(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重合した全重鎖ヒトフェリチンを６Ｍを超える尿素の条件で解重合させるステップと、
解重合した全重鎖ヒトフェリチンに腫瘍治療薬物を加え、前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを前記腫瘍治療薬物と結合させるステップと、
濃度がゼロまで次第に低下する尿素勾配により、前記腫瘍治療薬物が結合されている前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを改めてナノ粒子に重合させるステップと、を含む腫瘍標的性薬物デリバリーシステムを調製する方法。
【請求項２】
前記腫瘍治療薬物が、ドキソルビシンのような、化学療法薬物、放射性同位体、サイトカイン、核酸、抗腫瘍又は抗炎薬物から選択されるものである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍治療薬物が、結直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、胃癌、膵癌、膀胱癌、腎癌、前立腺癌、脳癌、及びHodgkin氏病、非Hodgkin氏リンパ腫、白血病のような各種の造血システム癌、のような人体の悪性腫瘍と癌の治療に用いられる請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記システムが、静脈、皮下、動脈内又は局部投与の方法により、それを必要とする患者に投与される請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ技術、生物バイオニクス、免疫学及び生物医薬の交差分野に属す。特に、本発明は、全重鎖ヒトフェリチンを含む腫瘍標的性薬物キャリアと、腫瘍治療薬物とを含む腫瘍標的性薬物デリバリーシステムを開示する。さらに、本発明は前記腫瘍標的性薬物デリバリーシステムの調製方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、ますますよく見られ、且つ人類の命や生活の質をひどく脅かす主な疾病の一つとなっている。高齢者人口が続々増加するため、癌の発病率が増加し続けると予想される。現在では、癌を治療する方法は、主に手術、放射線治療、化学療法の三種類である。癌の治療方法の選択は、癌のタイプ、部位と散布状況によって決められる。化学療法は、化学薬物を利用して腫瘍細胞を殺し、腫瘍生長を抑制する治療方法であり、それは全身性治療手段であり、原発巣、転移巣、及び亜臨床的な転移巣のいずれに対しても治療作用を有する。手術と放射線治療が不可能な癌に対して、化学療法に頼るしかない。現在では、臨床的に慣用な化学療法抗癌薬物は標的性に欠けるため、厳重な副作用が存在する。これらの副作用は、通常、化学療法薬物の応用を制限し、多くの癌が治療選択を失ってしまう。例えば、ほとんどのアントラセン環類の抗腫瘍薬物分子及び白金含有物質の非特異性毒性による厳重な副作用は、これらの化学療法薬物の応用を大きく制限している。そこで、腫瘍組織を特異的にターゲットし、化学療法薬物の毒副作用を低下させることができる薬物キャリアを開発することは、現在癌の治療分野が早急に解決する必要がある難題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
理想的な腫瘍治療薬物キャリアは、腫瘍細胞又は腫瘍組織を特異的にターゲットする；高分量の治療薬物を担持でき、且つ腫瘍細胞中に薬物を放出又は薬物を腫瘍細胞に作用させることができる；生理条件下で安定であり、良好な体内分布と代謝特徴及び優れた生物許容性を有する；という特徴を有すべきである。しかし、これらの全ての特徴を一種のナノ材料に統合することは非常にチャレンジ性がある。われわれの実験室の前期の仕事により、ヒトH-フェリチンは、何らの特異性リガンドによる修飾も標記もなしに、その受容体であるトランスフェリン受容体1(Transferrin Receptor 1、TfR1)を結合することで、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、結直腸癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、胸腺癌等のよく見られる人体固形腫瘍組織、及びTリンパ細胞白血病、赤血球白血病等の血液悪性腫瘍転化した細胞を特異的にターゲットすることができることを明らかにした(Fanら、Nature Nanotech. 2012；中国特許出願201110122433.0)。さらに、H-フェリチンは、外径が12 nmであり、粒子径が均一であり、非常に強い腫瘍部位での浸透や滞留の効果を有するため(Dreher, M.R.ら、J Natl Cancer I, 2006)、自発ターゲットと受動ターゲットを兼ねて有し、ヒトH-フェリチンの体内での腫瘍に対する標的性がさらに良くなる。H-フェリチンナノ粒子は直径8 nmのキャビティを有し、タンパク殻を解重合・重合させることにより、そのタンパクキャビティの内部に小分子薬物を担持できる。研究者は、H-フェリチンナノ粒子は、腫瘍細胞における受容体TfR1と結合した後、エンドソームに搬送され、最終的にリソソームに入ることを発見した。これによって、H-フェリチンを薬物キャリアとして利用するとき、薬物を細胞内部にデリバリーすることができ、腫瘍細胞に対する殺傷作用を発揮することができる。より重要なことは、ヒトH-フェリチンは人体内に自然に存在する一種の鉄貯蔵タンパク質であるため、その自然の生物許容性と低い免疫反応性は他の合成タイプの材料が及ばないものである。これ以外、ヒトH-フェリチンは、便利に大腸菌の中で大量に発現でき、また、便利にその耐高温の特性(75℃)を利用して迅速、便利に精製できる。ヒトH-フェリチンのこれらの特徴から見れば、それ自身は薬物キャリアとして、各種のメリットを一身に集める理想的な生物ナノ材料である。
【０００４】
本発明の目的は、腫瘍特異性標的の新規タンパク類化学療法薬物ナノキャリア及びその応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明が提供する薬物キャリアは、人体に自然に存在する、腫瘍組織及び細胞を特異的に識別でき、受容体と結合した後、細胞内部のリソソームに入り、その内部に担持される抗腫瘍活性薬物を放出できるタンパク殻ナノ粒子である。
