(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性の一価のＦｃダイアボディであって、前記二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢのエピトープおよびＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合することができ、かつＩｇＧのＦｃドメインを保有しており、前記二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖を含み、前記第一のポリペプチド鎖および前記第二のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、前記第一のポリペプチド鎖および前記第三のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、かつ：
Ａ．前記第一のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）システイン含有ペプチド（配列番号１）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含むドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって：
（１）ＣＤ３２Ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号１１）を含むサブドメイン（２Ａ）；および
（２）ＣＤ７９ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）（配列番号１４）を含むサブドメイン（２Ｂ）；
を含んでおり、前記サブドメイン（２Ａ）および（２Ｂ）が、ペプチドリンカー（リンカー２）（配列番号４）によって相互に隔てられているドメイン２と；
ｉｉｉ．ドメイン３であって、前記ドメイン３は、Ｅ−コイルドメイン（配列番号７）またはＫ−コイルドメイン（配列番号８）であり、前記ドメイン３は、前記ドメイン２からペプチドリンカー（配列番号５）によって隔てられているドメイン３と；および
ｉｖ．Ｃ末端スペーサーペプチド（配列番号６）と；
を含み；
Ｂ．前記第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ７９ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）（配列番号１３）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＣＤ３２Ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号１２）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含んでおり、前記サブドメイン（１Ａ）および（１Ｂ）が、ペプチドリンカー（リンカー２）（配列番号４）によって相互に隔てられているドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって、前記ドメイン２は、Ｋ−コイルドメイン（配列番号８）またはＥ−コイルドメイン（配列番号７）であり、前記ドメイン２は、前記ドメイン１からペプチドリンカー（配列番号５）によって隔てられており；かつ前記第一のポリペプチド鎖の前記ドメイン３と、前記第二のポリペプチド鎖の前記ドメイン２は、両方Ｅ−コイルドメインでも、両方Ｋ−コイルドメインでもないドメイン２と；
を含んでおり；ならびに
Ｃ．前記第三のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン１を含み、前記ドメイン１は：
（１）システイン含有ペプチド（配列番号１）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有するＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み；かつ：
（ａ）前記第一のポリペプチド鎖および前記第三のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインの前記ポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し；
（ｂ）前記第一のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメインおよび前記第二のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインが、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成し；および
（ｃ）前記第一のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインおよび前記第二のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメインが、ＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成する、二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項２】
前記第一のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）が、前記第三のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）の配列とは異なる配列を含む、請求項１に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項３】
前記第一のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）が、配列番号９のアミノ酸配列を有し、前記第三のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項４】
前記第一のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）が、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、前記第三のポリペプチド鎖の前記サブドメイン（１Ｂ）が、配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項５】
前記第一のポリペプチド鎖の前記ドメイン１および／または前記第三のポリペプチド鎖の前記ドメイン１が、Ｆｃγ受容体に対する結合の変化を示す改変体ＣＨ２−ＣＨ３配列を含む、請求項１または２に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項６】
前記第一のポリペプチド鎖の前記ドメイン３が、Ｅ−コイル（配列番号７）を含み、かつ前記第二のポリペプチド鎖の前記ドメイン２が、Ｋ−コイル（配列番号８）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項７】
前記第一のポリペプチド鎖の前記ドメイン３が、Ｋ−コイル（配列番号８）を含み、かつ前記第二のポリペプチド鎖の前記ドメイン２が、Ｅ−コイル（配列番号７）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項８】
二重特異性の一価のＦｃダイアボディであって、前記二重特異性の一価のＦｃダイアボディが、ＣＤ３２ＢのエピトープおよびＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合することができ、かつＩｇＧのＦｃドメインを保有し、前記二重特異性の一価のＦｃダイアボディが：
（１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド鎖と；
（２）配列番号１６のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド鎖と；および
（３）配列番号１７のアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド鎖であって、前記第三のポリペプチド鎖のアミノ酸残基１〜１０が、ペプチド１（配列番号１）であり、前記第三のポリペプチド鎖のアミノ酸残基１１〜２２７が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（配列番号１０）であり；
前記第一のポリペプチド鎖および前記第二のポリペプチド鎖が第一のジスルフィド結合によって互いに共有結合され、前記第一のポリペプチド鎖および前記第三のポリペプチド鎖が第二のジスルフィド結合によって互いに共有結合される、二重特異性の一価のＦｃダイアボディ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディ、および生理学的に許容され得る担体を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項１０】
炎症性の疾患または状態を処置するための薬剤の製造における、請求項９に記載の薬学的組成物又は請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性の一価のＦｃダイアボディの使用。
【請求項１１】
前記炎症性の疾患または状態が自己免疫疾患である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記炎症性の疾患または状態が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願に対する相互参照］
本出願は、米国特許出願第号６１／８６４，２１７（２０１３年８月９日出願；係属中）；同第６１／８６６，４１６号（２０１３年８月１５日出願；係属中）；同第６１／８６９，５１９号（２０１３年８月２３日出願；係属中）；および同第６１／９０７，５２５号（２０１３年１１月２２日；係属中）に対して優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、書類及びコンピュータ可読媒体の両方において開示されており、上記書類及びコンピュータ可読型開示は、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
発明の背景：
発明の分野：
本発明は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む二重特異性の一価のダイアボディ（「二重特異性の一価のＦｃダイアボディ」）であって、３つのポリペプチド鎖から構成され、かつＣＤ３２Ｂのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合部位、およびＣＤ７９ｂのエピトープに特異的な１つの結合部位を保有するダイアボディ（すなわち、「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ」）に関する。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに対して同時に結合し得る。本発明は、このような組成物に、このような二重特異性の一価のＦｃダイアボディを含む薬学的組成物に、ならびに炎症性の疾患または状態、具体的には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および移植片対宿主病の処置におけるそれらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明：
Ｉ．Ｆｃγ受容体およびＣＤ３２Ｂ
抗体−抗原複合体と、免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性の細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒、および食作用のようなエフェクタ機能から、リンパ球増殖および抗体分泌の調節のような免疫調節性シグナルにおよぶ幅広い応答を生じる。全てのこれらの相互作用は、造血細胞上の特異的な細胞表面レセプターに対する抗体または免疫複合体のＦｃドメインの結合を通じて開始される。抗体および免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造的な不均質性に起因する。Ｆｃ受容体は、おそらく細胞内シグナル伝達を媒介する、構造的に関連するリガンド結合ドメインを共有する。
【０００５】
Ｆｃ受容体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのタンパク質のメンバーである。それらは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分に結合し得る表面糖タンパク質である。ファミリーの各々のメンバーは、Ｆｃ受容体のα鎖上の認識ドメインを通じて１つ以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。
【０００６】
Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンサブタイプに対するそれらの特異性によって規定される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６を参照）。
【０００７】
ＩｇＧ抗体に結合可能なＦｃ受容体は、「ＦｃγＲ」と呼ばれる。このファミリーの各々のメンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのＣ２−セット、単一膜貫通ドメイン、および可変長の細胞質内ドメインに関連する細胞外ドメインを保有している内在性膜糖タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と命名された３つの公知のＦｃγＲ類がある。この３つの受容体は、別個の遺伝子によってコードされているが、３つのファミリーのメンバーの間の広範な相同性から、それらのメンバーは、おそらく遺伝子重複によって共通の前駆体から生じたことが示唆される。
【０００８】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）タンパク質は、単量体のＩｇに対する低い親和性（１０６Ｍ−１）に起因して複合型のＩｇＧにのみ結合する、４０ＫＤａの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞および血小板を含む全ての造血細胞上に存在する、最も広範に発現されるＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖の中に２つだけ免疫グロブリン様領域を有し、したがって、ＦｃγＲＩよりもＩｇＧに関して親和性がかなり低い。３つのヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２Ｃ））があり、その全てが、凝集物または免疫複合体中でＩｇＧに結合する。
【０００９】
ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン内の明白な相違によって、レセプター連結に対する２つの機能的に異種の応答が生じる。基本的な相違は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合の際に、ＦｃγＲＩＩＡアイソフォームは、免疫系活性化（例えば、食作用、呼吸バーストなど）をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するのに対し、ＦｃγＲＩＩＢアイソフォームは、免疫系の抑制または阻害をもたらす（Ｂ細胞活性化の阻害など）シグナルを開始するということである。
【００１０】
このような活性化および阻害性のシグナルは両方とも、ＩｇＧのＦｃ領域に対する連結の後にＦｃγＲを通じて導入される。これらの全く正反対の機能は、異なるレセプターアイソフォームの間の構造的な相違に起因する。免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs：ＩＴＡＭｓ）または免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motifs：ＩＴＩＭｓ）と呼ばれる受容体の細胞質シグナル伝達ドメイン内の２つの別個のドメインが、異なる応答の原因である。これらの構造に対する異なる細胞質内の酵素の補充は、ＦｃγＲ媒介性の細胞性応答の転帰を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含むが、ＩＴＩＭ含有複合体は、ＦｃγＲＩＩＢしか含まない。
【００１１】
ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的な抗体架橋を介したＦｃγＲＩＩＡのクラスター形成は、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼとともにＩＴＡＭを凝集するように働く。ＩＴＡＭリン酸化は、その活性化が下流の基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）の活性化を生じる、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として働く。細胞活性化は、炎症促進性のメディエーターの放出につながる。
【００１２】
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現される。その細胞外ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡに対して９６％同一であり、区別できない方法でＩｇＧ複合体を結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲのこの阻害性のサブクラスを規定する。この阻害の分子的機序は確立されている。ＦｃγＲＩＩＢが、免疫複合体のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域を経由して活性化受容体に対して共連結する場合、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭは、リン酸化されて、イノシトールポリリン酸塩５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これが、ＩＴＡＭ含有、ＦｃγＲ媒介性チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果として細胞内Ｃａ++の流入を妨げる。従って、このようなＦｃγＲＩＩＢと活性化受容体の架橋は、活性化受容体の活性を抑制し、これによって細胞応答性を阻害する。従って、Ｂ細胞上では、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌は、抑制又は中止される。従って、抗原検出の発現の際、単量体のＩｇＧ抗原結合が生じ、結合した抗体のＦｃ領域は、活性化ＦｃγＲのＩＴＡＭに結合して、免疫系の活性化を媒介する。宿主の応答が進行するにつれて、ＦｃγＲＩＩＢに結合し得る（従って、このような複合体と活性化受容体とを共連結する）、多量体のＩｇＧ−抗原免疫複合体が形成され、これは免疫応答の抑制および最終的な休止をもたらす（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、特許文献３１、特許文献３２、特許文献３３、特許文献３４、特許文献３５、特許文献３６、特許文献３７、特許文献３８、特許文献３９、特許文献４０、特許文献４１、特許文献４２、特許文献４３、特許文献４４、特許文献４５、特許文献４６、特許文献４７、特許文献４８、特許文献４９、特許文献５０、特許文献５１、特許文献５２、特許文献５３を参照）。
【００１３】
ＩＩ．Ｂ細胞受容体およびＣＤ７９ｂ
Ｂ細胞は、抗体の産生を担う免疫系細胞である。抗原に応答するＢ細胞は、正常な免疫系の必須の構成要素である。Ｂ細胞は、特異的な細胞表面レセプター（Ｂ細胞受容体；「ＢＣＲ」）を保有する。Ｂ細胞が細胞のＢＣＲに結合し得る抗原に遭遇すると、Ｂ細胞は刺激されて増殖し、その結合した抗原に特異的な抗体を産生する。抗原に対する有効な応答を生じるために、ＢＣＲ関連タンパク質およびＴ細胞の支援もまた必要である。抗原／ＢＣＲ複合体は、内部移行されて、その抗原はタンパク質分解的にプロセシングされる。抗原の小さな部分は、Ｂ細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（「ＭＨＣ−ＩＩ」）分子と複合体を形成したままであり、ここでは、この複合体がＴ細胞によって認識され得る。そのような抗原提示によって活性化されたＴ細胞は、Ｂ細胞成熟を誘導する様々なリンホカインを分泌する。
