(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏を診断またはスクリーニングするための組成物であって、
式（Ｉ）：
【化１３】
0006272834.tif 000020
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１４】
0006272834.tif 000021
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
の標識試薬またはその塩もしくは水和物
を含み、
１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を含有する分析物が、前記標識試薬を用いて誘導体化されることにより、標識された分析物を形成することと、
前記標識された分析物がイオン化されることと、
前記標識された分析物のシグネチャーイオンフラグメントが、質量分析によって検出されることと、
前記シグネチャーイオンフラグメントの強度が、標準のシグネチャーイオンフラグメントと比較されることと
を特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、
７α−コレステン−３−オン、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，１２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうちの１種または複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのうち少なくとも２種を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記誘導体化が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む分析物のパネルを誘導体化することを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記分析物のパネルが、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記分析物が、生体マトリックスから得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記生体マトリックスが、新鮮血液、乾燥血液、血清、または血漿を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体マトリックスの体積が、１０μＬ以下である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記シグネチャーイオンフラグメントが、前記分析物の構造フラグメントおよび前記標識試薬またはその一部を含む中性損失フラグメントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
１種または複数の標準化合物が、式（Ｉ）の標識試薬を用いて誘導体化されることにより、同位体濃縮されている標識された標準を形成すること、ならびに前記標識された分析物および前記標識された標準の両方がイオン化されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標準化合物が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記検出が、単回の質量分析の試行で実施される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
同位体標識された標準に対する前記標識された分析物の相対濃度が測定されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記標識された分析物のイオン化が、約１０〜約１３０ｅＶの範囲にある衝突エネルギーを使用して実施される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
ケトステロール胆汁酸前駆体を分析するためのキットであって、
ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットと、
式（Ｉ）
【化１６】
0006272834.tif 000022
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１７】
0006272834.tif 000023
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
のうちの２種以上の化合物またはその塩もしくは水和物を含む質量標識のセットと、
アッセイを実施するためのバッファー、試薬、分離カラムおよび説明書のうちの１種または複数と
を含む、キット。
【請求項１８】
前記ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットが、
７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうち２種以上を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ケトステロール胆汁酸前駆体のセットが、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年５月１８日出願の米国仮出願第６１／６４９，０４４号による優先権の利益を主張し、その仮出願の全内容は、参照によって本明細書で援用される。
【０００２】
政府認可の権利
本発明は、ＮＣＲＲおよびＮＩＨのＮＣＡＴＳによって授与されたＯＣＴＲＩ認可番号５ＫＬ２  ＲＲ０２４１４１−０４下における政府支援を部分的に用いて行われ得る。政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００３】
本明細書に記載された教示は、標識試薬を使用するケトステロール胆汁酸前駆体の分析を対象とする方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
新生児スクリーニングプログラムは、遺伝子状態の早期検出および治療によって、命を救うことならびに精神遅滞などの重篤な病的状態を防ぐことにおいて有効であり得る。したがって、新生児のためのスクリーニングは、さらなる障害、特に、治療選択肢を有するものを含むよう拡大されるべきである。
【０００５】
新生児スクリーニングプログラムが、特に有用であり得る遺伝子状態として、ステロール経路に変更を含むものが挙げられる。これらの状態は、早すぎる死亡および病的状態を引き起こすことがあり、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）、スミス−レムリ−オピッツ症候群、家族性高コレステロール血症および先天性副腎皮質過形成症などの状態を含む。ＣＴＸは、最近の米国臨床遺伝学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）の報告書においてユニバーサルな新生児スクリーニングの候補として同定されている。しかし、有効であるためには、ＣＴＸのスクリーニングおよび／または診断方法は、十分に感度が高く、選択性でなくてはならない。
【０００６】
ＣＴＸは、ＣＹＰ２７Ａ遺伝子（ＣＹＰ２７Ａ遺伝子は、ステロール２７−ヒドロキシラーゼ遺伝子としても公知である）中の突然変異によって引き起こされる稀な遺伝的ステロール状態である。ＣＹＰ２７Ａ遺伝子は、胆汁酸の産生において重要であるＰ４５０酵素と関連している。ＣＹＰ２７Ａ活性が、阻害されるか、遮断される場合に、胆汁酸前駆体が、種々の組織中に蓄積する。ＣＴＸは、ケトステロール胆汁酸前駆体およびゆっくりと増大するその誘導体の蓄積によって引き起こされる症状を伴って小児期に現れることが多い。ＣＴＸは、重大な損傷が行われてしまった後の成人期まで同定されないことが多い。ＣＴＸの生化学的表現型は、図１２に示されている。
【０００７】
２７−ヒドロキシラーゼ欠乏のバイオマーカーのスクリーニングがこれまでに考慮されてきた。しかし、ＣＴＸのバイオマーカーは、ケトステロールバイオマーカー化合物であり、このようなスクリーニングは、これらのバイオマーカーが、一般的に、血漿などの臨床および生体試料中に低レベルで存在するので、課題を提示する。さらに、バイオマーカーは、罹患していない個体ではさらに低レベルで存在し得、このため参照を得ることが困難となる。高度に疎水性のケトステロイドは、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを使用する場合にはクロマトグラフィー上の課題をもたらす。また、質量分析によるケトステロールバイオマーカーステロイドの検出および定量も、このような化合物のイオン化効率の不十分さ、複雑なイオン化パターン、等圧化合物による質量測定における干渉および試料媒体中の低い試料濃度のために特に困難なものである。
【０００８】
化学的誘導体化後の分析のためのＧＣ−ＭＳ法などの標準クロマトグラフィー技術が利用可能である。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｎｇ，  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．、７９１巻、１〜２号（１２７〜１３５頁）２００３年を参照のこと。蛍光検出およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含めたいくつかのイムノアッセイを使用する方法も利用可能であるが、これらは、普通、多成分分析を提供しない。ＲＩＡを用いる主な問題は、特異性がないことであり、各ステロイドについて異なるアッセイを実施する必要がある。
【０００９】
ＣＴＸおよび腸疾患において蓄積する５α−コレスタ−３−オンおよび他の胆汁酸前駆体などのケトステロールを分析するための１つの既存の分析方法が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１５８，４３５号、Ａｎｄｒｅａ  Ｅ．  ＤｅＢａｒｂｅｒら；Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、４１１巻（２０１０年）４３〜４８頁；Ａｋｉｒａ  Ｈｏｎｄａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６巻、３７号（２００１年）３４５７９〜３４５８５頁およびＭ．  ＣａｍｉｌｌｅｒｉらＮｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ（２００９年）２１巻、７３４−ｅ４３頁のＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅに記載されている。ＥＳＩ−ＭＳＭＳ検出とともに、Ｇｉｒａｒｄ  Ｐ誘導体化を使用するＣＴＸの生化学的スクリーニングのために、ＧＣ−ＦＩＤまたはＧＣ−ＭＳが使用された。しかし、ＧＣベースの方法論の制限として、長い分析時間（＞３０分）および複雑な試料調製が挙げられる。
【００１０】
試料中のケトステロールバイオマーカー化合物を検出し、定量化することと関連している上記の課題は、対象の特定の化合物またはケトステロール胆汁酸前駆体のパネルについて、多数の生物学的試料を迅速にスクリーニングし、および／または分析したいという要求によって拡大される。
【００１１】
さらに、従来法は、労働集約的であり、特に、典型的には少ない試料容積しか利用可能ではない新生児スクリーニングのための、正常な罹患していない患者血清または全血試料を測定するのに必要な感度を欠く場合がある。したがって、罹患したおよび正常なヒト試料中のＣＴＸバイオマーカーのレベルを分析するための簡単で特異的な方法を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第８，１５８，４３５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｏｎｇ，  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．、７９１巻、１〜２号（１２７〜１３５頁）２００３年
【非特許文献２】Ａｎｄｒｅａ  Ｅ．  ＤｅＢａｒｂｅｒら；Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、４１１巻（２０１０年）４３〜４８頁
【非特許文献３】Ａｋｉｒａ  Ｈｏｎｄａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６巻、３７号（２００１年）３４５７９〜３４５８５頁
【非特許文献４】ＣａｍｉｌｌｅｒｉらＮｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ（２００９年）２１巻、７３４−ｅ４３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、ＣＴＸの同定および定量化のための適した感度の高い選択的スクリーニング試験が依然として必要である。このような試験は、ＣＴＸのマーカーとして有用であるケトステロールおよび他の分析物の定量化のために感度が高く、特異的であることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏を診断またはスクリーニングする方法であって、
１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を含有する分析物を、式（Ｉ）：
【化１３】
0006272834.tif 000002
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１４】
0006272834.tif 000003
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
の標識試薬またはその塩もしくは水和物を用いて誘導体化することにより、標識された分析物を形成するステップと、
前記標識された分析物をイオン化するステップと、
前記標識された分析物のシグネチャーイオンフラグメントを、質量分析によって検出するステップと、
前記シグネチャーイオンフラグメントの強度を、標準のシグネチャーイオンフラグメントと比較するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）に起因する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏が、Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏に起因する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、
７α−コレステン−３−オン、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，１２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうちの１種または複数を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体が、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのうち少なくとも２種を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記誘導体化が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む分析物のパネルを誘導体化することを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記分析物のパネルが、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標識試薬が、構造：
【化１５】
0006272834.tif 000004
またはその塩もしくは水和物を有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記分析物が、生体マトリックスから得られる、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記生体マトリックスが、新鮮血液、乾燥血液、血清、または血漿を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記生体マトリックスの体積が、１０μＬ以下である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記シグネチャーイオンフラグメントが、前記分析物の構造フラグメントおよび前記標識試薬またはその一部を含む中性損失フラグメントである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
１種または複数の標準化合物を、式（Ｉ）の標識試薬を用いて誘導体化することにより、同位体濃縮されている標識された標準を形成し、前記標識された分析物および前記標識された標準の両方をイオン化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記標準化合物が、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記検出するステップが、単回の質量分析の試行で実施される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
同位体標識された標準に対する前記標識された分析物の相対濃度を測定することをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記標識された分析物をイオン化する前記ステップが、約１０〜約１３０ｅＶの範囲にある衝突エネルギーを使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ケトステロール胆汁酸前駆体を分析するためのキットであって、
ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットと、
式（Ｉ）
【化１６】
0006272834.tif 000005
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化１７】
0006272834.tif 000006
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
のうちの２種以上の化合物またはその塩もしくは水和物を含む質量標識のセットと、
アッセイを実施するためのバッファー、試薬、分離カラムおよび説明書のうちの１種または複数と
を含む、キット。
（項目１９）
前記ケトステロール胆汁酸前駆体標準のセットが、
７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、
５α−コレスタン−３−オン、
４−コレステン−３−オン、
７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および
７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン
のうち２種以上を含む、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
前記ケトステロール胆汁酸前駆体のセットが、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含む、項目１８に記載のキット。
本教示の一部の広い態様に従って、罹患したまたは正常なヒト試料などのヒト試料中のＣＴＸおよびＩＢＳ（過敏性腸症候群）バイオマーカーを検出および定量化する方法が開示されている。多数の実施形態では、このような方法は、少体積、例えば、１０μＬ未満、例えば、約３〜約５μＬの範囲にある試料体積などの約５マイクロリットル（μＬ）未満の試料体積を有する試料についてでさえ、必要とされるＬＬＯＱを達成するために、マススペクトロスコピーによるその検出のための、対象の分析物、例えば、ＣＴＸバイオマーカーのイオン化効率を改善するために、本明細書に開示される第四級アミノキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）（ＱＡＯ）試薬を使用する。ケトステロール胆汁酸前駆体は、ＣＴＸおよびＩＢＳバイオマーカーの例である。
【００１６】
種々の実施形態では、本明細書に開示された同位体濃縮された第四級アミノキシ試薬が、他の物質が混じっていない標準との簡単な反応によって、対象の各分析物の内部標準を作製するために使用され得る。一部の実施形態では、バイオマーカーのパネルの内部標準は、既知濃度の複数のバイオマーカー分析物を、本明細書に開示される第四級アミノキシ試薬の同位体変異体で標識すること（すなわち、各バイオマーカーを、ＱＡＯ試薬の異なる同位体変異体で標識すること）によって作り出され得る。このような内部標準は、対象のバイオマーカーの絶対定量化を可能にするために試験試料に添加され得る。
【００１７】
種々の実施形態では、本教示による方法は、少体積の、複雑な生体マトリックスを有する試料を含めた種々の試料からのケトステロイド胆汁酸前駆体の検出を可能にする、ケトステロールバイオマーカーの高度に感度の高い、特異的な分析のために使用され得る。
【００１８】
一部の実施形態では、２７−ヒドロキシラーゼ欠乏を診断またはスクリーニングする方法が開示されており、これは、ヒト試料を、上記で開示されたものなどのＱＡＯ試薬で処理して、試料中の１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を標識することならびに処理した試料をＬＣ−ＭＳ分析に付して、標識された前駆体を検出および定量化することを含む。
【００１９】
一部の場合には、上記の方法は、既知濃度の種々のケトステロール胆汁酸前駆体を、本明細書に開示された、異なって同位体標識されたＱＡＯ試薬で標識することによって、１種または複数の内部標準を調製することをさらに含み得る。一部の実施形態では、このような内部標準は、例えば、ＬＣ−ＭＳを使用してバイオマーカーのパネルを同時定量化するために利用され得る。例えば、一部の実施形態では、このような内部標準の使用によって、ＬＣ−ＭＳ分光計の単回試行でバイオマーカーのパネルを検出および定量化することが可能となる。
【００２０】
一部の実施形態では、質量分析のためにケトステロール胆汁酸前駆体を標識するために使用された第四級アミノキシ（ＱＡＯ）試薬として、式（Ｉ）：
【化１】
0006272834.tif 000007
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、
【化２】
0006272834.tif 000008
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
である］
の標識試薬またはその塩もしくは水和物が挙げられる。
【００２１】
一部の実施形態では、標識試薬は、
【化３】
0006272834.tif 000009
である。
【００２２】
一部の実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、尿または唾液などの生体マトリックスである。新生児スクリーニングの一部としての血液試料の分析は、本教示の範囲内にある。例えば、一部の実施形態では、本教示の方法は、１０μＬ以下もしくは５μＬ以下の容積の乾燥血液、血清、または血漿試料の分析または新生児スクリーニングカードのパンチから得られた乾燥血液、血清、または血漿試料の分析のために使用され得る。
【００２３】
一部の実施形態では、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、７α，１２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７α，ｌ２α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ−３−ｏｎｅ）、７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン（７α，１２α−Ｃ４）のうちの１種または複数などの１、２、３または４種のケトステロール胆汁酸前駆体が分析される。
【００２４】
さらに、本発明は、極めて低濃度の質量の定量化を提供し、したがって、ケトステロール胆汁酸前駆体の濃度を、例えば、普通は高濃度のこれらの化合物を有さない集団において測定するために使用され得る。
【００２５】
一部の実施形態では、ケトステロイド分析キットは、複雑な生体マトリックスからのケトステロイドの高度に感度の高い（低ｐｇ／ｍＬ濃度）定量化を可能にするよう提供され得る。
【００２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、相対濃度、絶対濃度または両方を測定でき、１種または複数の試料中の１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体に適用され得る。本方法は、ケトステロイドの検出のための化合物の同位体置換および標識戦略の選択に応じて、同位体濃縮された内部標準（ＩＳ）または等圧標識試薬ならびに質量差のある（ｍａｓｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）標識試薬を使用できる。
【００２７】
一部の実施形態では、本教示は、ケトステロイドおよびケトまたはアルデヒド官能基を含有する分析物を定量化するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、誘導体化化学および液体クロマトグラフィー／タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳＭＳ）ワークフローを含み得る。本方法は、ケトステロイドの検出限界を大幅に高め得る永久荷電型アミノオキシ（ａｍｉｎｏｏｘｙ）試薬を使用することを含み得る。
【００２８】
明らかとなるであろう実施形態のこれらおよび他の特徴が、本明細書において示され、記載されている。
【００２９】
種々の実施形態の詳細な説明が、例として以下の図面を参照して、本明細書において以下に提供される。当業者ならば、以下に記載される図面は、単に例示目的であるということを理解するであろう。図面は、決して、本出願人の教示の範囲を制限しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、試料調製、誘導体化および誘導体化された分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す方法のフローダイアグラムである。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、試料調製、誘導体化および誘導体化された分析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す２種の方法のフローダイアグラムである。７αＣ４は、図２Ａおよび２Ｂの一例として使用される。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、試料調製、誘導体化および誘導体化された分@0004析物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す２種の方法のフローダイアグラムである。７αＣ４は、図２Ａおよび２Ｂの一例として使用される。
【００３２】
【図３】図３は、この方法を使用するＤＣＳ血清中の７α−コレステン−３−オン１〜４００ｎｇ／ｍＬの代表的濃度曲線を提供する。
【００３３】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、代表的な正常（図４Ａ）およびＣＴＸ（図４Ｂ）患者血漿ならびにブランクＤＣＳ血清（図４Ｃ）およびＤＣＳ血清中の１．３ｎｇ／ｍＬ試料（図４Ｄ）から得られた乾燥試料スポットの、ＱＡＯタグが付けられた７α−コレステン−３−オンについて作製されたＭＲＭデータを提供する。
【００３４】
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、代表的な正常（図５Ａ）およびＣＴＸ（図５Ｂ）患者血漿ならびにブランクＤＣＳ血清（図５Ｃ）およびＤＣＳ血清中の１．３ｎｇ／ｍＬ試料（図５Ｄ）から得られた乾燥試料スポットの、ＱＡＯタグが付けられた４−コレステン−３−オンについて作製されたＭＲＭデータを提供する。
【００３５】
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、代表的な正常（図６Ａ）およびＣＴＸ（図６Ｂ）患者血漿ならびにブランクＤＣＳ血清（図６Ｃ）およびＤＣＳ血清中の１．３ｎｇ／ｍＬ試料（図６Ｄ）から得られた乾燥試料スポットのＱＡＯタグが付けられた５α−コレスタン−３−オンについて作製されたＭＲＭデータを提供する。
【００３６】
【図７】図７は、３種の異なるＱＡＯタグを付けたケトステロールのＱＡＯ誘導体化法成績を実証する。
【００３７】
【図８】図８は、ＩＳとしてｄ７  ７αＣ４（四角）およびＩＳとして重水素化試薬（菱形）を使用する濃度曲線である。
【００３８】
【図９】図９は、ＩＳとしてｄ７  ７αＣ４（右）およびＩＳとして重水素化試薬（左）を使用する正常およびＣＴＸ試料の分析を示すグラフである。
【００３９】
【図１０】図１０は、方法３を使用するＤＣＳ血清中の７αＣ４の濃度曲線である。
【００４０】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ブランクＤＣＳ血清（幾分かの内因性７αＣ４が存在する）２．５ｎｇ／ｍＬ標準および正常な罹患していない対象の典型的な試料の代表的クロマトグラムを提供し、ここで、図１１Ａは、ＤＣＳ中のブランク７αＣ４のクロマトグラムである。図１１Ｂは、７αＣ４の内部標準である。図１１Ｃは、２．５ｎｇ／ｍＬ  ７αＣ４のクロマトグラムである。図１１Ｄは、７αＣ４の内部標準である。図１１Ｅは、７αＣ４の典型的な試料のクロマトグラムである。図１１Ｆは、７αＣ４の内部標準である。
【００４１】
【図１２】図１２は、ＣＹＰ２７Ａ欠乏の生化学的表現型である。
【００４２】
【図１３】図１３Ａは、５０ｐｇの、カラム上で誘導体化されていない７αＣ４のスキャンである。図１３Ｂは、８０ｆｇの、カラム上で誘導体化されている７αＣ４のスキャンである。シグナルは、４００倍増強される。
【００４３】
【図１４】図１４は、ｍ／ｚ  ５１５．７［Ｍ］＋、ｍ／ｚ  ４５６．５［Ｍ−５９］＋、ｍ／ｚ  ４３８．６［Ｍ−５９−１８］＋およびｍ／ｚ  １５２．３［ＱＡＯ部分フラグメント］＋に強度を有するＱＡＯタグが付けられた７αＣ４生成物イオンスペクトルである。
【００４４】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、スパイクされた血漿較正物における、ＱＡＯタグが付けられた７αＣ４のモニタリングを提供し、ここで、図１５Ａは、５１５．７＞１５２．３でのｍ／ｚ遷移を有する５．０ｎｇ／ｍＬのＤＳＣ血漿を提供し、図１５Ｂは、ＤＣＳ血漿ブランクを提供し、図ＤＣは、２．５ｎｇ／ｍＬのＤＣＳ血漿を提供する。
【００４５】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、代表的な罹患していない試料における血漿中のＱＡＯタグが付けられた７ａ  Ｃ４のモニタリングを提供し、ここで、図１６Ａは、５１８．７＞１５２．３でｍ／ｚ遷移を有する７αＣ４−ｄ７誘導体（上側の線）および５１５．７＞１５２．３でｍ／ｚ遷移を有する７αＣ４−ｄ０誘導体（下側の線）を提供する。図１６Ｂおよび１６Ｃは、２５倍希釈のＣＴＸ試料を提供する。
【００４６】
【図１７】図１７は、ＱＡＯ試薬およびケト−ｄ０タグが付けられた７αＣ４−ｄ７内部標準を使用する７αＣ４定量化方法検証データの表を提供する。
【００４７】
【図１８】図１８は、ＱＡＯ試薬およびケト−ｄ３タグが付けられた７αＣ４−ｄ０内部標準を使用する７αＣ４定量化方法検証データの表を提供する。
【００４８】
【図１９】図１９は、ｄ３内部標準と比較されるｄ７を使用して算出された７αＣ４濃度の表を提供する。
【００４９】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃは、代表的な罹患していない試料の血漿中のＱＡＯタグが付けられた７α１２α  Ｃ４のモニタリングを提供し、ここで、図２０Ａは、５３４．７７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４誘導体（上側の線）および５３１．７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４−ｄ０誘導体（下側の線）を提供する。図２０Ｂおよび２０Ｃは、２５倍希釈のＣＴＸ試料を提供する。
【００５０】
【図２１】図２１は、ＱＡＯ試薬およびケト−ｄ３タグが付けられた７α２１αＣ４内部標準を使用する７α１２αＣ４定量化方法検証データの表を提供する。
【００５１】
【図２２】図２２は、ＣＴＸの診断マーカーとしての７αＣ４および７α１２αＣ４の表を提供し、これでは、ｄ３タグが付けられた内部標準の血漿濃度である。
【００５２】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、成人ＤＢＳにおけるＱＡＯタグが付けられた７α１２αＣ４のモニタリングを提供する。代表的な罹患していない試料が、図２３Ａに示されており、これでは、５３４．７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４−ｄ３誘導体（上側の線）および５３１．７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４−ｄ０誘導体（この試料では、下側の線は見られない）である。図２３Ｂおよび２３Ｃは、ｄ０（上側の線）およびｄ３（下側の線）を有するＣＴＸ試料を提供する。
【００５３】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｃは、新生児ＤＢＳにおけるＱＡＯタグが付けられた７α１２αＣ４のモニタリングを提供する。図２４Ａには、代表的な罹患していない試料が示されており、これでは、５３４．７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４−ｄ３誘導体（上側の線）および５３１．７＞１５２．３にｍ／ｚ遷移を有する７α１２αＣ４−ｄ０誘導体（下側の線）である。図２４Ｂおよび２４Ｃは、ｄ０（上側の線）およびｄ３（下側の線）を有するＣＴＸ試料を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
図面は単に例示的なものであり、図面へのすべての参照は、単に例示目的で行われ、決して、以下に本明細書に記載される実施形態の範囲を制限するよう意図されるものではないということは理解されよう。便宜上、参照数字は、類似の成分または特徴を示すよう図を通して反復され得る（補正値を伴って、または伴わずに）。
【００５５】
明確にするために、以下の考察が、教示の実施形態の種々の態様を説明するが、特定の具体的な詳細は、そうすることが好都合か否か、または適当であるか否かに関わらず省くことを理解されたい。例えば、代替実施形態における同様または類似の特徴の考察は、幾分か省略され得る。周知の見解または概念は、簡潔さのためにかなり詳細には論じられない場合もある。当業者ならば、一部の実施形態は、どの実施においても、実施形態の完全な理解を提供するためだけに本明細書において示される、いくらかの具体的に記載された詳細を必要としない場合もあるということを認識する。同様に、記載された実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、普通の一般知識によるわずかな変更または変形の影響を受けやすい場合があるということは明らかであろう。以下の実施形態の詳細な説明は、決して、本教示の範囲を制限するとみなされてはならない。