【０００６】
本発明に係るタンパク殻は、遺伝子組み換えた又は天然のアポフェリンであってもよく、アポフェリンは、12個又は24個の重鎖サブユニットと軽鎖サブユニットが任意の割合で自己組織化してなり、中では、天然アポフェリンは真核生物、原核生物又は哺乳類動物に由来することができる。
【０００７】
本発明に係るタンパク殻は、熱ショックタンパク(Heat Shock Proteins、HSPs)、Dpsタンパク(DNA protection during starvation)又はナノキャビティ構造を有するウイルスタンパク殻であっても良い。 
【０００８】
本発明に係るタンパク殻は、抗体、ポリペプチド又は核酸アプタマー等の標的分子、又は蛍光や放射性核種等のシグナル分子を化学カップリング又は遺伝子融合できる。
【０００９】
本発明に係るタンパク殻内部に担持される抗腫瘍活性薬物は、化学療法薬物、放射性同位体、サイトカイン、核酸、抗腫瘍又は抗炎症薬物から選択できる。
【００１０】
本発明に係るタンパク類標的性ナノ薬物キャリアは特に、組み換えた全重鎖ヒトフェリチン(H-フェリチン)のことを指す。このようなフェリチン外殻は、腫瘍細胞と腫瘍組織を特異的に結合でき、抗体、ポリペプチド等の標的分子に修飾される必要がなく、且つ、その受容体TfR1と結合した後、腫瘍細胞の中に入ることができる。
【００１１】
本発明に係る腫瘍標的性タンパク類ナノ薬物キャリアの薬物担持方法は以下の二種類であっても良い。抗腫瘍活性小分子薬物が金属イオンと結合した後、タンパク殻における金属イオン通路を介してタンパク殻の内部に入る；pH又は尿素によりタンパク殻を解重合-重合させる方法で、タンパク殻重合の過程で、抗腫瘍薬物を入れ、薬物のタンパク殻内への担持を実現する。
【００１２】
本発明に係る腫瘍標的性タンパク類ナノ薬物キャリアが作用する腫瘍性疾病は、人体の悪性腫瘍と癌であり、中でも好ましくは結直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫である。特に、人体実質性腫瘍(例えば、肺、卵巣の癌，乳腺、腸胃、結腸、膵臓、膀胱、腎、前立腺、脳の癌等)及び各種の造血システム癌(例えば、Hodgkin氏病、非Hodgkin氏リンパ腫、白血病等)である。
【００１３】
本発明に係る腫瘍標的性タンパク類ナノ薬物キャリアは、静脈、皮下、動脈内投与又は局所投与の方法により、悪性腫瘍に罹る患者に与えることができる。
【００１４】
本発明の腫瘍標的性タンパク類ナノ薬物キャリア及び抗腫瘍応用は、巨大な社会的利益と経済的利益を有し、良好な応用前景も有する。
【００１５】
より具体的に、本発明は以下の各項を提供する。
1.全重鎖ヒトフェリチンを含む腫瘍標的性薬物キャリアと、腫瘍治療薬物とを含む腫瘍標的性薬物デリバリーシステム。
2.全重鎖ヒトフェリチンが重合して、キャビティを有するナノ粒子を形成し、前記腫瘍治療薬物が前記キャビティ内に担持されている前記1に記載のシステム。
3.以下の方法で調製される前記2に記載のシステム。
重合した全重鎖ヒトフェリチンを解重合させる；
解重合した全重鎖ヒトフェリチンに前記腫瘍治療薬物を加え、前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを前記腫瘍治療薬物と結合させる；
前記腫瘍治療薬物が結合されている前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを改めてナノ粒子に重合させる。
4.全重鎖ヒトフェリチンが高濃度の尿素条件下で解重合し、そして、濃度がゼロまで次第に低下する尿素勾配により、解重合した全重鎖ヒトフェリチンを改めて重合させる前記3に記載のシステム。
5.前記腫瘍治療薬物が、人体の悪性腫瘍と癌の治療に用いられ、好ましくは、結直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、胃癌、膵癌、膀胱癌、腎癌、前立腺癌、脳癌、及び各種の造血システム癌、例えば、Hodgkin氏病、非Hodgkin氏リンパ腫、白血病の治療に用いられる前記1-4のいずれかに記載のシステム。
6.前記腫瘍治療薬物が、結直腸癌の治療に用いられる前記5に記載のシステム。
7.前記腫瘍治療薬物が、化学療法薬物、放射性同位体、サイトカイン、核酸、抗腫瘍又は抗炎薬物から選択され、例えば、ドキソルビシンである前記1-4のいずれかに記載のシステム。
8.前記システムが、静脈、皮下、動脈内又は局所投与の方法により、それを必要とする患者に与えられる前記1-4のいずれかに記載のシステム。
9.重合した全重鎖ヒトフェリチンを解重合させること；と
解重合した全重鎖ヒトフェリチンに腫瘍治療薬物を加え、前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを前記腫瘍治療薬物と結合させること；と
前記腫瘍治療薬物が結合されている前記解重合した全重鎖ヒトフェリチンを改めてナノ粒子に重合させること；とを含む腫瘍標的性薬物デリバリーシステムを調製する方法。
10.前記キャリアが全重鎖ヒトフェリチンを含む腫瘍標的性薬物キャリア。
11. 全重鎖ヒトフェリチンの腫瘍標的性薬物キャリアとしての応用。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、腫瘍標的性ナノ薬物キャリアの調製及び特性評価を示す図である。図1aは、腫瘍標的性ナノ薬物キャリアH-フェリチン(H-Ferritin、HFn)が薬物のドキソルビシン(Doxorubicin、Dox)を担持する過程の模式図である；図1bは、薬物ドキソルビシンを担持する前後、薬物キャリアのクライオ電子顕微鏡の特性評価図である；図1cは、薬物ドキソルビシンを担持する前後、薬物キャリアの動的光散乱の特性評価の粒子径分布図である。
【図２】図2は、薬物を担持した標的性ナノキャリア(HFn-Dox)の安定性研究を示す図である。図2aは、生理食塩水及び正常なマウス血清の条件下で、薬物を担持した後のナノキャリア(HFn-Dox)の安定性を示す図である；図2bは、HFn-Doxが酸性条件下で(pH=5)および中性条件下で(pH=7.4)の薬物放出を示す図である。
