(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、
前記微生物はクレブシエラであり、
ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路およびピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されており、
野生型のクレブシエラよりも乳酸、コハク酸およびエタノールの生成量が少ない、
２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物。
【請求項２】
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼが抑制されることにより、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路およびピルビン酸をギ酸に転換する経路が抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
乳酸脱水素酵素が抑制されることにより、ピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるｐｆｌＢおよび乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるｌｄｈＡのいずれもが欠損または抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
アセチルＣｏＡをエタノールに転換する酵素をコードする遺伝子が欠損されていないことを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項６】
ギ酸または酢酸の生成能が抑制されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
回分式培養を基準として２，３‐ブタンジオールの選択度が７０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項８】
回分式培養を基準として２，３‐ブタンジオールの収率が０．３５ｇ／ｇ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項９】
流加式培養を基準として２，３‐ブタンジオールの選択度が７０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
流加式培養を基準として２，３‐ブタンジオールの選択度が８０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
前記培養液から２，３‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む、２，３‐ブタンジオールの生産方法。
【請求項１２】
好気条件で培養することを特徴とする、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
４５０ｒｐｍ以下の攪拌速度で撹拌を行いながら培養することを特徴とする、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１４】
前記培養は、撹拌を行いながら行われ、
培養途中にアセトインの濃度が５ｇ／Ｌ以上に増加する場合に撹拌速度を減少させることを特徴とする、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１５】
前記培養は、酸素供給量を調節することにより、２，３‐ブタンジオールの生産性を調節することを特徴とする、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１６】
前記培養は、撹拌を行いながら行われ、
前記培養は、撹拌速度を調節することにより、２，３‐ブタンジオールの生産性を調節することを特徴とする、請求項１１に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２，３‐ブタンジオールの生成能が増強された組換え微生物およびこれを用いた２，３‐ブタンジオールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
四つの炭素と二つのヒドロキシ基（−ＯＨ）を有するアルコールの一つ（ＣＨ3ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ3）である２，３‐ブタンジオールは、合成ゴムの製造工程における原料物質である１，３‐ブタジエン（１，３‐Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）と燃料添加剤および溶媒として使用されるメチルエチルケトン（Ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ、ＭＥＫ）に化学的触媒転換が可能である（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２９：３５１，２０１１）。また、２，３‐ブタンジオールは、ガソリン（Ｇａｓｏｌｉｎｅ）と混合してｏｃｔａｎｅ  ｂｏｏｓｔｅｒとして適用することができ、産業的に非常に重要な中間体である（Ｃｅｌｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２７：７１５，２００９）。
【０００３】
２，３‐ブタンジオールは、化学的合成工程と微生物醗酵工程により生産することができる。しかし、前記工程による２，３‐ブタンジオールの生産価格が非常に高いことから商業的規模への２，３‐ブタンジオールの生産は行われていない。一方、最近、微生物醗酵工程による２，３‐ブタンジオール生産技術の飛躍的な発展とともに、化石原料物質の急激な価格上昇と国際的な環境汚染に対する規制が強化されるに伴い、微生物醗酵によるバイオベースの２，３‐ブタンジオール生産への関心と研究開発の重要性が増大している。
【０００４】
