(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻油体、リン脂質および油体タンパク質を含み、前記藻油体は５０〜１００重量部であり；前記リン脂質は０．５〜１０重量部であり；前記油体タンパク質は０．５〜１０重量部であり、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質である、組成物。
【請求項２】
前記油体タンパク質は、落花生油体タンパク質、大豆油体タンパク質、菜種油体タンパク質、ゴマ油体タンパク質、ヒマワリ種子油体タンパク質、オリーブ油体タンパク質、パーム油体タンパク質、茶実油体タンパク質または前記油体タンパク質のいずれかの混合物であり、及び／又は藻油体は油生産藻類から由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記藻油体は７０〜１００重量部であり；前記リン脂質は０．５〜５重量部であり；前記油体タンパク質は２〜５重量部である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物中の８０％以上の粒子が、１．５〜３．５μｍの粒子径の分布範囲を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
リン脂質と油体タンパク質を藻油体に加えることを含む、藻油体を安定化させる方法であって、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質である、方法。
【請求項６】
前記油体タンパク質は、落花生油体タンパク質、大豆油体タンパク質、菜種油体タンパク質、ゴマ油体タンパク質、ヒマワリ種子油体タンパク質、オリーブ油体タンパク質、パーム油体タンパク質、茶実油体タンパク質または前記油体タンパク質のいずれかの混合物であり、及び／又は藻油体は油生産藻類から由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記藻油体は５０〜１００重量部であり；前記リン脂質は０．５〜１０重量部であり；前記油体タンパク質は０．５〜１０重量部である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
藻油体、リン脂質と油体タンパク質の混合物を超音波振動することを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
藻油体に油体タンパク質を加えること、または藻油体に油体タンパク質およびリン脂質を加えることを含み、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質である、藻油体の抗酸化性を増強させる方法。
【請求項１０】
前記藻油体は５０〜１００重量部であり；前記リン脂質は０〜１０重量部であり；前記油体タンパク質は０．５〜１０重量部である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は生化学と食品加工分野に属し、改質藻油体、藻油体の安定化方法、及び藻油体の抗酸化性の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は重要な海洋生物資源であり、脂肪、タンパク質、アスタキサンチン等の栄養物質に富む。微細藻類油は心・血管疾患を治療し、血圧降下、抗癌、免疫系機能を調節する作用を有し、そのうち、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は最も注目されており、乳児用粉乳と保健用食品中によく用いられる。また、近年、エネルギー危機の影響で、微細藻類か藻油を抽出して生物燃料に変換することも、前途有望な科学研究方向になっている（Michael  H,  et  al.  Biofuels  from  algae:  challenges  and  potential.  Biofuels.  2010,  1:  763−784）。
【０００３】
現在、微細藻類油を抽出する方法は主に化学法であり、通常、ｎ−ヘキサンのような化学試薬で微細藻類発酵物を抽出することを含み、環境汚染のリスクもある。
【０００４】
ＥＰ１９５２６９５では、油体を用いて微細藻類油を抽出する方法であって、まず乾燥した微細藻類をショ糖溶液で溶解させ、サンドグラインドし、その後塩イオン緩衝液で溶出することで、精製した藻油体を得ることを含む方法が開示された。このように得られる藻油体の油脂性能を測定したところ、藻油体の最も好ましい粒子径は０．５〜３０μｍの範囲内にあるが、その幅の範囲は広いため、藻油滴の集積が引き起こされやすく、且つ常温下で油漏れしやすいので、次の製品の加工と利用に不利である（Ghislain  YC,  et  al.,  Oil  bodies  and  method  of  producing  such  oil  bodies.  EP1952695.  2007-01-31.）。
【０００５】
