(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ（DPP）-IV阻害剤であって、前記茶葉タンパク質分解物に、Leu-Tyr及びIle-Proの配列からなるペプチドの1種または2種を含有するDPP-IV阻害剤（但し、茶葉タンパク質分解物中の環状ジペプチドを除く）。
【請求項２】
茶葉タンパク質分解物から得られるVal-Ala-Tyr-Proを有効成分とするDPP-IV阻害剤。
【請求項３】
Val-Ala-Tyr-Pro、Thr-Gly-Tyr、His-Asp-Tyr及びLeu-Tyr-Asnの配列からなるペプチドの1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤。
【請求項４】
請求項1乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用である飲食品。
【請求項５】
請求項１乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用であるサプリメント。
【請求項６】
請求項１乃至３に記載の剤を有効成分として含有するDPP-IV阻害用である医薬品および/または医薬部外品。
【請求項７】
Val-Ala-Tyr-Proの配列からなる新規テトラペプチド、及びHis-Asp-Tyr又はLeu-Tyr-Asnの配列からなる新規トリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のペプチドの１種または2種以上を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、茶葉由来のタンパク質をプロテアーゼ処理して得られる茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、国民の5人に1人以上がその患者か予備軍と言われる疾患であり、血糖値を降下させるホルモンであるインスリンの作用不足によって起こる慢性的な高血糖を特徴とする疾患である。糖尿病では、高血糖が続くことによって血管さらには臓器に障害を生じ、腎症、網膜症、神経症を発症する。また、動脈硬化性疾患のリスクが高まることも知られている。糖尿病には、膵β細胞が破壊されてインスリンが欠乏することによって発症する1型糖尿病と、インスリン分泌の低下と組織におけるインスリン感受性の低下によって発症する2型糖尿病がある。糖尿病と診断される人の90〜95%が2型糖尿病と言われており、2型糖尿病は体質以外にも肥満、運動不足、ストレス、飲酒、喫煙などの生活習慣の乱れが要因となっているため、生活習慣病の1つとして数えられている。
【０００３】
近年、2型糖尿病の治療においては、インクレチンと呼ばれる消化管ホルモンが脚光を浴びている。インクレチンは、食事の摂取に伴い消化管から分泌され、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進するホルモンであり、血糖値を上昇させるグルカゴンの分泌抑制作用や、膵β細胞の保護および増殖作用なども有している。このように、インクレチンは血糖値降下に重要な役割を担っているが、血中でジペプチジルペプチダーゼ-IV（dipeptidyl peptidase-IV、以下「DPP-IV」ともいう）により速やかに分解されて不活化するという問題があるため、2型糖尿病の治療戦略の1つとして、DPP-IV阻害剤が開発されている。
【０００４】
DPP-IV阻害剤としては、例えばフルオロピロリジン誘導体（特許文献１）、プロリン誘導体（特許文献２）などが知られている。しかし、これらのDPP-IV阻害剤は化学合成品であり、安全性の問題に注意を払わなければならない。
【０００５】
また、天然物由来のものとしてはカゼイン加水分解物（特許文献３）やチーズの水溶性画分（特許文献４）、コラーゲン酵素処理物（特許文献５）などが報告されているが、茶葉由来のタンパク質をプロテアーゼ処理して得られる茶葉タンパク質分解物がDPP-IV阻害活性を有するという報告はなく、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するという報告のみである（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2007-63286
【特許文献２】特表2007-537231
【特許文献３】特開2013-184962
【特許文献４】特開2014-1223
【特許文献５】WO2012/102308
【特許文献６】特開2015-100276
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、天然物から得られ、安全性が高いDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供することにある。また新規ペプチドVal-Ala-Tyr-Pro、His-Asp-Tyr又はLeu-Tyr-AsnをDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤として提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、茶葉あるいは茶殻をアルカリ溶液で抽出した後、抽出液をプロテアーゼ活性を有する酵素で処理して得られる茶葉タンパク質分解物がDPP-IV阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、茶葉タンパク質分解物を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤を提供するものであり、ジペプチジルペプチダーゼ-IV活性を阻害し、インクレチンの分解を抑制することによる血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供するものである。例えば、本発明は（工程１）茶葉にアルカリ溶液を加えて抽出液を得る工程、および、（工程２）工程１で得られる抽出液を、プロテアーゼ活性を有する酵素で処理して酵素反応液を得る工程、を含む製造方法により得られる茶葉タンパク質分解物を利用することができる。
本発明者らは茶葉タンパク分解物中にDPP-IV阻害活性を有するトリペプチドLeu-Gly-Pro、Thr-Gly-Tyr、His-Asp-Tyr、Val-Asp-Tyr及びLeu-Tyr-Asnを見出した。また該トリペプチドの内、His-Asp-Tyr、Leu-Tyr-Asnは今までに報告のない新規ペプチドである。
さらに、本発明者らは茶葉タンパク分解物中に高いDPP-IV阻害活性を有するテトラペプチドVal-Ala-Tyr-Proを見出した。当該テトラペプチドは今までに報告のない、新規ペプチドである。
即ち、本発明はトリペプチドであるLeu-Gly-Pro(以下「LGP」ともいう)、Thr-Gly-Tyr（以下「TGY」ともいう)、His-Asp-Tyr（以下「HDY」ともいう）、Val-Asp-Tyr（以下「VDY」ともいう）、Leu-Tyr-Asn（以下「LYN」ともいう）、テトラペプチドであるVal-Ala-Tyr-Pro（以下「VAYP」ともいう）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤、およびそれらを有効成分として含有するDPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用飲食品、サプリメント、医薬品および/または医薬部外品を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、高いDPP-IV阻害活性を有し、かつ、天然物である茶葉や茶殻由来のため安全性が高い。また、本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、茶飲料や茶エキスの製造工程で生じる茶殻を利用して製造することもできるため、製造コストの抑制や未利用資源の有効活用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例6で行った、茶葉タンパク質分解物12-Pをゲルろ過クロマトグラフィーに供したクロマトグラム（A）とDPP-IV阻害率（B）を示す図である。Aの縦軸はUV 230nmの吸光度、横軸は保持時間を示す。Bの縦軸はDPP-IV阻害率、横軸は保持時間を示す。