【００１４】
ＢＣＲを通してのシグナル伝達は、抗体の産生において、自己免疫において、および免疫寛容の確立において重要な役割を果たす（非特許文献７）。骨髄中にまだ存在している間の自己抗原に結合する未成熟Ｂ細胞は、アポトーシスによって除去される。対照的に、成熟Ｂ細胞への抗原結合は、活性化、増殖、アネルギーおよびアポトーシスをもたらす。観察される特定の機能的応答は、Ｂ細胞が、他の表面受容体および活性化される特定のシグナル伝達経路を通じて補助刺激シグナルを受け取るか否かに依存する。
【００１５】
ＢＣＲは、ＣＤ７９の非共有結合したαサブユニットおよびβサブユニット（それぞれ「ＣＤ７９ａ」および「ＣＤ７９ｂ」）と一緒にＢＣＲ複合体を形成する、膜免疫グロブリンから構成される。ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂは、シグナル伝達のために必要とされる保存された免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含むシグナル伝達サブユニットである（非特許文献８；非特許文献９）。多価抗原によるＢＣＲ複合体の凝集は、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂＩＴＡＭのリン酸転移反応および受容体関連キナーゼの活性化を開始する（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。リン酸化されたＩＴＡＭは、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣ−γおよびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路のメンバーなどのさらなるエフェクタを補充する。これらのシグナル伝達事象は、Ｂ細胞増殖、および続くＴヘルパー（「Ｔｈ」）細胞との相互作用のためにＢ細胞をプライミングするのに必要とされる活性化マーカー（例えばＭＨＣＩＩおよびＣＤ８６）の発現増加の両方を担う。
【００１６】
ＩＩＩ．炎症性の疾患または状態
炎症とは、身体の白血球および化学物質が、細菌およびウイルスのような外来物質による感染から我々の身体を防御するプロセスである。炎症は通常、罹った領域の疼痛、腫脹、温覚および発赤によって特徴付けられる。サイトカインおよびプロスタグランジンとして公知の化学物質は、このプロセスを制御して、順序付けされ自己限定性のカスケードで血液または罹患した組織中に放出される。この化学物質の放出は、損傷または感染の領域への血流を増大して、発赤および温覚を生じ得る。いくつかの化学物質が、組織中への体液の漏出を生じ、これが腫脹を生じる。この防御プロセスは、神経を刺激して、疼痛を生じ得る。これらの変化は、関連する領域で限られた期間で生じる場合、身体にとって利点となる。
【００１７】
炎症性の疾患または状態は、身体自体の細胞および組織に対する免疫系の攻撃（すなわち、「自己免疫」応答）を反映する。異なる経路で身体に影響する多くの異なる自己免疫障害がある。例えば、脳は、多発性硬化症を有する個体で影響され、腸は、クローン病を有する個体において影響され、種々の関節の滑膜、骨および軟骨が、関節リウマチを有する個体において影響される。自己免疫障害は、１種以上の身体組織の破壊を進行させるので、臓器の異常な成長、または臓器機能の変化が生じ得る。自己免疫障害は、１つだけの臓器または組織種に影響する場合もあるし、または多数の臓器および組織に影響する場合もある。自己免疫障害によって一般に影響される臓器および組織としては、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば、甲状腺または膵臓）、筋肉、関節および皮膚が挙げられる。自己免疫障害の例としては、限定するものではないが、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、自己免疫内耳疾患、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、自己免疫肝炎、家族性腺腫様ポリープ、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００１８】
炎症性の疾患または状態はまた、身体の正常な防御免疫系が、存在すると身体に有益な外来の細胞または組織を攻撃することによって（例えば、移植片の拒絶（宿主対宿主の疾患））、または導入された移植片の免疫担当細胞による免疫抑制された宿主の細胞の拒絶から（移植片対宿主病）、損傷を生じる場合にも生じ得る（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。
【００１９】
このような疾患または状態の処置における近年の進歩にもかかわらず、炎症性の疾患または状態を処置または防止できる組成物の存在は要求され続けている。
【００２０】
ＩＶ．二重特異性ダイアボディ
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖上の可変ドメイン（すなわち、それぞれ、ＶＬドメインおよびＶＨドメイン）の存在に依存する。ダイアボディの設計は、単鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）に基づく（例えば、非特許文献１９；特許文献５４；特許文献５５；非特許文献２０；非特許文献２１；特許文献５６；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６を参照）。
【００２１】
抗体軽鎖および抗体重鎖の相互作用、特にそのＶＬドメインおよびＶＨドメインの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位の１つを形成する。対照的に、ｓｃＦｖ構築物は、単一のポリペプチド鎖に含まれる抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、該ドメインは、機能的なエピトープ結合部位への２つのドメインの自己アセンブリを可能にするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬドメインおよびＶＨドメインの自己アセンブリが、不十分な長さ（約１２アミノ酸残基未満）のリンカーに起因して不可能にされる場合、ｓｃＦｖ構築物の２つが互いに相互作用して、二価の分子を形成し、１つの鎖のＶＬドメインが、他方の鎖のＶＨドメインと会合する（非特許文献２７で概説される）。
【００２２】
天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合し得る（すなわち、単一特異性（mono-specific））が、それらの抗体は、その種の複数のコピーに結合してもよい（すなわち、二価または多価を示す）。本技術分野は、２つ以上の異なるエピトープ種に結合し得る（すなわち、二価または多価に加えて二重特異性または多重特異性を示している）という点で、このような天然の抗体とは異なるダイアボディを生じる能力に注目している（例えば、非特許文献１９；特許文献５４；特許文献５５；非特許文献２０；非特許文献２１；特許文献５６；非特許文献２８；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６を参照）。
【００２３】
単一特異性ではないダイアボディの提供によって、異なるエピトープを発現する細胞を共連結（co‐ligate）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って、二価のダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二価性によって、種々の用途におけるダイアボディの設計および加工の大幅な柔軟性を可能とし、多量体抗原に対するアビディティーの上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献２９）。特に重要なことは、異なる細胞の共連結、例えば、細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献３０および非特許文献３１）。
【００２４】
ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４等のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基も指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究では、エフェクタ細胞決定因子（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも見出された（非特許文献３１；非特許文献３２；特許文献５７；特許文献５８；特許文献５９；特許文献６０；特許文献６１）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を介したエフェクタ細胞への抗原結合抗体の結合により引き起こされる。従って、この点に関して、本発明のダイアボディ分子は、Ｆｃドメイン（例えば、本技術分野で公知のまたは本明細書に例示される任意のエフェクタ機能分析（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）により分析される）を有するか否かとは無関係にＩｇと同様の機能性を示し得る。腫瘍およびエフェクタ細胞を架橋することにより、ダイアボディは、エフェクタ細胞を腫瘍細胞に近接させるだけでなく、効果的な腫瘍の殺傷ももたらす（例えば、非特許文献３３を参照）。
【００２５】
しかし、上記の利点には著しく費用がかかる。このような単一特異性でないダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好なアセンブリを必要とする（すなわち、このような形成には、ダイアボディが異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体化を通じて形成される必要がある）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体化を通じて形成される単一特異性のダイアボディとは対照的である。単一特異性ではないダイアボディを形成するためには、少なくとも２つの異種のポリペプチド（すなわち、２つのポリペプチド種）を提供しなければならず、このようなポリペプチドのホモ二量体化は、不活性な分子をもたらすので（非特許文献２５）、このようなポリペプチドの産生は、同じ種のポリペプチドの間の共有結合を妨げるような方法で達成されなければならない（非特許文献２５）。したがって、本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合を教示している（例えば、非特許文献２２；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２１を参照）。
【００２６】
しかし、本技術分野において、非共有結合したポリペプチドから構成される二重特異性ダイアボディが、不安定であって、かつ非機能的な単量体に容易に分離することも広く認識されている（例えば、非特許文献２１を参照）。
【００２７】
この課題に直面して、本技術分野では、安定で共有結合したヘテロ二量体の非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば、特許文献５７；特許文献５８；特許文献５９；特許文献６０；特許文献６１；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６を参照）。このようなアプローチは、１つ以上のシステイン残基を、各々の使用されたポリペプチド種へ加工する工程を伴う。例えば、このような構築物のＣ末端へのシステイン残基の付加は、ポリペプチド鎖の間のジスルフィド結合を可能にして、二価分子の結合特性を妨害することなく、得られたヘテロ二量体を安定化することが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】米国特許第８，４４５，６４５号明細書
【特許文献２】米国特許第８，２１７，１４７号明細書
【特許文献３】米国特許第８，２１６，５７９号明細書
【特許文献４】米国特許第８，２１６，５７４号明細書
【特許文献５】米国特許第８，１９３，３１８号明細書
【特許文献６】米国特許第  ，１９２，７３７号明細書
【特許文献７】米国特許第８，１８７，５９３号明細書
【特許文献８】米国特許第８，１３３，９８２号明細書
【特許文献９】米国特許第８，０４４，１８０号明細書
【特許文献１０】米国特許第８，００３，７７４号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，９６０，５１２号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，７８６，２７０号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，６３２，４９７号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，５２１，５４２号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，４２５，６１９号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，３５５，００８号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１２／０２７６０９４号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１２／０２６９８１１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１２／０２６３７１１号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１２／０２１９５５１号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８１号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１２／０１４１４７６号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２０１１／０３０５７１４号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２０１１／０２４３９４１号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１０／０３２２９２４号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１０／０２５４９８５号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１０／０１９６３６２号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２０１０／０１７４０５３号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００９／０２０２５３７号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００９／０１９１１９５号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００９／００９２６１０号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２００９／００７６２５１号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２００９／００７４７７１号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２００９／００６０９１０号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２００９／００５３２１８号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２００９／００１７０２７号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２００９／００１７０２６号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２００９／００１７０２３号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２００８／０１３８３４９号明細書
【特許文献４０】米国特許出願公開第２００８／０１３８３４４号明細書
【特許文献４１】米国特許出願公開第２００８／０１３１４３５号明細書
【特許文献４２】米国特許出願公開第２００８／０１１２９６１号明細書
【特許文献４３】米国特許出願公開第２００８／００４４４２９号明細書
【特許文献４４】米国特許出願公開第２００８／００４４４１７号明細書
【特許文献４５】米国特許出願公開第２００７／００７７２４６号明細書
【特許文献４６】米国特許出願公開第２００７／００３６７９９号明細書
【特許文献４７】米国特許出願公開第２００７／００１４７９５号明細書
【特許文献４８】米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号明細書
【特許文献４９】米国特許出願公開第２００５／０２６０２１３号明細書
【特許文献５０】米国特許出願公開第２００５／０２１５７６７号明細書
【特許文献５１】米国特許出願公開第２００５／００６４５１４号明細書
【特許文献５２】米国特許出願公開第２００５／００３７０００号明細書
【特許文献５３】米国特許出願公開第２００４／０１８５０４５号明細書
【特許文献５４】米国特許出願公開第２００４／００５８４００号明細書
【特許文献５５】米国特許出願公開第２００４／０２２０３８８号明細書
【特許文献５６】国際公開第０２／０２７８１
【特許文献５７】国際公開第２００６／１１３６６５号パンフレット
【特許文献５８】国際公開第２００８／１５７３７９号パンフレット
【特許文献５９】国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレット
【特許文献６０】国際公開第２０１２／０１８６８７号パンフレット
【特許文献６１】国際公開第２０１２／１６２０６８号パンフレット
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】ラベッチ・ジェイ・ヴィ（Ravetch J. V.）ら、「エフシー・レセプターズ（Fc Receptors）」、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annual Review of Immunology）、１９９１年、第９巻、ｐ．４５７−９２
【非特許文献２】ガーバー・ジェイ・エス（Gerber J.S.）ら、「スティミュラトリー・アンド・インヒビトリー・シグナルズ・オリジネーティング・フロム・ザ・マクロファージ・エフシーガンマ・レセプターズ（Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcγ Receptors）」、マイクローブズ・アンド・インフェクション（Microbes and Infection）、２００１年、第３巻、ｐ．１３１−１３９
【非特許文献３】ビロドウ・ディー・ディー（Billadeau D. D.）ら、「アイティエーエムズ・バーサス・アイティーアイエムズ：ストライキング・エー・バランス・デュアリング・セル・レギュレーション（ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）２００２年、第２巻  第１０９号、ｐ．１６１−１６８１
【非特許文献４】ラベッチ・ジェイ・ヴィ（Ravetch J. V.）ら、「イムノ・インヒビトリー・レセプターズ（Immune Inhibitory Receptors）」、２０００年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２９０巻、ｐ．８４−８９
