(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分からの生物有機化合物の精製および／または濃縮のための試料調製容器であって、前記容器は反応チャンバとクロマトグラフィ媒体とを含み、
前記反応チャンバは、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を保持するためのものであり、超音波処理および／または沸騰による溶解；クロマトグラフィ精製；還元；アルキル化；およびタンパク質分解などの酵素反応、という反応のうちの少なくとも１つが内部で実行され得るように構成されており、
前記クロマトグラフィ媒体は、前記生物有機化合物を精製および／または濃縮するように構成されており、
（ａ）前記クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの壁に位置しており、前記壁は閉鎖または封止されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、もしくは
（ｂ）前記試料調製容器は、前記生物有機化合物を受けるための受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、
ここにおいて、前記受けチャンバは、精製および／または濃縮された生物有機化合物を受けるように構成され、かつ、前記試料調製容器の対応する連結要素に連結されるように構成されている連結要素を備える、試料調製容器。
【請求項２】
前記生物有機化合物は、タンパク質；ペプチド；ポリペプチド；核酸；脂肪酸を含む脂質；および代謝産物、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の試料調製容器。
【請求項３】
ふたをさらに含み、前記ふたは前記反応チャンバに隣接しており、針での貫通によって試料の供給を可能にするように構成されている、請求項１または２に記載の試料調製容器。
【請求項４】
前記クロマトグラフィ媒体の表面は、ろ過表面として作用するように構成され、および／または、さらなるろ過層および／または反応層を含み、前記表面または層は前記反応チャンバの内部に面している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項５】
前記試料調製容器は、前記生物有機化合物を受けるための受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、
シールをさらに含み、前記シールは前記受けチャンバに隣接しており、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために構成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項６】
前記容器は、ポリプロピレン；ポリエチレン；熱、マイクロ波、衝撃波、音波および／または電気を伝導するように構成された材料；低結合表面を有する材料；透明または不透明であるか、または電磁放射を選択的に伝導する材料、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項７】
試料調製容器の少なくとも１つの内壁は、ポリテトラフルオロエチレンを用いた少なくとも部分的なコーティングによって、少なくとも部分的に低い結合特性および／または低い保持特性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項８】
細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分から、精製および／または濃縮された生物有機化合物を調製する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を、容器の反応チャンバに導入するステップであって、前記容器はクロマトグラフィ媒体と受けチャンバとをさらに含み、前記クロマトグラフィ媒体は前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されているステップと、
（ｂ）前記反応チャンバの内部で、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を分裂させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果が前記クロマトグラフィ媒体を通過することを可能にし、それにより、前記受けチャンバにおいて前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るステップとを含み、
生物有機化合物は、タンパク質；ペプチド；ポリペプチド；核酸；脂肪酸を含む脂質；および代謝産物、のうちの少なくとも１つを含み、
前記方法は、前記容器内でのみ行なわれる、方法。
【請求項９】
前記分裂させるステップは、
（ａ）超音波処理、
（ｂ）カオトロピック剤および／または変性剤の存在下での沸騰、および／または
（ｃ）ミリングビーズなどの物理的作用物の存在下でのビーズミリング、によって遂行される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィ媒体は、
（ａ）逆相材料、陽イオン交換材料、陰イオン交換材料、混合モードイオン交換材料、イオン錯化材料、抗体結合および／またはレクチン結合された親和性結合基質、という材料のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）異なるクロマトグラフィ媒体の２つ以上のスタック、を含む、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項１１】
（ａ）前記生物有機化合物は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドを含み、前記容器は、
（ｉ）前記容器が洗剤を含むこと、
（ｉｉ）前記容器が還元剤を含むこと、
（ｉｉｉ）前記容器がアルキル化剤を含むこと、
（ｉｖ）前記容器内のｐＨ値が７〜９であること、
（ｖ）前記容器が質量分光分析用スタンダードを含むこと、
（ｖｉ）前記容器がカオトロピック剤を含むこと、
（ｖｉｉ）前記容器が、酸化防止剤および／またはＵＶ吸収剤などの分析物安定化化学物質を含むこと、
（ｖｉｉｉ）前記容器が、プロテアーゼ；グリコシダーゼ；およびキナーゼ、から選択される少なくとも１つの酵素を含むこと、
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてによって特徴づけられ、および／または
（ｂ）前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、
（ｉ）前記容器が、エンドヌクレアーゼを含む１つ以上のヌクレアーゼを含むこと、
（ｉｉ）前記容器が、ＰＣＲによる核酸増幅用試薬を含むこと、および
（ｉｉｉ）前記容器内のｐＨ値が７〜９であること、
のうちの１つ、２つ、またはすべてによって特徴づけられる、
請求項１〜７または１０のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項１２】
前記容器はさらに、
（ａ）ミリングビーズ、洗剤、カオトロピック剤、アルキル化剤、還元剤、有機溶剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜７または１０のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項１３】
（ａ）前記細胞物質は、無傷細胞、明らかにされていない細胞溶解物、組織、病原体のうちの１つであり、および／または
（ｂ）前記サブ成分はサブ細胞構造である、請求項１〜７または１０〜１２のいずれか１項に記載の試料調製容器。
【請求項１４】
前記クロマトグラフィ媒体は、
（ａ）逆相材料、陽イオン交換材料、陰イオン交換材料、混合モードイオン交換材料、イオン錯化材料、抗体結合および／またはレクチン結合された親和性結合基質、という材料のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）異なるクロマトグラフィ媒体の２つ以上のスタック、を含む、
請求項８または９に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）前記生物有機化合物は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドを含み、前記容器は、
（ｉ）前記容器が洗剤を含むこと、
（ｉｉ）前記容器が還元剤を含むこと、
（ｉｉｉ）前記容器がアルキル化剤を含むこと、
（ｉｖ）前記容器内のｐＨ値が７〜９であること、
（ｖ）前記容器が質量分光分析用スタンダードを含むこと、
（ｖｉ）前記容器がカオトロピック剤を含むこと、
（ｖｉｉ）前記容器が、酸化防止剤および／またはＵＶ吸収剤などの分析物安定化化学物質を含むこと、
（ｖｉｉｉ）前記容器が、プロテアーゼ；グリコシダーゼ；およびキナーゼ、から選択される少なくとも１つの酵素を含むこと、
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてによって特徴づけられ、および／または
（ｂ）前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、
（ｉ）前記容器が、エンドヌクレアーゼを含む１つ以上のヌクレアーゼを含むこと、
（ｉｉ）前記容器が、ＰＣＲによる核酸増幅用試薬を含むこと、および
（ｉｉｉ）前記容器内のｐＨ値が７〜９であること、
のうちの１つ、２つ、またはすべてによって特徴づけられる、
請求項８、９または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記容器はさらに、
