(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸及び非標的核酸を含有する母集団から標的ヌクレオチドを濃縮し、かつ標的ヌクレオチドにアダプターを連結するための方法であって、ここで標的核酸は標的ヌクレオレオチド及び非標的ヌクレオチドを含み、非標的核酸は標的ヌクレオチドを含まず、
（ａ）溶液中で、前記母集団および標的単離プローブを合わせるステップであって、標的単離プローブは、親和性結合ドメインを含む、ステップ；
（ｂ）標的単離プローブの一本鎖領域を、前記母集団中における、標的ヌクレオチドの全部または一部のみとハイブリダイズさせるステップ；
（ｃ）標的単離プローブを捕捉ドメインと結合させることによって、前記母集団から、ステップ（ｂ）でハイブリダイズされた標的ヌクレオチドを選択的に固定化し、そして非結合材料を除去することにより、標的ヌクレオチドを濃縮するステップ；
（ｄ）前記ハイブリダイズされた標的ヌクレオチドが選択的に固定化された後、１種以上の３’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、標的ヌクレオチドの３’末端から非標的ヌクレオチドを除去して、標的ヌクレオチドの特定された読み取り開始点で平滑末端を形成するステップ、及び
（ｅ）アダプターの５’末端を、前記標的ヌクレオチドの３’末端に連結するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
母集団中の標的核酸及び非標的核酸の一部または全部が反復配列を含む領域を含有し、（ａ）が、反復配列とハイブリダイズする除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを、前記母集団と合わせるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）が、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを選択的に分解するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）における標的単離プローブの一本鎖領域が、標的ヌクレオチドの第１の部分とハイブリダイズする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標的単離プローブの末端が、標的ヌクレオチドの３’末端部もしくは５’末端部、またはそれに近接する部分と二重鎖を形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）に続いて、第２のプローブの一本鎖領域を、標的ヌクレオチドの第２の部分にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
第２のプローブが、標的単離プローブ付近の、標的単離プローブに近接するまたは標的単離プローブから遠位の標的ヌクレオチドの一部とハイブリダイズする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２のプローブの末端が、標的ヌクレオチドの５’末端または３’末端の両方でなくどちらかに位置するまたはそれに近接する、前記標的ヌクレオチドの第１又は第２の部分と二重鎖を形成する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
標的単離プローブおよび第２のプローブのハイブリダイゼーションが標的ヌクレオチドの３’末端および５’末端で起こるように、標的単離プローブが、標的ヌクレオチドの一方の末端でハイブリダイズし、第２のプローブが、標的ヌクレオチドの反対側の末端とハイブリダイズする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
親和性結合ドメインが、標的単離プローブの３’末端に位置する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
親和性結合ドメインが、標的単離プローブの３’末端と５’末端との間に位置する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
４〜１０ヌクレオチドのランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを、母集団中の核酸とハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項１から３、４、５、１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的単離プローブまたは標的ヌクレオチドの５’部分に位置する第２のプローブがフラッププローブであり、ここで前記フラッププローブは一本鎖領域と二本鎖領域を有し、前記フラッププローブの一本鎖領域のみが標的ヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｆ）１種以上の５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的ヌクレオチドを標的ヌクレオチドの５’末端から除去するステップをさらに含む、請求項１から１１および１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
フラッププローブの二本鎖領域は、オリゴヌクレオチドを含むか、又は前記フラッププローブの一部が前記フラッププローブ自体とハイブリダイズしてヘアピンを形成しており、
前記方法は、前記オリゴヌクレオチドまたはヘアピンを標的ヌクレオチドの５’末端に連結するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
１種以上の３’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＴからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アダプターの二本鎖領域の３’末端を、標的ヌクレオチドの５’末端に連結するステップをさらに含む、請求項１から１１および１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ヘアピンアダプターの二重鎖領域を、標的ヌクレオチドの３’末端および標的単離プローブの５’末端に連結し、それによって標的単離プローブを標的ヌクレオチドに共有結合させるステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
５’エキソヌクレアーゼ消化後に第２のプローブが置換されるように、ポリメラーゼによって標的単離プローブの３’末端を伸長させるステップをさらに含み、ここで、前記第２のプローブは、標的核酸中の標的ヌクレオチドの５’末端領域に位置する、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
アダプターを、標的核酸中の標的ヌクレオチドの各末端に連結し、標的配列を決定するステップを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
標的ヌクレオチド中の突然変異を検出するステップをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異が、挿入、欠失またはヌクレオチド多型からなる群から選択することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的ヌクレオチド中の突然変異を生物の表現型の変異と相関させるステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的単離プローブの一本鎖領域が、標的ヌクレオチドの３’末端および５’末端の両方とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
親和性結合ドメインが、標的単離プローブの３’末端または５’末端の間であるが標的単離プローブの３’末端でも５’末端でもない位置で標的単離プローブと結合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｆ）１種以上の５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、非標的ヌクレオチドを標的ヌクレオチドの５’末端から除去するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
標的単離プローブがフラッププローブであり、前記フラッププローブは、一本鎖領域の３’末端から伸長される二本鎖領域を有するフラッププローブである、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アダプター分子を標的ヌクレオチドの３’末端に連結するステップをさらに含む、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
アダプター分子を標的ヌクレオチドの５’末端に連結するステップをさらに含む、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
アダプターが、シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位、ユニークサンプル識別子およびユニーク分子識別子のうち少なくとも１つを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）抽出物から核酸サンプルを得るステップ；
（ｂ）請求項１の方法によって、標的ヌクレオチドを濃縮し、そして前記標的ヌクレオチドをアダプターに連結するステップ；および
（ｃ）濃縮された標的ヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、動物または植物の抽出物を分析する方法。
【請求項３２】
（ｃ）において決定されたヌクレオチド配列が、３’末端において５つ未満の非標的ヌクレオチドを含むか、または（ｃ）において決定されたヌクレオチド配列が、標的ヌクレオチドの少なくとも９０％を構成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｂ）が、標的ヌクレオチドの３’末端および５’末端に配置された１つ以上のアダプターとハイブリダイズするプライマーを用いて、濃縮された標的ヌクレオチドを増幅するステップをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
標的ヌクレオチドの特徴を原核生物または真核生物の表現型と相関させるステップをさらに含む、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
標的単離プローブはフラッププローブであり、ここで前記フラッププローブは一本鎖領域と二本鎖領域を有し、前記フラッププローブの一本鎖領域のみが標的ヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、癌（Ｄａｎｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、４８巻：４０９−４２０頁（２０１２年）；Ｄａｗｓｏｎら、ＮＥＪＭ、３６８巻：１１９９−１２０９頁（２０１３年））、心筋症（Ｍｅｄｅｒら、Ｃｉｒｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｇｅｎｅｔ．、４巻：１１０−１２２頁（２０１１年）；Ｎｏｒｔｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｉｏｌ、２７巻：２１４−２０頁（２０１２年））、遺伝性の障害（Ｂｏｙｃｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４巻：６８１−６９１頁（２０１３年））、出生前診断（Ｎｅｐｏｍｎｙａｓｈｃｈａｙａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．、５１巻：１１４１−５４頁（２０１３年）；Ｐａｐｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４巻：４６頁（２０１２年））および神経学的障害（Ｎｅｍｅｔｈら、Ｂｒａｉｎ、１３６巻：３１０６−１８０頁（２０１３年））を含めた、多くの疾患の診断および治療において貴重なツールであることが判明している。しかしながら、ＮＧＳによれば数日以内にヒトゲノム全体のシークエンシングが可能になるが、シークエンシングの費用およびデータ分析の負担は、診療所にとって全ゲノムシークエンシングの翻訳の大きな妨げとなる。結果として、標的配列を濃縮することによって、ＮＧＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ、（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｒｏｃｈｅ／ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ））、マルチプレックスＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｋａｉｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ））、分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）（Ｈｉａｔｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２３巻、８４３−５４頁（２０１３年））、高並列ＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ｒａｉｎｄａｎｃｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））および単一プライマー増幅法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ／ＡｒｃｈｅｒＤｘ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、ＮｕＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ））に頼る分子診断を容易にすることが望ましい。
【０００２】
濃縮のための現行法としては、作成されたＤＮＡライブラリーからのハイブリダイゼーション捕捉（Ａｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：９０３−９０５頁（２００７年）；Ｏｋｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：９０７−９０９頁（２００７年））が挙げられる。ハイブリダイゼーション捕捉は、一連の固定化されたプローブを必要とする。理論上では、溶液中の断片化された核酸は、相補的配列を有する場合、これらの固定化されたプローブとハイブリダイズする。二重鎖の両方の鎖が捕捉できることを除いて、これらの方法は、溶液ハイブリダイゼーションの場合と同様の欠点がある。しかしながら、これらの方法のさらなる欠点は、ハイブリダイゼーション前にプローブが表面に結合される場合、ハイブリダイゼーションの効率が下がることを含む。さらなる欠点としては、２から３日の長時間を要するプロトコール、試験の費用を増大させる複数のステップ、大量の初期投入ＤＮＡ（１μｇから５μｇ）の必要性；ライブラリーのサイズ分布が広範であること、特異性が５５％から６５％にすぎないこと、８０％の＋／−２００から５００塩基対（ｂｐ）および反復を捕捉することができないことまたは非標的配列内の反復配列を含有する核酸を取り扱うことができないことが含まれる。
【０００３】
現行法は、標的の末端における人工配列に依存することから、読み取り開始点（核酸分子のシークエンシングが開始される位置）を特定するのに適していない。さらに、現行法は、両方の標的ストランドを捕捉するのに適していない。本ハイブリダイゼーション法は、通常、Ｓａｋｈａｒｋａｒら、Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻：３８７−３９３頁（２００４年）で記載されている通り、２００ｂｐ未満であるエクソン上の平均サイズを超える核酸フラグメントを捕捉することから、結果的に読み取り開始点を具体的に定義できずに実質的に非標的のシークエンシングになる。ハイブリダイゼーションに基づくエクソーム捕捉技術の性能比較は、Ｃｌａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻：９０８−９１４頁（２０１１年）によって総論されている。
【０００４】
マルチプレックスＰＣＲは、ハイブリダイゼーションを捕捉するための代替法である。マルチプレックスＰＣＲ法はかなり速く、濃縮前にライブラリーの調製を必要としないが、プライマーの相互作用のために反応ごとの拡張性が制限され、異なる効率で増幅するプライマーの組を使用することから生じる増幅バイアスにより標的全体にわたって増幅の均一性が一定せず、重複をフィルターできず、さらに増幅産物の末端上に、標的のアニーリングに用いられたプライマー配列の付加分が含まれる。シークエンシング中、これらの配列を一通り読まざるを得ないため、それによってシークエンシングの時間および費用が増加する。さらに、合成プライマーの配列は、標的配列だけでなく配列レポートにも含有されるため、不必要な配列の複雑性をもたらす。分子反転プローブおよび高並列ＰＣＲはどちらも、マルチプレックスＰＣＲにより遭遇する問題の一部を解決しているが、両方法ともはるかに高額である。分子反転プローブは長鎖のオリゴヌクレオチド上で合成する必要があることから、高並列ＰＣＲ法に伴う装置費用が生じる。さらにどちらの方法も、増幅産物の末端に合成プライマー配列を導入する。シングルプライマー法は、増幅産物の末端の一方のみにプライマー配列を導入することからプライマー配列の量を半分に減らせるが、２つのプライマーを用いて正確な標的配列を濃縮することにより適用される追加の選択性を犠牲にする。その結果、拡張性、特異性および均一性が高いオフターゲットまたはプライマー領域のシークエンシングを最小限にする標的の濃縮方法は依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄａｎｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、４８巻：４０９−４２０頁（２０１２年）
