(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができるペプチドであって、以下のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド: MOG 41-55（配列番号１）、MOG 44-58（配列番号３）およびMOG 45-59（配列番号４）から選択される、ペプチド。
【請求項２】
MOG 41-55（配列番号１）である、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
インビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができるペプチドを含む、脱髄疾患の治療および／または予防のための医薬組成物であって、前記ペプチドが、以下のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド: MOG 41-55（配列番号１）、MOG 43-57（配列番号２）、MOG 44-58（配列番号３）およびMOG 45-59（配列番号４）から選択される、医薬組成物。
【請求項４】
該疾患が多発性硬化症である、請求項3記載の医薬組成物。
【請求項５】
脱髄疾患の予防および／または治療における使用のための医薬の製造における、インビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができるペプチドであって、以下のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド: MOG 41-55（配列番号１）、MOG 43-57（配列番号２）、MOG 44-58（配列番号３）およびMOG 45-59（配列番号４）から選択されるペプチドの使用。
【請求項６】
該疾患が多発性硬化症である、請求項5記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）由来のペプチドに関する。特に、本発明は、MHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくインビトロでT細胞に提示されることができるペプチドであって、MOGの領域40-60の一部を含むペプチドに関する。本発明はまた、疾患の治療および／または予防におけるそのようなペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（MS）は、神経軸索の脱髄により特徴づけられる、中枢神経系を冒す慢性変性疾患である。MSは多くの身体的および精神的症状を引き起こす可能性があり、しばしば、身体障害および認知障害の両方へと進行する。発病は、通常、若い成人（20〜40歳）において生じ、女性でより多く見られ、世界中で百万人以上が罹患している。
【０００３】
MSの疾患経過は様々であり、潜伏状態となったり、あるいは経時的に徐々に進行しうる。MSの幾つかの亜型が進行パターンに基づいて記述されている。MS患者は、ほぼ全ての神経症状または徴候、例えば感覚の変化、例えば感度の喪失、うずき、チクチクする痛み、またはしびれ（感覚鈍麻および感覚異常）、筋力低下、クローヌス、筋痙攣、または運動困難；協調運動困難および平衡困難（運動失調）、発語障害（構音障害）または嚥下障害（嚥下困難）、視覚障害（眼振、視神経炎、例えば光視、または複視）、疲労、急性または慢性疼痛、ならびに膀胱および腸障害を患いうる。
【０００４】
MSは、現在、身体自身の免疫系がミエリンを攻撃し損傷する免疫媒介性障害であると考えられている。
【０００５】
MSに対する公知の治療法は存在しない。幾つかの現在の治療法は、攻撃（再発）後の機能の回復、新たな攻撃（再発）の程度または頻度の予防または軽減、あるいは障害の度合の予防または軽減において有益であることが判明している。しかし、多くの現在のMS治療法は有害な副作用を伴っており、または忍容性が低い。したがって、MSの治療およびMSの症状の緩和または軽減に有効である、MSに対する代替的治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、T細胞に対して一定の抗原提示細胞により提示されうる、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質から誘導可能な幾つかのペプチドを同定した。これらのペプチドは多発性硬化症のような脱髄疾患の予防および／または治療において有用でありうる。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、インビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができるペプチド（すなわち、アピトープ）であって、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）の領域40-60の一部を含むペプチドを提供する。
