(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材及び前記基材上に配置された支持型脂質二重層（supported lipid bilayer；SLB）を含む人工細胞膜（artificial cell membrane）において、
前記支持型脂質二重層は、脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、第１のリガンドが結合された第１の脂質と、前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３の脂質とを含み、
前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを１００〜１００，０００個／μｍ２以上の密度で含む第１の金属粒子は、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの結合を通じて２つ以上の前記第１の脂質と結合し、平均０〜０．５×１０−８ｃｍ２／ｓｅｃまで前記支持型脂質二重層での前記第１の金属粒子の移動性が減少し、
前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子は、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合し、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記第１の金属粒子に比べて前記第２の金属粒子は前記支持型脂質二重層での移動性が大きいことを特徴とする人工細胞膜。
【請求項２】
前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドは、それぞれ独立して抗原、抗体、リガンド、受容体、キレート、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、互いに特異的に結合する化学分子、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されるものである、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項３】
前記第２のリガンドは、チオール基を含み前記チオール基を通じて第１の金属粒子に共有結合されたものである、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項４】
前記第１の金属粒子は、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドとの間の抗原−抗体結合、リガンド−受容体結合、核酸混成化、キレート結合、共有結合または静電結合により脂質に結合されたものある、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項５】
前記第１の金属粒子は、粒子の大きさまたは形態に応じて固有の波長でプラズモン散乱を発生するものである、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項６】
前記第１のリガンドが結合された前記第１の脂質を前記支持型脂質二重層の全脂質に対して０．０５〜０．５モル％で含まれるものである、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項７】
前記支持型脂質二重層の全脂質に対して１〜１０モル％のポリエチレングリコールが結合された第２の脂質をさらに含むものである、請求項１に記載の人工細胞膜。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールの平均分子量は、５００〜２０００である、請求項７に記載の人工細胞膜。
【請求項９】
人工細胞膜を利用してＡ分子とＢ分子の相互作用を確認するための分析装置であって、
前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３の脂質を前記支持型脂質二重層が含む請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の人工細胞膜と、
前記人工細胞膜中の前記第１の金属粒子の表面上に結合されたＡ分子と、
前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であって、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合するとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子と、
前記人工細胞膜中の前記第２の金属粒子の表面上に結合されたＢ分子とを含み、
移動性が大きい前記第２の金属粒子が前記第１の金属粒子に接近して、前記Ａ分子と前記Ｂ分子の相互作用により、前記第２の金属粒子が前記第１の金属粒子に拘束されることを特徴とする分析装置。
【請求項１０】
前記Ａ分子及び前記Ｂ分子は、それぞれ独立してＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、リガンド、キレート、受容体、アプタマー、ポリマー、有機化合物、金属イオン及びポリペプチドで構成された群から選択される、請求項９に記載の分析装置。
【請求項１１】
前記Ａ分子と前記Ｂ分子の相互作用は、抗原−抗体結合、リガンド−受容体結合、核酸混成化、キレート結合、共有結合、及び静電結合で構成された群から選択される、請求項９に記載の分析装置。
【請求項１２】
前記第１の金属粒子は、前記支持型脂質二重層上に固定され、前記第２の金属粒子は、前記Ａ分子と前記Ｂ分子の間に相互作用がない場合、前記支持型脂質二重層上で２次元的自由ブラウン運動（2-dimensional brownian motion）が可能であることを特徴とする、請求項９に記載の分析装置。
【請求項１３】
請求項９に記載の分析装置を用いて、前記Ａ分子と前記Ｂ分子の相互作用を確認する、方法。
【請求項１４】
前記第１の金属粒子の位置及び前記第１の金属粒子による散乱強度または波長の変化をモニタリングすることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の金属粒子のリアルタイム移動軌跡または速度、または前記第２の金属粒子による信号の強度または波長の変化をモニタリングすることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記モニタリングは、前記第１の金属粒子のプラズモン散乱を測定することにより達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記モニタリングは、前記第２の金属粒子のプラズモン散乱を測定することにより達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、特定の方向に力を加えて粒子の密度を高め、粒子間の衝突頻度を増加させることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から前記第１の金属粒子と前記第２の金属粒子との間の距離を確認して前記Ａ分子と前記Ｂ分子の結合有無を確認するための分析キットであって、
基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第１の脂質及び第３の脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、前記第１の脂質には第１のリガンドが結合され、前記第３の脂質には前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合されている、人工細胞膜と、
前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子であって、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子と、
前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であって、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合可能であるとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子と
を含むことを特徴とする分析キット。
【請求項２０】
Ａ分子及びＢ分子と結合可能な標的物質の定性的または定量的分析のためのキットにおいて、
前記キットは、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から前記第１の金属粒子と前記第２の金属粒子との間の距離を確認し、前記標的物質を通じた前記Ａ分子と前記Ｂ分子の結合の有無を確認するためのものであり、
基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第１の脂質及び第３の脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、前記第１の脂質には第１のリガンドが結合され、前記第３の脂質には前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合されている、人工細胞膜と、
前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子であって、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子と、
前記第１の金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の一部分に特異的に結合するＡ分子と、
前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であって、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合可能であるとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子と、
前記人工細胞膜中の前記第２の金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の前記Ａ分子と結合しない他の部分に特異的に結合するＢ分子と
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２１】
前記標的物質、前記Ａ分子、前記Ｂ分子、前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドは、それぞれ独立して抗原、抗体、リガンド、受容体、キレート、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、互いに特異的に結合する化学分子及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されるものである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第１の金属粒子は、前記支持型脂質二重層上に固定され、前記第２の金属粒子は、前記標的物質を通じた前記Ａ分子と前記Ｂ分子の結合がない場合、前記支持型脂質二重層上で２次元的自由ブラウン運動（2-dimensional brownian motion）が可能であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記標的物質が存在する場合、前記Ａ分子及び前記Ｂ分子と前記標的物質の結合により、移動性が大きい前記第２の金属粒子が前記第１の金属粒子に接近して発生する前記第１の金属粒子の位置でプラズモン散乱信号の強度、波長、またはその両方の変化を測定するものである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
プラズモン散乱測定によるｉｍａｘ×ｍｍａｘ個の標的物質の定性的または定量的分析のための多重分析キット（ｉは１〜ｉｍａｘの整数であり、ｍは１〜ｍｍａｘの整数であり、ｉｍａｘ及びｍｍａｘはそれぞれ独立して１以上の整数であり、ｉｍａｘ＝ｍｍａｘ＝１を除く）であって、
前記多重分析キットは、
基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第Ｉｉ脂質及び第Ｍｍ脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置を移動可能であり、前記第Ｉｉ脂質には第Ｉｉリガンドが結合され、第Ｍｍ脂質には第Ｍｍリガンドが結合されている、人工細胞膜（ここで、前記第Ｉｉリガンド及び前記第Ｍｍリガンドは互いに同一または異なってもよい）と、
前記第Ｉｉリガンドに特異的に結合する、第Ｉ’ｉリガンドを含む第Ｉｉ金属粒子であって、前記第Ｉｉリガンドと前記第Ｉ’ｉリガンドの相互作用により１つ以上の前記第Ｉｉ脂質と結合する第Ｉｉ金属粒子と、
前記第Ｉｉ金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の一部分に特異的に結合するＡｉ分子と、
前記第Ｍｍリガンドに特異的に結合する第Ｍ’ｍリガンドを含む第Ｍｍの金属粒子であって、前記第Ｍｍリガンドと前記第Ｍ’ｍリガンドの相互作用により１つ以上の前記第Ｍｍ脂質と結合するとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第Ｉｉ金属粒子に比べて大きい第Ｍｍの金属粒子と、
前記人工細胞膜中の前記第Ｍｍの金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の前記Ａｉ分子と結合しない他の部分に特異的に結合するＢｍ分子とを含み、
