(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、ＫＩＴのドメインＤ５（配列番号：２５）に特異的に結合し、ＫＩＴのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型ＫＩＴの分解を誘導し、
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体。
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の抗体。
【請求項５】
ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、ＫＩＴのドメインＤ５（配列番号：２５）に特異的に結合し、ＫＩＴのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型ＫＩＴの分解を誘導する、単離されたヒト中和抗体であって、
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体。
【請求項６】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖可変領域が、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、ＫＩＴのドメインＤ５（配列番号：２５）に特異的に結合し、ＫＩＴのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型ＫＩＴの分解を誘導し、
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２７、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：２８及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：２９を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体。
【請求項１０】
軽鎖可変領域が、配列番号：２６に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：２６に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項９又は１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、ＫＩＴのドメインＤ５（配列番号：２５）に特異的に結合し、ＫＩＴのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型ＫＩＴの分解を誘導し、
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：３１、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３２及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：３３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗体。
【請求項１３】
軽鎖可変領域が、配列番号：３０に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：３０に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディからなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体のフラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸又は請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体又は請求項１５に記載のそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
薬物として使用するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体又は請求項１５に記載のそのフラグメント。
【請求項２１】
ガンを処置するのに使用するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体又は請求項１５に記載のそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ヒト中和抗ＫＩＴ抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ＫＩＴは、成長因子レセプターとして機能する１４５ｋＤのＩＩＩ型チロシンキナーゼレセプターである。ＫＩＴリガンドは、幹細胞因子（ＳＣＦ）である（Roskoski 2005）。ＩＩＩ型チロシンキナーゼレセプターは、細胞外領域における５つのＮ−グリコシル化イムノグロブリンドメインの存在と、スプリットチロシンキナーゼ細胞内ドメインとを特徴とする。最初の３つの細胞外ドメイン（Ｄ１〜３）は、ＳＣＦの結合に関与する一方（Lev, Blechman et al. 1993）、第４（Ｄ４）及び第５（Ｄ５）のドメインは、レセプターの二量体化とそれに続くＳＣＦの結合に関係する（Blechman and Yarden 1995）。ＫＩＴの細胞内領域は、ＡＴＰ結合部位及びホスホトランスフェラーゼドメインから構成される触媒ドメインを含有する。ＳＣＦによるＫＩＴ刺激は、その二量体化及び自己リン酸化を誘導すると、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ、ホスホリパーゼＣ、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）及びＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼ経路を含む下流のエフェクタータンパク質が活性化される（Roskoski 2005）。ＳＣＦは、胚における造血系、生殖細胞、メラノサイト、腸及び中枢神経系の自己再生、増殖及び分化の主なサイトカインである（Orr-Urtreger, et al. 1990）。成体マウスでは、ＫＩＴは、限られた数の組織で発現しており、ＫＩＴの欠損は、造血障害、組織肥満細胞の数の減少、受精及び色素形成の減少、並びにカハール介在細胞（これは、腸のペースメーカー活動に関与する）の発達不全を誘導する（総説については、Broudy 1997を参照のこと）。
【０００３】
ガンでは、ＳＣＦ及び／若しくはＫＩＴそれ自体の過剰発現により、又はＫＩＴシグナル伝達をＳＣＦから独立させる突然変異の活性化により、ＫＩＴシグナル伝達の異常が観察される。カハール細胞に由来する消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（Demetri, von Mehren et al. 2002）、一部の急性骨髄性白血病（コア結合因子急性骨髄性白血病ＣＢＦ−ＡＭＬ）（Wang, Zhao et al. 2011）及びメラノーマ（Hodi, Corless et al. 2013）、並びにそれほど多くはないが他のガンでは、ＫＩＴのこれらの突然変異が主な発ガンドライバである。したがって、これらの病状では、チロシンキナーゼ阻害剤による発ガン性ＫＩＴの阻害の成功が証明されている（総説については、Lennartsson and Ronnstrand 2012）。非突然変異ＫＩＴはまた、一般に、胚形成中にＫＩＴを一過性発現した細胞型に由来する多数の悪性疾患に関与する（Bernex, De Sepulveda et al. 1996）。ＳＣＦ／ＫＩＴ軸は、ガン細胞の増殖及び／又は遊走を支える自己分泌ループ又は傍分泌ループとして機能する。実際、ＫＩＴは、ＡＭＬの５０％に存在し（Ikeda, Kanakura et al. 1991）、ＡＭＬ芽球は、増殖の増加によるＳＣＦ刺激に高頻度で応答する（Pietsch et al., 1992）。一貫して、化学療法難治性のＡＭＬ患者の症例は、ＴＫＩによって治癒され得る（Xiang, Kreisel et al. 2007）。また、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）、メラノーマ、セミノーマを含む多数の固形腫瘍が、ＫＩＴ及び／又はＳＣＦを高頻度で発現する（Went, Dirnhofer et al. 2004）。典型的には、ＳＣＬＣの７０％が、ＳＣＦ及びＫＩＴを同時発現し（Hibi, Takahashi et al. 1991; Rygaard, Nakamura et al. 1993; Krystal, Hines et al. 1996）、高いＫＩＴレベルが予後不良に関連する一方（Micke, Basrai et al. 2003）、ＫＩＴキナーゼ阻害剤イマチニブは、in vitroでガン細胞増殖を減少させ（Krystal, Honsawek et al. 2000）、ＳＣＦ依存性ＶＥＧＦ分泌を減少させる（Litz and Krystal 2006）。小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）もまた、ＫＩＴを高頻度で発現し（Yoo, Kim et al. 2004）、興味深いことに、イマチニブ又はＳＣＦ遮断ｍＡｂは、ＮＳＣＬＣガン幹細胞亜集団を壊滅する（Levina, Marrangoni et al. 2010）。乳ガン（Hines et al., 1995）、神経芽細胞腫（Cohen et al., 1994）、結腸ガン（Toyota et al., 1994）、婦人科腫瘍（Inoue et al., 1994）及び神経膠腫（Stanulla et al., 1995）を含む他の固形腫瘍は、ＫＩＴを発現すると報告されている。
【０００４】
ＫＩＴの薬理学的阻害は、ＫＩＴレセプターの活性に部分的又は完全に依存する悪性腫瘍を処置するための潜在的なアプローチである。イマチニブ（Heinrich, Griffith et al. 2000）又はダサチニブ（Schittenhelm, Aichele et al. 2003）のようなＡＴＰ競合チロシンキナーゼ阻害剤は、ＫＩＴリン酸化を阻害し、細胞の成長又は生存を妨げる。残念なことに、臨床では、活性化ループに位置する多数のＫＩＴ突然変異がイマチニブ耐性を示し（Zermati, De Sepulveda et al. 2003; Ma, Mali et al. 2012）、病初では、イマチニブ感受性調節突然変異体は、患者の処置耐性につながる二次突然変異を蓄積する（Antonescu, Besmer et al. 2005）。
【０００５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Adams and Weiner 2005）は、それらの高い特異性及び高い結合親和性と、免疫エフェクターをリクルートするそれらの自然能力により、発ガン性ＫＩＴをターゲティングする魅力的なアプローチを提供する。したがって、最近、抗ＫＩＴｍＡｂ（ＳＲ−１、国際特許出願第９２／１７５０５号に最初に開示された）は、マウスＧＩＳＴモデルにおいて、マクロファージ依存性機構によって腫瘍進行を制限すると報告されており（Edris, Willingham et al. 2013）、放射性標識抗ＫＩＴ抗体（１２Ａ８ｍＡｂ）は、マウスモデルにおいて、ＳＣＬＣ進行を減少させることが示された（Yoshida, Tsuji et al. 2013）。抗体ＳＲ１は、ＫＩＴに対するＳＣＦ結合を阻害することが示されており、ＳＣＦは、ＫＩＴに対するＳＲ１結合を阻害する（Ashman, Buhring, et al. 1994）。加えて、ＫＩＴのドメイン４をターゲティングするモノクローナル抗体は、ＫＩＴの活性化に必須の同型Ｄ４相互作用を阻害することによって、ＫＩＴ依存性細胞成長を中和すると記載されている（Reshetnyak, Nelson et al. 2013）。
【０００６】
最近、ヒトｃ−ＫＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特異的にターゲティングするモノクローナル抗体が開示された（国際特許出願第２０１２／１５４４８０号）。ヒトｃ−ＫＩＴのＥＣＤを特異的にターゲティングするこれらのモノクローナル抗体（ＣＫ６抗体を含む）は、腫瘍細胞におけるｃ−ＫＩＴアゴニスト活性を誘導せずに、原形質膜に結合したｃ−ＫＩＴのインターナリゼーション及び／又は分解を誘導することができると示されている。しかしながら、抗ｃ−ＫＩＴｍＡｂ  ＣＫ６が、ＧＩＳＴ８８２ヒト腫瘍細胞によって発現される、Ｍｏ７ｅヒト腫瘍細胞によって発現される、及びＭａｌｍ−３Ｍヒト腫瘍細胞によって発現されるｃ−ＫＩＴの分解を時間依存的に有意に誘導することは観察されていないので、前記特許出願に開示されている結果はこの主張と矛盾している。
【０００７】
したがって、これまでに、発ガン型ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解を誘導することができるモノクローナル抗体は記載されていない。また、ＫＩＴのＤ５に結合する中和抗体も、まだ記載されていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。したがって本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２７、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：２８及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：２９を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。本発明はまた、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：３１、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３２及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：３３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明：
本発明は、ＳＣＦ結合を妨げて、その結果として、ＳＣＦ依存性ＫＩＴリン酸化及び下流シグナル伝達を阻害した２つの中和ｓｃＦｖ−Ｆｃの作製及び特性評価に基づくものである。これらの抗体は、処置の３日後に、ＳＣＦ依存性ＫＩＴ野生型を発現する赤白血病細胞株ＵＴ−７の生存率を減少させたことから、これらの特性は機能的効果につながるものであった。
【００１０】
興味深いことに、これらの抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃはまた、ＫＩＴの活性化突然変異を有する２つの肥満細胞白血病細胞株（（Ｖ５６０Ｇ  ＫＩＴ活性化突然変異を有する）ＨＭＣ１．１イマチニブ感受性細胞株及び（Ｖ５６０Ｇ／Ｄ８１６Ｖ  ＫＩＴ活性化突然変異を有する）ＨＭＣ１．２イマチニブ耐性細胞株を含む）の細胞生存率を減少させた。阻害は、抗体処置による発ガン型ＫＩＴの強力なインターナリゼーション及び分解に起因するものであった。
【００１１】
これらのモノクローナル抗体（２Ｄ１及び３Ｇ１と称される）は両方とも、ＳＣＦの結合後におけるＫＩＴ−Ｄ５の膜近位ドメイン間の同型相互作用（これらは、レセプター活性化に重要である）を阻害することによって、ＫＩＴ野生型ＫＩＴシグナル伝達を阻害する可能性がある。２Ｄ１及び３Ｇ１によるＫＩＴ−Ｄ５のターゲティングは、野生型ＫＩＴ及び発ガン性ＫＩＴの両方のインターナリゼーションを誘導し、かつＷＴ  ＫＩＴを損傷させずに、発ガン性ＫＩＴの分解を誘導する。興味深いことに、ＫＩＴのインターナリゼーションは、したがって野生型又は突然変異型（触媒又は膜近傍突然変異体のいずれか）とは無関係に観察されたが、強力な分解は、突然変異のバックグラウンドにおいてのみ観察された。
【００１２】
したがって、これらの完全ヒト抗体は、ＫＩＴ又はＳＣＦの過剰発現に関連する疾患をターゲティングするために、及びガン（例えば、ＡＭＬ又はＧＩＳＴ）における発ガン性ＫＩＴシグナル伝達をターゲティングするために、及び特定の突然変異体のＴＫＩ耐性をバイパスするために有用な新たな治療ツールの代表的なものである。
【００１３】
定義：
「ＫＩＴ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトＫＩＴを指す。ＫＩＴはまた、「ｋｉｔ」、「ｃ−ｋｉｔ」、「ＣＤ１１７」又は「幹細胞因子レセプター」として公知である。「ＫＩＴ」という用語は、天然型及びリコンビナント型のヒト天然ＫＩＴタンパク質の両方を指す。したがって、この用語は、天然に存在するＫＩＴ並びにその変異体及び改変型を含む。ＫＩＴは、過剰発現又は発ガン性突然変異を介してガンに関与する細胞表面ＩＩＩ型チロシンキナーゼレセプターであり、キナーゼを構成的に活性にする。ＫＩＴリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）は、レセプターのホモ二量体化及びリン酸化をトリガーし、細胞型に応じて、細胞の生存、増殖、ホーミング又は分化に関与する下流のエフェクター経路を活性化する。ＫＩＴシグナル伝達は、白血病及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に関与する。例示的なネイティブＫＩＴアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-ProtにおいてアクセッションナンバーＰ１０７２１）で示されている。
【００１４】
本明細書で使用される「発ガン型ＫＩＴ」という語は、ＳＣＦにかかわらず、腫瘍の成長及び進行を促す構成的シグナルの伝達をもたらす活性化突然変異を有するＫＩＴ突然変異体を指す。ガンでは、２つのグループのＫＩＴ活性化突然変異が存在する：ＧＩＳＴにおける調節型突然変異（例えば、ＫＩＴ  Ｖ５６０Ｇ）及び急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ）における酵素型突然変異（例えば、ＫＩＴ  Ｄ８１６Ｖ）。
【００１５】
「抗ＫＩＴ抗体」という用語は、ＫＩＴに対する抗体を指す。
【００１６】
本発明によれば、「抗体」又は「イムノグロブリン」という用語は、同一の意味を有し、本発明において同様に使用される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体フラグメント、並びに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な５つの重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン（可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ））を含む。重鎖は、４個のドメイン（可変ドメイン（ＶＨ）及び３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３。ＣＨと総称される））を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対する結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分から構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基から構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲ（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される）を有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。
