(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＭの製造方法であって、
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／またはＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドＤをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドＭを得る工程を含み、
前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
２時間の反応後に、レバウジオシドＤの少なくとも４０％がレバウジオシドＭに転化される、方法。
【請求項２】
前記グルコシルドナーが、ＵＤＰ−グルコース、またはスクロース、スクロースシンターゼおよびＵＤＰを含むＵＤＰ−グルコース再生系である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／またはＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドＤをグルコシルドナーと反応させる工程が、２５℃〜３５℃の温度および６．５〜７．５のｐＨにおいて水系中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水系がｐＨ７．０のリン酸緩衝液を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
レバウジオシドＤのグルコシルドナーとの反応が、前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、１〜３体積％の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびピキア酵母からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
レバウジオシドＭの製造方法であって、
ａ．第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／または第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドＡをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドＤを得る、および
ｂ．第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／または第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドＤをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドＭを得る、各工程を含み、
前記第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、および前記第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
２時間の反応後に、レバウジオシドＡの少なくとも４０％がレバウジオシドＭに転化される、方法。
【請求項９】
前記第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび前記第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、１：０．８〜１：１．２の重量比で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記グルコシルドナーが、ＵＤＰ−グルコース、またはスクロース、スクロースシンターゼおよびＵＤＰを含むＵＤＰ−グルコース再生系である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／または第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドＡをグルコシルドナーと反応させる工程が、２５℃〜３５℃の温度および６．５〜７．５のｐＨにおいて水系中で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／または第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドＤをグルコシルドナーと反応させる工程が、２５℃〜３５℃の温度および６．５〜７．５のｐＨにおいて水系中で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記水系がｐＨ７．０のリン酸緩衝液を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
レバウジオシドＡのグルコシルドナーとの反応が、前記第１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、１〜３体積％の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
レバウジオシドＤのグルコシルドナーとの反応が、前記第２のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、１〜３体積％の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびピキア酵母からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レバウジオシドＭの製造方法、特にレバウジオシドＭの生物製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘味料は、食品、飲料およびキャンディ製造に幅広く使用する食品添加剤であって、食品の製造過程で添加してもよいし、家庭でベーキングする際に適当に希釈してスクロースの代わりに使用してもよい。甘味料は天然甘味料および人工甘味料を含み、前者には、例えばスクロース、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜などがあり、後者には、例えばアスパルテーム、サッカリンなどがある。ステビオシドは、植物ステビアの中から抽出した天然甘味料であって、現在、既に食品および飲料に幅広く使用されている。ステビアの抽出物にはレバウジオシドを含む多種のステビオシドが含有されているが、天然抽出のステビオシドはロットごとの成分が大きく異なり、後続の精製が必要とされる。現在、産業化の製品レバウジオシドＡには、レバウジオシドＣ、ＤおよびＦなどの幾つかのその他のステビオシドが含まれている。抽出の方法で製造されたステビオシドには通常幾つかの不純物がさらに混入されており、その使用範囲に一定の影響を与える可能性がある。レバウジオシドＭは、レバウジオシドＡより優れているが、ステビアの葉における含有量が極めて少なく、かつステビアＭｏｒｉｔａ株からしか検出されていない（非特許文献１）。現在、レバウジオシドＭの産業化生産はまだない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】２０１０，Ｊ，Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，５７，１９９−２０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、従来技術の欠点を克服して、低コスト、短い周期で高純度のレバウジオシドＭ製品を製造可能な、酵素法によるレバウジオシドＭの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するために、本発明は、下記の技術的解決手段：レバウジオシドＡまたはレバウジオシドＤを基質とし、グルコシルドナーの存在下で、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／またはＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒として、基質を反応させてレバウジオシドＭを生成するという、酵素法によるレバウジオシドＭの製造方法を採用する。