【図２】試験例7で行った、各画分におけるDPP-IV阻害活性貢献度を示す。縦軸はDPP-IV阻害活性貢献度、横軸は分取したフラクションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は茶葉タンパク質分解物を有効成分とする。分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物が好ましく、例えば、（工程１）茶葉にアルカリ溶液を加えて抽出液を得る工程、および、（工程２）工程１で得られる抽出液を、プロテアーゼ活性を有する酵素で処理して酵素反応液を得る工程を含む製造方法により得られる。
【００１２】
本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、血糖値の上昇を抑制し、高血糖状態の改善、糖尿病の進行を遅らせるために利用できる。なお、抗糖尿病剤とは糖尿病の予防、改善又は治療のために用いることができる剤を意味する。
【００１３】
（工程１）で使用する茶葉とは、チャノキ（Camellia sinensis）から得られる生葉、緑茶、白茶、烏龍茶、紅茶、ジャスミン茶などの茶葉を意味し、本発明においては、これら茶葉を原料として茶飲料や茶エキスを製造する際に生じる抽出残渣（茶殻）も茶葉の範疇に含む。茶葉に含まれるポリフェノール類がプロテアーゼを阻害し、茶葉タンパク質の分解効率を損なう恐れがあることから、茶葉を温水や熱水などで抽出してポリフェノール類が除去された茶殻を使用するのが好ましい。また、未利用資源の有効活用という点からも茶殻を使用するのが好ましい。使用する茶葉の大きさは浸漬が可能であれば特に限定されるものではなく、茶葉または茶殻を粉砕機等で粉砕しても良い。
【００１４】
アルカリ溶液の調製には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどのpH調整剤を用いる。茶葉タンパク質の抽出効率の点から、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの強アルカリを用いるのが好ましく、これらのpH調整剤を2種類以上混合して用いることも可能である。また、アルカリ溶液の濃度は茶葉タンパク質の抽出が可能な濃度であれば特に限定されるものではないが、茶葉タンパク質の抽出効率の点から、アルカリ溶液の濃度は0.01〜1Mが好ましく、0.02〜0.5Mがより好ましく、0.05〜0.2Mがさらに好ましい。
【００１５】
アルカリ溶液量には特に制限はなく、茶葉または茶殻100gに対して0.5〜10Lを用いれば良い。抽出後の中和反応と茶葉タンパク質の抽出効率の点から、1〜5Lが好ましく、1.5〜3Lがより好ましい。また、抽出時の抽出温度は茶葉タンパク質の抽出が可能な温度であれば特に限定されるものではないが、40〜95℃が好ましく、60〜90℃がより好ましく、75〜85℃がさらに好ましい。抽出時間は30分〜24時間程度であるが、製造コストと茶葉タンパク質の抽出効率の点から1〜15時間が好ましく、2〜10時間がより好ましく、3〜5時間がさらに好ましい。
【００１６】
次に、（工程２）では、（工程１）で得られる抽出液にプロテアーゼ活性を有する酵素を加え、茶葉由来のタンパク質を分解することでDPP-IV阻害活性を有する茶葉タンパク質分解物を含む酵素反応液を得ることができる。酵素の添加に先立ちアルカリ溶液で抽出した残渣を分離しても良いが、得られる茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害活性が高い点から、残渣を抽出液に混在させたまま（工程２）を行うのが好ましい。
茶葉のタンパク質は膜タンパク質であると推測され、膜に緩く結合している表在性タンパク質はアルカリ溶液で茶葉から抽出することが可能であるが、膜内在性タンパク質はアルカリ溶液では抽出され難く、残渣に残存していると考えられる。このため、残渣が混在する抽出液をプロテアーゼ処理することで、残存している膜内在性タンパク質の一部（親水性部分）が分解され、DPP-IV阻害活性成分と推測されるペプチドが遊離され易くなり、茶葉タンパク質分解物のDPP-IV活性が高まると考えられる。
【００１７】
本発明における「プロテアーゼ」は、「エンドペプチダーゼ」と「エキソペプチダーゼ」の総称である。さらに「エキソペプチダーゼ」は、「アミノペプチダーゼ」と「カルボキシペプチダーゼ」に分類される。また、プロテアーゼの至適pHによって、それぞれ酸性、中性、アルカリ性という用語を各酵素に付けることがあり、例えば「酸性エキソペプチダーゼ」、「中性アミノペプチダーゼ」、「アルカリ性エンドペプチダーゼ」のように記載することもある。
本発明におけるプロテアーゼ活性を有する酵素の由来は、微生物、植物、動物のいずれであっても良いが、安全性や価格を考慮すると市販の食品用プロテアーゼを用いることが好ましい。エンドペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼとしては、ビオプラーゼSP-20FG、ビオプラーゼOP（以上、エイチビィアイ）、スミチームLP-G、スミチームFL-G、スミチームCP、スミチームFP-G、スミチームMP、スミチームBR、スミチームBNP（以上、新日本化学工業株式会社）、ブロメラインF、プロテアーゼA「アマノ」SD、プロテアーゼM「アマノ」SD、プロテアーゼP「アマノ」3SD、サモアーゼPC10F、サモアーゼC100、サモアーゼC160、プロチンSD-NY10、プロテアックス（以上、天野エンザイム株式会社）、精製パパイン（三菱化学フーズ）を例示することができる。エキソペプチダーゼ活性を有するプロテアーゼとしては、スミチームLP-G、スミチームFL-G、スミチームFP-G、スミチームACP-G（以上、新日本化学工業）プロテアーゼA「アマノ」SD、プロテアーゼM「アマノ」SD、プロテアーゼP「アマノ」3SD、プロテアックス（以上、天野エンザイム）を例示することができる。本発明の実施において、プロテアーゼは1種もしくは2種以上を組み合わせても良い。組み合わせる場合には、それぞれのプロテアーゼ処理は同時に行っても良く、別々に行っても良い。茶葉タンパク質の分解効率の点から、エンドペプチダーゼ処理した後、エキソペプチダーゼ処理するのが好適である。
【００１８】
プロテアーゼの添加量は特に限定されないが、茶葉あるいは茶殻に対して、0.001〜5重量％の割合で用い、好ましくは0.01〜4重量％、さらに好ましくは0.02〜3重量％の割合で用いる。
【００１９】
プロテアーゼ処理の際、抽出液の液量は特に限定されるものではない。茶葉あるいは茶殻100gに対して0.5〜10Lが適しているが、膨潤した抽出残渣が存在する状態での混合、好ましくは撹拌を鑑みると、1〜5Lが好ましく、1.5〜3Lがより好ましい。茶葉あるいは茶殻100gに対して0.5L未満でもプロテアーゼ処理に支障はないが、抽出残渣が撹拌力の低下要因になる可能性がある。また、茶葉あるいは茶殻100gに対して10Lを超えると、濃縮工程にかかる負担が増大し、製造コストが上昇する要因になる。
【００２０】
プロテアーゼ処理時の反応pHは、プロテアーゼが作用できるpHであれば特に制限はないが、安定的に酵素が作用できるという点で、酵素の至適pH±1.5が好ましく、至適pH±1.0がより好ましく、至適pH±0.5がさらに好ましい。例えば、サモアーゼC160の至適pHは7.0付近であるが、茶葉由来のタンパク質を分解できる反応pHは5.5〜8.5であり、得られる茶葉タンパク質分解物の収量を増加させるためには、反応pHは6.0〜8.0が好ましく、6.5〜7.5がより好ましい。また、スミチームACP-Gの至適pHは4.5付近であるが、茶葉由来のタンパク質を分解できる反応pHは3.0〜6.0であり、得られる茶葉タンパク質分解物の収量を増加させるためには、反応pHは3.5〜5.5が好ましく、4.0〜5.0がより好ましい。
【００２１】
プロテアーゼ処理時の反応温度は、プロテアーゼの至適温度であることが望ましいが、プロテアーゼが作用できる温度であれば特に制限はない。プロテアーゼ処理中の雑菌汚染などのリスクを回避するためには50℃以上が好ましい。例えばサモアーゼC160の場合、70℃以下の温度で安定であり、至適温度は65℃付近である。茶葉由来のタンパク質を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は50〜68℃が好ましく、55〜65℃がより好ましい。また、スミチームACP-Gの場合、70℃以下の温度で安定であり、至適温度は50℃付近である。茶葉由来のタンパク質を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は40〜60℃が好ましく、50〜55℃がより好ましい。
【００２２】
