(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定細胞集団における膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞のソーティング又は補助ソーティングの方法であって、
被測定細胞集団における細胞でＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるか否かを検出し、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させると、該当細胞を膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞とし、又はこれらの候補とし、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させないと、該当細胞を膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞としなく、又はこれらの候補としないステップを含み、
前記ＳＵＳＤ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列表における配列２である、ソーティング又は補助ソーティングの方法。
【請求項２】
前記被測定細胞集団における細胞でＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるか否かは、被測定細胞集団における細胞に、ＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を含有するか否かを検出することにより行われ、前記被測定細胞集団における細胞にＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を含有するか否かを検出する方法は、
１）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体とした免疫蛍光抗体法、或いは
２）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体としたフローサイトメトリー法、或いは
３）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体とした磁気ビーズ分離である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被測定細胞が膵臓内胚葉細胞である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記膵臓内胚葉細胞がヒト由来膵臓内胚葉細胞である、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マーカーとしてのＳＵＳＤ２タンパク質、そのコード遺伝子、又は前記ＳＵＳＤ２タンパク質の前駆体タンパク質をコードするｍＲＮＡの膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞の同定、スクリーニング又はソーティングでの使用であって、
前記ＳＵＳＤ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列表における配列１に示され、
前記ＳＵＳＤ２タンパク質のコード遺伝子のヌクレオチド配列は、配列表における配列２に示される、使用。
【請求項６】
前記ＳＵＳＤ２タンパク質に特異的に結合できる抗体の、膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞を同定、スクリーニング又はソーティングする試薬の調製での使用。
【請求項７】
前記抗体は蛍光標識を有し、前記抗体はモノクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記使用は、膵臓内胚葉細胞から膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞をスクリーニング又はソーティングすることであり、
前記スクリーニング又はソーティングする方法は、免疫磁気ビーズ分離法及びフローサイトメトリー法であり、
前記同定方法は、免疫蛍光抗体法及びフローサイトメトリー分析法である、ことを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＳＵＳＤ２タンパク質の前駆体タンパク質をコードできるｍＲＮＡに特異的に結合できるプライマー対、プローブ又はこれらの相補鎖の膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生
内分泌細胞の同定用試薬の調製での使用。
【請求項１０】
前記プライマー対は、配列表における配列３に示される一本鎖ＤＮＡ分子と、配列表における配列４に示される一本鎖ＤＮＡ分子からなる、ことを特徴とする請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ技術分野に関し、特にＳＵＳＤ２タンパク質のマーカーとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞に由来する膵臓ｂｅｔａ細胞は、糖尿病、特にＩ型糖尿病に対する細胞置換療法のために十分なドナー膵島細胞源を提供できる。また、ヒト多能性幹細胞から膵臓ｂｅｔａ細胞への指向性誘導分化は、ヒト膵臓の発達過程を研究するためにインビトロ研究モデルを提供できる。発達過程のｉｎ  ｖｉｖｏシミュレーションによって、ヒト多能性幹細胞から膵臓ｂｅｔａ細胞への指向性誘導分化は、主に、胚内内胚葉、腸管、前腸後部、膵臓内胚葉及び膵臓内分泌細胞という複数の段階を含む。その中、膵臓内胚葉段階にある細胞は、ハイブリッド細胞であり、一般的に膵臓前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞等を含む。従来、主に膵臓発達に関連する遺伝子の発現によって細胞の運命を決定する。膵臓前駆細胞は主に関連遺伝子、例えばＰＤＸ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６等の遺伝子を発現させることにより決定される。膵臓内分泌前駆細胞の最も主なマーカー遺伝子の一つはＮＧＮ３であるが、ＮＧＮ３は一時的に発現されるので、その下流遺伝子、例えばＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１等の遺伝子の発現及びＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮ  Ａ、ＩＮＳＵＬＩＮ、ＧＬＵＣＡＧＯＮ等の内分泌関連遺伝子の非発現と組み合わせることで膵臓内分泌前駆細胞の運命を決定するのが一般的である。これらマーカー遺伝子の発現によって特定細胞の運命を決定できるが、該当マーカー遺伝子はすべて転写因子又は分泌タンパク質等であり、細胞質又は細胞核内に位置するのが一般的であるため、これらタンパク質の発現によって特定の細胞群、特にヒト膵臓内分泌前駆細胞と新生膵臓内分泌細胞を分離して精製させることができないので、その分子的特徴を詳細に研究することができない。
【０００３】
現在、ヒト多能性幹細胞の指向性誘導分化を利用して膵臓前駆細胞が得られるが、該当細胞はインビトロで機能が成熟した膵臓ｂｅｔａ細胞への分化効率が低い。ヒト多能性幹細胞に由来する膵臓前駆細胞を免疫不全マウスの体内に移植することで、機能が成熟した膵島細胞が得られるが、膵臓前駆細胞は一定の増殖能力を有するので、発癌性によって臨床使用への進展が制限されてしまう。膵臓前駆細胞に比べて、機能が成熟した膵臓ｂｅｔａ細胞は、ドナー細胞源として好ましい。しかしながら、インビトロで膵臓前駆細胞を機能が成熟した膵臓ｂｅｔａ細胞に誘導分化するという課題は、糖尿病の細胞置換療法の実現を大幅に制限し、膵臓前駆細胞が膵臓ｂｅｔａ細胞へ分化する過程において、膵臓内分泌前駆細胞を正確且つ効率よく誘導分化することは肝心なことである。マウス等のモデル生物の研究により、膵臓ｂｅｔａ細胞の発達過程に対する理解を大幅に促進し、これら研究は、膵臓ｂｅｔａ細胞のインビトロ指向性分化を指導するのに決定的な役割を果たす。しかし、膵臓内分泌前駆細胞の運命特殊化、異なる内分泌細胞同士の運命選択についての研究は依然として少なく、また、ヒトとマウス等のモデル生物には一定の種差が存在するため、関連分子マーカーを使用して特定発達段階にある膵臓関連細胞を直接分離して研究することが実現されれば、機能が成熟した膵臓ｂｅｔａ細胞のインビトロ増殖速度を大幅に高める。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、被測定細胞集団における膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞のソーティング又は補助ソーティングの方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る方法は、被測定細胞集団における細胞でＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるか否かを検出し、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させると、該当細胞を膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞とし、又はこれらの候補とし、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させないと、該当細胞を膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞としなく、又はこれらの候補としないステップを含む。
