲ２．２又は５’３’ＭＡＲ３．０と称したエレメントであってよい。
【００２６】
本発明による発現ベクターは、遺伝子発現を高めるためのキメライントロンを含むことができる。
【００２７】
そのようなキメライントロンは、配列番号２５で表すことができる（Ｂａｃｋｌｉｗａｌ，Ｇ．、Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．、Ｃｈｅｎｕｅｔ，Ｓ．、Ｗｕｌｈｆａｒｄ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ，Ｍ．、Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３６［１５］、ｅ９６［２００８年］、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＪＱ７９５９３０）が、本発明はそれに制限されない。本発明において、遺伝子発現の増大に対する効果は、ルシフェラーゼアッセイによって確認された（実施例１−３を参照のこと）。
【００２８】
本発明によると、ＭＡＲエレメントとキメライントロンエレメントの両方を含む発現ベクターは、生産性に対する相乗効果を示し、遺伝子発現レベルの増加をもたらす（実施例３−３及び表９を参照のこと）。
【００２９】
本発明の一実施形態によると、ＭＡＲエレメント、ＳＶプロモーター及びキメライントロンを含む新規ベクター対ＩＩ（ｐＭＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）は、キメライントロンを含有しない従来のプロモーターベクター、従来のイントロンベクター及び新規ベクター対Ｉ（ｐＭＳ−Ｐ−Ｄ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳ−ＥＲ２ＨＣ）と比較して卓越した遺伝子発現増加効果を示す。
【００３０】
本発明による発現ベクターは、ＬＣＲエレメントを更に含むことができる。
【００３１】
本発明において、遺伝子発現増加エレメントを同定するために、国際公開番号ＷＯ  ２００９／１０２０８５に開示されるように第ＩＸ因子発現増加効果をこれまでに示した多重体（×１及び×４）及び二重（５’、３’及び５’＋３’）関連試験を、ＡＡＴ１０８（α−１−アンチトリプシン前駆体、１２０ｂｐ、配列番号１３）及びＡｌｂ  Ｅ６（血清アルブミンプレプロタンパク質、８１ｂｐ、配列番号１４）についてルシフェラーゼアッセイを使用して実行し、その結果、好ましいＬＣＲエレメントを選択した（実施例１−２を参照のこと）。
【００３２】
本発明における好ましいＬＣＲエレメントは、配列番号１５で表されるＡＡＴ１０８×４であってよく、そのエレメントを、ベクターの３’末端だけ（３’ＡＡＴ１０８×４）；又は５’及び３’末端の両方（５’３’ＡＡＴ  １０８×４）に存在するように含めることができる。また、ＬＣＲエレメントは、配列番号１６によって表されるＡｌｂ  Ｅ６×４であってもよい。
【００３３】
また、発現がプロモーターによって調節される標的遺伝子を、本発明の発現ベクターに挿入することができる。
【００３４】
標的遺伝子は、発現させようとする外来性産物をコードする遺伝子であり、組換えタンパク質として発現させ得る任意の型のタンパク質をコードしている遺伝子であってよい。そのような標的遺伝子は、ベクターに挿入するための制限酵素切断部位を有する核酸配列である「多重クローニング部位（ＭＣＳ）」を含む。
【００３５】
上記の標的遺伝子は、血液凝固関連遺伝子及び様々な抗体遺伝子のうちの１つであってよく；例えば第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子、上皮増殖因子受容体ファミリー抗体遺伝子、インスリン遺伝子、インターロイキン遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、インターフェロン遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、ケモカイン遺伝子、エリスロポイエチン遺伝子、α−フェトプロテイン遺伝子、ａ−グルコシダーゼ遺伝子、α１−アンチトリプシン遺伝子、アンチトロンビン遺伝子、リポタンパク質遺伝子、セルロプラスミン（celluloplasmin）遺伝子、フィブリノゲン遺伝子、グルコセレブロシダーゼ遺伝子、ハプトグロビン遺伝子、プラスミノゲン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、及びトランスフェリン遺伝子からなる群から選択することができるが、それに限定されない。本発明の一実施形態によると、標的遺伝子は、ＦＩＸ（第ＩＸ因子）遺伝子又は上皮増殖因子受容体ＥＲ２抗体遺伝子であってよい。
【００３６】
本発明による発現ベクターは、任意の従来から公知の転写ターミネータを含むことができる。好ましくは、それはｐｏｌｙＡに接続していてよい。例えば、それはＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）を含むことができる。
【００３７】
本発明の一実施形態によると、本発明の発現ベクターは、図１９に示すｐＭＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ又はｐＭＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣの切断地図を有する。図１９は、ＭＡＲエレメント、キメライントロンエレメント、ＳＶ４０プロモーター、ｐｏｌｙＡ等のような遺伝子発現増加エレメントを含む発現ベクターを図式的に例示する。
【００３８】
一方、本発明は、上記の発現ベクターによって形質転換された細胞を提供する。
【００３９】
本明細書では、細胞は、一般に公知な動物細胞であってよく、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＳ１細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＢＨＫ細胞からなる群から選択できるが、それに限定されない。
【００４０】
また、本発明は、上記の発現ベクターを使用して標的タンパク質を産生する方法を提供する。より具体的には、本発明は、上記の発現ベクターによって形質転換された細胞を培養して標的タンパク質を発現させる工程と、次いで標的タンパク質を回収する工程とを含む、標的タンパク質を大量に産生する方法を提供する。
【００４１】
そのような方法は、
（１）発現ベクターに発現がプロモーターによって調節される標的遺伝子を挿入する工程と、
（２）標的遺伝子が挿入されている発現ベクターで細胞を形質転換する工程と、
（３）発現ベクターによって形質転換された細胞を培養して標的タンパク質を発現させ、次いで標的タンパク質を回収する工程と
を含むことができる。
【００４２】
標的遺伝子を挿入し、細胞を形質転換し、細胞を培養して標的タンパク質を発現させ、標的タンパク質を回収するための方法は、当業者に公知の技術を使用することによって実施できる。
【００４３】
本発明は、以下の実施例により更に詳細に記述する。以下の実施例は、その範囲を制限することなく本発明を更に例示することを目的とする。
【実施例１】
【００４４】
エレメントの選択
１−１：ＭＡＲエレメント選択
ベクターを改善するために、ヒトβ−グロビン（β−グロビンＭＡＲ、３ｋｂ、２．２ｋｂ）のＭＡＲ及びヒトＣＳＰ−Ｂ遺伝子隣接ＳＡＲ（１．２ｋｂ）を候補として選択した。また、タンパク質発現の間接的な評価を可能にするレポータ遺伝子アッセイを実行するために、ルシフェラーゼアッセイを、評価の利便性を考慮して選んだ。
【００４５】
分析用のベクターと、ＭＡＲエレメントを含有しない対照ベクターとの間の蛍光値の差異を比較することによってベクターの効果を接近することを計画し、それに応じて分析用のベクターを調製した。安定した状況において効果を評価するために、ｐＧＬ４．２０［ｌｕｃ２／Ｐｕｒｏ］ホタルルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を選択した、このベクターは、速く、強力な細胞選択マーカーであるピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有する。
【００４６】
最初に、鋳型としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ７９０−２０）、配列番号１及び２のプライマー組、並びにＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ−Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ）を使用することにより、ＰＣＲを実施して、ＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。次いで、鋳型を９４℃で５分間変性させてＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡ分子を、変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間及び伸長７２℃で１分間の過程を３０サイクル繰り返し、続けて７２℃で５分間更に伸長させることによって増幅させた。ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片をゲル抽出によって精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ４５００−０１）に挿入した。配列番号１１によって表されるＣＭＶプロモーターの存在を、制限酵素を使用する切断マッピング及び塩基配列分析によって検証し、ＣＭＶプロモーターをｐＧＬ４．２０［ｌｕｃ２／Ｐｕｒｏ］ベクターの多重クローニング部位のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたベクターをｐＧＬ４．２−ＣＭＶと称し、対照ベクターとして使用した。
【００４７】
次に、ＳＡＲ用のプライマー組（配列番号３及び４）、ＭＡＲ２．２用のプライマー組（配列番号５及び６）及びＭＡＲ３．０用のプライマー組（配列番号７及び８）を使用して、ＳＡＲ、ＭＡＲ２．２及びＭＡＲ３．０を、上記と同じ方法によってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターにそれぞれ挿入した。調製したベクターを、ｐＣＲ２．１−ＳＡＲ、ｐＣＲ２．１−ＭＡＲ２．２及びｐＣＲ２．１−ＭＡＲ３．０と称した。
【００４８】
ｐＭＳＧ及び５’Ｂ１−Ｐ１ベクター（韓国特許第４０８８４４号を参照のこと）を、それぞれＭＡＲ及びＳＡＲのためのＰＣＲ鋳型として使用した。制限酵素を使用する切断マッピング及び塩基配列分析によって、配列番号３９、４０及び４１によってそれぞれ表されるＳＡＲ、ＭＡＲ２．２及びＭＡＲ３．０の存在を検証した。以降のクローニング手順において、すべての挿入物は、制限酵素による切断及びゲル抽出による精製後に使用され；ベクターは、制限酵素による切断及びエビアルカリホスファターゼによる処理後に使用された。