Nguyenら（Nguyen  HM,  et  al.  Proteomic  profiling  of  oil  bodies  isolated  from  the  unicellular  green  microalga  Chlamydomonas  reinhardtii:  With  focus  on  proteins  involved  in  lipid  metabolism.  2011,11:4266-73.）は、植物から油体を抽出する方法を真似して藻油体を抽出した。しかしながら、前記方法は、工程が複雑であり、多種のプロテアーゼ阻害剤の添加、多種の緩衝液と有機試薬の使用、複数回の遠心に関わり、最終的に油体が得られる。該方法は時間がかかり、且つプロテアーゼ阻害剤は高価である。
【発明の概要】
【０００６】
本分野において、藻油体を抽出する、藻油体の抗酸化性を増強させる及び/又は藻油体を安定化してその油漏れを防止するより好ましい方法が切望されている。
【０００７】
したがって、第一の面では、藻油体、リン脂質および油体タンパク質を含む藻油体含有組成物が提供される。
【０００８】
第二の面では、リン脂質と油体タンパク質を藻油体に加えることを含む、藻油体を安定化させる及び／又はその油漏れを防止する方法が提供される。
【０００９】
第三の面では、油体タンパク質を藻油体に加えることを含む、藻油体の抗酸化性を増強させる方法が提供される。
【００１０】
第四の面では、改質藻油体であって、該藻油体の粒子径主要分布範囲は１．５〜３．５μｍであり、好ましくは本出願で開示された方法により調製されることを特徴とする改質藻油体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動図である。
【図２】図２は改質藻油体の安定性を示す写真である。
【図３】図３は改質藻油体の安定性を示す写真である。
【図４】図４は四つのサンプルの粒子径の統計図である。
【図５】図５は三つのサンプルの粒子径の統計図である。
【図６】図６は三つのサンプルの粒子径の統計図である。
【図７】図７は五つのサンプルにおける藻油を４０℃オーブンで処理する場合の、１２時間おきの共役ジエン価を示す。
【図８】図８は五つのサンプルにおける藻油を４０℃オーブンで処理する場合の、１２時間おきのアニシジン価（ＰＡＶ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本願の発明者は、油体タンパク質とリン脂質を藻油体に加えることで、より安定した改質藻油体が獲得できることを見出した。また、油体タンパク質は、藻油体に抗酸化性を付与するように、藻油体の抗酸化剤として使用することもできる。
【００１３】
藻油体は微細藻類から由来の油体構造であり、分子量の小さい脂質体主要タンパク質（ＭＬＤＰ）を含有するが、植物油体における油体タンパク質や油体タンパク質と類似するタンパク質を含有しない。ある実施形態において、藻油体は油生産藻類から、例えばシゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類などから、特にシゾキトリウムから由来するものであってもよいが、それらに限定されるものではない。
【００１４】
植物油体タンパク質は植物、例えば油料作物から抽出することができる。ある実施形態において、前記油体タンパク質は、その加工においてｎ−ヘキサンなどの化学助剤が適用されず、合成製剤に比べて天然で健康に有利という利点があり、潜在の利用価値がある。
【００１５】
ある実施形態において、前記リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等の化合物のうちの１種または多種であってもよいが、前記リン脂質を含む組成物、例えば複合リン脂質（大豆リン脂質を含むが、それに限定されるものではない）やレシチンであってもよい。
【００１６】
したがって、第一の面では、藻油体、リン脂質および油体タンパク質を含む藻油体組成物が提供される。前記油体タンパク質は任意由来の植物油体タンパク質であってもよい。一つの実施形態において、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質であり、落花生油体タンパク質、大豆油体タンパク質、菜種油体タンパク質、ゴマ油体タンパク質、ヒマワリ種子油体タンパク質、オリーブ油体タンパク質、パーム油体タンパク質、茶実油体タンパク質またはそれらの任意の混合物を含むが、それらに限定されるものではない。もう一つの実施形態において、前記油体タンパク質は落花生油体タンパク質である。
【００１７】
ある実施形態において、藻油体は油生産藻類から、例えばシゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類などから、特にシゾキトリウムから由来するものであってもよいが、それらに限定されるものではない。
【００１８】
一つの実施形態において、前記改質藻油体において、前記藻油体は５０〜１００重量部、好ましくは７０〜１００重量部、より好ましくは９０〜１００重量部、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量部であるが、それらに限定されるものではない；前記リン脂質は０．５〜１０重量部、好ましくは０．５〜５重量部、１．０〜２．５重量部、或いは０．５、１、１．５、２重量部である；且つ前記油体タンパク質は０〜１０重量部、例えば２〜５重量部、２．５〜４．５重量部、或いは２、３、４重量部である。ある実施形態において、前記改質藻油体は、構造安定性が向上し、油漏れが低減される。