【非特許文献２】Ｄａｗｓｏｎら、ＮＥＪＭ、３６８巻：１１９９−１２０９頁（２０１３年）
【非特許文献３】Ｍｅｄｅｒら、Ｃｉｒｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｇｅｎｅｔ．、４巻：１１０−１２２頁（２０１１年）
【非特許文献４】Ｎｏｒｔｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｉｏｌ、２７巻：２１４−２０頁（２０１２年）
【非特許文献５】Ｂｏｙｃｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４巻：６８１−６９１頁（２０１３年）
【非特許文献６】Ｎｅｐｏｍｎｙａｓｈｃｈａｙａら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．、５１巻：１１４１−５４頁（２０１３年）
【非特許文献７】Ｐａｐｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４巻：４６頁（２０１２年）
【非特許文献８】Ｎｅｍｅｔｈら、Ｂｒａｉｎ、１３６巻：３１０６−１８０頁（２０１３年）
【非特許文献９】Ｈｉａｔｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２３巻、８４３−５４頁（２０１３年）
【非特許文献１０】Ａｌｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：９０３−９０５頁（２００７年）
【非特許文献１１】Ｏｋｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：９０７−９０９頁（２００７年）
【非特許文献１２】Ｓａｋｈａｒｋａｒら、Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻：３８７−３９３頁（２００４年）
【非特許文献１３】Ｃｌａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻：９０８−９１４頁（２０１１年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般に、核酸の母集団から標的配列を濃縮するための方法および組成物が提供される。本方法は、溶液中で、核酸の母集団および標的単離プローブを合わせるステップ（標的単離プローブは、親和性結合ドメインを含む。）；標的単離プローブの一本鎖領域を、核酸の母集団中の標的配列の全部または一部とハイブリダイズさせるステップ；標的単離プローブを捕捉ドメインと結合させ、非結合材料を除去することにより、標的配列を含有する母集団からハイブリダイズされた核酸を選択的に固定化するステップおよび１種以上の３’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって、標的配列の３’末端から非標的配列を除去するステップを含む。
【０００７】
様々な態様において、母集団中の核酸の一部または全部は、反復配列を含有し、核酸の母集団は、標的単離プローブの前でまたは標的単離プローブと共に反復配列とハイブリダイズする除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドと合わせることができる。過量の除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを用いるおよび二重鎖変性ステップ後にハイブリダイゼーションが可能になると有利になり得る。次いで、核酸／除去可能なオリゴヌクレオチド二本鎖中の除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’非標的配列の３’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼとの分解と同時にまたは分解前に、選択的に分解することができる。除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドの分解は、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドがＲＮＡである場合、ＲＮＡｓｅによって行うことができるまたは例えば、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドが複数のウラシルを含有するＤＮＡである場合、ウラシルデグリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）およびエンドヌクレアーゼによって行うことができる、または除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを特異的に切断するための任意の他の適当な技法によって行うことができる。
【０００８】
様々な態様において、前述の標的単離プローブの一本鎖領域は、標的配列の３’末端および５’末端の両方とハイブリダイズすることができる。こうした状況下において、親和性ドメインは、標的単離プローブの３’末端または５’末端の間であるが、標的単離プローブの３’末端でも５’末端でもない場所に位置する部位で標的単離プローブと好ましく結合される。標的配列とのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの適度に厳密な条件下において標的単離プローブの長さに従って行うことができる。これらの条件により、これらの方法の使用が一塩基変異多型を検出することである場合、個別の塩基対ミスマッチを、予測可能なように生じさせることが可能である。あるいは、ハイブリダイゼーションは、様々な供給源から得られた選択された標的配列に特徴的であり得る挿入または欠失に起因して生じる可能性があるミスマッチの重要な内部領域を有する標的単離プローブの末端で生じる可能性もある。標的配列／標的単離プローブが、親和性ドメインと固定化された捕捉ドメインとの結合により固定化され、３’非標的配列が除去された後または１種以上の３’エキソヌクレアーゼを用いて除去されるのと同時に、５’非標的配列は、１種以上の５’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼによって標的配列の５’末端から除去することができる。アダプターを連結するのに適した平滑末端または付着末端を生成するため、標的配列の３’末端および５’末端でエキソヌクレアーゼを消化した後、標的配列が、表現型的に重要な配列多様性について容易に同定し、単離し、増幅し、配列決定し、特徴付けるおよび／または分析することができるように、アダプターを標的配列に連結させる。
【０００９】
本方法の態様は、標的単離プローブの異なる立体配置を利用し、本明細書に記載した第２のプローブと併せて用いることができる。プローブに関係なく、本方法のいくつかの共通の特徴によって、すなわち、親和性ドメインに結合される標的単離プローブとの母集団中の核酸のハイブリダイゼーションが維持され、その後、標的単離プローブが固定化される場合に行われる濃縮の第１のステップにより、ハイブリダイズしない核酸および試薬を洗浄し、次いで、エキソヌクレアーゼ消化による３’非標的配列を除去することにより取り除くことが可能になる。
【００１０】
本方法の一態様において、標的単離プローブは、フラッププローブ（ｆｌａｐ  ｐｒｏｂｅ）であってもよく、このフラッププローブは、一本鎖領域の３’末端から伸長する、ハイブリダイズしない二本鎖領域を有する。ハイブリダイズしない二本鎖領域は、プローブの一本鎖領域の３’末端上において一方の鎖の５’末端で連結することができるまたは一本鎖プローブの一部となることができ、そこにハイブリダイズしない二本鎖領域において第２の鎖を構成する、３’−５’オリゴヌクレオチドがアニールされる。あるいは、ハイブリダイズしない二本鎖領域は、折りたたまれ、それ自体とハイブリダイズされて二本鎖領域を形成する一本鎖プローブの３’末端でヘアピンから形成され得る。フラッププローブを標的配列の５’末端とハイブリダイズした後、５’非標的配列は、５’フラップエンドヌクレアーゼ消化によって除去することができ、３’−５’オリゴヌクレオチドまたはヘアピンは、５’アダプターとして働くようにニッキングステップ後に標的配列の５’末端に連結させることができる。３’アダプターは、標的配列の３’末端に連結させることができる。３’および５’アダプターは、シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位、独特なサンプル識別子および独特な分子識別子配列の１つ以上をそれぞれ含有することができる。
【００１１】
本方法の他の態様において、標的単離プローブの一本鎖領域は、標的配列の第１の部分とハイブリダイズする。例えば、標的単離プローブの末端は、標的配列の３’末端もしくは５’末端の位置におけるまたはそれに近接する配列を有する二本鎖を形成する。標的単離プローブ付近の、標的単離プローブに近接するまたは標的単離プローブから遠位の位置で標的配列の第２の部分への第２のプローブの一本鎖領域のハイブリダイゼーションが、さらに可能になり、この位置は、標的単離プローブと反対側にある標的配列の末端を定義する第２のプローブを示す。一態様において、第２のプローブは、標的配列中のヌクレオチドの９０％、７０％、５０％、３０％、または１０％の非ランダム配列を有し、同様に、標的単離配列は、標的配列の１０％、３０％、５０％または７０％または９０％のヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
本方法の態様において、３’標的単離プローブ上の親和性ドメインは、標的単離プローブの３’末端内または３’末端の位置にあるが５’末端を除くいずれかに位置することができ、一方、５’標的単離プローブ上の親和性ドメインは、標的単離プローブの５’末端内または５’末端の位置にあるが３’末端を除くいずれかに位置することができる。
【００１３】
本方法の態様において、標的単離プローブが、標的配列の一部と、例えば、標的配列の３’末端でハイブリダイズする場合、長さが４から１０ヌクレオチドの範囲であるランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができ、このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ拡張のためのプライマーとして働いて、アダプター連結に適した二重鎖の５’末端を創出する。
【００１４】
本方法の他の態様において、標的単離プローブまたは標的配列の５’部分に位置する第２のプローブは、ハイブリダイズする一本鎖領域および一本鎖領域の３’末端から伸長するハイブリダイズしない二本鎖領域を有する前述のものと類似のフラッププローブである。５’非標的配列は、５’エキソヌクレアーゼ消化によって除去されて、直鎖のプローブが標的配列の５’末端で用いられる場合、標的配列へのアダプター連結または５’フラッププローブが用いられる場合、５’フラップエンドヌクレアーゼへのアダプター連結に適した平滑末端または付着末端を生成することができる。ブロッキング部分、例えば、修飾されたヌクレオチドを生成して、アダプターを標的単離プローブまたは第２のプローブに連結させないようにする。５’末端のエキソヌクレアーゼ消化が、５’非標的配列よりも多くまたは少なく除去する場合、付着末端を充てんする追加のステップは、５’アダプターの連結前に用いることができる。
【００１５】
前述の方法の態様のいずれかにおいて、３’アダプター、場合によって５’アダプターは、ヘアピンアダプターであってもよい。ヘアピンアダプターの使用は、さらなる利点をもたらし、標的配列の末端を定義する標的単離プローブまたは第２のプローブは、ヘアピンアダプターの一方の末端に共有結合することができ、標的配列は、ヘアピンアダプターのもう一方に共有結合される。変性条件下で、一本鎖核酸は、標的配列のプライムド増幅を開始するために利用可能なアダプター配列によって生じる。
【００１６】
本方法の一態様において、標的単離配列の３’末端は、５’エキソヌクレアーゼを消化した後に５’プローブを置換するために、ポリメラーゼによって伸長することができる。
【００１７】
本方法の態様において、アダプターは、標的配列の各末端および直接または増幅後に配列決定される標的配列に連結される。シークエンシング反応中の読み取り開始点は、標的配列の３’末端の位置においてまたはその近接で行われ、標的配列をわかりにくくするまたは標的配列における重大な突然変異をわかりにくくするプライマーの心配もなく、標的配列中で各ヌクレオチドのシークエンシングを可能にする方式で、標的配列の５’末端の位置においてまたはその近接で終了される。突然変異の例には、挿入、欠失、またはヌクレオチド多型もしくは一塩基変異多型の１つ以上が含まれる。このようにして、突然変異と生物の表現型との相関は、忠実に記録することができる。
【００１８】
標的配列の一方の末端または両方の末端で非標的配列を除去するため、非標的配列の不必要なシークエンシングおよび分析は回避される。一般に、抽出物から核酸サンプルを得るステップ；前述した標的配列を濃縮するステップ；および濃縮された標的分子のヌクレオチド配列を得るステップを含めた、動物または植物の抽出物を分析するための方法が提供される。一態様において、濃縮された標的分子から得られたヌクレオチド配列は、３’末端における５より少ない非標的ヌクレオチド；または標的配列の少なくとも９０％を含む。シークエンシング前に、標的配列は、標的配列の３’末端および５’末端に配置されるアダプター内に位置する配列とハイブリダイズするプライマー配列を用いて増幅することができる。標的配列が得られてから、これを用いて、原核生物または真核生物による変更された表現型との配列変化の相関を確立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】標的の選択および濃縮のための方法を示す概要図である。（１）は、一本鎖核酸または熱によって変性された二重鎖核酸の１本の鎖を示す。（２）は、（１）とハイブリダイズされる、標的単離プローブの３’末端および５’末端の間であるが、３’末端および５’末端でない位置で、親和性ドメイン
【化１】
0006441893.tif 000002
に、共有結合した標的単離プローブを示す。ここで、標的単離プローブは、標的核酸配列の全長とハイブリダイズされる。標的単離プローブは、エキソヌクレアーゼ分解、連結および／またはポリメラーゼ拡張を防止するための３’末端および５’末端のどちらか一方または両方における修飾を含んでいてもよい。修飾としては、以下に示すもの、すなわち逆方向塩基対；炭素リンカー；ホスホロチオエート連鎖；およびジデオキシヌクレオチドのうちの１つ以上を挙げることができる。さらに、内部修飾は、１つ以上のｄＵまたは１つ以上のリボヌクレオチドなど、標的単離プローブの増幅を妨げるために含むことができる。（３）は、捕捉ドメイン
【化２】
0006441893.tif 000003
への（２）の結合を示す。捕捉ドメインに結合されない核酸は、洗浄することにより除去される。（４）は、標的分子／標的単離プローブ二重鎖の３’末端および５’末端の両方で二本鎖の平滑末端を生じる、１種以上の３’および５’一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼによる消化の産物に対応する。３’および５’の消化は、一緒にまたは連続して行うことができる。消化後、酵素および緩衝液は、洗い流される。（５）は、アダプターが標的配列の各末端に連結している標的核酸を示す。標的単離プローブへの連結は遮断される。ここで用いられるアダプターは、ＤＮＡ標的用のＴ４  ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡ標的用のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２などのＲＮＡリガーゼを用いて、末端に連結されるＮＧＳプラットフォーム−特異的アダプター；一塩基オーバーハング（一塩基によって伸長された３’末端への連結、例えば、ＤＮＡ標的におけるクレノウ（エクソ−）を用いたｄＡの付加など）を含有するアダプター；ユニーク配列が標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの３’末端および５’末端に特異的に付加することができるような、切断可能部位を有するＹ構造もしくはヘアピンアダプター；完全に相補的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）アダプター、または連結接合部と反対側の末端における一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オーバーハングを有するｄｓＤＮＡアダプターとなり得る。これらのアダプターは、ジデオキシヌクレオチド、逆方向ヌクレオチドまたは標的単離プローブへの連結および／もしくはコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を回避するような、標的核酸への連結を目的としないアダプター終端上での５’リン酸の非存在など、１つ以上の修飾を含有することができる。標的ＤＮＡの３’末端に連結するアダプター鎖は、連結用の５’−リン酸を含有することができる。あるいは、このアダプター鎖は、プローブの３’末端およびそのアダプターの５’末端が修飾されないで連結を妨げる場合、５’−リン酸を欠くことができる。このような場合には、アダプター配列は、プローブをアダプターに連結した後、ニックトランスレーションによって標的の３’末端に付加することができる。次いで、非連結アダプター、酵素および緩衝液は、洗い流される。一方または両方のアダプターは、標的配列を生じさせる核酸サンプルを同定するためのユニークＤＮＡ配列（ＵＩＤ）または１種以上の核酸サンプルが引き出される個別の生物を同定するためのバーコードを含有することができる。ＵＩＤｓおよび／またはバーコードを使用すると、サンプルのバリデーションが容易になり、多重化する反応の同定（６）は、固体担体からの溶離後、アダプターに連結された標的分子の、場合によるＰＣＲ増幅の産物に対応する。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲが用いられる場合、ＰＣＲプライマーは、追加の配列、例えば、シークエンシングプラットフォームによって必要とされる配列を加えることも、アダプターに相補的な配列を単に含有することもできる。あるいは、アダプターに連結された標的分子が、捕捉ドメインに順番に結合される親和性ドメインによって固定化される場合、固定化された標的分子は、溶液中での固形もしくは半固形基質から��溶離を必要とせず、増幅反応に直接加えることができる。次いで、得られたライブラリーは、定量化され配列決定することができる。
