(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膠芽腫の治療用医薬の製造における、ニクロサミドおよびテモゾロミドの使用。
【請求項２】
ニクロサミドとテモゾロミドのモル比が、10%ニクロサミド/90%テモゾロミド〜90%ニクロサミド/10%テモゾロミドの範囲にある請求項１に記載の使用。
【請求項３】
膠芽腫が、原発性膠芽腫、新たな膠芽腫（de novo glioblastoma）、二次性膠芽腫、再発性膠芽腫、遺伝子O6-メチルグアニン-メチルトランスフェラーゼ（MGMT）のプロモーターのメチル化の増加を伴う膠芽腫、MGMTのプロモーターのメチル化の増加を伴わない膠芽腫、突然変異p53を伴う膠芽腫、突然変異p53を伴わない膠芽腫、B細胞インヒビター中のカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー（NFKBIA）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、NFKBIAをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、上皮成長因子受容体（EGFR）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、EGFRをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、血小板由来増殖因子受容体（PDGFRA）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、PDGFRAをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、イソクエン酸脱水素酵素1（IDHI）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、IDHIをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、神経線維腫症1型（NF1）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫およびNF1をコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫から選ばれる請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ニクロサミドおよびテモゾロミドが、同時または連続投与用に製剤される請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
同時投与用製剤が、ニクロサミドおよびテモゾロミドの混合物である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ニクロサミドが、中枢神経系に再吸収されるように製剤される請求項１〜５に記載の使用。
【請求項７】
膠芽腫の治療において用いるための、ニクロサミド、テモゾロミドおよび医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
ニクロサミドおよびテモゾロミドを用いる療法が、膠芽腫の患者を治療するのに適しているかどうかを決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の膠芽腫細胞または膠芽腫組織のサンプル中のNFκBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミドおよびテモゾロミドを用いる療法が、患者に適しているかどうかを決定すること（ここで、NFκBIAの低発現または欠失は、療法が患者に適していることを示す）；
を含む方法。
【請求項９】
膠芽腫を有する患者に投与されるべきニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の膠芽腫細胞または膠芽腫組織のサンプル中のNFκBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定すること（ここで、（i）基準値を上回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %未満でなければならないことを示し、（ii）基準値を下回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %以上でなければならないことを示す）；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療のためのニクロサミドの新規な治療上の使用に関する。特に、ニクロサミドまたはその誘導体の１つとアルキル化剤との併用を、固形腫瘍の治療のために提供する。さらに、ニクロサミドまたはその誘導体の１つは、NFKBIAの低発現を特徴とする固形腫瘍の治療のために使用することができる。最後に、本発明は、ニクロサミド単独またはアルキル化剤との併用での治療が、がん患者にとって適しているかどうかを決定するための診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、がんに対する防御のますます有効なラインとして発達している（1）。膠芽腫（GBM）において、アルキル化剤であるテモゾロミド（TMZ）が、外科的切除および放射線療法との併用において、スタンダードとなっている。それにもかかわらず、GBMが、全生存期間の中央値がわずか15ヶ月という致命的疾患であるので、別の治療選択肢を開発する必要性が非常に大きい（2、3）。抗がん薬を発見するために、２つの主な方策が伝統的に採用されている（4）。１つは、がん関連分子および／または特定の化合物に曝露されることを必要とするシグナル伝達カスケードが明確な干渉および阻害のために設計されうる標的化アプローチである。別法として、数百から数千の化合物の経験的スクリーニングを、別の予測できない抗新生物効果を同定するために行うことができる。しかしながら、両方の方策は、臨床試験段階において高い割合で不適格となるとなる重荷を負っている（5、6）。このことは、部分的に、早期開発段階での薬物評価のために不適切な細胞モデル系を使用することによって生じ（7）、たとえば、患者間および患者内腫瘍不均質性が、これらの系内でまれに反映される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、インビボでのGBMを緊密にミラーリングし、したがって、インビボで用いる場合に、GBM特異的抗がん活性も提供する可能性がある化合物および化合物の組合せを同定するのに特に適しているインビトロ細胞系を開発している。このインビトロ細胞系を用いて、本発明者らは、膠芽腫の改善された化学療法のための化合物および化合物の組合せを同定することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第一の態様において、本発明は、固形腫瘍の治療における使用のための、式（I）、（II）または（III）：
0006272861.tif 000002
（I）
0006272861.tif 000003
（II）
0006272861.tif 000004
（III）
［式中、
Aは、カルボニル、メチレン、ヒドロキシメチニル、アルコキシメチニル、アミノメチニル、オキシム、ヒドラゾン、アリールヒドラゾンまたはセミカルバゾンである；
Bは、存在する場合、CR25R26、O、SまたはNR27である；
R1、R3、R4、R8、R10およびR11は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロゲンまたはC1〜C6アルキルである；
R2およびR7は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシルまたは水素である；
R5は、存在する場合、ヒドロキシル、ホスフェート、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルコキシ、アルキルチオまたはアミノである；
R6は、存在する場合、水素またはC1〜C6アルキルである；
R9は、ニトロ、水素、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールである；および
R21、R22、R23およびR24は、存在する場合、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールである；
R25およびR26は、存在する場合、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールである；および
R27は、存在する場合、水素またはC1〜C6アルキルである］
で示される第一の細胞増殖抑制性化合物またはその塩と、アルキル化化合物の組み合わせに関する。
【０００５】
本発明の１つの態様において、アルキル化化合物は、式（IV）：
0006272861.tif 000005
（IV）
［式中、
XおよびYは、独立して、カルボニル、メチレン、ヒドロキシメチニル、アルコキシメチニル、アミノメチニル、オキシム、ヒドラゾン、アリールヒドラゾンまたはセミカルバゾンである；
R31は、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールである；および
R32は、アミノ、水素、ヒドロキシルまたはハロゲンである］
で示される構造を有する化合物であるか、またはその塩である。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、固形腫瘍の治療において用いるための、A、B、R1〜R11およびR21〜R24が、前記と同意義である式（I）、（II）または（III）で示される化合物、アルキル化剤および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、NFKBIAの低下した発現を特徴とする固形腫瘍の治療において用いるための、A、B、R1〜R11およびR21〜R24が、前記と同意義である式（I）、（II）または（III）で示される化合物に関する。
【０００８】
なおさらなる態様において、本発明は、上述の式（I）、（II）または（III）で示される細胞増殖抑制性化合物を用いる療法が、固形腫瘍を有する患者を治療するのに適しているかどうかを決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の腫瘍細胞または腫瘍組織のサンプル中のNFKBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミドを用いる療法が、患者に適しているかどうかを決定すること（ここで、NFKBIAの低発現または欠失は、療法が患者に適していることを示す）；
を含む方法に関する。
【０００９】
なおさらなる態様において、本発明は、固形腫瘍を有する患者に投与されるべきニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の腫瘍細胞または腫瘍組織のサンプル中のNFKBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定すること（ここで、（i）基準値を上回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %未満でなければならないことを示し、（ii）基準値を下回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %以上でなければならないことを示す）；
を含む方法に関する。
【００１０】
発明の詳細な記載
他に特記しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。
【００１１】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms：（IUPAC Recommendations）」、Leuenberger、H.G.W、Nagel、B. および Klbl、H.編（1995）、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland）に記載のように定義される。
【００１２】
文脈が他を要求しない限り、本明細書および請求の範囲を通して、単語「含む（comprise）」および「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などのその変形は、述べられた整数またはステップあるいは整数またはステップの群を包含するが、任意の他の整数またはステップあるいは整数またはステップの群を排除しないことを意味する。
【００１３】
いくつかの文献が、本明細書において引用される。前述および後述する本明細書中に引用された各文献（特許、特許出願、科学文献、製造者の仕様書、使用説明書のすべてを含む）は、その全体において参照することによって本明細書に援用される。本明細書において、引用文献は、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈されるべきではない。
【００１４】
固形腫瘍、特に膠芽腫の治療に適した新規な化合物を同定するために、インビトロにて患者および疾患特異的な特徴を保つことが知られている初代ヒトGBM細胞（pGBM）（8-10）を経験的なスクリーニングアプローチに適用した。疾患の複数の小面を表しているpGBMのポートフォリオにおいて創薬および検証を行った。３つの独立したヒト非悪性神経細胞集団（hnNCs）ならびに５つの通例用いられる神経膠腫細胞株は、実験のコントロールとして働いた。小分子ニクロサミドは、pGBM選択的、アポトーシス促進性および増殖抑制性化合物として、これらの研究から出現した。ニクロサミドの多面的作用機序は、幹細胞品質有りおよび無しで、GBMを効果的に激減させ、異種移植モデルにおいて有意に生存期間を増加させた。TMZおよびこれらの効果についての関連するバイオマーカーとの併用での相乗的抗がん活性は、GBMの一次療法における現在の標準へ加えるものとして、ニクロサミドの臨床開発のためのユニークな評価能力を示唆した。
【００１５】
このように、本発明の根底にある問題は、固形腫瘍の治療における使用のための、式（I）、（II）または（III）：
0006272861.tif 000006
（I）
0006272861.tif 000007
（II）
0006272861.tif 000008
（III）
［式中、
Aは、カルボニル、メチレン、ヒドロキシメチニル、アルコキシメチニル、アミノメチニル、オキシム、ヒドラゾン、アリールヒドラゾンまたはセミカルバゾン、好ましくはカルボニルである；
Bは、存在する場合、CR25R26、O、SまたはNR27である；
R1、R3、R4、R8、R10およびR11は、独立して、水素、ヒドロキシル；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；またはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル：好ましくはいずれの場合にも水素である；
R2およびR7は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシルまたは水素、好ましくはいずれの場合にもハロゲンである；
R5は、ヒドロキシル、ホスフェート、水素；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニル；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ、アルキルチオ、好ましくはC1〜C6アルキルチオまたはアミノ；最も好ましくはヒドロキシルまたはホスフェートである；
R6は、存在する場合、水素またはC1〜C6アルキルである；
R9は、ニトロ、水素、ヒドロキシル、アミノ；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、好ましくはフェニル；最も好ましくはニトロである；および
R21、R22、R23およびR24は、存在する場合、独立して、水素、ヒドロキシル；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニルである；
R25およびR26は、存在する場合、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニルである；および
R27は、存在する場合、水素またはC1〜C6アルキルである］
で示される第一の細胞増殖抑制性化合物またはその塩と、アルキル化化合物の組合せの提供によって解決される。
【００１６】
化合物は、もしそれが腫瘍細胞の増殖を抑制することができるならば、本明細書に述べる「細胞増殖抑制性化合物」である。好ましくは、細胞増殖抑制性化合物は、細胞毒性でもあり、すなわち、実際に腫瘍細胞を殺す。好ましくは、所定の濃度の細胞増殖抑制性化合物の上述の効果は、該化合物によって健康な組織が損傷されないか、または腫瘍組織と比較して損傷がより少ないように、非腫瘍細胞よりも強く、腫瘍細胞に影響を及ぼす。化合物の細胞毒性効果の強度を決定する好ましい方法は、細胞集団の代謝活性をコントロールの活性の50％まで減少させる濃度の（ICM50）決定である。このことは、たとえば、細胞培養物にレサズリンを適用することによって行うことができる。健康な細胞において、レサズリンは、蛍光生成物レソルフィンに変換される。変換速度は、細胞の代謝活性を測定するのに用いることができる。好ましくは、本発明の細胞増殖抑制性化合物は、同じ設定におけるニクロサミドまたはニクロサミドとアルキル化剤のICM50濃度の2倍、5倍、10倍、20倍または50倍以下のICM50濃度を有する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、化合物は、式（I）：