【００１９】
第二の面では、リン脂質と油体タンパク質を藻油体に加えることを含む、藻油体を安定化させる方法が提供される。
【００２０】
前記のように、前記油体タンパク質は任意由来の植物油体タンパク質であってもよい。一つの実施形態において、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質である。もう一つの実施形態において、前記油体タンパク質は落花生油体タンパク質である。
【００２１】
ある実施形態において、藻油体は油生産藻類から、例えばシゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類などから、特にシゾキトリウムから由来するものであってもよいが、それらに限定されるものではない。
【００２２】
ある実施形態において、藻油体の構造を安定化させ、油漏れを防止するように、適量のリン脂質と油体タンパク質を共に藻油体に加えることができる。ある実施形態において、前記藻油体を安定化させる方法において、藻油体は５０〜１００重量部、好ましくは７０〜１００重量部、より好ましくは９０〜１００重量部、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量部である；添加されるリン脂質は０．５〜１０重量部、好ましくは０．５〜５重量部、より好ましくは１．０〜２．５重量部、例えば０．５、１、１．５、２重量部である；添加される油体タンパク質は０．５〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部、より好ましくは２．５〜４．５重量部、例えば２、３、４重量部である。
【００２３】
ある実施形態において、前記藻油体を安定化させる方法は、藻油体、リン脂質と油体タンパク質の混合物を超音波振動することを含む。もう一つの実施形態において、前記超音波振動は５〜３０秒、好ましくは１０〜２５秒、例えば約１０、１５または２０秒とする。もう一つの実施形態において、前記時間で藻油体、リン脂質と油体タンパク質の混合物を超音波振動してから、１〜１０ｍｉｎ、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９或１０ｍｉｎ氷浴する。ある実施形態において、前記超音波振動と氷浴は２〜５回、例えば２、３、４または５回繰り返す。
【００２４】
藻油体自身の構造は安定ではなく、その粒子径は主に２〜４μｍ程度に分布し、且つ分布範囲は広いことにより、油滴の集積が引き起こされやすく、油漏れが発生し、それで後段の生産加工に不利である。
【００２５】
本願の発明者は意外なことに、リン脂質と植物油体タンパク質を共に藻油体に加えると、藻油体の粒子径は植物天然油体の粒子径に接近し、平均で２μｍになり、粒子径の主要分布範囲が１．５〜３．５μｍ、好ましくは１．５〜２．５μｍ、より好ましくは１．５〜２．０μｍになり、不純物ピークが減少または消失し、且つ分布範囲も狭くなることにより、改質藻油体が得られる、ということを見出した。理論的に制限されないように、前記改質藻油体は、油体タンパク質がリン脂質単分子層外に嵌め込み、藻油の被覆をより充分にすることにより得られるものである。それから分かるように、藻油体にリン脂質と油体タンパク質を加えると、より均一で安定な単分散エマルション系が形成され、藻油の集積と油漏れが有効に防止される。
【００２６】
第三の面では、藻油体に油体タンパク質を加え、任意選択的にリン脂質を加えることを含む、藻油体の抗酸化性を増強させる方法が提供される。
【００２７】
一つの実施形態において、前記油体タンパク質は植物由来の油体タンパク質であってもよい。一つの実施形態において、前記油体タンパク質は油料作物の油体タンパク質であり、好ましくは落花生油体タンパク質である。
【００２８】
ある実施形態において、藻油体は油生産藻類から、例えばシゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類などから、特にシゾキトリウムから由来するものであってもよいが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
ある実施形態において、前記藻油体の抗酸化性を増強させる方法において、藻油体は５０〜１００重量部、好ましくは７０〜１００重量部、より好ましくは９０〜１００重量部、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量部である；添加されるリン脂質は０〜１０重量部、好ましくは０〜５重量部、より好ましくは０〜２．５重量部、例えば０．５、１、１．５、２重量部である；添加される油体タンパク質は０．５〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部、より好ましくは２．５〜４．５重量部、例えば２、３、４重量部である。
