(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするヒアルロン酸シンターゼ２発現促進剤。
【請求項４】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項３記載のヒアルロン酸シンターゼ２発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、グリコサミノグリカンの一種であり、関節、硝子体、皮膚などの細胞外マトリックスに広く分布している。関節においては、関節液、関節軟骨に多く含まれ、潤滑作用や緩衝作用など、関節の動きを良くする働きをしている。また、目の硝子体においては、緩衝作用や組織形状の維持などの働きをしている。さらに、皮膚においては、保湿作用をしている。
【０００３】
関節や皮膚や眼のヒアルロン酸含量が低下すると、湿潤作用、緩衝作用、保湿作用が十分でなくなるため、関節の動きの低下、関節痛、しわ、かさつき等が生じる。
これらの関節、眼、皮膚の症状を予防又は改善するため、ヒアルロン酸やその原料であるグルコサミンの局所注入、塗布、点眼、経口摂取等が行なわれている。
【０００４】
しかしながら、健康食品、美容食品、医薬品、化粧品中に配合されたヒアルロン酸が、吸収され、作用部位に到達するか否かは不明である。また、ヒアルロン酸の局所注入は医師が行なわなければならない。
【０００５】
かかる観点から、低分子で吸収されやすい成分を用いて体内でヒアルロン酸を産生させるためのヒアルロン酸産生促進剤が報告されている。ヒアルロン酸産生促進剤としては、インスリン株成長因子−１などのサイトカインの他、サフラン抽出物（特許文献１、２）、シクロヘキセノン類（特許文献３）が報告されている。
【０００６】
一方、マイコスポリン様アミノ酸は、藻類やホタテ等に含まれるアミノ酸の一種であり、紫外線吸収作用（非特許文献１）や、繊維芽細胞増殖促進作用（特許文献４）を有することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０６５１０号公報
【特許文献２】特開２００５−３４３８８２号公報
【特許文献３】特開２０１５−７１５５５号公報
【特許文献４】特開２００７−１６００４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Phycol. 34, 418-430(1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、低分子で吸収性が良好で安全な新たなヒアルロン酸産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで本発明者は、新たなヒアルロン酸産生促進剤を探索すべく、種々の天然由来成分の機能を検討してきたところ、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が強力なヒアルロン酸産生促進作用を有し、その作用が繊維芽細胞増殖促進作用からは考えられない程度に強力であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
【００１２】
〔１〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
〔２〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔１〕記載のヒアルロン酸産生促進剤。
〔３〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするヒアルロン酸シンターゼ２発現促進剤。
〔４〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔３〕記載のヒアルロン酸シンターゼ２発現促進剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、低分子で吸収性が良好であるから、経皮的や経口的に投与された後、生体内でヒアルロン酸を産生する。従って、関節、皮膚、眼等においてヒアルロン酸の産生を促進し、関節痛、関節の動きの改善、皮膚の弾力改善等の目的で、医薬品、化粧品、機能性食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡＳ）のヒアルロン酸産生促進効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の有効成分は、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩である。
マイコスポリン様アミノ酸は、海藻、微細藻等の藻類、海産物、カビ類等が生産することが知られているシクロヘキサノン構造を有するアミノ酸である。元来、紫外線吸収物質として発見されたものである。前記のように、マイコスポリン様アミノ酸が紫外線吸収作用、繊維芽細胞増殖促進作用を有することは知られているが、ヒアルロン酸産生促進作用を有することは知られていない。
【００１６】
マイコスポリン様アミノ酸としては、例えば次の化合物が知られている。
【００１７】
【化１】
0006272814.tif 000002
【００１８】
【化２】
0006272814.tif 000003
【００１９】
【化３】
0006272814.tif 000004
【００２０】
本発明に用いられるマイコスポリン様アミノ酸又はその塩としては、貝類等の海産物、カビ類等から抽出することもできるが、藻類由来のものが好ましく、藍藻類、紅藻類、褐藻類又は緑藻類由来のものがより好ましく、藻類由来のマイコスポリン様アミノ酸には、前記化合物が含まれている。
【００２１】
