(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
包埋三次元微生物培養のための組成物であって、機械的に分解された数平均直径が２００ｎｍ以下であるナノフィブリルセルロース及び少なくとも１つの栄養源を含み、ヒドロゲルの形態である組成物であって、組成物中のナノフィブリルセルロース含有量が０．０５〜８０重量％である、組成物。
【請求項２】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のナノフィブリルセルロース及び微生物のナノフィブリルセルロースから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ナノフィブリルセルロースが、天然ナノフィブリルセルロース及び化学的に改質したナノフィブリルセルロースから選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ナノフィブリルセルロースが、天然のイオン交換ナノフィブリルセルロースである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が、水、及び任意選択で添加物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
包埋三次元微生物培養のためのヒドロゲルの形態の組成物の製造方法であって、機械的に分解された数平均直径が２００ｎｍ以下であるナノフィブリルセルロースを提供する工程と、前記ナノフィブリルセルロースを水、少なくとも１つの栄養源及び任意選択で添加物と混合して混合物を得る工程とを含む方法であって、組成物中のナノフィブリルセルロース含有量が０．０５〜８０重量％である、方法。
【請求項７】
ナノフィブリルセルロースが、植物由来のナノフィブリルセルロース及び微生物のナノフィブリルセルロースから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ナノフィブリルセルロースが、天然ナノフィブリルセルロース及び化学的に改質したナノフィブリルセルロースから選択される、請求項６又は７に記載の方法。 
【請求項９】
ナノフィブリルセルロースが、天然のイオン交換ナノフィブリルセルロースである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
嫌気性又は半嫌気性微生物培養、発酵プロセス、又はバイオリーチングプロセスにおける、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
包埋微生物培養のための三次元マトリックスであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と、生きた微生物細胞とを含み、該微生物が、細菌、酵母、カビ及び原生動物から選択される、マトリックス。
【請求項１２】
微生物細胞が、好気性細菌、通性細菌又は耐気性細菌の細胞である、請求項１１に記載のマトリックス。
【請求項１３】
微生物培養における培養マトリックスとしての、発酵プロセスにおける固定化マトリックスとしての、並びに微生物の貯蔵及び移送のための、請求項１１又は１２に記載のマトリックスの使用。
【請求項１４】
微生物の包埋三次元培養方法であって、生きた微生物細胞を提供する工程であって、該微生物が、細菌、カビ、酵母及び原生動物から選択される工程と、該細胞を請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と接触させてマトリックスを形成する工程と、包埋微生物培養のための環境において、三次元的な配置で、前記マトリックス中で該細胞を培養する工程とを含む、方法。
【請求項１５】
不活性ガスが、マトリックス中及び／又はマトリックス上を通過する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
大気圧を下回る圧力下で実施する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
分析的方法、発酵方法又はバイオリーチング方法である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野におけるフィブリルセルロースの新規適用に関する。特に、本発明は、嫌気性及び半嫌気性微生物の培養方法を含む、包埋微生物培養方法のためのフィブリルセルロースを含む組成物に関する。本発明はまた、嫌気性及び半嫌気性微生物培養方法を含む包埋微生物培養方法のためのフィブリルセルロースを含む三次元のマトリックスにも関する。本発明はさらに、包埋微生物培養方法のためのマトリックスにおけるフィブリルセルロースの使用及び使用方法、並びに包埋微生物培養の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲル材料は、親水性の支持材料を必要とする培養作業で使用されており、例えば、寒天タイプのハイドロコロイドが、様々な微生物学的目的のために、植物細胞、細菌及び真菌の培養において広く使用されている。
【０００３】
寒天は、Ｄ−ガラクトース及び３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースからなる直鎖状かつ非イオン性の多糖であり、海藻から生産される。固体培養では、微生物細胞の懸濁液を、通常、１．５ｗｔ％の寒天と栄養液とを含む寒天ヒドロゲルの表面上に塗抹する。微生物は増殖し、肉眼で見えるコロニーを形成するが、これは分離することができ、純粋な培養物が得られ得る。固体寒天プレートの使用により二次元増殖がもたらされ、切り取りによる機械的分離が必要になる。
【０００４】
寒天プレートの使用に代わるいくつかの方法、例えば、シュードモナス・エロディア（Pseudomonas elodea）によって生産されるジェランガムなどが提案されている。ジェランガムは、お湯に溶けやすく、冷却すると固いゲルを形成し、より高い温度で改善された安定性を示す。ジェランガムをベースとするヒドロゲルは、栄養物及び添加物への感受性が高く、慎重な培地の配合が必要となる。また、固体ジェランガムプレートを使用すると、二次元増殖がもたらされる。
【０００５】
Deguchi, S. et al．Preparation and characterisation of nanofibrous cellulose plate as a new solid support for microbial culture, Soft Matter, 2007, Vol. 3, No． 9, s. 1170-1175では、微生物の固体培養のために、ナノファイバーセルロースプレートが提案されており、ここでは、微結晶性セルロースをＣａ（ＳＣＮ）２飽和水溶液に分散させることによってセルロースを得て、セルロースとチオシアン酸カルシウムイオン間で複合体を形成し、その後、加熱によりセルロースを溶解し、粘性溶液を得た。次いで、前記溶液を培養皿に注ぎ、固化させてから、メタノール及び水で洗浄した。洗浄後、ゲル化を固定した。プレートにおける最適なセルロース濃度は、２〜３ｗｔ％であった。プレートの孔を適切な栄養液で満たした。大腸菌、枯草菌及びS. セレビシエ（S. cerevisiae）並びにT. サーモフィラス（T. thermophilus）が、該セルロースプレート上で増殖した。
【０００６】