本発明においては（工程１）の前および／または後に、植物の細胞壁や細胞間の結合部の主成分であるヘミセルロース、ペクチン、セルロースなどを分解する植物組織分解酵素で茶葉あるいは茶殻を処理し、茶葉の細胞壁や細胞間の結合部を分解することで茶葉タンパク質の抽出効率を高くし、茶葉タンパク質分解物の歩留を上昇させることも可能である。使用可能な植物組織分解酵素としては、微生物、植物、動物由来の酵素ならいずれも使用することができるが、安全性や価格を考慮すれば市販の食品用植物組織分解酵素を用いることが好ましい。食品用植物組織分解酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）、ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなど）、プロトペクチナーゼなどを例示できる。植物組織分解酵素を含有する酵素としては、スミチームC、スミチームACH、スミチームPX、スミチームSPC、スミチームMP（以上、新日本化学工業）、セルラーゼA「アマノ」3、セルラーゼT「アマノ」4、ヘミセルラーゼ「アマノ」90、ペクチナーゼG「アマノ」、ペクチナーゼPL「アマノ」（以上、天野エンザイム）、スクラーゼA、スクラーゼN、スクラーゼS、スクラーゼC、スクラーゼX（以上、三菱化学フーズ）、ペクチナーゼXP-534 NEO、セルラーゼXL−531、セルラーゼSS（以上、ナガセケムテックス）、マセロチームA、マセレイティングエンザイムY、セルラーゼ“オノズカ”3S、セルラーゼY-NC、ペクチナーゼ3S、ペクチナーゼSS、ペクチナーゼHL（以上、ヤクルト薬品工業）を例示することができる。また、1種の酵素製剤に2種以上の植物組織分解酵素が含有されていることがある。例えば、スクラーゼXはヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）の他に、セルラーゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼを含み、スクラーゼCはセルラーゼの他にヘミセルラーゼ（キシラナーゼ）とペクチナーゼを含有する。また、複数の植物組織分解酵素を含有する酵素を使用する場合は、複数の酵素を同時に作用させても、１種類ずつ逐次に作用させても良い。
【００２３】
植物組織分解酵素を含有する酵素の添加量は特に限定されないが、茶葉あるいは茶殻あたり、0.001〜5重量％の割合で用いるとよく、好ましくは0.01〜4重量％の割合で、より好ましくは0.02〜3重量％の割合で用いる。
【００２４】
植物組織分解酵素を含有する酵素を用いて処理する際の反応pHは、安定的に酵素が作用できるという点で、酵素の至適pH±1.5が好ましく、至適pH±1.0がより好ましく、至適pH±0.5がさらに好ましい。また、工程数を増加させることなく植物組織分解酵素を作用させるには、プロテアーゼとの併用となるため、pHが5.0〜9.0で安定的に作用できる植物組織分解酵素を含有する酵素が望ましく、スクラーゼC、スクラーゼX、ペクチナーゼXP-534 NEO、セルラーゼSS、マセレイティングエンザイムYを例示することができる。
【００２５】
植物組織分解酵素を含有する酵素を用いる際の反応温度は、酵素製剤に含有される植物組織分解酵素が安定的に作用できる温度であれば良く、至適温度であることが望ましい。しかしながら、酵素反応中の雑菌汚染などのリスクを回避するためには50℃以上で酵素分解を行うことが好ましい。例えばスクラーゼXの場合、65℃以下の温度で安定であり、至適温度は60℃付近である。茶葉の植物組織を分解できる温度は30〜70℃であり、反応温度は40〜65℃以下が好ましく、50〜60℃がより好ましい。
【００２６】
プロテアーゼ処理した酵素反応液のpHを2.0〜5.0、好ましくは2.5〜4.5、より好ましくは3.0〜4.0に調整して、未分解の茶葉タンパク質を等電点沈澱させた後、遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いてろ過することにより、純度の高いDPP-IV阻害活性を有する茶葉タンパク質分解物を得ることができる。この時に使用するpH調整剤は、pH2.0〜5.0に調整できるものであれば特に限定されないが、飲食物への利用を考慮して塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸など使用する。凝集沈殿の効率や製造後の除去のし易さを考えると、塩酸、硫酸、酢酸を使用することが好ましい。複数のpH調整剤を併用してもよい。酵素反応液に抽出残渣を含む場合は、等電点沈殿処理した後に沈殿した未分解の茶葉タンパク質と同時に抽出残渣を遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いたろ過により除去することができるし、等電点沈殿処理前に抽出残渣を遠心分離や珪藻土などのろ過助剤を用いたろ過で除去した後、未分解の茶葉タンパク質を等電点沈殿処理することも可能である。また、上述のpH調整の前後で、プロテアーゼや植物組織分解酵素を加熱失活させることも可能である。加熱失活の温度は80〜100℃、好ましくは90〜95℃、加熱失活の時間は10秒〜30分、好ましくは1〜25分である。
【００２７】
また、酵素反応液から目的とする茶葉タンパク質分解物を得るために、未分解の茶葉タンパク質および使用されたプロテアーゼなどを除去する方法としては、抽出残渣などの不溶物を除去した酵素反応液をそのまま限外ろ過膜を用いて膜処理し、透過液として茶葉タンパク質分解物を得る方法もある。限外ろ過膜を利用する場合はDPP-IV阻害活性成分であるペプチドを透過させることができるものであれば何でもよいが、好ましくは分画分子量1000〜100000、より好ましくは分画分子量2500〜50000、さらに好ましくは分画分子量3000〜5000以下が適している。酵素反応液から茶葉タンパク質分解物を得るためには、上述の限外ろ過膜のいずれか１種を用いて限外ろ過膜処理を行えば十分であるが、溶解性と色調により優れた茶葉タンパク質分解物を得るためには、例えば初めに分画分子量10000〜100000の限外ろ過膜処理を行い、透過液をさらに分画分子量1000〜10000の限外ろ過膜処理を行うなど、2種以上の限外ろ過膜を用いても良い。限外ろ過膜の分画分子量を100000より大きくした場合、透過液に未分解の茶葉タンパク質が多く含まれるため、得られる茶葉タンパク質分解物の溶解性が悪くなる可能性がある。限外ろ過膜の分画分子量が1000未満の場合、透過液の茶葉タンパク質分解物中のDPP-IV阻害活性成分であるペプチドの含有量が低下することが考えられるため、限外ろ過膜として好ましくない。
【００２８】
得られた茶葉タンパク質分解物には塩化ナトリウムなどの無機塩が含まれているが、電気透析やイオン交換樹脂、ナノろ過膜を用いて無機塩を除去することができる。また、酵素反応液を等電点沈澱処理した後に得られる茶葉タンパク質分解物に含まれる色素は、澄明な清涼飲料等の飲食品に違和感を与える可能性があるため、活性炭などの吸着剤を用いて色素を減少させ、添加した清涼飲料などの飲食品から違和感を除去することもできる。
【００２９】
さらに、得られた茶葉タンパク質分解物の溶液をそのままスプレードライやフリーズドライなどの方法により乾燥して粉末化することもできる。より好ましい方法としては、得られた茶葉タンパク質分解物溶液に、澱粉、加工澱粉、デキストリン、環状デキストリン、還元水飴、水飴、難消化性デキストリン、オリゴ糖、α化澱粉・アラビアガムなどの粉末化基材を添加溶解後、スプレードライやフリーズドライなどの方法により乾燥して茶葉タンパク質分解物を粉末化し、食品素材あるいは食品添加剤とすることもできる。
【００３０】
また、本発明の茶葉タンパク質分解物からなるDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を経口的に投与する場合の剤形は各種適宜選択することができ、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップなどの経口投与剤を例示することができる。
【００３１】
本発明で得られる茶葉タンパク質分解物はDPP-IV阻害活性を有するため、DPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿剤として経口的に摂取して、生体においてDPP-IVを阻害することにより血糖値の上昇を抑制することができる。また、本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる。DPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用の飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。茶系飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、炭酸飲料、果実飲料、果実、野菜飲料、清涼飲料（ボトルドウォーター）、乳飲料類、乳酸菌飲料類、ドリンク剤類、スポーツドリンク、豆乳、粉末飲料などの飲料類；アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、氷菓、ヨーグルト、プリン、ゼリーなどのデザート類；饅頭、羊羹、キャラメル、キャンディー、錠菓、スナック、クラッカー、ビスケット、クッキー、パイ、チョコレート、チューインガムなどの菓子類；和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類；パン類；ジャム類；マヨネーズ、ドレッシングなどの調味料類；レトルトカレーなどのレトルト食品などを挙げることができる。
