(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の非古典的クラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質をコードする外因性配列を含む、単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、さらに、該細胞内の少なくとも１種の古典的内因性ＨＬＡ遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって不活化されているＮＫ細胞。
【請求項２】
前記非古典的クラスＩ  ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項３】
前記非古典的クラスＩ  ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ−Ｅタンパク質およびＨＬＡ−Ｇタンパク質である、請求項１または請求項２に記載のＮＫ細胞。
【請求項４】
前記外因性配列は、１つまたは複数のプラスミドによって担持されている、請求項１〜３のいずれかに記載のＮＫ細胞。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下の表
0006433480.tif 000004
の単列に示される認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＮＫ細胞。
【請求項６】
前記細胞は、１または複数の追加のゲノム修飾を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＮＫ細胞。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の細胞に由来する細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のＮＫ細胞を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞を提供することを含む、細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解を減らす方法であって、該細胞のＮＫ媒介細胞溶解が減らされる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／７７７，６２７号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書により
（連邦政府による支援を受けた研究の下でなされた発明に対する権利の陳述）
適用されず
【０００２】
本開示は、遺伝子発現、ゲノム工学、および遺伝子治療の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ＭＨＣ抗原は、移植反応において重要な役割を担うタンパク質として最初に特徴付けられた。拒絶反応は、埋め込まれた組織の表面の組織適合性抗原に反応するＴ細胞に媒介され、これらの抗原の最も大きな群は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）である。これらのタンパク質は、すべての高等脊椎動物の表面で発現し、マウスでは（組織適合性−２抗原について）Ｈ−２抗原、ヒト細胞では（ヒト白血球抗原について）ＨＬＡ抗原と呼ばれる。
【０００４】
ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞刺激において重要な役割を果たす。抗原提示細胞（樹状細胞であることが多い）は、ＭＨＣの細胞表面上の外来タンパク質の分解生成物であるペプチドを示す。共刺激シグナルの存在下でＴ細胞は活性化され始め、同じペプチド／ＭＨＣ複合体を示す標的細胞上で作用するであろう。例えば、刺激されたＴヘルパー細胞は、そのＭＨＣと共に抗原を示すマクロファージを標的化し、または細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、外来ウィルス性ペプチドを示すウィルス感染細胞に作用するであろう。
【０００５】
ＭＨＣタンパク質は、２つのクラス、すなわちＩおよびＩＩのものである。クラスＩ  ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣ１クラスＩ遺伝子にコード化された膜貫通タンパク質であるα鎖、およびＭＨＣ遺伝子クラスター内部にはない遺伝子によってコード化された小さな細胞外タンパク質であるβ２マイクログロブリン（ｍｉｃｒｏｂｌｏｇｕｌｉｎ）鎖の２種のタンパク質のヘテロ２量体である。α鎖は３つの球状ドメインに折り畳まれ、β２マイクログロブリン鎖が結合すると、球状構造複合体は抗体複合体に類似する。外来ペプチドは、やはり最も変化しやすい２つのＮ−最末端ドメイン上に提示される。クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質もヘテロ２量体であるが、このヘテロ２量体は、ＭＨＣ複合体内部の遺伝子によってコード化された２種の膜貫通タンパク質を含む。クラスＩ  ＭＨＣ：抗原複合体は、細胞障害性Ｔ細胞と相互作用するが、クラスＩＩ  ＭＨＣは、抗原をヘルパーＴ細胞に提示する。また、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質は、ほとんどすべての有核細胞および血小板（およびマウスでは赤血球）において発現される傾向にあるが、一方、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質は、より選択的に発現される。典型的には、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、いくつかのマクロファージおよび単球、ランゲルハンス細胞、ならびに樹状細胞上で発現される。
【０００６】
ヒトにおけるクラスＩ  ＨＬＡ遺伝子クラスターは、３種の主遺伝子座Ｂ、ＣおよびＡ、ならびに数種の微量の遺伝子座を含む。また、クラスＩＩ  ＨＬＡクラスターも３種の主遺伝子座ＤＰ、ＤＱおよびＤＲを含み、クラスＩおよびクラスＩＩの遺伝子クラスターは両方とも、集団内にクラスＩおよびＩＩ遺伝子の両方の数種の異なる対立遺伝子が存在する点で多形性である。また、ＨＬＡ機能においてもある役割を果たす数種のアクセサリータンパク質も存在する。Ｔａｐ１およびＴａｐ２サブユニットは、ペプチド抗原をクラスＩ  ＨＬＡ複合体に負荷するために必須のＴＡＰトランスポーター複合体の部分であり、ＬＭＰ２およびＬＭＰ７プロテオソームサブユニットは、ＨＬＡ上に示すための抗原のペプチドへのタンパク質分解において役割を担う。ＬＭＰ７における還元は、おそらくは安定化不足によって、細胞表面でのＭＨＣクラスＩの量を減少させることが示された（Ｆｅｈｌｉｎｇら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１２３４−１２３７参照）。ＴＡＰおよびＬＭＰに加えて、タパシン遺伝子があり、その生成物は、ＴＡＰ複合体とＨＬＡクラスＩ鎖との間に架橋を形成し、ペプチド負荷を強化する。タパシンの低減は、損なわれたＭＨＣクラスＩアセンブリーを持つ細胞をもたらし、ＭＨＣクラスＩおよび損なわれた免疫応答の細胞表面発現の減少を引き起こす（Ｇｒａｎｄｅａら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：２１３−２２２およびＧａｒｂｉら（２０００）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１：２３４−２３８参照）。
【０００７】
クラスＩ発現の制御は一般に転写レベルであり、ウィルス感染などのような数種の刺激により、転写に変化を起こすことができる。クラスＩ遺伝子は、いくつかの特定の組織において下方制御され、この下方制御の出所は、プロモーターおよび３’遺伝子間配列の内部にあるようである（Ｃｏｈｅｎら（２００９）ＰＬｏｓ  ＯＮＥ４（８）：ｅ６７４８参照）。また、マイクロＲＮＡは、いくつかのクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子を制御することができるという証拠もある（Ｚｈｕら（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ２０２（６）：５９２参照）。
【０００８】
クラスＩＩ  ＭＨＣ発現の制御は、ＭＨＣＩＩエンハンセオソーム複合体の活性によって決まる。エンハンセオソーム成分（エンハンセオソーム複合体の最もよく研究された成分の１つは、ＲＦＸ５遺伝子生成物である（Ｖｉｌｌａｒｄら（２０００）ＭＣＢ２０（１０）：３３６４−３３７６参照））は、ほぼ普遍的に発現し、これらの成分の発現は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の組織特異的発現またはそれらのＩＦＮ−γ誘発上方制御をコントロールしないようだ。そうではなく、非ＤＮＡ結合タンパク質である、ＣＩＩＴＡ（クラスＩＩトランスアクチベーター）として知られるタンパク質が、ＭＣＨＩＩ発現の主コントロール因子としての役目を果たすようだ。ＣＩＩＴＡは、他のエンハンセオソームメンバーとは対照的に、組織特異的発現を発揮せず、ＩＦＮ−γによって上方制御され、ＭＨＣクラスＩＩ発現の下方制御を起こすことができる（免疫監視機構を回避するための細菌の試みの一部と考えられる（ＬｅｉｂｕｎｄＧｕｔ−Ｌａｎｄｍａｎｎら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ３４：１５１３−１５２５参照））数種の細菌およびウィルスによって抑制されることが示されている。
【０００９】
クラスＩまたはＩＩ遺伝子の制御は、いくつかの腫瘍の存在下で妨害される可能性があり、そのような妨害は、患者の予後に因果関係を持つ可能性がある。例えば、いくつかのメラノーマでは、Ｔａｐ１、Ｔａｐ２およびＨＬＡクラスＩ抗原の減少の観察は、転移性メラノーマ（Ｐ＜０．０５）において、原発腫瘍におけるよりも一般的であることが見出された（Ｋａｇａｓｈｉｔａら（１９９９）Ａｍ  Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ１５４（３）：７４５−７５４参照）。
【００１０】
ヒトにおいては、数種の疾患に対する感受性が、ＨＬＡハプロタイプに結び付いているのではないかと考えられる。これらの疾患としては、とりわけ、アジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、バージャー病、セリアック病、慢性活動性肝炎、グレーブス病、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群およびエリテマトーデスが挙げられる。
【００１１】
また、ＨＬＡは、移植拒絶反応においても重要な役割を担う。移植拒絶反応の急性期は、約１〜３週間以内に起こる可能性があり、通常、ホストシステムのドナークラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＬＡ分子への感作の結果、ホストＴリンパ球のドナー組織に対する作用を伴う。ほとんどの場合、トリガー抗原は、クラスＩ  ＨＬＡである。最高の成功を得るためには、ドナーは、ＨＬＡに合う種類とされ、患者レシピエントにできる限り完全に適合させられる。しかし、ＨＬＡ同一性を高い割合で共有しうる家族の間でさえ、その提供はしばしば成功しない。したがって、レシピエント内で移植組織を保つために、患者は拒絶反応を避けるためにしばしば強い免疫抑制薬治療を受けなければならない。そのような治療は、患者が克服し難い可能性のある日和見感染に起因して、合併症および重大な病的状態を引き起こす可能性がある。
【００１２】
細胞治療は、ある種の細胞（例えば、腫瘍抗原またはＢ細胞に反応性があるＴ細胞）をレシピエントに与える、特殊な種類の移植である。細胞治療は、自己の（レシピエント由来）または同種異系の（ドナー由来）細胞を用いて行うことができ、該細胞は、幹細胞のような未成熟細胞であっても、Ｔ細胞のような完全に成熟した機能細胞であってもよい。実際、ある種の癌のようないくつかの疾患では、Ｔ細胞をエクスビボで操作して、ある種の腫瘍抗原への結合活性を増やし、拡大し、次いで、腫瘍の根絶を試みて、その種の癌を患う患者に導入してもよい。これは、内因性Ｔ細胞応答が腫瘍自体によって抑止される場合、特に有用である。しかし、拒絶反応に関してさらによく知られた固形臓器移植に適用されるのと同じ警告が、細胞治療にも適用される。ドナーＴ細胞は、クラスＩ  ＨＬＡ抗原を発現し、したがって、レシピエントの内因性免疫系からの拒絶反応応答を誘発することができる。
【００１３】
米国特許公開公報第２０１２／００６０２３０号には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃのような古典的ＨＬＡ遺伝子の特定のジンクフィンガータンパク質制御因子が記載されている。これらの制御因子は、１個または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子を発現せず、したがって、自己移植に使用することができる細胞（例えば、幹細胞）を造るために使用することができる。しかし、古典的ＨＬＡ発現の欠失により、遺伝子的に修飾された細胞は、ＫＩＲのリガンドの欠失に基づくナチュラルキラー（ｋｉｌｌｅｄ）（ＮＫ）細胞媒介細胞毒性の標的となるかもしれない。例えば、Ｐａｒｈａｍら（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（３）：２０１−２１４参照。
したがって、いくつかのまたはすべての古典的ＨＬＡ発現を欠くが、溶解のためにＮＫ細胞によって標的化されない細胞を開発するための組成物および方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００６０２３０号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｆｅｈｌｉｎｇら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１２３４−１２３７
【非特許文献２】Ｇｒａｎｄｅａら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：２１３−２２２およびＧａｒｂｉら（２０００）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１：２３４−２３８
【非特許文献３】Ｃｏｈｅｎら（２００９）ＰＬｏｓ  ＯＮＥ４（８）：ｅ６７４８
【非特許文献４】Ｚｈｕら（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ２０２（６）：５９２
【非特許文献５】Ｖｉｌｌａｒｄら（２０００）ＭＣＢ２０（１０）：３３６４−３３７６
【非特許文献６】ＬｅｉｂｕｎｄＧｕｔ−Ｌａｎｄｍａｎｎら（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ３４：１５１３−１５２５
【非特許文献７】Ｋａｇａｓｈｉｔａら（１９９９）Ａｍ  Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ１５４（３）：７４５−７５４
【非特許文献８】Ｐａｒｈａｍら（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（３）：２０１−２１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本明細書では、ＨＬＡ発現を修飾する方法および組成物を開示する。特に、本明細書では、ＨＬＡ関連障害、例えば個人のＨＬＡハプロタイプに関連するヒト障害を処置するように、ＨＬＡ遺伝子の発現を調節する方法および組成物を提供する。また、本明細書では、ＨＬＡ遺伝子を削除（不活化）または抑制して、ＨＬＡヌル細胞、細胞フラグメント（例えば、血小板）、組織または生物全体、例えば、１または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子を発現しない細胞を生成する方法および組成物を提供する。また、これらの方法および組成物は、１種だけの古典的ＨＬＡ遺伝子、または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子にヌルである、またはすべての古典的ＨＬＡ遺伝子に完全にヌルである細胞、細胞フラグメント、組織、または生物を造るために使用してもよい。ある実施形態では、古典的ＨＬＡヌル細胞または組織は、移植における使用に有利なヒト細胞または組織である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、一態様において、本明細書では、１または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子は不活化され、１または複数の非古典的ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ）は細胞内部に存在する細胞を記載する。非古典的クラスＩ  ＨＬＡ分子は、内因性遺伝子から発現され（過剰発現され）てもよく、細胞に加えられ、および／または細胞の遺伝子的修飾により発現されてもよい（例えば、１または複数の非古典的ＨＬＡ分子を発現するポリヌクレオチドの安定なまたは一過性トランスフェクション）。ある実施形態では、非古典的ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを含む。
【００１８】
修飾細胞は、リンパ系細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）、骨髄系細胞（例えば、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、マスト細胞）、幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（例えば、ヒトＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）または神経幹細胞）、または細胞のフラグメント（例えば、血小板）であってもよい。幹細胞は、全能性（ｔｏｔｉｔｐｏｔｅｎｔ）であっても、多能性（例えば、多能性骨髄またはリンパ球幹細胞であるＨＳＣのように、部分的に分化している）であってもよい。いくつかの実施形態では、複数の古典的ＨＬＡ遺伝子の発現が変更されている修飾細胞は、１または複数の非古典的ＨＬＡの発現も変更される。他の実施形態では、本発明は、１または複数の、またはすべての古典的ＨＬＡ遺伝子に関して、ヌル表現型を有する幹細胞を生成する方法を提供する。本明細書に記載する修飾幹細胞（ＨＬＡ遺伝子座で修飾された）は、いずれも、次に分化して、本明細書に記載するような幹細胞に由来する分化型（インビボでまたはインビトロで）細胞を生成してもよい。
【００１９】
他の実施形態では、（例えば、１または複数の遺伝子のヌクレアーゼ媒介不活化によって）１または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子を欠く細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解を減らす方法であって、本明細書に記載する細胞（例えば、古典的ＨＬＡ遺伝子（複数を含む）が不活化され、１または複数の非古典的ＨＬＡ分子が存在する細胞）を提供し、これによってＮＫ媒介細胞溶解を減らすことを含む方法が本明細書に記載される。
【００２０】
別の態様では、本明細書に記載する組成物（修飾細胞）および方法は、例えば、任意のＨＬＡ関連障害（すなわち、ＨＬＡハプロタイプに関連する）の処置、予防または改善において使用することができる。本方法は、典型的には、（ａ）単離細胞（例えば、Ｔ細胞またはリンパ球）中の内因性ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ制御因子遺伝子を、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）またはヌクレアーゼ系、例えば、遺伝子工学的に操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを持つＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、ＨＬＡまたはＨＬＡ制御因子遺伝子が不活化するように開裂することと、（ｂ）非古典的ＨＬＡ分子を該細胞に導入することと、（ｃ）該細胞を対象に導入し、それによってＨＬＡ関連障害を処置または予防することとを含む。ある実施形態では、ＨＬＡ関連障害は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。ヌクレアーゼ（複数を含む）は、タンパク質形態のｍＲＮＡとしておよび／またはヌクレアーゼ（複数を含む）をコード化するＤＮＡ配列として導入することができる。同じように、非古典的ＨＬＡ分子（例えば、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ）を、タンパク質形態のｍＲＮＡとしておよび／または分子をコード化するＤＮＡ配列として導入してもよい。ある実施形態では、対象に導入された単離細胞は、さらに、追加のゲノム修飾、例えば、組込み外因性配列（開裂されたＨＬＡあるいはＨＬＡ制御因子遺伝子、または異なる遺伝子、例えば、セーフハーバー遺伝子に）および／または追加の遺伝子、例えば、１または複数のＴＣＲ遺伝子の不活化（例えば、ヌクレアーゼ媒介の）を含む。外因性配列は、ベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶ、ＬＶ）により、またはエレクトロポレーションのような技術を使用して導入してもよい。いくつかの態様では、組成物は、単離された細胞フラグメントおよび／または分化した（部分的または完全に）細胞を含んでもよい。
【００２１】
また、本明細書に記載するような修飾細胞（例えば、非古典的ＨＬＡ遺伝子（複数を含む）を発現する、不活化された古典的ＨＬＡ遺伝子（複数を含む）を持つ幹細胞）を含む医薬組成物も提供する。ある実施形態では、本医薬組成物は、さらに、１種または複数種の医薬的に許容されうる賦形剤を含む。そのような医薬組成物は、予防的にまたは治療的に使用してもよく、ｉＰＳＣ、ｈＥＳ、ＭＳＣ、ＨＳＣあるいはこれらの組合せおよび／またはこれらの誘導体を含んでもよい。他の実施形態では、そのような修飾された幹細胞に由来する細胞、細胞フラグメント（例えば、血小板）または組織は、該組織が、要求通りにＨＬＡ遺伝子座で修飾されるように提供される。いくつかの態様では、そのような細胞は、部分的に分化し（例えば、造血幹細胞）、他の態様では、完全に分化した細胞が提供され（例えば、リンパ球または巨核球（ｍｅｇａｋａｒｏｃｙｔｅ））、さらに他の態様では、分化細胞のフラグメントが提供される。他の実施形態では、変更されたＨＬＡまたはＨＬＡ制御因子遺伝子（複数を含む）を含む幹細胞および／またはそれらの分化子孫が提供され、これらは、関心対象である別の遺伝子座でのドナーＤＮＡの削除、変更、または挿入を始めとする、追加の遺伝子修飾も含むことができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞のような成熟した細胞であってよい。いくつかの態様では、成熟細胞は、細胞治療、例えば、Ｔ細胞移植に使用されてよい。他の実施形態では、Ｔ細胞移植で使用する細胞は、関心対象である別の遺伝子修飾を含む。一態様では、Ｔ細胞は、癌マーカーに特異的な、挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。さらなる態様では、挿入ＣＡＲは、Ｂ細胞悪性腫瘍に特徴的なＣＤ１９マーカーに特異的である。そのような細胞は、ＨＬＡを適合させる必要なしに患者を処置するための治療組成物において有用であろうし、したがって、処置を必要とする任意の患者のための、「既製」治療として使用できるかもしれない。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ鎖）をコード化する遺伝子が操作された細胞、または所望の特異性および親和性を持つＴＣＲ鎖をコード化する遺伝子が導入された細胞を提供する。他の実施形態では、血小板減少症（ｔｈｒｏｍｏｂｙｔｏｐｅｎｉａ）または他の出血障害のような障害の処置における治療的使用のために、ＨＬＡ修飾血小板を提供する。
【００２３】
本明細書に記載する方法はいずれも、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで実施することができる。ある実施形態では、本方法を、処置の必要な対象を処置するための使用の前に、例えば、幹細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を修飾するために、エクスビボで実施する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
１種または複数種の非古典的クラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を含む、単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、さらに、該細胞内の少なくとも１種の古典的内因性ＨＬＡ遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって不活化されるＮＫ細胞。
（項目２）
前記非古典的クラスＩ  ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載のＮＫ細胞。
（項目３）
前記非古典的クラスＩ  ＨＬＡタンパク質は、内因性遺伝子から発現される、項目１または項目２に記載のＮＫ細胞。