【００５６】
本発明は、ヒト血漿、血清または全血などのヒト試料などにおいて、胆汁酸前駆体などのケトステロールバイオマーカーを検出および定量化する方法を記載する。一部の実施形態では、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）障害において見られるＣＹＰ２７Ａ１欠乏などの２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏を診断またはスクリーニングする方法が開示される。種々の実施形態では、ＣＴＸおよび過敏性腸症候群疾患のケトステロールバイオマーカーの同時分析のための迅速な、簡単な溶液が提供され、したがって、これらの障害ならびに他の障害および／またはＣＹＰ２７Ａ１欠乏と関連している状態の日常的なスクリーニングの可能性を提供する。これは、例えば、ＣＴＸの新生児スクリーニングとして有用であり得る。
【００５７】
対象のバイオマーカーの中には、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７α１２αＣ４）および２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏のために蓄積される他のケトステロール胆汁酸前駆体がある。
【００５８】
対象の各ケトステロールバイオマーカーの内部標準を作り出すための簡単な、安価な方法を有することは有用であり、時には、極めて重要である。本明細書において記載されるＱＡＯ試薬は、これらのケトステロール胆汁酸前駆体のイオン化効率を実質的に改善し、ＱＡＯ試薬を用いない場合よりも大幅に低いＬＬＯＱを提供する。この方法は、３〜５ｐＬ程度の少ない試料体積を使用する分析を提供する。
【００５９】
本明細書に記載される実施形態は、新生児スクリーニングの診断またはスクリーニング方法を含む。しかし、本明細書に記載される方法は、幼児および成人などの他の集団およびスクリーニング／診断にとっても同等に有用である。
【００６０】
一部の実施形態では、他の物質が混じっていない標準との簡単な反応によって対象の各分析物のＩＳを作製するために、同位体濃縮された第四級アミノキシ試薬が使用され得る。バイオマーカーのパネルの内部標準の特定の濃度は、第四級アミノキシ試薬の同位体の変異体を用いて既知濃度の分析物を標識することによって作り出され得る。次いで、これが、試験試料中にスパイクされ得、内部標準として使用され得る。
【００６１】
本明細書に記載されるマススペクトロメトリー技術において分析物として使用されるケトステロールバイオマーカーは、生理流体試料などの種々の生体マトリックス、細胞または組織溶解物試料、タンパク質試料、細胞培養試料、発酵ブロス培地試料、農産物試料、動物製品試料、動物食餌試料、ヒト消費のための食物または飲料の試料、それらの組合せなど、およびケトステロールバイオマーカー官能性が存在する本質的に任意の試料中に見られる。生体マトリックスの例は、血液、血清、血漿、汗、涙、尿、腹膜液、リンパ、膣分泌物、精液、脊髄液、腹水（ａｓｃｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、唾液、痰、乳房滲出液およびそれらの組合せなどの生理流体を含み得る。一部の実施形態では、試料は、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）に由来する。一部の実施形態では、ＤＢＳ試料は、新生児スクリーニングから得られたＤＢＳである。
【００６２】
本教示は、２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏のために蓄積するケトステロール胆汁酸前駆体に適用される。ケトステロール胆汁酸前駆体として、例えば、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが挙げられる。
【００６３】
本教示はまた、ＣＴＸをスクリーニングおよび／または診断する方法に適用される。ＣＴＸの診断および／またはスクリーニングにとって特に有用な胆汁酸前駆体として、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが挙げられる。
【００６４】
一部の実施形態では、１種または複数の胆汁酸前駆体を含む分析物をＱＡＯ試薬で誘導体化し、標識された分析物をイオン化し、質量分析によって前記の標識された分析物のシグネチャーイオンフラグメントを検出し、濃度を定量化する方法が提供される。一部の実施形態では、胆汁酸前駆体は、７αＣ４を含み、５０ｎｇ／ｍＬ超の濃度は、ＣＴＸを示す。他の実施形態では、７５ｎｇ／ｍＬ超、１００ｎｇ／ｍＬ超、１５０ｎｇ／ｍＬ超、２００ｎｇ／ｍＬ超、２５０ｎｇ／ｍＬ超、または３００ｎｇ／ｍＬ超の７αＣ４の濃度は、ＣＴＸを示す。他の実施形態では、試料が、２７−ヒドロキシラーゼ欠乏を示すかどうかを定義するために使用される胆汁酸前駆体の濃度は、７αＣ４を使用するＣＴＸ−スクリーニングのための図９に提供されるものなどの表を使用することによって決定され得る。
【００６５】
本教示はまた、Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏をスクリーニングおよび／または診断する方法に適用される。Δ４−３−オキソステロイド−５Ｂレダクターゼ欠乏の診断および／またはスクリーニングにとって特に有用な胆汁酸前駆体として、７α−コレステン−３−オンおよび７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが挙げられる。
【００６６】
本教示はまた、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）をスクリーニングおよび／または診断する方法に適用される。
【００６７】
本教示はまた、胆汁酸吸収不良をスクリーニングおよび／または診断する方法に適用される。胆汁酸吸収不良にとって特に有用な胆汁酸前駆体として７α−ヒドロキシ−４−コレステン（ｃｈｌｅｓｔｅｎ）−３−オンが挙げられる。
【００６８】
一部の実施形態では、単一のケトステロール胆汁酸前駆体が定量化される。一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体のうち２種以上が定量化される。一部の実施形態では、２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）欠乏のために蓄積されるケトステロール胆汁酸前駆体のうち３種以上が、単一アッセイにおいてパネルとして定量化される。
【００６９】
さらに他の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体のうち４種以上が、１つのパネルで定量化される。一部の実施形態では、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのうち少なくとも１種が定量化される。一部の実施形態では、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの各々が定量化される。一部の実施形態では、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オンの各々が分析される。一部の実施形態では、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、７α−ヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オン、および７α，１２α−ジヒドロキシ−５β−コレスタン−３−オンの各々が定量化される。
【００７０】
試料は、種々の方法によって濃縮され得る。濃縮方法は、血液（新鮮または乾燥）、血漿、血清、尿または唾液などの試料の種類に応じて変わる。例示的濃縮方法として、タンパク質沈殿、液液抽出、固液抽出および限外濾過が挙げられる。他の濃縮方法または２種以上の濃縮方法の組合せが使用され得る。
標識試薬
【００７１】
したがって、特定の標識試薬および分析のためのシグネチャーイオンフラグメント選択を使用するケトステロール胆汁酸前駆体の質量分析のための方法が本明細書で提供される。
【００７２】
一部の実施形態では、生体試料中のケトステロール胆汁酸前駆体の相対定量化、絶対定量化または両方のための、一般式（Ｉ）：
【化４】
0006272834.tif 000010
［式中、ｎは、２、３、４、５または６であり、Ｙは、構造：
【化５】
0006272834.tif 000011
（式中、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、
ｍは、１から２０の間の整数であり、
Ｘは、陰イオンである）
を有する］
を有するアミンオキシドまたはその塩もしくは水和物である標識試薬を含めた標識試薬および標識試薬のセットが提供される。
【００７３】
一部の実施形態では、ｎは、２〜４であり、他の実施形態では、ｎは３である。一部の実施形態では、Ｙは、−Ｎ（ＣＨ３）３（＋）である。一部の実施形態では、ｍは、１から１２の間の整数または１から５の間の整数である。一部の実施形態では、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、あるいは各Ｒ４は、独立して、Ｈまたは分岐鎖もしくは直鎖であるＣ１〜Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ４は同一である。
【００７４】
一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、塩である。一部の実施形態では、塩は、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯ−またはＣＦ３ＳＯ３ＣＯＯ−である。一部の実施形態では、塩は、ペルフルオロカルボン酸塩である。
【００７５】
一部の実施形態では、式Ｉの標識試薬は、以下：
【化６】
0006272834.tif 000012
またはその塩もしくは水和物である。一部の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は塩である。一部の実施形態では、塩は、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯ−またはＣＦ３Ｓ０３ＣＯＯ−である。一部の実施形態では、塩は、ペルフルオロカルボン酸塩である。
【００７６】
種々の態様では、本教示は、標識された分析物を提供し、これでは、分析物は、少なくとも１つのケトン基ならびに式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の標識試薬を含み得る。種々の態様では、本教示は、標識された分析物を提供し、これでは、分析物は、少なくとも１つのアルデヒド基および本明細書に記載されるＱＡＯ標識を含み得る。
【００７７】
種々の実施形態では、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の標識試薬が、内部標準（ＩＳ）を標識するために使用される。このような同位体標識された内部標準は、多数のケトステロイドの同位体標識された内部標準として特に有用であり得、他のアルデヒド化合物は、市販されていない。さらに、入手可能である標準は、高価であることが多く、形態で制限される。
【００７８】
一部の実施形態では、ケトステロイド胆汁酸前駆体−ＱＡＯ付加物のシグネチャーイオンフラグメントは、以下：
【化７】
0006272834.tif 000013
［式中、各
【化８】
0006272834.tif 000014
は、単結合または二重結合のいずれかであり、各
【化９】
0006272834.tif 000015
は、存在しないか、または１つもしくは複数の結合を示す］
を含む。分析物が、７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）である場合には、シグネチャーイオンフラグメントは、一部の実施形態では、１５２．０の質量を有するフラグメントイオンを含み得る。分析物が、５α−コレスタン−３−オンである場合には、シグネチャーイオンフラグメントは、一部の実施形態では、４４３．０の質量を有するフラグメントイオンを含み得る。分析物が４−コレステン−３−オンである場合には、シグネチャーイオンフラグメント（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、一部の実施形態では、１６１．２の質量を有するフラグメントイオンを含み得る。
【００７９】
主なシグネチャーイオンフラグメントは、例えば、中性損失フラグメントまたは分析物の構造フラグメントおよび標識試薬を含む中性損失またはその一部であり得る。一部の実施形態では、１種よりも多くの主なシグネチャーイオンフラグメントがある。一部の実施形態では、２、３、４または５種の主なシグネチャーイオンフラグメントがある。
【００８０】
ケトステロール胆汁酸前駆体であるものなどの稀なケトステロールの同位体濃縮された内部標準（ＩＳ）は、市販されていないか、または作製することが極めて高価であるかのいずれかである。例えば、７αＣ４については安定な同位体標識された内部標準が入手可能であるが、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オンまたは７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンのいずれかについては、標識されたＩＳは市販されていない。
【００８１】
したがって、一部の実施形態では、「重い」（同位体濃縮された）ＱＡＯ試薬は、これらのケトステロールの内部標準を提供し得る。一部の実施形態では、これらの内部標準は、２種以上のケトステロール胆汁酸前駆体が分析される予定である場合には特に有利である。したがって、標識試薬の同位体濃縮された類似体が使用され得、定量化のために内部標準が作製され得る。例えば、炭素（１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ）、窒素（１４Ｎおよび１５Ｎ）、酸素（１６Ｏおよび１８Ｏ）、硫黄（３２Ｓ、３３Ｓおよび３４Ｓ）および／または水素（水素、重水素およびトリチウム）の重い原子同位体が、内部標準の調製において使用され得る。米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／０６８４４６Ａ１には、同位体濃縮された化合物の合成が開示されており；質量分析ワークフローおよび戦略は、米国特許出願公開番号ＵＳ２００８／００１４６４２Ａ１に開示されており、その両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
同位体濃縮された化合物は、例えば、
【化１０】
0006272834.tif 000016
を含み得る。本方法は、ケトステロイドの定量的分析のためのＭＲＭワークフローを使用することを含み得る。試薬は、ケト化合物の個々またはパネルの定量的分析のために同位体コード化（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ）され得る。ケトステロイドプロファイリングが関係する研究では、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションは、アミノオキシ誘導体化生成物から主に中性損失シグネチャーイオンを生成するよう低衝突エネルギーで標的化され得る。ＭＲＭ遷移は、Ｑ１における誘導体化ステロイドの質量およびＱ３における中性損失フラグメントの質量であり得る。本教示は、一部の実施形態では、誘導体化によってバックグラウンドノイズを大幅に低減するプロセスを提供し、感度の改善および特異性の改善をもたらすＱ３フラグメントの標的化された選択をもたらす。
【００８３】
一部の実施形態では、７αＣ４などのステロイドの同位体標識された内部標準のセットが提供される。このセットは、本明細書において記載されるような第四級アミンオキシド（ＱＡＯ）試薬で標識された既知濃度のケトステロイドを含む２種以上の付加物を含み得、ここで、２種以上の付加物の各々は、異なる同位体濃縮された類似体を有する。
【００８４】
一部の態様では、本教示は、質量に差のある標識のセットを含めた質量に差のあるタグを使用する試薬および方法を含み、ここで、セットの１種または複数の標識は、１種または複数の重原子同位体を含有する。質量に差のある標識のセットはまた、異なる全体的な質量および異なる一次レポーター基または質量平衡基を有する標識を調製することによって提供され得、質量に差のあるタグのセットのどのメンバーも同位体濃縮される必要はない。本試薬および方法は、質量に差のある標識および親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１種または複数の試料におけるケトステロールバイオマーカー分析物の分析を可能にする。本教示は、質量に差のあるタギング試薬およびマススペクトロメトリーを使用するこのような分析物の定性的および定量的分析のために使用され得る。質量に差のあるタグは、それだけには限らないが、非等圧同位体によってコード化された試薬を含む。本教示は、同位体濃縮された標準化合物の使用を伴うか、または伴わないケトステロールバイオマーカー化合物の絶対定量化のための試薬および方法をさらに含む。
【００８５】