【００４９】
ＢａｍＨＩでｐＣＲ２．１−ＳＡＲベクターを切断することにより調製した挿入物を、同じ制限酵素で切断することによって調製したｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターに挿入した。制限酵素を使用する切断マッピングにより、所望のＳＡＲ  ＤＮＡ断片がフォワード方向に存在することを検証し、得られたベクターをｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＳＡＲと称した。次に、ｐＣＲ２．１−ＳＡＲベクターをＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで切断することによって調製した挿入物を、同じ制限酵素で切断したｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＳＡＲベクター及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターにそれぞれ挿入した。制限酵素を使用する切断マッピングにより、各プラスミドにおける標的ＤＮＡ断片の存在を検証し、得られたプラスミドをそれぞれｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’３’ＳＡＲ及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＳＡＲと称した。
【００５０】
ＭＡＲ２．２及びＭＡＲ３．０を含むベクターを調製するために、ｐＣＲ２．１−ＭＡＲ２．２及びｐＣＲ２．１−ＭＡＲ３．０をそれぞれＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで切断することによって調製した挿入物を、同じ制限酵素で切断することによって調製したｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターに挿入し、それによって最初にｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ２．２及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ３．０ベクターを調製し；更に、ｐＣＲ２．１−ＭＡＲ２．２及びｐＣＲ２．１−ＭＡＲ３．０をＢａｍＨＩで切断することによって調製した挿入物を、それぞれ同じ制限酵素で切断することよって調製したｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ２．２及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ３．０ベクターに挿入して、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’３’ＭＡＲ２．２及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’３’ＭＡＲ３．０ベクターを調製した。ＭＡＲエレメントを、逆方向に挿入した。調製したルシフェラーゼベクターの概略図を図１に示す。
【００５１】
ＭＡＲ候補エレメントを持つベクターのルシフェラーゼ発現レベルを、付着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１を使用して測定した。Ｃｉｓ＋Ｔｒａｎｓ効果を評価するための１組のベクターを、上で調製したベクターに、トランスフェクションにも使用したＳＡＲ又はＭＡＲエレメントを４倍のモル数有するように更に付与することによって調製した。
【００５２】
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１６６８０２７）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）に上記のホタルルシフェラーゼベクター１．０μｇをトランスフェクトし、４８時間後に、ピューロマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ、１１２−６０４Ｆ）に継代しながら培養した。安定な細胞を、約２〜４週間の選択期間で樹立した。試験を、合計で３組実施し、ホタルルシフェラーゼ分析を、値が細胞数に補正されるＯｎｅ−ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１１０）によって行った。
【００５３】
ホタルルシフェラーゼ分析法は以下の通りである。最初に、細胞を培養していたウェルから培地を除去し、１×ＰＢＳの各々  １ｍＬで洗浄した。トランスフェクトした細胞に１００μＬ／ウェルでトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、３７℃で１分間反応させて、底部から細胞を分離した。各ウェルに、１ｍＬの培地を添加した。細胞数を計数した後、形質転換細胞を、１．０×１０５個細胞／ｍＬ（生細胞数に基づく）になるように培地で希釈した後に１．５ｍＬチューブにそれぞれ分注した。９６ウェル白色プレートに、各試験済みＤＮＡに対して１００μＬ／ウェルで細胞を入れた。前もって調製したＯｎｅ−ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ試薬を、１００μＬ／ウェルでウェルに添加し、室温で３分間反応させた。光度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  ＬＢ  ９６Ｖ）を使用して、ホタルＲＬＵ（相対的光量単位）を測定した。ｐＧＬ４．２−ＣＭＶと比較した試験ベクターの測定結果を、図２及び表１に示す。
【００５４】
結果として、５’ＭＡＲエレメントが最高の効果を示し、効果（平均）においてｐＧＬ４．２−ＣＭＶ対照ベクターと比較して１．６〜５．３倍の増加を示した。更に、単一及び二重ＭＡＲの間又はＣｉｓ及びＣｉｓ＋Ｔｒａｎｓ  ＭＡＲの間で効果に差異は見られなかった。このように、候補エレメントの試験結果の値は、それらの中で有意な差異を示さなかったが、大きな変動を示し、従って、２つのエレメント、５’ＭＡＲ２．２及び５’ＭＡＲ３．０を主として選択した。
【００５５】
【表１】
0006347838.tif 000002
【００５６】
ＭＡＲエレメントの効果は、予想通り不十分であり、従って、ＣＭＶ及びＳＶ４０プロモーターに関してＭＡＲ効果を評価した。具体的には、ＰＣＲを、鋳型としてｐＧＬ４．２０ベクターを使用し、配列番号９及び１０のプライマー組を使用して行って、ＳＶ４０プロモーターを含有するＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片をゲル抽出によって精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入した。配列番号１２によって表されるＳＶ４０プロモーターの存在を、制限酵素を使用する切断マッピング及びＤＮＡ配列分析によって検証した。次いで、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ２．２及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＭＡＲ３．０ベクターを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理してＣＭＶプロモーターを除去し、同じ制限酵素で処理したＳＶ４０プロモーターをそこへ挿入して、ｐＧＬ４．２−ＳＶ４０、ｐＧＬ４．２−ＳＶ４０−５’ＭＡＲ２．２及びｐＧＬ４．２−ＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０ベクターを調製した。
【００５７】
付着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１におけるルシフェラーゼ発現レベルを、ＭＡＲ候補エレメント試験と同じ方法によって測定した。安定な細胞を、約２週間の選択期間で樹立した。試験を、合計２組において実施し、ホタル蛍光値を上記と同じ様式で測定した。
【００５８】
図３に示すように、ＳＶ４０は、ＣＭＶプロモーターと比較して効果において約４倍の増加を示した。中でも、ｐＧＬ４．２−ＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０ベクターは、最高の結果を示し、ＣＭＶ対照群及びＳＶ４０対照群と比較してそれぞれ９倍及び２．２倍の遺伝子発現増加効果を示した。
【００５９】
１−２：ＬＣＲエレメント選択
国際特許公開ＷＯ  ２００９／１０２０８５に開示されるＬＣＲエレメントのうち、ｉｎ  ｖｉｖｏで第ＩＸ因子発現増加効果を示したＡＡＴ  １０８（α−１−アンチトリプシン前駆体、１２０ｂｐ、配列番号１３）及びＡｌｂ  Ｅ６（血清アルブミンプレプロタンパク質、８１ｂｐ、配列番号１４）を選択して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を評価した。ＡＡＴ  １０８又はＡｌｂ  Ｅ６を、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの５’領域、３’領域、並びにｐＧＬ４．２−ＣＭＶ対照ベクターの５’及び３’領域の両方に付加して、試験用として様々なベクターを得た（図４を参照のこと）。
【００６０】
加えて、ＬＣＲエレメントは、長さが非常に短いので、各部位に４コピーのエレメントが複数挿入されているベクターを調製して、エレメントが複数挿入されている場合の発現に対する効果を評価した。
【００６１】
国際特許公開ＷＯ  ２００９−１０２０８５に開示されるベクター（ｐＣＲ−ＡＡＴ１０８ＬＣＲ、ｐＣＲ−Ｅ６ＬＣＲ）を使用して、ＰＣＲを１回だけ行うことによって各エレメントの単量体を得て；Ａｌｂ  Ｅ６×４多重体を、組換えＰＣＲを４回行うことによって調製した。
【００６２】
最初に、各エレメントの単量体を得るために、配列番号１７及び１８のプライマー組並びに配列番号１９及び２０のプライマー組を、それぞれＡｌｂ  Ｅ６×１及びＡＡＴ１０８×１に対して使用した。次いで、鋳型を９４℃で２分間変性させてＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡ分子を、変性９４℃で１５秒間、アニーリング５５℃で１５秒間及び伸長７２℃で１分間の過程を３０サイクル繰り返し、続けて７２℃で５分間更に伸長させることによって増幅させた。ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片をゲル抽出によって精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入した。配列番号１３及び１４によって表されるＡＡＴ１０８及びＡｌｂＥ６遺伝子それぞれの存在を、制限酵素を使用する切断マッピング及びＤＮＡ配列分析によって検証した。
【００６３】