［式中、
Aは、カルボニルである；
R1、R3、R4、R8、R10およびR11は、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲンまたはC1〜C6アルキル、好ましくはいずれの場合にも水素である；
R2およびR7は、独立して、ハロゲン、ヒドロキシルまたは水素、好ましくはいずれの場合にもハロゲン、より好ましくはフッ素、塩素または臭素、最も好ましくはc塩素である；
R5は、ヒドロキシル、ホスフェート；水素；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニル；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ、アルキルチオ、好ましくはC1〜C6アルキルチオまたはアミノ；最も好ましくはヒドロキシルまたはホスフェートである；および
R9は、ニトロ、水素、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール、好ましくはニトロである］
で定義される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様において、化合物は、式（I）：
［式中、
Aは、カルボニルである；
R1、R3、R4、R8、R10およびR11は、独立して、水素、ヒドロキシル；ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；または C1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；好ましくはいずれの場合にも水素である；
R2およびR7は、独立して、ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；ヒドロキシルまたは水素；最も好ましくは塩素である；
R5は、ヒドロキシル、ホスフェート、水素、ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素；アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニル；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルコキシ、アルキルチオ、好ましくはC1〜C6アルキルチオ、すなわちすなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキルチオ；または アミノ；最も好ましくはヒドロキシルまたはホスフェートである；および
R9は、ニトロである］
で定義される。
【００１９】
式（I）で定義される化合物においてより好ましい化合物は、
Aが、カルボニルであり；
R1、R3、R4、R6、R8、R10およびR11が、水素であり；
R2およびR7が、塩素であり；
R5が、ヒドロキシルであり；および
R9が、ニトロである化合物である。
【００２０】
本発明のもう１つの好ましい実施態様において、化合物は、
Aが、カルボニルであり；
R1、R3、R4、R6、R8、R10およびR11が、水素であり；
R2およびR7が、塩素であり；
R5が、ホスフェートであり；および
R9が、ニトロである；
式（I）によって定義される。
【００２１】
最も好ましい実施態様において、細胞増殖抑制性化合物は、ニクロサミドである。
【００２２】
ホスフェート基が、式（I）で示される化合物の再吸収を有意に増加させることが明らかにされており（Panら、2012、Niclosamide、an old antihelminthic agent、demonstrates antitumor activity by blocking multiple signalling pathways of cancer stem cells、Vol. 31：178-184）、したがって、この化合物のバイオアベイラビリティは改善される。
【００２３】
用語「アルキル化剤」は、グアニンをO6-アルキルグアニン、O4-アルキルグアニンまたはN7-アルキルグアニンに変換することができる任意の医薬的化合物、すなわちO6-アルキル化剤、O4-アルキル化剤またはN7-アルキル化剤に関する。適当なアルキル化剤は、当業者に公知である。典型的には、アルキル化剤によって添加されるアルキルは、メチルである。この変換は、DNAを損傷し、問題になっている細胞の死を引き起こす。この効果は、最初に、がん細胞などの急速に分裂する細胞に影響を及ぼす。アルキル化されたグアニンを、Rehら、（1999）「O6-methylguaninde DNA adducts associated with occupational nitrosamine exposure」、Carcinogenesis、21：29-33に記載されているように検出することができる。好ましくは、アルキル化剤は、O6-アルキル化剤であり、すなわち、それは、グアニンのC6-原子を排他的または最初にアルキル化する。
【００２４】
本発明の１つの態様において、アルキル化化合物は、式（IV）：
0006272861.tif 000009
（IV）
［式中、
XおよびYは、独立して、カルボニル、メチレン、ヒドロキシメチニル、アルコキシメチニル、アミノメチニル、オキシム、ヒドラゾン、アリールヒドラゾンまたはセミカルバゾン、好ましくはカルボニルである；
R31は、アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；水素；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルコキシ、アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニル；好ましくはアルキルである；および
R32は、アミノ、水素、ヒドロキシルまたはハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素である］
で示される構造を有する化合物であるか、またはその塩である。
【００２５】
好ましい実施態様において、アルキル化剤は、
Xが、カルボニルおよびYが、カルボニル、メチレン、ヒドロキシメチニル、アルコキシメチニル、アミノメチニル、オキシム、ヒドラゾン、アリールヒドラゾンまたはセミカルバゾン、好ましくはカルボニルであり；
R31が、アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル；水素；アルコキシ、好ましくはC1〜C6アルコキシ、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルコキシ、アルケニル、好ましくはC2〜C6アルケニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルケニル；アルキニル、好ましくはC2〜C6アルキニル、すなわちC2、C3、C4、C5またはC6アルキニル；シクロアルキル、好ましくはC3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル；またはアリール、好ましくはC6〜C14アリール、特にフェニル；好ましくはアルキルであり；および
R32が、アミノ、水素、ヒドロキシルまたはハロゲン、好ましくはフッ素、塩素または臭素である；
式（IV）で示される化合物またはその塩によって定義される。
【００２６】
特に好ましい実施態様において、アルキル化剤は、
XおよびYが、カルボニルであり；
R31が、アルキル、好ましくはC1〜C6アルキル、すなわちC1、C2、C3、C4、C5またはC6アルキル、好ましくはメチルであり；および
R32が、アミノである；
式（IV）で示される化合物によって定義される。
【００２７】
最も好ましい実施態様において、アルキル化剤は、テモゾロミドである。
【００２８】
上記で用いた用語は、以下の好ましい意味を有する：
アルキル基は、直鎖または分枝鎖のC1〜C10アルキル基であるのが好ましく、C1〜C6アルキル基であるのがより好ましい。６個以下の炭素原子を含むアルキル基は、「低級アルキル」と呼ばれる。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、3-ペンチル、ヘキシルおよびオクチル基を含む。
【００２９】
好ましいシクロアルキル基は、C3〜C8シクロアルキル、特にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルである。さらに好ましいのは、対応するシクロアルケニル基、特にシクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルである。
【００３０】
好ましいアルケニル基は、C2〜C10アルケニル、特にエテニル、1-または2-プロペニル、1-、2-または3-ブテニル、1-、2-、3-または4-ペンテニル、1-、2-、3-、4-または5-ヘキセニル、1-、2-、3-、4-、5-または6-ヘプテニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-オクテニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-または8-ノネニルまたは1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8- または9-デセニルである。
【００３１】
好ましいアルキニル基は、C2〜C10アルキニル、特にエチニル、1-または2-プロピニル、1-、2-または3-ブチニル、1-、2-、3-または4-ペンチニル、1-、2-、3-、4-または5-ヘキシニル、1-、2-、3-、4-、5-または6-ヘプチニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-または7-オクチニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-または8-ノニニルまたは1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8- または9-デシニルである。
【００３２】
用語「アルキル基」、「シクロアルキル基」、「アルケニル基」および「アルキニル基」は、置換アルキル、シクロアルキル、アルケニルおよびアルキニル基も意味する。該基の好ましい置換基は、少なくとも１つのハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、シアノ、C1〜C6アシルアミノ、C1〜C6 アミノアシル、C1〜C6アシルオキシ、C1〜C6アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、C6〜C10アリール、C4〜C7シクロアルキル、C2〜C6アルケニルおよびC2〜C6アルキニルを含む。
【００３３】
好ましいアルコキシ基は、上述のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、3-ペンチル、ヘキシルおよびオクチル基、より好ましくはメチルの１つによって置換された酸素を含む。
【００３４】
好ましいアルキルチオ基は、上述のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、3-ペンチル、ヘキシルおよびオクチル基、より好ましくはメチル、スルホキシドおよびスルホンの１つによって置換されたイオウを含む。
【００３５】
好ましいアミノ基は、-NH2、-NHR51、-NR51R52（ここで、R51およびR51は、C1〜C10アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、3-ペンチル、ヘキシルおよびオクチル基、最も好ましくはメチルまたはシクロアルキル基から選ばれるか；またはR51およびR52は、Nと結合して、環構造、好ましくはピペリジンなどの5〜7員環構造を形成するか；またはR51およびR52は、Nおよびもう１つのへテロ原子と結合して、飽和、置換もしくは部分飽和の5〜7員ヘテロシクロ基を形成する）を含む。好ましいへテロ原子として、O、NおよびSが挙げられる。
【００３６】
好ましいアリール基は、C6〜C14アリール、より好ましくはC6〜C10アリールを含む。より好ましくは、アリール基は、フェニル、ナフチル、フェナントレニル、アントラセニル、インデニル、アズレニル、ベフェニル、ビフェニレニルまたはフルオレニルである。用語「アリール基」は、後述する置換アリール基も意味する。
【００３７】
アリールの好ましい置換基は、少なくとも１つのアシル、アルキレンジオキシ（-OCH2O-）、ハロゲン、C6〜C10アリール、C4〜C7シクロアルキル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6ヒドロキシアルキル、ニトロ、アミノまたはC1〜C6アルコキシ基を含む。
【００３８】
好ましいハロゲンは、フッ素、ヨウ素、塩素および臭素を含む。
【００３９】
もう１つの好ましい実施態様において、アルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、アルキルスルホン酸塩、白金系化学療法薬および非古典的アルキル化剤から選ばれる。
【００４０】
好ましいナイトロジェンマスタードは、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、トロフォスファミドおよびイホスファミドである。
【００４１】
好ましいニトロソウレアは、カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシンである。
【００４２】
好ましいアルキルスルホン酸塩は、ブスルファンである。
【００４３】
好ましい白金系化学療法薬は、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンおよび四硝酸トリプラチンである。
【００４４】
好ましいび非古典的アルキル化剤は、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパおよびミトゾロミドである。特に好ましいのは、ダカルバジンおよびミトゾロミドである。
【００４５】
最も好ましくは、アルキル化剤は、ニトロソウレア、特にカルムスチンである。
【００４６】
用語「固相腫瘍」は、新生物細胞のまとまりのあるグループを意味する。本願の「固相腫瘍」は、良性、前がん性または悪性であってよい。それが、前がん性または悪性であるのが好ましく、悪性であるのが最も好ましい。
【００４７】
好ましい前がん性腫瘍は、光線性角化症、 皮角、化学線口唇炎、タール角化症、ヒ素角化症、X線角化症、ボーエン病、ボーエン様丘疹症、悪性黒子、硬化性苔癬および苔癬ゴム粘膜（lichen rubber mucosae）；消化管の前がん、特に紅板症、白板症、バレット食道、プランマー・ヴィンソン症候群、下腿潰瘍、胃の巨大肥大（gastropathia hypertrophica gigantea）、境界線がん、腫瘍性腸ポリープ、直腸ポリープ、磁器胆嚢；婦人科前がん、特に上皮内腺管がん（carcinoma ductale in situ（CDIS））、子宮頸部上皮内腫瘍（CIN）、白板症、子宮内膜増殖症（グレード（III））、外陰ジストロフィー、外陰上皮内腫瘍（VIN）、胞状奇胎；泌尿器科前がん、特に膀胱乳頭腫症、ケイラー赤色肥厚症、精巣上皮内腫瘍（TIN）、白板症および上皮内がん（CIS）から選ばれる。
【００４８】
好ましい悪性腫瘍は、膠芽腫、びまん性大B細胞リンパ腫（DLBCL）、T細胞リンパ腫、たとえば、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）、非皮膚末梢T細胞リンパ腫、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス（HTLV）と関連するリンパ腫、成人T細胞リンパ腫（ATLL）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（原発性中枢神経系リンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、中皮腫、小児固形腫瘍、骨がんおよび軟組織肉腫、成人の一般的な固形腫瘍、たとえば、頭頸部がん（たとえば、口腔、喉頭および食道）、泌尿生殖器がん（たとえば、前立腺、膀胱、腎臓（特に悪性腎細胞がん（RCC）、子宮、卵巣、精巣）、結腸直腸がん、肺がん（たとえば、小細胞がんおよび扁平上皮がんおよび腺がんを含む非小細胞肺がん）、乳がん、膵臓がん、黒色腫およびその他の皮膚がん、基底細胞がん、転移性皮膚がん、潰瘍性および乳頭状の両方の型の扁平上皮がん、胃がん、脳がん、肝細胞がん、副腎がん、腎臓がん、甲状腺がん、髄様がん、骨肉腫、軟組織肉腫、ユーイング肉腫、細網細胞肉腫、およびカポジ肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、セミノーマ、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、小細胞肺がん、上皮がん、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、血管腫、重鎖病および転移から選ばれる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様において、固形腫瘍は、膠芽腫、ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、メラノーマ、肝細胞がん、乳がんおよび多発性骨髄腫から選ばれる。固形腫瘍が、膠芽腫であるのが最も好ましい。
