(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチノプラネス属に属する、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）を含有する培地に、コンパクチン又はその塩を添加して培養することを特徴とするプラバスタチン又はその塩の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用したプラバスタチンの新たな製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラバスタチンナトリウムは、コレステロール生合成酵素の一つであるＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害作用を有し、高コレステロール血症治療薬として世界中で広く使用されている。プラバスタチンは、種々の微生物によりコンパクチンからプラバスタチンへ変換されて製造され、当該微生物としてはストレプトマイセス属、アスペルギルス属、モナスカス属、ペニシリウム属、アクチノマデュラ属が知られている（特許文献１〜５）。また、マイクロモノスポラ属に属する菌により、コンパクチンからプラバスタチンが得られることも報告されている（特許文献６、７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５８−１０５７２号公報
【特許文献２】米国特許第４３４６２２７号明細書
【特許文献３】米国特許第４４４８９７９号明細書
【特許文献４】米国特許第４５３７８５９号明細書
【特許文献５】米国特許第５１７９０１３号明細書
【特許文献６】特表２００３−５０４０７１号公報
【特許文献７】特表２００３−５２８５７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の微生物によるコンパクチンからプラバスタチンへの変換効率は十分でなく、さらに新たな微生物によるプラバスタチンの製造法が望まれている。
従って、本発明の課題は、新たな微生物を利用したプラバスタチンの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、プラバスタチン生産能を有する微生物を求めて種々検討したところ、全く意外にも、アクチノプラネス属に属する微生物の中にコンパクチンをプラバスタチンに変換する能力が優れた微生物が複数存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕の発明を提供するものである。
〔１〕アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する微生物を含有する培地に、コンパクチン又はその塩を添加して培養することを特徴とするプラバスタチン又はその塩の製造法。
〔２〕アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する微生物が、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）又はこの菌株と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の同一性が９３％以上のアクチノプラネス属細菌である〔１〕記載のプラバスタチン又はその塩の製造法。
〔３〕アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する微生物が、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）、アクチノプラネス  コイキイ、アクチノプラネス  ロバタス、アクチノプラネス  イタリカス、アクチノプラネス  レギュラリス、アクチノプラネス  フィリピネンシス、アクチノプラネス  ブラジリエンシス及びアクチノプラネス  テイコマイセチカスから選ばれる微生物である〔１〕又は〔２〕記載のプラバスタチン又はその塩の製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明方法によれば、コンパクチンから良好な収率で高コレステロール血症治療薬として有用なプラバスタチン又はその塩を製造できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のプラバスタチン又はその塩の製造法は、アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する微生物を含有する培地に、コンパクチン又はその塩を添加して培養することを特徴とする。
【０００９】
アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有する微生物としては、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）、及びこの菌株と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の同一性が９３％以上のアクチノプラネス属細菌が挙げられ、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）、及びこの菌株と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の同一性が９５％以上のアクチノプラネス属細菌が好ましく、ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）、及びこの菌株と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の同一性が９８％以上のアクチノプラネス属細菌がより好ましい。
【００１０】
前記菌株と１６ＳｒＲＮＡの塩基配列の同一性が９３％以上のアクチノプラネス属細菌としては、アクチノプラネス  コイキイ（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｃｏｉｃｈｉｉ）、アクチノプラネス  ロバタス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｌｏｂａｔｕｓ）、アクチノプラネス  イタリカス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）、アクチノプラネス  レギュラリス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）、アクチノプラネス  フィリピネンシス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）、アクチノプラネス  ブラジリエンシス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アクチノプラネス  テイコマイセチカス（Ａｃｔｉｏｎｐｌａｎｅｓ  ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）等が挙げられる。
【００１１】
ＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）の菌学的性質は、次のとおりである。
（１）比較的大きく、シワ状の硬いコロニーを形成する。色はオレンジ〜やや茶色である。胞子は形成しない。
（２）ＩＳＰ−２寒天培地で良好に生育する。ＩＳＰ−１、ＩＳＰ−３、ＩＳＰ−４、ＩＳＰ−５、ＩＳＰ−６、Ｖ８ジュース寒天培地及びＢｅｎｎｅｔｔ’ｓ−マルトース培地で中程度に増殖する。ＩＳＰ−７、ＩＳＰ−９、ＨＶ及びＹＳ−Ｂ寒天培地で僅かに増殖する。
（３）生育炭素源として、グルコースよりもマルトースの方をよく好み、増殖する傾向がある。