【０００６】
本発明によると、グルコシルドナーは、ＵＤＰ−グルコースまたはスクロース、スクロースシンターゼおよびＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生系（２００７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８１，２５６２−２５６６）であってもよく、かつ好ましくはスクロース、スクロースシンターゼおよびＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生系であり、ＵＤＰグルコースの価格は高く、ＵＤＰ−グルコース再生系を採用するとコストを大幅に低減することができる。
【０００７】
本発明によると、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（すなわちウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、ＵＧＴと略称する）は既知のものである。好ましくは、本発明に用いられるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはステビア（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）に由来するＵＧＴ−Ａおよび／または水稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に由来するＵＧＴ−Ｂである。
【０００８】
ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有してもよい。好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する。さらに好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する。最も好ましくは、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する。一つの具体的な形態によると、ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と完全に一致している。
【０００９】
ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも６０％の同一性を有してもよい。より好ましくは、ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有する。さらに好ましくは、ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する。最も好ましくは、ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する。一つの具体的な形態によると、ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と完全に一致している。
【００１０】
本発明によると、反応を温度４〜５０℃およびｐＨ５．０〜９．０の水系中で行わせることができる。好ましくは、反応を温度２５〜３５℃およびｐＨ６．５〜７．５の水系中で行わせる。
【００１１】
より好ましくは、反応を温度３０℃で行わせる。
【００１２】
より好ましくは、反応をｐＨ７．０下で行わせる。
【００１３】
一つの具体的な好ましい形態によると、反応をｐＨ７．０のリン酸緩衝液中で行わせる。
【００１４】
本発明によると、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒として用いる場合、反応を細胞透過剤の存在下で行わせることができる。好ましくは、前記細胞透過剤はトルエンであり、それの反応系全体における体積濃度は１〜３％であってもよい。より好ましくは、トルエンの体積濃度は２％である。
【００１５】
本発明によると、組換え細胞は微生物細胞であってもよく、かつ好ましくは微生物細胞であり、微生物は大腸菌であってもよく、かつ好ましくは大腸菌、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア酵母などである。
【００１６】
一つの具体的でかつ好ましい形態によると、製造方法は下記のように実施される。反応に用いられる全ての原料を反応装置に加え、均一に混合した後、設定された温度下に配置し、撹拌して反応させる。反応終了後、精製処理によって使用要求を満たしたレバウジオシドＭ製品が得られる。一つの具体的な精製方法は、樹脂分離を含む後処理であり、該精製方法に従って、純度が９５％にも達するレバウジオシドＭ製品が得られる。
【００１７】
本発明の一つの具体的な形態によると、基質はレバウジオシドＡであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはステビアに由来するＵＧＴ−Ａと水稲に由来するＵＧＴ−Ｂとの混合物であり、ステビアに由来するＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有し、水稲に由来するＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する。好ましくは、混合物の中で、ステビアに由来するＵＧＴ−Ａと水稲に由来するＵＧＴ−Ｂとの重量比は１：０．８〜１．２であり、例えば、二者の重量比は１：１であってもよい。
【００１８】
本発明のもう一つの具体的な形態によると、基質はレバウジオシドＤであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはステビアに由来するＵＧＴ−Ａであり、該ステビアに由来するＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する。
【発明の効果】
【００１９】
以上の技術的解決手段の実施によって、本発明は従来の技術に比べて以下の長所を有する。
【００２０】
