(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２次元電子センサーを伴うＣＭＯＳ又はｓＣＭＯＳカメラと、
前記カメラの前記２次元電子センサー上に基板の少なくとも一部分を撮像して２次元画像を生成するように構成される対物レンズ構成要素と、
前記対物レンズ構成要素との関係において第１の方向に前記基板を連続運動で移動させるように構成される位置決めステージと、
前記基板の画像を前記２次元電子センサーにおいて安定した状態に維持しながら前記対物レンズ構成要素からの光を撮像カメラに対して反射するために、前記位置決めステージが前記基板を前記第１の方向に移動させている間に、前記移動する位置決めステージと協調して同期的な連続運動で傾動するように構成される走査ミラーと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の光学経路内に位置づけされる第１の傾動プレートであって、前記対物レンズ構成要素により獲得された基板画像に対する第１のオフセット補正を発生させるように構成される、第１の傾動プレートと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の前記光学経路内に位置づけされる第２の傾動プレートであって、前記第１のオフセット補正に対して垂直である方向において前記基板画像に対する第２のオフセット補正を発生させるように構成される、第２の傾動プレートと、
を備えた撮像システム。
【請求項２】
前記走査ミラーと前記カメラとの間の光学経路内に位置づけされるチューブレンズ構成要素をさらに備え、前記走査ミラーが、前記対物レンズ構成要素からの光を前記チューブレンズ構成要素を通して前記カメラの前記２次元電子センサーまで導くように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
光源及びダイクロイックミラーをさらに備え、前記ダイクロイックミラーが、少なくとも（ａ）前記光源由来の光を反射して前記基板を照明し、かつ（ｂ）前記対物レンズ構成要素により獲得された光を通過させる、ように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記位置決めステージ及び前記走査ミラーの移動がサーボ機構によりなされるようになっている、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記カメラがＣＭＯＳカメラである、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
基板の少なくとも一部分を撮像するための方法において、
対物レンズ構成要素の下で、前記基板上に核酸標的を担持する位置決めステージを移動させることと、
前記基板が移動している間に、
前記移動する位置決めステージと協調して同期的な連続運動で走査ミラーの角度を変更して、前記対物レンズ構成要素により獲得された基板画像が、フルフレームモードで動作できるＣＭＯＳ又はｓＣＭＯＳカメラの２次元電子センサーとの関係において静止状態に維持されるようにすることと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の光学経路内に位置づけされる第１の傾動プレートによって、前記基板画像に対する第１のオフセット補正を発生させることと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の前記光学経路内に位置づけされる第２の傾動プレートによって、前記第１のオフセット補正に対して垂直である方向において前記基板画像に対する第２のオフセット補正を発生させることと、
前記２次元電子センサーを通して前記基板画像を記録することと、
を含む方法。
【請求項７】
角度センサーを用いて、前記走査ミラーの前記角度を測定することと、
前記走査ミラーの前記角度を変更する上で前記角度センサーからの測定値を使用することと、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記走査ミラーの前記角度を測定して、前記走査ミラーの運動中に何らかの非線形性が存在するか否かを検出することと、
前記走査ミラーの前記運動中に検出された何らかの非線形性を前記基板画像から除去するために、前記オフセット補正を使用することと、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣＭＯＳ又はｓＣＭＯＳカメラの２次元電子センサー上に生化学材料を含むアレイチップを撮像する対物レンズ構成要素と、
前記対物レンズ構成要素からの光を前記２次元電子センサーに対して反射する、角運動可能な走査ミラーと、
連続移動中前記２次元電子センサーにおいて前記アレイチップの安定した画像を維持するため前記走査ミラーと連続的に同期的に協調して前記対物レンズ構成要素との関係において前記アレイチップを移動させる位置決めステージと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の光学経路内に位置づけされる第１の傾動プレートであって、前記対物レンズ構成要素により獲得された基板画像に対する第１のオフセット補正を発生させるように構成される、第１の傾動プレートと、
前記走査ミラーと前記カメラとの間の前記光学経路内に位置づけされる第２の傾動プレートであって、前記第１のオフセット補正に対して垂直である方向において前記基板画像に対する第２のオフセット補正を発生させるように構成される、第２の傾動プレートと、
を備える撮像システム。
【請求項１０】
前記アレイチップがその上に配置されたＤＮＡ高分子を有し、前記カメラがＣＭＯＳカメラである、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
チューブレンズ構成要素をさらに備え、前記走査ミラーが、前記対物レンズ構成要素からの光を前記チューブレンズ構成要素を通して前記２次元電子センサーまで導くように構成される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記走査ミラーの角度を測定する角度センサーをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記角度センサーが光学レバーを備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記角度センサーが、レーザー及び前記走査ミラーにより反射されたレーザーからの光を検出するリニアアレイ検出器を備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記アレイチップ画像を前記２次元電子センサーへと通過させる一方で、前記アレイチップを照明するように配置された照明光源及びダイクロイックミラーをさらに備える、請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して撮像システムに関し、詳細には、生化学利用分野で使用するための撮像システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学実験画像から有用なデータを得るためには、高い空間解像度、精度及び速度が求められる。このような画像は、典型的に、個別の実験を明確に解像するのに充分高い倍率で得られる必要がある。同時に、画像は、実験を正しく識別するために充分大きい視野を網羅する必要がある。大規模研究のためには、撮像及び画像処理は、商業的に実現可能になるよう充分高速で行なわれなければならない。
【０００３】
ステップアンドリピート撮像装置及び時間遅延積算（ＴＤＩ）撮像装置が、生化学実験を撮像するために使用可能な２つの広範なタイプの撮像システムである。ステップアンドリピートシステムは、約５μｍのアライメント精度で毎秒約１０メガピクセルの画像データを獲得できる。ＴＤＩシステムは、約５０ｎｍのアライメント精度で毎秒約３０メガピクセルの画像データを獲得できる。これら２つのタイプのシステムは、一部の利用分野については適度に良好な性能を示すかもしれないものの、他の利用分野については、全体的スループットに不利な影響を及ぼすいくつかの構造的及び機能的欠点を有する。例えば、大規模な生化学実験研究（例えば大規模並列処理全ゲノムシークエンシング）が関与する利用分野では、典型的に、ステップエンドリピート及びＴＤＩ撮像システムが現在提供できるものよりも高い全体的スループットが求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
必要とされるのは、大量の詳細データを迅速に捕捉できる走査式撮像システムである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によると、位置決めステージが対物レンズ構成要素との関係において連続的に並進運動させられ、平面的基板上の生化学的部位の画像が作り出されている間に、走査ミラーが位置決めステージと同期的に再度位置づけされる撮像システムが提供されている。好ましい実施形態において、撮像システムは、２Ｄカメラ、対物レンズ構成要素、位置決めステージ及び走査ミラーを備える。対物レンズ構成要素は、カメラにより基板（又はその一部分）を撮像するように構成され、作動する。位置決めステージは、カメラが２Ｄ画像を捕捉している間に対物レンズ構成要素との関係において特定された方向に基板を移動させるように構成され作動する。走査ミラーは、対物レンズ構成要素からの光をカメラに対し反射するために、位置決めステージが同じ特定された方向に基板を移動している間に、位置決めステージと協調して移動するように構成され、作動する。ここに記載される撮像システムは、機械的に所望される連続的ステージ運動の使用を保存するが、画像獲得中のカメラのセンサーアレイとの関係において基板の画像をフリーズする。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】一実施形態に係る代表的走査式撮像システムのブロック図である。
【図２】一実施形態に係る顕微鏡の視野内の撮像部域の例示的詳細を伴うブロック図である。
【図３】一実施形態に係る走査ミラーの線形性誤差及び補正のグラフである。
【図４】一実施形態に係る、走査ミラー角度センサーを含む例示的撮像システムの一部のブロック図である。
【図５】一実施形態に係る基板を撮像するための例示的方法である。
【図６Ａ】例示的シークエンシングシステムを示す。
【図６Ｂ】例示的シークエンシングシステムを示す。
【図７】シークエンシング機械及び／又はコンピュータシステムにおいて使用され得る又はこれと併用され得る例示的計算装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本開示では、本発明をより完全に理解できるようにするための多くの具体的な詳細が記載されている。しかしながら、当業者にとって、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を伴わずに実施可能なものであることは明らかである。他のケースでは、当業者にとって周知である手順及び周知の特徴は、本発明が不明瞭になるのを回避するため記載されていない。本開示は、例えば生化学材料及び他の生化学反応を観察しかつ／又は記録するのに使用されるオペレーションなどのさまざまな撮像及び／又は走査オペレーションを行なうために使用してよい新規の撮像システムの実施形態及びその特徴について記載している。
概説
【０００８】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、カメラ、対物レンズ構成要素、位置決めステージ及び走査ミラーを備えている。単純さを期して、位置決めステージの位置づけを制御し、走査ミラーの走査を制御する機械的構成要素は示されていない。しかしながら、位置決めステージ及び走査ミラーの移動が、適切なサーボ制御システムを通して協調させられていることが理解される。対物レンズ構成要素は、基板又はその一部分をカメラ上に撮像するように構成され、作動する。位置決めステージは、対物レンズ構成要素との関係において特定の方向に基板を移動させるように構成され作動し、ここで１つの態様において、特定の方向は対物レンズ構成要素の光学軸に対し実質的に垂直である。走査ミラーは、対物レンズ構成要素からの光をカメラに対し反射するため、位置決めステージが特定された特定の方向に基板を移動させている間に、位置決めステージの移動と同期的に移動する、すなわち傾動するように、構成され作動する。
【０００９】
１つの好ましい実施形態において、走査ミラーは、基板が位置決めステージによって移動させられている間に、基板（又はその一部分）の静止画像をカメラが獲得できるようにする角運動を実施するように構成され、作動する。
【００１０】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムはさらに、走査ミラーとカメラの間の光学経路内に位置づけされたチューブレンズ構成要素をさらに備え、こうして、走査ミラーは、対物レンズ構成要素からの光をチューブレンズ構成要素に導くことができるようになっている。
【００１１】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、走査ミラーとカメラの間の光学経路内に位置づけされた傾動プレートをさらに備えていていよく、傾動プレートは、対物レンズ構成要素により獲得された基板（又はその一部の）画像に対するオフセット補正を発生させるように構成され作動している。１つの態様において、撮像システムはさらに、傾動プレートに作動的に結合され傾動プレートを傾動させてオフセット補正を提供するように作動するサーボシステムを備えている。別の態様において、撮像システムは、走査ミラーとカメラの間の光学経路内に位置づけされた第２の傾動プレートをさらに備え、ここで第２の傾動プレートは、第１のオフセット補正に対して垂直である第２の方向で基板又はその一部分の画像内で第２のオフセット補正を発生させるように構成され作動する。