一部の実施形態では、一般式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の質量に差のある標識のセットが提供される。種々の実施形態では、その非塩の形態および／または非水和物の形態の一般式（Ｉ）の等圧標識のセットが提供される。種々の実施形態では、標識の質量は、非塩の形態および／または非水和物の形態において約０．０５ＡＭＵ未満だけ異なる。提供される標識のセットは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の２種以上の化合物を含み得、ここで、標識のセット中の化合物のうちの１種または複数は、１種または複数の重原子同位体を含有する。種々の実施形態では、重原子同位体は、各々独立に、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓである。
【００８６】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、それだけには限らないが、モノＴＦＡ塩、モノＨＣｌ塩、ビス−ＨＣｌ塩またはビス−ＴＦＡ塩またはそれらの水和物を含めた多種多様な塩および水和物の形態で提供され得る。式（Ｉ）の変種は、米国特許公開第２０１１／０００３３９５号およびＷＯ２００５／０６８４４６に開示されており、その両方とも参照により具体的に組み込まれ、全般的に、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬と呼ばれる。
【００８７】
種々の実施形態によれば、同位体は、平衡基または平衡部分、例えば、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、塩素、臭素などの同位体として使用され得る。例示的平衡基または部分はまた、例えば、２００４年１１月４日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０２１９６８５Ａ１、２００４年１１月４日に公開されたＵＳ２００４／０２１９６８６Ａ１、２００４年１１月４日に公開されたＵＳ２００４／０２２０４１２Ａ１および２０１０年５月６日に公開されたＵＳ２０１０／０１１２７０８Ａ１に記載されたものを含み得、それらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８８】
種々の実施形態では、標識のセットの化合物の１種または複数は、２種以上の重原子、３種以上の重原子を用いて；および／または４種以上の重原子を用いて同位体濃縮される。種々の実施形態では、式（Ｉ）の標識のセットは、重原子同位体を組み込むことによって形成される。一部の実施形態では、少なくとも８０パーセント同位体純度で、少なくとも９３パーセントの同位体純度および／または少なくとも９６パーセントの同位体純度で同位体は存在する。
【００８９】
質量平衡タグの代わりに、またはそれに加えて、等圧タグが使用され得る。同位体濃縮された等圧タグが使用される場合には、等圧標識のセットは、１種または複数の重原子同位体を含み得る。等圧標識のセットは、同一の、または具体的に定義された範囲の凝集体質量を有し得るが、異なる測定可能な質量の一次レポーターイオンまたは帯電分析物を有し得る。等圧試薬のセットは、マススペクトロスコピーを使用するケトステロールバイオマーカー分析物化合物の定性的および定量的分析の両方を可能にする。例えば、特定のケトステロイドまたはケトステロイドの群などの試料中の１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を検出および定量化するために、同位体濃縮された等圧タグおよび親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）が使用され得る。
【００９０】
等圧標識のセットを含む実施形態では、リンカー基部分は、平衡基と呼ばれることもある。例えば、一部の実施形態では、４種の等圧標識のセットが、１種または複数の分析物のセットに加えられ、組み合わされて、組み合わされた試料を形成し、これが、ＭＳ／ＭＳ分析に付され、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体をフラグメンテーションし、異なる質量または帯電分析物の４種のレポーターイオンが得られる。標識は、レポーター基または質量平衡基またはその一部または質量平衡基単独またはその一部の重原子置換の適当な組合せによって等圧にされ得る。
【００９１】
以下は、本教示の種々の実施形態による第四級アミノオキシ質量に差のある試薬の例示的セットである：
【化１１】
0006272834.tif 000017
【００９２】
以下は、本教示の種々の実施形態による第四級アミノオキシ等圧試薬の例示的セットである：
【化１２】
0006272834.tif 000018
分析
【００９３】
本教示は、質量に差のある標識、等圧標識またはその両方および親−娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して、１種または複数の試料における１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体の分析するための試薬および方法を提供し得る。本教示は、質量に差のあるタギング試薬、等圧タギング試薬またはその両方およびマススペクトロスコピーを使用して、１種または複数の試料中の、ケトステロール胆汁酸前駆体などの１種または複数の分析物の相対濃度、絶対濃度またはその両方を決定する方法を提供し、試料中の複数の分析物、複数の試料中の１種または複数の分析物またはそれらの組合せの、相対濃度、絶対濃度またはその両方が、マルチプレックス様式で決定され得る方法を提供し得る。
【００９４】
本明細書に記載される種々の方法の一部が、図１のフローダイアグラムによって説明され得る。特に、血液、血清、または血漿などの生体マトリックスの一部であり得る試料は、アミノオキシ化学とそれに続いて、標識された分析物およびＱＡＯ標識された標準を混合することによって、本明細書において開示される１種または複数のＱＡＯ標識試薬を用いて選択され、誘導体化され得る。混合物は、例えば、ＨＰＬＣなどによるＬＣによるクロマトグラフィー分離と、それに続く、ＭＲＭによる質量分析に付され得る。同位体濃縮された試薬が、内部標準として使用される場合には、誘導体化ステップ後に付加されることが好ましい。
【００９５】
方法はまた、誘導体化ステップに先立って、疎水性溶媒を使用する、液液抽出、固液抽出またはタンパク質沈殿を使用して分析物を抽出するステップを含み得る。あるいは、誘導体化ステップに先立って、分析物をクロマトグラフィー分離に付すステップ。
【００９６】
ＭＲＭにおいて測定されたシグネチャーフラグメントイオンが、標識試薬またはその一部が結合された構造フラグメントを含むよう注意深く選択され得る。例えば、標識試薬がトリメチルアミンを含む場合には、シグネチャーフラグメントイオンは、部分Ｎ（ＣＨ３）３ならびに分析物の骨格の少なくとも一部を失ったイオンを含み得る。一部の実施形態では、シグネチャーフラグメントイオンを形成するよう選択された衝突エネルギーは、単一の主なシグネチャーフラグメントイオンを生成するような低い衝突エネルギーである。
【００９７】
一部の実施形態では、衝突フラグメントエネルギーは、１０〜１３０ｅＶの範囲であるよう選択される。例えば、３０または３５ｅＶが使用され得る。
【００９８】
一部の実施形態では、分析は、最小の試料調製後に行われる。例えば、試料調製は、乾燥血液スポットから出発して、３０分未満または２０分未満または１０分未満である。一部の実施形態では、分析は、調製の間に実施されるＧＣ分離ステップを伴わずに行われる。
【００９９】
いくつかの態様は、永久荷電型アミノキシ試薬（第四級アミノキシ）を用いるケトステロイドの誘導体化化学ならびに試薬および誘導体化された化合物の骨格の両方を含み得る標的化されたフラグメンテーションを使用することによってバックグラウンドノイズの低減または排除を提供する。容易にイオン化される／イオン化可能な分子を用いる誘導体化は、対象の分析物の感度および検出を増大し得る、例えば、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにおいてより良好なイオン化効率をもたらし得る。フラグメントイオン（Ｑ３シグネチャーイオン）が、誘導体化試薬（または試薬の一部）が結合された構造フラグメントを含むよう注意深く選択される場合には、感度および選択性の両方が増強され得る。同一Ｑ１／Ｑ３遷移を有する化合物が検出され、ＢＫＧノイズ干渉を作り出す機会は極めて低い。
【０１００】
容易にイオン化可能な標識試薬の少なくとも一部を含むシグネチャーイオンフラグメントの賢明な選択をもって、質量分析は、大幅に低いバックグラウンドノイズおよび改善された検出の限界をもって行われ、標識試薬の付加を伴わずに実施されるケトステロール胆汁酸前駆体のＭＲＭ分析に対して比較され得る。誘導体化を伴わない検出と比較される増強因子も見られ得る。例えば、一部の実施形態では、非誘導体化試料の検出の限界が、カラムでおよそ２０から１００ｐｇ／ｍＬの間である場合には、誘導体化試料の検出の限界は、カラムで約０．０８ｐｇ／ｍＬ未満である。したがって、ＱＡＯを用いる誘導体化による増強は、少なくとも２００倍または少なくとも４００倍または１０００倍を超える、または２０００倍を超える。
【０１０１】
本明細書において提供される方法の直線性およびダイナミックレンジは、特に良好であり得る。例えば、一部の実施形態では、直線性は、ＤＳＣで０．９９０よりも高い。一部の実施形態では、直線性は、ＤＳＣで０．９９５より高い。
【０１０２】
一部の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、分析物骨格の一部を含有し、標識試薬の一部も含有する中性損失フラグメントである。一部の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、４４２．６、９３．３、１６４．２、１５２．１、４４０．８、４５６．８、１５２．３、および／または１７９．９のｍ／ｚを有する１種または複数のフラグメントである。これらの実施形態では、またその他の実施形態では、シグネチャーイオンフラグメントは、１３Ｃが濃縮されたフラグメントなど同位体濃縮され得る。
【０１０３】
定量化は、１種または複数の分析物および標準に由来するシグナルの相対的または絶対的測定によって可能にされ得る。正電荷はマススペクトロメトリーによって検出されるフラグメントイオンとして機能する分析物に移され得る
【０１０４】
本明細書に記載される他の種々の方法は、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃのフローダイアグラムによって説明され得る。特に、７αＣ４としてこれらの図において例示される、および血液、血清、または血漿などの生体マトリックスの一部であり得る、ケトステロール胆汁酸前駆体を含有する試料が選択される。同位体濃縮された７αＣ４などの内部７αＣ４標準は、任意選択で、試料に付加される。次いで、７αＣ４は、任意選択で、例えば、液／液抽出または固／液抽出によって抽出され得る。試料および任意選択で内部標準は、アミノオキシ化学によってＱＡＯ標識試薬で誘導体化される。図２Ａに記載される方法では、付加物および同位体濃縮されている内部７αＣ４標準が、誘導体化される。次いで、試料を混合し、インキュベートすることを可能にすることによって、試料はＱＡＯ試薬で誘導体化される。図２Ｂに記載される方法では、付加物は、同位体濃縮されている７αＣ４標準と組み合わされた標識された付加物である。試料は、まず、試料を混合し、インキュベートすることを可能にすることによって、ＱＡＯ試薬で誘導体化される。次いで、同位体濃縮されている標準７αＣ４前駆体−ＱＡＯ付加物と組み合わされる。
【０１０５】
図２Ａおよび図２Ｂに記載された方法について、混合物は、例えば、ＨＰＬＣなどによるＬＣによるクロマトグラフィー分離と、それに続く、ＭＲＭによる質量分析に付され、これでは、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体のＭＲＭ遷移が分析される。定量化は、１種または複数の分析物に由来するシグナル(単数または複数)および１種または複数の標準のものの相対的または絶対的測定によって可能にされる。図２Ａでは、７αＣ４濃度は、濃度曲線に基づいて決定される。正電荷は、マススペクトロメトリーによって検出されるフラグメントイオンとして機能する分析物に移される。
【０１０６】
定量化は、内因性を含まないマトリックスに増大した量の既知分析物濃縮物をスパイクして、較正曲線を作り出すことによって可能にされ得る。未知濃度の試料は、濃度曲線の直線回帰から算出される。濃度曲線の直線プロットは、較正物および内部標準の濃度比対較正物およびＩＳの面積比を含む。あるいは、相対定量化は、既知量のスパイクされた内部標準を使用する１点較正によって可能にされ得る。等圧異性体である試料については、これらの化合物が同一の質量パターンを有し得るので、その質量分析に先立って試料を分離するためにクロマトグラフィー分離が使用され得る。生体試料中の等圧ケトステロイドは、同様のＱ１／Ｑ３  ＭＲＭ遷移を有し得るので、等圧ケトステロイドは、干渉として現れるために分析物と同一フラグメンテーションパターンを共有し得る。このような場合には、等圧ケトステロイドは、分析物からクロマトグラフィーによって分離されることが好ましい。
【０１０７】
標識試薬の付加される利点は、一部の実施形態では、ＭＳＭＳフラグメンテーション時に、誘導体化された分析物が、誘導体化された分析物上に電荷を有するフラグメントイオン（Ｑ３シグネチャーイオン）を生成し、これが、ＭＳ３分析に従うようにするということである。
【０１０８】
誘導体化された分析物は、質量分光分析の感度および選択性の両方を増強し得る。例えば、ここで特許請求される方法は、非誘導体化試料のものの２００〜２０００倍である感度で、生体マトリックスに由来する３ケトステロール胆汁酸前駆体を検出するために使用され得る。一部の実施形態では、ＭＳ／ＭＳ感度は、化合物に応じて、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍またはさらに２０００倍またはそれ以上増強される。例えば、一部の実施形態では、非誘導体化試料の検出の限界が、カラムでおよそ２０から１００ｐｇ／ｍＬの間である場合には、誘導体化試料の検出の限界は、カラムで約０．０８ｐｇ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、誘導体化後の検出の限界は、＜１ｐｇ／ｍＬほど低いものであり得る。（図７を参照のこと）。
【０１０９】
種々の実施形態では、標準試料に標識を添加して、試料中の１種または複数の標準化合物を用いて標識するステップは、アミノオキシ基が、分析物標準のケトンまたはアルデヒド基とオキシムを形成する１ステップ反応を含む。
【０１１０】
種々の態様では、本教示は、ケト分析物を標識して、標識された分析物化合物を形成する方法を提供する。種々の実施形態では、方法は、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の標識化合物を、ケトン含有化合物を反応させることを含む。具体的には、化合物７α−コレステン−３−オン（７αＣ４）、５α−コレスタン−３−オン、４−コレステン−３−オン、および７α，ｌ２α−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンは、式Ｉの標識試薬で誘導体化され、室温で、６０分以上、ＭｅＯＨ中、５％酢酸中で特異的に標識された。
【０１１１】
以下の実施例、図および表を参照して、標識試薬を用いてケトステロール胆汁酸前駆体を標識することの一例が示されている。これらの反応では、アミノオキシ部分は、ステロイド上のケトンまたはアルデヒドと反応して、標識された化合物上にオキシム基を形成して、標識された分析物をもたらす。
【０１１２】
本明細書において記載されるように、各試料に異なる標識を付加すること、異なって標識された試料を組み合わせることおよびＰＤＩＴＭを使用して、試料中の１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体化合物の濃度を決定することによって、２種以上の試料において１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体の濃度を決定する方法が提供される。試料の１種は、対照試料、参照試料、既知濃度の化合物を有する試料などといった標準試料を含み得る。したがって、方法は、複数の試料に由来する複数の化合物の分析を提供し得る。
【０１１３】
種々の実施形態では、１種または複数の標識されたケトステロール胆汁酸前駆体の濃度を決定するステップは、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体のうちの１種または複数の絶対濃度を決定すること、標識されたケトンまたは分析物化合物のうちの１種または複数の相対濃度を決定することまたは両方の組合せを含む。
【０１１４】
特定の方法は、対象の各試料に、タグのセットに由来する異なるタグを付加して、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体のパネルを形成することによって、２種以上の対象の試料において１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を標識するステップを含む。タグのセットに由来する各タグは、本明細書に記載される標識試薬またはその一部を含み得る。標識されたケトステロール胆汁酸前駆体のうちの１種または複数は、各分析物が得られた、または含有されている試料に対して、異なって標識され得る。ケトステロール胆汁酸前駆体に標識を付加するステップは、標識の第１の部分が式（Ｉ）または（ＩＩ）からなる１ステップ反応を含み得る。
【０１１５】