他方で、図５に示す通り、Ａｌｂ  Ｅ６×４多重体を、組換えＰＣＲを４回行うことによって調製した。ＰＣＲは、アニーリング時間を３０秒間に延長したことを除いて、上記と同じ方法によって行った。ＤＮＡ配列分析によって、配列番号１６によって表されるＡｌｂ  Ｅ６×４遺伝子の存在が検証された。ＡＡＴ  １０８×４多重体（配列番号１５）を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃで合成した。
【００６４】
ｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクター内のプロモーターの５’領域にＬＣＲエレメントを挿入するために、ベクター及びＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで切断し、その後ライゲーションした。クローニングされた産物を同じ制限酵素で処理し、所望のサイズを持つバンドがＤＮＡゲル上に存在するかどうか検証した。上記の手順によって、５’ＡＡＴ  １０８×１、５’ＡＡＴ  １０８×４、５’Ａｌｂ  Ｅ６×１、及び５’Ａｌｂ  Ｅ６×４ベクターを得た。
【００６５】
ｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクター内のＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの３’領域にＬＣＲエレメントを挿入するために、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクター及びＡｌｂ  Ｅ６エレメントをＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ＡＡＴ  １０８エレメントをＢｇｌＩＩ制限酵素で切断した。生成物を、適合する末端を使用してｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターに挿入した。上記の手順によって、３’ＡＡＴ  １０８×１、３’ＡＡＴ  １０８×４、３’Ａｌｂ  Ｅ６×１及び３’Ａｌｂ  Ｅ６×４ベクターを得た。
【００６６】
ＬＣＲを、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクター内のプロモーターの５’領域及びＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの３’領域に挿入するために、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの３’領域にＬＣＲエレメントを含有するベクター、及び上で調製したＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで切断し、その後ライゲーションした。上記の手順によって、５’３’ＡＡＴ  １０８×１、５’３’ＡＡＴ  １０８×４、５’３’Ａｌｂ  Ｅ６×１及び５’３’Ａｌｂ  Ｅ６×４ベクターを得た。
【００６７】
ＬＣＲエレメントの効果を評価するために、ＣＨＯ−Ｋ１付着細胞株を、トランスフェクションに供した。トランスフェクションの２４時間前に、ＤＭＥＭ（ＬＯＮＺＡ、１２−６０４Ｆ）（ｗ／ｖ  １０％ＦＢＳ）培地中で二次培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞培養各５００μＬを、０．５×１０５個細胞／ウェルで２４ウェルプレートに分注した。試験ＤＮＡ（それぞれｐＧＬ４．２−ＣＭＶ、５’ＡＡＴ  １０８×１、５’ＡＡＴ  １０８×４、５’Ａｌｂ  Ｅ６×１、５’Ａｌｂ  Ｅ６×４、５’３’ＡＡＴ  １０８×１、５’３’ＡＡＴ  １０８×４、５’３’Ａｌｂ  Ｅ６×１、及び５’３’Ａｌｂ  Ｅ６×４）８００ｎｇを、総容量５０μＬ（１ウェルに基づく）になるように１．５ｍＬチューブ中でＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５−０８８）と混合した。他の１．５ｍＬチューブ中で、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１６６８０２７）２μＬを、総容量５０μＬになるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、室温で５分間反応させた。上で調製した２つの溶液を混合し、室温で２０分間反応させた。生成物を１００μＬ／ウェルでウェルに分注した。２４時間後に、各ウェル中の培地を新しくし、５０μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８−０３）をウェルに添加して細胞を選択した。
【００６８】
７つの組について、安定な細胞を、約２〜４週間の選択期間で樹立した。樹立された安定な細胞を使用して、ルシフェラーゼ分析を、ＭＡＲ候補エレメント分析と同じ方法によりＯｎｅ−ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１１０）によって行った。７組の結果の中で、最も類似した結果を示した３組の結果を選び、個々のエレメントの効果を比較した。各エレメントのホタル蛍光値を測定し、細胞数に対して補正し、その値はｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターと比較して０．５４〜３．９４倍の増加を示した（図６を参照のこと）。
【００６９】
図６に示すように、最高の結果を示したエレメントは、従来から使用されている５’ＭＡＲ  ３．０ｋｂエレメントであり、それは０．２４〜９．０２（３．９４±４．５５）倍の増加効果を示した。次に、５’３’ＡＡＴ  １０８×４エレメントが、１．７９〜４．６７（３．３８±１．４６）倍の増加効果を示した。
【００７０】
安定発現におけるｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’Ａｌｂ  Ｅ６、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’Ａｌｂ  Ｅ６×４、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＡＡＴ  １０８×１及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＡＡＴ  １０８×４ベクターの効果を評価するために、上と同じ試験を行った。ピューロマイシン選択を２週間行い、１組の試験を行った。結果を、図７に示す。
【００７１】
図７に示すように、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＡＡＴ  １０８×４ベクターは、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶベクターと比較して約２倍の増加を示した。この結果は、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’ＡＡＴ  １０８×４ベクターが、平均１．１５倍以下の増加を示したが、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’３’ＡＡＴ  １０８×４ベクターは平均３．３８倍の増加を示したことを間接的ではあるが説明できると考えられた（図６を参照のこと）。
【００７２】
安定な条件下におけるルシフェラーゼ分析試験の結果から、有効なＬＣＲエレメントの型が２つ同定されたが、それらは、従来から使用されている５’ＭＡＲ  ３．０ｋｂと比較して有意な改善を示さなかった。また、蛍光測定試験における大きい変動を考慮して、本試験において効果を検証済みのベクター、ｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−３’ＡＡＴ  １０８×４ベクター及びｐＧＬ４．２−ＣＭＶ−５’３’ＡＡＴ  １０８×４ベクターを選び、組換えタンパク質の発現レベルを直接評価しようと計画した。
【００７３】
１−３：イントロンエレメント選択
ヒト補体因子Ｈ（ｄＣＦＨ）の欠失形態の発現によってキメライントロンの効果を評価するために、ｄＣＦＨ遺伝子を最初に調製した。
【００７４】
２工程ＰＣＲにより、ＳＣＲ＃１〜４（調節領域）をＳＣＲ＃１８〜２０（結合領域）に連結することによって合計７つのＳＣＲ（短いコンセンサス反復配列）を有するｄＣＦＨを調製した。これらのＳＣＲは、ＣＦＨ中にある２０個のＳＣＲのうち、中間の１３個のＳＣＲを除いて選択した。以下で行われる試験において、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｆ−５３０Ｓ）をポリメラーゼとして使用し；鋳型を９８℃で３０秒間変性させてＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡ分子を、変性９８℃で１０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間及び伸長７２℃で３０秒間の過程を３０サイクル繰り返し、続けて７２℃で５分間更に伸長させることによって増幅させた。
【００７５】
今後のクローニングにおいて使用できるように、ＳＣＲ  １Ｆプライマー（配列番号２１）は制限酵素ＮｏｔＩ部位を含有し、ＳＣＲ  ２０  Ｂプライマー（配列番号２４）はＸｈｏＩ部位を含有していた。
【００７６】
ＰＣＲの第１の工程において、鋳型としてｐＭＳＧｎｅｏ−ｈＣＦＨを使用し、ＳＣＲ＃５の後部（３’）領域及びＳＣＲ＃１８の前部（５’）領域を含有するＳＣＲ  １Ｆプライマー（配列番号２１）及びＳＣＲ  ５（１８）Ｂプライマー（配列番号２２）を使用して、ＳＣＲ＃１〜５を得た。また、鋳型としてｐＭＳＧｎｅｏ−ｈＣＦＨを使用し、ＳＣＲ＃５の後部（３’）領及びＳＣＲ＃１８の前部（５’）領域を含有するＳＣＲ  １８（５）Ｆプライマー（配列番号２３）、並びにＳＣＲ  ２０  Ｂプライマー（配列番号２４）を使用して、ＳＣＲ断片＃１８〜２０を得た。調製した２種類の断片を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、回収した。
【００７７】
上記のｐＭＳＧｎｅｏ  ｈＣＦＨの調製方法は、以下の通りである。
【００７８】
最初に、鋳型としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＣＦＨベクター（Ｉｍａｇｅｎｅ、＃ＩＲＡＴｐ９７０Ｂ１０１４０Ｄ）を使用して、プライマー対（配列番号４７及び４８）を使用して、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、以下の通りに実施した：ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＣＦＨ  ５ｎｇ、各プライマー（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）１μＬ、ＰＣＲプレミックス（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ［登録商標］ＰｒｏＦｉ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）１μＬ及び蒸留水４６μＬを混合することによって、合計５０μＬのＰＣＲ反応混合物を調製し；次いで、混合物を、９４℃で３０秒間、６５℃で６０秒間、６５℃で３分２０秒間の反応過程に３０サイクル供した。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、ｈＣＦＨをコードしている遺伝子断片をゲル溶出によって得た。