（項目４）
前記非古典的クラスＩ  ＨＬＡタンパク質は、外因性配列から発現される、項目１〜３のいずれかに記載のＮＫ細胞。
（項目５）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表１の単列に示される認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を含む、項目１〜４のいずれかに記載のＮＫ細胞。
（項目６）
前記細胞は、１または複数の追加のゲノム修飾を含む、項目１〜５のいずれかに記載のＮＫ細胞。
（項目７）
項目５または項目６に記載の細胞に由来する細胞。
（項目８）
項目１〜７のいずれかに記載の細胞のフラグメント。
（項目９）
項目１〜８のいずれかに記載のＮＫ細胞を含む医薬組成物。
（項目１０）
項目１〜９のいずれかに記載の細胞を提供することを含む、細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解を減らす方法であって、該細胞のＮＫ媒介細胞溶解が減らされる方法。
（項目１１）
処置を必要とする対象におけるＨＬＡ関連障害を処置する方法であって、項目１〜９のいずれかに記載のＮＫ細胞を、該対象に投与することを含む方法。
（項目１２）
前記ＨＬＡ関連障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、項目１１に記載の方法。
【００２４】
これらのおよび他の態様は、本開示全体を考慮すれば、当業者に簡単に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１のパネルＡおよびＢは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイにより査定された、ＨＬＡ−Ａ３（図１Ａ）およびＨＬＡ−Ａ２（図１Ｂ）遺伝子破壊のレベルを示す。下方の（高速）バンド（矢印）は、ＺＦＮ媒介遺伝子修飾を示す消化生成物である。レーンの下の数値は、デンシトメトリーに基づく修飾ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のパーセントを示す。ニセトランスフェクト細胞およびＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からのＤＮＡを、陰性対照用に使用した。
【００２６】
【図２Ａ】図２のパネルＡおよびＢは、ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＥＫ２９３の単離を示す。図２Ａは、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３タンパク質発現の欠失を示す。親ＨＥＫ２９３細胞でのＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３発現、ならびにＨＬＡ−Ａ欠失を持つ３つの誘導遺伝修飾クローン（１８．１、８．１８および８３と番号を付ける）のフローサイトメトリー分析。点線は、イソタイプ（ＨＬＡ−Ａ２）またはＳＡ−ＰＥ（ＨＬＡ−Ａ３）対照を示し、実線は、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのないＨＬＡ−Ａ発現を示し、塗りつぶし線は、６００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γおよび１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで４８時間培養した後のＨＬＡ−Ａ発現を示す。親カラムの破線は、ＥＢＶ−ＬＣＬでのＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３発現を示す。図２Ｂは、ＨＬＡ修飾クローンのＣＴＬ媒介溶解に対する耐性を示す。親ＨＥＫ２９３および誘導ＨＬＡ−Ａｎｅｇクローンを、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αで４８時間培養し、ＰＡＮＥ１（あるいはセントロメアタンパク質Ｍアイソタイプｃ）に由来し、ＣＴＬクローン７Ａ７）によって認識された同族ＨＬＡ−Ａ３ペプチドＲＶＷＤＬＰＧＶＬＫ（配列番号：１、ＮＰ＿００１１０３６８５．１も参照）、またはＣ１９ＯＲＦ４８／Ａ２に由来し、ＣＴＬクローンＧＡＳ２Ｂ３−５）によって認識されたＨＬＡ−Ａ２ペプチドＣＩＰＰＤＳＬＬＦＰＡ（配列番号２、また、ＮＭ＿１９９２５０．１の代替オープンリーディングフレーム）の段階希釈でパルスし、標的に対するエフェクターの比が２０：１で、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるＣＴＬクローンによる認識について評価した。ＰＡＮＥ１ｍＨＡｇ（ペプチドを負荷していない）を発現するＨＬＡ−Ａ２＋ＬＣＬ（ハッチングした棒）を、陽性対照として使用した。
【図２Ｂ】図２のパネルＡおよびＢは、ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＥＫ２９３の単離を示す。図２Ａは、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３タンパク質発現の欠失を示す。親ＨＥＫ２９３細胞でのＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３発現、ならびにＨＬＡ−Ａ欠失を持つ３つの誘導遺伝修飾クローン（１８．１、８．１８および８３と番号を付ける）のフローサイトメトリー分析。点線は、イソタイプ（ＨＬＡ−Ａ２）またはＳＡ−ＰＥ（ＨＬＡ−Ａ３）対照を示し、実線は、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのないＨＬＡ−Ａ発現を示し、塗りつぶし線は、６００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γおよび１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで４８時間培養した後のＨＬＡ−Ａ発現を示す。親カラムの破線は、ＥＢＶ−ＬＣＬでのＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３発現を示す。図２Ｂは、ＨＬＡ修飾クローンのＣＴＬ媒介溶解に対する耐性を示す。親ＨＥＫ２９３および誘導ＨＬＡ−Ａｎｅｇクローンを、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αで４８時間培養し、ＰＡＮＥ１（あるいはセントロメアタンパク質Ｍアイソタイプｃ）に由来し、ＣＴＬクローン７Ａ７）によって認識された同族ＨＬＡ−Ａ３ペプチドＲＶＷＤＬＰＧＶＬＫ（配列番号：１、ＮＰ＿００１１０３６８５．１も参照）、またはＣ１９ＯＲＦ４８／Ａ２に由来し、ＣＴＬクローンＧＡＳ２Ｂ３−５）によって認識されたＨＬＡ−Ａ２ペプチドＣＩＰＰＤＳＬＬＦＰＡ（配列番号２、また、ＮＭ＿１９９２５０．１の代替オープンリーディングフレーム）の段階希釈でパルスし、標的に対するエフェクターの比が２０：１で、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおけるＣＴＬクローンによる認識について評価した。ＰＡＮＥ１ｍＨＡｇ（ペプチドを負荷していない）を発現するＨＬＡ−Ａ２＋ＬＣＬ（ハッチングした棒）を、陽性対照として使用した。
【００２７】
【図３】図３のパネルＡおよびＢは、ＺＦＮによる遺伝子修飾後の初代ＯＫＴ３増殖Ｔ細胞上でのＨＬＡ−Ａ発現の欠失を示す。図３Ａ（上のパネル）は、ＺＦＮ−Ｌをコード化するｍＲＮＡ種およびＨＬＡ−Ａ２を標的化するＺＦＮ−Ｒの電気泳動転写後のＨＬＡ−Ａ２の細胞表面発現の欠失を示す（それぞれ、ＳＢＳ＃１８８８９およびＳＢＳ＃１８８８１、米国特許公開公報第２０１２００６０２３０号参照）。ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ４およびＣＤ８の共発現を、ＺＦＮ−Ｌをコード化するｍＲＮＡ種およびＺＦＮ−Ｒの段階的用量の電気泳動転写から４日後に分析した。フローサイトメトリーデータを、ヨウ化プロピジウム陰性生細胞集団上でゲートした。右下象限中の数値は、ＨＬＡ−ＡｎｅｇであるＣＤ４およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。図３Ａ（下のパネル）は、「低温ショック」によるＨＬＡ−Ａ発現の妨害の向上を示す。データは、ＺＦＮ−Ｌをコード化するｍＲＮＡ種およびＺＦＮ−Ｒの段階的用量の電気泳動転写から４日後に集めた。細胞をＺＦＮの電気泳動転写後１〜３日目に３０℃で培養し、３７℃に戻し、分析の前にさらに１日培養した。図３Ｂは、ヘテロ二量体Ｆｏｋ  Ｉドメイン変異体に融合するＺＦＮ−ＬおよびＺＦＮ−ＲによるＨＬＡ−Ａ妨害効率の向上を示す。ＨＬＡ−Ａを標的化するＺＦＮ−ＬおよびＺＦＮ−Ｒヘテロ二量体Ｆｏｋ  Ｉ突然変異体ＥＬ：ＫＫをコード化するｍＲＮＡ種を、初代Ｔ細胞に電気泳動転写した。細胞を、３７℃で４日間、または３０℃で３日間、その後３７℃で１日間培養した後、ＨＬＡ−Ａ２発現を分析した。Ｘ軸はＣＤ４およびＣＤ８発現を示し、ｙ軸はＨＬＡ−Ａ２発現を示す。
【００２８】
【図４Ａ】図４のパネルＡ〜Ｃは、非古典的ＨＬＡ分子の発現によりＮＫ媒介細胞溶解が防がれることを示す。図４Ａは、健康なドナー（各ドナーはＮＫ−１およびＮＫ−２と示される）からの２種の個々のＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞の免疫表現型を示す。示されたフローサイトメトリーデータは、ＰＩｎｅｇ集団に関してゲートされる。数値は、各上側象限のパーセントを表す。図４Ｂは、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを発現するための、ＨＬＡクラスＩｌｏｗ７２１．２２１細胞の遺伝子修飾を示す。７２１．２２１細胞の３つのクローンにおいて、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを均質に発現するために、ＳＢトランスポゾン／トランスポゼース系を使用した。各数値は、フローサイトメトリーで検出したＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅの両方の発現パーセントを示す。図４Ｃは、７２１．２２１細胞を標的化するＮＫ細胞による特異的溶解を示す。親（ＨＬＡクラスＩｌｏｗ）、ＨＬＡ−Ｅ＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびＨＬＡ−Ｅ＋ＨＬＡ−Ｇ＋７２１．２２１細胞の両方を殺すＮＫ細胞の相対的能力。各カラムは、平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊．０１＜Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜．０１；および＊＊＊Ｐ＜．００１。
【図４Ｂ】図４のパネルＡ〜Ｃは、非古典的ＨＬＡ分子の発現によりＮＫ媒介細胞溶解が防がれることを示す。図４Ａは、健康なドナー（各ドナーはＮＫ−１およびＮＫ−２と示される）からの２種の個々のＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞の免疫表現型を示す。示されたフローサイトメトリーデータは、ＰＩｎｅｇ集団に関してゲートされる。数値は、各上側象限のパーセントを表す。図４Ｂは、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを発現するための、ＨＬＡクラスＩｌｏｗ７２１．２２１細胞の遺伝子修飾を示す。７２１．２２１細胞の３つのクローンにおいて、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを均質に発現するために、ＳＢトランスポゾン／トランスポゼース系を使用した。各数値は、フローサイトメトリーで検出したＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅの両方の発現パーセントを示す。図４Ｃは、７２１．２２１細胞を標的化するＮＫ細胞による特異的溶解を示す。親（ＨＬＡクラスＩｌｏｗ）、ＨＬＡ−Ｅ＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびＨＬＡ−Ｅ＋ＨＬＡ−Ｇ＋７２１．２２１細胞の両方を殺すＮＫ細胞の相対的能力。各カラムは、平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊．０１＜Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜．０１；および＊＊＊Ｐ＜．００１。
【図４Ｃ】図４のパネルＡ〜Ｃは、非古典的ＨＬＡ分子の発現によりＮＫ媒介細胞溶解が防がれることを示す。図４Ａは、健康なドナー（各ドナーはＮＫ−１およびＮＫ−２と示される）からの２種の個々のＰＢＭＣから単離されたＮＫ細胞の免疫表現型を示す。示されたフローサイトメトリーデータは、ＰＩｎｅｇ集団に関してゲートされる。数値は、各上側象限のパーセントを表す。図４Ｂは、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを発現するための、ＨＬＡクラスＩｌｏｗ７２１．２２１細胞の遺伝子修飾を示す。７２１．２２１細胞の３つのクローンにおいて、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを均質に発現するために、ＳＢトランスポゾン／トランスポゼース系を使用した。各数値は、フローサイトメトリーで検出したＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｅの両方の発現パーセントを示す。図４Ｃは、７２１．２２１細胞を標的化するＮＫ細胞による特異的溶解を示す。親（ＨＬＡクラスＩｌｏｗ）、ＨＬＡ−Ｅ＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびＨＬＡ−Ｅ＋ＨＬＡ−Ｇ＋７２１．２２１細胞の両方を殺すＮＫ細胞の相対的能力。各カラムは、平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊．０１＜Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜．０１；および＊＊＊Ｐ＜．００１。
【００２９】
【図５Ａ】図５のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮによる遺伝子修飾後のＨＬＡ−Ａｎｅｇ初代Ｔ細胞の濃縮を示す。図５Ａは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞集団の生成を示す。ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞を、磁気ビーズによる選択によって濃縮した。ｍＲＮＡの電気泳動転写後のＺＦＮをコード化するｍＲＮＡのインプット用量および３日間の培養条件（３７℃対３０℃）を示す。数値は、ＣＤ４内のＨＬＡ−Ａ２ネガティブ集団およびＣＤ８ポジティブ集団を示す。図５Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイを示す。ＨＬＡ−Ａ２発現の欠失に関する濃縮されたＴ細胞の分析は、高速バンド（矢印）の出現によるＨＬＡ−Ａ２遺伝子座における破壊を実証する。図５Ｃは、ＨＬＡｎｅｇＴ細胞の配列決定の結果（配列番号３９〜５３）を示す。濃縮細胞（２．５μｇのＺＦＮ、ＥＬ：ＫＫ  Ｆｏｋ  Ｉドメイン、３０℃で処理）からのＨＬＡ−Ａ２特異的プライマーを使用するＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミド生成物を配列決定した。野生型配列を一番上に挙げ、予測されるＺＦＮ結合部位に下線を引いている。ＺＦＮで処理した濃縮細胞から得た配列を下に示す。削除はハイフンで表し、配列変化は、太文字で強調する。１８の配列変化は、すべて、タンパク質翻訳を防ぐことが予測されるフレームシフトを起こす。
【図５Ｂ】図５のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮによる遺伝子修飾後のＨＬＡ−Ａｎｅｇ初代Ｔ細胞の濃縮を示す。図５Ａは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞集団の生成を示す。ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞を、磁気ビーズによる選択によって濃縮した。ｍＲＮＡの電気泳動転写後のＺＦＮをコード化するｍＲＮＡのインプット用量および３日間の培養条件（３７℃対３０℃）を示す。数値は、ＣＤ４内のＨＬＡ−Ａ２ネガティブ集団およびＣＤ８ポジティブ集団を示す。図５Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイを示す。ＨＬＡ−Ａ２発現の欠失に関する濃縮されたＴ細胞の分析は、高速バンド（矢印）の出現によるＨＬＡ−Ａ２遺伝子座における破壊を実証する。図５Ｃは、ＨＬＡｎｅｇＴ細胞の配列決定の結果（配列番号３９〜５３）を示す。濃縮細胞（２．５μｇのＺＦＮ、ＥＬ：ＫＫ  Ｆｏｋ  Ｉドメイン、３０℃で処理）からのＨＬＡ−Ａ２特異的プライマーを使用するＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミド生成物を配列決定した。野生型配列を一番上に挙げ、予測されるＺＦＮ結合部位に下線を引いている。ＺＦＮで処理した濃縮細胞から得た配列を下に示す。削除はハイフンで表し、配列変化は、太文字で強調する。１８の配列変化は、すべて、タンパク質翻訳を防ぐことが予測されるフレームシフトを起こす。
【図５Ｃ】図５のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮによる遺伝子修飾後のＨＬＡ−Ａｎｅｇ初代Ｔ細胞の濃縮を示す。図５Ａは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞集団の生成を示す。ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞を、磁気ビーズによる選択によって濃縮した。ｍＲＮＡの電気泳動転写後のＺＦＮをコード化するｍＲＮＡのインプット用量および３日間の培養条件（３７℃対３０℃）を示す。数値は、ＣＤ４内のＨＬＡ−Ａ２ネガティブ集団およびＣＤ８ポジティブ集団を示す。図５Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞のＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイを示す。ＨＬＡ−Ａ２発現の欠失に関する濃縮されたＴ細胞の分析は、高速バンド（矢印）の出現によるＨＬＡ−Ａ２遺伝子座における破壊を実証する。図５Ｃは、ＨＬＡｎｅｇＴ細胞の配列決定の結果（配列番号３９〜５３）を示す。濃縮細胞（２．５μｇのＺＦＮ、ＥＬ：ＫＫ  Ｆｏｋ  Ｉドメイン、３０℃で処理）からのＨＬＡ−Ａ２特異的プライマーを使用するＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミド生成物を配列決定した。野生型配列を一番上に挙げ、予測されるＺＦＮ結合部位に下線を引いている。ＺＦＮで処理した濃縮細胞から得た配列を下に示す。削除はハイフンで表し、配列変化は、太文字で強調する。１８の配列変化は、すべて、タンパク質翻訳を防ぐことが予測されるフレームシフトを起こす。
【００３０】
【図６】図６のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮで遺伝的に修飾された初代ＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞上でのＨＬＡ−Ａ発現の欠失を示す。図６Ａは、ＺＦＮをコード化するｍＲＮＡの電気泳動転写によるＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−Ａ２の破壊を示す。ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからのＴ細胞をエレクトロポレートし、増殖させ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）を発現させた。これらのＴ細胞を、ＨＬＡ−Ａ特異的ＺＦＮ（ＺＦＮ−Ｌ−ＥＬおよびＺＦＮ−Ｒ−ＫＫ）のヘテロ二量体Ｆｏｋ  Ｉドメイン変異体をコード化する各ｍＲＮＡ２．５μｇで再エレクトロポレートした。３０℃で３日間、次いで３７℃で１日間培養した後、ＨＬＡ−Ａ２発現を分析した。ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ集団の濃縮を、常磁性選択により行った。図６Ｂは、ＨＬＡ−ＡｎｅｇＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬによる溶解を逃れることを示す。示されたＣＡＲ＋Ｔ細胞のプールを、ＣＲＡにおける標的として使用する前に、同族ペプチドの段階希釈でパルスした。Ｃ１９ＯＲＦ４８／Ａ２に特異的であるＣＴＬクローンＧＡＳ２Ｂ３−５を、標的に対するエフェクターの比が２０：１で加えた。図６Ｃは、ＺＦＮ修飾ＨＬＡｎｅｇＣＡＲ＋Ｔ細胞が、所望の抗原特異的細胞毒性を維持することを示す。ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲを発現するＨＬＡ−ＡｎｅｇＴ細胞によるＣＤ１９への再指向特異性を、ヒトＣＤ１９のトランケート型変異体を発現するように遺伝的に修飾したマウスＴ細胞株ＥＬ４を使用して実証した。ＥＬ４での導入されたヒトＣＤ１９の発現は１００％であった。
【００３１】
【図７】図７は、ヒトＥＳＣでのＨＬＡ−Ａ発現のＺＦＮ媒介排除を示す。ＨＬＡＡ２＋ＨＬＡ−２４＋ｈＥＳ親細胞株ＷＩＢＲ３を、ＺＦＮおよび抗生物質耐性をコード化するドナープラスミドで修飾した。クローン（５２３０、５２５５、５２５８）を、ＨＬＡ−Ａ発現の欠失を伴って選択し、線維芽細胞に分化させた。６００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γおよび１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで４８時間培養した後、誘導線維芽細胞でのＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４の発現を、フローサイトメトリーにより査定した。親パネル内の破線は、イソタイプ対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書では、１または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子が不活化されるが、１または複数の非古典的ＨＬＡ遺伝子を発現する細胞を生成する組成物および方法を開示する。この様式で標的化された修飾細胞は、非古典的ＨＬＡ遺伝子（複数を含む）の存在により、ＨＬＡヌル細胞のＮＫ媒介溶解が減少しまたは排除されるので、治療薬、例えば移植片として使用することができる。さらに、関心対象である他の遺伝子を、ＨＬＡ遺伝子が操作された細胞に挿入してもよい。
【００３３】
したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、ＨＬＡ関連障害の処置方法を提供し、これらの方法および組成物は、標的遺伝子および遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼを調節することができる、ジンクフィンガー転写因子を含むことができる。
【００３４】
概要
本明細書に開示される方法の実施、ならびに本明細書に開示される組成物の調製および使用は、別段の記載がない限り、分子生物学、生物化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野における従来の技術を使用し、これらは当業者の力量の範囲内である。これらの技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８７年および定期的更新、シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９８年、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９９年、およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、１９９９年を参照。
【００３５】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖または環状構造の、１本鎖または２本鎖形態のどちらかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。本開示の解釈上、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈されない。該用語は、天然のヌクレオチドの既知の類縁体、および塩基、糖および／またはリン酸塩部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含しうる。一般に、特定のヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対特異性を有し、すなわち、Ａの類縁体は、Ｔと塩基対を形成するであろう。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。また、該用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学類縁体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３７】