【０００６】
前記ＳＵＳＤ２遺伝子のヌクレオチド配列が配列表における配列２である。
【０００７】
上記方法では、前記被測定細胞集団における細胞でＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるか否かを検出することは、被測定細胞集団における細胞にＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を含有するか否かを検出することにより行われ、前記被測定細胞集団における細胞にＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を含有するか否かを検出することは、下記の何れかの方法によって行われる。
１）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体とした免疫蛍光抗体法。
２）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体としたフローサイトメトリー法。
３）抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体を抗体とした磁気ビーズ分離。
【０００８】
上記方法では、前記被測定細胞が膵臓内胚葉細胞である。
【０００９】
上記方法では、前記膵臓内胚葉細胞がヒト由来膵臓内胚葉細胞である。
【００１０】
また、本発明は、膵臓内胚葉細胞の遺伝子発現を分析することにより、ＳＵＳＤ２遺伝子が膵臓分泌前駆細胞及び新生分泌細胞で富化発現され、すなわち、該遺伝子を発現させるＳＵＳＤ２タンパク質が両方の分子マーカーであることを見出すことを目的とする。
【００１１】
上記事情に鑑み、本発明は、マーカーとしてのＳＵＳＤ２タンパク質の膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞の同定、スクリーニング又はソーティングでの使用を提供し、前記ＳＵＳＤ２タンパク質のアミノ酸配列は配列１に示される。
【００１２】
前記ＳＵＳＤ２タンパク質のＮＣＢＩでの登録番号（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、ＮＰ＿０６２５４７．１である。
【００１３】
前記新生膵臓内分泌細胞は、ヒト多能性幹細胞が膵臓ｂｅｔａ細胞へ指向性誘導分化する過程に生じた一群のホルモン（Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、Ｇｈｒｅｌｉｎ、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ等を含む）陽性細胞であり、該当細胞は、複数のホルモンを共発現させることが一般であり、成熟した膵臓内分泌細胞に比べて機能が成熟していない。ｉｎ  ｖｉｖｏでの発達過程において、前記新生膵臓内分泌細胞は主に胚胎発達段階にある機能が成熟していない膵臓内分泌細胞を意味する。
【００１４】
本発明は、前記ＳＵＳＤ２タンパク質に特異的に結合できる抗体の、膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞を同定、スクリーニング又はソーティングする試薬の調製での使用を更に提供する。
【００１５】
前記ＳＵＳＤ２タンパク質は、遺伝子ＳＵＳＤ２を発現させるタンパク質であり、細胞膜上に位置する受容体タンパク質であり、転写因子でも分泌タンパク質でもない。
【００１６】
免疫蛍光抗体法によって被測定細胞にＳＵＳＤ２タンパク質を含有するか否かを検出することにより、被測定細胞が膵臓分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞であるか否かを確
定する。
【００１７】
前記抗体は、完全な抗体分子、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、重鎖と軽鎖のホモ二量体とヘテロ二量体、及び抗原結合断片と誘導体であってもよい。完全な抗体分子はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１８】
前記のように、一般的に、対応した蛍光マーカーを有する抗体又は該抗体の二次抗体を用いる免疫蛍光抗体法によってＳＵＳＤ２タンパク質を検出する。
【００１９】
前記膵臓内分泌前駆細胞と新生膵臓内分泌細胞とは膵臓内胚葉細胞のうちの一群の細胞であり、適切な条件下で機能が成熟した膵臓内分泌細胞を発生できるものである。
【００２０】
前記ヒト膵臓内胚葉細胞とは、主にヒト多能性幹細胞が膵臓ｂｅｔａ細胞へ指向性誘導分化する過程における膵臓内胚葉段階にある細胞、又は分離したばかり、及びインビトロ培養した対応発達段階にあるヒト胚膵臓組織細胞であり、主に膵臓前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞を含み、本発明の主な目的は膵臓内胚葉細胞集団から膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞をスクリーニング又はソーティングすることである。
【００２１】
前記膵臓内胚葉細胞は、１、ヒト多能性幹細胞を指向性誘導分化することにより取得される細胞、２、分離したヒト胚膵臓組織細胞により取得される細胞、３、分離したヒト胚性膵臓内胚葉細胞をインビトロ培養する細胞を含む。
【００２２】
前記スクリーニング又はソーティングする方法として、免疫磁気ビーズ分離法又はフローサイトメトリー法が一般的である。
【００２３】
ＳＵＳＤ２遺伝子の発現過程では、先ずｍＲＮＡに転写し、次に翻訳してＳＵＳＤ２タンパク質の前駆体タンパク質を得て、更に加工して成熟したＳＵＳＤ２タンパク質を得る。
【００２４】
以上の原因に鑑み、本発明は、マーカーとしての、前記ＳＵＳＤ２タンパク質の前駆体タンパク質をコードするｍＲＮＡの膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞の同定での使用を更に提供する。
【００２５】
本発明は、ｍＲＮＡに特異的に結合できるプライマー、プローブ又はこれらの相補鎖の膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞を同定する試薬の調製での使用を更に提供する。
【００２６】
前記プライマーは、ｍＲＮＡ全体を増幅するプライマーであっても、ｍＲＮＡ特徴領域を増幅するプライマーであってもよく、前記プローブはｍＲＮＡ特定領域を識別するヌクレオチドであり、一般的に標識を有する。
【００２７】
実施例によれば、本発明は、具体的に前記ｍＲＮＡを増幅する下記のプライマーを提供する。
【００２８】
上流プライマー：ＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡ
【００２９】
下流プライマー：ＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＣＴＴＧＡ。
【００３０】