【００７９】
次いで、ｈＣＦＨをコードしている遺伝子断片、及び骨格ベクターであるｐＭＳＧｎｅｏベクター（Ｍｏｇａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｏｒｅａ）を、それぞれＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで処理し；次いで、それらを、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションしてｈＣＦＨの発現ベクターを得て；このように調製した発現ベクターを、「ｐＭＳＧｎｅｏ−ｈＣＦＨ」と称した。
【００８０】
ＰＣＲの第２の工程は、鋳型として第１のＰＣＲ工程において得た２種類の断片を使用し、ＳＣＲ  １Ｆプライマー（配列番号２１）及びＳＣＲ  ２０  Ｂプライマー（配列番号２４）を使用して行った。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｆ−５３０Ｓ）を使用して、鋳型を９８℃で３０秒間変性させてＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡ分子を、変性９８℃で１０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間及び伸長７２℃で４５秒間の過程を３０サイクル繰り返し、続けて７２℃で５分間更に伸長させることによって増幅させて、ｄＣＦＨ遺伝子（配列番号４６）（図８）を得た。
【００８１】
次に、発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨを調製した。
【００８２】
ｐＭＳＧｎｅｏ−ｄＣＦＨベクター及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で、３７℃で約３時間切断した。切断したベクターを、アガロースゲルで電気泳動し；切断したｐＭＳＧｎｅｏ−ｄＣＦＨ遺伝子の中のｄＣＦＨ遺伝子、及び切断したｐｃＤＮＡ３．１（＋）遺伝子の中のベクターのサイズを持つ遺伝子を、ゲルから切り出した。切り出した遺伝子を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍで精製し、回収した。切断した遺伝子を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を使用して１６℃で約６時間反応させて、ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨ発現ベクターを調製した。
【００８３】
次いで、ｐｃＤＳーｄＣＦＨ発現ベクターを調製した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター及びＹ１１  ＬＣ  ｐｃＩＷベクター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００８年９月；３６［１５］：ｅ９６を参照のこと）を、ＮｈｅＩ（ＮＥＢ／Ｒ０１３１Ｓ）及びＮｏｔＩ制限酵素で切断した。切断した遺伝子を、アガロースゲルで電気泳動し；切断したＹ１１  ＬＣ  ｐｃＩＷベクター遺伝子の中のキメライントロン遺伝子（配列番号２５）及び切断したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター遺伝子を、ゲルから切り出した。切り出した遺伝子を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍで精製し、回収した。切断した遺伝子を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を使用して１６℃で約６時間反応させて、ｐｃＤＳ−ＭＣＳベクターを調製した。更に、上で調製したｐｃＤＳ−ＭＣＳベクター及びｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨベクターを使用して、ｐｃＤＳ−ｄＤＦＨベクターを上記の方法によって調製し、この際にｄＣＦＨ遺伝子を、ｐｃＤＳ−ＭＣＳベクターのＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。
【００８４】
ＷＰＲＥ遺伝子（配列番号２６）を確保するために、鋳型としてＹ１１  ＬＣ  ｐｃＩＷベクターを使用してＰＣＲを行った。以下で行われる試験において、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｆ−５３０Ｓ）をポリメラーゼとして使用し；鋳型を９８℃で３０秒間変性させてＤＮＡ鎖を分離し、ＤＮＡ分子を、変性９８℃で１０秒間、アニーリング５５℃で３０秒間及び伸長７２℃で３０秒間の過程を３０サイクル繰り返し、続けて７２℃で５分間更に伸長させることによって増幅させた。今後のクローニングにおいて使用できるように、本明細書に使用するＷＰＲＥ  Ｆプライマー（配列番号２７）は制限酵素ＸｈｏＩ部位を含有し、ＷＰＲＥ  Ｂプライマー（配列番号２８）はＸｂａＩ部位を含有していた。得られたＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍで精製し、回収した。
【００８５】
上記のＰＣＲによって得られたＷＰＲＥ遺伝子及びｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクターを、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ（ＮＥＢ／Ｒ０１４５Ｓ）制限酵素で、３７℃で約１時間切断した。切断した遺伝子を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍで精製し、回収した。切断した遺伝子を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１を使用して１６℃で約３時間反応させて、ｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨベクターを調製し、この際にＷＰＲＥ遺伝子を、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクターのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ切断部位に挿入した。
【００８６】
キメライントロンの一過性発現レベル増加効果を検証するために、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｒ８００−０７）を調製した。細胞を解凍し；エルレンマイヤー目盛を使用して３×１０５個細胞／ｍＬでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１２６５１−０１４）３０ｍＬへ播種し；それらが２〜３日間で１．２〜２．０×１０６個細胞／ｍＬに増殖できるように、２〜３継代保った。次いで、細胞に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１６４４７−１００）を使用して上で調製したｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨベクター、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクター及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション後に、培養液１ｍＬを、３日目〜７日目まで１日に１回採集した。採集した培養液を使用して、細胞数及び生存度を測定し；ヒト補体因子Ｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＫ３４２）を使用して、ｄＣＦＨ発現レベルを検証した（図９）。
【００８７】
ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞は、約１３．０２５μｇ／ｍＬの最大発現レベルを示したが、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクター及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞は、それぞれ約３０．７５７μｇ／ｍＬ及び４８．２０８μｇ／ｍＬの最大発現レベルを示した。各ベクターは、ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨより約２．４〜３．７倍高い発現レベルを示した。
【００８８】
第２に、キメライントロンの効果を検証するために、調製したｄＣＦＨ発現ベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｒ７９０−０７）にトランスフェクトした。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）  ２９３−Ｆ細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ／１２３３８−０１８）中で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を７×１０５個細胞／ｍＬで継代した。
【００８９】