【図２Ａ】図１に記載の標的の選択および濃縮のための方法についての変形法を示す図である。（７）から（１１）は、図１中の（１）から（３）の続きである。（７）は、親和性ドメインを有する標的単離プローブが、捕捉ドメインに付着し、続いて結合している、一本鎖核酸または熱によって変性されたランダム核酸フラグメントの１本の鎖を示し、３’非標的核酸は、３’二本鎖の平滑末端を残す、１種以上の３’一本鎖のＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼによって消化されている。消化後、酵素および緩衝液は、洗い流され；次いで、３’アダプターは、３’末端に付加される（８）。アダプターの構造は、（５）について記載したものと同じである。（９）は、標的核酸の５’末端で二本鎖の平滑末端または標的核酸が陥凹されるまたはオーバーハングを示す末端を残す、１種以上の５’一本鎖のＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼによる消化の産物を示す。消化後、酵素および緩衝液は、洗い流される。標的分子の一部が付着末端を含有する場合、これらの末端は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるプローブの３’末端の伸長または消化によって平滑末端化することができる。標準的なデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、伸長のために用いることができ、または１種以上の修飾されたヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、例えば、デオキシウラシル三リン酸（ｄＵＴＰ）を含有する混合物は、その後、任意の伸長された配列を消化するために用いることができる。平滑末端化した後、酵素および緩衝液は、洗い流される。上記（５）について記載された５’アダプターは、標的分子（１０）の５’末端に連結されて、上記（６）について記載されたＰＣＲ（１１）を可能にする。別法として、図２Ａに示される方法は、５’一本鎖核酸を除去し、まず５’アダプターを連結し、その後、３’一本鎖核酸を除去し、３’アダプターを連結することにより行うことができる。
【図２Ｂ】図１に記載の標的の選択および濃縮のための方法についての変形法を示す図である。図１に示した標的の選択および濃縮のための方法の変形法を示す図である。（１２）は、（１）からの続きであり、フラッププローブである親和性ドメインに共有結合されたフラップ標的単離プローブを示し、標的単離プローブの３’末端は、標的に相補的ではなく、ＮＧＳプラットフォーム−特異的アダプター配列の一部または全部を含有する二本鎖ＤＮＡ領域を含有する。この二本鎖領域は、標的単離プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーション前、ハイブリダイゼーション中またはハイブリダイゼーション後に、標的単離プローブの一本鎖領域の３’末端を、ＮＧＳアダプター配列に相補的な第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより創出することができる。あるいは、標的単離プローブは、切断可能部位を有するヘアピンを形成させてまたはそこに連結させて、アダプター配列の一部または全部に架かる二本鎖領域を生成することができる。二本鎖領域の３’末端は、標的単離プローブの３’末端を終結させ、または標的単離プローブ中に１つ以上の前の塩基を伸長させる。親和性ドメインは、ヘアピンプローブの３’末端を除いて、標的単離プローブ内の任意の位置に配置することができる。（１２）の分子は、捕捉ドメイン（１３）において固定化される。（１４）は、図２Ａに記載の通り達成されるアダプター連結前の３’非標的核酸の消化の産物を示す。標的分子上の５’一本鎖ＤＮＡは、ＦＥＮ−１などのフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、標的核酸とベイトの二重鎖領域の間でニックを生じる。このニックは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼと連結される。（１５）は、図１に示される通り、標的の、場合によるＰＣＲの産物を示す。
【図２Ｃ】図１に記載の標的の選択および濃縮のための方法についての変形法を示す図である。図１に記載の方法の変形法を示す図である。標的単離プローブに連結することができない３’アダプター（例えば、図１に記載されているアダプターを参照のこと）は、（４）の３’末端に連結されて（１６）を生成する。（１７）は、３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ジデオキシヌクレオチドなどの修飾を阻害する連結を除去し、続いて、３’アダプターを伸長して平滑末端を形成し、固定化された標的単離プローブから標的を放出することができる、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるアダプターの３’末端の伸長産物を示す。標準的なデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、伸長のために用いることができる、またはｄＵＴＰなどの１つ以上の修飾されたＮＴＰを含有する混合物は、その後、任意の伸長された配列を消化するために用いることができる。伸長後、酵素および緩衝液は、洗い流される。（１８）において、５’アダプター（例えば、図１を参照のこと）は、（１７）の５’末端に連結される。
【図３】１つのプローブとして標的単離プローブを利用し、第２のプローブとして小さい多様な（ランダムな）オリゴヌクレオチドを利用する標的の選択および濃縮のための２つのプローブ法を示す図である。（１９）は、より大きい核酸の機械的もしくは酵素的フラグメント化により得られた熱によって変性されたフラグメントの１本の鎖となり得る一本鎖核酸を示す。（２０）は、標的配列の３’末端とハイブリダイズされ、親和性ドメインに共有結合された３’標的単離配列であり、親和性ドメインは、標的単離プローブの５’末端でない位置に配置される。標的単離プローブは、エキソヌクレアーゼ分解、連結および／またはポリメラーゼ拡張を防止するために３’末端上での修飾を含むことができる。修飾の例には、逆方向塩基対、炭素リンカー、ホスホロチオエート連鎖およびジデオキシヌクレオチドが含まれる。標的単離プローブは、ホスホロチオエート連鎖などのエキソヌクレアーゼ分解を防止するための、５’末端における修飾を含むことができる。さらに、内部修飾は、例えば、１つ以上のｄＵまたは１つ以上のリボヌクレオチドなど、プローブの増幅を防止するために含むことができる。（２１）は、捕捉ドメインへの（２０）の固定化を示す。捕捉ドメインに結合されない核酸は、洗浄によって除去される。（２２）は、標的核酸／標的単離プローブ二本鎖の３’末端上に二本鎖の平滑末端を残す、３’一本鎖のＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼによる消化の産物である。消化後、酵素および緩衝液は、洗い流される。（２３）は、３’標的配列および標的単離プローブの５’末端に共有結合された切断可能部位（Ｘ）を有するヘアピンアダプターを示す。（２４）は、（２３）の標的核酸の５’領域とハイブリダイズされたランダムオリゴヌクレオチドを示す。（２５）は、平滑末端を形成するためのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるランダムプライマーの３’末端の伸長の産物である。標準的なデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、伸長のために用いることができ、または、ｄＵＴＰなどの、１種以上の修飾されたｄＮＴＰを含有する混合物は、その後、任意の伸長された配列を消化するために用いることができる。平滑末端化後、酵素および緩衝液は、洗い流される。（２６）は、５’アダプターを付着させる（２５）である（例えば、図１に記載された通り）。（２７）は、（２６）の増幅産物である。
【図４】２つのプローブを利用する標的の単離および濃縮のための方法を示す図であり、第２のプローブは、非ランダム配列を有する。（２８）は、（１９）から（２３）の産物であり、第２のプローブは、ランダム配列を有する４から１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの代わりに、標的核酸の５’部分とハイブリダイズされる。５’プローブは、ホスホロチオエート連鎖などのエキソヌクレアーゼ分解を防止するための５’末端上での修飾を含むことができる。さらに、内部修飾は、例えば、１つ以上のｄＵまたは１つ以上のリボヌクレオチドなど、プローブの増幅を防止するために含むことができる。（２９）では、５’非標的核酸は、１種以上の５’一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼにより除去され、その後、第２のプローブの３’末端を場合により伸長または消化している。（３０）は、５’アダプターの（２９）への付加を示す。（３１）は、（３０）の増幅産物に対応する。代替の態様において、図４に記載される方法は、第１に、標的核酸の５’部分における親和性ドメインを含有する５’標的単離配列のハイブリダイゼーションを用いて行い、その後、非結合プローブの捕捉および除去、５’非標的配列を除去するための５’エキソヌクレアーゼ消化、標的核酸の３’部分への第２の３’プローブのハイブリダイゼーション前の５’アダプターの連結および１種以上の３’エキソヌクレアーゼを用いた非標的配列の除去を行うことができる。
【図５Ａ】図４に記載の２つのプローブ法の変形法を示す図である。ステップ（１９）から（２３）によって開始され、その後、ステップ（２８）から（２９）へ続く方法を示す。（３２）は、標的核酸配列の３’末端に連結されたアダプターを有する標的核酸に対応する。標的核酸は、３’標的単離プローブとハイブリダイズされ、親和性ドメインは、標的単離プローブ内であるが、３’末端または５’末端でない場所で共有結合される。３’標的単離プローブは、ホスホロチオエート連鎖などのエキソヌクレアーゼ分解を防止するための３’および／または５’末端上での修飾を含むことができる。内部修飾は、１つ以上のｄＵまたは１つ以上のリボヌクレオチドなど、標的単離プローブの増幅を防止するために含むことができる。（３３）は、５’プローブを置換し、５’アダプターが連結される平滑末端を創出する、（３２）中の３’標的単離プローブの伸長の産物を示す。（３５）は、増幅の産物を示す。
【図５Ｂ】図４に記載の２つのプローブ法の変形法を示す図である。２つのプローブを使用した標的の選択および濃縮のための方法における変形法を示す図である。  ステップ（１９）から（２３）の後、（３５）は、（２３）に対応しており、親和性ドメインを有さない、（図２Ｂに記載されている）フラッププローブは、標的領域の５’末端とハイブリダイズされる。（３６）は、（３５）に対応しており、ＦＥＮ−１などのフラップエンドヌクレアーゼによる標的分子上での５’一本鎖核酸の切断後、標的核酸とプローブの二本鎖領域の間でニックを生じる。（３７）では、（３６）中のニックは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼと連結される。（３７）は、溶離後の標的核酸の産物増幅である。５Ｂの変形法には、図２Ｂに記載されている通り、親和性ドメインを含有する５’標的単離プローブのハイブリダイゼーション、その後のフラップエンドヌクレアーゼによる５’一本鎖核酸の捕捉および除去ならびに親和性ドメインが欠失した３’標的単離プローブのハイブリダイゼーション前のニックの連結、３’一本鎖核酸の除去および３’アダプターの連結が含まれる。
【図５Ｃ】図４に記載の２つのプローブ法の変形法を示す図である。２つのプローブを使用した標的の選択および濃縮のための方法についての変形法を示す図である。  （３８）は、（１９）の産物であり、親和性ドメインを含有する３’標的単離プローブおよび５’プローブの両方または３’プローブおよび親和性ドメインを含有する５’標的単離プローブの両方が単一の反応中に標的核酸配列とハイブリダイズされる。（３９）では、標的単離配列上の親和性結合ドメインは、標的配列を固定化する捕捉ドメインに結合する。（４０）は、標的核酸／標的単離プローブ二重鎖の３’末端および５’末端の両方において二本鎖の平滑末端を残す、３’および５’一本鎖のＤＮＡエキソヌクレアーゼまたはＲＮＡエキソヌクレアーゼによる消化の産物である。３’および５’消化は、一緒にまたは連続して行うことができる。消化後、酵素および緩衝液は、洗い流される。（４１）は、３’および５’アダプターが付加されている（４０）である。（４２）は、（４１）の増幅産物である。
【図６】３’平滑末端化の効率を示すＡＢＩシークエンサーについてのフラグメント分析を示す図である。図６Ａは、３’−ビオチン化プローブとハイブリダイズされ、ストレプトアビジンビーズに結合し、２０ｎｔの３’オーバーハングを形成する５’−ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチドを模式的に示す図である。図６Ｂは、フラグメント分析のためのＡＢＩシークエンサーから得られたクロマトグラムにおける対応するピークを示す図である。図６Ｃは、３’ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ処置後の平滑末端化された５’−ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチドを模式的に示す図である。図６Ｄは、図１Ｃに対応するピークを示す図であり、単一のピークが平滑末端化されたＤＮＡの存在と相関する。
【図７】３’−ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを用いて、５’平滑末端化の効率を示すＡＢＩシークエンサーについてのフラグメント分析を示す図である。３’−ＦＡＭ−標識オリゴは、５’−ビオチン化プローブとハイブリダイズされ、ストレプトアビジンビーズに結合されて、２０ｎｔの５’オーバーハングを形成する。５’ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼによりインキュベーションし、その後、ビーズを洗浄して酵素を除去した後、ＦＡＭ−標識オリゴは、ＮａＯＨ中で溶離され、フラグメント分析のためのＡＢＩシークエンサーにおいて実行される。図７Ａおよび図７Ｂは、出発材料を示す図である。図７Ｃおよび図７Ｄは、オーバーハングの消化の結果を示す図であり、図中、平滑末端ｄｓＤＮＡ、４−塩基オーバーハングおよび８−塩基オーバーハングに相関する３つのピークが示されている。
【図８】血小板由来増殖因子α受容体遺伝子（ＰＤＧＦＲＡ）中のエクソンの捕捉を示す図である。ビオチン化標的特異的プローブは、剪断されたＪｕｒｋａｔゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）とハイブリダイズされた。標的配列は、ストレプトアビジンビーズへの結合によって捕捉され、その後、ＢＷ緩衝液中で洗浄した。プローブの５’末端が標的の３’末端を定義したように、３’エキソヌクレアーゼを添加して、ｇＤＮＡ二重鎖である、プローブのｇＤＮＡ３’を除去した。３’ｄＡ−テーリングおよびアダプター連結後、ランダムプライマーは、ハイブリダイズされ、伸長されて、５’平滑末端を形成し、その後、５’アダプターを連結させた。ライブラリーは、ＰＣＲによって増幅され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（登録商標）系（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において配列決定された。プラス鎖およびマイナス鎖上での、固定された３’末端およびランダム５’末端によるＰＤＧＦＲＡ標的の捕捉を示す。
【図９】線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子（ＦＧＦＲ２）中のエクソンの捕捉を示す図である。ビオチン化標的特異的プローブは、剪断されたＪｕｒｋａｔ  ｇＤＮＡとハイブリダイズされた。標的は、ストレプトアビジンビーズへの結合によって捕捉され、その後、結合洗浄（ＢＷ）緩衝液中で洗浄した。３’エキソヌクレアーゼを加えて、３’非標的ｇＤＮＡを除去し、プローブの５’末端は標的の３’末端を定義した。３’ｄＡ−テーリングおよびアダプター連結後、標的特異的５’プローブは、標的配列とハイブリダイズされ、５’ｓｓＤＮＡは、平滑末端または小さい５’オーバーハングを残すエキソヌクレアーゼによって消化された。プローブは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、平滑末端を形成し、その後、５’アダプターを連結した。標的配列は、ＰＣＲによって増幅され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上で配列決定された。ＦＧＦＲ２標的配列の捕捉は、プラス鎖およびマイナス鎖上での、固定された３’末端および５’末端を用いて示される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に記載した方法および組成物は、別段の主張がない限り、本明細書に記載された特定の方法論または試薬に限定されることを意図しておらず、これらは単に例として示されるにすぎない。いくつかの態様は、説明のために、例示的な適用を参照しながら後述される。方法ステップが、当業者にとって標準的な周知の方法を含む場合、これらの方法ステップは、詳細に記載しない。本出願では、単数形の使用は、別段の具体的な記載がない限り、複数形も含む。「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」は、限定されるものではなく、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価の意味を有する。用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定されるある特定の値について許容される誤差の範囲内を意味し得るものであり、これは、いかにしてその値が測定され決定されるかに一部で依存している。ある特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、用語「約」は、別段の記載がない限り、ある特定の値について許容される誤差の範囲内を意味する。用語「近接の」は、規定された特徴部の付近もしくはその近傍の位置を意味する。例えば、プローブが標的配列の定義された末端とハイブリダイズする位置に関連して「近接の」が使用される場合、用語「近接の」は、定められた特徴から１０ヌクレオチド未満を意味し得る。用語「遠位の」は、定められた特徴に近接していないが、位置が近接であった場合であったよりも遠い部位にある位置を意味する。
