(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分とするＣＤ４陽性Ｔ細胞及びパイエル板内の免疫細胞の増殖促進剤。
【化１】
0006369830.tif 000015
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２】
0006369830.tif 000016
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化３】
0006369830.tif 000017
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化４】
0006369830.tif 000018
【化５】
0006369830.tif 000019
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化６】
0006369830.tif 000020
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化７】
0006369830.tif 000021
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化８】
0006369830.tif 000022
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化９】
0006369830.tif 000023
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１０】
0006369830.tif 000024
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１１】
0006369830.tif 000025
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１２】
0006369830.tif 000026
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表す。）
【請求項２】
以下の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有するＣＤ４陽性Ｔ細胞及びパイエル板内の免疫細胞の増殖を促進するための飲食品。
【化１３】
0006369830.tif 000027
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１４】
0006369830.tif 000028
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１５】
0006369830.tif 000029
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１６】
0006369830.tif 000030
【化１７】
0006369830.tif 000031
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１８】
0006369830.tif 000032
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化１９】
0006369830.tif 000033
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２０】
0006369830.tif 000034
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２１】
0006369830.tif 000035
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２２】
0006369830.tif 000036
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２３】
0006369830.tif 000037
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【化２４】
0006369830.tif 000038
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテキン代謝物又はその誘導体を有効成分とする免疫細胞増殖促進剤、免疫賦活剤、及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫は、体内に侵入する病原体やウイルスなどの抗原から身を守る防御システムであり、種々の器官、臓器、細胞の密な連携により機能を発揮する。ところが、一度機能に障害が起こると、抗体産生量の減少や抗原侵入頻度の増加などが生じ、感染症や癌、自己免疫疾患など様々な疾病の引き金となる。また、免疫機能低下と加齢との関連も深いことが知られており、高齢社会のわが国にとって深刻な問題となっている。このような背景から、免疫機能の維持向上は病気に罹りにくい体をつくる上で非常に重要であると考えられ、これまでの研究により免疫応答メカニズムや免疫調節成分の探索、臨床試験への応用など幅広い報告がされてきた。特に近年では、予防医学の概念に基づいた免疫学研究が注目されており、疾病予防に向けた免疫機能の重要性はますます高まっている。
【０００３】
生体における免疫は、自然免疫と獲得免疫の２大システムから成り立っている。自然免疫は、初期の免疫応答を主体とした抗原非特異的な先天性免疫であり、獲得免疫はＢ細胞やＴ細胞などのリンパ球を主体とした抗原特異的な後天性免疫である。また、獲得免疫には細胞性免疫と体液性免疫の２つの機構が存在し、前者はＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞あるいはＣＤ８陽性のキラーＴ細胞の作用により細胞内に感染する抗原を直接排除する。一方、後者はＢ細胞より産生された抗体が血液中に分泌されることで細胞外の抗原排除や毒素の中和を行う。さらに、獲得免疫は一度誘導されると長期にわたり抗原を記憶し、同一の抗原が再度侵入した際に速やかに応答することができる。
【０００４】
抗原の主要な侵入経路は呼吸器と消化器粘膜である。そのため、これらの器官にはとりわけ複雑な免疫システムが備わっており、中でも腸管粘膜は生体最大の免疫器官として重要な役割を担っている。腸管粘膜上皮には種々の免疫細胞が存在し、パイエル板と呼ばれるリンパ組織を形成している。パイエル板内の免疫細胞は、抗原と接触することで抗原情報を他の免疫細胞へ伝達し、抗原特異的な防御体制を整える。例えば、免疫細胞の一つであるＢ細胞はＩＬ−１２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０などのサイトカインによるシグナル伝達を受けて抗原特異的ＩｇＡを産生し、抗原の上皮細胞への付着及び定着を阻害する。
【０００５】
免疫機能低下の要因には、加齢や遺伝、大気汚染などの環境要因の他に、食生活の乱れや運動不足、ストレスなどの生活習慣も深く関わっている。特に、ストレス社会と呼ばれる現代では上記の要因が組み合わさり、慢性的な免疫機能低下状態に陥りやすいことが懸念される。
【０００６】
免疫機能低下に対する治療法として、免疫賦活剤を用いた薬物療法が知られている。例えば、ピシバニールは好中球、マクロファージ、リンパ球などの増加促進やＮＫ細胞の活性促進により免疫賦活に関与する。一般に、免疫賦活剤はがん患者の延命を目的として化学療法と併用されることが多い。しかし、副作用として発熱や疼痛、さらにはアナフィラキシー様症状や急性腎不全など重篤な症状をきたす可能性もある。よって、健常者が疾病予防を目的に摂取する場合には、副作用リスクが低く、これまでの食経験から日常的に摂取可能な天然物由来のものが望ましいとされている。
【０００７】
植物ポリフェノールの一種である茶由来のカテキン類には、抗酸化作用、抗菌、抗ウイルス、抗う蝕、抗突然変異、血小板凝集抑制、血中コレステロール低下、血糖上昇抑制、抗アレルギー、消臭作用など非常に広範な生理活性がある。茶及び茶由来のカテキン類の免疫調節作用に関する研究も行われており、１８〜７０歳のヒトを対象とした介入研究では、カテキン類及びテアニンの摂取によりγδＴ細胞の作用が増強され、風邪やインフルエンザ様症状の発生を抑制することが報告されている（非特許文献１参照）。また、カテキン類の血中ＩｇＧ、ＩｇＡ産生誘導作用（特許文献１参照）や、エピガロカテキン／エピガロカテキンガレートのある一定比率での摂取がマクロファージ貪食作用の活性化及び分泌型ＩｇＡ産生の促進に寄与すること（特許文献２参照）、さらに、茶葉ポリフェノールの一種であるストリクチニンがヒト単核球やＢ細胞におけるＩＬ−４シグナリングを阻害すること（非特許文献２参照）などが報告されている。このような背景から、茶及び茶由来のカテキン類が生体での免疫調節に深く関与することが推察される。
【０００８】
カテキン類の優れた生理機能が数多く報告される一方で、カテキン類の生体内動態に関する研究も広く行われている。カテキン類は生体内への吸収量が非常に低く、経口摂取した大部分のカテキン類は腸内において腸内微生物（腸内細菌）の作用により分解され、代謝物として生体内へ吸収されることが示されている。腸内微生物によるカテキン類の代謝に関する報告は多く（非特許文献３−６参照）、主な代謝物として５−フェニル−γ−バレロラクトン（5-phenyl-γ-valerolactone）や５−フェニル−４−ヒドロキシ−吉草酸（5-phenyl-4-hydroxy-valeric acid）などが挙げられる。また、５−フェニル吉草酸（5-phenyl-valeric acid）、３−フェニルプロピオン酸（3-phenyl-propionic acid）、フェニル酢酸(phenyl acetic acid）、安息香酸（benzoic acid）など様々な代謝物が尿中から見出されている（非特許文献７−９参照）。
【０００９】
カテキン代謝物の生体内での機能性に関する知見としては、上記に示した５−フェニル−γ−バレロラクトン及び５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸の血圧上昇抑制作用、５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの抗炎症作用、５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの食道扁平上皮癌細胞、ヒト結腸腺癌細胞に対する増殖抑制効果及び抗炎症作用などが報告されている（特許文献３、非特許文献１０、１１参照）。しかしながら、カテキン代謝物又はその誘導体の免疫細胞増殖作用や免疫賦活作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２３２１１５号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６８５７９号公報
【特許文献３】特開２０１２−１４４５３２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J. Am. Coll. Nutr., 26, 445-452, 2007
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun.,280, 53-60, 2001
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem., 49, 4102-4112, 2001
【非特許文献４】Chem. Res. Toxicol., 13, 177-184, 2000
【非特許文献５】J. Agric. Food Chem., 51, 5561-5566, 2003
【非特許文献６】J. Agric. Food Chem., 51, 6893-6898, 2003
【非特許文献７】J. Agric. Food Chem., 58, 1313-1321, 2010
【非特許文献８】J. Agric. Food Chem., 58, 1296-1304, 2010
【非特許文献９】Chem. Pharm. Bull., 45, 888-893, 1997
【非特許文献１０】Free Radical Biol. Med., 36, 811-822, 2004
【非特許文献１１】Bioorg. Med. Chem. Lett., 15, 873-876, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、長年食されて安全性が経験的に確認されている天然物由来の成分又はその誘導体を有効成分とする免疫細胞増殖促進剤、免疫賦活剤、及び飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、主なカテキン類の代謝物として報告のある１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール、１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール、２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール、５−フェニル吉草酸、５−（３−ヒドロキシフェニル）−レブリン酸、５−フェニル−γ−バレロラクトン、３−フェニルプロピオン酸の生理活性作用を検討した。その結果、これらのカテキン代謝物には、免疫賦活と深く関与するマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びマウスパイエル板内の細胞の増殖促進効果があることを見いだし、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）以下の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物（以下、これらの化合物を総称して「本件化合物」ともいう）を有効成分とする免疫細胞増殖促進剤。