前記同定方法として、蛍光定量的ＰＣＲが使用できる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、内胚葉細胞の遺伝子発現を分析することにより、ＳＵＳＤ２遺伝子が膵臓分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞で富化発現され、且つそのコードされるタンパク質が細胞膜上の受容体タンパク質であり、該タンパク質をマーカーとして膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞を同定、スクリーニング又はソーティングすることができることを見出し、各発達段階の膵臓関連細胞についての研究に対して重要な意義がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヒト多能性幹細胞から膵臓内胚葉細胞への指向性分化を示す図。（ａ）ヒト多能性幹細胞が膵臓ｂｅｔａ細胞へ指向性誘導分化する模式図である、（ｂ）分化の第四段階後期での膵臓内胚葉に関連するタンパク質、及びＮＧＮ３遺伝子を標識する緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を免疫蛍光染色により検出した染色図である。
【図２】膵臓内胚葉中のＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞が膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることをフローサイトメトリー法により同定した結果図である。（ａ）膵臓内胚葉細胞中のＮＧＮ３−ＥＧＦＰ及びＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）等の膵臓内分泌関連タンパク質の発現をフローサイトメトリー法により検出する図である、（ｂ）膵臓内胚葉細胞中のＮＧＮ３−ＥＧＦＰと膵臓前駆細胞のマーカータンパク質ＰＤＸ１の発現をフローサイトメトリー法により検出した結果、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞で膵臓前駆体関連タンパク質ＰＤＸ１を低発現させるか、発現させないことを表明する図である。
【図３】ソーティングしたＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞中の膵臓関連遺伝子の発現状況をｍＲＮＡシークエンシングにより分析した結果、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋の膵臓内分泌前駆細胞及び新生内分泌細胞集団には、膵臓内分泌関連遺伝子が比較的富化発現されていることを表明する図である。
【図４】ＳＵＳＤ２とＮＧＮ３−ＥＧＦＰの共染色状況を免疫染色により検出した結果、ＳＵＳＤ２はヒト多能性幹細胞分化由来のＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞の標識に適用できることが説明される図である。
【図５】ヒト多能性幹細胞由来の膵臓内胚葉細胞中のＳＵＳＤ２及び膵臓発達関連タンパク質の発現状況をフローサイトメトリーにより検出した分析図であり、ＳＵＳＤ２はインビトロ分化して得られた膵臓内分泌前駆細胞及び新生内分泌細胞の標識に適用できることが説明される図である。（ａ）膵臓内胚葉細胞中のＳＵＳＤ２及び膵臓内分泌関連タンパク質ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）等の発現状況をフローサイトメトリーにより検出する図である、（ｂ）膵臓内胚葉細胞中のＳＵＳＤ２と膵臓前駆細胞関連タンパク質ＰＤＸ１の発現をフローサイトメトリーにより検出する図である。
【図６】フローソーティングして得られたＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞及びソーティングしていない膵臓内胚葉細胞中の膵臓発達関連遺伝子の発現状況をＲＴ−ＱＰＣＲにより同定した結果、ＳＵＳＤ２＋細胞で膵臓内分泌前駆細胞関連遺伝子及び膵臓内分泌細胞関連遺伝子を比較的富化発現させ、膵臓前駆細胞関連遺伝子を低発現させることを表明するので、ＳＵＳＤ２で標識したものは膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生内分泌細胞であることが証明される図である。
【図７】ＳＵＳＤ２抗体を磁気ビーズ分離に用いて膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞を富化させる図である。（ａ）ＳＵＳＤ２抗体を使用してインビトロ分化して得られた膵臓内胚葉細胞に対して磁気ビーズ分離を行って富化させるＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞中の膵臓内分泌前駆細胞及び膵臓内分泌細胞のマーカータンパク質ＮＫＸ２．２の発現をフローサイトメトリーにより検出した結果、ＳＵＳＤ２抗体を磁気ビーズ分離に用いることによってＮＫＸ２．２＋膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞を効果的に富化できることが説明される図である、（ｂ）磁気ビーズ分離によって得られたＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞及びソーティングしていない膵臓内胚葉細胞に対して長期培養した後、膵臓前駆体及び膵臓内分泌関連タンパク質の発現を免疫組織化学により検出した結果、ＳＵＳＤ２＋細胞は内分泌細胞を大量で発生できることを表明するので、内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることが証明される図である、（ｃ）磁気ビーズ分離を行って得られたＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞を免疫不全マウスの体内に移植し、１９週間後に移植体を免疫蛍光染色して膵臓内分泌関連タンパク質の発現を検出した結果、ＳＵＳＤ２＋細胞は複数タイプの膵臓内分泌細胞を発生できるのに対して、ＳＵＳＤ２−細胞は主に導管細胞を発生させることを表明するので、ＳＵＳＤ２は膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞を富化させることが証明される図である。
【図８ａ】ＳＵＳＤ２はヒト胚由来の膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞の標識に適用できることを示す図である。（ａ）胚膵臓組織及び成体膵臓組織中のＳＵＳＤ２と膵臓内分泌前駆細胞関連タンパク質、膵臓内分泌細胞関連タンパク質との共発現を免疫組織化学により検出した結果、ＳＵＳＤ２は胚膵臓組織中の膵臓内分泌前駆体又は内分泌細胞のみで発現されることを表明する図である。
【図８ｂ】ＳＵＳＤ２はヒト胚由来の膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞の標識に適用できることを示す図である。（ｂ）胚膵臓組織中のＳＵＳＤ２と膵臓内分泌関連タンパク質及び膵臓導管関連タンパク質の発現を免疫蛍光により検出する図である。
【図９】ＳＵＳＤ２はヒト胚由来の膵臓内分泌前駆細胞及び新生膵臓内分泌細胞の富化に適用できることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
特に断らない限り、以下の実施例に使用される実験方法は常法である。以下の実施例に使用される材料や試薬等は、特に断らない限り、市販品として入手できる。ＳＵＳＤ２遺伝子は配列２に示され、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列１である。
【００３４】
実施例１、ＳＵＳＤ２の膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子としての発見及び使用
【００３５】
１、ＳＵＳＤ２の、修飾されたヒト多能性幹細胞を分化して得られた膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子としての使用
【００３６】
１．１、膵臓内胚葉細胞の取得
【００３７】
ＥＧＦＰ遺伝子（ＮＣ＿０１３１７９．１（３３１３．．４１２６））にインビトロのヒト多能性幹細胞系Ｈ１（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＩＨ番号ＷＡ０１）の相同的組み換え（Ｎｇｎ３  ｃｏｎｔｉｇ番号：ＮＴ＿０３００５９．１３、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０に位置し、左相同アームのゲノムにおける位置は７１３２５６５４−７１３３２１５４、右相同アームのゲノムにおける位置は７１３３２１５８−７１４６７５６８である）を行って、修飾された細胞のヒト多能性幹細胞系ＮＧＮ３−ＥＧＦＰを得た。それを１５％〜２０％の量で細胞培養液Ｉに接種して、１日間培養し、更に細胞培養液ＩＩで１〜２日間直接培養し、細胞培養液ＩＩＩで１日間直接培養し、次に、細胞培養液ＩＶで２日間直接培養し、細胞培養液Ｖで１日間直接培養し、細胞培養液ＶＩで３日間直接培養し、細胞培養液ＶＩＩで４日間直接培養し、細胞培養液ＶＩＩＩで４〜６日間直接培養し、細胞培養液ＩＸで４〜６日間直接培養して、膵臓内胚葉細胞を得た。