【００１７】
本明細書で使用される「中和抗体」という語は、抗体が特異的に結合するエピトープを含むポリペプチドの少なくとも１つの活性を遮断又は減少させる抗体を指す。中和抗体は、in vitro及び／又はin vivoで活性を減少させる。典型的には、中和抗体は、ＫＩＴに対する幹細胞因子（ＳＣＦ）の結合を遮断して、したがってＫＩＴのＳＣＦ誘導性活性化を阻害する。したがって、中和抗体は、ＳＣＦ誘導性ＫＩＴリン酸化、及びその後のＫＩＴ下流シグナル伝達を阻害する（これは、例えば、下記のようにＫＩＴのチロシン５６８、５７０及び／若しくは８２３のリン酸化、並びに／又はＡＫＴ及びＥＲＫアッセイのリン酸化を評価するリン酸化アッセイによって評価され得る）。
【００１８】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」という語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（パパイン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側のほぼ半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合によって共に結合している抗体フラグメントを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ’）２」という語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合している、Ｆａｂよりもわずかに大きな抗体フラグメントを指す。
【００２０】
本明細書で使用される「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。
【００２１】
本明細書で使用される一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドという用語は、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から、通常、発現される共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。
【００２２】
本明細書で使用される「ｄｓＦｖ」という用語は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価抗体フラグメント及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成し得るか、又はペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって作製され得る（例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２）。
【００２３】
本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の２個のドメイン間のペアリングを可能にするには短過ぎるリンカーを使用することによって、前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングさせて、２つの抗原結合部位を作る。
【００２４】
「精製された」及び「単離された」は、本発明の抗体又はヌクレオチド配列に言及する場合、同じ種類の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で、示されている分子が存在することを意味する。好ましくは、本明細書で使用される「精製された」という用語は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ種類の生物学的高分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、該ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかしながら、該分子は、組成物の基本的特性に悪影響を与えないいくつかのさらなる塩基又は部分を含み得る。
【００２５】
本発明の抗体：
本発明は、単離された抗ＫＩＴ抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。より具体的には、本発明は、ＫＩＴに結合する単離されたヒト中和抗体であって、ＫＩＴのインターナリゼーションをさらに誘導し、発ガン型ＫＩＴの分解のみを誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。
【００２７】
一実施態様では、本発明は、ＫＩＴドメインＤ５（配列番号：２５に定義される）に結合する単離されたヒト中和抗体であって、発ガン型ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解をさらに誘導する単離されたヒト中和抗体に関する。
【表１】
0006441949.tif 000002
【００２８】
特に、本発明者らは、抗体ファージディスプレイによって、ＫＩＴのリコンビナント型細胞外ドメインに対して選択された２つの完全ヒト抗ＫＩＴ一本鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）（２Ｄ１及び３Ｇ１と称される）を単離した。
【００２９】
本発明者らは、前記ｓｃＦｖ  ２Ｄ１の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表１に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表２】
0006441949.tif 000003
【００３０】
したがって、本発明は、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００３１】
本発明はまた、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００３２】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００３３】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＩＴ抗体を提供する。
【００３４】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明者らはまた、前記ｓｃＦｖ  ３Ｇ１の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表２に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表３】
0006441949.tif 000004
【００３６】
したがって、本発明は、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００３７】
本発明はまた、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００３８】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００３９】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＩＴ抗体を提供する。
【００４０】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００４１】
本発明はさらに、ＫＩＴに対する前記抗体のフラグメント（限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディを含む）を提供する。
【表４】
0006441949.tif 000005
【００４２】
一実施態様では、前記フラグメントは、配列番号：１７に記載されているアミノ酸配列を有するｓｃＦｖである。
【００４３】
別の実施態様では、前記フラグメントは、配列番号：１８に記載されているアミノ酸配列を有するｓｃＦｖである。
【００４４】
抗体２Ｄ１及び３Ｇ１は、マウスＫＩＴと交差反応することにさらに留意すべきである（これは、前臨床評価及び毒物学的研究にとって興味深いものである）。
【００４５】
本発明の抗体を生産する方法：
本発明の抗ＫＩＴ抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝的技術又は酵素学的技術（単独又は組み合わせのいずれか）によって生産され得る。
【００４６】
所望の配列のアミノ酸配列を認識することにより、当業者であれば、標準的なポリペプチド生産技術により前記抗体を容易に生産できる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは商業的に入手可能なペプチド合成装置（Applied Biosystems, Foster City, Californiaにより製造されているものなど）を使用して、製造業者の説明書にしたがって合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントＤＮＡ技術により合成され得る。例えば、抗体は、発現ベクターの中への抗体をコードするＤＮＡ配列の組み込み、及び所望の抗体を発現する適切な真核又は原核の宿主生物の中への上記ベクターの導入後に、ＤＮＡ発現産物として得られ、それらはそこから周知の技術を使用して後に単離され得る。
【００４７】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。より具体的には、前記核酸配列は、表３に記載されているように、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする：
【表５】
0006441949.tif 000006
0006441949.tif 000007
0006441949.tif 000008
【００４８】
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それらはプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれ得る。
【００４９】
本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、宿主生物のトランスフォーメーション及び導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）の促進のために、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞内に導入し得るビヒクルを意味する。
【００５０】
そのため本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００５１】
このようなベクターは、被験体への投与によって前記抗体の発現を引き起こす又は発現を促すために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御エレメントを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。
【００５２】
動物細胞のための任意の発現ベクターが、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子が挿入及び発現され得る限り、使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１  ｂｅｔａ  ｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。
【００５３】
プラスミドの他の例としては、複製開始点を含む複製プラスミド、又はｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組み込みプラスミドが挙げられる。
【００５４】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばトランスフェクションパッケージング細胞、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションなどによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見出され得る。
【００５５】
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸及び／又はベクターによりトランスフェクション、感染又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に関する。
【００５６】
「トランスフォーメーション」という用語は、所望の物質、典型的には、導入される遺伝子又は配列によりコードされたタンパク質又は酵素を産生させるために、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を発現できるように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け入れて発現する宿主細胞は、「トランスフォーメーション」されている。
【００５７】
本発明の核酸は、適切な発現系における本発明の抗体の生産に使用され得る。「発現系」という用語は、例えばベクターにより運ばれる外来ＤＮＡによるコードされたタンパク質の発現のための条件、及び宿主への導入の条件などの適切な条件に基づく宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。
【００５８】
一般的な発現系としては、E.coli宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されないが、原核細胞（細菌など）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例としては、E.coli、Kluyveromyces又はSaccharomyces酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、及び初代哺乳動物細胞又は樹立哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生産される）が挙げられる。また、例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクダーゼ遺伝子（「ＤＨＦＲ遺伝子」）が欠損されたＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇら；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、「ＴＢ２／０細胞」と称される）などが挙げられる。
【００５９】
本発明はまた、本発明の抗体を発現するリコンビナント宿主細胞を生産する方法であって、（ｉ）上記のとおりのリコンビナント核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞にin vitro又はex vivoで導入する工程、（ｉｉ）得られたリコンビナント宿主細胞をin vitro又はex vivoで培養する工程、並びに（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む方法に関する。このようなリコンビナント宿主細胞は、本発明の抗体の生産に使用され得る。
【００６０】
適切には、本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばタンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地から分離される。
【００６１】
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするＤＮＡ配列において、改変及び変更を行って、望ましい特徴を有する抗体をコードする機能分子をさらに得ることができる。
【００６２】
アミノ酸配列の変更を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮し得る。タンパク質に相互作用的生物機能を与えることにおけるアミノ酸ヒドロパシー指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシーは、結果物としてのタンパク質の二次構造に寄与することが認められており、それは、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体及び抗原などの他の分子とのタンパク質の相互作用を規定する。
【００６３】
各アミノ酸は、それらの疎水性特性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００６４】
本発明のさらなる態様はまた、本発明の抗体の機能保存変異体を包含する。
【００６５】
「機能保存変異体」は、限定されないが、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するアミノ酸との置換を含む、ポリペプチドの全体の立体構造及び機能を改変することなくタンパク質又は酵素における所定のアミノ酸残基が変更されているものである。類似機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列の類似性の割合は変化し得、例えば類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくクラスタ法などによるアライメントスキームにしたがって決定した場合に７０％〜９９％であり得るように、保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なり得る。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定した場合に、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、比較されるネイティブな又は親のタンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。
【００６６】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、またはより短い配列の全長に対して約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）である場合に「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）ｐｉｌｅｕｐプログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用してアライメントによって同定される。
