(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Ｈｉｂ）株を培地で培養し、その培養上清を収穫し、該上清を処理して莢膜多糖類を抽出することを含む、ワクチンに用いることを意図としたヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の莢膜多糖類（ＰＲＰ）を工業的規模で生産する方法であって、該培地が少なくとも：
−  一つ以上の炭素供給源、
−  プロトポルフィリン、
−  塩類、
−  アミノ酸類、
−  ＮＡＤまたはＮＡＤＨ、
−  ビタミン類、および
−  ｐＨ調節剤
を含んでおり、該培地が化学的に特定されており、少なくとも亜鉛を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
該ｐＨ調節剤が緩衝塩からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該炭素供給源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グリセロール、キシロース、リボース、フコース、シアル酸およびラクテートからなる群より選択される一つ以上の炭素供給源であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該プロトポルフィリンが合成プロトポルフィリンＩＸであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該塩類がカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、コバルト塩およびマンガン塩より選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該塩類が、Ｋ２ＨＰＯ４；ＫＨ２ＰＯ４；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；およびＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏより選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該アミノ酸類が、
・アルギニン、
・アラニン、
・アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸のうちの少なくとも１つのアミノ酸、
・リシン、
・ヒスチジン、
・トリプトファン、
・バリン、
・イソロイシン、
・ロイシン、
・チロシン、
・フェニルアラニン、および
・シスチンまたはその機能的等価物
より選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該培地が少なくともアルギニン、アラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シスチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シスチンがグルタチオンまたはシステインと置き換えられることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
該ビタミン類がチアミン、パントテン酸塩、ビオチン、リボフラビンおよびピリドキシンより選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される１つの窒素含有塩基を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アルギニンおよびウラシルがシトルリンと置き換えられることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って莢膜多糖類を製造する工程を含む、ワクチン組成物の調製方法。
【請求項１４】
さらに、得られた莢膜多糖類をキャリアタンパク質にコンジュゲートする工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キャリアタンパク質が破傷風トキソイドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリア、破傷風、ポリオ、Ｂ型肝炎、水疱瘡、おたふく風邪、風疹、髄膜炎菌または肺炎連鎖球菌により引き起こされる感染症、およびロタウイルスにより引き起こされる感染症からなる群から選択される１以上の感染症に対するワクチン接種を意図とする少なくとも１以上の抗原と合わせ、複数の疾患に対する同時免疫作用を可能とする混合ワクチンを取得する工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリア、破傷風およびＢ型肝炎の抗原と組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および２種の無細胞性百日咳菌抗原（トキソイドおよび繊維状赤血球凝集素）と組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および３種の無細胞性百日咳菌抗原（トキソイド、パータクチンおよび繊維状赤血球凝集素）と組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２０】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および５種の無細胞性百日咳菌抗原（トキソイド、パータクチン、凝集原類および繊維状赤血球凝集素）と組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２１】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、２種、３種または５種の無細胞性百日咳菌抗原、ならびに不活化１、２および３型ポリオウイルスと組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
次に、得られたコンジュゲートを、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｂ型肝炎抗原、２種、３種または５種の無細胞性百日咳菌抗原、ならびに不活化１、２および３型ポリオウイルスと組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
次に、得られたコンジュゲートを、全百日咳菌と組み合わせる工程を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Ｈｉｂ）の莢膜多糖類を工業的規模で生成する方法に関し、該発明によれば、その組成が化学的に特定されており、したがって複雑な窒素または炭素の供給源を全く含まない特有の培地にてＨｉｂ株が培養される。