【００３８】
該段階にある細胞集団中の膵臓内胚葉に関連する複数の標識転写因子の発現状況を免疫蛍光抗体法により検出する。
【００３９】
ＮＫＸ２．２検出用の抗体はマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号が７４．５Ａ５である）、ＰＤＸ１検出用の抗体はヤギ由来のポリ
クローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２４１９）であり、ＥＧＦＰ検出用の抗体は鶏由来のポリクローナル抗体（該抗体はＡｂｃａｍから購入し、カタログ番号がＡＢ１３９７０である）であり、ＮＧＮ３検出用の抗体はヒツジ由来のポリクローナル抗体である（該抗体はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍから購入し、カタログ番号がＡＦ３４４４である）である。
【００４０】
すべての抗体は非直接標識抗体であり、検出時に、それぞれＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社から購入する抗体である、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したロバ由来の抗ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号７０５−５４５−１４７）、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｃｙ３で標識したロバ由来の抗ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号７０５−１６５−１４７）、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｃｙ３で標識したロバ由来の抗ヒツジポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−１６５−１４７）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したロバ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−５４５−１５１）、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｃｙ３で標識したロバ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−１６５−１５１）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したロバ由来の抗鶏ポリクローナル抗体（カタログ番号７０３−５４５−１５５）で二重染色する。
【００４１】
その結果、図１に示されるように、該段階で得られた細胞のうち、一部の細胞でＰＤＸ１である膵臓前駆体のマーカータンパク質（図１Ａ）を発現させ、他の一部の細胞でＮＧＮ３−ＥＧＦＰを発現させ、両方はほぼ共染しない（図１Ｂ）。ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞で、膵臓内分泌前駆細胞の標識転写因子ＮＧＮ３又は早期段階にある内分泌細胞関連タンパク質ＮＫＸ２．２、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）等が発現されている（図１Ｃと図１Ｄ）。それにより、得られた細胞は、膵臓内胚葉段階にある細胞であり、そのうち、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰで標識した膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞が存在することが説明される。
【００４２】
上記に使用される培養液の処方は以下のとおりである。
【００４３】
細胞培養液Ｉは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地とＹ２７６３２とを１ｍｌ：１０μｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液Ｉを得る方法により調製される。
【００４４】
細胞培養液ＩＩはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地である。
【００４５】
細胞培養液ＩＩＩは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＢＳＡ、ｒｍＷｎｔ３Ａ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを、１ｍｌ：０．１ｇ：２５ｎｇ：１２０ｎｇの配合比率で混合して細胞培養液ＩＩＩを得る方法により調製される。
【００４６】
細胞培養液ＩＶは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＢＳＡ及びＡｃｔｉｖｉｎＡを１ｍｌ：０．１ｇ：１２０ｎｇの配合比率で混合して、細胞培養液ＩＶを得る方法により調製される。
【００４７】
細胞培養液Ｖは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＢＳＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ及びＷｎｔ−Ｃ５９を１ｍｌ：０．１ｇ：１２０ｎｇ：５０ｎｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液Ｖを得る方法により調製される。
【００４８】
細胞培養液ＶＩは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＶｉｔａｍｉｎＡ、ＫＧＦ及びＳＢ５２５３３４を１ｍｌ：１０μｌ：５０ｎｇ：１μｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液ＶＩを得る方法により調製される。
【００４９】
細胞培養液ＶＩＩは、ＤＭＥＭ−Ｈ培地、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ａｌｌ−ｔｒ
ａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＮＯＧＧＩＮ及びＳＡＮＴ−１を１ｍｌ：１０μｌ：２μｍｏｌ：２５０ｎｇ：０．２５μｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液ＶＩＩを得る方法により調製される。
【００５０】
細胞培養液ＶＩＩＩは、ＤＭＥＭ−Ｈ培地、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＶｉｔａｍｉｎＡ、ＮＯＧＧＩＮ及びＴＰＢ（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−２，４−ｐｅｎｔａｄｉｅｎｏｙｌａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｏｌａｃｔａｍ）を１ｍｌ：１０μｌ：２５０ｎｇ：５０ｎｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液ＶＩＩＩを得る方法により調製される。
【００５１】
細胞培養液ＩＸは、ＤＭＥＭ−Ｈ培地、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＶｉｔａｍｉｎＡ、ＮＯＧＧＩＮ、ｈｕｍａｎＬＩＦ及びＡｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩＩを１ｍｌ：１０μｌ：２５０ｎｇ：１０ｎｇ：１μｍｏｌの配合比率で混合して、細胞培養液ＩＸを得る方法により調製される。
【００５２】
１．２、フローサイトメトリーによる、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞が膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であるか否かについての同定
【００５３】