【００１２】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、走査ミラーの角度を測定するように構成され作動する角度センサーをさらに備えている。１つの態様において、角度センサーは、光学レバーを備えている。別の態様において、角度センサーは、レーザー及びリニアアレイ検出器を備えており、ここでリニアアレイ検出器は、走査ミラーにより反射されたレーザーからの光を検出するように構成され作動する。
【００１３】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、光源及びダイクロイックミラーをさらに備え、ここでダイクロイックミラーは、少なくとも（ａ）光源由来の光を反射して基板（又はその一部分）を照明し、かつ（ｂ）対物レンズ構成要素により獲得された光を通過させるように構成され作動する。
【００１４】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムには、走査ミラーに対して作動的に結合されかつ、位置決めステージが基板を移動させている間に位置決めステージと協調して走査ミラーを角度的に移動させて対物レンズ構成要素を通して画像が獲得されている間に基板（又はその一部分）画像をカメラとの関係において静止状態に保つように作動するサーボ機構がさらに備わっている。
【００１５】
１つの好ましい実施形態において、基板は、上に標的核酸が配置されたアレイを含む。別の実施形態において、基板は、撮像のための標的である多数の全く異なる特徴を含む。
【００１６】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムはフルフレームカメラ、例えばＣＭＯＳ（「相補型金属酸化膜半導体回路」）カメラを備えている。１つの態様において、カメラは、１００，０００ピクセルから１億ピクセルの範囲内のカメラ画素数を有する。別の態様において、カメラは１０％〜５５％の範囲内の読み出し効率で作動するように構成されている。別の態様において、カメラは、毎秒１０００ライン〜１，０００，０００ラインの範囲内のライン速度で作動するように構成されている。
【００１７】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、毎秒１００μｍ〜１，０００ｍｍの範囲内の速度で基板を移動させるように構成され作動する位置決めステージを備えている。
【００１８】
１つの好ましい実施形態において、基板（又はその一部分）を撮像するための方法は、位置決めステージが対物レンズ構成要素の下で基板を移動させるステップと、基板が移動している間に、走査ミラーの角度を変更して、対物レンズ構成要素により獲得された基板（又はその一部分）の画像が、カメラとの関係において静止状態にあるようにするステップと、基板が移動している間にカメラが基板（又はその一部分）の画像を記録するステップと、を含む。１つの態様において、走査ミラーの角度を変更するステップには、位置決めステージが対物レンズ構成要素の下で基板を移動させている間にサーボ機構が走査ミラーを移動させ、こうして画像が対物レンズ構成要素を通して獲得されている間に基板（又はその一部分）の画像をカメラとの関係において静止状態に保つことが含まれている。別の実施形態においては、カメラが基板（又はその一部分）の画像を記録するステップには、カメラが１０％〜５５％の範囲内の読み出し効率で作動することが含まれる。別の態様においては、カメラが基板（又はその一部分）の画像を記録するステップには、カメラが毎秒１０００ライン〜１，０００，０００ラインの範囲内のライン速度で作動することが含まれる。別の態様においては、位置決めステージが基板を移動させるステップには、毎秒１００μｍ〜１０００μｍの範囲内の速度で基板を移動させることが含まれる。別の態様において、カメラは、フルフレームモードで作動できる非ＣＭＯＳカメラ及びＣＭＯＳカメラのうちの１つである。別の態様において、カメラは、１００，０００ピクセル〜１億ピクセルの範囲内のカメラ画素数を有する。別の態様において、基板は、上に標的核酸が配置されているアレイを備える。さらに別の態様において、基板は、撮像のための標的である多数の全く異なる特徴を備える。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、基板（又はその一部分）を撮像するための方法は、角度センサーを用いて、走査ミラーの角度を測定することと、走査ミラー角度を変更する上で角度センサーからの測定値を使用することと、をさらに含む。１つの態様において、角度センサーは光学レバー及びリニアアレイ検出器のうちの１つ以上を含む。
【００２０】
１つの好ましい実施形態において、基板（又はその一部分）を撮像するための方法はさらに、対物レンズ構成要素とカメラとの間の光学経路内で光学プレートを傾動させて、基板（又はその一部分）の画像内でオフセット補正を行なうことをさらに含む。１つの態様において、方法はさらに、走査ミラーの角度を測定して、走査ミラーの運動中に何らかの非線形性が存在するか否かを検出することと、走査ミラーの運動中に検出された何らかの非線形性を基板（又はその一部分）の画像から除去するために、オフセット補正を使用することと、を含む。
【００２１】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムはカメラ、対物レンズ構成要素、走査ミラー及び位置決めステージを備えている。対物レンズ構成要素はカメラ上にアレイチップを撮像する。走査ミラーは、角運動で移動し、対物レンズ構成要素からの光をカメラに反射する。走査ミラーと協調して、位置決めステージは、対物レンズ構成要素との関係においてアレイチップを移動させる。１つの態様において、アレイチップは、上に配置された高分子を有し、カメラはＣＭＯＳカメラである。
【００２２】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムはさらにチューブレンズ構成要素を含み、ここで走査ミラーは対物レンズ構成要素からの光をチューブレンズ構成要素へと導く。１つの態様において、走査ミラーの角運動により、カメラは、アレイチップが位置決めステージにより移動させられている間にアレイチップの静止画像を獲得することができる。
【００２３】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、走査ミラーとカメラとの間に傾動プレートをさらに備え、ここで傾動プレートは第１の画像オフセット補正を提供している。１つの態様において、撮像システムは、走査ミラーとカメラとの間に第２の傾動プレートをさらに備え、ここで第２の傾動プレートは第１の画像オフセット補正に対して垂直な方向で第２の画像オフセット補正を提供する。
【００２４】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは走査ミラーの角度を測定する角度センサーをさらに備える。１つの態様において、角度センサーは、光学レバーを備える。別の態様において、角度センサーは、レーザー及び走査ミラーにより反射されたレーザーからの光を検出するリニアアレイ検出器を備える。
【００２５】
１つの好ましい実施形態において、撮像システムは、照明光源及びダイクロイックミラーをさらに備える。
【００２６】
１つの好ましい実施形態において、上にＤＮＡ高分子が配置されるアレイチップを撮像するための方法には、位置決めステージが顕微鏡対物レンズの下でアレイチップを移動させるステップと、走査ミラーの角度を変更して、顕微鏡対物レンズにより獲得されるアレイチップの画像がカメラとの関係において静止状態にあるようにするステップと、アレイチップが移動している間にカメラがアレイチップの画像を記録するステップと、が含まれている。１つの態様において、カメラはＣＭＯＳカメラである。
【００２７】
１つの好ましい実施形態において、上にＤＮＡ高分子が配置されているアレイチップを撮像するための方法にはさらに、角度センサーを用いることによって走査ミラーの角度を測定するステップと、走査ミラーの角度を変更する上で角度センサーからの測定値を使用するステップとが含まれる。１つの態様において、角度センサーは、光学レバー及びリニアアレイ検出器のうちの１つを含む。
【００２８】
１つの好ましい実施形態において、上にＤＮＡ高分子が配置されたアレイチップを撮像するための方法には、さらに顕微鏡対物レンズとカメラの間の光学経路内で光学プレートを傾動させて、アレイチップの画像内でオフセット補正を行なうステップが含まれている。１つの態様において、方法にはさらに、走査ミラーの角度を測定して、走査ミラーの運動中に何らかの非線形性が存在するか否かを検出するステップと、走査ミラーの運動中に検出された何らかの非線形性をアレイチップの画像から除去するために、オフセット補正を使用するステップと、が含まれる。
【００２９】
本明細書中及び添付のクレーム中で使用されているように、単数形態の「a」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別段の指示があるのでないかぎり、複数の指示対象も含んでいてよいという点が指摘される。したがって、例えば「付着部位（ａｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）」に対する言及は、文脈から明らかに別段の指示があるのでないかぎり、複数のこのような付着部位を意味してよく、「配列決定方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」に対する言及は、当業者により使用されてよい複数の等価のステップ及び方法に対する言及を含んでいてよい。
【００３０】
別段の定義がないかぎり、本明細書中で使用されている全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての刊行物は、その刊行物中に記載されておりここに記載する発明と関連して使用される場合があると考えられる装置、調合物及び方法論を説明し開示する目的でその内容が参照により本明細書に援用されるものである。
【００３１】
値の一範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各々の値ならびに、この記載された範囲内の部分的範囲又は任意の他の記載された又は介在する値が、本発明の範囲内に包含されるものと理解される。このようなより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてよく、同様に、記載された範囲内のいずれかの限界が特定的に除外される可能性があることを条件として、本発明の範囲内に包含される。記載された範囲が、限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか又は両方を除外する部分的範囲も同様に、本発明の中に含まれる。
【００３２】
選択された定義
「画像空間」とは、カメラ内の画素セットが網羅する部域を意味し、「画像空間画素」はカメラ画素を意味する。
【００３３】
「論理」とは、１つ以上の計算装置の１つ以上のプロセッサ（例えばＣＰＵ）により実行された場合に、１つ以上の機能性を実施するため及び／又は、機械的装置（例えばサーボ又は同種のもの）の作動を制御する素子によって及び／又は他の論理素子によって使用される入力データ又は１つ以上の結果の形でデータを戻すために作動する、一組の命令を意味する。さまざまな実施形態及び実装において、１つ以上のプロセッサ（例えばＣＰＵ）により実行可能である１つ以上のソフトウェア構成要素として、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）及び／又はフィールドプログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）などの１つ以上のハードウェア構成要素として、又は１つ以上のソフトウェア構成要素及び１つ以上のハードウェア構成要素の任意の組合せとして、任意の所与の論理を実装してよい。任意の特定の論理のソフトウェア構成要素（単複）は、非限定的に、独立型ソフトウェアアプリケーションとして、クライアント−サーバーシステム内のクライアントとして、クライアント−サーバーシステム内のサーバーとして、１つ以上のソフトウェアモジュールとして、１つ以上の関数ライブラリとして、及び１つ以上の静的な及び／又は動的にリンクされたライブラリとして実装されてよい。実行中、任意の特定の論理の命令は、１つ以上のコンピュータプロセス、スレッド、ファイバー及び１つ以上の計算装置のハードウェア中にインスタンス化され得かつ非限定的にメモリー、ＣＰＵタイム、記憶空間及びネットワーク帯域を含んでいてよい計算リリースの割当てを受けることのできる他の任意の好適なランタイムエンティティとして、具体化されてよい。
【００３４】
「物体空間」とは、物体（例えば基板）の部域を意味し、したがって「物体空間画素」とは、物体（例えば基板）上の部域の一単位を意味する。物体空間画素のサイズは、典型的に、画像空間画素（すなわちカメラ画素）のサイズ及び物体空間の画像を撮るためにカメラが使用された場合に適用される倍率によって決定される。倍率は、画像空間画素（すなわちカメラ画素）のサイズとカメラが観察する通りの画像空間画素に対応する物体空間部域の実際のサイズとの比率である。例えば、１６×の倍率は、８μｍの画素を用いるカメラが５００ｎｍの物体空間画素を観察できるようにする。さまざまな実施形態において、物体空間画素のサイズは、幅が１００〜１０００ｎｍで長さが１００〜１０００ｎｍであってよい。好ましい態様において、物体空間画素のサイズは３００ｎｍ×３００ｎｍ、より好ましくは５００ｎｍ×５００ｎｍ、さらに好ましくは６２０ｎｍ×６２０ｎｍであってよい。アレイチップを使用する一部の実施形態において、物体空間画素のサイズは、アレイチップ上の付着部位のサイズと実質的に同じか又はそれよりもわずかに大きくなるように選択され、こうして、単一の離散的部位のみが物体空間画素に適合するようになっている。こうして、作動中、アレイチップ上の付着部位から発出されたエネルギー（例えば光）の強度を、単一のカメラ画素で確実に記録することが可能になる。
【００３５】
「対物レンズ構成要素」とは、撮像システムにおいて、１つ以上のレンズを備え、電磁信号（例えば光信号）を増幅するように構成され作動する素子又は素子群を意味する。一部の実施形態において、対物レンズ構成要素は、大きい開口数（ＮＡ）（例えば０．９５〜１．５の範囲内のＮＡ）を有し、空気浸又は液浸（例えば水、油又は他の浸漬流体）を介して撮像を実施する。さまざまな実施形態において、対物レンズ構成要素は２ｍｍ〜２５ｍｍの範囲内の焦点距離を有していてよい。