【００６７】
例えば、特定のアミノ酸は、かなりの活性が欠損することなくタンパク質構造における他のアミノ酸により置換されてもよい。タンパク質の相互作用能力及びタンパク質の性質がタンパク質の生物学的機能活性を規定するため、類似の特性を有するタンパク質を得ることができれば、特定のアミノ酸の置換はタンパク質配列において生じてもよく、また、当然ながらその配列をコードするＤＮＡにおいて生じてもよい。したがって、様々な変更は、抗体の生物学的活性の多くを欠損することが無く、本発明の抗体の配列、又は該抗体をコードする対応のＤＮＡ配列において行われ得ると企図される。
【００６８】
特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸に置換されてもよく、その結果、類似の生物学的活性を有するタンパク質が生じる（すなわち、生物機能的に同等のタンパク質が得られる）ことが当技術分野で公知である。
【００６９】
したがって、上記のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷及びサイズなどに基づく。様々な上記特性を考慮に入れる例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
【００７０】
したがって、本発明はまた、可変ドメインが、
−配列番号：２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号：３に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号：４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号：６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号：７に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号：８に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４を含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で（より好ましくは、二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２Ｄ１と実質的に同じ親和性で）ＫＩＴに特異的に結合する抗体を提供する。
【００７１】
本発明者らは、増加した親和性を示す２Ｄ１変異体（２Ｄ１−Ｃ７と称される）の軽鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表４に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表６】
0006441949.tif 000009
【００７２】
したがって、本発明は、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００７３】
本発明はまた、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：２７、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：２８、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：２９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００７４】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：２７、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：２８、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：２９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００７５】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２７、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：２８及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：２９を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＩＴ抗体を提供する。
【００７６】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：２６に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００７７】
本発明はさらに、可変ドメインが、
−配列番号：１０に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号：１１に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号：１２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号：１４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号：１５に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号：１６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２を含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で（より好ましくは、二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ３Ｇ１と実質的に同じ親和性で）ＫＩＴに特異的に結合する抗体を提供する。
【００７８】
本発明者らは、増加した親和性を示す３Ｇ１変異体（３Ｇ１−Ａ２と称される）の軽鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、したがって表５に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表７】
0006441949.tif 000010
【００７９】
したがって、本発明は、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００８０】
本発明はまた、ＫＩＴに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：３１、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：３２、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：３３からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００８１】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：３１、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：３２、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：３３からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００８２】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：３１、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３２及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：３３を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＩＴ抗体を提供する。
【００８３】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：３０に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００８４】
前記抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により、特異的な結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットがエピトープビニングのために使用され得る。限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオ免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ及び補体結合アッセイなどの技術を使用する競合アッセイシステムを含む免疫アッセイが使用され得る。このようなアッセイは、ルーチンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）（GE Healthcare, Piscaataway, NJ）は、モノクローナル抗体のエピトープビンパネルにルーチン的に使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。さらに、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載されているようなルーチンクロスブロッキングアッセイが行われ得る。
【００８５】
本発明の人工抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して改変を施された抗体を含む。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体に由来する生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、その抗体に由来する生殖細胞系配列と抗体フレームワーク配列とを比較することにより同定され得る。フレームワーク領域の配列をそれらの生殖細胞系構造に戻すために、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲによる突然変異誘発により、生殖細胞系配列に復帰突然変異され得る。このような「復帰突然変異」された抗体もまた、本発明に含まれることが意図される。別の種類のフレームワーク改変は、Ｔ細胞のエピトープを除去してそれによって抗体の潜在的免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内、又は１つ以上のＣＤＲ領域内における１つ以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも称され、さらなる詳細はCarrらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に記載されている。
【００８６】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて又は代えて、本発明の抗体は、典型的には血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合及び／又は抗原依存性細胞毒性などの抗体の１つ以上の機能的特性を変更するために、Ｆｃ領域内における改変を含むように設計されていてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に改変されていてもよく（例えば、１つ以上の化学的部位が抗体に結合され得る）、また、そのグリコシル化を変更するように改変されていてもよく、また、抗体の１つ以上の機能的特性を変更するように改変されていてもよい。これらの各実施態様は、以下にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。
【００８７】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、そのヒンジ領域のシステイン残基の数が変更されるように、例えば増える又は減るように改変されている。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽鎖及び重鎖の構築を促進する、又は抗体の安定性を増加若しくは減少するように変更される。
【００８８】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少するように突然変異される。より具体的には、１つ以上のアミノ酸突然変異は、その抗体における黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）との結合性が天然ＦｃヒンジドメインのＳｐＡ結合性と比較して低くなるように、ＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェイス領域内に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００８９】
別の実施態様では、抗体はその生物学的半減期を増加するために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１つ以上が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加するために、抗体は、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号及び米国特許第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインにおける２つのループから得られるサルベージレセプター結合エピトープを含むようにＣＨ１又はＣＬ領域内で変更され得る。
【００９０】
また他の実施態様では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより変更される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが親抗体の抗原結合能力を維持するように、異なるアミノ酸残基に置換され得る。親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えばＦｃレセプター又は補体のＣ１コンポーネントであり得る。このアプローチは、Winterらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【００９１】
別の実施態様では、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合性、及び／又は減少若しくは抑制された補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基と置換され得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００９２】
別の実施態様では、抗体の補体結合能力を変更するように、１つ以上のアミノ酸残基は変更されている。このアプローチは、Bodmerらによる国際公開公報第９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【００９３】
また別の実施態様では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を改変することにより、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介するための抗体の能力を増加する、及び／又はＦｃレセプターに対する抗体の親和性を増加するように改変されている。このアプローチは、Prestaによる国際公開公報第００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧＩにおける結合部位は既に位置決定されており、改善された結合性を有する変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第２０１０１０６１８０号を参照のこと）。
【００９４】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が改変されている。例えば、脱グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性を増加するために変更され得る。このような炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変更することによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去することによってその部位におけるグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換はなされ得る。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加し得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第５，７１４，３５０号及び米国特許第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【００９５】
加えて又はあるいは、変更型のグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が減少しているか、若しくはフコシル残基を有しない低フコシル化若しくは非フコシル化抗体、又は増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加すると実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することにより達成され得る。変更されたグリコシル機構を有する細胞は、当技術分野で説明されており、本発明のリコンビナント抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hangらによる欧州特許出願公開第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されており、このような細胞株で発現された抗体は、低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠く。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８の発現が欠損している哺乳動物細胞株におけるリコンビナント発現により産生され得る。Prestaによる国際公開公報第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下している変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞であって、その細胞株で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umanaらによる国際公開公報第９９／５４３４２号には、人工細胞株で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと）。EurekaTherapeuticsには、フコシル残基が欠けた変更された哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を産生することができる遺伝子的に改変されたＣＨＯ哺乳動物細胞がさらに記載されている（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。
