(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）に作動可能に連結されているＣＭＶ  ｇＨタンパク質またはその断片をコードする第１のヌクレオチド配列；
ｂ）第２のＳＧＰに作動可能に連結されているＣＭＶ  ｇＬタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列；
ｃ）第３のＳＧＰに作動可能に連結されているＣＭＶ  ＵＬ１２８タンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列；
ｄ）ＩＲＥＳ配列またはウイルス２Ａ配列に作動可能に連結されているＣＭＶ  ＵＬ１３０タンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列；および
ｅ）ＩＲＥＳ配列またはウイルス２Ａ配列に作動可能に連結されているＣＭＶ  ＵＬ１３１タンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列；
を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子であって、
前記自己複製ＲＮＡ分子が、適した細胞の中に導入された場合に、前記ｇＨタンパク質またはその断片、前記ｇＬタンパク質またはその断片、前記ＵＬ１２８タンパク質またはその断片、前記ＵＬ１３０タンパク質またはその断片、およびＵＬ１３１タンパク質またはその断片が産生され、
前記ｇＨタンパク質またはその断片、前記ｇＬタンパク質またはその断片、前記ＵＬ１２８タンパク質またはその断片、前記ＵＬ１３０タンパク質またはその断片、および前記ＵＬ１３１タンパク質またはその断片が、タンパク質複合体を形成する、自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記第４のヌクレオチド配列が、ＩＲＥＳ配列に作動可能に連結されており、前記第５のヌクレオチド配列が、ＩＲＥＳ配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記第４のヌクレオチド配列が、ウイルス２Ａ配列に作動可能に連結されており、前記第５のヌクレオチド配列が、ウイルス２Ａ配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項４】
アルファウイルスレプリコンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項４に記載のアルファウイルスレプリコンを含む、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）。
【請求項６】
請求項５に記載のＶＲＰおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項９】
ＲＮＡ送達系をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ送達系が、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
タンパク質複合体を形成するための組成物であって、前記組成物は、請求項５に記載のＶＲＰまたは請求項１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子を含み、前記組成物は、細胞に送達され、そしてアルファウイルスレプリコンの発現に適した条件下で前記細胞が維持され、ここでタンパク質複合体が形成されることを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
個体において免疫応答を誘発するための組成物であって、請求項１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子、請求項５に記載のＶＲＰまたは請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項１４】
前記免疫応答が、中和抗体の産生を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記中和抗体が補体非依存性である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】
プラスミドである、請求項１６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１８】
個体において免疫応答を誘発するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子、請求項５に記載のＶＲＰ、請求項６から１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項１６もしくは１７に記載の組換えＤＮＡ分子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１２年９月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５４８３０．ｔｘｔと名付けられ、２３３，４８０バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
病原体は、個体において、実質的な病的状態および死亡をもたらし得る。例えば、ヘルペスウイルスは、蔓延しており、最悪の場合、主に、免疫無防備状態の個体（たとえば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体）において、実質的な病的状態および死亡に至り得る、ヒトにおける広範囲の疾患を引き起こす。ヒトは、少なくとも８つのヘルペスウイルスによる感染に感受性である。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１、ＨＨＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−２）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ、ＨＨＶ−３）は、アルファサブファミリーウイルスであり、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＨＨＶ−５）ならびにロゼオロウイルス（ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７）は、ベータサブファミリーウイルスであり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ、ＨＨＶ−４）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ−８）は、ヒトに感染するガンマサブファミリーウイルスである。
【０００３】
ＣＭＶ感染は、免疫無防備状態の個体（たとえば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体）において、実質的な病的状態および死亡に至り、先天性感染症は、新生児において、神経学的な発生において重篤な欠陥をもたらし得る。ＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、およびｇＮは、それらがウイルス表面上に発現されるので、魅力的なワクチン候補を代表し、防御的なウイルス中和体液性免疫応答を引き起こすことができる。いくつかのＣＭＶワクチン戦略は、有力な抗体応答を誘発することができる主な表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を標的にしてきた。（非特許文献１）。ＣＭＶ糖タンパク質ｇＢは、中和抗体応答を誘発することができ、ＣＭＶ陽性患者由来の血清における線維芽細胞の感染を中和する抗体の大部分は、ｇＢに対して指向性である（非特許文献２）。同様に、ｇＨおよびｇＭ／ｇＮは、自然感染に対する免疫応答の標的であることが報告されている（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００４】
ＣＭＶタンパク質の複合体もまた、それらがウイルス生活環における重要なプロセスに関与するように思われるので、魅力的なワクチン候補である。たとえば、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体は、線維芽細胞および上皮／内皮細胞侵入の両方において重要な役割を有するように思われる。一般的なモデルは、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体が線維芽細胞の感染を媒介することを示唆する。ｈＣＭＶ  ｇＯヌル突然変異体は、線維芽細胞上に小さなプラークおよび非常に低い力価のウイルスを産生し、侵入における役割を示す（Ｄｕｎｎ（２００３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻：１４２２３〜２８頁；Ｈｏｂｏｍ（２０００年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４巻：７７２０〜２９頁）。最近の研究は、ｇＯが、ｇＨ／ｇＬと共にビリオンの中に組み込まれないが、分子シャペロンとして作用し得、ＥＲからゴルジ体へのｇＨ／ｇＬエクスポートおよびビリオンの中への組み込みを増大させることを示唆する（Ｒｙｃｋｍａｎ（２００９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８２巻：６０〜７０頁）。パルスチェイス実験によって、少量のｇＯは、長い期間、ｇＨ／ｇＬに結合したままであるが、ほとんどのｇＯは、それが細胞外のビリオンにおいて見いだされずまた細胞から分泌もされないので、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体から解離するおよび／または分解されることが示された。ｇＯをＣＭＶ（ＴＲ）の臨床株から欠失させた場合、それらのウイルス粒子は、ビリオンの中に組み込まれるｇＨ／ｇＬの量が著しく低下した。さらに、また、ｇＯをＴＲウイルスから欠失させると、上皮および内皮細胞への侵入をも阻害され、ｇＨ／ｇＬもまた、上皮／内皮細胞侵入に必要とされることが示唆された（Ｗｉｌｌｅ（２０１０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（５号）：２５８５〜９６頁）。
【０００５】
ＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬはまた、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ（本明細書でＵＬ１３１とも呼ばれる）と結合することができ、上皮細胞、内皮細胞、および樹状細胞を含むいくつかの細胞型への侵入に必要とされる五量体複合体を形成する（Ｈａｈｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７８巻（１８号）：１００２３〜３３頁；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ（２００５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁；Ｇｅｒｎａら（２００５年）．Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（Ｐｔ  ６）：１４３１〜６頁；Ｒｙｃｋｍａｎら（２００８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８２巻：６０〜７０頁）。対照的に、この複合体は、線維芽細胞の感染に必要とされない。実験用ｈＣＭＶ分離株は、ＵＬ１２８〜ＵＬ１３１遺伝子座において突然変異を持ち、突然変異は、培養線維芽細胞におけるほんの数回の継代後に臨床分離株において生じる（Ａｋｔｅｒら（２００３年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（Ｐｔ  ５）：１１１７〜２２頁）。自然感染の間に、五量体複合体は、非常に高い効力で、上皮細胞、内皮細胞（および五量体複合体がウイルス侵入を媒介する潜在的な任意の他の細胞型）の感染を中和する抗体を誘発する（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。この複合体に対する抗体が、上皮細胞の感染を中和するヒト血清の能力に著しく寄与するようにも思われる（Ｇｅｎｉｎｉら（２０１１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．５２巻（２号）：１１３〜８頁）。
【０００６】
特許文献１は、ｇＨおよびｇＬを含有するある種のＣＭＶタンパク質複合体を作製する方法を開示する。複合体は、ｇＨおよびｇＬが同時発現されるように、ｇＨをコードするＤＮＡ構築物およびｇＬをコードするＤＮＡ構築物を細胞の中に導入することによって産生される。
【０００７】
特許文献２は、ＣＭＶタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を記載する。この文書によれば、異なるＣＭＶタンパク質をコードする別個のＤＮＡ分子の組み合わせは、コードされるＣＭＶタンパク質の同時発現を引き起こすために細胞の中に導入することができる。ｇＭおよびｇＮがこのように同時発現された場合、それらは、ジスルフィド結合した複合体を形成した。ｇＭ／ｇＮ複合体を産生するＤＮＡ構築物またはｇＢをコードするＤＮＡ構築物により免疫化されたウサギは、等価な中和抗体応答をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７６７，２５０号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０７６６４５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＧｏおよびＰｏｌｌａｒｄ、ＪＩＤ（２００８年）１９７巻：１６３１〜１６３３頁
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０年）６４：１０７９〜８５
【非特許文献３】Ｕｒｂａｎら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）７７巻（Ｐｔ．７）：１５３７〜４７頁
【非特許文献４】Ｍａｃｈら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（２０００年）７４巻（２４号）：１１８８１〜９２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
４つ以上のタンパク質をコードするポリシストロニック核酸、同じ細胞において４つ以上のタンパク質を発現する方法、およびより良好な免疫応答をもたらす免疫化方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、４つ以上のタンパク質、たとえば、ヘルペスウイルス（たとえば、ＣＭＶ）タンパク質などの病原体タンパク質、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達するための、ポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子など、組換えポリシストロニック核酸分子に関する。
【００１２】
一態様では、ポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子などの組換えポリシストロニック核酸分子は、ａ）第１のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）に作動可能に連結されている第１のタンパク質またはその断片をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）第２のＳＧＰに作動可能に連結されている第２のタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）第３のＳＧＰに作動可能に連結されている第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列およびｄ）第４のＳＧＰに作動可能に連結されている第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列を含み、ここで自己複製ＲＮＡ分子が、適した細胞の中に導入された場合に、第１のタンパク質またはその断片および第２のタンパク質またはその断片が産生される。任意選択により、ポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子などの組換えポリシストロニック核酸分子は、第５のＳＧＰに作動可能に連結されている第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、第１のタンパク質またはその断片、第２のタンパク質またはその断片、第３のタンパク質またはその断片、および第４のタンパク質またはその断片、および、存在する場合、第５のタンパク質またはその断片は、タンパク質複合体を形成する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質またはその断片および第２のタンパク質またはその断片、第３のタンパク質またはその断片、第４のタンパク質またはその断片および、存在する場合、第５のタンパク質またはその断片がそれぞれ、ヘルペスウイルス、たとえば、ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨＶ−４、ＨＨＶ−５、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８またはＨＨＶ−９に由来する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質またはその断片および第２のタンパク質またはその断片、第３のタンパク質またはその断片、第４のタンパク質またはその断片および、存在する場合、第５のタンパク質またはその断片はそれぞれ、ＨＨＶ−５（ＣＭＶ）に由来する。そのような実施形態では、第１のタンパク質または断片、第２のタンパク質または断片、第３のタンパク質または断片、第４のタンパク質または断片、および第５のタンパク質または断片は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、および前述のもののいずれか１つの断片からなる群より独立して選択される。たとえば、第１のタンパク質または断片は、ｇＨまたはその断片であり得、第２のタンパク質または断片は、ｇＬまたはその断片であり得、第３のタンパク質または断片は、ＵＬ１２８またはその断片であり得、第４のタンパク質または断片は、ＵＬ１３０またはその断片であり得、第５のタンパク質または断片は、ＵＬ１３１またはその断片であり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質またはその断片および第２のタンパク質またはその断片、第３のタンパク質またはその断片、第４のタンパク質またはその断片および、存在する場合、第５のタンパク質またはその断片はそれぞれ、ＨＨＶ−３（ＶＺＶ）に由来する。そのような実施形態では、第１のタンパク質または断片、第２のタンパク質または断片、第３のタンパク質または断片、第４のタンパク質または断片、および第５のタンパク質または断片は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、および前述のもののいずれか１つの断片からなる群より独立して選択される。