前記一連の第Ｉｉ金属粒子らは、互いに異なるプラズモン散乱波長を有し、一連の第Ｍｍの金属粒子らも互いに異なるプラズモン散乱波長を有するものである、多重分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材及び前記基材上に、移動性が減少した金属粒子が結合された支持型脂質二重層（supported lipid bilayer；SLB）を含む人工細胞膜（artificial cell membrane）；前記人工細胞膜を含む分子間の相互作用を確認するための分析装置またはキットにおいて、一つの分子は、前記人工細胞膜に結合された移動性が減少した金属粒子の表面に結合され、他の分子は、低い結合価で脂質に結合された移動性が大きい金属粒子の表面に結合されたことを特徴とする分析装置；前記分析装置を用いて、分子間の相互作用を確認する方法；プラズモン散乱測定による前記人工細胞膜を含む標的物質の定量的または定性的分析用キット；及び異なるプラズモン散乱波長及び／または支持型脂質二重層上での移動性を有する複数の金属粒子を利用して複数の標的物質を検出することができる多重分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
単一ナノ粒子解像度（single-nanoparticle-resolution）の本来の場所（in situ）の測定は、動的な、個々のナノ粒子の時間依存的スナップショットを提供し、したがって、ナノ粒子間の不均一な相互作用を明らかにし、アンサンブルから区別することができる。このような接近法は、コロイドナノ結晶成長に関する直接的かつ詳細な情報と組立機構（assembly mechanism）及び反応速度論（reaction kinetics）を究明する。しかし、電子顕微鏡を含む既存の高解像度映像化方法は、一般的に本来の場所の情報なしに構造の静的な情報を提供し、複雑な装置及び極限の条件（例えば、真空）における過程を要求する。このような理由から、分子間相互作用に対する動力学的情報の収集には、蛍光体ベースの単一分子レベルでの光学映像化（fluorophore-based single-molecule-level optical imaging）及び分析方法が主に用いられる。しかし、これらの方法は、蛍光体が点滅（blinking）であり、漂白（bleaching）するという問題がある。また、蛍光標識を有する種々の成分の短い範囲内での分子の相互作用を識別することは非常に困難である。蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）を利用する際にも測定可能な距離は１０ｎｍに制限され、種々の成分を含むシステムに対する解釈は難解になる。これは、分子間及びナノ粒子間の相互作用のリアルタイム研究及び多くの分析物に対して再現可能であり、信頼性の高い定量データの取得において重要な問題である。これらの既存の高解像度光学分析法における他の重要な問題は、調整不可能な３次元的な動きと光学的にすべての関心物体を追跡することが不可能であるため、ダイナミックに動く物体を溶液状態で個別にかつ信頼できるように分析して研究することができないという事実である。一方、高解像度の光学分析のために、これらの物体を表面に固定した場合、これらの物体の動的挙動を研究することができないことを考慮しなければならない。このようなすべての理由により、単一粒子感受性（single-particle sensitivity）により自由に動くナノ粒子間の相互作用の本来の場所の映像化及び分析の方法を開発することは非常に有用である。相互作用する粒子の研究から、より信頼性の高い情報を得て、新たな原則を誘導するために、単一粒子レベルの定量データにより多重反応位置から相互作用を同時に追跡する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、粒子の自由な動きを確保しながら、２次元平面上で粒子間の相互作用を高解像度で観察できる方法を見出すために鋭意研究努力した結果、支持型脂質二重層（supported lipid bilayer；SLB）上にストレプトアビジン−ビオチン結合を通じて導入した金属粒子は、粒子上のビオチン結合価を調節することにより、粒子の流動性を調整することができ、前記金属粒子の表面に導入された相補的な配列のＤＮＡ鎖の相互作用による粒子間の相互作用に対する反応動力学を、単一粒子レベルの高解像度で追跡及び分析することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様は、基材及び前記基材上に配置された支持型脂質二重層（supported lipid bilayer；SLB）を含む人工細胞膜（artificial cell membrane）において、前記支持型脂質二重層は、脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、第１のリガンドが結合された第１の脂質と、前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３の脂質とを含み、前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを１００〜１００，０００個／μｍ２以上の密度で含む第１の金属粒子は、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの結合を通じて２つ以上の前記第１の脂質と結合し、平均０〜０．５×１０−８ｃｍ２／ｓｅｃまで前記支持型脂質二重層での前記第１の金属粒子の移動性が減少し、前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子は、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合し、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記第１の金属粒子に比べて前記第２の金属粒子は前記支持型脂質二重層内での移動性が大きいことを特徴とする人工細胞膜を提供する。
【０００５】
本発明の第２の態様は、人工細胞膜を利用してＡ分子とＢ分子の相互作用を確認するための分析装置において、前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３の脂質を前記支持型脂質二重層が含む前記第１の態様による人工細胞膜と、前記人工細胞膜中の前記第１の金属粒子の表面上に結合されたＡ分子と、前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であり、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合するとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子と、前記人工細胞膜中の前記第２の金属粒子の表面上に結合されたＢ分子を含み、移動性が大きい前記第２の金属粒子が前記第１の金属粒子に接近して、前記Ａ分子と前記Ｂ分子の相互作用により、前記第２の金属粒子が前記第１の金属粒子に拘束されることを特徴とする分析装置を提供する。
【０００６】
本発明の第３の態様は、前記第２の態様に応じた分析装置を用いて、前記Ａ分子と前記Ｂ分子の相互作用を確認する方法を提供する。
本発明の第４の態様は、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から前記第１の金属粒子と前記第２の金属粒子との間の距離を確認して前記Ａ分子と前記Ｂ分子の結合有無を確認するための分析キットにおいて、基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第１の脂質及び第３の脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、前記第１の脂質には第１のリガンドが結合され、前記第３の脂質には前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合されている人工細胞膜と、前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子であって、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子と、前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であって、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合可能であるとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子とを含むことを特徴とする分析キットを提供する。
【０００７】
本発明の第５の態様は、Ａ分子及びＢ分子と結合可能な標的物質の定性的または定量的分析のためのキットにおいて、前記キットは、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から前記第１の金属粒子と前記第２の金属粒子との間の距離を確認し、前記標的物質を通じた前記Ａ分子と前記Ｂ分子の結合有無を確認するためのものであり、基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第１の脂質及び第３の脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、前記第１の脂質には前記第１のリガンドが結合され、前記第３の脂質には前記第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合されている人工細胞膜と、前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子であって、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子と、前記第１の金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の一部分に特異的に結合するＡ分子と、前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子であって、前記第３のリガンドと前記第４のリガンドの相互作用により１つ以上の前記第３の脂質と結合可能であるとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第１の金属粒子に比べて大きい第２の金属粒子と、前記人工細胞膜中の前記第２の金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の前記Ａ分子と結合していない他の部分に特異的に結合するＢ分子とを含むことを特徴とするキットを提供する。
【０００８】
本発明の第６の態様は、プラズモン散乱測定によるｉｍａｘ×ｍｍａｘ個の標的物質の定性的または定量的分析のための多重分析キット（ｉは１〜ｉｍａｘの整数であり、ｍは１〜ｍｍａｘの整数であり、ｉｍａｘ及びｍｍａｘはそれぞれ独立して１以上の整数であり、ｉｍａｘ＝ｍｍａｘ＝１を除く）であって、前記多重分析キットは、基材と、支持型脂質二重層と、前記支持型脂質二重層中の一部分としての第Ｉｉ脂質及び第Ｍｍ脂質とを含む人工細胞膜であって、前記支持型脂質二重層は、前記基材上に配置されて脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、前記第Ｉｉ脂質には第Ｉｉリガンドが結合され、第Ｍｍ脂質には第Ｍｍリガンドが結合されている人工細胞膜（ここで、前記第Ｉｉリガンド及び前記第Ｍｍリガンドは互いに同一または異なってもよい）と、前記第Ｉｉリガンドに特異的に結合する第Ｉ’ｉリガンドを含む第Ｉｉ金属粒子であって、前記第Ｉｉリガンドと前記第Ｉ’ｉリガンドの相互作用により１つ以上の前記第Ｉｉ脂質と結合する第Ｉｉ金属粒子と、前記第Ｉｉ、金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の一部分に特異的に結合するＡｉ分子と、前記第Ｍｍ脂質リガンドに特異的に結合する第Ｍ’ｍリガンドを含む第Ｍｍの金属粒子であって、前記第Ｍｍリガンドと前記第Ｍ’ｍリガンドの相互作用により１つ以上の前記第Ｍｍ脂質と結合するとともに、金属粒子に結合されたリガンドの数を調節することにより、前記支持型脂質二重層での移動性が前記第Ｉｉ金属粒子に比べて大きい第Ｍｍの金属粒子と、前記人工細胞膜中の前記第Ｍｍの金属粒子の表面上に結合され、前記標的物質の前記Ａｉの分子と結合していない他の部分に特異的に結合するＢｍ分子とを含み、前記一連の第Ｉｉ金属粒子らは、互いに異なるプラズモン散乱波長を有し、一連の第Ｍｍの金属粒子らも互いに異なるプラズモン散乱波長を有するものである、多重分析キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の金属粒子が結合された支持型脂質二重層を含む人工細胞膜は、金属粒子上に結合されたリガンドの数を調節することにより、脂質上で金属粒子の移動性を調節することができ、したがって、移動性が異なる２つの金属粒子上に相互作用を分析しようとする標的分子をそれぞれ導入して前記人工細胞膜上に導入することにより、プラズモン散乱により金属粒子の動きをモニタリングして標的分子間の相互作用を分析することができる。この時、本発明の人工細胞膜とプラズモン散乱波長または脂質上で移動性が異なる複数の粒子を使用して複数の標的物質を同時に検出及び定量する多重分析が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰＮＰ（plasmon nanoparticle）プローブ上のビオチン化されたＤＮＡ配列の平均数を支持型脂質二重層（supported lipid bilayer;SLB）結合配列のモル分率に対する関数で示した図である。独立して準備した３つの異なる試料に対する値を平均した。０．００１２５〜０．０６２５の範囲の実験値から線形フィット（linear fit）を計算した。
【図２】ＳＬＢ上でＰＮＰプローブの拡散動力学に対するビオチン結合価の効果を示した図である。（ａ）は、対応するＰＮＰの平均二乗移動（mean square displacement）を時間間隔の関数で表し、（ｂ）は、ＳＬＢ上でプラズモンプローブの平均拡散係数（average diffusion coefficient）を示す。
【図３】ビオチン結合価の変化による拡散係数の分布を示した図である。（ａ）〜（ｄ）でプローブ当りビオチン結合価はそれぞれ（ａ）１、（ｂ）５、（ｃ）２５及び（ｄ）１２８である。