（ａ）ミリングビーズ、洗剤、カオトロピック剤、アルキル化剤、還元剤、有機溶剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つを含む、請求項８、９または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）前記細胞物質は、無傷細胞、明らかにされていない細胞溶解物、組織、病原体のうちの１つであり、および／または
（ｂ）前記サブ成分はサブ細胞構造である、請求項８、９または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法のステップ（ｂ）は、還元およびアルキル化をさらに含む、前記生物有機化合物がタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである範囲の、請求項８、９または１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法のステップ（ｂ）は、タンパク質分解消化をさらに含む、請求項８、９または１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記受けチャンバにおいて前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得る前記ステップは、
（ｉ）ステップ（ｂ）の生成物が前記クロマトグラフィ媒体内に入って保持されることを可能にすること、および
（ｉｉ）前記生物有機化合物を溶離すること、によって遂行される、請求項８、９または１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）請求項１〜７または１０のいずれか１項に記載の試料調製容器と、
（ｂ）（ｉ）プロテアーゼ；アルキル化剤；還元剤；質量分光分析用スタンダード；カオトロピック剤；洗剤；および／または、前記容器内で７〜９というｐＨ値を確立するための手段、および／または
（ｉｉ）ヌクレアーゼ；および／または、ＰＣＲによる核酸増幅用試薬、とを含む、もしくはそれらからなる、キット。
【請求項２２】
（ａ）ビーズミリング材料、洗剤、カオトロピック剤、アルキル化剤、還元剤、有機溶剤、酸化防止剤、ＵＶ吸収剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、
（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、キナーゼ、グリコシダーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｃ）請求項８、９および１４〜２０のいずれか１項に記載の方法を行なうための使用説明を有するマニュアル、をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分からの生物有機化合物の精製および／または濃縮のための試料調製容器であって、前記容器は反応チャンバとクロマトグラフィ媒体とを含み、前記反応チャンバは、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を保持するためのものであり、たとえば超音波処理および／または沸騰による溶解；クロマトグラフィ精製；還元；アルキル化；およびタンパク質分解などの酵素反応、という反応のうちの少なくとも１つが内部で実行され得るように構成されており、前記クロマトグラフィ媒体は、前記生物有機化合物を精製および／または濃縮するように構成されており、（ａ）前記クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの壁に位置しており、前記壁は閉鎖または封止されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、もしくは、（ｂ）前記試料調製容器は、前記生物有機化合物を受けるための受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されている、試料調製容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
この明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用されている。これらの文献の開示は、この発明の特許性に関連すると考えられてはいないものの、その全体がここに引用により援用される。より特定的には、引用文献はすべて、各個々の文献が、引用により援用されるように具体的にかつ個々に示されたかのように、同じ程度まで引用により援用される。
【０００３】
細胞溶解を含む、或る生体物質を濃縮するために使用される試料調製方法は現在、生物学的研究の本質的にすべての分野で適用されている。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の抽出、精製および処理は、これらのおよび他の生体物質のin vitro分析のための初期工程である。現在の方法は、分析カラムなどの分析装置の閉塞を回避し、また時には所望の生体物質を濃縮するために、事前清浄工程と、異なる反応槽へのこれらの物質の移動とを伴う。結晶学および電子顕微鏡検査法などの生物学的研究の或る分野では、試料の純度は重要であると見なされている。これらの事前清浄工程および試料移動工程は、試料損失、試料調製時間の延長、たとえば分析すべきタンパク質の望ましくない改質、汚染の導入、有害物質または感染性物質を取扱う際の潜在的危険性、および材料コストの点で、いくつかの主な欠点を示す。しかし、それらは概して必須であると見なされている。
【０００４】
試料損失は、粗溶解物の事前清浄の工程で、不完全な抽出、および試料吸収が生じる槽表面への接触の延長に起因して生じる。試料損失を減少させる現在の解決策は、非常に厳しい抽出方法と、反応管上の低結合表面とを含む。
【０００５】
特に、研究者が居合わせなければならず、試料を取扱う必要がある実践では、試料移動の繰り返しは時間を要する。ＵＶ光または酸素露出の延長は、試料を損傷するかもしれず、また、望ましくない化学的改質につながり得る。これらの問題に対する解決策はそれぞれ、光保護槽の、およびシールドガスの使用である。しかしながら、これらの措置は試料の取扱いをさらにより難しく、時間のかかるものにする。さらに、槽間の試料移動中に汚染が導入されるかもしれず、汚染は現在、高価な無菌実験台で、層流の下で、または同様の予防策を用いて作業することによってしか回避できない。また、病原体などの有害な試料は、試料管と接触する人または機械を汚染するリスクを発生させる。最後に、試料調製におけるこれらの非効率性、および使い捨て材料の最低量を上回る使用のいずれも、処理コストを著しく増加させ得る。
【０００６】
クロマトグラフィ材料を含むピペットチップなどの装置は当該技術分野において公知であり、製造業者数社から入手可能であり、ピアス（Pierce）Ｃ−１８チップ（サーモフィッシャー：Thermo Fisher）、およびＣ１８−ＳＤカートリッジ（３Ｍ）を含む。これらの装置は、両端が開いている。そのような装置は、単一の反応槽における試料調製にとって好適ではない。この文脈における試料調製は、細胞物質からの質量分光分析用のペプチドおよびポリペプチドの調製、および／または、細胞物質からの発現プロファイリング用の核酸の調製を含む。
【０００７】
ラップシルバー（Rappsilber）ら（Anal Chem.；７５（３）：６６３−７０（２００３））は、両端が開いており、コンパクトなフォーマットでのクロマトグラフィの実行を可能にする、「ステージチップ」（StageTips）とも呼ばれる装置について記載している。
【０００８】
欧州特許出願ＥＰ１０３３１６９は、固相抽出用吸着剤カートリッジについて記載している。ＥＰ１０３３１６９に記載のカートリッジは、チップの遠位端に開口部を有するとして特徴づけられており、この開口部は参照符号（１８）で指定されており、その開口部はカートリッジが機能するために不可欠である。遠位端は、好ましくはビーズの形をした固相抽出材料が提供される場所である。キャップ（３２）が吸着剤カートリッジの近位端を閉鎖している一方、遠位端は、原料をビーズと接触させるために、開いているかまたは開放される必要がある。ＥＰ１０３３１６９の用語を使用した場合「遠位端」である、この発明の装置の底部は、閉鎖または封止された、もしくは、閉鎖した受けチャンバの形で提供された壁で作られている。にもかかわらず、原料の充填が、すなわち上端（「近位端」）で可能である。しかしながら、ＥＰ１０３３１６９に記載の試料充填は、遠位端が開いている場合のみ可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該技術分野において利用可能な手段および方法の限界に鑑みて、この発明の根底にある技術的課題は、試料調製のための装置および方法の提供において見つかり、前記試料調製は、移動工程なく単一の反応槽で遂行されることになっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、この発明は、第１の局面において、細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分からの生物有機化合物の精製および／または濃縮のための試料調製容器であって、前記容器は反応チャンバとクロマトグラフィ媒体とを含み、前記反応チャンバは、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を保持するためのものであり、たとえば超音波処理および／または沸騰による溶解；クロマトグラフィ精製；還元；アルキル化；およびタンパク質分解などの酵素反応、という反応のうちの少なくとも１つが内部で実行され得るように構成されており、前記クロマトグラフィ媒体は、前記生物有機化合物を精製および／または濃縮するように構成されており、（ａ）前記クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの壁に位置しており、前記壁は閉鎖または封止されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されており、もしくは、（ｂ）前記試料調製容器は、前記生物有機化合物を受けるための受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されている、試料調製容器に関する。
