(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(c)から選択されるタンパク質またはその断片：
(a)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質
(c)上記多糖結合部位と結合し得る、上記(a)もしくは(b)のタンパク質の断片
を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤。
【請求項２】
上記断片が、配列番号１の17〜258番目のアミノ酸を含む、請求項１記載の植物病原菌抵抗性向上剤。
【請求項３】
植物病原菌を請求項１または２記載の植物病原菌抵抗性向上剤と接触させることを含む、植物病原菌による多糖分解酵素活性を阻害する方法。
【請求項４】
多糖結合部位を有するタンパク質及び該多糖結合部位を含まないタンパク質を含む粗タンパク質標品を、以下の(a)〜(c)から選択されるタンパク質またはその断片：
(a)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質
(c)イネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得る、上記(a)もしくは(b)のタンパク質の断片
と混合し、複合体を回収することを含む、多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法。
【請求項５】
上記多糖結合部位を有するタンパク質がイネいもち病菌由来のセロビオヒドロラーゼII、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼまたはセロビオースデヒドロゲナーゼである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入されたトランスジェニック植物。
【請求項７】
イネ科植物、アブラナ科植物、ナス科植物、またはマメ科植物である、請求項６記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつイネいもち病菌由来セロビオヒドロラーゼIIの多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を植物に導入することを含む、トランスジェニック植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病原菌等で発現される多糖分解酵素等のタンパク質における多糖結合部位を認識して結合する新規な多糖結合部位認識タンパク質、植物病原菌の多糖分解酵素活性を阻害する方法、及び多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、上記多糖結合部位認識タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニック植物、及び植物病原菌に対する耐性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
植物病原菌の多くは植物に感染する際、植物細胞壁の多糖であるセルロースやヘミセルロース、ペクチンなどを分解する多種の酵素（多糖分解酵素）を生産および分泌し、植物細胞壁多糖を分解している（非特許文献１）。多糖分解酵素によって植物細胞壁多糖が分解されると、植物の細胞壁の強度が低下し（非特許文献２）、これにより植物病原菌菌糸の植物内への侵入が容易になる。また、植物病原菌は、細胞壁多糖の分解により得られるグルコースなどを炭素栄養源として摂取している。
【０００４】
多糖分解酵素は主として、それぞれの酵素が認識する多糖をエンド型またはエキソ型に加水分解し、多糖の低分子化および単糖やオリゴ糖の生成を触媒している。また、多糖分解酵素は多糖のグリコシド結合を切断した後、水分子を転移する加水分解反応を触媒するが、一部の多糖分解酵素は水分子の代わりに糖を転移する糖転移反応を触媒する（非特許文献３）。多糖分解酵素は構成されるアミノ酸配列の相同性をもとに、グリコシドヒドロラーゼファミリー (Glycoside hydrolase family, GH と略す)としてグループ分けされている(CAZY; http://www.cazy.org/)（非特許文献４、５）。
【０００５】
一部の多糖分解酵素は触媒作用を示す触媒部位(catalytic domain)の他に、多糖と結合する多糖結合部位(carbohydrate-binding module)を有する。多糖結合部位は、エンドグルカナーゼやセロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、エステラーゼなどの多糖分解酵素を含む多種の酵素にその存在が認められており、その多くは酵素のアミノ末端やカルボキシ末端などに付加されている。多糖分解酵素に含まれる多糖結合部位はそのアミノ酸配列の相同性から６９グループとこれらに属さない多糖結合部位のグループに分類されている。その中で、グループ1に属する多糖結合部位の多くは菌類に由来している（非特許文献４、５）。
【０００６】
多くの多糖分解酵素は水可溶性の多糖基質に対して高い分解活性を示すが、水不溶性の多糖基質に対する活性はかなり低い。一方、多糖結合部位を有する多糖分解酵素は水可溶性の多糖基質のみならず、水不溶性の基質に対しても高い分解活性を示す（非特許文献６−９）。そのため、多糖結合部位は水不溶性の多糖基質の分解を向上させる機能があると推察されている。
【０００７】
酵素化学的な実験では、水可溶性の多糖基質は活性測定が簡便であること、酵素にとって分解しやすい基質となること、などの理由により頻繁に使用されているが、実用レベルでは水不溶性の多糖基質を分解することが求められている。例えば、植物細胞壁多糖を原料としたバイオエタノール製造においては、水不溶性の植物細胞壁多糖を効率的に分解しなければならない。そのため、多糖結合部位を有する多糖分解酵素の利用は、実用レベルの水不溶性の多糖基質、セルロースなど、を効率的に分解する点において有利である。
【０００８】
一方、植物病原菌の植物への感染に対して、植物は植物病原菌由来のタンパク質や糖、感染刺激などを認識し、抵抗性因子をコードしている遺伝子の発現が誘導され、その後、抵抗性因子が生産され、植物病原菌に対する抵抗性を向上させている。
【０００９】
植物病原菌が生産するキシログルカナーゼやキシラナーゼはキシログルカンやキシランを分解するが、これに対して、植物はキシログルカナーゼ特異的インヒビタータンパク質 (Xyloglucan-specific endoglucanase inhibitor protein) やキシラナーゼインヒビタータンパク質(Xylanase inhibitor protein)を分泌し、これらの酵素活性を特異的に阻害していることが知られている（非特許文献１０−１４）。
【００１０】
これまでに多糖結合部位を認識するタンパク質は発見されていない。そのため、多糖結合部位をターゲットにした酵素活性の阻害方法や植物病原菌の防除方法はこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Walton JD, Deconstructing the cell wall. Plant Physiol. 104, 1113-1118 (1994)
【非特許文献２】Takeda T.等, Suppression and acceleration of cell elongation by integration of xyloglucans in pea stem segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 9055-9060 (2002)
【非特許文献３】Takahashi M.等, Degradation and synthesis of β-glucans by a Maganaporthe oryzae endotransglucosylase, a member of the glycoside hydrolase 7 family. J. Biol. Chem., 288, 13821-13830 (2013)
【非特許文献４】Henrissat B. and Bairoch A., Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J., 316, 695-696 (1996)
【非特許文献５】Henrissat B. and Davies G., Structure and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr. Opin. Biol., 7, 637-644 (1997)
【非特許文献６】Din N.R.等, Non-hydrolytic disruption of cellulose fibers by the binding domain of a bacterial cellulase. Bio/Technology, 9, 1096-1099 (1991)
【非特許文献７】Gilkes, N.R.等, Visualization of the adsorption of a bacterial endo-β-1,4-glucanase and its isolated cellulose-binding domain to crystalline cellulose. Int J Biol Macromol., 15, 347-351 (1993)