【００１２】
本発明の製造法には、アクチノプラネス属に属し、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有し、上記（１）〜（３）の菌学的性質を有する菌を好ましく用いることができる。
【００１３】
本発明に使用する株は、前記の株はもとより、その人工変異株あるいは自然変異株も、コンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を有するものであれば使用可能である。人工変異株は、例えば紫外線照射、コバルト６０照射、または化学変異誘発剤等により容易に得ることが出来る。
【００１４】
本発明方法に用いられる培地としては、アクチノプラネス属の菌が生育する培地であればよく、例えばグルコース、マルトース、キシロース、アラビノース、フルクトース、コーンスターチやパインデックスなどのでんぷん類等の炭素源、酵母エキス、乾燥酵母、牛肉エキス、魚エキス、麦芽エキス、大豆粉、ＮＺ  Ａｍｉｎｅ等の窒素源、ビオチン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ピリドキシン、パントテン酸、ｐ−アミノ安息香酸等のビタミン類、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マグネシウム、鉄（II）、鉄（III）、カルシウム、銅、リン等のミネラル類、ＦｅＳＯ4、ＭｇＳＯ4、ＣａＣＯ3、ＭｎＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＭｇＳＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮＨ4ＮＯ3、ＦｅＳＯ4等の塩類を含有する培地が好ましい。培地への前記アクチノプラネス属微生物の植菌量は、最初は一白金耳のような少量でよい。培養して微生物が増殖した時点でコンパクチン又はその塩を添加するのが好ましい。
【００１５】
培地にはコンパクチン又はその塩が添加される。ここで添加とは、培地にコンパクチン又はその塩を添加してもよいし、コンパクチン若しくはその塩又はそれらを含有する溶液等に培地成分を添加してもよい。コンパクチンの塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が挙げられる。培地中のコンパクチン又はその塩の濃度は、プラバスタチン又はその塩の生産性の点から、０．１ｍｇ／ｍＬ以上２．０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましい。
【００１６】
培養は、アクチノプラネス属微生物が生育する条件であればよく、例えば液体培地を用い、振とう培養、撹拌培養が好ましい。培養条件は、１５〜３５℃が好ましく、２６〜３０℃がより好ましく、ｐＨは７．５〜８．０が好ましく、７．５がより好ましい。コンパクチン又はその塩からプラバスタチン又はその塩への変換に要する時間は、３〜７日間が好ましく、３〜５日間がより好ましい。
【００１７】
変換培養により生成したプラバスタチン又はその塩は、多くの場合精製される。精製方法としては、培養液の濃縮、沈殿化、有機溶媒による抽出、クロマトグラフィー（薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）、および乾燥などが挙げられる。
【００１８】
上記の方法により得られるプラバスタチンの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。コンパクチン又はその塩からプラバスタチン又はその塩への変換率は、用いる微生物、培養条件等によって相違するが、１０％以上が好ましく、２０％以上がより好ましい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２０】
実施例１（プラバスタチン変換能の確認）
ＩＳＰ−２寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）で１４日間生育させたＲＤ０６１８０４で表されるアクチノプラネス属ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４株を菌体ごと掻き取り、１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬのＢｅｎｎｅｔｔ’ｓ−マルトース培地（マルトース１０．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、牛肉エキス１．０ｇ、ＮＺ  Ａｍｉｎｅ，Ｔｙｐｅ  Ａ（和光純薬工業株式会社製）２．０ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．３に調整）に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。
【００２１】
次に、これを１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬのＢｅｎｎｅｔｔ’ｓ−マルトース培地に５％植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで３日間振盪培養後、コンパクチンを終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、引き続き２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。得られた培養液の上清をＨＰＬＣにて分析し、プラバスタチン及びコンパクチンの濃度を求めた。プラバスタチン及びコンパクチン濃度から変換率を算出した結果、プラバスタチンへの変換率は８５．３％であった。
【００２２】
・ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＣ  Ｃ１８  ＵＧ１２０  φ３ｍｍ×１５０ｍｍ
装  置：Ｗａｔｅｒｓ（株）  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ
温  度：４０℃
移動相：Ａ液  メタノール：水：酢酸：トリエチルアミン  ＝  ５００：５００：１：１
Ｂ液  １００％メタノール
Ａ液  １００％，Ｂ液  ０％  →  Ａ液  ２０％，Ｂ液  ８０％となるようにグラジェント
時  間：２０分
流  速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
波  長：ＵＶ  ２３８ｎｍ
【００２３】
・濃度計算方法
【００２４】
【数１】
0006441599.tif 000002
【００２５】
実施例２（プラバスタチン変換能の確認）
ＩＳＰ−２寒天培地で１４日間生育させたアクチノプラネス属に属するＲＤ０６１８０４（ＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）を菌体ごと掻き取り、１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの生育培地（グルコース２０．０ｇ、ピルビン酸５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、大豆粉４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．５ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＣａＣＯ3 ４．０ｇ、を蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．５に調整）に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。