【００２１】
一般に、これらの方法は、核酸サンプルから標的核酸配列を濃縮して、標的が濃縮された核酸ライブラリーを創出するために本明細書において提供される。核酸に対して「標的濃縮」という用語は、試料中のある特定の核酸種の相対濃度を高めることに関することを意図している。
【００２２】
以下の特徴の１つ以上は、本明細書に記載の濃縮方法を用いて達成することができる。二重鎖核酸の標的ストランドの両方を分析して低頻度ＳＮＰについての信頼性を増す；読み取り開始点を指定する能力、ＧＣ含有量を問わない規準化されたプローブプールの生成、反復領域を標的にする能力、標的部位の検出の全効率の改善、捕捉前の標的の喪失の回避、標的領域外のＤＮＡ損傷と無関係の標的のライブラリーの調製、標的領域に架けるための複数のプローブの必要性の低下、プローブ対間のより大きな挿入および欠失（インデル）の捕捉、最適なクラスター形成のための狭いサイズ分布内でのライブラリーの生成、標的配列中で含有される非標的塩基の百分率の低下；必要とされるシークエンシングの読み取り長さおよび必要とされる被覆度の深度の最小化、均一性の増加および濃縮についての時間の縮小および複雑性の低下ならびにハイブリダイゼーションに基づいた標的濃縮の既存の方法と比較したライブラリーの調製。
【００２３】
精製され得るが、処置されていないまたは修飾されていない核酸は、ここで核酸サンプルと称される。核酸サンプルは、標的配列もしくは標的分子が濃縮される母集団中で、核酸または核酸分子の母集団に、場合によって断片化することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「核酸サンプル」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは標的および非標的配列を含有する任意の供給源から得られたＤＮＡおよびＲＮＡ分子または配列の混合物を意味する。例えば、核酸サンプルは、人工の供給源からもしくは化学合成によって、またはウイルス、微生物を含めた原核細胞もしくは真核細胞から得ることができる。生物サンプルは、ヒトを含めたまたはヒトを除く脊椎動物、無脊椎動物、植物、微生物、ウイルス、マイコプラズマ、真菌類または古代（ａｎｃｉｅｎｔ）となり得る。生体液には、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、喀痰、精液、骨髄、針吸引物（ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）など、固形物（例えば、大便）が含まれる。真核細胞サンプルには、胚性組織、生検組織もしくは死体組織、組織、組織培養、生検、臓器または他の生物学的な、農業のもしくは環境的な供給源が含まれる。細胞は、最初、例えば、高速度の小さいビーズの使用によって物理的に破壊されもしくは分解して、または例えば、洗剤および他の界面活性剤を用いることによって化学的に破壊されもしくは分解して、核酸サンプルを得ることができる。アルコールまたは他の化学薬品は、核酸を沈殿させるために用いることができる。
【００２５】
核酸サンプルは、全ゲノム配列、ゲノム配列の一部、染色体配列、葉緑体配列、ミトコンドリア配列、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、全ゲノム増幅産物または「増幅」下で以下に挙げられる他の増幅プロトコール、すなわち、ｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）または全トランスクリプトーム配列、エクソン、ロングターミナルリピート領域（ＬＴＲ）、イントロン領域および制御配列の産物を含むことができる。これらの例は、本発明の態様に適用可能なサンプルタイプに限定されるものと解釈すべきではない。
【００２６】
核酸サンプルは、核酸の母集団を生じることもあり、母集団中の核酸分子のサブセットは、濃縮のための標的配列を含有することができる。核酸の母集団は、例えば、酵素的手段、機械的手段もしくは化学的手段を用いたランダム切断の産物；制限酵素などの酵素を用いて一般に達成される非ランダムのもしくは偏った切断の産物；切断もしくはフラグメント化が必要とされないような適切なサイズ；または環境的な損傷の産物となり得る。核酸の母集団は、標的濃縮のための標的単離プローブと組み合わせて用いられる。
【００２７】
ランダム切断は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、ＤＮＡｓｅ  ＩおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）など、または他のタイプのヌクレアーゼの単一または組み合わせを含めた、酵素的方法によって達成することができる。Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅは、時間依存性の方式でｄｓＤＮＡ切断をもたらして、１００ｂｐから８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成するエンドヌクレアーゼである。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を効率的に切断することができるセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から得られた遺伝子改変のエンドヌクレアーゼである。他の酵素的方法には、Ｖｖｎヌクレアーゼ単独またはセラチアヌクレアーゼまたはＤＮａｓｅ  Ｉまたは当技術分野の他のヌクレアーゼ、例えば、Ｓｈｅａｒａｓｅ（商標）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）またはＩｏｎ  Ｓｈｅａｒ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の使用が含まれる。ＤＮＡがフラグメント化後に変性されるため、ニッキング酵素を用いることができる。
【００２８】
化学的手段には、マグネシウムイオンまたは亜鉛イオンのフラグメントＲＮＡへの使用が含まれる。物理的手段は、例えば、超音波処理、噴霧、物理的剪断および加熱などを用いることができる。工業用の機械的剪断方法の例は、Ｃｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）によって提供されている。
【００２９】
環境的な核酸損傷は、例えば、貯蔵中もしくは老化によってまたはフラグメント化方法、例えば、化学的に誘導される切断、酵素によって誘導される切断または温度もしくは時間の適用による切断などの適用によって行うことができる。用語「損傷ＤＮＡ」は、別段の言及がない限り、任意のインデル、任意のＳＮＰ、エピジェネティックな調節を伴わない任意の修飾された塩基、標的ＤＮＡへの任意の追加の修飾を意味することを意図している。様々なタイプのＤＮＡ損傷は、参照により組み込まれるＵＳ７，７００，２８３およびＵＳ８，１５８，３８８に記載されている。ＤＮＡ損傷の例は、貯蔵された組織または細胞から単離された、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）誘導され分解されたＤＮＡである。母集団中の核酸は、より大きい核酸のフラグメントであってもそうでなくてもよい。
【００３０】
標的配列は、核酸の母集団中で行うことができる。一般に、用語「標的配列」は、科学的な、医学的なまたは農業の特別な関連性を有する核酸中の対象とする領域を意味する。「標的分子」は、プローブなどとハイブリダイズする独立した化学実体である。これらの用語は、同義的に用いられる場合もあり、これらの意味は、用語が用いられる文脈によって明らかになる。標的核酸がＤＮＡである場合、ｇＤＮＡなどの大きいＤＮＡのフラグメントは、標的配列が濃縮される核酸の母集団を部分的にまたは実質的に形成することができる。本例において、対象とする標的配列は、核酸サンプルのサブセットのみであり、したがって、濃縮することが望ましい。
【００３１】
標的配列は、核酸分子全体でも核酸分子の一部でもよい。標的配列は、エクソン配列、突然変異のまわりのひと続きの短い核酸配列、１つ以上の反復配列、ｃＤＮＡ配列、イントロン配列および制御配列のうち１つ以上を含むことができる。対象とする特徴の例には、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、遺伝子融合、コピー数多型および／またはインデルが含まれる。統計的に意義がある場合、これらの特徴は、生物学的有意性のある表現型と相関し得る。標的分子は、１つ以上の疾患に伴う配列、対象とする表現型、代謝経路の調節もしくは関連する他の核酸または他を有し得る。標的分子は、ＤＮＡ配列の連続的な領域またはＤＮＡ配列の収集物（例えば、ｃＤＮＡ配列）を含むことができる。標的分子は、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡなどとなり得る。ＲＮＡ標的分子の例には、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または長鎖の非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）が含まれる。
【００３２】
核酸の母集団中の個別の核酸は、一般に、核酸の母集団内に含有される標的配列と同じサイズまたはそれよりも大型である。母集団中の核酸のサイズまたは標的配列のサイズに関して上限はない。しかしながら、大きい分子を取り扱う効率および濃縮された標的配列を配列決定するシークエンシングプラットフォームの能力によって、サイズを限定することができる。大きい核酸中の標的配列、例えば、生検試料から得られたウイルスゲノムは、５０００ヌクレオチド（ｎｔ）の大きさになっても、１０，０００ｎｔまたはそれ以上の大きさになってもよい。標的配列の長さは、ゲノムまたは大型ｍＲＮＡにおいて生じる５００ヌクレオチド未満となり得る。例えば、標的配列が、１００ｎｔから２００ｎｔの範囲である場合、核酸の母集団の個別のメンバーは、５００ｎｔあたりとなり得る。無処置のｇＤＮＡまたはＲＮＡは、標的濃縮のための適当なサイズに断片化することができる。標的配列の長さは、フラグメントサイズを決定するための一基準である。例えば、標的配列は、完全な標的領域の捕捉を支持する長さで少なくとも１００ｂｐから１０００ｂｐまで、例えば、２００ｂｐから８００ｂｐ、例えば、３００ｂｐから７００ｂｐ、例えば、１００ｂｐから３００ｂｐまたは１００ｂｐから４００ｂｐまたは１００ｂｐから５００ｂｐとなり得る。大部分のエクソンは、２００ｂｐ未満である。本明細書に記載した方法は、修飾されたヌクレオシドを利用して、以下の特徴の少なくとも１つを達成する。他の特徴の中でもとりわけ、ハイブリダイゼーション特異性または二重鎖の安定性の増強、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、酵素切断のための部位の導入、酵素連結の阻害、酵素伸長の阻害またはポリメラーゼ増幅の防止である。
【００３３】
これらの所期の目的に従って選択される修飾されたヌクレオシドの使用の例は、表１に記載されている。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇら、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９９２年）に記載されている通り、２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル形態を含めた、天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関連して「類似体」または「修飾されたヌクレオシド」は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０年）；Ｕｈｌｍａｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３−５８４頁（１９９０年）、Ｃｒｏｏｋｅら、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、６巻：８５５−８７０頁（１９９６年）；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻：３４３−３５５頁（１９９５年）などに記載されている、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する、合成のヌクレオシドを含む。二本鎖の安定性が濃縮された、いくつかのもしくは多くの類似体を含む、プローブまたはアダプターの使用には、オリゴヌクレオチドＮ３’−→Ｐ５’ホスホルアミデート（本明細書において「アミデート」と称する）、ペプチド核酸（本明細書において「ＰＮＡ」と称する）、オリゴ−２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）および同様な化合物が含まれる。かかるオリゴヌクレオチドは、市販されており、または文献中に記載の方法を用いて合成することができる。修飾されたヌクレオシド（例えば、ｄＵまたは８−オキソ−Ｇ）を選択して、特異的な酵素（ウラシルデグリコシラーゼまたはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを有するｆｐｇ）により類似体の部位でオリゴヌクレオチドを切断することを可能にし、またはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｒＮＭＰ）により増幅を防ぐことができる。修飾されたヌクレオシドは、プローブまたはアダプターの終端に置かれて、連結を可能にすることも遮断することもできる。例えば、連結が望まれない場合、プローブまたはアダプターの５’末端またはその両方が、非リン酸化されても脱リン酸化されてもよく、３’末端がジデオキシヌクレオシド、逆方向ヌクレオシドまたは付着部分を有するまたは有さない炭素リンカーでキャッピングすることができる。リン酸塩でオリゴヌクレオチド５’末端を修飾することによって、連結が可能になる。さらに、それだけに限らないが、ジデオキシヌクレオシド、逆方向ヌクレオシドまたは炭素リンカーを含めた３’修飾は、プローブまたはアダプターに取り込まれて、ポリメラーゼによる３’伸長を防ぐことができる。アダプター、プライマー、標的単離プローブまたは第２のプローブ、例えば、１つ以上のホスホチオエート上での３’および／または５’修飾を利用して、エキソヌクレアーゼ消化を防御することができる。
【００３４】
本方法の態様における修飾されたヌクレオシドの使用の詳細な例としては、例えば、図１、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃまたは図５Ｃにおいて例示される通り、アダプターの３’末端で連結を遮断するためのジデオキシヌクレオシドの使用が含まれる。連結を遮断するための３’修飾を、図１および図５Ｃ中の標的単離プローブに加えることができる。第２のプローブにおける３’修飾は、図４および図５Ａ−Ｃに例示される通り、連結を遮断することができる。図２Ｃ中のアダプターの３’末端および図５Ａに示される標的単離プローブの３’末端でジデオキシ修飾されたヌクレオシドを付加すると、連結が阻止されるが、その後の、ＤＮＡポリメラーゼとの３’末端または３’エキソヌクレアーゼ活性を有する逆転写酵素の伸長が可能になる。さらに、親和性ドメインおよび捕捉ドメインは、標的単離配列の３’終端ヌクレオチドに付着される大きい実体である（図３、図４、図５Ｂおよび図５Ｃを参照のこと）。３’末端における親和性結合分子は、プローブ連結および伸長を防止するために別々の遮断実体として働き得る。さらに、捕捉ドメインに結合された親和性結合分子は、図３、図４および図５Ｂ−Ｃに例示される通り、アダプターの部分標的配列への連結を立体的に阻止することができる。本方法の一態様において、３’プローブは、５’エキソヌクレアーゼ処置前にアダプターに連結させることができ、したがって、５’エキソヌクレアーゼ活性から保護されるため、２つのプローブ方法において、場合によって５’リン酸化を除く５’修飾を必要としない。それに対して、増幅可能なライブラリーへのプローブの変換を防止するために、単一のプローブ法においてプローブの３’末端上での連結を防止することが望ましい。
【００３５】
標的配列の境界は、１つ以上のプローブによって好ましくは定義される。本方法は、標的単離プローブを利用し、一本鎖分子またはフラッププローブとなり得る第２のプローブをさらに含むことができる。これらの方法は、小さいランダム配列オリゴヌクレオチドおよび／または除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに利用することができる。本明細書で使用される場合、用語「プローブ」は、濃縮のために同定された標的配列の領域に相補的である、公知の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを意味する。プローブは、オリゴヌクレオチドとなり得、「オリゴヌクレオチド」は、核酸合成機により合成することが可能である長さの合成の核酸を意味する。あるいは、オリゴヌクレオチドは、天然に存在する、単離および精製された、場合によって断片化された一本鎖核酸または部分的に一本鎖および部分的に二本鎖となり得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方となり得る。
【００３６】