【００１５】
【化１】
0006369830.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００１７】
【化２】
0006369830.tif 000003
【００１８】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００１９】
【化３】
0006369830.tif 000004
【００２０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表し、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００２１】
【化４】
0006369830.tif 000005
【００２２】
【化５】
0006369830.tif 000006
【００２３】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００２４】
【化６】
0006369830.tif 000007
【００２５】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００２６】
【化７】
0006369830.tif 000008
【００２７】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００２８】
【化８】
0006369830.tif 000009
【００２９】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００３０】
【化９】
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【００３１】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００３２】
【化１０】
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【００３３】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００３４】
【化１１】
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【００３５】
（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
【００３６】
【化１２】
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【００３７】
（式中、Ｒは水酸基又は水素を表す。）
【００３８】
（２）上記の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分とする免疫賦活剤。
【００３９】
（３）上記の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する免疫細胞の増殖を促進するための飲食品。
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、免疫機能の向上を図り、様々な免疫疾患の予防又は治療が可能となる免疫細胞増殖剤又は免疫賦活剤や、免疫細胞の増殖を促進する飲食品を提供することができる。さらに、本発明の免疫細胞増殖剤、免疫賦活剤、及び飲食品の有効成分はカテキン代謝物又はその誘導体であり、長年食されて安全性が経験的に確認されていることから、副作用リスクが低く安全性に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、茶カテキン類や、茶カテキン代謝物又はその誘導体を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図２】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、化合物（V-2a）を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図３】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、化合物（VI-2a）を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図４】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、化合物（VI-4a）を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図５】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、化合物（V-3a）を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図６】マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、化合物（VI-3a）を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【図７】マウスパイエル板内の細胞に対して茶カテキン類、茶カテキン代謝物又はその誘導体を添加した場合の細胞増殖率を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の免疫細胞増殖促進剤としては、上記の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分とする免疫細胞増殖促進剤（以下、「本件免疫細胞増殖剤」ともいう）であれば特に制限されず、かかる免疫細胞増殖剤は、他の免疫細胞増殖剤や、免疫賦活剤や、インターロイキンやインターフェロンなどのサイトカインや、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥなどの各種ビタミン剤や、乳酸菌、酢酸菌、納豆菌、麹菌、酵母などの微生物と併用してもよい。
【００４３】
前記免疫細胞としてはヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞などのＴ細胞、Ｍ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、ＮＫ細胞を挙げることができ、Ｔ細胞、Ｍ細胞を好適に挙げることができる。また、免疫細胞増殖としては、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫細胞の増殖であっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫細胞の増殖であってもよい。
【００４４】
また、本発明の免疫賦活剤としては、上記の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分とする免疫賦活剤（以下、「本件免疫賦活剤」ともいう）であれば特に制限されず、かかる免疫賦活剤は、他の免疫賦活剤や、免疫細胞増殖剤や、前記サイトカインや、前記各種ビタミン剤や、前記各微生物と併用してもよい。
【００４５】
上記免疫賦活とは、生体が本来有する免疫機能を向上させることを意味する。免疫細胞の増殖により免疫賦活を導くことができ、免疫賦活により様々な免疫機能の障害に起因する疾患の予防又は治療が可能となる。
【００４６】
本発明の他の態様としては、本件化合物を対象に投与することを特徴とする免疫疾患の治療方法や、免疫細胞増殖促進剤として使用するための本件化合物や、免疫賦活剤として使用するための本件化合物や、免疫細胞の増殖を促進するための飲食品として使用するための本件化合物や、本件化合物の、免疫細胞増殖促進剤の調製における使用や、本件化合物の、免疫賦活剤の調製における使用や、本件化合物の、免疫細胞の増殖を促進するための飲食品の調製における使用を挙げることができる。
【００４７】
本件免疫細胞増殖促進剤には、本件化合物以外の免疫細胞増殖促進作用を有する物質を含んでもよく、本件免疫賦活剤には、本件化合物以外の免疫賦活作用を有する物質を含んでもよい。さらに、本件免疫細胞増殖促進剤や本件免疫賦活剤には、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。
【００４８】
本件化合物はカテキン代謝物又はその誘導体であることから、かかる本件化合物を有効成分とすることで安全性に優れた免疫細胞増殖促進剤、免疫賦活剤又は飲食品とすることが可能である。なお、カテキン代謝物とは、ヒト、ラット、マウス、ブタなどの哺乳動物の生体内に生息する微生物の作用などにより、カテキン類から生成しうる化合物を意味し、カテキン代謝物の誘導体とは、カテキン代謝物の基本構造はそのままで、一部が変化して生じた化合物を意味する。
【００４９】
上記カテキン類としては、茶、カカオ、アカシアなどから得られるものを用いればよいが、茶カテキン類が好ましく、非ガレート型カテキン類である（＋）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキン、（−）−カテキン、（−）−ガロカテキンや、ガレート型カテキン類である（−）−カテキンガレート、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレートを挙げることができ、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキンを好適に挙げることができる。
【００５０】
本件化合物は、例えば次の文献に示す公知の有機化学合成法（Chem. Rev., 89, 4, 863-927, 1989.、有機合成化学会誌, 59, 2, 109-120, 2001、Adv. Synth. Catal. 346, 111-124, 2004、Angew. Chem. Int. Ed., 48, 6507-6510, 2009、J. Agric. Food Chem., 57, 1231-1238, 2009、SYNTHESIS, 9, 1512-1520, 2010、Bioorg. Med. Chem. Lett., 15, 873-876, 2005）を組み合わせることにより得ることができる。例えば、５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの場合は３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ）ブロモベンゼン[(3-(tert-Butyldimethylsiloxy)bromobenzene)を基質とし、スワーン酸化やウィッティヒ反応を含む７つの反応を用いることで調製することが可能である。
【００５１】
また、本件化合物は、上記非特許文献７−９に示す腸内微生物を用いた微生物変換法により製造することも可能である。微生物変換法によりカテキン代謝物を製造する場合、ラットやヒトの腸内微生物を含む糞や盲腸内容物を培養して腸内微生物を増殖させた後、培養菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させ、懸濁液に基質となるカテキン類を加えてインキュベーション処理する方法を挙げることができる。
【００５２】
カテキン類を式（I）で表わされる化合物に変換する能力を持つ微生物の好ましい例としては、エガーテラ・レンタ：Eggerthella lenta JCM9979株及びアドラークルーツィア・エクオーリファシエンス：Adlercreutzia equolifaciens MT4s-5株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７３８）を挙げることができる。
【００５３】
カテキン類を式（II）で表わされる化合物に変換する能力を持つ微生物の好ましい例としては、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンス：Adlercreutzia equolifaciens MT4s-5株及びアドラークルーツィア・エクオーリファシエンス：Adlercreutzia equolifaciens JCM14793株を挙げることができる。
【００５４】