米国特許第５，２５４，４７１号には、極細繊維でできた、細胞培養用の担体が開示されている。ＷＯ２００９／１２６９８０には、１５０〜６２００の平均重合度を示すセルロースを含む、セルロースベースのヒドロゲルが開示されている。
【０００７】
嫌気性及び半嫌気性微生物の培養技術は、通常、現在の増殖培地及びプレーティングシステムでは実施が難しいと考えられている。クロストリジウム種（Clostridial species）等、酸素に強い感受性を有する微生物種がいくつかあり、そのため、酸素を培養環境から取り除くことが必須である。さらに、微生物コロニーは、通常、培養培地から切り取られ、その後、培養培地を取り除かなければならない。
【０００８】
嫌気性及び半嫌気性微生物は、多くの場合、包埋システムで培養される。前記システムにおいては、例えば、微生物のパラフィン包埋培養と、２つの寒天層間又はプレート間での培養とが提案されている。
【０００９】
微生物の培養、発酵及び微生物試料の貯蔵に関連して、微生物の検出、計数（enumeration）及び定量化が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する技術に基づき、今日広く使用されている。ＰＣＲでは、微生物を破砕して、そのＤＮＡを取り出した後、該ＤＮＡを特異的オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ及び適切なサーマルサイクラーを使って定量化する。多くの材料、特にポリマー材料は、ＰＣＲ反応を阻害し、微生物定量化の信頼性を損なわせる。通常、そのような材料は、発酵培地、培養培地、試料貯蔵マトリックス、発酵促進剤（fermentation enhancers）及び移送マトリックスとして使用されているが、これらは検出及び定量化の手順を妨害する。
【００１０】
既存の三次元（３Ｄ）細胞培養生体材料では、培養細胞に深刻なダメージを与えることなく、例えば針でヒドロゲルマトリックスを移送することができない。
【００１１】
従って、技術水準の材料のデメリットを回避できるか、又は少なくともかなり低減できるような、嫌気性及び半嫌気性の方法を含む包埋微生物培養のための、改良された組成物、マトリックス及び方法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
要約
本発明は、水性環境に分散されるフィブリルセルロースから構成されるヒドロゲルの研究に基づく。フィブリルセルロースのファイバーは、セルロースポリマーのヒドロキシル官能性のために親水性が高く、ヘミセルロース多糖で部分的に覆われている。
【００１３】
本発明は、包埋微生物培養のためのフィブリルセルロースを含む組成物、とりわけ、包埋３Ｄ微生物培養のためのフィブリルセルロースを含む組成物を対象とする。前記組成物は、細菌、カビ、酵母及び原生動物等の微生物の嫌気性及び半嫌気性微生物培養に特に適している。微生物培養は、本明細書において、いずれの種類の培養及び発酵プロセスをも含むものと理解される。
【００１４】
本発明はまた、包埋微生物培養のための組成物の製造方法であって、
−  フィブリルセルロースを提供する工程と、
−  前記フィブリルセルロースを、水、並びに任意選択で栄養源及び添加物と混合して、混合物／組成物を得る工程
とを含む方法も対象とする。
【００１５】
組成物は、好適には、微生物の包埋３Ｄ培養のための環境に移されるか、又は置かれる。
【００１６】
本発明は、包埋３Ｄ微生物培養のためのマトリックスにおける組成物の使用を対象とする。
【００１７】
本発明はさらに、包埋微生物培養のための３Ｄマトリックスであって、フィブリルセルロース、任意選択で栄養源及び添加物を含む組成物と、生きた微生物細胞とを含むマトリックスを対象とする。
【００１８】
前記マトリックスはまた、特に微生物が細菌、カビ、酵母及び原生動物から選択される場合、発酵プロセスにおける固定化マトリックスとして、また、微生物の貯蔵及び移送のために、使用されてもよい。
【００１９】
本発明はさらに、包埋微生物培養のための３Ｄマトリックスにおけるフィブリルセルロースの使用及び使用方法であって、
−  生きた微生物細胞を提供する工程であって、該微生物が、細菌、カビ、酵母及び原生動物から選択される工程と、
−  フィブリルセルロース、並びに任意選択で栄養源及び任意選択で添加物を含む組成物を提供する工程と、
−  前記微生物細胞を該組成物に組み込み、三次元的な配置（arrangement）を提供する工程
とを含む方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、微生物の包埋培養、特に微生物の３Ｄ包埋培養のための方法であって、
−  生きた微生物細胞を提供する工程であって、該微生物が、細菌、カビ、酵母及び原生動物から選択される工程と、
−  該細胞を、フィブリルセルロースを含む組成物と接触させる工程と、
−  包埋微生物培養のための環境において、三次元的な配置にて、前記マトリックス中で該細胞を培養する工程
とを含む方法を対象とする。
【００２１】
本発明は、３Ｄ包埋微生物培養マトリックスにおける、フィブリルセルロースの使用に基づく。
【００２２】
微生物細胞は、培地上及び培地中で分裂し、増殖し始め、細胞培養プラットフォームの底部に細胞が堆積することなく、細胞クラスターが自然に成長し始める。フィブリルセルロースにおける細胞の均質な分裂は、該材料が３Ｄ微生物培養培地として機能するための必要条件である。
【００２３】
フィブリルセルロースは、不活性であり、蛍光バックグラウンドを生じないので、分析を妨害しない。フィブリルセルロースを含む培地は、注入、分散及びポンプ送りが可能である。この特性は、フィブリルセルロースをベースとするヒドロゲルのレオロジー特性により説明される。細胞が、マトリックス内で安定を保ち、注入後、マトリックス中に均質に分布するように、注入を実施できる。
【００２４】
従って、本発明は、フィブリルセルロースを含む組成物を用いた、微生物の包埋培養及び発酵のための手段であって、ここで、該組成物がヒドロゲルの形態である手段を提供する。前記培養方法は、小規模、より大きな工業用発酵規模、及びバイオリーチングプロセス等の非常に大きな規模において、いずれも嫌気性及び半嫌気性培養システムに特に適している。
【００２５】
本発明特有の特徴は、添付の特許請求の範囲に示される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、参照細菌クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）のフィブリルセルロースでのインキュベーション開始時（０時間）及び一晩インキュベーション後の細胞数をグラフで示す。
【図２】図２は、Ｃ．パーフリンジェンス（C. perfringens）希釈系列の定量ＰＣＲラン（run）をグラフで示し、１．５ｗｔ％の植物由来フィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とＰＣＲ反応との間の強い線形相関を示す。
【図３】図３は、フィブリルセルロース存在下でのＣ．パーフリンジェンスの微生物定量化と、コロニーの検出とを示す。
【図４】図４は、フィブリルセルロースとパーフリンジェンス寒天ベース培地（perfringens agar base media）とを組み合わせて培養したＣ．パーフリンジェンス希釈系列を示す。Ｃ．パーフリンジェンスのコロニーは、黒点として見える。