プローブのサイズは、標的配列と同じ長さでもそれより短くてもよい。例えば、より一般には、プローブは５００ｎｔ未満の長さであるが、１０，０００ｎｔと同じ数を含むことができる。プローブの長さの例には、１０ｎｔから２００ｎｔ、２５ｎｔから２００ｎｔ、１０ｎｔから１５０ｎｔ、１０ｎｔから１００ｎｔ、１０ｎｔから７５ｎｔまたは１０ｎｔから５０ｎｔが含まれる。プローブは、好ましくは、長さが２５ｎｔから２００ｎｔである。１回の濃縮に利用されるプローブのプールは、好ましくは、サイズが同一または類似する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「標的単離プローブ」は、定義された長さおよび配列核酸を意味し、これは合成することができる。標的単離プローブは、親和性結合分子と結合され、固形もしくは半固形の基質上またはその基質中で捕捉ドメインによって固定化することが可能である。標的単離プローブは、１つのプローブ法および２つのプローブ法において標的領域の少なくとも一方の末端を定義する。図１および図２Ａ−Ｃに記載されている１つのプローブ法において、標的単離プローブは、標的配列の両端を定義する。標的単離プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方であってもよく、１つ以上の修飾されたヌクレオシドをさらに含有することができる（例えば、表１を参照のこと）。３’標的配列とアダプターとの間の連結を可能にしながら、プローブの５’末端への二本鎖アダプターの連結を阻止するように、標的単離プローブは、５’末端においてリン酸が欠失していてもよい（例えば、図１、図２Ａ−Ｃおよび図５Ｃを参照のこと）。標的単離プローブは、二本鎖アダプターへの連結を容易にするために５’リン酸を含むことができる（例えば、図３、図４、図５Ｂを参照のこと）。標的単離プローブの３’末端を、修飾して、３’プローブ末端とアダプターの５’末端との間の連結を遮断することができる。標的単離プローブはまた、Ｔｍを増加させ、プローブの標的配列とのハイブリダイゼーションを安定化させるためにＬＮＡを含有することもできる。
【００３８】
３’標的単離プローブに結合される親和性ドメインは、３’末端または３’末端と５’末端との間であるが、好ましくは３’標的単離プローブの５’末端でない場所に位置し得る。５’標的単離プローブに結合される親和性ドメインは、５’末端または３’末端と５’末端との間であるが、好ましくは５’標的単離プローブの３’末端でない場所に位置し得る。標的単離プローブが標的配列の３’末端および５’末端の境界を定義する場合、親和性ドメインは、プローブの末端の間であり、末端でない場所に好ましくは位置する。
【００３９】
標的単離プローブが標的配列の３’末端とハイブリダイズする場合、標的配列の５’末端に相補的な配列を特徴とする第２のプローブは、標的配列の５’末端を定義するために用いることができる。あるいは、標的単離プローブが５’末端とハイブリダイズする場合、第２のプローブは、３’末端とハイブリダイズすることができる。
【００４０】
一例では、第２のプローブは、標的単離プローブが標的配列の３’末端にハイブリダイズされた後、優先的に付加され、その後、エキソヌクレアーゼ消化および標的単離プローブに相補的な配列の近傍の非標的核酸の除去が行われる。第２のプローブを標的配列にハイブリダイズする利点は、偽陽性の可能性が、記載された方式で２つの標的特異的プローブを使用することにより減ることである。あるいは、標的単離プローブおよび第２のプローブは、同時に核酸の母集団に加えることができ、それによって、標的配列の一方もしくは両方の末端における非標的核酸配列のエキソヌクレアーゼ消化前に、標的領域の３’末端および５’末端を定義する。
【００４１】
用語「フラッププローブ」は、標的核酸とハイブリダイズする一本鎖部分および一本鎖領域の３’末端から伸長するハイブリダイズしない二本鎖領域を含有する合成の核酸を意味する。図２Ｂ中で例示される１つのプローブ法において標的領域の両方の末端を定義する場合または図５Ｂ中で例示される２つのプローブ法において標的領域の５’末端を定義する場合、標的単離プローブは、フラッププローブとなり得る。フラッププローブの二重鎖３’末端は、ヘアピン構造によりまたは短い、３’−５’相補的オリゴヌクレオチドにより形成することができる。Ｆｅｎ−１などのフラップエンドヌクレアーゼは、フラッププローブの一本鎖領域の３’末端の反対側の部位で、標的の５’末端を切断し、５’非標的配列をも除去する。ニックの連結によって、３’ヘアピン配列が加わるまたはフラッププローブの３’領域に相補的なストランドが連結される。二重鎖３’領域は、標的配列の５’末端に連結される場合、アダプターとして働くことができ、アダプター、例えば、ＮＧＳプラットフォーム特異的シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位ならびに／またはサンプル同定のためのバーコードおよび／もしくはＵＩＤなどにルーチン的に取り込まれる配列要素を含むことができる。
【００４２】
前述した１つもしくは２つのプローブの使用の他に、核酸の母集団中に反復配列が存在し得る場合、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを用いることができる。用語「除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチド」は、短い核酸配列、例えば、ＲＮＡｓｅＨ消化に受け入れられるＲＮＡまたはその長さ全体を通して塩基が修飾されるＤＮＡを意味し、ブロッキング核酸は、標的または非標的配列にハイブリダイズされる間、消化されることが可能である。ブロッキングＲＮＡを用いる場合、これは、反復性の配列によって濃縮されたＤＮＡ（すなわち、ＣＯＴ−１  ＤＮＡ）からコピーされたｃＲＮＡまたは反復性ＤＮＡ配列をコード化する合成ＲＮＡに由来し得る。まれな状況において、反復領域は、標的核酸配列内に含有される。より一般には、１つの反復配列または複数の反復配列は、非標的ＤＮＡ全体を通して行われる。除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドを加熱して、変性させ、次いで冷却して、核酸の母集団とのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。標的単離プローブ、場合によって、第２のプローブとのハイブリダイゼーション後、除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨＩまたは反応混合物中に５’および／または３’エキソヌクレアーゼと場合によって合わせることができる他の適当な酵素により切断される。
【００４３】
標的単離プローブに加えておよび第２のプローブの代わりとして、長さが１０ｎｔ未満、例えば、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔまたは９ｎｔのランダム配列（ＮＮＮＮなど）を有するオリゴヌクレオチドは、標的配列の一本鎖領域とハイブリダイズすることができる。この短いオリゴヌクレオチドは、３’末端で伸長されて、そこにアダプターを連結させるのに適した平滑末端または付着末端を形成することができる。
【００４４】
標的単離プローブにおいて核酸の母集団内の標的配列を相補的配列とハイブリダイズした後、二重鎖は、固形もしくは半固形基質に結合される捕捉ドメインによって固定化することができる。固定化後、任意の非ハイブリダイズ核酸は、洗浄により除去することができ、その結果、固定化された核酸は、標的配列のために濃縮される。
【００４５】
これらの方法が、ハイブリダイゼーション温度、洗浄温度および非標的分子を排除し、標的分子を濃縮するための洗浄緩衝液の厳密さに依拠するため、非標的ＤＮＡを除去するために必要とされる洗浄ステップは、洗浄ステップが市販のハイブリダイゼーション濃縮法により使用されるという厳密さの欠如となる恐れがある。その結果、これらの方法は、プローブの厳格なＴｍ範囲を必要とし、洗浄条件は慎重に制御される。洗浄が、完全に結合されないライブラリーフラグメントを除去するために必要とされるにすぎないため、本明細書に示した方法は、プローブについてのはるかに大きいＴｍ範囲および厳密さに欠ける洗浄を許容する。本方法の高い特異性は、その後のステップにおいてエキソヌクレアーゼを用いることにより達成され、このステップは、平滑末端を創出するにすぎず、正確な標的配列がプローブとハイブリダイズされる場合、平滑末端は連結させることができる。
【００４６】
「相補的」または「実質的に相補的」は、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖の間または核酸の一本鎖領域上におけるオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーとプローブもしくはプライマー結合部位との二重鎖を形成するためにハイブリダイゼーションまたは塩基対形成を可能にする核酸分子の配列を意味する。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（もしくはＡおよびＵ）またはＣおよびＧである。１本の鎖のヌクレオチドが最適に整列され比較され、適切な、潜在的な、認識されたもしくは表現型的に意義があるヌクレオチド挿入または欠失を有し、対が他の鎖のヌクレオチドの少なくとも約５０％または少なくとも８０％、または少なくとも約９０％から９５％、より好ましくは約９８％から１００％を有する場合、２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、実質的に相補的であると言われる。あるいは、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖が、選択的なハイブリダイゼーション条件下でその補体とハイブリダイズして、安定した二本鎖を形成する場合、実質的な相補性は存在する。通常、少なくとも１４ｎｔから２５ｎｔのストレッチに対して少なくとも約６５％の相補、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約９０％の相補がある場合、選択的なハイブリダイゼーションは行われる（Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻：２０３頁（１９８４年）を参照のこと）。特異的なハイブリダイゼーションは、プローブと核サンプルの間で達成することができ、核酸サンプルおよびプローブの少なくとも一部は、一本鎖であり、ハイブリダイゼーションに利用可能である。プローブの一部は、二本鎖となり得、したがって、標的配列とのハイブリダイゼーションに利用できない。一本鎖領域は、熱変性または当技術分野で周知の他の手段によって二重鎖中でまたは二重鎖から形成することができる。
【００４７】
本方法の一態様において、標的単離プローブのハイブリダイゼーションは、好ましくは溶液中で実施される。ハイブリダイゼーション配列内のミスマッチが許容され得るという点で、ハイブリダイゼーションの条件は、比較的緩和することができる。例えば、標準的な方法、例えば、Ｔｉｑｕｉａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６６４−６７５頁（２００４年）；またはＪｏｈｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４４巻：２５９−２６４頁（２００８年）によって記載された方法などを用いることができる。さらに、ＡＴ／Ｕ塩基対、ＧＣ塩基対が優勢であるフラグメントまたは均衡した混合物はすべて、反応条件下で効率的にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、３日から３０分、例えば、１時間から１６時間に及んでもよく、温度は有意に及ぶことができ、ハイブリダイゼーションミックスは変わり得る。しかしながら、かかるハイブリダイゼーション期間は、ハイブリダイゼーション条件に応じて他の実施形態で程度の差があり得る。
【００４８】
標的核酸とハイブリダイズされた標的単離分子のハイブリダイゼーション産物は、固体もしくは半固体担体においてコーティングされてもよく、後述の固体もしくは半固体担体そのものであってもよい捕捉ドメインに親和性ドメインを結合することにより固定化される。母集団中で核酸を固定化すると、その後の、ハイブリダイゼーション、エキソヌクレアーゼ消化、アダプター連結、場合によって増幅のステップが容易になるならびに非反応物質、残留試薬および切断生成物の洗浄による除去が可能になり、それによって、相互汚染が回避され、したがって、標的配列濃縮の容易性および有効性が高まる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「捕捉ドメイン」は、親和性ドメインを結合するための固体担体（下記参照）または半固体担体（例えば、アガロースもしくはアクリルアミド）と結合される化学構造または部分を意味し、このドメインは、標的単離プローブと結合される。親和性ドメインは、ビオチン、抗原、ハプテン、修飾されたヌクレオチドまたはリガンドなどの小分子を含むことができ、この小分子は、結合することも架橋になることも可能である（例えば、直接もしくは間接的に捕捉ドメインへの、アミンチオール（ａｍｉｎｅｔｈｉｏｌ）、架橋、マレイミド架橋、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、ＺｅｎｏｎまたはＳｉｔｅＣｌｉｃｋによってさらに例示される光化学的もしくは化学的なもの）。
【００５０】
固体担体にＤＮＡを付着させることについて様々な方法が公知であり、そのうちのいずれも本発明の態様で用いることができる。これらは、担体表面への共有結合およびＤＮＡのその表面との非共有結合性相互作用（吸着、例えば、陽イオン性表面による結合）を含む。通常、共有結合性の固定化には、固体表面上の活性化された官能基（捕捉ドメイン）とのＤＮＡ（親和性ドメイン）上の活性の官能基の反応が関与する。反応性官能基の例には、アミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、チオール、ホスフィン、イソチオシアネート、イソシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボジイミド、チオエステル、ハロアセチル誘導体、塩化スルホニル、ニトロおよびジニトロフェニルエステル、トシレート、メシレート、トリフレート、マレイミド、ジスルフィド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、カルボニルジイミダゾール、エポキシド、アルデヒド、アシル−アルデヒド、ケトン、アジド、アルキン、アルケン、ニトロン、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールならびにボロネートが含まれる。かかる反応の例には、アミドを形成するアミンと活性化されたカルボキシ基との間の反応、チオエーテル結合を形成するチオールとマレイミドとの間の反応、１，３−双極性環化付加反応を行うアジドとアルキン誘導体との間の反応、アミンとエポキシ基との間の反応、活性化されたビス−ジカルボン酸誘導体のタイプの添加された二官能性リンカー試薬と反応させ、２つのアミド結合を生じるアミンと別のアミン官能基との間の反応または当技術分野で公知の他の組み合わせが含まれる。他の反応、例えば、ＵＶによって媒介される架橋結合の反応などは、ＤＮＡの固体担体への共有結合のために用いることができる。
【００５１】
官能基は、固体担体のために用いられる材料中に本来存在し得るまたは官能基は適当な材料で担体を処置するまたはコーティングすることにより形成することができる。官能基はまた、固体担体表面を適切な化学薬品と反応させることにより導入することもできる。本明細書で使用される場合、活性化は、結合剤の表面へのカップリングを可能にするための固体担体表面への官能基の修飾を意味する。本明細書で使用される場合、固体担体は、任意の固体（軟質または硬質の）材料を含むことを意味し、固体担体上で、ＤＮＡを捕捉するおよび固定化することが望ましい。
【００５２】
固体担体は、生物学的、非生物学的、有機、無機となってもその組み合わせとなってもよく、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、切片、フィルム、プレート、スライドの形態となってもよく、平ら、円板、球形、円などを含めて、任意の都合がよい形状を有する。固体担体の表面は、様々な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカに基づいた材料、炭素、金属、無機ガラス、膜などから構成することができ、ただし表面は官能基を支持することができる。都合がよい固体担体の例は、例えば、ガラススライド、マイクロタイタープレートおよび適当なセンサー要素などのガラス表面、特に（例えば、ビーズの形態の）置換基のついたポリマー、化学修飾された酸化物（ｏｘｉｄｉｃ）表面、例えば、二酸化ケイ素、五酸化タンタルもしくは二酸化チタン、または化学修飾された金属表面、例えば、金もしくは銀などの貴金属表面、銅またはアルミニウム表面、磁気表面、例えば、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏおよびそれらの酸化物、量子ドット、例えば、ＩＩＩ−Ｖ（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＩｎＰもしくはＩｎＡｓ）またはＩＩ−ＶＩ（ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅもしくはＣｄＴｅ）半導体、またはＬｎドープ処理したフッ化物ナノ結晶、希土類によりドープ処理した酸化物ナノ物質である。
【００５３】