式（I）で表わされる化合物を、式（III）のＲ1が水酸基で表わされる５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、式（III）のＲ1が水素で表される５−フェニル吉草酸、式（V-1）、式(V-2)、式(V-3)、式(VI-1)、式(VI-2)、式(VI-3)、式(VI-4)で表わされる５−フェニル−γ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物の好ましい例としては、ユウバクテリウム属細菌及びクロスリジウム属細菌（新学名としてフラボニフラクター属細菌に属する細菌）を挙げることができ、さらに好ましくは、ユウバクテリウム・プラウティ：Eubacterium plautii（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）ATCC29863株、ユウバクテリウム・プラウティ：Eubacterium plautii（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）MT42株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７６５）及びクロストリジウム・オルビシンデンス：Clostridium orbiscindens（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）ATCC49531株を挙げることができる。
【００５５】
カテキン類を式（I）で表わされる化合物に変換する能力を持つ微生物と、式（I）で表わされる化合物を式（III）のＲ1が水酸基で表わされる５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、式(III)のＲ1が水素で表される５−フェニル吉草酸、式(V-1)、式(V-2)、式(V-3)、式(VI-1)、式(VI-2)、式(VI-3)、式(VI-4)記載の５−フェニル−γ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物を共存させた培養菌体懸濁液又は培養液に、カテキン類及び／又はカテキン含有物を基質として添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで上記の５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、５−フェニル吉草酸及び／又は５−フェニル−γ−バレロラクトン含有物を容易に得ることができる。インキュベーション処理方法については、上記微生物を培養後、集菌したものを緩衝液や生理食塩水、水などに懸濁させ基質を添加する方法、若しくは前記微生物の培養時あるいは培養開始後一定期間経過後に基質を添加する方法がある。さらに、前記微生物の生育する培養液中に基質を添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、５−フェニル吉草酸及び／又は５−フェニル−γ−バレロラクトンを容易に得ることもできる。
【００５６】
なお、カテキン類のうちピロガロール型カテキン類を式（I）のＲが水酸基である化合物に微生物変換するためには、培地中に水素及び／又は蟻酸を添加する必要がある。また、カテキン類のうち（−）−エピカテキンあるいは（＋）−カテキンを式（I）のＲが水素である化合物に微生物変換するためには、培地中に水素及び／又は蟻酸を添加することが望ましい。さらに、水素や蟻酸を培地中に添加しない場合には、水素及び／又は蟻酸生成微生物を共存させることも可能である。このような微生物の例として、大腸菌（Escherichia coli）を挙げることができる。
【００５７】
前記に示した微生物を培養する場合には、該当微生物が生育できる栄養源含有培地に接種し、嫌気的条件下で培養する。培養菌体を得るための微生物培養及び基質存在下での微生物培養は、一般的な嫌気性微生物の培養方法を採用することができる。また、培養菌体を集菌した後、前記基質の存在下でインキュベーション処理する場合にも、嫌気条件下で行うことが望ましい。培養に用いられる培地としては、前記微生物が生育できる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＡＭブイヨン（日水製薬社製）などが利用可能である。
【００５８】
培養条件は、前記微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６．０〜７．５、３５〜４０℃であり、好ましくはｐＨ６．５〜７．３、３７〜３９℃である。培養時間は通常２４〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間である。上述した各種の培養条件は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、最適条件を選択することができる。
【００５９】
微生物変換法によりカテキン代謝物を製造する場合、調製時には数種類のカテキン代謝物を含む抽出物が得られるが、精製を重ねることで高純度のカテキン代謝物を得ることが出来る。有機合成方法と同様に種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことで所望する純度が得られる。例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ブタノールなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製し、抽出物中のカテキン代謝物の含有率を調節することが出来る。
【００６０】
本件化合物の抱合体は、有機合成法及び微生物変換法により得られた５−フェニル−γ−バレロラクトンを基質とし、次の文献に示す公知の有機化学合成法（J. Nat. Prod., 76, 157-169, 2013.、Org. Biomol. Chem., 3(5), 886-900, 2005）を組み合わせることにより調製することができる。例えば、５−フェニル−γ−バレロラクトンのグルクロン酸抱合体は、次の文献に示す光延反応（Angew. Chem. Int. Ed., 48, 6507-6510, 2009）を用いて基質をグルクロン酸化させることで調製することが可能である。その他の調製法としては、ラットやマウスなどにカテキン類を投与し、回収した尿からカテキン代謝物抱合体を精製する方法や、抱合化酵素が含まれる動物の臓器ホモジネートを粗酵素として利用する方法、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子組み換え酵母をカテキン類に加えてインキュベーション処理する方法などが挙げられる。
【００６１】
本件化合物における芳香族脂肪酸、硫酸エステル及びグルクロン酸エステルは、必要に応じて無機塩基若しくは有機塩基との塩を形成させることができるが、薬学的に許容される塩が好ましい。芳香族脂肪酸、硫酸エステル及びグルクロン酸エステルの塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムなどの水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩などである。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンのようなモノ−、ジ−、及びトリ−アルキルアミン塩、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ―メチルグルコサミン塩などを挙げることができる。
【００６２】
本件化合物及び本件化合物の抱合体は、公知の分離精製方法を適宜組み合わせることで純度を上げることができる。例えば，極性溶媒又は非極性溶媒を用いて行う溶剤抽出方法や遠心分離、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフなどの精製手段が挙げられる。さらに、有機化学合成法により得られる本件化合物及び本件化合物の抱合体は、医薬上許容しうる規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。
【００６３】
本件免疫細胞増殖促進剤又は本件免疫賦活剤の利用の形態は限定されないが、例えば液状、粉末状、顆粒状などが挙げられる。食品又は栄養補助品の場合は、通常用いられる形態として、液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、酒精剤などが挙げられる。
【００６４】
本件免疫細胞増殖促進剤又は本件免疫賦活剤は、医薬品として用いることができ、薬学的に許容される担体を添加して製剤とすることができる。
【００６５】
上記医薬品としては日本薬局方に収められている医薬品であって、例えば、胃がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、子宮がん、食道がん、肝臓がんなどのがんや、アトピー性皮膚炎、花粉症などのアレルギーや、関節リウマチ、乾癬性関節炎などの自己免疫疾患や、白血病などの血液疾患や、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎などの免疫細胞の増殖を促進させて免疫機能の障害に起因する疾患を治療又は予防するための医薬品あれば特に限定されず、医薬品の製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、輸液剤などが挙げられる。外用剤の場合は、皮膚表面や粘膜などから体内へ吸収されるものであればどのような形態でもよく、例えばローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤、吸引剤などが挙げられる。
【００６６】
本件免疫細胞増殖促進剤又は本件免疫賦活剤は、医薬部外品として用いることができ、薬学的に許容される担体を添加して製剤とすることができる。
【００６７】
上記医薬部外品としては、厚生労働大臣が指定した医薬部外品であって、免疫細胞の増殖を促進させて、吐きけその他の不快感又は口臭若しくは体臭の防止や、あせも、ただれなどの防止や、脱毛の防止、育毛又は除毛や、人又は動物の保健のためにするねずみ、はえ、蚊、のみなどの駆除又は防止を行うための医薬部外品あれば特に限定されず、医薬部外品の製剤形態としては、例えば内服液剤、健康飲料、ビタミン含有保健剤、錠剤、顆粒剤、液剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００６８】
本発明の飲食品としては、上記の式（I）〜（VII）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物、好ましくは上記の式（I）、式（II）、式（IV）、式（V-2）、式（V-3）、式（VI-2）、式（VI-3）、式（VI-4）で表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する免疫細胞の増殖を促進するための飲食品（以下、「本件飲食品」ともいう）であれば特に制限されず、かかる飲食品はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態、ゲル状やペースト状の半固形状形態、粉末や顆粒やカプセル、タブレットをはじめとするサプリメントなどの固形状形態であってもよい。
【００６９】
前記飲食品としては、例えば、即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料やタバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などが挙げられる。
【００７０】
カテキン代謝物又はその誘導体を本件免疫細胞増殖促進剤や、本件免疫賦活剤や、本件飲食品に含有させるには、精製されたカテキン代謝物又はその誘導体を含有させてもよく、あるいは、粗精製されたカテキン代謝物又はその誘導体のようなカテキン代謝物又はその誘導体を含有する組成物を含有させてもよい。
【００７１】
以下に、茶カテキン代謝物又はその誘導体の製造例、試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
［茶カテキン代謝物又はその誘導体の製造例］
茶カテキン代謝物又はその誘導体として、上記式（I）で表わされる化合物である化合物（Ia）、（Ib）、（Ic）、上記式（II）で表わされる化合物である化合物（II）、上記式（III）で表わされる化合物である化合物（IIIa）、（IIIb）、（IIIc）、（IIId）、（IIIe）、上記式（IV）で表わされる化合物である化合物（IV）、上記式（V-1）で表わされる化合物である化合物（V-1a）、（V-1b）、上記式（V-2）で表わされる化合物である化合物（V-2a）、上記式（V-3）で表わされる化合物である化合物（V-3a）、上記式（VI-1）で表わされる化合物である化合物（VI-1a）、上記式（VI-2）で表わされる化合物である化合物（VI-2a）、上記式（VI-3）で表わされる化合物である化合物（VI-3a）、上記式（VI-4）で表わされる化合物である化合物（VI-4a）、上記式（VII）で表わされる化合物である化合物（VIIa）、VIIb）を、以下に示す製造例１〜１６の方法で製造した。表１にそれぞれの化合物の化合物名を示す。
【００７３】
【表１】
0006369830.tif 000014
【００７４】
（製造例１）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物(Ia)）の製造方法を以下に示す。