藻類や貝類からマイコスポリン様アミノ酸を抽出するには、藻類の乾燥物又は凍結乾燥物から水、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル等の極性溶媒又はこれらの混合溶媒を用いて抽出することができる。抽出溶媒としては水−エタノール混液が好ましく、水：エタノール＝１：９〜９：１の混液がより好ましい。得られた抽出物は、さらに活性炭吸着カラム、樹脂カラム等を利用してマイコスポリン様アミノ酸を吸着させ、水−エタノール混液で溶出することにより濃縮するのが好ましい。さらに高速液体クロマトグラフィーにより精製することもできる。
【００２２】
また、マイコスポリン様アミノ酸を含有する藻類抽出エキスは、既に市販されており、これを用いることもできる。
【００２３】
マイコスポリン様アミノ酸の塩としては、塩酸塩等の酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２４】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩は、後記実施例に示すように、繊維芽細胞増殖促進作用の約１２５倍も強力なヒアルロン酸産生促進作用を有する。かかる優れたヒアルロン酸産生促進作用は、マイコスポリン様アミノ酸の繊維芽細胞増殖促進作用からは予測できない程強力である。
また、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩は、ヒアルロン酸シンターゼ２の発現を強く促進する作用を有する。従ってマイコスポリン様アミノ酸のヒアルロン酸産生促進作用はヒアルロン酸シンターゼ２発現促進作用に基づくものと考えられる。
【００２５】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、生体内の種々の部位でヒアルロン酸の産生を促進する作用を有する。従って、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、関節痛、関節の動きの改善剤、皮膚保湿剤、皮膚の弾力改善剤等の目的で、医薬品、医薬部外品、化粧品、特定保健用食品、機能性表示食品、機能性食品、美容食品、疾病者用食品等として有用である。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の投与形態としては、経口投与、注射による投与、経皮投与等が挙げられる。医薬品、医薬部外品、機能性表示食品等として用いる場合には、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、トローチ剤等の経口投与製剤；クリーム剤、軟膏剤、乳液、化粧水等の皮膚外用剤が好ましい。また、特定保健用食品、機能性表示食品の場合には、飲料、ヨーグルト等の通常の食品と同様の形態であってもよい。
【００２７】
上記製剤中へのマイコスポリン様アミノ酸又はその塩の配合量は、特に限定されないが、０．００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましい。
【００２８】
上記経口投与用製剤中には、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩以外に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を配合できる。また皮膚外用剤の場合には、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩以外に、各種油剤、色素、防腐剤、界面活性剤、増粘剤等を配合できる。さらに、他のヒアルロン酸産生促進剤を配合することもできる。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００３０】
試験例１（表皮細胞毒性試験）
１）ヒト正常皮膚由来表皮細胞の培養条件
ヒト正常皮膚由来表皮細胞は、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（表皮細胞専用培地）を用い、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で培養した。培地交換は一日おきに行った。
２）細胞毒性試験
正常ヒト表皮細胞を２×１０4個／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、翌日、各濃度サンプル（１０％を最高濃度とした１０倍希釈系列、８段階濃度）を含む培地（１００μＬ／ｗｅｌｌ）に交換し、２４時間培養した。培養終了時に位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、培地を除いてＰＢＳで一度洗浄した後、生細胞数測定試薬ＳＦを１０％の濃度で添加した培地１００μＬを加えて、３７℃、５％ＣＯ2で９０分インキュベートし、その間、３０分おきにマイクロプレートリーダーを用いてサンプルの吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。細胞の増殖性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、６０分後〜０分後のＯ．Ｄ．値として算出した。その後、サンプル無添加試験区を１００％としたときの相対値として、Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙを示した。各試験濃度はｎ＝３で実施した。
【００３１】
３）結果
サンプルとして、０．００００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのマイコスポリン様アミノ酸（藻類から、特開２００７−１６００４号公報と同様にして７０％エタノール水溶液及び活性炭カラムで抽出分画したマイコスポリン様アミノ酸乾燥物）を添加して培養しても何ら細胞毒性を示さなかった。