「固体担体」は、１つ以上の表面が硬質もしくは半硬質である材料または材料のグループを意味する。いくつかの実施形態において、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされた溝などを用いて、異なる化合物についての合成領域を物理的に分離することが望まれ得るが、固体担体は、固体担体の少なくとも１つの表面が実質的に平らとなり得る。あるいは、固体担体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的な立体配置となり得る。ビーズの例には、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ＭＡＣＳ（登録商標）ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、抗体結合型ビーズ（例えば、抗免疫グロブリンミクロビーズ）、タンパク質Ａ共役型ビーズ、タンパク質Ｇ共役型ビーズ、タンパク質Ａ／Ｇ共役型ビーズ、タンパク質Ｌ共役型ビーズ、オリゴｄＴ共役型ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンミクロビーズ、抗蛍光色素ミクロビーズおよびＢｃＭａｇ（商標）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）カルボキシ末端磁気ビーズが含まれる。標識された核酸を担体に付着させるステップは、複数のポリヌクレオチドにビオチンを付着させるステップおよび１つ以上の磁気ビーズをストレプトアビジンでコーティングするステップを含むことができる。
【００５４】
固体担体表面は、ポリマーの層と共に提供することができる。このような場合では、ポリマーは、官能基を運搬して活性化させる。ポリマーは、化合物の任意の適当なクラス、いくつかを述べるだけだが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミド、多糖類、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドから選択することができる。担体表面へのポリマーの付着は、当業者に容易に明らかである様々な方法によって実施することができる。例えば、トリクロロシリル基またはトリスアルコキシ基を有するポリマーは、基質表面上でヒドロキシル基と反応させて、シロキサン結合を形成することができる。金表面または銀表面への付着は、ポリマー上においてチオール基を介して行うことができる。あるいは、ポリマーは、アルカンチオールの自己組織化単分子層などの中間体種によって付着させることができる。したがって、選択されるポリマーのタイプおよびポリマーを表面に付着するために選択される方法は、基質表面に付着させるための適当な反応性を有するポリマー、特に、ＤＮＡへの非特異的な吸着に関するポリマーの特性に依存する。官能基は、ポリマーにおいて存在することも、単一の官能基または複数の官能基を付加することによりポリマーに付加することもできる。場合によって、スペーサーアームを用いて、結合ＤＮＡに柔軟性を与え、固体担体による立体障害が最小限になるようにその環境と相互作用させることを可能にすることができる。
【００５５】
固体担体の表面に核酸を固定化するために、表面において活性化された官能基は、事前定義された領域のみ、あるいは表面全体に存在することができ、ＤＮＡ分子中に存在する官能基と選択的に反応される。時間、温度、ｐＨ、溶媒、添加剤等を含めた、必要な反応条件は、特に、用いられる特定の種に依存し、それぞれの特定の状況のための適切な条件は、当業者に容易に明らかである。オリゴヌクレオチドは、合成されて所望の官能基を取り込むことができる。個別のヌクレオチドは、所望の反応性をもたらすために、官能基の任意のタイプを用いて、化学的にもしくは酵素的に修飾することができる。この化学的もしくは酵素的な機能付与は、ＤＮＡ分子に伸長させることができる。
【００５６】
生物学的材料による表面の機能付与は、ＤＮＡを固体担体に付着させるために用いることもできる。固体担体、例えば、マイクロプレートは、バインダー、例えば、抗体（もしくは抗体フラグメント）または別の親和性バインダー、例えば、ストレプトアビジンを用いて修飾することができる。その場合には、ＤＮＡ分子は、対応する親和性リガンド、例えば、ビオチンを用いて修飾され、別の親和性バインダー、例えば、抗体は、生体分子の配列の部分を認識する。本明細書で使用される場合、バインダーは、例えば、タンパク質もしくはそれらのフラグメントなどのポリペプチド；核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその相補的ストランドで塩基対形成を行うことができるその誘導体を含めた、特異的な結合対のメンバーである、任意の媒介物を意味する。バインダーの例には、細胞膜のためのアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、抗原決定基、ホルモンおよびホルモン受容体、ステロイド、ペプチド、酵素、基質、補助因子、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、タンパク質、糖タンパク質、細胞、細胞膜、オルガネラ、細胞の受容体、ビタミン、ウイルスエピトープおよび免疫グロブリン、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。結合対の例には、ビオチン−ストレプトアビジン／アビジン、ハプテン／抗原−抗体、炭水化物−レクチンまたは当業者に公知の他のものが含まれる。
【００５７】
ＤＮＡを固体担体に共有結合させる特異的な結合対の追加の例は、例えば、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）／ＡＧＴおよびベンジルグアニン誘導体（米国特許第７，９３９，２８４号、米国特許第８，３６７，３６１号、米国特許第７，７９９，５２４号、米国特許第７，８８８，０９０号および米国特許第８，１６３，４７９号）またはピリミジン誘導体（米国特許第８，１７８，３１４号）、ＣＬＩＰ−ｔａｇ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）／ＡＣＴおよびベンジルシトシン誘導体（米国特許第８，２２７，６０２号）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）およびクロロアルカン誘導体（Ｌｏｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、３５６巻：１９５−２０８頁（２００７年））、セリン−β−ラクタマーゼおよびβ−ラクタム誘導体（国際特許出願公開第２００４／０７２２３２号）である。このような例において、ＤＮＡは、ベンジルグアニン、ピリミジン、ベンジルシトシン、クロロアルカンまたはβ−ラクタム誘導体でそれぞれ官能性をもたせることができ、続いて、ＳＮＡＰ−ｔａｇ／ＡＧＴ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ／ＡＣＴ、ＨａｌｏＴａｇまたはセリン−β−ラクタマーゼを用いて修飾された固体担体中で捕捉することができる。あるいは、ＤＮＡは、ＳＮＡＰ−ｔａｇ／ＡＧＴ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ／ＡＣＴ、ＨａｌｏＴａｇまたはセリン−β−ラクタマーゼに特異的にまたは非特異的に付着することができ、続いて、ベンジルグアニン、ピリミジン、ベンジルシトシン、クロロアルカンまたはβ−ラクタム誘導体でそれぞれ官能性をもたせた固体担体中で捕捉することができる。ＤＮＡを固体担体に共有結合させる特異的な結合対のさらなる例は、アシル担体タンパク質およびそれらの修飾（バインダータンパク質）であり、これらは、シンターゼタンパク質（米国特許第７，６６６，６１２号）により補酵素Ａ（バインダー基質）から得られたホスホパンテテイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｈｅｔｅｉｎｅ）サブユニットに結合される。ＤＮＡを固体担体に都合よく結合させるタンパク質またはそれらのフラグメントの例は、例えば、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、糖タンパク質、トランスグルタミナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼａｌ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ、Ｓ−タグ、Ｈｉｓ−タグおよび当業者に公知の他のものである。通常、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはそのフラグメントは、特異的な結合対の一部であり、固体担体に共有結合もしくは非共有結合された、パートナーに特異的に結合することが可能である分子を用いて修飾される。
【００５８】
標的ＤＮＡが、前述した通り固定化され、１種以上の適当な３’一本鎖のＤＮＡエキソヌクレアーゼ、例えば、３’エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＴなどは、非標的ＤＮＡを除去して標的ＤＮＡの特定された読み取り開始点で平滑末端を形成するために加えることができる。「読み取り開始点」は、核酸分子のシークエンシングが開始する位置を意味する。シークエンシング読み取りの開始点は、１種以上のヌクレアーゼを用いて一本鎖核酸を消化して、プローブで平滑末端を形成し、次いで、シークエンシングプライマー部位が標的核酸配列に即時隣接するように、アダプターを連結させることにより生成することができる。その結果、選択されたプローブ配列は、読み取り開始点を定義する。好ましくは、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性がない平滑末端二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）末端を形成することができる一本鎖の３’エキソヌクレアーゼである。一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）などのアクセサリータンパク質は、加えられることができる。クレノウエクソ−およびｄＡＴＰを加えて、３’末端でｄＡ末端部を形成することができる。ｄＡ−テーリングステップは、Ｔ−オーバーハング３’アダプターと共に用いるための任意選択であり、平滑末端アダプターに必要とされない。ｄＡテーリングの場合、用いられる酵素、その濃度、インキュベーション時間および温度は重要ではない。しかしながら、酵素は、ｄＡなどの単一の鋳型にされないヌクレオチドを、Ｔ−オーバーハングアダプターのためのｄｓＤＮＡの３’末端に加えるべきである。
【００５９】
５’エキソヌクレアーゼを用いて、５’非標的一本鎖核酸を除去することができる。５’エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼを不活性化するために熱変性温度を必要とする場合、再ハイブリダイゼーションステップは、プローブを鋳型に再ハイブリダイズするために加えられることができる。５’エキソヌクレアーゼが５’陥凹末端または５’オーバーハングを残す場合、ポリメラーゼは、３’オーバーハングを消化するために用いることができるまたはプローブの３’陥凹末端を充てんして平滑末端もしくは１つのヌクレオチドにより伸長される末端を形成するために用いることができる。３’エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼは、平滑末端を形成するために好ましくは用いることができ、これは、平滑末端５’アダプターに連結させることができる。あるいは、クレノウ（３’→５’エクソ−）もしくはＢｓｔなどの３’エクソ−ポリメラーゼは置換して、Ｔ−オーバーハングを有する５’アダプターに連結させることができる末端を形成することができる。また、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰのｄＮＴＰミックスは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの代わりに用いてもよい。標的がＲＮＡである場合、逆転写酵素はｄＮＴＰＳと共に用いることもでき、リボＮＴＰを有するＲＮＡポリメラーゼを用いることもできる。フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）ポリメラーゼ、ポリメラーゼ濃度、プローブ濃度、インキュベーション時間および温度は、当技術分野で教示される通り変化し得る（例えば、Ｔａｂｏｒら、ＤＮＡ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  Ａｕｓｅｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３．５．１０−３．５．１２（１９８９年）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、ｐ５．４４−５．４７、ＣＳＨ  ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００６０】
標的濃縮後または標的濃縮中、アダプター配列を標的配列の一方もしくは両方の末端に連結することが望ましいこともある。「連結」は、２種以上の核酸、例えばオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの共有結合または連鎖による終端間の接着を意味する。結合または連鎖の性質は、広範に変わることがあり、連結は、酵素的にまたは化学的に行われ得る。本明細書で使用される場合、連結は、通常、酵素的に行われて、１つのオリゴヌクレオチドの終端ヌクレオチドの５’炭素と別のオリゴヌクレオチドの３’炭素との間にリン酸ジエステル連鎖を形成する。様々な鋳型主導型連結反応は、以下の参照文献に記載されており、これらは参照により組み込まれる。Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、ＵＳ４，８８３，７５０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、ＵＳ５，４７６，９３０；Ｆｕｎｇら、ＵＳ５，５９３，８２６；Ｋｏｏｌ、Ｕ．Ｓ．５，４２６，１８０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、ＵＳ５，８７１，９２１；ＸｕおよびＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻：８７５−８８１頁（１９９９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻：５０−７１頁（１９７９年）；Ｅｎｇｌｅｒら、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、１５巻：３−２９頁（１９８２年）；ならびにＮａｍｓａｒａｅｖ、米国特許出願公開第２００４／０１１０２１３号。
【００６１】
標的配列の末端に連結させることができるアダプターの様々なタイプを以下に記載する。用語「アダプター」は、少なくとも部分的に二本鎖であり、隣接する標的配列を増幅するためのプライマー部位として適する配列を含有する核酸、シークエンシングプラットフォームにより特定され、標的配列を有する連結部位の近傍の配列に配置されるシークエンシングプライマーおよび核酸供給源の同一性をトラッキングするためのユニーク識別子および／またはサンプルの同一性をトラッキングするためのバーコードを意味する。アダプターおよびシークエンシング反応におけるそれらの使用の例は、ＵＳ５，８８８，７３７、ＵＳ６，０１３，４４５、ＵＳ６，０６０，２４５、ＵＳ６，１７５，００２、ＵＳ７，７４１，４６３、ＵＳ７，８０３，５５０、ＵＳ８，０２９，９９３、ＵＳ８，２８８，０９７、ＵＳ２００４／０２０９２９９、ＵＳ２００７／０１７２８３９およびＵＳ２０１２／０２３８７３８などの特許公報において見出すことができる。
【００６２】
次いで、切断可能な一本鎖ヘアピンアダプター、二本鎖Ｙアダプター、完全に二本鎖のアダプター、または市販のＤＮＡシークエンシングプラットフォームにおける下流のシークエンシングに適した当技術分野で公知のアダプターの任意の他の形態は、標的ＤＮＡの３’末端および／または５’末端に連結することができる。ヘアピンアダプター内の切断可能部位は、ｄＵ、他の修飾されたヌクレオチド、１つ以上のＲＮＡヌクレオチド、または化学的に切断可能な部位となり得る。これらは、ＵＳ２０１２／０２３８７３８に記載の修飾された塩基のいずれか１つを含むことができる切断可能部位についての例としてのみ役立つ。ヘアピンアダプターを用いる利点は、これらのアダプターが、当技術分野におけるアダプターよりも短く、連結のために効果的に用いることができるという点である。さらに、これらのアダプターは、残留する一本鎖エキソヌクレアーゼ活性に対してさらに抵抗性がある。さらに、標的分子および標的単離プローブをヘアピンアダプターに連結させると、その標的分子が親和性ドメインに共有結合する。ヘアピンアダプターを切断し、任意の二本鎖領域を変性した後、切断されたヘアピン配列上でプライマー部位を含有する一本鎖領域は、標的配列を増幅するために用いることができる。
【００６３】
アダプターは、Ｔ−オーバーハングを含んでもよいが、平滑末端となり得る。アダプターは、ＮＧＳプラットフォーム表面上で増幅に必要とされる追加の配列と共に短いアダプター配列を含有することもでき、またはＮＧＳプラットフォームによって必要とされる完全な３’配列もしくは５’配列を供給することもできる。
【００６４】