バイオベースの２，３‐ブタンジオールの生産方法は、２，３‐ブタンジオール生産能を保有した微生物の醗酵により、再生可能なバイオ原料物質（Ｂｉｏｍａｓｓ）を２，３‐ブタンジオールに転換するものである。２，３‐ブタンジオールは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）など、各種の微生物によって生産される（Ｍａｄｄｏｘ  ＩＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６：２６９，１９９６）。特に、クレブシエラニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラオキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、パエニバチルスポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）が相対的に多量の２，３‐ブタンジオールを生産し、特に、クレブシエラニューモニエとクレブシエラオキシトカは、培養が容易で、生長速度が速く、木質系由来のペントースを含む各種のバイオ原料物質から２，３‐ブタンジオールを生産することができるという利点がある（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２９：３５１，２０１１；Ｃｈａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６３，２０１０；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２６：３６２，１９８４；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．，２７：８５，１９８３）。
【０００５】
微生物醗酵工程によるバイオベースの２，３‐ブタンジオールの生産研究は、醗酵工程最適化（温度、ｐＨ、溶存酸素など）と微生物開発（微生物発見、生理学的特性把握、突然変異、遺伝子操作など）分野に分けて行われている。醗酵工程最適化の面においては、２，３‐ブタンジオールを効率的に生産することができる温度、ｐＨ、溶存酸素濃度など、様々な条件が明らかになった（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１００：３４１０，２００９；Ｎａｋａｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０：６６１，２０００；Ｎａｋａｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０：１１３３，１９９８）。しかし、前記条件での微生物醗酵工程による２，３‐ブタンジオールの生産は、依然として生産性（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）および収率（Ｙｉｅｌｄ）が低くて、商業工程に直接適用し難いという問題がある。また、醗酵過程で２，３‐ブタンジオールとともに乳酸を含む有機酸（Ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）とエタノールを含むアルコール（Ａｌｃｏｈｏｌｓ）など、様々な副産物（Ｂｙ‐ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が生成されるという欠点がある。副産物の生成は、バイオ原料物質に対する２，３‐ブタンジオールの収率を低減するだけでなく、培養液から２，３‐ブタンジオール回収過程で莫大な分離および精製費用が求められる。
【０００６】
そのため、２，３‐ブタンジオールの生産に関する微生物開発研究は、主に副産物を減少させる方向に行われてきた。代表的に、Ｊｉなどは野生型クレブシエラオキシトカ菌株に物理／化学的突然変異方法の一種であるＵＶを露出させて副産物である有機酸の生成を一部抑制させることに成功した（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３０：７３１，２００８）。その他、イオン走査（Ｉｏｎ  ｂｅａｍ）方式をクレブシエラニューモニエ菌株に適用してバイオマスの消耗速度を増加させることで、２，３‐ブタンジオールの生産を向上させようとした（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８２：４９，２００９）。しかし、前記の開発された菌株は、２，３‐ブタンジオール生産性、最終濃度（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）および収率の面において商業工程に直接適用するには依然として足りないという問題がある。
【０００７】
したがって、本発明者らは、２，３‐ブタンジオールの生産性、濃度および収率が高いとともに、２，３‐ブタンジオールの選択度が高くて、副産物の生成が少ない組換え微生物について鋭意研究を重ねた結果、特定の遺伝子を欠損させた組換え微生物が、２，３‐ブタンジオールの選択度および生産性が高いとともに副産物の生成が少ないことを見出し、発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、２，３‐ブタンジオールの生成能が増強された組換え微生物およびこれを用いた２，３‐ブタンジオールの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために本発明は、アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路またはピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されている２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、本発明の組換え微生物を培養する段階と、前記培養液から２，３‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む２，３‐ブタンジオールの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の組換え微生物は、２，３‐ブタンジオールを高い選択度および濃度で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】クレブシエラ菌株で２，３‐ブタンジオールが合成される経路を示す模式図である。
【図２】乳酸生成に関する乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の遺伝子であるｌｄｈＡが除去されたことを確認するために、ＰＣＲ増幅後、電気泳動して撮影したＡｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌの写真である。