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な、非共有結合的な相互作用をいう。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸塩残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は結合の強さをいい、結合親和性が増加すると、Ｋｄは低下する相関関係にある。
【００３８】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体に結合する（ホモ２量体、ホモ３量体等を形成する）ことができ、そして／または異なる１個のタンパク質または複数のタンパク質の１個または複数個の分子に結合することができる。結合タンパク質は、複数の種類の結合活性を持つことができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００３９】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡを結合するタンパク質、または大型タンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。
【００４０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１個または複数個のＴＡＬＥ繰返しドメイン／単位を含むポリペプチドである。繰返しドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「繰返し単位」（「繰返し」とも呼ばれる）は、典型的には、長さが３３〜３５のアミノ酸であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内で、他のＴＡＬＥ繰返し配列との少なくともいくらかの配列相同性を発揮する。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号参照。
【００４１】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するために、天然起源のジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子工学的操作（１または複数のアミノ酸を変更すること）によって、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸の遺伝子工学的操作（繰返し可変２残基またはＲＶＤ領域）によって、「遺伝子工学的に操作され」うる。したがって、遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然起源ではないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを遺伝子工学的に操作する方法の限定ではない例示として、設計および選択がある。設計されたタンパク質は、その設計／組成が主に合理的な基準から得られる、天然には発生しないタンパク質である。設計の合理的な基準として、置換規則の適用、および既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計の情報および結合データを蓄えたデータベースの情報処理のためのコンピュータによるアルゴリズムが挙げられる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、および第６，５３４，２６１号参照、また、ＷＯ９８／５３０５８号、ＷＯ９８／５３０５９号、ＷＯ９８／５３０６０号、ＷＯ０２／０１６５３６号およびＷＯ０３／０１６４９６号も参照。
【００４２】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択のような経験的なプロセスにより主として製造される、自然界では見出されないタンパク質である。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国第５，９２５，５２３号、米国第６，００７，９８８号、米国第６，０１３，４５３号、米国第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１号、ＷＯ９６／０６１６６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ９８／５４３１１号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／６０９７０号、ＷＯ０１／８８１９７号およびＷＯ０２／０９９０８４号参照。
【００４３】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスをいう。本開示の解釈上、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性を利用した修復機構による細胞における２本鎖切断の修復中に起こる、そのような交換の特殊な形態をいう。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経たもの）の修復をテンプレートするために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入を引き起こすために、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として幅広く知られている。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、そのような導入は、切断された標的とドナーとの間で形成するヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または標的および／または関連プロセスの一部となるであろう遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」を伴いうる。そのような特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列を変更することとなる。
【００４４】
本開示の方法において、本明細書に記載する１または複数の標的化ヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）内の所定の部位で２本鎖切断を起こし、切断領域のヌクレオチド配列に相同性のある「ドナー」ポリヌクレオチドは、細胞内に導入されうる。２本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれるかもしれず、あるいはドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって、切断の修復のためのテンプレートとして使用され、その結果、ヌクレオチド配列のすべてまたは一部が、ドナーにおけるように、細胞クロマチンに導入されることになる。したがって、細胞クロマチンの第１配列は、変更することができ、ある実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、用語「置換する」または「置換」の使用は、１つのヌクレオチド配列を別の配列に置換すること（すなわち、情報の意味で配列の置換）を表すと理解することができ、１つのヌクレオチド配列を別の配列に物理的または化学的に置換することを必ずしも必要としない。
【００４５】
本明細書に記載するいずれの方法においても、ジンクフィンガータンパク質の追加の対を、細胞内の追加の標的部位の追加の２本鎖開裂のために使用することができる。
【００４６】
細胞クロマチン内の関心対象である領域における配列の標的化組換えおよび／または置換および／または変更の方法のある実施形態では、染色体配列を、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列を用いる相同組換えにより変更する。そのような相同組換えは、切断の領域に相同的な配列が存在する場合、細胞クロマチン内の２本鎖切断の存在によって刺激される。
【００４７】
本明細書に記載するあらゆる方法において、第１ヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、関心対象である領域内のゲノム配列に相同的だが同一ではない配列を含有することができ、それによって、関心対象である領域内の非同一配列を挿入するために、相同組換えを刺激することができる。したがって、ある実施形態では、関心対象である領域の配列に相同的なドナー配列の一部が、置換されるゲノム配列に対して約８０〜９９％（またはこの間の任意の整数）の配列同一性を発揮する。他の実施形態では、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、例えば、ドナーと１００個を超える連続塩基対のゲノム配列との間における場合のように、１個のヌクレオチドだけが違っていれば、９９％を超える。ある場合には、ドナー配列の非相同部分は、新しい配列が関心対象である領域に導入されるように、関心対象である領域に存在しない配列を含有することができる。これらの場合、非相同配列は、一般に、５０〜１，０００個（またはこの間の任意の整数値）の塩基対、または関心対象である領域の配列と相同的または同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は、第１配列に非相同的で、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【００４８】
本明細書に記載するいかなる方法も、関心対象である遺伝子（複数を含む）の発現を妨害するドナー配列の標的化組込みによって、細胞内の１または複数の標的配列の部分的または完全な不活化のために使用することができる。部分的または完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【００４９】
さらに、本明細書に記載するような標的化組込みの方法は、１または複数の外因性配列を組み込むためにも使用することができる。外因性核酸配列は、例えば、１または複数の遺伝子あるいはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード化あるいは非コード化配列、ならびに１または複数のコントロール要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。また、外因性核酸配列は、１または複数のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成しうる。
【００５０】
「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断をいう。開裂は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を始めとするが、これらに限定されない種々の方法によって開始することができる。１本鎖開裂および２本鎖開裂の両方が可能で、２本鎖開裂は、２本の異なる１本鎖開裂事象の結果として起こりうる。ＤＮＡ開裂により、平滑末端または付着末端のいずれかを生成する結果となりうる。ある実施形態では、融合ポリペプチドを標的化２本鎖ＤＮＡ開裂のために使用する。
【００５１】
「開裂ハーフドメイン」は、第２ポリペプチド（同一または異なる）と一緒になって、開裂活性（好ましくは２本鎖開裂活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２開裂ハーフドメイン」、「＋および−開裂ハーフドメイン」および「右および左開裂ハーフドメイン」は、交換可能に使用され、２量体化する開裂ハーフドメインの対をいう。
【００５２】
「遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ２量体を形成するように修飾された開裂ハーフドメインである。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、第８，６２３，６１８号および米国特許公開公報第２０１１／０２０１０５５号も参照。
【００５３】
用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列をいい、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、直鎖、環状または分岐状でもよく、１本鎖または２本鎖のいずれでもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列をいう。ドナー配列は、いかなる長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００（またはこの間のあるいはこれを超える任意の整数値）のヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１００〜１，０００（またはこの間の任意の整数）のヌクレオチドの長さ、より好ましくは、約２００〜５００のヌクレオチドの長さであってよい。
【００５４】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造体である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、およびヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を始めとするタンパク質を含む。大部分の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、該形態では、ヌクレオソームのコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２つ含む８量体と結合する約１５０のＤＮＡ塩基対を含み、リンカーＤＮＡ（生物によって長さが変わる）は、ヌクレオソームのコアの間に延びる。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと結合する。本開示の解釈上、用語「クロマチン」は、すべての種類の細胞核タンパク質、原核および真核の両方を包含することを意図する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００５５】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である核型を特徴とすることが多い。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含みうる。
【００５６】
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない核酸を含む、複製核酸、核タンパク質複合体または他の構造体である。エピソームの例として、プラスミドおよびある種のウィルスゲノムが挙げられる。
【００５７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のために充分な条件が存在する場合、そこに結合分子が結合するであろう核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
【００５８】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１または複数の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞内に通常存在する」ことは、特定の発育段階および細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にしか存在しない分子は、成体の筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能している変形体、または正常に機能している内因性分子の機能不全変形体を含むことができる。
【００５９】
外因性分子は、中でも、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体のような巨大分子、または１または複数の上記分子を含む任意の複合体であってよい。核酸として、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、１本鎖または２本鎖であってよく、直鎖、分岐状または環状であってよく、いかなる長さであってもよい。核酸として、２本鎖を形成することができる核酸、および３本鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号参照。タンパク質として、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファタ−ゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、およびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、感染ウィルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドまたはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含むことができる。細胞に外因性分子を導入する方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入およびウィルスベクター媒介導入が挙げられるが、これらに限定されない。また、外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子であってよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来するものでもよい。例えば、ヒト核酸配列を、元はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入してもよい。
【００６１】
対照的に、「内因性」分子は、特定の発育段階で特定の細胞の環境条件下で、特定の細胞に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他の細胞小器官のゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含むことができる。追加の内因性分子として、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
【００６２】
「融合」分子は、２個またはそれより多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結している分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であってよく、または異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、１または複数の活性化ドメインとの間の融合）、および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコード化する核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、３本鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および小溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
細胞内での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドの細胞への送達により生じることができ、そこで、融合タンパク質を生成するために、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳される。トランススプライシング、ポリペプチド開裂、およびポリペプチド連結も、細胞内でのタンパク質の発現に関与しうる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の別の箇所に提示される。
【００６４】
「遺伝子」として、本開示の解釈上、遺伝子産物（以下を参照）をコード化するＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を制御するすべての（そのような制御配列がコード化するおよび／または転写された配列に隣接してもしなくても）ＤＮＡ領域が挙げられる。したがって、遺伝子として、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えばリボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製オリジン、マトリックス結合部位、および遺伝子座コントロール領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００６５】
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含有される情報の遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳により生成されたタンパク質でありうる。また、遺伝子産物として、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集のようなプロセスにより修飾されたＲＮＡ、および例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボース化、ミリスチル化およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も挙げられる。
【００６６】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化をいう。発現の調節として、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活化、ランダム突然変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子不活化は、本明細書に記載するようなＺＦＰを含有しない細胞と比較した、遺伝子発現におけるいかなる減少もいう。したがって、遺伝子不活化は、部分的であっても完全でもよい。
【００６７】
「関心対象である領域」は、例えば、外因性分子を結合することが望まれる、遺伝子、または遺伝子内または遺伝子に隣接する非コード化配列のような、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ開裂および／または標的化組換えの目的のためであってよい。関心対象である領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウィルスゲノムに存在することができる。関心対象である領域は、コード化領域の上流または下流のいずれかの、遺伝子のコード化領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロンのような転写された非コード化領域内、または非転写領域内にあることができる。関心対象である領域は、長さが単一ヌクレオチド対または２，０００までのヌクレオチド対ほどの小さいものでも、ヌクレオチド対の任意の整数値であってもよい。
【００６８】
「真核」細胞として、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
用語「作動的連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）は、両成分が正常に機能し、該成分のうち少なくとも１つが、他の成分のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができるようになるように成分が配置されている、２またはそれより多くの成分（例えば、配列要素）の並置に関して、交換可能に使用される。例として、転写制御配列が、１または複数の転写制御因子の存在または不存在に応じて、コード化配列の転写のレベルをコントロールする場合、プロモーターのような転写制御配列は、コード化配列に作動的に連結される。転写制御配列は、一般に、コード化配列にシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していないが、コード化配列に作動的に連結された転写制御配列である。