【００１１】
「試料」という用語は、次の分析の準備ができている組成物を指す。たとえば、前記生物有機化合物がペプチドまたはポリペプチドである場合、好ましい次の分析は、質量分光法によるものである。この発明に従った試料調製容器は、そのような試料を得るための手段である。一般的に言えば、前記試料は、ここに「分析物」とも呼ばれる、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を含み、もしくはそれらからなる。
【００１２】
一般に、試料調製容器は、円錐形、箱形、または円筒状であってもよい。容器の体積は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００μｌを含む１０μｌ〜１５０μｌの試料体積に、ならびに１５０μｌを上回るより大きい体積にも適したものであってもよい。しかしながら、試料調製容器の総体積は、それが適している体積より著しく大きくてもよい。たとえば円錐形の容器の場合、底面半径は１〜５ｍｍ、たとえば１．５、２または３ｍｍであってもよく、高さは１０〜１５０ｍｍ、たとえば２５ｍｍであってもよい。
【００１３】
内部で溶解が実行され得るように構成された反応チャンバは、超音波処理、ビーズミリングおよび／または沸騰を含むもののそれらに限定されない、先行技術によって確立された溶解方法を行なうために構成されている、ということが理解される。
【００１４】
オプション（ａ）の場合、調製容器は、閉鎖または封止された壁の近くに、外部の受けチャンバ内での連結のための連結器、たとえばねじ連結器をさらに含んでいてもよい。そのような外部の受けチャンバは、連結器の対応する片われ、たとえば、調製容器の雌ねじ山と整合する雄ねじ山を含む。外部の受けチャンバは、壁に緊密に取付けられると壁を開放するように構成された開放手段を、追加で含んでいてもよい。これらの手段は、受けチャンバが調製容器のねじ連結器に緊密にねじ留められると壁を貫通する、ねじ山の端にある鋭い縁の延長部であってもよい。したがって、壁は、ともに前記鋭い縁の延長部で貫通されるように構成された、薄壁の硬質プラスチック材料または軟質プラスチック材料製であってもよい。
【００１５】
オプション（ｂ）の場合、受けチャンバの外面、すなわち、クロマトグラフィ媒体および反応チャンバとは反対の受けチャンバの自由端は、それがはさみまたはメスによって切除され得るように、薄壁状であってもよい。たとえば、容器が円錐形である場合、外面は、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために切り離され得る円錐の先端であってもよい。
【００１６】
この発明に従った容器は、単一の反応槽における試料調製を提供する。この発明の発明者らは、事前清浄工程および試料移動工程が、質量分光法ベースのプロテオミクスによる次の分析のためのポリペプチドまたはペプチド濃縮などの精製、もしくはタンパク質分解の精製にとって、不利であるだけではなく、なくてもよい、ということを見出した。この発見は、膜および核酸結合タンパク質にとって特に有利である。その主な理由は、液体におけるそのようなタンパク質の完全な可溶化は、それらの生化学的挙動に起因して難しく、さらには、状況によっては不可能であり得る、ということである。特に、発明者らは、試料溶解、試料改質、酵素反応、精製、および濃縮がすべて、単一の反応槽で行なれ得る、ということを見出した。この単一槽の解決策は試料損失を著しく減少させ、それは、ほんのわずかの量の試料で作業する場合に最も顕著である。この発明は、非常に少量の試料または非常に少数の細胞の分析を可能にする。さらに、すべての反応を単一の容器で行なうことは、処理時間、特に実践時間を減少させる。
【００１７】
これらの改良は、従来技術の機械の単純な組合せで、処理工程の自動化を、以前に可能なものをはるかに上回る程度まで可能にする。
【００１８】
試料調製によって生じる、タンパク質および核酸などの分析物の望ましくない改質は、試料調製速度が速くなるため減少する。手順の高効率は、必要とされる化学物質の量、および使い捨ての管またはチップの量を減少させ、コスト削減につながる。したがって、処理工程の自動化は、実践時間、作業時間に関するコスト、および使い捨て装置に関するコストを減少させる。
【００１９】
「〜を含む」という用語は「〜からなる」を含む、ということが理解される。また、「〜を含む」は、その前に試薬のリストが記載されている場合、試薬の閉じられたリストを提供するが、試薬として見なされないさらなる化合物の存在を除外しない、ということが理解される。試薬として見なされないであろう化合物は、たとえば水である。これは緩衝液にも当てはまる。
【００２０】
好ましい一実施形態では、前記生物有機化合物または分析物は、タンパク質；ペプチド；ポリペプチド；核酸、たとえばデオキシリボ核酸およびリボ核酸；脂肪酸を含む脂質；および代謝産物、のうちの少なくとも１つを含む。
【００２１】
一般的に言えば、生物有機化合物とは、生物系において自然に発生する有機化合物である。有機化合物とは、１つ以上の炭素原子を含む化合物である。生物系は、単細胞および多細胞生物を含む有機体；組織；有機体または組織からの細胞型；培養細胞；ミトコンドリア、クロロプラスト、リソソーム、ペルオキシソーム、ゴルジ体、小胞体、核小体、核、リボソーム、微小管、中心小体およびプロテアソームを含む細胞小器官などの細胞物質のサブ成分であってもよい。生物系はさらに、ウイルスおよびそれらのサブ成分を含む。「サブ成分」という用語は、巨大分子集合体を含む。
【００２２】
ペプチドおよびポリペプチドは、アミノ酸の、好ましくは２０個の自然発生アミノ酸の重縮合物である。典型的には、ペプチドは２〜３０個のアミノ酸を含有し、一方、ポリペプチドは３１個以上のアミノ酸を含有する。
【００２３】
核酸は、ヌクレオチドの重縮合物である。この発明に従った「核酸」という用語は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む、ＲＮＡのすべての形を含む。ノンコーディングＲＮＡの例は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リピート関連ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、および核内低分子ＲＮＡを含む。
【００２４】
「脂質」という用語は当該技術分野において周知であり、主として、極性頭部基を担持し、それにより脂質分子を両親媒性にし得る脂溶性／疎水性分子に関する。脂質は、炭化水素（トリアコンタン、スクアレン、カロチノイド）、アルコール（好ましくは２〜約３０個の炭素原子を有する、ワックスアルコール、レチノール、コレステロール、直鎖モノまたはポリヒドロキシル化炭化水素）、エーテル、脂肪酸、ならびに、モノ、ジ、およびトリアシルグリセロールなどのエステル、といった単純脂質を含む。さらに、リポタンパク質、リン脂質および糖脂質などの複合脂質が含まれる。リン脂質は次に、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、カルディオリピン、リゾビスホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、リゾフォスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールといったグリセロリン脂質、およびフォスフォノ脂質を含む。糖脂質は、モノおよびジガラクトシルジアシルグリセロール、ならびにスルホキノボシルジアシルグリセロールといったグリセロ糖脂質を含む。また、この発明に従った「脂質」という用語により、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質およびセラミドも含まれる。
【００２５】
「代謝産物」という用語は一般に、代謝およびシグナリングに中間体および生成物として関与する小分子として定義される。これらは、代謝中間体として分類される代謝産物、ホルモンなどのシグナリング分子、および二次代謝産物を含む。
【００２６】
さらに好ましい一実施形態では、容器はふたをさらに含み、前記ふたは反応チャンバの開口部を封止するように構成されており、たとえば針での貫通によって試料の供給を可能にするように構成されており、好ましくは供給後に自己再封止するように構成されている。この好ましい実施形態は、（完全に）閉鎖された試料調製容器を提供する。
【００２７】
ふたが管を封止するように構成されているというオプションは、必要な場合に酸化を減少させるシールドガスの下での作業を容易に可能にする。管を封止することはまた、試料調製中に導入される汚染を著しく減少させる。たとえば貫通可能なゴムふたを有する清潔な封止装置は、汚染の著しい減少を保証する。同時に、封止槽は、試料が外部を汚染することも防止して、有害物質または有毒物質を用いる作業をより安全でより実行可能にする。
【００２８】
ふたは、たとえば超音波溶接によってチャンバの残りと融合されることが、好ましい。また、これに代えて、このふたは、チャンバの残りに貼付けられてもよい。ふたは、尖った物体、たとえば針またはランセットによって貫通可能なあらゆる材料でできていてもよい。加えて、ふたはまた、尖った物体での貫通後に再封止するように構成されてもよい。
【００２９】
前記ふたの代替例として、前記反応チャンバは開いていてもよい。好ましくは、開口部は上部にある。その場合、クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの底部に位置することが好ましい。「上部」および「底部」という用語は、重力の方向に対して定義されている。重力は、クロマトグラフィを行なうための好ましい駆動力である。