【００３２】
飲食品に対する本発明の茶葉タンパク分解物の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。添加量としては飲食品一食あたり10〜2000mg、好ましくは50〜1000mg、より好ましくは100〜600mgであることがより好ましい。
【００３３】
また、本発明はVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を有効成分とするジペプチジルペプチダーゼ-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を提供するものである。本発明におけるVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）は、公知の有機化学合成法により得ることが出来る。また本発明記載の茶葉タンパク質分解物から単離することも可能である。
【００３４】
アミノ酸から有機合成方法によってVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を製造する場合、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば、ペプチド合成法としては、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法(ジシクロヘキシルカルボジイミド法)、活性エステル法、カルボイミダール法、酸加還元法等のペプチ合成法を例示することが出来る。これらのペプチド合成法は固相合成法と液相合成法（例えば特開2003-183298号公報参照）があり、固相合成法ではFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、Boc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）が公知の方法として知られているが、いずれの方法で合成してもよい。
【００３５】
Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）を本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。
【００３６】
当該ペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、経口的に摂取して生体においてDPP-IVを阻害することによりインクレチンの分解を抑制し、血糖値の上昇を抑制することができる。利用の形態は特に限定されないが、たとえば液剤、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として通常用いられる形態、たとえば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口投与剤を例示することができる。
【００３７】
当該ペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、当該ペプチドだけからなるものであってもよい。あるいは他の成分との組み合わせで調製してもよい。例えば他の血糖値上昇抑制剤、（スルホニル尿素薬、インスリン抵抗性改善薬、ビクアナイド薬、α―グルコシダーゼ阻害薬、グリニド薬など）、各種ビタミン剤（例えばビタミンＡ，ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥなど）などと併用してもよい。
【００３８】
本発明のVAYPを有効成分とするのDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を医薬品または医薬部外品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品または医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。
【００３９】
医薬品または医薬部外品に対する本発明のペプチド（VAYP）の配合量は、特に制限されない。対象となる医薬品または医薬部外品により配合量を適宜設定するが、一般的には、最終製品中でVAYPを0.001〜30重量％好ましくは0.01〜10重量％程度を含有する製剤形態に調製することが好ましい。
【００４０】
また本発明のVAYPを有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品として用いる場合はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。また、呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる。
【００４１】
本発明のペプチド（VAYP）を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。
即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、ボトルドウォーター（清涼飲料水）、栄養飲料、タバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類、レトルトカレーなどのレトルト食品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などを挙げることが出来る。
【００４２】
また、本発明の茶葉タンパク質分解物またはペプチド(VAYP)を含有するDPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用、又は抗糖尿病用の飲食品の例として、血糖値上昇抑制機能を有する特定保健用食品あるいは機能性表示食品、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または治療のために用いられる特定保健用食品あるいは機能性表示食品も含まれる。
【００４３】
本発明のトリペプチドであるLeu-Gly-Pro(LGP)、Thr-Gly-Tyr（TGY)、His-Asp-Tyr（HDY）、Val-Asp-Tyr（VDY）、Leu-Tyr-Asn（LYN）は、公知の有機化学合成法により得ることが出来る。また、本発明記載の茶葉タンパク質分解物から単離することも可能である。本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。また、前記記載のVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）と同様にアミノ酸から有機合成方法によってトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNを製造することができる。
【００４４】
本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNのアミノ酸からの合成方法は、例えば、ペプチド合成法としては、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法(ジシクロヘキシルカルボジイミド法)、活性エステル法、カルボイミダール法、酸加還元法等のペプチ合成法を例示することが出来る。これらのペプチド合成法は固相合成法と液相合成法（例えば特開2003-183298号公報参照）があり、固相合成法ではFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、Boc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）が公知の方法として知られているが、いずれの方法で合成してもよい。
【００４５】
本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY、LYNを本発明の茶葉タンパク分解物から得ようとする場合は、種々の既知精製手段を選択し、組合わせて行うことができる。例えば限外ろ過、ゲルろ過、高速液体クロマトグラフやイオンクロマトグラフ等の精製手段が挙げられる。