【非特許文献８】Ito, J.等, Improvement of cellulose-degrading ability of a yeast strain displaying Trichoderma reesei endoglucanase II by recombination of cellulose-binding domains. Biotechnol. Prog., 20, 688-691 (2004)
【非特許文献９】Tomme, P.等, Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi. Adv Microb Physiol., 37, 1-81 (1995)
【非特許文献１０】Qin Q.等, Characterization of a tomato protein that inhibits a xyloglucan-specific endoglucanase. Plant J., 34, 327-338 (2003)
【非特許文献１１】Juge N., Plant protein inhibitors of cell wall degrading enzymes. Trends Plant Sci. 11(7), 359-367 (2006)
【非特許文献１２】Gusakov A.V., Proteinaceous inhibitors of microbial xylanases. Biochemistry, 75, 1185-1199 (2010)
【非特許文献１３】Debyser W.等, Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI), a new class of enzyme inhibitor affecting breadmaking performance. J. Cer. Sci. 30, 39-43 (1999)
【非特許文献１４】McLauchlan W. R.等, A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem. J., 338, 441-446 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の通り、植物の主要ヘミセルロース鎖であるキシログルカンやキシランを分解する酵素（キシログルカナーゼやキシラナーゼ）に対する植物由来のインヒビタータンパク質の存在は認められているが、これらのインヒビタータンパク質は特異的に酵素活性を阻害するため、多種の酵素活性を阻害することは出来ず、植物病原菌からの植物の防除法としては利用に限界がある。
【００１３】
これに対して、多糖分解酵素の一部として存在する多糖結合部位をターゲットとすれば、多種の多糖分解酵素の活性を阻害することが出来、植物の植物病原菌からの効率的な防除方法として利用できると考えられる。本発明者等は、植物病原菌由来の多糖結合部位を有する多糖分解酵素の作用を阻害することによって、植物の細胞壁多糖の分解を抑制し、植物病原菌の感染の抑制に寄与し得る可能性を想定した。
【００１４】
また、現在、多種生物のゲノム遺伝子配列が解読され、それらの遺伝子情報から多糖分解酵素の遺伝子や多糖結合部位を有する多糖分解酵素の遺伝子を抽出することは可能である。しかし、抽出された遺伝子を用いて、これらの遺伝子がコードしているタンパク質を生産することは必ずしも可能ではなく、また生産したタンパク質が必ずしも酵素活性を示すとは限らない。例えば、イネいもち病菌はGH12に属する３種類の遺伝子を有しており、多糖結合部位を有していない２種類のGH12のタンパク質はイネいもち病菌や枯草菌などを宿主としてリコンビナントタンパク質の生産が成功しているが、多糖結合部位を有していることが推測されるGH12のタンパク質の生産は成功していない（Takeda T.等, Characterization of endo-1,3-1,4-β-glucanases in GH family 12 from Magnaporthe oryzae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 88, 1113-1123 (2010)。一方、微生物や植物などが実際に生産し、使用している多糖分解酵素や多糖結合部位を有する多糖分解酵素を酵素活性を基準に単離精製することは可能であるが、必ずしも多糖結合部位を有する多糖分解酵素を得られる保証はない。そのため、植物の細胞壁多糖などを効率的に分解する多糖結合部位を有する多糖分解酵素を容易に単離同定する方法が確立されれば、植物の細胞壁多糖を効率的に分解する酵素標品の作製が格段に前進する。
【００１５】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、多糖結合部位を有するタンパク質を認識し、結合するタンパク質、つまり多糖結合部位認識タンパク質を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明はまた、多糖結合部位認識タンパク質によって、多糖結合部位を有するタンパク質の酵素活性の阻害方法を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明はまた、多糖結合部位認識タンパク質を用いた、多糖結合部位を有するタンパク質の簡便な単離・回収方法を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明は更に、上記多糖結合部位認識タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニック植物、及び植物病原菌に対する耐性を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は、鋭意研究した結果、多糖結合部位を有するタンパク質における多糖結合部位を認識し、結合する、イネおよびコムギ由来の複数種のタンパク質を発見し、その生産方法の確立および諸性質の解明により、本発明に至った。
【００２０】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［８］を提供する。
［１］GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子がコードするタンパク質、または植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るその断片を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤。
［２］以下の(a)〜(b)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質
を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤。
［３］植物病原菌を上記［１］または［２］記載の植物病原菌抵抗性向上剤と接触させることを含む、植物病原菌による多糖分解酵素活性を阻害する方法。
［４］粗タンパク質標品を、GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子からなる群から選択される遺伝子がコードするタンパク質、または植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るその断片、あるいは以下の(a)〜(b)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質
と混合し、複合体を回収することを含む、多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法。
［５］GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子が導入された、植物病原菌による多糖分解に対する抵抗性が向上したトランスジェニック植物。
［６］以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された、植物病原菌による多糖分解に対する抵抗性が向上したトランスジェニック植物。
［７］GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子を植物に導入することにより、植物病原菌に対する耐性を向上させる方法。
［８］以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を植物に導入することにより、植物病原菌に対する耐性を向上させる方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のタンパク質は、植物病原菌由来のタンパク質の多糖結合部位を認識し、結合してその機能を抑制することができるため、植物病原菌抵抗性向上剤として利用することができる。
【００２２】
本発明のタンパク質を多糖結合部位を有するタンパク質に作用させることにより、多糖結合部位を有するタンパク質が有する触媒作用などの機能を阻害することが出来る。特に、本発明のタンパク質を多糖結合部位を有する多糖分解酵素に作用させることにより、多糖基質の分解を抑制することが出来る。
【００２３】
本発明のタンパク質は、例えば植物に噴霧や塗布などの方法によって適用することで、植物病原菌に由来する多糖結合部位を有するタンパク質の作用を抑制することが出来る。
【００２４】
また、本発明のタンパク質を粗タンパク質標品に作用させることにより、多糖結合部位を有するタンパク質を容易に単離・回収することが出来る。そのため、多種の微生物に由来する粗タンパク質標品から多糖結合部位を有するタンパク質を容易に得ることが出来る。特に、多糖結合部位を有する多糖分解酵素は水不溶性の多糖基質を効率的に分解出来るため、多糖結合部位を有する多糖分解酵素の実用的利用性は高い。