【図４】ＳＬＢ上に導入されたＰＮＰプローブのイメージを示した図である。（ａ）は、ＳＴＶ−コーティングされたＳＬＢ上の４８６のビオチン結合価を有するＩ−ＰＮＰの暗視野顕微鏡イメージである。（ｂ）は、Ｉ−ＰＮＰ−改質されたＳＬＢ上のＣｙ３−改質されたＳＴＶの蛍光顕微鏡イメージである。スケールバーは１０μｍである。
【図５】ＰＮＰクラスタの散乱強度分布をクラスタリング程度に対する関数で示した図である。（ａ）は単量体、（ｂ）は二量体、（ｃ）は三量体及び（ｄ）は四量体に対する結果である。
【図６】ＳＬＢ上に動力学的に結合されたナノ粒子間の相互作用を示した概略図である。二つの異なる形態のプローブ（移動及び固定プラズモンプローブ；左側）を含むプラズモンナノプローブ結合されたＳＬＢと標的ＤＮＡ混成化−誘導２Ｄクラスタの形成及びプラズモンカップリング（右側）を概略的に示した図である。
【図７】ＳＬＢ上に動力学的に結合されたナノ粒子の単一ナノ粒子の解像度の本来の場所の映像化及び分析方法を示した概略図である。（ａ）及び（ｂ）は、単一ナノ粒子の解像度を有する暗視野顕微鏡を用いたＳＬＢ−結合されたプラズモンナノプローブの超並列本来の場所の観察（massively parallel in situ observation）及び分析方法を示した図である（スケールバー＝１０μｍ）。（ｃ）の右側は、単一のプラズモンナノプローブの散乱強度及び色のスペクトルの暗視野顕微鏡イメージ−ベースの分析を示した図である。
【図８】ＳＬＢ上で相互作用するプラズモンナノ粒子の拡散動力学の調節及び光学分析の結果を示した図である。（ａ）は、ビオチン結合価に基づくナノ粒子の移動性の調節（増加する結合価は、より低い移動性を誘導する）を、（ｂ）は、プラズモンナノ粒子の代表的な拡散軌跡（diffusion trajectories）を、そして（ｃ）は、ビオチン結合価の関数としての移動割合（mobile fraction）を示した図である。
【図９】粒子の非特異的相互作用を分析したものであり、（ａ）標的ＤＮＡ配列不在時に固定されたプラズモンプローブの位置に対する散乱強度の変化の時間追跡（ｔｉｍｅ  ｔｒａｃｅ）及び（ｂ）、これを概略的に示した図である。
【図１０】（ａ）は、標的ＤＮＡ混成化−誘導プラズモンナノ粒子クラスターの暗視野顕微鏡イメージを示した図である。固定されたプローブの位置内（白色点線円）に捕獲された移動プローブの１５段階の軌跡を白色実線で強調し、灰色の矢印は、各軌跡の開始位置を示す。各軌跡段階に対する時間間隔（time interval）は０．１８８  ｓである。（ｂ）は、プローブクラスタの暗視野顕微鏡イメージで緑色に対する赤色の比をクラスタ当りプローブ数の関数で示した図である（Ｒ２＝０．９７０）。（ｃ）は、ナノ粒子クラスターの組み立て（assembly；上部）及び分解（disassembly；下部）過程に対する散乱強度の代表的な時間追跡を示した図である。
【図１１】Ｍ−ＰＮＰペアで修飾されたＳＬＢで単量体ＰＮＰ付着及びＰＮＰクラスタ間の融合の組み合わせを通じたクラスタの成長を示した図である。（ａ）は、互いに接近する二つの単量体ＰＮＰを、（ｂ）は、二つのＰＮＰ単量体の遠距離光学的重畳を、（ｃ）は、ＤＮＡ混成化−媒介されたＰＮＰ二量体の形成及びその結果としてのプラズモンカップリングを、（ｄ）は、互いに接近するＰＮＰ二量体及びＰＮＰ三量体を、最後に（ｅ）は、ＰＮＰ二量体及びＰＮＰ三量体間の融合を示す。
【図１２】プラズモンナノ粒子クラスターの成長動力学に対する本来の場所の映像化及び分析の結果を示した図である。（ａ）は、広いＳＬＢ表面積でナノ粒子プローブのＤＮＡ混成化−誘導プラズモンカップリングの超並列の本来の場所のモニタリングを示した図である。左側のイメージは、３０ｎｍの標的ＤＮＡ配列添加後、３３０秒で得た。標的ＤＮＡ配列添加前（０ｓ）及び後（３３０ｓ）白色点線領域の拡大されたイメージを示した。（ｂ）は、（ａ）の暗視野顕微鏡イメージにアルファベットで示した１０個の個別のナノ粒子のクラスタリング反応に対する時間−依存的散乱強度を示したグラフである。散乱強度は、単量体プローブの平均強度（average intensity）に対して標準化した。信号は、３３０秒間毎１秒ごとに記録した。
【図１３】プラズモンナノ粒子クラスターの成長動力学及びそのイメージを示した図である。（ａ）は、３０ｎＭの標的ＤＮＡ配列添加時（空円）、プラズモンクラスタ成長に対する反応速度を示した図である。それぞれの単一のプローブ追加の反応を成長するクラスタの散乱強度の段階的な増加をモニタリングして検出した（Ｎ＝１５０粒子）。クラスタの形成速度は、３段階の連続反応モデル（実線）に対して最適化した。（ｂ）は、クラスタ化されたプラズモンナノプローブの透過電子顕微鏡像を示す図である。
【図１４】プラズモンプローブを順次添加して二量体から三量体または三量体から四量体を形成する場合、２Ｄ立体障害因子（steric hindrance factor）の計算方法を示した図である。灰色の領域（扇形）は、次の粒子の添加のための可能な接近角を示す。四量体の形成において、立体障害因子を３番目の粒子（挿図の黒実線）の相対的な位置により決定されるθの関数で示した。平均ｆｔｒｉは０．３７５である（灰色点線）。
【図１５】ＳＬＢ上でプラズモンカップリングに基づいた定量的なＤＮＡ検出アッセイを示した図である。（ａ）は、散乱強度校正標準（calibration standard）を、クラスタ内のプラズモンプローブ数の関数で示した図である（Ｒ２＝０．９９９）。（ｂ）は、３００ｆＭの標的ＤＮＡと４時間反応させたＰＮＰ−改質されたパターン化されたＳＬＢを示した図である。（ｃ）は、標的ＤＮＡのアッセイ結果をＤＮＡ濃度の関数でプロットした図である（黒色ドット）。単一塩基ミスマッチＤＮＡ配列に対するアッセイ結果を灰色のドットで表示した。
【図１６】流体を利用したパターン化されたＳＬＢ上に導入された金属ナノ粒子の運動性の調節を通じたナノ粒子間の相互作用の調節方法を概略的に示した図である。
【図１７】流体の流れによるＳＬＢ上に導入されたナノ粒子の移動性を示した図である。（ａ）は、流体の流れの速度に基づくナノ粒子の移動軌跡を示した図であり、（ｂ）は、前記ナノ粒子の運動速度を示した図である。
【図１８】流体の流れによるＳＬＢ上に導入されたナノ粒子の移動性を示した図である。（ａ）と（ｂ）は、それぞれパターン化されたＳＬＢ表面にいて流体の流れにより移動濃縮される金ナノ粒子と銀ナノ粒子の暗視野顕微鏡イメージを示す。
【図１９】金ナノ粒子に対するパターン化されたＳＬＢで流体の流れにより濃縮された金属ナノ粒子の散乱スペクトルの変化を示した図である。（ａ）は、多様な塩（ＮａＣｌ）の濃度下での散乱スペクトルを、（ｂ）は、暗視野顕微鏡イメージを、そして（ｃ）は、プラズモン散乱ピークとゼータ電位の変化を示す。
【図２０】銀ナノ粒子に対するパターン化されたＳＬＢで流体の流れにより濃縮された金属ナノ粒子の散乱スペクトルの変化を示した図である。（ａ）は、多様な塩（ＮａＣｌ）の濃度下での散乱スペクトルを、（ｂ）は、暗視野顕微鏡イメージを、そして（ｃ）は、プラズモン散乱ピークとゼータ電位の変化を示す。
【図２１】ナノ粒子が導入された人工細胞膜ベースの細胞インタフェースのプラットフォームを利用した細胞のシグナル伝達機構解析方法を示す概略図である。
【図２２】それぞれ異なる色を帯びるように、異なる大きさと形状で製造されたそれぞれのナノ粒子の暗視野顕微鏡及び電子顕微鏡イメージ及びこれらの吸収／散乱スペクトルを示した図である。
【図２３ａ】支持型脂質二重層上にそれぞれ固定されるように、または自由に移動可能であるように結合価を調節して製造した３色の金属粒子の９つの可能な組み合わせを示した図である。
【図２３ｂ】一実施例による９種のｍｉＲＮＡの同時検出のために固定された３色の金属粒子及び自由に移動可能な３色の金属粒子から選択される、各標的分子に特異的に結合する粒子ペアを示した図である。
【図２３ｃ】３色の金属粒子を用いた多重分析の例であり、それぞれ異なる時点（０分及び６０分）での暗視野顕微鏡イメージを示した図である。
【図２３ｄ】３色の金属粒子を用いた９種のｍｉＲＮＡの同時検出を通じた時間に応じた各標的物質の累積結合の数を示す図である。
【図２４ａ】固定された赤色ナノ粒子及びこれと相互作用する移動可能な赤色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された赤色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２４ｂ】固定された緑色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な赤色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された緑色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２４ｃ】固定された青色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な赤色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された青色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２５ａ】固定された赤色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な緑色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された赤色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２５ｂ】固定された緑色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な緑色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された緑色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２６ａ】固定された赤色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な青色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された赤色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２６ｂ】固定された緑色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な青色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された緑色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２６ｃ】固定された青色ナノ粒子及びこれと相互作用する１つ以上の移動可能な青色ナノ粒子による暗視野顕微鏡イメージ及び前記固定された青色ナノ粒子の位置で三色プラズモン散乱スペクトルの経時強度の変化を示した図である。
【図２７】暗視野顕微鏡を用いて前記それぞれのカラー（それぞれ異なるプラズモン散乱波長）を有する、及び／または移動度を有する複数の粒子の挙動及びそのモニタリング過程を概略的に示した図である。
【図２８】相補的配列認識によるｍｉＲＮＡの検出の例（ｍｉＲ−２１）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、基材及び前記基材上に配置された支持型脂質二重層（supported lipid bilayer;SLB）を含む人工細胞膜（artificial cell membrane）において、前記支持型脂質二重層は、脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、第１のリガンドが結合された第１の脂質を含み、前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを１００〜１００，０００個／μｍ２以上の密度で含む第１の金属粒子が、第１のリガンドと第２のリガンドの結合を通じて２つ以上の第１の脂質と結合し、平均０〜０．５×１０−８ｃｍ２／ｓｅｃで支持型脂質二重層内の移動性が減少したことを特徴とする人工細胞膜を提供する。より好ましくは、前記人工細胞膜上に導入された第１の粒子は、支持体、脂質二重層内の移動が０〜０．１×１０−８ｃｍ２／ｓｅｃで、より好ましくは、顕微鏡下で検出不可能なレベルである０〜０．０１×１０−８ｃｍ２／ｓｅｃで減少したものであってもよい。前記移動性が０である場合は、完全に停止された状態を示す。
【００１３】
本発明の用語、「基材（substrate）」とは、脂質二重層を支持することができる支持体であり、一定の形態を有する固体であってもよい。好ましくは、ガラス、金、銀、白金、ＴｉＯ２等の透明固体基板；ポリメチルメタクリレート（poly(methyl methacrylate);PMMA）などのアクリル系ポリマー（Acrylic polymers）；ポリエチレン（polyethylene;PE）、ポリプロピレン（polypropylene;PP）、ポリスチレン（polystyrene）、ポリエーテルスルホン（Polyethersulfone;PES）、ポリシクロオレフィン（Polycycloolefin;PCO）、ポリウレタン（polyiourethane）またはポリカーボネート（polycarbonate;PC）のような透明な固体であってもよい。またはコーティング膜上に導入された脂質二重層が流動性を維持することができる限り、セルロースのように水和することができるコーティング剤を基板にコーティングして使用することもできる。
【００１４】