本発明により提供される酵素法によるレバウジオシドＭの製造方法は重要な応用価値を有する。微生物の成長速度は植物より遥かに速いため、本発明による製造方法を採用すると生産コストを大幅に低減し、生産周期を短縮し、製品の競争力を極めて大きく高めることができる。また、植物にはステビオシドの含有量が低く、かつ構造の異なるステビオシドが多いため、純粋な製品を抽出することは困難であるが、本発明の酵素法という合成方法を採用すると純度のより高い製品を提供することができ、その応用範囲をさらに広げることができる。ステビアの葉からレバウジオシドＭを抽出した従来の技術に比べて、本発明の方法は、生産周期を顕著に短縮し、生産能力を高め、コストが低く、かつ純度のより高い製品を提供することができるため、食品、飲料産業により経済的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例５で得られた製品の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭをそれぞれＲｅｂＡ、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭと略称し、三つの構造式はそれぞれ式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを参照する。
【００２３】
【化１】
0006272485.tif 000002
【００２４】
本発明は主にＲｅｂＭを合成する４つのルートを提供する。
【００２５】
ルート１：
【００２６】
【化２】
0006272485.tif 000003
【００２７】
ルート２：
【００２８】
【化３】
0006272485.tif 000004
【００２９】
ルート３：
【００３０】
【化４】
0006272485.tif 000005
【００３１】
ルート４：
【００３２】
【化５】
0006272485.tif 000006
【００３３】
本発明によると、用いられるＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂは酵素凍結乾燥粉末の形態で存在することができ、または組換え細胞中に存在ことができる。
【００３４】
ＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂを獲得する方法は下記の通りである。
【００３５】
分子クローニング技術、遺伝子工学技術によりＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂの組換え大腸菌（またはその他の微生物菌）の発現菌株を獲得し、その後、組換え大腸菌を発酵させ、製造してＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞を得、または製造してＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得る。
【００３６】
上記の分子クローニング技術および遺伝子工学技術はいずれも既知のものである。分子クローニング技術は『分子クローニング：実験マニュアル』第三版（Ｊ．サムブルック著、２００５）を参照することができる。
【００３７】
遺伝子工学技術により本発明の組換え菌株の発現を構築するステップは下記の通りである。
【００３８】
（１）（配列番号１および配列番号２、または配列番号３および配列番号４に基づいて）必要な遺伝子断片を遺伝子合成し、ｐＵＣ５７ベクターにライゲーションし、両端にそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を加えるステップ、
（２）２種類の制限酵素による切断、ライゲーションにより各遺伝子断片を発現ベクターｐＥＴ３０ａに対応する制限酵素切断部位に挿入して、各遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に置くステップ、
（３）組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入して形質転換させ、ＩＰＴＧにより標的タンパクの発現を誘導して、ＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂの組換え大腸菌発現菌株を得るステップ。
【００３９】
ＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現菌株によりＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂを含有する組換え細胞、またはＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を製造するステップは下記の通りである。
【００４０】
ＵＧＴ−ＡまたはＵＧＴ−Ｂを含有する組換え大腸菌発現菌株を１％の割合で液体ＬＢ培地４ｍｌ中に接種し、３７℃で一晩振盪培養し（２００ｒｐｍ）、一晩培養した培養物を取って１％の接種量で液体ＬＢ培地５０ｍｌに移して接種し、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで３７℃で振盪培養し（２００ｒｐｍ）、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えて２０℃で一晩振盪培養する。誘導終了後、遠心分離して細胞を収集し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌで細胞を再懸濁させて、組換え細胞を獲得し、またはさらに氷浴中で超音波により細胞を破砕し、破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、上清液を収集して２４ｈ凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を獲得する。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的な実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。
【００４２】
実施例１：ＵＧＴ−Ａを含む組換え大腸菌細胞の作製
配列番号１および配列番号２に基づいて、ＵＧＴ−Ａ遺伝子断片を遺伝子合成し、両端にそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を加え、ｐＵＣ５７ベクター（蘇州金唯智生物技術有限公司）にライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子断片を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、断片を回収して精製し、Ｔ４リガーゼを加えて断片をｐＥＴ３０ａの対応する制限酵素切断部位にライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させた。
【００４３】
ＵＧＴ菌種を１％の割合で液体ＬＢ培地４ｍｌに接種し、３７℃で一晩振盪培養し（２００ｒｐｍ）、一晩培養した培養物を取って１％の接種量で液体ＬＢ培地５０ｍｌに移して接種し、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで３７℃で振盪培養し（２００ｒｐｍ）、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えて２０℃で一晩振盪培養した。誘導終了後、遠心分離して細胞を収集し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌで細胞を再懸濁させて、ＵＧＴ−Ａを含む組換え細胞を獲得し、触媒として用いた。