【図５】図５は、Ｃ．パーフリンジェンス希釈物を示す。フィブリルセルロースとパーフリンジェンス寒天ベース培地との組み合わせにおける、１０−８希釈物及び１０−６希釈物。
【図６】図６は、１％天然セルロースナノファイバーヒドロゲルを通った、異なる分子量のデキストラン（２０ｋＤａ、７０ｋＤａ及び２５０ｋＤａ）の拡散を示す。
【図７】図７は、０．５％の水溶性ポリマー（ポリアクリルアミド（５０００ｋＤａ）及びＣＭＣ（２５０ｋＤａ））溶液と比較した、０．５％のフィブリルセルロースヒドロゲルの粘度を、適用した剪断応力の関数として示す。
【図８】図８は、０．５％のポリアクリルアミド及びＣＭＣと比較した、０．５％のＣＮＦヒドロゲルの粘度を、測定された剪断速度（shear rate）の関数として示す。様々な物理的プロセスの典型的な剪断速度の領域を図では矢印で記す。
【図９】図９は、針内を流れる、細胞を含んだフィブリルセルロースヒドロゲルを図式的（schematic presentation）に示す。剪断速度が高い領域（低い粘度）は、ゲル−針の境界面に位置し、剪断速度が低い領域（非常に高い粘度）は、針の中央に位置する。
【図１０】図１０は、０．５％の天然フィブリルセルロースヒドロゲル（上列）、及び０．５％のアニオン性フィブリルセルロースヒドロゲル（下列）における、２つの礫（gravel）懸濁液の１７日間の安定性を示す。礫は、平均粒径１〜２ｍｍ及び２〜３ｍｍを有するＣＥＮ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｎｄ（ＥＮ１９６−１）であった。試料は室温で保管した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
特記のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される用語は、微生物学及び巨大分子の分野で一般に使用される意味を有する。具体的には、以下の用語は、下記の意味を有する。
【００２８】
「包埋微生物培養」とは、本明細書においては、培養される微生物が、フィブリルセルロースを含む培養培地又はマトリックス中に部分的に又は完全に包埋される３Ｄ微生物培養をいうと理解される。包埋微生物培養は、本明細書においては、微生物が酸素を利用（access）できない、あるいは酸素の利用が制限される、微生物の嫌気性及び半嫌気性培養を含むと理解される。
【００２９】
「微生物培養」とは、本明細書においては、バイオリーチングプロセスを含む、微生物の任意の培養又は発酵をいう。
【００３０】
「嫌気性培養」とは、本明細書においては、酸素を含まない環境における微生物培養を意味する。嫌気性培養は、例えば、偏性嫌気性生物に特に適している。
【００３１】
「半嫌気性培養」とは、本明細書においては、限られた量の酸素を含む環境における微生物培養をいう。前記培養は、例えば、耐気性生物及び通性好気性生物（facultative aerobes）に特に適している。
【００３２】
微生物とは、本明細書においては、カビ、酵母、細菌及び原生動物をいう。そのような微生物の例は、特に、偏性嫌気性生物群、耐気性生物群及び通性好気性生物群のいずれか１つに属する種である。
【００３３】
用語「培地」又は「培養培地」とは、本明細書においては、任意の微生物が増殖するために必要な栄養環境をいう。生化学的（栄養）環境は、培養培地として利用される。培養培地は、微生物の純粋培養物の単離及び維持に用いられ、また例えば、生化学的及び生理学的特性に従った、細菌の同定にも使用される。
【００３４】
用語「バイオリーチング」又は「バイオヒープリーチング」とは、本明細書においては、銅、金、亜鉛、コバルト、ニッケル及びウラン等の金属を含有する鉱石中の不溶性金属化合物を水溶性金属化合物へと変換するために細菌を利用するバイオ酸化プロセスを意味しており、これは、元素金属へとさらに変換できる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「フィブリルセルロース」とは、すべてのミクロフィブリル化セルロース（ＭＦＣ）及びナノセルロースを包含すると理解される。さらに、フィブリルセルロースには、広く使用されている類義語が他にいくつかある。例：セルロースナノファイバー、ナノフィブリル化セルロース（nanofibrillated cellulose）（ＣＮＦ）、ナノフィブリルセルロース（nanofibrillar cellulose）（ＮＦＣ）、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース、又はセルロースミクロフィブリル。
【００３６】
さらに、特定の微生物によって生産されるフィブリルセルロースにも様々な類義語があり、例えば、細菌セルロース（ＢＣ）、微生物セルロース（ＭＣ）、バイオセルロース、ナタデココ（ＮＤＣ）又はココデナタ（coco de nata（ＣＤＮ））などである。
【００３７】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、フィブリルセルロースを含む組成物は、特にフィブリルセルロースがヒドロゲルの形態である場合に、包埋３Ｄ微生物培養に適していることが発見された。前記組成物は、微生物の増殖のために嫌気性又は半嫌気性条件を提供することが必須である、包埋微生物培養のためのマトリックスに使用されてよい。従って、本発明は、包埋微生物培養のための手段と、微生物の包埋培養、特に、微生物の嫌気性及び半嫌気性培養のための方法とを提供する。
【００３８】
微生物細胞は組成物中で分裂し、増殖し始め、細胞クラスターが自然に成長し始める。細胞は、フィブリルセルロースを含む培養培地において、均質に分裂する。フィブリルセルロースにおける細胞の均質な分裂は、該材料が包埋３Ｄ微生物培養において機能するための必要条件である。包埋培養によって、所望により、限られた量の空気又は酸素でも、空気又は酸素がなくても、培養が可能となる。
【００３９】
ヒドロゲル構造によって、微生物が、発酵容器等の容器の底部に沈殿（sedimentation）又は堆積することなく、ゲルマトリックスにおいて均一に増殖かつ分裂することが可能となる。ヒドロゲルはまた、組成物又は発酵培地中に含まれる栄養物、基質及び任意のその他の成分を安定化することができ、起こり得るその沈殿を防ぐ。ヒドロゲルの特性は、粘性を増加又は低下させる必要性に応じて、フィブリルセルロースの適切なグレードを選択することにより、あるいはヒドロゲル中のフィブリルセルロースの量を変えることにより調整されてよい。
【００４０】
上記の特徴は、小規模培養、及び発酵容器内でのより大規模な培養において有益であり、特にフィブリルセルロースヒドロゲルが、固体鉱物／石の基質が沈殿するのを防ぐことによって、微生物にとって最適な増殖環境を提供する大規模なバイオリーチングプロセスにおいて有益である。増殖培地は、高い均質性を維持し、バイオリーチングプロセスは、高い安定性及びより容易な制御可能性を維持する。
【００４１】
フィブリルセルロースは、任意の植物性セルロース原料から得られてよく、あるいはセルロースを生産する微生物、すなわち、微生物セルロース由来であってよい。
【００４２】
用語「セルロース原料」とは、セルロースを含有し、セルロースパルプ、精製パルプ及びフィブリルセルロースの生産に使用できる、任意のセルロース原料源をいう。
【００４３】