本発明の用語、「支持型脂質二重層（supported lipid bilayer）」とは、自然な細胞膜または核のような準細胞構造物を囲む二重層に対する試験管内で組み立てられた二重層であってもよく、合成または天然脂質で構成される、モデル脂質二重層の一種であり、固体基材に固定されて（anchored）増加した安定性を有し、したがって、バルク溶液では不可能な、特性化ツール（characterization tools）として使用することができる。脂質二重層が閉じたシェルで円形で結合されたビークルや細胞膜とは異なり、支持体二重層は、固体支持体上に存在する平面構造である。したがって、二重層の上面（upper face）のみが自由溶液（free solution）にさらされる。このような配置は、脂質二重層の研究に関連して長所と欠点を有する。支持型二重層の最大の長所は、信頼性である。ＳＬＢは、高速流速や振動にさらされてもそれほど損なわれずに維持され、他のモデル脂質二重層である黒脂質膜（black lipid membrane;BLM）とは異なり、ホールの存在が全体の二重層を破壊しない。このような安定性により数週間や数ヶ月間持続する実験が可能であるのに対し、ＢＬＭ実験は、通常、数時間に制限される。ＳＬＢの他の長所は、平らで、硬い表面上に存在するため、自由に浮遊する試料に対しては、実行が不可能であるか、または低解像度を提供する多くの特性化のツールとして使用することができるという点である。
【００１５】
このような長所の最も明確な例として、試料と直接物理的な相互作用を要求する機械的プローブ技法を使用できることが挙げられる。脂質の相分離、単一のタンパク質分子の吸着につながる膜の貫通ナノ気孔の形成及び蛋白質の組み立て（protein assembly）を染料標識がなくても、サブナノメートルの精度で映像化させるために、原子力顕微鏡（Atomic force microscopy；AFM）を使用している。最近では、単一の二重層の機械的性質を直接探知するために、個別の膜タンパク質上での力分光法の実行のためにＡＦＭを使用することもある。細胞や小胞（vesicle）の表面は、相対的に柔らかく（soft）、経時的に移動し、変化するため、ＳＬＢを使用せずには、前記研究は、困難または不可能となり得る。
【００１６】
また、様々な現代的な蛍光分光法においても、強く支持された平面表面（rigidly-supported planar surface）を必要とする。全反射蛍光顕微鏡（total internal reflection fluorescence microscopy；TIRF）及び表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance；SPR）のようなエバネセント場の技法（evanescent field method）は、分析物の結合及び二重層光学的性質の高感度測定が可能であるが、試料が特別に光学機能性材料上に支持されている場合にのみ機能することができる。支持された二重層にのみ適用可能な他の検出方法の例としては、光学的干渉をベースにした蛍光干渉コントラスト顕微鏡法（fluorescence interference contrast microscopy；FLIC）及び反射干渉コントラスト顕微鏡法（reflection interference contrast microscopy；RICM）などである。
【００１７】
一般に、ＳＬＢは、基材の表面に直接接触せず、非常に薄い水層に分離されている。前記水層の大きさ及び性質は基材物質及び脂質の種類に依存するが、最も一般的に使用される実験システムであるシリカ上に支持された双性イオン脂質（zwitterionic lipid）に対して一般的に１ｎｍ程度である。前記水層は非常に薄いため、二重層と基材との間には、広範囲な流体力学的カップリング（hydrodynamic coupling）が存在し、同じ組成の自由二重層に比べて支持された二重層でより低い拡散係数を有する。ＳＬＢ内の脂質の一部は、完全に固定されていてもよい。良質のＳＬＢ脂質上に対して、このような固定された画分が１〜５％である。
【００１８】
一般に、「人工細胞膜（artificial cell membrane）」は、細胞膜タンパク質、膜貫通タンパク質及びこれらに関連する相互作用のような、体内で細胞の表面で起こる細胞膜に関連する現象を研究するために人為的に製作した、試験管内で体内の細胞膜システムを模倣するための脂質膜を含むシステムである。人工細胞膜を提供するモデルシステムとしては、黒脂質膜（black lipid membrane；BLM）、支持型脂質二重層（supported lipid bilayer；SLB）、係留された二重層脂質膜（tethered bilayer lipid membrane；tBLM）、小胞（vesicle）、ミセル（micelle）、バイセル（bicelle）及びナノディスクなどがある。特に、ＳＬＢ膜は、生物物理膜的現象を究明するための有用な手段である。ｐＨ及び温度などのような環境的変数だけでなく、化学組成の変化により移動性及び活性などを調節することができる。
【００１９】
前記第１のリガンド及び第２のリガンドは、それぞれ独立して抗原、抗体、リガンド、受容体、キレート、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（aptamer）、互いに特異的に結合する化学分子またはそれらの組み合わせであってもよいが、これに制限されない。例えば、第１のリガンドが抗体である場合、第２のリガンドは、これに特異的な抗原であってもよい。または第２のリガンドは、前記抗原にさらに結合された抗体をすべて含み第１のリガンドである抗体と抗体−抗原−抗体複合体を形成するサンドイッチ免疫反応により結合することができる。他の例としては、第１のリガンドと第２のリガンドが互いに相補的な配列のＤＮＡ断片であることができ、このような場合、これらのＤＮＡ断片の混成化により結合を形成することができる。
【００２０】
本発明の具体的な実施例では、第１のリガンドとしてビオチンを、第２のリガンドとしてビオチン及びその受容体であるストレプトアビジンが結合されたコンジュゲートを利用して、ストレプトアビジンの空いている他の結合部位に第１のリガンドであるビオチンが結合するようにした。
【００２１】
また、前記第１の金属粒子は、前記脂質上の第１のリガンドと金属粒子の表面の第２のリガンドとの間の特異的な抗原−抗体結合、リガンド−受容体結合、ＤＮＡ混成化、キレート結合、共有結合、静電結合または化学反応による結合により脂質に結合することができる。この時、第１の金属粒子は、表面に複数の第２のリガンドを含むことができ、その密度に応じて一つの金属粒子が多数の脂質粒子と結合を形成することができる。このような場合、脂質膜上で、個々の脂質分子の動きは自由であるが、複数の脂質分子が一つの粒子に結合された場合、前記粒子を動かすためには、これに結合された複数の脂質分子が同時に２次元脂質平面上で、有機的に移動しなければならないため、相対的にその動きを制約されるしかない。
【００２２】
本発明の具体的な実施例によると、単位粒子当りの結合価が増加するほど、粒子の動きは著しく阻害されており、結果的に結合価が４８６に達したときには、固定されたかのように、ほとんど動きが捕捉されなかった（図２及び図６）。
【００２３】
前記第１の金属粒子の動きをモニタリングする方法は、これに制限されないが、好ましくは、プラズモン散乱を測定することにより行うことができる。
好ましくは、前記第２のリガンドは、チオール基を含み、前記チオール基を通じて第１の金属粒子に共有結合することができる。
【００２４】
本発明の人工細胞膜は、プローブとして金属粒子が結合されたことを特徴とする。金属粒子は、ポリマーや脂肪二重層で構成され小胞（vesicle）などの粒子に比べて安定していて、相対的にやや低いか、高い塩濃度やｐＨ条件でも分解されたりせず、形態及び／または物性を維持することができる。また、好ましくは、プラズモン性金属粒子を含み自体としてプラズモン散乱を示すため、別途のプローブがなくても自主的に検出可能であるだけでなく、蛍光体などを標識して蛍光シグナルを検出する場合に比べ、ちらつきや消光などを示さないため、長時間安定的にモニタリングすることができるという長所を有する。また、チオール基などの官能基と直接強固な共有結合を形成することができるため、これを利用して表面にリガンドなどを導入することができる。
【００２５】
好ましくは、前記第１のリガンドが結合された第１の脂質を前記支持型脂質二重層の全脂質に対して０．０５〜０．５モル％で含むことができる。前記第１のリガンドは、第２のリガンドとの結合を通じて粒子が導入される位置であり、全脂質において前記第１のリガンドが結合された第１の脂質の割合が０．０５モル％未満に低くなると、脂質の表面で第１のリガンドの頻度が低いので、すなわち、第１のリガンド間の距離が遠くなって一つの粒子が複数の第１のリガンドと結合して脂質二重層上に固定されるのが困難であり、０．５モル％を超過する場合には、第１のリガンドの密度があまりにも高くなって、これと特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の粒子の凝集が誘導され、結合価と無関係に、粒子の動きを阻害したり、分析を妨害することがある。
【００２６】
好ましくは、前記支持型脂質二重層は、全脂質に対して１〜１０モル％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合された第２の脂質をさらに含むことができる。この時、前記ポリエチレングリコールの平均分子量は、５００〜２０００であることが好ましいが、これに制限されない。例えば、２０００以下の相対的に低い分子量を有するＰＥＧを使用することにより、一般に、脂質二重層を安定化するために使用されるものよりもやや高い含有量である１０モル％のレベルまでＰＥＧ結合された第２の脂質の含有量を高めても遮蔽効果などを誘発しないと共に、脂質二重層を物理的に安定させて二重層の寿命及び安定度を増加させ、ナノ粒子間、ナノ粒子と脂質二重層との間の非特異的結合を効率的に減少させて流動性を増加させる。しかし、分子量が前記範囲を超える場合、またはその含有量が前記範囲を超える場合、遮蔽効果を誘発し、脂質膜に対するナノ粒子の接近及び／または第１のリガンドと第２のリガンドの結合を妨害し得るため、使用するＰＥＧの分子量及び全脂質で、前記ＰＥＧが結合された第２の脂質の含有量を適切に組み合わせて選択することが望ましい。
【００２７】
もう一つの態様として、本発明は、人工細胞膜を利用してＡ分子とＢ分子の相互作用を確認するための分析装置において、支持型脂質二重層が、第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３脂質をさらに含む、前記人工細胞膜；前記人工細胞膜中、第１の金属粒子の表面上に結合されたＡ分子；前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子として、第３のリガンドと第４のリガンドの結合を通じて１つ以上の第３の脂質と結合するが、第１の金属粒子より支持型脂質二重層内の移動性が大きい第２の金属粒子；及び前記人工細胞膜中、第２の金属粒子の表面上に結合されたＢ分子を含み、移動性が大きい第２の金属粒子が第１の金属粒子に接近してＡ分子とＢ分子の相互作用により、第２の金属粒子が第１の金属粒子に拘束されることを特徴とする分析装置を提供する。
【００２８】
前記第４のリガンドは、第２のリガンドと同一または異なってもよい。
前記Ａ分子及びＢ分子は、それぞれＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、リガンド、キレート、受容体、アプタマー、ポリマー、有機化合物、金属イオン、またはポリペプチドであってもよい。
【００２９】
したがって、前記本発明の分析装置で確認しようとするＡ分子とＢ分子の相互作用は、抗原−抗体結合、リガンド−受容体結合、タンパク質−タンパク質結合、核酸混成化、キレート結合、共有結合または静電気的結合であってもよい。前記核酸混成化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、及びこれらの組み合わせとの間の混成化を制限なく含む。
【００３０】
前記第１の粒子は、複数の脂質との結合を通じて支持型脂質二重層上に固定され、第２の粒子は、相互作用不在時に支持型脂質二重層で２次元的自由ブラウン運動（2-dimensional brownian motion）が可能であることが望ましい。これにより、第１の粒子上のＡ分子と第２の粒子上のＢ粒子間に相互作用による刺激、すなわち、前記粒子間の引力または斥力が発生したとき、第１の粒子は固定されており、第２の粒子は第１の粒子の方（引力によって）、または第１の粒子と遠い方向に（斥力によって）移動することができる。したがって、固定された第１の粒子に対する第２の粒子の相対的な動きを確認し、Ａ粒子とＢ粒子間の相互作用を確認することができる。
【００３１】
もう一つの態様として、本発明は、前記分析装置を用いて、Ａ分子とＢ分子の相互作用を確認する方法を提供する。
前述したように、前記分析装置において、第１の粒子は、支持型脂質二重層の平面上に固定されており、第２の粒子は、別途の刺激が加わえられない限り、自由ブラウン運動をする。
【００３２】
したがって、第１の金属粒子の位置及び第１の金属粒子による信号の強度または波長の変化をモニタリングすることができる。
また、第２の金属粒子のリアルタイム移動軌跡または速度、または第２の金属粒子による信号の強度または波長の変化をモニタリングすることができる。
【００３３】
好ましくは、前記モニタリングは、第１の金属粒子及び／または第２の金属粒子のプラズモン散乱を測定することにより行うことができる。プラズモン散乱を発生するナノ粒子は、粒子間の距離が近づくとき、プラズモンカップリングにより散乱信号を増強させることができ、一定の距離、すなわち、プラズモンカップリング距離以内に、さらに近づく場合には、散乱波長が長波長に移動する。したがって、遠距離では、粒子の軌跡から粒子間の距離を測定することができ、一定の距離未満で近づいた場合には、測定された散乱信号の強度及び波長から粒子間の距離を推定することができる。
【００３４】
本発明の具体的な実施例では、相補的な配列のＤＮＡを標識した金ナノ粒子を使用するが、粒子当り２つ以上のＤＮＡを結合させ、複数の粒子がＤＮＡ混成化により近づくようにした。その結果、結合された粒子の数が増加して二量体、三量体から四量体へと発展するにつれて散乱強度が段階的に増加し、その信号は長時間持続した。一方、非特異的な一時的相互作用によっては、信号の増加が観察されたが、その信号は数秒間も持続されないことを確認し、非特異的相互作用による信号の増加と特異的相互作用による信号の増加が互いに区別されることを確認した（図６）。このような粒子凝集によっては信号強度が増加するだけでなく、散乱の波長が長波長に移動することが確認できた。