【図３】図3は、薬物を担持した後の標的性ナノキャリアHFn-Doxナノ粒子が体外や体内で、その受容体TfR1により、腫瘍細胞の特異性標的性を実現する研究を示す図である。図3aは、蛍光標記したHFnタンパク質及びHFn-Doxと腫瘍細胞との特異性結合を示す図である；図3bは、HFnタンパク質と腫瘍細胞との特異性結合が、HFnタンパク質又はHFn-Doxに特異性的に競争性に抑制されることを示す図である。中でも、抑制曲線にはほとんど差がない；図3cは、抗TfR1の抗体がHFn-Doxと腫瘍細胞との結合を特異的に阻害できることを示す図である；図3dは、放射性標記したHFn-Doxナノ粒子の体内での腫瘍に対する特異性標的画像である。
【図４】図4は、HFn-Doxが細胞内部に入る過程のレーザー共焦点研究を示す図である。中では、タンパク殻をCy5.5で標記する；リソソームのmarker分子LAMP-1をAlexa-488で標記する；Doxは、それ自身の蛍光シグナルを観察する。
【図５】図5は、HFn-Doxナノ粒子の体内での薬物動態学、組織分布、及びインビボクリアランスの研究を示す図である。図5aは、HFn-Doxナノ粒子とFree Doxの薬物半減期の研究を示す図である；図5bとcは、HFn-Doxナノ粒子とFree Dox薬物がそれぞれ腫瘍組織及び心臓組織での累積量の研究を示す図である；図5dは、HFn-Doxナノ粒子とFree Doxのインビボクリアランスにおける研究を示す図である。
【図６】図6は、ドキソルビシンを担持したHFn-Doxナノ粒子がヌードマウス結直腸癌に対する治療効果を示す図である。図6aは、腫瘍生長に対する抑制曲線を示す図である；図6bは、担癌マウスの生存期間に対する統計結果を示す図である；図6cは、投与後、担癌マウスの体重変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、実施例で具体的に本発明の内容を説明するが、これらの実施例はあらゆる意味で本発明に対する制限と理解すべきではない。本発明者が潜心に研究した結果、本実験室の前期の仕事(Fanら、Nature Nanotech. 2012)及び中国発明特許出願201110122433.0に基づいて、遺伝子工程の方法で組換え発現したヒトH-フェリチンを癌の診断と治療に用いた。この上で、本発明を完成した。
【実施例】
【００１８】
［実施例１：腫瘍標的性ナノ薬物キャリアHFn-Doxの調製及び特性評価］
薬物キャリアとして、まずに解決すべきなのは薬物の担持問題である。前文に記載した通り、現在の慣用な方法は、pH値制御下でのタンパク殻の解重合-重合によりタンパクキャビティ内に薬物を担持する。しかし、実際に、H-フェリチンは安定性があるため、pH=2の条件で解重合し始める。このような強烈な酸性条件でフェリチンタンパク殻を処理すれば、pH値が中性条件に戻ったとき、フェリチンサブユニットが元のタンパク殻に完全に組み立て直すことができず、幾つかの「ギャップ」を招来する(Kim, M.ら、Biomacromolecules,2011)。これで、薬物を担持した後、フェリチンナノ粒子が不安定となり、薬物収容率が低下する。また、タンパク殻の不完全性は腫瘍に対する標的性に影響する。フェリチン内部に薬物を担持する他の方法は、金属イオンを薬物添加補助材料として、化学療法薬物が金属イオンと結合した後、フェリチンタンパク殻における親水性通路を介してタンパク殻内部に入るものである。このような方法を利用することは、薬物をタンパク殻内部に担持できるが、同時に金属イオンを導入してしまい、ほとんどは重金属元素である。このような方法により薬物を担持した後、腫瘍治療を行う場合、代謝器官の負担が重くなり、重金属中毒になる。薬物担持の問題を解決するために、本発明は、相対的に温和な尿素変性複性の方法で、担持量の高いH-フェリチン-ドキソルビシンナノ粒子(HFn-Dox)を調製することができた。ヒトH-フェリチン殻は、高濃度の尿素(例えば、6Mを超える)の条件で、タンパク殻が解重合し、同時に溶液にドキソルビシン(Dox)を加える。そして、勾配尿素透析の方法でヒトH-フェリチンのDoxに対する担持を実現する。DoxのpKa値が8.2 (Yang, S.C.ら、J Appl Polym Sci, 2000)であるため、H-フェリチン殻を解重合-重合させる過程で、Dox分子とH-フェリチン殻内部表面との静電吸着作用により(Harrison, P.M. & Arosio, P. Biochim Biophys Acta, 1996)、Dox分子をH-フェリチン殻内部に収容することができる。クライオ電子顕微鏡、動的光散乱等の方法で鑑定したら、Doxを担持する前後、ヒトH-フェリチンナノ粒子の構造は全く変化していないと分かった。具体的な実施例は以下の通りである。
【００１９】
まず、高発現H-フェリチンのHela細胞系のcDNAをテンプレートとし、ヒトH-フェリチンの完全長プライマーを設計し、ヒトH-フェリチンのcDNA (ATGACGACCGCGTCCACCTCGCAGGTGCGCCAGAACTACCACCAGGACTCAGAGGCCGCCATCAACCGCCAGATCAACCTGGAGCTCTACGCCTCCTACGTTTACCTGTCCATGTCTTACTACTTTGACCGCGATGATGTGGCCTTGAAGAACTTTGCCAAATACTTTCTTCACCAATCTCATGAGGAGAGGGAACATGCTGAGAAACTGATGAAGCTGCAGAACCAACGAGGTGGCCGAATCTTCCTTCAGGATATCAAGAAACCAGACTGTGATGACTGGGAGAGCGGGCTGAATGCGATGGAGTGTGCATTACATTTGGAAAAAAATGTGAATCAGTCACTACTGGAACTGCACAAACTGGCCACTGACAAAAATGACCCCCATTTGTGTGACTTCATTGAGACACATTACCTGAATGAGCAGGTGAAAGCCATCAAAGAATTGGGTGACCACGTGACCAACTTGCGCAAGATGGGAGCGCCCGAATCCGGCTTGGCGGAATATCTCTTTGACAAGCACACCCTGGGAGACAGTGATAATGAAAGCTAG、552bp)を発現キャリアpET30a (Novagen)に構築した；そして、原核発現システムにより、HFn-pET30aを発現菌株BL21(DE3) (Novagen)に形質転換し、IPTGで誘導発現し、その後、ヒトHFnタンパク質を純化した(ヒトH-フェリチンの分子構築、発現及び純化について、Fanら、Nature Nanotech. 2012及び中国発明特許申請201110122433.0を参照する)。