【図３】ギ酸生成に関するピルビン酸‐ギ酸リアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）の遺伝子であるｐｆｌＢが除去されたことを確認するために、ＰＣＲ増幅後、電気泳動して撮影したＡｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌの写真である。
【図４】比較例１のクレブシエラオキシトカ菌株の醗酵結果を示す図である。
【図５】比較例２の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の醗酵結果を示す図である。
【図６】実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の醗酵結果を示す図である。
【図７】撹拌速度（１５０ｒｐｍ）に対する実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の回分式醗酵結果を示す図である。
【図８】撹拌速度（２５０ｒｐｍ）に対する実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の回分式醗酵結果を示す図である。
【図９】撹拌速度（３５０ｒｐｍ）に対する実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の回分式醗酵結果を示す図である。
【図１０】撹拌速度（４５０ｒｐｍ）に対する実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の回分式醗酵結果を示す図である。
【図１１】撹拌速度に対する１時間当りの２，３‐ブタンジオールの濃度を示す図である。
【図１２】撹拌速度を４５０ｒｐｍに維持し、好気条件下で実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の流加式醗酵結果を示す図である。
【図１３】撹拌速度を調節して行った実施例１の組換えクレブシエラオキシトカ菌株の流加式醗酵結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路またはピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されている２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物に関するものである。
【００１４】
また、本発明は、本発明の組換え微生物を培養する段階と、前記培養液から２，３‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む２，３‐ブタンジオールの生産方法に関するものである。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
＜２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物＞
本発明の組換え微生物は、アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路またはピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されている２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物である。
【００１７】
また、本発明の組換え微生物は、アルコール脱水素酵素（アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子、すなわち、ａｄｈＥが欠損されていないものである。
【００１８】
好ましくは、本発明の組換え微生物は、図１のように、アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有しており、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路およびピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制された組換え微生物である。
【００１９】
また、本発明の組換え微生物は、２，３‐ブタンジオールの選択度、収率、濃度および生産性が高い。すなわち、本発明の組換え微生物は、回分式培養または流加式培養を基準として、２，３‐ブタンジオールの選択度が７０％以上であり、好ましくは、８０％以上であり、２，３‐ブタンジオールの収率が０．３５ｇ／ｇ以上である。また、本発明の組換え微生物は、前記組換えにより、野生型微生物よりギ酸、酢酸またはエタノールの生成能が抑制されたものである。
【００２０】
＜アセチルＣｏＡ生合成経路＞
本発明のアセチルＣｏＡ（Ａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ）生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物からアセチルＣｏＡが合成される経路を意味する。本発明のアセチルＣｏＡ生合成経路は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）からアセチルＣｏＡが合成される経路などであってもよい。
【００２１】
＜乳酸生合成経路＞
本発明の乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）生合成経路は、微生物内の特定の代謝産物から乳酸が合成される経路を意味する。本発明の乳酸生合成経路は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）から乳酸が合成される経路などであってもよい。
【００２２】
＜アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物＞
本発明のアセチルＣｏＡ生合成経路および乳酸生合成経路を有する微生物は、上述の前記生合成経路を有する微生物であればよく、特に限定されない。また、本発明の微生物は、アセチルＣｏＡ生合成経路および乳酸生合成経路を野生型として有している微生物または遺伝子組換えにより有するようになる組換え微生物であってもよい。例えば、本発明の微生物は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属またはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物であってもよく、好ましくは、クレブシエラオキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等であり、最も好ましくは、クレブシエラオキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）である。