【００３５】
また、本発明の方法は、さらに、特定の方向に力を加えて粒子の密度を高め、粒子間の衝突頻度を増加させることにより、分析感度を向上させ、検知時間が短縮できることを特徴とする。この時、加わる力は磁場、電場、流体の流れなどであってもよいが、これに制限されない。
【００３６】
もう一つの態様として、本発明は、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から第１の金属粒子と第２の金属粒子との間の距離を確認してＡ分子とＢ分子の結合有無を確認するための分析キットにおいて、基材；前記基材上に配置され、脂質の一部または全部が二重層内で位置を移動可能な支持型脂質二重層；及び前記支持型脂質二重層の一部として、第１のリガンドが結合された第１の脂質及び第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３脂質；を含む人工細胞膜；前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子として、第１のリガンドと第２のリガンドの結合を通じて１つ以上の第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子；及び前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子として、第３のリガンドと第４のリガンドの結合を通じて１つ以上の第３の脂質と結合可能な第２の金属粒子；を含むことを特徴とする分析キットを提供する。
【００３７】
前述したように、２つの分子の相互作用を確認するために、これらの分析しようとする分子のうち、一方の分子が結合された金属粒子は人工細胞膜上に固定され、もう一方の分子は、相対的に移動性が高い金属粒子に結合された分析装置を利用することが検出の便宜上望ましいが、現在の光学検出技術では、脂質二重層上で自由に移動する粒子のモニタリングが可能であるため、Ａ分子とＢ分子の両方が移動性が高い金属粒子に結合されており、脂質二重層で自由に移動可能であるが、個々の粒子のモニタリングが可能であるため、これらのシステムもＡ分子とＢ分子の相互作用を確認するための分析キットとして利用することができる。前記分析キットは、公知のプラズモン散乱検出システムに適用することができる。
【００３８】
もう一つの態様として、本発明は、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から第１の金属粒子と第２の金属粒子との間の距離を確認ししてＡ分子とＢ分子の結合有無を確認するための分析キットにおいて、基材；前記基材上に配置され、脂質の一部または全部が二重層内で位置を移動可能な支持型脂質二重層；及び前記支持型脂質二重層の一部として、第１のリガンドが結合された第１の脂質及び第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３脂質；を含む人工細胞膜；前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子として、第１のリガンドと第２のリガンドの結合を通じて１つ以上の第１の脂質と結合可能な第１の金属粒子；及び前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子として、第３のリガンドと第４のリガンドの結合を通じて１つ以上の第３の脂質と結合可能な第２の金属粒子；を含むことを特徴とする分析キットを提供する。
【００３９】
もう一つの態様として、本発明は、Ａ分子及びＢ分子と結合可能な標的物質の定性的または定量的分析のためのキットにおいて、分析キットは、人工細胞膜上でＡ分子が結合された第１の金属粒子とＢ分子が結合された第２の金属粒子のプラズモン散乱信号から第１の金属粒子と第２の金属粒子との間の距離を確認し、前記標的物質を通じたＡ分子とＢ分子の結合有無を確認するためのものであり、基材；前記基材上に配置され、脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能な支持型脂質二重層；及び前記支持型脂質二重層の一部として、第１のリガンドが結合された第１の脂質及び第１のリガンドと同一または異なる第３のリガンドが結合された第３脂質；を含む人工細胞膜；前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の金属粒子として、第１のリガンドと第２のリガンドの結合を通じて１つ以上の第１の脂質と結合された第１の金属粒子；前記第１の金属粒子の表面上に結合されて標的物質の一部に特異的に結合するＡ分子；前記第３のリガンドに特異的に結合する第４のリガンドを含む第２の金属粒子として、第３のリガンドと第４のリガンドの結合を通じて１つ以上の第３の脂質と結合する第２の金属粒子；及び前記人工細胞膜中、第２の金属粒子の表面上に結合されて標的物質中、Ａ分子と結合していない他の部分に特異的に結合するＢ分子を含むことを特徴とキットを提供する。
【００４０】
前述したように、前記標的物質、Ａ分子、Ｂ分子、第１のリガンド及び第２のリガンドは、それぞれ独立して抗原、抗体、リガンド、受容体、キレート、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、互いに特異的に結合する化学分子またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
これらに限定されるものではないが、第１の金属粒子は、支持型脂質二重層上に固定され、第２の金属粒子は、標的物質を通じたＡ分子とＢ分子の連結不在時、支持型脂質二重層上で２次元的自由ブラウン運動（2-dimensional brownian motion）できるように結合価を調節すると、固定された第１の金属粒子を中心に第２の金属粒子の相対的な動きを追跡することができるため、モニタリングを容易にすることができる。
【００４２】
この時、標的物質が存在する場合、Ａ分子及びＢ分子と標的物質の結合により移動性が大きい第２の金属粒子が第１の金属粒子に接近して発生する第１の金属粒子の位置でプラズモン散乱信号の強度、波長、またはその両方の変化を測定することにより、Ａ分子及びＢ分子と標的物質との間の相互作用を確認することができる。
【００４３】
もう一つの態様として、本発明は、プラズモン散乱測定によるｉｍａｘ×ｍｍａｘ個の標的物質の定性的または定量的分析のための多重分析キットにおいて、（ｉｍａｘ及びｍｍａｘは、それぞれ下記に定義された変数ｉとｍの最大値として、それぞれ独立して１以上の整数であり、ｉｍａｘ＝ｍｍａｘ＝１を除く）、前記多重分析キットは、基材；前記基材上に配置され、脂質の一部または全部が二重層内で位置移動可能な支持型脂質二重層；及び前記支持型脂質二重層の一部として、第Ｉｉリガンドが結合された第Ｉｉ脂質及び第Ｍｍリガンドが結合された第Ｍｍ脂質；を含む人工細胞膜（ここで、第Ｉｉリガンド及び第Ｍｍリガンドは、それぞれ独立して同一または異なってもよい）。前記第Ｉｉリガンドに特異的に結合する第Ｉ’ｉリガンドを含む第Ｉｉ、金属粒子として、第Ｉｉリガンドと第Ｉ’ｉリガンドの結合を通じて１つ以上の第Ｉｉ脂質と結合された第ｉｉ金属粒子；前記第Ｉｉ、金属粒子の表面上に結合されて標的物質の一部に特異的に結合するＡｉ分子；前記第Ｍｍ脂質にそれぞれ特異的に結合する第Ｍ’ｍのリガンドを含む第Ｍｍの金属粒子として、第Ｍｍリガンドと第Ｍ’ｍリガンドの結合を通じて１つ以上の第Ｍｍ脂質と結合する第ｍｍの金属粒子；及び前記人工細胞膜中、第Ｍｍの金属粒子の表面上に結合されて標的物質のＡｉの分子と結合していない他の部分に特異的に結合するＢｍ分子を含み、前記一連の第Ｉｉ金属粒子らは、互いに異なるプラズモン散乱波長を有し、一連の第Ｍｍの金属粒子らも互いに異なるプラズモン散乱波長を有するものである、多重分析キットを提供する。
【００４４】
本発明の具体的な実施例では、それぞれ異なる色、すなわち、赤、緑、青の色を帯びた金／銀ナノ粒子を製造し、これらの表面に脂質二重層上に結合された捕獲配列と相補的な配列のＤＮＡを調整された割合で導入して脂質二重層との結合価を調節することにより、それぞれに対して脂質二重層上に固定されている粒子と脂質二重層上で自由に移動する粒子、すなわち、全６種の異なる金属粒子を準備した。また、これらの表面には、標的物質として使用された全９種のｍｉＲＮＡの一部分と特異的に結合することができる相補的な配列のＤＮＡを導入した（図２３ｂ、図２８及び表３）。この時、モニタリングの便宜のために、それぞれの標的物質は、それぞれ脂質二重層上に固定された一つの金属粒子と自由に移動可能な一つの金属粒子と結合するように、各粒子に導入されるＤＮＡ配列を組み合わせた。例えば、固定された赤色金属粒子を中心に、該粒子のプラズモン散乱、これに接近する他の金属粒子の経時軌跡及び三色の波長でのプラズモン散乱強度をモニタリングし、三色プラズモン中、他の金属粒子の接近により強度が増加する波長を同定し、他の金属粒子の種類を同定し、増加した強度を確認して１つの固定された赤色金属粒子に結合された他の金属粒子の数を確認することができた。即ち、固定された赤金属粒子の位置をモニタリングすることにより、この結合可能な脂質二重層上で自由に移動可能な３種の金属粒子と、それぞれ異なるプラズモン散乱パターンを示すことを確認した（図２４ａ、２５ａ及び２６ａ）。これは、固定された緑色の金属粒子と固定された青の金属粒子についても類似した方法で現れ（図２４〜２６、ｂ及びｃ）、これらをすべて組み合わせて、９つのｍｉＲＮＡによってそれぞれ異なるプラズモン散乱の変化を示すことを確認することができた（図２３ｄ）。これは、移動性、及び／またはプラズモン散乱波長が異なる複数の金属粒子を利用し、複数の標的物質を同時に定性及び定量的に分析することができることを示すものである。
【００４５】
もう一つの態様として、本発明は、流体の流れを利用し、支持型脂質二重層上の特定の領域内の粒子を濃縮させる方法として、チャネル内の一面に配置された支持型脂質二重層を含み、前記支持型脂質二重層は、脂質一部または全部が二重層内で位置移動可能であり、第１のリガンドが結合された第１の脂質を含む支持型脂質二重層；及び前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む第１の粒子として、第１のリガンドと第２のリガンドの結合を通じて１つ以上の第１の脂質と結合された第１の粒子を備えた流体チャネルに流体の流れを適用する段階を含む粒子を濃縮させる方法を提供する。
【００４６】
使用目的に応じて前記粒子は、さらに遺伝子、タンパク質などが結合されたものを用いることができる。
本発明に係るリガンド結合を通じて脂質上に結合された粒子を含む支持型脂質二重層を含む流体チャネルに流体の流れを適用すると、前記粒子は、脂質二重層上で自由なブラウン運動が可能であるため、流体の流れ方向に沿って移動して流体チャネル内の特定の部分に濃縮することができる。従来の脂質二重層上に位置する粒子を濃縮させるための方法としては、電場などの刺激を加える方法が使用されたが、電場を適用した場合の露出時間が長くなるにつれて粒子上に結合されたタンパク質や遺伝子などが変性したり、脂質二重層自体が破壊されることがあり、これにより、ｐＨや温度が変化したり、空気の泡が発生するなどの実験条件の変化をもたらすことがあるが、本発明に係る流体の流れを利用する場合、このような欠点を克服することができる。
【００４７】
本発明の具体的な実施例では、基板上にフローチャネルを製作し、上部スライドグラスの両側に穴を形成し、一定の方向に流体の流れを適用することができるようにした。前記フローチャネル内に、本発明に係る金または銀ナノ粒子が結合された脂質二重層を形成して流体の流れの速度を調節しながら、前記金属ナノ粒子の動きをモニタリングした。流れが加わる前の粒子は、２次元脂質二重層で自由拡散運動をしたが、流体の流れが加えながら、これらのナノ粒子は、流れと同じ方向に移動し始め、流れが速くなると、ナノ粒子の動きも共に速くなった。また、このように一方の方向に粒子が移動するにつれて、特定の区画での粒子の密度が増加し、プラズモンカップリングによる散乱波長の移動が確認された（図１１及び１２）。
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施に限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：物質