【００７５】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨン（組成（１Ｌ中）：ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１、日水製薬社製）に植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。大腸菌Ｋ１２株は、１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（−）−エピガロカテキン４２３ｍｇを含む４００ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記の培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析することで（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。ＬＣ／ＭＳ分析条件を以下に記載する。
【００７６】
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）、流速：０．２ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：（水／アセトニトリル／酢酸＝１００：２．５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝３５：２．５：６５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、２５分：Ａ０％  Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％  Ｂ０％、３３分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブとした。
【００７７】
次に、培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）して菌体を除去し、上清に塩酸を加えてｐＨ４．０に調整した。この上清液を３００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル層をエバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮液を適量の５％メタノール水溶液に溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【００７８】
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：５：９０：０．３  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：６５：３０：０．５  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、２０分：Ａ１０％  Ｂ９０％、２５分：Ａ１％  Ｂ９０％、２６分：Ａ８０％  Ｂ２０％、３５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【００７９】
分取後、上記ＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする代謝物の含まれる画分を確認後エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に５ｍｌの純水を加えて溶解し、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解して、凍結乾燥に供した。（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを９５．２ｍｇ得た。
【００８０】
（製造例２）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(R)-5-(3,5-Dihydroxyphenyl)-4-Hydroxy-Valeric Acd]（化合物（IIIa））及び（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3,5-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(VI-1a)）の製造方法を以下に示す。
【００８１】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピガロカテキン２９０ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析することで（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。次に、上記ＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行った。その後、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）に供し、得られた上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した。
【００８２】
培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した後、２００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル層に５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加えよく混合し、遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により２層分配させた。この酢酸エチル層に再度５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加えて混合し、同様に遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により２層分配を行った。この酢酸エチル層はエバポレーターにより濃縮乾固し、製造例１と同様に分取ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ分析処理を行い、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを４５ｍｇ得た。回収した炭酸ナトリウム水溶液は約２０ｍｌになるまでエバポレーターで濃縮し、塩酸を加えてｐＨ２．０〜４．０に調整後、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【００８３】
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水（５：５：９０  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水（５：６５：３０  容量比（ｖ／ｖ／ｖ）、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、２０分：Ａ１０％  Ｂ９０％、２５分：Ａ１０％  Ｂ９０％、２６分：Ａ８０％  Ｂ２０％、３５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【００８４】
分取後、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を含む画分（約５０ｍｌ）には１／２量の純水（２５ｍｌ）を加えてエバポレーターで液量が約５０ｍｌになるまで減圧濃縮し、有機溶媒を除去して水溶液とした。この水溶液を純水で平衡化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオンＳＫ１Ｂ  ナトリウム型、１０×６５ｍｍ）に通液し、純水で溶出した。得られた溶出液をエバポレーターで減圧濃縮し、凍結乾燥に供することにより（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸のナトリウム塩を１０３ｍｇ得た。
【００８５】
（製造例３）
アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＪＣＭ１４７９３株による（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール[(2R,3R)-2-(3,5-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-3,5,7-triol]（化合物(II)）の製造方法を以下に示す。
【００８６】
アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＪＣＭ１４７９３株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピガロカテキン１００ｍｇを含む１５０ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記菌株の前培養液を加え、３７℃で７２時間嫌気培養して変換反応を行った。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、製造例１のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析を行い、（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオールの生成を確認した。培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）して菌体を除去した後、上清に塩酸を加えてｐＨ２．０〜５．０に調整し、１２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル層をエバポレーターで濃縮乾固し、適量の純水で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣは製造例１の方法に従って行った。
【００８７】
分取後、代謝物を含む画分を製造例１の方法と同様にエバポレーターで濃縮乾固し、凍結乾燥に供することにより（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオールを３６ｍｇ得た。
【００８８】
（製造例４）
微生物変換法による５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）吉草酸[5-(3,5-dihydroxyphenyl)-valeric acid]（化合物(IIIb)）の製造方法を以下に示す。
【００８９】
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）５匹から糞便を５．６ｇ採取し、ＧＡＭブイヨン３００ｍｌに入れ、３７℃で２日間嫌気培養を行った。次に、この培養液を滅菌済みの遠心管に入れ、９０００×ｇで２０分間遠心分離を行った。上清を捨て、菌体に２００ｍｌの滅菌水を加えて菌体を洗浄した後、再度遠心分離（９０００×ｇ、２０分）を行った。得られた菌体を（−）−エピガロカテキン５０ｍｇを含む１００ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁した。３７℃で１０日間嫌気培養した。その後、培養液に２Ｍ塩酸水を加えてｐＨ４．０に調整し、遠心分離（９０００×ｇ、２０分）に供して菌体を除去した。上清を１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った後、酢酸エチル層を合わせてエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮液を１０％メタノール水溶液で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣは製造例１の方法に従って行った。
【００９０】
分取後、代謝物を含む画分を製造例１の方法と同様にエバポレーターで濃縮乾固し、凍結乾燥に供することにより５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）吉草酸を５．５ｍｇ得た。
【００９１】
（製造例５）
アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール[(3-hydroxyphenyl)-3-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-propan-2-ol]（化合物(Ib)）の製造方法を以下に示す。
【００９２】
アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。大腸菌Ｋ１２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（−）−エピカテキン３５０ｍｇを含む２００ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。次に、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１に記載のＬＣ／ＭＳ分析に供し、（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。
【００９３】
培養液は製造例１の方法に準じて調製及び分取精製を行い、（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを１１０ｍｇ得た。