【００３０】
ある実施形態において、前記藻油体の抗酸化性を増強させる方法は、藻油体、リン脂質と油体タンパク質の混合物を超音波振動することを含む。もう一つの実施形態において、前記超音波振動は５〜３０秒、好ましくは１０〜２５秒、例えば約１０、１５または２０秒とする。もう一つの実施形態において、前記時間で藻油体、リン脂質と油体タンパク質の混合物を超音波振動してから、１〜１０ｍｉｎ、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９或１０ｍｉｎ氷浴する。ある実施形態において、前記超音波振動と氷浴は２〜５回、例えば２、３、４または５回繰り返す。
【００３１】
第四の面では、改質藻油体であって、該改質藻油体の粒子径の主要分布範囲は１．５〜３．５μｍであり、好ましくは主に本出願の第二の面または第三の面に記載の方法により調製され、且つ好ましくは第一の面に記載の組成物からなる改質藻油体が提供される。
【００３２】
ある実施形態において、藻油体の粒子径の主要分布範囲は１．５〜２．５μｍであり、好ましくは１．５〜２．０μｍである。
【００３３】
本発明において、藻油体の「粒子径の主要分布範囲」とは、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、より好ましくは９０％以上の藻油体の粒子径の分布範囲を指す。
【００３４】
天然に抽出される藻油体が極めて酸化しやすいことは、その共役ジエン価と過酸化物価（一次酸化度を評判するためのもの）およびアニシジン価（二次酸化産物量を評判するためのもの）が試験時間につれて上昇することで表される。それに比べて、本発明にかかる油体タンパク質を加えた藻油体の抗酸化能が増強され、一次酸化産物量が有効に低減され、且つ二次酸化産物量が４８時間内で変化しない。以上のことから分かるように、油体タンパク質の添加は、藻油体の抗酸化性を増強させ、その構造をより安定化させ、保管期間を延長させることができる。
【００３５】
さらに、本出願では、シゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類のような微細藻類発酵液を研磨せん断処理し、その後０．６Ｍ蔗糖含有リン酸塩緩衝液を加え、遠心を行うことを含む、藻油体を抽出する方法が提供される。ある実施形態において、前記微細藻類はシゾキトリウムである。
【００３６】
通常の化学的な油分抽出方法に比べて、藻油体を用いて藻油を抽出するほうが天然であり、且つ環境を汚染する恐れがなく、大量な工業生産に有用である。Nguyenらに記載の藻油体抽出方法に比べて、本出願の方法では、工程が減少され、特にプロテアーゼ阻害剤の添加、有機溶媒の使用、複数回の遠心などの工程が不要になり、コストが大幅に削減される。ＥＰ１９５２６９５に比べて、本願の発明者はシゾキトリウム、スラウストキトリウム、クリプテコジニウム類のような微細藻類発酵液から直接に藻油体を抽出し、微細藻類を溶解する工程が不要になる。それにより、全ての工程が水相中で行われ、緩衝液で溶出する工程が不要になり、藻油の無駄使いが低減される。
【００３７】
本出願において、用語の「実質的に……からなる」または「組成は実質的に」とは、セミオープンエンドタイプの用語であり、一つまたは複数の他の非必須な要素、成分または工程が前記の主要な要素、成分または工程による本発明の特性を実質的に影響しない限り、それらの他の非必須な要素、成分または工程の存在を排除しない。また、用語の「含む」または「含有する」とは、用語の「……からなる」、「組成は」、および用語の「実質的に……からなる」と「組成は実質的に」を含む。
【００３８】
特に断らない限り、用語の「一つ」とは、通常「一つまたは一つ以上」を指す。
【００３９】
本出願に引用される文献と参考書目の内容は引用によりここに取り入れるものである。
実施例
以下、図面を参照して実施例により本発明をさらに説明する。以下の実施例は本発明を説明するためのものだけであり、本発明の範囲を制限するように意図していない。本発明の範囲は本出願のクレームにより限定される。
【００４０】
下記実施例で用いられるホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンはいずれもシグマ（sigma）社から購入される。
【００４１】
下記実施例で用いられる培地は：
種培地（ｇ／Ｌ）：ブドウ糖３０．０、ペプトン１０．０、酵母エキス５．０、海塩１５．０。発酵培地（ｇ／Ｌ）：ブドウ糖１０９．７、ペプトン１９．２、酵母エキス２０．０、海塩１２．５。
実施例１    藻油体および藻類タンパク質の抽出：
シゾキトリウムＡＴＣＣ２０８８８を種培地に接種し、２８度、２００ｒｐｍで２４ｈ培養して、種液を得、種液を発酵培地に接種し、２８℃、７５０ｒｐｍで９６ｈ培養して、シゾキトリウム発酵液を得た。
【００４２】