【００２５】
更に、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を植物に導入し、多糖結合部位認識タンパク質を高レベルに発現するトランスジェニック植物を作出することができる。このトランスジェニック植物は、植物病原菌に由来する多糖結合部位を有する多糖分解酵素などの作用に対する抵抗性が向上しており、植物病原菌に対する抵抗性を増強させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】イネいもち病菌由来の多糖分解酵素に作用するイネ由来のタンパク質の単離を示す結果である。黒三角は混合液に加えたイネいもち病菌由来の多糖分解酵素を示す。矢印はイネいもち病菌由来の多糖分解酵素と結合したイネ由来のタンパク質を示す。1: セロビオヒドロラーゼII (XM_360146);2: β-グルコシダーゼ (XM_364573);3: セロビオヒドロラーゼI (XM_367082)；4: イネ由来のタンパク質のみ。
【図２】NM_001060670がコードするタンパク質との相同性を有するタンパク質の系統樹を示す。NM_001060670がコードするタンパク質のアミノ酸配列をブラスト検索した後、高い相同性を示すタンパク質を得た。これらをClastalWを用いて相同性配列を作製し、GENETYX のプログラムを用いて系統樹を作製した。GenBank登録番号の右側に記載された数字はコードされるタンパク質のアミノ酸の数を示す。
【図３】NM_001060670がコードするタンパク質との相同性が高いタンパク質の立体構造モデルを示す。AK243295は立体構造が異なるタンパク質の一例である。
【図４】NM_001060670がコードするタンパク質と高い相同性を有する2種のタンパク質（KD518572およびKD114170）のアミノ酸配列比較を示す。
【図５】本発明の多糖結合部位認識タンパク質による多糖結合部位への結合を示す。1: HAタグを有する本発明のタンパク質を含む抽出タンパク質のみ; 2: HAタグを有する本発明のタンパク質を含む抽出タンパク質＋ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146); 3: HAタグを有する本発明のタンパク質を含む抽出タンパク質＋ヒスチジンタグを有する多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼII (XM_360146); 4: HAタグを有する本発明のタンパク質を含む抽出タンパク質＋ヒスチジンタグを有する多糖結合部位を有さないセロビオヒドロラーゼII(XM_362054)。
【図６】多糖結合部位認識タンパク質による多糖結合部位を有するタンパク質の単離を示す。黒三角はヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質を示す。矢印はヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質に作用したイネいもち病菌由来のタンパク質を示す。LC/MS/MS の結果より、これらは(1) セロビオースデヒドロゲナーゼ (XM_003710939); (2) セロビオヒドロラーゼII (XM_360146); (3) エンドグルカナーゼ (XM_365863)およびキシラナーゼ (AY124591)であることが判明した。
【図７】多糖結合部位認識タンパク質による多糖結合部位を有するまたは多糖結合部位を有しない多糖分解酵素の活性への影響を示す。ヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質 (0-10μg)と、多糖結合部位を有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼII、または多糖結合部位を有しないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054)とを混合し、4℃で15分間静置した後、セルロースを基質として多糖分解酵素の酵素活性を測定した。●：多糖結合部位を有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146);○：多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼ II ;□：多糖結合部位を有しないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054)。
【図８】多糖結合部位認識タンパク質による多糖結合部位を有する多糖分解酵素の活性阻害を示す。ヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質(0-6μg)を、多糖結合部位を有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、エンドグルカナーゼ(XM_365863)、またはキシラナーゼ (AY124591) と混合し、4℃で15分間静置した後、酵素活性を測定した結果を示す。(A): 基質としてセルロースを用いた時のセロビオヒドロラーゼII(XM_360146)の酵素活性; (B): 基質としてカルボキシメチルセルロースを用いた時のエンドグルカナーゼ(XM_365863)の酵素活性; (C): 基質としてセルロースを用いた時のエンドグルカナーゼ(XM_365863)の酵素活性; (D): 基質として水可溶性のキシランを用いた時のキシラナーゼ(AY124591)の酵素活性; (E): 基質としてキシランを含む水不溶性のイネ細胞壁を用いた時のキシラナーゼ (AY124591)の酵素活性。
【図９】多糖結合部位認識タンパク質によるセロビオヒドロラーゼのセルロースへの結合阻害を示す。1: ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) のみを使用した時; 2: ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) とヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質を使用した時、の結果を示す。
【図１０】リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析の結果を示す。（A)  イネいもち病菌処理0-4日後のイネ葉を回収した。イネ葉からtotal RNAを抽出した後、cDNAを合成した。作製したcDNAを用いてリアルタイムPCRにより多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現を決定した。標準サンプルとして、ユビキチン遺伝子を用いた。（B)  イネいもち病菌処理、サリチル酸処理(SA)、ジャスモン酸処理 (JA)、セロビオース処理 (C2)、キチンオリゴ糖処理、低温(10℃)処理、または物理的障害（葉の先端１cmを切断）処理を行った１日後のイネ葉を回収した。イネ葉からtotal RNAを抽出した後、cDNAを合成した。作製したcDNAを用いてリアルタイムPCRにより多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現を決定した。標準サンプルとして、ユビキチン遺伝子を用いた。
【図１１】イネ葉における多糖結合部位認識タンパク質の蓄積を示す。黒三角は加えたヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼを示す。矢印で示すタンパク質は LC/MS/MS による解析の結果、多糖結合部位認識タンパク質であることが確認された。1: イネいもち病菌感染1日後のイネ葉; 2: イネいもち病菌感染2日後のイネ葉; 3: イネいもち病菌感染3日後のイネ葉; 4: イネいもち病菌感染4日後のイネ葉; 5: イネいもち病菌未感染のイネ葉。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
上記の通り、本発明は、植物病原菌等で発現される多糖結合部位を有するタンパク質の多糖結合部位を認識して結合する新規な多糖結合部位認識タンパク質を有効成分として含む植物病原菌抵抗性向上剤、植物病原菌の多糖分解酵素活性を阻害する方法、及び多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法を提供する。
【００２８】
本発明は、一実施形態として、植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質（多糖結合部位認識タンパク質）を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤を提供する。
【００２９】
具体的には、本発明の植物病原菌抵抗性向上剤は、GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子がコードするタンパク質、または植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るその断片を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤である。
【００３０】
また、本発明の植物病原菌抵抗性向上剤は、以下の(a)〜(b)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質
を有効成分として含む、植物病原菌抵抗性向上剤である。
【００３１】