【００２３】
＜ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路の抑制＞
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）は、ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの転換を調節する。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することにより、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路が抑制されることができる。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの抑制は、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの発現抑制、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの酵素活性の抑制などにより行われることができる。例えば、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるｐｆｌＢを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することができる。
【００２４】
＜ピルビン酸をギ酸に転換する経路の抑制＞
ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）は、ピルビン酸のギ酸への転換を調節する。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することにより、ピルビン酸をギ酸に転換する経路が抑制されることができる。前記ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの抑制は、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの発現抑制、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼの酵素活性抑制などにより行われることができる。例えば、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼをコードする遺伝子であるｐｆｌＢを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼを抑制することができる。
【００２５】
＜ピルビン酸を乳酸に転換する経路の抑制＞
乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、ピルビン酸の乳酸への転換を調節する。前記乳酸脱水素酵素を抑制することにより、ピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されることができる。前記乳酸脱水素酵素の抑制は、乳酸脱水素酵素の発現抑制、乳酸脱水素酵素の酵素活性抑制などにより行われることができる。例えば、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるｌｄｈＡを欠損させたり、前記遺伝子に突然変異（一部の塩基を変異、置換または削除したり、一部の塩基を導入して正常な遺伝子の発現を抑制させるなどの突然変異）を起こしたり、転写過程または翻訳過程での遺伝子発現調節など、当業者は適切な方法を選択して、乳酸脱水素酵素を抑制することができる。
【００２６】
＜アルコール脱水素酵素＞
アルコール脱水素酵素（アルデヒド／アルコール脱水素酵素）は、アセチルＣｏＡをエタノールに転換する経路を調節する。そのため、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるａｄｈＥを欠損させてエタノール生産を阻害することにより、２，３‐ブタンジオールの生産の増加を図る場合もある（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８５：１７５１，２０１０）。しかしながら、本発明の組換え微生物の場合、ａｄｈＥが追加に欠損される場合、２，３‐ブタンジオールの生産量、選択度および生産性が著しく低下する問題がある。そのため、本発明では、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子であるａｄｈＥを欠損させない。
【００２７】
＜２，３‐ブタンジオールの生産方法＞
本発明の２，３‐ブタンジオールの生産方法は、本発明の組換え微生物を培養する段階と、前記培養液から２，３‐ブタンジオールを回収する段階と、を含む。
【００２８】
前記培養は、好気条件で行われ、好ましくは、微好気的条件（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で行われる。例えば、前記培養は、培養の際に酸素、すなわち空気を供給しながら行われ、具体例として、これは、撹拌により行われることができる。好ましくは、前記培養は、４５０ｒｐｍ以下で撹拌を行いながら行われ、より好ましくは、５０〜４５０ｒｐｍで撹拌を行い、さらに好ましくは１５０〜４５０ｒｐｍで行う。
【００２９】
好ましくは、前記培養は、酸素供給量を調節することにより２，３‐ブタンジオールの生産性を調節することができる。本発明の培養の際に酸素供給量を調節する方法として、例えば、本発明の培養は、撹拌を行いながら行われ、培養途中に撹拌速度を調節することにより、２，３‐ブタンジオールの生産性を調節することができる。例えば、アセトインの濃度が５ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上に増加する際に、撹拌速度を減少させて行うことが、２，３‐ブタンジオールの濃度および生産性を増加させ、副産物の生成を阻害するために好ましい。
【００３０】