試料の各々の一部が組み合わされて、透過イオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを親−娘イオン遷移モニタリングおよび測定することによって分析される、組み合わされた試料およびその一部が生じ得る。透過親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析物化合物のｍ／ｚ値を含み得、透過娘イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析物化合物のタグに由来するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含むか、またはイオン化された分析物自体である。次いで、標識された分析物化合物のうちの１種または複数の濃度が、少なくとも、対応する伝達物質レポーターまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナル対標準化合物の１種または複数の測定されたイオンシグナル比較に基づいて決定され得る。イオンシグナル(単数または複数)は、例えば、イオンピークの強度（平均値、平均、最大など）、イオンピークの面積またはその組合せに基づいたものであり得る。対象の２種以上の試料のうちの１種または複数が、１種または複数の標準化合物を含有する標準試料であり得る。
【０１１６】
一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体の濃度は、対応する標識されたケトステロール胆汁酸前駆体−レポーターイオン遷移シグナルの測定されたイオンシグナルを、
（ｉ）標準化合物−レポーターまたは分析物イオン遷移の濃度曲線；または
（ｉｉ）標識されたケトステロール胆汁酸前駆体と組み合わされた試料中の標準化合物の標準化合物−レポーターイオン遷移シグナル
のうちの１種または複数に対して比較することによって決定される。
【０１１７】
一部の実施形態では、「親−娘イオン遷移モニタリング」または「ＰＤＩＴＭ」は、分析の方法およびワークフロー状態として使用される。ＰＤＩＴＭとは、第１の質量分離器（「ＭＳ」またはマススペクトロメトリーの第１次元と呼ばれることが多い）の透過された質量対電荷（ｍ／ｚ）範囲が、分子イオン（「親イオン」または「前駆体イオン」と呼ばれることが多い）を、イオンフラグメンター（例えば、衝突セル、光解離領域など）に透過して、フラグメントイオン（「娘イオン」と呼ばれることが多い）を生じるよう具体的に選択され、第２の質量分離器（「ＭＳ／ＭＳ」またはマススペクトロメトリーの第２次元と呼ばれることが多い）の透過されたｍ／ｚ範囲が、１種または複数の娘イオンを、娘イオンシグナルを測定する検出器に透過するよう選択される技術を指す。この技術は、予測される娘イオン質量に検出器を「パーキング」することによって、スペクトラムにおける娘イオンの検出に焦点があてられる場合に独特の利点を提供する。モニタリングされる親イオンおよび娘イオン質量の組合せは、モニタリングされる「親−娘イオン遷移」と呼ばれることもある。モニタリングされる所与の親イオン−娘イオン組合せのための検出器での娘イオンシグナルは、「親−娘イオン遷移シグナル」と呼ばれ得る。
【０１１８】
例えば、親−娘イオン遷移モニタリングの一実施形態は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（選択的反応モニタリングとも呼ばれる）である。ＭＲＭの種々の実施形態では、所与の親−娘イオン遷移のモニタリングは、第１の質量分離器（例えば、対象の親イオンｍ／ｚにパーキングされた第１の四重極子）を使用して、対象の親イオンを透過させることおよび第２の質量分離器（例えば、対象の娘イオンｍ／ｚにパーキングされた第２の四重極子）を使用して、１種または複数の対象の娘イオンを透過させることを含む。種々の実施形態では、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器（例えば、対象の親イオンｍ／ｚでパーキングされた四重極子）を使用して、親イオンを透過させることおよび第２の質量分離器を、１種または複数の対象の娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたってスキャンすることによって実施され得る。
【０１１９】
例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）機器または、より一般には、多次元的質量分析機器が、ＰＤＩＴＭ、例えば、ＭＲＭを実施するのに使用され得る。適した質量分析器システムの例は、それだけには限らないが、トリプル四重極子、四重極子−線形イオントラップ、四重極子ＴＯＦおよびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１種または複数を含むものを含む。
【０１２０】
したがって、ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器およびイオンフラグメンターおよび第２の質量分離器を含む質量分析器システムで実施され得る。ＰＤＩＴＭスキャンの透過親イオンｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器によって選択される）は、標識された分析物化合物の１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの透過娘イオンｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器によって選択される）は、透過された標識された分析物化合物のタグに対応するレポーターイオンのうちの１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択される。
【０１２１】
一部の実施形態では、標識された分析物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）は、トリプル四重極子ＭＳプラットフォームを使用して実施される。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのより詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／０１８３２３８Ａ１に記載されている。一部の実施形態では、アミノオキシＭＳタギング試薬は、ＭＳＭＳの際に中性損失を起こし、帯電分析物種であるレポーターイオンを残す。一部の実施形態では、アミノオキシＭＳタギング試薬は、ＭＳＭＳの間に、タグフラグメントであるレポーターイオンを形成する。
【０１２２】
したがって、種々の実施形態では、本教示の標識を使用して１種または複数の試料において１種または複数ケトステロール胆汁酸前駆体を分析するために、（ａ）１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体化合物各々を、式（ＩＩ）の標識のセットに由来する異なる標識を用いて標識して、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体化合物、各々質量平衡またはレポーターイオン部分を有する標識された前駆体化合物を提供するステップと、（ｂ）標識された分析物化合物の各々の少なくとも一部を組み合わせて、組み合わされた試料を得るステップと、（ｃ）組み合わされた試料の少なくとも一部を、親−娘イオン遷移モニタリングに付すステップと、（ｄ）透過された分析物またはレポーターイオンの１種または複数のイオンシグナルを測定するステップと、（ｅ）少なくとも、対応する前駆体またはレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの、標準化合物の１種または複数の測定されたイオンシグナルに対する比較に基づいて、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体のうちの１種または複数の濃度を決定するステップとを含む。したがって、種々の実施形態では、１種または複数の試料中の複数のケトステロール胆汁酸前駆体化合物の濃度は、例えば、２種以上の標識された分析物化合物を組み合わせて、組み合わされた試料を得ることおよび組み合わされた試料をＰＤＩＴＭに付すことおよび標識された前駆体化合物のうち２種以上の分析物またはレポーターイオンをモニタリングすることによって、マルチプレックス様式で決定され得る。
【０１２３】
組み合わされた試料の少なくとも一部を、ＰＤＩＴＭに付すステップは、組み合わされた試料の一部を、クロマトグラフィーカラム（例えば、ＬＣカラム、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムまたはそれらの組合せ）にロードすること、クロマトグラフィーカラムからの溶出物の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに付すことおよび透過レポーターイオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを測定することを含む。
【０１２４】
標識されたケトステロール胆汁酸前駆体化合物のうちの１種または複数の濃度を決定するステップにおいて使用される標準化合物の１種または複数の測定されたイオンシグナルは、多数の方法で提供され得る。種々の実施形態では、１種または複数の同位体濃縮されていない標準化合物は、タグで標識され、１種または複数の標識された標準化合物のうちの１種または複数の少なくとも一部が、標識された前駆体化合物の各々の少なくとも一部と組み合わされて、組み合わされた試料が得られ、続いて、この組み合わされた試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに付し、透過レポーターイオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを測定する。
【０１２５】
タグのセットに由来するタグが、１種または複数の標準試料に付加されて、１種または複数の標識された標準試料を提供し、各標準試料は、タグによって標識されている、１種または複数の同位体濃縮されていない標準化合物を含有し、１種または複数の標準試料に付加されるタグは、対象の試料に付加されるタグとは異なっている。１種または複数の標識された標準試料のうちの１種または複数の少なくとも一部は、対象の試料の各々の少なくとも一部と組み合わされて、組み合わされた試料が得られ、続いて、この組み合わされた試料の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに付し、透過レポーターイオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを測定する。
【０１２６】
次いで、組み合わされた試料中の１種または複数の標識された標準化合物のうちの１種または複数に対応する、レポーターまたは分析物イオンのうちの１種または複数の測定されたイオンシグナルは、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体化合物のうちの１種または複数の濃度の決定において使用され得、標準化合物のいくつかの値をプロットすることによって濃度曲線を作製するために使用され得る。したがって、一部の実施形態では、標識された分析物化合物の濃度を決定することは、少なくとも、対応するレポーターまたは分析物の測定されたイオンシグナルの、組み合わされた試料中の１種または複数の標識された標準化合物のうちの１種または複数に対応する、１種または複数のレポーターまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルに対する比較に基づいている。この組み合わされた試料の少なくとも一部を、ＰＤＩＴＭに付すステップは、例えば、質量分析器システムへの直接導入、まず、この組み合わされた試料の少なくとも一部を、クロマトグラフィーカラムにロードすること、続いて、クロマトグラフィーカラムからの溶出物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに付すことおよび透過レポーターイオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを測定することを含み得る。
【０１２７】
本明細書に開示されるように、標準化合物でＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器およびイオンフラグメンターおよび第２の質量分離器を含む質量分析器システムで実施され得る。ＰＤＩＴＭスキャンの透過親イオンｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器によって選択される）は、標識された標準化合物のうちの１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択され得、ＰＤＩＴＭスキャンの透過娘イオンｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器によって選択される）は、透過された標準化合物に対応するレポーターまたは分析物イオンのうちの１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択され得る。
【０１２８】
標識された分析物化合物のうちの１種または複数の濃度を決定することは、（ｉ）対応するレポーターまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルの、１種または複数の標準化合物の１種または複数の濃度曲線に対応する１種またはレポーターまたは分析物イオンの測定されたイオンシグナルに対する比較および（ｉｉ）対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体と組み合わされた１種または複数の標識された標準化合物に対応する１種または複数のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する比較の両方に基づき得る。第１の濃度を有し、タグのセットに由来するタグで標識された同位体濃縮されていない標準化合物が提供され得、標識された試料の各々の少なくとも一部と組み合わされて、組み合わされた試料が得られ、この組み合わされた試料は、次いで、本明細書に記載されるようにさらに分析され得る。
【０１２９】
本教示の種々の実施形態では、標準化合物の濃度曲線は、（ａ）第１の濃度を有する、同位体濃縮された、または同位体濃縮されていない標準ケトステロール胆汁酸前駆体を提供するステップ；（ｂ）標準化合物を、標識のセットに由来する標識で標識するステップであって、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体標準化合物がレポーターイオン部分を有するこステップ；（ｃ）標識された標準化合物の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムにロードするステップ；（ｄ）クロマトグラフィーカラムからの溶出物の少なくとも一部を、親−娘イオン遷移モニタリングに付すステップ；（ｅ）透過された分析物またはレポーターイオンのイオンシグナルを測定するステップ；（ｆ）１種または複数の異なる標準化合物濃度についてステップ（ａ）〜（ｅ）を反復するステップ；および（ｇ）少なくとも、１つまたは複数の標準化合物濃度での透過された分析物またはレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに基づいて、標準化合物の濃度曲線を作成するステップによって作成され得る。
【０１３０】
種々の実施形態では、本開示は、１種または複数の試料において１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体の濃度を決定する方法を提供する。本方法は、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体の各々を、式（Ｉ）のタグのセットに由来する異なるタグで標識するステップを含み、ここで、Ｙ基は、第四級窒素であり得、レポーターイオン部分を含む。本方法はまた、標識された前駆体化合物の各々の少なくとも一部を組み合わせて、組み合わせられた試料を得るステップおよび組み合わされた試料の少なくとも一部を親−娘イオン遷移モニタリングに付すステップ（ここで、透過親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析物化合物のｍ／ｚ値を含み、透過娘イオンｍ／ｚ範囲は、標識された分析物化合物のタグに対応するレポーターイオンのｍ／ｚ値を含む）および透過レポーターイオンのうちの１種または複数のイオンシグナルを測定するステップ；次いで、少なくとも、対応するレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの、標準化合物の１種または複数の測定されたイオンシグナルに対する比較に基づいて、標識された分析物化合物のうちの１種または複数の濃度を決定するステップも含む。イオンシグナル(単数または複数)は、例えば、イオンピークの強度（平均値、平均、最大など）、イオンピークの面積またはその組合せに基づいたものであり得る。
【０１３１】
ＰＤＩＴＭは、第１の質量分離器およびイオンフラグメンターおよび第２の質量分離器を含む質量分析器システムを含めた、当技術分野で公知の任意の適した質量分析器で実施され得る。ＰＤＩＴＭスキャンの透過親イオンｍ／ｚ範囲（第１の質量分離器によって選択される）は、標識された分析物化合物のうちの１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択され、ＰＤＩＴＭスキャンの透過娘イオンｍ／ｚ範囲（第２の質量分離器によって選択される）は、透過された標識された分析物化合物のタグに対応するレポーターイオンのうちの１種または複数のｍ／ｚ値を含むよう選択される。
【０１３２】
一部の実施形態では、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体試料は、同一実験測定内で、（ｉ）異なる試料（例えば、対照、処理）に由来する複数のケトステロール胆汁酸前駆体を含有する化合物が、比較および／または定量化され得る；（ｉｉ）同一試料に由来する同一ケトステロール胆汁酸前駆体化合物で複数の濃度測定値が決定され得る；および（ｉｉｉ）ベースライン試料に対して臨床試料の異なる単離物が評価され得るよう、質量に差のあるタグのセットから選択されるタグのうちの１種または複数で標識される。