【００９６】
あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて改変され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠いている抗体を産生することができる酵母又は糸状菌で産生され得る（例えば、欧州特許第１２９７１７２号を参照のこと）。
【００９７】
本発明によって企図される本発明の抗体の別の改変はペグ化である。抗体は、例えば抗体の生物学的（例えば、血清）半減期の増加のためにペグ化され得る。抗体のペグ化のために、通常、抗体又はそのフラグメントは、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合する条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ若しくはアリールオキシポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコールマレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの形態のいずれかを含むことを意図する。特定の実施態様では、ペグ化すべき抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawaらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。
【００９８】
本発明によって企図される抗体の別の改変は、得られる分子の半減期を増加させるための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメント）へのコンジュゲート又はタンパク質融合である。このようなアプローチは、例えばBallanceらの欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。別の可能性は、得られる分子の半減期を増加させるための、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質に結合することができるタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）への融合である。このようなアプローチは、例えばNygrenらの欧州特許第０４８６５２５号に記載されている。
【００９９】
イムノコンジュゲート：
本発明の抗体は、抗ＫＩＴイムノコンジュゲートを形成するために、検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。適切な検出可能な標識としては、例えば放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識又は金コロイドが挙げられる。このような検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを作製及び検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載する。
【０１００】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用なアイソトープは、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び１４Ｃである。
【０１０１】
抗ＫＩＴイムノコンジュゲートはまた、蛍光化合物により標識され得る。蛍光標識された抗体の存在は、適切な波長の光にそのイムノコンジュゲートを当てて、それにより生じた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが挙げられる。
【０１０２】
あるいは、抗ＫＩＴイムノコンジュゲートは、化学発光化合物に抗体をカンプリングさせることにより検出可能に標識され得る。化学発光タグ化イムノコンジュゲートの存在は、化学的反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１０３】
同様に、生物発光化合物が、本発明の抗ＫＩＴイムノコンジュゲートを標識するのに使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学的システムにおいて見出された化学発光の１種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びイクオリンが挙げられる。
【０１０４】
あるいは、抗ＫＩＴイムノコンジュゲートは、酵素に抗ＫＩＴ抗体を結合させることにより検出可能に標識され得る。抗ＫＩＴ酵素コンジュゲートが適切な基質の存在下でインキュベーションすると、酵素部分は、基質と反応して、例えば分光光度法、蛍光分析法又は可視的手段により検出され得る化学的部分を生成する。多特異的イムノコンジュゲートを検出可能に標識するのに使用され得る酵素の例としては、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０１０５】
当業者であれば、本発明にしたがって使用され得る他の適切な標識を認識するであろう。抗ＫＩＴモノクローナル抗体にマーカー部を結合することは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成され得る。これに関する一般の方法論は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int’l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990；及び上記Coliganに記載されている。
【０１０６】
さらに、免疫化学検出の簡便性及び汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンとコンジュゲートされた抗ＫＩＴモノクローナル抗体を使用することによって増強され得る（例えば、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).を参照のこと）。
【０１０７】
イムノアッセイを実施するための方法は、十分に確立されている（例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).を参照のこと）。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、抗ＫＩＴ抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本明細書で使用される「抗ＫＩＴ抗体−薬物コンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされた本発明の抗ＫＩＴ抗体を指す。このような抗ＫＩＴ抗体−薬物コンジュゲートは、患者（例えば、ＫＩＴ発現性ガンを有する患者など）に投与した場合に、典型的には、単独で投与した場合だけではなく他の治療剤と組み合わせて投与した場合にも、ＫＩＴ発現細胞に対して臨床的に有益な効果をもたらす。
【０１０９】
典型的な実施態様では、抗ＫＩＴ抗体は、得られる抗体−薬物コンジュゲートが、ＫＩＴ発現細胞（例えば、ＫＩＴ発現ガン細胞）に取り込まれ、又はインターナリゼーションされると、前記細胞に対する細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を発揮するように、細胞毒性薬にコンジュゲートされている。抗体にコンジュゲートするのに特に適切な部分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物又は毒素である。例えば、抗ＫＩＴ抗体は、細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は毒素（例えば、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素など）にコンジュゲートされ得る。
【０１１０】
細胞毒性薬の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、単核（白金）、二核（白金）及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤又はビンカアルカロイドなどが挙げられる。
【０１１１】
個々の細胞毒性薬としては、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（etopside phosphate）（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。
【０１１２】
特に適切な細胞毒性薬としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテイン）、トポテカン、モルフォリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、エチノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン並びにミトキサントロンが挙げられる。特定の実施態様では、細胞毒性薬は、従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシドなどである。加えて、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗ＫＩＴ抗体に連結し得る。
【０１１３】
特定のバリエーションでは、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン１０としても公知である）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチン誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、ＡＥＢ及びＡＥＶＢをそれぞれ生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロリン−フェニルアラニン）及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開第２００３００８３２６３号；国際公開公報第２００２／０８８１７２号及び国際公開公報第２００４／０１０９５７号；並びに米国特許第６，８８４，８６９号；米国特許第６，３２３，３１５号；米国特許第６，２３９，１０４号；米国特許第６，０３４，０６５号；米国特許第５，７８０，５８８号；米国特許第５，６６５，８６０号；米国特許第５，６６３，１４９号；米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，５９９，９０２号；米国特許第５，５５４，７２５号；米国特許第５，５３０，０９７号；米国特許第５，５２１，２８４号；米国特許第５，５０４，１９１号；米国特許第５，４１０，０２４号；米国特許第５，１３８，０３６号；米国特許第５，０７６，９７３号；米国特許第４，９８６，９８８号；米国特許第４，９７８，７４４号；米国特許第４，８７９，２７８号；米国特許第４，８１６，４４４号；及び米国特許第４，４８６，４１４号に記載されている。
【０１１４】
他のバリエーションでは、細胞毒性薬は、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤である（例えば、米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、特定の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、ＣＢＩ化合物である。他の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、エンジインである（例えばカリケアミシン）。
【０１１５】
特定の実施態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）並びにドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルチシン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド並びにエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、他のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.; また Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992を参照のこと）。
【０１１６】
他の実施態様では、細胞毒性薬は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリン又はミコフェノレートモフェチル）、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジン、アラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカーネット又はトリフルリジンであり得る。
【０１１７】
他の実施態様では、抗ＫＩＴ抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされている。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して、抗体にリコンビナント融合又は化学的にコンジュゲートされ得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、βグルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、βラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１１８】
治療剤をタンパク質（特に、抗体）にコンジュゲートするための技術は、周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、国際公開公報第８９／１２６２４号も参照のこと）。
【０１１９】
診断用途：
本発明のさらなる態様は、ガン疾患、及びＫＩＴレベルが改変（増加又は減少）している他の疾患を診断及び／又はモニタリングするための本発明の抗ＫＩＴ抗体に関する。
【０１２０】
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、蛍光分子、放射性分子又は上記の当技術分野で公知の任意の他の標識などの検出可能な分子又は物質を使用して標識され得る。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法により放射性分子を使用して標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されないが、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。本発明の抗体はまた、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（核磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても公知である）のためのスピン標識を使用して標識され得る。抗体の投与の後、患者内における抗体の分布が検出される。任意の特定の標識の分布を検出する方法は、当業者に公知であり、任意の適切な方法が使用され得る。いくつかの非限定的な例としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光及び超音波検査法が挙げられる。
【０１２１】
本発明の抗体は、（例えば、放射性イメージングにおいて）ＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患を診断及び病期分類するために有用であり得る。ＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患としては、典型的には、限定されないが、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、血液ガン（例えば、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン、メラノーマ、結腸ガン、結腸直腸ガン、精巣セミノーマ、ＫＩＴを発現又は過剰発現する他の過剰増殖性疾患が挙げられる。
【０１２２】
本発明の抗体は、ＫＩＴ発現が増加又は減少している（可溶性ＫＩＴ型又は細胞ＫＩＴ型）ガン以外の疾患を診断するのに有用であり得る。
【０１２３】
典型的には、前記診断方法は、患者から得られた生物学的サンプルの使用を含む。本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、被験体から得られた様々な型のサンプルを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用され得る。生物学的サンプルとしては、限定されないが、血液及び他の生物起源の液体サンプル、生検材料若しくは組織培養物又はそれら由来の細胞及びその子孫などの固体組織サンプルが挙げられる。例えば、生物学的サンプルとしては、ＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患を有すると疑われる個体から回収された組織サンプルから得られた細胞を含み、好ましい実施態様では、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン、メラノーマから得られた細胞が挙げられる。したがって、生物学的サンプルは、臨床サンプル、培養液中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生物学的流体及び組織サンプルを包含する。
【０１２４】
特定の実施態様では、本発明は、本発明の抗体を使用して、被験体由来の細胞上のＫＩＴを検出することによって、被験体におけるＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患を診断する方法である。特に、前記診断方法は、
（ａ）ＫＩＴを発現する生物学的サンプルの細胞と抗体が複合体を形成するのに十分な条件で、ＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患を患っている可能性がある被験体の生物学的サンプルを本発明の抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記複合体を検出及び／又は定量する工程を含み得、それにより、前記複合体の検出は、ＫＩＴ過剰発現に関連するガン疾患を示す。