【００３６】
標的核酸に関する「配列決定」（「シークエンシング」とも呼ばれる）とは、標的核酸内のヌクレオチドの配列に関する情報の決定を意味する。このような情報は、標的核酸の部分的及び／又は完全な配列情報の同定又は決定を含んでいてよい。配列情報は、変動する統計学的信頼性又は信頼度で決定され得る。一態様では、「シークエンシング」という用語は、標的核酸内の異なるヌクレオチドから出発した、標的核酸内の複数の隣接するヌクレオチドの同一性及び順序付けの決定を含む。
【００３７】
「基板」とは、撮像のための標的である多数の全く異なる特徴を有する物体を意味する。例えば、一部の実施形態において、基板は、標的特徴として標的核酸が付着したビーズ又はウェルなどの表面を伴う非平面的構造を備えている。別の例において、一部の実施形態では、基板は、アレイチップを備えている。「アレイチップ」（「アレイ」、「マイクロアレイ」、又は単に「チップ」とも呼ばれる）は、表面、好ましくは（ただし排他的ではなく）平面的な又は実質的に平面的な表面を有し、標的核酸（例えば高分子）が標的特徴として付着された付着部位を担持する固相支持体を意味する。アレイチップ上では、付着部位は、秩序あるパターンで又はランダムな形で配置されていてよく、典型的には、標的核酸の付着のために好適である寸法（例えば長さ、幅そして場合によっては深さ又は高さ）を有するように構成される。こうして付着部位は空間的に画定され、他の部位とは重複していない。すなわち、付着部位は、アレイチップ上で空間的に離散化されている。付着部位に付着される場合、標的核酸は、アレイチップに対し共有的又は非共有的に結合されてよい。「ランダムアレイ」（又は「ランダムマイクロアレイ」）とは、標的核酸（又はそのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）の同一性をアレイチップ上のそれらの場所から同定できないもののシークエンシング、ハイブリッド形成解読プローブ又は同種のものなどのアレイに対する特定の作業によって決定し得るアレイチップを意味する（例えば米国特許第６，３９６，９５５号明細書；同６，５４４，７３２号明細書；同６，４０１，２６７号明細書；及び同７，０７０，９２７号明細書；国際公開第２００６／０７３５０４号パンフレット及び同２００５／０８２０９８号パンフレット；及び米国特許出願公開第２００７／０２０７４８２号明細書及び同２００７／００８７３６２号明細書を参照のこと。同様に例えば、Ｓｃｈｅｎａ  Ｅｄ．２０００，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄなどの一部の従来のマイクロアレイ技術も精査されている）。基板の標的特徴のタイプ及び数は、異なる実装、作動状況及び利用分野において変動する場合がある。例えば、さまざまな実施形態において、アレイチップは、（ａ）１００万〜１５０億の範囲内にある、（ｂ）５０％〜９５％の範囲内又はそれ以上の付着部位の標的核酸占有率を結果としてもたらす；及び／又は（ｃ）１μｍ2あたり０．５〜１０の範囲内又はそれ以上のアレイチップ上の平均標的核酸密度を結果としてもたらす数量でその上に多数の標的核酸を付着させてよい。さらに、一部の実施形態においては、基板を、フロースライド又はフローセルなどの流体デバイス上に配置してもよい。フロースライドは典型的に、環境に対し開放しており、基板を横断する液体の流量は主として重力によって決定される。一方、フローセルは典型的に環境からその基板を密封し、圧力駆動式システム（例えばさまざまなタイプのポンプ、バルブ、ライン及び他の流体連結部を備えたもの）によって使用されて流体フローセル内へそしてその外へと移動させる閉鎖された液体通路を提供する。概して、異なる実施形態及び実装にお���て、基板は、撮像のための標的であるさまざまな異なる特徴を伴うさまざまな異なる装置の形で実施することができる。この理由から、この段落中で記述されている基板及びその特徴の例は、限定的な意味ではなくむしろ例示的意味合いで考慮されなければならない。
【００３８】
「標的核酸」とは、シークエンシング、観察及び／又は他の研究の対象である遺伝子、調節要素、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び同種のものを含む）及びそれらのフラグメント由来の核酸を意味する。標的核酸は、試料由来の核酸又は増幅及び／又は複製反応（単複）の産物などの二次的核酸であってよい。このような産物の一例は、高分子である。核酸に関連して使用される「高分子」は、二次構造（例えばアンプリコン）を備えた直鎖核酸分子、分岐核酸分子及び相互作用する構造要素、例えば相補的配列、パリンドローム又は核酸内で３次元構造要素を発生させる他の配列インサートを伴う個別の配列の多数の別個のコピーを含めた、測定可能な３次元構造を有する核酸を意味する。
【００３９】
移動する標的を走査するための撮像システム
本明細書中に記載の撮像システムは、カメラを通して画像を移動させない高速カメラを使用することにより、連続的に移動する標的（例えば基板）を走査するように構成されている。例えば、一部の実施形態においては、ＤＮＡシークエンシング用の撮像システムを、ＣＭＯＳカメラ又は科学的ＣＭＯＳ（ｓＣＭＯＳ）カメラを用いて構成することができる。フルフレームカメラは、ＣＣＤアレイカメラと異なり、ＴＤＩモードでは作動できないことから、この作動上の制限の帰結として、画像は、獲得中、フルフレームカメラのセンサーアレイとの関係において移動してはならない。本明細書中に記載の撮像システムは、位置決めステージが対物レンズ構成要素の下で基板（例えばアレイチップ）を移動させている間、カメラセンサー上で画像を静止状態に保持することのできる走査ミラー（及び／又は別の光学装置）を提供することによって、少なくとも部分的にこの作動上の制限に対処するものである。このようにして、本明細書中に記載の撮像システムは、フルフレームカメラ（例えばＣＭＯＳカメラ）の高速性、高解像度及び低コストという利点を達成しながら、これらのカメラの作動上の制限を克服する。
【００４０】
本明細書中に記載の撮像システムは同様に、前述のＴＤＩ撮像システム及びステップエンドリピート撮像システムを使用した場合に比べて、移動する基板を走査することの結果として得ることのできる速度、精度及びスループットの利点をも達成する。ＴＤＩ撮像システムが使用される場合、基板は、画像データが読み出されるのと同じ速度でチップの画像がＴＤＩカメラのセンサーアレイを横断して移動するように、移動する顕微鏡対物レンズの下で連続的に走査されてよい。しかしながら、ＴＤＩカメラは、概して高価であり、非常に高いスループットを必要とする一部のシークエンシング実装にとって充分な解像度を提供しない場合がある。一方、ステップエンドリピートシステムは、位置決めステージが基板を画像間の新しい位置まで移動させるにつれて、各画像のための基板の運動を停止させる必要がある。したがって、開始と停止によりスループットが低下することに加えて、ステップエンドリピートシステムでは、位置決めステージの加速及び減速が、特に撮像スループットを維持するために高速で実施された場合に、基板とカメラの間のアライメントの精度の低下を導く。
【００４１】
ここで記載されている撮像システムは、機械的に望ましい連続的なステージ運動の使用を保つものの、画像獲得中は、カメラのセンサーアレイとの関係において基板の画像をフリーズさせる。一部の実施形態において、これは、より重い位置決めステージに比べはるかに容易かつ精確に加速及び減速可能な、軽量のサーボ制御型走査ミラーを使用することによって達成される。走査ミラーの性能を監視しオンザフライで小さな画像位置補正を行なうための装置も同様に、一部の実施形態において、撮像システムの一部を成してよい。その結果として、本明細書中の技術にしたがった撮像システムは、約５０ｎｍのアライメント精度を維持しながら、毎秒５５０メガピクセル（又はそれ以上）の画像データを獲得することができる。シークエンシング機械内において好適な生化学反応サブシステムと結合されて、このような撮像システムは、例えば毎日約１００ヒトゲノム当量のデータのシークエンシングなどの非常に高いシークエンシングスループットを可能にする。
【００４２】
一部の実施形態において、撮像システムは、対物レンズ構成要素、１つ以上のカメラ、可動式位置決めステージそして好ましくは（ただし排他的ではなく）チューブレンズ構成要素を備えた蛍光ベースのシステムである。これらの実施形態において、撮像システムは、基板（例えばアレイチップ）全体又はその一部分の画像を撮るように構成され作動し、ここで基板は位置決めステージ上に取付けられているか又は他の形で設置されており、カメラ（単複）により画像が撮られている間、運動している。本明細書中に記載の技術によると、このような撮像システムは、移動する基板の画像を獲得するために実際に高速であるカメラ（例えば、ＣＭＯＳカメラ）を使用できるようにする。このシステムオペレーションモードを容易にするため、本明細書中に記載の技術は、対物レンズ構成要素とカメラ（単複）の間の光学経路内に配置される可動式走査ミラーを提供している。この構成要素配置は、従来の撮像システムとは対照的であり、従来のシステムでは光学経路に沿って完全に整列させられしたがって（従来の撮像システムでは望ましくないとみなされている効果を可動式構成要素が生成することを理由として）この光学経路の中央に可動構成要素を許容できない対物レンズ及びカメラが、この構成要素配置では概して使用されている。
【００４３】
ＤＮＡシークエンシングのために使用される蛍光ベースの撮像システムは蛍光画像が薄暗いことを理由として、典型的に非常に低い光レベルを使用するという点も、指摘に値する。こうして、このような撮像システム内のカメラ（単複）及び光学素子は、画像獲得時間を最短に保つため、可能なかぎり効率が良くかつ感度の高いものであることが求められる。さらに、照明強度は、シークエンシングされつつある標的核酸に損傷を与え得る点より低いレベルにとどまらなければならない。これらの要因は、移動する標的核酸の撮像のための蛍光撮像システムを設計する際に考慮に入れる必要のある要因の一部である。
【００４４】
高速カメラ
本明細書中に記載の撮像システムは、撮像中の基板が移動している間に静止画像の連続的露光を達成するために可動式走査ミラーと併せて高速カメラを使用するように構成されている。一部の実施形態において、カメラ画素のサイズ（長さ及び／又は幅）は５μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは（ただし排他的ではなく）６〜８μｍの範囲内にある。
【００４５】
さまざまな実施形態において、本明細書中に記載の撮像システムは、例えばカメラを通して画像を移動させない非ＴＤＩカメラ及びフルフレーム２Ｄモードで作動する他のカメラ（ＴＤＩカメラを含む）などの高速カメラを使用することによって、連続的に移動する基板（例えばアレイチップ）を走査するように構成されている。ＣＭＯＳカメラは、このようなカメラの１つの例示的部類である。ＣＭＯＳカメラは典型的に、画素アレイを格納する集積回路で構成された画像センサーである能動画素センサー（ＡＰＳ）を使用し、ここで各画素は、光検出器と能動形増幅器を含んでいる。ＣＭＯＳカメラの一例は、Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製のＳｃｉＭＯＳ２０５１モデルである。ＳｃｉＭＯＳ２０５１は、２８６ＭＨｚの読み出し及び二電子未満の典型的読み出し雑音で毎秒１００フレームで５．５メガピクセルの画像を捕捉できる高速カメラである。
【００４６】
好ましくは（ただし排他的にではなく）、カメラの高い速度は、一単位時間内にカメラから読み出し可能である画素行数を定義するカメラの１作動特性であるライン速度によって定義づけされる。カメラのライン速度は、以下の等式（１）に従って決定される：
【数１】
0006272314.tif 000002
なお式中、「Ｒline」はカメラのライン速度、「Ｐreadout-frequency」はカメラの画素読み出し周波数（例えば、一単位時間内に読み出し可能な画素の数）、「Ｎpixels-per-line」はカメラのセンサー行内の画素数である。例えば、２８６ＭＨｚの読み出し周波数及び１アレイセンサー行あたり２５６０ピクセルを有するカメラは、Ｒline＝２８６ＭＨｚ／２５６０≒１０5ライン／秒のライン速度を有すると考えられる。
【００４７】
あるいは、高速カメラは、一単位時間内にカメラが露光できる画素数の観点から定義づけされてよい。例えば、カメラの速度は、カメラが撮ることのできる毎秒フレーム数及び視野内の画素数の数学的積により定義されてよい。こうして、毎秒１００フレーム（ｆｐｓ）で走行する５．５メガピクセルの視野（例えば２５６０ピクセル×２１６０ピクセルの視野）を有するカメラは、毎秒５５０メガピクセルを露光することができる。こうして、このようなカメラは本明細書において「５５０」メガピクセルカメラと呼ばれる。このようなカメラの例としては、非限定的に、ＣＭＯＳ、ｓＣＭＯＳ及び類似のカメラが含まれる。さまざまな実施形態において本明細書中に記載の撮像システムは、１０メガピクセルから２５００メガピクセルの範囲内のカメラを使用してよい。
【００４８】
移動する標的の効率の良い高速撮像
本明細書中に記載の技術によると、さまざまな実施形態において、撮像システムは、移動する基板を走査式に撮像するように構成されている。このような実施形態において、基板は典型的に、カメラが基板（又はその一部分）の画像を撮っている間に対物レンズ構成要素の下で基板を連続的に移動させることのできる１つ以上の機構（例えばモーター、アクチュエータなど）に結合された位置決めステージ上に取付けられる（又は他の形で設置される）。位置決めステージは、対物レンズ構成要素の光学軸に対して垂直な方向に沿って基板を移動させるように構成され作動する（これは、概して対物レンズの光学軸に沿って物体及び／又は対物レンズ全体を移動させる自動焦点タイプの機構の作動に対し直交するという点が指摘される）。
【００４９】