【０００８】
該ペプチドはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の領域41-59の一部を含みうる。
【０００９】
該ペプチドは、以下のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド: MOG 41-55、43-57、44-58および45-59から選択されうる。
【００１０】
該ペプチドはMOG 41-55でありうる。
【００１１】
第2の態様においては、脱髄疾患の治療および／または予防における使用のための、本発明の第1の態様に従うペプチドを提供する。
【００１２】
第3の態様においては、本発明は、本発明の第1の態様に従う1以上のペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
第4の態様においては、本発明は、脱髄疾患の治療および／または予防を要する対象における脱髄疾患の治療および／または予防方法であって、本発明の第1の態様に従うペプチドをその対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
第5の態様においては、本発明は、脱髄疾患の予防および／または治療における使用のための医薬の製造における、本発明の第1の態様に従うペプチドの使用に関する。
【００１５】
本発明の第2、第4および第5の態様に関しては、該疾患は多発性硬化症でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、種々のMOG特異的ハイブリドーマクローンのペプチド特異性を示すグラフである。
【図２】図2は、MOG35-55での免疫前のROK5（MOG 41-55）でのマウスの処置およびその後のMOG35-55でのインビトロ呼び戻し（recall）の効果を試験するための呼び戻し増殖アッセイの結果を示す。
【図３】図3は、ROK5またはPBSでインビトロで前処置され、MOG35-55で免疫化され、その後MOG35-55でのインビトロ呼び戻しに付されたマウスからの脾細胞からの上清からのサイトカインプロファイルを示す。
【図４】図4はインビトロEAE予防プロトコールを図示する。
【図５】図5は、ペプチドMOG35-55がマウスモデルにおいてEAEを誘発することを示す。
【図６】図6は、マウスおよびヒトROK5アピトープの両方が、MOG35-55により誘発される疾患の重症度を低減しうることを示す。
【図７】図7は、huROK5が疾患の重症度を低減し、疾患負荷のピークの遅延を引き起こしたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
第1の態様において、本発明はペプチドに関する。
【００１８】
ペプチド
「ペプチド」なる語は、典型的には隣接アミノ酸のα-アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連結された一連の残基、典型的にはL-アミノ酸を意味する通常の意味で用いられている。この用語は修飾ペプチドおよび合成ペプチド類似体を含む。
【００１９】
本発明のペプチドは、主要組織適合性複合体（MHC）クラスIまたはII分子にインビトロで結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができる長さのものである。換言すれば、該ペプチドは、一方または両方の末端における何らのトリミングをも要することなくMHC分子のペプチド結合溝内に直接結合することができる。
【００２０】
MHCクラスI分子に結合するペプチドは典型的には7〜13、より通常は8〜10アミノ酸長である。該ペプチドの結合は、全MHCクラスI分子のペプチド結合溝内の不変部位と該ペプチドの主鎖内の原子との間の接触により、その２つの末端において安定化される。該ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に結合する、該溝の両末端に不変部位が存在する。ペプチド長の変動は、要求される柔軟性を可能にするプロリンまたはグリシン残基に位置することが多い、ペプチドバックボーン中のキンキング（kinking；ねじれ）により調整される。
【００２１】
MHCクラスII分子に結合するペプチドは典型的には8〜20アミノ酸長、より通常は10〜17アミノ酸長である。これらのペプチドは、（MHCクラスIペプチド結合溝とは異なり）両末端で開いているMHC IIペプチド結合溝に沿った伸ばされたコンホメーションで存在する。該ペプチドは、主に、ペプチド結合溝に沿って並んだ保存残基との主鎖原子接触により、適所に保持される。
【００２２】