【非特許文献５】ラベッチ・ジェイ・ヴィ（Ravetch J. V.）ら、「アイジージー・エフシー・レセプターズ（IgG Fc Receptors）」、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annual Review of Immunology）２００１年、第１９巻、ｐ．２７５−９０
【非特許文献６】ラベッチ・ジェイ・ヴィ（Ravetch J. V.）「エフシー・レセプターズ：ルバー・ルダックス（Fc Receptors:Rubor Redux）」、セル（Cell）、１９９４年、第７８巻  第４号、ｐ．５５３−６０
【非特許文献７】ゴールド・エス・ビー（Gauld, S. B.）ら、「ビー・セル・アンチゲン・レセプター・シグナリング：ロールズ・イン・セル・デベロップメント・アンド・ディジーズ（B Cell Antigen Receptor Signaling: Roles In Cell Development And Disease）」、サイエンス（Science）２００２年、第２９６巻（５５７３号）、ｐ．１６４１−１６４２
【非特許文献８】ディルク・ジェイ（Dylke, J.）ら、「ロール・オブ・ザ・エクストラセルラー・アンド・トランスメンブラン・ドメイン・オブ・アイジーアルファ・ベータ・イン・アセンブリ・オブ・ザ・ビー・セル・アンチゲン・レセプター（ビー・シー・アール）（Role of the extracellular and transmembrane domain of Ig-alpha/beta in assembly of the B cell antigen receptor(BCR)）」、イムノロジー・レターズ（Immunology Letters）２００７年、第１１２巻、第１号、ｐ．４７−５７
【非特許文献９】カムビー・ジェイ・シー（Cambier, J. C.）「ニュー・ノーメンカルチャー・フォー・ザ・レス・モチーフ（New Nomenclature For The Reth Motif）（またはＡＲＨ１／ＴＡＭ／ＡＲＡＭ／ＹＸＸＬ）」、イムノロジー・トゥディ（Immunology Today）、１９９５年、第１６巻、ｐ．１１０
【非特許文献１０】デフランコ・エー・エル（DeFranco,A.L.）「ザ・コンプレキシティ・オブ・シグナリング・パスウェイズ・アクチベーティッド・バイ・ザ・ビーシーアール（The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR）」、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Current Opinion Immunology）１９９７年、９巻、ｐ．２９６−３０８
【非特許文献１１】クロサキ・ティー（Kurosaki, T.）「モレキュラー・メカニズム・イン・ビー・セル・アンチゲン・レセプター・シグナリング（Molecular Mechanisms In B-Cell Antigen Receptor Signaling）」、カレント・オピニオン・イン・イムノロジー（Current Opinion In Immunology）１９９７年、第９巻、ｐ．３０９−３１８
【非特許文献１２】キム・ケー・エム（Kim, K. M.）ら、「シグナリング・ファンクション・オブ・ザ・ビー・セル・アンチゲン・レセプターズ（Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors）」、イムノロジー・レビュー（Immunology Review）、１９９３年、１３２巻、ｐ．１２５−１４６
【非特許文献１３】デパオリ・エー・エム（DePaoli, A. M.）ら、「グラフト・バーサス・ホスト・ディジーズ・アンド・リバー・トランスプランテーション（Graft-Versus-Host Disease And Liver Transplantation）」、アナルズ・オブ・インターナル・メディスン（Annals of Internal Medicine）、１９９２年、第１１７巻、ｐ．１７０−１７１
【非特許文献１４】サドヒドラン・エス（Sudhindran,S.）ら、「トリートメント・オブ・グラフト・バーサス・ホスト・ディジーズ・アフター・リバー・トランスプランテーション・ウイズ・バシリキシマブ・フォロード・バイ・ボウル・レゼクション（Treatment Of Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation With Basiliximab Followed By Bowel Resection）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・トランスプランテーション（American Journal of Transplantation）、２００３年、第３巻、ｐ．１０２４−１０２９
【非特許文献１５】ポラック・エム・エス（Pollack, M. S.）ら、「シビア・レイト・オンセット・グラフト・バーサス・ホスト・ディジーズ・イン・ア・リバー・トランスプラント・レシピエント・ドキュメンテッド・バイ・キメリズム・アナライシス（Severe,Late-Onset Graft-Versus-Host Disease In A Liver Transplant Recipient Documented By Chimerism Analysis）」、ヒューマン・イムノロジー（Human Immunology）２００５年、第６６巻、ｐ．２８−３１
【非特許文献１６】ペリ・アール（Perri, R.）ら、「グラフト・ブイエス・ホスト・ディジーズ・アフター・リバー・トランスプランテーション：ア・ニュー・アプローチ・イズ・ニーデッド（Graft Vs. Host Disease After Liver Transplantation: A New Approach Is Needed）」、リバー・トランスプランテーション（Liver Transplantation）、２００７年、第１３巻、ｐ．１０９２−１０９９
【非特許文献１７】マワド・アール（Mawad, R.）ら、「グラフト・バーサス・ホスト・ディジース・プレゼンティング・ウイズ・パンサイトペニア・アフター・エン・ブロック・マルチオーガン・トランスプランテーション：ケース・レポート・アンド・リタラチャー・レビュー（Graft-Versus-Host Disease Presenting With Pancytopenia After En Bloc Multiorgan Transplantation: Case Report And Literature Review）」、トランスプランテーション・プロシーディングス（Transplantation Proceedings）、２００９年、第４１巻、ｐ．４４３１−４４３３
【非特許文献１８】アクブラット・エス（Akbulut, S.）ら、「グラフト・バーサス・ホスト・ディジーズ・アフター・リバー・トランスプランテーション：ア・コンプレヘンシブ・リタラチャー・レビュー（Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation: A Comprehensive Literature Review）」、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology）、２０１２年、第１８巻、第３７号、ｐ．５２４０−５２４８
【非特許文献１９】ホリガー（Holliger）ら、「『ダイアボディ』：スモール・バイバレント・アンド・バイスペシフィック・アンチボディ・フラグメンツ（‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）１９９３年、第９０巻、ｐ．６４４４−６４４８
【非特許文献２０】アルツ（Alt）ら、エフイービーエス・レターズ（FEBS Letters）、１９９９年、第４５４巻  第１〜２号、ｐ．９０−９４
【非特許文献２１】ルー・ディー（Lu, D.）ら、「ア・フリー・ヒューマン・リコンビネーション・アイジージー・ライク・バイスペシフィック・アンチボディ・ツー・ボース・ザ・エピダーマル・グロース・ファクター・レセプター・アンド・ザ・インスリン・ライク・グロース・ファクター・レセプター・フォー・エンハンスド・アンチチューモア・アクティビィティ（A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologycal Chemistry）、２００５年、第２８０巻、第２０号、ｐ．１９６６５−１９６７２
【非特許文献２２】オラフセン・ティー（Olafsen, T.）ら、「コバレント・ジスルフィド・リンクド・アンチ・シーイーエー・ダイアボディ・アロウズ・サイト・スペシフィック・コンジュゲーション・アンド・ラジオラベリング・フォー・チューモア・ターゲティング・アプリケーションズ（Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications）」、プロテイン・エンジニアリング・デザイン・アンド・セレクション（Protein Engineering Design and Selection）、２００４年、第１７巻、第１号、ｐ．２１−２７
【非特許文献２３】ウー・エー（Wu, A.）ら、「マルチマリゼーション・オブ・ア・キメリック・アンチ・シー・ディー２０・シングル・チェイン・エフヴィ・エフヴィ・フュージョン・プロテイン・イズ・メディエーテッド・スルー・バリアブル・ドメイン・エクスチェンジ（Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）２００１年、第１４巻、第２号、ｐ．１０２５−１０３３
【非特許文献２４】アサノ（Asano）ら、「ア・ダイアボディ・フォー・キャンサー・イムノテラピー・アンド・イッツ・ファンクショナル・エンハンスメント・バイ・フュージョン・オブ・ヒューマン・エフシー・リージョン（A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region）」、要約３Ｐ−６８３、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）、２００４年、第７６巻、第８号、ｐ．９９２
【非特許文献２５】タケムラ・エス（Takemura, S.）ら、「コンストラクション・オブ・ア・ダイアボディ（スモール・リコンビネーション・バイスペシフィック・アンチボディ）ユージング・ア・リフォールディング・システム（Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）、２０００年、第１３巻、第８号、ｐ．５８３−５８８
【非特許文献２６】バウエルレ・ピー・エー（Baeuerle, P. A.）ら、「バイスペシフィック・ティーセル・エンゲージング・アンチボディーズ・フォー・キャンサー・テラピー（Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy)」、キャンサー・リサーチ(Cancer Research）、２００９年、第６９巻、第１２号、ｐ．４９４１−４９４４
【非特許文献２７】マーヴィン（Marvin）ら、「リコンビナント・アプローチズ・ツー・アイジージーライク・バイスペシフィック・アンチボディーズ（Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies）」、アクタ・ファーマコロジカ・シニカ（Acta Pharmacologica Sinica）２００５年、第２６巻、ｐ．６４９−６５８
【非特許文献２８】マーテンス・エヌ（Mertens, N.）ら、「ニュー・リコンビナント・バイ・アンド・トリスペシフィック・アンチボディ・デリバティブズ（New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives）」、ノベル・フロンティアーズ・イン・ザ・プロダクション・オブ・コンパウンズ・フォー・バイオメディカル・ユース（Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use）、エー・ヴァンブロークホーベン（A. VanBroekhoven）ら、（編集）、クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（Kluwer Academic Publishers）、ドルドレヒト（Dordrecht）、ザ・ネザーランズ（The Netherlands）、２００１年、ｐ．１９５−２０８
【非特許文献２９】フィッツジェラルド（Fitzgerald）ら、インプローブド・チューモア・ターゲティング・バイ・ジスルフィド・スタビライズド・ダイアボディ・エクスプレスド・イン・ピチア・パストリス（Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris）、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）、１９９７年、第１０巻、ｐ．１２２１
【非特許文献３０】シュタエルツ（Staerz）ら、「ハイブリッド・アンチボディーズ・キャン・ターゲット・サイツ・フォー・アタック・バイ・ティー・セルズ（Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells）」、ネイチャー（Nature）  １９８５年、第３１４巻、ｐ．６２８−６３１
【非特許文献３１】ホリガー（Holliger）ら、「スペシフィック・キリング・オブ・リンフォーマ・セルズ・バイ・サイトトキシック・ティー・セルズ・メディエーテッド・バイ・ア・バイスペーシフィック・ダイアボディ（Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）、１９９６年、第９巻、ｐ２９９−３０５
【非特許文献３２】ホリガー（Holliger）ら、「カルシノエンブリオニック・アンチゲン（シーイーエー）・スペシフィック・ティー・セル・アクチベーション・イン・コロン・カルシノーマ・インデュースド・バイ・アンチ・シィーディー３×アンチシーイーエーバイスペシフィック・ダイアボディ・アンド・ビー７×アンチ・シーイーエー・バイスペシフィック・フュージョン・プロテインズ（Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD 3 × Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 × Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９９年、第５９巻：２９０９−２９１６
【非特許文献３３】カオ（Cao）ら、バイスペシフィック・アンチボディ・コンジュゲーツ・イン・テラピューティクス（Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics）、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced Drug Delivery Reviews）２００３年、第５５巻、ｐ．１７１−１９７
【非特許文献３４】ジョンソン・エス（Johnson, S.）ら、「エフェクタ・セル・リクルートメント・ウイズ・ノベル・エフヴィ・ベースド・デュアル・アフィニティー・リターゲティング・プロテイン・リーズ・ツー・ポテント・チューモア・サイトライシス・アンド・イン・ビボ・ビー・セル・デプレッション（Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオオロジー（Journal of Molecular Biology）、２０１０年、第３９９巻、第３号、ｐ．４３６−４４９
【非特許文献３５】ベリ・エム・シー（Veri, M. C.）ら、「セラピューティク・コントロール・オブ・ビー・セル・アクチベーション・ビア・リクルートメント・オブ・エフシーガンマ・レセプター・ＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）インヒビトリー・ファンクション・ウイズ・ア・ノベル・バイスペシフィック・アンチボディ・スキャフォード（Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold）」、アーティリティス・アンド・リューマトロジー（Arthritis and Rheumatology）、２０１０年、第６２巻、第７号、ｐ．１９３３−１９４３
【非特許文献３６】ムーア・ピー・エー（Moore,P.A.）ら、「アプリケーション・オブ・デュアル・アフィニティ・リターゲティング・モレキュラーズ・ツー・アチーブ・オプティマル・リダイレクテッド・ティーセル・キリング・オブ・ビーセル・リンホーマ（Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma）」、ブラッド（Blood）  ２０１１年、第１１７巻、第１７号、ｐ．４５４２−４５５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
このような成功にもかかわらず、安定な機能的ヘテロ二量体の非単一特異性の生成は、ポリペプチド鎖で使用されるドメインの注意深い検討および置換によってさらに改善され得る。したがって、本発明は、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに同時に結合し得るヘテロ二量体Ｆｃダイアボディを、共有結合を介して形成するように特に設計されている特異的なポリペプチドの供給に関する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明の要旨：
本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のダイアボディ（「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディ」）に関する。本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖（「第一」、「第二」および「第三」のポリペプチド鎖）から構成され、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、互いに共有結合されて、第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖は互いに共有結合される。このような共有結合は、例えば、各々のポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合による。本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、お互いとヘテロ二量体の方式で会合して、ＣＤ３２Ｂのエピトープに特異的な１つの結合部位、およびＣＤ７９ｂのエピトープに特異的な１つの結合部位を形成する。したがって、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、それらがＣＤ３２Ｂのエピトープのコピー１つだけに、およびＣＤ７９ｂのエピトープのコピー１つだけに結合し得るという点では一価であるが、単一のダイアボディが、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して、およびＣＤ７９ｂのエピトープに対して同時に結合し得るという点では二重特異性である。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに同時に結合し得る。本発明は、このようなＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディに関し、このような二重特異性の一価のＦｃダイアボディを含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、このようなダイアボディを炎症性の疾患または状態の処置に使用する方法に関し、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および移植片対宿主病の処置に使用する方法に関する。
【００３２】