本明細書中に記載の技術によると、ステージの運動は、充分な露光を提供する時間周期だけカメラ上に基板（又はその一部分）の画像を静止（安定）状態に保つような形で、走査ミラーの逆走査運動と協調させられる。換言すると、ステージが移動している間、その上に取付けられた基板の静止画像が、カメラに対し露光されている。露光周期中の画像の安定化は、対物レンズ構成要素とカメラの間の光学経路内の前記走査ミラーの運動（例えば傾動）によって提供される。こうして、走査ミラー及び位置決めステージは、撮像中の基板が連続的に運動している間に画像を静止／安定状態に保持するために、協調式の戻り走査オペレーションにおいて有効に結合される。
【００５０】
撮像システムの好ましい実施形態においては、作動中、位置決めステージは、露光された画素の１つ以上の行をカメラから読み出すためにコンピュータシステムが論理を実行している間に、上に取付けられた基板を移動させている。同時に、同じ及び／又は異なるコンピュータシステムは、論理を実行して、位置決めステージのタイミングに走査ミラーのタイミングを同期させ、こうして走査ミラーが戻り走査しカメラ上の別の画像を静止状態に保ちこれによりカメラ画素の１つ以上の行の別のセットを露光する。
【００５１】
このようなオペレーションモードでは、位置決めステージの速度は、以下の等式（２）に従って計算可能である：
【数２】
0006272314.tif 000003
なお式中、「Ｖstage」はステージ速度、「Ｓpixel」は、物体空間画素のサイズ（例えば長さ又は幅）、「Ｒline」はカメラのライン速度（例えば画素行がカメラから読み出される速度）であり、「η」はカメラからの全読み出しの効率（例えば、進行中である他の露光に支障をきたすことなくカメラから読み出しを抽出できる時間の百分率で表わされるもの）である。例えば、さまざまな実施形態において、物体空間画素のサイズ（例えば長さ及び／又は幅）は、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内であり得、カメラのライン速度は毎秒１０3ライン〜１０6ライン（Ｈｚ）の範囲内であり得、カメラからの全読み出し効率は、１０％〜９０％の範囲内又は９０％超であり得る。したがって、さまざまな実施形態において、位置決めステージの速度は毎秒０．１ｍｍ〜１０００ｍｍの範囲内（又はそれ以上）であってよい。好ましい実施形態において、物体空間画素は６２０ｎｍであり、カメラのライン速度は、毎秒１０5ライン（Ｈｚ）であり、カメラからの全読み出し効率は９０％であり、これは毎秒約５５．８ｍｍのステージ速度を提供する。
【００５２】
本明細書中に記載の技術によると、１つ以上の計算装置及び／又はそのさまざまな論理は、走査ミラー及び位置決めステージの協調運動を制御するように構成され作動する。こうして、一部の実施形態において、位置決めステージ（したがってその上に取付けられた基板）は、一定速度で移動するように構成され得、その場合、走査ミラーの戻り走査運動も同様に、好適な一定速度で行われる。他の実施形態において、位置決めステージを、一定でない速度で移動するように構成することができ、その場合、走査ミラーの戻り走査運動も同様に好適な一定でない速度で行われる。
【００５３】
さまざまな実施形態において、位置決めステージの所与の所望される速度での運動を容易にするために、さまざまな機構を使用してよい。このような機構は、運動を発生させる１つ以上の構成要素（例えばリニアモーター、リードスクリュー、スクリューモーター、スピードスクリューなど）及び摩擦を低減させる１つ以上の構成要素（例えばさまざまなタイプの軸受）を備えていてよい。
【００５４】
例えば、一部の実施形態は、位置決めステージを移動させるために空気軸受を伴う機構を提供してよい。空気軸受は、２つの表面間に非常に低い摩擦界面（例えば軸受隙間）を提供する圧搾空気の薄膜である。こうして、これらの実施形態において、位置決めステージの底面は、別の表面と直接接触した状態にはなく、むしろ空気軸受の隙間の上に懸吊されており、このため（空気は軸受空隙から常時漏出するものの）軸受の複数の面間に加えられる空気圧は位置決めステージの荷重を支持するのに充分なものである。本明細書中に記載されている撮像システム内でこのような空気軸受を使用することで、１０〜２０ｎｍのアライメント許容誤差の範囲内でカメラ上に静止画像をロックすることが可能になる。
【００５５】
別の例において、一部の実施形態は、数ミクロンの再現性を有する金属軸受（例えば玉軸受、円筒軸受、クロスローラー玉軸受など）を使用してよい。再現性は、根本的に、油中の金属軸受の転がり効果であり、金属軸受は転がるにつれて跳ね上がり、この跳ね上がりが、軸受上を移動させられつつある物体の運動の中にジッタを導き入れる。このような運動の「再現性」は、任意の２つの金属軸受が同じ形で跳ね上がり得るのは一定の許容誤差内においてだけであるため、一定の範囲よりも上でしか均一であり得ない。したがって、玉軸受を使用する実施形態は、より大きいアライメント許容誤差（例えば、２０ｎｍ超の許容誤差）を有し、位置決めステージのより低い速度を有しかつ／又は物体空間画素あたり多数のカメラ画素を使用するかもしれない。
【００５６】
上述の等式（２）が示す通り、全カメラ読み出しの効率（「η」）は、撮像システムの全体的スループットを決定する１つのパラメータである。例えば、撮像中の基板を照明するために使用される機構に応じて、異なる読み出し効率を生成する少なくとも複数の異なる実施形態が存在してよい。１つの実施形態において、走査照明（例えば全内容が本明細書中に完全に記載されている場合と同様に参照により本明細書に援用されている「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｓｃａｎｎｅｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ」という名称で本明細書と同日に出願された米国仮特許出願第６１／６５６，７４４号中に記載のもの）を使用することによって、η＝９０％（又はそれ以上）のカメラ読み出し効率を達成することができる。別の実施形態においては、音響光学変調器（ＡＯＭ）又はパルスレーザービームを生成することのできる他のタイプの高速スイッチによって制御されるレーザー光源を使用することにより、η＝３０〜５５％（又はそれ以上）のカメラ読み出し効率を達成することができる。別の実施形態においては、広帯域照明及び標準フルフレームモードで作動するカメラを使用することによって、η＝１０〜３０％（又はそれ以上）のカメラ読み出し効率を達成することができる。
【００５７】
例えば、一部の実施形態において、撮像システムは、（「２次元」画像とも呼ばれる）カメラ画素の多数の行に跨る画像を捕捉するために、フルフレームモードでカメラを作動させる。これらの実施形態では、フルフレームモードで作動するカメラの全体的カメラ読み出し効率を改善するために、撮像システムは、１つ以上の他の（すでに露光された）画素行セット内で同時に画素を読み出しながら、１つの画素行セットを露光するように構成されている。こうして、カメラが１つの画素行セットを露光することによって基板の一部分の２次元画像を収集している間に、コンピュータシステムは、すでに露光された別の画素行セットを読み出すために論理を実行する。この作動モードは、走査照明を使用することによってさらに最適化されてよく、これにより、カメラから読み出しを抽出できる時間の百分率は最大になる。例えば、カメラが基板の一部分の２次元画像を収集している間に、コンピュータシステムは、照明ミラーの角度を変更することによって基板の一部分を横断して光のラインを走査し、こうしてカメラ内の第１の画素行（単複）を露光し、他の第２の画素行（単複）を暗状態に保つために論理を実行する。その後、第１の画素行（単複）の露光が完了した時点で、コンピュータシステムは、第２の画素行（単複）を露光するために基板の一部分を横断して光のラインを同時に走査し続けながら、第１の画素行（単複）を読み出すために論理を実行する。
【００５８】
走査型撮像システムの例
図１は、好ましい実施形態に係る走査蛍光撮像システム１００の略図である。図１の撮像システム１００は、基板（例えばアレイチップ）１０５が顕微鏡の対物レンズ構成要素１１５を通過して走査されるにつれてカメラ１２５のセンサー上に基板の画像を一時的に定着させる。
【００５９】
図１に示されている実施形態において、アレイチップ１０５は、例えばＤＮＡ高分子などの標的核酸を担持する。位置決めステージ１１０は、対物レンズ構成要素１１５との関係においてアレイチップ１０５を移動させる。位置決めステージ１１０は、高精度でコンピュータ制御式の空気軸受ステージである。対物レンズ構成要素１１５は、既製の対物レンズである。一部の実施形態において、対物レンズ構成要素は、カスタム設計の多素子光学構成要素であってよい。さらに、一部実施形態では、水浸式を用いて対物レンズ構成要素の開口数（ＮＡ）を増大させてよい。
【００６０】
対物レンズ構成要素１１５及びチューブレンズ構成要素１２０は、アレイチップ１０５の一部分の画像をカメラ１２５のセンサーアレイ上に投影する。チューブレンズ構成要素１２０は、第２の拡大対物レンズとして機能する１つ以上のチューブレンズを備えた１つの素子又は素子群である。カメラ１２５は、好ましくは（ただし排他的ではなく）フルフレームモードで作動し、低い読み出し雑音、高解像度及び高撮像速度を特徴とするセンサーアレイを使用する高速ＣＭＯＳカメラである。
【００６１】
図１に示されている実施形態において、走査ミラー１３０は、下にあるフィードバック制御型サーボシステム（図示せず）を含むサーボ回転機構（図示せず）により傾動させられる軽量ミラーである。走査ミラー１３０と同じ軸上に枢動的に位置づけされたライン１３２及び１３４が、走査ミラー１３０の角運動範囲を示す。走査ミラー１３０が極限位置１３２と１３４の間で前後に傾動するにつれて、対物レンズ構成要素１１５の視野内の部域は、カメラ１２５のセンサー素子上に撮像される。走査ミラー１３０の運動が位置決めステージ１１０の運動と協調されている場合、アレイチップ１０５上の固定部域は、ステージが移動している一方でカメラにより撮像される。走査ミラー１３０の回転（例えば図１の平面に対して垂直な軸を中心とした回転）は、図中に示されたｙ軸方向で画像を走査する効果を有する。この結果は、走査ミラー１３０が内部に設置されている撮像システム１００の視準を合わせた区分内での傾動がカメラ１２５の焦点面における横方向並進運動に対応することを理由として得られるものである。
【００６２】
蛍光撮像のための照明は、照明源１５５（例えば１つ以上のレーザー又は他の照明源）により提供される。照明光はダイクロイックビームスプリッター１５０により光学経路内に向けられ、このダイクロイックビームスプリッターは照明波長では反射するが、蛍光発光波長では透過させる。一度に２つ以上のタイプの蛍光マーカーを調べる撮像システムにおいては、多数の照明源（例えば各々別個の光スペクトルを発出する多数のレーザー）及びダイクロイックビームスプリッターを使用してよい。さまざまな実施形態において、照明源は、例えば４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内の波長の光などの、シークエンシングで使用可能なさまざまなフルオロフォアと適合性のあるさまざまな波長の光を発出することができる。
【００６３】
撮像システム１００において傾動プレート１４０及び１４５は、カメラ１２５のセンサーアレイ上の画像の配置に対する小さい補正を行なうために使用される。例えば、およそ直径２．５ｃｍ、厚み３．５ｍｍのガラス製の傾動プレートの重量は数グラムにすぎない。プレートは、サーボシステムのフィードバック制御下で、高速かつ精確な動作のためサーボ回転機構（図示せず）上に取付けられる。光が非垂直入射で傾動プレート１４０内を通過する場合、その位置は、以下の等式（３）から求められる量Δｘだけオフセットされる：
【数３】
0006272314.tif 000004
なお式中、「ｔ」はプレートの厚み、「ｎ」は屈折率、「θ」は入射角である。以上で示した寸法のガラス板（ｎ＝１．５）の場合、５度の傾動が約１００μｍの横方向画像オフセットを生み出す。類似の関係が、傾動プレート１４５についても適用できる。
【００６４】
上記の等式（３）に基づいて、カメラ１２５のセンサーアレイとの関係における画像アライメントについての情報を用いて、傾動プレート１４０及び１４５を駆動するフィードバック信号を提供する。このようなアライメント情報の１つの供給源は、カメラにより獲得された画像の分析結果である。ｙ方向におけるアライメント情報の別の供給源は、以下に記述する通り、走査ミラー１３０の性能を監視することによって得られる。一部の実施形態において、このような画像アライメント情報は、計算装置に送られ、計算装置は走査ミラー、チップ位置決めステージ、１つ以上の傾動プレートの作動そして好ましくは（ただし必須ではないが）撮像中のアレイチップを照明することに関与するあらゆる照明ミラー及び／又は照明源（単複）の作動を制御する論理を実行する。
【００６５】
例示的走査オペレーション
図２は、１つの好ましい実施形態に係る対物レンズ構成要素の視野内の撮像部域の詳細である。図２では、円２０５が図１中の対物レンズ構成要素１１５の視野を表している。陰影のある矩形２３０は、走査ミラー１３０が中間位置にある場合にカメラ１２５のセンサーアレイ上で撮像される視野２０５内の部域を表わしている。矩形２３２及び２３４（破線の縁を伴う）は、それぞれ走査ミラーが極限位置１３２及び１３４にある場合にカメラ１２５のセンサーアレイ上で撮像される視野２０５内の部域を表わしている。
【００６６】
作動中、対物レンズ構成要素１１５は、ｙ方向に間断なく移動しているアレイチップ上に焦点が合せられ、走査ミラー１３０は位置１３４から１３２まで回転する。アレイチップ１０５の速度がカメラ１２５上で撮像される視野２０５内の部域の速度と同じである場合には、カメラ上のチップの画像は移動せず、こうして、カメラの画像センサー上への充分な露光を可能にする。
【００６７】