【００５０】
用語「膠芽腫」または「多形性膠芽腫」は、膠細胞が関与する原発性脳腫瘍を意味する。膠芽腫は、増殖性膠腫瘍細胞、血管増殖および優先壊死組織領域（さらなる分類のために：Louis、D.N.、Ohgaki、H.、Wiestler、O.D.、Cavenee、W.K.、Burger、P.C.、Jouvet、A.、Scheithauer、B.W.および Kleihues、P. 2007. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol 114：97-109.）の存在に基づいて診断されるのが好ましい。
【００５１】
本発明のより好ましい実施態様において、膠芽腫は、原発性膠芽腫、二次性膠芽腫、新たな膠芽腫（de novo glioblastoma）、再発性膠芽腫、遺伝子O6-メチルグアニン-メチルトランスフェラーゼ（MGMT）のプロモーターのメチル化の増加を伴う膠芽腫、MGMTのプロモーターのメチル化の増加を伴わない膠芽腫、突然変異p53を伴う膠芽腫、突然変異p53を伴わない膠芽腫、B細胞インヒビター中のカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー（NFKBIA）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、NFKBIAをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、上皮成長因子受容体（EGFR）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、EGFRをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、血小板由来増殖因子受容体（PDGFRA）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、PDGFRAをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、イソクエン酸脱水素酵素1（IDHI）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫、IDHIをコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫、神経線維腫症1型（NF1）をコードする遺伝子の改変を伴う膠芽腫およびNF1をコードする遺伝子の改変を伴わない膠芽腫から選ばれる。
【００５２】
用語「改変」は、問題になっている遺伝子の突然変異、欠失およびさらなるコピーの存在を意味する。突然変異および欠失は、ホモまたはへテロ接合であってよい。さらに、用語「膠芽腫」は、原発性ならびに再発性疾患を意味する。
【００５３】
特に好ましいのは、式（I）、（II）または（III）で定義される化合物とアルキル化剤の併用による、NFKBIAの低発現を特徴とする固形腫瘍、特に膠芽腫、ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、黒色腫肝細胞がん、乳がんおよび多発性骨髄腫から選ばれる固形腫瘍の治療である。該NFKBIAの低発現が、14q13におけるNFKBIA遺伝子座（NFKBIA+/-）のヘテロ接合欠失によって引き起こされるのが好ましい。
【００５４】
式（I）、（II）または（III）で示される化合物およびアルキル化剤は、同時または連続投与されるのが好ましい。
【００５５】
用語「同時に」は、5分以内、10分以内または20分以内の間隔で両方の化合物の投薬量を投与することを意味する。両方の化合物が、患者に投与される単一の医薬組成物に含まれる成分であるのがさらに好ましい。
【００５６】
用語「続いての投与」は、両方の化合物の投与間隔が、併用の相乗効果を可能にする化合物または最大にするように選択される投与法を意味する。式（I）、（II）または（III）で示される化合物およびアルキル化剤の投与間隔が、両方の物質の同時ピーク血漿レベルを達成するように選択されるのが好ましい。式（I）、（II）または（III）で示される化合物およびアルキル化剤の投与間隔が、1日、3日、6日または9日を超えないのが好ましい。
【００５７】
化合物の投与量は、腫瘍部位において活性化合物の定義された比率が達成されるように選択されるのが好ましい。腫瘍部位における医薬化合物の有効濃度は、投与経路、異なる部分（たとえば、血液および組織）中の化合物の分布、プロドラッグの酵素的活性化および／または活性化合物の酵素的不活性化ならびに身体からの化合物の排出速度に応じて変わることが当業者に知られている。このように、適当な投薬量についての決定は、上述したパラメーターに応じて変わる。しかしながら、当業者は、このことを十分に承知しており、薬力学的解析は、腫瘍の部位において活性化合物の所望の濃度をもたらす、化合物の投薬量を決定するのを補助する。
【００５８】
好ましい投与経路は、経口、静脈内、髄腔内、実質内投与である。
【００５９】
腫瘍部位におけるニクロサミドのモル比（ニクロサミドおよびテモゾロミドの加えられたモル濃度のmol%で表される）が、10 mol%、20 mol%、30 mol %、40 mol%、50 mol%、60 mol%、70 mol%、80 mol%または90 mol%であるのが好ましい。両方の化合物のモル比が、NFKBIAの発現状態に応じて換わるのがより好ましい。
【００６０】
問題になっている腫瘍が、NFKBIAの低下した発現を特徴とするならば、ニクロサミドのモル比は、ニクロサミドおよびテモゾロミドの加えられたモル濃度の40%以上であるのが好ましい。濃度が、50 mol%以上、60 mol%以上、70 mol%以上、80 mol%以上または90 mol%以上であるのが好ましく、50 mol%が最も好ましい。
【００６１】
問題になっている腫瘍が、NFKBIAの低下した発現を特徴としないならば、ニクロサミドのモル比は、ニクロサミドおよびテモゾロミドの加えられたモル濃度の40%以下であるのが好ましい。濃度が、40 mol%以下、30 mol%以下、20 mol%以下または10 mol%以下であるのが好ましく、10 mol%が最も好ましい。
【００６２】
用語「治療する」は、患者の健康を回復または維持する目的で、本発明化合物を患者に投与することを意味する。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様において、治療は、治癒的である。好ましくは、治癒的治療は、患者の身体からすべての腫瘍細胞を完全に撲滅することを目的とする。治癒的治療が、治療を受けているすべての患者において成功するとは限らないことを理解すべきである。一般的に、ほとんど薬物療法、特に、ほとんどのがん療法は、ありとあらゆる患者において効き目があるわけではない。しかしながら、治癒的治療は、患者の有意に大きい部分が、治療を受けていないか、またはプラセボのみを受けている患者のグループに比べて、治癒されうることを意味する。治療を受けていないか、またはプラセボのみを受けている患者のグループ（コントロールグループ）が、治療を受けているグループと同じ特徴（年齢、疾患の種類および重篤度、性別または体重など）を有するのが好ましい。成功の比率が、患者の１つのグループにおいて、もう１つのグループと比べて、より高いかどうかを決定するための統計的方法は、当業者にとって周知である。
【００６４】
本発明のもう１つの好ましい実施態様において、治療は、苦痛緩和である。患者の身体からすべての腫瘍細胞を完全に撲滅することが、用語「緩和治療」から除外されるわけではないが、緩和治療は、そのような結果を目的としない。緩和治療が、患者の痛みまたは神経学的欠陥などの腫瘍関連症状の低減化を目的とするのが好ましい。緩和治療が、腫瘍体積および腫瘍関連症状の低減化、腫瘍進行までの時間の延長または生存期間の延長を目的とするのも好ましい。さらに、「緩和治療」が、腫瘍の安定性をが持つ、すなわち、腫瘍体積の増加および新たな転移形成を阻止するのが好ましい。
【００６５】
好ましいサブタイプは、アジュバントまたはネオアジュバント治療計画である。アジュバントおよびネオアジュバント治療の両方が、１つ以上の固形腫瘍の外科手術的除去と組み合わせての本発明化合物の投与を特徴とする。
【００６６】
用語「ネオアジュバント治療」は、好ましくは、外科手術前の本発明化合物の投与を意味する。完全な除去の機会を増加させるため、または外科手術が患者にとってより緊張の少ないものとなるように外科手術中に切除されるべき組織の量を減少させるために、このような投与計画を用いて、外科施術前に腫瘍の大きさを減少させることができる。
【００６７】
用語「アジュバント治療」は、好ましくは、外科手術後の本発明化合物の投与を意味する。アジュバント治療は、放射線療法を伴ってもよい。多くの場合、外科手術は、当該腫瘍またはすべての腫瘍を患者の身体から完全に切除することをもたらさない。遠く離れた転移がんがすでに存在していても造影法によって検出されるには小さすぎるかもしれない。同様に、腫瘍細胞は、腫瘍の明らかな端の部分を越えて、すでに局所的に拡散したかもしれない。両方の場合において、本発明化合物を用いるアジュバント療法は、外科手術および適用できる場合の放射線療法によって除去されないそのような腫瘍細胞を殺す機会を提供し、したがって、完全治癒の機会を改善する。
【００６８】
アジュバントならびにネオアジュバント療法の両方が、治癒的治療ならびに緩和治療として投与されうる。
【００６９】
患者が弱っているので外科手術が受け入れがたいリスクであるとみなされる、あるいは腫瘍が患者の生命維持に必要な解剖学的構造を損傷することのない外科手術では接近不可能である、のいずれかの理由から、腫瘍が外科手術に適していないこともある。両方の状況は、転移した腫瘍をもつ患者において頻繁に起こる。このような場合、がん疾患の進行したステージは患者を著しく弱め、同時に、身体に存在する多くの腫瘍は広範囲の手術を必要とする。これらの場合において、式（I）、（II）または（III）で示される化合物は、単独またはアルキル化剤との併用で、外科手術なしの全身的治療として投与される。当業者は、腫瘍の医療が、典型的には、2、3またはそれ以上の医薬的化合物の併用に依存することを知っている。したがって、式（I）、（II）または（III）で示される化合物あるいは式（I）、（II）または（III）で示される化合物とアルキル化剤との併用は、さらなる細胞増殖抑制性および／または細胞毒性化合物で補完されうる。
【００７０】
本発明のさらに別の好ましい実施態様において、本発明化合物による治療は、明らかに成功裏に治療された腫瘍の再発を防止することを目的とする。外科手術、放射線療法、化学療法または前述の療法のいずれかの組合せによる腫瘍の治療は、腫瘍の寛解を誘発することが多い。腫瘍の寛解は、たとえば、造影法、目視検査または検査値によって、腫瘍の痕跡を臨床的に検出することができない状態である。しかしながら、多くの場合、腫瘍は、原発腫瘍と同じ位置に、あるいは離れた身体部分に、明らかに成功した治療から２、３年以内に再発する。したがって、腫瘍の寛解は、成功した治癒と等しくはない。本発明化合物は、選択された一次療法とは無関係に、明らかに成功裏に治療された腫瘍の再発を防止するために投与されうる。
【００７１】
患者が、脊椎動物であるのが好ましく、哺乳動物であるのがより好ましい。患者が、ネコ、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ネズミ、ラットまたはヒトであるのがなおさらに好ましい。患者がヒトであるのが最も好ましい。
【００７２】
本発明の１つの実施態様において、上記概略した化合物は、医薬的に許容しうる塩として存在する。用語「医薬的に許容しうる塩」は、本発明化合物の塩を意味する。本発明化合物の適当な医薬的に許容しうる塩として、たとえば、本発明化合物の溶液と、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの医薬的に許容しうる酸の溶液を混合することによって形成される酸付加塩が挙げられる。さらに、本発明化合物が、酸性部分を有する場合、その適当な医薬的に許容しうる塩として、アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩またはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（たとえば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）；および適当な有機リガンドと形成される塩（たとえば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、ホスフェート、硝酸塩、アルキルスルホン酸とアリールスルホン酸塩などの対アニオンを用いて形成されたアンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミンカチオン）が挙げられる。医薬的に許容しうる塩の説明的例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムケート（mucate）、2-ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、N-メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボネート）、パルミチン酸、パントテン酸、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ホスフェート/ジホスフェート、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシレート、トリエチオダイド、ウンデカン酸塩、吉草酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない（たとえば、Berge、S. M.ら、「Pharmaceutical Salts」、Journal of Pharmaceutical Science、1977、66、1-19を参照）。本発明の特定の化合物は、化合物が塩基性塩または酸付加塩のいずれかに変換されるのを可能にする、塩基性および酸性官能基の両方を含む。
【００７３】
化合物の中性形態は、従来の様式で、塩を塩基または酸に接触させ、親化合物を単離することによって再生されうる。化合物の親型は、極性溶媒中の溶解性などの特定の物理的特性において各種塩形態とは異なるが、それ以外の点では、その塩は本発明の目的のための化合物の親型と同等である。
【００７４】
塩形態に加えて、本発明はプロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載されている化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学変化を起こして一般式（I）〜（III）で示される化合物化合物を提供する化合物である。プロドラッグは、患者に投与された後に、加水分解、代謝などのインビボ生理作用を介して、本発明化合物へと化学的に変更される薬理学的に活性または不活性な化合物である。さらに、エクスビボ環境において、化学的または生化学的方法によって、プロドラッグを本発明化合物に変換することができる。たとえば、適当な酵素とともに経皮パッチリザーバー中に置く場合、プロドラッグを本発明化合物にゆっくりと変換することができる。プロドラッグを作成し、使用することに関与する適合性および技術は、当業者に周知である。エステルを含むプロドラッグの一般的議論については、Svensson and Tunek、Drug Metabolism Reviews 16.5（1988）、and Bundgaard、Design of Prodrugs、Elsevier（1985）を参照。マスクされた酸性アニオンの例として、アルキル（たとえば、メチル、エチル）、シクロアルキル（たとえば、シクロヘキシル）、アラルキル（たとえば、ベンジル、p-メトキシベンジル）およびアルキルカルボニルオキシアルキル（たとえば、ピバロイルオキシメチル）などのさまざまなエステルが挙げられる。アミンは、インビボでエステエラーゼによって切断されて遊離薬物を放出するアリールカルボニルオキシメチル置換誘導体としてマスクされた（Bungaard J. Med. Chem. 2503（1989））。また、イミダゾール、イミド、インドールなどの酸性NH基を含む薬物は、N-アシルオキシメチル基によってマスクされた（Bundgaard Design of Prodrugs、Elsevier（1985））。ヒドロキシ基は、エステルおよびエーテルとしてマスクされた。EP 0 039 051（Sloan and Little、Apr. 11、1981）は、マンニッヒ塩基ヒドロキサム酸プロドラッグ、その製造および使用を開示する。