具体的には、本発明は、二重特異性の一価のＦｃダイアボディを提供し、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢのエピトープおよびＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合することができ、かつＩｇＧのＦｃドメインを保有しており、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖を含み、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、かつ：
Ａ．第一のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）システイン含有ペプチド（特に、ペプチド１（配列番号１）の配列を有するペプチド）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分（最も好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含むドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって：
（１）ＣＤ３２Ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号１１）を含むサブドメイン（２Ａ）；および
（２）ＣＤ７９ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）（配列番号１４）を含むサブドメイン（２Ｂ）；
を含んでおり、サブドメイン（２Ａ）および（２Ｂ）が、ペプチドリンカー（特に、配列番号４の配列を有するペプチドリンカー（リンカー２））によって相互に隔てられているドメイン２と；
ｉｉｉ．ドメイン３であって、ドメイン３は、Ｅ−コイルドメイン（配列番号７）またはＫ−コイルドメイン（配列番号８）であり、ドメイン３は、ドメイン２からペプチドリンカー（特に、配列番号５の配列を有するペプチドリンカー）によって隔てられているドメイン３と；および
ｉｖ．Ｃ末端スペーサーペプチド（特に、配列番号６の配列を有するスペーサーペプチド）と；
を含み；
Ｂ．第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ７９ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）（配列番号１３）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＣＤ３２Ｂに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号１２）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含んでおり、サブドメイン（１Ａ）および（１Ｂ）が、ペプチドリンカー（特に、配列番号４の配列を有するペプチドリンカー（リンカー２））によって相互に隔てられているドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２は、Ｋ−コイルドメイン（配列番号８）またはＥ−コイルドメイン（配列番号７）であり、ドメイン２は、ドメイン１からペプチドリンカー（特に、配列番号５の配列を有するペプチドリンカー）によって隔てられており；かつ第一のポリペプチド鎖のドメイン３と、第二のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方Ｅ−コイルドメインでも、両方Ｋ−コイルドメインでもないドメイン２と；
を含み；ならびに
Ｃ．第三のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン１を含み、ドメイン１は：
（１）システイン含有ペプチド（特に、ペプチド１（配列番号１）の配列を有するペプチドリンカー）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分（最も好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み；
かつ：
（ａ）第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖のＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃドメインを形成し；
（ｂ）第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよび第二のポリペプチド鎖のＶＨドメインが、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成し；および
（ｃ）第一のポリペプチド鎖のＶＨドメインおよび第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインが、ＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成する。
【００３３】
本発明はさらに、二重特異性の一価のＦｃダイアボディを提供し、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢのエピトープおよびＣＤ７９ｂのエピトープに対して結合することができ、かつＩｇＧのＦｃドメインを保有しており、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖を含み、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、かつ：
Ａ．第一のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）システイン含有ペプチド（特に、ペプチド１（配列番号１）の配列を有するペプチド）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分（最も好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含むドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって：
（１）ＣＤ７９ｂ（ＶＬCD79b）に結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（配列番号１３）を含むサブドメイン（２Ａ）；および
（２）ＣＤ３２Ｂ（ＶＨCD32B）に結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（配列番号１２）を含むサブドメイン（２Ｂ）；
を含んでおり、サブドメイン（２Ａ）および（２Ｂ）が、ペプチドリンカー（特に、配列番号４の配列を有するペプチドリンカー）によって相互に隔てられているドメイン２と；
ｉｉｉ．ドメイン３であって、ドメイン３は、Ｅ−コイルドメイン（配列番号７）またはＫ−コイルドメイン（配列番号８）であり、ドメイン３は、ドメイン２からペプチド（特に、配列番号５の配列を有するペプチドリンカー）によって隔てられているドメイン３と；
ｉｖ．Ｃ末端スペーサーペプチド（特に、配列番号６の配列を有するスペーサーペプチド）と；
を含み；
Ｂ．第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３２Ｂ（ＶＬCD32B）に結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（配列番号１１）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＣＤ７９ｂ（ＶＨCD79b）に結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン（配列番号１４）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含んでおり、サブドメイン（１Ａ）および（１Ｂ）が、ペプチドリンカー（特に、配列番号４の配列を有するペプチドリンカー）によって相互に隔てられているドメイン１と；
ｉｉ．ドメイン２であって、ドメイン２は、Ｋ−コイルドメイン（配列番号８）またはＥ−コイルドメイン（配列番号７）であり、ドメイン２は、ドメイン１からペプチドリンカー（特に、配列番号５の配列を有するペプチドリンカー）によって隔てられており；かつ第一のポリペプチド鎖のドメイン３と、第二のポリペプチド鎖のドメイン２は、両方Ｅ−コイルドメインでも、両方Ｋ−コイルドメインでもないドメイン２と；
を含み；
Ｃ．第三のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ドメイン１を含み、ドメイン１は：
（１）システイン含有ペプチド（特に、ペプチド１（配列番号１）の配列を有するペプチドリンカー）を含むサブドメイン（１Ａ）；および
（２）ＩｇＧのＦｃドメインのポリペプチド部分（最も好ましくは、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する）を含むサブドメイン（１Ｂ）；
を含み；
かつ：
（ａ）第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖のＦｃドメインのポリペプチド部分は、ＩｇＧのＦｃ領域を形成し；
（ｂ）第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよび第二のポリペプチド鎖のＶＨドメインが、ＣＤ７９ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成し；および
（ｃ）第一のポリペプチド鎖のＶＨドメインおよび第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインが、ＣＤ３２Ｂのエピトープに対して特異的に結合し得る抗原結合ドメインを形成する。
【００３４】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のドメイン１が、第三のポリペプチド鎖のドメイン１の配列とは異なる配列を含む、実施形態に関する。
【００３５】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のサブドメイン（１Ｂ）が、配列番号９のアミノ酸配列を有し、第三のポリペプチド鎖のサブドメイン（１Ｂ）が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、実施形態に関する。
【００３６】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のサブドメイン（１Ｂ）が、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、第三のポリペプチド鎖のサブドメイン（１Ｂ）が配列番号９のアミノ酸配列を有する、実施形態に関する。
【００３７】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のドメイン１および／または第三のポリペプチド鎖のドメイン１が、Ｆｃγ受容体に対する結合の変化を示す改変体ＣＨ２−ＣＨ３の配列を含む、実施形態に関する。
【００３８】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のドメイン３がＥ−コイル（配列番号７）を含み、第二のポリペプチド鎖のドメイン２が、Ｋ−コイル（配列番号８）を含む、実施形態に関する。
【００３９】
本発明はさらに、全ての上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディの実施形態であって、第一のポリペプチド鎖のドメイン３がＫ−コイル（配列番号８）を含み、第二のポリペプチド鎖のドメイン２が、Ｅ−コイル（配列番号７）を含む、実施形態に関する。
【００４０】
本発明はさらに、ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃを含む二重特異性の一価のダイアボディ（二重特異性の一価のＦｃダイアボディ）を提供し、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは：
（１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド鎖と；
（２）配列番号１６のアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド鎖と；および
（３）配列番号１７のアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド鎖とを含み、第三のポリペプチド鎖のアミノ酸残基１〜１０が、ペプチド１（配列番号１）であり、第三のポリペプチド鎖のアミノ酸残基１１−２２７が、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（配列番号１０）であり；
第一および第二のポリペプチド鎖が第一のジスルフィド結合によって互いに共有結合され、第一および第三のポリペプチド鎖が第二のジスルフィド結合によって互いに共有結合される。
【００４１】
本発明はさらに、任意の上記二重特異性の一価のＦｃダイアボディ、および生理学的に許容され得る担体を含んでいる、薬学的組成物を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、炎症性の疾患または状態の処置における上記薬学的組成物の使用であって、特に炎症性の疾患または状態が自己免疫疾患であり、具体的には、自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である炎症性の疾患または状態の処置における上記薬学的組成物の使用を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、炎症性の疾患または状態の処置における上記薬学的組成物の使用であって、特に炎症性の疾患または状態が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である炎症性の疾患または状態の処置における上記薬学的組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】好ましい二重特異性の一価のＦｃダイアボディの３つのポリペプチド鎖、および共有結合した鎖の構造を示す。
【図２】別の二重特異性の一価のＦｃダイアボディの３つのポリペプチド鎖、および共有結合した鎖の構造を示す。
【図３Ａ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディおよび非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディが、初代ヒトＢ細胞の増殖を阻害する能力を示す。
【図３Ｂ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディおよび非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディが、初代ヒトＢ細胞の増殖を阻害する能力を示す。
【図４Ａ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディ、および非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディが、ナイーブＢ細胞におけるシグナル伝達を阻害する能力を示す。
【図４Ｂ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディ、および非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディが、記憶Ｂ細胞におけるシグナル伝達を阻害する能力を示す。
【図５Ａ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、または非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディが、ＳＬＥ細胞の増殖を阻害する能力を示す。このような阻害は、疾患の状況に依存しないことが見出された。
【図５Ｂ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、または非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディが、ＳＬＥ細胞の増殖を阻害する能力を示す。このような阻害は、疾患の状況に依存しないことが見出された。
【図５Ｃ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、または非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディが、ＳＬＥ細胞の増殖を阻害する能力を示す。このような阻害は、疾患の状況に依存しないことが見出された。
【図６Ａ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、または非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディが、インビボでＢ細胞応答を調節する能力を示しており、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの予期されない優位性を示す。
【図６Ｂ】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、または非ＦｃのＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディが、インビボでＢ細胞応答を調節する能力を示しており、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの予期されない優位性を示す。
【図７】好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、マウスにおいて異種間のＧｖＨＤを低下させる能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明：
本発明は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む二重特異性の一価のＦｃダイアボディ（「二重特異性の一価のＦｃダイアボディ」）であって、３つのポリペプチド鎖から構成されており、かつＣＤ３２Ｂのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合部位、およびＣＤ７９ｂのエピトープに特異的な１つの結合部位を保有する二重特異性の一価のＦｃダイアボディ（すなわち、「ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ」）に関する。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに対して同時に結合し得る。本発明は、このような組成物、このような二重特異性の一価のＦｃダイアボディを含む薬学的組成物、ならびに炎症性の疾患または状態の処置に使用する方法に関し、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および移植片対宿主病の処置に使用する方法に関する。
【００４６】
上記で示されるとおり、ＣＤ７９ｂは、Ｂ細胞によって発現され、したがって、抗原認識に応答して増殖している細胞上で発現される。ＣＤ７９ｂに対して免疫特異的に結合し得る抗体は、このようなＢ細胞に結合し得る。ＣＤ３２Ｂは、ＦｃγＲであり、かつＢ細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に免疫特異的に結合し得る抗体、特に、Ｆｃ結合を実質的に妨害することも邪魔することもなくＦｃγＲＩＩＢに結合するこのような抗体は、ＦｃγＲＩＩＢが免疫複合体の活性化受容体と共連結する能力を増大し得る。ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂの両方に結合し得る二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、望ましくないＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌に対して応答して、宿主の免疫系を阻害または弱める能力を有する。したがって、このような二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、炎症性の疾患および障害の処置に有用性を有する。
【００４７】