画像は、撮像された物体空間部域が矩形２３４により示される位置から矩形２３２により示される位置まで移動する時間中だけカメラ１２５との関係において不動の状態にある。走査ミラー１３０は、極限位置１３２に達した場合、次に位置１３４まで「フライバック」しなければならない。フライバック時間は走査ミラーサイクルの小さな分率しか占めないように構成され得るが、必要な場合には連続する撮像部域は隣接するかさらには重複していてよい。効率をさらに高めるためには、走査ミラーが撮像された各部域上で費やす時間の量を、カメラのフレームレートに相応するものにし、こうして、すでに撮像され視野の外にある他の物体空間部域についてカメラから画像データを読み出すことができるようになると同時に、カメラ上へと各々の物体空間部域の画像を露光するための充分な時間が可能となる。
【００６８】
撮像上の問題を処理しやすい単位に分割するため、一部の実施形態において、アレイチップの付着部位は、ミクロンからミリメートルサイズのフィールドに分割される。（例えば、さまざまな態様において、典型的なフィールドは、３２０〜１６００μｍ×３２０〜１６００μｍ、５００〜６００μｍ×５００〜６００μｍ、さらには１．６ｍｍ×７００μｍ）の範囲内のサイズのものであってよい）。典型的なアレイチップは、矩形の行列パターンに配置された数百又は数千ものフィールドに分割されてよい。（例えばフィールドの行及び列は、実質的にそれぞれ水平寸法と垂直寸法に沿って整列させられているトラック領域を含んでいてよい）。
【００６９】
付着部位のフィールドを伴うこのような実施形態において、本明細書中に記載の技術は、アレイチップを部分毎に走査し撮像することを提供しており、ここで各々の部分は、長さの１つ以上のフィールドと幅の１つ以上のフィールドとに跨る列である。一実施例において、撮像システムは、対物レンズ構成要素の光学軸に対し実質的に垂直である平面及び／又は軸の中でｙ方向に沿って位置決めステージがアレイチップを移動させている間に（本明細書中に記載の通り）走査する形でアレイチップを撮像する。この実施例において、撮像システムは、撮像中のフィールド（単複）の列の終りに達した時点で撮像を停止して、位置決めステージがアレイチップを復帰させてそれをフィールド（単複）の次の列の撮像のために位置づけすることができるようにする。別の実施例において、撮像システムは、位置決めステージが対物レンズ構成要素の光学軸に対して実質的に垂直である平面内で蛇行する形（例えばｙ方向に沿って）でアレイチップを前後に移動させている間に、（本明細書中に記載の通り）走査する形でアレイチップを撮像する。この実施例において、撮像システムは、位置決めステージがアレイチップを一方の方向に移動させている間にフィールド（単複）の１本の列を撮像し、その後位置決めステージがアレイチップを反対方向に復帰させている間にフィールド（単複）の次の／隣接する列を撮像する。換言すると、撮像システムは、連続する蛇行の形でフィールドの列を有効に横断することによって、アレイチップを撮像する。
【００７０】
高スループットのＤＮＡシークエンシングのための撮像には、典型的に、撮像中の基板上に配置されている標的核酸の密度が高くサイズが小さいことを理由として、高い精度での画像アライメントが求められる。しかしながら、一部の実施形態において、走査ミラー（例えば市販のサーボスキャナー）を駆動できる機構は、それ自体充分な精度を有していない場合がある。したがって、本明細書中に記載の技術に係る撮像システムは、走査ミラーの性能を測定し走査誤差を補正するために追加のサブシステムを使用してよい。
【００７１】
線形性誤差の補正
図２に関して、完全な走査ミラーサブシステムが、視野２０５内部で画像部域２３０を時間と共に線形的に移動させると考えられる。すなわち、画像部域が１ミリセカンド以内で一定の距離だけ移動する場合、それは、２ミリセカンドでこの距離の２倍移動するはずである。しかしながら、走査ミラーのこのような完全な運動は、実際には達成が困難である。
【００７２】
図３は、１つの好ましい実施形態に係る走査ミラーの線形性誤差及び補正のグラフである。図３のグラフ３０５は、フライバック時間を除いた１回の走査サイクル全体にわたる理想的な線形走査からの偏差を示す。走査ミラーの線形運動からの偏差Δｙは、任意の適切な距離単位で測定されてよい。ここでは、グラフ３０５は画像センサー画素内の偏差を示している。グラフ３１０は、グラフ３０５により表わされた誤差を除去するのに必要とされる補正を示す。走査範囲の特定の部分についての誤差が例えば＋１．１５ピクセルである場合には、対応する補正は−１．１５ピクセルである。
【００７３】
一部の実施形態において、グラフ３１０により表わされた補正信号は、図１に示された傾動プレート１４５に対するフィードバックとして適用される。例えば、計算装置が、線形性誤差情報を受信し、必要な誤差補正項を（例えばΔｙに基づいて）計算し、誤差補正項に基づいて傾動プレート１４５をサーボ機構に回転させる論理を実行してよい。傾動プレート１４５が行なう補正は小さいものであることから、それ自体の非線形性は無視することができる。走査ミラー性能の測定は、図４に示された通り、走査ミラー角度センサーを用いて行なうことができる。
【００７４】
走査ミラーのオペレーション制御
図４は、一実施形態に係る走査ミラー角度センサーを含む例示的撮像システムの略図である。図４では、図１に示されているものと同じである撮像システムの構成要素が、同じ参照番号で識別されている。したがって、図４において、アレイチップ１０５は、位置決めステージ（図示せず）上に取付けられており、標的核酸を担持している。対物レンズ構成要素１１５は、既成の顕微鏡対物レンズ又はカスタム設計の多素子光学構成要素であってよい。走査ミラー１３０は、サーボ回転機構により傾動される軽量ミラーである。点線１３２及び１３４は、走査ミラー１３０の角運動範囲を示す。
【００７５】
角度センサー４００は、レーザー４０５及びリニアアレイ検出器４１０を含む光学レバーである。センサー４００は、精確かつ迅速に走査ミラー１３０の傾動角度を測定する。一実施形態において、リニアアレイ検出器４１０は、およそ２０００の素子を有し、そのうち約３つ又は４つが、検出器に到達する前に走査ミラー１３０により反射されるレーザー４０５由来の光により照明される。走査ミラー１３０が傾動するにつれて、アレイ検出器４１０の異なる素子がレーザー４０５由来の光を検出する。角度センサー４００は、４０ｋＨｚ以上の速度でミラー角度測定値を提供する。一部の実施形態では、１つ以上の追加の固定ミラーからの反射を用いて、測定用ビームが走査ミラーを多数回打撃して光学レバーの感度を高めることができるようにしてよい。線形アレイ検出器４１０からの角度測定値を用いて、ｙ方向の傾動プレート（図示せず）に対する補正を提供し、ここで、補正された走査ミラーサブシステムの線形性は、１０，０００分の１部分以上である。例えば、一部の実施形態において、リニアアレイ検出器は、計算装置内で実行する論理に対して角度測定値情報を提供し、ここで、論理は、ｙ方向についての必要な補正項を計算し、計算された補正項に基づいてサーボ機構に傾動プレートを回転させるために、測定値情報を使用する。
【００７６】
本明細書中に記載の走査ミラーを使用することによって、撮像システムは、移動する基板の静止画像を獲得するために、フルフレームモードで作動するカメラ（例えばＴＤＩモードで作動しないＣＭＯＳカメラ）を使用することができる。ＤＮＡシークエンシングのために利用される一部の実施形態においては、蛍光撮像の極限的アライメント精度要件のため、走査ミラー運動内の非線形性を除去する目的での走査ミラー角度センサー及び画像オフセット補正サブシステム（例えば１つ以上の傾動プレート）の使用が必要となるかもしれない。一部の実施形態においては、このような撮像システムは、追加のカメラに対して発出された光を送るために、付随するダイクロイックビームスプリッターを伴う追加の光源を含み入れることによって、異なる波長での同時蛍光撮像を提供するように拡張されてもよい。このような実施形態において、各々のカメラは、必要に応じて小さいアライメント補正を提供するために、独自の走査ミラー角度センサー及び傾動プレート（単複）のサブシステムを有していてよい。
【００７７】
例示的使用方法
図５は、一実施形態に係る基板を撮像するための例示的方法を示している。例示を目的として、図５中の方法は、以下で撮像システムを含むシークエンシング機械によって実施されるものとして記述されている。しかしながら、この方法のステップはさまざまなタイプの装置および撮像システムにより実施可能であることが理解される。こうして、図８中の方法は、任意の特定のタイプの機械または装置によって実施されることに限定されず、したがって、以下の方法記述は、制限的な意味合いではなくむしろ例示的意味合いで考慮されるべきものである。
【００７８】
ステップ５０２では、位置決めステージが、対物レンズ構成要素の光学軸に対して垂直な平面内で対物レンズ構成要素の下で基板を移動させており、ここで基板は、撮像の標的である多数の全く異なる特徴を備えている。一部の態様において、基板は、上に標的核酸が配置されたアレイチップを備えており、シークエンシング機械には、それ自体位置決めステージ及び対物レンズ構成要素並びにフルフレームモードで作動する高速カメラを含む撮像システムが含まれている。例えばカメラは、毎秒１０００ライン〜１，０００，０００ラインの範囲内のライン速度を有するＣＭＯＳカメラであってよく、位置決めステージは毎秒１００μｍ〜１０００ｍｍの範囲内の速度で基板を移動させてよい。
【００７９】
基板が運動している間、ステップ５０４においてサーボ機構は走査ミラーの角度を変更し、これにより対物レンズ構成要素が獲得する基板（又はその一部分）の画像は、カメラとの関係において静止状態に保たれる。一部の態様においては、シークエンシング機械の一部であるか又はそれに結合された計算装置が、位置決めステージと協調してサーボ機構を制御する論理を実行する。例えば、論理は、位置決めステージの動作を表わすフィードバック制御情報を受信し、この情報を用いてサーボ機構に対する入力信号を調整し、このサーボ機構はそれ自体走査ミラーの角度を変更して、走査ミラーの運動を位置決めステージの運動と同期する。一部の態様において、論理は同様に、走査ミラー自体の運動内に何らかの非線形性が存在するか否かを検出する角度センサーからフィードバック角度情報を受信する。論理はその後、この角度情報を用いてオフセット補正を計算し、オフセット補正を入力信号としてサーボ機構に渡し、サーボ機構は走査ミラーとカメラ間の光学経路内の傾動プレートの角度を制御する。このようにして、傾動プレートの角度に対してわずかな調整を行なうことで、論理は、獲得中の画像から、走査ミラーの運動内の非線形性によりひき起こされるあらゆる誤差を有効に除去する。
【００８０】
ステップ５０６において、カメラは、基板が位置決めステージにより移動させられている間に基板（又はその一部分）の静止画像を記録する。一部の態様においては、カメラがそのセンサー内の画素行セット内に画像を記録している間に、他の先に露光された画素行からの画像データがカメラから読み出される。例えば、シークエンシング機械の一部を成すか又はこれに結合されている計算装置が、すでに露光されていて現在はもう光を獲得していない画素行を読み出す論理を実行する。このようにして、カメラのセンサーの一部分からの画像データの抽出は、センサーの異なる部分内の別の画像の獲得と同時に進行し、これによりカメラの読み出し効率ひいては撮像システムの全体的スループットは高められる。例えば、一部の態様において、カメラは１０％〜５５％の範囲内の読み出し効率で作動可能である。
【００８１】
シークエンシングシステム及び計算装置
一部の実施形態において、ＤＮＡ試料（例えば全ヒトゲノムを表わす試料又はエクソームを表わす試料）のシークエンシングは、シークエンシングシステムによって実施されてよい。図６Ａ及び６Ｂは、例示的シークエンシングシステムを示す。
【００８２】
図６Ａ及び６Ｂは、本明細書中に記載の好ましい実施形態に係るＤＮＡシークエンシングを実施するように構成された例示的シークエンシングシステムのブロック図である。シークエンシングシステム６００は、例えば、シークエンシング機械６９０などの１つ以上のシークエンシング機械、コンピュータシステム６９７などの１つ以上のコンピュータシステム、及びデータレポジトリ６９５などの１つ以上のデータレポジトリなどの多数のサブシステムを含むことができる。図６Ａに示された実施形態において、システム６００のさまざまなサブシステムは、遠隔システム間の情報交換を容易にするように構成されたパケット交換又は他のタイプのネットワークインフラデバイス（例えばルーター、スイッチなど）を含んでいてよい１つ以上のネットワーク６９３上で通信接続されていてよい。図６Ｂに示されている実施形態において、シークエンシングシステム６００は、さまざまなサブシステム（例えばシークエンシング機械（単複）６９０、コンピュータシステム（単複）６９７、そして場合によってはデータレポジトリ６９５）が通信的かつ作動的に結合されデバイス内に内蔵された構成要素である、シークエンシングデバイスである。
【００８３】
一部の作動状況下では、図６Ａ及び６Ｂ内に示された実施形態のデータレポジトリ６９５及び／又はコンピュータシステム（単複）６９７は、クラウド計算環境内で構成されていてよい。クラウド計算環境では、データレポジトリを備えた記憶デバイス及び／又はコンピュータシステムを備えた計算装置が、ユーティリティとしてかつオンデマンドで使用するために割当てられインスタンス化されてよい。こうして、クラウド計算環境は、インフラ（例えば物理的及びバーチャルマシン、ロー／ブロックストレージ、ファイヤウォール、ロード・バランサー、アグリゲータ、ネットワーク、ストレージクラスタなど）、プラットフォーム（例えば計算装置及び／又はオペレーティングシステムを含んでいてよいソリューションスタック、プログラミング言語実行環境、データベースサーバー、ウェブサーバー、アプリケーションサーバーなど）及び任意のストレージ関連及び／又は計算タスクを実施するのに必要なソフトウェア（例えばアプリケーション、アプリケーションプログラミングインターフェース、又はＡＰＩなど）をサービスとして提供する。
【００８４】
さまざまな実施形態において、本明細書中に記載の技術は、さまざまな構成及びフォームファクタで上述のサブシステム及び構成要素（例えばシークエンシング機械、コンピュータシステム及びデータレポジトリ）の一部又は全てを含むさまざまなシステム及び装置によって実施可能であることが指摘される。したがって、図６Ａ及び６Ｂに示された好ましい実施形態及び構成は、制限的意味合いではなくむしろ例示的意味合いで考慮されるべきものである。