【００３０】
さらに好ましい一実施形態では、前記クロマトグラフィ媒体の表面は、ろ過表面として作用するように構成され、および／または、さらなるろ過層および／または反応層を含み、前記表面または層は前記反応チャンバの内部に面している。
【００３１】
前記クロマトグラフィ媒体の表面がろ過表面として作用するように構成され、および／または、さらなるろ過層および／または反応層を含むというオプションは、微視的なおよび／またはメゾスコピックな不純物を試料から除去することを可能にし、また、前記層が反応性のものである範囲で、さらなる化学反応を行なうことを可能にする。ろ過は、ろ過表面に組込まれたメッシュによって行なわれてもよい。加えて、メッシュは、たとえば反応層として作用しているペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）などの化学反応基または酵素といった反応物質でコーティングされてもよい。また、これに代えて、ろ過は、織られたフィルターまたは紙フィルターによって行なわれてもよい。この場合、織られた材料または紙は、同様に反応物質でコーティングまたは処理されてもよい。
【００３２】
また、これに代えて、特に、前記クロマトグラフィ媒体が、５μｍ、１０μｍおよびそれ以上といったより大きいクロマトグラフィ粒径を使用すること、もしくは、ミクロまたはマクロ多孔性のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）などのポリマー材料を使用することなどによって、より低い背圧を達成し、それにより閉塞のリスクの減少を提供するように構成されている場合、前記ろ過表面、ろ過層および／または反応層はなくてもよい。
【００３３】
主な実施形態の局面（ｂ）の、および主な実施形態の局面（ｂ）に言及される範囲の上に開示された好ましい実施形態の、さらに好ましい一実施形態では、容器はシールをさらに含み、前記シールは前記受けチャンバを封止するように構成されており、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために構成されている。たとえば、シールは受けチャンバの外面に位置していてもよく、または、前記外面を完全に置換してもよい。
【００３４】
前述のふたについては、このふたは、たとえば超音波溶接によって受けチャンバと融合されることも、好ましい。また、これに代えて、前記シールは、ふたが反応チャンバに貼付けられてもよいのと同様に、受けチャンバに貼付けられてもよい。したがって、ふたはまた、尖った物体、たとえば針またはランセットによって貫通可能なあらゆる材料でできていてもよく、また、尖った物体での貫通後に再封止するように構成されてもよい。
【００３５】
さらに好ましい一実施形態では、前記容器は、ポリプロピレン；ポリエチレン；熱、マイクロ波、衝撃波、音波および／または電気を伝導するように構成された材料；低結合表面を有する材料；透明または不透明であるか、または電磁放射、好ましくは光、より好ましくはＵＶ放射を選択的に伝導する材料、のうちの少なくとも１つを含む。
【００３６】
前記容器が熱、マイクロ波、衝撃波、音波または電気を伝導するように構成された材料を含むというオプションは、たとえば超音波処理または沸騰による異なる形の溶解を強化し得る。熱を伝導するように構成された材料は、金属、たとえば銅および／または銀および／または金および／またはアルミニウム、もしくはハードプラスチックであってもよい。金属は、容器の外側または内側部分でコーティングされてもよい。加えて、超音波処理の場合、前記金属はまた、衝撃波または音波を伝導するように構成される。マイクロ波が容器に印加されている場合、容器は主としてプラスチック材料を含むことが好ましい。
【００３７】
さらに好ましい一実施形態では、試料調製容器の少なくとも１つの内壁は、好ましくはポリテトラフルオロエチレンを用いた少なくとも部分的なコーティングによって、少なくとも部分的に低い結合特性および／または低い保持特性を有する。
【００３８】
また、これに代えて、低い保持特性は、非常に高い流体撥水性、たとえば超疎水性から生じてもよい。高い流体撥水性は、接触角、すなわち流体と内壁の固体表面との間の角度が大きく、好ましくは１５０°を上回るナノコーティングによって達成され得る。低い保持特性はまた、表面処理によって、たとえばミクロンサイズの乳頭状構造を形成することによって達成されてもよい。
【００３９】
第２の局面では、この発明は、主な実施形態の項目（ａ）に記載のこの発明に従った試料調製容器に連結されるように構成され、精製および／または濃縮された生物有機化合物を受けるように構成された、受けチャンバを提供する。
【００４０】
第２の局面の好ましい一実施形態では、前記受けチャンバは、連結要素、好ましくはねじ山を含み、それは、主な実施形態の項目（ａ）に記載のこの発明に従った試料調製容器の対応する連結要素、好ましくは対応するねじ山に連結されるように構成されている。
【００４１】
この発明のこの局面は、別個の受けチャンバを、この発明に従った試料調製容器がそのような受けチャンバをまだ含まないという範囲で提供する。精製および／または濃縮された生物有機化合物を受けるための言及された構成は、前記受けチャンバが、前記試料調製容器に連結されると、前記クロマトグラフィ媒体によって、前記容器内の反応チャンバから分離されるように実現されてもよい。さらに、および主な実施形態の項目（ｂ）と類似して、第２の局面に従った受けチャンバは、精製および／または濃縮された生物有機化合物を受けるための、言及された連結要素によって実現され得る構成を提供する形状構成を除き、閉鎖されている。閉鎖された外面は好ましくは、前記受けチャンバから精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成される。
【００４２】
図１は、この発明に従った試料調製容器１００の例示的な一実施形態を示す。試料調製容器１００は、自己封止ゴムふたまたはゴム栓１０１と、反応チャンバ１０２と、ろ過表面１０３として作用するクロマトグラフィ媒体１０４の表面とを含む。シール１０５は、試料溶解の前に反応チャンバ１０２を完全に封止するために使用される。
【００４３】
自己封止ゴムふたまたはゴム栓１０１は、試料、化学物質またはシールドガスを導入するために、１本または数本の針によって貫通可能である。加えて、ゴムふたまたはゴム栓１０１は、針の除去後に再封止する。反応チャンバ１０２は、超音波処理による細胞溶解、たとえばヨードアセトアミドによるタンパク質アルキル化、およびタンパク質分解などの或る反応用に構成されている。反応チャンバ１０２は好ましくは、ポリプロピレンまたはポリエチレン製である。試料調製容器１００の内壁は好ましくは、低い保持特性を有する。したがって、それはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）でコーティングされてもよい。
【００４４】
反応チャンバ１０２の隣りには、クロマトグラフィ媒体１０４があり、それは、対象となっている細胞物質を結合し、精製し、および／または濃縮するために使用される。この文脈では、基質は、クロマトグラフィ媒体の複数のスタックを用いることによって遂行され得る多次元クロマトグラフィを行なうように設計可能である。クロマトグラフィ媒体の後の表面１０３は、ろ過表面として作用する。しかしながら、たとえばミリポア（Millipore）フィルターなどの非結合ろ過基質といった他の表面も、クロマトグラフィ媒体の表面１０３の上に適用可能である。
【００４５】
自己封止ゴムふた１０１に対向する試料調製容器１００の端には、シール１０５が形成されており、それは、試料溶解の前に反応チャンバを完全に封止するために使用される。試料調製容器はポリエチレン製であるため、シールは、洗浄、精製および溶離工程が次に実行され得るように、はさみまたはナイフで開放され得る。したがって、試料調製容器１００のこの部分では、壁の厚さは、試料調製容器１００の残りと比べて減少している、ということが好ましい。
【００４６】
この実施形態では、試料調製容器１００は円錐形である。したがって、シール１０５は、もっぱら円筒状の試料調製容器１００と比べて、容易にはさみで除去可能である。
【００４７】
図２は、この発明に従った試料調製容器１００と受けチャンバ２００とを含むシステムの例示的な一実施形態を示す。この実施形態では、試料調製容器１００は円筒形状を有していてもよい。自己封止ゴムふたまたはゴム栓１０１の反対側のシール１０５の代わりに、試料調製容器１００は、閉鎖され封止された壁１０７を含み、その壁１０７は、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されている。このため、壁１０７は、試料調製容器１００の他の壁に比べて、厚さが薄い。したがって、壁１０７は、鋭い縁の物体によって容易に貫通可能である。
【００４８】
図２はさらに、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を試料調製容器１００から受けるように構成された受けチャンバ２００を示す。受けチャンバ２００の上側はしたがって、開いていてもよい。また、これに代えて、受けチャンバの上側は封止されており、シールは、受けチャンバ２００が前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を試料調製容器１００から受ける直前に開放される。
【００４９】
試料調製容器１００はさらに、壁１０７の近くにねじ山１０８を含み、それは、外部の受けチャンバ２００の対応するねじ山２０８と連結されるように構成されている。試料調製容器１００と連結されるために、受けチャンバ２００は、試料調製容器１００の対応するねじ山１０８に適合するねじ山２０８を含む。加えて、受けチャンバ２００のねじ山２０８は、ねじ山２０８の端に、試料調製容器１００に面する鋭い縁の延長部２０８ａを有する。受けチャンバ２００が双方のねじ山１０８および２０８のねじ連結器によって試料調製容器１００に連結されると、鋭い縁の延長部２０８ａは試料調製容器の壁１０７を貫通し、精製および／または濃縮された生物有機化合物が、貫通された壁１０７を通って受けられ得る。