トランスフェクションの当日に、細胞を、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中に、７×１０６個細胞／ｍＬで総容量３０ｍＬになるように培地を使用して希釈した。１．５ｍＬチューブ中で、トランスフェクションのためのプラスミド（ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨ、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨ及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨ）３０μｇ及びＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ／１２３０９−０１９）を、総容量６００μＬになるように混合した。新たな１．５ｍＬチューブ中で、ＰＥＩ  ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ／２４７６５−２）（１μｇ／μＬ）９０μＬ及びＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ５１０μＬを混合した。プラスミドを含有する溶液及びＰＥＩ  ＭＡＸを含有する溶液を混合し、室温で１０分間反応させた。２９３−Ｆ細胞を含有するエルレンマイヤーフラスコをゆっくりと回転させながら、混合溶液をそこへ添加した。細胞を、５％  ＣＯ２の懸濁インキュベーターにおいて１３０ｒｐｍで、３７℃で７日間培養した。培地を、３日目から７日間１．５ｍＬチューブに採集し、５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を沈殿させた。次いで、上清を取り、ヒト補体因子Ｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ／ＨＫ３４２）を使用して、ｄＣＦＨ発現レベルを測定した（図１０）。
【００９０】
図１０に示すように、ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨ、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨ及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨをトランスフェクトした細胞は、それぞれ約１３８．９μｇ／ｍＬ、６３８．８μｇ／ｍＬ及び８９６．７μｇ／ｍＬの最大発現レベルを示した。ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨ発現ベクターと比較して、キメライントロンを含有するベクターをトランスフェクトした細胞は約４．６倍の増加を示し、キメライントロン及びＷＰＲＥの両方を含有するベクターをトランスフェクトした細胞は約６．５倍の増加を示した。
【００９１】
最後に、キメライントロンの安定発現に対する効果を検証するために、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（ＤＲ  Ｌ．Ｃｈａｓｉｎ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を調製した。細胞を解凍し；３×１０６個細胞／Ｔ７５フラスコでＭＥＭ  α  ｗ／ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、１２５７１−０６３）＋１０％ＤＦＢＳ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１０３）培地へ播種し；それらが２〜３日間で９０％の集密度に増殖できるように、２〜３継代保った。次いで、調製したｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨベクター、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクター及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨベクターを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００形質転換試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１６６８−０２７）を使用して５×１０６個細胞／フラスコで細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、培地を５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８で補充した培地と置き換えて、細胞を選択した。細胞増殖を約１週間モニターしながら、第１の継代を、８０〜９０％集密度で実施した。最初の継代後に細胞が、２〜３日間で約８０〜９０％の集密度を示した場合、継代を更に２回実施し、細胞を、同じ様式で５×１０６個細胞／フラスコでＴ７５フラスコに植菌し、次いで、培養液１ｍＬを、３日目〜７日目まで１日に１回採集した。７日間の最終日に、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ、＃２５２００−０５６）で細胞を処理した後に細胞数及び生存度を計数し；ｄＣＦＨ発現レベルを、ヒト補体因子Ｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃ＨＫ３４２）を使用して測定した（図１１）。
【００９２】
図１１に示すように、ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、約０．０５４μｇ／ｍＬの最大発現レベルを示したが、ｐｃＤＳ−ｄＣＦＨベクター及びｐｃＤＳＷ−ｄＣＦＨベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、それぞれ約０．９３４μｇ／ｍＬ及び０．９２４μｇ／ｍＬの最大発現レベルを示した。各ベクターは、ｐｃＤＮＡ−ｄＣＦＨより約１７．３〜１７．１倍高い発現レベルを示した。
【００９３】
１−４：追加のエレメントの選択
更なる選択を、ＭＡＲ及びＬＣＲエレメントの一次選択で選択された４つのエレメントを使用してＦＩＸ（第ＩＸ因子）タンパク質発現のレベルを比較することによって実施した。上で調製したルシフェラーゼベクターからルシフェラーゼ遺伝子を除去し、ＦＩＸ遺伝子をそこへ挿入することによってベクターを調製しようと計画した。新規ベクター調製において使用する場合、プライマーが、ＦＩＸ遺伝子の前部にＸｈｏＩ、ＰａｃＩ及びＡｐａＩ制限酵素部位、並びに後部にＡｐａＩ及びＦｓｅＩ部位を含むようなプライマー組（配列番号２９及び３０）を調製した。
【００９４】
次いで、鋳型としてｐＭＳＧ−ＦＩＸベクター及びプライマー組（配列番号２９及び３０）を使用してＰＣＲを実施した。
【００９５】
ｐＭＳＧ−ＦＩＸベクターの調製方法は、以下の通りである。最初に、ｍＲＮＡを、オリゴｄＴカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してヒト肝細胞から抽出して、ＦＩＸ遺伝子を分離した。遺伝子バンク（参照；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１３０９；１〜２７７５ｂｐ）に登録されているＦＩＸ遺伝子配列に基づいてＦＩＸ遺伝子特異的５’末端及び３’隣接領域と結合するプライマー組（配列番号４９及び５０）を調製した後、Ｔｉｔａｎ  ｏｎｅ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施して、約１３８３ｂｐ（４６１アミノ酸）のサイズを持つＦＩＸ  ｃＤＮＡを合成し、次いでそのｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００９６】
分離したＦＩＸ遺伝子を、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩを含むプライマー組（配列番号５１及び５２）を使用するＰＣＲによって増幅し、動物細胞発現ベクターであるｐＭＳＧベクター（Ｍｏｇａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｏｒｅａ）にクローニングした。ＰＣＲから得たＦＩＸ遺伝子を、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して切断し、次いで１．２％アガロースゲル電気泳動に供して１．４ｋｂのサイズを持つ遺伝子を分離した。分離したＦＩＸ遺伝子を、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素で前処理したｐＭＳＧベクターにライゲーションして、ＦＩＸ発現ベクターを調製した。ＣａＣｌ２沈殿を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａをライゲーション反応が完了したＤＮＡ混合物で形質転換した。形質転換した大腸菌を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗り広げ、３７℃で終夜培養した。培養皿上に形成されたコロニーを培養した後、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  ｍｉｎｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してプラスミドを単離した。ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ制限酵素での処理によって、単離したプラスミドＤＮＡがＦＩＸ  ＤＮＡ断片を含有することを確認した。このように調製した発現ベクターを、「ｐＭＳＧ−ＦＩＸ」と称した。
【００９７】
ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片をゲル抽出によって精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入した。配列番号３１によって表されるＦＩＸ遺伝子の存在を、制限酵素を使用する切断マッピング及びＤＮＡ配列分析によって検証した。ＸｈｏＩ及びＦｓｅＩ制限酵素を使用してルシフェラーゼ遺伝子が除去されたベクターに、同じ制限酵素を使用してＦＩＸ遺伝子を挿入した。このように調製したＦＩＸ発現ベクター組１の概略図を、図１２に示す。
【００９８】
付着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１におけるＦＩＸ発現を、ルシフェラーゼ発現試験と同じ方法によって測定した。上記と同じ様式で、安定な細胞を、約２週間の選択期間で樹立した。試験を、合計４組において実施し、ＦＩＸ発現レベルをＥＬＩＳＡ法によって測定し、細胞数に対して補正した。
【００９９】
ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ法は以下の通りである。ウェル中の培地を１．５ｍＬチューブに採集した。各ウェルを、１×ＰＢＳ  １ｍＬで洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ  １００μＬ／ウェルをウェルに添加し、次いで細胞インキュベーター内で、３７℃で１分間反応させて、底面からトランスフェクトした細胞を分離した。各ウェルに、１ｍＬの培地を添加して細胞を採集し、細胞の数を計数した。連続培養の場合、細胞を、１２ウェルプレートを使用して０．５〜１．０×１０５個細胞／ｍＬでの継代で培養し、細胞選択を、ピューロマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を使用して実施した。
【０１００】