【背景技術】
【０００２】
先行文献、特にＷＯ２００９／００７６４１は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型用の改善された培地を記載しており、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌を培養する目的が後に抗原としてワクチンの組成中に配合される莢膜多糖類を生成することである場合に推奨されるように、該培地は動物源からの成分を全く含まない。当該先行文献に記載の培地では、一般に動物性ペプトンからなる窒素供給源は、植物性ペプトンと置き換えられている。
【０００３】
かかる培地は特にウシ海綿状脳症（bovine spongiform encephalitis）などの疾患が伝染する危険性を排除することに関する医薬生成物の安全性の観点から大きな進展をもたらすものであり；したがって該培地は保険局の推奨要件に適合することを可能とする。
【０００４】
しかしながら、ペプトンの組成は提供されるバッチに応じて変化することがあり、そのことは細菌の生成量に、また目的とする抗原の収量にも変化をもたらすこともあり、そのワクチンの製造者は該方法を履行する間に特定のパラメータを修飾することで制限または訂正しようとする。しかしながら、医薬生成物を工業的に生産する上で、各履行において修飾はできる限り少なくするように求められ、その結果、各工程で、バッチ毎に再現可能な安定した方法を利用しうることが望ましい。
【０００５】
かかる方法はまた、工業的収益と両立できる収率を可能とする必要があり、抗原を細菌から生成する場合には、その基準は可能性のある最大量の細菌を取得するだけでなく、生成される細菌の抗原価と量との間で最高の比率を得ることである；従って、細菌はその代謝作用を莢膜多糖類の生成に向ける条件下で培養されることが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
このために、本発明は、ワクチンに用いることを意図とするヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の莢膜多糖類（ＰＲＰ）を工業的規模で生産する方法であって、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Ｈｉｂ）株を培地で培養し、その培養上清を収穫し、該上清を処理してそこから該莢膜多糖類を抽出することからなり、該培地が少なくとも：
−  一の炭素供給源、
−  プロトポルフィリン、
−  塩類、
−  アミノ酸類、
−  ＮＡＤまたはＮＡＤＨ、
−  ビタミン類、
−  ｐＨ調節剤
を含んでおり、該培地が化学的に特定されていることを特徴とする、方法を対象とする。
【０００７】
本発明によれば、安定した工業的方法であって、それでバイオマスを増やすことなく、莢膜多糖類の生成を増大させることが可能であり、それによりＰＲＰの生成量に関連して生成されるリポ多糖類（ＬＰＳ）の量を減らすことが可能となる。
【０００８】
さらには、培地の組成にてタンパク質が不含であることは、必要とされる消泡剤のニーズを減らし、精製工程を簡素化し、培養上清から莢膜多糖類からなる抗原を取得することを可能とする。
【０００９】
本発明によれば、培地はｐＨ調節手段を含む。これらのｐＨ調節手段は緩衝塩類および／またはｐＨ測定手段（酸または塩基のいずれかを培地に添加する手段と合わせた手段）からなり得る。収量はｐＨの調節を介して最適化され得る。
【００１０】
一の実施態様によれば、本発明の方法はまた、生成されたＰＲＰをキャリアタンパク質（例えば、破傷風タンパク質）にコンジュゲートすることからなる。
【００１１】
本発明の対象はまた、ワクチン組成物の調製方法であって、
−  ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Ｈｉｂ）株を化学的に特定される培地で培養することで、莢膜多糖類（ＰＲＰ）からなるＨｉｂに対する抗原を工業的規模で調製し、ここにその培地中の個々の成分の特性および配合量は完全に特定され、少なくとも：
−  一の炭素供給源、
−  プロトポルフィリン、
−  塩類、
−  アミノ酸類、
−  ＮＡＤまたはＮＡＤＨ、
−  ビタミン類、およびまた
−  ｐＨ調節手段
を含み、
−  培養上清を収穫し、該上清を処理してそこから精製された莢膜多糖類を抽出し、
−  該莢膜多糖類をキャリアタンパク質にコンジュゲートする
ことを含む、方法である。
【００１２】
一の実施態様によれば、得られるコンジュゲートはまた、数種の疾患に対して同時に免疫接種することを可能とするのに、１または複数の以下の感染症：ジフテリア、破傷風、ポリオ、Ｂ型肝炎、水疱瘡、おたふく風邪、風疹、髄膜炎菌または肺炎連鎖球菌により引き起こされる感染症、ロタウイルスにより引き起こされる感染症に対するワクチン接種を意図とする少なくとも１または複数の抗原とも組み合わされる。
【００１３】
本発明によれば、培地は化学的に特定され、すなわち各成分の化学構造もその配合量も既知である。かかる培地は、レプトン、カゼイン、血清等などの複雑な窒素または炭素源が不含であり、従って、所望により、動物より由来するいずれの成分も含まれないことを保証することができる。
【００１４】
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の莢膜多糖類を工業的規模で製造する方法に関する。かかる方法は、工業的な制限事項と両立できる、バイオマスおよび莢膜多糖類またはＰＲＰの収率を得ることを可能とする。かかる方法は、培地を特に調節することなく（ｐＨまたはｐＯ２などを特に調節することなく）、その遺伝コードに、莢膜合成を可能とする機能をコードする少なくとも２つのｃａｐ遺伝子座のコピーを有するヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌株から、１２時間培養した後に６９４ｎｍで少なくとも２．４のＯ．Ｄ．に相当する量のバイオマス、および１リットルの培地当たり少なくとも２４０ｍｇの量のアソシエートしたＰＲＰを取得することを特に可能とする。生成されるＰＲＰの量の決定は、パルス電流検出での高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）技法（Dionex）により、または同等の結果をもたらす一の方法により測定される。有利には、本発明の方法は、１リットルの培地当たり少なくとも２７０ｍｇの量のＰＲＰを取得することを可能とし、そのうえさらに有利には、少なくとも３００ｍｇ／Ｌの量で取得することを可能とする。
【００１５】