【００７５】
本発明化合物およびその製造のための出発物質を、本明細書に記載のように、および、別法として、当業者に周知であり、該反応に適した反応条件下、当業者に周知の標準的方法および手順によって、すなわち、文献（たとえば、Houben-Weyl、Methoden der organischen Chemie [Methods of Organic Chemistry]、Georg-Thieme-Verlag、Stuttgartなどの標準的研究）の記載にしたがって合成することができる。
【００７６】
要すれば、反応混合物から単離せず、本発明化合物に迅速にさらに変換することによって、出発物質をインサイチュで作成することもできる。一方、反応を段階的に行うことも可能である。一般的手順が、不特定の立体化学を有する化合物の製造に関するものとして示されることに留意すべきである。しかしながら、このような手順は、一般に、不斉中心における立体化学が、（S）または（R）である場合などの特定の立体化学を有する化合物に適用可能である。さらに、たとえば、反転などの周知の方法を用い、立体化学（たとえば、（R））を有する化合物を利用して、逆の立体化学（たとえば、（S））を有する化合物を製造することができることが多い。
【００７７】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態ならびに水和物などの溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であり、本発明の範囲に含まれることが意図される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶性または非晶質形態で存在することができる。一般に、すべての物理的形態は、本発明によって企図される用途にとって等価であり、本発明の範囲内に含まれルことが意図される。
【００７８】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する。ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、すべて、本発明の範囲に包含されることを意図される。したがって、本発明化合物は、立体異性体の混合物、特にエナンチオマーの混合物、ならびに精製された立体異性体、特に精製されたエナンチオマーまたは立体異性体的に富んだ混合物、特にエナンチオマー的に富んだ混合物を包含する。下記の式（I）〜（IV）で示される化合物の個々の立体異性体ならびにその完全もしくは部分平衡混合物も本発明の範囲に包含される。本発明はまた、一つ以上の不斉中心が反転される下記の式で示される化合物の個々の異性体を包含する。また、式（I）〜（IV）で示される化合物のすべての互変異性体および互変異性体の混合物が、式（I）〜（IV）で示される化合物および好ましくはそれらに対応する式および下位式（subformulas）の範囲に包含されることが理解される。
【００７９】
得られたラセミ体は、それ自体知られている方法によって、機械的または化学的に異性体に分割されうる。ジアステレオマーが、光学活性分割剤による反応によって、ラセミ混合物から形成されるのが好ましい。
【００８０】
適当な分割剤の例は、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または樟脳スルホン酸などの種々の光学活性樟脳スルホン酸のDおよびL体などの光学活性酸である。光学活性分割剤（たとえば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）で満たされたカラムを用いるエナンチオマー分割も有利である；適当な溶離液の例は、ヘキサン／イソプロパノール／アセトニトリル混合物である。
【００８１】
たとえば、クロマトグラフィーまたは分別結晶などの標準的精製工程によって、ジアステレオマー分割を行うことができる。
【００８２】
すでに光学的に活性である出発物質を用い、上述の方法によって、式（I）〜（IV）で示される光学活性化合物を得ることも可能である。
【００８３】
さらなる態様において、本発明は、固形腫瘍の治療に用いるための、AおよびR1〜R11が、上述の定義および好ましい定義を有する式（I）、（II）または（III）で示される化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。好ましい実施態様において、医薬組成物は、さらに、X、Y、R31およびR32が、上述の定義および好ましい定義を有する、好ましくは式（IV）で定義される化合物であるアルキル化剤を含む。
【００８４】
本願で意味する「医薬組成物」は、少なくとも１つの本発明化合物および少なくとも１つの医薬的に許容しうる担体を含む。
【００８５】
本発明化合物から医薬組成物を製造するために、医薬的に許容しうる担体は、固体または液体のいずれでもありうる。固体形態製剤として、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤および分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、風味剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤または封入材料として働く１種以上の物質でありうる。
【００８６】
散剤において、担体は、微粉化した活性成分との混合物中の、微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、適当な割合において必要な結合特性を有する担体と混合され、所望の形状および大きさに圧縮される。
【００８７】
散剤および錠剤が、5%〜80%、より好ましくは20%〜70%の活性化合物（１種または２種以上）を含むのが好ましい。適当な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。
【００８８】
用語「製剤」は、他の担体の有無での条件下に活性成分が担体によって取り囲まれる、すなわち、伴われる、カプセルを提供する担体としての封入材料を伴う活性化合物の製剤を包含する。同様に、カシェおよびロゼンジも包含されうる。経口投与に適した固体投与剤形として、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびロゼンジを用いることができる。
【００８９】
座剤を製造するために、まず、脂肪酸グリセリドの混合物またはカカオバターなどの低融点ワックスを融解させ、攪拌などによって、その中に活性成分を均質に分散させる。次いで、融解した均質な混合物を都合のよい大きさの型に注ぎ入れ、冷却して固化させる。
【００９０】
液体形態製剤として、溶液剤、懸濁液剤および乳液剤、たとえば、水または水/プロピルエングリコール溶液が挙げられる。眼への局所適用のためには、液体形態が特に好ましい。非経口注射のためには、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として液体製剤を製剤することができる。
【００９１】
活性成分を水に溶解し、必要に応じて、適当な着色剤、香味料、安定化剤および増粘剤を添加することによって、経口用途に適した水溶液を製造することができる。微粉化した活性成分を、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびその他の周知の懸濁化剤などの粘度のある材料とともに水に分散させることによって、経口用途に適した水性懸濁液を製造することができる。
【００９２】
使用直前に、経口投与用の液体形態製剤に変換されることを意図される固体形態製剤も包含される。このような液体形態として、溶液剤および乳液剤が挙げられる。これらの製剤は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。
【００９３】
医薬製剤は、単位投与剤形であるのが好ましい。このような剤形において、製剤は、適切な量の活性成分を含む単位投与量に再分割される。単位投与剤形は、包装された製剤にすることができ、該包装には、包装された錠剤、カプセル剤およびバイアルまたはアンプル中の散剤などの分離された量の製剤が含まれる。また、単位投与剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤またはロゼンジ自体であってもよく、あるいは、適当な数のこれらの包装形態のいずれかであってもよい。
【００９４】
本発明の好ましい実施態様において、医薬組成物は、さらに、さらなる細胞増殖抑制性または細胞毒性化合物を含む。該さらなる化合物は、テモゾリミド、ダウノルビシン、ガンボギン酸アミド、ガンボギン酸、チメロサール、ミトキサントロン塩酸塩、酢酸フェニル水銀、ダクチノマイシン、プリスチメリン、エピルビシン塩酸塩、硫酸ビンクリスチン、エメチン、パクリタキセル、10-ヒドロキシ、ドキソルビシン、コルヒチン、カンプトテシン、テニポシド、ビンブラスチン硫酸塩、マイトマイシンC、フロクスウリジン、ウアバイン、塩酸アンシタビン、キナクリン、塩酸、ニクロサミド、アムサクリン、チオグアニン、ロテノン、アクラビン塩酸塩、シタラビン、メトトレキサートおよびピクロポドフィロトキシンから選ばれる。
【００９５】
さらに好ましい追加の細胞増殖抑制性または細胞毒性化合物として、ファスロデックス、タモキシフェンまたはラロキシフェンなどの抗エストロゲン；カンプトテシン（トポI）またはエトポシド（トポII）などの任意のトポイソメラーゼIまたはIIのインヒビター；アナストロゾールまたはレトロゾールなどのアロマターゼ活性を阻害することを通して作用する任意の化合物；ハーセプチンなどのHER2シグナル伝達を妨害する任意の製剤；ドキソルビシンなどのDNAに挿入する任意の化合物が挙げられる。本発明化合物と併用できる特に好ましい細胞増殖抑制性または細胞毒性薬物は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、エポシロン、核内受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、白金化合物、ホルモンおよび抗ホルモン、インターフェロンおよび細胞周期依存性プロテインキナーゼの阻害剤（CDK）、シクロオキシゲナーゼおよび/またはリポキシゲナーゼのインヒビター、プロスタノイドおよびロイコトリエンなどの生体脂肪酸および脂肪酸誘導体、プロテインキナーゼのインヒビター、プロテインホスファターゼのインヒビター、脂質キナーゼのインヒビター、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン、トラジン（trazines）、ビンカアルカロイド、ピリミジン類縁体、プリン類縁体、アルキルスルホン酸塩、葉酸類似体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カルボプラチン、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンB、エポチロンD、エストラムチンホスフェート、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミドホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、放出ホルモンアナログゴナドトロピン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンγ、イリノテカン、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェニド硫酸オラミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メガストロール、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンC、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフラザジン、ニフルチモックス、ニムスチン、ニノラゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムチン、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プレ���シン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、塩化スクリフラビニウム、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセトアミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コ-トリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニラミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、テストステロンプロピオネート、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクオン、トレオスルファン、トリメトプリン、トロホスファミド、UCN-01、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびズルビシンまたはそのそれぞれの誘導体もしくは類縁体である。
【００９６】
本発明の特に好ましい実施態様において、付加的な細胞増殖抑制性または細胞毒性化合物はテモゾロミドである。
【００９７】
塩／エステル
本発明の組成物中の化合物または本発明にて利用可能な化合物は、塩またはエステルとして、特に医薬的に許容しうる塩またはエステルとして存在しうる。本発明の化合物の医薬的に許容しうる塩は、その適当な酸または塩基付加塩を包含する。適当な医薬上許容される塩は、Bergeら、J Pharm Sci、66、1-19（1977）に概説されている。塩は、たとえば、鉱酸、たとえば、硫酸、リン酸または塩酸などの無機強酸で；置換されていないか、置換されている（たとえば、ハロゲンで）炭素数1-4のアルカンカルボン酸、たとえば酢酸などの有機強酸で；飽和または不飽和の二カルボン酸、たとえばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸で；ヒドロキシカルボン酸、たとえば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸で；アミノ酸、たとえばアスパラギン酸またはグルタミン酸で；安息香酸で；または置換されていないか、（たとえば、ハロゲンで）置換されている（C1-C4）-アルキル-またはアリール-スルホン酸、たとえばメタン-またはｐ-トルエンスルホン酸などの有機スルホン酸で形成される。
【００９８】
エステルは、官能基のエステル化に応じて、有機酸またはアルコール／ヒドロキシドのいずれかを用いて形成される。有機酸は、置換されていないか、置換されている（たとえば、ハロゲンで）炭素数1−12のアルカンカルボン酸、たとえば酢酸などのカルボン酸を；飽和または不飽和の二カルボン酸、たとえばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸を；ヒドロキシカルボン酸、たとえば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸を；アミノ酸、たとえばアスパラギン酸またはグルタミン酸を；安息香酸を；または置換されていないか、（たとえば、ハロゲンで）置換されている（C1-C4）-アルキル-またはアリール-スルホン酸、たとえばメタン-またはｐ-トルエンスルホン酸などの有機スルホン酸を包含する。適当なヒドロキシドは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどの無機ヒドロキシドを包含する。アルコールは、置換されていないか、（ハロゲンで）置換されていていてもよい炭素数1−12のアルカンアルコールを包含する。
【００９９】
同位体
同位体 本発明の化合物はまた、かかる化合物を構成する１つまたは複数の原子で、天然に存在しない割合の原子同位体を含有してもよい。本発明の剤またはその医薬的に許容しうる塩の同位体変形は、少なくとも一つの原子が自然界で通常認められる原子量と異なる原子量であるが、同じ原子番号を有する原子と置き換えられているものとして定義される。該剤およびその医薬上許容される塩に組み込むことのできる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、たとえば、各々、2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18Fおよび36Clが挙げられる。該剤およびその医薬的に許容しうる塩の特定の同位体変形、たとえば、3Hまたは14Cなどの放射性同位元素が組み込まれている変形は、薬物および／または基質の組織分散実験にて有用である。トリチウム化水素、すなわち3H、および炭素-14、すなわち14C同位元素がその調製および検出特性の容易性から特に好ましい。さらには、ジュウテリウム、すなわち２Ｈなどの同位元素での置換は、より大きな代謝安定性よりもたらされるある治療有利性、たとえば、インビボでの半減期の増加または必要用量の減少を提供し、そのために状況次第では好ましい可能性がある。本発明の剤およびその医薬的に許容しうるの同位体変形は、一般に、適当な試薬の適切な同位体変形を用いる通常の操作により調製され得る。