発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になるであろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に具現され、ただし、本実施例は本発明の開示を完全にし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであって、本発明は請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００３１】
＜材料および方法＞
‐２，３‐ブタンジオールの濃度（ｇ／Ｌ）：単位体積当たり生産される２，３‐ブタンジオールの量
‐２，３‐ブタンジオールの収率（ｇ／ｇ）：２，３‐ブタンジオール生産量（ｇ）／炭素源（ｇ）×１００
‐２，３‐ブタンジオールの生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）：単位時間、単位体積当たり生産される２，３‐ブタンジオールの量
‐２，３‐ブタンジオールの選択度（％）:２，３‐ブタンジオール生産量（ｇ）／（２，３‐ブタンジオール、エタノール、アセトイン、こはく酸、乳酸、ギ酸および酢酸の生産量）（ｇ）×１００
【００３２】
＜実験例１＞組換え微生物の製造
標的遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片で作製されたクレブシエラオキシトカの標的遺伝子を不活性化させるためにバクテリアの組換えメカニズムを用いており、除去しようとする遺伝子の相同部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎ）をＰＣＲで増幅した。その後、相同部位を含む当該ＤＮＡ断片をバクテリアに伝達した後、ＤＮＡ断片に存在する遺伝子の相同部位とクレブシエラオキシトカの染色体に存在する遺伝子の間にリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）による組換えメカニズムで標的遺伝子を除去することになる。
【００３３】
先ず、クレブシエラオキシトカの乳酸脱水素酵素をクローニングするために標的遺伝子であるｌｄｈＡ（配列番号１）の相同部位１（配列番号２）を配列番号３および４のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号５）を配列番号６および７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１と２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２が含まれたＤＮＡ断片（配列番号８）を完成した。
【００３４】
一方、クレブシエラオキシトカのピルビン酸ギ酸リアーゼの相同部位をクローニングするために標的遺伝子であるｐｆｌＢ（配列番号９）の相同部位１（配列番号１０）を配列番号１１および１２のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。また、相同部位２（配列番号１３）を配列番号１４および１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。その後、相同部位１と２を同時に鋳型としてＰＣＲで増幅し、相同部位１と２がＤＮＡ断片（配列番号１６）を完成した（表１）。標的遺伝子の組換え確率を高めるために前記完成されたＤＮＡ断片は抗生剤耐性遺伝子などを含むことができ、染色体内に組換えされた抗生剤耐性遺伝子を除去するためにレバンスクラーゼ酵素をコードするｓａｃＢ遺伝子を含むことができる。
【００３５】
【表１】
0006305511.tif 000002
【表１−２】
0006305511.tif 000003
【表１−３】
0006305511.tif 000004
【表１−４】
0006305511.tif 000005
【表１−５】
0006305511.tif 000006
【表１−６】
0006305511.tif 000007
【００３６】
＜組換え微生物の作製＞
前記作製されたＤＮＡ断片を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、２５μＦ、２００Ω、１８ｋＶ／ｃｍ）を用いてクレブシエラオキシトカに伝達し、微生物の組換えメカニズムを用いて標的遺伝子を除去することができた。
【００３７】
クレブシエラオキシトカ野生型にｌｄｈＡ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達してｌｄｈＡ遺伝子を除去した組換えクレブシエラオキシトカを製造した（比較例２）。一方、クレブシエラオキシトカ野生型でｌｄｈＡ遺伝子を除去した後、ｐｆｌＢ遺伝子の相同部位を含むＤＮＡ断片を伝達してｌｄｈＡ遺伝子に追加でｐｆｌＢ遺伝子が除去されたクレブシエラオキシトカを製造した（実施例１）。
【００３８】
電気穿孔法を行った後、前記組換え微生物を３０℃で１時間培養して安定化させた後、抗生剤（カナマイシンまたはクロラムフェニコールなど）が入っているＬＢ複合固体培地に３７℃にそれぞれスプレード（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）して培養した。
【００３９】
その後、固体培地で育ったコロニーでコロニーＰＣＲを行い、前記コロニーで当該遺伝子が除去されたことを確認した（それぞれ図２および図３）。この際、ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたことを確認するために配列番号１７および１８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐｆｌＢ遺伝子が除去されたことを確認するために配列番号１９および２０のプライマーを用いてＰＣＲを行った（表２）。
【００４０】
【表２】
0006305511.tif 000008
【００４１】
この後、試験では、クレブシエラオキシトカ野生型を比較例１として使用した。一方、ｌｄｈＡが除去された比較例２の組換えクレブシエラオキシトカにエタノール生産に直接関与するアルコール脱水素酵素（アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子であるａｄｈＥを追加に欠損させて、ｌｄｈＡおよびａｄｈＥが欠損された組換えクレブシエラオキシトカを製造し、これを比較例３として試験を行った。前記ｌｄｈＡやｐｆｌＢ遺伝子の除去方法と同様にしてａｄｈＥ遺伝子を除去した。ｌｄｈＡが除去されたクレブシエラオキシトカにａｄｈＥ遺伝子の相同部位を含んでいるＤＮＡ断片を伝達してｌｄｈＡ遺伝子に追加にａｄｈＥ遺伝子が除去されたクレブシエラオキシトカを製造した。