【０１２５】
ガン疾患をモニタリングするために、本発明の診断方法を異なる時間間隔で反復して、サンプルに対する抗体結合が増加又は減少しているかを決定し、それにより、ガン疾患が進行又は退縮しているか決定し得る。
【０１２６】
治療用途：
本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートは、ＫＩＴ発現に関連する任意の疾患（優先的には、ガン）を処置するために有用であり得る。本発明の抗体は単独で、又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。
【０１２７】
本発明の抗ＫＩＴ抗体は、ＫＩＴの発現、過剰発現及び／又は活性化に関連する過剰増殖性疾患の処置として使用され得る。ＫＩＴの発現、過剰発現又は活性化に関連するこのような疾患の例は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、血液ガン（例えば、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン、メラノーマ、結腸ガン、結腸直腸ガン、精巣セミノーマ、ＫＩＴを発現又は過剰発現する他の過剰増殖性疾患を包含する。より好ましいガンは、ＧＩＳＴ、ＡＭＬ、小細胞肺ガン、膵臓ガン、肥満細胞腫、卵巣ガン、乳ガン及びメラノーマである。
【０１２８】
前述のように、ＫＩＴの過剰発現又は活性化に関連するガンでは、２つのグループの活性化突然変異が存在する：ＧＩＳＴにおける調節型突然変異（例えば、ＫＩＴ  Ｖ５６０Ｇ）及び急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ）における酵素型突然変異（例えば、ＫＩＴ  Ｄ８１６Ｖ）。
【０１２９】
特定の一実施態様では、ＫＩＴの発現、過剰発現及び／又は活性化に関連する前記過剰増殖性疾患は、ＴＫＩ耐性疾患、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴ又はＡＭＬなどである。このような疾患は、ＫＩＴの触媒突然変異体（活性化ループの突然変異）では一次抵抗を示し、又は薬物結合残基の突然変異（ゲートキーパー突然変異、例えばＴ６７０Ｉ又はＶ６５４Ａ）では二次抵抗を示し得る。
【０１３０】
本明細書に記載される処置方法の各実施態様では、抗ＫＩＴ抗体又は抗ＫＩＴ抗体−薬物コンジュゲートは、処置しようとする疾患又は障害の管理に関連する従来の方法にしたがって送達される。本明細書の開示にしたがって、有効量の抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、疾患又は障害を予防又は治療するために十分な時間及び条件下で、このような処置を必要とする患者に投与される。
【０１３１】
したがって、本発明の態様は、ＫＩＴの過剰発現及び／又は活性化に関連する疾患を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【０１３２】
本発明との関連では、本明細書で使用される「処置すること」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは症状、又はこのような障害若しくは症状の１つ以上の症候の進行を回復、緩和、阻害又は予防することを意味する。
【０１３３】
本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、ＫＩＴの過剰発現及び／又は活性化に関連する疾患に罹患しているか、又は罹患している可能性があるヒトを意図する。
【０１３４】
本発明の抗体の「治療有効量」は、医薬的治療に適用できる適切なベネフィット／リスク比において、ＫＩＴの過剰発現及び／又は活性化に関連する前記疾患、例えばガン（例えば、ＧＩＳＴ又はＣＭＬ）を処置するための抗体の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の抗体及び組成物の１日当たりの総用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されよう。任意の特定の患者のための特定の治療的有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度、使用される特定の抗体の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、使用される特定の抗体の排出率、治療の期間、使用される特定の抗体と組み合わせで使用される又は同時に使用される薬物、並びに医学分野で周知の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの化合物の用量で開始すること、及び所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することは当業者に周知である。
【０１３５】
特定の実施態様では、抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、疾患又は障害の処置のための第２の薬物と組み合わせて使用される。ガンの処置に使用される場合、本発明の抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、例えば手術、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどの従来のガン治療と組み合わせて使用され得る。
【０１３６】
特定の態様では、本発明の抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとの併用ガン治療に有用な他の治療剤としては、抗血管新生薬が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、サイトカイン（例えば、腫瘍に対しての免疫応答を刺激するサイトカイン）と同時投与される。
【０１３７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるとおりの抗ＫＩＴモノクローナル抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と組み合わせて使用される。
【０１３８】
一実施態様では、ＴＫＩは、欧州特許出願公開第０５６４４０９号に記載されているＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、国際公開公報第２００４００５２８１号に記載されているピリミジニルアミノベンズアミド誘導体、国際公開公報第００６２７７８号に記載されている環状化合物、国際公開公報第２００７０７５８６９号に記載されている二環式ヘテロアリール化合物、米国特許第６００２００８号に記載されている置換３−シアノキノリン誘導体、国際公開公報第２００５０４６６９号に記載されている４−アニロ−３−キノリンカルボニトリル誘導体、並びに米国特許第７７２８１３１号及び国際公開公報第２００５０６３７０９号に記載されているアミド誘導体からなる群より選択される。
【０１３９】
特定の実施態様では、ＴＫＩは、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブ、ボスチニブ及びバフェチニブからなる群より選択される。
【０１４０】
好ましい実施態様では、ＴＫＩは、イマチニブ又は式（Ｉ）：
【化１】
0006441949.tif 000011
の４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−Ｎ−（４−メチル−３−｛［４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェニル）ベンズアミド（NovartisによってGLIVEC（登録商標）として販売されており、以前はＳＴＩ５７１として公知である）である。
【０１４１】
好ましい実施態様では、ＴＫＩは、ニロチニブ又は式（ＩＩ）：
【化２】
0006441949.tif 000012
の４−メチル−Ｎ−［３−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−３−［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］ベンズアミド（NovartisによってTASIGNA（登録商標）として販売されており、以前はＡＭＮ１０７として公知である）である。
【０１４２】
好ましい実施態様では、ＴＫＩは、ダサチニブ又は式（ＩＩＩ）：
【化３】
0006441949.tif 000013
のＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾール−カルボキサミド一水和物（BMSによってSPRYCEL（登録商標）として販売されており、以前はＢＭＳ−３５４８２５として公知である）である。
【０１４３】
好ましい実施態様では、ＴＫＩは、ポナチニブ又は式（ＩＶ）：
【化４】
0006441949.tif 000014
の３−（２−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イルエチニル）−４−メチル−Ｎ−［４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド（ICLUSIG（登録商標）として販売されており、以前はＡＰ２４５３４として公知である）である。
【０１４４】
好ましい実施態様では、ＴＫＩは、ボスチニブ又は式（Ｖ）：
【化５】
0006441949.tif 000015
の４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル（PFIZERによってBOSULIF（登録商標）として販売されており、以前はＳＫＩ−６０６として公知である）である。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるとおりの抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、治療モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組み合わせて使用される。トラスツズマブ（ハーセプチン、Roche）、ベバシズマブ（アバスチン、Roche）、及びセツキシマブ（アービタックス、Merck）は、認可されているこのようなｍＡｂ３種である。他のｍＡｂとしては、限定されないが、インフリキシマブ（レミケード、Johnson&Johnson）、リツキシマブ（リツキサン、Roche）、アダリムマブ（ヒュミラ、Abbott）及びナタリズマブ（タイサブリ、Biogen）が挙げられる。
【０１４６】
医薬組成物：
投与のために、抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化される。抗ＫＩＴ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって製剤化され得、それにより、治療分子は、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者に許容され得る場合、「薬学的に許容し得る担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質のロスを防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。
【０１４７】
医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、当然のことながら、処置すべき状態、疾患の重篤度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。
【０１４９】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水の添加によって、注射液の構成が可能となる。
【０１５０】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。
【０１５１】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散し得る。
【０１５２】
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【０１５３】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【０１５４】
本発明の抗体は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩、及び無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０１５５】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０１５６】
必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１５７】
より濃縮された又は高濃縮された直接注射用溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして高濃度の活性薬剤を小腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
【０１５８】
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【０１５９】
水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下注入液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【０１６０】
本発明の抗体は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【０１６１】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１６２】
特定の実施態様では、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。
【０１６３】
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内のポリマーオーバーローディングによる副作用を回避するために、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を設計する。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が本発明における使用に企図され、このような粒子は容易に作製され得る。
【０１６４】
水性媒体に分散されて多層状で同心円状の二層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自然に形成するリン脂質から、リポソームが形成される。ＭＬＶは、一般に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）であって、コアに水溶液を含有する小単層ベシクルが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１６５】
キット：
最後に本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、ＫＩＴの発現（増加又は減少）を検出する際に、又は治療的アッセイ若しくは診断的アッセイにおいて使用される。本発明のキットは、例えば組織培養プレート又はビーズ（例えば、セファロースビーズ）などの固体支持体にカップリングされた抗体を含有し得る。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットでは、ＫＩＴをin vitroで検出及び定量するための抗体を含有するキットが提供され得る。検出に有用なこのような抗体は、蛍光又は放射性標識などの標識と共に提供され得る。
【０１６６】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖのパネルの選択及び初期特性評価。（Ａ）リコンビナントバキュロウイルスが感染したHigh Five細胞で産生され、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー後に精製したＫＩＴ−ＥＣＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）抗ＫＩＴ  Ｎ末端モノクローナル抗体（Santa Cruz）による精製ＫＩＴ−ＥＣＤのウエスタンブロット分析。（Ｃ）２回目及び３回目の選択ラウンドで得られたファージ抗体の多様性の分析。ＫＩＴ−ＥＣＤに対する結合についてＥＬＩＳＡで陽性であったファージ抗体のクローンを配列決定した。（Ｄ）ＨＭＣ１．２細胞に結合するｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析。ｐＨＥＮファージミドを含有するＴＧ１細菌から、ＩＰＴＧ １mMを用いて、２５℃で一晩かけてｓｃＦｖを誘導した。上清を回収し、Amicon ultra-4 centrifugal unitsで濃縮し、ＨＭＣ１．２細胞と共に４℃でインキュベーションした。抗ｃ−ｍｙｃ抗体、及びフィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウス免疫グロブリンを用いて、細胞に結合したｓｃＦｖを検出した。ＦＡＣＳによって、蛍光を測定した。９超のＭＦＩシグナル（非特異的Ｂｏｔ−Ｆｃを用いて得られたＭＦＩ）を陽性とみなした。
【図２】二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットへのファージ抗体フォーマットの変換。（Ａ）非還元条件（左のパネル）対還元条件（右のパネル）における５つの抗ＫＩＴ  ＥＣＤ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ及び無関係なｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｂｏｔ−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＣＨＯ細胞でＳｃＦｖ−Ｆｃを生産し、プロテインＡアガロースで精製する。（Ｂ）リコンビナントｃ−ＫＩＴ  ＥＣＤに対する精製ｓｃＦｖ−Ｆｃ結合のＥＬＩＳＡ分析（ＥＣ５０の計算については、表１を参照のこと）。
【図３】野生型ＫＩＴシグナル伝達の抗体干渉。（Ａ）無血清培地中でＴＦ−１細胞を一晩飢餓させ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/ml）と共にインキュベーションしてから、ＳＣＦ（２５０ng/ml）で５分間刺激した。ホスホ特異的抗体を用いてウエスタンブロットによって、ＫＩＴ及びＡＫＴのリン酸化を分析した。膜を脱ストリップし、抗ＫＩＴ及び抗ＡＫＴ抗体で再プローブした後に、全ＫＩＴ及びＡＫＴレベルを可視化した。（Ｂ）５μg/mL（破線）若しくは５０μg/mL（灰色）で示されている抗ＫＩＴ抗体若しくはコントロール抗体の存在下の、又は抗体なし（黒色）のＥＰＯ（上のパネル）又はＣＨＯ−ＫＬ上清中で、ＵＴ７／ＥＰＯ細胞をインキュベーションした。細胞生存率をＯＤ４９５nmで表す。