【００８５】
シークエンシング機械は、生体試料のフラグメントから誘導された標的核酸を含む１つ以上の基板を受取り、標的核酸上でシークエンシングを行なうように構成され作動する。シークエンシングを実施できる任意の好適な機械を使用してよく、ここでこのような機械は、非限定的にハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、合成によるシークエンシング、単分子シークエンシングそして本明細書中に記載の撮像システムを使用することによりＤＮＡからのシークエンシング読み出しを生成するのに好適な現在公知であるか又は今後開発される他の任意の技術を含めたさまざまなシークエンシング技術を使用してよい。さまざまな実施形態において、シークエンシング機械は、標的核酸をシークエンシングでき、ギャップを含んでいてもいなくてもよくかつメイトペア（例えばペアードエンド）読み出しであってもなくてもよいシークエンシング読み出しを生成することができる。図６Ａ及び６Ｂに示されているように、シークエンシング機械６９０は、基板（単複）６９２上にある標的核酸をシークエンシングし、シークエンシング読み出し６９４を得、このシークエンシング読み出しはデータレポジトリ６９５への（一時的及び／又は持続的）記憶及び／又は１つ以上のコンピュータシステム６９７による処理のために伝送される。本明細書中に記載の技術によると、シークエンシング機械６９０は、例えば図１内に示された撮像システムなどの撮像システム６９１を含む。
【００８６】
図６Ａ及び６Ｂを参照すると、データレポジトリ６９５は、ディスクアレイ（例えばＳＣＳＩアレイ）、ストレージクラスタ又は他の任意の好適なストレージ組織として構成されてよい１つ以上の記憶装置（例えばハードディスクドライブ、光ディスク、半導体ドライブなど）の上に実装されてよい。データレポジトリの記憶装置（単複）は、システム６００の内部／内蔵構成要素としてか又は、（例えば図６Ｂに示されているような）システム６００に取付け可能な外部構成要素（例えば外部ハードディスク又はディスクアレイ）として構成され得、かつ／又は、例えばグリッド、ストレージクラスタ、ストレージエリアネットワーク（ＳＡＮ）及び／又はネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（例えば図６Ａに示されている通り）などの好適な形で通信相互接続されてよい。さまざまな実施形態及び実装において、データレポジトリは、ファイルとして情報を記憶する１つ以上のファイルシステムとして、データ記録の形で情報を記憶する１つ以上のデータベースとして、及び／又は他の任意のデータ記憶組織として、記憶装置上に実装されてよい。
【００８７】
コンピュータシステム６９７は、汎用プロセッサー（例えば中央処理装置又はＣＰＵ）、メモリー及び、構成データ及び／又はオペレーティングシステム（ＯＳ）ソフトウェアと共に本明細書中に記載の技術及び方法の一部又は全てを実行することのできるコンピュータ論理６９９を備えた１つ以上の計算装置を含んでいてよい。例えば、本明細書中に記載の撮像に関与する方法（例えば画像位置補正、サーボ回転制御、走査ミラーの回転及び制御、チップ位置決めステージの移動及び同期、フィードバック制御、画像データ読み出しなど）のいずれも、方法のさまざまなステップを実施するための論理６９９を実行するように構成され得るプロセッサを含む計算装置によって、全面的又は部分的に実施可能である。さらに、方法ステップは、付番されたステップとして提示されているかもしれないが、本明細書中に記載の方法ステップは、同時に（例えば同じ計算装置上又は計算装置のクラスタ内で並列で実行する論理によって）又は異なる順序で実施可能である。コンピュータ論理６９９の機能性は、単一の統合モジュールとして（例えば統合論理の形で）実装されてよく、又はいくつかの追加の機能性を提供し得る２つ以上のソフトウェアモジュールの形に組合わされてもよい。
【００８８】
一部の実施形態において、コンピュータシステム６９７は、単一の計算装置であってよい。他の実施形態において、コンピュータシステム６９７は、グリッド、クラスタ又はクラウド計算環境内で通信的及び／又は作動的に相互接続されてよい多数の計算装置を備えていてよい。このような多数の計算装置は、コンピューティングノード、ブレード、又は他の任意の好適なハードウェア構成などの異なるフォームファクターで構成されていてよい。これらの理由から、図６Ａ及び６Ｂのコンピュータシステム６９７は、制限的な意味合いよりもむしろ例示的な意味合いで考慮されるべきものである。
【００８９】
図１０は、シークエンシング機械（単複）及び／又はコンピュータシステム（単複）の一部として撮像に関与するさまざまな方法を実施するための命令を実行するように構成され得る例示的計算装置７００のブロック図である。
【００９０】
図７において、計算装置７００は、バス７７５などの１つ以上のシステムバスを介して直接または間接的に相互接続される複数の構成要素を備えている。このような構成要素としては、キーボード７７８、永続的記憶域デバイス（単複）７７９（例えば固定ディスク、半導体ディスク、光ディスク及び同種のもの）及び１つ以上のディスプレー装置（例えばＬＣＤモニター、フラットパネルモニター、プラズマスクリーン及び同種のもの）を結合することのできるディスプレーアダプタ７８２が含まれていてよいが、これらに限定されるわけではない。Ｉ／Ｏコントローラ７７１に結合する周辺機器及び入出力（Ｉ／Ｏ）デバイスを、１つ以上のシリアルポート、１つ以上のパラレルポートそして１つ以上の汎用シリアルバス（ＵＳＢ）を含む（ただしこれらに限定されない）当該技術分野において公知の任意の数の手段により、計算装置７００に対して接続することができる。（ネットワークインタフェースカード及び／又はシリアルポートを含んでいてよい）外部インタフェース（単複）７８１を使用して、計算装置７００をネットワーク（例えばインターネット又はローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ））及び／又は他の機械及び装置に接続することができる。外部インタフェース（単複）７８１は、同様に、さまざまな外部装置から情報を受信できる一定数の入力インタフェースを含んでいてもよい。システムバス７７５を介した相互接続は、１つ以上のプロセッサ（例えばＣＰＵ）７７３が各々の接続された構成要素と通信しかつシステムメモリー７７２及び／又は記憶装置（単複）７７９からの命令を実行する（及びその実行を制御する）ことを可能にし、かつさまざまな構成要素間の情報交換を可能にする。システムメモリー７７２及び／又は記憶装置（単複）７７９は、プロセッサ（単複）７７３によって実行される命令シーケンスならびに他のデータを記憶する１つ以上のコンピュータ可読非一時的記憶媒体として実施されてよい。このようなコンピュータ可読非一時的記憶媒体としては、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、電磁媒体（例えばハードディスクドライブ、半導体ドライブ、サムドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクなど）、光媒体、例えばコンパクトディスク（ＣＤ）またはデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、フラッシュメモリー及び同種のものが含まれるが、これらに限定されない。さまざまなデータ値及び他の構造化情報又は非構造化情報を、１つの構成要素又はサブシステムから別の構成要素又はサブシステムに出力することができ、ディスプレーアダプタ７８２及び好適なディスプレーデバイスを介してユーザーに提示することができ、ネットワーク上で遠隔の装置又は遠隔のデータレポジトリまで外部インタフェース（単複）７８１を通して送ることができ、あるいは、記憶装置（単複）７７９上に（一時的及び／又は永久的に）記憶することができる。
【００９１】
計算装置７００により実施される方法及び機能性のいずれも、モジュール式又は統合された形でハードウェア及び／又はコンピュータソフトウェアを用いる論理の形で実装可能であるという点を理解すべきである。実行された場合、このような論理は、本明細書中に記載の通りの撮像に関与するさまざまな方法（例えば画像位置補正、サーボ回転制御、走査ミラーの回転及び制御、チップ位置決めステージの移動及び同期、フィードバック制御、画像データ読み出しなど）を実施するように適応されている。
【００９２】
配列決定
本明細書中に記載の撮像システムは、さまざまな生化学分析のために使用されてよい。このような分析の一例としては、未知の配列の標的核酸の配列決定がある。さまざまな実施形態において、本明細書中に記載の撮像システムを使用して核酸高分子の配列を決定するために、以下のものを含めた（ただしこれらに限定されない）さまざまなシークエンシング方法が使用されてよい：ハイブリダイゼーション法（例えば、米国特許第６，８６４，０５２号明細書、同６，３０９，８２４号明細書、及び同６，４０１，２６７号明細書に開示されているもの）、合成によるシークエンシング法（例えば米国特許第６，２１０，８９１号明細書、同６，８２８，１００号明細書、同６，８３３，２４６号明細書、同６，９１１，３４５号明細書、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：３７６〜３８０、及びＲｏｎａｇｈｉら（１９９６）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４〜８９）で開示されているもの）、ライゲーションに基づくもの（例えば米国特許第６，３０６，５９７号明細書及びＳｈｅｎｄｕｒｅら（２００５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１７２８〜１７３９）に開示されているもの）。これらの文献は、その教示について参照が指示されるものである。
【００９３】
一部の実施形態において、基板（例えばアレイチップ）上に配置された標的核酸から発出される蛍光信号が、本明細書中に記載の技術にしたがってカメラのセンサーアレイ上にそれらを撮像することによって記録される。例えば、一部の撮像システムにおいて、センサーアレイ内の各画素は、別個の蛍光実験の結果を記録し、一方他の撮像システムにおいては、１回の実験につき２つ以上の画素が使用される。
【００９４】
概して、生化学基板は、数百万回もの生化学実験を並行して実施できるようにする。この能力は、各実験を極小体積で実施し、これらの実験を密集させる技術の開発の結果としてもたらされている。例えば、一部の実施形態において、１つのアレイチップ上に規則的なパターンまたはランダムパターンで多数の付着部位を構成してよく、ここで付着部位の数は、好ましくは５０億〜５００億の範囲内にあり、より好ましくは１００億〜１５０億の範囲内にあり、より一般的には、それらの間の任意の部分範囲内にある。規則的パターンを使用する実施形態において、任意の２つの隣接する付着部位の中心間のピッチは２５０ｎｍ〜１．５μｍの範囲内にあってよい。作動中、高分子又は他の標的核酸が付着部位上に配置された時点で、さまざまな実施形態において、好ましくは付着部位の６０％〜９５％の単一分子占有率が提供される。さらに、さまざまな実施形態における収量（例えば、任意の所与の撮像ランにおいて信号を発出する高分子又は標的核酸の平均数）は、好ましくは、高分子又は標的核酸を保持する全ての付着部位の３５％〜６５％の範囲内にあってよい。
【００９５】
一部の実施形態において、ＤＮＡシークエンシングには、ＤＮＡ試料の化学的処理、生の配列フラグメントを得るための処理済み試料の物理的分析、及び計算アルゴリズムを用いた配列フラグメントの完全ゲノムへの集合が含まれる。ＤＮＡシークエンシングのための一部の方法において、計算作業が始まる前に生の配列データを増大させるため、多数の化学的処理及び物理的分析サイクルを使用してよい。
【００９６】
このような実施形態において、蛍光撮像を使用して、異なる色の染料（例えば、赤、緑、青又は黄色）が各々１つの反応に対応するように生化学反応を設計することによってＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ）を同定する。次に各色についてのこのようなＤＮＡ実験の画像を、対物レンズ構成要素（例えば顕微鏡対物レンズ）を通して撮像してよい。観察される色は、特定の化学的処理ステップにおけるＤＮＡ塩基を示す。こうして、このような画像からのデータの抽出は、基板（例えばチップ）上で行なわれる数百万回さらには数十億回の生化学実験が発生させる蛍光の色の記録に依存している。
【００９７】
一部の実施形態においては、本明細書中に記載の撮像システムを、例えばヒト個体のゲノムなどの全ヒトゲノムのＤＮＡシークエンシングのために使用してよい。ヒトゲノムシークエンシングの商業的実行可能性は、一部には、ＤＮＡを迅速かつ精確にシークエンシングする能力によって左右される。本明細書中に記載の撮像システムは、多数の並列ＤＮＡ実験（例えばアレイチップ上に高密度で配置されているもの）の処理をサポートし、迅速かつ精確なゲノムデータ獲得を容易にすることができるため、これらの基準を満たしている。
【００９８】
本発明は、本発明の好ましい実施形態に関連して詳述される通り多くの異なる形の実施形態によって満たされるが、本開示は、本発明の原理の一例としてみなされるべきものであり、本発明を本明細書中で図示され記載されている具体的実施形態に限定するように意図されたものではないということが理解される。当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、多くの変更を加えることができる。本発明の範囲は、本出願に由来するクレーム及びその等価物により測られるものである。要約及び名称は、該当する当局ならびに一般公衆が本発明の全体的内容を迅速に見極めることができるようにすることを目的としたものであるため、本発明の範囲を限定するものとみなされてはならない。以下のクレームでは、「手段」という用語が使用されているのでないかぎり、その中で列挙された特徴又は要素のいずれも、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ、第１１２条第６項に準じたミーンズ・プラス・ファンクション制約条件としてみなされるべきではない。