本発明のペプチドは、化学的方法（Peptide Chemistry, A practical Textbook.  Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.）を用いて製造されうる。例えば、ペプチドは固相技術（Roberge JYら (1995) Science 269: 202-204）により合成され、樹脂から切断され、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製されうる（例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。例えばABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を、製造業者により提供される説明書に従い使用して、自動合成が達成されうる。
【００２３】
該ペプチドは代替的に組換え手段により、またはより長いポリペプチドからの切断により製造されうる。例えば、該ペプチドはミエリン塩基性タンパク質からの切断により得られうる。ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解法）により確認されうる。
【００２４】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）は、単一の細胞外Ig可変ドメイン（Ig-V）を有するI型内在性膜タンパク質である。MOGのアミノ酸配列は動物種間で高度に保存されており（>90％）、これは重要な生物学的機能を示唆している。MOGは、CNSにおいて、ミエリン鞘の最外ラメラならびにオリゴデンドロサイトの細胞体および突起上で特異的に発現される。
【００２５】
成熟MOG（29アミノ酸のシグナルペプチドを欠く）の配列を以下に示す（配列番号5）。
配列番号5
GQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLLQITVGLVFLCLQYRLRGKLRAEIENLHRTFDPHFLRVPCWKITLFVIVPVLGPLVALIICYNWLHRRLAGQFLEELRNPF
【００２６】
本発明のペプチドはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）の領域40-60から誘導可能である。該ペプチドは、抗原提示細胞による該抗原の自然プロセシングにより生じる抗原の断片から誘導可能でありうる。
【００２７】
MOGの領域40-60は以下の配列を有する。
配列番号6
YRPPFSRVVHLYRNGKDQDGD
【００２８】
該ペプチドは以下のペプチド：MOG 41-55、43-57、44-58および45-59に由来する最小エピトープを含みうる。
【００２９】
MOG 41-55、43-57、44-58および45-59の配列は以下のとおりである。
MOG 41-55: RPPFSRVVHLYRNGK (配列番号1)
MOG 43-57: PFSRVVHLYRNGKDQ (配列番号2)
MOG 44-58: FSRVVHLYRNGKDQD (配列番号3)
MOG 45-59: SRVVHLYRNGKDQDG (配列番号4)。
【００３０】
該ペプチドはMOG 41-55由来の最小エピトープを含みうる。該ペプチドはMOG 41-55からなるものでありうる。
【００３１】
アピトープ
適応免疫応答においては、Tリンパ球はタンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞（APC）はタンパク質抗原を取り込み、それらを短いペプチド断片へと分解する。ペプチドは細胞内で主要組織適合性複合体（MHC）クラスIまたはII分子に結合し、細胞表面に運ばれうる。該ペプチドは、MHC分子と共に細胞表面に提示されると、（T細胞受容体（TCR）を介して）T細胞により認識されることが可能であり、この場合、該ペプチドはT細胞エピトープである。
【００３２】
T細胞エピトープは、自己のものであれ外来のものであれ任意の抗原に対する適応免疫応答における中心的な役割を果たす。過敏性疾患（これはアレルギー、自己免疫疾患および移植拒絶を含む）においてT細胞エピトープにより果たされる中心的な役割は実験モデルの使用により実証されている。アジュバントと組み合わせた合成ペプチド（T細胞エピトープの構造に基づくもの）の注射により炎症またはアレルギー疾患を誘発することが可能である。
【００３３】
これとは対照的に、可溶性形態のペプチドエピトープの投与により、個々のペプチドエピトープに対する免疫寛容を誘発することができることが示されている。可溶性ペプチド抗原の投与は、実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE - 多発性硬化症（MS）のモデル）（MetzlerおよびWraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; LiuおよびWraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; AndertonおよびWraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261）、ならびに関節炎、糖尿病および網膜ブドウ膜炎の実験モデル（前記のAndertonおよびWraith (1998)において概説されている）において、疾患を抑制する有効な手段として実証されている。これは、EAEにおいて、進行中の疾患を治療する手段としても実証されている（前記のAndertonおよびWraith (1998)）。