【０１３３】
組み合わされた試料の少なくとも一部を、ＰＤＩＴＭに付すステップは、例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）イオン供給源を使用して適した溶液中の組み合わされた試料を導入することによって、質量分析器システムに組み合わされた試料を直接導入するステップを含む。
【０１３４】
組み合わされた試料中の１種または複数の標識された標準化合物のうちの１種または複数に対応するレポーターのうちの１種または複数の測定されたイオンシグナルは、標識された分析物化合物のうちの１種または複数の濃度を決定する。標識された分析物化合物の濃度を決定することは、少なくとも、対応するフラグメントイオンの測定されたイオンシグナルの、組み合わされた試料中の１種または複数の標識された標準化合物のうちの１種または複数に対応する１種または複数のフラグメントの測定されたイオンシグナルに対する比較に基づいている。この組み合された試料の少なくとも一部を、ＰＤＩＴＭに付すステップは、例えば、質量分析器システムへの直接導入；まず、この組み合わされた試料の少なくとも一部を、クロマトグラフィーカラムにロードすること、続いて、クロマトグラフィーカラムからの溶出物の少なくとも一部をＰＤＩＴＭに付すことおよび透過レポーターまたは分析物イオンのうちの１種または複数またはその組合せのイオンシグナルを測定することを含み得る。
【０１３５】
一部の実施形態では、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体化合物のうちの１種または複数の濃度を決定することは、対応する分析物またはレポーターイオンの測定されたイオンシグナルの、１種または複数の標準化合物の１種または複数の濃度曲線に対応する１種または複数のレポーターイオンの測定されたイオンシグナルに対する比較を含む。第１の濃度を有し、タグのセットに由来するタグで標識された同位体濃縮されていない標準化合物が提供される。標識された標準化合物の一部が、親−娘イオン遷移モニタリングに付され（ここで、透過親イオンｍ／ｚ範囲は、標識された標準化合物のｍ／ｚ値を含み、透過娘イオンｍ／ｚ範囲は、標識された標準化合物のタグに対応するレポーターまたは分析物イオンのｍ／ｚ値を含む）、レポーターまたは分析物イオンのイオンシグナルが測定される。標準化合物の濃度曲線を作成するために、標識するステップおよびＰＤＩＴＭのステップおよび透過されたレポーターまたは分析物イオンのイオンシグナルを測定するステップは、第１の濃度とは異なる少なくとももう１種の標準化合物濃度について反復される。
【０１３６】
試料の誘導体化は、ＱＡＯ試薬が、アミノオキシＭＳタギング部分ならびに一般式（Ｉ）で示される標識部分を含む１ステップ反応である場合も、付加物が、オキソ含有試薬およびケトステロール胆汁酸前駆体の反応と、それに続く、アミノオキシＭＳタグとの組合せによって形成されるマルチステップ反応である場合もある。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第６１／５８８，９０２号に記載されている。一部の実施形態では、多重化能を提供する２ステップ標識反応が提供され得る。例えば、一部の実施形態では、異なるケトステロール胆汁酸前駆体が、異なるＱＡＯ試薬で標識され得る。他の実施形態では、異なるケトステロール胆汁酸前駆体は、単一ＱＡＯ試薬で標識され得、得られた付加物は、異なるアミノキシタグと反応され得る。
【０１３７】
本方法は、既知ケトステロール胆汁酸前駆体を含む標準を提供すること、標準の既知ケトステロール胆汁酸前駆体をＱＡＯ試薬で処理して、標準付加物を形成することをさらに含み得る。種々の実施形態では、標準は、本教示に従う１ステップまたは２ステップ標識反応によってＱＡＯ試薬で処理されて、標準付加物を形成し得る。次いで、標準付加物は、ケトステロール胆汁酸前駆体をＱＡＯ試薬で標識して、混合物を形成することによって形成された付加物と混合され得る。次いで、混合物は、マススペクトロメトリーを使用して、例えば、ＬＣ／ＭＳＭＳ分光法を使用して分析され得る。一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体の相対濃度が得られ得る。他の実施形態では、既知濃度の標準を使用してケトステロール胆汁酸前駆体の絶対定量化が得られ得る。
【０１３８】
種々の実施形態によれば、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体の相対定量化のための方法は、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を標識し、それに続いて、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含み得る。一部の実施形態によれば、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体および／またはその代謝産物は定量化され得る。一部の実施形態によれば、アミノキシタギング剤は、等圧タグのセットを含み得る。一部の実施形態によれば、第１のステップでは、標準中の少なくとも１種のケトステロール胆汁酸前駆体がＱＡＯ試薬で標識されて、標準付加物を形成し得る。第２のステップでは、標準付加物は、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグでタグを付けられ得る。試験試料は、ＱＡＯ試薬と反応され、試験試料中の、存在すれば、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体を標識し得る。試験試料中の標識されたケトステロール胆汁酸前駆体は、次いで、第１の等圧タグとは異なっている、同一セットの等圧タグに由来する第２の等圧タグでタグを付けられ得る。次いで、標識された標準および標識された試験試料は組み合わされ得、得られた混合物は、逆相カラム上での液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離に付され得る。標識されたケトステロール胆汁酸前駆体は、個別の保持時間を有し得、別個の時間にカラムから溶出し得る。溶出ピークは、標識された分析物を含有するピークおよび標識された標準を含有するピークを含み得る。カラムからの溶出物は、その後、マススペクトロメトリーを使用して分析され得る。
【０１３９】
ケトステロール胆汁酸前駆体の絶対定量化は、標準が既知濃度のケトステロール胆汁酸前駆体を有する場合には、相対的定量化について上記で記載されたような同一の様式で実施され得るということは理解されなくてはならない。また、ケトステロール胆汁酸前駆体および／またはケトステロール胆汁酸前駆体の代謝産物が上記で記載される場合には、任意のケトステロール胆汁酸前駆体が使用され得るということが理解されなければならない。
【０１４０】
種々の実施形態によれば、複数の異なるケトステロール胆汁酸前駆体を含む試料が、異なるＱＡＯ試薬で処理されて、２種以上のケトステロール胆汁酸前駆体の各々を、前記試薬のうち異なる１種で標識し得る。次いで、標識された試料は、マススペクトロメトリー、例えば、ＬＣ／ＭＳＭＳを使用して分析され、標識されたケトステロール胆汁酸前駆体を定量化し得る。一部の実施形態では、試料のこのような分析は、分光器の単回試行で実施され得る。上記で論じられたように、一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体は、ステロイドまたはステロイド様分析物であり得る。
【０１４１】
種々の実施形態によれば、１種または複数の化合物を含有する試料は、分析に先立って種々の方法によって濃縮され得る。濃縮方法は、血液（新鮮または乾燥）、血漿、血清などといった試料の種類に応じて変わり得る。例示的濃縮方法として、制限するものではないが、タンパク質沈殿、液液抽出、固液抽出および限外濾過が挙げられる。他の濃縮方法または２種以上の濃縮方法の組合せが使用され得る。
【０１４２】
一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体の分析は、例えば、質量分析計における高エネルギー衝突によって、レポーターイオンを作製することおよび定量化のためにレポーターイオンの強度またはピーク面積を利用することを含み得る。例として、上記で示されたＱＡＯ試薬は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）の際に中性損失を起こし、レポーターイオンとして帯電分析物種を残し得、次いで、レポーターイオンはＭＳ３分析に付され得る。一部の実施形態では、ＱＡＯ試薬は、高エネルギー衝突の際にタグフラグメントを作製し得、次いで、タグフラグメントは、ＭＳ３分析に付され得る。
【０１４３】
種々の実施形態によれば、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体および／または本教示にしたがって形成されたその付加物を標識するのに、複数のマススペクトロメトリー（ＭＳ）タギング剤が使用され得る。一部の実施形態によれば、アミノキシタギング剤は、良好にフラグメンテーションして、強力なレポーターイオンを提供し得る。一部の実施形態によれば、アミノキシタギング剤は、  マススペクトロメトリーのために特に設計されているタギング剤を含み得、一部の実施形態によれば、アミノキシタギング剤は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイのために特に設計されている。一部の実施形態では、アミノキシタギング剤は、ケトステロール胆汁酸前駆体を標識することによって生じた付加物にタグを付けるために使用され得る。標準付加物がケトステロール胆汁酸前駆体の定量化のために使用される一部の実施形態では、標準付加物にタグを付けるためにアミノキシタギング剤が使用され得る。種々の実施形態では、標準付加物は、ケトステロール胆汁酸前駆体の相対定量化のために使用され得る。標準付加物の濃度が既知である一部の実施形態では、標準付加物は、ケトステロール胆汁酸前駆体の絶対定量化のために使用され得る。一部の実施形態では、種々のアミノキシＭＳタギング剤は、種々の分析物を標識するために使用され得る。例えば、アミノキシＭＳタギング剤は、異なる等圧タグまたは異なる質量に差のあるタグであり得る。例として、標準付加物にタグを付けるために使用されるアミノキシＭＳタギング剤は、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグを含み得、一方で、試料に由来する付加物にタグを付けるために使用されるアミノキシＭＳタギング剤は、第１の等圧タグとは異なっている、等圧タグの同一セットに由来する第２の等圧タグを含み得る。
【０１４４】
等圧タグによって、多重化が可能となり、ケトステロール胆汁酸前駆体を、ハイスループットな、試料当たり、より低コストの分析を用いて多重化分析する方法を提供する。ケトステロール胆汁酸前駆体のすべてにおいて、１つの共通の官能基があるので、種々の実施形態では、各分析物についてただ１つだけのタグが必要である。一部の実施形態では、ＰＤＩＴＭを使用することで、特異性が増大し、エラーのリスクが低減する。試薬設計によって、ＦｌａｓｈＱｕａｎｔＴＭ適用にとって良好なツールとなり、分析物の同一性の確認において役立つＭＳ３能を可能にする。
【０１４５】
種々の実施形態によれば、あるセットの等圧試薬に由来する第１の等圧タグは、既知ケトステロール胆汁酸前駆体を例えば、既知濃度で含み得る標準と接触するよう作製され得る。接触は、第１の等圧タグおよび標準間の反応に有利に働く条件下で行われ得る。第１の等圧タグと同一セットの等圧試薬に由来する第２の等圧タグは、未知濃度のケトステロール胆汁酸前駆体を含む試料と接触するよう作製され得る。以下にさらに記載されるように、標準および試料のタグが付けられた分析物は、一緒に混合され、分析され、試料中の分析物の濃度を決定できる。分析は、混合物を分けて、別個の分析物を形成することおよび別個の分析物を分析することを含み得る。使用され得る分離法は、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、他のクロマトグラフィー法、電気泳動法、電気浸透法、質量に差のある分離法などを含む。例示的実施形態では、混合物中の種々の分析物を分離し、したがって、別個の分析物を形成するために、液体クロマトグラフィーが使用される。
【０１４６】
一部の実施形態では、クロマトグラフィー分離は、逆相カラムで実施され得、カラムから溶出するピークがその後の分析に付され得る。一部の実施形態では、その後の分析は、マススペクトロメトリー、より詳しくは、親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を含み得る。以下により詳細に記載されるように、ＰＤＩＴＭから得られた結果を比較することによって、試料中のケトステロール胆汁酸前駆体の濃度が決定され得る。ＰＤＩＴＭおよびその使用についてのより詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開ＵＳ２００６／０１８３２３８Ａ１に見出すことができる。
【０１４７】
一部の実施形態によれば、本明細書において上記に記載される質量に差のある薬剤の対など、等圧タギング試薬の代わりに質量に差のあるタギング剤が使用され得る。種々の実施形態によれば、アミノキシＭＳタギング剤は、マルチプレックスアッセイにおける相対および絶対定量化のために使用され得る。一部の実施形態によれば、アミノキシＭＳタギング剤は、二重、三重、四重および他の多重アッセイのために使用され得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、ＱＡＯ試薬は、オキソ部分の等モル濃度で試料と組み合わされる。一部の実施形態では、過剰の（例えば、約１０％、約２０％、約２倍過剰または約４倍過剰）のＱＡＯ試薬が付加される。一部の実施形態では、等モル濃度未満のＱＡＯが使用され、例えば、ＱＡＯ濃度は、オキソ部分のモル濃度の約２５％、約５０％または約７５％であり得る。一部の実施形態では、ＱＡＯ試薬は、試料溶液中、１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの間または１００μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で試料と組み合わされる。
【０１４９】
本教示の種々の実施形態に従って使用され得る種々の液体クロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリー方法、システムおよびソフトウェアとして、２００９年５月３１日に出願された米国仮特許出願番号第６１／１８２，７４８号に、また２００６年８月１７日に公開された米国特許出願番号第ＵＳ２００６／０１８３２３８Ａ１号に記載されるものが挙げられる。これらの参考文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
本教示のさらに他の実施形態によれば、上記で論じられるものなどのＱＡＯ試薬を含むキットが提供される。他の実施形態では、ＱＡＯ試薬および１種または複数のアミノキシＭＳタギング剤を含むキットが提供される。アミノキシＭＳタギング剤は、上記のアミノキシＭＳタギング剤の第１および／または第２の分類またはセットに由来する化合物を含み得る。一部の実施形態では、キットは、既知ケトステロール胆汁酸前駆体を含む標準を含み得る。
【０１５１】
本教示の種々の実施形態によれば、ＱＡＯ試薬およびアミノキシＭＳタギング剤のうちの１種または複数を含み得るキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、既知濃度のケトンを含むステロイド分析物を含む標準を含み得る。
【０１５２】
一部の実施形態では、キットは、既知濃度の既知ケトステロール胆汁酸前駆体を含む少なくとも１種の標準を含み得る。一部の実施形態によれば、アミノキシＭＳタギング剤は、等圧タグのセットに由来する等圧タグであり得、一部の実施形態では、キットは、等圧タグのセットに由来する複数の異なる等圧タグを含み得る。一部の実施形態によれば、アミノキシＭＳタギング剤は、質量に差のあるタグのセットに由来する質量に差のあるタグであり得、一部の実施形態では、キットは、質量に差のあるタグのセットに由来する複数の異なる質量に差のあるタグを含み得る。一部の実施形態によれば、キットは、ＱＡＯ試薬、アミノキシＭＳタギング剤、既知ケトステロール胆汁酸前駆体および／または既知濃度の既知ケトステロール胆汁酸前駆体を含む標準を含み得、標識のための説明書をさらに含み得る。
【０１５３】
一部の実施形態では、例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）の、１種または複数の永久荷電型アミノオキシ化合物を含む、本明細書に記載された１種または複数のアミノオキシ試薬を含むキットが提供され得る。
【０１５４】
一部の実施形態では、方法は、ケトステロイドの定量的分析のためのＭＲＭワークフローを使用することを含み得る。試薬は、ケト化合物の個々またはそのパネルの定量的分析のために同位体コード化され得る。ＭＳ／ＭＳを用いるプロファイリング研究のために、低衝突エネルギーでのフラグメンテーションは、１種の主なシグネチャーイオンをもたらし得る。シグネチャーイオンは、アミノオキシ誘導体化生成物からの中性損失に起因し得る。ＭＲＭ遷移は、Ｑ１における誘導体化ステロイドの質量およびＱ３における中性損失フラグメントの質量であり得る。低濃度定量化のためには、標識試薬および分子の骨格の一部を含む高衝突エネルギーでのＭＳ／ＭＳフラグメンテーションは、誘導体化によってバックグラウンドノイズを大幅に低減するための方法を提供し、改善された感度および改善された特異性をもたらすＱ３フラグメントの標的化された選択をもたらし得る。
【０１５５】