一方もしくは両方の末端のアダプターは、シークエンシングプラットフォームにおいてシークエンシングするのに適したユニーク識別子（ＵＩＤ）または分子バーコード、例えば、ｍｉＳＥＱ  ＨｉＳＥＱ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ナノポアに基づいたシークエンサー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）またはＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を場合によって含有する。本明細書で使用される場合、用語「ユニーク識別子」（ＵＩＤ）は、同一性（例えば、タグＤＮＡ配列）が、サンプル中でポリヌクレオチドを識別するために用いることができるポリヌクレオチドと結合される、タグまたはタグの組み合わせを意味する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド上のＵＩＤは、ポリヌクレオチドが誘導される供給源を同定するために用いられる。供給源識別子はまた、バーコードと称されることもある。例えば、核酸サンプルは、異なる供給源に由来するポリヌクレオチドのプール（例えば、異なる個体、異なる組織もしくは細胞に由来するポリヌクレオチド、または異なる時点で単離されるポリヌクレオチド）となり得、それぞれの異なる供給源から得られたポリヌクレオチドは、固有のＵＩＤでタグを与えられる。そのようなものとして、ＵＩＤは、ポリヌクレオチドとその供給源との間の相関をもたらす。いくつかの実施形態において、ＵＩＤを使用して、サンプル中でそれぞれの個別のポリヌクレオチドに独自にタグを与える。サンプル中の固有のＵＩＤの数の同定は、個別のポリヌクレオチドがサンプル中でどのくらい多く存在するのかまたは元のポリヌクレオチドのどのくらいの多さから、操作されたポリヌクレオチドサンプルが引き出されたかという読み出しを提供することができる。本明細書において利用される識別子の例には、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７巻：１６６５−１６７０頁（２０００年）；Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻：１８４−１８８頁（１９８８年）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４巻：４５０−４５６頁（１９９６年）；およびＨａｒｄｅｎｂｏｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻：６７３−６７８頁（２００３年）において示される例が含まれる。
【００６５】
アダプター濃度、リガーゼ濃度、リガーゼ反応量、反応緩衝液、反応体積、インキュベーション時間およびインキュベーション温度は変わり得る。さらに、連結後の洗浄ステップによって、非連結アダプターおよびアダプター２量体の除去が可能になる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成後、核酸合成の開始点として作用し、伸長する二重鎖が形成されるように鋳型に沿ってその３’末端から伸長させることができる、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセス中に加えられるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長産物の合成におけるその使用と適合する長さであり、通常、長さが８ｎｔから１００ｎｔ、例えば、１０ｎｔから７５ｎｔ、１５ｎｔから６０ｎｔ、１５ｎｔから４０ｎｔ、１８ｎｔから３０ｎｔ、２０ｎｔから４０ｎｔ、２１ｎｔから５０ｎｔ、２２ｎｔから４５ｎｔ、２５ｎｔから４０ｎｔなどの間の範囲、より典型的には、長さが１８ｎｔから４０ｎｔ、２０ｎｔから３５ｎｔ、２１ｎｔから３０ｎｔの間の範囲のサイズから選択される類似のもしくは同一の長さならびに特定された範囲の間の任意の長さのものである。典型的なプライマーは、長さ１０ｎｔから５０ｎｔ、例えば、１５ｎｔから４５ｎｔ、１８ｎｔから４０ｎｔ、２０ｎｔから３０ｎｔ、２１ｎｔから２５ｎｔなどの範囲および特定された範囲の間の任意の長さとなり得る。
【００６７】
プライマーは、通常、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、代わりとして二本鎖でもよい。二本鎖の場合、プライマーは、通常、伸長産物を調製するために用いられる前に、その二本鎖を分離するために最初に処置される。この変性ステップは、通常、熱に影響されるが、代わりとしてアルカリを用いて行い、その後中和することができる。したがって、「プライマー」は、ポリメラーゼによる合成を開始するためのプライマー／鋳型複合体を生成するために、鋳型に相補的な少なくとも１つの３’配列および水素結合または鋳型とのハイブリダイゼーションによる複合体を有し、ＤＮＡ合成のプロセス中に鋳型に相補的なその３’末端に連結した、共有結合した塩基を付加することにより伸長される。
【００６８】
本方法の実施形態においてプライマーを使用すると、従来のＰＣＲ濃縮法と比べて、標的配列をさらに均一に増幅させる。ＰＣＲ濃縮において、各プライマー対は、標的配列に特異的であり、単一のプライマー対は、核酸の母集団中のすべての標的配列のためにここで用いられる。
【００６９】
一本鎖センス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも、標的の３’末端領域と順番にハイブリダイズされる標的単離配列に結合された捕捉ドメインにより、好ましくは固定化されて、アダプターに連結するのに適した二本鎖のＤＮＡ領域を形成する。この時点で、標的配列の３’末端以外の任意の３’一本鎖ＤＮＡ領域は、エキソヌクレアーゼ切断によって好ましくは除去されている。標的鋳型の５’末端で５’プローブをハイブリダイズし、標的領域以外の外来性のＤＮＡを除去し、５’アダプターを付加した後、核酸標的鋳型は、増幅し、配列決定することができる。
【００７０】
３’アダプターおよび５’アダプターが標的配列に共有結合される場合、部分的に二本鎖の分子を変性すると、いずれか一方の末端でアダプター配列を有する一本鎖配列になる。これらのアダプター配列は、ここで、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅または２つのプライミング配列に依拠する当技術分野で公知の他の増幅プロトコールのためのプライマー部位として作用する。濃縮された標的ＤＮＡは、例えば、熱、ＮａＯＨもしくはホルムアミドを用いて捕捉ドメインから溶離することができる、またはこれらが捕捉ドメインのために用いられる場合、ビーズに付着させたままでもよい。増幅後、増幅されたライブラリーは、ビーズ（例えば、Ａｍｐｕｒｅ（登録商標）ビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ、ＣＡ）を参照のこと）を用いてまたはカラム精製（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ製の精製製品）または当技術分野で公知のＤＮＡ精製の他の方法を用いて浄化することができる。次いで、得られたライブラリーは、定量化し、配列決定することができる。
【００７１】
標的濃縮後に本明細書において場合によって用いられる増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅、リアルタイムＰＣＲ”リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、Ｑβレプリカーゼによって媒介されるＲＮＡ増幅または等温増幅法、例えば、転写によって媒介される増幅、ＲＮＡ技術のシグナルによって媒介される増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ループによって媒介される等温増幅（ＬＡＭＰ）、もしくはヘリカーゼ依存性増幅（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２７巻：２２４−４３頁（２００８年）；ＵＳ５，２４２，７９４、ＵＳ５，４９４，８１０、ＵＳ４，９８８，６１７およびＵＳ６，５８２，９３８：ＵＳ４，６８３，１９５；ＵＳ４，９６５，１８８；ＵＳ４，６８３，２０２；ＵＳ４，８００，１５９（ＰＣＲ）；ＵＳ５，２１０，０１５（ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を用いたリアルタイムＰＣＲ）；ＵＳ６，１７４，６７０；特公４−２６２７９９（ローリングサークル増幅）；Ｌｅｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６巻：２１５０−２１５５頁（１９９８年）を参照のこと）のいずれかを含むことができる。
【００７２】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、従来のシークエンシング法（例えば、標準のサンガーまたはマクサム−ギルバートのシークエンシング法）を用いて、前例がなかった速度でポリヌクレオチドを配列決定する能力を有するシークエンシング技術を意味する。これらの前例のない速度は、並行して数千から数百万のシークエンシング反応を行い、読み出すことにより達成される。ＮＧＳシークエンシングプラットフォームには、それだけには限らないが以下が含まれる。マッシブリーパラレルシグニチャーシークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）；４５４ピロシーケンス（４５４  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）；固相リバーシブルダイターミネーターシークエンシング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＳＯＬｉＤ（登録商標）技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ、ＮＹ）；イオン半導体シークエンシング（Ｉｏｎ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ、ＮＹ）；およびＤＮＡナノボールシークエンシング（ＤＮＡ  ｎａｎｏｂａｌｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。いくつかのＮＧＳプラットフォームの説明は、以下において見出すことができる。Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２６巻：１１３５−１１４５頁（２００８年）；Ｍａｒｄｉｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２４巻：１３３−１４１頁（２００７年）；Ｓｕら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ、１１巻（３号）：３３３−４３頁（２０１１年）；およびＺｈａｎｇら、Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３８巻（３号）：９５−１０９頁（２０１１年）。
【００７３】
前述の本方法の一実施形態は、以下のようにまとめることができる。標的が濃縮された核酸ライブラリーは、核酸サンプル、例えば、真核生物から得られたｇＤＮＡまたは核酸の母集団中のＲＮＡ転写物を所定のサイズ範囲に断片化し、基質を結合するために親和性標識を含有する標的単離プローブを加え（標的単離プローブは、核酸フラグメント中で標的配列を架ける。）、１種以上の３’および５’特異的ヌクレアーゼまたは１種以上の３’エキソヌクレアーゼ、場合によって１種以上の５’エキソヌクレアーゼ、例えば、ＥｘｏＶＩＩを、同時に（例えば、組み合わせて）または異なるステップで用いて非標的核酸を除去することにより生成することができる。３’アダプター、場合によって５’アダプターは、同時に（例えば、組み合わせて）または本方法における異なるステップで標的ＤＮＡの末端に付加することができる。次いで、濃縮されたＤＮＡの増幅およびシークエンシングが続くことができる。バーコードおよびユニーク識別子配列は、アダプター配列またはプローブ配列中に場合によって含むことができる。
【００７４】
他の態様において、少なくとも１つのプローブが親和性結合ドメインを含む標的単離プローブである３’および５’標的プローブは、同時に（例えば、組み合わせて）または異なるステップでハイブリダイズされ、標的の長さは、両方のプローブのハイブリダイゼーションにより定義され、一本鎖の非標的配列は、エキソヌクレアーゼにより除去される。あるいは、特異的な標的単離プローブおよび３’エキソヌクレアーゼを用いて、標的の３’末端を定義し、その後、５’ヌクレアーゼの非存在下で非特異的プローブを伸長させて、標的配列の定義されていない５’末端を形成することができる。
【００７５】
本明細書に記載した方法の実施形態は、標的配列が定義され、オフターゲット配列がないため、開始点を特定するステップを含むことから、以前のハイブリダイゼーションに基づいた方法に対して有利であり、他のハイブリダイゼーション法において、標的配列は、非標的配列との境界が定義されていない母集団中の核酸内に残存する。さらに、両方のストランドは、従来のハイブリダイゼーション法よりも標的内でさらにＡＴまたはＧＣに富む配列を捕捉し、許容することができる。
【００７６】
従来技術におけるＰＣＲに基づいた方法に対する本実施形態の利点は、人工のシークエンスが、標的の末端に導入されない点である。さらに、本実施形態は、スケーラブルであり、増幅バイアスが少なく、固有のＵＩＤを標的分子に付加させることが可能である。ＵＩＤによって、同じ標的分子のＰＣＲ重複を同定することが可能である。その結果、ＰＣＲ重複は、分析中ろ過することができ、突然変異または転写物の正確な定量が可能になる。
【００７７】
用語「キット」は、本発明の方法を実施するために材料または試薬を送達するための任意の送達系を意味する。反応アッセイに関連して、かかる送達系には、ある位置から別の位置への反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素、アダプター、プライマーなど）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイなどを行うことについての指示を記載した文書）の保存、輸送または送達を可能にする系が含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上の閉鎖容器（例えば、箱）が含まれる。かかる内容物は、一緒にまたは別々に、対象とするレシピエントに送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイにおいて用いるための酵素を含有することができ、第２の容器は、プローブを含有する。キットは、非標的配列および標的配列を含有する核酸サンプルから標的鋳型を選択し、濃縮するために配合することができる。キットは、キットの考案者もしくは製造者によってまたは研究者によって定義される第１の親和性結合ドメインを含む３’プローブ（標的単離プローブ）；５’プローブ；アダプター；プライマー：ヌクレアーゼ；リガーゼ；ポリメラーゼ；緩衝液；ヌクレオチド；除去可能なブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または基質と結合される捕捉ドメインを含むことができる。キットは、ＤＮＡライブラリーを創出するための１種以上の緩衝液および標準液をさらに含むことができる。
【００７８】
本明細書において引用されたすべての文献は、それぞれの個々の文献が参照により組み込まれることが詳細におよび個別に示された場合と同じ程度で、任意の目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる。
【００７９】
【表１】
0006441893.tif 000004
0006441893.tif 000005
0006441893.tif 000006
0006441893.tif 000007
【実施例】
【００８０】
以下の例は、特定の温度、インキュベーション時間および緩衝液を記載している。しかしながら、これらの条件は、限定することを意図していない。当業者は、そこから様々なシークエンスを濃縮するための出発原料として本明細書で例示されるヒトｇＤＮＡが、限定されることを意図しておらず、そしてまた、ｐＨ、緩衝液および塩の条件ならびにインキュベーション時間が類似の程度のハイブリダイゼーションまたは増幅を行うために変わり得る程度で、以下の指定された条件に限定されるべきではないことを知っているはずである。同様に、親和性ドメインとしてのビオチンの説明は、限定することを意図していない。特異的な切断可能部位を有する特異的なアダプターはまた、例として後述されており、限定することを意図していない。ステップの順番は、一例として記載されている。ステップの順番が変更され得るということは理解されている。さらに、いくつかのステップは、目的にかなうように加えられても取り除かれてもよい。
【００８１】
［実施例１］  １つの標的単離プローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法。
【００８２】
ヒトｇＤＮＡ（１μｇ）を、３００ｂｐフラグメントの場合の製造者のプロトコールに従ってＣｏｖａｒｉｓデバイスを用いて剪断した（図１（１））。長さ１００塩基であり、ビオチンと結合された標的単離プローブ２０ｎｍｏｌを含有するハイブリダイゼーション反応緩衝液２５μｌに、剪断したＤＮＡを加えた（１００塩基配列は、１００ｎｔ標的配列に相補的であった。）（図１（２））。ハイブリダイゼーション反応を、Ｊｏｈｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４４巻、２５９−２６４頁（２００８年）に従って行った。ハイブリダイゼーション後、標的単離プローブ／標的ＤＮＡ二重鎖を、３０分間親水性のストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５０μｌに結合させ（図１（３））、標準ＢＷ緩衝液（５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。
【００８３】
本明細書を通して使用される場合、「反応混合物」は、反応を行うために必要な反応物すべてを含有する溶液を意味し、これには、それだけには限られないが、反応中選択されたレベルでｐＨを維持する緩衝剤、酵素、基質、塩、補助因子、捕捉剤などが含まれ得る。
【００８４】
ビーズを、１×ＮＥ緩衝液４、２．５ＵエキソヌクレアーゼＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）および２．５ＵエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有する反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを洗浄し、ＲｅｃＪｆ３０ユニットを含有する１×ＮＥ緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５０μｌに再懸濁し、２０℃で１０分間インキュベートした（図１（４））。
【００８５】