【００５０】
生物有機化合物を受けた後、受けチャンバ２００は、さらなる使用のために切り離され得る。
【００５１】
第３の局面では、この発明は、細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分から、精製および／または濃縮された生物有機化合物を調製する方法であって、前記方法は、（ａ）前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を、容器の反応チャンバに導入するステップであって、前記容器はクロマトグラフィ媒体と受けチャンバとをさらに含み、前記クロマトグラフィ媒体は前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されているステップと、（ｂ）前記反応チャンバの内部で、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分を分裂させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の結果が前記クロマトグラフィ媒体を通過することを可能にし、それにより、前記受けチャンバにおいて前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るステップとを含み、生物有機化合物は、タンパク質；ペプチド；ポリペプチド；デオキシリボ核酸およびリボ核酸などの核酸；脂肪酸を含む脂質；および代謝産物、のうちの少なくとも１つを含み、前記方法は、前記容器内でのみ行なわれる、方法を提供する。
【００５２】
前記導入するステップは、前記容器の反応チャンバがふた、好ましくは自己封止ゴムふたで閉鎖される場合に好ましくは使用される注入針を含む任意の手段によって遂行可能である。特に、前記反応チャンバが、ふたによって閉鎖される代わりに開いている場合、導入する他の手段は、ピペット操作を含む。
【００５３】
「分裂させる」という用語は、先行技術によって確立されているような意味を有する。それは、前記細胞物質、ウイルスおよび／またはそれらのサブ成分の崩壊を指し、それにより、前記細胞物質、ウイルスおよびそれらのサブ成分の内部構成要素を、分析用にアクセス可能にする。分裂の好ましい手段を、以下にさらに詳述する。
【００５４】
ステップ（ｃ）に従った前記可能にするステップは、重力、遠心分離および／または増加した圧力が、ステップ（ｂ）の結果が前記クロマトグラフィ媒体を通過することを提供するように、反応チャンバがクロマトグラフィ媒体の上方に位置するように容器を配置すること、および／または、ステップ（ｂ）の結果がクロマトグラフィ媒体を通過することだけでなく、さらに前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得ることも提供するように、受けチャンバを開放すること、を含んでいてもよく、もしくはそのことからなっていてもよい。「得る」という用語は、前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を、たとえば分析のために、受けチャンバから除去することを指す。
【００５５】
この発明の重要な局面は、前記細胞物質、ウイルスおよび／またはそれらのサブ成分がステップ（ａ）に従って一旦導入されると、この方法が前記容器内でのみ行なわれる、ということである。これは、上記背景の項で詳述されたような試料損失または汚染を引き起こし得る厄介な移動工程を回避する。図３は、先行技術によって確立された手順と比べて優れた性能の証拠を提供する。実際の適用は、実施例２で示す。この方法は、この実施例で述べられたもの（出芽酵母および分裂酵母）などの全プロテオームを同定し、定量化することができる。この発明によって与えられるような向上した精度はとりわけ、全プロテオームのタンパク質コピー数を推測することを可能にする。コピー数の値は、システム生物学、システムモデリング（それらはタンパク質の初期および／または安定状態の量を提供する）、ならびに、タンパク質劣化などの生物活動のモニタリングにとって、特に有益である。
【００５６】
好ましい一実施形態では、前記分裂させるステップは、（ａ）超音波処理、（ｂ）カオトロピック剤および／または変性剤の存在下での沸騰、および／または、（ｃ）ミリングビーズなどの物理的作用物の存在下でのビーズミリング、によって遂行される。これらは分裂の一般的手段であり、当業者によって苦もなく採用され得る。
【００５７】
この発明の第１および第３の局面双方の好ましい一実施形態では、前記クロマトグラフィ媒体は、（ａ）逆相材料、陽イオン交換材料、陰イオン交換材料、混合モードイオン交換材料、イオン錯化材料、抗体結合および／またはレクチン結合された親和性結合基質、という材料のうちの少なくとも１つ、および／または、（ｂ）異なるクロマトグラフィ媒体の２つ以上のスタック、を含む。
【００５８】
好ましいクロマトグラフィ材料は、逆相材料のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、実施例１で使用されるようなＣ４、Ｃ８、Ｃ１８材料、スルホン化結合表面などの陽イオン交換材料、および、結合表面としての第四級アンモニウムイオンなどの陰イオン交換材料である。
【００５９】
第１の局面に従った前記容器を使用する場合、および／または第３の局面に従った方法のステップ（ｃ）を行なう場合、２つ以上のクロマトグラフィ工程を実現するために、異なるクロマトグラフィ媒体の２つ以上のスタックまたは層が使用されてもよい。
【００６０】
第１の局面に従った容器または第３の局面に従った方法のさらに好ましい一実施形態では、（ａ）前記生物有機化合物は、タンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドを含み、前記容器は、（ｉ）前記容器がプロテアーゼを含むこと、（ｉｉ）前記容器がアルキル化剤を含むこと、（ｉｉｉ）前記容器が質量分光分析用スタンダードを含むこと、および（ｉｖ）前記容器内のｐＨ値が８〜９、好ましくは８．５であること、のうちの１つ、２つ、３つ、またはすべてによって特徴づけられ、および／または、（ｂ）前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、（ｉ）前記容器が、好ましくはエンドヌクレアーゼを含む１つ以上のヌクレアーゼを含むこと、（ｉｉ）前記容器が、好ましくはＰＣＲによる核酸増幅用試薬を含むこと、および（ｉｉｉ）前記容器内のｐＨ値が８〜９、好ましくは８．５であること、のうちの１つ、２つ、またはすべてによって特徴づけられる。
【００６１】
第１の局面に従った容器または第３の局面に従った方法の別の好ましい実施形態では、（ａ）前記生物有機化合物は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドを含み、前記容器は、（ｉ）前記容器が洗剤、好ましくはＳＤＣを含むこと、（ｉｉ）前記容器が還元剤、好ましくはＴＣＥＰを含むこと、（ｉｉｉ）前記容器がアルキル化剤、好ましくはクロロアセトアミドを含むこと、（ｉｖ）前記容器内のｐＨ値が７〜９、好ましくは８〜９、より好ましくは８．５であること、（ｖ）前記容器が質量分光分析用スタンダードを含むこと、（ｖｉ）前記容器がカオトロピック剤、好ましくはＧｄｍＣｌを含むこと、（ｖｉｉ）前記容器が、酸化防止剤および／またはＵＶ吸収剤などの分析物安定化化学物質を含むこと、および（ｖｉｉｉ）前記容器が、プロテアーゼ、好ましくはトリプシンおよび／またはＬｙｓ−Ｃ；グリコシダーゼ、好ましくはＰＮＧａｓｅ  Ｆ；およびキナーゼ、から選択される少なくとも１つの酵素を含むこと、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはすべてによって特徴づけられ、および／または、（ｂ）前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、（ｉ）前記容器が、好ましくはエンドヌクレアーゼを含む１つ以上のヌクレアーゼを含むこと、（ｉｉ）前記容器が、好ましくはＰＣＲによる核酸増幅用試薬を含むこと、および（ｉｉｉ）前記容器内のｐＨ値が８〜９、好ましくは８．５であること、のうちの１つ、２つ、またはすべてによって特徴づけられ、および／または、（ｂ）前記生物有機化合物は核酸を含み、前記容器は、（ｉ）前記容器が、好ましくはエンドヌクレアーゼを含む１つ以上のヌクレアーゼを含むこと、（ｉｉ）前記容器が、好ましくはＰＣＲによる核酸増幅用試薬を含むこと、および（ｉｉｉ）前記容器内のｐＨ値が７〜９、好ましくは８〜９、より好ましくは８．５であること、のうちの１つ、２つ、またはすべてによって特徴づけられる。
【００６２】
項目（ａ）の上述のサブ項目（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）は、好みの順序で提示されている。
用途のタイプ、および／または、精製および／または濃縮すべき生物有機化合物のタイプに依存して、前記容器は、１つ以上の薬剤で事前充填されてもよく、それらの薬剤は、検討中の特定のクラスの生物有機化合物の精製および／または濃縮にとって有用であり、必要とされており、および／または特異的である。項目（ａ）は、タンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドの精製および／または濃縮にとって好適な薬剤および／または条件を提供する。
【００６３】
好ましい洗剤は、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）である。
好ましい還元剤は、ＴＣＥＰである。