【００１６】
組換えポリシストロニック核酸分子は、ポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子であり得る。自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスレプリコンであり得る。そのような場合には、アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の形態で送達することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、「裸の」ＲＮＡ分子の形態とすることもできる。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子にも関する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、プラスミドである。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、コードされる自己複製ＲＮＡ分子の転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含む。
【００１８】
本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子および薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物にも関する。いくつかの実施形態では、組成物は、五量体複合体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１など、ＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む。組成物はまた、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせなどのＲＮＡ送達系を含有することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子は、リポソーム中に被包され得る。
【００１９】
ある実施形態では、組成物は、ＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンを含有するＶＲＰを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、五量体複合体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１をコードするレプリコンを含む。組成物はまた、アジュバントをも含むことができる。
【００２０】
本発明はまた、ＣＭＶタンパク質複合体を形成する方法にも関する。いくつかの実施形態では、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、細胞に送達され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここで、ＣＭＶタンパク質複合体が形成される。他の実施形態では、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、細胞に送達され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここでＣＭＶタンパク質複合体が形成される。方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成するために使用することができる。
【００２１】
本発明はまた、自己複製ＲＮＡ分子などの組換えポリシストロニック核酸分子を個体に投与することにより、個体において免疫応答を誘発するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、個体に投与される。自己複製ＲＮＡ分子は、リポソームなどのＲＮＡ送達系を含有する組成物として投与することができる。他の実施形態では、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、個体に投与される。好ましくは、誘発された免疫応答は、中和抗ＣＭＶ抗体の産生を含む。より好ましくは、中和抗体は、補体非依存性である。
【００２２】
本発明はまた、細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害する方法であって、細胞を４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子と接触させることを含む方法にも関する。細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその組み合わせからなる群より選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰと接触させられる。
【００２３】
本発明はまた、免疫応答を誘発するまたは細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害するために、細胞中でのＣＭＶタンパク質複合体に由来する、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子（たとえばＶＲＰ、自己複製ＲＮＡ分子を含む組成物、およびリポソーム）の使用にも関する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ａ）第１のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）に作動可能に連結されている第１のタンパク質またはその断片をコードする第１のヌクレオチド配列；および
ｂ）第２のＳＧＰに作動可能に連結されている第２のタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列；
ｃ）第３のＳＧＰに作動可能に連結されている第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列；および
ｄ）第４のＳＧＰに作動可能に連結されている第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列；
を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子であって、
上記自己複製ＲＮＡ分子が、適した細胞の中に導入された場合に、上記第１のタンパク質またはその断片、上記第２のタンパク質またはその断片、上記第３のタンパク質またはその断片、および上記第４のタンパク質またはその断片が産生される、自己複製ＲＮＡ分子。
（項目２）
上記第１のタンパク質、上記第２のタンパク質、上記第３のタンパク質、および上記第４のタンパク質が、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、上記第１のタンパク質が、上記第２のタンパク質の断片でも上記第３のタンパク質の断片でも上記第４のタンパク質の断片でもなく、上記第２のタンパク質が、上記第１のタンパク質の断片でも上記第３のタンパク質の断片でも上記第４のタンパク質の断片でもなく、上記第３のタンパク質が、上記第１のタンパク質の断片でも上記第２のタンパク質の断片でも上記第４のタンパク質の断片でもなく、かつ上記第４のタンパク質が、上記第１のタンパク質の断片でも上記第２のタンパク質の断片でも上記第３のタンパク質の断片でもないという条件を有する、項目１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目３）
第５のＳＧＰに作動可能に連結されている第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含む、項目１または２に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目４）
上記第１のタンパク質またはその断片、上記第２のタンパク質またはその断片、上記第３のタンパク質またはその断片、および上記第４のタンパク質またはその断片、および、存在する場合、上記第５のタンパク質またはその断片が、タンパク質複合体を形成する、項目１から３のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目５）
上記第１のタンパク質またはその断片、上記第２のタンパク質またはその断片、上記第３のタンパク質またはその断片、上記第４のタンパク質またはその断片、および、存在する場合、上記第５のタンパク質またはその断片がそれぞれ、ヘルペスウイルスに由来する、項目１から４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目６）
上記ヘルペスウイルスが、ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨＶ−４、ＨＨＶ−５、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８、およびＨＨＶ−９からなる群より選択される、項目１から５のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目７）
上記ヘルペスウイルスが、ＨＨＶ−５（ＣＭＶ）である、項目６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目８）
上記第１のタンパク質または断片、上記第２のタンパク質または断片、上記第３のタンパク質または断片、上記第４のタンパク質または断片、および上記第５のタンパク質または断片が、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＭ、ｇＮ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、および前述のもののいずれか１つの断片からなる群より独立して選択される、項目７に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目９）
上記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、上記第２のタンパク質または断片が、ｇＬまたはその断片であり、上記第３のタンパク質または断片が、ＵＬ１２８またはその断片であり、上記第４のタンパク質または断片が、ＵＬ１３０またはその断片であり、上記第５のタンパク質または断片が、ＵＬ１３１またはその断片である、項目８に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１０）
上記ヘルペスウイルスが、ＨＨＶ−３（ＶＺＶ）である、項目６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１１）
上記第１のタンパク質または断片、上記第２のタンパク質または断片、上記第３のタンパク質または断片、上記第４のタンパク質または断片、および上記第５のタンパク質または断片が、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、および前述のもののいずれか１つの断片からなる群より独立して選択される、項目１０に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１２）
アルファウイルスレプリコンである、項目１から１１のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１３）
項目１２に記載のアルファウイルスレプリコンを含む、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）。
（項目１４）
項目１３に記載のＶＲＰおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
（項目１５）
アジュバントをさらに含む、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
項目１から１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
（項目１７）
ＲＮＡ送達系をさらに含む、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
上記ＲＮＡ送達系が、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせである、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
タンパク質複合体を形成する方法であって、項目１３に記載のＶＲＰまたは項目１から１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡを細胞に送達する工程およびアルファウイルスレプリコンの発現に適した条件下で上記細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。
（項目２０）
上記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
個体において免疫応答を誘発する方法であって、項目１から１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、項目１３に記載のＶＲＰまたは項目１４から１８のいずれか一項に記載の組成物を上記個体に投与する工程を含む、方法。
（項目２２）
上記免疫応答が、中和抗体の産生を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記中和抗体が補体非依存性である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
項目１から１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子。
（項目２５）
プラスミドである、項目２４に記載の組換えＤＮＡ分子。
（項目２６）
個体において免疫応答を誘発するための、項目１から１２のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、項目１３に記載のＶＲＰ、項目１４から１８のいずれか一項に記載の組成物または項目２４もしくは２５に記載のＤＮＡの使用。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ヘルペスウイルスタンパク質（たとえば、ＣＭＶタンパク質）などのタンパク質（たとえば、タンパク質抗原）、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達するためのプラットフォームを提供する。本明細書において記載される組換えポリシストロニック核酸分子は、細胞に、４つ以上のタンパク質をコードする配列を送達し、かつタンパク質の発現を駆動する利点を提供する。このアプローチを使用して、４つ以上のコードされるタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて４つ以上のタンパク質を含有するタンパク質複合体の形成に十分な細胞内レベルで発現することができる。たとえば、コードされるタンパク質またはその断片は、適切な発現制御配列を選択することによって、実質的に同じレベルでまたは所望の場合、異なるレベルで発現することができる。これは、非効率的で、非常に変わりやすいものとなり得る、異なるタンパク質をコードする２つ以上の個々のＤＮＡ分子を同じ細胞に同時送達することよりも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質複合体を産生するための著しくより効率的な方法である。たとえば、国際公開第２００４／０７６６４５号を参照されたい。
【００２６】
好ましくは、組換えポリシストロニック核酸分子は、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子であって、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のそれぞれが、それ自身のアルファウイルスサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）に作動可能に連結されている自己複製ＲＮＡ分子である。これらの自己複製ＲＮＡ分子は、他の発現制御配列（たとえば、他のプロモーター）を使用する対応する分子より小型である。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、この種の自己複製ＲＮＡ分子は、ＩＲＥＳなどの他の発現制御配列を含有する対応する分子より効率的に、かつ、より高収率でＶＲＰの中にパッケージされ得ると考えられる。また、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子およびそれらを含有するＶＲＰは、ＩＲＥＳなどの他の発現制御配列を含有する対応する分子より良好な免疫応答をもたらすことができるとも考えられる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、送達されるタンパク質またはそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体を惹起する。タンパク質、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を同時送達することによりもたらされる免疫応答は、他のアプローチを使用してもたらされる免疫応答より優れたものとなり得る。たとえば、ＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１をコードするＲＮＡ分子を発現させて、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を生成させ、単一のＣＭＶタンパク質（たとえば、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬなど）をコードするＲＮＡ分子、なおまたはｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１を個別にコードするＲＮＡ分子の混合物と比較して、より良好な中和力価および／または防御免疫を誘発することができる。
【００２８】
一般的な態様では、本発明は、４つ以上のタンパク質を細胞に送達するための、組換えポリシストロニック核酸分子、たとえば、自己複製ＲＮＡ分子に関する。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子などの組換えポリシストロニック核酸分子は、第１のＳＧＰに作動可能に連結されている第１のタンパク質またはその断片をコードする第１の配列、第２のＳＧＰに作動可能に連結されている第２のタンパク質またはその断片をコードする第２の配列、第３のＳＧＰに作動可能に連結されている第３のタンパク質またはその断片をコードする第３の配列、および第４のＳＧＰに作動可能に連結されている第４のタンパク質またはその断片をコードする第４の配列を含む。所望の場合は、第５のＳＧＰに作動可能に連結されている第５のタンパク質またはその断片をコードする第５の配列、および、任意選択により、他のタンパク質またはその断片をコードするさらなる配列も、自己複製ＲＮＡ分子の中に存在させることができる。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、第３のタンパク質、第４のタンパク質、および第５のタンパク質をコードする各配列は、ヘルペスウイルス（たとえば、ＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする。