本明細書において、「数個」とは、１０個未満、好ましくは５個未満、より好ましくは３個未満であることを意味する。
【００３２】
アミノ酸配列における置換は、保存的置換であっても非保存的置換であっても良いが、好ましくは保存的置換である。
【００３３】
本発明の多糖結合部位認識タンパク質は、CBM Family 1 に属する多糖結合部位を認識して結合する。糖質関連酵素のデータベースであるCAZY (Carbohydrate-Active Enzymes, http://www.cazy.org/)にまとめられているように、このCBM Family 1のほとんどは菌類に由来する。
【００３４】
従って、本発明による防除対象に含まれる植物病原菌としては、特に限定するものではなく、CAZY, CBM Family 1に記載されている生物が挙げられ、例えばイネいもち病菌等のいもち病菌、麹菌、酵母等が挙げられる。これらの植物病原菌によって分泌される多糖分解酵素としては、セルロースやヘミセルロース、ペクチン等の分解に関わるセロビオヒドロラーゼIおよびII、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、ペクチンエステラーゼ等が挙げられる。また、グリコシド結合を加水分解する酵素を総称してグリカナーゼまたはグルカナーゼという。
【００３５】
本発明において、「多糖結合部位」（Carbohydrate-binding module, Carbohydrate-binding domain、CBM）とは、それ自体は触媒作用を持たず、多糖への結合に重要な作用を及ぼす部位を意味する。上記したように、多糖結合部位は、そのアミノ酸配列の相同性からグループ分けされている。
【００３６】
多糖結合部位を有するタンパク質は、主として水不溶性の基質に対する結合性を有する。従って、例えば、セルロースは水不溶性の多糖であるため、多糖結合部位のセルロースへの結合性を容易に測定することができる。一方、キシランはそれ自体水可溶性の多糖であるが、細胞壁においてはセルロースと結合しているため、セルロース・キシランの複合体においてキシランは水不溶性の状態であると言える。水に可溶化している高分子のキシランがある一方、セルロースに結合することで水不溶性の状態になっている低分子のキシランも存在する。
【００３７】
多糖結合部位を有するタンパク質の一例として、例えばいもち病菌のセロビオヒドロラーゼIIが挙げられる。この酵素は、多糖結合部位を除去することによりセルロースの分解能力が低下することが報告されている。セルロース分解作用における多糖結合部位の役割として、多糖結合部位が基質であるセルロースに結合することで触媒部位の作用が安定すること、多糖結合部位がセルロースの結晶構造を乱すために触媒作用が促進されること、などが推測されている。
【００３８】
いもち病菌のゲノム遺伝子の配列はすでに公開されており、セロビオヒドロラーゼII（MoCel6A）の遺伝子配列は公知である。
【００３９】
本発明者等は、本発明を完成させる過程で、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼIIを作製した。セロビオヒドロラーゼIIのアミノ酸配列（配列番号３）から、その多糖結合部位の位置は31〜59番目のアミノ酸に該当する（下線部分）と推測されたため、多糖結合部位を除去した66番目のセリンから487番目のロイシンまでのタンパク質を作製するために、このアミノ酸配列をコードするDNAを導入した。
0006441659.tif 000002
【００４０】
本発明において「多糖結合部位認識タンパク質」とは、上記の多糖結合部位を認識して結合することが可能なタンパク質をいう。
【００４１】
本発明の多糖結合部位認識タンパク質は、CBM Family 1 を特異的に認識して結合することができる。本発明の多糖結合部位認識タンパク質と多糖結合部位の複合体を単離することができることから、これらの結合は強固かつ安定である、と言うことができる。
【００４２】
本発明において好ましい多糖結合部位認識タンパク質は、イネゲノム遺伝子のNM_001060670（GenBank登録番号）として登録されている、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（アミノ酸配列を配列番号２に示す）である。これまで、NM_001060670が示す遺伝子および遺伝子がコードしているタンパク質の機能については全く未知であった。
【００４３】
上記のように、本発明のタンパク質は多糖結合部位を認識し、結合するため、多糖結合部位を有する多糖分解酵素の活性を阻害することが出来る。
【００４４】
本発明において、「植物病原菌抵抗性向上剤」とは、植物病原菌と接触した場合の感染を防止したり、病害の程度を軽減させることができる物質を意味する。
【００４５】
本発明の植物病原菌抵抗性向上剤は、有効成分として上記のタンパク質を含み、場合によって、農業分野において通常用いられる他の有効成分、例えば殺菌剤、殺虫剤、植物成長調整剤等を更に含むものであっても良い。また、本発明の植物病原菌抵抗性向上剤は、単独で、または、農業用組成物の形態で、使用することができる。農業用組成物は、担体、希釈剤等の賦形剤を含み、粉剤、液剤、乳剤、エアゾール剤、ペースト剤等の農業分野で通常使用される形態で使用することができる。
【００４６】
本発明の多糖結合部位認識タンパク質は、イネ等の植物に対して植物病原菌が感染した際に発現が誘導される。植物病原菌の感染に対して多糖結合部位認識タンパク質を発現させる植物としては、例えばイネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ等のイネ科植物、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、タバコ等のナス科植物、ダイズ等のマメ科植物等が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のタンパク質の一例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の性質として、（１）可溶性タンパク質であること、（２）イネカルスおよびイネ植物体において生産可能であること、（３）イネカルスにおいて、培地中に分泌されること、（４）258のアミノ酸より構成されているが、1-16番目のアミノ酸が分泌シグナルとなっており、分泌される際16番目と17番目の間で切断され、25.7kDaのペプチドとなること、などが挙げられる。
【００４８】
本発明はまた、植物病原菌を上記の植物病原菌抵抗性向上剤と接触させることを含む、植物病原菌による多糖分解酵素活性を阻害する方法を提供する。
【００４９】
本発明において、「接触させる」とは、植物病原菌が生産・分泌する多糖分解酵素と上記のタンパク質または植物病原菌抵抗性向上剤とを、結合可能な条件下におくことをいい、具体的には、植物病原体、または植物病原体が存在し得る場所（空間）に対して、上記のタンパク質または剤そのもの、またはこれらを含む組成物、例えば農薬としての組成物を噴霧等によって適用することを意味する。組成物の形態、適用形態は、当分野において慣用される技術の範囲内で当業者が適宜決定することができる。
【００５０】
本発明の方法によって、植物病原菌によって発現・分泌される少なくとも1種、少なくとも2種、または少なくとも3種の多糖分解酵素のそれぞれの活性を、好ましくは30％、40％、50％、またはそれ以上阻害することができる。一実施形態において、本発明の方法によって、最大40-60％の活性阻害が認められる。
【００５１】
植物病原菌の多糖分解酵素活性を阻害することによって、植物病原菌による感染を予防・軽減することができる。本発明の方法を用いる対象の植物は、上記イネ科植物、アブラナ科植物、ナス科植物、マメ科植物の他、各種の農作物、園芸植物等を挙げることができ、特に限定するものではない。
【００５２】
また、本発明のタンパク質による多糖結合部位を有するタンパク質の機能の阻害作用は多糖結合部位を有する多糖分解酵素に限定されることはなく、多糖結合部位を有するタンパク質に対して作用するものである。
【００５３】
従って、本発明は、多糖結合部位を有するタンパク質を上記の本発明のタンパク質と接触させることを含む、多糖結合部位を有するタンパク質の多糖結合部位への結合及びその機能を阻害する方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、粗タンパク質標品を上記の本発明のタンパク質と混合し、複合体を回収することを含む、多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法を提供する。
【００５５】
すなわち、本発明は、粗タンパク質標品を、GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子からなる群から選択される遺伝子がコードするタンパク質、または植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るその断片、あるいは以下の(a)〜(b)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質
と混合し、複合体を回収することを含む、多糖結合部位を有するタンパク質の回収方法を提供する。
【００５６】
「粗タンパク質標品」とは、多糖結合部位を有するタンパク質を含み、更に多糖結合部位を含まないタンパク質や様々な夾雑物を含むものを意味し、例えば多糖分解酵素等の種々の酵素、植物病原菌等の微生物そのもの、微生物の破砕物、微生物を含む培養液等を含む。
【００５７】