【００６４】
好ましいアルキル化剤は、ヨードアセトアミドおよびクロロアセトアミドである。特に、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）が好ましい。
【００６５】
特に、クロロアセトアミドであるアルキル化剤とＴＣＥＰである還元剤とを組合わせた使用が好ましい。
【００６６】
項目（ａ）または（ｂ）に従ったｐＨ値はそれぞれ、緩衝水溶液の形をした、または緩衝液の調製に必要とされる乾燥した構成要素の形をした緩衝材料で、容器を事前充填することによって確立されてもよい。
【００６７】
質量分光分析用の好ましいスタンダードは、ＷＯ２０１１／０４２４６７に記載されているようなＳＵＰＥＲ−ＳＩＬＡＣスタンダードである。典型的には、前記スタンダードは、自然発生同位体分布から外れた同位体分布を呈する。たとえば、それは、重同位体または軽同位体について濃縮され得る。好ましくは、およびＷＯ２０１１／０４２４６７に開示されているように、そのようなスタンダードは、試料における１つまたは複数の第１の生体分子を定量化するためにスタンダード混合物を調製するための方法によって得られる。その方法は、１つまたは複数の基準生体分子を含む複数の第２の生体分子を、少なくとも２つの異なる細胞集団の混合物から抽出するステップを含み、前記少なくとも２つの異なる細胞集団は、（ｉ）異なる細胞型の細胞、（ｉｉ）異なる細胞株からの細胞、（ｉｉｉ）異なる細胞系統の細胞、または（ｉｖ）異なる細胞培養からの細胞、の集団であり、培養物は異なる培養条件にさらされ、前記１つまたは前記複数の基準生体分子は、前記１つまたは前記複数の第１の生体分子の代謝的に同位体標識された形であり、前記生体分子はタンパク質またはペプチドである。
【００６８】
この好ましい実施形態から明らかであるように、事前充填された試料調製容器は、特に興味深い。上に開示された好ましい実施形態の項目（ａ）が、特定されたオプションのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはすべてを提供するならば、請求項は、前記試料調製容器内で確立すべき薬剤または条件の限定された数のサブ組合せを本質的に特定する。特に好ましいサブ組合せは、以下のとおりである。以下に挙げるサブ組合せの各々は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドであるかもしくはそれらを含む生物有機化合物（ここに「分析物」とも呼ばれる）に関する。
【００６９】
好ましい酵素はプロテアーゼである。好ましいプロテアーゼは、Ｌｙｓ−Ｃ、トリプシン、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、およびキモトリプシンのうちの１つまたはそれらの組合せである。上に開示されているように、トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃは、単独でも組合されても、特に好ましい。この好ましい実施形態から明らかであるように、事前充填された試料調製容器は、特に興味深い。上に開示された好ましい実施形態の項目（ａ）が、特定されたオプションのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはすべてを提供するならば、請求項は、前記試料調製容器内で確立すべき薬剤または条件の限定された数のサブ組合せを本質的に特定する。特に好ましいサブ組合せは、以下のとおりである。以下に挙げるサブ組合せの各々は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドであるかもしくはそれらを含む生物有機化合物（ここに「分析物」とも呼ばれる）に関する。
【００７０】
（１）試料調製容器であって、前記容器は、好ましくは唯一の試薬として、アルキル化剤、還元剤、洗剤を含み、前記容器内のｐＨ値は８〜９である。特に、好ましくは唯一の試薬として、ＣＡＡ、ＴＣＥＰ、ＳＤＣおよびトリス緩衝剤を、ｐＨ８．５で含む試料調製容器が好ましい。
【００７１】
（２）上述の実施形態（１）であって、前記容器は、質量分光分析用スタンダード、好ましくはＳＩＬＡＣスタンダードまたはＳＵＰＥＲ−ＳＩＬＡＣスタンダードをさらに含む。
【００７２】
（３）（１）または（２）に従った実施形態であって、グリコシダーゼをさらに含み、好ましいグリコシダーゼはＰＮＧａｓｅ  Ｆである。
【００７３】
上に開示された好ましい実施形態に従って、前記特に好ましい実施形態（１）〜（３）はまた、この発明に従った方法の好ましい実現化例も同時に定義する。ここに開示されているように、タンパク質分解を行なう直前に、すなわち、溶解、還元およびアルキル化が遂行された後に、プロテアーゼまたはプロテアーゼの混合物が添加される、ということが好ましい。
【００７４】
したがって、この発明はさらなる局面で、閉鎖された試料調製容器であって、前記容器は反応チャンバとクロマトグラフィ媒体とを含み、前記反応チャンバは、好ましくは唯一の試薬として、アルキル化剤、還元剤、洗剤を含み、前記容器内のｐＨ値は８〜９であり、（ａ）前記クロマトグラフィ媒体は前記反応チャンバの壁に位置しており、前記壁は閉鎖または封止されていて、開放されるように構成されており、もしくは、（ｂ）前記試料調製容器は受けチャンバをさらに含み、前記受けチャンバは、前記クロマトグラフィ媒体が前記受けチャンバから前記反応チャンバを分離するように、前記クロマトグラフィ媒体に隣接しており、前記受けチャンバの外面は閉鎖されていて、開放されるように構成されている、試料調製容器を提供する、ということが理解される。特に好ましいアルキル化剤、還元剤および洗剤、ならびにｐＨ値は、ここに上で定義されたような特に好ましい実施形態（１）〜（３）に従ったものである。
【００７５】
項目（ｂ）に従った好ましい核酸は、ｍＲＮＡである。核酸増幅用の前記試薬を用いて行なうべき好ましい反応は、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分に含まれる複数のｍＲＮＡからの、ＲＮＡ−ｓｅｑ（当該技術分野では「ＲＮＡディープシーケンシング」とも呼ばれる）分析のためのＲＮＡポリ（Ａ）ライブラリの生成である。核酸増幅用の好ましい試薬は、ＲＴ−ＰＣＲに好適な塩、デオキシ−ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、プライマー（通常、ポリ−ｄＴプライマー）、および逆転写酵素である。
【００７６】
この発明の第１および第３の局面双方の好ましい一実施形態では、前記容器はさらに、（ａ）ミリングビーズ、洗剤、好ましくはクロマトグラフィに干渉しないことが公知である洗剤、尿素、チオ尿素またはグアニジン塩酸塩（ＧｄｍＣｌ）などのカオトロピック剤、ヨードアセトアミドおよびクロロアセトアミドなどのアルキル化剤、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤、アセトニトリルまたはメタノールなどの有機溶剤、上にさらに記載されたようなＳＵＰＥＲ−ＳＩＬＡＣミックスなどの質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、および／または、（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、デカルボキシラーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つを含む。
【００７７】
好ましいカオトロピック剤は、ＧｄｍＣｌである。
この発明の第１および第３の局面双方のさらに好ましい一実施形態では、（ａ）前記細胞物質は、無傷細胞、明らかにされていない細胞溶解物、組織、病原体のうちの１つであり、および／または（ｂ）前記サブ成分はサブ細胞構造、特に細胞小器官である。例示的な細胞小器官は、上にさらに言及されている。
【００７８】
明らかにされていない細胞溶解物は残骸を含み、そのような残骸は典型的には、前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分の分裂の過程で形成される、ということが理解される。
【００７９】
この発明の方法のさらに好ましい一実施形態では、前記生物有機化合物がタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである範囲で、前記方法のステップ（ｂ）は、還元およびアルキル化をさらに含む。
【００８０】
この発明の方法のさらに好ましい一実施形態では、前記方法のステップ（ｂ）は、タンパク質分解消化をさらに含む。タンパク質分解消化は還元およびアルキル化の後に影響される、ということが好ましい。前記タンパク質分解消化を行なう直前に、すなわち、還元およびアルキル化が影響された後に、タンパク質分解消化に必要な１つ以上のプロテアーゼが容器または反応混合物に添加される、ということがさらに好ましい。この発明が事前充填された試料調製容器、すなわち１つ以上の試薬をすでに含む試料調製容器に関する範囲で、プロテアーゼは、事前充填された試料調製容器内に含まれる薬剤の中にはない、ということがしたがって好ましい。
【００８１】
さらに好ましい一実施形態では、前記受けチャンバにおいて前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を得る前記ステップは、（ｉ）ステップ（ｂ）の生成物が前記クロマトグラフィ媒体内に入って保持されることを可能にすること、および（ｉｉ）前記生物有機化合物を溶離すること、によって遂行される。
【００８２】