【００９４】
（製造例６）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＭＴ４２株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(R)-5-(3-hydroxyphenyl)-4-hydroxy-valeric acid]（化合物(IIId)）及び（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3-hydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(V-1a)）の製造方法を以下に示す。
【００９５】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピカテキン２００ｍｇを含む２００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。次に、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＭＴ４２株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンへの変換を行った。培養後、製造例２に記載の方法に準じて培養液を調製し、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを５１ｍｇ得た。また、製造例２と同様の方法で培養液から（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸のナトリウム塩を５３ｍｇ得た。
【００９６】
（製造例７）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及び大腸菌Ｋ１２株共存下での（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール[(R)-1-(3-hydroxyphenyl)-3-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-propan-2-ol]（化合物(Ic)）の製造方法を以下に示す。
【００９７】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。大腸菌Ｋ１２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（＋）−カテキン２１０ｍｇを含む２００ｍｌのＧＡＭブイヨンに上記のＪＣＭ９９７９株及び大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供することで（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。培養液を製造例１に記載の方法に準じて調製及び分取精製を行った結果、（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを９７ｍｇ得た。
【００９８】
（製造例８）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ４９５３１株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(S)-5-(3-hydroxyphenyl)-4-hydroxy-valeric acid]（化合物(IIIe)）及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(S)-5-(3-hydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(V-1b)）の製造方法を以下に示す。
【００９９】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ４９５３１株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（＋）−カテキン２９０ｍｇを含む３００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養後、培養液１ｍｌをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＡＴＣＣ４９５３１株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンへの変換を行った。製造例２に記載の方法に準じて培養液を調製し、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを４１ｍｇ得た。また、製造例２に記載の方法と同様の方法で培養液から（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸のナトリウム塩を５２ｍｇ得た。
【０１００】
（製造例９）
有機合成方法による３−（３，５−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸[3-(3,5-dihydroxyphenyl)-propionic acid]（化合物(VIIa)）の製造方法を以下に示す。
【０１０１】
メタノール２０ｍＬに、炭酸カリウム８２９．２ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ）とホスホノ酢酸トリメチル（trimethyl phosphonoacetate）４３１．９μＬ（３．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌させた。次に、３，５−ジベンジルオキシベンズアルデヒド（3，5-dibenzyloxybenzaldehyde）を６３６．７ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）加え、さらに室温で２時間攪拌させた。攪拌後、２Ｍ塩酸を３．０ｍＬ加えて反応停止させ、水を３．０ｍＬ加えた後、酢酸エチル５０ｍＬで３回抽出した。酢酸エチル層を合一し、硫酸ナトリウムを加えて脱水後、硫酸ナトリウムをろ別し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮することで（Ｅ）−３−（３，５−ジベンジルオキシフェニル）−プロペン酸メチルエステル[(E)-3-(3,5-dibenzyloxyphenyl)-propeonic acid methyl ester]を７１４．９ｍｇ（１．９１ｍｍｏｌ、収率９５．５％）得た。
【０１０２】
得られた（Ｅ）−３−（３，５−ジベンジルオキシフェニル）−プロペン酸メチルエステルの全量（１．９１ｍｍｏｌ）を、メタノール１．５ｍＬとテトラヒドロフラン５ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム溶液を１．５ｍＬ滴下させながら室温で５時間攪拌した。攪拌後、２Ｍ塩酸を１．８ｍＬ加えて溶液をｐＨ７．０に調整し、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。次に、酢酸エチル層をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮液にパラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）［Ｐａｌｌａｄｉｕｍ，１０ｗｔ％（ｄｒｙ），ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｗｄｅｒ，ｗｅｔ］を３６８．１ｍｇ加えてアルゴン置換し、水素ガス供給下、室温で７．５時間攪拌させた。攪拌後は反応液をろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【０１０３】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：９．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、１３．５分：Ａ１３％  Ｂ８７％、１４分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６．５分：Ａ１００％  Ｂ０％、１９分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１０４】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮し、３−（３，５−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸の精製物を３２５．１ｍｇ（１．７９ｍｍｏｌ，収率８９．５％）得た。
【０１０５】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ＿ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），６．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），２．７６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）
【０１０６】
（製造例１０）
有機合成方法による５−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸[5-(3-hydroxyphenyl)-valeric acid]（化合物(IIIc)）の製造方法を以下に示す。
【０１０７】
３−（エトキシカルボニル）プロピル］−トリフェニルホスホニウムブロミド[3-(ethoxycarbonyl)propyl]-triphyenylphosphonium bromide３．４ｇ（７．４ｍｍｏｌ）にテトラヒドロフランを２０ｍＬ加えて脱気し、氷冷下にて２０分間攪拌した。次に、１．９Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド[sodium bis(trimethylsilyl)amide]のテトラヒドロフラン溶液を５．０ｍＬ加えてアルゴン置換し、氷冷下にて１時間攪拌した。さらに、１．１ｇ（５．１８ｍｍｏｌ）のｍ−ベンジルオキシベンズアルデヒド(m-benzyloxybenzaldehyde)を１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、反応液に加えて室温にて３時間攪拌した。攪拌後、５％クエン酸溶液を１０ｍＬ加えて反応停止させ、ジエチルエーテル５０ｍＬで３回抽出し、ジエチルエーテル層を水５０ｍＬ、飽和重曹水５０ｍＬ、飽和食塩水５０ｍＬの順で洗浄した。ジエチルエーテル層に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、硫酸ナトリウムをろ別し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮液にヘキサン／ジエチルエーテル＝１５０／５０（ｖ／ｖ）混合溶液を加えて一晩放置し、生成した不溶物をろ過することにより得られたろ液を再度減圧濃縮し、濃縮残渣にヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０（ｖ／ｖ）混合溶液を加えてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。最後に、分画液をエバポレーターで減圧濃縮することにより、（Ｚ）−５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸エチル[Ethyl(Z)-5-(3-benzyloxyphenyl)-4-pentenoate]を１．０２ｇ（３．２８ｍｍｏｌ、収率６３．３％）得た。
【０１０８】
得られた（Ｚ）−５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸エチルの全量（３．２８ｍｍｏｌ）をメタノール２ｍＬとテトラヒドロフラン２ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム溶液を２ｍＬ加えて室温にて８時間攪拌した。次に、２Ｍ塩酸を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を加えて１０ｍＬにした後、酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した。得られた酢酸エチル層を合一し、水１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬの順で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウムで脱水後、硫酸ナトリウムをろ別し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮することで（Ｚ）−５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸[(Z)-5-(3-benzyloxyphenyl)-4-pentenoic acid]を９３７．２ｍｇ（３．２７ｍｍｏｌ、収率９９．０％）得た。