【図４】ＷＴ状況におけるＫＩＴレベルの抗体モデュレーション。非競合１０４Ｄ２−抗ＫＩＴ抗体を使用してＦＡＣＳ（Ａ、Ｂ）によって、ＫＩＴレベルを推定した。（Ａ）ＥＰＯを補充した完全ＩＭＤＭ培地中、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体（１０μg/mL）又はＣＨＯ−ＫＬ（５００倍希釈）と共に、ＵＴ７／ＥＰＯ細胞を１時間、４時間又は２４時間インキュベーションした。（Ｂ）ＥＰＯを補充した完全ＩＭＤＭ培地中、示されているように、単独で、又はＣＨＯ−ＫＬ若しくは抗体（５又は５０μg/mL）と共に、又はＣＨＯ−ＫＬ（５００倍希釈）のみと共に、ＵＴ７／ＥＰＯ細胞をインキュベーションした。ＮＭ：非マーク細胞。結果をＭＦＩで表す（平均蛍光強度）。（Ｃ）示されているＫＩＴ及びホスホＫＩＴ特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって、全ＫＩＴレベルも決定した。分析前に、１０μg/mLの抗体と共に、細胞を５日間インキュベーションした。
【図５Ａ】発ガン性ＫＩＴの抗体モデュレーション。５μg/mL（薄灰色）若しくは５０μg/mL（中灰色）で示されている抗ＫＩＴ抗体若しくはコントロール抗体の存在下の、又は抗体なし（濃灰色）のＩＭＤＭ １％血清中で、ＨＭＣ１．１又はＨＭＣ１．２細胞をインキュベーションした。非処理細胞と比較した細胞生存率を％で表す。抗ＫＩＴ抗体又はコントロール抗体（１０μg/mL）の存在下のＩＭＤＭ １０％血清中で、ＨＭＣ１．１又はＨＭＣ１．２細胞を１時間、２時間又は２４時間インキュベーションした。
【図５Ｂ】発ガン性ＫＩＴの抗体モデュレーション。示されているように、１０４Ｄ２抗ＫＩＴ抗体を使用してＦＡＣＳによって分析した。
【図５Ｃ】発ガン性ＫＩＴの抗体モデュレーション。示されているように、抗ＫＩＴ及びホスホ特異的抗ＫＩＴ抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。
【図５Ｄ】発ガン性ＫＩＴの抗体モデュレーション。抗ＫＩＴ抗体で３日間処理することにより、両方の肥満細胞腫細胞株で低いＫＩＴレベルを維持した。
【図６】リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤに対するｓｃＦｖ−Ｆｃ結合のＳＰＲ分析及び動態データの決定。BIACORE 3000装置（GE Healthcare, Biacore AB, Uppsala, Sueden）を使用してリアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって、動態測定を実施した。GEHealthcareの抗ヒト捕捉キットプロトコールにしたがって、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５センサーチップのフローセル上に固定化した。抗体を用いない以外は同じ化学処理を用いて、参照フローセルを作製した。２つのフローセルにおいて、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（１０mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、３．４mM ＥＤＴＡ及び０．００５％Biacore（商標）界面活性剤）を使用して、流速３０μL／分、２５℃で全ての分析を実施した。各ｓｃＦｖ−Ｆｃを２０μg/mLで３分間注入し、続いて、様々な濃度（２０nM〜３３０nM）のＫＩＴ−ＥＣＤを注入（９０μL）した。４００秒間の解離工程の後、３M ＭｇＣｌ２溶液を使用して、各ラン間でフローセル表面を再生した。無関係なｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｂｏｔ−Ｆｃ）をネガティブコントロールとして使用した。各ｓｃＦｖについて、ＫＩＴ−ＥＣＤに代えて緩衝液を用いてランを実施して、減衰表面効果を補正した。参照フローセルのシグナルを差し引くことによって、全てのセンサーグラムを補正し、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを使用してグローバルフィッティングした。（Ａ）ラングミュア１：１プロットを用いて、２Ｄ１−Ｆｃ及び３Ｇ１−Ｆｃセンサーグラムをフィッティングした。（Ｂ）２Ｄ１及び３Ｇ１の固有親和性は、それぞれ１７３nM及び６６nMであった。
【実施例】
【０１６８】
材料及び方法
細胞及び細胞培養条件：ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）を補足した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）を含有するＲＰＭＩ（Gibco）中で、Ｂａ／Ｆ３、Ｂａ／Ｆ３−ＫＩＴ及びＴＦ−１細胞株（Dr. Patrice Dubreuil, INSERM U891, Institut Paoli-Calmettes, Marseille, Franceより寄贈）を成長させた。ＧＭ−ＣＳＦ（１０ng/mL）（Invitrogen）を含むＸ６３−ＩＬ−３（Patrice Dubreuilより寄贈）及びＴＦ−１の０．１％調節培地をＢａ／Ｆ３及びＢａ／Ｆ３−ＫＩＴ細胞に補充した。ＦＢＳ及び抗生物質を含有する上記ＩＭＤＭであって、ＥＰＯ（２U/mL）又はＳＣＦのいずれかを補充したＩＭＤＭ中で、ＵＴ７／Ｅｐｏ細胞株（Ｅｐｏの存在下で６カ月超維持したＵＴ−７細胞から樹立した亜系統のＵＴ−７細胞）（Dr. Isabelle Dusanter-Fourt, INSERM U1016, Institut Cochin, Paris, Franceより寄贈）を成長させた。実験に応じて、リコンビナントヒトＳＣＦ（Cell Signaling）又はＣＨＯ−ＫＬ（マウスＳＣＦを分泌するように改変されたＣＨＯ細胞株）培養上清（Michel Arock, LBPA, ENS Cachanの寄贈物）をＳＣＦ源として使用した。単一突然変異Ｖ５６０Ｇ  ＫＩＴアレル又は二重突然変異Ｖ５６０Ｇ  Ｄ８１６Ｖ  ＫＩＴアレルを有するＨＭＣ１．１及びＨＭＣ１．２細胞株は、Michel Arock, ENS Cachan, Cachan, Franceの寄贈物である。Ｇ４１８（０．５mg/mL）（Gibco）を補充したＤＭＥＭ−ＦＢＳ１０％−ペニシリン／ストレプトマイシン中で、ＨＥＫ−Ｔ細胞株を成長させた。ＣＯ２（５％）が豊富な加湿雰囲気中で、これらの細胞全てを３７℃で培養した。それぞれ２０mM Ｌ−グルタミン（Invitrogen）、ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＧｒａｃｅ培地又はＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（両方ともFisher Scientific製）中で、昆虫細胞であるＳｆ９細胞及びHigh Five細胞（Invitrogen）を２７℃で成長させた。また、１０％ＦＢＳをＧｒａｃｅ培地に補充した。
【０１６９】
抗体及び薬理学的試薬：ウエスタンブロット分析では、抗ＫＩＴ細胞外ドメイン（Ｈ３００）及び抗Ｅｒｋ２抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.から入手したものであり、抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）及び抗ホスホ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）はCell Signalingから入手したものであり、抗Ａｋｔ及び抗ＧＡＰＤＨはMilliporeから入手したものであり、抗ホスホ−ＫＩＴ（Ｙ８２３）はInvitrogenから入手したものであった。フィコエリトリン（ＰＥ）結合１０４Ｄ２ヒトモノクローナル抗体（これは、ＳＣＦ結合を阻害しない）（Biolegend）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合１０４Ｄ２（BD Biosciences）をフローサイトメトリー分析に使用した。イマチニブは、Serge Roche (Centre de Recherche de Biochimie Macromoleculaire −CNRS UMR 5237, Montpellier, France)から寄贈物であり、ダサチニブは、Santa Cruzから入手したものであった。
【０１７０】
リコンビナント可溶性ＫＩＴ−ＥＣＤの発現及び精製：可溶性リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤを、バキュロウイルス／昆虫細胞系において産生した。６ｘＨｉｓタグに融合したＫＩＴ−ＥＣＤインサートを、プラスミドｐＳＫΔＳａｐＩ  ｃ−Ｋｉｔ（Frederic Subra, LBPA, ENS Cachan, Cachan, Franceからの寄贈物）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって作製した。ＢａｍＨＩ（５’末端）及びＸｂａＩ（３’末端）制限部位を含有する増幅産物をベクターｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Promega）にクローニングし、制限分析によって分析した。Ｋｉｔ−ＥＣＤ  ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩをｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙからBD Baculogold（商標）トランスファーベクターｐＶＬ１３８３（Beckton Dickinson）にサブクローニングした。BD Baculogold（商標）プロトコールにしたがって、Ｓｆ９細胞において、リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤバキュロウイルスを生産した。可溶性リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤタンパク質を生産するために、High Five細胞を無血清培地に播種し、リコンビナントバキュロウイルスを感染させ、無血清培地中で４日間成長させた。分泌６Ｈｉｓタグを含有する培養培地を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）による精製前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析した。Amicon濃縮装置(Millipore)を使用して溶出画分（溶出緩衝液ＰＢＳ−イミダゾール２５０mM）を濃縮し、ＰＢＳ中に緩衝化した。ＢＣＡアッセイタンパク質定量キット（Interchim）によって総タンパク質濃度を決定し、クマシーブルー染色前に、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製タンパク質を分析した。
【０１７１】
ＫＩＴ−ＥＣＤ特異的ファージ抗体の選択：５０μg/mLのＫＩＴ−ＥＣＤ １００μLを使用して、ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc）のウェルを４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ−２％ミルクでウェルを室温（ＲＴ）で２時間飽和させてから、ＰＢＳ−２％ミルクで希釈した１０１１cfuのファージライブラリ（Sheets et al., 1998）を追加した。室温で２時間インキュベーションした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％でプレートを２０回洗浄し、ＰＢＳで１０回洗浄した。１００mMトリエチルアミンでファージを溶出し、トリス１Ｍ溶液（ｐＨ７）で中和した。記載されているように（Marks et al., 1991）、Escherichia coli TG1の感染によってインプットファージ及びアウトプットファージを滴定して、選択をモニタリングした。別の選択ラウンドのために、結合したファージを増幅した。３回の選択ラウンドを実施した。記載されているように（Marks et al., 1991）、２回及び３回の選択ラウンドの後、９６ウェルプレートで成長させた単一コロニーから可溶性ｓｃＦｖを発現させ、１mMＩＰＴＧで一晩誘導した。記載されているように（Schier et al., 1996）、可溶性ｓｃＦｖを含有する未精製の培養上清を、リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma）（ネガティブコントロール）に対する結合について、ＥＬＩＳＡによって試験した。配列決定によって、ＥＬＩＳＡの陽性クローンの多様性を決定した。細胞結合について、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＥＬＩＳＡの陽性クローンを試験した。２０００００個のＨＭＣ１．２細胞を４℃のＰＢＳ−１％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）１００μLに再懸濁した。培養上清１００μLを細胞に４℃で２時間かけて追加した。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０；Sigma）、続いてＰＥ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）（Beckton Dickinson）を用いて、細胞に対するｓｃＦｖ結合を検出した。
【０１７２】
ヒトｓｃＦｖ−Ｆｃの発現及び精製：ヒト免疫グロブリンγ１のＦｃフラグメントと融合したｓｃＦｖを発現させるために、ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化し、ファージミドｐＨＥＮ（Hoogenboom et al., 1991）からｐＦＵＳＥ−ｈＦｃ２（ＩＬ２ｓｓ）ベクター（Moutel et al., 2009）（Frank Perez, CNRS-Institut Curie UMR144, 26 rue d’Ulm, Paris, Franceからの寄贈物）にサブクローニングした。１５０cm2組織培養皿に培養したＨＥＫ−Ｔ細胞の一過性トランスフェクションの後、１１０ｋＤの可溶性ｓｃＦｖ−Ｆｃを生産した。細胞が８０％コンフルエンスに達したら、培養培地を除去し、ＤＭＥＭ−ペニシリン／ストレプトマイシンと交換した。プラスミドＤＮＡ ３０μg及びポリエチレンイミン（Polyscience）２００μgを使用して、トランスフェクションを実施した。３７℃で５日間経過した後、細胞上清を回収し、プロテインＡセファロースカラム（GE Healthcare）を用いてｓｃＦｖ−Ｆｃを精製した。ＰＢＳで溶出画分を希釈し、Amicon ultra-4 centrifugal unitsで濃縮した。同じ条件で生産したｓｃＦｖ−Ｆｃ結合ボツリヌス神経毒（Ｂｏｔ）（Amersdorfer et al., 1997）及びＣＤ７１（Ｈ７）を無関係な抗体フラグメント及び抗増殖ポジティブコントロールとして使用した。
【０１７３】
リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤに対するｓｃＦｖ−Ｆｃ結合のＥＬＩＳＡ分析：ＰＢＳで５μg/mLに希釈したＫＩＴ−ＥＣＤ（又はＢＳＡ）でｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc）を４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ−ＢＳＡ １％３００μLでウェルを室温で２時間飽和させた。ＰＢＳ−ＢＳＡ １％でｓｃＦｖ−Ｆｃを希釈し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．０５％でプレートを２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄してから、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃフラグメント免疫グロブリン（Sigma）を追加した。２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）溶液（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、プレートを明らかにした。GraphPadソフトウェアを用いて、フィット及びＥＣ５０を決定した。
【０１７４】
細胞に対するｓｃＦｖ−Ｆｃ結合のフローサイトメトリー分析：ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）１００μLに再懸濁した２×１０５個の細胞を使用してフローサイトメトリーによって、細胞結合を試験した。全てのインキュベーションを４℃で行って、ＫＩＴのエンドサイトーシスを防止した。ＡＰＣ結合抗ＫＩＴを用いて、ＫＩＴの細胞表面発現を測定した。ＰＥ結合ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント抗ヒトＦｃフラグメント（Rockland）を用いて、ｓｃＦｖ−Ｆｃ結合（１０μg/mL）を検出した。競合実験では、細胞をＳＣＦ（１μg/mL）と共に４０分間プレインキュベーションしてから、ｓｃＦｖ−Ｆｃを追加した。GraphPadソフトウェアを用いて、フィット及びＥＣ５０を決定した。
【０１７５】
酵母ディスプレイ及び酵母ディスプレイを使用した親和性測定：２Ｄ１及び３Ｇ１のＫｄ値を改善するために、本発明者らは、酵母ディスプレイを使用した軽鎖シャッフリングによる親和性成熟を使用した。ＶＨ配列をヒトＶＬラムダライブラリと組み合わせ、ベクターｐＹＤ２（Zhao, Qu et al., 2014）を使用して酵母上にディスプレイさせ、ＫＩＴ親和性がより高いｓｃＦｖをディスプレイする酵母を、限界濃度の抗原で染色がより強いことに基づいてＦＡＣＳによって選別した。Ｋｄを測定するために、１００００００個の親ｓｃＦｖ−２Ｄ１をディスプレイする酵母、親和性成熟ｓｃＦｖ−２Ｄ１Ｃ７、ｓｃＦｖ−３Ｇ１、親和性成熟ｓｃＦｖ−３Ｇ１Ａ２又は無関係なｓｃＦｖを、少なくとも６倍モル過剰のビオチン化ＫＩＴ−ＥＣＤと共に４℃で１時間インキュベーションした。次いで、細胞を氷上に置き、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、結合した抗原をＰＥ結合ストレプトアビジンで検出した。
【０１７６】