【００２０】
そして、ヒトHFnタンパク質を終濃度が1mg/mLになるように8mol/Lの尿素に加えた。室温で30min反応し、HFnタンパク質殻を徹底的に解重合させた。そして、終濃度が1mg/mLになるようにドキソルビシン試薬を加えた。10分間遮光反応した後、反応液を透析バッグ(分画分子量が3kDa)に転移し、そして遮光、4度の条件で、反応液に対して勾配尿素(7-5-3-2-1 mol/L、各勾配4時間)透析複性を行った。最後に生理食塩水中に透析した。反応終了後、得られたHFn-Doxナノ粒子をSuperdex 200 10/300 GL分子篩を介して純化させ、単分散の単量体ナノ粒子が得られ、さらに分析を行った。図1aは、尿素の方法により、標的性薬物キャリアのHFnタンパク質に薬物ドキソルビシンを担持する模式図である。
【００２１】
薬物が担持されたHFnナノ粒子に対してクライオ電子顕微鏡による特性評価を行うために、同じ濃度のHFnタンパク質とHFn-Dox (20 μL, 0.25 mg/mL)サンプルをFEI Vitrobot Mark VI (FEI, Oregon)で埋め込んだ後、Gatan UltraScan4000 (model 895) 16-兆画素のCCD レンズが装着されたクライオ電子顕微鏡FEI 300-kV Titan Krios (FEI, Oregon)を用いて、サンプルを特性評価した。HFnタンパク質とHFn-Dox ナノ粒子がいずれも96,000倍拡大した条件で撮影し、各視野における電子ビームが約20 e-/Åである。図1bは、薬物を担持する前後のHFnタンパク質のクライオ電子顕微鏡による特性評価図である。結果として、HFn-Doxのコンフォメーションは薬物を担持する前のHFnタンパク質と基本的に全く差がないことを発見した。
【００２２】
薬物を担持する前後のHFnタンパク質の動的光散乱特性評価は、温度が制御されたDynaPro Titan(Wyatt Technology)で完成された。等量のHFnタンパク質とHFn-Doxが25 ℃の条件で測定された。図1cは、動的光散乱の方法による薬物を担持する前後のHFnタンパク質の特性評価である。薬物を担持した後、HFn-Doxの分散性が良く、粒子径が均一であることを発見した。HFnタンパク質とほとんど差がない。
【００２３】
［実施例2：薬物を担持したナノ薬物キャリアHFn-Doxの体外放出及び安定性研究］
(1)薬物を担持した後の標的性薬物キャリアHFn-Doxの安定性を研究するために、HFn-Doxナノ粒子(500 μmol/L, Doxの量で、500μL)を透析チューブD-tube(分画分子量 6〜8 kDa、Novagen)に入れ、そして生理食塩水又は正常なマウス血清中に入れて、37℃でインキュベートした。インキュベート時間0、1、2、4、8、12、24、36、48、60時間でそれぞれサンプリングし、HPLC方法でドキソルビシンの量の測定を行った。測定結果は解離百分率で表される。薬品保留百分率=100%-解離百分率。
【００２４】
結果は図2aに示されるように、安定性試験の結果より、HFn-Dox薬物キャリアシステムが37℃の条件で、マウス血清において非常に安定であることを明らかにした。60時間後10%未満が解離した。これは、HFn-Doxが尾静脈を介してマウスに投与された後、マウス血清中で安定に存在できることを示す。
【００２５】
(2) HFn-Doxの薬物放出挙動を研究するために、pH7.4のPBS模擬生理条件で、pH5.0の酢酸バッファーで細胞内リソソーム環境を模擬し、HFn-Doxナノ粒子(500 μmol/L, Doxの量で、500μL)を透析チューブD-tube (分画分子量 6〜8 kDa、Novagen)に入れ、37℃の条件でPBSと酢酸バッファーにそれぞれインキュベートし、インキュベート時間0、1、2、4、8、12、24、36、48、60時間でそれぞれサンプリングし、HPLC方法でドキソルビシンの量の測定を行った。測定結果が薬品解離百分率で表される。
【００２６】
結果は図2bに示されるように、pH5.0の条件で60時間インキュベートした後、HFnタンパク質殻に担持されるドキソルビシンがすべて放出された。生理条件では、ほとんど放出されなかった。よって、薬物を担持したキャリアHFn-Doxの薬物放出形式はpH値条件に依存する。
【００２７】
［実施例3：化学療法薬物を担持するナノ薬物キャリアHFn-Doxの腫瘍細胞に対する体外と体内での標的性研究］
化学療法薬物ドキソルビシンを担持する前後、薬物キャリアHFnタンパク質殻が体外と体内で腫瘍細胞に対する標的性が影響されるかどうかを研究するために、よく見られる人結直腸癌細胞HT-29 (ATCC：HTB-38)を選択して研究を行った。体外で、HT-29腫瘍細胞と蛍光分子標記したバイオニックフェリチンをインキュベートし、フローサイトメトリー及びレーザー共焦点の方法により、バイオニックフェリチンと腫瘍細胞との結合状況を検測した。体内で、放射性125Iで標記したHFn-Doxナノ粒子を用いて、担癌マウスを尾静脈注射投与した。さらに、放射性標記したHFn-Doxが体内でHT-29移植腫瘍に対する標的性が影響されるかどうかを研究した。
【００２８】
実験方法は以下の通りである。明細書に提供した標記方法により、NHS活性化したCy5.5 (Cy5.5-NHS、GE Healthcareから購入される)を、空HFnタンパク質殻、及び、薬物を担持した後のHFn-Doxタンパク殻に標記した。HT-29細胞を1×105程度まで培養し、パンクレアチンで消化し、0.3%のBSA/PBSで細胞を３回洗浄し、50μg/mlのCy5.5標記したHFnタンパク質粒子及びHFn-Doxナノタンパク粒子を加え、4℃で45分間インキュベートした。その後、さらに0.3%のBSA/PBSで細胞を３回洗浄し、最後にPBS中に再度懸濁させ、フローサイトメトリーによりサンプルの蛍光を検測した。結果は図3aに示されるように、腫瘍細胞HT-29に対するドキソルビシンを担持した後のHFn-Dox結合は、薬物を担持する前のHFnタンパク質殻とは差がない。つまり、尿素変性複性によりHFnにドキソルビシンを担持する操作は、HFnタンパク質殻の腫瘍細胞に対する結合を影響しない。