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；DOPC）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（キャップビオチニル）ナトリウム塩（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)sodium salt;biotinylated DOPE）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］アンモニウム塩（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-1000] ammonium salt；PEG-DOPE）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Alabaster、AL、USA）から購入した。Ｃｙ３−修飾されたストレプトアビジン（streptavidin；STV）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Eugene、OR、USA）から購入した。カルボキシメチルポリエチレングリコール（carboxymethyl polyethylene glycol；MW 5000）は、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（Arab、AL、USA）から購入した。ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin；BSA）、ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate；SDS）及びジチオトレイトール（dithiothreitol；DTT）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（St.Louis、MO、USA）から購入した。０．１５ＭのＰＢＳ溶液は、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＣｌ（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）を脱イオン水（DI water）に溶かして１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で製造した。０．０２５ＭのＰＢＳは、同じ試薬で２５ｍＭのＮａＣｌを含むように製造した。すべての実験に最小の抵抗（＞１８ＭΩ／ｃｍ）を有するナノピュアウォーターを使用した。小胞（vesicle）の製造（小胞押出；vesicle extrusion）のために、気孔径が１００ｎｍであるポリカーボネート（polycarbonate；PC）フィルタ（Whatman、Fisher Scientific）を使用した。クロロホルム、アセトン、及びエタノールのような有機溶媒は、Ｄｕｋｓａｎ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Gyeonggi-do、Korea）から購入した。硫酸及び過酸化水素は、Ｄａｅｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＆Ｍｅｔａｌｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Gyeonggi-do、Korea）から購入した。５０ｎｍの金ナノ粒子及びオリゴヌクレオチドは、それぞれＢＢＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Cardiff、UK）、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Coralville、IA、USA）から購入した。Ｉ−ＰＮＰ（immobile PNP）に対する標的捕獲配列は５’−ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＰＥＧ６−ＣＴＴＴＧＡＧＣＡＣ  ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴ−３’（配列番号１）、Ｉ−ＰＮＰのＳＬＢ結合（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）配列は５’−ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＰＥＧ６−ＣＴＴＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＴＡＡＴ−ビオチン−３’（配列番号２）である。Ｍ−ＰＮＰ（mobile PNP）の標的捕獲配列は５’−ＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＣ  ＣＡＣＧＡＧＴＴＴＣ−ＰＥＧ  ６−（ＣＨ２）３−ＳＨ−３’（配列番号３）、Ｍ−ＰＮＰのＳＬＢ結合（tethering）配列は５’−ビオチン−ＴＡＡＴＴＴＴＡＡＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＣＧＡＧＴＴＴＣ−ＰＥＧ６−（ＣＨ２）３−ＳＨ−３’（配列番号４）である。標的配列は、５’−ＧＡＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡ  ＴＡＡＧＧＡＴ−３’（配列番号５）である。標的捕獲配列の下線部分は、標的ＤＮＡ配列に混成化した（hybridize）。単一塩基対の不一致ＤＮＡ配列には、標的ＤＮＡ配列のＡをＴに置換したものを用いた。非相補的ＤＮＡ配列は、５’−ＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴ−３’（配列番号６）であった。
【００５０】
実施例２：ＳＵＶ（small unilamellar vesicle）の製造
９７．４モル％のＤＯＰＣ、０．１モル％のビオチン化−ＤＯＰＥ及び２．５モル％のＰＥＧ−ＤＯＰＥを含むＳＵＶの拡散によりカバーグラス上に支持型脂質二重層（supported lipid bilayer;SLB）を形成した。クロロホルムに適量の脂質を溶解させてＳＵＶ溶液を製造した。回転蒸発器（rotary evaporator）を利用し、５０ｍｌの丸底フラスコで、脂質溶液を蒸発させた。窒素の流れの下で脂質薄膜（lipid film）を完全に乾燥させた。乾燥した混合物は、脱イオン水に再懸濁させ、凍結−融解サイクル（freeze-thaw cycle）を３回繰り返して行った。総脂質濃度は２ｍｇ／ｍｌであった。溶液を２５℃で１００ｎｍ細孔径のＰＣ膜を通じて２１回以上押出した。生成されたＳＵＶ溶液は使用するまで４℃で保管した。
【００５１】
実施例３：ＤＮＡを用いた金プラズモンナノプローブ（nanoprobe）の機能化及びビオチン結合価（valency）の定量
１００ｍＭのＰＢ（ｐＨ８．０）に溶解した１００ｍＭのＤＴＴと２時間インキュベーションしてチオール化されたオリゴヌクレオチドを還元させてＮＡＰ−５カラム（GE health care、Buckinghamshire、UK）を用いて分離した。ＤＮＡ機能化のために、新たに還元させた４μＭのオリゴヌクレオチドを５０ｐＭの５０ｎｍ金ナノ粒子と混合し、室温で一晩中インキュベーションした。Ｉ−ＰＮＰに対して、ＳＬＢ結合配列と標的捕獲配列のモル比を２００：６００（ＳＬＢ結合配列のモル分率＝０．２５）であった。Ｍ−ＰＮＰに対して、モル比は、１：７９９（ＳＬＢ結合配列のモル分率＝０．００１２５）であった。その後、溶液を調整し、１０ｍＭのリン酸緩衝液と０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳを得た。前記調節された溶液を、３０分間の軌跡攪拌機（orbital shaker）でさらにインキュベーションし、２Ｍ  ＮａＣｌ  ６  ａｌｉｑｕｏｔを添加して０．０５Ｍの段階に増加し、最終的にＮａＣｌ濃度が０．３Ｍになるようにした。それぞれの２ＭのＮａＣｌ添加後、溶液を５５℃で１０分間加熱し、室温で３０分間インキュベーションした。ＤＮＡ−金ナノ粒子混合物を一晩中放置した後、溶液を遠心分離した（４５００ｒｐｍ、１０分）。上澄液を除去し、沈殿は、脱イオン水に再分散させた（前記の過程を３回繰り返した）。ＤＮＡ−機能化された金ナノ粒子溶液は使用時まで４℃で保管した。金ナノ粒子当りＳＬＢ結合配列の数を定量するためにＣｙ３−標識オリゴヌクレオチド−改質金ナノ粒子を３０ｍＭ  ＫＣＮ溶液に溶解させた。そして、励起光源としてキセノンランプ（５００Ｗ）を備えたＡｃｔｏｎ分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｒｏ、ＭＡ、ＵＳＡ）でＣｙ３の蛍光発光強度を測定した。
【００５２】
実施例４：ＳＬＢ及びこれに連結された金プラズモンナノ粒子の製造
ガラスフローチャンバーでＳＬＢと結合された金プラズモンナノ粒子を製造した。フローチャンバーは、互いに１００μｍの厚さの熱可塑性スペーサ（thermoplastic spacer）で分離された上部（top）及び下部（bottom）ガラス基質（glass substrate）で構成される。入口及び出口の細孔は、上部ガラスの両端に穴を打った。上部スライドガラスは、０．１５ＭのＢＰＳに溶かした１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで１時間前処理してＳＬＢ沈着（deposition）に不活性であるようにした。下部カバーガラスは、クロロホルム、アセトン、及びエタノールで１０分間超音波処理して洗浄した。音波処理した後のカバーガラスを脱イオン水で洗浄し、窒素流により乾燥した。次に、下部カバーガラスを１時間の間、１Ｍ  ＮａＯＨで前処理し、蒸留水で完全に洗浄した。ガラス基質は、サンドイッチされた熱可塑性プラスチックのスペーサと共にデジタルホットプレート上で１２０℃で加熱して組み立てた。製造されたＳＵＶ溶液を０．１５ＭのＰＢＳと１：１ｖ／ｖで混合して入口を通じてガラスフローチャンバーに導入した。約７０μｌのＳＵＶ溶液を流れチャネルに満たした。２５℃で４５分間インキュベーションした後、過量の非融合（excess and unfused）ＳＵＶを２００μｌの脱イオン水で２回洗浄した。流れチャネル内の脱イオン水をＰＢＳで置換した後、０．１５ＭのＰＢＳに溶かした１ｎｍ  ＳＴＶをビオチン化されたＳＬＢと１時間反応させた。未反応ＳＴＶを０．１５ＭのＰＢＳで洗浄し、流れチャネルを０．０２５ＭのＰＢＳで満たした。次に、２ｐＭ  Ｉ−ＰＮＰと１５ｐＭ  Ｍ−ＰＮＰプローブを導入し、１０分間反応させた。結合していないＰＮＰを除去し、未反応ＳＴＶの結合部位を１μＭの自由ビオチンを含む０．０２５ＭのＰＢＳで洗浄して抑制した。１５分後、緩衝液を０．１５ＭのＰＢＳに交換した。一般的には、前記のプロセスを通じて１：３の割合でＳＬＢ−結合されたＩ−ＰＮＰ及びＭ−ＰＮＰを得ることができる。
【００５３】
４．１．金ナノ粒子当りビオチン結合価の決定及び定量
まず、ＰＮＰのビオチン結合価を変化させることにより、脂質−結合されたＰＮＰの拡散を調節した。これから、粒子当りリガンドの数は脂質膜上でナノ粒子の横的移動性に顕著な効果を示すことを確認した。本発明者らは標的捕獲ＤＮＡ配列とＳＬＢ結合ＤＮＡ配列との間のモル比を変化させることにより、ＤＮＡ機能化の段階でＡｕＮＰ上のビオチン分子の結合価を調節した。前記化学量論的調節方法で高い再現性のある結果を獲得した。ＫＣＮ溶液にＡｕＮＰを溶解させた後、ＳＬＢ結合配列に修飾されたＣｙ３分子の蛍光発光強度を測定することにより、ＰＮＰ当りＳＬＢ結合配列の数を計算した。平均ビオチン結合価はＳＬＢ結合ＤＮＡリンカーの添加量が増加するにつれて、約０．５７から１２８まで直線的に増加した（図１及び表１）。製造したＰＮＰプローブをビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じてＳＬＢ表面に結合させた。０．５７のビオチン結合価を有するＳＬＢ上のＰＮＰプローブは、ビオチンを含まないＰＮＰは、ＳＬＢに結合することができず、表面から完全に洗浄することができるため、一つのビオチンを有するものとみなされた。
【００５４】
【表１】
0006402351.tif 000002
４．２．ＳＬＢ上でＰＮＰプローブの拡散動力学に対するビオチン結合価の影響
暗視野顕微鏡を用いて単一ナノ粒子の解像度でＳＬＢ結合ＰＮＰプローブの横的動きを観察し、イメージ解析プログラムを用いて個々の軌跡を分析した（ImageJソフトウェア；具体的な実験と解析の方法は、後述）。他のビオチン結合価を有するＳＬＢ−結合ＰＮＰプローブの事件の関数で平均二乗変異（mean square displacement；MSD）の値をそれぞれ図２ａに示した。多結合価ＰＮＰは、少数結合価（paucivalent）ＰＮＰと比較し、遥かにゆっくり拡散し、より短い距離を移動する傾向を示した。４８６個のビオチンを含むＰＮＰは、ほとんど移動性がなく、ほぼ同じ位置に留まることを確認した。４８６個のビオチンを含む場合を除き、これらの軌跡のＭＳＤプロットは、ＭＳＤと時間間隔の間の線形関係を明確に示した。これらの結果は、これらのナノ粒子は、ＳＬＢの表面上の任意の２Ｄブラウン運動を表すことを意味する。ＰＮＰプローブの拡散係数を計算するために、本発明者らは、各ビオチン結合価に対して１００個の粒子の軌跡を分析し、対応するＭＳＤプロットを下記の数式に最適化した。
【００５５】
【数１】
0006402351.tif 000003
前記＜ｒ２＞は、ＭＳＤ、Ｄは拡散係数であり、ｔは時間間隔である。１、５、２８、及び１２８のビオチン結合価に対する拡散係数の平均値は、それぞれ１．７９±０．８７×１０−８、０．７２±０．３５×１０−８、０．３８±０．２９×１０−８及び０．１８±０．１４×１０−８ｃｍ２／ｓで計算された（図２ｂ）。計算されたＤ値の分布を図３に示した。これらの値は、脂質の動きを可視化するためにＳＬＢを３０〜５０ｎｍのＡｕＮＰに改質した他の文献的結果と一致した。ＰＮＰがより多結合価化するにつれて、移動性分画はより減少し、ほとんどの粒子はビオチン結合価が４８６に達したとき、実質的に固定された。さらに、多結合価ＰＮＰの暗視野顕微鏡イメージを観察して関連性を確認し、ＰＮＰの位置を証明するためにＳＬＢ上Ｃｙ３−式ＳＴＶの蛍光顕微鏡イメージを局部的に集中したＳＴＶの位置と一致した。その結果、２つのイメージは、互いによく一致しており、これも結合価ＰＮＰの下でＳＴＶの局所蓄積が粒子の移動の消失を誘発することを示す（図４）。
【００５６】
４．３．金ナノ粒子の光学的安定性テスト
金属ナノ粒子の共鳴光散乱は、有機色素からの蛍光とは異なる物理的起源を有する。局部化された表面プラズモンの放射減衰（radiative damping）は、散乱された光子を形成し、これらの過程は、点滅及び光漂白の影響を受けない。ＰＮＰの光安定性を確認するために、ＳＬＢ上の５０ｎｍのＡｕＮＰを３０分間継続的に、暗視野顕微鏡の照射に露出させ、散乱強度を、６秒間隔で記録した（図５）。粒子は全体の実験時間にわたって強度変更せずにきらめき（shining）を維持した。これは、ＡｕＮＰが単一粒子追跡するために、複数の染料を使用している場合でも、実質的に水分内に信号を失う蛍光染料に比べて、リアルタイム光学の研究において、より強い（robust）光学的標識であることを示すものである。
【００５７】
４．４．ＳＬＢ上に結合されたナノ粒子の単一ナノ粒子の解像度の本来の場所の映像化及びその分析法