【００４２】
＜実験例２＞
実験例１で準備した実施例１、比較例１および比較例２の微生物を用いて回分式培養を行った。先ず、前記クレブシエラ菌株を９ｇ／Ｌブドウ糖（５０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ）を含む２５０ｍｌの複合培地に接種して３７℃で１６時間培養した後、この培養液を３Ｌ複合培地に接種して培養した。この際、醗酵条件は、微好気条件（ｍｉｃｒｏ‐ａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；好気速度１ｖｖｍ、撹拌速度１５０ｒｐｍ）、９０ｇ／Ｌ初期ブドウ糖濃度、ｐＨ６．８、培養温度３７℃とした。醗酵中にｐＨの調整のために５Ｎ  ＮＨ4ＯＨを使用した。前記クレブシエラ菌株に対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して生長速度を測定し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および２，３‐ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００４３】
その結果、比較例２の場合、２，３‐ブタンジオール生産量は２９．９１ｇ／Ｌであり、２，３‐ブタンジオール生産収率（２，３‐ブタンジオールｇ／ブドウ糖ｇ）は０．３２であった。また、比較例２の菌株の２，３‐ブタンジオール生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）は１．０７であり、選択度は５９％であった。野生型クレブシエラオキシトカである比較例１と比較したとき、比較例２の組換え菌株は、乳酸生産が減少し、２，３‐ブタンジオールの生産能が良好になり、２，３‐ブタンジオールの生産濃度、生産収率、生産性および選択度がいずれも改善することが確認された。しかし、比較例２の組換えクレブシエラオキシトカは、依然として副産物であるギ酸およびエタノールを過量で生成し、これは、比較例２の２，３‐ブタンジオールの生産濃度、生産収率、選択度などを阻害する要因として判断された（図４：比較例１、図５：比較例２）。
【００４４】
一方、比較例２（クレブシエラオキシトカΔｌｄｈＡ、２，３‐ＢＤＯ２９．９１ｇ／Ｌ）と比較すると、実施例１の組換え菌株は、２，３‐ブタンジオール生産量が３９．１７±１．５１ｇ／Ｌに増加した。また、実施例１の組換え菌株は、ギ酸は９０％以上、エタノールは７３％以上生成量が減少し、２，３‐ブタンジオール生産収率（２，３‐ブタンジオールｇ／ブドウ糖ｇ）もまた０．３２から０．４５に大幅に増加したことが確認された。２，３‐ブタンジオールの理論収率（クレブシエラオキシトカに供給したグルコースがいずれも２，３‐ブタンジオールに転換されると仮定する場合の収率）が０．５ということを考慮すると、実施例１の収率（理論収率の９０％）は相当高いものである。
【００４５】
そのため、ｌｄｈＡおよびｐｆｌＢ遺伝子の除去によりギ酸、エタノールなどの副産物を同時に除去することで、副産物生成は著しく減少し、２，３‐ブタンジオールを高い純度で生産するということを確認することができた。これにより、クレブシエラの乳酸脱水素酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸‐ギ酸分解酵素（ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ）をコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）の除去は、２，３‐ブタンジオール生産経路の様々な段階において、２，３‐ブタンジオールの生産に非常に重要であるということを確認することができた（図６）（表３）。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
＜実験例３＞
２，３‐ブタンジオール生産微生物で２，３‐ブタンジオール生合成と競争して副産物の生産に関与する遺伝子を除去する場合、２，３‐ブタンジオールの生産能が改善するか否かを試験した。ａｄｈＥは２，３‐ブタンジオール生産において副産物であるエタノールの生産に直接関与するアルコール脱水素酵素（アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子である。そのため、ｌｄｈＡおよびａｄｈＥが除去された比較例３の組換えクレブシエラオキシトカを培養して、実施例１と比較した。この際、比較例３の組換え微生物の培養条件は、前記実験例２と同様に行った。
【００４８】
その結果、クレブシエラオキシトカでｌｄｈＡとａｄｈＥが同時に除去された比較例３の場合、比較例２（クレブシエラオキシトカΔｌｄｈＡ、２，３‐ＢＤＯ２９．９１ｇ／Ｌ）と比較の際に２，３‐ブタンジオール生産量が２５．９６ｇ／Ｌとむしろ減少することが示された。また、比較例３の２，３‐ブタンジオール生産収率は、比較例２の０．３２から０．２７に減少し、選択度は比較例２の５９％から５５％に減少し、生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）は比較に２の１．０７から０．３６に著しく減少した。また、比較例２と比較すると、比較例３のエタノール生産量は減少したが、２，３‐ブタンジオールの生産能力はむしろ悪化した。
【００４９】
また、実施例１と比較してみても、比較例３の２，３‐ブタンジオール生産能力が著しく低いことが分かった（表４）。そのため、副産物の生産に関与する遺伝子を除去するとしても、常に２，３‐ブタンジオールの生産に有利ではないということを確認することができた。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
＜実験例４＞酸素供給量の変化による２，３‐ブタンジオールの生産変化
実施例１の組換えクレブシエラオキシトカを用いて、培養の際に撹拌速度による培地の溶存酸素量の変化が、２，３‐ブタンジオールの生産収率、生産性および選択度に及ぼす影響を評価した。
【００５２】