【００２９】
HFn-Dox及びHFnタンパク質と腫瘍細胞との結合能力を定量的に研究するために、適当な濃度のFITCで標記したHFnを選択して、競争結合抑制実験を行った。同様に、細胞が1×105程度になるとき、パンクレアチンで消化し、バッファーで洗浄した後、同時に一定の濃度のFITC標記HFn、過剰の未標記HFn及び未標記のドキソルビシン薬物が担持されたHFn-Doxを加え、4℃で45分間インキュベートし、細胞を３回洗浄し、最後にPBS中に再度懸濁させ、フローサイトメトリーによりサンプルの蛍光を検測した。結果は図3bに示されるように、標記HFnと細胞との結合は、ほとんど過剰の未標記HFnタンパク質とHFn-Doxに競争され、且つ競争性抑制曲線はほぼ同じである。HFn-Doxと癌細胞との結合が特異的であり、HFnタンパク質及びHFn-Doxの腫瘍細胞に対する結合能力に差がないことをさらに証明した。
【００３０】
文献(Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010)によれば、ヒトHフェリチンの受容体がTfR1である。TfR1媒介HFn-Doxと癌細胞との相互作用を実証するために、過剰の抗TfR1の抗体とFITC標記したHFn-Doxで細胞表面受容体を競争した。具体的な実験方法は以下の通りである。腫瘍細胞HT-29のクライミングしたスライス(BD Biosciences)を、6ウェルプレートに置いて、密度が60%程度になるまで培養したときに、実験を開始した。過剰のマウス抗人TfR1の抗体CD71(BDPharmingenから購入される)とFITC標記したHFn-Doxを共に加え、又は単独にFITC標記したHFn-Doxを加え、 37℃で45分間インキュベートし、0.3%のBSA/PBSで細胞を３回洗浄し、最後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで３回洗浄した後、DAPIで(Roche Applied Science)室温で10分間核染色した。PBSでさらに３回洗浄した後、蛍光クエンチング防止用封入剤で封入した。レーザー共焦点顕微鏡(Olympus FluoView FV-1000, Tokyo, Japan)により観察した。結果は図3cに示されるように、FITC標記したHFn-Doxと腫瘍細胞HT-29とのほとんどの結合は、抗TfR1の抗体に特異的に競争されたので、HFn-Doxと癌細胞との相互作用はTfR1媒介性があることを示す。
【００３１】
体内HFn-Doxの移植腫瘍HT-29に対する標的性を研究するために、まずIodo-gen法により125IでHFnを標記した。標記溶液をPD-10カラムで純化した後に放射化学純度を測定した。125I-HFnの標記率が〜78.1%であり、純化した後の放射化学純度>98.0%である。そして、HT-29担癌マウスを尾静脈にて100 μL (400 μCi、約18.5 μgのタンパクを含む) の125I- HFn-Dox生理食塩水希釈液を注射し、1、2、4及び24 h注射後にそれぞれ単一光子放射コンピューター断層撮影装置(SPECT)を用いて平面γ現像を行った。結果は図3dに示されるように、放射性125Iで標記したHFn-Doxナノ粒子が迅速に腫瘍部位に集まり、1 h注射後に腫瘍がはっきり現像される。他の器官での非特異性集合は24時間以内で迅速に体内代謝により除去される。これは、HFn-Doxナノ粒子は、マウス体内で腫瘍組織を非常に特異的に標的できるだけではなく、他の器官における非特異性結合が迅速に代謝により体外に排出されることを明らかにした。つまり、われわれが新たに開発したこのようなH-フェリチンナノ薬物キャリアは、担持される薬物を体内で腫瘍部位まで特異的に搬送できる；同時に、健康な器官の中では効果的に除去されることで、健康器官に対する毒性副作用が避けられる。
【００３２】
［実施例4：ナノ薬物キャリアHFn-Doxの腫瘍細胞殺傷のメカニズム研究］
化学療法薬物ドキソルビシン分子が腫瘍を殺傷する原理は、ドキソルビシン分子が細胞核に入った後、DNA二重螺旋に嵌められ、DNAの複製と転写を抑制することで、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。つまり、ドキソルビシンが腫瘍を殺傷する効果を発揮するために、腫瘍細胞の細胞核に入れることが前提である。HFn-Doxが細胞に入る過程、及び、細胞に入った後、その内部に担持されるドキソルビシンを放出し、細胞核に入れるかどうかを研究するために、蛍光標記したHFn-Doxとレーザー共焦点の手段により、観察を行った。
【００３３】
具体的な実施例は以下の通りである。まず、HFn-Doxナノ粒子に対してCy5.5修飾を行った。HT-29細胞のクライミングしたスライスを12時間培養した後、それぞれ1μM Cy5.5-HFn-Doxで培養箱にて1分間、24時間、48時間および72 時間インキュベートした。PBSで３回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドで5分間固定した。そして、0.1% Triton X-100で細胞を透過処理した。PBSで再度洗浄した後、細胞を5%羊血清で室温にて30分間密封した。そして、37°CでAlexa-488で標記したリソソームマーカー分子Lamp1抗体(1:200, clone H4A3; Invitrogen)を１時間インキュベートした。最後に、DAPI (1 μg/mL, Roche Applied Science)で室温にて10分間核染色した。最後に、レーザー共焦点顕微鏡 (Olympus FluoView FV-1000, Tokyo, Japan)で観察した。結果は図4に示されるように、HFn-Doxナノ粒子におけるタンパク殻をCy5.5で標記し、リソソームのmarker分子LAMP-1をAlexa-488で標記する；Doxはそれ自身の蛍光シグナルを観察する。HFnの細胞内での挙動を観察することにより、HFnが膜タンパクにおける受容体と結合した後、受容体に媒介してエンドサイトーシスがなされ、エンドソームに輸送され、最終的にリソソームに入ることを発見した。これは文献報道に一致している(Li, L.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 2010)。HFn-Doxナノ粒子は腫瘍細胞における受容体TfR1と結合した後、HFnと同様に、いずれもエンドソームに輸送され、最終的にリソソームに入る。そして、HFn-Doxナノ粒子が分解し、HFnタンパク質の外殻がアミノ酸フラグメントに分解し、放出されたDoxが、リソソームから遊離し、最終的に細胞核に入り、腫瘍細胞に対する殺傷作用を発揮する。