Ｉ．本発明の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ
本発明の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、それらがＦｃドメインを含むので、「Ｆｃ」ダイアボディと呼ばれる。図１に模式的に示すとおり、このようなＦｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖から構成され、そのうち第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖が互いに共有結合され、かつ第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖が互いに結合される。第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第二のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第一の抗原に特異的である第一の機能的な抗原結合部位（すなわち、ＣＤ３２ＢまたはＣＤ７９ｂのいずれか）を形成する。同様に、第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第一のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第二の抗原に特異的である第二の機能的な抗原結合部位（すなわち、第一の抗原が特定されることにより決まるＣＤ７９ｂまたはＣＤ３２Ｂのいずれか）を形成する。従って、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が共同でＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに結合し得るＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むように調整される（すなわち、それらは、ＶＬCD32B／ＶＨCD32BおよびＶＬCD79b／ＶＨCD79bを含む）（図１）。各々のこのようなＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびにそれらを隔てる介在するリンカーは、まとめて分子の抗原−結合ドメインと呼ばれる。
【００４８】
本発明のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全なＦｃ領域（例えば、完全なＩｇＧのＦｃ領域）であっても、または完全なＦｃ領域のフラグメントのみであってもよい。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ以上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ（単数または複数））に結合する能力を保有し得、さらに好ましくはこのようなＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全なＦｃ領域のいくつかのもしくは全てのＣＨ２ドメインおよび／またはいくつかのもしくは全てのＣＨ３ドメインを含んでもよいし、あるいは改変体ＣＨ２および／または改変体ＣＨ３の配列（これは、例えば、完全なＦｃ領域のＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインに対して、１つ以上の挿入および／または１つ以上の欠失を含んでもよい）を含んでもよい。本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディのＦｃドメインは、非−Ｆｃポリペプチド部分を含んでもよく、または天然ではない完全なＦｃ領域の一部を含んでもよく、またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインの天然には存在しない方向性を含んでもよい（例えば、２つのＣＨ２ドメインもしくは２つのＣＨ３ドメイン、またはＮ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＨ２ドメインに連結されたＣＨ３ドメインなど）。
【００４９】
好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって）：アミノ末端、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、ＩｇＧのＦｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）、第一の介在するスペーサーペプチド（リンカー１）、ＣＤ３２ＢまたはＣＤ７９ｂのいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬCD32BまたはＶＬCD79bのいずれか）、第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）、ＣＤ７９ｂ（第一のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含む場合）またはＣＤ３２Ｂ（第一のポリペプチド鎖がＶＬCD79bを含む場合）のいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有の第三の介在するスペーサーペプチド（リンカー３）、ヘテロ二量体促進性ドメイン、ヘテロ二量体促進性ドメインに対する安定性を改善するための任意の第四のスペーサーペプチド（リンカー４）、ならびにＣ末端を含む（図１）。
【００５０】
好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって）：アミノ末端、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３２Ｂのいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ダイアボディの第一のポリペプチド鎖について選択されたＶＬドメインにより決まるＶＬCD79bまたはＶＬCD32Bのいずれか）、介在するリンカーペプチド（リンカー２）、ＣＤ３２Ｂ（第二のポリペプチド鎖がＶＬCD79bを含む場合）またはＣＤ７９ｂ（第二のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含む場合）のいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有スペーサーペプチド（リンカー３）、ヘテロ二量体促進性ドメイン、ならびにＣ末端を含む（図１）。
【００５１】
好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第三のポリペプチド鎖は、（Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって）：アミノ末端、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、第一のポリペプチド鎖のＦｃドメインのものと同じアイソタイプを有するＩｇＧのＦｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）、ならびにＣ末端を含む。好ましくは、第三のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型のＦｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く（図１）。
【００５２】
第一および第三の鎖のシステイン含有ペプチド（ペプチド１）は、同じアミノ酸配列から構成されても、または異なるアミノ酸配列から構成されてもよく、１、２、３またはそれ以上のシステイン残基を含む。特に好ましいペプチド１は、アミノ酸配列（配列番号１）：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを有する。第一の介在するスペーサーペプチド（リンカー１）は、アミノ酸配列（配列番号２）：ＡＰＳＳＳを含み、およびさらに好ましくはアミノ酸配列（配列番号３）：ＡＰＳＳＳＰＭＥを有する。好ましい第二の介在するスペーサーペプチド（リンカー２）は、配列番号４：ＧＧＧＳＧＧＧＧである配列を有する。好ましいシステイン含有の第三の介在するスペーサーペプチド（リンカー３）は、１、２、３またはそれ以上のシステインを含む。好ましいシステイン含有のスペーサーペプチド（リンカー３）は、配列番号５：ＧＧＣＧＧＧである配列を有する。好ましい第四のスペーサーペプチド（リンカー４）は、配列ＧＧＧを有するか、または配列番号６：ＧＧＧＮＳである。
【００５３】
最も好ましくは、介在するリンカーペプチド（ＶＬドメインおよびＶＨドメインを隔てるリンカー２）の長さは、ポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインが互いに結合することを実質的にまたは完全に妨げるように選択される。従って、第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、お互いに対して実質的にまたは完全に結合できない。同様に第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、お互いに対して実質的にまたは完全に結合できない。
【００５４】
互いに異なる第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドのヘテロ二量体促進性ドメインは、お互いと会合するように設計され、それによって、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖の会合を促進する。従って、好ましい実施形態では、これらのポリペプチド鎖のうちの１つは、残基がｐＨ７では負の荷電を形成するヘテロ二量体促進性「Ｅ−コイル」ドメイン（配列番号７）：
EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
を含むように設計され、２つのポリペプチド鎖のうちの他方は、残基がｐＨ７では正の荷電を形成するヘテロ二量体促進性「Ｋ−コイル」ドメイン（配列番号８）：
KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
を含むように設計される。このような荷電されたドメインの存在は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の会合を促進し、これによってヘテロ二量体化が助長される。第一および第二のポリペプチド鎖で使用されるコイルが異なっており、これによってこれらのポリペプチド鎖の間のヘテロ二量体化が助長される限りは、どちらのコイルがどちらの鎖に提供されるかは重要ではない。
【００５５】
上述したとおり、第一のポリペプチドおよび第三のポリペプチドのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを好ましくは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合を低下させる（野性型のＦｃ領域に対して）か、または取り除くように変異させる。このような変異は、当該分野で周知であり、位置２３４および２３５のアミノ酸置換、位置２６５のアミノ酸置換、または位置２９７のアミノ酸置換を含む（例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，６２４，８２１号を参照）。好ましい実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、位置２３４でアラニンによる置換、および位置２３５でアラニンによる置換を含む。
【００５６】
第一のポリペプチドおよび第三のポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、同一である必要はなく、２つのポリペプチドの間で複合体化を助長するように改変されることが有利である。例えば、アミノ酸置換（好ましくは、「ノブ」を形成するかさ高い側基（bulky side group）を含むアミノ酸、例えば、トリプトファンでの置換）を、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインに導入して、その結果立体障害が、同様に変異されたドメインとの相互作用を妨げ、相補的なまたは適応する変異に設計されているドメイン（すなわち、「ホール」（例えば、グリシンとの置換））とこの変異されたドメインとが対合する役割を与えてもよい。このような変異の組合せを、Ｆｃダイアボディ分子を含んでいる任意の対のポリペプチド中に設計してもよく、さらに、このような対のポリペプチド鎖の任意の部分に設計してもよい。ホモ二量体化を上回ってヘテロ二量体化を支持するためのタンパク質加工の方法は、当該分野では、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して周知であり、本明細書に包含される（例えば、Ridgwayら、（１９９６）「‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization」Protein Engr.9：６１７−６２１、Atwellら、（１９９７）「Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library」、J.Mol.Biol.270：２６−３５、およびXieら、（２００５）「A New Format Of Bispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization、Expression And Tumor Cell Lysis」、J.Immunol. Methods 296：９５−１０１（その各々が、その全体として参照によって本明細書に援用される）を参照）。好ましくは「ノブ」を、第一のポリペプチド鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン中に設計して、「ホール」を、第三のポリペプチド鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン中に設計する。このように「ノブ」は、第一のポリペプチド鎖を、そのＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを介したホモ二量体化から妨げるのを助ける。第三のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換を含むので、これは、第一のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、同様にそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然のＩｇＧのＦｃ領域を改変して、改変Ｔ３６６Ｗを含むことによって作製する。好ましいホールは、天然のＩｇＧのＦｃ領域を改変して、改変Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むことによって作製される。第一、第二および第三のポリペプチド鎖を含んでいる最終の二重特異性の一価のＦｃダイアボディから第三のポリペプチド鎖のホモ二量体を精製することを補助するために、第三のポリペプチド鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのプロテインＡ結合部位を、好ましくは、４３５位置でのアミノ酸置換によって変異する（Ｈ４３５Ｒ）。第一、第二および第三のポリペプチド鎖を含んでいる最終の二重特異性の一価のＦｃダイアボディから第三のポリペプチド鎖のホモ二量体を精製することを補助するために、第三のポリペプチド鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのプロテインＡ結合部位を、好ましくは、アミノ酸置換によって変異する。従って、第三のポリペプチド鎖ホモ二量体は、プロテインＡに結合しないが、二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、それが、第一のポリペプチド鎖上のプロテインＡ結合部位を介してプロテインＡに結合する能力を保持する。
【００５７】
第一のポリペプチド鎖中に存在する抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号９）。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGK
【００５８】
第三のポリペプチド鎖中に存在する抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１０）。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGK
【００５９】
ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）の好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１１）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 
GTKVEIK
【００６０】
ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）の好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１２）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE 
IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA 
LGLDYWGQGT LVTVSS
【００６１】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）の好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１３）。
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
LTFGGGTKLE IK
【００６２】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）の好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１４）。
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM 
IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM 
GYWGQGTTVT VSS
【００６３】
したがって、第一のポリペプチド鎖に好ましい配列は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって：ペプチド１、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、リンカー１、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）、リンカー２、ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）、リンカー３、Ｅ−コイルドメイン、リンカー４およびＣ末端という構造を有する。このような好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号１５）。
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKAPS SSPMEDIQMT QSPSSLSASV 
GDRVTITCRA SQEISGYLSW LQQKPGKAPR RLIYAASTLD SGVPSRFSGS 
ESGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQYFSYP LTFGGGTKVE IKGGGSGGGG 
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGM 
IDPSDSETHY NQKFKDRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARAM 
GYWGQGTTVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG 
NS
【００６４】
配列番号１５では、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号１）であり、アミノ酸残基１１〜２２７はＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（配列番号９）であり、アミノ酸残基２２８〜２３５はリンカー１（配列番号３）であり、アミノ酸残基２３６〜３４２はＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）（配列番号１１）であり、アミノ酸残基３４３〜３５０はリンカー２（配列番号４）であり、アミノ酸残基３５１〜４６３はＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）（配列番号１４）であり、アミノ酸残基４６４〜４６９はリンカー３（配列番号５）であり、アミノ酸残基４７０〜４９７はヘテロ二量体促進性Ｅ−コイルドメイン（配列番号７）であり、かつアミノ酸残基４９８〜５０２はリンカー４（配列番号６）である。
【００６５】
第一のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列を有する（配列番号２３）。
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgt
cagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccc
tgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg
agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagga
ctggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc
cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt
acaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtg
cctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg
cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct
tcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt
cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc
ctctccctgtctccgggtaaagccccttccagctcccctatggaagacatccaga
tgacccagtctccatcctccttatctgcctctgtgggagatagagtcaccatcac
ttgtcgggcaagtcaggaaattagtggttacttaagctggctgcagcagaaacca
ggcaaggcccctagacgcctgatctacgccgcatccactttagattctggtgtcc
catccaggttcagtggcagtgagtctgggaccgagttcaccctcaccatcagcag
ccttcagcctgaagattttgcaacctattactgtctacaatattttagttatccg
ctcacgttcggaggggggaccaaggtggaaataaaaggaggcggatccggcggcg
gaggccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggcgcctc
agtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctactggatgaac
tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatcggaatgattgatcctt
cagacagtgaaactcactacaatcaaaagttcaaggacagagtcaccatgaccac
agacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgac
acggccgtgtattactgtgcgagagctatgggctactgggggcaagggaccacgg
tcaccgtctcctccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaaga
ggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctg
gagaaaggcggcgggaactct
【００６６】
第二のポリペプチド鎖の好ましい配列は、以下のとおりである（配列番号１６）。
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK 
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【００６７】
配列番号１６では、アミノ酸残基１〜１１２はＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）（配列番号１３）であり、アミノ酸残基１１３〜１２０はリンカー２（配列番号４）であり、アミノ酸残基１２１〜２３６はＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）（配列番号１２）であり、アミノ酸残基２３７〜２４２はリンカー３（配列番号５）であり、かつアミノ酸残基２４３〜２７０はヘテロ二量体促進性Ｋ−コイルドメイン（配列番号８）である。
【００６８】
第二のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列を有する（配列番号２４）。
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccgg
cctccatctcctgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacata
tttgaattggtttcagcagaggccaggccaatctccaaaccgcctaatttatctg
gtgtctaaactggactctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggca
ctgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttatta
ctgctggcaaggtacacattttccgctcacgttcggcggagggaccaagcttgag
atcaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaagtgcagcttgtggagtctggag
gaggcttggtgcaacctggaggatccctgagactctcttgtgccgcctctggatt
cacttttagtgacgcctggatggactgggtccgtcaggccccaggcaaggggctt
gagtgggttgctgaaattagaaacaaagctaaaaatcatgcaacatactatgctg
agtctgtgatagggaggttcaccatctcaagagatgacgccaaaaacagtctgta
cctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactgccgtgtattactgtggggct
ctgggccttgactactggggccaaggcaccctggtgaccgtctcctccggaggat
gtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaa
ggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
【００６９】
第三のポリペプチド鎖に好ましい配列は、配列番号１７である。
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
【００７０】
配列番号１７では、アミノ酸残基１〜１０はペプチド１（配列番号１）であり、アミノ酸残基１１〜２２７はＩｇＧ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（配列番号１０）である。
【００７１】
第三のポリペプチド鎖をコードする好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列を有する（配列番号２５）。
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgt
cagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccc
tgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg
agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagga
ctggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc
cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt
acaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttg
cgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg
cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct
tcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgt
cttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagc
ctctccctgtctccgggtaaa
【００７２】
ＷＯ２０１２／０１８６８７に開示されるとおり、ダイアボディ分子のインビボの薬物動態学的特性を改善するためには、ダイアボディ分子の末端の１つ以上に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むように分子を改変してもよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディ分子のＣ末端にインストールされる。この目的のための血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、レンサ球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。特に、連鎖球菌の株Ｇ１４８のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が好ましい。
【００７３】
連鎖球菌の株Ｇ１４８のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定な３ヘリックスのバンドルを形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson,M.U.ら、（２００２）「Structure、Specificity、And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules」、J.Biol.Chem.277(10)：８１１４−８１２０）。アルブミンは、血清中で最も豊富なタンパク質であって、ヒトでの半減期は１９日である。アルブミンは、いくつかの低分子結合部位を保有しており、低分子結合部位によって他のタンパク質に対して非共有結合的に結合することが可能になり、その結果、アルブミンの血清半減期は延長する。短いリンカー（リンカー５）（例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１８）またはＧＧＧＮＳ（配列番号６））を使用して、ポリペプチド鎖のＥ−コイル（またはＫ−コイル）をアルブミン結合ドメインから隔てることが好ましい。好ましいアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９）を有する。
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALID EILAALP
【００７４】
ＩＩ．本発明の他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ
本発明の他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディ分子を、図２に模式的に示す。このような他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ分子は、３つのポリペプチド鎖を保有しており、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は互いに共有結合され、第一のポリペプチド鎖および第三のポリペプチド鎖は互いに結合される。他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディ分子は、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディ分子におけるドメインの順序に対して、ドメインの順序が異なる。しかし、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの場合のように、他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第一のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第二のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第一の抗原に特異的である第一の機能的な抗原結合部位を形成する（すなわち、ＣＤ３２ＢまたはＣＤ７９ｂのいずれか）。同様に、他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディの第一のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第二の抗原に特異的である第二の機能的な抗原結合部位を形成する（すなわち、第一の抗原が特定されることにより決まるＣＤ７９ｂまたはＣＤ３２Ｂのいずれか）。従って、第一および第二のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が協働でＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに結合し得るＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むように調整される（すなわち、それらは、ＶＬCD32B／ＶＨCD32BおよびＶＬCD79b／ＶＨCD79bを含む）（図２）。各々のこのようなＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびにそれらを隔てる介在するリンカーは、まとめて分子の抗原−結合ドメインと呼ばれる。
【００７５】
他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、アミノ末端、ＣＤ３２ＢまたはＣＤ７９ｂのいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ＶＬCD32BまたはＶＬCD79bのいずれか）、介在するスペーサーペプチド（リンカー２）、ＣＤ７９ｂ（第一のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含む場合）またはＣＤ３２Ｂ（第一のポリペプチド鎖がＶＬCD79bを含む場合）のいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有の第三の介在するスペーサーペプチド（リンカー３）、ヘテロ二量体促進性ドメイン、ヘテロ二量体促進性ドメイン（好ましくは、Ｅ−コイルドメイン）に対する安定性を改善するための任意の第四のスペーサーペプチド（リンカー４）、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、ＩｇＧのＦｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）、ならびにＣ末端を含む。好ましくは、第一のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型のＦｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインがこのような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く（図２）。
【００７６】
他のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、アミノ末端、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３２Ｂのいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＬドメイン（すなわち、ダイアボディの第一のポリペプチド鎖について選択されるＶＬドメインにより決まるＶＬCD79bまたはＶＬCD32Bのいずれか）、介在するリンカーペプチド（リンカー２）、ＣＤ３２Ｂ（第二のポリペプチド鎖がＶＬCD79bを含む場合）またはＣＤ７９ｂ（第二のポリペプチド鎖がＶＬCD32Bを含む場合）のいずれかに結合し得るモノクローナル抗体のＶＨドメイン、システイン含有のスペーサーペプチド（リンカー３）、ヘテロ二量体促進性ドメイン（好ましくは、Ｋ−コイルドメイン）、およびＣ末端を含む（図２）。
【００７７】
好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの第三のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、アミノ末端、システイン含有ペプチド（ペプチド１）、第一のポリペプチド鎖のＦｃドメインのものと同じアイソタイプを有するＩｇＧのＦｃドメイン（好ましくは、抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）、およびＣ末端を含む。好ましくは、第三のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の低下（野性型のＦｃ領域によって示される結合に対して）を生じるか、またはこのようなＦｃドメインが、このような受容体（単数または複数）に結合する能力を実質的に取り除く（図２）。
【００７８】
ＩＩＩ．薬学的組成物
本発明の組成物は、薬学的処方物の製造に有用なバルクの薬物組成物（例えば、不純な組成物または無菌でない組成物）および単位剤形の調製に用いられ得る薬学的組成物（すなわち、被験体または患者に対する投与に適切な組成物）を含む。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを含み、特に、本明細書に開示される任意のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディまたはこのような剤の組み合わせ、ならびに薬学的に許容され得る担体を含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の１種以上の本発明の分子、および薬学的に許容され得る担体を含む。
【００７９】
本発明はまた、このようなＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディおよび特定の自己免疫または炎症性疾患の抗原に特異的である第二の治療用抗体（例えば、自己免疫または炎症性疾患抗原特異的なモノクローナル抗体）、および薬学的に許容され得る担体を含んでいる薬学的組成物を包含する。
【００８０】