上記のように得られた膵臓内胚葉細胞に対して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩｕでフローサイトメトリーを行って、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋（膵臓内分泌前駆体に由来する細胞集団を含む）、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−（膵臓内分泌前駆体に由来する細胞集団を含まない）の二群の細胞を得て、ＥＧＦＰはＦＬ１チャンネルである。
【００５４】
ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋とＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−集団に、膵臓内分泌前駆細胞の複数の標識転写因子又は分泌タンパク質を含有するか否かを細胞内フローサイトメトリーにより検出する。
【００５５】
ＮＫＸ２．２検出用の抗体はマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号が７４．５Ａ５である）であり、ＮＧＮ３検出用の抗体はヒツジ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ３４４４である）とマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号がＦ２５Ａ１Ｂ３である）であり、ＮＥＵＲＯＤ１検出用の抗体はヤギ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２７４６である）であり、ＰＤＸ１検出用の抗体はヤギ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２４１９である）であり、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ検出用の抗体は兎由来のポリクローナル抗体（該抗体は中杉金橋から購入し、カタログ番号がＺＡ−０５０７である）である。
【００５６】
すべての抗体は非直接標識抗体であり、検出時に、それぞれＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入する抗体である、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号７０５−５４５−１４７）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−５４５−１５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７で標識したロバ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−６０５−１５１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識したヤギ由来の抗マウス抗原サブタイプ１ポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−５４５−２０５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７で標識したヤギ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−６０５−２０５）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識したヤギ由来の抗マウス抗原サブタイプ２ｂポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−５４５−２０７）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７で標識し
たヤギ由来の抗マウス抗原サブタイプ２ｂポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−６０５−２０７）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗兎ポリクローナル抗体（カタログ番号７１１−５４５−１５２）を使用して二重染色される。
【００５７】
その結果、図２に示されるように、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋（膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞を含む）集団にＮＫＸ２．２、ＮＧＮ３、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）を発現させるが、膵臓前駆体関連遺伝子ＰＤＸ１を発現せず又は低発現させ、それにより、該細胞集団は主に膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることを表明する。
【００５８】
ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−集団には、ＮＫＸ２．２、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）、ＧＦＰを発現させず、主に膵臓前駆体関連転写因子ＰＤＸ１を富化発現させ、少量の細胞でＮＧＮ３又はＮＥＵＲＯＤ１を発現させ、それにより、該細胞集団は主に膵臓前駆細胞又は非膵臓細胞タイプの細胞であることを表明する。
【００５９】
１．３、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞集団におけるＳＵＳＤ２発現の富化
【００６０】
１）ＲＮＡシークエンシングを行った結果、ＳＵＳＤ２はＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞集団に富化発現することが明らかになる。
【００６１】
ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して上記２で得られたＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞及びＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞を抽出し、それぞれ２μｇの全ｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡを精製した後に逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを得た。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）で得られた一本鎖ｃＤＮＡの３’末端にｐｏｌｙ  Ａテールを付ける。ｃＤＮＡを１２ＰＣＲサイクル増幅した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。次にＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ２０００を使用してシークエンシングした。Ｔｏｐｈａｔソフトウェアを使用してシークエンシング結果（ｒａｗ  ｒｅａｄｓ）とヒト参照ゲノム（ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３７、ｈｇ１９）を比較し、マッピング配列（Ｍａｐｐｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）とＮＣＢＩの参照データベース（ＲｅｆＳｅｑ  Ｇｅｎｅｓ  ｈｇ１９）を順方向又は逆方向マッチングしてトランスクリプトームを再構築した。すべての遺伝子の発現存在度を計算して、ＲＰＫＭで標準化した後、下記標準に応じてＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋とＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞間での遺伝子発現差異の有意性を判断する：１）発現倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）が２より大きく又は０．５未満である。２）Ｐ値が０．０５未満である。Ｒソフトウェアのヒートマップパッケージ（ｈｅａｔｍａｐ  ｐａｃｋａｇｅ）を使用して、ＲＰＫＭに基づき、取得したデータに対して、ｌｏｇ１０でヒートマップ分析を行う。識別的遺伝子発現（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＤＧＥ）によってＧＯ分析を行う。