利用可能な炭素源として、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌株により代謝され得るすべての供給源、特に：グルコース、フルクトース、ガラクトース、グリセロール、キシロース、リボース、フコース、シアル酸およびラクテートに言及しうる。２またはそれ以上の異なる供給源、特にラクトースおよびグルコースを用いることも可能である。
【００１６】
本発明によれば、出発培地に配合されるグルコースの量は５〜２５ｇ／Ｌであり、より詳しくは１０〜２０ｇ／Ｌであり、さらにより詳しくは１２〜１６ｇ／Ｌである。
【００１７】
出発培地に配合されるラクトースの量は０〜１５ｇ／Ｌであり、より詳しくは０．５〜１０ｇ／Ｌである。
【００１８】
本発明の実施態様によれば、培地のプロトポルフィリンは合成プロトポルフィリン、例えばSigma-Aldrich社により、整理番号２５８３８５で提供されるもの（プロトポルフィリン・二ナトリウム塩）である。かくして、動物起源の物質を全く含まないように保証され得る培地を用いることが可能である。
【００１９】
あるいはまた、次式：
【化１】
0006347778.tif 000002
［式中、ＲはＨまたは対イオンであり、好ましくはアルカリ金属、特にナトリウムの対イオンを表す］
で示される合成プロトポルフィリンＩＸを用いる。
【００２０】
かかるプロトポルフィリンＩＸおよびその調製方法は、特許出願ＦＲ２９１４３０２に記載される。
【００２１】
本発明によれば、出発培地に配合されるプロトポルフィリンの量は、有利には、０．１〜１０ｍｇ／Ｌ、より詳しくは０．２５〜２ｍｇ／Ｌである。
【００２２】
本発明の培地は、細菌に好都合の浸透圧となるようにし、またそのｐＨで緩衝能を発揮することを可能とする、細胞増殖に不可欠なミネラルを提供する塩を含む。
【００２３】
好ましくは、使用は、セイライン溶液の形態の、Ｎａ＋および／またはＫ＋などの一価のカチオン、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｆｅ＋＋などの二価のカチオン、ＨＰＯ４−−、Ｈ２ＰＯ４−および／またはＰＯ４−−−のホスフェートアニオン、およびＳＯ４−−およびＣｌ−アニオンの混合物からなり、その各々のモル濃度は、通常、１０−４ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度範囲内で変化しうる。
【００２４】
培地中に存在する塩類は、特に、Ｋ２ＨＰＯ４；ＫＨ２ＰＯ４；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ；ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏより選択される。
【００２５】
塩濃度は、浸透圧が２００〜７００ミリオスモル／Ｌ、特に３００〜４００ミリオスモル／Ｌ、とりわけ３５０ミリオスモル／Ｌであり、ｐＨが６．５〜７．５の範囲にあるように選択される。
【００２６】
このために、本発明の培地は、特に：
−  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１５０〜１５００ｍｇ／Ｌの濃度）、
−  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（６．５〜５２ｍｇ／Ｌの濃度）、
−  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１．２５〜１０ｍｇ／Ｌの濃度）、
−  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．５〜８０ｍｇ／Ｌの濃度）、
−  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．５〜２ｍｇ／Ｌ）、
−  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（２．５〜１０ｍｇ／Ｌ）、
−  ナトリウム（０〜４ｍＬ／Ｌの量の６０％での、特に、乳酸ナトリウムの形態）、
−  Ｋ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４（バッファー作用がＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ／ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏにより提供される場合、その各々は、１００〜１２００ｍｇ／Ｌの濃度）、
−  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（１５〜１２０ｇ／Ｌの濃度）、
−  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏより１０〜３０倍低い濃度）
を含み得る。
【００２７】
別法として、バッファー作用が対となるＫ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４によって付与されることも可能であり；この場合、Ｋ２ＨＰＯ４濃度は１５〜１２０ｇ／Ｌであり、ＫＨ２ＰＯ４濃度はＫ２ＨＰＯ４の濃度よりも１０〜３０倍低く；Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２ＯおよびＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏの濃度は、その場合、１００〜１２００ｍｇ／Ｌとすることができる。
【００２８】
言及される塩のうちで、亜鉛の存在が、特に２．５〜８０ｍｇ／Ｌ、より詳しくは５〜２０ｍｇ／Ｌの範囲の濃度で、バイオマスの生成およびＰＲＰの生成に特に有利であることに注目することが可能である。２０ｍｇ／Ｌの濃度で極めて良好な結果が得られた。
【００２９】
培地のｐＨが、培養期の間に、特にＮａＯＨまたはＫＯＨなどの高濃度の塩基を添加することで調節される場合に、培地中に存在する塩類の量、およびバッファーの対となるＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４またはＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４の量を減らすことが可能である；ただし、浸透圧は、ＮａＣｌを任意に添加することで、適切な値、すなわち２００と７００ミリオスモル／Ｌの間に維持されることを条件とする。
【００３０】