特定の実施形態では、「薬学的に許容され得る」という用語は、動物における、より具体的には、ヒトにおける使用について、連邦もしくは合衆国政府の規制機関によって承認されるか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方で列挙されることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、賦形剤、またはビヒクル（それと一緒に治療剤を投与する）を指す。このような薬学的な担体は、無菌の液体、例えば、水およびオイル、例としては、石油、動物、植物または合成に由来するもの、例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであってもよい。水は、薬学的組成物が静脈内投与される場合の好ましい担体である。生理食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液も、液体の担体として、特に注射溶液に使用してもよい。適切な薬学的な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの剤形をとってもよい。
【００８１】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々に又は一緒に混合して単位投与剤形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性薬剤の量を表示してあるアンプルまたは小袋などの密閉容器に入れて供給される。組成物を注入により投与する場合は、製薬等級の滅菌水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を注射により投与する場合は、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを、その成分が投与前に混合され得るように提供してもよい。
【００８２】
本発明の組成物は、中性または塩型として製剤化してもよい。薬学的に許容され得る塩としては、これらに限定されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される陰イオンにより形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導された陽イオンにより形成された塩が挙げられる。
【００８３】
本発明はまた、上で開示されたＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ単独、または上記薬学的に許容され得る担体を充填された１つ以上の容器を含んでいる薬学的なパックまたはキットも提供する。さらに、疾患の処置のために有用な１つ以上の他の予防剤または治療剤も、薬学的なパックまたはキット中に備えてもよい。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填された１つ以上の容器を備えている薬学的なパックまたはキットも提供する。必要に応じて、このような容器（単数または複数）には、製剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定した形態での通知（ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認が記された通知）を付随してもよい。
【００８４】
本発明は、上記の方法で用いられ得るキットを提供する。ある実施形態では、キットは本発明の１つ以上の分子を含む。別の実施形態では、キットはさらに、１つ以上の容器中に、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置のために有用な１つ以上の他の予防剤または治療剤を含む。さらに別の実施形態では、キットはさらに、自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する１つ以上の自己免疫疾患または炎症性疾患の抗原に結合する１つ以上の抗体を含む。特定の実施形態では、他の予防剤または治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、他の予防剤または治療剤は、生物学的治療剤またはホルモン治療剤である。
【００８５】
ＩＶ．本発明の組成物の使用
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、ＣＤ７９ｂの発現に関連するかもしくはそれによって特徴付けられるか、または疾患に対するＢ細胞成分を有する、任意の疾患もしくは状態を処置する能力を有する。従って、限定するものではないが、このような分子を含んでいる薬学的組成物は、自己免疫または炎症性の疾患または状態の診断または処置において使用され得る。
【００８６】
従って、本発明は、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むＢ細胞媒介性の疾患または障害の症状を処置するか、予防するか、その進行を遅らせるか、および／または緩和するために用いられ得る。
【００８７】
Ｖ．投与の方法
本発明の組成物は、被験体に対して有効量の本発明の薬学的組成物を投与することによる、疾患、障害または感染に関連する１つ以上の症状の処置、予防および緩和のために提供され得る。好ましい局面では、このような組成物は実質的に精製される（すなわち、その効果を制限するか、または望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、被験体とは、動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類など）、または霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、ヒトなど）である。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００８８】
様々な送達系が公知であり、かつ本発明の組成物を投与するために用いることが可能であり、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体または融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Wuら、（１９８７）「Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System」、J.Biol.Chem.、262：４４２９−４４３２を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。
【００８９】
本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディを投与する方法としては、限定するものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される。組成物は、任意の適当な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身的でも局所的でもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザーの使用により、およびエアロゾル化剤を用いる製剤化により肺投与を行ってもよい。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，３２０号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；および国際公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照（これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に援用される）。
【００９０】
本発明はまた、アンプルや小袋のような分子の量を表示している密閉容器中に本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを充填してもよい。ある実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて供給し、例えば、水または生理食塩水を用いて被験者に投与するための適当な濃度に再調製してもよい。好ましくは、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、乾燥した無菌凍結乾燥粉末として密閉容器に入れ、少なくとも５μｇ、さらに好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ、または少なくとも２００μｇの単位用量にて供給する。
【００９１】
本発明の凍結乾燥されたＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、それらの元の容器内で２〜８℃で貯蔵しなければならず、また、この分子は、再調製後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与しなければならない。別の実施形態では、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを、液剤として、この分子、融合タンパク質、またはコンジュゲートされた分子の量および濃度を表示する密閉容器に入れて供給する。好ましくは、本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの液剤を、少なくとも１μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する密閉容器にて供給する。
【００９２】
障害に関連する１つ以上の症状を処置、予防または改善するために有効である本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用量はまた、投与経路、および病状の重篤度にも左右され、医師の判断および各患者の状況によって決定されねばならない。有効な用量をインビトロまたは動物モデル試験系から誘導した用量−応答曲線から推定してもよい。
【００９３】
本発明により包含されるＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの場合、患者に投与される投薬量は、典型的には、被験体の体重に対して、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇ以上である。
【００９４】
本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディの投与の投薬量および頻度は、例えば、リピド化などの改変により、二重特異性の一価のＦｃダイアボディの取込みおよび組織浸透を増強することによって、低減または変更してもよい。
【００９５】
ある実施形態では、患者に投与される本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの投薬量は、単剤療法としての使用のために算出してもよい。別の実施形態では、本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディを他の治療用組成物と併用して用い、かつ患者に投与される投与量は、二重特異性の一価のＦｃダイアボディ分子を単剤療法として用いるときより低くする。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、処置の必要な部位に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、局所注入によって、注射によって、またはシラステック膜（sialastic membranes）のような膜または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料からなる移植片によって達成してもよい。好ましくは、本発明の分子を投与する時に、分子が吸収されない材料を使うように注意しなければならない。
【００９７】
別の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームにより送達してもよい（Langer、（１９９０）、「New Methods Of Drug Delivery」、Science、249:1527-1533;Treatら、「LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER」、Lopez-Berestein and Fidler(編)、Liss、New York、ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Lopez-Berestein、同書、ｐｐ．３１７−３２７；同書の全体を参照）。
【００９８】
さらに別の実施形態では、組成物を制御放出系または持続放出系で送達してもよい。当業者に公知の任意の技術を用いて、本発明の１種以上の分子を含んでいる持続放出製剤を作製してもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開ＷＯ９１／０５５４８；国際公開ＷＯ９６／２０６９８；Ningら、（１９９６）、「Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel」、Radiotherapy&Oncology、39：１７９−１８９、Songら、（１９９５）、「Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology、50：３７２−３９７；Cleekら、（１９９７）、「Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application」、Pro.Int’l.Symp.Control. Rel. Bioact.Mater.、24：８５３−８５４；およびLamら、（１９９７）、「Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery」、Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.、24：７５９−７６０を参照（これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に援用される）。ある実施形態では、ポンプを制御放出システムで用いてもよい（Langer、前掲；Sefton、（１９８７）、「Implantable Pumps」、CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.、14：２０１−２４０；Buchwaldら、（１９８０）、「Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis」、Surgery、88:507-516；およびSaudekら、（１９８９）、「A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery」、N.Engl.J.Med.、321：５７４−５７９を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を達成してもよい（例えば、MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE、Langer and Wise（編）、CRC Pres.、Boca Raton、Florida（１９７４）；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY,DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE、Smolen and Ball（編）、Wiley、New York（１９８４）；Levyら、（１９８５）「Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate」、Science、228：１９０−１９２；Duringら、（１９８９）「Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In Vivo Characterization」、Ann.Neurol.25：３５１−３５６；Howardら、（１９８９）「Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits」、J.Neurosurg.、7(1)：１０５−１１２；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開ＷＯ９９／１５１５４；および国際公開ＷＯ９９／２０２５３を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出システムを治療標的（例えば、肺）の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としないようにすることができる（例えば、Goodson,MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE、前掲、第２巻、１１５−１３８頁（１９８４）を参照）。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物を、Dunnら（米国特許第５，９４５，１５５号を参照）に従って用いる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のインサイチュ制御放出の治療効果に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所でおこなってもよい。別の実施形態では非ポリマー系の持続送達システムが用いられるが、この場合には、被験者の体内の非ポリマー移植片が薬物送達システムとして用いられる。体内に移植すると、移植片の有機溶媒が、この組成物から周囲組織液中に散逸、分散または浸出して、非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体の微孔質マトリックスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号を参照）。
【００９９】
制御放出システムは、Langerによる概説（１９９０、「New Methods Of Drug Delivery」、Science、249：１５２７−１５３３）で考察されている。本発明の１種以上の治療剤を含んでいる持続放出製剤は、当業者に公知の任意の技術を用いて作製してもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開ＷＯ９１／０５５４８およびＷＯ９６／２０６９８；Ningら、（１９９６）、「Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel」、Radiotherapy&Oncology、39：１７９−１８９；Songら、（１９９５）、「Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology、50：３７２−３９７；Cleekら、（１９９７）、「Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application」、Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.、24：８５３−８５４；およびLamら、（１９９７）、「Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery」、Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.、24：７５９−７６０を参照（これらの各々は、参照によってその全体が本明細書に援用される）。
【０１００】