種々の実施形態によれば、本教示は、生体試料の多段階精製およびクロマトグラフィー分離と関連する問題を伴うことなく、バックグラウンドノイズを低減または排除する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、永久荷電型アミノオキシ試薬（ＱＡＯ）を用いるケトステロイドの誘導体化化学および試薬および誘導体化されたステロイドの骨格の両方を含む標的化フラグメンテーションを利用することによってバックグラウンドノイズを排除する。容易にイオン化される／イオン化可能な分子を用いる誘導体化は、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳにおいて良好なイオン化効率をもたらし、分析物に対する感度を増大する。Ｑ３シグネチャーイオンであるフラグメントイオンは、誘導体化試薬または試薬の一部が結合された構造フラグメントを含むよう選択される場合には、感度および選択性の両方が増強され得る。正確に同一のＱ１／Ｑ３遷移を有する化合物が検出され、バックグラウンドノイズ干渉を作り出す機会は極めて少ない。同様のＱ１／Ｑ３  ＭＲＭ遷移の唯一の可能性は、生体試料中の等圧ケトステロイドの存在であろう。等圧ケトステロイドは、干渉として現れるには、分析物と同一のフラグメンテーションパターンを共有しなくてはならない。このような稀な状況では、等圧ケトステロイドは、分析物からクロマトグラフィー分離され得る。
【０１５６】
種々の実施形態によれば、試薬設計の付加される利点は、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションの際に、試薬が、フラグメントイオン、すなわち、誘導体化された分析物で電荷を有する、Ｑ３シグネチャーイオンを生成することであり、これによって、ＭＳ３分析に従うものとなるということである。一部の実施形態では、本方法は、ケトまたはアルデヒド官能基を有する分子のクラスで実施され得、その検出は、ＭＳ／ＭＳによる超高感度分析のための誘導体化から利益を受け得る。
【０１５７】
一部の実施形態では、ケトステロール胆汁酸前駆体を検出した後に、ケトステロール胆汁酸前駆体の相対濃度が、標準化合物のものに対する比較によって、または標準濃度曲線を使用することによって測定される。一部の実施形態では、少なくとも１種の分析物の絶対濃度が決定される。一部の実施形態では、少なくとも１種の重原子で標識された標準を含む較正物が使用される。一部の実施形態では、較正物は、少なくとも２種の重水素原子を有する化合物である。
【０１５８】
本教示は、ケトステロイドおよびケト官能基を含有する分子のクラスの、高度に感度の高い、特異的な分析を提供する。本教示は、例えば、標識試薬の一部および分子の骨格の一部を含むためのシグネチャーイオンの注意深い欠失のために、ＭＳ／ＭＳにおいて極めて低いバックグラウンドノイズを伴う、高いシグナル対ノイズ比を提供する。
質量分析器
【０１５９】
本教示において、ＰＤＩＴＭを実施するために、多種多様な質量分析器システムが使用され得る。適した質量分析器システムは、２種の質量分離器を含み、イオンフラグメンターが、２つの質量分離器の間のイオン飛行経路中に配置されている。適した質量分離器の例として、それだけには限らないが、四重極、ＲＦ多重極、イオントラップ、時間非行型（ＴＯＦ）および時限式イオン選別器と連結しているＴＯＦが挙げられる。適したイオンフラグメンターとして、それだけには限らないが、衝突誘導性解離（ＣＩＤ、衝突支援解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＣＡＤ）とも呼ばれる）、光誘導性解離（ＰＩＤ）、表面誘導性解離（ＳＩＤ）、ポストソース分解、電子線との相互作用による（例えば、電子誘導性解離（ＥＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ））、熱放射との相互作用（例えば、熱／黒体赤外放射解離（ｔｈｅｒｍａｌ／ｂｌａｃｋ  ｂｏｄｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｒａｄｉａｔｉｖｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＢＩＲＤ））、ポストソース分解またはそれらの組合せの原理で作動するものが挙げられる。
【０１６０】
質量分析器についての適したマススペクトロメトリーシステムの例として、それだけには限らないが、トリプル四重極、四重極−線形イオントラップ（例えば、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）、四重極ＴＯＦ（例えば、ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム）およびＴＯＦ−ＴＯＦのうちの１種または複数を含むものが挙げられる。
【０１６１】
種々の実施形態では、質量分析器システムは、ＭＡＬＤＩイオン供給源を含む。種々の実施形態では、組み合わされた試料の少なくとも一部が、ＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合され、ＭＡＬＤＩイオン化供給源を備えた質量分析器を使用する親−娘イオン遷移モニタリングに付される。種々の実施形態では、組み合わされた試料の少なくとも一部が、クロマトグラフィーカラムにロードされ、溶出物の少なくとも一部がＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合され、ＭＡＬＤＩイオン化供給源を備えた質量分析器を使用する親−娘イオン遷移モニタリングに付される。
【０１６２】
質量分析計システムは、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するためにトリプル四重極質量分析計を含み得る。この実施形態では、第１の四重極子は、親イオンを選択する。第２の四重極子は、複数の低エネルギー衝突が起こり、親イオンの一部のフラグメント化を引き起こすよう、十分に高い圧力および電圧で維持される。第３の四重極は、選択された娘イオンを検出器に透過するよう選択される。種々の実施形態では、トリプル四重極質量分析計は、イオン供給源とトリプル四重極子の間に配置されたイオントラップを含み得る。イオントラップは、イオン（例えば、すべてのイオン、特定のｍ／ｚ範囲を有するイオンなど）を集めるよう設定され得、全時間（ｆｕｌｌ  ｔｉｍｅ）の後、末端の電極にパルスをかけて、選択されたイオンがイオントラップを出るのを可能にすることによって、選択されたイオンを第１の四重極子に透過する。求められる充填時間は、例えば、イオン数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出間の時間、デューティーサイクル、励起状態種または多重帯電イオンの減衰率またはそれらの組合せに基づいて決定され得る。
【０１６３】
トリプル四重極質量分析計中の四重極子の１種または複数は、線形イオントラップとして設定可能であり得る（例えば、四重極子内に実質的に長い円筒上のトラップ体積を提供するよう末端電極を付加することによって）。種々の実施形態では、第１の四重極子は、親イオンを選択する。第２の四重極子は、複数の低エネルギー衝突が起こり、親イオンの一部のフラグメント化を引き起こすよう、十分に高い衝突ガス圧および電圧で維持される。第３の四重極子は、フラグメントイオンを捕捉し、充填時間の後、末端の電極にパルスをかけて、選択された娘イオンがイオントラップを出るのを可能にすることによって、選択された娘イオンを検出器に透過するよう選択される。求められる充填時間は、例えば、フラグメントイオンの数、イオントラップ内の電荷密度、異なるシグネチャーペプチドの溶出間の時間、デューティーサイクル、励起状態種または多重帯電イオンの減衰率またはそれらの組合せに基づいて決定され得る。
【０１６４】
質量分析計システムは、親イオンを選択し、そのフラグメント娘イオンを検出するために２種の四重極子質量分離器およびＴＯＦ質量分析計を含み得る。種々の実施形態では、第１の四重極子は、親イオンを選択する。第２の四重極子は、複数の低エネルギー衝突が起こり、イオンの一部のフラグメント化を引き起こすよう、十分に高い圧力および電圧で維持され、ＴＯＦ質量分析計は、例えば、対象の娘イオンを包含する質量範囲にわたってイオンをモニタリングし、作成されたイオンクロマトグラムを抽出すること、選択された娘イオンの時間枠の外側に現れるイオンを検出器からそらすこと、検出器に選択された娘イオンの到着時間枠に対して時間ゲーティングを行う（ｔｉｍｅ  ｇａｔｉｎｇ）こと、またはそれらの組合せによって、検出のために娘イオンを選択する。
【０１６５】
質量分析計システムは、２種のＴＯＦ質量分析器およびイオンフラグメンター（例えば、ＣＩＤまたはＳＩＤなど）を含み得る。種々の実施形態では、第１のＴＯＦは、イオンフラグメンター中に導入するために親イオンを選択し（例えば、選択された親イオンの時間枠の外側に現れるイオンをフラグメンターから離してそらすことによって）、第２のＴＯＦ質量分析計は、対象の娘イオンを包含する質量範囲にわたってイオンをモニタリングし、作成されたイオンクロマトグラムを抽出すること、選択された娘イオンの時間枠の外側に現れるイオンを検出器から離してそらすこと、検出器に選択された娘イオンの到着時間枠に対して時間ゲーティングを行うこと、またはそれらの組合せによって、検出のために娘イオンを選択する。ＴＯＦ分析器は、線形であっても、反射型分析器であってもよい。
【０１６６】
質量分析計システムは、対象の親イオンを選択するための時限式イオン選別器を有する第１のフィールドフリードリフト領域、娘イオンを生成するためのフラグメンテーションチャンバー（またはイオンフラグメンター）および選択された娘イオンを検出のために透過させる質量分離器を含むタンデムＭＳ−ＭＳ機器を含み得る。種々の実施形態では、時限式イオン選別器は、パルス化イオン偏向器（ｐｕｌｓｅｄ  ｉｏｎ  ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）を含む。種々の実施形態では、イオン偏向器は、パルス化イオン偏向器として使用され得る。質量分離器は、イオン反射器（ｉｏｎ  ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）を含み得る。種々の実施形態では、フラグメンテーションチャンバーは、イオンのフラグメンテーションを引き起こし、抽出を遅延するよう設計された衝突セルである。種々の実施形態では、フラグメンテーションチャンバーはまた、飛行時間型マススペクトロメトリーによるフラグメントイオンの分析のための遅延型抽出イオン供給源としても役立ち得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、イオン化は、構造的に特異的なフラグメントイオンおよびＱ３  ＭＲＭイオンを作製するために使用され得る。標識試薬は、構造的に特異的なフラグメントイオンで全体的にまたは部分的に含有され得る。本方法は、Ｑ３  ＭＲＭイオンに対する感度および特異性の両方を提供し得る。一部の実施形態では、イオン化は、優勢な中性損失フラグメントイオンをもたらすよう使用され得、これは、Ｑ３において選択され、次いで、フラグメント化されて、構造的に特異的なイオンを生成し得る。次いで、これらのフラグメントイオンは、ＭＳ３と呼ばれる手順での同定および定量化のために使用され得る。
キット
【０１６８】
一部の実施形態では、本教示は、ケトステロール胆汁酸前駆体の分析のためのキットを含む。キットは、２種以上の同位体濃縮された標準および１種または複数の試薬のセットを含む１種または複数の標識、容器、酵素、バッファーおよび／または使用のための説明書を含む。本教示のキットは、１種または複数の支持体のセットを含み、各支持体は、切断可能なリンカーを介して支持体と切断可能に連結している、異なる等圧標識化合物を含む。切断可能な結合の例として、それだけには限らないが、化学的にまたは光分解的に切断可能なリンカーが挙げられる。支持体は、異なる試料と反応させられ、それによって、試料の分析物を、それぞれの支持体と関連している等圧タグで標識できる。異なる試料に由来するケトステロール胆汁酸前駆体の分析は、異なる支持体と接触させられ、したがって、異なるレポーター／リンカー組合せで標識され得る。
【０１６９】
種々の実施形態によれば、キットは、複数の異なるアミノオキシタギング試薬、例えば、本明細書に記載される標識試薬のセットを含み得る。キットは、複数の異なるケトステロール胆汁酸前駆体、例えば、複数の異なるケトステロールを分析するよう構成され得、標識は、各々を複数の異なるそれぞれの標識試薬、例えば、異なるケトステロール胆汁酸前駆体各々のための異なる試薬で標識することを含み得る。本教示の種々の実施形態によれば、１種または複数のケトステロール胆汁酸前駆体にタグを付けるための１種または複数のアミノオキシＭＳタギング試薬を含むキットが提供される。アミノオキシＭＳタギング試薬は、本明細書において記載される構造のうちの１種を有する化合物を含み得る。
【０１７０】
キットは、１種または複数の既知ケトステロール胆汁酸前駆体を含む標準を含み得る。標準は、既知濃度の既知化合物を含み得る。一部の実施形態では、キット中のアミノオキシＭＳタギング試薬は、等圧タグのセットに由来する１種または複数の等圧タグを含み得る。一部の実施形態では、キットは、等圧タグのセットに由来する複数の異なる等圧タグを含み得る。一部の実施形態では、キット中のアミノオキシＭＳタギング試薬は、永久荷電型アミノオキシ試薬のセットに由来する１種または複数の永久荷電型アミノオキシ試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットは、永久荷電型アミノオキシ試薬タグのセットに由来する複数の異なる永久荷電型アミノオキシ試薬タグを含み得る。
【０１７１】
キットはまた、ケトステロール胆汁酸前駆体を標識するための説明書、例えば、紙の説明書または電子ファイルの形式の説明書、例えば、コンパクトディスクでの説明書を含み得る。説明書は、アッセイを実施するためのものであり得る。一部の実施形態では、キットは、試料のみが付加される必要がある、単一容器における均一アッセイを含み得る。キットの他の成分は、バッファー、他の試薬、１種または複数の標準、混合容器、１種または複数の液体クロマトグラフィーカラムなどを含み得る。
【０１７２】
一部の実施形態では、複雑な生体マトリックスからのケトステロイドの高度に感度の高い定量化、例えば、低ｐｇ／ｍＬ濃度の範囲での検出を可能にするケトステロイド分析キットが提供される。
定義
【０１７３】
本明細書において、用語「診断」「診断する」および「診断している」とは、対象が所与の疾患または状態を患っているか否かを決定または同定しようとするプロセスを指す。用語「診断」とは、特定の疾患の有無を１００％の正確性で決定する能力を指すものではなく、所与の経過または結果が、そうではない場合よりも起こる可能性が高いということでさえもない。そうではなく、当業者ならば、用語「診断」とは、対象において特定の疾患が存在する可能性の増大を指すということは理解されよう。診断は、本明細書においてまた、当技術分野で公知の他の方法を使用する診断によって確認され得る予備診断のための方法を含む。さらに、本明細書に記載された方法は、状態の進行および／または状態を治療するために使用されている療法の有効性をモニタリングするために使用され得るということが考慮される。
【０１７４】
用語「スクリーニング」とは、特定の疾患または臨床状態を対象とし、標的を使用するアッセイを指す。
【０１７５】
本明細書において、「水和物の形態」とは、化合物または混合物の任意の水和状態または化合物の１種よりも多くの水和状態を指す。例えば、本明細書において論じられる標識試薬は、半水和物、一水和物、二水和物などであり得る。さらに、本明細書に記載される標識試薬の試料は、一水和物、二水和物および半水和物形態を含み得る。
【０１７６】
語句「等圧標識」、「等圧タグ」および「等圧標識試薬」は、互換的に使用される。語句「等圧標識のセット」、「等圧タグのセット」および「等圧標識試薬のセット」は、互換的に使用され、例えば、セットのメンバー（個々の「等圧標識」、「等圧タグ」または「等圧標識試薬」）が、同一質量を有するが、セットの各メンバーが、イオンフラグメンテーション（例えば、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）、光誘導性解離（ＰＩＤ））に付された際に異なる娘イオンシグナルをもたらし得る、試薬または化学部分を指す。等圧タグのセットは、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物またはその塩もしくは水和物の形態を含み得る。セットのメンバー間を区別するために使用され得る等圧タグの娘イオンは、等圧タグのレポーターイオンまたは帯電分析物であり得る。等圧タグのセットは、ケトステロール胆汁酸前駆体を標識するために使用され、実質的にクロマトグラフィーによって識別不可能であるが、ＣＩＤ後にシグネチャーイオンを生成する標識された化合物を生成し得る。質量標識のセットの個々のメンバーの質量は、同一であっても、異なっていてもよい。個々の同位体置換が同一である場合には、質量は同一であり得る。セットの特定の標識に組み込まれる重い要素または軽い要素のための個々の原子の選択における相違はまた、同位体濃縮された置換基の特定の原子量に基づいて質量の相違をもたらし得る。
【０１７７】
本明細書において、「同位体濃縮された」とは、化合物（例えば、標識試薬）が、１個または複数の重原子同位体（例えば、それだけには限らないが、重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌまたは８１Ｂｒを含めた安定な同位体）を用いて合成的に濃縮されていることを意味する。同位体濃縮は、１００％有効ではないので、濃縮のより少ない状態である化合物の不純物が存在し得、これらはより少ない質量を有する。同様に、過剰な濃縮（望ましくない濃縮）のために、また、天然の同位体存在量の変動のために、より多い質量の不純物が存在し得る。
【０１７８】