シゾキトリウム発酵液（含有されるバイオマスは１００〜１５０ｇ／ｌである）を２５００ｒｐｍのせん断速度で、一回につき５ｍｉｎで２０回研磨することで、油体を２００μｍの篩孔から遊離させ、破砕した菌体破砕物と分離した。さらに１：１の体積比でｐＨ  ７．５の０．６Ｍ蔗糖含有リン酸塩緩衝溶液を５０ｍＭ加え、４°Ｃ、１０，０００×ｇで３０分間遠心し、溶液は三層に分離した。ただし、下層は菌体破砕物であり、中層は可溶性タンパク質を大量に含有する水相層であり、上層は油層であり、その外面が一層のタンパク質に被覆され、両者が共に藻油体を形成した。藻油体を遠心管から取り出した。
【００４３】
１：１の比率で藻油体にアセトンを加え、氷浴し、１０〜１５分間優しく攪拌し、四度の低温で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを除去し、さらに沈殿と同様な体積のＰＨ＝７．５、１００ｍＭのＰＢＳで懸濁させた。１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上澄みを捨て、洗浄を３回繰り返して、藻類タンパク質を得、タンパク質検出に備えた。
実施例２    落花生油体タンパク質の抽出：
落花生種を５０ｍＭ、ｐＨ  ７．５のＰＢＳに一晩浸漬した。浸漬した落花生種１００ｇを組織摩砕器（ネッチラブ（NETZSCH  Lab）  横型ミル  ＬＭＺ  ０．５）に置き、５００ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ  ７．５）を用い、３０００ｒｐｍで１ｍｉｎホモジナイズし、その後１００００ｒｐｍで２ｍｉｎホモジナイズすることを３回行った。得られた混合物を二層チーズクロスでろ過し、且つチーズクロスにあるケーキを加圧し、残ったケーキを同様な条件で研磨・ろ過し直した。二回のろ液を合わせ、さらに一層のマイクロクロスでろ過し、最終に得られたろ液を２０，０００×ｇで３０ｍｉｎ遠心した。遠心管上部で得られた乳化層を落花生粗油体として収集した。
【００４４】
得られた落花生粗油体を１００ｍＭ、ｐＨ  ７．５の冷凍ＰＢＳに置き、その後高速せん断ホモジナイザーＳＰＸを用いて２０，０００ｒｐｍで２ｍｉｎホモジナイズした。ホモジナイズした後、混合物を２０，０００×ｇで５ｍｉｎ遠心した。その後、乳化層を収集し直し、緩衝液に溶解させ、２０，０００ｒｐｍで２ｍｉｎ高速ホモジナイズし、さらに１００００ｇで３０ｍｉｎ遠心し、それらの三つのプロセスを一つの完全なサイクルとした。該サイクルを３回繰り返した。最終に収集された乳化層は精製された落花生油体であった。  
１：１の比率で落花生油体にアセトンを加え、氷浴し、１０〜１５分間優しく攪拌し、低温で１０，０００×ｇで１０分間遠心し、上澄みを除去し、さらに沈殿と同様な体積の１００ｍＭのＰＢＳ（ＰＨ＝７．５）で懸濁させた。１０，０００×ｇで３０分間遠心し、上済みを捨て、洗浄を３回繰り返し、精製された落花生油体タンパク質を得た。
実施例３    タンパク質の検出：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動：
得られた精製された落花生油体タンパク質および藻類タンパク質を１００ｍＭ、ｐＨ  ７．５のＰＢＳ（体積比５：１）で希釈した後、それぞれに５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥを加え、沸水で５分間加熱した。使用されたゲルは、分離ゲルが１５％であり、濃縮ゲルが６．７％であった。まず９０Ｖで定圧電気泳動し、ブロモフェノールブルー指示薬が分離ゲルに入ってから、１８０Ｖ定圧電気泳動に変更し、ブロモフェノールブルーのバンドがゲルから離れてから、電源を切れ、電気泳動を終了させた。ゲルをクリーン容器に入れ、３０ｍｌのタンパク質電気泳動染色液を流し、電子レンジで２ｍｉｎ加熱し、横型シェーカーで１００ｒｐｍで１ｈ染色した。染色液を捨て、所定量の脱色液を加え、タンパク質のバンドがクリアになるまで、一回につき２０分間で３〜４回洗浄した。
【００４５】
タンパク質電気泳動の結果は図１に示し、ただし、第１レーンはアセトンで沈殿された落花生油体タンパク質で、第２レーンはアセトンで沈殿され、さらにＰＢＳで洗浄された落花生油体タンパク質で、第３レーンはアセトンで藻油体を沈殿させて得られたタンパク質である。図１の結果により、落花生油体タンパク質の分子量は１６ｋＤ程度であり、アセトンで沈殿させた後、不純物バンドがあったが、緩衝液で洗浄した後、クリアな一本バンドになった。１６ｋＤの位置にあるのは、精製された落花生油体タンパク質であった（レーン１と２）。藻油体にタンパク質が大量に含まれるが、１５〜２５ｋＤの間にはタンパク質のバンドが少なく、油体タンパク質及びその類似物が現れていなかった（レーン３）。
実施例４    改質藻油体の調製およびその安定性試験
２００μｇのホスファチジルコリンをクロロホルムに溶解させ、ドラフトチャンバーで一晩揮発させた。該ホスファチジルコリンに１９．６ｍｇの藻油体および１００μｇ、２００μｇ、４００μｇまたは８００μｇの落花生油体タンパク質を加えた（それぞれ１、２、３と４番サンプルとした）。２０秒超音波振動してから、５ｍｉｎ氷浴した。超音波振動を３回繰り返した後、藻油体混合物が形成された。該サンプルを４０℃オーブンに置き、７２時間後、静置してその油漏れ状況を観察することで、その安定性を観察した。オーブン処理時間の増加につれて、油体に熱分解が出現した。油滴の漏れが現れ、且つ残った油体と明確な境界が現れる場合、油漏れと定義し、異なるサンプルはオーブン処理後で異なる油漏れ状況を表した。