次に、これを１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの生産培地（グルコース１０．０ｇ、ピルビン酸５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、大豆粉４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．５ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＣａＣＯ3 ４．０ｇ、を蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．５に調整）に５％植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで３日間振盪培養後、コンパクチンを終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、引き続き２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。実施例１と同様に変換率を求めた結果、変換率は８６．１％であった。
【００２６】
実施例３（コンパクチン濃度によるプラバスタチン変換能への影響）
ＩＳＰ−２寒天培地で１４日間生育させたＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）を菌体ごと掻き取り、１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの改良生育培地（溶性でんぷん３０．０ｇ、ソヤフラワーＡ（日清オイリオグループ株式会社製）２０．０ｇ、酵母エキス１０．０ｇ、ＣａＣＯ3  ５．０ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．０に調整）に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。
次に、これを１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの実施例２の生産培地に５％植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで３日間振盪培養後、コンパクチンを終濃度０．２、０．５及び１．０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、引き続き２８℃、２１０ｒｐｍで５日間振盪培養を行った。実施例１と同様に変換率を求めた結果、変換率はそれぞれ８５．４％、８２．８％及び８２．２％であった。
【００２７】
実施例４（プラバスタチン変換能に関する工業的使用の確認）
ＩＳＰ−２寒天培地で１４日間生育させたＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）を菌体ごと掻き取り、１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの実施例３の改良生育培地に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで４日間振盪培養を行った。次に、５Ｌ容ジャーファーメンター中の生産培地２．５Ｌに５％植菌し、２８℃、３５０ｒｐｍ及び１ｖｖｍ（２．５Ｌ／ｍｉｎ）で培養を行った。培養２．７日（６５時間）後にコンパクチンを終濃度１．０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、引き続き２８℃、３５０ｒｐｍで３日間培養を行った。実施例１と同様に変換率を求めた結果、変換率は８２．４％であった。
【００２８】
実施例５（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ同属異種菌株とのプラバスタチン変換能の比較）
独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より購入したＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属基準株（ＮＢＲＣ株）を用いて、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属のコンパクチンをプラバスタチンに変換する能力を比較した。
ＩＳＰ−２寒天培地で１４日間生育させたＲＤ０６１８０４（ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４）及び各ＮＢＲＣ株を菌体ごと掻き取り、１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの生育培地（マルトース２０．０ｇ、ピルビン酸５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、大豆粉４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．５ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＣａＣＯ3 ４．０ｇ、を蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．５に調整）に植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで５日間振盪培養を行った。
次に、これを１００ｍＬ三角フラスコ中の２０ｍＬの生産培地（マルトース１０．０ｇ、ピルビン酸５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、大豆粉４．０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １．５ｇ、ＮＨ4ＮＯ3 １．０ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ、ＣａＣＯ3 ４．０ｇ、を蒸留水１０００ｍＬに溶解しｐＨ７．５に調整）に５％植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで３日間振盪培養後、マルトース０．４ｇ及びコンパクチンを終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、引き続き２８℃、２１０ｒｐｍで５日間振盪培養を行った。実施例１と同様に変換率を求めた結果、表１に示したように、変換率はＲＤ０６１８０４で表されるアクチノプラネス属ＮＩＴＥ  Ｐ-０１８７４株で８３．３％、ＮＢＲＣ１２５１４株で２１．４％、ＮＢＲＣ１３８７８株で３３．９％、ＮＢＲＣ１３９９９株で１０．７％であった。
【００２９】
【表１】
0006441599.tif 000003
【００３０】
また、実施例２又は実施例３の培地を用いてＮＢＲＣ株を用いてコンパクチンからプラバスタチンへの変換能を検討した結果、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ  ＮＢＲＣ１３８７８、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｃｏｉｃｈｉｉ  ＮＢＲＣ１０６１４５、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ  ＮＢＲＣ１２５１４、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ１３９９９でも、１０〜４５％の変換率が得られた。