植物材料は木であってよく、該木は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ダグラスモミ若しくはツガ等の軟木由来、若しくはカバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ若しくはアカシア等の堅木由来、又は軟木及び堅木の混合物由来であり得る。非木質材料は、農業残留物、草又は他の植物性物質、例えば、わら、葉、樹皮、種子、殻、花、野菜又は果実であって、綿、トウモロコシ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、米、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、ジュート、ラミー、ケナフ、バガス、竹又は葦に由来するものであり得る。
【００４４】
セルロース原料はまた、細菌発酵プロセス等から、セルロースを生産する微生物由来であってもよい。微生物は、アセトバクター（Acetobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属、好ましくはアセトバクター（Acetobacter）属、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）種又はアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）種であり得る。
【００４５】
用語「セルロースパルプ」とは、化学的、機械的、熱機械的又は化学−熱機械的パルピングプロセスを用いて、任意のセルロース原料から分離したセルロースファイバーをいう。
【００４６】
植物由来、特に木のセルロースパルプ（軟木又は堅木パルプ、例えば、カバノキのさらしパルプ（bleached birch pulp））であって、セルロース分子が上記方法の１つで酸化されるものは、任意の機械的分解方法を用いて、フィブリルセルロースに分解しやすい。
【００４７】
用語「フィブリルセルロース」とは、セルロース原料に由来する、分離したセルロースミクロフィブリル（ナノファイバー）又はミクロフィブリル束の集合体をいう。ミクロフィブリルは、通常、高いアスペクト比を有する：長さは１マイクロメートルを超えるが、数平均直径は通常、２００ｎｍ未満である。ミクロフィブリル束の直径も、より大きくなり得るが、一般的には１μｍ未満である。最小のミクロフィブリルは、通常、直径２〜１２ｎｍである、いわゆるエレメンタリーフィブリル（elementary fibril）に近い。フィブリル又はフィブリル束の寸法は、原料及び分解方法によって決まる。
【００４８】
フィブリルセルロースは、非常に高い保水値、高度な化学的アクセシビリティ（chemical accessibility）、及び水又は他の極性溶媒において安定したゲルを形成する能力を特徴とする。フィブリルセルロース産物は、通常、高度にフィブリル化したセルロースの密なネットワークである。フィブリルセルロースはまた、いくらかのヘミセルロースを含有してもよい；その量は、植物源によって決まる。
【００４９】
フィブリルセルロースを得るために、セルロースパルプ又は酸化したセルロース原料の機械的分解が、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、超音波発生装置、フリューダイザー、例えば、マイクロフリューダイザー、マクロフリューダイザー又はフリューダイザー型ホモジナイザー等の適切な装置で行われる。好ましくは、機械的に分解したフィブリルセルロースが使用される。
【００５０】
複数の異なるグレードのフィブリルセルロースが、様々な生産技術を用いて開発されている。該グレードは、製造方法、フィブリル化の程度及び化学組成に応じて、異なる特性を有する。該グレードの化学組成もまた様々である。原料源、例えば、堅木（ＨＷ）対軟木（ＳＷ）パルプによって、異なる多糖類組成が、最終的なフィブリルセルロース産物に存在する。通常、非イオン性又は天然グレードが、より幅広いフィブリル直径を有する一方、化学的に改質（chemically modified）したグレードは、はるかに細い。サイズ分布もまた、改質グレードについては、より狭い。
【００５１】
フィブリルセルロースは、本明細書においては、任意の植物性セルロース原料から得られるセルロース、フィブリルセルロース又はナノファイバー束のいずれの化学的又は物理的に改質された誘導体をも包含するものと理解される。化学的改質は、例えば、セルロース分子のカルボキシルメチル化、酸化（ＴＥＭＰＯ触媒酸化を含む）、エステル化又はエーテル化反応に基づいてよい。改質はまた、アニオン性、カチオン性若しくは非イオン性物質又はこれらの任意の組み合わせを、セルロース表面上に物理的に吸着させることによって実施されてもよい。既記の改質は、フィブリルセルロース製造の前、後又はその最中に実施できる。特定の改質により、人体で分解可能な材料がもたらされてよい。改質したグレードは、通常、さらしパルプから調製される。改質したグレードでは、ヘミセルロースもセルロース領域とともに改質される。改質は均質でない、すなわち、ある部分が他の部分よりも改質されている可能性が非常に高い。従って、詳細な化学分析は不可能である−改質した生産物は、常に、異なる多糖構造の複雑な混合物である。
【００５２】
化学的に改質したグレード、特に、化学的又は物理的に改質した誘導体、例えば、アニオン性及びカチオン性グレード等は、通常、それらの表面電荷が改質されており、好適には、乾燥粉末又は水性ゲルとして使用されてよい。
【００５３】
フィブリルセルロースの乾燥粉末は、当分野で公知の任意の常法を用いて、前記フィブリルセルロースを含む懸濁液又は分散液を噴霧乾燥及び／又は凍結乾燥することにより都合よく製造されてよい。好適には、化学的に改質したグレードは、噴霧乾燥され、任意選択で粒状化されてよい。これらは、水を用いてゲルに戻してよい。
【００５４】
好適には、セルロースパルプ等のセルロース原料は、機械的分解の前に、酸と塩基とで前処理される。前処理は、＋１を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも取り除くために、セルロースパルプを酸処理、好ましくは塩酸での酸処理に供し、それに続いて、＋１の電荷を有する正電荷イオンを含む無機塩基、好ましくはＮａ＋イオンが先のイオンに置き換わるＮａＯＨで処理することによりなされる。＋１を超える電荷を有するいかなる正電荷イオンも存在しないことは、ライフサイエンス及び分子生物学での利用に特に有利であり、その場合、＋１を超える電荷を有するイオンとＤＮＡとの複合体の形成を回避することができる。前処理により、最終生産物に優れたゲル化特性及び透明性がもたらされる。前処理したセルロース原料から得られるフィブリルセルロースは、本明細書において、イオン交換フィブリルセルロースと称す。
【００５５】
多くの場合、フィブリルセルロースの微生物純粋性（microbial purity）が必須である。従って、フィブリルセルロースは、使用前に、好適にはゲルの形態で、滅菌されてよい。加えて、フィブリル化等の機械的分解の前及び最中には、生産物の微生物汚染を最小にすることが重要である。フィブリル化／機械的分解に先立って、パルプが未だ無菌であるさらし段階の直後に、パルプミルからセルロースパルプを無菌で回収することが有利である。
【００５６】