前記細胞物質、ウイルス、および／または、前記細胞物質および／またはウイルスのサブ成分が一旦分裂し、また好ましくは、ここに上で詳述された、還元、アルキル化およびタンパク質分解消化を含むさらなる処理工程にさらされると、前記反応チャンバ内に存在する混合物は、前記クロマトグラフィ媒体を通過できるようになる。典型的には、処理のこの段階では汚染物質として見なされる高分子量の材料は、反応チャンバ内に、より特定的には、前記反応チャンバに面するクロマトグラフィ媒体の表面で保持されるであろう。一方、塩、さらに還元剤およびアルキル化剤といった低分子量の化合物は、それらが存在し得る範囲で、クロマトグラフィ媒体を通過するであろう。クロマトグラフィ媒体は概して、生物有機化合物、好ましくは前記ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドを保持するであろう。タンパク質分解消化が遂行された範囲で、前記生物有機化合物は、処理のこの段階では、概してペプチドの形で存在するであろう。上に開示された好ましい実施形態のステップ（ｉｉ）に従った溶離のために、たとえばラップシルバーら（上記引用文中）に記載された、先行技術によって確立された溶離剤が使用されてもよい。好ましい例を提供するために、クロマトグラフィ媒体がＣ１８またはＣ８材料などの逆相材料である場合、アセトニトリルまたはメタノールが使用されてもよい、ということを述べておく。ＳＣＸがクロマトグラフィ材料として使用された場合、アンモニア、酢酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムが使用されてもよい。ＳＡＸがクロマトグラフィ媒体として使用された場合、ギ酸、酢酸および／または塩化ナトリウムが使用されてもよい。さらなる溶離剤が、当業者によって苦もなく、かつクロマトグラフィ媒体に依存して選択されてもよい。
【００８３】
この発明の第３の局面に従った方法のさらに好ましい一実施形態では、前記容器は、この発明の第１の局面の実施形態（ｂ）に従った容器である。
【００８４】
第４の局面では、この発明は、（ａ）この発明の第１の局面に従った試料調製容器と、（ｂ）（ｉ）プロテアーゼ、アルキル化剤、質量分光分析用スタンダード、および／または、前記容器内で８〜９、好ましくは８．５というｐＨ値を確立するための手段、および／または（ｉｉ）ヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ；および／または、好ましくはＰＣＲによる核酸増幅用試薬、とを含む、もしくはそれらからなる、キットを提供する。
【００８５】
それに関連して、この発明は、（ａ）この発明の第１の局面に従った試料調製容器と、（ｂ）（ｉ）プロテアーゼ、好ましくはトリプシンおよび／またはＬｙｓ−Ｃ；アルキル化剤、好ましくはクロロアセトアミド；還元剤、好ましくはＴＣＥＰ；質量分光分析用スタンダード；カオトロピック剤、好ましくはＧｄｍＣｌ；または洗剤、好ましくはＳＤＣ；および／または、前記容器内で７〜９、好ましくは８〜９、より好ましくは８．５というｐＨ値を確立するための手段、および／または（ｉｉ）ヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ；および／または、好ましくはＰＣＲによる核酸増幅用試薬、とを含む、もしくはそれらからなる、キットを提供する。
【００８６】
上にさらに説明されたように、この発明に従った容器は、１つ以上の薬剤で事前充填されてもよい。代替例として、この発明に従ったキットの構成要素（ａ）として、空であるかまたは部分的にのみ事前充填された容器が提供されてもよく、一方、この発明に従ったキットのさらに別の構成要素として、所与の生物有機化合物を精製および／または濃縮するのに好適な薬剤が提供されてもよい。
【００８７】
キットの好ましい一実施形態では、それは、（ａ）ビーズミリング材料、洗剤、カオトロピック剤、ヨードアセトアミドなどのアルキル化剤、還元剤、有機溶剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、キナーゼ、グリコシダーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つ、および／または（ｃ）この発明の第３の局面に従った方法を行なうための使用説明を有するマニュアル、をさらに含む。
【００８８】
キットの好ましい一実施形態では、それは、（ａ）ビーズミリング材料、洗剤、カオトロピック剤、ヨードアセトアミドなどのアルキル化剤、還元剤、有機溶剤、酸化防止剤、ＵＶ吸収剤、質量分光分析用スタンダード、という化学物質のうちの少なくとも１つ、（ｂ）プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、キナーゼ、グリコシダーゼ、という酵素のうちの少なくとも１つ、および／または（ｃ）この発明の第３の局面に従った方法を行なうための使用説明を有するマニュアル、をさらに含む。
【００８９】
第５の局面では、この発明は、（ａ）主な実施形態の項目（ａ）に記載のこの発明に従った試料調製容器と、（ｂ）この発明の第２の局面に従った受けチャンバとを含む、システムを提供する。
【００９０】
図は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】この発明に従った試料調製容器の例示的な一実施形態を示す図である。以下は、参照番号によって示された要素の説明である：  （１００）  試料調製容器；  （１０１）  自己封止ゴムふたまたはゴム栓は、試料、化学物質またはシールドガスを導入するために、１本または数本の針によって貫通可能である。ゴム栓は、針の除去後に再封止する；  （１０２）  反応チャンバは、超音波処理による細胞溶解、たとえばヨードアセトアミドによるタンパク質アルキル化、およびタンパク質分解などの或る反応用に構成されている；  （１０３）  クロマトグラフィ媒体の表面は、ろ過表面として作用する。たとえばミクロ多孔性のミリポアフィルターなどの非結合ろ過基質といった他の表面が、ろ過表面の上に、またはその代わりに適用可能である；  （１０４）  クロマトグラフィ媒体は、対象となっている細胞物質を結合し、精製し、および濃縮するために使用される。基質は、クロマトグラフィ媒体の複数のスタックを用いることによって遂行され得る多次元クロマトグラフィを行なうように設計可能である；  （１０５）  シールは、試料溶解の前に反応チャンバを完全に封止するために使用される。シールは、洗浄、精製および溶離工程のために開放され得る。
【図２】この発明に従った試料調製容器と受けチャンバとを含むシステムの例示的な一実施形態を示す図である。以下は、参照番号によって示された要素の説明である：  （１００）  試料調製容器；  （１０１）  自己封止ゴムふたまたはゴム栓は、試料、化学物質またはシールドガスを導入するために、１本または数本の針によって貫通可能である。ゴム栓は、針の除去後に再封止する；  （１０２）  反応チャンバは、超音波処理による細胞溶解、たとえばヨードアセトアミドによるタンパク質アルキル化、およびタンパク質分解などの或る反応のために構成されている；  （１０３）  クロマトグラフィ媒体の表面は、ろ過表面として作用する。たとえばミクロ多孔性のミリポアフィルターなどの非結合ろ過基質といった他の表面が、ろ過表面の上に、またはその代わりに適用可能である；  （１０４）  クロマトグラフィ媒体は、対象となっている細胞物質を結合し、精製し、および濃縮するために使用される。基質は、クロマトグラフィ媒体の複数のスタックを用いることによって遂行され得る多次元クロマトグラフィを行なうように設計可能である；  （１０７）  閉鎖され封止された壁であって、壁は、精製および／または濃縮された生物有機化合物を得るために開放されるように構成されている；  （１０８）  対応するねじ山、たとえば雄ねじ山と連結されるように構成されている、ねじ山、たとえば雌ねじ山；  （２００）  前記精製および／または濃縮された生物有機化合物を受けるように構成された受けチャンバ。受けチャンバの上側は開いていてもよく、または封止されていてもよい；  （２０８）  対応するねじ山、たとえば雌ねじ山と連結されるように構成されている、ねじ山、たとえば雄ねじ山；  （２０８ａ）  受けチャンバのねじ山の端にある鋭い縁の延長部であって、鋭い縁の延長部は、受けチャンバのねじ山が調製容器の対応するねじ山に緊密にねじ留められると、壁を貫通する。
【図３】この発明の方法と、公開されたＳＤＣべースの溶液内プロトコルとの比較の図である。後者の方法は、従来技術に従った好ましい方法であり、レオン（Leon）ら（Molecular & cellular proteomics  １２（１０）、２９９２（２０１３））を参照されたい。技術的な３組の中央値固有ペプチド同定±標準誤差が示される。
【図４】詳細な出芽酵母プロテオームの量的再現性、およびコピー数推測の図である：（ａ）  ４つの生物学的複製のタンパク質同定の頻度。４回の操業すべてで同定されたタンパク質は、コアプロテオームとして指定される。（ｂ）４つの生物学的複製における全ダイナミックレンジにわたる５つの代表的なタンパク質のＭＳ信号（MaxQuant出力からの無標識定量化（Label-free quantification：ＬＦＱ）強度）。（ｃ）単発分析で求められたＬＦＱ強度と６分画分析で求められたＬＦＱ強度との比較。
【図５】酵母プロテオームの詳細なカバレッジ、および酵母コピー数の推測の図である。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は出芽酵母データセットに基づき、（ｄ）および（ｅ）は分裂酵母データセットに基づく：（ａ）６分画ｉＳＴ−ＳＣＸ分析を使用した同定タンパク質と、最も深い実験的出芽酵母プロテオーム（ペング（Peng）ら、Nature methods  ９（６）、５２４（２０１２））との比較。（ｂ）６分画ｉＳＴ−ＳＣＸ分析を使用した推測コピー数と、２１個の合成ペプチドスタンダードを用いて報告されたコピー数（ピコッチ（Picotti）ら、Cell  １３８（４）、７９５（２００９））との相関。（ｃ）推測コピー数の分布。赤い垂直線は、１個の細胞当たりのコピー数が１００個であることを示す。青い瓶は、６分画ｉＳＴ−ＳＣＸ分析で固有に同定されるタンパク質を表わす。（ｄ）６分画ｉＳＴ−ＳＣＸ分析を使用した同定タンパク質と、分裂酵母の最も深いプロテオームを表わす最近の研究で報告されたタンパク質（ガナラトン（Gunaratne）ら、Molecular & cellular proteomics（１２（６）：１７４１−５１（２０１３））との比較。（ｅ）６分画ｉＳＴ−ＳＣＸ分析を使用した推測コピー数と、分裂酵母の別の最近の詳細な分析で報告されたコピー数（マルゲラット（Marguerat）ら、Cell  １５１（３）、６７１（２０１２））との相関。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