本発明によれば、培地はまた、ＮＡＤまたはＮＡＤ源を含むか、あるいは他の等価な補酵素を含む。ＮＡＤ（またはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）（コエンザイムＩまたはファクターＶとも称される）はヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の培養に不可欠な成長因子である。それは、有利には、培地中に、０．５〜５０ｍｇ／Ｌの濃度で、より詳しくは２〜１０ｍｇ／Ｌの、特に５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。ＮＡＤの代わりとして、本発明の培地は、細菌が使用しうるであろうＮＡＤ先駆体成分（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）またはＮＭＮ（β−ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド）またはＮＲ（ニコチンアミドリボシド）、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）または３−アセチルピリジンモノヌクレオチド（ＡＰＭＮ））を含みうる。
【００３１】
本発明によれば、培地は、有利には、アルギニン、アラニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、シスチン（または等価物）、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸より選択されるアミノ酸を含有する。
【００３２】
本発明の培地の一の処方は、アルギニン、アラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シスチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸だけを含む。あるいはまた、言及されるすべてのアミノ酸が培地に存在する。
【００３３】
本発明の一の特有の態様によれば、シスチンはグルタチオンまたはシステインと置き換えられる。
【００３４】
一の好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、以下のアミノ酸：Ｌ−メチオニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリンおよびＬ−トレオニンを含まない培地を使用する。これは、これらのアミノ酸の存在がバイオマスの増加をもたらすが、対応するＰＲＰ生成の増加をもたらさないからである。
【００３５】
アミノ酸はシグマ（Sigma）社より供給される極めて純粋な粉末の形態で供給される。特に有利には、これらのアミノ酸は、伝播性感染症による汚染の危険を排除するために、特にＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）による汚染のリスクを排除するために、合成起源とするか、または動物より由来する成分を全く含まないことを保証する方法により取得される。
【００３６】
細胞増殖およびＰＲＰ生成を最適化するのに、アミノ酸の各量を選択する。アスパラギン酸、アスパラギンおよびグルタミンの量は、細胞培養の間に欠乏を惹起し、それにより細胞の代謝作用を莢膜多糖類の生成に向かうことを可能とするように選択され、その一方で他のアミノ酸の量は培養期の間に欠乏しないように選択される。
【００３７】
本発明によれば、培地はまた、チアミン、パントテン酸塩、ウラシル、ヒポキサンチン、ビオチン、リボフラビンおよびピリドキシンより選択されるビタミンを含有する。本発明の目的を達成するために、「ビタミン」なる語はまた、窒素塩基である、ウラシルおよびヒポキサンチンを包含する。
【００３８】
本発明の培地に存在するビタミンは、動物以外を起源とし、特に合成起源とすることが特に有利であり、それにより伝播性感染症による汚染のどのようなリスクも、特にＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）による汚染のリスクも排除することが可能である。特に、その純度が正確に分かっているシグマ社により供給されるビタミンを用い、それにより培地を調製する際の正確な量を供与することができる。
【００３９】
培地中に存在するビタミンの量は、バイオマスの生成およびＰＲＰの生成を最適化するように選択される。
【００４０】
本発明の一の特有の態様によれば、培地はアルギニンおよびウラシルの代わりに用いることができるシトルリンを含む。
【００４１】
この場合、培地中のシトルリンの配合量は、１５０〜５００ｍｇ／Ｌであることが有利である。
【００４２】
本発明の培地によれば、従来の培地を用いる時よりも、より多くの量のポリリボシルリビトールホスフェートを生成することが可能であり、その一方で炭水化物をより多く消費することなく同じ量で消費し、より多くの汚染物、特にＬＰＳを生成することもない。
【００４３】
本発明の一の実施態様によれば、培養されるヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌株は、その遺伝コードにて少なくとも２つのｃａｐ遺伝子座のコピーを有する莢膜株である。大きさが１７と１８ｋｂの間にあるこのｃａｐ遺伝子座は、その発現が莢膜の合成および転送と関連付けられる遺伝子と群を形成する。
【００４４】
莢膜の発現は、細菌を特有の寒天上で培養した場合に、それを白色にし；そのため、このｃａｐ遺伝子座を有する細菌のコロニーは「白コロニー」と呼ばれるのに対して、莢膜多糖類を莢膜の表面に転送しない細菌は「灰コロニー」と称される。莢膜の発現は、莢膜欠損変異体の出現をもたらし得る、潜在的な遺伝的不安定性にさらされ、結果として、ＰＲＰ生成の減少に至る。研究により、本発明の方法に使用される化学的に特定される培地が、約２０回の細胞の生成の間に用いられる菌株の良好な遺伝的安定性を確保しうることを証明することが可能となった。
【００４５】
本発明によれば、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の培養を、バイオマスを徐々に増加させるように、数回の連続的工程で行うことが可能である。
【００４６】
この場合、凍結乾燥した試料より、または凍結した試料より由来の細菌を、通常は１リットルを越えない容量の培地に植菌する。一夜培養した後に、または培地の光学密度が十分である場合に、この第一培地を該第一培地と同じであるが、その容量が１０〜２０倍まで大きくてもよい第二培地に移す。第二培地に植菌される細菌の量は、６９４ｎｍでの第二培地の最初の光学密度（Ｏ．Ｄ．）が、細菌集団の迅速な増殖を促進するように、０．２と０．４の間となるように調整される。この第二の培養は、通常、発酵器中でなされるが、他の型の容器（フラスコ、スピナー等）を用いることもできる。培養を発酵器中で行う場合、３７℃±１℃の温度、一定の攪拌速度、０．１バールの圧力、３０％のｐＯ２、毎分培地の１容量当たり０．２５倍容量の空気の流速が、通常、培養の間に使用される。この型の培養を行う際に他のパラメータを選択することは当業者の能力の範囲内である。指数関数的な細菌の増殖期の最後に、さらに大きな容量の発酵器に移し、同じ操作等を用いることでバイオマスをさらに増幅することができる。得られる培養の容量は１０００リットルに達し、あるいはそれをも越え得る。培養は一般に「バッチ」方式で行われる。