【００２９】
本明細書において記載されるポリシストロニック核酸では、コードされる第１のタンパク質または断片、第２のタンパク質または断片、第３のタンパク質または断片、および第４のタンパク質または断片、ならびに、存在する場合はコードされる第５のタンパク質または断片は一般にかつ好ましくは、病原体（たとえば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、古細菌）など、同じ生物に由来する。ある例では、ポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質または断片は全て、ＣＭＶタンパク質またはＶＺＶタンパク質などのヘルペスウイルスタンパク質である。
【００３０】
組換えポリシストロニック核酸分子は、ＤＮＡ（たとえばプラスミドもしくはウイルスＤＮＡ）またはＲＮＡなどの任意の所望の核酸に基づくものであり得る。任意の適したＤＮＡまたはＲＮＡは、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを持つ核酸ベクターとして使用することができる。適した核酸ベクターは、１つを超えるタンパク質遺伝子を持ち、その発現を駆動するための能力を有する。そのような核酸ベクターは、当技術分野において公知であり、たとえばプラスミド、ワクシニアウイルスベクター（たとえばＮＹＶＡＣ、米国特許第５，４９４，８０７号を参照されたい）およびポックスウイルスベクター（たとえばＡＬＶＡＣカナリアポックスベクター、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）などのＤＮＡウイルスから得られるＤＮＡ、ならびにアルファウイルスなどの適したＲＮＡウイルスから得られるＲＮＡを含む。所望の場合、組換えポリシストロニック核酸分子は、修飾することができる、たとえば、本明細書においてさらに記載される修飾核酸塩基および／または連結を含有することができる。好ましくは、ポリシストロニック核酸分子は、ＲＮＡ分子である。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明は、ヘルペスウイルスｇＨまたはその断片およびヘルペスウイルスｇＬまたはその断片をコードする配列を含有するポリシストロニック核酸分子である。ｇＨおよびｇＬタンパク質またはその断片は、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ１型、ＥＢＶ２型、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６  Ａ型、ＨＨＶ−６  Ｂ型、ＨＨＶ−７、ＫＳＨＶ、およびその他同種のものなどの任意の所望のヘルペスウイルス由来のものであり得る。好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺＶ、ＨＳＶ−２、ＨＳＶ−１、ＥＢＶ（１型もしくは２型）、またはＣＭＶである。より好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺＶ、ＨＳＶ−２、またはＣＭＶである。さらにより好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＣＭＶである。ｇＨおよびｇＬタンパク質ならびにこれらのウイルス由来のタンパク質をコードする核酸の配列は、当技術分野において周知である。例示的な配列は、表１で特定される。ポリシストロニック核酸分子は、表１に開示されるｇＨタンパク質をコードする第１の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含有することができる。ポリシストロニック核酸分子はまた、表１に開示されるｇＬタンパク質をコードする第２の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列をも含有することができる。
【００３２】
【表１】
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本発明の本記載において、特定の配列成分は、核酸の明確な記載を容易にするために「第１の配列」、「第２の配列」などと呼ばれる。第１および第２の配列は、任意の所望の順序または方向で現れ得、特定の順序または方向は、「第１の」、「第２の」などの語によって意図されないことが理解される。同様に、タンパク質複合体は、複合体において存在するタンパク質、たとえばｇＨ／ｇＬを列挙することによって言及される。これは、複合体において存在するタンパク質によって複合体を記載するように意図され、タンパク質の相対量または組換え核酸上でタンパク質をコードする配列の順序もしくは方向を示すものではない。
【００３３】
ＣＭＶタンパク質をコードする配列を含有するアルファウイルスＶＲＰおよび自己複製ＲＮＡなどのある種の好ましい実施形態は、本明細書においてさらに記載される。そのような好ましい実施形態におけるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、他のヘルペスウイルス由来のｇＨおよびｇＬなどの、他の病原体に由来するタンパク質をコードする配列と交換することができることが意図される。
【００３４】
アルファウイルスＶＲＰプラットフォーム
いくつかの実施形態では、ＣＭＶタンパク質は、下記に記載されるポリシストロニックレプリコン（またはベクター）を用いるアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を使用して、細胞に送達される。本明細書において使用されるように、「ポリシストロニック」は、４つ以上のシストロンを含むベクターを含む。ポリシストロニックベクターにおけるシストロンは、同じＣＭＶ株または異なるＣＭＶ株由来のＣＭＶタンパク質をコードすることができる。シストロンは、任意の５’−３’の順序で方向づけることができる。ＣＭＶタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列は、タンパク質を産生するために使用することができる。２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードするポリシストロニック核酸を調製するのに有用な例示的な配列は、本明細書において記載される。
【００３５】
本明細書において使用されるように、用語「アルファウイルス」は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ；たとえばＴｒｉｎｉｄａｄ  ｄｏｎｋｅｙ、ＴＣ８３ＣＲなど）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイルス、バーマ森林ウイルス、ミッデルブルグウイルス、ピクスナウイルス、オニオニオンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ユナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルス（Ｂａｎｂａｎｋｉ  ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ヌドゥムウイルス、およびバギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ  ｖｉｒｕｓ）などの様々な種を含む。
【００３６】
「アルファウイルスレプリコン粒子」（ＶＲＰ）または「レプリコン粒子」は、アルファウイルス構造タンパク質によりパッケージされたアルファウイルスレプリコンである。
【００３７】
「アルファウイルスレプリコン」（または「レプリコン」）は、標的細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれ自体の増幅を指示することができるＲＮＡ分子である。レプリコンは、ＲＮＡ増幅を触媒するポリメラーゼ（複数可）（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードし、コードされるポリメラーゼ（複数可）によって認識され、利用される、複製に必要とされるシスＲＮＡ配列を含有する。アルファウイルスレプリコンは、典型的に、次の順序付けられたエレメントを含有する：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、およびポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）。アルファウイルスレプリコンはまた、異種ヌクレオチド配列の発現を指示する１つまたは複数のウイルスサブゲノム「ジャンクション領域」プロモーターを含有してもよく、これは、ある実施形態において、発現されることとなるサブゲノム断片および異種配列（複数可）のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾されてもよい。下記に記載される他の制御エレメントを使用することができる。
【００３８】
ＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンは、ＶＲＰを産生するために使用され得る。そのようなアルファウイルスレプリコンは、少なくとも２つのＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする配列を含む。これらの配列は、同じまたは異なるものであり得る、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳ（たとえばＥＭＣＶ、ＥＶ７１）、およびウイルス２Ａ部位などの１つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結されている。本明細書において開示されるポリシストロニックベクターを使用するこれらの複合体の成分の送達は、所望の相対量で２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする核酸配列を提供するための効率的な方法であるのに対して、複数のアルファウイルス構築物が、複合体形成のための個々のＣＭＶタンパク質を送達するために使用される場合、ＶＲＰの効率的な同時送達が、必要とされるであろう。
【００３９】
適した制御エレメントの任意の組み合わせもまた、任意の順序で使用することができる。好ましくは、ＣＭＶタンパク質をコードする各配列は、サブゲノムプロモーターなどの別個のプロモーターに作動可能に連結されている。
【００４０】
サブゲノムプロモーター
ジャンクション領域プロモーターとしても公知であるサブゲノムプロモーターは、タンパク質発現を調節するために使用することができる。アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質の発現を調節する。ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ、「Ｔｈｅ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ：  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９４年  ９月；５８巻（３号）：４９１〜５６２頁を参照されたい。ポリシストロニックポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来のサブゲノムプロモーターを含むことができる。２つ以上のサブゲノムプロモーターがポリシストロニックポリヌクレオチドにおいて存在する場合、そのプロモーターは、同じかまたは異なるものであり得る。たとえば、サブゲノムプロモーターは、配列ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡ（配列番号１）を有することができる。ある実施形態では、サブゲノムプロモーターは、タンパク質のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾することができる。米国特許第６，５９２，８７４号を参照されたい。
【００４１】
内部リボソーム導入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の制御エレメントは、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、複数のタンパク質が単一のｍＲＮＡ転写物から作製されるのを可能にする。なぜなら、リボソームがそれぞれのＩＲＥＳに結合し、翻訳を開始するために通常必要とされる５’キャップの非存在下において翻訳を開始するからである。たとえば、ＩＲＥＳは、ＥＶ７１またはＥＭＣＶであり得る。
【００４２】
ウイルス２Ａ部位
ＦＭＤＶ  ２Ａタンパク質は、非構造タンパク質（ＦＭＤＶ  ２Ｂ）からＦＭＤＶの構造タンパク質を隔てるための役目をする短いペプチドである。このペプチドに対する初期の研究は、それが自己触媒プロテアーゼとして作用することを示唆したが、他の研究（たとえばＤｏｎｎｅｌｌｙら、（２００１年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２巻、１０１３〜１０２５頁）は、この短い配列およびこれに続くＦＭＤＶ  ２Ｂの単一のアミノ酸（Ｇｌｙ）が、翻訳の停止−開始点（ｓｔｏｐ−ｓｔａｒｔ）として作用することを示唆する。厳密な作用様式にかかわらず、配列を、２つのポリペプチドの間に挿入し、単一のオープンリーディングフレームからの複数の個々のポリペプチドの産生に影響を与えることができる。本発明との関連において、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列を、少なくとも２つのＣＭＶタンパク質をコードする配列の間に挿入することができ、単一のオープンリーディングフレームの一部としてそれらの合成を可能にする。たとえば、オープンリーディングフレームは、ウイルス２Ａ部位をコードする配列によって隔てられたｇＨタンパク質およびｇＬタンパク質をコードしてもよい。単一のｍＲＮＡは、その後、翻訳ステップの間に転写され、ｇＨおよびｇＬペプチドは、ウイルス２Ａ部位の活性により別々に産生される。任意の適したウイルス２Ａ配列が使用されてもよい。多くの場合、ウイルス２Ａ部位は、コンセンサス配列Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である（配列番号２）。たとえば、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド配列は、ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３）である。Ｔｒｉｃｈａｓら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」  ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２００８年９月１５日；６巻：４０頁およびＨａｌｐｉｎら、「Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ２Ａ−ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ−−ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ」  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９年２月；１７巻（４号）：４５３〜９頁を参照されたい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、ＶＥＥ−シンドビスキメラレプリコン（ＶＣＲ）またはＶＥＥ株ＴＣ８３レプリコン（ＴＣ８３Ｒ）またはＴＣ８３−シンドビスキメラレプリコン（ＴＣ８３ＣＲ）などのキメラレプリコンである。いくつかの実施形態では、ＶＣＲは、ＶＥＥレプリコンのｎｓＰ３における配列の代わりに、また３’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを含有する；Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻、１０３９４〜４０３頁、２００３年を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣ８３ＣＲは、ＶＥＥ株ＴＣ８３レプリコンのｎｓＰ３における配列の代わりに、また３’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを含有する。
【００４４】
ＶＲＰの産生
ＶＲＰを調製するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、パッケージング細胞を使用してＶＲＰに構築される。「アルファウイルスパッケージング細胞」（または「パッケージング細胞」）は、１つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含有し、アルファウイルスレプリコン、真核生物層状ベクター開始系（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（たとえば米国特許第５，８１４，４８２号）、または組換えアルファウイルス粒子の導入後に組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞である。１つまたは複数の異なるアルファウイルス構造タンパク質カセットは、アルファウイルス構造タンパク質を提供することによって「ヘルパー」としての役目をする。「アルファウイルス構造タンパク質カセット」は、１つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、アルファウイルスレプリカーゼ認識配列の少なくとも１つ、５つまでのコピー（つまり１、２、３、４、または５）を含む発現カセットである。構造タンパク質発現カセットは、典型的に、５’から３’に、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、任意選択のアルファウイルスサブゲノム領域プロモーター、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（これはまた、ＲＮＡ転写をも指示する）、およびポリＡトラクト（ｐｏｌｙＡ  ｔｒａｃｔ）を含む。たとえば、国際公開第２０１０／０１９４３７号を参照されたい。
【００４５】
好ましい実施形態では、２つの異なるアルファウイルス構造タンパク質カセット（「分割された」不完全ヘルパー）は、複製能力のあるウイルスを産生し得る組換え事象を最小限にするために、パッケージング細胞において使用される。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質（Ｃ）をコードするが、どちらの糖タンパク質（Ｅ２およびＥ１）もコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質およびＥ１またはＥ２糖タンパク質のいずれか（両方ではない）をコードする。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質をコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、Ｅ１またはＥ２糖タンパク質（両方ではない）をコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、様々な供給源の細胞の中へのレプリコンおよびヘルパーＲＮＡの同時の導入によって産生される。これらの条件下で、たとえば、ＢＨＫＶ細胞（１×１０７）は、１０μｇレプリコンＲＮＡ：６μｇ不完全ヘルパーＣａｐ  ＲＮＡ：１０μｇ不完全ヘルパーＧｌｙ  ＲＮＡを、たとえば２２０ボルト、１０００μＦ、２つの手動のパルスでエレクトロポレーションされ、アルファウイルス含有上清は、約２４時間後に収集される。レプリコンおよび／またはヘルパーはまた、トランスフェクトされた細胞内に適したＲＮＡを送り出すＤＮＡ形態で導入することもできる。