【００４６】
当該トリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、経口的に摂取して生体においてDPP-IVを阻害することによりインクレチンの分解を抑制し、血糖値の上昇を抑制することができる。利用の形態は特に限定されないが、たとえば液剤、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として通常用いられる形態、たとえば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口投与剤を例示することができる。
【００４７】
当該トリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、当該トリペプチドだけからなるものであってもよい。あるいは他の成分との組み合わせで調製してもよい。例えば他の血糖値上昇抑制剤、（スルホニル尿素薬、インスリン抵抗性改善薬、ビクアナイド薬、α―グルコシダーゼ阻害薬、グリニド薬など）、各種ビタミン剤（例えばビタミンＡ，ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ，ビタミンＤ，ビタミンＥなど）などと併用してもよい。
【００４８】
本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を医薬品または医薬部外品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品または医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。
【００４９】
医薬品または医薬部外品に対する本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上の配合量は、特に制限されない。対象となる医薬品または医薬部外品により配合量を適宜設定するが、一般的には、最終製品中で前記トリペプチドの合計配合量を0.001〜30重量％好ましくは0.01〜10重量％程度を含有する製剤形態に調製することが好ましい。
【００５０】
また本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品として用いる場合はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。また、呈味性（旨味、コク、重厚感）、溶解性および色調（非呈色性、透明性）に優れているため、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に含有させることができる
【００５１】
本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を有効成分とするDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を含有する飲食品としては特に制限はされないが、具体的に対象となる食品としては、以下のものが挙げられる。
即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、ボトルドウォーター（清涼飲料水）、栄養飲料、タバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、和風スープ、洋風スープ、中華スープ、味噌汁などのスープ類、レトルトカレーなどのレトルト食品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などを挙げることが出来る。
【００５２】
また、本発明のトリペプチドであるLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNのいずれか1種または2種以上を含有する飲食品として、DPP-IV阻害用、血糖値上昇抑制用又は抗糖尿病用の飲食品が例示できる。更には、血糖値上昇抑制機能を有する特定保健用食品あるいは機能性表示食品、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または治療のために用いられる特定保健用食品あるいは機能性表示食品も含まれる。
【００５３】
飲食品に対する本発明のトリペプチドLGP、TGY、HDY、VDY及びLYNの1種または2種以上の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。一般的には、最終製品中で0.001〜30重量％であることが好ましく、0.001〜5重量％であることがより好ましい。
【００５４】
本発明のトリペプチドHis-Asp-Tyr(HDY)、Leu-Tyr-Asn(LYN)は、後述の検索結果より新規ぺプチドであることが確認できた。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、以下の例示以外についても本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００５６】
［試験例1］各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物の調製
（茶葉タンパク質分解物の調製）
緑茶の乾燥茶殻1.5gに0.05M水酸化カリウム水溶液を21mL加えた後、50℃で3時間振とう抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。2M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを5.0に調整した後、プロテアーゼM「アマノ」SD（天野エンザイム株式会社製） 12.0mgを加えて50℃で4時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を沸騰水浴中で20分間加熱して酵素を失活させた後、2M塩酸水溶液を加えてpH3.3に調整して遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた上清に1M水酸化カリウム水溶液を添加してpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物の粉末245.2mgを得た。
【００５７】
［試験例2］各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物の調製とDPP-IV阻害率
（茶葉タンパク質分解物の調製）
緑茶の乾燥茶殻1.5gに0.05M水酸化カリウム水溶液を21mL加えた後、50℃で3時間振とう抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。2M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを5.0に調整した後、プロテアーゼM「アマノ」SD（天野エンザイム株式会社製） 12.0mgと[スクラーゼX](三菱化学フーズ株式会社製) 2.5mgを加えて50℃で4時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を沸騰水浴中で20分間加熱して酵素を失活させた後、2M塩酸水溶液を加えてpH3.3に調整して遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた上清に1M水酸化カリウム水溶液を添加してpH5.4に調整後、超純水を加えて50mLに定容して茶葉タンパク質分解物の水溶液を得た。この茶葉タンパク質分解物の水溶液を後述するDPP-IV阻害活性の測定に用い、残りは凍結乾燥して茶葉タンパク質分解物1の粉末304.5mgを得た。
プロテアーゼの種類・添加量、反応pHを変更する以外は同じ操作を行い、各種プロテアーゼで処理した茶葉タンパク質分解物を計11種類調製した（プロテアーゼの種類・添加量、反応pHを表1に示す）。また、プロテアーゼ処理を実施しない以外は同じ操作を行い、茶葉タンパク質を82.4mg調製し、比較対照とした。
【００５８】
〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕
DPP-IV阻害活性の測定にはDPP(IV) Inhibitor Screening Assay Kit（item No. 700210、ケイマンケミカルカンパニー U.S.A）を用いた。
緩衝液：20mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0、100mM NaClおよび1mM EDTAを含む）
酵素液：ヒト組換えDPP-IV（キット付属の酵素液を緩衝液で5倍希釈した）
基質液：0.2mMグリシルプロリン-4-メチルクマリル-7-アミド（AMC）