【００４７】
最後に、細菌の不活化後に、最終培養の上清を採取する。不活化は、通常は、最終濃度が０．３５％−０．３７％（Ｖ／Ｖ）のホルモール溶液を用いて実施される。上清は、通常は、遠心分離工程により細菌と分離される。得られた上清に含有されるＰＲＰを次に当業者に周知の一般的方法に従って抽出して精製する。
【００４８】
次に、収穫し、精製したＰＲＰを、有利には、それをＴ−依存性とし、特に小さな子供を免疫化できるようにするために、破傷風タンパク質などのキャリアタンパク質にコンジュゲートする。こうして得られるＰＲＰ−Ｔ抗原は次に単独で一価ワクチンに用いるか、あるいは数種の疾患に対する同時ワクチン接種を可能とするために他の抗原と合わせることができる。
【００４９】
特に有利なこととして、本発明は、ワクチン組成物の調製方法であって、該方法に従って、得られたコンジュゲートを、小児用ワクチン中に一般に配合されている少なくとも１または複数の抗原と、特にジフテリア、破傷風、ポリオ、Ｂ型肝炎、髄膜炎菌または肺炎連鎖球菌により引き起こされる感染症、水疱瘡、おたふく風邪、風疹、ロタウイルスにより引き起こされる感染症等に対する抗原と合わせる方法を提供する。
【００５０】
一の実施態様によれば、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートは粉末形体で存在し、それに対して他の抗原は液体形態で存在し、抗原はすべて投与前にその場で混合される。一の別の実施態様によれば、ワクチン組成物は完全に液体である。
【００５１】
本発明の調製方法は、このように、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートに加えて、ジフテリア、破傷風およびＢ型肝炎の抗原を含む四価の混合ワクチンを調製することを可能とする。また、該方法は、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートに加えて、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および２種の無細胞性百日咳菌抗原（トキソイドおよび繊維状赤血球凝集素）または３種の無細胞性百日咳菌抗原（上記の２種＋パータクチン）あるいはまた５種の無細胞性百日咳菌抗原（上記の３種＋凝集原類）を含む四価の混合ワクチンを調製することも可能とする。
【００５２】
該方法はまた、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートに加えて、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、２種、３種または５種の無細胞性百日咳菌抗原と、さらに不活化１、２および３型ポリオウイルスを含む五価の混合ワクチンを調製することも可能とする。
【００５３】
該方法はまた、ＰＲＰ−Ｔコンジュゲートに加えて、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、２種、３種または５種の無細胞性百日咳菌抗原、Ｂ型肝炎抗原と、さらに不活化１、２および３型ポリオウイルスを含む六価の混合ワクチンを調製することも可能とする。かかる六価の混合ワクチンは、特に液体とすることができ、０．５ｍＬの用量に付き：
−  ジフテリアトキソイド（２０ＩＵの量）、
−  破傷風トキソイド（４０ＩＵの量）、
−  Ｂ型肝炎表面抗原（１０μｇの割合）、
−  百日咳トキソイド（２５μｇの割合）、
−  百日咳繊維状赤血球凝集素（２５μｇの割合）、
−  ＰＲＰ−Ｔ（ＰＲＰの１２μｇの割合）、
−  不活化１、２および３型ポリオウイルス（各々、４０、８および３２ＤＵの量）、
−  水酸化アルミニウム（０．６ｍｇのＡｌ３＋の割合）
を含み得る。
【００５４】
あるいはまた、該方法は百日咳抗原が全百日咳菌のみからなる混合ワクチンを調製することを可能とする。
【００５５】
本発明の培養方法によれば、ポリリボシルリビトールホスフェートの生成を、バイオマスの量を増やすことなく、増加させることが可能であり、それにより汚染するＬＰＳの量を減らすことができる；本発明の方法のこの利点は、これらの産物を抗原としてワクチン組成物に配合し、ＬＰＳの量を最小限にまで減らさなければならない、ワクチン業界にとって極めて重要なことである。ＰＲＰの量を増やすために生成されるＬＰＳの量を増やさないことを可能とする方法が利用できることは、その後の精製工程を簡素化する可能性を提案するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
原文に記載なし
【発明を実施するための形態】
【００５７】
実施例１：本発明の培地の調製
本発明の培地は、濃縮溶液（enrichment solution）をその場で塩基性培地に添加することで、該培地より調製された。
【００５８】
塩基性培地の組成を以下の表Ｉに示す：
【表１】
0006347778.tif 000003
【００５９】
１リットルの培地を調製するのに、種々の化合物を脱塩水（約１００ｍＬ）に磁気攪拌棒を用いて攪拌しながら上記した表に記載の順序で加えた。添加する前に、粉末はすべて、少量の脱塩水に予め溶かされており、ある場合には、酸または塩基を添加した。
【００６０】
このように、バリン、イソロイシンおよびロイシンでは、表に示される量に対して、１０Ｎ  ＫＯＨ（１４０μＬ）を添加する必要があり；チロシンに対しては、１０Ｎ  ＫＯＨ（２８０μＬ）を添加する必要があり；フェニルアラニンに対しては、３７％ＨＣｌ（２１０μＬ）を添加する必要があり；およびシスチンに対しては、３７％ＨＣｌ（７０μＬ）を添加する必要があった。
【００６１】
最後に、１０Ｎ  ＫＯＨを用いてｐＨを７．２に調整し（ｐＨが高すぎる場合には、３７％ＨＣｌを用いた）、次に脱塩水を用いて容量を所望の量にした。
【００６２】
ついで、該培地を０．２２μｍのカットオフ閾値を有するフィルター上で濾過することにより滅菌した。
【００６３】
こうして、該培地は５℃で７２時間貯蔵することが可能であった。
【００６４】
該培地を植菌する前に、次の成分：
−  製品番号２４３７９．２９４の下でＶＷＲ社より供給される無水Ｄ（＋）グルコースから調製される５１２．８ｇ／Ｌでのグルコース（２７．３ｍＬ）、
−  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（製品番号４３４１０）の名称の下で、シグマ社より供給される１ｇ／ＬでのＮＡＤ溶液（５ｍＬ）、