複合体形成後、複合体を形成しなかったタンパク質と分離するために、例えば遠心分離、クロマトグラフィー、SDS-PAGE等の当分野で通常使用される分離手段を利用することができる。また、簡便な回収のために、HAタグ、ヒスチジンタグ等のタグを多糖結合部位認識タンパク質に付加することにより、多糖結合部位認識タンパク質と結合した多糖結合部位を有する多糖分解酵素を容易に単離することができる。
【００５８】
本発明の一態様では、例えばイネのカルス細胞に上記の本発明のポリヌクレオチドを導入することにより、本発明の多糖結合部位認識タンパク質を大量に生産することが出来る。得られた多糖結合部位認識タンパク質は、植物病原菌抵抗性向上剤として、また、多糖結合部位を有するタンパク質の単離・回収のために、好適に使用することができる。
【００５９】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドが導入された、植物病原菌による多糖分解に対する抵抗性が向上したトランスジェニック植物を提供する。
【００６０】
すなわち本発明は、GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子が導入された、植物病原菌による多糖分解に対する抵抗性が向上したトランスジェニック植物を提供する。
【００６１】
本発明はまた、以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された、植物病原菌による多糖分解に対する抵抗性が向上したトランスジェニック植物を提供する。
【００６２】
上記の配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％の配列同一性を有し得る。
【００６３】
２つの塩基配列の配列同一性％の決定は、当業者であれば容易に行うことができる。配列比較のための数学的アルゴリズムも周知である。比較対象の２つの配列は同じ長さであっても異なっていても良い。
【００６４】
本発明のトランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチドを、当分野において通常用いられる形質転換方法、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって、植物中に導入することによって得ることができる。
【００６５】
形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物の器官、組織、又は培養細胞を好適に使用することができる。植物における発現はユビキチンプロモーターなどの一般的に用いられているプロモーターを用いる事により恒常的に誘導することが出来る。また、植物病原菌による感染、もしくはこれに由来する多糖分解酵素による刺激によって行うこともできる。
【００６６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び該ベクターで形質転換された形質転換体にも関する。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されているものを適宜使用可能であるが、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００６８】
ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するには、まず、ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６９】
上記ベクターには複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明の形質転換体の宿主としては、限定するものではないが、大腸菌、麹菌、枯草菌、酵母、コス細胞、植物細胞等が挙げられる。好ましい宿主は、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ等のイネ科植物、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、タバコ等のナス科植物、ダイズ等のマメ科植物等が挙げられる。
【００７１】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを導入することにより、植物病原菌に対する耐性を向上させる方法を提供する。
【００７２】
すなわち、本発明は、GenBank登録番号NM_001060670、KD114170、KD518572、AL731589、AY576676、NM_001058980、またはNM_001059001で示される遺伝子を植物に導入することにより、植物病原菌に対する耐性を向上させる方法を提供する。
【００７３】
本発明はまた、以下の(a)〜(d)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号２、１４または１６で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号１、１３または１５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物病原菌由来タンパク質の多糖結合部位と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を植物に導入することにより、植物病原菌に対する耐性を向上させる方法を提供する。
【００７４】
本発明により、多糖結合部位認識タンパク質遺伝子の発現誘導や多糖結合部位認識タンパク質の蓄積により、イネいもち病菌等の植物病原菌に由来する多糖結合部位を有するタンパク質の認識、結合、酵素活性の阻害を含めた多糖結合部位認識タンパク質の作用により、イネいもち病菌に対する抵抗性を向上させることが出来る。
【００７５】
また、イネいもち病菌が感染したイネにおいて多糖結合部位認識タンパク質が生産され、イネいもち病菌の感染に対して抵抗性を向上させることが出来る。
【００７６】
また、多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子を高発現させることや多糖結合部位認識タンパク質の蓄積レベルを増加させる処理、例えばイネいもち病菌などの病原菌の接種、により、多糖結合部位認識タンパク質の生産レベルを向上させ、植物病原菌に対する抵抗性を向上させることが出来る。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
［実施例１］
多糖結合部位認識タンパク質の単離および同定
イネいもち病菌に由来する多糖分解酵素の作用を抑制する植物由来のタンパク質を単離同定するため、以下の実験を行った。
【００７９】
イネいもち病菌をオートミールプレートで25℃、10日間育てた後、ブラックライト下で6日間置くことにより胞子形成を行った。プレート上に形成されたイネいもち病菌の胞子は滅菌水を用いて回収した。回収したイネいもち病菌を含む溶液にTween20（登録商標）（最終濃度0.01 ％）を添加した後、約3週間栽培したイネ（3葉）に噴霧した。噴霧4日後にイネ葉を回収し、液体窒素を用いて粉砕し、リン酸バッファー (10 mM, pH7.0) によりイネ葉からタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を遠心分離 (15,000 rpm, 5 分) した後、上清を可溶性タンパク質として回収した。
【００８０】
具体的には、可溶性タンパク質(約10 mg)とリン酸バッファー（最終濃度100 mM, pH 7.0）、連続する7個のヒスチジンタグをカルボキシ末端に有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、β-グルコシダーゼ (XM_364573)、またはセロビオヒドロラーゼI (XM_367082)(各20μg) をそれぞれ混合し、4℃で15分間静置した。混合溶液にヒスチジン結合樹脂（TALON Metal Affinity Resin, Clontech）を加え、4℃で震盪した。その後、遠心分離 (3,000 rpm, 1 分) によりヒスチジン結合樹脂を回収した。ヒスチジン結合樹脂をバッファー（50 mMリン酸バッファー(pH7.0)、100 mM NaCl）で3度洗浄した後、溶出バッファー（50 mMリン酸バッファー(pH7.0)、100 mM NaCl、300 mM イミダゾール）を加え、ヒスチジン結合樹脂に結合しているタンパク質を溶出した。さらに限外濾過カラムを用いて溶出液の脱塩・濃縮を行った。
【００８１】
得られたサンプルをSDS-PAGEにより分離した後、銀染色を行った結果、図１に示されるように、イネの抽出タンパク質にセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) を加えた場合に、矢印で示す特異的なタンパク質のバンドが認められた。
【００８２】
このタンパク質のバンドをSDS-ポリアクリルアミドゲルから切り出し、37℃で18時間、トリプシン処理を行い、消化されたペプチドをADVANCE UHPLCシステム（MICHROM Bioresources, Inc.）に接続したMagic C18 AQナノカラム（0.1×150mm, MICHROM Bioresources, Inc., CA, USA）にアプライし、0.1％ギ酸溶液に含まれる5-45％(v/v)のアセトニトリルの勾配を用い、流速500nL/分で溶出させた。分離されたペプチドはXcaliburソフトウェア  Ver. 2.0.7 (Thermo Fisher Scientific)を用い、LTQ Orbitrap XL質量分析装置 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)で解析し、MASCOT MS/MS ion search (http://www.matrixscience.com/home.html)プログラムを用いてNCBIデータベースを検索し、同定した。