ヒト第ＩＸ因子抗原（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＦＩＸ−ＥＩＡ）のＥＬＩＳＡ用としてＭａｔｃｈｅｄ−ｐａｉｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｔにより提供されている捕捉抗体を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液；３次蒸留水１ＬにＮａ２ＣＯ３  １．５９ｇ及びＮａＨＣＯ３  ２．９３ｇを添加した後に、ｐＨ９．６に調整した）を使用して１／１００に希釈した。希釈した捕捉抗体を、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分注し、室温で２時間反応させた。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回洗浄した。次いで、標準として因子ＦＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ、２５０μｇ／ｍＬ）を、希釈緩衝液を使用して５０ｎｇ／ｍＬから０．７８１ｎｇ／ｍＬへと１／２段階希釈により調製した。最初に採集した培地を、希釈緩衝液（１×ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ）を使用して１／１０、１／１００及び１／１０００に希釈し、次いで１００μＬ／ウェルでウェルに添加し、室温で１時間３０分間反応させた。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ基質１００μＬを添加し、室温で１０分間反応させた。次いで各ウェルに２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μＬを添加して反応を止め、吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【０１０１】
図１３及び下の表２に示すように、全体の傾向は、ルシフェラーゼによるこれまでの結果と類似していた。ＳＶ４０プロモーターは、ＣＭＶプロモーターと比較して約３．４倍高い増加効果を示した。最も有効なものは、ｐＧＬ４．２−ＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０ベクターであり、ＣＭＶ対照群及びＳＶ４０対照群と比較してそれぞれ７倍及び２．１倍の発現レベル増加効果を示した。
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＬＣＲエレメントの効果を調べるために、ベクターを、プロモーターを置き換えるためのクローニング過程に供した。ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用して、ＣＭＶプロモーターを有する上で調製したベクターからＣＭＶプロモーターを除去し、同じ制限酵素を使用してＳＶ４０プロモーターを挿入した。加えて、５’ＭＡＲ及び３’ＡＡＴ１０８×４、並びに５’３’ＭＡＲ３．０ベクターの組合せを有するベクターを調製し、試験に使用した。調製したＦＩＸ発現ベクター組２の概略図を、図１４に例示する。
【０１０４】
付着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１におけるＦＩＸ発現を、ＦＩＸ発現ベクター組１に対するのと同じ方法によって測定した。安定な細胞を、約２週間の選択期間で樹立した。試験を、合計３組において実施し、ＦＩＸ発現レベルをＥＬＩＳＡ法によって測定し、細胞数に対して補正した。
【０１０５】
図１５及び下の表３に示すように、ＳＶ４０対照群と比較して発現レベルの増加を示した場合はなく；置き換えられたＳＶ４０プロモーターを持つＬＣＲ候補群において、どのベクターも、ｐＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０と比較して高い発現レベルを示さなかった。よって、ＦＩＸ発現レベルの比較から、ＳＶ４０プロモーター及び５’ＭＡＲ３．０エレメントを選択した。
【０１０６】
【表３】
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【実施例２】
【０１０７】
新規ベクターの調製
実施例１において選択したエレメントを使用して新規ベクターを調製した。
【０１０８】
ＦＩＸ発現比較試験において使用したｐＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０−ＦＩＸベクターをＡｐａＩ制限酵素で処理してＦＩＸ遺伝子を除去し、自己ライゲーションさせ、それによりｐＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０−ＭＣＳベクターを得た。ＭＣＳは、４つの型の制限酵素部位：ＸｈｏＩ、ＰａｃＩ、ＡｐａＩ及びＦｓｅＩを含んでいた。
【０１０９】
ｐＳＶ４０−５’ＭＡＲ３．０−ＭＣＳベクター中のピューロマイシン選択領域をＤＨＦＲ発現領域で置き換えて、ＤＨＦＲ遺伝子を有するベクターを更に調製した。置き換えのために制限酵素部位を調べると、２つのＳａｐＩ部位が存在する（前部及び後部に）ことが判明し；Ｓａ１Ｉ及びＡｆ１ＩＩＩで処理し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を使用して平滑末端を調製し、その後自己ライゲーションすることによって後部にあるＳａｐＩ部位を除去した。ピューロマイシン発現系（ｐＭＳ−Ｐ−ＭＣＳ）の制限酵素地図の概略図を、図１６に示す。
【０１１０】
必要なＤＨＦＲ発現系として、本研究所において従来から使用されてきたｐＤＣＨ１Ｐベクターの発現系を使用した。ハムスターＤＨＦＲ遺伝子を含む約２．５ｋｂにおいて、５’隣接及び３’隣接、プロモーター並びにｐｏｌｙＡ部分を、参照文献（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９１年、第８８巻．８５７２頁；及びＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８４年、第４巻、３８頁）に基づいて確認し、サイズを約１．５ｋｂに短くするためにＰＣＲプライマー（配列番号３２及び３３）を設計した。
【０１１１】
鋳型としてｐＤＣＨ１Ｐベクターを使用してＰＣＲを実施して、ＤＮＡ断片を得、次いでその断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入し、配列決定した（配列番号３４）。遺伝子配列を検証済みのＤＨＦＲ発現領域を、ｐＳＶ４０−５’ＭＡＲ  ３．０−ＭＣＳベクターに挿入した。ベクター及び挿入物を、ＳａｐＩ及びＳａ１Ｉ制限酵素で各々切断し、再び接続した。クローニングされた産物を同じ制限酵素で処理し、所望のサイズを持つバンドがＤＮＡゲル上に存在するかどうか検証した。上の手順によって、新規ベクター対１（ｐＭＳ−Ｐ−ＭＣＳ及びｐＭＳ−Ｄ−ＭＣＳ）を調製した（図１７）。
【０１１２】
調製した新規ベクターの対の遺伝子発現能力を、従来のベクターと比較するために、ＥＲ２抗体（ＥＧＦＲ抗体；韓国特許第１１０８６４２号を参照のこと）遺伝子を、新規ベクターの対、及び従来のＭＡＲベクターであるｐＭＳＧｎｅｏベクター（Ｍｏｇａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、韓国）のそれぞれにクローニングした。２種類のベクターにクローニングする場合、ＥＲ２抗体の軽及び重鎖の両方に対し、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ部位を５’領域に、並びにＰａｃＩ及びＸｈｏＩ部位を３’領域に付加し、次いでＰＣＲを実施した。ＰＣＲの場合、鋳型としてｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＥＲ２ＨＣ及びｐｃＤＮＡ３．３−ＥＲ２ＬＣベクターをそれぞれ使用し、重鎖及び軽鎖用のプライマーとしてＨＣ（配列番号３５及び３６）組及びＬＣ（配列番号３７及び３８）組をそれぞれ使用した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入し、ＤＮＡ配列（配列番号４２及び４３）を確認した。
【０１１３】
配列を検証済みのＥＲ２抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用してｐＭＳＧｎｅｏベクターにクローニングし、ＸｈｏＩ及びＰａｃＩ制限酵素を使用して新規ベクターの対（ｐＭＳ−Ｐ−ＭＣＳ及びｐＭＳ−Ｄ−ＭＣＳ）にもそれぞれクローニングした。
【０１１４】
クローニングされた産物を同じ制限酵素で処理し、所望のサイズを持つバンドがＤＮＡゲル上に存在するかどうか検証した。このように、４つのベクターを調製し、それにはＥＲ２抗体発現用の新規ベクター対Ｉ（ｐＭＳ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）及び一対のＭＡＲベクター（ｐＭＳＧｎｅｏ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳＧｎｅｏ−ＥＲ２ＨＣ）が含まれる（図１８Ａ及び１８Ｂ）。
【０１１５】
他方で、上で調製した新規ベクター対Ｉにキメライントロンを付加する効果を検証するために、ベクターを更に調製した。ＰＣＲを、鋳型としてｐｃＤＳｄＣＦＨベクターを使用し、配列番号４４及び４５のプライマー組を使用して実施して、ＤＮＡ断片を得、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入し、キメライントロン（配列番号２５）のＤＮＡ配列を検証した。ＥＲ２抗体発現用の新規ベクター対Ｉ（ｐＭＳ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣベクター及びｐＭＳ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣベクター）をＸｈｏＩで切断し、同じ制限酵素で処理したキメライントロンを、それぞれに挿入した。上の手順により、ＥＲ２抗体発現用の新規ベクター対ＩＩ（ｐＭＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＭＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ  ＥＲ２）を調製した（図１９）。
【０１１６】
ＥＲ２抗体発現ベクターを更に調製して、新規ベクター対ＩＩのエレメント特性を検証した。
【０１１７】
ＳＶ４０プロモーターだけを持つベクターに関しては、ｐＳ−Ｐ−ＭＣＳベクターを、上記と同じ方法によってｐＧＬ４．２−ＳＶ４０−ＦＩＸベクターからＦＩＸ遺伝子を除去することによって調製し、ｐＳ−Ｄ−ＭＣＳベクターを、ピューロマイシン遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子で更に置き換えることによって調製した。次いで、ＸｈｏＩ及びＰａｃＩを使用してそこにＥＲ２の軽及び重鎖遺伝子を挿入して、ＳＶ４０プロモーターを持つＥＲ２抗体発現ベクター用の一対のベクター（ｐＳ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＳ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）を調製した（図２０Ａ）。ＸｈｏＩ制限酵素を使用して調製したベクターへキメライントロンを挿入して、キメライントロンを含む一対のベクター（ｐＳＩ−Ｐ−ＥＲ２ＬＣ及びｐＳＩ−Ｄ−ＥＲ２ＨＣ）を調製した（図２０Ｂ）。