【００９９】
例示的シークエンシングプラットフォーム
ヒトゲノムのＤＮＡシークエンシングの一例は、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．により商業的に開発された高精度コンビナトリアルプローブ−アンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）である。ｃＰＡＬシークエンシング技術は、アレイチップ上でパターン化されたアレイ内に装填された自己集合ＤＮＡナノボール（「ＤＮＢ」）から各塩基を独立して検定することに依存するものである。ｃＰＡＬシークエンシングにおける第１のステップは、ＤＮＢのランダムな取り合せを生化学的アレイチップに装填することである。ＤＮＢは、標的核酸（単複）を表わすＤＮＡフラグメント及びアダプタの同じ配列の、シリーズの形で連鎖された多数のコピーを含むコンカテマーである。このようなコンカテマーの生成は、例えば、その全内容が参照により本明細書に援用され本明細書中に完全に記載されているＲａｄｏｊｅ  Ｄｒｍａｎａｃらにより２００６年６月１３日に出願された米国特許出願第１１／４５１，６９１号明細書中に記載されている。ＤＮＢセットは、ヒトゲノム全体に集合的に跨ることができるＤＮＡフラグメントを含むが、ＤＮＢが最初にアレイチップ上の付着部位に付着された時には、任意の特定のＤＮＢがどこに行くかを制御することはできない。一方、ＤＮＢは、ひとたび付着部位に付着されたならば、後続する液体処理ステップ全体にわたりそこにとどまり、１つの部位から別の部位へと移動することはない。後続する処理ステップでは、さまざまな試薬及び緩衝液がアレイチップ上のＤＮＢ上で洗われ、ＤＮＢからの蛍光信号が蛍光撮像システムで記録される。
【０１００】
より具体的には、ｃＰＡＬシークエンシング技術は、以下のステップの循環を含む。第１に、アンカーが、ＤＮＢ内の第１のアダプタ（典型的には１つのアダプタの５’又は３’末端において直ちに）に対してハイブリッド形成させられる。その後、例えば蛍光染料で標識された例えば８−ｍｅｒのプローブの完全に変性したプローブ集団に対するアンカーとの酵素的ライゲーション反応が行なわれる。プローブは、例えば約６〜２０塩基又は好ましくは約７〜１２塩基の長さを有していてよい。任意の所与のサイクルにおいて、使用されている８−ｍｅｒプローブの集団は、その位置のうち１つ以上のものの同一性がその８−ｍｅｒプローブに付着したフルオロフォアの同一性と相関されるような形で組織される。例えば、７−ｍｅｒシークエンシングプローブが利用される場合、アダプタに直近の塩基を同定するための１組のフルオロフォア標識されたプローブは、以下の構造を有していてよい：３’−Ｆ１−ＮＮＮＮＮＮＡｐ、３’−Ｆ２−ＮＮＮＮＮＮＧｐ、３’−Ｆ３−ＮＮＮＮＮＮＣｐおよび３’−Ｆ４−ＮＮＮＮＮＮＴｐ（式中、「ｐ」はライゲーションのために利用可能なリン酸塩である）。さらに別の実施例において、アダプタに由来する標的核酸内への３つの塩基である塩基を同定するための１組のフルオロフォア標識された７−ｍｅｒプローブは、以下の構造を有していてよい：３’−Ｆ１−ＮＮＮＮＡＮＮｐ、３’−Ｆ２−ＮＮＮＮＧＮＮｐ、３’−Ｆ３−ＮＮＮＮＣＮＮｐおよび３’−Ｆ４−ＮＮＮＮＴＮＮｐ。（これらはカタログ化すべきゲノム配列ではなく、単に例示を目的とした構造例にすぎないということを理解すべきである）。リガーゼが問合せされた位置での相補性の有無を判別するかぎりにおいて、蛍光信号はその塩基の同一性を提供する。
【０１０１】
ライゲーション及び４色撮像を実施した後、アンカー８−ｍｅｒプローブ錯体は取り除かれ、新しいサイクルが開始される。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ライゲーション接合部から６個以上の塩基に至るまで精確な配列情報を得ることができ、アダプタ１個あたり少なくとも１２の塩基対（ｂｐ）（５’末端と３’末端の両方から６個の塩基）、合計で４アダプタＤＮＢ１個あたり４８ｂｐ、５−アダプタＤＮＢ１個あたり６０ｂｐなどにアクセスできることになる。
【０１０２】
所与のサイクルがどの位置を調べようとしているかに応じて、８−ｍｅｒプローブは異なる形で構造化される。具体的には、各々の８−ｍｅｒプローブ内部の単一の位置が、それを標識しているフルオロフォアの同一性と相関される。さらに、フルオロフォア分子は、ライゲーション接合部に標的化された末端との関係において８−ｍｅｒプローブの反対側の末端に付着されている。例えば、アンカーは、その３’末端が標的核酸に隣接するような形でハイブリッド形成されてよい。標的核酸内に１つの位置を問合せするため、縮重した８−ｍｅｒプローブの集団を使用してよく、ここでプローブは、アンカーにライゲートする８−ｍｅｒプローブの末端である８−ｍｅｒプローブの５’末端から５番目の核酸と相関している。８−ｍｅｒプローブは４個のフルオロフォアの１つで個別に標識され、ここでＣｙ５のフルオロフォアはＡと相関され、Ｃｙ３はＧと相関され、テキサスレッドはＣと相関され、ＦＩＴＣはＴと相関される。（この例は、１サイクルあたり１つの単一塩基を問合せするために４つのフルオロフォアを使用することについて記述しているものの、１サイクルあたり８個又は１６個以上のフルオロフォアを使用して、任意の一回のサイクル中に同定可能な塩基数を増大させてもよいということを認識すべきである）。
【０１０３】
所望されるシークエンシングの量、利用される標識のタイプ、各々のライブラリ構成体の中で使用される異なるアダプタの数、１サイクルあたりに問合せされている塩基数、アレイの表面に対するＤＮＢの付着方法、所望されるシークエンシングオペレーション速度、信号検出アプローチ及び同種のものなどのさまざまな要因に基づいて、ｃＰＡＬ又は他のライゲーションによるシークエンシングアプローチの多くの異なる変形形態を選択してよい。
【０１０４】
縮重（例えば８−ｍｅｒ）プローブを、放射性部分、蛍光部分、比色部分、化学発光部分及び同種のものの直接的又は間接的付着を含めたさまざまな方法で標識することができる。ＤＮＡを標識し、ＤＮＡアダプタを構築するための方法の多くの包括的再精査が、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの構築に適用可能な助言を提供している。このような再精査には、Ｋｒｉｃｋａ（２００２），Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１４〜１２９、及びＨａｕｇｌａｎｄ（２００６）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ）、Ｋｅｌｌｅｒ及びＭａｎａｋ（１９９３）、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）、及びＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９９１）、Ｅｄ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）及び同種のものが含まれる。
【０１０５】
１つの態様においては、オリゴヌクレオチドプローブのための標識として１つ以上の蛍光染料が使用される。米国特許第６，３２２，９０１号明細書、同第６，５７６，２９１号明細書、同第６，４２３，５５１号明細書、同第６，２５１，３０３号明細書、同第６，３１９，４２６号明細書、同第６，４２６，５１３号明細書、同第６，４４４，１４３号明細書、同第５，９９０，４７９号明細書、同第６，２０７，３９２号明細書、米国特許出願公開第２００２／００４５０４５号明細書、同第２００３／００１７２６４号明細書及び同種のものなどの、参照により本明細書に援用されている米国特許及び米国特許出願公開中で開示されている通り、量子ドットで標識を行なうこともできる。縮重プローブ内に容易に取込まれる市販の蛍光ヌクレオチド類似体としては、例えばカスケードブルー、カスケードイエロー、ダンシル、リサミンローダミンＢ、マリーナブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙフルオロフォア、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）フルオロフォア、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）フルオロフォア及び同種のものが含まれる。ＦＲＥＴタンデムフルオロフォアも使用してよい。オリゴヌクレオチドを検出するための他の好適な標識としては、フルオロセイン（ＦＡＭ）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ホスホル−アミノ酸（例えば、Ｐ−ｔｙｒ、Ｐ−ｓｅｒ、Ｐ−ｔｈｒ）又は任意の他の好適な標識が含まれていてよい。
【０１０６】
本明細書中に記載の撮像システムを含むシークエンシングシステムにより、このようなシークエンシングサイクルの画像獲得を実施することができる。プログラミング言語（例えばＣ／Ｃ++）で書かれたソースコードからコンパイルされる一連のバイナリを実行する計算装置（単複）によりデータ抽出を実施してよく、塩基呼び出し及び読み出しマッピングを一連のＭａｔｌａｂ及び／又はＰｅｒｌスクリプトにより実施してよい。例えば、以上に記載の例示的シークエンシング技術に従って、問合せすべき標的核酸内の各塩基について（例えば各ＤＮＢの各々の標的核酸部分の５’末端及び３’末端の両方から６個の塩基を読み込む１２個の塩基について）、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反応、撮像及びプライマストリッピング反応が実施される。所与の位置での流通装置上のアレイ内の各ＤＮＢの同一性を判定するため、生物学的シークエンシング反応を実施した後、各視野（「フレーム」）が、使用された４つの蛍光剤、例えば８−ｍｅｒに対応する４つの異なる波長で撮像される。各サイクル由来の画像は全て、サイクルディレクトリ内にセーブされ、ここで画像数は４×フレーム数（例えば４フルオロフォア技術が使用される場合）である。このとき、サイクル画像データを、下流側処理のために組織されたディレクトリ構造内にセーブしてもよい。
【０１０７】
データ抽出には典型的に、２つのタイプの画像データ、すなわちアレイ内の全てのＤＮＢの位置を画定するための明視野像及び各シークエンシングサイクル中に獲得される蛍光画像セットが求められる。計算装置がデータ抽出ソフトウェアを実行して、明視野像を伴う全ての物体を同定し、次に各物体について、各シークエンシングサイクルについての平均蛍光値を計算する。任意の所与のサイクルについて、その塩基がＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれであるかを問合せするため異なる波長で撮られた４つの画像に対応する４つのデータ点が存在する。これらの生塩基呼び出しは統合され、（場合によっては不連続な）シークエンシング読み出しを各ＤＮＢについて生成する。これらのシークエンシング読み出しは次に、１つ以上の計算装置を含む１つ以上のコンピュータシステム上で実施可能なさまざまな技術及びアルゴリズムを使用することによって、基準ゲノムに対してマッチングされてよい。
【０１０８】
選択された生化学的定義
本明細書中に記載されているさまざまな実施形態は、当業者の技能の範囲内に入る有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学及び生化学が関与する従来の技術によって調製される試薬、緩衝液及び他の流体を使用してよい。このような従来の技術には非限定的に、ポリヌクレオチドのポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション及びライゲーション、ならびに標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれていてよい。好適な技術の具体的例示は、本明細書中の実施例を参照することによって得られる。しかしながら、当然のことながら、他の同等の手順を使用することも可能である。このような手順は、例えば、その全てがあらゆるの目的のために全て参照により本明細書に援用されている、Ｇｒｅｅｎら、Ｅｄｓ．（１９９９）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ〜ＩＶ）、Ｗｅｉｎｅｒ、Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、Ｅｄｓ．（２００７）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、Ｅｄｓ．（２００３）、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｏｗｔｅｌｌ及びＳａｍｂｒｏｏｋ（２００３）、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ、Ｍｏｕｎｔ（２００４）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００６、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（以上全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ及びＣｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、及びＢｅｒｇら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、などの標準的な実習マニュアル中に見い出すことができる。
【０１０９】