【００３４】
疾患を治療または予防するための免疫寛容誘発ペプチドの使用は相当な注目を集めている。この1つの理由は、ある免疫寛容誘発エピトープが同じ組織内の異なる抗原に対するT細胞の応答をダウンレギュレーションしうることが示されていることである。この現象は「バイスタンダー現象」として公知であり、特定の免疫寛容誘発ペプチドを使用して、所与の抗原内の2以上のエピトープ（好ましくは全てのエピトープ）に対する、そして所与の疾患に関する2以上の抗原に対する寛容を誘発することができるはずであることを意味する（前記のAndertonおよびWraith (1998)）。これは、個々の疾患における病原性抗原の全てを特定する必要性をなくすであろう。
【００３５】
ペプチドはまた、それらの比較的低いコストおよび改変された免疫学的特性を有するペプチド類似体を製造できるという事実のため、治療法のための好ましい選択肢である。したがって、ペプチドは、MHCまたはTCRとのそれらの相互作用を改変するために修飾されうる。
【００３６】
このアプローチに関する1つの考えられうる問題は、T細胞エピトープとして作用する全てのペプチドが寛容を誘発できるわけではないことが示されていることである。ミエリン塩基性タンパク質（MBP）ペプチド89-101は免疫化後の免疫優性抗原であり、T細胞反応性のためのプライミングおよびEAEの誘発の両方の点で非常に効果的な免疫原でもある。しかし、このペプチドは、溶液状態で投与された場合、寛容を誘発するのに無効であることが示されている（前記のAndertonおよびWraith (1998)）。
【００３７】
寛容を誘発するT細胞エピトープの能力における観察された階層に関する幾つかの説明が提案されている（前記のAndertonおよびWraith (1998)において概説されている）。特に、MHCに対する該ペプチドのアフィニティと免疫寛容誘発性との間に相関性が存在することが提案されているが（前記のLiuおよびWraith (1995)）、これは観察の幾つかとは合致しない。例えば、MBP［89-101］は免疫寛容誘発性ではなく、比較的高いアフィニティでI-ASに結合する。したがって、どのペプチドが免疫寛容を誘発するのかを予測することは容易ではない。
【００３８】
ペプチドエピトープが、抗原プロセシングを受けることなく未熟APCにより提示されるのに適当なサイズを有する場合、それは免疫寛容を誘発できることを、本発明者らは示した（国際特許出願番号PCT/GB01/03702）。したがって、免疫寛容誘発性であるT細胞エピトープもあれば、免疫寛容を誘発できないものもあるという観察は、幾つかのエピトープはそれらがMHC分子により提示されうる前に抗原プロセシングを要することにより説明されうる。更なるプロセシングを要するこれらのエピトープは、アジュバントと共に注射された場合には疾患を誘発する能力をそれらが有するにもかかわらず、可溶性形態で投与された場合には寛容を誘発しない。
【００３９】
更なるプロセシングを要しないエピトープは寛容を誘発することができ、「アピトープ（apitope）」（抗原プロセシング非依存的エピトープ（Antigen Processing Independent epiTOPES））と本発明者らにより称されてきた。
【００４０】
抗原プロセシング非依存的提示系（APIPS）
本発明のペプチドはインビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができる。
【００４１】
「無プロセシング」系を使用して、抗原プロセシングを受けることなくMHC分子にペプチドが結合しうるかどうかを試験することができる。そのような系はMHC分子を介してT細胞に抗原を提示できるはずであるが、抗原をプロセシングすることはできない。したがって、ペプチドは、インビトロでのMHC分子へのその結合能、および抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示される能力に関して、抗原プロセシング非依存的提示系（APIPS）を使用して試験されうる。
【００４２】
APIPSの例には以下のものが含まれる。 
a）固定APC（CD28に対する抗体の存在下または非存在下）、
b）クラスIまたはII MHC分子を含有する脂質膜（CD28に対する抗体の存在下または非存在下）、
c）プレート結合形態の、精製された天然または組換えMHC（CD28に対する抗体の存在下または非存在下）。
【００４３】