【００４７】
パッケージング細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞（たとえばＳＦ９）またはトリの細胞（たとえば初代ニワトリもしくはアヒル線維芽細胞もしくは線維芽細胞細胞株）などの非哺乳動物細胞であってもよい。米国特許第７，４４５，９２４号を参照されたい。細胞のトリの供給源は、ＥＢ６６（登録商標）（ＶＩＶＡＬＩＳ）などのトリの胚性幹細胞；ＥＢｘ（登録商標）細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞、およびニワトリ胚性生殖細胞などのニワトリ胚性幹細胞を含むニワトリ細胞；たとえばＶａｃｃｉｎｅ  ２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）および国際公開第２００５／０４２７２８号において記載されるＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）などのアヒル細胞；ならびにガチョウ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ＡＧＥ．ＣＲ（ＰＲＯＢＩＯＧＥＮ）などの初代アヒル線維芽細胞またはアヒル網膜細胞株である。
【００４８】
同時の核酸導入および／またはパッケージング細胞のための細胞の哺乳動物の供給源は、たとえば国際公開第０１／３８３６２号および国際公開第０２／４０６６５号において記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０下で寄託されるＰｅｒＣ６（ＰＥＲ．Ｃ６）細胞（ＣＲＵＣＥＬＬ  Ｎ．Ｖ．）；ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）；ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）；ヒト胎児腎臓細胞（たとえば剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換された２９３細胞）；サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞を含むヒトまたは非ヒト霊長類細胞；ウマ、ウシ（たとえばＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（たとえば、国際公開第９７／３７００１号において記載されるようなイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、またはＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）の細胞；ネコ、ならびにげっ歯類（たとえば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などのハムスター細胞）を含むが、これらに限定されず、たとえば成体、新生児、胎児、および胚を含む種々様々の発生段階から取得され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、１つまたは複数の構造タンパク質発現カセット（複数可）により安定して形質転換される。構造タンパク質発現カセットは、トランスフェリン−ポリカチオン媒介性のＤＮＡ移行（ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、裸の核酸または被包された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性の細胞融合、ＤＮＡでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」法、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションを含む、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞の中に導入することができる。構造タンパク質発現カセットは、ＤＮＡ分子として宿主細胞の中に典型的に導入されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡとして導入することもできる。発現カセットはそれぞれ、別々にまたは実質的に同時に導入することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、安定したアルファウイルスパッケージング細胞株は、組換えアルファウイルス粒子を産生するために使用される。これらは、それらのゲノムの中に安定して組み込まれる不完全ヘルパーＲＮＡを発現するＤＮＡカセットを含むアルファウイルス許容細胞である。Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６巻、４５９８〜６０３頁、１９９９年を参照されたい。ヘルパーＲＮＡは、構成的に発現されるが、アルファウイルス構造タンパク質は、遺伝子がアルファウイルスサブゲノムプロモーターの制御下にあるので、そうではない（Ｐｏｌｏら、１９９９年）。トランスフェクションまたはＶＲＰ感染によるパッケージング細胞のゲノムの中へのアルファウイルスレプリコンの導入に際して、レプリカーゼ酵素は、産生され、ヘルパーＲＮＡ上でカプシドおよび糖タンパク質遺伝子の発現を引き起こし、結果としてＶＲＰが産生される。レプリコンの導入は、アルファウイルスレプリコン粒子のシードストックによるトランスフェクションおよび感染の両方を含む様々な方法によって達成することができる。その後、パッケージング細胞は、培養上清中にパッケージされたアルファウイルスレプリコン粒子を産生するのに十分な条件下でかつ十分な時間、インキュベートされる。
【００５１】
したがって、パッケージング細胞は、ＶＲＰが自己増殖ウイルスとして作用するのを可能にする。この技術は、ＶＲＰが、弱毒化生ワクチンまたはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現する細胞において成長させた複製能力がないアデノウイルスベクターなどの入手可能なプロデューサー細胞株を有する他のウイルスベクターに使用されるものとほとんど同じ様式で、また同じ設備を使用して産生されるのを可能にする。
【００５２】
いくつかの実施形態では、２ステップのプロセスが、使用され、第１のステップは、レプリコンＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンによりパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってアルファウイルスレプリコン粒子のシードストックを産生することを含む。その後、レプリコン粒子のはるかに多くのストックは、シードストックによりパッケージング細胞の新鮮な培養物を感染させることによって、第２のステップにおいて産生される。この感染は、ＭＯＩ＝０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、３、５、１０、または２０を含む、様々な感染多重度（ＭＯＩ）を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、感染は、低いＭＯＩ（たとえば１未満）で実行される。ある期間にわたって、レプリコン粒子は、シードストックにより感染させたパッケージング細胞から収集することができる。いくつかの実施形態では、その後、レプリコン粒子は、繰り返しの低多重度の感染によって、ナイーブパッケージング細胞のさらにより多くの培養物において継代され得、同一の高い力価を有する商業規模の調製物をもたらすことができる。
【００５３】
自己複製ＲＮＡプラットフォーム
４つ以上のＣＭＶタンパク質は、被験体の細胞における、タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって産生することができる。好ましくは、組換え核酸分子は、４つ以上のＣＭＶタンパク質をコードし、たとえばこれらはポリシストロニックである。ＣＭＶタンパク質の産生を引き起こすために被験体に投与することができる好ましい核酸は、自己複製ＲＮＡ分子である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基づくが、１つまたは複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＲＮＡウイルスの非構造タンパク質およびＣＭＶタンパク質を産生するために翻訳することができる。
【００５４】
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’および３’末端シス活性複製配列ならびに２つ以上の所望のＣＭＶタンパク質をコードする異種配列を含む。異種配列（複数可）の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に含むことができる。所望の場合、異種配列は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで融合されてもよいおよび／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあってもよい。
【００５５】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮＡにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子が、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子は、取り除くことができる。所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【００５６】
自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆるタンパク質がなくても、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、コードされるＣＭＶタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよいまたはコードされるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を提供するために翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有する転写物をさらに提供するために転写されてもよい。
【００５７】
自己複製を達成するのに適したある系は、本明細書において記載されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの＋鎖レプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を生じるために細胞に送達した後に翻訳される。レプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム−鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの−鎖転写物は、＋鎖の親ＲＮＡのコピーをさらに提供するために、また、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードするサブゲノム転写物をも生じさせるために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞によるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【００５８】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。
【００５９】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードするわけではないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物（ＣＭＶタンパク質またはその断片）をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【００６０】
したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、異なるＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする４つ以上の配列を有する。ＣＭＶタンパク質または断片をコードする配列は、任意の所望の方向とすることができ、同じまたは別々のプロモーターに作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、たとえば他の追加のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする、１つまたは複数の追加の（下流）配列またはオープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができる。
【００６１】
一態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、本明細書において定義されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【００６２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有し、そのため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて改善された安定性を有し、分解およびクリアランスに対して抵抗性であり、また他の利点を有することができる。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡが細胞に送達される場合、エンドソームおよび細胞質内免疫受容体の刺激を回避するまたは低下させると考えられる。これは、自己複製、増幅、およびタンパク質の発現が起こるのを可能にする。修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡが、自然免疫系の活性化および続く望まれない結果（たとえば注射部位の炎症、注射部位の刺激、痛み、およびその他同種のもの）を低下させるので、これはまた、修飾ヌクレオチドを含有しない自己複製ＲＮＡに関する安全性の問題をも低下させる。自己複製の結果として産生されるＲＮＡ分子が、細胞質内免疫受容体によって外来核酸として認識されることもまた、考えられる。したがって、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞におけるＲＮＡの効率的な増幅およびＣＭＶタンパク質の発現ならびにアジュバント効果を提供する。
【００６３】
ＲＮＡ配列は、たとえば、ＲＮＡの翻訳の有効性および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾されてもよい。ポリＡテイル（たとえば約３０アデノシン残基以上の（配列番号４６））は、その半減期を延長させるためにＲＮＡの３’末端に付加されてもよい。ＲＮＡの５’末端は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する修飾リボヌクレオチドまたはその誘導体によりキャップされてもよく、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込むことができるまたはＲＮＡ転写後に酵素により操作することができる（たとえば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒する、ｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼ（ｇｕａｎｉｎｅ−７−ｍｅｔｈｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）から成るワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子に対して、安定性および翻訳の有効性を提供することができる。ＲＮＡ分子の５’キャップは、翻訳の有効性をさらに増大させ得るキャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成をもたらす２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよい。
【００６４】
本明細書において使用されるように、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の窒素を含む塩基においてまたはその塩基上に１つまたは複数の化学修飾（たとえば置換）を含有するヌクレオチドを指す。所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ヌクレオシドの糖部分（たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員環糖アナログ、もしくは鎖状糖アナログ）またはホスフェート中にまたはその上に化学修飾を含有することができる。
【００６５】
自己複製ＲＮＡ分子は、好ましくは５’キャップの一部ではない、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有することができる。したがって、自己複製ＲＮＡ分子は、単一の位置に修飾ヌクレオチドを含有することができるか、２つ以上の位置に特定の修飾ヌクレオチド（たとえばプソイドウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含有することができるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる（たとえば、それぞれ１つもしくは複数の位置に）。好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、窒素を含む塩基上にまたはその中に修飾を含有するが、修飾糖部分または修飾ホスフェート部分を含有しない修飾ヌクレオチドを含む。
【００６６】
いくつかの例では、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの０．００１％〜９９％または１００％は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの０．００１％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５％、または１％〜２５％は、修飾ヌクレオチドである。
【００６７】