【００８３】
その結果、以下の配列（配列番号４〜１２）を有する9種類のペプチドが検出された。
AACYDCGTSVWR（配列番号４）
AACYDCGTSVWRDAGSACR（配列番号５）
AKDVALVYNECYAR（配列番号６）
DVALVYNECYAR（配列番号７）
LLAATAEYAAGDIAR（配列番号８）
LLAATAEYAAGDIARK（配列番号９）
GCLEGLVAR（配列番号１０）
WWDTFPANVDGAR（配列番号１１）
SEVYPFYTGAPMVVLRE（配列番号１２）
【００８４】
これらはいずれもイネゲノムにおいてNM_001060670として登録されている遺伝子がコードするタンパク質に含まれる配列であることが分かった。NM_001060670が示す遺伝子の塩基配列を配列番号２に、この遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸配列（258個のアミノ酸）を配列番号１に示す。
【００８５】
NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質は、水稲野生種のオリザ・ブラギアンサ（Oryza brachyantha）由来のシステインリッチレセプターライクプロテインキナーゼ (Cysteine-rich receptor-like protein kinase, XM_006657742) やオリザ・サティバ・ジャポニカグループ（Oryza sativa Japonica Group）（ジャポニカ米）由来のセリン/スレオニンキナーゼ (Serine/threonine kinase, AP005156) と推測されるタンパク質と高い相同性を有していた。しかしながら、
（１）NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質は258個のアミノ酸から形成されているのに対して、オリザ・ブラギアンサ由来のシステインリッチレセプターライクプロテインキナーゼは661個のアミノ酸から形成され、またオリザ・サティバ・ジャポニカグループ由来のセリン/スレオニンキナーゼは609個のアミノ酸から形成されており、NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質がこれらのタンパク質とは異なるタンパク質であることは明白であること、
（２）オリザ・ブラギアンサ由来のシステインリッチレセプターライクプロテインキナーゼやオリザ・サティバ・ジャポニカグループ由来のセリン/スレオニンキナーゼなどとの高い相同性にもかかわらず、これらのタンパク質は、アミノ酸配列を元に形成した系統樹において、NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質とは分岐していたこと、
（３）相同性を示すタンパク質はシステインリッチレセプターライクプロテインキナーゼと推測されるのに対して、NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質はセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) に結合すること、
などの理由から、NM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質は、アミノ酸配列の相同性から推測される機能とは全く異なる機能を有する新規なタンパク質であることが明らかとなった。
【００８６】
次いで、NM_001060670が示す遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を更にブラスト検索した結果、本発明者等は、これと高い相同性を示す、上記とは異なる数種のタンパク質を見出した。これらをClastalWを用いて相同性配列を作製し、GENETYX のプログラムを用いて系統樹を作製した結果、図２に示すように、構成するアミノ酸の数および相同性から、NM_001060670が示す遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有することが想定されるタンパク質として、ウラルツコムギ（Triticum urartu）由来のKD114170、タルホコムギ（Aegilops tauschii）由来のKD518572、イネ（Oryza sativa）由来のAL731589、AY576676、NM_001058980、及びNM_001059001が示す遺伝子がコードするタンパク質が存在することを見出した。これらのタンパク質のいずれも、細菌由来のタンパク質における多糖結合部位を認識することは全く知られていない。
【００８７】
これらの遺伝子がコードするタンパク質の立体構造モデルを図３に示す。図３から明らかなように、これらのタンパク質は非常に類似した立体構造を有するものであり、同様の機能を有することが強く示唆される。また、7種のタンパク質のうちの5種がイネ由来、2種がコムギ由来であることも非常に興味深い知見である。
【００８８】
図４に、NM_001060670、KD518572およびKD114170がコードするタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。これらのタンパク質はアミノ酸配列の相同性が高く、またタンパク質のサイズも類似していることがわかる。KD518572がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を配列番号１３および１４、KD114170がコードするタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を配列番号１５および１６にそれぞれ示す。
【００８９】
［実施例２］
多糖結合部位認識タンパク質の単離および同定
イネ（４葉）の葉を回収し、液体窒素中で粉砕した後、Superscript III First-strand synthesis System(Invitrogen)を用いて、cDNAを合成した。cDNAからDNAプライマー (5'-ATGGCGCGGT GCACTTTGCTCGTTCTC-3'(配列番号１７)と5'-CTCACGCAGCACCACCATCGGGGCGCC-3'(配列番号１８))、GXL DNA polymerase(Takara-Bio)を用いて、PCRによりNM_001060670の遺伝子を増幅してNM_001060670の遺伝子を得た。
【００９０】
ヒトインフルエンザヘマグルチニン（Human influenza hemagglutinin: HA）タグを付与したNM_001060670の遺伝子を含むpVXベクターをアグロバクテリウムに導入し、25℃で栽培したニコチアーナ・ベンサミアーナ（Nicotiana benthamiana、6-8葉）にアグロバクテリウムを注入して、4日後にニコチアーナ・ベンサミアーナの葉を回収した。NM_001060670の遺伝子がコードするタンパク質が発現すると、HAタグが付与されているため、HAタグを認識する抗体により検出することができる（図５）。
【００９１】
NM_001060670が示す遺伝子がコードするタンパク質を生産しているニコチアーナ・ベンサミアーナの葉をリン酸バッファー (100 mM, pH 7.0) 中で破砕し、遠心分離 (15,000 rpm, 5分) により上清の可溶性タンパク質を回収した。
【００９２】
一方、イネいもち病菌由来のヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼII、および多糖結合部位を持たないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054) 遺伝子の3'末端にヒスチジンタグを付加し、それぞれイネいもち病菌に導入して、イネいもち病菌においてこれらのタンパク質を作製した。
【００９３】
いもち病菌への遺伝子導入法は、MPG1P プロモーターの下流にヒスチジンタグを付加したセロビオヒドロラーゼII遺伝子を配置し、PEG法を用いていもち病菌に導入した（Takahashi et al., Appl. Environ. Microbiol., 76, 6583-6590, 2010）。
【００９４】
イネいもち病菌を宿主として作製したヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼIIおよび多糖結合部位を持たないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054)は、それぞれヒスチジン結合樹脂を用いて実施例１と同様にして回収した。
【００９５】
上記のようにして得られた可溶性タンパク質と、ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) または多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼとを、リン酸バッファー（100 mM, pH7.0）存在下において混合し、4℃で15分間静置した。その後、混合液にヒスチジン結合樹脂を加え、4℃で15分間震盪した。
【００９６】
次に、ヒスチジン結合樹脂に結合したタンパク質と非結合タンパク質とをSDS-PAGEにより分離した後、メンブレンにタンパク質を転写し、ヒスチジンタグ(A)またはHAタグ(B)に対する抗体（Penta-His HRP Conjugate (Qiagen)及びAnti-HA High Affinity (Roche)）を用いて抗原抗体反応を行った。