語句「質量に差のある標識」、「質量に差のあるタグ」および「質量に差のある標識試薬」は、本明細書において互換的に使用される。語句「質量に差のある標識のセット」、「質量に差のあるタグのセット」は、互換的に使用され、例えば、セットのメンバー（すなわち、個々の「質量に差のある標識」または「質量に差のあるタグ」）が、実質的に同様の構造的および化学的特性を有するが、セットのメンバー間での重い同位体濃縮の相違のために質量が異なっている試薬のセットまたは化学部分を指す。質量に差のあるタグのセットの各メンバーは、イオンフラグメンテーションに付された際に異なる娘イオンシグナルを生成し得る。イオンフラグメンテーションは、例えば、不活性ガスとの衝突による（例えば、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）、衝突活性化解離（ＣＡＤ）など）、解離をもたらす光子との相互作用による（例えば、光誘導性解離（ＰＩＤ））、表面との衝突による（例えば、表面誘導性解離（ＳＩＤ））、解離をもたらす電子線との相互作用による（例えば、電子誘導性解離（ＥＩＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ））、熱／黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、ポストソース分解またはそれらの組合せによるものであり得る。セットのメンバー間を区別するために使用され得る、質量に差のあるタグまたは標識の娘イオンは、質量に差のあるタグまたは標識のレポーターイオンと呼ばれ得る。
【０１７９】
本明細書において、「天然の同位体存在量」とは、自然界における同位体（単数または複数）の天然の地球上の蔓延に基づいた、化合物において見出される、１種または複数の同位体のレベル（または分布）を指す。例えば、生きている植物から得られた天然化合物は、典型的には、約０．６％の１３Ｃを含有する。
【０１８０】
本明細書において、「１種の主なシグネチャーイオンフラグメント」などの用語「主な」とは、フラグメンテーションプロセスの間に作り出されたイオンの少なくとも５０％超が、シグネチャーイオンであることを意味する。一部の実施形態では、フラグメンテーションプロセスの間作り出されたイオンの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％が、シグネチャーイオンである。同様に、「優勢な中性損失フラグメンテーション」などの用語優勢なとは、フラグメンテーションプロセスの間に作り出されたイオンの少なくとも５０％超が、中性損失フラグメントであることを意味する。一部の実施形態では、フラグメンテーションプロセスの間に作り出されたイオンの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％が、中性損失フラグメントである。
【０１８１】
本明細書において、用語「塩の形態」は、化合物の塩または化合物の塩の混合物を含む。さらに、化合物の双性イオンの形態も、用語「塩の形態」に含まれる。アミンまたは他の塩基性基を有する化合物の塩は、例えば、適した有機酸または塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などといった無機酸との反応によって得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物はまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸、過塩素酸などといった対アニオンも含有し得る。カルボン酸または他の酸性官能基を有する化合物の塩は、化合物を適した塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることによって調製され得る。したがって、酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといった対カチオンを有し得る。
【０１８２】
本明細書において、用語「罹患していない」または罹患していない個体、患者または試料とは、２７−ヒドロキシラーゼ欠乏と関連する状態を有さない個体、患者または試料を指す。このような個体、患者または試料は、比較する試料および／または対照に使用され得る。
【０１８３】
上記の説明は、種々の実施形態の実施例および特定の詳細を提供するが、記載された実施形態の一部の特徴および／または機能は、記載された実施形態の範囲から逸脱することなく改変を認めることを理解されたい。上記の説明は、本明細書の教示の例示的なものであって、その範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲にある文言によってのみ制限される。
【実施例】
【０１８４】
本出願人の教示の態様は、以下の実施例を踏まえるとさらに理解され得るが、これは、決して、本出願人の教示の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【０１８５】
（実施例１）
ケトステロイドの抽出−方法１
以下の手順は、同位体濃縮されたＩＳを使用する、乾燥血液、血清、または血漿スポット試料からのケトステロールの抽出を説明する。
【０１８６】
３μＬの乾燥血清、血漿または全血スポット（３．１７ｍｍ  パンチ）を含有する試料を得た。ＭｅＯＨ＋５％酢酸中のＱＡＯ試薬５０μＬ（２５０μｇ）を添加した。１０μＬの同位体濃縮された内部標準（ＩＳ）（１１２ｐｇ）も、試料に添加した。次いで、試料をボルテックスで混合し、周囲温度で６０分間インキュベートした。
【０１８７】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析のために５μＬの試料を注入した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＲＰ  Ｃ８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５０〜４．６ｍｍ、５ｐｍ、４０℃で）を使用して実施し、ＡＰＩ  ４０００ＴＭ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、ポジティブモードで作動するＥＳＩ供給源を用いて実施した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ勾配法（８分）は、水／アセトニトリル／０．１％ギ酸移動相を用いた。
【０１８８】
誘導体化ケトステロールの定量化は、同位体濃縮されたＩＳを作製することによって可能になった。
【０１８９】
上記の方法を使用する抽出回収率は、７α−コレステン−３−オン、５α−コレスタン−３−オン、および４−コレステン−３−オンの各々について＞９０％であるとわかった。
【０１９０】
濃度曲線に使用した較正物：各較正物について、所望の量の標準および内部標準を含有するＭｅＯＨ溶液３ｐＬを、３．１７ｍｍの濾紙パンチ上にスパイクし、乾燥させた。ＤＣＳ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｃｈａｒｃｏａｌ  Ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清（３μＬ）を各パンチディスク上にスパイクし、周囲温度で乾燥させた。較正物は、ＭｅＯＨ＋５％酢酸中の試薬５０μＬ（２５０μｇ）を用いて上記のように抽出した。
【０１９１】
図３は、この方法を使用する、ＤＣＳ血清中の７αＣ４  １〜４００ｎｇ／ｍＬの代表的な濃度曲線を提供する。
【０１９２】
図４Ａ〜４Ｄ、５Ａ〜５Ｄおよび６Ａ〜６Ｄは、これらのＱＡＯタグが付けられたバイオマーカーが単一ピークとして同時に溶出することを示す。
【０１９３】
表１は、５αコレスタン−３−オン、４−コレステン（Ｃｈｏｌｅｓｅｎ）−３−オン、および７αコレスタン−３−オンの分析のために利用されるＭＳ／ＭＳ条件を提供する。
【表１】
0006272834.tif 000019
【０１９４】
図７は、３種の異なるＱＡＯタグを付けたケトステロールのＱＡＯ誘導体化法成績を提供する。検出の限界、増強因子、直線性、ダイナミックレンジ、ＣＶおよび正確性が示されている。誘導体化後の増強因子は、２７５から２５００の間であり、これは、実質的な改善を実証する。
【０１９５】
（実施例２）
ケトステロイドの抽出＝方法２
以下のステップは、同位体濃縮された試薬を使用する、乾燥血液、血清、または血漿スポット試料からのケトステロールの抽出を説明する。
【０１９６】
３μＬの乾燥血清、血漿または全血スポット（３．１７ｍｍ  パンチ）を含有する試料を得た。ＭｅＯＨ＋５％酢酸中のＱＡＯ試薬５０μＬ（２５０μｇ）を添加した。この混合物にボルテックスをかけ、それを周囲温度で６０分間インキュベートした。次いで、同位体濃縮されたＱＡＯ試薬で誘導体化した、１０μＬのケトステロール分析物をＩＳとして添加した（約１１２ｐｇ）。
【０１９７】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析のためにこの試料を注入した（５μＬの試料）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＲＰ  Ｃ８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ、４０℃で）を使用して実施し、ＡＰＩ  ４０００ＴＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、ポジティブモードで作動するＥＳＩ供給源を用いて実施した。水／アセトニトリル／０．１％ギ酸移動相を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ勾配法（８分）を使用した。
【０１９８】
誘導体化されたケトステロールの定量化は、同位体濃縮されたＩＳを作製することによって可能になった。各濃度について、較正を実施した。各較正物について、所望の量の標準を含有するＭｅＯＨ溶液３μＬを、３．１７ｍｍの濾紙パンチ上にＩＳとともにスパイクし、乾燥させた。ＤＣＳ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｃｈａｒｃｏａｌ  Ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清３μＬを各パンチディスク上にスパイクし、周囲温度で乾燥させた。較正物は、ＭｅＯＨ＋５％酢酸中の試薬５０μ＞Ｌ（２５０μｇ）を用いて上記のように抽出した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに先立って、同位体濃縮された試薬ですでに誘導体化された、既知濃度（１１２ｐｇ）のケトステロール分析物１０μＬをスパイクした。
【０１９９】
図６の濃度曲線において示されるように、濃度の決定を実施し、実際の試料について極めて近く、これはＩＳとして重水素化試薬を使用することの実現可能性を示す。図８では、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に試薬をスパイクした。
【０２００】
（実施例３）
ケトステロイドの抽出−方法３
乾燥形態ではない試料３〜１０μＬを、以下の方法を使用して分析した。
【０２０１】
５μＬの血清、血漿または全血スポット（３．１７ｍｍ  パンチ）を含有する試料を得た。ＭｅＯＨ＋５％酢酸中のＱＡＯ試薬７５μＬ（２．８ｍｇ／ｍｌ）を添加した。１０μＬの同位体濃縮された内部標準（７ａＣ４−ｄ７、ＭｅＯＨ中１０ｐｇ／μＬ）を添加した。この試料を３０秒間ボルテックスで混合し、周囲温度で６０〜１２０分間インキュベートした。
【０２０２】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、１０μＬを注入した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、ＲＰ  ＣＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５０ｘ４．６ｍｍ、５ｐｍ、４０℃で）を使用して実施し、ＱＴＲＡＰ  ５５００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、ポジティブモードで作動するＥＳＩ供給源を用いて実施した。水／アセトニトリル／０．１％ギ酸移動相を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ勾配法（６分）を使用した。
【０２０３】
各較正物は、５μＬ  ＤＣＳ血清を用いて作製し、ＭｅＯＨ溶液中の、漸増濃度のケトステロール分析物７αＣ４およびＩＳ  ７αＣ４−ｄ７  １０μＬを用いてスパイクした。ＭｅＯＨ＋５％酢酸中の７５μＬ（２．８ｍｇ／ｍｌ）試薬を用いて上記のように較正物を抽出した。方法３を使用するＤＣＳ血清中、０から２５０ｎｍ／ｍＬの間の濃度の７αＣ４の代表的な濃度曲線が、図１０に示されている。
【０２０４】
図１１は、幾分かの内因性７αＣ４が存在するＤＳＣ血清の典型的な試料のクロマトグラフを提供する。
【０２０５】
（実施例４）
ケトステロイドの抽出および分析
実施例４の分析のために使用されるような定量化ワークフローを使用した。具体的には、血漿試料（５μＬ）を、ＭｅＯＨ＋５％酢酸中の、５０μＬのＱＡＯ試薬および１０μＬの内部標準（１１２ｐｇ）と組み合わせた。この混合物をボルテックスで混合し、室温で１〜２時間インキュベートした。ＭｅＯＨ＋５％酢酸４０μＬを添加した。試料５μＬを、ＱＴＲＡＯ  ５５００ＴＭを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に注入した。
【０２０６】
この方法の感度増強は、５０ｐｇの非誘導体化７αＣ４のスキャンを、８０ｆｇのＱＡＯ誘導体化７αＣ４と比較する図１３に示されており、これでは、シグナルは、４００倍増強される。このワークフローを使用して分析されたケトステロイドは、図１４〜２４のうち少なくとも一部に記載されている。
【０２０７】
（実施例５）
７αＣ４の抽出および分析
７αＣ４の分析のために使用されるような定量化ワークフローを使用した。具体的には、血漿試料（５μＬ）をＭｅＯＨ＋５％酢酸中、８０μＬ（２１０μｇ）ＱＡＯ試薬と組み合わせ、ＭｅＯＨ中の、１０μＬの同位体濃縮された（ｄ７）内部標準を添加した。この混合物をボルテックスで混合し、室温で１〜２時間インキュベートした。２０μＬのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ中のＩＳ−ｄ３を添加した。ＱＴＲＡＯ  ５５００ＴＭを使用するＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、５μＬの試料を注入した。分析には、６分かかった。このワークフローを使用して分析された７αＣ４が、図１４〜２４のうち少なくとも一部に記載されている。
【０２０８】
それだけには限らないが、特許、特許出願、論文、書籍、専門書およびウェブページを含めた、本願に引用される、すべての文献および同様の材料は、このような文献および同様の材料の形式に関わらず、すべての目的のために参照によりその全体が明確に組み込まれる。組み込まれた文献および同様の材料のうちの１種または複数が、それだけには限らないが、定義された用語、用語使用、記載された技術などを含めた本願と異なるか、または矛盾する事象では、本願が支配する。
【０２０９】
本明細書において使用される節の見出しは、単に組織化される目的のためであって、決して、記載される主題を制限すると解釈されるべきではない。
【０２１０】
本出願人の教示が、種々の実施形態とともに記載されるが、本出願人の教示が、このような実施形態に制限されることを意図するものではない。対照的に、本出願人の教示は、当業者によって理解されるように、種々の代替物、改変および同等物を包含する。
【０２１１】
教示は、その効果への記載がない限り、記載された順序または要素に制限されると読まれてはならない。本教示の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変形がなされ得るということは理解されなければならない。例として、開示される方法ステップのいずれも、他の開示されたステップのいずれかと組み合わせて、本教示の種々の実施形態と一致する環含有化合物を分析する方法を提供してもよい。したがって、本教示の範囲および趣旨内に入るすべての実施形態およびその同等物が特許請求される。
【図１】
0006272834.tif 000024
【図２Ａ】
0006272834.tif 000025
【図２Ｂ】
0006272834.tif 000026
【図３】
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【図４】
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【図５】
0006272834.tif 000029
【図６】
0006272834.tif 000030
【図７】
0006272834.tif 000031
【図８】
0006272834.tif 000032
【図９】
0006272834.tif 000033
【図１０】
0006272834.tif 000034
【図１１】
0006272834.tif 000035
【図１２】
0006272834.tif 000036
【図１３】
0006272834.tif 000037
【図１４】
0006272834.tif 000038
【図１５】
0006272834.tif 000039
【図１６】
0006272834.tif 000040
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006272834.tif 000044
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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