【００３４】
［実施例5：腫瘍標的性ナノ薬物キャリアHFn-Doxの体内薬物動態学研究］
HFn-Doxの体内での薬物代謝動力学を研究し、遊離ドキソルビシンと比較するために、等量のドキソルビシン(10mg/kgマウス体重)の遊離ドキソルビシン及びHFn-Doxナノ粒子を尾静脈にて雌BALB/cマウス(各組6匹)に注射した。そして、投与後の5分間、30分間、1時間、2時間、4時間、8時間、10時間及び24時間に、静脈採決の方法で10〜15 μLのマウスの血液検体を採取して、直ちにヘパリン(1000 U/mL)を含有するPBSバッファーに加えた。続いて、酸性イソプロパノール抽出法により、血液検体におけるドキソルビシン含有量を測定した。血液検体と酸性イソプロパノールを均一に混合した後、-20 ℃にして、遮光のままで、徹夜抽出した。そして抽出液を徹底的に振盪、遠心した後、上澄みを取って、光を透過しない96ウェルプレート(Corning)に入れた。そして、蛍光読取器(Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reader、ThermoFisher Scientific)で、励起波長485 nm、放射波長590 nmを用いて、血液検体におけるドキソルビシンの特異性蛍光数を測定した。標準ドキソルビシンサンプルの蛍光値曲線により、血液検体におけるドキソルビシンの含有量を測定した。結果は図5aに示されるように、マウス体内におけるHFn-Doxナノ粒子の薬物動態学を研究した結果、等量のDoxを注射する条件では、HFn-Doxナノ粒子注射組において、ヒトH-フェリチンで収容されたDoxの血液半減期は、遊離ドキソルビシン注射組の12.2倍であることを発見した。血液半減期濃度-時間の曲線下面積(AUC)について、HFn-Dox組は遊離ドキソルビシン組の209倍である。この顕著に増加した血液半減期とより高い曲線下面積は、HFn-Doxナノ粒子がシステム循環において、より長い薬物滞留時間を有することを示す。これよっても、薬物が持続的に腫瘍部位に集合できるようになる。
【００３５】
［実施例6：腫瘍標的性ナノ薬物キャリアHFn-Doxの体内分布研究］
体外と体内薬物動態学の結果より、HFn-Doxが体外で腫瘍細胞を効果的に殺害でき、且つ良好な体内代謝挙動を有することを明らかにした。HFn-Doxが体内で腫瘍部位に特異的に集合できるかどうかという問題をさらに研究するために、HFn-Doxの体内分布を研究した。
【００３６】
具体的な実施例は以下の通りである。24匹の担HT-29移植腫瘍のBALB/cヌードマウスをランダムに２組(遊離ドキソルビシン処理組とHFn-Dox投与組)に分けた。腫瘍体積(体積=0.5×長×幅×幅)が300立方ミリメートルに達したときに、試験を開始した。２組のマウスに対して、等量のドキソルビシンの遊離ドキソルビシンとHFn-Dox (10 mg/kgマウス体重)を注射した。そして、投与後の1時間、4時間及び24時間(各時間点に4匹のマウス)に、マウスを殺し、腫瘍、血液検体と主な組織器官を取った。血液検体におけるドキソルビシン含有量を酸性イソプロパノール抽出法で測定した。腫瘍と組織におけるドキソルビシン含有量の測定は、以下の処理を採用した。まず、腫瘍又は器官組織を秤量し、そしてホモジネートをした。すべての操作は氷上、遮光の環境下で完成した。そして、100μLのホモジネートを取って酸性イソプロパノール抽出処理した。ドキソルビシン濃度測定の方法は体内薬物動態学の部分と同様である。結果は図5b, 5cに示されるように、HT-29移植腫瘍マウスに等量のDoxを注射する前提で、HFn-Doxナノ粒子投与組と遊離のDox投与組は、マウス体内器官と腫瘍組織におけるDox累積量の差異が非常に大きい。HFn-Dox投与組は投与後、腫瘍におけるDoxの含有量が遊離Dox投与組の十倍以上である。H-フェリチンを薬物キャリアとしてドキソルビシンを担持した後、腫瘍部位で顕著に増加したDoxの含有量は、HFn-Doxナノ粒子の長い血液半減期、主動的な腫瘍標的および受容体媒介のエンドサイトーシスの総合的な要因で影響された結果である。同じく重要なことは、H-フェリチン殻がドキソルビシンを担持した後、HFn-Doxナノ粒子は健康器官におけるDoxの累積量を顕著に低下させた。特に、DoxをH-フェリチン内部に封入することは、心臓器官におけるDoxの濃度を大幅に低下し、遊離のDoxに比べて、約7.8倍低下し、Dox薬物の心臓に対する厳重な毒性を低下した。化学療法薬物Doxの腫瘍部位での集合及び健康器官における分布の減少は、H-フェリチンは非常に有効なDox薬物キャリアであることを十分に表明した。
【００３７】
図3dからわかるように、腫瘍部分に標的されなかったナノ粒子はすぐに体内を清除された。HFn-Doxがどのような経路により体外に排出されたかをはっきり研究するために、薬物のマウス体内での除去実験を行った。具体的な実施例は以下の通りである。10匹の健康なBALB/c マウスをランダムに２組に分けた。すべてのマウスは代謝籠の中で育てられた。２組のマウスを尾静脈にて同じ分量の遊離ドキソルビシンとHFn-Doxを注射した(10 mg/kgマウス体重)。育てる過程で、マウスの尿液と排泄物を収集した。24時間培養した後、マウスを殺し、マウスの主要組織器官を取った。酸性イソプロパノール抽出法で、すべての排泄物とマウスの主要組織器官におけるドキソルビシンの含有量を測定した。結果は図5dに示されるように、健康なマウスにおけるHFn-Doxナノ粒子の代謝をさらに研究することにより、ほとんどの薬物は排泄物と尿液により体外に排出され、体内に滞留するのが少ないことを発見した。これによっても、HFn-Doxナノ粒子は体内の健康器官から効果的に体外に排出されることにより、健康器官に対する毒副作用を避けることができることをさらに確認した。