例えば、末端切断型ペプチドに対する応答を測定することによりポリペプチド内の最小エピトープを調べるための研究において、T細胞応答を調べるために固定APCを使用することが公知である（Fairchildら (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043）。APCは、例えば、ホルムアルデヒド（通常はパラホルムアルデヒド）またはグルタルアルデヒドを使用して固定されうる。
【００４４】
脂質膜（これは平面膜またはリポソームでありうる）は、人工脂質を使用して調製可能であり、またはAPC由来の細胞膜／ミクロソーム画分でありうる。
【００４５】
使用においては、APIPSは組織培養プレートのウェルに適用されうる。ついでペプチド抗原を加え、APIPSのMHC部分への該ペプチドの結合を、選択されたT細胞系またはクローンの添加により検出する。T細胞系またはクローンの活性化は、当技術分野で公知の方法のいずれかにより、例えば3H-チミジン取り込み又はサイトカイン分泌により測定されうる。
【００４６】
ペプチドがAPIPSによりT細胞に提示されうる場合、それは抗原プロセシングを受けることなくMHC分子に結合することができ、それはアピトープである。
【００４７】
寛容
本発明のペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）に対する寛容を誘発しうる。
【００４８】
本明細書中で用いる「寛容誘発性」なる語は、寛容を誘発できることを意味する。
【００４９】
寛容は、抗原に応答しないことである。自己抗原に対する寛容は免疫系の必須の特徴であり、これが失われると、自己免疫疾患が生じうる。適応免疫系は、自分自身の組織内に含有される自己抗原の自己免疫攻撃を回避しながら多種多様な感染因子に応答する能力を維持する必要がある。これは大部分は、胸腺内のアポトーシス細胞死に対する未熟Tリンパ球の感受性により制御される（中枢性寛容）。しかし、全ての自己抗原が胸腺内で検出されるわけではなく、したがって自己反応性胸腺細胞の死は不完全なままである。したがって、末梢組織内の成熟自己反応性Tリンパ球により寛容が獲得されうるメカニズムも存在する（末梢寛容）。中枢性および末梢寛容のメカニズムの総説はAndertonら (1999) (Immunological Reviews 169:123-137)に記載されている。
【００５０】
寛容は、CD4+ T細胞の少なくとも一部において、アネルギーの誘導により生じるか又は特徴づけられうる。T細胞を活性化するために、ペプチドは、2つのシグナルをT細胞に送出できる「専門的（professional）」APCと結合する必要がある。第1シグナル（シグナル1）はAPCの細胞表面上のMHC-ペプチド複合体により送出され、TCRを介してT細胞により受領される。第2シグナル（シグナル2）はCD80およびCD86のようなAPC表面上の共刺激分子により送出され、T細胞の表面上のCD28により受領される。T細胞がシグナル2の非存在下でシグナル1を受領したら、それは活性化されず、実際にはアネルギー性になると考えられている。アネルギー性T細胞は後続の抗原チャレンジに対して無反応性であり、他の免疫応答を抑制する能力を有しうる。アネルギー性T細胞はT細胞寛容の媒介に関与していると考えられている。
【００５１】
MHC分子と共に提示されうる前にプロセシングを要するペプチドは寛容を誘発しない。なぜなら、それらは成熟抗原提示細胞により取り扱われる必要があるからである。成熟抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、B細胞および樹状細胞）は抗原プロセシングの能力を有するだけでなく、シグナル1および2の両方をT細胞に送出してT細胞活性化を引き起こしうる。一方、アピトープは未熟APC上のクラスII MHCに結合できるであろう。したがって、それらは共刺激を伴うことなくT細胞に提示されて、T細胞アネルギーおよび寛容を招くであろう。
【００５２】
勿論、アピトープは成熟APCにおける細胞表面のMHC分子にも結合することができる。しかし、免疫系は、成熟APCよりも多い存在量の未熟APCを含有する（樹状細胞の10％未満しか活性化されていないと示唆されている；Summersら (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295）。したがって、アピトープに対する初期設定（default position）は活性化ではなくアネルギー／寛容であろう。
【００５３】
ペプチド吸入により寛容が誘発されると、抗原特異的CD4+ T細胞の増殖能が低下することが示されている。また、これらの細胞によるIL-2、IFN-γおよびIL-4の産生はダウンレギュレーションされるが、IL-10の産生は増加する。ペプチド誘発性寛容の状態のマウスにおけるIL-10の中和は疾患に対する感受性を完全に回復させることが示されている。調節細胞の集団は、IL-10を産生し免疫調節を引き起こす寛容状態において持続することが提案されている（Burkhartら (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634）。