【００４６】
結果は図２に示し、ただし、１は藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：０．５であるサンプルで、２は藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：１であるサンプルで、３は藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：２であるサンプルで、４は藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：４であるサンプルである。
【００４７】
図２からみれば、７２時間経過後、試験が行われた四つのサンプルのうち、改質藻油体の安定性はいずれも増強し、且つ油体タンパク質含有量の増加につれて、改質藻油体の安定性も相応に増強し、四つのサンプルの中、４番サンプルにおける藻油体は一番安定であった。その原因は、タンパク質の比率の増加につれて、藻油体に対する被覆がより充分になるからであるかもしれない。
【００４８】
次の実験から分かるように、油体タンパク質含有量の増加が所定の程度に達すると、藻油体の安定性は相応に増強せず、藻油体：油体タンパク質の重量比は９８：４が最も好ましい。現在、藻油体：油体タンパク質の重量比が９８：１０であることは、今のところで藻油体の安定性を増強できると共に、顕著な異臭が生じないという許容される比率である。
実施例５  
０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、４００μｇのホスファチジルコリンをクロロホルムに溶解させ、ドラフトチャンバーで一晩揮発させた。該ホスファチジルコリンに１９．６ｍｇの藻油体および８００μｇの落花生油体タンパク質を加えた（それぞれ１、２、３と４番サンプルとした）。２０秒超音波振動してから、５ｍｉｎ氷浴した。超音波振動を３回繰り返した後、藻油体混合物が形成された。該サンプルを４０℃オーブンに置き、７２時間後、静置してその油漏れ状況を観察した。オーブン処理時間の増加につれて、油体に熱分解が出現した。油滴の漏れが現れ、且つ残った油体と明確な境界が現れる場合、油漏れと定義し、異なるサンプルはオーブン処理後で異なる油漏れ状況を表し、結果は図３に示す。
【００４９】
図３に示すように、ホスファチジルコリンの存在下で、油体タンパク質を加えた藻油体の安定性は増強し、且つ藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：４または９８：２：４である場合、その安定性は重量比が９８：０．５：４である場合よりも優れたことから、油体タンパク質とホスファチジルコリンは互いに協力して藻油体を良好に被覆し、油漏れを防止し、その安定性を増強できるということが分かった。
実施例６    改質油体の粒子径の測定
実施例４の実験結果により、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質の重量比が９８：１：４であるサンプルと三つの対照群を選択し、比較試験を行った：対照１：藻油体＋ホスファチジルコリン（ｓｏｂ  ＋  ｐ、重量比が９８：１である）；対照２：藻油体＋落花生油体タンパク質（ｓｏｂ  ＋  ｏｌｅ、重量比が９８：４である）；および无添加の藻油体（ｓｏｂ、９８重量部）。処理方法は上記と同様であった：四つのサンプルを超音波振動してから、混合物を形成し、全てのサンプルの粒子径を測定した。
【００５０】
粒子径の統計データは図４に示す。図４からみれば、藻油体の粒子径は主に２〜４μｍ程度に分布し、その範囲は広い；ホスファチジルコリンまたは落花生油体タンパク質を加えると、その粒子径は小さくなるが、不純物ピークが存在し、粒子径分布は均一ではない；ホスファチジルコリンと落花生油体タンパク質を共に加える場合、粒子径は植物天然油体の粒子径に接近し、平均で２μｍであり、しかも分布範囲も狭くなり、主に１．５〜３．５μｍに分布することから、藻油体は比較的に均一で安定な分散乳化系になることが分かった。よって、油体タンパク質を加え、ホスファチジルコリンの使用を低減することで、ホスファチジルコリンの高価によるコストアップを抑えることができる。
【００５１】
さらに、他の重量比での試験も行った。
【００５２】
藻油体、ホスファチジルコリンとタンパク質の重量比率で、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：０．５：４であるものと、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：４であるものと、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：２：４であるものとの三種類のサンプルを準備した。処理方法は上記と同様であった：三つのサンプルを超音波振動してから、混合物を形成し、全てのサンプルの粒子径を測定した。結果は図５に示す。
【００５３】