【０１００】
放射性であっても、なくても、本発明の化合物および組成物の同位体変形はすべて本発明の範囲内に含まれることを意図とする。
【０１０１】
溶媒和物
本発明はまた、組成物に含まれる化合物または本発明に従って使用可能な一般式（I）〜（III）で示される化合物の溶媒和形態を包含する。特許請求の範囲で使用される語はこれらの形態を包含する。
【０１０２】
多形体
本発明はさらには、その種々の結晶形、多形体および（無）水和形の、本発明の組成物中に含まれる化合物または本発明に従って使用可能な式（I）で示される化合物に関する。このような化合物の合成にて使用される溶媒からの精製および／または単離方法を少し変形することで、化合物がこのようないずれかの形態で単離され得ることは、製薬産業の分野で十分に確立されている。
【０１０３】
投与
本発明の化合物は、経口、直腸、胃内、脳内および非経口投与、たとえば静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下および同様の投与経路を含む、種々の周知経路により投与され得る。非経口投与、特に静脈内投与、好ましくはデポー注射が好ましい。投与経路に応じて、異なる医薬製剤が必要とされ、そのいくつかは保護コーティングが薬物製剤に塗布されており、たとえば消化管での本発明の化合物の分解が妨げられることを必要とする。
【０１０４】
このように、好ましくは、本発明の化合物は、シロップ、注入または注射液、錠剤、カプセル、カプレット、トローチ、リポソーム、坐剤、プラスター、バンドエイド、遅延放出性カプセル、散剤または遅効性製剤として処方される。好ましくは、希釈剤は水、緩衝液、緩衝化塩溶液または塩溶液であり、担体は好ましくはココアバターおよびビテボソール（vitebesole）から選択される。
【０１０５】
本発明の化合物を投与するのに特に好ましい医薬形態は注射可能な使用に適する形態であり、滅菌水溶液または分散液ならびに滅菌注射用溶液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。あらゆる場合で、最終溶液または分散液の形態は滅菌かつ流動性でなければならない。典型的には、このような溶液または分散液は、たとえば、水緩衝性水溶液、例えば生体適合性緩衝剤、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、その適当な混合液などのポリオール、界面活性剤または植物油を含有する溶媒または分散媒体を包含する。本発明の化合物はまた、リポソームに、特に非経口投与用に処方され得る。リポソームは、遊離薬物の場合と比べて、循環において半減期を増加させ、封入薬物においてさえ放出を長期化するとの利点を提供する。
【０１０６】
注入または注射用溶液の滅菌処理は、これらに限定さるものではないが、抗菌剤または抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールのような保存剤を添加することを含む、当該技術分野にて理解される種々の方法により達成され得る。さらには、糖類または塩、特に塩化ナトリウムなどの等張剤が注入または注射用溶液に配合されてもよい。
【０１０７】
１つまたは複数の本発明の化合物を含有する滅菌性注射可能な溶液の製造は、個々の化合物を必要とされる量で、必要ならば上記される種々の成分と共に、適切な溶媒に配合し、つづいて滅菌処理することにより達成される。滅菌散剤を得るには、上記した溶液を必要に応じて真空乾燥または凍結乾燥させる。本発明の好ましい希釈剤は、水、生理的に許容される緩衝液、生理的に許容される緩衝塩溶液または塩溶液である。好ましい担体はココアバターおよびビテボソールである。上記されている好ましい賦形剤の他に、これらに限定されるものではないが、種々の医薬的に許容しうる形態の本発明の化合物と共に用いるのに、以下に示される賦形剤も選択され得る：
ａ）結合剤、たとえば、乳糖、マンニトール、結晶性ソルビトール、二塩基性リン酸塩、リン酸カルシウム、糖類、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン等；
ｂ）滑沢剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、硬化植物油、ロイシン、グリセリドおよびステアリルフマル酸ナトリウム；
ｃ）崩壊剤、たとえば、デンプン、クロスカルメロース、ナトリウムメチルセルロース、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど。
【０１０８】
他の適切な賦形剤は、米国医薬品協会（the American Pharmaceutical Association）より発行される「Handbook of Pharmaceutical Excipients」に開示され得る。この文献は、その全体において参照することによって本明細書に援用される
【０１０９】
障害の重篤度および本発明の化合物の一つで治療できる障害の特定の型、ならびに治療される個々の患者、たとえば、患者の通常の健康状態等に応じて、個々の化合物で治療的または予防的作用を惹起するのに必要とされる用量が変わることを理解すべきである。適切な用量の決定は顧問医の裁量の範囲内にある。
【０１１０】
当該技術分野にて知られているように、所定の組成物の薬学的に効果的な量は、投与経路にも依存している。一般に、投与が消化管、たとえば坐剤により、直腸を介してなされるならば、その必要な用量は多く、投与経路が非経口、たとえば静脈内であるならば少ない。
【０１１１】
本発明の意義の範囲内で、置換基または可変基の組み合わせは、このような組み合わせが安定したまたは化学的に可能性のある化合物をもたらす場合においてのみ許容される。安定したまたは化学的に可能性のある化合物は、40℃以下の温度で、水分または他の化学的に反応する条件下になく、少なくとも１週間保持された場合に、実質的に変化しない化合物である。本発明はまた、本明細書に開示される化合物の塩基性窒素を含有する基の四級化も想定する。水または油溶性あるいは水または油分散性の生成物はこのような四級化で得られてもよい。
【０１１２】
化合物が、経口、静脈内、髄腔内、実質内投与用に製剤されるのが好ましい。式（I）、（II）および（III）で定義される化合物ならびにテモゾロミドの両方が、経口投与されうるので、両方の化合物が経口投与用に製剤されるのが特に好ましい。この場合、腫瘍部位において最も有効な濃度が同時に達成されるように、両方の化合物の適切な量を、同時投与用に容易に合せることができる。
【０１１３】
本発明の最も好ましい実施態様において、式（I）〜（IV）で示される化合物は、中枢神経系に再吸収されるように製剤される。
【０１１４】
もう１つの態様において、本発明は、NFKBIAの低発現を特徴とする固形腫瘍の治療に用いるための、R1〜R11およびR21〜R27が前記と同意義である式（I）、（II）または（III）で示される化合物に関する。
【０１１５】
他に特記されない限り、上述のすべての定義は、本発明のこの態様にも適用される。
【０１１６】
NF-κB経路は、腫瘍発生、ならびに化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性において重要な役割を演じると考えられる。上記のように、NFKBIAは、細胞質ゾル中で核因子カッパBに結合し、核へのNF-κBの転座を阻害する。本発明の基礎となる研究において、驚くべきことに、ニクロサミドは、遺伝子の2つの完全なコピーを持つ腫瘍細胞においてNFKBIAの発現を増加させないが、NFKBIAをコードする遺伝子のヘテロ接合欠失を有する細胞においてNFKBIAの発現を有意に増加させることが見い出された。
【０１１７】
したがって、ニクロサミドは、NFKBIAの低発現、特にNFKBIAをコードする遺伝子のヘテロ接合欠失によって引き起こされる低発現を特徴とする固形腫瘍の治療に特に適している。腫瘍は、NFKBIAの低発現を示すという条件で、上述の腫瘍のいずれであってもよい。腫瘍が、膠芽腫、ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、黒色腫肝細胞がん、乳がんおよび多発性骨髄腫から選ばれるのが好ましい。固形腫瘍が、膠芽腫であるのが最も好ましい。
【０１１８】
本発明のこの態様の好ましい実施態様において、式（I）、（II）または（III）で示される化合物は、本願発明における任意の上述の細胞増殖抑制性または細胞毒性化合物と併用される。該併用はアルキル化剤に限定されない。
【０１１９】
本発明のこの態様に好ましい実施態様は、NFKBIAの低発現を特徴とする固形腫瘍の治療に用いるための、R1〜R11およびR21〜R27が前記と同意義である式（I）、（II）または（III）で示される化合物および医薬的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０１２０】
もう１つの態様において、本発明は、式（I）、（II）または（III）で示される細胞増殖抑制性化合物およびアルキル化剤を用いる併用療法が、固形腫瘍を有する患者を治療するのに適しているかどうかを決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の腫瘍細胞または腫瘍組織のサンプル中のNFKBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミドおよびアルキル化剤を用いる併用療法が、患者に適しているかどうかを決定すること（ここで、NFKBIAの低発現または欠失は、併用療法が患者に適していることを示す）；
を含む方法に関する。
【０１２１】
もう１つの態様において、本発明は、上述の式（I）、（II）または（III）で示される細胞増殖抑制性化合物を用いる療法が、固形腫瘍を有する患者を治療するのに適しているかどうかを決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の腫瘍細胞または腫瘍組織のサンプル中のNFKBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミドを用いる療法が、患者に適しているかどうかを決定すること（ここで、NFKBIAの低発現または欠失は、併用療法が患者に適していることを示す）；
を含む方法に関する。
【０１２２】
本発明方法が、インビトロで行われるのが好ましい。患者が、上述の固形腫瘍を患っているのが好ましい。患者が、膠芽腫を患っているのがより好ましい。
【０１２３】
サンプルが、腫瘍細胞を含むか、または腫瘍細胞からなる、問題になっている患者からのサンプルであるのが好ましい。このようなサンプルは、生検などによって採取されうる。サンプル中の腫瘍細胞の画分を増加させるために、腫瘍細胞に加えて他の細胞を含むサンプルを前処置してもよい。
【０１２４】
遺伝子の発現レベルの測定方法は当業者に周知である。遺伝子発現は問題になっている遺伝子のmRNA-転写物の量を測定することで決定され得、該遺伝子によりコードされるタンパク質の量を測定することによっても決定され得る。産生されたmRNA-転写物の量の測定に基づく好ましい方法は、定量的リアルタイムPCRおよびマイクロアレイなどの技法に基づくハイブリッド形成を包含する。特定のタンパク質の量を測定するための好ましい方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）などの免疫学的方法を包含する。
【０１２５】
低発現が、特定の方法によって測定された、問題になっているサンプルにおいて決定された発現レベルを、同じ用法によって測定された参照サンプル（１つまたは複数）において決定された発現レベルと比較することによって定義されるのが好ましい。好ましい参照サンプルは、NFKBIAをコードする遺伝子の2つの完全なコピーを持つ固形腫瘍である。該腫瘍中の遺伝子の両コピーのプロモーター領域が、突然変異を含まないのが好ましい。
【０１２６】
本発明の好ましい実施態様において、NFKBIAの低発現は、14q13におけるNFKBIA遺伝子座のヘテロ接合欠失（NFκBIA +/-）によって引き起こされる。
【０１２７】
本発明のもう１つの好ましい実施態様において、NFKBIAをコードする遺伝子の両コピーが存在するが、これらのコピーの少なくとも１つは、機能障害を有する。１つのコピーは、野生型によってコードされる遺伝子産物と同じ機能および活性を有する遺伝子産物をコードしない場合、本願において理解される「機能障害」を有する。NFKBIAは、サイトゾル内で核因子カッパB（NF-κB）に結合する能力を有する。それが、NF-κBに結合している間は、NF-κBは、核の中に入ることができず、転写調節因子として機能する。したがって、本発明において最も重要であるNFKBIAの活性は、そのNF-κBへの結合である。したがって、本願において理解される「機能障害」が、NF-κBへのNFKBIAの結合不全であるのが最も好ましい。このことは、他のアミノ酸に対するNFKBIAの結合特性に不可欠であるアミノ酸の交換によって引き起こされ得るか、またはNFKBIAをコードする遺伝子の一部の欠失によって引き起こされ得るものであり、その結果として遺伝子産物が短くなる。
【０１２８】
NFKBIAの非機能性コピーは、停止コドンまたは部分欠失の導入をもたらしうる。この場合、不可欠な機能ドメインを欠くならば、活性の低下した短くなった遺伝子産物が産生される。
【０１２９】
非機能性コピーは、遺伝子産物においてアミノ酸の交換を引き起こす点突然変異から得ることができる。もし該交換が、その機能にとって重要な遺伝子産物の一部に影響を及ぼすならば、その活性は低下するかまたは消失する。
【０１３０】
もう１つの態様において、本発明は、固形腫瘍を有する患者に投与されるべきニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定する方法であって、以下のステップ：
a）患者の腫瘍細胞または腫瘍組織のサンプル中のNFκBIAの発現レベルを決定すること；
b）決定された発現レベルを基準値と比較すること；
c）ステップb）の比較の結果に基づいて、ニクロサミド：テモゾロミドのモル比を決定すること（ここで、（i）基準値を上回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %未満でなければならないことを示し、（ii）基準値を下回る発現は、ニクロサミドのモル比が40 %以上でなければならないことを示す）；
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ニクロサミドは、pGBM細胞生存性を効率的に阻害する。（A）ニクロサミド曝露の5日後における21個のpGBM（＃を図示）の薬力学的解析。３回測定の平均±SDとしてのデータ。（B）代謝活性をコントロールレベルの50%まで減少させる濃度を表すIC50値のスペクトル。３個のヒト非腫瘍神経細胞集団（hnNC、「方法」の項を参照）、５個の市販の神経膠腫/GBM細胞株（「方法」の項を参照）および２１個のpGBM（（A）；表3を参照）から集めたデータ。差し込み図は、「腫瘍中心」対「末梢」、「原発性疾患」対「再発性疾患」、「過メチル化MGMTプロモーター」対「非メチル化試料」および「NFKBIA+/+を有するサンプル」対「ヘテロ接合NFKBIA欠失遺伝子型（NFKBIA+/-）を有するサンプル」に由来するpGBMにおける追加の一対比較実験（コード化された符号）からのIC50データを表す。P値（***p＜0.001）は、それぞれ一元配置分散分析およびテューキー事後検定を用いて、hnNCおよびGBM細胞株データをpGBMと比較して計算した。
【図２】ニクロサミドは、細胞増殖抑制性および細胞毒性効果を有する。（A）ニクロサミド（ニクロ）処置サンプルにおいて強く増加されるG1ピークを曝露させる適用の24時間後における細胞周期分析。（B）この時点で誘導される細胞抽出物のサイクリンD1（CCND1）ウエスタンブロット。（C）ニクロサミド（1.5μM；四角）またはDMSO（0.01%；菱形）への１回曝露後の細胞増殖動力学。（D）ニクロサミド（黒棒）または0.01% DMSO（白棒）の適用の5日後における非生活（avital）細胞、すなわち、アネキシンV+および／またはヘキスト33258+細胞の頻度を表すグラフ。差し込み図：平均データ（n＝5 pGBM；**p＜0.01）。非悪性ヒト細胞サンプル＃155におけるアポトーシス促進効果の欠如に留意。右の差し込み図：代表的分散プロット（＃046）。（E）125nM ニクロサミド（点線）または0.0025% DMSO（実線）の曝露の2日後においてスクラッチアッセイ（n＝2 pGBM）を行った。グラフは、ケースス＃046のクラッチ閉鎖（scratch closure）の時間経過を示す（平均±SD；3回分析）。