【００５４】
したがって、寛容の誘発は、以下のものを含む種々の技術によりモニターされうる：
（a）該ペプチドがインビボにおける標的エピトープである疾患に罹る感受性の低下；
（b）CD4+ T細胞におけるアネルギーの誘導（これはインビトロにおける抗原での後続チャレンジにより検出されうる）；
（c）以下のものを含むCD4+ T細胞集団における変化：
（i）増殖の低減；
（ii）IL-2、IFN-γおよびIL-4の産生のダウンレギュレーション；
（iii）IL-10の産生の増加。
【００５５】
標的疾患
本発明のペプチドは疾患の治療および／または予防において使用されうる。該疾患は脱髄疾患、例えば副腎白質ジストロフィー、VWM型白質脳症（vanishing white matter disease）または多発性硬化症（MS）でありうる。
【００５６】
本発明のペプチドは多発性硬化症（MS）の治療および／または予防において特に有用である。多発性硬化症（MS）は、種々の部位および時期で見出されCNS白質の全体に散在する複数の脱髄病変により特徴づけられる慢性炎症疾患である（McFarlinおよびMcFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188および1246-1251）。MSは自己反応性T細胞により引き起こされると考えられている。
【００５７】
医薬組成物
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の1以上のペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明者らは、「バイスタンダー抑制（bystander suppression）」にもかかわらず、寛容を効果的に誘発するためには幾つかの異なるT細胞クローンを標的化することが必要かもしれないと予想している。したがって、疾患を予防または治療するために、複数のペプチドが個体に投与されうる。
【００５９】
該医薬組成物は、例えば、1〜20個のアピトープ、例えば、1〜15個、2〜8個または4〜6個のアピトープを含みうる。
【００６０】
2以上のアピトープが存在する場合、該医薬組成物はキットの形態であってよく、この場合、アピトープの幾つか又はそれぞれは同時投与、別々の投与または連続投与のために別々に提供される。
【００６１】
その代わりに（またはそれに加えて）、該医薬組成物（またはそのいずれかの部分）を複数回用量で投与しようとする場合には、各用量は別々にパッケージ（包装）されうる。
【００６２】
該医薬組成物は、そのアピトープまたは各アピトープの治療的または予防的に有効な量と、所望により、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含みうる。
【００６３】
また、本発明の医薬組成物においては、そのアピトープまたは各アピトープは任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤と混合されうる。
【００６４】
投与
該ペプチドはアジュバントの非存在下で可溶性形態で投与されうる。
【００６５】
該ペプチドは粘膜経路により投与されうる。
【００６６】
ペプチドは、可溶性形態で腹腔内（i.p.）、静脈内（i.v.）または鼻腔内（i.n.）または経口的に投与された場合、T細胞寛容を誘発しうることを、研究は示している（前記のAndertonおよびWraith (1998); 前記のLiuおよびWraith (1995); MetzlerおよびWraith (1999) Immunology 97:257-263）。
【００６７】
該ペプチドは鼻腔内に投与されうる。
【００６８】
マウスにおける研究は、寛容を誘発するために要するペプチド投与の持続期間がレシピエントにおけるT細胞の前駆体頻度に依存することを示している（前記のBurkhartら (1999)）。多数の実験研究において、寛容を誘発するためにはペプチドの反復投与が必要であることが示されている（前記のBurkhartら (1999)）。したがって、ペプチドの厳密な用量および投与回数は個体によるが、好ましい実施形態においては、複数の用量が投与される。
【００６９】
複数のペプチドが同時に投与される場合、それらは、単一または複数の用量の投与に適した「カクテル」の形態でありうる。あるいは、複数用量を投与することが好ましいかもしれないが、用量相互間の該ペプチドの相対濃度を変化させることが好ましいかもしれない。
【００７０】