【００７０】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動的に連結された」は、各成分が、他の成分への連結において、そのように連結していない場合と同じ機能を果たすという事実をいうことができる。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が活性化ドメインに融合する融合ポリペプチドに関して、該融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメインの部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することができ、一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができれば、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、作動的連結の状態にある。ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合する融合ポリペプチドの場合、該融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメインの部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することができ、一方、開裂ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを開裂することができれば、ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、作動的連結の状態にある。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが、活性化または抑制ドメインに融合する融合ポリペプチドに関して、該融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメインの部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合することができ、一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御でき、または抑制ドメインが遺伝子発現を下方制御できれば、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは、作動的連結の状態にある。
【００７１】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的フラグメント」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の機能と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的フラグメントは、それに対応する天然の分子における残基の数を超える、それ未満またはそれと同じ数の残基を有することができ、および／または１または複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード化機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定する方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定する方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって測定することができる。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。前述のＡｕｓｕｂｅｌら参照。タンパク質の別のタンパク質と相互反応する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝子的および生化学的の両方の相補性によって測定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０号参照。
【００７２】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、関心対象である遺伝子の発現を方向付けることができ、導入遺伝子配列を標的細胞に導入することができるあらゆる核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローン化および発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
【００７３】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、簡単に、好ましくは日常的なアッセイによって（必ずしも必要ではないが）測定されるタンパク質生成物を生成する任意の配列をいう。適切なレポーター遺伝子として、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介する配列コード化タンパク質、着色、蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコード化する配列、および細胞成長および／または遺伝子増殖の強化を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとして、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１または複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」として、関心対象である遺伝子の発現をモニターするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結されていてもよいレポーターをコード化する配列が挙げられる。
【００７４】
ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書では、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ制御因子を含む任意の遺伝子内の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物を記載する。いかなるＤＮＡ結合ドメインも、本明細書に記載される組成物および方法において使用することができる。
【００７５】
ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質は、好ましくは、選択された標的部位に結合するように遺伝子工学的に操作された、非天然起源のものである。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＢｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，５０３，７１７号、第６，６８９，５５８号、第７，０３０，２１５号、第６，７９４，１３６号、第７，０６７，３１７号、第７，２６２，０５４号、第７，０７０，９３４号、第７，３６１，６３５号、第７，２５３，２７３、および米国特許公開公報第２００５／００６４４７４号、第２００７／０２１８５２８号、第２００５／０２６７０６１号参照。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第２０１２／００６０２３０号（例えば表１）に開示されるジンクフィンガータンパク質を含む。
【００７６】
遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。遺伝子工学的操作方法として、合理的設計および種々の種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計として、例えば、トリプレット（またはクワドラプレット）ヌクレオチド配列と、個々のジンクフィンガーアミノ酸配列とを含み、各トリプレットまたはクワドラプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクワドラプレット配列を結合するジンクフィンガーの１または複数のアミノ酸配列と結合するデータベースを使用することが挙げられる。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号参照。
【００７７】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／８８１９７号および英国第２，３３８，２３７号に開示されている。また、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００７８】
また、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを始めとする、任意の適切なリンカー配列を使用して、互いに連結してもよい。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の代表的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載するタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。また、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００７９】
標的部位の選択、ＺＦＰ、および融合タンパク質（およびそれをコード化するポリヌクレオチド）の設計および構築方法は、当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、第７８９，５３８号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１号、ＷＯ９６／０６１６６号、ＷＯ９８／５３０５７号、ＷＯ９８／５４３１１号、ＷＯ００／２７８７８号、ＷＯ０１／６０９７０号、ＷＯ０１／８８１９７号、ＷＯ０２／０９９０８４号、ＷＯ９８／５３０５８号、ＷＯ９８／５３０５９号、ＷＯ９８／５３０６０号、ＷＯ０２／０１６５３６号、およびＷＯ０３／０１６４９６号に詳細に記載されている。
【００８０】
また、これらおよび他の参考文献に開示するように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを始めとする、任意の適切なリンカー配列を使用して、互いに連結してもよい。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の代表的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載するタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
【００８１】
ある実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ制御因子遺伝子内の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、ＨＬＡの発現を調節する、遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガータンパク質である。ＺＦＰは、関心対象である特異的ハプロタイプに選択的に結合することができる。米国の国民において同定されているＨＬＡハプロタイプおよび異なる人種によるそれらの頻度の検討については、参照によって本明細書に組み込まれるＭａｉｅｒｓら（２００７）Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６８：７７９−７８８参照。
【００８２】
また、機能的ＨＬＡ制御因子遺伝子、例えば、Ｔａｐ１、Ｔａｐ２、タパシン（Ｔａｐａｓｃｉｎ）、ＣＴＦＩＩＡおよびＲＦＸ５（これらに限定されない）に結合するＺＦＰを提供する。ＨＬＡ標的部位は、典型的には、少なくとも１個のジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６個、またはそれより多くのフィンガー）も含みうる。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある種のＺＦＰは、４、５または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、一方、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。また、ＺＦＰは、転写活性化または抑制ドメインでありうる、１個または複数個の制御ドメインを含む融合タンパク質でもありうる。
【００８３】
ＺＦＰの具体例は、米国特許公開公報第２０１２００６０２３０号の表１に開示されている。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩのようなホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が既知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログ参照。また、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、天然ではない標的部位に結合するように遺伝子工学的に操作されうる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７：４９−６６、米国特許公開公報第２００７０１１７１２８号参照。
【００８５】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０９−１５１２、ならびにＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１参照）、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ７３（１３）：４３７９−４３８４）、米国特許出願第２０１１０３０１０７３号および第２０１１０１４５９４０号参照に由来するものに類似するＴＡＬエフェクターから遺伝子工学的に操作されたドメインを含む。ｇｅｎｕｓ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの植物病原菌は、重要な作物において多くの疾患を引き起こすことが知られている。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系によるものである。これらの中で、注入タンパク質は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインとを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．ＶｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ２１８：１２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０号参照）。ＴＡＬＥは、タンデム繰返しの集中ドメインを含有し、各繰返しは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要な約３４個のアミノ酸を含有する。また、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓら（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ１６３（３）：２５６−２７２参照）。また、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの２つの遺伝子において、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  １  ｓｔｒａｉｎ  ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ  ４  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ１０００におけるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同である、指定されたｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７が発見されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ７３（１３）：４３７９−４３８４参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において、互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の繰返しドメインにおいて、１，５７５ｂｐの削除だけ相違する。しかし、両遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００８６】
また、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば、長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを始めとする、任意の適切なリンカー配列を使用して、互いに連結してもよい。また、長さが６またはそれより多くのアミノ酸の代表的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載するタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。また、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００８７】
融合タンパク質
本明細書に記載するようなＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と、異種制御（機能的）ドメイン（またはその機能的フラグメント）とを含む融合タンパク質も提供する。一般的なドメインとして、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファタ−ゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子および修飾因子が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号および第２００７／０２１８５２８号。
【００８８】
活性化を達成する適切なドメインとして、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、５９５２−５９６２（１９９７）参照）、核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）参照）、核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ  ＆  Ｂａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ  ＆  Ｈｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ８：２９３７−２９４２（１９９７））；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、または人工キメラ機能的ドメイン、例えば、ＶＰ６４（Ｂｅｅｒｌｉら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、６４３９−６４４７）が挙げられる。追加の代表的な活性化ドメインとして、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１、４９６１−４９６８（１９９２）およびｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒら（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏら（２０００）Ｇｅｎｅ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａら（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４参照。追加の代表的な活性化ドメインとして、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、およびＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａら（２０００）Ｇｅｎｅ２４５：２１−２９、Ｏｋａｎａｍｉら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ１：８７−９９、Ｇｏｆｆら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１５、３４８−１５、３５３参照。
【００８９】
ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間での融合タンパク質（またはそれをコード化する核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして適切であることは、当業者に明らかになるであろう。活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化）を標的遺伝子に補充することができる本質的にすべての分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。インスレータードメイン、局在化ドメインおよびクロマチンリモデリングタンパク質、例えば、融合分子内の機能的ドメインとしての使用に適切なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、米国特許出願第２００２／０１１５２１５号および第２００３／００８２５５２号、ならびにＷＯ０２／４４３７６に記載されている。
【００９０】
代表的な抑制ドメインとして、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄら（１９９９）Ｃｅｌｌ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２参照。追加の代表的な抑制ドメインとして、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ８：３０５−３２１、およびＷｕら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１９−２７参照。
【００９１】
融合分子は、当業者に周知のクローン化および生化学的結合の方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）とを含む。また、融合分子は、場合によっては、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原からのもの）と、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニン）とを含む。融合タンパク質（およびそれらをコード化する核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の成分間で保存されるように設計される。
【００９２】
片方の機能的ドメイン（またはその機能的フラグメント）のポリペプチド成分と、
もう一方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、干渉物質、小溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に既知の生化学的結合方法により構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照。小溝結合剤とポリペプチドとの間の融合を造る方法および組成物は、Ｍａｐｐら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：３９３０−３９３５に記載されている。
【００９３】
ある実施形態では、ジンクフィンガータンパク質により結合された標的部位は、細胞クロマチンの到達可能な領域内に存在する。到達可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および第７，９２３，５４２号に記載するようにして決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能な領域に存在しない場合は、１または複数の到達可能な領域を、米国特許第７，７８５，７９２号および第８，０７１，３７０号に記載するようにして造ることができる。追加の実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能な領域に存在するか否かに関係なく、細胞クロマチンに結合することができる。例えば、そのようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することができる。この種類の「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある種のステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）に見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら（１９８７）Ｃｅｌｌ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａら（１９９０）Ｃｅｌｌ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２４４−２５４。
【００９４】
融合分子は、当業者に既知の医薬的に許容されうる担体を用いて製剤化してもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５、および米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号参照。
【００９５】
融合分子の機能的成分／ドメインは、一旦融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる種々の異なる成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能的成分として、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子、およびサイレンサーのような種々の転写因子ドメインを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９６】