【図３】ニクロサミドは、pGBMの腫瘍開始潜在力を低下させる。（A）ニューロスフェアアッセイ（n＝4 pGBM；平均±SD）。グラフは、ニクロサミド前処置pGBM（一回曝露）からの一次（1°）、二次（2°）および三次（3°）ニューロスフェアの相対頻度を表す。データは、スフェア形成細胞（SFC）の持続的減少を示す。（B）1.5μM ニクロサミド（ニクロ；点線）対0.01% DMSO（実線）の単回適用後の長期細胞増殖データ（3回分析の平均±SD）。（C）異種移植片のカプラン-マイヤー生存曲線。実験のために、pGBM ＃046細胞をニクロサミド（点線）またはDMSO（実線）で前処置した。106個の生活細胞（vital cell）を第5日に採取し、免疫不全マウスの線条体に定位的に注射した。苦しんでいる動物を麻酔した。１つの例外（ニクロサミド；赤点）以外は、動物は脳内腫瘍の兆候を示した。
【図４】ニクロサミドは、いくつかのがん調節シグナル伝達経路に同時に影響を及ぼす。単回用量適用の5日後に、切断されたNOTCH1（A）およびホスホ-S6-タンパク質（B）のウエスタンブロット分析を行った。（C）データ定量化は、核ホスホCTNNB1（Ser552）+細胞の有意な減少を示した（***p＜0.001、３回実験、平均±SD）。（D）WNT/CTNNB1標的遺伝子のqRT-PCR分析（***p＜0.001、３回実験、平均±SD）。発現レベルは、DMSOコントロールに相関する。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析法を用いてP値を計算した。すべての実験が、pGBM ＃046、078、106および118を用いて行われたことに留意。
【図５】NFKBIAの欠失および発現レベルは、ニクロサミドおよびTMZの相乗的活性を予測する。（A）「NFKBIA+/-遺伝子型（紫）」対「NFKBIA+/+ サンプル（緑）」を有するpGBMのウエスタンブロット分析。経路活性を示すホスホRELA（p65-NF-κB）のレベルを、ニクロサミド曝露の3日後に決定した。（B）ニクロサミド（明）またはDMSO（暗）曝露に応答した、「NFKBIA+/+（046、078、138）pGBM」対「NFKBIA+/-（081、106、066）pGBM」中のmRNAレベルの定量。データは、DMS0コントロールに対して表す。差し込み図は、NFKBIAの基準mRNA発現レベルを表す。（C）「NFKBIA+/+（n＝4）pGBM」対「NFKBIA+/-（n＝3）pGBM」におけるTMZおよびニクロサミドのコンビナトリアル薬力学。増加する濃度のニクロサミドは、50μM TMZとの併用またはコントロールとしての0.05% DMSOとの併用のいずれかにおいて供給された。データを＃046（NFKBIA+/-、四角および三角）および106（NFKBIA+/+、逆三角および菱形）で例示し、3回実験の平均±SDで表した。矢印は、NFKBIA+/- サンプルについての相乗的活性を強調する。他の試験されたpGBMのデータを表２に示す。
【図６】ニクロサミドの用量応答曲線。化合物曝露の5日後に、細胞生存性のための尺度としての代謝活性を測定した（平均±SD、3回分析）。データは、DMS0コントロールに対して表す。代謝活性をコントロールレベルの50%まで減少させるニクロサミドの濃度としてIC50を決定した。（A）「市販のヒト神経膠腫/GBMであるLN229、T89G、U87、U138およびU272（グレー）」対「21個のpGBM（黒；平均±SD、図2Aに匹敵）」のデータの比較。（B）「ヒト非悪性神経細胞サンプル（コントロール）であるPKI-3、＃155およびH9.2（グレー）」対「21個のpGBM（黒；平均±SD、図2Aに匹敵）」のデータの比較。（C）pGBM ＃046、066および078の「腫瘍コア（四角）」対「腫瘍周辺部（三角）」に由来する対サンプルの評価。（D）pGBM ＃091、118および132の「原発性疾患（四角）」対「再発性疾患（三角）」に由来する対サンプルの評価。（E）「MGMTプロモーター過メチル化pGBMサンプルである＃023および＃025（三角）」対「MGMTプロモーター非メチル化pGBMサンプルである＃046、106および138（四角）」のデータの比較。（F）「NFKBIA+/+ pGBMサンプルである＃066、081および106（四角）」対「NFKBIA+/- pGBMサンプルである＃046、078および118（三角）」のデータの比較。
【図７】ニクロサミドは、pGBMにおいて一時的G1期停止を誘発する。細胞周期分析は、＃046および＃106において同様の結果を示した（PI、ヨウ化プロピジウム）。（A）6時間、（B）12時間、（C）24時間、（D）48時間、（E）72時間および（F）5日後における「1.5μM ニクロサミド」対「0.01% DMSO」に曝露された＃046 を示す。
【図８】ニクロサミドは、pGBM ＃GNV019の腫瘍開始潜在力を枯渇させる。（A）「ニクロサミド適用（1μM、点線）」対「DMSO（0.01%、実線）」の単回投与後の長期細胞増殖データ。（B）レシピエントとして新生仔マウスを用いる以外は図4Cについて記載した方法と同様にして異種移植片実験を行った。カプラン-マイヤー生存曲線は、「DMSO前処置（実線）細胞移植片」対「ニクロサミド前処置（点線）細胞移植片」の経過を示す。脳内腫瘍の兆候は、DMSOコントロールグループの9匹のうち8匹の動物に見られた。対照的に、ニクロサミド前処置移植片を移植された動物は、腫瘍形成の兆候は見られなかった（打ち切りイベント）。p値の計算は、ログ-ランク検定に基づいて行った。
【図９】グラフは、「pGBM」対「標準的芽腫（GBM）細胞株」の薬力学的分析からのIC50データを表す。規定培地（dm；n＝5；平均±SD）中に維持されたニクロサミド処置標準的細胞株は、pGBMに類似したニクロサミドに対する感受性の度合いを示す。P値は、一元配置分散分析およびテューキー事後検定を用い、標準的芽腫細胞株のデータとpGBMとの比較から計算した。n.s.は、有意でないことを意味する。（sm；標準培地条件）
【図１０】ニクロサミド用量応答曲線（A-E）；「標準培地条件（sm；実線）」対「規定培地条件（dm；点線）」中に維持された標準的GBMから得られた結果の比較。ニクロサミド効果が、dm条件下で、より明確（pGBM様）であることが明らかである。（F）各IC50値をまとめた表。
【図１１】hnNCケース＃155を様々なpGBMと組合わせる培養実験。（A）培養物のCellaVistaに基づく分析。ニクロサミド（1μM）の適用後、示された時点でデータを得た。3回分析（***、p＜0.001；**、p＜0.01）。（B）ニクロサミド（1μM）を各培養物に適用した5日後に得たFACSデータ。差し込み図は、分散プロットの代表的セットを表す。pGBMのケース＃046および＃078が、NFKBIA+/-であり；ケース＃035および＃106が、NFKBIA+/+遺伝子型であることに留意。LT、レンチウイルス形質導入；CT、セルトラッカー標識集団。
【図１２】ニクロサミドは、細胞NFKBIA状態（＃046＝NFKBIA+/-；＃106＝NFKBIA+/+）とは無関係に、NOTCHおよびmTORシグナル伝達を阻害する（NDの単回用量適用の5日後のリン酸化S6タンパク質のレベルの減少によってここに示される；n＝4のpGBMを分析した）。
【図１３】ニクロサミドは、pGBM（NFKBIA+/- 遺伝子型）の悪性潜在力を阻害する。（A）ニューロスフェアアッセイ（n＝2 pGBM、3回実験；平均±SD）。グラフは、ニクロサミド前処置pGBM（一回曝露）からの一次（1°）、二次（2°）および三次（3°）ニューロスフェアの相対頻度を表す。スフェア形成細胞（SFC）の持続的減少に留意、**p＜0.01。（B）カプラン-マイヤー生存曲線（追加の証拠に類似、図4）。脳内腫瘍の兆候は、1つを残してすべての動物に現れた（ニクロサミド；赤点）。
【図１４】NFKBIAの欠失および発現レベルは、pGBMにおけるニクロサミド（ニクロ）およびテモゾロミド（TMZ）の相乗的活性を予測する。（A）ニクロサミド（DMSOコントロールに相対する）に応答した、「NFKBIA+/+（グレー）」対「NFKBIA+/-（黒/白）」pGBMにおけるmRNAレベルの変化。差し込み図は、NFKBIAの基準mRNA発現レベル。（B）pGBMにおけるニクロサミド＋テモゾロミドの適用についてのコンビナトリアルインデックス（CI）評価。CIは、「観察された細胞活性」対「予測された細胞活性」の比率として表した。予測された結果は、テモゾロミド（のみ）による処置後の細胞の比率を乗じた、1 μMのニクロサミド（のみ）による処置後の生存細胞の比率として、参考文献（Chou TC、2010）にしたがって計算された（CI＜1：相乗、CI＝1：相加；CI＞1：拮抗）。（C）「NFKBIA+/-pGBM（左）」対「NFKBIA+/+pGBM（右）」におけるテモゾロミドおよびニクロサミドの代表的コンビナトリアル薬力学。増加する濃度のニクロサミドは、50μM テモゾロミドとの併用またはコントロールとしての0.05% DMSOとの併用のいずれかにおいて供給された。データは、3回実験の平均±SDとして提供した。
【図１５】NFKBIAの欠失および発現レベルは、規定培地条件（dm）中に維持された標準芽腫（GBM）細胞株におけるニクロサミド（ニクロ）およびテモゾロミド（TMZ）の相乗的活性を予測する。（A）ニクロ（DMSOコントロールに相対する）に応答した、「NFKBIA+/+（グレー）」対「NFKBIA+/-（黒/白）」におけるmRNAレベルの変化。差し込み図は、NFKBIAの基準mRNA発現レベル。（B）ニクロ＋TMZの適用についてのCI評価。CIは、「観察された細胞活性」対「予測された細胞活性」の比率として表した。予測された結果は、TMZ（のみ）による処置後の細胞の比率を乗じた、1 μMのニクロサミド（のみ）による処置後の生存細胞の比率として計算された（CI＜1：相乗、CI＝1：相加；CI＞1：拮抗）。（C）「NFKBIA+/-標準GBM細胞株（左）」対「NFKBIA+/+標準GBM細胞株（右）」におけるTMZおよびニクロの代表的コンビナトリアル薬力学。増加する濃度のニクロは、50μM TMZとの併用またはコントロールとしての0.05% DMSOとの併用のいずれかにおいて供給された。データは、3回実験の平均±SDとして提供した。ニクロ効果は、dm条件下でpGBM様であることが明らかである（図15に匹敵）。
【図１６】TNF-aは、NFKBIA+/- pGBMにおいて相乗活性をアンタゴナイズする。グラフは、化合物（ニクロ、1μM；テモゾロミド、50μM；TNF-a、50ng/ml）の適用の3日後の「NFKBIA+/-（黒）pGBM」対「NFKBIA+/+（グレー）pGBM」におけるコンビナトリアル処理パラダイムからのデータを提供する。差し込み図は、pREL Aのウエスタンブロット分析であり、TNF-a（Ta；50ng/ml）または0.002% ウシ血清アルブミン（C；コントロール）への曝露の24時間後のNF-kB経路活性を示す。***p＜0.001；**p＜0.01；*p＜0.05（3回実験；平均±SD；一元配置分散分析およびテューキー事後検定）。
【図１７】本研究における様々な実験的パラダイムのために用いたpGBMおよびそれらの各パッセージ番号のリスト。（Pharma、薬力学的分析；CT/LT、共培養実験；WB、ウエスタンブロット）。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
実施例
試薬
後述する実験用試薬は、自由に購入することができ、特に；アラマーブルー(alamarBlue：登録商標)、ヨウ化プロピジウムおよびヘキスト33258は、Life Technologiesから購入した；ニクロサミドおよびテモゾロミドは、Sigma-Aldrichから購入した；FITCアポトーシス検出キットIは、BD Bioscienceから購入した。
【０１３３】
マウス
ボン大学医療センターの倫理委員会は、実験動物を含むすべての研究を承認した。Rag2-/-Il2rg-/-マウスは、National Institute of Allergy and Infectious Diseases’ investigators（42）の受託業者であるTaconic Farm Inc.から入手した。SCID/ベージュマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。
【０１３４】
組織サンプル
ボン大学医療センターの脳神経外科におけるGBM手術からの腫瘍組織およびてんかん手術からの海馬組織（ケース＃155）。患者の特徴は、表３に詳述する。フロリダ大学脳神経外科における9歳の少年の外科手術からのpGBMケースGNV019。両方の場所における地方倫理委員会は、この研究を承認した；すべての患者または彼等の保護者は、インフォームドコンセントを提供された。組織診断および等級付けは、世界保健機関（43）の現在の分類に基づき、ボン大学医療センターの脳神経外科（the National Brain Cancer Reference Center）において2名の別の神経病理学者によって確認された。
【０１３５】
表３
0006272861.tif 000010
A：患者は、さらなる治療を拒否した；B：術後合併症；C：臨床悪化による治療の中止；D：２つのpGBMサンプルは、この患者に由来し、１つは、腫瘍コア（中心）であり、２つ目は、腫瘍周辺部に由来する（（10）参照）；E：２つのpGBMサンプルは、この患者に由来し、１つは、原発性疾患の時点、２つ目は、再発性疾患の時点である；R：腫瘍の切除；RT：標準的放射線療法；RT/TMZ：RT＋継続的毎日のテモゾロミド（併用）；TMZ：テモゾロミド（5/28：28日周期において1〜5日間）；PFS：無増悪生存；OS：全生存；メチル化：メチル化MGMTプロモーター；非メチル化：非メチル化MGMTプロモーター。
【０１３６】
組織の取り扱いおよび初代細胞の培養
最近の説明にしたがって、新鮮な生検サンプルの取扱いおよびpGBM（10）および海馬組織由来AHNP（＃155）（11）の誘導体化を行った。細胞の多面お培地条件は、（44）に詳述されている。他のすべてのpGBMおよびAHNPサンプルのための培地条件は、（18）に記載されている。データは、培養継代7〜13からのものである。
【０１３７】
樹立神経膠腫/GBM細胞株の培養
LN229、T98G、U87（MG）、U138およびU373（MG）細胞を、DMEM/F12ベース10%ウシ胎児血清（ハイクローン製）補足接着条件において維持し、分析した。これらの条件もまた、「sm条件」と呼ばれている。
【０１３８】
ヒトESおよびiPS細胞からの神経幹細胞の培養
この実験において、初代AHNP（上記参照）とともに、非悪性神経コントロール細胞として、２つの長期自己複製神経幹細胞培養物（lt-NES）を用いた。lt-NESは、元々ヒト胚性幹細胞株H9.2（45）およびヒト誘導多能性幹細胞株PKa（46）に由来した。lt-NESの維持のための条件は、近年記載された（45、47）。
【０１３９】
いくつかの研究のために、実験開始前に10日間、規定培地（dm）をGBMモデル細胞株に適用した。pGBMおよびhnNCs/AHNPの培養に用いた「dm」類似培地組成物、すなわち、（Lee J、Kotliarova S、Kotliarov Y、Li A、Su Q、Donin NMら、Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines。Cancer Cell 2006；9（5）：391-403）から適合された組成物：成長因子（EGF、bFGF；それぞれ10ng/ml）を１日置きに添加したN2/B27補足Neurobasal（商標）。組織の取扱いおよびpGBM4、海馬由来AHNP（＃155）（Walton NM、Sutter BM、Chen HX、Chang LJ、Roper SN、Scheffler Bら、Derivation and large-scale expansion of multipotent astroglial neural progenitors from adult human brain。Development 2006；133（18）：3671-81.）および＃GNV019細胞（Scheffler B、Walton NM、Lin DD、Goetz AK、Enikolopov G、Roper SNら、Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis。Proc Natl Acad Sci U S A 2005；102（26）：9353-8.）の誘導体化は、近年記載された。本明細書において提供するデータは、短期増殖pGBMおよびAHNPから得た（継代5-12；図18）。ニューロスフェアアッセイ以外は、全ての細胞は、ラミニン／ポリ-L-オルニチンコーティングプラスチック上で接着的に培養された。AHNPに加えて、非悪性神経コントロールとして、２つの長期自己複製神経幹細胞培養物（lt-NES）を用いた。lt-NESは、ヒト肺性幹細胞株H9.218およびヒト誘導多能性幹細胞株PKa19に由来した。
【０１４０】
共培養実験
使用説明書（Life Technologies）にしたがって、GFPのコーティング配列をもつpLenti6.2/V5-DESTゲートウェイベクターを用いて、pGBMのレンチウイルス形質導入および選択を行った。フルオロサイトメトリーは、安定な細胞発現を確認した。別法として、使用説明書にしたがって、pGBMおよびhnNCをセルトラッカーTM（-CFSE緑色蛍光色素または-赤色CMTPX；Life Technologies）で標識した。各共培養の開始のために、1：1の比率で細胞を混合し、培養実験パラダイムを行う前に24時間維持した。細胞増殖の典型的なモニタリングのために、蛍光可能なセラビスタ（CellaVista(登録商標)）システムアナライザー（Roche Diagnostics）を用いた。FACSキャリバーフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて、終点分析のためのFACSデータを得た。