【００９７】
図５に示すように、HAタグを付加したNM_001060670が示す遺伝子がコードするタンパク質は、単独ではヒスチジン結合樹脂には結合しない(レーン1)。一方、HAタグを付加したNM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質とヒスチジンタグを付加したセロビオヒドロラーゼII (XM_360146) を混合した場合、ヒスチジン結合樹脂の結合タンパク質には、HAタグを付加したNM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質(B)とヒスチジンタグを付加したセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)(A)が含まれていた（レーン2）。また、HAタグを付加したNM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質とヒスチジンタグを付加した多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼIIを混合した場合、ヒスチジン結合樹脂の結合タンパク質には多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼII(A)のみ検出された（レーン3）。HAタグを付加したNM_001060670が示す遺伝子がコードしているタンパク質と多糖結合部位を持たないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054) を混合した場合には、ヒスチジン結合樹脂の結合タンパク質には多糖結合部位を持たないセロビオヒドロラーゼII (XM_362054)(A)のみが検出された（レーン4）。
【００９８】
これらの結果から、NM_001060670が示す遺伝子がコードするタンパク質は、多糖結合部位を認識し、結合することが明らかである。
【００９９】
［実施例３］
多糖結合部位認識タンパク質を用いた多糖結合部位を有するタンパク質の単離
ヒスチジンタグを付与した多糖結合部位認識タンパク質遺伝子をユビキチンプロモーター下に配置したプラスミドベクターをアグロバクテリウムに導入した。
【０１００】
イネ（ササニシキ）の種子を滅菌した後、C1 培地において置床し、30℃、5日間、暗所で培養することによりカルス化を誘導した。イネカルスをアグロバクテリウムと混合し、K2培地に広げ、25℃、3日間、暗所に静置した。回収したイネカルスを洗浄バッファーでアグロバクテリウムを除去した後、カルベニシリン (400μg/ml) とハイグロマイシン (50μg/ml) を含むK2培地に置床し、30℃、10日間培養した。その後、イネカルスをカルベニシリン (300μg/ml) とハイグロマイシン (50μg/ml) を含むK2培地に置床し、遺伝子導入体を選抜した。使用した培地の組成を以下に示す。
【０１０１】
C1 (1Lあたり)
N6-1-アラニン     20 ml
N6-2              50 ml
N6-3               1 ml
N6-4              10 ml
N6-ビタミン        1 ml
スクロース       3.75 g
カザミノ酸        0.3 g
プロリン        2.878 g
2,4-D (100 mg/L)  20 ml
ゲランガム          3 g
(pH 5.8)
K2 (1Lあたり)
N6-1-アラニン    20 ml
N6-2             50 ml
N6-3              1 ml
N6-4             10 ml
N6-ビタミン       1 ml
スクロース      3.75 g
グルコース        10 g
カザミノ酸       0.3 g
2,4-D (100 mg/L)  20 ml
ゲランガム         3 g
(pH 5.2)
【０１０２】
多糖結合部位認識タンパク質をコードする遺伝子をイネのカルス細胞に導入し、イネのカルス細胞において多糖結合部位認識タンパク質を発現させた。この際、多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子の3'末端にヒスチジンタグを付加した。
【０１０３】
イネのカルス細胞において発現されたヒスチジンタグを付加した多糖結合部位認識タンパク質は、実施例１および２と同様にして、ヒスチジンタグ結合樹脂を用いて精製した。
【０１０４】
一方、播種後3週間のイネ幼葉の粉砕物を含む液体培地において、イネいもち病菌を25℃で4日間培養した後、液体培地に含まれる分泌タンパク質を硫酸アンモニウム(60％)沈殿法により回収した。
【０１０５】
ヒスチジンタグを付加した多糖結合部位認識タンパク質と、イネいもち病菌由来の分泌タンパク質とを混合し、4℃で15分間静置した。その後、混合液にヒスチジン結合樹脂を加え、4℃で15分間震盪した。
【０１０６】
ヒスチジンタグ結合樹脂に結合したタンパク質をSDS-PAGEにより分離した後、銀染色を行った。ヒスチジンタグを付加した多糖結合部位認識タンパク質以外のタンパク質をSDS-アクリルアミドゲルから切り出して回収し、LC/MS/MSによりペプチドの解析を行った結果、配列番号４〜１２に示す配列のペプチドであった。
【０１０７】
その結果、図６に示すように、多糖結合部位を有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、エンドグルカナーゼ (XM_365863)、キシラナーゼ (AY124591)、セロビオースデヒドロゲナーゼ (XM_003710939)が検出された。
【０１０８】
上記の通り、ヒスチジンタグを付加した本発明の多糖結合部位認識タンパク質は、粗タンパク質標品中の多糖結合部位を有するタンパク質と複合体を形成する。多糖結合部位認識タンパク質に付加したヒスチジンタグを利用して、多糖結合部位認識タンパク質と複合体を形成しているタンパク質を回収することができた。
【０１０９】
上記の方法において利用できるタグは、ヒスチジンタグのみではなく、HAタグやc-Mycタグ、FLAGタグなどの当分野で利用され得るあらゆるタグを利用することが可能である。
【０１１０】
［実施例４］
多糖結合部位認識タンパク質を用いたセロビオヒドロラーゼ活性の阻害
イネ由来の多糖結合部位認識タンパク質と、セロビオヒドロラーゼII (XM_360146)、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼII、または多糖結合部位を有さないセロビオヒドロラーゼ(XM_362054)とを混合した後、4℃で15分間静置した。その後、リン酸バッファー（最終濃度 100 mM, pH6.0）と基質となるセルロース（最終濃度0.5％）を加えた反応液(100μL)を37℃で5時間震盪した。
【０１１１】
分解産物である糖量を測定するため、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（最終濃度 0.5％）を0.5 N HClに溶解した後、0.5 N NaOHを加えた溶液を作製した。
【０１１２】
反応液を遠心分離 (10,000 rpm、5分)した後、上清を50μL回収し、0.5％ p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド溶液を150μL加えた。混合液を100℃、5分静置した後、分光光度計を用いて410 nmの吸光度を測定した。
【０１１３】
その結果、図７および図８(A) に示すように、多糖結合部位認識タンパク質を混合することにより、セロビオヒドロラーゼII (XM_362054) の分解活性は最大50％減少した。一方、多糖結合部位を除去したセロビオヒドロラーゼIIおよび多糖結合部位を有さないセロビオヒドロラーゼ (XM_362054) の分解活性への影響は認められなかった。
【０１１４】
［実施例５］
多糖結合部位認識タンパク質を用いたエンドグルカナーゼ活性の阻害
多糖結合部位認識タンパク質とエンドグルカナーゼ (XM_365863)とを混合した後、4℃で15分間静置し、その後、リン酸バッファー（最終濃度 100 mM, pH6.0）と基質となるカルボキシメチルセルロースまたはセルロース（最終濃度0.5％）を加えた反応液 (100μL) を加え、37℃で5時間震盪した。コントロールとして、多糖結合部位認識タンパク質の代わりに同量のウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。
【０１１５】
実施例４と同様に、反応液を遠心分離 (10,000 rpm、5分)した後、上清を50μL回収し、0.5％ p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド溶液を150μL加えた。混合液を100℃、5分静置した後、分光光度計を用いて410 nmの吸光度を測定した。
【０１１６】
その結果、図８(B)および(C)に示すように、エンドグルカナーゼ(XM_365863)のカルボキシメチルセルロースに対する分解活性(B)は多糖結合部位認識タンパク質の影響をほとんど受けなかったが、セルロースを基質として用いた時(C)には多糖結合部位認識タンパク質との混合により、分解活性は最大40％減少した。
【０１１７】
［実施例６］
多糖結合部位認識タンパク質を用いたキシラナーゼ活性の阻害