「アダプター」とは、「アダプター要素」を含む工学処理された構成体を意味し、ここでライブラリ構成体内の標的核酸の内部に１つ以上のアダプターが散在していてよい。任意のアダプター内に含まれるアダプター要素又は特徴は、アダプターの使用に応じて大きく変動し得るが、典型的には、制限エンドヌクレアーゼ認識及び／又は切断のための部位、プライマー結合（例えばライブラリ構成体の増幅）又はアンカープライマーの結合（例えばライブラリ構成体内の標的核酸のシークエンシング）のための部位、ニッカーゼ部位、及び同種のものを含む。一部の態様において、アダプターは、１）約２０〜約２５０ヌクレオチド、又は約４０〜約１００オリゴヌクレオチド、又は約６０ヌクレオチド未満、又は約５０ヌクレオチド未満の長さ、２）２つの「アーム」として標的核酸にライゲートされるための特徴、３）隣接する標的核酸（単複）のシークエンシングに使用するためのアダプターの５’及び３’末端における異なる及び全く異なるアンカー結合部位、及び４）１つ以上の制限部位、のうちの１つ以上を含むように工学処理されている。
【０１１０】
「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物を意味する。例えば、アンプリコンは、１つ以上の出発配列から複製されたポリヌクレオチドの集団であってよい。アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅、サークル依存性増幅及び同種の反応（例えば米国特許第４，６８３，１９５号明細書、４，９６５，１８８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８００，１５９号明細書、同第５，２１０，０１５号明細書、同第６，１７４，６７０号明細書、同第５，３９９，４９１号明細書、同第６，２８７，８２４号明細書及び同第５，８５４，０３３号及び米国特許出願公開第２００６／００２４７１１号明細書参照）を含めた（ただしこれらに限定されない）さまざまな増幅反応によって生産されてよい。
【０１１１】
「サークル依存性増幅」又は「ＣＤＡ」とは、円形鋳型の両方のストランドにアニールして鋳型の両方のストランドを表わす産物を生成し、結果として多重ハイブリダイゼーション、プライマー拡張及びストランド変位事象のカスケードをもたらすプライマーを用いた２本鎖円形鋳型の多重変位増幅を意味する。こうして、プライマー結合部位数の指数関数的増加が導かれ、その帰結として、生成される産物の量は経時的に指数関数的に増大する。使用されるプライマーは、ランダム配列のものであってよく（例えばランダムヘキサマー）、又は所望される産物の増幅のために選択するよう特異的配列を有していてよい。ＣＤＡは、一組のコンカテマー２本鎖フラグメントを結果としてもたらす。
【０１１２】
「サークル依存性複製」又は「ＣＦＲ」とは、円形鋳型の同じストランドにアニールして鋳型の１つのストランドのみを表わす産物を生成するプライマーを用いた２本鎖円形鋳型の多重変位増幅を意味する。ＣＤＲでは、追加のプライマー結合部位は全く生成されず、産物の量は、時間と共に線形的に増大するだけである。使用されるプライマー（単複）はランダム配列のものであってよく（例えば１つ以上のランダムヘキサマー）、又は所望される産物の増幅のために選択するよう特異的配列を有していてよい。最終産物のさらなる修飾無く、ＣＤＲは多くの場合、タンデムで円形鋳型のストランドの多数のコピーを有する線形構成体、例えば鋳型のストランドの多数のコピーの線形コンカテマーを作り出す結果となる。
【０１１３】
「相補的」または「実質的に相補的」とは、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば２本鎖ＤＮＡ分子の２本のストランド間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の２重鎖の形成又はハイブリダイゼーション又は塩基対合を意味する。相補的ヌクレオチドは、概して、Ａ及びＴ（又はＡ及びＵ）又はＣ及びＧである。２つの１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、最適に整列され比較されかつ適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴う１つのストランドのヌクレオチドが、もう１つのストランドの少なくとも約８０％、通常は約９０％〜約９５％、さらには約９８％〜約１００％と対合する場合に、実質的に相補的であると言われる。
【０１１４】
「２重鎖」とは、完全に又は部分的に相補的であり、そのヌクレオチドの全て又は大部分の間でワトソン・クリックタイプの塩基対合を受け、こうして安定した鎖体が形成されることになる。少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。「アニーリング」及び「ハイブリダイゼーション」という用語は、安定した２重鎖の形成を意味するように互換的に用いられる。２重鎖に関して「完全にマッチした」というのは、２重鎖を構成しているポリ又はオリゴヌクレオチドストランドが、互いに２本鎖構造を形成し、こうして各ストランド内の全てのヌクレオチドがもう一方のストランド内のヌクレオチドとのワトソン・クリック塩基対合を受けるようになっていることを意味している。２つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド間の２重鎖内の「ミスマッチ」は、２重鎖内のヌクレオチドの対がワトソン・クリック塩基対合を受けることができないことを意味している。
【０１１５】
「フルオロフォア」は、特異的吸収スペクトル内でエネルギーを吸収し異なる（ただし同等に特異的な）発出スペクトルでエネルギーを再発出する官能基を含む又はこの官能基で構成された分子を意味する。マーカーとして使用するための好ましいフルオロフォアとしては、フロオロセイン、カスケードブルー、ヘキサクロロ−フロオロセイン、テトラクロロ−フロオロセイン、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−メトキシフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４−アジアザ−ａ−Ｓ−インダセン−プロピオン酸、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、テキサスレッド、エオシン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−エトキシフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン３−プロピオン酸及び４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン−プトピオン酸、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州ＷａｌｔｈａｍのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ系列及びＯｒｅｇｏｎ州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１６】
「ハイブリダイゼーション」とは、２つの１本鎖ポリヌクレオチドが非共有的に結合して、安定した２本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを意味する。結果として得られる（そして通常は）２本鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」又は「２重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」には典型的には、約１Ｍ未満、より典型的には約５００ｍＭ未満の塩濃度が含まれ、約２００ｍＭ未満であってもよい。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は５％ＳＳＰＥなどの緩衝塩溶液又は当該技術分野において公知の他のこのような緩衝液である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃という低いものであり得るが、典型的には２２℃超、そしてより典型的には約３０℃超、そして典型的には３７℃超である。ハイブリダイゼーションは通常ストリンジェント条件下、例えばプローブがその標的サブ配列に対してハイブリッド形成するものの他の非相補性配列に対してはハイブリッド形成しない条件の下で実施される。ストリンジェント条件は配列に依存し、異なる状況の中で異なっている。例えば、フラグメントが長いと、短かいフラグメントに比べて特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度が必要となる場合がある。相補的ストランドの塩基組成及び長さ、有機溶媒の存在、及び塩基ミスマッチ度を含めた他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす場合があることから、複数のパラメータの組合せは、任意の１つのパラメータ単独の絶対尺度よりも重要である。概して、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特異的配列についてのＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。ストリンジェント条件の例としては、約７．０〜約８．３のｐＨ及び少なくとも２５℃の温度で少なくとも０．０１Ｍから１Ｍ以下のナトリウムイオン濃度（又は他の塩）という塩濃度が含まれる。例えば、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションには、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．４で７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ）及び３０℃の温度という条件が好適である。
【０１１７】
「ライゲーション」とは、鋳型駆動型反応において例えばオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドなどの２つ以上の核酸の末端間で共有結合又は連鎖を形成するプロセスを意味する。結合又は連鎖の性質は、大きく変動する場合があり、ライゲーションは酵素的に又は化学的に実施されてよい。本明細書中で使用されるライゲーションは、通常、酵素的に実施されて、１つのオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素の間のホスホジエステル連鎖を形成する。鋳型駆動型ライゲーション反応については、米国特許第４，８８３，７５０号明細書、同第５，４７６，９３０号明細書、同第５，５９３，８２６号明細書、及び同第５，８７１，９２１号明細書といった参考文献中に記載されている。
【０１１８】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」又は本明細書中で使用される文法的等価物は、概して共に共有結合的に連鎖されている少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、核酸塩基（又は単に「塩基」）、５炭糖（例えばリボース又は２’−デオキシリボース）、そしてヌクレオチドの主鎖を形成する１〜３個のリン酸基で構成されている。同時に、塩基（例えばＲＮＡ内に見い出される塩基ＵとＣ、Ｇ、Ａ、Ｔの４つの主要ヌクレオチド塩基のうちの１つ）と糖はヌクレオシドを構成する。ポリヌクレオチドは概してホスホジエステル結合を含むが、一部の場合において、代替的な主鎖、例えばホスホラミダイト、ホスホロジチオエート又はメチルホスホラミダイト連鎖、及びペプチド核酸主鎖及び連鎖を有する核酸類似体を含み入れてもよい。他の類似体核酸としては、ロックド核酸、正の主鎖及び非リボース主鎖を含む二環構造を伴うものが含まれる。
【０１１９】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型との２重鎖を形成した時点で、核酸合成の開始点として作用でき、拡張された２重鎖が形成されるように鋳型に沿ってその末端の１つから拡張され得る、天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。拡張プロセス中に加えられるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定される。プライマーは通常、ＤＮＡポリメラーゼにより拡張される。
【０１２０】
「Ｔm」とは、２本鎖核酸分子の集団の半分が１本鎖へと解離された状態になる温度として一般に定義される用語である。核酸のＴmを計算するための等式は、当該技術分野において周知である。標準的参考文献により示されている通り、Ｔm値の単純な推定値は、核酸が０．５Ｍ以下のカチオン濃度を有する水溶液中にあり、（Ｇ＋Ｃ）含有量が３０％〜７０％であり、「ｎ」が塩基数であり、「ｍ」が塩基対ミスマッチの百分率である場合、等式：Ｔm＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）０．４１（％［Ｇ＋Ｃ］）−６７５／ｎ−１．０ｍにより計算されてよい（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照のこと）。他の参考文献には、Ｔmの計算のために構造的特性ならびに配列特性を考慮に入れたより高度の計算が含まれている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ（１９８５）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ａｌｌａｗｉ  ａｎｄ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１０５８１〜９４も参照のこと）。
【０１２１】
本発明は、具体的実施形態を参考にしながら説明されてきた。当業者には、本開示を参照した時点で他の実施形態が明らかになるものである。したがって、添付クレームにより示されている場合を除き、本発明を限定することは意図されていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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