追加の代表的な機能的ドメインは、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号および第６，９３３，１１３号に開示されている。
【００９７】
また、外因性小分子またはリガンドによって制御されている機能的ドメインを選択してもよい。例えば、外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下でのみ、機能的ドメインがその活性立体配座をとるＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術（例えば、米国第２００９０１３６４６５号参照）を使用してもよい。したがって、ＺＦＰは、ＺＦＰ−ＴＦの得られる活性が外部のリガンドによってコントロールされる、制御可能な機能的ドメインに作動可能に連結されてもよい。
【００９８】
ヌクレアーゼ
ある実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合性の結合ドメインと、開裂（ヌクレアーゼ）ドメインとを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子工学的に操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。遺伝子工学的に操作されたヌクレアーゼ技術は、天然起源のＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子工学的操作に基づく。例えば、目的に合わせたＤＮＡ結合特異性を持つホーミングエンドヌクレアーゼの遺伝子工学的操作が、記載されている。Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３３（２０）：ｅ１７８、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−４５８。また、ＺＦＰの遺伝子工学的操作も、記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９７９，５３９号、第６，９３３，１１３号、第７，１６３，８２４号、および第７，０１３，２１９号参照。
【００９９】
また、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ、すなわちその遺伝子工学的に操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介して意図した核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性によってＤＮＡ結合部位の近くをＤＮＡに切断させることができる機能エンティティーを造るために、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥは、ヌクレアーゼドメインに融合している。例えば、Ｋｉｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９３（３）：１１５６−１１６０参照。より最近では、そのようなヌクレアーゼは、種々の生物におけるゲノム修飾のために使用されている。例えば、米国特許公開公報第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００６００６３２３１号、および国際公開公報ＷＯ０７／０１４２７５号参照。
【０１００】
したがって、本明細書に記載する方法および組成物は、関心対象である任意のヌクレアーゼに広く適用可能であり、それらに関与しうる。ヌクレアーゼの限定ではない例示として、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および開裂ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、異種開裂ドメインを含むメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでもよく、あるいは選択された標的部位に結合するように、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを変更してもよい（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子工学的に操作されたメガヌクレアーゼ）。
【０１０１】
本明細書に記載する任意のヌクレアーゼにおいて、ヌクレアーゼは、遺伝子工学的に操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）とを含むことができ、ＴＡＬＥＮとも呼ばれる。頑強な部位特異的相互作用のために、使用者の選択する標的配列を含むこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を遺伝子工学的に操作する方法および組成物が、公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号参照）。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとメガヌクレアーゼ開裂ドメインとを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ開裂ドメインは、モノマーとして活性であり、活性のために２量体化を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌら、（２０１３）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ：１−１３、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４参照）。また、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能を発揮する場合もある。
【０１０２】
さらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する１本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関してどこに位置しているかによって、ＴＡＬＥ領域により局在化されるニッカーゼとして作用することができるか、あるいは２本鎖切断を造ることができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１−８ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２参照）。任意のＴＡＬＥＮを、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１または複数のメガＴＡＬを含む１または複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））、または他のＤＮＡ開裂酵素と組み合わせて使用してもよい。
【０１０３】
ある実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）、または開裂活性を発揮するその一部を含む。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０の塩基対開裂部位を認識し、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔ  ｂｏｘファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分けられる。代表的なホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は既知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照。
【０１０４】
天然起源のメガヌクレアーゼ、主としてＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーからのＤＮＡ結合ドメインは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞、およびマウスにおける部位特異的ゲノム修飾を促進するために使用されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子（Ｍｏｎｅｔら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）、またはすでに認識配列が導入されている予備的に遺伝子工学的に操作されたゲノム（Ｒｏｕｔｅら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６、Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１３３：９５６−６５、Ｐｕｃｈｔａら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５０５５−６０、Ｒｏｎｇら（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１、Ｇｏｕｂｌｅら（２００６）、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）のいずれかの修飾に限定されてきた。したがって、新規な結合特異性を医学的にまたは生物工学的に適切な部位で発揮させるようにメガヌクレアーゼを遺伝子工学的に操作する試みがなされてきた（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７：４９−６６、米国特許公開公報第２００７０１１７１２８号、第２００６０２０６９４９号、第２００６０１５３８２６号、第２００６００７８５５２号、および第２００４０００２０９２号）。また、天然起源の、またはメガヌクレアーゼからの遺伝子工学的に操作されたＤＮＡ結合ドメインを、異種ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの開裂ドメインで作動可能に連結することもでき、および／またはメガヌクレアーゼからの開裂ドメインを、異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）で作動可能に連結することもできる。
【０１０５】
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子および開裂ドメインまたは開裂ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載するような制限および／またはメガヌクレアーゼからのもの）内の標的部位に結合するように遺伝子工学的に操作された、ＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
【０１０６】
先に詳細に記載したように、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを、選択された配列に結合するように遺伝子工学的に操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６参照。遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然起源のタンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。遺伝子工学的に操作する方法として、合理的設計および種々の種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計として、例えば、トリプレット（またはクワドラプレット）ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列とを含み、各トリプレットまたはクワドラプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクワドラプレット配列を結合する、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ繰返し単位の１または複数のアミノ酸配列と結合する、データベースを使用することが挙げられる。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号参照。
【０１０７】
標的部位の選択、ならびに融合タンパク質（およびそれをコード化するポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は当業者に既知であり、その詳細は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号に記載されている。
【０１０８】
また、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを始めとする、任意の適切なリンカー配列を使用して、互いに連結してもよい。（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号３）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号４）、ＴＧＱＫＰ（配列番号５）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号６））。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の代表的なリンカー配列に関しては、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号を参照。本明細書に記載するタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。また、米国仮特許出願第６１／３４３，７２９号も参照。
【０１０９】
したがって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合ドメインと、任意のヌクレアーゼ（開裂）ドメイン（開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン）とを含むことができる。先に記載したように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、およびヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインからの開裂ドメイン、および異なるヌクレアーゼからの開裂ドメインと異種であってもよい。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインが由来しうる代表的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８参照。ＤＮＡを開裂する追加の酵素は、既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、ミクロコッカルヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、またＬｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３も参照）。これらの酵素（またはその機能的フラグメント）のうち１または複数のものを、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインのソースとして使用することができる。
【０１１０】
同様に、開裂ハーフドメインは、先に記載したように、開裂活性のための２量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来しうる。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含んでいれば、２種の融合タンパク質が開裂のために必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することもできる。２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）由来であっても、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）由来であってもよい。また、好ましくは、２種の融合タンパク質の標的部位は、それぞれの標的部位に対する２種の融合タンパク質の結合が、開裂ハーフドメインが機能的開裂ドメインを、例えば２量体化によって形成できるような互いに対する空間位置に開裂ハーフドメインを置くように、互いに関して配置される。したがって、ある実施形態では、標的部位の近位端は、５〜８のヌクレオチドまたは１５〜１８のヌクレオチドによって分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位（例えば、２〜５０またはそれより多くのヌクレオチド対）の間に介在できる。一般に、開裂の部位は、標的部位の間にある。
【０１１１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに対して（認識部位で）配列特異的に結合し、結合の部位またはその近くでＤＮＡを開裂することができる。ある種の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り除かれた部位でＤＮＡを開裂し、分離可能な結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、１本の鎖のその認識部位から９のヌクレオチド、およびもう１つの鎖のその認識部位から１３のヌクレオチドで、ＤＮＡの２本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号、および第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１、９７８−３１、９８２参照。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン（遺伝子工学的に操作されたものでも、されていないものでもよい）からの開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
【０１１２】
開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である代表的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ  Ｉである。この特定の酵素は、２量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の解釈上、開示する融合タンパク質において使用されるＦｏｋ  Ｉ酵素のその部分は、開裂ハーフドメインであると考えられる。したがって、ジンクフィンガーＦｏｋ  Ｉ融合を使用する細胞配列の標的化２本鎖開裂および／または標的化置換に関して、それぞれＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２種の融合タンパク質は、触媒的に活性な開裂ドメインを再構築するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ  Ｉ開裂ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガーＦｏｋ  Ｉ融合を使用する標的化開裂および標的化配列変更のパラメーターは、本開示の別の箇所に提供される。
【０１１３】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持する、または多量体化（例えば、２量体化）して機能的開裂ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であることができる。
【０１１４】
代表的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開公報ＷＯ０７／０１４２７５号に記載される。追加の制限酵素も分離可能な結合および開裂ドメインを含有し、これらも本開示によって意図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０参照。
【０１１５】
ある実施形態では、開裂ドメインは、１または複数の、ホモ２量体化を最小限にするまたは防ぐ、遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメイン（２量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含み、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、および第８，６２３，６１８号、ならびに米国特許公開公報第２０１１０２０１０５５号に記載される。Ｆｏｋ  Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、すべて、Ｆｏｋ  Ｉ開裂ハーフドメインの２量体化に影響する標的である。
【０１１６】
偏性ヘテロ２量体を形成するＦｏｋ  Ｉの代表的な遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインとして、第１開裂ハーフドメインが、Ｆｏｋ  Ｉの４９０および５３８位のアミノ酸残基で突然変異を含み、第２開裂ハーフドメインが、４８６および４９９位のアミノ酸残基で突然変異を含む対が挙げられる。
【０１１７】
したがって、一実施形態では、４９０での突然変異が、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８での突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６での突然変異が、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位での突然変異が、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載する遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、１つの開裂ハーフドメイン内の４９０（Ｅ→Ｋ）位および５３８（Ｉ→Ｋ）位を突然変異させ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」という遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインを生成し、別の開裂ハーフドメイン内の４８６（Ｑ→Ｅ）位および４９９（Ｉ→Ｌ）位を突然変異させ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」という遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインを生成することによって調製された。本明細書に記載する遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小限にされた、またはなくされた偏性ヘテロ２量体突然変異体である。例えば、すべての目的について、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第２００８／０１３１９６２号参照。ある実施形態では、遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６（野生型ＦｏｋＩに関する番号付け）位での突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）で置換する突然変異を含む。他の実施形態では、遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７（野生型ＦｏｋＩに関する番号付け）位での突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）で置換する突然変異を含む。他の実施形態では、遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、４９０および５３７（野生型ＦｏｋＩに関する番号付け）位での突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）で置換する突然変異を含む（米国特許公開公報第２０１１０２０１０５５号参照）。
【０１１８】
本明細書に記載する遺伝子工学的に操作された開裂ハーフドメインは、任意の適切な方法、例えば、野生型開裂ハーフドメイン（Ｆｏｋ  Ｉ）の、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号、ならびに米国特許公開公報第２０１１０２０１０５５号に記載されるような、部位特異的な突然変異誘発を使用して調製することができる。
【０１１９】
あるいは、ヌクレアーゼを、核酸標的部位で、いわゆる「分割酵素」技術（例えば、米国特許公開公報第２００９００６８１６４号参照）を使用して、インビボで組み立ててもよい。そのような分割酵素の成分は、離された発現構築物上で発現しうるか、または個々の成分が、例えば、２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列を自己開裂することによって離された１つのオープンリーディングフレーム内で連結することができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【０１２０】