【００３８】
［実施例7：腫瘍標的性ナノ薬物キャリアHFn-Doxの抗腫瘍の薬力学研究］
腫瘍標的性ナノ薬物キャリアとして、最も直接な検証効果は、腫瘍に対する殺傷や抑制作用である。具体的な実施例は以下の通りである。40匹のHT-29腫瘍が移植された雌BALB/cヌードマウスをランダムに5組に分けた。移植腫瘍体積が100立方ミリメートル程度になったとき、すべての担癌マウスを尾静脈にて薬物を注射した。その中で、対照組がPBS、HFnタンパク質組である。投与組が遊離ドキソルビシン、HFn-Dox組と臨床用のリポソームドキソルビシン薬物Doxil組である。マウスの遊離ドキソルビシンに対する最大耐量が5 mg/kgマウス体重であるため、遊離ドキソルビシン組の投与量が5 mg/kgマウス体重である。HFn-Dox投与量が20 mg/kgマウス体重である。Doxilの副作用とHFn-Doxの副作用を定量的に比較研究するために、Doxilの注射量が同じく20 mg/kgマウス体重である。マウスの体重と腫瘍の測定は週に３回である。治療過程で、マウスは、体重低下が15%超又は腫瘍体積が1000立方ミリメートル超すれば、殺される。
【００３９】
実験結果は図6に示される通りである。癌症患者に対する治療において、投与の分量及び投与回数が非常に重要である。しかし、化学療法薬物の毒副作用に限られ、癌の治療が少量で複数回投与することが多い。しかし、少量で複数回投与することは、腫瘍細胞を効果的に殺傷できないことがよくある。よって、化学療法薬物に対する生体の耐量を増強できれば、即ち、化学療法薬物の毒副作用を低下できれば、それも薬物キャリアの一つの発展方向である。研究者が実験により、健康なマウスにとって、一回投与の前提で、HFn-Doxに対するマウスの最大耐量がDox等量の20 mg/kgであり、遊離ドキソルビシンに対する最大耐量が5 mg/kgであることを発見した。これは、H-フェリチンは薬物キャリアとして、標的性を有するだけではなく、器官の毒副作用を低下させ、Doxに対するマウスの耐量を4倍向上させたことを示す。
【００４０】
図6aに示されるように、遊離ドキソルビシン投与組、PBS組、及びH-フェリチン殻組の腫瘍生長が非常に早く、18日目に、平均腫瘍体積が既に1000 mm3を超えていた。HFn-Doxナノ粒子が最大耐量(Dox等量の20mg/kg)で投与治療するマウスは、腫瘍の生長が、観察期間内で非常に顕著に抑制された。臨床化学療法薬物リポソームドキソルビシンDoxilは、HFn-Doxと同等な分量条件で、マウスに対する毒副作用が非常に大きい。図6b、cに示されるように、一括にDoxilを投与した後、マウスの体重が顕著に低下した。且つ時間の増加につれて、体重の低下がより多くなる。対照組に比べて、Doxilは顕著な腫瘍抑制効果を示すが、その副作用のせいで、生存期間が相変わらず顕著に改善されていない。PBS、遊離Dox、及びH-フェリチン殻投与組の担癌マウスは、平均生存期間がそれぞれ17、18、18日間である。Doxil処理組は23日間である。遊離ドキソルビシンに対するマウスの最大耐量5 mg/kgで一回投与治療し、腫瘍の生長に対してほとんど抑制作用がなかった。それに対し、40日間の実験窓口内で、最大耐量で一回投与したHFn-Doxナノ粒子は腫瘍の生長を顕著に抑制した。よって、H-フェリチンを化学療法薬物Doxの薬物キャリアとして、単に一回投与するだけで、非常に顕著な腫瘍抑制効果を有している。
【００４１】
癌の治療過程で、薬物を精確に病巣部位までデリバリーして化学療法薬物の毒副作用を低下させることは、癌の治療効果を向上できる。本発明より、内径が8 nmのキャビティを有する天然ヒトH-フェリチンナノ粒子は、高分量の化学療法薬物Doxを腫瘍部位まで特異的にデリバリーでき、一回投与するだけで、腫瘍の生長を顕著に抑制できる。この天然のナノ薬物キャリアは理想的な物理化学性質及び特異性の高い腫瘍標的性を示し、化学療法薬物Doxの毒副作用を低下させるとともに、腫瘍部位における薬物の累積量を増加することで、抗腫瘍効果を改善することができる。
【００４２】
臨床治療に広く用いられているナノ薬物デリバリーキャリア(Jain, K.K. Bmc Med、2010)、リポソーム類(Doxil)、又は重合物類ナノ粒子に比べて、本発明に記載のヒトH-フェリチンナノキャリアは以下のメリットがある。(1) 主動標的性：天然のH-フェリチンナノ粒子であり、全くリガンド機能化の修飾を必要とせずに、腫瘍細胞表面に高発現される受容体TfR1と特異的に結合することにより、受容体媒介のエンドサイトーシス途径により、Doxを腫瘍細胞にデリバリーすることができる。多くの臨床的に慣用な重合物類又はリポソーム薬物デリバリーキャリアに比べて、このような主動標的腫瘍の特性と受容体媒介のエンドサイトーシスメカニズムにより、薬物が腫瘍部位に特異的に滞留と吸收されることで、腫瘍内部に高濃度の薬物分布を有することになり、腫瘍の生長を効果的に抑制できる(図6a)。伝統的なナノ薬物キャリアの多くは、受動的EPR (enhanced permeability and retention effect、増強した滞留と浸透)効果により治療性薬物の腫瘍部位へのデリバリーを実現する。このような受動標的治療対策は、有限の治療効果を示し、且つ薬物の漏れを引き起こし、薬物抗性の発生を誘導することが多い(Barenholz, Y. J ControlRelease, 2012;Wang, R.B.et al., J Nanomater, 2013;Kieler-Ferguson, H.M.et al.Wires Nanomed Nanobi, 2013)。(2) 良好な薬物動態学特徴と安全性：HFn-Doxナノ粒子は遊離のドキソルビシンに比べて、より長い血液半減期及びより高いAUC累積、より高い腫瘍薬物累積及びより低い健康器官の薬物分布を示し、最終的に健康組織から体外に排出できる。これらの特徴により、HFn-Doxナノ粒子が腫瘍を治療するときに、薬物の毒副作用を低下させるとともに、腫瘍の治療効果を極めて大きく改善できる。より重要なのは、H-フェリチンは人体内に天然に存在する一種のタンパク質であり、何の潜在毒性成分も存在しないから、集団炎症又は免疫反応を引き起こさず、優れた生物許容性を示す。