【００６２】
その結果、図３に示されるように、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞に比べて、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞は、膵臓内分泌関連遺伝子ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、ＡＲＸ等を富化発現させ、膵臓前駆細胞関連遺伝子ＰＤＸ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ６等を低発現させ、それにより、ソーティングしたＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞及び新生内分泌細胞であることが説明される。
【００６３】
ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞はＳＵＳＤ２（ＮＲ０２２１２）を富化発現させて、発現倍数変化が２．３０であり、それにより、ｍＲＮＡレベル上、ＳＵＳＤ２遺伝子（配列２）は被測定細胞が膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞であるか否かを同定するため
の標識とすることができることが説明される。次に、ＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質も同様であるか否かを同定する。
【００６４】
２）ＳＵＳＤ２がＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞集団を標識できることの免疫蛍光抗体法による認証
【００６５】
上記２で得られたＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞及びＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞に対して、免疫蛍光抗体法によりＥＧＦＰとＳＵＳＤ２の発現を検出する。
【００６６】
ＥＧＦＰ検出用の抗体は鶏由来のポリクローナル抗体（該抗体はＡｂｃａｍから購入し、カタログ番号がＡＢ１３９７０である）であり、ＳＵＳＤ２検出用の抗体はマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０１である）である。
【００６７】
すべての抗体は非直接標識抗体であり、検出時に、それぞれＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社から購入する抗体である、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｃｙ３で標識したロバ由来の抗マウスポリクローナル抗体（カタログ番号７１５−１６５−１５１）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗鶏ポリクローナル抗体（カタログ番号７０３−５４５−１５５）抗体を使用して二重染色される。
【００６８】
結果は図４に示され、免疫組織化学結果から明らかなように、ＳＵＳＤ２の発現はＮＧＮ３−ＥＧＦＰと完全に一致し、更にＮＧＮ３−ＥＧＦＰ−細胞で発現されず、すなわち、ＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞で富化発現される。ＳＵＳＤ２はＮＧＮ３−ＥＧＦＰ＋細胞、すなわち膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞からなる混合細胞集団の同定又は標識に適用できることが説明される。
【００６９】
２、ＳＵＳＤ２の、ヒト多能性幹細胞を分化して得られた膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子としての使用
【００７０】
２．１、膵臓内胚葉細胞の取得
【００７１】
インビトロのヒト多能性幹細胞系ＮＧＮ３−ＥＧＦＰを、１．１の方法により分化して膵臓内胚葉細胞を得る。
【００７２】
２．２、フローサイトメトリーによる、ＳＵＳＤ２遺伝子の発現及び膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１の発現の検出
【００７３】
上記２．１で得られた膵臓内胚葉細胞に対して、ＳＵＳＤ２遺伝子でコードされるタンパク質の発現をフローサイトメトリー法により検出し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入する細胞固定／透明化キット（カタログ番号５５４７１４）に応じて行い、上記２．１で得られた膵臓内胚葉細胞を固定した後に、対応した抗体及びＳＵＳＤ２直接標識抗体（マウス由来のＰＥ標識抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０６である）及びマウス由来のＡＰＣ標識モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０８である）。マウス由来の未標識モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０１である））を使用して染色した後、蛍光二次抗体で二重染色する。フローソーターによって分析する。
【００７４】
ＮＫＸ２．２検出用の抗体はマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号が７４．５Ａ５である）であり、ＮＧＮ３検出用の抗体はヒツジ由
来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ３４４４である）とマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号がＦ２５Ａ１Ｂ３である）であり、ＮＥＵＲＯＤ１検出用の抗体はヤギ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２７４６である）であり、ＰＤＸ１検出の抗体はヤギ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２４１９である）であり、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ検出用の抗体は兎由来のポリクローナル抗体（該抗体は中杉金橋から購入し、カタログ番号がＺＡ−０５０７である）である。
【００７５】
二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入する、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号７０５−５４５−１４７）であり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したヤギ由来の抗マウス抗原サブタイプ２ｂポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−５４５−２０７）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識したヤギ由来の抗マウス抗原サブタイプ２ｂポリクローナル抗体（カタログ番号１１５−６０５−２０７）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ
４８８で標識したロバ由来の抗兎ポリクローナル抗体（カタログ番号７１１−５４５−１５２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したロバ由来の抗鶏ポリクローナル抗体（カタログ番号７０３−５４５−１５５）である。
【００７６】
図５に示す結果図のように、第四段階の０日目に、ＮＧＮ３陽性又は弱陽性細胞は、ＳＵＳＤ２又はＮＥＵＲＯＤ１を発現させず、ＮＫＸ２．２を低発現させる。第四段階の１日目に、それぞれ８０％、９３％及び８８％のＳＵＳＤ２＋細胞は、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及びＮＥＵＲＯＤ１を発現させる。それにより、大部分のＳＵＳＤ２＋細胞はＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及びＮＥＵＲＯＤ１を同時発現させることを表明し、該当群のＳＵＳＤ２＋細胞は内分泌前駆細胞の特徴を有することが説明される。第四段階の４日目に、大部分のＳＵＳＤ２＋細胞はＮＫＸ２．２又はＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）を発現させるが、ＮＧＮ３を発現させず、それにより、該時期にあるＳＵＳＤ２＋／ＮＧＮ３−細胞は内分泌細胞の特徴を有することが説明される。また、ＳＵＳＤ２＋細胞は、膵臓前駆体の標識ＰＤＸ１を連続的に低発現させ又は発現させない。それにより、ＳＵＳＤ２は膵臓内分泌前駆細胞及びその後代内分泌細胞の標識に適用できることが説明される。