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、使用の前に、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３号および２００９００６８１６４号に記載するような酵母系染色体システムで、活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該分野で既知の方法を使用して、簡単に設計することができる。例えば、米国特許公開公報第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、第２００６００６３２３１号、および国際公開公報ＷＯ０７／０１４２７５参照。ヌクレアーゼの発現は、構成プロモーターまたは誘発性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターのコントロール下にあってもよい。
【０１２１】
ある実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。該システムのＲＮＡ成分をコード化する、ＣＲＩＳＰＲ（規則的にクラスターされ、間隔の開いた、短い回帰性繰返し）遺伝子座、およびタンパク質をコード化するｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６、Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ１：７、Ｈａｆｔら、２００５．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を作りあげる。微生物ホスト内のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介核酸開裂の特異性をプログラムすることができる非コード化ＲＮＡ要素の組合せを含有する。
【０１２２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられているシステムの１つで、４つの連続ステップにおいて、標的化ＤＮＡ２本鎖切断を実施する。先ず、２つの非コード化ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写する。２番目に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの繰返し領域にハイブリダイズし、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。３番目に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標識認識のための追加の要求であるプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間で、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基ペアリングによって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介し、プロトスペーサー内で２本鎖切断を行う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は、（ｉ）異質なＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入により、「順応」と呼ばれるプロセスにおいて、将来の攻撃を防止するステップと、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、および上記アレイの発現およびプロセシングのステップ、続いて、（ｉｉｉ）異質な核酸によるＲＮＡ媒介干渉ステップの３つのステップを含む。したがって、細菌細胞では、数種のいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの自然の機能に関与し、異質なＤＮＡなどの挿入のような機能において役割を果たす。
【０１２３】
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと同様に、質的な生物学的特徴を有する化合物である。「機能的誘導体」として、天然配列のフラグメント、天然配列ポリペプチドの誘導体、およびそのフラグメントが挙げられる（これらに限定されない）が、ただし、それらは、対応する天然配列ポリペプチドと同様に、生物学的活性を有することが条件である。本明細書で意図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチド、共有結合修飾体のアミノ酸配列変異体、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはそのフラグメントの適切な誘導体として、Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントの突然変異体、融合物、共有結合修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントを含有するＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはそのフラグメントの誘導体は、細胞から得られえ、または化学的に合成されえ、またはこれら２つの手順の組合せによって得られうる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を自然に生成する細胞であってもよく、またはＣａｓタンパク質を自然に生成し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を生成するように、または外因的に導入された、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコード化する核酸からＣａｓタンパク質を生成するように、遺伝子工学的に操作された細胞であってもよい。ある場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を自然に生成せず、Ｃａｓタンパク質を生成するように遺伝子工学的に操作される。
【０１２４】
ＨＬＡおよび他の遺伝子に標的化された代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、例えば、米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号に開示されている。
【０１２５】
送達
タンパク質（例えば、ヌクレアーゼおよび非古典的ＨＬＡ分子）、それをコード化するポリヌクレオチド、および本明細書に記載するタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質および／またはｍＲＮＡの注入を始めとする任意の適切な手段によって、標的細胞に送達されてもよい。
【０１２６】
適切な細胞として、真核および原核細胞および／または細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞、またはそのような細胞から生成される細胞株の限定ではない例示として、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞が挙げられる。ある実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。また、適切な細胞としては、例示として、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経細胞幹細胞、および間葉系幹細胞のような幹細胞も挙げられる。
【０１２７】
本明細書に記載するようなＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、すべてその開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５０３，７１７号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，６０７，８８２号、第６，６８９，５５８号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号に記載される。
【０１２８】
また、本明細書に記載するようなＤＮＡ結合ドメイン、およびこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質は、１または複数のＤＮＡ結合タンパク質をコード化する配列を含有するベクターを使用して送達されてもよい。また、追加の核酸（例えば、非古典的ＨＬＡタンパク質をコード化するドナーおよび／または配列）も、これらのベクターによって送達されてもよい。プラスミドベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ポックスウィルスベクター；ヘルペスウィルスベクターおよびアデノ関連ウィルスベクター等（これらに限定されない）を始めとするあらゆるベクターシステムを使用してもよい。また、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４も参照。さらに、これらのベクターのいずれも、１または複数のＤＮＡ結合タンパク質コード化配列および／または適切であれば、追加の核酸を含んでもよいことが明らかになるであろう。したがって、１または複数の本明細書に記載するようなＤＮＡ結合タンパク質が、細胞、および適切であれば、追加のＤＮＡに導入される場合、それらは、同じベクターまたは異なるベクター上に担持されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１または複数のＤＮＡ結合タンパク質、および所望の場合追加の核酸をコード化する配列を含んでもよい。
【０１２９】
細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織内の遺伝子工学的に操作されたＤＮＡ結合タンパク質をコード化する核酸を導入するために、従来のウィルス系および非ウィルス系遺伝子導入方法を使用し、所望のように追加のヌクレオチド配列を共導入することができる。そのような方法は、インビトロで細胞に核酸を投与する（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ドナーおよび／または非古典的ＨＬＡタンパク質をコード化する）ために使用することもできる。ある実施形態では、インビボまたはエクスビボでの遺伝子治療使用のために、核酸を投与する。非ウィルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーのような送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウィルスベクター送達システムは、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルスを含み、これらは、細胞に送達後、エピソームまたは組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｈｍ（編）（１９９５）、およびＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１：１３−２６（１９９４）を参照。
【０１３０】
核酸の非ウィルス性送達の方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ウィルス粒子、およびＤＮＡの薬剤強化取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。好ましい実施形態では、１または複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。キャップドｍＲＮＡの使用も、翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性の増加のために好ましい。ＡＲＣＡ（抗逆キャップ類縁体）キャップまたはその変異体もとりわけ好ましい。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号参照。
【０１３１】
追加の代表的な核酸送達システムとして、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（例えば、米国第６００８３３６号参照）により提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国第５，０４９，３８６号、米国第４，９４６，７８７号、および米国第４，８９７，３５５号に記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性脂質として、Ｆｅｌｇｎｅｒのもの、ＷＯ９１／１７４２４号、ＷＯ９１／１６０２４号が挙げられる。送達は、細胞（エクスビボで投与）にも、標的組織（インビボで投与）にも行われうる。
【０１３２】
免疫脂質複合体のような標的化リポソームを始めとする脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号参照）。
【０１３３】
追加の送達方法として、送達される核酸の、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、もう１つのアームがＥＤＶに対する特異性を有する２重特異的抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。該抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面にもたらし、次いでＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内にもたらされる。一旦細胞内に入ると、中身が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第２７（７）巻、第６４３頁参照）。
【０１３４】
遺伝子工学的に操作されたＤＮＡ結合タンパク質、非古典的ＨＬＡ分子および／または他の所望のドナーをコード化する核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウィルス系システムの使用は、体内の特異的細胞へウィルスを標的化し、ウィルス性負荷を神経核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウィルスベクターは、患者に（インビボで）直接投与することができ、またはインビトロで細胞を処置するためにこれらを使用することができ、修飾された細胞を患者に（エクスビボで）投与する。核酸の送達のための従来のウィルス系システムとして、遺伝子導入のためのレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ関連、ワクシニアおよび単純ヘルペスウィルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウィルス、レンチウィルスおよびアデノ関連ウィルス遺伝子導入方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期間の発現をもたらすことが多い。また、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞種および標的組織において観察されてきた。
【０１３５】
レトロウィルスの向性は、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張する、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができる。レンチウィルスベクターは、非分割細胞を形質導入する、または非分割細胞に感染することができ、典型的には、高いウィルス力価を生み出すことができるレトロウィルスベクターである。レトロウィルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織によって決まる。レトロウィルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列に対してパッケージング能力を有するシス作用性長末端繰返しで構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに充分であり、次いで、これは、永久的な導入遺伝子発現を提供するために、治療遺伝子の標的細胞への組込みに使用される。広く使用されるレトロウィルスベクターとして、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組合せに基づくもの（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）が挙げられる。
【０１３６】
一過性発現が好ましい適用においては、アデノウィルス系システムを使用することができる。アデノウィルス系ベクターは、多くの細胞の種類において非常に高い形質導入効率が可能で、細胞分裂を必要としない。そのようなベクター用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られてきた。このベクターは、比較的簡単なシステムで大量に生産することができる。また、アデノ関連ウィルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産において、およびインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために、標的核酸を用いて細胞を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を始めとする、数多くの刊行物に記載されている。
【０１３７】
少なくとも６つのウィルスベクターのアプローチが、現在、臨床試験において遺伝子導入に利用可能で、これらは、形質導入剤を生成するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用する。
【０１３８】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されてきたレトロウィルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％またはそれを超える形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターで観察されてきた（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１３９】
組換えアデノ関連ウィルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウィルスアデノ関連２型ウィルスに基づく、有望な代替遺伝子送達システムである。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ反転末端繰返しだけを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクターシステムの重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む他のＡＡＶセロタイプ、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６のような偽型ＡＡＶも、本発明に従って使用することができる。
【０１４０】
複製欠損組換えアデノウィルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で生成することができ、数多くの異なる細胞種に簡単に感染することができる。ほとんどのアデノウィルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換え、続いて、削除された遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞において、複製欠陥ベクターが増殖するように遺伝子工学的に操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉にあるような、非分裂の分化細胞を始めとする複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウィルスベクターの使用の追加の例示として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２４：１  ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１４１】
宿主細胞に感染することができるウィルス粒子を形成するために、パッケージング細胞を使用する。そのような細胞として、アデノウィルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウィルスをパッケージするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウィルスベクターは、通常、核酸ベクターをウィルス粒子にパッケージするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング、およびそれに続く宿主（該当する場合）への組込みに必要な最小限のウィルス配列、発現されるタンパク質をコード化する発現カセットによって置換されている他のウィルス配列を含有する。欠損しているウィルス機能は、パッケージング細胞株によって途中で供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆転した末端繰返し（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウィルスＤＮＡは、細胞株にパッケージされるが、この細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコード化するヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列を欠く。また、該細胞株は、ヘルパーとして、アデノウィルスに感染する。ヘルパーウィルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠乏しているため、有意な量でパッケージされない。アデノウィルスの混入は、例えば、それに対してアデノウィルスの方がＡＡＶよりも感受性のある熱処理によって減らすことができる。
【０１４２】
多くの遺伝子治療の適用においては、遺伝子治療ベクターは、特定の組織種に対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウィルスベクターは、ウィルスの外表面に、ウィルスコートタンパク質を用いて融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、ある細胞種に関する特異性を持つように修飾されうる。リガンドは、関心対象である細胞種に存在することが知られている受容体に対して親和性を持つように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウィルスを、ｇｐ７０に融合するヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウィルスが、ヒト表皮増殖因子受容体を発現するある種のヒト乳癌細胞に感染すると報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウィルスが細胞表面受容体用のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウィルス標的細胞対にも拡張することができる。例えば、繊維状ファージを、実質的にあらゆる選択された細胞受容体への特異的結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を示すように遺伝子工学的に操作することができる。先の記載は、主にウィルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウィルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターを、特異的標的細胞によって取込みを有利にする特異的取込み配列を含有するように遺伝子工学的に操作することができる。
【０１４３】
遺伝子治療ベクターは、典型的には以下に記載するような全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）、または局所投与によって個々の患者に投与することによって、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者からの外植細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または普遍的なドナー造血幹細胞のような細胞にエクスビボで送達し、次いで、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を患者に再埋め込みすることもできる。
【０１４４】
診断、研究、移植または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入による）に関するエクスビボでの細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞を対象生物から単離し、ＤＮＡ結合タンパク質核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、対象生物（例えば患者）に再注入する。エクスビボでのトランスフェクションに適した種々の細胞種が、当業者には周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４））、および患者からの細胞の単離および培養方法の検討のために、該文献に引用された参考文献参照）。