以下の実施例は、この発明を例示するものの、限定的であると解釈されるべきでない。
【実施例】
【００９３】
実施例１：
質量分光法を使用するプロテオミクス分析のためのペプチドの精製
システムが、プロテオミクスの分野で、完全に封止された管、または一方側（通常は底部、底部は受けチャンバの場所であり、または受けチャンバが取付けられ得る場所である）のみで封止された管を使用して試験された。細胞が、上述の管の内部で、および外部でも、管内溶解についての顕著な欠点なく溶解された。含有されたタンパク質がタンパク質分解消化され、未処理の汚染物質が、テフロン（登録商標）材料に埋込まれた逆相精製基質Ｃ１８の表面上でろ過された。Ｃ１８材料上で、ペプチドが濃縮され、脱塩された。清浄なペプチドがＣ１８材料から溶離され、次にＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。
【００９４】
結果は、高い安定性と、サンプル量の点で拡大または縮小する能力とを実証している。効率は非常に高くなり、そのため損失は観察されなかった。このアプローチの効率は、わずか５００個のＨｅＬａ  Ｓ３細胞の処理によって示すような確立された先行技術の手法では不可能だった数個の単細胞の処理を可能にする。処理速度は、現在の方法と比べて非常に速く、１時間以内で試料調製が完了する。一方、他の先行技術の方法では、少なくとも約４時間、またはより一般的には１２時間かかる。すべての工程が単純化されて、失敗の原因が最小に低減されているため、専門知識は必要ではない。分析物の望ましくない改質（酸化、ＵＶ光による改質など）がわずかに観察された。再現性よく、高い同定率（ＭＳ／ＭＳ  ＩＤ率：６０％）が、ＬＣ−ＭＳ分析によって観察された。少ない量の試料で作業する場合も、汚染の量は著しく減少した。以前に公知の手順で必要とされるような１つ以上の移動工程に起因して、ポリマーまたはプラスチックが汚染源として生じるかもしれない。試料調製は、ＤＴＴおよびヨードアセトアミドなどの有害で有毒な化学物質を用いて作業することを伴う場合があるが、それらはこの発明の事前充填され封止された容器内に提供され得るため、危害のリスクが減少する。反応槽を生産するために使用され得る別々の材料は周知であり、説明されており、非常に安価な態様で組合わされ得る。システムの自動化バージョンは実行可能であり、容易に実現され得る。
【００９５】
実施例２：
出芽酵母および分裂酵母におけるコピー数
タンパク質コピー数は、生物系および生物群集にとって非常に興味深いものであり、我々は、合理化された最小主義の試料処理方法が、特に偏りのない値を提供し得ると推論した。よく特徴づけられた酵母モデル系に対する最小主義の試料処理方法を評価するために、我々は、出芽酵母を４つの生物学的複製で成長させ、それらを９６ウェルフォーマットで並列処理した（ＯＤ６００＝０．８の１００ｕＬ培養物）。４回の単一操業分析は合わせて４，２７０個の区別可能なタンパク質群を同定し、注目すべきことに、それらの９７％は、４つの複製のうちの少なくとも３つで、高い量的再現性で検出された（総中央値シーケンスカバレッジ：３４．４％、固有ペプチドＩＤの総数：４６，１２５個、図４ａ、ｂ）。同じ下流ＬＣ−ＭＳ／ＭＳセットアップを使用した、シングル操業モードでの我々の最近の酵母プロテオーム分析（ナガラジ（Nagaraj）ら、Molecular & cellular proteomics：ＭＣＰ  １１（３）、Ｍ１１１  ０１３７２２（２０１２））では、各個々の操業における平均同定は、４，０８４個のタンパク質群であった（３３，１２２±４０５個のシーケンス固有ペプチド同定、中央値シーケンスカバレッジ２３．４％）。一方、最小主義の処理方法は、さらに大きい数を生み出した（４，１４４個のタンパク質群、３７，８８０±１７７１個のシーケンス固有ペプチド、中央値シーケンスカバレッジ２７．２％）。
【００９６】
酵母試料を、反応装置から直接、６つのオートサンプラーバイアルへとＳＣＸ分別し、その後、以前と本質的に同じＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行なって、４，５７７個のタンパク質群を定量化した。これは、これまで報告された最大の発現酵母プロテオームである。重要なことに、我々は、発現されたメッセージまたはタンパク質を表わしていないと考えられる６５６個の曖昧な読取り枠をまったく同定しなかった。無標識強度の値と単一操業分析の値（Ｒ２＝０．９１）との優れた相関は、強度が非常に低い領域でさえ、ステージチップ内分別が偏りを発生させなかったことを示す（図４ｃ）。
【００９７】
指数関数的に成長する出芽酵母の最も深い以前のプロテオームは、５つの異なるタンパク質分解酵素と、ペプチドの広範でカラムベースのＳＣＸ分別とを使用した（ペングら、Nature methods  ９（６）、５２４（２０１２））。我々の単一の６分画データセットは、以前の研究を大部分（９４．９％）包含し、４００個のタンパク質を追加した。そのうち、内在性膜タンパク質は著しく濃縮された（ｐ＝９．４×１０−６）（図５ａ）。我々は次に、４，５７０個の酵母タンパク質についてコピー数を推測するために、各タンパク質について、プロテオームの総ＭＳ信号の一部として無標識ＭＳ信号を使用した（ウイスニウスキー（Wisniewski）ら、Molecular systems biology  ８、６１１（２０１２））。コピー数は、２１個の酵母タンパク質について合成ペプチドスタンダード６を用いて以前に確立されており、我々の値は、予期された不確実性（Ｒ２＝０．８２）以内によく合致している（図５ｂ）。１個の細胞当たりのコピー数が１．６×１０６個で最も豊富な酵母タンパク質は、３つのゲノム遺伝子座でコード化される糖分解酵素Ｔｄｈ３ｐであった。中央値酵母タンパク質は、１個の細胞当たりのコピー数が約８００個であり、２０００倍のコピー数範囲は、タンパク質の９０％以上を含んでいた。６つのＯＲＣ複合体要素は、３３２±１５０個の中央値コピー数を有しており、出芽酵母における推測された５００個の複製起点（ニーダスジンスキー（Nieduszynski）ら、Nucleic acids research  ３５（データベース版）、Ｄ４０（２００７））に興味深く関係している。
【００９８】
我々は、７６３個を超える酵母タンパク質で、１個の細胞当たりのコピー数が１００個未満であり（図５ｃ）、それは、酵母コピー数の古典的研究（ガエンマガミ（Ghaemmaghami）ら、Nature  ４２５（６９５９）、７３７（２００３））での割合よりはるかに大きい割合であることに、興味を引き付けられた。この集団は、ＧＯターム細胞周期プロセスおよびＤＮＡ修復のために著しく濃縮された（それぞれ、ｐ<９×１０−１０および<１．８×１０−４）。
【００９９】
非常に少量のタンパク質については、弱いＭＳ信号が不確実性を導入するかもしれない。にもかかわらず、我々は、後期促進複合体（anaphase promoting complex：ＡＰＣ）の要素について、大部分一貫したコピー数を測定し、１個の細胞当たり約３０個のＡＰＣが示された。或る細胞状態でのみ存在するタンパク質はしばしば、非常に低い見かけコピー数を有することが見出され、たとえば、サイクリンＣＬＢ２（Ｇ２／Ｍ相）のコピー数は１００個、またはキナーゼ阻害剤ＦＡＲ１（Ｇ１相）のコピー数は約５０個であった。これは、我々のデータセットが、いくつかの異なるプロテオーム状態からの寄与をすでに含んでいることを示す。
【０１００】
分裂酵母は、４億年以上前に出芽酵母から分岐し、興味深い相対的モデルを提供する。その有機体の最も深いプロテオーム研究はごく最近、３，５４２個のタンパク質を同定するために、いくつかの成長条件と非常に広範な直交分別とを採用した（ガナラトンら、Molecular & cellular proteomics：ＭＣＰ（２０１３））。指数関数的に成長する細胞にのみ、６分画アプローチを使用して、我々は、同じデータベースに対してサーチする４，０８７個のタンパク質を得た。これは、分裂酵母ＯＲＦの８０％を表わし、以前のプロテオームの９６．５％、および６７０個の追加の概して少量のものをカバーしている（図５ｄ）。別の深い分裂酵母プロテオーム（マルゲラットら、Cell  １５１（３）、６７１（２０１２））を参照すると、我々の分裂酵母コピー数は、同位体標識スタンダードが合成された（Ｒ２＝０．８９）３４個のタンパク質について報告されたものと非常によく合致し、内在性膜タンパク質を含むタンパク質クラスに対する見かけの偏りはなかった（図５ｅ）。出芽酵母と同様に、最も豊富なタンパク質は、１個の細胞当たりのコピー数が約１０６個であったが、コピー数が１００個未満である割合は非常に減少した（１７％対３％）。中央値コピー数は５，１３７個で、出芽酵母でのものより約６倍多かった。プロテオームの最も低く発現された５％は、複製フォーク処理およびＤＮＡ修復関連タンパク質のために著しく濃縮された（それぞれ、ｐ<１．１×１０−６および<１．２×１０−６）。プロテオームのこの部分は、これまで特徴づけられていない多くの分裂酵母ＯＲＦを含有している（２０７個のタンパク質のうちの５９個；ｐ<３．９×１０−５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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