【０１４１】
一次ドラッグスクリーニングおよび薬力学的分析
試験した化合物を、線形対数期の細胞増殖に供給した。分析前に、使用したすべての細胞サンプルについてそれぞれ滴定実験を行った。2〜3x103個の細胞／ウエルを、ラミニン／ポリ-L-オルニチンコーティング96ウエルプレートに播種した24時間後に、1μMの各化合物（ストック溶液 10mMのDMSO溶液）で細胞を処理した。0.01〜0.1% DMSOでコントロール細胞を処理した。適用から5日後、使用説明書（Life Technologies）にしたがって、アラマーブルー(登録商標)アッセイを用いて、細胞増殖の尺度としての代謝活性を決定した。インフィニット200マイクロプレートリーダー（Tecan）を用いて、λex＝540nmおよびλem＝590nmにて蛍光を測定した。実験は、各サンプルについて3回繰り返して行った。
【０１４２】
薬力学的解析のために、5x104個の細胞を１２ウェルのプレートに２４時間プレーティングし、一連の化合物および併用化合物をそれぞれ適用した。処置の3〜5日後に、アラマーブルー（登録商標）をベースとする解析を行った。実験は3回繰り返して行った。IMC50は対照の状態と比べて代謝活性を50%まで減少させる化合物の濃度として定義され、グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）4.0のデータ解析を介して決定された。
【０１４３】
増殖動力学
処置後5日目に、3.5cmのラミニン／ポリ-L-オルニチンコーティングプラスチック皿に4.7x104個のウイルス細胞をプレーティングし、トリプシン処理の4〜6日後に、採取し、計数し、4.7x104の密度で再プレーティングした。手順を4〜5回繰り返した。細胞増殖変へのニクロサミド誘発性変化の長期モニタリングのために、使用説明書にしたがって、セラビスタ(登録商標)システムアナライザー（Roche Diagnostics）を用いて、細胞集密度を決定した。
【０１４４】
細胞遊走分析
ミニン／ポリ-L-オルニチンでコーティングした12ウエルプレートに、5x104個の細胞をプレーティングした。4日間、24時間毎に125nM ニクロサミドで細胞を処置した。プレーティング（70%の細胞密度で）の3日後、滅菌ピペットチップで引っ掻き傷をつけた。その後、非接着細胞を除去するために培養培地を交換した。セラビスタ(登録商標)システム（Roche Diagnostics）のプラークアッセイへの適用を、使用説明書に従って行い、引っ掻き傷サイズを経時モニターした。3回分析データSEM。
【０１４５】
細胞周期分析
細胞（5x104個／ウェル）を12ウェルプレートで増殖させ、表示される時点で処理した後に集めた。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）に再び懸濁させ、氷冷メタノールで固定し、４℃で少なくとも24時間インキュベートした。細胞ペレットを遠心分離により集め、50μg/mlのヨウ化プロピジウムおよび50μg/mlのRNaseを含有する、PBS溶液に再び懸濁させた。３７℃で30分間インキュベートした後、細胞をFACSキャリバーフローサイトメーター（calibur flow cytometer）（BD Bioscience）を用いてDNA含量について分析した。
【０１４６】
アネキシンVベースFACS分析
化合物適用の5日後に、1x105個の細胞を集め、遠心分離に節、100μlのアネキシンV緩衝液に再懸濁させ、5μlのアネキシンV-FITCとともに室温にて1時間インキュベートした。生存細胞と死亡細胞を区別するために、1.2μg/mlのヘキスト33258による標識を用いた。アネキシンVの存在を、FACSDivaソフトウェアを備えたLSRII（BD Bioscience）における標準的条件を用いて決定した。測定ごとに、2x104個の細胞をカウントした。用語「非生活細胞」は、アネキシンV+-、アネキシンV+/ H33258+およびH33258+細胞について用いた。
【０１４７】
ニューロスフェアアッセイ
確立されたプロトコル（10、44）に基づいて、自己複製性クローン形成細胞の頻度を評価するために、ニューロスフェアアッセイを行った。ニューロスフェアを培養して21日目に定量し、単個細胞懸濁液にトリチュレートし、第二または第三のニューロスフェアを解析するために再びプレーティングした。３°ニューロスフェアの表示フラクションをラミニン／ポリ-Ｌ-オルニチンをコートしたガラス製カバースリップ上にプレーティングし、2-3週間分化させ、4％パラホルムアルデヒド（PFA）に固定することで多能性を決定した。
【０１４８】
蛍光分析
免疫蛍光解析は、PFA固定のサンプルについて、bIIIチュブリン（Promega；モノクローナルマウス、1：1000）およびＧＦＡＰ（DAKO；ポリクローナルウサギ、1：600）に対する抗体を用いて、標準プロトコル（44、48）に従って行われた。細胞核を、DAPI（Sigma）を用いて可視化した。
【０１４９】
ウエスタンブロット分析
化合物適用後、24〜144時間に、細胞抽出物を調製し、（49）に記載のように処理した。ブロット膜を、それぞれサイクリン-D1（1：1000； BD Pharmingen）、開裂したノッチ１（cleaved-Notch 1）（1：1000）またはホスホ-S6タンパク質（1：1000；all Cell signaling）とともに4℃にて一夜インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合第二抗体（SantaCruz）を１時間添加した。洗浄後、ブロットを、ECLシステム（Millipore）を用いて発色させた。均等なローディングを確認するために、ブロットをβ-アクチン抗体（Sigma；1：5000）で再びプロービングした。
【０１５０】
定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応（qRT-PCR）
使用説明書にしたがって、RNeasyミニキット（Qiagen）を用いて、総RNAを単離した。ナノドロップ（Peqlab）を用いてRNA濃度の定量を行い、反応混合物中で400ngの総RNAをオリゴ-dTプライマーで逆転写した（1xRT-Puffer、10mM DTT、500μMのプールしたdNTPs、1U/μl RNasインヒビター、2.5U/μlのエキスパンド逆転写酵素；すべてRoche Diagnostics）。反応は、42℃にて1時間起こった。96ウエルプレートにおいて、総体積10μl中で、リアルプレックス4 マスターサイクラー Epp グラディエントS（Eppendorf）および次のPCR条件：95℃にて2分間、次いで、95℃にて15秒間、60℃にて20秒間および72℃にて30秒間を40サイクル；を用い、cDNA産物を増幅させた。
【０１５１】
S100A4 フォワード：5’-CTCAGCGCTTCTTCTTTC-3’（配列番号：1）；
S100A4 リバース： 5’-GGGTCAGCAGCTCCTTTA-3’（配列番号：2）；
c-Myc フォワード： 5’-TTCGGGTAGTGGAA-AACCAG-3’（配列番号：3）；
c-Myc リバース：5’-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3’（配列番号：4）；
サイクリン D1 フォワード： 5’-CCGTCCATGCGGAAGATC-3’（配列番号：5）；
サイクリン D1 リバース：5’-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3’（配列番号：6）；
NFKBIA フォワード： 5’-ACACCAGGTCAGGATTTTGC-3’（配列番号：7）；
NFKBIA リバース： 5’-GCTGATGTCAATGCTCAGGA-3（配列番号：8）。
【０１５２】
ハウスキーピング遺伝子 グリセリンアルデヒド-3-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のcDNA定量のために、以下のプライマーを用いた：フォワード：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3（配列番号：9）；リバース：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’（配列番号：10）。データ解析は、マスターサイクラーEppレイアルプレックスソフトウェア（Eppendorf）を用いて行った。3回のqRT-PCR反応から平均値を計算した。発現された遺伝子の各平均値を、GAPDH cDNAの各平均量に標準化した。
【０１５３】
SNP（Single nucleotide polymorphism）アレイ解析
NFKBIA遺伝子座の評価のために、全ゲノム遺伝子型決定解析を行なった。製造者のインフィニウムHDアッセイにしたがい、イルミナHUMANCytoSNP-12 v2.1（Illumina、サンディエゴ、USA）を用いて、299,140個のSNPの遺伝子型決定を行った。 GenotypingおよびGenomeViewerモジュールを含むイルミナGenomeStudio（2011.1）ソフトウェアによりデータを解析した。LogR比およびアレル頻度の検査によって染色体異常を同定した。
【０１５４】
MGMTプロモーターメチル化状態
近年記載された（50）パイロシーケンシングによってMGMT遺伝子のメチル化状態を決定した。簡単に述べると、製造者の推奨にしたがって、EpiTect Bisulfiteキット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用い、0.5 μgのゲノムDNAを、亜硫酸水素ナトリウムで処理した。パイロシーケンシングのために、プライマー：MGMT-Py フォワード、5’-ビオチン-GGATATGTTGGGATAGTT-3’（配列番号：11）（GenBank受託番号 AL355531、ヌクレオチド46891〜46908）およびMGMT-Bis リバース、5’-AAACTAAACAACACCTAAA-3’（配列番号：12）（GenBank受託番号 AL355531、ヌクレオチド47138〜47156）およびフォワードプライマーの5’末端に結合したビオチンを用い、亜硫酸水素修飾ゲノムDNAから265 bp領域を増幅した。伸長反応に用いたプライマーは、12 CpGサイトを含む63 bpのフラグメントの配列決定を可能にする5’-CCCAAACACTCACCAAA-3’（配列番号：13）であった。強いメチル化部分を有するCpGサイトを標的とするパイロシーケンシングアッセイを設計した。使用説明書にしたがい、Pyromark Q24装置（Biotage、ウプサラ、スウェーデン）にて、PyroGold Reagents（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用い、パイロシーケンシングを行った。相対ピーク高さパーセンテージによる「メチル化」対「非メチル化」アレルのパーセンテージを決定するためのCpG定量ソフトウェアを用い、PyroMark Q24ソフトウェア（Biotage、ウプサラ、スウェーデン）によって、パイログラムの出力を解析した。個々の位置におけるCpGメチル化を測定し、年齢の一致した正常脳組織から得られたメチル化データと比較した後、メチル化または非メチル化で腫瘍サンプルをスコア付けした。SssIメチラーゼによってインビトロメチル化されたヒト参照DNAを、メチル化についてのポジティブコントロールとして用いた。
【０１５５】
腫瘍異種移植片実験
細胞を採取し、係数し、0.1% DNase/PBSに再懸濁した。トリパンブルー排除を介して細胞活力を確認した。ケース＃046について、106個のDMSOコントロール（n＝5）-前処置pGBMまたはニクロサミド（n＝5）-前処置pGBMを、12週齢のRag2Il2rg-/-マウスの線条体に定位注射した（0.8 mm 前方、2 mm 側方、3 mm 深さ）。ケース＃GNV019について、2.5x104個の疑似コントロール（キラー・プレート(登録商標)化合物 2F05；n＝9）-前処置pGBMまたはニクロサミド（n＝6）-前処置pGBMを、P2〜P3齢のスキッドベージュマウスに頭蓋内注射した。マウスを毎日モニターし、苦痛/神経症状または有意な体重減少の兆候が現れたら、安楽死させた。＃019GNV実験は、苦痛を示さない一匹の動物を残して、第169日に終了した。次の組織学的分析のために、脳を除去し、抗凍結し、クライオスタット（Leica）上で20μmの厚さに連続的に切断した。5番目の切片毎に、ルーチンである腫瘍形成の組織学的分析用B＆E染色に付した。
【０１５６】
統計分析
統計分析のためにGraphPad Prism 4.0ソフトウェアを用いた。誤差バーとともに示すデータは、他に特記しない限り、3回実験からの平均±SDを表す。薬力学的分析のために、一元配置分散分析およびテューキーの事後検定を用いて、p値を計算した（図1）。多重比較のために、一元配置分散分析およびボンフェローニ事後検定を用いて、p値を計算した。適用可能であれば、両側スチューデントのｔ検定を用いて、統計的有意さを決定した。＜0.05であるp値を有意とみなした。
【０１５７】
結果
ニクロサミドは、GBM療法のための予め認識されていない候補である。
スクリーニングアプローチのために、160個の合成および天然毒性物質を含むライブラリを用いた。患者特異的およびGBM特異的特徴を保持すること、および幹細胞品質を有するかまたは有さない腫瘍細胞の亜集団を含むことが予め分かっている4つのpGBMは、発見プラットホームとしての役割を果たした（＃023、035、046、106；（10）を参照）。ライブラリの化合物の単回適用後の第5日における細胞生存性の尺度としての代謝活性を決定するアラマーブルー(登録商標)アッセイに基づいて、一次スクリーニングを行った。実験において、4つのpGBMの平均代謝活性をコントロールレベルの50%未満まで低下させたすべての化合物を「ヒット」とみなした。31種の化合物、特にそれらのうちのニクロサミドがこの基準を満たした。さらに、ニクロサミドは、試験したpGBM（表１）のすべてにおいて効果的に影響を及ぼすことによって、患者間の不均一性に取り組む十分な潜在力を示し、非悪性原発性成人ヒト神経前駆細胞（AHNP；（11）、表１）のコントロールケースであるhnNCサンプル＃155に同様に影響を及ぼすようには見えなかったので、がん特異的潜在力を実証した。ニクロサミドは、脳腫瘍を治療するために未だ示唆されなかった選択的pGBM抗がん潜在力を明らかにした。ニクロサミドは、数十年間知られており、多くの規制機関によって駆虫薬として承認されている。神経外、たとえば、前臨床結腸直腸がんモデルにおける最近の研究は、この薬物のある活性を示唆した（12、13）。しかしながら、膠芽腫の治療のための効果的細胞増殖抑制性化合物の不足を考慮すると、この腫瘍実体におけるニクロサミドの効能は、驚くべきものであった。
【０１５８】
表１
0006272861.tif 000011
【０１５９】
ニクロサミドは、pGBM細胞生存性を効果的および選択的に阻害する。
ライブラリの一次スクリーニングから得られた結果を有効にするために、Sigma-Aldrichから入手したニクロサミドの製剤を用いて、薬力学的分析を行った。スクリーニング実験においてすでに用いた4つのケースを含む合計21のpGBMを研究した。得られた用量-応答曲線は、すべてのサンプルについて一貫性のある経過を示した（図1A）。ニクロサミドが相対的代謝活性の50％の減少を誘発する濃度（IC50）は、300nM〜1.2μMの範囲であった。これは、参照およびコントロール細胞サンプルにおいて観察される、より耐性のある性能とは著しく異なるものであった。本明細書においてコントロールとして用いた5つの一般的に調査された神経膠腫/GBM細胞株（LN229、T98G、U87、U138およびU373、方法の項を参照）のIC50値は、2.4〜4.2倍高い濃度にて計算された（図1B；図6）。ニクロサミド曝露に対して神経膠腫/GBM細胞株の感受性が低いのは、過去の早期発症段階における薬物スクリーニングの多くの結果を妨げた主要因子である、それらの維持の標準的状態（すなわち、血清含有、マイトジェンフリー）によるものである（7）。さらなる実験は、この過程が正しいことを明らかにした。「標準的GBMモデル」細胞株（すなわち、LN229、T98G、U87（MG）、U138、U373（MG））が、「dm条件」下、すなわち、pGBMの維持に用いた培養条件下で維持される場合、ND効果は、pGBMから得られた発見と非常に似ている。
【０１６０】
しかしながら、特に、pGBMと同じ規定培養条件で維持された３つの非悪性hnNCの分析もまた、感受性の有意に低いレベルを明らかにした（方法の項；図1B；図6参照）。このことは、ニクロサミドのpGBM特異的活性を示唆した。pGBMおよび非悪性hnNCが、dm条件下で共培養される場合、hnNCのより低い感受性が確認されうる。これらのデータは、非悪性神経細胞におけるND毒性が低レベルであることおよびpGBMに対する選択的活性を示唆する。
【０１６１】