他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定の未修飾ヌクレオチドの０．００１％〜９９％または１００％は、修飾ヌクレオチドと交換される。たとえば、ウリジンを含有する自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの約１％は、ウリジンのプソイドウリジンとの交換によってなどのように、修飾することができる。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における所望の量（パーセンテージ）の２、３、または４つの特定のヌクレオチド（ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニンを含有するヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００１％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５、または１％〜２５％は、修飾ヌクレオチドである。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００１％〜２０％、０．００１％〜１５％、０．００１％〜１０％、０．０１％〜２０％、０．０１％〜１５％、０．１％〜２５、０．０１％〜１０％、１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、または約５％、約１０％、約１５％、約２０％は、修飾ヌクレオチドである。
【００６８】
自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの１００％未満が、修飾ヌクレオチドであることが好ましい。自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの１００％未満が、修飾ヌクレオチドであることもまた好ましい。したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、少なくともいくつかの未修飾ヌクレオチドを含む。
【００６９】
哺乳動物ＲＮＡ上に見つけられる９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾がある。たとえばＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照されたい。ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製物は、当技術分野において、たとえば、すべてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４３７３０７１号、第４４５８０６６号、第４５００７０７号、第４６６８７７７号、第４９７３６７９号、第５０４７５２４号、第５１３２４１８号、第５１５３３１９号、第５２６２５３０号、第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが、市販で入手可能である。
【００７０】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子において存在することができる修飾核酸塩基は、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミルシチジン（ｆｏｎｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）））；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（非修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クエオシン）；ｏＱ（エポキシクエオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシル−クエオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕを含む。これらの修飾核酸塩基のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、本発明の自己複製ＲＮＡ中に含まれてもよい。これらの修飾核酸塩基およびそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、民間の供給者から入手可能である。
【００７１】
所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、および／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。
【００７２】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を産生するためのいくつかの適した方法は、当技術分野において公知である。たとえば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ、およびその他同種のものまたはＲＮＡ分子への修飾ヌクレオチドの効率的な組み込みを可能にするポリメラーゼの突然変異体などの適したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写すること（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）によって、調製することができる。転写反応は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに適した緩衝剤および適した塩などの、選択されるポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有するであろう。自己複製ＲＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込みは、たとえば、そのようなＲＮＡ分子の安定性を改変するために、ＲＮアーゼに対する抵抗性を増大させるために、適切な宿主細胞に導入した後に複製を確立するために（ＲＮＡの「感染性」）、ならびに／または自然および適応免疫応答を誘発するもしくは低下させるために操作されてもよい。
【００７３】
適した合成方法は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子を産生するために、単独でまたは１つもしくは複数の他の方法（たとえば組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ技術）と組み合わせて使用することができる。デノボ合成に適した方法は、当技術分野において周知であり、特定の用途に適合させてもよい。例示的な方法は、たとえば、ＣＥＭなどの適した保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら、（２００７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１巻：３〜４頁）、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９巻：２６１９〜２２頁）を含む。これらの化学反応は、実行することができるまたは市販で入手可能な自動核酸合成装置との使用に適合させることができる。追加の適した合成方法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０巻：５４４〜８４頁およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １巻：１６５頁において開示される。核酸合成はまた、ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物のクローニング、プロセシング、ならびに／または発現を含む、当技術分野において周知であり通常の適した組換え法を使用して実行することができる。無作為の断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計し、操作するために使用することができる公知の技術の例である。部位特異的突然変異誘発は、核酸およびコードされるタンパク質を改変するために、たとえば、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドン優先度（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させる、スプライスバリアントを産生する、突然変異を導入する、およびその他同種のもののために、使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現に適した方法は、当技術分野において公知であり、通常のものである。（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．、第３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２年；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照されたい）。
【００７４】
自己複製ＲＮＡ分子における１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡは、モノホスフェートに消化され得（たとえば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化することができ（たとえば、ＣＩＡＰなどの適したホスファターゼを使用して）、結果として生じるヌクレオシドは、逆相ＨＰＬＣ（たとえばＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配、３０％Ｂ（０〜５分）〜１００％Ｂ（５〜１３分）を使用し、１００％Ｂ（１３〜４０）分、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）で溶離することによって分析することができる。緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５）、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］））。
【００７５】
自己複製ＲＮＡは、送達系と結合させてもよい。自己複製ＲＮＡは、アジュバントと共にまたはなしで、投与されてもよい。
【００７６】
ＲＮＡ送達系
本明細書において記載される自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への侵入を容易にする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせたものなどの様々なモダリティーの送達に適している。自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した技術を使用して、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）、およびその他同種のものによって、標的細胞または被験体の中に導入することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号５）を有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン（配列番号４））に核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。
【００７７】
自己複製ＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【００７８】
自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえば単にＲＮＡの水溶液として）送達することができるが、細胞への侵入およびまた続く細胞間の効果をも増強するために、自己複製ＲＮＡは、好ましくは、微粒子またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与される。多くの送達系は、当業者らに周知である。そのような送達系は、たとえばリポソームベースの送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３年）国際公開第９３／２４６４０号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻（７号）：６８２〜６９１頁；Ｒｏｓｅ  米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１年）ＷＯ  ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４巻：７４１３〜７４１４頁）ならびにウイルスベクターの使用（たとえばアデノウイルス（たとえばＢｅｒｎｓら（１９９５年）Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７７２巻：９５〜１０４頁；Ａｌｉら（１９９４年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１巻：３６７〜３８４頁；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻（Ｐｔ  ３）：２９７〜３０６頁を検討のために参照されたい）、パピローマウイルス、レトロウイルス（たとえばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）２７３１〜２７３９頁；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０年）Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３年）ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版  Ｐａｕｌ（編）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中の参考文献、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）前掲を参照されたい）、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０巻：３８〜４７頁；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９年）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら  ＷＯ  ９３／２４６４１（１９９３年）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：７９３〜８０１頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｓｔ．９４巻：１３５１頁、およびＳａｍｕｌｓｋｉ（前掲）をＡＡＶベクターの概要について参照されたい；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５巻（１１号）：３２５１〜３２６０頁；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，４巻：２０７２〜２０８１頁；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６４６６〜６４７０頁��ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁もまた、参照されたい）、ならびにその他同種のものを含む。
【００７９】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
【００８０】
リポソーム
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。
【００８１】
リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。
【００８２】
脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁において開示されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【００８３】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、リポソームを形成するために使用することができる。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包する。
【００８４】
リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。
【００８５】
適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁．）。
【００８６】
ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性ＲＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（たとえばリポソームの表面上に）が、好ましくは、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、実質的にそのすべて）は、被包される。
【００８７】
ポリマー微粒子
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を調製するのを支援するために滅菌することもできる。
【００８８】
適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを含む。
【００９０】
微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【００９１】
適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：２４７〜２５１頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。
【００９２】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。ＲＮＡは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオン性脂質）を含めることによって容易になる。
【００９３】
水中油型カチオン性エマルジョン
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、ＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンの使用により達成することができる。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。
【００９４】
エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【００９５】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。
【００９６】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【００９７】
好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）。
【００９８】
エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。
【００９９】
エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１００】
エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２ＢＵ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリＬ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ＾ＧｌｕＰｈＣｎＮ）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃｌ４ＧＩｕＣｎＮ＋）を含むが、これらに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ  ２００８／００８５８７０およびＵＳ  ２００８／００５７０８０において記載される。カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【０１０１】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１０２】
これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【０１０３】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【０１０４】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。
【０１０５】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比は、典型的である（過剰な油）。
【０１０６】
エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。
【０１０７】
理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ以下の多分散性を有する。
【０１０８】
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションの使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。
【０１０９】
マイクロフルイダイゼーションの代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。
【０１１０】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。
【０１１１】
ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【０１１２】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【０１１３】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【０１１４】
カテーテルまたは同様のデバイスは、標的器官または組織の中に、裸のＲＮＡとしてまたは送達系と組み合わせて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を送達するために使用されてもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，１８６，７４５号；第５，３９７，３０７号；第５，５４７，４７２号；第５，６７４，１９２号；および第６，１２９，７０５号において開示される。
【０１１５】
本発明は、単独でまたは他の高分子と組み合わせて、たとえば、免疫応答を引き起こすために、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を送達するために、被包されたまたは吸着された自己複製ＲＮＡを有するリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適した送達系の使用を含む。本発明は、吸着されたおよび／または被包された自己複製ＲＮＡ分子を有するリポソーム、微粒子、およびサブミクロンエマルジョンならびにその組み合わせを含む。
【０１１６】
リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と結合した自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞に有効に送達することができ、自己複製ＲＮＡによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる。
【０１１７】
ＣＭＶタンパク質をコードするポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子およびポリシストロニックアルファウイルスレプリコンを使用して産生されるＶＲＰは、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成するために使用することができる。複合体は、ｇＢ／ｇＨ／ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ；ｇＭ／ｇＮ；ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１；およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＶＲＰの組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、１．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ；
２．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよびｇＢ  ＶＲＰ；
３．ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰおよびｇＢ  ＶＲＰ；
４．ｇＢ  ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
５．ｇＢ  ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
６．ｇＢ  ＶＲＰおよびｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ；
７．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
８．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬｇＯ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
９．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
１０．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ／Ｏ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
１１．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ
を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子の組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、
１．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
２．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
３．ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
４．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
５．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
６．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
７．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
８．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
９．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１０．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１１．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子
を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
ＣＭＶタンパク質
適したＣＭＶタンパク質は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１を含み、任意のＣＭＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ、ＡＤ１６９、ＶＲ１８１４、Ｔｏｗｎｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、ＴＲ、ＰＨ、ＴＢ４０、またはＦｉｘ株由来のものであり得る。例示的なＣＭＶタンパク質および断片は、本明細書において記載される。これらのタンパク質および断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）かまたはコドン脱最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＭＶタンパク質およびそれらのタンパク質をコードする核酸の例示的な配列は、表２において提供される。
【０１２１】
【表２】
0006305925.tif 000003
ＣＭＶ  ｇＢタンパク質
ｇＢタンパク質は、完全長であり得るかまたはタンパク質の１つもしくは複数の領域を取り除くことができる。その代わりに、ｇＢタンパク質の断片を使用することができる。ｇＢアミノ酸は、９０７アミノ酸長である配列番号７において示される完全長ｇＢアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＢ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。完全長タンパク質から除くことができるまたは断片として含むことができるｇＢタンパク質の適した領域は、シグナル配列（アミノ酸１〜２４）、ｇＢ−ＤＬＤディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸５７〜１４６）、フューリン切断部位（アミノ酸４５９〜４６０）、７アミノ酸繰り返し領域（アミノ酸６７９〜６９３）、膜通過ドメイン（アミノ酸７５１〜７７１）、およびアミノ酸７７１〜９０６由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｇＢタンパク質は、アミノ酸６７〜８６（中和エピトープＡＤ２）および／またはアミノ酸５３２〜６３５（免疫優性エピトープＡＤ１）を含む。ｇＢ断片の具体例は、ｇＢの最初の６９２アミノ酸を含む「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」およびｇＢの最初の７５０アミノ酸を含む「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」を含む。シグナル配列、アミノ酸１〜２４は、所望されるように、ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２およびｇＢ  ｓｏｌ  ７５０に存在してもよいまたは存在しなくてもよい。任意選択で、ｇＢタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＢ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、または８７５アミノ酸を含むことができる。ｇＢ断片は、残基番号：
【０１２２】
【化１】
0006305925.tif 000004
【０１２３】
【化２】
0006305925.tif 000005
のいずれからでも始まり得る。
【０１２４】
任意選択で、ｇＢ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＢ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１２５】
ＣＭＶ  ｇＨタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、完全長ｇＨタンパク質（たとえば、７４３アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＨ  ＦＬ、配列番号１３）である。ｇＨは、７１６位から出発して７４３位までの膜通過ドメインおよび細胞質ドメインを有する。７１７〜７４３のアミノ酸の除去により、可溶性ｇＨ（たとえばＣＭＶ  ｇＨ  ｓｏｌ、配列番号１５）が提供される。いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、または７２５アミノ酸を含むことができる。任意選択で、ｇＨタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、または７２５アミノ酸を含むことができる。ｇＨ断片は、残基番号：
【０１２６】
【化３】
0006305925.tif 000006
【０１２７】
【化４】
0006305925.tif 000007
のいずれからでも始まり得る。
【０１２８】
ｇＨ残基は、配列番号１３において示される完全長ｇＨアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＨ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１２９】
ＣＭＶ  ｇＬタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＬタンパク質は、完全長ｇＬタンパク質（たとえば、２７８アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＬ  ＦＬ、配列番号１７）である。いくつかの実施形態では、ｇＬ断片を使用することができる。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０アミノ酸を含むことができる。ｇＬ断片は、残基番号：
【０１３０】
【化５】
0006305925.tif 000008
のいずれからでも始まり得る。
【０１３１】
ｇＬ残基は、配列番号１７において示される完全長ｇＬアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＬ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３２】
ＣＭＶ  ｇＯタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＯタンパク質は、完全長ｇＯタンパク質（たとえば、４７２アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＯ  ＦＬ、配列番号２３）である。いくつかの実施形態では、ｇＯタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＯ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、または４５０アミノ酸を含むことができる。ｇＯ断片は、残基番号：
【０１３３】
【化６】
0006305925.tif 000009
のいずれからでも始まり得る。
【０１３４】
ｇＯ残基は、配列番号２３において示される完全長ｇＯアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＯ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３５】
ＣＭＶ  ｇＭタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＭタンパク質は、完全長ｇＭタンパク質（たとえば、３７１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＭ  ＦＬ、配列番号１９）である。いくつかの実施形態では、ｇＭタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＭ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０アミノ酸を含むことができる。ｇＭ断片は、残基番号：
【０１３６】
【化７】
0006305925.tif 000010
のいずれからでも始まり得る。
【０１３７】
ｇＭ残基は、配列番号１９において示される完全長ｇＭアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＭ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３８】
ＣＭＶ  ｇＮタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＮタンパク質は、完全長ｇＮタンパク質（たとえば、１３５アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＮ  ＦＬ、配列番号２１）である。いくつかの実施形態では、ｇＮタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＮ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１２５アミノ酸を含むことができる。ｇＮ断片は、残基番号：
【０１３９】
【化８】
0006305925.tif 000011
のいずれからでも始まり得る。
【０１４０】
ｇＮ残基は、配列番号２１において示される完全長ｇＮアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＮ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４１】
ＣＭＶ  ＵＬ１２８タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、完全長ＵＬ１２８タンパク質（たとえば、１７１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１２８  ＦＬ、配列番号２５）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１２８断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、または１５０アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１２８断片は、残基番号：
【０１４２】
【化９】
0006305925.tif 000012
のいずれからでも始まり得る。
【０１４３】