緩衝液30μL、酵素液10μLおよび茶葉タンパク質分解物または茶葉タンパク質の水溶液10μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、基質液50μLを加えた。DPP-IVによって遊離する7-アミノ-4-メチルクマリンの蛍光を37℃で30分間反応させながら、プレートリーダーCYTOFLUOR Series 4000（パーセプティブバイオシステムズ）を用い、5分間隔で測定した。励起波長は360nm、蛍光波長は460nmとした。
茶葉タンパク質分解物の水溶液の代わりに超純水10μLを加えた場合の蛍光を100とし、茶葉タンパク質分解物の水溶液を添加した場合の蛍光を100から差し引いた分をDPP-IV阻害率（%）とした。その結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
0006369951.tif 000002
【００６０】
表１に示す結果の通り、プロテアーゼ処理を施していない茶葉タンパク質のDPP-IV阻害率18.2%に対し、各種プロテアーゼ処理を施した茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害率は33.1〜67.3%と、茶葉タンパク質のプロテアーゼ処理によってDPP-IV阻害活性が顕著に向上していることが分かった。
【００６１】
［試験例3］茶葉タンパク質分解物の調製
緑茶葉50gを95℃の水1.25kgを用いて1時間抽出を行い、再度同じ条件で抽出を行って水分を含む茶殻115gを得た。茶殻115gに0.05M水酸化カリウム水溶液を0.71kg加えた後、50℃で3時間撹拌抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。4M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを7.0に調整し、サモアーゼC160 0.58gを加えて50℃で15時間酵素反応を行った。次に4M塩酸水溶液でpHを4.4に調整し、スミチームACP-G 0.50gを加えて50℃で1.5時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を90℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、4M塩酸水溶液で酵素反応液のpHを3.3に調整し、珪藻土ろ過を行った。得られたろ液を濃縮し、2M水酸化カリウム水溶液を用いてpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物を8.86g得た。
【００６２】
［試験例4］茶葉タンパク質分解物の調製
緑茶葉50gを95℃の水1.25kgを用いて1時間抽出を行い、再度同じ条件で抽出を行って水分を含む茶殻115gを得た。茶殻115gに0.05M水酸化カリウム水溶液を0.71kg加えた後、50℃で3時間撹拌抽出して抽出残渣が混在する抽出液を得た。4M塩酸水溶液を添加して抽出液のpHを7.0に調整し、サモアーゼC160 0.58gとスクラーゼX（三菱化学フーズ株式会社製）0.083gを加えて50℃で15時間酵素反応を行った。次に4M塩酸水溶液でpHを4.4に調整し、スミチームACP-G 0.50gを加えて50℃で1.5時間酵素反応を行って酵素反応液を得た。酵素反応液を90℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、4M塩酸水溶液で酵素反応液のpHを3.3に調整し、珪藻土ろ過を行った。得られたろ液を濃縮し、2M水酸化カリウム水溶液を用いてpH5.4に調整した後凍結乾燥を行い、茶葉タンパク質分解物12を11g得た。
【００６３】
［試験例５］茶葉タンパク質分解物の限外ろ過
試験例４で得た茶葉タンパク質分解物12（9.09g）を超純水180mLに溶解し、遠心式限外ろ過ユニットAmicon Ultra-15 3K（分画分子量3000、メルクミリポア）に15mLずついれ、遠心分離（3000g、60分間）を行った。得られた透過液を回収し、保持液側に超純水10mLを加えて遠心分離（3000×g、60分間）を行う操作を3回繰り返した。保持液と透過液を回収後、凍結乾燥を行い、分子量3000を超える画分（茶葉タンパク質分解物12-R）1.99gと分子量3000以下の画分（茶葉タンパク質分解物12-P）6.82gを得た。試験例２の方法により、DPP-IV阻害率を測定し、試験例９に従いIC50値を算出した。その結果、試験例４で得た茶葉タンパク質分解物のDPPIV阻害活性（IC50値）は579μg/ml、茶葉タンパク質分解物12-RのDPPIV阻害活性（IC50値）は542μg/ml、茶葉タンパク質分解物12-PのDPPIV阻害活性（IC50値）は519μg/mlであった。茶葉タンパク質分解物中における12-R、12-Pの画分の寄与率を以下の式で計算した。
12-Rの寄与率（％）＝[試験例４の茶葉タンパク質分解物のIC50（579μg/ml）/12-RのIC50（542μg/ml）]×試験例４記載の茶葉タンパク質分解物中の12-Rの含有量（21.9％）
12-Pの寄与率（％）＝[試験例４の茶葉タンパク質分解物のIC50（579μg/ml）/12-PのIC50（519μg/ml）]×試験例４記載の茶葉タンパク質分解物中の12-P含有量（75.0％）
その結果、12-Rの寄与率は23.4%、12-Pの寄与率は83.7%であった。この結果から、分子量3000以下の画分である12-Pが、茶葉タンパク質分解物中でのDPP-IV阻害活性に寄与していることが明らかになった。
【００６４】
［試験例６］分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のゲルろ過
試験例５で得た茶葉タンパク質分解物12-P 300mgを超純水10mLに溶解し、10%エタノール水溶液で平衡化したSephadex G-15カラム（26mm×970mm、GEヘルスケア）により分画した。移動相：10%エタノール水溶液、流速：50mL/hr、検出：UV 230nm。送液開始から100分経過後、カラムからの溶出液をフラクションコレクターにより5分12秒毎に1フラクションずつ採集した（フラクション1〜100）。試験例２の方法により奇数フラクションのDPP-IV阻害率を測定した。ゲルろ過クロマトグラムとDPP-IV阻害率を図１に示す。
【００６５】
図１に示す結果の通り、フラクション43〜53の画分（茶葉タンパク質分解物12-P-1）とフラクション67〜72の画分（茶葉タンパク質分解物12-P-2）に高いDPP-IV阻害活性が認められた。この2つの画分を凍結乾燥して茶葉タンパク質分解物12-P-1を65.5mg、茶葉タンパク質分解物12-P-2を21.8mg得た。
【００６６】
〔試験例７〕分取HPLCによるゲルろ過画分中のペプチドの精製
試験例６記載のゲルろ過画分12-P-1、12-P-2をそれぞれ分取HPLCに供し、さらに精製を行った。分取HPLCの条件は以下の通りである。
HPLCシステム：PLC761  分取HPLCシステム、ＧＬサイエンス株式会社製  
カラム：CAPCELLPAK MG 20i.d.×150mm、5μm、株式会社  資生堂社製
カラム温度：40℃
流速:15mL/分
移動相：(A)   水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
(B)   水/MeCN/HCOOH=60/40/0.1(容量比)
グラジエントプログラム：0〜10分 B 0%、10〜30分 B 0〜100%、30.1〜40分 B 0%
検出器:UV270nmとした。
ピークが検出される測定開始3〜25分までの間を20個のフラクションに分けて回収した。各画分について、エバポレータで濃縮し、凍結乾燥に供した。収量を確認後、各画分を2mg/mlの濃度になるよう、5％メタノール水溶液で溶解し、上記記載の〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕に準じて試験を行い、活性の強さを評価した。また、DPP-IV阻害率を算出後に、収量から各画分のDPP-IV阻害活性貢献度(％)を算出した。各画分の2mg/mlの[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値を算出し、フラクション1から20それぞれの[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値の合計値に対する1つの画分の[DPP-IV阻害率（％）×収量（mg）]の値が占める割合をDPP-IV阻害活性貢献度とした。