−  プロトポルフィリンを０．２５ｇ／Ｌの濃度で、水酸化アンモニウムを５ｍＬ／Ｌの濃度で含むストック溶液（４ｍＬ）（該プロトポルフィリンはプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩（製品番号２５８３８５）の名称の下でシグマ・アルドリッチ社より供給され、水酸化アンモニウムはアンモニア溶液２８％（製品番号２１１９０．２９２）の名称の下でＶＷＲ社より供給される）
を添加し、上記した表Ｉに記載の成分に加えて、次の添加成分を下記の表ＩＩ：
【表２】
0006347778.tif 000004
に示される濃度で含む、すぐに植菌することのできる１リットルの培地を得た。
【００６５】
実施例２：従来の培地の調製
従来の培地は特有の濃縮溶液を塩基性培地に添加することにより調製された。
【００６６】
塩基性培地の組成は、以下の表ＩＩＩ：
【表３】
0006347778.tif 000005
に示される。
【００６７】
この塩基性培地を調製するのに、各成分を、表に示される順序で、磁気攪拌棒を用いて攪拌し続けた脱塩水（１００ｍＬ）に加えた。粉末形で供給される各成分は少量の脱塩水に予め溶かされた。
【００６８】
エンドウペプトン（pea peptone）はケリー社（company Kerry）に由来し、製品番号（Hy-pea ７４０４）の下にある固体である。（ＮＨ４）２ＳＯ４は製品番号（２１３３３．２９６）の下でＶＷＲ社より供給される。他の成分は、本発明の培地を調製するための実施例１に記載の成分と同じ供給業者に由来し、同じ製品番号の下で供給される。
【００６９】
最終ｐＨは１０Ｎ  ＫＯＨを用いて７．２±０．１に調整した（ｐＨが高すぎる場合には、３７％ＨＣｌを用いた）。
【００７０】
次に脱塩水を加えて所望の容量とし、１２０℃で３０分間のサイクルでオートクレーブに付して滅菌処理に供した。
【００７１】
滅菌処理に供した後に、該培地は４℃で１５日間貯蔵することができた。
【００７２】
濃縮溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤをこの塩基性培地に添加した。
【００７３】
溶液Ａは、無水グルコース（無水Ｄ（＋）グルコース（製品番号２０２４３７９．２９４）の名称の下でＶＷＲ社より供給される）を５１２．８ｇ／Ｌの濃度で含む、溶液である。
【００７４】
溶液Ｂは、ＮＡＤ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（製品番号４３４１０）の名称の下でシグマ社より供給される）を１ｇ／Ｌの濃度で含む、ストック溶液である。
【００７５】
溶液Ｃは、プロトポルフィリンを０．２５ｇ／Ｌの濃度で、水酸化アンモニウムを５ｍＬ／Ｌの濃度で含むストック溶液（４ｍＬ）であり、該プロトポルフィリンはプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩（製品番号２５８３８５）の名称の下でシグマ・アルドリッチ社より供給され、水酸化アンモニウムはアンモニア溶液２８％（製品番号２１１９０．２９２）の名称の下でＶＷＲ社より供給される。
【００７６】
溶液Ｄは、自己溶菌性酵母エキス限外濾過液（Ｕｆｅｌ）を１２５ｇ／Ｌで含む濃縮液であり；それはUltrafiltratd'extrait autolytique de levure（Ｕｆｅｌ）［自己溶菌性酵母エキス限外濾過液］（製品番号スプリンガー０７０１）の名称の下でバイオスプリンガー（Biospringer）より供給される。
【００７７】
これらの溶液は、各々、カットオフ閾値が０．２２μｍであるフィルターで濾過することにより滅菌される。
【００７８】
次の溶液：
−  溶液Ａ（３５．１ｍＬ）
−  溶液Ｂ（５ｍＬ）
−  溶液Ｃ（４ｍＬ）
−  溶液Ｄ（４０ｍＬ）
を１リットルの塩基性培地に添加した。
【００７９】
各溶液の塩基性培地への添加はラミナーフローフードの下でなされ、植菌の前に、上記の表ＩＩＩに記載の成分に加えて、次の添加成分を、下記の表ＩＶ：
【表４】
0006347778.tif 000006
に示される濃度で有する培地を得た。
【００８０】
実施例３：実施例１に記載の本発明の培地と、実施例２に記載の従来技術での培地とのＰＲＰ生成の比較
これらの比較実験を２工程の培養プロトコル：
−  非バッフル性ガラス製エルレンマイヤーフラスコ（１リットル）中、３６℃、１３０ｒｐｍ（毎分回転数）で８時間にわたって攪拌しながら前培養（その終わりが、菌株の線形増殖期の終わりである）に供する工程（この前培養は、２８０ｍＬの培地を、少なくとも２つのｃａｐ遺伝子座のコピーを含有するヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の種菌を用いて０．５％（容量／容量）の濃度で植菌することで開始される）；
−  次に、９０ｍＬの前培養体を、植菌を可能とする、１．８リットルの培地を含有する２リットルのバイオスタットＢプラス発酵器に移す工程（この発酵器に空気を０．４５ｌｐｍ（毎分リットル）で混入し、４００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃に１２時間維持した）
に従って実施した。
【００８１】
１２時間培養した後、６９４ｎｍでのＯ．Ｄ．を測定し、その操作でバイオマスを決定することが可能となった。これは、前の試験の間に、６９４ｎｍで測定された光学密度の一単位が、０．６４ｇのバイオマス（乾燥質量）／リットルに相当することを決定することを可能としたためである。
【００８２】
培養上清中の全ＰＲＰの量を、Sturgessら（Vaccine 17 (1999) 1169-1178）による刊行物に記載の方法と極めて類似する方法に従って、パルスアンペロメトリック検出での高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）で測定した。培養上清を０．２２μｍのフィルターを通して該上清を濾過し、次に５００μＬの上清を１０ｋＤａのカットオフ閾値を有するアミコン（Amicon）ウルトラカラム（ミリポアの製品番号ＵＦＣ５０１０ＢＫ）の使用を通して限外濾過に付し、ついでＮａＯＨを添加することで塩基性加水分解工程に供した。
【００８３】
該加水分解を外界温度で最低４時間行った。
【００８４】
該アッセイの有効性を、加水分解溶液中に存在する、内部標体、すなわちグルコサミン−１−ホスフェート（ＧｌｃＮ１Ｐ）を用い、既知のＰＲＰ濃度の内部対照を定期的に通すことにより調整した。Sturgessらの指示によれば、移動相は３５ｍＭ  ＮａＯＨおよび１１４ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａからなり、再生期は１００ｍＭ  ＮａＯＨと４００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａとで１０分間実施された。
【００８５】
得られた結果を以下の表Ｖに示す：
【表５】
0006347778.tif 000007