【００３２】
試験例２（ヒアルロン酸産生促進作用）
１）本試験細胞培養
正常ヒト線維芽細胞を１×１０4個／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう増殖培地で調整し、９６ウェルプレートに播種した。翌日、各濃度サンプルを含む試験培地（１００μＬ／ｗｅｌｌ）に交換し、７２時間（３日間）後に培養上清を回収し、ヒアルロン酸量測定を行った。５段階濃度、ｎ＝５で試験を行った。
【００３３】
２）ヒアルロン酸産生量測定
培養上清中のヒアルロン酸の測定は、キットに添付のプロトコールに従い、下記のように行なった。
ｉ）９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１００μＬのＣａｐｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、室温で２４時間反応させる（ヒアルロン酸の固相化）。
ii）各ウェルを洗浄液にて３回洗浄し、３００μＬのブロック緩衝液を添加し１時間反応させる。
iii)ヒアルロン酸標準原液（１７２０μｇ／ｍＬ）をもとに、反応緩衝液を用いて９０，３０，１０，３．３３，１．１１，０．３７，０．１２３ｎｇ／ｍＬのヒアルロン酸標準溶液を調製する。被験検体（培養上清）は反応緩衝液で１００倍希釈する。
iv）ヒアルロン酸固相化マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄する。
ｖ）ヒアルロン酸標準溶液および検体をそれぞれの各ウェルに１００μＬ添加し、室温で２時間反応する。
vi）各ウェルを洗浄液で３回洗浄し、１００μＬのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質溶液）を添加し、室温で２時間反応する。
vii)各ウェルを洗浄液で３回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加し、室温で２０分間静置する。
viii)各ウェルを洗浄液で３回洗浄し、酵素基質溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、遮光・室温下で２０分間静置する。
ix）反応停止溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長４５０ｎｍ）。
ｘ）標準曲線から、検体中のヒアルロン酸濃度を算出し、希釈倍数を乗じた値を測定値とする。
【００３４】
３）ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）
遺伝子発現解析
正常ヒト線維芽細胞を１ｘ１０4個／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、３７℃）で培養した。翌日、３段階の濃度のサンプル（ご相談の上決定）を添加した試験培地２に交換し、４８時間培養、ＰＢＳで細胞を洗浄後、トータルＲＮＡを回収、リアルタイムＰＣＲ法にてＨＡＳ２遺伝子発現量を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、陰性対照との相対値として算出した。試験数はそれぞれｎ＝５で行った。
【００３５】
４）トータルＲＮＡの回収及びｃＤＮＡ化
細胞からのトータルＲＮＡの回収およびｃＤＮＡ化はＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従って行った。
【００３６】
５）結果
図１に、添加したマイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡＳ）濃度と培養上清中のヒアルロン酸濃度の関係を示す。マイコスポリン様アミノ酸は、１ｍｇ／ｍＬ〜０．００８ｍｇ／ｍＬ濃度で、有意にヒアルロン酸産生を促進した。また、０．００１６ｍｇ／ｍＬでもヒアルロン酸産生促進効果を有していた。
また、マイコスポリン様アミノ酸は、０．２０ｍｇ／ｍＬで有意（ｐ＜０．００１）にＨＡＳ２遺伝子の発現を促進していた。
【００３７】
試験例３（繊維芽細胞増殖試験）
１）培養条件
正常ヒト線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で培養した。１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地は、ＤＭＥＭ培地４４５ｍＬにＦＢＳ５０ｍＬとＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５ｍＬを加えて調整した。
【００３８】
２）細胞賦活試験（ＷＳＴ−８アッセイ）
増殖培地で５×１０4個／ｍＬに調製した繊維芽細胞を、１ウェル（９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）あたり１００μＬ播種した（５×１０3個／１００μＬ／１ウェル）。これは、翌日におよそ５０％コンフルエント、つまり対数増殖期となる細胞数であり、被験物質が細胞増殖活性に与える影響を解析するのに適した細胞数である。播種後約２４時間培養し、各濃度のサンプルを含む増殖培地１００μＬに交換して、さらに２４時間培養した。培養終了時に培地を除き、生細胞数測定試薬ＳＦを１０％の濃度で添加した培地１００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。添加後、３０分、９０分後にマイクロプレートリーダーにて吸光度測定し（測定波長４５０ｎｍ）、９０分、３０分の値から１時間あたりの吸光度変化量を算出した。各試験濃度はｎ＝５で実施した。
【００３９】
３）結果
マイコスポリン様アミノ酸は、１ｍｇ／ｍＬ添加で有意（ｐ＜０．０５）な繊維芽細胞増殖作用を示した。
【図１】
0006272814.tif 000005