好ましい実施形態においては、「用量漸増」法を用い、この場合、複数の用量を、次第に増加する濃度で患者に投与する。そのようなアプローチは、例えば、ハチ毒アレルギーに対する免疫療法適用において、ホスホリパーゼA2ペプチドに関して用いられている（Mullerら (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754およびAkdisら (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106）。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は特に、これらの実施例に記載されている特定の実施形態に関するものである。
【００７２】
実施例1 - ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）内のアピトープの同定
材料および方法
抗原
細胞外ドメインに相当するヒトMOGの125アミノ酸のN末端部分をコードする核酸配列を細菌発現ベクター（pET系）内にクローニングした。この組換えヒトMOG細胞外ドメイン（rhMOGED）をC末端にHisタグを有する融合タンパク質として細菌系内で発現させた。
【００７３】
rhMOGEDにまたがる15マー重複ペプチドの一群を、標準的なF-moc化学法を用いて合成した。該15マーペプチド群は5アミノ酸ずつずらされており、10アミノ酸ずつ重複しているものであった。
【００７４】
T細胞クローンの作製
MOG特異的ハイブリドーマT細胞クローンをDR2+マウスの免疫化により作製した。DR2+マウスを完全フロイントアジュバント（CFA）中のrhMOGEDまたはMOG重複ペプチドのプールで免疫化した。10日後、脾臓および流入領域リンパ節を摘出し、CD4+ T細胞を精製し、インビトロで抗原／CFAで再刺激した。1週間後、T細胞をインビトロで抗原で再刺激して、活性化抗原特異的細胞の数を増加させた。
【００７５】
3日後、活性化T細胞を胸腺腫細胞系BW 5147と融合させた。ついでハイブリドーマクローンを、HAT選択培地を使用して選択し、IL-2 ELISAによりペプチド特異性に関してスクリーニングした。
【００７６】
増殖アッセイ
生きた又はp-ホルムアルデヒド固定Mgar（HLA-DR2 +ve）細胞を、T細胞と共に、血清単体中、または血清中のペプチドと共に48時間インキュベートした。T細胞増殖応答をIL-2産生により測定した。
【００７７】
結果
ネスティッドMOGペプチドの提示に対する種々のMOG特異的ハイブリドーマクローンの応答を図1に示す。ペプチドMOG 41-55（「ROK5」）はアピトープと定められたが、それは、更なるプロセシングを受けることなく、固定APCによりT細胞に提示されることが可能だったからである。ついで、1つのアミノ酸ずつずれているペプチド群を使用して、領域25-60における重複ペプチドを使用して詳細な研究を行った。ペプチドMOG 41-55、43-57、44-58および45-59がアピトープとして同定された（図1）。
【００７８】
これらのペプチドの配列を表1に示す。
【表１】
0006347065.tif 000002
【００７９】
実施例2 - エクスビボ寛容アッセイ
アピトープとして同定されたペプチドが抗原に対する寛容を誘発できるかどうかを決定するために、エクスビボ（ex vivo）研究を行った。HLA-DR2トランスジェニックマウスを100μgのROK5 (MOG 41-55)、100μgのMOG 35-55またはPBSで第-8日、第-4日および第-2日に免疫化した。第0日に、尾基底部への注射により、CFAと組み合わせた100μgのMOG 35-55でマウスをチャレンジした。
【００８０】
第10日に、脾細胞および流入領域リンパ節を収集し、それらのそれぞれの細胞集団を単離し、呼び戻し（recall）増殖アッセイをMOG 35-55で準備した。個々のマウスからの細胞を別々に処理し、データは図2において別々にプロットされている。該呼び戻し（recall）応答のために、MOG35-55（100、10、1、0.1、0.01、0μg）の用量範囲で細胞をエクスビボで処理し、3H-チミジン取り込みにより増殖を測定した。刺激指数（抗原の非存在下の増殖と比較したもの）を各条件に関して計算した。
【００８１】
図2に示されているとおり、ROK5（MOG 41-55）はMOG 35-55でのチャレンジに対する免疫応答を抑制することができた。
【００８２】
種々のサイトカインプロファイルに対するROK5前処理の効果も調べた。図3に示されているとおり、脾細胞によるIFNγ、IL-2、GM-CSF、IL6の産生はROK5前処理により明らかに影響を受けている。
【００８３】
実施例3 - ROK5 EAEの予防
EAE（実験的自己免疫脳脊髄炎）は、広範に研究されているMSモデルであり、強力なアジュバント中のミエリンまたはミエリン成分（MOGを含む）での免疫化により多種多様な遺伝的感受性の実験動物種（げっ歯類および霊長類を含む）において誘発されうる。
【００８４】