【００７７】
全分化過程において、一部のＳＵＳＤ２−細胞は膵臓内分泌関連タンパク質ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２等を発現させるが、大部分のＳＵＳＤ２−細胞はこれら膵臓内分泌関連タンパク質を発現させず、膵臓前駆体関連タンパク質ＰＤＸ１を発現させる。それにより、ＳＵＳＤ２−細胞は主に膵臓前駆細胞又は非膵臓細胞タイプの細胞を含むことが説明される（図５）。
【００７８】
上記結果から明らかなように、ＳＵＳＤ２＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞であるので、更にＳＵＳＤ２遺伝子でコードされるタンパク質の発現により、細胞が標的細胞であるか否かを同定できることが証明される。
【００７９】
２．３、フローソーティングによって得られたＳＵＳＤ２−細胞とＳＵＳＤ２＋細胞をＳＵＳＤ２＋細胞のｍＲＮＡレベルで検出し、この二群の細胞及びソーティングしていない膵臓内胚葉細胞の遺伝子発現状況を定量的ＰＣＲ技術により分析する。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ(登録商標) Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキットを使用して定量的ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、カタログ番号が４３６７６５９である）を行い、増幅プライマーは表１に示され、内部参照プライマーはＧＡＰＤＨであり、具体的な操作は取扱い書を参照する。
【００８０】
【表１】
0006294571.tif 000002
【００８１】
その結果、図６に示すように、ＳＵＳＤ２＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞及び内分泌細胞関連遺伝子であるＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、ＡＲＸ等の発現を富化させる。それにより、それは膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることを表明する。ＳＵＳＤ２−細胞は膵臓前駆体関連遺伝子ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９、ＰＴＦ１Ａの発現を富化させる。それにより、膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞では
ないことを表明する。
【００８２】
３、ＳＵＳＤ２陽性細胞とＳＵＳＤ２陽性細胞の磁気ビーズ分離
【００８３】
３．１、膵臓内胚葉細胞の取得
【００８４】
インビトロのヒト多能性幹細胞系Ｈ１を、１．１の方法により分化して膵臓内胚葉細胞を得る。
【００８５】
３．２、磁気ビーズ分離
【００８６】
膵臓内胚葉細胞に対して、要望の抗体であるＳＵＳＤ２直接標識抗体（マウス由来のＰＥで標識した抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０６である）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入する磁気ビーズ分離に関連する試薬を使用して磁気ビーズ分離を行い、取扱い書に従ってＳＵＳＤ２陽性細胞とＳＵＳＤ２陰性細胞を得る。
【００８７】
３．３、検出
【００８８】
Ａ、フローサイトメトリー
【００８９】
以上と同じ検出方法により、ＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞及びソーティングしていない細胞に対してフローサイトメトリーを行う。
【００９０】
その結果、図７（ａ）に示すように、ＳＵＳＤ２＋細胞はＮＫＸ２．２＋細胞を高純度で富化させることができ、該細胞はＮＧＮ３＋の内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞（図７（ａ））である。
【００９１】
Ｂ）ＳＵＳＤ２陽性細胞を使用して培養した子孫細胞に対する免疫蛍光同定
【００９２】
ソーティングして得られたＳＵＳＤ２＋細胞、ＳＵＳＤ２−細胞及びソーティングしていない膵臓内胚葉細胞に対してインビトロ長期培養を行う。標的細胞を細胞培養液Ｘに再懸濁させて、Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆された細胞培養板に敷いて１日間培養して付着させた。翌日、培地を除去した後に、ＰＢＳで一回洗浄し、細胞培養液ＸＩで更に５日間培養する。培養条件は摂氏３７度、５％の二酸化炭素である。
【００９３】
細胞培養液Ｘは、ＤＭＥＭ−Ｈ：Ｂ２７  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＶｉｔａｍｉｎＡ：Ｙ２７６３２＝１ｍｌ：１０μｌ：１０μＭのように取得される。
【００９４】
細胞培養液ＸＩは、ＤＭＥＭ−Ｈ：Ｂ２７  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｔａｍｉｎＡ：Ｎｏｇｇｉｎ：ｈｕｍａｎ  ＬＩＦ：Ａｌｋ５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ＝１ｍｌ：１０μｌ：２５０ｎｇ：１０ｎｇ：１００ｎＭのように取得される。
【００９５】
免疫組織化学染色を行う。
【００９６】
その結果、図７（ｂ）に示すように、ＳＵＳＤ２＋を培養して得られた細胞は大量のＩＮＳＵＬＩＮ＋、すなわち大量の内分泌細胞を発生でき、ＳＵＳＤ２−を培養して得られた細胞は主にＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞を富化させ、少量だけのＩＮＳＵＬＩＮ＋細胞を発生させる。それにより、ＳＵＳＤ２が富化する細胞は膵臓内分泌前駆細胞であることが説明される。
【００９７】
それにより、ＳＵＳＤ２は膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞を富化させることが説明される。
【００９８】
Ｃ）免疫不全マウスの腎嚢胞への移植
ソーティングして得られたＳＵＳＤ２陽性細胞、ＳＵＳＤ２陰性細胞及びソーティングしていない膵臓内胚葉細胞を、免疫不全マウス（６−８週間）の腎嚢胞に移植する。移植１９週間後、移植物を取って凍結切片に対する免疫組織化学染色を行う。
【００９９】
その結果、図７（ｃ）に示すように、ＭＡＣＳで得られたＳＵＳＤ２＋及びＳＵＳＤ２−をマウスの体内に移植すると、ＳＵＳＤ２＋細胞はすべての種類の内分泌細胞（ＩＮＳＵＬＩＮ＋のｂｅｔａ細胞、Ｇｌｕｃａｇｏｎ＋のａｌｐｈａ細胞、ＳＳＴ＋のｄｅｌｔａ細胞、Ｇｈｒｅｌｉｎ＋のｅｐｓｉｌｏｎ細胞及びＰＰＹ＋のＰＰＹ細胞）を発生させるが、導管構造を発生させない。それにより、ＳＵＳＤ２＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることが説明される。
【０１００】
４、ＳＵＳＤ２を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでヒト胚由来の膵臓内分泌前駆細胞及び新生内分泌細胞をソーティングする。
【０１０１】
４．１、ヒト胚組織の凍結切片の免疫蛍光染色
【０１０２】
組織切片：４％のＰＦＡを使用して、インビトロのヒト胚膵臓組織を４℃で２時間固定し、ＰＢＳを使用して４℃で三回洗浄する（時間はそれぞれ瞬時、１０分間、２時間である）。次に、組織塊を３０％の蔗糖溶液に入れて４℃で組織が沈降するまで一晩放置する。組織塊をＯｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｏ．Ｃ．Ｔ）（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）で包埋した後、液体窒素で凍結し、凍結ミクロトームＣｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ）で１０μｍの切片に切る。