「フィブリルセルロース」とは、本明細書においては、フィブリルセルロースの１つのグレード若しくはタイプ、又はフィブリルセルロースの２つ以上の異なるグレード若しくはタイプの組み合わせをいう。例えば、フィブリルセルロースの化学的に改質したグレードを天然グレードと混合してよい。
【００５７】
フィブリルセルロースゲル又はヒドロゲルとは、本明細書においては、フィブリルセルロースの水性分散液をいう。フィブリルセルロースは優れたゲル化能を有し、つまり、これは、水性媒体において、低コンシステンシーですでにヒドロゲルを形成することをいう。
【００５８】
本発明においては、好適には、植物由来のフィブリルセルロースが使用される。
【００５９】
栄養源は、培養されるそれぞれの微生物に特有の要件に従って選択される。特にバイオリーチングプロセスにおいて、栄養源は、銅  亜鉛、ニッケル、コバルト等の有価金属を提供するための、粉砕した金属鉱石から選択される基質を含む。
【００６０】
任意選択で、微生物培養において一般に使用される、当業者に周知の更なる添加物を組成物中に含めてよく、増殖因子、無機塩、抗生物質等である。
【００６１】
好適には、植物由来のフィブリルセルロースがヒドロゲルとして使用され、これは、使用前に、乾燥粉末を水と接触させることによって元に戻すことにより得られてもよい。特に、アニオン性及びカチオン性グレード等の改質したグレードは、粉末などの乾燥生産物、及びヒドロゲルとして提供されてよい。天然及び非イオン性グレードは、好ましくは、ヒドロゲルとして提供される。
【００６２】
組成物は、すぐに使えるヒドロゲルとして提供されてよく、これは、予め滅菌されて、滅菌パッケージで包装されてよく、あるいはヒドロゲルとして、例えば、アプリケーター、容器又はシリンジに包装されてよく、これはゲルの適用に使用できる。
【００６３】
フィブリルセルロースの数平均フィブリル直径（number average fibril diameter）は、好適には、１〜２００ｎｍであり、好ましくは、天然グレードの数平均フィブリル直径は、１〜１００ｎｍであり、化学的に改質したグレードでは、１〜２０ｎｍである。
【００６４】
組成物は、０．０５〜８０ｗｔ％のフィブリルセルロースを含む。組成物がヒドロゲルである場合には、０．０５〜５ｗｔ％、好適には０．１〜３ｗｔ％のフィブリルセルロースを含んでよい。粉末等の乾燥した組成物は、より多い量、通常、最大でおよそ９５ｗｔ％のフィブリルセルロースを含んでよい。乾燥した組成物は、使用前に、水で戻してよい。
【００６５】
組成物は、０．０５〜８０ｗｔ％、好適には０．１〜５０ｗｔ％、特に０．１〜４０ｗｔ％の栄養源を含んでよい。前記栄養源は、以下の少なくとも１つを含んでよい：炭素源、窒素源、リン源、ミネラル源及び微量元素源。高い栄養源とは、特に、金属鉱石基質が栄養源に含まれるバイオリーチングプロセスをいう。
【００６６】
組成物は、培養方法に応じて、水、好適には脱イオン水又は滅菌水を含んでよい。好適には、ヒドロゲルにおける気泡形成と空気混入を防ぐために、フィブリルセルロースは、水と注意深く混ぜられる。
【００６７】
フィブリルセルロースヒドロゲルは、通常、低濃度で高い降伏応力及び高いゼロ剪断粘度を有する。従って、実施例６に示されるように、ヒドロゲルは、固形粒子を沈殿に対して効果的に安定化させる。同じ物理的特徴は、フィブリルセルロースヒドロゲルから上昇する、ゲル中に形成し得る気泡も防ぐ。しかしながら、気泡の浮力は、ゲル上部の気圧を低下させる（例えば、１５ｍｍＨｇ）ことによって、容易に増加させることができ、これにより、ヒドロゲル相中の気体の溶解度が低下し、当初の気泡の容積がそれぞれ増大する。増大した気泡は、上方の気体相へと容易に逃げだすが、培養された微生物はゲル相に残る。この圧力サイクルは、形成される気体状の生成物を集めるために、所望に応じて反復してもよい。
【００６８】
前記ヒドロゲル組成物は、培養される微生物に応じて、追加の成分をさらに含んでよい。
【００６９】
組成物は、
−  フィブリルセルロースを提供する工程と、
−  前記植物由来のフィブリルセルロース、並びに任意選択で栄養源及び任意選択で添加物を水と混合して、組成物を得る工程
を含む方法で得ることができる。戻すための乾燥組成物を作製する場合は、任意選択での乾燥工程が含まれる。
【００７０】
前記組成物は、好適には、生きた微生物細胞の接種材料と接触させてよく、ここで、前記微生物は、細菌、酵母、カビ、及び原生動物から選択され、かつ前記微生物の包埋培養のための環境に移されるか、又は置かれてよい。
【００７１】
本発明はまた、包埋微生物培養のための、フィブリルセルロースを含む組成物と、生きた微生物細胞とを含む三次元（３Ｄ）マトリックスにも関する。
【００７２】
包埋微生物培養のためのマトリックスにおけるフィブリルセルロースの使用方法は、
−  生きた微生物細胞を提供する工程と、
−  フィブリルセルロース、並びに任意選択で栄養源及び添加物を含む組成物を提供する工程と、
−  包埋微生物培養のための環境において、３Ｄ配置にて、前記組成物中で細胞を培養する工程
とを含む。
【００７３】
包埋微生物培養のための環境とは、酸素が部分的又は完全に取り除かれた環境をいう。
【００７４】
本発明はさらに、微生物の包埋３Ｄ培養のための方法であって、
−  生きた微生物細胞を提供する工程であって、前記微生物が、細菌、酵母、カビ及び原生動物から選択される工程と、
−  該微生物細胞を、フィブリルセルロースを含む組成物と接触させて、３Ｄマトリックスを形成する工程と、
−  包埋培養のための環境において、三次元的な配置にて、前記３Ｄマトリックス中で細胞を培養する工程
とを含む方法を対象とする。
【００７５】
組成物、マトリックス及び培養方法における追加の成分及び栄養源は、各ケースにおいて、微生物の要求を考慮して選択されてよい。
【００７６】
さらに、フィブリルセルロースを含むマトリックスは、ヒドロゲルとして、小さな粒子を容易に拡散可能であり、これによって、例えば、小さなウイルスを水で流す（flush）ことが可能になる。この拡散効果は実施例においても例証する。
【００７７】
前記組成物は、分析方法のための包埋微生物培養用のマトリックスとして又はマトリックス中の成分として、また、微生物の嫌気性及び半嫌気性発酵プロセスにおいて、特に適している。前記発酵プロセスは、バッチ操作又は連続操作されてよく、小規模又はより大きな産業規模、及びバイオリーチングプロセス等の非常に大きな規模、特にバイオヒープで実施されてよい。組成物はまた、好適には、工業用酵素、スターターカルチャー等が生産される大規模な液体又は半液体（semi-liquid）発酵プロセスにおいて、またバイオリーチングプロセスにおいても使用されてよい。例えば、栄養源は、発酵容器（fermentor vessel）を通して再循環されてよい。
【００７８】
前記組成物及びマトリックスはまた、微生物の貯蔵及び移送のために、また、特に嫌気性微生物の発酵プロセスにおける固定化マトリックスとして使用されてもよい。
【００７９】
フィブリルセルロースだけでは、十分な炭素源を提供しないため、それだけでは、十分な増殖がもたらされない。しかしながら、３Ｄ構造は、適切な増殖条件下で、微生物の増殖を向上させる。３Ｄヒドロゲル構造は、自由な分子の拡散、十分な支持体を提供する一方、十分な柔軟性ももたらす。
【００８０】