【実施例３】
【０１１８】
ベクターの遺伝子発現能力の評価
上で調製した新規ベクターの遺伝子発現能力を、以下の通りに検証した。
【０１１９】
３−１：付着細胞株におけるＥＲ２抗体発現についての新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩの評価
最初に、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩを使用するＥＲ２抗体発現を、ＣＨＯ−Ｋ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４付着細胞株において実施した。発現レベルを、一対の市販の二重ベクター及び表４に示す一対のＭＡＲベクターと比較した。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
トランスフェクションの２４時間前に、ＤＭＥＭ（ｗ／１０％ＦＢＳ）培地中で培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、０．８×１０５個細胞／ウェルで、各５００μＬの量で１２ウェルプレートのウェルへ分注した。ＭＥＭ−αｗ／ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、１２５７１−０６３）培地中で培養したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、１．５×１０５個細胞／ウェルで、各５００μＬの量でウェルへ分注した。分注の２４時間後に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ及び試験ベクターを、総容量５０μＬ（１ウェルに基づく）になるように１．５ｍＬチューブ内で混合した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  ４７μＬ及びｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ３μＬを、新たな１．５ｍＬチューブ中で混合し、室温で５分間反応させた（１ウェルに基づく）。反応が完了した後、上で調製した２種類の溶液を混合し、室温で２０分間反応させた。２４時間後に、各ウェルからトランスフェクトした培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）を、１００μＬ／ウェルでそこへ分注し、３７℃で１分間反応させて、細胞を分離した。培地を１０００μＬ／ウェルでそこへ分注し、細胞の数を計数した。
【０１２２】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、総容量１ｍＬになるように１．０×１０５個細胞／ウェルで１２ウェルプレートのウェルに分注し；１０００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ＰＡＡ、Ｐ１１−０１２）又は５０μｇ／ｍＬピューロマイシンを各ベクターに対して適切にそこへ添加し；細胞選択を実施した。ＤＧ４４細胞を、総容量１ｍＬになるように１．５×１０５個細胞／ウェルで１２ウェルプレートのウェルに分注し；７５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８又は２０μｇ／ｍＬピューロマイシンを各ベクターに対して適切にそこへ添加し；細胞選択を実施した。トランスフェクションを合計２組で行い、３週間の間に１組当たり合計３回サンプルを得て、ＥＬＩＳＡ試験を行った。
【０１２３】
ＥＲ２  ＥＬＳＩＡ法については以下の通りである。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５２６０）を、コーティング緩衝液を使用して５μｇ／ｍＬに希釈した。希釈した捕捉抗体を、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分注し、室温で２時間又はそれ以上反応させた。それらを、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液３００μＬを使用して３回洗浄した。ＰＢＳ−１％ＢＳＡを、３００μＬ／ウェルでそこへ添加し、ブロッキングを室温で２時間実施した。生成物を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液３００μＬを使用して３回洗浄した。標準としてＨＢＩＧ遺伝子（２．８ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡを使用して２８０、１４０、７０、３５、１７．５、８．７５及び４．３７５ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。培養液を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡを使用して希釈した。標準及び希釈した培養液を、２つ組で１００μＬ／ウェルの捕捉抗体でコーティングした９６ウェルプレートへ分注し、室温で１時間反応させた。ウェルを、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液３００μＬを使用して３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ａ０１７０）を、ＰＢＳ−ＢＳＡを使用して１／１０００００に希釈した。希釈した溶液を、１００μＬ／ウェルでプレートへ分注し、室温で１時間反応させた。生成物をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液３００μＬで３回洗浄した。ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ基質を、１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分間反応させた。２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を、１００μＬ／ウェルで分注して反応を止め、吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。標準曲線を、４パラメータフィッティングで作製し、測定した培養液の吸光度をパラメータと置き換えて濃度を算出した。
【０１２４】
表５、並びに図２１Ａ及び２１Ｂに示すように、ＣＨＯ−Ｋ１において市販の二重ベクターの対でＥＲ２  Ａｂの発現レベルは確認できなかった。従来のＭＡＲベクターの対、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩは、それぞれ約９．７ｎｇ／ｍＬ、約１４．０ｎｇ／ｍＬ、及び約１４７３．２ｎｇ／ｍＬの平均発現レベルを示した。新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩはそれぞれ、一対のＭＡＲベクターより約１．４倍及び約１５１．３倍高い発現レベルを示した。加えて、新規ベクター対ＩＩは、新規ベクター対Ｉより約１０５．４倍高い発現レベルを示し、これから、キメライントロンの効果が優れていることが示された。
【０１２５】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞において市販の二重ベクターの対、ＭＡＲベクターの対、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩのＥＲ２  Ａｂの平均発現レベルはそれぞれ、１３．１ｎｇ／ｍＬ、３．８ｎｇ／ｍＬ、２７．５ｎｇ／ｍＬ及び６５３．０ｎｇ／ｍＬであった。市販の二重ベクターの対は、ＭＡＲベクターの対より約３．５倍高い発現レベルを示した。新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩはそれぞれ、ＭＡＲベクターの対より約７．３及び１７３．７倍高い発現レベルを示した。加えて、新規ベクター対ＩＩは、新規ベクター対Ｉより約２３．８倍高い発現レベルを示した。
【０１２６】
【表５】
0006347838.tif 000006
【０１２７】
３−２：懸濁細胞株における新規ベクター対ＩＩの評価
新規ベクター対ＩＩを、ＣＨＯ−Ｓ及びＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ懸濁液細胞株において評価した。
【０１２８】
トランスフェクションの２４時間前に、ＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１３６９６−０１）を、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地に５〜６×１０５個細胞／ｍＬで必要量まで継代した。トランスフェクションの当日、細胞の数及び生存度（必ず９５％以上）を、測定した。細胞を、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１４８３−０１）を使用して１×１０６個細胞／ｍＬで１２５ｍＬフラスコへ分注した。プラスミドＤＮＡ  ９０μｇを、総容量１．５ｍＬになるようにＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭと混合した。ＰＥＩ  ＭＡＸ（１μｇ／μＬ）２７０μＬ及びＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ  １２３０μＬを、一切ボルテックスせずに混合した。ＰＥＩ  ＭＡＸを含有するＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭを、プラスミドＤＮＡを含有するＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭに入れ、次いで穏やかに混合した。次いで、生成物を室温で５分間反応させた。産生したＤＮＡ：ＰＥＩ複合体３ｍＬを、予め調製しておいた１２５ｍＬフラスコ中のＣＨＯ−Ｓ細胞に滴下した。細胞を、ＣＯ２振盪培養器内で、１３０〜１５０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で培養し、細胞選択を４８時間後に実施した。
【０１２９】