流動性ＳＬＢにＰＮＰを動的に連結し、粒子の結合価を調節することにより、ＰＮＰの動力学的挙動を調節した。また、単一粒子レベルの解像度で本来の場所のＤＮＡ混成化により誘導された粒子のクラスタ成長動力学と相互作用するＰＮＰとの間のリアルタイムプラズモンカップリングを使用し、前記プラットフォーム上で定量を分析した（図６及び７）。複数の粒子の反応場所からの相互作用を同時にモニタリングして分析した。二量体、三量体、及び四量体ナノ粒子クラスターの形成に対する速度論的研究を行い、本方法の適用事例として、多重平行の単一粒子分析ベースのＤＮＡ検出アッセイを開始した。前記プラズモンナノ粒子（ＰＮＰ）は、効果的に共鳴光を散乱させ、光漂白及びちらつきの影響を受けないため、このような接近に使用され、長期間に渡って優れた時空間解像度で、単一ナノ粒子を追跡することができる（〜１．５ｎｍと〜１０μｓ解像度で１時間以上）。個別の金または銀ナノ粒子（ＡｕＮＰまたはＡｇＮＰ）のプラズモンは、距離依存の方法で、互いに相互作用し、これは追加の標識なしに散乱強度または分光学的反応の変化をモニタリングすることにより、数十ナノメートル以内の分子相互作用の測定のベースとなる基本的原理を形成する。ＳＬＢは、固体基質上に２Ｄ流体表面を合成して調節し、側方流動性を有する多様な膜種を含むことができる非常に強力なプラットフォームである。ＳＬＢにナノ粒子を連結することにより、ナノ粒子を２Ｄ関心のあるすべての粒子の効率的な映像化及び追跡のために、光学顕微鏡の焦点面（focal plane）に閉じ込めることができる一方、ＳＬＢの流動的性質により、ナノ粒子の自由な動きを保存することができる。連結されたＰＮＰは入射光を共鳴散乱させ、常に平面の脂質二重層表面上で移動することにより、単一粒子の解像度で２Ｄ拡散軌跡及び光学信号を暗視野顕微鏡（Axiovert 200M、Carl Zeiss、Gottingen、Germany）に本来の場所で記録することができる（図７）。暗視野顕微鏡観察の結果から、連結されたＰＮＰが２Ｄ膜表面を通じて均一に分散され、膜表面にわたる自由拡散に優れた側方移動性を示すことを確認した。前記粒子の動力学的２Ｄ拘束及びＰＮＰ標識の使用は、粒子間の効率的な衝突及びナノ粒子上の分子との間のほぼすべての反応の本来の場所観察及び分析を容易にする。
【００５８】
実施例５：パターン化されたＳＬＢの製造
ＤＮＡアッセイのために、ガラス基質上にパターン化された金フィルムに１２０×１２０μｍ２  ＳＬＢを形成した。金パターンは、既存のフォトリソグラフィとリフトオフ工程（lift-off process）により製造した。金表面はＳＬＢ形成に対して不活性であるため、ＳＵＶ溶液の導入により露出されたガラス表面上にＳＬＢを選択的に沈着させることができた。ＳＬＢを形成した後、ＰＮＰと標的ＤＮＡの非特異的結合を抑制するために、金の表面をＰＢＳに溶かした２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと１０μＭカルボキシポリエチレングリコールで不活性化（passivate）した。その後、ＤＮＡアッセイ実験に使用するためにＰＮＰを結合させた。
【００５９】
実施例６：暗視野顕微鏡法−ベースＰＮＰプローブの本来の場所（in situ）観察及び光学分析
４０×対物レンズ（ＮＡ  ０．６）を備えた暗視野顕微鏡（Axiovert 200M、Carl Zeiss、Gottingen、Germany）によりＳＬＢ−結合されたＰＮＰプローブの移動とプラズモンカップリングを観察した。すべてのイメージ分析プロセスは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いて行った。個々のＳＬＢ−結合ＰＮＰプローブの追跡及び軌跡の分析のために、ＭＯＳＡＩＣプラグインを使用した（http://www.mosaic.ethz.ch/Downloads/ParticleTracker）。散乱強度及びＲＧＢ色のスペクトルは、それぞれＩｍａｇｅＪソフトウェアの基本的な強度測定及びＲＧＢ色強度分割機能により測定した。Ｃｙ３−改質ＳＴＶを５３２ｎｍレーザーで励起し、６０×レンズ（ＮＡ  １．４９）を備えたｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡（TE-2000、Nikon、Tokyo、Japan）を用いて観察した。
【００６０】
６．１．相互作用する粒子の高解像度映像化アッセイ
高解像度映像化アッセイの他の重要な点は、相互作用する粒子を観察することができる安定的で信頼性の高い方法であるということである。これを容易にするために、著しく異なる側方移動性を有する２つの形式のＤＮＡ修飾されたプラズモンナノ粒子（ＤＮＡ−ＰＮＰ）を考案し、製造してＳＬＢの表面に連結させた（高移動性のＰＮＰ及びほぼ固定されたＰＮＰ（それぞれＭ−ＰＮＰ及びＩ−ＰＮＰ）プローブ；図６）。固定されたＩ−ＰＮＰ位置からの散乱信号は、安定的にモニタリングし、分析することができ、Ｍ−ＰＮＰは、Ｉ−ＰＮＰ位置で拡散してプラズモンカップリング−ベース散乱信号の変化を誘導することができる。Ｉ−ＰＮＰ及びＭ−ＰＮＰプローブは、それぞれ５’−チオール−改質されたＤＮＡ及び３’チオール−改質されたＤＮＡプローブで製造した。二つの異なるチオール化されたＤＮＡ配列（標的捕獲配列とＳＬＢ連結配列）を使用し、それぞれのＰＮＰプローブを機能化した。ＳＬＢ連結配列はチオールと他の末端にビオチン基を含み、ストレプトアビジン−改質されたＳＬＢに安定結合を形成する。ＰＮＰプローブの移動性をＤＮＡ修飾過程でＳＬＢ連結配列のモル分率を異にして探針のビオチン結合価により調節した。ＰＮＰがより多結合性であるほど、拡散係数、及び移動の分率は、より減少し、０．１５６２５モル分率のＳＬＢ連結配列で達成されるビオチン結合価が４８６に達したとき、すべての粒子は実質的に固定された（図８）。Ｍ−ＰＮＰプローブを製造するために、０．００１２５モル分率のＳＬＢ連結配列を添加して１ビオチン結合価を得た。Ｍ−ＰＮＰプローブは、少数結合価（paucivalent）であり、任意の２Ｄブラウン運動により遥かに自由に拡散することができる。一方、多結合価Ｉ−ＰＮＰプローブは、ほぼ完全に膜表面上に固定された。散乱強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、本発明に使用された顕微鏡装置の光学解像度、ｄと類似の５００ｎｍの半径のＩ−ＰＮＰ位置（ｓｉｔｅ）−中心の円形区域（nanoparticle-centered circular area）を平均して分析した（ｄ＝λ／２ＮＡ；λは、５０ｎｍ  ＡｕＮＰの共鳴散乱波長である５３０ｎｍ、ＮＡは対物レンズの開口数（numerical aperture）である０．６）。
【００６１】
Ｍ−ＰＮＰ及びＩ−ＰＮＰプローブは、ＳＬＢのＳＴＶリンカーを介してビオチン化された脂質に結合するため、ＰＮＰ−結合された脂質の局所位置及び動きは暗視野顕微鏡で共鳴光散乱信号を追跡することができる。粒子−結合された標的ＤＮＡ不在時、Ｍ−ＰＮＰプローブは、固定されたＩ−ＰＮＰ位置に接近することができ、前記プローブは、暗視野顕微鏡で一時的に重畳することができる。その結果、Ｉ−ＰＮＰ位置の散乱強度は、初期には一定であるが、Ｍ−ＰＮＰが光学回折限界内に進入するのに伴い変動した（図９）。興味深いことに、信号において２つの瞬間的な鋭い上昇が観察された。より頻繁なケースで、散乱強度は初期値の約２倍に達した。これは、二つのＰＮＰが光学的解像度以内に存在するが、プラズモンカップリングを惹起させるほど互いに十分に近くない遠い光学的重畳に起因し得る（図９ｂ−ｉ）。他のケースにおいて、散乱強度の約３．５倍の上昇が観察され、このような高い向上は、プラズモンカップルされた二つのＰＮＰ間の近接場相互作用に起因した（図９ｂ−ｉｉ）。大部分のこのような信号の変化は、粒子間の特異的な相互作用の不在により、０．５秒未満の間持続した。脂質間の一時的な分子間の近接をプラズモンカップリングにより準−回折長スケールで確認した。前記したように、本発明の方法を利用して、ＰＮＰプローブ間のドッキング（docking）及びプラズモンカップリングにより引き起こされる分子間の相互作用をモニターすることができることを提示する。次に、本発明者らは、ＳＬＢ上でＤＮＡ修飾ＰＮＰプローブの組み立て及び分解により誘発される本来の場所のＤＮＡ混成化及び脱混成化（dehybridization）イベントを観察し、単一ナノ粒子の解像度でリアルタイムに対応する散乱強度の変化を記録した。標的ＤＮＡ配列が存在するとき、少数結合価のＭ−ＰＮＰは、固定されて追跡中心としてモニターすることができる多結合価のＩ−ＰＮＰにより捕獲され、多粒子のクラスターを形成した。暗視野顕微鏡イメージで組立過程は、単一ナノ粒子添加のイベントを観察するにおいて、成功的に分析された（resolved）。単量体から四量体に粒子−ｂｙ−粒子のＰＮＰクラスタ成長が観察され、捕獲されたＭ−ＰＮＰプローブの軌跡は、白実線で強調した（図１０ａ）。クラスタの発達に伴い、Ｉ−ＰＭＰ位置に対するすべての単一のＭ−ＰＮＰ添加段階において散乱強度及び色の両方で急な変化が観察された。散乱効率及び共鳴波長での変化は、クラスタ化されたＡｕＮＰでのプラズモンカップリングにより惹起された。３ｎｍの標的ＤＮＡの濃度での反応は、１５分以内に完結され、多くの単量体Ｍ−ＰＮＰプローブが消費されながら、クラスタを形成した。Ｍ−ＰＮＰの数が限られており、単一位置で４つを超える粒子の組み立てに対する粒子上でＤＮＡ鎖間の大きな粒剤障害が存在するため、クラスタの成長は、通常、四量体以内に制限され、四量体を超える追加の成長はほぼ観察されなかった。固定されたＩ−ＰＮＰの使用は、不規則な２Ｄ凝集体を形成し、定量性を損なう小型クラスタ間の融合を効果的に除去することにより、単量体の付着に対するクラスタ成長経路を制限する（Ｍ−ＰＮＰ対修飾ＳＬＢで観察される融合過程（coalescence process）については、��１１を参照）。ＰＮＰプローブ間のプラズモンカップリングは、共鳴波長の赤方偏移（長波長に移動；red-shift）を誘発し、したがって、プラズモンカップルされた緑色のＡｕＮＰは暗視野顕微鏡イメージから赤色に変わった。ＲＧＢチャネルを分割してプラズモンの色の変化を分析した（図７）。クラスタが成長するにつれて、緑色と赤色の信号が増加する一方、青色信号は一定に維持された。これに基づいて、本発明者らは、赤色に対する緑色の割合をグラフで示し、クラスタ化された粒子の数が増加するにつれて割合の線形的増加が観察された（図１０ｂ）。色検定標準は、実質的に粒子間の相互作用の状態を正確に定義し、定量することと非特異的光学重畳から、特異的相互作用−ベースのプラズモンカップリングを区別するのに有用である。標的ＤＮＡの認識及び混成化を通じて、Ｉ−ＰＮＰ位置にＭ−ＰＮＰプローブを一つずつ（particle-by-particle）添加することを観察し、散乱強度の時間追跡で定量した（図１０ｃの上部のグラフ）。前記結果は、それぞれのＭ−ＰＮＰがＩ−ＰＮＰプローブに添加されることにより、順次二量体、三量体、及び四量体が形成され、散乱信号の強度が段階的に増加することを示す。高塩ＰＢＳ溶液（１６７ｍＭ  Ｎａ＋）を遥かに少ない塩（１７ｍＭ  Ｎａ＋）を含む低塩ＰＢ溶液に交換したとき、標的ＤＮＡは脱混成化され、Ｍ−ＰＮＰは、Ｉ−ＰＮＰプローブから解離され、自由にＳＬＢ表面に亘って拡散され、その結果、散乱強度で段階的な一連の減少が誘発された（図１０ｃの下部のグラフ）。これは、散乱信号の強度がプローブ添加段階の毎に多段階変化を経験し、次の粒子が添加されたり脱落するまで一定に維持されることを示す。
【００６２】
６．２．クラスター成長速度（cluster growth kinetics）の分析
単量体から四量体でクラスタ成長速度をＩ−ＰＮＰに比べてＭ−ＰＮＰが過量で存在することと仮定して３−段階の１次連続反応で最適化された。
【００６３】
【化１】
0006402351.tif 000004
各種の変化速度に対する微分型は、下記の通りである。
【００６４】
【数２】
0006402351.tif 000005
前記微分方程式を解いて、各種の時間依存濃度を描写する解法を得ることができる：
【００６５】
【数３】
0006402351.tif 000006
この時、初期Ｉ−ＰＮＰ単量体の濃度、［Ｍ］０は、ここで分析された粒子数である１５０である。前記方程式を利用して、速度データを最適化することにより、速度定数値ｋ１、ｋ２、及びｋ３を確認した。
【００６６】
広い表面積にわたるＰＮＰプローブの個々のプラズモンカップリングを同時に分析することにより、多重相互作用における高度の並列の本来の場所を観察することが実現できた（一般的には〜３０，０００μｍ２；図１２ａ）。本発明に係る３３０秒の観察時間の間（８０ｍｓ露光時間及び１ｓの時間間隔）本来の場所の並列粒子クラスターの成長の分析結果は、連続的なｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｙ−ｐａｒｔｉｃｌｅクラスタの成長が、一般的に観察されるにもかかわらず（図１２ｂ−ｉ及びｉｖ）他の多くのクラスタリングモードも、他のクラスタリング速度で観察されることを示す。あるプローブは、かすかに形成されただけで、これ以上は成長しなかった（図１２ｂ−ｉｉ及びｉｉｉ）。また、四量体を形成するさらなる成長はせずにプローブクラスタが成長し、三量体を形成する場合もある。Ｉ−ＰＮＰプローブに対する２種類のプローブの同時添加（図１２ｂ−ｉｉｉ及びｖｉ）及び非常に短い時間フレーム内では、Ｉ−ＰＮＰプローブに対する２種類または３種類のプローブの相次ぐ添加を観察し、分析した（図１２ｂ−ｖｉｉ、ｉｘ及びｘ；挿図参照）。本発明では、前記本来の場所の並列単一粒子の解像度解析機能に基づいてＤＮＡ混成化誘導クラスターの形成における反応速度を研究した。このために、１５０個の個々のＩ−ＰＮＰ位置の散乱強度を同時にモニターした。単量体から四量体までの成長速度（単量体、二量体、三量体、四量体）をＭ−ＰＮＰがＩ−ＰＮＰ単量体に比べて過量に存在することを仮定して３段階の連続反応により最適化した。二量体、三量体、及び四量体の形成に対する速度定数は、それぞれ０．０１６５、０．０１１６及び０．００６１ｓ−１と算出した。前記モデルは、ナノ粒子クラスターの成長動力学が１８０秒以内の時間で実行されることを説明する。前記結果は、二量体から三量体の形成が単量体から二量体の形成よりも困難で速度の遅い過程であり、ＤＮＡ修飾ＰＮＰプローブ間の立体障害により、四量体の形成は最も困難で、時間消耗的な過程であるという仮定に対する直接的な証拠である。立体障害因子（ｆ）を考慮し、三量体及び四量体の形成の速度定数は、それぞれ及びで表現することができる。立体障害因子は、最適化された速度定数から計算することができる（ｆｄｉｍに対して０．７０４０、ｆｔｒｉに対して０．３７１６）。透過電子顕微鏡の測定は、ＰＮＰクラスタが、他の幾何学的形状に形成されることを示す（図１３）。このような観察に基づいて、本発明者らは２Ｄ二量体及び２Ｄ三量体に対する次のＰＮＰの添加に対して立体因子を幾何学的に計算した（幾何学的に計算された立体障害因子；ｆｄｉｍ＝０．６６６７及びｆｔｒｉ＝０．３７５０；図１４）。これらの数値は、最適化された（ｆｉｔｔｅｄ）速度定数から取得した立体因子と一致し、このことは、３段階の連続反応モデルがＤＮＡ修飾ＰＮＰプローブの２Ｄクラスタの成長を説明していることを示す。