磁気ビーズを洗浄し、ｄＡ−テーリング反応ミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５０μｌに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）４５μｌおよびＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）アダプター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）に再懸濁した。クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５μｌを連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（図１（５））。
【００８６】
次いで、磁気ビーズを洗浄し、ＵＳＥＲ（商標）酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５μｌおよびＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）プライマー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含有する１×ホットスタートＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）に再懸濁した。ＰＣＲ混合物を、３７℃で１５分間インキュベートし、下記のＰＣＲサイクリング条件を用いる。９５℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間の２５サイクル（図１（６））。２５サイクルの終了時、ＰＣＲ混合物を、７２℃で５分間インキュベートした。次いで、標的配列から得られたＰＣＲ産物を、従来の方法を用いて配列決定した。
【００８７】
［実施例２］  １つの標的単離プローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法についての変形法。
【００８８】
実施例１および図１中のプロトコールは、ストレプトアビジンビーズ（１）−（３）への結合を経て、その後、図２Ａ（７）−（１１）に示されるステップに従った。
【００８９】
ビーズを、１×ＮＥ緩衝液４、２．５ＵエキソヌクレアーゼＴおよび２．５ＵエキソヌクレアーゼＩを含有する反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした（７）。
【００９０】
磁気ビーズを洗浄し、ｄＡ−テーリング反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション４５μｌおよびＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔアダプターに再懸濁した。クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした  図２Ａ（８）。
【００９１】
磁気ビーズを洗浄し、エキソヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）２０ユニットを含有する１×エキソヌクレアーゼＶＩＩ緩衝液５０μｌに再懸濁し、３０℃で１０分間インキュベートした（９）。製造者のプロトコールに従って、酵素を熱失活させた。ビーズを洗浄し、１５Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）および１００μＭ  ｄＮＴＰを含有する１×ＮＥ緩衝液２  ５０μｌに再懸濁した。反応を、２０℃で３０分間インキュベートした。
【００９２】
次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよびＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔアダプターに再懸濁した。クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（１０）。
【００９３】
アダプターのＵＳＥＲ切断およびＰＣＲ増幅を、実施例１に記載の通り実施した。
【００９４】
［実施例３］  １つのフラッププローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法。
【００９５】
実施例１に記載のプロトコールは、フラップ標的単離プローブを用いた３’アダプターの連結に従った（図２Ｂを参照のこと）。フラップ標的単離プローブは、標的配列の５’末端に特異的な一本鎖の３’領域、内部ビオチン−ｄＴ、切断可能なｄＵを含有する５’ヘアピン、ＮＧＳプラットフォーム−特異的シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位およびユニークサンプル識別子配列によって特徴付けられる（１−３、１２−１３）。３’アダプターの連結後、ビーズを洗浄し、１０×ＢＳＡ添加剤（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）５μｌおよび０．５Ｕ  ヒトＦｅｎ−１（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含有する１×ＲＥＣ反応緩衝液１２（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）５０μｌに再懸濁し、３０℃で３０分間インキュベートした（１４）。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよびクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。
【００９６】
アダプターのＵＳＥＲ切断およびＰＣＲ増幅を、実施例１に記載の通り実施した（１５）。
【００９７】
［実施例４］  １つの標的単離プローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法についての変形法。
【００９８】
実施例１におけるプロトコールは、３’−ジデオキシヌクレオチドを有する標的単離プローブを用いた一本鎖３’および５’消化（図１（１）から（４）および図２Ｃ（１６）から（１８））に従った。ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよび５０μＭ  ３’平滑断端にしたヘアピンＤＮＡアダプター１０μｌに再懸濁し、クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを、連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（１６）。３’アダプター配列は、ＮＧＳプラットフォーム−特異的シークエンシングプライマー部位、５’リン酸および３’−ジデオキシヌクレオチドを含有した。
【００９９】
ビーズを洗浄した後、標的／プローブ二重鎖は、平滑末端化され、ｄＡテイルを付加し（ｄＡ−ｔａｉｌｅｄ）、５’アダプターは、標的に連結され、標的は、サイズ選択がないライブラリーの調製についての製造者のプロトコールに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔウルトラＤＮＡライブラリープレップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて増幅された（１７）、（１８）。
【０１００】
［実施例５］  標的単離プローブおよびランダムオリゴヌクレオチドを用いて配列決定するための標的配列について濃縮するための方法。
【０１０１】
ヒトｇＤＮＡ（１μｇ）は、５００ｂｐフラグメントの場合の製造者のプロトコールに従ってＣｏｖａｒｉｓデバイスを用いて剪断した（図３（１９））。Ｔｉｑｕｉａら（２００４年））によって記載された技法を用いて、剪断したＤＮＡを、長さ５０塩基で、５００ｂｐのｇＤＮＡフラグメント内の１００ｂｐから３００ｂｐのヌクレオチド標的配列の３’末端に特に相補的な３’標的単離プローブ２０ｎｍｏｌを含有するハイブリダイゼーション反応混合物２５μｌに加えた（図３（２０））。ハイブリダイゼーション後、３’標的単離プローブ／標的ＤＮＡ二重鎖を、製造者のプロトコールに従って３０分間親水性ストレプトアビジンビーズ５０μｌに結合させた（図３（２１））。
【０１０２】
ビーズを、１×ＮＥ緩衝液４、２．５ＵエキソヌクレアーゼＴおよびエキソヌクレアーゼＩ２．５μｌを含有する反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした（図３（２２））。磁気ビーズを洗浄し、ｄＡ−テーリング反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよびｄＵの切断可能な核酸塩基を含有する３’Ｔオーバーハングを有する５０μＭヘアピンアダプター１０μｌに再懸濁し、クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（図３（２３））。３’アダプター配列は、ＮＧＳプラットフォーム−特異的シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位およびユニークストランド識別子配列、ならびに３’ｄＴ−オーバーハングを含有した。
【０１０３】
連結後、ビーズを洗浄し、ランダム６量体の追加の２０ｎｍｏｌを含有する１×ＮＥ緩衝液２  ５０μｌに再懸濁した。反応を、９５℃で５分間加熱し、次いで、クレノウ（エクソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１５ユニットおよび１００μＭ  ｄＮＴＰを添加する前に、氷に移した（図３（２４））。反応を、２０℃で１０分間、その後３７℃で２０分インキュベートした（図３（２５））。
【０１０４】
次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）４５μｌおよびｄＵの切断可能な核酸塩基を含有する５’一本鎖ヘアピンアダプターに再懸濁し、クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５μｌを連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（図３（２６））。５’アダプター配列は、ＮＧＳプラットフォーム−特異的シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅部位およびサンプル同定用のバーコード配列を含有した。
【０１０５】
次いで、磁気ビーズを洗浄し、ＵＳＥＲ酵素５μｌならびに３’および５’ライブラリー増幅部位に相補的な１０μＭ増幅プライマーそれぞれ２．５μｌを含有する１×ホットスタートＯｎｅＴａｑ  ＰＣＲマスターミックスに再懸濁した。ＰＣＲ混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、以下のＰＣＲサイクリング条件を用いる。９５℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間の２５サイクル（図３（２７））。２５サイクルの終了時、ＰＣＲ混合物を７２℃で５分間インキュベートした。次いで、標的配列から得られたＰＣＲ産物を従来の方法を用いて配列決定した。
【０１０６】
［実施例６］  標的単離プローブおよび第２のプローブを用いて配列決定するための標的配列について濃縮するための方法についての変形法。
【０１０７】
実施例５に記載のプロトコールは、３’アダプターの連結（（１９）−（２３））に従った。連結後、磁気ビーズを洗浄し、長さ５０塩基で、標的配列の５’末端に相補的な５’標的単離プローブ２０ｎｍｏｌを有する、１×エキソヌクレアーゼＶＩＩ緩衝液５０μｌに再懸濁した。標的単離プローブを、９５℃で５分間加熱し、その後３０℃までゆっくりと冷却することにより標的にアニールした（図４（２８））。エキソヌクレアーゼＶＩＩ  １０Ｕを、反応に加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートした（図４（２９））。酵素を製造者のプロトコールに従って熱失活した。ビーズを洗浄し、追加の２０ｎｍｏｌの５’標的単離プローブを含有する１×ＮＥ緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５０μｌに再懸濁した。反応を、９５℃で５分間加熱し、その後、１５Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）および１００μＭ  ｄＮＴＰを添加する前に３０℃までゆっくりと冷却した。反応を２０℃で３０分間インキュベートした。
【０１０８】
ビーズを洗浄した後、５’アダプターの連結、アダプターのＵＳＥＲ切断およびＰＣＲ増幅を、３’−Ｔオーバーハングを有するヘアピンアダプターを用いて実施例４に記載される通り実施した（（図４（３０）、（３１））。
【０１０９】
［実施例７］  ２つのプローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法についての変形法。
【０１１０】
実施例４に記載のプロトコールは、３’ビオチンではなく、内部を有する３’標的単離プローブを用いた５’エキソヌクレアーゼ消化および熱失活（（１９）−（２３）、（２８）−（２９））に従った。熱失活後、ビーズを洗浄し、クレノウ（エクソ−）ＤＮＡポリメラーゼ１５ユニットおよび１００μＭ  ｄＮＴＰを含有する１×ＮＥ緩衝液２  ５０μｌに再懸濁した。反応を、２０℃で１０分間、その後３７℃で２０分インキュベートした（３２）。
【０１１１】
ビーズを洗浄した後、５’アダプターの連結、アダプターのＵＳＥＲ切断およびＰＣＲ増幅を実施例５に記載された通り実施した（（２６）、（２７））。
【０１１２】
［実施例８］  標的単離プローブおよび５’フラッププローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法。
【０１１３】
実施例６に記載のプロトコールは、３’ヘアピンアダプターの連結に従った（図３、（１９）−（２３））。３’アダプターの連結後、ビーズを洗浄し、フラップ５’プローブ２０ｎｍｏｌを含有する１×ＲＥＣ反応緩衝液１２  ５０μｌに再懸濁した。フラッププローブは、標的の５’末端に相補的な一本鎖の３’−領域ならびに切断可能なｄＵ、ＮＧＳプラットフォーム−特異的シークエンシングプライマー部位、ライブラリー増幅プライマー部位およびユニークサンプル識別子配列を含有する５’ヘアピンからなっていた。プローブを、９５℃で５分間加熱し、その後、３０℃までゆっくり冷却することにより標的配列の５’末端にアニールした（３５）。
【０１１４】
アニーリング後、１０×ＢＳＡ添加剤５μｌおよびヒトＦｅｎ−１  ０．５ユニットを加えて、５’一本鎖領域を除去し、反応を３０℃で３０分間インキュベートした（３６）。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよびフラッププローブの第２のストランドと標的ＤＮＡとの間のニックを修復するためのクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。
【０１１５】
次いで、磁気ビーズを洗浄し、ＵＳＥＲ酵素５μｌおよび増幅プライマーを含有する１×ホットスタートＯｎｅＴａｑ  ＰＣＲマスターミックスに再懸濁した。ＰＣＲ混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、以下のＰＣＲサイクリング条件を用いた。９５℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間の２５サイクル。２５サイクルの終了時、ＰＣＲ混合物を７２℃で５分間インキュベートした（３７）。次いで、標的配列から得られたＰＣＲ産物を従来の方法を用いて配列決定した。
【０１１６】
［実施例９］  ２つのプローブによって配列決定するための標的配列について濃縮するための方法についての変形法。
【０１１７】
ヒトｇＤＮＡ（１μｇ）を、５００ｂｐフラグメントの場合の製造者のプロトコールに従ってＣｏｖａｒｉｓを用いて剪断した（１９）。剪断したＤＮＡを、長さがそれぞれ５０塩基で３’標的単離プローブ２０ｎｍｏｌおよび５’プローブ２０ｎｍｏｌを含有し、１００個の標的の３’末端および５’末端を特定するハイブリダイゼーション反応２５μｌに加えた（３８）。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされた標的配列を、実施例２に記載された通り捕捉した（３９）。
【０１１８】
ビーズを、１×ＮＥ緩衝液４、エキソヌクレアーゼＴ２．５ユニットおよびエキソヌクレアーゼＩ２．５μｌを含有する反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。磁気ビーズを洗浄し、ＲｅｃＪｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）３０ユニットを含有する１×ＮＥ緩衝液２  ５０μｌに再懸濁し、２０℃で１０分間インキュベートした（図４）。
【０１１９】
磁気ビーズを洗浄し、ｄＡ−テーリング反応ミックス５０μｌに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、１×クイックライゲーション緩衝液４５μｌおよびＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔアダプターに再懸濁した。クイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ５μｌを、連結混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした（４１）。
【０１２０】
アダプターのＵＳＥＲ切断およびＰＣＲ増幅を、実施例１に記載の通り実施した（４２）。
【図１】
0006441893.tif 000008
【図２Ａ】
0006441893.tif 000009
【図２Ｂ】
0006441893.tif 000010
【図２Ｃ】
0006441893.tif 000011
【図３】
0006441893.tif 000012
【図４】
0006441893.tif 000013
【図５Ａ】
0006441893.tif 000014
【図５Ｂ】
0006441893.tif 000015
【図５Ｃ】
0006441893.tif 000016
【図６】
0006441893.tif 000017
【図７】
0006441893.tif 000018
【図８】
0006441893.tif 000019
【図９】
0006441893.tif 000020
【配列表】
0006441893000001.app