他方で、ＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ細胞株を、以下の方法によって調製した。最初に、無血清培地（ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｙｃｌｏｎｅ］＋１×ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を使用して、ＣＨＯ  ＤＧ４４付着細胞株（α−ＭＥＭ［ｗ／］＋１０％  ｃＦＢＳ培地中で培養した）を、１２５ｍＬスピナーフラスコを使用して５０ｍＬ培地中で２〜３日間隔で継代し、それにより細胞を懸濁培養に適応させた。適応細胞を、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ（Ｓｉｇｍａ、１４３６１Ｃ）／４ｍＭ  Ｌ−グルタミン／１×ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍが入った置き換え培地で、２〜３日間隔で二次培養し、それにより細胞を培地に適応させた。細胞の増殖が安定であり、生存度が９０％以上で維持され、細胞の濃度が１〜２×１０６個細胞／ｍＬに達した場合、ＣＨＯ  ＤＧ４４−Ｓ宿主細胞株を預託し、それにより細胞株の確立を保証した。
【０１３０】
トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＣＤ  ＣＨＯ（Ｓｉｇｍａ、１４３６１Ｃ）に５〜７×１０５個細胞／ｍＬで必要量まで継代した。細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ培地を使用して２×１０６個細胞／ｍＬで、１５ｍＬの量で１２５ｍＬフラスコへ分注した。プラスミドＤＮＡ３０μｇを、総容量０．７５ｍＬになるように、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと混合した。ＰＥＩ  ＭＡＸ（１μｇ／μＬ）９０μＬ及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを、一切ボルテックスせずに混合した。ＰＥＩ  ＭＡＸを含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌを、プラスミドＤＮＡを含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌに入れ、穏やかに混合した。生成物を室温で５分間反応させた。産生したＤＮＡ：ＰＥＩ複合体１．５ｍＬを、予め調製しておいた１２５ｍＬフラスコ中のＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ細胞に滴下した。細胞を、ＣＯ２振盪培養器内で、１３０ｒｐｍで、３７℃で５時間培養し、細胞の選択を４８時間後に実施した。
【０１３１】
ＣＨＯ−Ｓの場合、細胞の選択は、表６に示す選択培地を使用して実施した。
【０１３２】
【表６】
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【０１３３】
最初に、トランスフェクトされた細胞の数を計数した。各条件に適切な選択培地を使用して、細胞を、５×１０５個細胞／ｍＬで、５０ｍＬの量でＴ−１７５フラスコへ分注した。細胞数が十分でなかった場合、総容量を減少させた。細胞を、ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で、静止状態で培養した。選択の７日後に、細胞の数を計数した。生存度が３０％を超えた場合、試験を次の工程に進めたが、そうでない場合、細胞の数を１０〜１１日後に計数した。１１日後でも生存度が３０％未満であった場合、選択培地を新たな培地に置き換え、濃度が３×１０５個細胞／ｍＬ以上になるように、Ｔ−フラスコのサイズを小さくした。培地を３〜４日間隔で完全に置き換え、もしあれば回復シグナルを調べた。回復シグナルが存在し、生存度が３０〜５０％であった場合、細胞を、条件に適切な選択培地を使用して３×１０５個細胞／ｍＬで１２５ｍＬフラスコに継代した。細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいて１５０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で培養した。３〜４日間隔で、細胞を、条件に適切な選択培地を使用して３×１０個細胞／ｍＬで、３０ｍＬの量で１２５フラスコに継代した。希釈倍率が２倍以上だった場合、培地は完全には新しくしなかった。生存度が８５％以上、生細胞密度が１×１０６個細胞／ｍＬ以上だった場合、選択が完了したと見なした。
【０１３４】
他方で、ＣＤ  ＤＧ４４−Ｓの場合、細胞の選択は、表７に示す選択培地を使用して実施した。
【０１３５】
【表７】
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【０１３６】
トランスフェクトされた細胞の数を計数した。細胞を、各ベクターに適切な選択培地を使用して５×１０５個細胞／ｍＬで、各３０ｍＬの量で１２５ｍＬフラスコへ分注した。細胞数が十分でなかった場合、総容量を減少させることになった。細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいて１３０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で培養した。３〜４日間隔で、細胞を、選択培地を使用して３×１０５個細胞／ｍＬで、３０ｍＬの量で１２５ｍＬフラスコに継代した。希釈倍率が２倍以上だった場合、培地は完全には新しくしなかった。生存度が８０％以上、生細胞密度が１×１０６個細胞／ｍＬ以上だった場合、選択が完了したと見なした。トランスフェクションを合計２組で実施し、３〜４週間の間に各組当たり合計３回サンプルを得て、ＥＬＩＳＡ試験を行った。
【０１３７】
ＥＲ２  ＥＬＩＳＡを、付着細胞株について記述したのと同じ様式で実施し、その結果を表８に示す。
【０１３８】
下記の表８に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞株におけるＥＲ２抗体の３日間の生産性について、市販の二重ベクターの対、ＭＡＲベクターの対、及び新規ベクター対ＩＩの発現レベルは、それぞれ０．２〜０．３μｇ／ｍＬ、１．０〜２．０μｇ／ｍＬ、及び９．５〜１７．０μｇ／ｍＬ（平均）であった。バッチ生産性において、市販の二重ベクターの対、ＭＡＲベクターの対、及び新規ベクター対ＩＩの最大産生量は、それぞれ０．７μｇ／ｍＬ、１０．３μｇ／ｍＬ、及び３５．０μｇ／ｍＬ（平均）であった。従って、バッチ生産性において、本発明の新規ベクター対ＩＩは、市販の二重ベクターの対及びＭＡＲベクターの対と比較して、それぞれ約５０倍、及び約３．４倍以上の抗体発現増加効果を示した。
【０１３９】
加えて、ＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ細胞株におけるＥＲ２抗体の３日間の生産性について、市販の二重ベクターの対、ＭＡＲベクターの対、及び新規ベクター対ＩＩの発現レベルは、それぞれ０．２〜０．３μｇ／ｍＬ、０．２〜０．２５μｇ／ｍＬ、及び１．０〜１．５μｇ／ｍＬであった。バッチ生産性において、市販の二重ベクターの対、ＭＡＲベクターの対、及び新規ベクター対ＩＩの最大産生量は、それぞれ０．７μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、及び３．６μｇ／ｍＬ（平均）であった。
【０１４０】
バッチ生産性において、新規ベクター対ＩＩは、市販の二重ベクターの対及びＭＡＲベクターの対と比較して、それぞれ約５．１倍、及び約７．２倍以上の抗体発現増加効果を示した。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
３−３：新規ベクターの構成エレメントの特性評価
新規ベクターの構成エレメントの特性評価を、ＣＨＯ−Ｓ及びＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ細胞株において実施した。下記の表９に示すように、試験に使用したベクターの対は、以下の通りであった：ｐＳ（一対のプロモーターベクター）、ｐＳＩ（一対のイントロンベクター）、ｐＭＳ（新規ベクター対Ｉ）及びｐＭＳＩ（新規ベクター対ＩＩ）。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
実施例３−２と同じ評価方法を、以下の通りに使用した。ベクターの各対をトランスフェクトし、選択期間を過ぎて選択が完了したら、ＥＲ２抗体発現レベルを比較した。その結果を、以下の表１０に示す。
【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
表１０に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞株において、新規ベクター対Ｉ、新規ベクター対ＩＩ、プロモーターベクターの対、及びイントロンベクターの対に関する細胞選択は、それぞれ約４週間、約４．５週間、及び約７週間で完了した。ＭＡＲエレメントを有する新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩは、イントロンベクターの対より約１．８倍短い選択期間を示した。選択結果は、プロモーターベクターの対と比較して、イントロンベクターの対、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩの３日間の生産性が、それぞれ１８．４倍、１．８倍、及び２０．６倍増加し；イントロンベクターの対、新規ベクター対Ｉ、及び新規ベクター対ＩＩのＰＣＤ（ｐｇ／細胞／日）が、それぞれ１３．３倍、１．０倍、及び２６．１倍増加したことを示した。
【０１４７】
ＣＤ  ＤＧ４４−Ｓ細胞株において、４つのベクターの細胞の選択は、約３週間ですべて完了した。ＣＨＯ−Ｓとは異なり、すべてのベクターが、同様の期間の間に適応した。また、プロモーターベクターの対と比較して、イントロンベクターの対、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩの３日間の生産性が、それぞれ１３．８倍、２．４倍、及び６４．８倍増加し；イントロンベクターの対、新規ベクター対Ｉ及び新規ベクター対ＩＩのＰＣＤが、それぞれ１４．７倍、３．８倍及び８６．４倍増加したことが判明した。
【０１４８】
結論として、ＭＡＲエレメント、及びイントロンエレメントを別々に使用するのではなく一緒に使用した場合に、３日間の生産性及びＰＣＤにおいて約１．６〜２．０倍の相乗効果が観察された。
【０１４９】
本発明は、上の特定の実施形態に関して記述してきたが、当業技術者は本発明を様々に修飾及び変更することができ、それらも、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲に含まれることは認識されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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