各画分の2mg/mlのDP各画分におけるDPP-IV阻害活性貢献度を図２に示した。これらのHPLC画分をさらにLC-MS分析に供し、含有されるペプチドの同定を行った。LC-MS分析条件を以下に記す。
【００６７】
[試験例８］LC-MS分析
試験例７で得た茶葉タンパク質分解物12-P-1と12-P-2のHPLC画分をLC-MS分析に供した。LC-MS分析条件は以下の通りである。
HPLCシステム：Surveyor HPLCシステム（サーモフィッシャー）
カラム：Poroshell 120 EC-C18（2.1mm×75mm、粒子径2.7μm、アジレント）
カラム温度：40℃
流速：0.2mL/min
移動相：（A）水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
（B）水/MeCN/HCOOH=50/50/0.1（容量比）
グラジエントプログラム：0〜3分 B 0%、3〜12分 B 0〜80%、12〜16分 B 80%、
16〜22分 B 0%
MSシステム：LCQ DECA XP PLUS（サーモフィッシャー）
イオン化：ESI
スプレー電圧：5kV
キャピラリー温度：350℃
ポラリティ：ポジティブ
【００６８】
LC-MS分析の結果、複数の画分でペプチドが確認された。このうち、茶葉タンパク質分解物12-P-1のHPLC画分からは以下のペプチドが検出された。フラクション4からはVal-Trp（VW）が検出された。フラクション5および6からAla-Trp（AW）が検出された。フラクション10からはHis-Asp-Tyr（HDY）が検出された。フラクション13からはIle-Pro（IP）、Ile-Trp(IW)、Ala-Asn-Leu（ANL）、Leu-Gly-Pro（LGP）が検出された。フラクション14からはIle-Pro（IP）、Val-Asp-Tyr（VDY）、 Leu-Gly-Pro（LGP）が検出された。フラクション15でVal-Ala-Tyr-Pro（VAYP）が検出された。
また、12-P-2のHPLC画分からは以下のペプチドが検出された。フラクション6でVal-Trp（VW）、Val-Asp-Tyr（VDY）、Thr-Gly-Tyr（TGY）、Leu-Tyr-Asn（LYN）が検出された。フラクション7でVal-Trp（VW）が検出された。フラクション9、10でLeu-Tyr（LY）、Ile-Tyr（IY）が検出された。
これらの検出されたペプチドのうち、ジペプチドは市販品（Bachem AG）を合成標準品とし、トリペプチドは株式会社医学生物学研究所に、またテトラペプチドは株式会社スクラムに合成を委託して作製させたものを合成標準品とした。これらの合成標準品を使用して、各フラクションで見られたペプチドと一致するか、LC-MSを用いて、多段階質量分析により、確認を行った。その結果、リテンションタイム、および4次までのプロダクトイオンのマススペクトルが合成標準品と全て一致し、これらのペプチドを同定した。
【００６９】
〔試験例９〕含有ペプチドのIC50値算出
次に茶葉タンパク質分解物中に存在することが確認されたペプチドについてDPP-IVの阻害活性を評価した。評価対象は表２に記載のペプチドとし、試験例８の各合成標準品を使用して、DPP-IV阻害活性を調べた。評価方法は上記記載の〔評価試験：DPP-IV阻害活性の測定〕に準じて行った。各ペプチドのDPP-IV阻害活性の強さを比較するため、DPP-IV阻害活性におけるIC50値（50%阻害濃度）を調べた。この値が低いものほど阻害活性が高く、少量で効率的にDPP-IV活性を阻害する評価基準となる。具体的には、各ペプチドをそれぞれ秤量し、2％アセトニトリル水溶液で溶解後、同溶液で段階的に5段階の濃度に希釈した。それぞれのサンプルについてDPP-IV阻害活性を確認した。濃度を横軸、阻害率を縦軸として、各濃度における阻害率をグラフ化して近似曲線を作成した。近似曲線から阻害率50％の時の濃度を算出し、IC50値とした。
各ペプチドのIC50値を表２に記す。
【００７０】
【表２】
0006369951.tif 000003
【００７１】
各ペプチドのIC50値を算出したところ、Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）で最も強いDPP-IV阻害活性があることが見出された。また、Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）をScifinder(化学関連情報検索サイト)で検索したところ、今までに報告のない新規ペプチドであることが確認できた。
また、His-Asp-Tyr(HDY)、Leu-Tyr-Asn(LYN)も同様にScifinderで検索したところ、新規ペプチドであることが確認できた。
【００７２】
〔試験例１０〕茶葉タンパク質分解物中のDPP-IV阻害活性ペプチドの定量分析
試験例９でDPP-IV阻害活性を有することが見出されたペプチドについて、試験例５で得られた分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物画分中の含有量を調べた。尚、試験例８の合成標準品をスタンダードとして使用した。結果を表3に記す。定量分析のためのLC-MS分析条件は以下の通りである。
分析機器： AgilentHPLCシステム（アジレント）
カラム：Poroshell 120 EC-C18（2.1mm×75mm、粒子径2.7μm、アジレント）
カラム温度：40℃
流速：0.2mL/min
移動相：（A）水/MeCN/HCOOH=100/2/0.1(容量比)
（B）水/MeCN/HCOOH=50/50/0.1（容量比）
グラジエントプログラム：0〜3分 B 0%、3〜12分 B 0〜80%、12〜16分 B 80%、
16〜22分 B 0%
MSシステム：3200QTRAP（ABSCIEX）
Ion Spray Voltage(IS)：5500.0
Temperature (TEM)：550
Curtain Gas (CUR)：10
Collision Gas (CAD): 3
スキャンモード：MRM(Multiple Reaction Monitoring) (各ペプチドのMRM設定を表に記した)
【００７３】
【表３】
0006369951.tif 000004
【００７４】
表３に記載したペプチドの合成標準品を約1mg/mlになるように2％アセトニトリル水溶液で溶解した。このペプチド溶液を1mlずつ試験管に入れ、さらに3mlの2％アセトニトリル水溶液を足して、合計10mlのペプチドスタンダート溶液を調整した。このペプチドスタンダート溶液を2％アセトニトリル水溶液で段階的に希釈し、スタンダートを調整した。茶葉タンパク分解物は5ml容量のメスフラスコに30mg程度計り取り、2％アセトニトリル水溶液で溶解した。0.45μmのフィルター(HP045AN;アドバンテック株式会社製)でろ過をしてから、上記のLC-MS分析に供した。測定終了後にまず各ペプチドスタンダードの検量線を作成した。横軸に各ペプチドスタンダートの濃度、縦軸に各ペプチドの検出されたMRM面積値とし、検量線を作成した。茶葉タンパク質分解物中に検出されたペプチド含量をこの検量線より算出した。
【００７５】
定量分析の結果、表４に示したぺプチドが試験例5で得た分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中に含まれることを確認した。次に各ペプチドの茶葉タンパク質分解物中におけるDPP-IV阻害活性への関与を調べるために含量から寄与率を算出した。寄与率の算出方法は、以下の通りである。
寄与率（％）＝（分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のIC50 / 各ペプチドのIC50）×分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の各ペプチド含有量（％）
尚、上記式の分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物のIC50は、試験例５より、519 μg/mlであること。また各ペプチドとは、表４に記載の単体のペプチドであり、寄与率（％）は、式中の各ペプチドのIC50、分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の各ペプチド含有量（％）は同じペプチドの値より算出した。各ペプチドのIC50は表２の値を使用した。
各ペプチドの試験例5で得た分子量3000以下の茶葉タンパク質分解物中の含有量（％）とDPP-IV阻害活性の寄与率（％）を表4に記す。
各ペプチドのうち茶葉タンパク質分解物中に多く含まれているのはTGY、IP、LGPであり、茶葉タンパク質分解物のDPP-IV阻害活性への寄与率が高いのはIP、VAYP、LGPであることが確認された。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