ＵＬ１２８残基は、配列番号２５において示される完全長ＵＬ１２８アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１２８  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１２８断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１２８断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４４】
ＣＭＶ  ＵＬ１３０タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、完全長ＵＬ１３０タンパク質（たとえば、２１４アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１３０  ＦＬ、配列番号２７）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１３０断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３０断片は、残基番号：
【０１４５】
【化１０】
0006305925.tif 000013
のいずれからでも始まり得る。
【０１４６】
ＵＬ１３０残基は、配列番号２７において示される完全長ＵＬ１３０アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１３０  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３０断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３０断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４７】
ＣＭＶ  ＵＬ１３１タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、完全長ＵＬ１３１タンパク質（たとえば、１２９アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１３１、配列番号２９）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１３１断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３１断片は、残基番号：
【０１４８】
【化１１】
0006305925.tif 000014
のいずれからでも始まり得る。
【０１４９】
ＵＬ１３１残基は、配列番号２９において示される完全長ＵＬ１３１アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１３１  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３１断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３１断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１５０】
上記に述べられるように、アルファウイルスＶＲＰおよびＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する自己複製ＲＮＡなどのある好ましい実施形態の前述の記載は、本発明の例証となるが、本発明の範囲を限定するものではない。そのような好ましい実施形態におけるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨＶ−４、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８などの他のヘルペスウイルス由来のｇＨおよびｇＬまたは１０アミノ酸長以上のその断片などのタンパク質をコードする配列と交換することができることが十分に理解されるであろう。たとえば、適したＶＺＶ（ＨＨＶ−３）タンパク質は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、およびｇＬならびに１０アミノ酸長以上のその断片を含み、任意のＶＺＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＶＺＶタンパク質またはその断片は、ＶＺＶのｐＯｋａ、Ｄｕｍａｓ、ＨＪＯ、ＣＡ１２３、またはＤＲ株由来のものであり得る。これらの例示的なＶＺＶタンパク質およびその断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化されたかまたはコドン脱最適化された配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードすることができる。ＶＺＶタンパク質の例示的な配列は、本明細書において提供される。
【０１５１】
たとえば、一実施形態では、ポリシストロニック核酸分子は、ＶＺＶ  ｇＨタンパク質またはその断片をコードする第１の配列およびＶＺＶ  ｇＬタンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する。
【０１５２】
適した抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物などの病原体または腫瘍に由来するタンパク質およびペプチドを含む。自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得るウイルス性の抗原および免疫原は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス；ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（たとえば、麻疹ウイルス）など、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスなどのニューモウイルス；１〜４型パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、５型サルウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、へニパウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルス；真正痘瘡ウイルス（大痘瘡ウイルスおよび小痘瘡ウイルスを含むがこれらに限定されない）などのオルトポックスウイルスを含むＰｏｘｖｉｒｉｄａｅ科；ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）などのメタニューモウイルス；麻疹ウイルスなどのモルビリウイルス；エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、パレコウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなどのピコルナウイルス；１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、または３型ポリオウイルス、Ａ１〜２２型コックサッキーウイルスおよびＡ２４型コックサッキーウイルス、Ｂ１〜６型コックサッキーウイルス、１〜９型エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス、１１〜２７型ＥＣＨＯウイルス、および２９〜３４型ＥＣＨＯウイルス、ならびに６８〜７１型エンテロウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルスなど、オルソブニヤウイルスを含むブニヤウイルスなどのエンテロウイルス；リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス；クリミア−コンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのへパルナウイルス；ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどのトガウイルス（風疹ウイルス）；ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、（１、２、３、または４型）デングウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスなどのフラビウイルス；ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス；リッサウイルス（狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルス；ノーウォークウイルス、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスなどのＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス；ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）などのコロナウイルス；がんウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなどのレトロウイルス；オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルティウイルスなどのレオウイルス；Ｂ１９型パルボウイルスなどのパルボウイルス；デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）；Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）；Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、６型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６）、７型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ７）、および８型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ８）などのヒトヘルペスウイルス；パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびアレナウイルスなどのパポバウイルスに由来するタンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、抗原タンパク質は、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（また、大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知である）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）など、魚類に感染するウイルスに由来する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、抗原タンパク質は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、またはＰ．ｏｖａｌｅなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生虫に由来する。したがって、本発明は、マラリアに対する免疫化のために使用することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科の寄生虫、特にＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属の寄生虫、たとえばＬｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどのウオジラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）に由来する寄生虫に対する免疫応答を引き起こす。
【０１５５】
自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得る細菌性抗原および免疫原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．（たとえば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ（ボツリヌス中毒）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．（たとえば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓおよびＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ，）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（たとえば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａおよびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ（腸管毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、びまん性付着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ；尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）など）、および／または腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）など、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（腸チフス）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどに由来するタンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０１５６】
自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得る真菌性抗原および免疫原は、以下を含む皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）にタンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されない：
【０１５７】
【化１２】
0006305925.tif 000015
【０１５８】
【化１３】
0006305925.tif 000016
自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得る原虫性抗原および免疫原は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ属に由来するタンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０１５９】
自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得る植物性抗原および免疫原は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するタンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
適した抗原は、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｏｒｕｓ）、ノロウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エンテロウイルス（たとえば、７１型エンテロウイルス）、エボラウイルス、およびウシ下痢症ウイルスなどのウイルスに由来するタンパク質およびペプチドを含む。好ましくは、抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ４０、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域およびｔａｔ領域に由来するポリペプチドからなる群より選択される。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原タンパク質またはペプチドは、たとえば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの細菌に由来する。
【０１６１】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得るＨＩＶ抗原は、それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、１９９０年３月９日に出願された米国出願第４９０，８５８号、および欧州出願公開第１８１１５０号（１９８６年５月１４日）のほか、米国出願第６０／１６８，４７１号；同第０９／４７５，５１５号；同第０９／４７５，５０４号；および同第０９／６１０，３１３号において記載されている。
【０１６２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得るサイトメガロウイルス抗原は、それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８９，２２５号、１９８９年６月１６日に出願された米国出願第３６７，３６３号、およびＰＣＴ国際公開第８９／０７１４３号において記載されている。
【０１６３】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得るＣ型肝炎抗原は、それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／米国公開第８８／０４１２５号、欧州出願公開第３１８２１６号（１９８９年５月３１日）、１９８８年１１月１８日に出願された特願平１−５００５６５号、カナダ出願第５８３，５６１号、およびＥＰＯ公開第３８８，２３２号において記載されている。それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、１９９０年３月１６日に出願された欧州特許出願第９０／３０２８６６．０号、および１９８９年１２月２１日に出願された米国出願第４５６，６３７号、およびＰＣＴ／米国公開第９０／０１３４８号では、ＨＣＶ抗原の異なるセットが記載されている。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、上記抗原は、アレルゲンに由来する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ  ｖｅｎｏｍ  ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ  ｏｒ  ｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）。
【０１６５】
ある実施形態では、腫瘍免疫原もしくは腫瘍抗原またはがん免疫原もしくはがん抗原は、自己複製ＲＮＡ分子によりコードされ得る。ある実施形態では、腫瘍免疫原および腫瘍抗原は、ポリペプチドの腫瘍抗原または糖タンパク質の腫瘍抗原など、ペプチド含有腫瘍抗原である。
【０１６６】
本明細書における使用に適する腫瘍免疫原および腫瘍抗原は、ポリペプチド（たとえば、この範囲外の長さもまた一般的であるが、長さが８〜２０アミノ酸の範囲にわたり得る）、リポポリペプチド、および糖タンパク質を含むポリペプチド含有腫瘍抗原など、多種多様な分子を包含する。
【０１６７】