ウエスタンブロット分析：無血清培地中で細胞を３７℃で一晩飢餓させ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/mL）と共に４５分間インキュベーションしてから、リコンビナントＳＣＦ（１００ng/mL）で５分間刺激した。停止緩衝液［１５０mM ＮａＣｌ、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、１mM ＥＤＴＡ、２mM Ｎａ３ＶＯ４、７．５mM、Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１００mM ＮａＦ］で細胞を迅速に洗浄し、１mM ＰＭＳＦ、０．２５％ＤＯＣ、１％ＮＰ４０及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostic）を補充した停止緩衝液に溶解した。溶解物を氷上で３０分間インキュベーションし、４℃、１３０００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化した。ＢＣＡアッセイ（Interchim）を用いて、新鮮な溶解物を定量した。タンパク質３０μgを還元ローディング緩衝液［２Ｍトリス（ｐＨ６．７）、４％ＳＤＳ、４０mM ＤＴＴ、４０％グリセロール、ブロモフェノールブルー］と混ぜ合わせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Amersham Bioscience）に転写した。
【０１７７】
増殖アッセイ：ＵＴ−７を細胞１０４個／ウェルで播種し、ＥＰＯ又はＣＨＯ−ＫＬ上清（５００倍希釈）の存在下、５又は５０μg/mLの２Ｄ１、３Ｇ１、Ｈ７又は無関係なＢｏｔ抗体で４日間処理した。１０％に代えて１％ＳＶＦを使用し、サイトカインを使用しなかった以外は同様に、ＨＭＣ１．１及び１．２を７日間処理した。製造業者が推奨するように、ＭＴＳアッセイ（PROMEGA）を用いて、細胞生存率を推定した。
【０１７８】
インターナリゼーションアッセイ：ＨＭＣ１．１、ＨＭＣ１．２及びＵＴ−７／ＥＰＯ細胞を細胞１０５個／ウェルの密度でプレーティングし、ＥＰＯ中２Ｄ１、３Ｇ１若しくはＢｏｔ−Ｆｃ（１０μg/mL）又はＣＨＯ−ＫＬ上清（５００倍希釈）と共に３７℃で１時間、４時間、２４時間又は５日間インキュベーションした。ＰＢＳで細胞を室温で洗浄し、４℃で１５分間固定し（Cytofix, BD biosciences）、非競合ＰＥ／Ｃｙ７結合抗ヒトＫＩＴ  １０４Ｄ２で染色し、上記のようにＦＡＣＳによって分析した。
【０１７９】
結果
ＫＩＴ−ＥＣＤ特異的一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）抗体の選択及び初期特性評価：本研究の目的は、ＫＩＴシグナル伝達を阻害してＫＩＴ依存性腫瘍におけるガン細胞成長を妨げ得る完全ヒトＫＩＴ特異的抗体を単離することであった。本発明者らは、本発明者らがバキュロウイルス感染によって昆虫細胞で生産したリコンビナント型ヒトＫＩＴ細胞外ドメイン（ＫＩＴ−ＥＣＤ、アミノ酸２６〜５０９、Ｐ１０７２１  ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）に対する抗体ファージディスプレイ選択を進めた。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、精製Ｃ末端６ＨｉｓタグリコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤを分析し（図１Ａ）、ＫＩＴの細胞外ドメインに対する市販の抗体（H-300, Santa Cruz）を用いたウエスタンブロットによって検出された、６０ｋＤの主要タンパク質も示されたので（図１Ｂ）、その産生が証明された。選択のために、７．０×１０９メンバーヒトｓｃＦｖファージナイーブ抗体ライブラリ（Sheets, 1998）からファージを調製した。３回の選択ラウンド（表１）の後、２回目及び３回目のラウンドからの９４個のクローンを、リコンビナントＫＩＴ−ＥＣＤに対する結合について、可溶性ｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡによって試験した。陽性クローン（２回目のラウンドでは７／９４；３回目のラウンドでは１３／９４）を配列決定及び分析して、異なる選択頻度を示した８個の異なるｓｃＦｖを同定した（２Ｄ１が最も高頻度である）（図１Ｃ）。これらのクローンのうちの５個は、２回目の選択ラウンドから存在し（２Ｄ１、２Ａ３、２Ｂ８、２Ｂ１２、２Ａ６）、３個は、３回の選択ラウンド後にのみ現れた（３Ｇ１、３Ｃ１２、３Ａ１２）。哺乳動物細胞と比較して区別可能なＮ−グリコシル化酵素機構を有する（Shi and Jarvis 2007）昆虫細胞で生産したリコンビナント型ヒトＫＩＴに対する親和性について、これらのクローンを選択したので、本発明者らは、ＫＩＴを高発現するヒト肥満細胞腫細胞株ＨＭＣ１．２を使用して、それらが内因性ＫＩＴに結合し得るかを試験した。ｓｃＦｖ可溶性フォーマットの８個のうちの５個の抗体（２Ｄ１、２Ａ３、３Ｇ１、２Ｂ１２、２Ａ６）は、ＨＭＣ１．２細胞を染色し、したがって十分な感度で内因性ＫＩＴを検出することが見出され（図１Ｄ）、さらなる分析のために処理した。
【表８】
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【０１８０】
二価ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットへの変換：ＫＩＴに対する結合活性を増加させるために、５個の抗ＫＩＴ一価のｓｃＦｖを、ヒンジドメインのｓｃＦｖとヒトγ１免疫グロブリンアイソタイプの２つの定常ドメインとのＣ末端融合物からなる二価ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマット（Moutel et al., 2009）に変換した。ＨＥＫ細胞で一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ分子を生産し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。回収した分子種のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、共有結合ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体（各５５ｋＤ）に対応する予想分子量１１０ｋＤのタンパク質を示した（図２Ａ）。次に、本発明者らは、リコンビナントＫｉｔ−ＥＣＤに対する結合をＥＬＩＳＡにより試験することによって、５個のｓｃＦｖ−Ｆｃを検証した。全てのｓｃＦｖ−ＦｃのＫｄ（見掛けの親和性定数又はＥＣ５０）（表２）は、２Ａ６を除いてナノモル範囲であり、２Ａ６については、最大試験濃度（１０μg/mL又は９１nM）でＥＬＩＳＡシグナルの飽和が得られず、これは、結合能力が低いことを示唆している。試験した抗体のうち、２Ｄ１は、最低の見掛けのＫｄ（０．６nM又は０．０６７μg/mLのＥＣ５０）を示した（図２Ｂ）。したがって、全てのｓｃＦｖ−Ｆｃがレセプターに結合した一方、同じ条件で生産した同じフォーマットの無関係な抗体フラグメントは結合しなかったことから、ｓｃＦｖのｓｃＦｖ−Ｆｃへの再フォーマット、及び細菌に代えて哺乳動物細胞における生産は、抗体特異性を保存した。
【表９】
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【０１８１】
細胞に対するｓｃＦｖ−Ｆｃ結合、及びＫＩＴに結合するＳＣＦとの競合：本発明者らは、市販の１０４Ｄ２マウスｍＡｂよって検出されたように（Broudy et al., 1998）、異なるレベルの表面ＫＩＴを発現する細胞株（ヒト肥満細胞腫ＨＭＣ１．２細胞株、赤白血病ＴＦ−１細胞株、及びヒトＫＩＴを発現するように改変したマウスｐｒｏ−Ｂ  Ｂａ／Ｆ３細胞株（中レベルのＫＩＴ、Ｂａ／Ｆ３−ＫＩＴ細胞株）を含む）に対する５個の抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃの結合を試験した。内因性マウスＫＩＴを発現しない親マウスＢａ／Ｆ３細胞株をネガティブコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ分析により、５個の抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/mL）全てについて、ＨＭＣ１．２及びＴＦ−１細胞上におけるＫＩＴ検出が示され、２Ａ６−Ｆｃは、両方の細胞株においてより弱い染色を示した。２Ｂ１２、２Ｄ１及び３Ｇ１−ＦｃはＢａ／Ｆ３−ＫＩＴ細胞を染色したが、Ｂａ／Ｆ３細胞株では染色は陰性であり、これは、ＫＩＴ特異性を裏付けている。予想外のことに、２Ａ３は、ＨＭＣ１２細胞の染色が強かったにもかかわらず、Ｂａ／Ｆ３  ＫＩＴ細胞株を染色しなかった。
【０１８２】
次いで、本発明者らは、ＳＣＦが、ＫＩＴに対する抗体の結合を遮断し得るかを試験した。ＫＩＴ高発現細胞ＨＭＣ１．２を４℃で維持し、ＳＣＦ（１μg/mL）の有無の下でインキュベーションしてから、抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/mL）を追加し、結合した抗体をＦＡＣＳによって検出した。ＳＣＦと共にプレインキュベーションすることによって、２Ａ６、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃの結合は有意に減少したが、これは、ＳＣＦ及び抗体が、このレセプター上の重複部位に結合し得ることを示唆している。あるいは、ＳＣＦは、抗ＫＩＴ抗体のさらなる結合を防ぐＫＩＴの立体構造変化を誘導し得る。
【０１８３】
野生型ＫＩＴシグナル伝達の抗体干渉：ＫＩＴ活性化は、ＳＣＦ結合によって誘導される二量体化によって生じるので、抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃは、それらの二量体フォーマットによりＫＩＴをアゴニスティックに活性化し得る。この仮説を試験するために、野生型ＫＩＴの２つのアレルを示す赤白血病細胞株ＴＦ−１を、無血清無ＧＭ−ＣＳＦ培地中で一晩培養してから、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/mL）で処理した。粗タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、５個のｓｃＦｖ−Ｆｃはいずれも、ＫＩＴの完全キナーゼ活性に必要なチロシン８２３（これは、キナーゼドメインの活性化ループに位置する）のＫＩＴリン酸化（Agarwal et al. 2013）を誘導しなかったことが示された。あるいは、本発明者らは、ｓｃＦｖ−ＦｃがＳＣＦによるＫＩＴ刺激を防ぎ得るかを試験した。飢餓ＴＦ−１細胞をｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μg/mL、４５分間）と共にインキュベーションしてから、リコンビナントＳＣＦ（１００ng/mL、１０分間）で刺激した。ウエスタンブロットにより、２Ａ６、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは、チロシン８２３のＳＣＦ誘導性ＫＩＴリン酸化を阻害したが（２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが最も有効である）、無関係な同一の抗体フォーマットは阻害しなかったことが明らかになった（図３Ａ）。同じ抗体によってＡＫＴリン酸化も減少し、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃによる減少は、２Ａ６Ａ−Ｆｃよりも強力であった。したがって、本研究の残りの部分において、本発明者らは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃ抗体フォーマットに焦点を当てた。
【０１８４】
ＳＣＦ依存性ＫＩＴシグナル伝達に対する２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃのアンタゴニスト効果が機能効果に変わったかを調査するために、本発明者らは、ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞株（これは、そのin vitro増殖がＥＰＯ又はＳＣＦのいずれかに依存する）（Erickson-Miller, Pelus et al. 2000）を使用した。抗体は単独で、ＥＰＯ又はＳＣＦの非存在下では、ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞の成長を維持しなかったが（示さず）、細胞をＥＰＯではなくＳＣＦと共に培養した場合には、細胞生存率を用量依存的に減少させた一方、同じフォーマットの抗ＴｆＲ１（輸送レセプター１）抗体は、ＥＰＯ及びＳＣＦ培養細胞の両方において、細胞生存率を減少させ、無関係な抗体は効果がなかった（図３Ｂ）。加えて、ＴＦ−１細胞のように、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは、ＫＩＴシグナル伝達に関連する下流のエフェクター経路（チロシン８２３におけるＫＩＴのリン酸化、ＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化）を阻害し、単独で使用した場合には、ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞株におけるＫＩＴシグナル伝達を刺激しなかった（示さず）。
【０１８５】
これらの結果は、ＫＩＴ特異的２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが、野生型ＫＩＴを発現する細胞においてＳＣＦ依存性ＫＩＴシグナル伝達を阻害すること、並びにこの効果がおそらく部分的には、ＫＩＴに対するＳＣＦ結合の遮断によるものであることを示している。２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃの特性評価を完了するために、ＫＩＴ−ＥＣＤに対するそれらの固有親和性を表面プラズモン共鳴によって決定したところ、それぞれ１７３及び６６nMであると推測された（図６）。
【０１８６】
２Ｄ１及び３Ｇ１の詳細なエピトープマッピング：ＫＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、５つのＩｇドメインから構成される。結晶構造から、ドメイン２及び３に対する二量体ＫＩＴリガンド結合が、細胞表面におけるＫＩＴの二量体化、ＫＩＴ二量体の各メンバーのドメイン４とドメイン５との間の同型相互作用（これは、このレセプターの細胞内チロシンキナーゼの活性化に有利な細胞内ドメインのねじれを引き起こす）を誘導することが公知である（Yuzawa S, et al. 2007）。２Ｄ１及び３Ｇ１抗体が結合するドメインを明確に同定するために、本発明者らは、全長ＫＩＴ又は短縮型ＫＩＴを酵母の表面にディスプレイさせた。目的の抗原を酵母表面Ａｇａ２タンパク質に融合する。目的の抗原とＡｇａ２との間の柔軟なリンカーは、抗体に対する抗原のアクセシビリティを保証する。ＫＩＴのようなチロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであるヒトＥＧＦＲのドメインは、酵母表面上に機能的にディスプレイされ、Ａｂエピトープをマッピングするのに使用されている（Johns, Adams et al. 2004）。Zhao, Qu et al. 2014に記載されているように、酵母発現ベクターｐＹＤ２を使用して、全長ヒトＫＩＴ細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜５１９；ヌクレオチド７６〜１５４２、ｃＤＮＡ配列参照ＮＭ＿００１０９３７７２．１）を酵母上にディスプレイさせ、また、短縮型Ｄ１−Ｄ３（アミノ酸２６〜３０７、ヌクレオチド７６〜９２１）、Ｄ４−Ｄ５（アミノ酸３０８〜５１６、ヌクレオチド９２２〜１５４８）、Ｄ４（アミノ酸３０８〜４０９、ヌクレオチド９２２〜１２２７）及びＤ５（アミノ酸４１０〜５１６、ヌクレオチド１２２８〜１５４８）のいずれかを発現させた。異なるドメインを発現する酵母を２Ｄ１若しくは３Ｇ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ、続いてフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＩｇＧで染色し、又はＫＩＴに対するＳＣＦ結合を阻害しないと記載されている市販のフィコエリトリン（ＰＥ）−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）結合モノクローナル抗ヒトＫＩＴ抗体１０４Ｄ２（Biolegend）で染色した。
【０１８７】
抗Ｋｉｔ抗体２Ｄ１及び３Ｇ１−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１５nM）又はＰＥ−Ｃｙ７結合１０４Ｄ２（１，５nM）を、ＫＩＴドメイン１〜３（ＫＩＴ−Ｄ１−３）、ＫＩＴドメイン４及び５（ＫＩＴ−Ｄ４−５）又は全長ＫＩＴ細胞外ドメイン（ＫＩＴ−Ｄ１−５）のいずれかをディスプレイする１００００００個の酵母と共に室温で１時間インキュベーションした。ＰＥ結合抗Ｈｕ−Ｆｃ  Ｉｇを用いて、２Ｄ１及び３Ｇ１−ｓｃＦｖ−Ｆｃの結合を検出した。１０４Ｄ２がＫＩＴＤ１３に結合するかにかかわらず、２Ｄ１及び３Ｇ１はＫＩＴ  Ｄ４−Ｄ５に結合する。抗Ｋｉｔ可溶性２Ｄ１及び３Ｇ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃを、酵母上にディスプレイされたＫＩＴドメインＤ４又はＫＩＴドメインＤ５と共にインキュベーションした。２Ｄ１及び３Ｇ１は両方とも、ＫＩＴのドメインＤ５に特異的に結合する。２Ｄ１及び３Ｇ１−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１５nM）の存在下において、酵母上にディスプレイされたＫＩＴ−Ｄ１−５に対するＰＥ−Ｃｙ７結合１０４Ｄ２（１，５nM）の結合を試験した。２Ｄ１及び３Ｇ１はいずれも、酵母上にディスプレイされたＫＩＴに対する１０４Ｄ２結合を阻害しない。
【０１８８】
２Ｄ１及び３Ｇ１が重複エピトープに結合したかを調査するために、ｓｃＦｖ−２Ｄ１を酵母上にディスプレイさせた。２Ｄ１  ｓｃＦｖをディスプレイする１００００００個の酵母を、昆虫細胞で生産したリコンビナントビオチン化Ｋｉｔ−ＥＣＤ（１００nM）のみと共に、又は可溶性２Ｄ１若しくは３Ｇ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１５nM又は１，５nM）の存在下において室温で１時間インキュベーションした。ＰＥ結合ストレプトアビジンを使用して、結合した抗原を検出した。予想通り、可溶性２Ｄ１−ｓｃＦｖ−Ｆｃは、酵母上にディスプレイされたｓｃＦｖ−２Ｄ１に対するＫＩＴの結合を阻害した。特に、３Ｇ１は、２Ｄ１に対するＫＩＴの結合も阻害したが、これは、３Ｇ１及び２Ｄ１がＤ５上の重複エピトープに結合することを示している。
【０１８９】
したがって、２Ｄ１及び３Ｇ１はおそらく、ＳＣＦの結合後に、ＫＩＴ−Ｄ５の膜近位ドメイン間の同型相互作用（これは、レセプター活性化に重要である（Yuzawa S, et al. 2007））を阻害することによって、ＫＩＴ野生型ＫＩＴシグナル伝達を阻害する。
【０１９０】
ＷＴ型におけるＫＩＴレベルの抗体モデュレーション：治療指向戦略では、ガン細胞におけるＫＩＴシグナル伝達を減少させる１つの方法は、細胞表面のＫＩＴレベルを減少させて、そのＳＣＦアクセス性を低下させ、かつ／又はその分解を誘導することであろう。細胞表面のＫＩＴに対するＳＣＦの結合は、ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解、ＫＩＴの新合成を必要とする細胞表面におけるその再発現を迅速に誘導することが示されている（Shimizu, Ashman et al. 1996）。本発明者らは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが、ＫＩＴリン酸化を誘導しない場合であっても、ＳＣＦのようにＫＩＴのインターナリゼーション及び分解をトリガーし、細胞表面のＫＩＴレベルに対する長期効果を有するか疑問に思った。