本発明の組成物の特定の実施形態は、本発明の二重特異性の一価のＦｃダイアボディをコードする核酸であり、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、これが細胞内に取り込まれるようにこの核酸を投与することによって、この核酸をインビボで投与し、そのコードされた二重特異性の一価のＦｃダイアボディの発現を促進してもよい。細胞内への取り込みは、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射によって、または微粒子衝突（例えば、遺伝子銃；Biolistic,Dupont）の使用によって、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、または核に侵入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと連結させて投与すること（例えば、Joliotら、（１９９１）「Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis」、Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)、88：１８６４−１８６８を参照）などによって行う。あるいはまた、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んでもよい。
【０１０１】
治療上または予防上有効な量の本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを用いる被験者の処置は、単回治療であってもよいし、好ましくは、一連の処置を含んでもよい。好ましい実施例においては、本発明の分子を用いて、週１回、約１〜１０週間にわたって、好ましくは約２〜８週間にわたって、さらに好ましくは約３〜７週間にわたって、より一層好ましくは約４、５、または６週間にわたって、被験体を処置する。他の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、１日１回、１日２回、または１日３回投与する。他の実施形態では、薬学的組成物を、週１回、週２回、２週毎に１回、月１回、６週毎に１回、２ヶ月毎に１回、年２回または年１回投与する。当然のことながら、処置に用いる分子の有効投与量は、特定の処置期間にまたがって増減することがあることも理解される。
【０１０２】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、同じことは以下の実施例への言及を通してより容易に理解される。この実施例は、例示の目的で示すものであって、特段指定しない限り、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０１０３】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂの二重特異性の一価のＦｃダイアボディおよび対照ダイアボディの構築
表１は、発現されて精製された、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディのポリペプチド鎖の配列のリストを含む。さらに、２つの対照ダイアボディを生成した。１つは、ＣＤ３２ＢおよびＦＩＴＣについて二重特異性の一価のダイアボディであり、２つ目は、ＣＤ７９ｂおよびＦＩＴＣについて二重特異性の一価のダイアボディである。
【０１０４】
【表１】
0006395834.tif 000002
【０１０５】
上記のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂに同時に結合し得ることが見出された。対照ＣＤ３２Ｂ×ＦＩＴＣダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＦＩＴＣに同時に結合し得ることが見出された。対照ＣＤ７９ｂ×ＦＩＴＣダイアボディは、ＣＤ７９ｂおよびＦＩＴＣに同時に結合し得ることが見出された。ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖（各々の挙げられたアミノ酸配列のうち１つの鎖）から構成されるヘテロ三量体である。二重特異性の一価のダイアボディを形成するための方法は、ＷＯ２００６／１１３６６５、ＷＯ２００８／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８、ＷＯ２０１２／０１８６８７、ＷＯ２０１２／１６２０６８およびＷＯ２０１２／１６２０６７に示される。
【０１０６】
このような好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの利点をさらに実証するために、２つの非Ｆｃ含有ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディも調製した。これらのダイアボディは、２つのポリペプチド鎖から各々構成され、ダイアボディのうちの１つ（ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディ）がアルブミン結合ドメインを含んでいるが、もう一方（ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディ）は含まないという点で異なる。
【０１０７】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディ
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）、リンカー２、ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）、リンカー３、Ｅ−コイルドメイン、リンカー５、アルブミン結合ドメインおよびＣ末端を含む第一のポリペプチド鎖から形成される。第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）、リンカー２、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）、リンカー３、Ｋ−コイルドメインおよびＣ末端を含む。このようなポリペプチドのアミノ酸配列は以下のとおりである。
第一のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV 
AALEKEVAAL EKGGGSLAEA KVLANRELDK YGVSDYYKNL IDNAKSAEGV 
KALIDEILAA LP
第二のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK 
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【０１０８】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディ
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディとは、アルブミン結合ドメインを有さないと言う点で異なる。従って、このようなダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD32B）、リンカー２、ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD79b）、リンカー３、Ｅ−コイルドメイン、およびＣ末端を含む第一のポリペプチド鎖から形成される。第二のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向へ向かって、ＣＤ７９ｂに結合する抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD79b）、リンカー２、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD32B）、リンカー３、Ｋ−コイルドメインおよびＣ末端を含む。このダイアボディの第一のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号２２）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV 
AALEKEVAAL EK
このダイアボディの第二のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上記で示される配列番号２１である。
【実施例２】
【０１０９】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ヒト初代Ｂ細胞増殖を阻害する。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、免疫系を弱めるか、または阻害する能力をさらに実証するために、上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを、２つのドナーから得た初代ヒトＢ細胞の存在下でインキュベートした。増殖は、ヤギ抗ヒトＩｇＭ  Ｆｃ  μＦ（ａｂ）2（５μｇ／ｍｌ）および種々の濃度のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディまたはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＡＢＤダイアボディのいずれかの存在下で、４８時間後に、3Ｈ−ＴｄＲの取り込みによってモニターした。その結果を、図３Ａ（ドナー１）および図３Ｂ（ドナー２）に示しており、その結果は、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディまたはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディの存在下におけるＢ細胞増殖の顕著な低下を示している。
【実施例３】
【０１１０】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ナイーブＢ細胞および記憶Ｂ細胞におけるシグナル伝達を阻害する。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、Ｂ細胞による免疫系のシグナル伝達を減弱させるまたは阻害する能力をさらに実証するために、精製されたナイーブＢ細胞または記憶Ｂ細胞を、ヤギ抗ヒトＩｇＭ  Ｆｃμ（抗μ）（３０μｇ／ｍｌ）単独の存在下で、または追加して上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの存在下で、３０分間インキュベートした。図４Ａ（ナイーブＢ細胞）および図４Ｂ（記憶Ｂ細胞）に示されるとおり、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディ、またはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディの存在は、全てがＢ細胞シグナル伝達を顕著に低下させた。
【実施例４】
【０１１１】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、ＳＬＥ患者のＢ細胞の増殖を阻害する。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、Ｂ細胞による免疫系のシグナル伝達を減弱させるまたは阻害する能力をさらに実証するために、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹患している患者のＢ細胞を、ヤギ抗ヒトＩｇＭ  Ｆｃμ（抗μ）単独の存在下で、または追加して上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの存在下で、インキュベートした。増殖は、3Ｈ−ＴｄＲの取り込みによってモニターした。
【０１１２】
図５Ａに示されるとおり、上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９ｂの両方に結合し得ることが見出された。図５Ｂでは、ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ＧＡＨ抗μ）の供給が、対照と比較して、Ｂ細胞の増殖を増大させたこと、および上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディまたはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディの追加の投与がこのような増殖の程度を顕著に阻害することを実証している。
【０１１３】
上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、またはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディがＳＬＥに罹患している個体のＢ細胞増殖の程度を低下させる能力は、疾患の状態とは関係がないことが見出された。活性または不活性なＳＬＥを有する患者におけるＢ細胞増殖の低下の程度は、ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ＧＡＨ抗μ）のみの存在下で観察された増殖に対して約４０％であり、したがって、疾患状態とは関係がなかった（図５Ｃ）。図５Ｃでは、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディの方が、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ（ＡＢＤ）ダイアボディよりも大きい阻害を提供したことを、さらに実証している。
【実施例５】
【０１１４】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、インビボでＢ細胞の応答を調節する。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、Ｂ細胞による免疫系のシグナル伝達を減弱させるまたは阻害する能力をさらに実証するために、ヒトＰＢＭＣを、免疫欠損のＮＳＧマウスに注射した（Agliano、A.ら、（２００８）「Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-Related Strains」、Int.J.Cancer 123(9)：２２２２−２２２７；Sanchez、P.V.ら、（２００９）「A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia」、Leukemia 23(11)：２１０９−２１１７；Racki、W.J.ら、（２０１０）「NOD-Scid IL2rgamma(Null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection」、Transplantation 89(5)：５２７−５３６；Choi、B.ら、（２０１１）「Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/SCID/IL-2Rγ(Null)(NSG) Mice Conditioned By Busulfan」、J.Clin.Immunol.31(2)：２５３−２６４；Sartelet、H.ら、（２０１２）「Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/Il2rg Null(NSG) Mice」、In Vivo 26(1)：１９−２９；Spranger、S.ら、（２０１２）「NOD/scid IL-2Rg(null)Mice:A Preclinical Model System To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo」、J.Transl.Med.10：３０；von Bonin、M.ら、（２０１３）「in vivo Expansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice」、PLoS One.8(4)：ｅ６０６８０）。動物には、対照ビヒクル（１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／動物、ｑ３ｄ×２週）、上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ（１００μｌ／動物、ｑ３ｄ×２週）、またはＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディ（２つのポリペプチド鎖のみから構成されており、かつアルブミン結合ドメインを含んでいる）を投与した。血漿は、その両方とも移植片対宿主病の発現の指標である、ヒトＩｇＭ（図６Ａ）またはヒトＩｇＧ（図６Ｂ）の存在下で７日および１４日にＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１１５】
対照ビヒクルを投与されたマウスは、高レベルのヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧを呈した。対照的に、このような抗体は、上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを投与されたマウスでは本質的に検出されなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディを投与されたマウスは、対照ビヒクルを投与されているマウスと比較して低下したレベルのヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧを呈したが、このようなレベルは、ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディを投与されたマウスでのレベルよりも実質的に高かった。これらの知見によって、二重特異性の一価のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂダイアボディは、治療有用性および有効性を有するが、予想外なことに、本発明の上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディは、非Ｆｃダイアボディよりも優れており、より大きい治療有用性および有効性を保有することが実証されたのである（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【実施例６】
【０１１６】
ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂ二重特異性の一価のＦｃダイアボディは、マウスにおいて異種のＧｖＨＤを低下させる。
本発明のＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディが、Ｂ細胞による免疫系のシグナル伝達を減弱させるまたは阻害する能力をさらに実証するために、ヒトＰＢＭＣ（５×１０6細胞、静脈内注射）を免疫不全のＮＯＤ．ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγヌル（ｎｕｌｌ）ＮＳＧマウスに注射した。動物に、対照ビヒクル（１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／動物）、上記の好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディ（５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれか）または抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ；５ｍｇ／ｋｇ；１回用量）を投与した。マウスの累積的生存を経時的に測定した。図７に示されるとおり、好ましいＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９ｂのＦｃダイアボディのいずれかの用量を投与されている動物は、ＰＣＳ対照またはリツキシマブのいずれかを投与されているマウスに対して生存の顕著な向上を示した。
【０１１７】
本明細書において言及した刊行物および特許はすべて、各々の個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照によりその全体を援用すると示された場合と同じ範囲で、と参照により本明細書に援用される。本発明はその特定の実施形態に関連して説明されてはいるが、本発明は追加の改変が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野内で公知のまたは習慣的な慣行内に収まり、上文に記載された本質的特徴に適用され得るような、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図していることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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