【０１４５】
一実施形態では、幹細胞を、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のために、エクスビボ手順で使用する。幹細胞を使用する利点は、それらが、インビトロで他の細胞種に分化することができ、または哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入することができ、そこで幹細胞が、骨髄に生着するであろうことである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞種に分化させる方法が既知である（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。
【０１４６】
幹細胞は、既知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、骨髄細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）のような望ましくない細胞に結合する抗体でパニングすることにより、幹細胞を骨髄細胞から単離する（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）参照）。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、修飾された幹細胞を使用してもよい。例えば、幹細胞が本発明のＺＦＰ  ＴＦも含有する場合、アポトーシス耐性にした神経細胞幹細胞を、治療組成物として使用してもよい。アポトーシスに対する耐性は、幹細胞内でＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許出願第１２／４５６，０４３号参照）、またはやはり、例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを使用してカスパーゼ内で破壊されたものを使用して、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることにより生じうる。これらの細胞を、ＨＬＡを制御することが知られているＺＦＰ  ＴＦでトランスフェクトすることができる。
【０１４８】
また、治療ＤＮＡ結合タンパク質（またはこれらのタンパク質をコード化する核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、リポソーム等）を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することもできる。投与は、分子を最終的に血液や組織細胞と接触させるために通常使用されるいかなる経路、例えば（限定ではない）、注射、注入、局所投与、およびエレクトロポレーションによっても行われる。該核酸を投与するための適切な方法は、利用可能であり当業者に既知である。特定の組成物を投与するために、複数の経路を使用することができるが、ある特定の経路は、しばしば別の経路よりも迅速でより効果的な反応をもたらすことができる。
【０１４９】
ＤＮＡを造血幹細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子を造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞に導入するのに有用なベクターとして、アデノウィルス３５型が挙げられる。
【０１５０】
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するのに適したベクターとして、非組込みレンチウィルスベクターが挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２５：２１７−２２２参照。
【０１５１】
医薬的に許容されうる担体は、一つには、投与される特定の組成物、および組成物の投与に使用される特定の方法によって決定される。したがって、以下に記載するような、利用可能な医薬組成物の広範囲の適切な医薬組成物の製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９参照）。
【０１５２】
先に記載したように、開示する方法および組成物は、任意の種類の細胞、例えば（これらに限定されない）、任意の種類のＴ細胞および幹細胞を始めとした、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞において使用することができる。タンパク質発現に適切な細胞株は、当業者に既知であり、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体および誘導体もまた使用することができる。
【０１５３】
適用
開示する組成物および方法は、ＨＬＡ調節が望まれる治療および研究適用を始めとする（これらに限定されない）、ＨＬＡ発現および／または機能を調節することが望まれるあらゆる適用に使用することができる。
【０１５４】
ＨＬＡに結び付けられる疾患および状態として、とりわけ、アジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、バージャー病、セイアック病、慢性活動性肝炎、グレーブス病、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群およびエリテマトーデスが挙げられる。また、ＨＬＡ遺伝子の修飾も、関心対象である細胞の他の遺伝子修飾と共に有用でありうる。例えば、ＣＴＬの特異性を変更するキメラ抗原受容体によるＣＴＬのような標的細胞の修飾は、治療を必要とする任意のほとんどの患者で使用される細胞治療を発展させるために、本明細書に記載するように、エクスビボでＨＬＡ修飾と組み合わせてもよい。
【０１５５】
また、本発明の材料および方法は、移植片対宿主病の処置、予防または改善において使用することができる。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、同種異系のＴ細胞（例えば、骨髄輸注および／または輸血）を患者に投与する時によく見られる合併症である。注入される材料における機能的免疫細胞は、レシピエントを「外来」であると認識し、免疫学的攻撃を開始する。ＧＶＨＤの危険性が減少し、または取り除かれ、またさらに、非古典的ＨＬＡ分子の提供も修飾された細胞のＮＫ媒介溶解を減少させ、または取り除くで、同種異系のＴ細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲ発現を調節することによって、「既製」Ｔ細胞（例えば、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞）を、要求に応じて、「薬剤」として投与することができる。
【０１５６】
また、本方法および組成物は、幹細胞内の１または複数の古典的ＨＬＡ遺伝子が不活化され、１または複数の非古典的ＨＬＡ分子が活性化された幹細胞組成物を含む。例えば、骨髄アブレーション後、ＨＬＡ修飾造血幹細胞を患者に導入することができる。これらの変更されたＨＳＣにより、拒絶反応および／またはＮＫ媒介細胞溶解に起因する移植片の欠失なしに、患者は再コロニー化が可能になるであろう。また、その後の治療（例えば、化学療法耐性）の間に、根底にある疾患の処置を手助けするように、導入された細胞は他の変更を有してもよい。
【０１５７】
また、本発明の方法および組成物は、例えば、治療薬としての使用のためのＨＬＡ修飾血小板の開発にも有用である。したがって、ＨＬＡ修飾血小板を、突発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、および薬剤誘発血小板減少性紫斑病（例えば、ヘパリン誘発血小板減少症）のような血小板減少性障害を処置するために使用してもよい。本発明のＨＬＡ修飾血小板を用いて処置されうる他の血小板障害として、ゴーシェ病、再生不良性貧血、オニアライ、胎児母体同種免疫血小板減少症、ＨＥＬＬＰ症候群、癌、および何らかの化学療法薬からの副作用が挙げられる。ＨＬＡ修飾血小板は、また、外傷患者のいる緊急治療室の状況での「既製」治療としても使用される。
【０１５８】
本発明の方法および組成物は、異種移植においても使用することができる。具体的には、一例にすぎないが、ブタＭＨＣ遺伝子が削除および／またはヒトＨＬＡ遺伝子と置換されたブタの組織を、ヒトへの移植に使用することができる。これらの有用な遺伝子突然変異を含有するブタの株を（内因性ＭＨＣ遺伝子が破壊されるように、注入されたｍＲＮＡによってコード化されたＨＬＡ標的ＺＦＮを有していたブタ胎仔から、またはそれらのＨＬＡ遺伝子をうまく標的化させた細胞の核を使用した、ブタ胎仔への体細胞核移植から）発生させることができ、これらの動物は、最終的には組織採取のために育ててもよい。これにより、ヒトにおいてこれらの組織の拒絶反応は防止され、移植の成功の可能性が増えるであろう。
【０１５９】
また、本発明の方法および組成物は、インビトロおよびインビボモデル、例えば、ＨＬＡまたは他の障害の研究を可能にする、これらの障害動物モデルの設計および実施に有用である。
【実施例】
【０１６０】
実施例１：材料および方法
ＺＦＮ
米国特許公開公報第２０１２００６０２３０号に記載するような、実証済みの２−フィンガーおよび１−フィンガーモジュールの確立されたアーカイブを使用して、５または６本のフィンガーを含有するＨＬＡ−Ａ結合ＺＦＮを設計し、組み立てた。使用してもよい代表的なＺＦＮを、以下の表１に示す。この表の第１欄は、ＺＦＰの内部参照名（番号）であり、表２の第１欄の同じ名前に対応する。「Ｆ」はフィンガーをいい、「Ｆ」の後ろに付く数字は、どのジンクフィンガーかをいう（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１をいう）。
【表１】
0006433480.tif 000002
【０１６１】
代表的なＨＬＡ−Ａ結合タンパク質の標的部位の配列を、表２に開示する。表２は、示されたジンクフィンガータンパク質の標的配列を示す。ＺＦＰ認識らせんにより接触された標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示し、非接触ヌクレオチドは小文字で示す。
【表２】
0006433480.tif 000003
【０１６２】
細胞培養
１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｌｏｎｚａ）および２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ−１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）を補ったダルベッコ修飾イーグル培地（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）中に、ＨＥＫ２９３細胞を維持した。１０％熱不活性化ＦＢＳおよび２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）中に、ＥＢＶ−ＬＣＬ、７２１．２２１およびＥＬ−４細胞株を維持した。これらの細胞株の同一性を、ＳＴＲ  ＤＮＡフィンガープリンティングにより確認した。ｍＨＡｇについて特異的なＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１において、ＰＡＮＥ１転写物によってコード化されたペプチドＲＶＷＤＬＰＧＶＬＫ（配列番号１）を認識するクローン７Ａ７（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７（９）：３７７９−３７８６）、およびＣ１９ＯＲＦ４８中でＯＲＦ＋２／４８からＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＩＰＰＤＳＬＬＦＰＡ（配列番号２、ＮＭ＿１９９２５０．１の代替オープンリーディングフレーム）ペプチドを認識するクローンＧＡＳ２Ｂ３−５（Ｔｙｋｏｄｉら（２００８）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（１６）：５２６０−５２６９）であった。ＣＴＬクローンを、５１クロム放出アッセイの１日前に解凍し、１０％ヒトアルブミン血清、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）、および２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ、エメリービル、ＣＡ）を補ったＲＰＭＩ１６４０に維持した。
【０１６３】
ＯＫＴ３が負荷された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）による初代Ｔ細胞の活性化
１：１の比（Ｔ細胞：２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンおよび５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０中のγ−照射（１００Ｇｙ）ａＡＰＣ）（ａＡＰＣの添加の次の日から始め、１日おきに添加）のａＡＰＣ（クローン＃４：ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌを安定に共発現するように遺伝的に修飾されたＫ５６２細胞、およびＥＧＦＰ１７で同調的に発現されたインターロイキンＩＬ−１５の膜結合型突然変異タンパク質（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら（２０１２）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ２：２４９、Ｍａｎｕｒｉら（２０１０）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ２１（４）：４２７−４３７）参照）上に前負荷されたＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）でＰＢＭＣを刺激することによって、インビトロでＣＤ３を架橋することにより、Ｔ細胞（ＣＡＲｎｅｇ）を持続的増殖のために活性化した。ＯＫＴ３負荷ａＡＰＣを、１４日毎に再添加し、Ｔ細胞増殖を持続させた。
【０１６４】
遺伝的に修飾されたＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生成およびＣＤ１９＋ａＡＰＣ上での増殖
臨床グレードのＣＡＲ＋Ｔ細胞を製造する我々のアプローチを、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞を生成するように適合させた（例えば、Ｓｉｎｇｈら（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８（８）：２９６１−２９７１参照）。ＳＢトランスポゾンＣＤ１９ＲＣＤ２８およびＳＢ機能亢進トランスポゼースＳＢ１１をコード化するＤＮＡプラスミドを、ヌクレオフェクターＩＩデバイス（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞に、同時に電気泳動転写した（ヒトＴ細胞ヌクレオフェクター溶液、プログラムＵ−０１４）。５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（ａＡＰＣの添加の次の日から始め、１日おきに添加）の存在下、γ−照射（１００Ｇｙ）ａＡＰＣ（ＯＫＴ３負荷のないクローン＃４）を、エレクトロポレーションを行った日に加え、１４日毎（Ｔ細胞：ａＡＰＣの比１：２）に再添加することによって、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の集団を、選択的に数値的に拡張した。
【０１６５】
メッセンジャーＲＮＡのインビトロでの転写
インビトロで転写されたｍＲＮＡ種を、先にＴｏｒｉｋａｉら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１１９（２４）：５６９７−５７０５に記載されるように調製した。簡単にいうと、ＺＦＮ−ＬおよびＺＦＮ−Ｒをコード化するＤＮＡテンプレートプラスミドを、ＸｈｏＩで直線化した。製造者の指示に従って、インビトロで転写（ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７、Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）およびキャッピング（ＡＲＣＡキャップ類縁体、Ａｍｂｉｏｎ、オースチン、ＴＸ）の後、ポリアデニンを、ポリＡテーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して加えた。ｍＲＮＡ種の完全性を、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液を用いて、変性１％アガロースゲル上で検証し、分光光度計（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によってＯＤ２６０で濃度を測定した。ｍＲＮＡを、１回の使用のためにバイアルに入れ、−８０℃で保存した。
【０１６６】
ＺＦＮをコード化するＤＮＡプラスミドおよびｍＲＮＡ種の電気泳動転写
ＨＥＫ２９３細胞の修飾のために、ＨＬＡ−Ａ標的ＺＦＮをコード化する発現ベクターを、製造者のプロトコルを使用して、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）により導入した。最初の刺激から６日後、またはγ−照射ａＡＰＣによる再刺激から２〜３日後にＴ細胞を採取した。５００万個のＴ細胞を、１００μＬのヒトＴ細胞ヌクレオフェクター溶液（Ｌｏｎｚａ）中のＺＦＮ−ＬおよびＺＦＮ−Ｒ  ｍＲＮＡ種のそれぞれ２．５〜１０μｇと予備混合し、プログラムＴ−２０で、ヌクレオフェクターＩＩデバイスを用いてキュベットでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの後、予備的に暖めた、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０に細胞を直ちに置き、３７℃および５％ＣＯ２で４〜６時間培養し、この時点で、さらなる培養のために５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を加えた。「低温ショック」実験で、３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターでの一晩の培養の後、Ｔ細胞を３０℃、５％ＣＯ２インキュベーターに移し、３日間培養し、次いで、分析前に３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻した。
【０１６７】
ＨＬＡ−Ａの発現が欠如した細胞の濃縮
２％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡを補ったリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄した後、４℃で１５分間、該細胞を、ＰＥ結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）特異的抗ＨＬＡ−Ａ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）で標識化し、洗浄し、１０分間、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、ＣＡ）で標識化した。洗浄後、標識化細胞をＬＤカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に通し、通過画分を集め、培養した。Ｔ細胞を、γ−照射ＯＫＴ３負荷ａＡＰＣで増殖させ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンおよび５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（１日おきに添加）を含む１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０中、ＣＤ１９＋ａＡＰＣ（ＯＫＴ３を負荷せず）で、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を増殖させた。
【０１６８】
フローサイトメトリー
以下の抗体を使用した。フィコエリトリン（ＰＥ）抗ＨＬＡ−Ａ２（クローンＢＢ７．２）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８（クローンＨＩＴ８ａ）、ＰＥおよびＡＰＣ抗ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＰＥ抗ＣＤ５６（クローンＢ１５９）、ＰＥ抗ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＧ４６−６）、ＰＥマウスＩｇＧ２ｂγ、ＰＥマウスＩｇＧ２ａκ、ＦＩＴＣ非特異的マウスＩｇＧ１、第２試薬ストレプトアビジンＰＥ（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、ビオチン結合抗ＨＬＡ−Ａ３（クローン４ｉ１５３）、ＡＰＣ抗ＨＬＡ−Ｇ（クローンＭＥＭＧ１９）、ＰＥ抗ＨＬＡクラスＩ（クローンＷ６／３２、Ａｂｃａｍから、ケンブリッジ、ＭＡ）およびＰＥ抗ＨＬＡ−Ｅ（クローン３Ｄ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ）。Ａｌｅｘａ４８８結合抗ＣＤ１９ＲＣＤ２８  ＣＡＲ抗体（クローン番号１３６−２０−１）を我々の実験室で生成した。ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、分析物から死んだ細胞を除外した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔバージョン３．３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．１（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、アシュランド、ＯＲ）によって分析した。
【０１６９】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイ
ＺＦＮトランスフェクト細胞における、ＨＬＡ−Ａ遺伝子配列の修飾のレベルを、Ｇｕｓｃｈｉｎら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ６４９：２４７−２５６に記載するような、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイによって測定した。簡単にいうと、ＺＦＮ修飾細胞からのゲノムＤＮＡを、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３遺伝子座内のＺＦＮ標的領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲに供した。変性および再アニーリング後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒエンドヌクレアーゼ（Ｃｅｌ−１）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、オマハ、ＮＥ）を使用してヘテロ２本鎖ＤＮＡ生成物を切断し、突然変異事象の証拠であると解釈された、ポリアクリルアミドゲル上の高速バンドを明らかにした。標的修飾のパーセントを、デンシトメトリーにより定量した。標的遺伝子座の増幅のために使用したＰＣＲプライマーは、以下の通りであった。
ＨＬＡ−Ａ３  Ｆｏｒｗａｒｄ；５’−ＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＡ−３’；（配列番号７）
ＨＬＡ−Ａ３  Ｒｅｖｅｒｓｅ；５’−ＣＣＧＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＣＧ−３’（配列番号８）
ＨＬＡ−Ａ２  Ｆｏｒｗａｒｄ；５’−ＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番号９）
ＨＬＡ−Ａ２  Ｒｅｖｅｒｓｅ；５’−ＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１０）
ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース、例えば、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ受入番号；ＨＬＡ−Ａ２：ＨＬＡ００００５、ＨＬＡ−Ａ３：ＨＬＡ０００３７から得た。
【０１７０】
５１クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）