【０１０９】
得られた（Ｚ）−５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸の全量（３．２７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル８ｍＬに溶解させ、溶液にパラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）［Ｐａｌｌａｄｉｕｍ，１０ｗｔ％（ｄｒｙ），ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｗｄｅｒ，ｗｅｔ］を３０１．０ｍｇ加えてアルゴン置換し、水素ガス供給下、室温で６．５時間攪拌させた。攪拌後は反応液をろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【０１１０】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：９．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ７０％  Ｂ３０％、３分：Ａ７０％  Ｂ３０％、１０分：Ａ０％  Ｂ１００％、１３分：Ａ０％  Ｂ１００％、１３．５分：Ａ７０％  Ｂ３０％、１８分：Ａ７０％  Ｂ３０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１１１】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸の精製物を４４５．２ｍｇ（４４５．２ｍｇ、収率４４．３％）得た。
【０１１２】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），６．６２（３Ｈ，ｍ），２．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．６４（４Ｈ，ｍ）
【０１１３】
（製造例１１）
有機合成方法による５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸（化合物(IV)）の製造方法を以下に示す。
【０１１４】
１．０ｍＬのアセトンに、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン４８．７ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム１０５ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌させた。次に、クロロメチルメチルエーテル（chloromethylmethyl ether）を８０．４μＬ（０．５０ｍｍｏｌ）加え、室温で２日間攪拌させた。攪拌後、５％クエン酸溶液を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、クロロホルム５ｍＬで３回抽出した。クロロホルム層を水５ｍＬと飽和食塩水５ｍＬで洗浄後、エバポレーターで減圧濃縮し、（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3-methoxymethyloxyphenyl)-γ-valerolactone]を６３．３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、収率９６．０％）得た。
【０１１５】
得られた（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの全量（０．２４ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム溶液を１００μＬ加えて室温で１時間攪拌した。次に、１Ｍギ酸−ナトリウムバッファーを加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、酢酸エチル４ｍＬで３回抽出した。さらに、酢酸エチル層にトリエチルアミンを１００μＬ加え、エバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）吉草酸[5-(3-methyoxymethyloxyphenyl)-valeric acid]のトリエチルアミン塩を５８．４ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ、収率９５．０％）得た。
【０１１６】
ジクロロメタン３ｍｌに５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）吉草酸のトリエチルアミン塩５８．４ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）とピリジン８０μＬ、デス−マーチンペルヨージナン(Dess-Martin periodinane)１７９．０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。次に、５％チオ硫酸ナトリウム溶液を３ｍｌ加えて３０分間攪拌し、５％クエン酸溶液を加えて溶液をｐＨ３．０に調整し液量を１０ｍＬにした後、ジクロロメタン１０ｍＬで３回抽出した。抽出後、ジクロロメタン層を５％チオ硫酸ナトリウム溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬの順で洗浄し、ジクロロメタン層を硫酸ナトリウムで脱水した。脱水後、硫酸ナトリウムをろ別して得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【０１１７】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：９．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ６０％  Ｂ４０％、３分：Ａ６０％  Ｂ４０％、１３分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６．５分：Ａ６０％  Ｂ４０％、２０分：Ａ６０％  Ｂ４０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１１８】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮し、５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸を３３．８ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、収率５８．３％）得た。
【０１１９】
得られた５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸の全量（０．１３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン１．５ｍＬと水０．５ｍＬ、トリフルオロ酢酸１ｍＬを加え、室温で１時間攪拌させた。攪拌後、反応液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮残渣を１ｍＬのアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【０１２０】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：９．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ９０％  Ｂ１０％、３分：Ａ９０％  Ｂ１０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８．５分：Ａ９０％  Ｂ１０％、２２分：Ａ９０％  Ｂ１０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１２１】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸の精製物を１１．６ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、収率２２．０％）得た。
【０１２２】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【０１２３】
（製造例１２）
有機合成方法による３−（３−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸『[3-(3-hydroxyphenyl)-propionic acid］』（化合物(VIIb)）の製造方法を以下に示す。
【０１２４】
トランス−ｍ−クマル酸(trans-m-coumaric acid)５．５３ｇ（３３．７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２ｍＬとメタノール２ｍＬに溶解させ、パラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）［Ｐａｌｌａｄｉｕｍ，１０ｗｔ％（ｄｒｙ），ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｗｄｅｒ，ｗｅｔ］を１．０ｇ加えてアルゴン置換した後、水素ガス供給下、室温で１８．５時間攪拌させた。攪拌後は反応液をろ過し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。
【０１２５】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：９．５ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、３分：Ａ８０％  Ｂ２０％、１２分：Ａ０％  Ｂ１００％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１５．５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、１８．５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１２６】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸[3-(3-hydroxyphenyl)-propionic acid]の精製物を５．３５ｇ（３２．２ｍｍｏｌ、収率９５．７％）得た。
【０１２７】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．０９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．６９（２Ｈ，ｍ），６．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．３Ｈｚ），２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．５８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）
【０１２８】
（製造例１３）
有機合成方法による（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトン（化合物(V-2a)）の製造方法を以下に示す。
【０１２９】
３０．９ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンにピリジン１０ｍｌ、硫酸ナトリウム５ｍｇ及び三酸化硫黄ピリジン１５２．２ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３日間攪拌させた。次に、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）と水を加えて反応停止させてエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮残渣を３ｍＬの水で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【０１３０】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：１９．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：過塩素酸ナトリウム／水（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、溶媒Ｂ：過塩素酸ナトリウム／アセトニトリル（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６分：Ａ１００％  Ｂ０％、２０分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１３１】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮し（（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンの粗精製物を得た。
【０１３２】