(3) 極めて良い抗腫瘍活性：HFn-Doxナノ粒子は単に一回注射治療するだけで、腫瘍の生長を抑制できる。このような治療効果は臨床的に慣用な重合物類又はリポソーム類薬物キャリアよりも遥かに効果的である。伝統的なナノ薬物キャリアは、複数回の分量の治療により腫瘍生長を抑制する目的を達成できる(Tang, N.ら、J Natl Cancer Inst, 2007;Kaminskas, L.M.ら、Mol Pharmaceut, 2012;Hrkach, J.ら、Sci Transl Med, 2012)。(4) 量産と純化しやすい：天然のH-フェリチンナノキャリアは完全に遺伝子組み換えられ、大腸菌から発現されるタンパク質であり、発現量が高く、純化しやすい(Fan, K.ら、Nat Nanotechnol, 2012)。その主動標的腫瘍の特性により、何のリガンドの修飾又は物理化学性質の調整に必要とせず、複雑な、多くの場合コストが高く、産出が低く、及び重複性が悪い等の特徴の人工修飾過程が避けられる。これ以外、DoxをH-フェリチンナノ籠に担持することは、簡単にフェリチン殻を解重合-重合する操作により実現できる。本発明のHFn-Doxナノ粒子の合成過程は、臨床レベルの応用時に必要とする標準薬物生産条件を容易に実現できる。これらの恵まれた特性だからこそ、本発明のH-フェリチンナノ粒子を理想的な腫瘍標的薬物デリバリーキャリアにしたと信じている。
【００４３】
参考文献
1. Fan, K. etc.、Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizing tumour tissues. Nat Nanotechnol7, 459-464 (2012).
2. Dreher, M.R.etc.、Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer I98, 335-344 (2006).
3. Kim, M. etc.、pH-dependent structures of ferritin and apoferritin in solution: disassembly and reassembly. Biomacromolecules12, 1629-1640 (2011).
4. Yang, S.C., Ge, H.X., Hu, Y., Jiang, X.Q. & Yang, C.Z. Doxorubicin-loaded poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles produced by emulsifier-free emulsion polymerization. J Appl Polym Sci78, 517-526 (2000).
5. Harrison, P.M. & Arosio, P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation. Biochim Biophys Acta1275, 161-203 (1996).
6. Li, L.ら、Binding and uptake of H-ferritin are mediated by human transferrin receptor-1. Proc Natl Acad Sci U S A107, 3505-3510 (2010).
7. Jain, K.K. Advances in the field of nanooncology. Bmc Med8 (2010).
8. Barenholz, Y. Doxil (R) - The first FDA-approved nano-drug: Lessons learned. Journal of Controlled Release160, 117-134 (2012).
9. Wang, R.B., Billone, P.S. & Mullett, W.M. Nanomedicine in Action: An Overview of Cancer Nanomedicine on the Market and in Clinical Trials. J Nanomater (2013).
10.    Kieler-Ferguson, H.M., Frechet, J.M.J. & Szoka, F.C. Clinical developments of chemotherapeutic nanomedicines: polymers and liposomes for delivery of camptothecins and platinum (II) drugs. Wires Nanomed Nanobi5, 130-138 (2013).
11.    Tang, N. etc.、Improving penetration in tumors with nanoassemblies of phospholipids and doxorubicin. J Natl Cancer Inst99, 1004-1015 (2007).
12.    Kaminskas, L.M. etc.、Doxorubicin-Conjugated PEGylated Dendrimers Show Similar Tumoricidal Activity but Lower Systemic Toxicity When Compared to PEGylated Liposome and Solution Formulations in Mouse and Rat Tumor Models. Mol Pharmaceut9, 422-432 (2012). 
13.    Hrkach, J. etc.、Preclinical development and clinical translation of a PSMA-targeted docetaxel nanoparticle with a differentiated pharmacological profile. Sci Transl Med4, 128ra139 (2012).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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