HLA-DR2トランスジェニックマウスにおいてMOG誘発性EAEを予防するROK5の能力を試験するために、該疾患モデルをこのマウス系統において確立した。該疾患を誘発するために、脳炎惹起性MOGペプチドであるマウスMOG 35-55（mMOG35-55）を使用した。ついでROK5をEAE予防実験において以下のとおりに試験した。
【００８５】
実験1: 3回用量ROK5前処理およびそれに続くmMOG35-55での免疫化。 
実験2: 5回用量ROK5前処理およびそれに続くmMOG35-55での免疫化。
【００８６】
各実験において、1群当たり10匹のマウスを使用した。
【００８７】
ペプチド配列:
mMOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (配列番号7)
hROK5 (41-55): RPPFSRVVHLYRNGK (配列番号1)
mROK5 (41-55): RSPFSRVVHLYRNGK (配列番号8)
【００８８】
ヒトMOGとマウスMOGとは42位のアミノ酸置換（プロリンからセリンへの置換）により異なっている。両方のMOG35-55ペプチドは免疫原性であるが、マウスMOG35-55はより脳炎惹起性であり、したがってマウスMOG35-55を、該モデルにおいてEAEを誘発するために選択した。
【００８９】
インビボEAE予防法を図4Aおよび4Bに示す。
【００９０】
MOG誘発性EAEモデル:
2群のDR2トランスジェニックマウスを準備し、第0日に、「100μg」群の動物（n=7）には完全フロイントアジュバント（CFA）中の100μgのmMOG35-55を投与し（100μl, 皮下（s.c.）, 尾基底部への注射）、「200μg」群の動物（n=8）にはCFA中の200μgのmMOG35-55を投与した。第0日および第2日に、全ての動物に百日咳毒素（PBS中の200mg, 腹腔内（i.p.））の注射を行った。毎日、臨床的EAEを評価し、動物の体重を測定した。
【００９１】
以下の図5A、5Bおよび表2に示されているとおり、mMOG35-55の両方の用量が良好な頻度でEAEを誘発できる。
【表２】
0006347065.tif 000003
【００９２】
ROK5 EAE予防実験:
これに基づいて、MOG誘発性EAEを予防するROK5の能力を試験した。
【００９３】
A / 第1実験
第1実験を行った。この実験では、マウスROK5、ヒトROK5またはPBS（CFA中の100μl中の100μg）で動物を3回（3日間隔）前処理し（脇腹への皮下（s.c.）注射）、ついで第0日および第2日に、全ての動物をCFA中の200μgのmMOG35-55（尾基底部への皮下（s.c.）注射）で、および200ngの百日咳毒素（PBS中の200ng, 腹腔内（i.p.））で免疫化した。
【００９４】
毎日、臨床的EAEをスコアリングし、動物の体重を測定した。図6は、マウスROK5アピトープおよびヒトROK5アピトープが共に、MOGに誘発された疾患の重症度を低減できることを示している。興味深いことに、ヒトROK5はより有効である。
【００９５】
図6Aおよび6Bに示されているとおり、実験1は、マウスROK5アピトープおよびヒトROK5アピトープが共に、MOG35-55により誘発された疾患の重症度を低減できることを示している。
【００９６】
B / 第2実験
第2実験を行った。この実験では、ヒトROK5またはPBS（CFA中の100μl中の100μg）で動物を5回（3日間隔）前処理し（脇腹への皮下（s.c.）注射）、ついで第0日および第2日に、全ての動物をCFA中の200μgのmMOG35-55（尾基底部への皮下（s.c.）注射）で、および200ngの百日咳毒素（PBS中の200ng, 腹腔内（i.p.））で免疫化した。毎日、臨床的EAEをスコアリングした。
【００９７】
実験2（図7）においては、huROK5は疾患の重症度を低減し、疾患負荷のピークの遅延を引き起こした。
【００９８】
結論としては、ヒトROK5アピトープは両方のEAE実験において疾患重症度を低減することができた。
【００９９】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法および系の種々の修飾および変更が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求している本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、化学または分子生物学または関連分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための記載されている態様の種々の修飾が、本発明に含まれると意図される。前記の本明細書に挙げられている全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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