プロセスが完了した後、例えば、水性又は非水性の液体で希釈し、それに続いて、デカンテーション、ろ過、若しくは穏やかな遠心分離による沈殿を用いて；又はセルラーゼ等のセルロース分解酵素を用いて、フィブリルセルロースベースのヒドロゲル材料の残りを細胞増殖材料から除去することは容易である。培養された微生物が非病原性である場合には、残りの分離したフィブリルセルロース材料を動物の餌として使用することも可能である。
【００８１】
組成物は、すぐに使えるヒドロゲルの形態であってよく、これは、予め滅菌されて、滅菌容器、パッケージ等に包装されてよく、あるいは、ヒドロゲルとして、例えば、より小さな容器又はシリンジに、予め包装されてよく、これはゲルの適用に使用できる。ヒドロゲルの粘度は、使用要件に応じて、容易に変更され得る。
【００８２】
さらに、組成物は、キットに組み込まれてよく、これは、例えば、分析目的のために使用されてよい。かかるキットは、予め滅菌したヒドロゲルを含む、透明で薄く、シールされた容器、例えば、小さなキュベット又は薄い容器であって、厚みよりも大きな長さ及び高さを基本的に有するものなどを含んでよい。微生物試料は、前記ヒドロゲル中に注入された後、前記微生物試料に適した嫌気性又は半嫌気性条件でインキュベートされてよく、その計数及び検出は、任意の適切な方法、例えば、微生物が可視コロニーを生じる場合（例えば、嫌気性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens））には自動可視化法を用いて、ＵＶによって、又はＰＣＲ計数法を用いて実施してよい。テスト容器へと注入する前に、微生物試料を少量のヒドロゲルと混合することが好都合であり得る。
【００８３】
包埋培養方法において、微生物細胞は、通常、フィブリルセルロースファイバーによってもたらされる機械的支持のため、連続相（ヒドロゲル）へと均質に懸濁される。著しく高い降伏応力により、微生物細胞及び増殖した細胞クラスターが沈殿に対して安定化される。
【００８４】
フィブリルセルロースヒドロゲルは、特に３Ｄ培養に対してほぼ最適な特性をもたらす：
−  透明、非毒性、非動物性、かつ粘度の高いヒドロゲル
−  高い懸濁力、高い保水性、良好な機械的接着性を有する
−  塩、温度又はｐＨに対して非感受性
−  培養条件下で非分解性
−  材料の化学構造により自己蛍光を有さない
−  分注可能、ポンプ送り可能、シリンジによる注入可能
−  フィブリルセルロースは不活性であり、分析を妨害しない
【００８５】
フィブリルセルロースを含むマトリックスは、微生物の貯蔵及び移送に、並びに微生物の発酵及び微生物の集積（enrichment）のための固定化マトリックスに特に適しており、潜在的な検出又は計数上の問題のリスクが全くなく、特に嫌気性微生物に適している。
【００８６】
微生物の定量化及び計数は、今日では通常行われている。培養培地には、ＰＣＲ反応を妨害又は阻害し、微生物定量化の信頼性を損なわせる材料が含まれないことが必須である。フィブリルセルロースを含む組成物又はマトリックスは、微生物を破砕してそのＤＮＡを取り出した後、該ＤＮＡを特異的オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ及び適切なサーマルサイクラーを用いて定量化するリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術の使用を含む、ＰＣＲ検出又はＰＣＲに基づく微生物計数と相互作用せず、あるいはこれを阻害しない。これは実施例で例証される。
【００８７】
顕著な利点は、植物由来のフィブリルセルロースを含む培養培地、組成物又はマトリックスは、注入でき、あるいは大規模にポンプ送りできることである。これによって、切り取りなどの機械的処置を使用する必要なく、材料を非常に容易に操作及び移動することが可能になる。注入性は、植物由来のフィブリルセルロースに固有のレオロジー特性で説明される。細胞が、ヒドロゲル又はマトリックス内で安定を保ち、注入又はポンプ送り後に、ヒドロゲル又はマトリックス中で均質に分布して維持されるように、注入を行うことができる。少量又は単一のコロニーは、例えば、滅菌ピペットを用いて、マトリックスから容易にピックアップすることができ、それに続く特性評価又は分析により、簡単な検出及び複雑でないコロニーの単離がもたらされる。
【００８８】
さらに、ヒドロゲルは、単離した微生物を特徴付けるために多くの場合使用される分子生物学技術を妨げない。植物由来のフィブリルセルロースヒドロゲルを含むマトリックスにおけるクロストリジウム・パーフリンジェンスの嫌気性包埋培養を実施例で例証する。
【００８９】
組成物及びフィブリルセルロースヒドロゲルは、予め滅菌でき、かつ使用前に冷却できるので、滅菌したフィブリルセルロースヒドロゲルマトリックスを所望時に使える状態で棚に保管しておくことが可能である。従って、例えば、実験室の作業者は、滅菌したフィブリルセルロース組成物を棚に保管しておくことができる。微生物試料をそれに混合して、微生物の培養に適した条件でインキュベーションを実施することが非常に好都合である。これにより時間が節約され、微生物に非常にやさしい。フィブリルセルロースにより、容易な接種、良好な増殖特性が可能となり、特に、フィブリルセルロースヒドロゲルの柔軟性により、それに包埋された微生物の良好な増殖が可能となる。
【００９０】
組成物及びマトリックスはまた、特に好ましくは微生物の嫌気性及び半嫌気性培養において、研究室ロボットが使用される分析的及び診断的適用においても適している。
【００９１】
好ましい一実施形態によれば、本発明は、嫌気性細菌、通性細菌、耐気性細菌、原生動物、カビ及び酵母の培養に特に適している。
【００９２】
より大きな産業規模で、微生物は、液体成分及び固体成分を含む培養培地並びに本発明の組成物中、発酵容器内で培養でき、あるいはバイオリーチングプロセスにおいてより大きなバイオヒープでも培養できる。
【００９３】
フィブリルセルロースを含む３Ｄヒドロゲルは、微生物の嫌気性及び半嫌気性包埋培養、特にクロストリジウム・パーフリンジェンス等の嫌気性細菌を培養するための優れたマトリックスを提供する。本発明はまた、従来の培養技術を用いて培養することが多くの場合困難である、いくつかの病原生物及び土壌微生物を培養するための優れた組成物及びマトリックスも提供する。これは、微生物学及び診断学の分野における検出及び特性評価方法においても特に有用である。そのような生物の例は、Ａ及びＢ群ストレプトコッカス（group A and B Streptococcus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、アシネトバクター・バウマニー（Acinetobacter baumannii）、コクシエラ・バーネッティイ（Coxiella burnetii）、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ種（Leptospira species）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）であり、土壌細菌の例は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）及びアルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）である。
【００９４】
実施例
以下の実施例は、上述の本発明の実施態様を例証するものであり、これらは、決して本発明を限定することを意味しない。
【００９５】