【０１９１】
ＳＣＦ並びに２Ｄ１及び３Ｇ１のＫＩＴ結合を妨げない１０４Ｄ２抗ＫＩＴｍＡｂを使用したＦＡＣＳによって、ＫＩＴ表面レベルに対する抗体処理の効果を分析した。最初に、本発明者らは、ＳＣＦ処理と比較した抗ＫＩＴの短期効果を分析した。ＥＰＯ（及びＳＣＦなし）の存在下で培養したＵＴ−７／ＥＰＯに２Ｄ１又は３Ｇ１−Ｆｃを追加すると、ＳＣＦと同様の速度で強力なＫＩＴ表面ダウンレギュレーションが迅速に開始されたが、これらの抗体では、この処理を通して、ＳＣＦよりも定量的に少ない減少がもたらされた（１時間後、それぞれ５０％対７０％）（図４Ａ）。２４時間後において、細胞表面のダウンレギュレーションは依然として安定であり、処理の２時間後の場合であっても抗体又はリガンドの存在下では共に、少なくとも部分的には合成の増加（ＣＨＸによって増加が阻害されたので）により、ＫＩＴ表面レベルがわずかに増加し始めた（示さず）。したがって、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは、下流のＫＩＴシグナル伝達を誘導せずに、ＫＩＴのインターナリゼーションを誘導した。次いで、本発明者らは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ処理の長期効果を分析した（図４Ｂ）。ＥＰＯで培養したＵＴ７／ＥＰＯ細胞のＫＩＴ表面レベルは、２Ｄ１又は３Ｇ１−Ｆｃによる処理の５日後に減少したが、（ＥＰＯに加えて）ＳＣＦ処理は、ＫＩＴレベルをモデュレーションしなかった。これまで、ＵＴ７／ＥＰＯ細胞は、サイトカイン源としてＳＣＦで培養した場合には、ＥＰＯと比較して高レベルの表面ＫＩＴを有していたが、これは、以前に発表されたデータ（Kosmider, Buet et al. 2009）と一致している（図４Ｂ）。本発明者らはまた、ＥＰＯと共に培養したＵＴ７／ＥＰＯ細胞の短期又は長期抗体処理のウエスタンブロットによって、全ＫＩＴレベルを測定した。２４時間後において、２Ｄ１及び３Ｇ３−Ｆｃ並びにＳＣＦ処理のいずれによっても、全ＫＩＴレベルは劇的な影響を受けなかったが、抗体又はＳＣＦの両方において、長期処理はＫＩＴレベルを劇的に減少させた（図４Ｃ）。
【０１９２】
したがって、ＫＩＴの下流エフェクター経路を刺激せずに、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは、ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞株上のＫＩＴの長期細胞表面ダウンレギュレーションを誘導する。
【０１９３】
２Ｄ１及び３Ｇ１−ＦｃのＫＩＴ表面ダウンレギュレーションがキナーゼ活性非依存性であったことを確認するために、ＥＰＯと共に培養したＵＴ−７／ＥＰＯ細胞上の抗ＫＩＴ  ２Ｄ１又は３Ｇ１−Ｆｃにイマチニブを結合させた。興味深いことに、ＴＫＩは、ＫＩＴ表面ダウンレギュレーションに対して相加効果を有していたが、ＫＩＴの活性化はその分解に連動しているので（Yee, Hsiau et al. 1994）、反対にイマチニブは、予想通り、ＳＣＦ誘導性のＫＩＴ表面レベルの減少を阻害した。最近発表されたように（D’Allard, Gay et al. 2013）、イマチニブ処理は単独で、ＫＩＴ表面レベルを減少させた。これらのデータは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが、ＫＩＴのキナーゼ活性とは無関係に表面ＫＩＴを減少させること、並びにイマチニブ処理が、未知の機構によってこの減少を増強することを示している。
【０１９４】
発ガン性ＫＩＴ活性化及び表面レベルの抗体干渉：発ガン性ＫＩＴ突然変異体のＫＩＴシグナル伝達は、ＳＣＦ非依存性である。３Ｇ１及び２Ｄ１−Ｆｃは、ＵＴ−７細胞におけるＫＩＴのインターナリゼーション及び分解を誘導することができたので、本発明者らは、活性型ＫＩＴ発ガン性突然変異体を構成的に発現し、成長及び生存をＫＩＴシグナル伝達に依存する肥満細胞腫ＨＭＣ１．１（ＫＩＴＶ５６０Ｇ）及びＨＭＣ１．２（ＫＩＴ  Ｖ５６０Ｇ  Ｄ８１６Ｖ）ガン細胞株に対するそれらの効果を試験した。予想通り、イマチニブ及びダサチニブＴＫＩはＨＭＣ１．１細胞に対して毒性であったが、Ｄ８１６Ｖ突然変異体はイマチニブ耐性であるため、ダサチニブのみがＨＭＣ１．２細胞に対して毒性であった。５及び５０μg/mLの抗体でＨＭＣ１．１及びＨＭＣ１．２細胞株を７日間処理し、細胞生存率を定量した。最大濃度では、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは両方とも、ＨＭＣ１．１及びＨＭＣ１．２細胞の生存率を減少させたが（図５Ａ）、無関係な抗体は効果がなかった。生存率の減少は、強力なＫＩＴ分解並びにＫＩＴのチロシン５６８及び５７０のリン酸化の減少に関連していた。ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞株と同様に、ＫＩＴ表面レベルのモデュレーション速度を分析した。両方の肥満細胞腫細胞株では、１時間後に、２Ｄ１及び３Ｇ１は両方とも、ＳＣＦ処理と同様にＫＩＴレベルの強力な減少を誘導した（図５Ｂ）。ＳＣＦ処理ＨＭＣ１．１細胞株を除く全ての条件において、低レベルの表面ＫＩＴが２４時間維持されていた。ＫＩＴは細胞表面で再発現しており、２４時間後にほぼ初期レベルに達した。新合成は、ＣＨＸの存在下では観察されなかったので、ＨＭＣ１．１の細胞表面におけるＳＣＦ処理ＨＭＣ１．１細胞のＫＩＴの再出現に関与していた。これらの観察結果は、２つの細胞株におけるＫＩＴの輸送／合成の異なるレギュレーションがおそらく、ＫＩＴの区別可能な突然変異に関連することを示している。抗ＫＩＴ処理細胞上の細胞表面ＫＩＴの減少は、ウエスタンブロットによって見られたように、全ＫＩＴレベルの減少に関連していた（図５Ｃ）。抗体で３日間処理することにより、両方の肥満細胞腫細胞株で低レベルのＫＩＴが維持された（図５Ｄ）。
【０１９５】
要するに、これらのデータは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが、肥満細胞腫細胞株（ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異の存在によりイマチニブ耐性の細胞を含む）の細胞生存率を阻害することを示している。成長及び生存を発ガン性ＫＩＴシグナル伝達に依存するこれらの細胞では、２Ｄ１及び３Ｇ１−ＦＣは、強力なＫＩＴ分解を誘導して、おそらくは下流の発ガン性シグナル伝達を低減する。
【０１９６】
親和性成熟：ＥＬＩＳＡによれば、プラスチック上に吸着させた一価ＫＩＴ−ＥＣＤに対する二価ｓｃＦｖ−２Ｄ１及び３Ｇ１の結合は、それぞれ０，０６７μg/mL及び０，２４０μg/mLのＥＣ５０（これは、それぞれ０，６１及び２，１８nMの見掛けの解離定数Ｋｄに対応する）であった。Biacoreによって測定した２Ｄ１及び３Ｇ１の親和性は、２Ｄ１及び３Ｇ１パラトープの固有のＫＩＴ親和性が１００nMの範囲内であり、速度定数ｋｏｎが３．２２及び７．８１  １０４Ｍ−１．ｓ−１であり、ｋｏｆｆが５，６３及び５，２１  １０−３ｓ−１であったことを示した。固有のＫｄ値を改善するために、酵母ディスプレイを使用して軽鎖シャッフリングによって、２Ｄ１及び３Ｇ１を親和性成熟した。ＶＨ配列をヒトＶＬラムダライブラリに結合させ、酵母上にディスプレイさせ、ＫＩＴ親和性がより高いｓｃＦｖをディスプレイする酵母を、限界濃度の抗原で染色がより強いことに基づいてＦＡＣＳによって選別した。
【０１９７】
親抗体と比較して増加した親和性を示す２Ｄ１−Ｃ７（２Ｄ１の変異体）及び３Ｇ１−Ａ２（３Ｇ１の変異体）が得られた。親和性成熟２Ｄ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（２Ｄ１−Ｃ７）は、同じＶＨ配列と、ＶＬ遺伝子における５つのアミノ酸置換及び２つのアミノ酸付加とを有するｓｃＦｖから構成されていた。元のＶＬ−２Ｄ１配列では、７つの改変のうちの６つは、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に存在していた。親和性成熟３Ｇ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（３Ｇ１−Ａ２）は、同じＶＨ配列と、ＶＬにおける３つの置換と、それに加えてＣＤＲ３の完全改変とを有するｓｃＦｖから構成されていた。
【０１９８】
親和性は大幅に増加しており、濃度１０nMのＡｇで飽和に達し、２Ｄ１−Ｃ７及び３Ｇ１−Ａ２の固有のＫｄはそれぞれ４，２＋／−１，２nM及び１，７＋／−０，５nMであった。
【０１９９】
考察：
ＫＩＴアンタゴニスト抗体の獲得：ファージ抗体ライブラリは、診断用途又は治療用途に適切な抗体を単離及び開発するための有用なツールとなっている。ファージ上で発現されたコンビナトリアルライブラリから選択された抗体の大部分は、人工表面上に固定化された精製抗原を使用して単離されている。このアプローチは、生理的状況でネイティブなタンパク質を認識する又はしない抗体を選択し得る。本研究では、本発明者らは、昆虫細胞中で生産したＫＩＴの細胞外ドメインに対する８個の抗体を作製した（図１）。抗体２Ｄ１−Ｆｃは、この選択で回収された結合体の４０％を占めていた。可溶性一価ｓｃＦｖとして発現させた場合、８個のうちの３個は、それらがリコンビナントＫＩＴに結合した場合であっても、ＨＭＣ１．２細胞上の内因性ＫＩＴを検出しなかったが、これは、低いＫＩＴ親和性によるものであり得るか、又は昆虫細胞に特異的なＮ−グリコシル化（Shi and Jarvis 2007）の認識によるものであり得る。二価ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットに再フォーマットし、哺乳動物細胞で生産した場合、５個の抗体は全て、ＫＩＴ高発現ＨＭＣ１．２細胞に結合したが、２個は、ＷＴヒトＫＩＴ細胞を発現するようにトランスフェクションしたＢａ／Ｆ３細胞上のＫＩＴを検出しなかった。この結合の欠如は、おそらく２Ａ６の場合には、より低いＫＩＴ親和性によるものであるが（表２）、ＴＦ−１及びＨＭＣ１２細胞における２Ａ３のＫＩＴ親和性（表１）及び２Ａ３のＫＩＴ染色強度は、Ｂａ／Ｆ３−ＫＩＴ細胞上のＫＩＴを実際に検出する他の３個の抗体２Ｂ１２、２Ｄ１及び３Ｇ１と同程度であったので、２Ａ３については、その理由は不明である。
【０２００】
（ＫＩＴがその野生型である場合に）ＳＣＦによって誘導されるＫＩＴ二量体化は、その細胞内ドメインを交差リン酸化するのに必要である。本発明者らが使用したｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体フォーマットにより、本発明者らは、ＫＩＴに対するこのフォーマットのアゴニスト活性の可能性を予想した。しかしながら、５個の抗ＫＩＴ  ｓｃＦｖ−Ｆｃはいずれも、ＫＩＴリン酸化を誘導せず、サイトカインフリー培地中でＳＣＦ依存性細胞株（ＴＦ−１、ＵＴ−７／ＥＰＯ）の成長を維持することができなかった。反対に、３個の抗体は、ＳＣＦ依存性のＫＩＴリン酸化を阻害し（２Ａ６、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃ）、ＫＩＴに対する結合についてＳＣＦと競合した。最高の競合体（２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃ）は、サイトカイン源としてのＳＣＦの存在下で成長させた場合に、ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞の細胞生存率を減少させたが、これは、それらが、ＫＩＴシグナル伝達を特異的及び効率的に阻害したことを実証している。したがって、この戦略は、ＳＣＦのＫＩＴアクセス性及びさらなる下流シグナル伝達を遮断した抗体の単離を可能にした。興味深いことに、２Ｄ１及び３Ｇ１はおそらく、ＳＣＦの結合後に、ＫＩＴ−Ｄ５の膜近位ドメイン間の同型相互作用（これは、レセプター活性化に重要である（Yuzawa S, et al. 2007））を阻害することによって、ＫＩＴ野生型ＫＩＴシグナル伝達を阻害する。ＫＩＴのＤ５に結合する阻害抗体は、まだ記載されていない。
【０２０１】
ＫＩＴ（ＷＴ及び突然変異アイソフォーム）のモデュレーション：野生型ＫＩＴは、抗ＫＩＴ抗体２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃによって活性化されなかったので、本発明者らは、細胞表面におけるＫＩＴのモデュレーション及び抗体処理によるその分解の問題を検討した。興味深いことに、ＫＩＴのインターナリゼーションは、野生型又は突然変異型（触媒又は膜近傍突然変異体のいずれか）とは無関係に観察されたが、強力な分解は、突然変異のバックグラウンドにおいてのみ観察された（図４及び図５）。
【０２０２】
正常肥満細胞では、ＳＣＦ刺激により、ＫＩＴは迅速に（数時間以内に）分解され、その表面発現は、新合成によってのみ４８時間後に細胞表面で完全に復活する（Shimizu, Y JI 1996）。ＫＩＴについては、リサイクルは記載されていない。レセプターキナーゼ活性は、ＫＩＴのユビキチン化並びにリソソーム経路及びプロテアソーム経路の両方に関与するＳＣＦ誘導性の効率的なＫＩＴ分解に必要である（Yee, Hsiau et al. 1994）。発ガン性突然変異型ＫＩＴは、野生型ＫＩＴと比較して改変した細胞内局在性を示し、重要なタンパク質画分は細胞内小胞に連結されており、細胞内からのシグナル伝達を開始することができる（Schittenhelm, Aichele et al. 2003）。細胞表面におけるＫＩＴ突然変異体の発現が、in vivoにおける発ガン性シグナル伝達に必要であるか、及び突然変異ＫＩＴがどのようにして、野生型ＫＩＴ（これは、ガン細胞ではＫＩＴと同時発現している（Theou, Tabone et al. 2004））と相互作用し、野生型ＫＩＴの細胞内輸送に影響を及ぼすかは不明である。薬理学的な薬物でＫＩＴ突然変異体の活性を阻害すると、細胞表面のＫＩＴが数分以内に再局在化するので（Bougherara et al, 2009）、細胞表面のＫＩＴレベルは、新合成の変化とは無関係に、ＫＩＴ触媒活性に依存する。ＳＣＦによる刺激の非存在下で、ＷＴ  ＫＩＴのＡＴＰポケットをイマチニブで遮断すると、不活性化ＫＩＴのインターナリゼーション及び分解が誘導されたので、ＫＩＴ表面レベルはまた、ＫＩＴの細胞内キナーゼドメインのＡＴＰ結合部位の占有に依存する（Kosmider O. et al, 2013）。本明細書では、２Ｄ１又は３Ｇ１−Ｆｃによる処理は、ＫＩＴのインターナリゼーションを誘導したが、ＫＩＴの分解を誘導しなかった。最近、Edris及び同僚が抗ＫＩＴ抗体ＳＲ１（Ashman, Buhring et al. 1994, Papayannopoulou, Brice et al. 1991）を使用したところ、様々なＫＩＴアレルを提示するＧＩＳＴ細胞株（さらなるゲートキーパー突然変異を有する又は有しない膜近傍突然変異体を含む）では、長期処理後にＫＩＴの分解が観察されなかった（Edris, Willingham et al. 2013）。したがって、２Ｄ１及び１Ｇ１抗ＫＩＴ抗体は、ＳＲ１抗体と異なる作用を有する。２Ｄ１及び３Ｇ１によるＫＩＴドメイン５のターゲティングは、野生型ＫＩＴ及び発ガン性ＫＩＴの両方のインターナリゼーションを誘導し、かつＷＴ  ＫＩＴを損傷せずに、発ガン性ＫＩＴの分解を誘導する。
【０２０３】
野生型又は突然変異型の両方におけるＫＩＴ阻害に対する潜在的な相乗効果を解明するために、ＴＫＩ及び２Ｄ１又は３Ｇ１−Ｆｃ処理を組み合わせた実験が進行中である。
【０２０４】
ドメインＤ５をターゲティングする抗ＫＩＴと、ＫＩＴ活性の薬理学的阻害剤との組み合わせは、ＫＩＴ活性の阻害を増強するアプローチであり得る。
【０２０５】
血清及びＥＰＯを補充したＩＭＤＭの存在下で成長させたＵＴ７白血病細胞を、１μMのイマチニブ及び／又は１０μg/mLの２Ｄ１又は３Ｇ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃによって３７℃で４時間処理した。次いで、細胞を４℃で維持し、ＰＥ−ＣＹ７結合１０４Ｄ２抗ＫＩＴ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。予想通り、ＴＫＩイマチニブによる単一処理は、細胞表面のＫＩＴレベルを減少させた（D’Allard et al, 2013）。抗ＫＩＴ抗体及びＴＫＩ処理の組み合わせは、単一処理と比較してＫＩＴ表面レベルの減少を増強し、無関係な抗体（Ｂｏｔ−Ｆｃ）は効果がなかった。
【０２０６】
毒性
低分子阻害剤と比較して、腫瘍の抗体系免疫療法は、抗体のＦｃ部分を介して免疫エフェクターをリクルートするという利点を有する（Adams and Weiner 2005）。（ヒトガンマ１Ｆｃ領域をディスプレイする）本研究のｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体フォーマットは、理論的には、ＮＫ細胞のような免疫エフェクターをリクルートし得るか、又は補体カスケードを介して細胞溶解を媒介し得るが、本発明者らは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃを使用したところ、ＫＩＴ高発現ＨＭＣ１．１及びＨＭＣ１．２細胞において、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗ＫＩＴ媒介性のＡＤＣＣ及びＣＤＣを観察しなかった。したがって、エフェクター機能を欠くが、ＫＩＴシグナル伝達を妨げる抗体によるＫＩＴのターゲティングは、二次的効果を回避し、ＫＩＴ依存性ガンにおいて治療効果を達成するための最良のＫＩＴターゲティング戦略であり得る。
【０２０７】
結論として、本発明者らは、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃが、肥満細胞腫細胞株（ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異の存在によりイマチニブ耐性の細胞を含む）の細胞生存率を阻害することを示した。成長及び生存を発ガン性ＫＩＴシグナル伝達に依存するこれらの細胞では、２Ｄ１及び３Ｇ１−Ｆｃは、強力な長期ＫＩＴ分解を誘導して、おそらくは下流の発ガン性シグナル伝達を低減する。２Ｄ１−Ｃ７及び３Ｇ１−Ａ２の親和性改善変異体は、２Ｄ１及び３Ｃ７と比較して増加した阻害活性を有するはずである。また、これらの抗体は、免疫エフェクター機能を誘発しないので、in vivoにおける毒性が限定的であると予測される。
【０２０８】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する現状技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【配列表】
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