次に、得られた粗精製物に水を加え、エバポレーターにより減圧濃縮してアセトニトリルを除去した。この濃縮液をＳＵＰＥＬＣＯ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＤＳＣ−１８カラムにのせ、水３０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル３０ｍｌにて（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンを溶出した。溶出後、得られたアセトニトリル溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮して凍結乾燥に供することにより、白色粉末状の（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンの精製物を１５．８ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、収率３６．３％）得た。
【０１３３】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．２４（２Ｈ，ｍ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｍ），３．０４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，１２．０Ｈｚ），２．５０（２Ｈ，ｍ），２．３２（１Ｈ，ｍ），２．０２（１Ｈ，ｍ）
【０１３４】
（製造例１４）
有機合成方法による（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン］（化合物(VI-2a)）及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物(VI-4a)）の製造方法を以下に示す。
【０１３５】
１６３．１ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−５−（３，５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンにピリジン１０ｍｌと硫酸ナトリウム５ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した。次に、三酸化硫黄ピリジンを７９０．４ｍｇ（４．６８ｍｍｏｌ）加え、室温で１時間攪拌させた。攪拌後、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）を加えて反応停止させ、エバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣を３ｍｌの水で溶解し分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【０１３６】
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、資生堂社製）、流速：１９．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：過塩素酸ナトリウム／水（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、溶媒Ｂ：過塩素酸ナトリウム／アセトニトリル（１２２．４：５００  容量比（ｗ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１６分：Ａ１００％  Ｂ０％、２０分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２８０ｎｍとした。
【０１３７】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することによりアセトニトリルを除去し、（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの粗精製物をそれぞれ得た。得られた各粗精製物をＳＵＰＥＬＣＯ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＤＳＣ−１８カラムにＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  １５−３０μｍ、１０ｃｍ３）を追加充填したカラムにのせ、水１６０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル１７５ｍｌにて溶出した。得られた各アセトニトリル溶出画分をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮して凍結乾燥に供することにより、白色粉末状の（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの精製物をそれぞれ１２．５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、収率５．２％）、１４．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ、収率４．４％）得た。
【０１３８】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２４（２Ｈ，ｓ），６．１９（１Ｈ，ｓ），４．７９（１Ｈ，ｍ），２．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｍ），２．４６（１Ｈ，ｍ），２．３３（１Ｈ，ｍ），２．００（１Ｈ，ｍ）
（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【０１３９】
（製造例１５）
ラットを用いた（−）−エピカテキン経口投与による（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン(化合物((V-3a))の製造方法を以下に示す。
【０１４０】
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）６匹を精製飼料で１週間予備飼育し、試験前日より絶食させて試験に用いた。投与サンプルは（−）−エピカテキンを生理食塩水に溶解させた溶液とし、各ラットに２０ｍｇ／１．７ｍＬずつ胃内強制投与した。投与は4日間反復して行い、それぞれ投与後６時間〜２４時間の尿を回収した。
【０１４１】
回収した尿２３０ｍＬを合一し、エバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮した。次に、得られた濃縮液にメタノール２２５ｍＬを加えてよく混合した後、高速遠心分離（３０００×ｇ、１０分間、４℃）によりタンパク質沈殿物を除去した。得られた上清をエバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮し、水を加えて４５０ｍＬとした後、酢酸を加えてｐＨ３．０に調整した。０．１Ｍリン酸−クエン酸バッファーでｐＨ３．０に調整した尿水溶液をＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、３５ｃｃ）に通液した後、水１７５ｍＬ、２０％メタノール１７５ｍＬの順で洗浄した後、４０％メタノール１７５ｍＬにて（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを含む画分を溶出した。得られた４０％メタノール溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣に水５ｍＬを加えて分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【０１４２】
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ１８  ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学社製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒Ａ：メタノール／水／酢酸（５／９５／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：メタノール／水／酢酸（６０／４０／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％  Ｂ２０％、５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、１５分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８分：Ａ０％  Ｂ１００％、１８．１分：Ａ８０％  Ｂ２０％、２５分：Ａ８０％  Ｂ２０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【０１４３】
分取後、得られた分取液をＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれることを確認した。ＬＣ／ＭＳ条件を以下に記載する。
【０１４４】
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）、流速：０．２ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ：（水／アセトニトリル／酢酸＝１００：２．５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ：（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝３５：２．５：６５：０．１  容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ１００％  Ｂ０％、３分：Ａ１００％  Ｂ０％、２５分：Ａ０％  Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％  Ｂ０％、３３分：Ａ１００％  Ｂ０％、検出器：ＵＶ２７０ｎｍ、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブとした。
【０１４５】
さらに、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれる画分をリサイクルＨＰＬＣに供し、精製を行った。リサイクルＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【０１４６】
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ１８  ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学社製）、流速１５ｍｌ／分、溶媒：アセトニトリル／水／酢酸（１５／８５／０．２  容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、検出器：ＵＶ２７０ｎｍとした。
【０１４７】
分取後、本製造例１５における上記のＬＣ／ＭＳ分析により、分画した画分に（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれていることを確認した。この（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれる画分をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍｌの水を加えて溶解した後、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで、有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。最後に、乾固物に水２ｍＬを加えて溶解し、凍結乾燥に供することで（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを５．０ｍｇ得た。
【０１４８】
（製造例１６）
ラットを用いた（−）−エピガロカテキン経口投与による（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン（化合物(VI-3a)）の製造方法を以下に示す。
【０１４９】
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）６匹を精製飼料で１週間予備飼育し、試験前日より絶食させて試験に用いた。投与サンプルは（−）−エピガロカテキンを生理食塩水に溶解させた溶液とし、各ラットに２０ｍｇ/１．７ｍＬずつ胃内強制投与した。投与は４日間反復して行い、それぞれ投与後６時間〜２４時間の尿を回収した。回収した尿２５０ｍＬを合一し、製造例１５記載の方法に準じて調製及び分取精製を行うことで、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを２８．０ｍｇ得た。
【実施例２】
【０１５０】
［マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた免疫細胞増殖促進活性試験］
以下に免疫細胞増殖活性試験について説明する。
【０１５１】
（ａ）使用動物及び飼育方法
８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを無菌特殊環境下で予備飼育後、試験に用いた。飼育条件は、室温２０℃、相対湿度６０％、照射時間１２時間（８時〜２０時）とした。