多糖結合部位認識タンパク質とキシラナーゼ (AY124591)とを混合した後、4℃で15分間静置し、その後、リン酸バッファー（最終濃度 100 mM, pH6.0）、基質となる水可溶性のキシランまたはキシランを含むコムギ細胞壁画分（最終濃度0.5％）を加えた反応液 (100μL)を加え、37℃で5時間震盪した。コントロールとして、多糖結合部位認識タンパク質の代わりに同量のウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。
【０１１８】
基質調製のために、暗所、25℃で栽培したコムギの子葉鞘を液体窒素で粉砕した後、熱水で10分間処理した。遠心分離(10,000 rpm、5分)により沈殿画分を回収した後、水で3度洗った。次に、37℃、5時間のアミラーゼ処理を行い、遠心分離 (10,000 rpm、5分) により沈殿画分を回収した後、水で3度洗った。これにより得られた沈殿画分をコムギ細胞壁画分として用いた。
【０１１９】
実施例４と同様に、反応液を遠心分離 (10,000 rpm、5分)した後、上清を50μL回収し、0.5％ p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド溶液を150μL加えた。混合液を100℃、5分静置した後、分光光度計を用いて410 nmの吸光度を測定した。
【０１２０】
結果を図８(D)および(E)に示す。キシラナーゼ(AY124591)の分解活性は、水可溶性のキシランに対しては約30％減少した(D)。また、キシランを含むコムギ細胞壁画分を基質として用いた時(E)には、多糖結合部位認識タンパク質との混合により、活性は最大60％減少した。
【０１２１】
［実施例７］
多糖結合部位認識タンパク質を用いた酵素・基質複合体形成の阻害
ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)のみ、またはヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質とヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)との混合液を、4℃で15分間静置した。次いで、BSA(1％)を含むリン酸バッファー（100 mM, pH 6.0）で1時間処理したセルロース (最終濃度0.5％)を加え、この反応液(100μL)を4℃で1時間撹拌した。
【０１２２】
反応液を遠心分離 (10,000 rpm、5分) により上清画分と沈殿画分に分け、それぞれの画分のタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。この際、沈殿画分はSDS-PAGEサンプルバッファーで熱処理した後、遠心分離 (10,000 rpm、5分)により得られた可溶性画分をSDS-PAGEに供した。その後、メンブレンにタンパク質を転写した後、ヒスチジンタグに対する抗体を用いて、抗原抗体反応を行った。
【０１２３】
その結果、図９に示すように、多糖結合部位認識タンパク質が存在しない場合（レーン1）、ヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼは上清画分には検出されず、全てが沈殿画分に存在していた。つまり、セロビオヒドロラーゼは基質であるセルロースに結合した状態で沈殿画分に存在した。一方、ヒスチジンタグを有する多糖結合部位認識タンパク質とヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼを混合した場合（レーン2）には、一部のセロビオヒドロラーゼはセルロースに結合していたが、大部分のセロビオヒドロラーゼは上清画分に存在した。
【０１２４】
これらの結果は、多糖結合部位認識タンパク質がセロビオヒドロラーゼと結合することにより、セロビオヒドロラーゼが基質であるセルロースに結合することが出来なくなることを示している。
【０１２５】
［実施例８］
多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現誘導
イネ葉（3葉）にいもち病菌を含む溶液（3 X 105 spores/ml）を噴霧し、接種1-4日後にイネ葉を回収した。イネ葉からtotal RNAを抽出した後、cDNAを合成した。作製したcDNAを用いてリアルタイムPCRにより多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現を決定した。リアルタイムPCRにおいて、多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子を5'-CGTTCGACATCACGCTGGAG-3'（配列番号１９）と5'-GAACGGGTACACCTCCGACC-3'（配列番号２０）のDNAプライマー対を用いて増幅した。また、標準サンプル（コントロール）としてユビキチン遺伝子(D12629)を、5'-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3'（配列番号２１）と5'-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3'（配列番号２２）のDNAプライマー対を用いて増幅した。
【０１２６】
その結果、図１０(A)に示すように、イネいもち病菌感染1日後に多糖結合部位認識タンパク質遺伝子の発現レベルが急激に増加し、その後、徐々に減少した。
【０１２７】
また、イネ葉にイネいもち病菌処理、サリチル酸（1.5mM）処理 (SA)、ジャスモン酸（0.1mM）処理 (JA)、セロビオース（1.5mM）処理 (C2)、キチンオリゴ糖（キトヘキサオース、90μM）処理、低温(10℃)処理、または物理的障害（葉の先端１cmを切り取る）処理、を行い、１日後にイネ葉を回収した。回収したイネ葉を用い、上記と同様にリアルタイムPCRにより多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現を決定した。
【０１２８】
その結果、図１０(B)に示すように、イネいもち病菌の接種により、多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現レベルが大幅に増加した。また、キチンオリゴ糖（キチンヘキサオース）処理により未処理サンプルより高い遺伝子発現レベルが認められた。一方、抵抗性因子を誘導することが知られているサリチル酸やジャスモン酸などによる多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現誘導は認められなかった。
【０１２９】
［実施例９］
多糖結合部位認識タンパク質の合成誘導および蓄積
イネいもち病菌の感染1-4日後のイネ葉、および未感染イネ葉を液体窒素中で破砕し、リン酸バッファー (100 mM, pH7.0)中に懸濁した。懸濁液を遠心分離 (15,000 rpm、5分) した後、上清を回収し、イネ抽出タンパク質とした。イネ抽出タンパク質とヒスチジンタグを有するセロビオヒドロラーゼII (XM_360146)とを加えた混合液を、4℃で1時間撹拌した。次いで、実施例１および２と同様にして、ヒスチジンタグ結合樹脂を用いて精製し、銀染色を行った。さらに、検出されたタンパク質のバンドをLC/MS/MSにより解析を行った。
【０１３０】
その結果、図１１に示すように、イネいもち病菌が感染していない葉（レーン5）では多糖結合部位認識タンパク質が認められなかったが、イネいもち病菌感染1-4日後の葉（レーン1-4）において、矢印で示す特異的なタンパク質のバンドが検出された。検出されたタンパク質のバンドは、LC/MS/MSにより多糖結合部位認識タンパク質であることが確認された。
【０１３１】
リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析の結果から、イネにおける多糖結合部位認識タンパク質の遺伝子発現はイネいもち病菌感染1日後に高いレベルであったが、その後減少した。一方、多糖結合部位認識タンパク質は少なくともイネいもち病菌感染4日後まで存在し、機能していることが推察された。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明により、従来報告されていないメカニズムによる植物病原菌抵抗性向上剤を提供することができる。
【０１３３】
また、本発明により、粗タンパク質標品から、水不溶性の多糖基質を効率的に分解出来る多糖結合部位を有する多糖分解酵素を容易に得ることが出来る。
【０１３４】
更に、本発明のタンパク質を高レベルに発現するトランスジェニック植物は、植物病原菌に対する抵抗性が向上したものである。
【０１３５】
一方、菌類が生産している多糖分解酵素の大部分は多糖結合部位を有していないことが知られている。例えば、トリコデルマ属が生産している多糖分解酵素のほとんどは多糖結合部位を有していない。このことは、トリコデルマ属の生産する多糖分解酵素に多糖結合部位を有する多糖分解酵素を添加することや、遺伝子操作を用いて多糖結合部位を有する多糖分解酵素を生産するトリコデルマ属を創出することにより、植物の細胞壁多糖をより効率的に分解する酵素標品を作製することが出来る。この目的を達成するためには、分解力の高い多糖結合部位を有する多糖分解酵素を選抜することが必要となる。このような植物の細胞壁多糖を効率的に分解する多糖結合部位を有する多糖分解酵素の単離およびその利用は、植物の細胞壁多糖の分解により得られるオリゴ糖や単糖（グルコースやキシロースなど）などの生産性を向上させることが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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