【００４４】
実施例２：ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末の作製
実施例１で作製されたＵＧＴ−Ａの組換え細胞を氷浴において超音波により破砕し、破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、上清液を収集して２４ｈ凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を獲得した。
【００４５】
実施例３：ＵＧＴ−Ｂを含む組換え大腸菌細胞の作製
配列番号３および配列番号４に基づいて、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝子合成し、両端にそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を加え、ｐＵＣ５７ベクター（蘇州金唯智生物技術有限公司）にライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子断片を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、断片を回収して精製し、Ｔ４リガーゼを加えて断片をｐＥＴ３０ａの対応する制限酵素切断部位にライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させた。
【００４６】
ＵＧＴ菌種を１％の割合で液体ＬＢ培地４ｍｌに接種し、３７℃で一晩振盪培養し（２００ｒｐｍ）、一晩培養した培養物を取って１％の接種量で液体ＬＢ培地５０ｍｌに移して接種し、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで３７℃で振盪培養し（２００ｒｐｍ）、終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加えて２０℃で一晩振盪培養した。誘導終了後、遠心分離して細胞を収集し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌで細胞を再懸濁させて、ＵＧＴ−Ｂを含む組換え細胞を獲得し、触媒として用いた。
【００４７】
実施例４：ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末の作製
実施例３で作製されたＵＧＴ−Ｂの組換え細胞を氷浴において超音波により破砕し、破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、上清液を収集して２４ｈ凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を獲得した。
【００４８】
実施例５：ＲｅｂＤを基質とする、酵素法によるＲｅｂＭの合成（ルート１）
本実施例においては、実施例２の方法に従って作製されたＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を触媒としてＲｅｂＭの合成に用いた。
【００４９】
反応系に０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰグルコース０．２５５ｇ、ＲｅｂＤ０．１７ｇ、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末１．５ｇを順次加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＤの転化率は４０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．０５４ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５０】
実施例６：ＲｅｂＡを基質とする、酵素法によるＲｅｂＭの合成（ルート２）
本実施例においては、実施例２の方法に従って作製されたＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末および実施例４の方法に従って作製されたＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を触媒としてＲｅｂＭの合成に用いた。
【００５１】
反応系に０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰグルコース０．５１ｇ、ＲｅｂＡ０．１４５ｇ、ＵＧＴ−ＡおよびＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末それぞれ１．５ｇを順次加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＡの転化率は４０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．０５ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５２】
実施例７：ＲｅｂＤを基質とする、酵素法によるＲｅｂＭの合成（ルート３）
本実施例においては、スクロース、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するスクロースシンターゼ（以下、ＡｔＳＵＳ１と略称する）およびＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生系をグルコシルドナーとして使用した。
【００５３】
反応系に０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰ０．１８２ｇ、スクロース５１．３ｇ、ＲｅｂＤ０．１７ｇ、ＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末１．５ｇおよびＡｔＳＵＳ１の凍結乾燥粉末０．５ｇを順次加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＤの転化率は８０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．１１ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５４】
実施例８：ＲｅｂＡを基質とする、酵素法によるＲｅｂＭの合成（ルート４）
本実施例においては、スクロース、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するスクロースシンターゼ（以下、ＡｔＳＵＳ１と略称する）およびＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生系をグルコシルドナーとして使用した。
【００５５】