【０１５２】
（ｂ）マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製及び試験方法
マウスより脾臓を摘出し、５ｍＬのロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地を入れた５ｍＬディッシュに浸した。次に、脾臓をスライドガラスですり潰して細胞懸濁液とし、金属メッシュを用いてろ過した。ろ過後、遠心分離（３５０×ｇ、５分）により上清を除去し、赤血球溶解バッファーで１分間培養した後、新しいＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて懸濁した。この洗浄操作を２回繰り返し行った後、ＣＤ４  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｔ（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ社製）を用いて細胞を分離し、ＲＰＭＩ培地にて１．５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。
【０１５３】
調製したマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対して、茶カテキン類である（−）−エピガロカテキンガレート（(-)-EGCG）、（−）−エピガロカテキン（(-)-EGC）、（−）−エピカテキンガレート（(-)-ECG）、（−）−エピカテキン（(-)-EC）、（＋）−カテキン（(+)-C）、（−）−カテキンガレート（(-)-CG）、（−）−ガロカテキン（(-)-GC）、（−）−ガロカテキンガレート（(-)-GCG）（三井農林社製）、及び上記実施例１で製造した茶カテキン代謝物又はその誘導体である化合物（Ｉa）〜（Ic）、（II）、（IIIa）〜（IIIe）、（IV）、（V-1a）、（V-1b）、（VI-1a）、（VIIa）、（VIIb）を最終濃度が１０μＭとなるように添加した。コントロール群は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を処理した群とした。各化合物を添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間培養し、ＡＴＰ測定キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞増殖率を測定した。測定方法はキットのプロトコールに従い行った。
【０１５４】
（ｃ）統計処理方法
得られた測定結果を平均値（ｍｅａｎ）及び標準誤差（ＳＥ）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔによりコントロール群と各試料の有意差を調べた。有意水準は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１とした。結果を図１に示す。
【０１５５】
同様に、調製したマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞に、上記実施例１で製造した茶カテキン代謝物又はその誘導体である化合物(V-2a)、(VI-2a)、(VI-4a)、(V-3a)、(VI-3a)を最終濃度が０．２５、０．５、１、５、１０μＭとなるように添加し、マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞増殖率を測定した。結果を図２〜６に示す。
【０１５６】
なお、図１において、横軸は添加した化合物、縦軸はコントロールを１００とした場合の相対ＡＴＰレベルを示し、図２〜６において、横軸は添加した各化合物の濃度、縦軸はコントロール（１０％ＤＭＳＯ処理）を１００とした場合の相対ＡＴＰレベルを示す。
【０１５７】
図１から図６に示すように、マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた場合、いずれの茶カテキン代謝物又はその誘導体を添加した場合でも、細胞増殖率がコントロール群に比べ有意に上昇し、特に、茶カテキン代謝物である化合物（IIIe）を添加した場合に関しては、マウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖率は３０７．５％と高い増殖率を示した。また、化合物（V-2a）、(VI-2a)、(VI-4a)、(V-3a)、(VI-3a)、を添加した場合に関しては，１０μＭ以下の低濃度においてもマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞の細胞増殖率の有意な上昇が認められた。
【実施例３】
【０１５８】
［マウスパイエル板内の細胞を用いた免疫細胞増殖促進活性試験］
（ａ）マウスパイエル板内の細胞の調製及び試験方法
マウスよりパイエル板を摘出し、２ｍＬの１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地を入れた５ｍＬディッシュに浸した。次に、１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を入れた別のディッシュにパイエル板を移し、カミソリで切断した、シリンジのピストンでパイエル板を潰し、３ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地をシャーレに入れて細胞懸濁液とした。２重にしたメッシュに通してろ過後、遠心分離（３００×ｇ、５分）により上清を除去し、５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加えて同条件下で遠心分離した。この操作を３回繰り返し行った後、ＲＰＭＩ１６４０培地を適量添加して１．５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した。
【０１５９】
調製したマウスパイエル板内の細胞に対して、（−）−エピガロカテキンガレート（(-)-EGCG）、（−）−エピガロカテキン（(-)-EGC）、（−）−エピカテキンガレート（(-)-ECG）、（−）−エピカテキン（(-)-EC）、（＋）−カテキン（(+)-C）、（−）−カテキンガレート（(-)-CG）、（−）−ガロカテキン（(-)-GC）、（−）−ガロカテキンガレート（(-)-GCG）（三井農林社製）、及び上記実施例１で製造した茶カテキン代謝物である化合物(Ia)、(Ic)、(V-1a)を最終濃度が１０μＭとなるように添加した。コントロール群は、１０％ＤＭＳＯを処理した群とした。各化合物を添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間培養し、ＡＴＰ測定キットを用いてマウスパイエル板内の細胞の細胞増殖率を測定した。測定方法はキットのプロトコールに従い行った。
【０１６０】
（ｂ）統計処理方法
得られた測定結果を平均値（ｍｅａｎ）及び標準誤差（ＳＥ）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔによりコントロール群と各試料の有意差を調べた。有意水準は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１とした。結果を図７に示す。
【０１６１】
なお、図７において、横軸は添加した化合物、縦軸はコントロールを１００とした場合の相対ＡＴＰレベルを示す。
【０１６２】
図７に示すように、マウスパイエル板内の細胞を用いた場合、化合物(Ia)、(Ic)、(V-1a)のいずれの茶カテキン代謝物を添加した場合でも、細胞増殖率が棄却率５％で有意に上昇した。上記３つの化合物はマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞においても有意な細胞増殖率を示し、高い免疫細胞増殖促進効果を有することが確認された。
【実施例４】
【０１６３】
（製造例：錠剤）
（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（０．５重量％）、キシリトール（３３．８重量％）、マンニトール（３０．６重量％）、微結晶性セルロース（６．１重量％）、着香料（１４．１重量％）、ステアリン酸（４．３重量％）、タルク（０．６重量％）及びソルビトール（１０．０重量％）を混合した粉体を錠剤プレスによって圧縮し、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的とした錠剤を得た。
【実施例５】
【０１６４】
（製造例：皮膚外用液剤）
精製水に（Ｒ）−５−(３，５−ジスルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトン（５．０重量％）、グリセリン（５．０重量％）及びプロピレングリコール（４．０重量％）を加え溶解した。一方、エタノール（０．１重量％）にオレイルアルコール（０．１重量％）及び安息香酸（０．０５重量％）を室温で溶解した。これを精製水部に加えて可溶化してろ過後、充填することにより、（Ｒ）−５−(３，５−ジスルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的とした皮膚外溶液剤を得た。
【実施例６】
【０１６５】
（製造例：軟膏）
精製水に（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（３．０重量％）、ハッカ油（０．５重量％）、ティーツリー油（０．３重量％）、ワセリン（２５．０重量％）、ステアリルアルコール（２０．０重量％）、プロピレングリコール（１２．０重量％）、ＰＯＥ硬化ヒマシ油（４．２重量％）、モノステアリン酸グリセリン（１．０重量％）、プロピルパラベン（０．１重量％）及びメチルパラベン（０．１重量％）を湯浴上で加温融解させて混合した後、混合物を室温に冷却し、（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを含有する免疫機能の維持向上を目的とした軟膏を得た。
【実施例７】
【０１６６】
（製造例：キャンディー）
砂糖（３３．０重量％）、水飴（６６．０重量％）、クエン酸（０．６７重量％）、香料（０．２１重量％）、着色料（０．０７重量％）及び（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（０．０５重量％）をキャンディー処方により常法で調製し、（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを含有する免疫機能の維持向上を目的としたキャンディーを得た。
【実施例８】
【０１６７】
（製造例：清涼飲料水）
果糖ブドウ糖液糖（１３．０重量％）、クエン酸（０．３重量％）、アスコルビン酸（０．０３重量％）、クエン酸ナトリウム（０．０２重量％）、香料（グレープフルーツフレーバー）（０．１重量％）及び（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール（０．１重量％）に水を加えて溶解し、５リットルの飲料を調製した。溶液は１００ｍｌをガラス瓶容器に分注して常法により殺菌を行い、（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオールを含有する免疫機能の維持向上を目的とした清涼飲料を得た。
【実施例９】
【０１６８】
（製造例：無糖茶飲料）
市販無糖茶飲料として緑茶（三井農林社製）２００ｍｌに（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸０．1ｇを添加溶解後、常法にて殺菌し、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を含有する免疫機能の維持向上を目的とした無糖茶飲料を得た。
【実施例１０】
【０１６９】
（製造例：スポーツ飲料）
（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシ− ５−ヒドロキシフェニル)−γ−バレロラクトン（０．１ｍｇ）、ビタミンＢ１塩酸塩（０．４５ｍｇ）、ビタミンＢ２（０．２ｍｇ）、ビタミンＣ（１０ｍｇ）、ナイアシン（０．８ｍｇ）、パントテン酸Ｃａ（０．２２ｍｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（１２．５７ｍｇ）、クエン酸（１００ｍｇ）及び果糖（２．５ｇ）の成分にイオン交換水を加え全量を２００ｍｌとし、（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシ− ５−ヒドロキシフェニル)−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的としたスポーツ飲料を調製した。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明の免疫細胞増殖促進剤又は免疫賦活剤は免疫細胞の増殖や免疫賦活を促進することから、免疫機能の向上を図り、様々な免疫疾患の予防又は治療分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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