標的細胞を、０．１ｍＣｉの５１Ｃｒで２時間標識化した。１０％ＦＢＳを補った氷冷ＲＰＭＩ１６４０で標識化細胞を３回洗浄した後、これを希釈し、９６ウェルｖ字型底プレートの各ウェルに、１００μＬ中１０３個の標的細胞で分配した。標的細胞を、ペプチド滴定アッセイで、室温で３０分、ペプチドの１０倍の段階希釈でインキュベートした。ＣＴＬを、示されたエフェクターで標的比で加えた。５％ＣＯ２中３７℃での４時間のインキュベーションの後、５０μＬの細胞のない上澄みを集め、ＴｏｐＣｏｕｎｔデバイス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、シェルトン、ＣＴ）で計数した。すべてのアッセイは、３回行った。あるアッセイでは、アッセイの前に、親ＨＥＫ２９３細胞株およびＨＬＡ−Ａ修飾ＨＥＫ２９３クローンを、６００ＩＵ／ｍＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）および１０ｎｇ／ｍＬの組織壊死因子−α（ＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で４８時間処理した。特異的溶解パーセントを以下のように計算した。
（（実験ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自然ｃｐｍ））×１００
７２１．２２１細胞上での非古典的ＨＬＡのＮＫ細胞単離および強制発現
【０１７１】
製造者の指示に従って、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）およびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、ＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。ＳＢトランスポゾンＨＬＡ−Ｅ（受入番号００５５１６）および／またはＨＬＡ−Ｇ（受入番号ＮＭ＿００２１２７）をコード化するＤＮＡプラスミドを、ＳＢ１１トランスポゼースで、ＡｍａｘａヌクレオフェクターＩＩデバイス（プログラム：Ａ−０１６）によって、親ＨＬＡクラスＩｌｏｗ７２１．２２１細胞に共エレクトロポレートした。蛍光結合ｍＡｂ［ＰＥ抗ＨＬＡ−Ｅ、ＡＰＣ抗ＨＬＡ−ＧおよびＰＥ抗ＨＬＡ−Ｇ（クローン８７Ｇ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）］および常磁性ビーズ［抗ＰＥマイクロビーズおよび抗ＡＰＣマイクロビーズ（ｃａｔ＃１３０−０４８−８０１、１３０−０９０−８５５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）］によって、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ陽性細胞を選別した後、導入ＨＬＡ分子の安定で均質な発現を示すＨＬＡ−Ｅ＋およびＨＬＡ  Ｇ＋クローンを、限界希釈により誘導した。７２１．２２１クローンのＮＫ細胞の死滅を４時間のＣＲＡにより査定し、データの統計的有意差を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、ＣＡ）を用いた、一元配置分散分析、次いでＴｕｋｅｙの多重比較法によって計算した。
【０１７２】
ｈＥＳＣの培養および分化
ｈＥＳＣ株ＷＩＢＲ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ケンブリッジ、ＭＡ）２２を、先に記載するように（Ｓｏｌｄｎｅｒら（２００９）Ｃｅｌｌ１３６（５）：９６４−９７７）、ｈＥＳＣ培地［１５％ＦＢＳ、５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％の非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）および４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中のマイトマイシンＣ不活化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層上に維持した。標的化ｈＥＳＣを、先に記載するように（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ３（３）：３４６−３５３）線維芽細胞様細胞に分化させた。簡単にいうと、１５％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ培地中の非付着性懸濁培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ＮＹ）で５日間、胚様体（ＥＢ）形成により、分化を誘発した。続いてＥＢを付着組織培養皿に載せ、実験を始める前に、初代線維芽細胞プロトコルに従って、トリプシンを使用して少なくとも４つの通路に関して通過させた。
【０１７３】
ｈＥＳＣのＺＦＮ媒介ゲノム編集
エレクトロポレーションの２４時間前に、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ケンブリッジ、ＭＡ）で、ＨＥＳＣを培養した。０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を採取し、ＰＢＳに再懸濁した。ＨＬＡ−Ａ２４の仮想ＺＦＮ結合領域に相同な５’および３’アームに隣接するホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのコントロール下、ピューロマイシン耐性遺伝子をコード化するドナープラスミド３５μｇおよび７．５μｇの各ＺＦＮコード化プラスミドで、または３５μｇのドナープラスミドおよび１０μｇの各ＺＦＮコード化ｍＲＮＡで、１０００万個の細胞をエレクトロポレートした（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ：２５０Ｖ、５００μＦ、０．４ｃｍキュベット）。次いで、ＲＯＣＫ阻害剤を補ったｈＥＳＣ培地中のＤＲ４  ＭＥＦ支持細胞層で最初の２４時間、細胞を平板培養した。エレクトロポレーションから７２時間後、ピューロマイシン選択（０．５μｇ／ｍｌ）を開始した。エレクトロポレーションから１０〜１４日後に、個々のピューロマイシン耐性コロニーを選び取り、拡張した。正しい標的化および遺伝子破壊を、サザンブロット分析およびゲノム遺伝子座の配列決定によって検証した。
【０１７４】
実施例２：複数の内因性ＨＬＡ−Ａ遺伝子を標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼの設計および検証
ＺＦＮを、内因性ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のゲノムコード化配列（例えば、米国特許公開公報第２０１２／００６０２３０号の表２参照）内の既定義の部位を開裂するように設計した。ヒト細胞におけるこれらのＺＦＮの発現は、標的化ＨＬＡ遺伝子座のリーディングフレームの破壊をもたらす、導入された２本鎖切断の謝りがちな修復によって、ＨＬＡ−Ａ分子の発現を排除するはずである。これらのＺＦＮのＨＬＡ−Ａ発現を妨害する能力を評価するため、我々は、最初に、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１（ＨＬＡ−Ａ３）およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＨＬＡ−Ａ２）を共発現する、ヒト胚腎臓細胞株ＨＥＫ２９３を使用した。実施例１に記載したように、ＺＦＮをコード化する発現プラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした後、対立遺伝子特異的ＰＣＲおよびＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを用いて、予測されるＺＦＮ標的部位で、遺伝子修飾のレベルを定量化した。
【０１７５】
図１に示すように、ＨＬＡ−Ａ３遺伝子座の約１０％の修飾およびＨＬＡ−Ａ２遺伝子座の約６％の修飾が、修飾されたＨＬＡ−Ａ標的化ＺＦＮであった。
【０１７６】
実施例３：ＨＬＡ−ＡｎｅｇＨＥＫ２９３細胞の単離および機能的検証
ＨＬＡ−Ａの発現を妨害する影響を査定するために、限界希釈を使用して、ＺＦＮ修飾ＨＥＫ２９３細胞プールから単細胞クローンを得た。翻訳の早期終結に導くフレークシフトを起こす、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３または両対立遺伝子における予測されるＺＦＮ結合部位内で小さな挿入または削除を持つクローンを、配列決定により明らかにした。ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＬＡ−Ａ発現の定常レベルは、ＥＢＶトランスフォームリンパ芽細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）のような造血細胞と比べて低いので、ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＬＡレベルを増大させることが知られている前炎症性サイトカインに暴露した。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（４）：１８９４−１９０２参照。
【０１７７】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および組織壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の添加により、親ＨＥＫ２９３細胞において、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３の両方の発現が増加した（図２Ａ、上のパネル）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ２および／またはＨＬＡ−Ａ３に突然変異を持つＺＦＮ処理ＨＥＫ２９３クローンは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αによる誘発後であっても、これらのタンパク質を発現しなかった（図２Ａ、下３つのパネル）。したがって、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３に特異的なｍＡｂを使用するフローサイトメトリーにより、細胞表面でのＨＬＡ−Ａ発現の対立遺伝子特異的欠失が確認された。
【０１７８】
次に、ＺＦＮ修飾クローン上のＨＬＡ−Ａ発現の欠失がＴ細胞認識を妨げるかどうかについて尋ね、これを、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ａ２制限細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンを使用して試験した。予想通り、ＨＬＡ−Ａ３制限ＣＤ８＋ＣＴＬクローン７Ａ７は、１ｎｇ／ｍＬのパルス同族ペプチドで、観察された５０％最大溶解で、同族ペプチド（ＲＶＷＤＬＰＧＶＬＫ、配列番号１、ＮＰ＿００１１０３６８５）の段階希釈で負荷されたＨＬＡ−Ａ３＋親ＨＥＫ２９３細胞の頑強な特異的溶解を示した。（図２Ｂ、上のパネル）。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子の発現は失われているが、ＨＬＡ−Ａ３で野生型であるＨＥＫ２９３クローン８．１８も、このＨＬＡ−Ａ３制限ＣＴＬクローンによって溶解した。対照的に、同じペプチドでパルスすると、ＨＬＡ−Ａ３発現をしないように編集されたＨＥＫ２９３クローン１８．１は、ＨＬＡ−Ａ３制限ＣＴＬクローン７Ａ７によって溶解せず、ＨＬＡ−Ａ２／Ａ３ダブルノックアウトＨＥＫ２９３クローン８３によっても溶解しなかった（図２Ｂ、上のパネル）。ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローンＧＡＳ２Ｂ３−５の細胞溶解性活性も評価したところ、親ＨＥＫ２９３細胞またはＨＬＡ−Ａ２野生型クローン１８．１とともに提示された時に頑強な致死活性が観察され、一方ＺＦＮ修飾ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＨＥＫ２９３クローン８．１８およびＨＬＡ−Ａ２／Ａ３ダブルノックアウトクローン８３は、溶解しなかった（図２Ｂ、下のパネル）。
【０１７９】
これらのデータは、ＺＦＮでの処置が、完全にＨＬＡ−Ａの発現を排除し、内因性ＨＬＡ−Ａ発現を上方制御する炎症誘発性条件下であっても、ＨＬＡ−Ａ制限ＣＴＬ媒介致死からの保護をもたらすことを示す。
【０１８０】
実施例４：ＨＬＡｎｕｌｌ細胞に対するＮＫ細胞媒介溶解は、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇの強制発現により防止することができる。
我々は、抗体系細胞選別を組み合わせたＺＦＮ標的ＨＬＡクラスＩ遺伝子を使用する本明細書で略述するアプローチを、最終的にはＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ発現の排除に使用することができることを予想する。致死抑制受容体（ＫＩＲ）の主リガンドとして知られている、古典的ＨＬＡ発現のない細胞、とりわけＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃは、ＫＩＲおよびそのリガンドの間の相互作用の欠失によって根絶されうる。Ｐａｒｈａｍら（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（３）：２０１−２１４。ＮＫ細胞媒介細胞毒性を減らせるかどうかを試験するため、ＮＫ細胞媒介細胞毒性を減らすことが示され（Ｂｏｒｒｅｇｏら（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７（５）：８１３−８１８、Ｒｉｔｅａｕら（２００１）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２）：１９３−２０１、Ｒｏｕａｓ−Ｆｒｅｉｓｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９４（１０）：５２４９−５２５４、Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１（６６６９）：７９５−７９９）、古典的ＨＬＡ分子よりはるかに多形性の低い、非古典的ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇ分子を、ＨＬＡクラスＩ低細胞株７２１．２２１（図３Ａ）に導入し、ＮＫ細胞による殺害に対するこれらの感受性を評価した。
【０１８１】
ＰＢＭＣから直接単離されたＮＫ細胞のフローサイトメトリー分析は、９４％を超える純度（ＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３ｎｅｇ集団）（図４Ａ）、および９０％を超える遺伝的に修飾された７２１．２２１クローンにおけるＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇ発現（図４Ｂ）を示した。７２１．２２１でのＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇの強制発現により、これらの標的細胞のＮＫ細胞媒介溶解が有意に防がれたことを実証した（図４Ｃ）。
【０１８２】
これは、レシピエントＮＫ細胞によって投与されたＨＬＡｎｅｇ同種異系細胞の除去を未然に防ぐことに対する解決策を提供し、したがって、免疫導入遺伝子の導入を避けることによって、完全ＨＬＡクラスＩを、ヒトへの適用が可能なノックアウトにする。
【０１８３】
実施例５：「ヒットエンドラン」方策を使用する初代Ｔ細胞におけるＨＬＡ−Ａ遺伝子の破壊
臨床的に関連する初代細胞に対する我々の結果を拡張するために、ヒトＴ細胞において、ＨＬＡ−Ａ特異的ＺＦＮの活性を評価した。ＺＦＮは、所望の標的遺伝子の安定な破壊を達成するために一時的発現しか必要としないので、ＺＦＮをインビトロ転写ｍＲＮＡから一時的に発現させた。ＨＬＡ−Ａ２ホモ接合ドナーからＰＢＭＣにＺＦＮをコード化するｍＲＮＡの電気泳動転写（ＨＬＡ−Ａ２は、白人において最も一般的なＨＬＡ−Ａ対立遺伝子である。例えば、Ｍｏｒｉら（１９９７）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６４（７）：１０１７−１０２７参照）により、これらのＴ細胞ＨＬＡ−Ａ２の約１９％をネガティブとした（図５Ａ、上のパネル）。我々は、トランスフェクション後にインキュベーション温度を一時的に下げることでＺＦＮ活性を増加させることができることを先に実証した。米国特許公開公報第２０１１／０１２９８９８号参照。
【０１８４】
エレクトロポレートされた初代Ｔ細胞を一過性体温低下に供することで、ｍＲＮＡ用量依存的様式で、ＨＬＡ−Ａ２ネガティブ細胞の割合が、最大５７％だけ上昇した（図５Ａ、下のパネル）。
【０１８５】
実施例６：初代Ｔ細胞における臨床的に適切なレベルでのＨＬＡ−Ａ破壊の達成
ＨＬＡ標的ＺＦＮの臨床適用のために、ホモ２量体化３３を妨げることによって、オフターゲット開裂事象の可能性を減少させるように設計された「ハイファイ」偏性ヘテロ二量体Ｆｏｋ  ＩドメインＥＬ／ＫＫの使用を評価した。ＺＦＮ−ＬおよびＺＦＮ−ＲのＥＬ／ＫＫ  ＺＦＮ変異体をコード化するｍＲＮＡの使用により、ｍＲＮＡの用量を制限（各ＺＦＮで２．５μｇ）したにもかかわらず、５２％までのＴ細胞集団でＨＬＡ−ＡｎｅｇＴ細胞が顕著に増加し、ＨＬＡ−Ａ発現が排除される結果となった（図５Ｂ）。
【０１８６】
抗体で被覆した常磁性ビーズでのＨＬＡ−ＡポジティブＴ細胞欠乏の１ラウンドは、ＣＤ４またはＣＤ８発現に影響を及ぼすことなく、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞画分を、集団の９５％超に容易に増加させた（図６Ａ）。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ（図６Ｂ）によるこのＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ集団の分析および直接ＤＮＡ配列決定（図６Ｃ）により、ＺＦＮによって標的化された領域内のＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子の１００％に近い編集が正確に明らかになった。
【０１８７】
これらのデータを合わせると、ＺＦＮ駆動型ゲノム編集は、ＨＬＡネガティブ初代Ｔ細胞集団を迅速に生成できることを実証する。
【０１８８】
実施例７：特異性を再指向するように遺伝的に修飾されたＴ細胞におけるＨＬＡ−Ａ遺伝子の破壊
ＨＬＡ編集の潜在的有用性を実証するために、次に、ＨＬＡ発現の排除の後、同種異系設定において広く使用することができ、すなわち、ＨＬＡ認識３４とは無関係に腫瘍関連抗原に対して特異性を再指向する、「普遍的」キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に修飾された細胞障害性Ｔ細胞である、細胞の特異的クラスに焦点を当てた。実際、我々および他の者は、現在、ＣＤ１９＋悪性腫瘍の研究的処置のために、患者特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞に熱意を注いでいる（例えば、Ｋａｌｏｓら（２０１１）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ３（９５）：９５ｒａ７３、Ｐｏｒｔｅｒら（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３６５（８）：７２５−７３３参照）。近年、我々は、内因性αβＴＣＲ発現を排除するためにＺＦＮを使用すると、ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、ＣＤ１９に対する再指向特異性を保持することを発表した（Ｔｏｒｉｋａｉら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１１９（２４）：５６９７−５７０５およびＰｒｏｖａｓｉら（２０１２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ１８（５）：８０７−１５）。実際に、そのようなＴＣＲ編集Ｔ細胞は、インビボで、向上した効力および安全性の両方（ＧＶＨＤ）を示した。
【０１８９】
「既製」Ｔ細胞治療を造る我々の能力についてさらに述べると、ＺＦＮが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するように先に遺伝子工学的に操作された初代Ｔ細胞から、ＨＬＡ−Ａ発現を排除することができるかどうかを調べた。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン／トランスポゼースシステム由来のＤＮＡプラスミドの同期的電気泳動転写、次いでＣＤ１９＋ａＡＰＣ、クローン＃４３９での選択的増殖によって遺伝的に修飾されたＰＢＭＣは、９０％を超えるＴ細胞において、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９ＲＣＤ２８という）の発現をもたらした。これらのＳＢおよびａＡＰＣプラットフォームは、我々によって、４つの臨床試験（ＩＮＤ＃１４１９３、１４５７７、１４７３９および１５１８０）において、ヒト適用のために適合させられた。
【０１９０】
続いて、ＨＬＡ−Ａ  ＺＦＮの偏性ヘテロ二量体変異体をコード化するインビトロ転写ｍＲＮＡで、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をエレクトロポレートした。ＺＦＮ処理は、選択無しで約２２％のＣＡＲ＋Ｔ細胞において、ＨＬＡ−Ａ２発現をうまく妨害し、この集団は、ＨＬＡポジティブ細胞に関するネガティブ選択によって、約９９％のＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ細胞に簡単に濃縮された。（図６Ａ）。ＣＤ１９＋ａＡＰＣでの５０日間の連続共培養後、約９４％のＣＡＲ＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇに残存したので、これらの細胞は、新しい表現型を維持することが示された。これらのＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬによる攻撃を避け（図６Ｂ）、ＣＤ１９＋腫瘍標的のＣＡＲ依存性溶解により証明されたように、その抗腫瘍活性を維持した（図６Ｃ）ことは重要である。
【０１９１】
概して、これらのデータは、ＣＡＲ再指向腫瘍特異的Ｔ細胞が、ＺＦＮによって遺伝的に修飾され、ＨＬＡ−Ａ発現を排除することができることを実証する。そのようなＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞には、１つのドナーから予備的に調製し、要求に応じて複数のレシピエントに注入することができる「既製」の腫瘍特異的Ｔ細胞を可能にする可能性がある。
【０１９２】
実施例８：ｈＥＳＣにおけるＨＬＡ−Ａ遺伝子の破壊
組織再生を始めとする治療適用のための同種異系細胞の適用を広げるため、Ｔ細胞認識を回避しうるｈＥＳＣを生成しようと試みた。当然、すべてのｈＥＳＣは、潜在的レシピエントに関して同種異系であり、分化の際に、ＨＬＡ４０の発現を上方制御するであろう。ＨＬＡ−ＡｎｅｇｈＥＳＣの生成のためのＺＦＮの使用を試験するために、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を標的化するＺＦＮをコード化するｍＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドのいずれかで、ＨＬＡ−Ａ２＋／Ａ２４＋ｈＥＳＣ株ＷＩＢＲ３を遺伝的に修飾した。ＨＬＡ−ＡｎｅｇｈＥＳＣの生成を促進するため、相同組換え修復によって標的組込みを媒介するＺＦＮ標的部位を取り巻く相同性の領域に隣接するピューロマイシン耐性遺伝子をコード化するドナーＤＮＡプラスミドを共送達した。ドナー相同性アームの外側に位置するプローブを使用して、ＺＦＮ標的領域のＰＣＲ配列決定、および標的化領域のサザンブロット分析によって、ピューロマイシン耐性クローンを、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の修飾についてスクリーニングした。これらのクローンは、両ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子においてＺＦＮ標的領域内に突然変異を含有しており、非修飾親ｈＥＳＣ株とともに線維芽細胞様細胞に分化した。ＨＬＡ発現は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを用いる処理によって誘発され、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４を認識する抗体を用いるフローサイトメトリーにより分析された。
【０１９３】
親細胞株は、両ＨＬＡ対立遺伝子の強い発現を示したが、３種のノックアウト株はすべて、両ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の細胞表面発現を欠いていた（図７）。これらのデータは、移植後細胞残存のために必要なステップでありうる、ｈＥＳＣへのＨＬＡ−Ａノックアウトアプローチの移行性を実証する。
【０１９４】
本明細書に記載するすべての特許、特許出願および公報は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
開示を、理解を明確にする目的で、説明および例示のために、若干詳細に提供したが、本開示の精神または範囲を逸脱しない限り、種々の変更および修飾をなしうることが、当業者には明らかであろう。したがって、先に記載した開示および例示は、限定するものであるとは解釈されるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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