材料及び方法
ａ）フィブリルセルロース試料。
高度に精製されたカバノキさらしパルプを高圧ホモジナイゼーション（５回の連続サイクル）し、それに続いてオートクレーブ滅菌することにより、天然フィブリルセルロースを生産した。流動化後、フィブリルセルロースは、低濃度のヒドロゲル（１．８ｗｔ％）であった。イオン交換した天然フィブリルセルロースは、同様の方法で得たが、高い原子価の陽イオンを取り除くために、フィブリル化の前にさらに酸−塩基処理（先のセクションに記載した方法）に供した。高圧ホモジナイゼーション（１５回の連続サイクル）後、イオン交換したフィブリルセルロースは、他の試料と比較して低い濁度を有する、強固なヒドロゲルを形成する。必要に応じて、フィブリルセルロースをオートクレーブ滅菌した。透明なアニオン性フィブリルセルロースは、化学的に改質したセルロースパルプ（ＴＥＭＰＯ酸化セルロースパルプ）の同様のホモジナイゼーションプロセスにより、ヒドロゲル（０．９ｗｔ％）として得た。
【００９６】
ｂ）微生物株及び培養。
全実験において、新鮮な一晩培養物を接種に使用した。接種培養物は、フィブリルセルロースを含まなかった。微生物の培養を最適な条件及び増殖培地で行った。使用した微生物株は、嫌気性グラム陽性クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）であり、増殖培地は、パーフリンジェンス寒天ベースであった。
【００９７】
ｃ）微生物の検出。
微生物の増殖は、コロニー形成が顕著になった際に可視的に検出した。メタスルファイトナトリウム（sodium metasulphite）及びクエン酸第二鉄アンモニウムを含むパーフリンジェンス寒天ベース培地は、亜硫酸塩の還元によって、クロストリジウム・パーフリンジェンス培養物において黒いコロニーを生成した。以下に記載の定量ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）によって細胞数も決定した。
【００９８】
０．１ｍｌの細菌培養物試料を、ＰＣＲに基づく微生物計数に使用した。計数方法は、Ｒｕｍｉｎｏｌｙｚｅプロトコルに基づいており、微生物試料を最初に洗浄バッファーに希釈し、遠心分離（１０分間、１８０００×ｇ）によって微生物細胞をペレット化した。酵素的及び機械的の両方により微生物細胞を溶解して、それらのＤＮＡ内容物を取り出すために、上清を捨て、ペレットを酵素溶解バッファーに懸濁した後、ガラスビーズで強く攪拌（beaten）した。取り出したＤＮＡを、フェノールクロロホルム抽出で精製し、次いで、エタノールで沈殿し、最後に、ＤＮＡ保存バッファーに溶解した。クロストリジウム・パーフリンジェンスの計数は、２つのクロストリジウム・パーフリンジェンス選択的ＤＮＡプライマー及びＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎ  Ｉケミストリを用いて実施した。
【００９９】
実施例１：細菌の唯一のエネルギー源としてのフィブリルセルロース
植物由来のフィブリルセルロースの製造プロセスは、微生物汚染のリスクを増大させる工程を含み得る。従って、天然フィブリルセルロースが、唯一のエネルギー源として微生物の増殖をサポートする能力についてこれを試験した。図１には、フィブリルセルロースにクロストリジウム・パーフリンジェンス微生物汚染源を暴露（challenged with）し、フィブリルセルロースでのインキュベーション開始時（０時間）及び一晩インキュベーション後の細菌細胞数をグラフで示す。参照細菌細胞をフィブリルセルロース（１．５ｗｔ％）で一晩インキュベートし、細菌細胞数をカウントした。さらに、汚染の程度は高く、１０６〜１０７細胞／ｍｌ超であった（細胞数の大まかな推定値は、１６Ｓ遺伝子数を１０で除することによって算出できる）。結果は、細菌株が、フィブリルセルロースで全く増殖しなかったことを明確に示す。一方で、いずれの微生物接種も行っていないコントロールが、ＰＣＲ分析で高い値を示している。これは、死滅微生物のそれ以前の汚染に起因し得るか、あるいは、セルロースフィブリルによってもたらされたアーチファクト（artefact）であり得る。唯一のエネルギー源としてのフィブリルセルロースは、微生物の増殖を効果的にサポートしない。
【０１００】
実施例２：フィブリルセルロース担体からの微生物の計数
クロストリジウム・パーフリンジェンス細菌を、２つの異なる培地（１つは１．５ｗｔ％の天然フィブリルセルロースを含み、もう１つは含まない）で培養した。ＰＣＲに基づく計数を試験（trial）で使用し、フィブリルセルロースの、ＰＣＲ検出との相互作用の好例が得られた。
【０１０１】
実験で使用した増殖培地は、標準的なパーフリンジェンス寒天培地であり、製造者の指示に従って調製し、滅菌のためにオートクレーブした。増殖培地は、オートクレーブの前に２つの部分に分け、そのうちの１つに１．５重量％のフィブリルセルロースを加えた。密なクロストリジウム・パーフリンジェンス培養物（約１０９細胞／ｍｌ）の希釈系列（１０倍、１００倍及び１０００倍希釈）を、１．５重量％のフィブリルセルロースの存在下及び非存在下にて調製した。両方の試験培地を、接種後０時間及び２４時間にてサンプリングした。０．１ｍｌの培養試料をＰＣＲに基づく微生物計数に使用した。計数方法は、Ｒｕｍｉｎｏｌｙｚｅプロトコルに基づいており、微生物試料を最初に洗浄バッファーに希釈し、遠心分離（１０分間、１８０００×ｇ）によって微生物細胞をペレット化した。酵素的及び機械的の両方により微生物細胞を溶解して、それらのＤＮＡ内容物を取り出すために、上清を捨て、ペレットを酵素溶解バッファーに懸濁した後、ガラスビーズで強く攪拌（beat）した。取り出したＤＮＡを、フェノールクロロホルム抽出で精製し、次いで、エタノールで沈殿し、最後に、ＤＮＡ保存バッファーに溶解した。ＤＮＡを単離後、ＤＮＡ試料を、Ｃ．パーフリンジェンス（C. perfringens）特異的プライマー及びＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎ  Ｉケミストリを用いたＰＣＲに基づく計数に使用した。ＰＣＲ定量化の結果を図２にグラフで示す。データは、フィブリルセルロースからなんら妨害されることなく、ＰＣＲの結果と算出される希釈度との間に強い線形相関を示し、すなわち、１．５重量％のフィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とＰＣＲ反応との間に強い線形相関を示す。
【０１０２】
Ｃ．パーフリンジェンス希釈系列の定量ＰＣＲラン（run）に関する本実験は、１．５％のフィブリルセルロースの有無に関わらず、希釈度とＰＣＲ反応との間に強い線形相関を示す。
【０１０３】
実施例３：フィブリルセルロース存在下での微生物の定量化−コロニーの検出
嫌気性及び半嫌気性技術は、通常、現在の増殖培地及びプレーティングシステムでは実施が難しい。嫌気性グラム陽性細菌であるクロストリジウム種の例として、クロストリジウム・パーフリンジェンスを挙げることができ、その増殖は、黒いコロニーとして検出される。
【０１０４】