先ず、実施例１の組換え微生物を９ｇ／Ｌブドウ糖（５０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ）を含む２５０ｍｌの複合培地に接種して３７℃で１６時間培養した後、この培養液を３Ｌ複合培地に接種して回分式醗酵を行った。醗酵条件は、微好気条件（ｍｉｃｒｏ‐ａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；好気速度１ｖｖｍ）、９０ｇ／Ｌ初期ブドウ糖濃度、ｐＨ６．８、培養温度３７℃とし、撹拌速度はそれぞれ１５０、２５０、３５０、４５０ｒｐｍと異なるようにした。醗酵中にｐＨの調整のために５Ｎ  ＮＨ4ＯＨを使用した。前記組換えクレブシエラに対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して生長速度を測定し、採取された試料は、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および２，３‐ＢＤＯ濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００５３】
その結果、実施例１の組換えクレブシエラオキシトカは、撹拌速度の変化に応じて２，３‐ブタンジオールの生産性（ｇ／Ｌ／ｈ）が大幅に変化することで示された。すなわち、１５０ｒｐｍで撹拌するときより、４５０ｒｐｍで撹拌する場合、２，３‐ブタンジオールの生産性が５倍以上増加したことを確認することができた（表５、図７〜１１）。これにより撹拌速度による酸素供給量変化により実施例１の生産性を改善することができることを確認することができた。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
＜実験例５＞好気条件（４５０ｒｐｍ撹拌）下の流加式醗酵による２，３‐ブタンジオールの生産
実験例４の結果に基づき生産性が最も改善した４５０ｒｐｍに撹拌速度を維持して２，３‐ブタンジオール生産のための流加式醗酵を実施例１の菌株を用いて行った。
【００５６】
実施例１の組換えクレブシエラ菌株を９ｇ／Ｌブドウ糖（５０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ）を含む２５０ｍｌの複合培地に接種して３７℃で１６時間培養した後、この培養液を３Ｌ複合培地に接種して流加式培養を行った。この際、醗酵条件は、微好気条件（ｍｉｃｒｏ‐ａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；好気速度１ｖｖｍ）、９０ｇ／Ｌ初期ブドウ糖濃度、ｐＨ６．８、培養温度３７℃とした。撹拌速度は４５０ｒｐｍに維持し続けた。醗酵中にｐＨの調整のために５Ｎ  ＮＨ4ＯＨを使用した。醗酵中にブドウ糖濃度が１０ｇ／Ｌ以下に低減すると７００ｇ／Ｌ以上のブドウ糖溶液をフィード（ｆｅｅｄｉｎｇ）した。前記組換えクレブシエラに対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して生長速度を測定し、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および２，３‐ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００５７】
その結果、撹拌速度を４５０ｒｐｍに維持し続けた時には２，３‐ブタンジオール生産能力が維持され続けないことを確認した（表６）。特に、アセトイン濃度が１０ｇ／Ｌを超える時、２，３‐ブタンジオール生産能力が著しく低下することを確認することができた（図１２）。４５０ｒｐｍ撹拌速度に維持した流加式培養結果に基づき撹拌速度の調節による流加式培養をしなければならないということが分かり、蓄積されるアセトイン濃度に基づき撹拌速度調節時点を決定しなければならないということが分かった。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
＜実験例６＞流加式醗酵による２，３‐ブタンジオールの生産
実施例１の組換えクレブシエラ菌株を９ｇ／Ｌブドウ糖（５０ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ）を含む２５０ｍｌの複合培地に接種して３７℃で１６時間培養した後、この培養液を３Ｌ複合培地に接種して流加式培養を行った。この際、醗酵条件は、微好気条件（ｍｉｃｒｏ‐ａｅｒｏｂｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；好気速度１ｖｖｍ）、９０ｇ／Ｌ初期ブドウ糖濃度、ｐＨ６．８、培養温度３７℃、撹拌速度４５０ｒｐｍとした。醗酵中にｐＨの調整のために５Ｎ  ＮＨ4ＯＨを使用した。醗酵中にブドウ糖濃度が１０ｇ／Ｌ以下に低下すると、７００ｇ／Ｌ以上のブドウ糖溶液をフィード（ｆｅｅｄｉｎｇ）した。また、副産物の一つであるアセトイン（ａｃｅｔｏｉｎ）の濃度が７ｇ／Ｌになる時点で撹拌速度を４５０ｒｐｍから３５０ｒｐｍに転換して醗酵を行った。前記組換えクレブシエラに対して醗酵中にサンプルを採取し、採取された試料のＯＤ６００（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定して生長速度を測定した、採取された試料は１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液の代謝産物および２，３‐ブタンジオール濃度を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６０】
その結果、実験例５で４５０ｒｐｍで撹拌速度を一定に維持して流加式培養を行った場合よりも２，３‐ブタンジオールの濃度は７４．５％、生産性は２９．７％、収率は５５．２％、選択度は２７．０％に大幅に増加した。したがって、実施例１の組換え菌株を用いた２，３‐ブタンジオールの生産には撹拌速度による溶存酸素量の調節が大きい影響を及ぼすことを確認することができた。そのため、撹拌速度の調節によって培地内の溶存酸素量を調節することで、２，３‐ブタンジオールの生産性を改善することができると判断された（表７、図１３）。
【００６１】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、アセチルＣｏＡおよび乳酸生合成経路を有する微生物であって、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換する経路、ピルビン酸をギ酸に転換する経路またはピルビン酸を乳酸に転換する経路が抑制されている２，３‐ブタンジオールの生成能が増加した組換え微生物に関するものである。本発明の組換え微生物は、２，３‐ブタンジオールを高い選択度および濃度で生産することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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