反応系に０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰ０．３６４ｇ、スクロース５１．３ｇ、ＲｅｂＡ０．１４５ｇ、ＵＧＴ−ＡとＵＧＴ−Ｂそれぞれ１．５ｇ、およびＡｔＳＵＳ１の凍結乾燥粉末０．５ｇを順次加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＡの転化率は８０％以上であった。シリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．１０８ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５６】
実施例９：ＲｅｂＤを基質、全細胞を触媒とするＲｅｂＭの合成
本実施例においては、実施例１で作製されたＵＧＴ−Ａを含む組換え細胞を触媒としてＲｅｂＭの合成に用いた。
【００５７】
反応系に０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰグルコース０．２５５ｇ、トルエン３ｍＬ、ＲｅｂＤ０．１７ｇ、ＵＧＴ−Ａを含有する組換え細胞１０ｇを順次加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＤの転化率は４０％以上であった。遠心分離、上清のシリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．０５２ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５８】
実施例１０：ＲｅｂＡを基質、全細胞を触媒とするＲｅｂＭの合成
０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍＬ、ＵＤＰグルコース０．５１ｇ、トルエン３ｍＬ、ＲｅｂＡ０．１４５ｇを含有する反応系に、ＵＧＴ−ＡおよびＵＧＴ−Ｂをそれぞれ含有する全細胞１０ｇを加え、均一に混合した後に３０℃の水浴に配置し、１６０ｒｐｍで２ｈ撹拌して反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：１％ギ酸水溶液：メタノール＝２０％：８０％、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃）で測定した。ＲｅｂＡの転化率は４０％以上であった。遠心分離、上清のシリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、ＲｅｂＭ０．０５ｇを得、純度は９５％を超えた。
【００５９】
以下、好ましい実施形態を項分け記載する。
【００６０】
実施形態１
レバウジオシドＡまたはレバウジオシドＤを基質とし、グルコシルドナーの存在下で、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼおよび／またはＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒として、前記基質を反応させてレバウジオシドＭを生成することを特徴とする、酵素法によるレバウジオシドＭの製造方法。
【００６１】
実施形態２
グルコシルドナーが、ＵＤＰ−グルコースまたはスクロース、スクロースシンターゼおよびＵＤＰからなるＵＤＰ−グルコース再生系であることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００６２】
実施形態３
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビアに由来するＵＧＴ−Ａおよび／または水稲に由来するＵＧＴ−Ｂであることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００６３】
実施形態４
ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態３に記載の方法。
【００６４】
実施形態５
ＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態４に記載の方法。
【００６５】
実施形態６
ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態３に記載の方法。
【００６６】
実施形態７
ＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態６に記載の方法。
【００６７】
実施形態８
反応を温度２５〜３５℃およびｐＨ６．５〜７．５の水系中で行わせることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００６８】
実施形態９
反応をｐＨ７．０のリン酸緩衝液中で行わせることを特徴とする、実施形態８に記載の方法。
【００６９】
実施形態１０
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒とし、反応系に体積濃度が１〜３％のトルエンをさらに含有することを特徴とする、実施形態８に記載の方法。
【００７０】
実施形態１１
反応に用いられる全ての原料を反応装置に加え、均一に混合した後、設定された温度下に配置し、撹拌して反応させるように実施することを特徴とする、実施形態８に記載の方法。
【００７１】
実施形態１２
組換え細胞が微生物細胞であることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【００７２】
実施形態１３
微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア酵母であることを特徴とする、実施形態１２に記載の方法。
【００７３】
実施形態１４
基質がレバウジオシドＡであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼがステビアに由来するＵＧＴ−Ａと水稲に由来するＵＧＴ−Ｂとの混合物であり、前記ステビアに由来するＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有し、前記水稲に由来するＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【００７４】
実施形態１５
混合物中で、ステビアに由来するＵＧＴ−Ａと水稲に由来するＵＧＴ−Ｂとの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする、実施形態１４に記載の方法。
【００７５】
実施形態１６
基質がレバウジオシドＤであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼがステビアに由来するＵＧＴ−Ａであり、前記ステビアに由来するＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【００７６】
上記実施例は、本発明の技術構想および特徴を説明するためだけのものであって、その目的は当該業者が本発明の概要を理解して実施できるようにすることにあり、本発明の保護範囲を制限するためのものではない。本発明の主旨に基づいて行われた同等の変更や修飾は、本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【配列表】
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