図５の結果に示されるように、それらの三つのサンプルは、乳化系が均一で、粒子径が小さく、安定性に優れ、そのうち、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：４または９８：２：４である場合、それらの乳化系は一番均一であり、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：０．５：４である系よりも粒子径が小さく、安定性に優れた。
【００５４】
藻油体、ホスファチジルコリンとタンパク質の重量比率で、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：１であるものと、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：３であるものと、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：４であるものとのさらなる三種類のサンプルを準備した。処理方法は上記と同様であった：三つのサンプルを超音波振動してから、混合物を形成し、全てのサンプルの粒子径を測定した。結果は図６に示す。
【００５５】
図６の結果に示されるように、それらの三つのサンプルは、乳化系が均一で、粒子径が小さく、安定性に優れ、そのうち、藻油体：ホスファチジルコリン：タンパク質が９８：１：４である場合、その乳化系は一番均一であった。
実施例７    抗酸化性試験
藻油（ｓｏ）、藻油体（ｓｏｂ）、藻油体＋ホスファチジルコリン（ｓｏｂ  ＋  ｐ）（９８：１）、藻油体＋落花生油体タンパク質（ｓｏｂ  ＋  ｏｌｅ）（９８：４）、および藻油体＋ホスファチジルコリン＋落花生油体タンパク質（ｓｏｂ  ＋  ｐ  ＋  ｏｌｅ）（９８：１：４）の五つのサンプルを４０℃オーブンに入れ、１２時間おきに各酸化指標を測定した。
一、共役ジエン価（diene  value、ＤＶ）の測定：
共役ジエン価はジエン価とも言われ、１００ｇ油脂に必要な無水マレイン酸をヨウ素に換算したグラム数を指す。無水マレイン酸は油脂における共役二重結合とＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を行うことができるため、ジエン価は油脂不飽和脂肪酸における共役系を特定する特徴的な指標である。ジエン価が高いほど、油脂が酷く酸化されたことが示される。
【００５６】
共役ジエン価の測定方法は以下の通りである。油または油抽出物を０．０１〜０．０３ｇ正確に秤量し、２５ｍｌ定容瓶に入れ、イソオクタンで溶解させて２５ｍｌに希釈し、油サンプル溶液を調製した。溶媒であるイソオクタンを分光光度計の参照用スロットに入れて空白対照として、２３３ｎｍでサンプルスロットにおける油サンプル溶液の吸光度（Ａλ）を測定した。計算式は：
【００５７】
【数１】
0006305530.tif 000002
Ｅ：吸光係数、Ａλ：２３３波長における吸光度、ＣＬ：１００ｍｌ油脂の質量、ｌ：キュベットの経路長
結果は図７に示す。図７からみれば、オーブン処理時間の増加につれて、五つのサンプルにおける藻油はいずれも異なる程度で酸化された。ホスファチジルコリンを加えると、藻油体は不安定になり、大量の自己酸化産物が生じたことから、ホスファチジルコリンは好ましい藻油抗酸化剤ではない。しかし、ホスファチジルコリンと落花生油体タンパク質を共に加える場合、および落花生油体タンパク質のみを加える場合、藻油体におけるラジカルの酸化は有効に抑えられ、共役ジエン価の増加は相対的に穏やかでした。
二、過酸化物価（peroxide  value、ＰＶ）の測定：
過酸化物価は油脂と脂肪酸等の一次酸化度のインデックスであり、油脂の酸敗程度の指標である。一般的には，過酸化物価が高いほど、酸敗が激しくなる。過酸化物価は１キロのサンプルにおける活性酸素含有量であり、過酸化物のｍｅｑ／ｋｇで表わされる。
【００５８】
本出願において、ＧＢ／Ｔ５００９．３７−２００３法によりＰＶ値を測定する。具体的には、均一に混合したサンプルを２〜３ｇ正確に秤量し、２５０ｍｌヨウ素フラスコに入れた。３０ｍｌのトリクロロメタン・氷酢酸（２：３）の混合液を加えてサンプルを溶解させ、さらに１ｍｌの飽和ヨウ化カリウム溶液を加え、栓で密栓し、且つ０．５ｍｉｎ軽く振とうした。その後、暗いところに３ｍｉｎ置き、取り出して１００ｍｌの水を加え、均一に振とうした。直ちに０．００２ｍｏｌ／Ｌのチオ硫酸ナトリウム標準溶液で滴定し、浅黄色になるとき、１ｍｌの澱粉指示薬を加え、青色が消失するまで滴定を続けた。同量のトリクロロメタン・氷酢酸溶液、ヨウ化カリウム溶液および水を取り、前記と同様な方法で空白試験を行った。
【００５９】
ＰＶ値の計算式は：
【００６０】
【数２】
0006305530.tif 000003
【００６１】
【数３】
0006305530.tif 000004
式中：
Ｘ１−サンプルの過酸化物価、単位はｇ／１００ｇである；
Ｘ２−サンプルの過酸化物価、単位はｍｅｑ／ｋｇである；
Ｖ１−サンプルが消耗したチオ硫酸ナトリウム標準溶液体積、単位はｍＬである；
Ｖ２−空白対照が消耗したチオ硫酸ナトリウム標準溶液体積、単位はｍＬである；