【００８６】
これらの結果は、ＰＲＰ生成性に関する本発明の方法の利点を示す；実際、同じ容量の培地で、得られるバイオマスの質量は従来技術の培地の方が大きいが、他方でＰＲＰの量は小さい。
【００８７】
実施例４：本発明の方法に係る培養上清中に存在するＰＲＰとＬＰＳの量と、従来技術の方法に係る培養上清中に存在するＰＲＰとＬＰＳの量の比較
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の培養を、実施例３に記載される様式にて、本発明に係る培地と、従来技術の培地とを比較して行った：ただし、従来技術の方法の塩基性培地は、実施例３の培地中に存在するエンドウペプトンの代わりにソラビア社（the company Solabia）により供給される１０ｇ／Ｌのカゼインの酸加水分解物（製品番号Ａ１４３４）を含むという違いがあった。
【００８８】
前培養時間は、実施例３に記載されるように、８時間であり、培養時間は１２時間である。
【００８９】
ＰＲＰのアッセイおよびＬＰＳのアッセイは共にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで実施されるが；ＬＰＳのアッセイは、同じプロトコルを受ける標準レンジの精製されたＬＰＳを用い、特定の単糖、すなわちヘプトースを定量することで実施される（このアッセイの内部標体はラムノースである）。
【００９０】
得られた結果を以下の表ＶＩ：
【表６】
0006347778.tif 000008
【００９１】
得られる結果は本発明に係る方法の利点を示し、ＰＲＰの量に関連して生成されるＬＰＳの量を減らすことを可能とする。
【００９２】
これは本発明に係る方法の著しい利点を示す；というのも、これは精製操作を極めて簡素化する一方で、同じ時間で適切な安全レベルを維持するからである。
【００９３】
実施例５：亜鉛の重要性を評価する試験
培地中の亜鉛の存在の重要性を研究した。
【００９４】
これを行うために、３種の培地：
−  実施例１に記載されるような、ＭＳと称される培地、
−  実施例１の組成と同じ組成を有するが、ＺｎＳＯ４を含まない、ＭＳ  Ｚｎ−と称される培地、
−  実施例１に記載されるような培地であるが、ＺｎＳＯ４濃度が４倍高い、すなわち２０ｍｇ／Ｌであり、ＭＳ  Ｚｎ＋＋と称される培地
を比較した。
【００９５】
次に、該培地を０．２２μｍのカットオフ閾値を有するフィルターで濾過することにより滅菌処理に付した。
【００９６】
実施例４に記載される培地（２８０ｍＬ）に、遺伝コード中に少なくとも２個のｃａｐ遺伝子座のコピーを有するヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の凍結試料を植菌することにより、３６℃で１６時間、１３０ｒｐｍで攪拌する、非バッフル性ガラス製エルレンマイヤーフラスコ（１リットル）中での前培養の工程をまず第一に行った。
【００９７】
試験する培地（１７０ｍＬ）を含有するバッフル付きポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ（５００ｍＬ）中の培養物に各植菌を行う前に、９．５ｍＬの前培養体を試験する各培地で洗浄し；培養を３７℃で１２時間行い、攪拌を１５０ｒｐｍで行った。
【００９８】
各培地について、培養の終わりでのバイオマス、ＰＲＰ濃度、またＬＰＳの量を、実施例３および４に記載されるのと同じように、決定し、ＰＲＰ／バイオマスおよびまたＬＰＳ／バイオマスの割合を算定した。
【００９９】
得られた結果は以下の表ＶＩＩ：
【表７】
0006347778.tif 000009
【０１００】
これらの結果は、培地中の亜鉛の存在がバイオマスの生成を著しく増大させ、またＰＲＰの生成を、ＬＰＳの量に比例して増えることなく、増大させることを可能とすることを示した。
【０１０１】
実施例６：５リットルの発酵器中での試験
特許出願ＦＲ２９１４３０２に記載され、ソルビアスＡＧ（Solvias AG）によって製品名：プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩（製品番号ＳＯＬ２０４０２）の下で供給される、実施例１に記載の本発明に係る培地にて、動物より由来のプロトポルフィンが不含で、合成プロトポルフィリンを用いることが供給者により保証される製品だけを用いてヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の培養を実施した。次に該試験を実施例３に記載されるように実施する（ただし、使用される発酵器は、３７℃で調整され、５５０ｒｐｍで攪拌され、空気を０．５ｌｐｍで混入する、５リットルの発酵器である）。植菌の体積は２８０ｍＬであり、すなわちすべてが前培養エルレンマイヤーフラスコに収まった。
【０１０２】
ＰＲＰおよびＬＰＳ濃度を実施例３および４に記載のプロトコルに従って決定した。
【０１０３】
得られた結果を以下の表ＶＩＩＩ：
【表８】
0006347778.tif 000010
に示す。
【０１０４】
これらの結果は上記の結果を確認するものであり、多量のＰＲＰを取得するための本発明の方法の利点を明らかにする。
【０１０５】
実施例７：実施例１に記載される本発明の培地を用いた、および従来技術にて説明される化学的に特定される培地を用いたバイオマスの、およびＰＲＰの生成の比較
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の培養を、実施例１に記載の本発明の培地にて、またヘモフィルス・インフルエンザの培養と関連する刊行物に記載されており、化学的に特定して示される８種の培地にて行った。
【０１０６】
これらの８種の培地をその著作者らが推奨する方法に従って調製した。それらは、時系列で、以下：
−  TalmadgeおよびHerriott：Biochemical and Biophysical Research Communications, (March 1960), Vol.2 No3, p 203-206、
−  Butler：J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60、
−  Wolin：J. Bacteriol. Vol.85, (1963) Notes, p 253-254、
−  Herriottら：Journal of Bacteriology, (Feb. 1970), Vol. 101, No2, 513-516、
−  KleinおよびLuginbuhl：Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411、
−  Colemanら：Journal of Clinical Microbiology, (Sept 2003), Vol.41, No9 p. 4408-4410
に示される培地である。