クロストリジウム種は、多くの場合、培養を必要とする。それらの酸素に対する強い感受性により問題が生じている。本実験では、フィブリルセルロースを含む支持マトリックスを使用することにより、その培養を容易にするシステムを記載する。滅菌したパーフリンジェンス寒天培地（ＧＲＯＴＨ  ＭＥＤＩＡ）及び天然フィブリルセルロース（１．５ｗｔ％）を、培養試験のために、長期保存容器用の厚壁嫌気性血清ボトル内で滅菌した。Ｃ．パーフリンジェンス培養物を嫌気的に希釈し、シリンジ及び針により、ゴム製容器シールを通して培地の上部に移した。その後、容器をボルテックスして微生物と培地とを混合し、Ｃ．パーフリンジェンスの明らかな増殖が目に見えるまで最適な温度で培養した。Ｃ．パーフリンジェンスは、容易に計算可能な、あるいは適切な機器によって自動的に記録することさえ可能な黒い点を培地に形成できた。図３には、フィブリルセルロースとパーフリンジェンス寒天ベース培地との組み合わせ中で培養したＣ．パーフリンジェンス希釈系列を示す。Ｃ．パーフリンジェンスコロニーは、黒点として見える。図４及び５は、フィブリルセルロースとパーフリンジェンス寒天ベース培地との組み合わせ中、Ｃ．パーフリンジェンス希釈物：１０−８希釈物及び１０−６希釈物を示す。嫌気性微生物培養のために、この技術は単純かつ迅速であった。
【０１０５】
実施例４：フィブリルセルロースヒドロゲルによるデキストランの拡散
細胞培養材料の拡散特性についての詳細な知見は重要である。細胞培養材料は、培養細胞に栄養物及び酸素を拡散させるために、また、細胞からの代謝物の効果的な拡散を可能にするために、十分に多孔性でなければならない。異なる分子量のデキストランを用いて、以下の方法で、フィブリルセルロースヒドロゲルの拡散特性を実証した：
【０１０６】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）フィルターウェルプレート（フィルター孔径０．４μｍ）の頂端部のコンパートメント（apical compartment）に、フィルターあたり、４００μｌのアニオン性（酸化）又は天然のフィブリルセルロース（１％）を置いた（plant）。１ｍｌのＰＢＳを基底側（basolateral side）に添加し、１００μl（２５μｇ）の蛍光標識デキストランをヒドロゲルの上部に添加した（ＭＷ：２０ｋ、７０ｋ及び２５０ｋ）。プレートをしっかりと固定し、ウェルプレートロッカー上に静置した。１００μｌの試料を基底側から採取し、等量をＰＢＳで置き換えた。最初の試料は、１５分間隔で採取し、他の試料は、３０分〜２時間の範囲の異なる時点で採取し、最後の試料は２４時間で採取した。全部で１６８の試料を採取した。それぞれ励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍで、標的プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）−９６Ｆ）を測定した。
【０１０７】
１％の天然セルロースナノファイバーゲルを通った、異なる分子量のデキストランの拡散を図６に示す。モデル化合物の拡散は、一定の速度で起こり、化合物の分子量（サイズ）に大きく依存する。フィブリルセルロースヒドロゲルにおいては、そのゲル構造は細胞懸濁液を安定化させるのに十分なほど硬いが、分子は効果的に拡散可能であることが明らかである。
【０１０８】
実施例５：フィブリルセルロースヒドロゲルの流動性
フィブリルセルロースヒドロゲルのレオロジー流動性は、細胞培養での使用に有益ないくつかの特徴を示す。ヒドロゲルは、最適な細胞懸濁能のために低剪断（又は静止）では高い粘度を有するが、より高い剪断速度では剪断減粘挙動も示し、容易な分配及び注入を可能にする。フィブリルセルロース分散液の粘度を、幅広い剪断応力（速度）の範囲にわたって回転レオメーター（ＡＲ−Ｇ２、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）にて測定する試験シリーズで、これらの種類のレオロジー特性をもたらすフィブリルセルロースの能力を実証した。
【０１０９】
フィブリルセルロース分散液は、図７に示すように、他の水溶性のポリマーよりもはるかに高いゼロ剪断粘度（小さい剪断応力で粘度が一定な領域）を示す。フィブリルセルロースのゼロ剪断粘度は、出発材料の先行する化学的前処理によって生じる、より小さなナノフィブリル直径によって大幅に高まる。剪断減粘挙動が始まる応力（「降伏応力」）も、フィブリルセルロース分散液では著しく高い。材料の懸濁能が良好であるほど、降伏応力は高まる。細胞は、高いゼロ剪断粘度、高い降伏応力及び高い貯蔵弾性率の組み合わせ効果によって、沈殿に対して効果的に安定化される。細胞によって加わる重力は、降伏応力よりもはるかに弱い。従って、懸濁細胞は、フィブリルセルロースと混合する場合には、ゲルマトリックス内部で「停止（frozen）」し、あるいはゲル上部に付着（deposited）する場合には、ゲル上で「停止（frozen）」する。
【０１１０】
図８には、測定した剪断速度の関数として粘度を示す。この図６から、フィブリルセルロース分散液の粘度は、比較的低い剪断速度で低下し、約２００ｓ−１の剪断速度にて参照材料で測定された粘度と同様のレベルに達することが明白である。
【０１１１】
フィブリルセルロースのネットワーク構造は、剪断すると崩壊する（図８）。一定の応力を加えると、該システムの粘度は劇的に低下し、固体状から液状挙動への遷移が起こる。この種の挙動は、適度な機械的剪断によって、細胞をフィブリルセルロース懸濁液へと均質に混合することが可能になるため有益である。凝集フィブリルセルロース分散液などの二相の液体が剪断されると（例えば、レオメーター内又はチューブ内で）、分散相は、固体の境界から遠ざかるように移動する傾向があり、それによって、容器の壁に、より低粘度の液体層の形成が生じる（図９）。この現象は、流れ抵抗、すなわち粘度が、分散液の大部分よりも境界でより低いことを意味する。シリンジ及び針、又はピペットによるフィブリルセルロースヒドロゲルの注入は、それぞれ、高濃度（１〜４％）でさえ容易である。この現象はまた、細胞の障害を最小限にとどめて、細胞懸濁液を容易に分注することを可能にしており、すなわち、大部分の細胞は、針の中央部に位置し、実質的に停止している（図９）。
【０１１２】
実施例６：安定性
フィブリルセルロースの非常に希薄な分散液でさえ、低剪断速度で非常に高い粘度を有する。ヒドロゲル構造はまた、注入等の剪断が止まると、元の状態に戻る。静止状態で、フィブリルセルロースは、高い弾性係数と極めて高い降伏応力とを有するヒドロゲルネットワークを形成する。これらの特性のため、フィブリルセルロースは、非常に低い濃度でも、非常に高い固形粒子懸濁力を有する。
【０１１３】
静止状態での懸濁能は、礫（gravel）懸濁液で実証される。天然フィブリルセルロース及びアニオン性フィブリルセルロースの０．５％分散液は、２〜３ｍｍサイズの礫粒子でさえ非常に長い期間安定化できる（図１０参照）。アニオン性フィブリルセルロースは、天然フィブリルセルロースよりも低い濃度で粒子懸濁液を安定化できることに留意すべきである。
【０１１４】
本発明は、本発明を実施するのに現在好ましい形態を含めて、特定の実施例について記載されているが、当業者は、上述の実施態様には、本発明の精神及び範囲内で、多くの変形及び順序があることを理解するであろう。本発明が、その適用において、本明細書に記載の成分の配置及び構成の詳細に限定されないこと理解されるべきである。上記の変形及び変更は、本発明の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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