ｃ−チオ硫酸ナトリウム標準溶液のモル濃度、単位はｍｏｌ／Ｌである；
ｍ−サンプルの質量、単位はｇである；
０．１２６９−１．００ｍＬのチオ硫酸ナトリウム標準滴定溶液［ｃ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）＝１．０００ｍｏｌ／Ｌ］に相当するヨウ素の質量、単位はｇである；
７８．８−換算係数。
表１には、ＧＢ／Ｔ５００９．３７−２００３法により測定した、４０℃オーブンで処理した場合の、１２時間おきの五つのサンプルの過酸化物価（ＰＶ）が示される。
【００６２】
ＰＶ値の結果により、４８時間のオーブン処理後、藻油体（ｓｏｂ）のＰＶ値は多くても藻油（ｓｏ）のＰＶ値の五分の一であることが分かった。一方、藻油体＋落花生油体タンパク質（ｓｏｂ  ＋  ｏｌｅ）および藻油体＋ホスファチジルコリン＋落花生油体タンパク質（ｓｏｂ  ＋  ｐ  ＋ｏｌｅ）の二つのサンプルは、それらのＰＶ値が４８時間内で殆ど変化せず、多くても藻油（ｓｏ）のＰＶ値の二十分の一であった。
【００６３】
以上の結果により、落花生油体タンパク質を加えることで、藻油体をより安定な構造になるように被覆し、外乱から守ることができることが証明された。
【００６４】
【表１】
0006305530.tif 000005
三、ＰＡＶ（Ｐ−アニシジン価）値の測定：
アニシジン価は油における不飽和アルデヒド、即ちアルデヒド、ケトン、キノンなどの二次産物の量を示す指標である。このような物質の含有量が多いほど、加熱において小分子のアルデヒド、ケトンが生じやすくなる。アニシジン価は二次酸化産物であるα−およびβ−不飽和アルデヒド（２−アルキルアルデヒドおよび２，４−ジエンアルデヒド）の量を評判するためのものである。
【００６５】
本出願において、ＧＢ／Ｔ２４３０４−２００９法によりＰＡＶ値を測定する。具体的には、２５ｍｌ定容瓶に油サンプルを０．５〜４．０ｇ（０．００１ｇまで正確に）秤量し、イソオクタンで溶解させて２５ｍｌに希釈し、油サンプル溶液を調製した。溶媒を上海天美ＵＶ１０００分光光度計の参照用スロットに入れて空白対照として、３５０ｎｍでサンプルスロットにおける油サンプル溶液の吸光度（Ａｂ）を測定した。
【００６６】
５ｍｌの油サンプル溶液を正確に吸い取って、第一試験管に入れると共に、５ｍｌの溶剤を正確に吸い取って、第二試験管に入れた。ピペットで正確に１ｍｌのＰ−アニシジン試薬を取って各試験管にそれぞれ入れ、振とうを行った。
【００６７】
１０分後、参照用スロットにおける第二試験管内の溶液を空白対照として、３５０ｎｍでサンプルスロットにおける第一試験管内の油サンプル溶液の吸光度（Ａｓ）を測定した。
【００６８】
PAVの計算式は：
【００６９】
【数４】
0006305530.tif 000006
式中、
ＡＳ−−Ｐ−アニシジン価試薬と反応した油サンプル溶液の吸光度
Ａｂ−−油サンプル溶液の吸光度
Ｗ−−油サンプルの重量（ｇ）
ＰＡＶ値は図８に示す。図８からみれば、酸化時間の増加につれて、二次酸化産物はいずれも増加した。６０時間後、藻油のアニシジン価は大きく増加したが、藻油体のアニシジン価は藻油の三分の一程度であった。落花生油体タンパク質を加えた後、ＰＡＶ値は変化せず、最初の数値のままであった。以上のデータから分かるように、６０時間内で、落花生油体タンパク質はある程度で藻油の二次酸化を阻止した。
実施例８
実施例４〜７の方法により、ホスファチジルコリンの代わりにホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンをそれぞれ用いて改質藻油体を調製し、且つ改質した藻油体の安定性、抗酸化性および粒子径を測定した。結果から分かるように、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンを用いて得られる改質藻油体は、ホスファチジルコリンを用いて得られる改質藻油体と類似の安定性、抗酸化性および粒子径を有する。具体的には、安定性の点で、油体タンパク質を加えることにより、優れた安定性を藻油体に与えることができ、藻油は漏れにくくなり、油体タンパク質がリン脂質と共に作用する場合、より均一で好ましい粒子径を藻油体に与えることができる。抗酸化性の点で、油体タンパク質を加えることにより、藻油体の抗酸化性能を増強させ、一次および二次酸化産物の生成を低減させることができる。
以上は本発明の具体的な実施形態だけであり、本発明の保護の範囲はそれらに制限されるものではなく、当業者が本発明に記載の範囲内で創造的労働なしで想到できる変更や修正はいずれも、本発明の保護の範囲内に含まれるべきである。
【図１】
0006305530.tif 000007
【図２】
0006305530.tif 000008
【図３】
0006305530.tif 000009
【図４】
0006305530.tif 000010
【図５】
0006305530.tif 000011
【図６】
0006305530.tif 000012
【図７】
0006305530.tif 000013
【図８】
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