【００６７】
最後に、本発明者らは、クラスタで反応した粒子数に対する光学的検定基準を示し、前記標準曲線に基づいて、標的ＤＮＡの検出を行い、ＰＮＰ結合ＳＬＢプラットフォームの検出感度を評価した。３０個の個々のクラスタを同時に分析して検定標準プロットを獲得し、粒子添加イベントをすべて分析して記録することによりクラスタ内の粒子数を確認した。単一のフレーム収集内に複数のＰＮＰプローブを同時に添加することを防ぐために、フレーム速度を毎秒５．３フレームに上昇させた。本発明者らは、平均化された散乱強度をプロットして、クラスタされた粒子数との線形関係を確認した（Ｒ２＝０．９９９、図１５ａ）。図５に相応する分布を示した。その結果は、狭い標準偏差を示し、本発明者らはクラスタ化された状態を明確に区別することができた。
【００６８】
６．３．ＳＬＢ上に連結された相補的ＤＮＡが修飾されたＰＮＰとの相互作用を利用した標的ＤＮＡ検出の限界
標的ＤＮＡとその相補的な配列との相互作用により形成された金ナノ粒子クラスターの場合、散乱信号の強度増加が明確であり、単一ナノ粒子レベルで観察が可能であるため、クラスターの形成程度を定量化する場合は、標的ＤＮＡを検知するバイオセンサーとして応用することができる。したがって、標的ＤＮＡの濃度に応じて、ナノ粒子クラスターが形成され、変化する暗視野顕微鏡イメージの信号の明度を分析し、検出可能な濃度範囲を確認した。金フィルムに挿入された（embeded）１２０×１２０μｍ２のＳＬＢパターンでＤＮＡの検出を行った（図１５ｂ）。ＰＮＰ−修飾されたＳＬＢを４時間の間３００ａＭ〜３００ｆＭの範囲の異なる濃度の標的ＤＮＡと反応させた。対照試料を含む、すべての試料は、本発明に係るアッセイの選択性を検証するために、３００ｆＭの非相補的ＤＮＡ配列を含む。本発明に使用された標的ＤＮＡの濃度範囲でＰＮＰは、三量体及び四量体へのさらなる成長はせずに、二量体のみを形成した。カップルされた二量体散乱強度を示すＩ−ＰＮＰ位置（＞３．５倍−の向上；図１５ａ）を標的ＤＮＡ配列に対する光学的信号として係数した（図１５ｂ）。アッセイ結果は、最適化過程なしに３０ｆＭの検出限界を示した（図１５ｃ）。また、単一塩基対の不一致ＤＮＡ配列も明確に区別された（図１５ｃ）。
【００６９】
このような高い感度は、ＳＬＢ上で動くＭ−ＰＮＰと動かないＩ−ＰＮＰが同じ２次元平面で移動して反応するため、衝突の確率が高くなり、迅速な反応を示すことができることを意味する。実際に、Ｍ−ＰＮＰを支持型脂質二重層に導入せずに、溶液上に分散させた後、ＳＬＢ上に固定されたＩ−ＰＮＰと反応させる場合、非常にゆっくりと非効率的な反応を起こすことが観察された。
【００７０】
６．４．外部刺激によるＳＬＢ上に連結されたナノ粒子の分布調節及びプラズモンカップリング誘導
ＳＬＢ上に導入された金属ナノ粒子のビオチン結合価を適切に調節すると、ナノ粒子は、ＳＬＢ上で流動性を有するようになる。流動的なナノ粒子は、自由な２次元拡散運動をするようになるが、外部からの刺激（例えば、電場あるいは流体の流れ）を利用し、ＳＬＢ上でナノ粒子が所望の方向に移動するように調節することができ、この時、刺激の強度、すなわち、加えられる電場のサイズまたは流速を変化させることにより、粒子の移動速度も調節可能である。図１６に示すように、パターン化されたＳＬＢでナノ粒子の空間的分布を操作する場合、特定の部分で粒子の密度を高め、粒子間の衝突頻度を大幅に向上させることができる。したがって、ＳＬＢ上でナノ粒子間の相互作用を増加させて反応速度を向上させ、バイオセンサーの感度を高め、検知時間を短縮させることができる。また、粒子間の距離を調節してプラズモンカップリングを調節するためのプラットフォームとして使用することもできる。
【００７１】
具体的には、ＳＬＢのプラットフォームに導入された金属ナノ粒子の動きを制御するために、ガラス基板上にフローチャネルを作製した。上部スライドグラスの両側に穴を形成して流体の流れを作るための緩衝溶液を導入するようにした。このような方法でチャネルの内部に流体の流れを導入すれば、ナノ粒子は、２次元の自由拡散運動において少しずつ経路を変化させながら、特定の方向に移動するようになる。流速を増加させるほど、このような移動傾向がはっきりと観察された（図１７ａ及びｂ）。Ｃｒを用いてＳＬＢをパターン化する場合、ナノ粒子がＣｒ障壁の外部に出ずに閉じ込められる（図１６右下段）。この時、流体の流れでナノ粒子の運動方向を一方的に調節すると、ナノ粒子が流体の流れと同じ方向に移動して濃縮されるという現象を観察することができる（図１８ａ及びｂ）。金と銀ナノ粒子は両方とも流動性ナノ粒子が一方向に蓄積されて特有の表面プラズモン共鳴（surface plasmon resnonace）の波長の色を示すことを確認した。また、流体の流れを反対方向に変える場合、濃縮されていたナノ粒子が逆方向に移動し、同様に蓄積されることが観察された。
【００７２】
パターンをさらに拡張して数ｍｍ２のサイズに製作する場合、より多くのナノ粒子を一箇所に集中させることができる。広い領域のナノ粒子を集めるために台形型のパターンを製作し、６ｍｌ／ｈの流速で約３０分間ナノ粒子を密集させた。密集したナノ粒子は、パターンの終端の部分で特有のプラズモン散乱色を帯びていることを暗視野顕微鏡により確認した。この時、ナノ粒子は、流体の流れに後押しする力とＤＮＡが修飾されたナノ粒子間のファンデルワールス（Van der Walls）の相互作用とＤＮＡ分子間の立体反発力（steric repulsion）、静電反発力（electrostatic repulsion）により平衡をなしている。ナノ粒子間の距離を狭めるために、本研究では、流体に含まれるＮａＣｌ塩の濃度を増加させた。ＮａＣｌ濃度を増加させることにより、ナノ粒子間の静電反発力が減少し、粒子間の距離がより近づいてプラズモンカップリングが誘導されることを確認した。この時の散乱スペクトルを測定して分析した（図１９ａ及びｂ、図２０ａ及びｂ）。散乱スペクトルの最大ピークは、塩の濃度が増加するにつれて、長波長移動（red shift）を示した。ナノ粒子のゼータ電位の測定結果、塩の濃度が増加するにつれて、ナノ粒子の表面電荷が減少することを確認し、その結果、粒子間の静電反発力が減少し、距離が近づいたことを確認した（図１９ｃ及び２０ｃ）。
【００７３】
６．５．生体模倣型人工細胞膜プラットフォームの開発
細胞膜は、細胞の内部と外部を区別する構造物であり、リン脂質及びタンパク質分子で構成された薄いリン脂質二重層である。細胞膜は、選択的な透過性を有し、複数のタンパク質を通じて細胞の機能及び組織を維持する機能を行う。このように、細胞膜では細胞の恒常性の維持及び必須機能のための多様な生物学的現象が行われているため、細胞膜での生物学的及び細胞生物学的な理解は非常に重要である。
【００７４】
このような点に着眼し、前記実施例６．４．に開示した電気的または流体学的に調節可能な人工細胞膜の構造であるＳＬＢプラットフォームを利用し、細胞の挙動を観察することができる。人工細胞膜であるＳＬＢに化学的、生物学的結合方法を使用し、生体物質を含む金属ナノ粒子のような標識物質を導入し、前記標識物質の光学的特性を検出し、細胞の挙動をモニタリングすることができる。ＳＬＢに導入された生体物質は、細胞内部に信号伝達を誘導したり、外部的に表現型を調節するなどの反応を誘導することができる。このような観察は、実際の細胞膜で起こる生物学的反応と似ているという点で、これまで明らかになっていなかった新たな生物学的メカニズムを解明するのに役立てることができる。
【００７５】
プラズモン共鳴のような光学的特性を有している金属ナノ粒子は、周辺の粒子との距離に依存して混成化することができる。このような特性のため、周辺の金属粒子との距離及びクラスタリングの程度に応じて、暗視野顕微鏡で観察したとき、それぞれ異なる色を帯びるようになる。また、金属ナノ粒子は、強いプラズモン散乱により長時間高い信号対雑音比（S/N ratio）で観察が可能である。プラズモン散乱信号だけでなく、いくつかのマルチ検知が可能な表面増強ラマン散乱（surface-enhanced Rman scattering）信号を発生する細胞のモニタリングプローブを細胞膜に導入することにより、細胞の反応を観察することができる。
【００７６】
したがって、生体物質を含む金属ナノ粒子をＳＬＢ表面に導入して細胞を培養した後、細胞による金属ナノ粒子の動きを光学的に分析することができる。これは、細胞の挙動をリアルタイムで観察することができるというメリットだけでなく、細胞と生体物質の相互作用をナノレベルでリアルタイムでモニタリングすることができるという点で、細胞シグナル伝達機構をより精密に分析することができるようにする（図２１）。
【００７７】
実施例７：赤／緑／青（ＲＧＢ）の三色のナノプローブを用いた多重検知
金及び銀のような貴金属ナノ粒子は、プラズモン共鳴現象を示し、ナノ粒子の形状及び／またはサイズに応じて多様な色を散乱する特性を有するため、このような特性を利用し、ナノ粒子の組成、形状、及び／またはサイズを変化させ、それぞれ赤、青、または緑色の光を散乱させるナノ粒子を提供することができ、これらのナノ粒子は、互いに異なる色を表すため、暗視野顕微鏡で区分が可能である。したがって、互いに異なる結合の区分を可能にすることにより、これらのそれぞれ異なる３色のナノ粒子を使用してｍｉＲＮＡの多重検知に対する適用可能性を確認した。一方、ｍｉＲＮＡは、生体内の機能を調節する短いＲＮＡ鎖で、がんのような疾患を有する患者から誤発現することが知られているため、がんなどの疾患を診断するバイオマーカーとして作用することができる。様々ながん疾患で確認された誤発現されるｍｉＲＮＡを表２に示した。
【００７８】
【表２】
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７．１．ＲＧＢ三色ナノ粒子の製造
赤色を散乱するナノ粒子は、１５ｎｍ×１５ｎｍ×４５ｎｍサイズの金ナノロッドに約５ｎｍの厚さで銀のシェルをコーティングして製造した。緑色を散乱するナノ粒子としては、５０ｎｍの直径の球状の金ナノ粒子を使用した。一方、青色を散乱するナノ粒子は、２０ｎｍの直径の球状の金ナノ粒子に約１０ｎｍの厚さの銀のシェルを導入して製造した。前記製造されたそれぞれのナノ粒子を暗視野顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて色相と形態を確認し、その結果を図２２に示した。また、各粒子の吸収／散乱スペクトルを測定し、共に示した（図２２右）。
【００７９】
７．２．三色ナノプローブの結合を通じたマイクロＲＮＡの多重検知
前記実施例７．２．から得たそれぞれのナノ粒子に、実施例３と同様の方法でＤＮＡを導入して機能化してナノプローブを合成した。実施例４と同様の方法で、前記三色のナノプローブの移動性を調節して三色のナノ粒子のそれぞれに対して、Ｉ−ＰＮＰ（以下、ＩＲ、ＩＧ、及びＩＢと表記）及びＭ−ＰＮＰ（以下、ＭＲ、ＭＧ及びＭＢと記す）、計６種のナノプローブをＳＬＢ上に導入した。実施例６．１．で確認したように、プラズモン共鳴散乱を示す金属ナノ粒子は、これに結合された相補的な配列のＤＮＡの混成化に応じて互いに接近して２つ以上の粒子がクラスターを形成し、これにより、プラズモン散乱強度が変わるだけではなく、プラズモン色の変化を伴うため（図５〜７）、これを互いに異なる色を表す３つの粒子に適用すると、互いの組み合わせによりプラズモンスペクトルから計９種の異なる変化が示されると予想することができ（図２３ａ）、これを具体的な実施例を通じて確認した（図２３ｂ〜２３ｄ）。具体的には、それぞれのナノプローブを組み合わせて、９つのｍｉＲＮＡ（図２３ｂ）と結合することができるように相補的なＤＮＡで改質し、各結合をリアルタイムで観察することができるだけでなく、９種のｍｉＲＮＡを定量的に分析することができることを確認した。結合前（０分）、及び６０分間反応させた後（６０分）、同じフレームで測定した暗視野顕微鏡イメージを図２３ｃに示し、反応時間による累積結合数の変化を図２３ｄに示した。固定された個々の粒子（ＩＲ、ＩＧ及びＩＢ）で経時による同種または異種粒子との結合によるプラズモン散乱スペクトルの変化をそれぞれ図２４〜２６に示し、暗視野顕微鏡を用いて前記それぞれのカラー（それぞれ互いに異なるプラズモン散乱波長）を有する、及び／または移動度を有する複数の粒子の挙動及びその測定方法を図２７に概略的に示した。したがって、本発明の多重検知方法は、９種以上のｍｉＲＮＡを同時に定性及び／または定量分析することができるため、６種以上の異なる種類のがんを区別して診断するのに使用することができる。
【００８０】
相補的配列認識によるｍｉＲＮＡの検出の例を図２８に示し、前記多重検知の可能性を確認するために使用された９種のｍｉＲＮＡの配列及びこれらを検出するために、それぞれの粒子に導入したＤＮＡ配列を下記表３に示した。
【００８１】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006402351.tif 000015
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0006402351.tif 000029
【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２３ｄ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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