【０１０３】
上記切片を１．１の免疫蛍光抗体法により検出した結果、切片は膵臓内胚葉段階にある細胞であり、ＳＵＳＤ２で標識した細胞は膵臓内分泌前駆細胞及び／又は新生膵臓内分泌細胞である（図８）。
【０１０４】
４．２、磁気ビーズ分離による、ヒト胚由来の膵臓内分泌前駆細胞及び新生内分泌細胞の富化
【０１０５】
胚膵臓組織を冷たいＰＢＳで二回洗浄した後、眼科はさみで１立方ミリメートルの小さなピースに切る。消化液（ＰＲＭＩ  １６４０、１００−４００Ｕ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．２Ｕ／ｍｌ  ＤｉｓｐａｓｅＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ（０．０２％、（ｗｔ／ｖｏｌ））  ａｎｄ
０．５％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ））を使用して３７℃で３０分間消化し、５分間おきにピペットで軽くピペッティングして細胞を分散させる。消化した単細胞をＰＲＭＩ  １６４０  ｗｉｔｈ  ０．５％ＦＢＳに移し替え、０．５％のＢＳＡと２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで二回洗浄する。残った組織塊を収集して、上記ステップにより再消化する。得られた細胞懸濁液を４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過し、得られた単細胞懸濁液を０．５％のＢＳＡと２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳに保存し、氷に置いて後続分析に用いる。
【０１０６】
要望の抗体であるＳＵＳＤ２直接標識抗体（マウス由来のＰＥで標識した抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０６であ
る）を使用して、上記単細胞懸濁液に対して磁気ビーズ分離を行い、ＳＵＳＤ２陽性細胞とＳＵＳＤ２陰性細胞を得る。
【０１０７】
４．３、蛍光定量的ＰＣＲにより認証した結果、陽性細胞は膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であり、磁気ビーズ分離を行って得られたＳＵＳＤ２陽性細胞、ＳＵＳＤ２陰性細胞及びソーティングしていない胚膵臓細胞に対して定量的ＰＣＲを行って、膵臓内胚葉細胞関連遺伝子の発現状況を検出する。具体的な操作は２．３に示される。
【０１０８】
その結果、図９に示されるように、ＳＵＳＤ２陽性細胞はＳＵＳＤ２遺伝子の発現を富化させ、同時に膵臓内分前駆細胞及び早期段階にある内分泌細胞関連遺伝子ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、ＡＲＸ等の発現を富化させ、膵臓前駆体関連遺伝子ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９、ＰＴＦ１Ａ、後期段階にある内分泌細胞関連遺伝子ＩＮＳＵＬＩＮ、ＧＬＵＣＡＧＯＮ、ＰＡＸ６、ＭＡＦＢ、ＭＡＦＡ、ＣＨＲＯＭＯＧＲＡＮＩＮＡ（ＣＨＧＡ）及び外分泌関連遺伝子ＣＰＡ１等を低発現させる。それにより、ＳＵＳＤ２陽性細胞、即ちＳＵＳＤ２＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞であることが説明される。
【０１０９】
従って、ＳＵＳＤ２遺伝子を膵臓内分泌前駆細胞又は新生内分泌細胞の標識遺伝子として、その発現の有無によって被測定細胞集団における膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞をソーティング又は補助的にソーティングできることが分かる。具体的には、下記のとおりである。
【０１１０】
被測定細胞集団における細胞でＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるか否かを検出し、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させると、該当細胞がヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞であり、又はこれらの候補であり、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させないと、該当細胞がヒト膵臓内分泌前駆細胞又はその新生膵臓内分泌細胞でなく、又はこれらの候補でない。
【０１１１】
検出方法では、被測定細胞集団における細胞に、ＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を含有するか否かを検出し、具体的には、ＳＵＳＤ２遺伝子のｍＲＮＡレベル発現を定量的に検出し、又はＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質を免疫蛍光抗体法により検出し、又はＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質をフローサイトメトリーにより検出し、又はＳＵＳＤ２遺伝子を発現させるタンパク質に対して磁気ビーズ分離を行う。
【０１１２】
実施例２、ＳＵＳＤ２遺伝子の発現による、ヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞のソーティング。
【０１１３】
１、膵臓内胚葉細胞の取得
【０１１４】
インビトロのヒト多能性幹細胞系を、１．１の方法により分化して膵臓内胚葉細胞を得る。
【０１１５】
２、ＳＵＳＤ２遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより検出することによる、ヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞のソーティング
【０１１６】
要望の抗体であるＳＵＳＤ２直接標識抗体（マウス由来のＰＥで標識した抗ＳＵＳＤ２モノクローナル抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し、カタログ番号が３２７４０６である）を使用して、膵臓内胚葉細胞をフローサイトメトリーにより検出し、染色後に、蛍光二次抗体で二重染色する。
【０１１７】
いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させると、該当細胞がヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞であり、又はこれらの候補であり、いずれかの細胞がＳＵＳＤ２遺伝子を発現させないと、該当細胞がヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞でなく、又はこれらの候補でない。
【０１１８】
ＳＵＳＤ２＋細胞を選択して、ヒト膵臓内分泌前駆細胞又は新生膵臓内分泌細胞とする。
【０１１９】
その同時に、ＳＵＳＤ２＋細胞に対して、膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１の発現をフローサイトメトリーにより検出する。ＮＫＸ２．２検出用の抗体はマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号が７４．５Ａ５である）であり、ＮＧＮ３検出用の抗体はヒツジ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ３４４４である）とマウス由来のモノクローナル抗体（該抗体はＤＳＨＢから購入し、カタログ番号がＦ２５Ａ１Ｂ３である）であり、ＮＥＵＲＯＤ１検出用の抗体はヤギ由来のポリクローナル抗体（該抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号がＡＦ２７４６である）である。
【０１２０】
その結果、ＳＵＳＤ２＋細胞は膵臓内分泌前駆細胞のマーカー遺伝子ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＥＵＲＯＤ１を発現させる。それにより、それはヒト膵臓内分泌前駆細胞又はホルモンを分泌しないその子孫細胞であることが証明される。更に、本発明の方法は正確であることが証明される。
【図１】
0006294571.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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