〔試験例１１〕飲料中のDPP-IV阻害活性ペプチドの定量分析
定量分析の条件は試験例１０記載の方法に準じて行った。飲料100mlをメスシリンダーで計り取り、エバポレーターで濃縮乾固させた。少量の2％アセトニトリル水溶液で洗い込みながら、全量を5ml容量のメスフラスコに移し、2％アセトニトリル水溶液でメスアップした。フィルター(HP045AN;アドバンテック株式会社製)でろ過をした後に試験例１０記載の定量方法で分析を行った。
【００７８】
合成法によるペプチドの合成を下記に示す。
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機（ABI433Aモデル）を使用し、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）によりペプチド鎖を延長し目的の保護ペプチド樹脂の合成をおこなった。
【００７９】
樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護基とペプチドの樹脂担体からの切り離しはトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid (TFA)） cocktail solution (4.125mL TFA, 0.25mL H2O, 0.375g フェノール（phenol）, 0.125 mL エタンジチオール（ethanedithiol）, 0.25mL チオアニソール（thioanisole）, 120 min) によって行った。得られた粗ペプチドは精製水に溶解し、0.45μmのフィルター (HP045AN;アドバンテック株式会社製) で濾過し、得られた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィーに供し精製を行い、目的のペプチドを得た。
カラム：SunFireC18OBD (30 i.d.×250 mm, 5μm, Waters社製)
移動相：Buffer A：H2O, 0.1% TFA（0.1体積％TFA水溶液）
Buffer B：Acetonitrile, 0.1% TFA（0.1体積％TFAアセトニトリル溶液）
勾  配：0〜10分：0% Buffer B, 10〜90分：0〜40% Buffer B
流  速：20 mL / min
検  出：UV 220 nm
【００８０】
精製ペプチドの純度はODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで測定した。
カラム：SunFireC18 (4.6 i.d.×150 mm, 5 μm, Waters社製)
移動相：Buffer A：H2O, 0.1% TFA（0.1体積％TFA水溶液）
Buffer B：Acetonitrile, 0.1% TFA（0.1体積％TFAアセトニトリル溶液）
勾  配：0〜20分：5〜40% Buffer B
流  速：1 mL / min
検  出：UV 220 nm
【００８１】
Val-Ala-Tyr-Pro（VAYP）の合成
出発アミノ酸担体はH-Pro-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、Val-Ala-Tyr-Proの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、100.0%であった。
【００８２】
His-Asp-Tyr（HDY）の合成
出発アミノ酸担体はH-Tyr(tBu)-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Asp-OH, Fmoc-His(Trt)-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、His-Asp-Tyrの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、99.8%であった。
【００８３】
Leu-Tyr-Asn（LYN）の合成
出発アミノ酸担体はH-Asn(Trt)-Trt-Resin樹脂を使用し、アミノ酸誘導体Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OHを用いてペプチド鎖を伸長した。上記の方法で精製を行い、Leu-Tyr-Asnの精製物を得た。上記の方法で精製物の純度を測定した結果、99.3%であった。
【００８４】
製造例1：烏龍茶飲料
烏龍茶葉（色種）30ｇを70℃のイオン交換水900ｇで5分間抽出し、続いて濾紙（No.2、アドバンテック株式会社製）で濾過することにより茶葉を除去して、820gの烏龍茶抽出液（pH5.5、Brix  0.9 °、タンニン濃度250mg/100mL）を得た。この烏龍茶抽出液を30℃ 以下まで冷却し、飲用濃度（タンニン濃度50mg/100mL）となるようにイオン交換水で希釈し、L-アスコルビン酸(30mg/100mL)と本発明のペプチド(VAYP)を飲用濃度50mg/100mLとなるよう添加した。これに炭酸水素ナトリウムを添加してpH6に調製した烏龍茶調合液を得た。これを容器に充填し、レトルト殺菌処理（121℃、7分間）を行って、烏龍茶飲料を得た。
【００８５】
製造例２：紅茶飲料
紅茶葉（ディンブラ）30ｇを70℃のイオン交換水900ｇで5分間抽出し、続いて濾紙（No.2、アドバンテック社製）で濾過することにより茶葉を除去して、780gの紅茶抽出液（pH5.0、Brix  1.0 °、タンニン濃度300mg/100mL）を得た。この紅茶抽出液を30℃ 以下まで冷却し、飲用濃度（タンニン濃度60mg/100mL）となるようにイオン交換水で希釈し、L-アスコルビン酸（30mg/100mL）と本発明のペプチド(VAYP)を飲用濃度50mg/100mLとなるよう添加した。これに炭酸水素ナトリウムを溶解してpH6に調製した紅茶調合液を得た。殺菌方法はＵＨＴ殺菌（１３５℃、３０秒）を行い、ＰＥＴボトルに充填し、紅茶飲料を得た。
【００８６】
製造例３：錠剤
以下の配合になるように各原料を混合した。
１．VAYP                                ３５．０重量％
２．結晶セルロース                      ３０．０重量％
３．乳糖                                ２０．０重量％
４．澱粉分解物                          １０．０重量％
５．グリセリン脂肪酸エステル              ５．０重量％
混合して得られた粉末を１錠あたり0.35gとなるように打錠成型することにより、VAYPを含有する錠剤を得た。
【００８７】
製造例４：粉末緑茶飲料
以下の配合になるように各原料を混合し、本発明のVAYPを含有する粉末緑茶飲料を調製した。
１．デキストリン                        ６０．０重量％
２．緑茶エキスパウダー                  ２６．０重量％
３．VAYP                                １０．０重量％
４．ビタミンＣ                            ４．０重量％
【００８８】
製造例５：食品素材
以下の配合になるように各原料を混合し、茶葉タンパク質分解物（分子量3000以下）を含有する食品素材を調製した。なお、茶葉タンパク質分解物は試験例５で調製したタンパク質分解物を使用した。
１．茶葉タンパク質分解物（分子量3000以下）     ８０．０重量％
２．デキストリン                                １５．０重量％
３．シクロデキストリン                            ５．０重量％
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤は、糖尿病予防・治療剤として使用できる。また、安全性が高い本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を飲食品中に配合することで、血糖値上昇抑制作用を有する飲食品を開発することができる。また、抽出残渣である茶殻を利用して本発明のDPP-IV阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤を製造することで、未利用資源の有効活用ともなる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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