ある実施形態では、腫瘍免疫原は、たとえば、（ａ）がん細胞と関連する全長分子、（ｂ）欠失部分、付加部分、および／または置換部分を有する分子を含む、この全長分子の相同体および修飾形態、ならびに（ｃ）この全長分子の断片である。腫瘍免疫原は、たとえば、ＣＤ８＋リンパ球により認識されるクラスＩ拘束性抗原またはＣＤ４＋リンパ球により認識されるクラスＩＩ拘束性抗原を含む。
【０１６８】
ある実施形態では、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ  ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ  １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。
【０１６９】
特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、
【０１７０】
【化１４】
0006305925.tif 000017
（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。
【０１７１】
方法および使用
いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、免疫応答を刺激するために個体に投与される。そのような実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、典型的に、薬学的に許容される担体および任意選択でアジュバントを含んでいてもよい組成物中に存在する。たとえば米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第７，６４１，９１１号；米国特許第７，３０６，８０５号；およびＵＳ  ２００７／０２０７０９０を参照されたい。
【０１７２】
免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、それぞれの送達されるＣＭＶタンパク質に対して誘発される。細胞媒介性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、体液性免疫応答を含み、抗体は、中和抗体である。中和抗体は、細胞のウイルス感染を遮断する。ＣＭＶは、上皮細胞におよびまた線維芽細胞の細胞にも感染する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低下させるまたは予防する。中和抗体応答は、補体依存性または補体非依存性であってもよい。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、補体非依存性である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、交差中和性である；すなわち、投与された組成物に対して生成される抗体は、組成物において使用される株以外の株のＣＭＶウイルスを中和する。
【０１７３】
当技術分野における抗体効力の有用な尺度は、「５０％中和力価」である。５０％の中和力価を決定するために、免疫化された動物由来の血清を希釈し、どれくらい希釈した血清が、依然として細胞への５０％のウイルスの侵入を遮断する能力を保持するかを評価する。たとえば、７００の力価は、血清が、７００倍に希釈された後にウイルスの５０％を中和する能力を保持したことを意味する。したがって、より高い力価は、より強力な中和抗体応答を示す。いくつかの実施形態では、この力価は、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、または約７０００の下限を有する範囲にある。５０％の中和力価範囲は、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４０００、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、または約３００００の上限を有することができる。たとえば、５０％の中和力価は、約３０００〜約６５００であり得る。「約」は、記載される値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。中和力価は、下記の具体例において記載されるように測定することができる。
【０１７４】
免疫応答は、個体、典型的に、ヒトを含む哺乳動物にＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡを投与することによって刺激することができる。いくつかの実施形態では、誘発される免疫応答は、防御免疫応答である、つまり、応答は、ＣＭＶ感染の危険性または重症度を低下させる。防御免疫応答の刺激は、特にＣＭＶ感染および疾患の危険性のあるいくつかの集団において特に望ましい。たとえば、危険な状態にある集団は、実質臓器移植（ＳＯＴ）患者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者を含む。ＶＲＰは、移植前の移植ドナーまたは移植前および／もしくは後の移植レシピエントに投与することができる。母親から子供への垂直伝播が乳児を感染させるよくある原因であるので、妊娠し得る女性へのＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡの投与は、特に有用である。
【０１７５】
投与の任意の適したルートを使用することができる。たとえば、組成物は、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または経皮的に投与することができる。いくつかの実施形態は、口腔内に（ｉｎｔｒａ−ｏｒａｌｌｙ）、鼻腔内に、腟内に、および直腸内になどのように、粘膜内ルートを通して投与されるであろう。組成物は、任意の適したスケジュールに従って投与することができる。
【０１７６】
受託番号によって言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む本開示において引用される特許、特許出願、および参考文献はすべて、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。上記の開示は、全般的な説明である。より完全な理解は、例示のみの目的のために提供される次の特定の実施例に対する参照によって得ることができる。
【実施例】
【０１７７】
ＣＭＶタンパク質をコードするバイシストロニックおよびペンタシストロニック核酸
ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡの合成のための鋳型としての役目をした。アルファウイルスレプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされる遺伝子エレメントを含有するが、粒子構築に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを欠き、アルファウイルスゲノムの構造遺伝子は、異種タンパク質をコードする配列と交換する。真核細胞へのレプリコンの送達に際して、プラス鎖ＲＮＡは、４つの非構造タンパク質を産生するように翻訳され、これらは、ともに、ゲノムＲＮＡを複製し、異種遺伝子産物または目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現が欠如していることにより、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘発することができない。アルファウイルスｃＤＮＡの上流のバクテリオファージプロモーター（Ｔ７またはＳＰ６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレプリコンＲＮＡの合成を容易にし、ポリ（Ａ）テイルの直ぐ下流のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を通して正確な３’末端を生成する。
【０１７８】
抗原性タンパク質複合体の形成を可能にするために、同じ細胞における当該複合体の個々の成分の発現は、最も重要である。理論上、これは、個々の成分をコードする遺伝子により細胞を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。しかしながら、非ウイルスまたはＶＲＰ送達アルファウイルスレプリコンＲＮＡの場合には、この戦略は、複数のＲＮＡの同じ細胞への非効率的な同時送達によってか、あるいは個々の細胞における複数の自己複製ＲＮＡの非効率的な開始（ｌａｕｎｃｈ）によって妨げられる。タンパク質複合体の成分の同時発現を容易にするための潜在的により効率的な方法は、同じ自己複製ＲＮＡ分子の一部としてそれぞれの遺伝子を送達することである。この目的のために、発明者らは、目的の複数の遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコン構築物を創出した。すべてのＧＯＩの前に、アルファウイルス転写機構によって認識されるそれ自体のサブゲノムプロモーターを置く。それによって、複数のサブゲノムメッセンジャーＲＮＡ種は、個々の細胞において合成され、多成分タンパク質複合体の構築を可能にする。
【０１７９】
適した制限エンドヌクレアーゼによるＨＤＶリボザイムの下流のプラスミドＤＮＡの直線化の後に、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成した。転写は、製造者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供される説明書に従って、７．５ｍＭのそれぞれのヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）の存在下において３７℃で２時間実行した。転写の後に、鋳型ＤＮＡは、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により消化した。レプリコンＲＮＡは、ＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。キャップがないＲＮＡは、ユーザーマニュアルにおいて概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）により転写後にキャップした。転写後にキャップしたＲＮＡは、ＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。ＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度を測定することによって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１８０】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の糖タンパク質複合体を発現するバイシストロニックおよびペンタシストロニックアルファウイルスレプリコンを、調製した。アルファウイルスレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に基づいた。５種のペンタシストロニックＲＮＡレプリコン：Ａ５２６、Ａ５２７、Ａ５５４、Ａ５５５およびＡ５５６（各々５つのＣＭＶタンパク質をコードする）を使用した。アルファウイルスの非構造タンパク質１〜４（それぞれＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４）は、ウイルスを複製するのに必要とされる。レプリコンは、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の中にパッケージしたか、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に被包したか、またはカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と共に処方した。レプリコンのそれぞれからのコードされたＨＣＭＶタンパク質およびタンパク質複合体の発現は、免疫ブロット法、免疫共沈降、およびフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリーは、五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を使用して、複合体のタンパク成分をコードする五量体のレプリコンからの五量体のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体の発現を検証するために使用した（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。Ａ５２７  ＲＮＡレプリコンによりトランスフェクトされ、そしてｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現するＢＨＫＶ細胞の蛍光ヒストグラムを得た。細胞染色は、この五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗体を使用して実行した。ヒストグラム分析は、これらの抗体が、ＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体（Ａ５２７）を発現するレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞に結合することを示す。細胞を同じレプリコン構築物から作製したＶＲＰにより感染させた場合、同様の結果が得られた。これは、五量体複合体を発現するように設計したレプリコンが、潜在的な副産物ｇＨ／ｇＬではなく所望の抗原を実際に発現することを示す。
【０１８１】
ＶＲＰ、ＬＮＰ中に被包したＲＮＡ、およびカチオン性水中油型ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と共に処方したＲＮＡは、後方の四頭筋への筋肉内注射によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスは、３回、３週間間隔で免疫化し、血清試料は、それぞれの免疫化に先立ってならびに３回目および最終の免疫化の３週間後に収集した。血清は、ワクチン接種によって引き起こされる中和抗体応答の効力を測定するためにマイクロ中和アッセイにおいて評価した。力価は、５０％の中和力価として表現する。
【０１８２】
ＬＮＰ被包ＲＮＡおよびｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（Ａ１６０）と比較した、五量体複合体をコードするＬＮＰ被包ＲＮＡ（Ａ５２６およびＡ５２７）の免疫原性を評価した。表３は、五量体複合体を発現するレプリコンがｇＨ／ｇＬを発現するレプリコンよりも強力に中和抗体を惹起したことを示す。
【０１８３】
【表３】
0006305925.tif 000018
最高の力価の中和抗体を惹起したペンタシストロニックＶＥＥベースのＲＮＡレプリコン（Ａ５２７）は、ＶＲＰとしてパッケージし、ＶＲＰの免疫原性は、ｇＨ／ｇＬ発現ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬおよび五量体複合体を発現するＬＮＰ被包レプリコンと比較した。表４は、五量体複合体を発現するＶＲＰがｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰよりも高度な力価の中和抗体を惹起したことを示す。さらに、ＶＲＰの１０６感染単位は、ＶＲＰおよびＲＮＡが同じタンパク質複合体をコードした場合、１μｇのＬＮＰ被包ＲＮＡと少なくとも同じくらい強力である。
【０１８４】
【表４】
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五量体複合体をコードするＶＥＥベースのＲＮＡ（Ａ５２７）により免疫化したマウス由来の血清におけるＨＣＭＶ中和活性の幅および効力は、ＨＣＭＶの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表５は、抗ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１免疫血清が広く強力に上皮細胞の感染を中和したことを示す。この効果は、補体非依存性であった。対照的に、血清は、線維芽細胞の感染に対して低下したまたは検出可能でない効果を有した。五量体複合体が線維芽細胞の感染に必要とされず、その結果として、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１に対する抗体が線維芽細胞の感染を遮断しないので、これらの結果は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体に対して特異的な抗体をほとんど含有する免疫血清について期待されるものである（Ａｄｌｅｒら（２００６年）、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８７巻（Ｐｔ．９）：２４５１〜６０頁；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ（２００５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁）。したがって、これらのデータは、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体をコードする五量体レプリコンがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体に対する抗体を特異的に引き起こすことを実証する。
【０１８５】
【表５】
0006305925.tif 000020
ｇＨ／ｇＬを発現するバイシストロニックレプリコンおよびペンタシストロニックレプリコンが、異なる処方物において中和抗体を惹起するかどうかを確かめるために、コットンラットを、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と混合したバイシストロニックレプリコンまたはペンタシストロニックレプリコンで免疫化した。表６は、ＣＮＥ中のレプリコンが、ＬＮＰ中に被包された同じレプリコンと匹敵する中和抗体力価を惹起したことを示す。
【０１８６】
【表６】
0006305925.tif 000021
【０１８７】
【数１】
0006305925.tif 000022
【０１８８】
【数２】
0006305925.tif 000023
【０１８９】
【数３】
0006305925.tif 000024
【０１９０】
【数４】
0006305925.tif 000025
【０１９１】
【数５】
0006305925.tif 000026
【０１９２】
【数６】
0006305925.tif 000027
【０１９３】
【数７】
0006305925.tif 000028
【０１９４】
【数８】
0006305925.tif 000029
【０１９５】
【数９】
0006305925.tif 000030
【０１９６】
【数１０】
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【０１９７】
【数１１】
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【０１９８】
【数１２】
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【０１９９】
【数１３】
0006305925.tif 000034
【０２００】
【数１４】
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