GBMを特徴付ける細胞および遺伝的多様性を考慮して、本発明者らは次に、重要な臨床的コンステレーション（clinical constellations）を表しているpGBMにおけるニクロサミドの薬理効果を調査した（10、14-16）。したがって、（i）同一GBM患者の「腫瘍コア（中心）領域」対「末梢領域」、（ii）同一GBM患者の「原発性疾患」対「再発性疾患」、（iii）MGMT-プロモーター「過メチル化組織」対「非メチル化組織」ならびに（iv）「ヘテロ接合欠失NFKBIA遺伝子型を有するGBM」対「非欠失NFKBIA遺伝子型を有するGBM」に由来するサンプルを用いて比較実験を行った（下記参照）。すべてのこれらのpGBMサンプルにおいて同様にニクロサミドの強い阻害活性を決定することができた（差し込み図1B；図6）。同時に、これらのデータは、本発明者らの一次スクリーニングの結果を確認し、有効にし、有効性および選択性の高いpGBMインヒビターとしてのニクロサミドを示す。
【０１６２】
ニクロサミドは、pGBMにおいて細胞増殖抑制性、細胞毒性および抗郵送効果を有する。
pGBMにおけるニクロサミドの阻害活性をさらに分類するために、化合物への単回曝露後に、細胞周期、活力および遊走機能の研究を行った。ヨウ化プロピジウム（PI）ベースのフローサイトメトリー分析は、pGBMの一過性のＧ１期停止を示した（図2A；図7）。これは、G1期からS期への細胞周期移行の調節因子であるサイクリンD1発現の強い減少と一致した（図2B）。迅速かつ一過性の活性の細胞増殖抑制性についての証拠は、pGBMの増殖動力学の試験において同じように示された（図2C）。5日間の増殖遅延が見られたことにより、さらなる細胞毒性応答が明らかになった。この時点で、ニクロサミドのアポトーシス促進効果は、位相差顕微鏡法によって観察されたように（図示せず）、そして、ヘキスト／アネキシンVフローサイトメトリー分析によって定量されたように（図2D）、生活細胞（vital cells）の強くてpGBM選択的な減少を引き起こした。興味深いことに、結腸がん細胞について記載された近年の発見と同様に（12）（図2E）、亜毒性（sub-toxic）濃度でのニクロサミドの適用は、さらに、pGBMにおいて、抗遊走効果を引き起こした。このように、ニクロサミドは、pGBMにおいて、細胞毒性、細胞増殖抑制性および抗遊走効果の組合せを誘発した。
【０１６３】
ニクロサミドは、pGBM腫瘍開始活性を阻害する。
次の一連の実験では、腫瘍開始細胞（TIC）の活性におけるニクロサミドの影響を決定することを目的とした。TICは、少なくともヒトGBMにおける腫瘍内不均一性という重篤な機能的結果を具体化し、それらは、幹様、すなわち、自己複製性および多能性細胞の小さい亜集団によって表されることが予想される（たとえば、17-19）。しかしながら、それらの正確な表現型の特徴は捉えどころがないままである（20）。本発明者らは、それらの応答を測定するために、アッセイの組合せを間接的にニクロサミドに適用した。最初に、ニューロスフェアアッセイ（NSA）を用いて、自己複製性および多能性細胞のプールに対する潜在的改変を評価した。先の研究において、本発明者らは、培養継代5-10のpGBMのうち、0.25〜1%の範囲のそれらの頻度を確立した（（10）参照）。現在の研究において、3つのこれらの不均一なpGBMサンプル（＃046、078、106）が、ニクロサミドに曝露され、NSAでの処理のために第5日において生活細胞が採取された（方法の項参照）。「DMSO前処置」対「ニクロサミド前処置」細胞からの一次、二次および三次スフェアの定量は、ニクロサミドの単回適用が、pGBMにおいて自己複製性、多能性細胞の頻度を強く低下させることを示した（図3A）。ニクロサミドは、適用濃度1.5μMにて、残っている自己複製しているpGBMにおいて多能性潜在力を無効にしなかったので（図3A、差し込み図）、この設定を用いることは、同様に、インビボでの腫瘍原性細胞頻度の測定可能な減少を実証することができると推測させるものであった。pGBMの平行長期増殖分析（セラビスタ(登録商標)、細胞集密度ベース、方法の項参照）は、この濃度において、細胞増殖抑制性ニクロサミド効果からの生活細胞の回復が、14-23日遅れで予測されるべきであったことを示した（図3B）。しかしながら、同所異種移植研究は、ニクロサミド前処置生活細胞を移植された動物が、予測よりも著しく長く生存することを実証した（図3C；図8）。これらの結果の統計的有意さを、ニクロサミド前処置細胞移植片に腫瘍形成が観察される、より低い程度と対にした。１つの移植シリーズ（＃GNV019）において、ニクロサミドへの単回曝露は、pGBMの腫瘍形成能を完全に消滅させた（図8）。第二の実験シリーズ（＃046）において、強い低下を観察することができた。ここで、一方的に線条体に移植されたDMSO前処置＃046 pGBMは、88±5日後、レシピエント動物（n＝5）において、苦痛の深刻な兆候を引き起こした。次の組織学的分析は、これらのケースのすべてにおいて、大規模な脳内腫瘍形成および白質路に沿った対側大脳半球への移植された細胞の強い浸潤能を明らかにした。一方、移植後153±23日でのニクロサミド前処置＃046 pGBMを受けた動物の4/5において発生した腫瘍は、より小さいサイズであり、細胞は、線条体移植部位に隣接する領域に蓄積した。脳室下帯にクラスター形成し、脳梁に分散し、個々の細胞が対側大脳半球に到達した増殖pGBMが見い出された（図3E、差し込み図）。これは、DMSO前処置＃046細胞の早期移植後ステージに対応した。明らかに、pGBMの拡散的侵襲性は、長期実験中に、拡大する腫瘍塊の兆候の前でさえも安楽死を必要とする動物に神経学的機能不全/苦痛を誘発するのに十分であった。ともかく、実験のデータを合せると、ニクロサミドの単回曝露が、pGBMの腫瘍開始活性の有効な減少をもたらすことが強く示唆された。
【０１６４】
ニクロサミドは、がん駆動シグナル伝達カスケードを妨げた。
ヒトがん細胞において、限局的な数（circumscribed number）の転写因子および関連するシグナル伝達経路が、過活動的であることが知られている（21）。先の研究からの証拠は、すでに、ニクロサミドが、血液、乳房および結腸がん細胞中のこれらのいくつか、特にノッチ-、mTOR-、Wnt-/β-カテニン-およびNF-κB-シグナル伝達を妨げることを示唆していた（12、13、22-24）。したがって、該研究は、pGBMにおける作用機序分析のために、経路のこの一群に焦点を合せた。ニクロサミドへの単回用量曝露後の第5日に、細胞を調査した（n＝4 ケース：＃046、078、81、106）。切断されたノッチ1-タンパク質のレベルの低下によって示されるように、ウエスタンブロットは、pGBMにおけるノッチ経路活性の濃度依存性阻害を実証した（図4A、12Aおよび12C）。同様に、活性mTORシグナル伝達の主なインジケーターとしてのリン酸化S6タンパク質のレベル（25）は、すべてのサンプルにおいて低下することが明らかにされた（図4B、12Bおよび12D）。この効果は、NFKBIA遺伝子の状態とは独立している。多面的活性はまた、疾患の動物モデルにおいて同所移植された前曝露pGBMにおけるNDの強い抗腫瘍潜在力を説明する（図13）。Wnt-/β-カテニン経路の調査はさらに、ベータ-カテニンの転写活性の非標準（別）Akt依存性調節によるニクロサミドの特異的妨害を示唆した。腫瘍浸潤に重要な役割を演じることが知られているこのメカニズムの活性状態の特徴は、Ser552にてリン酸化されたβ-カテニンの脳内蓄積の増加である（26）。pGBMにおけるそれぞれの免疫細胞化学的暴露および定量は、ニクロサミドの適用に応答した核内ホスホβ-カテニン（Ser552）抗原の強い減少を実証した。その結果として、特徴的なβ-カテニン標的遺伝子の発現は、pGBMにおいて有意に減少してみえた（12、17、28）。このように、ニクロサミドは、pGBMにおいて多面的作用機序を示し、主ながん駆動シグナル伝達カスケードを阻害する。
【０１６５】
NFKBIAは、ニクロサミドおよびテモゾロミドの相乗効果を予測する。
ノッチ-、mTOR-およびWnt-/β-カテニン-媒介性経路における一貫した抑制性への影響とは対照的に、ニクロサミドはpGBMにおけるNF-κB-において可変的効果を示した。作用機序分析のために用いた4つのケースはのうち、ホスホ-p65-NFκBタンパク質のレベルの減少によって示されるように、ウエスタンブロットは、2つのケース（＃046および＃078）についてのみ経路阻害を示した（図5A）。続いてのゲノム解析（方法の項を参照）は、これらの2つのケースについて、細胞内NF-κB-シグナル伝達の主要リプレッサーをコードする、14q13におけるNFKBIA遺伝子座（NFκBIA+/-）のヘテロ接合欠失を実証した。近年の研究は、NFκBIAの欠失および低発現が、GBM患者における望ましくない臨床的結果（16）、を伴うことを示唆しており、さらなるNFκBIA+/-およびNFκBIA+/+pGBMおよび標準的GBMモデルは、さらなる調査のためのコホートから同定された。これらのサンプル（pGBM：各グループについて、n＝3；GBM：各グループについて、n＝2）は、NFκBIAの各ゲノム状態と一致する基準発現レベルを示した（差し込み図5B；insets of 図14Aおよび15Aの差し込み図）。しかしながら、ニクロサミドに曝露させると、dm条件下でのNFκBIA+/-pGBMならびに標準的GBMモデルは、それらのNFκBIA発現を強く上方調節されることが明らかであった（図5B、14Aおよび15A）。同様な応答が、NFκBIA+/+サンプルにおいて観察されたので、pGBMでのNF-κB-シグナル伝達におけるニクロサミドの可変的効果を、NFκBIA+/-サンプルにおけるNFκBIA発現の差動刺激（differential stimulation）によって説明することができた。GBM細胞におけるNFκBIAの下方調節が、標準的GBM化学療法剤であるTMZなどのアルキル化剤への応答の欠如を伴うことが知られているので、この観察は興味を引かれるものであった（29）。一方、NF-κB単独の阻害は、ほとんどの固形腫瘍に重篤には影響を及ぼしえず、むしろ、化学療法に対するがん細胞の耐性を防げるのに役立つことが知られている（30、31）。このように、ニクロサミドとTMZの併用がこの設定を有しうるという潜在的利点は調査された。
【０１６６】
表２
0006272861.tif 000012
【０１６７】
実験は、7つのpGBM（n＝4、NFκBIA+/-；n＝3 NFκBIA+/+；表２）および4つの標準的GBM細胞株のコホートを用いた。これらのサンプルのすべては、標準的放射線/TMZ化学療法に対する乏しい臨床応答を示す状態である、非メチル化MGMTプロモーター状態を明らかにした（2、16）。ニクロサミドのコンビナトリアルインデックス分析は、50μM TMZの存在下で行われた。pGBMおよびGBMのコンビナトリアルインデックスを図14Bおよび15Bに示す。TMZの濃度は、多くのこれまでの研究において、インビトロで維持された神経膠腫細胞の生存性に非常に少ない影響しか及ぼさないことが明らかにされた（10、33、34）、患者における報告された血漿ピークレベルに基づいて選ばれた（32）。同様に、本発明者らは、pGBMへの50μMのTMZの適用が、それらの代謝活性を、コントロールレベルのわずか94±4%まで低下させ（n＝7、3回分析；データ示さず）、GBMの活性をわずか89±8%まで低下させることを観察した。しかしながら、ニクロサミドとの併用で、TMZは、NFκBIA+/- pGBMならびにGBMサンプルにおいて特定の効果を示した。それらの用量-応答曲線は、NFκBIA+/+サンプルと比較して、ニクロサミド/TMZ併用の、より強い阻害活性を示す著しい左シフトを示した（図5C、14Cおよび15C）。コンビナトリアルインデックス（CI；(35)）の計算は、NFκBIA+/+pGBMに対する相加効果（CI＝0.92±0.05）およびすべてのNFκBIA+/-サンプルにおけるニクロサミド/TMZの明らかな相乗効果（CI＝0.61±0.11）を示唆した（表１）。
【０１６８】
標準的細胞株に対して同様な結果が得られた（図15参照）。
【０１６９】
観察された相乗活性にけるNFκBの関与を直接実証するために、本発明者らは、NFκBアクチベーターであるTNFα（Peprotech）を用いて、コントロール研究を行った。TNFαの適用は、pGBMにおいてNFκBを活性化させ、本発明者らの仮説にしたがって、NFKBIA+/-遺伝子型における相乗効果に対抗した（図16）。
【０１７０】
これらのデータは、ニクロサミドが、現在のGBMの標準的化学療法剤であるTMZの抗がん効果を増強させることを示唆した。GBM細胞におけるNFκBIAのゲノム状態を実証することに基づいて、ニクロサミドおよびTMZの相乗効果は、さらに予測可能になりえる。
【０１７１】
考察
本研究の総合データは、ニクロサミドの多面的抗がん作用が、さまざまな重要な臨床的コンステレーションから理想的にPGDMを阻害するために適していることを示す。細胞増殖抑制性、細胞毒性および抗遊走効果は、誘発され、pGBM中の幹様／腫瘍原性細胞フラクションは強く減少される。このように、GBMにおける治療的アプローチを困難にする患者間および患者内腫瘍不均一性の課題ならびに神経膠腫細胞の侵襲性（36）は、１つの薬物によって接近可能になる可能性がある。それにもかかわらず、この化合物のいくつかのユニークな特徴は、脳腫瘍治療への変換のための将来的調査を保証する。ニクロサミドは、まだ脳腫瘍の治療のために考慮されていない多くの規制機関によって承認されている駆虫薬である。ニクロサミドは、1959年に軟体動物駆除剤（molluscide）としてBayerによって発表されたサリチル酸の化学的誘導体であるサリチルアニリドである。動物およびヒトにおける医薬用途には、わずかの毒性しか引き起こさない経口適用が好ましい。動物における研究は、変異原性、発癌性または胎児毒性活性がないこと、および累積的効果がないことを示唆した。腸管からの吸収率は、33%と見積もられた（蓄積レビューについては、（37）を参照）。インビトロデータは、ニクロサミドが、ヒト非悪性神経（コントロール）細胞に、ほんのわずかしか影響を及ぼさない濃度範囲で、原発性疾患、再発性疾患、MGMTプロモーターメチル化および非メチル化ならびにNFκBIA+/+およびNFκBIA+/- GBMサンプルに由来するGBMコアおよび末梢細胞を阻害することを示唆する。
【０１７２】
作用機序分析のために、この研究は、ほとんどが、血液腫瘍学、結腸および乳がん調査の分野における以前の研究からの証拠に依存している（12、13、22-24）。本研究の発見は、これらの研究の結果を確認しており、GBM悪性腫瘍においても極めて重要な役割を演じることが知られているWnt-/β-カテニン-、ノッチ-およびmTor-シグナル伝達におけるニクロサミドの多面的な阻害効果を明らかにする（16、38-40）。将来的臨床適用に特に興味深いものは、NFκBIA+/-がん遺伝子型においてNFκBIA発現を刺激するという、ニクロサミドのこれまでに認識されていない属性である。応答可能なメカニズムは不明確なままであるが、得られるNF-κB活性の阻害を、TMZなどのアルキル化剤に対する耐性に打ち勝つために用いることができた（29）。本明細書に置いて実証された、NFκBIA+/- pGBMにおけるニクロサミドと現在の標準的GBM化学療法剤であるTMZの相乗効果は、この仮説のための証拠を提供する。ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、黒色腫、肝細胞がん、乳がん、および多発性骨髄腫などの、NFκBIAの特定のシングルヌクレオチド多形およびハプロタイプ（集団的参照には、（16）を参照）を提示している他のがん実体が、ニクロサミドとアルキル化剤化学療法処方を組合わせることから利益を得る可能性が高い。
【０１７３】
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【図１】
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【図２ＡＢＣ】
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【図２ＤＥ】
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【図３】
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【図４ＡＢＣ】
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【図４Ｄ】
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【図５ＡＢ】
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【図５Ｃ】
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【図６ＡＢＣ】
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【図６ＤＥＦ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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