【０１０７】
これらの８種の培地を調製するのに用いられる生成物との関連事項を次の表ＩＸに示す。
【表９】
0006347778.tif 000011
0006347778.tif 000012
【０１０８】
ついで、該培地を０．２２μｍのカットオフ閾値を有するフィルターで濾過して滅菌処理に付す。
【０１０９】
非バッフル性ガラス製エルレンマイヤーフラスコ（１リットル）中での前培養の工程を、まず第一に、その遺伝コードにて、少なくとも２つのｃａｐ遺伝子座のコピーを有するヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の凍結試料を植菌することにより、３６℃、１３０ｒｐｍで攪拌しながら１６時間行った。
【０１１０】
次に、試験する培地（１７０ｍＬ）を含有するバッフル付きポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ（５００ｍＬ）中の培養物に各植菌を行う前に、前培養物（９．５ｍＬ）を試験する各培地で洗浄し；培養を３７℃で１２時間行い、１５０ｒｐｍで攪拌した。
【０１１１】
各試験を少なくとも３回行った。
【０１１２】
各培地について、実施例３に記載されるのと同じように、時間毎に６９４ｎｍでのＯ．Ｄ．を測定し、ＰＲＰ濃度を培養の最後に決定した。
【０１１３】
Ｏ．Ｄ．結果を図１に示す。
【０１１４】
ＰＲＰ測定の結果を以下の表Ｘ：
【表１０】
0006347778.tif 000013
に示す。
【０１１５】
実施例８：工業的規模でのＰＲＰの生産（１０００リットル）
亜鉛について、その濃度が５ｍｇ／Ｌでなく、２０ｍｇ／Ｌである、実施例１の組成を有する本発明の培地を調製した。これは、実施例５がこの濃度でＬＰＳの量を増やすことなくＰＲＰをより多く生成することが可能であることを示した、からである。
【０１１６】
培地は、ｐＨ（最初のｐＨが７．２±０．１であり、前培養ではｐＨがフリーであり、生成培養ではｐＨが６．７±０．１に調整されている）を除いて、前培養および最終培養で同じものであった。
【０１１７】
培地を実施例１と同様にして調製した。少量の精製水に予め溶かした化合物を、ある場合には、酸または塩基を添加して混合した後（実施例１を参照）で、十分な量の精製水を添加する前に、ｐＨを前培養では７．２±０．１に、最終培養では６．７±０．１に（１０Ｎ水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムあるいは３７％ＨＣｌを用いて）調整した。
【０１１８】
次に、該培地を０．２２μｍのカットオフ閾値を有するフィルターでの濾過操作により滅菌した。
【０１１９】
こうして、該培地を５℃で７２時間貯蔵することが可能であった。
【０１２０】
該培地を植菌する前に、以下の成分：
−  製品番号２４３７９．２９４の下でＶＷＲ社より供給される無水Ｄ（＋）グルコースから調製される５１２．８ｇ／Ｌでのグルコース、
−  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（製品番号４３４１０）の名称の下で、シグマ社より供給される１ｇ／ＬでのＮＡＤ溶液、
−  プロトポルフィリンを０．２５ｇ／Ｌの濃度で、水酸化アンモニウムを５ｍＬ／Ｌの濃度で含むストック溶液（該プロトポルフィリンはプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩（製品番号ＳＯＬ２０４０２）の名称の下でソルビアスＡＧ社より供給され、水酸化アンモニウムはアンモニア溶液２８％（製品番号２１１９０．２９２）の名称の下でＶＷＲ社より供給される）
を添加し、上記した実施例１の表Ｉに記載の成分に加えて、添加成分を実施例１の表ＩＩに示される濃度（グルコースの最終濃度が１４ｇ／Ｌではなく、１４．８７ｇ／Ｌであることを除く）で含む、すぐに植菌することのできる培地を得た。
【０１２１】
１０００リットルの規模の方法は、一連の３つの前培養：
−  一連の第一の前培養は、完全培地（２９０ｍＬ）を含有する非バッフル性エルレンマイヤーフラスコ（１リットル）中、３７℃、１３０ｒｐｍ（毎分回転数）で１７−１８時間にわたって攪拌しながら行われた。これらの前培養を、該培地を、少なくとも２つのｃａｐ遺伝子座のコピーを含有するヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の種菌で、０．０１４の初期標的ＯＤ６９４ｎｍに相当する植菌レベルに植菌することで開始した；
−  一連の第二の前培養は、６．８リットルの発酵器中でなされた。５．２リットルの完全培地を含有する２つの発酵器の各々を、一連の第一の前培養（２６０ｍＬ）で植菌した。これらの発酵器を３７℃で４時間維持し、初期ｐＨを７．２±０．２で、ｐＯ２を攪拌を大きくすること（５００から８００ｒｐｍに増やすこと）を含むカスケードで３０％に維持し、ついでエアレーションを（０．５から２．５ｌｐｍ）に増やし、次に純粋なＯ２の流速を０〜６ｌｐｍとした；
−  一連の第三の前培養は、５７リットルの完全培地を含有する１２０リットルの発酵器でなされ、それを第二の発酵器から由来の前培養（５．８リットル）で植菌した。この発酵器を３７℃±１℃で３時間維持し、初期ｐＨを７．２±０．２で、ｐＯ２を攪拌を大きくすること（３００から４２５ｒｐｍに増やすこと）を含むカスケードで３０％に維持し、ついでエアレーションを（６から２８ｌｐｍに）増やし、次に純粋なＯ２の流速を０〜５０ｌｐｍとした；
を含む。
【０１２２】
工業的培養を７７８リットルの完全培地を含有する１０００リットルの発酵器で行い、それを第三の発酵器の前培養（３９リットル）で植菌した。この発酵器を３２℃±１℃に維持し、ｐＨを６．７±０．２に（２．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液）で制御し、ｐＯ２を攪拌を大きくすること（１００から２３０ｒｐｍに増やすこと）を含むカスケードで７０％に維持し、ついでエアレーションを（７０から１５０ｌｐｍに）増やし、次に純粋なＯ２の流速を０〜５００ｌｐｍとした。さらには、消泡剤（Biospumex、４％）を、泡沫体のレベルに応じて、オンデマンドで添加した。
【０１２３】
１２時間培養した後、６９４ｎｍでのＯ．Ｄ．を測定し、それでバイオマスの決定が可能となった（その対応によれば、一のＯＤ単位が０．６４ｇの乾燥バイオマスに相当する）。ＰＲＰおよびＬＰＳの濃度を実施例３および４に記載のプロトコルに従って決定した。
【０１２４】
得られた結果を以下の表ＸＩに示す：
【表１１】
0006347778.tif 000014
【０１２５】
これらの結果は本発明の方法がＰＲＰ生産性およびＰＲＰ／ＬＰＳの割合に対して利点を有することを示し、該結果は工業的規模での結果であることを明らかにした。
【図１】
0006347778.tif 000015